/
Автор: Дероум Э.
Теги: химия физическая химия химическая физика электромагнетизм монография ядерный магнитный резонанс химические исследования
ISBN: 5-03-001750-х
Год: 1992
Текст
Modern NMR Techniques
for
Chemistry Research
Andrew E. Derome
The Dyson Perrins Laboratory,
University of Oxford, UK
Pergamon Press
Oxford - New York - Beijing Frankfurt
Sao Paulo Sydney Tokyo-Toronto
Э. Дероум
Современные
методы
ЯМР
для химических
исследований
Перевод с английского
Ю. М, Дёмина
и
канд. хим. наук В. А. Черткова
под редакцией
д-ра хим. наук, проф. Ю.А. Устынюка
Москва «Мир» 1992
ББК 24.5
дзб
УДК 541.1
Дероум Э.
Д36 Современные методы ЯМР для химических исследований:
. Пер. с англ. -М.: Мир, 1992.-403 с., ил.
ISBN 5-03-001750-х
Монография английского ученого представляет собой руководство по ЯМР,
доступное по уровню наложения исследователю, не имеющему специальной под-
готовки по спектроскопии. В ней наряду с изложением основ стандартных методов
ЯМР (импульсный ЯМР и фурье-преобразование сигналов свободной прецессии,
методы подготовки образцов, выбор растворителя и т. д.) рассматриваются новые
методики одномерной (ядерный эффект Оверхаузера и т.п.} и двумерной спектро-
скопии ЯМР. Изложение материала имеет ярко выраженную практическую направ-
ленность, приведены многочисленные примеры решения структурных химических
задач.
Для химиков-исследователей, преподавателей и студентов старших курсов хими-
ческих вузов.
„ 1708000000-241 л
Д —— -----------— 66—91
041 (01)—92
ББК 24.5
Редакция литературы по химии
ISBN 5-03-001750-х (русск.)
ISBN 0-08-032513-0 (англ.)
© 1987 Pergamon Books Ltd.
© перевод на русский язык,
Дёмин Ю.М., Чертков В. А., 1992
Предисловие редактора перевода
Спектроскопия ЯМР высокого разрешения как наиболее инфор-
мативный и мощный метод структурных и динамических исследований
столь глубоко пронизывает все химические дисциплины, что без овладе-
ния ее основами нельзя рассчитывать на успех в работе в любой области
химии. Поразительная особенность этого метода-необычайно быст-
рое его развитие на протяжении всех последних 45 лет с момента
открытия ЯМР в 1945 г. События последних 10 лет завершились полным
обновлением методического арсенала и аппаратуры ЯМР. Основу при-
борного парка сейчас составляют спектрометры, оснащенные мощными
сверхпроводящими соленоидальными магнитами, позволяющими со-
здавать постоянные и очень однородные поля напряженностью до
14,1 Т. Каждый из таких приборов представляет собой сложный измери-
тельно-вычислительный комплекс, содержащий помимо магнита и
радиоэлектронных блоков один или два компьютера, обладающие
высоким быстродействием, большими объемами оперативной памяти
и дисками огромной емкости. Импульсные методики возбуждения и
регистрации сигналов с последующим быстрым фурье-преобразованием
окончательно вытеснили режим непрерывной развертки, доминировав-
ший в ЯМР до конца 70-х годов. Как правило, получаемая спектральная
информация перед ее отображением в виде стандартного спектра под-
вергается сложной математической обработке. На несколько порядков
возросла чувствительность приборов. Методы двумерной спектроскопии
и другие методики, реализующие сложные импульсные последователь-
ности при возбуждении систем магнитных ядер, кардинально изменили
весь методический арсенал исследователей и открыли перед ЯМР новые
области применений. Эти новые и новейшие достижения уже нашли свое
отражение в нескольких монографиях, появившихся за рубежом и в пере-
водах на русский язык. Но они рассчитаны на специалистов с хорошей
физико-математической подготовкой. Между тем подавляющее боль-
шинство химиков-экспериментаторов не обладают такой подготовкой.
Более того, для практического приложения современного ЯМР вполне
достаточно ясного понимания лишь основных физических принципов
поведения ансамблей магнитных ядер при воздействии радиочастотных
полей. Это понимание обеспечивает химику правильный выбор метода
6
Предисловие редактора перевода
или совокупности методов при решении многих структурных задач.
Книга Э. Дероума представляет, иа мой взгляд, весьма удачную попыт-
ку изложить современные методы ЯМР в таком практическом аспекте
иа качественном уровне, В ией автор очень умело воспользовался
наглядными графическими схемами, позволяющими легко понять
эволюции векторов намагниченностей в спиновой системе под воздей-
ствием импульсных последовательностей, В книге, богато иллюстри-
рованной конкретными примерами спектров всех видов, подробно рас-
смотрено влияние разных экспериментальных факторов иа результирую-
щий спектр, а также весьма типичные ошибки, возникающие в практи-
ческой работе. Поэтому такие непростые понятия, как перенос намагни-
ченности и перенос когерентности, обретают совершенно реальный
смысл даже для слабо подготовленного читателя, хотя и приходится
мириться с некоторой долей вульгаризации. Я думаю, что тот, кто
решил воспользоваться книгой 3, Дероума в качестве практического
руководства для освоения современных методик ЯМР, ие ошибся
в выборе. Оиа быстро станет настольным руководством в каждой
лаборатории ЯМР и вполне может быть использована как лекционный
материал для студентов старших курсов и аспирантов.
Ю. Устынюк
Предисловие автора
Впервые открыв эту книгу и раздумывая, покупать ли ее, вы,
возможно, спросите себя: «А зачем мне усложнять себе жизнь?». Ведь
в ией много внимания уделяется физическим основам эксперимента
ЯМР, хотя и делается это на качественном уровне. Такой подход может
испугать химика или биолога. Здесь много экспериментальных деталей,
которые могут показаться липшими тому, кто привык доверять спе-
циалистам решение спектральных проблем. Даже многие из тех, кто
наслышан о последних достижениях метода ЯМР, часто получают
больше удовольствия, занимаясь вопросами интерпретации и доверяя
технические детали кому-то другому. На основании целого ряда сообра-
жений я считаю, что подобное отношение к методу ЯМР как к «черному
ящику» нельзя считать правильным при решении химических и биологи-
ческих задач. Подробное описание того, что содержится в этой книге,
приведено в первой главе.
Почему ЯМР является столь полезным методом? Это вызвано
многими причинами, но главная из них в том, что метод ЯМР позволяет
устанавливать взаимосвязи между конкретными объектами. Высокая
информативность, определяемая большим диапазоном химических
сдвигов и интенсивностей сигналов, имеет по существу общий характер
для остальных спектральных методов, в том числе для И К-спектро-
скопии. В этом отношении ЯМР не имеет больших преимуществ. Его
особая ценность обусловлена тонкой структурой спектра, возникающей
за счет взаимодействия между ядрами, а также различными другими
взаимодействиями, такими, как ядерный эффект Оверхаузера, зависящий
от взаимного расположения ядер. Если мы хотим охарактеризовать
структуру выделенного чистого соединения, оценить протон-протонные
расстояния в белке или выделить сигнал меченого метаболита из
сложной природной смеси, то должны обратиться к тем свойствам,
которые основаны на взаимодействии одного ядра с другим.
Исключительные достоинства импульсного ЯМР полностью рас-
крылись за последние примерно 10 лет, что привело к развитию ряда
совершенно новых способов использования этих взаимосвязей. На пер-
вый взгляд один только перечень новых экспериментов может обескура-
жить. Этих экспериментов так много, что кажется невозможным хоть
8
Предисловие автора
как-то начать их понимать. Однако это не так сложно. В разных
сочетаниях для этого используется несколько основных принципов. Если
усвоить эти принципы, то любой новый эксперимент может быть легко
встроен в общую картину. Это важная причина для того, чтобы
попытаться понять, что же происходит во время импульсных экспери-
ментов. Вы сможете оценить, на самом ли деле какой-то новый метод
лучше подходит для решения вашей конкретной задачи. Важным свойст-
вом импульсного ЯМР является то, что в целом его легче понять, чем
ЯМР с непрерывной разверткой, даже несмотря на то, что последний
метод может быть хорошо знаком. В импульсном эксперименте система
большую часть времени совершает эволюцию независимо от внешнего
воздействия, поэтому здесь одновременно нужно учитывать меньшее
число взаимодействий.
Современный импульсный эксперимент ЯМР выполняется исключи-
тельно в режиме с фурье-преобразованием. Вопрос о том, почему это
так, детально рассматривается в этой книге, но сам факт столь широкого
использования метода Фурье заставляет лишний раз задуматься о при-
роде экспериментов ЯМР. Несомненна польза от реализации этого
метода. Особенно эффективные результаты могут быть получены при
использовании преобразования в пространстве более чем одной пере-
менной. Важно при этом понимать и те ограничения, которые характер-
ны для цифровой обработки сигналов. Оцифровка сигналов и их
преобразование с помощью компьютера часто ограничивают точность
измерений частоты и интенсивности, а в отдельных случаях могут даже
делать невозможной одновременную регистрацию сигналов. В целом
это нетрудно понять, но вопрос носит несколько абстрактный характер
для тех, кто только начинает знакомство с методом фурье-спектро-
скопии ЯМР. Даже если вы не собираетесь сами садиться за спектро-
метр, то вам целесообразно хотя бы бегло ознакомиться с тем, как
^.связаны между собой следующие параметры: время регистрации и раз-
решение или интервал между импульсами, время релаксации и интенсив-
ность сигнала. При использовании современного метода ЯМР много
ошибок происходит из-за непонимания возникающих при этом огра-
ничений.
Другая причина, по которой стоит изучать ЯМР, особенно его
практические аспекты, заключается в том, что это просто приятно.
Многие химические, а в последнее время и биологические проекты
в своей кульминационной стадии оказываются завязанными на экспе-
римент ЯМР. После года упорной работы над синтезом какого-то
меченого субстрата может потребоваться лишь несколько дней для того,
чтобы провести решающий эксперимент методом ЯМР, с помощью
которого может быть установлен механизм органической реакции или
найден путь метаболизма внутри живой клетки. И несправедливо пере-
давать специалисту-оператору не только хлопоты, но и радостные
волнения при проведении такого эксперимента: учитесь делать это
сами. Конечно, определенные усилия придется затратить для начального
Предисловие автора
9
ознакомления со спектрометром. Вас ждет несколько бессонных ночей,
пока вы наконец не получите хоть какого-то удовлетворения. Придется
изо всех сил поработать и для того, чтобы понять саму суть эксперимен-
тальной техники ЯМР. В итоге вы приобретете глубокое понимание
наиболее важного спектрального метода, а заодно получите заряд
бодрости и сделаете полезный перерыв в однообразной рутине лабо-
раторной жизни.
Многие помогали мне в подготовке этой книги, и я выражаю
им свою благодарность. Я приношу искренние извинения всем тем, кого
по недоразумению ие отметил. В первую очередь я признателен Джейн
Макинтайр за первоначальное уведомление меня о том, что проект стал
возможен. Некоторые мои коллеги из Лаборатории Дайсона Перрииса
и Лаборатории неорганической химии прочитали текст и сделали много
полезных замечаний. Среди них есть и студенты-дипломники, и опера-
торы ЯМР, н инженеры по электронике, и университетские лекторы,
и дипломированные научные сотрудники. Я благодарен Барбаре До-
мейн-Хейман, Элизабет Макгиннесс, Дермоту О’Харе, Майку Роберт-
сону, Майку Робинсону, Крнсу Шофилду и Нику Тернеру. Особенно
я признателен Элизабет Макгиннесс и Тине Джексон, которые вынесли
основную нагрузку по обеспечению потребностей в ЯМР сотен иссле-
дователей из многочисленных химических подразделений Оксфорда, что
дало мне возможность сосредоточиться на работе над текстом. Майк
Робертсон провел значительную модификацию коммерческого спектро-
метра для некоторых из наиболее необычных экспериментов, а Тина
Джексон осуществляла техническую помощь.
Многие исследователи предоставили мне рисунки и химические
соединения для проведения вспомогательных экспериментов. Я благо-
дарен Джону Брауну (рис. 9.6 и 9.7), Джорджу Флиту (соединение 1 в гл.
8-10), Нику Тернеру (соединение 6 в гл. 5) и Робу Янгу (соединение
6 в гл. 8) из Лаборатории Дайсона Перрииса (Оксфорд); Дермоту О’Харе
(рис. 8.45, 9,10 и 10.11) из Лаборатории неорганической химии (Окс-
форд); Крису Бауэру (рис. 7.19), Рею Фримену (рис. 8.21) и Питеру Хору
(рис. 2.23) из Лаборатории физической химии (Оксфорд); Джонатану
Бойду (рис. 8.36) с Биохимического факультета (Оксфорд); Джеймсу
Килеру (рис. 8.24 и 10.13) из университетской химической лаборатории
(Кембридж); Дине Кеглевич (соединение 2 в гл. 8) из Института Рудера
Бошковича (Загреб). Фирмы Oxford Instruments и Bruker Spectrospin
также предоставили большое число рисунков (я выражаю им благодар-
ность в соответствующих подписях). Рис. 5.10 воспроизводится с раз-
решения из книги: Noggle J. Н„ Schirmer R. Е., The Nuclear Overhauser
Effect-Chemical Applications, Academic Press, 1972.
Как и другие книги серии «Органическая химия», этот текст под-
готовлен к печати методом фотокопирования с шаблона. Для того
чтобы достичь наивысшего качества, я сам набирал, текст с помощью
устройства Monotype Lasercomp в службе компьютерного сервиса
Оксфордского университета. Я признателен этой службе за предостав-
10
Предисловие автора
лениую возможность работать с таким устройством и Кэтрин
Гриффин за ценные рекомендации по его использованию. Кристин
Палмер из Лаборатории неорганической химии (Оксфорд) превосходно
выполнила графические работы с моих едва разборчивых эскизов,
причем зачастую с высокой скоростью; я благодарю ее за столь
существенную помощь. Окончательное размещение текста выполнено
в «Пергамон-пресс» под руководством эксперта Колина Дрейтона,
который нашел возможность не огорчать меня даже в тот момент, когда
весь проект иа месяц отставал от графика,
Эндрю Дероум
Предисловие
С появлением в 50-х годах промышленных ЯМР-спектрометров
высокого разрешения химики получили в руки новый исключительно
мощный аналитический инструмент. Структура и симметрия молекул
прямо связаны с видом спектра, что позволяет легко и быстро решать
такие структурные задачи, которые раньше были под силу лишь не-
многим ученым, обладающим высоким интеллектом и химической
интуицией. В те годы на все исследования, проводимые иа спектрометре
с мощным электромагнитом или постоянным магнитом, требовалось
лишь 100 мг вещества.
Еще один переворот в области ЯМР происходит в наши дни. Ои
обусловлен внедрением надежных сверхпроводящих магнитов совместно
с импульсными методиками и преобразованием Фурье. Разрешение
и чувствительность приборов выросли настолько, что исследования
можно проводить на микрограммовых количествах вещества. Но, воз-
можно, еще более важное значение имеет развитие импульсных методик,
позволяющих в небывалой степени контролировать намагниченность
образца и управлять ею, В результате с помощью импульсной спектро-
скопии ЯМР химики получают, вероятно, более обширную структурную
информацию, чем с использованием любого другого отдельно взятого
аналитического метода.
В этой книге Э. Дероум знакомит химиков с практическими аспек-
тами новых методов ЯМР. С ее помощью любой химик, не имеющий
специальной подготовки физика-спектроскописта, сможет понять и ис-
пользовать для решения структурных задач огромные возможности,
заложенные в новом поколении фурье-спсктрометров со сверхпроводя-
щими магнитами. Я настоятельно рекомендую прочитать эту книгу
химикам и биологам, работающим как в научных учреждениях, так
и в промышленности, чтобы в полном объеме овладеть новыми возмож-
ностями спектроскопии ЯМР.
Лаборатория Дайсона Перрннса
Оксфордский университет
Джек Болдуин
член Королевского
общества
Введение
Сигналы ЯМР отражают влияние целого ряда слабых взаимодей-
ствий между ядрами и электронами внутри молекулы, между различ-
ными ядрами одной молекулы и между ядрами соседних молекул. Если
бы мы смогли различить и понять природу всех этих взаимодействий, то
получили бы чрезвычайно богатый источник информации о структуре
и конформации молекул, о межмолекулярных взаимодействиях и моле-
кулярном движении.
Все это становится возможным благодаря очень большим временам
релаксации, свойственным ядрам со спииом 1/2 в подвижных жидкостях.
Действительно, спектры с сигналами шириной 0,1 Гц или меньше на
частоте 500 МГц кажутся просто невероятными. Ведь это означает, что
мы можем различать даже сигналы, расположенные очень близко друг
к другу.
Спектры высокого разрешения даже небольших молекул часто ока-
зываются весьма сложными. Но упоминавшиеся выше взаимодействия
являются слабыми, поэтому описывающие их перекрестные члены при
измерениях в сильных магнитных полях становятся малыми. В результа-
те получающиеся спектры интерпретируются достаточно легко, поэтому
неудивительно, что спектроскопия ЯМР стала столь незаменима для
химиков-органиков.
С увеличением размеров молекул сложность спектров ЯМР быстро
возрастает, сигналы начинают перекрываться, и в результате интер-
претация спектров затрудняется. В этом случае приходится прибегать
к гораздо более сложной последовательности экспериментов, и перед
химиком-органиком возникает вопрос: насколько глубоко ему следует
изучать технические аспекты современного ЯМР? Важно понимать, что,
не освоив новых методов спектроскопии ЯМР, химик ие будет даже
представлять себе, каким же образом спектроскопия ЯМР может помочь
ему решить конкретную структурную задачу. Не следует использовать
ЯМР как некий «черный ящик», производящий непонятные операции.
Большинству химиков-органиков сегодня просто необходимо знать
возможности современной спектроскопии ЯМР. В этой книге д-р
Э. Дероум описывает основные принципы и способы практического
использования ЯМР на понятном для химиков языке. Несмотря иа
Введение
13
большой объем книги, ее все же стоит прочитать. Она окажет существен-
ную помощь в работе тем, кто внимательно ее изучит. Я также надеюсь,
что читатели получат большое удовольствие от энтузиазма, прони-
зывающего весь текст книги. Тем же, кто захочет получить более
глубокие знания об описываемых экспериментах, помогут приводимые
в книге ссылки на литературу.
Рекс Ричардс
член Королевского общества
Оксфордский университет
Глава 1
О чем эта книга
1.1. Введение
На рис. 1.1 показан протонный спектр ЯМР холестерилацетата,
зарегистрированный на спектрометре с непрерывной разверткой и с
рабочей частотой 60 МГц. В 60-е годы и в начале 70-х годов было
исследовано много соединений подобного типа. Тогда такой спектро-
метр считался прибором высшей категории для научных исследований.
Даже такие грубые спектры произвели настоящую революцию в органи-
ческой химии, что является прекрасной иллюстрацией больших возмож-
ностей ЯМР в решении химических задач и доблести первых исследова-
телей, применявших этот метод.
В настоящее время мы вправе ожидать много большего от наших
спектрометров (рис, 1.2), рабочие частоты которых почти в 10 раз
больше, ио и стоимость по крайней мере в 30 раз выше. Очевидно, что
Рис. 1.1. Спектр ЯМР, зарегистрированный на спектрометре с рабочей частотой
60 МГц в режиме непрерывной развертки.
О чем эта книга
15
Рис. 1.2. Спектр того же образца (см. рис, 1.1), записанный на фурье-спектро-
метре с рабочей частотой 500 МГц.
спектр на рнс, 1,2 лучше, однако я хочу подчеркнуть вовсе не это. Этот
спектр все же недостаточно хорош. Внутренние ограничения ЯМР
таковы, что, несмотря на все наши усилия по улучшению конструкции
спектрометра, мы ие можем интерпретировать протонные спектры даже
относительно простых соединений «с первого взгляда». Такое положение
сохранится и в обозримом будущем, если только ие будет найдена
совершенно новая конструкция магнита. Вспомним, например, что
резкий скачок напряженности поля в 3-4 раза произошел при переходе
от электромагнитов к сверхпроводящим магнитам. Но дальнейшие
усилия по совершенствованию конструкции сверхпроводящих магнитов
на протяжении почти 20 лет привели к увеличению напряженности поля
только в 2 раза.
Одни лишь успехи в создании новых приборов не смогли бы
обеспечить решение наших спектроскопических задач. Но, к счастью,
одновременно с совершенствованием спектрометров ЯМР необычайно
быстро развивались и наши знания о свойствах ядерных спиновых
систем. Примерно в 1980 г. была достигнута некая критическая точка
16
Глава 1
в накоплении этих знаний, что привело к быстрой разработке целого
ряда новых экспериментальных методик. Почти каждый химик-исследо-
ватель сейчас определенно наслышен о том, что в ЯМР произошло
что-то необычное. Однако круг тех, кто действительно понимает суть
событий, еще достаточно узок. Большинство статей по ЯМР имеет
техническую направленность. Они появляются в самых разных и иногда
необычных химических, физических и биологических журналах, поэтому
неспециалисту трудно быть в курсе самых современных достижений.
В курсах по спектроскопии ЯМР для химиков-органиков импульсная
фурье-спектроскопия ЯМР до сих пор иногда остается лишь дополне-
нием к методу ЯМР с непрерывной разверткой. Современные методы
ЯМР в ннх почти никогда не рассматриваются. Так дальше оставаться
не может, потому что понимание того, как использовать ЯМР для
решения тех или иных проблем, составляет основу успеха в химических
исследованиях.
Я стремился дать введение в современный ЯМР в такой доступной
для неспециалиста форме, чтобы в книге можно было найти все
необходимое. Конечно, для работы с ией нужны знания основ, о которых
сказано в следующем разделе. Книга рассчитана на заинтересованного
студента или начинающего научного работника. Она будет полезна
и более опытным химикам, желающим познакомиться с новыми мето-
диками ЯМР, В ее основу положен краткий курс лекций для аспирантов,
который я читал в Оксфорде, Правда, в этом курсе не содержалось
экспериментальных деталей и описания ряда методик. Я надеюсь, что
основное содержание книги будет понятно для студентов старших
курсов. Сейчас студентов редко учат применению современных методик
ЯМР. Одиако это лишь означает, что мы не поспеваем за событиями,
и совсем ие связано с чрезвычайной концептуальной сложностью
предмета.
1.2. Что вам нужно знать
Я полагаю, что вы уже сталкивались с «традиционным» ЯМР
и близко знакомы с использованием протонного магнитного резонанса
(ПМР) для решения структурных задач. В связи с этим книга не
содержит разделов о связи химических сдвигов или констант спин-спиио-
вого взаимодействия (КССВ) со структурой, так как эту информацию
легко найти в других книгах и учебниках, но не только поэтому. Более
важно то, что современные эксперименты ЯМР могут уменьшить нашу
зависимость от таких эмпирических корреляций. До сих пор мы чаще
всего ограничивались формулировками типа: «Спектр находится в со-
ответствии со структурой X». Наша цель состоит в том, чтобы перейти
к формулировкам: «Доказательство структуры X следует из...». Я
q надеюсь, что вам знаком метод двойного протои-протонного резонанса,
, представляющий собой подавление спин-спинового взаимодействия
между протонами (гомоядерная развязка). Этот метод несколько раз
О чем эта книга
17
упоминается в тексте, но детально не объясняется. Вы могли также
встречаться с ядерным эффектом Оверхаузера, ЯЭО (NOE, от англ.
Nuclear Overhauser Effect), которому в книге посвящена гл. 5.
Что касается других ядер, то вам должно быть известно о возмож-
ности наблюдения ядра 13С и о трудностях регистрации спектров
вследствие низкого естественного содержания этого изотопа. Если вы
использовали в работе углеродные спектры, то в таком случае вы
должны были встречаться и с экспериментами с внерезонансной раз-
вязкой, которые дают возможность определить число протонов, связан-
ных с каждым из углеродов. Химики-неорганики или биологи в большей
степени используют спектры 31Р. Ваш предварительный опыт в этой
области не столь важен, так как изложение материала в книге в равной
мере относится ко всем типам ядер. Примеры часто будут привлекаться
из протонной и углеродной спектроскопии, поскольку я чаще всего
использую их в своей работе на кафедре органической химии. Суще-
ственными являются различия между ядрами со спииом 1/2 и ядра-
ми с большим спином (квадрупольные ядра). Обсуждение большин-
ства вопросов в этой книге концентрируется вокруг ядер со спином
1/2, ио в некоторых случаях рассматриваются и квадрупольные
ядра.
Время от времени мы будем использовать простую математику, но
это не должно вызывать боязни, так как она не существенна для
понимания материала. Эта книга написана не для физикохимнков, в ней
нет выводов уравнений или детального математического анализа, но
приводятся отдельные действительно полезные формулы. Физическая
модель, введенная в гл. 4, требует знания основ тригонометрии и декар-
товых координат. В нескольких местах также используются уравнения
скорости первого порядка, но более трудных математических вычисле-
ний нет, за исключением небольших по объему векторных вычислений
в гл. 4, которые можно опустить без ущерба для понимания. В одном
или двух местах потребуется понимание таких компьютерных терминов,
как «память» или «байт».
1.3. Что вы найдете в этой книге
Эта книга не является полным обзором современных методов ЯМР.
Любая попытка включить такой обзор в текст ограниченного объема не
оставила бы возможностей для объяснений или примеров. Вместо этого
я решил рассмотреть несколько типичных экспериментов, чтобы
продемонстрировать принципы современного ЯМР и его некоторые
практические аспекты. При описании новых экспериментов я попытался
прежде всего показать их физический смысл и пояснить их в той мере,
в какой это возможно без применения математики. Некоторые считают,
что следует избегать такого подхода, поскольку он не является опре-
деленным и информативным. Но это дело личного вкуса, поэтому
я надеюсь, что вы отнесетесь ко мне с должной терпимостью, если вам
18
Глава 1
иногда покажется, что я слишком упрощаю объяснения или провожу
физические аналогии слишком далеко.
Начальной точкой для наших рассуждений должно быть введение
в методы Фурье (гл. 2). Несмотря на то что они широко используются
уже много лет, химики все еще имеют слабое представление об их
достоинствах и ограничениях. Еще недавно можно было мириться с этой
ситуацией, хотя она уже была далека от идеальной, поскольку в простых
рутинных одномерных спектрах мы редко встречаемся с ограничениями
метода Фурье. Но положенне в корне меняется для двумерных экспери-
ментов, которые описаны в гл. 8-10. Велико искушение пренебречь
техническими аспектами спектроскопии ЯМР, особенно когда кажется,
что математический смысл их не вполне ясен. Но в этом случае нужно
себя перебороть. Спектроскопия ЯМР столь важна для химиков, что мы
не можем пользоваться ею в качестве «черного ящика».
При обсуждении импульсных экспериментов нам потребуется не-
которая модель для их описания. Наглядный способ описания дан в
гл. 4. Большая часть содержания книги требует знания материала гл. 2
и 4, поэтому эти главы необходимо прочитать первыми. Остальные
главы не так сильно связаны друг с другом. Гл. 5 посвяшена только
ядерному эффекту Оверхаузера. В гл. 6 идея переноса поляризации
изложена сначала на частном примере, а затем развита в более общей
форме в гл. 8 и 9. Общее представление о двумерном ЯМР вводится
в первой части гл. 8. Эта часть является необходимым введением
в последние три главы. Рассуждения о методиках двумерной спектро-
скопии с преобразованием Фурье отдельно от их приложений выглядят
абстрактными, поэтому в гл. 8 также разбирается один из типов
двумерного эксперимента-гомоядерная корреляционная спектроскопия.
Гл. 9 посвящена гетероядерной корреляционной спектроскопии, а в
гл. 10 описаны различные эксперименты, в которых имеют дело с
мультиплетной структурой (/-спектроскопия).
Две оставшиеся главы (3 и 7) посвящены экспериментальным мето-
дикам. Я думаю, что очень важно уметь запасаться опытом эксперимен-
тальной работы с ЯМР всякий раз, когда для этого появляется возмож-
ность. Тогда достаточно сухие и абстрактные рассуждения приобретают
совершенно другую окраску. Тот, кто сам постоянно работает на
импульсном фурье-спектрометре, без большого труда может понять
важность цифрового разрешения, времени pei истрации данных, функций
фильтра и т.п. Невозможно дать исчерпывающее руководство по всему
экспериментальному ЯМР [1] в двух главах, поэтому я вынужден был
провести отбор материала. Я сознаю, что мой выбор может показаться
довольно странным. Он основан на моих личных наблюдениях за
многими исследователями, которые начинали осваивать спектрометры
с высокими магнитными полями, и на анализе тех трудностей, с которы-
ми сталкивались такие новички.
Я включил изложение основ экспериментальной техники в первую
часть гл. 3, так как часто имел возможность наблюдать, как многие
О чем эта книга
19
новички па чрезвычайно дорогом и трудно доступном спектрометре
начинали измерять спектр образца, который непригоден даже для
спектрометра на 60 МГц. Высокочастотные спектрометры ЯМР явля-
ются высокопрецизионными приборами, и образцы для них должны
быть тщательно приготовлены. Большая часть гл. 3 посвящена методи-
ческим трудностям, связанным с разрешением и чувствительностью.
В этой главе также дано критическое обсуждение тестов, используемых
для проверки работы спектрометра. Я надеюсь, что оно будет полезно
всякому, кто собирается покупать прибор.
В гл. 7 приводится дополнительная информация об эксперименталь-
ных методах. Новички быстро сообразили, что даже полное понимание
теории гетероядерной корреляционной спектроскопии не приносит поль-
зы, если экспериментатор не может измерить ширину импульса в канале
развязки. Навыки таких экспериментов до сих пор передаются изустно.
Собрав вместе несколько простых процедур, я попытался создать более
доступное описание этих новых экспериментов. В гл.7 также рассказано
о том, каким образом выбрать экспериментальные параметры для
получения оптимальной чувствительности или количественных резуль-
татов. В ней также описаны различные процедуры, такие, как подавление
сигналов, составные импульсы и селективное возбуждение, которые ие
вошли в другие главы, но заслуживают рассмотрения.
1.4. Что можно сделать с помощью ЯМР
Многие книги по спектроскопии включают главу по «способам
решения задач» или подборки типичных спектров и задач. Несмотря на
то что в книгу включено множество примеров, я совершенно намеренно
уклонился от попытки подробно рассказать вам, что делать с новым
экспериментом. Для этого существуют две причины. Первая полностью
личного характера: я понял, что сам никогда не читаю подобные
разделы в других книгах. Ведь спектральные проблемы либо тривиаль-
ны (в этом случае они неинформативны), либо требуют столь больших
усилий, что большинство людей не будет в них вникать. Чтобы вы
должным образом заставили работать свой мозг, вам нужен стимул.
Изучаемое соединение должно быть творением ваших рук. Однако эта
причина ие столь важна, как вторая.
К настоящему времени многие новые эксперименты ие используются
настолько долго, чтобы судить об их полезности. Мой собственный
взгляд на это, естественно, обусловлен личным опытом-типом соедине-
ний, которые мне приходилось изучать, и тем оборудованием, которым
я располагал для работы. Это последнее обстоятельство особенно
важно. Если бы вы спросили меня в прошлом году: «Что вы думаете
о трехквантовой фильтрации?», то я бы ответил так: «Я не знаю, мы не
получили достаточно хорошего фазовращателя». В этом году мой ответ
звучал бы так: «Кажется работает, но мы еще не решали этим методом
реальных задач». И кто знает, как я отвечу в следующем году. Моя
2*
20
Глава 1
позиция состоит в том, что я не хочу навязывать вам мои сегодняшние
идеи относительно быстро развивающегося предмета. Намного важнее
развить у вас достаточное понимание предмета для того, чтобы вы сами
были в состоянии оценить вашу позицию.
Говорят, что стоит попытаться обрисовать перспективу последних
достижений в области ЯМР. Применение спектроскопии ЯМР охватыва-
ет очень широкий круг задач: с простого определения структуры к иссле-
дованию конформаций ферментов в растворе и далее к мониторингу
метаболизма in vivo н медицинской диагностике. Несмотря на все это
разнообразие, фактически существует всего несколько главных идей,
лежащих в основе всех экспериментов. Следующие разделы могут стать
более понятными позднее, когда вы дочитаете книгу до конца, но тем не
менее приходится начинать именно с них.
Все эксперименты, описанные в книге, основаны на наличии связи
между магнитными ядрами. Скалярное спин-спнновое взаимодействие
(J-взаимодействие) хорошо известно. Это оно вызывает расщепление
линий в обычных спектрах. Такое взаимодействие является важным для
всех экспериментов, кроме тех, которые основаны на ЯЭО. Сам по себе
ЯЭО также определяется взаимодействием между ядрами, но это диполь-
ное взаимодействие, о котором подробнее рассказано в гл. 5.
Важность спин-спинового взаимодействия при определении структу-
ры достаточно ясна из одномерных протонных спектров. Изучая струк-
туру мультиплетов, мы часто можем решить, сколько соседей имеет
протон. Мы даже можем проследить последовательность соседних
протонов, анализируя расщепления. Эксперименты с гомоядерной раз-
вязкой еще более облегчают идентификацию ядер-соседей. Высокая
информативность КССВ связана с тем, что их величины легко пред-
сказать для разных фрагментов. Для протонов константы через 2 и 3 свя-
зи всегда лежат примерно в области от 2 до 20 Гц, а константы через
большее число связей очень малы. Предсказуемость КССВ, а также тот
факт, что они позволяют определить пары взаимодействующих ядер,
делают их чувствительным индикатором молекулярной структуры. В
противоположность этому химические сдвиги позволяют только грубо
оценить химическое окружение индивидуального ядра.
Основу «современного» ЯМР составляет наше возросшее умение
воздействовать на связанные системы. Более глубокое понимание их
природы позволяет найти наилучшне способы проведения обычных
измерений и разработать эксперименты, которые, подобно спиновой
развязке, дают возможность создавать полную картину спиновой систе-
мы (гл. 8 и 9). На нем же основан ряд методов наблюдения ядер
с низкими резонансными частотами, в которых их взаимодействие
с протонами используется как «рычаг» для усиления их сигнала (гл. 6).
Оба этих приема позволяют осуществлять то, что уже давно возможно
и в традиционном ЯМР. Но они облегчают работу, ускоряют экспери-
мент, делают его более информативным или более общим. Некоторые
эксперименты являются совершенно новыми. Примером может служить
О чем эта книга
21
многоквантовая фильтрация, которая дает возможность различать спи-
новые системы по числу ядер в них (см. гл. 6 и 8). В последних главах
разные эксперименты рассматриваются с точки зрения их возможных
приложении, что делает их понимание более определенным. Но следует
иметь в виду, что в основе всех этих экспериментов лежит воздействие
на энергетические уровни спиновых систем, возникающие вследствие
взаимодействий между магнитными ядрами.
Вторая большая область современного ЯМР-применение метода
Фурье для анализа данных. В следующей главе будет показано, что это
ускоряет процесс получения информации, что весьма существенно,
поскольку сигналы ЯМР имеют низкую интенсивность. Использование
метода получения данных как функции времени в экспериментах,
включающих две или более временные переменные, может дать исклю-
чительные преимущества как в скорости, так и в разрешающей способ-
ности (гл. 8-10). Двумерное преобразование Фурье является важным
дополнением к представлениям о взаимодействии, на которых основаны
новые эксперименты. Оно увеличивает эффективность обработки дан-
ных. С его помощью можно косвенным методом обнаруживать такие
явления, как, например, переходы между энергетическими уровнями,
«запрещенные» квантовомеханическимн правилами отбора.
1,5. Маленькая прогулка вокруг спектрометра ЯМР
Чтобы попять, о чем мы говорим в последующих главах, познако-
мимся с современным высокочастотным спектрометром и его важней-
шими компонентами (рис, 1.3). Наблюдать протонные спектры на резо-
нансных частотах выше 100 МГц можно только с использованием
сверхпроводящих магнитов. Соленоид (рис. 1.4), намотанный из сплавов
ниобия, погружен в емкость с жидким гелием, которая находится внутри
высококачественного криостата (большой цилиндр справа на рис. 1.3).
Криостат имеет внешнюю охлаждающую рубашку для охлаждения
«радиационного экрана», заполненную жидким азотом. Продуманная
конструкция и тщательное изготовление криостата обеспечивают низкий
расход жидкого гелия. Его добавляют в криостат каждые 2-9 мес
в зависимости от модели конструкции. Спектрометр на рис. 1.3 дает
возможность наблюдать протоны на частоте 500 МГц, т. е. напряжен-
ность поля в центре магнита составляет 11,7 Т.
Внутри отверстия магнита помещен набор градиентных катушек для
устранения градиентов поля («шнммы», см. гл, 3), а внутри их находится
датчик ЯМР (рис, 1.5).,Датчик-самая ответственная часть всей системы.
Он обеспечивает передачу импульсов к образцу и регистрацию сигналов
ЯМР. В спектрометре, показанном иа рисунке, датчики вставляются
снизу с основания криостата в активную область магнита. При необхо-
димости датчик можно заменить на другой. Образцы для измерении
готовятся в обычных цилиндрических ампулах для ЯМР. Образец
опускается через верхнее отверстие в зазор криостата и попадает
22
Г лава 1
Рис. 1.3. Импульсный фурье-спектрометр ЯМР с рабо-
чей частотой 500 МГц.
Рис. 1.4. Соленоид
магнита спектрометра
ЯМР на 470 МГц (лю-
безно предоставлено
Oxford Instruments
Ltd.).
в верхнюю часть датчика (рис. 1.6). Образец вращается вокруг верти-
кальной оси с помощью воздушной турбинки. Шиммирующие катушки
для настройки однородности поля, датчик и образец находятся при
комнатной температуре, хотя совсем рядом с ними поддерживается
температура жидкого гелия 4 К.
Пульт спектрометра содержит генератор радиочастотных импульсов
и приемник для регистрации сигналов ЯМР. Оба этих блока похожи на
обычные радиоустройства. В частности, приемник весьма похож на
приемный тракт в радио или телевизоре. В современных спектрометрах
предусматриваются возможности для получения самых разных им-
пульсных последовательностей с различной продолжительностью и
фазой, т. е. для осуществления «импульсного программирования». Все
функции спектрометра обычно находятся под контролем компьютера,
который также используется для обработки данных и представления
результатов. Электрические сигналы ЯМР превращаются в цифровые
данные для ввода в компьютер с помощью аналого-цифрового пре-
образователя. Именно он часто является узким местом, ограничиваю-
щим класс экспериментов, которые мы можем выполнять (см. гл. 2 и 3).
О чем эта книга
23
Рис. 1.5. Набор датчиков ЯМР разной формы и размеров
для образцов различного диаметра и магнитов с различ-
ными теплыми отверстиями.
Рис. 1.6. Внутрен-
нее устройство дат-
чика. Образец удер-
живается внутри
приемно-передаю-
щей катушки. Ниже
можно видеть не-
которые компонен-
ты резонансного
контура (см. гл. 3).
Разные стандартные компьютерные периферийные устройства (печатаю-
щее устройство, дисковод, графопостроитель и т. п.) применяются для
обработки и представления данных. Почти все спектры в этой книге
получены иа спектрометре, показанном на рис. 1.3.
Литература
(
1. Подробный обзор традиционных аспектов экспериментального ЯМР см.
в книге: Martin M.L., Delpuech J,-J., Martin G.J., Practical NMR Spectroscopy,
Heyden, 1980.
Глава 2
Некоторые вопросы
импульсного ЯМР
2.1. Введение
Регистрация спектров методом непрерывной развертки кажется есте-
ственной. При этом простой и очевидной представляется идея воздей-
ствия иа образец монохроматического излучения, частота которого
варьируется для локализации максимума поглощения. Измерение погло-
щения энергии до сих пор довольно часто используется в оптической
спектроскопии-инфракрасной (ИК) и ультрафиолетовой (УФ). Почему
же в таком случае нам необходимо рассматривать столь неочевидную
альтернативу, как импульсное возбуждение в случае ЯМР? Чтобы найти
ответ на этот вопрос, надо познакомиться поближе с некоторыми
особенностями ЯМР (рис, 2.1). На первый взгляд этот спектр выглядит
достаточно красиво, но как только мы усилим его в 4 раза, мы
обнаружим проклятие всех ЯМР-спектроскопистов - шум.
Трудность состоит в том, что в физически достижимых магнитных
полях переходы между уровнями ЯМР имеют очень низкую энергию.
Она мала даже по сравнению с параметром кТ (fc-постояиная Больц-
мана) при комнатной температуре. Вследствие этого разность заселен-
ностей нижнего и верхнего энергетических уровней также очень мала.
Соответственно, получаемые нами сигналы слабые. Во многих случаях
они незначительно превышают шумы, которые неизбежно возникают
в электрических цепях спектрометра. Тщательно отрабатывая конструк-
Рис. 2.1. Шум - постоянная проблема в спектроскопии ЯМР.
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
25
цию. можно снизить до минимума число источников электрического
шума, но сигналы ЯМР настолько слабые, что по сравнению с ними
заметным оказывается даже тепловое движение электронов в куске
проволоки. Поэтому, сколько бы мы ни совершенствовали конструкцию
прибора, мы не сможем избежать весьма высокого уровня шума нулевой
линии. Следовательно, необходимо найти какой-нибудь другой способ
для улучшения отношения сигнал! шум в спектре ЯМР.
Одним из способов улучшения отношения сигиал/шум, позволяю-
щим обойти естественные ограничения спектрометра, является накопле-
ние и усреднение сигналов. Мы воспользуемся тем, что можем записать
один и тот же спектр несколько раз. Сигналы ЯМР каждый раз
появляются на одном и том же месте, и, таким образом, их интенсив-
ность растет пропорционально числу повторений. При этом судьба
случайно возникающего шума немного сложнее; он не «усредняется»,
как это часто ошибочно полагают, но растет медленнее, чем сигнал.
Фактически через п повторений амплитуда сигнала увеличивается ровно
в п раз, а амплитуда шума при этом увеличивается примерно в ^/й раз.
Таким образом, отношение сигнал/шум улучшается как ^/и. Доказа-
тельство того, что шум растет как квадратный корень из числа экспери-
ментов, нетривиально, и если этот вопрос вас интересует, то обратитесь
к «центральной предельной теореме» в учебниках по статистике.
В спектроскопии ЯМР почти всегда необходимо накопление и усред-
нение сигналов для улучшения отношения сигпал/шум, В этом состоит
отличие ЯМР от других обычных спектральных методов; чувствитель-
ность УФ- и ИК-спектрометров значительно выше. Она обычно доста-
точна для получения спектров высокого качества при однократной
записи. Сама по себе необходимость проводить накопление и усреднение
многих экспериментов не является тем не менее основанием для ис-
пользования импульсного возбуждения. В принципе усреднение сигнала
может быть применено и в ЯМР с непрерывной разверткой. В началь-
ный период становления ЯМР действительно применялся такой способ
накопления с помощью компьютера (метод CAT, от англ. Computer
Averaged Transients). Но этот метод оказался не очень жизнеспособным.
Чтобы понять причину этого, необходимо рассмотреть проблемы,
возникающие при многократной записи спектра в режиме с непрерывной
разверткой. При этом камнем преткновения становится количество
времени, требуемое для получения каждого спектра.
Скорость, с которой мы можем получать данные ЯМР в режиме
с непрерывной разверткой, сильно ограничена фундаментальными
условиями. Линии ЯМР (спин ядра 1/2) обычно являются «острыми»,
т. е. энергии соответствующего перехода незначительно изменяются для
ядер одного типа. Поэтому нам часто приходится в экспериментах
регистрировать близко расположенные линии. Предположим, что наи-
меньшее расстояние между линиями, которые мы хотели бы разрешить,
составляет 1 Гц. Это эквивалентна измерению разности энергий
26
Г пава 2
в h Дж (h постоянная Планка, Е = hv). Принцип неопределенности
гласит:
&Ebt~h (2.1)
Следовательно, если ДЕ = h, то, чтобы выполнить измерение, необхо-
дим временной интервал порядка 1 с. Что это означает в терминах
эксперимента ЯМР с непрерывной разверткой? Измерения проводятся
в некоторой полосе частот, где, по нашему мнению, могут находиться
резонансные сигналы. Требование проводить измерения каждого интер-
вала, равного 1 Гц, в течение 1 с ограничивает скорость развертки до
1 Гц/с. В настоящее время типичная ширина протонного спектра состав-
ляет Юм. д., т.е. 1000 Гц для спектрометра с рабочей частотой на
протонах 100 МГн. Таким образом, для записи такого спектра потре-
буется 1000 с (около 15 мин). Нам нужно 4 прохождения, чтобы улуч-
шить отношение сигнал/шум вдвое, и 16-вчетверо, поскольку это
соотношение растет пропорционально квадратному корню из числа
экспериментов. Тогда, чтобы удвоить енгнал/шум, потребуется 1 ч,
а еще раз его удвоить ие удастся даже до обеда. Таким образом,
применяемая в ЯМР с непрерывной разверткой методика накопления
оказывается не очень полезной.
Заметим, что сложность возникла из-за того, что нам требуются
измерения с «высоким разрешением». Если мы смягчим требования по
разрешению, то сможем быстрее выполнить измерение. Это соотноше-
ние между скоростью регистрации спектра и разрешением необходимо
учитывать не только для спектроскопии ЯМР, но и для всех видов
спектроскопии. Просто для ЯМР эта проблема встает ианболее остро.
При регистрации спектров ЯМР ядер со спнном 1/2 в жидкостях или
в растворах режим с непрерывной разверткой, как будет показано ниже,
оказывается, заметно уступает импульсному методу. При регистрации
широких линий, например, в спектрах твердых тел, недостатки метода
непрерывной развертки не столь существенны, но в этой книге мы не
рассматриваем такие спектры. Для решения наиболее важных химичес-
ких задач нам нужно найти такой быстрый способ регистрации спектра,
который бы позволил более эффективно использовать накопление и
усреднение сигналов. Однако сначала обратимся к проблеме колоколов,
хотя она и кажется здесь не относящейся к делу.
2.2. Настройка колоколов
Представим себе большой колокол, скажем церковный, только что
отлитый в мастерской. Его еще нельзя использовать. При грубом литье
не удается получить красивого гармоничного звучания. Колокол имеет
много диссонирующих резонансных частот. Требуется его тщательная
настройка, при которой с колокола срезаются слои металла, что изменя-
ет относительные вклады разных гармоник. Предположим, что в качест-
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
27
ве физиков нас пригласили для того, чтобы изучить возможность
автоматизации измерения состава гармоник колокола.
Мы можем предложить схему, немного похожую на следующую.
Установим на колокол источник звука, например громкоговоритель,
и какой-нибудь вид принимающего устройства, например микрофон,
С помощью низкочастотного генератора будем создавать в колоколе
звук и варьировать его частоту от самых низких до самых высоких,
воспринимаемых человеческим слухом. Скорость, с которой мы изменя-
ем частоту, будет ограничена требуемой точностью измерения н свой-
ствами самого колокола. Регистрируемый микрофоном отклик колокола
будет изменяться при изменении частоты. Мы сможем зафиксировать
все его характеристические резонансные частоты, если подадим выход-
ной сигнал на графопостроитель, с помощью которого получим спектр
откликов как функции частоты. Получив спектр, мы можем снять
с колокола слой металла и повторять всю процедуру до получения
нужного отклика. Этим способом можно выполнить настройку, но
работа займет очень много времени, поскольку мы воспользовались
методом измерений с непрерывной разверткой.
Тем временем настройщик колоколов, имеющий за плечами годы
практики, будет тихо веселиться в углу комнаты, потому что он знает
намного более быстрый способ проведения данного эксперимента. Он
держит наготове свой верный молоток и, как только мы перестанем
путаться под ногами, произведет им по колоколу хороший удар.
Любому, кто не глух к звуковым тонам, тут же станет ясно, что
требуемую информацию дает звук колокола. Отклик колокола на
импульс (удар молотка) содержит одновременно все характеристические
частоты, и мы можем анализировать их прямо на слух. Мы переключи-
лись с непрерывной развертки на импульсный метод, и преимущество
очевидно.
2.3. Импульсный ЯМР
2.3.1. Введение
Возможность получить полный частотный отклик системы сразу,
с помощью одного эксперимента-это как раз то. что нам нужно для
ускорения измерения спектра ЯМР. Способ осуществления «удара мо-
лотком» в спектроскопии ЯМР, а также способ расшифровки частотной
информации в результирующем отклике пока не ясны, но потенциаль-
ные преимущества этого подхода легко оценить. В эксперименте с не-
прерывной разверткой для получения разрешения в 1 Гц на ширине
спектра в 1000 Гц нужно затратить 1000 с. Но если мы научимся
анализировать отклик образца на импульс, то, очевидно, сможем завер-
шить такой альтернативный эксперимент как раз за 1 с. При этом на
измерение каждой частоты по-прежнему будет расходоваться 1 с, по-
скольку теперь мы измеряем все частоты одновременно, а не одну за
Другой. Это очень важный вывод, и поэтому я повторю его еще раз. Мы
28
Глава 2
можем перейти от последовательного измерения (эксперимент с непре-
рывной разверткой) к одновременному измерению (импульсный экспе-
римент) и, таким образом, уменьшить полное время эксперимента.
На этом основании можно заключить, что мы получим тысяче-
кратный выигрыш во времени (преимущество Фелгетта). На самом деле
это верно только для единичного измерения. Выигрыш при многократ-
ном повторении, что необходимо для накопления и усреднения сигнала,
будет значительно меньше. До сих пор мы рассмотрели только один
фундаментальный вопрос точности. При более близком знакомстве
с импульсным экспериментом мы увидим, что другие свойства ядерной
системы ограничивают максимальную частоту повторения измерений^
Однако оказывается, что в этом случае использование импульсных
методов для возбуждения сигналов ЯМР дает весьма значительную
экономию времени. Это и стало изначальным стимулом широкого
распространения импульсного ЯМР. Далее в этой главе мы предполага-
ем показать, как осуществляются импульсные эксперименты и, в част-
ности, как анализируются получаемые этим методом данные. Помимо
быстроты импульсные методы обладают другими многочисленными
интересными особенностями, которые и составляют предмет обсужде-
ния в этой книге.
2.3.2. Возбуждение образца
При настройке колокола методом «непрерывной развертки» мы
применяли слабое механическое возбуждение, а для выполнения экспери-
мента в «импульсном» режиме иам было необходимо сильное возбужде-
ние. Поскольку в методе ЯМР с непрерывной разверткой также исполь-
зуется облучение «слабым» радиочастотным генератором, то, как легко
представить, в импульсном эксперименте нужен мощный генератор. Это
так, но нз всего этого нельзя понять, что означает «слабый» или
«мощный» в данном контексте, или как определить, что такое достаточ-
но короткий «импульс» в эксперименте ЯМР. Для правильного понима-
ния этих вопросов нам надо дойти до гл. 4. Тогда наши знания будут
достаточными для точного анализа процессов, протекающих внутри
образца, когда он подвергается действию импульса. Однако уже на
основании самых общих соображений мы можем доказать, что радио-
частотный «импульс» должен иметь определенные характеристики.
Мы хотим возбудить сигналы ЯМР, лежащие в определенном
частотном интервале, но в нашем распоряжении имеется радиочастот-
ный генератор, настроенный на одну длину волны. Следовательно, мы
должны разработать способ использования единственной частоты для
возбуждения множества частот. Для того чтобы понять, как это можно
сделать, мы вновь воспользуемся принципом неопределенности. Если
облучение применяется в течение времени Дг, то, рассуждая точно так
же, как и раньше, мы имеем
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
29
Л Av h (2.2)
Следовательно, для монохроматического излучения появляется неопре-
деленность по частоте, равная 1/Дг Гц, если его длительность составляет
д? с. В импульсном эксперименте Ai-это ширина импульса. Поэтому,
чтобы возбудить все сигналы в нашем спектре шириной 1000 Гц, нужен
импульс не длиннее 1 мс. И вновь это лишь грубая оценка по порядку
величины на основе самых общих принципов. Позднее мы поймем,
почему импульс должен быть намного короче (порядка нескольких
микросекунд). И все же из этого по крайней мере стало ясно, какой тип
«импульса» требуется в ЯМР.
Вот основной способ проведения импульсного эксперимента ЯМР.
Образец подвергается короткому, как всплеск, действию радиочастоты
длительностью заведомо меньше 1 мсг Время измерения возникающих
при этом сигналов зависит от требуемой точности. В обсуждаемом нами
примере оно составляет 1 с.Точно так же как колокол перестает звучать
совсем благодаря физическому затуханию его вибрации, так и отклик
ЯМР спадет в течение следующего за импульсом периода времени.
Такой затухающий отклик называют спадам свободной индукции (ССИ).
Затем мы можем повторить эксперимент для улучшения отношения
сигнал/шум. После выполнения достаточного числа повторений мы
получаем в свое распоряжение данные, содержащие информацию обо
всех частотах в спектре ЯМР, однако в непривычной для нас форме.
В случае колокольного звона интуитивно очевидно, что такая необычная
форма содержит такую же информацию, что и эксперимент с непрерыв-
ной разверткой, и, используя свои органы чувств, мы можем извлечь из
нее желаемые детали. Теперь мы должны вернуться к вопросу о том, как
выделить нужный нам спектр в его привычном виде из данных ЯМР,
полученных в импульсном режиме.
2.3.3. Время и частота
Какая разница между сигналами, которые мы получаем в экспери-
менте с непрерывной разверткой и в импульсном эксперименте? В мето-
де непрерывной развертки, меняя частоту радиочастотного поля, мы
измеряем зависимость амплитуды сигнала от частоты (измерение в
частотном представлении). Однако при регистрации данных после
импульса мы измеряем то, как амплитуда развивается во времени (т. е.
во временном представлении) (рис. 2.2). По своей природе время и часто-
та обратно пропорциональны друг другу, поэтому может существовать
прямая взаимосвязь между двумя формами представления данных,
и оказалось, что это действительно так. Преобразование Фурье позволяет
нам переходить от одного представления к другому и является обычным
методом анализа результатов импульсных экспериментов. Сам по себе
Фурье-анализ составляет целый раздел математики, У нас нет времени
подробно рассматривать его в этой книге, но по крайней мере мы можем
30
Глава 2
Рис. 2,2. Два различных взгляда на
одну и ту же электромагнитную
волну; амплитуда как функция вре-
мени (временное представление) и
амплитуда как функция частоты
(частотный спектр).
убедиться, что переходы от частотного представления к временному
и обратно являются реально выполнимыми операциями.
Для этого требуется тщательное рассмотрение природы каждой
формы представления данных. Частотный спектр состоит нз набора
«пиков», интенсивности которых воспроизводят соотношения всех при-
сутствующих частотных компонент. При предельном разрешении каж-
дый пик был бы совершенно узким, но в действительности все они
имеют конечную ширину по частоте. Во временном представлении
в результате наложения всех резонирующих частот мы будем наблюдать
осцилляцию, которая является суммой составляющих частот с соот-
ношениями их амплитуд в частотном представлении. Вопрос о том,
можем ли мы найти взаимный переход между этими двумя представле-
ниями, эквивалентен вопросу, можно ли найти комбинацию частот
и амплитуд, которая описывала бы осцилляцию, наблюдаемую во
временном представлении. Эту процедуру можно выполнить прямым
способом, просто численно моделируя различные комбинации частот
и сравнивая результат с экспериментальными данными. В принципе эта
процедура должна работать, хотя и неясно, сколько времени это
потребовало бы иа практике. Фактически ее удается осуществить, но
объем вычислений при этом намного больше, чем требует метод
фурье-преобразования (см. разд, 2.6).
Более детальный анализ проблемы приводит к следующему извест-
ному выражению, связывающему два типа представления данных [1]:
/(<>) = J dt (2.3)
“ -JC
Здесь/(/) описывает данные во временном представлении, а/(«^-требу-
емый частотный спектр. Эта формула имеет ряд неприятных особенно-
Некоторые вопросы-импульсного ЯМР
31
стей. В нее входит интеграл, а подынтегральное выражение включает
комплексное число, К счастью, их не так сложно преодолеть. Получен-
ные сигналы ЯМР могут быть преобразованы к цифровому виду,
интеграл может быть аппроксимирован суммой, а для его вычисления
существует эффективный алгоритм - алгоритм быстрого фурье-преобра-
зования Кули и Тьюки. Если принять, что соотношение (2,3) справедли-
во, то можно перейти к более неотложному вопросу о том, как его
можно применять в практической деятельности,
2.4. Практическое выполнение импульсного ЯМР
2.4.1. Введение
В этом разделе я хочу показать, как довольно абстрактные идеи разд,
2.3 применяются на практике. Мы уже убедились, что измерять отклик
ЯМР (ССИ), следующий за импульсом, весьма выгодно, так как экспе-
римент можно провести быстрее, Я утверждал, что у нас есть реальные
возможности выделять из полученных данных известные спектральные
частоты и что преобразование Фурье является ианболее общим спосо-
бом для этого. Эта идея перехода от одного вида представления данных
к другому составляет основную трудность для тех, кто впервые сталки-
вается с импульсной фурье-спектроскопией ЯМР. Лучший способ пре-
одолеть ее-посидеть у спектрометра н понаблюдать за ходом вычис-
лений, Если у вас есть шанс поступить таким образом, то не упустите
его. Вы можете кое-что увидеть и понять.
На рнс. 2.3 (вверху) показан ССИ образца (смесь H20/D2O), в спект-
ре козорого содержится только одна линия. Он имеет ряд ожидаемых
нами характерных особенностей. Осцилляции (биения), соответствую-
щие по частоте химическому сдвигу линии, затухают в течение несколь-
ких секунд. Почему это происходит, будет ясно из гл, 4, Но из простых
физических соображений очевидно, что такой спад должен происходить.
Ниже мы видим результат цифрового преобразования к частотному
представлению. ССИ существует в течение конечного времени, поэтому
возникает некоторая неопределенность в определении частоты и линия
имеет характерную форму. Форму линии, которую мы видим па этом
рисунке, называют лоренцевой. Она является результатом преобразова-
ния экспоненциально спадающего ССИ, что типично для сигналов в
спектрах жидкостей.
Существует ряд трудностей, связанных с выполнением этой последо-
вательности операций в импульсном ЯМР, Сигналы ЯМР представляют
собой высокочастотные электромагнитные колебания, а нам необходи-
мо анализировать их в цифровом виде. Процесс перевода данных ЯМР
в удобную для цифрового анализа форму налагает на эксперимент
определенные ограничения, которые очень важно понять. Мы должны
взять электрическое колебание, превратить его в цифровой ряд и в таком
виде записать его в память так, чтобы можно было повторять процесс
32
Г лава 2
. ГЧ11'Г>МЧ1.., >,,ГТ..1ТП I I I I I |..
250 200.150 too 50
Гц
Рис. 2.3. Преобразование Фурье
переводит сигнал во временном
представлении (вверху) в соот-
ветствующий частотный спектр
(внизу).
при накоплении и усреднении сигналов. Каждая из этих операций вносит
свои трудности и ограничения. До недавнего времени вычисления при
фурье-преобразовании требовали значительного времени на имевшихся
компьютерах. Сейчас заметные трудности возникают только в случае
двумерных экспериментов, в которых приходится обрабатывать боль-
шие массивы данных.
2.4.2. Детектирование и регистрация
Введение. Преобразование электрических сигналов к цифровому виду
является весьма общей задачей. Для этого используются аналого-цифро-
вые преобразователи (АЦП). АЦП превращает подаваемое на его вход
напряжение в двоичное число, воспроизводящее его величину. Важными
характеристиками АЦП являются время, затрачиваемое на эту опера-
цию, и число бит, используемых для двоичного представления чисел
(разрешение АЦП). Обе эти характеристики определяют, какой вид
эксперимента ЯМР мы можем проводить. В гл. 3 (см. в разд. 3.4.3
параграф «Динамический диапазон и разрешение АЦП») обсуждается
влияние скорости преобразования и разрешения АЦП.
Сигналы ЯМР возникают в приемнике нашего спектрометра, и на
первый взгляд можно было бы прямо регистрировать их с помощью
АЦП (рис. 2.4). Однако быстро выясняется, что это слишком трудно.
Например, в протонном спектре иа частоте 500 МГц все возникающие
радиочастотные сигналы имеют частоты, близкие к 500 МГц, и мало
различаются в соответствии со своими химическими сдвигами в этом
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
33
Рис. 2.4. Простейшая, но не самая лучшая схема для проведения фурье-экспери-
мента ЯМР.
диапазоне. Для протонов типичен диапазон в 10 м. д. или 5000 Гц.
Следовательно, резонансные частоты лежат, в интервале от 500000000
до 500005000 Гц. В принципе можно попытаться напрямую оцифровать
эти сигналы. Однако задача заметно облегчается, поскольку в действи-
тельности нам нужно знать только разности резонансных частот (хими-
ческих сдвигов). Вычтем из сигнала ЯМР некоторую опорную частоту,
скажем 500 МГц. Тогда нужно провести оцифровку частот, которые
изменяются от 0 до 5000 Гц, в соответствии с диапазоном химических
сдвигов. В сущности высокая частота (все мегагерцы) не представляет
интереса, поскольку она является всего лишь несущей частотой, а нуж-
ная информация содержится в химических сдвигах. Подобно этому
в радиовещании радиоволны используются для переноса звуковых
сигналов от одной точки к другой; Радиопередачи выглядели бы чрезвы-
чайно странно, если бы мы сразу же не вычитали из сигнала несущую
частоту!
Схема реального импульсного спектрометра должна содержать
устройство для детектирования сигнала (рис, 2.5). В гл. 4 (разд. 4.3.5)
мы увидим, что существуют различные способы детектирования. Здесь
же мы можем представить его как- вычитание из сигнала частоты,
которая ниже, чем частота самого низкочастотного ожидаемого сигнала
в спектре. Выходной сигнал детектора, содержащий частоты от 0 до
5000 Гц для нашего протонного спектра на 500 МГц, направляется
к АЦП. Теперь нам предстоит решить, как часто и как долго нужно
вести выборку для этого сигнала.
Выборка данных. Мы уже касались вопроса о том, как много времени
требует выборка ССИ, и пришли к выводу о преимуществах импульсно-
го метода. Если мы хотим различить две линии, разделенные в спектре
интервалом Av Гц, то выборка должна продолжаться не менее l/Av с.
При этом мы предполагаем, что сигналы ЯМР существуют в течение
всего этого времени. Если же они затухают до нуля раньше, то мы не
3 75
34
Глава 2
Рис. 2.5. Более чувствительная схема фурье-эксперимеита ЯМР включает детек-
тирование от опорной частоты.
можем различить так близко расположенные линии, потому что соб-
ственная ширина линии в образце окажется слишком большой. Время,
затрачиваемое иа выборку данных, называется временем регистрации At.
Индекс t может показаться лишним в данный момент, но ои нужен для
описания экспериментов, где используется несколько времен регистра-
ции. С ними мы познакомимся позднее.
На практике необходимо, чтобы разрешение было ограничено свой-
ствами образца, а ие методом измерения. Поэтому используется доста-
точно длинное время регистрации протонных сигналов, чтобы заре-
гистрировать почти весь ССИ (обычно 2-3 с). Для других ядер достиже-
ние высокого разрешения ие столь важно. Важнее быстро провести
регистрацию данных. Поэтому для них мы проводим выборку только
начальной части ССИ. Такое обрезание данных дает несколько интерес-
ных эффектов, обсуждаемых позже.
Продолжительность выборки зависит от минимальной разности
частот, которую мы хотим зарегистрировать, а скорость выборки
определяется общим диапазоном спектра. Выборка проводится по точ-
кам через конечные интервалы времени. Ясно, что при этом нельзя
точно воспроизвести полностью произвольную форму линии, поскольку
не ясно, что происходит между точками. Однако сигналы ЯМР являются
периодическими колебаниями, и для каждого эксперимента мы знаем,
какая самая высокая частота может присутствовать в спектре. Это
означает, что можно вычислить скорость выборки, достаточную для
характеристики данных: если присутствуют частоты до -Л' Гц, то сигнал
должен выбираться каждые 1/2 Ж с.
Самую высокую частоту Ж, которая может быть охарактеризована
при выборке с такой скоростью, называют частотой Найквиста, но
в спектроскопии ЯМР она часто называется просто шириной спектра.
По аналогии с методом ЯМР с непрерывной разверткой иногда ширину
спектра, определяемую скоростью выборки, называют «шириной раз-
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
35
вертки». Однако это может ввести в заблуждение, так как нет развертки
в импульсном эксперименте. В этой книге мы будем использовать
термины «ширина спектра», «спектральный диапазон» или «частота
Найквиста». Заметим, что максимально возможная ширина спектра для
данного спектрометра определяется качеством его АЦП, поскольку
существует верхний предел скорости выборки сигнала. В спектрометрах,
предназначенных для регистрации спектров высокого разрешения, время
самого короткого преобразования в АЦП обычно лежит в диапазоне от
10 до 3 мкс, прн этом максимальная ширина спектра составляет от 50 до
150 кГц.
Вывод соотношения между скоростью выборки и шириной спектра
был бы слишком большим отступлением от темы. Однако порядок
величины этого соотношения легко оценить при рассмотрении процесса
выборки данных (рис. 2.6). Пусть нам необходимо охарактеризовать
синусоидальную волну, делая выборку значений напряжения в дискрет-
ных интервалах. Очевидно, что частота выборки не должна быть много
ниже частоты волны, поскольку в таком случае каждый цикл характе-
ризуется менее чем одной точкой. Подобным же образом ие имеет
смысла делать выборку много раз в течение одного цикла, так как мы
можем восстановить полную форму периодической волны всего по
нескольким точкам (фактически по двум).
Интересно рассмотреть, что происходит с формой волны, частота
которой больше, чем частота Найквиста (рис, 2.7). Мы видим на рисунке
два сигнала: один с частотой F (F < Ж) и другой с частотой 2 Ж — F
(явно больше Ж). Отметим, что оба они проходят через одни и те же
точки выборки. Более высокочастотное колебание имеет дополнитель-
Рис. 2.6. Цифровая выборка двух различных колебаний через равные интервалы
(показаны вертикальными линиями). При интервале между точками выборки
100 мкс этот рисунок представляет первые миллисекунды выборки при частоте
Найквиста 5 кГц, а два представленных здесь колебания имеют частоты 4,5
и 1,2 кГц,
36
Глава 2
ные максимумы между точками выборки, но после оцифровки информа-
ция о них будет утеряна. Этот пример демонстрирует очень важную
особенность спектроскопии, использующей цифровую выборку: часто-
ты, леждщие вне полосы, определенной данной скоростью выборки, все
же детектируются, но их положения в спектрах неверны. Вследствие
этого в спектрах возникают ложные сигналы, которые называют мни-
мыми или отраженными. Пример их проявления в реальном спектре
приведен в разд. 2.5.5.
Эти соображения по поводу выборки имеют важные практические
следствия для экспериментальной импульсной спектроскопии ЯМР.
Предположим, что мы хотим иметь разрешение 0,2 Гц в эксперименте
с временем регистрации Л, = 5 с. Если мы наблюдаем протоны при
500 МГц, то желательно иметь ширину спектра около 5000 Гц. Следова-
тельно, в соответствии с критерием Найквиста необходимо проводить
выборку сигнала каждые 1/10000 с (= 0,1 мс). В результате за 5 с будет
получено 50000 чисел, которые нужно запомнить и для которых
впоследствии нужно выполнить преобразование Фурье. На большинстве
современных спектрометров можно легко обрабатывать такие массивы
данных, но при выполнении двумерных экспериментов, в которых число
точек возрастает в квадрате, оцифровка на основе этого принципа
становится немыслимой.
Контроль ширины полосы. При оцифровке сигнал будет содержать
информацию о всех частотах, но часть их будет воспроизведена неверно.
Это главный недостаток импульсного ЯМР, и чем больше об этом
думаешь, тем хуже все кажется. Наиболее очевидной проблемой являет-
ся невозможность исключить из спектра неинтересные для нас пики,
например интенсивные резонансные сигналы растворителей. В спектро-
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
37
Рис. 2.8. В еще более совершенной схеме импульсного фурье-эксперимента ЯМР
перед АЦП помещается полосовой фильтр.
скопив ЯМР с непрерывной разверткой, выбирая соответствующим
образом диапазон развертки, мы можем просто не записывать область
спектра, где находится такой очень интенсивный пик. Но в импульсном
ЯМР нмпульс неселективно возбуждает все сигналы, а если при этом
учесть особенности цифровой выборки, то станет ясно, что мы получим
в спектре все пики, хотим мы того или нет. Связанные с этим трудности
обсуждаются в гл. 3 (разд. 3.4.3), а различные сопутствующие им
обстоятельства-в гл. 7 (разд. 7.7.2).
Даже если нам удастся сделать так, что все пики попадут внутрь
спектрального диапазона при заданной нами скорости выборки, то все
равно что-нибудь будет лежать за его пределами. Это электрический
шум, который содержит бесконечный диапазон частотных компонент
(белый шум) и от которого мы старались избавиться. На первый взгляд
это кажется фатально слабым местом в схеме импульсного ЯМР.
В сущности в спектре может отразиться неограниченное количество
шума, что полностью сведет на нет любой выигрыш в чувствительности,
полученный за счет накопления. Чтобы избежать этой катастрофы,
необходимо ограничить электрическую ширину полосы спектрометра,
поместив полосовой фильтр перед АЦП. Тогда мы получим третью
схему приемника, показанную на рис. 2.8.
Для различных спектрометров необходимо задавать различные
спектральные диапазоны, должна регулироваться ширина полосы в этом
фильтре от нескольких герц до максимально возможной для данного
АЦП. При работе спектрометра установка ширины полосы фильтра
часто не видна. Ее задает программа компьютера, как только мы
установим скорость выборки данных. Однако важно помнить о сущест-
вовании этого фильтра. На рис. 2.9 показано, как влияет на вид спектра
выбор ширины спектра и ширины полосы фильтра. Такой выбор
является нетривиальной задачей, а связанные с этим разнообразные
искажения в спектрах рассматриваются в других главах.
38
Г лава 2
5000
5000
Гц
. | Г . I I Т Т Т Г"! | . t I I I I I | ! V » rT I I I | I ' I" I
200 150 100 $0 0 -50 -100 -150 -200
Гц
I Т ’ 1Л I I < « I I. > I > < < 1ТГТТ1
200 150 100 50 0 -50 -100 -150 -200
Гц
Рис. 2.9. Иллюстрация важности полосового фильтра. На спектре вверху боль-
шие значения имеют как спектральная ширина, так и ширина полосы фильтра.
Ширина среднего спектра была уменьшена, в то время как фильтр остается
неизменным; все шумы, наблюдаемые в верхнем спектре, отражаются на новую
область наблюдения. При правильной установке фильтра, соответствующего
новой ширине спектра (внизу), сильно улучшается отношение сигнал/шум.
2.4.3. Преобразование
После того как путем накопления и усреднения получено достаточно
хорошее отношение сигиал/шум, цифровые данные должны быть пре-
образованы в частотное представление. В разд. 2.5 обсуждаются практи-
ческие аспекты этой процедуры, а также ряд очень интересных операций,
которые можно провести с временным представлением данных перед их
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
39
преобразованием. Здесь же, перед более обстоятельным обсуждением
методов детектирования в гл. 4, я хочу кратко остановиться на смысле
терминов, используемых в преобразовании Фурье. Тот, кто испытывает
затруднения, может опустить этот раздел, взяв из него лишь то, что
касается двух форм лоренцевой линии.
Вспомним формулу для преобразования Фурье:
(2-3)
Здесь f(t) может быть комплексной функцией, но при описании экспери-
мента мы показали, что она действительная и описывает временную
зависимость амплитуды сигнала ЯМР. Несмотря на это, /(со) может
быть комплексной из-за того, что под знаком интеграла стоит комплекс-
ная экспонента. На первый взгляд это кажется непонятным, но объясня-
ется весьма просто. Представим экспоненту в ее альтернативной форме
как комбинацию тригонометрических функций:
el<at = cos (со/) + isin(coO
(2-4)
Видно, что преобразование в таком случае имеет действительную
и мнимую части:
Re [/(со)] = J /(/) cos (<в /) d t
Im №)] = J /(0 sin (co 0 d t
(2.5)
Каждая из этих частей содержит представление спектра, однако при
этом с различными формами лоренцевой линии. Если выполняются
определенные экспериментальные условия (см. гл. 4), то действительная
часть преобразования соответствует сигналу поглощения^ а мнимая -сиг-
налу дисперсии (рис. 2.10). Спектры ЯМР принято записывать в форме
сигналов поглощения, таким образом, для регистрации используется
действительная часть спектра.
Рис. 2.10. Формы представления лоренцевой линии: в виде сигнала поглощения
(слева) и в виде сигнала дисперсии (справа); отметим широкие крылья у линии
дисперсии.
40
Глава 2
Рис. 2.12. При изменении фазы сигнала во временном представлении (здесь
шагами в 10") в частотном спектре к сигналу поглощения примешивается сшнал
дисперсии, что приводит к изменениям формы линии, показанным па рисунке.
Возникновение двух форм спектра при преобразовании показывает,
что существует еще одна переменная во временном представлении,
которую мы не рассматривали. Каждый сигнал ЯМР имеет свою
характерную амплитуду н частоту, но колебание имеет еще и фазу,
которая указывает момент времени, соответствующий началу волны
(рнс. 2.11). Все сигналы могут иметь отличную от нуля одинаковую фазу
или различные фазы при различных частотах, что найдет отражение
в соотношении действительной и мнимой частей преобразования, В гл. 4
мы рассмотрим этот вопрос более тщательно; там же предложена схема
эксперимента, при которой функция f(t) становится комплексной, т. е.
сигнал во временном представлении имеет две компоненты. Отметим,
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
41
что изменение фазы во временном представлении приводит к смещению
действительной и мнимой частей частотного представления спектра. Это
приводит к форме линии, содержащей наряду с компонентой поглоще-
ния также вклад дисиерсии (рис. 2.12).
2.5. Практические аспекты фурье-спектроскопии ЯМР
2.5.1. Введение
Химики, использующие фурье-спектроскопию ЯМР от случая к слу-
чаю, часто ие хотят вникать во все детали детектирования, оцифровки,
запоминания и преобразования данных, которые рассматриваются в
разд. 2.4, Для многих простых приложении ими действительно можно
пренебречь, поскольку налагаемые методом ограничения не препят-
ствуют интерпретации результатов на простом качественном уровне.
Например, пусть протонный спектр шириной Юм.д. занимает лист
бумаги длиной 50 см. При рабочей частоте прибора 500 МГц это
означает, что спектр записан в масштабе 100 Гц/см. Точки данных,
воспроизводящие спектр, в этом случае располагаются на расстоянии
0,4 Гц друг от друга. Следовательно, на каждом сантиметре рисунка
расположено 500 точек, которые образуют практически сплошную
линию. Влияние оцифровки здесь незначительно, и в этом случае для нас
не важно, что спектр может не быть непрерывной линией. Для рутинных
анализов или проверок чистоты образцов таких спектров вполне доста-
точно. Но как только мы беремся за решение действительно сложных
структурных задач, этот подход уже не может нас удовлетворить.
При решении таких задач необходимо использовать спектрометр на
пределе его возможностей. Имея мощный и дорогостоящий фурье-
спектрометр ЯМР, нет смысла применять его подобно прибору с непре-
рывной разверткой, спектры которого отличаются лишь тем, что не
имеют раздражающих «виглей» после сигнала и занимают чуть боль-
ший диапазон частот, В следующих разделах описываются различные
особенности спектров с преобразованием Фурье, Для них существуют
как преимущества, так и ограничения.
2.5,2, Цифровое разрешение и время регистрации
Введение. До сих пор мы рассматривали параметры, используемые
при выборке в основном в терминах времени. Ширина спектра определя-
ет интервал между измерениями сигнала, а требуемое разрешение-об-
щую продолжительность выборки. Это удобно при постановке экспери-
мента, поскольку измерения проводятся во временной области. Однако
после преобразования данных более естественным становится проанали-
зировать эти параметры в терминах частот. Если мы обозначим интер-
вал между точками выборки данных в частотном спектре через $d Гн
(цифровое разрешение), то получим
42
Глава 2
&л = 1/Л * (2.6)
Чтобы охарактеризовать спектральную ширину Г, мы проводили вы-
борку через каждые 1/2 F с. Следовательно, общее число выбранных
точек N равно 2F'AV Поскольку только половина этих точек воспроиз-
водит действительную часть спектра, цифровое разрешение равно 2F/N,
При ближайшем рассмотрении мы можем видеть, что это абстракт-
ное рассуждение имеет очень конкретное следствие для спектра
(рис. 2.13). Для протонных спектров обычно используется 0td, равное
0,3-0,4 Гц на точку. Однако ширины протонных линий в спектрах
небольших молекул могут быть 0,1 Гц и меньше. Поэтому, если мы
хотим наблюдать и интерпретировать тонкую структуру в протонном
спектре, нам необходимо улучшить цифровое разрешение, поскольку,
для того чтобы правильно воспроизвести форму линии в спектре, 0td
должно быть заметно меньше ширины линии. Это достигается либо
увеличением At, либо уменьшением ширины спектра, или же путем
.jdb,
—Г—’—I—'—I—1—I—г~~1—'—I—'—!—'—I—'—Г—’—I—1—<—'—I—’—I
24 22 20 18 16 14 12 10 в 6 4 2
ГЦ
Рис. 2.13. Неадекватное цифровое разрешение может полностью скрыть особен-
ности спектров. В нижнем спектре, зарегистрированном при совершенно «нор-
мальных» условиях для протонного ЯМР (At = 2 с, = 0,5 Гц на точку), можно
ясно видеть отдельные точки представления данных (спектр как бы составлен из
отдельных частей прямых линий). Улучшение оцифровки (верхний спектр, At =
=65 с, = 0,015 Гц на точку) позволяет получить истинный спектр. Форма
сигналов в нем определяется естественными ширинами линий и разрешением на
данном спектрометре (это тестовый образец для чрезвычайно узких линий). .
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
43
увеличения числа точек, используемых для регистрации спектра. Не-
избежная плата за это-понижение чувствительности, потому что чем
больше времени тратится на регистрацию каждого спектра, тем меньшее
число накоплений и усреднений сигнала можно сделать.
При регистрации спектров других ядер, даже таких ядер, как 13С,
дающих очень узкие линии в спектрах, принято работать с довольно
низким цифровым разрешением (2-3 Гц на точку или хуже). Это вполне
естественно, так как обычно в первую очередь приходится заботиться
о чувствительности. Многие гетероядра имеют низкое природное содер-
жание, а тонкая структура в их спектрах отсутствует. Средн обычных
ядер заслуживающее упоминания исключение составляет 31Р, В ЯМР
31Р высокая резонансная частота сочетается с большим диапазоном
химических сдвигов и наличием расщеплений за счет гомоядерного
спин-спннового взаимодействия, поэтому достижение адекватного циф-
рового разрешения может оказаться трудным делом.
Дополнение нулями. Если нас интересует только получение хорошо
разрешенных линий, то установление времени регистрации в соответ-
ствии с требуемым расстоянием между линиями автоматически обеспе-
чит подходящее цифровое разрешение. Однако существует большая
разница между тем, чтобы обнаружить расщепление сигналов и иметь
возможность полностью охарактеризовать их форму реальными точка-
ми данных. В последнем случае требуется более высокое цифровое
разрешение, чем мы могли бы получить при увеличении А,. Тогда для
Рис. 2.14, Дополнение нулями данных во временной области увеличивает число
точек в частотном спектре, улучшая его вид.
44
Глава 2
улучшения 3№,л может быть использован метод дополнения нулями полу-
ченного ССИ, который спадает до величины, близкой к нулю, в конце Аг
Если это так, то дальнейшее увеличение времени регистрации At не
приводит к получению дополнительной информации, а поэтому мы
можем, не увеличивая At, просто использовать компьютер для дополне-
ния данных нулями перед преобразованием (рис. 2.14). Эго дает прямой
выигрыш, поскольку легко использовать дополнительную память ком-
пьютера, а времени для накопления сигнала всегда не хватает.
Улучшение за счет дополнения нулями оказывается лишь космети-
ческим, поскольку никакой дополнительной информации в спектре не
прибавляется. Тем не менее часто оно полезно. При работе с одномер-
ным спектром обычно применяют дополнение нулями в сочетании со
специальными приемами увеличения разрешения для улучшения вида
сложных мультиплетов (см. разд. 2.5.4). В двумерных экспериментах, где
время регистрации иногда бывает слишком коротким, дополнение нуля-
ми часто с успехом используется для улучшения вида спектра по крайней
мере по одной из координат. Несколько подробнее этот вопрос обсужда-
ется в гл. 8. При регистрации двумерных спектров или в других случаях,
когда оказывается неверным предположение о том, что ССИ спадает
почти до нуля в течение At, нужна большая аккуратность для выполне-
ния корректной аподизации (см. ниже).
2.5.3. Обрезание и аподизация
С оцифрованными линиями ЯМР случаются довольно странные
вещи, если At оказывается коротким по отношению к естественному
времени затухания ССИ. При таких условиях регистрации спектра мы
имеем дело с данными, которые как будто бы являются произведением
«полного» ССИ и ступенчатой функции, т.е, функции, равной 1 в интер-
вале t от 0 до At и равной 0 за пределами этого интервала. Такое
умножение обрубает сигнал в момент времени At. В частности, такой вид
имеет дополненный нулями ССИ на рис. 2.15. Оказывается, что фурье-
образ этого произведения двух функций является в некотором смысле
смешением (конволюцией) фурье-образов каждой из иих, т. е. нечто вроде
текущего среднего двух кривых. Преобразование ступенчатой функции
дает функцию (sinx)/x, которую часто обозначают как sincx (рис. 2.16).
Ее конволюция с линией лоренцевой формы приводит к «виглям»
в основании линии (рис. 2.17).
Этот тип искажения формы линии наблюдается только при относи-
тельно коротких At, поэтому он редко встречается в рутинных одномер-
ных протонных спектрах, но иногда проявляется в появлении пьедестала
у сигналов растворителя. Однако в гетероядерном и двумерном ЯМР
устранение «виглей», вызванных обрезанием, становится важной пробле-
мой. Ключ к ее решению лежит в том, чтобы сгладить «острый край»
в конце ССИ, ответственный за появление «виглей». Если это сделать, то
«вигли» исчезают. Край может быть сглажен умножением ССИ на
Рис. 2.15. Один из способов представления данных, полученных при слишком
коротком Л/ это результат умножения полного ССИ на ступенчатую функцию.
Рис. 2.16. Фурье-преобразование ступенчатой функции довольно часто встречает-
ся в фурье-спектроскопии ЯМР; оно представляет собой функцию sine х.
Рис. 2.17. Преобразование обрезанных данных (внизу) является «конволюцией»
лоренцевой линии и функции sine; сглаживание обрезания ССИ при аподизации
устраняет «вигли», но уширяет линию (вверху).
46
Глаза 2
функцию, которая начинается с 1 и плавно спадает до нуля к концу At.
Пример использования такой взвешивающей функции перед преобра-
зованием Фурье показан на рис. 2.17. Такую операцию называют аподи-
зацией («отсечением ступней»), В следующем разделе приведены при-
меры функций, используемых для этой цели.
2.5.4. Взвешивающие функции
Введение. Описанная в предыдущем разделе аподизация-это только
один пример из целого ряда эффектов, которые можно получить при
обработке ССИ перед преобразованием. По существу, подбирая форму
огибающей затухания ССИ, мы можем управлять отношением сигнал/
шум и разрешением в преобразованном спектре. Используемые для
этого средства применяются не только в фурье-спектроскопни ЯМР, но
доступность данных в форме временного представления в этом случае
делает требуемые вычисления довольно простыми. (Отметим также, что
спектрометры с непрерывной разверткой обычно не имеют встроенных
компьютеров.) Использование взвешивающих функций-существенная
часть процесса анализа спектров. Их применение имеет целью либо
оптимизацию чувствительности или разрешения, либо просто аподиза-
цию данных. Предел возможностей спектрометра реализуется тогда,
когда найдена и испробована оптимальная для данной задачи взвеши-
вающая функция. Из большого набора функций, которые были пред-
ложены для этих целей, мы рассмотрим две; одну, предназначенную
для увеличения чувствительности, и другую -для улучшения разре-
шения.
Чувствительность-согласованный фильтр. Сигнал ЯМР спадает во
времени при каждом прохождении, а амплитуда шума остается постоян-
ной. Поэтому, понижая относительный вклад хвоста в конце ССИ,
можно улучшить отношение сигнал/шум. Это достигается умножением
ССИ на спадающую экспоненциальную функцию. Естественный спад
сигнала описывается выражением
= Ae-trr г (2.7)
(В гл. 4 будет показано, почему символ Т2 используется для временной
постоянной этого спада.) Умножим ССИ на взвешивающую функцию Д’:
£ = e~t)a (2.8)
Если а положительно, то произойдет нужное нам уменьшение вклада
хвоста (рис. 2.18). Однако мы должны соблюдать некоторую осторож-
ность. Такое умножение ускоряет наблюдаемое затухание сигнала.
В частном представлении это приведет к уширению линии, поскольку
очевидно, что у нас была возможность уменьшить в эксперименте время
выборки сигнала. Ширина на полувысоте лоренцевой линии Sv соотно-
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
47
Рис. 2.18. Применение согласованного фильтра улучшает чувствительность.
сится с временной постоянной Т2 следующим образом:
5v=-^
л Т2
Применение взвешивающей функции £ понижает значение Т2 до эф-
фективного Т2, давая
i__j_ 1
Т'2 Т2 а
(2-9)
(2.10)
Но при таком уширении линии понижается ее высота. Следовательно,
отношение высоты пика к амплитуде шума прн умножении ССИ иа $ не
обязательно улучшается. Тщательный анализ проблемы показывает, что
чрезмерное уширение линии, т. е. выбор слишком маленькой величины а,
понижает чувствительность. В то же время большие величины а не дают
заметного эффекта. Существует оптимальный баланс между понижени-
ем шума и эффектами уширения линии, достигаемый при а = Т2, т. е.
тогда, когда взвешивающая функция удваивает ширину линии в частот-
ном представлении. Эта взвешивающая функция известна как согласо-
ванный фильтр и является наиболее подходящей для получения лучшей
чувствительности (рис. 2.18). Отметим, что термин «согласованный»
означает «согласованность с ССИ по скорости спада огибающей», так
что, если огибающая-экспонента, идеальный согласованный фильтр
также экспоненциальный.
Требуемую величину а легко определить практически. Для этого
сначала проведем преобразование ССИ без использования взвешиваю-
щей функции и выясним ширины интересующих нас сигналов. (Предва-
48
Глава 2
зрительно нужно убедиться, что подобрано правильно. Если не-
обходимо, то следует провести дополнение нулями.) Затем вычислим Т2
по уравнению (2.9). Теперь, приняв а = Т2, умножим ССИ на взвешиваю-
щую функцию и повторим преобразование. Специальная программа
в компьютере многих спектрометров сама рассчитывает параметр такой
взвешивающей функции как фактор уширения линии. В таком случае нет
необходимости считать в уме. Взвешивающие функции этого вида, или
так называемое экспоненциальное умножение, могут оказаться полезны-
ми н для аподизации. Однако обычно при этом степень уширения линий
не соответствует условию согласованного фильтра. В таком случае
лучшие результаты можно получить, если использовать функцию,
описанную в следующем разделе.
Разрешение преобразование лоренцевой формы линии в гауссову. По-
скольку ускорение спада ССИ при экспоненциальном умножении уширя-
ет линии в частотном представлении, можно ожидать, что противо-
положный эффект достигнут при ослаблении его затухания. Другими
словами, обратный знак а в уравнении (2.8) должен дать нам функцию
улучшения разрешения. Это верно, но есть определенные проблемы:
происходящее при этом усиление конечной части ССИ увеличивает
уровень шума и может приводить к возникновению больших «виглей».
Лучший результат получается при использовании функции, которая
сильно уменьшает затухание начальной части ССИ, но к концу гладко
спадает до нуля. Существует много функций, обладающих этим
свойством. Одна из самых популярных-функция (2.11), которая осу-
ществляет преобразование лоренцевой формы линии в гауссову:
с§ = (2.11)
В этом случае а выбирается равным — Т2, а Ь-положительным. Затем
можно отрегулировать параметр b в соответствии с требуемым резуль-
татом. На некоторых спектрометрах нельзя прямо вводить Ь, но
обязательно есть параметр, связанный с ним, и нужно только выяснить
из описания к программам, каким соотношением они связаны. Описыва-
емая функция улучшает разрешение двояким образом. Прежде всего
некоторые значения b действительно уменьшают ширину линии на
полувысоте; однако при этом заметно понизится отношение сигнал/
шум. Но возможно, что более важным оказывается изменение формы
линии, которая становится гауссовой (рис. 2.19), Гауссовы линии намно-
Рис. 2.19. Лоренцева (А) и гаус-
сова (5) линии с равными шири-
нами на полувысоте; гауссова
линия намного уже в основании.
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
49
го уже у основания, чем соответствующие им лоренцевы. Например, при
равных ширинах на полувысоте на расстоянии от основания пика,
соответствующем 1% его амплитуды, гауссова линия в 5 раз уже, чем
лоренцева. Именно это свойство преобразования лоренцевой формы
линии в гауссову делает его столь полезным.
Лучший способ использования данной методики на практике-это
метод проб и ошибок. Сначала определяют а тем же способом, который
был описан выше, а затем варьируют b (или его эквивалент). Каждый
раз при изменении параметров повторяется обработка данных и иссле-
дуется частотное представление спектра, чтобы увидеть, произошло ли
желаемое улучшение. Поскольку а зависит от естественных ширин
линий, задача выбора величины, оптимальной одновременно для всех
пиков, может оказаться невыполнимой. Для сложного спектра часто
необходимо применять несколько различных взвешивающих функций.
Это тот случай, когда настойчивость и терпение определенно вознаграж-
даются, и в результате иногда удается выявить поразительно тонкую
Рис. 2.20. Улучшение разрешения при преобразовании лоренцевой формы линии
в гауссову. Внизу показаны естественный ССИ и его преобразование. Вверху
показан спектр, полученный после преобразования ССИ, у которого с помощью
взвешивающей функции была ослаблена начальная часть (одновременно эта же
функция обеспечивает аподизацию). Столь сильное воздействие можно при-
менять к данным только с очень высоким отношением сигнал/шум.
4-75
50
Глава 2
структуру сигналов, имевших вид безнадежных бугров и холмов
(рис. 2.20). Но такой результат можно получить лишь тогда, когда
холмы действительно состоят из многих перекрывающихся линий.
Попытки обузить сигналы, широкие по своей природе (например,
вследствие обмена), приведут только к потере чувствительности. С боль-
шими значениями а и Ь„ подобранными так, чтобы понизить ССИ до
нуля к концу At, преобразование лоренцевой формы линии в гауссову
также хорошо подходит для уменьшения «виглей», вызванных обреза-
нием. На рис. 2.17 показан результат обработки данных именно таким
способом.
2.5.5. Распознавание отраженных пиков
Явление отражения, описанное в разд. 2.4.2, может причинять замет-
ные неудобства. Даже при работе с «обычными ядрами», такими, как ‘Н.
не всегда есть уверенность в том, что ширина спектра включает все пики.
Время от времени возникают такие неожиданности, как протоны,
включенные в водородную связь или присоединенные непосредственно
к металлу. Следовательно, важно уметь находить в спектре отраженные
пики. Существует несколько характерных для них признаков.
Обычно в протонном спектре большинство пиков находится внутри
спектрального диапазона, а один илн два необычных сигнала попадают
за его пределы. В этом случае легко идентифицировать отраженные
пики, поскольку они имеют отличающуюся от других фазу (рнс. 2.21).
правильный
спектр
Рис. 2.21. Идентификация отраженных пиков на основании их фазовых свойств.
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
51
Г I | I I I Г I г Г I I | г г тI I I I I 1 | Г» | I I 1 ГГ Г | Г Т
100 о -100 -200
Гц
ТГ1 Г Г Т Г | I | I | I I I I | | I I | I I I I I I | >
100 D -100
Гц
I I | >Т 1Т7 I I I I | I I I !Т| I I I | Т"1 "> I I г Г7 I | I I
200 100 0 -100
ГЦ
Рис. 2.22. При отсутствии других пиков, относительно которых можно делать
сравнение по фазе, попытаемся сместить спектральное окно. Слева показан
результат для правильно охарактеризованного пика, а справа-для сигнала,
отраженного от границы спектрального окна. Во втором случае результат будет
зависеть от того, как на спектрометре детектируются сигналы, но в любом случае
положение отраженного сигнала будет неверным.
Но если спектр содержит только один сигнал, как это часто случается
при работе с гетероядрами, то этот способ непригоден, поскольку нельзя
провести сравнение фаз, В этом случае или если есть другие основания
предполагать, что сигналы не попали в спектральный диапазон (напри-
мер, при исследовании необычных ядер), нужно провести тест для
проверки на отражение. Для этого смещают окно спектра на значитель-
ную величину, скажем на 100 Гц. Неотражеиные пики, естественно,
оказываются сдвинутыми в направлении, противоположном сдвигу
спектрального окна, но на ту же самую величину (рис. 2.22). В то же
время отраженные пики либо сместятся в том же (т. е. неверном)
направлении, либо на другую (т. е. неверную) величину в зависимости от
того, насколько их истинные частоты превышают частоту Найквиста.
2.6. Преобразование Фурье не единственный способ
Все рассматриваемые в этой книге спектры получены с помощью
преобразования Фурье. Одиако, как уже указывалось в разд. 2.3.3, это не
единственный путь выделения частотного спектра из данных во времен-
ном представлении. Альтернативная методика, известная как метод
максимальной энтропии (МЕМ, от аигл. Maximum Entropy Method),
привлекла в последнее время столь пристальное внимание и много-
численные комментарии, что нам показалось уместным упомянуть
о ней, хотя в дальнейшем мы не будем ее использовать, В грубом
д*
52
Глава 2
приближении метод основан на реконструкции ССИ путем численного
моделирования в виде суммы осцилляторов, т. е. линий ЯМР, н на
построении соответствующего сигнала во временном представлении.
Полученный модельный сигнал сравнивают с экспериментальным ССИ
и по методу наименьших квадратов проводят оценку близости модели.
Затем проводят варьирование модельного спектра н находят тот, кото-
рый наилучшим образом совпадает с экспериментальным ССИ. Слож-
ность заключается в том, что у этой задачи не существует единственного
решения, поскольку экспериментальные данные ие полные-они содер-
жат шум и были измерены в течение ограниченного времени. Кроме
того, поиск решения может быть очень долгим.
Как выбрать правильное решение из многих возможных, которые
кажутся одинаково «близкими» к экспериментальным данным. Согласно
критерию максимума энтропии, самый подходящий спектр тот, который
содержит минимум информации, т. е. максимум энтропии. При таком
подходе не существует риска получить из экспериментальных данных
лншией информации, которую они не содержат. Этот подход широко
используется в других областях, таких, как радиоастрономия и улучше-
ние оптических изображений, когда необходимо проанализировать дан-
ные с шумом. Первые примеры применения МЕМ в ЯМР [2] породили
надежду, что в спектрах, обработанных таким образом, можно получить
намного более высокую чувствительность, так как МЕМ дает независи-
мый от экспериментатора критерий идентификации пиков. Эта точка
зрения все еще находит своих сторонников, но кажется, что действитель-
ные преимущества здесь весьма иллюзорны. Пока не ясно, является ли
обработка спектра с помощью МЕМ лучшим способом выделения
сигналов из данных с шумом, чем просто применение согласованного
фильтра и выбор порога над уровнем шумов, ниже которого пики
должны быть отброшены. Количественный ответ на этот вопрос еще не
получен, причем складывается мнение, что между двумя этими метода-
ми в данном отношении нет большой разницы.
МЕМ действительно имеет большие преимущества при обработке
либо очень неполных данных, либо спектров, накопленных с коротким
временем регистрации. Используя в этом случае преобразование Фурье,
мы должны применять аподизацию. При этом какую бы взвешивающую
функцию мы ни выбирали, она неизбежно будет уширять линии. При-
меняя МЕМ, мы подбираем модельный сигнал во временной области
независимо от уровня шума, и проблема обрезания просто не возникает
(рис, 2.23). Весьма возможно, что МЕМ окажется особенно полезным
при обработке двумерных спектров, для которых часто используются
довольно короткие времена регистрации [3], Большинство современных
спектрометров еще не оснащено программами для применения МЕМ
при обработке данных. Объем вычислений здесь больше, чем при
использовании преобразования Фурье. Однако нет сомнений в том, что
в скором времени такие программы станут доступными.
Некоторые вопросы импульсного ЯМР
53
Рис. 2.23. Обработка сильно обрезанного ССИ с использованием метода макси-
мальной энтропии (ср. с рис. 2.17).
Литература
1. В рамках качественного подхода в этой книге мы не будем пытаться объяснить
смысл преобразования Фурье или обсуждать его математические свойства. Эти
вопросы разбираются во многих других руководствах по ЯМР и по физике.
См., например (по мере повышения трудности): МйНеп К., Pregosin P.S.,
Fourier Transform NMR Techniques: A Practical Approach (Chapter I), Academic
Press, 1976; Shaw D., Fourier Transform NMR Spectroscopy, 2nd. edition (Chap-
ter 3), Elsevier, 1984; Arfken 6'., Mathematical Methods for Physicists, 3rd. edition
(Chapters 14, 15), Academic Press, 1985.
2. Sibisi S., Nature (London), 301, 134 (1983); Sibisi S., Skilling J., Breretan R.G.,
Laue E.D., Staunton J., Nature (London), 311, 446 (1984).
3. Ноге P.J., J. Mag. Res., 62, 561-567 (1985).
Глава 3
Основные экспериментальные
методы
3.1. Введение
Эта глава-первая из двух глав (гл. 3 и 7), посвященных эксперимен-
тальным методам спектроскопии ЯМР. Наибольший интерес они пред-
ставляют для тех, кто хочет научиться самостоятельно работать на
спектрометре. Однако некоторые из обсуждаемых тем имеют прямое
отношение и к химикам (приготовление образцов), и к тем, кто соби-
рается купить спектрометр (тесты на качество прибора). Покупая при-
бор, очень полезно полностью владеть всеми тонкостями процедур
тестирования, поскольку производители спектрометров по вполне по-
нятным причинам стремятся слегка подтасовать получаемые результаты
в свою пользу. Некоторые полезные, но не очень распространенные
тесты обсуждаются в гл. 7. В двух коротких главах нельзя дать полный
обзор всех экспериментальных методов, поэтому в них включены только
те вопросы, которые вызывают наибольшие сложности у начинающих
работать с импульсными спектрометрами, а также изложение общих
принципов выполнения экспериментов, описанных в оставшейся части
книги.
3.2. Приготовление образцов
3.2.1. Введение
В этом разделе основное внимание будет уделено вопросам, чаще
всего возникающим при приготовлении образцов. Многие из обсуждае-
мых здесь факторов имеют принципиальное значение только для про-
тонных спектров, однако нужно помнить о них и при выполнении всех
других экспериментов. Возможно, содержание первых параграфов пока-
жется вам очевидным и тривиальным, но пренебрежение этими просты-
ми правилами приводит обычно к неудачам в практической работе
и отсутствию понимания более сложных проблем, рассматриваемых
в других главах книги. Подготовка к измерению спектра ЯМР вызывает
вполне понятное оживление, поскольку она завершает многомесячный
труд по синтезу вещества. Поэтому приготовление образца и помещение
его в спектрометр часто производят с излишней поспешностью. А ведь
несколько минут, потраченных на планирование этих действий, могут
сэкономить вам часы приборного времени.
Основные экспериментальные методы
55
3.2.2. Выбор растворителя
Конечно же, прежде всего ваше вещество должно растворяться
в выбранном растворителе. Но растворимость не обязательно должна
быть очень высокой, особенно если вы собираетесь регистрировать
прогонный спектр. В этом случае 1 мг вещества в 0,4 мл растворителя
вполне достаточно для получения хорошего спектра на приборе со
средним и сильным полем. Растворитель может повлиять на получаемые
результаты еще несколькими путями. При наблюдении протонов и угле-
рода сигналы растворителя могут закрывать некоторые области спект-
ра. Вязкость растворителя влияет на разрешение в спектре, особенно при
работе с протонами. Некоторые растворители, например вода и мета-
нол, содержат способные к обмену атомы водорода, что не позволяет
наблюдать сигналы обменивающихся протонов в изучаемом веществе.
Если планируются температурные эксперименты, то необходимо учесть
температуры кипения и замерзания растворителей, равно как и возмож-
ные температурные изменения растворимости исследуемого вещества.
Растворители ароматической природы, такие, как бензол и пиридин,
могут вызывать большие изменения химических сдвигов в спектре
растворенного вещества по сравнению со спектрами, полученными прн
использовании неароматических растворителей. Интенсивность н шири-
на сигнала дейтерия от растворителя могут оказывать влияние на
результаты некоторых экспериментов, таких, как, например, разностная
спектроскопия. И наконец, цены на дейтерированные растворители
различаются очень сильно, что может оказаться важным фактором при
выборе методик для ежедневного приготовления и измерения спектров
большого числа образцов. От тщательного учета всех перечисленных
факторов может во многом зависеть успех всего эксперимента.
В настоящее время в продаже имеется большое число частично или
полностью дейтерированных соединений. В табл. 3.1 приведены некото-
рые физические свойства наиболее широко используемых в ЯМР раство-
рителей. Самые дешевые из них-вода и хлороформ, причем свойства
хлороформа значительно больше подходят для использования в ЯМР.
Стоимость других растворителей растет пропорционально трудности
получения их в дейтерированной форме. Так, стоимость наиболее
распространенных в органических синтезах растворителей, таких, как
бензол, толуол, диметилсульфоксид (ДМСО), ацетои, ацетонитрил, ме-
танол, хлористый метилен, диметилформамид (ДМФ) и пиридин, оказа-
лась приблизительно одинаковой. В то же время тетрагидрофуран (ТГФ)
и циклогексан стоят значительно дороже.
Если нужно записать протонные спектры образцов, содержащих
менее нескольких миллиграммов исследуемого вещества, то при выборе
растворителя необходимо учитывать положение в спектре сигналов
остаточных протонов растворителя. Существуют три источника допол-
нительных сигналов в спектре: остаточные протоны дейтерированного
растворителя, растворенная вода и другие растворенные примеси. Обыч-
56
Глава 3
Таблица 3.1. Свойства некоторых распространенных дейтерированных ЯМР-раст-
ворителсй. Знак «—» перед величиной указывает на то, что она относится
к соответствующему недейтерирован ному препарату. В столбце «Цена» приво-
дятся примерные цены (в фунтах стерлингов за 10 г) на мелкорасфасованные
растворители в Великобритании на 1985 г.
Растворитель гс гш., °C 8 1Н б”с Цена
Уксусная кислота 15,8 115,5 11,53; 2,03 178,4; 20,0 15
Ацетон - 93,8 55,5 2,05 206,0; 29,8 10
Ацетонитрил 48,0 80,7 1,95 118,2; 1,3 15
Бензол 6,8 79,1 7,16 128,0 10
Хлороформ -64,0 60,9 7,27 77,0 1
Циклогексан -6,5 78,0 1,38 26,4 75
Хлористый метилен - - 97,0 40,0 5,32 53,8 20
Диметилформамид 61,0 - 153,0 8,01; 2,91; 2,74 167,7; 35,2; 30,1 130
Диметил сульфоксид - 18,0 - 190,0 2,50 39,5 10
Диоксан - 12,0 - 100,0 3,53 66,5 ПО
Метанол 98,0 65,4 3,31 49,0 20
Нитробензол - 5,0 -210,0 8,11; 7,67; 7,50 148,6; 134,8; 129,5; 123,5 35
Нитрометан - - 29,0 100,0 4,33 62,8 25
Пиридин 42,0 114,4 8,71; 7,55; 7,19 149,9; 135,5; 123,5 20
Тетрагидрофуран - 106,0 65,0 3,58; 1,73 67,4; 25,2 150
Толуол 93,0 110,0 7,09; 7,00; 6,98; 2,09 137,5; 128,9; 128,0; 125,2; 20,4 20
Т рифторуксуспая кислота 15,0 75,0 11,30 163,8; 115,7 5
Вода 3,8 101,4 4,63 - 3
Источники: Aldrich Catalogue Handbook of Fine Chemicals 1985; Merck, Sharp and Dohme NMR
reference data; Aldrich Library of NMR Spectra 1983; Preisch E., Seibl J., Simon W., Clerv T.,
Tabellen zur Strukturaufklarung organischer Verbindungen, Springer-Verlag, 1981.
но в спецификациях растворителей указывается содержание только
остаточных протонов, но не меньшие осложнения могут вызвать н два
других источника (особенно вода).
Продажные растворители обычно содержат от 99,5 до 99,995%
дейтерия, при этом более чистые растворители часто поставляются
в небольших (0,5 мл) ампулах, Чем выше чистота препарата, тем он
дороже. Важно помнить, что в спецификациях указывается только
степень дейтерирования, и в них не всегда есть указания о содержании
остальных примесей. В растворителях большой степени дейтерирования
содержание воды и других примесей иногда близко или даже превышает
содержание остаточных протонов. Определить, нужен вам для данного
эксперимента более чистый растворитель или нет, вы сможете, только
накопив опыт его использования.
Основные экспериментальные методы
57
При идеальном подборе растворителя сигналы его остаточных про-
тонов не должны перекрываться с сигналами растворенных веществ.
Конечно, на практике это недостижимо, и приходится идти на компро-
мисс. Сигналы из некоторой области, расположенной вблизи сигналов
растворителя (их положение заранее известно), приходится считать
недостоверными. Эта область может быть достаточно большой, по-
скольку в общем случае сигналы остаточных протонов представляют
собой мультиплеты за счет спин-спинового взаимодействия с дейтерием.
Исключения из этого правила составляют хлороформ и вода, Остаточ-
ные сигналы таких растворителей, как ацетон или диметилсульфоксид,
представляют собой квинтеты и могут легко закрывать участки спектра
шириной до нескольких десятых миллионных долей. При концентрации
изучаемого вещества порядка 2 мг на 0,4 мл (для веществ средней
молекулярной массы) интенсивность остаточных сигналов раствори-
телей «нормальной» чистоты (т. е. 99,5-99,9%) превышает интенсив-
ность сигналов.
Вода часто еще больше, чем сигналы остаточных протонов, мешает
наблюдению спектров. Почти все ЯМР-растворители содержат воду,
а большинство из них весьма гигроскопично. Например, сигнал воды
в обычном хлороформе, как правило, интенсивнее сигнала остаточных
протонов. Кроме того, этот широкий сигнал находится в неудобной
области спектра (около 1,6 м. д.). С некоторыми растворителями, напри-
мер с ДМСО, следует работать в инертной атмосфере с помощью
шприцевой техники. Только в этом случае они останутся достаточно
сухими для приготовления сильно разбавленных растворов. Дейтери-
рованная вода тоже гигроскопична, н ее следует хранить в эксикаторе.
Содержание воды в растворителе можно значительно уменьшить фильт-
рованием раствора через осушающие агенты, если, конечно, образец это
позволяет. Обезвоживание можно совместить с фильтрованием образца
с целью удаления твердых частиц при переносе его прямо в ампулу для
ЯМР. Это позволяет избежать дополнительных процедур. Для обезво-
живания можно использовать большинство обычных осушителей. Во
многих случаях подходит активированный оксид алюминия. Менее
удобны молекулярные сита, поскольку при фильтровании через них
в раствор попадают очень мелкие, ухудшающие разрешение частицы,
которые потом трудно отделить.
Значительное влияние на наблюдаемую ширину линии и релаксаци-
онные свойства образца оказывает вязкость растворителя. Эти эффекты
будут подробно обсуждаться далее. В первом приближении можно
разделить применяемые для ЯМР растворители на вязкие (бензол,
ДМФ, ДМСО, пиридин, толуол и вода) и невязкне (ацетон, ацетонитрил,
хлороформ, хлористый метилен и метанол). Предельно высокое разре-
шение можно получить только в невязких растворителях. Наиболее
подходящими для использования в ЯМР свойствами среди них обладает
ацетон, который обычно и применяется при изготовлении образцов для
тестов на разрешение. В рутинных экспериментах ЯМР вязкость раство-
58
Глава 3
В
д
Р
а
П"7-т । р-т I । | I । I I । : । । q-rr 'i г i i i i | > i i i । i i i i ; i > r r | i i t r ।
987654321 0
м.а.
рителя обычно не создает затруднений, но в прецизионных измерениях,
особенно на обезгаженных образцах, она приобретает олень важное
значение.
Для облегчения выбора растворителя на рис. 3.1 приведены спектры
нескольких растворителей иа частоте 500 МГц. Для измерений были
использованы образцы дейтерированных растворителей с самым низким
содержанием дейтерия фирмы Aldrich, поставляемые в ампулах по 5 или
10 мл. Растворители, хранившиеся какое-то время, обычно содержат
Основные экспериментальные методы
59
м. о.
Рис. 3.1. Протонные спектры распространенных ЯМР-растворителей на частоте
500 МГц: я-хлороформ, о метанол, в-бензол, г-ацетон, d ди мет ил сульфо-
ксид. е- хлористый метилен, ж-вода, з-толуол, и-ацетонитрил, к пиридин.
Сигналы растворителя помечены буквой Р, воды-буквой В. Иногда видны
и некоторые другие примеси (см. текст).
60
Глава 3
значительно большее количество воды. Сигналы посторонних примесей
малой концентрации приведены с усилением в 128 раз. Возможно, ваш
растворитель не содержит этих примесей, но все же перед работой
с очень разбавленными образцами обязательно проверьте его чистоту.
3.2.3. Ампула для регистрации спектров ЯМР
Фирма Wilmad, основной производитель и поставщик стекла для
ЯМР, предлагает очень широкий выбор самых разнообразных ампул.
Нужен определенный опыт, чтобы правильно выбрать ампулу для
эксперимента, поскольку невозможно надежно предсказать, что про-
изойдет при изменении, допустим, ее концентричности. При этом чем
выше поле вашего спектрометра, тем больший смысл имеет покупать
дорогостоящие высококачественные ампулы. Чаще всего признаком
неправильно выбранной ампулы служат большие боковые линии от
вращения. Они тем интенсивнее, чем больше дефектная ампула отклоня-
ется от осевой симметрии.
Но как бы ни были хороши ваши ампулы, вы ие получите качествен-
ных результатов, если не будете хранить их чистыми, без пыли и цара-
пин. После того как из ампулы вылит раствор, ее можно вымыть без
риска оцарапать опусканием в подходящий обезжиривающий раствор.
Лучше ие использовать традиционные ершики. Затем ампулы нужно
вынуть из раствора и промыть дистиллированной водой или ацетоном.
Сушить их можно продуванием через ампулу профильтрованного азота
с помощью пипетки. Для фильтрования достаточно поместить в пипетку
небольшую ватную пробочку. Обычный способ мытья ампул с последу-
ющей сушкой в печи создает массу возможностей для попадания в них
пыли и порчи.
Обратите внимание на то, что совсем новые, только что распакован-
ные ампулы обычно недостаточно чисты. Очень часто бывает так, что
химик, решивший приготовить образец для очень точных измерений,
специально для этого достает новую ампулу, не моет ее н получает
в спектре целый лес огромных пиков от смазки, диоктилфталата или
чего-нибудь еще. Храня свои ампулы постоянно в чистоте, вы легко
избежите таких драматических историй.
3,2.4. Объем образца
Если мы располагаем для регистрации спектра неограниченным
(разумеется, в масштабах эксперимента ЯМР) количеством вещества, то
объем раствора можно сделать достаточно большим, и поэтому его
точное количество не будет иметь значения. Но если мы приближаемся
к пределу чувствительности прибора, что обычно и происходит даже при
использовании спектрометров с самым сильным полем, подбор опти-
мального объема образца становится очень важным. Причина этого
проста: катушки приемника регистрируют только сигналы ядер, находя-
Основные экспериментальные методы
61
щихся внутри некоторого конечного объема, а весь остальной образец
для них как бы отсутствует. К сожалению, невозможно сконцентриро-
вать все вещество внутри чувствительного объема датчика, поскольку,
если внутрь его попадут границы раствор/воздух, это значительно
снизит однородность поля, приведет к искажению формы линии и соот-
ветственно понизит чувствительность. В дальнейшем мы обсудим этот
вопрос более подробно.
С практической точки зрения для каждого конкретного датчика
лучше всего экспериментально найти минимальный объем образца
и соответствующее ему положение ампулы в турбинке, позволяющие
получить приемлемое разрешение. Их важно знать и в тех случаях, когда
требуется очень высокое разрешение; взяв объем образца, в 1,5 раза
больший минимального, вам легче будет настроить разрешение.
Имеется несколько приспособлений, облегчающих работу с образца-
ми минимального объема. Наиболее важное из них-это так называемый
подавитель мениска, представляющий собой тефлоновый или стеклян-
ный вкладыш, выполненный точно по внутреннему диаметру ампулы.
Он вставляется в ампулу н опускается до плотного касания поверхности
раствора. Таким образом удается предотвратить образование глубоких
«водоворотов» в ампулах большого диаметра. Кроме того, на границе
раствор/тефлон не происходит столь резкого искажения поля, как на
границе раствор/воздух. По этой причине подавитель мениска стоит
использовать даже в ампулах диаметром 5 мм. Но надо помнить, что
тефлон имеет очень большой коэффициент термического расширения
и поэтому непригоден для температурных экспериментов. При низкой
температуре вкладыш погрузится в раствор, а при высокой - раздавит
ампулу.
Существуют тефлоновые вкладыши, которые помещают в нижнюю
округлую часть ампулы, чтобы вытеснить исследуемый раствор в рабо-
чий объем датчика. Эта идея уменьшения объема нашла свое воплоще-
ние в микроячейках различных конструкций. Обычно они представляют
собой небольшие полые стеклянные шарики или цилиндры с образцом,
помещаемые внутрь обычных ампул. Тогда удается расположить обра-
зец полностью внутри чувствительного рабочего объема и с целью
уменьшения искажений поля окружить его не воздухом, а растворите-
лем. Этот метод оправдывает себя при использовании ампул диаметром
10 мм и более. Однако для повышения чувствительности лучше все-таки
приобрести датчик с ампулами меньшего диаметра (см. разд. 3.4.3). При
попытках использовать микроячейки в ампулах диаметром 5 мм, по
крайней мере при регистрации протонных спектров на спектрометре
с высоким полем, по моему личному опыту, потеря разрешения оказыва-
ется настолько большой, что перекрывает выигрыш в чувствительности.
Но для некоторых сочетаний конструкций датчиков й магнитов примене-
ние микроячеек может оказаться полезным, поэтому стоит их испро-
бовать.
62
Глава 3
3.2,5. Приготовление образца
Спектры высокого разрешения можно получить только на образцах,
полностью свободных от взвешенной пыли и других твердых частиц.
Поэтому лучше всего ввести в свою постоянную практику обязательное
фильтрование растворов непосредственно при их переносе в ампулу.
Удивительно эффективным фнлыром служит небольшая ватная про-
бочка, помещенная в сужение пипетки Пастера. При этом необходимо
предварительно промыть ее небольшим количеством растворителя для
удаления отделившихся волокон. Свежая медицинская вата не содер-
жит растворимых в органических растворителях загрязнений, но этого
совсем нельзя сказать о кусочках ваты, лежащих в лаборатории в тече-
ние месяцев. Поэтому храните вату в герметичных коробочках. Некото-
рые растворы способны реагировать с хлопковой ватой. В этом случае
подойдет стеклянная вата, но она фильтрует не так хорошо. Тонкие
суспензии можно удалить из образца фильтрованием через цеолиты.
Неплохо также дополнить эту процедуру упоминавшимся ранее обезво-
живанием раствора.
Еще ряд проблем, связанных с загрязнением, возникает при работе
с разбавленными водными растворами. Следы пота из отпечатков
пальцев каким-то образом часто попадают в такие образцы. Поэтому
прн приготовлении образцов, содержащих несколько сотен микрограмм
вещества, необходимо надевать перчатки. Признаками загрязнения за
счет отпечатков пальцев в спектрах образца служат появление дублета
при 1,4 м. д. с константой 7 Гц и соответствующего ему квартета прн
4 м. д. (эти сигналы, по-видимому, принадлежат аланнну или молочной
кислоте).
В преддверии обсуждения шиммирования в разд. 3.3.4 заметим, что
оно сильно облегчается для образцов с достаточно высоким столбиком
раствора. Если вы готовите образец добавлением концентрированного
раствора вещества в ампулу с требующимся количеством растворителя,
то его необходимо тщательно перемешать. Причиной удивительного
и необъяснимого ухудшения разрешения может оказаться наличие непе-
ремешавшихся слоев разной концентрации в ампуле диаметром 5 мм.
Образование воронок в таких слоях очень сильно ухудшает разрешение,
особенно в сильных полях.
3.2.6. Ядра, отличные от протонов
Остаточные сигналы растворителя не создают проблем при наблю-
дении гетероядер, т. е. ядер, отличных от протонов. В этом случае
образцы можно готовить в обычных растворителях, добавив лишь такое
количество дейтерированного, чтобы сигнал дейтерия был достаточно
интенсивным для нормальной работы системы лока (см. разд. 3.3.4).
При наблюдении спектров углерода все же лучше использовать
полностью дейтерированные растворители. Это обусловлено тем, что
Основные экспериментальные методы
63
интенсивность углеродных сигналов в их спектрах значительно ниже,
чем в спектрах недейтерированной формы, поскольку для них отсутст-
вует ядерный эффект Оверхаузера (см. гл. 5), а сами линии расщеплены
в мультиплеты за счет спин-спинового взаимодействия с дейтерием.
В особенно трудных ситуациях, когда сигналы растворителя накладыва-
ются на сигналы растворенного вещества, можно использовать спе-
циальные растворители, не содержащие ядер углерода-13.
3.3. Настройка разрешения
3.3.1. Введение
Настроив прибор на предельно высокое разрешение, исследователь
всегда испытывает большое удовлетворение. Но иногда настройка
может причинять и огромные неприятности, особенно если спектрометр
решил заупрямиться, а вы как раз собрались провести самые высокоточ-
ные измерения или за вашей работой начал наблюдать шеф. В разд. 3.3.4
мы расскажем о методах шнммирования магнитов с высокой напряжен-
ностью поля, которые позволяют быстро получать нужный результат.
Ошибочно считать, что от качества настройки разрешения зависит
только ширина линии. От нее также зависит чувствительность. Хорошая
настройка нужна и для проведения экспериментов по разностной и дву-
мерной спектроскопии, где требуется высокая стабильность отношения
поле/частота. Каждый оператор, работающий на спектрометре с высо-
кой напряженностью поля, должен уметь уверенно настраивать разреше-
ние на любом образпе. В первой части этого раздела обсуждаются
методы измерения разрешения, которые особенно важны для тех, кто
покупает новый прибор или занимается обслуживанием спектрометров.
И все же, если вы только осваиваете ЯМР, но уже имеете доступ
к прибору, проверьте, сумеете ли вы получить паспортное разрешение
вашего прибора или превзойти его. Если вам это удалось, то можете
быть уверены, что и для реальных образцов вы сможете получить
хорошие результаты.
3.3.2. Критерии разрешения
Одной из основных характеристик спектрометра служит получаемое
на дайной комбинации магнит/датчик «разрешение». Очень важно пони-
мать, что подразумевается под этим термином и какое большое число
взаимосвязанных факторов его определяет. Чаще всего под разреше-
нием понимается выраженная в герцах ширина некоторой линии ЯМР на
ее полувысоте. Это очень простой, но вполне подходящий критерий,
поскольку нет параметра, более сложного для оптимизации и более
полно характеризующего спектрометр, чем ширина линии. Однако при
этом надо учитывать степень отличия формы реальной линии от
идеальной лоренцевой (или степень отличия сигнала ССИ от экспонен-
64
Глава 3
ты), которая очень важна для правильного определения ширины ли-
нии.
К сожалению, правильность формы лнннн в явном виде не учитыва-
ется в характеристиках спектрометра. Вместо этого ширину линии
измеряют на полувысоте н в двух других специальных точках возле ее
основания (на высоте 0,55 и 0,11% от максимальной амплитуды).
Необходимо очень аккуратно интерпретировать данные таких измере-
ний для правильного суждения о характеристиках спектрометра. Описы-
ваемый далее тест проводится на протонах. Существует набор образцов
и для тестов на других ядрах (в частности, на углероде). На широкопо-
лосных датчиках настройку и измерение разрешения можно проводить
при наблюдении протонов через катушку декаплера*.
Стандартный образец для измерения ширины линии в протонном
спектре представляет собой 10-15%-ный раствор орто-дихлорбензола
(ODCB) в ацетоне. Он обычно поставляется обезгаженным и запаянным
в ампулы разных диаметров. Как н многие другие тестовые образцы,
ODCB был выбран для этой цели много лет назад, когда существовали
только приборы с низкой напряженностью поля н непрерывной разверт-
кой. Он очень прочно укрепился в этой роли, но по нескольким
причинам его все же нельзя считать идеальным для современных
спектрометров с высоким полем.
Спектр ароматических протонов ODCB представляет собой систему
АА ВВ . которая содержи! 24 линии. Каждая из них может использо-
ваться для измерения ширины. Но в сильных полях и сравнительно
концентрированных растворах начинает проявляться эффект радиочас-
тотного затухания, вызывающий уширение линии, поэтому надежные
измерения можно делать только на самых слабых сигналах, находящих-
ся с края мультиплетов. Радиочастотное затухание - это ускорение спада
сигнала свободной индукции за счет индуктивной связи с резонансным
окружением датчика. Оно в меньшей степени оказывается на сигналах
малой интенсивности и может быть ослаблено небольшой преднамерен-
ной расстройкой приемного контура, На приборах с частотой 400 МГц
и выше можно использовать 1%-ные растворы ODCB. На рнс. 3.2
приведены тестовые спектры приборов на 250 и 500 МГп. Еще одно
неудобство представляют собой заметные изменения в спектрах второго
порядка при переходе к более сильным полям. Обычно на 5-мм датчиках
легко получается разрешение 0,1 Гц или немного меньше. Производите-
ли спектрометров в большинстве случаев гарантируют разрешение
0,2 Гц.
Измерения формы линии (т.е. ширины в точках на 0,55 и 0,11%
высоты) производятся для раствора хлороформа СНС13 в дейтероацето-
не. Опять стандартные запаянные образцы оказываются слишком кон-
центрированными для тестирования приборов с высоким полем. К сожа-
лению, здесь нельзя использовать очень разбавленные растворы, по-
* От англ, „decoupler”, что означает «развязьтватель»,-Прим, перев.
Основные экспериментальные методы
65
Рис. 3.2. Тест на разрешение с образцом орто- дихлорбензол а на приборах
с частотой 250 МГц (Л) и 500 МГц (Я); ширина линии в последнем спектре равна
0,06 Гц.
скольку за малое число прохождений требуется получить достаточно
высокое о тношение енгнал/шум,
Производители спектрометров приводят некоторые максимальные
значения ширины линии на двух высотах. Упоминавшиеся ранее высоты
выбраны потому, что они соответствуют полной интенсивности 13С-са-
теллитов линии СНС13 и их одной пятой доле. Однако реальный смысл
этих величин становится ясен только при сравнении со значениями,
вычисленными для идеальной лоренцевой линии той же ширины на
полувысоте. Идеальные величины легко рассчитать по уравнению на
рис. 3.3. Из него получаем, что на 0,55% высоты линия должна быть
в 13,5 раз шире, чем на полувысоте, а на 0,11% высоты в 30 раз. При
Рис. 3.3. Лоренцеву линию можно опи-
сать с помощью ее амплитуды А и ши-
рины на полувысоте W:
AW2 '
У W2 + 4(х0 - х)2
66 Глава 3
ширине линии 0,25 Гц это будет 3,4 Гц иа 0,55% высоты и 7,5 Гц на
0,11% высоты. Обычные паспортные данные составляют 10-15 и
20-30 Гц соответственно, что заметно больше теоретических значений.
Если тест на форму линии выполнен с помощью усреднения несколь-
ких прохождений, то очень интересно сравнить времена релаксации
основной линии хлороформа и ее 13С-сателлитов (объяснение 7} см.
в гл. 4). Сателлиты имеют время релаксации, в 2 раза меньшее, чем
у основной линии (обычно 15 и 30 с), поэтому основная линия случайно
может оказаться насыщенной. В результате интенсивность сателлитов
окажется завышенной. Это приведет к слишком хорошим показателям
формы линии. Поэтому сначала следует проверить интенсивность сател-
литов, которая должна составить 0,55% от интенсивности основной
линии.
На практике часто удается превзойти паспортные величины, и неред-
ко можно видеть линию, более узкую иа высоте 0,55%, чем соответст-
-0,3%
9Гц
-- -*9Гц
| Т I I | I Т I |-I I F I I I I I I ' I I | "Г- | I | I I I | I Г-Г -| I I I р I I | I I И I р | I
120 100 80 60 40 20 О -20 -40 -60 -80 -Ю0 -I2O
ГЦ
Рис. 3.4. Пример теста на форму линии (протонный спектр на 500 МГц). Ширина
линии на полу высоте 0,3 Гц; получены ожидаемые .тля лоренцевой формы
ширины в тестовых точках-4 и 9 Гц. Видны боковые полосы первого порядка
с интенсивностью, вполне допустимой для таких магнитов, и небольшие горбы
справа от основного сигнала, от которых, по-видимому, можно избавиться за
счет настройки А1-град центов высших порядков.
Основные экспериментальные методы
67
вующая лоренцева. Такой ситуации лучше избегать, поскольку эта
форма линии столь же неправильна, как и при слишком большой
ширине на 0,55% высоты. Необходимо сначала измерить ширину
тестируемой линии на полувысоте и по этим данным вычислить нужную
ширину у основания. Конечно, лучше характеризовать форму линии
степенью отклонения ее контура от идеального лоренцева, но пока нет
способов для проведения такой оценки.
Второй параметр, измеряемый при выполнении теста иа форму
линии - интенсивность боковых полос от вращения. Это сателлитные
сигналы, находящиеся по обе стороны от основной липни на расстоя-
ниях, кратных скорости вращения образца (выраженной в герцах). Если
в настройке поля не допущено очень грубых ошибок, то будут видны
только две пары боковых полос, отделенные от основной линии расстоя-
ниями в одну и две скорости вращения. В соответствии с характеристи-
ками прибора интенсивность боковых полос не должна превышать 1%
амплитуды основного сигнала. Их реальная интенсивность сильно зави-
сит от конкретного магнита, и на приборах со средним и низким полем
боковые полосы часто вообще не видны. Природа возникновения
боковых полос будет подробно обсуждаться в дальнейшем. На рис. 3.4
приведен тест на форму линии и боковые полосы, выполненный на 5-мм
датчике прибора на 500 МГц.
3.3.3. Факторы, влияющие на разрешение
Отклонения формы линии от идеальной лоренцевой при небольших
ширинах обусловлены большим числом факторов. Некоторые из них
находятся под контролем оператора спектрометра, и умение обращаться
с ними составляет большое искусство. Ряд других факторов определяет-
ся технологией изготовления блоков спектрометра, они составляют
главную область соперничества различных фирм. Поскольку от качества
формы линии зависит множество других характеристик спектрометра,
прн покупке нового прибора ее следует тестировать с особой тщатель-
ностью.
Все линии ЯМР имеют свою собственную естественную ширину,
определяемую релаксационными процессами. Однако при наблюдении
ядер со спином 1/2 в веществах с низкой молекулярной массой в невяз-
ких растворителях вклад естественной ширины линии в большинстве
случаев пренебрежимо мал. Например, естественная ширина линии ядра
13С может составлять 0,02 Гц и менее, в то время как обычно наблюдае-
мая величина как минимум в 10 раз больше. Таким образом, отклонения
от идеальной формы объясняются разнообразными аппаратурными
дефектами. Существуют три основных источника этих дефектов: посто-
янное магнитное поле, датчик и сам образец.
На спектрометре с частотой 500 МГц можно наблюдать линию
шириной 0,1 Гц. Это значит, что однородность постоянного магнитного
поля в пределах образца поддерживается с точностью до 10-9. Посколь-
5*
68
Глава 3
ку информация о любом спектре собирается в течение некоторого
конечного промежутка времени, поле должно быть постоянным еще и во
времени. Хорошими характеристиками с обеих точек зрения обладают
соленоиды высокопольных сверхпроводящих магнитов, но и в них без
корректировки однородности и стабилизации во времени обойтись
нельзя. Корректировка и стабилизация осуществляются с помощью
градиентных катушек, так называемых шнммов, и системы стабилиза-
ции отношения поле/частота. Хорошее представление об этих системах
составляет непременное условие успешного проведения прецизионных
экспериментов. Мы рассмотрим их далее в этой главе, а системе
стабилизации, кроме того, посвящена и гл. 5.
Датчик неизбежно выполнен из каких-то материалов, и некоторые из
них, в частности катушки, должны быть расположены вплотную к образ-
цу. Если магнитная восприимчивость этих материалов отлична от нуля,
то неизбежно возникают искажения постоянного магнитного поля.
Очень часто именно эти искажения, а не собственная неоднородность
поля являются причиной плохой формы линии и низкого разрешения.
Исправить их с помошью градиентных катушек намного сложнее, чем
собственные неоднородности поля магнита, поскольку искажениям в
местах скачков магнитной восприимчивости соответствуют большие
изменения напряженности поля на коротких расстояниях. В последние
годы интенсивная разработка материалов с низкой магнитной воспри-
имчивостью и подходящими электрическими свойствами позволила
значительно уменьшить такие эффекты н, следовательно, поднять разре-
шение и чувствительность. В результате современные спектрометры
значительно превосходят по своим характеристикам более ранние при-
боры с той же напряженностью поля. Однако вы легко можете усовер-
шенствовать старый прибор простой заменой уже имеющихся датчиков
более новыми. Конечно, можно поменять и некоторые другие элементы
спектрометров, но смена датчиков обычно дает наибольший эффект.
Второй фактор, зависящий от конструкции датчика и влияющий на
форму лнннн-это коэффициент, с которым катушка принимает или
передает радиочастотную энергию в различные части образца. Его
называют однородностью радиочастотного поля Вх (постоянное поле
обозначается Во). Этот параметр чрезвычайно важен для успешного
проведения большинства сложных многоимпульсных экспериментов,
описываемых далее. Он будет часто упоминаться в книге. Методики
измерения однородности поля Вг не рассматриваются в данной книге, но
мы приведем несколько примеров экспериментов, чувствительных к этой
характеристике. К сожалению, однородность поля В{ обычно не входит
в паспортные характеристики датчика.
Сам образец также неизбежно вносит искажения в постоянное маг-
нитное поле. Искажения создаются во всех местах, где изменяется его
магнитная восприимчивость. Это происходит и на торцах столбика
жидкости, и на границах раствор/стекло или раствор/воздух (или раст-
вор/тефлон при использовании подавителя мениска). По этой причине
Основные экспериментальные методы
69
хорошее разрешение можно получить только на образцах со стобликом
жидкости, который заметно больше высоты чувствительной области
датчика. Посмотрите на стандартный тестовый образец: высота стол-
бика его раствора составляет много сантиметров. Но это не значит, что
если вам нужно высокое разрешение, то следует разбавлять образец
обязательно до этого объема. Лучше найти минимально допустимую
высоту столбика, как это описывалось ранее. Однородность поля может
нарушаться и изменениями каких-либо характеристик внутри раствора,
например концентрации, температуры или при наличии взвешенных
частиц. Эти факторы, которые легко устранить, уже обсуждались в пре-
дыдущем разделе. Наиболее неприятны температурные градиенты, по-
скольку они создают конвекционные потоки. Поэтому при выполнении
температурных экспериментов необходимо делать значительную паузу
после каждого изменения температуры образца.
3.3.4. Шиммирование
Введение. Этот курьезный термин пришел из инженерной практики
использования небольших металлических пластинок (называющихся
шиммами, т. е. клинышками) для точной подгонки друг к другу каких-
либо механических частей. В спектроскопии ЯМР шиммами называются
магнитные поля небольшой напряженности, которыми исправляют не-
однородности сильного постоянного поля. При каждой смене образца
в магните необходимо подобрать новые шиммы, и для эффективного
проведения этого процесса потребуется некоторое умение. Трудности
подбора шиммов возрастают (но не обязательно линейно) с увеличением
напряженности поля магнита, резонансной частоты наблюдаемых ядер
и объема катушки приемника. Таким образом, самая трудная ситуация
возникает при наблюдении протонов на частоте 600 МГц (а в будущем
и на более высоких частотах) в датчике большого диаметра. Затрачивае-
мые на настройку разрешения усилия и получаемый результат в огром-
ной степени зависят от сочетания магинта и датчика. Рекомендации,
которые даются в этой книге, больше относятся к сложным случаям,
таким, как настройка спектрометра на 500 МГц или работа с датчиком
очень большого диаметра. Только ваш собственный опыт сможет
подсказать, сколько нужно подстроить градиентов и на какую величину,
чтобы получить заданный результат.
Шиммы. В сверхпроводящих магнитах существует несколько уровней
настройки однородности поля. В основном это зависит от конструкции
соленоида, которая разрабатывается таким образом, чтобы по возмож-
ности оставлять наиболее простые, легко подстраиваемые градиенты.
Существуют два набора градиентных катушек. Сверхпроводящие катуш-
ки, обычно называемые холодными шиммами, настраиваются только
при зацуске магнита и в дальнейшем не используются. Шиммы, находя-
щиеся при комнатной температуре, или теплые шиммы, подстраиваются
70
Глава 3
для каждого образца. Оператор спектрометра обычно настраивает
только теплые шиммы. Чаще всего он работает лить с небольшим
числом имеющихся градиентов.
В магнитах с общепринятым вертикальным расположением зазора
шиммовые катушки выполнены методом печатного монтажа на вставля-
емом в магнит цилиндрическом каркасе (рис. 3.5). Затем внутрь этого
каркаса вставляется датчик так, чтобы его рабочий объем оказался
в центре катушки Z-градиента. Расположение всего набора шиммов
в свою очередь должно быть согласовано с расположением холодных
шиммов, находящихся внутри криостата. Катушки, поле которых ориен-
тировано вдоль вертикальной оси магнита, называются Z-градиентами
(например, Z, Z2, Z3 и т.д.). Катушки, поля которых ориентированы
вдоль двух других перпендикулярных осей, называют X- и Кградиента-
ми различных порядков (или горизонтальными градиентами, или гра-
диентами без вращения, см. ниже). В набор шиммов должна также
входить катушка, позволяющая в некоторых пределах изменять общую
напряженность магнитного поля. Она иногда называется катушкой
Рис. 3.5. Различные наборы теплых шиммов и их компоненты; на двух компонен-
тах справа видны градиентные катушки. (Снимок любезно предоставлен фирмой
Oxford Instruments.)
Основные экспериментальные методы
71
развертки, или Z°-градиентом. Диапазон подстройки поля с ее помощью
обычно не превышает 100-200 м.д.
Если вы знакомы с выпускавшимися ранее спектрометрами с посто-
янными магнитами или электромагнитами, то. вы заметите, что в сверх-
проводящих магнитах используются другие названия шиммов. Это
объясняется тем, что в них направление поля совпадает с вертикальной
осью образца, а не перпендикулярно ей. Два важнейших градиента
Z и Z2 сверхпроводящих магнитов соответствуют У и R2 (последний
иногда называется «кривизной») в случае электромагнитов. Исполь-
зуемые в этом разделе названия шиммов соответствуют стандартам
фирмы Oxford Instruments.
Между градиентами, параллельными оси образца и перпендикуляр-
ными ей, есть существенное различие. Вращение образца с некоторой
скоростью вокруг своей оси позволяет усреднить многие дефекты поля
в плоскости х-у, но не оказывает влияния на вертикальные градиенты.
Поэтому настройка однородности поля по вертикальной оси более
существенна для получения хорошего результата и требует более тща-
тельного подхода. Для настройки сверхпроводящих магнитов использу-
ются теплые Z-градиенты до четвертого порядка (т.е. Z, Z2, Z3 и Z4).
Иногда имеется и градиент Z5, но обычно только в магнитах на
500 МГц или в магнитах с широким зазором. Настройка этих градиен-
тов сильно влияет на ширину и форму получаемой линии. В отличие от
них для подстройки горизонтального поля используются только шцммы
до третьего порядка. Это X и У (первый порядок), XZ, YZ, АУи X1 — У2
(второй порядок) и XZ2 и YZ2 (третий порядок). На магнитах с высокой
напряженностью поля могут также использоваться X3, У3, ZXY, Z(X2 —
— Y2) и др. Горизонтальные градиенты оказывают наиболее сильное
влияние на упоминавшиеся ранее боковые полосы от вращения, но
градиенты высших порядков частично влияют и на форму линии.
Глядя на изобилие регулировок, представленных иа старых прибо-
рах в виде ужасающего количества ручек, можно прийти в отчаяние.
И действительно, начальная настройка магнита после его запуска-очень
трудная задача, которой по возможности лучше избегать. Но, к счастью,
после того как получено приличное разрешение на конкретном датчике
в конкретном магните, переход от образца к образцу не требует
серьезных регулировок. В дальнейшем при изложении методов шнмми-
рования я буду исходить из того, что, если даже у вас пока и нет
необходимости заниматься полной настройкой только что запущенного
магнита, вам могут встретиться другие «сложные» задачи, как, напри-
мер, настройка прибора с очень сильным полем илн наблюдение
спектров прн большом объеме образца. Поэтому я постараюсь не
надоедать вам длинным и скучным изложением. Но в то же время я не
предлагаю вам просто покрутить Z и Z2 и закончить на этом. Превос-
ходное подробное описание процесса шиммирования появилось не-
сколько лет назад в журнале фирмы Nicolet Instruments (сейчас это
фирма GE NMR Instruments), издававшемся для внутреннего пользова-
72
Глава 3
ния, и среди спектроскопистов ходило множество сделанных без разре-
шения копий этой статьи. Сейчас она опубликована, и я привожу здесь
ссылку на нее [1].
В идеальном случае шиммирование могло бы быть очень простым
процессом, поскольку градиенты конструируются таким образом, чтобы
каждый из них не зависел от остальных. Поэтому, казалось бы, настрой-
ку каждого по очереди градиента можно проводить просто по достиже-
нии максимального разрешения. К сожалению, на практике невозможно
полностью реализовать идеальную форму магнитного поля с помощью
реальных катушек. И образец, который в идеале должен быть сферичес-
ким, на самом деле таким не бывает. Кроме того, изменение тока
в катушке любого градиента неизбежно приводит к изменению других,
«примешанных» к нему градиентов. В этом состоит основная сложность
пшммирования: подбирая один градиент, мы тем самым сбиваем
оптимизированные ранее. Если бы каждый градиент содержал в качестве
примесей все другие, то при шиммировании было бы почти невозможно
достичь хоть какого-нибудь прогресса. К счастью, не все так плохо.
В действительности можно определить пары или небольшие группы
градиентов, оказывающих сильное влияние друг на друга. Работа
с взаимодействующими парами градиентов может быть продемонстри-
рована на примере очень часто подстраиваемой пары Z/Z2. Но сначала
мы должны установить, каким способом будем определять, повышается
ли однородность поля при изменении градиента.
Дейтериевая стабилизация (лок*). Наиболее важным критерием одно-
родности поля служит форма лиини. Однако на практике довольно
сложно после каждого изменения градиента получать новый спектр
и проверять форму линии. На современных спектрометрах существуют
два более простых способа определения однородности-по опорному
сигналу дейтерия в канале стабилизации и по спаду свободной индукции.
При решении обычных спектральных задач вполне достаточно первого
метода; определенные преимущества второго мы обсудим позднее.
Дейтериевый лок используется для поддержания постоянной напря-
женности магнитного поля в течение длительных промежутков времени.
Более подробное обсуждение работы этой системы проводится в гл. 5,
где вводится необходимая для этого терминология. Но основная идея
метода очень проста: наблюдается заданный сигнал ЯМР, его частота
сравнивается с некоторой эталонной и затем производится подстройка
поля до совпадения частоты сигнала с эталоном. Такой метод превраща-
ет задачу по поддержанию высокой стабильности магнитного поля
* От английского „lock” - замок, запор. Подразумевается, что система стаби-
лизации как бы «запирает» магнитное поле, не дает ему изменяться. В общем
случае под словом «лок» подразумевается вся система стабилизации поля.
Однако часто, например в выражениях типа «сигнал лока» или «уровень лока»,
имеется в виду сигнал ядер дейтерия, регистрируемый в канале стабилиза-
ции. -Прим, перев.
Основные экспериментальные методы
73
в задачу по поддержанию высокой стабильности частоты. Если у вас
есть наручные кварцевые часы, то вам совершенно ясно, что эту задачу
решить гораздо проще. В качестве наблюдаемого сигнала удобно
использовать сигнал дейтерия ядер дейтерированного растворителя, что
и делается во всех современных спектрометрах. Они обычно оборудова-
ны индикатором уровня д^ка. Для этой цели можно использовать
простой стрелочный индикатор или графический дисплей. Амплитуда
сигнала лока зависит от нескольких факторов и в том числе от
однородности поля. Поэтому ее можно использовать в качестве крите-
рия при шиммировании. Для корректного шиммирования н корректной
работы спектрометра в целом важно правильно выбрать условия регист-
рации сигнала лока.
По существу канал лока представляет собой самостоятельный спект-
рометр, работающий на частоте дейтерия совместно с основным спект-
рометром, работающим на частоте наблюдаемых вами ядер. В таком
случае для оптимальной работы необходимо установить как минимум
три параметра: мощность радиочастотного сигнала, использующегося
для возбуждения резонансной линии дейтерия (мощность передатчика
лока), усиление принимаемого сигнала (амплитуда лока или усиление
лока) и опорную фазу приемника (объяснение этого термина дается
в гл. 5). В описаниях спектрометров разных фирм применяются различ-
ные названия этих параметров. Полезно запомнить наиболее употреби-
тельные английские термины (мощность радиочастотного сигнала-lock
transmitter power; усиление в канале лока-lock gain; фаза приемника
лока-lock reference phase). Из этих трех параметров особенно важно
правильно установить мощность передатчика и фазу приемника. Описы-
ваемая ниже настройка градиентов должна производиться уже при
настроенном канале лока. Методика его настройки зависит от конкрет-
ного спектрометра. Подробное описание настройки канала лока вы
можете найти в руководстве к своему прибору.
На первый взгляд может показаться, что мощность передатчика
и усиление приемника лока выполняют одинаковые функции. Ведь,
изменяя их, мы тем самым заставляем расти или уменьшаться интенсив-
ность сигнала лока. Но между ними есть существенная разница. Измене-
ние усиления приемника не влияет на процессы, происходящие в образце,
и поэтому его можно менять совершенно свободно. Одиако при высоком
усилении в сигнале лока появляется дополнительный шум, в большинст-
ве случаев ие создающий затруднений (но см. гл. 5). Напротив, мощ-
ность передатчика можно увеличивать только до насыщения, т.е. до
возникновения такой ситуации, когда в образец посредством облучения
радиочастотным полем вводится больше энергии, чем он может рас-
сеять с помощью релаксационных процессов (гл. 4). Одним из проявле-
ний насыщения может служить уширение наблюдаемой линии, другим -
непонятные постоянные изменения амплитуды лока. И то и другое
крайне нежелательно в работе канала стабилизации.
С одной стороны, недопустимо работать с сигналом лока в условиях
74
Глава 3
насыщения, а с другой - желательно использовать по возможности
большую мощность передатчика, чтобы получить максимальное отно-
шение сигиал/шум. Значительное насыщение можно определить по
большим случайным изменениям амплитуды сигнала лока, которые
легко заметны. Небольшое насыщение на его первых стадиях можно
обнаружить с помощью следующего эксперимента. Слегка увеличьте
мощность передатчика и посмотрите на сигнал лока. Сначала он будет
расти, но, если насыщение уже достигнуто, через короткий промежуток
времени его амплитуда станет меньше первоначальной. Только в том
случае, если сигнал вырастет иа некоторую величину и после этого не
изменится, можно утверждать, что насыщение отсутствует. Тот же
эксперимент можно проделать и в обратном направлении. Понизим
мощность передатчика и определим, произошло ли понижение амплиту-
ды или после некоторого уменьшения она вновь восстановилась. Таким
путем можно легко подойти вплотную к точке насыщения и затем
установить подходящую амплитуду сигнала лока с помощью усиления
приемника.
Важность установки опорной фазы приемника лока обсуждается
в гл. 5. Обычно фаза подбирается просто по максимуму сигнала. Однако
такая установка ие будет правильной, если форма линии сигнала
дейтерия существенно отличается от лоренцевой. Лучше поступить
следующим образом: после обнаружения сигнала лока подстроить его
фазу, затем подстроить градиенты Z и Z2 и снова вернуться к фазе.
Неправильно установленная фаза может привести к нестабильности
амплитуды сигнала. Такую нестабильность легко спутать с насыщением.
При неправильно установленной фазе могут также отсутствовать замет-
ные изменения амплитуды лока при подстройке шиммов. Понять
причину такой нечувствительности может только оператор, достаточно
освоившийся со спектрометром. Совершенно неправильная фаза сделает
стабилизацию поля вообще невозможной. Методика предварительной
настройки фазы до обнаружения сигнала лока зависит от конкретного
спектрометра, поэтому следует внимательно изучить руководство к ва-
шему прибору.
Настройка разрешения. Правильно настроенная система лока позво-
ляет получать информацию об однородности магнитного поля, необхо-
димую при настройке разрешения. Амплитуда сигнала лока зависит
в первом приближении от однородности магнитного поля, поэтому цель
настройки шиммов состоит в достижении ее максимума. Существование
связей между определенными наборами шиммирующих катушек не
позволяет разработать определенную схему этого процесса. Искусство
шиммирования основано на знании того, какие именно катушки связаны
друг с другом и как справиться с этим взаимным влиянием. Очень важно
также чувствовать, насколько нужно изменить градиент для получения
определенного эффекта и с какой скоростью его можно менять, чтобы не
произошел сбой условий стабилизации. Здесь каждый конкретный спект-
Основные экспериментальные методы
75
рометр имеет свои особенности, поэтому для надежной настройки
целесообразно сначала научиться «чувствовать» новый магнит. Попрак-
тикуйтесь в настройке пары Z/Z2, что в реальной работе приходится
делать постоянно. Очень часто процедура шиммировання на этом
и заканчивается. Но все же не думайте, что это так просто.
Прн настройке пар градиентов мы будем следовать такому важному
правилу: не заканчивать регулировку на шимме более высокого порядка
(например, Z2). Лучше еще раз подстроить градиент более низкого
порядка (Z) и только потом судить об обшем эффекте-произошло
улучшение или нет. Приводимая ниже процедура может быть использо-
вана для настройки Z и Z2.
Подвигайте Z-градиент в ту и другую сторону; уровень сигнала лока
должен подниматься и опускаться. Выберите величину Z, при которой
уровень максимален, и запомните ее. Это удобно сделать, если вы
можете, подбирая усиление приемника, установить уровень на какую-
либо отметку по делениям стрелочного измерителя или сетке графичес-
кого дисплея. Теперь измените Z2 до появления смещения уровня
сигнала, не обращая внимания на то, в какую сторону он изменился.
Иными словами, не беспокойтесь, если он упадет или поднимется; пусть
он поменяется хоть как-нибудь. После того как произошло заметное
изменение в ту или другую сторону, подберите Z по максимальному
сигналу. Сравнивая полученный уровень с установленным ранее, вы
сможете определить, лучше или хуже стала новая комбинация шиммов.
Если лучше, продолжайте смещать Z2 в ту же сторону, каждый раз
заново подстраивая Z, до тех пор, пока наблюдается повышение уровня
сигнала лока. Если хуже, изменяйте Z2 в обратном направлении. Для
начинающих спектроскопистов трудно запомнить, в каком направлении
менялся Z2, но, работая на приборе, вы скоро научитесь делать это не
задумываясь. Эта процедура несколько отличается от описанной в рабо-
те [1], где различаются два типа взаимодействия шиммов, но мой опыт
показывает, что она вполне отражает сущность шиммировання, без
ввода чрезмерных усложнений.
Во многих случаях такая последовательность операций кажется
слишком сложной, поскольку прямая настройка каждого градиента по
максимуму сигнала часто дает удовлетворительный результат. Причина
этого заключается в том, что если настройка шиммов близка к опти-
мальной, то установка градиентов низших порядков по максимуму
сигнала позволяет сразу получить их правильное положение. Такая
ситуация может возникать довольно часто, если вы правильно обращае-
тесь со своим прибором и используете рекомендуемый объем образца.
Но не думайте, что по этой причине можно не изучать полных методик
шиммировання; неизбежно придет время, когда оии вам понадобятся.
Например, вам нужно будет добиться хорошего разрешения иа образце
с низким столбиком вещества, а именно высота столбика оказывает
наибольшее влияние на величины градиентов.
Или вы можете оказаться счастливчиком, имеющим доступ к прибо-
76
Глава 3
ру с очень сильным полем. По причинам, связанным с переходом от
односоленондиых к двухсоленоидным конструкциям, усложнение проце-
дуры шиммирования при переходе от прибора на 400 МГц к прибору на
500 МГц оказывается непропорционально большим. На приборах с час-
тотой 500 МГц и выше для получения приемлемого разрешения прихо-
дится настраивать все четыре Z-градиента на каждом образце. Но в то
же время разрешение, которое мы считаем «приемлемым», обычно тем
больше, чем выше стоимость прибора. Поэтому на сильнопольных
спектрометрах в любом случае стоит затратить побольше усилий, чтобы
извлечь максимум результата. Но здесь шиммы третьего и более
высоких порядков уже не настрнваются непосредственно по максимуму
сигнала лока, поэтому неизбежно приходится пользоваться описанной
процедурой.
При выполнении обычных спектральных работ бывает полезно
подстроить и другие iрадиенты-Z3, Z4 и горизонтальные градиенты
низких порядков-X, Y, XZ, YZ и X2 — Y2. Однако их настройка
требуется достаточно редко, обычно только на упоминавшихся выше
сильнопольных спектрометрах. Она также бывает нужна при некоторых
нетрадиционных экспериментах, например при наблюдении протонного
спектра с помощью катушкн спиновой развязки гетероядерного датчика.
Чтобы судить о необходимости такой настройки, полезно иметь пред-
Рис, 3.6. Некоторые дефекты формы линии.
(боковые полосы
i-го поряЭка)
Основные экспериментальные методы
77
ставлеиие о том, какого рода искажения в форме линии вызывают
ошибки в том или ином градиенте. На рис. 3.6 приводятся примеры
линий при неправильно настроенных шиммах, полученные на протон-
ном 5-мм датчике прибора на 500 МГц. Учтите, что на практике линия
может одновременно содержать все эти искажения в различных соотно-
шениях, что может сделать форму линии совсем непонятной.
Все Z-градиенты оказывают влияние иа ширину линии, причем чем
выше порядок градиента, тем в более низкой части линии проявляются
искажения. Градиенты нечетных порядков (Z, Z3, Z5) вызывают симмет-
ричное уширение, а четных порядков (Z2, Z4) - несимметричное (рис. 3.6,
б, г и <)). Обычно чем выше порядок градиента, тем большие изменения
требуются в нем; на уровне поворота ручки это определяется конструк-
цией спектрометра. Для получения заметных искажений линии, приве-
денных на рис. 3.6, использовались довольно большие смещения шим-
мов от правильного положения, При слабых отклонениях от правильных
значений или в случае спектрометра с более слабым полем вместо
отчетливых горбов на линии наблюдалось бы только ее уширение.
Теоретически Z-градиенты четных порядков в основном содержат
в виде примесей также четные градиенты, а нечетные-в свою очередь
примеси нечетных порядков. Таким образом, самое сильное взаимодей-
ствие будет только между Z и Z3, Z2 и Z4. Но на практике иа это лучше
не полагаться и после каждого изменения какого-либо градиента под-
страивать все остальные шиммы более низких порядков. Следствием
наличия примесей четпых порядков в четных градиентах оказывается
влияние Z2 и Z4 на Z0 (т.е. на напряженность поля), поэтому при
слишком быстром их изменении может произойти сбой условий стаби-
лизации. Это и есть те упоминавшиеся ранее градиенты, для которых на
практике требуется определить максимально допустимую скорость из-
менения.
От горизонтальных шиммов низких порядков зависят интенсивность
н форма боковых линий от вращения. Ошибки в X- и У-градиентах
нечетных порядков (т, е. X, X XZ н УХ) приводят в основном к появле-
нию боковых линий первого порядка, а ошибки в X- и У-градиен-
тах четных порядков (XX X2 — У2)-к линиям второго порядка
(рис. 3.6,в и е). Поскольку неоднородности поля, устраняемые с по-
мощью этих градиентов, усредняются прн вращении, их следует на-
страивать без вращения', отсюда и произошел термин «шиммы без
вращения».
Каждый из перечисленных выше градиентов второго порядка следует
считать взаимодействующим и с X, и с У одновременно, поэтому три
этих градиента нужно настраивать совместно. Кроме того, после любо-
го изменения горизонтального шимма, содержащего Z (XZ, УХ), необ-
ходимо подстраивать Z-градиент. Неплохо также подстраивать Z сразу
после выключения вращения, поскольку при этом слегка изменяется
высота столбика жидкости в образце относительно датчика.
Для сведения сложностей настройки шиммов к разумному уров-
78
Глава 3
ню некоторые их взаимодействия следует считать преобладающими
(табл. 3.2) и соответствующие группы шиммов настраивать отдельно.
Не входящие в эти группы градиенты низких порядков требуют под-
стройки только после значительных изменений в шиммах высоких
порядков или при заключительной тонкой регулировке. Боковые полосы
от вращения могут возникать не только из-за расстройки градиентов, но
и от искажений в форме ампулы, образования воронки в ампуле
большого диаметра, наличия в образце твердых частиц, загрязнений или
царапин на турбинке; поэтому, прежде чем тратить время на настройку
шиммов без вращения, проверьте, отсутствуют ли перечисленные выше
причины.
Таблица 3.2. Основные |руппы взаимно влияющих друг на
друга шиммов. Изменение каждого шимма из первого
столбца оказывает сильное влияние на шиммы второго
столбца. Значительные изменения первых градиентов
могут также создать необходимость подстройки градиен-
тов третьего столбца
Настраиваемый
градиент
Основные
взаимодействия
Прочие
взаим оде йствия
Z
Z2
Z3
Z4
Z5
У
А’
X
У
X, Y
XY
XZ
YZ
XY
X2- У2
X
У
XZ
XY
XZ2
yz2
ZXY
Z(X2 - У2)
X3
У3
Z2
Z, Z2
Z2, Z4
Z
Z
Z
Z
X, У
X, Z
у, Z
X, Y 7.
X7Y,Z
У
Градиенты высоких порядков (Z5 и шиммы без вращения третьего
порядка) имеют заметно меныпсе влияние на однородность поля, чем
остальные градиенты. XZ2 и YZ2 часто вызывают похожее на Z3
симметричное уширение линии, но в еще более низкой ее части. Кроме
того, в сочетании с Z3 и Z4 они позволяют переходить от линии с узким
основанием н большими боковыми полосами к широкой линии без
боковых полос и наоборот. В этом случае приходится затрачивать
большие усилия для поиска подходящего компромисса методом проб
н ошибок, что требует слишком большого времени при проведении
рутинных измерений. Расстройка остальных шиммов без вращения
Основные экспериментальные методы
79
может вызывать появление небольших (0,1 % по интенсивности) горбов,
находящихся очень далеко от основной лднии (до сотен герц). Эти
дефекты не выявляются при обычном тесте на форму линии, но иногда
очень мешают проведению измерений. Обнаружив их появление, вам
надо сообщить об этом специалистам н предоставить им устранение
этих дефектов.
Настройка шиммов но ССИ. Хотя амплитуда лока довольно хорошо
отражает однородность поля и вполне достаточна для настройки прибо-
ра при измерении рутинных спектров, иногда она может вводить
оператора в заблуждение. Причина этого станет понятна, если задумать-
ся, каким образом высота сигнала дейтерия связана с происходящими
в магнитном поле изменениями. Сигнал лока-это просто синглетная
линия дейтериевого спектра, принадлежащая обычно растворителю.
Однородность магнитного поля не оказывает влияния на площадь под
этой линией, но влияет на ее форму. Таким образом, при сужении линии,
чтобы сохранить постоянной площадь, должна увеличиваться ее высота,
которая как раз и отражает уровень лока. Теперь мы без труда можем
вообразить такую ситуацию, когда линия становится выше, но при этом
не приближается к идеальной лоренцевой форме. Например, так может
произойти при сужении верхней части линии с сохранением широкого
основания. Можно сказать, что амплитуда лока отражает в основном
изменения ширины линии (в том числе и упомянутого типа), а для более
строгой оценки формы линии требуются иные критерии.
Многие спектрометры обладают возможностью вывода на дисплей
сигнала спада свободной индукции (ССИ) в масштабе реального време-
ни после выполнения каждого прохождения. Эта возможность очень
полезна при шиммировании. ССИ обладает двумя информативными
характеристиками-протяженностью и формой. Протяженность ССИ
дает информацию о действительной ширине линии, как н амплитуда
сигнала стабилизации. Информация о форме линии содержится в огиба-
ющей ССИ (экспоненциальная она или нет). Конечно, такая оценка
весьма субъективна, но с накоплением опыта она становится более
надежной, чем оценка по амплитуде сигнала стабилизации. На рис. 3.7
показаны формы ССИ до и после настройки шиммов.
ССИ в форме простой затухающей экспоненты наблюдается только
на образцах, где доминирует одна мощная синглетная линия (в нашем
случае линия хлороформа в тестовом образце). У реальных образцов
ССИ имеет огибающую более сложной модулированной формы. На-
стройка однородности поля по ССИ требует несколько иного стиля
работы с градиентами, поскольку информация о происшедших измене-
ниях становится доступна только после завершения прохождения. Лучше
всего иметь возможность одновременно наблюдать ССИ и уровень
лока, чтобы одновременно получать и более быструю и более медлен-
ную, но точную информацию. Удивительно, что эта простая и полезная
возможность не всегда предусмотрена даже на современных спектро-
метрах.
80
Глава 3
Рис. 3.7. Правильная (Л) и неправильная (£) формы ССИ, наблюдаемые при
шиммиро вании.
Настройка разрешения без лока. Иногда появляется необходимость
регистрации спектров без лока. Например, это бывает прн наблюдении
спектров самого дейтерия или прн невозможности использовать дейте-
рированный растворитель. Вместо сигнала дейтерия в канале лока
можно использовать сигнал другого ядра, главным образом фтора, но
на сверхпроводящих магнитах вполне можно настроить разрешение
и без лока. Но в этом случае вам придется затратить побольше времени
(до нескольких часов). При этом настройку нужно будет производить
по ССИ.
Еще одну сложность создают «примеси» напряженности поля (гради-
ент Z0) в градиентах Z2 и Z4 . В отсутствие стабилизации изменения
напряженности поля при подстройке градиентов не корректируются
автоматически. Проявлением этого служат причудливые изменения
формы ССИ, особенно если градиенты были смешены в течение одного
прохождения. На них просто не следует обращать снимания. Важнее
другое: поле может сдвинуться настолько сильно, что выбранное вами
«спектральное окно» переместится совсем в другое место, поэтому,
прежде чем запустить продолжительное накопление и уйти на обед,
проверьте, виден ли интересующий вас участок спектра.
3.4. Достижение максимальной чувствительности
3.4.1. Введение
Название «Достижение максимальной чувствительности» вполне
можно отнести к большей части этой книги, поскольку проблема
чувствительности была и остается одной из самых важных в спектроско-
пии ЯМР. В этом разделе будет рассмотрена в основном аппаратурная
сторона вопроса о чувствительности, т.е. проблема правильного подбо-
ра компонентов спектрометра и нх настройки. Выбор параметров
эксперимента, таких, как длительность импульса и задержки, которые
также очень важны, будет обсуждаться в гл. 7. Существенное влияние на
чувствительность оказывает форма линии, поскольку площадь сигнала
Основные экспериментальные методы
81
ЯМР, пропорциональная его мощности, постоянна. Таким образом
уширение пика приводит к снижению его высоты. Поэтому все сказанное
ранее о настройке разрешения очень важно для получения максимальной
чувствительности.
3.4.2. Критерии чувствительности
Чувствительность спектрометров ЯМР-одна из важнейших облас-
тей конкуренции фирм-производителей приборов. Казалось бы, именно
поэтому должны были появиться стандартные методики для ее опреде-
ления. К сожалению, этого не произошло. Вместо стандартных методик
мы вынуждены использовать запутанный список тестовых данных, на
основании которых большинство фирм-производителей приходит к вы-
воду о высокой чувствительности своих приборов. В последние годы,
когда практически все фирмы добились на этом пути реального про-
гресса, такие претензии стали особенно энергичными. И все же на
практике можно вполне честно сравнить два спектрометра, если иметь
ясное представление о проводимых измерениях.
В этом разделе будет дан обзор проблемы чувствительности с точки
зрения пользователя прибора, для которого важна совокупность всех его
характеристик. Именно на это и рассчитаны приводимые здесь тесты.
В последнее время производители спектрометров навязывают пользова-
телям такие тесты, которые позволяют исключить дополнительные
факторы, влияющие на тестируемый параметр, Например, в тесте ASTM
(смесь 60% дейтеробензола и 40% диоксана) для определения чувстви-
тельности на ядрах углерода эффективность развязки от протонов
и в некоторой степени качество настройки градиентов не влияют на
измерения. Это очень удобно в том случае, если вы-производитель
спектрометра и хотите измерить его собственную аппаратурную чув-
ствительность. Но химиков значительно больше интересует чувстви-
тельность прибора в реальных экспериментах, где перечисленные выше
факторы весьма важны. Вопрос формулируется ими, например, так:
можно ли зарегистрировать углеродный спектр 2 мг вещества.
Прежде всего надо ясно понимать, что измеряемая величина чувстви-
тельности или отношение сигнал/шум-зла статистический параметр.
Мы сравниваем интенсивность пика, полученного в стандартных услови-
ях, с уровнем шума, представляющего собой случайную величину.
Нельзя интерпретировать статистические данные, проделав несколько
измерений и выбрав из них лучшее; вместо этого следует вычислить
среднюю величину. Неправильная интерпретация данных часто служит
источником появления подозрительных величин чувствительности. Но,
как мы увидим далее, существуют и более тонкие способы подтасовки
данных. Одним из важнейших источников путаницы оказывается нали-
чие двух понятий чувствительности: чувствительность при постоянной
концентрации образца, измеряемая в большинстве тестов, и чувстви-
тельность при постоянном количестве образца, наиболее интересная для
6-75
82
Глава 3
химиков. Прежде чем начать с ними разбираться, мы обсудим практи-
ческие вопросы измерения отношения сигнал/шум.
Как уже говорилось, для измерения отношения сигнал/шум надо
зарегистрировать в определенных условиях спектр стандартного образ-
ца и вычислить отношение высоты некоторого сигнала к уровню шума.
Но что же такое уровень шума? Если в шуме положительные и отрица-
тельные значения встречаются одинаково часто (предполагается гауссо-
во распределение вокруг нуля), то его амплитуда, усредненная по
достаточно большому числу точек, будет нулевой. Поэтому интерес
представляет среднеквадратичная амплитуда шума, или, что то же
самое, стандартное отклонение амплитуды от нуля. Его можно полу-
чить, усреднив квадраты интенсивностей множества шумовых точек
и взяв из них квадратный корень. Далее полученную величину нужно
умножить иа 2, поскольку шумовые точки находятся по обе стороны от
нуля; поэтому при использовании вычисленной среднеквадратичной
величины всегда проверяйте, было ли проведено это умножение.
К сожалению, из-за необходимости привлечения компьютера такой
расчет выполняется довольно редко. Это еще один случай, где мы
находимся в плену исторического прецедента, поскольку все современ-
ные спектрометры оборудованы компьютерами, способными легко про-
делать необходимые вычисления, а процедуры определения чувствтель-
ности остаются неизменными со времен стационарных спектрометров.
Вместо этого среднеквадратичная величина получается умножением
пиковой интенсивности шума на некоторый преобразующий фактор. Это
сразу вносит дополнительную неопределенность, так как при действи-
тельно случайной природе шума понятие пиковой интенсивности вообще
не имеет смысла: просмотрев дополнительный участок шума, всегда
можно найти еще более интенсивный шумовой пик. На практике для
получения разумных и сравнительно точных величин очень важно
выработать некоторый осмысленный подход.
Для правильного измерения разности интенсивностей самой положи-
тельной и самой отрицательной шумовых точек необходимо иметь
хорошее представление шума, т.е. использовать достаточно большое
количество точек (достаточно широкий участок спектра, не содержащий
сигналов). Здесь возникает непреодолимое стремление к занижению
оценки шума, особенно если вы потратили несколько часов на настройку
прибора специально для этого теста. Точки с максимальными амплиту-
дами будут встречаться довольно редко, и между ними и тем, что
кажется основной частью шума, образуется большой пробел (рис. 3.8).
Нужно быть твердым как сталь, чтобы не назвать эти пики случайными,
не относящимися к шуму выбросами. Настоящие аппаратурные выбро-
сы можно легко опознать и исключить из рассмотрения. Для этого
нужно повторить эксперимент несколько раз и посмотреть, окажется ли
подозрительный пик случайным (шумовым), или ои обязательно при-
сутствует в каждом спектре.
Измерение шума производится обычно по вычерченному на бумаге
Основные экспериментальные методы
83
Рис. 3.8. Правильное измерение пиковой интенсивности шума нужно действи-
тельно проводить по максимальным пикам.
спектру с помощью линейки. Проследите за тем, чтобы ие внести на
этом этапе дополнительных ошибок. Специфической особенностью
плоттеров служит то, что чем быстрее они чертят спектр, тем в большей
степени срезают углы; поэтому, если есть возможность изменения
скорости, следует выбрать минимальную. Иногда для точных измерений
бывает необходимо отдельно вычертить дополнительно усиленный учас-
ток шума. Не имеет смысла вычислять отношение 20-см сигнала к шуму
высотой в несколько миллиметров. Усильте его настолько, чтобы он
тоже стал высотой в несколько сантиметров. Необходимость такой
процедуры кажется вполне очевидной, однако ее очень часто опускают.
Коэффициент для перевода пиковой интенсивности шума в средне-
квадратичную равен 2,5. Он получается из выбора такой области
в гауссовом распределении, чтобы вероятность встречи шумовой точки
за ее пределами была «пренебрежимо малой». Если стандартное откло-
нение гауссова распределения равно о, то в область +2,5 ст вокруг нуля
попадают 99% шумовых точек. Таким образом, отношение сигнал/шум
определяется по формуле
2,5-Л
-----
где Л-интенсивность сигнала, а N^-пнковая интенсивность шума.
Можно сравнить использованный в этом выражения коэффициент 2,5
с упоминавшимся ранее коэффициентом 2 для вычисления более адек-
ватного отношения сигнала к среднеквадратичному шуму. Если для
определения пикового шума взят достаточно большой его участок
(допустим, несколько тысяч точек), то коэффициент перехода к средне-
квадратичной величине может оказаться немного больше, однако на
практике во всех случаях используется 2,5, Различия в отношениях
сигиал/шум, меньшие 10%, можно просто игнорировать, поскольку
такая точность уже не нужна.
(ЗЛ)
6*
84
Глава 3
Теперь обсудим те стандартные условия, в которых должен регистри-
роваться спектр тестового образца. С тем, что проводить обсуждавшие-
ся ранее процедуры действительно необходимо, согласятся, по-видимо-
му, все спектроскописты, даже те, кто иа практике их и не делает. Что же
касается стандартных условий, то здесь вообще нет никаких обязатель-
ных элементов, не считая того, что это должно быть одно прохождение
с импульсом длительностью тг/2 (см. гл. 4). В результате остаются
произвольными такие параметры, как ширина спектрального диапазона,
полоса фильтра и взвешивающая функция для обработки спектра.
Поэтому единственное, что можно сделать для сравнения чувствитель-
ности спектрометров при их покупке, это настаивать на проведении
тестов с совершенно одинаковыми,параметрами и в вашем присутствии.
Если же мы хотим проверить чувствительность прибора на протонах
примерно в тех условиях, в каких он будет использоваться, то можно
взять следующие параметры: спектральный диапазон 10 м. д., время
выборки 2-3 с, полосу фильтра, чуть большую ширины развертки,
и умножение на подходящую экспоненциальную функцию перед преоб-
разованием Фурье, Стандартный образец для протонного теста-
0,1 %-ный раствор этилбензола в дейтерохлороформе. Измерения произ-
водятся по центральному пику квартета этильных протонов (рис. 3.9).
Эти линии несколько шире обычных, поскольку на них проявляется
связывание с ароматическими протонами, еще недостаточное для полно-
го расщепления. Оптимальным в этом случае будет экспоненциальное
взвешивание с уширением линии иа 1-1,5 Гц.
Выбор условий регистрации углеродного спектра для теста па чувст-
вительность менее однозначен. В рутинной спектроскопии 13С использу-
ется низкое цифровое разрешение (2-3 Гц на точку). Надежное измере-
ние интенсивности пиков при таком цифровом разрешении возможно
только с использованием значительного уширения линии, а соответст-
Рис. 3.9. Тест на чувствительность в протонном спектре по образцу этилбензола.
Высота центрального пика квартета при 2,7 м. д. сравнивается с интенсивностью
участка шума. Отношение сигнал/шум равно 270:1.
Основные экспериментальные методы
85
вуюший ему фильтр далек от оптимального и может маскировать
зависимость чувствительности от разрешения или эффективности раз-
вязки. Особенно важен последний аспект, поскольку изменения условий
развязки от протонов оказывают существенное влияние на ширину
линии. Один из используемых для этой цели образцов (ASTM) специаль-
но предназначен для исключения влияния развязки, а большая естествен-
ная ширина линии дейтеробензола снижает зависимость чувствитель-
ности от формы линии. Это позволяет определить чувствительность
датчика и предусилителя отдельно от остальных компонентов спектро-
метра. Однако с точки зрения химиков более информативным будет тест
иа общую чувствительность. Его проводят на старомодном 10%-иом
растворе этилбензола в хлороформе. Измеряется интенсивность самого
высоко! о ароматического сигнала с развязкой от протонов.
Регистрировать следует полный спектральный диапазон (скажем,
200 м. д.), но с достаточно большим временем выборки (порядка 2-3 с),
чтобы после оптимальной фильтрации получить удовлетворительно
оцифрованный спектр. На современных спектрометрах с большой па-
мятью это вполне реально. При использовании широкополосной развяз-
ки получаемая ширина линии во многом зависит от режима декаплера
(методики обсуждаются в гл. 7). Лучший результат почти всегда удается
получить с селективной развязкой от ароматических протонов, но этот
метод проведения теста не совсем правильный.
Для тестов на чувствительность на других ядрах используются:
1%-ный раствор тримегилфосфита в дейтсробензоле для 31Р (без развяз-
ки от протонов); 90%-ный раствор диметилформамида в дейтеро диме-
тилсульфоксиде для 15N (может применяться с развязкой и без развяз-
ки); 0,1%-ный раствор трифторэтанола в дейтероацетоне для 19F;
водопроводная вода для 2Н и 17О (без лока). Если вы интересуетесь еще
более необычными ядрами, то придумайте свой собственный тестовый
образец и предложите его производителям спектрометров.
Теперь набор тщательно измеренных отношений сигиал/шум нами
уже получен, и остается только правильно его интерпретировать. За-
метьте, что во всех упоминавшихся ранее образцах оговаривалась
концентрация раствора, а не общее количество вещества. Поэтому при
выполнении теста с ампулой диаметром 10 мм мы получим существенно
более высокую чувствительность, чем в ампуле диаметром 5 мм. Но
означает ли это, что 10-мм датчик более чувствительный? Конечно, нет.
Просто мы использовали большее количество вещества. В действитель-
ности 10-мм датчик скорее всего менее чувствителен (см. далее).
Зависимость чувствительности от диаметра ампулы вполне очевидна,
но существует еще одно измерение активного объема дачика-высота,
о которой часто забывают. Усовершенствованные в последние годы
конструкции магнитов сделали возможным использование более высо-
ких катушек; это позволило повысить паспортную чувствительность
спектрометров, получаемую на стандартных тестовых образцах. Но
увеличение высоты катушки может и не повысить чувствительность,
36
Глава 3
отнесенную к обшему количеству вещества в образце (в этом случае
применение высоких катушек скорее приносит вред).
Наибольший интерес представляет величина отношения сигиал/шум,
отнесенная к одному молю вещества в образце. Для ее расчета необходи-
мо узнать объем активной области датчика, вычислить содержащееся
в нем количество вещества, например этилбензола, и поделить на него
полученное отношение сигиал/шум. Под объемом активной области
датчика подразумевается внутренняя площадь сечения ампулы, умно-
женная на ту минимальную высоту стоблика раствора, которая позволя-
ет работать с образцом без искажения формы линии. Площадь сечения
можно узнать из параметров ампулы: обычно 5-мм ампулы имеют
внутренний диаметр 4,2 мм, а 10-мм ампулы-9 мм. Минимальную
высоту стоблика определить гораздо труднее. Если вы не доверяете
сведениям производителей спектрометра, то измерьте сами высоту
приемной катушки датчика. Минимальный размер столбика должен
быть заметно больше высоты катушки, но известно, что он ей пропор-
ционален. Это позволяет более или менее объективно сравнить чувстви-
тельность двух спектрометров с разными высотами катушек.
И наконец, есть еще одна тонкость, на которую часто не обращают
внимания. Все тестовые образцы представляют собой растворы кова-
лентных молекул в органических растворителях невысоких концентра-
ций. Датчики, оптимизированные для работы с такими образцами,
могут оказаться совсем неприспособленными для измерений 0,5 М
водных растворов неорганических солей, а подобный состав могут иметь
многие интересные образцы. Если вы собираетесь в дальнейшем с ними
работать, то имеет смысл разработать собственный тестовый образец,
моделирующий реальные растворы, и тестировать спектрометры с его
помощью.
3.4.3. Факторы, влияющие на чувствительность
Датчик. Самый важный компонент любого спектрометра ЯМР-это
его датчик, т. е. некоторое устройство, в функции которого входит
регистрация слабых сигналов ЯМР при минимальном уровне привноси-
мого шума. Уровень шума в значительной степени зависит и от первой
ступени приемника (предусилителя). Но конструкции современных пред-
усилителей весьма совершенны, поскольку они очень давно используют-
ся в радиолокационных приборах. Разница между предусилителями,
выпускаемыми разными фирмами, не может быть существенной, по-
скольку их конструкции взяты из одних и тех же литературных источни-
ков. Датчик же, напротив, используется только в спектроскопии ЯМР.
К его конструкции предъявляется необычное требование: ои не должен
вносить сильных искажений в напряженность магнитного поля возле
образца. Соревнование фирм-производителей в области совершенство-
вания конструкции датчиков составляет существенную часть прогресса
в спектроскопии ЯМР. Естественно, покупатель спектрометра может
Основные экспериментальные методы
87
приобрести датчики только той фирмы, которая произвела и сам
прибор, но их выбор обычно довольно широк. Далее мы рассмотрим
ряд факторов, которые следует учитывать при выборе датчика для
вашего эксперимента.
Прежде всего надо решить, какого он должен быть размера. Размер
выражается диаметром ампулы, которую можно вставить в датчик.
Обычно это 5, 10 и 15 мм. В последние годы с развитием медицинских
и биологических применений ЯМР некоторые фирмы для спектрометров
высокого разрешения стали выпускать датчики очень большого диамет-
ра, в которые можно поместить, нанример, крысу, но все наши предыду-
щие обсуждения к ним не относятся. Часто химики совершенно непра-
вильно подходят к выбору диаметра датчика, и это имеет свои истори-
ческие причины. Традиционно спектры малочувствительных ядер, таких,
как 13С, регистрировались с помощью датчиков большого диаметра. Но
нельзя делать выбор на основании только того, что для слабых сигналов
лучше использовать большой диаметр датчика. Давайте сначала разбе-
ремся, почему так происходит.
Смысл использования датчика большого диаметра для регистрации
малочувствительных ядер состоит в том, что вы помещаете в активную
область датчика максимальное количество вещества. Это полезно толь-
ко в том случае, когда концентрация образца ограничивается только его
растворимостью. Такая ситуация возникает очень редко, поскольку
насыщенные растворы большинства ковалентных соединений можно
считать весьма концентрированными с точки зрения регистрации спект-
ров обычных ядер (1Н, 13С и 31Р) на современных приборах средней
и высокой напряженности поля. Конечно, часто бывает полезно исполь-
зовать и датчики большого диаметра, например, при низкой раствори-
мости вещества или при наблюдении совсем редких ядер.
Если же ограничивающим фактором служит не растворимость ве-
щества, а его общее количество, то ситуация становится противо-
положной. В этом случае нужно использовать датчик минимально
возможного размера, поскольку он обладает более высокой собственной
чувствительностью. Причины этого в основном имеют аппаратурный
характер; вы можете прочитать о них в работах [2, 3]. Помимо
чувствительности на датчиках малого диаметра намного меньше проб-
лем с формой линии, боковыми полосами от вращения и широко-
полосной развязкой от протонов. Если вам предстоит работать в основ-
ном с образцами несинтетического происхождения, например в биологи-
ческих приложениях или при анализе природных веществ, то имеет
смысл укомплектовать ваш прибор преимущественно датчиками малого
диаметра. Если же вы занимаетесь синтезом, то вам будет полезно
иметь и датчик большого диаметра, что во многих случаях позволит
существенно экономить время.
Второй аспект выбора конфигурации прибора заключается в наличии
как широкополосных, так и селективно-настроенных датчиков. Широко-
полосные выглядят очень соблазнительно, поскольку кажется, что вы
88
Глава 3
приобретаете сразу несколько датчиков, заплатив при этом всего за один
(или, скорее, за два', они могут весьма дорого стоить). В значительной
степени так оио и есть, но, конечно, кое-что (а именно чувствительность)
приходится приносить в жертву. Однако не следует путать действитель-
но широкополосный и просто настраиваемый датчики. К последнему
типу относится, например, протонный датчик, который можно пере-
строить на ближайшие частоты фтора (чуть ниже) и трития (чуть выше).
В таких настраиваемых датчиках ие происходит потери чувствитель-
ности. Широкополосные же датчики настраиваются в очень широком
диапазоне, где, скажем, минимальная частота в 10 раз ниже максималь-
ной. В них следует ожидать в 2 раза меньшей чувствительности на
оптимальной частоте (обычно i3C) и еще меньшей на других частотах.
Перед тем как отдать предпочтение одному широкополосному или
двум селективным датчикам, надо тщательно обдумать, что вы хотите
получить от наблюдения гетероядер. Для того чтобы скомпенсировать
потерю чувствительности на обычных ядрах, вы должны быть уверены
в информативности измерений на более редких. Если же вы не уверены,
что вообще будете на них работать, то зачем вам широкополосный
датчик? Всегда есть возможность договориться с коллегами или пред-
ставителями фирмы и получить доступ к прибору с другой комплекта-
цией для регистрации спектра иа необычном ядре. Кроме того, если вы
собираетесь часто работать с 15N или I09Ag, не лучше ли иметь
оптимизированный именно для них датчик вместо широкополосного,
далеко пе оптимального на их частотах? Вообще довольно трудно
придумать такую ситуацию, когда бы выбор широкополосного датчика
оказался предпочтительным. Однако, если учесть чисто практические
трудности, возникающие при смене датчиков, широкополосный может
оказаться идеальным, когда вам надо, например, быстро регистриро-
вать спектры 13С, 31Р и 2Н большого количества концентрированных
образцов.
Настройка датчика. Основная составная часть датчика-это отрезок
провода, свернутого в форме катушки, внутрь которого попадает обра-
зец после ввода в магнит. Это, если хотите, антенна, принимающая
сигналы ЯМР. В большинстве датчиков для сверхпроводящих магнитов
она еще и передает в образец импульсы. Для наиболее эффективного
рассеяния импульса в образце и наибольшего усиления принятого
сигнала полное сопротивление этого провода должно быть согласовано
с выходным сопротивлением передатчика и входным сопротивлением
приемника (т. е. просто равно им). Это следствие теоремы о максималь-
ной мощности, которую вы, возможно, помните из школьной физики,
где она была сформулирована для постоянного тока. Правда, в условиях
радиочастот она несколько усложняется, поскольку наряду с активным
сопротивлением в полное сопротивление входят реактивные члены.
Химику, работающему на спектрометре, не обязательно представ-
лять электрическую сторону поведения полного сопротивления иа ра-
Основные экспериментальные методы
89
диочастотах, но обязательно нужно уметь настраивать датчик до согла-
сования сопротивлений на нужной частоте. Это следует делать по
нескольким причинам. Только при условии правильной настройки мож-
но добиться максимальной чувствительности. Только при правильной
настройке импульсы будут иметь минимальную длительность, что
снижает эффекты неоднородности импульса иа краях спектрального
диапазона (см. гл. 4). Длительности импульсов остаются постоянными
при перестройке датчика с одного образца на другой. Поэтому, если на
каком-либо образце невозможна калибровка импульсов из-за малой
чувствительности, при условии правильной настройки датчика можно
проводить миогоимпульсные измерения с использованием длительнос-
тей, определенных иа других образцах (см. гл. 7). Гетсроядерные датчи-
ки часто имеюз еще одну катушку для широкополосной развязки от
протонов, и для правильной ее работы также требуется настройка,
особенно при использовании составных импульсных последовательнос-
тей для развязки (см. гл. 7). Широкополосные датчики обязательно
должны перестраиваться с одной частоты на другую. При этом часто
используется сочетание заменяющихся или переключающихся конденса-
торов (скачкообразная настройка) и тонкой подстройки, описываемой
далее. И наконец, эксперименты, в которых применяется облучение
низкой мощности (гомоядерная развязка или эксперименты по эффекту
Оверхаузера), будут воспроизводимыми только при настройке датчика
на каждый конкретный образец. Различные спектрометры имеют раз-
личные схемы настройки, но все они преследуют одну и ту же цель.
Начинающие спектроскописты часто считают настройку датчика непо-
нятным трюком. Но вы измените о ней свое мнение, если будете хорошо
понимать смысл своих действий. В следующих параграфах будут рас-
смотрены две наиболее распространенные схемы настройки, которые
должны помочь вам в понимании методики регулировки датчика.
Схема универсальной цепи для преобразования полного сопротивле-
ния провода (в которое входят его активное сопротивление и индуктив-
ность) в сопротивление нужной величины (50 Ом) приведена на рис. 3.10.
Два конденсатора обычно помещаются внутрь датчика возле катушки
и настраиваются с помощью двух длинных стержней, проходящих через
весь датчик. Настройка конденсаторов требуется для компенсации изме-
Рис. 3.10. Типичная схема резонан-
сного контура датчика ЯМР. В
сверхпроводящих магнитах с верти-
кальным зазором приемная катуш-
ка обычно не выполняется в фор-
ме соленоида. РЧ -радиочастотное
поле.
90
Глава 3
Рис. 3.11. Настройка датчика с помощью моста.
неиия индуктивности катушки при вводе в нее различных образцов. Нам
не нужно разбираться в том, как именно работает эта цепь, но будет
полезно понять различия двух подстраиваемых конденсаторов. С\ изме-
няет резонансную частоту контура, которая должна быть равна частоте
регистрируемых ядер, а С2 изменяет полное сопротивление цепи. Слож-
ность состоит в том, что обе эти регулировки зависят друг от друга,
и для настройки цепи требуются многократные подборы емкости каждо-
го конденсатора (это похоже на обсуждавшиеся ранее взаимодействия
шиммов).
Для определения правильного положения обеих ручек нам нужен
некоторый индикатор согласования сопротивлений и достижения часто-
ты резонанса. Эта проблема обычно решается двумя способами. Первый
и лучший из них-реальное измерение отклика цепи с помощью радио-
частотного моста. Его устройство аналогично обычному мосту сопро-
тивлений (люстиу Уинстона), но модифицированному для работы с пере-
менным током. Он имеет четыре вывода (обычно он представляет собой
просто небольшую коробочку с четырьмя разъемами), два из которых
используются для ввода сигнала опорной частоты и вывода ответа па
измерительное устройство (лучше всего осциллограф). К одному из
оставшихся двух подключается эталонное сопротивление (50 Ом), к дру-
гому-настраиваемый датчик (рис. 3.11). При равенстве полного со-
противления цепи датчика эталонному сопротивлению мост достигает
баллаиса, и вывод на измерительное устройство становится мини-
мальным.
Основные экспериментальные методы
91
Лучше всего в дополнение к этому непрерывно менять частоту
опорного сигнала возле интересующей величины. Тогда на измеритель-
ном устройстве мы увидим периодическое колебание резонансного
сигнала, амплитуда которого отражает согласованность сопротивлений.
Теперь нам очень легко преодолеть взаимодействие двух регулировок,
поскольку мы контролируем оба эффекта отдельно друг от друга по
интенсивности и амплитуде колебаний сигнала на индикаторе. Некото-
рые спектрометры оборудованы именно таким устройством. Если в ва-
шем приборе его нет, но вы заинтересованы в проведении очень точных
измерений, то постарайтесь приобрести необходимое дополнительное
оборудование. Генератор развертки и высокочастотный осциллограф
довольно дорого стоят, чтобы их приобретать только для этой цели. Но
их можно купить в подходящем комиссионном магазине (по крайней
мере в Великобритании такие есть) или иайти в своей лаборатории. Сам
высокочастотный мост весьма дешев, и вы можете использовать его без
генератора развертки (например, получать опорный сигнал из декаплера
спектрометра), но это, конечно, лишает его основных достоинств.
Второй, более распространенный подход к определению качества
настройки - это включение радиочастотного зонда между выходом пере-
датчика и датчиком (рис. 3.12). На выходе он дает сигнал, пропорцио-
нальный отраженной от датчика энергии, которая зависит от настрой-
ки контура и согласования сопротивлений. Обычно отраженный сигнал
выводится на стрелочный измеритель, который может быть выполнен
как встроенным в спектрометр, так и в виде отдельного блока (в ие очень
дорогих спектрометрах). Это более прямой метод индикации согласова-
Рис. 3.12. Настройка датчика с помощью направленного ответвителя.
92
Глава 3
иия передатчика и цепи датчика, поскольку отраженная энергия характе-
ризует согласование сопротивлений независимо от их абсолютной вели-
чины (в мостовом методе предполагалось, что она всегда составляет
50 Ом).
В последнем методе есть ряд проблем. Большинство радиочастотных
зондов работает с сигналами большой мощности. Это очень хорошо при
настройке передатчика, но хуже при настройке декаплера. Еще одна
проблема заключается в том, что вместо отдельной индикации резонан-
са и согласования сопротивлений вы видите теперь только суммарный
эффект. Поэтому для подбора конденсаторов необходимо пользоваться
каким-то систематическим методом, например методом настройки гра-
диентов Z и Z2 из раздела о шиммировании (см. параграф «Настройка
разрешения» в разд. 3.3.4), где «Z» и «Z2» нужно заменить иа «резонан-
сную частоту» и «согласование сопротивлений» соответственно. Нако-
пив опыт работы с датчиком, вы сможете очень легко определять точку
оптимальной настройки, поскольку при правильном согласовании со-
противлений небольшое изменение резонансной частоты дает резкое
увеличение показаний индикатора. Если же оба параметра далеки от
правильных значений, то их изменение вообще ие будет давать никакого
отклика иа измерителе, и вам может показаться, что достичь улучшения
невозможно. Но это происходит только при сильной расстройке конден-
саторов или если вы по неопытности слишком далеко повернули
регулировочную ручку.
Динамический диапазон и разрешение АЦП. Необходимость предвари-
тельного преобразования аналогового сигнала ЯМР в цифровую форму
для проведения численного преобразования Фурье оказывает определен-
ное влияние па проведение эксперимента. Ранее мы уже обсудили метод
разложения непрерывного в частотной области спектра на дискретные
точки, но вернемся к нему еще раз в гл. 8. Дискретность реального
спектра ЯМР можно легко увидеть глазами при тщательном его
обследовании, и те, кто хоть раз работал на спектрометре, прекрасно это
знают. В процессе оцифровки наибольшие трудности вызывает опреде-
ление амплитуды точки, а не ее частоты. Очень важно тщательно
контролировать оцифровку, поскольку в некоторых ситуациях недоста-
точно аккуратный подход может привести к полному исчезновению
пиков, т. е. к резкому снижению чувствительности. В дальнейшем изло-
жении предполагается, что вы уже знакомы с некоторыми компьютер-
ными терминами, такими, как «бит» и «слово».
Входящий в компьютер электрический сигнал ЯМР должен преобра-
зовываться в поток чисел. Мы уже зиаем, с какой скоростью и в течение
какого времени это следует делать. Осталось только разобраться,
в каком виде должны быть представлены числа и где им храниться. При
построении ССИ аналого-цифровой, преобразователь (АЦП), ко входу
которого прикладывается некоторое напряжение, выдает на выходе
пропорциональное этому напряжению двоичное число, помещаемое
Основные экспериментальные методы
93
в память компьютера. Этот процесс характеризуется следующими наи-
более важными параметрами: число бит, используемое АЦП для пред-
ставления напряжения сигнала; максимально возможная скорость оциф-
ровки; число бит в одном слове памяти компьютера. Сочетание этих
параметров определяет такие характеристики спектрометра, как макси-
мальная ширина спектрального диапазона, диапазон регистрируемых
амплитуд сигналов и максимально возможное число прохождений.
При прочих равных условиях желательно, чтобы АЦП представлял
сигнал максимальным'Числом бит, ио на практике большое число бит
создает дополнительные проблемы. Причина этого станет понятна, если
попытаться выяснить, какой диапазон амплитуд может быть представ-
лен, например, в 12 бит (в спектрометрах ЯМР обычно используются
12 16-битные АЦП). Будем считать, что приемник спектрометра на-
строен таким образом, чтобы максимальный сигнал каждого прохожде-
ния как раз заполнял шкалу АЦП, т. е. чтобы ему соответствовало
максимальное число. Поскольку один бит используется для знака,
максимальное число будет 211 — 1 (немногим более 2000). Минималь-
ный регистрируемый сигнал будет соответствовать минимальному чис-
лу, т. е. I. Отношение этих величин (около 2000:1) и будет динамическим
диапазоном 12-битиого АЦП.
Необходимость соответствия амплитуды сигналов ЯМР и шкалы
АЦП создает некоторые сложности. Если самый большой сигнал ССИ
оказывается больше шкалы АЦП, то в спектре появляются искажения
(рис. 3.13). Если максимальный сигнал точно подходит под шкалу АЦП,
то сигналы, в 2000 и более раз меньшие его по амплитуде, оказываются
ниже разрешения АЦП и вообще ие регистрируются. В этом случае не
поможет и сколь угодно длительное накопление, потому что такие
слабые сигналы просто не оцифровываются. Однако, если амплитуда
шума больше, чем минимальный оцифровываемый сигнал, малые сигна-
лы, которые скрыты в шуме, обнаружатся при многократном усредне-
нии. Таким образом, АЦП препятствует выделению сигналов только при
сочетании широкого динамического диапазона с очень высоким отноше-
нием сигиал/шум. Обычно такие условия возникают только при наблю-
дении протонов.
На рис. 3.14 показано влияние длины слова АЦП иа выделение
сигналов. Использованный для этих спектров образец содержит еще
один сигнал (ие показанный на рисунке), в 100 раз больший максималь-
ного из трех приведенных. Самый маленький сигнал (видимый только на
двух верхних спектрах) примерно в 100 раз меньше максимального,
таким образом, динамический диапазон составляет 10 000:1. Спектры
получены за три прохождения при длине слова АЦП в 10, 12 и 16 бит (все
остальные параметры одинаковы); максимальный пик иа всех спектрах
имеет одинаковую высоту. Обратите внимание, насколько вырастает
уровень шума с уменьшением разрешения АЦП: при использовании
10 бит минимальный сигнал уже не виден. Такой дополнительный шум
называется шумом оцифровки. Ограничения по динамическому диапазо-
Рис. 3.13. Сильное искажение базовой линии при переполнении АЦП. Внизу
показан спектр, полученный при правильно подобранном усилении приемника,
вверху- при слишком большом.
16 Hum
12 bum
>8
Юбитп
“1 I 1 1 1----г 1 1 ' Г ’ “ 'I 1 I Г *|— , -
3,4 32 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0)5 0,4
м.а.
Рис, 3.14. Влияние разрешения АЦП на чувствительность (подробности см.
в тексте).
Основные экспериментальные методы
95
иу чаще всего возникают в биологических исследованиях, где многие
образцы должны быть приготовлены обязательно в протонной воде.
В этом случае требуются АЦП с самой большой доступной длиной
слова и тщательная настройка усиления приемника на точное соответ-
ствие максимального сигнала максимальному выходному числу АЦП.
Можно также попробовать подавить самый большой сигнал (методики
обсуждаются в гл. 7).
Существуют как минимум две чисто практические причины, по
которым не всегда можно использовать максимальную длину слова
АЦП. Поскольку создание длинного слова требует большего времени,
снижается общая скорость оцифровки и соответственно ширина спект-
рального диапазона. Обычно 12-битиый АЦП выполняет одну операцию
за 3 мкс, и его максимальная рабочая частота составляет 300 кГц, что
в соответствии с критерием Найквиста позволяет получать спектры
шириной 150 кГц. Скорость 16-битного АЦП понижается до 30-50 кГц.
Однако даже на приборах с частотой 500 МГц этого вполне хватает для
полного перекрытия всего спектрального диапазона протонов в раство-
рах, поэтому первая причина ие так важна.
Более серьезные препятствия для использования длинных слов АЦП
появляются при проведении длительных накоплений. При выполнении
каждого прохождения к содержимому памяти компьютера добавляется
массив 16-битных чисел. Если они по-прежнему представлены в форме
двоичных целых чисел, то этот процесс может продолжаться только до
тех пор, пока суммарное значение каждой точки данных умещается
в слове памяти компьютера. Например, в таком нереальном случае,
когда 16-битиый АЦП (максимальное число 215 — 1 и знак) используется
с 16-битным словом компьютера, переполнение произойдет уже при
выполнении второго прохождения, содержащего сигнал максимальной
величины.
Надо сказать, что такой случай не всегда бывает нереальным,
поскольку 16 бит-это наиболее распространенная длина слова неболь-
ших компьютеров. Раньше, когда было очень трудно увеличивать объем
памяти компьютера, недостаточная длина слова составляла довольно
серьезную проблему. Для ее решения был предложен ряд схем усредне-
ния данных в коротких словах [5]. Помимо этого часто изготовлялись
спектрометры с необычной длиной слова в 20 или 24 бит, представляю-
щие собой компромисс между стремлением к повышению длины слова
и снижению стоимости, прибора. В последние годы произошло резкое
снижение цен иа компьютеры, и проблема исчезла сама собой. Поэтому
мы прекратим дальнейшее обсуждение; заметим только, что 24-битное
компьютерное слово при 12-битном АЦП достаточно для большинства
применений (можно произвести несколько тысяч накоплений). При
16-битиом АЦП 24-битного слова не хватает, и лучше использовать
32-битное. Более подробное обсуждение этой проблемы проводится
в работах [4, 5].
96 Глава 3
Литература
1. Conover W. W.. in; Topics in Carbon-13 NMR Spectroscopy (ed. Levy G. C.). 4,
38-51, Wiley, 1984.
2. Hoult D.I., in: Topics in Carbon-13 NMR Spectroscopy (ed. Levy G.C.), 3, 16-27,
Wiley, 1979.
3. Shootery J.N., ibid., 28-38, 1979.
4. Martin M.L., Delpuech J.-J., Martin G. J„ Practical NMR Spectroscopy,
pp. 120-131, Heyden, 1980.
5. Cooper J. IK. in: Topics in Carbon-13 NMR Spectroscopy (ed. LevyG.C.), 2,
411-419, Wiley, 1976.
Глава 4
Импульсная спектроскопия ЯМР
4.1. Введение
В этой книге рассматриваются физические процессы, но мы все же
остаемся химиками и не станем моделировать их строгим математи-
ческим путем. Одиако такой подход создает дилемму: стараясь ие
вдаваться в теоретические подробности импульсного ЯМР, мы рискуем
превратить книгу просто в каталог экспериментов и остаться без всякого
представления о процессах, происходящих в образце. В то же время
попытки строгого описания даже такого простого двухимпульсиого
эксперимента, как COSY (гл. 8), могут привести к столь громоздким
математическим выкладкам, что большинство из нас просто не станет
их читать. Но мы постараемся удержаться между этими двумя край-
ностями и передать большинство основных концепций импульсного
ЯМР с помощью простых физических представлений.
С их помощью можно иа понятном качественном уровне описать
релаксационный процесс (но не все его механизмы), воздействие идеаль-
ных радиочастотных импульсов на поведение макроскопической на-
магниченности, спиновое эхо и центральную концепцию двумерной
спектроскопии - частотные метки. Однако еще две очень важные кон-
цепции импульсного ЯМР описать будет не так просто, хотя первую из
них можно передать с помощью диаграмм заселенности простых спино-
вых систем. Это процесс переноса когерентности, а также возникновение
и свойства многоквантовой когерентности.
В этой главе мы разработаем словарь, которым будем пользоваться
в дальнейшем при описании импульсных экспериментов в форме образ-
цов. Если она покажется вам слишком далекой от практики, то взгляни-
те на любую из следующих глав, и вы поймете, что без глубинного
понимания обсуждаемых здесь вопросов невозможно дальнейшее изуче-
ние книги. Самый лучший стимул к приобретению знаний о происходя-
щих в образце процессах - это желание использовать их для решения
практических задач. Поэтому будет очень хорошо, если вы попробуете
реально выполнить некоторые многоимпульсные эксперименты.
98
Глава 4
4.2. Составные части эксперимента
4.2.1. Введение
Само явление ЯМР состоит во взаимодействии осциллирующего
магнитного поля (радиочастотного поля) с объемной намагниченностью
образца, которая возникла вследствие упорядоченности магнитных
моментов входящих в него ядер в результате наложения постоянного
магнитного поля. Это явление всегда наблюдается в макроскопических
объектах, и большая часть его теории описывается в терминах класси-
ческой физики. Например, полностью классической стала теория по-
глощения Блоха. Она не требует никаких представлений о квантовании
уровней энергии. Но, как ни странно, часто именно это и вводит
в заблуждение химиков, освоивших квантовую теорию. Они легко
понимают переходы между различными дискретными энергетическими
уровнями, ио теряются, когда существование этих переходов выводится
из простой классической намагниченности вещества.
Возможность описания явлений ЯМР как в терминах квантовой
механики, так и классической физики дает большое преимущество
и представляет собой одну из приятных особенностей предмета. Для
наших целей больше подойдет классическая картина, и большая часть
дальнейшего изложения будет связана с поведением именно макро-
скопической намагниченности. Об этом нужно постоянно помнить. Все
те места текста, где мы будем переходить от микроскопической к объем-
ной намагниченности, будут выделяться особо. Мы рассмотрим сначала
поведение ядра в постоянном магнитном поле и природу радиочастот-
ных электромагнитных волн и затем объединим их подходящим путем.
Во всех последующих разделах мы будем рассматривать только ядра со
спином 1/2. Символом В будет обозначаться магнитная индукция,
которая удобна для измерения намагниченности в материалах с отлич-
ной от нуля магнитной восприимчивостью. Во многих публикациях
вместо нее используется напряженность магнитного поля (символ Н)
или Ви Н совместно. При нашем эмпирическом подходе различие между
ними ие существенно. Кроме того, мы будем совершенно свободно
переходить от угловой скорости (в рад/с), обозначаемой вектором <а или
скаляром о), к соответствующей частоте v (в герцах), предполагая, что
читатель будет преобразовывать их друг в друга мысленно по формуле
о) = 2п v.
4.2.2. Ядра
Мы, наверное, уже привыкли представлять себе ядро со спином 1/2
как маленький магнит, момент которого возникает вследствие враще-
ния. Энергия этого ядра в постоянном магнитном поле становится
зависимой от взаимной ориентации его спина и вектора напряженности
поля. С точки зрения квантовой механики она может принимать два
дискретных значения с квантовым числом т(± 1/2), которые в нашем
Импульсная спектроскопия ЯМР
99
Рис. 4.1. Вращающийся зарял (на-
пример, протон) с угловым момен-
том J создает магнитный момент
|i = у — J. В магнитном поле его
ось вращения будет прецессировать
вокруг направления поля как гиро-
скоп.
классическом представлении соответствует параллельной и антипарал-
лельиой ориентации спииа ядра и поля. Таким образом, сигнал ЯМР-
это последовательность переходов между двумя энергетическими уров-
нями, вызываемых воздействием радиочастотного поля. Для того чтобы
перейти к макроскопическому описанию, рассмотрим движение наших
маленьких ядерных магнитов более подробно.
Возникающие при движении угловой ядериый момент J и магнитный
момент ц могут быть представлены в виде векторов. Их постоянное
отношение мы назовем гиромагнитным отношением у. Именно эта
константа определяет резонансную частоту ядра. Взаимодействие маг-
нитного и углового моментов с постоянным магнитным полем Во
(рис. 4.1) может быть описано в классических терминах:
— = цхВй (4.1)
at
Это дифференциальное уравнение решить не так уж трудно (см.
разд. 4.3.2), но нам этого делать не придется. Обратите внимание, что
уравнение (4.1) аналогично уравнению движения тела, обладающего
угловым моментом, в гравитационном поле, если вектор углового
момента заменить на магнитный момент, а гравитационное поле-на
магнитное. Почему это важно для нас? Потому что решение второго
уравнения уже известно: это движение гироскопа. Гироскоп в гравита-
ционном поле прецессирует, т. е. ось его вращения сама вращается
вокруг направления поля. Точно такое же движение совершают и ядер-
ные спины.
Таким образом, отдельное ядро имеет магнитный момент, прецес-
сирующий с некоторой частотой вокруг направления поля. Эта частота
называется ларморовой частотой ядра, а также частотой ЯМР-поглоще-
иия о. Вы уже знаете, что она зависит от напряженности поля и внутрен-
них свойств ядра, определяемых его гиромагнитным отношением: со =
= — уВ0. Магнитный момент ядра может вращаться, как по часовой
стрелке, так и против (в зависимости от знака гиромагнитного отноше-
ния), но обязательно в одну и ту же сторону для всех одинаковых ядер.
Если мы расположим систему координат таким образом, чтобы
7*
100
Глава 4
Рис. 4.2. При большом количестве
магнитных моментов возникает из-
быточная намагниченность, направ-
ленная вдоль оси z. В этом направ-
лении образец оказывается намаг-
ниченным.
направление поля совпадало с ее осью z, то магнитный момент ядра
будет иметь постоянную проекцию на ось z и вращающуюся с ларморо-
вой частотой проекцию на плоскость т — у. Вы можете считать z-компо-
неиту магиитиого момента тем самым маленьким магнитом из нашего
начального представления о ядре. Именно ее ориентация определяет
энергию системы. Заметьте, что с точки зрения ЯМР очень удобно
определять напряженность магнитного поля как соответствующую ей
частоту ларморовой прецессии, и часто можно слышать выражения
типа: «Мы купили магнит на 500 МГц». Частота ларморовой прецессии
оказывается удобной и для определения напряженности радиочастотно-
го поля. Не забывайте, что каждое ядро имеет свою собственную
ларморову частоту: магнит на 500 МГц для протонов-это то же самое,
что магнит иа 125 МГц для ядер углерода-13.
Теперь рассмотрим большое число спинов с одинаковой ларморовой
частотой (рис. 4.2). Мы знаем, что параллельная ориентация z-компо-
ненты магнитного момента и направления поля имеет более низкую
энергию, чем антипараллельная. Поэтому, предположив, что между
ними каким-то образом установилось термическое равновесие, можно
ожидать в соответствии с уравнением Больцмана избыточного заселения
низкого энергетического уровня. Таким образом, объемная намагничен-
ность образца окажется параллельной направлению магнитного поля.
В то же время все составляющие ее спины имеют прецессирующую
в плоскости т — у компоненту. Но, поскольку все направления в этой
плоскости эквивалентны и нет причин для выбора из них преимуще-
ственного, фаза прецессии будет случайной. Поэтому очень большое
число равновесных спинов не будет иметь никакой намагниченности
в плоскости х - у и общая намагниченность будет постоянна и парал-
лельна направлению оси г.
4.2.3. Радиочастотное поле
Переменное напряжение, приложенное к катушке датчика ЯМР, соз-
даст в образце переменное магнитное поле. Катушка имеет такую
геометрию, что создаваемое ею поле оказывается перпендикулярным
постоянному, т. е. его ось лежит в плоскости х — у. В идеальном случае
Импульсная спектроскопия ЯМР
101
Рис. 4.3. Осциллирующее магнитное поле (в верхней части рисунка) эквивалентно
двум вращающимся в противоположные стороны векторам намагниченности.
поле В: (постоянное поле обозначается Во) должно быть однородным во
всем объеме образца и резко спадать до нуля на его границах; на
практике это, конечно, недостижимо. Напряженность переменного поля
в несколько тысяч раз меньше напряженности постоянного, его частота
должна совпадать с частотой наблюдаемого ядра, т. е. быть лармо-
ровой.
Посмотрите иа рис. 4.3. В его верхней части показана половина цикла
осцилляции намагниченности при воздействии на нее радиочастотного
поля, В нижней части рисунка намагниченность представлена в виде двух
векторов постоянной амплитуды, вращающихся вокруг оси z в разных
направлениях. Частота вращения совпадает с радиочастотой. Убедитесь,
что сумма этих двух векторов будет вести себя точно так же, как
осциллирующий вектор из верхней части рисунка. Иными словами, пара
вращающихся в разные стороны векторов - тоже представление радио-
частотного сигнала. Разложение переменного магнитного поля на два
вращающихся вектора поможет нам яснее понять, каким образом оно
взаимодействует с намагниченностью образца.
4.2.4. Вращающаяся система координат
Теперь посмотрим, что произойдет при взаимодействии радиочас-
тотного поля с намагниченностью образца. Проблема состоит в том,
что радиочастотное поле ие постоянно, и даже постоянная намагничен-
ность образца, будучи отклоненной от оси z, начнет совершать прецес-
сирующее движение вокруг оси постоянного поля. В результате от
такого большого числа различных вращательных движений может
закружиться голова. Однако проблема легко решается, если подойти
к ней с другой стороны. Чтобы исключить все вращения, достаточно
ввести новую систему координат, связанную с прецессией ядра, и по-
смотреть, что при этом получится.
Вернемся ненадолго в микроскопический масштаб. Если наша систе-
ма координат будет вращаться с той же скоростью и в том же
102
Глава 4
лабораторная сиешама координат
Рис. 4.4. Типичная взаимная ориентация полей в эксперименте ЯМР. В лабо-
раторной системе координат (слева) имеются постоянное поле, намагниченность
образца и два вращающихся в противоположные стороны вектора радиочастот-
ного поля. Переход к вращающейся системе координат упрощает картину за счет
исчезновения постоянного поля и фиксации одного из векторов радиочастотного
поля (второй просто игнорируется).
Ьращянщаяся
система
координат)
направлении, что и прецессия ядра, то магнитный момент каждого
индивидуального ядра будет в ней постоянным. Вместе с исчезновением
прецессии должна исчезнуть и ее причина-внешнее поле, которого
в новой системе координат уже нет. Однако объемная намагниченность
образца остается по-прежнему направленной вдоль оси z (рис. 4.4).
Поскольку частота поля Bi выбиралась равной ларморовой частоте,
одна из двух компонент, на которые его можно разложить, становится
постоянной в плоскости х — у. Вторая, вращаюшаяся с той же частотой
в противоположном направлении, в новой системе координат вращается
вдвое быстрее и не оказывает существенного влияния на эксперимент
(для доказательства этого утверждения нам надо будет уйти далеко
в сторону от основного предмета, поэтому мы примем его иа веру).
Это преобразование координат изначально вводилось как некоторый
математический прием для упрощения уравнений движения намагничен-
ности, ио мы позаимствуем эту идею и постараемся с ее помощью
изобразить на рисунках процессы в образце. Подобный прием исполь-
зуется и в более известной задаче о вращательном движении, где переход
к новой системе координат вызывает появление новой силы (центробеж-
ной) аналогично тому, как в нашем случае исчезло поле Во. В дальней-
шем мы к этому еще вернемся и рассмотрим более строго. При
обозначении осей стационарной и вращающейся систем координат
принято использовать различные буквы, например х, х ’ и у, у’, для того
чтобы подчеркнуть их различие. Однако в этой книге мы будем иметь
дело почти всегда с вращающейся системой координат и только на
качественном уровне, поэтому ие будем использовать такие обозначе-
ния. В тех же случаях, когда рассматривается стационарная система
координат (в основном в следующем разделе), рисунки будут снабжены
дополнительными указаниями.
Импульсная спектроскопия ЯМР
103
4.2.5. Импульс!
Теперь мы уже можем рассмотреть, что же происходит в образце во
время радиочастотного импульса, т. е. что происходит при включении на
некоторый промежуток времени поля ВА и последующем его выключе-
нии. Во вращающейся системе координат вектор намагниченности
образца и вектор поля постоянны; первый направлен по оси и,
а второй-под прямым углом к нему, допустим, по оси х (рис. 4.5).
В соответствии с правилом правой руки из школьного курса физики два
перпендикулярных вектора намагниченности вызывают появление вра-
щательного момента, перпендикулярного им обоим, и система начинает
работать как настоящий мотор. Намагниченность образца вращается
вокруг вектора поля Вх (т. е. вокруг оси х) со скоростью, зависящей от
напряжеииости поля, и в конце концов проходит через плоскость х — у.
Если мы как-то узнали скорость его вращения, то можно рассчитать,
в какой момент намагниченность будет направлена по оси у, и выклю-
чить поле Вг Мы осуществим поворот намагниченности на 90°, т. е. 90-
или л/2 (в радиаиах)-импульс. Теоретически, включая поле на различные
промежутки времени, можно повернуть вектор намагниченности на
любой угол, где каждые 360° будут возвращать намагниченность в на-
чальное положение. Однако на практике возможно только несколько
поворотов, после которых по целому ряду причин намагниченность
исчезает.
Теперь рассмотрим, что будет происходить после выключения поля
В: и поворота намагниченности на угол я/2. Мы хотим узнать, что
обозначает ситуация, когда вектор намагниченности направлен по оси у,
а поля В! уже нет (рис. 4.6). Доказав ранее, что во вращающейся системе
координат радиочастотный сигнал может быть представлен в виде
суммы постоянного и вращающегося с двукратно ларморовой частотой
векторов, мы можем предположить (и вполне справедливо), что этот
новый постоянный вектор сохраняет сущность радиочастотного сигнала.
Вернувшись назад в стационарную систему координат (рис. 4.6), мы
сможем яснее понять происходящее. В лабораторной системе координат
радиочастотное
поле----------
выключено
включечо
Рис. 4.5. Импульс! При включенном радиочастотном поле намагниченность
образца совершает вращательное движение. Мы можем выключить поле в любой
момент (в нашем случае в момент достижения вектором намагниченности оси у).
Выключено
104
Глава 4
Вклочко
4knU*O4*Hfl
Рис. 4.6. После выключения поля В( намагниченность остается в плоскости х — у.
В лабораторной системе координат мы увидим ее прецессию вокруг оси постоян-
ного поля и, следовательно, появление радиочастотного сигнала.
Рис. 4.7. Импульсы с различными углами поворота намагниченности. Во многих
экспериментах ЯМР используются только я/2- и я-импульсы.
намагниченность образца вращается с ларморовой частотой вокруг оси
г. Построив проекции этого вращающегося вектора на оси х и у, мы
получим два радиочастотных сигнала, в некотором смысле ортогональ-
ные друг другу. Именно эти два сигнала измеряются в эксперименте
ЯМР в качестве спада свободной индукции (ССИ). Они могут регистриро-
ваться как раздельно, так и в определенной смеси. Это зависит от
условий регистрации, которые будут подробно разбираться далее.
Теперь иам легко понять эффект от импульсов различной длитель-
ности. На рис. 4.7 приведены некоторые примеры. Все импульсы с про-
должительностью, отличной от л/2, оставляют некоторую часть 7-на-
магниченности, не создающей сигнала ССИ. Только ее компонента
в плоскости х — у способна создавать напряжение в катушке приемника.
Таким образом, л/2-импульс (или теоретически Зл/2, 5л/2 и т. д.) создает
максимальный сигнал (это верно только для экспериментов из Одного
прохождения). И напротив, л-импульс (или 2л, Зл, ...) вообще не
вызывает появления сигнала, поскольку он помещает намагниченность
на ось z. В гл. 7 это свойство будет использовано для определения
длительности л-импульса, а следовательно, и напряженности поля ВР
Импульсная спектроскопия ЯМР
105
4,2.6, Векторы и уровни энергии
Рассматривая объемную намагниченность как классическую величи-
ну, что мы и будем делать на протяжении большей части книги, мы тем
самым избегаем погружения в пучины квантовой механики и матриц
плотности. В этом состоит недостаток нашего подхода: мы не сможем
понять подробностей, связанных с квантовомеханическими свойствами,
такими, как перенос когерентности и критерий многоквантовой коге-
рентности (гл. 8). Это необходимое для книги без формул упрощение,
и оно должно вам понравиться. Одиако неправильно будет полностью
игнорировать тот факт, что молекула имеет квантованные уровни
энергии. Мы вполне можем рассмотреть хотя бы влияние импульсов на
заселенность этих уровней. Обсуждение заселенностей может помочь
нам в понимании экспериментов с переносом когерентности. Этот
подход мы и будем использовать в следующих главах.
Рассмотрим систему с двумя уровнями энергии а и Р (рис. 4.7а)
и предположим, что на них должно разместиться N молекул. Если
уровни равны по энергиям, то иа каждом из них окажется по У/2
молекул. Но если энергия состояния а чуть меньше, чем (J, то оно будет
иметь некоторый избыток заселенности. Пусть иа уровне а находится на
8 ядер больше, чем на уровне р. Тогда их заселенности равны (У + 6)/2
и (У — 8)/2 соответственно. Для того чтобы рассчитать изменения
заселенностей уровней при воздействии иа систему импульса с углом
поворота 0, мы рассмотрим поведение z-компоненты намагниченности.
Для расчетов удобнее использовать избыток заселенностей (т. е. откло-
нения от числа У/2) Ра и Рр, которые изначально имели величины +8/2
и -8/2.
В любой момент времени z-компонеита намагниченности пропор-
циональна разности заселенностей уровней:
Мх ос (Рц - Рр) (4.2)
поэтому сначала Мо пропорциональна 8. Кроме того, нам известно, что
Ра + Рр = 0 (4.3)
После 0-импульса z-компонента равна (рис. 4.7а)
Mz = Мо cos 6 (4.4)
Рис. 4.7а. Начальные заселенности двухуровневой системы (слева) и влияние
импульса с углом поворота 6 на z-компоненту вектора намагниченности (справа).
106
Глава 4
отсюда
Ра- Pp = 5cos9 (4.5)
Учитывая (4.3), мы рассчитываем новые заселенности:
„ 5 cos 0 „ — 5cos0 _ '
Р« = —. ----2--- (4'б)
Эти простые формулы позволяют нам отнести все, что мы уже знаем
о п/2- и n-импульсах, к поведению квантованных уровней энергии. Если
О = п/2, то cos 0 = 0 и избыток заселенностей отсутствует, т. е. импульс
выравнивает заселенности. Если 0 = я, то cos 0 = — 1 и заселенности
инвертируются.
4.3. Реальный эксперимент
4.3.1. Введение
В разд. 4.2 мы исходили из предположения, что в эксперименте
участвует только один сигнал, т. е. все ядра имеют одинаковую лармо-
рову частоту, ту же, что и радиочастотное поле, попадающее таким
образом точно в резонанс. В реальной спектроскопии такого не бывает;
ее предмет состоит как раз в измерении различий резонансных частот
ядер образца. Для того чтобы на одном рисунке во вращающейся
системе координат одновременно изобразить несколько частот, в боль-
шей части книги мы будем поступать весьма свободно, выбирая такую
частоту вращения, чтобы картина была наиболее простой. При этом нам
придется игнорировать все последствия иеидеальиости условий поведе-
ния эксперимента. Однако, перед тем как войти в этот мир фантазий
о бесконечно сильном и однородном поле Вь о бесконечно больших (в
масштабах импульсных последовательностей) временах релаксации, мы
постараемся коротко описать ситуацию нарушения резонансных условий
каким-либо не очень сложным способом. Если этот вопрос вас не
интересует, то пропустите разд. 4.3.2; это не должно причинить серьез-
ного ущерба вашим знаниям. Но разд. 4.3.3 и 4.3.4 следует обязательно
уделить внимание, поскольку в них будут приниматься некоторые
используемые в дальнейшем условия.
4.3.2. Когда импульс не попадает в резонанс
Чтобы понять, что произойдет, когда поле конечной мощности
будет иметь частоту, отличающуюся от точно резонансной, нам надо
подробнее рассмотреть поведение намагниченности во вращающейся
системе координат. Хотя в этом разделе мы будем иметь дело только
с магнитным моментом р отдельного ядра, он в точности отражает
поведение всей объемной намагниченности М. Если приводимая здесь
алгебра покажется вам слишком сложной, то уделите больше внимания
Импульсная спектроскопия ЯМР
107
приводимым в конце результатам в геометрической форме -они должны
быть понятнее.
Мы уже приводили уравнение зависимости движения углового мо-
мента J от вращательного момента ц х Во, возникающего при взаимо-
действии ядерного магнитного момента и постоянного поля Во:
t/J
— = |i х Во (4.1)
Используя определение гиромагнитного отношения у:
H = (4.7)
мы можем заменить J
= уц х Во (4.8)
в стационарной системе координат. Скорость изменения р в системе
координат, вращающейся с угловой скоростью <а, имеет вид
бц / еЛ
— = nix(B0 + -) (4.9)
(эту формулу можно проверить в [1]). Если мы присвоим переменной
о значение <а0, такое, что <в0 = — уВ0, то в системе координат, враща-
ющейся со скоростью <а0,
би
7^ = 0 (410)
О/
т. е. магнитный момент становится стационарным. Следовательно, в
лабораторной системе координат он прецессирует с угловой скоростью
— уВ0, равной ларморовой частоте. Этот удивительно простой вид
решения векторного дифференциального уравнения (4.8) как раз и по-
служил причиной преобразования координат.
Теперь добавим поле В! и выберем такое значение о, при котором
один из компонентов Bt стационарен во вращающейся системе коорди-
нат. В этом случае
5 в (
—~ = УН х Во +В: + -I (4.11)
о t \ у /
Если частота Bj совпала с резонансной, то й = й0 и
Sit
— = уц х В0 + В, Ч -
о i \ у /
= yji х (Во + В: — Во) = уц х В, (4.12)
Это уравнение имеет ту же форму, что и (4.8), описывающее, как мы уже
знаем, прецессию вокруг Во. Следовательно, в последнем случае на-
108
Глава 4
Рис. 4.8. Если импульс не попа-
дает точно в резонанс, то во
вращающейся системе коорди-
нат влияние постоянного поля
не исчезает полностью. Намаг-
ниченность образца вращается
вокруг векторной суммы оста-
точного поля и В..
магииченность будет вращаться со скоростью — уВ: вокруг направле-
ния поля В,.
Если ю не равна ю0 (т.е. Вх ие попадает в резонанс), то
5 ц ( & \ /о — сип \
— = уцх(во+- + В1) = уц х (----------+ BJ (4.13)
о / \ у / \ У /
Мы можем рассматривать член (о — <а0)/у как некоторое редуцирован-
ное постоянное поле Вг во вращающейся системе координат. Тогда
р. будет прецессировать вокруг суммы Bt и Вг (рис. 4.8), т. е. вокруг так
называемого эффективного поля Beff. Это дает иам критерий для выбора
величины напряженности поля Bt: поскольку большинство эксперимен-
тов построено в расчете на то, что во вращающейся системе координат
все векторы вращаются вокруг одной и той же оси, не следует слишком
сильно отклоняться от этого условия. Другими словами, угол 0 иа
рис. 4.8 должен быть малым. 9 можно определить уравнением
= (4.14)
Поэтому член у (скорость прецессии вокруг Bj или, если хотите,
напряженность поля, выраженная в единицах частоты, как мы это
делали для постоянного поля в разд. 4.2.2) должен быть достаточно
большим в сравнении с максимальной ожидаемой величиной расстройки
резонанса о — ю0.
Рассмотрим какой-либо конкретный пример. Допустим, мы решили,
что 0 не должно превышать 1°. Для протонного спектра с диапазоном
в Юм.д. иа 200 МГц максимальный отход от резонанса составит
Импульсная спектроскопия ЯМР
109
1000 Гц (5 м.д.). Тангенс 0 имеет величину порядка 0,017, поэтому
напряженность поля должна быть 1000/0,017 «60 кГц. При этих усло-
виях длительность п/2-импульса составит около 4 мкс-вполне реальная
величина для этой частоты на 5-мм датчике. Именно это требование
вращения магнитных моментов различных серий ядер вокруг примерно
одной и той же оси объясняет необходимость использования коротких
мощных импульсов в фурье-спектроскопии ЯМР.
Проделав те же вычисления для наблюдения углерода на спектро-
метре с частотой 500 МГц (частота углерода 125 МГц), где максималь-
ная расстройка резонанса составит около 15 кГц, мы получим длитель-
ность л/2-импульса 0,3 мкс. Однако на практике при работе с жидкостя-
ми на спектрометрах высокого разрешения эта величина составляет
чаще всего 15-20 мкс на 10-мм датчике, что соответствует максималь-
ному значению угла эффективного поля около 45°. Это служит основ-
ным камнем преткновения для проведения большого числа много-
импульсных экспериментов, и именно здесь ведутся активные конструк-
ционные разработки. Частично решить эту проблему можно с помощью
остроумной концепции составных импульсов, которой мы еще коснемся
в гл. 7.
Воздействие на систему импульса, ие попавшего в резонанс, зависит
от его длительности. В случае n/2-импульса, когда основной объект
облучения должен полностью потерять z-намагничеиность. вектор на-
магниченности ядер, ие попавших в резонанс, ие доходит до плоскости
х — у из-за наклонного положения оси вращения. Однако, поскольку
напряженность эффективного поля ВеП больше, чем Въ вектор вра-
щается быстрее. В результате такой «самокомпенсации» л/2-импульс
вполне пригоден для элиминирования z-иамагииченности в широком
Рис. 4.9а. Если нас интересует только степень переноса z-намагниченности в
плоскость х — у, то для п/2-импульса эффекты расстройки резонанса не так
велики.
110
Глава 4
Рис. 4.96. В случае тс-импульса мы заинтересованы только в инверсии намагни-
ченности; наклонное положение оси вращения создает большие помехи.
диапазоне частот, но векторы намагниченности с различной расстройкой
от резонанса приходят в поперечную плоскость с фазовыми ошибками
(рис. 4.9а).
В случае n-импульса, наоборот, важно полностью удалить намагни-
ченность в плоскости х — у. Здесь уже не помогает повышенная скорость
прецессии вокруг Betf, поскольку при этом вектор попадает в плоскость
х — z (рис. 4.96). Большие различия в эффективности инверсии намагни-
ченности могут составлять основной источинк ошибок в таких экспери-
ментах, как обсуждающийся далее метод инверсии-восстановления для
измерения Тг.
4.3.3. Когда детектируется несколько частот одновременно
Теперь, независимо от того, ознакомились вы с предыдущим разде-
лом или решили сэкономить время, мы не будем прибегать к формаль-
ному математическому описанию, а постараемся на качественном уров-
не разобраться с образцами, дающими несколько линий в спектре. При
этом мы будем полностью пренебрегать всеми рассмотренными в пре-
дыдущем разделе эффектами. Воздействуя на образец некоторым им-
пульсом, мы предполагаем, что все векторы намагниченности различных
ядер проделывают один и тот же поворот вокруг одной и той же оси.
Таким образом, в результате л/2-импульса объемная намагниченность,
представляющая собой сумму намагниченностей различных ядер, будет
направлена по некоторой оси в плоскости х — у. Очень часто иас будет
интересовать ее поведение в промежуток времени между последователь-
ными импульсами. Поскольку вращающаяся система координат может
вращаться со скоростью только одного из ядер, нам придется иметь
дело со значительно более сложным объектом, чем сохраняющий
Импульсная спектроскопия ЯМР
111
после
импульса
спустя
некоторое время
Рис. 4.10. Две линии во вращающей-
ся системе координат. Мы выбираем
такую скорость вращения системы ко-
ординат, чтобы одна из линий была
в ней стационарна. Вторая прецессиру-
ет с частотой, равной ее относитель-
ному химическому сдвигу.
неизменным свое направление стационарный вектор. В этом вопросе
легче всего разобраться иа нескольких примерах.
Рассмотрим сначала только две линии с разностью частот между
ними v (рис. 4.10). Если мы выберем частоту вращения системы коорди-
нат равной частоте одной из них, то намагниченность соответствующих
ей ядер после л/2-им пульса будет сохранять свое направление вдоль оси
у. Намагниченность, соответствующая второй линии, также сразу после
импульса оказавшаяся иа оси у, прецессирует с отличной от первой
линии частотой (различие незначительное, поскольку химические сдвиги
обычно составляют несколько миллионных долей ларморовой частоты),
и ее прецессия полностью не исчезает во вращающейся системе коорди-
нат. Вектор намагниченности прецессирует вокруг оси z с частотой,
равной разности химических сдвигов двух ядер. Если вспомнить, что
единица измерения частоты-герц-соответствует просто числу оборо-
тов в секунду, то мы легко можем рассчитать положение намагничен-
ности в любой момент времени I. За каждые 1/v с она будет совершать
полный оборот вокруг системы координат, за t с повернется на 2nvt рад.
Такое преобразование абсолютной частоты прецессии ядра (порядка
мегагерц) в частоту, представляющую разность химических сдвигов
между ними (обычно порядка килогерц), напоминает процесс вычитания
опорной радиочастоты из сигнала ЯМР перед его оцифровкой (гл. 2).
И действительно, частота вращения системы координат вполне может
служить опорной частотой.
Однако еще больший интерес представляет случай, когда различные
компоненты намагниченности в плоскости х — у соответствуют частям
мультиплета, иными словами, когда разность частот сигналов пред-
ставляет собой не химический сдвиг, а константу спии-спинового
взаимодействия. На рис. 4.11 показана эволюция компонент триплета.
В качестве опорной частоты (скорости вращения системы координат)
была выбрана частота центральной линии триплета (т.е. его химичес-
кий сдвиг), и поэтому намагниченность этой линии остается постоянной.
Две другие компоненты во вращающейся системе координат движутся
в противоположных направлениях со скоростями + J и — J об/с
112
Глава 4
Рис. 4.11. Для мультиплета опорную частоту удобно установить равной химичес-
кому сдвигу сигнала. Так выглядит результат для триплета.
Wo
J
заполните
эту диаграмму
сами
Рис. 4.12. Определите, где будут находиться компоненты дублета после i/J с.
(+ 2nJ рад/с). Каждые 1/J с оии собираются все вместе на оси + у.
Теперь аналогичным образом рассмотрим дублет. Поместим опор-
ную частоту иа его химический сдвиг (т. е. в центр между линиями, см.
рис. 4.12). Через тот же промежуток времени его компоненты соберутся
вместе, ио на противоположном направлении оси у.
4.3.4. Оси и фазы
Итак, с одной стороны, мы совершенно произвольным образом
выбирали направления в плоскости х — у, располагая поле Bi вдоль оси
х и создавая л/2-импульсом начальную намагниченность образца вдоль
оси у. С другой стороны, возвращаясь после импульса в лабораторную
Импульсная спектроскопия ЯМР
113
Вращающаяся
Система
коор&инат
Рис. 4.13. Тщательно проанализировав поведение намагниченности образца в
лабораторной системе координат после (л/2)я-импульса, мы обнаружим два
радиочастотных сигнала, отличающиеся только по фазе на 90е.
поспв
(и/2)у- импульса
систему координат, мы по-прежнему находили два «в некотором смысле
ортогональных» радиочастотных сигнала, осциллирующие вокруг раз-
личных осей неподвижной системы координат. Эта ситуация требует
дополнительных разъяснений, поскольку именно поведение намагничен-
ности после импульса в неподвижной системе координат дает нам ключ
к пониманию происходящих событий. Рассмотрим рис. 4.13. Здесь мы
снова возвращаемся к простейшему случаю единственной линии с точно
резонансными опорной частотой и частотой импульса. Во вращающейся
системе координат намагниченность образца поворачивается на 90°
вокруг оси х и остается на оси у. Теперь вернемся в лабораторную
систему и посмотрим, что произойдет, если намагниченность будет
прецессировать с ларморовой частотой.
Предположим, что мы умеем независимо друг от друга детектиро-
вать проекции намагниченности иа оси хну лабораторной системы
координат, но ие будем задумываться, каким конкретно способом это
можно сделать. Они, очевидно, будут различаться только тем, что
непосредственно после импульса у-компонеита будет иметь максималь-
ную величину, а х-минимальную. Иными словами, оии различаются
только фазой’, осцилляция х-компонеиты описывается функцией сииус,
а г-компоиенты - функцией косинус. Однако наводимое в катушке
приемника напряжение пропорционально не намагниченности, а ско-
рости ее изменения, поэтому в нулевой момент времени х-компоиента
создает максимальное напряжение, а у-компонеита-минимальное (про-
изводная синуса-косинус, а производная косинуса-минус сииус). Эти
два сигнала, различающиеся по фазе на 90°, называются сигналами
поглощения и дисперсии. Им соответствуют две различные формы
К 75
114
Глава 4
вращающаяся
система
координат
Рис. 4.14. То же, что и на рис. 4.13, но после (тг/2)у-импульса.
лоренцевой линии, с которыми мы уже встречались в гл. 2. В ЯМР
с непрерывной разверткой спектрометр настроен на регистрацию только
сигнала поглощения (там тоже существуют обе его компоненты, хотя
и используется другая схема возбуждения). В фурье-спектроскопии им
соответствуют действительная и мнимая части комплексного спектра.
Как мы вскоре увидим, в общем случае это смеси двух компонент.
Теперь попробуем проделать все то же самое, но поместим поле В(
вдоль оси у (рис. 4.14). Легко видеть, что мы получим тот же результат,
ио синусная и косинусная компоненты поменяются местами (и косинус-
ная еще поменяет знак). Поверием поле В( еще иа 90 так, чтобы оно
совпало с осью — х (рис. 4.15). Ситуация станет похожа на исходную: но
обе компоненты поменяют знак (их фазы сдвинутся на 180°). Если
сигналы, возбужденные импульсами поля Bi с осей + х и — х, преобра-
зовать независимо и первый из них будет «положительный», то во
втором мы обнаружим «отрицательные» пики. Важно понимать, что это
происходит по причине изменения фазы сигнала, а не от замены
поглощения энергии ее испусканием. В обоих случаях энергия испускает-
ся образцом.
Нам ие нужно подробно рассматривать экспериментальные методы
разделения сигналов поглощения и дисперсии, но полезно в общих
чертах узнать об основах этого процесса. Как уже упоминалось несколь-
ко раз, при детектировании сигнала ЯМР из него вычитается некоторая
опорная частота, в результате чего все сигналы попадают в звуковой
диапазон и могут быть оцифрованы. Мы приравнивали эту частоту
скорости вращения системы координат. Прибор, выполняющий это
вычитание (обычно так называемый двойной балансный смеситель, ио
возможны и другие варианты), контролирует сочетание фаз сигнала
и опорной частоты (это фазочувствительный детектор). Соответствую-
Импульсная спектроскопия ЯМР
115
Вращавшаяся
система
координат
Рис. 4.15. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)_х-импульса.
после
импульса
Wo
♦
щий подбор фазы опорного сигнала позволяет выделять ту или другую
компоненту или любые их смеси.
Если фаза опорного сигнала в точности равна фазе сигнала ЯМР, то
он будет регистрироваться в режиме чистого поглощения. Если фазы
отличаются иа 90°, то будет выделяться чисто дисперсный сигнал.
Однако на практике обычно регистрируется смесь компонент, поскольку
иет никакой необходимости или удобства в настройке прибора иа
какой-либо специальный режим. Точно так же, как мы выбрали частоту
опорного сигнала в качестве скорости вращения системы координат, мы
можем использовать ее фазу для задания осей х и у. Но так как это ие
соответствует процедуре эксперимента иа импульсном спектрометре, мы
будем использовать другое определение, которое сейчас коротко обсу-
дим. Если вы работали иа спектрометре с непрерывной разверткой
с низким магнитным полем, то вам почти наверняка приходилось
подстраивать опорную фазу приемника для получения формы линии,
соответствующей чистому поглощению, когда ее небольшая расстройка
давала примесь дисперсионной компоненты (рис. 4.16).
Рис. 4.16. Влияние расстройки
фазы детектора на вид спектра
известно еще из спектроскопии
ЯМР с непрерывной разверткой
(это один из двух спектров на
частоте 60 МГц во всей книге!).
116
Глава 4
Теперь вы уже можете догадаться о важности «установки поля Bi на
ось х», т. е. настройки фазы радиочастотного импульса. Поскольку
важна только относительная фаза, мы можем просто-напросто назвать
наш первый импульс х-импульсом, и если нужно далее произвести
у-импульс. то можно сместить фазу первого на 90°. Для — х-импульса
потребуется смещение иа 180", для — у-импульса-иа 270° (такие им-
пульсы бывают нужны в некоторых экспериментах). Именно эти фазы
передатчика и задают названия осей во вращающейся системе коорди-
нат. В идеальном случае хотелось бы и опорную фазу приемника
настроить таким образом, чтобы она соответствовала одной из осей, ио,
как уже упоминалось ранее, это оказывается невозможным на импульс-
ных спектрометрах. Фаза приемника связана некоторым произвольным
(но постоянным) соотношением с фазой передатчика, поэтому в экспери-
Рис. 4.17. Во всех экспериментах используются только импульсы с четырьмя
фазами, приведенными на этом рисунке.
Импульсная спектроскопия ЯМР
117
менте регистрируется в общем случае смесь двух компонент сигнала.
После выполнения преобразования Фурье они разделяются численным
способом, который мы обсудим в дальнейшем. На этом этапе исправля-
ются и фазовые ошибки, возникающие по другим причинам.
Все это станет намного яснее, когда мы перейдем к реальным
экспериментам. Введение подходящих фазовых соотношений между
наборами импульсов для воздействия на отдельные компоненты общей
намагниченности - одни из важнейших элементов импульсного ЯМР.
Теперь мы будем обозначать импульсы в форме (я/2)ф, где <р обозначает
фазу импульса и соответственно ось, вокруг которой вращается намагни-
ченность во вращающейся системе координат. Таким образом, (п/2)х-
импульс поворачивает намагниченность вокруг оси х и оставляет ее иа
оси +у; (я/2), поворачивает вокруг оси у и т. д. (рис. 4.17). Повороты
принято считать происходящими по часовой стрелке (реальное направ-
ление зависит от знака у, но, поскольку он постоянен для одного типа
ядер, не имеет значения, какое конкретно направление мы выберем). Во
многих экспериментах меняется также и фаза приемника, которую мы
будем обозначать просто буквами х, у и т.д., подразумевая при этом,
что при необходимости в дальнейшем будут использованы процедуры
численной коррекции фазы. Дополнительные сложности, вносимые фа-
зой приемника, будут обсуждены в следующем разделе,
4.3.5. Квадратурное детектирование
Вам может показаться, что данный раздел относится только к
специалистам, поскольку квадратурное детектирование-это некоторая
инструментальная методика, предназначенная для повышения чувстви-
тельности. Если вас интересуют только одномерные спектры, то такую
точку зрения вполне можно допустить. Однако проблемы, которые мы
намерены сейчас рассмотреть, снова появятся в слегка измененном виде
в двумерной спектроскопии ЯМР, и нам будет намного легче ориенти-
роваться в них, если мы сначала разберемся с одномерным случаем.
Кроме того, при регистрации одномерных спектров с очень большим
динамическим диапазоном неидеальность систем квадратурного детек-
тирования может вызывать появление квадратурных отражений. Метод
подавления этих отражений служит введением в теорию фазовых циклов,
которая чрезвычайно важна в многоимпульсных экспериментах. Если вы
впервые знакомитесь со спектроскопией ЯМР, то вам лучше пока
пропустить этот раздел. Вернитесь к нему позже, когда почувствуете
необходимость разобраться в этом материале.
Мы уже много раз говорили о том, что сигналы в импульсном ЯМР
регистрируются посредством вычитания из них опорной частоты, близ-
кой к резонансной частоте ядра, оцифровки и последующего их пре-
образования в частотный спектр. Свойства преобразования Фурье соз-
дают дополнительные проблемы при выборе опорной частоты. На
первый взгляд может показаться, что лучше всего поместить ее в центр
118
Глава 4
Рис. 4.18. Середина спектрального окна кажется самым подходящим местом для
помещения опорной частоты детектора, однако при этом нам нужно будет
регистрировать как положительные, так и отрицательные частоты. Они будут
различимы только при использовании двухфазного (квадратурного) детектиро-
вания.
спектрального диапазона, так чтобы половина линий имела частоты
большие, а половина-меньшие, чем опорная (рис, 4.18), Основное пре-
имущество такого выбора состоит в том, что ои позволяет понизить
необходимую скорость работы аналого-цифрового преобразователя
(АЦП). Если ширина спектра составляет F Гц, то необходимо обраба-
тывать частоты только до F/2 (при этом в соответствии с критерием
Найквиста АЦП должен работать со скоростью F Гц). Но, к сожалению,
при использовании только одной компоненты сигнала для преобразова-
ния Фурье в получающемся частотном спектре положительные и отрица-
тельные частоты будут неразличимы. Если во временном представлении
ССИ содержится сигнал с частотой v0 + 5 (где 5 - расстояние от сигнала
до опорной частоты), то в частотном спектре ему будут соответствовать
два пика ± 8, поскольку положительные и отрицательные частоты'
неразличимы.
Чтобы понять, как это все происходит, вообразим себя ЯМР-детекто-
ром и посмотрим на сигналы во вращающейся системе координат.
Чтобы отличить друг от друга положительные и отрицательные часто-
ты, нам нужно узнать, в какую сторону прецессируют соответствующие
им векторы намагниченности во вращающейся системе координат,
которая вращается, разумеется, со скоростью v0. Если мы наблюдаем
только проекцию вектора на одну какую-либо ось, то независимо от
Импульсная спектроскопия ЯМР
119
сигнал
ЯМР
чувст^итель-
- ный
Зитек тор
О-опорная
фаза
С*)о
90-опорная
Фаза
АЦП
\ память
'компьютера А
Фазо-
чувств отель-
л ный
детектор
АЦП
тьютера В
Рис. 4.19. Схема эксперимента для квадратурного детектирования.
направления его вращения мы увидим только осциллирующую вниз
и вверх намагниченность. Такой взгляд слишком узок для полного
понимания происходящих событий. Мы можем его расширить, наблю-
дая одновременно две проекции вектора намагниченности иа разные оси.
Сравнивая величины этих проекций друг с другом в каждый момент
времени, мы сможем легко определить направление вращения вектора.
Такое наблюдение сигнала называется квадратурным детектирова-
нием. Реально оно состоит в использовании двух фазо чувствительных
детекторов с одинаковыми опорными частотами, ио с различающимися
на 90° фазами (рис. 4.19). Для простоты предположим, что первый
настроен иа регистрацию косинусной компоненты намагниченности,
а второй - синусной (на практике каждый из них регистрирует смесь
обеих компонент). Оба сигнала оцифровываются отдельно друг от друга
и становятся действительной и мнимой частями комплексного спектра.
После выполнения комплексного преобразования Фурье мы получим
правильно распределенные положительные и отрицательные частоты.
Чтобы понять, почему это происходит, нам пришлось бы углубиться
в математику преобразования Фурье дальше, чем это нужно неспециа-
листу. Однако мы вполне можем понять происходящее на качественном
уровне, если используем одно из известных свойств преобразования
Фурье-сохранение симметрии функции.
Под симметрией функции подразумевается ее поведение при измене-
нии знака переменной. Мы выделим два случая: если /(— х) — j (х), то
функция f будет называться четной, если же/(— х) = — /(х),-нечетной.
Мы сразу сообразим, что синус-это нечетная функция, а косинус-чет-
иая (рис. 4.20). Четность или нечетность функции во временной области
(т.е, наличие косинусной или синусной компоненты) сохранится и в
частотной области, где будет проявляться в совпадении или различии
знаков амплитуды двух компонент комплексного спектра поглощения на
частотах + 6 и — 8. Следовательно, выполнив преобразование, вклю-
120
Глава 4
Рис. 4.20. Очевидно, что си-
нус-это нечетная функция, а
косинус-четная (см. текст).
__ четная
составляющая
— нечетная
составляющая
сумма
Рис. 4.21. Для того чтобы понять, как различаются положительные и отрицатель-
ные частоты, вообразим себе две компоненты комплексного спектра, полученные
раздельно и затем совмещенные.
чающее обе компоненты, т. е. комплексное преобразование данных
квадратурного детектирования, мы в частотном спектре одну линию
усилим, а вторую уничтожим. На этом нашу дискуссию можно считать
исчерпанной. На рис. 4.21 приведена иллюстрация из книги Фукусимы
и Рой дера [2], где вы можете найти более подробное обсуждение
предмета.
Может показаться, что вполне пригоден и такой способ регистрации,
когда опорная частота помещается иа один из краев спектрального
диапазона и все детектируемые сигналы имеют одинаковый знак
(рис. 4.22). Одиако при этом появляются некоторые сложности. Даже
если мы можем гарантировать, что по одну сторону опорной частоты не
будет сигналов, то там все же неизбежно будет шул*. В отсутствие
квадратурного детектирования он будет накладываться иа шум в инте-
ресующем нас диапазоне, понижая отношение сигнал/шум на ^/2 (имен-
но иа ^/2, а ие на 2, потому что шум имеет случайную природу;
применяется статистическая теорема о центральном пределе).
Повышение отношения сигнал/шум-одно из принципиальных пре-
имуществ квадратурного детектирования, и именно по этой причине оно
Импульсная спектроскопия ЯМР
121
Гц
Рис. 4.22. Такое помещение опорной частоты детектора позволяет решить проб-
лему отрицательных частот, но при однофазном детектировании на спектр будет
накладываться дополнительный шум (находящийся справа от опорной частоты
на нашем рисунке).
так широко используется иа современных спектрометрах. Но есть
и другие более или менее существенные достоинства. При помещении
опорной частоты в центр спектрального диапазона требуется регистра-
ция максимальной частоты, в 2 раза меньшей ширины спектра, что
снижает требования к скорости АЦП. Но здесь уже требуются два АЦП,
и суммарные затраты на оцифровку можно считать неизменными. На
большинстве спектрометров частота импульсов совпадает с опорной,
поскольку в общем случае не очень удобно генерировать несколько
близких радиочастот. В отсутствие квадратурного детектирования это
означало бы помещение частоты импульса ие в центр, а на край
спектрального диапазона, что усиливает эффекты расстройки резонанс-
ных условий (разд. 4.3.2).
Проблемы квадратурного детектирования. Как это обычно бывает,
использование квадратурного детектирования помимо повышения чув-
ствительности создает и некоторые сложности. Основная проблема
состоит в том, что мы рассчитываем на исчезновение ненужных пиков
при сложении двух сигналов, полученных из разных блоков прибора.
Это будет достигаться только при точном равенстве амплитуд сигналов
в двух каналах и различии их фаз точно иа 90°. В действительности же
это идеальное условие недостижимо, и в спектрах присутствуют не-
большие остаточные сигналы от неполного подавления так называемых
122
Глава 4
Рис. 4.23. Квадратурные отражения могут вносить искажения в спектры с широ-
ким динамическим диапазоном. Они в значительной степени подавляются при
использовании фазового цикла CYCLOPS.
отраженных пиков. Они имеют вид отражения пиков от центра спектра,
и их легко отличить от небольших настоящих сигналов по изменению
фазы и частоты при изменении опорной (рис. 4.23). Обычно амплитуда
таких квадратурных отражений не превышает 1% основного сигнала,
поэтому они мешают только при измерении слабых пиков в присутствии
сильных.
Фазовые циклы. Квадратурные отражения можно значительно умень-
шить балансировкой каналов, применив простую идею о фазовых
циклах. Здесь ие так важны специфические детали, как сама концепция,
поскольку она широко применяется в многоимпульсных экспериментах.
Вернемся к рис. 4.19. После предварительного усиления до необходи-
мого уровня сигнал ЯМР разделяется с помощью опорной частоты на
две компоненты, которые независимо друг от друга оцифровываются
и помещаются в две разные области памяти компьютера А и В. Легко
видеть, что любые различия двух каналов приемника перестанут про-
являться, если мы будем получать данные в результате усреднения
многократных прохождений, и каждый канал будет давать одинаковый
вклад как в данные области А, так и в данные области В. Но при этом
мы не должны забывать, что в А можно помещать только данные
с фазой 0°, а в В-только с фазой 90\ Поэтому при смене каналов мы
должны поменять и фазы проходящих через них сигналов.
Каким образом в каналах можно изменять фазы сигналов? Вероятно,
Импульсная спектроскопия ЯМР
123
Рис. 4.24. Так на двух первых шагах цикла CYCLOPS происходит обмен
потоками данных между каналами приемника. Это позволяет усреднить их
несбалансированность.
можно просто поменять фазы опорной частоты. Но здесь нужно быть
очень осторожным, поскольку сама опорная частота вполне может
служить источником разбалансировки каналов. Нам хотелось бы, не
меняя аппаратурных режимов работы приемника, поменять местами
выводы данных в области А и В (что представляет собой только
программную компьютерную операцию) и в то же время сместить фазу
сигналов иа 90; . Мы уже видели в разд. 4.3.4, как это можно сделать,-
просто сместив на 90" фазу импульса. Это позволит поменять местами
сигналы поглощения и дисперсии именно так, как нам нужно. Внима-
тельно посмотрев на рис. 4.24, вы заметите, что один из сигналов при
этом еще и меняет знак; значит, после оцифровки его нужно дополни-
тельно умножить на —1. Теперь нужно только соответствующим обра-
зом обработать данные, что умеют делать управляющие программы
всех спектрометров. В результате мы получим двухшаговый фазовый
124
Глава 4
цикл, меняющий на различных прохождениях фазу передатчика с 0 на
90° и одновременно переназначающий области памяти компьютера для
размещения данных.
Неплохо сместить фазу передатчика и на 180°, заменив при этом
сложение текущих данных с областями А и В на вычитание. Это
позволит уничтожить все ложные сигналы, фаза, которых ие зависит от
фазы импульса. Такие сигналы могут образовываться из-за аппаратур-
ных дефектов или каких-либо внешних наводок. Совместив эту процеду-
ру с каждым из прохождений предыдущего цикла, мы получим четырех-
шаговый цикл CYCLOPS (табл. 4.1), который сейчас используется
в качестве стандартного на всех спектрометрах, оснащенных квадратур-
ным детектором. На рис. 4.23 приведено также сравнение интенсивности
квадратурных отражений, полученных с применением и без применения
цикла CYCLOPS. При определении фазового цикла принято обозначать
различные режимы приемника х, у, —хи — у, как будто бы при этом
действительно происходит переключение фазы опорного сигнала. Одна-
ко подробности реальной работы спектрометра остаются неясными, они
зависят от его программного обеспечения.
Таблица 4.L Фазовый цикл CYCLOPS для подавления квад-
ратурных отражений. Два последних столбца отражают
требующуюся при каждом прохождении обработку данных.
Два канала приемника, отличающиеся по фазе на 90°, обозна-
чаются цифрами 1 и 2, а два блока памяти-буквами А и В
Прохождение Фаза импульса Режим приемника А В
1 д- X + 1 4-2
2 У У -2 + 1
3 — X — X - 1 - 2
4 — у — у + 2 - 1
Фазовые циклы широко используются в мн ого импульсных экспери-
ментах для подавления артефактов (как в нашем примере) и для
селективного воздействия на отдельные компоненты намагниченности.
Это будет более подробно обсуждаться в других местах книги, особенно
в главах, посвященных двумерной спектроскопии. Для того чтобы цикл
производил желаемый эффект, общее число усредненных прохождений
должно быть кратно числу его шагов. Во многих двумерных эксперимен-
тах это требование и определяет суммарные затраты времени. Конечно,
разработку новых циклов лучше предоставить специалистам в этой
области, но и вам не помешает приобрести некоторый опыт их интер-
претации на своем спектрометре. Часто основные усилия при отлажива-
нии методик новых экспериментов приходится тратить на исправление
текста программы, управляющей фазами. Хотя это и не очень сложно,
Импульсная спектроскопия ЯМР
125
но малейшие ошибки в фазовой части программы могут привести
к совершенно неожиданным и непонятным результатам. По этой причи-
не тестировать новые методики следует на таких образцах, для которых
заранее известен ожидаемый результат, и желательно, чтобы этот
результат можно было получить быстро.
Метод Редфилда. Для полноты добавим, что существует еще одна
широко используемая реализация схемы квадратурного детектирования.
Здесь нас опять больше всего будет интересовать то, что аналогичные
методы используются в двумерной спектроскопии, и вполне может
оказаться, что ваш спектрометр (например, прибор фирмы Bruker)
использует одни из них. Целью методики служит проведение квадратур-
ного детектирования с помощью только одного АЦП, который пред-
ставляет собой довольно дорогостоящий компонент спектрометра.
Это достигается оцифровкой сигнала со скоростью, в 2 раза пре-
вышающей ширину спектра, т. е. с такой же, как при однофазном
детектировании. Но опорная частота, как и при нормальном квадратур-
ном детектировании, помещается в центр спектра. Фаза приемника
увеличивается иа 90° после оцифровки каждой точки. Понять это можно,
представив себе оцифровку единственной частотной компоненты. Из-за
изменения фазы приемника фаза оцифровываемого сигнала на каждой
точке будет получать приращение, иа 90° большее, чем ожидалось.
Поэтому аналого-цифровому преобразователю будет казаться, что это
просто сигнал более высокой частоты. Если ширина всего спектрального
диапазона F и мы ведем оцифровку со скоростью 2F, то смещение фазы
на 90° (=1/4 цикла) приведет к кажущемуся увеличению частоты иа
2F/4 = F/2. Если вспомнить, что мы оцифровывали частоты от — F/2 до
F/2 (относительно опорной), то прибавление к ним F/2 даст нам
диапазон от 0 до F. Таким образом, проблема отрицательных частот
решена. Исходные данные для преобразования Фурье теперь пред-
ставляют собой набор действительных чисел, а не комплексных пар,
поэтому требуется несколько иная их обработка. Поскольку после
выборки каждой точки фаза изменяется на определенную величину,
метод получил название пропорционального времени фазового инкре-
мента или TPPI (Time Proportional Phase Increment).
Однако на практике довольно сложно так часто изменять фазу
приемника (тем чаще, чем больше ширина спектра). Удобный выход из
этой ситуации состоит в использовании двух детекторов, как
при обычном квадратурном детектировании, и только одного АЦП
(рис. 4.25). Изменение фазы приемника на 90° достигается переключе-
нием АЦП с одного детектора на другой. Сдвиги на 180 и 270° можно
получить умножением на — 1 данных со сдвигом 0 и 90° соответственно.
В этом эксперименте, так же как и в двухканальном детектировании,
могут получаться квадратурные отражения, подавить которые можно
с помощью аналогичных фазовых циклов.
126
Глава 4
Рис. 4.25. Одна из реализаций схемы квадратурного детектирования Редфилда
(TPPI).
4.3.6. Фазовые ошибки и коррекция фазы
В первое же свое знакомство с фурье-спектрометром вы столкнетесь
с необходимостью коррекции фазы частотного спектра после выполнения
преобразования. На одномерных спектрах возможна более или менее
осмысленная настройка фазы. Но все же не следует забывать, что ее
нельзя установить точно, поскольку она зависит от ряда предположений
о характере фазовых ошибок, которые могут оказаться неправильными.
При переходе к двумерной фазочувствительной спектроскопии картина
резко усложняется. Обычно мы уже не можем настраивать фазу в интер-
активном режиме (т. е. поворачивая ручку фазы и наблюдая за одно-
временным изменением спектра на дисплее). Вместо этого приходится
разрабатывать какие-то методы определения необходимой коррекции
фазы по отдельной части данных или по подходящему одномерному
модельному спектру. Поэтому мы попробуем разобраться в причинах
возникновения фазовых ошибок в фурье-спектрах и в численных методах
их компенсации. Опять-таки этот раздел не будет существенным для
понимания остальных частей книги, и вы можете не изучать его прямо
сейчас, а вернуться к нему позже, когда почувствуете необходимость
разобраться в описываемых здесь вопросах.
Мы уже несколько раз упоминали один из источников фазовых
ошибок, который заключается в трудности настройки фазы опорной
частоты таким образом, чтобы в обоих каналах регистрировались
сигналы чисто поглощения и дисперсии. Возникающая при этом фазовая
ошибка будет одинаковой на протяжении всего спектра, т. е. изменение
фазы не зависит от частоты. При неправильной настройке фазы опорной
частоты мы получим спектр, действительная (&) и мнимая (#) части
которого будут представлять ие абсорбционную (А) и дисперсионную
(D) компоненты, а их смесь.
Итак, нам хотелось бы получить
^ = А, X = D (4.15)
Импульсная спектроскопия ЯМР
127
-J-------------1_____________I______________I_____________L.
0 0,25 В, 0,5В, 0,755, В,
расстройка
Рис. 4;26. Расстройка резонансных условий вызывает изменение фазы сигнала
после л/2-импульса. На рисунке представлены экспериментальные линии, по-
лученные с помощью очень слабого поля Bt (— 80 Гц); другими источниками
фазовых ошибок можно пренебречь. Заметьте, что с увеличением расстройки
резонанса амплитуда сигнала изменяется незначительно.
ио вместо этого мы имеем
$? = AcosG + Dsin0, $ = Asin0 — Dcos0 (4.16)
где 0-фазовая ошибка. Мы, очевидно, можем восстановить отдельные
А- и Ь-компоиенты, взяв линейную комбинацию St и
А = ^cosG + /sin0, D = J? sinO - /cos О (4.17)
Величина 0 определяется экспериментальным способом при наблюдении
зависимости от иее формы линии.
Существует много разнообразных причин, вызывающих появление
зависящих от частоты фазовых ошибок. В разд. 4.3.2 мы уже наблюдали
эффект, возникающий при отклонении импульса от условий резонанса.
На рис. 4.26 представлено увеличивающееся изменение фазы при посте-
пенном увеличении разности частот импульса и возбуждаемой линии.
Еще один неизбежный источник частотио-зависимых ошибок фазы
состоит в том, что мы не можем начинать выборку данных сигнала ССИ
сразу же вслед за импульсом. Приемник нельзя включать как минимум
во время действия самого импульса, имеющего конечную длительность.
Кроме того, после завершения импульса еще требуется небольшая
(порядка десятков микросекунд) задержка для восстановления электро-
ники приемника. Вносимые таким образом фазовые ошибки иллю-
стрируются рис. 4.27. Во время задержки перед началом выборки сигна-
лы различной частоты успевают изменить свою фазу иа разные величи-
ны. И наконец, электроника приемника сама может вносить изменения
фазы в различные частоты. Это в особенности относится к фильтрам
звуковых частот, использующимся после детектирования перед оциф-
ровкой. Все эти источники вносят дополнительную фазовую ошибку,
128
Глава 4
f-0
первая оцифрованная точка
Рис. 4.27. Задержка выборки данных служит важным источником частотно-зави-
симых ошибок фазы. За время, протекающее до выборки первой точки, фазы
сигналов с различными частотами, совпадавшие непосредственно после импуль-
са, успевают разойтись на существенную величину.
которая, как мы считаем, линейно зависит от частоты v. Таким образом,
6 можно представить как
0 (v) = а + р v
(4Л8)
где а и р - два экспериментально подбираемых параметра. Лучше всего
подбирать их следующим образом: выбрать два пика, находящиеся на
большом расстоянии друг от друга, установить а по первому из них
и p-по второму. При этом влияние частотно-зависимого члена будет
максимальным, что позволит легко заметить небольшие фазовые
ошибки.
При некоторых обстоятельствах подобная настройка фазы может
быть очень трудна или вообще невозможна. Предположение о линейном
характере фазовых ошибок может оказаться неверным. Но, даже если
оно и верно, оценки правильности формы линии сигнала поглощения
весьма субъективны, особенно когда в спектре нарушена базовая линия.
Ее нарушения в большей степени оказываются иа краях спектрального
диапазона. Поэтому, если вы хотите точнее произвести коррекцию фазы,
постройте эксперимент так, чтобы интересующие вас пики оказались
в центре спектрального окна. В спектрах, полученных с небольшим
временем выборки и недостаточной оцифровкой (обычная ситуация
в спектроскопии 13С), могут появляться искажения формы линии,
похожие на фазовые, но тем не менее имеющие иную природу [3].
4.4. Релаксация
4.4.1. Введение
В большинстве видов спектроскопии мы вводим в образец некую
энергию, например пропускаем через него свет, и видим, что на одних
частотах она поглощается в большей степени, а на других-в меньшей.
Куда же при этом девается поглощенная энергия? Большинство людей
ответят на это: «Она преобразуется в теплоту». Действительно, вопрос
о том, куда уходит энергия, редко встречается в спектроскопии, по
Импульсная спектроскопия ЯМР
129
крайней мере в оптической. Но в спектроскопии ЯМР этот вопрос или
его более интересный вариант-«Как быстро это происходит?» - напро-
тив, приобретает первостепенную важность. Причина этого состоит
в том, что расстояние между рассматриваемыми в ЯМР уровнями
энергии настолько мало, что часто время, требующееся для установле-
ния равновесия между ними, оказывается очень большим в шкале
времени эксперимента. Это обстоятельство и диктует условия его
проведения.
При наблюдении электронных переходов в молекуле посредством
облучения ее ультрафиолетовым светом возбужденные электроны воз-
вращаются иа исходные орбитали очень быстро (за несколько десятков
пикосекунд), и измерить время жизни возбужденного состояния оказы-
вается совсем непросто. В ЯМР возбужденные состояния могут суще-
ствовать на протяжении нескольких минут. Это создает большие не-
удобства в импульсном ЯМР, идея которого состоит в многократном
повторении возбуждения ядра с целью повышения отношения сигнал/
шум при усреднении данных различных прохождений. И действительно,
успех эксперимента в фурье-спектроскопии ЯМР во многом определя-
ется скоростью возвращения наблюдаемого ядра из возбужденного
состояния в основное, и если она очень велика или мала, то эксперимент
может не дать требующейся информации.
Поскольку мы в большей степени химики, чем физики, мы можем
заинтересоваться релаксацией (наиболее общий термин, обозначающий
восстановление равновесия) по двум причинам. Первая состоит в том,
что описываемые далее параметры коррелируют со структурой молекул
и в особенности с их движением. Но, к сожалению, их связь со строением
понятна в значительно меньшей степени, чем в случае химических
сдвигов или констант спин-спииового взаимодействия. Хотя иногда
релаксационные измерения могут удачно разъяснить структурные воп-
росы, полагаться на них в полной мере все же не следует. Объясняется
это тем, что довольно трудно провести точные и воспроизводимые
измерения времен релаксации, поскольку, как мы увидим, в них вносит
вклад множество посторонних (с химической точки зрения) факторов.
По этой причине и из-за стремления вообще ие обсуждать в нашей книге
эмпирических зависимостей мы не будем касаться этой стороны пробле-
мы релаксации [4].
Второй и наиболее важный для нас аспект состоит в том, что
изучение процессов релаксации необходимо для построения экспери-
мента ЯМР. Очевидность этого станет понятна, если вспомнить, что
даже в простой одноимпульсной схеме то, что мы регистрируем под
названием спада свободной индукции, как раз и представляет собой
происходящий посредством процессов релаксации спад намагниченно-
сти. С практической точки зрения информация о временах релаксации
нужна нам для достижения максимальной чувствительности, за которую
приходится бороться даже на лучших современных спектрометрах.
Обсуждаемая далее концепция поперечной релаксации привела к появле-
9-75
130
Глава 4
нию идеи спинового эха, которая легла в основу многих интересных
экспериментов. Введенная нами модель вращающейся системы коорди-
нат позволит легко разобраться в различиях нескольких путей релакса-
ции, важных для спектроскопии ЯМР.
4.4.2. Двигаясь к равновесию
Если иаш диамагнитный образец не находится в магнитном поле, то
в нем не будет возникать намагниченность. Можно предположить, что
при вводе его в магнит наведенное поле появится не мгновенно, а будет
устанавливаться в течение некоторого промежутка времени. Вычисление
его длины на основании фундаментальных законов природы и общих
подходов к вопросам равновесия требует широкого привлечения все-
возможных приближений и представляет собой отдельный раздел физи-
ки. Теория Блоха с помощью предположения об экспоненциальном
характере релаксации сводит эту проблему к измерению коистаиты
скорости процесса. Погрузившись с головой в вывод формул времен
релаксации, очень легко забыть о том, что экспоненциальный характер
этого процесса - только гипотеза, а не универсальный факт. К счастью,
для молекул в растворах, с которыми мы имеем дело, такое приближе-
ние очень точно отражает действительность. Выразим эту идею форму-
лами. Наводимое в образце поле будет расти в соответствии с уравне-
нием (рис. 4.28)
.zm, м„-м, (419)
dt 7j
где Мо-равновесная намагниченность. Если намагниченность в началь-
ный момент времени равна нулю, то
Mz = Мо(1 - e"t/T0 (4.20)
Константа 7] известна как время продольной или спин-решеточиой
релаксации. Существование второго термина объясняется тем, что
Рис. 4.28. Продольная релаксация. В предположении об экспоненциальном на-
растании напряженности наведенного поля мы должны бесконечно долго
ожидать достижения Мо.
Импульсная спектроскопия ЯМР
131
разработка основных концепций релаксации проводилась на твердых
телах, где наибольший интерес представляет взаимодействие магнит-
ного момента с кристаллической решеткой. В случае растворов этот
термин не отражает характера происходящих процессов, и мы не будем
его употреблять; однако он очень широко используется в литературе по
ЯМР. Первый термин-продольная релаксация-будет напоминать нам
о том, что имеется в виду поведение z-компоненты намагниченности.
Мы предполагаем, что при отклонении вектора намагниченности от оси
z и отсутствии внешних воздействий он будет возвращаться на эту ось по
экспоненциальному закону с константой 7].
Теперь мы можем вернуться к импульсному эксперименту во вра-
щающейся системе координат и добавить некоторые детали (рис. 4.29).
Мы утверждали, что после воздействия ir/2-импульса вектор объемной
намагниченности бесконечно долго прецессирует вокруг оси z. Применяя
к нему модель экспоненциальной релаксации, мы получаем, что z-иамаг-
ниченность будет восстанавливаться с константой Тх, и, следовательно,
намагниченность в плоскости х — у будет исчезать как минимум с такой
же скоростью. Вскоре мы увидим, что иногда она может исчезать
быстрее, чем восстанавливается z-намагниченность, но обратная ситуа-
ция, очевидно, невозможна. Нет причин предполагать, что все линии
сложного спектра будут релаксировать с одной и той же скоростью,
поэтому следует ожидать существования набора различных констант Тх
для разных ядер молекулы. Из конечного времени жизни возбужденного
состояния вытекает конечная ширина резонансной линии в частотном
спектре. Поскольку время ЯМР-релаксации в растворах в большинстве
случаев довольно велико, резонансные линии в спектре ЯМР оказывают-
ся очень узкими в сравнении, например, с УФ-спектрами поглощения.
Почему время релаксации Тх обычно велико? Для ответа на этот
вопрос потребовалось бы несколько самостоятельных книг, ио мы
можем попробовать разобраться в этой проблеме хотя бы на качествен-
ном уровне. Прежде всего заметим, что небольшие энергии ЯМР-пере-
ходов настолько малы в сравнении с общей тепловой энергией образца,
что с их рассеянием не возникает абсолютно никаких проблем. Следова-
□о
I
Рис. 4.29. Эволюция спиновой системы после импульса с учетом релаксации.
9*
132
Глава 4
тельно, релаксация замедляется не по причине невозможности рассеяния
энергии, а из-за недостатка путей для ее вывода из спиновой системы.
Мы знаем, что вероятность самопроизвольного излучения для случая
близко расположенных энергетических уровней чрезвычайно мала (по-
рядка 10-25 переходов в секунду), и ею можно пренебречь. Таким
образом, релаксация должна происходить за счет стимулированного
излучения. Большие наблюдаемые величины Т\ свидетельствуют об
отсутствий подходящих источников стимулирования.
Иными словами, поскольку ЯМР-переходы инициируются осцил-
лирующим магнитным полем, а при нормальных условиях регистратши
спектра полей с подходящей частотой не так уж много, спиновая система
ядра не имеет хорошей энергетической связи с окружающей средой. Мы
будем строить нашу теорию релаксации на оценках эффективности
инициирования ЯМР-переходов подходящими полями. Основным ис-
точником таких полей в растворе для ядер со спином 1/2 служит
магнитное (диполь-дипольное) взаимодействие между ядрами, которое
модулируется движением молекул. Следовательно, можно предполо-
жить, что скорость релаксации будет зависеть от таких параметров, как
температура, вязкость раствора, размер и структура молекул и иногда
напряженность постоянного магнитного поля. Эти сложные вопросы
широко обсуждаются в классических учебниках по ЯМР, например
в книгах Абрагама [5] и Сликтера [1].
Разработать методику эксперимента для измерения времен релакса-
ции не так уж трудно. Для этого подойдет любая импульсная последова-
тельность, дающая спектр с зависящей от времени релаксации интенсив-
ностью сигналов. Один из популярных методов представлен на рис. 4.30
(это наш первый многоимпульсный эксперимент!). Его идея состоит
в использовании следующей последовательности; л-импульс для инвер-
тирования z-иамагничениости; пауза для возвращения намагниченности
к оси + z; и далее л/2-импульс и измерение сигнала. Заметьте, что если
задержка т будет меньше Т1/1п2, то измеряемый сигнал будет произво-
диться вектором намагниченности, расположенным сначала иа оси — у.
Мы уже знаем, что ему будут соответствовать пики отрицательной
амплитуды, если фаза настроена таким образом, что намагниченность
вдоль оси + у дает положительные пики. Результат этого эксперимента
при различных т приведен на рис. 4.31; измерить величину 7\ можно
Рис. 4.30. Метод инверсии - восстановления для измерения Гр
Импульсная спектроскопия ЯМР
133
Рис. 4.31. Результаты эксперимента по методике инверсии-восстановления.
Группа пиков в слабом поле (т. е. в левой части спектра) имеет чуть большее
время релаксации Т\, чем группа сигналов в сильном поле.
графически, интерполируя высоту пиков. Поскольку схема этого экспе-
римента очень проста, получить точные результаты за разумный проме-
жуток времени будет затруднительно, однако это не должно нас сму-
щать. В большинстве случаев требуется быстро и довольно приблизи-
тельно оценить величины 7^ для оптимизации чувствительности, как это
описано в гл. 7. Подробное обсуждение достоинств и недостатков
различных методов измерения 7^ можно найти в книге [6].
Наконец, мы сами можем частично управлять величинами
контролируя доступность подходящих путей релаксации. Простейшей
причиной ускорения релаксации служит присутствие в образце пара-
магнитных веществ, которые с помощью своих неспаренных электронов
эффективно инициируют ЯМР-переходы. Их можно специально до-
бавлять в образец, если нужно сократить время релаксации для ускоре-
ния эксперимента или для повышения точности количественных измере-
ний. Для этой цели обычно используется ацетилацетонат хрома(Ш).
В то же время приготовленные в обычных условиях образцы неизбежно
содержат примеси парамагнитного вещества - растворенного кислорода,
которые нужно удалить обезгаживанием, если мы хотим получить самые
узкие из возможных линии или собираемся проводить измерения 7\,
ядерного эффекта Оверхаузера или других параметров релаксационных
процессов.
4.4.3. Релаксация в плоскости х — у
Вернемся к простому однонмпульсному эксперименту на образце
с единственной линией, попадающей точно в резонанс с опорной
частотой. Забудем на мгновение о существовании продольной релакса-
ции и рассмотрим поведение объемной намагниченности, остающейся
134
Глава 4
Рис. 4.32. Поперечная релаксация. Различные изохроматы, составляющие объем-
ную намагниченность, постепенно превращаются в «лопасть пропеллера» (свер-
ху); в результате мы регистрируем экспоненциальный спад намагниченности
(внизу).
постоянной в плоскости х — у вращающейся системы координат
(рис. 4.32). Существуют ли в отсутствие продольной релаксации причи-
ны, препятствующие бесконечно долгому сохранению намагниченности?
Вспомнив о том, что объемная намагниченность складывается из боль-
шого числа отдельных ядер, разбросанных по всему объему образца, мы
можем предложить самую прозаическую причину: постоянное магнит-
ное поле не может быть абсолютно однородным.
Мысленно разделим образец на малые области, в пределах каждой из
которых поле можно считать абсолютно однородным. Общая намагни-
ченность складывается из намагниченности отдельных областей. Каж-
дой из них будет соответствовать вектор в неподвижной системе
координат, прецессирующей с точно заданной скоростью (такие векторы
часто называют изохроматами) но частота векторов различных облас-
тей не будет совпадать. Во вращающейся системе координат мы полу-
чим суммарный вектор, изначально помещенный на ось у и далее
«размазывающийся» в плоскости х — .у, поскольку одни из изохроматов
прецессируют чуть быстрее, а другие-чуть медленнее вращения системы
координат (рис. 4.32). Таким образом, общая намагниченность будет
спадать даже в отсутствие продольной релаксации. Этот процесс не
сопровождается изменением энергии образца, поскольку не происходит
переходов между энергетическими уровнями, но он снижает упорядочен-
ность системы. Иными словами, энтальпия образца остается постоян-
ной, а энтропия повышается.
Этот механизм также представляет собой форму релаксации и назы-
вается поперечной или спин-спиновой релаксацией. Опять же второй
термин может создать некоторую путаницу, и поэтому мы не станем его
употреблять, хотя вскоре и коснемся причин его возникновения. Слово
«поперечная» будет напоминать нам о том, что процесс происходит
Импульсная спектроскопия ЯМР
135
в плоскости х — у и не обязательно распространяется на ось z. Мы снова
будем считать, что ои развивается по экспоненциальному закону и
характеризуется константой Т2- На практике невозможно разделить
вклады в потерю упорядоченности от неоднородности магнитного поля
(которая представляет собой аппаратурный недостаток) и от других
причин (см. далее), к которым обычно и относят символ Т2. Константа
реально наблюдаемого спада намагниченности, которая может состоять
в основном из вклада неоднородности поля, в общем случае обозначает-
ся Г}.
Все процессы, сопровождающиеся потерей поперечной намагничен-
ности, включая и ее возвращение на ось z, дают вклад в величину Т2.
Таким образом, при отсутствии всех механизмов поперечной релаксации
Т2 должна быть равной Ти поскольку переход намагниченности на ось
z будет, очевидно, сопровождаться ее уходом из плоскости х - у. При
нормально настроенной однородности поля такая ситуация довольно
часто встречается в жидкости, поэтому огибающая ССИ будет иметь
вид экспоненты с константой ’/(. В твердых телах, напротив, каким бы
однородным ни было поле, константа Т2 будет очень малой по причине
различия локальных магнитных полей вследствие неоднородности
окружения молекул, а Tlt наоборот, будет очень большой из-за отсут-
ствия вклада в релаксацию движения молекул. Обе причины серьезно
затрудняют ЯМР в твердых телах.
4.4.4. Спиновое эхо
Введение. Если подействовать иа образец двумя последовательными
радиочастотными импульсами с небольшой (по сравнению с задерж-
кой между ними, то мы увидим чрезвычайно интересное явление.
Следить за поведением намагниченности удобнее всего при использова-
нии последовательности п/2-т-л (рис. 4.33), хотя подобный эффект
производят и импульсы других длительностей. Рассмотрим еще раз
простейшую схему с единственной линией в резонансных условиях.
После воздействия ir/2-импульса неоднородность магнитного поля по-
степенно превратит набор изохроматов, составляющих намагничен-
ность, в «лопасть пропеллера», т. е. «размажет» вектор в плоскости
% — у. На рис. 4.33 передний край «размазанного» вектора помечен
выйзркп
Рис. 4.33. Образование спинового эха при рефокусировкс намагниченности, фаза
которого «размазалась» из-за неоднородности поля.
136
Г лава 4
знаком « + », поскольку находящиеся с этой стороны изохроматы пре-
цессируют чуть быстрее системы координат, а задний край, где изо-
хроматы прецессируют медленнее, помечен знаком «—». Далее л^-им-
пульс повернет одновременно все изохроматы вокруг оси х и поместит
«размазанный» вектор на ось — у. Обратите внимание, что сторона
вектора со знаком «+» теперь находится позади усредненного положе-
ния изохроматов, а сторона со знаком «—»-перед ним. Следовательно,
быстрые векторы теперь догоняют усредненное положение, а медленные
как бы падают на него. Если скорость векторов осталась такой же, как
и в период «размазывания», то в конце следующего промежутка времени
т они опять соберутся вместе на оси — у: л-импульс рефокусировал их.
Если при проведении этого эксперимента мы начнем наблюдать за
ху-намагниченностью (т. е. сигналом ЯМР) сразу же после л/2-импульса,
то мы, следовательно, должны увидеть его спад до момента я-импульса;
далее сигнал будет нарастать в течение т с и затем снова начнет спадать
(рис. 4.34). Восстановление амплитуды сигнала в момент 2 т называется
спиновым эхом. Оно широко используется в многоимпульсных экспе-
риментах ЯМР.
Спиновое эхо, как мы вскоре увидим, обладает рядом исключительно
полезных свойств. Но сначала более подробно обсудим, что нужно для
его генерации. Основное требование заключается в том, чтобы изо-
хроматы имели неизменную скорость препессии до и после л-импульса.
Если предположить, что скорость зависит от однородности постоянного
поля, то это требование при сохранении неизменного положения облас-
тей образца в течение всего эксперимента. Другими словами, скорость
диффузии молекул внутри образца и скорость его вращения, так как
образец обычно вращается, должны быть небольшими в сравнении с т.
Рис. 4.34. Сигнал, наблюдающийся в эксперименте по спиновому эху. Выборка
данных начата сразу после п/2-импульса. л-Импульс последовал в момент
времени т (импульс вносит возмущения в канал приемника, поэтому сразу после
него си [’нал искажен). Сигнал набрал максимальную амплитуду в момент 2т
и далее затухает, как в обычном эксперименте.
Импульсная спектроскопия ЯМР
137
Оба этих требования никогда полностью ие выполняются на практике,
но при использовании не очень больших величин т всегда удается
получить эффективное спиновое эхо.
Интересно спросить, будет ли равна 7\ скорость затухания серии эхо
с различными т с учетом того, что амплитуда эха не зависит от
однородности поля? На этот вопрос иногда следует ответить «нет»,
потому что помимо неоднородности поля могут существовать и другие
причины потери х — у-намагииченности, не сопровождающейся ее по-
явлением на оси z. Однако для небольших молекул в растворе ответ
чаще всего будет положительным. Один из возможных механизмов
потери х — г-намагниченности - это совместная релаксация двух ядер,
когда одно ядро переходит из основного состояния в возбужденное
одновременно с переходом второго ядра в обратном направлении. При
этом может происходить потеря фазовой когерентности в плоскости
х — у без появления ^-намагниченности. Такому механизму обязан
своим появлением термин «спии-спиновая релаксация», часто неоправ-
данно широко относимый ко всем видам поперечной релаксации. В твер-
дом теле этот механизм играет очень важную роль. Константа, описы-
вающая скорость затухания огибающей ССИ серии спиновых эхо,
называется, как уже упоминалось ранее, естественным временем релак-
сации Т2, поскольку оио не зависит от однородности поля. В жидкостях
оно может отличаться от '1\ по причине химического обмена или
связывания с квадрупольными ядрами (т.е. имеющими спин больше
1/2).
Измерения Т2 с помощью спинового эха. Измерения Т2 сопряжены
с большими экспериментальными трудностями. Простейший подход,
заключающийся в получении серии эхо с различными величинами
т и измерении скорости затухания амплитуды сигнала, не очень хорош,
поскольку с увеличением т начинают сказываться такие эффекты, как
диффузия. В качестве его замены рассмотрим последовательность
(тг/2) х — т — пх — 2т — — 2т — — ...
(эксперимент Карра-Парселла), где мы должны измерять амплитуду
сигнала посредине каждого 2 г-интервала или, как это чаще делается на
практике, измерять каждый раз последнюю амплитуду, повторяя экспе-
римент с увеличивающимся числом задержек. Если выбрать т доста-
точно малым (в сравнении со скоростью диффузии), то проблема
диффузии отпадает.
К сожалению, импульсы работают не точно так, как мы себе это
представляем; в особенности это относится к тс-импульсам. Уже самый
простейший их дефект-неточная длительность - ухудшает эксперимент
Карра-Парселла, поскольку в нем намагниченность постоянно вращает-
ся в одну и ту же сторону, в результате чего все ошибки накапливаются.
В качестве упражнения на владение моделью вращающейся системы
координат сравните эксперимент Карра-Парселла с его модификацией
138
Глава 4
Карра- Парсслла Мсйбума Джилла (CPMG), которая представляет
собой последовательность
(л/2)х — — 2т-лу — 2т-яу — ...
и попробуйте доказать, что а) использование луимпульса вместо
позволяет создать эхо (но на оси +у) н б) ошибки в длительности
импульса не накапливаются. Для решения второй задачи проще всего
рассмотреть поведение только одного самого быстрого изохромата при
использовании вместо л-импульса импульса длительностью л + б, где
8-небольшая величина. Вы должны обнаружить, что эффект от этой
ошибки отсутствует в эхо с четными номерами. Подробное решение
задачи можно найти в книге [6] на с. 281-283.
Эксперимент CPMG служит примером одного из способов образова-
ния названий методов в спектроскопии ЯМР-составление названия из
имен авторов. По отсутствию гласных букв и очень краткой форме
названия мы можем легко догадаться: что CPMG-довольно старый
эксперимент, поскольку в последние годы такие сочетания букв не
используются. Пример недавнего названия, которое значительно лег-
че произносить, - это WAHUHA (ВАХУХА), образовавшееся из имен
Waugh, Huber, Haeberlen. Самое оригинальное название, образованное
из имени автора, получила последовательность MLEV, которая не
просто связана с именем Malcolm Levitt, ио и напоминает каламбур от
названия твердотельного эксперимента MREV, которое в свою очередь
составлено из имен его авторов (Mansfield, Rhim, Elleman, Vaughan).
Альтернативный метод, снимающий все проблемы выбора соавторов по
созвучности фамилий, состоит просто в подобре любой подходящей
аббревиатуры, например DANTE (Delays Alternating with Nutations for
Tailored Excitation-чередование задержек и нутаций для «скроенного»
возбуждения) и WALTZ (Wonderful ALternating phase Technique for Zero
residual splittings удивительная альтернативная фазовая методика для
обнуления остаточного расщепления). Эти названия очень удачны,
поскольку отражают сущность эксперимента (см. гл. 7).
К счастью, нам вообще не нужно измерять Т2. Обычно бывает вполне
достаточно знать время поперечной релаксации Г*, включающее эффект
неоднородности поля. Его можно определить при анализе огибающей
ССИ: за Т% с ее амплитуда должна уменьшиться в I/е раз, т. е. около 0,4
(рис. 4.35). Однако, если в спектре преобладает линия растворителя,
такое измерение будет некорректным, поскольку растворитель как веще-
ство с небольшой молекулярной массой обычно имеет большее время
релаксации. Правильнее будет измерить в преобразованном спектре
ширину линии на полувысоте S v, которая связана с Т* соотношением
5¥=1/яГ*. Оценки величины Т* часто требуются для определения
времени выборки. Особенно это важно в двумерных экспериментах, где
желательно по возможности сократить время выборки без потери
в чувствительности. Величины нужны и при оптимизации частоты
повторения выборок и длительности импульсов (гл. 7), где в зависи-
Импульсная спектроскопия ЯМР
139
Рис. 4.35. ССИ; после с его амплитуда изменяется в 1/е раз.
мости от соотношения частоты повторения с 7] и Т2 используются
различные критерии. Нужны они и при выборе параметров взвешиваю-
щей функции (хотя параметры чаще задаются в терминах ширины
линии, а не временем релаксации).
Полезные свойства спинового эха. Важность понимания природы
спинового эха определяется прежде всего тем, что оно служит составной
частью многоимпульсных экспериментов, обладающей многими полез-
ными свойствами. Первое из иих-это рефокусировка однородности
поля магнита. В гл. 10 мы встретим эксперимент, в котором с помощью
спиновых эхо удается измерять спектры с естественной шириной линии,
т. е. в некоторой степени освободиться от несовершенства реальных
магнитов. Другие полезные свойства эха станут нам понятны при
рассмотрении его воздействия на системы с различающимися химичес-
кими сдвигами и константами спин-спинового взаимодействия..
Сначала разберем наиболее простой случай двух сигналов с раз-
личающимися химическими сдвигами. На рис. 4.36 представлено воз-
действие спинового эха на такую систему. Частота вращения системы
координат выбрана так, чтобы одна линия в ней была неподвижной.
Тогда вторая будет прецессировать с частотой, равной относительному
сдвигу v. Мы уже знаем о том, что в момент пика эха устраняется
влияние неоднородности поля, и не будем изображать на диаграмме
«размазывание» и рсфокусировку каждой линии. Пусть г будет мало
в сравнении с 1/v и прецессирующий вектор не будет выходить за
пределы первой четверти плоскости л — у. Это предположение не влияет
на приводимые доводы, но позволяет упростить рисунки. л-Импульс
переместит постоянный вектор на ось — у, а вращающийся - во вторую
четверть плоскости, где он сохранит свое движение по направлению
к оси — у и догонит постоянный вектор в момент 2 т. Таким образом,
140
Глава 4
Рис. 4.36. Воздействие спинового эха на сигналы с различными химическими
сдвигами.
сигналы с различными химическими сдвигами рефокусируются в момент
пика эха. Этот факт кажется удивительным, поскольку получается, что
с точки зрения эха не существует различий между химическим сдвигом
и неоднородностью поля: и то и другое-просто различные источники
изменения локального ноля на ядре.
Важность этого свойства спинового эха трудно переоценить. Оно
позволяет нам создавать такие воздействия на ядерную намагничен-
ность, которые не зависят от химических сдвигов, по крайней мере в той
степени, которую допускает неидеальность реальных импульсов. Это
значит, что селективные эксперименты, которые неудобно проводить на
практике, можно привести к обобщенному виду и, следовательно, резко
повысить их эффективность. Таким способом, например, простейшая
последовательность SPI (Selective Population Inversion-селективная
инверсия заселенности) превращается в INEPT (Insensitive Nuclei Enhan-
ced by Polarization Transfer - пизкочувствительные ядра, усиленные с
помощью переноса поляризации, см. гл. 6). ;
Избавившись таким путем от неоднородности поля и химического
сдвига, мы можем больше не изображать их на диаграммах систем со
спип-спиновым взаимодействием. Рассмотрим двухспииовую систему
первого порядка, которая дает в спектре два дублета с соотношением
интенсивностей линий 1:1 и константой J. Посмотрим на один из
дублетов (рис. 4.37). На первый взгляд ситуация в точности повторяет
предыдущую с той только разницей, что для удобства опорная частота
помещена в центр дублета, и во вращающейся системе координат
прецессируют обе линии со скоростью + J/2 и — J/2 об/с. До момента
тг-импульса все происходит так же, как и раньше,-два вектора оказыва-
ются во второй и третьей четвертях плоскости х — у (рис. 4.37). Но
теперь, прежде чем предположить, что они будут продолжать двигаться
к оси — у, вспомним, что другое ядро, вызывающее расщепление этой
линии, также испытало воздействие я-импульса. Это воздействие очень
Импульсная спектроскопия ЯМР
141
Рис. 4.37. Спиновое эхо в системе со спин-спиновым взаимодействием (см. текст).
Рис. 4.38. Уровни энергии спиновой системы АХ.
важно, поскольку именно оно объясняет поведение систем с гомоядер-
иым спин-спииовым взаимодействием, отличающееся от всех других
типов расщепления линий.
Для того чтобы понять происходящее, мы должны ненадолго вер-
нуться к квантовой механике нашей системы. Если два состояния ядра со
спином 1/2 назвать а и 0, то две компоненты дублета будут соответство-
вать таким переходам ядра, когда его сосед находится в том или другом
состоянии (рис. 4,38), т.е. переходам (act) (pa) и (а0) -> (00) (в книгах
по ЯМР встречаются разногласия по поводу выбора а или 0 в качестве
состояния с наименьшей энергией; в этой книге будет использоваться
а как наиболее часто употребляемое). Состояния соседнего ядра а и 0
имеют приблизительно равную вероятность, поэтому обе компоненты
дублета имеют равную интенсивность. л-Импульс инвертирует заселен-
ность уровней (разд. 4.2.6), т. е. переводит каждое состояние а в 0 и на-
оборот. Следовательно, ядра, имеющие a-соседа и дающие линию
с частотой, допустим, + J/2 (в действительности это зависит от знака J),
после импульса обнаружат своего соседа в состоянии 0 и начнут
прецессировать с частотой — <7/2. То же самое произойдет и с другим
ядром, т. е. п-импульс поменяет две линии местами.
142
Глава 4
Рис. 4.39. Спиновое эхо дублета с т = 1/4J.
Теперь дополним нашу векторную диаграмму полученной информа-
цией. Мы увидим, что в момент времени 2 т компоненты дублета ие
рефокусируются, поскольку после л-импульса направление их вращения
изменилось. Если т не будет связано некоторым соотношением с J, то
компоненты ие выстроятся ни на какой оси. На рис. 4.37 изображен
именно такой случай. Но в реальных экспериментах чаще требуется
в момент пика эха выстроить компоненты каким-то определен-
ным образом. Например, если мы возьмем т, равное 1/4 J с, то
в случае дублета компоненты окажутся на оси ± х в противофазе
(рис. 4.39).
Очень важно понимать, что отсутствие рефокусировки в спиновой
системе с гомоядерным спин-спиновым взаимодействием связано не
с наличием спин-спин ового взаимодействия, а с се гомоядерностъю.
Компоненты дублета, обусловленного гетероядерным связыванием, на-
пример, сигнала углерода метиновой группы без развязки от протонов,
будут рефокусироваться так же, как сигналы с разными химическими
сдвигами или изохроматы, поскольку протоны не ощутят воздействия
л-импульса иа частоте углерода и обмена компонент не произойдет.
В этом конкретном случае мы можем, по своему усмотренйю, рефо-
кусировать или не рефокусировать компоненты, так как можно генери-
ровать л-импульс и на частоте протонов (если, конечно, спектрометр это
позволяет). В гл. 10 мы обсудим эксперимент, позволяющий этим
способом определить число протонов, связанных с конкретным ядром
13С.
4.5. Импульсный ЯМР
Теперь мы знаем все остальные части импульсной спектроскопии
ЯМР. Это радиочастотные импульсы, поворачивающие намагничен-
ность иа любой угол (обычно на л/2 и я рад). Вращение намагничен-
ности происходит по часовой стрелке вокруг любого из четырех направ-
лений х, у, — хи —у или иногда вокруг других промежуточных
направлений. Выбор оси вращения осуществляется установкой фазы
импульса, которая задает названия осей во вращающейся системе
Импульсная спектроскопия ЯМР
143
координат. Сигнал ЯМР регистрируется с помощью вычитания из него
некоторой постоянной частоты, определяющей скорость вращения
нашей системы координат. Фаза опорной частоты связана с фазой
импульсов некоторым произвольным (но постоянным) соотношением,
конкретный вид которого не имеет значения, поскольку мы подбираем
фазу детектора численным способом при обработке спектра после
преобразования Фурье.
После перехода с оси z в плоскость х — у компоненты намагничен-
ности прецессируют (во вращающейся системе координат) в соответ-
ствии с величиной разности их ларморовой частоты и опорной частоты
детектора. В то же время намагниченность восстанавливается на оси
z с константой и исчезает из плоскости х — j с константой Т*. При
желании мы можем с помощью л-импульса создать спиновое эхо, т. е.
устранить все расщепления компонент намагниченности, кроме возник-
ших по причине гомоядерного спин-спинового взаимодействия, и попут-
но устранить вклад неоднородности постоянного поля в спад попереч-
ной намагниченности. Константа экспоненциального затухания ампли-
туды серии спиновых эхо, последовательно создаваемых после началь-
ного импульса, называется Т2.
Для описания импульсного ЯМР мы будем продолжать пользовать-
ся векторной моделью поведения объемной намагниченности, но не
следует думать, что эта модель обеспечит строгость наших выводов.
Реальная ситуация намного сложнее. Мы ие рассматриваем влияние
импульсов на относительные заселенности уровней связанных спиновых
систем и их фазовую когерентность. Методы расчета заселенности
уровней после воздействия импульса мы уже рассмотрели в разд. 4.2.6,
но это только часть общей картины; таким способом нельзя моделиро-
вать фазовые соотношения различных состояний. Одиако мы достигли
предела, доступного при использовании нашего теоретического аппара-
та, и его будет вполне достаточно для обсуждения основ многих
экспериментов.
Возможно, оставшиеся неразрешенными вопросы послужат более
смелым читателям поводом к дальнейшему изучению ЯМР. Наиболее
ясное описание ядерных систем получается с помощью теории матриц
плотности [7]. В этой теории используется обычная квантовомеханичес-
кая модель волновой функции системы в виде линейной комбинации ее
собственных состояний. Каждый комплексный коэффициент этой ком-
бинации содержит информацию и об амплитуде, и о фазе. Для описания
реального образца мы должны усреднить огромное число коэффициен-
тов для подсистем, находящихся в различном окружении. Полученные
таким образом средние величины по ансамблям составляют матрицу
плотности, которую можно представить себе как карту усредненных
парных связей между энергетическими уровнями системы в данный
момент времени. Импульсы представляются в виде операторов, пре-
образующих матрицу плотности. В промежутки между импульсами
матрица плотности эволюционирует в соответствии с гамильтонианом
144
Глава 4
системы. Все это позволяет получить результат воздействия на образец
любой импульсной последовательности в явном виде.
Неудобство формализма матрицы плотности состоит в том, что ее
трудно соотнести с какими-либо физическими иллюстрациями, а для
систем, содержащих более двух спинов, расчеты быстро становятся
громоздкими. Существуют альтернативные подходы, часто оказываю-
щиеся более плодотворными. Это формализм мультипликативных
операторов [8] и определение траектории когерентности [9, 10]. Первый
метод сочетает в себе элементы векторной модели и матрицы плотности,
что позволяет совместить простые физические картины с квантовой
механикой. Второй подход очень удобен для разработки фазовых
циклов для реальных экспериментов, и его сравнительно легко понять.
Но мы не будем их обсуждать, поскольку нам уже пора заняться
конкретными экспериментами.
Литература
1. Сликтер Ч, Основы теории магнитного резонанса. Пер. с англ.-М.: Мир, 1981.
2. Fukushima Е.. Roeder S.B., Experimental Pulse NMR-a Nuts and Bolts Approach,
Addison-Wesley, 1981.
3. Comisarow M.B., J. Mag. Res., 58, 209-218 (1984).
4. Примеры использования измерений 7\ ядер и 31P для решения структур-
ных проблем: Lyerla J. R., Levy G. С., in: Topics in Carbon-13 NMR Spectroscopy
(ed. Levy G. С.), 1, 79-148, Wiley, 1974; Han P.A., in: Phosphorus-31 NMR-Prin-
ciples and Applications (ed. Gorenstein D. G.), 317 -347, Academic Press, 1984;
James T.L., ibid., 349-400. Применения в 1Н-ЯМР более редки.
5. Ahragam A., Principles of Nuclear Magnetism, Oxford University Press, 1983.
(Имеется перевод издания 1961 г.: Абрагам А. Ядерный магнетизм. Пер.
с англ.-М.: ИЛ, 1963.)
6. Martin M.L., Delpuech J.-J., Martin G.J., Practical NMR Spectroscopy, Heyden,
1980.
7. См. ссылку 1, гл. 5.
8. Sorensen О. W., Eich G. Ж, Levitt M. H., Badenhausen G.. Ernst R. R., Prog. Mag. Res.,
16, 163-192 (1983). Хотя эта работа и насыщена математикой, она легко
понятна и содержит много иллюстраций; с ней очень полезно ознакомиться
при дополнительном чтении.
9. Badenhausen G„ Kogler Н., Ernst R.R., J. Mag. Res., 58, 370-388 (1984).
10. Bain A.D.. J. Mag. Res., 56, 418-427 (1984).
Глава 5
Ядерный эффект Оверхаузера
5.1. Введение
Эксперименты, основанные на использовании ядерного эффекта
Оверхаузера (ЯЭО), занимают совершенно особое положение среди
современных спектральных методов. Если вам приходилось исполь-
зовать спектроскопию ’И-ЯМР для решения структурных задач, то вы,
вероятно, уже слышали о разностной ЯЭО-спектроскопии, которой нам
предстоит заниматься в этой главе. Этот экспериментальный метод
имеет принципиальное отличие от остальных, обсуждаемых в нашей
книге. Только он позволяет получать структурную информацию о моле-
куле независимо от наличия скалярного спин-спинового взаимодействия
между ядрами. В основе метода лежит прямое магнитное взаимодей-
ствие ядер (так называемое диполь-дипольное взаимодействие), обычно
не оказывающее никакого влияния на внешний вид спектра в жидкой
фазе. ЯЭО дает иам косвенный путь получения информации об этом
диполь-дипольиом взаимодействии, которое в свою очередь зависит от
межъядерных расстояний и движения атомов в молекуле. Отсутствие
других удобных способов измерения таких параметров молекул в раст-
воре делает ЯЭО чрезвычайно важным инструментом.
При попытке выяснения природы ЯЭО и возможностей его примене-
ния для получения структурной информации мы сталкиваемся с не-
сколькими проблемами. ЯЭО связан с релаксационными процессами. Он
проявляется в изменении интенсивности одного резонансного сигнала
при облучении каким-либо способом другого. Для полного понимания
этого явления нам придется проанализировать возможные пути релакса-
ции многоспиновой системы, выявить механизм их действия и рассчи-
тать относительные вклады различных путей в общую скорость релакса-
ции. Основная идея такого анализа не очень сложна, гораздо сложнее
разобраться в его деталях. Например, в простой двухспииовой системе,
как мы вскоре увидим, может существовать до шести различных путей
релаксации, каждый из которых может реализоваться различными
способами. При попытке строгого описания этой ситуации мы рискуем
заблудиться в множестве надстрочных и подстрочных индексов. Меха-
низмы релаксации связаны с движением молекул, которое, очевидно,
носит случайный характер и может оказаться чрезвычайно сложным
даже для небольших молекул. Нам лучше ие связываться с такими
10 75
146
Глава 5
проблемами; в этом вы сразу убедитесь, взглянув на превосходную гл.
8 книги Абрагама [1].
Но отказываться полностью от изучения физических процессов ЯЭО
тоже не очень хорошо. Это может привести к излишне упрощенному
подходу, заключающемуся в одной фразе: «ЯЭО обратно пропорци-
онален шестой степени межъядериого расстояния». К сожалению, очень
часто интерпретация экспериментальных данных проводится на основе
именно этого подхода. Он может создать большую путаницу, поскольку
приведенное утверждение часто ие выполняется. В следующем разделе
мы попробуем настолько разобраться в механизмах ЯЭО, чтобы уметь
надежно применять полученные знания на практике. Мы рассмотрим его
возникновение в простейшем случае (двухспиновая гомоядерная систе-
ма), его связь с релаксацией и диполь-дипольным взаимодействием
между ядрами, а также способы его измерения. Мы выведем несколько
формул, позволяющих в некоторых простых случаях получать количест-
венную информацию о межъядерных расстояниях. В большинстве реаль-
ных экспериментов проводить количественный анализ не имеет смысла,
поскольку лучший способ решения структурных задач для молекул
разумной сложности это чисто качественное сравнение различных ЯЭО.
В разд. 5.2 обсуждается теоретическая сторона ЯЭО, а в разд. 5.3
и 5.4-способы его измерения и примеры интерпретации.
5.2. Происхождение ядерного эффекта Оверхаузера
5.2.1. Введение
ЯЭО представляет собой изменение интенсивности одного сигнала
ЯМР при возбуждении другого. Под словом «возбуждение» в этой главе
будет подразумеваться насыщение, перехода, т. е. устранение разности
заселенностей его уровней при облучении слабым радиочастотным
полем, одновременно с наблюдением других сигналов. Таким образом,
ЯЭО-это результат попыток системы в целом удержаться в состоянии
теплового равновесия. Мы принудительно изменяем разность заселен-
ностей одной части системы, и другие ее части пытаются скомпенси-
ровать внесенное возбуждение. Способ компенсации можно продемон-
стрировать на очень простой системе из двух ядер со спином 1/2. Но
сначала определим понятие величины ЯЭО. Пусть нормальная интен-
сивность сигнала в условиях теплового равновесия и при отсутствии
возбуждения системы равна /0. Интенсивность, наблюдающаяся при
насыщении какого-либо другого резонанса, достаточно длительном для
установления нового равновесия, равна I. Тогда ЯЭО равен
= Wo (5.i)
Это выражение часто умножается на 100 для перевода в проценты.
Заметьте, что ЯЭО будет положительным, если новая интенсивность
больше исходной, и отрицательным, если меньше. На практике встре-
чаются оба случая. г|1 (jr) обозначает ЯЭО иа ядре i при насыщении ядра
Ядерный эффект Оверхаузера
147
$ (использующееся в этой главе обозначение взято из книги Ноггла
и Ширмера [2], ио оригинальная буква f заменена иа более обычную г,).
Методы оценки изменения интенсивности сигнала ядра /, которое может
быть очень небольшим, обсуждаются в разд. 5.3; в этом разделе мы
выясним, как и почему оно возникает.
5.2.2. Пути релаксации
В предыдущей главе мы рассматривали продольную релаксацию
с макроскопической точки зрения. Мы предполагали, что при помеще-
нии образца в магнит наведенная намагниченность возникает в нем
в соответствии с процессом первого порядка (т. е. экспоненциально)
с константой Тг. Это было всего лишь предположение, но оно часто
подтверждается экспериментально. В основе изменений макроскопичес-
кой намагниченности должен лежать весьма сложный процесс установ-
ления равновесия по всем многочисленным переходам системы ядер.
Именно этим процессом мы сейчас и займемся.
Рассмотрим два ядра i и .у со спином 1/2, одинаковыми у, но разными
химическими сдвигами. Предположим, что они находятся в одной
молекуле, но не испытывают спин-спинового взаимодействия. Такая
система будет иметь четыре уровня энергии, соответствующие состоя-
ниям ядер аа, а0, [За и рр (рнс. 5.1). Химические сдвиги в общем случае
очень малы в сравнении с ларморовой частотой (миллионные доли),
поэтому переходы различных ядер будут иметь приблизительно равную
энергию, а состояния ар и ра будут почти вырожденными. На рисунке
различие их энергий для наглядности сильно преувеличено. Мы пред-
полагаем отсутствие косвенного спин-спинового взаимодействия, по-
этому оба перехода ядра i, так же как и s, имеют в точности одинаковую
энергию. В результате в обычном спектре будут наблюдаться два
синглета равной интенсивности.
Пусть общее число ядер в образце равно 4N. Если бы вес четыре
уровня имели равную энергию, то они были бы равнозаселены-по
N ядер на каждом. Однако это не так. При тепловом равновесии
заселенности будут соответствовать распределению Больцмана. Для
простоты будем считать различие энергий состояний ар и ра пренебре-
жимо малым, а их заселенности одинаковыми. Состояние аа с низкой
Рис. 5.1. Уровни энергии гомоядерной системы АХ и их заселенность.
ю*
148
Глава 5
энергией будет иметь избыток, а рр-недостаток одного и того же
количества ядер. Если мы обозначим избыток или недостаток заселен-
ности как 9, то получим распределение, приведенное иа рис. 5.1. Наи-
больший интерес представляют разности заселенностей. Запишем их
в кратком виде:
переходы ядра I:
аа — сф)
У ... о
₽а - PPJ
переходы ядра s:
аа — Ра)
ар —рр/
переход ДМ — 0:
Ра — ар} ... 0
переход ДМ = 2:
аа-рр}..,25 (5.2)
Первые четыре разности соответствуют нормальным переходам,
дающим линии в спектре, а два других перехода должны сопровождать-
ся изменением квантового числа М (суммы индивидуальных квантовых
чисел т двух ядер) на 2 (аа — РР) или на 0 (ра — ар). Хотя переходы
такого типа и ие наблюдаются в нормальных условиях (запрещены
квантовомеханическими правилами отбора), мы не можем с уверен-
ностью утверждать, что они не будут давать вклада в релаксацию
системы, поскольку пока не существует описывающей их теории. Нам
следует считать, что, если приведенные разности заселенностей наруше-
ны, система старается восстановить их любыми доступными способами.
Это приводит к целому набору возможных путей релаксации системы
(рис. 5.2), эффективность которых мы должны подтвердить или опро-
вергнуть экспериментально.
Сделаем некоторые предположения. Будем считать, что релаксация
через один переход -процесс первого порядка, т. е. его скорость пропор-
циональна первой степени отличия разности заселенностей от ее равно-
весной величины. Будем обозначать константы скорости различных
Рис. 5,2. Связи различных уровней энергии системы АХ, способные принимать
участие в релаксации.
Ядерный эффект Оверхаузера
149
процессов буквой fV с подстрочным индексом, указывающим иа измене-
ние М (например, JF0 для pct — а0, для аа — ар и т.д.), и надстроч-
ным, указывающим ядро, изменяющее свое состояние (PFi или И7!).
В наиболее общем случае (когда может присутствовать и спин-спнновое
взаимодействие) нет причин предполагать, что два перехода одного ядра
будут иметь одинаковую скорость релаксации (т. е. понадобятся шесть
констант скоростей), но для простоты мы будем считать, что такое
предположение верно.
Мы ввели много новых символов, которые легко могут нас запутать,
поэтому стоит ненадолго остановиться и задуматься о том, что мы
делаем (см. рис. 5.2). Мы хотим представить релаксацию системы
взаимодействующих ядер как совокупность отдельных переходов и со-
отнести измеряемые величины (например, 7'/) с реально происходящими
процессами. При измерении 7\ мы наблюдаем процесс возвращения
продольной намагниченности в состояние равновесия. Проделав этот
эксперимент на ядре i нашей двухспиновой системы, мы увидим суммар-
ную интенсивность двух вырожденных переходов. Следовательно, полу-
ченная величина будет каким-то образом связана со скоростями И71!,
W2 и JF0. Если две последние будут нулевыми (т. е. отсутствуют переходы
ДМ = 0 и ДМ = 2), то Т{ можно будет представить в виде
П = 1/21Г'1 (5.3)
Поскольку И7-константа скорости, 7, постоянная времени, общая ско-
рость релаксации складывается из скоростей по двум переходам. Если
W2 и Ио не равны нулю, то в общую скорость релаксации ядра i,
очевидно, будет давать вклад разность заселенностей ядра 5. Это
опровергает сделанное при определении 7] предположение о том, что
скорость изменения макроскопической намагниченности одного типа
ядер зависит только от его собственного отклонения от равновесия и не
связана с намагниченностью других ядер. Следовательно, в миого-
спиновых системах простое измерение 7\ может не дать корректной
информации. Это довольно важное замечание, ио оно не относится
к нашей дискуссии (более подробное изложение см. в книге Ноггла
и Ширмера [2], гл. 1, разд. D, Е и G).
При выполнении эксперимента по ЯЭО мы принудительно изменяем
разность заселенностей по некоторым переходам и наблюдаем сигналы
других переходов. Мы должны стараться воздействовать на все пере-
ходы ядра в равной степени (неравное возмущение создает дополни-
тельные сложности, обсуждаемые в разд. 5.3), т. е. мы должны насыщать
оба перехода ядра л и наблюдать ядро i после установления нового
равновесия. Для того чтобы проанализировать полученные данные
с учетом сделанных замечаний о релаксации, мы должны составить
систему уравнений, описывающих различные пути релаксации, и решить
их с граничными условиями, заданными насыщением ядра 5. Это вполне
строгий путь, но он сопряжен с громоздкими вычислениями, поэтому
мы не будем его рассматривать. Исходное описание можно найти
150
Глава 5
Рис. 5.3. Заселенность уровней после насыщения переходов
в книге [2]. Вместо этого мы попробуем установить возможный вклад
каждого пути релаксации. Рассмотрим состояние системы сразу после
достижения насыщения ядра .у (рис. 5.3). Новые разности заселенностей
[для сравнения с равновесными (5.2)] теперь таковы;
переходы ядра i:
аа - ар)
переходы ядра 5:
аа — Ва]
? ... О
ар - PPJ
переход ДМ = 0:
Ра — ар} ... 8
переход Д М = 2:
аа-рр}...8 (5.4)
Система в целом больше не находится в равновесии, ио в соответ-
ствии с нашей гипотезой должна стремиться к нему. Рассмотрим каждый
из возможных путей релаксации. И7], очевидно, не подходит, поскольку
разность заселенностей по этому переходу зафиксирована его насыще-
нием. Разность заселенностей каждого перехода ядра I в состоянии
теплового равновесия была равна 8; эта же величина сохранилась
и сейчас, следовательно, с точки зрения И7) никаких изменений не
требуется. Если релаксация осуществляется только за счет однокванто-
вых переходов, то насыщение ядра s не будет оказывать влияния на
интенсивность сигналов i; иными словами, при облучении s на ядре i не
будет наблюдаться ЯЭО.
Интереснее попробовать учесть скорости W2 и Wo. Разность заселен-
ностей уровней ар и ра составляет сейчас 8, а при равновесии была
нулевой. Следовательно, процесс будет соответствовать переходам
ядер из состояния Ра в ар, что способствует восстановлению равновес-
ной нулевой разности заселенностей. Это приведет к повышению заселен-
ности верхнего уровня первого перехода и понижению заселенности
нижнего уровня второго перехода ядра /, т.е. к понижению общей
Ядерный эффект Оверхаузера
151
ар
/ф
Рис. 5.4. Начальное направление кросс-релаксации после насыщения переходов s.
интенсивности его сигнала (рис. 5.4). Но этому процессу будет препят-
ствовать W1, так как с его точки зрения переходы i уже находились
в состоянии равновесия. Суммарный эффект будет зависеть от соот-
ношения W‘i и Ио. Если в релаксации преобладает путь Wo, то насыщение
ядра s будет сопровождаться понижением интенсивности сигналов i, или
ЯЭО на i при облучении j будет отрицательным.
Примем те же рассуждения к W2. Разность заселенностей аа — f3[5
составляет теперь 5, в то время как в равновесии была 2 5. Следователь-
но, процесс W2 будет сопровождаться переходом ядер из состояния 00
в аа для восстановления разности заселенностей 28. Это приведет
к понижению заселенности верхнего уровня одного перехода и повыше-
нию заселенности нижнего уровня другого перехода ядра Z, т.е. к повы-
шению интенсивности его сигнала. Этому процессу препятствует и
т. д. Если в релаксации преобладает путь W2, то насыщение ядра s будет
сопровождаться повышением интенсивности сигналов г, или ЯЭО на i при
облучении 5 будет положительным.
Формальное решение дифференциальных уравнений этой системы
позволяет нам получить формулу, включающую W2 и Ио в момент
достижения системой новых равновесных условий:
W2~W0
n,(s) 2W\ + W2 + W„
(5.5)
Мы получили это выражение, не задумываясь о том, как осуществля-
ется релаксация. Мы рассмотрели ее абстрактные возможные пути.
Теперь посмотрим, какой же из путей реализуется в эксперименте.
Существование ЯЭО подтверждает участие в релаксации процессов W2
и/или % (они вместе называются кросс-релаксацией), а его знак позволя-
ет определить доминирующий процесс. Для небольших молекул в невяз-
ких растворах ЯЭО должен быть положительным (подразумевается, что
в этих условиях преобладает W2), а для макромолекул или очень вязких
растворов- отрицательным (преобладает Ио). Между ними находится
область, где W2 и Ио сбалансированы, и ЯЭО отсутствует. Это наблюде-
ние подтверждает сделанное ранее предположение о том, что релаксация
связана с движением молекул. Теперь мы должны более подробно
проанализировать ее механизм.
152
Глава 5
5.2.3. Причины релаксации
Введение. Все описанные выше переходы не осуществляются само-
произвольно с какой-либо заметной скоростью. Для объяснения ядерной
релаксации мы должны найти механизмы, способные инициировать
переходы, и затем вычислить их эффективность. Переходы могут про-
исходить под влиянием электромагнитных полей, осциллирующих на
подходящей частоте. Мы попробуем найти их в окружении молекул.
Сделать это будет не так просто, поскольку существует несколько
возможных источников возникновения флуктуирующих электромагнит-
ных полей. К счастью, только один из них будет эффективен на
расстояниях порядка межъядерных. Количественное описание процессов
релаксации осложняется еще и тем, что необходимо каким-то образом
моделировать случайное движение молекул в растворе. Следовательно,
нам недоступно получение более конкретных результатов в этой обла-
сти. Но получить представление о физической природе механизма
релаксации не так трудно. В любых теоретических книгах по ЯМР вы
можете найти более строгое количественное описание этого предмета.
Магнитные диполи и днполь-дипольиое взаимодействие. Как уже упо-
миналось ранее, ЯЭО обусловлен диполь-дипольным взаимодействием
ядер. Осмыслить это утверждение не просто. Мы не знаем, что такое
магнитный диполь, не говоря уже о взаимодействии диполей друг
с другом. Рассмотрим сначала электрический диполь. Ои состоит из двух
точечных зарядов-положительного и отрицательного (рис. 5.5). Мы
воображаем его окруженным силовыми линиями, которые задают на-
правление силы, действующей на помещенный в его поле тестовый
положительный заряд. Магнитный же диполь-это просто удобная
выдумка (магнитный «монополь», т. е. аналог электрического заряда,
видимо, не существует вообще). Она сделана на основе сходности
силовых линий электрического диполя и петли с током на не слишком
близком от иее расстоянии (рис. 5.5). Эта связь позволяет физикам
Рис. 5.5. Возможные диполи: элект-
рический (а), петля с током (о),
постоянный магнит (й), ядро (г).
Ядерный эффект Оверхаузера
153
Рис. 5.6. Взаимодействие двух диполей зависит от их взаимной ориентации.
С-Северный полюс, FO-Южный полюс.
сэкономить некоторую часть усилий по расчету сил взаимодействия двух
петель с током: они могут просто взять готовые результаты, полученные
для электростатического случая.
Ядро (имеющее заряд и угловой момент) и постоянный магнит - еще
два источника магнитного поля, которые удобно описывать в терминах
магнитных диполей (рис. 5.5). Вектор ц, использовавшийся в предыду-
щих главах для обозначения ядерного магнетизма, совпадает с направ-
лением диполя; стрелка указывает воображаемый Северный полюс (С).
Для наших целей вполне достаточно представлять себе взаимодействие
ядер как усиление или ослабление одним ядром поля Во в точке
расположения другого (рис. 5.6). Результат этого усиления или ослабле-
ния называется локальным полем иа ядре, создаваемым другими ядрами.
Ориентация ядерных диполей определяется внешним полем, но их
относительные положения зависят от положения молекулы в целом,
поэтому локальное поле на ядрах одного типа неодинаково в различных
молекулах. В аморфных стеклообразных растворах или в поликристал-
лических порошках положения отдельных молекул можно считать фик-
сированными, ио их ориентации не одинаковы, что приводит к образова-
нию целого диапазона резонансных частот и уширению линий. В моно-
кристаллах, напротив, может быть только несколько или вообще одна
относительная ориентация диполей, и диполь-дипольиое взаимодей-
ствие непосредственно проявляется в спектре в виде расщепления линий,
величина которого зависит от ориентации кристалла в магнитном поле.
Заметьте, что это прямое магнитное взаимодействие намного превыша-
ет обычное скалярное спии-спиновое взаимодействие, но довольно часто
превышает н разность химических сдвигов ядер. В результате изменение
резонансной частоты может составлять много килогерц.
Однако нам хорошо известно, что ширина линии в растворах может
составлять доли герца, что кажется удивительным при наличии диполь-
дипольного взаимодействия. Быстрое хаотическое движение молекул
усредняет диполь-дипольное взаимодействие по всем возможным их
154
Глава 5
ориентациям. Расчеты показывают, что это среднее значение равно
нулю. Кроме того, быстрая переориентация диполей представляет собой
хороший источник флуктуирующих полей для стимулирования продоль-
ной релаксации. Сила диполь-дипольного взаимодействия должна, оче-
видно, зависеть от расстояния между ядрами: в этом заключается связь
наших физических идей с требующейся химической информацией.
Логично будет предположить, что диполь-дипольное взаимодействие
создает подходящие условия для кросс-релаксации (т. е. процессов Wo
и W2), поскольку оно обеспечивает энергетическую связь между двумя
ядрами (мы увидим и другие механизмы релаксации, которые не
связывают ядер и, следовательно, не создают кросс-релаксации). Нам
осталось только разобраться, каким образом движение молекул вызыва-
ет релаксацию через диполь-дипольное взаимодействие и как это соот-
носится с путями И'о, и W2 -
Релаксация через диполь-дииольное взаимодействие. Для того чтобы
выразить продольную релаксацию и ЯЭО через диполь-дипольное
взаимодействие, нам нужна модель движения молекул в растворе.
Построить ее для больших сложных молекул, очевидно, не представля-
ется возможным. Сама молекула может поступательно двигаться и
вращаться, а различные ее части, кроме того, могут двигаться не так, как
остальные. Большинство этих движений носит случайный характер.
Обычно в этом случае делается грубое приближение, при котором для
описания всех случайных движений вводится одни параметр-время
корреляции молекулы тг
В зависимости от конкретной решаемой задачи используется не-
сколько различных определений тс. Предположим, что молекула иногда
совершает переходы от одной ориентации к другой и эти переходы
мгиовеины. Тогда тс характеризует величину промежутков времени
между движениями молекулы. «Времена ожидания» между движениями
будут распределены каким-то случайным образом, поэтому время кор-
реляции тс выбирается так, чтобы интервалы, меиыпие тс, встречались
редко. Такое слегка необычное определение (более правильным кажется
выбор среднего времени ожидания) обладает тем достоинством, что
нижний предел времени ожидания соответствует верхнему пределу
распределения частот флуктуирующих полей, образующихся в результа-
те движения молекул.
Параметр те объединяет целый комплекс различных факторов, оказы-
вающих влияние на молекулярное движение. Поэтому он должен зави-
сеть от молекулярной массы, вязкости раствора, температуры и, воз-
можно, других специфических факторов, таких, как водородные связи
и pH раствора. Сравнивать величины тс различных молекул следует,
полагаясь иа опыт и химическую интуицию. Например, молекулы
с большой массой в растворах обычно движутся медленнее легких
и поэтому имеют большее тс. Теперь нам нужно разобраться, каким
образом изменения тс будут влиять иа времена релаксации и относи-
Ядерный эффект Оверхаузера
155
тельные вклады различных путей. Вскоре мы получим формулу, связы-
вающую н W2 с тс (для двухспиновой системы), но сначала
попробуем сделать предположение об их связи на основе физики. Для
этого иам нужно будет понять, каким образом распределение частот
осциллирующих полей, возникающих при движении молекул, зависит от
тс, и затем сравнить их с частотами, необходимыми для инициирования
процессов Wr и W2.
Учитывая, что энергия диполь-дипольного взаимодействия не зави-
сит от тс (она зависит только от межъядерного расстояния, которое
в нашей модели считается фиксированным), а скорость его изменения,
наоборот, зависит от тс, мы можем предсказать, что общее число
осциллирующих полей будет постоянным, а верхний предел их частот
будет определяться тг Если мы построим график зависимости напряжен-
ности флуктуирующих полей (спектральная плотность, обусловленная
диполь-дипольным взаимодействием, обычно обозначается J) от часто-
ты со для нескольких значений тс, то они будут иметь одинаковую
площадь под кривой, но различные верхние пределы (рис. 5.7). Мы
можем также принять без доказательства, что при со « 1/тс. спектральная
плотность будет приблизительно постоянной, как это показано на
рисунке (такое предположение доказывается теоретически и подтвержда-
ется экспериментально). Это позволяет нам дать некоторые количест-
венные оценки величин 7\ и даже W исходя из тс (т. е. с учетом
температуры, вязкости и т.д.).
Скорость релаксации будет определяться интенсивностью поля,
флуктуирующего с подходящей для соответствующих переходов часто-
той. Например, для процесса это частота ш0. Рассмотрим сначала
случай, когда 1/тс намного больше соо, т.е. мы находимся иа горизон-
тальной части кривой спектральной плотности. С уменьшением rt (на-
пример, при повышении температуры) высота кривой в точке соо будет
также уменьшаться (поскольку площадь под кривой остается постоян-
ной, а верхний предел отодвигается еще дальше). Следовательно, 7]
будет расти (замедление релаксации). Если мы изменим Во, а значит,
и со0, то изменений не должно произойти, так как мы находимся на
горизонтальном участке кривой спектральной плотности (см. рис. 5.7).
Рис. 5.7. Функции спектральной плот-
ности для двух различных значений тс.
Ядро с ларморовой частотой <оо будет
испытывать предельное сужение линии
при коротких, а не длинных те.
156
Глава 5
Если теперь постепенно увеличивать тг, то 7j будет понижаться, ио
только до области 1/тс ж со0. Здесь мы уходим с горизонтальной части
кривой, и дальнейшее уменьшение тс будет вызывать увеличение Т(.
В этой области можно ожидать зависимости 7\ от напряженности поля,
поскольку кривая спектральной плотности не горизонтальна. Таким
образом, на графике зависимости 7] от должен наблюдаться мини-
мум, что и подтверждается экспериментально.
Каковы же будут относительные вклады в релаксацию процессов
и И’2‘’ W2 будет стимулироваться самой высокой частотой (поскольку
он представляет собой сумму двух обычных переходов), самой
низкой, а И]-средней между ними. Следовательно, в области 1/те as ш0
процесс W2 должен исчезать первым, а И70 еще будет достаточно
эффективным. Такую ситуацию мы уже наблюдали, когда с увеличением
размера молекул происходило изменение знака ЯЭО (разд. 5.2.2). Таким
образом, наша модель релаксации по механизму диполь-дипольного
взаимодействия способна хотя бы на качественном уровне объяснить
наблюдаемую связь Тх и ЯЭО с молекулярным движением.
Количественный подход позволяет получить формулы, выражающие
зависимость скорости релаксации от диполь-дипольного взаимодей-
ствия в системе из двух спииов, находящихся на расстоянии г друг от
Друга:
„Я Зт<
г6(1 + со? т2)
_______2тс________
г6 [1 + (со, - o)s)2 т2]
РК ос -т—---№ тс— ^5 6)
Г6 [ 1 + + Со/тЛ
Коэффициент пропорциональности в каждой формуле один и тот же; со,
и (оя-ларморовы частоты двух ядер. Заметьте, что W\ зависит только от
частоты со,, a W2 и Ид- о т суммы и разности частот двух ядер
соответственно. Это согласуется с нашими предыдущими рассужде-
ниями.
Условие l/tc»oi0 (т.е. режим, когда Т, растет с уменьшением т4.)
можно выразить в форме со2т2 « 1. В этом случае все частотно-зависи-
мые члены в знаменателях выражений (5.6) можно считать пренебрежи-
мо малыми, и они принимают вид
Зт, 2 т, 12 т, ,
(5.7)
Условие со2 т2 « 1 известно под названием условие предельного суже-
ния (это условие соответствует полному исчезновению диполь-диполь-
ного уширения линий за счет усреднения по всем ориентациям молеку-
лы). Считается, что это условие выполняется для всех обычных органи-
Ядерный эффект Оеерхаузера
157
ческих молекул в невязких растворах, но в последнее время в связи
с более широким применением сильнопольных спектрометров отклоне-
ния от него встречаются все чаще. При работе с белками и другими
биологическими макромолекулами предельное сужение вряд ли может
быть достигнуто, поэтому для описания скоростей релаксации нужны
другие, более сложные выражения. Мы приведем их вместе с формулами
для ЯЭО в разд. 5.2.4 и попробуем с их помощью измерять межъядер-
ные расстояния.
Другие механизмы релаксации. Дипольное взаимодействие, промоду-
лированное движением молекул, представляет собой наиболее важный
механизм релаксации протонов и других ядер со спином 1/2 (таких, как
13С) в растворах. Мы кратко упомянем и другие существующие механиз-
мы, чтобы уметь обнаруживать и подавлять их при проведении экспери-
ментов по ЯЭО, поскольку все они не связаны с кросс-релаксацией и,
следовательно, снижают ЯЭО. Прежде всего заметим, что до сих пор мы
рассматривали диполь-дипольные взаимодействия только между ядра-
ми одной молекулы, хотя иет никаких запретов на существование
межмолекулярного диполь-дипольного взаимодействия. Межмолеку-
лярные взаимодействия происходят иа больших расстояниях, но это ие
значит, что ими можно пренебречь. Первым зарегистрированным ЯЭО
был именно межмолекулярный эффект на протонах в смеси хлороформа
и циклогексана. Поскольку при измерении ЯЭО используются только
дейтерированные растворители, единственным вероятным межмолеку-
лярным эффектом будет взаимодействие друг с другом молекул раство-
ренного вещества. На практике для его подавления следует готовить
достаточно разбавленные растворы.
Другой чрезвычайно эффективный механизм диполь-дипольной
релаксации - взаимодействие с иеспарениыми электронами. Магнитный
момент электрона приблизительно в 2000 раз больше, чем у протона,
поэтому в присутствии парамагнитных веществ даже межмолекуляриое
взаимодействие оказывается сильным. Это приводит к большому сокра-
щению времен релаксации, полностью останавливает кросс-релакса-
цию и подавляет гомоядерный ЯЭО. Умышленно добавляя в образец
парамагнитные вещества, мы можем подавлять нежелательный ЯЭО
и сокращать 7j (см. гл. 7). В то же время все обычные растворы содержат
заметные количества парамагнитного кислорода, который следует
удалять перед измерением ЯЭО (см. разд. 5.3).
Еще один широко распространенный механизм релаксации работает
только на ядрах со спином, большим 1/2 (квадрупольные ядра). Такие
ядра помимо магнитного поля способны взаимодействовать и с градиен-
том электрического поля, что служит очень эффективным механизмом
релаксации. Поэтому квадрупольные ядра (например, 17О или 1+N)
имеют очень малые времена релаксации 7j и Тг и широкие линии.
Однако ядра в симметричном окружении (например, 14N в соединениях
типа R4N+ X ) илн в окружении с малыми градиентами электрического
158
Г лава 5
поля (классический пример-14N в изоцианидах) представляют собой
исключение. Дейтерий (спин 1)-возможно, наиболее важное для хими-
ков квадрупольное ядро-дает относительно узкие линии в небольших
молекулах по причине малого квадрупольного момента. Но все же ои
релаксирует значительно быстрее ядер со спином 1/2. Большая скорость
релаксации, не зависящая от процессов кросс-релаксации, делает ЯЭО
нехарактерным для квадрупольных ядер.
Существует еще несколько механизмов релаксации, эффективных
в определенных условиях, но мы не будем загружать ими свою память.
Можно с уверенностью предположить, что для молекул среднего разме-
ра в невязких растворах (подразумевается, что надо исключить только
очень маленькие и очень большие молекулы) основным механизмом
релаксации протонов будет внутримолекулярный диполь-дипольный
механизм. В необезгаженных образцах возможен вклад растворенного
кислорода, другие межмолекуляриые механизмы маловероятны. Исчер-
пывающий обзор всех остальных механизмов релаксации можно найти
в гл. 9 книги Шоу [3].
5.2.4. ЯЭО и межъядерные расстояния
Максимальный ЯЭО. Мы можем объединить выражения для ЯЭО
и скоростей различных процессов релаксации №и попробовать извлечь
из пих информацию о межьядерных расстояниях. Вспомним, что для
двухспиновой системы, релаксирующей только через диполь-дипольное
взаимодействие, ЯЭО выражается как
W2-Wo
2 И71; + W2 + %
(5-5)
Заменив все W на их выражения в условиях предельного сужения (5.7),
получим
(12-2) т,//’ 1
(6 + 12 + 2) zjr6 ~ 2
(5-8)
Такого результата мы не ожидали! В соответствии с нашим предпо-
ложением ЯЭО должен не зависеть от г и быть равным точно 0,5 (или
50%, как это принято записывать в химическом контексте). Мы не
сделали ошибки: паше предположение совершенно верно, но оно при-
менимо только к идеальной системе двух диполей, полностью изолиро-
ванной от всех остальных источников релаксации. Если бы Вселенная
состояла только из двух протонов, находящихся в условиях предельного
сужения, то насыщение сигналов одного из них дало бы 50% ЯЭО на
другом независимо от того, находились бы они на расстоянии в несколь-
ко ангстрем или в несколько световых лет. Отсюда можно сделать
вывод, что, если реальный химический эксперимент достаточно близко
подходит к ситуации двух изолированных протонов, ЯЭО может не
Ядерный эффект Оверхаузера 159
содержать никакой информации о межъядерных расстояниях. Для
правильного использования величин ЯЭО необходимо помнить об
этом.
Каким бы нереалистичным ни было наше вычисление, из него можно
извлечь полезный результат. Максимальный положительный гомоядер-
ный ЯЭО, который можно получить в эксперименте, составляет 50%.
В гетероядерном случае максимальный ЯЭО определяется выражением
0,5 Оно объясняет значительное увеличение чувствительности при
наблюдении гетероядер в условиях широкополосной развязки от прото-
нов. Например, ун//ус составляет около 4, и максимальный ЯЭО-200%,
что приведет к трехкратному увеличению интенсивности сигналов по
сравнению с интенсивностью без ЯЭО (/ = /0(1 + ц)). В то же время
некоторые ядра имеют отрицательное значение гиромагнитною от-
ношения (например, 29Si и 15N), поэтому облучение протонов может
понизить или даже инвертировать их сигналы. Например, состав-
ляет около — 5, и максимальный ЯЭО-около — 250%. Если же реализу-
ется не полный ЯЭО, а около — 100%, то сигнал может исчезнуть
вообще. Этот вопрос будет обсуждаться в следующей главе, где мы
сравним ЯЭО с другими способами повышения интенсивности сигналов,
использующими гетероядерное спин-спи новое взаимодействие с прото-
нами.
Когда ие выполняется условие предельного сужения. По мере того как
растет напряженность полей спектрометров, а вместе с этим и наше
стремление к изучению сложных молекул, довольно обычными стано-
вятся ситуации, когда предельное сужение уже отсутствует. Химики-
органики, работающие с молекулами, массы которых составляют не-
сколько тысяч единиц, попадают в ловушку сбалансированных W2 и
где ЯЭО становится пренебрежимо малым. Единственный выход из
нее-замена растворителя или изменение температуры с целью вернуть-
ся в область предельного сужения или перейти в другой режим, где
основную роль будет играть Жо. Именно в этом режиме работают
биохимики (см. ниже). Совсем недавно появилась новая эксперимен-
тальная методика (ЯЭО «во вращающейся системе координат» [4]),
позволяющая надеяться на решение этой проблемы, но к моменту
написания книги она еще недостаточно хорошо разработана, чтобы
делать окончательные выводы.
При очень больших временах тс, наблюдающихся в растворах белков
или нуклеиновых кислот с молекулярной массой более 10 000,
полностью преобладает над Подставив в выражение (5.5) нулевые
и W2, мы видим, что ЯЭО снова восстанавливается, но уже с макси-
мальным значением — 1. Таким образом, в макромолекулах ЯЭО
отрицателен и по величине в 2 раза превышает ЯЭО в условиях
предельного сужения. Это очень удобно для отнесения сигналов в спект-
рах белков, особенно если ЯЭО определяется в двумерном вариан те (ем.
гл. 8).
160
Глава 5
ЯЭО в реальных системах. Мы получили довольно пессимистический
вывод о возможностях применения ЯЭО. Но, к счастью, если в образо-
вании ЯЭО участвует большее число взаимодействий, он все-таки
сохраняет связь с межъядериым расстоянием. Эту связь можно выявить
двумя основными путями. Во-первых, ЯЭО даже в двухспиновой систе-
ме может зависеть от межъядериого расстояния, если имеются кон-
курирующие пути релаксации, всегда присутствующие в реальных экспе-
риментах. Приняв некоторые допущения об этих путях, мы можем
экспериментально прокалибровать зависимость ЯЭО от межъядерного
расстояния. Во-вторых, в многоспиновых системах, где не наблюдается
кросс-релаксация, иногда удается связать величины ЯЭО с отношениями
межъядерных расстояний (но не с самими расстояниями). Ниже будет
представлено особенно полезное уравнение такого типа.
Сравнение величии ЯЭО в двухспиновых системах. Первый подход,
разработанный Беллом и Сондерсом [5], лег в основу большинства
применений ЯЭО в органической химии. Посмотрев на уравнение (5.5),
мы заметим, что его числитель содержит информацию о чистой кросс-
релаксации и обычно обозначается ois:
= (5.9)
Знаменатель уравнения (5.5) выражает общую релаксацию ядра i и обыч-
но обозначается pf:
Pi = 2W\ + W2+WQ (5.10)
Наши предыдущие вычисления показывают, что для случая чисто
гомоядерной диполь-дипольной релаксации двух ядер со спином 1/2
pf = 2ais (5.11)
т. е. ЯЭО составляет 0,5. В реальной ситуации будут присутствовать
и другие механизмы релаксации. В предположении, что они ие связаны
с кросс-релаксацией, мы можем просто включить их в знаменатель (5.5)
в виде дополнительного члена р*:
ре + р*
или с учетом (5.11):
Перевернем полученное выражение:
1 „ 2р*
Пс(^) Р.
Используя нашу модель диполь-дипольиой релаксации, в условиях
(5Л2)
(5.13)
(5.14)
Ядерный эффект Оверхзузера
161
предельного сужения мы получаем
(5.15)
Уравнение (5.14) приобретает форму
По Беллу и Сондерсу, для подобных молекул величину р*/тс часто
можно считать постоянной, и измеряемый ЯЭО должен быть непосред-
ственно пропорционален I/г6. Они проверили это предположение иа ряде
молекул с известной геометрией и получили хорошее соответствие
между 1/г6 и т|. Этот вывод позволяет сравнивать межъядерные расстоя-
ния в различных молекулах с помощью величин ЯЭО, однако для
получения корректных результатов нужно тщательно проверять нали-
чие необходимых условий. Особое внимание следует обратить иа такие
моменты:
1. будет постоянной только для молекул с близкими молекуляр-
ными массами в одинаковых растворителях при одинаковых температу-
рах. Специфические взаимодействия с растворителем, способные изме-
нить тс, должны отсутствовать. Не должно быть и внутримолекулярных
движений, в результате которых эффективное корреляционное время
конкретного ядра может отличаться от тс для молекулы в целом, т.е.
эксперимент можно проводить только на жестких молекулах.
2. Необходимо работать с достаточно малыми молекулами, чтобы
в поле вашего магнита достигался режим предельного сужения.
3. р* - дополнительная релаксация, обусловленная посторонними
диполь-дипольиыми взаимодействиями. Ее скорость должна быть по-
стоянной. Поэтому нельзя менять растворитель и концентрацию. Очень
важно постараться исключить возможные различия во внутримолеку-
лярных взаимодействиях сравниваемых молекул. Одиако полностью
этого достичь невозможно. Эти взаимодействия и представляют собой
наиболее вероятный источник ошибок при интерпретации ЯЭО, В даль-
нейшем мы обсудим этот вопрос более подробно.
4. При переходе от соединения к соединению не должны изменяться
структурные особенности, способные изменить зависящий от межмоле-
кулярных взаимодействий член р*. Например, все используемые для
измерений ядра должны находиться на периферии молекулы, а не
в какой-либо полости. Не должно быть специфических взаимодействий,
таких, как водородные связи, обусловливающих неодинаковое сродство
различных частей молекулы к растворителю.
5. Образец нужно готовить очень тщательно, обращая особое внима-
ние иа удаление растворенного кислорода. Случайное попадание в обра-
зец кислорода может вызвать значительное снижение измеряемого ЯЭО,
что приведет к получению неверных результатов. Этот момент будет
обсуждаться в разд. 5.3.
11 -75
162
Глава 5
ЯЭО в системе из нескольких ядер. Из предыдущего обсуждения ясно,
что сравнение друг с другом величии ЯЭО, полученных для различных
молекул, может быть ие совсем корректным. Но, к счастью, многие
задачи решаются с помощью сравнения ЯЭО для различных ядер внутри
одной молекулы, если мы имеем о ней некоторую достоверную дополни-
тельную информацию. В разд. 5.4 мы приведем несколько примеров
использования этого метода на качественном уровне. Для ограничен-
ного числа случаев можно вывести и количественные выражения. На-
пример, для системы АМХ без посторонних источников кросс-релакса-
ции (рис. 5.8) имеем [2]
/гах\6 = Па(М) + Па(Х)Пх(М)
Vam/ Па (X) + Па (М) Пм (X)
Если мы измерили все ЯЭО в такой системе и знаем некоторые
межъядерные расстояния, это уравнение позволяет нам вычислить не-
известные межъядерные расстояния. Например, положение геминальных
протонов у зр3-гибридизованного углерода почти не меняется при
переходе от молекулы к молекуле. Если эти протоны составляют
АМ-частъ системы АМХ, то по измеренным ЯЭО мы можем определить
положение ядра X. Применение формулы возможно только при условии
жесткой связи между тремя ядрами (одинаковые тс для двух межъядер-
ных векторов) и в отсутствие посторонних источников кросс-релаксации
(т.е. в отсутствие поблизости других ядер со спином 1/2). Последнее
требование надежно выполняется только в случае очень небольших
молекул, однако убедиться в отсутствии других источников кросс-релак-
сации можно и с помощью изотопного замещения водорода иа дейте-
рий. Кроме того, даже присутствующие в молекуле посторонние источ-
ники кросс-релаксации могут не оказывать существенного влияния на
эксперимент, если они достаточно удалены от интересующих нас ядер.
Проверить это условие можно с помощью ЯЭО: облучение посторонних
ядер не должно давать заметного ЯЭО на исследуемых ядрах.
Два основных принципа для многоспиновых систем. Разбор нескольких
конкретных примеров (рис. 5.9) поможет нам сделать довольно аб-
страктные рассуждения этого раздела более понятными. Сначала рас-
смотрим два протона в молекуле, не содержащей других ядер со спином
1/2. При правильном выборе условий проведения эксперимента дополни-
тельных источников релаксации будет не так много (т. е. р* а; 0), и мы
получим почти максимальный (50%) ЯЭО иа одном протоне при
Ядерный эффект Оверхаузера
163
б
41 Нв Нс
Рис. 5.9. Двухспиновая система
и два возможных расположения
ядер трехспиновой системы.
облучении другого независимо от расстояния между ними. Этот пример
подтверждает первый принцип:
Наблюдение ЯЭО между двумя протонами само по себе еще
не говорит об их близости.
Для правильной интерпретации таких измерений нужна дополни-
тельная информация: другой эксперимент для сравнения, например, по
методу Белла и Сондерса или уверенность в том, что использующийся
для измерения ЯЭО протон не изолирован от других источников
кросс-релаксации. Второе условие выполняется при наличии в молекуле
как минимум еще одного спина (рис. 5.9,6). Пусть три протона находят-
ся на одной линии и один из крайних (НА) находится ближе к централь-
ному (HR), чем другой (Нс). Облучение НА будет давать значительное
повышение интенсивности сигнала Нв, поскольку он ближе, чем Нс.
и преобладает его кросс-релаксация. По этой же причине облучение Нс
будет давать небольшое увеличение сигнала Нв. Сравнение данных двух
экспериментов позволяет нам с очевидностью сделать вывод об относи-
тельных межьядерных расстояниях. Однако облучение Нв даст похожие
увеличения сигналов НА и Нс, поскольку с их точки зрения Нв-един-
ственный ближайший протон; поэтому такое измерение делать бесполез-
но. Это подтверждает тот факт, что в общем случае ЯЭО между двумя
ядрами неодинаков в различных направлениях, так как каждое ядро
может иметь различные связи с другими источниками релаксации.
Очень интересно также посмотреть, что произойдет с Нс при облуче-
нии НА. В молекуле с описанной ранее геометрией НА не будет
оказывать заметного прямого влияния на Нс; Нс «почувствует» только
увеличение разности заселенностей уровней своего соседа Нв, которое
произошло по причине ЯЭО от ядра НА. Поскольку понижение разности
заселенностей при насыщении создает на соседнем ядре положительный
ЯЭО, на ядре Нс мы должны получить отрицательный ЯЭО. Это
известный «трехспиновый эффект», который нужно обязательно учиты-
вать при интерпретации данных ЯЭО. Наличие отрицательного ЯЭО
в условиях предельного сужения очень характерно для линейного (или
почти линейного) расположения ядер. Можно представить себе и даль-
нейшее распространение ЯЭО по длинным цепям ядер, сопровождаю-
щееся чередованием его знака, но на практике непрямой ЯЭО более чем
через два ядра почти всегда пренебрежимо мал.
и*
164
Глава 5
Рис. 5.10. Зависимость т|( (2) от 0 иллюстрирует «трехспиновый эффект».
Другой аспект трехспинового эффекта можно рассмотреть иа модели
с геометрией, показанной иа рис. 5.9,в. Расстояние НА-НС сделано здесь
достаточно малым для того, чтобы прямой положительный ЯЭО между
ними не был пренебрежимо малым. Суммарный ЯЭО, наблюдающийся
на Нс при облучении НА, теперь будет определяться соотношением
прямого положительного и непрямого (через Нв) отрицательного
эффектов и при некотором отношении межъядерных расстояний может
исчезнуть вообще. Поэтому иногда ЯЭО может отсутствовать даже
у близко расположенных ядер при наличии значительной взаимной
кросс-релаксации. На рис. 5.10 представлен диапазон ЯЭО при «трех-
спиновом эффекте». Отсюда вытекает наш второй принцип:
Отсутствие ЯЭО между двумя ядрами само по себе еще не ,
говорит об их удаленности друг от друга.
Использовать этот принцип нужно еще внимательнее, чем первый,
поскольку отсутствие или малая величина ЯЭО может наблюдаться по
целому ряду причин. Отсюда можно сделать общий вывод, что интер-
претация ЯЭО требует учета всех испытываемых ядрами взаимодей-
ствий. Измерения ЯЭО в условиях равновесия можно также дополнить
измерениями неравновесного ЯЭО (разд. 5.2.5).
Важность такого подхода можно проиллюстрировать на примере
теоретической четырехспиновой системы, релаксирующей только за счет
диполь-дипольного взаимодействия [6] (рис. 5.11). ЯЭО обозначен на
рисунке стрелками, направленными от облучаемого протона к протону,
сигнал которого регистрируется. Не отмеченные на рисунке возможные
взаимодействия пренебрежимо малы. Сравните большую величину ЯЭО
на протоне НА н малую на протоне Нс при облучении Нв. Некритичный
подход к интерпретации таких данных позволил бы утверждать, что Нв
Ядерный эффект Оверхаузера
165
|____________________I_________i____I
О 4 6 7
относительное расстояние
Рис. 5.11. ЯЭО в линейной четырехспиновой системе. Величины, использованные
в тексте, приведены в толстых рамках.
находится ближе к НА, чем к Нс, хотя правильно как раз обратное.
Большой ЯЭО на НА объясняется тем, что он не имеет других источни-
ков релаксации, кроме Нв. Проанализировав все возможные в системе
ЯЭО, мы, вероятно, уже не сделаем этой ошибки. На практике при более
реальном соотношении межъядерных расстояний и ненулевом р* такой
внезапный эффект, обусловленный величинами ЯЭО, не возникнет, но
вывод ясен: к интерпретации данных нужно подходить очень аккуратно.
5.2.5. Неравновесный ЯЭО
Важная дополнительная информация о геометрии молекулы может
быть получена при измерении не самой величины т|, а скорости ее
установления [7]. Величина ЯЭО зависит от соотношения эффектив-
ности различных конкурирующих путей релаксации, которое, как мы
уже видели, может выражаться весьма непросто. Но начальная скорость
роста зависит только от скорости кросс-релаксации между двумя рас-
сматриваемыми ядрами. При постоянном тс она будет зависеть только
от межъядериого расстояния, и в случае рассматривавшейся ранее
четырехспиновой системы (разд. 5.2.4) начальная скорость роста цА (В)
должна быть значительно меньше скорости роста т]в (С), несмотря на то
что их конечные величины близки. Измерение скоростей роста ЯЭО-
менее надежный источник информации, чем определение равновесных
значений, но простота интерпретации этих данных с избытком компен-
сирует усложнение методики эксперимента. Кроме того, на описываемой
далее технике измерения неравновесного ЯЭО основан двумерный экспе-
римент NOESY (гл. 8).
В принципе скорость роста г| может быть измерена таким же путем,
как и его равновесное значение,-с помощью разностного метода (см.
разд. 5.3) при изменяющейся длительности периода насыщения. Однако
для интерпретации таких данных потребуется довольно сложная модель,
учитывающая рост как ЯЭО, так и насыщения, поскольку насыщение
тоже не может быть достигнуто моментально. Для того чтобы обойти
166
Глава 5
эту трудность, сначала с помощью селективного л-импульса осуще-
ствляют инверсию заселенностей облучаемого ядра и перед выборкой
данных дают задержку переменной длительности тт (рис. 5.12). Для
определения интенсивностей можно по-прежнему использовать разност-
ный метод. Сигнал, дающий в равновесных условиях положительный
ЯЭО, в эксперименте на скорость роста при небольших тт также даст
положительный резонанс, увеличивающийся от нуля до некоторого
максимума с ростом тт. При дальнейшем увеличении тт он начнет
постепенно уменьшаться за счет процессов обычной продольной релак-
сации, возвращающих систему в состояние теплового равновесия
(рис. 5.13). Наклон кривой роста интенсивности в начальный момент
времени представляет собой интересующую нас величину.
Практическая трудность определения скорости роста ЯЭО заклю-
тг
2
выборка
Рис. 5.12. Схема эксперимента для измерения нестационарного ЯЭО.
0,5 с
Рис. 5.13. Нестационарный ЯЭО (наверху-обычный спектр, ниже - разностные
ЯЭО-спектры с переменной задержкой тт). После селективной инверсии синглета
в центре спектра на трех других сигналах наблюдается рост отклика. При
достаточно больших интенсивности инвертированного пика и возникших ЯЭО
приближаются к нулю.
Ядерный эффект Оверхаузера
167
чается в том, что нам нужно проводить несколько измерений при
различных тт. Такой эксперимент займет, вероятно, больше времени,
чем измерение этого же ЯЭО в равновесных условиях, хотя, конечно, это
зависит от соотношения используемой в равновесном эксперименте
длительности периода насыщения с задержками и числом спектров
при измерении скорости роста. Кроме того, в первых точках кривой
ЯЭО далек от максимума, поэтому требуется большее отношение
сигиал/шум. Селективность инвертирующих импульсов создает те же
проблемы, что и насыщение; однако с помощью импульсов специальной
формы удается получить очень хорошие результаты (гл. 7, разд. 7.7.3).
5.3. Измерение ЯЭО
5.3.1. Введение
Чтобы немного отдохнуть от теоретических выкладок, мы перейдем
к практическим вопросам и рассмотрим, как ЯЭО измеряется на
практике. Для регистрации столь небольших изменений в интенсивности
сигнала (несколько процентов) нужна более высокая точность, чем
в большинстве других экспериментов ЯМР. Это требует самой высоко-
качественной работы как от спектрометра, так и от экспериментатора.
Помимо описания разностного метода измерения ЯЭО, а также спосо-
бов получения максимальных его значений и способов уменьшения
помех в эксперименте, мы уделим здесь внимание и таким важным для
разностной спектроскопии характеристикам спектрометра, как надеж-
ность канала дейтериевой стабилизации и стабильность частоты. Все
сказанное полезно знать не только при измерениях ЯЭО, ио и при
выполнении других экспериментов, требующих длительной стабиль-
ности спектрометра, как, например, двумерная спектроскопия.
5.3.2. Приготовление образца
Основное требование к образцам для измерения ЯЭО-это отсут-
ствие парамагнитных примесей (в основном кислорода), методы удале-
ния которых обсуждались в гл. 3. Эффективным способом обезгажива-
ния образца служит метод замораживания-откачивания-разморажива-
ния, который лучше всего проводить непосредственно в ЯМР-ампуле
(ампулы с удобными краниками, облегчающими эту процедуру, произво-
дит фирма Wilmad). Метод состоит из такой последовательности дей-
ствий:
]. Охладите образец в осушенной атмосфере с помощью жидкого
азота или смеси сухого льда с ацетоном.
2. Подсоедините его к хорошей вакуумной линии и откачайте.
3. Отсоедините образец от линии и нагрейте до комнатной темпе-
ратуры.
168
Глава 5
4. Напустите в образец азот и повторите всю процедуру с самого
начала.
Эту последовательность нужно повторять много раз (как минимум
нять). Удалить кислород полностью очень трудно; это легко продемон-
стрировать на растворе любого вещества с небольшими молекулами,
как, например, бензол. Проделывайте над ним циклы замораживания-
откачивания-размораживания и после каждого цикла проверяйте Т\
(быстрый метод определения Т\ описан в гл. 7). Обратите внимание,
насколько долго нужно обезгаживать образец до получения постоянного
Такой эксперимент, кроме того, позволит хорошо проверить ваше
оборудование. Старайтесь проводить обезгаживание образца непосред-
ственно перед измерением ЯЭО, поскольку кислород довольно быстро
диффундирует внутрь образца даже в ампуле с краником. Очень полезно
иметь вакуумную линию непосредственно в ЯМР-лаборатории.
Значительно труднее обезгазить водные растворы, при заморажива-
нии которых ампула может лопнуть. В этом случае обезгаживание
следует проводить в колбе и переносить раствор в ампулу в инертной
атмосфере. Используйте для переноса только специальные шприцы без
металлических деталей, поскольку обычные шприцы и иглы обязательно
внесут в раствор ионы металла. Нельзя обезгаживать образец пропуска-
нием через раствор газообразного азота. Этот способ ие эффективен,
и при его использовании в образец может легко попасть еще большее
количество парамагнитных примесей.
Обезгаживать водные растворы можно и с помощью простой откач-
ки образца без замораживания (естественно, подразумевается, что раст-
вор нелетуч). Это можно делать и непосредственно в Я МР-ампуле (очень
осторожно!), заполняя ее после каждого легкого вакуумирования инерт-
ным газом. Многократные повторения этого цикла позволяют сравни-
тельно эффективно обезгазить образец.
5.3.3. Метод разностных спектров
Введение. При измерении ЯЭО мы должны насыщать один резонанс-
ный сигнал и сравнивать интенсивности остальных сигналов с их
равновесными величинами. В принципе для этого можно просто про-
интегрировать сигналы, полученные в условиях насыщения и без него, но
такой способ недостаточно точен для измерения малых ЯЭО. Вместо
него применяется методика, известная под названием разностной спект-
роскопии ЯЭО (рис. 5.14). Кроме собственно разностного метода этот
эксперимент включает также использование прерываемой развязки.
Этот тип развязки позволяет производить сравнение спектра, получа-
емого при насыщении какого-либо сигнала, со спектром без насыщения.
Облучение нужного сигнала с помощью декаплера создает новые раз-
ности заселенностей в соответствии со всеми ЯЭО. При этом совсем
необязательно продолжать облучение сигнала и во время выборки ССИ,
поскольку заселенность уровней вернется к равновесной только по
Ядерный эффект Оверхаузера
169
А -------------------
предварительное
насыщение
Б
облучение
с большой
расстройкой
повторяется
N раз
выборка
выборка
повторяется
V раз
разностный спектр ™ А — б
Рис. 5.14. Схема эксперимента разностной спектроскопии ЯЭО.
истечении промежутка времени порядка Тг. Более того, желательно
выключить декаплер при выборке (что обычно и делается непосредствен-
но перед ее началом), чтобы избежать появления возможных сдвигов от
развязки или сдвигов Блоха-Зигерта. На первый взгляд может показать-
ся непонятным, почему в обычном эксперименте с развязкой облучение
необходимо производить на протяжении всего эксперимента, а ЯЭО,
будучи создай, продолжает существовать и без облучения. Но на самом
деле здесь нет ничего сложного.
После накопления нескольких прохождений спектра с облучением
сигнала нужно записать столько же прохождений без облучения. Чтобы
различие условий двух экспериментов было минимальным, обычно
вместо выключения декаплера просто смещают его частоту так, чтобы
она была существенно удалена от всех сигналов спектра. Это позволяет
предельно снизить все чисто аппаратурные эффекты, и разность получен-
ных спектров будет отражать только ЯЭО (однако существует эффект
селективного переноса заселенности, который мы обсудим позже). Вы-
читание невозбуждеиного ССИ нз возбужденного и последующее пре-
образование Фурье даст нам спектр, в котором будут присутствовать
только сигналы, не совпадающие в двух исходных ССИ (рис. 5.15).
Обязательно будет присутствовать и пик самого облучавшегося сигнала.
В разностном спектре ои инвертирован.
Таким способом мы должны определять ЯЭО совершенно однознач-
но. Методы численного измерения его величины мы обсудим позднее.
Однако на практике корректное вычитание спектров возможно только
при очень стабильной работе спектрометра. На стабильность прибора
влияет множество факторов, и многое здесь зависит от мастерства
оператора. Вообще разностная спектроскопия-это хороший тест иа
качество спектрометра (гл. 7). Ниже мы рассмотрим трудности, возника-
ющие в разностной спектроскопии, и те приемы, с помощью которых
можно получить иаилучшие результаты.
Вычитание лоренцевых линий. Зарегистрировав два раза сигнал ССИ
в одинаковых условиях, мы должны получить идентичные данные. Но иа
170
Глава 5
Т I 1 I 1 I F ' F I I I I I I fl 1 I I | I !' I P ] , I I 1 | I ' I I j I I I 1 “ I I.| I I I I I I I I I | 1 I I rj' I I I | I l"i I | I F I 1
4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 4,5 Aft 3,5 10 2,5 2,0 15 1,0
м.Э. и3
Рис, 5,15. Разностный эксперимент по ЯЭО, Слева внизу представлен спектр
с облучением, частота которого смещена от резонанса, а слева вверху-получен-
ный при облучении помеченного стрелкой сигнала. В разностном спектре видны
типичные для таких экспериментов особенности: пик с увеличившейся интенсив-
ностью (7); пик с дисперсионной формой линии, возникший из-за ошибок
вычитания (2); насыщавшийся резонанс, инвертированный в разностном спектре
(5); интенсивный отрицательный пик, возникший из-за недостаточной селектив-
ности насыщения (4).
практике из-за несовершенства спектрометров данные этих двух экспери-
ментов могут различаться по амплитуде, фазе и частоте. Поэтому после
вычитания ССИ, при котором должны исчезнуть все совпадающие пики,
в разностном спектре все же сохраняется ряд остаточных сигналов,
интенсивность которых зависит от типа и величины искажений ССИ.
Предельно допустимая интенсивность остаточных пиков зависит от типа
проводимого эксперимента. При измерении ЯЭО желательно иметь
возможность надежно регистрировать изменение амплитуды сигнала на
1%. Для этого интенсивность остаточных пиков не должна превышать
0,1%. В следующих параграфах мы увидим, насколько трудно выпол-
нить это требование, поскольку оно затрагивает такие характеристики
спектрометра, как стабильность фазы и частоты. Но сначала выясним,
как нам провести измерение ЯЭО с минимальными трудностями.
Основа разностного эксперимента состоит в суммировании несколь-
ких прохождений в условиях насыщения некоторого сигнала и такого же
числа прохождений без насыщения. Это число можно выбрать в соответ-
ствии с требующимся отношением сигнал/шум. Однако существует
и другой лимитирующий фактор, пе позволяющий использовать малое
число прохождений даже для протонных спектров. Усреднение сигналов
позволяет повысить степень подавления паразитных пиков, если не-
стабильность прибора, приводящая к их появлению, носит случайный
характер. В этом случае мы достигнем улучшения подавления паразит-
ных пиков по сравнению с одним прохождением в число раз, равное
квадратному корню из числа прохождений, как и при улучшении
Ядерный эффект Оверхаузера
171
отношения сигнал/шум. Но нестабильность прибора помимо случайных
факторов может содержать также и систематические дрейфы пара-
метров, возникающие, например, за счет постепенного изменения темпе-
ратуры. Поэтому лучше всего через некоторые промежутки времени
чередовать накопление насыщаемого и ненасыщаемого спектров. На-
пример, мы можем сделать 16 прохождений с облучением сигнала, затем
16 без облучения и повторить всю эту процедуру 10 раз, чтобы получить
в сумме 160 прохождений в каждом ССИ.
Таким образом мы можем добиться дополнительного уменьшения
интенсивности остаточных пиков в 10-12 раз. Это значит, что если нам
в конечном счете нужна ошибка 0,1%, то точность при вычитании ССИ
для простой пары прохождений не должна превышать 1-2%. Добиться
хорошего воспроизведения амплитуды сигналов на практике достаточно
легко. Значительно труднее устранить нестабильность фазы и частоты.
Это два аспекта одного и того же явления, так как шум фазы непосред-
ственно связан с модуляцией частоты. Но мы будем рассматривать их
раздельно, поскольку они дают различные результаты. Наш подход
основан на анализе реального разностного спектра после преобразова-
ния. т. е. спектра в частотной области.
Сначала рассмотрим последствия небольшого изменения фазы <р при
переходе от одного прохождения к другому. Будем считать, что реаль-
ная часть ССИ после первого прохождения содержи! чисто абсорбцион-
ный сигнал. Тогда при втором прохождении (см. гл. 4), результат
которого мы собираемся вычитать из первого, сигнал за счет сдвига
фазы будет представлять собой
£ = Acos<p — D sirup (5.18)
Поскольку ф-малый угол (если, конечно, спектрометр не сломан), мы
можем значительно упростить это выражение. Градиент costp при ф = 0
минимален, а градиент simp максимален. Небольшие отклонения <р от
нуля вызовут незначительное изменение абсорбционной составляющей,
в то время как дисперсионная часть существенно вырастет. Таким
образом, мы можем считать, что в разностном спектре с небольшим
сдвигом фазы ф абсорбционная составляющая исчезнет полностью,
а остаточные сигналы будут состоять только из дисперсионной части
с амплитудой, пропорциональной sin ф. Остаточные сигналы такого
типа можно легко найти почти во всех спектрах этой главы. Возьмем
конкретный пример: если <р = Г, то cos ф = 0,99985, a sin ф — 0,017, т. е.
даже такая небольшая ошибка фазы приводит к появлению предельно
допустимых остаточных сигналов. Спектрометр с частотой 500 МГц, на
котором получено большинство спектров для иллюстраций этой книги
(самый совершенный прибор с цифровой генерацией частот и фаз), имеет
среднюю нестабильность фазы порядка + 2а. Такая ошибка легко
объясняем появление в разностных спектрах значительных остаточных
сигналов. В этом отношении коммерческие приборы нуждаются в даль-
нейшем усовершенствовании.
172
Глава 5
pW
Рис. 5.16. При вычитании двух лорен-
цевых линий, даже совсем немного от-
личающихся по частоте, остается зна-
чительный сигнал (в левой части рисун-
ка различие частот едва заметно).
Остаточные пики могут появляться и при вычитании сигналов
с одинаковой амплитудой и фазой, но различными частотами (рис. 5.16).
Похожая ситуация встречается и в фазочувствительной двумерной
спектроскопии (гл. 8) при перекрывании двух линий с противоположны-
ми фазами. В гл. 3 мы уже записывали уравнение лоренцевой линии
с амплитудой А и шириной на полувысоте И7 (рис. 3.3):
ЛИ72
Ж2 4- 4(v0 - v)2
(5.19)
Рассмотрим две линии с v0 = (+ 1/2)/? Ж и (— 1/2)/? И7 (т. е. разделен-
ные на р ширин линий; нас интересуют случаи, когда р меньше 1). Пусть
х = 2 v/W, тогда их разность можно записать как
7ЛЯ“л(1+01-^"1+^+^) <5'2О)
Это выражение не соответствует точно дисперсионной лоренцевой фор-
ме, но задаваемая им линия также проходит в центре через нуль: в точке
х = 0 или посредине между двумя лореицевыми линиями (рис. 5.16).
Нам нужно узнать амплитуду этой линии, и мы найдем х-координаты ее
максимума и минимума. Продифференцировав (5.20), приравняв полу-
ченное уравнение нулю и решив его относительно х, получим
х = + —= (р2 + 2 v/p4 + Р2 + 1 ” 1)1/2 (5-21)
V3
Это очень интересное уравнение. Из него следует, что даже для сравни-
тельно больших величин р измеряемая разность частот двух противо-
фазных пиков значительно отличается от их действительной разности.
Например, для р = 4 ошибка составляет 17%. Об этом важно помнить
при измерении в двумерном фазочувствительиом спектре константы
спин-спииового взаимодействия протонов порядка нескольких герц по
двум линиям с противоположными фазами примерно той же ширины.
Ядерный эффект Оверхаузера
173
Техника таких измерений рассматривается в гл. 8, где приведено графи-
ческое решение уравнения (5.21).
Амплитуда остаточных пиков задается довольно сложным выраже-
нием (эта зависимость изображена графически на рис. 5.17), но иас
с точки зрения разностной спектроскопии интересуют только малые
величины р. Выражение (5.21) имеет предел х = ± 1/^/3 при т. е.
расстояние между максимумами близко к ИУ^/з при любых достаточно
малых р. При этом условии амплитуда линии, т. е. разность интенсив-
ностей самой положительной и самой отрицательной точек, отнесенная
к амплитуде исходных линий, будет иметь вид
= (5.22)
Таким образом, для того чтобы интенсивность остаточных сигналов не
превышала 2%, частота линий не должна изменяться от прохождения
к прохождению более чем на 1% их ширины! Это значит, что для
типичных протонных липни шириной 1 Гц флуктуации поля не должны
превышать 10 мГц, т. е. 5-10“10 на 500 МГц. Это близко к пределу
стабильности частоты термостатированных кварцевых генераторов.
Такая стабильность может быть достигнута, но это требует использова-
ния оптимальных конструкций приборов и тщательного контроля усло-
вий эксперимента. Использование при обработке данных экспоненциаль-
ного умножения ССИ уменьшает амплитуду остаточных сигналов этого
типа, поэтому желательно использовать экспоненциальную функцию
с большим уширением линии, чем в оптимальном фильтре.
Оптимальные условия разностной спектроскопии ЯЭО. Нам стало
ясно, что измерение небольших ЯЭО требует от спектрометра предель-
ной реализации всех его возможностей. Поэтому нужно выяснить, что
174
Глава 5
можно сделать для увеличения ЯЭО и улучшения подавления остаточ-
ных сигналов. Сначала рассмотрим последний вопрос. Стабильность
спектрометра может зависеть от таких аспектов эксперимента, как
дейтериевый лок и параметры окружающей среды образца. В гл. 3 мы
уже рассматривали систему лока, в разд. 5.3.4 дан более подробный ес
разбор. Здесь мы постараемся выяснить, какие факторы, связанные
с условиями, в которых находится образеп, могут дестабилизировать
эксперимент.
Наиболее вероятный фактор-нестабильная температура. Химичес-
кие сдвиги во многих случаях обладают значительной зависимостью от
температуры, которая может проявляться на интересующих нас сигна-
лах как непосредственно, так и через изменение химического сдвига
опорного сигнала лока. Особенно сильно это проявляется в водных
растворах. Таким образом, при измерении ЯЭО очень хорошо исполь-
зовать температурную стабилизацию, которая легко достигается нагре-
ванием образца чуть выше комнатной температуры. Нагревание полезно
еще и потому, что оно приближает образец к области предельного
сужения. При работе с большими молекулами может оказаться необхо-
димым использовать максимально допустимую для раствора темпе-
ратуру. Следует иметь в виду, что обычный температурный блок
спектрометра ЯМР-довольно грубое устройство с точки зрения под-
держания температуры, близкой к комнатной. По возможности, лучше
купить или сделать самому более качественный блок [8]. В любом
случае следует экспериментально проверить, дает использование темпе-
ратурного контроля улучшение или нет.
Другой фактор, влияющий на качество разностных экспериментов,-
это, по рассказам ЯМР-спектроскопистов, перемещение людей и боль-
ших предметов возле лаборатории. Поэтому эксперименты по ЯЭО
рекомендуется делать ранним утром или в воскресенье, хотя, по опыту
автора, увеличение времени выборки позволяет полностью исключить
влияние этих факторов. Но все-таки во время проведения разностных
экспериментов лучше стараться избегать всяких движений в комнате, где
стоит спектрометр, особенно если это прибор с высокой напряжен-
ностью поля.
Другое направление, в котором мы можем частично контролировать
эксперимент по ЯЭО, это сама величина ЯЭО. Минимизируя р* и обес-
печивая условия предельного сужения, мы тем самым увеличиваем шанс
измерения чистой кросс-релаксации. Это означает, что мы должны
работать с разбавленными, тщательно обезгажеиными образцами в дей-
терированных растворителях высокой изотопной чистоты. Желательно
выбирать наименее вязкий из подходящих растворителей. Надо про-
верить, достаточен ли период насыщения для установления новой
равновесной заселенности, г. е. длительность облучения должна быть
как минимум в 3 раза больше максимального Г]5 а лучше-еще больше.
Особенно медленно возникает непрямой трехспиновый ЯЭО, поскольку
установление промежуточного прямого ЯЭО, который должен появить-
Ядерный эффект Оверхаузера
175
ся первым, само требует времени порядка Тг. Очень полезно предвари-
тельно оценить 7] по быстрой методике (гл. 7, разд. 7.5.3), особенно это
важно в случае протонов, где в одной и той же молекуле 7\ может
меняться от долей секунды до 5 с и более. Величины могут помочь
и в интерпретации данных ЯЭО, поскольку необычно большие Т,
свидетельствуют об относительной изоляции протона от источников
диполь-дипольной релаксации. Выводы из величин ЯЭО на таком
протоне следует делать очень осторожно (вспомните протон НА
четырехспииовой системы, обсуждавшейся в конце разд. 5.2.4).
Селективность и проблема селективного нереноса заселенности. До сих
пор мы предполагали, что можем произвольно насыщать все линии
любого мультиплета. Одиако на практике насыщение одного сигнала
в сложном спектре без возмущения остальных может представлять
собой столь сложную проблему, что именно она часто определяет
возможность применения разностного метода измерения ЯЭО. Решить
ее можно только методом проб и ошибок, используя различные напря-
женности радиочастотного поля и оценивая насыщение желательных
и нежелательных сигналов (общее обсуждение проблемы селективного
облучения полями малой напряженности см. в гл. 7, разд. 7.7.2). Обычно,
чтобы избежать насыщения находящихся поблизости сигналов, мы
вынуждены использовать неполное насыщение интересующего нас муль-
типлета, что приводит к понижению величин ЯЭО. В связанных спино-
вых системах эта проблема может усложняться еще и эффектом, извест-
ным под названием селективного переноса заселенности (SPT, от англ.
Selective Population Transfer).
SPT может возникать в связанных спиновых системах, когда различ-
ные переходы одного и того же ядра испытывают неравное возмущение.
В идеальном случае, когда все переходы насыщаются полностью, SPT не
возникает вообще. Однако, пытаясь повысить селективность облучения,
мы стремимся снизить напряженность радиочастотного поля и тем
самым создаем возможность для появления SPT. Мы ие будем здесь
рассматривать механизм переноса заселенности, поскольку он подробно
обсуждается в гл. 6; укажем только природу этого явления и способы его
подавления. В отличие от ЯЭО, повышающего общую интенсивность
мультиплета, SPT создает только разностную поляризацию, т. е. приво-
дит к появлению линий с противоположными фазами, суммарный
интеграл которых равен нулю (рис. 5.18). При интегрировании сигналов
для определения ЯЭО линии SPT не изменяют величину интеграла, но
интенсивные линии с противоположными фазами искажают спектр,
поэтому имеет смысл попробовать их подавить.
К счастью, это легко достигается при использовании тг/2-импульсов
для регистрации спектра [9J. При этом задержки между прохождениями
обязательно должны быть в несколько раз больше Тг Это необходимо
также из соображений повышения чувствительности. Для действительно
полного подавления SPT-сигналов рекомендуется использовать состав-
176
Глава 5
1 I I I I I I I I I !
4-5 4,4 4,3 4,2 4,1 4,0 3,3 3,8 3,2 3,S
M.d.
Рис. 5.18. При использовании импульсов небольшой длительности неравное на-
сыщение мультиплетов создает в спектре значительный SPT-эффект (спектр
в центре), полностью перекрывающий небольшие ЯЭО. Использование состав-
ных л/2-импульсов (верхний спектр) позволяет эффективно подавить SPT и вы-
явить ЯЭО.
иые п/2-импульсы (гл. 7, разд. 7.3). Все спектры в этой главе, кроме
приведенного на рис. 5.18, были получены именно таким путем.
Количественные измерения. После того как получен удовлетворитель-
ный разностный спектр, нам остается провести интегрирование его
сигналов и получить численные величины различных ЯЭО. Существуют
два подхода к решению этой задачи. Прямой подход следует из
определения 1). Он состоит в получении величин интегрированием
мультиплетов в невозбуждениом спектре (т. е. отдельно преобразован-
ной части Б иа рис. 5.14), которым приписывается интенсивность 100%.
Интегрирование соответствующих мультиплетов в разностном спектре
даст непосредственно величины ц. Спектр должен иметь тот же масшта-
бирующий фактор. Для этого, возможно, потребуется установить не-
который флажок в программном обеспечении спектрометра.
Ядерный эффект Оверхаузера 177
Хотя такая процедура и позволяет получить величину реального
увеличения интенсивности каждого мультиплета, пользоваться ей мож-
но не всегда. При снижении напряженности насыщающего поля для
повышения селективности мы, вероятно, получим неполное насыщение.
В этом случае имеет смысл как-то масштабировать полученные значения
ЯЭО с учетом степени насышения, чтобы определить те значения,
которые были бы получены при полном насыщении. Это можно сделать
при использовании в качестве эталона интенсивности насыщавшегося
сигнала в разностном спектре. Ему нужно приписать интенсивность
-100%, если это мультиплет одного протона. Интегралы остальных
пиков вычисляются в этой шкале. Численные величины ЯЭО, приводи-
мые в разд. 5.4, получены именно таким способом.
Какой бы способ измерения ни был выбран, не стоит рассчитывать на
высокую точность результатов. Отношение сигиал/шум для разностного
пика интенсивностью в несколько процентов обычно достаточно мало,
и нет смысла приводить его величину с несколькими десятичными
знаками. Но, к счастью, в большинстве случаев нас интересует отличие,
скажем, 5% ЯЭО ог 20%, которое можно заметить вполне отчетливо.
Большая точность не нужна даже при выполнении вычислений по
уравнению (5.17), поскольку обратная зависимость расстояний от
шестой степени ЯЭО делает их нечувствительными к ошибкам отдель-
ных величин т|.
5.3.4. Некоторые замечания о дейтериевой стабилизации
Использование системы долговременной стабилизации поля с помо-
щью системы дейтериевой стабилизации необходимое условие осуще-
ствления разностной спектроскопии. Однако в масштабе времени от-
дельного прохождения такая система ие в состоянии обеспечить доста-
точную стабилизацию. Причины этого станут нам вскоре ясны, но это не
приведет к улучшению стабильности поля. Нам необходимо обеспечить
оптимальные условия стабилизации. Мы уже обсуждали их в гл. 3, но
теперь, когда объем наших знаний вырос, пора снова вернуться к этому
вопросу. Сказанное здесь полностью относится и к двумерной спектро-
скопии, где эффекты кратковременной нестабильности отношения
поле/частота проявляются как «г,-шум» (см. гл. 8).
Задача системы стабилизации - поддержание постоянного отношения
напряженности поля к рабочей частоте. Для этого постоянно наблю-
дают сигнал некоторой линии ЯМР, обычно дейтериевого резонанса от
молекулы растворителя, и подстраивают постоянное поле так, чтобы эта
линия оставалась на одном н том же месте. Для этой цели очень удобна
дисперсионная форма линии, имеющая нулевую амплитуду в точке
резонанса, которая становится положительной и отрицательной по
разные от него стороны (рис. 5.19). Выделяемый таким образом сигнал
можно непосредственно использовать для коррекции поля в петле
обратной связи. Нам сразу, становится понятна необходимость правнль-
12 75
178
Глава 5
Рис. 5.19. Петля обратной связи системы стабилизации, обеспечивающая по-
стоянное положение опорной линии, использованной в форме сигнала дисперсии.
иой настройки фазы катима стабилизации (гл. 3). Полностью неправиль-
ная установка фазы, например, соответствующая линии поглощения,
нарушает стабилизирующую способность петли обратной связи, по-
скольку амплитуда сигнала в точке резонанса нс будет нулевой. Даже
небольшие ошибки фазы в канале стабилизации приводят к уменьшению
градиента линии в ее центре, снижая тем самым эффективность его
работы.
При отсутствии шума в опорном сигнале система будет способна
устранять изменения отношения поле/частота с достаточно большой
скоростью, ограничиваемой быстротой коррекции поля и необходи-
мостью подавления возможных осцилляций или устранения сбоя резо-
нансных условий. Однако сигналы ЯМР неизбежно содержат шум, и мы
вынуждены увеличивать время регистрации опорной линии, чтобы этот
шум не вызвал флуктуаций постоянного поля (это была бы просто
аварийная ситуация!). Регистрируемый опорный сигнал стабилизации
усредняется электронным интегратором в течение довольно длитель-
ного промежутка времени от десятков до сотен секунд. Обычно постоян-
ная времени усреднения-это внутренняя характеристика спектрометра,
которую не может менять оператор. Нет оснований ожидать выполне-
ния коррекции поля в промежутки времени, меньшие указанного. Это
очень плохо, поскольку именно такие времена и интересны с точки
зрения разностной спектроскопии.
Таким образом, стабилизация вряд ли будет эффективно работать во
временных интервалах порядка одного прохождения. Но тем не менее
долговременная стабилизация остается важной, и мы можем обсудить
способы оптимизации се работы. Сигнал коррекции, получаемый из
дисперсионной формы опорной линии, будет наиболее чувствителен
Ядерный эффект Оверхаузера
179
к изменениям отношения поле/частота при условии, что сигнал узкий,
при правильно настроенной фазе и большом отношении сигиал/шум.
Мы можем воздействовать на эти факторы как с помощью выбора
режима работы спектрометра (тщательная настройка разрешения, пра-
вильная настройка мощности и фазы опорного сигнала стабилизации),
так и подбором растворителя, поскольку ширины резонансных линий
дейтерия в спектрах различных растворителей изменяются в широких
пределах. Один из лучших ЯМР-растворителей-ацетон, дающий в
спектре дейтерия очень узкую линию, так как его вязкость мала. Более
вязкие растворители (например, диметилсульфоксид, пиридин), вероят-
но, создают худшие условия для стабилизации. Один из самых плохих
в этом плане растворителей - неизбежная во многих экспериментах вода.
Ее протоны (или ионы дейтерия) участвуют в обменных процессах. При
определенных pH, температуре и типе растворенного вещества они
могут давать чрезвычайно широкую линию. Эти факторы необходимо
учитывать при планировании эксперимента, поскольку небольшие из-
менения характеристик водных растворов могут вызвать значительное
уширение линии опорного сигнала в канале стабилизации.
5.4. Использование ЯЭО
5.4.1. Очень простой случай
Рассмотрим самую обычную проблему: надо различить цитрако-
новую (1) и мезаконовую (2) кислоты. В этом случае мы можем
использовать подход Белла и Сондерса, поскольку обе молекулы
н
ногс
НО2С
Me
1 2
очень близки по структуре и нет опасности наложения посторонних
диполь-дипольных взаимодействий. При выполнении эксперимента в
растворе D2O в молекуле останутся только интересующие нас протоны:
олефиновые и метильные. При исследовании изомерных олефинов по-
лезно помнить об одном правиле: отношение межъядериых расстояний
в цис- и транс-изомерах составляет около 1,3:1. В этом очень простом
случае использование стандартных длин связей позволяет рассчитать (в
предположении усреднения положений метильных протонов) отношение
расстояний между олефиновым и метильными протонами в цис- и
транс-изомерах, которое оказывается равным 1,32:1.
Удобнее всего измерить ЯЭО на олефиновом протоне при насыще-
нии метильных. Возможен и образный эксперимент, но он менее
12*
180
Глава 5
разностный
спеитр ЯЭО
мезаконовая кислота
6,6
6,2
М.0.
U,UniраненоАаа кислота
нормальный
j спектр
26
2,4
2,2 2,0
М.0.
1,6 1,6
Рис. 5.20. Разностные спектры, обсуждающиеся в тексте.
интересен, поскольку метильные протоны релаксируют в основном за
счет диполь-дипольного взаимодействия друг с другом и измеряемый на
них ЯЭО будет намного меньше. На рис. 5.20 показаны протонные
спектры обеих кислот и соответствующие разностные ЯЭО-спектры
с облучением метильных протонов. Много усилий было затрачено на
получение действительно равновесного ЯЭО. Это оказалось не самым
простым делом для таких малых молекул: 7\ олефинового протона
в щрйнс-изомере составляет около 18 с. Как и ожидалось, ЯЭО, получен-
ный для цитраконовой кислоты, значительно превышает ЯЭО для
мезаконовой кислоты. Для двух соединений интегрирование сигналов
дает значения т), равные 0,29 и 0.06 соответственно. Предполагая
зависимость р от расстояния типа 1/г6, мы получаем отношение межъ-
ядерных расстояний 1,30:1, и если точность определения р составляет
+ 0,01 (оптимистичная оценка!), то ошибка в величине отношения
расстояний составляет + 0,04. Таким образом, найденная величи-
на совпадает с известными расстояниями в пределах ошибки экспери-
мента.
Итак, мы получили вполне удовлетворительный результат. Но все-
таки рассмотрим, с какими проблемами мы столкнулись бы в случае
доступности только одного из изомеров. Мы бы получили некоторый
результат, допустим, 6%. Но какой вывод мы должны отсюда сделать?
Не имея данных по второму веществу, мы не можем сказать, «большой»
это или «малый» ЯЭО. Действительно, при плохом приготовлении
образца и неоптимальном выборе параметров регистрации спектра мы
легко можем получить такую величину и на i/uc-изомере. Например, если
вы предварительно не проверили 7? и выбрали длительность периода
насыщения только несколько секунд, то ЯЭО не успеет полностью
установиться. Сущность использования ЯЭО для определения структу-
ры состоит в сравнительном характере этого метода. В самом деле,
надежные результаты можно получить только при сравнении двух
Ядерный эффект Оверхаузера
181
стереоизомеров. Чем дальше вы отходите от такой ситуации, тем
осторожнее надо интерпретировать полученные данные.
Еще один интересный аспект эксперимента состоит в ширине диа-
пазона возможных величин ЯЭО. Максимально возможный ЯЭО со-
ставляет, разумеется, 50%. Величины, меньшие 1%, трудно измерить
достоверно. Таким образом, максимально возможное соотношение со-
ставляет 5011, что соответствует отношению межъядерных расстояний
чуть менее 2:1. Это задает «динамический диапазон» эксперимен-
та; расстояния, имеющие большее отношение, оказываются несравни-
мыми.
5.4.2. Проверка трехспинового уравнения
Если в нашем образце можно выделить изолированную трехспиио-
вую систему, то очень полезно попробовать использовать уравнение
(5.17). В качестве примера рассмотрим акриловую кислоту. Протон
карбоксильной группы снова можно заменить на дейтерий и оставить
чисто трехспиновую систему, дающую на частоте 500 МГц спектр
первого порядка. Измерение ЯЭО в этой системе представляет собой
интересную техническую проблему, поскольку резонансы разделены
всего на 120 Гц, что затрудняет селективное облучение. При облучении
мультиплетов первого порядка хорошо работает процедура последова-
тельного насыщения линий [10]. Частота декаплера настраивается на
одну из линий, и на короткое время включается слабое поле (несколько
герц). Затем частота облучения переводится на следующую линию
и т.д.; этот цикл выполняется в течение всего периода насыщения,
Максимальное Tt акриловой кислоты в обезгаженном метаноле
составляет около 10 с (протон Нх в формуле 3). При проведении
эксперимента каждая линия мультиплета подвергается краткому облуче-
нию в течение 0,5 с, полный цикл для четырех линий составляет 2 с.
Цикл повторяется 45 раз, и общая длительность периода насыщения
получается равной 9 . Как видно из разностного спектра на рис. 5.21
(приведен только один из трех экспериментов), применение очень слабо-
го радиочастотного поля позволяет добиться чрезвычайно высокой
селективности. Полученные величины ц приведены в табл. 5.1 (обозначе-
ние протонов соответствует формуле 3).
Таблица 5.1, Величины ЯЭО для акриловой
кислоты (индексы протонов даны в соответ-
ствии с формулой 3)
Облучается А М X
т]г - 0.340 0,068
пм 0,360 - -0,015
Г|х 0,140 - 0.035
182
Глава 5
Рис. 5.21. Один из трех ЯЭ О-экспериментов для акриловой кислоты.
При использовании уравнения (5.17) для данных такого типа не-
обходимо выбрать наиболее удобное для расчетов отношение межъ-
ядерных расстояний. В нашем примере каждый изомер характеризуется
только одним геометрическим соотношением, но выразить его можно
разными способами. Например, мы можем выбрать отношение межъ-
ядерных расстояний в цис- и т/мнс-изомерах, а можем выбрать и от-
ношение одного из них к геминальному расстоянию (гЛМ в формуле 3).
Такие варианты соответствуют перестановке индексов А, М, X в уравне-
нии (5.17). Анализируя уравнение и типичные данные для таких систем,
легко догадаться, что наиболее точный результат может быть получен
при такой расстановке индексов, когда взаимодействия AM и АХ велики
по сравнению с MX. Другая расстановка индексов (формула 4) поставит
отношение межъядерных расстояний в зависимость от очень малой
разности неточных величии, что внесет большую ошибку.
Итак, самым удобным для вычислений будет отношение расстояний
между цис- и гел/-протонами; исходя из длин связей, оно должно быть
Ядерный эффект Оверхаузера
183
1,30:1. Подставив нужные значения из табл. 5.1 в уравнение (5.17), мы
получим 1,32:1. Это вполне удовлетворительный результат. Чтобы
проиллюстрировать важность правильного выбора расстояний, попро-
буйте повторить расчеты с индексированием протонов по формуле 4. Вы
будете сравнивать цис- и трднс-расстояния; оценка их отношения с уче-
том длин связей составляет 0,79:1. Вычисленный по (5.17) результат
должен значительно отличаться от этой величины. Объясняется это тем,
что в системе преобладает взаимодействие MX, в то время как требую-
щаяся информация содержится именно в разности взаимодействий AM
н АХ.
5.4.3. Реальная задача
При попытке использовать измерения ЯЭО для более интересных
молекул, чем приведенные в предыдущем разделе, мы столкнемся
с некоторыми трудностями. Вероятно, большое число взаимодействую-
щих протонов сделает невозможным расчет межъядерных расстояний.
Предположение о равных корреляционных временах для всех межъядер-
ных векторов, на котором основаны такие расчеты, скорее всего вообще
не выполняется для больших молекул, и мы не должны забывать об
этом. Для того чтобы добиться успеха в определении структур сложных
молекул, мы должны частично забыть о «двух основных принципах» из
разд. 5.2.4. Мы будем считать, что наблюдаемая величина ЯЭО отража-
ет относительную близость ядер, ио при этом надо помнить, что в не-
которых случаях наши выводы могут быть неверны. Попробуем решить
реальную задачу.
При длительном нагревании трипептида 5 с ферментом изопеницил-
лин-М-синтетазой (IPNS, схема 1) [11] из реакционной смеси выделяется
соединение 6. Общая структура легко устанавливается при простом
SH
5
Схема 1
анализе протонного спектра и подтверждается протонным двумерным
корреляционным спектром (гл. 8). Задача состоит в выяснении
стереохимии этого соединения и особенно в определении ориентации
гидроксильной группы в семичлениом цикле, которая частично оп-
ределяется механизмом действия фермента. В более изученных ци-
клических системах задачи такого типа легко решаются с помощью
протои-протонных констант спин-спинового взаимодействия, но для
подобных систем этих данных нет, и, кроме того, будет не так просто
184
Глава 5
Рис. 5.22. Эксперимент по измерению ЯЭО для соединения 6.
определить конформацию большого цикла. Однако на основании
протонных констант мы можем утверждать, что два протона в
четырехчлениом цикле находятся в г/мс-положении (как показано в
формуле 6); это дает начальную информацию для построения экспери-
мента по ЯЭО.
Прежде чем представить полученные величины ЯЭО, делающие
отнесение структуры почти очевидным, мы коснемся некоторых практи-
ческих трудностей, встретившихся при решении этой задачи. Изучаемое
соединение малоустойчиво, а в ферментативной реакции в каждом
опыте можно получить его в очень небольших количествах (ие более
1 мт). Как хорошо видно из некоторых разностных спектров на рис. 5.22,
такое количество вещества соответствует пределу чувствительности
даже спектрометра па 500 МГц. Это значит, что регистрация ЯЭО
требует большого количества времени работы спектрометра порядка
15ч па каждый эксперимент, а достаточную информацию о структуре
можно получить только за несколько дней. Трудно описать в книге эту
сторону спектральной работы. Простой перечень результатов и сделан-
ных из иих выводов придают эксперименту излишне сухой и аналитичес-
кий вид. На самом же деле это настоящая борьба и настоящий под-
виг. Еще одним следствием трудной доступности вещества ока-
зывается низкая точность полученных величин ЯЭО. Величины, от-
личающиеся друг от друга менее чем в 2 раза, приходится считать
неразличимыми.
Результаты измерения ЯЭО на соединении 6 приведены на схеме 2.
Ядерный эффект Оверхаузера
185
Схема 2
Сначала рассмотрим эксперимент на протонах Н2а и H2h (на схеме
слева). Нашей точкой отсчета будет протон Н7, которому мы приписы-
ваем изображенную стереохимию и который, как известно, находится
в t/wc-положении по отношению к другому протону р-лактама. Заметный
ЯЭО (5%) на Н7 при облучении Н2а и нулевой эффект при облучении Н2Ъ
свидетельствуют о том, что Н2а также находится за плоскостью рисунка
(см. формулу 6). (У авторов уже был большой опыт работы с Р-лактам-
ными системами, поэтому такое отнесение не вызывало сомнений.) Как
очевидно, Н2Ь находится по ту же сторону плоскости рисунка, что и Н5
(3% ЯЭО). Это позволяет зафиксировать относительные конфигурации
С7 и С5. К сожалению, вопрос о конфигурации С3 не так ясен. Похоже,
что Н2а создает на Н3 больший ЯЭО, чем Н2Ь, ио низкая точность
измерений и сложность спиновой системы делают рискованным отнесе-
ние конфигурации по этим данным.
Только что описанные эксперименты были выполнены в первой серии
измерений, и задача, таким образом, осталась нерешенной. Спустя
некоторое время была проделана вторая серия измерений с облучением
протонов Н4а н H4h (на схеме 2 справа), которые полностью прояснили
структуру. Прежде всего большие величины ЯЭО на Н5 н Н3 при
облучении Н4Ь свидетельствуют об их сходном положении, а поскольку
Н5 уже связан с Н2Ъ, можно утверждать, что гидроксильная группа
находится за плоскостью рисунка. Конфигурация С4 была подтверждена
взаимодействием Н4а и Н7, также свидетельствующим о предложенной
конфигурации цикла. Таким образом, установленная стереохимия со-
ответствует формуле 7. Позже она была подтверждена обратной карти-
ной взаимодействия протонов при С2 с протоном Н3 в изомерном
веществе 8.
СО2Н
СО2Н
Из этого примера можно сделать важный вывод: почти всегда имеет
смысл измерять все возможные ЯЭО. Даже если вам кажется, что еще
186
Глава 5
один эксперимент будет пустой тратой времени, все-таки проделайте
его - ведь он ие потребует больших дополнительных усилий. Не думайте,
что вы сможете заранее предсказать его результаты. Например, взаимо-
действие Н4а и Н7 в веществе 6 оказалось неожиданным и принесло
полезную информацию. Чем- больше можно получить информации,
подтверждающей гипотетическую структуру, тем лучше, поскольку
ошибки в интерпретации данных по ЯЭО встречаются гораздо чаще, чем
в других областях ЯМР,
5.4.4. Гетероядерный ЯЭО
До сих пор мы занимались только гомоядерным ЯЭО и упомянули
гетероядерный эффект только как источник повышения чувствительности
на ядрах со спином 1/2 и малым у. ЯЭО между протоном и гетероядром
может быть информативен и в селективных экспериментах, позволяя
преодолеть некоторые технические трудности. Возьмем, к примеру, 13С.
Релаксация протонированного углерода происходит в основном за счет
непосредственно связанных с ним протонов, и в этом случае ЯЭО не
будет интересеи-информацию легче получить с помощью развязки или
двумерной гетероядериой корреляции химических сдвигов. Очень инте-
ресный момент состоит в том, что часто можно избежать создания
прямого ЯЭО, поскольку он получается при насыщении не основного
протонного сигнала, а его 13С-сателлитов. На практике обычно удается
облучать центральную 12С-линию, не задевая сателлитов, поскольку
прямые константы протон-углеродного взаимодействия довольно вели-
ки. В этом случае мы должны увидеть ЯЭО только на четвертичных
углеродах, связанных с тем атомом углерода, протоны которого облуча-
лись. Этот эксперимент может дать совершенно необычную стерео-
химическую информацию.
Важнейшая проблема таких эксперимеитов-чувствительиость. Она
осложняется еще и тем, что спектры необходимо регистрировать с
широкополосной развязкой от протонов, поэтому между прохождения-
ми приходится делать значительные задержки, чтобы все ненужные ЯЭО
успели исчезнуть, а нужные-появиться. Задержки должны быть в не-
сколько раз больше четвертичных углеродов, которые часто превы-
шают 10 с. Тем не менее, используя концентрированные образцы и не
жалея времени спектрометра, можно получить очень полезные результа-
ты. На рис. 5.23 этот принцип проиллюстрирован на примере трет-
бутильной группы. Внизу приведен спектр, полученный без ЯЭО с боль-
шой задержкой между прохождениями. Более сильнопольный метиль-
ный сигнал, как и ожидалось, в 3 раза интенсивнее сигнала четвертич-
ного углерода. В разностном спектре (вверху), полученном при облуче-
нии протонов метильных групп (только 12С-линии), мы видим 80% ЯЭО
иа четвертичном углероде и отсутствие ЯЭО иа метильном сигнале.
Такая большая величина вполне нормальна, поскольку максимальный
ЯЭО иа углероде при насыщении протонов составляет 200%.
Ядарный эффект Оверхаузера
187
Рис. 5.23. Селективный гетероядерный ЯЭО для соединения с mpem-бутильной
группой. Мультиплет в слабом поле принадлежит растворителю.
По причине недостаточной чувствительности такие эксперименты
пока не нашли широкого применения. Тем не меиее в литературе
появляются отдельные примеры (см. [12-15]). В будущем они станут,
видимо, более обычными, поскольку получаемая с их помонтью инфор-
мация труднодоступна другими путями.
Литература
1. Абрагам А. Ядерный магнетизм. Пер. с англ.-М.: ИЛ, 1963.
2. Noggle J. Н., Schirmer R. E.t The Nuclear Overhauser Effect-Chemical Applications,
Academic Press, 1972.
3. Shaw D., Fourier Transform NMR Spectroscopy, 2nd edn., Elsevier, 1984.
4. Bothner-By A. A., Stephens R.L . Lee J., Warren C.D., Jeanloz R. W„ J. Amer. Chem.
Soc., 106, 811-813 (1984); Bax A.. Davis D.G.. J. Mag. Res., 63, 207-213 (1985).
5. Bell R. A., Saunders J. K.M., Can. J. Chem., 48, 1114-1122 (1970).
6. Mersh J.D.. Saunders J. К. M, Prog. NMR Spec., 15, 353 400 (1982).
7. Примеры использования нестационарного ЯЭО для решения структурных
задач; Heatley F., Akhier L., Brown R. T, J. Chem. Soc. Perkin II, 919-924 (1980).
8. Void R.L., Void R R.. J. Mag. Res., 55, 78- 87 (1983).
9. Shaka A. J., Bauer C.J., Freeman R., J. Mag. Res., 60, 479-485 (1984).
10. KinnsM., Saunders J. K.M., J. Mag. Res., 56, 518-520 (1984).
11. Baldwin J.E., AdUngton R. M., Derome A.E., Ting Turner N.J.. J. Chem. Soc.
Chem. Commun., 1211-1214 (1984).
12. Rover R.E., Batta G„ J. Chem. Soc. Chem. Commun., 647-648 (1986).
13. R6v£r К. E., Batta G.. J. Amer. Chem. Soc., 107, 5829-5830 (1985) и ссылки в этой
работе.
14. Aldersley M.F., Dean F.M.. Mann B.E., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 107-108
(1983).
15. Leeper KJ.. Staunton J., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 911-912 (1982).
Глава 6
Перенос поляризации и
редактирование спектров
6.1. Введение
По общему мнению, спектроскопия ЯМР-идеальный аналитический
метод для решения химических задач: ЯМР имеет высокое разрешение,
и его параметры (химические сдвиги и константы спин-спинового взаи-
модействия) связаны с химическими представителями об электронной
структуре и топологии молекул вполне прямым и понятным путем. Но
основной ее недостаток - это невысокая чувствительность. Слишком
часто от ЯМР-спектроекопистов можно услышать слова: «Вот если бы
у вас было еше 50 мг вещества...» Низкая чувствительность объясняется
тем, что в существующих магнитных полях энергия ядерных переходов
настолько мала, что оии оказываются не так далеки от насыщения даже
при комнатной температуре. При проведении ЯМР-эксперимента при-
бор должен регистрировать очень тонкое различие заселенностей энерге-
тических уровней. Вообще эти переходы заметны только благодаря
наличию резонансных условий. Недостаток чувствительности существен-
но снижает достоинства ЯМР, поскольку уже сейчас можно без больших
преувеличений утверждать, что при наличии неограниченного количества
любого вещества с молекулярной массой не более, скажем, 3000 единиц,
можно подобрать такую последовательность ЯМР-экспериментов, кото-
рая с очевидностью установит его структуру. Но, к сожалению, интере-
сующие нас вещества редко доступны в неограниченных количествах.
Любой метод повышения чувствительности чрезвычайно важен для
ЯМР. Именно поэтому химики сегодня с радостью покупают магниты,
которые в 10 раз дороже, чем двадцать лет назад. Повышение напряжен-
ности поля постоянных магнитов-прямой способ увеличения интенсив-
ности сигналов ЯМР. Однако прогресс в этом направлении неизбежно
имеет определенный предел. Современная технология производства
стационарных постоянных сверхпроводящих магнитов (в отличие от
магнитов, создающих мощные поля на короткие промежутки времени)
позволяет получать напряженности полей, соответствующие протонным
переходам на частотах 500-600 МГц. Прогресс в этом направлении пока
еще не остановился, технология продолжает совершенствоваться, по
трудно предположить возможность увеличения напряженности поля па
несколько порядков. Даже если бы это и было достижимо, дальнейшее
увеличение напряженности поля оказалось бы бессмысленным по ряду
Перенос поляризации и редактирование спектров
189
других причин. Например, с ростом поля мы быстро приближаемся
к такой ситуации, когда обычное молекулярное движение становится
медленным в шкале времени ЯМР. Повышения чувствительности можно
добиваться и с помощью других технических новшеств, как, например,
использование криогенных датчиков [1], однако здесь также обязатель-
но существует предел.
Практическим критерием эффективности спектроскопии ЯМР с точки
зрения чувствительности служит ее способность анализировать такие
количества вещества, с которыми обычно имеют дело химики. В настоя-
щее время это количество составляет примерно! мг при использовании
обычной хроматографической техники или несколько микрограммов
при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Это количество вещества химики уже «чувствуют». Вещество становится
невидимым при уменьшении его количества, и с ним трудно обращаться.
Биологи же, напротив, часто могут определить присутствие вещества по
его биологической активности, поэтому микрограммовые количества
считаются достаточными для работы. Мы будем использовать компро-
миссную величину 100 мкг в качестве наименьшего доступного количест-
ва вещества. Какие ЯМР-эксперименгы можно провести с таким образ-
цом на современных спектрометрах с не самой высокой напряженностью
поля?
К сожалению, их не так много. Мы можем зарегистрировать протон-
ный спектр (а также спектр на фторе и экзотическом тритии). Сможем,
вероятно, провести некоторые эксперименты по ЯЭО и зарегистриро-
вать протонный спектр COSY (гл. 8), хотя это и потребует много
времени. С другими ядрами дело обстоит сложнее. На очень сильиополь-
ных спектрометрах, возможно, удастся зарегистрировать спектр ядра 31Р
и, поставив накопление в микроячейке на субботу и воскресенье, спектр
13С с широкополосной развязкой от протонов. Если же мы-химики-
иеорганики и хотим получить спектры низкочастотных металлов, то без
увеличения количества вещества в сотни раз у нас ие будет никакой
надежды на успех. Вообще, протон-это единственное ядро, позволяю-
щее проводить ЯМР-эксперименты с такими количествами вещества,
которые обычно имеются в распоряжении химика. Для наблюдения
других ядер необходимо получать его в больших количествах.
Возможность переноса этого замечательного свойства протонов на
другие ядра была бы очень важна. В этой главе мы сначала рассмотрим
очень старый эксперимент SPI и на его примере установим необходимые
для такого переноса законы. В двух других разделах мы обсудим два
наиболее общих эксперимента по переносу поляризации: INEPT и
DEPT. Первый из них интересен по двум причинам. Во-первых, он был
разработан первым и способствовал быстрому прогрессу в этой экспери-
ментальной области, и, во-вторых, он более удобен для изложения
с помошью нашего иллюстративного метода. DEPT же в большей
степени подходит для практических применений и излагается в основном
с этой точки зрения: понять его механизм в деталях невозможно без
190
Глава 6
привлечения концепции многоквантовой когерентности, которую мы
рассмотрим в гл. 8.
6.2. Селективный перенос заселенности
Как это ни странно, метод, позволяющий перенести интересующие
нас свойства протонов на другие ядра, известен уже много лет под
названием селективного переноса заселенности SPT (Selective Population
Transfer) или, что более точно соответствует нашему эксперименту,
селективной инверсии заселенности SPI (Selective Population Inversion).
Для того чтобы понять происходящие в нем процессы, мы должны
подробнее рассмотреть уровни энергии спиновой системы и их заселен-
ности. Мы проанализируем систему АХ, которую можно представлять
себе состоящей из протона и ядра 13С, но это может быть и любая
другая пара ядер со спином 1/2. На рис. 6.1 изображена диаграмма
энергетических уровней этой системы и спектры каждого из ядер. Мы
остановимся на нескольких существенных деталях рисунка. Энергии
протонных и углеродных переходов переданы в масштабе. Ларморова
частота протонов в 4 раза выше частоты углерода, поэтому протонные
переходы имеют в 4 раза большую энергию. Различия энергий двух
переходов (Нх и Н2, С2 и С2), обусловленные спин-спиновым взаимодей-
ствием, настолько малы в сравнении с общей энергией, что в масштабе
диаграммы не видны. Нас больше интересует разность заселенностей по
каждому из переходов. В условиях теплового равновесия, которое
наблюдается в начале эксперимента, разность заселенностей по протон-
ным переходам должна в соответствии с законом Больпмана в 4 раза
превышать разность по углеродным переходам. Будем обозначать эти
разности 2ДН и 2ДС, тогда АН = 4ДС. Реальная заселенность каждого
уровня и, следовательно, численные величины разностей зависят от
-ДНтДС
Рис, 6J. Энергетические уровни гегероядерной системы АХ и их заселенности.
Перенос поляризации и редактирование спектров
191
общего числа присутствующих ядер N, Но нам удобнее пользоваться не
собственно заселенностями уровней, а их отличием от N/4 (этот прием
мы уже использовали для двухуровневой системы в разд. 4.2.6 гл. 4
и для гомоядерной двухспиновой системы в разд. 5.2.2 гл. 5); именно эти
значения и приведены на диаграмме.
Теперь мы уже можем кое-что сказать об относительных интенсив-
ностях сигналов 13С и *Н в нашей системе. Избыток заселенности по
протонным переходам в 4 раза больше углеродного, кроме того,
протонный магнитный момент в 4 раза превышает углеродный (по-
скольку он пропорционален у); следовательно, воздействие я/2-импуль-
са иа протоны создает в 16 раз большую поперечную намагниченность,
чем в случае 13С. Сигнал, наводимый в катушках приемника прецессией
этой намагниченности, пропорционален скорости самой прецессии (в
4 раза большей у протонов). Таким образом, регистрируемый сигнал
протонов будет в 64 раза интенсивнее сиг нала углерода (т. е. в общем
случае интенсивность сигнала ЯМР ядер с гиромагнитным отношением
у пропорциональна у3). Помимо этого, низкое природное содержание
изотопа 13С уменьшает сигнал еще примерно в 100 раз, но это уже
несущественно для нашего обсуждения. Мы можем считать, что рабо-
таем с веществом, обогащенным изотопом 13С.
Именно по причине пропорциональности сигнала ЯМР величине у3
наблюдение протонов оказывается наиболее удобным. Следующее за
ними ядро, представляющее широкий интерес (в отличие от ядер 19F,
3Н, 3Не и двух изотопов таллия, не представляющих интереса)- это 31Р,
имеющее у, в 2,5 раза меньшее, чем у протонов, что приводит к 16-крат-
пому понижению чувствительности, т.е. к увеличению в 256 раз времени
накопления спектра для получения того же отношения сигнал/шум
в предположении равных скоростей релаксации. Если же взять, напри-
мер, родий (103Rh) с у, составляющим только 3% от ХН, то мы получим
снижение чувствительности в 32 тысячи раз, несмотря на 100%-ное
природное содержание этого ядра.
Эксперимент по SPI позволяет очень простым способом сделать
зависимость от у только квадратичной. Наша система дает спектр
первого порядка, поэтому каждая наблюдаемая в нем линия соответст-
вует переходу отдельного ядра. Теперь представим себе, что одна нз
протонных линий подверглась воздействию селективного я-импульса,
в результате чего заселенности по соответствуюшему переходу инверти-
ровались. На практике это достигается при использовании достаточно
низкой мощности радиочастотного поля протонного декаплера, напри-
мер импульса длительностью 20 мс при амплитуде поля 25 Гц.
На рис. 6.2 изображено состояние системы после селективной инвер-
сии заселенности. Оно отличается от равновесного только тем, что
заселенности по переходу Hi поменялись местами. Но посмотрите, что
произошло с разностями заселенностей. Их величины но протонным
переходам ие изменились, пс считая того, что одна нз разностей
поменяла знак. По углеродному же переходу С,, где разность раньше
192
Глава 6
J----°C- ю
Рис. 6.2. Новые заселенности после инверсии одного из протонных переходов.
составляла 2ДС, теперь мы получаем (ДН + ДС) — (-АН — ДС) или
2ДН + 2ДС. По переходу С2, наоборот, получаем ( АН + ДС) — (ДН —
— ДС) или — 2ДН + ДС. Таким образом, мы перенесли протонные
разности заселенностей на углеродные переходы и прибавили их к су-
ществующим разностям! Если сразу после этого подействовать на
углеродную намагниченность л/2-импульсом и зарегистрировать сиг-
нал, то мы получим дублет с интенсивностями компонент +5 и — 3
(относительно интенсивности сигналов при прямом наблюдении без
селективной ипверсии), поскольку ДН = 4ДС. Так как один из переходов
получает отрицательный вклад от протонов, а другой-положительный,
то говорят, что суммарный перенос намагниченности отсутствует, но
наблюдается разностный перенос поляризапии. Заметим, наконец, что
полная инверсия заселенностей не обязательна, достаточно будет любо-
го неравного их возмущения. Именно в такой ситуации возникает
SPT-эффект, обсуждавшийся в разд. 5.3.3 гл. 5. На рис. 6.3 представлен
результат эксперимента SPI.
Существует несколько проблем, связанных с экспериментом SPI.
Первая - это его селективность', при выполнении эксперимента нам
придется инвертировать не сами протонные линии, а их 13С-сателлиты.
Кроме того, SPI не может использоваться для получения спектров
с развязкой от прогонов, поскольку включение декаплера приведет
к частичной компенсации противофазных линий, т.е. восстановлению
нормальных интенсивностей. Таким образом, эксперимент SPI интере-
сен не сам по себе. Он важен тем, что открывает путь к целому классу
Перенос поляризации и редактирование спектров
193
Рис. 6.3. Эксперимент SPI,
выполненный для хлорофор-
ма: «-инвертирование сател-
лита в слабом поле; б-ин-
вертирование сателлита в
сильном поле; в-нормаль-
ный спектр.
более общих методов переноса поляризации, разработанных после
1980 г. Обсуждаемые в этой главе эксперименты обычно осуществляют
перенос поляризации от одного ядра к другому, сопровождающийся
увеличением интенсивности регистрируемого сигнала в раз.
6.3. INEPT
6.3.1. Введение
Основная идея. Основное ограничение эксперимента SPI-это не-
достаточная общность. Если мы найдем какой-либо способ поляризации
всех протонных переходов независимо от частоты, то мы, очевидно,
получим многообещающий эксперимент. Мы должны предложить та-
кую последовательность импульсов, которая, как и SPI, придает парам
протонных переходов противоположные фазы, но делает это с помощью
иеселективных импульсов и независимо от химических сдвигов. Такая
последовательность может использовать спиновое эхо для ориентации
компонент дублетов вдоль различных осей:
S: (тг/2К - т - л* - т - (я/2),
I: я* (п/2)х Выборка...
В этой записи, которая была приведена в первом сообщении об экспе-
рименте INEPT [2] (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarisation Transfer -
низкочувствительные ядра, усиленные с помощью переноса поляри-
зации), буква S (sensitive) обозначает чувствительные ядра, т.е, дающие
мощный сигнал, a I (insensitive) - низкочувствительныс со слабым сигна-
лом (в нашем случае ХН и 13С соответственно). К сожалению, не все
авторы придерживаются этого обозначения, и во многих публикациях
можно встретить использование буквы I для ядра, с которого перено-
сится поляризация, и буквы S для ядра, на которое она переносится.
Конечно, это совершенно произвольное обозначение, ио от авторов
(3-75
194
Глава 6
Рис. 6.4. Последовательность INEPT для системы АХ.
можно было бы ожидать большей последовательности. Везде в этой
главе буквой S будут обозначаться ядра, с которых переносится поля-
ризация, и буквой 1-ядра, на которые она переносится (независимо от
того, какое из них чувствительнее).
Мы легко можем проанализировать воздействие приведенной выше
последовательности иа систему АХ с константой J (рис. 6.4). Задержка
т выбирается равной 1/4J, и компоненты дублета (прецессирующие во
вращающейся системе координат с частотой Гц) успевают за это
время пройти 1/8 полного цикла, я-Импульс на частоте ядра S переносит
эти компоненты во вторую половину плоскости х-у, а импульс на
частоте ядра I предохраняет его от рефокусировки с помощью из-
менения направления прецессии. Во время второй задержки т химические
сдвиги и неоднородность поля рефокусируются, и в дальнейшем их
можно не учитывать. В конце второй задержки компоненты дублета
ядра S находятся на осях +х. Два заключительных п/2-импульса на
ядрах S и I обычно производятся одновременно, но для облегчения
понимания мы будем считать, что сначала производится S-импульс.
Будучи (я/2) -импульсом, он помещает находящиеся на осях +х компо-
ненты на ось z: одна из них оказывается направленной вверх, а другая-
вниз. В результате мы получили требующуюся противофазную ориен-
тацию компонент дублета и после п/2-импульса на ядре I можем
регистрировать более интенсивный сигнал, как и в случае SPI (рис. 6.5).
Исходная намагниченность ядра I. При воздействии иа систему
последовательностей SPI и INEPT перенесенная разность заселенностей
накладывается на уже существующую разность по переходам ядра I. По
этой причине интенсивности регистрируемых положительных и отри-
цательных сигналов не равны и в случае дублета 13С составляют +5
и — 3. Во многих применениях переноса поляризации такое влияние
исходной намагниченности переходов ядра I оказывается нежелатель-
ным, поэтому требуется принимать какие-то меры для его исключения.
Существует несколько способов, позволяющих устранить влияние
Перенос поляризации и редактирование спектров
195
у nW»*
П-----------!-----------I-----------I------------I-----------г
95 90 85 80 ?S 70
м.Э.
Рис. 6.5. INEPT позволяет получить на всех дублетах эффект, который SPI
позволяет только на одном.
исходной намагниченности. Поскольку поляризация ядра I не требуется
на протяжении всей последовательности, его можно, например, на-
сытить до начала эксперимента. Для этого подойдут широкополосное
облучение (но оно обычно недоступно на отличных от протонов ядрах),
один или несколько я/2-импульсов на частоте I или создание градиента
поля Во вслед за тг/2-импульсом (т.е. нарушающий однородность им-
пульс-homospoil pulse). В разд. 6.4.6 мы обсудим эксперимент по
переносу поляризации, использующий предварительное насыщение, но
в обычных случаях при переносе поляризации с протонов на низко-
частотные ядра предварительное насышение не требуется. Исходную
намагниченность ядра I можно нейтрализовать с помощью фазового
цикла, поскольку она не лак велика по сравнению с переносимой
поляризацией.
В таком цикле должна изменяться фаза заключительного я/2-им-
пульса на частоте ядра S (обычно протонов). Замена (п/2)у на (л/2)_у
поменяет знак протонной поляризации; это значит, что те компоненты
дублета, которые раньше были направлены по оси + 2, теперь окажутся
на оси ~ и наоборот (рис. 6.6). В результате компонента намагни-
ченности ядра I, обусловленная перенесенной поляризацией, будет про-
тивоположной, и для правильной ее регистрации необходимо изменить
фазу приемника. Исходная же поляризация спина 1 создает сигнал
с постоянной фазой (просто сигнал ядра I после тт/2-импульса), поэтому
13*
196
Глава 6
Рис. 6.6. Подавление исходной намагниченности ядра I при чередовании фазы
заключительного импульса ядра S.
Рис. 6,7. Спектры INEPT ядра 13С без использования (левый) и с использованием
(правый) подавления исходной намагниченности.
перемена фазы приемника полностью его нейтрализует. Обычно такое
вычитание позволяет уменьшить интенсивность нежелательных сигна-
лов в несколько сот раз, чего вполне достаточно при переносе поля-
ризации с протонов иа гетероядра (рис. 6.7).
INEPT с рефокусировкой. Спектры последовательности INEPT ие
могут быть получены с применением развязки от протонов, поскольку
компоненты мультиплетов имеют противоположные фазы. Одиако этот
недостаток легко преодолеть с помощью небольшой задержки А перед
выборкой данных. Правильный выбор длительности А позволяет ком-
понентам спиновых мультиплетов снова стать синфазными, например
Перенос поляризации и редактирование спектров
197
Рис. 6.8. Рефокусировка в системе АХ позволяет использовать во время выборки
широкополосную развязку.
для дублетов требуется А = 1/2J (рис. 6.8). Чтобы предотвратить влия-
ние различия химических сдвигов, понадобится дополнительное спино-
вое эхо в виде я-импульса посредине задержки:
S:
I:
@1 1 М д д
~ — - л - —- - I -1 - - ~ я - — - Развязка...
х 4J х 4J \2j±y 2 2
кх Q я Выборка (±.г)...
Эта последовательность известна под названием INEPT с рефокуси-
ровкой. Она обладает очень интересными свойствами с точки зрения
изменения длительности Д (разд. 6.3.3), ио пока при получении спектров
с развязкой от протонов (рис. 6.9) мы будем считать Д постоянной.
В отличие от дублетов, для которых оптимальная задержка составляет
1/2J, другим мультиплетам нужны другие величины Д (см. табл. 6.2
в разд. 6.3.3), поэтому при наличии в спектре различных мультиплетов
необходимо выбрать некоторое компромиссное значение. Для случая
1____________L
linUMWiBWH
Ейеям
tn АЭС
Рис. 6.9. Различные спектры хлороформа. В спектре INEPT с рефокусировкой
можно заметить некоторое уменьшение интенсивности в сравнении с простым
INEPT; это частично объясняется поперечной релаксацией во время периода
рефокусировки и частично-неидеальностью импульсов.
1 '.i1 I '-Г’ 1 '«i ’ 1 '«А 1 А ’4
Гц Г» Гц
198
Глава 6
углеродных спектров, которые могут состоять только из дублетов,
триплетов и квартетов, подойдет величина 0,3/7сн- Но поскольку сама
константа 7СН может изменяться, такая задержка, конечно, не идеальна.
6.3.2. Характеристики спектров INEPT
Влияние иа чувствительность. Повышение чувствительности для ядер
I в Ys/Yi Раз> т.е. замена зависимости интенсивности наблюдаемого
сигнала вида у иа у2 - фундаментальное свойство последовательности
INEPT. Однако это не такое уж и большое повышение, поскольку
получаемую интенсивность правильнее будет сравнивать ие с равно-
весной для сигналов ядер I, а с сигналом, полученным в условиях
развязки от протонов. Широкополосная развязка от протонов будет
повышать интенсивность сигнала за счет ЯЭО, который также зависит
от отношения гиромагнитных постоянных. Правильное сравнение будет
выглядеть так:
INEPT *: I = 10 -
Yi
ЯЭО: / =
\ ^Yi/
Здесь буквой I обозначается интенсивность усиленного сигнала,
a IQ-интенсивность сигнала без усиления (обычно величина ЯЭО оце-
нивается через коэффициент усиления р, а ие через конечную интен-
сивность сигнала; в этой главе буквой I будет обозначаться именно
конечная интенсивность, за исключением тех случаев, где это специально
оговаривается). Важно отметить, что интенсивность сигнала последо-
вательности INEPT зависит от модуля отношения гиромагнитных
постоянных, в то время как ЯЭО зависит и от его знака. Таким образом,
ЯЭО между протонами и ядром с отрицательным у может вызывать не
увеличение интенсивности, а, наоборот, ее понижение; если величина
т| окажется близкой к — 1, то сигнал может исчезнуть вообще (разд. 5.2.4
гл. 5). Вскоре мы вернемся к этой проблеме.
Проводя сравнение спектров, полученных с помощью INEPT, и
спектров с полным ЯЭО, мы должны также учитывать релаксационные
свойства ядер. Для эксперимента по ЯЭО важна величина 7] наблю-
даемых ядер, в то время как в эксперименте INEPT на интенсивность
конечного сигнала оказывает влияние только разность заселенностей
ядра S, обычно протонов, и именно их 7] определяет частоту повторения
прохождений. В результате частота прохождений в эксперименте INEPT
не зависит от ядра I, что на практике часто оказывается важнее, чем
сам перенос поляризации.
* Такое соотношение достигается при наличии одного ядра S. При другом
количестве ядер S коэффициент усиления слегка изменится (см. табл. 6.2).
Перенос поляризации и редактирование спектров
199
Таблица 6.1. Сравнение интенсивностей сигналов
при прямом наблюдении гетероядра в условиях
полного ЯЭО со стороны протонов с результа-
том переноса поляризации с протонов на гетеро-
ядро. Приведенные значения вычислены относи-
тельно интенсивности сигнала при прямом на-
блюдении ядра без ЯЭО
Ядро Максимальный ЯЭО Перенос поляризации
31р 2,24 2,47
13С 2,99 3,98
2QSi - 1,52 5,03
15N - 3,94 9,87
57Fe 16,48 30,95
I03Rh - 14,89 31,78
Теперь мы можем рассмотреть реальные случаи. В табл. 6.1 срав-
ниваются теоретические интенсивности сигналов некоторых ядер в
спектрах INEPT (по отношению к равновесным величинам без ЯЭО)
с интенсивностями при максимальном ЯЭО. Как мы видим, результаты
довольно близки, хотя нельзя забывать о том, что условия эксперимента
иногда не позволяют использовать INEPT и реализовать максимальный
ЯЭО. Величина ЯЭО зависит от величины вклада ядер S в релаксацию
ядра I по механизму диполь-дипольного взаимодействия, поэтому в
зависимости от обстоятельств ЯЭО может быть небольшим или вообще
отсутствовать, а в случае ядер с отрицательным у он может оказаться
близким к —-1, что приведет к нулевой интенсивности сигнала. В таких
случаях INEPT будет намного эффективнее даже без учета увеличения
частоты повторения прохождений.
Однако для атомов 13С, связанных с протонами, чаще бывает
характерен полный ЯЭО, а их времена релаксации ненамного пре-
вышают времена релаксации связанных протонов, поэтому исполь-
зование INEPT с рефокусировкой, вероятно, не даст существенных
преимуществ при регистрации спектров с развязкой от протонов. Для
получения неразвязанных спектров, где ЯЭО отсутствует, использование
переноса поляризации может оказаться очень полезным; к этому вопро-
су мы вернемся в дальнейшем.
В полной мере преимущества INEPT реализуются на ядрах с очень
большим Ту, и в особенности на ядрах с отрицательным у. Распро-
страненные ядра, обладающие такими свойствами,-это 29Si и ,5N.
Рассмотрим гипотетическое вещество, содержащее ядро 15N и связанные
с атомом азота протоны. Даже при наличии полного ЯЭО (отно-
сительная интенсивность —4) эксперимент INEPT будет в 2 раза
эффективнее (относительная интенсивность 10). Помимо этого, величина
Ту азота может составлять 32 с, в то время как Ту протонов-порядка 2 с.
В результате за один и тот же промежуток времени мы сможем получить
200
Глава 6
в эксперименте INEPT в 16 раз больше прохождений, чем при не-
посредственном наблюдении азота, что приведет к дополнительному
четырехкратному повышению отношения сигнал/шум. Таким образом,
в реальной ситуации с помощью INEPT мы легко можем добиться
10-кратного повышения чувствительности на ядре l5N (рис. 6.10; см.
также рис. 6.14 с примерами спектров 29Si). Сочетание этих двух досто-
инств эксперимента INEPT создает широкие возможности для наблю-
дения низкочастотных, медленно релаксирующих ядер.
Другая область, где повышение чувствительности позволяет по-
лучать новые результаты,- это спектроскопия ЯМР на ядрах переходных
металлов. Для многих комплексных соединений из спектров металлов
можно извлечь очень ценную информацию, но чрезвычайно низкая
чувствительность и малое природное содержание ядер со спином 1/2,
таких, как 103Rh или 109Ag, создают серьезные трудности при изме-
рениях их спектров ЯМР. Для переноса поляризации требуется наличие
значительной константы взаимодействия протон-металл, которая не
всегда присутствует в реальных комплексах. Однако почти всегда есть
константа взаимодействия с ядром 31Р, обусловленная широкой рас-
пространенностью фосфиновых лигандов. Обычно отношение уР/угас<а4
довольно велико, и перенос поляризации в этих условиях оказывается
очень эффективным. На рис. 6,11 сравниваются спектры прямого на-
блюдения родия со спектрами переноса поляризации с фосфора на родий
ю
Рис. 6.10. Разлнчкыеспособы регистрации спектров 15N. В нижней части рисунка
приведены спектры с полной релаксацией (одинаковое число прохождений),
а в верхней-с частотой повторения, оптимизированной по соответствующему
(1SN или *Н) времени Г] (одинаковое время регистрации). В использованном
соединении (фталимиде) имеется протон, непосредственно связанный с азотом,
поэтому время релаксации 15N сравнительно невелико (примерно я 2 раза
больше, чем протона). Для азота, не связанного непосредственно с протонами, но
все же имеющего с ними заметную константу спин-спинового взаимодействия,
можно ожидать еще большего увеличения интенсивности.
Перенос поляризации и редактирование спектров
201
INEPT
г -4вЬ,0 -sdo.o -520,0 -54b,О -560,0 -5Й0,0
и. а.
Рис. 6.11. Усиление сигнала ядра 103Rh при переносе поляризации с 31Р. (С
любезного разрешения д-ра Бревара, фирма Bruker Spectrospin, и д-ра Тевиссена
с сотрудниками, фирма TTC-TNO, Утрехт, Нидерланды.)
с помощью последовательности INEPT. Мы видим, что спектры, ка-
завшиеся ранее недоступными, теперь можно получить достаточно
просто. К сожалению, выпускаемые промышленностью спектрометры
очень редко оборудуются для таких экспериментов (необходимы датчик,
настраивающийся одновременно на две Х-частоты, и двухканальиый
широкополосный передатчик), но в будущем ситуация несомненно из-
менится.
Влияние ня спектры без развязки. В спектрах INEPT, полученных без
рефокусировки и развязки, мультиплетная структура сохраняется, но их
вид становится совсем необычным. Дублеты, как мы уже видели,
представляются парами линий в противофазе. Можно показать, что
триплеты теряют свою центральную линию и дают сигналы с ин-
тенсивностями — 1:0:1, а квартеты имеют структуру — 1: — 1:1:1 (в
гл. 8 вы увидите, что эта интенсивности, так же как и кросс-пики
эквивалентных ядер в спектрах COSY, соответствуют правилу «проти-
вофазного треугольника»). Такую мультиплетную структуру можно
считать как полезной (рис. 6.12), так и вредной, отвлекающей внимание.
Описанная в разд. 6.4 последовательность DEPT позволяет получать
спектры без развязки с нормальной мультиплетной структурой.
202
Глава 6
I-----1------[-----1-----1-----1------]-----1-----1------1-----
SO *5 10 SS 30 2$ 20 15 10
м.д.
Рис. 6.12. Структура мультиплетов в спектрах INEPT без развязки.
6.3.3. Задержка
Получение оптимальной чувствительности. Исследуем более тщатель-
но роль задержки Д в последовательности INEPT с рефокусировкой.
Сначала рассмотрим условия получения оптимальной интенсивности
сигналов в спектре с развязкой. Как мы уже видели в разд. 6.3.1,
величина 1/2J, подходящая для дублетов, совершенно ие подойдет для
триплетов (рис. 6.13). В конце периода задержки компоненты триплета
окажутся в противофазе, что приведет к исчезновению сигнала при
включении декаплера. Та же картина будет наблюдаться и для всех
остальных мультиплетов, поэтому спектры, полученные с задержкой
Д = 1/2J, будут содержать только дублеты спиновых систем IS. С по-
мощью несложных вычислений [3] мы получаем, что для произвольной
спиновой системы ISft оптимальное значение Д последовательности
INEPT с рефокусировкой и развязкой равно
Д — --sin”1 ( —=• ) ' (6.1)
nJ
В табл. 6.2 приведены некоторые величины Д и соответствующие им
коэффициенты усиления сигнала, зависящие от числа ядер п. Во многих
случаях переноса поляризации иа ядра, отличные от 13С, в спектрах
Перенос поляризации и редактирование спектров
203
Рис. 6.13. Различное поведение дублетов и триплетов во время периода рефо-
кусировки последовательности INEPT основа для редактирования спектров.
Таблица 6.2. Оптимальные значения А (в единицах 1/J) и соот-
ветствующее им усиление (в единицах Уз/у,) для последователь-
ности INEPT с рефокусировкой при переносе поляризации с п
ядер со спином 1/2
п 1 2 3 4 5 6
Д(х 1/J) 0,5 0,25 0,196 0,167 0,148 0,134
£(х Ys/Yi) 1,0 1,0 1,15 1,30 1,43 1,55
встречается только один тип мультиплетов, что позволяет выбрать
оптимальную величину Д. Например, спектр 2 9 Si широко распростра-
ненной трнметилсилильной труппы лучше всего получать с помощью
INEPT с задержкой Д, соответствующей п = 9 (рис. 6.14).
Редактирование спектров. Изменение величины Д позволяет опреде-
лить число ядер S, связанных с ядром 1, т. е. провести редактирование
спектра в соответствии с мультиплетиостью его сигналов. Например,
в спектроскопии 13С можно получить отдельные спектры для групп СН,
СН2 и СН3. Информацию, получаемую из неразвязанных спектров
таким образом, мы можем получить в условиях широкополосной раз-
вязки, повышающей как чувствительность, так н разрешение. Вскоре мы
рассмотрим практические способы регистрации таких спектров с по-
мощью последовательности DEPT (разд. 6.4.3), но основные принципы
легче изучить иа примере INEPT.
Пусть 0-угол, определяемый условием 9 — л7Д. Проанализировав
прецессию компонент мультиплетов групп СН, СН2 и СН3 во время
204
Глава 6
Рис. 6.14. Спектр INEPT ядра 29Si с переносом поляризации с *Н демонстрирует
отчетливое увеличение интенсивности сигналов (все спектры получены с опти-
мальной частотой повторения за одинаковые промежутки времени).
задержки А, мы можем выразить интенсивность сигнала каждой группы
(в условиях развязки) как функцию угла 0:
СН: / ос sin 0
СН2: /ос sin20 (6.2)
3
СН3: j се -(sin 0 + sin 30)
4
Легко видеть, что рассмотренный ранее случай (Д = 1/2J, т, е. 0 = п/2)
согласуется с этнмн формулами. Чтобы выделить сигналы углеродов
трех различных типов, необходимо зарегистрировать три спектра с
такими задержками Д, чтобы соответствующие им углы 0 были равны
п/4, п/2 и Зп/4. В табл. 6.3 приведены относительные интенсивности
каждой группы в таких спектрах.
Таблица 63. Относительные интенсивности сигна-
лов при редактировании спектров
е(= л7Д) СН СН2 сн3
п/4 1/72 1 3/2^2
п/2 1 0 0
Зп/4 1/ч/2 — 1 3/2 ^/2
Важность этих величин станет понятнее после анализа некоторых
спектров (рис. 6.15). Спектр 0 = я/4 содержит сигналы всех групп, спектр
0 — п/2-только групп СН, а спектр 0 = Зп/4 опять содержит все ре-
зонансы, ио сигналы групп СН2 инвертированы. Как мы вскоре увидим,
складывая и вычитая эти спектры определенным образом, можно
получить подспектры групп СН, СН2 н СН3.
Перенос поляризации и редактирование спектров
205
Рис. 6.15. Вид сигналов групп СН, СН2 и СН3 при редактировании спектров.
Как раз из таких манипуляций с фазами и интенсивностями сигналов
и состоит редактирование спектров. В ием вообще иет ничего необычно-
го. Механизм изменения фазы в последовательности DEPT будет менее
понятен (поскольку в нем используется концепция гетероядерной много-
квантовой когерентности), однако основные принципы останутся не-
изменными. Но эксперимент INEPT также требует весьма глубокого
анализа. Мы избежали ситуаций, в которых векторная модель оказы-
вается несостоятельной только потому, что ограничились случаем дуб-
лета н выбрали определенный порядок следования заключительных
n/2-импульсов.
Для лучшего понимания редактирования спектров попробуйте срав-
нить процессы, происходящие во время задержки А последовательности
INEPT н во время периода эволюции эксперимента по гетероядерному
J-модулироваииому спиновому эху (разд. 10.2 гл. 1-0). Начальные со-
стояния спиновых систем в этих экспериментах различны, ио в ос-
тальном они очень похожи.
6.4. DEPT
6.4.1. Введение
Буква D в названии эксперимента происходит от слова „Distortion-
less”-«без искажений» (расшифровать остальные буквы вы сможете
сами). Эта последовательность осуществляет аналогичный эксперименту
INEPT перенос поляризации, но с той существенной разницей, что все
сигналы нечувствительных ядер перед началом выборки оказываются
синфазными. Таким образом, спектры с развязкой от протонов можно
получать, не прибегая к дополнительной рефокусировке с задержкой Д,
а спектры без развязки сохраняют обычную мультиплетную структуру,
206
Глава 6
именно это и подразумевается под словами «без искажений». Это
и многие другие достоинства делают DEPT наиболее удобной после-
довательностью для практического редактирования спектров с по-
мощью переноса поляризации.
6.4.2. Последовательность DEPT как многоквантовый
фильтр
В разд. 6.4 в качестве наиболее часто встречающегося объекта для
применения последовательности DEPT мы будем рассматривать пере-
нос поляризации с протонов на углерод, но при этом не будем забывать
о том, что их можно заменить любой другой парой ядер со спином 1/2.
Последовательность DEPT выглядит так:
1Н;
13С:
1 1 л 1
-----ти-------------------Развязка...
2J 2J ±у 2J
/ л \
-1 п
\2/*
Выборка ( + л)...
где G+j-протонный импульс переменной длительности, который, как
мы вскоре увидим, выполняет те же функции, что и задержка Д в INEPT.
Переключение фазы этого импульса (вместе с переключением режима
сложение/вычитаиие приемника) служит для устранения исходной на-
магниченности 13С. Фазы обоих ти-нмпульсов также можно переключать
для уменьшения интенсивности ложных сигналов. Во время выборки
в зависимости от требований к спектру можно использовать, а можно
и не использовать широкополосную развязку от протонов.
Если вы попытаетесь с помощью векторной модели во вращающейся
системе координат проаиализировать воздействие этой последова-
тельности иа спиновую систему, то обнаружите, что ситуация после
углеродного л/2-импульса окажется не очень простой. Поперечная на-
магниченность будет одновременно присутствовать на углеродной и
протонной частях связанной спиновой системы, и имеющихся у нас
знаний оказывается недостаточно для предсказания ее поведения. Дей-
ствительно, очень трудно описать это состояние системы (известное под
названием гетероядерной многоквантовой когерентности) в терминах
классической векторной модели [4]. Мы столкнемся с некоторыми
проблемами и при попытках предсказать эффект 9-импульса без прив-
лечения квантовой механики. В результате механизм эксперимента
DEPT остается для нас не совсем понятным. Однако предварительно
ознакомившись с гл. 8 (где в разд. 8.3.5 излагается, хотя и несколько
метафизически, многоквантовая когерентность), вы вполне сможете
понять дальнейшие комментарии к последовательности DEPT. В про-
тивном случае вам не стоит их читать. Если вы не хотите нарушать
порядок чтения книги и переходить к гл, 8, то пропустите оставшуюся
часть до разд. 6.4.3.
Перенос поляризации и редактирование спектров
207
Рассмотрим сначала другую последовательность [5]:
•Н:
\2/<р 2J 2J \2h\2j-x
13С: (^) it — -—Выборка ( + х)...
\2/х 2J
Ее существенное отличие от DEPT состоит в том, что 0-импульс заменен
парой
UAW-*
где ср - произвольная фаза (не обязательно т или у), определяющаяся
через угол с осью у. Вы, наверное, сможете самостоятельно убедиться
(хотя бы начиная с "-намагниченности) в том, что эта пара импульсов
эквивалентна одному импульсу 0у, где ф = 0, поэтому DEPT и описанная
последовательность оказываются одинаковыми. Группа импульсов до
(7c/2)(p включительно может рассматриваться как эквивалент критерия
миогокваитовой когерентности (разд. 8.4.3 гл. 8), расширенный для
случая гетероядер. Таким образом, непосредственно перед (я/2)_х-нм-
пульсом существует двухквантовая когерентность для группы СН, трех-
квантовая для группы СН2 и четырехкваитовая для группы СН3.
Заключительный протонный импульс-это нмпульс «чтения», он вос-
станавливает однокваитовую когерентность углерода, пригодную для
регистрации. В соответствии с рецептом, данным в гл. 8, изменение фазы
последовательности возбуждения по отношению к фазе импульса «чте-
ния» должно сделать возможным разделение сигналов по кратности
квантовой когерентности, т.е. многоквантовую фильтрацию. Это н
создает возможность редактирования спектров.
Такой способ редактирования был реализован в эксперименте с
названием POMMIE [6] (это и есть приведенная выше последова-
тельность с небольшими фазовыми поправками). Но мы не будем
обсуждать этот метод, поскольку большинство доступных в настоящий
момент спектрометров не способно создавать фазовый сдвиг, необ-
ходимый для разделения сигналов с квантовой когерентностью раз-
личного порядка. Если ваш спектрометр обладает таким свойством, то
вам имеет смысл сравнить эту последовательность с DEPT, чтобы
выбрать наиболее подходящую. Поскольку фазовый сдвиг в POMMIE
эквивалентен 0-импульсу в DEPT, различие методик будет определяться
ие их принципиальными свойствами, а характеристиками спектрометра.
6.4.3. Редактирование спектров с помощью DEPT
Введение. Если вы пропустили разд. 6.4.2 и решили продолжить
чтение с этого места, то принцип редактирования спектров при ис-
пользовании О-нмпульса в последовательности DEPT будет вам не
208
Глава 6
совсем понятен. Однако для практических нужд вполне достаточно
понимать, что эксперимент DEPT с заключительным 0у-импульсом
будет давать такой же результат, как и INEPT с задержкой А = 0/rcJ.
Следовательно, весь материал разд. 6,3.3 может быть без изменений
перенесен на случай последовательности DEPT, только вместо rcJA
следует читать G. В последовательности INEPT величина А зависит от J;
например, оптимальная чувствительность на системе IS„ достигается
при А = (l/rcJ)sin-1 (l/v/n) [уравнение (6.1)]. Тогда в соответствующем
эксперименте DEPT величина 0 оказывается независящей от J. В этом
состоит его принципиальное преимущество. Конечно, в последователь-
ности еще есть зависящие от J величины, но процесс редактирования
спектров к ним менее чувствителен.
Редактирование. Для разделения подспектров групп СН, СН2 и СН3
мы регистрируем спектры с 0-импульсом, равным гс/4, гс/2 и Зтг/4, таким
же образом, как мы это делали с помощью изменения задержки
А в INEPT [7]. В эксперименте 0 = л/2 требуется зарегистрировать
в 2 раза больше прохождений для получения одинакового с остальными
спектрами отношения сигиал/шум. Как и в разностной спектроскопии
ЯЭО, для уменьшения влияния медленных дрейфов экспериментальных
условий очень хорошо через равные промежутки времени чередовать
накопление разных спектров (разд. 5.3.3 гл. 5). Общее число прохожде-
ний определяется обычными требованиями чувствительности. По
табл. 6.3 мы можем легко определить операции, необходимые для
получения подспектров.
СН-тн)спектр мы получаем в эксперименте с 0 = гс/2. Но он на-
верняка содержит ложные пики (в основном принадлежащие метильным
группам), которые можно устранить после получения остальных под-
спектров (см. далее). Спектры 0 = тг/4 и 0 = Зя/4 отличаются друг от
друга только фазами сигналов групп СН2. Их разность даст иам
СЯ2-л(и)сиектр. Сложив результаты этих двух экспериментов, мы по-
лучим спектр, содержащий сигналы групп СН и СН3. Вычитание из него
данных эксперимента 0 = тг/2 (умноженных на 1/^/2) приведет к
СНуподспектру. В заключение можно из спектра 0 = тг/2 вычесть не-
большую часть суммы (0 = тг/4) + (0 = Зя/4) (которую мы уже получали
при работе над СН3-подспектром) с целью уменьшения в нем ин-
тенсивности метильных сигналов. Однако, по личному опыту автора,
это требуется довольно редко. На рис. 6.16 изображен полный процесс
получения подспектров.
Как наилучшим образом проделать все эти сложения и вычитания?
Мы могли бы, например, поступить так же, как и в случае разностной
спектроскопии ЯЭО, складывая и вычитая ССИ с необходимыми мас-
штабирующими множителями. Однако иа практике гораздо удобнее
работать в частотной области, что позволяет анализировать комби-
нации спектров по мере их получения. Для этого программное обес-
печение спектрометра должно позволять работать с двумя спектрами
Перенос поляризации и редактирование спектров
209
1-я ступень
2-я ступень
3-я ступень
Рис. 6.16. Полный процесс редактирования спектров в эксперименте DEPT (см.
текст).
в интерактивном режиме; особенно удобно складывать и вычитать
спектры с подбором масштабирующего миожителя в реальном времени.
В этом случае вам не нужно помнить о том, что 1/^/2 = 0,707; вы просто
складываете спектры и подбираете их соотношение таким образом,
чтобы исчезли нежелательные пики. При этом практически всегда легко
отличить СН-пики от СН2 и т.д., поэтому не стоит беспокоиться
о возможной потере информации. Такой способ позволяет автома-
тически скомпенсировать отклонения амплитуд сигналов различных
групп от их теоретических величии. Если все сигналы группы имеют
одинаковые ошибки, то редактирование сохраняет свою эффективность.
Какова точность редактирования? Нетрудно догадаться о причинах,
по которым процесс редактирования может оказаться несовершенным.
Например, амплитуды сигналов зависят от угла поворота 0-импульса,
и неправильная его калибровка или неоднородность поля В2 вызовут
появление ошибок. Далее, три входящие в последовательность задержки
должны соответствовать величине прямой константы спин-спинового
взаимодействия протон - углерод, которая может изменяться от 125 до
(4-75
210
Глава 6
210 Гц. Обычно выбирается компромиссное значение 150 Гц, если в
соединении есть олефиновые углероды или углероды, связанные с
электроотрицательными заместителями, и 130 Гц во всех остальных
случаях. Если соответствующая константа какого-либо углерода значи-
тельно отличается от этой величины, то в подспектрах могут появляться
принадлежащие ему ложные сигналы [7]. В литературе по ЯМР этим
проблемам уделялось много внимания, и в результате обе они были
решены: DEPT GL [8] допускает большее различие констант спни-
спинового взаимодействия, а модифицированный DEPT с составными
импульсами [9] менее чувствителен к точности калибровки углов пово-
рота импульсов,
В этих более совершенных экспериментах используются весьма
сложные импульсные последовательности и фазовые циклы, и химику,
поставившему своей задачей отнесение мультиплетов, не обязательно
в них разбираться. Важно то, что даже при наличии ложных пиков
анализ отдельных спектров DEPT позволяет отнести сигналы совер-
шенно однозначно. Спектр 0 = тг/4 содержит сигналы всех протониро-
ванных углеродов значительной интенсивности. При 0, близком к л/2,
амплитуды сигналов групп СН2 и СНЛ должны значительно умень-
шиться. Пусть они и не станут точно нулевыми; одни останутся
положительными, другие исчезнут, третьи станут отрицательными, ио
все они обязательно уменьшатся. При дальнейшем увеличении 0 в
спектре могут происходить самые разные изменения, но сигналы групп
СН3 в отличие от СН2 никогда ие станут отрицательными (есть одно
редкое исключение, когда частота повторения прохождений слишком
велика для изолированных, свободно вращающихся метильных групп
в молекулах с заторможенными конформационными переходами; см.
работу [7], с. 283, и работу [10]). Сравнение исходных спектров по-
зволяет полностью разобраться во всех непонятных пиках. А затем
можно получить подспектры, которые можно считать наиболее под-
ходящим способом представления результатов для большинства сиг-
налов.
6.4.4. DEPT для спектров без развязки
Как мы выяснили в разд. 6.3, повышение чувствительности ядра 13С
с помощью переноса поляризации с протонов - очень эффективный
метод регистрации углеродных спектров без развязки. В этом случае
DEPT позволяет получать спектры с точно такой же мультиплетной
структурой, как и при прямом наблюдении без развязки от протонов.
Однако из-за различия констант спин-спинового взаимодействия про-
тон-углерод могут появляться некоторые искажения формы линии. Для
подавления этих эффектов были предложены два эксперимента [11]:
DEPT+ и DEPT+ +. Первый из них, видимо, представляет собой самый
лучший компромисс между сложностью реализации и качеством по-
лучаемых результатов. Последовательность DEPT+ такова:
Перенос поляризации и редактирование спектров 211
(неправильная
задержка)
_ РЕРТ
(неправильная
задержка)
л
4
'Н:
13С:
so *s «о JS м is ю is ю
м.б.
Рис. 6.17. Устранение фазовых ошибок в спектрах DEPT без развязки с помощью
последовательности DEPT+. Два верхних спектра получены с задержкой, в 2 раза
превышающей правильную.
я Выборка (±х)...
Она в точности повторяет DEPT с дополнительным протонным л-им-
пульсом на каждом втором прохождении. Так же как и DEPT, она
требует точного подбора длительности задержек, ио при наличии
некоторого диапазона констант этот эксперимент дает меньшие фазовые
искажения сигналов (рис. 6.17). Влияние неправильно установленных
задержек сводится в DEPT+ к изменению интенсивности компонент
мультиплетов. Возникающие при этом ошибки интенсивностей можно
попробовать удалить с помощью DEPT+ + , который описан в работе
[11].
* Этот я-импульс должен создаваться при каждом втором прохождении.
14*
212
Глава 6
6.4.5. Кнадрупольные ядра
Сфера применения переноса поляризации не ограничивается ядрами
со опии ом 1/2. Любое из ядер спиновой системы или оба могут быть
квадрупольными [12], Единственное ограничение состоит в том, что
суммарная длительность импульсной последовательности должна быть
намного меньше времени релаксации. Эта длительность, очевидно,
зависит как от величины константы спин-спниового взаимодействия
(чем оиа больше, тем лучше), так и от релаксационных характеристик
соединения. При выполнении этого условия можно попробовать про-
вести все описанные выше типы экспериментов (повышение чувстви-
тельности в спектрах без развязки, редактирование и т. д.). Однако для
наиболее общего случая редактирования неразвязанных спектров спи-
новой системы из произвольных ядер выбор параметров становится
очень сложным [13], и мы не будем его рассматривать в нашей книге.
Такой эксперимент может понадобиться только в весьма экзотических
ситуациях. Мы сосредоточим свое внимание на повышении чувстви-
тельности в обычных спектрах с развязкой. Одним из наиболее ин-
тересных для химиков случаем может быть наблюдение дейтерия с раз-
вязкой от протонов. Для работы с квадрупольными ядрами последова-
тельность DEPT следует несколько изменить:
_ /тг\ 1 1 А
S: ----------ж —— — 0+,, Развязка ...
\2/, U 2J у
I: <рх я — — — Выборка ( + х) ...
Эта последовательность получила название UPT (Universal Polari-
sation Transfer-универсальный перенос поляризации), хотя введение
нового названия при изменении длительности всего лишь одного им-
пульса может показаться излишним. Для оптимальной чувствитель-
ности необходимо подобрать 6, исходя из спина и числа ядер S, и ср,
исходя из спина и числа ядер 1. И в том и в другом случае это делается
следующим образом. Пусть мы имеем N ядер со спииом л. Каждое
конкретное ядро I может находиться в состоянии, определяющемся
спиновым квантовым числом которое может принимать 2? + 1
значение в диапазоне от --.v до 5 с шагом 1. Если мы определим число
М как
М = £
i=l
то оно будет принимать значения от — Ns до Ns (2Ns + 1 значение).
Оптимальный угол поворота а для последовательности UPT (т. е. 0, если
рассматриваются ядра, с которых переносится поляризация, и ср в случае
ядер, иа которые она переносится) можно иайти из уравнения
Перенос поляризации и редактирование спектров
213
£PwM2cos2Ma = 0 (6.3)
м
где DM - вырождение состояния М. Общую формулу для DM вывести не
так просто, ио в реальных случаях ее можно рассчитать прямым
способом. Например, для двух ядер со спииом I состояние М = 0 имеет
вырождение DM = 3, поскольку оио реализуется в трех случаях: (0, 0),
(1, — 1) и (— 1, 1). В обшем случае можно выписать все члены суммы (6.3)
и получить из нее некий полином относительно cos а, который можно
решить численно [13]. Таким образом, в общем случае рассчитать
0 и ф не так просто, но обычно хотя бы одно из ядер имеет спнн 1 /2, что
позволяет при вычислении оптимального угла поворота пользоваться
довольно простой формулой (6.1).
6.4.6. «Обращенные» эксперименты
Введение. Все применения переноса поляризации, с которыми мы до
сих пор встречались, заключаются в переносе поляризации с ядра
с большим у иа ядро с меньшим у. В принципе иет никаких причин
считать это «прямое» направление единственно возможным, вполне
возможно провести перенос, например, с 13С иа *Н или с 2Н на 13С.
Однако такие эксперименты могут показаться бессмысленными, по-
скольку оии неизбежно должны приводить к потере чувствительности
в сравнении с прямым наблюдением. Но, с другой точки зрения,
подобные эксперименты могут оказаться полезными. Сравним спектро-
скопию *Н и 13С- Первая из них обладает той особенностью, что
протоны присутствуют практически во всех объектах. Интересующие нас
сигналы в протонных спектрах многих распространенных систем, таких,
как среды с химическими реакциями или живые клетки, полностью
закрываются интенсивными сигналами воды или других растворителей
или таких распространенных в биохимии веществ, как липиды. Ядро
13С, напротив, имеет низкое природное содержание, что позволяет
пометить им интересующие нас объекты или их части, которые далее
можно контролировать с помощью 13С-ЯМР, ие встречая помех со
стороны интенсивных протонных сигналов. Таким образом, протонам
присуща высокая чувствительность, а углероду (и другим ядрам с низ-
ким природным содержанием)-высокая селективность.
Теперь мы можем представить себе эксперимент, где «обратное»
направление переноса поляризации могло бы оказаться полезным.
В идеальном случае эксперимент (с помощью фазового цикла или
другими путями) полностью подавляет исходную намагниченность
чувствительных ядер. Если при этом мы будем переносить иа протоны
намагниченность с редких ядер, использованных в качестве меток, то
в результате протонные спектры будут обладать селективностью редких
ядер. Этот процесс, конечно, будет сопровождаться некоторой потерей
чувствительности по сравнению с непосредственным наблюдением. На-
214
Глава 6
пример, при переносе поляризации с 13С иа протоны разность за-
селенностей в самом худшем случае будет в 4 раза меньше наблюдаемой
в обычном эксперименте, в результате в 4 раза понизится чувстви-
тельность. Но полученный спектр будет обладать достоинствами угле-
родных спектров в том смысле, что мы увидим сигналы только тех
объектов, которые содержат ядра 13С. Поэтому правильнее проводить
его сравнение с наблюдением углерода, а ие протонов. Сигнал 13С при
прочих равных условиях в 64 раза слабее сигнала 1Н, поэтому обратный
перенос поляризации позволит в сравнении с непосредственным наблю-
дением углерода получить 16-кратиое усиление. Далее, если мы будем
облучать протоны в перерывах между прохождениями, то ЯЭО на
углероде увеличит его разность заселенностей еще примерно в 3 раза.
В результате чувствительность составит 3/4 прямого наблюдения про-
тонов, что в 50 раз выше, чем при прямом наблюдении 13С.
Но с практической точки зрения такие оценки могут оказаться
слишком оптимистичными. Например, сигналы 13С всегда сниглетиы,
тогда как протоны часто входят в состав сложных спиновых систем. При
каждом расщеплении линии иа две части отношение сигнал/шум умень-
шается в 2 раза. В то же время константы спин-спинового взаимо-
действия дают дополнительную информацию о структуре. Другая проб-
лема состоит в том, что частота повторения прохождений ограничи-
вается релаксацией редких ядер, которая может быть достаточно мед-
ленной. Поэтому вопрос об эффективности такого эксперимента надо
решать в каждом конкретном случае. Например, времена релаксации
углеродов пептида, спектры которого мы увидим ниже, очень неболь-
шие, ио для других соединений может наблюдаться обратная картина.
Это необходимо учитывать при планировании эксперимента. Наконец,
в реальном эксперименте мы можем и не получить теоретических
интенсивностей. У большинства датчиков, настраивающихся на какое-
либо гетероядро, катушка для наблюдения протонов (катушка декап-
лера) редко оптимизируется по чувствительности. Однако очень хорошее
подавление исходных сигналов протонов можно получить с помощью
описываемой далее процедуры. Все эти моменты обязательно нужно
учитывать при сравнении обратного DEPT с другими альтернативными
методами, например с методом разностного спинового эха из гл. 10.
Обратный DEPT. Импульсную последовательность для реализации
обратного переноса поляризации легко построить на основании прин-
ципов эксперимента UPT, описанного в предыдущем разделе [14].
Наибольший интерес представляет перенос поляризации с одного ядра
со спином 1/2 (например, метка 13С) на несколько ядер со спином 1/2
(например, на два протона в группе СН2). Из уравнения (6.3) мы
получаем величину 0-импульса л/2, а величина (р будет зависеть от числа
ядер, иа которые переносится поляризация. Если мы его заранее ие
знаем, то можно использовать компромиссное значение, позволяющее
получить заметные интенсивности всех групп ХН„; для случая 13С такой
Перенос поляризации и редактирование спектров
215
’Н
развита
с — у ~ Выборке ta:
Рис. 6.18. Схема обратного эксперимента DEPT.
величиной будет <р = л/4. Таким образом, для осуществления обратного
DEPT иам потребуется последовательность, изображенная иа рис. 6.18.
Фазовый цикл последовательности должен быть похожим иа обыч-
ный DEPT, его основная функция-чередование фаз заключительного
импульса 13С и фазы приемника с целью подавления исходной на-
магниченности протонов. Поскольку исходная намагниченность про-
тонов гораздо больше переносимой поляризации, одного фазового
цикла будет, по-видимому, недостаточно для полного ее подавления,
и чередование фаз следует сочетать с предварительным насыщением
протонов с помощью широкополосного облучения. Насыщение, помимо
этого, будет создавать на гетероядрах ЯЭО, соответствующим образом
повышающий их чувствительность, поэтому предварительное облучение
следует считать существенным элементом последовательности. Широ-
кополосная же развязка от гетероядер во время выборки-это необя-
зательный элемент. Она, с одной стороны, увеличивает интенсивность
сигналов, но с другой - лишает спектр дополнительной информации,
поэтому ее использование оказывается желательным далеко не всегда.
I
Рис. 6.19. В верхней части представлен нормальный протонный спектр три-
пептида, помеченного ядром ‘3С. На нижнем спектре сигналы протонов у по-
меченного углерода получены отдельно от остальных с помощью обратного
DEPT с широкополосной развязкой от 13С во время выборки (эксперимент
GARP-1, гл. 7). Другие небольшие сигналы, чуть видимые в спектре, возникают за
счет природного содержания ядер 1ЭС в положениях, связанных спин-спиновым
взаимодействием с другими протонами.
216
Глава 6
Кроме того, широкополосная гетероразвязка от ядер типа 13С с их
широким диапазоном химических сдвигов - далеко не простая задача
(см. разд. 7.4 гл. 7).
На рис. 6.19 представлен спектр, полученный с помощью такой
последовательности. Очень хорошее подавление протонных сигналов
было достигнуто с помощью сочетания фазового цикла с насыщением
протонов в течение 1 с перед каждым прохождением. С точки зрения
отношения сигиал/шум полученный спектр сравним с прямым наблю-
дением протонов, но, как мы уже упоминали ранее, это соединение имеет
очень благоприятные релаксационные свойства. Возможности экспе-
римента и его аналогов, которые обсуждаются в гл. 10, выглядят весьма
внушительными, однако иа сегодняшний день мы знаем лишь несколько
примеров их применения [15].
Литература
1. Styles Р.. Soffe N., J. Mag. Res., 50, 397-404 (1984).
2. Morris G.A., Freeman R., J. Amer. Chem. Soc., 101, 760-762 (1979).
3. Pegg D, T„ Doddreli D. M., Brooks W. M„ Bendall M. R.t J. Mag. Res., 44, 32-40
(1981).
4. Такие попытки делались; см.: Lynden-Bell R. M., Bulsing J. M., Doddreli D. M., J.
Mag. Res., 55, 128-144 (1983).
5. Levitt M.H., Ernst R.R., Mol. Phys., 50, 1109-1124 (1983). Основная тема этой
работы не включает DEPT, но он упоминается как многоквантовый фильтр
в связи с поиском источников ошибок в импульсных последовательностях.
6. Bulsing J.M., Brooks W.M., Field J., Doddreli D.M., J. Mag. Res., 56, 167-173
(1984).'
7. Bendall M.R., Pegg D. T, J. Mag. Res., 53, 272-296 (1983).
8. Sorensen О. И-, Bildsfc S.r Bildsfc EL, Jakohsen H. J,, J. Mag. Res., 55, 347-354
(1983).
9. Pegg D.T., Bendall M.R., J. Mag. Res., 60, 347-351 (1984).
10. Bendall M. R., Pegg D. T.t J. Mag. Res., 53, 40-48 (1983).
11. Sorensen O.W., Ernst R. R., J. Mag. Res., 51, 477 489 (1983).
12. Pegg D. T„ Bendall M.R., J. Mag. Res., 55, 51-63 (1983).
13. Pegg D.T., Bendall M.R., J. Mag. Res., 58, 14-26 (1984).
14. Bendall M.R., Pegg D.T., Doddreli D.M., Field J., J. Mag. Rcss., 51, 520-526
(1983).
15. Cm.; Brooks W.M.. Irving M.G., Simpson S. J., Doddreli D. M., J. Mag. Res., 56,
521-526 (1984); Doddreli D.M., Staunton J., LaueE.D., J. Chem. Soc, Chem.
Commun., 602-605 (1983).
Глава 7
Дополнительные сведения
об экспериментальных методах
7.1. Введение
В этой главе мы рассмотрим экспериментальные проблемы, с ко-
торыми часто приходится сталкиваться в практической миогоимпульс-
иой спектроскопии ЯМР. Эта книга, как мы уже говорили в гл. 1, не
претендует иа роль исчерпывающего учебника по практическому ЯМР.
В первую очередь мне хотелось бы сосредоточить внимание иа про-
цедурах, связанных с выбором параметров эксперимента, которые при-
ходится выполнять каждый день, и описать, как их следует правильно
выполнять. Описываемые далее некоторые современные приемы ра-
боты-это не «методы экспериментального ЯМР» в полном смысле
слова. Они в сочетании с другими методиками позволяют повысить
производительность спектрометра или ослабить влияние ошибок экс-
периментатора и недостатков спектрометра на качество получаемых
результатов. Многие современные эксперименты чрезвычайно чувстви-
тельны к тщательному выбору длительностей импульсов, задержек
и фазовых сдвигов и к тому, насколько точно заданные параметры
воспринимаются спектрометром. К сожалению, к большинству спектро-
метров следует относиться с известным скептицизмом, поскольку очень
часто реальные сигналы иа выходе передатчика могут быть слабо
связаны с тем, что мы от него требовали. Это в особенности относится
к таким экспериментам, как, например, упоминающиеся в разд. 7.3
составные импульсы, где последовательность некоторых действий про-
изводится в микросекуидном масштабе времени.
При любых многоимпульсных экспериментах нужно тщательно ка-
либровать длительности импульсов, это особенно необходимо при
первом выполнении нового эксперимента. Чтобы уменьшить вероят-
ность ошибок и путаницы, важно изучить сущность вашего экспери-
мента и знать характеристики вашего спектрометра, наиболее для него
критичные. Перед проведением нового эксперимента его следует от-
тестировать иа таком объекте, для которого результат уже известен,
а выполнение эксперимента не требует много времени. Это значит, что
нужно использовать концентрированные растворы простых соединений,
сложность которых, однако, еще достаточна для демонстрации воз-
можностей эксперимента. Для увеличения частоты повторения полезно
сократить величины 7\ с помощью добавления ацетилацетоиата
218
Глава 7
хрома(Ш) (в органические растворы) или хлорида маргаица(П) (в
водные растворы). Для работы с протонными спектрами полезно иметь
образцы, даюпще спектр с единственным сигналом (например, хлоро-
форм в дейтерохлороформе с небольшой добавкой релаксационного
реагента для сокращения 7\ до 1 нли 2 с), и с двух- и трехспииовой
системами первого порядка (вполне подойдут 0-хлоракиловая кислота
и 1,2-дибромпропиоиовая кислота в дейтерохлороформе). Количество
тестовых образцов для работы с гетероядерными системами может быть
бесконечным. Тестирование большинства протон-углеродных экспери-
ментов удобно проводить с помощью обогащенного по 13С метилиоди-
да. Часто бывает нужно дополнительно сократить 7\.
7.2. Длительность импульса и напряженность поля
7.2.1. Введение: шкала мощности в децибелах
При настройке спектрометра перед проведением миогоимпульсиого
эксперимента часто приходится измерять мощности нескольких радио-
частотных полей. Различные названия этой операции-калибровка дли-
тельности импульсов или измерение напряженности поля - отражают
только разные стороны определения одного и того же параметра. Для
измерения амплитуды радиочастотного поля можно использовать еди-
ницы типа гаусс (Гс) или тесла (Т): 1Т = 10 000 Гс, ио с точки зрения
ЯМР ее наиболее удобно выражать, как мы это уже делали в гл. 4, через
скорость прецессии ядерной намагниченности, В этом случае связь
между амплитудой поля В в герцах, т.е. в числе поворотов намаг-
ниченности в секунду, и длительностью л-импульса вызывающего
поворот намагниченности на 1/2 цикла, выглядит особенно просто
= 1/2В). Например, обычный жесткий тг-импульс длительностью
10 мкс соответствует амплитуде поля 50 кГц, а обычная для гомоядер-
ной развязки амплитуда поля 50 Гц эквивалентна мягкому те-импульсу
длительностью 10 мс. Термины «жесткий» и «мягкий» довольно часто
неправильно применяются для обозначения неселективных и селектив-
ных импульсов. Поэтому точное значение этих терминов зависит от
контекста. Для измерения амплитуды радиочастотного поля нам по-
требуется некоторое чувствительное к этой величине явление ЯМР. Мы
рассмотрим целый набор таких явлений, а выбор конкретного из них
будет зависеть от обстоятельств.
Обычно передатчик и декаплер, если последний используется в им-
пульсном режиме, работают на максимально возможной мощности.
Однако во многих экспериментах, например при получении мягких
импульсов заданной длительности или для селективной развязки, нужно
использовать некоторую конкретную мощность. Более низкая мощность
обычно получается делением максимальной мощности с помощью
аттенюатора. Нам будет полезно иметь представление о том, как
параметр, отражающий отношение мощностей (децибел или дБ), связан
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
219
с амплитудой радиочастотного поля в ЯМР-эксперимеите. Децибел (дЕ)
дает иам логарифмическую шкалу отношения мощностей и определяет-
ся как
дБ=10Ы^) (7.1)
2/
где Рг и две сравниваемые мощности. Очень часто удобнее срав-
нивать не мощности, а напряжения сигналов, которые связаны с мощ-
ностью соотношением
V2
Р = у (7-2)
При выполнении расчетов, исходя из величии напряжений, нужно поль-
зоваться соотношением
дБ = 201g (7.3)
Как мы видим, децибелы характеризуют отношение величин. Поэтому
их обычное использование в качестве некоторой абсолютной величины
в выражениях типа «громкость звука взлетающего самолета превышает
150 дБ» или в более важном для ЯМР (если, конечно, ваша лаборатория
находится не возле аэропорта) «выходная мощность синтезатора со-
ставляет + 10дЕм» может несколько озадачить. Фокус состоит в том,
что в этих выражениях говорится об отношении интересующей нас
величины к некоторой стандартной; последняя, как предполагается, всем
известна. Для обычных единиц измерения радиочастотной мощности
(дБм и дБВт) эта величина составляет 1 мВт и 1 Вт соответственно.
Обычные генераторы прямоугольных сигналов имеют иа выходе мощ-
ность в несколько дБм, а обычные импульсные передатчики спектро-
метров ЯМР могут давать + 20 дБВт.
Двукратное снижение мощности соответствует ее изменению на
— 3,01 дБ (101g0,5), или, можно считать, просто на — ЗдБ. Однако
мощность радиочастотного поля пропорциональна напряжению сигна-
ла, прикладываемого к катушке, поэтому для понижения напряженности
поля в 2 раза нужно снизить напряжение сигнала на 6 дБ. Запомнив это
простое соотношение, вы легко сможете подобрать величину соот-
ветствующего параметра для получения нужной амплитуды радио-
частотного поля.
7.2.2. Импульсы на частоте наблюдаемых ядер
В случае высокой чувствительности. Длительность импульса пере-
датчика измеряется легче всего, когда чувствительность ядер и кон-
центрация образца достаточны для получения хорошего отношения
сигнал/шум за одно прохождение, В этом случае мы можем искать
220
Глава 7
Рис. 7.1. Калибровка длительности импульса, Интенсивность сигналов проходит
через нуль при углах поворота импульса я, 2п...
длительность я-импульса, исходя из того, что ему должен соответ-
ствовать сигнал нулевой интенсивности. Сначала следует получить
спектр с помощью короткого импульса, угол поворота которого за-
ведомо меньше п/2. На обычных передатчиках спектрометров высокого
разрешения таким требованиям должна удовлетворять длительность
1-2 мкс. По этому спектру следует подобрать условия коррекции фазы
для получения положительного сигнала поглощения. Повторение этого
эксперимента с увеличивающейся длительностью импульса позволяет
иайти точку нулевого сигнала, соответствующую я-импульсу. Пред-
варительное определение условий коррекции фазы облегчает поиск
нулевой точки, поскольку после прохождения через нее сигналы ин-
вертируются (рис. 7.1), Имейте в виду, что некоторые спектрометры
автоматически масштабируют каждый новый спектр. Поэтому для
получения таких спектров, как на рис. 7.1, автоматическое масштаби-
рование необходимо отключить.
На практике такая процедура сопряжена с рядом сложностей. Если
вы еще ие очень освоились со спектрометром и не имеете представления
о возможной длительности я-импульса, то убедитесь, что найденная
вами нулевая интенсивность действительно первая. Аналогичные точки
нулевой интенсивности соответствуют импульсам с углами поворота 2я,
Зя и т. д., поэтому начинающему пользователю очень полезно иметь
представление о приблизительных величинах длительностей импульсов
на различных ядрах. Еще одно препятствие состоит в том, что оператору
надо решить, какой спектр принять за «нулевой». л-Импульс ие может
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
221
Рис. 7.2. Остаточный сигнал, полу-
ченный с помощью л-импульса. На
конкретном приборе его вид опре-
деляется конструкцией датчика.
быть идеальным, и во всех спектрах обязательно будут наблюдаться
какие-либо остаточные сигналы. Одна из причин этого состоит в
чувствительности л-импульсов к расстройке резонансных условий (гл. 4).
Ее легко исключить, просто поместив несущую частоту точно иа
измеряемую линию. Но из-за неоднородности поля В± специфические
остаточные сигналы все равно сохранятся (рис. 7.2), и вам самостоя-
тельно придется принимать решение о том, какая длительность им-
пульса наиболее близка к искомой. При этом лучше всего учитывать
среднюю часть линии сигнала, которая отражает поведение основного
объема образца, и не обращать внимания на ее боковые части.
В случае низкой чувствительности. Если с одного прохождения ста-
новится трудно зарегистрировать сигнал образца, то при измерении
длительности импульса приходится проявлять больше изобретатель-
ности и терпения. В зависимости от того, насколько плоха чувстви-
тельность, можно использовать различные пути. Если сигналы, видимые
в некоторых спектрах, исчезают в шуме при приближении к ти-импульсу,
то может быть достаточно определять последний видимый положи-
тельный сигнал и первый видимый отрицательный и взять среднюю
между ними величину. Кроме того, если оператору хватит терпения,
можно использовать накопление. Прн калибровке длительности им-
пульса большинства ядер делать задержку в несколько Тх, достаточную
для полного восстановления ^-намагниченности между прохождениями,
ие так просто. Можно повторять импульсы и ие дожидаясь полной
релаксации, ио при этом выборка данных должна проводиться только
после установления стационарного режима. В этом случае более эффек-
тивным будет поиск второго «нуля», соответствующего 2тг-импульсу,
поскольку длительность этого импульса и «нуль» л-импульса связаны
довольно просто [1].
Если за разумные промежутки времени ие удается увидеть вообще
222
Глава 7
никаких сигналов, то необходимо использовать предварительную ка-
либровку. Можно, например, описанными ранее способами определить
длительность импульса на концентрированном образце. При тщатель-
ной настройке датчика (гл. 3) эта величина должна воспроизвестись и на
разбавленном образце. Исключение составляют случаи, когда интере-
сующий иас образец сильно отличается по электрическим свойствам от
раствора, на котором производилась калибровка. Это может быть при
попытке работать с водными растворами электролитов, когда исполь-
зуются длительности импульсов, полученные иа органических раство-
рах. Значительно лучше приготовить образец, похожий по свойствам на
исследуемый, но с достаточной для калибровки тг-импульса концентра-
цией. Полученная таким образом величина может применяться без
дополнительной настройки спектрометра. Некоторые ядра, например
многие металлы, не позволяют получить видимые сигналы ни при каких
концентрациях растворов. Если вам приходится заниматься экспери-
ментами на таких ядрах, то единственный способ калибровки им-
пульсов-это использование описываемого далее метода, когда импульс
для интересующего вас ядра калибруется с применением гетероядериого
спин-спинового взаимодействия с другими ядрами.
7.2.3. Импульсы на других ядрах
Во многих экспериментах импульсы должны производиться иа час-
тоте других ядер, связанных с наблюдаемыми. Это прежде всего
эксперименты по переносу поляризации, такие, как DEPT, и соответ-
ствующие двумерные эксперименты. Чаще всего другим ядром ока-
зывается ТН, а наблюдаемым-13С или еще какое-либо гетероядро.
Протонный импульс создается протонным декаплером, поэтому опре-
деление длительности ти-импульса часто называют «калибровкой дли-
тельности импульса декаплера». Но мы сохраним этот термин для
случая, когда иас будет интересовать именно развязка. Во множестве
экспериментов протоны ие используются в качестве «других» ядер. Это,
например, DEPT с переносом поляризации с 31Р на металл или обрат-
ный перенос поляризации с 13С на протоны. Во всех этих случаях задача
остается той же: найти длительность я-импульса ядер, ие наблюдаю-
щихся непосредственно.
Все методы калибровки можно разделить иа группы по типу за-
висимости интенсивности сигналов наблюдаемых ядер от угла поворота
импульса, воздействующего иа связанные с ними другие ядра. На-
пример, вот простая последовательность [2]:
— х-Выборка ...
а
где X - наблюдаемое ядро, Y-«другое» ядро, оба со спином 1/2. Для
калибровки требуется спиновая система XY (т. е. дублет сигнала X). При
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
223
импульс 1Н
О
21 мкс 23 мкс
25 мкс
Г'"1' "Т" ' 1.................................................... г.............ПН................... [П»рт..|.И.|..„|„.
ню о -loo 1П0 0 .t(M( 100 о 100 lB0 0 _i00
Г* Гк Гц Гц,
Рис. 7.3. Калибровка импульсов на системе связанных ядер (первый метод).
т, равном 1/2JXy, импульс иа ядре Y с углом поворота а = л/2 (заметьте,
ти/2, а не п) приведет к регистрации сигнала нулевой интенсивности.
Компоненты дублета всегда оказываются в противофазе. При переходе
длительности а-импульса через точку тг/2 фазы компонент инверти-
руются (рис, 7.3). Основной недостаток этого эксперимента состоит
в невозможности развязки от ядра Y при выборке сигнала X, что
приводит к потере чувствительности. Кроме того, оптимальная частота
повторения прохождений определяется величиной Т\ ядра X, что может
вызвать затруднения в наиболее распространенном случае, когда
Y-протои, а X-малочувствительное и, возможно, медленно релак-
сирующее ядро.
Лучше использовать последовательность DEPT (гл. 6), где допус-
кается развязка от Y, а частота повторения прохождений определяется
величиной Т{ ядер Y. Начиная с небольшого импульса 0 для настройки
фазовой коррекции, нужно иайти такую длительность 9-импульса, при
которой сигналы групп XY2 и/или XY3 становятся нулевыми; эта
величина будет соответствовать 0 = л/2 (рис. 7.4). При переносе по-
ляризации с протонов иа углерод можно вполне точно откалибровать
длительность импульса на сильно разбавленных образцах, суммируя
8-16 прохождений, повторяющихся через 1 или 2 с. Но предварительно
необходимо измерить длительность импульса на углероде и подобрать
длительность входящей в последовательность задержки в соответствии
с ожидающейся величиной константы спин-спииового взаимодействия
протон - углерод.
Два этих метода пригодны для калибровки только достаточно
сильных радиочастотных полей (соответствующих неселективным им-
пульсам). Калибровка мягких импульсов иа системе связанных ядер,
которая требуется для проведения эксперимента SPI, может оказаться
224
Глава 7
Рис. 7.4. Калибровка им-
пульсов на системе свя-
занных ядер с помощью
последовательности
DEPT.
гораздо сложнее. Вероятно, для этого лучше использовать первый из
описанных методов с резонансным импульсом иа ядре Y при достаточно
большой напряженности поля (например, около 1 кГц), чтобы его
можно было считать иеселективным. Когда найдена длительность им-
пульса для этой напряженности поля, ее можно снизить до нужной
величины с помощью точного аттенюатора.
7.2.4. Мощность радиочастотного поля
при гом оя дерн ой развязке
Если иам необходимо осуществить непрерывное облучение ядер
сигналом малой мощности, например при гомоядериой развязке, то
удобнее использовать амплитуду поля, а ие длительность импульса. Для
выбора параметров эксперимента с целью получения эффективной раз-
вязки-или оптимальной селективности удобно иметь таблицу, отра-
жающую связь амплитуды поля и мощности декаплера. Расчет эф-
фективной амплитуды поля декаплера по длительности его тг-импульса
может оказаться очень сложным, поскольку на фурье-спектрометрах
гомоядериая развязка реализуется при помощи облучения короткими
импульсами (развязка с разделением времени), которая снижает эф-
фективную амплитуду поля на неизвестную в общем случае величину.
Значительно лучший способ измерения амплитуды слабого поля для
гомоядериой развязки состоит в использовании так называемых сдвигов
Блоха-Зигерта. Они представляют собой изменение частоты сигналов
относительно их обычного положения при облучении системы на близкой
частоте (рис. 7.5). Это изменение связано с амплитудой поля декаплера
(В2) и разностью частот сигнала и облучения следующим образом:
s В22
Sv =-----------
2(v - v;)
(7.4)
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
225
во 60 40 2d О
Гц
Рис. 7.5. Сдвиг Блоха-Зигсрта. Внизу изображен нормальный спектр, вверху-
спектр, полученный при облучении системы на нулевой частоте; остальные
параметры регистрации те же. Вычисленная из величины сдвига напряженность
поля составляет около 20 Гц.
где В2 выражается в герцах, v-исходная частота наблюдаемого сигнала,
v; частота облучения и В2 « v - vP Это измерение удобно проводить
с помощью разностного метода: нормальный спектр, содержащий одну
линию, вычитается из спектра, облучаемого на близкой частоте, что
позволяет непосредственно измерить сдвиг частоты. Частота облучения
должна быть удалена от сигнала на расстояние, значительно большее
ожидающегося сдвига Блоха - Зигерта. Серия таких экспериментов
с различными аттенюаторами должна показать линейную зависимость
напряженности поля от коэффициента деления в дБ.
7.2.5, Мощность радиочастотного поля
при гетероядерной развязке
Измерение мощности поля при гетероядерной развязке (т. е. развязке
от ненаблюдаемых ядер) обычно требуется в двух случаях-в качестве
предварительного эксперимента прн определении длительности импульса
по методу, описанному в разд. 7.2.3, и для настройки развязки от
гетероядер. Конечно, длительность импульса можно определить и без
измерения мощности поля. Но если вы определяете импульс на каком-
либо экзотическом ядре или иа незнакомом датчике, то предварительная
калибровка поля альтернативным способом поможет ускорить экспе-
римент и снизит вероятность ошибок. Более важная сторона такого
подхода состоит в том, что современные методики широкополосной
развязки требуют использования фазовых сдвигов декаплера в соот-
ветствии с заданной последовательностью, скорость которых
определяется мощностью поля (разд. 7.4), Если гетероядерный пере-
датчик допускает работу в непрерывном режиме, то определение мощ-
ности поля позволяет обойтись вообще без процедуры, упомянутой
в разд. 7.2.3.
Простой и не очень точный метод состоит в наблюдении эффектов
развязки в нерезонансных условиях. Рассмотрим в качестве примера
15-73
226
Глава 7
группу СН. Сигнал углерода без развязки от протонов представляет
собой дублет с константой J. Если мы будем с достаточной ин-
тенсивностью облучать систему точно иа частоте протонов, то дублет
углерода превратится в сииглет. Смещение частоты облучения в сторону
от протонного сигнала приведет к восстановлению дублета, ио с мень-
шим расстоянием между линиями. В приближении значительно большей
напряженности поля по сравнению с разностью частот протонного
сигнала и облучения его можно выразить через величину остаточного
расщепления:
J8v
В2
(7.5)
где Достаточное расщепление, Sv-разность частот протонного сиг-
нала и облучения. Существует и более точная формула:
В 2 — j (7. о)
ио при В2 » Sv приближение (7.5) вполне приемлемо. Общая процедура
будет состоять из измерения константы спии-спинового взаимодействия,
измерения точной частоты протонного сигнала и последующего ие-
резонаисиого облучения с Sv, выбранным таким образом, чтобы полу-
чить небольшое, но надежно измеряемое остаточное расщепление
(рис. 7,6). Такие измерения ие очень точны, поэтому их можно ис-
пользовать только в качестве предварительной оценки перед прове-
дением калибровки более точными методами. Описанный метод больше
подходит для измерения средних и высоких напряженностей поля
декаплера в отличие от метода сдвигов Блоха-Зигерта, который лучше
работает на слабых полях.
расстройка
декаплера
Рис. 7.6. Использование
эффекта расстройки резо-
нансных условий для из-
мерения напряженности
поля гетероядерной раз-
вязки.
Дополнительные сведения об экспериментальных методах 227
7.3. Уменьшение неидеальности импульсов
7.3.1. Введение
Сколько бы сил вы ни затратили на точное измерение длительности
импульсов с помощью описанных выше процедур, вам все же не удастся
достичь эффекта идеального я/2-или тг-импульса. Объясняется это двумя
причинами—неоднородностью поля Вг по объему образца, обуслов-
ленной несовершенством конструкции катушки передатчика, и откло-
нением эффективного угла поворота намагниченности, обусловленным
конечной величиной напряженности поля Вг (гл. 4, разд. 4.3.2). В ру-
тинной одномерной спектроскопии, где используются только тг/2-им-
пульсы или более короткие, ни одни из этих эффектов не заметен.
Отклонение угла поворота намагниченности вызывает появление в
спектре фазовых ошибок, которые суммируются с ошибками из других
источников и корректируются при обработке данных, поскольку они
приблизительно линейно зависят от величины расстройки резонансов.
Небольшие изменения в эффективной длительности импульса, обус-
ловленные неоднородностью поля В^ по объему образца, не оказывают
заметного влияния на результаты.
Одиако все виды многоимпульсиых экспериментов могут быть в
значительной степени подвержены влиянию этих факторов. Простым
примером этого может служить упомянутый в гл. 4 метод инвер-
сии-восстановления для измерения величин 7j. В этом методе из-
меряется скорость, с которой намагниченность, помещенная ти-импуль-
сом на ось —z, возвращается к состоянию равновесия. Легко догадаться,
что некорректная отработка импульса приведет к получению неверных
результатов. Другой пример, более важный для химических прило-
жений,-это многие современные эксперименты по переносу поляри-
зации, использующие прием размещения векторов намагниченности
вдоль определенных осей. В эту категорию попадают рассмотренные
ранее эксперименты INEPT и DEPT, их двумерные аналоги (гл. 9),
а также другие одномерные и двумерные эксперименты, такие, как
INADEQUATE (гл. 8). Отклонение векторов намагниченности от их
идеального положения, которое может быть обусловлено их вращением
вокруг наклонной оси или неправильным углом поворота, снижает
чувствительность этих экспериментов, а в некоторых случаях может
вызывать появление ложных сигналов. Потеря чувствительности может
быть особенно нежелательна, поскольку многие из этих экспериментов
разработаны специально для ее повышения. К дефектам импульсов
очень чувствительны также все эксперименты, использующие спиновое
эхо. В двумерных экспериментах, известных под названием 7-спектро-
скопии, некорректность импульсов создает целые наборы ложных сиг-
налов (гл. 10).
15*
228
Глава 7
7.3.2. Составные импульсы
Одно из направлений борьбы с дефектами импульсов-это чисто
аппаратурное совершенствование конструкции датчиков. Оно решает
обе проблемы, поскольку позволяет повысить как однородность, так
и амплитуду поля Вх. Последний параметр, казалось бы, должен
в большей степени зависеть ие от датчика, а от передатчика, поскольку
амплитуду поля Bt можно повысить, просто увеличивая напряжение
радиочастотного сигнала. Действительно, на практике нет реальных
препятствий (кроме стоимости прибора), мешающих повысить выходное
напряжение, передатчика иа несколько порядков. Препятствия создают
именно компоненты датчика, которые должны работать при высоких
напряжениях без деформаций и пробоя изоляторов. В настоящее время
на датчиках небольших диаметров можно создать поля Bt с амплитудой
в 20-50 кГц (длительность я/2-импульса 12,5-5 мкс) и выше. Одиако
параллельно с совершенствованием конструкций датчиков происходит
и рост напряженности постоянных магнитных полей, что требует
дальнейшего расширения спектральных диапазонов. При амплитуде
радиочастотного поля 20 кГц отклонение частоты импульса от ре-
зонанса на 3,5 кГц Приводит к существенному (10°) наклону оси
поворота намагниченности. При наблюдении ядра 13С на спектрометре
с рабочей частотой 500 МГц для протонов диапазон 3,5 кГц составляет
только 28 м. д., а полный спектральный диапазон может быть около
± 120 м. д.
Таким образом, неидеальиость импульсов необходимо компенси-
ровать каким-либо способом. Одним из самых впечатляющих дости-
жений последних лет стали попытки разработки комплексных (состав-
ных) импульсов, эквивалентных в сумме одному л- или тг/2-импульсу, но
менее чувствительных к отклонению от резонанса и/или неоднородности
поля Вх. Исследования в этой области еще продолжаются, и проблема
пока не решена, но достигнутые к настоящему времени успехи по-
зволяют надеяться на ее решение. Для большинства последователь-
ностей, реализующих составные импульсы, вполне очевидно, что же-
лаемый эффект будет достигнут только в случае идеальности каждого из
входящих в них импульсов. Иногда влияние на последовательность
отклонения от резонанса или неоднородности поля можно изобразить
графически в терминах векторной модели, как это сделано на рис. 7.7.
Но в общем случае для правильного понимания этих эффектов вам
нужно ознакомиться с оригинальными работами.
В первых попытках построения составных импульсов проблемы
отклонения от резонанса и неоднородности поля Вх решались отдельно
[3]. Дальнейшие последовательности разрабатывались для одновре-
менного решения обеих проблем. Особое внимание уделялось тг-им-
пульсам, поскольку они в большей степени чувствительны к отклонению
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
229
Рис. 7.7, Диаграмма движения намагниченности системы после составного тг-им-
пулъса. Движение начинается на оси + z и представлено в виде серии линии на
поверхности сферы. Каждая линия соответствует уменьшению длительности
тс/2-импульса с шагом 5° от номинальной величины. Для различных величин В.
строится несколько серий. Траектории заканчиваются гораздо ближе к оси — z,
чем можно было бы ожидать в случае обычного л-импульса с той же ошибкой
в напряженности поля.
от резонанса [4, 5]. Два первых составных импульса, эквивалентных л-
и л/2-импульсам, выглядят так:
тс
2'
я/.
Входящие в них импульсы должны создаваться без промежуточных
задержек, но на практике это недостижимо, и между импульсами иногда
нужно вставлять задержки в несколько микросекунд. Наибольший ин-
терес для нас представляет л-импульс, который применяется как для
инверсии z-намагниченности, так и для создания спинового эха. Мы eine
вернемся к нему в гл. 10. Для того чтобы понять его работу, нужно
рассмотреть траектории компонент иамагничеиности, первоначально
находящихся на оси z, с увеличивающейся ошибкой компонент импульса
(см., например, рис. 7.7). Составной импульс вставляется в нужную
последовательность на место своего эквивалента. Для изменения его
фазы следует на равные величины измеинть фазы его компонент, так
чтобы относительные фазы остались прежними.
Трехэлементный составной л-импульс обеспечивает хорошую ком-
пенсацию неоднородности поля Вх (отклонения длительности импульсов
от идеальной величины порядка +20% изменяют эффективность ин-
версии не более чем на 1%), по только при отсутствии отклонений от
резоиаиса. Для компенсации обоих эффектов требуется более сложная
230
Глава 7
последовательность, наилучшая из доступных в настоящее время имеет
весьма подозрительное название GROPE-16 («поиск-ощупью-16») [5].
Для описания более длинных последовательностей составных импульсов
удобно пользоваться специальными правилами сокращения. Пусть
я/2-импульс, поворачивающий намагниченность вокруг оси х, обозна-
чается X. Такой же импульс вокруг оси у будет обозначаться Y,
а 18(Г-фазовый сдвиг-при помощи верхней черточки, т.е. X и Y.
Импульсы другой длительности будут записываться как кратные
ти/2-импульсу, например х-импульс - это 2Х. В качестве примера
использования правил сокращения мы можем записать упоминавшийся
ранее составной п-импульс как X2YX. Последовательность GROPE-16
будет выглядеть так:
3X4XY3Y4YX
Эта последовательность допускает ошибки в длительности импульсов
до +20% и отклонения от резонанса до +О,5/?3 при снижении эф-
фективности инверсии намагниченности ие более 1%. На примере поля
Вг в 50 кГц 99%-ная эффективность инверсии будет достигаться при
задании длительности ти/2-импульса от 3 до 6 мкс в диапазоне +25 кГц
вокруг резонанса. Это дает огромное преимущество при тестировании
новых экспериментов и не только за счет большой допустимой погреш-
ности в длительности импульсов.
Составные тг/2-импульсы с двойной компенсацией особенно удобны
для подавления SPT-сигналов в экспериментах по ЯЭО [6] (разд. 5.3.3
гл. 5). Последовательность Y3X4X, используемая в качестве составного
ти/2-импульса, создает поперечную намагниченность с 99%-ной эффек-
тивностью при тех же допусках по однородности поля Bt и отклонению
от резонанса, что и GROPE-16. Почти все разностные спектры ЯЭО
в гл. 5 были получены с помощью этого импульса.
Однако дело обстоит не так благополучно, как это может показаться
иа первый взгляд. Описанные здесь последовательности разрабаты-
вались для воздействия только на z-компонеиту намагниченности-для
ее устранения (л/2-импульс) или инверсии (ти-импульс). Только к этой
компоненте и относятся компенсационные свойства последовательно-
стей. Наличие поперечной намагниченности значительно изменяет их
влияние на спиновую систему. Рассмотрим простой пример: после-
довательность (п/2)х (%/2)у помещает z-намагничениость в поперечную
плоскость с компенсацией неоднородности поля Bt. Одиако если мы
подействуем этой парой импульсов на вектор, находящийся иа оси +у,
то он окажется на оси +х, чего мы вовсе ие хотели. В то же время
упоминавшийся составной п-импульс все же будет осуществлять вра-
щение поперечной намагниченности на 180°, но при этом компенса-
ционные свойства последовательности уменьшатся [7]. Было найдено,
что составной импульс, такой, как X2YX, снижающий чувствительность
амплитуды спинового эха к неоднородности поля вносит ошибку
в его фазу (в отличие от обычного тг-импульса, создающего эхо с фазой,
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
231
не зависящей от угла поворота). Это значит, что составные импульсы
нельзя просто так вставлять в импульсные последовательности на место
их аналогов без тщательного анализа задачи. Эффективный пример
этого можно найти в работе [8],
На результаты таких последовательностей оказывает влияние и ряд
экспериментальных факторов. Использование составных импульсов сни-
жает зависимость эксперимента от параметров датчика, но повышает
зависимость от качества других блоков спектрометра. Для корректного
их применения необходимо тщательно контролировать синхронность
и величину фазовых сдвигов. Большинство спектрометров можно легко
запрограммировать иа генерацию составных импульсов, но соответ-
ствующие им реальные процессы останутся окутанными дымкой ие-
I________i________1________1_____ртытрйна i—.________1 „_„_i----------pjctmpoune
О 0,255, 0,55, 0,755) 0 0,255, 0,55,
Рис. 7.8. Сравнение составного гс-импульса GROPE-16 (вверху) с обычным тс-им-
пульсом (внизу). Для того чтобы смоделировать влияние неоднородности поля
Въ зависимость амплитуды сигнала от расстройки изображена в обоих случаях
при оптимальном угле поворота (слева) и при угле, превышающем оптимальный
на 20% (справа).
232
Глава 7
известности. Более длинные последовательности помимо проблемы
синхронности фазовых сдвигов будут страдать и от «затухания им-
пульса», поскольку передатчик, предназначенный для создания импуль-
сов длительностью порядка 20 мкс, при попытках генерации длинных
импульсов начинает выдавать ложные сигналы (например, продолжи-
тельность GROPE-16 составляет 160 мкс при длительности обычного
тг/2-импульса 10 мкс).
Именно по этой причине эффективность использования составных
импульсов нужно проверять на каждом конкретном спектрометре. Во
многих экспериментах при попытках использования составных импуль-
сов можно получить совершенно неожиданные результаты. Например,
может возрасти точность измерений. Поэтому перед их использованием
требуется независимая проверка, результат которой должен ясно сви-
детельствовать об их корректности. Подходящий тест для составного
л-им пульса таков:
п
П — --Выоорка ...
где П-составной импульс. Эффективность инверсии намагниченности
можно проверить, определив ее зависимость от величины отклонения от
резонанса или длительности импульса на образце, дающем спектр
с единственным сигналом. Для предотвращения дополнительных эф-
фектов отклонения от резонанса при определении зависимости эф-
фективности инверсии от частоты П-импульса частота я/2-импульса
должна быть строго резонансной. На рис. 7.8 показаны результаты
сравнения обычного я-импульса с GROPE-16 на спектрометре с часто-
той 500 МГц при амплитуде радиочастотного поля равной 30 кГц,
7.4. Широкополосная развязка
Во многих экспериментах необходимо полностью освободиться от
спин-спинового взаимодействия между двумя ядрами с помощью ши-
рокополосного облучения второго ядра (т. е. не находящегося под наблю-
дением). Чаще всего это протоны, но иногда бывает удобно развязаться
и от других активных с точки зрения ЯМР ядер с высоким природным
содержанием, таких, как 31Р или 19F. Широкополосная развязка тра-
диционно состоит из облучения большой мощности и фазовой мо-
дуляции радиочастоты для создания «боковых полос», распределенных
по всему интересующему нас диапазону. Различные схемы модуляции,
в том числе и самая первая случайная или шумовая модуляция, раз-
рабатывались эмпирическим путем. Схема шумовой модуляции по-
служила причиной широкого распространения термина «шумовая про-
тонная развязка» или PND (prolon-noise-decoupling) для обозначения
широкополосной развязки вообще. Этот термин не совсем корректен,
поскольку современные спектрометры почти ие используют такой ме-
тод.
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
233
Ни один из эмпирически найденных методов нельзя считать пол-
ностью удовлетворительным. Две основные проблемы таковы: 1) не-
обходимость использования достаточно высоких напряженностей поля
В2 и, следовательно, высоких мощностей радиочастотных сигналов,
нагревающих образец; 2) недостаточная эффективность развязки, при-
водящая к потере разрешения. Обе проблемы еще более осложняются на
снльнопольных спектрометрах, где требуется более широкая полоса
облучения. Уширение линий, обусловленное недостаточно эффективной
развязкой и приводящее к снижению чувствительности, не рефокуси-
руется с помощью спинового эха и поэтому особенно вредно для
использующих его экспериментов (см. гл. 10).
За последние годы в области широкополосной развязки были сде-
ланы очень важные разработки, позволившие решить многие из этих
проблем. Для начала попробуем разобраться, почему непрерывная
развязка высокой мощности работает недостаточно хорошо. Очень
интересный способ решения вопроса-это вообразить себе цепь я-им-
пульсов на частоте ядра, от которого нужно развязаться (пусть это
будут протоны при наблюдении 13С):
1Н: я—т — я—т—я — т—я—т — я—т — я — т — ...
13С:
- Выборка
Каждый раз, воздействуя импульсом на протоны, мы изменяем направ-
ление прецессии компонент мультиплета 13С (рис. 7.9). Следовательно,
в середине каждого интервала т они будут оказываться на одной оси, и,
производя выборку в эти моменты, мы получим спектр, не содержащий
информации о спин-спиновом взаимодействии, т. е. развязанный от
протонов. Мы уже знаем, почему цепь я-импульсов будет очень чувстви-
тельна как к ошибкам в длительности импульсов, так и к наклону оси
поворота намагниченности ведь с каждым импульсом эти ошибки
будут накапливаться (см. эксперимент Карра - Парселла в гл. 4). Поэто-
му в том, что это нс самый лучший метод широкополосной развязки, нет
ничего удивительного. Если представить себе такую цепь с задержками
т, сжатыми до нуля, то она будет эквивалентна непрерывному облу-
чению, и ее несостоятельность можно будет показать с помощью тех же
аргументов.
Рис. 7.9. Широкополосная развязка с помощью серии л-импульсов.
234
Г лава 7
Предложенная модель развязки как цепи ти-импульсов позволяет нам
провести ее дальнейшее улучшение. Возможно, замена неидеальиого
я-импульса на его составной аналог позволит настолько снизить влия-
ние неоднородности поля В2 и отклонения от резонансов, что развязка
окажется эффективной. В этом направлении было проведено много
исследований, идея которых состояла в использовании исходного со-
ставного я-импульса с систематической перестановкой его компонент
и фаз [9]. В качестве основы для такой последовательности можно
использовать упоминавшиеся ранее составные я-импульсы, одиако осо-
бенно удобным оказался составной импульс
/я\ /Зти\
достоинство которого состоит в гом, что он не использует 90°-фазовые
сдвиги и поэтому может быть реализован на существующих фазовых
модуляторах канала развязки. Для удобства описания последователь-
ностей развязки, использующих только 180 -фазовые сдвиги, мы не-
сколько модифицируем принятые ранее правила записи. Продолжи-
тельность импульса будет по-прежнему обозначаться кратной я/2-им-
пульсу, а фазовому сдвигу будет соответствовать черточка над симво-
лом. Так как 90°-сдвиги уже ие нужны, то отпадает необходимость
в использовании X и У, достаточно будет только цифры, обозначающей
длительность. Таким образом, указанный составной импульс запишется
как 123 (соответствующая ему последовательность носит сокращенное
имя WALTZ, см. гл. 4). В качестве основы последовательностей развязки
можно использовать и другие составные импульсы, которые, возможно,
дадут еще лучший результат, но модификация 123, названная WALTZ-16
[10], полностью решает все проблемы, связанные с неточностью калиб-
ровки поля В2, и представляется самой предпочтительной для прак-
тического использования. WALTZ-16 можно записать в виде
...QQQQ
Перестановки фаз импульсов должны производиться без задержек, а
Q = 342312423
Эта последовательность легко реализуется при помощи современных
аппаратурных средств и, вероятно, станет стандартной методикой раз-
вязки на спектрометрах, которые будут выпускаться после 1984 г. На
рис. 7.10 приводится сравнение эффективности развязки WALTZ-16 с
более старой схемой модуляции (прямоугольная волна с разверткой по
частоте).
Использование для развязки составных импульсов в значительной
степени решает проблему нагревания образца даже иа спектрометрах
с частотой 500 МГц. В спектрах, полученных в условиях широкопо-
лосной развязки, становятся возможными измерения с высоким раз-
решением, поскольку ширина линии может достигать 0,25 Гц и менее;
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
235
Рис. 7.10. Сравнение результатов широкополосной развязки с применением мето-
дики WALTZ-16 и с помощью обычно используемой в продающихся приборах
схемы модуляции (прямоугольная волна с разверткой по частоте). Наблюдается
углеродный сигнал бензола при различном отклонении частоты развязки от
частоты сигнала протонов. Напряженность поля в обоих случаях одинакова.
Ширина линии в спектрах WALTZ-16 не превышает 0.3 Гц.
прямоугольная волна
-Э -2 -1 О 12
расстройка, кГц
соответствующее ей увеличение Т2 во временной области может быть
очень полезно в экспериментах по спиновому эху. Наконец, становится
значительно более реальной широкополосная развязка и от других ядер,
например от ЧР при наблюдении 1Н, Ширина полосы эффективной
развязки для WALTZ-16 при использовании поля с амплитудой В2
составляет около 2В2. Мощности порядка 5 кГц легко получаются без
привлечения очень высоких мощностей радиочастотного сигнала, но это,
конечно, зависит от датчика и частоты ядер. На спектрометрах со
средней напряженностью поля (250 МГц) это позволяет, например,
получать спектры 1ЭС в диапазоне 160 м. д. или спектры l9F в диапазоне
40 м. д. с вполне эффективной развязкой и узкими линиями. Если
допускается большее остаточное уширение линий, то можно исполь-
зовать другие последовательности, дающие еще более широкую полосу
развязки (например, GARP-1 [11] имеет полосу эффективной развязки
шириной около 5В2).
7.5. Релаксация и повторение прохождений
7.5.1. Введение
В экспериментах, где требуется усреднение многих прохождений,
связь между двумя параметрами релаксации 7] и Т2, идеальной дли-
тельностью импульса а и частотой повторения прохождений Тг довольно
сложна. Однако часто можно сделать некоторые упрощающие пред-
положения, позволяющие подобрать оптимальные параметры экспери-
мента, при условии, что мы уже знаем величины 1\ и Т2, Измерить на
практике величину Т2 довольно трудно, но на концентрированных
образцах по методике, описанной в разд. 7.5.2, можно приближенно
измерить величину 7), которая даст верхнюю границу Т2. В этом разделе
мы рассмотрим те факторы, которые необходимо учитывать при выборе
236
Глава 7
параметров эксперимента. Заметьте, что нашей основной пелью будет
получение максимальной чувствительности при минимальных ложных
сигналах, а не количественное измерение интенсивностей, для которого
требуется установление равновесных, а ие стационарных условий
(разд. 7.6).
7.5.2. Длительность импульса
и частота повторения прохождений
Во многих экспериментах длительность импульса определяется не
соображениями релаксации, а, например, необходимостью выполнения
определенных типов переноса поляризации (см. гл. 8). В этом случае
частота повторения прохождений-единственный произвольный пара-
метр. Однако в обычных одномерных спектрах мы можем произволь-
ным образом выбирать и длительности импульса и частоту повторения
прохождений, причем оба этих параметра будут оказывать значительное
влияние на результаты эксперимента. Чтобы разобраться в этом, мы
должны рассмотреть два взаимосвязанных явления-поведение z-на-
магниченности и поведение намагниченности в плоскости х — г. Отно-
сительная скорость восстановления z-иамагниченности (по сравнению
с частотой повторения прохождений) будет определять амплитуду ре-
гистрируемого сигнала. Если же мы повторяем импульсы настолько
часто, что поперечная намагниченность к следующему импульсу пол-
ностью не исчезает, то картина значительно усложняется. Для начала
легче вообще исключить из рассмотрения поперечную намагниченность,
т. е. предположить, что Т2 « Tj, и заниматься только z-компонентой. Но,
к сожалению, такое предположение слишком далеко от реальности,
и позже мы будем вынуждены рассмотреть ситуацию, когда опо не
работает.
Воздействие ти/2-импульса на образец, находящийся в состоянии
теплового равновесия, даст иам максимальный сигнал ЯМР, поскольку
при этом вся намагниченность переводится в поперечную плоскость.
Однако при усреднении многих прохождений такая длительность им-
пульса не самый лучший вариант, поскольку z-намагниченность ие
будет каждый раз успевать восстанавливаться в достаточной степени,
если, конечно, промежуток между импульсами 7Г не будет во много раз
превышать 7\. Низкая частота повторения прохождений нс эффективна,
и поэтому такая ситуация редко встречается на практике, за исклю-
чением экспериментов по измерению 7\, где необходимо регистрировать
именно равновесную намагниченность. Гораздо лучше сделать задержку
между прохождениями равной времени выборки, которое определяется
требованиями к разрешению, и подобрать такую длительность им-
пульса «, чтобы максимизировать создающуюся в стационарном со-
стоянии z-иамагииченность. Точная величина а зависит от отклонения
частоты сигнала от резонансной [12], по можно взять некую среднюю
оптимальную величину аЕ (угол Эрнста), определяющуюся выражением
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
237
cos аЕ = е Tr'Ti (7.7)
В условиях 7) и 7Д = А) > Г2 эта длительность импульса
будет иаилучшей. Именно в таких условиях и pei истрируется на прак-
тике большинство протонных спектров (хотя при количественных из-
мерениях мы можем склоняться к выбору более коротких импульсов).
Но при наблюдении гетероядер, где требования к разрешению могут
быть ниже, At короче, и Т2 уменьшено за счет неполной развязки, или
в двумерных экспериментах, где время выборки всегда имеет величину
порядка Г*. такие условия используются редко.
Если иаш эксперимент подразумевает обязательное использование
ти/2-импульсов (или в какой-либо последовательности нам необходимо
полностью устранить z-намагниченность), то, очевидно, приведенная
выше формула не может быть использована для определения опти-
мальной длительности импульса. В этом случае мы должны найти
компромисс между повышением чувствительности за счет увеличения
числа прохождений в заданный промежуток времени и ее понижением за
счет уменьшения z-иамагииченности в стационарном состоянии. В пред-
положении полного затухании поперечной намагниченности в промежут-
ках между прохождениями можно показать, что оптимальная частота
повторения прохождений задается формулой Тг = 1,277\ [В]. В этом
случае мы получим отношение сигиал/шум, составляющее 80% от
аналогичного эксперимента с большей частотой повторения прохожде-
ний и углом Эрнста для импульса, если бы он был возможен. Для
многих экспериментов, включающих устранение z-иамагииченности с
помощью последовательности импульсов, где поперечная намагничен-
ность действительно затухает между прохождениями или где описанные
выше эффекты не влияют на результат, лучшим выбором частоты
повторения прохождений будет 1,37).
Но предполагавшиеся выше условия выполняются далеко не всегда.
Гораздо вероятнее, что наше Т* будет значительно меньше Т2, в свою
очередь Т2 может быть меньше 7), и, будучи ограничены во времени, мы
заинтересованы в таком времени выборки, чтобы получить спектр
с плохим разрешением, но без потери сигналов (т.е. At = Т*). Почти все
двумерные эксперименты и многие одномерные эксперименты по наб-
людению гетероядер производятся в этих условиях. Повторение про-
хождений с Тг < Т2 приводит к появлению стационарного эха [14],
поскольку существующая к моменту следующего импульса поперечная
намагниченность рефокусируется во время прохождения. Анализ такой
ситуации слишком сложен, чтобы приводить его здесь (см. работы [14,
15]). На практике можно получить следующие результаты.
В одномерйых спектрах, полученных в таком режиме, фазы и ин-
тенсивности сигналов оказываются зависящими от отклонения их час-
тоты от резонансной, если, конечно, а не равен углу Эрнста. Однако
такой угол не будет оптимальным с точки зрения чувствительности;
предпочтительнее импульсы большей длительности. В экстремальном
238
Глава 7
случае, когда Т = и Т* « Т2, 7] (например, при плохой однородности
постоянного поля), оптимальная длительность импульса становится
независимой от 7, [15] и составляет около 0,4л. На практике исполь-
зование фазовых циклов типа процедуры CYCLOPS для подавления
ложных сигналов при квадратурном детектировании позволяет в зна-
чительной степени снизить эффекты стационарного эха в одномерных
спектрах. Их можно снизить еще больше с помощью периодических
случайных изменений Тг [14]. В двумерных экспериментах по переносу
когерентности (см. гл. 8 и 9) наличие к началу следующего прохождения
остаточной поперечной намагниченности или других видов когерент-
ности может привести к появлению ложных сигналов, поскольку им-
пульсы этого прохождения произведут дополнительный перенос оста-
точной намагниченности. В этих случаях задержки между прохожде-
ниями должны быть больше, чем это требуется из соображений чувстви-
тельности. Величина Тг порядка 3Tt обеспечит достаточное затухание
всех видов когерентности.
7.5.3. Методы быстрого определения 1\
Все приведенные выше рассуждения подразумевают, что у нас уже
есть какие-то предположения о величинах 7] в нашем образце. Если он
достаточно концентрированный и дает заметный сигнал с одного про-
хождения, то для приближенной оценки 7\ можно использовать метод
инверсии - восстановления:
z-Намагинченность в конце задержки т определяется формулой
Мг = Мо(1 - 2е“1/Т') (7.8)
Интенсивность регистрируемого сигнала проходит через нуль при
= j (7.9)
Если вы выполняете серию экспериментов с различными т, начиная
с очень небольшого значения для подбора параметров коррекции фазы
(заметьте, что на этом этапе сигналы будут отрицательными) и за-
канчивая на спектре с нулевой интенсивностью интересующего сигнала
(рис. 7.11), то 7\ можно получить из формулы
(7.10)
1П 2
Такая оценка будет довольно грубой, ио ее вполне достаточно для выбора
частоты повторения прохождений и для других подобных задач. Наи-
более вероятный источник ошибок состоит в слишком частом повто-
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
239
Рис. 7.11. Определение приближенных величин методом инверсии-восстанов-
ления. Величины т соответствуют нулевой интенсивности помеченных стрелками
сигналов; отвечающие им величины составляют 0,3 с (средний спектр) и 1,0 с
(верхний спектр).
рении эксперимента, в результате чего ие все ядра будут успевать
полностью отрелаксировать, и мы получим заниженные величины для
больших Т\, Реальные образцы обязательно имеют различные величины
7], из которых следует выбрать некоторую компромиссную, поэтому
ошибки в их измерениях скорее всего не будут иметь серьезного
значения.
Однако сложность состоит в том, что оптимизация параметров
регистрации спектра наиболее важна именно для разбавленных образ-
цов, где 1\ определить совсем не просто. Если проводить описанные
выше эксперименты с усреднением, то между прохождениями необхо-
димо делать задержки порядка 57], что сразу делает эксперимент
недопустимо долгим. В такой ситуации нужно уметь интуитивно оце-
нивать возможные величины 7] для соединений и ядер, с которыми вы
работаете. Необходимый для этого опыт легко приобрести, измеряя все
возможные 7] в каждом удобном случае. Конечно, в литературе есть
большие таблицы 7], но они не очень полезны для практических целей,
поскольку содержат данные, полученные в необычных условиях (необыч-
ных с точки зрения повседневной спектроскопии; например, в обез-
гаженных образцах). Величины протонных Т[ в молекулах среднего
размера составляют обычно 1 или 2 с, хотя есть множество отклонений
как в ту, так и в другую сторону. Другие ядра со спином 1/2 могут иметь
чрезвычайно малые скорости релаксации, особенно этим отличаются
четвертичные углероды, а также ядра 29Si и 15N в самом различном
окружении. Для ядер 15N, не связанных с протонами, обычные величины
7] составляют несколько минут даже в иеобезгажеиных образцах.
Квадрупольиые ядра (спин > 1/2) эффективно релаксируют за счет
взаимодействия с градиентами локального электрического поля, их
величины 7] почти всегда попадают в диапазон от микросекунды до,
сотен миллисекунд.
240
Глава 7
7.6. Количественное измерение интенсивностей
7.6.1. Введение
Интегрирование спектров с целью получения информации о пло-
щадях пиков одна из самых обычных процедур протонной спектро-
скопии ЯМР. Ее точность вполне достаточна для определения числа
протонов, дающих вклад в какой-либо пик. Было бы очень заманчиво
использовать эту процедуру для других задач, требующих определения
относительных количеств каких-либо соединений в растворе, например
для экспериментов по кинетике или для количественного анализа смесей.
Но если точность в 10-15%, вполне достаточная для определения числа
протонов, достигается довольно легко, то точность, требующаяся для
других количественных применений (допустим, лучше 1-2%), может
оказаться недостижимой. В этом разделе мы коротко рассмотрим те
причины, которые затрудняют использование спектроскопии ЯМР и
особенно фурье-спектроскопни ЯМР для строгого количественного ана-
лиза. Эта тема подробно излагается в других руководствах по практи-
ческому ЯМР, ио она настолько важна, а ожидания химиков настолько
преувеличены, что, пожалуй, имеет смысл изложить здесь некоторые
наиболее существенные моменты,
7.6.2. Как сделать интенсивность сигналов
пропорциональной числу ядер
В предыдущем разделе, где мы оптимизировали эксперимент по
чувствительности, для повышения скорости регистрации спектра мы
использовали режим, в котором '-намагниченность возвращалась в
некоторое стационарное состояние, отличное от равновесного. Однако
такой режим совершенно не подходит для количественных измерений,
поскольку иитеисивиость сигнала зависит от величины 7j, и, если только
все Tf ие окажутся одинаковыми, измеренные интенсивности будут
содержать ошибки. В принципе, знание величии 7j измеряемых пиков
позволяет скорректировать интенсивности, но достаточно точное из-
мерение Т| сложнее, чем простая регистрация спектра без насыщения,
поэтому такой способ нельзя считать практичным. Однако полезно
приближенно оценить величины 7] по методу, описанному в разд. 7.5,3,
для того чтобы выбрать правильную частоту повторения прохождений
и избежать насыщения.
Чтобы получить представление о том, насколько трудно добиться
возвращения z-намагниченности всех ядер в состояние теплового рав-
новесия, рассмотрим несколько особых случаев. Как уже упоминалось
ранее, протонные составляют 1 или 2 с, ио при выборе Тг мы должны
учесть самое большое 7\ во всей молекуле. Пусть оно оказалось равным
3 с. Если мы используем импульс длительностью а и повторяем его
через каждые Тг с, то в системе установится стационарная "-нам а г-
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
241
ииченность М_, определяющаяся формулой
1 _ e-r/Ti '
— e~TrfTi cos а.
(7.11)
где MQ - равновесная намагниченность. Здесь предполагается, что по-
перечная намагниченность успевает полностью исчезнуть между Про-
хождениями; в количественных экспериментах это обычно реализуется.
Для случая а = тг/2 выражение упрощается до вида
Мй = М0(1-с-т^1) (7.12)
Будем считать, что наша стационарная намагниченность ие должна
отличаться от равновесной более чем на 1% (т. е. должна составлять
0,99Л/о). Это значит, что для 7] = 3 с и ти/2-импульса Тг должно состав-
лять 14 с! Для более коротких импульсов ситуация слегка упрощается:
при использовании тг/4-импульса тем же требованиям удовлетворяет
задержка в 10 с, однако дополнительные прохождения в сэкономленное
время не компенсируют потери чувствительности из-за уменьшения
длительности импульса, поэтому при недостаточной чувствительности
такой режим не подойдет. Разумнее использовать ти/2-импульс и за-
держку как минимум в 57], чтобы ошибки из-за насыщения не пре-
вышали 1%. Регистрация спектра в таком режиме может потребовать
довольно большого времени. Например, обычное 7] ядер 13С составляет
10-30 с, что требует задержки между прохождениями в несколько
минут. В этом случае очень полезно для сокращения 7] использовать
релаксационные реагенты, такие, как ацетилацетоиат хрома(Ш).
Дополнительные проблемы возникают при использовании широко-
полосной развязки от протонов при наблюдении гетероядер. Так как
развязка насыщает протонные переходы, то она может сопровождаться
появлением ЯЭО (гл. 5), который значительно изменяет интенсивности
сигналов независимо от эффектов насыщения. Например, максимальный
ЯЭО на ядре 13С составляет 200% (эта величина выражает усиление
сигнала, т. е. интенсивность сигнала с ЯЭО может быть в 3 раза больше,
чем без него). Эффект такой величины довольно часто реализуется иа
протонированных углеродах, в то время как интенсивность сигналов
четвертичных углеродов может увеличиваться лишь слегка или вовсе не
увеличиваться. В результате, сколько бы усилий мы ни тратили на
предотвращение насыщения, все количественные измерения теряют
смысл.
К счастью, ЯЭО ие возникает моментально при включении де-
каплера, для его создания требуется время, сравнимое с 7] ядра 13С,
поэтому мы можем подавить ЯЭО, выключая декаплер между про-
хождениями на достаточно большое время (эксперимент с обратной
прерываемой развязкой, рис. 7.12). Под словами «достаточно большое
время» подразумевается промежуток, большой по сравнению с ядра
13С. В любом случае мы ие должны повторять импульсы чаще, чем через
57\, а продолжительность времени выборки едва ли составит такую
16 75
242
Глава 7
Включен ....
'н-Эекаплер
Выключен —————
«с релаксация ТС Выборка
Рис. 7.12. Схема эксперимента с обратной прерываемой развязкой.
величину, поэтому использование обратной прерываемой развязки не
вызывает никаких затруднений. Релаксационные реагенты помимо со-
кращения 7] способствуют н подавлению ЯЭО, поэтому при исполь-
зовании широкополосной развязки их применение еще более жела-
тельно. Важно помнить, что при отсутствии ЯЭО и низкой частоте
повторения прохождений, неизбежных в количественных гетероядерных
экспериментах, реальное отношение сигнал/шум может оказаться зна-
чительно ниже величины, ожидавшейся для данной концентрации об-
разца. Это очень осложняет- эксперимент, поскольку высокое отношение
сигнал/шум, как мы вскоре увидим, необходимое условие для точных
количественных измерений.
7.6.3. Регистрация спектра
Обеспечив пропорциональность сигналов относительному количест-
ву создающих их ядер, мы тем самым проделали только одну часть
количественного анализа. Некорректные выполнение оцифровки данных,
производящееся в фурьс-спектрометрах, и выбор областей оцифрован-
ного спектра вносят дополнительные ошибки в величины интенсив-
ностей. Точность интегрирования зависит также н от отношения сиг-
нал/шум, что кажется вполне очевидным, но на практике мы часто об
этом забываем. И наконец, сами величины интегралов часто выглядят
случайными. Этот вопрос подробно обсуждался в связи с измерением
ЯЭО [16], н здесь мы только подытожим основные выводы.
Мы не должны забывать, что обычный сигнал спектра ЯМР до-
вольно узок и может быть представленным всего лишь парой точек.
Величины интегралов обычно вычисляются по правилу трапеции, поэ-
тому при недостаточной оцифровке мы получим неточные величины.
Более точный способ оценки плошади под сигналом состоит в ите-
рационной подгонке теоретической линии к точкам экспериментального
спектра, но мы остановимся только на простом численном интегри-
ровании как на самом распространенном методе. Однако требования
к оцифровке пс так высоки. Если на ширину линии на полувысоте
приходится более трех точек, то возникающие нз-за этого ошибки
составят нс более 1%. Реальная ширина линии в протонном ЯМР может
изначально составлять 0,5 Гц и увеличиваться при оптимальной фильт-
рации до 1,0 Гц, поэтому цифрового разрешения 0,2 Гц на точку должно
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
243
вполне хватать. Эта величина чуть меньше цифрового разрешения
в спектрах с полным диапазоном (обычно 0,3 0,4 Гц), но все же она
легко достижима. Недостаточная оцифровка гораздо чаше используется
при наблюдении гетероядер* поэтому при выполнении количественного
эксперимента необходимо илн увеличить число точек в спектре, или
уширить линии с помощью подходящей взвешивающей функции.
Следующий фактор, который мы должны рассмотреть,— это ширина
диапазона интегрирования. С точки зрения идеальной лоренцевой линии
ответ очень прост: для получения 99% точности следует брать интеграл
в диапазоне 20 ширин линий в обе стороны от сигнала, т. е. как минимум
20 Гц по обе стороны линии для предыдущего примера. Однако на
практике при этом возникает ряд проблем. Каждая линия будет иметь
боковые полосы от вращения и, возможно, 13С-сателлнты, для того
чтобы сравнение различных интегралов имело смысл, они должны или
всегда включаться в диапазон интегрирования, или всегда исключаться
из него. Боковые полосы первого порядка, вероятнее всего, будут
попадать внутрь 20-Гц диапазона, поэтому их имеет смысл включать.
К боковым полосам более высоких порядков и сателлитам следует
подходить более осторожно. Лучше нх, конечно, включить, но если
рядом находятся другие сигналы, крылья или сателлиты которых
попадают в диапазон интегрирования, то цх лучше исключить. Важно
быть в курсе таких проблем н в каждом конкретном случае находить
способ для нх решения.
Процесс оцифровки спектра и способ вычисления интегралов на-
ходятся полностью под нашим контролем, поэтому систематические
ошибки, производимые этими операциями, можно уменьшить до при-
емлемого уровня. Но остаются еще случайные ошибки, обусловленные
шумом в спектре, которые можно уменьшить только тремя спосо-
бами-сделать образец более концентрированным, купить спектрометр
с более сильным магнитом или провести более длительное накопление.
Первые два способа обычно оказываются неприемлемыми, и мы можем
только увеличивать время накопления до получения подходящего от-
ношения сигнал/шум. Однако в этом случае отношение сигнал/шум
растет пропорционально квадратному корню из числа прохождений,
поэтому па этот процесс не имеет смысла тратить более песколькнх
часов. Шумовая ошибка в величинах интегралов зависит не только от
отношения сигнал/шум, но и от способа оцифровки спектра. Выше мы
показали, что правильный выбор некоторых параметров снижает си-
стематические ошибки до 1%. Аналогично можно показать, что из-
меряемая величина интеграла совпадает с его истинным значением
с точностью +1% и вероятностью 99% при отношении сигнал/шум для
интегрируемого пика около 250:1 (определение величины см. в гл. 3).
Такая чувствительность получается без особых усилий при наблюдении
протонов, но для других ядер она может оказаться очень трудно
достижимой. В качестве примера на рис. 7.13 приведен пик с отно-
шением сигнал/шум около 250: 1.
244
Глава 7
Рис. 7.13. Вид резонанс-
ной линии при отношении
сигнал/шум, равном
250:1.
7.6.4. Другие аппаратурные трудности
Систематические ошибки в измерении интегралов могут возникать
по целому ряду других аппаратурных причин. Одна из важнейших-- это
невозможность точной настройки фазы на сигнал поглощения в полном
диапазоне спектра, полученного преобразованием Фурье. Пикн, вклю-
чающие дисперсионную составляющую, будут, очевидно, иметь мень-
шую интенсивность, поскольку интеграл дисперсионного сигнала равен
нулю. Само по себе это явление не вносит большой ошибки, поскольку
снижение интенсивности не настолько велико, чтобы заметно повлиять
на отношение сигнал/шум. Ошибки возникают из-за различия фазовых
сдвигов сигналов, поэтому наиболее важна именно частотно-зависимая
часть коррекции фазы. В спектре с хорошим отношением сигнал/шум
при помощи обычной двухпараметровой коррекции (гл. 4) можно ви-
зуально настроить фазу с точностью до нескольких градусов, но только
при выполнении предположения о линейной зависимости фазы от часто-
ты. Если же это предположение не выполняется, то перед интегри-
рованием фазу каждого сигнала нужно настраивать отдельно. Изме-
нение фазы сигнала на 5° приводит к изменению интеграла на 1%. Прн
очень прецизионных измерениях можно пользоваться специальными
процедурами, позволяющими настроить фазу с высокой точностью [17],
одиако они нужны только на том уровне точности, когда обычное
числовое интегрирование уже не подходит, и требуются итерационные
процедуры обработки полной формы линии.
Еще один источник обычных ошибок интегрнровання-это состояние
базовой линии спектра. По целому ряду аппаратурных причин даже прн
полном отсутствии шума базовая линия спектра (т. е. интенсивность
точек в тех местах, где нет сигналов) не будет не только нулевой, но даже
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
245
Рис. 7.14. Искажение базовой линии довольно часто наблюдается тогда, когда
в спектрах присутствует относительно широкий и интенсивный пик. Левый спектр
был получен при включении приемника в середине задержки между импульсом
и выборкой, правый-при использовании схемы, описанной в тексте. Масштаб
обоих спектров по вертикали одинаковый.
постоянной во всем спектре. Основная причина искривления базовой
линии заключается в том, что полосовой фильтр, включенный между
приемником и АЦП, способен возбуждаться проходящими через него
сигналами ЯМР.
Правильный подбор задержек между импульсом, включением при-
емника н началом оцифровки позволяет в значительной степени снизить
влияние фильтра. Обычно независимо от требований базовой линнн (с
целью минимизации фазовой коррекции первого порядка) задержка
между импульсом и регистрацией первой точки должна быть равна
обратной величине скорости выборки (1/2Ж в обозначениях, принятых
в гл. 2). При этом тип искажений базовой линии зависит от момента
включения приемника. Как было показано [18], включение приемника
после завершения 0,6 задержки придает искажениям базовой линнн вид
постоянного смещения от нуля (рис. 7.14). Установка момента вклю-
чения приемника не всегда производится автоматически, поэтому имеет
смысл проверить ее правильность.
Но, как бы мы ни исправляли базовую линию, она все же оказывает
влияние на величину интегралов, поэтому процедуры интегрирован ня
всегда сопряжены с какой-либо ее коррекцией, которая может быть как
автоматической, так н управляемой оператором [в форме установки
параметров «отклонение» („offset” или „drift”) и «наклон» („bias” или
„slope”)]. В пакеты программного обеспечения многих спектрометров
включаются также более сложные процедуры исправления базовой
липни, которые позволяют оператору вычитать различные функции нз
спектра с целью его сглаживания. По мнению автора, нанлучшне
результаты удается получить с помощью простого четырехчленного
полинома с ручной, а не автоматической настройкой коэффициентов.
Такая процедура предпочтительнее использования коррекции, автома-
тически производящейся прн интегрировании.
И наконец, сравнивая интегралы пиков в различных частях спектра,
мы делаем предположение о линейности всей цепи событий от импульса
до оцифровки данных. Мы считаем, что импульс в одинаковой степени
возбуждает сигналы всего спектрального диапазона (это вполне спра-
ведливо для %/2-импульса при ширине диапазона, значительно меньшей
246
Глава 7
напряженности поля ) и что все каскады приемника одинаково
усиливают разные частоты. Последнее предположение кажется довольно
сомнительным, если учесть, что приемник обычно состоит из пре-
дусилителя, смесителя, усилителя промежуточной частоты, еще одного
смесителя, усилителя звуковой частоты, настраивающегося фильтра
звуковых частот и АЦП. Фильтр звуковых частот, использование кото-
рого необходимо для повышения чувствительности,-самый первый
кандидат на роль создателя нелинейности в спектральном диапазоне.
Вместо теоретического разбора этого вопроса для конкретного спектро-
метра лучше проделать экспериментальный тест, состоящий в регистра-
ции спектров образца с единственной линией, помещая ее в разные места
спектрального окна. Такой эксперимент не эквивалентен регистрации
спектра с фиксированной несущей частотой и набором линий в разных
местах спектрального окна, но он все же позволяет оценить величину
возникающих при этом ошибок.
Мораль этого раздела состоит в том, что в фурье-спектроскопин
ЯМР существует множество факторов, влияющих иа точность коли-
чественных измерений, и, несмотря на то что ошибки каждого из них
можно снизить до 1% или около того, суммарная ошибка все же
остается значительной. Вообще, ко всем измерениям, точность которых
якобы превышает несколько процентов, лучше подходить скептически,
если, конечно, вам не станет ясно, что все описанные выше факторы
были учтены.
7.7. Селективное возбуждение и подавление
7.7.1. Введение
В некоторых обстоятельствах бывает полезно возбудить сигналы
только части спек трального диапазона, оставив остальные нсвозбуж-
деннымн. В зависимости от соотношения частей диапазона, подверг-
шихся и неподвергшихся воздействию, мы можем говорить о селек-
тивном или «скроенном» („tailored”) возбуждении или, наоборот, по-
давлении пиков. При подавлении пиков наиболее частая задача состоит
в устранении одного интенсивного сигнала с целью обойти трудности,
связанные с большим динамическим диапазоном (см. гл. 3). В качестве
примеров использования селективного возбуждения можно назвать
эксперименты по нестационарному ЯЭО и SPI и пропедуры по
выделению небольших частей сложного спектра. Это очень большая
тема, и, чтобы избежать излишнего затягивания, мы рассмотрим не-
сколько методов, использующихся для решения часто встречающихся
задач.
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
247
7.7.2. Подавление пиков
Подавление ников предварительным насыщением. Обзор литературы
по подавлению пиков содержал бы огромный список методов, поскольку
эта область очень популярна среди экспериментаторов. Но, к счастью,
это тот самый редкий случай, когда мы можем однозначно утверждать,
что один из методов -предварительное насыщение -самый лучший.
Однако нужно сразу добавить, что это верно только тогда, когда
подавляемый пик ие участвует в химическом обмене с другими ин-
тересующими нас сигналами. Предварительное насыщение в отсутствие
химического обмена-лучший метод понижения интенсивности сигналов
в том смысле, что оно сочетает в себе возможность значительного
подавления сигнала с минимальным возмущением оставшейся части
спектра. Нас интересуют два критерия: насколько мы можем ослабить
мешающий сигнал и что прн этом произойдет с остальными пиками.
Предварительное насыщение представляет собой облучение подав-
ляемого сигнала слабым радиочастотным полем, достаточно долгое для
устранения разности заселенностей по соответствующему переходу.
Чтобы близкие к подавляемому сигналы не испытывали сдвигов Блоха
Зигерта, непосредственно перед импульсами н выборкой данных облу-
чение выключается (рис. 7.15). Обычно проблемы динамического диапа-
зона возникают в протонных спектрах, н облучение удобно осуществ-
лять с помощью декаплера. Оптимизация эксперимента состоит из
подбора напряженности поля н длительности облучения. Напряжен-
ность поля В2 должна быть такой, чгобы «фактор насыщения» В^Т^
(Вг в герцах) оказался сравнительно большим (например, > 100), а об-
лучение должно быть достаточно длительным, чтобы насыщение успело
установиться (например, в несколько раз больше Т2).
Подавление пиков необходимо чаще всего в водных растворах,
поскольку остаточные сигналы воды велики, а многие вещества биоло-
гического происхождения растворимы только в воде, имеют высокую
молекулярную массу н доступны в небольших количествах, так что
подавляемый пнк это обычно HDO. Его времена 7\ н Т2 (сильно
зависящие, однако, от растворенного вещества) могут составлять 5 и 1 с,
поэтому включения поля В2 напряженностью 20 Гц на 2-3 с должно
быть достаточно. Этн параметры легко подобрать экспериментальным
В ключе н ।
селективное
маемщенив
передатчик
Рис. 7.15. Схема эксперимента по подавлению пиков с помощью предваритель-
ного насыщения.
248
Глава 7
путем и без знания характеристик релаксации, поскольку образец -
очевидно, довольно концентрированный, н предварительные экспери-
менты не потребуют много времени. Задача подбора параметров за-
ключается в снижении напряженности поля для повышения селектив-
ности и сокращении времени облучения для увеличения частоты пов-
торения прохождений при сохранении приемлемого подавления. Хотя
основная цель подавления сигналов-это уменьшение динамического
диапазона, оно требуется только при отношении интенсивностей, боль-
шем чем несколько тысяч к одному (для АЦП с длиной слова 12 бит).
Подавление для улучшения общего вида спектра полезно и при меньших
отношениях интенсивностей (рис. 7.16). Подавление интенсивного пика
может облегчить наблюдение его слабых соседей и снизить искажения
базовой линии.
Прн проведении двумерных экспериментов, как, например, COSY
(гл. 8), насыщающее поле желательно выключать перед выполнением
последовательности (тг/2 — — л/2 — Выборка). Однако это может при-
вести к недостаточному восстановлению намагниченности растворителя
за время В этом случае насыщающее поле следует оставлять до
начала интервала t2, т.е. до выборки данных. Наличие поля В2 во время
“I--'-1--'--!-1--1--Г~Г—'—1---1--1-1--1-'--!---1----1-'--Г"
5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2
м. а.
Рис. 7.16. Подавление сигнала HDO с помощью предварительного насыщения.
Часть нижнего спектра в середине усилена в 8 раз. Пик HDO подавлен на верхнем
спектре.
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
249
промежутка может вызвать в преобразованном спектре сдвиги Бло-
ха-Зигерта только по оси vn что нарушит его симметрию. Например,
упоминавшееся выше поле с амплитудой 20 Гц вызовет заметные сдвиги
сигналов в диапазоне в несколько сотен герц. Таким образом, этот
эффект может создавать серьезные осложнения.
Схема предварительного насыщения перестает работать, когда об-
лучаемый сигнал участвует в химическом обмене с другими интере-
сующими нас ядрами, на которые таким образом будет переноситься
насыщение. Эта проблема часто возникает прн подавлении сигналов
воды в водных растворах. Протоны воды неизбежно будут обмениваться
с такими функциональными группами, как ОН и NH. Кроме того, если
нам нужны именно их сигналы, то мы не можем использовать в качестве
растворителя дейтерированную воду. В результате предварительное
насыщение неприменимо именно там, где оно больше всего нужно.
В такой ситуации, очень часто встречающейся в биологических экспе-
риментах, необходимо применять другие методы, не использующие
облучение сигнала воды.
Подавление пиков «скроенным» возбуждением. Существует множество
схем «скроенного» возбуждения, которые «раскрывают» частотное рас-
пределение возбуждающего импульса таким образом, чтобы исключить
воздействие на некоторую спектральную область. В общем случае они
состоят из замены жесткого неселектнвного импульса группой слабых
импульсов или последовательностью жестких импульсов, производящих
аналогичный эффект (один из видов составных импульсов). Наиболее
распространенный метод «мягкого импульса»-это редфилдовский
2-1-4-«скроенный» импульс [19]. Но при всей эффективности его можно
применять только на спектрометрах, позволяющих производить дли-
тельные слабые импульсы, что часто оказывается недоступным. Кроме
того, прн необходимости значительного подавления пиков он очень
чувствителен к выбору параметров. В последние годы был предложен
целый ряд жестких составных импульсов для достижения того же
эффекта. Этн методы имеют более широкую область применения,
поэтому мы ограничимся их кратким описанием.
Последовательность
АА (^\
I - I -- т - I - I Выборка ...
\Л/х —х
известна под названием «прыжок - возврат» (Jump and return”, J R) [20].
Она вполне понятна и послужила прародителем целого семейства
экспериментов. Если частоту передатчика настроить точно на подав-
ляемый пик, то во время задержки т он будет оставаться постоянным во
вращающейся системе координат, н второй импульс вернет его иа ось z.
Остальные же пики во время задержки т будут прецессировать, и нх
намагниченность частично, а может быть, н полностью, не подвергнется
воздействию второго импульса (рнс. 7.17). Очевидно, что любой сигнал,
успевший за время т совершить прецессию точно на я, 2я... (т. е. линии на
250
Глава 7
Рис. 7.17. Воздействие двух импульсов «прыжок-возврат» на систему из двух
линий, одна из которых находится точно в резонансе, другая смещена по частоте
на 1/4 т.
частотах 1 /2т, 1/т Гц... от опорной), также будет подавлен, а сигналы
в диапазоне от 0 до 1/2т будут возбуждаться в неодинаковой степени
с максимумом на частоте 1/4т. Поэтому т подбирается таким образом,
чтобы поместить интересующий нас спектральный диапазон в область
максимального возбуждения.
Недостатки этого эксперимента, общие для всех экспериментов
такого типа, сразу понятны. Неравное возбуждение частей спектра
делает невозможным количественное сравнение интенсивностей сигна-
лов. Вероятно, это неизбежная плата за возможность не возмущать
сигнал растворителя, Кроме того, ширина полосы «нулевого возму-
щения» передатчика сравнительно невелика. Если сигнал растворителя
широк, или имеет боковые полосы, или частота передатчика непра-
вильно настроена, то подавление растворителя будет неполным.
Мы можем построить последовательность с лучшими характеристи-
ками. Например, можно расширить нулевую полосу передатчика, до-
бавив в последовательность новые импульсы с длительностями, опре-
деленными из коэффициентов биномиального разложения [21]. Ис-
пользуя введенное ранее сокращенное обозначение, мы можем записать
последовательность «прыжок-возврат» как 1Т. Тогда другис предста-
вители этой серии будут выглядеть как 121, 133Т, 14641 и т.д. (подра-
зумевается, что все импульсы разделены задержками т). Прн этом
импульс «1» не обязательно имеет длительность х/2; важно, чтобы
сохранялось правильное соотношение длительностей импульсов в по-
следовательности. Имеет смысл только суммарный угол поворота всех
импульсов, который определяет эффективный угол поворота намагни-
ченности сигналов, находящихся на расстоянии 1/2т от резонанса.
Обычно он выбирается х/2 илн меньше. Таким образом, обычный
«прыжок - возврат» оказывается нетипичным представителем серин.
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
251
поскольку его эффективный угол на указанных частотах составляет
я (т.е, нулевое возбуждение).
Наилучший компромисс между сложностью последовательности и ее
эффективностью-это, наверное, последовательность 1331. При ее вы-
полнении экспериментатор может выбрать суммарный угол я/4 и по-
добрать т исходя нз величины спектрального диапазона. Например, для
наблюдения большинства нормальных протонных спектров области
максимального возбуждения следует поместить на расстоянии ±4 м. д.
от сигнала воды. Тогда па спектрометре с частотой 500 МГц задержка
т будет составлять около 250 мкс. Поскольку длительность импульса
«1» должна составлять 1/8 от тг/4, он может оказаться слишком ко-
ротким для его практического выполнения. Выход состоит в ослаблении
поля В1 с помощью аттенюатора до такой величины, чтобы получить
разумную длительность. Если длительность я/4-нмпульса составляет
4 мкс без аттенюатора, то длительность «1»-нмпульса будет 0,5 мкс.
Для большинства спектрометров лучше всего увеличить ее как минимум
до 2 -3 мкс с помощью аттенюатора в 12 15 дБ, что позволит избежать
нежелательных эффектов от его плохой формы. Некоторые спектро-
метры позволяют автоматически подключать аттенюатор, в остальных
же необходимо использовать внешнее устройство, подключаемое к
выходу передатчика. При использовании последнего способа имейте
в виду, что аттенюатор следует включать между передатчиком и пред-
усилителем, а не между предусилителем и датчиком, поскольку это
приведет к ослаблению наблюдаемых сигналов ЯМР.
Импульс 133Т позволяет получать спектры с понижением интен-
сивности сигнала растворителя в несколько тысяч раз, сравнимым
1 1 • 1 ’ 1 1 1 ' ! • 1 1 1 ' 1 ' f ' 1 ’ 1 > 1
5,4 5,2 5,0 fl В 4,8 fl,fl fl,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2
м.0.
Рис, 7.18. Подавление сигнала растворителя с помощью импульса 1331 (спектр
с неподавленным сигналом приведен на рис, 7,16). Обратите внимание на то, что
единственный сигнал слева от растворителя имеет обратную фазу.
252
Глава 7
с результатами эксперимента с предварительным насыщением. Фаза
спектра сильно зависит от частоты сигналов, но зависимость носит
приблизительно линейный характер, и ее можно скомпенсировать обыч-
ным путем. Кроме того, сигналы, находящиеся по разные стороны от
опорной частоты, имеют противоположные фазы, поэтому, если у вас
нет специальной процедуры фазовой коррекции, одна половина спектра
окажется перевернутой (рис. 7.18).
7.7.3. Селективное возбуждение
Селективное возбуждение мягкими импульсами. Наиболее прямой
способ возбуждения ограниченной спектральной области-это снижение
амплитуды поля Ву. Каким же образом амплитуда поля связана с ши-
риной полосы эффективного возбуждения импульса? Заметьте, мы хо-
тим перейти от зависимости амплитуды радиочастотного поля от
времени к ее зависимости от частоты, т.е. перейти от временного
представления к частотному. При условии линейности спиновой системы
(т.е. прн условии равенства отклика на комбинацию возбуждений сумме
откликов на отдельные возбуждения) это можно сделать, подействовав
преобразованием Фурье на функцию во временной области. Фурье-образ
прямоугольного импульса (прямоугольник - хорошее приближение оги-
бающей импульса, получающегося при включении и последующем
выключении передатчика)-это бесконечная функция (sinx)/x или sincx
(см. гл. 2, рнс. 2.16).
Кривая sinc.v. соответствующая импульсу длительностью т, про-
ходит через нуль каждые 2/т Гц; область равного возбуждения на-
ходится внутри первой пары нулей, допустим, в области ±0,2/т от
центральной частоты. Однако с точки зрения селективности (т.е. от-
сутствия возбуждения прочих сигналов) активную область следует
распространить на большие расстояния, возможно, на ±10/т от цент-
ральной частоты, поскольку заметное возбуждение наблюдается не
только внутри первой пары нулей. Таким образом, чтобы избежать
воздействия на сигналы, не входящие в область 200 Гц, мы должны
использовать импульс длительностью как минимум 50 мс; прн этом
следует выбрать такую напряженность поля, чтобы получить нужный
угол поворота (например, 5 Гц для л/2-импульса). Учтите, что се-
лективность такого эксперимента будет намного ниже величины, ожи-
давшейся на основании измерений только напряженности поля; объяс-
няется это формой импульса. Но прн своей недостаточной селектив-
ности импульс длительностью 50 мс пригоден для создания равно-
мерного возбуждения лишь в узком диапазоне порядка ±4 Гц вокруг
резонансной частоты.
Такне мягкие прямоугольные импульсы, несмотря на их очевидные
недостатки, находят широкое применение. Если они нужны на про-
тонной частоте, например для описанного в гл. 6 эксперимента SP1 или
для инверсии сигналов при измерении нестационарного ЯЭО (гл. 5),
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
253
Рис. 7,19. Зависимость возбуждения, создаваемого одинаковыми прямоугольным
(внизу) и гауссовым (вверху) импульсами, от расстройки. Длительность импуль-
сов 80 мс, расстройка увеличивается с шагом 2,5 Гц.
то в качестве источника облучения можно использовать декаплер:
настройка его иа нужные длительности импульса и напряженности поля
обычно не вызывает затруднений. Если прибор позволяет управлять
амплитудой радиочастотного сигнала во время самого импульса, то
можно получить результаты с большей селективностью за счет выбора
подходящей формы импульса. Придав огибающей импульса гауссову
форму, мы устраняем боковые лепестки, присущие частотной харак-
теристике прямоугольного импульса, и обеспечиваем быстрый и плав-
ный спад возбуждения при удалении частоты от резонанса [22]. Это
очень похоже на устранение «внглей» с помощью аподизации усеченных
данных (гл. 2). На рис. 7.19 сравниваются зависимости эффективности
возбуждения от отклонения от резонанса для прямоугольного и гауссова
импульсов эквивалентной длительности.
Селективное возбуждение с помощью DANTE. Почти все спектро-
метры имеют стандартный источник облучения с настраиваемой мощ-
ностью, который может работать на частоте протонов в течение
большого промежутка времени (декаплер). Однако такой же источник,
работающий на частоте других ядер, встречается гораздо реже. Конечно,
мы можем попытаться использовать для этого широкополосный пере-
датчик, понизив его выходную мощность, но конструкция импульсных
усилителей часто не позволяет нм работать дольше нескольких сотен
микросекунд, и включение на более длительное время приводит к вы-
ходу из строя. Поэтому прн необходимости создания селективного
импульса на частоте гетероядра (например, при выполнении переноса
поляризации с 31Р) необходимо пользоваться другими методами. Это,
например, последовательность DANTE (Delays Alternating with Nutations
for Tailored Excitation-чередование задержек и нутаций для «скроенно-
го» возбуждения) [23], состоящая из т жестких импульсов, имеющих
254
Глава 7
очень малый угол поворота, постоянную фазу и одинаковые интервалы
между собой:
а — т — а — г — а — т — а ~ т — а — т — ...
Действие этой последовательности на спиновую систему можно про-
анализировать аналогично прямоугольному импульсу, выполнив преоб-
разование Фурье всей цепи илн рассмотрев ее с точки зрения векторной
модели. В последнем случае сигнал, находящийся точно на частоте
передатчика, будет постоянным во вращающейся системе координат
в интервале т. Малые импульсы будут суммироваться, и общий угол
поворота всей последовательности составит та. Остальные резонансы
в промежутках между импульсами будут препессировать и, таким
образом, окажутся менее возбужденными, если, конечно, не будут
успевать сделать целое число поворотов. Следовательно, частотная
характеристика возбуждения будет иметь лепестки через каждые 1/т Гц;
1 ! t ' Л I ’ f I I I '
34 32 ЗС 23 26 24 22 20 18 16
м. 3.
Рис, 7.20. Спектр :зС холеез ерилацетата без развязки от протонов очень сложен
даже на частоте 125 МГц (средний спектр); использование описанной в тексте
последовательности DANTF, позволяет извлекать из нею отдельные мульти-
плеты (два верхних спектра).
Дополнительные сведения об экспериментальных методах
255
более детальный анализ показывает, что каждый лепесток имеет форму
функции sincx.
Селективность облучения внутри каждого лепестка определяется
полной длительностью последовательности тт; расстояние между ну-
лями на кривой sine х составляет приблизительно 2/тт. Следовательно,
нужно выбирать такую величину а, чтобы опа составляла незначи-
тельную часть от требуемой длительности импульса, а тт оставался
малым в сравнении с временем релаксации. Короткие импульсы не очень
удобны, избежать их использования можно с помошью деления выход-
ной мощности передатчика. Величина т подбирается так, чтобы лепестки
частотной характеристики не попали па те пики, которые не следует
возбуждать. Частота передатчика настраивается на интересующий нас
диапазон.
Последовательность DANTE можно использовать во всех экспери-
ментах, где требуется селективное возбуждение. На рис. 7.20 приведен
пример разделения с сс помощью сложных спектров 13С на отдельные
сигналы. Во время генерирования DANTE включается широкополосная
развязка от протонов, тит выбраны таким образом, чтобы по-
следовательность в сумме была эквивалентна ти/2-импульсу. Во время
выборки декаплер выключается, что позволяет регистрировать мульти-
плетную структуру сигналов.
7.8. Несколько тестов для спектрометра
Описанные в гл, 3 тесты на чувствительность, форму линии и раз-
решение служат основными критериями качества спектрометра, и имен-
но на ннх тратится значительная часть времени при покупке нового
прибора. Однако круг различных производителей спектрометров не так
широк. Даже если вам покажется, ч i о тот или иной прибор имеет самые
хорошие характеристики, то в более реальных условиях окажется, что
между ним н остальными приборами нет существенных различий. Но
затраты на покупку современного спектрометра ЯМР довольно велики
даже для крупных промышленных концернов, поэтому имеет смысл
упомянуть несколько менее очевидных тестов, позволяющих более
детально оценить качество прибора. Эти тесты нельзя назвать стан-
дартными, поэтому при сравнении спектрометров вы должны точно
определить свои намерения и убедиться, что тесты на разных приборах
производятся в строго одинаковых условиях.
Не все из этих тестов предназначены для количественного опре-
деления характеристик спектрометра. Оценить количественно такие
важные показатели, как, например, кратковременную стабильность от-
ношения поле/частота нли однородноеть ноля Ву, может быть очень
непросто, в то время как качественное сравнение сделать довольно
легко. Оценка других качеств прибора, таких, как стиль программного
обеспечения,- дело чисто субъективное, но не менее важное. При покупке
прибора труднее всего решить, какие же задачи вы собираетесь решать
256
Глава 7
с его помощью. В университетах обычный ответ на этот вопрос-«все»,
но этот ответ не самый лучший. В промышленности круг задач может
быть гораздо более определенным.
Относительная важность различных качеств спектрометра опреде-
ляется предполагаемыми задачами. Например, если вы собираетесь
регистрировать только рутинные протонные спектры, то все обычные
тесты и все тесты из этой главы можно не проводить. Приборы всех
четырех основных производителей (фирмы JEOL, Bruker, Ge NMR
Instruments н Varian) имеют вполне пригодные для этой цели ха-
рактеристики. Лучше обратите внимание на пакеты программного
обеспечения: насколько быстро, легко и удобно с ними работать?
Сможет ли неспециалист овладеть нми за час нли два? В какой степени
возможна автоматизация операций? Отвечает ли требованиям доку-
ментация? (часто основной недостаток состоит именно в этом). Это
наиболее важные вопросы, на которые вы должны получить ответ.
Однако их очень трудно или даже невозможно выяснить во время
короткой демонстрации спектрометра. Лучше всего обсудить их со
сторонними пользователями приборов. Конечно, все они будут жа-
ловаться н критиковать производителен; но, возможно, пользователи
одних приборов будут настроены заметно критичнее, чем пользователи
других.
Если ваш прибор будет использоваться в нерутинном режиме, где
потребуется предельная чувствительность, разрешение илн еще что-
ннбудь, то вам необходим совершенно иной подход к его оценке.
Программное обеспечение сохраняет всю свою значимость, но некото-
рое неудобство работы с ннм вполне можно будет допустить. Ключевым
его достоинством становится гибкость. Для многих экспериментов из
оставшейся части этой книги необходимо надежно контролировать
импульсную последовательность в микросекундном масштабе времени.
Для двумерных экспериментов важно наличие мощных вычислительных
средств, позволяющих максимально свободно проводить обработку
данных. К сожалению, большинство современных спектрометров ие
обладает этими свойствами в достаточной мере, н фирмы продолжа-
ют совершенствовать программное обеспечение своих приборов;
поэтому такие свойства необходимо тщательно анализировать при
покупке.
Даже если программные средства прибора обеспечивают превос-
ходное управление экспериментом, то проверьте, дают ли конкретные
эксперименты требующиеся результаты. Такие характеристики прибора,
как стабильность, постоянство отношения поле/частота, диапазон и
точность фазовых сдвигов, диапазон и воспроизводимость длительности
импульсов, форма импульса, однородность поля не так легко
оттестировать, одиако они могут полностью испортить результаты
многоимпульсных экспериментов. Приводящиеся далее тесты позво-
ляют получить хотя бы качественную информацию о некоторых нз
них.
Дополнительные сведения об экспериментальных методах 257
Измерьте длительность я-нмпульса и затем повторите измерения
с другими фазами импульса (их должно быть как минимум 4, а можно
и больше): полученные величины ие должны различаться. Проана-
лизируйте форму остаточного сигнала тг-импульса, она характеризует
однородность поля В{. Проверьте, точно ли кратным длительностям
я-импульса (т. е. 2я-, Зя-импульсам и т. д.) соответствуют точки нулевой
интенсивности сигналов. Если это не так, значит, передатчик плохой и не
может генерировать длительные импульсы. Если последний тест про-
шел, то сравните длительность я-импульса с его длительностью при
понижении выходной мощности передатчика на 12 дБ. Она должна
увеличиться ровно в 4 раза; другие соотношения могут свидетельство-
вать о плохой форме импульса (но убедитесь, что делитель точно
откалиброван).
Чувствительный тест сразу на все характеристики спектрометра-это
разностная спектроскопия. Попробуйте зарегистрировать два прохожде-
ния одного и того же спектра, содержащего единственную линию,
и вычтите их друг из друга (убедитесь, что задержка между про-
хождениями обеспечивает полную релаксацию). Амплитуда остаточного
пика будет определяться кратковременной стабильностью (см. гл. 5).
Проделайте это несколько раз, чтобы получить диапазон возможных
величин. Выполните этот эксперимент, поменяв фазу передатчика и за-
менив вычитание сложением. Должен получиться тот же результат;
изменившийся результат свидетельствует о плохой отработке фазовых
сдвигов.
Отличные от 180° фазовые сдвиги проверить сложнее; на спектро-
метрах недавнего выпуска, позволяющих создавать небольшие фазовые
сдвиги, попробуйте провести с различными ср эксперимент:
/я\ /я\
1 — 1 1 — 1 Выборка ...
\2/х\2/ф
Амплитуда сигнала должна быть пропорциональна sin ср. Фазовые сдви-
ги в канале декаплера можно проверить с помощью модифицированного
варианта калибровки длительности импульса на «других ядрах»
(разд. 7.2.3):
л 1
13С: - — — — Выборка ...
. (п\ /л\
Н: - -
\2Д \2/q>
Прн точной калибровке длительности протонного я/2-импульса ин-
тенсивность компонент дублета 13С должна быть пропорциональна
cos ср. Дальнейшую проверку фазовых сдвигов н общей стабильности
спектрометра можно проделать с помощью эксперимента по много-
квантовой фильтрации максимально возможного порядка (не обяза-
17 75
258
Глава 7
тельно двумерного, см. гл. 8, разд. 8.4.3 и последнюю часть разд. 8.5.1).
Проанализируйте степень подавления нежелательных пиков и степень
возбуждения желательных.
Двумерная спектроскопия (гл. 8-10) в общем случае очень чувстви-
тельна к дефектам спектрометра. Выполните эксперимент COSY (гл. 8)
на концентрированном образце, где обычный шум пренебрежимо мал.
Проанализируйте величины «шума по /р> (гл. 8, разд. 8.3.6), которые
очень чувствительны к качеству спектрометра, но убедитесь, что все
условия проведения эксперимента (ширины спектров, углы импульсов,
задержки, режимы обработки данных и функции окна) одинаковы на
сравниваемых спектрометрах и спектры не «симметризованы»
(разд. 8.3.6). Особенно чувствительна к прибору ./-спектроскопия
(гл. 10); зарегистрируйте J-спектр без использования EXORCYCLE и
посмотрите, на что похожи ложные пики [24, 25].
Попробуйте, наконец, провести эксперименты того типа, которые вы
собираетесь выполнить на этом приборе. Сначала испытайте простые
образцы, свойства которых вам уже известны, а затем сложные, которые
вы еще никогда не исследовали. Попробуйте очень разбавленные и очень
концентрированные образцы (не удивляйтесь, дефекты электроники
приемника могут проявиться как раз на интенсивных сигналах). По-
смотрите, нет ли в спектре выбросов на частоте передатчика, других
выбросов, квадратурных пиков и т.д. Получите спектр без использо-
вания фазового цикла CYCLOPS и посмотрите, насколько он ухуд-
шился. Попробуйте зарегистрировать спектр одновременно с выпол-
нением серьезной вычислительной задачи (например, двумерного пре-
образования Фурье); часто компьютер или система его дисков могут
наводить помехи в радиочастотном канале спектрометра.
Литература
1. Gunther И., Wesener J.R., J. Mag. Res., 62, 158 (1985).
1. Thomas D. M., Bendall M. R,, Pegg D. T., Doddrell D. M., Field J.t J. Mag. Res., 42,
298 (1981).
3. Freeman R., Kempsell S. P., Levitt M.H., J. Mag. Res,, 38, 453—479 (1980).
4. Levitt M.H., Ernst RR, J. Mag. Res., 55, 247-254 (1983).
5. Shako A. J., Freeman R., J. Mag. Res., 55, 487-493 (1983).
6. Shako A. J., Bauer C.J.. Freeman R., J. Mag. Res., 60, 479-485 (1984).
7. Levitt M.H., Freeman R., J. Mag. Res., 43, 65 (1981).
8. Levitt M.H., Ernst R.R., MoL Phys., 50, 1109-1124 (1983).
9. Waugh J.S., J. Mag. Res., 50, 30-49 (1982).
10. Shako A. J., Keeler J., Freeman /?., J. Mag. Res,, 53, 313-340 (1983).
11. Shako A,J„ Barker P.B., Freeman R., J. Mag. Res,, 64, 547-552 (1985).
12. Ernst R. R.r Anderson W. A., Rev. Sei. Inst, 37, 93-102 (1966). Это первая работа,
предлагающая использовать метод Фурье в спектроскопии ЯМР.
13. Waugh J.S, J. Mol. Spec., 35, 298-305 (1970).
14. Freeman R., Hill H.D. W, J. Mag. Res., 4, 366-383 (1971).
15. Waldstein P., Wallace WE., Rev. Sci. Inst., 42, 437 440 (1971).
16. Weiss G. H., Ferretti J. A., J. Mag. Res., 55, 397-407 (1983).
17. Herring F.G., Phillips P.S., J. Mag. Res., 59, 489-496 (1984) и ссылки в этой
работе.
Дополнительные сведения об экспериментальных методах 259
18. Houll D.L. Chen C.-N., Eden H.r Eden M., J. Mag. Res., 51, 110-117 (1983).
19. Redfield A.G., in: NMR-Basic Principles and Progress (Diehl P., Fluck E., Kos-
feld R., eds.), 13, 137-152, Springer-Verlag, 1976.
20. Plateau P.. Gueron M., J. Amer. Chem. Soc, 104, 7310-7311 (1982).
21. Ноге P.J., J. Mag. Res, 55, 283-300 (1983).
22. Bauer C. J., Freeman R., Frenkiel T. Keeler J., ShakaA.J., J. Mag. Res, 58,
442 457 (1984).
23. Morris G,A., Freeman R., J. Mag. Res., 29, 433-462 (1978).
24. Badenhausen G., Freeman R., Niedermayer /?, Turner D. L., J. Mag. Res, 26,
133-164 (1977).
25. Badenhausen G., Freeman R., Turner D.L., J. Mag. Res, 27, 511 (1977).
Глава 8
Двумерная корреляционная
спектроскопия ЯМР. Корреляция
за счет гомоядерного
взаимодействия
8.1. Введение
С помощью какого из двух основных типов экспериментов рас-
сматривать предмет двумерной спектроскопии? Мне было трудно выб-
ра гь между J-разрешеиной спектроскопией и корреляционной. /-Спект-
ры, описанные в гл. 10, могут быть поняты до конца (для систем первого
порядка) при использовании нашей графической векторной модели,
и с этой точки зрения начать можно было бы с ннх. Одиако эти
эксперименты достаточно ограниченны по числу приложений, и у не-
искушенного читателя может возникнуть ощущение того, что дости-
жение даже не очень значительных результатов с использованием этой
техники потребует больших усилий. В то же время гомоядерные кор-
реляционные спектры различных типов настолько полезны, что, оче-
видно, не придется разочароваться, если начать именно с них, С этой
точки зрения они, по-видимому, будут полезны в качестве вводных
примеров. К сожалению, нам, возможно, не удастся до конца постичь
всей глубины этих экспериментов без анализа поведения макроско-
пической намагниченности. Прн этом возникает опасность напустить
туману н окончательно запутать вопрос о том, что же все-таки про-
исходит в двумерных экспериментах. Как видно из названия этой главы,
я в конце концов сделал выбор в пользу корреляционной спектроскопии,
надеясь на то, что возникающая при этом нестрог ость описания экспе-
риментов в достаточной мере компенсируется тем, что уже в самое
ближайшее время нам удастся познакомиться с реальными химическими
приложениями.
Имея это в виду, я начинаю с объяснения меченых частот, которые
являются основой двумерных ЯМР-экспернментов. До конца это можно
осознать с привлечением понятия макроскопической намагниченности.
В дальнейшем я попрошу вас принять как факт, без перепроверки,
интересный результат, проявляющийся при действии второго радио-
частотного импульса на систему, которая к этому моменту уже имеет
определенную величину поперечной намагниченности. Это даст нам
возможность непосредственно приступить к рассмотрению прикладных
аспектов. В гл. 6 мы уже сталкивались с частными проявлениями этого
явления, поэтому нам не составит большого труда сделать здесь
некоторое обобщение. Несколько позже мы опять вернемся к вопросу
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
261
о том, что происходит во время второго импульса и постараемся
прочувствовать концепцию когерентности и переноса когерентности.
Однако до этого нам предстоит обсудить множество технических вопро-
сов, связанных с концепцией двумерного эксперимента. Части этого
раздела будут иметь аналогии с заключительными частями разд. 4.3
гл. 4. Ознакомление с некоторыми разделами настоящей главы можно
перенести на более позднее время, когда понимание этого материала
окажется необходимым. В этой главе технические детали обсуждаются
подробнее, чем в остальных главах, потому что большая часть из них
имеет общий характер для всех двумерных экспериментов. Основной
эксперимент, на котором построено содержание этой главы, имеет
множество разновидностей. В следующем разделе приводится обсужде-
ние тех из ннх, которые, на мой взгляд, наиболее полезны. В заключение
рассматриваются еще два корреляционных эксперимента, которые дают
несколько иную информацию.
8.2. Меченые частоты
Хотелось бы, чтобы вы представили себе следующий эксперимент.
На первый взгляд он может показаться не очень серьезным, но на самом
деле иллюстрирует основу техники, имеющей чрезвычайно важное
значение для спектроскопии ЯМР. Возьмем образец, спектр ЯМР
которого характеризуется только одной резонансной линией, например
раствор хлороформа в дейтерированном растворителе прн наблюдении
протонов. Линия имеет химический сдвиг v. Проследим за превра-
щением этой линии во вращающейся системе координат после (я/2)х-им-
пульса, так же как мы делали много раз раньше. Для простоты будем
полностью пренебрегать эффектами продольной релаксации, но учи-
тывать поперечную релаксацию, которая определяет форму липин сиг-
нала ЯМР. На рис. 8,1 изображена линия, которая в течение опре-
деленного времени прецессировала на частоте v (в Гц). Это время
обозначим через исходя из соображений, которые станут понятными
в дальнейшем (эту переменную не следует путать с -временем
продольной релаксации). В конце интервала tr прикладывается второй
(тг/2)*-импульс и производится регистрация сигнала ЯМР в форме
сигнала ССИ. Что же при этом происходит?
Лучший способ ответить на этот вопрос-проследить за проекциями
Рис. 8.1. Амплитудная модуляция сигнала ЯМР может быть следствием варьи-
рования интервала между двумя импульсами,
262
Глава 8
компонент намагниченности на осчх х и у. В течение интервала времени
вектор намагниченности совершил прецессию на угол 27rv/j. Если длина
вектора равна М, то из простых тригонометрических соотношений (см.
рис. 8.1) следует, что его компонента вдоль оси у равна Л/созЗтгу/^
а компонента вдоль оси х равна М sin 2xv?x . Величина М в свою очередь
связана с начальной намагниченностью Л/о соотношением
Л* = Л*ое~,1/Г2 (8.1)
которое следует из определения Т2 (правильнее было бы писать TJ,
однако я опускаю индекс «*» из соображений удобства набора текста).
Второй импульс, обозначенный (я/2)Л, поворачивает у-компоиенту
намагниченности дополнительно на угол 90”, переводя ее по направ-
лению оси z, в то время как х-компонента остается без изменения. Таким
образом, величина намагниченности, определяющая амплитуду сигнала
ЯМР, составит Afsin2nv/1. Прн этом наблюдается совершенно нор-
мальный спектр, за исключением того, что он имеет определенное
отклонение по амплитуде.
Теперь представим себе, что произойдет, если мы проведем серию
экспериментов с различными значениями ?lf например начинающимися
с нуля и монотонно возрастающими до нескольких секунд, т. е. проведем
дискретную выборку интервалов Если мы возьмем данные нз каждого
эксперимента н преобразуем их в спектр, то для каждого эксперимента
получим пик, причем амплитуда пиков будет изменяться как функция .
Действительно, она будет синусоидально осциллировать с частотой v,
и величина поперечной намагниченности в конце интервала составит
М sin 2nvfx. Рис. 8.2 точно иллюстрирует этот эксперимент или по
крайней мере несколько начальных значений (на нем изображены
протонные спектры хлороформа на частоте 500 МГц!). В этом экспе-
рименте v составляет 80 Гц и интервал между значениями принят
равным 1 мс.
Помия о том, что данные спектра ЯМР состоят из дискретного
набора чисел, представим себе, что будем выбирать по одной точке из
каждого спектра, причем выбранная точка должна соответствовать
максимуму сигнала хлороформа. Если предположить, что система
ЯМР-стабилизации нашего спектрометра работает нормально, это всег-
да будет одна и та же точка. Что же мы получим, записав эти точки как
функцию Просто график амплитуды сигнала, которая осциллирует
с частотой v н затухает экспоненциально с постоянной времени Т2, как
это изображено на рис. 8.3. Я надеюсь, вы сразу увидите, что этот
график выглядит как некий ССИ. Конечно же, так оно и есть-уму
синусоидальная осцилляция, экспоненциально затухающая, и мы оциф-
ровали ее, выбирая значения с некоторым шагом. Действительно, это
ССИ, но не существующий в «реальном времени» как сигнал, который
мы регистрируем в обычном ЯМР-эксперименте. Он генерируется точка
за точкой как функция переменной ?!. Чтобы подчеркнуть это, мы
назовем такой график интерферограммой.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
263
Рис. 8.2. Результат использования последовательности, изображенной на рис. 8.1,
с различными
Рис. 8.3. Изменение амплитуды сигнала в спектре, представленном на рис. 8.2.
Приведено сечение параллельно оси секущая плоскость проходит через
вершины пиков.
264
Глава 8
Сейчас мы отчетливо представляем себе, что если провести фурье-
преобразование такого набора данных, то получится частотный спектр,
содержащий лоренцеву линию с шириной 1/лТ2 и частотой v. Другими
словами, то же самое мы уже получили из «обычного» ССИ, состав-
ляющего основу этого эксперимента. Большей общности, чем при
преобразовании только точек, соответствующих максимумам сигнала
хлороформа, мы добьемся при фурье-преобразовании каждого столбца
точек, взятого из полного набора ССИ. Это равнозначно двумерной
обработке нашего набора данных, т. е. вместо функции одной временной
переменной, как в случае простого ССИ, это будет функция двух
переменных f(tlf t2). Первый временной параметр соответствует
интервалу между двумя импульсами (это первое время в эксперименте,
следовательно, tj, а второй параметр является «реальным временем»,
в течение которого производится выборка данных. Двумерное преоб-
разование Фурье переводит наши данные в двумерный спектр частот
f(vi> v2), и сейчас нам следует проработать вопрос о том, какую
смысловую нагрузку несут переменные v, и v2.
Очевидно, что v2 является мерой химического сдвига v сигнала и, как
мне кажется, легко видеть, что переменная vt также определяет хими-
ческий сдвиг сигнала v, поскольку полученная нами интерферограмма
имеет осцилляции с частотой у, Итак, мы получили квадратный спектр
с двумя ортогональными осями и с сигналом, имеющим в частотном
представлении максимум в точке с координатами (v, v), т. е. на диаго-
нали (рис. 8.4). Сечением этого спектра через его центр в направлении
осей Vi или v2 является лоренцева линия с шириной 1/лТ2. Это наш
первый двумерный ЯМР-эксперимент. Я могу согласиться, что он не
слишком впечатляющий, поскольку не содержит никакой дополнитель-
ной информации по сравнению с обычным спектром. Однако ои имеет
все необходимые элементы прототипа двумерного эксперимента
(рис. 8.5), в котором сигнал модулируется как функция переменной
и затем регистрируется как функция t2. Все двумерные эксперименты
Рис. 8.4. Результат преобразования по второй координате-двумерный сигнал
поглощения. Альтернативное контурное представление (справа) обсуждается
ниже в тексте.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР 26Б
нвчта ! .1 II.
Рис, 8.5. «Прототип» двумерного эксперимента.
осуществляются таким образом. Я хочу особо выделить эту мысль,
чтобы обратить внимание на то, что идея, лежащая в основе двумерной
спектроскопии, на самом деле исключительно проста. Композиция
некоторого «нечто» и некоторого «нечто другое» на рис. 8.5 может быть
сложным делом, но концепция модуляции намагниченности перед ее
регистрацией проста.
Причина, по которой выбранный нами эксперимент выглядит не-
достаточно впечатляюще, заключается в том, что намагниченность
претерпевает одинаковую модуляцию как в течение времени так
н в течение времени t2 (прецессия на собственной ларморовой частоте).
Более интересны такие эксперименты, в которых в обоих временных
интервалах происходят различные процессы. В общем мы стараемся
проводить двумерные эксперименты таким образом, чтобы намагни-
ченность, которая совершала эволюцию с какой-то частотой за время
(т. е. была «помечена» этой частотой), прецессировала с другой (отлич-
ной от первой) частотой в течение времени t2. Последняя частота
в экспериментах всех типов будет описывать и химические сдвиги,
и константы спин-спинового взаимодействия. Это приводит к сигналам
прн (vt, v2) с различающимися v2 и v2, т. е. к недиагональным нли
кросс-пикам. Для того чтобы понять, как интерпретировать экспери-
мент, нам нужно знать, что представляют собой частотные оси (в нашем
примере онн обе являются протонными химическими сдвигами, но
могут быть и сдвигами разных ядер или константами спин-спинового
взаимодействия и химическими сдвигами и т. д.). Важно также знать, как
связаны намагниченности в период и t2, или, другими словами, что
приводит к появлению кросс-пнков.
Когда мы проводим двумерный эксперимент, нам необходимо за-
дать диапазон изменения и величину приращения между отдельными
значениями (инкремент) tr. Более подробно этот вопрос мы обсудим
ниже, но сейчас я хотел бы отметить, что оцифровка интервалов
полностью аналогична оцифровке обычных ССИ. Таким образом мы
используем понятие ширины спектральной полосы (которая определяет-
ся диапазоном ожидаемых частотных модуляций в течение времени гу)
для того, чтобы определить инкремент в соответствии с критерием
Найквиста. Мы также используем понятие цифрового разрешения для
определения общего объема выборки данных по этой временной коор-
динате. Прн этом мы сразу сталкиваемся с серьезными практическими
проблемами. Вспомним пример из гл. 2, в котором мы оцифровывали
протонный спектр с рабочей частотой 500 МГц, занимающий область
химических сдвигов Юм.д. Для того чтобы получить цифровое раз-
решение 0,2 Гц на точку, необходимо использовать время выборки
266
Г лава 8
данных 5 с и объем памяти, достаточный для хранения 50000 действи-
тельных чисел (или 25000 комплексных чисел при использовании квад-
ратурного детектирования). Все эти параметры являются практически
достижимыми для спектрометров, оснащенных современными систе-
мами обработки данных. Если мы попытаемся провести описанный
выше двумерный эксперимент с использованием такой же полосы частот
и такого же цифрового разрешения в обоих измерениях, то для этого
потребуется 50 000 слов для представления переменной 12 и дважды по
25 000 слов для , что в целом составит 2 500 000 000 слов! Общее время
такого эксперимента можно оценить следующим образом: это 7,5 с
(средняя величина плюс время выборки данных по t2), повторенное
25 000 раз, и все это помножено на 8 (из-за технических ограничений это,
по-видимому, минимальное число прохождений для каждого значения
г,, как мы увидим в дальнейшем). Это составит 17 суток! Очевидно, нам
необходимо уточнить наши представления об оцифровке спектров, когда
мы приступаем к двумерным ЯМР-экспериментам.
Чтобы не показалось, что двумерная спектроскопия несет с собой
только одни бесконечные технические проблемы, мы сейчас перейдем
к рассмотрению таких ситуаций, когда этн эксперименты оказываются
в высшей степени информативными. Действительно, определенные труд-
ности возникают при обработке двумерных массивов данных. Накопив
определенный запас энергии и энтузиазма, мы вернемся к рассмотрению
этих проблем.
8.3. Эксперимент Джинера
8.3.1. Введение
Та последовательность, которую мы сейчас изучали, фактически
являющаяся первым двумерным ЯМР-экспериментом, предложена Джи-
нером в 1971 г. Ее полезность станет очевидной, когда мы рассмотрим,
что произойдет при действии второго импульса на систему, которая
имеет гомоядерную спин-спиновую связь. Однако перед тем, как перейти
к этому вопросу, я хочу обратиться к эксперименту, который, хотя
и является в высшей степени непрактичным, очевидно, мог бы оказаться
полезным, если бы его можно было бы реализовать. В дальнейшем
станет ясно, что основные недостатки этого вымышленного экспери-
мента не характерны для эксперимента Джинера, в то время как
информационная емкость каждого из них сравнима.
8.3.2. Двумерный эксперимент.
Непрерывная развертка-преобразование Фурье
Гомоядерная развязка является старым и очень информативным
экспериментом. Как известно, она позволяет определить, какие группы
ядер в молекуле связаны спин-спиновым взаимодействием, что в свою
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
267
очередь часто подтверждает или опровергает гипотезы о ее строении.
Подтверждение спин-спинового взаимодействия с помощью этого экспе-
римента принято считать более «солидным» доказательством типа
структуры, чем простое рассмотрение данных по химическим сдвигам
и константам спин-спинового взаимодействия, причем мнение это до-
статочно распространено. Оно основано на нашей уверенности в том,
что, например, в протонных спектрах большие константы будут редко
наблюдаться между ядрами, разделенными более чем тремя связями.
В сравнении с этим информация, полученная из величин химических
сдвигов, может оказаться в существенной степени неоднозначной, по-
скольку сдвиги подвержены влиянию большого числа факторов, и мы не
знаем точно их действие. Поэтому опасно опираться только на данные
по химическим сдвигам при определении структуры. Назначение этой
книги состоит в том, чтобы в ряде случаев нам избавиться от необ-
ходимости так поступать.
При определении характера спии-спиновой связи с помощью гомо-
ядерной развязки возникают некоторые проблемы. Если мы имеем дело
со сложным спектром, то может оказаться неочевидным, облучение
каких сигналов будет наиболее информативным. При этом мы можем
потратить массу времени на проведение тех экспериментов, которые
окажутся совершенно неинформативными. Даже если мы знаем, какие
сигналы следует облучить, не всегда в спектре, имеющем сильное
перекрывание сигналов, можно провести облучение с необходимой
селективностью. Из-за сложного характера мультиплетности результат
развязки может быть замаскированным и не замеченным. Для решения
последней проблемы предложен метод разностной развязки, но сам этот
метод имеет ряд недостатков, в особенности нз-за эффектов, возни-
кающих при сдвигах Блоха-Зигерта.
Тот эксперимент со спиновой развязкой, который мы хотели бы
провести, выглядит следующим образом. Пусть спектрометр в авто-
матическом режиме делает дискретную развертку частоты развязки при
прохождении через интересующую нас область частот. Пусть для каж-
дого значения частоты развязка осуществляется абсолютно селективно,
а результат ее однозначно проявляется в какой-то области спектра, ^се
эти эксперименты соберем в одном месте, для того чтобы могла быть
непосредственно отображена полная структура спиновой связи. Пусть
эксперимент проходит быстро и с высокой чувствительностью.
На практике к этому эксперименту наиболее близко можно было бы
подойти, по-видимому, реализовав серию экспериментов с разностной
развязкой (это был бы эксперимент INDOR с фурье-преобразованием)
при очень низком уровне мощности декаплера, что и обеспечит высокую
селективность. Не вдаваясь в детали, положим, что отклики проявляют-
ся для связанных спии-спиновым взаимодействием протонов, причем
в тех случаях, когда облучению подвергаются их партнеры по спиновой
связи. Было бы непросто изобразить такую серию спектров достаточно
информативным путем, но, не заостряя на этом внимания, перейдем
268
Глава 8
к более фундаментальной проблеме. Этот эксперимент привел бы
к двумерному спектру, но реально он является спектром непрерывной
развертки по одной координате. Частота развязки варьируется в спектре
тем же самым способом, что и частота передатчика в спектрометрах
старого типа. Ценой этого будет низкая скорость сбора информации.
Время, которое потребуется для перевода частоты развязки из одного
края спектра в другой, будет зависеть от того, насколько грубо или
тонко нам нужно делать приращения к частоте, другими словами, от
разрешения по этой координате. Это аналогично требованию малой
скорости прохождения для получения высокого разрешения на спектро-
метре с непрерывной разверткой. Даже без учета других его практи-
ческих недостатков это был бы по сути малоэффективный эксперимент,
поскольку измерения проводятся в частотной области. Вот если бы
использовать преимущества метода фуръе-преобразования по второй
координате!
8.3.3. Перенос намагниченности
Несомненно, вы не удивитесь, когда узнаете, что последовательность
Джинера обладает именно этими преимуществами перед вымышленным
двумерным спектром, полученным с помощью сочетания непрерывной
развертки н преобразования Фурье. Причина этого заключается в том,
что в системе, содержащей связанные спин-спииовым взаимодействием
ядра, второй импульс такого эксперимента приводит к перераспреде-
лению намагниченности, причем намагниченность, соответствующая
какому-то одному переходу в течение времени tit перераспределяется
между всеми другими, с которыми этот переход связан. Как сказано во
введении, я хотел бы обсудить механизм этого явления позднее, н на-
деюсь, что вы пока примете на веру то, что это действительно так.
В гл. 6 мы уже рассматривали эксперименты по переносу намагни-
ченности (SPI, DEPT, INEPT), которые, однако, значительно проще для
понимания, потому что этн системы являются гетероядернымн (что
позволяет независимо рассматривать действие импульсов на ядра раз-
ного типа), а также из-за того, что мы выбрали специальное распо-
ложение компонент мультиплета, для которых осуществляется перенос
намагниченности. В общем виде гомоядерный эксперимент, к рассмотре-
нию которого мы сейчас приступаем, несколько труднее визуализиро-
вать. Тем не менее нам необходимо выяснить, что стоит за словами
«всеми другими, с которыми этот переход связан». Итак, я напомню вам
диаграмму энергетических уровней системы АХ, к которой мы уже не
раз обращались в других главах (рис. 8.6).
Эта система описывает четыре перехода, и соответственно в спектре
ЯМР проявляются четыре линии. Каждый из переходов, например Ап
соответствует определенной лиини в спектре, например линии на частоте
vA 4- (1/2) JAX, что следует из основных свойств систем первого порядка.
Если второй импульс в эксперименте Джинера соответствует я/2, то та
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
269
Рис. 8.6, Энергетические уровни для системы АХ.
часть намагниченности, которая соответствует переходу Аь преобра-
зуется в намагниченность всех других переходов, т.е. А2, X, и Х2.
Некоторая доля намагниченности сохранится также и за переходом Ах.
Таким же образом перераспределятся компоненты для всех других
переходов. Это означает, что линия, регистрируемая в течение времени
г2, может содержать компоненты своей амплитудной модуляции с час-
тотами, соответствующими положению всех остальных лиинн по коор-
динате Это приведет к появлению кросс-пиков с этими линиями
в двумерном спектре. Не очень просто понять, как все одновременно
смешивается со всем, однако легко себе представить получающийся
спектр (рис. 8.7).
270
Глава 8
Сигналы, находящиеся на диагонали спектра, соответствуют тем
компонентам намагниченности, которые имеют ту же частоту как
в течение так н в течение /2- Это та часть намагниченности, которая
совсем не перенесена действием второго импульса. Итак, глядя на
сигналы, находящиеся на диагонали, мы обнаружим, что это нор-
мальный спектр системы. В нашем случае - только два дублета. Вне
диагонали мы видим сигналы кросс-пиков между всеми линиями,
которые могут принадлежать как одному и тому же мультиплету
(сигналы, расположенные по квадрату около диагонали), так и разным
мультиплетам, связанным спнн-спиновым взаимодействием (группы из
четырех линий вдали от диагонали). Следует отметить, что, поскольку
намагниченность переносится между переходами в обоих направлениях,
кросс-пик при (vlf v2) имеет симметрично расположенного партнера при
(v2, уд Корреляции между переходами, принадлежащими одному муль-
типлету, могут вызвать определенные неудобства, и ниже мы увидим,
что их можно устранить. Важными корреляциями являются те, которые
принадлежат переходам из разных мультиплетов. Онн необходимы для
выявления характера спнн-спиновых связей. В нашем простом примере
имеется только одна спиновая система, поэтому «все коррелирует со
всем». В более сложных системах мы можем непосредственно про-
следить путь передачи спин-спинового взаимодействия через недиаго-
нальные пики. Это происходит благодаря тому, что спнн-спиновое
взаимодействие между протонами открывает тот путь, по которому
может переноситься намагниченность при действии второго импульса.
8.3.4, Два реальных примера
Сейчас мы приступим к рассмотрению содержащего массу инте-
ресных деталей вопроса о том, как мы проводим этот эксперимент
и в чем собственно состоят его достоинства и недостатки. Одиако, для
того чтобы возбудить ваш аппетит, перед тем, как, перейти к разделам,
содержащим больше технических вопросов (они будут следовать ниже),
мне представляется целесообразным обратиться к двум реальным
задачам для того, чтобы вы могли убедиться, насколько легко можно
сделать спектральное отнесение на основе эксперимента Джинера. Пер-
вая нз них относительно проста и могла бы быть решена более
традиционными средствами, в то время как вторая лет десять назад
представляла бы серьезную проблему. Сейчас она может быть решена за
вечер. Перед тем как обращаться к спектрам, следует прояснить еще два
вопроса. Первый касается названия метода, который я до сих пор
называл экспериментом Джинера. В литературе иногда используют это
обозначение, но значительно чаще встречается термин COSY (от англ.
Correlation Spectroscop Y-корреляционная спектроскопия). Практически
все методы используют какого-либо типа корреляцию, поэтому термин
COSY (часто в сочетании с модифицирующими дополнительными
терминами), к сожалению, используют также и для обозначения разно-
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
271
образных родственных методов, что может приводить к недоразу-
мениям. Итак, термином COSY я буду пользоваться для обозначения
гомоядерной корреляции через спин-спиновое взаимодействие, осущест-
вляемой с помощью эксперимента Джинера.
Второй важный вопрос заключается в том, как правильно пред-
ставлять результаты эксперимента COSY. Двумерный спектр можно
представить как совокупность одномерных спектров (строк), смещенных
относительно друг друга. Такое представление используется до сих пор
для того, чтобы подчеркнуть природу данных. Но по мере того как
растет сложность спектра, оно оказывается излишне громоздким, и ин-
терпретация спектра может приводить к недоразумениям. Значительно
более ясное представление о соотношении между диагональными н не-
диагональными сигналами мы получим, если будем использовать кон-
турную форму записи, точно таким же образом, как изображается на
картах форма горного массива. В качестве иллюстрации на рис. 8.8
показаны в форме контурного представления те же самые данные, что
и на рис. 8.7. Достаточно реальное представление о спектре можно
получить, прописав только один нижний контур (что, кстати, и быстрее),
а не несколько уровней, как изображено на рисунке. При этом пред-
ставление об относительной высоте пика в той или иной степени можно
составить по его величине (площади контура). Для работы со спектром
COSY полезно иметь под рукой график обычного спектра, что
позволит легче идентифицировать сигналы на диагонали. Для того
-ад
-м
-в$
-V
-V
-ад
мЛ.
ад в,т о,в ад 6,4 ад
Рис. 8.8. Это альтернативное контурное представление двумерного спектра, в
общем, более удобно.
272
Глава 8
чтобы связать контуры диагональной части двумерного спектра с сиг-
налами в обычном спектре, требуется некий навык, который, однако,
легко приобретается в практической работе.
Теперь о примерах. В обоих случаях у нас были предварительные
соображения о структуре соединений, и цель детального отнесения
сигналов в спектре состояла в проверке того, насколько спектр со-
гласуется с этой структурой. Это, действительно, достаточно распро-
страненный случай, потому что, даже если проводить полный струк-
турный анализ «с нуля», т.е. не располагая предварительной инфор-
мацией, многие заключения о структуре фрагментов молекулы могут
быть получены на основании простых спектров ЯМР (или, конечно,
с помощью других спектральных методов). Гипотезы о взаимном
расположении фрагментов молекулы могут быть затем проверены
с помощью более детальной интерпретации спектров. Возможности
отнесения с помощью двумерных ЯМР-экспериментов делают стадию
такой проверки значительно более строгой.
Первое вещество (1) является природным соединением. Оно вы-
делено нз бобов [1] и представляет интерес, поскольку его структура
он он
ип ин
1
похожа на структуру других соединений-ингибиторов гликозидазы.
Обычный протонный спектр приведен на рис. 8.9, а контурное представ-
ление спектра COSY-на рис. 8.10. Сначала следует уделить некоторое
jljWk_JyL...
Нб'Н6 Нб н£н3 Н-^Н^ Hi н1е
I ’ 1 I “ ’-----1----1-----1---1 I 1-------------1 1 I—
4.0 3,8- 3,8 а 3.4 3,2 3,0 2.6
1 1 М. 0, ’ J
________________ м______________________ли
Н5 н1а н2е н2а
—I---,----1---.--1---1-----1-i---г----1--1-----1----•--1-------
2 Б 2,4 г,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2
’ ’ м.Э. 1
Рис. 8.9, Протонный спектр соединения 1 (500 МГц, D2O).
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
273
м.Э.
v2
Рис. 8.10. Полный спектр COSY соединения 1.
время сопоставлению групп сигналов в одномерном спектре с диагональ-
ной частью спектра COSY для того, чтобы сориентироваться в послед-
нем. Отметим, что двумерные эксперименты обычно проводятся со
значительно худшим, чем в одномерных спектрах, цифровым разреше-
нием, и поэтому не все элементы тонкой структуры, проявляющейся
в обычных спектрах, могут быть идентифицированы в контурном
представлении COSY. Однако, изучив вопрос более детально, мы уви-
дим, что лишь в редких случаях это может вызвать неудобства.
Прн интерпретации спектров наиболее важный вопрос состоит в том,
чтобы идентифицировать сигналы, отнесение которых однозначно. При-
мером этого может быть аномерный протон Hi в кольце глюкозы,
18-75
274
Глава 8
Нб,н£
Hfe-He
н4,н'4
Рис. 8,11. Слабопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.10. Показана
схема отнесения взаимодействующих протонов в кольце глюкозы.
Ж
В
8
которому, несомненно, принадлежит дублет в слабом поле. Таким
образом, мы имеем опорную точку для определения партнеров по
спин-спиновому взаимодействию, что в данном примере позволит нам
полностью отнести сигналы этого кольца. Рис. 8.11 иллюстрирует схему
отслеживания спии-спиновых взаимодействий, стартующую от аномер-
ного протона к его единственному кросс-пику, а затем снова на диаго-
наль для определения сигнала, соответствующего протону Н'2, после
чего к другому кросс-пику н т. д. Необходимо отметить, что кросс-пики
хорошо разрешены, несмотря на то что в обычном спектре даже на
частоте 500 МГц наблюдается сильное перекрывание сигналов в области
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
275
V2
Рис. 8.12. Сильнопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.10. Попытайтесь
сделать отнесение сигналов другого кольца, не обращаясь к рис. 8.9-8.11.
Стартовой точкой может быть любой из помеченных на рисунке протонов Н2.
резонанса протонов глюкозного кольца. Это происходит из-за того, что
положение кросс-пнка определяется двумя химическими сдвигами, и
вероятность их полного совпадения соответственно падает. Случайно
оказалось так, что в данном спектре мы можем идентифицировать
мультиплеты, соответствующие каждому протону, путем тщательного
изучения растяжек одномерного спектра. Если бы спектр был настолько
сложен, что этого уже нельзя было сделать, то вместо идентификации
сигналов по одномерному спектру нам часто приходилось бы ставить
перед собой лишь задачу идентификации кросс-пиков. Для этого по-
требуется совершенно новый взгляд на расшифровку спектра, но этот
18*
276
Глава 8
подход к установлению структуры является абсолютно правильным.
Хорошей стартовой точкой для отнесения сигналов другого кольца
может служить любой из двух снльиопольных мультиплетов, которые
должны принадлежать протонам Н2а или Н2е (а-аксиальный, е-эква-
торнальный). Только эти два протона не находятся по соседству с гете-
роатомами. Отметим, что, хотя мы по-прежнему используем химические
сдвиги для облегчения отнесения, реально мы пользуемся только боль-
шими эффектами, как в данном случае, а не какими-то малозначащими
несущественными деталями. Например, нам не потребуется использо-
вать предположение о том, находится ли слабопольный протон вблизи
азота или кислорода. Отнесение сигналов этого кольца я оставляю
v2
Рис. 8.13. Спектр COSY соединения 1, оптимизированный для регистрации даль-
них констант.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
277
в качестве упражнения; растяжка соответствующей части спектра при-
ведена на рис. 8.12.
Убедившись в том, что оба кольца предполагаемой структуры
согласуются со спектром, нам остается определить лишь место со-
членения колец. Одномерный спектр не содержит каких-либо конкрет-
ных указаний на это, но замечательное свойство эксперимента COSY
состоит в том, что он позволяет нам непосредственно определить место
сочленения. Это связано с возможностью регистрировать кросс-пикн,
вызываемые малыми константами, которые меньше наблюдаемой ши-
рины линии и вследствие этого не проявляются в одномерном спектре.
В прогонном спектре константы через четыре н пять связен часто
попадают в диапазон от 0,1 до 0,5 Гц. Хорошо известно, что геометри-
ческие факторы могут сделать эти константы значительно большими по
величине, как, например, прн расположении протонов по правилу W.
Для того чтобы зарегистрировать кросс-пики, сопряженные с малыми
константами, необходимо выполнить некоторые условия. Это будет
обсуждаться ниже в разд. 8,4.2, однако существенным является то, что
времена регистрации данных в обоих измерениях должны быть доста-
точно большими (обычный фактор контроля разрешения). На рис. 8.13
для того же диапазона, что и на рис. 8.11, приведен спектр COSY,
оптимизированный для регистрации дальних констант. Теперь ано-
мерный протон Hi имеет большое число кросс-инков с другими прото-
нами глюкозного кольца. Но весьма важно то, что он также имеет
кросс-пик с протоном Н4 другого кольца (отмечен стрелкой на рис. 8.13).
Он появляется благодаря существованию неразрешенной в спектре
константы через четыре связи между этими протонами н однозначно
указывает на место сочленения колец.
Во втором примере уровень сложности на порядок выше. Соединение
2 имеет молекулярную массу около 1000. Но для современных воз-
можностей двумерной спектроскопии даже такая задача остается доста-
2
точно простой. Использование спектра COSY (рис. 8.14а и 8.146)
в деталях подобно тому, как это делалось в предыдущем примере,
и я предоставляю читателю возможность убедиться самому в сог-
278
Глава 8
Т-' ' 1 ' I ' 1 ' 1 Г ' I .................... г
5,S 5,0 *,S 4,0 3, 5 3,0 2,5 2,0 1,5
М.В,
v2
Рис. 8,14а, Полный спектр COSY соединения 2.
ласованности отнесения, приведенного в подписи к рисунку (рис. 8.15).
В связи с этим примером я хотел бы обратить внимание на то, что важно
не забывать традиционные методы, которые по-прежнему могут ока-
заться весьма эффективными. Настолько легко поддаться очарованию
открывающимися возможностями двумерной спектроскопии ЯМР, что
о простых путях решения проблемы можно забыть.
Изучение всего протонного спектра соединения 2 (рис. 8.15) хорошо
иллюстрирует это положение. В этом примере сигналы занимают более
обширную область, чем в предыдущем случае, и некоторые из стоящих
в стороне сигналов выглядят весьма привлекательно в качестве воз-
можной опорной точки для отнесения. Например, таковы дублеты А,
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
279
—Г™1---1---1-’--1-1--1----1->--!---1----1--1--1---1---1->--1----Г~
6,0 5,6 5,6 5,4 5,2 5,0 4 В 4,6 4,4 4,2 4,0 3,6 5,6 3,4
М.0.
4
Рис. 8.146. Слабопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.14а.
В и С в слабом поле, которые могут быть отнесены к амидным
NH-протонам. В принципе, можно было бы провести эксперимент COSY
так, чтобы включить все сигналы спектра, но прн этом возникнут
определенные проблемы. При этом либо придется выполнять экспе-
римент с очень низким цифровым разрешением, что в этом случае никак
нельзя считать приемлемым, либо он займет много времени и в ходе
него возникнет громоздкий массив данных. От мощности имеющегося
в распоряжении компьютера зависит, составит нли не составит пробле-
му размер массива данных; однако большое время регистрации спект-
ра - это фундаментальное препятствие. Эксперимент COSY может быть
быстрее и проще проведен, если предварительно выполнить несколько
280
Глава 8
простых экспериментов двойного резонанса для того, чтобы иденти-
фицировать ближайшее окружение слабопольных протонов (рис. 8.16).
Имея в виду эту возможность, я мог бы проделать то же самое с двумя
дублетами метильных групп в сильном поле, сделав диапазон частот для
двумерного эксперимента еще уже. Однако в определенный момент
у меня были некоторые соображения для того, чтобы оставить эти
сигналы в двумерном спектре, а исключение области NH-протонов уже
уменьшило размер эксперимента до такого уровня, который, по моему
Рис. 8.15. Протонный спектр соединения 2 (500 МГц, пиридин-Отнесение
сигналов (обозначения атомов и групп см. на схеме соединения 2): А, кольцо
A NH; В, кольцо В NH; С, Ala (фрагмент D) NH; Р. А3; G, А4; Н, Вх; Д В4; J, Glu
(фрагмент Е) а-протон; К, АL, Ala (фрагмент D) а-протон; М, В2; N, А2; О, А6; Р.
Ala (фрагмент С) а-протон; Q, А6; В, В5; S, В6; Т, В3; U, А5; И, В6; W и X Glu
(фрагмент Е) СН2; СН3, Ala (фрагмент С) Me; CH®, Ala (фрагмент D) Me.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
281
jl_______, 11^__________till QflnwHue В
t
Jl____, ... 1111All JL об
РКСН;
мольный
н I j.k РЬСН;
1 I 1 1 1 1 I 1 1 1 1 I......................I ' ' ' ' I ' 1 ' ' T '"’ ' I I 1 ' I I I 1
5,30 5,20 5,10 5,00 4,30 4,80 4.70 4,60 4,50
M.0.
Рис. 8.16. Спектры двойного резонанса соединения 2.
.облучение А
опыту, мог бы быть проведен достаточно легко. Поэтому я не провел
этих развязок.
8.3.5. Детали эксперимента COSY
Введение. Сейчас у нас есть некоторое представление о том, на-
сколько полезным инструментом прн отнесении сигналов может слу-
жить эксперимент COSY, и я намерен приступить к более углубленному
изучению вопросов о том, как проводится эксперимент COSY, как
возникают разнообразные артефакты и как они могут быть устранены,
какие есть методы представления данных и как на практике подобрать
подходящие экспериментальные параметры. Этот раздел посвящен в
основном техническим вопросам и будет более интересен тем, кто
самостоятельно выполняет на спектрометре эксперимент COSY или
аналогичные эксперименты. Если у вас нет технических наклонностей
или вас вовсе не интересуют вопросы о том, как работать на спектро-
метре, я рекомендую опустить большую часть этого раздела, за исклю-
чением параграфов «Фазовые соотношения в фазочувствнтельном
COSY» н «Цифровое разрешение и времена выборки данных». Многие
из обсуждаемых здесь вопросов полностью или частично касаются не
только COSY, но и всех двумерных экспериментов, и в оставшихся
282
Глава 8
главах подразумевается, что читатель ознакомился с этим разделом.
Я также предполагаю в дальнейшем, что вы знакомы с разд. 4.3.5 гл. 4,
Влияние продольной релаксации. В нашем предварительном обсуж-
дении последовательности COSY я умышленно опустил вопросы, свя-
занные с продольной релаксацией. Причина, по которой я так поступил,
состоит в том, что продольная релаксация приводит к появлению
дополнительных сигналов в спектре; их устранение вызвало бы неко-
торое дополнительное усложнение, а мне не хотелось бы отвлекать вас
от основного вопроса-концепции меченых частот. Понять то, как
релаксация по осн z влияет на внд спектра, совсем не трудно; это
иллюстрируется рис. 8.17. Здесь изображена такая же диаграмма, как на
рнс. 8.1, за исключением того, что учтено неизбежное затухание сигнала
в течение времени Второй импульс, помимо того действия, которое
он совершает над поперечной намагниченностью и которое мы уже
обсудили, должен вернуть эту г-компоненту намагниченности в плос-
кость л — у, где она вызовет появление сигнала. Поскольку эта компо-
нента намагниченности не прецессировала в течение времени (она
была направлена по оси г), после второго преобразования Фурье
появятся сигналы с частотой vt, равной нулю. Таким образом мы
получим копию спектра на линии v: — 0; эти нежелательные сигналы
называются аксиальными пиками. Если спектр получен в режиме квад-
ратурного детектирования по vx (см. ниже), то линия vx = 0 проходит
через его центр, поэтому данный эффект весьма нежелателен (рис. 8.18),
К счастью, эти аксиальные сигналы легко устранить. Для того чтобы
это увидеть, рассмотрим эффект изменения фазы второго импульса на
180°. Компонента намагниченности, ответственная за появление ак-
сиальных пиков, приобретет инвертированную фазу, поскольку вектор
теперь направлен по оси —у (рис. 8.19). При этом та компонента
намагниченности, которая приводит к желаемым сигналам, будет на-
правлена по оси х. Очевидно, что оиа останется такой же независимо от
того, является второй импульс (я/2)х или (я/2)-х. Поэтому, если мы
будем проводить эксперимент парами прохождений с альтернированием
фазы второго импульса и последовательно складывать спектры, акси-
альные сигналы взаимно уничтожатся, а желаемые сигналы усилятся.
Этот прием и является первой компонентой фазового цикла экспери-
мента COSY.
Рис. 8.17. Возникновение «аксиальных пиков» за счет продольной релаксации
в период
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
283
--600
--М0
-400
-'300
-200
-400
-о
-100
-200
-300
-400
-500
-600
-700
Гц
Рис. 8.18. Без фазового цикла для подавления аксиальных ликов возникают
нежелательные сигналы по линии Vj = 0.
Устранение артефактов ио v2. Мы можем добавить еще несколько
стадий фазового цикла, представляя себе, что проблема устранения
квадратурных отражений и других артефактов по v2 идентична той,
с которой мы столкнулись в одномерном случае. Решение оказывается
точно таким же: мы используем процедуру CYCLOPS для всего экспе-
римента. Напомню, что эта процедура включает фазовые сдвиги на 90 J
для устранения разбалансировки приемника, а также сдвиги на 180° для
подавления других некогерентных сигналов, которые объединены под-
ходящим образом, В случае эксперимента COSY (и вообще для много-
импульсных экспериментов) мы подвергаем совместному циклированию
фазу всех импульсов, а также фазу приемника. Комбинируя этот цикл
284
Глава 8
Рис, 8.19. Альтернирование фазы второго импульса инвертирует фазу нежела-
тельной компоненты, в то время как нужная нам компонента остается без
изменения.
Таблица 8.1. Первая стадия фазового цикла
COSY, комбинирующая подавление аксиаль-
ных пиков и CYCLOPS. «Фаза 1» и «Фаза 2»
соответствуют фазе первого и второго импуль-
сов соответственно
Номер прохождения Фаза 1 Фаза 2 Приемник
1 X V .г
2 л — х X
3 У У У
4 У - У У
5 — X — X — X
6 — X X — X
7 -у -у -у
8 — у У — у
с двухшаговым подавлением аксиальных инков, мы получаем цикл,
состоящий пока только нз восьми шагов (табл. 8.1).
Квадратурное детектирование по v2. Те же самые соображения, что
побудили пас поместить опорную частоту приемника в центре спектра
(см. гл. 4), оказываются существенными и для двумерного случая.
С самого начала, в сущности, я молчаливо подразумевал, что квадра-
турное детектирование касается периода t2, т.е. нормального периода
регистрации, Сейчас нам придется столкнуться с проблемой распозна-
вания положительных н отрицательных модуляционных частот по ко-
ординате По прямой аналогии с одномерным экспериментом этого
можно достичь, измеряя такие два сигнала в период чьн опорные
фазы отличаются на 90°. Как видим, хорошо в двумерной спектроскопии
ЯМР то, что почти все проблемы здесь аналогичны тем, которые мы уже
обсуждали, поэтому для тех, кто уже работал с одномерными методами
или понимает их, переход к двумерным методам не будет сопряжен
с трудностями. Единственная проблема при этом состоит в том, чтобы
разобраться, что означает «опорная фаза» по координате Однако,
немного подумав, мы можем заключить, что это относительная фаза
двух импульсов (см. также рис. 8.20а н 8.206),
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
285
Рис. 8.20а. Базовая последовательность COSY приводит к синусоидальной моду-
ляции сигнала.
................ Ьморкл
Рис. 8.206. Для того чтобы получить косинусоидальную модуляцию, необходи-
мую для квадратурного детектирования по v,, фазу одного из импульсов
нужно сдвинуть на 90°.
Теперь, поскольку является дискретной переменной, у нас уже нет
больше возможности измерять два сигнала, как мы делали прн обычном
квадратурном детектировании. Вместо этого мы должны проводить два
эксперимента с одним и тем же значением вводя требуемый фазовый
сдвиг во втором эксперименте и запоминая его результат как мнимую
часть данных по tx. Этот метод предложен Рубеном, Стэйтсом и Ха-
бекорном [2] для квадратурного детектирования по vx. Авторы не
предложили какого-либо специального названия для этого метода,
поэтому впредь я буду называть его RuSH. Требуемое смещение фазы
может быть привнесено либо изменением фазы первого импульса н
приемника на 90, либо эквивалентным изменением фазы второго им-
пульса на —90°. Нетрудно проверить правильность этой процедуры
с помощью расчета двумерного преобразования Фурье, но это потребует
знакомства с некоторыми соотношениями между тригонометрическими
функциями н экспонентами комплексных чисел. Вместо того чтобы
заниматься этим, я отошлю вас к статье, в которой этот вопрос
обсуждается подробно [3]. Не связываясь со сложными алгебраически-
ми преобразованиями, с помощью рнс. 8,20а и 8.206 можно убедиться
в том, что эти две альтернативы действительно эквивалентны и анало-
286
Глава 8
гнчны по с уже знакомым нам двухфазным методом квадратурного
детектирования.
Первый вопрос, который необходимо иметь в виду, состоит в том,
чтобы регистрируемые сигналы модулировались как функцией синуса,
так и функцией косинуса. Это нужно для того, чтобы различить
положительные и отрицательные частоты при комплексном преобра-
зовании Фурье. В деталях этот вопрос объясняется в гл. 4 (разд. 4,3.5).
Очевидно, что если фазы двух импульсов последовательности COSY
совпадают (см. рнс. 8.20а), то сигнал в конце времени составит
М sin2?rvr1; если же они отличаются на 90°, то сигнал будет определяться
соответствующим косинусом (см, рис. 8.206). После того как мы убе-
дились в том, что модуляция сигналов верна, нам также нужно сдвинуть
еще н фазу приемника иа 90° (для того чтобы убедиться, что нужный нам
квадрант данных имеет интересующие нас фазы; см. ниже). Это про-
исходит автоматически, если мы варьируем второй импульс, однако
требуется фазовый сдвиг приемника, если мы варьируем первый им-
пульс. Полный фазовый цикл приведен в табл. 8.2. Прн этом мы
выбрали вариацию первого импульса.
Таблица 8.2. Полный фазовый цикл для фазочувствительного
COSY с квадратурным детектированием по v, методом RuSH
Номер прохождения Фаза 1 Фаза 2 Приемник Запомнить как (по б)
1 Л X X Реальное
2 Л — X X »
3 У У У »
4 У - У У »
5 — X — X — X »
6 —- X X — X »
7 - У -у -у »
8 -у У -у »
9 У X У Мнимое
10 У — X У »
11 — X У — X »
12 — X - У — X »
13 ~У - X -у »
14 ~У X -у »
15 -у X »
16 X У X »
Итак, для полного фазового цикла нам необходимо накопить крат-
ное 16 число прохождений для каждой точки по rt, т.е. независимо от
соображений чувствительности нам потребуется как минимум 16 про-
хождений для того, чтобы получить каждую комплексную точку по tx.
Часто это оказывается фактором, определяющим минимальное время,
которое нам необходимо затратить на накопление данных для дву-
мерного эксперимента. На практике никогда не используют CYCLOPS
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
287
в фазовом цикле, поскольку артефакты по v2 не так велики для
правильно настроенного спектрометра. Это уменьшает минимальное
число прохождений до четырех (по два для каждой компоненты комп-
лексной точки). Кроме того, необходимо добавить еще два нли больше
«холостых» прохождений для установления стационарного состояния
перед началом накопления. Фазовые циклы для других многоимпульс-
ных экспериментов строятся таким же образом, и я не буду их анализи-
ровать столь подробно.
Квадратурное детектирование по v1 можно также проводить с по-
мощью метода, аналогичного методу Редфилда. В этом случае мы
меняем относительные фазы двух импульсов. Фазу первого импульса мы
меняем с шагом 90° одновременно с введением инкремента по Точно
так же, как и в одномерном случае, мы проводим выборку по в 2 раза
быстрее, чем по методу RuSH, но мы запоминаем только один экспе-
римент для каждого значения tt; таким образом, общее число точек
остается тем же самым. Этот метод называется TPPI (от англ. Time
Proportional Phase Increment-пропорциональный времени фазовый ин-
кремент) [4]. Вам придется использовать именно этот метод, если ваш
спектрометр использует метод Редфилда для обычного квадратурного
детектирования по v2, и поэтому программы для преобразования Фурье
написаны для этого типа представления данных. Если же у вас есть
выбор, какой метод использовать, то в принципе между ними нет
разницы (см. работу [3]). На практике вы можете использовать тот или
иной метод фазового циклирования в зависимости от того, какой из этих
методов легче сопрягается с имеющимся в вашем распоряжении ма-
тематическим обеспечением.
Причина, почему я уделил столько времени этому, в общем все-такн
техническому вопросу, состоит в том, что использование этих методов
для квадратурного детектирования по еще не достаточно широко
распространено. В то же время широко распространена практика ре-
гистрации спектров с помощью тех процедур (о них пойдет речь ниже),
в которых компоненты поглощения и дисперсии смешиваются сложным
образом. Многие сложности н недостатки двумерной спектроскопии,
характерные для альтернативного подхода к квадратурному детекти-
рованию по Vj. отсутствуют в спектрах, полученных по одному из
описанных выше методов. Поэтому следует ожидать, что они постепен-
но получат широкое распространение. Однако в момент написания
преобладающее большинство спектров, приведенных в литературе, да
и большая часть двумерных спектров в этой книге получены не таким
способом. Сейчас, в переходный период, если вы сами являетесь поль-
зователем спектрометра, у вас может появиться желание оснастить
этими фазочувствительными методиками эксперимент COSY нлн другие
двумерные эксперименты. Описанный здесь подход применим для лю-
бого двумерного эксперимента, в котором именно амплитуда сигнала
модулируется как функция Zj.
288
Глава 8
Выбор между фильтрами типа эха и анти-эха. Описанные выше два
метода квадратурного детектирования по появились сравнительно
недавно (примерно в 1981-1982 гг,). До этого был распространен другой
и во многих аспектах худший способ. Но и до настоящего времени он
еще широко используется, поэтому мы должны его изучить. Существен-
ный момент, необходимый для того, чтобы различать знаки частот,
состоит в том, что выборка двух сигналов с фазовым смещением на 90°
остается той же самой, однако сигналы не хранятся отдельно. Вместо
этого они либо вычитаются, либо складываются, давая одну компоненту
(технически эта процедура преобразует амплитудную модуляцию сигна-
лов в модуляцию ее фазы), которая затем преобразуется так, словно она
возникала при однофазовом детектировании. Другими словами, основ-
ной фазовый цикл для COSY (без учета CYCLOPS) становится таким,
как в табл, 8,3 (вычитание, т. е. фильтр типа эха) или в табл. 8.4
(сложение, т. е. фильтр типа анти-эха). Отметим, что пары прохождений
1-2 и 3 4 используются для квадратурного детектирования, в то время
как 1-3 и 2-4 служат для подавления аксиальных пиков.
Таблица 8.3. Фазовый цикл COSY для квадра-
турного детектирования по V; с помощью
переноса когерентности эха
Номер Фаза I Фаза 2 Приемник
прохождения
) ххх
2 х у — х
3 А — .V X
4 х — у — х
Таблица 8.4. Фазовый цикл COSY для квадра-
турного детектирования по v, с помощью
фильтра типа анти-эха (не рекомендуемый)
Номер прохождения Фаза 1 Фаза 2 Приемник
1 X у X
2 X X
3 X — X X
4 X - У X
Сначала я хочу разобраться с разницей между сложением и вы-
читанием сигналов, что, хотя и представляет интерес с точки зрения
ЯМР, может показаться не столь существенным вопросом, если вас
интересует только интерпретация спектров илн если изучать другие
аспекты приложений этого метода, которые, несомненно, имеют огром-
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
289
ное значение. Если сигналы вычитаются, то знаки модуляционных
частот, в сущности, обращаются между и t2. Это имеет некоторое
сходство с описанным в гл. 4 эффектом последовательности спинового
эха, когда сигналы, которые во вращающейся системе координат дви-
гаются быстрее в первой половине последовательности, после второго
импульса начинают двигаться с запаздыванием, что приводит к ре-
фокусировке. В экспериментах с переносом намагниченности, таких, как
COSY, результат оказывается несколько более сложным, поскольку
компоненты намагниченности могут сами прецессировать с разными
частотами до и после второго импульса. Но тем не менее эхо возникает.
Это явление известно как эхо переноса намагниченности. Оно может
возникать в любом эксперименте, в котором регистрируемая намаг-
ниченность модулируется как функция временного интервала. Вычи-
тание сигналов называется детектированием эха илн иногда селекцией
пиков N-типа.
Другая компонента сигнала, получаемая сложением данных для
О и 90°, имеет одинаковые знаки для модуляционных частот по vx и v2.
Таким образом, формируется не эхо, а компонента, называемая анти-
эхом илн сигналом P-типа (лично мне термин «ангн-эхо» представляется
неподходящим; более подходящим, возможно, был бы термин «не-эхо»).
Формы линий компонент при использовании фильтров типа эха и анти-
эха различаются довольно сложным образом. В общем случае фильтр
типа эха более удобен [3]. Поэтому следует пользоваться фазовым
циклом, приведенным в табл. 8.3, в сочетании, прн необходимости,
с последовательностью CYCLOPS.
Не очень приятное свойство этого метода распознавания знаков
состоит в том, что в преобразованных спектрах компоненты поглощения
н дисперсии становятся взаимообратнымн. Это означает, что невоз-
можно выделить линии, которые бы соответствовали исключительно
сигналам поглощения или дисперсии, какую бы комбинацию реальной
н мнимой частей мы ни преобразовывали. Напротив, фаза каждой линии
в одном измерении варьируется по мере того, как мы проходим через нее
по второму измерению. Она имеет форму с перекрученной фазой,
показанной на рис. 8.21. Линия имеет как положительные, так и отри-
цательные компоненты, кроме того, у нее широкий пьедестал из-за
вклада широкой дисперсионной лоренцевой компоненты. Линию такой
формы неудобно представлять ни в контурном виде, ни в форме
налагающихся спектров, поэтому изыскивают возможности преобра-
зовать ее к такому виду, в котором есть только положительные
компоненты. Это достигается вычислением магнитуды спектра, обра-
зованной комбинацией реальной и мнимой частей следующим образом:
Л = (8.2)
Это, очевидно, устраняет отрицательные пики, хотя получаемая прн
этом форма линии имеет очень широкий пьедестал (рис. 8.22), Объемное
представление такой линии напоминает по форме звезду. Перекрывание
19-75
290
Глава 8
Рис. 8.21. Искаженная форма линии с перекрученной фазой возникает в экспери-
ментах с регистрацией переноса когерентности по типу эха.
Рис. 8.22. После вычисления магнитуды скручивание фазы исчезает, однако
полученная линия очень широкая. Сравните ее с рис. 8.4, на котором приведен
сигнал чистого поглощения (того же самого образца), записанный с теми же
параметрами усиления и ширины развертки.
лучей расположенных на близком расстоянии звезд может приводить
к серьезным недоразумениям.
Для того чтобы достичь приемлемого разрешения соседних линий
в магнитудиом спектре, следует использовать сильное улучшение раз-
решения. Для этих целей предложены разнообразные взвешивающие
функции, детальное обсуждение некоторых из них можно найти в книге
Бакса [5] (гл. 1), Наиболее популярными являются преобразование
лоренцевой формы лниии в гауссову, с которым мы уже сталкивались
в гл. 2, а также фильтр типа синусоидалъно-колоколообразпого окна.
Последний соответствует умножению ССИ на полуволну синусоид аль-
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
291
ной функции. Для достижения требуемой степени сужения и приемлемой
потери отношения сигнал/шум функция синуса может быть сдвинута по
фазе и/или возведена в квадрат. К желаемому результату приводят
взвешивающие функции, имеющие близкие к нулю значения на началь-
ном и конечном участках и симметричные относительно централь-
ной точки сигнала ССИ; прн этом в магннтудном спектре получается
такая форма линии, которая подобна сигналу поглощения. Необхо-
димый эффект достигается также прн использовании преобразования
лоренцевой формы линии в гауссову, параметризованного подходящим
образом. В этом случае его называют гауссовым псевдо-эхом, Однако
похожий эффект дает и синусоидальио-колоколообразное окно, которое
отличается более удобным заданием параметров (рис. 8.23). Обе эти
процедуры не слишком отличаются от используемых в одномерном
эксперименте. К тому же следует ожидать, что при их использовании
может возникнуть большой разброс в амплитуде сигналов (см. ниже).
Частные проявления эффектов улучшения разрешения довольно
сложным образом связаны с типом используемой функции и ее па-
раметрами. При этом возникает следующая общая проблема. Все
улучшающие разрешения функции ослабляют начальную часть сигнала
ССИ, но в то же время обеспечивают плавное затухание до нуля его
конечной части для получения надлежащей аподизации (гл. 2). Ослабляя
одну часть сигнала, мы с необходимостью усиливаем другую, более
зашумленную его часть, что в итоге понижает отношение сигнал/шум.
Обработка двумерных данных с целью получения желаемого магни-
тудного спектра потребует использования весьма жесткого фильтра,
поэтому мы должны ожидать большой потери чувствительности. Дру-
гая (и часто более серьезная) проблема состоит в том, что потеря
чувствительности будет различной для линий, имеющих в спектре раз-
Рис. 8.23. Умножение на синусоидальную взвешивающую функцию по каждому
измерению перед двумерным преобразованием Фурье сильно улучшает разреше-
ние. В магннтудном спектре в той или иной степени восстанавливается форма
сигнала поглощения, но за счет потери чувствительности. Виден «шум по /,»
вдоль направления vt (см. текст).
19*
292
Глава 8
ную ширину. Это легко представить себе, если вспомнить, что скорость
затухания сигналов во временной области соответствует нх ширинам 5v
в частотном представлении согласно формуле Т% = l/nSv.
Предположим, что у нас есть две линии (одна с шириной 1,0 Гц
и другая с шириной 0,1 Гц) и что мы накопили для них сигнал ССИ
с временем выборки данных 2 с. Если мы обработаем его такой
функцией, как синусоидально-колоколообразное окно, которая сильно
увеличивает центральную часть ССИ прн Z = 1 с, то в этой области
будет находиться еще значительная часть сигнала для линии шириной
0,1 Гц, поскольку для нее 7* равно примерно 3 с; фактически для
оптимальной регистрации этого сигнала нам бы следовало использовать
большее время выборки. Для линии шириной 1,0 Гц сигнал к этому
времени спадает до величины порядка 0,04 (е“Э его начальной амплиту-
ды. Используя такую взвешивающую функцию, мы просто выбросим
большую часть сигнала. Проблема состоит в том, что ни на стадии
регистрации, ни на стадии взвешивания нельзя подобрать параметров,
оптимальных для одновременной регистрации таких линий. Вариации
ширин линий в столь значительной степени встречаются достаточно
часто, например прн наличии неразрешенных констант, констант с
квадрупольными ядрами или химического обмена. Прн этом возникают
большие искажения интенсивности прн действии на магнитудный спектр
фильтров, улучшающих разрешение. Это и является довольно общей
причиной исчезновения кросс-пиков прн регистрации спектров COSY
в форме эха прн магнитудном представлении данных. Таким образом,
очень важно изучить диапазон имеющихся в спектре линий при выборе
подходящих для эксперимента времен регистрации данных, а также
важно оценить необходимые параметры взвешивающих функций для
обработки двумерного массива данных.
Для описанных раньше фазочувствнтельных экспериментов отпадает
необходимость сильного улучшения разрешения и вычисления магни-
туды, и поэтому уже только по одной этой причине их использование,
если оно возможно, оказывается более предпочтительным. Кроме того,
как мы увидим ниже, когда сравним свойства этих экспериментов, из
спектров фазочувствительного COSY можно извлечь больше инфор-
мации. Тем не менее большинство имеющихся к настоящему времени
в литературе спектров получено в режиме магнитуды, и вы можете
убедиться, что имеющийся у вас спектрометр или система обработки
данных вынуждают вас работать с этим типом спектров.
Фаза в двух измерениях. Результаты преобразования как по методу
RuSH, так н по методу TPPI, аналогичны привычным одномерным
спектрам. Так, преобразование по v2 имеет реальную н мнимую части,
которые после подходящей фазовой коррекции соответствуют компо-
нентам поглощения и дисперсии сигнала. Преобразование по vx также
приводит к реальной и мнимой компонентам, так что в итоге мы
получаем четыре фазовых квадранта, которые в представлении (v1T v2)
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
293
Рис. 8.24. Четыре типа формы линии, которые могут возникать в фазочувстви-
тельных двумерных спектрах.
описываются как (реальный, реальный), (реальный, мнимый), (мнимый,
реальный) и (мнимый, мнимый). Для графического представления мы
обычно стремимся использовать квадрант (реальный, реальный). На
рнс. 8.24 приведена иллюстрация четырех типов формы линии, полу-
чаемых в результате двумерного преобразования. Как и в одномерных
экспериментах, фазовая коррекция двумерного массива данных потре-
бует выделения части (реальный, реальный), соответствующей ком-
поненте чистого поглощения и/илн дисперсии. Для этого в зависимости
от обстоятельства применяются различные подходы.
По аналогии с используемыми в одномерной спектроскопии про-
цедурами можно выполнить полное двумерное преобразование и затем
попытаться провести интерактивную фазовую коррекцию, используя
линейные комбинации фазовых квадрантов. Фазовая подстройка по v2
будет включать комбинацию частей (реальный, реальный) и (реальный,
мнимый), что даст реальную часть по vt, а также комбинацию в том же
соотношении частей (мнимый, реальный) и (мнимый, мнимый), что даст
мнимую часть по v2. В настоящее время еще нет таких систем обработки
спектров ЯМР, которые имеют достаточно высокую скорость выпол-
нения арифметических операций для того, чтобы интерактивно выпол-
294
Глава 8
нять такие процедуры для массива данных разумного размера, хотя,
несомненно, в свое время это станет возможным. А пока нам приходится
искать альтернативные способы определения коэффициентов фазовой
коррекции.
Простой подход состоит в том, чтобы изучить одиночные сечения
преобразованного спектра и определить, какая нм требуется фазовая
коррекция, а после этого использовать ее для всего спектра. Однако при
этом возникают некоторые практические осложнения, с которыми мы не
сталкиваемся прн фазировании одномерного спектра, Сеченне спектра
COSY параллельно осн v2, проходящее через диагональный пнк, будет
содержать собственно этот диагональный пик н соответствующие ему
кросс-пики. При этом обычно имеется всего лишь один илн два
кросс-пика, которые к тому же далеко не всегда расположены удобно
для настройки двух фазовых параметров. Другими словами, для того
чтобы быть уверенным в правильности настройки фазы, нам бы хоте-
лось, чтобы весь спектр был заполнен сигналами, но в сечениях экспе-
римента COSY это бывает редко. Проблема осложняется еще и тем
обстоятельством, что, как мы вскоре увидим, диагональные н кросс-
пнкн смещены по фазе на 90 , к тому же пары кросс-пиков могут
оказаться противофазными. Если вы все-таки вынуждены пользоваться
этим методом подстройки фазы, то иаилучший путь состоит в том,
чтобы оценить параметры фазовой коррекции по нескольким сечениям,
взятым из разных частей спектра.
Определенные практические преимущества мы получим, если опре-
делим параметр фазовой коррекции по v2 перед двумерным преобра-
зованием. Прн этом оказывается, что после такой подстройки фазы
мнимая часть данных по v2 больше не нужна, и ею можно пренебречь,
сэкономив время и место для преобразования по vt. К сожалению,
в некоторых случаях не оказывается такого фрагмента двумерного
массива данных, который был бы удобен для определения фазовых
параметров до полного преобразования, из-за того, что ни для какого
отдельного массива точек по v2 не получается чисто положительных
сигналов поглощения. Например, в случае эксперимента COSY фази-
ровать следует спектр, соответствующий /1 = 0, Однако, если = 0,
последовательность тг/2 — — тг/2 становится эквивалентной тг-импульсу
и не приводит ни к какому сигналу. Если используется метод RuSH, то
можно взять мнимую часть эксперимента для = 0, которая уже
содержит сигнал, генерируемый последовательностью (л/2)у - (л/2)х.
Если квадратурное детектирование осуществляется с помощью метода
TPPI, то такой возможности не существует, поскольку величина
меняется одновременно с фазой. Однако можно сфазнровать после-
дующие точки по если только тщательно следить за амплитудной
модуляцией сигнала. Другими словами, некоторые сигналы могут быть
инвертированы, когда не равно нулю; это может приводить к недора-
зумениям прн настройке фазы первого порядка. Кроме того, если
фазовый цикл приемника ие отлажен достаточно тщательно, то прове-
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
295
денная таким способом фазовая коррекция нулевого порядка может
быть затем изменена на ±90°, при этом подобный эксперимент, прове-
денный на конкретном спектрометре с данным фазовым циклом, по-
зволит быстро найти необходимую процедуру.
В тех случаях, когда сам по себе вид двумерного спектра не содержит
прямой информации о фазе, остается единственная возможность попы-
таться изобрести и выполнить независимый калибровочный экспери-
мент. Для COSY простое решение заключается в проведении экспери-
мента для г, = 0 с использованием длительностей импульсов, несколько
меньших, чем тг/2, с тем, чтобы регистрировать сигналы. Фазовые
параметры этого спектра могут затем использоваться для коррекции по
v2. В других экспериментах может потребоваться совсем другой мо-
дельный спектр для получения фазовых параметров, что может ока-
заться нетривиальной задачей, поскольку требуемая фазовая коррекция
зависит от точной длины некоторых относительно коротких временных
интервалов. Этот вопрос обсуждается в работе [3],
Коррекция фазы по v, обычно не нужна, поскольку отсутствуют
источники фазовых искажений, которые встречаются в v2. Таким обра-
зом, фазовое соотношение между двумя импульсами, определяющее
форму модуляции каждой компоненты, составляет точно величину 0 или
90G (в предположении, что спектрометр настроен правильно!), поэтому
не возникают не зависимые от частоты фазовые ошибки. Не требуется
также задержка перед началом выборки данных по координате v19 так
как может начинаться с нуля; это устраняет частотно-зависимые
фазовые ошибки. На практике на некоторых спектрометрах нельзя
стартовать по it с нулевого значения. Только в данном случае потре-
буется зависимая от частоты коррекция фазы (в обозначениях гл. 4,
разд. 4,3.5, а должна иметь нулевое значение, а р необходимо под-
бирать). Это определяется при исследовании сечений по координате v1?
однако не является такой проблемой, как подстройка фазы по v2, потому
что может потребоваться лишь незначительная коррекция.
Фазовые соотношения в фазочувствнтельиом COSY. Помимо неко-
торых практических сложностей, связанных с коррекцией фазы, фунда-
ментальная проблема состоит в том, что ожидаемые нами фазы раз-
личны для разных сигналов. В одномерном спектре при нормальных
условиях все сигналы имеют одну и ту же фазу, и для удобства мы
настраиваем ее так, чтобы все сигналы были точно сигналами погло-
щения. Иногда это возможно и в двумерных экспериментах, однако
оказывается, что в спектре фазочувствительного COSY ситуация не-
сколько сложнее. Причина осложнений состоит в том, что процесс
переноса намагниченности, лежащий в основе этого эксперимента, вы-
зывает фазовые сдвиги для одних сигналов и не приводит к смещению
фазы других. Этого нельзя объяснить без детального квантовомеханн-
ческого описания эксперимента. Однако если мы воспользуемся резуль-
татами такого расчета в качестве доказательства, то легко будет понять
296
Глава 8
происхождение относительной фазы для разного типа сигналов.
Обратившись снова к диаграмме энергетических уровней для систе-
мы АХ (см. рис. 8.6), мы можем различить три типа соотношения между
переходами. Переходы, относящиеся к одному мультиплету, например
А] и А;, по очевидным соображениям описываются как параллельные.
Оставшиеся пары называются связанными переходами, причем пары,
составленные из переходов А1 и X,, называются прогрессивно связан-
ными, а пары таких переходов, как At и Х2,-регрессивно связанными.
В таком случае правила для фазовых сдвигов при переносе намагни-
ченности заключаются в следующем. Намагниченность, которая не
переносится или же переносится между параллельными переходами,
остается с той же фазой. Намагниченность, перенесенная между прогрес-
сивно связанными переходами, сдвигается по фазе на — 90 . в го время
как намагниченность, перенесенная между регрессивно связанными пе-
реходами, сдвигается по фазе на +90 '.
Одно следствие из этих правил должно немедленно потрясти вас,
а именно: фазы диагональных и кросс-пиков должны всегда отличаться
на 90е. Это связано с тем, что пики на диагонали или вблизи нее
возникают за счет неперенесенной намагниченности или намагничен-
ности, перенесенной между параллельными переходами, в то время как
кросс-пики, несомненно, возникают за счет переноса между связанными
переходами. Поэтому невозможно настроить фазу так, чтобы все сиг-
налы были в форме чистого поглощения; мы только можем иметь
диагональные сигналы в форме дисперсии, а кросс-пики в форме
поглощения или наоборот. Поскольку кросс-пики являются информа-
тивными сигналами, мы проводим настройку так, чтобы они были
в форме поглощения, при этом диагональная часть получается в форме
дисперсии. Иногда это оказывается не очень удобным, поскольку ши-
рокие сигналы дисперсии перекрываются исключительно сильно, однако
использование различных вариантов эксперимента позволяет отчасти
преодолеть это неудобство (разд. 8.4.3).
Второе следствие заключается в том, что пары кросс-пиков, воз-
никающие при переносе от одного перехода к двум другим, с которыми
он связан прогрессивно и регрессивно (конечно, на этих названиях
можно сломать язык, но это достаточно просто: например. А, с X,
и Х2), отличаются по фазе на 180°. Таким образом, настроив кросс-пик
на поглощение, мы получаем противофазные пары компонент мульти-
плета. На рис. 8.25 это показано па примере той же системы АХ, которая
была использована на рис. 8.7. Теперь вы, наверное, поняли, что сначала
Рис. 8.25. Фазочувствительный спектр COSY для системы АХ (положительные
контуры показаны черным, а отрицательные - красным). Отметим, что кросс-пики
настроены по фазе на чистое поглощение с компонентами мультиплета в про-
тивофазе (см. растяжку контурного представления). Диагональные пики имеют
форму сигналов дисперсии, а перекрывание широких дисперсионных сигналов
приводит к характерным линиям, напоминающим по форме крылья ангелов.
298
Глава 8
я несколько сплутовал, представляя спектр на рис. 8.7 в форме магни-
туды, для того, чтобы упростить предмет изложения. Противофазная
природа пар кросс-пиков имеет как преимущества, так и недостатки.
Основное неудобство состоит в том, что перекрывающиеся положи-
тельный и отрицательный пики могут взаимно уничтожаться. Важно
понять, что возможное взаимное уничтожение сигналов произойдет
даже в том случае, если мы захотим отбросить фазовую информацию,
проведя расчет магнитуды. Это является главным фактором, опреде-
ляющим, возможна ли регистрация кросс-пиков, соответствующих ма-
лым константам. Преимущество же состоит в том, что фазовые соот-
ношения между сигналами полезны при интерпретации н отнесении
спектра. Этот вопрос обсуждается ниже в разд. 8.3.6.
Цифровое разрешение н времена выборки данных. Одномерные про-
тонные спектры обычно регистрируются с цифровым разрешением,
равным или несколько меньшим, чем наблюдаемая ширина линии.
Например, для регистрации спектральной полосы шириной Юм.д.
типичные условия соответствуют регистрации от 16 до 32 К точек
данных, что в зависимости от напряженности поля приводит к временам
выборки данных порядка нескольких секунд н цифровому разрешению
0,2-0,4 Гц на точку. Для молекул среднего размера ширины линий
составляют обычно от 0,5 до 1,5 Гц в недегазированных растворах,
поэтому на каждую линию будет приходиться несколько точек. Это
может быть недостаточно для некоторых операций, требующих точных
количественных измерений, но в целом оказывается достаточным, если
преследовать только цель разрешения мультиплетной структуры. По-
скольку значения TJ лежат в диапазоне 0,2-0,6 с, за время каждого
прохождения поперечная намагниченность будет самопроизвольно за-
тухать практически до нуля. Поэтому не возникнет стационарного эха,
и использование импульсов, соответствующих углу Эрнста (гл. 7), дает
оптимальную чувствительность.
Как мы уже убедились на том нелепом примере, в котором на-
меревались получить цифровое разрешение 0,2 Гц на точку при спект-
ральной полосе 5000 Гц в обоих измерениях эксперимента COSY, столь
подробная оцифровка невозможна для двумерных экспериментов. Огра-
ниченность возможностей системы обработки данных для их запоми-
нания и преобразования является одним из двух основных препятствий
для достижения такого разрешения. Его можно преодолеть в тех
случаях, когда мы готовы потратить достаточно много денег или когда
мы готовы ждать, пока проблема не решится сама за счет продол-
жающегося быстрого роста мощности компьютеров. По этой причине,
а также из-за того, что уровень, на котором возникает данная проблема,
меняется иа порядок в зависимости от типа имеющегося у нас компью-
тера, я ие собираюсь рассматривать это ограничение. Даже если я по-
пытаюсь обрисовать то, что является общедоступным сейчас, то по
прошествии нескольких лет это определенно потеряет свое значение.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
299
Время, необходимое для регистрации данных, выступает в роли значи-
тельно более важного ограничивающего фактора, особенно если пола-
гать, что скорость переработки информации является основным пре-
имуществом методов фурье-спектроскопии. Причина того, что регистра-
ция выбранного в качестве примера эксперимента потребует 17 дней,
заключается в неправильной формулировке проблемы: мы просто пере-
несли на двумерный случаи те идеи, которые были нормальными для
одномерного спектра.
Выбор времени регистрации и цифрового разрешения для двух
измерений является более важным аспектом задания двумерных экспе-
риментов и требует переосмысления наших представлений о разреше-
нии. Основная мысль, иа которую следует обратить внимание,-это то,
что назначение эксперимента состоит в разрешении индивидуальных
линий в спектре: правильнее сказать, корреляций между группами линий,
представляющими интерес. Это положение станет гораздо яснее, если вы
вспомните, что эксперимент COSY следует сравнивать с гомоядериой
развязкой. Под понятием «разрешение по vp> для серии гомоядерных
развязок следует подразумевать ту степень селективности облучения,
которая вызывает четко различимые изменения в какой-либо части
спектра. Это, возможно, составит величину порядка 40-50 Гц н более,
так что даже «плохо оцифрованный» двумерный эксперимент с раз-
решением 10 Гц на точку имеет заметное преимущество перед своим
одномерным конкурентом. Действительно, неудачные попытки разли-
чить кросс-пнкн редко бывают обусловлены низким уровнем оцифров-
ки эксперимента COSY, при этом более сложные вопросы связаны
с чувствительностью н с тем, может ли быть зарегистрирован
кросс-пик, связанный с константой, заслуживающей особого вни-
мания.
Вначале я хочу высказать предположение, что наша цель заключается
в регистрации всех констант, превышающих некоторый пороговый
уровень, за минимальное время. При этом нам следует определить,
насколько можно уменьшать времена регистрации Atl и Л,2 и интервал
между прохождениями, не понижая в заметной степени чувствитель-
ность или объем информации.
Выбор частоты повторения последовательности прост, если у нас
имеются определенные предположения о величинах 7] для образца.
Поскольку в этом случае используются тг/2-импульсы, оптимальная
чувствительность достигается прн повторении эксперимента через каж-
дые 1,37] с (в предположении, что это ие вызовет проблем нз-за
формирования эха или ложного переноса намагниченности, см. гл. 7,
разд. 7.5.2). Прн таких условиях намагниченность будет находиться
в стационарном состоянии, достаточно далеком от состояния теплового
равновесия. Поэтому для каждого значения 7, необходимо делать
несколько холостых прохождений для установления этого стационар-
ного равновесия. Полезной могла бы быть такая процедура на спектро-
метре, которая уменьшала бы задержку между прохождениями каждый
300
Глава 8
раз. когда увеличивается для того чтобы частота повторения была
согласованной по всему эксперименту.
Время регистрации по ?2 может быть понижено до величины Т% или
даже до несколько меньшего значения без заметной потери чувстви-
тельности, за исключением тех случаев, когда желательно проводить
регистрацию настолько малых констант, что JT*« 1. Этот случай
обсуждается дальше в разд. 8.4.2. Действительно, из-за того, что частота
повторения определяется величиной 7], которая обычно много больше,
чем время регистрации по ?2, как правило, не определяет общей
длительности эксперимента, хотя оно на самом деле определяет размер
массива данных и вследствие этого-время, затрачиваемое на обработку
и графическое представление данных. Ключевым фактором, опреде-
ляющим длительность эксперимента, становится задание Atl (и, сле-
довательно, числа шагов по которые необходимо сделать). Нам
нужно знать, как выбор времени регистрации по влияет на воз-
можность детектирования констант с помощью COSY, другими слова-
ми, на интенсивность кросс-пиков. Поэтому нам следует изучить ряд
факторов, которые на них влияют.
Прежде всего интенсивность кросс-пика, естественно, отражает об-
щую интенсивность сигнала образца. Нормальное поведение характерно
и для отношения снгнал/шум. Если сигнал слишком мал, то ситуация
может быть исправлена, как обычно, путем накопления сигнала. В этом
отношении важно различать координаты t, и t2. В качестве примера
рассмотрим два способа, позволяющие распорядиться всем имеющимся
для проведения эксперимента временем. Одна возможность состоит
в том, чтобы провести относительно немного прохождений для каждого
значения ilt но сделать большое число шагов. Альтернатива заклю-
чается в том, чтобы иметь немного значений но для каждого нз них
сделать большое число прохождений. В обоих случаях общее число
прохождений одинаково, но будут ли равны полученные таким образом
сигналы? Нет, поскольку, по мере того как мы увеличиваем попе-
речная релаксация в конце концов приведет к понижению интенсивности
регистрируемого в течение t2 сигнала. Поэтому основное внимание при
задании эксперимента следует обращать на то, чтобы использовать
минимально возможное число шагов по tt при максимальном числе
прохождений на каждом шаге. Строго говоря, проблема оказывается
сложнее из-за того, что огибающая сигналов в эксперименте COSY
может не соответствовать просто спадающей экспоненте по каждой
координате. Однако для наших целей такое предположение оказывается
оправданным. Для детального ознакомления с этим вопросом см.
работу [6]. Остается определить минимальное число шагов, которое
можно использовать без потери информации.
Исключительно важным фактором в этом случае является проти-
вофазная природа компонент мультиплета. Если линии с противопо-
ложной фазой находятся одна от другой приблизительно на расстоянии
их ширины илн несколько ближе, то будет наблюдаться их взаимное
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
301
ослабление. Вспомнив обсуждение вопроса о вычитании линий лорен-
цевой формы в гл. 5 (разд. 5.3.3), мы найдем, что интенсивность линий
падает в 2 раза, если интервал между линиями составляет 40% от нх
ширины. Я готов принять это в качестве «приемлемой» степени ослаб-
ления; очевидно, вопрос о справедливости такого допущения всецело
зависит от обстоятельств, и вы можете сделать другое предположение.
Линин с другой формой ведут себя по-разному. Так, ситуация оказы-
вается несколько лучшей для линий гауссовой формы, поскольку они
имеют относительно узкий пьедестал. Однако мы не будем проводить
детального анализа н ограничимся лишь постановкой задачи.
Теперь нам предстоит решить, какую величину использовать в ка-
честве оценки ширины линии при определении того, какое расстояние
между линиями соответствует порогу «неприемлемого» ослабления. Эта
оценка не часто будет соответствовать ширине линии, посколько мы
довольно редко можем позволить себе роскошь столь подробно оциф-
ровать спектр. Скорее всего это будет соответствовать тон ширине
нашего сигнала, которую он приобретет для использованного нами
времени выборки данных прн условии правильной аподизации. Хоро-
ший критерий, определяющий, будут ли линии лоренцевой формы иметь
искажения за счет обрезания сигнала во временной области, заключается
в том, что времена регистрации должны быть по крайней мере ЗТ*. Если
он не соблюдается, то мы должны иметь в виду, что взвешивающая
функция несколько уширяет линии (т. е. сокращает кажущееся Т*) до тех
пор, пока критерий не выполнится. Другими словами, для времени
выборки в любом измерении, равном At, мы можем принять эффектив-
ную ширину линии равной 3/пЛ(, т.е. близкой к величине 1/Л(. Если мы
хотим увидеть минимально возможное расщепление противофазных
компонент, составляющее величину Av Гц, то в соответствии с этим
критерием мы должны иметь время выборки данных порядка 1/2,5Av
с (мы требуем, чтобы эффективная ширина не превышала 2,5Av). Это
условие учитывает степень «приемлемого» ослабления, поэтому явля-
ется менее жестким, чем условие Бакса [5], который предложил ис-
пользовать время выборки данных, равное 1/J с, для того, чтобы
с гарантией регистрировать линии, разделенные интервалом J Гц.
Остается неизвестной величина расщепления противофазных пар
линий. В общем случае эту величину совершенно невозможно пред-
сказать, потому что, даже если все константы имеют большие значения,
соответствующие разностные значения могут оказаться малыми. Вза-
имное уничтожение небольшого числа пар линий в мультиплете может
оказаться не существенным, если наличие корреляции можно установить
по оставшимся линиям. Поэтому нам следует оценить то минимальное
расщепление, которое окажется «значимым» (это предположение часто
не выполняется для сложных мультиплетов с близко расположенными
линиями). В качестве наименьшей значимой константы можно взять
произвольную величину; для протонных спектров реалистичная Оценка
этой величины лежит в области 3 Гц. С помощью COSY при соот-
302
Глава 8
ветствующем подборе параметров можно регистрировать значительно
меньшие по величине константы, но здесь я имею в виду рутинное
приложение метода. Подставляя это число в выведенную выше формулу
для времени выборки данных, мы получим минимальное значение
Л(1 примерно 130 мс. Для обычных протонов значения Гх и Г* состав-
ляют около 1,5 и 0,3 с (линия шириной 1 Гц типична для молекул
среднего размера). Затем мы можем выбрать At порядка 300 мс
и частоту повторения - одно прохождение каждые 2 с.
Этн выкладки предназначены только для того, чтобы проиллюстри-
ровать ход мысли при задании параметров эксперимента. Легко пред-
ставить мотивы, на основании которых следует уменьшать или увели-
чивать параметры. Например, форма линии редко бывает лоренцева,
потому что даже для фазочувствнтельных спектров вероятно исполь-
зование в каком-либо виде гауссова окна. Это сделает возможным
дальнейшее понижение Alt без заметной потери интенсивности. Во
всяком случае, при решении практических задач наши оценки «прием-
лемого» ослабления и минимально возможного расщепления могут
быть переосмыслены. Для образцов, дающих интенсивный спектр,
может быть вполне приемлемым ослабление более чем в 2 раза. Важно
заранее представить себе то, что мы хотим зарегистрировать, и по-
пытаться оценить необходимое цифровое разрешение. На практике
обычно хотят побыстрее записать возможный спектр в качестве стар-
товой точки исследования. Более тонкие эксперименты, возможно, на
более узких полосах частот, можно провести позднее, учитывая резуль-
таты, полученные в первом эксперименте.
При этом следует сделать одно предостережение. Многие практи-
ческие аспекты двумерной спектроскопии ЯМР разрабатывались иссле-
довательскими группами, изучающими белки. Для таких молекул общий
спектр является чрезвычайно сложным, однако он построен из хорошо
определенных субъединиц: спектров аминокислот. Спектры аминокис-
лот содержат не так много типов мультиплетов, как правило, с довольно
большими расщеплениями линий и короткими временами релаксации Т2
(когда они встроены в молекулу белка). Для этих случаев подходят очень
небольшие значения Я, . В спектрах обычных органических молекул
расщепления и ширины линий изменяются в более широких пределах,
поэтому простое использование рецептов задания параметров в после-
довательности COSY, полученных в экспериментах с белками, вряд ли
даст хороший результат. Прн планировании эксперимента здесь нужно
учесть данные одномерного спектра.
Сколько это займет времени? Сейчас мы (наконец-то!) подошли
к вопросу о том, сколько времени может потребоваться для регистрации
типичного спектра COSY. Рассмотрим опять изученный ранее случай
спектра шириной 10 м.д. при 500 МГц (будем, однако, иметь в виду, что
необходимость записывать весь диапазон 10 м. д, возникает не часто).
В соответствии с критерием Найквиста нам нужно для инкремента по
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
303
иметь значение 0,2 мс (с квадратурным детектированием), поэтому,
чтобы получить время регистрации 130 мс по этой координате, мы
должны сделать 650 шагов. Если использовать 6 прохождений на
каждый шаг (2 холостых плюс 4 реальных) и частоту повторения 2 с на
прохождение, то эксперимент займет около 2 ч (существенное улучшение
по сравнению с 17 днями!). Данный случай можно рассматривать как
самый неблагополучный, поскольку здесь используется широкий спект-
ральный диапазон и высокая частота спектрометра. Обычно результаты
могут быть получены значительно быстрее. Например, возьмем спект-
ральный диапазон 5 м. д. (на практике это довольно часто оказывается
приемлемым, особенно если исключить некоторые отдельно стоящие
-сигналы, как обсуждается в разд. 8.3.4), и пусть частота спектрометра
будет равна 200 МГц. Нам потребуется 130 шагов длительностью 1 мс,
а эксперимент займет примерно 25 мни. Прн изучении образцов, даю-
щих интенсивные липин спектра, и при переходе к гауссовой форме
линии эту величину, несомненно, можно сократить на 50% или более
(т.е. 64 инкремента по rlt время эксперимента 10 мин) без потерн
информации. Сколько вы успеете за это время поставить и накопить
гомоядерных экспериментов двойного резонанса? По мере того как
возрастает сложность задачи, эксперимент COSY начинает очень быстро
превосходить своего одномерного конкурента.
Из обсуждения этого вопроса следует, что разумно уменьшить число
прохождений для каждого инкремента до абсолютного минимума.
Есть два обстоятельства, когда это становится невозможным. На неко-
торых спектрометрах попытки использовать процедуру CYCLOPS при
циклировании фазы могут вызывать появление дополнительных арте-
фактов; на это следует обратить внимание инженера по обслуживанию
приборов. Важно, что реальная чувствительность эксперимента может
оказаться слишком низкой и потребуется дополнительное накопление.
На первый взгляд может показаться, что для сильных сигналов будет
достаточно о(раничиться только четырьмя прохождениями на инкре-
мент, но в действительности это не так. Мы не должны забывать, что все
сигналы ССИ по имеют вклады в окончательный преобразованный
спектр. Первый из описанных выше экспериментов содержит в общей
сложности 2600 прохождений. Это не совсем эквивалентно регистрации
одномерного спектра с таким же числом прохождении из-за того, что,
как упоминалось выше, для более поздних шагов по сигнал будет
меньше, а также нз-за того, что весь сигнал распределен в двумерном
спектре по большему числу пиков, но тем не менее чувствительность
довольно высока. Для протонного эксперимента на современном спект-
рометре с большой рабочей частотой обычно достаточно нескольких
миллиграммов вещества средней молекулярной массы для того, чтобы
пользоваться минимальным числом прохождений. Если вы будете улуч-
шать разрешение или попытаетесь регистрировать малые константы, то
чувствительность быстро упадет, поскольку нужно будет накопить
много спектров, да еще к тому же для больших значений /х. Это пример
304
Глава 8
извечного н характерного для всех форм спектроскопии баланса чув-
ствительности и разрешения.
Теперь мы можем также получить представление о том, какого типа
проблемы возникают при проведении эксперимента COSY. Для спектра
с диапазоном 5 м. д. на 200 МГц потребуется провести регистрацию 300
точек для получения по координате t2 времени выборки данных 300 мс.
Поскольку это время не очень критично влияет на общее время экспе-
римента, вероятнее всего, мы округлим его до ближайшего целого
делителя числа 1024(1 К), т.е. 0,5 К, При квадратурном детектировании
(по t2) регистрируются комплексные точки, следовательно, это соот-
ветствует 1 К слов реальной памяти машины. У нас 130 шагов по
и мы для каждого шага получаем реальную и мнимую части, поэтому
для хранения нам потребуется помнить 2 -130 -1 К чисел. Хранить этот
массив данных, вероятно, можно на диске, что в целом предпочти-
тельнее, а можно и непосредственно в памяти машины. Для того чтобы
улучшить четкость представления сигналов, мы могли бы один или
несколько раз дополнить спектр нулями. Например, дополнение нулями
до 1 К комплексных точек по t2 и до 0,25 К комплексных точек по
означает, что нам будет нужно выполнить преобразование массива
данных емкостью 1024 К (реальных) слов, если мы хотим сохранить все
четыре фазовых квадранта. При этом квадрант (реальный, реальный),
используемый для графического представления, будет содержать 256 К
слов. Если мы провели регистрацию эквивалентного эксперимента
с использованием фильтра типа эха, то нам потребуется несколько
меньший объем памяти: 130 шагов по llt как и раньше; однако для
каждого инкремента запоминается только один спектр, что приводит
к массиву данных во временном представлении в 2 раза меньшего
объема. Общее время регистрации данных останется таким же потому,
что для достижения равного отношения сигнал/шум требуется на каж-
дый инкремент в 2 раза больше прохождений. Расчет магнитуды после
преобразования еще уменьшает в 2 раза количество данных за счет
отбрасывания мнимой части по v2; поэтому в итоге мы получаем массив
данных, равный по величине части (реальный, реальный) фазочувстви-
тельного эксперимента.
Цифровое разрешение для каждого нз этих экспериментов составляет
3,9 Гц на точку по v1 и 1 Гц на точку по v2. Отметим, что цифровое
разрешение по v2 совсем не столь плохое и может быть еще допол-
нительно улучшено ценой небольшой потери времени. Это обычно
наиболее продуктивный путь в тех случаях, когда требуется детальное
разрешение мультиплетной структуры. При этом разрешение по
требуется делать настолько высоким, чтобы можно было различить
скоррелированные мультиплеты, а затем брать сечения по координате v2
для их детального анализа. Использование столь сильно различающихся
уровнен оцифровки по vt и v2 оказывается эффективным прн учете как
фактора времени, так и чувствительности. Однако это служит пре-
пятствием для разумного использования популярного искусственного
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
305
приема прн обработке данных, известного под названием симметри-
зации. Достоинства и недостатки этого приема обсуждаются в
разд. 8.3.6.
Еще раз о переносе намагниченности. В конце данного «технического»
раздела я, как и обещал, хочу вернуться к более детальному изучению
вопроса о том, что происходит во время действия второго импульса. До
сих пор мы весьма бойко говорили о намагниченности и переносе
намагниченности, но все время обходили стороной саму концепцию, не
предпринимая попыток разобраться в ней. Ясно, что без привлечения
подходящей квантовомеханической модели невозможно дать детальное
описание этих понятий, а в особенности более общей концепции ко-
герентности. По этой причине именно здесь обычно заканчивается не
содержащее математических выкладок повествование о спектроскопии
ЯМР, а на смену ему приходит заполняющая эту область атмосфера
таинственности. Однако, хотя детали и будут ускользать от нас, мы
сосредоточим свое внимание на определенных физических оценках яв-
ления. Эти понятия настолько важны для современного ЯМР, что, мне
кажется, стоит попытаться объяснить нх в самых простых выражениях.
Надеюсь, вы поймете, что я хочу лишь стимулировать ваше лю-
бопытство, а не удовлетворить его. Существует много подробных
н полных описаний теории ЯМР для тех, кто найдет этот вопрос
интересным.
Когерентность является центральной концепцией, которую нам не-
обходимо понять. Это обобщение понятия намагниченности, которое
мы будем использовать для обозначения соотношений между состоя-
ниями, связанными одним ядерным переходом. Оно необходимо для
того, чтобы описывать определенные соотношения между состояниями
различных переходов. Для начального знакомства с понятием коге-
рентности рассмотрим различие между насыщенным переходом ЯМР
(нлн переходом, только что оказавшимся в магнитном поле) и таким
переходом, на который только что подействовали тг/2-импульсом. Ни
в одном нз этих случаев нет компоненты намагниченности по оси z; это
означает, что заселенности состояний аир равны. В чем же тогда их
различие? Насыщенному переходу вообще не соответствует никакая
намагниченность. Для перехода, на который подействовали тг/2-им-
пульсом, компонента намагниченности прецессирует в плоскости х —
Это является следствием того, что х — ^компоненты намагниченности
в образце прецессируют вместе и с той же самой фазой. Эта фаза была
придана им действием импульса. Мы будем говорить, что в образце
с насыщенным переходом ядра прецессируют некогерентно (т, е, со
случайной фазой); в образце, на который подействовали импульсом,
возникла фазовая когерентность между состояниями а й 0.
Когерентность, связанная, как в нашем случае, с одним переходом,
называется одноквантовой и приводит к такой прецессии макроско-
пической намагниченности, которая может быть зарегистрирована в
20 75
306
Г лава 8
форме сигнала ЯМР. Раз существуют такие фазовые соотношения между
двумя уровнями, то онн в свою очередь могут быть преобразованы
в какую-то другую форму действием последующих импульсов. Это
проще всего понять на импульсах, действующих селективно на инди-
видуальный переход, так как мы должны одновременно думать только
об одном. В качестве примера снова возьмем систему АХ (рнс. 8.6)
и предположим, что первоначально прн действии селективного я/2-им-
пульса возникла когерентность, соответствующая переходу Аг Если
затем после этого импульса мы подействуем л-импульсом на переход
Xj, то тем самым мы перенесем фазовую информацию, которая при-
сутствовала в состоянии (а₽), к состоянию (рр); это состояние приоб-
ретет когерентность с состоянием (аа). Эти два состояния отличаются на
2 по значению квантового числа М; поэтому когерентность такого типа
называется двухквантовой. Когерентность, соответствующая ДМ,
равной 0 илн (для более сложных спиновых систем) 3, 4 и т.д.,
аналогично называется нуль-, трех- или четырехквантовой когерент-
ностью н т.д. Ни одни из этих типов когерентности не приводит
непосредственно к наблюдаемой намагниченности. Только однокван-
товая когерентность может приводить к ней как соответствующая
квантовомеханнческому правилу отбора ДМ = ± 1.
Вскоре я вернусь к обсуждению вопроса о значении многоквантовой
когерентности, но сейчас еще немного проследим за тем, к каким
последствиям приводит действие второго импульса эксперимента COSY.
В приведенном выше примере действие л-нмпульса на переход Хх
является в некотором смысле особым случаем, поскольку переводит всю
когерентность, соответствующую переходу Ап в двухквантовую. Для
импульсов другой длительности, например тг/2, не вся фазовая инфор-
мация, представленная в состоянии (ар), переводится дальше, поэтому
некоторая доля (одноквантовой) когерентности сохраняется в исходном
состоянии, другая переводится в двухквантовую когерентность, а также
возникает новая одноквантовая когерентность, соответствующая пере-
ходу ХР Именно эта последняя когерентность является результатом
того процесса, который мы называем «переносом намагниченности»
и который следовало бы называть переносом когерентности. Эта ком-
понента ответственна за появление кросс-пиков.
Конечно, в реальном эксперименте мы не действуем селективными
импульсами на одиночные переходы, а работаем с обычными неселек-
тнвными импульсами. Мы можем примириться с этой ситуацией,
представив себе, что неселектнвный импульс состоит нз последователь-
ности (обычно называемой каскадом) селективных импульсов, действую-
щих быстро на все переходы по очереди. Таким образом, точно так же
как фазовая информация состояния (ар) частично перенесена к состоя-
нию (рр), аналогичные процессы происходят для всех других пар
состояний. Поэтому второй импульс потенциально перераспределяет
намагниченность между всеми возможными когерентностями спиновой
системы. Для спиновой системы АХ это соответствует не только
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
307
четырем одноквантовым когерентностям, но также н нуль- и двух-
квантовой когерентности. Значения и J, а также длительность второго
импульса определяют долю когерентности, перенесенной к каждому
состоянию. Относительно простое обсуждение данного вопроса можно
найти в книге [5] (разд, 2.3.3 н приложение III). Однако детали этого для
нас не столь важны, поскольку мы будем иметь дело с качественной
картиной такого перераспределения.
При первом знакомстве когерентности, отличные от одноквантовой,
могут показаться несколько загадочными категориями, поскольку не
имеют прямых физических проявлений. Однако они имеют достаточно
хорошо определенные свойства, а манипуляции с ними могут приводить
к полезным результатам. Прн действии через некоторое время третьего
импульса на спиновую систему мы можем еще раз перетасовать ко-
герентности. В результате ненаблюдаемые нуль-квантовые и многокван-
товые когерентности, которые до этого времени совершали эволюцию
по своим законам, могут быть переведены в состояние наблюдаемой
одноквантовой когерентности. Эта идея является основой для целой
серии экспериментов; некоторые из ннх будут обсуждаться ниже. В лю-
бом из этих экспериментов центральной проблемой считается проблема
выделения из большого числа сигналов, возникающих в конце импульс-
ной последовательности, тех, которые прошли через состояние много-
квантовой когерентности желаемого уровня. Практическая реализация
этого основана на том факте, что фаза сигналов, возникающих при
обратном переносе нз состояния /^квантовой когерентности в одно-
квантовую, в р раз чувствительнее к фазовым сдвигам импульсов,
вызывающих этот перенос, чем фаза непосредственно возбуждаемой
одноквантовой когерентности. По этой причине построенные подхо-
дящим образом фазовые циклы для импульсов и приемника могут
проводить разделение различных путей переноса когерентности, по
которым система проходит к конечной наблюдаемой нами прецессии
намагниченности в плоскости х — у. Изучение путей переноса коге-
рентности привело к исключительно элегантному н важному в практи-
ческом плане методу конструирования подходящих фазовых циклов для
многоимпульсных экспериментов, предложенному независимо Эрнстом
н Бэйном. К сожалению, обсуждение этого вопроса увело бы нас сильно
в сторону (см., однако, работы [9, 10] в гл. 4).
8.3.6. Работа с COSY
Мне кажется, что основная идея использования недиагональных
пиков спектра COSY с целью определения пути передачи спин-спннового
взаимодействия достаточно проста, поэтому я не буду более докучать
вам объяснением этого вопроса. Лучший способ научиться легко ис-
пользовать этот эксперимент заключается в том, чтобы как можно
быстрее прописать вначале несколько спектров, желательно для таких
соединений, в которых сигналы легко относятся другими методами.
20*
308
Глава 8
Если работать на минимальном уровне оцифровки, как обсуждалось
в предыдущем разделе, то выполнение этих экспериментов займет не так
много времени, и вы без труда получите примеры для ваших упраж-
нений. В связи с этим я не буду в дальнейшем рассматривать рутинные
спектры, подобные приведенным в разд. 8.3.4. Вместо этого в данном
разделе я хочу дать обзор ряда характерных особенностей или проблем
метода COSY, с которыми вы можете столкнуться. К числу наиболее
важной и до последнего времени редко используемой относится ин-
формация, которую несет относительная фаза кросс-пиков в фазо-
чувствительном варианте. В категории «проблем» будут рассмотрены
разнообразные артефакты, характерные для двумерной спектроскопии;
с некоторыми из них мы уже имели дело.
Использование фазовой информации. Оба представленных в разд. 8.4.3
спектральных примера были зарегистрированы с использованием фильт-
ра типа эха в форме магнитуды. Если мы сравним этот эксперимент
с серией гомоядерных развязок и на время забудем об одной важной
практической проблеме, связанной с последним методом,-проблеме
селективности, то оказывается, что двумерный эксперимент имеет один
важный недостаток. Этот спектр не несет информации о том, какал
константа ответственна за появление какого-либо частного кросс-пика.
Это значит, что если каждый из приведенных сигналов, между которыми
есть кросс-пик, проявляет также и другие расщепления, то не существует
способа для определения того, какая из констант ответственна за
корреляцию, кроме тех случаев, когда эта константа имеет значение,
сильно отличающееся от всех других, и разрешается визуально. Но так
или иначе в этом случае мы могли бы определить ее в одномерном
спектре. В случае эквивалентного эксперимента с развязкой будет не так,
поскольку для систем первого порядка соответствующее расщепление
исчезнет в наблюдаемом мультиплете, если мы облучим его партнера.
Это существенный недостаток, но, к счастью, он не характерен для
фазочувствительного эксперимента - и это еще одна причина, почему
следует предпочитать фазочувствительный эксперимент. Для того чтобы
увидеть, как извлекать эту дополнительную информацию, нам потре-
буется несколько более сложный пример, чем система АХ, изображенная
на рис. 8.25. Для этих целей годится 2,3-дибромпропионовая кислота (3),
излюбленное тестовое соединение для спектроскопистов, занимающихся
двумерным ЯМР. Его фазочувствительный спектр представлен на
рис. 8.26. Этот спектр получен с высоким и, что необычно, с одинаковым
цифровым разрешением по обоим измерениям для того, чтобы избежать
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
309
Рис. 8.26. Фазочувствитс.тьный COSY для системы АМХ (положительные и отри-
цательные контуры показаны красным и черным). В нижней части рисунка,
изображающей одномерные спектры, сравниваются обычный одномерный спектр
высокого разрешения (внизу) с одномерным спектром, полученным с тем же
временем выборки и такой же взвешивающей функцией, как и в двумерном
эксперименте (в центре), а также с сечением двумерного спектра по строке,
отмеченной стрелками на контурном представлении (вверху).
некоторых рассматриваемых ниже недоразумений. Поскольку это трех-
спиновая система АМХ, каждая пара протонов является скоррелирован-
ной и каждый кросс-пик далее проявляет расщепление на третьем
протоне. Для каждого такого случая мы хотим определить, какая
константа ответственна за появление кросс-пика. Мы будем называть ее
активной константой, а остальные константы -пассивными.
310
Глава 8
Для того чтобы это сделать, мы возьмем за основу фазовые соотно-
шения в системе АХ и затем представим, что кросс-пики модельной
системы АХ с характерными противофазными дублетами расщеплены
пассивными константами без дополнительного изменения фазы. Тогда
мы можем отличить расщепление, соответствующее активной констан-
те, определив, какие компоненты кросс-пика проявляются в противо-
фазе. Возьмем, например, кросс-пик между Н1 и Н3 (правый нижний
угол на рис. 8.26). При прохождении через мультиплет по направлению
оси v2 фаза альтернирует для меньшего расщепления и остается неиз-
менной для большего. Поэтому малое расщепление соответствует ак-
тивной константе (т.е. J13), а большое - константе взаимодействия с Н2.
Действительно, поскольку мы проходим через мультиплет в направле-
нии v2, он должен соответствовать Н,. а константа-JI2. В этом примере
образы, соответствующие модельной системе АХ, легко обнаружи-
ваются при прохождении через каждый из четырех квартетов мульти-
плета параллельно и v2, и V,. Естественно, что тот же результат
получается при движении через кросс-пик параллельно V,, но теперь
второе расщепление соответствует J23, или при изучении кросс-пика
в левом верхнем углу. Однако заметим, что дело будет обстоять таким
образом, только когда цифровое разрешение одинаково по обеим
координатам. Ниже мы рассмотрим, что происходит, если это условие
не выполняется. В качестве примера убедитесь в том, что рассмотрение
оставшихся кросс-пиков дает самосогласованную систему отнесения
констант.
В более приближенном к реальной жизни случае у нас уже не будет
возможностей достичь столь высокого уровня оцифровки, при этом
более низкое цифровое разрешение мы будем иметь скорее по vt, нежели
по v2. На рис. 8.27 приведен фазочувствительный спектр соединения 1 из
разд. 8.3.4, полученный в таких условиях. В этом случае еще возможно
определить фазовые соотношения из контурного представления спектра
(см. справа на рисунке растяжку мультиплета). Однако, по мере того как
возрастает сложность задачи, более полезным становится изучение
сечений, записанных как одномерные спектры. При этом, конечно,
сечения следует делать по v2, поскольку в данном случае цифровое
разрешение выше. В качестве примера на рисунке приведено сечение,
проходящее через Н2а параллельно v2. В этом сечении легко иденти-
фицируются все активные константы, как указано на рисунке. Некоторое
осложнение возникает только в случае кросс-пика между Н2а и Н1а. При
этом близость значений двух констант вызывает почти полное исчезно-
вение центральных компонент мультиплета, что дает ложный противо-
фазный дублет. Величина расщепления между линиями соответствует
удвоенной константе, поэтому истинный партнер слабопольной компо-
ненты должен бы проявляться в центральной части мультиплета, как
отмечено скобкой на рисунке. Таким образом, фазочувствитсльный
эксперимент дает полное отнесение спиновой системы; этот спектр был
зарегистрирован в течение 1,5 ч.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
311
И
Н„ Ни
Рис. 8.27. Реальный фазочувствитсльный спектр (фрагмент спектра соединения 1),
зарегистрированный со следующими параметрами: времена регистрации-487 ме-
ло t2 и 122 мс по г, (512 инкрементов); спектральная полоса 2100 Гц по обеим
координатам; дополнение нулями до 4 К (действительных) слов по v, и 1 К по V.,
что приводит к цифровому разрешению 1 Гц на точку (v2) и 4 Гц на точку (у,).
Для этого соединения время регистрации по Г, слишком мало, и это проявляется
в относительной слабости кросс-пика протона Н2,, который представляет собой
мультиплет с малыми расщеплениями. Отметим запутывающий картину эффект
дисперсионных диагональных кросс-пиков (см. также рис. 8.37). Над спектром
показано сечение по v2, проведенное по месту, отмеченному стрелками.
312
Глава 8
Рис. 8.28. Нормальный протонный спектр соединения 4 (Л) и сечения фазо-
чувствительного спектра COSY, проходящие параллельно v2 через положение
химического сдвига метильной группы (Б) и протона СН (5) в vP Строка
Б показывает характерный вид кросс-пика, возникающего при наличии взаимо-
действия с тремя эквивалентными ядрами.
Когда спин-спиновое взаимодействие с группой эквивалентных ядер,
как, например, для кросс-пика, соответствующего корреляции одиноч-
ного протона и метильной группы (система А3Х), наблюдается такая
картина альтернирования фазы, как если бы в группе ядер одно было бы
активным, а остальные-пассивными. Например, для нашей системы
А3Х, если представить себе, что Х-часть проявляет сначала противо-
фазное дублетное расщепление за счет активной константы, а затем
каждая из этих линий еще дважды расщепляется без изменения фазы за
счет двух других констант АХ (конечно, с той же самой величиной
константы спнн-спииового взаимодействия), мы получим в итоге четыре
линии с соотношением интенсивностей 1:1:— 1: — 1. Это видно в
спектре соединения 4 на рис, 8,28,
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
313
сн3
сн3
о
4
Точно так же как соотношения интенсивностей для спин-спинового
взаимодействия с группой эквивалентных ядер по правилам первого
порядка в обычных спектрах описываются с помощью треугольника
Паскаля:
1
1 1
1 2 1
13 3 1
14 6 4 1
1 5 10 10 5 1
и т.д., мы можем записать «противофазный треугольник» для исполь-
зования в спектрах COSY:
1
1 -1
1 0 -1
1 1-1-1
1 2 0-2-1
1 3 2 -2 -3 -1
и Т.д.
Измерение констант спин-сппиового взаимодействия. Если хотя бы по
одной координате цифровое разрешение является адекватным, то экспе-
римент COSY представляет собой удобный метод определения величины
расщепления для тех случаев, когда из-за сильного перекрывания сиг-
налов возникают сложности с их интерпретацией. Прн этом мы исполь-
зуем то обстоятельство, что сигналы распределены по двум коорди-
натам, а это увеличивает вероятность разделения перекрывающихся
мультиплетов. Измерения могут быть просто проведены для сечений по
v2 при условии, что линии отстоят одна от другой на величину, большую,
чем эффективная ширина линии. В тех спектрах, в которых линии имеют
ту же самую фазу (т.е, в обычных одномерных спектрах), линии вовсе не
разрешаются, если они отстоят одна от другой на величину, значительно
меньшую ширины линнн. Однако для противофазных дублетов, как мы
уже знаем, линии остаются разрешенными, и только их интенсивность
падает. К сожалению, опасно использовать расстояние между пиками
для таких слабо расщепленных противофазных дублетов в качестве
оценки истинного расстояния между линиями, поскольку эти линии
имеют тенденцию к «взаимному уничтожению», При этом наблюдаемое
314
Глава 8
Истинное расщепление ( часть ширины линии)
Рис. 8.29. Соотношение между наблюдаемым и истинным расщеплением линий
для перекрывающихся в противофазе лоренцевых линий равной ширины.
расстояние между пиками стремится в пределе к значению ЗуД/З, где
8v- ширина линии на полувысоте (см. гл. 5).
Поскольку в спектрах COSY эффективная ширина линии может
оказаться довольно большой из-за ограничений, обусловленных оциф-
ровкой, этот фактор может вызвать большие неудобства. Если известна
ширина линии, то можно использовать график (рис. 8.29) для исправ-
ления полученных оценок. При этом, однако, следует иметь в виду, что
измерение будет связано со значительной ошибкой, которая быстро
возрастает по мере того, как уменьшается расстояние между линиями.
Поскольку цифровое разрешение по vx в общем будет ниже, бесполезно
пытаться проводить измерения в сечениях спектра по этой координате.
Альтернативным методом для расшифровки перекрывающихся мульти-
плетов является гомоядерная J-спектроскопия, которая обсуждается
в гл. 10. Однако этот метод имеет то неудобство, что дает простые
результаты исключительно для систем первого порядка.
Исчезновение кросс-пиков. Регистрация кросс-пика между двумя яд-
рами надежно указывает на то, что онн являются связанными (един-
ственное исключение обсуждается ниже в параграфе «Симметризация»),
В то же время отсутствие кросс-пика следует воспринимать с осто-
рожностью. В этом случае отсутствие взаимодействия, естественно,
является наиболее вероятной причиной, ио возможны и другие вариан-
ты. С большинством из них мы уже имели дело, но поскольку иногда
немного трудно преодолеть искушение и не делать далеко идущие
выводы из отсутствия корреляции, я решил собрать здесь вместе все эти
случаи для того, чтобы подчеркнуть сложность проблемы.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
315
Прежде всего необходимо уточнить, что означает «отсутствует». На
практике при этом обычно подразумевается, что представляющий ин-
терес кросс-пик расположен ниже нижнего контура, выводимого на
график, или в пределе ниже уровня шума в спектре. Таким образом, нет
ясного порогового уровня, на котором корреляция исчезает; конечно,
чем слабее сигнал, тем с меньшей вероятностью мы можем его наблю-
дать, Все факторы, понижающие интенсивность кросс-пиков, могут,
следовательно, способствовать нх исчезновению. Можно выделить че-
тыре важных фактора: величина константы спин-спинового взаимо-
действия, ослабление противофазных дублетов из-за неадекватного эф-
фективного цифрового разрешения, неправильное задание параметров
взвешивающей функции и огибающей ССИ, что происходит при на-
личии сильно различающихся значений Т2, н неоптнмальиое задание
частоты повторения, что бывает прн наличии сильно различающихся
значений 7j.
Отмечу, что величина константы возникает здесь дважды. Она будет
определять ослабление противофазных дублетов. Можно также пока-
зать, что степень переноса намагниченности между ядрами с константой
J пропорциональна величине
е sin (rcJzJ (8.3)
поэтому для очень небольших констант сигнал ослабляется поперечной
релаксацией. Из этого фундаментального свойства вытекает, что кор-
реляция через малые константы всегда будет слабой. Что считать
«малой константой», будет, очевидно, зависеть от величины Т2 или,
другими словами, от ширины линии. Оптимизация измерений малых
констант обсуждается в разд, 8,4.2.
Осложнения, вызываемые неправильным использованием взвеши-
вающих функций, проявляются в большей степени при использовании
магнитудного представления нз-за того, что прн этом возникает необ-
ходимость сильного улучшения разрешения. Поскольку этот вопрос уже
обсуждался ранее, я лишь еще раз укажу, что это, по-видимому, является
наиболее общей причиной потери кросс-пика. Ядра, участвующие в хи-
мическом обмене (протоны NH или ОН), вероятнее всего, могут попасть
в ловушку такого типа. Подобные сигналы и в одномерных спектрах
часто не обнаруживают констант. Для фазочувствительных спектров
подбор параметров функции окна производится таким же образом, как
н в одномерных спектрах, в зависимости от того, требуется ли улучшить
отношение сигнал/шум или разрешение. Однако прн этом больше
внимания следует обращать иа процедуру аподизации. Это необходимо
нз-за того, что ССИ с большой вероятностью обрезан (особенно по уД
а также в силу того, что в спектре, где есть как положительные, так
н отрицательные сигналы, боковые лепестки, обусловленные неточной
аподизацией сигнала, могут приводить к недоразумениям, особенно
в случае контурного представления.
316
Глава 8
Для протонов в обычных органических растворителях не характерно
сильное изменение значений Тг (особенно, если используются недегази-
рованные растворы), однако возможность этого в принципе следует
предусмотреть. В параграфе, посвященном цифровому разрешению
и временам выборки данных (см. разд. 8,3.5), предлагается использовать
частоты повторения порядка 2 с, хотя это и несколько заниженная
оценка. Часто вы, не задумываясь, можете воспользоваться этим зна-
чением и быстро получить желаемую информапию. Но если вы присту-
паете к работе с сильно разбавленными растворами, то стоит с большим
вниманием изучить вопрос о частоте повторения (см. гл. 7).
Шум в двух измерениях. Двумерные спектры содержат случайный
шум, возникающий главным образом за счет тепловых шумов в датчике
и начальных каскадах приемника. Он имеет ту же природу, что и шум
в одномерном спектре, и в эксперименте COSY при наблюдении про-
тонов становится значимым лишь при достаточно слабых сигналах
в спектре. Значительно больше неприятных осложнений возникает из-за
случайной интерференции сигналов, зависяшей от способа проведения
эксперимента, Поскольку интерферограммы, образующие координату
получаются как результат большой серии экспериментов, разно-
образные нестабильности аппаратуры могут вызывать ложные модуля-
ции сигнала. Представим, например, что произойдет, если импульсы,
используемые для возбуждения сигнала, были ие всегда одинаковыми по
длительности или интенсивности. Тогда амплитуда сигналов в период
будет меняться нежелательным для нас образом, приводя в итоге
к появлению случайных частотных компонент по этой координате.
Аналогично этому появление ложной частотной модуляции может быть
вызвано любой нестабильностью отношения поля к частоте, возни-
кающей из-за недостаточной эффективности системы стабилизации, или
если прибор подвергается внешним воздействиям. Эти эффекты, а также
множество других [7], которых так много, что иногда кажется удиви-
тельным, что эксперимент вообще работает, приводят к явлению,
называемому шумом по tY.
Характеристики шума по t, несколько отличаются от характеристик
обычного теплового шума. Они обусловлены нестабильностями, воз-
никающими при построении длинных интерферограмм по и поэтому
наблюдаются только по координате vt. Более того, поскольку эти
нестабильности должны промодулировать какой-нибудь сигнал для
того, чтобы проявиться в виде шума, они возникают только в сечениях,
соответствующих сигналам, и пропорциональны амплитуде этих сиг-
налов. Практическим следствием этого является то, что сильные диа-
гональные пики, такие, как сигналы метильных групп или раствори-
телей, сопровождаются шумовой дорожкой, направленной по коорди-
нате Vj. Обычно это более чем неприятный источник интерференции
сигналов в двумерных спектрах (рис. 8.30). Будет это представлять
проблему или нет, зависит от относительной величины интересующих
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
317
Рис. 8.30. При очень высоком пороговом уровне (слева) полоса шума по
проявляется только для сильного сигнала при 2,8 м. д., однако при записи спектра
с более низким пороговым уровнем (справа) шумовые дорожки обнаруживаются
для всех сигналов.
нас кросс-пиков и наибольшего шума по Если кросс-пики достаточно
велики, то можно подобрать уровень самого низкого контура так, чтобы
он был выше уровня шума по tt.
Многие из источников шума по t1 определяются конструкционными
особенностями спектрометра, поэтому теперь у вас нет возможностей
избавиться от того, что вы получили. Однако важно быть уверенным
в том, что шум не возрастет еще больше в результате ошибок оператора,
и следует принять определенные предосторожности. Это очень похоже
иа оптимизацию условий для регистрации серии разностных спектров
ЯЭО, детально обсужденных в гл. 5, Короче говоря, важными фак-
торами являются наличие узкой и сильной линии для канала стаби-
лизации, а также хороший контроль за окружающей спектрометр
обстановкой. Если для каждого значения регистрируется много
прохождений, что бывает относительно редко для спектров COSY, то
полезно распределить их по всему периоду регистрации, построив
эксперимент из нескольких циклов и повторяя измерения для каждого
значения в разное время. Это поможет устранить долговременные
нестабильности,
Отражение в двух измерениях. Если сигналы находятся на частотах за
границами спектрального диапазона, определенного нашей скоростью
выборки данных по какой-либо координате, то они, как обычно, появят-
ся отраженными. В этом отношении принципиальной разницы между
одномерной спектроскопией и двумерной нет. Однако существуют
некоторые различия в практическом плане. В двумерном эксперименте
вероятность попадания сигналов за пределы спектральной полосы
намного больше, поскольку мы всегда стремимся минимизировать
318
Глава 8
размер массива данных, обрезая спектральный диапазон. Если сигналы,
возникающие от неперенесеипой намагниченности, являются отражен-
ными, то пики расположены на диагонали, но не на своем месте; обычно
не составляет проблемы проследить за ними. Значительно больше
недоразумений возникает из-за сигналов, соответствующих переносу
намагниченности, поскольку они в принципе могут отразиться по любой
из двух координатных осей. Положение, которое займут отраженные
пики на одной или двух координатных осях, зависит не только от того,
насколько их истинные частоты превышают относительные частоты
Найквиста, но и от тонких деталей метода квадратурного детектиро-
вания по каждой из координат. Таким образом, достаточно сложно
предсказать положение отраженного кросс-пика, и, по-видимому, луч-
шим способом получить представление о том, как это происходит,
является проведение пробного эксперимента на конкретном спектро-
метре. По описанным ниже причинам сигналы, отраженные по vx, будут
больше, чем отраженные по v2.
В случае COSY нет оснований делать различными ширины полос по
координатам Vj и v2, если только вы не пытаетесь умышленно сэко-
номить место, используя отражение по vb как это делается в экспе-
рименте, называемом FOCSY [8], Следовательно, партнер (по другую
сторону от диагонали) кросс-пика, отраженного по vt, отразится и по v2.
Однако вследствие различий способов регистрации в периоды 1Л и t2
интенсивности сигналов, отраженных по vt и v2, различаются, Для
координаты v2 полосовой фильтр спектрометра ослабляет сигналы,
лежащие за пределами спектрального диапазона, и если они располо-
жены далеко, то могут полностью исчезнуть. Одиако по координате
такой фильтрации не происходит, поэтому отраженные по этой коор-
динате сигналы сохраняют свою полную интенсивность. Это иллюстри-
руется рис, 8.31 для системы АХ.
Симметризация. Как шум по так и отраженные кросс-пики могут
быть ослаблены по интенсивности с помощью вычислительной процеду-
ры, называемой симметризацией. Большинство пакетов спектральных
программ представляет такую возможность, и ее использование стало
очень популярным. Это не совсем хорошо; пользоваться симметриза-
цией следует с предельной осторожностью. Оиа оказывается несомненно
полезной в некоторых особых случаях, хотя и в этих случаях в спектре
могут возникать неоднозначности, что легко обнаруживается при изу-
чении данной процедуры.
Симметризация использует то обстоятельство, что в COSY (и в не-
которых других экспериментах) истинные сигналы симметричны отно-
сительно диагонали, т.е, кросс-пик при (vH v2) соответствует другому
при (v2, vt). Артефакты, например шум по или отраженные пики, не
обладают такой симметрией из-за того, что они имеют случайную
природу (в случае шума), или в силу причин, обсужденных выше (в
случае отраженных пиков). Итак, можно ожидать, что эти артефакты
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
319
Рис. 8.31. Пики, отраженные по vv нс ослабляются в двумерном эксперименте
в отличие от пиков, отраженных по v2. Этот рисунок демонстрирует также очень
большой шум по г(.
устранятся при обработке спектра таким образом, чтобы опустить
сигналы, не симметричные относительно диагонали. Это действительно
так, но здесь возникают две проблемы. Если в эксперименте сильно
различается цифровое разрешение по обеим координатам, а также если
он содержит противофазные сигналы, то симметризация существенно
понизит чувствительность за счет того, что менее интенсивные сигналы
по V! переносятся на v2. Данное обстоятельство исключает исполь-
зование симметризации для экспериментов COSY, проводимых в
соответствии с рекомендациями, предложенными в этой главе. Однако
эта процедура может оказаться полезной, если цифровое разрешение по
обеим координатам почти не различается, или для экспериментов,
в которых сигналы имеют одинаковую фазу (как в NOESY, описанном
в разд. 8.5.2).
Вторая проблема является очень важной. На рис. 8.32 приведен
спектр COSY смеси хлороформа и хлористого метилена, содержащий
два синглета, чьи протоны вообще находятся в разных молекулах,
причем даже ие возникает вопрос о том, чтобы они были связаны.
В несимметризоваином спектре, очевидно, присутствуют обычные
дорожки шума по симметризация устраняет большую часть из них, за
исключением тех точек, которые симметричны относительно диагонали.
Точно то же самое происходит при появлении кросс-пика, если два
сигнала действительно связаны. Глядя на контурное представление
320
Глава 8
Рис. 8.32. Характерная для симметризации ловушка (см. текст); остерегайтесь
попасть в нее.
симмет ризоваииого спектра, мы могли бы сделать ошибочное заклю-
чение, что он соответствует системе АХ, Тот факт, что диагональные
и кросс-пики проявляются в форме синглетов, вряд ли насторожил нас,
поскольку при магнитудном представлении спектра дублеты часто
оказываются плохо разрешенными. Пересечение дорожек шума по или
широких крыльев от интенсивных линий в магнитудиых спектрах может,
таким образом, приводить к серьезным недоразумениям после симмет-
ризации. Если вы хотите симметризовать спектр, то можно полагать,
что это сильно улучшит его внешний вид. Но при этом стоит придержи-
ваться общего принципа и всегда изучать его несимметризованный
вариант, чтобы избежать возможных осложнений, описанных выше.
Ядра, отличные от протонов. Эксперимент COSY не ограничен ни
регистрацией протонов, ии ядрами со спином 1/2. Распространение его
иа ядра со спииом 1/2, проявляющие гомоядерное спии-спииовое взаи-
модействие (такие, как 31Р или 19F), достаточно очевидно. Практические
преимущества этого могут, вероятно, оказаться значительными, по-
скольку большинство спектрометров не имеет оборудования для про-
ведения гомоядериой развязки от ядер, отличных от протонов. Рис. 8.33
иллюстрирует эксперимент 31Р — 31P-COSY (для соединения с предпо-
лагаемой структурой 5), который, как обычно, сразу позволяет уста-
новить структуру по спин-спииовым связям. Единственную сложность, с
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
321
Рис. 8.33. Выявление последовательности связей и констант 31Р для соединения,
которому приписана возможная структура 5.
322
Глава 8
которой вы можете, по-видимому, столкнуться при использовании этой
техники для произвольных ядер со спином 1/2, представляют широкие
спектральные диапазоны, которые могут потребоваться. Как следствие
этого, в некоторых случаях возникают большие массивы данных. Для
квадрупольных ядер времена релаксации не должны быть настолько
короткими, чтобы совсем исчезло спин-спнновое взаимодействие.
Однако константы, хотя бы частично разрешенные в одномерном
спектре, могут все-таки приводить к появлению кросс-пиков.
Этот эксперимент нашел свои наиболее интересные приложения при
исследовании спектров ядер таких элементов, которые образуют много-
ядерные кластерные соединения. COSY зарекомендовал себя идеальным
методом для установления сложных структур в этой области. Например,
COSY использован в спектроскопии :1В [26] и 183W [27]. Некоторые
другие методы корреляционной спектроскопии (см. разд. 8.5) также
использовались для 183W [28].
8.4. Эксперименты, родственные COSY
8.4.1. COSY-45
Варьирование длительности второго импульса эксперимента COSY,
т. е. использование последовательности
с переменной а, приводит к изменению относительных интенсивностей
кросс-пиков и близких к диагонали пиков. В частности, можно показать
с использованием подхода, основанного на каскадах импульсов, или
с помощью формального квантовомеханического описания, что соот-
ношение интенсивностей прн переносе когерентности между прямо
и косвенно связанными переходами определяется как ctg2 (а/2). Прямо
связанные переходы в системе АХ- это пара переходов, таких, как ДА
и Xj. имеющих общий уровень энергии. Косвенно связанные переходы
могут возникать в более сложных спиновых системах и являются
непараллельными переходами, не имеющими общего энергетического
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯЛ/1Р
323
уровня. Задавая а равной я/4, мы получим соотношение порядка 6.
Интенсивности пиков, соответствующих переносу между параллель-
ными переходами, также понижаются на определенную величину.
Это н есть популярный эксперимент COSY-45, который имеет два
преимущества перед основным COSY, Понижение интенсивности пере-
носа между параллельными переходами упрощает вид спектра вблизи
диагонали из-за уменьшения кросс-пиков внутри мультиплетов. В слож-
ном спектре это может сделать возможной идентификацию корреляций,
которые в противном случае были бы скрыты в нагромождении пиков
вблизи диагонали. Благодаря тому, что межмультиплетный перенос
ограничивается в основном непосредственно связанными переходами,
возникает возможность определения относительных знаков констант
спин-спинового взаимодействия в системах нз трех и более спинов по
некоторой аналогии с одномерным экспериментом спин-тиклинг. Этот
последний тип информации используется при определении структуры
лишь в особых случаях. По этой причине, а также учитывая то, что
данный вопрос подробно обсуждается в книге [5] (разд. 2.3.4), я не буду
в дальнейшем развивать эту тему.
На рис. 8.34 показаны спектры COSY и COSY-45 2,3-дибромпро-
пионовой кислоты (оба в форме магнитуды). Вндио, что в нижнем
спектре исчезли некоторые компоненты кросс-пиков н корреляции внут-
ри мультиплетов. Однако эта иллюстрация, по-вндимому, несколько
обманчива. Важно помнить, что эти корреляции не устраняются пол-
ностью, а лишь уменьшаются в некоторое число раз, В более сложных
случаях может оказаться невозможным так определить нижний контур-
ный уровень, чтобы исключить все ослабленные корреляции, поэтому не
получается столь хорошее упрощение диагональной части спектра.
Сопоставление рис, 8.35 (COSY-45) и рис. 8.10 (COSY-90 того же соеди-
нения) отчетливо указывает на то, что при этом следует ожидать. Для
рутинных спектров COSY-45 запись с фильтром типа эха при магни-
тудном представлении тем не меиее в целом является предпочтительной.
Однако прн этом происходит некоторая потеря чувствительности по
сравнению с COSY-90. Этот метод нельзя использовать в фазочувствн-
тельном варианте из-за того, что сигналы возникают не только за счет
амплитудной модуляции. Из новых экспериментов, в которых могут
быть получены фазочувствительные данные, стоит посмотреть Е, COSY
га-
8.4.2. Определение малых констант
Небольшие константы, значительно меньшие ширины линии, также
дают кросс-пики в эксперименте COSY, хотя и с низкой интенсивностью.
Для протонных спектров это означает, что часто возможно иденти-
фицировать константы через 4 и 5 связей, лежащие обычно в диапазоне
0.10.5 Гц и, следовательно, неразрешимые в рядовых одномерных
экспериментах. Спектроскописты считают эту возможность весьма прн-
21*
COSY- 90
ш
A
4,S Д4 4,3 4,2 41 4,0 3,9 3,8 37 3,6
«.a
Рис. 8,34. Спектры COSY-90 и COSY-45 2,3-дибромпропионовой кислоты и сече-
ние спектра COSY-45.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
325
Т ' I—’ I ' I ' I ' I I । г ' । 1 ! ’ I ’—1—'—Г~'—I—•—Г"
4,4 4,2 4,0 3,8 3,8 3,4 3.2 3,0 2,8 2, Б 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4
м.а.
Рис. 8.35. Спектр COSY-45 соединения 1.
влекательион, так как кажется, что это позволяет расширить границы
измерения. Но как химики мы должны быть более осторожны в сужде-
ниях. Несомненно, бывают случаи, когда полезно определить очень
небольшие константы, как, например, для соединения 1 из разд. 8.3.4.
Тем не менее встречаются и такие ситуации, когда проявление в спектрах
всех дальних корреляций становится очень нежелательным. В частности,
в спектрах молекул с жестким или напряженным углеродным скелетом,
а также в спектрах полнненасыщенных соединений иногда может пока-
заться, что все коррелируют со всем, и информация о структуре из
подобных спектров извлекается с трудом, В настоящее время един-
326
Глава 8
ственным способом ослабить возникающие за счет малых констант
корреляции является работа с низким цифровым разрешением и корот-
кими временами регистрации. Однако эти корреляции могут быть особо
выделены в описанном ниже случае.
Мы уже обсуждали главные факторы, определяющие интенсивность
кросс-пиков, обусловленных малыми константами. Кратко напомню,
что эти факторы определяются как степень ослабления противофазных
пиков, и соотношение между переносом когерентности и поперечной
релаксацией представляется выражением (8.3). Это выражение действи-
тельно описывает спад огибающей ССИ для сигнала, соответствующего
переносу когерентности по обеим координатам. Он достигает максимума
для значения времени гтах, определяемого соотношением
'max = ”arctg(n/r2) (8.4)
nJ
Для очень небольших значений J (JT2« 1) оно хорошо аппроксими-
руется как rmai = Т2. Таким образом, чтобы предотвратить потерю
сигнала, вызванного малыми константами, нам необходимо иметь
времена выборки по каждой из координат, значительно превышающие
T2't это условие не выполняется для рутинных экспериментов COSY.
В экспериментах с фильтром типа эха при магннтудном представ-
лении данных для получения формы линии, похожей на сигнал погло-
щения, нам требуется так подобрать функцию окна, чтобы она напо-
минала сигнал эха, т.е. была симметрична относительно центральной
точки времени выборки. Для того чтобы максимум этой функции
соответствовал максимуму сигнала переноса когерентности, нам по-
требуется время регистрации порядка 2Т2 по обеим координатам. Это
временное ограничение неизбежно, однако можно избежать необходи-
мости хранения н обработки очень больших массивов данных, которые
могут при этом возникнуть. Это достигается введением двух допол-
нительных задержек фиксированной длины в интервалы и t2. в таком
случае последовательность приобретает вид
я
— — Д — G— a — Д - G
2
Прн этом смягчается требование к временам выборки до Л(р(2 —
~ 2Т2 — 2Д, т. е., если для регистрации данных потребуется одно и то же
общее время, для оцифровки нужно будет меньше точек. Как и в
COSY-45, прн необходимости а может принимать значение, меньшее
чем я/2. Однако это может оказаться нецелесообразным, поскольку так
или иначе могут возникать проблемы, связанные с чувствительностью.
Мы уже видели пример спектра, полученного таким образом (рис. 8,13).
В этом случае Д было выбрано равным 0,25 с. Для типичного диапазона
протонных Т2 от 0,2 до 0,6 с подходящие значения Д лежат в интервале
0,05-0,45 с в предположении, что для времени регистрации исполь-
зовано значение 0,3 с. В экспериментах этого типа может уменьшаться
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
327
интенсивность корреляций, обусловленных большими по величине конс-
тантами, если выражение J (Т2 — А) принимает значение, близкое к це-
лочисленному (т. е. J 2s 7 или 14 Гц для приведенных выше параметров);
таким образом, для того чтобы избежать недоразумений, хорошо было
бы иметь обычный спектр COSY,
8.4.3, Многоквантовая фильтрация
Если мы добавим дополнительный я/2-импульс непосредственно
в конце последовательности COSY следующим образом:
- -I. - - - - z2
\2/ф \2/ф \2/х
то в таком случае многоквантовая когерентность, которая, как ока-
зывается, возникает перед третьим импульсом, может быть опять
переведена в наблюдаемую намагниченность (см. параграф «Еще раз
о переносе намагниченности» в разд. 8.3.5). При этом в идеале третий
импульс должен следовать сразу за вторым, однако на практике может
быть использована задержка до нескольких микросекунд для фазового
сдвига. Как обсуждалось выше, задание подходящего фазового цикла
может затем разделить сигналы, возникающие от многоквантовон
когерентности различных порядков. Так, например, двухквантовая ко-
герентность в 2 раза более чувствительна к изменению фазы в возбуж-
дающей ее последовательности, чем одноквантовая. Поэтому, если мы
смещаем фазу ср первых двух импульсов (в общем случае всех импульсов
до того момента, как возникла когерентность) на 90°, фаза того
регистрируемого сигнала, который прошел через состояние двухкван-
товой когерентности, инвертируется. Тогда инвертирование фазы при-
емника (т. е. вычитание 90°-экспернмента из О°-эксперимента) выде-
ляет компоненту, прошедшую через состояние двухквантовой когерент-
ности.
Правило для выделения р-квантовой когерентности заключается
в том, чтобы шагами изменять фазу возбуждающих импульсов в сле-
дующей последовательности: 0, 180//?, 2 х 180//?... (2р — 1) х 180//?, аль-
тернируя фазу приемника по мере движения [10]. Эта процедура также
позволяет детектировать когерентности порядка р(2т + 1), m = 0, 1, 2 ...
Однако в общем когерентности более высокого порядка возбуждаются
с низкой интенсивностью. Многоквантовые когерентности модулируют-
ся как функция обычным образом, поэтому результирующий спектр
оказывается похожим на нормальный COSY, но испытавшим воздей-
ствие многоквантовой фильтрации. Квадратурное детектирование по
координате vt в этих экспериментах может осуществляться с помощью
любого из обсуждавшихся выше методов, если вы не забыли, что для
получения необходимого сдвига фазы на 90° в р-квантовой когерент-
ности вам нужно сместить фазу возбуждающей последовательности на
90/р градусов. Отметим, что многоквантовая фильтрация может по-
328
Глава 8
требовать фазовых сдвигов, не кратных 90°: спектрометры, созданные
примерно после 1983-1984 гг., как правило, обеспечивают это.
Существуют две совершенно ясные причины, побуждающие к про-
ведению многоквантовой фильтрации: упрощение спектра и усовершен-
ствование фазочувствительного эксперимента COSY. Упрощение спект-
ра, возникающее за счет многоквантовой когерентности, может до-
стигаться только в связанных многоспиновых системах; р-квантовая
когерентность может возникать только между по крайней мере р-ядрами
со спином 1/2. Следовательно, в двухквантовом эксперименте устраняют-
ся синглеты (например, сигналы растворителя), в то время как обычные
корреляции сохраняются. Трехквантовый эксперимент устраняет до-
полнительно системы АХ и АВ и так далее для более высоких порядков
(однако чувствительность быстро падает при переходе к более высоким
порядкам). Устранение пиков осуществляется только за счет вычитания
сигналов, поэтому на практике в лучшем случае, вероятно, можно
ожидать ослабления их интенсивностей в несколько сот раз. При этом
также не возникает облегчения по отношению к динамическому диапа-
зону-АЦП по-прежнему должен быть в состоянии оцифровать весь
диапазон амплитуд имеющихся сигналов. На рис. 8.36 сопоставлены
спектры трипептида Gly-Tyr-Gly с двух- и трехквантовой фильтра-
цией. Трехквантовые эксперименты и эксперименты более высокого
порядка, очевидно, не имеют столь общего характера, как основной
COSY. Необходимо заранее знать типы имеющихся спиновых систем
и в соответствии с этим выбирать тип эксперимента.
Второе важное свойство эксперимента с двухквантовой фильтрацией
в его фазочувствительном варианте заключается в том, что в отличие от
фазочувствительного COSY фаза как диагональных, так и кросс-пиков
Рис. 8.36. Спектры COSY с двух- и трехквантовой фильтрацией для трипептида
Gly-Tyr-Gly.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
329
W 4 М И М V » И
д« w w>tl| до г,« м г.4
Рис. 8.37. Сравнение нормального фагочу ветви тельного COSY (слева, те же
самые данные, что и на рис. 8.27) с DQF-COSY (справа). Сильное упрощение
вида диагональной части последнего с лихвой компенсирует потерю чувстви-
тельности в этом эксперименте (см. текст).
может быть настроена на чистое поглощение. Фактически для систем,
содержащих более двух спинов, диагональные пики все же будут иметь
вклад дисперсионной компоненты; тем не менее на практике улучшение
весьма значительно. Это устраняет единственный недостаток фазочув-
ствительного COSY. За это приходится расплачиваться двукратным
понижением чувствительности, которая определяется как отношение
сигнала к тепловому шуму. В разд. 8.3.5 мы уже видели, что, по крайней
мере при наблюдении протонов, помехи при детектировании чаще
определяются уровнем шума по а не теплового шума. Поскольку
синглеты, вызывающие самый значительный шум по устраняются
в эксперименте с двухквантовой фильтрацией, можно добиться эффек-
тивного улучшения по сравнению с таким же нефильтрованным спект-
ром. В настоящее время фазочувствительный COSY с двухквантовым
фильтром (DQF - COSY), по-видимому, является лучшим методом
для отнесения констант. Сравните два спектра на рис. 8.37 и вы уви-
дите. насколько понятнее становится диагональная часть в спектре
DQF-COSY.
8.4.4. Эстафетный перенос когерентности
Достаточно общая проблема при отнесении протонных спектров
состоит в идентификации линейных цепей спинов, т.е. таких последо-
вательностей СН—СН—СН—СН ..., которые могут возникать в поли-
замещенных соединениях или олефинах. Отнесение с использованием
COSY должно быть простым, однако иногда может возникнуть неопре-
330
Глава 8
деленность. Рассмотрим, например, только три спина, расположенные
в ряд. Они образовали бы систему АМХ, в которой JAM н JMX были бы
вицинальными константами, a JAX-нулевой (для насыщенных соеди-
нений). Соответствующий спектр COSY имел бы кросс-пики между
А н М и между М и X, но не между А и X. Такая картина не содержит
прямых указаний на то, что А и X являются составными частями одной
и той же спиновой системы, поскольку тот же результат был бы получен
для двух двухспиновых систем AM и М'А, если бы М и М' имели
одинаковый сдвиг. В сложном случае (особенно в спектрах белков, где
эта проблема возникает часто) из исследования одномерного спектра
иногда нельзя определить, имеется лн перекрывание сигналов в неко-
торой заданной области спектра.
В эксперименте по эстафетному переносу когерентности (RCT, от
англ. Relayed Coherence Transfer) эта проблема решается путем передачи
намагниченности, перенесенной от А к М в нормальном эксперименте
COSY, к следующим ядрам, связанным с М, Это достигается простым
добавлением третьего л/2-импульса для того, чтобы вызвать другое
распределение когерентности, поэтому основная последовательность
будет иметь вид
я я я
2 “ 11 ~ 2 ~ ” 2 ” *2
При этом возникает проблема, что делать с интервалом h. В идеале
можно было бы представить проведение трехмерного эксперимента,
в котором этот интервал изменялся бы с определенным шагом не-
зависимо от гх. После трехмерного преобразования мы получили бы
массив данных, в котором амплитуда представляется как функция трех
частот. Эта идея не имеет практической ценности, потому что вы-
полнение такого эксперимента потребовало бы много времени. Кроме
того, трудно найти достаточно информативный способ представления
данных такого типа. Обычно применяется другой способ. Значение h
принимается равным такому вычисленному значению, которое обеспе-
чивает максимальный перенос когерентности от А к X через М.
Существует и третий метод, получивший название «аккордеон-спектро-
скопия», в котором, по существу, трехмерный эксперимент сводится
к двум измерениям за счет того, что h представляется как функция t1
(см. работу [И]), но мы не будем его здесь рассматривать. Для того
чтобы сделать результат эстафетного переноса не зависящим от раз-
ностей химических сдвигов, необходимо поместить я-импульс в середине
интервала h. Тогда последовательность будет выглядеть следующим
образом:
я я я
--?t— Т - т — я — т — - — /2
2 1 2 2
Для системы АМХ, в которой JAX ~ 0, количество намагниченности,
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
331
перенесенное от А к X при использовании этой последовательности,
пропорционально
sin(2rcJAMt)sin(2jtJMx'O (8-5)
поэтому оптимальное значение т можно выбрать, если удается оценить
величину константы спин-спинового взаимодействия. В системах со
свободным вращением вицинальные константы обычно близки к 7 Гц.
Тогда оптимальное значение т составляет примерно 35 мс. Для других
систем т сложным образом зависит от типа констант н нх значений;
обширные таблицы оптимальных значений т для разнообразных фраг-
ментов приводятся в работе [29].
Очевидно, дто этот эксперимент не имеет общего характера, по-
скольку требует некоторых предварительных знаний о спиновой системе
и возможных значениях констант спин-спинового взаимодействия. Од-
нако в сочетании с COSY он может часто использоваться для устранения
неоднозначностей. На рис. 8.38а и 8.386 сравниваются спектры COSY
и RCT для соединения 6. Одномерный протонный спектр и спектр COSY
тЬ
Рис. 8.38а. Протонный и COSY-спектры соединения 6.
332
Глава 8
I ' ' 1 ’ I ’ ' ' t ’ Ч~ > ' I ' ' ’ 1 ' t ' ' ’ ’ I Т ' У"'г r-
5,S 5,0 4»S 4,0 „ 3,5 3,0 2,5
’ М.Э.
Рис. 8.386. Спектр RCT соединения 6. В некоторых случаях помечены дополни-
тельные эстафетные пики.
представлены на рис, 8,38а, а спектр RCT, на котором помечены допол-
нительные корреляции,-на рис, 8,386, Хотя т подобрано для регистра-
ции небольших констант углеводного цикла, эстафетный перенос
когерентности можно все-таки видеть и для других резонансных
сигналов. Этот подход широко используется в спектроскопии ЯМР
белков. Составляющие их спектры спиновые системы аминокислотных
остатков известны, но часто сложность спектра такова, что даже
кросс-пики могут недостаточно разрешаться. Использование экспери-
мента RCT позволяет определить связи между сигналами ^-протонов
аминокислотных остатков и соответствующих протонов NH-групп даже
тогда, когда не разрешаются сигналы а-протонов [12], При работе
с малыми молекулами более полезным, по-видимому, является гетеро-
ядерный вариант эксперимента RCT (см. гл. 9).
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
333
8.5. Другие эксперименты по гомоядерной корреляции
8.5.1. INADEQUATE
Введение. Это, пожалуй, одна нз наиболее ужасных аббревиатур (от
англ. Incredible Natural Abundance DoublE QUAntum Transfer Expe-
riment-эксперимент с невероятным двухквантовым переносом намагни-
ченности на природном содержании) в этой книге. Один из видов этого
эксперимента до снх пор служит наиболее совершенным средством для
установления строения скелета органических молекул. К сожалению, он
также одновременно является н одним из наименее чувствительных нз
имеющихся экспериментов. По этой причине мы рассмотрим его лишь
очень кратко. Исторически данный метод возник нз идеи, связанной
с измерением углерод-углеродных констант спнн-спинового/взаимодей-
ствия на природном содержании, однако сформировавшие его концеп-
ции имеют значительно более общий смысл. Я намерен подойти
к эксперименту INADEQUATE с другой стороны, на базе того, что мы
уже знаем о COSY, а затем вернуться к первоначальному эксперименту.
Прн этом станет ясно, что мы уже изучили его принципы.
Самое большее, для чего мы до снх пор использовали двухквантовую
когерентность, которая может быть получена в конце основной после-
довательности COSY,-так это преобразование ее опять в однокван-
товую когерентность. Это приводит к эксперименту DQF -COSY, в ко-
тором единственная роль, отводимая двухквантовой когерентности,
состоит в том, чтобы отличать ядра, не имеющие констант, от тех,
которые их имеют. Все интересное, что происходит в DQF”-COSY
в период эволюции tr, совершается с однокваптовой намагниченностью;
следовательно, в этом смысле можно лишь подразумевать, что это
двухквантовый эксперимент. Используя ту же последовательность им-
пульсов, мы могли бы провести реальный двухбайтовый эксперимент,
фиксируя интервалы между первыми двумя импульсами и помещая
интервал между двумя следующими импульсами таким образом:
С использованием подходящего фазового цикла, выделяющег о сигналы,
которые возникли благодаря двухбайтовой когерентности, мы полу-
чим, что именно частоты двухквантовых переходов будут совершать
эволюцию в течение периода 1Г, Для оптимального эксперимента нам
нужно выбрать такое значение т, чтобы создать максимальную двух-
квантовую когерентность. Мы также поместим я-нмпульс в центре
интервала 2т для того, чтобы возбуждение не зависело от химических
сдвигов:
л ля
2 2 1 2 2
334
Глава 8
Это основная двумерная последовательность INADEQUATE. Как и в
случае COSY, я сначала собираюсь обсудить получаемые при этом
результаты и лишь затем сравнительно кратко обратиться к техни-
ческим деталям проведения эксперимента.
Двумерные снектры INADEQUATE. Частоты двухквантовых пере-
ходов, совершающие эволюцию в течение периода этого экспери-
мента, являются просто суммой химических сдвигов (относительно
частоты передатчика) для тех пар ядер, которые участвуют в форми-
ровании двухквантовой когерентности. Пики в двумерном спектре,
соответствующие двум ядрам со сдвигами vA и vB, имеют координаты
((vA + vB)y X), где Х-частота одноквантовой когерентности, в которую
переводится намагниченность действием последнего импульса. Как мы
вскоре уввд&м. для сильных ядер, например ХН, это может приводить
к некоторому усложнению; данный эксперимент изобретен и проде-
монстрирован для ядер 13С [3], Преимущество рассеянных ядер, таких,
как углерод, состоит в том, что в конечном спектре заметную интен-
сивность имеют только сигналы от двухспиновых систем АВ или АХ.
Они возникают благодаря тому, что 0,01% молекул вещества содержит
два атома 13С. Значительно более интенсивные сигналы от одиночных
атомов 13С устраняются за счет двухквантовой фильтрации, а сигналы
от молекул с тремя атомами 13С (грехспиповые системы) имеют
пренебрежимо малую интенсивность. Можно так подобрать значение т,
Рис. 8.39. Схематический двумер-
ный спектр INADEQUATE для по-
следовательности систем АХ. Те ча-
сти спектра, которые расположены
снаружи от заштрихованных линий,
не могут содержать сигналов.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
335
что будут наблюдаться только сигналы от атомов, связанных большими
по величине прямыми константами. Таким образом, для каждой часто-
ты по Vj, по которой наблюдается сигнал, можно выделить прямую,
параллельную v2, на которой будут находиться компоненты систем АВ
или АХ для пары связанных атомов 13С, т.е. в двумерном спектре
возникнут дублеты прн ((vA -I- vB), vA) н ((vA + vB), vB). Центр между
каждой парой сигналов попадает в точку ((vA + vB), (vA + vB)/2), поэтому
эти точки лежат на линии, имеющей коэффициент наклона, равный
2 (рис. 8.39). Этот факт можно использовать для того, чтобы отличить
истинные сигналы от артефактов.
Поясним это на примере соединения 7 (рис. 8.40). Поскольку каждый
15С и'о 130 120 110 W0 ' 90 80 60 50 40 30 20
м.5.
Рис. 8.40. Двумерный спектр INADEQUATE 13С лимонена (7). Время регистра-
ции по Z| составляло 30 мс (256 инкрементов при спектральной полосе 9 кГц; 128
прохождений на инкремент). Остаточные одноквантовые сигналы видны на линии
Vi = 0. Поскольку т было подобрано для средней по величине константы С—С
между алифатическими углеродами, два корреляционных пика за счет взаимо-
действия через двойную связь имели низкую интенсивность и не проявились на
графике.
336
Глава 8
неконцевой атом углерода связан с двумя или более партнерами,
в принципе может быть восстановлен весь скелет молекулы (если только
нет разрывов в углеродной цепи, как во фрагментах С—X—С). Начи-
ная, как обычно, с наиболее легко относимого сигнала, мы проходим по
линии, соответствующей его химическому сдвигу на оси v2 н параллель-
ной Vi, до тех пор, пока не обнаружим сигнал. Двигаясь далее параллель-
но v2, мы определим одного из его партнеров по спин-спиновому
взаимодействию. Стартуя опять с этого сигнала и повторяя то же самое,
мы, очевидно, определим очередного партнера по спин-спнновому вза-
имодействию. Этот метод открывает феноменальные возможности, но
одновременно имеет исключительно низкую чувствительность. Его не-
достаток состоит в том, что мы пытаемся наблюдать сигналы, интен-
сивность которых равна интенсивности 13С-сателлитов от сигналов 13С,
т.е. возникающих лишь от одной нз 10000 молекул. Это исключает
возможность использования эксперимента для большинства реальных
задач, одиако он может найти применение в биохимических исследова-
ниях с соединениями, меченными по 13С.
Если мы проделаем то же самое для такого сильного ядра, как 41. то
проблема чувствительности исчезает, но вместо нее возникают другие
сложности [14]. Выбор задержки г в случае 13С прост: для систем АХ ее
оптимальное значение составляет 1/4J (для сильносвязанных систем
нужны несколько различающиеся значения, см. книгу [5]). Диапазон
значений J для прямых углерод-углеродных констант относительно
невелик (примерно 35-55 Гц), Для протонов, напротив, зависимость т от
J оказывается более сложной нз-за того, что часто приходится иметь
дело со сложными спиновыми системами, да н диапазон изменения
констант спин-спинового взаимодействия оказывается шире (для срав-
нения, скажем, от 2 до 20 Гц). Другая проблема для систем, содержащих
более двух спинов, состоит в том, что двухквантовая когерентность при
действии последнего импульса может перераспределяться по всем пере-
ходам в спиновой системе; это усложняет интерпретацию каждой строки
по v1? соответствующей сигналам от пары связанных ядер. К счастью,
этот недостаток может быть частично устранен в результате того, что
последний импульс задается равным Зя/4, а не я/2, что по аналогии
с COSY-45 ограничивает большую часть перераспределения теми пере-
ходами, в которых участвующие ядра непосредственно формируют
двухквантовую когерентность [ 14] (здесь термин «непосредственно»
используется в прямом смысле, безотносительно связи между перехо-
дами). На рнс. 8.41 представлен протонный двумерный спектр
INADEQUATE 2,3-дибромпропноиовой кислоты с завершающими им-
пульсами я/2 и Зя/4.
Преимущество этого эксперимента по сравнению с COSY заклю-
чается в том, что в нем отсутствуют диагональные пики. Поэтому
для очень сложных задач можно с помощью двумерного спектра
INADEQUATE определить те корреляции, которые трудно найти в
спектре COSY, когда соответствующий кросс-пик расположен близко
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
337
Рис. 8.41. Двумерные спектры INADEQUATE 11I 2,3-дибромпропионовой кисло-
ты с варьированием угла последнего (или «считывающего») импульса. Пики,
возникающие в результате нежелательного переноса намагниченности к «пассив-
ным» спинам, помечены стрелками на левом спектре.
к диагонали. Неудобство заключается в меньшей общности. Для этого
метода невозможно задать оптимальное значение т, подходящее для
всех возможных величин констант и типов расположения ядер. В на-
стоящее время уже есть ряд примеров, демонстрирующих полезность
этого метода для анализа спектров ЯМР белков [15], но пока еще рано
делать вывод о том, что окажется важнее-преимущества или недо-
статки. Для спектроскопии ЯМР малых молекул этот эксперимент
определенно не является экспериментом первой необходимости,
однако его можно рассматривать как альтернативу в тех случаях,
когда COSY или его модификации не дают ответа на поставленный
вопрос.
Детали двумерной последовательности INADEQUATE. Прн задании
параметров для этого эксперимента мы сталкиваемся с обычными
проблемами двумерной спектроскопии: выбором ширины спектральной
полосы, параметров оцифровки н фазового цикла. В литературе имеется
целый ряд подходов к нх решению. Метод активно использовался
в нескольких исследовательских группах, а детали его выполнения
сильно меняются в зависимости от возможностей н конструкции спект-
рометра, которые существенно изменялись. Я собираюсь рассматривать
его так же, как это было сделано для DQF-COSY и COSY, но для
полноты упомяну некоторые другие возможности, с которыми вы
можете столкнуться.
Создавая фазовый цикл, мы должны иметь в виду двухквантовую
фильтрацию, подавление артефактов и квадратурное детектирование по
22-75
338
Глава 8
Vj. Двухквантовая фильтрация может достигаться точно так же, как
и для DQF-COSY. Мы используем тот факт, что сдвиг на 90' фазы
возбуждающей части последовательности (первые три импульса) ин-
вертирует сигналы, возникающие за счет двухбайтовой когерентности.
Однако в литературе чаще используется циклирование фазы последнего
импульса, по-видимому, с целью достижения удобства при программи-
ровании. Сдвиг по фазе этого импульса на 90° смещает фазу сигнала,
который прошел через двухквантовую когерентность, на 270°. Это
можно понять, если представить себе, что мы имеем сдвиг на 90°
относительно возбуждающей последовательности (что приводит к фазо-
вому смещению на 180°) плюс прямой 90 -сдвиг возникшей однокван-
товой когерентности. Если мы будем менять фазу последнего импульса
по кругу в последовательности х, у, — х, —у, то фазу приемника следует
менять в противоположном направлении (т.е. х, —у, —х, у) для того,
чтобы следовать за двухкваитовым сигналом. Для подавления арте-
фактов к этому четырехшаговому циклу можно добавить процедуру
CYCLOPS. Полезным может оказаться и смена фазы л-нмпульса.
Имеются также дополнительные возможности, описанные в работе [16].
В общем, размер реально необходимого фазового цикла лучше опре-
делять экспериментально для данного спектрометра, потому что никто
не хочет без реальной необходимости увеличивать число прохождений
на каждом шаге по .
Квадратурное детектирование по vx требует, как обычно, сдвига на
90° фазы регистрируемого сигнала. Для сигналов, возникающих за счет
двухквантовой когерентности, это требует сдвига на 45“ фазы возбуж-
дающих импульсов. На современных спектрометрах это можно сделать
непосредственно. Одиако в то время, когда метод INADEQUATE
только разрабатывался, спектрометры не были приспособлены для
таких фазовых сдвигов, поэтому были разработаны два косвенных
способа. Первый состоит в использовании так называемого составного
z-импульса [17], т.е. последовательности
где нет задержки между импульсами, а ср обозначает угол импульса*,
соответствующий желаемому фазовому сдвигу (т. е. я/4 в нашем случае).
Для намагниченности в плоскости х — у эта последовательность будет
совершать поворот намагниченности по оси z на угол ср (рис. 8.42). То,
что произойдет в реальном эксперименте, будет сильно зависеть от
качества спектрометра. Для выявления мнимой части эксперимента
с квадратурным детектированием мы расположим эту группу импуль-
сов непосредственно после третьего импульса последовательности
• То есть вызываемый импульсом поворот вектора намагниченности.
Прим, перге.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
339
Рис. 8,42. Составной z-импульс.
INADEQUATE [18] и, опустив взаимно погашающую пару импульсов
(71/2)х и (я/2)-х, получим
(л\ /л\ /л\ /л\
-) —т — л — т—-| - —С— - — и
2/х \4j_y\2jx 1 \2jx 2
Существует еще возможность использовать фильтр типа эха. Она
основана на зависимости интенсивности сигналов типа эха и анти-эха от
длительности последнего импульса. Здесь слишком сложно дать полное
обоснование такого эксперимента. Упомянем только, что задание по-
следнего импульса равным 2я/3, по существу, устраняет компоненту
аитн-эха, не требуя дополнительных экспериментов со сдвигом фазы
[19].
Выбор цифрового разрешения может быть сделан обычным путем.
Для этого необходимо стремиться сохранить время регистрации данных
по t2 по крайней мере равным Т%, чтобы избежать потерн чувстви-
тельности. Время регистрации данных по может быть очень коротким.
На первый взгляд может показаться, что полоса спектра по Vj должна
быть в 2 раза больше, чем по v2, из-за того, что двухквантовые частоты
являются суммой химических сдвигов. Но в действительности, если мы
будем считать обе спектральные полосы равными, то, хотя и произойдет
отражение двухквантовых частот, это не приведет к неоднозначностям
(рнс. 8.43). Последовательность связей углеродных атомов скелета вы-
является так же, как уже описано выше, а при определенных обстоя-
тельствах чувствительность для одинакового времени эксперимента
улучшается в у/1 раз [20].
Исходный эксперимент INADEQUATE. Наконец, мы подошли к
тому, с чего началось измерение углерод-углеродных констант спин-
спинового взаимодействия. Строго говоря, этот предмет не совсем
подходит для главы, посвященной гомоядерной корреляции. Но он
столь тесно связан с описанными выше экспериментами, что было бы
неразумно его от них отрывать. Углерод-углеродные взаимодействия
проявляются в спектрах 13С как 13С-сателлиты линий. Сателлиты,
обусловленные прямыми константами, находятся на расстоянии
15-25 Гц от линий и, конечно, имеют амплитуду, составляющую 0,55%
22*
340
Глава 8
Рис. 8.43. Схематическое представление
двумерного спектра INADEQUATE, та-
кое, как на рис. 8,39, но с заведомым
отражением по vP Это не вносит никакой
неоднозначности.
от основного сигнала. Константы через две и три связи, имеющие
значения 0—15 Гц, проявляются в виде сателлитов на расстоянии 0-7 Гц
от основной линии. Для реальных форм линий, полученных на сверх-
проводящих магнитах, это означает, что сателлиты от прямых констант
должны непосредственно легко наблюдаться, а сателлиты от дальних
констант могут потеряться на крыльях линии. Трудности могут воз-
никать не только при плохой форме линии, но также нз-за боковых
полос от вращения, имеющих обычно интенсивность порядка 0,1-1%, н,
конечно, нз-за примесей. Чтобы надежно обнаруживать линии сателли-
тов, весьма полезно устранить нз спектра основной сигнал вместе
с боковыми полосами от вращения, а также вообще все сигналы, кроме
сателлитов.
Как мы уже знаем сейчас, этого можно достигнуть с помощью
двухквантовой фильтрации. Если мы не будем проводить изменений ч
в двумерном INADEQUATE (т.е. фиксируем = 0), то получим после-
довательность
(л\ /п\ /л\
2jx ~ Т “ Л ~ Т ~ (2/Д2Х
представляющую собой одномерный эксперимент с двухквантовой
фильтрацией. Использование уже описанного циклирования фазы (ко-
нечно, без компоненты квадратурного детектирования по / j приводит
к спектру, в котором подавляются все сигналы, возникающие от не-
связанных ядер. В то же время сигналы спиновых систем АВ нлн АХ
останутся в спектре, хотя и без какого-либо улучшения чувствитель-
ности, поскольку мы по-прежнему наблюдаем сигналы от 0,01% ядер.
Компоненты дублетов проявляются в виде характерных линий с проти-
воположными фазами (рис. 8.44). Для достижения успеха в этом экспе-
рименте требуются большое количество вещества и столь же высокая
стабильность работы спектрометра, как в экспериментах с ЯЭО, а также
правильный выбор частоты повторения и т. Последние два условия
широко обсуждаются в книге Бакса [5j (гл. 5), поэтому я не буду здесь
их рассматривать.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
341
Рис, 8.44, Часть одномерного спектра
INADEQUATE 13С для атома углерода,
связанного с двумя другими; можно раз-
личить две разные прямые константы. Хо-
рошо виден небольшой остаточный сиг-
нал от основной (нерасщепленной) линии;
он не попадает Точно на центр дублетов
вследствие изотопного сдвига при замеще-
нии 12С на 13С.
Вследствие ограничений по чувствительности н из-за специфичности
информации, получаемой из спектра INADEQUATE, маловероятно, что
этот эксперимент станет широко использоваться в его первоначальной
форме. Однако идея использования двухквантового фильтра (или фильт-
ра более высокого порядка) в одномерном спектре для разделения
сигналов, представляющих интерес, от основных интенсивных сигналов
имеет много возможных приложений, в частности в биохимии. Одним нз
очевидных примеров было бы прослеживание дважды меченных по 13С
метаболитов непосредственно в биологической системе. Такой экспе-
римент следовало бы сравнить с методом обратного переноса поля-
ризации, уже рассмотренным в гл. 6, и с методиками разностного
спинового эха в гл. 10.
8.5.2. NOESY или обменная спектроскопия
Введение. Если вы вернетесь назад и снова посмотрите на рис, 8.1, то
поймете, что существует еще одна получаемая прн действии последо-
вательности COSY компонента намагниченности, которую мы до сих
пор полностью игнорировали. Это часть поперечной намагниченности,
возвращенная к направлению осн z прн действии второго импульса.
Отметим, что та намагниченность также модулируется как функция
т.е. она представляет собой частоту, меченную точно так же, как
и намагниченность в плоскости х — у. Конечно, в COSY эта компонента
не генерирует сигналов, поэтому нам даже не следует беспокоиться
о том, чтобы устранить ее прн циклировании фазы. Однако, поскольку
она была вовлечена в некий физический процесс, мы можем провести
двумерный эксперимент, который позволит его зарегистрировать. Для
этого нужно возвратить намагниченность в плоскость х — у и про-
детектнровать возникающий сигнал. Можно представить себе по край-
ней мере два информативных взаимодействия, в которые может быть
вовлечена z-компонента меченой частоты: химический обмен с другим
ядром и ядерный эффект Оверхаузера.
342
Глава 8
Результат химического обмена, возможно, легче представить. Если
мы выжидаем время после второго импульса, используя последова-
тельность
я л я
““ ““ ““ f-,
2 2 2
называемую NOESY, в таком случае при наличии обмена то ядро,
z-намагннченность которого модулируется при одном химическом сдви-
ге в течение может мигрировать к другому положению за период тж,
называемый временем смешивания. Следовательно, оно имеет другой
химический сдвиг в течение периода /2, и результирующий спектр будет
похож на спектр COSY, а кросс-пики будут наблюдаться между обме-
нивающимися положениями. Этот эксперимент, применяемый для об-
наружения химического обмена, представляет собой двумерный аналог
обычного эксперимента по переносу намагниченности и для сложных
систем должен обладать обычными преимуществами двумерных спект-
ров. Однако, как мы увидим дальше, он имеет целый ряд технических
недостатков.
Ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) также приводит к тому, что
изменения в z-намагниченности одного ядра приводят к изменению
z-намагниченности другого. Поэтому пары ядер, которые показывали
бы ЯЭО в одномерном спектре, могут иметь кросс-пнкн в данном
двумерном эксперименте. В методе обычного равновесного ЯЭО, ко-
торый рассмотрен в гл. 5, изменение z-намагниченностн, используе-
мое нами, представляет собой насыщение (т. е. устранение) ее, но при
этом любое нарушение теплового равновесия также может воздейст-
вовать на заселенности соседних ядер. NOESY является двумер-
ным аналогом неравновесного ЯЭО, рассмотренного в гл. 5 (разд.
5.2.4).
Итак, эксперимент NOESY позволяет определять пути химического
обмена и устанавливать пространственную структуру быстро и с хоро-
шим разрешением, что характерно для двумерного метода. Таким,
образом, он кажется весьма привлекательным. Я не хотел бы показаться
слишком пессимистичным, но все же должен указать вам на ряд
основных трудностей, связанных с его применением. Очевидно, что
обменные и ЯЭО-взаимодействия здесь невозможно различить. Но тот
же недостаток свойствен и обычным одномерным методам, поэтому нет
причины на этом основании избегать использования NOESY, Обычно из
химии известно, могут ли протекать обменные процессы в данном
соединении, что позволяет правильно интерпретировать спектр NOESY.
В стадии развития находятся различные эксперименты, в том числе так
называемая zz-спектроскопия [21], которая позволит отличить обмен от
ЯЭО. Но она пока не находит широкого применения. Две существенно
более серьезные трудности возникают прн выборе задержки тм и из-за
возможного присутствия перекрывающихся кросс-пиков, обусловленных
спин-спиновой связью.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
343
Выбор тт. Задержка тш должна выбираться таким образом, чтобы
происходил максимальный обмен или сформировался максимальный
ЯЭО перед тем, как конечный импульс прикладывается к z-иамагни-
ченности. Это потребовало бы знания значений времен 7] вовлеченных
во взаимодействие ядер, а также скорости обмена или формирования
ЯЭО. Если мы знаем только один из этих двух параметров, то нам
трудно начать эксперимент без предварительных допущений. Здесь
существует четкая разница между возможным диапазоном тт для опре-
деления обмена и для ЯЭО (в последующем изложении я подразумеваю,
что вам известны динамические эффекты в спектрах ЯМР; см., напри-
мер, гл. 8 в книге Гюнтера [22]).
Конечно, химический обмен может происходить фактически с лю-
быми скоростями. Очевидно, что с помощью NOESY можно изучать
область медленного обмена. Основываясь на разности химических
сдвигов обменивающихся ядер, мы можем оценить верхнюю границу его
скорости. Для двухпозицнонного обмена с равными заселенностями
и разностью их химических сдвигов Av при коалесценции сигналов
константа скорости процесса кс равна Поэтому при медленном
обмене в нашем случае скорость обмена к должна быть заведомо
меньше, чем кс. В то же время к ие должна быть намного меньше 1/Тх.
В противном случае частотно-меченая z-намагниченность исчезнет до
того, как произойдет миграция. Диапазон значений к, для которых имеет
смысл эксперимент NOESY, лежит между этими двумя границами. Чаще
всего полезно использовать одномерный вариант намагниченности или
NOESY в области довольно медленного обмена, где к не слишком
сильно отличается от l/7j, поскольку именно в этой области не су-
ществует других методов получения сведений о химическом обмене.
В этом случае оптимальное значение тт для обнаружения обмена,
протекающего со скоростью к между равнозаселеннымн положениями,
зависит от к7\ и медленно изменяется от значения 0,5/Л при к = 1/Тх до
1,5/А при к = 10/77- Обычно к точно не известна, поэтому вполне
разумно для грубой оценки тт принять его равным 1/к.
На практике бывает необходимо выполнить несколько эксперимен-
тов, используя различные оценки для к. Даже такой требующий значи-
тельного времени эксперимент все же дает только качественную инфор-
мацию о путях обмена, поскольку пока нет простого метода коли-
чественного расчета констант скоростей из получаемых данных. Обе эти
проблемы (определение тт и количественный расчет констант) могут
быть решены при использовании метода «аккордеон-спектроскопии»
[11], в котором тт устанавливается пропорциональной времени . В нем
трехмерный спектр можно эффективно представить в виде двумерного.
Прн этом по координате vt расположены линии, формы которых
зависят от величины fc. Расчет констант скорости из такого спектра
требует количественного анализа формы линии этих сигналов. Прог-
раммы такого анализа пока еще не очень широко доступны, поэтому
я не буду дальше продолжать его обсуждение. Вполне возможно, что
344
Глава 8
в будущем такие эксперименты найдут более широкое применение.
В противоположность химическому обмену формирование ЯЭО
сдерживается скоростью продольной релаксации. Многие обстоятельств
ва могут сделать формирование ЯЭО более медленным, чем 1/77, но
ничто не может заставить его возникать быстрее. Это означает, что,
выбрав примерно равным 1/77, мы с большой вероятностью сможем
наблюдать кросс-пики ЯЭО между соседними ядрами. Ядерные эффекты
Оверхаузера между более удаленными ядрами формируются медленнее,
поэтому для их регистрации нужны большие времена смешивания. Но
конкурирующая продольная релаксация приводит к тому, что кросс-
пики в этом случае будут очень слабыми. Конечно, в одномерных
экспериментах такие ЯЭО тоже очень слабые, но в эксперименте NOESY
используется стационарная, а не равновесная намагниченность, поэтому
трудности дополнительно возрастают. Кроме того, при спин-спииовом
взаимодействии могут возникнуть артефакты, очень запутывающие
картину двумерного спектра и затрудняющие идентификацию истинных
кросс-пиков ЯЭО. И наконец, еще раз отмечу, что не существует
простого способа получения количественных результатов в данном
эксперименте. Мы имеем только указание на присутствие ЯЭО, но не
надежное измерение его величины. Существование этих неблагоприят-
ных факторов объясняет, почему NOESY мало используется при изу-
чении небольших молекул. Однако прн исследованиях белков этот метод
приобрел большое значение. Причина в том, что большие молекулы
белков совершают беспорядочные движения в растворе относительно
медленно. В связи с этим в таких системах вклад в быструю диполь-
диполъную релаксацию дает процесс Wo (см. гл. 5). В них ЯЭО оказы-
ваются большими и отрицательными, и онн быстро устанавливаются.
Примеры использования метода NOESY для отнесения сигналов в
спектрах белков приведены в работах [23, 24].
Трудности, обусловленные спин-спнновым взаимодействием. Не уди-
вило ли вас то, что последовательность NOESY отличается от исполь-
зованной для метода DQF-COSY только введением интервала тж. Это
означает, что в эксперименте могут присутствовать различные сигналы
переноса когерентности, и, как обычно, нужная компонента выделяется
при помощи фазового цикла. Легко видеть, что фаза сигналов, воз-
никающих от намагниченности, ориентированной вдоль оси z в течение
времени тт, не зависит от фазы первых двух импульсов, но следует за
фазой третьего. Поэтому большую часть нежелательных сигналов
можно подавить либо совместным циклированием фазы первых двух
импульсов в последовательности х, у, —х, —у при постоянной фазе
приемника, либо совместным циклированием фаз последнего импульса
и приемника. Квадратурное детектирование можно провести обычными
способами-фазочувствительным илн с фильтром типа эха. Однако,
к сожалению, существует перенос когерентности, приводящей к сигналам
с точно таким же фазовым поведением, как и желаемая z-компонента.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
345
Эта часть проходит через нуль-квантовую когерентность. Это значит,
что в спектре NOESY для нашего соединения на кросс-пики, обуслов-
ленные ЯЭО или обменом, накладывается спектр COSY с нуль-квантовой
фильтрацией, причем циклирование фазы не может препятствовать
этому. Очевидно, что для связанных систем эта проблема неразрешима.
Она сродни эффектам SPT, возникающим в одномерных экспериментах
по ЯЭО, но в двумерном эксперименте трудно или невозможно различать
реальные и нуль-квантовые кросс-пики.
Было предложено несколько решений этой проблемы, но ни одно нз
них нельзя считать полностью удовлетворительным. Простейший прием
сводится к варьированию интервала случайным образом при переходе
от одного прохождения к другому. Интенсивность кросс-пиков, обуслов-
ленных ЯЭО илн обменом, медленно изменяется с изменением тж, тогда
как пики переноса когерентности модулируются с нуль-квантовыми
частотами, которые равны разностям химических сдвигов связанных
ядер. Таким образом, по крайней мере некоторые из нуль-квантовых
сигналов изменяются так же быстро, как и тт. Поэтому при благо-
приятном стечении обстоятельств онн должны усредняться н исчезать
после некоторого числа прохождений. Наилучший способ реализации
этой идеи - введение п-импульса в тт:
ля я
h - 2~ [2
Теперь тт равняется т,- + 2г- (использованное здесь обозначение взято из
работы [25]). Т/ и т; можно изменять, в то время как тт сохраняется
постоянным. Тогда обменные или ЯЭО-пнкн не изменяются от про-
хождения к прохождению, а нуль-квантовые пики модулируются как
функция только поскольку все эффекты в оставшейся части тт
рефокусируются. Можно менять случайным образом, но все же прн
использовании этого способа приходится полагаться на удачу, и на-
дежное подавление можно получить лишь прн большом числе про-
хождений. Существует и другой метод, когда вычисляется оптимальный
набор значений т,- для каждого числа прохождений, который также
зависит от диапазона подавляемых нуль-квантовых частот, т. е. от
разностей химических сдвигов между парами взаимодействующих ядер.
Оказывается, что самый лучший результат дает комбинация вычислен-
ных и случайных переменных при пошаговом изменении т; как функции
Тогда т; выражается следующим образом:
X^l + "^random
В работе [25] содержатся таблицы и формулы для определения наилуч-
ших значений т/ для разных сочетаний диапазонов химических сдвигов
и числа прохождений на каждое значение
Даже прн использовании этого тщательно разработанного метода
подавление нуль-квантовых компонент прн малом числе прохождений
на каждое значение оказывается весьма слабым, особенно в том
346
Глава 8
случае, если велик диапазон разностей химических сдвигов. Но по-
скольку эксперимент NOESY всегда имеет низкую чувствительность, как
правило, прн накоплении сигнала используется большое число про-
хождений. Если на каждом шаге по ц используется больше 10 про-
хождений, то подавление нуль-квантовых пиков становится вполне
достаточным для типичных диапазонов химических сдвигов. Ко всему
этому нужно добавить, что тт должно быть порядка Tt. Поэтому
очевидно, что эксперимент NOESY требует больших затрат времени.
<5,М-Д.
Рис. 8.45. Отслеживание пути химического обмена во флуктуирующем металло-
органическом соединении.
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР
347
Рис. 8.46. Спектр NOESY производно-
го пенициллина (8). Метильная группа,
обращенная под плоскость молекулы,
показывает в спектре кросс-пик с од-
ним из 0-протонов (Н5) лактамного
цикла. При облучении этого метила на
лактамном протоне проявляется равно-
весный ЯЭО, составляющий 15%. На-
против, метильная группа, расположен-
ная над плоскостью молекулы, обнару-
живает корреляцию с протоном Н3,
Примеры. Несмотря на все сказанное в двух предыдущих разделах,
в действительности эксперименты NOESY все же можно провопить!
Я склонен думать, что обнаружение химического обмена с практической
точки зрения представляет собой наиболее важное применение этого
метода для небольших молекул, В качестве примера на рис. 8.45 при-
веден спектр NOESY для стереохимически нежесткого металлооргани-
ческого соединения, на котором можно проследить механизм обмена.
Пример обнаружения ЯЭО дан на рнс. 8.46. Это спектр NOESY сое-
динения 8, которое является производным пенициллина. Времена релак-
сации протонов 7] в его обезгаженном растворе в D2O изменяются
рц
Н '"coj н
в
в широком диапазоне от 0,4 до 2 с, поэтому для параметра тт было
выбрано промежуточное значение 1 с. Тем не меиее кросс-пикн прояв-
ляются в местах, ожидаемых для измерений равновесного ЯЭО, В этом
случае не возникает трудностей, связанных со спнн-спиновым взаимо-
действием, и мы вполне уверены, что кросс-пнкн возникают как след-
ствие эффекта Оверхаузера,
348
Глава 8
Литература
1. Evans S. R„ Hayman A. R., Fellows L. E., Shing T. К. M„ Derome A, E., Fleet G. W. J.,
Tet. Lett. 26, 1465-1468 (1985).
2. States D.J., Habekorn R.A.. Ruben D.J., J. Mag, Res., 48, 286-292 (1982).
3. Keeler J., Neuhaus D., J. Mag. Res., 63, 454-472 (1985).
4. Marion I)., Wuthrich K., Biochem. Biophys. Res. Comm., 113, 967-974 (1983).
5. Бакс Э. Двумерный ядерный магнитный резонанс в жидкости. Пер. с
англ- Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1989.
6. Levitt М.Н., Badenhausen G., Ernst R. R., J. Mag. Res., 58, 462-474 (1984).
7. Mehlkopf A.F., Korbee D., Tiggelman T.A., Freeman R-. J. Mag. Res., 58, 315-323
(1984).
8. Nagayama K„ Kumar A., Wuthrich K., Ernst R.R., J. Mag. Res., 40, 321 (1980).
9. Griesinger C. IL, Sorensen O. W„ Ernst R. R., J. Amer. Chem. Soc., 107, 6394—6396
(1985).
10. Piantini V., Sorensen O. W„ Ernst R. 7?., J. Amer. Chem. Soc., 104, 6800-6801 (1982).
11. Badenhausen G„ Ernst R.R„ J. Amer. Chem. Soc., 104, 1304-1309 (1982).
12. Wagner G„ J. Mag. Res., 55, 151-156 (1983).
13. Bax A., Freeman R., Frenkiel T.A., J. Amer. Chem. Soc., 103, 2102-2104 (1981).
14. Mareci TH., Freeman 7?., J. Mag. Res., 51, 531-535 (1983).
15. Boyd J., Dobson C.M., Redfield C„ J. Mag. Res., 55, 170-176 (1983).
16. Bax A.. Freeman R„ Kempsell S.P., J. Amer, Chem. Soc., 102, 4849-4851 (1980).
17. Freeman R„ Frenkiel T.A., Levitt M.H., J. Mag. Res., 44, 409 (1981),
18. Bax A„ Freeman R„ Frenkiel T.A., Levitt M. H., J. Mag. Res., 43, 478 (1981).
19. Mareci TH., Freeman R., J. Mag. Res,, 48, 158 (1982).
20. Turner D.L., J. Mag. Res., 58, 500-501 (1984).
21. Wagner G., Badenhausen G.r Muller N„ Rance M., Sorensen O.W, Ernst R.R.,
Wuthrich K., J. Amer. Chem. Soc., 107, 6440 6446 (1985),
22. Гюнтер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР. Пер. с англ. М.: Мир, 1984.-
23. Wagner G., Kumar A., Wuthrich К., Eur. J. Biochem., 114, 375 (1981).
24. Wuthrich К.. Billeter М., Braun W., J. Mol. Biol., 180, 715-740 (1984).
25. Rance M.. Badenhausen G., Wagner G„ Wuthrich K., Ernst R.R., J. Mag. Res,, 62,
497-510 (1985).
26. Venable T.L., Hutton W.C., Grimes R.N., J. Amer. Chem. Soc., 106, 29-37 (1984).
27. Brevard C.( Schimpe R., Tourne G., Tourne C. M.t J. Amer. Chem. Soc., 105,
7059-7063 (1983).
28. Finke R. G., Rapko B„ Saxton R J., Domaille P. J., J. Amer. Chem. Soc., 108,
2947-2960 (1986).
29. Bax A., Drobny G., J. Mag. Res., 61, 306-320 (1985).
Глава 9
Гетероядерная корреляционная
спектроскопия
9.1. Введение
При создании эксперимента INEPT на основе SPI в гл. 6 мы должны
были тщательно исключить влияние химических сдвигов спинов S с
помощью спинового эха. Если уберем эхо н сделаем варьируемым
интервал между оставшимися импульсами, то получим
S:
я я
2 ~ ~2
Выборка (12)...
Ясно, что этот эксперимент может также приводить к переносу поляри-
зации, но степень переноса будет зависеть от специфического располо-
жения векторов намагниченности, относящихся к компонентам мульти-
плета, во время второго импульса. Оно в свою очередь зависит от
резонансных частот сигналов S и длительности гх. Таким образом, мы
имеем основу для двумерного эксперимента: амплитуда сигнала I,
детектируемая в течение времени t2, будет модулироваться как функция
г, на резонансных частотах спинов S. Приведенная выше схема состав-
ляет фундамент гетероядерной корреляционной спектроскопии. Другой
путь рассмотрения этой последовательности состоит в сравнении с
COSY. Единственная разница заключается в том, что перенос коге-
рентности после второго импульса распространен на другое ядро с по-
мощью одновременного импульса на частоте этого ядра. Таким обра-
зом, видно, что все эксперименты в гл. 6, 8 (исключая NOESY) и 9 осно-
ваны на одном и том же явлении; переносе когерентности между
взаимодействующими спинами, который проще всего можно понять
в контексте SPL
Так как все основы для понимания двумерного ЯМР изложены
в предыдущей главе, то здесь у нас остается относительно простая
задача-изучить несколько технических деталей гетероядерного экспе-
римента и сделать обзор некоторых его вариантов. Простейший вид
гетероядерной корреляции, описанный в следующем разделе, н COSY
(предпочтительно в форме фазочувствительного DQF - COSY) представ-
ляют собой два главных метода двумерного ЯМР, к которым вы
должны обращаться в первую очередь, берясь за решение проблемы. Все
350
Глава 9
другие эксперименты более специфичны и приспособлены, к частным
ситуациям, поэтому лучше всего держать их в резерве до тех пор, пока
анализ сколько-нибудь не продвинется.
Довольно странно, что, несмотря на популярность игры по изобре-
тению сокращений, не возникло согласия по поводу того, как называть
гетероядерную корреляционную спектроскопию. Полное название про-
износить очень неудобно, и авторы обычно прибегают к некоторой
сокращенной версии. Часто ее называют H-X-COSY. Но тогда возни-
кает путаница, если другое ядро не протон, так же как и в случае, когда
говорят просто COSY. Для ясности и краткости в дальнейшем я буду
называть этот эксперимент в его оригинальной форме HSC (от англ.
Heteronuclear Shift Correlation). Не сомневаюсь, что читатели с боль-
шими творческими способностями придумают свое собственное, более
запоминающееся обозначение.
9.2. Детали HSC
9.2.1. Устранение различных КССВ
Введение. На рис. 9.1 показано, что получается в результате при-
менения основной последовательности HSC для системы АХ. Сигналы
в каждом измерении связаны кросс-пиками. Точно так же как и в фазо-
чувствительном COSY, компоненты оказываются в противофазе. Очень
часто координата спектра vx как бы воспроизводит протонные хими-
ческие сдвиги, a v2 содержит сдвиги гетероядра, например углерода.
Ясно, что поставленный таким образом эксперимент не удовлетворяет
полностью тем требованиям, которые мы предъявляем к спектрам этих
-7,в
-7,7
-7,8
-7,9
-в^О
Д2
м.а.
I । । । ।—।—।—>—।—।—।—I-
165,0
Рис. 9.1. Основной тип эксперимента
по гетероядерной корреляции 1Н~13С
для системы АХ (муравьиная кислота,
квадратурное детектирование по Vj с
помощью метода TPPI). Обе коорди-
наты, как гН, так и 13С, содержат
дублеты в противофазах (положитель-
ные и отрицательные контуры пока-
заны красным и черным цветом). Се-
чение параллельно v2 показано над
контурным представлением.
Гетероя^ерная спектроскопия
351
ядер по одной из двух координат. Например, во время регистрации
гетероядра применяется широкополосная протонная развязка; следова-
тельно, мы не наблюдаем структуру мультиплетов, обусловленную
взаимодействием с протонами. В то же время координата vt содержит
частоты протонных линий, вызванных спин-спин овым взаимодействием
с гетероядром, например 13С-сателлиты протонных линий при наблю-
дении углерода. Поэтому для упрощения интерпретации и получения
оптимальной чувствительности в эксперименте желательно устранить
гетероядерное взаимодействие по обеим координатам. Однако мы долж-
ны соблюдать осторожность, чтобы не разрушить также и сам экспери-
мент, который непосредственно зависит от наличия взаимодействия.
Устранение взаимодействия по v2. Для того чтобы иметь возможность
включить широкополосную развязку в течение времени t2, мы должны
получить компоненты детектируемого ядра в одной фазе. Возникает та
же проблема, что н прн развязке в INEPT, н, как обычно, она решается
путем введения задержки после конечных импульсов последователь-
ности. Эта задержка, обозначаемая Д2 в терминах HSC, играет ту же
роль, что и задержка А в INEPT. В действительности это и есть та же
самая задержка, поэтому ее можно выбирать на основании критериев,
рассмотренных в гл. 6. Единственная разница состоит в том, что если
двумерный эксперимент предназначен для представления спектра в виде
магнитуды, то нам не нужно заботиться о фазовых изменениях, обус-
ловленных химическими сдвигами, в течение этого интервала. Таким
образом, нет нужды помещать n-импульс в центр Д2 с целью создания
спинового эха для экспериментов в режиме магнитуды спектра. Фазовые
изменения следует принимать во внимание, если используется фазо-
чувствительное детектирование.
Устранение взаимодействии по Для получения по координате
спектра, «развязанного» от гетероядра, требуется довольно тонкий под-
ход. Чтобы понять почему, представьте сначала, что у нас есть истинная
широкополосная развязка от ядра I. Если ее применять иа всем протя-
жении rt, то эксперимент не получится совсем, потому что компоненты
мультиплета, обусловленные гетероядерным взаимодействием, никогда
не будут иметь противофазу, необходимую для переноса поляризации.
В действительности мы хотим сделать так, чтобы гетероядерное взаимо-
действие не модулировало сигнал в течение но хотели бы все же
получать с помощью этого взаимодействия линии в противофазе, что
необходимо для переноса поляризации. Этого можно добиться подав-
лением спин-спинового взаимодействия в течение и установкой другой
задержки Дх между концом и стадией переноса поляризации, во время
которой развязка выключается. В результате мы получим полную
последовательность HSC для экспериментов в режиме магнитуды спект-
ра (рис. 9.2, последовательность А).
Дело выглядит так, как будто бы вы получили пирожное, но
с условием, что откусывать от него можно только в течение времени
352
Глава 9
А
*н: ----- t, -------ролбязка
1^Q. | раэвябка | Ьыборка
>u. it j Д1 Ai Az__--------------
H- 2 ---------- ‘1-----* I * 2 2 2 2 —^_] развязка
13C. J развязка |_ п n ft Ьыборка
В
’H: p 2 **“ 2 _>ПЧ_Т“>5 ^развязка
13q. it* тт rt rt t Ьыборка
*- 11 oml (IV, ф,
Рис. 9,2. Улучшенные схемы последовательностей HSC: Л-с гетероядерной
развязкой по V] и v2; Б-то же самое, но с рефокусировкой во время задержек
Д для фазочувствительных экспериментов; В-устранение необходимости точ-
ной широкополосной углеродной развязки с помощью п-импульса по 1ЭС
в середине
Постоянные задержки, такие, как А х, не влияют на амплитудную
модуляцию сигнала, но обеспечивают появление частотно-зависимых
сдвигов фаз в vt. Еще раз отмечу, что это не влияет на эксперимент
в режиме магнитуды спектра. Но необходимо исключить такие сдвиги
фаз, если применяется фазочувствнтельный вариант со спиновым эхом
(рис. 9,2, последовательность Б).
Практические трудности прн реализации последней последователь-
ности возникают в связи с необходимостью осуществлять широко-
полосную развязку от ядра X, что трудно или даже невозможно на
современных спектрометрах, К счастью, поскольку tt изменяется дис-
кретными шагами, вместо развязки можно просто воздействовать оди-
ночным я-нмпульсом на ядро I в центре . Как н в гипотетической схеме
широкополосной развязки, описанной в гл. 7 (разд. 7.4), при этом
направление прецессии компонент мультиплета меняется на противо-
положное, а поэтому спин-спииовое взаимодействие исчезает к концу
Для достижения развязки достаточно только одного импульса, поэтому
не происходит накопления ошибок, что препятствует применению тако-
Гетероядерная спектроскопия
353
16^0
7,6
-7,7
7, в
ЧГн)
7.9
8Р
6,1
Рис. 9.3. Эксперимент HSC с ге-
тероядерной развязкой по обеим
координатам (снова муравьиная
кислота).
го подхода при обычной широкополосной развязке. Однако н здесь
часто используют составной импульс. В таком случае оптимальной
схемой для фазочувствительного HSC с развязкой по координатам vt
и v2 была бы последовательность В на рнс. 9.2.
Задержка (1/2)Д, в этой последовательности эквивалентна т в INEPT,
и, следовательно, она должна иметь длительность 1/4J (т. е. At = 1/2*7).
Весь диапазон прямых КССВ протонов и углерода составляет
125-210 Гц. Одиако в большинстве случаев при записи С—Н-корреля-
ционных спектров можно принять, что эта константа составляет около
130-150 Гц. Тогда Aj будет равно 3-4 мс. При необходимости значение
А 2 можно использовать для редактирования, но обычно оно устанав-
ливается равным 0,3/J (2-2,5 мс для Н—С-корреляции) для того, чтобы
правильно воспроизводить интенсивности для групп IS, IS2 и IS3. В этом
случае для системы АХ получается спектр, приведенный иа рис, 9.3.
9.2.2. Другие экспериментальные аспекты
Фазовый цикл. При создании фазового цикла для HSC самой важной
проблемой является исключение аксиальных пиков и квадратурное
детектирование по vх. Фазовое альтернирование конечного импульса по
спину S и приемника позволяет исключить аксиальные пики. Такая же
процедура используется для устранения собственной намагниченности
ядра I в эксперименте INEPT. При этом необходимо, чтобы квадратурное
детектирование проводилось в фазочувствительном режиме с помощью
процедуры RuSH или TPPI, выбор которой зависит от особенностей
конструкции вашего спектрометра. Однако в литературе часто встре-
чаются примеры создания эксперимента по правилам эха в режиме
магнитуды спектра. Для этого случая конечный л/2-импульс по спину
S сдвигается на 90° одновременно со сдвигом приемника на —90°.
Базовый фазовый цикл, таким образом, имеет четыре шага, или две
пары из двух шагов, каждая в фазочувствительной форме.
При необходимости этот четырехшаговый цикл может быть рас-
23 75
354
Глава 9
ширен с помощью последовательности CYCLOPS. В этом случае про-
исходит циклирование фазы всех импульсов и приемника с шагом в 90 ,
а также фазовое альтернирование всех л-импульсов.
Время регистрации и частота повторения. Поскольку данный экспе-
римент включает гетероядерное детектирование, потребуется тщатель-
ная оптимизация всех временных параметров для обеспечения прием-
лемой чувствительности. Изложенные здесь принципы уже обсуждались
в гл. 7 (разд. 7.5.2) и 8 (разд. 8.3.5). Так как эта последовательность
включает перенос поляризации, то частоту повторения определяют
времена 7] ядер S (обычно протонов). Для релаксации ядер S между
прохождениями должен быть оставлен период около 1,37]. Заметим, что
это-время между прохождениями, а не общая скорость повторения,
включающая время регистрации, потому что широкополосная развязка
от S включается в течение времени /2.
Время регистрации по должно быть по крайней мере равно
среднему TJ для ядер I. Данное условие легко выполнимо, так как это
время не является критическим для общего времени эксперимента. При
этом время регистрации по может быть очень коротким. В отличие от
COSY, где нам следовало быть весьма аккуратными, чтобы избежать
уменьшения сигнала прн подавлении противофазных пиков, сигналы
в HSC находятся в фазе. Таким образом, необходимо только, чтобы
А(1 было достаточно большим для получения нужного нам разрешения
по этой координате. Прн рутинном использовании HSC мы просто
хотим скоррелировать протонные сдвиги с их гетероядернымн партне-
рами-ядрами X; следовательно, по координате vt допустимо цифровое
разрешение в 10 Гц на точку или более, соответствующее ЛГ1 = 100 мс
или меньше. Если же по Vi необходимо получить высокое разрешение,
то в таком случае следует увеличить время Atl. Однако прн этом
чувствительность эксперимента быстро понижается. В гл. 10 (разд.
10.4.3) для такого случая описан альтернативный подход. Идеальный,
хотя н трудно выполнимый на практике, способ достижения высокого
разрешения по координате протонов состоит в том, чтобы эту коор-
динату сделать v2, т.е. выполнить эксперимент «наоборот» [1].
Если эксперимент HSC содержит небольшое число инкрементов по
и частота повторения оптимизирована для протонных времен 7], то
чувствительность этого эксперимента очень высока. Однако, поскольку
чувствительность зависит от огромного числа факторов, ее довольно
трудно точно предсказать. Я нашел следующее исключительно полезное
правило. Определим возможное число прохождений на каждый инкре-
мент задавая общее время эксперимента и требуемое число инкре-
ментов. Затем получим спектр INEPT с этим числом прохождений, т. е.
выполним эксперимент с = 0. Тогда если в спектре проявляется
большинство ожидаемых резонансных сигналов даже с плохим отно-
шением сигнал/шум, то двумерный корреляционный эксперимент не-
сомненно будет иметь подходящую чувствительность при условии, что
Гетероядерная спектроскопия
355
мы правильно подобрали и взвешивающие функции. Гетероядерная
корреляционная спектроскопия имеет шанс на успех даже тогда, когда
в эксперименте с Z, = 0 сигналы не видны. Мы не должны забывать, что
все прохождения дают вклад в конечные сигналы.
9.2.3. Использование HSC
Необходимость применения HSC для решения химических проблем
вполне очевидна. Метод HSC позволяет идентифицировать спин-спи-
новую связь в гетероядерных системах. Здесь мне бы хотелось это
продемонстрировать, а также показать некоторые значительные преиму-
щества двумерного варианта. Первое преимущество - скорость. На
рис. 9.4 представлены протонный н углеродный спектры соединения 1,
1
Рис. 9.4. Протонный и углеродный спектры соединения 1. Углеродный спектр
зарегистрирован с использованием DEPT (400 прохождений). На рис. 9.5 ис-
пользован тот же образец для эксперимента HSC.
23*
356
Глава 9
Vj’
Рис. 9.5. Спектр HSC соединения 1 (128 инкрементов по для времени регистра-
ции по этой координате в 76 мс; 192 прохождения на инкремент). Приведено
отнесение протонов, полученное с использованием COSY в предыдущей главе.
В содержащей много сигналов центральной области непросто определить про-
тонные сдвиги по контурному представлению. Однако их легко измерить при
исследовании вертикальных сечений спектра. Отнесение Н+ и Hi может быть
обратным.
которое мы уже широко исследовали в гл. 8, а на рис. 9.5-спектр HSC.
После того как отнесены сигналы в протонном спектре, упражнение
по отнесению углеродных резонансных сигналов является тривиальным.
Получение той же самой информации с помощью селективной гетеро-
ядерной развязки в этом случае, весьма вероятно, было бы невоз-
можным из-за сильного перекрывания сигналов в протонном спектре.
Но, даже если такие селективные развязки возможны, выполнение более
чем двух или трех подобных экспериментов чрезвычайно утомительно
по сравнению с регистрацией HSC.
Эксперимент HSC может показаться очень простым, но при наличии
сильной связи между протонами [7] возникают серьезные осложнения.
В слабосвязанных системах наблюдаются только кросс-пики между
протонами и непосредственно связанными с ними гетероядерными
партнерами. Однако при наличии сильной связи намагниченность может
переноситься через систему, приводя к непрямым корреляциям. Сле-
довательно, в системе типа НА — СА — Св — Нв протои НА может давать
кросс-пик с Св, если он сильно связан с Нв. На практике подобная
ситуация распознается без труда. При этом необходимо учитывать
следующий нюанс: именно 13С-сателлнты должны проявлять сильную
связь. Система, в которой наблюдается первый порядок для 12С-изото-
померов, может иметь снльносвязапные 13С-сателлиты, потому что
относительные химические сдвиги протонов в этих системах могут
заметно различаться. Противоположное (т.е. слабая связь 13С-сателли-
Гетероядерная спектроскопия
357
тов при наличии сильной связи у соответствующих 12С-нзотопомеров)
также иногда бывает верным.
Второе преимущество составляет тип распределения информации.
Обычные гетероядра, такие, как 13С и 31Р, имеют диапазон химических
сдвигов как в герцах, так и в миллионных долях, намного больший, чем
протоны. Часто их спектры состоят нз наборов одиночных линий,
поскольку отсутствует гомоядерная связь, что обусловлено либо низким
изотопным содержанием партнеров по гомоядерному взаимодействию,
либо наличием в молекуле только одного гетероядра с высоким содер-
жанием, а также благодаря широкополосной развязке от протонов.
Совместное действие этих двух факторов приводит к тому, что эффек-
тивная протяженность гетероядерного спектра намного больше, чем
протонного. Даже для сравнительно больших молекул в спектре редко
возникает перекрывание резонансных сигналов. В спектре HSC инфор-
мация о частотах протонов передается на резонансной частоте гетеро-
ядра, что делает возможным использование различия в свойствах
гетероядер для анализа сложных протонных спектров. При отсутствии
сильной связи протонов и при условии, что по Vi достигается доста-
точное цифровое разрешение, эту идею можно реализовать весьма
просто. Сечение спектра HSC параллельно Vt на частоте, соответствую-
щей химическому сдвигу ядра X, дает в итоге положение протонов,
связанных с этим ядром. Действительно, выводить на график только
отдельные сечения часто бывает полезнее, чем расписывать полное
контурное представление.
Рис. 9.6 и 9.7 помогают проиллюстрировать эффективность этой
методики. На рис. 9.6 представлена ароматическая область протонного
спектра на рабочей частоте 500 МГц иридиевого комплекса, который
является интермедиатом каталитического гидрирования. Наша цель
состояла в отнесении всех резонансных сигналов. С помощью экспе-
Рис. 9.6. Протонный спектр иридиевого комплекса.
358
Глава 9
I I Н I [ n I 11 I! I I 11 и и I I м 11 11 I 11 И I 11' Ч и III [ I I I 111 m I u u I и 11 I и н H'tir
1 ?,4D \Z0 7,00 8,50
М-Э.
Рис. 9.7. Сечения спектра 1H-31P-HSC иридиевого комплекса, показанного на
рис. 9.6, параллельно vP Отдельные сечения приведены в виде сигналов поглоще-
ния, хотя и не проводилось фазочувствительного эксперимента.
риментов ЯЭО мы смогли определить расположение лигандов вокруг
иридия [2]. Связи между протонами были легко определены с исполь-
зованием COSY. Оставалось найти опорные точки для отнесения. На
рис. 9.7 показаны сечения спектра 1II — 3LP-HSC на частотах химических
сдвигов каждого атома фосфора. Таким способом были однозначно
отнесены орто-протоны фенильных колец. Особенно стоит отметить
протон Нх, который был идентифицирован с помощью данной мето-
дики, хотя в одномерном протонном спектре область, где наблюдается
резонанс этого протона, выглядит совершенно неподдающейся интер-
претации. На рис. 9.7 также видны небольшие отклики на некоторых
других протонах фенильных колец, связанных с фосфором. Они появ-
ляются благодаря переносу поляризации за счет дальних протон-фос-
форных констант, даже несмотря на то, что задержки Дг и Д2 выбраны
в соответствии с величиной константы через три связи с орто-прото-
нами.
Этот пример также иллюстрирует третье преимущество мощность
метода. Ясно, что по стандартам двумерного ЯМР это было «простое»
соединение. Как только эксперимент закончен, последующее отнесение
является минутным делом. Нет больших трудностей в распространении
методики на более сложные задачи, чем эта. Важная особенность
заключается в преимуществе совместного использования COSY и HSC,
поскольку это позволяет проследить всю структуру молекулы. Начиная
с некоторого легко относимого резонансного сигнала, скажем в угле-
родном спектре, соответствующий протонный сдвиг может быть идеи-
Гетероядерная спектроскопия
359
тнфицирован из HSC. Тогда COSY позволяет локализовать соседние
протоны, с помощью которых в свою очередь можно провести даль-
нейшее отнесение углеродных сигналов. Для проведения анализа про-
тонного спектра вовсе не нужно, чтобы он имел простую структуру, так
как можно локализовать полученные кросс-пикн. Пример такого под-
хода к отнесению безнадежно неразрешенного протонного спектра
описан в работе [3]. Некоторые другие методики (например,
INADEQUATE или RCT) также дают возможность определить углерод-
ный скелет молекулы. Но совместное использование COSY и HSC
наиболее практично. Для реальных задач, когда доступно только огра-
ниченное количество вещества, такое сочетание является лучшим спо-
собом их решения.
9.3. Эксперименты, родственные HSC
9.3,1. Широкополосная гомоядерная развязка
по Vt в эксперименте HSC
В типичном спектре HSC с довольно низким разрешением по vt
наличие гомоядерного протон-протонного взаимодействия является
неблагоприятным фактором. Зачастую отдельные линии не разрешают-
ся нз-за ограничений оцифровки, и тогда гомоядерное взаимодействие
ведет к уширению резонансных сигналов и понижению чувствитель-
ности, Для задач с низким разрешением в работе [4] предложен такой
вариант эксперимента, который с учетом определенных ограничений
позволяет исключить большую часть гомоядерных взаимодействий по
V1-
Способ, которым это достигается, состоит в следующем. Допустим,
что на 13С-сателлиты линий протонного спектра можно воздействовать
селективным я-импульсом, не затрагивая остальные резонансные сигналы.
Пусть протон, присоединенный к 13С, одновременно взаимодействует
с другими протонами, связанными с соседними 12С-атомами. Поэтому,
используя такой «полуселектнвный» импульс, можно инвертировать
состояние протона при 13С, не воздействуя на его партнеров по спин-
спиновому взаимодействию, В гл. 4 уже было показано, почему гомо-
ядерное взаимодействие обычно не рефокусируется п-импульсами. При-
чина в том, что оба ядра, вовлеченные в спин-спииовое взаимодействие,
инвертировали свои спиновые состояния в результате смены направ-
лений прецессии компонент мультиплета после импульса. Однако этот
гипотетический «полуселектнвный» импульс не инвертирует вектор на-
магниченности ядра, присоединенного к 12С, Следовательно, поместив
его в центре /j в эксперименте HSC, можно рефокусировать гомоядерное
взаимодействие. Исключение, конечно, составят геминальные взаимо-
действия, поскольку в этом случае оба протона присоединены к 13С,
Остается найти способ инвертирования 13С-сателлитов без воздей-
360
Глава 9
ствия на другие сигналы. Таким свойством обладает приведенная ниже
последовательность, называемая «билинейным оператором поворота»
[5]:
111 © -27-”’-27--©
\2/х "сн "сн \2/ х
13С: я
Действие его иа протоны, связанные с 13С, и другие («дальние») протоны
показано на рнс. 9.8. В гл. 10 (разд. 10.2.2) описана последовательность
TANGO, которая аналогичным образом действует тс/2-импульсом на
прямо связанные ядра и тс-импульсом на дальние ядра одного и того же
типа. Помещая билинейный оператор поворота иа место n-нмпульса по
13С в центре /х последовательности HSC (рис. 9.9), мы получим спектр
без гомоядерного взаимодействия по v, (рис. 9.10). Отметим, что в этом
спектре еше проявляются геминальные взаимодействия. При этом ре-
зонансные сигналы ядер, не вовлеченных в геминальные взаимодей-
ствия, стали синглетами по координате vv
Для успешного осуществления данного эксперимента необходимо,
чтобы величины гомоядерных и гетероядерных КССВ существенно
различались. В работе [4j выдвигается условие, определяющее успех
эксперимента. Оно заключается в том, что общая ширина протонных
Рис. 9.8. «Билинейный оператор поворота»; последовательность селективной
инверсии для протонов, связанных с гетероядром.
’н. /5) _Пу— 1 _ Д1_ Н — развязка
2 2J / 2J 2 2 Г
13С: п Ё
2 выборка
Рис. 9.9. Эксперимент HSC с широкополосной гомоядерной развязкой по коор-
динате vt.
Гетероядерная спектроскопия
361
Рис. 9,10, Спектр HSC (вверху справа), полученный с использованием последова-
тельности, приведенной на рис. 9.9, вместе с протонным и COSY-спектрамн того
же соединения.
мультиплетов должна быть по крайней мере в 5 раз меньше, чем
величина гетероядерной константы. Для прямых констант Н—С это
означает, что ширина протонных мультиплетов не должна превышать
25-30 Гц. В то же время диапазон гетероядерных констант должен
быть небольшим, поскольку задержка между импульсами в билинейном
операторе поворота не должна отклоняться слишком сильно от
величины 1/2J. Ошибки в этой задержке, возникающие из-за таких
отклонений, приводят к артефактам, которые можно уменьшить с
помощью одновременного поворота фазы всех протонных импульсов
билинейной последовательности с шагом в 90° при постоянной фазе
приемника [6]. Последнее ограничение заключается в том, что по-
перечные времена релаксации для протонов не должны быть слишком
короткими во избежание потери сигнала в течение дополнительного
интервала 1/J, помещенного в гг.
9.3.2. Дальние константы 13С—1Н.
Последовательность COLOC
Поскольку последовательность HSC содержит фиксированные за-
держки, определяемые величиной гетероядерного взаимодействия, в
случае малых КССВ чувствительность падает за счет поперечной ре-
лаксации. Потеря чувствительности возникает при попытке скоррели-
ровать протоны и углероды, связанные спин-спиновым взаимодействием
через две или три связи, например в тех случаях, когда нет взаимо-
362
Глава 9
Л|
н. гс --- (1 --- п --- fl ---— гс ---------Л2 -----развязка
2 2 ; 2 2
: И и
2
Рис. 9.11. Последовательность COLOC. Интервал содержащий в центре п-им-
пульс, помещается внутрь интервала АР
действий через одну связь, как в примере 1Н-31Р, описанном в
разд. 9.2.3. И вот наступает момент, когда задержка Д2 больше, чем
(1/2)Л( ; тогда стоит использовать модифицированную последователь-
ность, известную как COLOC [8J. Для типичного значения At равного
100 мс, этот момент будет достигнут, когда JHx упадет ниже 20 Гц.
Задержки Дх и Д2 являются неизбежными, но последовательность
COLOC экономит на общей длительности эксперимента за счет вклю-
чения интервала внутрь интервала Д, (рис. 9,11).
Интересно отметить, что последовательность COLOC без допол-
нительных модификаций дает спектры с широкополосной гомоядерной
развязкой по координате Vj. Так как интервал между первым импульсом
и шагом переноса поляризации фиксирован, то гомоядерные взаимо-
действия не подвергаются действию мобильного я-импульса в этом
интервале и ие модулируют сигнал как функцию В то же время на
химические сдвиги влияет положение л-импульса, поскольку они ре-
фокусируются за время и затем совершают эволюцию в оставшейся
части времени Др Координата vt спектра COLOC содержит, таким
образом, только протонные химические сдвиги. При этом наблюдаются
корреляции между взаимодействующими ядрами, как н для экспери-
мента HSC. Однако нужно помнить, что, хотя задержки Дх и Д2
определяются в соответствии с величинами интересующих нас малых
констант, в спектре могут присутствовать корреляции, обусловленные
большими константами. Значения задержек Д, определенные для даль-
них констант, могут оказаться кратными величинам, соответствующим
большим константам, что позволяет наблюдать оба типа корреляций.
Если это вам мешает, то в эксперимент может быть встроен низко-
частотный J-фильтр, упоминаемый в следующем разделе.
9.4. Эстафетный перенос когерентности
9.4.1. Введение
Постоянная цель исследований в области спектроскопии ЯМР-най-
ти метод, который позволит провести прямое определение скелета
органической молекулы в единичном эксперименте. Двумерный вариант
последовательности 13С-13C-INADEQUATE, который мы рассмотрели
Гетероядерная спектроскопия
363
в гл. 8, довольно близко подходит к решению данной задачи, однако
ценой крайне низкой чувствительности. На другом конце шкалы после-
довательностей, который ближе к реальной жизни, мы приходим к
совместному использованию COSY н HSC. Но это, конечно, два экспе-
римента, а не один. Где-то между этими крайними точками лежат
различные методы эстафетного переноса когерентности (RCT, от англ.
Relayed Coherence Transfer). Они имеют существенно более низкую
чувствительность, чем HSC, но все же гораздо большую, чем двумерный
INADEQUATE, и несут похожую, хотя н не идентичную, информацию.
Эстафетные методики, как правило, основаны на комбинации двух
шагов переноса когерентности. Один из них используется для моду-
лирования сигналов и генерации координаты Другой остается фик-
сированным и служит для того, чтобы передавать сигнал в наиболее
интересную точку. Например, самая обычная схема состоит в переносе
намагниченности от одного протона к другому, а затем на гетероядро,
связанное со вторым протоном. В результате исходный протон может
быть скоррелирован не только с тем гетероядром, с которым он прямо
связан, но и с соседним. Таким образом, возникает требуемая инфор-
мация о скелете молекулы. Существенную проблему методик этого типа
составляет отсутствие общности, потому что при наличии разнообраз-
ных спиновых систем и широкого диапазона возможных значений
протон-протонных констант оказывается невозможным оптимизировать
схему эксперимента. Поэтому к таким экспериментам не стоит обра-
щаться вначале, когда вы беретесь за решение задачи; нх можно
использовать тогда, когда другие подходы оказались бесплодными.
9.4.2. Эстафета Н—Н—С
Эстафетный Н—Н—С-эксперимент может быть построен на основе
HSC [9], как показано на рнс. 9.12. Первый шаг-удалить импульс по
углероду в конце периода гь ограничивая таким способом перенос
намагниченности к протонам. Для того чтобы сделать возможной
передачу к углероду намагниченности, перенесенной между протонами,
необходимо выждать, чтобы приняли одинаковую фазу те компоненты
мультиплета, которые обусловлены гомоядерным взаимодействием и
в данный момент находятся в противофазе. Это происходит в течение
периода тм, в котором создается спиновое эхо для исключения влияния
химических сдвигов (рнс. 9.12, последовательность Б). Теперь мы воз-
вращаемся в состояние, подобное HSC, и, как обычно, должны выждать
время Дх для того, чтобы компоненты мультиплета, обусловленные
гетероядерный взаимодействием, стали противофазными перед тем, как
завершить перенос намагниченности с помощью импульсов по про-
тонам и углероду. Задержка Д2 выполняет ту же функцию, что и в по-
следовательности HSC. Последняя модификация состоит в том, чтобы
поместить протонные и углеродные я-импульсы в центры задержек Д1
и Д2. Это необходимо, как и раньше, для фазочувствнтельных спектров,
364
Глава 9
А
’Hi *-----------^1 --------► *—Л1—й2 —> развязка
Ъ | ЬыВорка
6
1
Н:
”С:
•Н: | <------------------------ *1
’V. п
5 <— Ьв —>п*-тл —х-д, <— Д2 —* развязка
।
t
5 Ьыборка
2
-------> 1 <_ —> тг <— 5 4- й? _^п 4-^2 —> развязка
2 2 2 2 2 2
I
I
гг<- (И->- 4- Л? -+П4-- _>Ьыборка
2 2 2 2
Рис. 9.12. Построение эстафетного Н-Н-С-эксперимента на основе HSC: А-
нормальный HSC; ^’добавление второго шага протон-протонного переноса
перед гетсроядерным переносом; /?-оптимальная последовательность (см. текст).
поскольку такая процедура и в случае эстафетного эксперимента опти-
мизирует процесс переноса намагниченности [9]. На протоны действуют
два последовательных я-импульса, которые оказывается возможным
слить в один. Он помещается посередине между второй парой про-
тонных п/2-импульсов (вообще-то я бы рекомендовал не беспокоиться
по поводу этих детален!). Последовательность В (см. рис. 9.12) опти-
мальна для эстафетного Н—Н—С-эксперимеита.
Камнем преткновения в этом эксперименте является интервал т„,
который должен регулироваться в соответствии с типом протонной
спиновой системы и величинами КССВ. В литературе проанализиро-
ваны некоторые детали этой проблемы. Например, работа [10] вклю-
чает графики зависимости эффективности переноса намагниченности от
величины т для различных спиновых систем. Отметим, что в этой статье
используется обозначение т, относящееся к общему времени смешивания,
которое в наших обозначениях соответствовало бы т^ + Др В отсут-
ствие точной оценки значения (ясно, что, строго говоря, этого нельзя
сделать для неизвестной структуры) выбирается величина, равная при-
мерно 1/5,/нн. Типичные значения протои-протонных констант состав-
ляют около 7 Гц. Следовательно, значение надо устанавливать
равным примерно 28 мс. Несогласованность величины с требова-
ниями спиновой системы может приводить к очень сильному ослаб-
лению сигналов переноса намагниченности в эстафетных экспериментах.
Гетероядерная спектроскопия
365
В самом лучшем эксперименте RCT чувствительность, вероятно, в 4 раза
меньше, чем при использовании HSC.
9,4.3, Использование RCT
На рис. 9,13 приведен пример использования эстафеты Н—Н С.
Здесь сравниваются схематические спектры HSC и RCT для фрагмента
типа НЛ—Сд—Св—Нв, В спектре HSC кросс-пики появляются при
химических сдвигах (НА, СА) и (Нв, Св). В эстафетном спектре Н-Н-С
эти пики еще присутствуют, однако они скомбинированы с другими при
(НА, Св) и (Нв, СА), возникающими в результате косвенного переноса
намагниченности. Таким образом, углеродный скелет молекулы может
быть прослежен через вицинальные протон-протонные взаимодействия.
На рис. 9.14 приведен реальный эстафетный спектр Н-Н-С для соеди-
нения 2.
То, что непосредственно связанные атомы все еще дают кросс-пики
в спектрах переноса когерентности по типу эстафеты, весьма неудобно.
Поэтому был предложен метод [11], ослабляющий кросс-пики между
«соседями». Он основан на использовании разницы между величинами
прямых и дальних углерод-протониых КССВ. Этот «низкочастотный
J-фильтр», в принципе хотя и привлекателен, одиако содержит прак-
тически неудобный длинный фазовый цикл, увеличивающий минималь-
ное число прохождений на каждый инкремент до уровня, который во
многих случаях может оказаться неприемлемым.
Было предложено множество разнообразных экспериментов по эста-
фетному переносу когерентности: Н-С-С [12], Н-Х-Н [13] (к со-
жалению, обозначенный термином HERPECS) и С-Н-Н [14]. Оче-
видно, что применение этих методов зависит от конкретных обстоя-
тельств. Например, эстафета Н-С-С сходна с INADEQUATE и тре-
бует, чтобы в молекуле находились рядом два атома 13С. Следова-
тельно, для необогащенных систем этот метод очень мало чувствителен.
Однако в этом отношении он иемиого лучше, чем INADEQUATE,
Рис. 9.13. Схематическое представление спектра HSC (слева) и эстафетного спект-
ра Н Н-С (справа).
366
Глава 9
О Mi
_ШЦ
Нс
—I----1----1----1----1—“1-----1-----г— I —~1------Г"
5.5 5,4 5,3 5,2 51 5,0 49 48 4? 4,8 45
м.Э.
Рис. 9.14. Эстафетный спектр Н-Н--С для соединения 2. Прямые корреляции
помечены N (для «соседей»), а эстафетные корреляции-R (для «дальних»).
Отметим, как заметно изменяется интенсивность пиков вплоть до того, что
в одном случае “N’’-пик полностью отсутствует. Такие изменения амплитуды
сигнала являются основным слабым местом в данном эксперименте.
530 120 110 100
и. а.
-44
-4S
-5.0
-5,2
-5,4
130 120 110 100
м.З.
м_а.
и может быть оптимизирован для определения четвертичных углеродов.
Эстафета Н-Х-Н основана на регистрации протонов и является по-
тенциально чувствительным экспериментом, который может заполнить
пустоты в сетке взаимодействий при корреляции протонов через общее
гетероядро. Он имеет то преимущество, что вообще не требует изме-
рений на гетероядрах, и должен быть весьма практичным для ядер
с большим естественным содержанием, таких, как Л1Р.
Литература
1. Neuhaus Keeler J., Freeman R., J. Mag. Res., 61, 553 558 (1985).
2. Alcock N.W., Brown J. M., Derome A. E., Lucy A. R., J. Chem. Soc. Chem. Com-
mun„ 575-578 (1985).
3. BhaceaN.S., Balandrin M. F„ Kinghorn A.D., Frenkiel Г.А.. Freeman R., Mor-
ris G.A., J. Amer. Chem. Soc., 105, 2538 -2544 (1983).
4. Bax A., J. Mag. Res., 53, 517-520 (1983).
5. Garbow J. R., Weitekamp D.F., Fines A., Chem. Phys. Lett., 93, 504 (1982).
6. Bolton P.H., Wilde J. A.. J. Mag. Res., 59, 343-346 (1984).
7. Morris G.A., Smith K.L, J. Mag. Res,, 65, 506 509 (1985).
8. Kessler H., Griesinger C., Zarbock J., Loosli H. R., J. Mag. Res., 57, 331-336 (1984).
9. Kessler FL, Bernd M.. Kogler FL. Zarbock J., Sorensen O. W., Badenhausen G..
Ernst R. R., J. Amer. Chem? Soc., 105, 6944-6952 (1983).
Гетероядерная спектроскопия
367
10. SarkarS.K., Вах A., J. Mag. Res., 63, 512-523 (1985).
11. Kogler H„ Sorensen О. ИС, Badenhausen G„ Ernst R.R., J. Mag. Res., 55, 157-163
(1983).
12. Kessler П. Bermel ИС, Griesinger C., J. Mag. Res., 62, 573 -579 (1985).
13. Delsuc M.A., Guittet E.„ Troitin N., Lallemand J. K, J. Mag. Res., 56, 163-166
(1984); Neuhaus D.. Wider G., Wagner G., Wuthrich K., J. Mag. Res., 57, 164-168
(1984).
14. Field L.D., Messerle B. A., J. Mag. Res., 62, 453-460 (1985).
Глава 10
Спиновое эхо и «/-спектроскопия
10.1. Введение
Теперь мы рассмотрим эксперименты, которые включают спиновое
эхо, такие, как INEPT, INADEQUATE и RCT. Во всех этих примерах эхо
используется ие для того, чтобы добавить что-либо новое к экспери-
менту. Ойо устраняет влияние химического сдвига. Есть еще одни класс
экспериментов, в которых эхо непосредственно определяет получаемый
результат. Они объединены здесь под общим названием «./-спектро-
скопия», подчеркивающим тот факт, что влияние структуры мульти-
плета иа вид окончательного спектра представляет главную особенность
этих экспериментов. J-Спектроскопии было уделено большое внимание
на раннем этапе развития двумерного ЯМР, н ее теоретические н прак-
тические аспекты были весьма подробно проанализированы. Однако
вследствие различных обстоятельств большинство из этих эксперимен-
тов не имеет столь общего применения, как корреляции химических
сдвигов, рассмотренные нами в двух предыдущих главах. По этой
причине и из-за доступности обширной литературы я не буду излагать
этот вопрос детально, а просто представлю короткий обзор основных
экспериментов по спиновому эху и некоторых их приложений.
10.2. Гетероядерная J-модуляция и спиновое эхо
10.2.1. Введение
Обсуждение вопроса удобно начинать с рассмотрения именно этого
эксперимента, потому что его легко понять, используя векторную
модель во вращающейся системе координат. В гл. 4 (разд. 4.4.4) я от-
метил, что если вы выполняете эксперимент по спиновому эху в гетеро-
ядерной системе, то у вас есть право выбора, рефокусировать ли
гетероадерное взаимодействие или нет, поскольку вы можете действо-
вать тг-импульсом на второе ядро, а можете и не действовать. Если вы
выбираете метод, основанный на использовании п-импульса в соот-
ветствии с последовательностью
/ п\
X: ~ т — — t — Выборка...
Y: я (Развязка...)
Спиновое эхо и J-спектроскопия
369
Y: Я (развязка)
Рис. 10.1. Последовательность спинового эха для гетероядерной системы АХ.
где X - наблюдаемое ядро (например, 13С), a Y-другое ядро (например,
1Н), то в таком случае эхо не рефокусирует константу спин-спинового
взаимодействия. Широкополосная развязка от Y по желанию может
быть включена или выключена во время регистрации, а подходящим
образом подобрав т, можно получить интересные эффекты, зависящие
от величины константы спин-спинового взаимодействия между X и Y.
Это довольно легко понять на основе векторной модели во вращаю-
щейся системе координат.
Рис. 10.1 показывает результаты действия этой последовательности
для групп XY и XY2 в предположении, что X и Y имеют спины 1/2
(например, ядро 13С и протоны метиновой и метиленовой групп)
и г равно 1/2J. Для группы XY сигнал X является дублетом, и,
следовательно, если мы совместим опорную частоту с его центром, то
увидим две компоненты, сдвинутые на ± J/2 Гц во вращающейся систе-
ме координат. Через промежуток времени, равный 1 /2J, они повернутся
на угол + 1/2J х J/2, т. е. на 1/4 оборота, и будут направлены вдоль осей
+ х. В течение второй половины последовательности они продолжают
движение в том же самом направлении, так как я-импульс по ядру
Y обменивает все а- и ^-состояния; в то же время импульс я, по ядру
X меняет местами две компоненты, поэтому к началу периода ре-
гистрации они обе выстраиваются вдоль оси — г Теперь мы можем
спокойно включить широкополосную развязку по Y и регистрировать
спектр на ядре X, который содержит синглет. В результате при обычной
коррекции фазы сигналы, ориентированные в начальный момент вдоль
положительного направления оси + у, дадут синглет с перевернутой
фазой.
Для группы XY2 сигнал X представляет собой триплет (рис. 10.2).
Если мы совместим опорную частоту с центром триплета, то в таком
случае одна линия остается в покое вдоль оси +>’. тогда как крайние
компоненты мультиплета поворачиваются в противоположных направ-
лениях на угол ±J. Поскольку они двигаются вдвое быстрее, чем
дублетные компоненты, в момент действия тс-импульса они совместятся
Друг с другом и направлением оси — у и возвратятся в исходное
состояние вдоль оси +>’ к началу регистрации. Таким образом, полу-
ченный развязанный сигнал имеет фазу, противоположную той, которая
была получена для группы XY. Следовательно, эксперимент позволяет
различать число протонов, присоединенных к ядру X, и в этом смысле
370
Глава 10
-----------------Ьиборно
(poitaSHB)
(П
Рис. 10.2. Та же последовательность, что и на рис. 10.1, но только для системы
АХ2.
Рис. 10.3. Альтернативный «метод переключаемого декаплера» для осуществле-
ния гетероядерной J-модуляции спинового эха.
конкурирует с внерезонансной развязкой и методами редактирования
спектров. Если мы повторим эту процедуру для групп X (т.е. четвер-
тичного углерода) и XY3 (т. е. метила), то оказывается, что эксперимент
для группы X приводит к той же самой фазе, что и в случае группы XY2,
а для группы ХУ3-как в случае XY. В общем, все сигналы от ядер,
прямо связанных с четным числом протонов, имеют фазу, противо-
положную по отношению ко всем сигналам ядер X, имеющих нечетное
число непосредственно связанных протонов.
Интересно, что тот же самый эксперимент можно провести без
применения импульса по ядру Y. Достаточно только включить на
некоторое время декаплер, как показано на рис. 10.3. Так как развязка,
по существу, «замораживает» компоненты мультиплета, где бы они ни
находились во вращающейся системе координат в момент ее включения,
то, установив т = 1/J и включив декаплер одновременно с л:-импульсом
по X, мы получим желаемый результат. Тот же эффект достигается
выключением декаплера в течение первой части эха, включением его во
время второго интервала т и в период регистрации. Описанные два
эксперимента одинаковы только тогда, когда нужны развязанные сиг-
налы. Если развязка не используется во время регистрации, то первый
эксперимент приводит к экзотическим результатам [1].
Все эти последовательности дают спектры, в которых сигналы групп
с четным и нечетным числом протонов различаются по фазе (рис. 10.4).
Поскольку в эксперименте по ./-модулированному спиновому эху
регистрация происходит с широкополосной развязкой, получаемые
Спиновое эхо и Л спектроскопия
371
"" 40 38 36 34 32 30 28 26 24 5 20 18 iF”
М.Э.
Рис. 10.4. Нормальный спектр ЯМР 13С (внизу, часть спектра холестерилацетата)
и спектр /-модулированного эха (вверху, метод переключаемого декаплера при
т = 1//). Фаза спектра приведена к такому виду, что сигналы групп СН2
и четвертичных углеродов положительны, а групп СН3 и СН отрицательны.
в этом случае разрешение и чувствительность значительно выше, чем
при использовании виерезонансной развязки. В то же время он менее
информативен, поскольку группы X и XY2 неразличимы, так же как
и группы XY и XY3. Надо иметь в виду, что доведенная до конца
расшифровка спектра должна давать лучшие результаты, чем любой из
этих двух методов; она позволяет различить все типы групп, но требует
больше внимания к экспериментальным деталям. Эксперимент с /-мо-
дуляцией, выполненный с помощью переключения декаплера (такие
эксперименты меиее трудоемки из-за того, что не требуют проведения
калибровки амплитуды импульса декаплера), иногда может быть по-
лезным для быстрого отнесения. Прежде всего его следует использовать,
когда спектр с виерезонансной развязкой оказывается слишком пере-
груженным сигналами или зашумленным и кажется, что постановка
эксперимента DEPT требует слишком много хлопот.
Большая проблема для эксперимента по /-модулированному спи-
новому эху заключается в том, что задержка т зависит от значения J.
В реальных ситуациях мы встречаемся с широким диапазоном величин
J, который, например, для прямых углерод-протоиных констант состав-
ляет примерно 125-210 Гц. Любое отклонение от условия т = 1// (или
1/2/) ведет к понижению амплитуды детектируемых сигналов. В крайней
ситуации, когда т = 1/2.7 для эксперимента с переключением декаплера
(или 1/4/ для импульсного эксперимента), сигналы всех ядер, за исклю-
чением тех, которые не имеют связанных с ними протонов, оказываются
24*
372
Глава 10
Рис. 10.5. Нулевое условие (г = 1/4 J) для взаимодействующих ядер в эксперимен-
те по гетероядерному ./-модулированному спиновому эху.
JL
|-1--1-1--1-1--1-1--1-Г—]--1--1-Г" 1 J-!--1-1--г—I--1-1--1-Г-Г" 1--1-1-1--1--1-г~
70 60 50 *0 JO 20
м.Э.
Рис. 10,6. Идентификация четвертичных углеродов с использованием нулевого
условия (тот же пример, что и на рис. 10.4). Обнуление сигналов протонирован-
ных углеродов зависит от точности задания задержки т, поэтому, если есть
разброс в значениях констант спин-спинового взаимодействия, некоторые сиг-
налы устраняются не до конца.
нулевыми (рис. 10.5 и 10.6). Эта зависимость амплитуды сигналов от
длительности т дает иам ключ к тому, как обобщить эксперимент.
К этому я еще вернусь.
10.2.2. Разностное спиновое эхо
Фазовое поведение ./-модулированного эха может быть использовано
как основа для простой техники расшифровки спектров. Рассмотрим
специфический пример - вещество, содержащее единственную метку 13С.
Мы выполним эксперимент по J-модулированному эху наоборот, ис-
пользуя развязку по углероду и наблюдение протонов. Использование
широкополосной развязки по углероду является характерной чертой
методов с составными импульсами, описанными в гл. 7. Если ваш
Спиновое эхо и ^ спектроскопия
373
спектрометр не дает таких возможностей, то для эха можно исполь-
зовать импульсный метод, и в получаемом протонном спектре будет
наблюдаться взаимодействие с 13С, В данном случае мы должны
рассмотреть только группы «X» (т.е. протоны, присоединенные к 12С)
и группы «XY» (т.е. протоны, присоединенные к метке 13С). Если мы
принимаем, что протон-протонные константы настолько меньше, чем
углерод-протонные, что их влияние пренебрежимо мало в течение
интервала т, равного 1/./сп- то анализ проводится точно так же, как
и раньше. Положим, что мы выполняем два эксперимента:
— т — — т — Выборка ...
'Н:
13С:
Развязка ...
н
( п\
Н: “ т — Пу — т — Выборка ...
13С: Развязка ...
Первый из них ведет к нормальному спектру, поскольку взаимодействие
углерод-протон рефокусируется вместе со всеми другими. Однако во
втором эксперименте включение развязки в течение второй половины
последовательности останавливает рефокусировку взаимодействия. Та-
ким образом, сигналы от протонов, связанных с меткой 13С (и только
эти протоны), инвертируются во втором эксперименте. Вычитание двух
спектров усиливает сигналы протонов, присоединенных к метке, и по-
гашает сигналы всех других (рнс. 10.7). Так же как и в случае разностных
экспериментов, уровень погашения будет зависеть от многих аспектов
конструкции спектрометра. Практически мы можем ожидать понижения
амплитуды нежелательных пиков в несколько сот раз.
Достоинство этого эксперимента заключается в том, что он соеди-
няет в себе селективную природу метки 13С с чувствительностью
протонного детектирования. В противоположность обращенному DEPT
(гл. 6) мы должны иметь полную чувствительность по протонам. Потеря
сигнала происходит только через механизм поперечной релаксации
в течение эха. Обращенный DEPT переносит углеродные заселенности
к протонам, понижая таким образом чувствительность в 1,3-4 раза;
частота повторения также определяется значениями Т\ для углеродов.
В то же время эксперимент по обратному переносу поляризации дает
много лучшее подавление сигналов протонов, присоединенных к 12С, так
как они могут быть насыщены при широкополосном облучении между
прохождениями. Поскольку технические требования этих двух конку-
рирующих экспериментов довольно различны, имеет смысл рассмотреть
оба эксперимента прн планировании действий по решению проблемы
метки. Примеры использования разностного спинового эха даны в ра-
боте [2].
374
Глава 10
Ч 1 ' ' ’ t ' 1 ' ' I ’ 1 ’ ' I.I ’ ' ’ 1 1.T1
150 100 50 0 -50 -100 -ISO
Гц
Рис. 10.7. Принцип разностного спинового эха (протонный спектр муравьиной
кислоты, обогащенной по 13С на 60%; импульсный метод был использован таким
образом, чтобы была видна линия от необогащенного соединения). Получены два
спектра: один с использованием л-импульса по 13С (вверху слева) и другой без
этого импульса (внизу слева). В разностном спектре (справа) сигналы, обуслов-
ленные спин-спиновым взаимодействием, рефокусируются, а сигналы ядер, не
имеющих констант, исчезают.
Для многих случаев простое разностное спиновое эхо, возможно,
будет давать недостаточное подавление сигналов протонов, не свя-
занных с меткой. К счастью, эксперимент можно улучшить, если
заменить п/2-импульс последовательностью, известной как TANGO [3].
Эта последовательность для селективного возбуждения действует
по-разному на ядра разного типа в соответствии с тем, связаны они
с гетероядром или нет, действуя как я/2-импульс на связанные ядра и как
я-импульс в противном случае. Это достигается с помощью спинового
эха:
‘Н:
13С:
На рис. 10.8 показано действие этой последовательности при т, равном
1/2JCH. Сравним эту последовательность с «билинейным оператором
поворота», введенным в гл. 9 (разд. 9.3.1). Последовательность TANGO
сама по себе обычно не дает адекватного подавления сигналов протонов,
не связанных с меткой, но в сочетании с разностным спиновым эхом
получаемые результаты сравнимы с достигаемыми прн использовании
обращенного DEPT, но при этом с лучшей чувствительностью. В этом
Спиновое эхо и ./-спектроскопия
375
Рис. 10.8. Последовательность TANGO для селективного возбуждения ядер,
имеющих гетероядерную константу.
Рис. 10.9. Селективное детектирование протонов, присоединенных к метке 13С.
с помощью разностного спинового эха; начальный я/2-им пульс заменен после-
довательностью TANGO. Во время регистрации применяется широкополосная
развязка по 13С. Подавление сигналов от необогатценных молекул подобно тому,
что получается при использовании обращенного DEPT, но чувствительность
значительно выше. Это тот же самый образец, который использовался для
рис. 6.19, однако эксперимент был проведен спустя некоторое время; в слабо-
польной области относительно основного сигнала видны некоторые сигналы от
продуктов разложения вещества, содержащего изотопную метку.
376
Глава 10
можно убедиться, сравнив рис. 10.9, демонстрирующий спектр, полу-
ченный при сочетании TANGO и разностного спинового эха, с рис. 6.19
в гл. 6, на котором для того же самого соединения изображен экспе-
римент обращенного DEPT.
10.3. Гетероядерный J-спектр
10.3.1. Введение
Рассмотрим последовательность J-модулированного эха с примене-
нием импульсного метода, однако в то же время вместо тщательно
определенного интервала т мы будем использовать произвольный ин-
тервал ^/2. Ниже я буду повсюду говорить о наблюдении связанных
спин-спиновым взаимодействием ядер и 13С, но, конечно, это может
быть любая пара ядер:
Ч I 1 1 1 _
С: (j/ - — - - -- Выборка ...
1Н: я Развязка ...
Исследуя рис. 10.10, мы можем проследить за поведением дублета.
В течение данной последовательности каждая компонента отклоняется
на угол Поскольку мы собираемся включить развязку во время
регистрации, главный интерес представляет результирующая этих ком-
понент. Проецируя их на оси х и у, мы получим величину IWcosfnJrj)
вдоль оси у, в то время как проекции компонент вдоль оси х направлены
в противоположные стороны и взаимно погашаются. Таким образом,
к началу регистрации детектируемый вектор намагниченности всегда
направлен вдоль оси +у, т.е. он имеет постоянную фазу, не зависящую
от ц. Однако его амплитуда подвержена модуляции, характер которой
определяется величиной константы спин-спинового взаимодействия.
Рис. 10.10. Амплитудная модуляция сигнала углерода группы СН-основа ге-
тероядерной J-спектроскопии.
Спиновое эхо и J-спектроскопия
377
Отметим, что эта чисто амплитудная модуляция возникает как ре-
зультат симметричного расположения компонент дублета, которое в
свою очередь обусловлено тем, что спиновая система имеет первый
порядок, В более сложном случае, включающем взаимодействия как
между протонами, так и между протонами и углеродом, в системе
может встретиться порядок, отличный от первого. Тогда предполо-
жение, что мультиплеты должны быть симметричными относительно их
центров, оказывается несостоятельным. Это может привести к замет-
ному усложнению вида спектра, Я буду везде подразумевать взаимо-
действия исключительно первого порядка; более детальный анализ
данного вопроса представлен в работе [4],
Если проследить за применением показанной выше последователь-
ности к группам СН2 и СН3, то можно убедиться, что в основном линии
показывают амплитудную модуляцию в течение ;1г, степень которой
зависит от их положения относительно центра мультиплета. Это озна-
чает, что если мы выполняем двумерный эксперимент с варьируемыми
то координата v: будет содержать только мультиплетную структуру,
в то время как v2 будет содержать только химические сдвиги, так как
регистрация происходит с широкополосной развязкой. Это и есть
J-спектр; он соответствует протонно-связанному углеродному спектру,
в котором мультиплетные структуры разных сигналов разошлись в
пространстве и стали направленными по второй координате. Тот же
самый эксперимент может быть выполнен с использованием переклю-
чения декаплера вместо л-импульса на протонах, как описано выше для
одномерного ./-модулированного эха (эксперимент с «переключаемым
декаплером»), В этом случае из-за того, что J-модуляция происходит
только в течение половины гь расстояния между линиями по этой
координате уменьшаются вдвое. В зависимости от обстоятельств это
можно рассматривать и как полезное, ,н как нежелательное свойство.
10.3.2. Примеры гетероядерных J-спектров
Существуют две до некоторой степени крайние ситуации, когда
выгодно применять гетероядерный ./-спектр: стремление либо к очень
высокому, либо к очень низкому разрешению по координате vt. В пер-
вом случае эксперимент используется в качестве средства разделения
мультиплетов, которые перекрывались бы в обычном спектре; он также
имеет то преимущество, что устраняет неоднородность за счет спино-
вого эха. Во втором случае это скорость и высокая чувствительность при
определении мультиплетности интересующих нас сигналов. Для боль-
шинства структурных проблем применяется быстрый эксперимент с
низким разрешением, но я буду обсуждать оба.
Эксперимент с высоким разрешением ио координате Vj. Так же как
и в эксперименте с высоким разрешением, в J-спектре можно наблюдать
мультиплеты с естественными ширинами линий. Это происходит из-за
378
Глава 10
того, что огибающая сигнала в течение 4 определяется истинным
значением Т2, а не TJ, когда спиновое эхо устраняет неоднородность
магнитного поля. (Как и обычно в случае спинового эха, ограничения
возникают вследствие диффузии внутри образца.) Однако использова-
нию этой особенности могут мешать другие практические трудности.
Если наблюдаются истинные ширины линий, то потребуется тонкая
оцифровка по координате vx, поскольку значения Т2 для углеродов
могут быть большими, зачастую достигая 10 с и выше.
Идеальными были бы времена регистрации, в несколько раз большие,
чем величины Т2, однако прн этом потребуется много инкрементов по Z,
при небольшой ширине спектра по этой координате. Самыми широкими
мультиплетами у протонно-связанных углеродов являются квартеты,
возникающие для метильных групп. Имея в виду, что прямая КССВ не
превышает 200 Гц, нам может потребоваться оцифровать диапазон
спектра в 600 Гц (для эксперимента с импульсами по протонам). Это
означает, что инкремент по должен быть около 0,8 мс. Чтобы
получить время регистрации по хотя бы 10 с, мы должны, таким
образом, сделать более тысячи прохождений. Это редко удается, так как
частота повторения эксперимента определяется временами для 13С
и поэтому оказывается достаточно малой. Чувствительность также
будет низкой, поскольку многие эксперименты необходимо проводить
с большими значениями At ; следовательно, время регистрации по v2
должно быть не меньше чем 71, даже если меньшие значения давали бы
приемлемое разрешение по этой координате. Одновременное выполне-
ние двух этих условий приводит к очень большим массивам данных.
Может показаться, что вариант эксперимента с переключаемым
декаплером уменьшает проблему оцифровки по vx (фактически вдвое)
из-за того, что в этом методе диапазон спектра вдвое уже. Однако при
этом желаемое нами разрешение, а также расстояние между линиями
также будут вдвое меньше, что, напротив, создает проблему для полу-
чения высокого разрешения. Для описанных ниже экспериментов с низ-
ким разрешением уменьшение диапазона спектра оказывается полезным.
Кроме того, есть и другие преимущества использования метода пере-
ключаемого декаплера перед импульсным, которые мы обсудим в
разд. 10.3.3.
Приняв во внимание все эти соображения и имея известное терпение,
при необходимости, если того потребует эксперимент, можно получить
довольно высокое разрешение в J-спектре. Хотя массив данных может
иметь большой объем, нужно всего лишь, чтобы было место для его
хранения, так как его обработка, как правило, не вызывает серьезных
проблем, поскольку можно не выполнять полное двумерное преобра-
зование. Вместо этого достаточно преобразовать только по координате
v2 и затем для преобразования по vx выбирать единичные столбцы,
соответствующие интересующим нас химическим сдвигам. Эти сечення
могут быть дополнены нулями и преобразованы с большим числом
точек как обычные одномерные спектры. На рис. 10.11 показаны выде-
Спиновое эхо и J-спектроскопия
379
fflJKHw-.M-Wru
н|1ГИьнв,1»ь)-%5Гц
j 4_(СН)-В8Гц
120 ' 80
Рис. 10.11. Сечения через координату vt гетероядерного J-спектра металло-
органического соединения с высоким разрешением по vP В принципе таким
образом могут быть получены естественные ширины линий.
Гм!
do ' 40 QO -40 -80
Гц
ленные таким образом сечения из J-спектра металлоорганического
соединения. Отметим, что, хотя сам двумерный спектр следует пред-
ставлять в виде магнитуды (ограничения, определяющие этот выбор, мы
обсудим ниже в разд. 10.3.3), отдельные сечения могут быть настроены
по фазе на сигнал чистого поглощения.
Основным неблагоприятным фактором для получения высокораз-
решенных гетероядерных констант с помощью J-спектра является от-
носительно большая ширина спектра, которая определяется наличием
больших по величине прямых констант. Если вас в этой ситуации
в первую очередь интересует тонкая мультиплетная структура, обус-
ловленная дальними константами (т. е. константами через две и три
связи в спектре 13С), то для этого случая предложен хороший альтер-
нативный подход [15]. Замена я-импульса в центре периода «би-
линейным оператором поворота», уже рассмотренным в гл. 9 (разд.
9.3.1), устраняет J-модуляцию, вызванную большими прямыми кон-
стантами за счет рефокусировки соответствующих компонент мульти-
плетов. Малые константы прн этом не подвергаются воздействию
и поэтому модулируют сигнал как функцию . Эта процедура понижает
требуемый диапазон спектра до ширины мультиплета, обусловленной
дальними константами, и делает возможной тонкую оцифровку по
координате Vi.
Эксперимент с низким разрешением по координате vP Традиционной
проблемой в спектроскопии ЯМР 13С является определение числа
протонов, связанных с каждым атомом углерода. Мы рассмотрим
сейчас два способа, альтернативных традиционному методу внерезо-
нансной развязки: редактирование спектра посредством переноса поля-
380
Глава 10
ризации н применение ./-модулчрованного спинового эха. Используя
./-спектр, можно заполнить пробел между неполной информацией, пре-
доставляемой одномерным экспериментом по спиновому эху, и полной,
оцененной экспериментально с использованием процедуры редактиро-
вания на основе J-спектра. Когда структуры 13С-мультиплетов при-
сутствуют на координате v15 очевидно, что там содержится вся желаемая
информация. Но если речь идет о сравнении данного эксперимента
с конкурирующими методами, то сделать это нужно быстро н с высокой
чувствительностью. Для этого требуется определить, каково минималь-
но приемлемое число инкрементов по при котором еще не происходит
потери разрешения.
Для данного эксперимента с низким разрешением мы, естественно,
выбрали метод с переключением декаплера, который обеспечивает
минимальную ширину спектра по и более удобен в работе. Обсуждая
вопрос о цифровом разрешении в гл. 8 (разд. 8.3.5), мы убедились в том,
что для получения эффективной ширины линии 6v нам нужно время
регистрации l/8v. Теперь, если минимальное значение прямой угле-
род-протонной константы будет около 130 Гц, в эксперименте с пере-
ключением декаплера расстояние между линиями уменьшается до 65 Гц.
лЛлЛ Л
5t6 4
г
28 27 2Б 25 24 23 22 21 20 19
, М-3.
1-1DQ
--50
- О
- 50
-100
' Гц
Рис. 10.12. J-Спектр с низким разрешением по V] обеспечивает быстрое определе-
ние мультиплетности (часть спектра 13С холестерилацетата, экспериментальные
условия описаны в тексте). Спектр *Н с широкополосной развязкой (Л) приведен
над контурным представлением J-спектра (Я), а спектр с внерезонансной развяз-
кой (В) можно сравнить с вертикальными сечениями через Vj (Г). Сечения 1-4
позволяют очень хорошо определить мультиплетности, а в сечениях 5 и 6 отчет-
ливо обнаруживается недостаточное разрешение по v2, Вследствие перекрывания
триплета и квартета в двумерном эксперименте на этих срезах картина выглядит
запутанной. Ее можно исправить, если несколько увеличить время регистрации по
v2 или даже просто дополнить нулями по этой координате.
Спиновое эхо и J-спектроскопия
381
Максимально приемлемая ширина линии, не приводящая к неразре-
шенным линиям, должна быть меньше этого расстояния, скажем 40 Гц,
Из этого вытекает время регистрации по равное 25 мс. Диапазон
спектра составляет 300 Гц, следовательно, нам нужно около 15 инкре-
ментов. В этом случае во избежание искажений формы пиков сильно
усеченный сигнал по этой координате должен быть умножен на тща-
тельно подобранную взвешивающую функцию. На рис. 10,12 показан
спектр, полученный в точно таких условиях. Общее время регистрации
составило 30 мин, что сравнимо со временем, необходимым для полу-
чения спектра с внерезонансной развязкой с приемлемым отношением
сигнал/шум.
Существует возможность еще более понизить число инкрементов по
tti используя иной подход к обработке данных. Как было показано выше,
можно увеличить эффективную ширину линии Sv^ при действии взве-
шивающей функции таким образом, чтобы At} было примерно 1 /б
(3TJ). Если этого не сделать, то можно показать, что эффективная
. 1ХАА ААХАЛАЛАЛДЛАААЛД
» э 1 • Н 4 В 3 20 7 | 9 13ЖГ?Ю14 1Э1в17
Рис. 10.13. ./-Спектроскопия только с 5 инкрементами по fj с использованием
специальной обработки данных (см. текст). Для этого соединения при редакти-
ровании спектра был получен ошибочный результат (верхние спектры) из-за
большой константы 1JCH для С20 (помечена стрелкой). Однако J-спектр дает
вполне однозначный ответ.
382
Глава 10
ширина линии составит примерно 0,6/Л(1, однако сигналы исказятся
при усечении. Возникающие при этом «вигли» можно удалить другими
средствами помимо аподизации, В частности, можно использовать тот
факт, что нам известна форма искажения, определяемая малостью
значения Перспективным методом обработки таких сильно усе-
ченных данных является метод максимальной энтропии [5] (гл. 2); в нем
делаются определенные предположения о форме спектра, который
следует восстановить. Недавно предложен новый вариант этого метода
[6], предъявляющий намного меньше требований по вычислительным
затратам (метод впервые использован в радиоастрономии). В этом
случае для определения истинного положения пиков применяется итера-
ционная процедура. На рис. 10.13 показано определение мультиплет-
ности этим методом с использованием только 5 инкрементов по
в ./-спектре.
10.3.3. Экспериментальные аспекты
EXORCYCLE и составные п-импульсы. Оказывается, что больше
всего ущерб качеству J-спектров наносит искажение каждого из им-
пульсов по наблюдаемому ядру, но особенно это касается л-импульса.
Детальный анализ этой проблемы приведен в работе [7]; я же просто
покажу связь наиболее очевидных проблем и существующих стандарт-
ных решений.
Представим, что л/2-импульс в начале последовательности немного
короче своей номинальной длительности, что может возникнуть либо
из-за его неправильной калибровки, либо вследствие неоднородности
неизбежной в определенных частях образца. При этом небольшая
часть намагниченности останется направленной вдоль оси z к началу
По-видимому, л-импульс будет тоже короче номинальной длительности,
поэтому вместо безобидного инвертирования этой намагниченности он
будет переводить некоторую ее часть в плоскость х — у. Здесь она будет
совершать прецессию в течение второй половины с частотой, опре-
деляемой как химическими сдвигами 13С, так и углерод-протоннымн
константами в импульсном варианте эксперимента. После двумерного
преобразования появляются дополнительные пики. Поскольку они со-
вершали эволюцию на частоте, определяемой как химическими сдви-
гами, так и константами, почти наверняка они будут отражаться по
координате Vj.
Более глубокий анализ обнаруживает другие нежелательные аспекты
использования неидеальных л-импульсов, В гетероядерном эксперимен-
те с импульсом по протонам несовершенство этого импульса также
вызывает появление в спектре дополнительных пиков между истинными
компонентами мультиплета [8]. В гомоядерном J-спектре (см. следую-
щий раздел) существует даже больше оснований для беспокойства.
Предположим, что я-импульс был слишком длинным. Тогда мы можем
мысленно выделить в эксперименте ту его часть, которая соответствует
Спиновое эхо и J-спектроскопия
383
действию номинального по длительности я-импульса, а остальная часть
в этом случае будет состоять из последовательности п/2 — tJ2 — а. —
— 1^/2-Выборка, тир а-избыточная часть «длинного» л-импульса. С
точностью до несущественных деталей задания временных интервалов
это представляет собой последовательность переноса когерентности,
точно такую же, как в COSY. Мы ожидаем, что протонная намагни-
ченность, совершающая эволюцию в течение первой половины ts с про-
тонными химическими сдвигами и константами, будет переноситься
и детектироваться как модуляция намагниченности других взаимодей-
ствующих протонов в течение t2. В узком диапазоне координаты Vi
химические сдвиги будут отражаться много раз, приводя к дополни-
тельным пикам в непредсказуемых местах. Весьма вероятно, что дейст-
вие л-импульсов будет сопровождаться инверсией намагниченности
(гл. 4), и возникнут связанные с этим проблемы. В гетероядерной
эксперименте проблем с протонными п-импульсами избежать просто,
выбрав вариант эксперимента с переключаемым декаплером. В гомо-
ядерной J-спектроскопии (разд. 10.4) такой возможности нет.
Чтобы избежать появления дополнительных пиков в J-спектрах,
совершенно необходимо использовать подходящее циклирование фазы.
Циклирование л-импульса по 13С в последовательности х, у, — х, —у
с инверсией фазы приемника с шагом в 90° по фазе импульса устраняет
много проблем. Эта процедура известна как EXORCYCLE [9] (из-за
того, что некоторые из дополнительных пиков в J-спектрах называются
по-разному: и как «фантомы», н как «призраки»). Она может быть
скомбинирована обычным образом с CYCLOPS при одновременных
шагах поворота всех фаз в 13С и фазы приемника. Проблемы про-
тонного л-импульса лучше всего решать в гетероядерном случае, ис-
пользуя метод переключаемого декаплера, как упомянуто выше. Для
гомоядерной ./-спектроскопии рекомендуется использовать составной
л-импульс (it/2)xiCj, (л/2)х (гл. 7).
Распознавание знака и форма линии. Распознавание знаков частот по
Vi в ./-спектре часто не является столь проблематичным, как в экспе-
риментах с переносом когерентности. Для случаев чисто первого по-
рядка, которые мы обсудили, или всегда для экспериментов с низким
разрешением мультиплетность сигналов симметрична относительно
Vi = 0, так что можно использовать отражение относительно этой
линии. Результирующий спектр может быть скорректирован по фазе
в спектр чистого поглощения, поэтому нет нужды использовать необыч-
ные взвешивающие функции. Однако спектр поглощения возникает из-за
наложения симметрично расположенных пар линий с нежелательной
фазоскрученной формой, и любое отклонение от точной симметрии
относительно линии V] = 0 будет искажать его.
В этом случае (т. е. для систем, не имеющих чисто первого порядка)
или просто для того, чтобы восстановить определенные области муль-
типлетов по vx, комбинирование подходящих квадрантов преобразо-
384
Глава 10
ванных данных позволяет провести распознавание знаков частот по ?!
[10]. Поскольку индивидуальная компонента мультиплета (а не резуль-
тирующая пары компонент) претерпевает фазовую модуляцию в течение
tr, линии в таком случае имеют форму со скрученными фазами, так же
как н для линий эхо-селекция в экспериментах по переносу когерент-
ности (гл, 8). Вычисление магнитуды и сильное улучшение разрешения (с
присущими нм недостатками) становятся, таким образом, необходи-
мыми для того, чтобы сделать форму линии похожей на сигнал
поглощения. Однако даже это ие фатально, потому что отдельные
сечения спектра по столбцам могут быть еще приведены к правильному
виду поглощения. В случае систем непервого порядка для получения
данных также Необходимо использовать метод переключаемого де-
каплера. В методе протонного импульса оказывается недействительным
предположение в том, что л-импульс на протонах обменивает метки всех
состояний, что приводит к таким линиям по у,, которые ие отражают
мультиплетную структуру одномерного спектра.
Для большего удобства в работе и получения наилучшего разре-
шения существуют методы, в которых распознавание знака по V]
возможно при использовании представления спектров в форме сигналов
чистого поглощения как для импульсного метода, так и для метода
переключаемого декаплера [10, И]. Поскольку только последний кор-
ректно воспроизводит мультиплетную структуру систем непервого по-
рядка, очевидно, что ему должно отдаваться предпочтение. Необхо-
димое распознавание знака достигается сложением двух экспериментов
с использованием обеих возможностей для переключаемого декаплера
(т.е. выключение либо в течение первой половины либо в течение
второй половины). Знаки частот по v, противоположны в этих двух
экспериментах, поэтому перед сложением необходимо перевернуть ко-
ординату V; одного из них. В известном смысле это вызывает обращение
скрученной фазы и устранение дисперсионных компонент. Хотя этот
метод был предложен в 1979 г., оказывается, что вплоть до середины
1984 г. в литературе ие было сообщений о его применении к реальным
задачам. Точное и детальное изучение углерод-протонных констант
проводится редкб, поэтому создание новых и совершенствование имею-
щихся способов решения этой задачи не слишком актуальны*.
10.4. Гомоядерный J-спектр
10,4.1. Введение
Если последовательность спинового эха используется при наличии
гомоядериой связи, то автоматически возникает J-модуляция детекти-
* В 1982 г. предложен весьма перспективный метод измерения дальних
констант 13С--1Н, основанный на использовании селективного инвертирующего
л-импульса для получения гетеровдерного J-спектра; см.: Вах A., Freeman Я..
J. Amer. Chem. Soc., 104, 1099 (1982). //fu,w. перев.
Спиновое эхо и J-спектроскопия
385
Рис. 10.14. Сравнение гомоядсрного (а) и гетероядерного (б) J-спектров систем
А3Х. В случае гомоядерного спектра константа проявляется по обеим координа-
там, поэтому мультиплет имеет наклон 45°.
руемого сигнала как функция поскольку гомоядерпые константы не
рефокусируются. Двумерный эксперимент, выполненный при варьиро-
вании таким образом, ведет к разделению мультиплетных структур
по vn как и в гетероядерном случае. Существует, одиако, важная
разница: взаимодействия присутствуют еще и в течение /2. В гетеро-
ядерном эксперименте мы устраняем их за счет широкополосной раз-
вязки, но ясно, что это невозможно для гомоядерных констант. В ре-
зультате мультиплеты лежат не на линии, параллельной координате vr,
а на наклоненной к ией под углом 45°. Для иллюстрации этого случая на
рис. 10.14 сравнивается гетероядерный .7-спектр метильной группы
с гомоядерным спектром Х-части протонной системы А3Х в одном
масштабе как по vt, так н но v2. На практике обычно масштаб
изображения по координате v2 бывает намного мельче, чем для v1?
потому что спектр должен включать весь диапазон химических сдвигов,
а не только ширину одного мультиплета; поэтому наклон будет менее
явно выражен (рис. 10.15).
Как мы увидим позднее, поворот мультиплетных структур в не-
которых случаях может быть сопряжен с определенными проблемами.
Однако сначала рассмотрим вопрос о том, с какой целью мы хотим
получить гомоядериый J-спектр. Сугубо умозрительно преимущества
этого метода таковы: разделение перекрывающихся мультиплетов при
их развороте на вторую координату, возможное улучшение ширины
линии по vx из-за устранения неоднородности поля и возможность
отличить гомоядерные константы, которые проявляются по координате
v1T от гетероядерных, которые в рамках этого эксперимента выступают
подобно химическим сдвигам и проявляются только по координате v2-
Имея в виду первые два связанных друг с другом аспекта, необходимо
помнить, что эксперимент работает нормально только для систем чисто
первого порядка. При наличии сильной связи появляются дополни-
тельные линии. Это означает, что эффективное дополнительное разре-
386
Глава 10
L_uJli
Рис. 10.15. Гомоядерный J-спектр все того же соединения 1 из гл. 8 (только часть
спектра, нормальный одномерный спектр приведен над контурными представле-
ниями). Время регистрации по J-координате было около 2,5 с. Контурное
представление такого спектра не является идеальным. При высоком пороговом
значении интенсивности в контурном представлении хорошо разрешаются детали
интенсивных пиков, но пропадают некоторые резонансные сигналы (слева). Если
же понизить пороговое значение при построении контурного спектра, то его
интерпретация становится неоднозначной (справа).
шение мультиплетной структуры может быть получено только для
довольно ограниченного случая перекрывания большого числа сигналов,
которые тем не менее должны быть мультиплетами первого порядка.
В тех случаях, когда эти условия выполняются, полученный J-спектр
может оказаться достаточно информативным, но необходимо учиты-
вать при этом некоторые осложнения, обсуждаемые дальше.
10.4.2. Наклон Лспектров
Наиболее интересная информация заключена в ./-спектре по коор-
динате Vj. Хорошо бы иметь возможность, как и в гетероядерном
эксперименте, в сечениях параллельно Vj обнаружить все компоненты
мультиплета. К сожалению, нз-за поворота на 45" мы в действи-
тельности находим, что они содержат только одиночные линии. Каждый
столбец, несущий сигнал по vb содержит одну компоненту мультиплета.
Другой недостаток гомоядерного J-спектра обнаруживается, если пред-
ставить себе его проекцию на координату v2 параллельно vn т.е.
просуммировав столбцы массива данных. В гетероядерном экспери-
Спиновое эхо и J-спектроскопия
387
менте такие столбцы либо содержат все компоненты мультиплета в тех
случаях, когда они находятся при соответствующей сигналу частоте по
координате v2, либо они не содержат ничего (кроме шума). Следова-
тельно, проецирование на v2 восстанавливает одномерный спектр де-
тектируемого ядра без каких-либо констант. Напротив, проекция гомо-
ядериого эксперимента на v2 параллельно vt просто дает вам нормаль-
ный спектр со всеми константами. Тем не менее открывается захваты-
вающая перспектива получения спектра с широкополосной гомоядерной
развязкой. Это достигается при проецировании вдоль линии, наклонен-
ной к осн v2 под углом 45°, что заставляет все компоненты мультиплета
выстраиваться вдоль одного направления (это действительно так) и,
таким образом, приводит к спектру, содержащему просто одиночную
линию на месте каждого химического сдвига. К сожалению, если
двумерный массив данных сохраняет свою фазовую информацию, то
свойство соотношения Фурье (теорема о сечениях и проекциях) пока-
зывает, что фактически сигналы не будут наблюдаться прн проециро-
вании J-спектра под углом 45°. Это происходит из-за того, что поло-
жительные и отрицательные части фазоскрученных линий при точной
ориентации вдоль направления, наклоненного под углом 45°, взаимно
погашаются при суммировании. Проецирование спектра в виде магни-
туды обходит эту проблему, но мы будем иметь все обычные неудобства
магнитудных спектров, связанные с широкими линиями и необходи-
мостью сильного улучшения разрешения.
Даже для магнитудных спектров проекция под углом 45° может
оказаться полезной. Получение проекций н сечений, которые также
могут оказаться полезными для выделения сложных мультиплетов,
значительно упрощается с помощью специального приема: повороту
подвергается весь массив данных. Это влечет за собой перемещение
каждой заполненной строки в большей или меньшей степени в зави-
симости от ее частоты по Vi и ведет к представлению, похожему на
гетероядерный J-спектр. Вычисляется магнитудный спектр, тогда
сечения параллельно v2 содержат мультиплеты, а проекция на коорди-
нату v2 выглядит как спектр с широкополосной гомоядерной развязкой;
это показано на рнс. 10.16. Во всем этом деле разочаровывает сле-
дующее: прилагая значительные усилия прн проведении эксперимента,
который должен увеличить разрешение, мы затем ухудшаем его снова,
проводя вычисление магнитуды.
В настоящее время не существует способа полностью избежать этого.
Если главный интерес представляет разрешение единичных мультипле-
тов, то отдельные столбцы из повернутого массива данных могут быть
изучены без вычисления магнитуды. Однако даже тогда в отличие от
гетероядерного случая они не имеют вида истинного поглощения: линии
обнаруживают сильное искажение у основания, возникающее при пово-
роте, который смешивает дисперсионные компоненты (рис. 10.17). По-
скольку рефокусирующее влияние на ширину линии на практике часто
невелико, основное преимущество состоит просто в разделении пере-
388
Глава 10
jbA^JOdi
нормальный
спектр
проекция
—1----,----1----1----1----1----1--------1----1----|—
3,8 3,Б 3,4 3,2 3,0 2,В
М, Э,
- 10
Гц
D
Рис, 10,16. Наклоненное представление спектра, данного на рис. 10.15, с проекци-
ей на координату v2 (в форме магнитуды). Оно похоже на спектр с широкополос-
ной гомоядерной развязкой, однако это справедливо только для слабосвязанных
систем. При наличии сильного спин-спинового взаимодействия на половине
расстояния между сигналами сильносвязанных ядер появляются дополнительные
пики, которые отмечены стрелками на этом спектре.
крывающихся мультиплетов. Если же вас интересует проекция, то в этом
случае требуется особое внимание уделить подбору взвешивающей
функции по каждой координате. Но как ни старайся, очень узких линий
получить все-таки не удается. Представлеине гомоядерного J-спектра
с фазой, соответствующей сигналу чистого поглощения, было бы весьма
привлекательным для каждой из двух поставленных задач, но пока еще
не существует полностью удовлетворительного решения. Известна по-
следовательность, позволяющая получить фазу чистого поглощения для
двухспиновой системы [12], но для систем, состоящих из большего
Числа спинов, снова возникает вклад дисперсии. Также предложен
вычислительный метод [13], родственный используемому для обра-
ботки сильно усеченных данных, который упомянут в разд. 10.3.2, но он,
кажется, требует большого объема вычислений и, по моим сведениям,
в настоящее время не может быть реализован в подходящей форме
в системах обработки данных, которыми оснащены компьютеры спект-
рометров.
Спиновое эхо и J-спектроскопия
389
& Рис. 10.17. Вертикальные сечения из накло-
ненного гомоядерного J-спектра можно пред-
ставить в виде сигналов, близких по форме
к сигналам поглощения (Л), но форма линии
в таких спектрах сильно искажается. На ри-
сунке для сравнения представлены два сече-
ния из массива данных рис. 10.16: с вычисле-
q нием и без вычисления магнитуды (Б) вместе
с тем же мультиплетом из нормального одно-
мерного спектра (Б), обработанного эквива-
лентной взвешивающей функцией.
В заключение можно сказать, что гомоядерный ./-спектр полезен
только с учетом ряда ограничений. Мы должны иметь взаимодействие
чисто первого порядка и удовлетвориться либо тем разрешением,
которого можно достичь в режиме магнитуды, либо пойти на сильное
искажение формы линий. В таком случае мы получаем возможность
применить данный эксперимент для разделения перекрывающихся муль-
типлетов, а при использовании проекций получить положения центров
мультиплетов. Если присутствует гетероядерное взаимодействие, то оно
также проявится на проекции, поэтому эксперимент может быть ис-
пользован для идентификации гетероядерных констант.
10.4.3. Непрямой J-спектр
В последний раз вернувшись к идее разделения перекрывающихся
мультиплетов, мы рассмотрим эксперимент, который находится на
стыке гетеро- и гомоядерной J-спектроскопии, причем в эксперимен-
тальном аспекте он очень близок к гетероядерной корреляционной
спектроскопии (гл. 9). Этот метод решает проблему полностью пе-
рекрывающихся мультиплетов, перекрывание которых, очевидно, сохра-
нится и в гомоядерном J-спектре. Ои позволяет перенести гомоядерную
мультиплетную структуру на химические сдвиги соседних гетероядер.
В действительности идея довольно проста. Гетероядерный корреля-
ционный эксперимент в принципе уже содержит тонкую структуру по
вследствие гомоядерных взаимодействий между ядрами, от которых
переносится намагниченность. Эту структуру не просто разглядеть
390
Глава 10
1Н: — *— —> Tt <— ?! —> ? 4— —>Л 4— —>раз6я»ка
22 2 2 ! 2 2
13C: П * вклборка
2
Рис. 10.18. Последовательность для непрямого J-спектра. Сравним с последова-
тельностью HSC: для устранения различий химических сдвигов по координате Vj
в середину интервала tx помещается тс-импульс по 1Н. При этом рефокусируется
и гетероядерное взаимодействие, в связи с чем отпадает необходимость импульса
по иС. В интервал At необходимо встроить jc-импульсы по обоим ядрам, но
в интервале А2 они необязательны.
в экспериментальном спектре, поскольку сложно оцифровать vL до-
статочно тонко из-за того, что эта координата включает весь диапазон
химических сдвигов для протонов-до 10 м.д. Если химические сдвиги
убрать с этой координаты, что в принципе можно сделать с помощью
спинового эха, то только ширина самого широкого мультиплета из тех,
которые нужно охарактеризовать, будет определять диапазон частот по
vb что уже делает возможным достижение высокого разрешения. Таким
образом, последовательность нормальной корреляции химических сдви-
гов модифицируется просто добавлением протонного л-импульса в
центре периода эволюции (рис, 10.18), при этом убираются химические
сдвиги с координаты vr Эксперимент подробно описан в работе [14],
Этот эксперимент имеет те же ограничения, что и гомоядерная
J-спектроскопия, но характеризуется более низкой чувствительностью
из-за того, что детектируется гетероядро, поэтому пользоваться им
следует только в самых крайних случаях-при полном перекрывании
сигналов в нормальном J-спектре. На рис, 10.19 показаны результаты,
ллЛ
Рис. 10.19. Примерно «эквивалентные» области непрямого (а) и гомоядерного (б)
J-спектров глюкозы. Отметим, что порядок протонных и углеродных сдвигов
неодинаков.
Спиновое эхо и J-спектроскопия
391
полученные для образца глюкозы в D2O. Нормальный протонный
спектр (вверху справа) плохо разрешен из-за довольно большой ширины
линии и в силу того, что вещество существует в виде смеси аномеров.
Протонный J-спектр немного лучше, но мультиплеты все еще трудно
идентифицировать. Но уже в непрямом ./-спектре мультиплетная струк-
тура хорошо просматривается.
Литература
1. Levitt M.JL, Badenhausen G., Ernst R.R., J. Mag. Res., 53, 443-461 (1983).
2. Freeman R., Mareci Т.Н., Morris G. A., J. Mag. Res., 42, 341 345 (1981); Dod-
drell D.M., ReidD.G., Williams D. H., J. Mag. Res., 56, 279-287 (1984); Dod-
dreli D.M., Williams D. H, ReidD.G., Fox K., Waring M. J., J. Chem. Soc. Chem.
Commun., 218-220 (1983).
3. Wimperis S.C., Freeman R., J. Mag. Res., 58, 348-353 (1984).
4. Badenhausen G., Freeman R., Morris G.A., Turner D.L., J, Mag. Res., 28, 17-28
(1977).
5. Ноге PJ„ J. Mag. Res., 62, 561-567 (1985).
6. Keeler J., J. Mag, Res., 56, 463-470 (1984).
7. Badenhausen G., Freeman R., Niedermayer R., Turner D. L., J. Mag. Res., 26,
133-164 (1977).
8. Freeman R., Keeler J., J. Mag. Res., 43, 483-486 (1982).
9. Badenhausen G„ Freeman R.t Turner D.L., J. Mag. Res., 27, 511 (1977).
10. Freeman R.t Kempsell S.P, Levitt M.H., J. Mag. Res., 34, 663-667 (1979).
11. Bachmann P.t Aue WP„ Midler L., Ernst R. R, J. Mag. Res., 28, 29-39 (1977).
12, Williamson M.P., J. Mag. Res., 55, 471-474 (1983).
13. Shaka A. J., Keeler J.. Freeman R., J. Mag. Res., 56, 294 313 (1984).
14. Morris G.A., J. Mag. Res., 44, 277-284 (1981).
15. Bax A, J. Mag. Res., 52, 330-334 (1983).
Предметный указатель
Акриловая кислота 181, 182
Аксиальные пики 282, 283
Алгоритм быстрого фурье-преоб-
разования Кули и Тьюки 31
Аморфные стеклообразные раст-
воры 153
Амплитуда сигнала 287
- спинового эха 230
- шума 93
Амплитудная модуляция 376
Ампула для регистрации спектров
ЯМР 60
Аналого-цифровой преобразова-
тель (АЦП) 22, 32, 92
-разрешение 32, 92
Аподизация 44
Аттенюатор 251
Ацетилацетонат хрома (III) 133,
241
Билинейный оператор поворота
360
Боковые полосы 66, 67, 71, 78, 232
mpem-Бутильная группа 186
Взвешивающие функции 46, 49,243
«Витли» 41, 44, 50, 253
Возбуждение образца 28
Вращательный момент 103
Вращающаяся система координат
101
Времена выборки данных 298
-ожидания 154
Временное представление 29
Время регистрации 34, 41, 354
- смешивания 342, 364
Выборка 197, 206, 212, 368, 373
-данных 33, 136
Выбор растворителя 55
Гауссово псевдо-эхо 291
Гауссовы линии 48
Геминальные взаимодействия 359
Гетероядерная корреляционная
спектроскопия 18, 349
- многоквантовая когерентность
205
-./-модуляция 368
Гетероядерный 7-спектр 376
- ЯЭО 186, 187
Гиромагнитное отношение 99
Гомоядерная развязка 16
Гомоядерный 7-спектр 384
Гравитационное поле 99
Z-Градиенты 77
Датчики ЯМР 23, 86
- настройка 88
- селективно-настроенные 87
- широкополосные 87
- -с помощью моста 90
--направленного ответвителя 91
Двумерная корреляционная спект-
роскопия ЯМР 260
Предметный указатель
393
- спектроскопия ЯМР 302
Двумерные спектры
INADEQUATE 334-337
- эксперименты 18
Двумерный эксперимент NOESY
165
- ЯМР-эксперимент 264-266
Двухквантовая когерентность 306
Дейтериевая стабилизация (лок) 72
Дейтерированная вода 249
Дейтерированные ЯМР-раствори-
тели 56
- протонные спектры 59
Декаплер 64
Детектирование сигнала 33
Дефекты формы линии 76
2,3-Дибромпропионовая кислота
308
Динамический диапазон 92, 93
Диполь-дипольное взаимодейст-
вие 132, 152
- сила 154
Дискретная выборка интервалов
262
орто-Дихлорбеизол (ODCB) 64, 65
Длительность импульса 218, 236
Дополнение нулями 43
Естественная ширина линий 139,
377
Задержка 202, 353
- выборки данных 128
Избыточная намагниченность 100
Измерение ЯЭО 167
Изохроматы 134
Импульс 103
Импульсная фурье-спектроскопия
ЯМР 31
Импульсный фурье-спектрометр
ЯМР 22
- ЯМР 27, 142
Импульсы на частоте наблюдае-
26-75
мых ядер 219
Инверсия заселенностей 166
INEPT с рефокусировкой 196
Интенсивность сигнала 83, 199
Интерферограмма 262
Использование ЯЭО 179
Исходная намагниченность ядра
194
Исходный эксперимент
INADEQUATE 339
Калибровка длительности импуль-
са декаплера 222
Квадратурное детектирование 117,
119, 121
--по Vj 284
Квадрупольные ядра 212
Когерентность 305
Комплексный спектр 119
Константа активная 309
- пассивная 309
Константы спин-спинового взаи-
модействия (КССВ) 16, 111, 129,
223, 313
Контроль ширины полосы 36
Коррекция фазы 126
Коэффициент усиления 198
Критерии разрешения 63
- чувствительности 81
Критерий Найквиста 36, 118, 302
Кросс-пики 265, 275, 277, 296, 310,
342
- идентификация 275
- интенсивность 300
- исчезновение 314
Кросс-релаксация 151, 174
Лабораторная система координат
112
Р-Л актам 185
Ложные сигналы 36
Локальное поле на ядре 153
- электрическое поле 239
Лоренцева форма линии 31
394
Предметный указатель
Магнитные диполи 152
Магнитуда спектра 289, 353
Магиитудные спектры 320, 387
Максимальный ЯЭО 158, 199
Матрица плотности 143
Межъядерные расстояния 158, 162,
182
Мезаконовая кислота 179
Метод «аккордеон-спектроскопия»
330, 343
- CAT 25
- DANTE 138
- WALTZ 138
- инверсии-восстановления 132,
238
- максимальной энтропии (МЕМ)
51, 53
- непрерывной развертки 24, 27
- переключаемого декаплера 370,
377
- разностных спектров 168
- Редфилда 125
- RuSH 285, 292, 294
- TPPI 125, 287, 292, 294
- Эрнста- Бэйна 307
- ЯМР с непрерывной разверткой
34
Методы Фурье 18
Меченые частоты 261
Многоимпульсные эксперименты
227
Многоквантовая когерентность 97,
105, 306
- фильтрация 21, 207, 327
Мост Уинстона 90
Мощность радиочастотного поля
при гетероядериой развязке 225
----при гомоядериой развязке
224
— сигнала 73
Наклон 7-спектров 386
z-Намагииченность 230, 238, 240,
342
Намагниченность образца 103
- объемная 102
Напряженность поля 77, 218
Настройка колоколов 26
- разрешения 63, 74
--без лока 80
- шиммов по ССИ 79
Насыщение 73
- перехода 146
Непрерывная развертка 266
Непрямой и гомоядериый 7-спект-
ры глюкозы 390
- 7-спектр 389
Непрямые корреляции 356
Низкочастотный 7-фильтр 362
Обменная спектроскопия 341
«Обращенные» эксперименты 213
Обращенный DEPT 214, 373, 374
Обрезание 34, 44
Объемная намагниченность 143
Объем образца 60
Одиокваитовая когерентность 305
Опорная частота 112, 114
Определение траектории когерент-
ности 144
Осцилляции (биения) 31
Отношение поле/частота 63, 68,
178
- сигнал/шум 25, 26, 38, 46, 65, 81,
120, 244, 300
Отражение в двух измерениях 317
Отраженные пики 122
Перенос когерентности 97, 105, 306
- намагниченности 268, 305
- поляризации 18, 199
Переходы-
- параллельные 296
- прогрессивно связанные 296
- регрессивно связанные 296
- связанные 296
Петля обратной связи 178
Пиковая интенсивность шума 82,
83
Повторение прохождений 235
Предметный указатель
395
- частота 236
Подавление пиков 247
- предварительным насыщением
247
- «скроенным» возбуждением 249
Подспектры групп СН, СН2 и СН3
208
Подход Белла-Сондерса 179
Поликрнсталлические порошки
153
Полное сопротивление цепи 90
Полный процесс редактирования
спектров в эксперименте DEPT
209
Полосовой фильтр 38, 245
Последовательное насыщение ли-
ний 181
Последовательности WALTZ и
WALTZ-16 234
Последовательность COLOC 361
- CYCLOPS 289
- DANTE 253
- DEPT 205, 206
- GROPE-16 230
- HSC 350
- MLEV 138
- «прыжок - возврат» 249, 250
- SPI 140, 223
- TANGO 374, 375
- UPT 212
Преимущество Фелгетта 28
Преобразование лоренцевой фор-
мы линии в гауссову 48
- Фурье 29, 51
Прерываемая развязка 168
Приготовление образца 54, 62, 167
Протонные спектры хлороформа
262
Протонный декаплер 222
- спектр 312
— муравьиной кислоты 374
— иридиевого комплекса 357
— холестерилацетата 14
Процедура CYCLOPS 283, 303
- EXORCYCLE 382
Пути релаксации 147
26*
Равновесная намагниченность 241
Радиочастотное поле 100
Развязка 197, 206, 212, 368, 373
- с разделением времени 224
Разностная спектроскопия ЯЭО
168
- оптимальные условия 173
Разностное спиновое эхо 372
Разностный перенос поляризации
192
Разрешение 48
Распознавание знака 383
- отраженных пиков 50
Регистрация спектра 242
Редактирование спектров 203, 207,
208
- точность 209
Резонансная частота контура 90
Релаксационные процессы 73
Релаксация 128, 235
- поперечная 129, 134
- продольная 130, 131, 261, 282
- через диполь-дипольное взаимо-
действие 154
Сдвиги Блоха -Зигерта 169, 224,
225, 267
Селективная инверсия заселеннос-
ти (SPI) 190
Селективное возбуждение 246, 252
- мягкими импульсами 252
- с помощью DANTE 253
Селективность 175
Селективный перенос заселенности
(SPT) 175, 190
Сигнал дисперсии 39
- поглощения 39
- ЯМР 142
Сигналы ССИ 303
Сильнопольная часть спектра 275
Симметризация 318
Синусоидальная осцилляция 262
Систематические ошибки 243
Скорость развертки 26
- релаксации 156
396
Предметный указатель
Слабопольная часть спектра 274
Смешение (конволюция) фурье-об-
разов 44
Согласованный фильтр 46, 47
Составной z-импульс 338, 339
Составные импульсы 228, 232
- тс-импульсы 382
Спад свободной индукции (ССИ)
29, 104
Спектральная плотность 155
- ширина 142
Спектр COSY 273, 276, 278, 294,
314, 319
- 13С холестерилацетата 254
- INEPT 354
- HSC 356-358, 361
- J-модулированиого эха 371
- непрерывной развертки по од-
ной координате 268
- NOESY производного пеницил-
лина 347
7-Спектроскопия 18
Спектр RCT 332
Спектры двойного резонанса 281
- COSY-45 н COSY-90 323-325
- INEPT 196, 198
— характеристики 198
- хлороформа 197
Спиновое эхо 130, 135, 136, 368
Спии-спиновое взаимодействие
270, 274
Среднеквадратичная амплитуда
шума 82
Стационарная система координат
107
Стационарное эхо 237
Суммарный перенос намагничен-
ности 192
Схема обратного эксперимента
DEPT 215
- резонансного контура датчика
ЯМР 89
- эксперимента разностной спект-
роскопии ЯЭО 169
Теорема о сечениях н проекциях
387
- о максимальной мощности 88
- о центральном пределе 120
Теория поглощения Блоха 98
- фазовых циклов 117
Тест ASTM 81
Тесты для спектрометра 255
Треугольник Паскаля 313
Трехспиновый эффект 164
Триплет 369
Угол Эрнста 236
Уровни энергии 105
- заселенность 105, 150
Усиление в канале лока 73
Условие Бакса 301
- предельного сужения 156
Усреднение сигналов 25
Устранение артефактов по v2 283
- взаимодействия по vx 351
--по v2 351
Уширение несимметричное 77
- симметричное 77
Фаза 40, 50, 113
- в двух измерениях 292
- канала стабилизации 178
- относительная 116
- приемника лока 73
Фазовая информация 308
- когерентность 143, 305
Фазовые квадранты 292
- ошибки 110, 126,127, 295
- циклы 122, 353
Фазовый цикл CYCLOPS 122
- четырехшаговый 124
Фазочувствительиый COSY с
двухквантовым фильтром
(DQF-COSY) 329
- детектор 114
- спектр COSY 296, 309
Фильтр типа синусоидально-коло-
колообразного окна 290
Фильтры типа эха и анти-эха 288
Предметный указатель
397
Форма импульса 252
- линии 48, 383
- с перекрученной фазой 289
Формализм мультипликативных
операторов 144
Фурье-спектроскопия ЯМР 41
Цитраконовая кислота 179
Цифровое разрешение 41, 42, 298
Частота декаплера 181
- ларморовой прецессии 100, 147,
190
- Найквиста 34, 35, 51
-- повторения 354
Частотное представление 29
Частотные метки 97
Чувствительность 46, 186
- высокая 219
- максимальная 80
- низкая 221
- оптимальная 202
Шиммирование 69
Шиммы 69
- теплые 70
Ширина импульса 29
- линии 47
- развертки 34
Широкополосная развязка 203,
232, 354
— гомоядерная 359, 387
Шкала мощности в децибелах 218
Шум 24
- белый 37
- в двух измерениях 316
- оцифровки 93
- по ?! 316
Шумовая модуляция 232, 233
- протонная развязка (PND) 232
Эксперимент COSY 97, 270, 271,
277, 279, 281, 287, 294, 300
- COSY-45 322
- для квадратурного детектирова-
ния 119
- Джинера 266, 268, 269
- FOCSY 318
- HSC 353, 354
- INADEQUATE 333
- INDOR с фурье-преобразова-
нием 267
- INEPT 193
- Карра-Парселла 137
- Карра - Парселла - Мейбу ма -
Джилла (CPMG) 138
- NOESY 342, 346
- POMMIE 207
- с обратной прерываемой
развязкой 241
- SPI для хлороформа 193
Эксперименты DEPT+и DEPT+ +
210
Электрический диполь 152
Эстафета Н-Н-С 363
Эстафетный перенос когерентнос-
ти (RCT) 329, 330, 362
- спектр Н-Н-С 365, 366
- Н - Н - С-эксперимеит 364
Эффективное поле 108
Эхо переноса намагниченности 289
Ядерный эффект Оверхаузера
(ЯЭО) 17, 63, 133, 145, 160, 342
- в двухспиновых системах 160
- в реальных системах 160
- в системе из нескольких ядер 162
- неравновесный 165
- отрицательный 163
- положительный 163
Ядра 98
- отличные от протонов 62, 320
ЯМР с непрерывной разверткой
114
Оглавление
399
Оглавление
Предисловие редактора перевода................;...................... 5
Предисловие автора................................................... 7
Предисловие .......................................................... | ]
Введение .......................................................... 12
Глава 1. О чем эта юнита............................................ 14
1.1, Введение................................................... 14
1.2, Что вам нужно знать........................................ 16
1.3. Что вы найдете в этой книге................................ 17
^/1.4. Что можно сделать с помощью ЯМР....................... , 19
1,5. Маленькая прогулка вокруг спектрометра ЯМР................. 21
Литература ................................................. 23
Глава 2. Некоторые вопросы импульсного ЯМР.......................... 24
2.1, Введение .................................................. 24
2.2. Настройка колоколов........................................ 26
2.3. Импульсный ЯМР............................................. 27
2.3.1. Введение ............................................ 27
2.3.2. Возбуждение образца.................................. 28
2.3.3. Время и частота...................................... 29
2.4. Практическое выполнение импульсного ЯМР.................... 31
2.4.1. Введение . . ........................................ 31
2.4,2, Детектирование и регистрация......................... 32
2,4.3. Преобразование ...................................... 38
2.5. Практические аспекты фурье-спектроскопии ЯМР............... 41
\/2.5.1. Введение ............................................ 41
2.5.2. Цифровое разрешение и время регистрации.............. 41
2.5.3. Обрезание и аподизация............................... 44
2.5.4. Взвешивающие функции ................................ 46
2.5.5. Распознавание отраженных пиков . , .................. 50
2.6. Преобразование Фурье-не единственный способ................ 51
Литература ................................................. 53
Глава 3. Основные экспериментальные методы.......................... 54
3.1, Введение .................................................. 54
3.2. Приготовление образцов..................................... 54
3.2.1. Введение ............................................ 54
3.2.2. Выбор растворителя.................................... 55
3.2.3. Ампула для регистрации спектров ЯМР................... 60
3.2.4. Объем образца......................................... 60
3.2.5. Приготовление образца................................. 62
3.2.6. Ядра, отличные от протонов............................ 62
3.3. Настройка разрешения....................................... 63
3.3.1. Введение ............................................. 63
3.3.2. Критерии разрешения................................... 63
3.3.3. Факторы, влияющие на разрешение...................... 67
3.3.4. Шиммирование ......................................... 69
3.4. Достижение максимальной чувствительности................... 80
3.4.1. Введение ...........................................
3.4.2. Критерии чувствительности............................. 81
3.4.3. Факторы, влияющие на чувствительность................. 86
'Литература ................................................. ^6
Глава 4. Импульсная спектроскопия ЯМР.............................
4.1. Введение ................................................
4.2. Составные части эксперимента.............................
4.2.1. Введение ...........................................
4.2.2. Ядра ...............................................
4.2.3. Радиочастотное поле ................................
4.2.4. Вращающаяся система координат.......................
4.2.5. Импульс!............................................
4.2.6. Векторы и уровни энергии............................
4.3. Реальный эксперимент.....................................
4.3.1. Введение ...........................................
4.3,2. Когда импульс не попадает в резонанс................
4,3.3. Когда детектируется несколько частот одновременно ....
4.3.4. Оси и фазы..........................................
4.3.5. Квадратурное детектирование.........................
4.3.6. Фазовые ошибки и коррекция фазы.....................
•V4.4. Релаксация ..............................................
v 4.4.1. Введение ...........................................
4.4.2. Двигаясь к равновесию...............................
xj 4.4.3. Релаксация в плоскости х - у.......................
v 4.4.4. Спиновое эхо........................................
4.5. Импульсный ЯМР ..........................................
Литература ................................................
Глава 5. Ядерный эффект Оверхаузера...............................
5.1. Введение ...............................................
5.2. Происхождение ядерного эффекта Оверхаузера..............
5.2.1. Введение .........................................
5.2.2. Пути релаксации...................................
5.2.3. Причины релаксации................................
5.2.4. ЯЭО и межъядерные расстояния......................
5.2.5. Неравновесный ЯЭО.................................
5.3. Измерение ЯЭО...........................................
5.3.1. Введение .........................................
5.3.2. Приготовление образца............ . . .........
5.3.3. Метод разностных спектров.........................
5.3.4. Некоторые замечания о дейтериевой стабилизации....
4.^,4. Использование ЯЭО........................................
5.4.1. Очень простой случай..............................
97
97
98
98
98
100
101
103
105
106
106
106
ПО
112
117
126
128
128
130
133
135
142
144
145
145
146
146
147
152
158
165
167
167
167
168
177
179
179
400
Оглавление
5.4.2. Проверка трехспинового уравнения..................... 181
5.4.3. Реальная задача ..................................... 183
5,4.4. Гетероядерный ЯЭО ................................... 186
Литература ................................................. 187
Глава 6. Перенос поляризации н редактирование спектров............. 188
6.1. Введение ................................................... 188
6.2. Селективный перенос заселенности........................ 190
6.3. INEPT .................................................. 193
х/ 6.3.1. Введение ........................................... 193
6.3.2. Характеристики спектров INEPT............:........... 198
6.3.3. Задержка ............................................... 202
6.4. DEPT ....................................................... 205
6.4.1. Введение ............................................... 205
6.4.2. Последовательность DEPT как многоквантовый фильтр . . 206
6.4.3. Редактирование спектров с помощью DEPT............... 207
6.4.4. DEPT для спектров без развязки....................’ . 210
6.4.5. Квадрупольные ядра ........................... 212
6.4,6. «Обращенные» эксперименты ...................... 213
Литература ............................................... 216
Глава 7. Дополнительные сведения об экспериментальных методах ... 217
7.1. Введение ................................................. 217
7.2. Длительность импульса и напряженность поля................ 218
7.2.1. Введение: шкала мощности в децибелах................ 218
7.2.2. Импульсы на частоте наблюдаемых ядер................ 219
7.2.3. Импульсы на других ядрах............................ 222
7.2.4. . Мощность радиочастотного поля при гомоялерной развязке 224
7.2.5. Мощность радиочастотного поля при гетероядерной раз-
вязке ...................................................... 225
7.3. Уменьшение неидеальности импульсов........................ 227
7.3.1. Введение ........................................... 227
7.3.2. Составные импульсы ................................. 228
7.4. Широкополосная развязка................................... 232
7.5. Релаксация и повторение прохождений....................... 235
7.5.1. Введение ........................................... 235
7.5.2. Длительность импульса и частота повторения прохождений 236
7.5.3. Методы быстрого определения Г]...................... 238
\/7.6. Количественное измерение интенсивностей................... 240
V 7.6.1. Введение ........................................... 240
7.6.2. Как сделать интенсивность сигналов пропорциональной
числу ядер................................................. 240
7.6.3. Регистрация спектра................................. 242
v 7.6.4. Другие аппаратурные трудности....................... 244
7.7. Селективное возбуждение и подавление...................... 246
7.7.1. Введение .......................................... 246
7.7.2. Подавление пиков.................................... 247
7.7.3. Селективно» возбуждение............................. 252
7.8. Несколько тестов для спектрометра......................... 255
Литература ................................................ 258
N/ Глава 8. Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР. Корреляция за
счет гомоядерного взаимодействия................................ 260
< /8.1. Введение ............................................... 260
< 8.2. Меченые частоты......................................... 261
< z8.3. Эксперимент Джинера..................................... 266
8.3.1. Введение ........................................... 266
Оглавление
401
8.3.2. Двумерный эксперимент. Непрерывная развертка-преобра-
зование Фурье............................................... 266
8.3.3. Перенос намагниченности............................. 268
8.3.4. Два реальных примера................................ 270
8.3.5. Детали эксперимента COSY............................ 281
8.3.6. Работа с COSY....................................... 307
8.4, Эксперименты, родственные COSY............................ 322
8.4.1. COSY-45 ............................................ 322
8.4.2. Определение малых констант...................... 323
8.4.3. Многоквантовая фильтрация ...................... 327
8.4.4. Эстафетный перенос когерентности ............. 329
8.5. Другие эксперименты по гомоядерной корреляции......... 333
8.5.1. INADEQUATE ..................................... 333
8.5.2, NOESY или обменная спектроскопия.................... 341
Литература ................................................ 348
Г лава 9. Гетероядерная корреляционная спектроскопия.............. 349
9.1. Введение ................................................ 349
9.2. Детали HSC............................................... 350
9.2.1, Устранение различных КССВ.......................... 350
9.2.2. Другие экспериментальные аспекты................... 353
9.2.3. Использование HSC.................................. 355
9.3. Эксперименты, родственные HSC............................ 359
9.3.1. Широкополосная гомоядерная развязка по v, в экспери-
менте HSC ................................................. 359
9.3.2. Дальние константы 13С 'Н. Последовательность COLOC 361
9.4. Эстафетный перенос когерентности......................... 362
9.4.1. Введение ......................................... 362
9.4.2. Эстафета Н-Н-С..................................... 363
9.4.3. Использование RCT.................................. 365
Литература ............................................... 366
Г лава 10. Спиновое эхо и /-спектроскопия......................... 368
10.1. Введение ............................................... 368
10.2. Гетероядсрная J-модуляция и спиновое эхо................ 368
10.2.1. Введение ......................................... 368
10,2.2. Разностное спиновое эхо........................... 372
10.3. Гетероядерный /-спектр.................................. 376
10.3.1. Введение ......................................... 376
10.3.2. Примеры гетероядерных /-спектров.................. 377
10.3.3. Экспериментальные аспекты......................... 382
10.4. Гомоядерный /-спектр.................................... 384
10.4.1. Введение ......................................... 384
10.4.2. Наклон /-спектров................................. 386
10.4.3. Непрямой /-спектр................................. 389
Литература ............................................... 391
Предметный указатель...................................... 392