/
Теги: почвоведение почвенные исследования историческая геология
ISBN: 5-89118-315-7
Текст
М.М. Умаров, А.В. Кураков,
А.Л. Степанов
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ
ТРАНСФОРМАЦИЯ
АЗОТА В ПОЧВЕ
им. М.В. Ломоносова
Факультет почвоведения
Российский фонд фундаментальных исследований
#и
М.М. Умаров, А.В. Кураков, А.Л. Степанов
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ
ТРАНСФОРМАЦИЯ АЗОТА
В ПОЧВЕ
Москва
ГЕОС
2007
УДК 631.4
ББК 26.323
К 70
М.М. Умаров, А.В. Кураков, А.Л. Степанов Микробиологическая
трансформация азота в почве М.: ГЕОС, 2007. - 138 с.
ISBN 5-89118-315-7
В книге обобщены современные данные об основных звеньях круговорота
азота в биосфере - азотфиксации, нитрификации и денитрификации,
осуществляемых, главным образом, микроорганизмами. Особое внимание уделено
участию микроорганизмов наземных экосистем (почв) в процессах
трансформации этого элемента в биосфере.
Книга рассчитана на широкий круг специалистов, аспирантов и студентов,
интересующихся проблемой трансформации азота в биосфере.
Публикуется при финансовой поддержке Российского фонда
фундаментальных исследований (проект № 06-04-62063)
Ответственный редактор
ак. Г.В. Добровольский
Marat M. Umarov, Alexander V. Kurakov, Alexey L. Stepanov MICROBIAL
TRANSFORMATION OF NITROGEN IN SOIL. Moscow, GEOS, 2007. -
138 p.
The monograph makes attempt with possible comprehension realize review of
current data about participation of soil microorganisms in global processes of nitrogen
transformation - molecular nitrogen fixation, nitrification and denitrification, as long
as they are mainly influenced on rate of nitrogen turnover in nature and supply and
removal of nitrogen from soils.
The book is recommended for the specialists in microbiology, ecology, soil science
and agrochemistry.
Responsible Editor
ak. G.V. Dobrovolsky
Published at financial support of Russian Foundation
for Basic Research (grant №06-04-62063)
© М.М. Умаров, А.В. Кураков, А.Л. Степанов, 2007
© Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 2007
©ГЕОС, 2007
Содержание
Предисловие 7
Глава 1. Особенности трансформации азота в почвах 9
1.1. Введение 9
1.2. Особенности жизнедеятельности микроорганизмов в почве 12
1.3. Особенности трансформации азота в биосфере 18
1.4. Химия и биогеохимия азота 25
Литература 28
Глава 2. Азотфиксация в почвах 30
2.1. Введение 30
2.2. Азотфиксирующие системы прокариот 30
2.3. Генетический контроль азотфиксации 36
2.4. Роль азотфиксации в современном земледелии 41
2.4.1. Азотфиксирующие растительно-микробные системы 42
2.4.2. Ассоциативная азотфиксация 43
2.4.3. Азотфиксирующий симбиоз бобовых растений 47
2.4.4. Азотфиксирующие симбиозы небобовых растений 49
2.4.5. Искусственный симбиоз - паранодуляция 51
2.4.6. Бактериальная инокуляция растений 55
2.4.7. Инокуляция растений чистыми культурами бактерий 56
2.4.8. Инокуляция смешанными культурами микроорганизмов ... 57
2.5. Азотфиксация в кишечнике термитов 58
2.6. Азотфиксация в желудочно-кишечном тракте грызунов 61
2.7. Заключение 63
Литература 65
Глава 3. Нитрификация в почвах 67
3.1. Введение 67
3.2. Физиолого-биохимические особенности нитрификаторов 69
3.2.1. Автотрофные нитрифицирующие бактерии 69
3.2.2. Гетеротрофные нитрифицирующие микроорганизмы 72
3.3. Анаэробное окисление аммония (анаммокс) 74
3.4. Экология нитрифицирующих микроорганизмов 76
3.4.1. Автотрофные нитрификаторы 76
3
3.4.2. Гетеротрофные нитрификаторы 80
3.5. Влияние экологических факторов на нитрификацию в почвах 86
3.6. Аэробное и анаэробное МС^-зависимое окисление
аммония Nitrosomonas (ЫОх-цикл) 90
3.6.1. Анаэробное МС^-зависимое окисление
аммония Nitrosomonas 90
3.6.2. Роль NOx в аэробном окислении аммония Nitrosomonas 91
3.7. Роль нитрификации в образовании окислов азота 93
3.8. Взаимосвязь окисления аммония и метана в почвах 96
3.9. Ингибирование нитрификации в почвах 97
3.10. Соотношение авто- и гетеротрофной
нитрификации в почвах 100
3.11. Заключение 107
Литература 110
Глава 4. Денитрификация в почвах 114
4.1. Введение 114
4.2. Физиолого-биохимические особенности денитрификации 116
4.3. Влияние факторов среды на денитрификацию 118
4.4. Денитрификация в почвах разных типов 122
4.4.1. Активность денитрификации в засоленных почвах 125
4.4.2. Денитрификация в агрегатах почв 128
4.4.3. Влияние пестицидов на денитрификацию в почвах 131
4.4.4. Влияние тяжелых металлов на денитрификацию в почве .. 132
4.4.5. Денитрификация в переувлажненных почвах 133
4.5. Заключение 134
Литература 135
4
List of contents
Preface 7
Chapter 1. Characteristics of nitrogen transformation in soils .9
1.1. Introduction 9
1.2. Particularities of microbial functions in soils 12
1.3. Particularities of nitrogen transformation in biosphere 18
1.4. Chemistry and biogeochemistry of nitrogen 25
References 28
Chapter 2. Molecular nitrogen fixation in soils 30
2.1. Introduction 30
2.2. N2 fixing systems of prokaryotes 30
2.3. Genetic control of N2 fixation 36
2.4. Role of N2 fixation in current agriculture 41
2.4.1. Plant-microbial nitrogen fixing systems 42
2.4.2. Associative N2 fixation 43
2.4.3. N2 fixing symbioses of plants 47
2.4.4. N2 fixing symbioses of non-legumes 49
2.4.5. Artificial symbioses - paranodulation 51
2.4.6. Bacterial inoculation of plants 55
2.4.7. Inoculation of plants by pure bacterial cultures 56
2.4.8. Inoculation of plants by mixed microbial cultures 57
2.5. N2 fixation in termite guts 58
2.6. N2 fixation in gastrointestinal tract of rodents 61
2.7. General conclusion 63
References 65
Chapter 3. Nitrification in soils 67
3.1. Introduction 67
3.2. Physiological and biochemical features of nitrifying
microorganisms 69
3.2.1. Autotrophic nitrifying bacteria 69
3.2.2. Heterotrophic nitrifying microorganisms 72
3.3. Anaerobic ammonium oxidation (anammox) 74
3.4. Ecology of nitrifying microorganisms 76
3.4.1. Autotrophic nitrifiers 76
5
3.4.2. Heterotrophic nitrifiers 80
3.5. Effects of environmental factors on nitrification in soils 86
3.6. Aerobic and anaerobic N02-dependent ammonium
oxidation by Nitrosomonas (NOx cycle) 90
3.6.1. Anaerobic N02-dependent ammonium oxidation
by Nitrosomonas 90
3.6.2. Role NOx in aerobic ammonium oxidation by Nitrosomonas 91
3.7. Input of nitrification in nitrogen oxides formation 93
3.8. Interrelation of methane and ammonium oxidation 96
3.9. Inhibition of nitrification in soils 97
3.10. Ratio of autotrophic and heterotrophic nitrification in soils 100
3.11. General conclussion 107
References 110
Chapter 4. Denitrification in soils 114
4.1. Introduction 114
4.2. Bochemistry of denitrification 116
4.3. Enzymes of denitrification 118
4.4. Effects of environmental factors on denitrification 122
4.4. Denitrification in various types of soils
4.4.1. Activity of denitrification in saline soils 125
4.4.2 Denitrification in soil aggregates 128
4.4.3. Influence of pesticides on denitrification in soils 131
4.4.4. Influence of heavy metals on denitrification in soils 132
4.4.5. Influence of high level of wetting on denitrification in soils 133
4.5. General conclusion 134
References 135
6
Natura in minimis maxima
Lois Pasteur
Предисловие
Гениальное предсказание Луи Пастера главенства микроорганизмов в
круговороте химических элементов на Земле («в природе бесконечно велика
роль бесконечно малых») получило к настоящему времени полное
подтверждение. По современным данным, микроорганизмам принадлежит ведущая
роль в круговороте не только всех биогенных макро- и микроэлементов (Н,
О, С, N, P, S, Fe, Ca, Na, К, Mn, Mg, Mo, I, Br, В, Zn, Al, Si, Ni, Co, V), но и в
трансформации и геохимической миграции множества других химических
элементов в биосфере. В общей сложности 65-68 элементов Периодической
системы Менделеева в той или иной степени подвергаются воздействию
микроорганизмов, вызывающих, по образному выражению В.И. Вернадского,
«вихрь миграции элементов». Такой круговорот элементов возник еще в
раннем докембрии, задолго до появления высших организмов (эукариот) и
осуществлялся в течение более 2,5 млрд лет только прокариотами. Их ведущая
роль в биогеохимической трансформации элементов на Земле сохраняется и
поныне. Новый взгляд на роль микроорганизмов в биосфере обусловлен тем,
что согласно полученным в последнее десятилетие оценкам, экосистемы
суши (почвы) существенно превосходят все другие геосферы (воду, ил,
воздух) по численности микроорганизмов. Из этого следует, что они в такой же
существенной степени влияют и на напряженность и масштабы процессов
микробной трансформации различных химических элементов, вследствие
чего изменение свойств наземных экосистем (почв) в таких же масштабах
отражается на состоянии всей биосферы. Тем не менее участие микробного
населения суши (почв) в глобальном круговороте химических элементов к
настоящему времени относительно хорошо определено только для углерода, а их
роль в трансформации других биогенных элементов, и в частности азота, до
настоящего времени неизвестна.
Достигнутые в последние десятилетия заметные успехи в исследовании
особенностей трансформации азота в почвах пока не привели к изменению
имеющихся представлений о вкладе микроорганизмов суши (почв) в
круговорот азота в масштабах биосферы. В свою очередь, недостаток таких знаний
проявляется не только в неполноценности общебиологической картины мира,
но и не позволяет подойти к решению важнейших практических проблем
современной цивилизации, в числе которых особое место занимают устойчивость
развития биосферы и продовольственная безопасность населения планеты.
В монографии сделана попытка с возможной полнотой осуществить обзор
современных данных об участии микроорганизмов почв в глобальных
процессах трансформации азота - азотфиксации, нитрификации и денитрифика-
ции, поскольку именно они в наибольшей степени влияют на скорость
круговорота азота в природе. При этом из рассмотрения были исключены два
других звена в цикле азота - аммонификация и иммобилизация, роль
микроорганизмов в которых пассивна.
7
Natura in minimis maxima
Lois Pasteur
Brilliant prediction of L.Pasteur about priority of microorganisms in the cycle
of chemical elements on the Earth («Role of infinitesimals are infinite quantity in
Nature») obtained now total confirmation. According present-day data,
microorganisms play main role in the turnover not only biogenic macro- and
microelements (H, O, C, N, P, S, Fe, Ca, Na, K, Mn, Mo, I, Br, B, Zn, Al, Si, Ni, Co, V), but
also in the transformations and geochemical migration of multitude of other
chemical elements in biosphere. Totally 65-68 elements of Periodical system are subject
to effects of microorganisms that are causing as V.I.Vernadsky has expressed
figuratively «whirlwind of element migrations». Such turnover of elements originated
in early Precambrian, long before of high organisms (eukaryotes) had appear-
anced. Prokaryotes only fulfilled the cycle of elements during more than 2,5
milliard years. Their leading role in biochemical transformations of elements is
retaining up to the present time. New view on the role of microorganisms in biosphere is
stating according of last decade assessments that terrestrial (soil) ecosystems
significantly exceeded all other geospheres (water, sediments, air) in the quantity of
microorganisms. It means that terrestrial ecosystems govern in such considerable
degree intensity and scales of microbial transformation of various elements on the
Earth, and modification of properties of soils has great effect on the status of the
biosphere. At the same time participation of microbial populations of soils in
global cycle of chemical elements well assessed currently only for carbon. Their role in
transformation of other biogenic elements, for nitrogen particularly, is not known
today.
Achieved successes of last decades in the studies of nitrogen transformations in
soils up till now did not change general concept about input of terrestrial (soil)
microorganisms in the nitrogen cycle in the scale of the biosphere. In turn, lack of
such knowledge lead not only to inferiority of general biological picture of world,
but did not allow to approach to decisions of important problem of modern
civilization - sustainable development of biosphere and food safety of humans.
The monograph makes attempt with possible comprehension to review of
current data about participation of soil microorganisms in global processes of
nitrogen transformation - molecular nitrogen fixation, nitrification and denitrification,
as long as they mainly influence on rate of nitrogen turnover in nature and supply
and removal of nitrogen from soils.
8
Глава 1. ОСОБЕННОСТИ ТРАНСФОРМАЦИИ
АЗОТА В ПОЧВАХ
1.1. Введение
Современное естествознание накопило огромный фактический материал
о необратимом и прогрессивном изменении биосферы Земли за время ее
эволюции, сопровождавшимся непрерывным ростом биологического
разнообразия и усложнением экосистем.
В процессе такого развития наибольшее разнообразие и максимальную
сложность приобрели экосистемы суши (почвы), что, в свою очередь,
способствовало увеличению масштабов их влияния на биосферу.
Впервые высказанное В.И. Вернадским [1987] мнение о главенствующей
роли почвенного покрова Земли («живой пленки планеты») в глобальных
функциях биосферы получило к настоящему времени вполне отчетливое
подтверждение. Согласно имеющимся данным, экосистемы суши играют
важную, возможно ведущую, роль в биосфере, поскольку по важнейшим
экологическим показателям они значительно превосходят экосистемы
Мирового океана, вследствие чего стабильность и устойчивое развитие биосферы
Земли определяются, главным образом, свойствами наземных экосистем.
Занимая 29,2% поверхности Земли, экосистемы суши существенно отличаются
от океана по основным биогеохимическим показателям [Добровольский,
2003]:
• по содержанию живой массы суша превосходит океан примерно в 750
раз; «сгущение жизни» (по В.И. Вернадскому) на суше на несколько
порядков выше, чем в любых других природных средах;
• живая биомасса экосистем суши составляет почти 90% всей биомассы
Земли, а ее суммарная первичная продукция вдвое выше, чем в океане;
• на суше обитают около 92% всех известных к настоящему времени видов
живых существ;
• человечество получает около 90% продуктов питания и 87% белка
(азота) за счет использования ресурсов суши при земледелии и животноводстве.
Высокая продуктивность и необычайно богатое биологическое
разнообразие экосистем суши обусловлены прежде всего особыми, во многом
уникальными свойствами их основного компонента - почв. Среди этих свойств
наибольшее значение принадлежит огромной поглотительной способности и
высокой неоднородности (мозаичности) строения, позволяющей почвам не
только удерживать практически все химические элементы, но и
осуществлять их внутрипочвенный круговорот во множестве микрозон, характери-
9
зующихся исключительным разнообразием физико-химических условий.
Присущая почвам замкнутость биогеохимических циклов большинства
элементов и мозаичность строения существенно отличает их от всех других
геосфер - воды, илов и воздуха - и создает условия для одновременного
протекания большого числа разнонаправленных химических и микробиологических
процессов. Вследствие этого в любой почве непрерывно возникает и
присутствует широчайший набор различных по составу и концентрации
минеральных и органических веществ, а каждая микрозона выступает центром
особого микрокосма с множеством разнообразных организмов, жизнедеятельность
которых еще больше увеличивает гетерогенность почвы.
В итоге у почвы появляется плодородность - удивительная и уникальная
способность обеспечивать жизненные потребности множества организмов,
причем плодородность не только в известном агрономическом смысле, но и в
уже указанной способности служить благоприятной средой для всего
огромного по разнообразию и численности населяющих ее толщу и поверхность
живых существ.
Почва представляет собой практически идеальную среду для развития
подавляющего разнообразия организмов и по своему генофонду является
наиболее богатым природным субстратом. Неслучайно, как отмечалось, из
числа известных к настоящему времени видов живых организмов около 92%
обитают в почве или на почве.
Кроме того, высокая неоднородность (мозаичность) строения почвы
определяет ее способность обеспечивать условия для одновременного
присутствия и развития весьма далеких по своим потребностям организмов -
аэробных и анаэробных, термофильных и психрофильных, ацидофильных и
алк&лофильных, авто- и гетеротрофных, про- и эукариот.
В максимальной степени эти свойства почвы используются
микроорганизмами, и наиболее важная с точки зрения роли в биосфере особенность
экосистем суши состоит в том, что от 60 до 90% ее суммарной биомассы
представляют бактерии, микроскопические грибы, водоросли и простейшие -
физиологически и биогеохимически самая активная часть населения почвы.
Численность микроорганизмов в почве по сравнению с другими природными
средами (вода, илы) выше на несколько порядков - в 1 г почвы содержится
примерно 5-10 млрд клеток бактерий, длина гиф грибов составляет
3-7 тыс. м, а суммарная биомасса достигает нескольких десятков тонн на 1 га.
Особая роль, которую играет микробное население суши (почв) в
биосфере Земли, следует также из того, что помимо высокой численности
микроорганизмы по свойствам заметно отличаются от макроорганизмов (растений и
животных):
• физиологическая (и, соответственно, биогеохимическая) активность
микроорганизмов (бактерий) в 100-1000 раз выше, чем у макроорганизмов
вследствие значительно более высокого соотношения между их
поверхностью и объемом; поэтому, хотя суммарная биомасса прокариот на Земле
примерно равна биомассе эукариот (5 • 1011 т), влияние первых на биосферу
неизмеримо больше;
• микроорганизмы выделяются среди всех прочих организмов
максимально высокой скоростью размножения и могут достичь предельной
численности за весьма короткий промежуток времени; в биосфере суммарная числен-
10
ность прокариот (бактерий и архей) оценивается в 5 • 1030 клеток, что на
несколько порядков выше численности клеток эукариот;
• «границы жизни» микроорганизмов существенно шире, чем у
макроорганизмов, - они осуществляют свои функции в более широких пределах
температуры (от -13 до 110°С), кислотности (рН от 1 до 13), влажности (до aw
0,67), осмотического давления (от бидистиллята до рапы) и пр.;
• микроорганизмы (прокариоты) обладают значительно более высоким
разнообразием метаболизма, что выражается не только в использовании
большого числа веществ, недоступных высшим организмам (газообразные
соединения Н, С, N, S, Se, летучие, жидкие и твердые углеводороды, лигнин,
гумус, многие металлы и т.д.), но и в способности к разным типам
метаболизма, поскольку реализуют все 8 возможных типов питания, тогда как
макроорганизмы только 2;
• микроорганизмам (прокариотам) принадлежит главная роль в
круговороте азота в природе, поскольку только они обладают уникальной
способностью к азотфиксации, нитрификации и денитрификации.
Исключительно высокая плотность микробного населения почв
позволяет предполагать, что микроорганизмы почв являются основным
геохимическим агентом не только на суше, но и в масштабах биосферы.
Впервые высказанная Луи Пастером мысль о главенствующей роли
микроорганизмов не только в малом (биологическом), но и в большом
(геологическом) круговороте элементов получила к настоящему времени полное
подтверждение [Заварзин, 2003]. Согласно последним достижениям
бактериальной палеонтологии, именно деятельность микроорганизмов (прокариот)
определила не только появление уже в раннем докембрии кислородной
атмосферы за счет быстрого распространения оксигенной фототрофии, но и
обеспечила мощный приток доступного азота в процессе приобретенной ими
в то же время диазотрофии, что стало решающим для последовавшего затем
расцвета биосферы.
Деятельность микроорганизмов суши (почв) отчетливо отражается и на
современной биогеохимии Земли, причем не только на материках, но и в
Океане и атмосфере.
Активная микробная жизнь определяет напряженность и разнообразие
биогеохимических процессов на водосборных территориях на суше, что, в
свою очередь, оказывает влияние на формирование и динамику химического
состава наземных и подземных вод и на гидросферу Земли в целом [Ковда,
1985].
Микробное население почв играет важную роль в регулировании газового
состава атмосферы Земли, включая ее макро- и микрокомпоненты, в числе
которых важнейшие парниковые микрогазы - С02, СН4 и N20. Считается,
что долговременный прогноз глобальных изменений климата возможен
только при учете условий жизнедеятельности микроорганизмов в почве
[Добровольский, Умаров, 2004].
Микроорганизмы (прокариоты) помимо активного участия в круговороте
всех биогенных (биофильных) макро- и микроэлементов (Н, О, С, N, P, S, Fe,
Mn, I, Mg, Ca, Na, К, Mo, Br, В, Zn, Al, Si, Ni, Co, V), выступают главными
агентами трансформации и геохимической миграции множества других
химических элементов. По современным оценкам, в общей сложности 65-68 элемен-
11
тов Периодической системы Менделеева подвергаются микробному
воздействию, вызывающему, по образному выражению В.И. Вернадского, «вихрь
миграции элементов».
Совокупность полученных к настоящему времени данных позволяет
утверждать, что почвы, существенно превосходя все другие геосферы по
концентрации микроорганизмов, могут в такой же существенной степени влиять на
напряженность и масштаб процессов микробной трансформации
большинства химических элементов в биосфере, вследствие чего изменение свойств
почв практически немедленно отразится на состоянии биосферы. В качестве
примера можно отметить, что прогрессирующий в настоящее время
парниковый эффект на Земле в первую очередь связывают с нарушениями
почвенного покрова.
К настоящему времени стало также достаточно очевидным, что решение
не только глобальных, но и многих региональных экологических проблем
должно проводиться с учетом деятельности почвенных микроорганизмов.
В частности, эти знания необходимы при расчетах предельных
антропогенных нагрузок на конкретные экосистемы с использованием так называемой
«самоочищающей способности почв», обусловленной в основном
активностью микроорганизмов, при проведении комплексных экологических
экспертиз, при экологическом прогнозировании и т.д.
1.2. Особенности жизнедеятельности
микроорганизмов в почве
С позиций современной природоведческой микробиологии почва
представляет собой комплекс одновременно существующих, но резко
различающихся по химическим и физическим свойствам микросред, в которых
создаются условия для роста и развития не только большого числа видов
микроорганизмов, но и, что поразительно, для весьма Далеких по своим потребностям
микроорганизмов. Как отмечалось, в любом комочке почвы одновременно
присутствуют и активно функционируют аэробные и анаэробные,
термофильные и психрофильные, ацидофильные и алкалофильные, автотрофные и
гетеротрофные бактерии и археи, прокариоты и эукариоты.
Как следствие, почва - уникальная по физическим и химическим
свойствам полидисперсная многокомпонентная система - является практически
идеальной средой для развития подавляющего большинства
микроорганизмов и по микробному генофонду почва - самый богатый природный
субстрат. Неслучайно, что большинство используемых в промышленности
микроорганизмов с ценными свойствами - продуценты антибиотиков,
аминокислот, витаминов, ферментов и пр., выделены из почв.
Современная биотехнология рассматривает почву в качестве главного
природного банка при поиске культур микроорганизмов с любыми
необходимыми свойствами.
Наличие в почве живых растений и животных еще более усложняет ее
гетерогенность как среды обитания почвенных микроорганизмов. По
имеющимся в настоящее время представлениям, ризосфера растений и кишечный
12
тракт почвенных беспозвоночных животных являются естественными
аналогами проточных биореакторов и характеризуются наивысшей активностью
микробиологических процессов в природе [Умаров, 2003].
Универсальность почвы как среды обитания самых разных
микроорганизмов и причины этого уникального природного феномена являются
предметом специальных исследований [Звягинцев, 2003].
В каждой почве поддерживается определенный, характерный для
конкретного типа почв уровень численности бактерий и грибов, так называемый
пул микроорганизмов. Он ответствен за саморегулирующийся гомеостаз в
почве, выражающийся в величине рН и Eh, концентрации подвижных
соединений биофильных элементов, разнообразных органических и
неорганических веществ. Совокупная деятельность микроорганизмов проявляется в
присущей каждой почве биологической активности, оцениваемой в основном по
показателям напряженности биогеохимических циклов ряда элементов
(поглощению С>2, выделению СС>2 и СН4, азотфиксации, нитрификации, денит-
рификации и пр.), и находит итоговое выражение в виде универсальной
характеристики почв - плодородности.
Как отмечалось, в отличие от высших организмов (эукариот),
микроорганизмы (главным образом, прокариоты) активно трансформируют множество
других химических элементов, которые не используются в метаболизме
живой клетки. В их числе ртуть (Hg), мышьяк (As), селен (Se), сурьма (Sb),
кадмий (Cd), хром (Сг), свинец (РЬ), олово (Sn), теллур (Те), палладий (Pd),
висмут (Bi), алюминий (А1), серебро (Ag), золото (Аи), литий (Li), уран (U),
технеций (Тс) и др. По имеющимся оценкам, микроорганизмы способны
трансформировать в общей сложности 65-68 химических элементов^ В
результате микробного воздействия миграционная способность этих
элементов, как правило, резко возрастает, и они рассеиваются по большим
территориям, обусловливая, по образному выражению В.А. Ковды, нарастающую
«металлизацию» биосферы.
Ранее исследования В.И. Вернадского, Б.Б. Полынова и их
последователей убедительно показали главенствующую роль биологических факторов в
выветривании горных пород и первичном почвообразовании. Согласно
накопленным к настоящему времени данным, микробиологические процессы
по масштабности и глубине осуществляемых реакций занимают ведущее
положение при трансформации элементов в земной коре в ходе разрушения
минералов и горных пород. Показано, что в естественных условиях на суше все
горные породы и минералы (причем не только на поверхности, но и на
значительной - до нескольких (2-5) километров - глубине, в подповерхностных
слоях) обильно населены разнообразными микроорганизмами. При
возникновении благоприятных условий они активизируют свою жизнедеятельность
и разрушают их, выщелачивая различные химические элементы. Деградация
горных пород и минералов может идти под воздействием как прямого, так и
косвенного влияния микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.
Известно несколько механизмов такого воздействия:
• окисление (восстановление) переменно-валентных элементов;
• действие биогенных кислот и щелочей (ацидолиз и алкалолиз);
• комплексолиз (хелатообразование);
• биосорбция.
13
Переменно-валентные элементы (S, N, Fe, Mn, Sb, Mo, Cu, As и др.), когда
они присутствуют в составе минералов и горных пород в восстановленном
состоянии, способны служить источником энергии для автотрофных
бактерий, переходя в окисленную форму.
Наиболее легко бактерии окисляют двухвалентную серу в сульфидных
минералах (антимонит, висмутин, галенит, молибденит, пирит, сфалерит и
др.). При этом сера сульфидов переходит в шестивалентную форму
сульфатов и возникают разнообразные вторичные сульфатные минералы - гипс,
алунит, ярозит и др., характерные для многих почв.
Другим широко распространенным в почве процессом является
нитрификация - бактериальное окисление трехвалентного азота (в составе аммония),
приводящего к образованию пятивалентного азота нитратов.
Помимо серы и азота источником энергии для автотрофных бактерий
могут служить двухвалентное железо, марганец, сурьма, одновалентная медь,
молибден, уран и ряд других химических элементов. Под воздействием
микроорганизмов содержащие эти элементы минералы разрушаются,
превращаясь в иные минералы, как правило более растворимые и более подвижные.
Противоположный процесс - микробиологическое восстановление
переменно-валентных элементов - также широко распространен в почвах и
играет важную роль в биогеохимических циклах современных биогеоценозов.
Наиболее характерным является микробное восстановление Fe(III), Mn(IV),
Co(III), Cr(VI), Mo(VI), Hg(II) и ряда других металлов, которое активно
протекает при изменении влажности (аэробности) почв и сопряжено с
циклами азота, кислорода, серы, оказывая значительное воздействие на состояние
природной среды. Осуществляется оно, главным образом, гетеротрофными
микроорганизмами, которые используют эти элементы как акцепторы
электронов при окислении органических веществ в отсутствие свободного
кислорода в ходе анаэробного дыхания. Примерами происходящих при этом
процессов являются глееобразование (восстановление трехвалентного железа),
денитрификация (восстановление пятивалентного азота), сульфатредукция
(восстановление шестивалентной серы), метанообразование и пр.
Кислотность (щелочность), обусловленная органическими и
минеральными кислотами и щелочами микробного происхождения - еще один важный
природный фактор минералообразования и первичного почвообразования.
Способностью к продуцированию кислот и щелочей обладают все без
исключения микроорганизмы, но наиболее активны автотрофные бактерии и
микроскопические грибы. Бактерии-нитрификаторы образуют азотную и
азотистую кислоты, серные бактерии - серную и сернистую кислоты, а многие
бактерии-сульфатредукторы выделяют сероводород. Разнообразные
микроорганизмы проводят аммонификацию и образуют аммиак - биогенную
щелочь, которая также выступает в роли активного геохимического агента.
Микроскопические грибы известны как продуценты сильных органических
кислот - уксусной, щавелевой, янтарной, лимонной и пр., под воздействием
которых постепенно разрушаются любые горные породы и минералы.
Комплексолиз (хелатообразование) - широко распространенный процесс
при биологическом выветривании минералов и горных пород. Образование
металлоорганических комплексов может протекать одновременно с
действием биогенных кислот и щелочей, многих других микробных метаболитов. По
14
современным представлениям, хелатообразование - основной механизм
деградации горных пород и минералов при развитии гетеротрофных
микроорганизмов. Поскольку одной из главных отличительных особенностей хелатов
является их хорошая растворимость, комплексолиз резко увеличивает
подвижность химических элементов. И наоборот, при разрушении хелатов, что
также осуществляется микроорганизмами, использующими органическую
часть их молекулы, происходит локальная концентрация этих элементов.
Биосорбция - еще один путь воздействия микроорганизмов на
химические элементы в природных средах, на что указывал еще В.И. Вернадский.
В основе биосорбции лежат процессы взаимодействия химических элементов
с поверхностными структурами клеток микроорганизмов, микробными
метаболитами и экзополимерами. Многие бактерии и микроскопические грибы
накапливают в своей биомассе значительное количество различных
элементов, в результате чего происходит их концентрирование в местах массового
развития или скопления этих организмов. Биосорбция некоторых металлов
(золото, уран, медь, кадмий) микроорганизмами из малоконцентрированных
природных растворов широко используется в современных биогеотехнологи-
ях [Каравайко, 2004].
К настоящему времени считается однозначно установленным, что в
поверхностных слоях (2-5 км) земной коры (в зоне гипергенеза)
микроорганизмы являются главным фактором деградации всех основных групп
минералов — сульфидов, арсенатов, силикатов, оксидов и гидроксидов.
Окисление сульфидных минералов - наиболее распространенный пример
микробиологической деградации минералов в почве. Бактерии окисляют
сульфиды меди (пирит и марказит, пирротин, ковеллин, халькопирит, борнит
и др.), никеля (миллерит), кобальта (кобальтин), цинка (сфалерит, марма-
тит), молибдена (молибденит), свинца (галенит, геокронит). Также широко
распространено окисление соединений мышьяка - арсенатов (реальгар, ау-
рипигмент и др.). Наиболее активно эти процессы протекают при увеличении
аэрации почв - при осушении, вспашке, рыхлении и пр.
Деградацию силикатов осуществляют разнообразные микроорганизмы,
разрушающие силоксанные и алюмокислородные связи, лежащие в основе
кристаллической структуры этих минералов.
Среди прочих минералов, подвергающихся микробиологической
трансформации, в почве наиболее широко представлены соединения марганца и
железа. Известно более 100 марганецсодержащих минералов - оксидов,
карбонатов и силикатов. Важнейшими окислами являются псиломелан, бир-
несит, пиролюзит, манганит; из карбонатов - родохрозит, из силикатов -
родонит. Все эти минералы вторичные, возникшие в результате
микробиологической деградации первичных минералов вулканического происхождения
в ходе первичного почвообразования.
Как отмечалось, деятельность микроорганизмов суши (почв) привела к
скачкообразному усложнению микрозон и появлению в почвенном профиле
множества микролокусов с резко различающимися физико-химическими
условиями, что в итоге способствовало существенному расширению
горизонтов биоразнообразия. Известно также, что биологическая продуктивность
наземных и водных экосистем и биосферы в целом в значительной степени
зависит от источников доступного азота. По существующим представлениям,
15
главным из них является микробная азотфиксация, обеспечивающая не
только сиюминутную потребность организмов, но и резервирование азота в виде
различных азотсодержащих соединений. Азотфиксация, появившаяся у
самых первых живых организмов (бактерий и архей), практически
одновременно с возникновением на Земле жизни, приобрела по мере ее распространения
на планете глобальные масштабы, а связанный при этом азот стал играть
ключевую роль в биосфере. Микробная азотфиксация активно протекает в
самых разнообразных локусах (микрокосмах) с широким сочетанием
физико-химических условий (почвы разных типов, речная и морская вода, илы,
ризосфера и филлосфера растений, желудочно-кишечный тракт животных и
т.д.), в итоге способствуя поддержанию динамического равновесия
концентраций различных соединений азота в природе. Особенно велика роль
почвенных микроорганизмов в формировании и поддержании биогеохимического
цикла азота, и прежде всего за счет его биологической фиксации.
В ходе эволюции продукты былых биосфер в виде разнообразных
органических остатков - каустобиолитов и керогенов (угля, нефти, сапропеля,
торфа, гумуса) - постепенно становились разнообразнее, а их общее количество
возрастало. Одновременно возрастало и количество запасенного в их составе
азота, поступившего, главным образом, в результате деятельности бактерий-
азотфиксаторов и трансформированного в разнообразные азотсодержащие
соединения, отличающиеся не только по составу, но и по времени
нахождения в природной среде.
Азот среди биогенных элементов выделяется высокой подвижностью всех
природных соединений и большой скоростью метаболизма, чем объясняется
отсутствие заметных его скоплений в природе (в виде минералов и
агрономических руд) и в составе запасных веществ живой клетки.
Наиболее длительным сроком сохранения выделяется азот
органического вещества почв, в основном почвенного гумуса, являющегося главным
резервуаром «биологического* азота в биосфере. Только почвы обладают
способностью к запасанию (иммобилизации) связанного в ходе азотфик-
сации азота и играют роль единственного в биосфере долговременного
депо этого элемента.
Однако этот азот с трудом поддается минерализации и не может служить
легкодоступным источником для большинства организмов, вследствие чего
они реализуют другие способы его пополнения, главными из которых по
распространенности являются симбиозы и ассоциации с бактериями-диазот-
рофами.
Вторым важнейшим микробиологическим звеном в глобальном
круговороте азота является нитрификация. Осуществляется она двумя
принципиально разными группами микроорганизмов. К первой относятся таксоно-
мически и физиологически однородные высокоспециализированные в
отношении окисляемого субстрата бактерии, проводящие автотрофную
нитрификацию; ко второй - таксономически и физиологически разнообразные
бактерии и грибы, осуществляющие гетеротрофную нитрификацию.
Длительное время считалось, что ведущая роль в глобальном процессе
окисления аммония до нитрита и далее до нитрата принадлежит автотроф-
ной нитрификации, а деятельность гетеротрофных нитрификаторов даже не
рассматривалась. В последние годы, благодаря появлению новых методов
16
изучения нитрификации в природной среде, эти взгляды пересматриваются.
Согласно полученным данным, гетеротрофная нитрификация играет
важную, нередко ведущую, роль в окислении восстановленных соединений азота
во многих почвах и, соответственно, в глобальном его круговороте.
Довольно распространено мнение, что конечным продуктом
нитрификации являются нитраты, которые легко вымываются из почвы и уносятся
водой, вследствие чего основное количество связанного азота переносится с
суши в океан, оставаясь при этом в неизменном состоянии. Однако в последнее
время появляется все больше данных, что значительные потери азота из почв
происходят не только в результате выщелачивания нитратов, но и в виде
азотсодержащих газов. При нитрификации основным из них является закись
азота (N20).
Денитрификация - последнее звено в «контролируемом»
микроорганизмами биогеохимическом цикле азота, в котором связанный азот вновь
превращается в атмосферный N2. Как выяснилось в последние годы, при
микробной денитрификации наряду с молекулярным азотом (N2) в большом
количестве образуется закись азота (N20), которая нередко является основным
конечным продуктом процесса.
Закись азота, несмотря на относительную химическую инертность,
принимает активное участие в парниковом эффекте, и растущее ее содержание в
атмосфере Земли изменяет тепловой баланс планеты. Кроме того,
взаимодействие ее с озоном (03) в верхних слоях тропосферы Земли служит одной из
главных причин разрушения озонового экрана планеты, защищающего
живые объекты от жесткого ультрафиолетового излучения Солнца. Появляется
все больше данных, что регистрируемое в настоящее время медленное, но
неуклонное снижение биологического разнообразия на Земле является
следствием и этого эффекта.
Полученные в последние два десятилетия данные о роли микробного
населения почвы в глобальных циклах азота (и углерода) позволили по-новому
подойти к объяснению причин изменения климата на Земле.
Предполагается, что оно может быть следствием протекающего в настоящее время
широкомасштабного процесса ухудшения свойств' почв, которое сопровождается
быстрой потерей ими запасов органического вещества и проявляется в
нарушении существующего динамического равновесия в глобальном балансе не
только углерода, но и азота - уменьшении его запасов в почве и увеличении
(главным образом, в виде закиси азота) в атмосфере [Добровольский, Ума-
ров, 2004].
Поддерживавшееся длительное время динамическое равновесие в
содержании разных форм азота в биосфере, которое регистрировалось главным
образом по количеству нитратов в почве и воде и концентрации закиси азота в
атмосфере, примерно 50 лет назад стало меняться. Наблюдаемое в настоящее
время увеличение содержания нитратов и N20 обусловлено комплексом
причин, объединяемых обычно общим термином «деградация почв»,
приводящих к ускоренной минерализации органического вещества почв - дегуми-
фикации. Мониторинг динамики органического вещества почв, который
ведется почти 200 лет (в настоящее время координируется международной
программой Global Change And Terrestrial Ecosystems), не оставляет
сомнений в ускорении этого процесса. Органическое вещество почв и его важней-
17
шая часть - почвенный гумус - накапливались в течение длительного
времени (от нескольких сотен до тысяч лет) и отражают историю
почвообразования на Земле. Содержание гумуса и прочих органических соединений
быстро снижается при самых разнообразных воздействиях на почву:
внесении удобрений, известковании, загрязнении почв кислотными дождями,
тяжелыми металлами и многими иными веществами. Гумус быстро реагирует
также на осушение и орошение почв, вспашку и рыхление, причем, как
правило, его содержание при этом уменьшается.
«Биологический» азот, длительное время сохранявшийся в составе
гумуса, в ходе дегумификации переходит в другие соединения, превращаясь в
итоге в закись азота и молекулярный азот, причем на соотношение между этими
газами влияет также комплекс факторов природной среды, и таким образом,
изменение условий природной среды достаточно быстро отражается на
биогеохимическом цикле азота в биосфере. В свою очередь, изменение
(увеличение) скорости круговорота азота (и углерода) проявляется на климате
Земли - чем выше средняя температура атмосферы, тем быстрее происходят
иссушение почв и потеря ими органического вещества. Взаимосвязанность и
взаимообусловленность свойств почв и климата на Земле - важнейшие
проблемы современного фундаментального почвоведения.
Несмотря на важность, масштабы и интенсивность процессов азотного
цикла в биосфере Земли до настоящего времени изучены слабо, а роль почв в
образовании и поглощении азотсодержащих газов остается невыясненной,
хотя именно азот во многом определяет способность почв поддерживать
продуктивность наземных экосистем.
Несмотря на то что состояние экосистем суши и, соответственно,
стабильность биосферы напрямую зависят от содержания и скорости
трансформации азота в почвах, исследование особенностей поведения азота в наземных
экосистемах осуществляется лишь фрагментарно.
1.3. Особенности трансформации
азота в биосфере
Роль азота в качестве одного из основных химических носителей свойств
живой материи известна достаточно хорошо. Известны также общая
направленность круговорота азота в природе и особенности его звеньев - азотфик-
сации, аммонификации, нитрификации и денитрификации.
Биологический смысл такого круговорота состоит в том, что в ходе
циклических превращений азота в биосфере непрерывно возникают и с разной
длительностью присутствуют его разнообразные по составу соединения,
позволяющие всем живым существам получать азот в предпочтительной
для них форме.
С превращениями азота в природе связаны такие важнейшие проблемы
современной биологии, как сохранение биологического разнообразия и
устойчивое развитие биосферы Земли.
В еще более тесной связи с круговоротом азота находится проблема
обеспечения человечества пищевым белком (связанным азотом), недостаток ко-
18
торого существовал во все эпохи цивилизации и сохраняется в настоящее
время. Согласно имеющимся оценкам, мировое растениеводство ежегодно
выносит с урожаем из почвы примерно 110-120 млн т азота, тогда как
вносится на поля около 80 млн т в виде минеральных азотных удобрений и
30 млн т в составе органических удобрений. С учетом коэффициента
усвоения азота растениями (не более 50% для минеральных удобрений и 30% для
органических) из этих источников в мировой урожай поступает в среднем
около 40-45 млн т азота, или около 1/3 его выноса.
Современное производство азотных удобрений обеспечивает не более
1/3 суммарной потребности мирового растениеводства в этом элементе, и,
соответственно, основное его количество сельскохозяйственные растения
получают из азотного резерва почв, созданного и поддерживаемого
деятельностью микроорганизмов-азотфиксаторов.
Азотфиксирующие бактерии (диазотрофы), единственные из всего
населения планеты, ассимилируют атмосферный азот (N2) и обеспечивают этим
элементом не только себя, но и все другие организмы, вследствие чего
процесс фиксации атмосферного азота играет ведущую, ключевую роль в
балансе азота не только в природе, но и на полях.
Азотфиксация являлась основным источником доступного азота для всех
живых существ в биосфере во все периоды ее развития, хотя на долю
единовременно присутствующего «биологического» азота приходится лишь
ничтожная часть (около 0,0007%) общих его запасов на Земле [Newton, 1999].
Предполагается, что феномен азотфиксации возник уже в раннем докембрии
и существует без особых изменений в течение нескольких миллиардов лет [Ми-
шустин, Шильникова, 1968]. Появившаяся первоначально у анаэробных
прокариот, использовавших энергию брожения «первичного бульона», способность к
азотфиксации распространилась затем среди всех групп бактерий и архей.
Вероятным свидетельством «древности» азотфиксации можно считать
низкую субстратную специфичность осуществляющего этот процесс
фермента нитрогеназы - способность восстанавливать не только N2, но и ряд других
соединений с тройной связью в их молекулах (ацетилен, цианиды и пр.), что
отличает ее от других ферментов, обладающих, как известно, исключительно
высокой специфичностью в отношении субстратов [Кретович, 1995].
Вопреки существовавшему ранее мнению о наличии диазотрофии только
у узкой группы высокоспециализированных бактерий, к настоящему
времени все более широкое распространение получает представление о
способности к азотфиксации всех прокариот (бактерий и архей), относящихся к самым
разным физиологическим и таксономическим группам - хемолитотрофам,
фототрофам и гетеротрофам, аэробам, микроаэрофилам и анаэробам, трихом-
ным, почкующимся и мицелиальным, грамположительным и грамотрица-
тельным [Умаров, 1986].
Одним из косвенных подтверждений «родства» всех бактерий по этому
признаку может служить то, что азотфиксирующие ферменты - молибденсо-
держащие нитрогеназы разных бактерий - не только сходны по строению, но
и способны к образованию активных «гибридных» нитрогеназ, собранных из
компонентов, выделенных из различных организмов [Л^вов, 1989].
Еще одна особенность этой нитрогеназы состоит в том, что она - один из
самых медленно «работающих» ферментов с очень низким числом оборотов
19
(около 1,5 с при 23°С), требующих большого количества энергии (28М АТР
для восстановления 1М N2> или 12 г глюкозы для фиксации 1 г азота), а азот-
фиксация является наиболее энергоемким процессом в живой клетке [Крето-
вич, 1995].
В природных экосистемах азот как биофильный элемент не лимитирует
их продуктивность благодаря высокой сбалансированности всех звеньев его
биогеохимического цикла, когда приход азота полностью покрывает все
расходные статьи, а часть азота запасается в составе органического вещества
почв. Напротив, в почвах агроэкосистем азот является основным элементом,
определяющим их продуктивность, поскольку в них этот цикл не только
резко нарушен, но и разорван вследствие частых обработок почвы и
непрерывного плодосмена, разрушающих микробные ценозы, ответственные за
азотфиксацию. Вместе с регулярным выносом азота с урожаем все это
обусловливает его дефицит в пахотных почвах и вызывает необходимость
регулярного внесения азотных туков. Отчуждение продукции из агроэкосистем
увеличивает дисбаланс между обеспечением сельскохозяйственных
растений доступным азотом и его приходом с растительными остатками и
отходами переработки урожая. Более того, этот дисбаланс усугубляется тем, что
основное потребление азотсодержащих продуктов территориально
разобщено с их производством. Как паллиатив служат минеральные азотные
удобрения.
Интенсивное применение минеральных азотных удобрений (в 10-кратном
объеме) и внедрение сортов растений, использующих высокие дозы азота,
обеспечило в 1950-1960-е гг. успех «зеленой революции» в растениеводстве,
которая, однако, полностью не решила продовольственную проблему в мире.
В современном обществе такие технологии обеспечивают сбалансированное
по белку (азоту) питание населения индустриально развитых стран, тогда как
в развивающихся государствах сохраняется ситуация с хронической
нехваткой белков в рационе.
Массированное применение азотных удобрений в развитых странах стало
причиной широко известных отрицательных эффектов в природе:
поступления нитратов в грунтовые воды, ускоренной минерализации органического
вещества почв (дегумификации) и обусловленной этим возросшей эмиссии
парниковых микрогазов (N20, C02, СН4,) из почв. При этом происходит не
только локальное ухудшение качества природной среды, но и наблюдается
дисбаланс азотного цикла в глобальном масштабе, что влияет уже на
стабильность климата и озонового экрана Земли и проявляется в виде
разнообразных нарушений основных функций биосферы.
Известно также, что синтез, транспортировка, хранение и внесение
азотных удобрений требуют значительных затрат энергии. В настоящее время,
при ежегодном производстве 80 млн т удобрений, на эти цели расходуется
примерно 35% суммарного энергопотребления в мировом сельском хозяйстве
[Шумный, 1991]. Согласно расчетам, повышение урожаев в 2 раза (с 20 до
40 ц/га, что необходимо в настоящее время для ликвидации существующего
дефицита продовольствия в мире) увеличит энергетические затраты в 10 раз
[Жученко, 1996]. Неизбежный при этом рост цен на энергоносители повысит
стоимость азотных удобрений, высокая цена которых и сегодня - главная
причина их ограниченного применения в развивающихся странах.
20
Бактерии восстанавливают азот в основном за счет энергии Солнца, и их
использование позволяет существенно снизить затраты энергетического
сырья при производстве азотных удобрений. Кроме того, микробная
фиксация атмосферного азота - единственный экологически чистый путь
снабжения растений доступным азотом, при котором принципиально невозможно
загрязнение почв, воды и воздуха. Обусловлено это тем, что для большинства
азотфиксирующих систем характерно тесное сопряжение азотфиксации и
фотосинтеза, благодаря чему весь фиксированный азот немедленно
используется для синтеза азотсодержащих соединений в клетках растений, а затем,
после их отмирания, связывается с органическим веществом почвы, улучшая
ее качество и снижая вымывание и потерю азота в виде газов.
Неслучайно поэтому в системе находящего все более широкое признание
и распространение так называемого биологического (biological, sustainable,
alternative) земледелия признается необходимым, с одной стороны,
максимально возможное ограничение использования минеральных азотных
удобрений, а с другой - увеличение доли экологически чистого и недорогого
«биологического» азота.
Широкое распространение получает мнение, что устойчивость мирового
земледелия и рост продуктивности растениеводства невозможны без
усиления деятельности в почве бактерий-диазотрофов [Romanenko, 2004].
Прогнозируя ситуацию с продовольственной (белковой) безопасностью
современной цивилизации, можно утверждать, что роль и вклад
«биологического» азота в земледелии и растениеводстве XXI века будут неуклонно
возрастать.
Именно поэтому с середины 1970-х проблема «биологического» азота
приобрела статус приоритетной в науке, а мировое научное сообщестйо стало
активно изучать ее особенности.
Ряд достижений в этой области знаний имеет общебиологическое
значение, подтверждающее ведущую роль микробной азотфиксации в биосфере.
Еще недавно полагали, что азотфиксация присуща только узкому кругу
микроорганизмов - представителям pp. Azotobacter, Clostridium, Rhizobium и
сине-зеленым бактериям (цианобактериям) [Мишустин, Шильникова, 1968].
Как отмечалось, к настоящему времени такая способность обнаружена у
представителей большинства физиологических и таксономических групп
бактерий и архей, что позволило постулировать ее наличие у всех прокариот.
Из числа азотфиксаторов были окончательно исключены эукариоты —
грибы, водоросли, растения и животные, а азотфиксация включена в
перечень принципиальных различий, отделяющих прокариот от мира эукариот.
Новым и неожиданным стало обнаружение у многих бактерий-азотфикса-
торов способности переходить к противоположному процессу - денитрифи-
кации при наличии минеральных соединений азота (нитратов) в среде. Такая
«двойственность поведения» выявлена у представителей pp. Agrobacterium,
Alcaligenes, Aquaspirillum, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Desulfovibrio,
Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Klebsiella, Methanobacterium, Pseudo-
monas, Rhizobium, Spirillum, Thiobacillus, Vibrio, и этот перечень продолжает
расширяться [Умаров, 2001; Burris, 2003].
Важным для понимания роли азотфиксирующих бактерий в поддержании
продуктивности и устойчивости биосферы стало обнаружение разнообраз-
21
ных по составу симбиозов с эукариотными организмами, причем не только
с растениями, но и с животными.
По современным представлениям, симбиозы являются не только
способом совместного существования организмов разных видов, но и особой
формой жизни, в которых комбинация разнородных компонентов преобразуется
в интегрированную систему, имеющую собственную уникальную
морфологию, анатомию, физиологию и экологию [Головлев, 2000].
Предполагается также, что сама непрерывность существования жизни на
Земле является следствием устойчивой способности организмов
формировать симбиозы, которые являются больше нормой, чем исключением, для
различных биоценозов.
Азотфиксирующие симбиозы весьма различны по составу входящих в них
организмов, но обладают одним общим свойством - тесным сопряжением
биогеохимических циклов азота и углерода [Тихонович и др., 2004]. Такая
интеграция азотного и углеродного метаболизма наиболее характерна для
симбиозов бактерий и растений (см. табл. 1.1).
Таблица 1.1
Азотфиксирующие симбиозы растений и бактерий
Растения (семейства)
Leguminosae
Ulmaceae
Betulaceae
Casuarinaceae
Coriariaceae
Datiscaceae
1 Elaeagnaceae
Myricaceae
Rhamnaceae
1 Rosaceae
1 Azolla
| Ceratozamia
Бактерий (роды)
Rhizobium, Azorhizobium,
Bradyrhizobium, Mesorhizobium,
Sinorhizobium
Bradyrhizobium
Frankia
»
»
»
»
»
»
»
Anabaena (Nostoc)
»
Фиксация N2 1
(кг/га/сезон)
350
70
300
50
Нет данных
»
»
»
»
»
120 !
60
Важная роль в природе принадлежит синцианозам - симбиозам цианобак-
терий с протистами, животными, грибами и растениями. Являясь самыми
древними на Земле, обладая высокой структурно-функциональной
пластичностью и сочетая способность к фотоавтотрофии и диазотрофии, они
относятся к самым распространенным в биосфере [Скрипников, 2006].
Цианобактерии образуют симбиозы с представителями четырех
крупнейших филогенетических групп высших растений - бриофитами
(печеночниками и антоцеровыми), папоротниками (азолла), голосеменными
(саговниковыми) и покрытосеменными (гуннерой). При этом места локализации
цианобактерии (цианобионта) в организме растения-хозяина в разных
симбиозах могут существенно различаться. У антоцеровых цианобионт локализован
в специальных полостях на нижней стороне таллома, где существуют специ-
22
альные выросты, значительно увеличивающие поверхность взаимодействия
и обеспечивающие транспорт сахарозы от растения и связанного азота в
обратном направлении. Эффективность такой системы очень велика - наружу
выходит менее 1% фиксированного азота.
В симбиозах с саговниковыми цианобактерии локализуются в
специализированных кораллоидных корнях (кораллоидных клубеньках), где цианоби-
онт занимает особую зону. В симбиозах с покрытосеменными цианобактерии
заселяют особые железы на стебле в основании листовых черенков.
Наибольшую известность и распространение имеет синцианоз водного
папоротника Azolla с азотфиксирующей цианобактерией Anabaene (Nostoc, по
современным данным), который уже много столетий используется в
тропическом земледелии для улучшения азотного питания сельскохозяйственных
растений. Симбиозам морских цианобактерии с диатомовыми водорослями
отводят важное место в глобальной системе биологической азотфиксации.
Одним из важнейших свойств всех синцианозов является образование по-
лисахаридной слизи, которая может быть образована как
растением-хозяином, так и цианобионтом или обоими партнерами одновременно. Обильное
слизеобразование характерно и для ризопланы высших растений, заселенных
гетеротрофными бактериями-диазотрофами. Можно полагать, что слизь
препятствует диффузии кислорода и тем самым предохраняет нитрогеназу от его
ингибирующего воздействия.
Однако, несмотря на высокую эффективность азотфиксации в симбиозах,
в масштабах биосферы их вклад в общий баланс «биологического» азота
сравнительно невелик, что обусловлено ограниченностью распространения
таких сообществ - даже в агроэкосистемах доля бобовых культур не
превышает 10% общей площади посевов сельскохозяйственных культур, а в
природных фитоценозах бобовые растения присутствуют лишь на первых этапах
растительных сукцессии и их практически нет в климаксных экосистемах.
В природе азот в наибольших масштабах фиксируется в ходе
ассоциативной азотфиксации, при взаимодействии бактерий и растений, не
образующих специализированных органов (клубеньков) на корнях и стеблях [Ума-
ров, 1979; Dobereiner, 1979].
Такой тип азотфиксации наиболее широко распространен на планете и
играет ведущую роль в поддержании азотного баланса биосферы. По
имеющимся оценкам, за счет ассоциативной азотфиксации в зонах умеренного
климата в почвы ежегодно поступает не менее 30-50 кг N2/ra, а в тропической
зоне - 100 кг/га [Умаров, 1986].
В мире животных азотфиксацию впервые обнаружили у насекомых —
термитов, тараканов, тлей и саранчовых, которые питаются в основном
целлюлозой, пектином и прочими не содержащими азот углеводными соединениями.
Эти соединения расщепляются микроорганизмами-целлюлозолитиками в
желудочно-кишечном тракте животных до мономеров, а затем используются
находящимися в сообществе с ними бактериями-диазотрофами. О размерах
поступления азота в организм хозяина можно судить, например, по термитам,
доля «биологического» азота в которых достигает 60% общего содержания
азота в их телах [Tayasu, 1998].
В последнее время микробная азотфиксация выявлена и у позвоночных
животных, причем наиболее активна она у так называемых «зеленоядных»
23
млекопитающих (полевок, песчанок, бобров и пр.), использующих, главным
образом, бедные азотом зеленые части растений [Наумова и др., 2000].
Полученные результаты позволяют считать, что для мелких
млекопитающих-фитофагов бактериальная азотфиксация может иметь важное физиологическое
значение. Весьма вероятно также, что в дальнейшем будут найдены и иные
экологические ниши с высоким уровнем микробной азотфиксации. По
предварительным данным, азотфиксация активно протекает и в рубце жвачных
животных, а «биологический» азот играет заметную роль в их азотном
питании.
Данные о столь большой роли микробной азотфиксации в природе
представляются еще более поразительными при учете, что общее количество
единовременно присутствующей нитрогеназы в биосфере оценивается в
несколько килограммов [Вэнс, 2002].
Сегодня известны 4 типа бактериальных нитрогеназ, взаимодополняющих
друг друга в биосфере: «классическая» молибден-зависимая и три
«альтернативных» - ванадий-, железо- и супероксид-зависимые. Несомненно, что
такое дублирование позволяет не только бактериям-диазотрофам, но и всем
организмам избежать дефицита необходимого им связанного азота при
отсутствии молибдена в почве. Молибден - сравнительно редкий элемент в земной
коре (кларк Мо составляет -1 г/т), распределен крайне неравномерно, и его
недостаток в ряде биогеохимических провинций мог бы блокировать не
только азотфиксацию, но и другие звенья азотного цикла, поскольку
осуществляющие их ферментные системы также содержат молибден.
В природе связывание молекулярного азота может происходить и в
небиологических высокотемпературных процессах - при электрических разрядах
в атмосфере, извержениях вулканов, пожарах и пр., однако их суммарный
вклад в масштабах планеты не превышает 10% микробной азотфиксации.
Даже краткий обзор сведений по «биологическому» азоту позволяет
сделать вывод о том, что фиксация молекулярного азота - одна из главных
функций бактерий в биосфере и основной путь обеспечения ее доступным
азотом.
По значимости для живой природы фиксация и ассимиляция N2
сравнима только с другим глобальным процессом - фотосинтезом.
Особенность азота, отличающая его от других биофильных элементов
(углерода, фосфора, серы) состоит в том, что он практически не запасается в
живой клетке (как исключение, обнаруживается у некоторых цианобактерий в
виде запасного белка - цианофицина). Более того, как впервые заметил еще
Ю.Либих, чем больше азота поступает в организм с питанием, тем больше
выводится из него в виде продуктов азотного обмена.
Другая особенность азота состоит в высокой растворимости и
подвижности всех его соединений, вследствие чего в природе практически нет
азотсодержащих минералов и руд, а первичные минералы содержат только «следы»
азота.
Единственным исключением являются почвы, способные удерживать и
накапливать азот в составе органического вещества, становясь
уникальным природным резервуаром доступных форм этого элемента. Именно за
счет этой способности обеспечиваются такие важнейшие свойства почв, как
поддержание высокого биологического разнообразия и продуктивности
24
(плодородия), что уже в масштабах биосферы проявляется в ее стабильности
и устойчивом развитии.
Как отмечалось, для почв характерна замкнутость биогеохимических
циклов большинства химических элементов. Однако цикл азота в почве
разомкнут, поскольку важнейшие его звенья (нитрификация, денитрификация)
приводят к образованию газообразных соединений (N2, N20, NO и др.),
которые поступают в атмосферу и только постепенно возвращаются в почву.
Примерно 50 лет назад глобальный баланс азота, определяемый, главным
образом, по количеству нитратов (NO3) в почвах и природных водах и
содержанию закиси азота (N20) в атмосфере, был близок к нейтральному и не
вызывал никаких вопросов. С тех пор происходит постоянное увеличение
концентрации NO3 и N20> что привлекло внимание уже не только геохимиков,
но и многих других специалистов. Беспокойство вызывается прежде всего
участием азотсодержащих биогенных газов в парниковом эффекте и
глобальном изменении климата.
Как известно, усиление этого эффекта связывают, главным образом, с
увеличением концентрации в атмосфере Земли так называемых парниковых
микрогазов (С02, СН4 и N20) в результате нарушений глобальных циклов
углерода и азота [Bouwman, 1990].
Помимо участия в парниковом эффекте закись азота является основной
причиной деградации озонового экрана планеты и происходящего вследствие
этого возрастания дозы жесткого ультрафиолетового излучения Солнца на
поверхности Земли, непосредственно влияющего на биологическое
разнообразие биосферы и, соответственно, на ее устойчивость.
1.4. Химия и биогеохимия азота
Азот (N) входит в V подгруппу периодической системы элементов и
имеет во внешнем слое пять электронов, вследствие чего у него отчетливо
выражена тенденция к дополнению этого слоя до октета. Наиболее характерным
для азота валентным состояниям отвечают значности -3, 0, +3, +5. В
основном состоянии атом азота имеет структуру внешнего электронного слоя
2s22p3 и трехвалентен. Последовательные энергии ионизации азота имеют
следующие значения (эв): 14,53; 29,59; 47,43; 77,45; 97,86. Сродство атома
азота к одному электрону составляет +12 ккал/г-атом, к трем - 500 ккал/г-атом.
Точка плавления азота лежит при -210°С, точка кипения при -196°С.
В составе природных соединений на Земле азот представлен двумя
стабильными изотопами - 14N и 15N, доля которых составляет соответственно
99,635% и 0,365%. Искусственно могут быть получены радиоактивные
изотопы (12N, 13N, 16N, 17N), отличительной особенностью которых является
короткое время жизни; у самого «долгоживущего» из них (13N) период
полураспада составляет 10,8 мин, что не позволяет использовать
высокочувствительные радиоизотопные методы при изучении метаболизма азота в живой
клетке и особенностей его трансформации в природе.
Общее содержание азота в земной коре оценивается в 0,03%. Наибольшая
его часть (около 4 • 1015 т) сосредоточена в атмосфере Земли в виде свобод-
25
ного (молекулярного) азота (N2), где он составляет основную часть (79%)
воздуха. Молекулярный азот (N2) химически весьма инертен и при обычных
условиях практически не реагирует ни с металлоидами, ни с металлами.
Нагревание увеличивает его химическую активность главным образом по
отношению к металлам, с некоторыми из них он соединяется, образуя нитриды
(например, Mg3N2). В верхних слоях атмосферы Земли непрерывно
протекает фотохимическая диссоциация молекулы N2, вследствие чего выше 500 км
в небольшом количестве присутствуют ионы N+.
Молекула N2 образована тремя связями и характеризуется ядерным
расстоянием d(NN) = 1,095А, волновым числом =2331 см1, силовой константой
к = 22,4 и энергией диссоциации 226 ккал/молъ. Энергия разрыва первой из
трех связей в молекуле N2 составляет 130 ккал/молъ. Для разрыва всех трех
связей необходимо 941 кДж/моль. Растворимость N2 в воде мала - около
2 об.%.
В земной коре азот образует три основных типа минералов, содержащих
ионы CN~, NO3 и NHJ. Они редки в природе, и ограниченное промышленное
значение имеют натриевая (чилийская) селитра NaN03 и калийная
(индийская) селитра KNO3. В небольших количествах азот содержится в каменном
угле (1,0-2,5%) и нефти (0,2-1,7%).
В биосфере Земли связанный азот концентрируется в основном в составе
органического вещества почв (1,5 • 1011 т) и в биомассе прокариот
(1,3 • 1011 т), что на несколько порядков больше, чем в биомассе растений
(1 Ю9 т) и животных (6,1 • 107 т) [Орлов, Безуглова, 2000].
Биофильность (среднее содержание элемента в живых системах по
отношению к его содержанию в земной коре) азота близка к биофильности
углерода. Индекс биогенного обогащения почв азотом по отношению к земной
коре равен 1000, а растений по отношению к почве - 10 000 [Ковда, 1985].
Обобщая особенности участия микроорганизмов в биогеохимическом
цикле азота, можно выделить следующее:
• круговорот азота в природе осуществляется микроорганизмами,
главным образом прокариотами (бактериями и археями);
• высокая подвижность всех природных соединений азота и большая
скорость метаболизма являются основными причинами отсутствия заметных его
скоплений в природе (в виде минералов и агрономических руд) и в составе
запасных веществ живой клетки;
• азот, единственный из всех биофильных элементов, исходно
отсутствует в материнских горных породах и появляется в почвах в результате
деятельности бактерий-диазотрофов, завершающих формирование ее важнейшего
свойства - плодородия;
• только почвы, из-за уникальности свойств, способны накапливать и
удерживать азот в составе гумуса, вследствие чего играют роль главного
природного резервуара и источника доступных форм азота;
• в наибольших масштабах круговорот азо™ осуществляется в почвах,
поскольку (и как следствие) по суммарной биомассе, биологическому
разнообразию и продуктивности экосистемы суши почти в 1000 раз превосходят
океан;
• биогеохимический цикл азота в биосфере тесно сопряжен с
биогеохимическим циклом углерода;
26
• происходящая в настоящее время глобальная деградация почв
проявляется в нарушении биогеохимического цикла азота - сдвиге существующего
динамического равновесия между содержанием его в почве и атмосфере.
Если при азотфиксации осуществляется приход азота в биосферу, то в
ходе других процессов в его биогеохимическом цикле происходит потеря,
главным образом в виде газов. Два звена в круговороте азота (нитрификация и де-
нитрификация) ответственны за образование в качестве конечных продуктов
газообразных соединений - закиси азота (N20) и молекулярного азота (N2).
Закись азота (гемиоксид, оксид диазота, «веселящий газ») - один из
важнейших биогенных микрогазов атмосферы Земли, ответственный не только
за формирование парникового эффекта, но и за разрушение озонового
экрана планеты (при этом происходит так называемый стратосферный сток N20).
По сравнению с другими парниковыми микрогазами (С02 и СН4) закись
азота обладает значительно большей (примерно в 150 раз, чем диоксид углерода,
и в 40 раз, чем метан) экранирующей способностью, а также существенно
превосходит их по времени резиденции в атмосфере (около 130 лет), что
предопределяет важность изучения почв как ее основного источника в природе
(см. табл. 1.2).
Таблица 1.2
Некоторые свойства важнейших парниковых микрогазов
[Bouwman, 1990]
| Свойства / Газы
Экранирующий
эффект, усл. ед.
Роль биоты, %
Время резиденции
в атмосфере, лет
со2
1
30
100
сн4
39
80
10
N20
150
90
130
В настоящее время общее содержание закиси азота в атмосфере
оценивается в 1500 Тг N-N05, а концентрация повысилась до 320 ppb [Bouwman,
1990]. Ежегодный прирост концентрации составляет 0,2-0,3%, причем в
последнее время темпы этого процесса возрастают. В качестве контрольной
исходной концентрации обычно используют данные о содержании закиси азота
во вмерзших пузырьках воздуха во льдах Антарктиды и Гренландии.
Согласно этим оценкам, еще 200-300 лет назад она была на уровне 260-280 ppb,
следовательно, происходит смещение динамического равновесия в содержании
закиси азота в атмосфере в сторону ее неуклонного увеличения, причем
среднегодовое поступление закиси азота выросло почти на 50%.
Помимо образования закиси азота в биосфере, главным образом в почвах,
постоянно протекает ее поглощение (восстановление до N2), и этот плохо
изученный процесс может служить еще одним стоком для N20 (так
называемый тропосферный сток).
Хотя восстановление закиси азота может происходить при участии
четырех ферментных систем: Cu-зависимой редуктазы закиси азота (рустициани-
на), Mo-зависимой нитрогеназы, Ni-Fe-зависимой дегидрогеназы и Со-зави-
симой синтазы [Berks et al., 1995], в природе этот процесс осуществляется в
27
основном двумя группами бактерий - денитрификаторами и азотфиксатора-
ми [Umarov, 1990].
Согласно полученным в последние годы данным, между почвами разных
типов существуют значительные различия по скорости образования и
поглощения N20. Зональные почвы характеризуются сбалансированностью
процессов образования и поглощения закиси азота, а итогом является
сравнительно низкая эмиссия этого газа. Напротив, засоленные почвы, а также
почвы с нарушенной структурой (пахотные эродированные почвы) отличаются
невысокой способностью к поглощению закиси азота и потому могут
выступать в качестве активного ее «генератора». Эти данные указывают на особую
(возможно, ведущую) роль засоленных и эродированных почв в образовании
закиси азота в глобальных масштабах. Принимая во внимание, что более 35%
почв мира находится в состоянии прогрессирующего опустынивания и
засоления, подвергаются ветровой и водной эрозии, причем за последние 50 лет
скорость такой деградации возросла в 30 раз по сравнению с предыдущим
периодом [Добровольский, 2003], совершенно отчетливой представляется
огромная роль почв в изменении баланса закиси азота в атмосфере Земли (см.
табл. 1.3).
Таблица 1.3
Площадь деградированных почв в мире [Добровольский, 2003]
Причина
Водная эрозия
Ветровая эрозия
Химическая деградация
(засоление, загрязнение и пр.)
Площадь |
млрд га
1,09
0,55
0,23
% 1
55,6
27,9
12,2
До настоящего времени азотный статус большинства экосистем суши не
определен, как неизвестны и масштабы их участия в процессах
трансформации азота и в перераспределении его между сушей и атмосферой.
Литература
Вернадский В.И. Химическое строение биосферы Земли и ее окружения.
М: Наука, 1987. 339 с.
Вэнс К. // Rhizobiaceae - молекулярная биология бактерий
взаимодействующих с растениями. СПб.: 2002. С. 541-564.
Головлее ЕЛ. // Микробиология, 2000, т. 69(1), с. 5-12.
Добровольский Г.В. (ред.) Структурно-функциональная роль почв и
почвенной биоты в биосфере. М.: Наука, 2003.364 с.
Добровольский Г.В., Умаров ММ. // Природа, 2004, № 6, с. 15-23.
Жученко АЛ. Адаптивное растениеводство (эколого-генетические
основы). Кишинев: Штиинца, 1996. 423 с.
Заварзин ГЛ. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука,
2003. 348 с.
28
Звягинцев Д.Г. // Структурно-функциональная роль почв и почвенной би-
оты в биосфере. М.: Наука, 2003. С. 102-114.
Каравайко Г.И. // Экология микроорганизмов. М.: Academia, 2004.
С. 119-220.
Ковда В А. Биогеохимия почвенного покрова. М.: Наука, 1985. 263 с.
Кретович В.Л. Биохимия усвоения азота воздуха растениями. М.: Наука,
1995.137 с.
Львов Н.П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов.
М.: Наука, 1989. 135 с.
Мишустин Е.Н., Шилъникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного
азота. М.: Наука, 1968. 368 с.
Наумова ЕМ., Ушакова НА., Мещерский И.Г., Костина Н.В., Умаров М.М. //
Изв. АН. Сер. биол., 2000, № 3, с. 329-331.
Орлов Д.С., Безуглова О.С. Биогеохимия. М.: Феникс, 2000. 320 с.
Скрипников А.Ю. Биология развития клеток растений в культуре. Авто-
реф. дисс. д-ра биол. наук. МГУ, 2006.
Тихонович И А., Борисов А.Ю. и др. // Докл. РАСХН, 2004, № 3, с. 58-62.
Умаров М.М. // Известия АН СССР. Сер. биол., 1979, № 6, с. 42-47.
Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во МГУ, 1986. 136 с.
Умаров М.М. // Перспективы развития почвенной биологии. М.: МАКС
Пресс, 2001. С. 47-52.
Умаров М.М. // Структурно-функциональная роль почв и почвенной био-
ты в биосфере. М.: Наука, 2003. С. 125-138.
Шумный В.К. (ред.) Биологическая фиксация азота. Н.: Наука, 1991.145 с.
Berks B.C., Fergusson S. J., Morr J.W. // Biochim. Biophys. Acta,Л995,
vol. 1232(3), p. 97-173.
Bouwman A.F. (Ed.) Soils and the Greenhouse Effect. J.Wiley & Sons, 1990.
501 p.
Bums R.Y. //J. Biol. Chem., 2003. P. 24-29.
DobereinerJ. // Isotop. Biol. Dinitrogen Fixat. Proc. Vienna, 1979. P. 51-69.
Newton W.E. // Proc. 12 Int. Cong. Nitrogen Fix. Kluwer, Dordrecht, 1999.
P. 3-10.
Romanenko GA. // Biol. Plant-Microbe Interact. St.-Petersburg, 2004.
P. 19-23.
Tayasu I. // Ecol. Res., 1998, № 13, p. 23-28.
Umarov M.M. // Soils and the Greenhouse Effect. J.Wiley & Sons, 1990.
P. 141-150.
29
Глава 2. АЗОТФИКСАЦИЯ В ПОЧВАХ
2.1. Введение
Азотфиксация - процесс восстановления молекулярного азота (N2) до
аммиака ферментным комплексом нитрогеназа в клетках азотфиксирующих
(диазотрофных) бактерий. Образовавшийся аммиак немедленно
ассимилируется, превращаясь в аминокислоты, а затем в белки или другие
азотсодержащие соединения клетки.
За счет микробной азотфиксации был создан и ныне поддерживается
азотный статус всех природных экосистем и биосферы в целом. Как отмечалось,
современная цивилизация, несмотря на большие успехи в производстве
минеральных азотных удобрений, потребности в азоте более чем на 2/3
продолжает покрывать за счет «биологического» азота. Расширение масштабов
использования «биологического» азота позволит снизить энергетические
затраты в земледелии и уменьшить техногенные нагрузки на природную среду.
Большинство знаний по особенностям азотфиксации получены в
последние два десятилетия, когда во многих странах начались широкомасштабные
исследования этого уникального природного феномена.
Неослабевающий интерес мировой науки к феномену азотфиксации
иллюстрируется, например, на проходящих каждые два года международных
конгрессах и ежегодных симпозиумах по азотфиксации, и список стран-
участниц постоянно растет. Кроме того, проблема «биологического» азота
является непременной частью программ международных конгрессов
почвоведов, микробиологов, физиологов растений, агрохимиков, что подчеркивает ее
междисциплинарный характер.
2.2. Азотфиксирующие системы прокариот
У всех азотфиксирующих бактерий восстановление N2 до NH3
катализируется ферментным комплексом нитрогеназа. Согласно современным
представлениям, процесс азотфиксации описывается следующим уравнением:
N2 + 8Н+ + 8ё + 16MgATO -> 2NH3 + H2 + 16Л^АДФ + 16Фнеорг.
Соответственно, восстановление одной молекулы азота сопровождается
выделением одной молекулы водорода, а для переноса одного электрона
необходим гидролиз двух молекул MgATO.
30
Среди известных в настоящее время четырех нитрогеназ наиболее
подробно изучены строение и свойства молибдензависимой нитрогеназы (Мо-нит-
рогеназа, нитрогеназа 1).
Мо-нитрогеназа представляет собой комплекс, состоящий из двух
ферментов: динитрогеназы и редуктазы динитрогеназы. Нередко для
обозначения этих ферментов используют и другие названия: MoFe-белок и Fe-белок,
или компонент 1 и компонент 2 нитрогеназы, а также аббревиатуры бактерии,
из которой выделен белок, и номер компонента: например, Rrl и Rr2 -
соответственно ферменты из фототрофной бактерии Rhodospirillum rubrum.
Белковая структура Мо-нитрогеназы в высокой степени консервативна, и
такие нитрогеназы, выделенные из различных бактерий, во многом сходны,
что подтверждается возможностью получения активной «гибридной»
нитрогеназы (например, MoFe-белок выделен из клеток Azotobacter chroococcum,
Fe-белок - из клубеньков гороха) [Кретович, 1995].
Динитрогеназа (MoFe-белок, компонент 1) имеет тетрамерную
структуру и молекулярную массу около 220-230 кДа. Каждый тетрамер MoFe-белка
содержит четыре металлокластера: два Р-кластера (FegS7) и два MoFe7Sg-ro-
моцитратных кластера (FeMo-co).
Р-кластеры являются интермедиатами при переносе электрона от Fe-бел-
ка к FeMo-co. Именно в FeMo-co происходит связывание и восстановление
основного физиологического субстрата нитрогеназы, молекулы N2.
Редуктаза динитрогеназы (Fe-белок, компонент 2) представляет собой
гомодимер с массой около 60 кДа и содержит железо в составе единичного
кластера Fe4S4. Обе субъединицы Fe-белка соединены между собой Fe4S4-
кластером и имеют места для связывания одной молекулы MgATO/MgAAO.
К настоящему времени известны две функции компонента 2 (Fe-бёлка)
Мо-нитрогеназы:
• Fe-белок необходим для биосинтеза FeMo-co и его встраивания в MoFe-
белок;
• редуктаза динитрогеназы функционирует как уникальный донор
электронов для динитрогеназы, при этом Ре454-кластер является активным
центром, который находится в восстановленном (1+) или окисленном (2+)
состоянии; она восстанавливается различными донорами электронов с низким
потенциалом, а затем электроны переносятся на динитрогеназу и этот процесс
продолжается до тех пор, пока количество электронов на динитрогеназе не
станет достаточным для протекания реакции восстановления N2 до NH3.
Помимо молекулярного азота, субстратами Мо-нитрогеназы могут быть
другие молекулы с тройными и двойными связями (ацетилен, N20, цианид-
ион, азид, циклопропен и др.)> а также протоны. Кроме того, нитрогеназа
может восстанавливать С02 до СО и карбонилсульфид до СО и H2S.
Благодаря простоте и высокой чувствительности реакция восстановления
ацетилена послужила основой для получившего широкое распространение
газохроматографического метода определения нитрогеназной активности у
микроорганизмов, а также в почве, ризосфере и филлосфере растений [Ума-
ров, 1976].
Одно из основных свойств реакции восстановления N2 - ее
исключительно высокая энергоемкость, что обусловлено необходимостью разрыва
прочной тройной связи в молекуле азота. Это хорошо известно для химического
31
синтеза аммиака, аналогичная ситуация и в клетках диазотрофов,
вынужденных использовать энергию гидролиза не менее 2 молекул АТФ при
переносе каждого электрона на динитрогеназу. Кроме того, энергоемкость
реакции биологической азотфиксации возрастает вследствие того, что при
восстановлении каждой молекулы азота еще два протона расходуются на
образование молекулы Н2, который бесполезно теряется клеткой диазотрофной
бактерии.
Другая ключевая особенность Mo-зависимой нитрогеназы - ее
чувствительность к кислороду, обусловленная в основном свойствами компонента 2.
Поэтому азотфиксация в основном протекает в анаэробных или
микроаэробных условиях, а аэробные азотфиксаторы используют разнообразные
способы защиты нитрогеназы от кислорода. В их числе и пространственное ее
отделение от источников 02 (гетероцисты у нитчатых цианобактерий),
внутриклеточная компартментализация и образование крупных капсул
(азотобактер), синтез леггемоглобина (ризобии, франкии) и пр.
В последнее время установлено, что динитрогеназа (MoFe-белок)
обладает двумя местами (сайтами) связывания субстрата: высокоспецифичным
сайтом связывания ацетилена, с которым также может связываться и СО
(ингибитор восстановления всех субстратов нитрогеназы, исключая протоны), но
не могут связываться азот, азид и N20, и низкоспецифичным местом
связывания ацетилена, с которым также могут связываться СО, N2, азид и N20. Как
предполагается, оба сайта связывания находятся довольно близко на
специфической грани Fe4S4-ioiacTepa FeMo-co.
Первичными физиологическими донорами электронов для нитрогеназы
являются ферредоксин и флаводоксин - низкомолекулярные (-20 кДа)
растворимые белки. Ферредоксин содержит два Fe4S4-ioiacTepa (так называемый
'ферредоксин бактериального типа, или Fdl).
Флаводоксин содержит флавинмононуклеотид (ФМН). Окислительно-
восстановительный потенциал этих белков около -400 мВ.
Общую схему стадий катализа Мо-нитрогеназы можно представить
следующим образом (рис. 2.1):
2 MgATO X 8
2 (МрАДФ+Фн) * 8
Рис. 2.1. Схема реакции восстановления молекулярного азота,
катализируемой Mo-зависимой нитрогеназой
32
Восстановленный ферредоксин или флаводоксин переносит электрон к
Ре484~кластеру редуктазы динитрогеназы, вследствие чего Fe-белок
(компонент 2) восстанавливается. После связывания молекул MgATO с
восстановленным Fe-белком окислительно-восстановительный потенциал пары
Fe4S42+/i+ изменяется с -300 до -450 мВ (относительно стандартного
водородного электрода). При этом Fe-белок претерпевает конформационные
изменения, которые способствуют образованию комплекса с MoFe-белком.
В комплексе Fe- и MoFe-белков окислительно-восстановительный
потенциал Fe4S4-icnacTepa Fe-белка изменяется на дополнительные -200 мВ, что
создает энергетически выгодные условия для переноса одного электрона от Fe-
белка к MoFe-белку. Одновременно с гидролизом молекул MgATO, которые
связаны с Fe-белком, происходит перенос электрона; при этом обе
субъединицы должны функционировать равноправно при гидролизе молекул
MgATO для успешного восстановления субстрата. За этими сопряженными
процессами следует самая медленная стадия всего каталитического цикла -
диссоциация комплекса нитрогеназы. Как предполагают, электроны
накапливаются в Р-кластере до переноса необходимого их количества на FeMo-co.
В момент восстановления Fe-белка низкопотенциальным донором
электронов происходит обмен MgAДO на MgATO. Цикл повторяется до тех пор,
пока связанный с FeMo-co субстрат полностью не восстановится.
Mo-зависимая нитрогеназа является одним из наиболее медленно
работающих ферментов с необыкновенно малым числом оборотов (один оборот
за 1,5 с при 23°С), и именно поэтому клетки активных азотфиксаторов
вынуждены синтезировать много молекул нитрогеназы - до 20% общего
содержания белков в клетке [Львов, 1989].
Помимо Mo-содержащей нитрогеназы (нитрогеназы 1) у многих азотфик-
сирующих бактерий обнаружены другие типы нитрогеназ, получившие
название альтернативных.
К настоящему времени известны три альтернативные нитрогеназы:
ванадий (У)-содержащая (нитрогеназа 2), железо (Ре)-содержащая
(нитрогеназа 3) и супероксидзависимая (СОЗ, нитрогеназа 4).
Как отмечалось выше, такие нитрогеназы синтезируются в условиях
дефицита молибдена в среде (нитрогеназа 2) или молибдена и ванадия
(нитрогеназа 3).
Пока мало данных о строении и свойствах альтернативных нитрогеназ.
Недавно появилось первое сообщение о Mn-содержащем белке, выделенном
из мутанта A. vinelandii UW3 и, как предполагают, являющемся динитрогена-
зой [Huang et al., 2001]. Наличие обеих альтернативных нитрогеназ выявлено
у A. vinelandii, а для A chroococcum показана способность к синтезу лишь V-
содержащей нитрогеназы.
Альтернативные нитрогеназы 2 и 3, подобно нитрогеназе 1, также состоят
из двух ферментов: динитрогеназы и редуктазы, причем редуктаза
альтернативной динитрогеназы по свойствам в высокой степени схожа с редуктазой
Mo-содержащего комплекса.
Однако имеются и существенные отличия в строении и свойствах этих
нитрогеназ от Mo-зависимой нитрогеназы:
• альтернативные динитрогеназы 2 и 3 - это гексамеры (а не тетрамеры),
субъединицы которых участвуют в стабилизации четвертичной структуры
33
белка альтернативной динитрогеназы; для диазотрофного роста A vinelandii
наличие субъединиц необходимо, но для восстановления ацетилена
альтернативными нитрогеназами эти субъединицы не требуются;
• FeV-co и FeFe-co являются активными центрами связывания и
восстановления субстратов у альтернативных нитрогеназ; Р-кластеры (FesSg.)
служат для транспорта электронов от Fe-белка к активному центру;
• уникальным свойством альтернативных нитрогеназ 2 и 3 является их
способность восстанавливать ацетилен не только до этилена (С2Н4), но и до
этана (С2Н6) - не более 10% от количества образующегося этилена, что
используется в качестве теста на присутствие этих нитрогеназ.
В конце 1990-х гг. обнаружена еще одна (четвертая) нитрогеназа,
выделенная из аэробной, термофильной (Топт. 65°С) бактерии (актиномицета)
Streptomyces thermoautotrophicus [Ribbe et al., 1997]. Бактерия обладала
способностью расти в атмосфере СО или смеси С02+Н2. Несмотря на то что у
других диазотрофов СО и Н2 ингибируют азотфиксирующую активность, эта
бактерия активно фиксировала азот в присутствии этих газов. Ацетилен она
восстанавливает, но очень слабо - не более 0,001% ацетиленредуцирующей
активности Az. chroococcum, следовательно, метод ацетиленредукции для
обнаружения новой нитрогеназы неприменим. Поскольку в процессе азотфик-
сации участвует фермент супероксиддисмутаза (СОД), новая нитрогеназа
получила название супероксидзависимой (СОЗ-нитрогеназы).
СОЗ-нитрогеназа представляет собой во многом необычную
^-фиксирующую систему. Она состоит не из двух, а из трех компонентов:
динитрогеназы (компонент 1), Mn-содержащей супероксидредуктазы (компонент 2) и
Mo-содержащей СО-дегидрогеназы (компонент 3) (см. рис. 2.2).
(СО-дегид-
рогеназа)
(Мо)
(Супероксид- (Динитро- NHj
редуктаза) геназа)
(Mil) (Mo)
Рис. 2.2. Схема реакции восстановления азота, катализируемой
альтернативной супероксидзависимой (СОЗ) нитрогеназой
Другое отличие ее от рассмотренных ранее нитрогеназ состоит в том,
что если они чрезвычайно чувствительны к присутствию 02, то
СОЗ-нитрогеназа не только стабильна, но, более того, использует 02 для образования
NH3.
Еще более необычным свойством новой нитрогеназы является ее низкое
энергопотребление (4-12 М ATP/моль азота) по сравнению с Мо-зависимой
нитрогеназой (14-28 М АТР). Гибридизация с ДНК из Frankia alnus и
Klebsiella pneumoniae не происходит, а Mn-супероксидредуктаза (компонент
2) очень похожа на супероксиддисмутазу бактерий p. Bacillus.
34
Схематически реакция фиксации атмосферного азота СОЗ-нитрогеназой
выглядит следующим образом:
N2 + 8Н+ + 8ё + (4-12)MgATP -» 2NH3 + H2 + (4-12)MgADP +
+ (4-12)Фнеорг.
Таким образом, к особенностям новой нитрогеназы можно отнести
следующее:
• потребность в О2;
• необходимость в минимуме всего в 4 MgATP для восстановления N2;
• повышенная активность в присутствии СО и Н2.
Считается, что устойчивость СОЗ-нитрогеназы к 02 делает ее идеальным
кандидатом для введения в растения.
Важное экологическое значение «альтернативных» нитрогеназ и, в
частности, их присутствие в почвах разных типов может подтверждаться тем, что
почвы в целом характеризуются более высоким содержанием ванадия по
сравнению с молибденом [Ковда, 1985].
Экспериментально ванадиевая альтернативная нитрогеназа (нитрогеназа
2) обнаружена в образцах следующих почв: серой лесной, черноземе
обыкновенном, черноземе типичном, черноземе южном, лугово-черноземной, темно-
каштановой и коричневой [Киликовский, Умаров, 1993]. О ее наличии
судили по образованию этана (С2Н6) при инкубации образцов в атмосфере
ацетилена. Параллельно определяли активность нитрогеназы 1 по образованию
этилена (С2Н4) в тех же условиях (см. табл. 2.1).
Примечательно, что V-зависимая нитрогеназа присутствовала во всех
изученных почвах при наличии Mo-зависимой нитрогеназы. Максимальная
активность образования этана (С2Н6) обнаружена в черноземе типичном и
черноземе южном, а минимальная - в серой лесной и коричневой почвах.
Таблица 2.1
Активность V- и Mo-зависимых нитрогеназ в почвах (нМ/г/сут)
Почва
Темно-каштановая
Серая лесная
Чернозем типичный
Чернозем обыкновенный
Чернозем южный
Лугово-черноземная
Коричневая
с2н6
0,09
0,06
0,24
0,11
0,37
0,15
0,07
с,н4
0,72
0,47
0,42
0,72
0,55
0.69
0,62
С2Нб/С2Н4, %
0,013
0,010
0,058
0.014
0,069
0,021
0,011
Сравнение показателей образования этилена (суммарная активность
Мо и V-зависимых нитрогеназ) и образования этана (активность V-зависи-
мой нитрогеназы) приводит к заключению, что эти величины в почвах
разных типов не совпадают. Поскольку скорость образования этилена V-
зависимой нитрогеназой примерно на порядок ниже, чем Mo-зависимой, можно
считать, что образование этилена связано, главным образом, с активностью
Mo-зависимой нитрогеназы. Наиболее высокой ее активностью отличались
чернозем типичный, чернозем обыкновенный и темно-каштановая почва, а
наименьшей - серая лесная почва.
35
Наличие альтернативных нитрогеназ позволяет бактериям-диазотро
фам осуществлять азотфиксацию при недостатке молибдена и
поддерживать баланс азота в почвах, дефицитных по этому микроэлементу.
2.3. Генетический контроль азотфиксации
Для синтеза, функционирования и регуляции нитрогеназ бактерии имеют
множество генов. Основная часть этих генов находится в nif- и яя/-областях
генома. Кроме того, в регуляции нитрогеназы участвует ряд генов, не
включенных в эти кластеры, например draTG и hvrA [Зинченко, 1999].
Первоначально схема генетического контроля регуляции азотного
метаболизма была разработана для азотфиксирующей бактерии К. pneumoniae. По
мере изучения особенностей процесса азотфиксации стало ясно, что у разных
бактерий подобная регуляция осуществляется по собственному сценарию,
хотя имеется и много общего.
В табл. 2.2 перечислены гены и кодируемые ими белки бактерий,
контролирующие процесс азотфиксации [Зинченко, 1999].
Таблица 2.2
Гены и кодируемые ими белки, контролирующие азотфиксацию
Ген
NifH
NifD
Nif К
\NifQ
nifB1
nifB2
NifE
NifN
NifX
NifV
NifW
nifU1
nifU2
NifY
NifS
rnfABCDGEH
FdxN
FcbcC
FprA
FdxB
FdxD
FdxA
Продукт гена и его функция
NifH-субъединица редуктазы динитрогеназы I
NifD-субъединица динитрогеназы
NifK-субъединица динитрогеназы I
Участие во встраивании молибдена в FeMo-co I
Участие в биосинтезе FeMo-co (в частности, I
Fe-S-кластера, NifB-co) I
Апобелки, гомологичные NifD и NifK-каркас для I
биосинтеза FeMo-co
Участие в биосинтезе FeMo-co I
NifV/гомоцитратсинтаза |
Участие во встраивании гомоцитрата в MoFe-белок
Усеченные гены nifU. Участие в сборке MoFe-белка |
Участие в сборке MoFe-белка |
» I
Мембранно-связанные белки, участвующие в переносе I
электронов к нитрогеназе
FdxN/FdI/2 [ Fe4S4] -ферредоксин
In vivo донор электронов для Fe-белка
FdxC/FdIV/[Fe2S2]-фeppeдoкcин; возможно, in vivo
донор ё для FprA
FprA/флавопротеин
FdxB/FdIII/2[Fe4S4l-фeppeдoкcин
FdxD/[Fe2S2]^ep]
FdxA/FdII/[Fe3S4]
редоксин
[Fe4S4]-ферредоксин
36
FdxE
NifF
Mod
: ABCD
1 mopA
mopB
GlnD
GlnB
GlnA
GlnK
amtB
NifR1
NifR2
NifR3
nifA1
I nifA2
nifR4
(rpoN)
vnf
HDGK
I onf
HDGK
AnfA
Anf123
draT
draG
hvrA
FdxE/[Fe2S2]-(i)eppwc)KCHH I
NifF/флаводоксин. In vivo донор электронов для Fe-белка |
Белки высокоаффинной транспортной системы молибдена
ModA - периплазматический связывающий субстрат
белок; ModB - интегральный мембранный белок;
ModC - АТФ-связывающий белок
Молибдоптеринсвязывающие белки
GlnD/уридилилтрансфераза
(Utase-UR). Модификация (фосфорилирование) GlnB
GlnB/PII/NifR5. Регуляторный белок - негативный I
регулятор транскрипции nif-генов у Rba. Capsulatus
Глутаминсинтетаза (ГС). Ассимиляция аммония |
GlnB-подобный белок
Мембранно-связанный белок-переносчик аммония
высокоаффинной транспортной системы
NtrC-подобный белок-регулятор ответа, активатор
транскрипции glnBA
NtrB-подобный белок, гистидинпротеинкиназа
Белок с неизвестной функцией; экспрессия его зависит
от азотного статуса клетки и от NifR3
Активаторный белок для активации транскрипции
nif-генов НГ совместно с NifR4
Альтернативный сигма-фактор РНК-полимеразы
Белки нитрогеназы 2; субъединица VFe-белка
Белки нитрогеназы 3; субъединица FeFe-белка
Транскрипционный активатор, специфичный для
нитрогеназы 3 |
Anfl-З. Белки, необходимые для диазотрофного роста за
счет нитрогеназы 3; возможно, участвуют в сборке FeFe-co
DraT/АТФ-рибозилтрансфераза; инактивация Fe-белка
DraG/активирующая гликогидролаза редуктазы
динитрогеназы; активация Fe-белка
Гистоноподобный ДНК-связывающий регуляторный
белок; возможно косвенное участие в регуляции
активности NifA
Несмотря на большое количество генов, участие которых в биосинтезе,
функционировании и регуляции нитрогеназной системы установлено
однозначно, приведенный список оценивается как далеко не полный.
Например, почти ничего не известно о генах бактерий с альтернативными нитроге-
назами, контролирующих транспорт ванадия, сборку FeV-co и компонентов
СОЗ-нитрогеназы.
Нитрогеназная система включает ряд ферментов и переносчиков
электронов (Fe- и MoFe-белки; ферредоксины, флаводоксины; DraT, DraG и пр.),
37
участвующих в процессе ассимиляции атмосферного азота, который связан с
большими затратами энергии и восстановителей. Поэтому азотфиксирующие
бактерии выработали эффективные регуляторные механизмы,
обеспечивающие экспрессию генов азотфиксации и функционирование необходимых
ферментов лишь в условиях, необходимых для диазотрофного роста. Эти
механизмы препятствуют неоправданным затратам энергии на синтез и
функционирование Nif-белков при наличии в среде доступного азота. В
присутствии в среде нитрата клетки синтезируют нитратредуктазу, Мо-зависимый
фермент, который конкурирует за молибден с нитрогеназой, подавляя тем
самым ее биосинтез [Львов, 1989]. Вследствие этого при недостатке молибдена
биосинтез Mo-зависимой нитрогеназы репрессируется и активируются
vnf/anf-гены, необходимые для биосинтеза альтернативных нитрогеназ.
Далее, поскольку многие компоненты молибден-зависимой нитрогеназы
чрезвычайно чувствительны к кислороду и синтез и активность нитрогеназы
подавляет кислород, это также регулируется соответствующими генами.
Генетическая регуляция экспрессии ш/-генов наиболее полно изучена у
пурпурной бактерии Rba. capsulatus (см. рис. 2.3; [Зинченко, 1999]).
Экспрессия ш/-генов зависит от азотного статуса клетки, который определяется
соотношением внутриклеточных концентраций глутамин: 2-оксоглутарат. При
недостатке аммония соотношение глутамин: 2-оксоглутарат снижается, и это
сказывается на активности фермента уридилилтрансферазы (белка GlnD). В
этих условиях уридилилтрансфераза модифицирует белок РП, продукт гена
glnBy путем присоединения УМФ. В этом случае РП-УМФ является
неактивным и не взаимодействует с №П12-6елком. В таких условиях NifR2
функционирует как протеинкиназа, фосфорилируя белок NifRl. В условиях избытка
связанного азота №П12-6елок функционирует как фосфатаза, дефосфорили-
руя NifRl. NifRl-Ф является активной формой, которая запускает
транскрипцию двух копий гена nifA (если в среде присутствует молибден).
Каждая копия экспрессируется по-разному в зависимости от содержания
аммония. Белок NifA, совместно с NifR4-6eлкoм, инициирует транскрипцию
остальных nif-генов, в том числе структурных генов нитрогеназы 1, nifHDK.
В случае отсутствия молибдена в среде при участии nifRl-Ф происходят
экспрессия гена ап/А и трансляция оперона mopA-modABCD. После этого
белок AnfA совместно с белком RnfR4 инициирует транскрипцию генов,
необходимых для синтеза нитрогеназы 3.
Азотфиксирующие микроорганизмы способны быстро «выключать»
нитрогеназную активность в ответ на появление в среде аммония.
Установлено существование двух типов ответов нитрогеназной активности на
добавление аммония в зависимости от фазы роста культур диазотрофных
бактерий:
• быстрое и обратимое ингибирование ацетиленредукции, так
называемый эффект «выключения» нитрогеназы (switch off); такой ответ
наблюдается у молодых культур с низкой плотностью, причем длительность ингибиро-
вания прямо пропорциональна количеству добавленного аммония; этот тип
эффекта принято называть типичным;
• снижение скорости восстановления ацетилена (magnitude effect);
эффект наблюдается у выросших при высокой концентрации аммония культур
с высокой плотностью; такие клетки растут при глубоком лимитировании не
38
только по азоту, но и по углероду; при этом ингибирование необратимо
(1-2 ч), а степень ингибирования прямо пропорциональна концентрации
экзогенного аммония.
Механизм эффекта выключения нитрогеназы аммонием до конца не
выяснен. Предполагают, что выключение является результатом модификации
нитрогеназы путем связывания АДФ-рибозила с аргининовым остатком
(ArglOl) Fe-белка.
glnB
nirB nirC
-Ж4
+ УТФ
NirC
GlnB- УМФ] + <ZiNirB^>\+AT0
неактивный белок
NirC-Ф
f nifAl, nh
активный белок
HvrA
©
+NH4 t
ni£A2
anfA » mop. mod f
© — О -Mo
© I © +Mo
I 1 Mnn I—I
Mop
NifA
AnfA
♦ nif- гены
©
I
anf-гены!
©
I
Мо-НГ
0+NH4
Fe-НГ
DraT, DraG
G>+NH4
Рис. 2.З. Схема регуляции транскрипции nif-генов и регуляции активности
нитрогеназы у Rba. capsulatus [Зинченко, 1999]
(«+» и «-» указывают соответственно на позитивную и негативную
регуляцию транскрипции генов или активацию/инактивацию белков)
Когда в среде появляется аммоний, при участии Н АД-зависимого
фермента АДФ-рибозилилтрансферазы (DraT), кодируемого геном draTt происходит
39
образование N-гликозидной связи между ArglOl и рибозой молекулы НАД
на одной из субъединиц Fe-белка. При этом Fe-белок становится
неактивным, то есть неспособным к ассоциации с MoFe-белком.
Несмотря на то что модифицированный белок не способен гидролизовать
MgATO, он все еще может связывать MgATO и подвергаться конформацион-
ным изменениям, дающим доступ Fe4S4-KJiacTepa к конститутивному
партнеру. По мере исчерпания экзогенного аммония при участии фермента
активирующей гликогидролазы редуктазы динитрогеназы (DraG), кодируемого
геном draGy происходит удаление АДФ-рибозильной группы с Fe-белка, что
приводит к восстановлению его активности без изменения свойств ArglOl.
Субстратом действия DraG может служить лишь восстановленная форма ри-
бозилированного Fe-белка, который связан с MgATO. Пока что точно
механизм взаимодействия DraT и DraG с Fe-белком не выяснен, но полагают, что
каждый белок воздействует на ту же поверхность Fe-белка, со стороны
которой связывается MoFe-белок. В то же время накапливаются свидетельства,
что АДФ-рибозилирование Fe-белка может не являться причиной
выключения нитрогеназы аммонием. У ряда бактерий - A. vinelandii, Rhizobium strain
ORS571, Methylosinns trichosporium, Rba. sphaeroides и Anabaena variabilis - не
обнаружено белков, обладающих одинаковой электрофоретической
подвижностью. Кроме того, мутант Az. brasilense, у которого ArglOl Fe-белка замещен
другой аминокислотой и DraT не способен катализировать присоединение
АДФ-рибозы к Fe-белку, проявлял эффект выключения нитрогеназы в ответ
на добавленный аммоний. Показано также, что АДФ-рибозилированный Fe-
белок присутствует не только в условиях резкого изменения окружающей
среды (экзогенный аммоний), но и в обычных условиях азотфиксации. При
этом соотношение модифицированной и свободной форм Fe-белка зависело
от азотного статуса клетки (внутриклеточное содержание глутамина).
Наряду с АДФ-рибозилированием описан также и другой тип ковалент-
ной модификации, связанный с пальмитированием Fe-белка [Gallon et al.,
2000]. Он обнаружен у одноклеточной цианобактерии Gloeothece sp.
АТСС27152, однако функциональное значение такой модификации остается
неизвестным.
Существуют и другие предположения о возможных механизмах,
приводящих к эффекту выключения нитрогеназы аммонием.
Было постулировано, что снижение нитрогеназной активности в
присутствии аммония связано с уменьшением мембранного потенциала клетки, что
приводит к снижению соотношения АТФ/АДФ и, как следствие, замедлению
скорости реакции, катализируемой нитрогеназной системой.
Полагают также, что регуляция нитрогеназной активности аммонием
может быть связана с изменением уровня восстановленности пиридиннуклео-
тидов. На это указывает окисление внутриклеточного пула восстановленных
пиридиннуклеотидов при добавлении аммония, а также ингибирование
нитрогеназной активности клеток экзогенным НАД с параллельной ковалентной
модификацией Fe-белка. На основании этого высказано предположение, что
изменение концентрации НАД инициирует эффект выключения
нитрогеназной активности аммонием.
Таким образом, в основе посттрансляционной регуляции нитрогеназы
аммонием могут лежать разные механизмы, а общепринятое предположение,
40
что АДФ-рибозилирование Fe-белка нитрогеназы является причиной
эффекта выключения нитрогеназы аммонием, пока не имеет достаточных
оснований.
2.4. Роль азотфиксации в современном земледелии
Население Земли растет в соответствии с экспоненциальным законом и к
2035 году, по прогнозам, достигнет 10 млрд человек, то есть почти удвоится
по сравнению с численностью в конце XX века. При этом 90% людей будут
жить в развивающихся странах Азии, Африки и Южной Америки, где
основным источником (около 80%) энергии и белка для их питания являются
растения, и эта тенденция сохранится. Если в 1910 году человечество
потребляло примерно 10% углерода, фиксируемого в процессе фотосинтеза, то в
настоящее время потребляется 40% этого углерода, а в 2030 году будет 80%. При
нынешней численности населения Земли (около 6,2 млрд) на 1 человека в
среднем приходится в день 70 г белка и 2400 ккал энергии. В зависимости от
страны количество потребляемого белка варьирует в пределах 38-125 г, или
1800-3500 ккал/день, причем наименьшие значения характерны для
развивающихся стран.
Ожидаемое удвоение населения Земли еще более усилит неравенство в
условиях питания, особенно по белковым продуктам. Для того чтобы избежать
этого, в ближайшие 40 лет необходимо добиться беспрецедентного (не
менее чем в 2 раза) увеличения урожайности большинства
сельскохозяйственных растений. Причем это должно сделать в условиях значительного
истощения многих первичных земельных угодий, что потребует вовлечения в
сельскохозяйственную деятельность больших территорий, многие из
которых не являются благоприятными для земледелия.
Особая сложность проблемы состоит в том, что уже в настоящее время
высокая стоимость азотных удобрений значительно ограничивает возможность
повсеместного использования минерального азота в земледелии. Рост и
развитие большинства современных (интенсивных) сортов
сельскохозяйственных растений и формирование ими высоких урожаев невозможны без
применения азотных удобрений как источника азота для белковых соединений. Как
отмечалось, высокая энергоемкость не только синтеза, но и применения
минеральных азотных удобрений (необходимость многократного внесения
небольшими дозами, особые условия перевозки и хранения) вынуждает
развитые страны тратить на эти цели более трети всей энергии, расходуемой в
сельском хозяйстве.
Величайший парадокс жизни состоит в том, что все без исключения
организмы на Земле, постоянно нуждаясь в доступных соединениях азота и не
имея способов его резервирования, находятся в «океане» молекулярного
азота, который не просто окружает, но и буквально пропитывает их. Только бак-
терии-азотфиксаторы способны обеспечивать не только себя, но и всю
биосферу «биологическим» азотом в виде разнообразных соединений (аммоний,
белки, аминокислоты, аминосахара и пр.), а единственный способ запасания
его впрок - превращение в специфическое органическое вещество почвы -
41
гумус. Неслучайно по значимости для живой природы азотфиксацию
принято сравнивать с другим глобальным процессом - фотосинтезом.
Азотфиксация являлась основным источником доступного для всех
живых существ азота в биосфере во все периоды ее развития, несмотря на то что
на долю «биологического» азота приходится лишь ничтожная часть (около
0,0007%) общих его запасов на Земле.
Выше отмечалось, что применение высоких норм минеральных азотных
удобрений (до 200-300 кг/га) приводит к нарушению биогеохимического
цикла азота. Происходит массированное выделение в атмосферу закиси
азота (N20) и поступление нитратов в фунтовые воды, причем не только за счет
азотных удобрений, но, главным образом, из органического вещества почв,
подвергающегося ускоренной дегумификации. Как следствие, отмечается
истощение невоспроизводимых природных ресурсов и общий дисбаланс
глобального азотного цикла.
Десятикратный рост применения минеральных азотных удобрений и
внедрение интенсивных сортов растений, способных использовать
высокие дозы азота, обеспечили в 1950-1960-х успех зеленой революции в
мировом растениеводстве, но не решили полностью проблему дефицита
продовольствия в мире.
Азот минеральных удобрений (технический азот) по сравнению с
«биологическим» более доступен растениям. Однако он практически не обладает
последействием, так как быстро вымывается и улетучивается из почвы, а
избыток минерального азота ведет к накоплению в растениях нитратов.
Затраты на производство и применение равного количества «биологического»
азота в 20-30 раз меньше «технического», а тонна белка, полученного за
счет азотфиксации, в 9-10 раз дешевле белка, накопленного за счет
минерального азота [Ньютон, 2002]. Поэтому использование экологически
чистых и дешевых источников «биологического» азота в большинстве случае
оправдано не только экологически, но и экономически.
Именно поэтому при разработке систем устойчивого земледелия одним из
основных требований является ограничение использования минеральных
азотных удобрений и всемерное увеличение поступления экологически
чистого и недорогого «биологического» азота. Существенно важным следствием
этого представляется не только улучшение качества почвы, но и общее
оздоровление природной среды.
2.4.1. Азотфиксирующие растительно-микробные системы
В 1879 году Антуан де Бари любое известное в то время межвидовое
взаимодействие обозначил термином «симбиоз». Однако в современной
литературе понятие «симбиоз» употребляется чаще всего в более узком смысле -
как синоним термина «мутуализм», что подразумевает длительный
пространственный контакт между симбионтами и подчеркивает облигатность и
обязательную взаимовыгодность симбиоза [Заварзин, 2003].
Бактерии-диазотрофы по их связи с растением делят на ассоциативные и
симбиотические.
42
К ассоциативным относят бактерии, обитающие в сфере прямого влияния
растения, в прилегающей к корням почве (ризосфере) или непосредственно
на поверхности корней и листьев (ризоплана и филлосфера), но, как
правило, не проникающие внутрь растительных тканей и не образующие
разрастания растительных тканей.
К симбиотическим диазотрофам относят те, которые проникают в ткани
ограниченного числа видов растений-хозяев, стимулируя образование
особых разрастаний на корнях или стеблях в форме клубеньков или узелков
(nodule).
2.4.2. Ассоциативная азотфиксация
Интерес к ассоциативной азотфиксации обусловлен, как уже отмечалось,
ее важной ролью в азотном балансе природных экосистем и
перспективностью для сельскохозяйственного производства. Считается, что за счет
активизации этого процесса можно существенно повысить питание небобовых
растений «биологическим» азотом и уменьшить дозы применяемых в
растениеводстве минеральных азотных удобрений [Romanenko, 2003].
Несмотря на то что способность бактерий к ассоциативным
взаимоотношениям с растениями обнаружена только в 1970-х, к настоящему времени
известно множество бактерий, принадлежащих к разным родам, образующих
ассоциации с корнями растений.
Ассоциативные азотфиксирующие бактерии распространены повсеместно
и встречаются среди представителей самых разных таксономических групп,
относящихся как к хемотрофам, так и к фототрофам, аэробам и анаэробам.
У всех растений на корнях и корневых волосках образуется слизистый
слой - муцигель. По характеру развития ассоциации бактерий принято
разделять на две группы: экторизосферные (развивающиеся в почве,
примыкающей к корням) и эндоризосферные (находящиеся в муцигеле). Считается, что
последние более защищены от неблагоприятных условий среды, в том числе
и от избытка кислорода, ингибирующего нитрогеназу диазотрофов.
Эндоризосферные бактерии обнаружены на корнях культурных злаков и
трав, и множество исследований было направлено на выявление их
способности связывать агрономически значимые количества азота для их хозяев.
Тем не менее на пути к управлению ими непосредственно в природной среде
стоит еще множество нерешенных проблем.
Одним из принципиальных является вопрос о необходимости внесения в
почву, точнее в ризосферу и ризоплану, бактерий-азотфиксаторов. Уже в
ранних работах по ассоциативной азотфиксации (выполненных с
использованием нового в те годы метода ацетиленредукции) показано, что у растений
риса, кукурузы и некоторых пастбищных трав азотфиксирующая активность
даже в отсутствие инокуляции была высокой и соответствовала фиксации
значительного количества азота - до 100 кг/га/сезон [Dobereiner, 1979; Ума-
ров, 1979].
Затем в многочисленных экспериментах было показано, что внесение в
любую почву легкодоступного энергетического субстрата (глюкозы, сахаро-
43
зы и пр.) вызывает практически немедленное и резкое усиление нитрогеназ-
ной активности, косвенно, но отчетливо свидетельствуя о богатстве
естественного азотфиксирующего генофонда почв. Исходя из этого казалось
вполне возможным использовать азотфиксирующий потенциал почвы
(«аборигенные» бактерии-диазотрофы) для активизации азотфиксации в
прикорневой зоне растений.
С целью усиления ассоциативной азотфиксации применялись
разнообразные приемы усиления фотосинтетической активности растений -
внесение небольших (так называемых стартовых) доз азота, фосфорных и
калийных удобрений, использование сидератов и повышение концентрации
углекислоты в приземном слое, что определенно усиливало рост растений и
должно было увеличить размеры корневого экзосмоса. Однако радикального
улучшения азотного питания небобовых растений этими методами достичь
не удалось, и в настоящее время такие подходы отвергнуты [Умаров, 2001].
Более заметный успех достигнут при искусственном обогащении
ризосферы и филлосферы небобовых растений активными штаммами азотфиксиру-
ющих бактерий.
В многочисленных опытах с разными видами растений и в различных
почвенно-климатических условиях показано, что путем интродукции в
ризосферу азотфиксирующих и ростстимулирующих бактерий можно
достоверно улучшить рост и питание сельскохозяйственных культур.
Установлено, что эффективность функционирования искусственных растительно-
бактериальных ассоциаций в значительной степени зависит от специфичной
реакции различных видов и сортов растений на инокуляцию, от свойств инт-
родуцируемых штаммов, а также от почвенно-климатических условий
выращивания растений. Эти данные открыли перспективу для широкого поиска
бактерий с целью применения их в качестве бактериальных удобрений для
небобовых растений.
Особый интерес представляют смешанные культуры азотфиксирующих
микроорганизмов, важными свойствами которых является высокая
стабильность состава и относительное постоянство азотфиксирующей активности
(см. ниже).
Чаще всего главным показателем, который используют при поисках
бактерий, положительно влияющих на растения (PGPR-бактерии, plant growth
promotion regulator), является их высокая нитрогеназная активность. Такие
микроорганизмы признают потенциально полезными для сельского
хозяйства, однако их «ассоциативность» должна быть доказана на основании
изучения колонизационного потенциала, пространственных взаимоотношений с
растениями, способности интенсифицировать процесс азотфиксации при
активном развитии в корневой зоне инокулированного растения-хозяина
[Скворцова и др., 1998].
В этой связи отмечается, что проблема поиска и селекции
высокоактивных культур азотфиксирующих бактерий для инокуляции небобовых
растений - одна из наиболее важных и сложных, поскольку такие культуры
должны отвечать многим требованиям, в числе которых не только высокий
уровень нитрогеназной активности, но и способность колонизировать
поверхность определенных видов растений, противостоять конкуренции со стороны
дикой микрофлоры и пр.
44
Нерегулярная воспроизводимость результатов инокуляции, не
позволяющая достаточно надежно прогнозировать реакцию растений,
является в настоящее время главной причиной ограниченного применения
«ассоциативных» бактериальных удобрений в сельскохозяйственной
практике.
Несмотря на обилие данных о высокой активности азотфиксации в
ризосфере растений, вопрос о масштабах ассоциативной азотфиксации в
конкретных почвах и под конкретными видами растений остается дискуссионным.
В литературе имеются резко различающиеся данные о размерах
ассоциативной азотфиксации под разными видами растений и об усвоении ими
фиксированного бактериями азота.
Еще в 1970 году одним из первых Ж.Ренни в модельных опытах с
помощью изотопного и балансового метода установил, что в растениях
кукурузы (без инокуляции) доля атмосферного азота составляла не менее 13% его
общего содержания.
В.П. Шабаев [Шабаев и др., 1985] с целью определения размеров
ассоциативной азотфиксации и усвоения фиксированного микроорганизмами азота
атмосферы небобовыми растениями провел специальное исследование в
контролируемых условиях фитотрона с использованием метода изотопного
(515N) разбавления. В опытах применялись стандартные вегетационные
сосуды, отмытый кварцевый песок, деминерализованная вода и полные
питательные смеси (содержавшие макро- и микроэлементы), приготовленные из
реактивов с категорией не ниже «х.ч.». Растения выращивали при
искусственном освещении (8-10 тыс. л к) с 8.00 до 20.00 при относительной
влажности воздуха 60% и температуре 18-21°С.
Азот вносили в виде меченой 15N кальциевой селитры из расчета 0, 0,5 и
1 дозы азота в составе питательной смеси Кнопа. Избыток атом.% 15N в
кальциевой селитре составлял 8,8%. В опытах использовали растения райграса
и овса. Инокуляцию проводили селекционными штаммами ризобактерий.
Содержание азота в растениях и субстрате определяли феноловым
методом на 30-50-е сутки роста. Изотопный состав азота анализировали на
эмиссионном спектрометре NOI-5. По разности общего количества азота
(14N+15N) и меченого (15N) рассчитывали содержание 14N в пробах.
Результаты определения содержания изотопов азота (14N и 15N) в
растениях свидетельствовали, что в течение вегетационного периода в них поступает
азот атмосферы 14N2, причем величина поступления зависела от
особенностей культуры и исходной дозы азота (см. табл. 2.3). Результаты опыта
свидетельствовали о высокой доступности фиксированного микроорганизмами
азота небобовым растениям - до 50-60% общего его содержания.
Процесс формирования ассоциативного симбиоза не имеет явно
выраженных фенотипических реакций, поэтому многие специалисты предпринимали
попытки разработать критерии ассоциативности, которые бы позволили
оперативно анализировать систему на предмет эффективности.
В.Т. Емцев и М.И. Чумаков [1988] предложили схему доказательства
ассоциативности азотфиксирующих бактерий с небобовыми растениями,
которая, по мнению авторов, может выступать в качестве экспресс-метода
определения перспективности использования исследуемых микроорганизмов для
инокуляции растений.
45
Таблица 2.3
Усвоение небобовыми растениями азота атмосферы
Культура
1 Овес
1 Райграс
Вариант
Контроль(без N)
0,5 дозы 15N
1 доза15N
Контроль(без N)
0,5 дозы «N
1 доза 15N
14N атмосферы в растениях |
% общего
выноса
14N+15N
63,0
12,2
5.8
60,0
13,9
6,8
%
фиксированного 14N
35,1
57,1
49.6
8,7
57,0
59,1
% внесенной
дозы 15N
—
10,8
4,1
14,7
5,9 1
Поэтапная схема-гипотеза реализации ассоциативного процесса
предложена также Я.Оконом [Окоп, Тог, 1993], которая предусматривает три этапа
взаимодействия. На первом этапе бактерий привлекаются химическими ат-
трактантами из корневых экссудатов как специфическими белковыми или
углеводными компонентами. На втором этапе происходит адсорбция
бактерий на корневой поверхности, которая медиируется некоторыми
компонентами гликокаликса. В осуществлении этих процессов могут участвовать
особые белки корней растений - лектины. Затем происходит обмен
сигнальными молекулами за счет связывания между лектинами и липополисахаридами
и возникает ассоциация.
Все микроорганизмы, составляющие такие ассоциации, должны отвечать
следующим требованиям: 1) адсорбироваться на поверхности корней
экспериментальных растений; 2) синтезировать гормоноподобные вещества и/или
ферменты, разрушающие клеточную стенку растений (целлюлазу, пектина-
зы). Перспективными агентами биологической нодуляции могут также
выступать PGPR-бактерии, приспособленные к утилизации корневых экзомета-
болитов растений и специфически колонизирующие их корни. Кроме того,
использование таких бактерий может являться перспективным
агротехническим приемом, обеспечивающим эффективный биоконтроль развития
патогенов в ризосфере растений.
Адсорбция компонентов ассоциаций на поверхности корней растений,
проникновение их вглубь тканей кортикальной паренхимы и
распространение по системе межклетников во вновь образуемые ткани растений
способствует формированию на поверхности корней каллусоподобных структур -
псевдоклубеньков [Glagoleva et al., 1996].
Корневые эксудаты оказывают значительное влияние на микробные
популяции и некоторые органические вещества оказывают хемотаксическое
действие на почвенные бактерии. Для многих бактерий, обитающих в
ризосфере, хемотаксис и прикрепление к корням завершают взаимодействие с
растением. Для симбионтов растений, таких как Rhizobium, Frankia, это только
первые этапы в цепи событий, завершающихся формированием симбиоза.
Повышенная защищенность от вымывания из ризосферы за счет адгезии
микробных клеток на поверхности корней, способствуют концентрированию
бактерий в местах инфицирования.
46
К настоящему времени известно более 200 видов почвоудобрительных
бактериальных препаратов на основе ассоциативных диазотрофов,
оказывающих достоверно положительный эффект на продуктивность (урожай)
растений. Из них в Российской Федерации производится около 20
коммерческих препаратов, действующим началом которых являются различные
ассоциативные бактерии: «Агрофил», «Мизорин», «Экстрасол» и пр.
2.4.3. Азотфиксирующий симбиоз бобовых растений
Как отмечалось, азотфиксирующий симбиоз является одним из способов
тесного сопряжения циклов азота и углерода в биосфере на основе
интеграции азотного и углеродного метаболизма растений и бактерий. Наиболее
ярким и сравнительно хорошо изученным примером растительно-микробных
взаимодействий с позитивным результатом служит бобово-ризобиальный
симбиоз.
Семейство бобовых растений Fabaceae (Leguminosae) подразделяется на
три подсемейства - Mimosoideae, Caesalpinioideae и Papilionoideae,
включающие 674 рода и 16 000-19 000 видов [Тихонович, Проворов, 2002].
Уникальным свойством бобовых является образование корневых (реже -
стеблевых) клубеньков, которые относят к основным диагностическим
признакам этих растений.
Не все бобовые растения образуют клубеньки, а многие виды еще не
изучены в этом отношении. Например, у Caesalpinioidaeae только 23%
изученных видов обладают этим свойством, тогда как у Mimosoideae и Papilionoideae
соответственно 90 и 97% образуют клубеньки.
По современной классификации, семейство Rhizobiaceae включает 7 родов
бактерий: Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Azorhizo-
bium, Agrobacterium и Phyllobacterium.
Первоначально было проведено разделение родов Rhizobium и
Bradyrhizobium на основании ряда морфологических и физиологических
признаков, главным из которых является медленный рост представителей
последних.
Позднее выделили род Sinorhizobium, что обосновано данными о составе
генов рРНК малой субъединицы рибосомы. По этим же критериям
предложено и формально принято родовое название Mesorhizobium,
Род Azorhizobium выделен, главным образом, по способности некоторых
его видов (A. caulinodans) образовывать азотфиксирующие клубеньки не на
корнях, а на стеблях тропического древовидного растения Sesbania rostrata.
Виды p. Agrobacterium, изначально классифицированные в соответствии с
их фитопатогенностью (образование корончатых галлов и «волосатых
корней»), из-за большого сходства с клубеньковыми бактериями в настоящее
время также включены в семейство Rhizobiaceae, хотя круг хозяев этих
бактерий существенно шире по сравнению с другими клубеньковыми бактериями.
Бактерии p. Phyllobacterium, обнаруживаемые, главным образом на
поверхности и в разрастаниях листьев ряда тропических растений, - пока наименее
изученный род этого семейства.
47
В период развития симбиоза клубеньковые бактерии и растение
находятся в тесных взаимоотношениях, кульминацией которых является
образование клубенька.
Общая схема возникновения азотфиксирующего бобово-ризобиального
симбиоза выглядит следующим образом [Тихонович, Проворов, 2002].
Образование клубеньков начинается с обмена высокоспецифичными
сигнальными метаболитами («молекулярными сигналами») между растением и
бактериями. Среди таких сигнальных веществ основная роль принадлежит так
называемым Nod-факторам, продуцируемым бактериями и служащим для
индукции первых этапов образования клубенька. Эти вещества состоят из хити-
ноподобного скелета, включающего 3-6 молекул N-ацетилглюкозамина с
остатком какой-либо жирной кислоты, причем в зависимости от вида ризобий
могут быть и другие боковые заместители.
Появление этих веществ вызывает отчетливые морфологические и
биохимические эффекты в тканях корня - деформацию корневых волосков,
формирование инфекционных нитей и пр. Характерно, что хотя в каждом
клубеньке содержится множество клеток бактерий, активные защитные реакции
у растений не возникают, что определяется мембранами растительной
клетки, предохраняющими бактерии от прямого контакта с цитоплазмой.
Несмотря на исходное обилие, только часть бактерий, попавших внутрь
корня, способны вызывать «очаги» инфекции на корнях, большая роль в
возникновении которых принадлежит флавоноидам - веществам фенольной
природы растительного происхождения, ответственным за хемотаксис бактерий.
Со своей стороны бобовое растение-хозяин не является пассивным
партнером, а может существенно влиять на судьбу клубеньковых бактерий в
почве, что обусловлено способностью растения «выбирать» определенные
генотипы (биовары) ризобий из присутствующей в почве популяции. Например,
в присутствии растений гороха популяция R. leguminosarum bv. viceae на 3
порядка была более многочисленной, чем популяция R. leguminosarum bv.
phaseoli, тогда как на соседнем участке, засеянном фасолью, ситуация была
противоположной.
Известна также различная степень предпочтительности растений по
отношению к находящимся в почве штаммам одного и того же вида ризобий.
Таким образом, в дополнение к избирательности заражения растения
обладают способностью ограничивать образование клубеньков некоторыми
штаммами ризобий, что проявляется в так называемой их «эффективности» или
«неэффективности».
К настоящему времени сформировалось достаточно четкое представление
о процессе образования симбиотической пары «ризобий - бобовые
растения». По фенотипическим признакам у ризобий различают следующие этапы
образования симбиоза: 1) реинфекцию, включающую колонизацию корней,
адгезию к корням, ветвление и изгибание корневых волосков; 2) инфекцию -
этап, на котором происходит собственно инфекция, инициация клубенька,
бактериальная реализация, развитие бактероида; 3) функционирование
клубенька - синтез нитрогеназы, комплементарное функционирование,
существование клубенька.
Взаимодействие клубеньковых бактерий и бобового растения носит
сложный характер. Согласно современным представлениям, оно осуществляется в
48
том числе и на уровне взаимодействия генов и продуктов их экспрессии.
В процессе сложного и многостадийного образования и функционирования
азотфиксирующего аппарата происходит последовательный обмен
сигналами между микро- и макросимбионтами, избирательно регулирующими
активность симбиотических генов у бактерий и растений. Растительные гены,
вовлеченные в симбиотическое взаимодействие, различаются по времени
включения (ранние и поздние), характеру воздействия (регуляторные и
структурные), количеству продуктов (мажорные и минорные).
Установлено, что у клубеньковых бактерий имеется несколько групп
генов, определяющих процесс азотфиксации. Во-первых, это nod-тены,
кодирующие процесс образования клубеньков [Кретович, 1995]. Поскольку даже у
разных видов рода Rhizobium nod-тепы могут существенно различаться,
предполагается, что существуют особенности структуры системы nod-тенов у
каждой симбиотической системы. Во-вторых, это ш/-гены, от которых
зависит собственно процесс фиксации молекулярного азота. В эту группу также
входят /ix-гены, необходимые для симбиотической азотфиксации. У многих
Rhizobium гены азотфиксации, включая nod-гены, располагаются в плазми-
дах. Так, R. meliloti имеет две мегаплазмиды с молекулярной массой около
1000 МДа. Одна из них содержит nod-, nif-, и /ur-гены, а другая - /гх-гены,
способствующие внедрению бактерий в клубеньки. Кроме того, fix-гены
имеются и в хромосоме бактерий. Мегаплазмида имеет также другие гены,
облегчающие процесс образования клубеньков - ея/-гены.
Наиболее полная сводка данных о бобово-ризобиальном симбиозе
изложена в книге «Rhizobiaceae - молекулярная биология бактерий,
взаимодействующих с растениями» [Тихонович, Проворов, 2002].
2.4.4. Азотфиксирующие симбиозы небобовых растений
Ярким примером высокоэффективного азотфиксирующего симбиоза у
небобовых растений является актиноризный симбиоз, возникающий при
взаимодействии актиномицетов p. Frankia с кустарниковыми и деревянистыми
двудольными растениями, принадлежащими к 8 различным семействам (см.
табл. 1. в гл. 1).
Еще в 1896 году показано, что ольха (род Alnus) хорошо растет в не
содержащей связанный азот среде только при том условии, если на ее корнях
имеются клубеньки, из которых затем были выделены актиномицеты рода
Frankia, а само явление получило название актиноризного симбиоза. Позднее
такой тип симбиоза обнаружен у ряда других растений - лоха, малины,
облепихи. Как отмечалось, их вклад в азотный баланс почв пока не оценен, хотя
известно, что они являются хорошими почвоулучшителями, косвенно
свидетельствуя об активном участии в процессе азотфиксации.
Другим примером симбиоза может служить небобовое растение - пионер
пустынных почв Kallar grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth) и бактерии
p. Azoarcus. Электронно-микроскопические исследования показали, что эти
микроорганизмы могут вторгаться в зону растяжения и дифференциации,
колонизировать межклеточно и внутриклеточно кортекс, проникать глубоко в
49
васкулярную систему, а именно в ксилемные ткани, и тем самым
распространяться по всему растению.
Й.Доберейнер с соавторами [Dobereiner et al., 1992] высказали
предположение о наличии облигатного симбиоза между растениями сахарного
тростника (Saccharum sp.) и тремя бактериями - Acetobacter diazotrophicus,
Herbaspirillum seropedicae и H. rubrisubalbicans. В качестве доказательства
такого симбиоза указывается, что микроорганизмы регулярно выделялись из
стеблей и листьев растений, тогда как при анализе почвы, на которой рос
сахарный тростник, эти бактерии не обнаружены.
Цианобактерии, как отмечалось, образуют широко распространенные в
биосфере симбиозы с представителями четырех крупнейших
филогенетических групп высших растений - бриофитами (печеночниками и антоцеровы-
ми), папоротниками (азоллой), голосеменными (саговниковыми) и
покрытосеменными (гуннерой).
Являясь древнейшими из прокариот, цианобактерии используют энергию
Солнца для разложения воды с целью получения восстановителей
(протонов), необходимых как для азотфиксации, так и для ассимиляции
углекислоты. По химической природе азотфиксация и оксигенный фотосинтез
несовместимы, поскольку нитрогеназа инактивируется уже при низких
концентрациях кислорода. Такое противоречие преодолевается у ряда цианобактерии
путем пространственного разделения азотфиксации (протекает в гетероцис-
тах) и фотосинтеза (осуществляется в вегетативных клетках). У других
цианобактерии для этой же цели служит внутриклеточная компартментализа-
ция, а также обильная полисахаридная слизь, позволяющие уменьшить
доступ кислорода к активному центру нитрогеназы.
Места локализации цианобионта у растения-хозяина в разных симбиозах
существенно различаются. У антоцеровых и печеночников он располагается
в особых полостях на нижней стороне таллома, где растения образуют
специальные многоклеточные выросты, значительно увеличивающие поверхность
взаимодействия с цианобионтом и обеспечивающие транспорт сахарозы от
растения-хозяина к цианобионту и связанный азот (аммоний) в обратном
направлении. Эффективность передачи аммония в этой системе весьма
высока - <1% фиксированного азота теряется в окружающей среде.
Хорошо известна способность азотфиксирующих цианобактерии
(цианобионта) Nostoc sp. и других сопутствующих им бактерий развиваться в апоге-
отропных (то есть с отрицательным гравитропизмом) корнях растений
семейства Cycadaceae: Cycas revoluta, С. circinalis, С. rumphii, Zamia pumila, а также с
растением Gunnera monicata. В таких симбиозах цианобактерии (цианобионт)
локализуются в так называемых кораллоидных клубеньках (кораллоидах),
внешне очень похожих на корневые клубеньки у актиноризных растений.
Широкое распространение имеет симбиоз водного папоротника Azolla с
цианобактерией Anabaena azollae (по современным данным, представителя р.
Nostoc) и бактериями p. Arthrobacter. При этом цианобионт локализован в
многочисленных волосках внутри листовых полостей растения-хозяина, где
и происходит взаимный обмен метаболитами.
В симбиозах со мхами цианобактерии растут внутриклеточно, в так
называемых гиалиновых клетках, но никогда не заселяют хлорофиллоносные
клетки.
50
В симбиозах с Gunnera цианобактерии заселяют секреторные железы на
стебле в основании листовых черешков. Эти железы называют, по аналогии с
корневыми клубеньками бобовых растений, стеблевыми клубеньками.
Многие свободноживущие цианобактерии, образующие гетероцисты,
могут поддерживать рост растений даже в отсутствие симбиоза при развитии на
поверхности листьев или корней.
В симбиозах с высшими растениями цианобактерии претерпевают
разнообразные модификации:
• у них в несколько раз возрастает нитрогеназная активность;
• усиливается экскреция фиксированного азота;
• значительно снижается активность глутаминсинтетазы - ключевого
фермента в системе ассимиляции фиксированного азота;
• резко (до 80%) увеличивается доля гетероцист;
• полностью или частично инактивируется фотосистема II и,
соответственно, существенно подавлено выделение молекулярного кислорода;
• ослаблена или полностью отсутствует фиксация СО2;
• активно образуется внеклеточный слизистый полисахаридный матрикс;
• рост клеток и их деление существенно тормозятся.
Существуют и иные модификации цианобионта и другие типы симбиозов
цианобактерии, в частности с водными беспозвоночными животными.
Бактерии рода Klebsiella, фиксирующие азот, образуют на листьях
некоторых тропических растений узелки, которые принято считать результатом их
симбиоза.
Высокая продуктивность азотфиксирующих симбиозов уже давно
привлекает внимание специалистов с целью переноса этого явления на другие
виды растений, важные в сельскохозяйственном и производственном
отношениях. В этой связи обсуждается несколько подходов, направленных на
распространение симбиотической азотфиксации на несимбиотрофные виды
растений:
• прямой перенос ш/-генов из бактериальных клеток в растительные;
• использование свойства тотипотентности растительных клеток и
создание растений, заселенных азотфиксирующими микроорганизмами через
стадию смешанного каллуса;
• применение в качестве бактериальных удобрений композиций эндофит-
ных микроорганизмов, выделенных из природных симбиозов;
• паранодуляция - формирование на корнях небобовых растений
псевдоклубеньков под воздействием различных химических агентов.
Из них на практике применение получили два последних.
2.4.5. Искусственный симбиоз - паранодуляция
Как отмечалось, в последнее время предпринимаются попытки
использовать выделенные из природных источников микроорганизмы для
формирования искусственных симбиозов с важными сельскохозяйственными
культурами с целью улучшения их качества и повышения урожайности [Coocking,
Davey, 1993; Glagoleva et al., 1996].
51
Первое сообщение об образовании клубеньковоподобных структур
(получивших название псевдоклубеньков (р (para)-nodules) при обработке
проростков пшеницы 2,4-Д с одновременной инокуляцией бактериями Rhizobium
sp. появилось в 1983 г. [Nie, 1983]. При окрашивании псевдоклубеньков йодо-
нитротетразолиумом они приобретали темно-красный цвет, который
свидетельствовал о низком окислительно-восстановительном потенциале (ОВП).
Такой ОВП (отрицательный Eh), коррелируя с присутствием значительного
числа микроорганизмов, является непременным условием для успешной
азотфиксации, особенно у тех бактерий, у которых отсутствуют эффективные
механизмы защиты от токсических форм кислорода.
Другой способ формирования р-клубеньков продемонстрирован на рисе с
использованием ферментативной (целлюлаза, пектолиаза) обработки корней
для облегчения проникновения бактерий p. Rhizobium. При этом нодуляция
на каждом проростке пшеницы, обработанном 2,4-Д, достигала 100% по
сравнению с вариантом, где использовалась ферментативная обработка,
вызывающая образование р-клубеньков с частотой 5% или менее [Kennedy et al.,
1990].
Накопленный к настоящему времени экспериментальный материал
позволяет дать следующее определение этому явлению. Паранодуляция - это
явление образования на корнях небобовых растений
клубеньковоподобных структур под воздействием различных индуцирующих агентов. В
качестве веществ, индуцирующих нодуляцию, предложены помимо 2,4-Д такие
соединения, как хлорамбен, хлорсульфорн, различные синтетические
ауксины, и др. Все эти вещества в высоких концентрациях (до 20-30 кг/га)
используются как гербициды, а в низких действуют аналогично фитогормонам. Для
успешного образования псевдоклубеньков оказалось необходимым: а)
уменьшить высокое парциальное давление кислорода в среде; б) понизить
кислотность среды.
Для «заселения» новообразованных клубеньков предложено
использовать различные азотфиксирующие микроорганизмы. Помимо высокой нит-
рогеназной активности такие бактерии должны обладать следующими
свойствами:
• способностью вступать в симбиотические отношения с клетками
растения-хозяина;
• устойчивостью к высоким концентрациям кислорода (рС^);
• способностью приспосабливаться к изменениям рН в окружающей среде;
• способностью «передавать» часть фиксированного азота
растению-хозяину
Всестороннее изучение свойств образующихся р-клубеньков проводили
на злаковых растениях (рис, пшеница, просо). В качестве инокулянта
применяли бактерии pp. Rhizobium, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Derxia и
Klebsiella [Cocking, Davey, 1993].
Ацетиленовый метод показал наличие высокой нитрогеназной активности
в псевдоклубеньках на корнях растений. Методом изотопного разбавления
(15N) было установлено, что не менее 16-23% азота поступает в растения из
воздуха как результат искусственной нодуляции и инокуляции.
По данным световой микроскопии, р-клубеньки образовывались из
клеток перицикла корня и содержали васкулярные образования, которые были
52
инфицированы бактериями. Электронно-микроскопические исследования
показали, что клетки кортикальной зоны корня содержат наибольшее
количество инокулянта. С помощью световой и электронной микроскопии
установлено также проникновение бактерий внутрь клеток и существование их
как стабильной популяции.
С целью изучения эффектов от паранодуляции был проведен ряд
вегетационных опытов в условиях, приближенных к естественным. Клубеньково-
подобные структуры были индуцированы на корнях пшеницы с помощью
низких концентраций гормонов роста растений, таких как 2,4-Д, хлор-
сульфорн и др. Псевдоклубеньки появлялись в течение 10-20 дней после
обработки раствором 2,4-Д (в концентрации 1 мкг/мл) и инокуляции
Azorhizobium sp. При культивировании растений на питательных смесях
(водная культура) образовывалось 20-30 р-клубеньков на растение, в то время
как в почве - более чем 100 клубеньков на растение.
Электронно-микроскопические исследования показали, что
инфицированные клетки содержат большое количество азоризобий. Обнаружено
также, что бактерии, находясь внутри псевдоклубеньков на пшенице, образуют
поли—гидроксибутиратные гранулы; иногда обнаруживались и перибактеро-
идные мембраны. Такие же результаты получены на рисе, кукурузе и масло-
семянном рапсе при воздействии 2,4-Д, хлорамбена и хлорсульфорна при
одновременной инокуляции Rhizobium [Cocking, Davey, 1993]. Изучение
активности азотфиксации (АФА) при инокуляции культурой Azorhizobium
caulinodans показало высокую активность этого процесса в
псевдоклубеньках на корнях растений. В нодулированных корешках АФА достигала
100 нМС2Н4/раст. • день, или 4 нМС2Н4/раст. • ч. Методом изотопного
анализа (15N) в вегетационных опытах подтверждено, что около 8,85-22,69%
азота растений поступает из воздуха в результате азотфиксации.
Также р-клубеньки образовывались на корнях кукурузы при воздействии
2,4-Д или индолилуксусной кислоты (ИУК) с параллельной инокуляцией
Azospirillum brasilense. Удалось выявить колонизацию псевдоклубеньков
бактериями и значительное увеличение ацетилен-редуктазной (нитрогеназной)
активности.
Клубеньковоподобные структуры в условиях вегетационного опыта
получены на корнях пшеницы, кукурузы и риса при обработке их проростков
(проростки с 2-3 листьями и корнями, достигшими длины 10 см) 2,4-Д в
концентрации 0,5-1,0 мкг/мл. В качестве инокулянтов использовали: а) для
пшеницы: Azorhizobium caulinodas, Azospirillum brasilense, Klebsiella
pneumoniae, Alcaligenes faecalis, Azotobacter chroococcum и некоторые виды бактерий
рода Rhizobium; б) для кукурузы: Azospirillum brasilense; в) для риса: Azorhizobium
caulinodans. Опыт проводили в четырех вариантах: 1) без 2,4-Д и инокуляции;
2) добавив только 2,4-Д; 3) используя только инокуляцию какими-либо
бактериями; 4) тест-группа (добавление 2,4-Д и инокуляция). При этом в
четвертом варианте опыта возникали р-клубеньки, зараженные бактериями, в то
время как на контрольных растениях с добавлением только 2,4-Д
образовывались «стерильные» р-клубеньки (без каких-либо бактерий в них).
Образование псевдоклубеньков происходило примерно на 10-й день после закладки
опыта. Световая микроскопия показала, что в пшеничных и рисовых р-клу-
беньках васкулярные ткани обычно окружают клетки кортекса, которые ко-
53
лонизированы бактериями; в кукурузных псевдоклубеньках, напротив, зона
колонизированных клеток оказывается окруженной васкулярными тканями.
С помощью электронной микроскопии обнаружены бактерии p. Rhizobium
внутри кортикальных клеток или в межклеточном пространстве зрелых
пшеничных пара-клубеньков, в которых они могут образовывать бактероиды и
перибактероидные мембраны (в клетках), а также толстый слой целлюлозо-
подобных веществ (в межклеточном пространстве).
При проведении вегетационных опытов в песчаных культурах
продемонстрирована высокая нитрогеназная активность на корнях растений с
псевдоклубеньками, колонизированными перечисленными выше диазотрофами,
которая намного превышала АФА в контрольной группе (только бактериальная
инокуляция). Как и при истинной симбиотической азотфиксации, в
зависимости от азотфиксирующей активности инокулянта псевдоклубеньки можно
разделить на эффективные и неэффективные, у которых азотфиксация
отсутствует.
В табл. 2.4 приведены данные о влиянии паранодуляции («химической» -
с помощью 2,4-Д и «биологической» - при использовании смешанных
культур бактерий) на содержание азота в биомассе рапса.
Таблица 2.4
Влияние паранодуляции на содержание азота в биомассе рапса
Вариант обработки корней
1. Контроль (без обработки)
2. Обработка 2,4-Д
3. (Micrococcus sp. +Rhodococcus sp.)
4. (Azotobacter nigricans+Bacillus sp.)
5. (Micrococcus sp. +Rhodococcus sp. +
Azotobacter nigricans +Bacillus sp.)
6. 2,4-Д + (Az.nigricans+Bacillus sp.)
Общий
азот, %
1,45
1,54
1,52
1,51
1,98
2,01
Белковый
азот, %
1,28
1,43
1,41
1,49
1,91
1,97
Белок, % ]
8,00
8,94
8,81 1
9,31
11,94 J
12,31
Достоверная прибавка азота выявлена в вариантах с использованием
смешанной азотфиксирующей культуры и при совместном внесении с 2,4-Д.
Азотфиксация выявлена также у псевдоклубеньков на корнях ячменя и
кукурузы, индуцированных 2,4-Д с инокуляцией Azospirillum lipoferum и
Azospirillum unlike. АФА на корнях зерновых с образованными р-клубеньками
была примерно в 5 раз выше по сравнению с активностью, зафиксированной
на необработанных корнях. В этих опытах ячменные и кукурузные
проростки были обработаны 2,4-Д в различной концентрации: при добавлении 2,4-Д
в концентрации 1 и 1,5 мг/кг удлинение корней было резко ограничено, и
растения образовывали клубеньковоподобные узелки вдоль корней. При
концентрации 2,4-Д, равной 5 и 10 мг/кг, проявлялась деформация корней.
Показано также, что растение-хозяин способно накапливать вещества, необходимые
для азотфиксирующих бактерий внутри р-клубеньков.
Считается, что одной из основных причин увеличения азотфиксации при
развитии диазотрофных бактерий в псевдоклубеньках является защита нит-
рогеназы от кислорода, оказывающего сильное ингибирующее воздействие
на этот фермент [Глаголева и др., 1997].
54
Другими исследователями показано, что ризобии, выделенные из
стеблевых клубеньков тропического бобового растения p. Aeschynomene, способны
проникать в корневую систему небобовых растений - кукурузы, риса и
пшеницы. Проникновение ризобий происходит через корневой кортекс в месте,
где появляются боковые корни, в результате чего ризобии обнаруживаются
как в межклетниках, так и в клетках кортекса молодых боковых корней,
которые утолщаются и укорачиваются. При этом нодулированные растения
обладают значительной АФА [Cocking, Davey, 1993].
Проводилось также множество опытов, включающих: 1) совместное
воздействие на корни небобовых растений 2,4-Д, целлюлолитических энзимов
при инокуляции Rhizobium sp. или другими азотфиксирующими бактериями;
2) использование для инокуляции смешанных культур целлюлозопектино-
литических и азотфиксирующих бактерий в сочетании с повышенной дозой
2,4-Д, который, воздействуя при этом как мутаген, увеличивает способность
микроорганизмов колонизировать корни; 3) использование для инокуляции
генетически измененных штаммов азотфиксирующих бактерий.
По результатам работ сформулирована так называемая «нодуляционная
гипотеза», которая заключается в следующем:
• 2,4-Д и другие индуцирующие нодуляцию агенты выполняют роль ноду-
ляционных сигнальных молекул с широким спектром «узнавания» и нодуля-
ции; при использовании 2,4-Д без каких-либо микроорганизмов можно
локально стимулировать деление клеток молодого корня для формирования
псевдоклубеньков («стерильные» р-клубеньки);
• под воздействием 2,4-Д клеточная стенка приобретает свойства
пластичности, губчатости, что является подходящим условием для проникновения
бактерий; если инокуляцию активными диазотрофами произвести именно в этот
момент, может быть сформирована эффективная азотфиксирующая система;
• псевдоклубеньки являются модификацией молодых корней,
формирующихся из клеток перицикла, которые способны как к делению, так и к
дифференциации на ткани корня [Глаголева и др., 1998].
2.4.6. Бактериальная инокуляция растений
В последние годы все более широкое распространение получает
инокуляция растений разнообразными по составу ростстимулирующими бактериями
(PGPR-bacteria, PGPB). При этом одним из важных результатов
эффективного взаимодействия интродуцируемых популяций бактерий с растениями
является не только активизация азотфиксации в ризосфере, но и общее
усиление микробиологической активности в прикорневой зоне, что в целом
положительно влияет на растения [Хотянович, 1995].
Значительный положительный ответ на инокуляцию происходит, если:
1) инокулируемый штамм (штаммы) успешно конкурирует с природной
(«дикой», аборигенной) популяцией; 2) инокулируемый штамм имеет
повышенную АФА или 3) обладает способностью к синтезу гормонов роста растений.
Для обработки растений (семян и проростков) используются как чистые,
так и смешанные культуры таких бактерий.
55
2.4.7. Инокуляция растений чистыми культурами бактерий
В последнее время появляется все больше данных о том, что интродукция
селекционных штаммов PGPR-бактерий дает достоверную прибавку урожая
и положительно влияет на рост и развитие большого числа небобовых
культур. По полученным при этом оценкам, инокуляция повышает урожай
небобовых растений от 5-30 до 60-70% [Burdman et al, 1998]. В зависимости от
почвенно-климатических условий увеличение урожая при инокуляции
эффективными штаммами диазотрофов (Azospirillum lipoferum, Agrobacterium
radiobacter, Arthrobacter mysorens, Flavobacterium sp.) составляет 10-30% для
злаковых культур и 20-40% для овощных. В ассоциации с кукурузой
некоторые диазотрофы фиксировали 30-90 кг азота/га, а урожай пшеницы
возрастал на 200-900 кг/га.
Инокуляция сорго, ячменя и озимой пшеницы азотфиксирующими
бактериями оказывала значительное влияние на продуктивность растений.
Урожай сорго увеличивался на 15-30% в зависимости от выбранного сорта, а
вынос азота возрастал на 20-50% [Завалин, 2005]. При этом основная масса
фиксированного азота накапливалась в ризосфере сорго, а в растения
поступало не более 25% азота атмосферы. Наиболее эффективными для
инокуляции растений сорго являлись чистые культуры бактерий pp. Bacillus и
Pseudomonas, а среди четырех культур, использованных для инокуляции
ячменя, наиболее положительное влияние оказали штаммы Arthrobacter и
Pseudomonas. На этих вариантах урожайность ячменя в 2-3 раза превышала
контроль.
Повышение урожая растений при инокуляции семян или корней
селекционными штаммами бактерий pp. Bacillus, Azospirillum и Pseudomonas
связывают не только с активизацией азотфиксации, но и с тем, что микроорганизмы
выделяли регуляторы роста растений, увеличивали растворимость
минеральных соединений и ингибировали развитие патогенов. Штаммы Ps. putida и Ps.
fluoresceins положительно влияли на рост и развитие картофеля [Шабаев и
др., 1999]. При инокуляции клубней картофеля суспензией бактерий Ps.
fluoresces (5 • 109, 2 • 1010,1,3 • 1011 кл./мл) наблюдался лучший рост именно
молодых растений картофеля (увеличение до 111%). Инокуляция картофеля
перед посадкой в полевом опыте улучшала рост растений на 4-30% и в
последующем увеличила урожай клубней.
Инокуляция сельскохозяйственных растений активными штаммами
азотфиксирующих бактерий не только повышает их урожай, но и
улучшает качество растительной продукции. Так, урожай озимой пшеницы и
картофеля увеличивался на 15-50%, а содержание белка в зерне пшеницы и
крахмала в клубнях картофеля возрастало на 10-20%. Достоверный
положительный эффект получен при испытании микробных препаратов «Флаво-
бактерин», «Мизорин» и «Азоризин» в опытах с кормовыми, зерновыми и
овощными культурами. У кормовых культур возрастало содержание
«сырого» белка, каротина, аскорбиновой кислоты, фосфора, калия; в зерне ячменя
увеличивалось содержание лизина, а в клубнях картофеля - таких
аминокислот, как аспарагиновая, лизин, пролин, тирозин.
Максимальное увеличение урожая пшеницы достигнуто сочетанием
небольших доз азотных удобрений и инокуляцией семян азотфиксирующими
56
бактериями, причем коэффициент использования азота удобрений инокули-
рованными растениями возрастал на 10-15%. Наибольший положительный
эффект от инокуляции получен при имитации засухи [Завалин, 2005].
Помимо традиционного способа инокуляции растений (заражение семян
перед посевом) в настоящее время все шире применяется новый метод -
нанесение суспензий азотфиксирующих культур на побеги растений. По
результатам испытаний отмечено достоверное увеличение урожая овощных и
зерновых культур при таком способе инокуляции культурами Azotobacter,
Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter, Klebsiella, Flavobacterium, однако механизм
положительного эффекта неясен. Дополнительная, помимо ризосферы,
инокуляция филлосферы розовопигментными бактериями способствовала более
высокой отзывчивости растений на бактеризацию: прибавка урожая клубней
в этих опытах была 29-33%, а урожай клубней при однократной инокуляции
филлосферы возрастал на 30-40% и более. Наибольший эффект от
инокуляции филлосферы отмечен в полевых опытах с морковью и кабачками, где
прибавка урожая составляла от 40 до 120%.
Одной из основных причин того, что ассоциативные азотфиксаторы
уступают симбиотическим по активности азотфиксации и прибавке урожая
растений является то, что бактерии-симбионты имеют значительно более
высокий титр при установлении симбиотическцх взаимоотношений с растениями
(1011 кл./г корней), тогда как у ассоциативных культур он не превышает
108 кл./г [Burdman et al., 1998].
Помимо усиления азотфиксации бактериальная инокуляция может
повышать всхожесть семян, усиливать рост и развитие растений, улучшать их
минеральное питание и повышать урожайность, что обусловлено:
• продукцией сидерофоров, связывающих железо в комплексы,
недоступные для фитопатогенов, что ограничивает их развитие;
• синтезом антибиотиков, токсичных для фитопатогенов;
• способностью продуцировать регуляторы роста растений;
• улучшением фосфорного питания растений.
2.4.8. Инокуляция смешанными культурами микроорганизмов
К настоящему времени сложилось вполне однозначное мнение, что
инокуляция смешанными культурами диазотрофных бактерий дает более
стабильные и воспроизводимые результаты, чем инокуляция чистыми культурами
микроорганизмов. Смешанные культуры обладают большей нитрогеназной
активностью, и их принято рассматривать как метаболические синтрофные
ассоциации [Умаров, 2001].
Как отмечалось, чистые культуры ростстимулирующих бактерий при
применении в качестве бактериальных удобрений не всегда дают
воспроизводимые результаты. Одним из способов получения более надежного эффекта
считается использование искусственных или естественных смешанных
бактериальных культур, которые способны гибко реагировать на изменение
условий среды и полнее использовать субстраты. Поэтому в настоящее время
одним из перспективных направлений в разработке новых высокоэффектив-
57
ных и стабильных препаратов является создание микробных композитов-
смесей микроорганизмов, обладающих экологической поливалентностью. В
этой связи можно отметить, что дополнительная инокуляция различными
бактериями бобовых и небобовых симбиотрофных растений усиливает
эффект от обработки их препаратами бактерий pp. Rhizobium, Bradyrhizobium и
Frankia [Burdman et al., 1998]. Показано также, что внесение бактерий
p. Azospirillum совместно с бактериями p. Rhizobium увеличивало в 2-3 раза
численность клубеньков у бобовых растений, способствовало повышению
азотфиксации и улучшало минеральное питание. При этом образование
клубеньков происходило на более ранних стадиях развития растения.
По аналогии с ризобиями предложены мультикомпонентные инокуляты,
состоящие из микоризных грибов и свободноживущих бактерий. К
настоящему времени получено экспериментальное подтверждение эффективности
таких смешанных культур. Совместное внесение в почву ВАМ и бактерий р.
Pseudomonas увеличило урожай овса и сои на 15-30%, столовой свеклы и
редиса на 30-50%. При этом растения формировали хорошо развитый
фотосинтетический аппарат и, как следствие, у них повышалась фотосинтетическая
активность растений, возрастала азотфиксация и увеличивалась доля
«биологического» азота в урожае [Шабаев и др., 1985; 1999].
При инокуляции растений риса смесью бактерий Azospirillum+Bacillus
нитрогеназная активность в основном обеспечивалась за счет штамма
Azospirillumy а штамм Bacillus принимал участие в разрушении пектиновых
веществ, которые затем использовались азоспириллой. Инокуляция смешан*
ными культурами бактерий достоверно и значительно повышает урожай
растений и улучшает их качество. Урожай кукурузы при инокуляции такими
культурами увеличивался в среднем на 30%, при этом одновременно
возрастало и содержание белка в растениях.
Несмотря на очевидную перспективность использования смешанных
культур в растениеводстве, эти работы не получили пока должного размаха, что
обусловлено сложностью получения и, главное, поддержания таких культур.
2.5. Азотфиксация в кишечнике термитов
Термиты - широко распространенные в природе и населяющие, главным
образом, почву общественные насекомые, играющие важную, часто ведущую
роль во многих экосистемах, где они составляют до 85% суммарной
биомассы. Общий вклад термитов в азотный баланс почв пока не определен, однако
хорошо известно, что во многих африканских странах измельченные гнезда
термитов (термитники) традиционно используют как высокоэффективные
азотные удобрения.
Одной из специфических черт биологии термитов является своеобразие
их диеты, состоящей в природе, главным образом, из растительного
материала. Большинство видов термитов потребляют мертвые древесные остатки,
находящиеся на разных стадиях разложения. Такой растительный материал
содержит не более 0,03-0,15% азота, при этом отношение углерода к азоту
(C/N) может составлять в нем 1000/1. В то же время содержание азота в тка-
58
нях термита составляет -11%, что существенно не отличается от этого
показателя у других животных.
Дж.Кливленд в 1925 году впервые обратил внимание на то, что термиты
способны неопределенно долго жить, питаясь чистой целлюлозой. Он же
впервые высказал гипотезу, согласно которой термиты восполняют
недостаток азота в своем корме за счет атмосферного азота. Тогда это предположение
не получило должной экспериментальной поддержки, и только с появлением
современных методов изучения азотфиксации (ацетиленредукция,
изотопная метка) удалось доказать его истинность. По включению стабильного
изотопа азота (15N) установлено, что до 60% азота, входящего в организм
термита, имеет атмосферное происхождение [Tayasu, 1998].
Поскольку фиксировать атмосферный азот способны только бактерии,
именно они и являются проводниками этого процесса у термитов.
Джон Брезнак [Breznak, 1982] обобщил обширный массив данных по
показателям АФА весьма широкого спектра видов термитов (см. табл. 2.5).
Таблица 2.5
Азотфиксирующая активность термитов
[Breznak, 1982]
Вид термитов
Armitermes sp.
Coptotermes formosanus
1 Coptotermes lacteus
Cornitermes sp.
1 Cryptotermes brevis
Cubitermes sp.
1 Heterotermes sp.
1 Incisitermes sp.
1 Labiotermes sp.
1 Macrotermes ukuzii
1 Mastotermes darwiniensis
Nasutitermes corniger
1 Nasutitermes exitiosus
Nasutitermes sp.
Каста*
P.+C.
P.
С
P.
P.+C.
Kp.
P.
С
P.
С
p.
с
Pen.
P.
С
Pen.
P.
»
С
Вся
колония
p.
»
с.
P.+C.
. [мг фикс. N / г
(жив. Терм.)* сут]
1,44
0,16-49,39
0,03
0,37-1,87
1,06
0,38
0,17
0,00
0,94
0,00
1,00-18,87
0,33
0,66
0,16
0,00
0,00
0,00
0,00-23,47
6,00-8,00
0,90-28,40
27,40-81,68
0,00-5,60
0,20-13,28
0,87-7,44
1,11-18,31
TDN 1
31
283-1
1507
122-24
43
119
265
48
45-2
137
68
282
—
[-1-2
8-6 \
50-2
2-0,5
[-J-88 |
226-3
52-6
41-2
59
Neocapritermes sp.
Reticulitermes flavipes
Rhynchotermes speratus
Trinervitermes trinervoides
Zootermopsis sp.
P.
»
С
P.
С
p.
с
Pen.
P.+Kp.
0,00
0,05
0,02
3,5
<0,5
6,86
4,48-4,73
0,00
0,06
—
904
2260
13
<90
7
10-9
753
* P. - рабочие особи, С. - солдаты, Кр. - крылатые личинки, Реп. - репродуктивные
особи, TDN - время, необходимое термитам для удвоения содержания азота (годы).
Характерной особенностью является широкая вариабельность азотфикса-
ции у разных видов термитов, обусловленная биологией этих организмов.
Например, исходя из представленных в табл. 2.5 данных, трудно
предположить, что азотфиксация может играть существенную роль в жизни R. flavipes,
поскольку время удвоения азота для этих термитов составляет порядка 1000
лет. К подобному же выводу можно прийти, анализируя азотфиксирующую
активность Zootermopsis sp. Напротив, азотфиксация, по-видимому,
достаточно важна для Cryptotermes brevis и других видов термитов, TDN которых
сравнительно невелико.
Репродуктивные крылатые особи, образующие новую колонию, не
обладают азотфиксирующей активностью, хотя содержат повышенное количество
азота в тканях, достаточное для образования новой колонии. При этом,
прежде чем появятся первые рабочие особи, вес родительской пары уменьшается
на 26%.
Можно выделить несколько факторов, которые следует принимать во
внимание для объяснения вариабельности азотфиксации у термитов. Одним их
них, несомненно, является количество азота, содержащегося в корме
термитов, который они получали до проведения измерений. Так, азотфиксирующая
активность Coptotermes formosanus находилась в обратной зависимости от
количества NO3 и NH£ добавленных в корм термитов, а значительное снижение
уровня азотфиксации обнаруживалось уже через 5 ч после изменения диеты
термитов. Очевидно, это связано со скоростью подавления активности и
синтеза нитрогеназы у азотфиксирующих бактерий по мере добавления в
субстрат доступного азота. Изменение нитрогеназной активности у термитов
отражает реакцию азотфиксирующих бактерий на появление доступного
азота в субстрате. Так, например, различия в азотфиксирующей активности у
собранных в природе Rhynchotermes speratus и Nasutitermes corniger вполне
отчетливо связаны с содержанием азота, которого в листовой подстилке
больше, чем в древесине.
По всей видимости, некоторые термиты не нуждаются в азотфиксации
только потому, что корм, которым они питаются в естественных условиях,
содержит хотя и небольшое, но все же достаточное для их развития количество
азота. В литературе имеются многочисленные сведения, согласно которым
лабораторные культуры термитов Reticulitermes, Zootermopsis и Incisitermes
вообще не проявляли азотфиксирующую активность, когда использовали
древесину, предварительно разложенную грибами. Грибы обогащают древесину
60
азотом посредством переноса его из почвы во время мицелиального роста.
Вообще известно, что многие термиты предпочитают потреблять
растительные остатки, содержащие определенное количество грибной биомассы.
Еще одним существенным фактором, определяющим общий уровень азот-
фиксации у термитов, являются сезонные изменения и колебания температуры.
В природе максимальный уровень нитрогеназной активности отмечается
у термитов весной и осенью, при умеренной температуре окружающей среды.
У лабораторных культур термитов, содержавшихся при постоянных
температурах в термостатах, выявлен оптимум, при котором нитрогеназная
активность максимальна - 26°С. При уменьшении или увеличении температуры до
соответственно 22 и 32°С нитрогеназная активность также уменьшалась.
Несмотря на то что уже достаточно давно известно о том, что АФА
термитов обусловлена бактериями-диазотрофами в их кишечнике, в литературе
имеется сравнительно мало данных об этих бактериях.
Из природных популяций термитов Amitermes rhizophagus и Anacantho-
termes turkmenicus выделены бактерии р. Azotobacter, а также длинные
подвижные и веретеновидные палочки со спорами клостридиального типа,
возможно Clostridium pasteurianum.
Затем были описаны азотфиксирующие бактерии Citrobacter freundii из
австралийских видов термитов. К.Потрикус и Дж.Брезнак [Potricus, Breznak,
1980], исследуя симбиотическую азотфиксацию у С. formosanus,
ассоциировали ее с деятельностью Enterobacter agglomerans. Им же из кишечника
термитов удалось выделить азотфиксирующие бактерии p. Treponema, способность
к диазотрофии у которых ранее не отмечалась.
Особенности рациона, обусловленные пониженным содержанием в нем
азота, выработали у термитов определенную стратегию его консервации:
• предпочтение наиболее богатых азотом кормов;
• питание разлагающимися растительными волокнами, вместе с
которыми получают также грибную и бактериальную биомассу;
• эффективную ассимиляцию азота с низким уровнем его экскреции,
включающую использование отходов азотного обмена бактериями.
(Отметим в этой связи, что при помощи бактерий термиты способны реутилизиро-
вать мочевую кислоту и ее производные, которая является конечным
продуктом азотистого обмена у всех наземных насекомых.);
• фиксацию атмосферного азота бактериями в кишечнике. (Как уже
отмечалось, до 60% азота, содержащегося в термите, имеет атмосферное
происхождение.);
• консервацию азота за счет некрофагии и каннибализма; у многих видов
термитов независимо от кастовой принадлежности раненых или больных
особей поедают здоровые представители рода.
2.6. Азотфиксация в желудочно-кишечном
тракте грызунов
Проблема участия животных в почвообразовании и биогенном
круговороте химических элементов - одна из традиционных в почвоведении. Тем не
менее имеются лишь отрывочные сведения о влиянии наиболее широко распро-
61
страненных из них и массовых по численности на микробиологическую
трансформацию азота в почве.
По указанным признакам особо выделяются грызуны, для которых
характерен интенсивный тип использования пространства, когда их группировки в
течение длительного времени используют ресурсы относительно
ограниченных территорий.
Один из самых неясных моментов в питании растительноядных
млекопитающих и в обеспечении их питательными веществами - это механизм
мобилизации азота, поскольку многие из грызунов потребляют травянистые
субстраты, богатые клетчаткой, но бедные белковым азотом. Известно, что
ферментация целлюлозы в пищеварительном тракте животных-фитофагов
осуществляется микросимбионтами - бактериями и простейшими - и
требует большого объема ферментативных камер, наиболее ярким примером
которых является рубец жвачных животных. У мелких млекопитающих быстрая
ферментация обеспечивается комплексом морфофункциональных
механизмов - мелким перетиранием клетчатковых волокон зубами, параллельной
ферментацией клетчатки в преджелудке и слепой кишке, быстрым
продвижением пищи по пищеварительному тракту [Наумова, 1999]. При этом для
успешного усвоения ими углерода в составе целлюлозы и прочих углеводов и
превращения их в полноценную белковую пищу необходим постоянный
приток диетарного азота, которым бедны вегетативные части растений.
Одним из путей обогащения азотом может являться деятельность бакте-
рий-азотфиксаторов, обитающих в пищеварительном тракте и содержимом
кишечника грызунов, однако до последнего времени таких данных не было.
Впервые выяснение их участия в азотном питании грызунов проведено на
красных полевках Clethrionomys rutilus [Наумова и др., 2000]. Контрольных
животных кормили влажными зернами бобовых - горохом и фасолью,
содержавшими много (22,6-23,5%) переваримого сырого белка. Опытная группа,
напротив, получала корм, бедный белковым азотом, - листья одуванчика,
сырые и сушеные яблоки. На наличие азотфиксации проверяли следующие
отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ): преджелудок, слепую кишку
(основные места локализации микросимбионтов - целлюлозолитиков), а также
ободочную кишку, функции которой заключаются в сепарации
бактериальной массы и ее возврате в слепую кишку. Кроме того, исследовали поедаемые
полевками в процессе копрофагии их мягкие фекалии.
Во всех образцах содержимого и тканей пищеварительного тракта (стенки
ЖКТ) красной полевки выявлена азотфиксация разной интенсивности (см.
табл. 2.6).
Таблица 2.6
Активность азотфиксации в разных отделах ЖКТ красной полевки
Clethrionomys rutilus, (нМ С2Н4/г-ч)
Группа
полевок
1 Контроль
Опыт
Преджелудок
содержимое
0,13
0,21
стенки
0,11
1,80
Слепая кишка
содержимое
2,40
4,83
стенки
5,31
2,79
Ободочная кишка
содержимое
6,73
24,39
стенки
1,00
4,65
Мягкие
фекалии
0,36
1,93
62
Сравнительно низкий уровень азотфиксации во всех пробах наблюдался у
контрольных зверьков, получавших достаточное количество белкового азота
с пищей. Напротив, у полевок опытной группы, потреблявших корм с низким
содержанием белкового азота, АТФ была заметно выше.
Самый высокий уровень азотфиксации обнаружен в ободочной кишке
животных этой группы - активность азотфиксации у них примерно в 4 раза
выше, чем у полевок контрольной группы. В преджелудке у контрольной
группы полевок наблюдался наименьший уровень азотфиксации. В преджелудке
у животных опытной группы, хотя и происходит более чем 10-кратное (в
стенках) повышение активности азотфиксации, тем не менее этот орган
ЖКТ, очевидно, не так хорошо приспособлен для функционирования азот-
фиксирующих бактерий, как слепая и ободочная кишка.
В содержимом слепой кишки, а также в мягких фекалиях у полевок
опытной группы активность азотфиксации также выше, чем у полевок
контрольной группы.
Полученные данные свидетельствуют о том, что у красной полевки в
состав симбиоценозов ЖКТ входят сообщества бактерий, способных к
интенсивной азотфиксации.
Примерно такие же данные получены и для других групп грызунов. В
частности, изучали активность азотфиксации в пищеварительном тракте
обыкновенной полевки Microtus arvalis - наиболее распространенной во многих
экосистемах и длительно использующей ресурсы относительно ограниченных
территорий [Белов и др., 2002]. Высокий уровень азотфиксации был характерен
для большинства отделов пищеварительного тракта, а максимальная величина
процесса отмечена для содержимого слепой и ободочной кишок (см. табл. 2.7).
Таблица 2.7
Азотфиксация в пищеварительном тракте обыкновенной полевки
(Microtus arvalis), нмоль С2Н4/г«ч
Образец
Преджелудок
Ободочная кишка (содержимое)
Ободочная кишка (стенки)
Слепая кишка (содержимое)
1 Слепая кишка (стенки)
Азотфиксация
0,21 + 0,08
3,31 ± 0,28
5,48 ± 0,35
3,79 ± 0,39
7,17 ± 0,55 |
Именно содержимое этих кишок составляет основную часть экскрементов
животных, вследствие чего они оказывают заметное влияние на баланс азота
в почве в местах их поселений. Кроме того, высокий уровень азотфиксации в
кишечнике полевки косвенно свидетельствует о важной роли ее в азотном
питании этих грызунов.
2.7. Заключение
Понимание глобальной роли микробной азотфиксации пришло не сразу -
долгое время ее вообще не принимали во внимание при расчете баланса азо-
63
та в биосфере. Основной причиной было отсутствие прямых оценок
активности и масштабов процесса в природной среде и бытовавшее представление
об ограниченной способности микроорганизмов к азотфиксации.
Широко распространенный метод определения азота по Кьельдалю
малоприменим для изучения азотфиксации, поскольку требует длительной (до
нескольких суток) инкубации образцов в замкнутом объеме. Ранее его
использовали в исследованиях прироста концентрации азота в безазотных
питательных средах при культивировании микроорганизмов, что нередко
приводило к ошибочным результатам. В частности, именно так получено
«подтверждение» способности высших животных (эмбрионов кур, перепелок и
пр.) к мобилизации атмосферного азота (работы М.И. Волского в 1960-
1975 гг.), позднее полностью опровергнутое.
Внедрение в аналитическую практику изотопов азота (стабильного 15N и
радиоактивного 13N) не упростило задачу, что связано с особенностями этих
изотопов.
Для включения изотопной метки 15N2 в клетки диазотрофных бактерий в
аналитически необходимом количестве требуется от нескольких часов до
1 сут инкубации в замкнутом объеме, что делает практически невозможным
проведение исследований азотфиксации в природной среде или на
природных образцах.
Радиоактивный изотоп азота 13N имеет очень короткий период
полураспада (10,8 мин), и это является главным препятствием для его применения на
практике.
Разработанный в конце 1970-х гг. ацетиленовый метод определения
азотфиксации впервые позволил проводить измерения в условиях, близких к
природным, - в образцах почв, воды, илов, у живых животных и др., что
обусловлено его особенностями. Среди них особо следует выделить высокую
чувствительность (10"9 М) и относительную простоту метода, позволяющие
осуществлять измерения при кратковременной инкубации образцов,
проводить их на выборках большого объема, с большой повторностью и получать
достоверные результаты.
Однако ацетиленовый метод также имеет ряд ограничений. Главный из
них связан с тем, что молекулы ацетилена и молекулярного азота мало схожи
между собой по многим физико-химическим свойствам. Кроме того, как
отмечалось, этот метод практически неприменим для определения активности
альтернативных нитрогеназ.
Несмотря на эти ограничения, именно метод ацетиленредукции позволил
впервые получать большие объемы информации об особенностях
азотфиксации в самых разнообразных экосистемах и при различных сочетаниях
условий, что привело не только к скачкообразному количественному росту
знаний, но и к качественной их переоценке. Способность к азотфиксации
обнаружена у широчайшего набора прокариот, как архей, так и бактерий, что
принципиально изменило существовавшие представления о роли и месте
этого процесса в живом мире. Наряду с переоценкой роли азотфиксации в
биосфере существенно обновились подходы к ее практическому
использованию. Все большее распространение получают новые и нетрадиционные
методы регуляции азотфиксации - инокуляция смешанными культурами, пара-
нодуляция, применение ростстимулирующих бактерий и пр. Кроме того,
64
выяснение тесной взаимосвязи микробной азотфиксации с фотосинтезом у
растений позволило по-новому объяснить хорошо известные в
растениеводстве и агрохимии эффекты - высокие урожаи на фосфорно-калийных агро-
фонах, явление «экстраазота» и др. [Умаров, 1986].
Наконец, впервые удалось подойти к оценке масштабов азотфиксации в
природных средах, что выявило ведущую роль экосистем суши не только по
размерам мобилизации атмосферного азота, но и по их роли в азотном
балансе биосферы. Почвы, являясь местом максимальной концентрации бактерий-
диазотрофов, играют роль главного биогеохимического реактора,
снабжающего биосферу доступными соединениями азота.
Литература
Белов Л.П., Костина H.B.t Наумова Е.И., Умаров ММ. // Изв. АН. Сер. би-
ол.,2002,№1,с. 102-105.
Глаголева О.Б., Ковальская Н.Ю., Лобакова Е.С., Умаров ММ. // Микроби-
ол., 1997, т. 66(4), с. 545-552.
Глаголева О.Б., Лобакова Е.С., Ковальская Н.Ю., Умаров ММ. // Докл. АН,
1998, т. 362(2), с. 283-285.
Емцев В.Т., Чумаков М.И. // Микробиол. журн., 1988, т. 50(3), с. 93-102.
Завалин А.А. Биопрепараты, удобрения и урожай. М.: Изд-во ВНИИ
агрохимии, 2005. 302 с.
Заварзин ГА. Лекции по природоведческой микробиологии. М.: Наука,
2003. 230 с.
Зинченко В.В. // Генетика, 1999, т. 35, с. 1495-1510.
Киликовский В.В., Умаров ММ. // Вестн. МГУ. Сер. 17, 1993, №1, с. 62-64.
Ковда В.А. Биогеохимия почвенного покрова. М.: Наука, 1985. 263 с.
Кретович В.Л. Биохимия усвоения азота воздуха растениями. М.: Наука,
1995,137 с.
Львов Н.П. Молибден в ассимиляции азота у растений и микроорганизмов.
М.: Наука, 1989.135 с.
Наумова ЕМ. // Экология в России на рубеже XXI века. М.: Научный мир,
1999. С. 181-212.
Наумова Е.И., Ушакова Н.А., Мещерский И.Г., Костина Н.В., Умаров ММ. //
Изв. АН. Сер. биол., 2000, №3, с. 329-331.
Ньютон В. // Rhizobiaceae - молекулярная биология бактерий
взаимодействующих с растениями. СПб.: 2002. С. 175-186.
Скворцова Н.Г} Умаров ММ., Костина Н.В. // Микробиол., 1998, т. 67(2),
с. 244-248.
Тихонович И.А., Проворов Н.А. (ред). Rhizobiaceae - молекулярная
биология бактерий, взаимодействующих с растениями. СПб., 2002. 567 с.
Умаров ММ. // Почвоведение, 1976, №11, с. 119-123.
Умаров ММ. // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1979, №6, с. 42-47.
Умаров ММ. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во МГУ, 1986. 136 с.
Умаров ММ. Перспективы развития почвенной биологии. М., 2001.
С. 47-56.
65
Умаров ММ., Коновалова О.Е., Шабаев В.П. // Биологический азот в
сельском хозяйстве СССР. М.: Наука, 1989. С. 116-124.
Умаров ММ., Шабаев В.П., Смолин В.Ю. // Изв. АН СССР. Сер. биол.,
1987, №2, с. 254-263.
Умаров ММ., Шабаев В.П., Коновалова О.Е., Смолин В.Ю. // Почвоведение,
1990, №7, с. 136-141.
Хотянович А.В. // 9-й Баховский коллоквиум по азотфиксации. 1995.
С. 101-104.
Шабаев В.П., Умаров ММ., Смолин В.Ю. Количественная оценка
микробиологической азотфиксации и роли атмосферного азота в питании небобовых
и бобовых растений. Пущино, 1985. 35 с.
Шабаев В.П., ОлюнинаЛ.И., Смолин В.Ю. // Изв. АН. Сер. биол., 1999, №1,
с. 39-46.
Шумный В.К. (ред.) Биологическая фиксация азота. Н.: Наука, 1991.145 с.
Berks B.C., Fergusson S.J., Morr J.W. // Biochim. Biophys. Acta, 1995,
vol. 1232(3), p. 97-173.
Bouwman A.F. Soils and the Greenhouse Effect. J.Wiley & Sons, 1990. P. 501.
BreznakJA. // Ann. Rev. Microbiol. 1982. P. 323-343.
Burns R.Y. //J. Biol. Chem., 2003.
Burdman S., Vedder D., German M. // Proc. XI Inter. Congr.on Nitrogen
Fixation, 1998. P. 609.
Coocking E.C., Davey M.R. // Chemistry and Industry, 1993. P. 831-835.
DobereinerJ. // Isotop. Biol. Dinitrogen Fixat. Proc. Vienna, 1979. P. 51-69..
DobereinerJ. //J. Brazil. Associat. For the Advanc. Of Sci., 1992. vol. 44(5).
P. 345-349.
Gallon J.R., Cheng J., Dougherty L.J. // FEBS Lett., 2000, vol. 468, p. 231-233.
Glagoleva O.B., Kovalskaya N.U., Umarov MM. // Endosymbiosis and Cell
Res., 1996, vol. 11, p. 147-158.
HuangJJ., WangD.Y., DongZ.G. //J. Acta Bot. Sin., 2001, vol. 43, p. 918-922.
Kennedy I.R., Zeman A., Tchan Y. // Abst 14 Iner. Congr. Soil Sci., 1990, vol. 3,
p. 146-151.
Nie Y.E. // Nature J. Chinese., 1983 vol. 6, p. 36-326.
Okon Y., Bar T. // Can. J. Microbiol. 1993. №1. P. 81-86.
Potricus С J., BreznakJA. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. vol. 78. №7.
P. 4601-4605.
Ribbe M., Gadkar D., Meyer O. // J. Biol. Chem., 1997, vol. 272,
p. 26627-26633.
Romanenko GA. // Boil. Plant-Microbe Interact. St.-Petersburg. 2003.
P. 19-23.
Tayasu I. // Ecol. Res., 1998, №13, p. 23-28.
66
Глава 3. НИТРИФИКАЦИЯ В ПОЧВАХ
3.1. Введение
После установления А.Шлезингом и Ш.Мюнцем биологической природы
нитрификации в 1877 году многие исследователи предпринимали попытки
изолировать микроорганизмы, осуществляющие этот процесс. Однако при
использовании богатых органическими веществами питательных сред не
удавалось обнаружить нитриты и нитраты в количествах, соответствующих
интенсивности нитрификации в почвах. В 1890-1892 гг. С.Н. Виноградский
[1952], используя строго минеральные среды, впервые выделил чистые
культуры нитрифицирующих бактерий и, более того, показал, что существуют две
группы нитрификаторов - одна активно окисляет аммоний до нитрита,
другая - нитрит до нитрата, и доказал, что нитрифицирующие бактерии
являются хемолитоавтотрофами, получающими энергию для биосинтетических
целей при окислении аммония и нитрита, а в качестве источника углерода
использующими С02. Значительно позднее установлено, что многие
гетеротрофные микроорганизмы, в том числе и грибы, могут тоже продуцировать
нитрит и нитрат, окисляя аммоний и иные восстановленные органические и
неорганические соединения азота.
Таким образом, в настоящее время нитрификация определяется как
биологический процесс окисления аммония узкоспециализированными хе-
молитоавтотрофными бактериями в нитриты и затем в нитраты, а в случае
гетеротрофных микроорганизмов - и разнообразных органических
азотсодержащих соединений. Деятельность нитрифицирующих
микроорганизмов является главным источником нитратов в почве и биосфере.
Исключение составляют несколько химических реакций образования нитратов из
оксидов азота в атмосфере, не играющих заметной роли в природе.
Микробная трансформация азотсодержащих соединений в нитраты прямо
влияет на интенсивность других процессов цикла азота. С одной стороны,
повышенные концентрации нитратов в почвах усиливают денитрификацию и
минерализацию органических веществ, а с другой - снижают поступление
азота в почву за счет азотфиксации и эффективность его микробной
иммобилизации [Кудеяров, 1999а]. С классических работ Д.Н. Прянишникова
[Прянишников, 1945; Петербургский, 1971] известно, что аммоний является более
предпочтительной формой азота для питания растений, поскольку нитраты
необходимо восстанавливать в аммоний, что требует дополнительных затрат
энергии. Однако это преимущество аммония часто не является
определяющим для растений, так как интенсивность ассимиляции аммония или нитра-
67
тов зависит еще от свойств почвы (рН, содержания катионов, соотношения
аммония и нитратов), фазы развития и особенностей биологии конкретных
видов растений. На слабокислых почвах более эффективны нитратные
удобрения, на нейтральных почвах - аммиачные удобрения в связи с отсутствием
негативного эффекта от их быстрого подкисления. В начальные фазы роста
растений оптимальным источником азота являются нитраты, а при
достаточном развитии листовой поверхности и, соответственно, высоком уровне
синтеза углеводов - аммиачный азот, так как устраняется накопление в клетках
растений аммиака в токсичных концентрациях.
Во многих природных экосистемах, особенно находящихся на последних
стадиях сукцессии (хвойные леса, луговые степи), аммонийный азот в почвах
преобладает над нитратным, а растения адаптированы к преимущественному
усвоению аммонийного азота.
В агроэкосистемах большинство сельскохозяйственных культур
энергичнее потребляют из почвы нитратный азот. Одна из причин этого - более
активное поступление питательных элементов в форме катионов в растения
при ассимиляции нитратов и изменение соотношения аммония и нитратов
при окультуривании почв. Улучшение физико-химических свойств,
происходящее при окультуривании почв, обусловливает повышение доли нитратов в
запасах минерального азота - с 20% в почвах с низким плодородием до 60% в
хорошо окультуренных почвах, а при внесении азотных удобрений и до 90%.
В большинстве случаев это обусловлено не столько использованием
нитратных удобрений, сколько интенсификацией нитрификации в почвах, посколь1
ку оптимумы условий для возделывания сельскохозяйственных культур и
процесса нитрификации сходны. Поэтому неслучайно, что высокую
нитрифицирующую активность уже давно используют как один из показателей
хорошего плодородия почв.
Вместе с тем избыточное образование нитратов в почвах агроэкосистем, а
в ряде случаев и в почвах природных экосистем, является причиной
многочисленных проблем, которые непосредственно касаются здоровья человека и
устойчивого функционирования биосферы. Нитраты легко теряются из
почвы - вымываются из почвенных горизонтов в грунтовые воды или
улетучиваются после восстановления микроорганизмами до N20 и N2 при денит-
рификации. Газообразные потери азота в форме N20 происходят и
непосредственно в ходе нитрификации. Поступление нитратов в подземные воды и
водоемы ухудшает качество питьевой воды и вызывает эвтрофикацию
водоемов, высокое содержание нитратов в аэрозолях приводит к кислотным
дождям, респираторным заболеваниям и другим негативным последствиям, а
возрастание эмиссии N20 из почв усиливает парниковый эффект и
разрушение озонового слоя атмосферы [Кудеяров, 19996].
Накопление нитратов в питьевой воде и растениях (особенно овощных и
кормовых) и передача их по пищевым цепям вызывает серьезные
медико-биологические проблемы. Чрезмерное поступление нитратов в организм
человека нарушает проницаемость мембран эритроцитов, повышает количество
холестерина в крови, снижает резистентность организма к действию
мутагенных и канцерогенных агентов. Образующиеся из нитратов нитриты и окись
азота вызывают метгемоглобинемию, нитрозосоединения обладают
канцерогенным действием. По существующим оценкам, в настоящее время нитратная
68
нагрузка на человека в разных странах колеблется от 50 до 300 мгДчел. • сут)
и продолжает возрастать.
Сложность ситуации состоит в том, что, хотя нитраты - основной
источник азотного питания сельскохозяйственных растений, при интенсивных
системах земледелия возникают условия их избыточного образования в
почве, что приводит к серьезным экологическим и медико-биологическим
последствиям. Для предупреждения заболеваний, связанных с нитратами,
актуальным остается изучение причин их аккумуляции в почвах, воде,
растениях, выявление путей поступления в организм человека и животных,
разработка нормативов ПДК для компонентов окружающей среды и
сельскохозяйственной продукции.
Решение этой комплексной проблемы может быть найдено в ходе
углубленного изучения эколого-физиологических особенностей микроорганизмов-
нитрификаторов и определения влияния природных и антропогенных
факторов на активность нитрификации в почвах, что позволит более успешно вести
поиск приемов землепользования, не допускающих накопления нитратов в
почвах и растениях в опасных для человека и биосферы концентрациях.
3.2. Физиолого-биохимические особенности
нитрификаторов
3.2.1. Автотрофные нитрифицирующие бактерии
Процесс автотрофной нитрификации осуществляется аммоний- и нитри-
токисляющими бактериями и описывается следующими уравнениями:
NH+ + 1,502 -> N02(N20) + Н20 + 2Н+, AGo - -272 кДж/моль,
N02 + 0,5О2 -> NO3, AGo - -73 кДж/моль.
Среди автотрофных нитрифицирующих бактерий встречаются штаммы,
которые лучше растут при парциальном давлении кислорода, более низком,
чем в воздухе, a Nitrobacterwinogradskyi и Nitrobacter hamburgensis -
факультативные анаэробы. Нитрифицирующие бактерии развиваются на средах в
диапазоне рН 5,8-9,0, с оптимум рН чаще всего 7,5-8,0. Температурный
оптимум - 25-30°С, лишь для некоторых штаммов - 38-40°С, а среди изолятов
Nitrosomonas europeus известны культуры, способные быстро расти при 4°С
[Кондратьева, 1996].
Большинство нитрифицирующих бактерий - облигатные хемолитоавтот-
рофы, рост которых ингибируется органическими соединениями в
концентрациях, обычных для культивирования гетеротрофов. Вместе с тем опыты с
14С-меченными соединениями показали, что некоторые из них - Nitrosomonas
europea, Nitrosococcus осеапш, Nitrosolobus multiformis - могут использовать
формиат, ацетат, пируват, аланин, глутамат, глюкозу и ряд других
органических соединений. Однако углерод этих соединений включается только в
отдельные компоненты клеток и в меньшем количестве, чем из диоксида угле-
69
рода, и, самое главное, они не обеспечивают энергетических потребностей
бактерий. Основным источником углерода у автотрофных нитрификаторов
является С02, ассимиляция которого осуществляется в восстановительном
пентозофосфатном цикле. Исключение составляют Nitrobacter vulgaris,
который хуже растет в хемолитоавтотрофных, чем в хемоорганогетеротрофных
условиях, и Nitrobacter hamburgensis, способный к росту в миксотрофных
условиях. При росте в миксотрофных условиях Nitrobacter winogradskyi и
Nitrobacter vulgaris сначала окисляют нитрит и только затем органические
соединения. У Nb. hamburgensis использование органических веществ и
нитрита идет одновременно. Способность некоторых видов нитробактеров
использовать органические соединения как источники энергии и углерода
определяется наличием у них всех ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК),
тогда как у облигатно автотрофных видов (например, Nitrosomonas europea и
Nitrosolobus multiformis) ЦТК функционировать не может из-за отсутствия
ключевого фермента - кетоглутаратдегидрогеназы.
В качестве источников азота нитрифицирующие бактерии используют
аммоний. Некоторые виды ассимилируют гидроксиламин, нитриты и
нитраты. Образование ассимиляторных нитрат-, нитритредуктазы известно у
Nitrobacter winogradskyi. Штаммы Nitrobacter xmnogradskyi и других видов
этого рода могут обладать способностью расти на средах с пептоном, гидролиза-
том казеина и дрожжевым экстрактом в качестве источников азота.
Nitrobacter europaea утилизирует в качестве источника азота гидроксиламин,
нитриты, но не нитраты. Представители Nitrosococcus sp. и Nitrosomonas sp:
могут проявлять уреазную активность [Кондратьева, 1996].
Большинство данных относительно биохимического механизма первой
фазы нитрификации получено при изучении бактерии Nitrosomonas europaea.
Энергетическим субстратом у нее является аммиак и превращение его в
нитрит идет в ходе двух последовательных реакций:
NH3 + 02 + НАД • Н2 -> NH2OH + Н20 + НАД+,
NH2OH + 02 -> N02 (N20) +. Н20 + Н+.
Первая из этих реакций, приводящая к образованию гидроксиламина,
является эндергонической. Ключевой фермент хемолитоавтотрофного
окисления аммония - мембранно-связанная Cu-содержащая аммониймонооксиге-
наза, которая катализирует присоединение к молекуле аммиака 1 атома 02, а
второй взаимодействует, вероятно, с НАД • Н2, что приводит к образованию
Н26. Гидроксиламин высвобождается в периплазматическое пространство
бактериальной клетки и далее окисляется до нитрита (и до закиси азота) гид-
роксиламиноксидоредуктазой. Аммониймонооксигеназа, катализирующая
окисление аммиака, может участвовать в гидроксилировании и ряда других
субстратов, которые не обеспечивают рост нитрификаторов. К их числу
относятся монооксид углерода (СО), метан, некоторые неполярные органические
соединения - углеводороды и спирты. Многие из них являются
ингибиторами окисления аммония. С другой стороны, известно, что монооксигеназы ме-
танокисляющих бактерий катализируют окисление не только метана, но
также NH3 и ряда других соединений.
Гидроксиламиноксидоредуктаза у Nitrosomonas europea локализована в пе-
риплазматическом пространстве. Это гемопротеин, который имеет молеку-
70
лярную массу 200 кД и состоит из (ХзРз~сУбъединиц. Помимо гемов с-типа в
него входит Р-460, также относящийся к гемовым соединениям. Окисление
гидроксиламина сопряжено с функционированием дыхательной электронт-
ранспортной цепи (ЭТЦ), в которую входят цитохромы с и а:
NH2OH -» цит. с-554 -> цит. с-552 -» цит. ах —> 02.
Электроны могут поступать в ЭТЦ при окислении HNO и NO до N02.
В ЭТЦ нитрифицирующих бактерий, окисляющих гидроксиламин, также
может входить убихинон - цитохром бс-комплекс [Кондратьева, 1996].
Четыре электрона, высвобождающихся при окислении гидроксиламина,
участвуют в окислении аммиака в ЭТЦ и ассимиляции С02. Действие дыхательной
системы ведет к созданию разности трансмембранного электрохимического
потенциала и синтезу АТФ. Часть энергии, видимо, расходуется на
образование восстановленного НАД, необходимого для биосинтетических реакций.
Кроме того, окисление гидроксиламина, связанное с ЭТЦ, обеспечивает
функционирование монооксигеназы, которая катализирует превращение
NH3 в NH2OH, так как при этом происходит образование донора электрона,
взаимодействующего с указанным ферментом.
Вторую фазу процесса - окисление нитрита до нитрата, осуществляет
мембранно-связанный фермент нитритоксидоредуктаза, обнаруженный у
бактерий рода Nitrobacter [Кондратьева, 1996]. В ее состав входит молибдоп-
терин и железосодержащие кластеры. Превращение нитрита в нитрат
происходит при участии воды и связано с функционированием ЭТЦ, в которую
входят цитохромы a, q (с-550) и аа$.
N02 —» цит. а\ —> цит. q —> цит. аа3 —* Н20.
Окисление N02 до NO3 - процесс обратимый. Нитритоксидоредуктаза
присутствует у нитробактера не только при его росте в аэробных хемолитот-
рофных условиях и наличии N02, но и в клетках, выросших на органических
средах с NO3, а при низком р02 и без нитрата.
Итак, синтез АТФ у автотрофных нитрификаторов происходит в
результате окислительного фосфорилирования при переносе электронов с NH^h
N02 на 02 по дыхательной цепи, а источником углерода является С02
(растворенные в воде карбонаты).
Низкий окислительно-восстановительный потенциал пары NH4/NH2OH,
NH2OH/N02 и N02/N03 обусловливает функционирование короткой
электрон-транспортной цепи, и потому для приращения биомассы на 1 мг
бактерии p. Nitrosomonas окисляют 35 мг N-NH4, a p. Nitrobacter - до 100 мг N-N02
[Кондратьева, 1996].
Оптимальные концентрации аммония для энергетического метаболизма у
разных штаммов автотрофных нитрификаторов варьируют от 2,0 до 50,0 мМ,
нитрита - от 2,0 до 10 мМ. Максимальная скорость нитрификации и
концентрация конечных продуктов у автотрофных нитрификаторов достигает
соответственно, 1000—70 000 мг N/(r • сут) или и 2-4 мг N/мл среды. Важным
компонентом среды, который может существенно лимитировать активность
нитрификации в природе, является содержание фосфора. В чистой культуре
оптимальная концентрация фосфора для Nitrosomonas лежит в диапазоне
300-3000 мг/л, для Nitrobacter - 300-900 мг/л, и ее снижение ведет к
существенному увеличение лаг-периода [Verstraete, 1981].
71
3.2.2. Гетеротрофные нитрифицирующие микроорганизмы
В отличие от автотрофных нитрификаторов гетеротрофные
микроорганизмы способны окислять не только соли аммония, но и азот различных
органических соединений с образованием широкого спектра соединений - гид-
роксиламина (NH2OH), аминооксимов (R3NO), гидроксамовых кислот (R-
CONH2OH), нитрозосоединений (R2N-NO), нитросоединений (RCH2-N02),
нитритов и нитратов. Для гетеротрофов процесс не является энергодающим
и не связан непосредственно с клеточным ростом, вследствие чего
нитрифицирующая активность у них значительно ниже, чем у автотрофных
нитрифицирующих бактерий.
К настоящему времени предложено несколько биохимических
механизмов гетеротрофной нитрификации. Основное отличие между гетеротрофным
и автотрофным окислением аммония в гидроксиламин состоит в источнике
электронов для гидроксилирования: у гетеротрофов это органические
вещества, у автотрофов - сам гидроксиламин. Процесс гетеротрофного окисления
аммония рассматривают как результат действия бифункциональной
медьсодержащей ферментной системы, сходной по свойствам с аммониймоноокси-
геназой и тирозиназой. Проявление той или иной активности регулируется
активностью дыхательной цепи [Сорокин, 1990].
Гетеротрофные бактерии Paracoccus denitrificans, Thiosphaera pan-
toiropha (пересмотрены как Paracoccus denitrificans), Alcaligenes faecalis,
Pseudomonas putida обладают аммоний- и гидроксиламинокисляющими
ферментами, имеющими значительное сходство с ферментами автотрофных
нитрификаторов. Многие почвенные денитрифицирующие бактерии
являются гетеротрофными нитрификаторами [Castignetti, Hollocher, 1984].
Некоторые из них (Thiosphaera pantotropha) способны осуществлять
одновременно гетеротрофную нитрификацию и аэробную денитрификацию.
Поэтому их нитрификационный потенциал не может быть оценен исходя из
накопления нитратов и был определен на основе полного баланса азота.
Максимальная активность окисления аммония у Thiosphaera pantotropha составляла
93,9 нМ NH3 мин-1 • мг белка"1, что всего лишь на порядок ниже по сравнению
с автотрофными нитрификаторами [Robertson et al., 1988]. Предполагается,
что такая комбинация нитрификации и денитрификации используется для ре-
циклизации восстановленных эквивалентов (НАДН) в условиях недостатка
кислорода. За счет этого бактерия может поддерживать высокую скорость
роста и получить преимущество в условиях избыточного количества субстратов.
До настоящего времени не установлено, является ли окисление аммония
главной каталитической функцией аммониймонооксигеназаподобных
ферментов у гетеротрофных микроорганизмов, так как они могут окислять и
многие другие субстраты.
Метанокисляющие микроорганизмы, и особенно облигатные метанот-
рофные бактерии, также способны окислять аммоний до гидроксиламина и
далее до нитрита благодаря широкой субстратной специфичности метанмо-
нооксигеназы. Предполагается, что окисление аммония у многих других
гетеротрофов имеет сходный механизм.
В природе одними из наиболее активных членов гетеротрофного
нитрифицирующего сообщества являются микроскопические грибы. Предпола-
72
гается, что биологический смысл гетеротрофной нитрификации для грибов
состоит в «сбросе электронов» при холостом окислении органических
веществ, а функции оксигенирования у них могут выполнять помимо
отмеченных выше и ферментные системы типа фенолоксидазы (тирозиназы).
Популярной является теория перекисного механизма, согласно которой
выделяющиеся при разложении Н202 пероксидазой и каталазой активные формы
кислорода (супероксидный и гидроксидные радикалы) окисляют
различные соединения азота. Полагают также, что соединения азота реагируют с
гидроксил-радикалами, образующимися в присутствии перекиси водорода
и супероксида. Такие условия могут возникать при лизисе клеток и
деградации лигнина, когда оксидазы и пероксидазы высвобождаются в окружающую
среду. Высокоактивные фенолоксидаза и пероксидаза выявлены у базиди-
альных дереворазрушающих грибов и подавляющего большинства микроми-
цетов верхних горизонтов почв, опада и подстилки. Активные продуценты
каталазы широко распространены среди типичных почвенных видов микро-
мицетов pp. Penicillium, Aspergillus, Talaromyces, Myrothecium и др. [Кураков и
др., 2001].
Установлено, что добавка пептона в лесную почву стимулировала
образование N20 и нитратов, и уже небольшие концентрации циклогексимида
существенно снижали продукцию N20, а это указывает на возможную роль
грибов в эмиссии N20 [Castaldi, Smith, 1998]. Вместе с тем ацетилен
эффективно блокировал выделение N20 и частично образование нитратов, из чего
можно заключить о возможной роли аммониймонооксигеназы в
органическом/неорганическом пути нитрификации у грибов.
Физиологическое значение нитрификации у гетеротрофов до конца не
понято. Нитрификация рассматривается также как защитный механизм,
позволяющий грибам избежать токсического воздействия нитрита или перекиси
водорода. Хонда с соавторами [Honda et al., 1998] полагают, что для
гетеротрофных нитрифицирующих бактерий, способных к денитрификации,
образование N-оксидов может представлять механизм ингибирования роста
микроорганизмов-конкурентов. Аналогичное мнение высказывалось ранее и для
других групп гетеротрофных нитрификаторов. Так, среди продуктов
окисления аммония и органических соединений азота грибами многие являются
физиологически активными веществами с антибиотическим, фитотоксичес-
ким, канцерогенным, стимуляторным действием [Кураков, Попов, 1995].
Альтернативное объяснение базируется на том, что нитрит и нитрат -
побочные продукты, или интермедиа™ дополнительного пути, используемого
для образования гидроксамовых кислот, которые играют важную роль в
связывании железа в хелатные комплексы, переносе и запасании в клетках.
Показано, что среди микроскопических грибов широко распространена
способность к синтезу гидроксамовых кислот в условиях, благоприятных для
нитрификации [Кураков и др., 1995]. Эти соединения появлялись в среде ранее
нитритов и нитратов.
Образование гетеротрофными микроорганизмами гидроксамовых
кислот, аминооксимов, нитро- и нитрозосоединений справедливее
рассматривать не только как процесс окисления азотных соединений, но и синтез
физиологически активных веществ (сидерофоров, антибиотиков, токсинов,
стимуляторов роста).
73
3.3. Анаэробное окисление аммония (анаммокс)
Обнаружение новой группы анаэробных нитритзависимых аммонийо-
кисляющих бактерий (анаммокогруппы и процесса) - одно из крупных
открытий в области изучения цикла азота в биосфере в последние годы
[Mulder et al., 1995; Kuenen, Jetten, 2001].
Первые несколько лет исследования были сфокусированы на доказательстве
микробной природы процесса и главных механизмах азотного и углеродного
метаболизма бактерий [Mulder et al., 1995; Van de Graaf et al., 1997].
Установлено, что получение энергии при анаэробном окислении аммония идет с
нитритом в качестве акцептора электронов и гидразином и гидроксиламином в
качестве интермедиатов (см. рис. 3.1). С02 используется как источник углерода.
Рис. 3.1. Анаэробное окисление аммония (анаммокс) Brocadia-подобными
микроорганизмами: НН - гидразин-гидролаза; HZO - гидразинокисляющий
фермент; NR - нитритвосстанавливающий фермент
В серии экспериментов с 15N раскрыты метаболические пути анаэробного
окисления аммония. На основе балансовых расчетов при развитии
накопительной микробной культуры определена стехиометрия процесса: 1NH4+ +
+ 1,32N02 + 0,066НСО5 + 0ДЗН+ - 1,02N2 + 0,26NO5 + 0,066CH2O0 5N015 +
+ 2,03Н2О.
Анаммокс протекает при температурах от 6 до 43°С и рН 6,7-8,3 (оптимум
8,0) [Strous et al., 1999] (см. табл. 3.1). Максимальная удельная скорость
потребления аммония (при оптимальных условиях) достигает 55 мкМ NH4+
(г белка • мин)"1, или (3,6 мМ (г белка • мин)"1, удельная скорость роста
около 0,0027 ч"1, константы сродства с субстратами - аммонием и нитритом -
<10 мкМ. Концентрации аммония и нитрата в 100 мМ не ингибируют
процесс. Анаммокс подавляется при концентрации нитрита >20 мМ. При
поддержании концентрации нитритов >5 мМ в течение периода, превышающего
12 ч, проявления анаммокс-активности исчезают. Однако активность
культуры восстанавливается при добавлении следовых количеств (50 мкМ)
гидразина и гидроксиламина. Процесс полностью ингибируется кислородом при
его содержании в воздухе 0,5%.
Умеренная ультразвуковая обработка и градиентное центрифугирование
обогатительной культуры позволили провести физическое изолирование
74
клеток бактерий, ответственных за анаммокс-процесс. Активность
анаэробного окисления аммония изолированными клетками зависела от их
плотности и добавки интермедиатов анаммокс-процесса, гидразина и гидроксилами-
на. Филогенетический анализ 16S рДНК у изолированных бактерий показал,
что они группируются в новую ветвь в порядке Plactomycetales. В настоящее
время среди анаммокс-бактерий дифференцировано три рода: Brocadia,
Kuenenia и Scalindua. Применение FISH-метода продемонстрировало
доминирование этих бактерий в экосистемах с высокими потерями азота.
Представители первых двух родов обнаружены в системах обработки сточных вод,
а р. Scalindua, кроме того, и в морских экосистемах, в Черном море. Планкто-
мицеты, по-видимому, одна из древних групп бактерий, имеющих
уникальные свойства. У Brocadia anammoxidans в протеиновой клеточной стенке
отсутствует пептидогликан. Они характеризуются медленной скоростью роста,
делятся почкованием раз в 11 сут, имеют цитоплазму, дифференцированную
на компартменты, которые ответственны за различные функции клетки.
Один из ключевых ферментов анаэробного окисления аммония - гидрок-
силаминоксидоредуктаза. Из Brocadia anammoxidans был получен в
очищенном виде энзим, который катализирует окисление гидразина и гидроксила-
мина. Фермент расположен в мембранно-ограниченной, органеллоподобной
структуре, называемой анаммоксома. Она занимает 30% объема клетки.
Постулировано, что анаммоксома представляет собой резервуар с двойной ли-
пидной оболочкой для гидразина.
Таблица 3.1
Физиологические параметры анаэробного
и аэробного окисления аммония
Параметр
Максимальная удельная
скорость аэробного
окисления NHj
Максимальная удельная
скорость анаэробного
окисления NHj
| Урожай биомассы
Энергия активации
Сродство с аммонием
Сродство с аммиаком
Ингибирование
нитритом окисления аммония
1 Ингибирование
нитритом потребления нитрита
1 Температурный диапазон
рН диапазон
I Содержание белка в
биомассе
1 Плотность белка в
| биомассе
Анаммокс
0
1,1
0,07
70
<10"4
<10"4
/Сг«0,8,
а «0,8
Ki**l,
а «0,7
20-43
6,7-8,3
0,6
50
Нитрификация
2-5
<0,05
0,1
70
>ю-4
-
Обычно
-
<42
Варьирует
»
»
Единицы измерения
r NH4-N (г белка • сут)"1
r NH4-N (г белка • сут)1
г белка • r NHJ-N"1
kj ■ М-*
rNHJ-N-л-1
гЖ^-л-1
гЫО^-л-1
гЫО^-л-1
°С
г белка • г сух. в"1
г белка • л биомассы"1
75
Для условий лимитированного снабжения кислородом (<0,5%) была
получена смешанная культура аэробных и анаэробных аммонийокисляющих
бактерий. Эта культура превращала аммоний непосредственно в
молекулярный азот с нитритом в качестве интермедиата [Third et al., 2001].
Использование такого подхода (completely autotrophic nitrogen removal over nitrite -
CANON) позволяет проводить полное удаление аммиака в одном «автотроф-
ном» реакторе, посредством двух групп микроорганизмов, осуществляющих
две последовательные реакции.
Проведенные в последние годы исследования свидетельствуют о
важной роли анаэробного окисления аммония в глобальном цикле азота. В
морских экосистемах анаммокс-бактерии активно участвуют в
трансформации азота, и вклад их в продукцию молекулярного азота может достигать
50%. Анаэробное окисление аммония ответственно за образование 24 и 60%
N2 в осадках континентального шельфа на глубинах соответственно 380 и
695 м. В эвтрофных седиментах мелководной береговой зоны вклад этого
процесса в продукцию N2 был <2% [Thamdrup, Dalsgaard, 2002], в осадках в
устье Темзы достигал 8% и снижался до 1% у морского побережья [Trimmer et
al., 2003]. Получены данные, позволяющие полагать, что анаммокс-бактерии
могут быть ответственны за значительные потери азота из зон океана с
ограниченной обеспеченностью кислородом [Kuypers et al., 2005]. Нельзя
исключать, что анаэробное окисление аммония не вносит вклад в эмиссию
молекулярного азота из почв.
3.4. Экология нитрифицирующих
микроорганизмов
3.4.1. Автотрофные тарификаторы
Автотрофные нитрифицирующие бактерии представлены довольно
ограниченными по видовому разнообразию группами: первая из них -
pp. Nitrosospira, Nitrosomonas (распространены в почвах) и Nitrosococcus
(в морях) - окисляет аммоний до нитритов, вторая - pp. Nitrobacter (в
почвах) и Nitrospina, Nitrospira (в морях) - окисляет нитриты до нитратов [De
Boer, Kowalchuk, 2001]. Окисление аммония является стадией,
лимитирующей скорость автотрофной нитрификации, и по этой причине исследования
последних лет сконцентрированы в большей степени на
аммонийокисляющих, чем на нитритокисляющих бактериях.
Все известные почвенные аммонийокисляющие бактерии принадлежат к
одной монофилетической группе в Р-подклассе Proteobacteria, и, согласно
принятой в настоящее время классификации, в ней признаются только два
рода Nitrosospira и Nitrosomonas. Филогенетический анализ 16S рРНК генов
экстрагированной из почв ДНК праймерами, селективными на
аммонийокисляющие |3-протеобактерии, показал на существование по меньшей мере
семи отличных кластеров, 4 из которых принадлежат к p. Nitrosospira и 3 - к
Nitrosomonas. Бактерии p. Nitrosococcus, осуществляющие окисление аммония
в морях и других водоемах с солоноватой водой, относятся к у-подклассу
76
Proteobacteria. Представители нитритокисляющих бактерий находятся в
различных филогенетических группах: Nitrobacter (а-подкласс Proteobacteria),
Nitrococcus (у-подкласс Proteobacteria), Nitrospina (8-подкласс Proteobacteria)
и Nitrospira (отдельный филум Bacteria). Среди нитритокисляющих бактерий
только представители Nitrobacter обнаружены в почвах, а распространение
других родов не исследовано.
Недавние метагеномные исследования показали, что способность к
окислению аммония не ограничивается только отдельными |J- и у-группами
Proteobacteria. У некультивируемых неэкстремофильных Crenarchaeota
[Francis et al., 2005] обнаружены шиоА-гены уникальной аммониймоноокси-
геназы а-субъединицы. Получены молекулярно-генетические
доказательства широкого распространения аммонийокисляющих архей в морской воде
и седиментах. С использованием ПЦР праймеров, специфических для архей-
ных amoA-генов, аммонийокисляющие археи обнаружены в таких областях
океана, которые очень важны для описания глобального цикла-азота, то есть
в эвтрофной зоне, микроаэробной водной толще, эстуариевых и прибрежных
осадочных отложений. Разнообразные и отличные аммонийокисляющие ар-
хейные сообщества ассоциированы с каждым из этих местообитаний.
Большинство из последовательностей уникальны для каждого места отбора, но
малая часть из них обнаруживалась повсеместно. Полученные результаты
позволяют полагать, что аммонийокисляющие археи могут играть
существенную, ранее неизвестную роль в глобальном цикле азота, и, возможно,
не только в водных, но и в наземных местообитаниях.
Нитрифицирующие бактерии являются одной из самых
распространенных групп хемолитоавтотрофных бактерий, что связано с наличием
восстановленного минерального азота в почвах, воде и горных породах. Наиболее
высока в различных экосистемах численность аммонийокисляющих
микроорганизмов, так как в качестве дополнительного источника энергии они
могут использовать окисление СН4 и СО, а в условиях пониженного
парциального давления кислорода - NO2 как акцептор электронов.
Основным источником доступного для нитрификаторов аммонийного
азота в почве является деятельность азотфиксирующих бактерий и
минерализация органических азотсодержащих веществ. Субстрат для
нитрификаторов I фазы создается также бактериями, способными к диссимилятор-
ному восстановлению нитратов и нитритов в аммоний. Полагают, что
аммоний, образуемый Klebsiella sp. и Vibrio sp. в микроаэробных условиях, может
служить источником энергии для нитрификаторов, развивающихся в илах.
Некоторое количество азота поступает с атмосферными осадками, в
которых содержание аммония достигает 0,5-0,8 мг/л. В горных породах среднее
содержание азота колеблется от 20 до 800 г/т, причем от 50 до 90% находится
в аммонийной форме. Нитрифицирующие бактерии при определенных
условиях способны частично использовать аммонийный азот, заключенный в
кристаллическую структуру алюмосиликатных минералов. В лабораторных
опытах с Nitrospira briensis показано, что за 3-5 сут суспензия клеток
использовала от 1 до 3% азота, заключенного в кристаллической структуре горных
пород и минерала баддингтонита [Ляликова, Лебедева, 1989].
Автотрофные нитрифицирующие бактерии наиболее широко
распространены в хорошо аэрируемых удобряемых почвах. Из аммонийокисляю-
77
щих нитрификаторов в почвах обнаруживали Nitrosomonas europea,
Nitrosospira briensis, Nitrosolobus multiformis, Nitrosococcus mobilis, Nitrosovibrio
tenuis, из нитритокисляющих бактерий - Nitrobacter mnogradskyi и Nitrobacter
agilis. Высокой плотности (102-105 кл./г по методу предельных разведений)
достигают их популяции в выветренных горных породах, ультрабазитах,
глинах, известняках [Ляликова, Лебедева, 1989].
Хотя видовой состав нитрифицирующих бактерий в различных биотопах
изучен недостаточно, тем не менее имеющиеся данные позволяют проследить
определенные закономерности. В обрабатываемых почвах наиболее часто
встречаются представители Nitrosolobus, реже - Nitrosomonas, в полярных
почвах, примитивных почвах и горных породах, кислых почвах под
различной естественной растительностью и полевыми культурами - Nitrosospira,
Предполагают, что спиралевидная форма этого организма, обеспечивающая
большую поверхность, позволяет ему развиваться в средах с низким
содержанием аммонийного азота [Martikainen, Nurmiaho-Lassila, 1985]. В образцах
песчаников различных памятников в Германии самыми многочисленными
аммонийокисляющими нитрификаторами были Nitrosovibrio spp.
присутствовали также Nitrosomonas и Nitrosospira [Meineke et al., 1989], а среди
нитритокисляющих бактерий - Nitrobacter vulgaris, Nitrobacter winogradskyi [Bock
et al., 1990]. Способность образовывать агрегаты (зооглеи), причем в
ассоциации или в непосредственной близости от аммонифицирующих
организмов, позволяет им адаптироваться к условиям кислой почвы [De Boer,
Kowalchuk, 2001].
В последние годы значительный прогресс достигнут в выяснении состава
аммонийокисляющих бактерий в почвах с применением молекулярно-гене-
тических подходов, базирующихся на амплификации последовательностей
16S рРНК генов с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Подтверждено доминирование бактерий рода Nitrosospira в кислых почвах -
сельскохозяйственных и под естественной растительностью [De Boer,
Kowalchuk, 2001]. Наличие Nitrosospira установлено на основе детекции
последовательности маркерного шиоА-гена в кислых почвах сосняков
Голландии. Показано, что Nitrosospira 3-го кластера широко распространены в
окультуренных почвах с высоким уровнем доступного азота, а 1-, 2- и 4-го
кластеров превалируют в кислых, залежных и никогда не обрабатываемых и
не получавших азотные удобрения почвах [Mintie et al., 2003]. Сообщения о
детекции в кислых почвах и подстилках Nitrosomonas-nojio6ubix 16S РНК
последовательностей единичны [Hastings et al., 2000; De Boer, Kowalchuk,
2001]. Очень редко изолировали чистые культуры нитритокисляющих
бактерий из кислых почв, и все они принадлежали к роду Nitrobacter. Эти данные
также нашли подтверждение в работах с использованием молекулярно-гене-
тических методов [Degrange et al., 1998].
Метод конкурентной ПЦР, который в 10-100 раз чувствительнее метода
предельных разведений (МПР) при детекции клеток Nitrosomonas, позволил
установить рост популяции аммонийокисляющих бактерий в удобряемых
почвах в тех случаях, когда МПР не обнаруживал различий в их
численности [Philips et al, 2000].
При исследовании методами гибридизации in situ флоков активного ила в
стоках установлено, что виды pp. Nitrobacter и Nitrosomonas образуют кластеры
78
(скопления) и развиваются в тесном контакте [Mobarry et al., 1996].
Имеющиеся данные свидетельствуют о сходном поведении нитрификаторов в почвах.
Первые исследования показали, что нитрификаторы колонизируют площадь
от 10 до > 100 мкм2, средняя численность клеток в микролокусе варьирует от
десятка до нескольких сотен. По данным Грудманна с коллегами [Grundmann
et al., 2001] в микроагрегате диаметром 50 мкм находится в среднем 7 клеток
нитрификаторов. Численность нитритокисляющих бактерий в агрегате
размером 1 мм3 составляла 3 • 103, они колонизировали -0,0006% поверхности
почвенных пор. Места расположения нитритокисляющих бактерий довольно
удалены друг от друга (среднее расстояние 375 мкм). Нитритокисляющие
бактерии предпочтительно колонизировали агрегаты размером 250 мкм и
были случайным образом распределены в почве. Высокая скорость
нитрификации в почве требует, чтобы аммоний- и нитритокисляющие бактерии не были
расположены независимо. Распределение нитритокисляющих бактерий в
почвах более однородное, чем аммонийокисляющих бактерий, что отражает
их стратегию по перехвату мобильного нитрита. Так как микроколонии и
клетки расположены на довольно значительном расстоянии, нитрификация
базируется на связях во внутрипочвенном матриксе через микропоры, то есть
они являются главным месторасположением нитрификаторов.
Высокой плотности (102-105 кл./г по МПР) достигают популяции нитро-
фикаторов в выветренных горных породах, ультрабазитах, глинах,
известняках [Ляликова, Лебедева, 1989]. В результате продукции ими сильных кислот
выветриваются горные породы, в частности силикатные минералы,
известняк, мрамор, разрушаются каменные строения, бетон, подвергаются
коррозии трубопроводы. Крумбайн [Krumbein, 1972] показал наличие прямой
связи между численностью нитрификаторов и количеством нитратов в
разрушающихся породах.
Нитрифицирующие бактерии являются одной из трех групп
микроорганизмов (после грибов и хемоорганотрофных бактерий), обильно и широко
представленных в каменных исторических сооружениях в Германии [Mansch,
Bock, 1998]. Аммоний и нитритокисляющие бактерии обнаружены
соответственно в 55 и 62% образцов каменных зданий. Колонизация хемоорганотро-
фами природных камней протекает в течение нескольких месяцев, а
нитрифицирующими бактериями - в течение нескольких лет, их максимальная
численность наблюдается в поверхностном слое. В некоторых случаях
нитрификаторы обнаруживали и под верхним выветренным слоем камня.
Установлено предпочтительное обитание нитрификаторов в карбонатных породах с
порами диаметром 1-10 мкм. Количество клеток нитрификаторов не
коррелировало с содержанием нитратов в камнях, но показана четкая связь между
микробной колонизацией и антропогенным загрязнением воздуха. Высокая
плотность нитрификаторов обнаружена также в образцах камней, которые
имели поры диаметром <1 мкм, или были покрыты черной коркой.
Колонизация карбонатов нитрификаторами резко усиливалась при их химическом
выветривании.
Итак, получены многочисленные свидетельства, что физиологические
свойства определяют распространение конкретных групп автотрофных
нитрификаторов и связь между структурой аммонийокисляющих
бактериальных сообществ и скоростью нитрификации.
79
3.4.2. Гетеротрофные тарификаторы
К настоящему времени способность к гетеротрофной нитрификации
обнаружена у представителей разнообразных групп микроорганизмов -
одноклеточных и мицелиальных бактерий, грибов и одноклеточных зеленых
водорослей. В этой связи следует отметить, что круг известных гетеротрофных
микроорганизмов с высокой нитрифицирующей активностью до последнего
времени был ограничен отдельными представителями грибов - Aspergillus
flavus, A. wentii, Verticillium lecani, Absidia cylindrospora и бактерий pp. Arthro-
bacter, Alcaligenes, Bacillus и Pseudomonas. Поэтому мнение об
исключительной роли открытых С.Н. Виноградским [1952] автотрофных аммоний- и нит-
ритокисляющих бактерий в образовании нитратов в почвах оставалось
незыблемым, а деятельность гетеротрофных нитрификаторов, как правило, не
рассматривалась как значимый источник окисленных форм азота в наземных
экосистемах.
Однако многочисленные сообщения о низкой эффективности
ингибиторов нитрификации - препаратов, разработанных для подавления
автотрофных нитрифицирующих бактерий, в совокупности с данными о довольно
интенсивной нитрификации в кислых почвах (рН < 4,5) и в почвах аридных
зон при 37-40°С [Муравин, 1989], то есть в ситуациях, когда активность
автотрофных нитрификаторов по-видимому подавлена, указывали на то, что
роль гетеротрофных нитрификаторов может быть существенной.
Оценивая значение гетеротрофной нитрификации в почвах, обычно
определяют долю гетеротрофных нитрификаторов в общем числе
протестированных микроорганизмов. Очевидно, что эти данные должны быть
интерпретированы с осторожностью, поскольку питательные среды лишь в отдаленной
степени соответствуют условиям in situ. Вместе с тем такая оценка позволяет
сравнить активность чистых культур гетеро- и автотрофных нитрификаторов
и отобрать культуры для изучения скорости накопления нитратов в
модельных экспериментах со стерильной почвой, инокулированной
гетеротрофными нитрификаторами, то есть в условиях, значительно более близких к
природным.
Данные о распространенности среди почвенных гетеротрофных
микроорганизмов способности к нитрификации довольно противоречивы. В
исследованиях Кастиньетти и Холлохер [Castignetti, Hollocher, 1984] частота
встречаемости нитрифицирующих гетеротрофных бактерий не превышала 36%
общего числа выделенных штаммов. Нитрифицирующие культуры были
представлены Pseudomonas fluorescens, P. aerugenosa, P. aureofaciens,
Alcaligenes faecalis. Четверть из 350 штаммов грибов и бактерий,
изолированных из кислой почвы из-под березняка, продуцировали нитрит или нитрат на
жидкой или твердой среде с пептоном. Проверка 65 штаммов почвенных
грибов, выделенных из пустынных почв Бразилии, показала, что способностью к
нитрификации обладали 18 культур родов Aspergillus, Penicillium,
Cephalosporium (Acremonium), Fusarium, Rhodotorula, причем они окисляли
только органические источники азота (аминокислоты, белки), но не аммоний
и мочевину. В ряде работ получены результаты противоположного характера.
При изучении нитрифицирующего микробного сообщества кислых лесных и
луговых почв Новой Зеландии [Pennington, Ellis, 1993] гетеротрофные нит-
80
рификаторы не обнаружены среди 171 изолятов грибов и 258 - бактерий. Не
наблюдали продукции нитрита и нитрата ни у одного из 200 бактериальных
изолятов из почвы дубового леса, и только один из 21 штамма грибов
проявил явную способность к нитрификации.
Единичные исследования проведены по определению количества
гетеротрофных нитрификаторов в почве. Оценка численности гетеротрофных
бактерий проводилась чашечным методом с последующим высевом
доминирующих форм на среду с органическим источником азота и проверкой их
способности к нитрификации. Количество нитрификаторов составило 2 • 105-
3,8 • 106 кл./г почвы.
Противоречивость данных о распространенности среди гетеротрофов
нитрифицирующих микроорганизмов и их активности может быть объяснена
различиями в свойствах изучаемых почв, составе питательных сред для
выделения и тестирования, условиях выделения, спектре определяемых
продуктов нитрификации, а также использованием свежевыделенных изолятов или
после их продолжительного хранения.
Способность к нитрификации соединений азота установлена у бактерий
pp. Arthrobacter, Pseudomonas, Alcaligenes и Bacillus, которые окисляют гидрок-
силамин и его органические производные - оксимы до нитритов.
Значительно меньший таконолический круг бактерий окисляет аммонийный азот. К
примеру, только 3 (все Alcaligenes faecalis) из 150 изолятов бактерий
[Сорокин, 1990].
Гидроксиламин и оксимы окисляют многие микроскопические грибы, а
образование нитрата при росте на нитрите было установлено практически у
всех испытанных штаммов микромицетов. Нитритрезистентные виды
дрожжей Candida и Geotrichum candidum стехиометрически превращают нитрит в
нитрат со скоростью, намного превосходящей таковую у обычных
гетеротрофов - нитрификаторов и достигающей уровня, характерного для автотрофов.
Некоторые исследователи показали, что дереворазрушающие грибы
Hypholoma fasciculate, Phanaerochaete velutina и Phallus impudicus обладают
высокой аммонифицирующей активностью и окисляют некоторое
количество образующегося аммония до нитрата. Сообщалось также о способности
некоторых эктомикоризных грибов к нитрификации.
Изучена [Кураков, Попов, 1995; Кураков и др., 1995] нитрифицирующая
активность у 86 штаммов 37 видов почвенных микроскопических грибов (см.
табл. 3.2). Среди них были виды, характерные для дерново-подзолистой почвы
из-под ельника-кисличника (Chrysosporium (Geomyces) pannorum, Gliocladium
roseum, Trichoderma hamatum, Aspergillus niger, Penicillium melenii), окультуренной
дерново-подзолистой почвы (P. funiculosum, P. janthinellum, Fusarium,
Trichoderma) и типичные для коричневой, черноземных и каштановых почв
{Aspergillus ustus, A. terreus, A. flavus, A. fumigatus, A. ochraceus, A. wentii,
Cladosporium cladosporioides, Penicillium canescens, P funiculosum, Fusarium
solani). Многие из протестированных изолятов Р. nigricans, P. chrysogenum,
P funiculosum, A. niger, A. fumigatus, Cladosporium cladosporioides и различных
видов pp. Trichoderma, Fusarium, Gliocladium - представители эвритопных видов.
При росте на питательных средах с органическим источником азота 48%
испытанных штаммов почвенных микроскопических грибов проявляли
нитрифицирующую активность: 16% штаммов образовывали гидроксиламин,
81
24% - гидроксамовые кислоты, 10% - нитрит и 20% - нитрат. Количество
нитрифицирующих штаммов при культивировании грибов на среде с
аммонийным азотом было намного ниже - 28%, из них гидроксиламин и
гидроксамовые кислоты продуцировали 17 и 13% штаммов, нитрит и нитрат -
соответственно 4,8 и 3,5%. В зависимости от состава среды один и тот же штамм
продуцировал разные окисленные соединения азота или не проявлял
нитрифицирующей активности.
Подавляющее большинство штаммов Aspergillus flavus, A. niger, A. wentii,
Fusarium solani и Penicillium nigricans обладали способностью к
нитрификации. В то же время только единичные изоляты грибов рода Trichoderma
проявляли нитрифицирующая активность.
Широкий спектр видов, включающий P. chrysogenum, P. nigricans (P.
janczewski), P. martensii (P. aurantiogriseum), P lanoso-coeruleum (P aurantiogri-
seum), P. melenii, P. canescens, A. flavus, A. niger, A. terreus, A. wentii и G. roseum,
образовывали конечные продукты нитрификации - нитрат или нитрит. Для
большинства из перечисленных видов, за исключением A. flavus, A. wentii,
A. niger, это продемонстрировано впервые.
Тестирование дрожжевых грибов и гетеротрофных бактерий на
способность образовывать те же продукты нитрификации, что и микромицеты,
показало, что способность к нитрификации на соединениях аммонийного и амин-
ного азота встречается у них значительно реже, а активность процесса ниже.
Таким образом, результаты исследования, проведенного на
представительной выборке свежевыделенных изолятов микромицетов разных
систематических групп, свидетельствуют о широкой распространенности
способности к нитрификации среди микроскопических грибов.
Нитрифицирующую активность проявили 28% штаммов при росте на среде с аммонием и
48% штаммов на средах с органическим азотом. В зависимости от источника
азота в среде 5-15% изолятов образовывали конечные продукты
нитрификации (нитрит и нитрат). При росте на среде с аммонийным азотом
микромицеты чаще продуцировали гидроксиламин, а на средах с пептоном и |}-алани-
ном - нитриты и нитраты. Органический азот (пептон и Р-аланин) являлся
более предпочтительным субстратом для нитрификации, чем аммоний, что
особенно отчетливо выражено у микромицетов, выделенных из
дерново-подзолистой почвы зоны южной тайги, и в меньшей степени у изолятов из почв
степных и полупустынных регионов.
Таблица 3.2
Распространенность способности к нитрификации
среди микромицетов
Вид
Alternaria alternate3"
Aspergillus flavus3*
A. fumigatusi*
A. niger3"
1 A. ustus*'
Число
штаммов
1
4
1
3
1
NH2OH
11*
-
1
1
3
0
22«
0
2
1
2
0
R-CO-
NHOH
1
-
4
0
3
0
2
1
3
0
0
1
NOi
1
-
3
0
0
0
2
1
2
0
0
0
NOl
1
-
2
0
1
0
2
0
2
0
0
0
82
A. wentifi
Cladosportum
cladosporioides4
Chrysosporium
panorum*'
| Fusarium nivale3*
Fusarium solani*
Fusarium spA
1 Gliocladium roseumA
G. catenulatumA
1 Myrothecium
vermcaria?
1 Penicillium
canescensA*
1 P. chrysogenunfi"
1 P. nigricans3*
j P. verruculosum**
P. martensii4*
P. janthinellum4*
1 P. lanoso-coeruleumA*
I P. melenvA*
Penicillium sp.3*
Trichoderma
harzianum3*
1 Контроль3*-4*
1 Всего испытано
штаммов
| (из них активных)
3
1
1
4
4
1
1
1
1
1
9
8
1
2
1
1
1
i 4
1
0
865*
1
1
0
1
2
0
0
-
1
1
0
0
1
0
1
0
0
0
0
0
1(14)
0
0
0
1
0
0
0
1
-
1
5
1
—
0
0
.0
1
0
0
0
|(15)
~Г~\
0
1
0
0
0
0
—
0
1
1
5
1
0
0
0
1
2
1
0
(21)
1
0
0
0
2
0
0
0
-
0
1
1
—
0
0
0
0
1
0
0
(11)
1
0
0
2
0
0
1
—
0
0
0
1
0
1
0
0
о
0
0
0
(9)
2
0
0
0
0
0
0
0
-
0
0
1
—
0
1
0
0
0
0
0
(7)
2 '!
0
0
0
0
1
0
-
0
1
1
2
0
2
0
1
1
3
0
0
(12)
1 ]
0
0
0
0
0
0
0
-
0
0
0
— 1
0
0
0
0
1
0
0
(4)
1* Среда с пептоном или -аланином.
2* С сернокислым аммонием.
3* Штамм проверен на среде с пептоном.
4* С р-аланином; накопление гидроксиламина, гидроксамовых кислот, нитрита или
нитрата > ОД мкг N • мл"* на 5-12 сут.
5* Нитрифицирующая активность не обнаружена: P. cammemberti (9 штаммов,), P.
commune (4), P. funiculosum (1), Trichoderma hamatum (2), Gliocladium fimbriatum (1),
Coniothyrium fuckelii (1), Cladosporium herbarum (1), Phialophora sp. (1), Aspergillus ochraceus
(1), A. terreus (2), A. versicolor (1), Fusarium gibbosum (2), P. chrysogenum (1), P. purpurogenum
(1), Trichoderma sp. (1), Mycelia sterilia (1).
Известные в литературе гетеротрофные микроорганизмы с
относительно высокой активностью продукции нитритов и нитратов относятся,
главным образом, к бактериям, способным к аэробной денитрификации,
микроскопическим грибам и метанотрофам (см. табл. 3.3).
Наиболее высокий уровень продукции нитритов и/или нитратов (>3-20,
максимум 150 мкг N • мл-1) обнаружен у бактерий pp. Arthrobacter, Alcaligenes,
Corynebacterium, Nocardia и грибов A. flavns, A. ustus, Absidia cylindrocarpa,
Cladosporium herbarum, Penicillium citrinum на средах с различными органичес-
83
кими азотсодержащими соединениями (оксимы, нитрофенолы, пептон или
аминокислоты). Нитрифицирующие штаммы A, flavus образовывали до
60-120 мкг N-NO3 • мл1, A avenaceus - 40, A. wentii - 6, Verticillium lecanii -
14 мкг N-NO3 • мл"1 культуральной жидкости и Absidia cylindrospora - 18 мкг
N-NO2 • мл'1. У микроорганизмов (Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces,
Nocardia, Micromonospora, Aspergillus, Mortierella, Penicillium и Mucor,
Verticillium), способных к окислению аммония, накопление нитритов или
нитратов в среде намного ниже, в редких случаях >2 мкг N • мл1. Активность
продукции нитратов у грибов значительно выше при окислении нитрита, чем
аммония или органических соединений. Так, Acremonium kilense, Verticillium
lecanii, Trichoderma harzianum, Trichoderma sp., Mortierella alpina в течение 2 сут
образовывали из нитритов 35-45 мкг N-NO3 • мл1 культуральной жидкости.
Это позволяло полагать, что окисление нитрита в нитрат не лимитирует
нитрификацию в почве под лесом, из которой эти грибы выделены, даже при
низкой численности автотрофных нитрификаторов группы Nitrobacter.
Оценка нитрифицирующей активности на выборке из 18 штаммов,
относящихся к 10 видам микромицетов, показала, что большинство культур
продуцирует -1 мкг окисленных соединений азота (гидроксиламина, нитрита
или нитрата) в 1 мл культуральной жидкости за 12 сут [Кураков и др., 1995].
Это представители видов P. nigricans (1 штамм), P. chrysogenum (4),
Myrothecium verrucaria (1), Т. harzianum (1), образующие гидроксиламин, и
F. nivale (2 штамма) - гидроксиламин и нитрит. Более трети исследованных
штаммов образовывали от 1 до 20 мкг окисленных соединений азота в 1 мл:
гидроксиламин - Р chrysogenum, Pjanthinellum, P verruculosum, нитрит и
нитрат - Р nigricans, P chrysogenum, P martensii (по 1 штамму). Наиболее высокой
нитрифицирующей активностью в данной выборке обладали штаммы
A. flavus, A. niger, A wentii (38-90 мкг N-NO3 • мл-1 и P. nigricans (23 мкг
N-NO3 • мл"1). При уровне накопления нитратов в среде от 0,1 до 68,0 мкг
N-NO3 • мл"1 среды на 7-12-е сут культивирования грибов, скорость его
образования лежала в диапазоне от 0,2 до 6,8 мкг N-NO3 • (сут • мл)1 среды, что
соответствовало 0,1-1,8 мкг N-NO3 • (сут • мг)"1 мицелия. Активность
образования нитратов существенно варьировала в зависимости от вида и штамма
гриба, а также состава среды. У большинства штаммов, за исключением
P. nigricans 17, накопление нитратов было ниже, или они не образовывались
на среде с сульфатом аммония. Интенсивность образования нитритов и
нитратов у исследованных грибов была на 2 и более - до 4 порядков - ниже, чем
у автотрофных нитрифицирующих бактерий. Следует, однако, учитывать,
что среди микроскопических грибов родов Fusarium, Cylindrocarpon,
Trichoderma, Gliocladium, Paecylomyces, Chaetomium, Aspergillus, Penicillium
имеются представители, способные к восстановлению нитритов (а среди
Fusarium oxysporum, F. solani, Fusarium sp. и нитратов) при пониженном
парциальном давлении кислорода [Shoun et al., 1992; Kurakov et al., 2000]. Такие
условия создаются при длительном, более 5-7 сут, статическом их
культивировании, и потому не исключено, что скорость нитрификации у грибов более
высокая.
Максимальная скорость образования нитрита метанотрофами более чем в
20 раз ниже, чем у автотрофных нитрификаторов, и накопление нитритов в
среде невысокое (1-10 ррм) [Bedard, Knowles, 1989]. Хотя существует перек-
рытие в значениях константы Михаэлиса-Ментен (Кт) для этих групп
организмов, наименьшая величина Кт (ЫЩ)> выявленная у автотрофных нитри-
фикаторов, в 300 раз ниже, чем минимальная Кт для метанотрофов.
Попытки вырастить облигатные метанотрофы на аммонии, в отсутствие СН4,
оказались неудачными, окисление аммония не обеспечивало фиксацию СО2 у
Methylococcus capsulatus [Bedard, Knowles, 1989]. Установлено, что СН4, за
исключением некоторого стимулирующего эффекта в низких
концентрациях, ингибирует окисление аммония.
Таблица 3.3
Скорость нитрификации и максимальная концентрация нитратов
в среде у нитрифицирующих микроорганизмов*
Организм
1 Гетеротрофы
Метанотрофы*
Другие гетеротрофы*
Гетеротрофные
нитрифицирующие бактерии,
способные к аэробной
денитрификации* *
Автотрофы*
Nitrosomonas еигораеа**
I Nitrosomonas Sp.**
Максимальная скорость,
мкг N • г1 кл. • суг1
3920 (рН 6,8)
11 500 (рН 6,0)
80 000 (рН 6,0)
10-10 000
0,8-90
1 000 000-70 000 000
50-100
590-2300
Максимальная
концентрация, мкг N • мл"1
2,0
50
50
0,2-150
-
2000-4000
-
-
* По [Verstraete, 1981] и ** [Robertson et al., 1988) (активность в п моль NH3 (min • мг)
сухой вес.
Исследований по оценке активности накопления различных продуктов
нитрификации гетеротрофными микроорганизмами непосредственно в
почвах (нативных или стерильных) проведено крайне мало. Образование
нитратов показано в стерильной кислой подстилке соснового леса лигнинразлага-
ющим грибом Clitocybe metachroa. Интенсивное протекание нитрификации
наблюдали при развитии Absidia cylindrospora в стерильной водно-почвенной
суспензии с ацетатом и сульфатом аммония. Заметно меньшее образование
нитратов микромицетами отмечено при инокуляции ими стерильной почвы.
Возможно, как считали авторы, это связано с внесением в почву штаммов с
невысокой нитрифицирующей активностью. Образование значительных
количеств гидроксиламина и 1-нитрозоэтанола (CH3CH(OH)NO)
нитрифицирующим штаммом Arthrobactersp. обнаружено не только на питательных
средах, но и в образцах сточных вод и почв, в которые добавлен аммоний и
ацетат [Verstraete, Alexander, 1973].
Грибная нитрификация, связанная с деградацией лигнина или ацетата,
реальна для условий, существующих в кислых лесных почвах [De Boer,
Kowalchuk, 2001]. Высокое содержание лигнина характерно для подстилок, а
способность к образованию ацетата микроорганизмами - обычное явление
для различных лесных почв.
85
Установлено [Кураков и др., 1995], что при внесении в стерильную
дерново-подзолистую почву активно нитрифицирующих штаммов Aspergillus flavus,
A niger, Penicilliumjanthinellum, Р nigricans и P martensii наблюдается их рост и
накопление нитратов в количествах 2-16 MKrN-NO^ • г1 почвы за 10 сут.
Максимальная активность образования нитратов отмечена при развитии в почве
P.janthinellum 86 и A. flavus 134 и при совместном внесении пяти штаммов
грибов. Активность нитрификации у исследованных штаммов варьировала в
диапазоне 0,2-0,8 мкг N-NO3 • сут-1 - г1 почвы, или соответственно 1,1-5,4 мкг
N-NO3 • сут-1 • мг1 мицелия. Добавка пептона в почву стимулировала рост и
образование нитратов у грибов. Их накопление возрастало в 1,5-3 раза по
сравнению с контрольной почвой. При внесении сульфата аммония
достоверного увеличения нитрифицирующей активности и биомассы грибов не
наблюдали, за исключением P. nigricans 17. Активность этого штамма
существенно возросла при добавке сульфата аммония в почву и не менялась в варианте
с пептоном. Полученные данные позволяют полагать о преимущественном
окислении гетеротрофными микроорганизмами органических
азотсодержащих соединений в почве, что согласуется с результатами тестирования грибов
на питательных средах с органическим и аммонийным азотом и данными
краткосрочных инкубационных опытов с водно-почвенными суспензиями, в
которых использовали меченные 15N соединения и ингибиторы
нитрификации для определения формы окисляемого субстрата [Schimel et al., 1984].
Выявлен стимулирующий эффект добавки пептона на продукцию
грибами нитратов при их развитии в почве. Характерно также, что при расчете
скорости нитрификации на единицу биомассы мицелия она в большинстве
случаев была выше в почве, чем на питательных средах. В литературе имеются
сообщения о стимулирующем действии почвенной вытяжки и фульвокислот
на продукцию гетеротрофными микроорганизмами нитратов на питательных
средах. Образование нитритов и нитратов у гриба Absidia cylindrospora на
среде с Р-аланином происходило только при добавке почвенного экстракта или
стерильной почвы [Stroo et al., 1986].
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о широкой
распространенности среди почвенных грибов способности к нитрификации.
Уровень накопления ими нитратов при росте на питательных средах и в
стерильной почве указывает на необходимость учета роли этой группы
микроорганизмов в окислительном звене цикла азота. Наиболее значимой она
может быть в почвах, характеризующихся неблагоприятными условиями
для развития автотрофных нитрифицирующих бактерий и высоким пулом
жизнеспособной грибной биомассы.
3.5. Влияние экологических факторов
на нитрификацию в почвах
Максимальная активность нитрификации в почвах разных типов
достигается, как правило, при внесении сульфата аммония в дозах 100-200 мкг
N-NH4A почвы (в.-с. вес). Нитрификация подавлена или протекает с крайне
низкой скоростью при концентрации N-NH4 > 3 г/кг почвы.
86
Длительное время полагали, что органическое вещество токсично для ав-
тотрофных нитрификаторов, однако это вступает в противоречие с высокой
нитрифицирующей активностью в черноземах, навозе, компосте, сточных
водах. Стабильные органические соединения почв не ингибируют
нитрификацию, но для их разложения требуется неорганический азот и кислород, и это
может ограничивать доступность последних для нитрификаторов.
Жизнедеятельность автотрофных нитрификаторов подавляется в субстратах с
высоким содержанием подвижного (доступного) органического вещества, а
концентрация водорастворимого углерода в почвах (0,1% общего углерода)
заметно ниже тех, которые ингибируют бактерии в культуре.
Нитрификация существенно зависит от температуры. Процесс идет
медленно при температуре <5°С и >40°С. Установлено наличие нитрификации в
почве при температурах, близких к замерзанию (2°С). Наиболее высокие
температуры, отмеченные для этого процесса, являются 50-60°С, но
выделить чистую культуру термофильных автотрофных нитрификаторов не
удалось [Илялетдинов, 1976; Ляликова, Лебедева, 1989; Paul, Clark, 1989].
Оптимум активности нитрификации в почвах лежит в диапазоне 25-35°С.
Хранение почвы при -5 и -20°С не снизило ее нитрификационный потенциал, что
указывает на хорошую выживаемость нитрификаторов в этих условиях.
Некоторые штаммы нитрификаторов способны сохранять жизнеспособность
после достаточно сильной температурной обработки - нагревания до 60°С в
течение 10 мин. Вместе с тем установлено, что хранение при 4°С образцов
тропических почв, в отличие от почв других климатических зон, достоверно
снижает активность нитрификации определяемой методом инкубации
почвенной суспензии [Verchot, 1999].
Активность нитрификации и снижение концентрации аммония в водной
суспензии образцов полевых почв, максимальны в диапазоне 10-25°С и
ниже при 4 и 30-37°С. В то же время при отсутствии лимитирования по
аммонию скорость выделения N20 постепенно растет с повышением температуры
с 4 до 37°С. Продукция N26 при температуре 10-25°С составляла 35-50% от
потенциала нитрификации после короткого периода адаптации (5 сут)
нитрификаторов в водно-почвенной суспензии [Avrahami et al., 2003]. Согласно
ПЦР с праймером amoARl при инкубации суспензии при 4-10°С в течение
16 нед. в ней доминировали бактерии Nitrosospira 1-го кластера, но они
отсутствовали в почвах с невысоким уровнем применения удобрений.
Последовательности Nitrosospira 9-го кластера обнаруживали только при низкой
концентрации аммония, а Nitrosospira 3-го кластера обнаружены при большинстве
тестированных концентраций аммония и температур. Аммонийокисляющие
бактерии были способны адаптироваться к почвенным условиям
посредством модификации структуры сообщества, если имели достаточное
(несколько недель) время.
Свет оказывает ингибирующее, а при большой интенсивности - летальное
действие на нитрификаторы, которое может быть обусловлено фотоокислением
цитохрома с. Нитритокисляющие бактерии более чувствительны к
ультрафиолету и видимому свету по сравнению с аммонийокисляющими автотрофами.
Согласно термодинамическим закономерностям, окисление аммония и
нитрита микроорганизмами может осуществляться в диапазоне от рН 4,0 до
немного превышающей рН 9,0. При рН < 4 биологическое образование азо-
87
тистой кислоты невозможно, так как происходит азотирование азотистых
соединений нуклеиновых кислот [Заварзин, 1972]. Оптимальное значение рН
для нитрифицирующих бактерий чаще всего 7,5-8,0. При значениях рН
среды <5,8 и >9,0 рост культур обычно не наблюдается, хотя есть данные о
присутствии этих микроорганизмов в кислых почвах (с рН < 4,0).
Феномен нитрификации в кислых почвах является предметом
исследований и объясняется наличием среди автотрофных нитрификаторов
популяций, адаптированных к экстремальным условиям (например, ацидоустойчи-
вых штаммов) [De Boer, Kowalchuk, 2001], гетерогенностью почв
(существованием микрозон, удовлетворительных по кислотности для
функционирования автотрофов-нитрификаторов) и проведением нитрификации
гетеротрофными микроорганизмами.
Значительное влияние на интенсивность нитрификации оказывает
концентрация растворенного кислорода в среде. Нижний предел аэрации,
необходимый для нитрификации, достигается в тот момент, когда 20% общей
поверхности почвы наполнено воздухом. Жизнедеятельность автотрофных
нитрификаторов в почвах подавлена при Eh < 250 mV [Verstraete, 1981].
Вместе с тем показано, что в природной обстановке нитрифицирующие
бактерии могут развиваться в микроаэробных условиях [Ляликова, Лебедева,
1989]. Указывается на наличие нитрификационного потенциала в
анаэробных осадках. Аммонийокисляющие бактерии, выделенные из морских
осадков, довольно активно осуществляли нитрификацию при содержании
кислорода 0,1-0,25 мг/л.
Затопление почвы ограничивает диффузию кислорода - и скорость
нитрификации снижается. Другая крайняя ситуация - недостаток влаги для
развития бактерий и протекания нитрификации возникает при содержании
воды <3-8% в почвах. Нитрификация протекает активно при давлении влаги в
почвах в диапазоне от -0,1 до -1 МРа. Скорость нитрификации максимальна
при влажности 60-70% полной влагоемкости, это -18-25% содержания воды
в почвах. Процессы минерализации менее чувствительны как к водному
стрессу, так и к низкой температуре, что ведет к аккумуляции аммония в
холодных и подверженных засухе почвам [Paul, Clark, 1989].
Морские виды Nitrosomonas более активны в присутствии хлорида натрия,
в концентрациях <1,2 и максимум <5%. Наземные виды в целом растут хуже
в присутствии хлорида натрия, но могут к нему адаптироваться. Как
сообщалось [Verstraete, 1981], нитрификация в насыщенном аммонием растворе
протекала при концентрации хлорида натрия 3,6%.
В почвенной суспензии скорость нитрификации падала экспоненциально
при снижении осмотического потенциала (с повышением концентрации
солей) [Low et al., 1997]. Однако в образцах почвы при полевой влагоемкости и
добавке 2 мг N-NH4/Kr гросс-нитрификациия не зависела от осмотического
потенциала. Концентрация аммония контролировала скорость
нитрификации, а осмотический потенциал имел вторичное значение, что указывает на
способность нитрификаторов адаптироваться к токсическому действию
солей. Скорость гросс-аммонификации снижалась экспоненциально в
диапазоне от 0 до -500 кРа и не менялась в интервале от -500 до -1750 кРа. Скорость
микробной ассимиляции нитратов превышала аммонийную ассимиляции в 4
раза, что свидетельствует о значительной иммобилизации нитратов в услови-
88
ях лимитированного количества аммония. Микробная ассимиляция как
аммония, так и нитратов уменьшалась экспоненциально при снижении
почвенного осмотического потенциала и была несущественной при < -1500 кРа.
В связи с тем, что ассимиляция нитратов уменьшалась быстрее, чем гросс-
нитрификация, нетто-нитрификация возрастала с падением почвенного
осмотического потенциала.
Итак, оптимальными условиями для нитрификации в почвах являются
следующие параметры: рН 7-8, температура 25-30°С, влажность 60-70%
ППВ и внесение 100-200 MKrN-NH^/r почвы. Вместе с тем в ряде случаев
высокая активность нитрификации обнаружена в почвах, характеризующихся
неблагоприятными условиями для автотрофных нитрификаторов.
Важным фактором, влияющим на представленность нитрифицирующих
бактерий в почве, являются корневые выделения растений. Они могут быть
причиной низкого титра нитрификаторов в почвах климаксных
растительных сообществ. Уменьшение численности нитрификаторов и количества
нитратов и одновременно увеличение концентрации аммония в почве
наблюдали по мере сукцессии растительных сообществ к климаксу. Вырубка леса,
напротив, приводила к увеличению числа нитрифицирующих бактерий.
Низкая плотность автотрофных нитрификаторов обнаруживается часто в
луговых почвах, что также может быть связано с ингибированием их корневыми
выделениями растений.
При исследованит распространения аммонийокисляющих бактерий не
установлено корреляции между разнообразием ПЦР-идентифицированных
атоА-генов и видовым богатством растений лугов на различных стадиях
вторичной сукцессии [Kowalchuk et al., 2002]. Разнообразие
аммонийокисляющих нитрификаторов было минимальным в почвах участков с наибольшим
богатством видов растений.
В почвах, в которых содержание тяжелых металлов превышает фоновое до
10 крат и приближается к уровню ПДК, происходит достоверное снижение
активности нитрификации. Этот процесс чувствителен также к применению
многих пестицидов. Амитрол, 2,4-DВ, диаллат в рекомендуемых для
применения дозах могут оказывать ингибирующее воздействие на нитрификацию
по меньшей мере в течение 8 нед., атразин, симазин и пиклорам - более
короткий период. Некоторые продукты разложения пестицидов обладают ин-
гибирующим эффектом на нитрификацию. Вместе с тем есть примеры, когда
негативное влияние пестицидов на этот процесс отсутствует, и даже
отмечается стимулирующее воздействие этих агрохимикатов, включая и
вышеупомянутые.
Хемолитотрофные нитрифицирующие бактерии чувствительны к
загрязнению почвы нефтью. Нитрификация ингибируется уже при 0,5%-ном
загрязнении почвы, а микроорганизмы, осуществляющие этот процесс, не
обнаруживаются в почве, обработанной 5-10 л нефти на 1 м2. Одной из причин
подавления нитрификации является снижение содержания кислорода.
Минимальное содержание растворенного кислорода для нитрификации должно
составлять 2 мг/л, при снижении его количества до 1,3 мг/л скорость роста
нитрификаторов составляет <60% максимальной величины.
Важность внешних условий для активного протекания нитрификации в
почвах продемонстрирована в работе Дегранжа с соавторами [Degrange et al.,
89
1998]. В подзолистых почвах под лесом методами ПЦР и предельных
разведений была обнаружена довольно высокая плотность автотрофных
нитрифицирующих бактерий, то есть низкую активность образования нитратов и,
соответственно, ингибирование нитрификации в этих почвах определяли
внешние факторы.
3.6. Аэробное и анаэробное >Ю2-зависимое окисление
аммония Nitrosomonas (>Юх-цикл)
3.6,1. Анаэробное МС^-зависимое окисление
аммония Nitrosomonas
Важную роль в метаболизме аэробных аммонийокисляющих бактерий
играют оксиды азота (NO и N02). Известно, что концентрации N02 или
NO > 1 ррт оказывают бактерицидное действие на многие микроорганизмы.
Интересно, что такого эффекта N02 не отмечено в отношении Nitrosomonas
eutropha до концентрации 50 ррт. Установлено, что N02 играет регуляторную
роль в восстановлении активности аммониймонооксигеназы у Nitrosomonas
eutropha. Клетки Nitrosomonas eutropha, денитрифицирующие в анаэробных
условиях с водородом как донором электронов и нитритом - акцептором
электронов, были не способны к использованию аммония (аммиака) в
качестве энергетического источника. Окисление аммиака зависело от
присутствия N02. Анаэробное окисление аммиака наблюдали в атмосфере гелия с
введением 25 ррт N02 после лаг-периода 20 ч [Schmidt et al., 2001b]. NO при
концентрации >10 ррт снижала скорость анаэробного окисления аммония,
однако степень ингибирования значительно падала при повышении
содержания N02 в атмосфере [Schmidt et al., 2001b]. Получены доказательства
участия N02 в анаэробном окислении аммония Nitrosomonas [Schmidt, Bock, 1997;
Schmidt et al., 2002]. Nitrosomonas eutropha может окислять аммоний в
отсутствие кислорода, который замещается двуокисью азота или тетраокисью
азота (димер N02). Баланс азота показывает, что при таком превращении
аммиака соотношение азота аммиака, тетраокиси азота, нитрита и окиси азота
1:1:1:2 [Schmidt et al., 2002]:
NH3 + N204 + 2H+ + 2e -> NH2OH + H20 + 2NO;
NH2OH + H20 -> HN02 + 4H+ + 4e;
NH3 + N204 -> HN02 + 2NO + 2Н+ + 2ё.
В этой реакции образуются гидроксиламин и азотистая кислота, которая
частично используется как акцептор электронов, что ведет к продукции
молекулярного азота: HN02 + ЗН+ + Зё -> 0,5N2 + 2Н2.
Существует несколько различий между анаэробным Ж)2-зависимым и
аэробным 02-зависимым окислением аммония у Nitrosomonas [Hooper et al.,
1997]. При анаэробном окислении аммония вместо кислорода используется
N204 как акцептор электронов и образуется дополнительный продукт NO.
90
Этот процесс в природе зависит от поступления NO2 из местообитаний с
окислительным режимом.
Другое важное наблюдение касается того, что на анаэробное окисление
аммония с N02 (N204) не влияет ацетилен [Schmidt et al., 2001, 2002].
Клетки Nitrosomonas eutropha, обработанные ацетиленом, окисляли аммоний даже
в аэробных условиях, если присутствовал >Ю2. В отсутствие диоксида азота
окисления аммиака не наблюдали. Обнаружено, что 27-кД полипептид аммо-
ниймонооксигеназы не метился 14С-ацетиленом при анаэробном Ы02-зави-
симом окислении аммония. В присутствии кислорода сразу же стартовало
образование меченного 14С-ацетиленом полипептида. То есть необходимо
разграничивать N02 и 02-зависимое окисление аммония. Гипотетическая
модель анаэробного окисления аммония представлена на рис. 3.2.
NH2OH + Н20
NH,
Рис. 3.2. ЫОх-цикл. Гипотетическая модель анаэробного Ы02-зависимого
окисления аммония у Nitrosomonas; Ы2Од - окислитель для аммония
Итак, анаэробное окисление аммония зависит от присутствия N204-okhc-
лителя. NO продуцируется в стехиометрических количествах. Только когда
N02 доступен, аммоний окисляется в анаэробных условиях, гидроксиламин
обнаруживается как интермедиат, a NO - как конечный продукт.
Гидроксиламин в дальнейшем окисляется до нитрита.
3.6.2. Роль NOx в аэробном окислении
аммония Nitrosomonas
NOx играют важную роль и в аэробном метаболизме нитрифицирующих
бактерий. Удаление окиси азота интенсивной аэрацией ингибирует
жизнедеятельность бактерий группы Nitrosomonas. Нитрифицирующая активность у
91
микроорганизмов восстанавливается, если NO вводят в поток продуваемых
газов. Добавив NOx можно существенно уменьшить лаг-период
восстановления способности голодающих клеток окислять аммоний. Получены
свидетельства, что когда нет внешнего поступления NOx клетки образуют NO для
NOx-цикла посредством денитрификации [Zart et al., 2000]. Окисление
аммония в аэробных условиях с 25 ррт NO2 отмечено на 2-3-е сут. В то же время
без введения NO2 использование аммония в этих условиях начиналось на
8-9-е сут, а концентрация клеток повышалась с ростом активности
окисления аммония. Практически никакого окисления аммония не обнаружено,
когда окислы азота удаляли интенсивной аэрацией, что указывает на
принципиальное значение NO2 в реактивации аммониймонооксигеназы. Окислы
азота оказывают сильный стимулирующий эффект на чистые культуры
Nitrosomonas eutropha. Значительно увеличиваются скорость нитрификации
и роста бактерий, удельная активность окисления аммония, максимальная
плотность клеток и интенсивность аэробной денитрификации. Если
присутствуют окислы азота, около 50% продуцируемого нитрита аэробно
денитрифицируется в молекулярный азот.
Образующийся оксид азота в присутствии 02 может быть окислен до N02.
Следовательно, только небольшие количества NO обнаруживаются в газовой
фазе культуры Nitrosomonas. Согласно предложенной модели (см. рис. 3.3).
N204 - окисляющее соединение в аэробных условиях. Гидроксиламин и NO
являются интермедиатами, в дальнейшем гидроксиламин окисляется до
нитрита, a NO - до N02 (N204):
NH3 + N204 + 2H+ + 2ё -> NH2OH + Н20 + 2NO,
2NO + 02 -> 2N02 (N204),
NH3 + 02 + 2H+ + 2ё -> NH2OH + H20.
Последнее уравнение, представляющее сумму двух предыдущих, описано
ранее как реакция аэробного окисления аммония [Hooper et al., 2001] и
полностью соответствует новой модели. Скорость потребления аммония и
кислорода и образования гидроксиламина такие же, но механизм реакции
различен. Оксиды азота циркулируют в клетке, по-видимому, в связанной с
ферментами форме, и общее количество NOx в расчете на клетку низкое.
Гипотетическая модель (см. рис. 3.3) находится в хорошем согласии с
описанным механизмом аэробного окисления аммония. Согласно новой модели,
кислород служит для окисления окиси азота. Продукт реакции - диоксид
азота - потребляется при окислении аммония. Кислород в гидроксиламин
поступает из молекулярного кислорода, но включается в него посредством
диоксида азота [Schmidt et al., 2001a].
В контрольных экспериментах были протестированы различные виды ам-
монийокисляющих бактерий (например, Nitrosomonas eutropha, Nitrosolobus
multiformis). Все виды были способны окислять аммоний в условиях аноксии
с N02 в качестве окислителя (см. рис. 3.3), и активность аэробного окисления
аммония возрастала в присутствии NO и N02.
Необходимы дальнейшие исследования по определению функций
оксидов азота (NOx) в нитрификации. Во-первых, должна быть детально изучена
роль N02 как регуляторной и сигнальной молекулы в окислении аммония.
92
NH2OH + H20
NH,
Рис. 3.3. NOx цикл. Гипотетическая модель аэробного ЫС^-зависимого
окисления аммония у Nitrosomonas; N2O4 - окислитель для аммония; в окислительных
условиях кислород используется для реокисления NO до (NC^^O^
гидроксиламин окисляется до нитрита
Восстановление аммонийокисляющей активности денитрифицирующих
клеток Nitrosomonas (с водородом как донором электронов) регулируется
посредством доступности NO2. Во-вторых, оксиды азота, по-видимому,
функционируют как специфические сигнальные молекулы между аммонийокис-
ляющими бактериями [Schmidt et al., 2001b,c], в отличие от гомосерин-лакто-
нов, которые служат сигнальными молекулами между многими бактериями
[Batcheloretal., 1997].
3.7. Роль нитрификации
в образовании окислов азота
Хотя ведущая роль биогенных источников в образовании и поступлении в
атмосферу окислов азота из почв не вызывает сомнений, до настоящего
времени нет однозначных оценок масштабов этих процессов, особенно для
закиси азота (N20). Большая неопределенность существует в оценке продукции
почвами окиси азота (NO). Имеются данные о более высоком уровне эмиссии
N0 из хорошо аэрируемых почв - природных экосистем и агроэкосистем.
Мониторинг и контроль за потоками этих газов в атмосферу крайне важны,
так как NO и N20 участвуют в разрушении озонового слоя в тропосфере,
формировании парникового эффекта и кислых дождей.
Автотрофные нитрификаторы вносят существенный вклад в образование
окислов азота в почвах. Более 30 лет назад Иошида и Александер [Yoshida,
93
Alexander, 1970, 1971] впервые показали, что Nitrosomonas europaea выделяет
N20 при окислении аммония или гидроксиламина до нитрита. Затем с
использованием 15N соединений установлено, что при инкубации клеток в
среде с аммонием и нитритом в атмосфере 0,1% 02 большая часть N20
образуется из нитрита. Продукция N20 бактериями в анаэробных условиях
связана с восстановлением нитритредуктазой нитритов, а в аэробных условиях -
с сопряженным окислением аммония в нитриты. Последующие работы с 15N-
меткой подтвердили, что выделение N20 бактериями группы Nitrosomonas
является восстановительным процессом, в котором микроорганизм
использует нитрит как акцептор электронов, особенно если ограничено снабжение
кислородом. Это позволяет сохранить 02 для окисления аммония (в
результате чего автотрофный нитрификатор получает дополнительную энергию
для роста и размножения) и предотвратить накопление нитрита в токсичных
концентрациях.
Таким образом, хемолитоавтотрофные аммонийокисляющие бактерии
(нитрификаторы I фазы) способны к денитрификации с образованием NO,
N20 и N2.
В экспериментах с чистыми культурами автотрофных нитритокисляющих
бактерий {Nitrobacter winogradskyi) у них не обнаружено способности к
образованию N20 из аммония или нитрита.
Механизмы образования газообразных соединений нитрифицирующими
микроорганизмами могут быть различными и включают редукцию нитрита в
аэробных и анаэробных условиях с участием нитритредуктазы и при
окислении аммония и гидроксиламина в аэробных условиях [Poch, Focht, 1985;
Schmidt, Bock, 1997].
В условиях аноксии нитрит служит конечным акцептором электронов.
В отсутствие аммония виды Nitrosomonas способны использовать другие
субстраты в качестве доноров электронов. При окислении гидроксиламина
аммонийокисляющие бактерии образуют незначительные количества окиси
и закиси азота. Эти газы также образуются при аэробной денитрификации,
осуществляемой аммонийокисляющими бактериями. Более того,
Nitrosomonas способны к анаэробной денитрификации с молекулярным
водородом [Bock et al., 1995] или простыми органическими соединениями
[Abelovich, Vonhak, 1992] в качестве доноров электронов.
В последние годы появляются сообщения о продукции значительных
количеств N20 и NO облигатным хемолитотрофом Nitrosomonas eutropha при
низком парциальном давлении кислорода [Miller et al., 1993]. Установлено,
что этот организм при росте в анаэробных условиях может использовать
газообразные окислы азота - N02/N204 - как оксиданты [Schmidt, Bock, 1997].
Показано, что при окислении аммония Nitrosomonas eutropha в анаэробных
условиях с N02 образуются окись азота (NO) и нитрит (с гидроксиламином
в качестве интермедиата).
Nitrobacter vulgaris при низком р02 образует мембранно-связанную нит-
ритредуктазу диссимиляторного типа, которая катализирует восстановление
N02 до NO с использованием в качестве донора электронов цитохрома с.
Наличие такой нитритредуктазы констатировано в клетках Nitrobacter vulgaris,
окисляющих N02. В этих условиях фермент участвует в образовании N0,
который используется в качестве донора электронов для восстановления НАД.
94
Такой путь восстановления НАД энергетически более выгоден, чем
образование НАДН в результате обратного переноса электронов от N02.
Предполагается, что NO может участвовать в образовании восстановленного НАД и у
бактерий, осуществляющих I фазу нитрификации. Кроме того, считают, что
оксид азота может служить субстратом, который окисляют нитрификаторы
II фазы процесса [Кондратьева, 1996].
Примечательно, что в качестве ведущего источника образования NO
рассматривается деятельность именно нитрифицирующих бактерий, а не денит-
рификаторов при восстановлении нитратов, как полагали первоначально
[Bremner, 1997].
Метанотрофные бактерии при окислении аммония способны выделять
небольшие количества N20, что обусловлено неспецифической активностью
метанмонооксигеназы [Bedard, Knowles, 1989].
В качестве одного из продуктов гетеротрофной нитрификации возможно
образование N20 [Castignetti, Hollocher, 1982]. Согласно Тортосо и
Хатчинсона [Tortoso, Hutchinson, 1990]. Хемолитоавтотрофные аммонийокисляю-
щие бактерии вносили преобладающий по сравнению с гетеротрофными нит-
рификаторами вклад в образование N20 и NO в почве. Авторы определяли
относительный вклад автотрофных аммонийокисляющих, автотрофных нит-
ритокисляющих и гетеротрофных нитрификаторов с использованием
селективных ингибиторов (2-хлор-6-(трихлорметил)-пиридина и хлората натрия)
и добавлением глюкозы в почвы.. Другими исследователями на основе
сравнительных опытов с Nitrosomonas europaea и Alcaligenes faecalis показано, что
участие гетеротрофных нитрификаторов в эмиссии N20 из почв при
аэробных и близких к анаэробным условиям более значимо. То есть решение этого
вопроса требует дальнейших исследований. Тем не менее в настоящее время
гетеротрофная нитрификация и окисление аммония метанотрофами не
рассматриваются в качестве ведущих источников N20.
Доказательством существенного вклада автотрофных нитрифицирующих
микроорганизмов в эмиссию N20 из почв стал факт более высокой
продукции N20 из почв, получавших аммонийные или амидные удобрения, а не
нитратные, а также применение ингибиторов нитрификации (нитрапирина).
Ингибиторы нитрификации слабо влияли на денитрификацию нитратов, но при
этом наблюдали значительное снижение выделения N20. Эксперименты с
использованием ацетилена, который одновременно ингибирует
нитрификацию и восстановление N20 n нитрификаторами, дали разнообразные
результаты. Вместе с тем в последующем было получено множество
подтверждений, что деятельность нитрификаторов один из главных источников N20 в
почвах. При использовании аммонийных удобрений от 0,01 до 3%
добавленного азота (часто и выше, до 10%) составляют потери азота в форме N20. Это
количество N20 дает от 5 до 20% ежегодного повышения поступления
парникового газа в атмосферу.
Главными факторами, которые лимитируют нитрификацию в почвах,
являются доступность аммония, высокая кислотнесть, низкая влажность
почвы, доступность фосфатов, токсичность нитритов и аллелопатические
соединения. Оценка влияния экологических условий на уровень продукции N20 в
ходе нитрификации показала, что выделение N20 растет с увеличением рН,
содержания органического вещества, влажности (от воздушно-сухого состоя-
95
ния до полевой влагоемкости), температуры (от 5 до 40°С), внесения
нитрифицируемых форм удобрений и заметно снижается при добавлении ингиби-
рующих нитрификацию соединений [Муравин, 1989].
3.8. Взаимосвязь окисления аммония
и метана в почвах
На близость автотрофных аммонийокисляющих бактерий и метанотроф-
ных бактерий указывает молекулярно-генетический анализ 5S и 16S РНК и
особенности их метаболизма (практически одни и те же соединения ингиби-
руют эти микроорганизмы) [Bedard, Knowles, 1989].
Сходство ключевых ферментов метанмонооксигеназы и аммониймоно-
оксигеназы обусловливает возможность «переключения» метанокисляю-
щих бактерий на окисление аммония, а аммонийокисляющих бактерий при
недостатке основного субстрата - на окисление метана.
Механизм действия аммония включает конкурентное ингибирование
метанмонооксигеназы и неконкурентное (токсическое) подавление метано-
кисляющих микроорганизмов промежуточными продуктами окисления
аммония - гидроксиламином и нитритом [King, Schnel, 1994]. В некоторых
автоморфных почвах отмечено ингибирование метанокисления нитратом,
конечным продуктом нитрификации [Whalen, 2000].
Внесение аммонийных солей в почвенные образцы в лабораторных
опытах и аммонийных удобрений в полевых условиях существенно снижает
интенсивность окисления метана.
В пахотных почвах Бельгии достоверное уменьшение активности
метанокисления отмечено при внесении 5 мг NH4 -N/кг, а дозы 12-22 мг NH4 -N/кг
приводили к снижению метанокисляющей активности вдвое. Увеличение
концентрации вносимого аммония приводило к стимуляции нитрификации
как в почве с высокой нитрифицирующей активностью, так и с низкой.
Показана отрицательная корреляция между интенсивностью метанокисления и
нитрификации в этих пахотных почвах. Степень ингибирования
метанокисления в пахотных почвах существенно менялась в зависимости от
кислотности пахотных почв: при рН 6,4 составляла 62%, при рН 5,5 - 12%. Причиной
различий может быть уменьшение доли аммиака при снижении рН, так как
именно его молекулы связываются с активным центром
метанмонооксигеназы. Внесение аммония не приводило к падению метанокисляющей
активности почв под широколиственным и хвойными лесами в Московской области и
в лесных почвах Аляски [Кравченко, Быкова, 2004].
Низкие концентрации метана (0,06%) стимулировали нитрификацию в
лесной и пахотной почве, и количество нитратов увеличилось
соответственно на 37 и 20%. Напротив, высокие (6%) концентрации метана приводили к
достоверному снижению 15N-N03 как в лесных, так и пахотных почвах
[Кравченко, Быкова, 2004]. Ингибирование нитрифицирующей активности почв
метаном может достигать 40-50%.
Степень ингибирования метанокисления от внесения хлорида аммония в
дозе 83 мг N/кг варьировала в небольшом диапазоне - от 15 до 24% в серой
96
лесной почве, выщелоченном черноземе, торфяной и дерново-подзолистой
почве [Новиков, Степанов, 2002]. Оценка вклада нитрификаторов в
окисление метана в почвах показала, что в зависимости от типа почв он достигает
5-16%.
3.9. Ингибирование нитрификации
в почвах
Снижение интенсивности нитрификации в окультуренных почвах при
внесении высоких доз минерального азота - важная задача почвенной
микробиологии. Существует множество различных веществ, способных подавлять
окисление азота автотрофными бактериями-нитрификаторами. Давно
известно, что присутствие в среде гидразина препятствует окислению гидрокси-
ламина до нитрита клетками Nitrosomonas sp. Эффективным ингибитором
окисления нитрита до нитрата бактериями p. Nitrobacter является хлорат.
Однако ингибирование нитрификации на таких стадиях нежелательно,
поскольку ведет к накоплению токсичных соединений NH2OH и NO^.
Ингибирование нитрификации необходимо осуществлять на стадии окисления аммиака
до гидроксиламина.
Обширный список соединений, обладающих нитрифицидным действием
по отношению к бактериям группы Nitrosomonas, представлен следующими
классами:
• вещества биологического происхождения, продуцируемые растениями в
климаксных сообществах и образующиеся при разложении растительных
отстатков;
• неорганические соединения - азиды, сульфиды, хлориды, тяжелые
металлы;
• различные пестициды (гербициды, фунгициды и т.д), применяемые в
сельском хозяйстве (беномил, пиклорам, диурон, каптам и др.);
• химические соединения, не относящиеся к пестицидам - фенол, ацетон,
сульфоны, сульфоксиды, дитиол, меркаптанпроизводные, уретаны,
некоторые аминокислоты.
Эти соединения могут оказывать непосредственное воздействие на
метаболизм нитрифицирующих бактерий или создавать неблагоприятные
условия для их развития. Действие многих из вышеуказанных веществ носит
общий биоцидный характер, а не подавляет избирательно автотрофное
окисление аммония.
Идеальный ингибитор нитрификации должен обладать способностью в
небольших дозах эффективно и избирательно блокировать окисление
аммония бактериями группы Nitrosomonas, не действовать на Nitrobacter и другие
почвенные микроорганизмы, растения, животных, сохранять активность в
почве в течение нескольких недель и быть экономичным в применении.
С учетом этих требований были испытаны сотни соединений и для выпуска в
промышленных масштабах отобраны вещества из классов цианидов, нитро-
и галлоанилидов, производные фенолов, хинолинов, хлорпиридинов и пири-
мидинов, алкилгалогенидов, триазолы, ацетиленовые соединения, цитохром
97
Р-450, аминокислоты (L-гистидин, L-треонин, L-фенилаланин) и некоторые
другие [Муравин, 1989; Bedard, Knowles, 1989].
В настоящее время наиболее изученными препаратами являются нитра-
пирин (N serve), аминотриазол, дициандиамид, карбамоилпиразол и
некоторые другие. Установлено наличие избирательного действия нитрапирина (2-
хлор-б-(трихлорметил)-пиридин) на автотрофные аммонийокисляющие
бактерии, который в концентрации 1-10 мкг/мл эффективно подавлял
накопление биомассы и продукцию нитрита у Nitrosomonas, тогда как
Nitrobacter был устойчив к такой дозе препарата. Аналогичным действием
нитрапирин обладает по отношению к Nitrosolobus и Nitrosospira. На основе
анализа потребления кислорода и образования нитритов клетками
Nitrosomonas europaea обнаружено, что нитрапирин в дозе 0,2 мкг/мл
подавляет рост бактерий, но не влияет на окисление гидроксиламина в
концентрации 1-3 мкг/мл. Это гетероциклическое соединение инактивирует
аммониймонооксигеназу.
Чувствительность чистых культур автотрофных нитрифицирующих
бактерий к нитрапирину, как и к другим препаратам, в значительной степени
зависит от условий их культивирования. Клетки Nitrosomonas, растущие при
азотном лимитировании, демонстрировали повышенную устойчивость к
нитрапирину. Скорость роста Nitwsomonasf адсорбированных на стекле и затем
десорбированных, в отличие от свободных клеток не снижалась под
воздействием нитрапирина в дозе 0,5 мкг/мл. Нитрапирин (1 мкг/мл) не ингибиро-
вал продукцию нитрита у Nitrosomonas, растущего на вермикулите с аммонием.
Сравнивая эффективность таких ингибиторов нитрификации, как
нитрапирин, карбамоилметилпиразол и дициандиамид, Хикиш с соавторами
[Hickisch et al., 1987] показали близкую активность первых двух препаратов
по отношению к чистым культурам Nitrosomonas и необходимость более
высоких доз дициандимида для достижения такого же эффекта. В опытах Э. А. Му-
равина [1989] 50%-ное подавление окисления аммония до нитрита
накопительной культурой Nitrosomonas достигалось при концентрациях аминотриа-
зола и карбамоилметилпиразола, в 2-3 раза больших, чем нитрапирина.
Эффективность ингибиторов нитрификации в почве зависит от рН,
влажности, температуры и содержания органического вещества. Все эти факторы
определяют активность микроорганизмов, осуществляющих разрушение
препаратов в почве. От температуры зависит также скорость улетучивания
ряда ингибиторов нитрификации (нитрапирина), а от содержания
органического вещества - масштабы их адсорбции в почве. Глинистая фракция и
органическое вещество, поглощая препараты, уменьшают их активность.
Нитрапирин не подавляет нитрификацию в богатой органическим веществом
почве, хотя может присутствовать в концентрациях, достаточных для
подавления жизнедеятельности бактерий группы Nitrosomonas in vitro. Это
обусловлено не только его летучестью, но и сорбцией в богатых органикой кислых
почвах. Нитрапирин в дозе 8 мкг/г почвы и дициандиамид - 20 мкг/г
активно подавляли нитрификацию в почве с содержанием органического углерода
1,4%, тогда как в почве с Сорг 40% даже высокие дозы нитрапирина - 20 мкг/г
и дициандиамида - 100 мкг/г были менее эффективны. Вместе с тем
ацетилен в концентрациях 0,1 и 1% тормозил нитрификацию в тех же почвах.
Снижение эффективности нитрапирина отмечено при содержании органическо-
98
го вещества >50 г/кг почвы. Поведение дициандиамида и тиомочевины в
почвах с разным содержанием органического вещества (Сорг 0,52-3,89%)
было аналогично нитрапирину.
Гранулометрический состав почвы существенно влияет на эффективность
ингибиторов нитрификации. В песчаной почве аминотриазол имеет
преимущества перед нитрапирином, более летучим соединением.
Основные потери нитрапирина из почвы происходят за счет
улетучивания, и только небольшая его часть переходит в 6-хлорпиколиновую кислоту,
время разложения которой варьирует от 20 до 80 сут. 6-хлорпиколиновая
кислота обладает угнетающим действием на Nitrosomonas europaea в
экспоненциальной фазе роста. Снижение температуры с 20 до 10°С увеличивает
период полураспада нитрапирина с 10-20 до 40 сут. Внесенный осенью
препарат может сохраняться в почве несколько месяцев. Время полураспада
дициандиамида в почве возрастало с 18-25 сут при 20°С до 111—116 сут при 8°С
[Di, Cameron, 2004]. Время полужизни аммонийного азота удобрений
возрастало при применении дициандиамина соответственно с 44 до 243-491 сут при
8°С и с 22 до 55-64 сут при 20°С.
Промежуточные продукты разложения дициандиамида в почве - гуани-
дин и гуаниловая кислота - не ингибируют аммонийокисляющие бактерии.
В итоге, он разрушается до мочевины и аммония и может быть использован
растениями.
Ингибиторы нитрификации (нитрапирин, карбамоилметилпиразол,
аминотриазол) вносят из расчета порядка 2% дозы азотного удобрения, дициан-
диамид - 10%. При их применении численность автотрофных
нитрифицирующих бактерий в почвах снижается в 2-40 раз, затем происходит
постепенное восстановление плотности их популяции, а через 40-100 дней и более она
достигает начального уровня [Попов и др., 1990]. Продолжительность
удержания ингибиторами нитрификации азота в аммонийной форме в почве
составляет соответственно 3-5 нед.
Ингибиторы нитрификации обладают высоким избирательным
воздействием по отношению к автотрофным нитрификаторам и отсутствием или
слабым эффектом на рост гетеротрофных микроорганизмов на средах и их
численность в почве. Не обнаружено ингибирующего воздействия ацетилена
на нитрифицирующий штамм артробактера, что указывает на различия в
механизме окисления аммония у этого гетеротрофа по сравнению с нитрозо-
моносом.
В дозах, эффективных в отношении аммонийокисляющих автотрофных
бактерий, коммерческие препараты (нитрапирин, карбамоилметилпиразол,
аминотриазол) не оказывают действия на линейную скорость роста,
накопление биомассы и образование нитритов и нитратов у грибов-нитрифика-
торов [Кураков, Попов, 1995]. Однако это действие на нитрифицирующие
грибы проявлялось при концентрациях, на 1-4 порядка более высоких. Уже
при прозводственных дозах карбамоилметилпиразола установлено
изменение фитотоксической активности чистых культур грибов, что коррелировало
с повышением продукции гидроксамовых кислот. При систематическом
использовании этого ингибитора нитрификации установлены изменения в
структуре комплекса микромицетов и проявления микробной токсичности
почвы.
99
Применение ингибиторов нитрификации позволяет повысить
эффективность использования азотных удобрений (на 10-30%) и урожай
сельскохозяйственных растений (на 10-15%) за счет удержания аммиачного азота
почвы и удобрений в первые 1-1,5 мес. вегетационного периода. Действием
ингибиторов нитрификации обусловлено снижение потерь азота (до 40%) из-за
миграции образующихся нитратов из корнеобитаемого слоя почвы и
образования газообразных соединений азота при нитрификации и впоследствии -
денитрификации. Есть данные, указывающие на повышение закрепления в
почве азота в органической форме при внесении сульфата аммония с
ингибиторами нитрификации. При использовании нитрифицируемых форм
азотных удобрений многие ингибиторы нитрификации (нитрапирин, ацетилен,
карбид кальция, дициандиамид) заметно снижают выделение закиси азота из
почв. Наиболее перспективный из них - карбид кальция, который готовится
в капсулированной форме с восковой оболочкой, что позволяет при реакции
его с водой получить пролонгированное выделение ацетилена в почве.
Применение этого ингибитора значительно уменьшает потери азота в форме N20
из почв, удобряемых мочевиной.
3.10. Соотношение авто- и гетеротрофной
нитрификации в почвах
Сведения о соотношении авто- и гетеротрофной нитрификации в почвах
естественных биоценозов немногочисленны и противоречивы. Шимел с
соавторами [Schimel et al., 1984] на основе нескольких подходов (блокирование
активности автотрофных нитрифицирующих бактерий ацетиленом,
применение антибиотиков, внесение в почву меченого аммонийного азота для
выяснения источника окисляемого азота) показали, что гетеротрофная
нитрификация преобладала над автотрофной в лесных горных почвах. Однако
авторы инкубировали не образцы почвы как таковые, а почвенную
суспензию, что могло существенно повлиять на активность авто- и гетеротрофной
нитрификации.
В исследованиях Хайнеса и Ноулса [Hynes, Knowles, 1982] при
использовании ацетилена для блокирования нитрификации в горных пастбищных
почвах с высокой численностью автотрофных нитрификаторов установлено,
что только около 10% нитратов образуется гетеротрофными
микроорганизмами.
Штальберг и Круглов [1979] оценили вклад гетеротрофов как 8-64% в
зависимости от типа почвы и внесения в них органических субстратов. Однако
ими не была проведена оценка неспецифического действия использованного
ингибитора нитрификации (2,4-лутидина) на. гетеротрофное микробное
сообщество, а активность гетеротрофной нитрификации была искусственно
усилена инокуляцией в почву нитрифицирующего штамма Aspergillus flavus.
Кроме того, определение накопления нитратов проводили только на 30-е сут
инкубации, когда ингибирующее действие 2,4-лутидина могло существенно
снизиться.
100
Крайне противоречивые оценки природы нитрифицирующих агентов
имеются для наиболее изученных кислых почв под хвойными лесами.
Существуют сообщения об автотрофной природе нитрификации [De Boer et al.,
1991] и о преимущественном протекании в этих почвах гетеротрофной
нитрификации [Stroo et al., 1986]. Провести обобщение результатов
выполненных работ сложно, так как в них использовали различные приемы и
ограниченное число почв.
А.В. Кураковым [Кураков и др., 1995; 2001] проведено специальное
исследование оценки участия автотрофных нитрификаторов и гетеротрофных
микроорганизмов в окислительном звене цикла азота. В экспериментах был
использован комплекс подходов, единый для разных почв: 1) определение
численности автотрофных нитрифицирующих бактерий в почвах, 2)
сравнительное изучение нитрификации в лабораторных инкубационных опытах
при внесении сульфата аммония и пептона в почвы, 3) ингибирование
жизнедеятельности гетеротрофных микроорганизмов в почве антибиотиками,
4) подавление автотрофных нитрифицирующих бактерий и метанотрофных
бактерий в почвах ингибиторами нитрификации.
Полагали, что при преимущественном протекании гетеротрофной
нитрификации в почвах должна быть низкой плотность популяции автотрофных
нитрификаторов и применение специфических ингибиторов не повлияет на
скорость нитрификации, или она будет сохраняться на довольно высоком
уровне, образование нитратов повысится при добавке пептона, а внесение
аммония не окажет значимого эффекта.
Численность автотрофных нитрифицирующих бактерий в почвах
Полученные результаты убедительно продемонстрировали различия в
численности автотрофных нитрификаторов между почвами разных
биоценозов (см. табл. 3.4). Плотность популяций автотрофных нитрифицирующих
бактерий I и II фаз в почвах под лесом и в целинных почвах степной и
пустынной зон была крайне низкой (до 100-200 кл./г почвы). Минимальная их
численность обнаружена в дерново-подзолистой почве под
ельником-кисличником, несколько выше - в серой лесной почве под березняком, затем
следовали целинные почвы пустынной и степной зон. Численность
автотрофных аммоний- и нитритокисляющих бактерий была на несколько порядков
выше в почвах агроценозов по сравнению с соответствующими почвами под
лесом, степной и пустынной растительностью. Обнаружена тенденция
возрастания количества автотрофных нитрификаторов по мере окультуривания
и длительности сельскохозяйственного использования почв. Так,
численность автотрофных нитрифицирующих бактерий была выше в
окультуренной дерново-подзолистой почве по сравнению со слабоокультуренной серой
лесной, хотя первая характеризовалась более высокой кислотностью.
Максимальная численность автотрофных нитрифицирующих бактерий (в
диапазоне 103-105 клеток на 1 г в.-с. почвы) выявлена в коричневой карбонатной
почве, в зоне многолетнего орошаемого земледелия.
Таким образом, четко прослеживается наблюдавшееся и другими
исследователями возрастание количества автотрофных нитрификаторов в хорошо
окультуренных почвах и низкая их плотность в кислых почвах под лесом и
целинных почвах.
101
Таблица 3.4
Численность автотрофных нитрификаторов в почвах
(метод предельных разведений)
Почва, биоценоз
Дерново-подзолистая, ельник-
кисличник
Серая лесная, березняк
Серая лесная, агроценоз
Темно-каштановая, полынно-
разнотравная степь
Темно-каштановая, агроценоз
1 Крайне аридная, пустыня
Коричневая карбонатная,
1 агроценоз
Количество клеток в 1 г в.-с. почвы |
Нитрификаторы
I фазы
10
42-462
330-3630
16-228
6000-80 000
10-100
106 000-115 500
II фазы
нд*
нд*
136-1485
15-209
6000-80 000
10-100
200-2300
* нд - бактерии не обнаружены.
Нитрифицирующая активность почв
при внесении сульфата аммония и пептона
Отклик нитрифицирующих микроорганизмов был принципиально раз--
личным при внесении сульфата аммония в почвы естественных биоценозов и
окультуренные почвы аналогичного типа. Интенсивность нитрификации
достоверно не изменялась при внесении сульфата аммония в
дерново-подзолистую почву под ельником-кисличником, серую лесную почву под
березняком, брюниземы выщелоченные под естественной дубравой (черноземовид-
ные почвы) и темно-каштановую почву под полынно-степным разнотравьем.
Внесение аммонийного азота достоверно повышало скорость нитрификации
(в 1,2-2 раза) в брюниземах выщелоченных под молодым сосняком и
залежей под разнотравной прерией, серо-бурой пустынной и крайне аридной
почвах под пустынной растительностью. В почвах без добавок и при внесении
сульфата аммония содержание нитритов во все сроки анализов не
превышало 0,5 мкг N-NO2A в.-с. почвы.
. Добавление пептона способствовало существенному увеличению
скорости нитрификации в почвах естественных биоценозов, причем пептон
вызывал большую интенсификацию процесса, чем сульфат аммония. При
инкубации дерново-подзолистой и серой лесной почвы с пептоном отмечали
значительное повышение концентрации нитритов (до 5-15 мкг N-NO^/r в.-с.
почвы). Следует отметить в этой связи, что Адаме [Adams, 1986] при
исследовании природы агентов нитрификации в кислых почвах под хвойными
лесами также обнаружил, что активность нитрификации возрастала при добавке
пептона и не увеличивалась при внесении сульфата аммония.
В окультуренных почвах скорость нитрификации увеличивалась при
внесении как сульфата аммония, так и пептона. Максимальная интенсивность
процесса была в хорошо окультуренных коричневой карбонатной почве и
выщелоченном брюниземе, затем следовали окультуренные выщелоченный чер-
102
нозем и дерново-подзолистая почва, слабоокультуренные серая лесная и
темно-каштановая почвы.
Скорость нитрификации в выщелоченном брюниземе под 5-летней
залежью при внесении сульфата аммония и пептона была близкой к таковой в
окультуренном брюниземе и выщелоченном черноземе. Активность
нитрификации в брюниземе залежи 50-летнего возраста была намного ниже, чем в
пахотной почве этой зоны и почвы под 5-летней залежью. По скорости
нитрификации и отклику на внесение аммония и пептона почва 50-летней
залежи была близка к целинной темно-каштановой почве. Интенсивность
нитрификации возрастала в почве в 2-3 раза в результате проведения
периодического, каждые 7 лет, сжигания сухой травы на участке 50-летней залежи.
Ингибиторный подход
Известно, что нитрапирин обладает сильным ингибирующим
воздействием по отношению к автотрофным нитрифицирующим бактериям. Это
соединение подавляет рост и активность аммонийокисляющих бактерий в
питательных средах и стерильной почве при концентрациях 0,1-1 мкг/мл, нит-
ритокисляющих бактерий - 10 мкг/мл [Муравин, 1989] и метанотрофных
бактерий - 9 мкМ/мл [Bedard, Knowles, 1989]. Несколько более слабым
ингибирующим воздействием на эти группы бактерий по сравнению с нитрапи-
рином обладает аминотриазол [Bedard, Knowles, 1989].
Согласно результатам опытов с чистыми культурами грибов, влияние этих
ингибиторов нитрификации на гетеротрофные микроорганизмы
проявляется в концентрациях, на несколько порядков превышающих их активность по
отношению к автотрофным нитрифицирующим бактериям и метанотрофам.
Аминотриазол обладает наименьшей ингибирующей активностью в
отношении нитрифицирующих микроскопических грибов по сравнению с другими
нитрифицидами, нелетуч и хорошо растворим в воде [Кураков и др., 2001].
В предварительных экспериментах были установлены концентрации
ингибиторов, необходимые для дифференциальной оценки активности авто- и
гетеротрофной нитрификации в почвах. Для этого в почвы
(дерново-подзолистую окультуренную и под ельником-кисличником и окультуренную
коричневую карбонатную почву) вносили ингибиторы нитрификации (с
одновременным внесением 100 мкг N/r сульфата аммония и без него) в
возрастающих концентрациях - 0, 0,25, 1, 10, 100, 1000, 1000 мкг/г в.-с. почвы.
Интенсивность нитрификации снижалась в почвах при концентрациях нитрапи-
рина 1 мкг/г и аминотриазола 10 мкг/г почвы. Повышение концентрации
нитрапирина до 5 мкг/г и аминотриазола до 100 мкг/г приводило к
дальнейшему плавному понижению скорости нитрификации в почвах. При более
высоких дозах ингибиторов (нитрапирина до 100 мкг/г и аминотриазола до
1000 мкг/г) интенсивность нитрификации достоверно не изменялась и
кривая накопления нитратов выходила на «плато». Считается, что при таких
концентрациях нитрапирина и аминотриазола активность автотрофных
нитрифицирующих бактерий и метанотрофных бактерий в почвах подавлена, а
нитрификация осуществляется только за счет функционирования
гетеротрофных микроорганизмов. Поэтому для определения вклада гетеротрофных
микроорганизмов в нитрификацию в почвах использовали дозы
нитрапирина 20-30 мкг/г и/или аминотриазола 100 мкг/г, которые в таких концентра-
103
циях обладали сходной эффективностью подавления активности автотроф-
ной нитрификации. По снижению скорости нитрификации в почвах с
ингибиторами определяли вклад гетеротрофных микроорганизмов в
окислительное звено цикла азота.
Важно, что при таких дозах нитрапирина и аминотриазола не происходило
усиления минерализации азотсодержащих соединений почвы. Более высокие
концентрации ингибиторов нитрификации приводили к гибели части
микробной популяции и ее минерализации. То есть наблюдался эффект,
аналогичный фумигации почв, что вызывает дополнительное поступление аммония.
Полное ингибирование нитрификации в почве происходило при
концентрации нитрапирина 1000 мкг/г: подавлялся рост и нитрифицирующая
активность гетеротрофных микроорганизмов. Полного ингибирования
нитрификации в почве при внесении аминотриазола не происходило, что обусловлено
его значительно более слабым нитрифицидным действием в отношении
гетеротрофных микроорганизмов [Кураков и др., 2001].
Для оценки участия грибов и бактерий в нитрификации с окультуренной
дерново-подзолистой почвой, выщелоченным черноземом и коричневой
карбонатной почвой были проведены также эксперименты с применением
антибиотиков - циклогексимида и стрептомицин сульфата, аналогичные по
схеме описанным выше для ингибиторов нитрификации.
Использование ингибиторного подхода позволило дать
дифференциальную оценку участия авто- и гетеротрофных нитрификаторов в
окислительном звене цикла азота. Соотношение интенсивности авто- и гетеротрофной
нитрификации существенно менялось в ряду: почвы под хвойными,
мелколиственными и широколиственными лесами, травянистой степной
растительностью, почвы залежей и агроценозов (см. рис. 3.4). Скорость автотрофной
нитрификации варьировала в диапазоне от 0,2-0,4 до 18,7 мкг N-NO^/r • сут
и гетеротрофной нитрификации - от 1,4-3,6 мкг N-NO^/r • сут в кислой
дерново-подзолистой почве под ельником-кисличником до 0,1-0,4 мкг
N-NOjj/r • сут в окультуренных почвах. Активность гетеротрофной
нитрификации была выше в почвах естественных биоценозов по сравнению с почвами
агроценозов (см. рис. 3.4).
Вклад гетеротрофных микроорганизмов в нитрификацию в образцах
дерново-подзолистой почвы, отобранных под ельником-кисличником, достигал
94%, в серой лесной почве под березняком - 44%, в выщелоченном брюнизе-
ме под молодым сосняком и дубравами - 23 и 30%, целинной
темно-каштановой почве под полынно-злаковой степью - 33%. В выщелоченном брюниземе
5-летней залежи за счет деятельности гетеротрофных микроорганизмов
максимально образовывалось до 19% нитратов, в 45- и 50-летней залежи - 21 и
38%. В пахотных почвах их вклад в нитрификацию был минимальным и
варьировал в зависимости от почвы и ее окультуренности от 1 до 16%.
При внесении в окультуренные почвы сульфата аммония или пептона
относительный вклад гетеротрофов в нитрификацию резко падал (до 1-8%),
что было обусловлено активизацией автотрофных нитрификаторов.
Достоверное уменьшение относительного участия гетеротрофных
микроорганизмов в нитрификации наблюдали при добавке этих соединений в
выщелоченный брюнизем под залежами, сосняком и дубравой (до 4-25%). В дерново-
подзолистой почве под ельником-кисличником, серой лесной почве под
104
березняком и целинной темно-каштановой почве участие гетеротрофов в
нитрификации оставалось таким же высоким при внесении сульфата
аммония или пептона, как и без них.
12
10
8
о
U
m
О
2
Почвы под лесной и степной растительностью „
АБВ АБВ АБВ АБВ АБВ АБВ АБВ АБВ АБВ
I II III IV V VI VII VIII IX
20 Г
Окультуренные
□ 1
Рис. 3.4. Активность нитрификации в почвах: 1 - подавляется ингибиторами
нитрификации (ИН); 2 - не подавляется ИН (гетеротрофная нитрификация);
А - почва без добавок; Б - с добавлением сульфата аммония; В - с добавлением
пептона; почвы: I, X - дерново-подзолистая; II, XI - серая лесная; III, XII -
темно-каштановая; IV, V - выщелоченный брюнизем под дубравой и сосняком; VI,
VII - под 45- и 50-летней залежью (прерия); VIII - 50-летняя залежь (прерия),
траву периодически сжигают; IX - 5-летняя залежь (прерия); XIII - коричневая
карбонатная, пашня; XIV - выщелоченный чернозем, пашня
105
В литературе имеются единичные сообщения по оценке активности
гетеротрофной нитрификации непосредственно в почвах. Согласно
исследованию Бараклоух и Пури [Barraclough, Puri, 1995], в кислой почве под
дубравой, в которой проводили рубки, она составляла 0,08-0,12 мкг N • (г • сут).
В опытах А.В. Куракова [Кураков и др., 2001], активность гетеротрофной
нитрификации в брюниземе под естественным дубовым лесом достигала
0,3-0,6 мкг N • (г • сут). Использование метки 15N и ингибирование автотроф-
ных нитрификаторов ацетиленом показало, что скорость
гросс-нитрификации снижалась при переходе от почвы вырубки, к молодому и далее зрелому
смешанно-хвойному лесу, и составляла 45, 17 и 4,5 мкг N • кг1 • ч-1 [Pedersen
et al., 1999]. В почве из-под вырубки автотрофная нитрификация
представляла доминирующий процесс образования нитратов, скорость которого
достигала 45 мкг N • кг1 • ч"1, что составляло 30% интенсивности
гросс-минерализации (140 мкг N • кг1 • ч"1). В почвах под лесами ацетилен не влиял на
гросс-нитрификацию, что свидетельствует о ее гетеротрофной природе.
Гетеротрофная нитрификация достигала только 5% гросс-минерализации,
скорость которой в подстилке и верхнем минеральном горизонте (0-10 см)
составляла 90 и 550 мкг N • кг1 • ч"1.
В целом, активность гетеротрофной нитрификации в почвах разных
типов '- окультуренных и под естественной растительностью, варьировала не в
столь широком диапазоне (0,1-3,6 мкг N • (г • сут)), как автотрофной
нитрификации (0,2-18,8 мкг • (г • сут)) [Кураков и др., 2001]. Это можно объяснить
тем, что популяционная плотность гетеротрофных нитрификаторов не столь
резко различается в почвах разных типов, как высокоспециализированной
группы автотрофных нитрифицирующих бактерий.
Оценка вклада гетеротрофных микроорганизмов в образование нитратов
в окультуренных почвах (дерново-подзолистой, выщелоченном черноземе и
коричневой карбонатной) с использованием антибиотиков (циклогексимид,
стрептомицин + циклогексимид) дала результаты, близкие к полученным с
применением ингибиторов нитрификации. Ингибирующий эффект цикло-
гексимида был значительно (5-10 раз) выше, чем от стрептомицина, что
указывает на доминирующую роль грибов в гетеротрофной нитрификации в
почвах. В работах американских исследователей также установлено
значительное подавление активности нитрификации при внесении циклогексими-
да и отсутствие такового от стрептомицина в водно-почвенных суспензиях
образцов кислых почв под хвойным лесом [Stroo et al., 1986].
Корреляционный анализ показал наличие тесной взаимосвязи между
общей интенсивностью нитрификации, активностью нитрификации автот-
рофного блока и численностью автотрофных нитрифицирующих бактерий в
почвах (г = 0,61-0,66). Между активностью гетеротрофной нитрификации и
численностью автотрофных нитрификаторов в почвах корреляция
отсутствовала (г = -0,31), а для почв естественных биоценозов она была обратно
пропорциональной (г = -0,80). Так, в окультуренной коричневой карбонатной
почве, в которой вклад автотрофов в нитрификацию был максимальным, их
численность оказалась самой высокой среди исследованных почв. В
окультуренной дерново-подзолистой почве численность этих бактерий была на 3
порядка меньше, и их относительный вклад в образование нитратов ниже.
Наименьшие размеры вклада автотрофов в нитрификацию в дерново-подзолис-
106
той почве под ельником-кисличником соответствовали минимальному
количеству нитрифицирующих бактерий в этой почве.
3.11. Заключение
Рассмотрение только свойств почвы в данный момент времени, без учета
истории ее формирования как компонента биоценоза, не позволяет
объяснить возникающие противоречия при определении природы и скорости
нитрификации в почвах. Различия в активности авто- и гетеротрофных
микроорганизмов обусловлены не только физико-химическими свойствами почвы, но
в большей мере зависят от принадлежности ее к определенному агро- или
биоценозу, стадии его сукцессии, характера различных антропогенных и
природных воздействий на почву и биоценоз. Интенсивность нитрификации и
состав нитрифицирующих агентов будут существенно варьировать в
зависимости от того, формируется лесной биоценоз на месте пахотного поля, или
идет его обновление в климаксном лесу после ветровала, давности и
обширности лесных пожаров, проведения вырубок. Приведенные выше различия в
роли гетеро- и автотрофных нитрификаторов в окислительном звене цикла
азота в целинной степной почве и почвах залежей разного возраста со
сходными физико-химическими свойствами и растительностью обусловлены тем,
что одни из них были ранее под пашней, что, естественно, привело к
изменению в них сообщества нитрифицирующих микроорганизмов.
Восстановление микробных сообществ почв в исходное состояние, до использования
удобрений, может происходить в течение довольно продолжительного
периода - не менее нескольких десятков лет [Кураков, Козлова, 2002].
Наиболее важными причинами низкой численности и активности
автотрофных нитрификаторов в почвах климаксных биоценозов считается
наличие в корневых выделениях растений и продуктах разложения растительных
остатков веществ, ингибирующих эти бактерии, а также высокая кислотность
почв [White, 1991]. Вместе с тем в последние десятилетия обнаружены аци-
дотолерантные штаммы автотрофных нитрификаторов, способные
осуществлять нитрификацию в кислых почвах [De Boer et al., 1991]. Активное
функционирование автотрофных нитрификаторов может наблюдаться в кислых
почвах лесов, в которых проводили вырубки, были пожары или применяли
азотные удобрения. То есть после воздействий, которые обусловливали
повышение содержания аммония в почвах. Автотрофная природа нитрификации
выявлена также в дерново-подзолистых почвах ельников, подверженных
повышенной рекреационной нагрузке. Имеются сведения, что ингибирующее
действие токсических веществ корневых экссудатов и подстилки (феноль-
ных соединений, монотерпенов) на нитрификацию не столь высоко. Однако
их постоянное присутствие в почвах климаксных биоценозов, повышенное
накопление при разложении опада, особенно хвойных пород [White, 1991],
по-видимому, не может не ухудшать условия функционирования
автотрофных нитрификаторов.
Другим важным фактором является лимитирование роста автотрофных
нитрификаторов недостатком минеральных элементов, в первую очередь
107
фосфора [Verstraete, 1981]. Эта концепция тесно увязывается с тем, что
нитрификация интенсифицируется в почвах агроэкосистем при внесении
комплексных минеральных удобрений. Проблема в недостатке фосфора в почвах
природных экосистемах растениями решается с помощью микоризы, и, по-
видимому, в определенной мере микоризные грибы, перехватывая
питательные элементы, в частности фосфор, выступают как агенты биологического
контроля нитрификации [Verstraete, 1981].
Соотношение C:N играет важную роль в перераспределении участия авто-
и гетеротрофных нитрификаторов в образовании нитратов. В условиях
одновременного роста гетеротрофного Thiosphaera pantotropha и автотрофного
нитрификатора Nitrosomonas europaea в хемостате показано, что при высоких
значениях соотношения C:N (>8,7) и ухудшении аэрации существенно
увеличивается рост и активность окисления аммония у Thiosphaera pantotropha и
снижается у Nitrosomonas europaea [Van Niel et al., 1993].
Критическим фактором для ограничения жизнедеятельности автотроф-
ных нитрификаторов является недоступность для них аммония в почвах
естественных биоценозов по сравнению с агроценозами. В этих почвах выше
пул гетеротрофных микроорганизмов, главным образом грибов, содержание
органических веществ, водорастворимых соединений углерода [De Luca,
Keeney, 1992], и потому в случае инициации минерализационных процессов
аммоний быстро ими ассимилируется. Константа Михаэлиса-Ментэн (Км)
процесса окисления аммония у бактерий группы Nitrosomonas варьирует от
0,2 до 8,0 мг N-NHj/n (14-570 мкМ) в зависимости от температуры [Knowles
et al., 1965] и заметно снижается при увеличении рН (с 56 мг, рН 7,0 до 1,96 мг
N-NH^A, рН 9,1 (25°С)). Км ассимиляции аммония у грибов и
гетеротрофных бактерий значительно ниже - 0,20 мг N/л [McGill et al., 1981].
Максимальная скорость роста автотрофных нитрификаторов 0,3-0,8 сут1 также
существенно ниже, чем у гетеротрофных микроорганизмов [McGill et al., 1981].
Поэтому автотрофы не могут успешно конкурировать за аммоний с гетерот-
рофами в почвах природных экосистем, особенно таежной зоны, где
содержание аммония не так велико и всегда имеются доступные для гетеротрофов
органические вещества. Крайне важной представляется также роль
микоризных грибов в конкуренции за аммоний, который они предпочитают нитратам.
В природных экосистемах микотрофность растений несопоставимо выше,
чем в агроэкосистемах.
Прогрессирующее ингибирование нитрификации и все более полный
переход к усвоению аммонийного азота представляет общую закономерность
сукцессии в наземных экосистемах [Федоров, Гильманов, 1980]. Вследствие
этого достигается экономия энергии: растениям не приходится тратить ее на
восстановление нитратов в аммоний, снижаются потери азота, так как
аммоний достаточно прочно удерживается в корнеобитаемом слое почвы, причем
не только в форме фиксированного на глинистых минералах, но и из-за
иммобилизации микроорганизмами и большей эффективности его усвоения
микоризными растениями поздних стадий сукцессии.
Жесткое подавление активности автотрофных нитрификаторов в почвах
климаксных еловых лесов обусловлено сочетанием неблагоприятных
факторов. Наряду с низким рН (возникает проблема обеспечения аммониймоноок-
сигеназы автотрофов в такой кислой среде аммиаком (NH3) и защиты от ток-
108
сичных концентраций HN02) и наличием ингибирующих фенольных веществ
и монотерпенов, наиболее важным является быстрая иммобилизация азота
гетеротрофными микроорганизмами, главным образом грибами. Это
обусловлено постоянным присутствием доступных субстратов (лесной подстилки),
высоким уровнем водорастворимых органических соединений и грибной
биомассы в этих почвах. Применение в последние годы улучшенных технологий
масс-спектрометрии, определения N15 и запасов микробной биомассы
показало, что процессы азотного цикла в лесных почвах тесно сопряжены -
нитрификация и ассимиляция нитратов протекают одновременно с
минерализацией/аммонификацией. Проведенные эксперименты с меченым азотом
показывают важную роль микробной ассимиляции азота, недоучет которой не давал
реальной оценки скорости гросс-нитрификации в почве [Stark, Yart, 1997].
Практически любые нарушения в климаксном лесу (ветровал, пожар,
рубка, рекреационная нагрузка, атмосферные азотсодержащие осадки),
активизирующие минерализационные процессы в почвах и снижающие их иммоби-
лизационный потенциал ведут к повышению конкурентоспособности и
активности автотрофных нитрификаторов в кислых лесных почвах. Поэтому
роль автотрофных нитрифицирующих бактерий в накопление нитратов в
почвах природных экосистемах, по-видимому, выше, чем если исходить
только из результатов лабораторных опытов с ненарушенными почвами. В почвах
агроценозов микробная биомасса и содержание органических веществ ниже,
регулярно вносятся азотсодержащие удобрения, известь, при вспашке
усиливается аэрация, что одновременно обусловливает периодическое накопление
аммонийного азота и оптимизацию условий жизнедеятельности
автотрофных нитрификаторов. Все это приводит к практически полной передаче или
усилению ведущих позиций автотрофных нитрифицирующих бактерий в
окислительном звене цикла азота в окультуренных почвах, интенсификации
нитрификации и, как следствие, повышению потерь азота из почв из-за
вымывания нитратов и газообразных эмиссий азотсодержащих соединений,
накоплению нитратов в грунтовых водах и сельскохозяйственных растениях.
Понимание важности нитрификации в глобальном цикле азота указывает
на необходимость исследований, в которых будут тесно связаны молекуляр-
но-генетические, физиологические подходы и оценка активности азотных
процессов. Регулированием активности нитрификации в почвах,
по-видимому, в большинстве случаев достигается наиболее действенное снижение его
потерь из почв при сохранении высокого пула минерального азота для
растений. Выяснение механизмов ингибирования окисление аммония,
наблюдаемое в почвах многих экосистем, реальный путь достичь этого в агроэкосисте-
мах, что существенно уменьшит финансовые затраты на удобрения и
предотвратит загрязнение азотными соединениями окружающей среды.
Экологически безопасными приемами контроля нитрификации и,
соответственно, удержания азота в агроэкосистемах представляются повышение
запасов микробной биомассы, в первую очередь биомассы грибов, что
достигается внесением растительных субстратов (полимеров), увеличением уровня
микотрофности растений, применения органических удобрений в форме
компостов, снижением интенсивности обработки почв, внесением медленно-
растворимых аммонийных удобрений и применением в севооборотах
растений, разнообразных по потреблению азота и влиянию на азотные процессы.
109
Литература
Виноградский С.Н. Микробиология почв. Проблемы и методы. М.: Изд-во
АН СССР, 1952. С. 145-340.
Заварзин ГА. Литотрофные микроорганизмы. М.: Наука, 1972. 322 с.
Илялетдинов А.Н. Микробиологические превращения азотсодержащих
соединений в почве // Алма-Ата. Наука. 1976. 281 с.
Ляликова Н.Н., Лебедева Е.В. Хемосинтез: К 100-летию открытия С.Н. Ви-
ноградским. М.: Наука. 1989. С. 32-47.
Кондратьева ЕМ. Автотрофные прокариоты. М.: Изд-во МГУ, 1996. 312 с.
Кравченко И.К., Быкова СА. // Труды ин-та микробиологии им. С.Н. Ви-
ноградского. Вып. XII. Юбилейный сборник к 70-летию института. Ред. В.Ф.
Гальченко. М.: Наука, 2004. С. 235-248.
Кудеяров В.Н. // Почвоведение, 1999а, №1, с. 63-72
Кудеяров ВМ. // Почвоведение, 19996, №8, с. 988-998.
Кураков А.В., Попов AM. // Почвоведение, 1995, №3, с. 314-322.
Кураков А.В.У Попов А.И., Евдокимов И.В., Култышева ЕМ. // Вестн. Моск.
ун-та. Сер. 17. Почвоведение, 1995, №1, с. 54-62.
Кураков А.В.У Евдокимов И.В., Попов AM. // Почвоведение, 2001, №10,
с. 45-55.
Кураков А.В.у Куплетская М.Б., Скрынникова Е.В., Сомова Н.Г. // Прикл.
биохим. и микробиол., 2001, т. 37, №1, с. 67-72.
Кураков А.В.у Козлова Ю.Е. // Почвоведение, 2002, №5, с. 595-600.
Муравин ЭА. Ингибиторы нитрификации. М.: Агропромиздат, 1989.
248 с.
Новиков В.В.у Степанов АЛ. // Микробиол., 2002, т. 71, №2. с. 272-276.
Петербургский А.В. Агрохимия и физиология питания растений. М., Рос-
сел ьхозиздат, 1971, 334 с.
Попов АМ.у Мергель АА.У Кураков А.В., Семенов В.М., Гузев B.C. //
Почвоведение, 1990, №6, с. 78-86.
Прянишников Д.Н. Азот в жизни растений и в земледелии СССР. М.; Л.:
Изд-во АН СССР. 1945.197 с.
Сорокин ДЮ. // Успехи микробиологии, 1990, №24, с. 100-127.
Федоров В.Д.у Гильманов ТТ. Экология. М.: МГУ, 1980. 462 с.
Штальберг М.В., Круглое Ю.В. Круговорот и баланс азота в системе
почва-удобрение-растение-вода. М.: Наука. 1979. С. 213-215.
Abelovich Л., Vonhak A. // Arch. Microbiol, 1992, vol. 158, p. 267-270.
Adams J A. // Soil Biol. Biochem., 1986, vol. 18, p. 45-51.
Avrahami 5., Liesack W., Conrad R. // Environ. Microbiol., 2003, vol. 5, №8,
p. 691-705.
Barraclough D.t Puri G. // Soil. Biol. Biochem., 1995. vol. 27, №1, p. 17-22.
Batchelor S.E.y Cooper M.t Chhabra S.R.t Glover LA., Stewart G.SA.B., Williams
P.y ProsserJ.1. // Appl. Environ. Microbiol., 1997, vol. 63, p. 2281-2286.
Bedard C.f Knowles R. // Microbial. Rev, 1989. vol. 53, №1, p. 68-84.
Bock E.y Koops H.-P.y Moller V.C.t KudertM. // Arch. Microbiol., 1990, vol. 153,
p. 105-110.
Bock E.y Schmidt L, Stuven R.y Zart D. // Arch. Microbiol., 1995, vol. 163,
p. 16-20.
110
Bodelier P.L.E., Frenzel P. //Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol. 1999,
p. 45-54.
BremnerJ.M. //Nutrient Cycling in Agroecosystems, 1997, vol. 49, p. 7-16.
Castignetti D., Hollocher T.C.//App. Environ. Microbiol., 1982, vol. 44,
p. 923-928.
Castignetti D., Hollocher T.C. // Appl. Environ. Microbiol., 1984, vol. 47, №4, p.
620-623.
Castaldi S., Smith K.A. // Biol. Fert. Soils, 1998, vol. 27, Iss. 1, p. 27-34.
De Boer W., Klein P.J.A., Veenhuis M., Bock E., Laanbroek HJ. // Appl. Environ.
Microbiol., 1991, vol. 57, №12, p. 3600-3604.
De Boer W., Kowalchuk G.A. // Soil Biol. Biochem., 2001, vol. 33, p. 853-866.
Degrange V., Conteaux MM., Anderson J.M., Berg M.P., Lensi R. // Plant and
Soil. 1998. V. 198. 2. P. 201-208.
De Luca Т.Н., Keeney D.R. // Agron. Abstracts, USA. Madison. WI. 1992,
253 p.
Di HJ Cameron K.C. // Austral. J. Soil Res., 2004, vol. 42, №2, p. 927-932.
Francis C.A., Roberts К J., BemanJM., Santoro A.E., Oakley B.B. // Proc. Nat.
Acad. Sci. USA (Microbiology), 2005, vol. 102, №41, p. 14683-14688.
FochtD.D., Verstraete W. // Adv. Microbiol. Ecol., 1977, vol. 1, p. 135-214.
Grundmann G.L., Dechesne A., F.Bartoli,J.P.Flandrois,J.L.Chasse, Kizungu R. //
Soil Sci. Soc. Amer. J., 2001, vol. 65, p. 1709-1716.
Hastings R.C., Butler C, Singleton I., Saunders J.R., McCarthy A.J. // Lett. Appl.
Microbiol., 2000, vol. 30, p. 14-18.
Hickisch В., Hertbrich H.J., Merits С // Zbl. Mikrobiol., 1987, vol. 142, №6,
p. 417-430.
Honda N., Hirai M., Ano Т., Shoda M. // Biotechnology Letters. 1998. V. 20.
P. 703-705.
Hooper, A.B., Vannelli Т., Bergmann DJ. and Arciero DM. // Antonie van
Leeuwenhoek, 1997, vol. 79, p. 59-67. •
Hynes R.K., Knowles R. // Can. J. Microbiol. 1982. N 28. P. 334-340.
King G.M., SchnelS. // Appl. Environ. Microbiol., 1994, vol. 60, p. 3508-3513.
Knowles G., Downing A.L., Barrett A.L. // J. Gen. Microbiol., 1965, vol. 38,
p. 263-278.
Kowalchuk G.A., Вита D.S., de Boer W., Klinkhamer P.G.L., van VeenJA. //
Antonie van Leeuwenhoek, 2002, vol. 81, p. 509-520.
Krumbein W.E. // Rev. Ecol. Biol. Sol., 1972, vol. 9, №3, p. 283-319.
KuenenJ.G.Jetten, M.SM. // ASM News, 2001, vol. 67, p. 456-463.
Kurakov A. V., Nosikov A.N., Skrynnikova E. V., Lvov N.P // Current Microbiol.,
2000, vol. 41, №2, p. 114-119.
Kuypers МММ., Lavik G., Woebken D., Schmid M., Fuchs B.M., Amann R.,
Jorgensen B.B.,Jetten M.SM. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA (Microbiology), 2005,
vol. 102, №18, p. 6478-6483.
Low A.P., Stark J.M., Dudley LM. // Soil Sci., 1997, vol. 162, №1, p. 16-27.
Mansch R., Bock E. // Biodeterioration, 1998, vol. 9, №1, p. 47-64.
Martikainen P.J., Nurmiaho-Lassila E.L // Canad. J. Microbiol., 1985, vol. 31,
p. 190-197.
McGill W.B., Hunt H.W., Woodmansee R.G., Reuss J.O. Terestrial Nitrogen
Cycles. Processes, Ecosystem Strategies and Management Impacts. Ecol. Bull. 33.
HI
ЕЕ. Clark and T.Rosswall. Eds. Swedish Natural Science Research Council,
Stockholm, p. 49-115.
Meineke M., Ktieg E. and Bock E. // Appl. Environ. Microbiol., 1989, vol. 55,
p. 2108-2110.
Mintie A.T., Heichen R.S., Cromack K.,Jr., Myrold D.D., Bottomley P.J. // Appl.
Environmen. Microbiol. 2003. V. 69. №6. P. 3129-3136.
Miller L.G., Coutlakis M.D., Oremland R.S., Ward B.B. // Environ. Microbiol.,
1993, vol. 59, p. 2457-2464.
Mobarry B.K., Wagner M., Urbain V., Rittman B.E., StahlDA. // Appl. Environ.
Microbiol., 1996, vol. 62, p. 2156-2162.
MoirJ.W.B., EnticknapJJ., Richardson D.J., Spiro S. // Microbiology-UK, 1997,
vol. 143, p. 3775-3783.
Mulder A., van de GraafAA., Robertson LA., KuenenJ.G. // FEMS Microbiol.
Ecol., 1995, vol. 16, p. 174-184.
Paul E.A., Clark F.E. Soil microbiology and biochemistry. Academic Press, Inc.,
San Diego, USA. London, UK. 1989. 275 P.
Pedersen H., Dunkin К A., Firestone M.K. // Biogeochemistry, 1999, vol. 44, №2,
p. 135-150.
Pennington PL, Ellis R.C. // Soil Biol. Biochem., 1993, vol. 25, p. 1399-1408.
Philips С J., Harris D., Dollhopf S.L., Gross K.L., ProsserJ.1., Paul EA. // Appl.
Environ. Microbiol., 2000, vol. 66, №12, p. 5410-5418.
Poth M., Focht D.D. // Appl. Environ. Microbiol., 1985, vol. 49, p. 1134-1141.
Robertson LA., van Niel E.W.J., Torremans RAM., Kuenen J.G. // Appl.
Environ. Micro nbiol., 1988, vol. 54, №11, p. 2812-2818.
Schmidt L, Bock E. // Arch. Microbiol., 1997, vol. 167, p. 106-111.
Schmidt I., Bock E.,Jetten M.S.M. // Microbiology - UK, 2001a, vol. 147,
p. 2247-2253.
Schmidt L, ZartD., Bock E. // Antonie van Leewenhoek. 2001b. V. 79. P. 39-47.
Schmidt I., Zmt D., Bock E. // Antonie van Leewenhoek. 2001c. V. 79.
P. 311-318.
Schmidt I., Sliekers O., Schmid M., Cirpus L, Strous M., Bock E., KuenenJ.G.,
Jetten M.S.M. // FEMS Microb. Ecol., 2002, vol. 39, p. 175-181.
SchimelJ.P, Firestone M.K., Killham K. // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 48.
N 4. P. 802-806.
Shoun H., Kim D.H., Uchiyama H., SugiymaJ. // FEMS Microbiol. Lett., 1992,
vol. 92, p. 277-282.
Sorokin D., Tourova Т., Schmid M., Wagner M., Koops H.-P, Kuenen J.G.,
Jetten M.S.M. // Arch. Microbiol., 2001, vol. 176, p. 170-177.
Stark JM., Hart S.C. // Nature, 1997, vol. 385, p. 61-64.
Stroo H.S., Klein T.M., AlexanderM. // Appl. Environ. Microbiol., 1986, vol. 52.
№5, p. 1107-1111.
Strous M., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. // Appl. Environ. Microbiol., 1999,
vol. 67, №7, p. 3248-3250.
Thamdrup В., Dalsgaard T. // Appl. Environ. Microbiol., 2002, vol. 68,
p. 1312-1318.
Third K.A., Sliekers A. O., Kuenen J.G, Jetten M.S.M. // Syst. Appl. Microbiol.,
2001, vol. 71, p. 1066-1071.
112
Tortoso A.C., Hutchinson G.L. // Appl. Environ. Microbiol., 1990, vol. 56, №6,
p. 1799-1805.
Trimmer M., Nicholls J.C., Deflandre B. // Appl. Environ. Microbiol., 2003,
vol. 69, №11, p. 6447-6454.
Van de Graaf, АЛ. de Bruin P., Robertson LA.,Jetten M.S.M., KuenenJ.G. //
Microbiology (UK), 1997, vol. 143, p. 2187-2196.
Van Niel E.W.J., Arts RAM., Wesselink В J., Robertson L.A., KuenenJ.G. //
FEMS Microbiol. Ecol., 1993, vol. 102, p. 109-118.
VerchotL.V. // Soil Sci. Soc. Amer. J., 1999, vol. 63, p. 1942-1944.
Verstraete W., Alexander M. // Environ. Sci. Technol., 1973, №7, p; 39-42.
Verstraete W. // Terestrial Nitrogen Cycles. Processes, Ecosystem Strategies
and Management Impacts. Ecol. Bull. 33. F.E. Clark and T.Rosswall. Eds. Swedish
Natural Science Research Council, Stockholm. 1981, p. 303-314.
Whalen S.C. // Biol. Fertil. Soils, 2000, vol. 31, p. 279-287.
White C.S. // Biochem., 1991, №12, p. 43-68.
Yoshida Т., Alexander M. // Proc. Soil Sci. Soc. Amer., 1970, vol. 34, p. 880-882.
Yoshida Т., AlexanderM. // Soil Sci., 1971, vol. Ill, p. 307-312.
Zart D., Schmidt I., Bock E. // Antonie van Leewenhoek, 2000, vol. 77,
p. 49-55.
113
Глава 4. ДЕНИТРИФИКАЦИЯ В ПОЧВАХ
4.1. Введение
Первые сообщения о денитрификации как о процессе, вызывающем
потери азота в газообразной форме, принадлежат Гюйому и Дюперти (1888 г.).
Долгое время считалось, что денитрификация осуществляется
узкоспециализированными бактериями, в частности Paracoccus denitrificans и Р haloden-
itrificans. В настоящее время денитрификация рассматривается как широко
распространенное свойство аэробных и факультативно-аэробных бактерий
окислять органическое вещество в отсутствие кислорода с использованием
нитратов в качестве конечных акцепторов электронов. Поэтому процесс
нередко называют также нитратным дыханием, гетеротрофной денитрифи-
кацией или диссимиляционной нитратредукцией. Последнее название
обусловлено тем, что все бактерии, грибы и растения ассимилируют нитраты
как источники азотного питания, но используют для этого иную систему
ферментов, вследствие чего процесс называется ассимиляционной
нитратредукцией.
В процессе денитрификации происходит восстановление нитратов через
стадии образования промежуточных продуктов (NO2, NO, N20) до
молекулярного азота.
Восстановление окисленных соединений азота осуществляется
последовательно работающими ферментами: диссимиляционной нитратредуктазой,
нитритредуктазой, редуктазой окиси азота и редуктазой закиси азота.
Согласно имеющимся в настоящее время данным, денитрификация
осуществляется широким кругом бактерий, относящихся к самым разным
таксонам, которые наряду с полным - до молекулярного азота (N2) - могут
проводить и неполное восстановление нитрата - до нитрита (NO2), окиси азота
(N0) или закиси азота (N20).
Полная цепь нитратного дыхания имеется лишь у ограниченного числа
микроорганизмов, так называемых истинных денитрификаторов [Zumft,
1997]. К ним, например, относятся некоторые бактерии pp. Alcaligenes,
Bacillus, ParacoccuSy Pseudomonas, Thiobacillus и др. Нередко диссимиляцион-
ное восстановление нитратов бактериями протекает в усеченной форме -
только до нитритов (например, у представителей pp. Corynebacterium,
Propionibacterium, Spirillum) - или заканчивается на стадии образования
закиси азота (Aquaspirillum, Azospirillum, Pseudomonas). Такое разграничение
весьма условно, так как один и тот же организм в зависимости от условий может
осуществлять полный или усеченный процесс нитратного дыхания.
114
Денитрификация, протекающая с образованием N20 в качестве
конечного продукта, обычно осуществляется в условиях, отличных от
оптимальных для протекания полной денитрификации (например, при низких
температурах, высокой кислотности, в присутствии кислорода и пр.) [Conrad, 1996].
Помимо гетеротрофной денитрификации, в природе существуют и другие
пути восстановления нитратов. Некоторые бактерии проводят так
называемую автотрофную денитрификацию, используя нитраты для окисления
неорганических соединений, например S2, Fe+2, что наблюдается в подземных
водах, где нитраты поступают в зоны, богатые сульфидом железа [Но et al., 2002].
Известен также процесс хемоденитрификации, когда нитриты вступают в
реакцию с органическими компонентами, например с аминокислотами,
образуя N20 [Bouwman, 1990]. Кроме того, закись азота может выделяться в
реакциях между N02 и некоторыми солями железа и меди [Granli, Bockman,
1994]. Все эти процессы, по существующим оценкам, имеют низкую скорость
в природной среде и могут протекать, например, в нижних горизонтах почв и
подстилающих породах. Их общий вклад в биогеохимический цикл азота в
масштабах планеты невелик.
В биосфере основная роль принадлежит гетеротрофной
денитрификации, которая, наряду с нитрификацией, является и главным источником
закиси азота [Conrad, 1996].
Денитрификация с образованием закиси азота - сугубо бактериальный
процесс, однако способность выделять закись азота присуща и многим
грибам [Shoun et al, 1992]. Образование закиси азота грибами в условиях
пониженной концентрации кислорода связано с функционированием цитохрома
Р-450 dNir, существенно отличающегося по своим свойствам от
бактериального аналога [Takaya at al., 1999]:
• по количеству активных центров (один вместо трех);
• по способности акцептировать электроны с NADH (т.е. не участвует в
дыхательной цепи);
• по месту локализации (не связан с мембраной).
Таким образом, способность к истинной денитрификации у грибов не
обнаружена, а образование закиси азота рассматривается как приспособление
грибов к детоксикации нитритов, накапливающихся в процессе
гетеротрофной нитрификации. Об этом свидетельствует также отсутствие влияния
ацетилена на активность образования закиси азота грибами [Conrad, 1996].
В настоящее время предпринимаются попытки оценить вклад грибов и
бактерий в поток закиси азота из почв методом ингибиторного анализа с
использованием антибиотиков [Laughlin, Stevens, 2002]. В этой работе авторы
приходят к выводу, что применение циклогексимида (антигрибного
антибиотика) на 89% снижает интенсивность выделения закиси азота, а
стрептомицина (антибактериального антибиотика) - только на 23%. На этом основании
они делают заключение о преобладающем вкладе грибов в образование
закиси азота в луговой почве. Такая точка зрения опирается на представление о
преобладании грибов в составе микробной биомассы почв. Однако в этом
случае следует принимать во внимание не биомассу, а активность грибов и
бактерий. Известно, что активность грибов в отношении образования закиси
азота, как правило, на несколько порядков ниже, чем, например,
денитрифицирующих бактерий. Кроме того, бактериальные источники закиси азота
115
чрезвычайно разнообразны: аэробные и анаэробные денитрификаторы, авто-
и гетеротрофные нитрификаторы, актиномицеты, архебактерии, психрофи-
лы, ацидофилы и др. Следует также понимать, что путем внесения
антибиотиков невозможно полностью уничтожить всех почвенных грибов или, тем
более, всех почвенных бактерий (резистентные штаммы). Поэтому вклад
даже малой части выживших после внесения стрептомицина
денитрифицирующих бактерий может быть значимым за счет их высокой активности, но,
согласно методике, он будет приписан грибам. В то время как вклад устойчивых
к действию циклогексимида грибов из-за низкой активности не приведет к
существенной переоценке вклада бактерий. По-видимому, несмотря на
достаточно широкую известность, используемый метод мало применим для
определения вклада грибов и бактерий в образование закиси азота в почвах.
Очевидные недостатки метода следует принимать во внимание и при оценке
состава изотопов азота в N20 и N2. Необходимо делать поправки на образование
газообразных окислов и трансформацию азота авто- и гетеротрофными
бактериями в почвах (так называемая ко-денитрификация), а также почвенными
бактериями, устойчивыми к внесенным антибиотикам.
4.2. Физиолого-биохимические
особенности денитрификации
Первый этап восстановления нитратов протекает в соответствии с
уравнением
NO^ + 2ё + 2Н+ -> NO2 + H20 (AG° = -161 кДж/моль)
и осуществляется ферментом диссимиляционной нитратредуктазой. К
настоящему времени идентифицированы два типа этого фермента: встроенный в
цитоплазматическую мембрану (Nar) и находящийся в цитоплазме (Nap).
Вне зависимости от этого обе нитратредуктазы являются молибдопротеи-
нами, то есть содержат в активном центре молибденовый кофактор (МоСо).
Nar выделен из типичных денитрификаторов (Pseudomonas denitrificans) и
представляет собой комплекс из трех субъединиц [Zumft, 1997]. у-Субъеди-
ница массой 21 кДа погружена в цитоплазматическую мембрану и содержит
два цитохрома Ъ. Наиболее крупная а-субъединица (127 кДа) включает мо-
либдопротеин гуаниндинуклеотидный кофактор (MGD) и четыре сирогемо-
вых (Fe-4S) кластера. Р-Субъединица (55-64 кДа) состоит из трех кластеров
типа 4Fe-4S и одного 3Fe-4S типа. Синтез Nar кодируется narGHJI-оперошм.
Ген narG контролирует синтез соответственно a-, a narl и narH - у- и Р-субъ-
единиц. Предполагается, что narf-reu определяет функционирование всех
субъединиц как единого комплекса. Индукция Nar регулируется
концентрацией нитратов и нитритов, а также /nr-геном, активизирующимся в
анаэробных условиях (Jnr - анаэробный регулятор восстановления фумарата и
нитрата) [Zumft, 1997].
Nap состоит из двух субъединиц с молекулярными массами 16 и 93 кДа.
Меньшая субъединица включает два цитохрома с, а большая - молибденовый
кофактор и кластер 4Fe-4S. Синтез Nap определяется napEDABC-опероном,
116
где парА и парВ кодируют синтез соответственно большой и малой
субъединиц фермента [Berks et al., 1995].
Экспрессия генов и синтез Nar осуществляются только в анаэробных
условиях, тогда как Nap синтезируется и сохраняет активность в присутствии
кислорода [Moreno-Vivian et al., 1999]. Предполагается, что физиологическая роль
Nap проявляется в переходных условиях от аэробного к анаэробному
метаболизму, когда синтез Nar еще тормозится присутствием остаточного кислорода.
Функционирование обоих типов диссимиляционных нитратредуктаз
сопровождается выделением энергии согласно вышеприведенному уравнению.
Диссимиляционная нитритредуктаза восстанавливает нитриты до окиси
азота в соответствии с уравнением:
NO2 + 1ё + 2Н+ -> NO + H20 (AG° = -76 кДж/моль).
У денитрифицирующих бактерий различают два типа диссимиляционной
нитритредуктазы. Три четверти изученных на сегодняшний день денитрифи-
каторов обладают с^-типом нитритредуктазы (c^NiR), а остальные -
медьсодержащей нитритредуктазой (CuNiR) [Zumft, 1997]. Нитритредуктазы
обоих типов локализованы в периплазматическом пространстве.
Существенные различия между ними проявляются в сродстве к субстрату.
cd^NiR - представляет собой гомодимер с молекулярной массой -60 кДа
каждой субъединицы. Донором электронов для восстановления нитритов
служит цитохром с, а также азурин или псевдоазурин. Важной особенностью
crfjNiR является способность к восстановлению кислорода до воды, хотя
константа насыщения (Кт) для 02 значительно выше, чем для NO^. Поэтому
предполагается, что у бактерий, способных к аэробной денитрификации,
синтезируется нитритредуктаза типа c^NiR [Moir et al., 1996].
CuNiR представляет собой гомотример с молекулярной массой 36-40 кДа
каждой субъединицы. С помощью спектроскопического анализа
установлены три типа медьсодержащих активных центра, в которых атом меди связан
с цистеином (I тип), гистидином (II тип) и III тип - содержащий два атома
меди. Обнаружен и IV тип активного центра (СиА), связанный с
функционированием цитохрома с оксидазы и редуктазы закиси азота [Zumft, 1997].
Отличительной особенностью CuNiR является ее способность к
образованию N20 из N02 с использованием NH2OH в качестве восстановителя
[Schalk, 2000]. Хотя физиологическое значение этой реакции до конца не
выяснено, считается, что это один из способов детоксикации нитритов,
накапливающихся при окислении органического вещества бактерями-гетеротрофами.
Синтез o^NiR контролируется геном nirS, a CuNiR - nirK или nirU,
которые обычно объединены в кластеры [Zumft, 1997].
Активность обоих типов ферментов можно раздельно контролировать с
использованием медьхелатирующих препаратов, которые ингибируют
активность CuNiR. Специфическим ингибитором cd^NiR является азид.
Бактерий, обладающих одновременно обоими типами диссимиляционной
нитритредуктазы, не обнаружено, бреди ProteoAadem cdxMR- ft CllMR-Q((-
дуктазы встречаются у представителей а-, р- и у-подклассов.
В течение длительного периода считалось, что окись азота не является
обязательным интермедиатом процесса денитрификации, и только привлечение
методов молекулярной генетики позволило поставить окончательную точку в
117
этом вопросе. В настоящее время получены убедительные доказательства
существования редуктазы окиси азота (NOR) [De Boer et al., 1996] как
отдельного фермента в цепи денитрификации, связанного с мембраной и
осуществляющего восстановление NO до N20 в соответствии с уравнением:
2NO + 2ё + 2Н+ -» N20 + H20 (AG° - -306 кДж/моль).
Впервые редуктаза окиси азота изолирована из Ps. denitrificans, Ps. stutzeri
и Achromobacter cydoclastes. Ферменты, выделенные из разных организмов,
имеют единую структуру и состоят из двух субъединиц с молекулярной
массой 17 и 38 кДа, функционально связанных с цитохромом с (малая
субъединица) и цитохромом b (большая субъединица) [Zumft, 1997].
Окись азота даже в низких концентрациях токсична для бактерий.
Поэтому, после достижения равновесного состояния ее концентрация в
околоклеточном пространстве обычно не превышает 10-65 нМ. Как показано для
многих денитрификаторов, цитохром с может инактивировать окись азота и
служить эффективной защитой клетки от высоких концентраций N0. Кроме
того, окись азота может инактивироваться благодаря реакции с кислородом в
воздушной или водной среде:
2NO + 02-»2N02.
Последний этап восстановления закиси азота в молекулярный азот
катализируется ферментом редуктазой закиси азота (N2OR):
N20 + 2ё + 2Н+ -► N2 + H20 (AG° = -340 кДж/моль).
Редуктаза N20 выделена из штаммов Ps. stutzeri, Ps. denitrificans, A.
cydoclastes, A. faecalis и Th. pantotrophus. Выделение и очистка фермента связаны
с большими трудностями из-за быстрой его инактивации в присутствии
атмосферного кислорода [Zumft et al., 1985]. Однако использование в качестве
донора электронов цитохрома с, выделенного из сердечной мышцы лошади,
позволяет избежать быстрого ингибирования фермента [Berks et al., 1993].
Несмотря на различие источников, фермент состоит из двух приблизительно
равных субъединиц с молекулярной массой по 67 кДа, которые локализованы
на внешней стороне цитоплазматической мембраны [Zumft, 1997]. Редуктаза
закиси азота содержит до четырех атомов меди, находящихся в двух активных
центрах - СиА и Cuz. CuA выполняет перенос электронов на каталитический
центр, a Cuz - функцию связывания с субстратом. Донором электронов для
редуктазы N20 служит цитохром с2 или С551, а также псевдоазурин.
Перечисленные ферментные системы денитрифицирующих бактерий по-
разному действуют в конкретных сочетаниях факторов природной среды, что
в итоге влияет не только на интенсивность денитрификации, но и на состав
конечных продуктов процесса.
4.3. Влияние факторов среды
на денитрификацию
Факторы внешней среды - концентрация кислорода, влажность,
температура, кислотность, содержание минерального азота и др. - оказывают сущест-
118
венное влияние на денитрифицирующую активность микроорганизмов в
природе.
Концентрация кислорода в почвенном воздухе во многом определяется
степенью влажности почвы и ее структурой.
Обратная связь между скоростью денитрификации и концентрацией
кислорода показана во многих лабораторных исследованиях с чистыми
культурами микроорганизмов [Christiansen, Tiedje, 1998]. Сходные результаты
получены и при исследовании влияния кислорода на денитрифицирующую
активность почв. Так, по мере снижения концентрации кислорода в почвенном
воздухе денитрифицирующая активность возрастала, приближаясь к
максимальному уровню при содержании кислорода -0,5% [Arah et al., 1998].
Протекание денитрификации в незатопленных почвах объясняется
наличием анаэробных микрозон или возникновением локального анаэробиозиса
вследствие быстрого исчерпания кислорода при интенсивном разложении
органического вещества [Степанов с соавт., 1997].
От содержания кислорода в почвенном воздухе может зависеть состав
газообразных продуктов денитрификации. Многими авторами отмечается рост
соотношения N20/N2 с увеличением концентрации 02 [Granli, Bockman,
1994]. Поэтому увеличение доли закиси азота в продуктах денитрификации
можно рассматривать как результат снижения активности редуктазы закиси
азота под влиянием кислорода.
Увеличение скорости денитрификации с увеличением содержания
почвенной влаги, по-видимому, наиболее значимо при влажности >80% от
полной полевой влагоемкости (ППВ) [Heinemeyer et al., 1998]. По данным этих
авторов, основным продуктом денитрификации до затопления почв была
закись азота, а после затопления - N2. Это согласуется с сообщениями о том,
что затопленные почвы выделяют меньше закиси азота, чем дренированные
[Granli, Bockman, 1994].
Однако прямой пропорциональной зависимости между уровнем
влажности почвы и конечными продуктами денитрификации, по-видимому, не
существует [Hutchinson, Davidson, 1993].
Изучение соотношения окиси азота и закиси азота в продуктах
денитрификации показало, что при меньшей влажности увеличивается эмиссия NO,
а при большей - N20 [Davidson, 1994]. Переменное иссушение/увлажнение
почвы стимулирует эмиссию как NO, так и N20 [Davidson et al., 1993].
Температура является одним из важных факторов, определяющих
скорость биохимических реакций, в том числе и процесс денитрификации.
Температура влияет как на образование, так и поглощение закиси азота
бактериями, что в итоге отражается на интенсивности потока закиси азота из почв.
По сообщениям многих авторов, максимальная эмиссия закиси азота из почв
наблюдается в интервале температур от 25 до 32°С [Davidson, 1994; Conrad,
1996]. При температуре 4-6°С активность денитрифицирующих бактерий
резко падает [Костина с соавт., 1995], но может проявляться и при
отрицательных значениях (до -4°С). Даже незначительное прогревание почвы (до
5°С) приводит к существенному росту активности денитрифицирующих
бактерий. Обычно повышение температуры почвы влечет за собой изменение
других факторов среды, которые также влияют на скорость денитрификации.
Это физические (изменение растворимости газов в воде) и биологические
119
(рост микробной популяции) факторы. Оба они обычно сочетаются, так как
при увеличении температуры заметно возрастает потребление кислорода, что
способствует формированию анаэробных микрозон в почве и повышает
активность денитрифицирующих бактерий [Степанов и др., 1996].
При температуре 55-70°С нередко наблюдается второй максимум
образования закиси азота, являющийся результатом протекания химической денит-
рификации вследствие разложения аммонийной селитры при температурах
>60°С [Куракова, Умаров, 1983].
Некоторые авторы отмечают влияние температуры на соотношение
газообразных продуктов денитрификации. Так, с ростом температуры доля N20
уменьшается и при достижении 60°С азот теряется только в виде N2 [Granli,
Bockman, 1994].
Значительное влияние на процессы образования и поглощения закиси
азота в почвах оказывает кислотность. Считается, что оптимальным для
образования нитратов при нитрификации и сменяющей ее денитрификации
являются значения рН 7,0-8,0 [Кудеяров, 1999]. Подкисление вызывает быстрое
снижение активности автотрофных нитрифицирующих бактерий, и процесс
прекращается при рН < 4,5. Широко распространено мнение, что в кислых
почвах процесс протекает, главным образом, за счет деятельности
гетеротрофных нитрификаторов [Granli, Bockman, 1994]. Вместе с тем недавно получены
данные об автотрофных нитрификаторах, растущих при рН 4,0. Методом ин-
гибиторного анализа установлено, что даже в кислых болотных почвах вклад
гетеротрофных нитрификаторов не превышает 8% общего количества
нитратов, образующихся в результате автотрофной нитрификации [Schalk, 2000].
Кроме того, существует возможность участия в окислении аммония в почвах
метанотрофных бактерий, вклад которых в зависимости от типа почвы может
достигать 12-25% [Bodelier, Frenzel, 1999; Новиков, Степанов, 2002].
В отличие от автотрофных нитрификаторов, денитрифицирующие
бактерии более устойчивы к низким значениям рН, хотя активность процесса
заметно снижается. Наибольшее влияние кислая реакция среды, по-видимому,
оказывает на соотношение N20/N2 в продуктах денитрификации. При
увеличении кислотности в первую очередь снижается активность редуктазы N20,
что сопровождается ростом доли закиси азота в газообразных продуктах
денитрификации [Костина с соавт., 1995]. По данным некоторых авторов, при
высоких значениях рН (9,0-10,0) накопления закиси азота не происходит,
что является свидетельством высокой активности К2Оредуктазы в этих
условиях [Сорокин с соавт., 2001], хотя не исключаются и химические
процессы связывания закиси азота.
Влияние факторов внешней среды наиболее контрастно проявляется в
присутствии минеральных соединений азота, стимулирующих процессы
образования закиси азота в почвах.
Современные агроценозы, где широко применяются интенсивные
технологии, включающие использование высоких доз минеральных удобрений,
могут рассматриваться как объекты с повышенной активностью микробной
трансформации минерального азота, вносящие определенный вклад в
глобальный бюджет закиси азота.
Азотные удобрения разных минеральных форм неодинаково влияют на
величину эмиссии закиси азота из почвы (см. табл. 3.2 в гл. 3). Вопреки ожи-
120
даемому увеличению активности денитрификации в вариантах с
использованием нитратных соединений, наибольшие потери N20 зафиксированы при
внесении аммонийных и амидных соединений азота, что объяснялось
выделением закиси азота в процессах авто- и гетеротрофной нитрификации
[Schalk, 2000].
Одним из способов повышения эффективности высоких доз минеральных
удобрений и исключения неблагоприятных последствий их применения
является использование удобрений пролонгированного действия, таких как мо-
чевино-формальдегидные удобрения (МФУ).
Эмиссия закиси азота при совместном применении МФУ с мочевиной
(см. табл. 4.1) возрастала с увеличением общей дозы вносимых в почву
удобрений, а динамика этого процесса не отличалась от вариантов с применением
одной мочевины, причем потери закиси азота из почвы оказались выше на
10-20%. Более того, с увеличением доли МФУ в составе азотных удобрений
поток закиси азота также усиливался. Вероятнее всего, интенсивное
выделение N20 из почвы при внесении МФУ является следствием активизации
процесса гетеротрофной нитрификации. Таким образом, использование МФУ не
привело к снижению газообразных потерь азота в форме N20 по сравнению с
применением мочевины в тех же дозах.
Таблица 4.1
Эмиссия закиси азота из дерново-подзолистой почвы при внесении
минеральных азотных удобрений под ячмень
Вариант опыта
Эмиссия закиси азота, мг N-N20/Kr |
Дозы минерального азота: I - 25; II - 75 мг N/кг ]
Контроль
CO(NH2)2 I
| CO(NH2)2 II
NH4C11
1 NH4CIII
Ca(NO.,)2 I
Ca(N03)2 II
7,6 1
9,8 |
11,8 1
11,3
14,3
8,6
10,4
Дозы минерального азота: I - 100; II - 300 мг N/кг
1 Контроль
CO(NH2)2 I
1 CO(NH2)2 II
CO(NH2)2 + МФУ I
CO(NH2)2 + МФУ II
МФУ1
| МФУН
9,5 |
13,3
20,8
15,1 |
22,8
15,0 !
23,1
* МФУ - мочевино-формальдегидное удобрение.
Установлено, что наиболее окисленные соединения азота (нитраты,
нитриты) ингибируют или существенно замедляют процесс восстановления N20
в N2, хотя существуют исключения для штаммов некоторых бактерий [Tiedje,
1988]. Ряд авторов отмечают тесную корреляцию между концентрацией нит-
121
ратов в почве и увеличением соотношения N20/N2 в продуктах денитрифи-
кации [Кудеяров, 1999].
Концентрация нитратов в пределах 10-30 мг N - NO^/kt почвы обычно
является достаточной для полного ингибирования активности редуктазы
закиси азота. На первый взгляд кажется, что эти концентрации реально
недостижимы в почвах. Однако локально они могут быть даже превышены после
внесения минеральных азотных удобрений, особенно гранулированных, или
навоза. По мере снижения концентрации нитратов в почве в процессе
развития растений соотношение N20/N2 в продуктах денитрификации
уменьшается [Манучарова с соавт., 2001].
В затопленных почвах с высоким содержанием органического вещества,
ингибирование восстановления закиси азота ионами NO3 заметно падает
[Bouwman, 1990].
В целом, если содержание влаги в почве достаточно велико, то после
внесения минеральных азотных удобрений закись азота быстро выделяется в
атмосферу. Через некоторое время, обычно несколько часов или дней, выделение
N20 снижается и увеличивается поток N2. Как следствие, исходно высокое
соотношение N20/N2 с течением времени уменьшается [Aulakh et al., 1991].
Нитриты обладают большим ингибирующим эффектом на
восстановление закиси азота, чем нитраты [Van Cleemput et al., 1997]. При изучении
восстановления закиси азота в почвах с различным сочетанием NO, NO3 и N02
установлено, что ингибирующий эффект NO значительно слабее, чем
влияние N05 и N02 [Gaskell et al., 1992].
Таким образом, нитраты и нитриты в большинстве случаев являются
ингибиторами восстановления закиси азота в почвах. Однако в низких
концентрациях (<1 мг N/кг почвы) их присутствие необходимо для начала
внутриклеточного синтеза редуктазы закиси азота [Soo-Hoo, Hollocher, 1996].
4.4. Денитрификация в почвах разных типов
Как отмечалось, почвенные микроорганизмы не только выполняют
функцию главного генератора закиси азота в биосфере, но и участвуют в его
восстановлении, вследствие чего масштабы эмиссии закиси азота определяются
соотношением этих процессов в почве. Соответственно, по разнице в их
активности можно судить о вкладе конкретных почв в атмосферный бюджет
закиси азота. Поэтому оценку активности денитрификации обычно проводят
одновременно двумя методами: 1) по образованию закиси азота в
присутствии ацетилена (С2Н2) - специфического ингибитора редуктазы закиси
азота, блокирующего ее восстановление до молекулярного азота; 2) по скорости
поглощения закиси азота.
Однако оба метода имеют ограничения, которые необходимо учитывать
при интерпретации получаемых данных.
Определение активности денитрификации по скорости образования
закиси азота в присутствии ацетилена может давать завышенные результаты
вследствие участия в суммарном потоке закиси азота из почвы таких процессов,
как гетеротрофная нитрификация, диссимиляционное восстановление нит-
122
ратов в аммоний и хемоденитрификация. С другой стороны, результаты
могут быть занижены при длительной инкубации образцов в атмосфере
ацетилена, поскольку он является ингибитором многих метаболических процессов.
Определение активности денитрификации по скорости поглощения
закиси азота более точно отражает интенсивность процесса, поскольку в
природных средах закись азота может восстанавливаться двумя ферментами - редук-
тазой N20 и нитрогеназой, причем оба фермента имеются только у бактерий.
Рассмотренные выше методы были использованы для определения
потенциальной активности процесса в ряде почв зонального ряда европейской
части России [Степанов, 2000]. Полученные результаты позволили выявить
следующую закономерность: возрастание активности денитрификации от
дерново-подзолистой и серой лесной почв к чернозему обыкновенному и
каштановой почве (см. табл. 4.2).
Практически во всех исследованных почвах, за исключением засоленных,
скорость восстановления закиси азота превышала величину ее эмиссии. Из
этого следует, что в зональных почвах европейской части России основной
продукт денитрификации - молекулярный азот. При этом общим правилом
является возрастание активности процесса в гидроморфных и полугидромо-
рфных почвах.
При определении вклада почв разных типов в суммарный поток закиси
азота важен вопрос о приуроченности денитрификации к определенным
генетическим горизонтам почв. Как известно, почвенные горизонты могут
существенно отличаться по многим показателям, что является одним из
главных диагностических признаков почв. Однако до настоящего времени мало
сведений об их различиях в отношении процесса денитрификации.
Таблица 4.2
Потенциальная активность денитрификации
в почвах европейской части России, нМ N20 /r • ч
Почва
1 Дерново-подзолистая
| Светло-серая лесная
I Серая лесная
I Темно-серая лесная
| Чернозем обыкновенный
| Лугово-черноземная
Светло-каштановая
[ Каштановая среднесуглинистая
| Коричневая
1 Горно-луговая
Лугово-аллювиальная
Солонец каштановый
1 Солонец лугово-черноземный
1 Солодь луговая
1 Солончак гидроморфный
Эмиссия
закиси азота
76,9 ± 4,5
79,8 + 10,8
88,3 ± 20,0
97,2 ± 12,0
119,8 ±7,1
129,5 ± 14,2
115,3 ±2,4
122,8 ± 0,6
86,6 ± 16,1
98,7 ± 20,1
93,2 ± 6,8
105,2 ± 5,1
110,5 ±4,2
98,6 ± 8,9
93,6 ± 10,7
Поглощение
закиси азота
101,8 ± 8,2
114,0 ±11,8
118,3 + 6,5
125,5 ± 14,1
138,9 ± 5,4
134,9 ± 13,9
117,8 ±8,2
125,6 ± 20,0
114,9 + 9,6
130,6 ± 2,4
102,4 ± 7,1
61,2 ±11,9
64,4 ± 8,8
78,8 ± 23,0
50,0 ± 5,3
123
Распространено мнение, что в нижних горизонтах почв активность денит-
рификации наиболее высока, так как в них накапливаются нитраты и
формируются анаэробные условия. Согласно полученным для лугово-черноземной
почвы оценкам (см. табл. 4.3), активность денитрификации быстро убывает с
глубиной и приурочена к верхним, корнеобитаемым горизонтам.
Полученные данные хорошо согласуются с известным положением, что
активность денитрифицирующих бактерий определяется не столько
концентрацией нитратов, которые всегда в определенном количестве присутствуют
в почве, а лимитируется, прежде всего, наличием легкодоступного
энергетического материала (например, в виде корневых выделений) и потому
приурочена к верхним, корнеобитаемым горизонтам почв [Умаров, 1986].
Таблица 4.3
Образование и поглощение закиси азота
в разных горизонтах лугово-черноземной почвы, мкг N-N20/r
Глубина, см
0-4
10-20
30-40
70-80
85-95
Образование N20
74,52 ± 14,15
65,96 ± 15,14
56,93 ± 8,75
36,53 + 1,17
22;37 ± 1,82
Поглощение N20 |
104,94 ± 13,93
70,11 + 14,09
62,73 ± 10,99
44,36 ± 6,13
33,58 ± 4,27
Именно этим объясняются высокие потери азота из прикорневой зоны
сельскохозяйственных растений при внесении минеральных азотных
удобрений, что хорошо известно из данных агрохимии.
При определении роли почвенного покрова в поступлении закиси азота в
атмосферу наибольший практический интерес представляет оценка
интенсивности образования и поглощения закиси азота в конкретных почвах
непосредственно в поле - актуальная денитрификация. При проведении такого
рода измерений наибольшее распространение получил метод с
использованием ингибитора редуктазы закиси азота - ацетилена [Федорова и др., 1973;
Yoshinari et al., 1977]. Однако он не позволяет определить соотношение
между скоростью образования и поглощения закиси азота в почвах, поскольку
последний процесс оказывается заблокированным ацетиленом и, таким
образом, оценивается лишь потенциальная величина эмиссии закиси азота из
почв в атмосферу.
Гарсия [Garcia, 1974] предложил метод оценки скорости восстановления
закиси азота в почве с использованием в качестве внутреннего стандарта (для
определения скорости диффузии закиси азота в почве) инертного газа
криптона. Однако физико-химические свойства криптона (растворимость в воде,
размеры молекулы и связанные с этим скорость адсорбции, диффузии и др.)
существенно отличаются от закиси азота, что оказывает влияние на
результаты анализа.
Позднее был разработан метод с использованием закиси азота не только в
качестве субстрата для денитрифицирующих бактерий, но и как внутреннего
стандарта [Степанов с соавт., 1996], который позволяет выделить из общей
величины поглощенной закиси азота ее абиотическую составляющую -
поглощение N20 в присутствии ацетилена.
124
В настоящее время наиболее часто используют следующий способ
определения интенсивности образования и поглощения закиси азота в полевых
условиях [Методы..., 1991]. В реакционную камеру постоянного объема
(металлический или пластиковый цилиндр), врезанную в почву на глубину -10 см,
вводится N20 из расчета -5% объема камеры. Отбор проб газов из камеры для
определения концентрации закиси азота осуществляется с интервалом
20 мин после начала эксперимента. Затем в камеру вводится ацетилен (10%
об.) и после 15-минутного перерыва, необходимого для диффузии ацетилена
в почву, возобновляется отбор проб для измерения концентрации закиси
азота в этот период.
Некоторые данные об актуальной активности денитрификации в почвах
приведены в табл. 4.4.
Интенсивность процесса варьировала в широких пределах - от 0,503 до
1,782 мкг N/ra • ч. Наибольшая скорость поглощения закиси азота отмечена в
светло-серой лесной почве, минимальная - в черноземе обыкновенном. При
этом различия между потенциальной активностью денитрификации и
актуальной активностью процесса весьма велики - в -100 раз.
Таблица 4.4
Интенсивность поглощения закиси азота в почвах,
мкг N-N20/ га • ч
1 Почва
1 Светло-серая лесная
Серая лесная
Лугово-черноземная
Темно-серая лесная
Чернозем обыкновенный
Активность
1,782 ± 0,348
0,816 ±0,110
0,503 ± 0,074
0,478 ± 0,098
0,439 ± 0,092
4.4.1. Активность денитрификации в засоленных почвах
Изучение денитрифицирующей активности в образцах засоленных почв
Приаралья и европейской части России свидетельствует о том, что в
условиях избыточного засоления доля закиси азота в газообразных продуктах
денитрификации возрастает.
Для выяснения причин этого явления были определены численность,
активность и рассчитана биомасса денитрификаторов в почвах с сульфатно-
хлоридным типом засоления (табл. 4.5).
Общая биомасса микроорганизмов в изученных почвах тесно
коррелировала с запасами органического вещества и составляла 20-60 мкг С/г что, по
имеющимся в литературе оценкам, в 2-4 раза меньше, чем в других типах
почв. Концентрация солей и органическое вещество влияли на величину
газообразных потерь азота в процессе денитрификации (см. рис. 4.1). В почвах,
где содержание органического вещества приблизительно совпадало, степень
засоления прямо влияла на соотношение N20/N2 в продуктах
денитрификации - возрастала эмиссия N20 и падала скорость ее поглощения.
125
В литературе имеются противоречивые сведения о структуре микробного
комплекса засоленных почв. Например, отмечается, что он характеризуется
специфическим качественным и количественным составом, причем наиболее
четко это проявляется на галофильной части бактериального сообщества
[Galinski, Trueper, 1994].
Исходя из этого в составе денитрификаторов, выделенных из засоленных
почв, была оценена доля галофильных и галотолерантных бактерий. Для
этого методом посева была определена численность основных групп
микроорганизмов в этих почвах.
Количество негалофильных микроорганизмов, учитываемых на МП А и
глюкозо-минеральной среде [Добровольская с соавт., 1999], составляло
105-106 кл./г, в то время как на среде Бакстера для учета галофильных
микроорганизмов (5 и 10% NaCl) численность бактерий была на 1-2 порядка
ниже. Следовательно, во всех изученных нами засоленных почвах доминируют
галотолерантные гетеротрофные бактерии, что в целом совпадает с
имеющимися в литературе данными.
Таблица 4.5
Общая характеристика засоленных почв
Почвы
Глубина, см 1 Соли, % | рН | CoDr., % |
Дельта Амударьи |
Пустынная песчаная
слаборазвитая засоленная
Примитивная песчаная
Такыровидная остаточно-
луговая
0-4
0-3
0-5
0,5
0,6
0,6
8,1
8,0
8,0
1,2 1
0,3
1,1
Обсохшая часть дна Аральского моря
Солончак:
корковый-1
отакыренный
луговой-отакыривающийся
корковый-2
0-5
0-6
6-24
0-7
5,0
5,5
5,8
10,3
8,9
8,6
8,9
7,8
0,8 |
1,0
1,5
0,7 1
Полученные результаты позволяют заключить, что преимущественное
образование закиси азота в исследованных почвах не является следствием
доминирования в составе микробного комплекса особых М20-продуцирующих
бактерий, а определяется снижением скорости восстановления закиси азота
денитрифицирующими бактериями под влиянием избыточной
концентрации солей.
Для проверки обоснованности этого вывода в модельном эксперименте
было изучено влияние NaCl на процесс восстановления закиси азота
чистыми культурами денитрифицирующих бактерий. Как и предполагалось,
наблюдались значительные различия в способности денитрифицирующих
бактерий осуществлять разные этапы процесса денитрификации в присутствии
солей. Так, образование N20 культурой Bacillus subtilis отмечалось при
концентрации NaCl <7%, тогда как восстановление N2G прекращалось уже при
3-4% NaCl.
126
Рис. 4.1. Поглощение (■) и выделение (D) закиси азота в образцах
засоленных почв 1-7 (см. табл. 4.5)
Примерно такие же результаты получены и для представителей других
родов негалофильных бактерий, отличавшихся высокой активностью денитрк
фикации. Следует подчеркнуть, что концентрация соли, препятствующая
поглощению закиси азота, почти во всех случаях ниже, чем ее концентрация
ингибирующая образование N20. Эти данные свидетельствуют о том, что
процесс восстановления закиси азота обладает повышенной
чувствительностью к присутствию солей по сравнению с другими этапами диссимиляции
окислов азота денитрифицирующими бактериями в почвах и начинает
тормозится при 3-4% концентрации соли в среде.
Согласно этому выводу, искусственное засоление почв должно приводитг
к преимущественному подавлению процесса поглощения N20. Как следует
из полученных нами данных, в отсутствие соли, а также при ее минимальное
концентрации в почве выделения N20 практически не наблюдалось (см. рис
4.2), что указывает на протекание процесса денитрификации до конца, то есть
до стадии образования молекулярного азота. Дальнейшее повышение уровня
засоления почвы приводило к постепенному накоплению N20 в газовой фазе
и при максимальной концентрации вносимой соли поглощения закиси азот:
уже не наблюдалось.
Характерно, что при этом общая активность денитрификации падала с
увеличением степени засоления среды аналогично подавлению активности
дыхания (эмиссии С02), однако скорость восстановления закиси азота инги-
бировалась значительно сильнее.
127
_20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Сутки
Рис. 4.2. Динамика образования закиси азота темно-каштановой почвой при
внесении NaCl: 1 - контроль: 2 - 0,5%; 3 - 1%; 4 - 2,5%; 5 - 5%; 6 - 10%
Высказанное нами предположение, что доминирование закиси азота в
конечных продуктах денитрификации в засоленных почвах связано с ингиби-*
рованием последнего звена в цепи денитрификации, а именно процесса
восстановления закиси азота в молекулярный азот, по-видимому, не
распространяется на солончаки содового засоления. В этих местообитаниях обнаружены
алкалофильные бактерии, способные активно поглощать закись азота
[Сорокин ссоавт., 2001].
В заключение следует отметить, что сульфатно-хлоридное засоление почв
не только снижает их хозяйственную ценность, но и способствует
торможению процесса денитрификации на стадии образования закиси азота.
Учитывая тенденцию аридизации суши, роста площадей, подверженных засолению,
можно полагать, что эти процессы, помимо уже известных негативных
экологических последствий, будут способствовать повышенной эмиссии одного из
парниковых газов (закиси азота) из почв в атмосферу.
4.4.2. Денитрификации в агрегатах почв
Имеющиеся на сегодняшний день модели формирования анаэробных зон
внутри почвенных агрегатов предполагают, что их минимальный диаметр, при
котором еще возможны анаэробные процессы, составляет -10 мм [Sexstone et
al., 1985]. С целью проверки этой модели была проведена серия лабораторных
экспериментов, в которых оценку активности анаэробных процессов внутри
почвенных агрегатов диаметром <10 мм осуществляли по эмиссии двух
газовых метаболитов - закиси азота и метана. Как известно, метаногенез
протекает в строго анаэробных условиях. Считается также, что анаэробные условия
формируются внутри почвенных агрегатов за счет активного поглощения кис-
128
лорода на их поверхности в результате окисления органического вещества.
Для проверки этого предположения определяли скорость эмиссии СО2 из
агрегатов разного диаметра после обогащения почвы глюкозой. Согласно
полученным данным, динамика накопления С02 в газовой фазе имеет
экспоненциальный характер, причем с ростом удельной поверхности агрегатов (т.е.
уменьшением их диаметра) наблюдалось возрастание концентрации С02 в
газовой фазе. Так, накопление диоксида углерода для агрегатов диаметром 2 мм
составило 17,7 мг/г почвы, для агрегатов размером 6 мм и 10 мм -
соответственно 14,72 и 9,8 мг/г почвы. Очевидно, что окисление органического
вещества в почвах наиболее интенсивно протекает на поверхности почвенных
агрегатов, в результате чего формируются анаэробные зоны внутри агрегатов.
Поскольку образование закиси азота внутри агрегатов малого размера
может протекать одновременно с ее восстановлением (поглощением), то
введением ацетилена ингибировалась активность редуктазы закиси азота.
Изучение эмиссии N20 показало, что существует пропорциональная зависимость
между потоком закиси азота и размерами почвенных агрегатов. Результаты
исследований свидетельствуют о том, что даже внутри самых малых
агрегатов существуют анаэробные зоны, где активно протекает процесс денитрифи-
кации. Для агрегатов диаметром 4,8 и 10 мм концентрация N20 достигала
соответственно 0,72; 6,7 и 7,2 мкг/г.
Одновременно с выделением закиси азота наблюдалась эмиссия метана из
почвенных агрегатов всех исследуемых размеров (включая агрегаты
наименьшего диаметра - 2 мм), причем в присутствии атмосферного кислорода.
Количество метана, выделившегося из почвенных агрегатов за время эксперимента,
было пропорционально их диаметру и составило 3,14; 3,37 и 3,7 нг С-СН4/г.
Полученные результаты свидетельствуют о функционировании внутри
почвенных агрегатов размером от 2 до 10 мм строго анаэробных бактерий, в
результате чего выделяются продукты анаэробного метаболизма, включая
закись азота [Степанов с соавт., 1997].
Почвенные агрегаты подразделяют на водопрочные и неводопрочные,
разрушающиеся под действием воды, например при переувлажнении. Крупные
агрегаты, в свою очередь, состоят из водопрочных агрегатов меньшего
размера, которые в течение длительного времени сохраняют свою форму и
являются одним из диагностических признаков почв. Весьма вероятно, что именно
водопрочные агрегаты являются основными центрами в почве, где
осуществляется процесс денитрификации.
Изучение состава продуктов денитрификации в водопрочных агрегатах
показало, что сразу после внесения глюкозы основным является закись азота
и лишь через 3-6 сут, в зависимости от типа почвы, содержание ее снижалось,
а доля молекулярного азота возрастала (см. рис. 4.3). Так, концентрация N20
достигала минимального уровня в черноземе и серой лесной почве к 3-5-м
сут, а в дерново-подзолистой почве - лишь к 23-м сут. В буроземе закись
азота оставалась доминирующим продуктом денитрификации на протяжении
всего эксперимента, где на ее долю приходилось не менее 40% общей
величины газообразных потерь азота даже к 25-м сут опыта.
Динамика выделения молекулярного азота из почвенных агрегатов
носила иной характер. Так, выделение N2 в течение первых 2-3 сут не
наблюдалось ни в одном варианте опыта. Затем, по мере восстановления закиси азота
129
денитрифицирующими бактериями, происходило накопление
молекулярного азота в газовой фазе. В черноземе, серой лесной и дерново-подзолистой
почвах закись азота полностью восстанавливалась в N2 соответственно на 3-
е, 5-е и 25-е сут. Исключением являлись образцы бурозема, где закись азота
не восстанавливалась до конца и постоянно присутствовала в газовой фазе.
N-N20,MKr/r A N-N2,MKr/r N-N20,MKr/r Б N-N2, мкг/г
Рис. 4.3. Динамика образования и поглощения N20 (+) и N2 (А) агрегатами
разных типов почв (А) и накопление конечных продуктов денитрификации (N20 и
N2) в зависимости от размера агрегатов (Б): а - чернозем, б - серая лесная,
в - дерново-подзолистая, г - бурозем
Изучение соотношения продуктов денитрификации - закиси азота и
молекулярного азота, выделяющихся из водопрочных агрегатов, показало, что
прослеживается четкая зависимость между диаметром агрегатов и составом
газообразных потерь азота за счет денитрификации. С увеличением размера
агрегатов возрастала доля молекулярного азота и сокращалось количество
закиси азота в конечных продуктах денитрификации.
В целом, для водопрочных агрегатов диаметром 0,25-3,0 мм основным
продуктом денитрификации была закись азота, в то время как для агрегатов
диаметром 3-5 мм - молекулярный азот. Вероятно, в мелких агрегатах
размер анаэробной зоны настолько мал, что, проходя через нее, закись азота не
успевает восстановиться в молекулярную форму и выделяется в атмосферу.
130
Аэробное разложение органического вещества в почвенных агрегатах
осуществляется в периферической зоне преимущественно грибами и
сопровождается активным потреблением кислорода. В результате этого в центральной
части агрегата складываются анаэробные условия, при которых возможно
осуществление анаэробных процессов, таких как денитрификация.
Таким образом, вполне очевидно, что разрушение почвенной структуры
или распыление почв будет способствовать возрастанию доли закиси азота в
газообразных продуктах денитрификации.
4.4.3. Влияние пестицидов на денитрификацию в почвах
Применение пестицидов является важной частью современных агротехно-
логий, в связи чем особый интерес вызывают работы по исследованию
биологической активности почв, в частности процесса денитрификации в почвах
при внесении гербицидов из группы симазинов.
Изучение действия атразина на активность денитрификации выявило
стимулирующее влияние этого гербицида на поток закиси азота из почвы - 208,4;
206,9 и 203,9 мг N-N20/r при внесении атразина в дозах соответственно 0,02;
0,05 и 0,1 мг/кг. Однако дальнейшее увеличение дозы атразина до 0,2 мг/кг
оказалось настолько токсичным, что привело к сильному подавлению
биологической активности почвы - эмиссии СО2 и активности денитрификации.
Снижение эмиссии закиси азота на делянках с внесением продуктов
разложения атразина в почве - диэтилатразина (ДЭА) - указывает на то, что инги-
бирующий эффект также возрастает с увеличением дозы внесения этого
токсиканта (см. рис. 4.4). Аналогичное действие оказывает и смесь атразина с ДЭА.
12 3 4
Диэтилатразин
Рис. 4.4. Влияние атразина и диэтилатразина на активность
денитрификации в почве: 1 - 0,02; 2 - 0,05; 3 - 0,1; 4 - 0,2 (мг/кг)
131
Эти данные позволяют сделать вывод, что применение атразина и его
метаболитов в производственных концентрациях повышает долю закиси азота
в продуктах денитрификации и увеличивает ее эмиссию из почв в атмосферу.
Высокие дозы этих соединений весьма токсичны и ингибируют многие
биологические процессы в почве и денитрификации, в частности.
4.4.4. Влияние тяжелых металлов на денитрификацию в почвах
Широкое загрязнение почв тяжелыми металлами может сопровождаться
новыми, еще мало изученными экологическими последствиями. Примером
могут служить процессы микробной трансформации закиси азота [Степанов
и др., 1998].
Результаты исследований влияния хлористого никеля и сульфата меди на
hours
10
20
30
40
50
60
Рис. 4.5. Влияние солей тяжелых металлов на образование и поглощение
закиси азота в серой лесной почве (А) и черноземе обыкновенном (Б)
132
соотношение N20/N2 в конечных продуктах денитрификации в образцах
дерново-подзолистой, серой лесной почвах и чернозема обыкновенного
показали, что внесение солей тяжелых металлов приводит к значительному
снижению общей биологической активности почв, что выражается в
уменьшении скорости эмиссии С02 в почвах пропорционально дозе внесенных
металлов. Наиболее значимое снижение интенсивности выделения С02 отмечено
при внесении солей меди, что определяется их большей токсичностью по
сравнению с никелем.
Во всех вариантах опыта внесение водорастворимых солей никеля и меди
сопровождалось возрастанием доли закиси азота в конечных продуктах
денитрификации (см. рис. 4.5). Наиболее отчетливо эта тенденция проявилась
при внесении хлористого никеля. Максимальные различия между контролем
и вариантами опыта (в 2-8 раз) наблюдались в серой лесной почве и
черноземе. Меньший эффект в дерново-подзолистой почве можно объяснить
относительно низкой активностью денитрификации в этой почве по сравнению с
черноземом и серой лесной почвой.
Особый характер выделения закиси азота при внесении хлористого
никеля проявился также во временном смещении пика эмиссии N20. Так, в
контроле максимальное выделение закиси азота наблюдалось через 1-2 сут после
начала эксперимента, в то время как при внесении хлористого никеля в
наибольшей концентрации максимум аккумуляции N20 в газовой фазе
наблюдался только через 2-4 сут. Аналогичные результаты получены при внесении
и сульфата меди в серую лесную почву. В этих вариантах опыта выделение
N26 превышало уровень контроля в 2-3 раза. Причем с увеличением дозы
вносимого сульфата меди закись азота оставалась непоглощенной из газовой
фазы до конца эксперимента.
Оценка соотношения N20/N2 в продуктах денитрификации из чернозема
при внесении сульфата меди показала, что в контроле основным продуктом
денитрификации был молекулярный азот. Увеличение дозы сульфата меди
сопровождалось возрастанием доли N20 до 80% потерь азота в газообразной
форме.
4.4.5. Денитрификация в переувлажненных почвах
Для выявления общей зависимости эмиссии N20 от влажности почвы
были сопоставлены газообразные потери из почв разных типов с давлением
почвенной влаги [Степанов с соавт., 1996]. Данные об эмиссии закиси азота
выражены в виде относительной эмиссии (Э0Т||): содержание N20 в газовой
фазе при определенном давлении влаги, к максимальной эмиссии, отмеченной
для каждой почвы (см. рис. 4.6).
Максимум Эотп во всех почвах отмечался при давлении влаги от -0,10 до -
0,04 атм. При его увеличении до -0,01 атм Эотп вновь резко падает. Этот
уровень приближается к «капиллярной влагоемкости», при которой мениски воды
закрывают выходы из пор в атмосферу «водными пробками», что резко
снижает интенсивность эмиссии газов. Указанные усредненные зависимости очень
близки у всех исследованных почв и описываются следующими выражениями:
133
а) при -100 < Р < -0,1 атм N20 Эотн - lg(4,4/P°>28)
б) при -0,1 < Р < -0,01 атм N20 Эотн = lg(200 P), где
Р - давление почвенной влаги
N20
♦ Чернозем
■ Серозем
д Серая лесная
почва
х Краснозем
-0,01 Р, атм
Рис. 4.6. Зависимость относительной эмиссии (Э0Т1|) закиси азота от
давления почвенной влаги (Р). В диапазоне Р от -200 до -0,3 атм измерялось
полное Р (Рп); в диапазоне Р от -0,3 до до -0,01 атм - капиллярное Р (Рк)
Количественная оценка эмиссии N20 в зависимости от давления
почвенной влаги позволяет прогнозировать газообразные потери азота из почв в
атмосферу при разных уровнях влажности. Результаты исследования
указывают на то, что максимум эмиссии N20 из почв в атмосферу происходит при
влажности, близкой к полевой влагоемкости, что может достигаться после
выпадения атмосферных осадков или полива.
4.5. Заключение
Проведенные исследования свидетельствуют о важной роли денитрифи-
кации в азотном балансе всех изученных почв. Наиболее активно она
протекает в почвах с высоким содержанием гумуса и приурочена к верхним, корне-
обитаемым горизонтам почвы. Именно с этим связаны высокие газообразные
потери азота при ведении сельского хозяйства и низкий коэффициент
использования минеральных азотных удобрений.
Данные об активности денитрификации в почвах основных
биоклиматических зон европейской части России свидетельствует о том, что микробный
потенциал поглощения закиси азота в зональных типах почв, как правило,
превышает масштабы ее образования, вследствие чего конечным продуктом
денитрификации является молекулярный азот.
Особый характер денитрификации наблюдается в сульфатно-хлорид-
ных солончаках, в которых выявлено преимущественное образование
закиси азота в результате торможения процесса денитрификации на стадии
134
образования закиси азота. С учетом тенденции аридизации суши, роста
площадей, подверженных засолению, можно полагать, что эти процессы,
помимо уже известных негативных экологических последствий, будут
способствовать повышенной эмиссии этого микрогаза из почв в атмосферу.
Среди факторов среды, влияющих на активность денитрификации в
почвах, определяющее значение имеют влажность и температура. Максимум
эмиссии закиси азота наблюдается при влажности, близкой к полевой влаго-
емкости (-0,1 атм), а не при затоплении почвы, как считалось ранее. Таким
образом, интенсивное выделение закиси азота происходит при меняющемся
водном режиме почв (иссушении/увлажнении).
Восстановление (поглощение) закиси азота в почвах ограничивается
низкой температурой (до 4°С) и кислой реакцией среды (рН 4,0).
В агроценозах эмиссия закиси азота увеличивается пропорционально
дозе вносимого азота, достигая наибольшей величины при использовании
минеральных азотных удобрений в аммонийной и амидной формах, а не в
нитратной, как считалось ранее. Использование медленнодействующих азотных
удобрений на основе формальдегида не позволяет снизить газообразные
потери азота за счет денитрификации по сравнению с применением мочевины в
тех же дозах.
Существенное влияние на процесс денитрификации оказывает
агрегатный состав почв: с увеличением размера агрегатов возрастает доля
молекулярного азота и сокращается доля промежуточных продуктов
денитрификации (закиси азота и окиси азота). Разрушение почвенной структуры и
распыление почв способствует возрастанию доли закиси азота в суммарном
потоке газообразных соединений азота в атмосферу.
Поток закиси азота из почв является следствием нарушения
динамического равновесия между процессами ее образования и поглощения под
влиянием факторов внешней среды и антропогенных воздействий на почву:
применения минеральных и органических удобрений; искусственного орошения и
часто связанных с этим разрушения структуры почвенных агрегатов и
засоления почв; а также при использовании средств защиты растений
(гербицидов); вследствие аккумуляции в почвах тяжелых металлов и радионуклидов;
выпадения кислотных осадков и других факторов.
Литература
Добровольский Г.В. Структурно-функциональная роль почвы в биосфере.
М.: ГЕОС, 1999. С. 135-142.
Костина Н.В., Степанов А.Л., Умаров ММ. // Почвоведение, 1995, №6,
с. 725-731.
Кудеяров ВЛ. // Почвоведение, 1999, №8, с. 988-998.
Куракова Н.Г., Умаров ММ. // Вести. МГУ. Сер. почвовед., 1983, №2,
с. 64-65.
Манучарова НА., Степанов А.Л., Умаров ММ. // Почвоведение, 2001,
№10, с. 1261-1267.
Мепяшо 0,В., Степанов А.Л., Умаров ММ. // Почвоведение, 1998, №3,
135
с. 316-321.
Методы почвенной микробиологии и биохимии // Ред. Д. Г. Звягинцев. М.:
Изд-во МГУ, 1991.341с.
Новиков В.В., Степанов АЛ. // Микробиология, 2002, т. 71, №2, с. 272-276.
Пахненко О.А. Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1999. 26 с.
Сорокин Д.Ю., Лысенко A.M., Митюшина Л.Л. // Микробиология, 2001,
т. 65(3), с. 370-383.
Степанов АЛ., Судницын И.И., Умаров М.М., Галиманге Б. //
Почвоведение, 1996, №11, с. 1337-1340.
Степанов АЛ., Манучарова НА., Полянская Л.М. // Почвоведение, 1997,
№8. с. 973-976.
Степанов АЛ., Дурихина Н.В., Умаров М.М. // Удобрения и химические
мелиоранты в агроэкосистемах. М.: Изд-во МГУ, 1998, с. 477-483.
Степанов АЛ. // Автореф. дисс. д-ра биол. наук. М.: Макс-Пресс. 2000.49 с.
Умаров М.М. / Ассоциативная азотфиксация. Изд-во Моск. ун-та, 1986,
211с.
Федорова Р.И., Милехина Е.И., Илюхина Н.И. // Изв. АН СССР. Сер. биол.,
1973, №6, с. 797-806.
Arah J.R.M., Smith K.A., Crichton L, Li H.S. // J. Soil Sci., 1998. vol. 42,
p. 351-567.
Aulakh M.S, DoranJ.W., Walters D.T., Power J.F. // Soil Biol. Biochem., 1991,
vol. 23, p. 1161-1163.
Berks B.C., Barrata D., Richardson D.J., Ferguson SJ. // Europ. J. Biochem.,
1993, vol. 212, p. 467-476.
Berks B.C., Richardson D.J., Reilly A., Willis, Ferguson S.J. // Biochem. J., 1995,
vol. 309, p. 983-992.
Bodelier P.L.E., Frenzel P. // Appl. Environment. Microbiol., 1999, vol. 65,
p. 1826-1833.
Bouwman A.F. (Ed.) Soils and the greenhouse effect. John Wiley & Sons Ltd.
Chichester. 1990. P. 61-127.
Christiansen S., TiedjeJM. // FEMS Microbiol. Ecol., 1998. vol. 53, № 3-4,
p. 217-221.
Conrad R. // Microbiol. Rev., 1996, vol. 60, №4, p. 609-640.
Davidson E.A., Matson. PA., Vitousek P.M., Riley R., Dunkin K., Garsia-Mendes
G., MaassJ.M. // Ecology, 1993, vol. 34, p. 130-139.
Davidson E.A. // Soil Responses to Climate Change. NATO ASI sen, 1994.
vol. 1. P. 155-168.
De BoerA.P.N., Van der OostJ. //J. Biochem., 1996, vol. 242, p. 592- 600.
Galinski E.A., TrueperH.G. // FEMS Microbiol. Rev, 1994, vol. 15, p. 95-108.
GarsiaJ.L. // Soil Biol.Biochem., 1974, №6, p. 79-84.
GaskellJ.F, Blackmer A.M., BremnerJ.M. // Soil Sci. Soc. Amer. J., 1992, vol. 45,
p. 1124-1127.
Granli Т., Bockman O.C. //NorwegianJ. Agricult. Sci., 1994, №12, p. 128.
Heinemeyer O., Haider K., MosierA. // Biol. Fertil. Soils, 1998, vol. 6, p. 33-36.
Но СМ., Tseng S.K., Chang Y.J. // Lett. Appl. Microbiol, 2002, vol. 35,
p. 481-485.
Hutchinson G.L., Davidson E.A. //]. Geophis. Res., 1993, vol. 93, p. 9889-9896.
136
Laughlin R.J., Stevens RJ. // Soil Sci. Soc. Amer. J., 2002, vol. 66, p. 1540-1548.
Moir RJ., Kovach D.S., Solar P.V. // FEMS Microbiol. Lett., 1996, №102,
p. 1245-1248.
Moreno-Vivian C, Cabello P., Martinez-Luque M., Blasco R. //J. Bacteriol.,
1999, vol. 181, p. 6573-6584.
OgdenJ.E., MoorRK. //TIBTECH, 1995, vol. 13, p. 70-78.
Oren A. // 6 Intern. Symp. on Microb. Ecol., Barcelona, 1992. P. 256.
Payne WJ. Denitrification. New-York, J.Wiley & Sons, 1981, 214 p.
SchalkJ. A study of the metabolic pathway of anaerobic ammonium oxidation.
PhD Thesis in Microbiology, Technische Universiteit Delft, 2000,107 p.
Sexstone A J., Reusbech N.P., Parkin T.N., TiedjeJM. // Soil Sci. Soc. Amer. J.,
1985, vol. 49, p. 645-651.
Shoun H., Kim D.-H., Uchiyama H., SugiyamaJ. // FEMS Microbiol. Lett.,
1992, №94, p. 277-282.
Soo-Hoo C.K., Hollocher T.C. // Appl. Environment. Microbiol., 1996, vol. 56,
p. 3591-3592.
Takaya N., Suzuki S., Kuwazaki S. // Arch. Biochem. Biophys., 1999, vol. 372,
p. 340-346.
TiedjeJM. Biology of Anaerobic Microorganisms. New York: John Wiley &
Sons Ltd., 1988. P. 179-224.
Van Cleemput O., AbboudS., BaertL. // Proc. 5-th Intern. CIEC Sympos., 1997.
P. 307-311.
Yoshinari Т., Hynes R., Knowles R. // Soil Biol. Biochem., 1977, vol. 9,
p. 177-183.
Zutnft W.G., Coyle C.L., Frunzke K. // FEBS Lett., 1985, vol. 183, p. 240-244.
Zumft W.G. //Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1997, vol. 61, p. 533-616.
137
Научное издание
Марат Мутагарович Умаров
Александр Васильевич Кураков
Алексей Львович Степанов
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ
ТРАНСФОРМАЦИЯ АЗОТА В ПОЧВЕ
Редактор издательства Н.Б. Пурганская
Макет М. Старшова
Подписано к печати 26.12.2006.
Формат 70x100 1/16. Бумага офсетная.
Гарнитура PetersburgC. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 20,0.
Тираж 400 экз.
Тип. ВТИИ. Москва. Зак. № . Цс
Издательство ООО ГЕОС
125315, Москва, 1-й Амбулаторный пр., 7/3-114.
Тел.: (095) 152-19-14,230-80-92
Факс:(095)951-04-43
E-mail: geos@ginras.ru