/
Автор: Звягинцев Д.Г.
Теги: сельское хозяйство в целом биология микробиология почвоведение
Год: 1987
Текст
Д.Г Звягинцев
ПОЧВА
и
МИКРО
ОРГАНИЗМЫ
Д. Г. ЗВЯГИНЦЕВ
ПОЧВА
И
МИКРООРГАНИЗМЫ
ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
1987
УДК 631
Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. — М Изд-во Моск. ун-та,.
1987. — 256 с.
В книге на основании собственных исследований автора и литературных
данных рассмотрена специфика твердой, жидкой и газообразной фаз почвы,,
оказывающая влияние на развитие микроорганизмов в почве как
специфической среде обитания. Отражена микрозональность строения почвы, которая
фактически определяет всю жизнедеятельность почвенных микроорганизмов.
Описана иммобилизация микробных клеток и ее влияние на распределение микробов,,
их количественный учет и активность. Приведено количественное и
качественное распределение микроорганизмов по разным типам почв, а также по
почвенному профилю. Специальный раздел посвящен пространственным и
временным закономерностям в распределении микроорганизмов. Показаны
закономерности протекания микробной сукцессии в почве. Большое внимание уделено
разработке вопроса об основных закономерностях строения и функционирования,
комплекса почвенных микроорганизмов, а также возможностях управления
комплексом и отдельных его популяций.
Для специалистов, работающих в области почвенной микробиологии,
экологии, почвоведения и агрохимии.
Рецензенты:
академик Е. Н. Мишу стан,
член-корреспондент АН СССР М, В. Горлепко
Печатается по постановлению
Редашионно-издательского совета
№9вкор<®ре?14&нтрс$тета
МОНОГРАФИЯ
Дмитрий Григорьевич Звягинцев
ПОЧВА И МИКРООРГАНИЗМЫ
Зав. редакцией Я. М. Глазкова. Редактор Я. А. Жук. Переплет художника В. Б. Гор-
dona. Художественный редактор Ю. М. Добрянская. Технический редактор Г. Д. Колос-
кова. Корректоры И. А. Мушникова, Л. А. Костылева
ИБ № 2754
Сдано в набор 24.06.86. Подписано к печати 24.02.37. Л-62066. Формат 60X90/16 Бумага.
тип. № 1. Гарнитура литературная. Высокая печать Усл. печ. л. 16,0. Уч.-изд. л. 19,52
Тираж 1920 экз. Зака^з № 422. Цена 3 р. 10 к. Изд. № 4340
Ордена «Знак Почета» издательство Московского университета.
103009, Москва, ул. Герцена, 5/7.
Типография ордена «Знак Почета» изд-ва МГУ.
119899, Москва, Ленинские горы
3802020000—054 © Издательство Московского
077(02)—87 ^ университета, 1987
Содержание
Введение .»#•« 4
СПЕЦИФИКА ПОЧВЫ КАК СРЕДЫ ОБИТАНИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ , 7
Твердая фаза почвы 12
Адгезия (адсорбция) микроорганизмов в почвах . . . . . . . 13
Закономерности адгезии внесенных микроорганизмов 19
Зависимость адгезии от свойств микроорганизмов 20
Зависимость адгезии от свойств твердой поверхности .... 23
Зависимость адгезии от состава среды 26
Зависимость адгезии от условий, определяющих возможности
контакта между клетками и поверхностью адсорбента ..... 29
V Природа явления адгезии микроорганизмов 31
Величина адгезионных сил 41
^-Изучение форм и размеров клеток почвенных микроорганизмов . . 44
*~ Десорбция микроорганизмов при их количественном учете в почве 56
^.Активность адгезированных клеток . 65
Аэробные микробиологические процессы 65
Влияние адсорбентов на анаэробные микробиологические процессы . 93
Хранение микроорганизмов на адсорбентах 98
Действие антимикробных веществ в присутствии адсорбентов . . 102
Причины влияния адсорбентов на активность микроорганизмов . . ЮЗ
Жидкая фаза почвы 109
Термодинамическая характеристика состояния почвенной влаги
(термодинамический потенциал, активность воды) 110
Развитие микроорганизмов в пленках и капиллярах 118
Концентрация ионов водорода (рН) .125
Окислительно-восстановительные условия . . ...... 126
Газовая фаза почвы 128
ПУТИ ИЗУЧЕНИЯ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И
ВЫЗЫВАЕМЫХ ИМИ ПРОЦЕССОВ .t . . 140
КОНЦЕПЦИИ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КОМПЛЕКСА
ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 147
МИКРОБНАЯ СУКЦЕССИЯ В ПОЧВЕ 166
ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПОЧВ 197
УПРАВЛЕНИЕ МИКРОБНЫМИ ПОПУЛЯЦИЯМИ В ПОЧВАХ . . 222
Литература .. . .. . 235
Введение
Почвы содержат огромное количество и разнообразие
микроорганизмов. Существование почвы без микробов невозможно.
Микробы обусловливают протекание в почве ряда наиболее важных
процессов. Они являются необходимым звеном в круговороте всех
биогенных элементов, участвуют в почвообразовании и
поддержании почвенного плодородия.
До сих пор из почв удалось выделить далеко не все
обитающие в них микроорганизмы, нет четкого представления о
специфике * развития микробов«в почвах, трудно описать кинетику
вызываемых ими процессов.
Для более полного понимания почвенно-микробиологических
процессов и более полного выделения почвенных
микроорганизмов необходимо иметь четкое представление о специфике почвы
как среды обитания микроорганизмов. Осуществление этой
задачи и является одной из целей настоящей монографии.
Специфика почвы как среды обитания микроорганизмов во-
многом представляется загадкой. Из-за этого до сих пор
неизвестен ряд микроорганизмов, обитающих в почвах.
При изучении специфики почвы как среды обитания
микроорганизмов обычно применяли сравнительный подход и сравнивали:
почву с жидкими лабораторными питательными средами или с
естественной водной средой обитания (реки, озера, моря). Такой
подход представляется перспективным, и мы его продолжим в
настоящей работе.
Разные типы почв как среды обитания микроорганизмов
также различаются между собой, равно как и разные почвенные
генетические горизонты, что составляет предмет особого
рассмотрения. Однако разные типы почв различаются между собой
меньше, чем почва и вода. Разные генетические горизонты
различаются между собой больше, чем, например, горизонт А1 разных
почвенных типов. Почва как среда обитания резко меняется во>
времени и в пространстве, и этот вопрос также специально
освещается.
При изучении микроорганизмов, выделенных из любой почвы,,
поражает их разнообразие, но главное то, что они обладают
часто противоположными и несовместимыми для одной среды
обитания свойствами. Из почвы выделяются гетеротрофы и автотро-
фы, аэробы и анаэробы, олиготрофы и копиотрофы (евтрофы)„
гидролитики и негидролитики, термофилы и психрофилы, ацидо-
филы и алкалофилы, микробы-антагонисты и чувствительные к их
антибиотикам микроорганизмы.
Рассмотрение этих особенностей приводит к выводу, что
почва представляет собой не единую среду обитания, а является
системой множества микро- и мезосред обитания с совершенно
различными условиями. Именно поэтому она так богата самыми,
противоположными по свойствам и разнообразными микроорга-
4
низмами. По микробному разнообразию почва — самая богатая
среда обитания по сравнению с другими естественными средами,
такими, как природные воды, геологические отложения, силос,
рубец жвачных животных, кишечник, молочные продукты и т. д.
Почва оказывается не только лучшей средой обитания для
разнородных микроорганизмов, но и лучшей средой для их
сохранения и выживания. Почва в целом не столько среда обитания,-
сколько среда сохранения микробов. Среди организмов,
населяющих биосферу, именно микроорганизмы имеют самые большие
темпы размножения. Однако это положение к почвенным
микроорганизмам оказывается совершенно неприемлемым. Его нужно
дополнить другой формулировкой: микроорганизмы — это такие
организмы, которые могут в определенных условиях
размножаться быстрее или же гораздо медленнее других организмов.
Известно, что микробы могут находиться много лет в сухом или
замерзшем состоянии. В таком состоянии они сохраняются, но не раз-,
множаются. В вечномерзлых погребенных почвах многочисленные
и достаточно разнообразные бактерии сохранили
жизнеспособность на протяжении 1 млн. лет (Звягинцев и др., 1985). Они
могут переживать длительные периоды голодания и при
благоприятных для их развития условиях температуры и влажности
(Звягинцев, 1987). Таким образом, необходимо выделить две
особенности почвенных микроорганизмов: способность чрезвычайно
быстро размножаться и осваивать благоприятную среду, а также
способность очень длительно сохраняться в условиях,
неблагоприятных для развития.
Многие неудачи почвенных микробиологов по изоляции из
почвы новых форм микроорганизмов, количественному учету
микробов, внесению бактериальных удобрений, управлению
микробиологическими процессами, прогнозу микробиологических событий,
изучению микробной сукцессии в почве, изучению вопроса об эко-
лого-географических закономерностях распределения
микроорганизмов были обусловлены слабым представлением о специфике
почвы как среде обитания микроорганизмов.
Следует отметить, что специалисты смежных дисциплин, в
особенности почвенные зоологи (Гиляров, 1965), уделяли вопросу о
специфике почвы как среды обитания значительно больше
внимания, чем микробиологи.
На кафедре биологии почв Московского университета, где
работает автор настоящей книги, создались особенно
благоприятные условия для разработки рассматриваемой темы, в связи с тем
что работа ведется на факультете почвоведения, где изучается
специфика строения почвы, ее химические и физические свойства.
Эти результаты объединяются со сведениями по микробиологии,
получаемыми на кафедре биологии почв того же факультета.
Происходит синтез знаний о среде обитания (почве) и о
микроорганизмах, ее населяющих.
В книге обосновывается теория микрозональности развития
микроорганизмов в почвах. Дается подробная характеристика ос-.
• 5
новных типов микрозон. Эта теория поможет объяснить ряд
специфических явлений, наблюдающихся при развитии
микроорганизмов в почве. Вскрываются особенности взаимодействия
микроорганизмов с поверхностью почвенных частиц, их адсорбция
(адгезия, иммобилизация), специфика проявления их
жизнедеятельности на границе раздела твердых частиц и почвенного
раствора, их развитие внутри органоминерального геля. В
присутствии развитой твердой поверхности меняются скорость и
кинетика размножения микроорганизмов, образование ими биомассы,
морфология клеток, циклы их развития, продолжительность лаг-
фазы, интенсивность вызываемых или физиолого-биохимических
процессов, количество и характер образующихся метаболитов.
Приводятся данные по специфике развития микроорганизмов в
тонких пленках и капиллярах, в которых они реально развиваются.
В почвах развитие микробов идет именно в таких условиях, хотя
до сих пор на это явление обращалось мало внимания.
Изучение специфики почвы как среды обитания
микроорганизмов позволяет значительно полнее охарактеризовать
жизнедеятельность микробов в почве, особенности протекающих
физиолого-биохимических процессов, дать новые критерии для оценки
биологической активности почвы, их биодиагностики и
биоиндикации, определения воздействия различных антропогенных
факторов, включая агрохимические и агротехнические мероприятия,
действие ксенобиотиков, а также для целей охраны почв.
Исходя из основных представлений и идей С. Н. Виноград-
ского в области экологии почвенных микроорганизмов и из
конкретных представлений о специфике почвы как среды обитания,'
автор формулирует основные принципы строения и
функционирования комплекса почвенных микроорганизмов. Принципы не
только объясняют функционирование комплекса, но и дают
возможность прогнозировать его развитие, а также судить о его
целостности или повреждении, решать задачи биодиагностики и
биоиндикации почв.
В монографии с новых позиций рассматривается микробная
сукцессия в почве и делаются важные теоретические и
практические выводы.
Много внимания уделено рассмотрению такого важного для
всех разделов почвенной микробиологии вопроса, как динамика
показателей биологической активности почв. Даны критерии для
изучения биодинахмики.
Управление микробными популяциями в почве — это тот
раздел почвенной микробиологии, который будет наиболее
интенсивно развиваться в ближайшее время. Это касается не только
естественных, но и искусственно вносимых популяций, а также
микробов, созданных генной инженерией. Этот раздел также
освещается в монографии.
Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам и
аспирантам кафедры биологии почв за помощь в работе.
6
СПЕЦИФИКА ПОЧВЫ КАК СРЕДЫ ОБИТАНИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Специфика почвы как среды обитания микроорганизмов
состоят прежде всего в том, чтр это трехфазная система с очень
развитой твердой поверхностью, которая соседствует с жидкой
и газовой фазами. Твердые частицы и агрегаты делят почву на
многочисленные микрозоны, частично или полностью
изолированные объемы, в которых создаются резко отличные, а часто даже
противоположные условия. Только в первом приближении можно
рассматривать почву как единую среду обитания
микроорганизмов. Всегда необходимо помнить, что клетки микробов имеют
микроскопические размеры и средой их обитания является
микросреда. Сотни и тысячи таких микросред сосредоточены в каждом
грамме почвы. Таким образом, почва — это комплекс
одновременно существующих, но совершенно различных микросред. Эти
микросреды сменяются не только в пространстве, но и во
времени. Микросреда не может долго оставаться неизменной, и во
времени одна микросреда превращается в другую, часто
противоположную. Так, микросреда, содержащая легкодоступное
органическое вещество, например разлагающийся корешок
растения, быстро превращается в микросреду, содержащую только
труднодоступные органические вещества типа полимеров.
Относительно постоянной может оставаться только микросреда, где
нет метаболизирующих микроорганизмов. Если учесть, что
передвижение микроорганизмов в почве затруднено (см. с. 13), то
оказывается, что почвенные микроорганизмы находятся в среде с
очень; изменчивыми условиями и неравномерным питательным
режимом. После периода поступления в микрообъем почвы свежего
органического вещества наступает длительный период, когда
единственным источником питания служит почвенный гумус.
Остается неопределенным, какое питание поступит в данную
микрозону в последующем: белок, легкодоступные мономеры,
целлюлоза, лигнин, хитин и т. д. Однако опыт показывает, что
обычно в любой почвенной микрозоне оказываются микроорганизмы,
способные использовать любой питательный субстрат, причем в
различных условиях, которые создаются в микрозоне, например
при различном окислительно-восстановительном потенциале, рН,
7
температуре, активности воды. Это достигается благодаря
наличию в почве колоссального запаса разнообразных почвенных
микроорганизмов— микробного пула (см. с. 151).
Рассмотрим сначала модель строения почвы без живых
растений и беспозвоночных животных (рис. 1). Для примера взят
горизонт А1 хорошо оструктуренной почвы, которая имеет
агрегаты водопрочной структуры, достигающие в диаметре 2—5 мм.
Для более наглядного рассмотрения расположения
микроорганизмов в почве перейдем на
выражение всех размеров в микрометрах
(микронах), исходя из того, что
микроорганизмы имеют размеры от
долей микрометра до десятков
микрометров. Большинство почвенных
Рис. 1. Схема строения структурной почвы
как среды обитания микроорганизмов:
/ — почвенный агрегат; 2 — органическое
вещество; 3 — пленка воды; 4 — внутри-
агрегатная пора; 5 — межагрегатная пора;
6 — микроорганизмы
Рис. 2. Основные формы и размеры почвенных микроорганизмов
в люминесцентном и фазово-контрастном микроскопах. Участки
клеток, светящиеся при люминесценции: / — зеленые; 2 — красные;
3 — участки, которые не видны в люминесцентном микроскопе, но
видны при фазовом контрасте; 4 — светло-зеленые
8
бактерий имеет объем 0,1 мкм3, споры грибов — несколько
кубических микрометров и размеры гиф, равные десяткам, сотням и
тысячам кубических микрометров (рис. 2; Звягинцев, 1973).
По своим размерам микроорганизмы очень различны и
отличаются друг от друга гораздо больше, чем макроорганизмы. Это
положение явно упускалось из виду в почвенной микробиологии
при сложении количеств микроорганизмов совершенно разных
размеров, например бактерий и грибов, которые в среднем по объему
отличаются в 100—1000 раз (табл. 1),
Таблица 1
Линейные размеры и масса микроорганизмов
Группы микроорганизмов
Простейшие
Грибы
Дрожжи
Бактерии
Нитчатые бактерии, акти-
номицеты
Микоплазмы
Линейные
размеры, мкм
10—100
1—10Х1—1000
1 — 10
0,1—Ю
0,1—10X1—100
0,01—0,1
Масса, г
Ю-7—10-6
ю-10—ю-6
ю-10—ю-9
10-12-10-ю
ю-»—ю-8
Ю-13—10-12
Известно, что часть микроорганизмов располагается на
поверхности почвенных агрегатов, а часть занимает внутриагрегат-
ные пространства. Обычно считают, что на поверхности агрегатов
располагаются аэробы, а внутри них — анаэробы.
Действительно, микрозоны на поверхности агрегата и внутри него
отличаются (см. рис. 1). Однако в настоящее время от упрощенного
рассмотрения аэробной и анаэробной зон в почвах пришлось
отказаться.
Очевидно, и внутри агрегатов в течение длительных
промежутков времени могут существовать аэробные условия.
Обычно, доказывая анаэробность зон внутри агрегатов, ссылались на
то, что на поверхности идет развитие аэробов, они используют
кислород и внутри агрегатов могут развиваться только анаэробы.
Это положение справедливо для условий с интенсивным
развитием микроорганизмов. Достаточно пленки из аэробных
микроорганизмов (бактерий или грибов в несколько микрометров
толщиной), чтобы под ней создавались анаэробные условия, но при
активном дыхании клеток, образующих эту пленку. Однако в
почве (Звягинцев и др., 1976) в среднем интенсивность размножения
микроорганизмов очень низкая (см. с. 197). Поэтому и внутри
агрегатов в течение длительного времени могут быть аэробные
зоны. Это относится к тем периодам, когда микробы не метабо-
лизируют или очень слабо метаболизируют. В самом деле обыч-
9
но внутри агрегатов не наблюдается проявления выраженных
восстановительных условий. Анаэробные услофя скорее могут
создаваться при разложении органических остатков, когда на
поверхности кусочка органического вещества идет интенсивный
аэробный процесс, а внутри развиваются факультативные и обли-
гатные анаэробы.
Развитие микроорганизмов на поверхности агрегатов
возможно в следующих микрозонах (см. рис. 1): 1) в объеме
почвенного раствора; 2) в пленочной воде, причем микробы могут либо
свободно плавать в толстой пленке, либо быть зажатыми в
тонкой пленке, а в толстой пленке они могут находиться либо в
свободном состоянии, либо быть адгезированными на поверхности
твердых частиц; 3) в капиллярах, которые также могут иметь
разную толщину, и клетки могут либо свободно плавать, либо
прикрепляться к частицам. Они могут развиваться в
микроскоплениях органического вещества (разлагающийся корешок или
беспозвоночное животное). Внутри агрегатов микробы могут
находиться в более мелких капиллярах и пленках с другим составом
почвенного раствора и газовой среды, чем на поверхности
агрегатов. Они могут располагаться на поверхности пространств с
защемленным почвенным воздухом, в непроточных капиллярах, а
также быть запертыми в органоминеральном геле.
Разложение скоплений органического вещества (лесная
подстилка, степной войлок, мертвые корни растений и другие
растительные и животные остатки) ближе к условиям лабораторных
питательных сред. Здесь развитие микроорганизмов идет по
другим законам, чем на поверхности почвенных частиц, связь с
минеральной частью почвы гораздо меньше. Основная роль почвы
состоит в том, что она поставляет микроорганизмы для
разложения органического вещества.
Значительно сложнее выглядит почвенная микро- и мезозо-
нальность при наличии в почве живых растений и животных.
Особенно большое значение имеет ризоплана и частично
ризосфера, где микроорганизмы развиваются за счет корневых
выделений и корневого отпада. Специфические типы микрозон включают
микроорганизмы, связанные с беспозвоночными животными, в
первую очередь кишечный тракт беспозвоночных.
В последнее время наметился значительный прогресс в
изучении микроорганизмов ризосферы и ризопланы. К разложению
скоплений органических веществ можно подойти, исходя из
развития микроорганизмов на лабораторных питательных средах и
в ферментерах. Особенно неясным остается вопрос о
микроорганизмах, связанных с животными.
Отметим, что примерно 70% разлагаемых органических
веществ приходится на растительные остатки, примерно 30% — на
корневые выделения и корневой отпад. Грибы имеют большее
значение в разложении органических веществ, чем бактерии.
Микроорганизмы разлагают 95% органических веществ, животные, в
10
том числе и беспозвоночные, — только 5%. Оценки эти весьма
ориентировочны и, вероятно, будут сильно меняться. Здесь они
приводятся лишь для общей приблизительной ориентации
исследователей и для того, чтобы подчеркнуть необходимость их
уточнения.
Получены довольно многочисленные данные по
колебаниям отмеченных величин в конкретных экосистемах. В отдельных
экосистемах (биогеоценозах) эти соотношения, например по
долевому участию грибов, бактерий и беспозвоночных животных,
могут резко меняться. Однако методы, с помощью которых
получаются отмеченные соотношения, оставляют желать лучшего, и
поэтому работы такого рода нами более подробно не
рассматриваются, хотя сам факт больших различий в зависимости от типа
экосистемы не вызывает сомнений. Вышеизложенное касается
роли определенных групп организмов в деградации органических
веществ и потоке энергии. При рассмотрении других процессов,
например таких, как азотфиксация, роль в образовании
физиологически активных веществ, структурообразовании, рыхлении
почвы и т. д., значение отдельных групп организмов может резко
меняться. Так, по современным представлениям, несмотря на
меньшее использование энергии, ризосферные микроорганизмы
(бактерии) имеют большее значение в азотфиксации по сравнению с
деструкторами мертвого органического вещества, которое в
основном осуществляется грибами, не проводящими азотфиксации.
Роль узкой группы микроорганизмов, образующих определенный
антибиотик или токсин, может непропорционально возрастать,
если образуемое физиологически активное вещество имеет важное
экологическое значение.
Характер твердой фазы, с которой взаимодействуют почвенные
микроорганизмы, до сих пор полностью не определен. Первая
точка зрения основывается на том, что происходит
взаимодействие микробных клеток непосредственно с минеральной
поверхностью почвенных частиц, и минералогический состав почв
оказывает существенное влияние на их жизнедеятельность. Стотцкий
и Мартин (Stotzky, Martin, 1963) показали, что сохранение и
развитие в почвах ряда фитопатогенных грибов связаны с их
минералогическим составом. Установлена прямая связь между
распространением фузариозного вилта бананов и содержанием в почвах
минералов группы монтмориллонита. Исследователи,
придерживающиеся первой точки зрения, в качестве модели почвы часто
используют определенные минералы, особенно глинистые
(монтмориллонит, каолинит) или смеси минералов с песком. Другая
точка зрения сводится к тому, что вся поверхность минералов в
печве экранирована органическими веществами. Минеральная
поверхность может оказывать только косвенное влияние через
специфику адсорбции органических веществ, наличие внутришгоско-
стных пространств у глин типа монтмориллонита и т. д. Для
доказательства этой точки зрения приводятся, например, сведения
об адсорбции органических веществ на поверхности стекла. Из-
11
вестно, что если достаточно чистое обезжиренное (очищенное от
органических веществ) предметное стекло из хромпика оставить
на воздухе на несколько часов, то оно покрывается
органическими веществами, адсорбирующимися из воздуха. Стекло
приобретает гидрофобные свойства. На существование противоречия
между наличием в почвах большого набора самых различных
органических веществ и якобы существующей в почве чистой
минеральной поверхностью неоднократно обращалось внимание, но
разрешен вопрос не был. Более вероятно, что микробам приходится
сталкиваться не с чисто минеральными поверхностями, а с
поверхностями, покрытыми органическими веществами. Правда,
микробы могут использовать адсорбированные органические
вещества и освобождать минеральную поверхность. Процесс
занятия и освобождения минеральной поверхности органическими
веществами динамический. Количество и качество
адсорбированного органического вещества будут зависеть от качества и
величины минеральной поверхности. Очень часто в почве имеет место
многослойная адсорбция органических и минеральных веществ.
ТВЕРДАЯ ФАЗА ПОЧВЫ
Наличие развитой твердой фазы в виде минеральной и
органической части делает почву средой, резко отличной от
природных вод, где часто резко не хватает минеральных элементов,
необходимых для развития микроорганизмов, в первую очередь
фосфора. Хотя минеральные вещества и могут выступать в качестве
лимитирующего фактора для развития растений и
микроорганизмов, такого дефицита этих веществ, как в природных водах, в
почвах почти никогда не бывает. Сказанное можно пояснить на
следующем примере. Известно, что максимальная
продуктивность не зависит от среды, в которой развиваются организмы
(почва или природные воды). Некоторые районы природных вод
могут быть так же продуктивны, как наиболее богатые почвы,
причем максимальная продуктивность почв и природных вод
примерно равна. Почвы, например пустынные, и воды, например
открытый глубоководный океан, могут быть одинаково мало
продуктивными. При одинаковом световом и тепловом режиме
продуктивность природных вод в основном зависит от снабжения
аЛшеральными элементами питания, а почв — от режима
влажности. В продуктивные воды элементы минерального питания
должны привноситься со стороны водными потоками, в почвы же
эти элементы поступают из твердой фазы in situ. Сравним две
экосистемы: открытый глубоководный океан без привноса
элементов питания со стороны и дождевой тропический лес.
Продуктивность океана, несмотря на изобилие света и воды, а также
благоприятных для протекания биохимических процессов
температурных условий, оказывается очень малой. Тропический лес
обладает очень большой продуктивностью, так как обеспечивает
12
растения и микроорганизмы зольными элементами, и прежде
всего фосфором, который в океанической воде содержится лишь
в очень небольшом количестве. Этот призер интересен еще и тем,
что он ярко демонстрирует положение о том, что в природных
экосистемах в противоположность агроэкосистемам азот не
является лимитирующим фактором. В условиях обеспеченности
всеми другими факторами многочисленные и разнообразные бак-
терии-азотфиксаторы, как правило, обеспечивают естественный
биоценоз связанным азотом, что наблюдается в тропическом лесу.
Находясь на почвенных частицах, микробные клетки
располагаются либо на поверхности органоминерального геля, будучи
более или менее прочно и плотно связанными с этой поверхностью,
либо они могут быть погружены в органоминеральный гель
{рис. 3). Часто клетки заключены в гель из собственных капсул.
АДГЕЗИЯ (АДСОРБЦИЯ) МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВАХ
Микробы в почвах располагаются преимущественно на
поверхности твердой фазы. Это явление было названо адсорбцией
микроорганизмов. В последнее время для обозначения
описываемого явления стали применять еще два термина: адгезия и
иммобилизация.
Адгезию микробных клеток в почвах начали изучать С. Н. Ви-
ноградский, Н. Н. Худяков, Д. М. Новогрудский.
Изучение шло двумя путями. С одной стороны, выясняли
адгезию собственных микроорганизмов почв, с другой стороны,
были проведены очень большие
модельные эксперименты, в которых
изучалась адгезия искусственно
внесенных в почву чистых культур
микроорганизмов. Часто опыты ста-
Рис. 3. Схема расположения клеток на
поверхности частиц
вились не с почвами, а с минералами, ионообменными смолами и
другими адсорбентами. Такой подход оказался правильным и
позволил гораздо лучше изучить рассматриваемое явление.
Для изучения адгезии собственно почвенных микроорганизмов
особенно много дали люминесцентно-микроскопический метод и
электронная сканирующая микроскопия, хотя широкое
распространение адгезии микробов в почвах было отмечено с помощью
метода Виноградского при окраске почвы эритрозином.
Метод люминесцентной микроскопии очень удобен для
изучения адгезии микроорганизмов и вообще для исследования
специфики почвы как среды обитания микроорганизмов. Поэтому
рассмотрим его более подробно. Было предложено много люми-
несцирующих красителей (флуорохромов) и много методов, од-
13
нако наибольшее распространение получил метод Штруггера
(Strugger, 1949) с использованием в качестве красителя ^кри-
дина оранжевого. Этот ^основной (катионный) краситель
Отличается тем, что в форме мономера (одиночных катионов) он дает
зеленое свечение, а в форме димера (сдвоенных катионов) он
светится красным. При разном соотношении форм флуорохрома
получается свечение с широкой гаммой цветов и всевозможных
оттенков (красный, желтый, зеленый). На почвенных частицах
флуорохром концентрируется в больших количествах и в
большинстве случаев дает красное свечение при возбуждающем сине-
фиолетовом свете. Часть частиц выглядят черными — они не
адсорбируют краситель. Некоторые частицы выглядят желтыми и
зелеными. Клетки микроорганизмов обычно светятся зеленым.
В неповрежденную нативную спираль ДНК клетки краситель
входит только в виде одиночных катионов и заставляет ее
светиться зеленым. РНК не имеет такой жесткой структуры как
ДНК, краситель образует агрегаты, и РНК светится красным.
Краситель связывается с кислыми полисахаридами и белками и
другими анионными соединениями. С помощью этого красителя
можно, хотя бы частично, дифференцировать живые и мертвые
клетки, и хотя этот метод относительный, как и все другие
методы окраски, однако, особенно при изучении нативных почв, не
получавших свежего органического вещества, его можно
использовать. В обычных почвах большинство клеток являются
голодающими. Они не имеют большого количества РНК и запасных
питательных веществ. ДНК составляет значительную часть клетки.
Она и обусловливает яркое и четкое зеленое свечение клеток
почвенных бактерий. Разрушение структуры ДНК* путем автоклави-
рования почвы (Strugger, 1949) приводит к исчезновению
зеленого свечения клеток, и они становятся красными. Однако
возможен такой случай, когда клетка уже мертвая, но ДНК
сохранила свою нативную структуру. В этом случае клетка будет
светиться зеленым, но в обычных условиях такие случаи
встречаются не так часто. Красным могут светиться не только мертвые'
клетки, но и наиболее активно метаболизирующие клетки,
содержащие большое количество РНК. В этом случае для
доказательства того, что они живые, можно обработать клетки
РНК-азой: РНК исчезает и остается ДНК, которая светится
зеленым. Отметим, что при окрашивании акридином оранжевым
обычно светится не вся клетка, а ее центральная часть — «нук-
леоид» (Schuler, 1954; Мейеель, Миролюбова, 1959). Изучая
почвы под люминесцентным микроскопом при окраске акридином
оранжевым, мы пришли к выводу, что почва содержит лишь
небольшое количество мертвых бактериальных клеток. Метод не
дает возможности различить живые и мертвые гифы грибов. Для
этого рекомендуется использовать диацетат флуоресцеина (Lund-
green, 1981).
Живые клетки обладают ферментом, который отщепляет
ацетат и, таким образом, дает возможность проявиться окраске
14
флуоресцеина. Сам диацетат флуоресцеина не обладает
люминесценцией. Однако может быть ошибка за счет того, что клетка
может погибнуть, но фермент сохраняется. В определенных
условиях (низкие температуры, лимитация по элементам питания)
в почвах, например тундры, может накапливаться значительное
количество мертвых клеток и гиф грибов. Другой метод
разделения живых и мертвых клеток состоит в проведении опытов с на-
лидиксовой кислотой (Кочкина и др., 1980).
При окрашивании почвы акридином оранжевым и проведении
эпилюминесцентных исследований почвенные частицы в силу
гетерогенности своей поверхности имеют весьма различную окраску.
Одни флуоресцируют самыми различными оттенками красного
цвета, другие — желтым и зеленым, а третьи выглядят
абсолютно черными. Отдельные участки почвенных частиц и агрегатов
почти всегда светятся разными цветами или имеют разные
оттенки, что также указывает на гетерогенность их поверхности.
Интенсивная красная окраска присуща гуминовым веществам,
зеленая и желтая — обрывкам лигноцеллюлозы, черная — некоторым
минеральным частицам. По почвенным частицам разбросано
большое количество одиночных и собранных в колонии
прикрепленных клеток микроорганизмов. С помощью люминесцентной
микроскопии удалось выяснить, что большая часть почвенных
микроорганизмов (бактерий, актиномицетов, грибов, дрожжей,
водорослей, простейших) в естественных условиях адгезирована
на почвенных частицах. Это относится и к вегетативным клеткам
и спорам (Звягинцев, 1959в, 1962а). Такое явление наблюдалось
во всех исследованных почвах. Однако в дерново-подзолистых,
подзолистых и серых лесных почвах встречается относительно
меньшее количество адгезированных клеток (50—60%). В
богатой гумусом и тяжелой по механическому составу перегнойно-
глеевой почве и в черноземах на поверхности частиц и агрегатов
находится гораздо больше клеток (90%). Другие почвы
(каштановые, сероземы) занимают среднее положение.
Отмеченные закономерности были установлены на основании
рассмотрения расположения бактерий на поверхности почвенных
монолитов.
При рассмотрении почвенной суспензии, полученной после
взбалтывания почвы с водой, обнаруживается больше свободных
клеток, но большинство клеток продолжает находиться в адге-
зированном положении, по-прежнему располагаясь на
поверхности почвенных частиц. На частицах чернозема и перегнойно-глее-
вой почвы сохраняется множество микроколоний и одиночных
форм. На частицах дерново-подзолистой почвы остается
относительно меньше адгезированных клеток.
После интенсивного взбалтывания почвенной суспензии
агрегаты сильно уменьшаются по величине, но вновь
образовавшиеся мелкие частицы размером 1—10 мкм продолжают нести
клетки бактерий, причем часто на такой частице располагается по
нескольку клеток. Почти полное удаление клеток с поверхности
15
частиц достигается после обработки почвенной суспензии
ультразвуком небольшой частоты и мощности (Звягинцев, Галкина,,
1967).
При рассмотрении отдельных частиц выясняется, что разные
частицы заселены очень неравномерно: одни — плотно, другие —
слабо, третьи совсем лишены микроорганизмов. Частица может
нести от одной или нескольких клеток до нескольких десятков
клеток бактерий на 100 мкм2 поверхности. Клетки распределены
неравномерно не только на разных частицах, но и на отдельных
участках одной и той же частицы. Неравномерность
распределения усугубляется и тем, что на отдельных участках часто
располагаются микроколонии, состоящие из 4—10, а часто и из 50—
100, редко из нескольких сотен клеток. В большинстве случаев
микроколонии состоят из клеток одной формы и величины,
вероятно, чаще всего принадлежащих одному штамму, т. е. и в
естественных условиях в почве бактерии часто развиваются в виде
чистых микрокультур, и, таким образом, лабораторные чистые
культуры имеют прямое отношение к одной из форм развития
микроорганизмов в природе. Довольно часто микроколонии
располагаются в микроуглублениях на почвенных частицах.
Встречаются и сложные ценозы микроорганизмов, которые более четко
выявляются на почвенных монолитах.
Таким образом, выявляется микрозональность в
распределении микроорганизмов в почве, причем, как показывают опыты,
микрозональность распределения микроорганизмов может быть
прослежена вплоть до отдельных почвенных частиц.
Микрозональность распределения микроорганизмов в почве с адгезией
клеток на твердых поверхностях имеет принципиальное и
первостепенное значение при определении специфики почвы как среды
обитания микроорганизмов и при рассмотрении экологии и
жизнедеятельности почвенных микроорганизмов. В отдельных
микрозонах создаются совершенно различные условия, и, таким
образом, появляется возможность развития в почве как в
чрезвычайно структурированном биотопе самых различных по своим
свойствам групп микробов.
В природных средах микроорганизмы имеют вертикальную
стратификацию в соответствии с вертикальным изменением
факторов среды. В водоемах однородные зоны, кроме нейстона,
простираются в вертикальном направлении на десятки сантиметров,
иногда метры или десятки метров; в илах горизонтальные зоны
имеют толщину, измеряемую миллиметрами; в почвах также
имеется вертикальная стратификация микроорганизмов, в том числе
и по почвенным генетическим горизонтам, но здесь, кроме того,
имеются многообразные микрозоны со специфическими
условиями, занимающие микрообъемы с диаметром в несколько
десятков или сотен микрометров; они не имеют сколько-нибудь
большой горизонтальной протяженности.
Наличие в почве в определенные периоды большого
количества одиночных клеток указывает, как уже отмечал С. Н. Вино-
16
градский (1952), на существование у бактерий стадий, в которые
клетки не подвергаются адгезии и могут свободно передвигаться
и расселяться в объеме почвы. Наличие большого количества
одиночных клеток может объясняться и частичным
разрушением колоний при приготовлении препаратов. При применении
более мягких способов подготовки препаратов, например при
изучении микробов на монолитах, а не в почвенной суспензии,
одиночных клеток встречается значительно меньше.
Подтверждается мнение Т. В. Аристовской (1965) о наличии среди почвенных
бактерий обитателей почвенного раствора и обитателей твердой
фазы почвы. Обитатели почвенного раствора интенсивно
развиваются при внесении в почву растворимого органического
вещества, например глюкозы (Звягинцев, 1973). Однако в неактивном?
состоянии и они могут подвергаться адгезии. Обитателями
почвенного раствора являются многие грамотрицательные
неспороносные бактерии (Takai et al., 1970).
Несомненный интерес представляет изучение распределения
почвенных бактерий по частицам разных размеров. Имеется
ошибочное мнение, что крупные частицы и агрегаты не содержат
клеток бактерий. На основании этого мнения при посеве из
почвенной суспензии или при подсчете количества бактерий по
методу Виноградского фракции крупных почвенных частиц
исключают из опыта, так как считают, что они не содержат клеток
бактерий.
В опытах по изучению распределения клеток по почвенным
частицам разного размера мы использовали эпилюминесцентную-
микроскопию при окрашивании почвы акридином оранжевым.
С помощью падающего света можно более точно установить
характер распределения клеток по частицам, так как при
использовании проходящего света клетки, расположенные на крупных
частицах, вообще не могут быть видны: находясь в тени, они не
люминесцируют. Тем более их нельзя видеть, если используется
метод Виноградского.
На почвенных частицах располагается большое количество
бактерий (табл. 2). В первом приближении для перегнойно-глее-
вой почвы можно говорить о прямо пропорциональной
зависимости количества адгезированных клеток от величины поверхности
частиц, хотя при подсчетах было обнаружено, что бактерии
располагаются на отдельных частицах крайне неравномерно.
Некоторые частицы несут очень много клеток, другие частицы того же
размера почти лишены их, что обусловлено различиями в
химической природе поверхности почвенных частиц. Неравномерность
распределения обусловлена еще и тем, что многие частицы несут
на своей поверхности микроколонии, что увеличивает
неравномерность распределения бактерий на отдельных частицах. Самые
мелкие частицы (1—5 мкм) содержали непропорционально
большое количество клеток.
Мнение о том, что крупные почвенные частицы и агрегаты
не несут клеток бактерий, не подтверждено нашими исследова-
17
ки и КРУпные частицы оказались густо заселенными клетками
к рий. В некоторых опытах не удавалось обнаружить клеток
waK1Jyntfbix частицах, так как использовались непригодные для
Уг •цели методы (например, метод проходящего света).
°q на?° в опытах с дерново-подзолистой почвой было обнару-
но чТ° кРУпные прозрачные частицы, лишенные гумуса и ча-
е 'редставляющие собой зерна кварца, несут лишь небольшое
коли^ст^0 клеток> и пропорциональность величины поверхности
^тичества клеток для этих частиц не выдерживается (см.
И К0Лг г> ^
т бл 2)- Бактерии явно тяготеют к частицам, богатым гумусом,
_,а ' органическому веществу.
HtaH K Таблица 2
р деление микроорганизмов в перегнойно-глеевой и дерново-подзолистой
аспРдХ по частицам разной величины (количество адгезированных клеток)
ч<- ^ '
*srs-
части"'
ч_ J^«—¦ -^
20^-25
Величина
поверхности, мкм2
13
121
726
2 905
12 150
66 150
1215 000
Перегнойно-глеевая почва
найденное
в опыте
1
4
8
29
ПО
300
10 100
вычисленное*
теоретически
0,1
1
7
29
' 121
662
12 150
Дер НОВО-ПОДЗоли^тая почва
найденное
в опыте
0,1
0,3
1,1
5,0
7,0
14,0
53,0
вычисленное*
теоретически
0,02
0,2 *
1,2
5,0
21,0
138,0
2025,0
* Количество микробных клеток, которое должно было бы содержаться иа
аХ разного диаметра, если бы оно было прямо пропорционально вели-
ст* поверхности частиц. Эти данные вычислены по реальной плотности клеток,
ЧИН6 цРованных на 4aCTHl*ax диаметром 20—25 мкм.
т-трй оценке заселенности почвенных агрегатов разных
разменов следует учитывать, что большое количество клеток
находится внутри структурных отдельностей (агрегатов), что было
под^еР;КДено с П0М°ЩЬЮ прямых люминесцентно-микроскопиче-
ски# наблюдений. Поэтому заселенность крупных агрегатов
фактически значительно выше, чем указано в таблице, хотя и в ней
эта величина, например для перегнойно-глеевой почвы,
составляет Ю ^ клеток на частицу диаметром 500 мкм, т. е.
небольшой поденный агрегат (0,5 мм в диаметре) представляется сре-
лоточиеМ массы микробов. Такие же выводы, относящиеся к
другим по^ам, были сделаны Штором (Stohr, 1970).
^еС^отря на наличие огромного количества клеток в почве
(1-ЛО МЛРД. на 1 г), они занимают сравнительно небольшую
част> общей поверхности частиц (десятые доли процента). В
почве 0тд^льные микрозоны развития микроорганизмов разделены
Сравни?ельно большими свободными пространствами, т. е.
микрокод101*™ М0|ТТ развиваться сравнительно изолированно, и не-
посРеДсТВенной конкУРенДии за площадь на поверхности частиц
в почве Не наблюДается.
18
Интересен вопрос о распределении микробов внутри
почвенных агрегатов. Предполагается (Заварзин, 1984), что внутри
агрегатов должны быть сосредоточены анаэробы или по крайней
мере микрофлора поверхности агрегатов и их внутренних частей
должна отличаться. Экспериментально этот вопрос попытался
разрешить Хаттори (Hattori, 1973). Методика исследований
основывалась на допущении, что после простого взбалтывания
почвенной суспензии методом посева учитываются в основном
микроорганизмы, смытые с поверхности почвенных агрегатов, а
затем после обработки ультразвуком суспензии учитываются
микробы, которые были внутри агрегатов. Оказалось, что на
поверхности агрегатов были сосредоточены в основном грамположи-
тельные бактерии, а внутри агрегатов — грамотрицательные.
Грибы располагались главным образом на внешней поверхности»
Следует сказать, что методика этих исследований была весьма
условна, так как озвучивание не только вызывает деструкцию
агрегатов, но и десорбцию прочно прикрепившихся клеток, а также
разделение микроколоний. Жаль, что автор не определил
соотношение аэробных и анаэробных бактерий.
ЗАКОНОМЕРНОСТИ АДГЕЗИИ ВНЕСЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Адгезию микроорганизмов на почвенных частицах
исследовали с помощью двух принципиально различных подходов: 1)
изучение закономерностей адгезии искусственно внесенных
микроорганизмов, выращенных в лаборатории на питательных средах;
2) изучение закономерностей адгезии собственно почвенных
микроорганизмов. При первом подходе обычно использовался метод
посева, при втором — главным методом являлось микроскопи-
рование.
Первый подход использовался значительно больше, и с его
помощью изучены все основные закономерности адгезии
микроорганизмов, хотя он и имеет тот недостаток, что изучение
ведется на модельных опытах и при переходе к природным
закономерностям необходимо вносить коррективы. Другой недостаток этого
подхода заключается в том, что авторы обычно считали более
плодотворным изучение не на почвенных частицах, а на моделях
со стеклом или его модификациями, с глинистыми минералами,
полуторными окислами, ионообменными смолами, биополимерами
(целлюлоза, хитин, липиды). Это давало возможность получать
более четкие результаты, которые легче было интерпретировать,
но опять же при переходе к почвам требуются добавочные
коррективы.
Четко установлено, что адгезия микроорганизмов зависит:
1) от свойств микроорганизмов; 2) от свойств и особенностей
адсорбента; 3) от состава среды, в которой она происходит;
4) от условий, определяющих возможность контакта клеток с
поверхностью адсорбента.
19
Зависимость адгезии от свойств микроорганизмов
Уже давно было установлено, что микроорганизмы
проявляют большую избирательность в адгезии. Одни из них
адгезируются в больших количествах, другие — в меньших и третьи
совсем не адгезируются данным адсорбентом. Одни адгезируются
очень прочно, другие — слабо. Причем количество адгезирован-
ных клеток далеко не всегда коррелирует с силой адгезии.
Поэтому при характеристике адгезии необходимо указывать
численность адгезированных клеток на единицу поверхности или на
весовую единицу адсорбента и силу адгезии как совершенно
разные и независимые характеристики.
Не удается пока установить корреляции между адгезией и
размерами и формой клеток, окрашиваемостью по Граму,
подвижностью, наличием капсул и некоторыми другими свойствами.
В то же время устанавливается некоторая связь между
адгезией и систематическим положением микроорганизмов (правда,
только в общей форме), стадией их развития, фазой
диссоциации, составом среды выращивания, наличием или отсутствием
фимбрий, использованием определенных твердых субстратов
'(целлюлоза, углеводороды), спецификой растений- и
животных-хозяев.
Говорить о различиях в адгезии можно только по отношению
к определенному типу адсорбента, так как нет клеток, которые
бы не подвергались адгезии, хотя бы на каком-то адсорбенте.
Картина адгезии выглядит совершенно по-разному в зависимости
от протекания адгезии. Если адсорбент и клетки находятся в
водной среде, адгезия носит избирательный характер, если же
клетки высушиваются на адсорбенте, то избирательность
пропадает и адгезии подвергаются все клетки. При увлажнении
высушенных на адсорбенте клеток адгезия, как правило, сохраняется
и оказывается более прочной, чем без высушивания.
Зависимость адгезии от систематического положения мы
изучали на широком круге бактерий (Звягинцев, 1959а, 1969, 1973).
От общего числа обследованных штаммов 70% подвергались
адгезии, причем в большом количестве адгезировалось 30%. Много
штаммов, адгезирующихся в большом числе, было найдено среди
коринеформных бактерий, представителей родов Micrococcus,
Pseudomonas, Erwinia, Escherichia, очень мало -— среди
представителей родов Bacillus, Streptomyces. Однако по адгезии каждый
род не одинаков. Среди представителей всех обследованных родов
встречаются хотя бы единичные виды или штаммы, которые по
адгезивным свойствам резко выделяются среди других
представителей данного рода. Адгезия резко различна у разных
штаммов одного вида. Так, изучение 40 штаммов Е. coli (Перцовская,
Звягинцев, 1971) показало, что 10 штаммов не подвергались
адгезии на стекле, 13 штаммов адгезировались непрочно и в
небольшом числе, 12 — адгезировались в большом числе и сильно
и 5 — в очень большом количестве и очень сильно.
20
Адгезия микроорганизмов зависит от среды выращивания,
состояния культуры, стадии развития, формы диссоциации
культуры и т. д.
Зависимость адгезии от состава среды, на которой
выращивается микроорганизм, проявляется довольно часто. Правда,
изменение культуральной среды далеко не всегда изменяло
адгезионные свойства клеток. Наиболее часто адгезия изменялась при
переходе от культивирования на твердой агаризованной среде к
жидкой среде. Штамм Serratia marcescens, выращенный на
МПА, среде Эшби, бобовом и капустном агаре, адгезировался
примерно одинаково, но тот же штамм, выращенный на МПБ и
находящийся в той же фазе развития, адгезировался в гораздо
меньшей степени. Ряд испытанных штаммов бактерий,
выращенных на МПА или МПБ, изменял свои адгезионные свойства.
В некоторых случаях выдерживание микроорганизмов на
голодной среде или даже просто в водопроводной воде резко
увеличивало их адгезивность.
Адгезия может изменяться в зависимости от возраста
культуры и фазы ее развития. Клетки, взятые во время лаг-фазы и на
первых стадиях экспоненциального роста, адгезировались слабо.
Максимум адгезии для многих культур наступал в середине фазы
экспоненциального роста, и затем адгезия либо не изменялась,
либо уменьшалась к концу стадии стационарного роста.
Адгезивные свойства некоторых культур оставались стабильными на всех
этапах их развития. Некоторые культуры имели довольно
сложную зависимость адгезивных свойств и фаз развития (Перцов-
ская, Звягинцев, 1971).
Разные формы диссоциации Вас. brevis обладали разными
электрофоретическими и адгезивными свойствами (Гузев и др.,
1972).
Живые и убитые нагреванием клетки обычно не меняли
своих адгезивных свойств. Из 50 изученных культур исключение
составили только две (Звягинцев, 1973).
Несколько другая картина адгезии получается, когда
изучают не адгезию клеток, взятых на разных фазах развития
культуры, а непосредственно развитие адгезированных клеток.
Адгезия в процессе развития может меняться. Обычно, изучая
обрастания на адсорбентах, отмечают, что со временем адгезия
увеличивается и пленки из адгезированных микроорганизмов
утолщаются. Однако эксперименты, проведенные нами с чистыми
культурами (Звягинцев и др., 1977), заставили сделать вывод,
что часто может наблюдаться и обратная картина, т. е. клетки,
находившиеся в покое на поверхности адсорбента, с началом
развития оказываются в свободном состоянии. Они могут
выходить из состояния адгезии либо сразу после начала развития,
либо спустя некоторое время. Часто культура начинает
развиваться в растворе после того, как на поверхности адсорбента
оказываются занятыми все места, пригодные для адгезии клеток.
Некоторые культуры дают многослойную адгезию, но это
21
свойство лишь тех культур, которые способны образовывать
агрегаты. Адгезия и агрегация хотя и имеют много общего, однако
каждое явление имеет свои особенности (Marshall, 1984).
Изменения в адгезии микроорганизмов, выращенных на
разных средах и взятых в разном возрасте, объясняются
изменением поверхностных структур и электрокинетического потенциала
клеток, изменением степени гидрофобности, изменением
характера и количества выростов и других образований на поверхности
клетки (жгутики, фимбрии, различные выросты на спорах бактерий
и актиномицетов, капсулы и т. д.), появлением и потерей
молекул адгезинов. Изменение химического состава клеточной пофрх-
ности и электрокинетического потенциала клеток в зависимости
от условий выращивания и фазы роста культуры показано во
многих работах.
Каждый вид микроорганизма имеет несколько генетически
возможных вариантов строения поверхности, из которых феноти-
пическое выражение получает какой-нибудь один. В зависимости
от условий среды один тип поверхности может сменяться на
другой, причем изменения обратимы. Естественно, могут происходить
и генетические изменения, ведущие к изменению строения
поверхности клеток.
В литературе есть сведения о том, что подвижные
микроорганизмы не подвергаются адгезии. В наших опытах клетки
некоторых подвижных культур адгезировались в большой степени. Этим
свойством особенно отличались псевдомонасы. Бактерии часто
прикреплялись одним полюсом так, что другой полюс оставался
свободным, и клетки продолжали совершать вращательные и
колебательные движения, будучи в то же время закреплены на
одном месте. Некоторые подвижные клетки, покрутившись
некоторое время у поверхности, отрывались от нее и переходили
к свободному плаванию. Многие подвижные клетки,
прикрепившись сначала полюсом, затем прикреплялись боковой стороной,
прочно адгезировались и становились неподвижными. Клетки
микроорганизмов прикрепляются по-разному: одни — полюсом,
другие — боковой стороной, третьи — и боковой стороной и
полюсом. Полюсное прикрепление характерно для бактерий,
дающих поверхностные обрастания. Адгезия подвижных клеток в
последнее время была использована для изучения механизмов
движения и работы жгутиков.
Подвижные клетки бактерий, адгезированные на почвенных
частицах, не могли оторваться от частиц, но и после адгезии
сохраняли свою подвижность и часто заставляли двигаться
почвенные частицы в водной суспензии, что можно было наблюдать
непосредственно под микроскопом. При этом частицы по размеру
во много раз превосходили клетки бактерий (Звягинцев, 1973).
Зависимость адгезии от свойств твердой поверхности
Адгезия микроорганизмов сильно зависит от химической
природы поверхности. Каждый микроорганизм в разной степени и с
разной силой адгезируется на различных поверхностях. На
положительно заряженных поверхностях проявляется гораздо меньшая
избирательность в адгезии разных видов и штаммов микробов,
чем на отрицательно заряженных поверхностях. Это связано с
тем, что при физиологических значениях рН клетки
микроорганизмов заряжены отрицательно, и, таким образом, они
притягиваются к положительно заряженным поверхностям уже в силу
разности их электростатических зарядов. При взаимодействии с
отрицательно заряженной поверхностью заряд оказывает
отталкивающее действие, и должны иметься какие-то другие
притягательные силы, благодаря действию которых адгезия все же может
произойти, несмотря на отталкивание одноименных зарядов. На
гидрофобных поверхностях адгезируется больше видов
микроорганизмов, чем на гидрофильных поверхностях.
Некоторые виды бактерий подвергаются адгезии на всех
видах поверхностей: гидрофобных и гидрофильных, положительно
и отрицательно заряженных (Звягинцев, 1973).
Количество адгезированных клеток прямо пропорционально
величине поверхности, на которой могут адгезироваться клетки,
лоэтому адгезия при расчете на единицу веса адсорбента
пропорциональна степени раздробленности адсорбента. Когда
сравнивали адгезию на крупных и мелких фракциях кварца,
обнаружилось, что степень адгезии прямо пропорциональна суммарной
величине поверхности и увеличивается с уменьшением размеров.
Эксперименты Н. С. Карпинской (1926) с поглощением
культуры Serratia marcescens различными по размерам частиц
фракциями толченого кварцевого песка показали, что частицы
размером 50—100 мкм слабо адгезировали бактериальные клетки,
2—50 мкм — сильно, а частицы меньше 1,5 мкм, т. е. примерно
равные или меньшие по размерам, чем бактериальные клетки,
не давали эффекта адгезии. Особенно сильно клетки поглощались
агрегатами из частиц меньше 1,5 мкм. На агрегатах адгезирова-
лось так много бактерий, что частицы окрашивались в красный
цвет от наличия на них большого количества красных клеток.
Подобные же закономерности были обнаружены при изучении
адгезии бактерий различными фракциями чернозема.
А. Р. Миненков (1928), изучая адгезию бактерий на почвах
разных типов, установил резкие различия в адгезивной
способности различных почв, которые определялись в первую очередь
механическим составом почв: чем более тяжелым был
механический состав, тем больше была адгезия. Однако прямо
пропорциональной зависимости между механическим составом и
адгезией установить не удается, так как на адгезию влияют и другие
•факторы — содержание гумуса, характер поглощенных катионов»
рН (Chatterjee, Dalai, 1968; Marshall, 1976).
23
Если частицы меньше бактериальных клеток, то может
происходить адгезия этих частиц на поверхности клеток. Иногда
образуются конгломераты из клеток и частиц, более мелких, чем
клетки. Широко известна способность коллоидных веществ белкот
вой, полисахаридной, липидной природы адсорбироваться на
поверхности клеток бактерий. Это явление особенно подробно
изучено для микроорганизмов, вызывающих брожение.
Адгезию мелких почвенных частиц на клетках Вас. mycoidesr
наблюдала Н. С. Карпинская (1926). Клетки покрывались чехлом
из более мелких частиц адсорбента.
Многие авторы наблюдали отложения на поверхности клеток
коллоидов гидроокиси марганца и железа.
В ряде работ (Lahav, 1962; Santoro, Stotzky, 1966, 1968; Stot-
zky, 1966a, b; Stotzky, Rem, 1966; Marshall, 1968a, b; 1969; Fehr-
mann, Weaver, 1978) тщательно изучено взаимодействие клеток
бактерий с частицами глинистых минералов, которые по
размерам мельче бактериальных клеток. Эти частицы и бактериальные
клетки часто образуют прочные агрегаты. Особенно прочные
агрегаты образуются с частицами монтмориллонитовых глин.
Иногда поверхность клеток покрывается сплошным слоем из
глинистых частиц. Причем частицы монтмориллонита прикрепляются
к клеткам своей боковой стороной, которая несет
положительный заряд. Клетки при этом заряжены отрицательно (Lahdv,
1962; Marshall, 1976). Таким образом, имеет место
взаимодействие разноименно заряженных поверхностей. Отрицательный заряд
клеток клубеньковых бактерий (Marshall, 1968a, b, 1976)
обусловлен в основном карбоксильными группами. Некоторые виды
клубеньковых бактерий несут на своей поверхности участки,
заряженные отрицательно (карбоксильные группы), и участки,
заряженные положительно (аминогруппы). Такие клетки
прикрепляются и к боковой стороне пластинки монтмориллонита, и к ее
концам.
Виды клубеньковых бактерий с карбоксильными группами на
поверхности адсорбируют больше монтмориллонита на клетку,,
чем виды с комплексной поверхностью, содержащей и
карбоксильные и аминогруппы (Marshall, 1968a, b, 1969). Обработка
монтмориллонита гексаметафосфатом натрия, блокирующим
положительный заряд на концах пластинок кристаллической
решетки, приводила к прекращению адгезии бактерий с
карбоксильной поверхностью, но на частицах адгезировалось некоторое
количество клеток с поверхностью, содержащей аминогруппы
(Marshall, 1969).
Относительно небольшое число видов бактерий способно
образовывать на поверхности адсорбентов сплошной монослой или
давать многослойную адгезию. Последняя происходит только
тогда, когда клетки в суспензии, из которой проводится адгезия,
находятся не в виде одиночных клеток, а в виде агрегатов. Обычно
же даже при полном насыщении поверхности клетками остаются
большие свободные пространства, которые по площади обычнс*
24
превышают пространства, занятые клетками. Занятая клетками
площадь часто составляет только несколько процентов от общей
площади поверхности. Это не связано с недостатком клеток, так
как повторное насыщение клетками, а также использование
более концентрированных суспензий микроорганизмов не приводят
к увеличению адгезии. Причины этого явленця могут быть
разными: 1) разнокачественность поверхности (есть участки,
которые могут связывать клетки данного микроорганизма, и
участки, которые не могут связывать клетки); причем гетерогенность
поверхности обычно выражена очень сильно, что связано не
только с неоднородностью строения и разломов кристаллической
решетки, но и с наличием на ее поверхности адсорбированных
веществ; 2) адгезировавшиеся клетки благодаря своему заряду
начинают отталкивать клетки, готовящиеся к адгезии.
С рядом поверхностей при адгезии устанавливаются очень
специфические связи. Определенные узкоспецифические
группировки макромолекул поверхности клетки взаимодействуют со
столь же специфичными группировками макромолекул
поверхности адсорбента. Такой специфический тип адгезии очень
распространен при взаимодействии бактерий с животными и
растительными клетками, но он может встречаться и при взаимодействии
клеток с нерастворимым субстратом и т. д. Клетки, способные к
специфической адгезии, могут подвергаться и неспецифической
адгезии. Последний симпозиум по адгезии микроорганизмов
{Marshall, 1984) констатировал, что неспецифическая адгезия
широко распространена даже на тканях и органах.
Часто адгезию клеток рассчитывают на площадь адсорбента,
которая определяется по адсорбции молекул или ионов. Такие
расчеты носят условный характер и, конечно, часть поверхности,
доступной для молекул, оказывается недоступной для клеток
микроорганизмов, так как они гораздо крупнее молекул и не
могут проникнуть в поры, в которые могут войти молекулы.
Поэтому поверхность, доступную для адгезии клеток, лучше
подсчитывать геометрически, определяя ее величину под микроскопом
(Кириллова и др., 1983). В дерново-подзолистой почве доступная для
адгезии бактерий площадь составляет примерно 1 м2/г, а по
адсорбции ионов была получена величина 112 м2/г, т. е.
поверхность, доступная для клеток, в 100 раз меньше, чем для ионов.
Правда, часть внутренних поверхностей агрегатов может быть
занята собственно почвенными микроорганизмами, но она
недоступна для внесенных в суспензии клеток чистой культуры.
Адгезионная способность даже среднесуглинистой почвы,
содержащей только 2% гумуса, оказалась поразительно большой. На 1 г
почвы поглощалось 30 млрд. клеток артробактера и 400 млн.
клеток клубеньковых бактерий. Однако если рассчитать, сколько
же бактерий адгезируется на единицу площади, то оказывается,
что артробактер занимает только несколько процентов
геометрической поверхности частиц, а клубеньковые бактерии — только
сотые доли процента.
25
Зависимость адгезии от состава среды
Состав среды оказывает сильное действие на адгезию клеток.
Поэтому при проведении экспериментов нужно тщательно
учитывать и характеризовать состав среды, иначе полученные
результаты теряют смысл. Прежде всего большое значение имеют
концентрация и природа содержащихся в среде солей, ионная сила
среды, ее рН, наличие органических и других веществ,
макромолекул, коллоидов. Эти вещества, с одной стороны, могут
адсорбироваться на изучаемой поверхности, совершенно меняя ее харай*
тер, с другой стороны, они будут определять электрокинетический
потенциал взаимодействующих поверхностей, а уже отмечалось,,
что электрокинетический потенциал может сильно влиять на
адгезию. Наличие двухвалентных катионов, таких, как Са2+, Mg2+,
может обусловливать появление мостиков, благодаря которым
устанавливается взаимодействие между клеткой и поверхностью.
Катионы оказывают довольно сложное действие на адгезию
различных микроорганизмов, что связано со сложностью и
разнообразием строения поверхности разных микросТрганизмов, а
также с многосторонним воздействием катионов на этот процесс.
Поэтому среди общих правил всегда встречаются исключения.
Наличие катионов, как правило, способствует адгезии
микроорганизмов. При очень низких концентрациях катионов многие
культуры не подвергаются адгезии. Исключение составляют псев-
домонасы, большинство из которых, хотя и непрочно и в
небольшом числе, но адгезируется при любых концентрациях всех
катионов.
Высокие концентрации катионов могут подавлять адгезию.
В наших опытах (Звягинцев, 1962г) ионы алюминия и водорода
в высоких концентрациях подавляли адгезию почти всех
микроорганизмов. Адгезия неспороносных палочек уменьшалась даже
под действием одно- и двухвалентных катионов. В зависимости
от влияния разных концентраций катионов на адгезию
изученные бактерии можно условно разделить на группы — бациллы,.
кокки и неспороносные палочки (табл. 3). Возможно, при
исследовании большего количества представителей каждой группы
были бы найдены исключения. Адгезия бацилл подчиняется
правилу Шульца—Гарди: для начала адгезии клеток двухвалентных
катионов требуется в 10 раз меньше, чем одновалентных;
трехвалентных катионов нужно в 10 раз меньше, чем двухвалентных.
Для кокков эти закономерности проявляются далеко не так
четко: ион натрия оказывал более слабое действие по сравнению с
другими одновалентными катионами. Для неспороносных
палочек указанные закономерности не проявились. Для всех бактерий
отмечено, что многовалентные катионы и ион водорода при
оптимальных концентрациях вызывают более полную адгезию, чем
одно- и двухвалентные катионы. При уменьшении концентрации
того или иного катиона адгезия одних бактерий прекращается
резко, других — постепенно.
26
Условия, способствующие агрегации, в большинстве случаев
-являются и наиболее благоприятными для адгезии, причем при
агрегации часто адгезируются не единичные клетки, а агрегаты
из клеток. Границы адгезии гораздо шире, чем границы
агрегации. Для некоторых бактерий при любых концентрациях всех
катионов агрегация вообще не была отмечена, хотя при
определенных концентрациях они подвергались сильной адгезии. Адгезия
и агрегация клеток зависят от общих факторов, но каждое
явление имеет свою специфику.
Таблица 3
Влияние катионов на адсорбцию бактерий на стекле
Концентрация, н.
1
10~1
ю-2
Ю-3
ю-4
10-5
1
ю-1
ю-2
Ю-3
ю-4
10-5
ю-в
1
ю-1
ю-2
ю-4
10-5
Na+Ca2+Al3+H+
Bacillus
mycoides
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
3
3
3
3
1
1
3
3
3
! з
3
3
3
Micrococcus sp.
3
3
3
0
0
0
0
3
3
3
3
0
0
0
3
4
4
4
0
0
0
3
4
4
4
0
0
0
Serratia
marcescens
2
2
3
2
2
1
2
3
3
3
3
2
2
2
4
3
2
2
2
2
4
2
2
2
Na+Ca2+Al3+H+
Bacillus cereus
2
2
1
0
0
0
0
2
2
2
1
0
0
0
2
2
3
3
2
0
0
2
i 3
3
1 3
1 1
! о
0
Micrococcus
aureus 125
2
2
1
0
0
0
0
3
3
3
2
0
0
0
2
3
3
3
2
0
0
3
3
3
2
1
0
0
Escherichia coli
2
2
2
1
1
1
3
3
3
1
1
1
3
3
3
2
2
2
2
4
4
3
3
3
Na+Ca2+Al3+H+
Bacillus subtilis
2
2
0
0
0
0
0
2
2
1
0
0
0
0
i 2
4
4
4
0
0
0
2
3
3
3
Г
0
0
Micrococcus
aureus 126
2
2
2
1
0
0
0
2
2
2
2
1
0
0
2
3
3
3
1
0
0
2
3
3
2
1
0
0
Pseudomonas
pyocyanea
2
2
2
1
1
1
2
2
3
2
2
1
2
2
3
2
2
1
3
3
3
0
0
0
Na+Ca2+Al3+H+
Bacillus megate-
rium
1
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
1
3
4
3
0
0
0
0
2
3
1
0
0
0
Micrococcus
sulfureus
1
1
0
0
0
0
0
2
2
1
1
0
0
0
2
3
3
3
0
0
0
3
4
3
2
0
0
0
pseudomonas
fluorescens
0
2
3
0
0
0
2
2
3
2
1
0
3
3
3
1
1
0
2
3
3
1
1
0
По влиянию рН на адгезию клеток (табл. 4) бактерии
разделились на следующие группы: 1) адгезия не изменяется в
исследованных границах рН; 2) адгезия уменьшается с увеличением
рН; 3) адгезия имеет максимумы при средних значениях рН.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что
количество и качество катионов, присутствующих в среде, имеют большое
27
значение для адгезии микроорганизмов. Поскольку происходит
взаимодействие одноименно отрицательно заряженных
поверхностей, на адгезию большое влияние оказывают толщина
диффузного слоя ионов и величина электрокинетического потенциала
клеток, а также поверхности адсорбента. Наиболее эффективны те
катионы, которые сильно снижают заряд взаимодействующих
поверхностей. Однако влияние катионов нельзя объяснить только»
Таблица 4
Влияние на адсорбцию бактерий рН раствора (буфер Мак-Ильвейна)
рН раствора
2,2
2,8
3,5
4,1
4,9
5,5
6,1
7,1
7,5
8,0
2,2
2,8
3,5
4,1
4,9
5,5
6,1
7,1
7,5
8,0
МПБ j МПА
Micrococcus
aureus 125
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Serratia
marcescens
1
2
2
3
3
4
3
3
2
0
4
4
4
3
3
3
2
1
1
1
МПБ
МПА
Micrococcus
aureus 126
3
3
t 3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Bacillus mycoi-
des (S-форма)
4
4
3
3
3
3
2
2
2
1
4
4
3
2
МПБ
МПА
Micrococcus
sulfureus
4
4
4
4
3
3
3
2
3
0
4
4
4
4
3
3
3
2
2
1
Bacillus
cereus
1
2
4
4
4
4
4
3
2
1
2
2
4
4
3
3
3
3
1
1
МПБ | МПА
Pseudomonas
j pyocyanea
1
1
3
3
3
3
3
3
1
1
0
0
2 *
3
3
3
3
2
0
0
Bacillus
subtilis
4
3
3
0
0
—
—
—
— 1
—
—
—
—
—
МПБ
МПА
Escherichia
coli
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
1
Г
1
1
Bacillus
megaterium
4
0
0
0
0
0
0
0
0
о !
4
снижением электрокинетического потенциала или перезарядкой
поверхностей. Нужно также учитывать влияние катионов на
адгезионные силы, возможность установления химической связи
через катион или участие ионов металлов в образовании
координационных связей.
Установление зависимости адгезии от рН и концентрации
катионов дает существенную характеристику адгезионных свойств
исследуемых культур микроорганизмов.
Пил (Peele, 1936), изучая адгезию клеток Azotobacter chroo-
соссит на почвенных частицах, нашел, что почва, насыщенная
различными катионами, адгезирует различное число клеток этого
микроорганизма. По интенсивности адгезии почвенные образцы,;
28
насыщенные разными катионами, располагаются в следующий
ряд:
Na+<Li+<NH4-<K+<Mg2+<Ca2+<Ba2+<Mn2+<Al^<Fe3+
т. е. катионы располагаются в обычный ряд, характеризующий,
степень снижения ими электрокинетического потенциала.
Почвенные образцы, насыщенные одновалентными катионами, почти не
адгезировали клеток азотобактера, насыщенные двухвалентными
катионами — адгезировали довольно сильно, а особенно сильна
клетки адгезировались почвами, насыщенными трехвалентными:
катионами.
Большое влияние на увеличение адгезии и агрегации
оказывали катионы, способные к образованию координационных
связей и занимающие первые места в ряду Меллера—Мели. Это
дает основание полагать, что при адгезии клеток могут
устанавливаться и такого рода связи.
Внесение в среду для адгезии белков, полисахаридов,
поверхностно-активных веществ резко изменяет протекание процесса!
адгезии. Так, наличие в среде белков и пептона подавляло
адгезию бактерий. Адгезия Streptococcus faecium, S. sanguis
подавлялась овальбумином, кроличьей сывороткой, альбумином
сыворотки, слюной и конканавалином, так как они занимали места
адгезии. Однако есть сообщения, что наличие белка может
увеличивать адгезию некоторых бактерий (Hirotani, 1957), в этом,
случае устанавливается связь через адсорбированный белок.
Зависимость адгезии от условий, определяющих
возможность контакта между клетками
и поверхностью адсорбента
Все факторы, способствующие контакту клеток с
адсорбентом, благоприятствуют адгезии микроорганизмов. Как правило,,
адгезия протекает быстро и завершается через 5—15 мин.
Однако это относится к концентрированным суспензиям
микроорганизмов и относительно небольшой поверхности адсорбента.
Скорость адгезии определяется скоростью диффузии и конвекции. На
численность адгезированных клеток могут влиять следующие
факторы: концентрация бактериальных клеток в суспензии,
концентрация адсорбента в суспензии (суммарная величина поверхности
частиц), продолжительность контакта клеток и частиц и
интенсивность перемешивания суспензии.
При изучении зависимости количества адгезированных
клеток от концентрации клеточной суспензии была предложена
следующая схема изотерм адсорбции (рис. 4). Адсорбция зависит от
того, происходит ли взаимодействие одноименно или
разноименно заряженных поверхностей (рис. 4,а, б).
Обозначим через Q степень покрытия, которая выражается*
отношением числа клеток, адгезированных на единицу
поверхности, к максимальному числу клеток на поверхности при плотной.
29
гексагональной упаковке. При высокой концентрации
электролита действие двойного электронного слоя минимально, и получают
одинаковые изотермы необратимой адсорбции (адгезии) для
взаимодействующих и одноименно и разноименно заряженных
поверхностей. Обычно, однако, степень покрытия не достигает
теоретического предела, так как случаи идеальной гексагональной
упаковки очень редки. При низкой концентрации электролита и
одноименном заряде вообще не наблюдается адгезии (см. рис. 4,а),
а при разноименных зарядах отмечается слабая адгезия (см.
рис. 4,6). При средних концентрациях отдельные клетки orrajfc
Рис. 4. Изотермы адсорбции клеток при одноименном (а) и при
противоположном (б) зарядах поверхностей.
О — степень покрытия поверхности.
Ср — равновесная концентрация клеток: / — высокая; 2 — средняя;
3 — низкая; 4 — полное покрытие поверхности
асиваются друг от друга, и поэтому степень покрытия неполная.
Наблюдается относительно слабая обратимая (обратимая при
изменении концентрации клеток) адгезия, причем клетки
располагаются на некотором расстоянии от поверхности (10—100 нм),
хотя некоторые клетки могут преодолевать энергетический
барьер и приходить в прочный непосредственный контакт с
поверхностью. Если нет прочных контактов, то получают типичную
форму изотермы Лангмюра (это обратимая адгезия клеток). Однако
истинная равновесная ситуация достигается, когда все клетки
придут в непосредственный контакт с поверхностью. Тогда
получают изотерму необратимой адгезии.
Изотермы, подобные изображенным на рис. 4, были получены
рядом авторов (Звягинцев, 1973; Krishnamurti, Soman, 1951;
Fletcher, 1977; 0rstravik, 1977).
Адсорбционно-десорбционное поведение клеток на
поверхности включает тонкий баланс сил. Адгезия может быть слабой и
обратимой или прочной и необратимой. Клетки могут находиться
в тесном контакте с поверхностью или быть на некотором
расстоянии от нее. Можно наблюдать совсем разные степени
покрытия поверхности. Адсорбированные на твердой поверхности
полимеры оказывают сильное влияние на адгезию клеток.
30
ПРИРОДА ЯВЛЕНИЯ АДГЕЗИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Адгезия микроорганизмов представляется важной
экологической чертой существования микроорганизмов. Она экологически:
оправдана, и без адгезии микробы не могли бы нормально
существовать в почве: во-первых, адгезия помогает микробам
удержаться в почвенном профиле и не подвергаться вымыванию в
нижележащие горизонты; во-вторых, адгезированные клетки
оказываются на границе раздела твердого тела и жидкости, где
сосредоточены основные питательные вещества. Адгезия имеет и более
целенаправленное значение. Так, бактерии, использующие
целлюлозу, преимущественно адгезируются на целлюлозе,
использующие крахмал — на крахмале, использующие серу — на ее
кристаллах или каплях. Микробы, использующие углеводороды,
также избирательно адгезируются на них, а клубеньковые бактерии
и фитопатогенные микроорганизмы избирательно адгезируются
на корнях растений-хозяев. Обычно микроорганизмы по-разному
адгезируются на разных стадиях своего развития. Есть стадии, на
которых они находятся в свободном состоянии, и есть стадии, на
которых они ведут прикрепленный образ жизни. Некоторые
микробы переходят в адгезированное состояние в стадиях покоя,
другие, наоборот, в активном состоянии адгезируются, а в
стадиях покоя могут находиться в свободном состоянии.
Интересно, с помощью каких же механизмов достигается
такая тонкая регулировка процессов прикрепления и отрыва?
В настоящее время существует мнение, что микроорганизмы
могут очень тонко и точно регулировать свое положение
(свободное или адгезированное), для чего у них имеется ряд генетически
запрограммированных особенностей. Это возможность синтеза
определенных ферментов, изменения заряда и степени гидрофобности
своей поверхности, синтез поверхностно-активных веществ,
образование выростов, деление, хемотаксис и т. д. Микробы
экологически целесообразно могут менять свое положение, располагаясь
в свободном или адгезированном положении в зависимости от
того, что в данный момент экологически выгодно.
Существовало несколько подходов к изучению природы
адгезии микроорганизмов. Многие исследователи, изучавшие это
явление до 70-х гг., пытались проводить аналогию между адгезией
микроорганизмов и адсорбцией ионов и молекул. Именно тогда
широко употреблялся термин «адсорбция микроорганизмов».
Пытались установить, в чем сходство и в чем различие в адсорбции
микробных клеток и молекул, строили изотермы адсорбции,
определяли влияние рН и концентрации катионов, устанавливали
емкость поглощения, обменность адсорбции макроорганизмов и т.д..
Обменная адсорбция изучалась с двух разных позиций: с одной
стороны, устанавливалась возможность обмена одних микробных
клеток на другие (Новогрудский, 1957; Звягинцев, 1973), с
другой — изучалась возможность замены клеток на ионы
(Звягинцев, Гузев, 1971). «Адсорбционное» направление продолжает раз-
31
зиваться и в настоящее время, но теперь имеет подчиненное
значение. На наш взгляд, это направление исследований было
плодотворным, так как был установлен ряд ценных закономерностей
адсорбции микробных клеток. Однако такой подход не мог
разрешить всех вопросов.
Некоторые исследователи изучали явление концентрации
клеток на твердых поверхностях с позиций адгезионных процессов.
Адгезией называется слипание поверхностей двух разнородных
твердых тел. Адгезия обусловлена теми же причинами, что и
адсорбция, но проявления этого явления несколько другие, пос^ль-
,ку взаимодействуют не молекулы или ионы, а более крупные
частицы. С теоретических позиций такой подход является более
правильным и в последнее время почти все исследователи
пользуются термином «адгезия микроорганизмов», а не «адсорбция
микроорганизмов». Это направление успешно развивается и
позволяет уточнить ряд закономерностей.
В последнее время были введены еще од#н подход и еще один
термин для обозначения того же явления — •«иммобилизация
клеток» (обездвиживание клеток). Представление об
иммобилизованных клетках пришло из биохимии, где усиленно изучают
иммобилизованные ферменты. Изучена во многих случаях природа
связи ферментов с адсорбентом и специфика их активности.
'Поскольку было выяснено, что в ряде случаев для проведения
определенных биохимических процессов, особенно многоступенчатых,
часто выгоднее и удобнее использовать не отдельные ферменты,
а их комплексы, локализованные в целых живых или убитых
клетках микроорганизмов, то от изучения иммобилизованных
ферментов перешли к изучению иммобилизованных клеток. Под
иммобилизованными клетками понимают либо клетки, адгезиро-
ванные на твердых поверхностях самых различных частиц
(пористое стекло, полимерные частицы, керамика, полимеры и т.
д.),либо клетки, заключенные в самые различные гели. Последний
случай особенно часто используется и особенно подробно изучен.
Следует отметить, что оба случая имеют прямое отношение к
почвенным микроорганизмам, поскольку в почве микробы также
.либо адгезированы на почвенных частицах, либо заключены в
органоминеральный гель, покрывающий почвенные частицы.
Интересно отметить, что часто клетки, заключенные в прочные сети
теля, не могут размножаться. При изучении иммобилизованных
клеток были использованы методы и достижения биохимии и
молекулярной биологии. Однако природа сил, связывающих
клетки, изучена гораздо хуже, чем природа сил, связывающих
ферменты. Часто биохимики создают условия, которые могут быть
аналогичны природным, но в ряде случаев создаются и чисто
искусственные условия.
Наконец, четвертый подход, который стал очень популярным
ш последнее десятилетие и был особенно широко использован в
медицинской микробиологии, — это молекулярно-биологический
лодход, подобный тому, который используется в иммунохимии.
32
Внимание к вопросу об адгезии микроорганизмов было
привлечено в связи с тем, что стало ясно, что адгезия является первым
этапом многих инфекционных болезней, и если предотвратить
адгезию, то можно предотвратить и возникновение заболевания.
Полагают, что адгезия клеток микроорганизмов основывается на
очень специфическом механизме и происходит по принципу
взаимодействия антигена с антителом — поверхность клетки
подходит к адсорбирующей поверхности как ключ к замку. Особенные
успехи достигнуты в изучении адгезии клеток микроорганизмов
на животных или растительных клетках.
Исследуя адгезию микроорганизмов, первые исследователи
особенно большое значение придавали электрическому заряду
взаимодействующих поверхностей и считали, что происходит
взаимодействие противоположно заряженных поверхностей. Са-
лус (Salus, 1917) большое значение придавал действию
электростатических сил и считал, что происходит взаимодействие
разноименно заряженных поверхностей. В работах К. И. Рудакова
(1936) и Пила (Peele, 1936) установлена адгезия отрицательно
заряженных клеток на положительно заряженных частицах.
Подобное же явление наблюдали при адгезии клеток на оксидах
железа и алюминия при низких значениях рН, а также при
адгезии на ионообменных смолах (анионитах).
Однако в большинстве случаев при адгезии клеток
происходит взаимодействие поверхностей с одноименным отрицательным
суммарным зарядом. Это прежде всего взаимодействие с
большинством почвенных частиц, с минералами и гумусом. При этом
микроорганизмы несут на поверхности преимущественно
карбоксильные и аминогруппы, отчасти фосфорные, сульфгидрильные,
спиртовые и некоторые другие. Минералы в основном имеют
ОН-группы, гумус — карбоксильные группы. В ряде случаев
адгезия объяснялась мозаичностью зарядов поверхности клеток и
поверхности адсорбента. Маршалл (Marshall, 1968a, 1971, 1976),
изучавший адгезию мелких частиц монтмориллонита (0,1 мкм)
на клетках клубеньковых бактерий, пришел к выводу, что в
опытах имело место электростатическое притяжение положительно
заряженных концов пластинчатых частиц глины и отрицательно
заряженных карбоксильных групп поверхности клетки. Для
некоторых штаммов клубеньковых бактерий происходило
взаимодействие положительно заряженных участков клетки, несущих
аминогруппы, с отрицательно заряженными боковыми
плоскостями частиц монтмориллонита.
При взаимодействии двух отрицательно заряженных
поверхностей на установление контакта влияют силы отталкивания
одноименно отрицательно заряженных поверхностей, которые могут
быть учтены по теории Дебая — Гюккеля. Силы отталкивания
уменьшаются с расстоянием по экспоненциальному закону
(рис. 5). Кроме сил отталкивания между поверхностями
контактирующих клеток и частиц адсорбента будут действовать и
физические силы притяжения, обусловленные квантово-механическими
2 Д. Г. Звягинцев
33
эффектами взаимодействия электронных осцилляторов (силы Ван-
дер-Ваальса — дисперсионные, индукционные, ориентационные)^
Силы Ван-дер-Ваальса уменьшаются с увеличением расстояния
по степенному закону. Б. В. Дерягин и Л. Д. Ландау в конце
30-х гг. объяснили многие особенности поведения коллоидных
систем (флоккуляция, зависимость устойчивости от состава
среды) сложением электростатических сил отталкивания и ван-дер-
ваальсовых сил притяжения. На основании этой идеи построена
Gk
Рис. 5. Зависимость свободной энергии от удаления от частицы как функция'
концентрации электролита при сближении одноименно заряженных
поверхностей:
а — низкая концентрация; б — средняя концентрация; в — высокая
концентрация; k — расстояние от поверхности;
Gj — свободная энергия; GA — энергия сил Ван-дер-Ваальса; GE — энергия,,
связанная с присутствием на поверхности заряженных групп
теория стабильности коллоидных систем. Эта теория получила
название теория ДЛВО (Дерягин—Ландау—Вервей—Овербик), ш>
начальным буквам фамилий ее создателей. Эта теория широко
используется в биологии, в частности для объяснения адгезии
микроорганизмов.
Взаимодействие рассматриваемых сил приводит к
существованию двух областей, в которых преобладают силы притяжения..
Одна область расположена от> поверхности на расстоянии 5—
10 А. Прочность сцепления в этой области большая. На больших
расстояниях начинают преобладать силы отталкивания, и затем:
на расстоянии около 100—150 А от поверхности имеется вторая
область притяжения, однако прочность сцепления в этой областиг
невелика.
34
Для того чтобы поверхности сблизились до расстояния 5—
J О А, они должны преодолеть электростатическое отталкивание.
Силы отталкивания между поверхностями снижаются при
введении катионов, особенно многовалентных, или при подкислении
среды. Они пропорциональны радиусу взаимодействующих
поверхностей. Видимо, поэтому палочковидные клетки, по крайней
мере на первых этапах, прикрепляются полюсом. Большинство
микроорганизмов прикрепляется с помощью тонких выростов —
•фимбрий, стебельков, выростов капсул и т. д.
Точные определения расстояния между клетками и
поверхностью проводить довольно трудно. Однако есть основания
полагать, что клетки могут располагаться на расстоянии первого и
второго максимумов притяжения, а также может
устанавливаться химическая связь между клеткой и поверхностью. Наши
наблюдения, проведенные непосредственно под микроскопом,
показали, что довольно часто клетки свободно скользят вдоль
поверхности, но не могут отойти от нее. После высушивания препарата
и последующей его регидратации клетки оказываются прочно
закрепленными на определенных местах и их не удается смыть
даже сильной струей воды. Вероятно, здесь проявилось
прикрепление во втором максимуме притяжения или образование
химических связей. Отметим, что для прочного прикрепления
высушивание необязательно. Иногда клетки очень прочно
прикрепляются и из водной среды.
Микроорганизмы по своим размерам (1—10 мкм) относятся
к той категории частиц, которые должны быть подвержены
наиболее сильной адгезии. У частиц большего размера
гравитационные силы превосходят силы прилипания, частицы меньшего
размера вследствие малого веса не в состоянии выдавить слой
жидкости и вступить в непосредственный контакт с поверхностью.
Некоторые исследователи утверждают, что главную роль в
адгезии клеток микроорганизмов»играют силы Ван-дер-Ваальса
(Santoro, Stotzky, 1968). Однако в ряде случаев прочность
связи оказывается гораздо больше, чем можно было бы ожидать
.за счет сил Ван-дер-Ваальса (Звягинцев и др., 1971).
При адгезии действует сложный комплекс сил (Pethica, 1961).
1. Химические связи между взаимодействующими
поверхностями, например водородные, тиоловые, амидные, эфирные и т. д.
2. Образование ионных пар и ионных триплетов, например
NH3...—ООС— и —СОО—...Са ... —ООС—. Этот тип связей
включает энергию десольватации.
3. Силы, вызванные флуктуацией зарядов
взаимодействующих тел.
4. Мозаичный заряд на поверхностях подобного или
противоположного общего заряда, специфически возникающий из
электростатического притяжения геометрически упорядоченных
зарядов.
5. Силы, обусловленные притягательным взаимодействием
противоположно заряженных тел.
2*
35
6. Электростатическое притяжение между поверхностями,
несущими одинаковый заряд.
7. Электростатическое притяжение, обусловленное
отраженными силами. Эти силы можно рассматривать как обусловленные
десольватацией внутримембранных ионов при объединении
мембран.
8. Силы Ван-дер-Ваальса.
9. Гидрофобные взаимодействия.
Помимо сил притяжения при адгезии клеток могут
Действовать силы отталкивания.
10. Силы отталкивания одноименно заряженных
поверхностей.
11. Препятствия притяжению, обусловленные
пространственными барьерами, такими, как сольватные слои.
Таким образом, комбинация сил* действующих при адгезии,
представляется довольно сложной, расчет ц предсказание
величины этих сил практически невозможны.
Очень долго изучали адгезию клеток на чистых минеральных
поверхностях и только в последнее время пришли к выводу
(Marshall, 1984), что в подавляющем большинстве случаев
взаимодействие происходит между макромолекулами поверхности клеток
и макромолекулами или более простыми органическими
молекулами, такими, как липиды, поверхностно-активные вещества и
т. д., адсорбированными на минеральной поверхности. Таким
образом, вопрос об адгезии сводится к проблеме взаимодействия
макромолекул, которое очень разнообразно.
После того как проблема изучалась с физико-химических
позиций, она, как видно, в некоторых отношениях зашла в тупик.
В последнее время ее пытаются решить с позиций молекулярной
биологии.
Молекулярно-биологические аспекты адгезии микроорганизмов
на почвенных частицах представляют интригующую область,
которая только начинает развиваться в основном в медицинской
микробиологии при установлении взаимодействия бактерий с
поверхностью клеток животных тканей.
Микробы адгезируются на поверхности различных органов и
тканей, причем адгезия идет специфично и избирательно.
Микрофлора языка, щек, нёба, зубов, разных отделов кишечного
тракта различна, т. е. специфична для каждого органа. Наиболее
подробно изучена адгезия холерного вибриона, гонококка,
патогенных штаммов кишечной палочки и микробов, вызывающих
кариес зубов.
Адгезия бактерий включает в себя несколько этапов. Первый
этап состоит в целенаправленном движении бактерий к
адсорбирующей поверхности. Он возможен для подвижных
микроорганизмов и осуществляется благодаря наличию хемотаксиса.
Хемотаксис у бактерий в настоящее время хорошо изучен и
осуществляется по градиенту концентрации какого-либо вещества.
Подробно исследован хемотаксис в градиенте концентраций Сахаров и
36
аминокислот. Приблизившись к поверхности, бактерии
взаимодействуют с ней сначала с помощью достаточно слабых
гидрофобных взаимодействий, которые, однако, не могут обеспечить
большой специфичности взаимодействия. Обычно наступает
следующий этап специфического взаимодействия. При этом
молекула адгезина — полимера, расположенного на поверхности
бактерий, взаимодействует с рецептором — полимером,
расположенным на поверхности адсорбента (рис. 6). Взаимодействие
адгезина с рецептором осуществляется по тому же механизму, что и
взаимодействие антигена с антителом. Затем часто наступает бо-
> ¦ ¦ .
*1Л ТчтЧТ '
А
i шг
фз {« ft;
Рис. 6. Взаимодействие бактерий с поверхностью животных клеток по принципу
ключ—замок:
/ — молекула специфических адгезинов; 2 — комплементарные им рецептор-
ные молекулы; 3 — протеины; 4 — гидрофобные молекулы; 5 — фосфоли-
пиды;
а — адгезия осуществилась; бив — адгезия не наступила из-за введения
избыточного количества рецептора или адгезина (Beachey, 1980)
лее прочное прикрепление, которое требует времени и
осуществляется только через несколько часов или даже суток после начала
адгезии и достигается благодаря синтезу бактериями
биополимеров, обычно полисахаридов, но иногда и полипептидов, с
помощью которых клетки прикрепляются иногда так прочно, что
легче разрушить клетку, чем отделить ее от адсорбента.
Экспериментально показано, что именно так прочно прикреплены
многие собственно почвенные бактерии. В последнее время, правда,
появились некоторые сомнения, что в процессе многочасового
контакта должен обязательно синтезироваться новый
прикрепительный материал. Оказалось, что прочность адгезии любого по-
37
лимера возрастает со временем. Это обычное и хорошо
установленное в химии явление, обусловленное тем, что со временем
полимер связывается с поверхностью с помощью все новых и
новых точек контакта. Следует сказать, что полимерная линейная
молекула связывается с поверхностью в 1000—10 000 точек, и
полное связывание наступает не сразу. При прикреплении
микробов, вероятно, обычно действуют оба механизма. В ряде случаев
экспериментально показано, что происходит синтез капсулы, в
некоторых случаях капсула может и не образовываться или по
крайней мере не увеличиваться.
Для почвенной микробиологии представляют интерес и работы
медицинских микробиологов, поэтому рассмотрим их более
подробно. Были разработаны новые подходы и выполнены
обширные исследования (Beachey, 1980; Bittoq, Marshall, 1980; Rutter
et al., 1981; Marshall, 1984).
Сформулирована концепция, что адгезия осуществляется
благодаря наличию на микробной клетке адгезина, который она
обычно выставляет над своей поверхностью на различных выростах,
имеющих поперечник, измеряемый ангстремами или
нанометрами, и длину в несколько микрометров.
Бактериальные адгезины могут быть: 1) протеинами,
например для определенных штаммов ?. coli, гонококков и микоплазм;
2) липидной частью липотейхоевой кислоты для ряда
стрептококков; 3) сахарами и другими углеводами для некоторых фито-
патогенных бактерий и кариогенных стрептококков.
Насколько пока известно, рецепторами на эпителиальных
клетках животных и человека являются почти исключительно
углеводы. Это остатки D-маннозы для определенных штаммов
Е. coli, D-галактоза для некоторых актиномицетов, L-фукоза для
холерных вибрионов, сиаловая кислота для микоплазм, ($-галак-
тозильные остатки для Е. coli K-88.
Молекулярные механизмы адгезии ряда бактерий хорошо
выяснены. Однако что касается почвенных микроорганизмов, то
наиболее изученной является адгезия клубеньковых бактерий на
корневых волосках определенных бобовых растений-хозяев, отчасти
адгезия азоспириллы и некоторых фитопатогенных
микроорганизмов (Dazzo, 1984). Что касается клубеньковых бактерий, то
показано, что адгезия осуществляется через специфический белок —
лектин, который продуцируется растением. Лектин бивалентен и,
с одной стороны, связывается с полисахаридом капсулы бактерий,
а с другой — с полисахаридом поверхности корневого волоска
{Dazzo, Truchet, 1983) (рис. 7). Считают, что полисахариды
поверхности корневого волоска и капсулы бактерий одинаковы.
Таков механизм специфического прикрепления определенного
вида клубеньковых бактерий к корням только своего хозяина.
В последнее время Ф. Дазо лектиновую теорию распространил
на адгезию азоспириллы на корнях проса (Umali-Garsia et al.,
1980).
Микробная адгезия должна рассматриваться не как взаимо-
38
действие молекулы с молекулой, а как взаимодействие клетки с
поверхностью. Такое взаимодействие включает одновременное
связывание многих молекул адгезинов со множеством рецептор-
ных молекул с образованием большого числа независимых друг
от друга связей, что делает адгезию прочной и необратимой или
слабообратимой. Адгезия зависит от способности клеток
синтезировать и «выставлять» адгезины. Оба процесса находятся под
генетическим и фенотипическим контролем.
На взаимодействие бактерий с
почвенными частицами, пожалуй,
наиболее похожа адгезия
бактерий на зубной эмали. Здесь
осуществляется взаимодействие
бактерий с минералом оксиапа-
титом, из которого состоит эмаль
зуба. Процесс очень подробно
Рис. 7. Взаимодействие-клубеньковых
бактерий с поверхностью корневого волоска
растения-хозяина:
/ — корневой волосок; 2 — бактерия; 3 —
клеточная стенка; 4 — капсула; 5 — лек-
тин трифолин; 6 — О-антиген
изучался в связи с кариесом зубов и разработкой методов по его
предотвращению. Выполнено несколько сотен работ. Бактерии
прикрепляются к поверхности зуба и затем растворяют апатит
с помощью образуемых ими органических кислот. Основная роль
в этом процессе отводится Streptococcus mutatis, хотя зубные
бляшки обычно состоят из нескольких бактерий, образующих
сложное сообщество. Одна из простых гипотез молекулярного
механизма прикрепления сводится к утверждению, что фосфатные
группы липотейхоевых кислот, находящиеся на поверхности
бактериальных клеток, взаимодействуют с кальцием оксиапатита.
Однако эта гипотеза представляется сомнительной, так как
клетки обычно прикрепляются не непосредственно к минералу, а к
органическим биополимерам, адсорбировавшимся на эмали из
слюны. Видимо, и в почве адгезия микробов происходит часто не на
поверхности минеральных частиц, а на поверхности
адсорбированных органических веществ. Если учесть влияние
адсорбированного органического вещества, то наиболее вероятный механизм
прикрепления S. mutatis представляется следующим: клетки
бактерий синтезируют из сахарозы с помощью глюкозилтрансфера-
зы полимер декстран, который прикрепляется к макромолекулам
на поверхности зуба, адсорбировавшимся из слюны, а затем
осуществляется прикрепление бактерий к этому декстрановому слою
через фермент глюкозилтрансферазу.
Адгезия почвенных бактерий может быть для некоторых
бактерий весьма избирательной и очень зависит от характера
адсорбирующей поверхности, а в других случаях абсолютно не зави-
39
сит от характера поверхности. Пока мало известно о
молекулярных механизмах такого прикрепления. Оказалось, что бактерии,
использующие твердый субстрат, избирательно прикрепляются к
этому субстрату. Например, целлюлозоразлагающие бактерии
прикрепляются преимущественно к частицам целлюлозы, крах-
малолитические бактерии — к зернам крахмала и т. д.
Существует предположение, что такое взаимодействие осуществляется
через соответствующие гидролитические ферменты, которые, с
одной стороны, связаны с клеточной поверхностью, а с другой —
связываются со своим субстратом, что и обусловливает высокую
специфичность адгезии. Естественно, что фермент-субстратный
комплекс является непрочным и в соответствии с 7> величиной
константы Михаэлиса должен распадаться. Однако связь между
клеткой и субстратом при этом не нарушается, так как действует
«эффект молнии» — связь по множеству сайтов: в каждый
заданный момент часть связей распадается, цо клетка остается
прикрепленной за счет тех связей, которые в данный момент
сохраняются.
Мы обнаружили некоторые почвенные бактерии, котор.ые ад-
гезируются на всех видах поверхностей. Так, Micrococcus luteus
прикреплялся к гидрофильным и гидрофобным, к положительно
И отрицательно заряженным поверхностям. С молекулярных
позиций отмеченное явление можно объяснить наличием на
поверхности клеток различных типов адгезинов, которые могут
«выставляться», или «убираться» в зависимости от типа поверхности,
к которой клетки приближаются (рис. 8). Такие механизмы
встречаются у облигатно прикрепленных микроорганизмов.
Изучение молекулярных механизмов адгезии клеток позволит
глубже понять специфику процессов, осуществляемых
микроорганизмами в почве, разработать
методы их десорбции для
количественного учета и выделения, понять
интимные механизмы структурообра-
зования и глубже охарактеризовать
взаимодействие органических ве-
|&Мщг ZSL* л0,м с ее "инеральной
Однако самое поразительное
состоит в том, что микробы способны
на определенной стадии развития
разрывать эти связи и переходить
в свободное состояние. Осуществ-
^Г?
3
( )
П Г1 гН Рис. 8. Взаимодействие клеток бактерий
с j (/) с гидрофильной (2) и гидрофобной
. - S (3) поверхностями
ляется это с помощью принципиально различных механизмов. Так,
у каулобактера есть неподвижная прикрепленная стадия, когда
40
клетка адгезируется с помощью специфического прикрепительного1
материала, расположенного на конце стебелька. Прикрепленная
клетка образует подвижную дочернюю клетку, которая и служит
для расселения. Однако наши исследования показали, что у
других микроорганизмов имеются иные способы (Звягинцев и др., 1977;
Перцовская, Звягинцев, 1971), при которых на определенных
стадиях развития клетки выходят из адгезированного состояния.
Оказалось, что процессы адсорбции-десорбции очень зависят от
стадии развития культуры. Как осуществляется десорбция, в
настоящее время известно только в общих чертах. Здесь действуют
ферментативные механизмы, которые отделяют клетку, возможно
действие и других механизмов, таких, как изменение
электрокинетического потенциала, изменение степени гидрофобности
поверхности и т. д. Отрыв совсем не обязательно проходит по месту
прикрепления, он может проходить, например, и по внутренней
части капсулы.
Таким образом, адгезия генетически запрограммирована,
имеет очень важное экологическое значение и во многих случаях
определяет выживание вида. По своей химической природе
адгезия бактерий как адсорбция полимеров должна бы быть
необратимой, но в действительности это оказывается не так. Клетка
довольно легко регулирует свое положение, переходя из адгези-'
рованного в свободное состояние.
ВЕЛИЧИНА АДГЕЗИОННЫХ СИЛ
Прочность связи клеток бактерий с поверхностью определяли
методом центрифугального отрыва (Звягинцев и др., 1971). Для?
исследований использовали центрифугу со специально сконструи-^
рованным ротором. Адгезия характеризовалась числом yF,
равным отношению числа клеток, которые остались на пластинке;
после действия заданной отрывающей силы, к первоначальному
числу клеток в процентах: •
лмоо
где Af0 — число клеток, первоначально находившихся на
испытуемой поверхности, N — число микробов, оставшихся после
воздействия центробежной силы.
В некоторых случаях использовали другую величину clf\
равную доле клеток, оторвавшихся после воздействия заданной
силы: а/7=Ю0 — Хр-
После определения чисел адгезии строили кривые, выражающие
зависимость <xf от прикладываемой силы отрыва FOTP:
F =
mv
.2
отр- R
где v — линейная скорость (см/с); ? = ——, # —расстояние.
41
от оси вращения до поверхности с клетками, п — число оборотов
в минуту, т — масса клеток. Определялось воздействие
тангенциальной силы.
Различные микроорганизмы характеризуются различной
адгезией (табл. 5). По уменьшению адгезии изученные
микроорганизмы расположились в следующий ряд: Staph, aureus, Bad. fim-
briatum, Вас. mesentericus, Ser. marcescens, Ps. fluorescens, Ps.
pyocyanea, Вас. cereus, Вас. subiilis, Sacch. cerevisiae.
Таблица 5
Адгезия различных микроорганизмов, тыс. клеток/см2
Микроорганизмы
Staphylococcus aureus
Bacterium fimbriatum
Bacillus mesentericus 112
Serratia marcescens 71
Serratia marcescens 103
Bacillus mesentericus 53
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas pyocyanea
Bacillus cereus
Saccharomyces cerevisiae
Bacillus subtilis
No
| 4000
I 2730
2240
1810
896
590
510
316
176
50
75
'n
2000
205
164
1755
254
80
39
63
40
13
2
Y/7. %
' 50
* 11
7
97
30
13
8
20
23
26
3
Примечание. Центрифугирование проводилось при 16000 об/мин.
Наибольшее число прочно прикрепившихся на единицу площади
клеток наблюдалось у Staph, aureus и двух штаммов Ser.
marcescens, а наименьшее — у Вас. subtilis.
По числу клеток, оставшихся после центрифугирования,
нельзя еще судить о прочности их прикрепления к поверхности.
Более точные представления о прочно-
* сти связи клеток с поверхностью
дает величина у/7-
Наиболее прочное прикрепление
наблюдается у клеток Ser. marces-
~~ Рис. 9. Интегральные кривые
распределения клеток микроорганизмов по силе
адгезии, характеризующей долю (а)
оторвавшихся от поверхности клеток при данной
силе отрыва:
* 1пЬ с с / — Staph, aureus 120; 2 — Bad. fimbria-
wo 2 W6 3-Ю6 4-Ю6 turn 190; 3 — Ps. pyocyanea; 4 — Вас. sub-
cens менее прочное — у клеток Staph, aureus. Клетки остальных
культур прикреплены еще слабее, и после центрифугирования
остается всего 2—10% от общего числа адгезировавшихся клеток.
На рис. 9 представлены интегральные кривые распределения
микробных клеток по силам адгезии, характеризующие зависи-
42
мость доли оторвавшихся частиц от величины силы отрыва, для
4 видов бактерий, наиболее различающихся по адгезионным
свойствам. Адгезия исследованных неспороносных палочек к
поверхности незначительна, достаточно действия силы порядка
0,2-10—6—0,3-10~6 дин/кл, чтобы вызвать отрыв половины от
общего числа всех находившихся на поверхности клеток.
Обнаружены сходство в характере адгезии неспороносных палочек
(Ps. pyocyanea, Bad. fimbriatum) и своеобразие адгезии
культуры Staph, aureus, Вас. subtilis.
Сила, удерживающая клетки микроорганизмов на
поверхности (табл. 6; рис. 9), зависит от свойств микроорганизма. Одни
культуры (в основном представители рода Bacillus)
характеризуются тем, что число клеток, прикрепившихся к твердой
поверхности, оказывается небольшим, а величина адгезии F$o —
высокой. Адгезия таких культур, как Ser. marcescens, Staph, aureus,
характеризуется большим числом клеток, прикрепляющихся к
поверхности, и большой силой адгезии.
Таблица 6
Силы адгезии различных микроорганизмов
Микроорганизмы
Sacch. cerevisiae
Вас. subtilis
Вас. cereus
Вас. mesentericus
Ser. marcescens 71
Ser. marcescens 103
Staph, aureus
Ps. pyocyanea
Ps. fluorescens
Bad. fimbriatum
Объем
клетки,
мкм3
110,0
2,6
3,1
2,2
1,07
! 1,07
1 0,51
0,26
0,23
0,13
Плотность
клеток,
г/см8
1,096
1,076
1,068
1,082
1,056
1,056
1,096
1,064
1,100
1,060
F»
154,00
1,92
1,77
2,03
29,10
1,35
1,34
0,10
0,16
0,14
ра
1,400
0,740
0,572
0,923
27,200
1,260
2,630
0,396
0,695
1,108
Предполагаемая
площадь,
10~8 см2
6,8
2,8
2,0
2,2
1>2
1,2
0,19
0,45
0,38
! 0,22
F/S
22,600
0,685
0,885
0,925
24,200
1,120
7,050
1 0,226
0,420
0,654
Характерной особенностью адгезии неспороносных бактерий,
например Pseudomonas spp., является их способность
прикрепляться к твердым поверхностям в значительном количестве, при
этом их взаимодействие с поверхностью оказывается слабым.
Значения сил адгезии клеток микроорганизмов близки к адгезии
различных других частиц к твердым поверхностям.
Полученные данные не позволяют однозначно решить вопрос
о локализации места отрыва. Он может проходить либо по
контакту клетки с адсорбентом, либо внутри клеточных структур.
Однако можно утверждать, что истинная адгезия не меньше, а,
возможно, и больше найденных величин.
Для изучения адгезии клеток микроорганизмов чрезвычайно
полезным оказалось введение условного показателя адгезии
микроорганизмов Ра, равного отношению силы адгезии к массе
клетки W:
43
Pa= (FSo/W) Ю-6 дин/мкмз.
Правильнее было бы оценить прочность прикрепления клеток
по силе, действующей на истинную площадь контакта клетки с
поверхностью, но в настоящее время она не поддается
определению, поэтому и потребовалось ввести коэффициент Ра, чтобы
иметь возможность сравнивать адгезию клеток микроорганизмов
различных размеров. Анализ экспериментальных результатов
(см. табл. 6) показывает, что наибольшая прочность
прикрепления характерна для клеток Serratia marcescens и "Staphylococcus
aureus. Клетки остальных изученных культур прикрепляются
значительно слабее.
ИЗУЧЕНИЕ ФОРМ И РАЗМЕРОВ КЛЕТОК
ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Люминесцентная микроскопия дает возможность изучать
прижизненно окрашенные клетки, которые не подвергаются
фиксации, высушиванию и другим процедурам, сильно изменяющим
форму и величину клеток. В связи с этим была проделана
специальная работа по определению размеров и форм почвенных
микроорганизмов при использовании сочетания двух методов:
люминесцентного и фазово-контрастного. Клетки
идентифицировались по люминесценции, и затем их размеры и форма
определялись в фазовом контрасте (Звягинцев, 19646).
При беглом просмотре препаратов в каждой почве
обнаруживается несколько господствующих форм микробных клеток и
общая картина представляется довольно однообразной. В почвах
с автохтонной микрофлорой она однообразна даже в разных
почвах; в почвах с зимогенной микрофлорой можно наблюдать
большее различие в зависимости от состояния почвы. Однако при
детальном обследовании каждой почвы поражает разнообразие
форм и размеров встречающихся в ней микроорганизмов
(рис. 10—12), хотя многие из них встречаются редко.
Были определены размеры клеток почвенных
микроорганизмов. Для измерений находили клетку микроорганизма при
люминесценции; это было необходимо, так как в обычном свете
часто очень трудно отличить клетку от почвенной частицы, затем
измеряли величину клетки в фазовом контрасте.
Последовательно измеряли все клетки в поле зрения микроскопа.
Основную массу микробов почвы, находившейся длительное
время в увлажненном состоянии и свободной от растительности,
составляли овальные, шаровидные и иногда палочковидные
клетки небольшой величины. Для перегнойно-глеевой почвы их
размеры распределились следующим образом (табл. 7).
В почве с автохтонной микрофлорой преобладали клетки
размером 0,4—0,6 мкм овальной формы. Иногда удавалось видеть
клетки 0,2—0,3 мкм в поперечнике. Наиболее мелкие клетки
были прочно связаны с поверхностью почвенных частиц. Интересно
отметить, что общий объем многочисленных мелких клеток зна-
44
п-. -'^Щ*
ярд
, ¦
?' ¦¦¦-.¦¦¦..
Рис. 10. Бактерии и дрожжи, адгезированные на поверхности корней пшеницы
(фото В. С. Гузева).
Видны прикрепительные нити муцигеля. Клетки часто прочно вмонтированы в
муцигель. На фото е и з хорошо видны следы от оторвавшихся клеток
(увеличение: а, в, д, ж — 2500X; б, г, е, з — 8000X)
Рис 11 Бактерии на поверхности корней пшеницы иммобилизованные в му-
цигеле (фото В. С. Гузева).
На сЬото б и г видны клетки бактерий, заключенные в муцигель. На фото е
отчетливо заметны прикрепительные муцигельные тяжи
(увеличение: а, в, д — 2500Х; б, г, е, ж, з — 8000Х)
Ш$"'
i • ¦-
*
Рис. 12. Адгезия бактерий и дрожжей (фото В. С. Гузева): а, б, в — на
поверхности корневых волосков; д, е — корня; ж, з — стебля.
На фото в, г, ж, з показано прикрепление клеток дрожжей с помощью
слизистых капсул
(увеличение: а — 800Х; б — 2500х; в, г — 800X; д — 2500Х; е, ж —
8000Х; з — 2500Х)
чительно меньше объема малочисленные крупных клеток, что
нужно учитывать при определении биомассы микроорганизмов в
почве. Клетки с диаметром 0,4—0,8 мкм, составляющие 74%,
имели общий объем 22,9 мкм3 (только 14% от общего объема
клеток), а клетки размером 1—4 мкм, составляющие, всего только
10% от общего числа клеток, имели объем 122,6 мкм3 (75% от
общего объема клеток).
Таблица 7
Размеры клеток микроорганизмов перегнойно-глеевой почвы
Размер
клеток, мкм
0,4—0,6
0,6—0,8
0,8—1,0
1—2
2—4
Количество
клеток
данного размера
512
233
153
82
20
Общий
объем
клеток, мкм3
10,3
12,6
17,1
38,1
84,6
Количество
клеток данной
величины от
общего
количества
измеренных
клеток, %
51,2
23,3
15,3
8,2
2,0
Объем клеток
данной
величины к общему
объему клеток
в почве, %
6
8
10
23
52
По сравнению с клетками бактерий, развивающихся на
лабораторных питательных средах, для почвенных форм характерна
укороченность клеток. Толщина гиф актиномицетов в почве
сильно варьирует — от 0,3 до 1 мкм. Гифы грибов встречаются самой
разной толщины, некоторые очень тонкие — 1 мкм и даже
меньше.
При изучении распределения микроорганизмов по почвенным
агрегатам разных размеров обнаружилось, что бактерии
располагаются на всех частицах и агрегатах. Актиномицеты и особенно
грибы находятся на более крупных агрегатах, которые они
пронизывают своими гифами и с которыми прочно связаны. При
изучении отделенной мелкой фракции почвенных частиц грибные
гифы почти совсем не обнаруживались. Специфический характер
расположения бактерий, актиномицетов и грибов следует
учитывать при проведении их количественного и качественного учета в
пОчве. Известно, что некоторые виды грибов обнаруживаются при
посеве из более крупных фракций. При посеве почвенной
суспензии без предварительной подготовки почв путем диспергирования
недоучет некоторых форм грибов и актиномицетов может быть
особенно велик.
В почве часто обнаруживается большое количество высших
грибов, которые не дают колоний на обычных питательных
средах, и много гиф микоризных грибов. При прямой микроскопии
видно, что в большинстве почв биомасса грибов явно
доминирует над биомассой бактерий (табл. 8, 9). В то же время для
каждой почвы характерно определенное соотношение биомассы
грибов и бактерий. Оно может быть 10: 1, 1 : 1, в редких случаях
48
0,5:1. Отметим, что биомассу грибов, бактерий и актиноми^
цетов можно в почве определять только на основании данных
прямых микроскопических методов. Методы посева совершенно
непригодны для этой цели. Колебания в количестве и биомассе
Таблица 8
Соотношение биомассы грибов и бактерий в почвах
основных природных зон СССР (Мирчинк,
Паников, 1986), %
Зона
Хвойные
Степь
Влажные
тропики
Пустыни
леса
суб-
Почва; растительность
дерново-подзолистая;
ельник-кисличник
(Новгородская обл.)
чернозем мощный;
степь разнотравно-ко-
выльно-безостокостровая
(Курская обл.)
краснозем типичный;
смешанный
широколиственный буково-грабовый
лес
песчано-пустынная;
белосаксаульник илако-
вый
Грибы/бактерии
91/9
53/47
86/14
83/17
бактерий и грибов, которые встречаются в почвах, приведены в
шкалах для оценки степени обогащенности почв
микроорганизмами (табл. 10).
Таблица 9
Оборачиваемость грибного мицелия за год в почвах зональных экосистем
(экономический коэффициент 0,35; расчеты Т. Г. Мирчинк)
Зона
Тундра
Хвойные леса
Степь
Влажные
субтропики
Почва
перегнойно-глеевая
тундровая
дерново-подзолистая
чернозем типичный
краснозем типичный
Биомасса
грибов
(сухая),
кг/га
745
480
127
196
Первичная
продукция
(сухое
вещество),
кг/га
1200
12 000
20 750
21000
Первичная
продукция,
используемая
грибами, кг/га
600
1000
10 375
16 800
Оборачиваемость
мицелия,
число
генераций
в год
0,1
1
10
15
Клетки почвенных микроорганизмов в люминесцентном
микроскопе часто светятся не целиком. Периферическая часть
клетки не видна. Причем несветящиеся участки клетки могут
составлять в разных случаях большую или меньшую часть от
объема клетки (см. рис. 2). Особенно хорошо это видно на крупных
49
СО
X
ч
3
ag
5 в
-о
1'=
С Б
В*
X О)
«в 5
о *¦
О S
° *
* 3
5?
в! О
-х Я
5 ¦
СО 4)
* я-
8
а
s _
хая биом
грибов
д
й
?
к
1 &
•в*
X
и
у
«
S
i
g
5
ев
о
хая биомас
бактерий
5
а.
бакте]
§
н
ё
?
§
*
8
ff
vo
О
Ю
В"
о
U
X
н
! О
X
X
3"
ев
1 (-
обо
л
X
н
и
ев
и
X
^
2
«51
2
ев
U
X
Us
О.
§
о.
i
О
СМ
V
о
ю
t^
V
о
со
V
см
V
о
ю
V
^
V
к
СО
\о
Л
X
<и
?Г
О
о
о
1
о
СМ
8
1Л
СМ
1
о
ю
1^
о
о
7
1
о
со
ю
с»
1
см
о
о
т
о
см
^
к
СО
X
t<
О)
со
о
о
см
7
о
о
о
о
ю
1^
1
о
о
ю
см
о
о
со
1
1
8
о
1>-
т
ю
00
в
см
«А
о
ю
1
см
л
в
о
я
<V
1?
со
U
о
о
«
«
X
t=t
о>
о.
и
о
о
о
1
о
о
см
о
о
о
см
1
о
о
ю
•>".
о
о
о
7
1
о
о
СО
о
со
1
о
1^
о
о
4f
1
о
см
о
т
ю
03
со
ь
СО
С
о
Ю
о
о
о
л
о
о
о
ю
см
л
о
о
о
л
о
со
л
о
о
л
о
л
05
СО
н
со
U
о
о
л
X
О)
а*
о
СО 3"
tt се
4» X
03 ?
я о
-s5
X «в
as
2«
5л
ев *
>о .
л «в
? м
СО л>
1*
I
<
ев
X
«3
X
?
X
S
о
<и
г
§
X
ffl
s
с
X
н
о
X
X
Si.
S?
СЗ
8
о
Л
X
с
0»
{-
«J
"х4
1
и
2
X
3
и
>
3
о
V
см
V
см
V
<-«
V
«
СО
X
\о
л
х
О)
D*
о
о
о
7
1
о
1
см
о
ю
. 1
1
ю
см
см
1
1
«
СО
X
ч
а>
РЭ
о
ю
см
1
1
о
о
о
7
ю
см
7
1
о
ю
1
1
см
л
о
о
X
си
г
со
и.
о
о
к
к
я
сС
О)
а.
о
о
о
ю
1
1
о
ю
см
о
см
1
о
»-"•
о
ю
см
1
1
о
ю
о
1
1
ю
к
со
н
СО
и
о
in
о
о
л
о
см
л
о
ю
см
л
о
л
к
СО
н
СО
и
о
VO
л
X
О)
сг
о
клетках размером в несколько микрометров, у которых иногда
светится только 1/3 объема клетки. Для мелких клеток это
установить труднее, так как измерения приходится проводить на
границе разрешающей способности микроскопа. Отметим только*
что размер клеток, определенный в фазовом контрасте,
оказывается большим, чем при люминесценции. Подобное явление уже
отмечалось для чистых культур микроорганизмов. В клетках
бактерий более ярким свечением отличаются нуклеоиды, и часто
только они и видны.
Многим клеткам свойственно гетерогенное свечение (см.
рис. 2). Были выявлены следующие случаи: 1) вся клетка
светится одним цветом — зеленым или красным; 2) вся клетка
светится одним цветом, но периферия или, наоборот, центр клетки
более яркий; 3) центральная часть клетки светится зеленым, а по<
краям — красный ободок; 4) периферия светится зеленым, а
центр — красным; 5) пестрая картина свечения клетки: одни;
участки светятся более ярко, другие — бледнее, причем разными
цветами. Особенно разнородное свечение было отмечено у
инволюционных форм бактерий, которые встречаются в почве в виде
отдельных групп.
Цвет и яркость свечения разных частей клетки в сильной
степени зависят от применяемой концентрации красителя. Так,
споры стрептомицетов при невысокой концентрации акридина
оранжевого окрашиваются в однородный зеленый цвет, а при более
высокой концентрации имеют по краям красный ободок.
Споры бактерий актиномицетов и грибов окрашиваются
акридином оранжевым по-разному. Споры бактерий обычно не
окрашиваются, хорошо прокрашиваются только проспоры. Конидии
актиномицетов окрашиваются очень хорошо при низких
концентрациях красителя и светятся ярче, чем многие бактериальные
клетки и гифы актиномицетов. Конидии грибов окрашиваются
при совсем низких концентрациях акридина оранжевого. При
оптимальной концентрации для окрашивания спор актиномицетов
конидии многих грибов оказываются перекрашенными и
выглядят красными.
Многие бактерии образуют в почве микроколонии, состоящие
из нескольких десятков, а иногда и нескольких тысяч клеток.
Прочные колонии, не разрушающиеся при приготовлении
почвенной суспензии, образуют, видимо, относительно
немногочисленные виды бактерий. Образованы они главным образом кокко-
видными и овальными клетками. Из наиболее характерных
колоний отметим следующие.
1. Очень прочные микроколонии, имеющие правильную
шаровидную форму, состоящие из кокковидных клеток 0,5 мкм в
диаметре; в колонию обычно входит несколько сотен клеток.
2. Малиновидные колонии из мелких кокковидных или слегка
овальных клеток (0,6—0,8 мкм) состоят из нескольких десятков
клеток.
3. Малиновидные колонии из крупных шаровидных или слегка
51
овальных клеток размером 2—3 мкм; они выглядят красными, в
то время как большинство клеток почвенных бактерий светится
зеленым.
4. Колонии типа бактодерма, состоящие из палочковидных
клеток, лежащих в один слой.
5. Колонии, образованные клетками типа азотобактера; центр
клетки светится зеленым (собственно клетка), периферия —
красным (капсула).
6. Микроколонии, состоящие из крупных овальных клеток
2—3 мкм в диаметре, колонии имеют неправильные очертания и
включают несколько сотен клеток.
Кроме того, в почве встречается множество других колоний,
но они не имеют ярко выраженных отличительных признаков.
Микроорганизмы, образующие микроколонии, обычно ведут
прикрепленный образ жизни. Колонии почти всегда располагаются
на поверхности почвенных частиц.
Наибольшее количество бактерий среди исследованных почв
содержала перегнойно-глеевая почва (15 млрд. на 1 г почвы).
Причем даже после растирания почвы с пирофосфатом натрия
4,3 млрд. клеток, т. е. 30%, продолжали оставаться в адгезиро-
ванном состоянии. Полностью отделить клетки от частиц вообще
не удается. Как отмечал Касида (Casida, 1971), часть клеток
разрывается по внутренним поверхностям, но не отделяется от
частиц, т. е. связь между макромолекулами внутри клеток менее
прочная, чем связь клетки с частицей.
На основании многочисленных определений мы сделали
вывод, что средний размер клеток почвенных бактерий равен
0,08 мкм3, что значительно меньше среднего объема клеток,
который брался в расчеты ранее. Обычно при определении
биомассы бактерий в почве считали, что средний объем клетки равен
1 мкм3, т. е. ошибка при определении биомассы получалась
больше чем в 10 раз. Позже В. М. Богоев (1981) предложил для
каждой почвы, в которой определяется биомасса, подсчитывать
средний объем клеток. Для разных почв он несколько
отличается. Однако процедура точного определения объема клеток очень
трудоемкая, получить достоверные результаты весьма трудно,
поэтому мы считаем, что при обычных подсчетах вполне можно
брать средний размер 0,08 мкм3. В ризоплане растений объем
клеток значительно больше. Он резко увеличивается также при
обогащении почвы легкодоступными органическими веществами.
Если считать, что плотность бактерий примерно равна 1 г/см3,
то одна бактерия в обводненном состоянии весит 1,0-10~9 мг.
Проведенные расчеты показывают, что вес сухой бактериальной
биомассы составляет сотые или десятые доли процента от веса
почвы или несколько процентов от веса органического вещества
почвы. В пересчете на запас сухой бактериальной биомассы на
1 га получаем сотни, а в очень бедных почвах десятки
килограммов на гектар.
Несмотря на наличие огромного количества клеток в почве,
52
они, по нашим прямым микроскопическим определениям,
занимают даже в богатых почвах (черноземы, горно-луговые, пере-
гнойно-глеевые) сравнительно небольшую часть от общей
поверхности частиц (0,1—0,5%). В почве отдельные очаги развития
микроорганизмов разделены большими свободными пространствами,
т. е. отдельные микроколонии часто развиваются изолированно,
и непосредственной конкуренции за площадь в почве обычно не
наблюдается.
Изучение динамики развития микроорганизмов с помощью
люминесцентной микроскопии показало, что во времени
происходят не только количественные изменения, но меняется и
соотношение между одиночными и колониальными формами, а также
средняя величина микроколоний. По соотношению между
одиночными и колониальными формами можно судить о степени
активности микроорганизмов. Особенно много микроколоний
появляется через две недели после увлажнения сухих почвенных образцов
или образцов, обогащенных органическими веществами. Внесение
растворимых веществ (сахара, аминокислоты) приводит к
развитию одиночных форм, которые располагаются в почвенном
растворе.
При эпилюминесценции корни и корневые волоски растений,
окрашенные акридином оранжевым, светятся зеленым,
многочисленные приставшие к корню почвенные частицы выглядят
красными, желтыми, иногда черными (Звягинцев, 1962а, в). На
поверхности корня располагается масса бактериальных клеток. Они
четко видны на красном фоне почвенных частиц; на
поверхности корня и корневых волосков они менее заметны, так как и те
и другие светятся зеленым. Однако растительные клетки и
клетки микробов обладают разными оттенками зеленого свечения.
Поэтому в большинстве случаев бактерии вполне различимы и
на поверхности корня. Нуклеоиды бактерий люминесцируют очень
ярко.
Бактерии, расположенные на поверхности корня, часто
собраны в микроколонии, которые обычно состоят не из нескольких
десятков клеток, что характерно для почвы без растений, а из
нескольких сотен клеток. Встречаются колонии еще большей
величины, особенно на разлагающихся или поврежденных участках
корня. Бактерии, образующие микроколонии, довольно
разнообразны по морфологии. Это мелкие и крупные шаровидные,
овальные и палочковидные формы. Палочковидные формы являются
господствующими. В ризоплане преобладают более крупные
формы, чем в почве. Обычно микроколонии состоят из одинаковых
по морфологии клеток и, видимо, принадлежат одному виду,
реже — из разных. Часто в близком соседстве развиваются
микроколонии, состоящие из клеток разных микроорганизмов, т. е.
образуются сложные микробные сообщества.
При приготовлении препаратов для микроскопии путем
отмывания корней в воде можно видеть, что много клеток плавает
«свободно вокруг корня, но большинство клеток и микроколоний
53
даже при таком сравнительно жестком способе обработки
располагается непосредственно на поверхности корня и приставших к.
нему почвенных частиц. Одиночные клетки и целые микроколо-
нии прочно удерживаются на поверхности, и их трудно десорби-
ровать, что необходимо учитывать при подсчете микроорганизмов,
ризосферы и ризопланы.
С помощью люминесцентного метода в ризосфере можно
увидеть простейших животных. Изредка встречаются гифы актино-
мицетов. Гифы грибов, расположенных на поверхности корня и
почвенных частиц, видны плохо, так как их мицелий светится
слабо. Ярко люминесцируют только отдельные участки (ядра,,
некоторые включения). К сожалению, с помощью этого метода
трудно разрешать очень важный вопрос о доминировании в ри-
зоплане грибов или бактерий. Установлено, что основным
агентом, разрушающим мертвое органическое вещество, являются
грибы. Очень важно выяснить, бактерии или грибы доминируют
в ризоплане. Многие считают, что биомасса грибов в ризоплане
значительно больше, чем биомасса бактерий.
С помощью описываемого метода удается видеть
микроорганизмы, расположенные непосредственно на поверхности корневых
волосков (рис. 13). Рассмотреть клетки микробов на поверхности
корневых волосков, извлеченных из почвы, в обычном микроско-
Рис. 13. Расположение бактерии на срезах почвенных агрегатов
(люминесцентная микроскопия при окрашивании почвы акридином оранжевым).
Бактерии выглядят светлыми, а поверхность почвы темная. Видны сложные-
ценозы бактерий: а — зона корневого волоска; б — контрольная почва
(1000Х)
54
апе очень трудно, так как исследования затрудняются прилипшими
ж волоску почвенными частицами. В люминесцентный микроскоп
можно видеть, что на поверхности корневых волосков адгезиро-
ваны одиночные клетки и целые микроколонии. Иногда
несколько микроорганизмов прикреплено к одному волоску, причем они
могут принадлежать к разным видам.
Для изучения ризосферных микроорганизмов в почве с
ненарушенной или только слабо нарушенной структурой была
применена другая методика подготовки препаратов. С помощью формы
с острыми краями брали небольшой почвенный монолит из
участка почвы, содержащего корни растений. Верхняя грань
монолита срезалась острой бритвой. На участок среза, через который
проходил корень, наносили каплю акридина оранжевого. Сверху
накладывали покровное стекло, и препарат рассматривали в
отраженном свете. Благодаря этой методике удалось получить
более полную картину распределения микроорганизмов в ризосфере.
Этот метод позволяет видеть больше микроколоний и меньше
одиночных клеток. Отмечено резкое уменьшение количества
микроорганизмов по мере удаления от корня.
Метод люминесцентной микроскопии может быть с успехом
применен для изучения микрофлоры ризосферы. При этом нужно
пользоваться падающим светом (эпилюминесценция). В
ризосфере на поверхности корней, корневых волосков и приставших к
ним почвенных частиц располагается большое количество
микроколоний и одиночных адгезированных клеток микроорганизмов.
Они прочно удерживаются на поверхности, к которой
прикреплены, и их трудно десорбировать, с чем необходимо считаться при
количественном учете микроорганизмов ризосферы и ризопланы.
Многие микроколонии трудно разделить на составляющие их
клетки.
Большие возможности в изучении специфики почвы как среды
обитания микроорганизмов дает электронная микроскопия:
трансмиссионная и сканирующая.
Трансмиссионная электронная микроскопия показала, что в
почве находится еще больше микроорганизмов, чем
обнаруживает люминесцентная микроскопия, причем много
ультрамикроскопических форм (Никитин и др., 1966). Это положение можно
считать доказанным. Однако количественный учет
микроорганизмов в почве с помощью просвечивающей микроскопии пока
недостаточно разработан и имеет две нерешенные проблемы: 1) нет
критериев для разграничения почвенных коллоидных и предкол-
лоидных частиц от микроорганизмов; 2) концентрирование
микроорганизмов в пленках на поверхности жидкости вносит
значительные ошибки в определения. Метод хорош для обнаружения
новых форм, но пока мало пригоден для количественного учета.
Ценные сведения просвечивающая электронная микроскопия
дала в отношении изучения адгезии микроорганизмов
почвенными частицами. Этот метод выявляет ультраструктуры, с
помощью которых осуществляется прикрепление. Это выросты капсул,
55
иногда сами капсулы, фимбрии и т. д. Иногда клетки служат
мостиком, соединяющим почвенные частицы и образующим
агрегаты.
Часть бактериальных клеток, расположенных на поверхности
почвенных частиц, не видна, так как они погружены в органоми-
неральный гель, окружающий почвенные частицы.
ДЕСОРБЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ИХ КОЛИЧЕСТВЕННОМ
УЧЕТЕ В ПОЧВЕ
Для правильного количественного учета микроорганизмов в;
почвах на питательных средах необходимо проводить посев из
почвенной суспензии, в которой бактерии должны находиться в
виде одиночных свободноплавающих клеток, гифы грибов и ак-
тиномицетов должны быть разбиты на небольшие однородные^
участки. Каждая клетка, попав на питательную среду, должна
образовать колонию. Для выполнения первого условия в
почвенной микробиологии обычно рекомендовалось применять
5—10-минутное перемешивание водной почвенной суспензии в колбе.
Однако, как показали специальные исследования, такая обработка
совершенно не обеспечивает выполнения поставленного условия.
При использовании прямых микроскопических методов перед
проведением подсчета клеток также необходимо добиться такого
состояния суспензии, при котором были бы видны все клетки,
т. е. необходимо разрушить крупные агрегаты и также, по
возможности, десорбировать клетки, однако при использовании эпи-
люминесценции не обязательно десорбировать все клетки, так
как клетки, адгезированные на поверхности частиц, хорошо
видны.
В почвенной микробиологии делались неоднократные попытки
разработать более совершенные методы подготовки почв к
микробиологическому анализу. Ф. Н. Германов (1932) предложил при
учете бактерий по методу Виноградского использовать обработку
почвы слабой щелочью.
Методы подготовки почв к прямому микроскопическому
исследованию, но уже при использовании люминесцентной
микроскопии разрабатывались многими исследователями. Ожье и По-
шон (Augier, Pochon, 1958) применили обработку почвенной
суспензии раствором пирофосфата натрия. Хомригхаузен и Ромер
(Homrighausen, Rohmer, 1959) нашли, что этот прием лучше
заменить продолжительным встряхиванием почвенной суспензии со
стеклянными бусами. Диспергирование почв проводилось
ультразвуковой обработкой (Stevenson, 1958). Обнаружено, что
обработка почв пирофосфатом, метафосфатом натрия и щелочью
повышает определяемое количество бактерий (Звягинцев, 1959в;
Orcutt, 1940; Gamble et al., 1952; Hirte, 1962). Рахно (Rahno,
1961) применил ряд химических веществ, ультразвуковую обра-,
ботку и миксер и получил большое увеличение определяемого
количества бактерий. ... с
56
Наши опыты показали, что при посеве после 10-минутного
перемешивания почвенной суспензии в колбе колонии
микроорганизмов, как правило, формируются вокруг почвенных частиц,
попадающих при посеве на поверхность питательной среды, т. е.
вырастают из адгезированных клеток. Из адгезированных бактерий
развивается половина или даже больше колоний. Причем на
одной частице часто начинает развиваться несколько разных
микроорганизмов (несколько форм бактерий, актиномицеты, грибы).
В процессе дальнейшего роста обычно преобладание получает
одна форма, которую и учитывают как сформировавшую
микроколонию. Другие же формы ускользают от учета. Иногда
колонию формирует смешанная культура, но в этом случае смесь
учитывается также за одну клетку. Даже колония, состоящая из
клеток одного вида, развивается обычно не из одной клетки, а
лз микроколонии, находившейся в почве. Метод микроскопиро-
вания микроколоний, развивающихся на чашках Петри или в
миниатюрных микрокюветах Перфильева, в согласии с эпилюминес-
дентной микроскопией показывает, что 10-минутное
перемешивание почвенной суспензии не дает возможности отделить клетки
ют почвенных частиц. Обычно даже на одном агрегате остается
много клеток микроорганизмов. Огромное число различных
микробов остается на почвенных частицах в осадке на дне колбы и
ле учитывается.
При подготовке почв к микробиологическому анализу
необходимо вызвать три процесса: 1) разрушить почвенные
агрегаты, 2) десорбировать микроорганизмы с поверхности почвенных
частиц и из органоминерального геля, 3) дезагрегировать
микроколонии. Все эти процессы вызываются одинаковыми или
близкими приемами.
С целью наиболее полного учета количества
микроорганизмов образцы почв подвергались самым различным механическим
и химическим воздействиям. Было установлено, что механические
воздействия гораздо более эффективны, поэтому они были
выбраны как главные. Кроме того, часто бывает нежелательным
внесение химикатов в среду для культивирования
микроорганизмов, и химических обработок лучше избегать.
Из механических воздействий испытывались: 1) 1-минутное
перемешивание от руки почвенной суспензии в колбах; 2)
10-минутное встряхивание почвенной суспензии в пробирках,
закрытых резиновыми пробками; 3) растирание почвы, увлажненной
до пастообразного состояния; 4) обработка на пропеллерной
мешалке — миксере (микроизмельчитель тканей РТ-2, 5 000 об/мин);
5) обработка ультразвуком небольшой частоты и мощности на
установке английской фирмы MSE или установке УЗДН-1
отечественного производства.
Механическая обработка была наиболее эффективной, а
химическую обработку оказалось целесообразнее проводить лишь
в сочетании с механической. Из химических веществ испытыва-
57
Дерново-подзолистая почва
Встряхивание в колбах I 311 I I 330 I I 580 [ I 43 I I 40 I
Встряхивание в пробирках 793 2,5 940 2,8 1200 2,1 57 1,3 51 1,3
Растирание 5 мин 1334 4,3 1053 3,2 1520 2,6 163 3,8 100 2,5
Обработка на мешалке 5 мин 1271 4,1 1131 3,4 1415 2,4 150 3,5 83 2,1
Обработка УЗ 5 мин | 1392 | 4,4 | 1600 | 4,8 | 1911 | 3,5 | 200 | 4,6 | 123 | 3,8
Перегнойно-глеевая почва
Встряхивание в колбах I 326 I I 351 I I 520 I I 15 I I 14 I
Встряхивание в пробирках 700 2,1 720 2,0 1080 2,1 23 1,5 18 1,3
Растирание 10 мин 8784 27,0 11000 31,3 13320 25,6 254 16,9 200 14,3
Обработка на мешалке 30мин 16 492 50,6 10 670 30,4 14 000 26,9 204 13,6 210 15,0
Обработка УЗ 20 мин | 147720 | 453,1 | 160500 | 257,3 1546000 | 1050,0 | 2500 | 166,6 | 1800 |128,6
Мощный чернозем
Встряхивание в колбах I 338 I I 274 I I 890 I I 52 I I 62 I
Встряхивание в пробирках 480 1,4 334 1,2 1100 1,2 70 1,3 85 4,4
Растирание 5 мин 1512 4,4 1480 5,4 4 181 4,7 311 6,0 300 4,8
Растирание 5 мин с ал- 2376 7,0 2320 8,5 6112 6,8 466 9,0 438 7,0
килсульфатом
Обработка на мешалке 10 мин 1474 4,3 2 200 8,0 4 010 4,5 456 8,8 320 4 5,2
Обработка УЗ 3 мин 4720 14,0 6 460 23,6 13940 15,7 240 4,6 460 7,4
Обработка УЗ 3 мин с 5 840 17,2 6 060 22,1 13 220 14,8 700 13,4 820 13,2
алкилсульфатом III III
58
Продолжение табл. ti
Бактерии I Актин омицеты
Варианты обработки мясопептонный агар крахмало-аммиачный агар почвенный агар крахмало-аммиачный агар I почвенный агар
J I | II I I | II I I | II J I j II J I | II
Темно-каштановая почва
Встряхивание в колбах I 288 I I 380 1 | | I 20 I II
Встряхивание в пробирках 321 1,1 420 1,1 30 1,5
Растирание 5 мин 954 3,3 1000 2,7 65 .3,2
Растирание 5 мин с ал-
килсульфатом 1818 6,3 2123 5,6 89 4,4
Обработка на мешалке 10 мин 890 3,0 1118 2,9
Обработка УЗ 3 мин 2400 8,3 2771 7,3 121 6,0
Типичный серозем
Встряхивание в колбах I 636 | I 512 I I I 1 28 I II
Встряхивание в пробирках 831 1,3 780 1,5 51 1,8
Растирание 5 мин 1772 2,8 1210 2,3 124 4,4
Растирание 5 мин с
муравьиной кислотой 2160 3,4 1631 3,2 150 5,3
Обработка на мешалке 10 мин 1932 3,0 1376 2,7 122 4,4
Обработка УЗ 3 мин 2691 4,2 2030 4,0 175 6,3
Краснозем
Встряхивание в колбах I 362 | | 525 I I 720 I I актиномицетов при всех
Встряхивание в пробирках 590 1,6 632 1,2 1120 1,5 обработках очень мало
Растирание 5 мин 684 1,9 392 1,7 2018 2,8
Растирание 5 мин с пиро- 1066 2,9 1630 3,1 3900 5,4
фосфатом
Обработка на мешалке 10 мин 1043 2,9 1550 3,0 2192 3,4
Обработка на мешалке 1360 3,8 1645 3,1 4110 5,7
10 мин с пирофосфатом
Обработка УЗ 3 мин 840 2,3 2500 4,7 5229 7,3
Обработка УЗ 3 мин с 1448 4,0 4092 7,8 7360 10,2
пирофосфатом I I I I I I I
Примечание. I — тыс/га, II — увеличение по сравнению с контролем.
лись пирофосфат натрия, натриевая щелочь, органические и
неорганические кислоты (для карбонатных почв),
поверхностно-активные вещества (ПАВ), ферменты.
В табл. 11 представлены лучшие варианты обработки, которые
могут представлять интерес в практической работе
микробиологов. При учете бактерий и актиномицетов лучшим приемом для
всех почв оказалась обработка ультразвуком (УЗ), причем для
некоторых почв ее нужно было сочетать с химическим
воздействием определенными реагентами. Сочетание обработки
ультразвуком с воздействием пирофосфатом натрия дает существенное
увеличение определяемого количества бактерий в красноземе
(структура почвы образована полуторными окислами, которые
растворяются пирофосфатом), а сочетание ультразвуковой
обработки с воздействием алкилсульфатами натрия дает увеличение
определяемого числа бактерий в черноземе и каштановой почве
(структура почв образована органическими веществами).
Учитываемое количество бактерий в разных типах почв после
предварительной обработки возрастает не пропорционально: в
одних почвах в 2—5 раз, в других — в 10—1000 раз.
Эффективность обработки в большой степени зависит от особенностей
исследуемого типа почв (табл. 12). В дерново-подзолистой почве
определяемое количество бактерий увеличилось в 3,5—4,8 раза, в;
перегнойно-глеевой почве — в 450—1050, в черноземе — в 15—
22, в каштановой почве — в 7—8, в сероземе — в 4, в
красноземе — в 4—10 раз. Больший эффект получается для тех почв,,
которые сильно агрегированы, содержат большое число адгезиро-
ванных клеток и микроколоний. Например, эпилюминесцентная
микроскопия показывает, что перегнойно-глеевая почва
чрезвычайно богата бактериями и в этом отношении резко выделяется
среди всех остальных исследованных почв. В этой почве
определено 15 млрд. клеток бактерий на 1 г почвы, причем
большинство клеток было адгезировано, а также располагалось внутри
агрегатов. Обнаружено также очень много микроколоний. При
использовании чашечного метода в этой почве было выявлено
примерно столько же бактерий, сколько обнаруживалось в бедной
дерново-подзолистой почве или в красноземе. Таким образом*
обычная подготовка почв не дает возможности вскрыть различия
в количестве бактерий в почвах разных типов и мало пригодна
для их сравнения. Особенно искаженные результаты
получаются при применении метода тривиальной подготовки образцов для
сравнения количества бактерий в почвах, резко отличающихся
по агрегатному состоянию, или в почвах, обладающих различной
адгезионной способностью по отношению к клеткам
микроорганизмов.
Если судить по результатам обычной обработки
(встряхивание почвенной суспензии в колбах; табл. 13), то во всех
исследованных почвах содержится примерно одинаковое количество
бактерий, способных расти на взятых для опыта средах. Однако
после специальной предварительной обработки выясняется, что в
60
действительности количество бактерий в этих почвах резко
отличается.
Наибольшее число бактерий во всех случаях было выявлена
Таблица 12
Количество бактерий в почвах разных типов при обычной
и при ультразвуковой обработке образцов, тыс/г
Почва
Дерново-подзолистая
Мощный чернозем
Луговая чернозе-
мовидная
Перегнойно-карбо-
натная
Перегнойно-глеевая
Горно-луговая
субальпийская
Темно-каштановая
Типичный серозем
Краснозем
Обычная
обработка
1 (А)
340
420
510
430
330
230
300
636
362
Обработка
ультразвуком
(Б)
850
7 224
11730
5 590
149 490
2 346
2 430
2 671
1448
Б/А
2,5
17,5
23,0
13,0
453,1
10,2
' 8,1
4,2
4,2
Таблица 13
Влияние метода предварительной подготовки почв к микробиологическому
анализу на количественный учет бактерий в образцах из разных генетических
горизонтов
Почва; лучший вариант
обработки
Дерново-подзолистая;
растирание в
течение 5 мин
Обыкновенный
чернозем;
растирание 5 мин
с алкилсульфатом
Темно-каштановая;
растирание 5 мин с
алкилсульфатом
Горизонт
Ао
Ai
А,
в2
С
Ах
Bi
в2
В/С
С
А2
в1
в2
С
Глубина
взятия образца,
см
1—3
5-7
15—25
50—60
110—120
10—20
35—45
65-75
95—105
180—190
10—20
25—3-
40—50
60—70
Количество бактерий, тыс.
на 1 г воздушно-сухой почвы
(МПА, разведенный в 10 раз)
обычный
метод учета
(А)
360
440
180
48
22
к 534
342
' 108
32
18
310
250
48
11
лучший
вариант обработки
(В)
1940
1400
378
100
34
3508
2120
501
98
23
1457
1011
197
15
В/А
5,1
3,2
2,1
2,1
1,5
6,6
6,2
4,7
3,1
1,3
4,7
4,0
4,1
1,4
после ультразвуковой обработки. Специальная работа (Звягинцев-
и др., 1966; Звягинцев, Андреева, 1978) показала, что при
использовании ультразвуковой установки УЗДН-1 предпочтение следует
61
отдать следующему режиму обработки: 4 мин, 0,44 А, 15 кГц.
Однако ультразвуковая обработка может сильно повреждать
некоторые виды почвенных бактерий. Во всяком случае, чистые
культуры бактерий отличаются совершенно различной устойчивостью
к ультразвуковому воздействию. Так, Е. coli оказалась весьма
чувствительной (Перцовская и др., 1975), а клубеньковые
бактерии — устойчивыми (Звягинцев и др., 1976). Почвенные
бактерии, находящиеся непосредственно в почве, отличаются большой
устойчивостью к ультразвуку. Однако интенсивность гибели
клеток от действия ультразвука непосредственно в почве очень
трудно определить, так как в опытах по учету живых бактерий на
питательных средах определяется только результирующая двух
процессов: десорбции и дезагрегации, с одной стороны, и
отмирания клеток — с другой.
При отсутствии ультразвуковой установки или
нежелательности ее применения можно использовать метод растирания
почвенной пасты или метод обработки почвенной суспензии на
пропеллерной мешалке (миксере). Эти приемы дают сходные
результаты, но применение мешалки дает возможность больше
стандартизировать условия проведения опытов. В большинстве
исследованных почв этими методами учитывается всего в 1,1—
1,5 раза меньше бактерий, чем при применении ультразвука.
Исключение составляют сильно оструктуренные почвы, в которых
при помощи ультразвука учитывается в 2—40 раз больше
бактерий, чем при использовании мешалки. При определении числа
^актиномицетов обнаружены примерно такие же закономерности.
При учете почвенных грибов ультразвуковая обработка
оказывает явно отрицательное действие. Известно, что чем крупнее
клетка, тем больше она повреждается ультразвуком. Крупные
клетки грибов больше повреждаются ультразвуком, чем мелкие
клетки бактерий. При определении численности грибов лучше
всего использовать пропеллерную мешалку.
При применении же растирания и мешалки в некоторых
случаях становится особенно необходимой обработка химическими
реагентами, например при исследовании чернозема, каштановой
почвы и краснозема. Для двух первых почв при растирании
наиболее полезной оказалась обработка ПАВ — вторичным алкил-
сульфатом (додецилсульфатом). Это анионоактивное вещество
действовало наиболее эффективно при концентрации 0,05—0,01%.
Для краснозема наиболее эффективным было применение пиро-
фосфата натрия в концентрации 0,1%. Применение этих веществ
дало возможность повысить определяемое количество бактерий
в 1,5—1,7 раза.
Перемешивание почвенной суспензии в колбах является
самым неудачным способом подготовки почв к анализу (см.
табл. 11). При такой обработке почвенные агрегаты совершают
плавное поступательно-вращательное движение и не
подвергаются существенному диспергированию. Даже простая замена колб
лробирками, закрытыми резиновыми пробками, и замена враща-
62
тельного движения встряхиванием приводят к довольно сильному
увеличению определяемого количества бактерий.
Даже те большие количества бактерий, которые учитываются
после предварительной подготовки почв, никак нельзя считать
завышенными, а нужно рассматривать как заниженные. Это
обусловлено тем, что ни один из использованных методов не дает
возможности полностью десорбировать клетки, разрушить все
агрегаты и разделить все микроколонии, хотя лучшие варианты
обработки приближают к поставленным целям.
Сравнение количества микроорганизмов в разных генетических
горизонтах почв, определяемое обычным методом, не дает
достоверных результатов. В связи с различной степенью
агрегированное™ и различиями в адгезионной способности отдельных
горизонтов по отношению к микроорганизмам они в разных
горизонтах учитываются с неодинаковой степенью полноты (см»
табл. 13). Например, после предварительной обработки дерново-
подзолистой почвы в образцах из гор. АО удалось учесть в 5,1
раза, гор. В — в 2,1, а гор. С — только в 1,5 раза больше
бактерий, чем в тех же горизонтах при обработке обычным методом.
Та же закономерность отмечена для чернозема и каштановой
почвы. В нижних горизонтах почв содержится меньше адгезиро-
ванных клеток, структура выражена хуже, и бактерии даже при
обычном способе подготовки почв в нижних горизонтах
учитываются более полно, чем в верхних. При обычном способе
подготовки почв результаты по количеству микроорганизмов в
почвенном профиле получаются заниженными для верхних
горизонтов, т. е. в нижних горизонтах содержится еще меньше
микроорганизмов по сравнению с верхними горизонтами, чем считали до
сих пор.
Эффективность предварительной подготовки почв к
микробиологическому анализу сильно зависит от степени увлажнения почв.
До сих пор рассматривались материалы, относившиеся к
воздушно-сухим почвенным образцам. При проведении исследований с
образцами, взятыми в поле во влажном состоянии,
обнаружилось, что предварительная обработка дает возможность увеличить
определяемое количество микроорганизмов в меньшее число раз,
чем для сухих почв: часто в 2—3 раза, а для некоторых почв —
в 10 раз и более. Чем сильнее увлажнена почва, тем меньшее
действие оказывает предварительная обработка (Звягинцев,
1966). Наиболее сильно ее действие проявляется на образцах
сухой почвы, меньше — на почвах, увлажненных до
максимальной гигроскопичности, и обычно оно еще меньше на почвах,
увлажненных более сильно — до капиллярной влажности или
полной влагоемкости. Отсюда следует, что при использовании
обычного метода подготовки почв почти невозможно сравнить
количество бактерий в образцах, увлажненных до различной степени,
так как в зависимости от степени увлажнения бактерии будут
учитываться более или менее полно.
Если судить по результатам, полученным с помощью обычной
63
обработки, можно думать, что количество бактерий при
увлажнении почв до максимальной гигроскопичности увеличивается.
Например, количество бактерий, учитываемых на мясопептонном
агаре, увеличивается в почве, увлажненной до максимальной
гигроскопичности, по сравнению с сухой почвой почти в 2 раза.
Однако если сравнение вести по варианту с применением лучшей
лредварительной обработки почв, что, безусловно, более
правильно, то можно видеть, что количество бактерий после увлажнения
до максимальной гигроскопичности не увеличивается, т. е.
приходится сделать совершенно противоположный вывод (Звягинцев,
1966).
Таким образом, при сопоставлении количества бактерий в
образцах почв, увлажненных в разной степени, нужно учитывать
возможность возникновения ошибки из-за различной полноты
учета клеток при разной влажности.
Отсюда следует и другой важный вывод. Пользуясь обычной
подготовкой почв к анализам, нельзя судить о степени гибели
клеток бактерий при высушивании почвенных образцов. По
разнице в количестве бактерий, определяемых до и после
высушивания почвенного образца, обычно судили о степени гибели клеток
из-за высушивания. Однако оказалось (Звягинцев, 1970в), что
здесь действуют два фактора: гибель клеток и увеличение
степени адгезии их при высушивании. При применении
предварительной подготовки почв к микробиологическому анализу в
высушенных образцах удается гораздо более полно учесть количество
микроорганизмов.
Таким образом, обычный способ подготовки почв к
микробиологическому анализу (10-минутное перемешивание почвенной
суспензии в колбах) особенно плох, когда необходимо сравнивать
количество микроорганизмов в почвах разных типов, резко
отличающихся по агрегатному состоянию и по адгезионной
способности, в почвах, увлажненных до различной степени, или в сухих
и влажных образцах, в замерзших и незамерзших почвах, а
также при сравнении количества бактерий в разных генетических
горизонтах почв. В этих случаях обычная предварительная
обработка почв приводит к резкому искажению истинных
соотношений количества бактерий.
Однако все методы предварительной подготовки почв к
микробиологическому анализу не дают возможности учесть
абсолютное содержание микроорганизмов в почве, часть клеток всегда
остается адгезированной. Для более полного учета количества
микроорганизмов в почве мы (Звягинцев и др., 1982, 1984)
предложили использовать метод, подобный тем, которые используют
зоологи (энтомологи). Численность микроорганизмов
учитывается обычным методом с применением ультразвуковой обработки.
Затем собирается почвенный осадок, и он еще раз подвергается
ультразвуковой обработке для десорбции следующей порции
бактерий, которая и учитывается с помощью нового метода посева.
Затем расчет количества бактерий, находившихся в почве, прово-
64
дится по методу Циппина (Звягинцев и др., 1982, 1984).
Определения с внесением в почву клубеньковых бактерий показали, что
метод дает возможность учесть 90% от внесенного количества
«леток. Однократная обработка позволяет учесть только
30% клеток.
АКТИВНОСТЬ АДГЕЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК
Аэробные микробиологические процессы
Скорость размножения свободных и адгезированных клеток.
Прямое наблюдение под микроскопом за .скоростью размножения
адгезированных клеток и сравнение ее со скоростью размножения
•свободных клеток показали, что, если адгезия происходила на
веществах с относительно инертной поверхностью, не содержавшей
биологически активных веществ (микроклин, кварцевый песок,
асбест, измельченное стекло), адгезироваиные клетки начинали
размножаться одновременно со свободными. Адсорбенты,
содержавшие на своей поверхности биологически активные вещества;
резко изменяли продолжительность лаг-фазы адгезированных
клеток.
Продолжительная лаг-фаза для адгезированных клеток
отмечалась в тех случаях, когда в качестве адсорбента использовались
почвы, поверхность частиц которых всегда несет биологически
активные вещества. Лаг-фаза удлинялась в 1,5—3 раза.
Опыты с глинистыми минералами, обладавшими мелкими
частицами и образовывавшими с клетками агрегаты, показали, что
эти вещества могут оказывать большее действие на размножение
клеток, чем микроклин и роговая обманка. В одних случаях они
несколько стимулировали, в других — несколько задерживали
размножение клеток. f ;
В процессе развития микробной культуры адгезия клеток
может изменяться. Ряд бактериальных культур (Micrococcus sp.,
Staph, aureus, Ps. violacea, Ps, pyocyanea) прочно адгезируётсй
на стекле или других адсорбентах, и клетки на протяжении
своего развития (несколько суток) находятся в адгезированном со1
стоянии. Отделившиеся клетки могут оказаться в свободном со*
стоянии, но если клеток достаточно, то все участки, способные
адгезировать клетки, заполнены ими. Некоторые культуры,
например Вас. cereus (mycoides), в процессе развития выходили и?
адгезированного состояния.
Почвенные бактерии Pseudomonas sp. в начале опыта прочно
адгезировались на стекле. В процессе- развития клетки стали
подвижными и вышли из адгезированного состояния. Через двое
суток клетки вновь адгезировались на стекле и их не удалось
отмыть даже сильной струей воды. >
Таким образом, в процессе активного развития и
размножения клетки могут менять свое положение, переходя из адгезиро-
занного в свободное состояние и наоборот. Это, имеет определен-
3 Д- Г. Звягинцев
т
ное экологическое приспособительное значение, что уже отмечали
некоторые авторы.
Влияние адсорбентов на дыхание микроорганизмов. Многие
исследователи определяли активность адгезированных клеток по»
интенсивности дыхания как суммарному показателю, причем
обычно оставалось неизвестным, какие конкретные факторы
влияли на жизнедеятельность.
Определяя активность дыхания по выделению СОг, Е. В. Диа-
нова и А. А. Ворошилова (1925), Н. Н. Худяков (1926), Пил
(Peele, 1936) пришли к выводу, что адгезия сильно угнетает
жизнедеятельность бактерий. Авторы приписывали вредное
действие на клетки силам, обусловливающим адгезию. Мнение об
инактивирующем действии сил адгезии на клетки бактерий было»
широко распространено, хотя и является совершенно ошибочным.
Веблей (Webley, 1947) впервые применил для изучения
дыхания клеток адгезированных почвенными частицами, метод Вар-
бурга и пришел к выводу, что при различных степенях
увлажнения субстрата определяющим фактором является аэрация. Прк
внесении в суспензию большого количества почвы с увеличением
вязкости скорость потребления кислорода уменьшалась. Особенно*
малой она была при переходе почвенной суспензии в
пастообразное состояние и снова возрастала при дальнейшем увеличении
количества почвы. При достижении капиллярной влажности почвы
аэрация снова возрастала. Внесение в почву веществ,
улучшающих почвенную структуру, увеличивало аэрацию и повышало
потребление кислорода (Quastel, Webley, 1947). Эллингер и Квестел
(Ellinger, Quastel, 1948), изучая развитие дрожжей в тонких
пленках, окружающих частицы адсорбентов (фильтровальная,
бумага, пемза, пермутит, почва), пришли к выводу, что
добавление адсорбентов равноценно встряхиванию сосудиков прибора
Варбурга, т. е. улучшает снабжение клеток кислородом.
Добавление песка не приводило к существенному увеличению дыхания,,
так как он обладает малой величиной поверхности. Из всех
адсорбентов только кокс оказал отрицательное действие.
Экспериментально было показано, что он содержит токсические
вещества. При сильном увеличении толщины пленки на частицах
адсорбентов скорость диффузии кислорода становилась лимитирующим
фактором для размножения клеток.
Интересна работа по изучению влияния на дыхание Вас. sub-
tilis внесения в среду меньших по размеру, чем бактериальные
клетки (Lahav, Keynan, 1962), частиц бентонита и аттапульгита.
Частицы адсорбировались на бактериальных клетках и
образовывали вместе с ними агрегаты. Отмечается и положительное и
отрицательное влияние адсорбентов на интенсивность дыхания.
При низких концентрациях бентонита наблюдалось уменьшение
скорости дыхания, сопровождавшееся образованием крупных
агрегатов в суспензии. При высоких концентрациях этого минерала
происходило увеличение скорости дыхания, сопровождающееся
полным диспергированием суспензии. Аттапульгит образовывал
66
с клетками менее прочные агрегаты, и его действие было более
слабым по сравнению с бентонитом. Изучалось как эндогенное
дыхание, так и дыхание в присутствии глюкозы. Количество
доступной глюкозы уменьшалось в присутствии бентонита. Она
адсорбировалась и становилась частично недоступной для клеток.
Прямых доказательств адсорбции глюкозы не приводится, но
делается ссылка на работу Гринланда (Greenland, 1956), в
которой было найдено, что на М§2+-монтмориллоните фиксируется
до 1% глюкозы от веса минерала. Примерно такое же
количество глюкозы оказалось недоступным для микроорганизмов и в этой
работе. Авторы пришли к выводу, что основную причину в
изменении активности бактерий при внесении минералов следует
искать в образовании агрегатов, изменении диффузии
питательных веществ и газов, а также в фиксации на минералах
питательных субстратов.
Различное действие ряда адсорбентов на дыхание Staph,
aureus, Mycobact. tuberculosis, E. coll отмечено в работе Бунемана
(Bunemann et al., 1963). Наибольшее положительное действие
адсорбенты оказывали на Myvobact tuberculosis.
Угнетающее действие адгезии на дыхание бактерий Azotobac-
ier agile, E. coli, Ps. fluorescens, Micrococcus luteus на
ионообменных смолах — анионите Дауэкс-1 и катионите Дауэкс-50 —
отмечено Хаттори и др. (Т. Hattori, Furusaka, 1959a, b, 1961;
R. Hattori, T. Hattori, 1963; Т. Hattori, 1973; Filip, Hattori, 1984).
Причины такого действия адсорбентов авторы объяснить не
смогли, хотя дыхание адгезированных микроорганизмов сильно
снижалось (примерно на 30%). Установлено влияние на адгезиро-
ванные клетки специфического рН, создающегося на поверхности
раздела жидкости и ионообменной смолы. Наибольший интерес
в работах Хаттори представляет попытка выяснить причину
сокращения лаг-периода у адгезированных клеток по сравнению со
•свободными. В опытах с адгезированными клетками было
отмечено исчезновение лаг-периода при использовании янтарнокислого
натрия клетками, -предварительно выращенными на глюкозе, хотя
юн был более продолжительным у свободных клеток. Из клеток,
выращенных на глюкозе, горячей водой удалось экстрагировать
вещества, которые резко удлиняли лаг-период. При добавлении
смолы внесенные токсические вещества адсорбировались ею и
лаг-период резко сокращался. Токсичные вещества со смолы
удалось элюировать и идентифицировать как гекса- или гептануклео-
тиды. Сокращение лаг-периода может быть объяснено
следующим образом. Определенные нуклеопротеиды могут включаться
в контролирующий механизм индукционного образования сукци-
нат-транспортной системы и извлекаться из клеток, которые ад-
гезируются на смоле. Эти вещества могут играть роль в
блокировке сукцинат-транспортной системы в клетках, выращенных на
глюкозе. В настоящее время известно довольно много веществ,
вырабатываемых микроорганизмами и регулирующих их рост.
Адсорбция таких веществ на вносимых в среду твердых частицах,
з*
67
естественно, может сильно сказываться на развитии культуры.
Стотцкий (Stotzky, 1966a, b; Stotzky, Rem, 1966, 1967) изучал?
дыхание многих.микроорганизмов (бактерий и грибов) в
присутствии различных минералов. Для бактерий почти во всех
случаях наблюдался стимулирующий эффект, величина которого
зависела от природы адсорбента, характера насыщающих его
ионов, количества адсорбента, природы микроорганизма и т. д..
Минералы с большей емкостью оказывали более сильное положит
тельное действие, чем минералы с малой емкостью поглощения
катионов. Стимулирующее действие обычно наблюдалось при
концентрации адсорбента от 0,1 до 8%. Положительное действие
проявлялось на широком спектре бактерий, различающихся по
систематическому положению, морфологии, окрашиваемости по<
Граму, подвижности и т. д. Стимуляция наблюдалась на всех
стадиях роста культуры, но особенно в первый период ее
развития. Используя гомоионные образцы монтмориллонита, Стотцкий
(Stotzky, 1966a) показал уменьшение стимулирующей активности
минерала на дыхание бактерий в следующем ряду: Na+>Ca2+>
>Mg2+>K+>H+. Установленный порядок стимуляции не
совпадает с в;алентностью ионов или с электрокинетическим
потенциалом, а скорее отражает физиологическое действие катионов,
Стотцкий (Stotzky, 1966а,b) показал, что дыхание бактерий
зависит от катионообменной способности и от суммарной
поверхности глин, но не от величины их частиц.
Наиболее полно зависимость дыхания от природы адсорбента
была изучена на примере Agrobacterium radiobacter. Его
дыхание наиболее сильно стимулировалось минералами типа 1:2
(монтмориллонит, вермикулит, иллит, прохло.рит, тальк).
Некоторые минералы типа 2:1 (пирофилит, слюда), минералы типа 1: 1
(каолинит, галлоизит), а также ионообменные смолы, частицы
полистирола и стеклянные бусы оказывали более слабое
действие на стимуляцию дыхания. Стимулирующее действие авторы
объясняют буферной способностью минералов и тем, что они
могут служить источником некоторых питательных элементов.
Однако сами авторы отмечают недостаточность такого объяснения*
Интересно отметить, что в работах Стотцкого в
противоположность всем другим работам отмечается только
положительное действие адсорбентов на дыхание бактерий.
Стотцкий и Рем (Stotzky, Rem, 1967) изучали дыхание мице-
лиального гомогената 27 видов грибов, представляющих 4 класса.
В противоположность опытам с бактериями дыхание грибов не
зависело от добавления монтмориллонита и каолинита в
концентрации меньше 4%. Однако оно заметно подавлялось при
концентрации монтмориллонита более 4%. Каолинит подавлял дыхание
только при концентрации выше 40%. В этих случаях активность-
дыхания понижалась из-за возрастания вязкости среды и
затруднения диффузии кислорода.
Действие адсорбентов на дыхание микроорганизмов в
зависимости от конкретных условий проведения опытов может быть
68
очень различным и даже прямо противоположным (Звягинцев
1969; Великанов, 1969). Большое влияние на конечный эффект
действия оказывает природа адсорбентов, особенности
изучаемого микроорганизма и концентрация субстрата. Все это заставляв*
полагать, что влияние введения в питательную среду адсорбентов
и адгезия на его частицах клеток микроорганизмов проявляется
сложным образом через изменение не какого-то одного, а целого
комплекса факторов.
Действие адсорбентов (стекла) на развитие бактерий в очень
разбавленных питательных средах (вода) обусловлено, по
мнению Зобелла (Zobell, 1943), концентрированием на поверхности
клеток питательного субстрата и экзоферментов.
В наших экспериментах питательные вещества брались в
широком интервале концентраций, адсорбентами служили глинистые
минералы. Похожие исследования Стотцкого и Рема (Stotzky,
1966a,b; Stotzky, Rem, 1966, 1967) констатировали, что все глини-*
стые минералы стимулируют жизнедеятельность бактерий. В
наших опытах обнаружено, что глинистые минералы могут оказы*
вать на жизнедеятельность микроорганизмов более разнообразное
блияние. Адсорбенты действовали на разные бактериальные
культуры по-разному: стимулировали или угнетали их активность.
Стотцкий и Рем не приводят данных о степени адгезии бактерий
в разных вариантах опытов. Целью нашей работы было
выяснение активности именно адгезированных клеток. Для повышения
степени адгезии бактерий количество адсорбентов в среде
увеличивали до 10%. При этом подавляющее большинство клеток
бактерий было адгезировано, в то же время суспензия оставалась
еще достаточно жидкой, чтобы при встряхивании на аппарате
•Варбурга осуществлялись хорошее перемешивание и снабжение
кислородом. За время опытов бактерии не освобождались от
минералов, что устанавливалось с помощью прямого микроскопи-
рования. Поэтому можно считать, что дыхание осуществлялось
именно адгезированными клетками.
Проведенные опыты дают интересные сведения о зависимости
интенсивности дыхания адгезированных клеток от специфики
бактерий. Так, интенсивность дыхания, особенно в первые часы
опыта с Н-бентонитом, когда влияние адсорбента проявляется
наиболее сильно, сокращалась в 1,5—3 раза в опытах с культурами
Pseudomonas pyocyanea, Serratia marcescens, Bacillus megaterium,
Staphylococcus aureus, несколько подавлялась для Micrococcus
luteus, напротив, интенсивность дыхания Вас. brevis в 2—3 раза
возрастала. Н-гумбрин в 3 раза сокращал потребление кислорода
культурой Вас. megaterium и несколько стимулировал
потребление кислорода культурой Ser. marcescens. Н-каолинит
стимулировал дыхание Вас. brevis, почти не влиял или немного
стимулировал дыхание Ps. pyocyanea. ¦
Особенно сильная интенсификация дыхания и потребления
глюкозы была обнаружена в опытах с Az. chroococcum при
внесении в среду бентонита. Через 6 ч после начала опыта адгези-
69
рованные клетки потребляли в 21 раз больше кислорода
(рис. 14).
Однако влияние адсорбентов зависит не только от вида
изучаемой бактерии, но может для одной бактерии меняться даже на
противоположное, если изменяются условия проведения опытов.
Адгезия на почвенных частицах часто оказывает сильное
действие на активность микроорганизмов (Звягинцев, 19596). Адге-
зированные на частицах перегнойно-глеевой почвы клетки Staph,
aureus поглощали в 2 раза больше кислорода, чем свободные
клетки, находившиеся в почвенных вытяжках из этих же почв.
Следует отметить, что высокая интенсивность дыхания еще не
говорит о хорошем росте бактерий. Интенсификация дыхания
часто наступает при введении токсичных веществ. В
рассматриваемом случае интенсивное дыхание, видимо, было вызвано
наличием в почве токсичных для Staph, aureus веществ, так как в
скором времени клетки лизировались.
Потребление кислорода клетками, находящимися в адгезиро-
ванном состоянии на поверхности почвенных частиц, может
повышаться, понижаться или оставаться без изменений по
сравнению с интенсивностью дыхания
свободных клеток. Происходящие
изменения в интенсивности дыхания
зависят от вида бактерий,
подвергающихся адгезии, и от типа почвы,
взятой в качестве адсорбента.
Таким образом, наличие почвенных
частиц и прямой контакт клеток и
частиц ведут к сильному изменению
активности микроорганизмов.
Положительное влияние
бентонита на интенсивность дыхания
бактериальных культур отмечали ряд
авторов (Филип, 1968; Флайг и др,,
1971; Filip, 1969, 1973; Filip, Hat-
tori, 1984). С увеличением концент-
Рис. 14. Влияние адсорбентов на дыхание
и потребление глюкозы Azotobacter chroo-
^^__________^ соссит: 1 — среда с глюкозой (контроль);
/ 2*5 4 5 62 — та же среда +Н-каолинит; 3 — та
Время,ч же среда -ЬН-бентонит
рации бентонита дыхательная активность клеток бактерий
увеличивалась.
Аллофан оказывал на дыхание Е. coli и положительное, и
отрицательное действие. Положительное объяснено регулирующим
действием аллофана на рН среды, а отрицательное —
продуцированием растворенных алюминия и фтора (Cooper, Morgan,
1979).
Особо изучалось влияние добавления адсорбентов (глинистых
70
минералов, угля и т. д.) в почву или в песок и определялась
скорость потребления субстрата комплексом почвенных
микроорганизмов. В этом случае исследователи работали с пастообразной
системой, где могли быть затруднения в отношении скорости
диффузии газов, а также субстрат мог оказаться в определенных
микрозонах, где не было клеток микроорганизмов.
Принципиально новых закономерностей не было получено, но подтвердились
закономерности, которые были установлены для жидких
суспензий. В некоторых случаях был обнаружен дефицит кислорода.
Подробные исследования в этом направлении были проведены
Новаковой (Novakova, 1972, 1974a,b; 1975). Она изучала
дыхание смеси почвенных микроорганизмов в жидкой и песчаной
культурах, а также в почве с добавлением разных концентраций
каолинита и бентонита при внесении различных субстратов
(глюкоза — 0,1, 0,2, 0,5, 1%; крахмал% пептон). Полученные
закономерности не укладываются в простую схему. Из более общих
закономерностей следует отметить следующие. Внесение
минералов приводило к сокращению лаг-периода и стимулировало
дыхание на первых этапах проведения опыта. Интенсивность
дыхания зависела от природы и концентрации минерала, от природы
и концентрации субстрата, от качественного состава катионов,
насыщающих минерал. Изменяя эти условия, можно было резко
менять интенсивность дыхания. Бентонит действовал сильнее, чем
каолинит. Бентонит и каолинит уменьшали полноту разложения
глюкозы при всех концентрациях субстрата, но каолинит был в
этом отношении более активен, чем бентонит. В растворе, песке
и почве наблюдалось сходное действие глинистых минералов.
Наиболее сильный эффект наблюдался при содержании
3% глины.
При объяснении природы действия минералов нзГ'бактерии Но-
вакова большое место отводит адсорбции субстрата и продуктов
метаболизма. Однако такое объяснение может быть принято
только как самое общее.
Филип (Filip, 1973, 1975, 1977) установил, что внесение в
почву глинистых минералов на фоне внесения глюкозы приводило
к стимуляции использования глюкозы для роста
микроорганизмов, нарастанию их биомассы, образованию вторичных
метаболитов, например меланинов, увеличивалась гликолитическая
активность. В присутствии монтмориллонита использование энергии
на синтетические процессы было более эффективным.
Анализируя работы по изучению влияния глинистых
минералов на скорость разложения различных адсорбированных на них
субстратов, следует отметить, что действие минералов и
адсорбции может быть самым различным в зависимости от
многочисленных конкретных условий, которые в каждом случае образуют
свои особые комплексы: окислительно-восстановительный
потенциал, рН, адсорбция и инактивация ферментов, доступность
адсорбированных веществ для ферментов, прочность адсорбции ве*
ществ и т. д. Сама по себе адсорбция мономерных органических
71
веществ обычно является обратимой и не может препятствовать
их поступлению в клетку, хотя и может ускорять или
задерживать этот процесс. ¦
В некоторых случаях отмечается резкое сокращение
использования после адсорбции молекул полимерных веществ
(нуклеиновых кислот, декстранов). Отметим, что адсорбция полимеров
часто является необратимым процессом. Действует так называемый
«эффект застежки „молния"»: макромолекула связывается с
адсорбентом по ряду точек, и разрыв связей по некоторым точкам не
приводит к отрыву макромолекулы. В каждой из точек связь,
согласно закону динамического равновесия, то ослабевает, то
возрастает. Мономер в момент ослабления связи отрывается, а
полимер остается связанным, так как в тот момент, когда
ослабевают связи в одних точках, он удерживается связями,
действующими в других точках, и т. д. Меньшая доступность
адсорбированных полимеров, видимо, в первую очередь обусловлена
трудностями, возникающими при действии на адсорбированные
полимеры гидролаз. Участки макромолекулы, на которые
воздействуют гидролазы, могут оказаться закрытыми, могут возникать сте-
рические препятствия для действия гидролаз. Ферменты и
субстрат могут оказаться адсорбированными разными участками
адсорбента и, таким образом, изолированными друг от друга.
Монтмориллонит защищал от разложения нуклеиновые
кислоты, при этом образовывался комплекс монтмориллонита с
нуклеиновыми кислотами (Greaves, Wilson, 1970).
Олнес и Клап (Olness, Clapp, 1972) сообщили, что
монтмориллонит уменьшает начальную скорость разложения декстрана
смесью почвенных бактерий. Степень подавления была обратно
пропорциональна концентрации монтмориллонита. Примерно 25%
адсорбированного декстрана вообще не использовалось
микроорганизмами.
Добавление к сточной воде каолинита и бентонита ингибирова-
ло разложение полиуретана (Filip, 1978).
Защитное действие глины установил Кукерт (Cuckert et al.,
1977). Глюкозу и микробные полисахариды, меченные по 14С,
адсорбировали на монтмориллоните и затем подвергали
микробной минерализации. Сравнение скорости разложения в
монтмориллоните велось со скоростью разложения этих веществ в
песке. В адсорбированном комплексе с глиной процесс
минерализации шел медленнее, чем в песке (24—79% от скорости в
песке). Из комплекса быстрее минерализовалась глюкоза, затем
полисахариды и наиболее медленно — микробные клетки.
При наличии в реакционной среде монтмориллонита, иллита
И каолинита разрушения микроорганизмами липополисахаридов
не происходило из-за адсорбции ферментов и липополисахаридов
на поверхности минералов (Cortez, 1976). Добавление 10%
бентонита задерживало на первом этапе (20 сут) разложение
соломы (Kubista, 1976). Адсорбция казеина и аспарагина на
монтмориллоните задерживала их разложение (Kobus, 1970). Адсорб-
72
ция может задерживать и разложение мономеров. Так, степень
окисления азотистых оснований (аденин, гуанин, цитозин, ура-
цил, тимин), адсорбированных на монтмориллоните, каолините,
иллите, гибсите и гетите, была неполной и варьировала в
пределах от 5 до 80% (Ivarson et al., 1982).
Много работ посвящено изучению влияния адсорбентов на
скорость разложения пестицидов. Так, было показано (Weber, Coble,
1968), что каолинит не влиял на скорость разложения диквата, а
монтмориллонит ингибировал деградацию из-за адсорбции
гербицида в межплоскостных пространствах и малой доступности его
для микроорганизмов.
В очень многих работах отмечается стимулирующее действие
адсорбентов на разложение бактериями мономеров и полимеров,
в некоторых работах не установлено ни стимулирующего, ни ин-
гибирующего действия.
Кунц и Стотцкий (Kunc, Stotzky, 1974, 1977) подробно
исследовали действие глинистых минералов на разложение
органических веществ в почве (Сахаров, алифатических и ароматических
кислот, альдегидов, аминокислот, целлюлозы, крахмала, казеина
и др.). Добавление минералов в почву не оказывало
существенного влияния на скорость минерализации органических
соединений. Существенно стимулировалось только разложение
альдегидов. Причины этого явления остаются неясными. -"~^
Много работ выполнено по стимулирующему влиянию
добавления адсорбентов в сточные воды при их микробиологической
обработке. При очистке сточных вод, как это ни странно, почти
всегда отмечалось только положительное действие адсорбентов.
Для стимуляции активности микроорганизмов, участвующих
при расщеплении богатых органическим веществом отходов, ре*
комендуется добавлять в систему алюмосиликаты (от 0,25 до 7%
от веса органического вещества: Wallace, 1981).
Процессы деструкции гексаметилендиамина и капролактама
культурой Вас. subtilis при добавлении в синтетическую среду
глинистых минералов значительно ускорялись (Ротмистров и др.,
1975; Гарбара, Ротмистров, 1982).
Биодеградация органических веществ сточных вод
осуществляется гораздо интенсивнее и полнее при наличии адсорбентов. ¦
Гранулированный активированный уголь оказывается лучшим
адсорбентом, так как обладает наибольшей на единицу веса
площадью поверхности. Необходимым условием биодеградации орга*
нического вещества является его начальная адсорбция на* по-л
верхности угля. На адсорбенте же располагаются адгезирован-
ные клетки микроорганизмов. Рост бактерий на угле описывается
синусоидальной кривой.
Для окисления в сточных водах трехвалентного мышьяка до
пятивалентного используются бактерии Pseudomonas putida, A lea-
ligenes entrophus, адгезированные на пластмассе или древесных*
стружках (Абдарашитова и др., 1982).
Экспериментально установлено, что клетки Acinetobacter sp.,.
73
покрытые окислом коллоидного железа, в 2 раза сокращали
экзогенное и эндогенное дыхание (Mac Rae, 1975).
Использование микроорганизмами твердых и нерастворимых
.субстратов. Как уже отмечалось, адгезия клеток выступает как
экологическая приспособительная особенность бактерий.
Особенно четко это положение прослеживается при использовании
бактериями твердого нерастворимого или плохо растворимого
субстрата.
При определении роли хемолитотрофных бактерий в
выщелачивании минералов многие исследователи придерживались
мнения, что бактерии только косвенно помогают окислению
сульфидных минералов посредством генерирования окислителя. Другие
полагают, что бактерии прямо действуют на кристаллическую
решетку. Исследовались в основном Г. thiooxidans, 7. ferrooxidans,
Т. denitrificans, Sulfolobus sp.
Многочисленными исследованиями установлено, что
измельчение серосодержащих минералов или частиц серы резко ускоряет
процессы их использования. Однако эти работы еще не
доказывают необходимости или желательности прикрепления клеток к
твердому субстрату.
Однако многие исследователи с помощью сканирующей
электронной микроскопии или другими методами установили
непосредственную адгезию клеток, которая может быть весьма плотной и
прочной. В ряде случаев обнаружено, что большая часть
популяций бактерий находится на твердой поверхности. Однако часть
клеток всегда находится в свободном состоянии, причем
распределение клеток между твердой и жидкой фазами зависит от
фазы роста культуры (Takakuwa et al., 1979). Вопрос о
специфичности адгезии на минералах, содержащих серу, остается не
совсем ясным. Например, Диспирито и др. (Dispirito et al., 1980)
установили, что клетки Thiobacillus ferroxidans в большом числе
прикрепляются к частицам серы, но прикрепляются также к
стеклянныхМ бусам, фторапатиту, пириту и кварцу. Для адгезии
клеток не требовалось наличия энергетического субстрата
(закиси железа). Другие авторы (Berry, Murr, 1976) отмечают
избирательную адгезию клеток на поверхности сульфидных
минералов, но слабую адгезию или отсутствие ее на силикатах.
Предполагается наличие определенных специфических
структур, обусловливающих адгезию у разных видов (Головачева,
1979; Berry, Murr, 1976). Непосредственными рецепторами,
ответственными за прикрепление, часто считают сульфгидрильные
группы. Прикрепление клеток к сере и их сероокисляющая
активность почти полностью подавлялись при добавлении SH-реаген-
тов. Таким образом, сульфгидрильные группы могут играть
значительную роль в процессе прикрепления (Takakuwa et al., 1979).
Довольно подробно изучено использование нерастворимого
субстрата (серы) клетками Thiobacillus thiooxidans. Если
разделить клетки и серу полупроницаемой мембраной, то окисление
серы не происходит.
74
Шивер и Брок (Shivvers, Brock, 1973) показали, что в первые
3—6 дней роста Sulfolobus acidocaldarius на сере количество
неприкрепленных клеток превышает количество прикрепленных.
После 6 дней роста количество неприкрепленных организмов
падало, и через 17 дней кристаллы серы были покрыты клетками.
Наблюдалась прямая корреляция между количеством
прикрепленных клеток и окислением серы.
Электронно-микроскопическое исследование углеродных
реплик, снятых с частиц серы, показывает, что бактериальные
клетки располагаются в выемках на поверхности частиц серы.
Выемка образуется благодаря воздействию на кристаллы адгезиро-
ванных клеток.
Внесение в среду, в которой культивируются Thiobacillus thio-
oxidans, поверхностно-активных веществ (фосфолипидов, твина,
кефалина, лецитина, фосфотидилинозита) способствует более
быстрому использованию серы. С помощью меченых по углероду
клеток показано, что добавление поверхностно-активных веществ
способствует более прочному прикреплению бактерий к частицам
серы. Эти вещества на поздних стадиях развития культуры
обычно не оказывают благоприятного действия, вероятно потому, что
культура образует их сама. Большое влияние на скорость
процесса окисления серы оказывают размеры частиц и их суммарная
поверхность. Чем больше суммарная поверхность, тем быстрее
идет процесс. Часто большая часть микробной популяции
связана с нерастворимым субстратом (серой, халькопиритом).
Имеются работы и по влиянию адгезии на активность
некоторых других бактерий, участвующих в выщелачивании ряда
катионов из горных руд. Во многих из них подчеркивается роль
поверхностно-активных веществ и адгезии клеток в интенсификации
процессов выщелачивания. Дункан и др. (Dunkan et al., 1964)
особенно подробно исследовали влияние поверхностно-активных
веществ на выщелачивание халькопирита культурой Thiobacillus
ferroxidans. Показано, что введение поверхностно-активных
веществ способствует более тесному контакту бактерий с
халькопиритом.
Мур и Бери (Murr, Berry, 1976) приходят к следующим
выводам, касающимся прикрепления бактерий к сульфидным рудам:
1) подтверждается прямой контактный механизм при
бактериальном выщелачивании;
2) наблюдается предпочтительное прикрепление бактерий к
поверхностям, содержащим восстановленное железо и серу;
3) прикрепление сопровождается растворением железа и меди;
4) увеличение суммарной поверхности минерала способствует
бактериальному прикреплению;
5) в местах прикрепления бактерий происходит накопление
прикрепительных биополимеров.
Положение о предпочтительном прикреплении к
поверхностям минералов, содержащим энергетические субстраты, очень
интересно, но не вполне доказано. Мур и Бери (Murr, Berry,
75
1976) утверждают, что через 18 дней инкубации все бактерии
были прикреплены к поверхностям, содержащим восстановленные
серу и железо. Такое прикрепление можно объяснить по-разному:
1) наличием у бактерий хемотаксиса; 2) наличием специфических
адгезинов, приводящих к адгезии именно на этих поверхностях;
3) адгезией на всех поверхностях, но выживанием и
размножением клеток на тех поверхностях, где был субстрат, и
отмиранием и лизисом на тех поверхностях, где субстрата не было.
Мур и Берри пришли к выводу, что прямой контакт между
сульфидными минералами и бактериями, вероятно, необходим
для биологического окисления.
Клетки Thiobacillus ferrooxidans, адгезированные на
синтетических пленках, гораздо активнее и длительнее осуществляли
окисление железа по сравнению со свободными клетками.
Микроорганизмы располагаются в непосредственном контакте
с частицами минерала. Адгезия бактерий, возможно, является
обязательным условием для успешного протекания процесса
разрушения горных пород и минералов. Установлена прямая связь
между величиной поверхности твердых углеводородов, вносимых
в среду, прикреплением к ним клеток микроорганизмов и
скоростью их использования (Sohngen, 1913). В последнее время это
положение было подтверждено для твердых и жидких
углеводородов рядом авторов (Watkinson, 1980; Hallas, Vestal, 1978; Miu-
ra, 1978).
Только низкомолекулярные жидкие углеводороды (С5—Си),
а также некоторые ароматические углеводороды могут
незначительно растворяться в питательной среде. Судя по имеющимся
данным, углеводороды не окисляются внеклеточными
ферментами. Они поступают в клетку в неизменном виде. Их метаболизм
осуществляется только внутриклеточно, и поэтому для
поступления их в клетки необходим прямой контакт с каплями
углеводородов, если количество углеродных атомов более одиннадцати,
или прямой контакт с частицами твердых углеводородов. В
последние десятилетия накоплен большой фактический материал,
подтверждавший это положение. С помощью микроскопии
(обычной, люминесцентной, электронной сканирующей) показано, что
большая часть клеток располагается либо на каплях
углеводородов, либо мелкие капли углеводородов или их пленки
окружают клетки микроорганизмов (рис. 15). Количество адгезирован-
ных и свободных клеток меняется по стадиям развития
культуры (Neufeld et al., 1980). Изучена кинетика процессов адсорбции-
десорбции (Vercooyen et al., 1980). Культуры, использующие
углеводороды, в процессе своего развития выделяют
поверхностно-активные вещества, что приводит к диспергированию
углеводородов, увеличению площади их поверхности, увеличению
количества контактов между клетками и нерастворимыми
углеводородами и повышению их использования.
Мутант Acinetobacter calcoaceticus со слабой адгезионной
способностью плохо рос на гексадекане. Для его роста необходи-
76
itfo было добавление эмульсана (Rosenberg, 1981).
Данные о непосредственном контакте получены не только с
помощью прямых микроскопических методов, но и с помощью
техники меченых атомов, разделения клеток и углеводородов,
полупроницаемой мембраной и определения локализации
субстрата химическими методами.
Контакт клеток с углеводородами вызван гидрофобным
взаимодействием. Причем гидрофобными являются отдельные
участки, а не вся поверхность клетки. В ответ на контакт с
углеводородами клетка «выставляет»
гидрофобные участки своей
поверхности наружу. Клетки,
выращенные на углеводах, могут
отличаться малой гидрофобностью
своей поверхности. Комплекс ли-
пофильных веществ
накапливается на поверхности клеток в
первые часы их роста на среде с
углеводородами. \
- Использование жидких
углеводородов стимулируется
твердыми адсорбентами (песком,
глиной, асбестом, углем и т. д.).
Жидкие углеводороды
обволакивают частицы адсорбента, что
приводит к резкому возрастанию
суммарной поверхности
углеводорода и увеличению скорости их
использования.
Некоторым исследователям
Рис. 15. Клетки культуры (в
люминесцентном микроскопе), использующей
углеводороды, адгезированные на
поверхности капли нефти
трудно представить себе механизм использования клейкой
твердых углеводородов, и они считают необходимым этапом усвоения
этих углеводородов предварительный перевод их в жидкое
состояние. Однако непосредственное растворение молекул
поверхности твердого углеводорода в липофильном веществе
поверхности клеток не вызывает сомнений, но скорость использования
мала. Дифенилметан при 30° в виде жидкофазных капель
использовался быстро (время генерации 2 ч), а при 20°, когда капли
дифенилметана затвердевали, рост сильно задерживался (Wod-
zinski, Larocca, 1977). Нафталин использовался гораздо быстрее
в виде жидкой смеси с гептаметилнонаном. Использовавшаяся
культура Pseudomonas sp. (Hydrohenomonas sp.) не способна
использовать последнее вещество.
77
Таким образом, при использовании микроорганизмами
углеводородов адгезия выступает как приспособительный признак и
является необходимым условием использования твердого
субстрата.
Значение адгезии клеток в превращении нерастворимых или
очень слабо растворимых субстратов выявляется на примере с
трансформацией бактериями стероидных соединений (Звягинцева,.
Звягинцев, 1969). Проводилось прямое микроскопическое
наблюдение за растворением кристаллов стероидов в висячей капле.
Было установлено, что клетки адгезируются на кристаллах, чта
можно четко наблюдать и в обычном световом микроскопе.
Адгезия обычно идет полюсом, но часто и боковой стороной
клетки. В тех местах, где расположены клетки, начинается быстрое
растворение кристаллов. Уже через 20—40 мин кристалл
становится сильно «изъеденным» и через некоторое время ломается в:
том месте, где была расположена клетка. Кристаллы, лишенные
клеток и расположенные в той же капле, существенно не
изменялись. Недалеко от места прикрепления клеток часто начинает
формироваться кристалл продукта стероидного превращения.
Следует отметить, что клетки адгезируются на кристаллах не*
прочно и иногда отделяются от них, после чего растворение
кристалла прекращается.
В следующей серии опытов клетки и кристаллы стероида
разделяли полупроницаемой коллодиевой или целлофановой
мембраной. В опытах с полупроницаемой мембраной в качестве
субстрата использовали гидрокортизон, хорошо растворимый в
воде, и его ацетат, плохо растворимый в воде.
• Трансформация гидрокортизонацетата шла значительно
быстрее при наличии непосредственного контакта между клетками
бактерий и кристаллами стероида. При разделении их
полупроницаемой мембраной процесс замедлился в 4—6 раз.
Трансформация хорошо растворимого стероида гидрокортизона не
зависела от наличия полупроницаемой мембраны.
При низкой растворимости стероида адгезия клеток на
кристаллах является важным фактором в процессе трансформации.
Данные, подтверждающие роль адгезии в использовании
твердых субстратов, были получены и при изучении целлюлозоразла-
гающих бактерий.
А. А. Имшенецкий еще в 1953 г. отметил, что целлюлозораз-
лагающие бактерии прикрепляются к волокнам целлюлозы и
располагаются своей длинной стороной вдоль волокна, что было
подтверждено в опытах с клетками Cellulomonas sp., разлагающими
вату, и Cytophaga sp., разлагающими хлопок или карбоксиметил-
целлюлозу (Tien, Thayer, 1977). Клетки Trichoderma viride
адсорбируют на своей поверхности микрокристаллическую
целлюлозу. Целлюлозу адсорбируют клетки, использующие в качестве
источника углерода как глюкозу, так и целлюлозу. Величина
адсорбции целлюлозы определяется суммарной доступной
поверхностью клеток (Binder, Ghose, 1978).
78
Венцель и др. (Vancel et al., 1979) обнаружили, что клетки
бактерий, разлагающих целлюлозу, окружены сетью тонких
выростов — внеклеточным гликокаликсом. Гликокаликс, как
полагают, играет важную роль в прикреплении бактерий к твердым
субстратам, а также концентрировании и сохранении внеклеточных
ферментов. Однако часто, как показала сканирующая
электронная микроскопия, бактерии не находятся в прямом контакте с
волокнами целлюлозы, хотя и располагаются поблизости от них
(Akin, 1980).
Увеличение поверхности частиц целлюлозы при превращении
се в пульпу приводит к резкому увеличению скорости ее
разложения бактериями (Dunlap et al., 1976). Прочная адгезия ряда
целлюлозоразрушающих бактерий на волокнах целлюлозы и
разрушение ими волокон наблюдались и в наших опытах с
накопительными и чистыми культурами почвенных микробов. Клетки
этих бактерий отличались очень большой адгезионной
способностью и прочно адгезировались на волокнах целлюлозы.
Опыты с разрушением в почве полихлорвиниловой пленки
показали (Звягинцев и др., 1971), что на пленке селективно адге-
зируются и размножаются определенные формы бактерий и
именно под микроколониями этих бактерий происходит наиболее
сильное изменение пленки.
Наблюдения с помощью люминесцентной микроскопии
показали, что особенно много микроорганизмов расположено в почве
на гумусовых пленках. Здесь развивается микрофлора,
разрушающая гуминовые вещества.
Эти материалы свидетельствуют о роли адгезии
микроорганизмов как экологического признака при использовании
микроорганизмами твердого или нерастворимого субстрата.
В последние годы ферментация на твердых субстратах
привлекает к себе большое внимание и интенсивно разрабатывается.
Твердофазное культивирование перспективно для производства
ферментов, антибиотиков, токсинов, а также для биоконверсии
сельскохозяйственных отходов в ценные продукты.
Доступность адсорбированных аминокислот для
микроорганизмов. Изучение доступности аминокислот для адгезированных
бактерий интересно тем, что среди них можно найти вещества как
катионной, так и анионной природы, т. е. они могут подвергаться
как положительной, так и отрицательной адсорбции (Звягинцев,
Великанов, 1968).
Закономерности адсорбции аминокислот довольно хорошо
изучены. Рассмотрим более подробно адсорбцию аминокислот на
некоторых минералах. Адсорбция зависит как от свойств самих
аминокислот, так и от особенностей минералов. Протекает она
быстро, так как аминокислоты адсорбируются на минералах по
законам обмена катионов (Talibudeen, 1955; Laby, 1967). Обмен
аминокислот на минеральные катионы происходит в
эквивалентных количествах (Laby, 1967), что было подтверждено в наших
опытах с адсорбцией аргинина, лизина и гистидина на К4"-, Са2+-,
79
М§2+-бентоните. Однако при адсорбции очень малых количеств
аминокислот их не удалось извлечь с помощью катионного
обмена. Видимо, в данном случае действует другой механизм их
закрепления. Некоторые другие воздействия также приводили к
отклонению от простых закономерностей адсорбции. Так, после
подсушивания адсорбентов с аминокислотами удавалось извлечь
меньшее количество аминокислоты, чем до высушивания, т. е.
высушивание способствовало более прочному закреплению этих
веществ. Адсорбция аминокислот несколько увеличивалась после
автоклавирования (120°) раствора аминокислоты с адсорбентом,
что объясняется лучшим проникновением молекул органических
веществ внутрь кристаллической решетки бентонита при высоких
температурах.
Изотермы адсорбции основных аминокислот в исследованном
интервале концентраций, вычисленные в логарифмическом
выражении, представляли собой прямые линии, что подтверждает
обменную природу адсорбции. Максимальная адсорбция лизина»
при которой, однако, еще не было достигнуто насыщение
минерала аминокислотой, составила для Н-каолинита 400, для Н-бен-
тонита — 2240 мг/100 г минерала.
Таким образом, основные аминокислоты могут в больших
количествах адсорбироваться на глинистых минералах. Причем при
поглощении больших количеств основных аминокислот
происходит сильная агрегация частиц минерала. Величина агрегатов
достигает 1 мм. При адсорбции небольших количеств аминокислот
образования таких агрегатов не происходит.
Наибольшей поглотительной способностью отличаются
монтмориллониты, особенно гумбрин и бентонит, намного слабее
поглощали аминокислоты каолинит и монотермит. Например,
гумбрин адсорбировал 1600 мг аргинина, бентонит — 1300, а
каолинит и монотермит поглощали этой аминокислоты 600 и
700 мг/100 г минерала, т. е. в 2 раза меньше. По способности
адсорбировать аминокислоты минералы располагаются в следующий
ряд: гумбрин>бентонит>кил>нонтронит>монотермит>каолинит.
В наибольшем количестве адсорбировались аминокислоты,
обладающие свойствами оснований. Особенно сильно все минералы
поглощали аргинин, несколько слабее — гистидин, еще слабее —
лизин. Циклические нейтральные аминокислоты (триптофан, фе-
нилаланин) адсорбировались в больших количествах, но слабее
основных. Кислые аминокислоты (глутаминовая, аспарагиновая)
практически не адсорбировались.
Почвы адсорбировали аминокислоты слабее, чем минералы'
монтмориллонитовой группы, и были ближе в этом отношении к
каолиниту.
Наибольшей адсорбционной способностью отличались
черноземы, наименьшей — дерново-подзолистые почвы и красноземы.
Адсорбция аминокислот зависит от реакции раствора.
Наиболее сильное поглощение основных аминокислот происходит
в кислой среде при рН 2—3, а для кислых (глутаминовая кисло-
80
та) — при рН 1—2. В нейтральной среде адсорбция была
значительно меньше и несколько увеличивалась в щелочной среде
(рН 8—10).
Для десорбции аминокислот с глинистых минералов
использовали Ва(ОН)2, который наиболее полно извлекал эти вещества.
На средах с адсорбированными основными аминокислотами
(аргинин, лизин, гистидин) активность бактерий, о которой су-
02,мкл
Ш
2 3*567
Время, ч
Рис. 16. Влияние Н-бентонита на
дыхание клеток Ps. pyocyanea на
среде с аргинином:
/ — среда с аргинином; 2 —
среда с бентонитом аргинином;
3 — среда с бентонитом без
аргинина; 4 — среда без аргинина
3*5
Время, ч
Рис. 17. Влияние глинистых ми»
нералов на дыхание клеток Ps*
pyocyanea на среде с аргинином:
/ — среда с аргинином +Н-нонт-
ронит; 2 — среда с аргинином
+ Н-каолинит; 3 — среда с
аргинином; 4 — среда без аргинина
+ Н-нонтронит; 5 — среда без
аргинина +Н-каолинит, 6 — среда
без аргинина
дили по интенсивности дыхания и потреблению аминокислоты,
приросту клеток и биомассы, сильно стимулировалась. Наиболее
подробные опыты были проделаны с культурой Ps. pyocyaneay
которая могла использовать перечисленные основные
аминокислоты в качестве единственного источника углерода и азота.
Присутствие бентонита с адсорбированной на нем аминокис*
81
лотой значительно сокращает период задержки дыхания Ps.
pyocyanea (рис. 16). Если в присутствии бентонита клетки Ps.
pyocyanea начинали дышать почти сразу, то на среде без адсорбента
активное дыхание бактерий начиналось лишь через 1,5—2 ч.
В первые часы опыта бентонит стимулировал дыхание Ps.
pyocyanea в 2,5—3 раза. Он усиливал также эндогенное дыхание
бактерий.
Внесение в питательную среду других минералов также
оказывало стимулирующее действие. Нонтронит и каолинит
усиливали дыхание Ps. pyocyanea в 1,5—2 раза, монотермит — на 5—
10% (рис. 17, 18).
Не только дыхание, но и потребление аргинина
стимулируются при наличии в среде адсорбентов с поглощенной ими
аминокислотой. Значительное увеличение
использования аминокислоты
отмечается для вариантов опыта с Н-
бентонитом, Н-нонтронитом,
черноземом, каштановой почвой и
сероземом. Наибольший
стимулирующий эффект был получен в опытах
с черноземом. Краснозем и хвалын-
ская глина оказали слабое
стимулирующее действие. Н-гумбрин, как и
в ряде других опытов, сокращал
активность микробных клеток и
уменьшал использование аргинина
на 50% через 6 ч и на 33% через
8,5 ч. Итак, использование
аргинина зависит от природы минерала, на
котором он адсорбируется.
02,мкл
СО2, МКЛ
13001
300
200Y
1DO
4 5 6
Время, ч
Рис. 18. Влияние Н-каолинита на дыхание
культуры Ps. pyocyanea:
1 — среда с аргинином и каолинитом;
j. 2 — среда с аргинином; 3 — среда с као-
7 линитом без аргинина; 4 — среда без
аргинина
Такие же закономерности, как в потреблении аминокислот,
проявились и в образовании биомассы. Наибольшее количество
биомассы получено в опытах с черноземом, что объясняется
частичным использованием микроорганизмами органических веществ
самих почв. Во всех других вариантах опыта различия в
образованной биомассе были небольшими, за исключением явного
отставания варианта с Н-гумбрином.
Аналогичные результаты были получены в опытах и с
другими основными аминокислотами — лизином и гистидином.
Иные результаты получены в экспериментах с кислыми
аминокислотами — глутаминовой и аспарагиновой. Минералы не-
82
сколько уменьшали потребление глутаминовой кислоты клетками:
Ps. pyocyanea. Особенно резко влиял Н-бентонит, снижая
использование субстрата бактериями на 47%. Остальные минералы
уменьшали потребление глутаминовой кислоты на 4—10%. Почвы
могли либо стимулировать потребление глутаминовой кислоты
(краснозем), либо чаще угнетали его. Дерново-подзолистая почва„
например, уменьшала использование субстрата на 8—9%,
обыкновенный чернозем — на 19%, а мощный чернозем практически
на него не влиял. Образование биомассы также обычно была
больше на средах без адсорбентов.
Использование аспарагиновой кислоты бактериями Ps.
fluoresces очень мало зависело от наличия адсорбентов. Наиболее
сильное отрицательное влияние оказывали Н-бентонит и
обыкновенный чернозем. Остальные адсорбенты либо не влияли на
потребление субстрата (Н-гумрин), либо слабо стимулировали его-
(Н-каолинит, хвалынская глина, Н-нонтронит).
Дыхание бактерий на средах с кислыми аминокислотами
также было ниже в присутствии адсорбентов. Например, Са-бенто-
нит уменьшал дыхание Ps. pyocyanea на 20—24%. Число клеток
Ps. pyocyanea в присутствии адсорбента было меньше, чем в
контроле.
Таким образом, кислые аминокислоты в отличие от основных
использовались в присутствии адсорбентов с такой же скоростью
или медленнее, чем свободные. Объясняется это тем, что кислые
аминокислоты не адсорбировались минералами и почвами и даже
отталкивались от их поверхности, так как и те и другие имели
отрицательный заряд. Поэтому адсорбированные клетки,
особенно находящиеся внутри агрегатов из минеральных частиц,
испытывали недостаток аминокислоты. Наоборот, основные
аминокислоты адсорбировались и находились вблизи от клеток бактерий,
что ускоряло их использование. Конечно, одновременно
оказывали влияние и другие факторы, которые будут рассмотрены более
подробно ниже. Действием этих факторов нужно объяснить
отклонения от общей закономерности, которые имели место в
некоторых опытах, например в опытах с гумбрином.
Каолинит в широком интервале концентраций гистидина
(0,05—2,0 мг/л) стимулировал рост бактерий (Sugita et al., 1979).
Показано, что гистидин и клетки бактерий адсорбировались на
частицах каолинита. Максимальная удельная скорость роста с
каолинитом составляла 0,59, а без адсорбента — 0,49 ч-1; а
кажущаяся константа насыщения субстрата (Ks) — 0,023 и
0,29 мг/л.
В противоположность отмеченным работам Флетчер (Fletcher,
1984) не обнаружила адсорбции аминокислот на поверхности
стекла, полиэтиленовой пленки и полистирола. Возможно, эта
связано с тем, что адсорбенты брались в виде пластин, а не
мелких частиц и имели относительно небольшую суммарную площадь
поверхности, адсорбцию аминокислот на которой очень трудно
было установить, а также с загрязненностью поверхности стекла
83
и с гидрофобностью всех исследованных поверхностей. В работе
Флетчер, как и в других, отмечается положительное действие
адсорбентов на активность бактерий на примере псевдомонад.
Доступность адсорбированных аминокислот для дефицитных
то ним мутантов Е. colt. Доступность адсорбированных
аминокислот для бактерий выяснялась не только в опытах, где
аминокислоты служили единственным источником углерода и азота, но
и в опытах с дефицитными по определенным аминокислотам
мутантами Е. coli. Для исследования были взяты мутант Е. coli
К-12, дефицитный по лизину, Е. coli штамм Т, дефицитный по
триптофану, и Е. coli штамм Ф, дефицитный по фенилаланину
-(Великанов, Звягинцев, 1968).
Опыты, проведенные с различными минералами и почвами,
показали, что внесение адсорбентов с поглощенными на них
аминокислотами стимулировало дыхание бактерий и потребление
ими глюкозы. Величина стимулирующего влияния адсорбента
зависела от природы последних.
Количество микробных клеток, определявшееся после опытов,
«было на 50—70% больше в присутствии адсорбентов, чем на
средах без них. На средах без аминокислот адсорбенты не влияли
на размножение бактерий.
Таким образом, адсорбированные аминокислоты, необходимые
как дополнительный фактор роста, были вполне доступны для
микроорганизмов. Часто они использовались быстрее, чем
свободные, и культуры росли лучше.
Влияние адсорбентов на разложение адсорбированного белка
и аммонификацию. Довольно прочно установилось мнение о том,
что адсорбция препятствует использованию белка
микроорганизмами. Устойчивость к микробному воздействию лигнопротеино-
вого комплекса подчеркивал еще Ваксман (Waksman, 1927), что
затем было подтверждено в других работах (D. Lynch, О. Lynch,
1958). Однако в последнее время накапливаются данные,
которые показывают, что адсорбированный глинистыми минералами
белок вполне может быть доступным для микроорганизмов и их
ферментов и что в некоторых случаях адсорбированный белок
используется даже быстрее, чем свободный.
Таким образом, создается впечатление, что использованию
адсорбированного белка, по крайней мере во многих случаях,
препятствует не собственно адсорбция, а побочные явления,
связанные с ней. Вероятно, при взаимодействии белков с адсорбентами
в разных случаях возникают различные типы связей, о чем
свидетельствует различная устойчивость комплексов,
приготовленных разными способами. Во многих случаях препятствий для
разложения адсорбированного белка нет. Рассмотрим эти работы
более подробно.
Энсмингер и Гизекинг (Ensminger, Giseking, 1942) считали,
что адсорбция белка на кристаллической решетке минералов
предохраняет его от разложения, вызываемого ферментами и
микробами. Так, ферментный гидролиз альбумина и гемоглобина, адсор-
84
Жированных глинистыми минералами с большой адсорбционной
способностью, резко замедлялся как в кислой среде с пепсином,
так и в щелочной среде с панкреатином. Минерал с малой
поглотительной способностью (каолинит) не оказывал существенного
действия на гидролиз этих белков. Авторы предполагали, что
ингибирующее действие может быть обусловлено следующими
факторами: 1) инактивацией ферментов при адсорбции; 2)
расположением при адсорбции молекул белка таким образом, что
они становятся недоступными для воздействия ферментов.
Устойчивость комплексов из белков или аминокислот с
глинистыми минералами была обнаружена в работе Эриксона (Eric-
son, 1948). Пинк и др. (Pinck, Allison, 1951; Pinck et al., 1954)
изучали разложение комплекса желатина и альбумина с
бентонитом и их смеси с почвой. Скорость разложения в большой сте-
лени зависела от соотношения между белком и глиной в
комплексе. При содержании 20% белка в комплексе разлагалось
лримерно 20% от его общего количества, что, вероятно,
соответствовало белку, адсорбированному на внешней поверхности
минерала. Авторы полагают, что внутрь кристаллической решетки
ферменты не могли проникать. Если в комплекс включалось очень
много белка (30—50%), то разложение проходило примерно с
такой же скоростью, как и без глинистого минерала. Смесь
белка и глины даже при низком содержании белка в
противоположность комплексу оказывала большое задерживающее действие.
Дифракция рентгеновских лучей в системе желатина —
монтмориллонит показывает, что в комплексах с высоким содержанием
белка воздействие смеси почвенных микроорганизмов приводило
к уменьшению пространства 001 до тех пор, пока не оставался
монослой белка. Однако Эстерманн и др. (Estermann et al., 1959)
обнаружили, что некоторые бактерии, воздействуя на монослой
белка (денатурированный лизоцим), адсорбированный на
бентоните, могут приводить к уменьшению величины пространства 001
и освобождать 60—75% азота белка в виде аммиака.
Бирч и Френд (Birch, Friend, 1956) также отметили
предохраняющее действие бентонита на сохранение желатины; каолинит
же такого действия не оказал. В их опытах попеременное
увлажнение и высушивание комплекса обеспечивали частичное
освобождение связанного белка.
Линч и др. (Lynch et al., 1957) в противоположность Бирчу
и Фрейду установили, что желатина, адсорбированная на атта-
пульгите, разлагается с такой же скоростью, что и свободная.
Авторы объясняют это явление тем, что желатина не проникала
в межплоскостные пространства минерала. Разложение декстрина
на 39% задерживалось, так как он оказывался заключенным
внутри частиц аттапульгита.
Мак-Ларен и Эстерманн (McLaren, Estermann, 1956)
приготовление комплексов белка с минералами проводили следующим
образом. Минерал вносили в раствор белка при кислом значении
рН с таким расчетом, чтобы он образовал на внешней и внутрен-
85
ней поверхностях минерала монослой. Бентонит и каолинит
вносили в таком количестве, чтобы суммарная поверхность частиц
обоих минералов была одинаковой. Минерал с адсорбированным
белком отделяли центрифугированием, высушивали и автоклави-
ровали. Они обнаружили, что монослой денатурированного белка,,,
адсорбированного на каолините, подвергается действию химотрип-
сина в такой же степени, как и свободный белок. Монослой
белка, адсорбированного на бентоните, также подвергается сильному
воздействию химотрипсина, бактериальной протеазы из Вас. sub-
tilus, а также воздействию чистых и смешанных культур
почвенных бактерий (Estermann et al., 1959). Высушенный и вновь
увлажненный комплекс белка и монтмориллонита отличался
большей устойчивостью, чем свежеадсорбированный белок.
Предохраняющее действие подвижных кристаллических решеток глин,
по мнению авторов, объясняется другими факторами, чем просто
адсорбцией субстрата, инактивацией фермента или, наконец,
адгезией бактерий.
Дальнейшие опыты (Estermann, McLaren, 1969) показали, что
скорость разложения белка, адсорбированного на каолините,
может быть выше, чем скорость разложения свободного белка (о
разложении белка судили по образованию NH3). Это действие
проявлялось как в случае с адсорбированными, так и свободными
бактериями, но исчезало в случае со свободным белком. С
культурой Flavobacterium sp. стимулирующее действие проявлялось
при заражении среды небольшим количеством клеток и исчезала
при массированном заражении. Сделан вывод о том, что
каолинит воздействует как поверхность, концентрирующая субстрат и
экзоферменты, чем и способствует более быстрому протеканию
процесса. Flavobacterium sp. легко воздействует на белок,
адсорбированный на бентоните, что приводит к уменьшению
межплоскостного пространства (001). G бентонитом в некоторых случаях
также наблюдалась стимуляция процесса выделения NH3 по
сравнению с вариантом со свободным белком.
Устойчивостью к разложению отличались только лигно-
протеиновый комплекс и комплекс кремнекислого гелия с
белком.
Детальные исследования адсорбции на Н-, Na-, Ca-, A1-, La-
и Th-монтмориллоните 9 протеинов с молекулярной массой от
17 000 до 313 000, с изоэлектрической точкой рН от 2 до 11
показали, что количества адсорбированного протеина, форма
адсорбции, изотерма связывания (удержание после максимального
промывания дистиллированной водой) зависели от молекулярной
массы протеина и валентности насыщающего глину катиона
больше, чем от изоэлектрической точки или от рН среды. Пепсин
адсорбировался на положительно заряженных концах кристаллов
монтмориллонита, а казеин, химотрипсин и лизоцим
адсорбировались на основных плоскостях. Протеолиз зависел от взаимной
локализации фермента и субстрата. Фермент изменял свою
активность в связи с изменением конформации молекулы при адсорб-
86
ции, а также с изменением рН на границе раздела твердой и
.жидкой фаз. Смещение достигало одной целой единицы рН.
Таким образом, адсорбенты в зависимости от их природы и
условий проведения опытов (способ приготовления комплекса, рН
среды, влажность) могут оказывать как стимулирующее, так и
подавляющее действие на скорость использования белка.
Исследования Эстерманн убедительно показали, что использоваться
может даже белок, находящийся внутри кристаллической
решетки глинистых минералов монтмориллонитовой группы. Вслед за
-белком внутрь кристаллической решетки проникают ферменты,
которые и здесь проявляют свое действие. Прежняя точка зрения
о том, что адсорбция делает белок недоступным для
микробиологического разложения, должна рассматриваться только как
частный случай. В настоящее время убедительно показано, что
могут встречаться такие случаи, когда скорость использования
адсорбированного белка замедляется, когда она остается такой
-же, как для свободного белка, а в ряде случаев может
значительно стимулироваться. В разложении белка главную роль играют
экзоферменты, поэтому адгезия самих бактериальных клеток не
играет решающей роли в протекании этого процесса.
Влияние адсорбентов на азотфиксаторы и азотфиксацию. Еще
в ранних работах, посвященных изучению азотобактера,
отмечалось, что наличие в среде адсорбентов способствует его росту и
азотфиксации. Было установлено, что его клетки подвергаются
адсорбции (Костычев и др., 1926; Омелянский, 1953; Krzemieni-
«ewski, 1908). Добавление к питательной среде коллоидов и
крупнодисперсных адсорбентов (окиси железа, кремния и алюминия,
гуминовые кислоты, глинистые минералы) улучшало развитие
культуры азотобактера и увеличивало фиксацию азота иногда в
10—13 раз (Sohngen, 1913; McCalla, 1937, 1939).
Р. М. Курдина и М. Р. Борукаева (1962) показали, что
добавление адсорбентов (древесные стружки) в питательную среду
ускоряло использование Сахаров, почти в 3 раза повышало выход
клеток и в 5 раз увеличивало азотфиксацию.
Иной эффект наблюдал Чапек (Tschapek, 1962). Клетки
азотобактера помещались в тонкие пленки жидкости на поверхности
частиц кварца. С помощью прямого микроскопического метода
обнаружено, что адсорбированные и находящиеся в тонких
пленках клетки азотобактера не размножались и почти не потребляли
глюкозы. Наиболее сильное отрицательное действие адсорбента
наблюдалось в кислой среде. Авторы делают вывод о том, что
адсорбция сильно подавляет жизнедеятельность азотобактера.
Однако, по нашему мнению, основную роль здесь сыграла не сама
адсорбция, а неблагоприятное действие тонких пленок, возможно,
неблагоприятный окислительно-восстановительный потенциал.
Скорость роста культуры Az. chroococcum резко уменьшалась
на среде с гелем фосфата кальция, наблюдались изменения в
морфологии клеток и пигментообразовании (Yamagishi, Furusaka,
1964).
87
Отрицательное действие адсорбции на почвенных частицах на*
активность азотобактера отмечал Пил (Peele, 1936).
Несколько исследований было посвящено изучению влияния
адсорбентов на клубеньковые бактерии. Внесение адсорбентов в
культуры клубеньковых бактерий сильно влияет на их развитие,,
большое значение имеет природа катионов, насыщающих
адсорбент (McCalla, 1937, 1939).
А. И. Красильникова-Крайнова (1954) установила, что почвы
после известкования сильно адсорбируют клубеньковые бактерии,,
что приводит к необходимости увеличения доз нитрагина, так как
при обычных дозах не происходит заражения растений
клубеньковыми бактериями. Добавление древесного угля к культураль-
ной среде для клевера стимулировало образование клубеньков
при заражении среды бактериями (Turner, 1955). Автор связывает
положительное влияние с адсорбцией углем токсических веществ,,
выделяемых растениями клевера и препятствующих образованию*
клубеньков. Эти вещества извлекали из угля, и они
стимулировали или угнетали развитие клубеньковых бактерий в
зависимости от концентрации. Другие адсорбенты (иллит, бентонит,
слюда, гидроокись алюминия и железа) не оказывали влияния на
образование клубеньков.
Большие работы по изучению влияния адсорбентов на
выживание клубеньковых бактерий проведены Маршаллом и др.
(Marshall, Roberts, 1963; Marshall, 1968a, b). Внесение в легкую по
механическому составу почву высокодисперсных веществ
(кремнезем, глинистые минералы, зола) приводит к лучшему
выживанию клубеньковых бактерий в почве. По мнению автора, эти
вещества способствуют выживанию клубеньковых бактерий, так как
предохраняют почву от сильного высыхания. В лабораторных
опытах показано, что, частицы глинистых минералов
(монтмориллонит) адсорбируются на поверхности бактериальных клеток,
одевают их как бы чехлом и способствуют перенесению клетками
неблагоприятных условий.
Азотфиксирующая активность в почве была приурочена к
более крупным агрегатам (2—4 мм). Авторы полагают, что это
связано с возникновением в этих агрегатах более анаэробных
условий (Skrdleta et aL, 1979).
Влияние адсорбентов на нитрификацию. Давно замечено, что*
нитрификаторы при культивировании в жидких средах в большом
количестве располагаются на поверхности частиц мела, песка,
окиси алюминия, талька и других адсорбентов, вносимых в среду.
Культивирование нитрификаторов в средах без адсорбентов
обычно оказывается затруднительным. При очистке питательной
среды от твердых взвешенных частиц скорость нитрификации
уменьшается. В присутствии адсорбентов нитрификаторы лучше
сохраняются как в жидких средах, так и в высушенном состоянии
(Рубан, 1961; Заварзин, 1972).
Еще Альбрехт и Мак-Кала (Albrecht, McCalla, 1937)
установили, что адсорбированный почвами и глинистыми минералами,
88
-аммоний оказывается вполне доступным для микроорганизмов.
Изучение процесса нитрификации в перфузионном аппарате
{Lees, Questal, 1946) показало, что в почве этот процесс
протекает на поверхности твердой фазы, где находится
адсорбированный аммоний: бактерии также располагаются на поверхности
твердых частиц. Скорость нитрификации возрастает с
увеличением количества поглощенного аммония и почти не меняется с
.изменением его концентрации в растворе. Добавление к почве
веществ, обладающих большой способностью адсорбировать
катионы, в том числе и ион аммония, увеличивает скорость
нитрификации. Добавление твердых веществ, не обладающих катионо-
обменной способностью, не влияет на скорость процесса. Если
лз перфузионного аппарата после начала интенсивной
нитрификации убрать почву, процесс почти полностью прекращается, в
то время как в тех сосудах, где почва сохранилась,
нитрификация идет очень интенсивно. Эти опыты подтверждают положение
о том, что нитрификация происходит на поверхности почвенных
частиц. Подобные данные были получены и другими
исследователями (Nishio, Furusaka, 1970a, b; 1971). Установлено, что нитри-
фикаторы покрывают поверхность прерывистым или сплошным
^онослоем, но не дают многослойной адгезии.
Сейферт (Seifert, 1962) показал, что интенсивность
нитрификации была наибольшей в почвенной фракции с частицами
размером меньше 1 мм и сокращалась с увеличением размеров
частиц, что коррелирует с количеством адсорбируемого этими
фракциями аммония.
Улучшению прикрепления клеток нитрификаторов к частицам
может способствовать наличие фимбрий (Рубан, 1961).
Некоторые исследователи подробно изучали действие на
процесс нитрификации добавления к культурной среде глинистых
минералов, которые насыщались различными катионами. Они
устанавливали довольно сложные закономерности влияния
минералов на нитрификацию. Часть глинистых минералов может
фиксировать аммоний. Он не обменивается или с трудом
обменивается на другие катионы. Фиксации аммония способствует
добавление калия. Аллисон и др. (Allison et¦ al., 1953) показали, что
,.ион аммония фиксируется на глинистых минералах и, по крайней
мере частично, недоступен нитрификаторам. Вельч и Скот (Welch,
Scott, 1960) изучали нитрификацию на вермикулите, иллите,
бентоните, насыщенных аммонием. По их данным, интенсивность
нитрификации от добавления больших количеств калия сильно
сокращается. Это объясняется тем, что калий блокирует
освобождение аммония.
Гольдберг и др. (Goldberg et al., 1^5) установили, что
добавление минералов в среду для культивирования нитрификаторов
может повышать и понижать скорость процесса, а может и не
оказывать на нее заметного влияния. Введение в среду
минералов, обладающих большой емкостью поглощения, стимулировало
нитрификацию. Однако введение мусковита и каолинита, обла-
89
дающих небольшой емкостью поглощения, не стимулировало
процесс и даже могло замедлить его. Внесение в почву
монтмориллонита повышало скорость минерализации глицина и
нитрификации образующегося при этом аммония (Kunc, Stotzky, 1980).
В некоторых случаях отмечено значительное угнетение
нитрификации адсорбентами (почвами, ионообменными смолами,,
илом), что может быть отнесено за счет недостаточной аэрации
среды, а также токсического действия некоторых адсорбентов
(Рубенчик и др., 1934; Goldberg, Gainey, 1955; McLaren, Sku-
jins, 1963).
В опытах Шревена (Schreven, 1968) обменный аммоний был
вполне доступен для нитрификаторов, а фиксированный почвами
аммоний почти не использовался ими. Обменный аммоний
идентифицировался в течение 2 недель, а фиксированный —
сохранялся без изменений в течение 16 недель. Внесение калия делало
фиксированный аммоний особенно мало доступным. Аналогичные
данные были получены Акслей и Лег (Axley, Legg, 1960).
Кунц и Стотцкий (Kunc, Stotzky, 1980) показали, что
внесение монтмориллонита повышает скорость минерализации глицина
в почве и нитрификации образующегося при этом аммония.
Природа глинистых минералов оказывает влияние на
нитрификацию. Так, при значении рН жидкой среды, равном 5,5, на
аллофане нитрификация осуществлялась, а на каолините и
бентоните не проявлялась (Sarathehandra, 1978).
Таким образом, адсорбированные клетки нитрификаторов
могут успешно развиваться и использовать обменный аммоний. Ад-
гезированное состояние, видимо, является естественным для этих
бактерий при их развитии в почве. Обычно введение адсорбентов
благоприятствует нитрификации, но в некоторых случаях может
оказывать и отрицательное действие. Причина различного
действия адсорбентов определяется рядом специфических условий,
которые возникают в среде при внесении того или иного адсорбента
и сильно зависят от природы катионов, насыщающих адсорбент.
К сожалению, исследователи, изучающие влияние адсорбентов
на процесс нитрификации, часто не учитывали степень адсорбции
клеток, рН среды, степень аэрации и другие факторы. Вероятно,
положительное действие адсорбентов проявлялось в тех случаях,
когда клетки адсорбировались на поверхности частиц и
оказывались вблизи от адсорбированного обменного иона аммония,
причем рН и другие показатели этой микрозоны были
благоприятными для развития бактерий, осуществляющих первую фазу
нитрификации. Если аммоний находился в адсорбированном
состоянии, а клетки — в свободном, то внесение адсорбента не
оказывало положительного ^действия. Безусловно, фиксированный
аммоний слабо доступен для микроорганизмов.
Активность бактерий, осуществляющих вторую фазу
нитрификации и использующих не адсорбирующиеся почвенными
частицами и глинистыми минералами ионы N02~, при адсорбции
уменьшается. Причем на их развитие большое влияние оказывает спе-
90
дифическое рН, создающееся на границе раздела твердой и
жидкой фаз. Если судить о рН по его значению в жидкой фазе, то
•оптимум развития оказывается смещенным в щелочную сторону
(McLaren, Skujins, 1963; 1967; McLaren, 1969). Однако это
явление кажущееся, так как клетки в действительности развиваются
при более кислом рН, характерном для поверхности раздела
жидкой и твердой фаз. Вероятно, рН на поверхности этих минералов
было разным.
Довольно подробно в ряде работ изучена на колонках из почв
и других адсорбентов кинетика процесса нитрификации,
вызываемого адгезированными клетками. В колонках практически все
бактерии находятся в адсорбированном состоянии (Сох, Bazin,
1980). Обычно нитрифицирующие бактерии располагаются только
в верхней части колонки. В силу своих адгезионных способностей
клетки не образуют на поверхности адсорбента нескольких слоев
и располагаются только сплошным монослоем. В нижнем слое
колонки уже нет и сплошного монослоя, а обнаруживаются
отдельные участки, занятые клетками, или единичные клетки. Мо-
нослойное расположение клеток дает основание для построения
более простых математических моделей.
Ряд работ, выполненных в последнее время (Watanabe, 1980;
Krogulska, Mycielski, 1981; Tanaka, Dunn, 1982), посвящен
изучению кинетики процесса нитрификации в ферментерах с
инертной загрузкой или ферментерах с вращающимися дисковыми
биофильтрами. Отмечается, что в таких условиях процесс идет более
интенсивно, чем в аэротенках. Причем увеличение интенсивности
лроцесса достигается именно путем увеличения адсорбирующей
поверхности. Внутри прикрепленной биопленки реакция
нитрификации описана с учетом процесса молекулярной диффузии.
Влияние адсорбентов на окисление метана. Метан в природе
окисляется, как правило, бактериями, адгезированными на
поверхности твердых частиц. При проведении микробиологического
окисления метана в угольных шахтах это явление необходимо
учитывать (Москаленко и др., 1976).
Изучение чистых культур метанокисляющих бактерий
показало, что они сильно адгезируются на угле, часто адгезируются на
стекле и на других адсорбентах. Окисление метана
адгезированными клетками проходило интенсивнее по сравнению со
свободными клетками, и их активность возрастала с уменьшением
размеров частиц адсорбента (Нестеров, Назаренко, 1975).
Функционирование метанокисляющих бактерий зависит от химической
природы адсорбента (Карпенко и др., 1980).
Влияние адсорбентов на окисление водорода. С адсорбентами
окисление водорода протекает более интенсивно, причем
увеличиваются как потребление водорода, так и образование биомассы
(Крюков, 1981). Процесс идет в течение более продолжительного
времени, чем со свободными клетками. Скорость потребления
газа имела максимум и затем резко снижалась до уровня 20—30%
от максимальной. Причины падения четко не установлены. Пред-
91
полагается, что это, видимо, общее явление для микроорганизмов,,
потребляющих газообразный субстрат. На поздних этапах
развития с адгезированными клетками устанавливается линейная
скорость потребления газа.
Влияние адсорбентов на развитие микроорганизмов в средах
с малыми концентрациями органического вещества. Многие
водные микроорганизмы активно прикрепляются' к твердым
поверхностям и растут только в адсорбированном состоянии (облигатно
перифитонные формы). К ним относятся Sphaerotilus spp. и
большинство почкующихся бактерий (Dias et al., 1968; Hirsch, Rhein-
heimer, 1968). Таким образом, адсорбированное состояние
является нормальным для развития многих микроорганизмов.
При изучении водных микроорганизмов были сделаны и
некоторые другие интересные наблюдения при определении влияния
твердых поверхностей и адсорбции на активность микробов.
Например, установлено, что при помещении морской или речной воды
в стеклянную посуду количество бактерий в ней резко
увеличивается (Винберг, Яровицина, 1946; Харвей, 1958; Zobell, 1943;
Barder, 1968). Численность бактерий, развивающихся в озерной
воде после ее помещения в колбу, становится приблизительно
пропорциональной величине отношения поверхности колбы к ее
объему: При увеличении поверхности путем введения в колбу
стеклянных бус, предметных стекол или кварцевых частиц количества
бактерий резко возрастает, причем большинство клеток
развивается на поверхности погруженных частиц. Дальнейшие
исследования этого явления показали, что стимулирование проявляется
обычно только в очень разбавленных растворах, содержащих не
более 10 мг органического вещества на 1 л воды. При добавлении
к воде большого количества органического вещества влияние
величины поверхности стекла на количество развивающихся
бактерий исчезает. В некоторых случаях величина стеклянных стенок:
оказывает влияние на развитие микроорганизмов в достаточно
богатых средах. Так, при культивировании некоторых видов
дрожжей (Hansenula anomala, Candida utilis var. mayor, Saccharomy-
ces bayanus) в стеклянных сосудах на минеральной среде с
глюкозой вес образовавшейся дрожжевой массы пропорционален
площади стенок, соприкасающихся с жидкостью (Beraud, 1969).
Зобелл и Андерсон (ZoBell, Anderson, 1936) нашли, что при
добавлении на 1 л воды 100 мг пептона в колбах с равным
отношением величины поверхности к объему развивается уже
одинаковое количество бактерий.
Добавление стеклянных бус в очень разбавленные растворы
глюкозы и пептона (0;6ja-2j6 мг/л) делает возможным развитие
Е. coli, хотя без адсорбентов клетки этой культуры при таких
малых концентрациях не развивались. При более высоких
концентрациях органического вещества количество клеток как с
адсорбентом, так и без него было одинаковым (Heukelekian,
Heller, 1940). В очень разбавленных растворах рост Е. coli
становится возможным при добавлении талька (Bigger, Nelson, 194!)•
92
При низких концентрациях питательных веществ меняется
характер роста некоторых культур. Так, Sphaerotilus natans в
проточном аппарате растет в виде длинных прикрепленных нитей,,
а при высоких концентрациях — в виде слабо адсорбирующихся.
одиночных клеток. Причем ингибитор роста 9-р-Э-арабинофура-
нозиладенин в очень низких концентрациях подавляет
прикрепленный рост (Yoshikawa, Takiguchi, 1979).
При прикрепленном росте может изменяться относительное
содержание промежуточных продуктов обмена веществ.
Обобщая результаты ряда работ, Зобелл (ZoBell, 1943)
приходит к выводу, что твердые поверхности оказывают
благоприятное влияние на рост водных микроорганизмов по следующим
причинам.
1. Поверхность обеспечивает место для прикрепления клеток..
Многие же водные микроорганизмы предпочтительно
развиваются в прикрепленном состоянии, а некоторые нуждаются для своего-
развития в обязательном прикреплении.
2. На стеклянной и других поверхностях концентрируется от
2 до 27% органического вещества воды. На нем могут
адсорбироваться и искусственно вносимые органические вещества: лиг-
нопротеид, эмульгированный хитин, в слабой степени
адсорбируется и пептон (ZoBell, 1943).
3. Предполагается, что твердая поверхность может оказывать
благоприятное действие, препятствуя рассеиванию экзофермен-
тов и продуктов гидролиза органического вещества, которые
концентрируются на поверхности вблизи от адсорбированных клеток
и оказываются более доступными для них, чем для свободных
клеток.
Скорость роста микроорганизмов, прикрепляющихся к
поверхности, уменьшается при полном покрытии всей поверхности слоем,
клеток. Новое снижение активности наступает при развитии на
поверхности многослойной культуры клеток бактерий при такой
толщине слоя клеток, который затрудняет скорость диффузии
кислорода к клеткам, расположенным в нижних слоях .(Sanders,.
1967).
Влияние адсорбентов на анаэробные
микробиологические процессы
Многие исследователи изучали влияние адсорбентов на
различные брожения (спиртовое, ацетонобутиловое, пропионовокис-
лое, молочнокислое, метановое).
Спиртовое брожение. Влияние адсорбентов на спиртовое
брожение изучено наиболее подробно. Еще в 1857 г. Л, Пастер
отмечал, что добавление адсорбентов стимулирует спиртовое
брожение. Положительное действие адсорбентов на спиртовое
брожение подробно изучалось затем рядом исследователей (Звягинцев,,
1973; Amin, Verachtert, 1982; Arcuri, 1982).
Адсорбенты, как правило, оказывают* положительное действие
93
та спиртовое брожение; ускоряется процесс, повышается выход
спирта, усиливаются выделение углекислоты и использование
углеводов, возрастает активность алкагольдегидразы и
увеличиваются количество клеток и вес биомассы. Кроме того, адсорбенты
•облегчают производственный процесс получения спирта при
непрерывном способе брожения, препятствуя выносу дрожжевых
клеток.
В качестве адсорбентов использовались самые различные
вещества: буковые (древесные) стружки, морская губка,
фильтровальная бумага, различные сорта угля, инфузорная земля,
стеклянная вата, мел, картон, тальк, глинистые минералы и т. д.
Положительное действие оказывают и твердые частицы,
содержащиеся в естественных питательных средах. В фильтрованном
сусле процесс сбраживания идет значительно медленнее, чем в
исходном сусле (Забродский, Мовчан, 1952).
Величина стимулирующего действия адсорбентов в разных
работах разная (от 2—5 до 50—200%), что зависит от характера
и количества адсорбентов и условий среды, но, по нашему
мнению, в основном определяется тем, что опыты ставились в
стационарных условиях и момент наблюдений выбирался совершенно
произвольно. В разные моменты стимулирующее влияние
адсорбентов на динамику процесса по сравнению с контрольным
опытом очень отличается (Курдина, Борукаева, 1962; Шамис и др.,
1963). Наибольший эффект был достигнут через 24 ч, когда
выделение С02 в опыте с адсорбентом было в 2 раза больше, а вес
дрожжей превышал вес дрожжей в контрольном опыте в 2—4
раза. Энергия брожения дрожжей, предварительно выращенных с
адсорбентом, выше по сравнению с несортированными дрожжами.
Отмечено, что процесс спиртового брожения зависит от
характера вносимого адсорбента. Обычно чем больше поверхность
адсорбента, тем лучше идет процесс. Исключением могут быть
частицы, размер которых меньше размера клеток дрожжей. Скорость
^спиртового брожения зависит от степени адсорбции дрожжей,
которая, к сожалению, далеко не всегда учитывалась. Большое
влияние оказывают видовые особенности дрожжей (Шамис и др.,
1963).
Адгезия дает возможность изменить метаболизм дрожжей,
уменьшая образование С02 и увеличивая выход спирта.
Отмечается резкое сокращение (в 2—4 раза) времени генерации адге-
зированных клеток (Rasmussen, 1974; Navarro, Durand, 1980).
При проточном культивировании адсорбенты оказывают
селективное действие, отбирая сорбирующиеся дрожжи.
Для объяснения положительного действия адсорбентов на
дрожжи, осуществляющие спиртовое брожение, были выдвинуты
следующие гипотезы.
1. Адсорбенты способствуют улучшению газового режима. Они
препятствуют пересыщению среды углекислотой и улучшают
кислородное снабжение дрожжевых клеток за счет
адсорбированного на их поверхности кислорода на первых этапах развития
94
культуры, когда кислород особенно необходим (Забродский, Мов-
чан, 1952). Удаление избытка углекислоты, действительно,
благоприятствует процессу брожения. Высокое содержание
углекислого газа угнетает размножение дрожжей и все их жизненные
процессы (Kunkee, Ough, 1966).
2. Адсорбенты обеспечивают равномерное распределение
дрожжевых клеток в среде, что улучшает обмен веществ и условия
питания (Плевако, 1934).
3. Адсорбенты удаляют токсические вещества, содержащиеся
в среде, а также возникающие в процессе жизнедеятельности
микроорганизмов. Например, добавление активированного угля к
раствору мелассы, содержащему токсичные соли меди, снимало*
их угнетающее влияние на дрожжи. Нейберг (Neuberg, Sandbergv
1921) придавал большое значение связыванию токсичного аце-
тальдегида.
4. Адсорбенты могут улучшать питание прикрепленных
клеток дрожжей, адсорбируя из окружающей среды различные
питательные элементы, а также оказывая каталитическое влияние
на некоторые процессы.
Особое место занимают работы, в которых изучалось
действие на спиртовое брожение коллоидов. Коллоиды в разных
условиях оказывали то положительное, то отрицательное действие.
Зенген (Sohngen, 1913) отмечал, что гуминовые вещества,
желатина, гуммиарабик, агар-агар уменьшали скорость брожения.
Отрицательное действие коллоидов на спиртовое брожение
отмечалось во многих работах. В ряде случаев коллоиды оказывали и
положительное действие.
Отрицательное действие коллоидных веществ объясняется тем,,
что они адсорбируются на поверхности дрожжевых клеток и
препятствуют обмену веществ между клеткой и внешней средой.
Однако экспериментальных данных для последнего утверждения
явно недостаточно. Отмеченные факты стимулирующего действия
коллоидов заставляют полагать, что они скорее воздействуют
другими путями. Отрицательное действие могут оказывать
коллоиды, несущие токсичные вещества, или коллоиды,
способствующие агглютинации клеток и выпадению их в осадок.
Положительное действие могут оказывать коллоиды, несущие питательные-
или стимулирующие вещества.
Таким образом, действие коллоидов на спиртовое брожение
в первую очередь нужно связывать со свойствами вносимых
веществ, а не с их коллоидным состоянием.
В последнее время все большее внимание уделяется
проведению спиртового брожения с помощью бактерий. Описано
непрерывное получение этанола с помощью иммобилизованных клеток:
Zimomonas mobilis в биореакторе с применением плоских дисков
из пористого боросиликатного стекла (Arcuri, 1982). Непрерывно-
получали этанол в течение 17 сут. На первой стадии
функционирования (2—5 сут) увеличение концентрации этанола в
вытекающем растворе характеризуется экспоненциальной зависимостью,.
95
на 5—10-е сут получена линейная зависимость, на 13—17-е сут
содержание спирта в элюате практически не изменяется. Через
17 сут появляются флоккулированные неадсорбированные клетки
Zymomonas mobilis. Работа с иммобилизованными клетками этих
бактерий, включенными в каппа-каррагинановый гель, показала
лх преимущество перед свободными клетками и перед свободными
и иммобилизованными клетками (Amin, Verachtert, 1982).
Предложен ряд установок для получения пива с
использованием адгезированных клеток (Corrien et al., 1976; Колпакчи и
др., 1976; Monsanet al., 1978).
Ацетонобутиловое брожение. Ф. М. Чистяков (1932) подробно
исследовал влияние адсорбентов на бактерии, вызывающие
ацетонобутиловое брожение. В ряде случаев без адсорбентов
развития бактерий вообще не происходило, однако внесение в такую
среду адсорбентов приводило к нормальному развитию культур.
Внесение адсорбентов оказывает влияние на рост, размножение
и даже морфологию бактериальных клеток. Основная причина
стимуляции роста заключается, видимо, в создании вокруг
частиц адсорбента анаэробных условий, но только этим влияние
адсорбентов на ацетонобутиловые бактерии не исчерпывается.
Обстоятельные работы были проведены рядом авторов (Bahadur,
Ranganayaki, 1960; Bahadur, Saroi, 1960; Кестельман и др., 1969).
Адсорбенты стимулируют развитие и размножение ряда
микроорганизмов, осуществляющих ацетонобутиловое брожение:
усиливаются образование бутанола, использование углеводов и
размножение клеток, сокращается образование ацетона, изменяется
ход всего процесса. Внесение адсорбента (угля) по-разному
влияет на разные виды бактерий (С/, butylicum, CI. acetobutylicum,
CI. pasteurianum, CI. butylicum). Добавление адсорбентов в куль-
ггуральную среду Вас. polymyxa с сахарозой древесного угля
увеличивает выход 2,3-бутиленгликоля. Авторы полагают, что уголь
адсорбирует токсические вещества, которые вырабатываются в
первый период роста культуры и затем тормозят в среде без
адсорбентов образование 2,3-бутиленгликоля. Токсические вещества
были выделены с угля в вытяжку петролейного эфира, которая
увеличивала образование редуцирующих Сахаров и в 2 раза
понижала выход 2,3-бутиленгликоля, угнетала образование ацетона,
не влияя на потребление сахарозы. Применение окиси алюминия
ъ определенных условиях также дает возможность повысить
выход 2,3-бутиленгликоля. Однако объяснить действие адсорбентов
только связыванием токсических веществ не удается; оно более
сложное.
Пропионовокислое брожение. В работе Н. М. Нероновой и
И. Д. Иерусалимского (1960) описан способ непрерывного
культивирования Propionibacterium shermanii в проточной среде с
целью получения витамина В12. При наличии в среде твердой фазы
-(толченое стекло, стеклянная вата, асбест) численность клеток
возрастала в 100—200 раз по сравнению с культиватором без
твердой фазы. Правда, в присутствии адсорбентов около 50%
96
клеток оказывалось нежизнеспособными, а в культиваторе без
адсорбента почти все клетки были живыми.
Активацию этого процесса адсорбентами (фильтровальная
бумага, губка, буковые стружки) отмечают также Р. М. Курдина
и М. Р. Борукаева (1962). Активировались процессы кислотона-
копления и размножения клеток. Положительное действие
адсорбентов объясняется концентрированием на них питательных
веществ.
Молочнокислое брожение. К. И. Рудаков (1936), изучая
активность молочнокислых бактерий, нашел, что она резко падает
при адсорбции клеток на казеине молока, которая происходит при
подкислении реакции среды, наступающем в процессе развития
культуры. Накопление молочной кислоты, как было показано, не
является лимитирующим фактором, и уменьшение активности от-,
несено за счет адсорбции. В действительности отрицательную роль
в этих опытах, видимо, сыграла не адсорбция сама по себе, а
образование хлопьев, состоящих из бактерий и белка, которые
выпадали на дно сосуда, где создавались плохие условия для
обмена веществ.
Отрицательное действие адсорбции отмечала также У. Г. Ок-
«сентьян (1940). Использовалось несколько видов молочнокислых
бактерий. Адсорбентами служили животный и древесный уголь,
каолинит и тальк, которые не снижали скорости размножения
бактерий, но снижали скорость кислотообразования.
В зависимости от соотношения количества молочнокислых
бактерий и адсорбента можно наблюдать то положительное, то
отрицательное влияние адсорбентов на этот процесс (Литвинов, Кар-
бынь, 1949).
Метановое брожение. Роль адсорбентов при метановом
брожении особенно подробно исследовали Вреден и Бушвел (Breden,
Buswall, 1933). В качестве адсорбента они использовали
раздробленный асбест. Клетки бактерий сильно адсорбируются на этом
веществе. Без адсорбента размножение не происходило, причем
объяснить роль асбеста только созданием анаэробных условий
в определенных микрозонах нельзя, так как даже в анаэробных
условиях, но без адсорбента процесс не начинался. Внесение
асбеста в 5—7 раз увеличивало энергию брожения по сравнению
с энергией брожения в среде без адсорбента. Для успешного
протекания метанового брожения необходимо 5—20 г твердых
частиц на 1 л среды. Роль твердой фазы не выяснена. Авторы
считают вероятным предположение Фишера о том, что твердая фаза
катализирует протекание некоторых химических реакций.
Добавление лигнита заметно повышает выход метана (Johnson, 1972).
Влияние адсорбентов на денитрификацию. Необходимость
проведения очистки сточных и грунтовых вод от нитратов и нитритов
ставит вопрос о наиболее выгодных для осуществления этого
процесса способах и установках. Закрепление клеток на
адсорбентах или гелях дает возможность успешно проводить процесс де-
нитрификации и получать очищенную от нитратов воду, не содер-
4 Д. Г. Звягинцев
97
жащую микробных клеток или содержащую минимальное
количество их (Bonomo et al., 1978; Francis, Brinkley, 1977).
Применение взвешенной загрузки (песок, активированный-
yi\;sb) имеет ряд преимуществ по сравнению с ферментацией со
взвешенной биомассой: короче время пребывания сточной
жидкости в ферментере, возможно проведение процесса без вторичных
отстойников, процесс меньше зависит от температуры, скорость
денитрификации примерно в 10 раз выше, чем в ферментере со*
взвешенной биомассой. В установках со взвешенной загрузкой
константа денитрификации описывается уравнением половинного-
процесса.
Существует, однако, мнение, что суммарная площадь
поверхности частиц адсорбента сама по себе не стимулирует
восстановление нитратов бактериями и образование молекулярного азота*.
но увеличивает выделение растворимых газов N20, C02
(Stephenson, Murphy, 1980).
Для проведения денитрификации использовались также клетки:
Pseudomonas denitrificans, иммобилизованные включением в
Са+2-альгинатный гель. Использовали частицы размером от 0,5*
до 3 мм. Процесс проходил с большой интенсивностью. Однако
стабилизация альгинатных гранул поперечно-сшивающими
агентами вызывала 50—100%-ную потерю денитрификационной
активности. Поэтому весьма вероятно, что денитрификация
осуществлялась в основном растущими клетками, расположенными на*.
поверхности гранул (Nilsson, Ohlson, 1982).
Хранение микроорганизмов на адсорбентах
Для хранения микроорганизмов часто применяют самые
различные адсорбенты: почвы, песок, бентонит, каолинит, уголь,,
тальк, полоски фильтровальной бумаги, стеклянные и
фарфоровые бусы, хлопчатобумажные ткани, силикагель, костную муку,
нерастворимые фосфаты, полимерную соль фосфорной кислоты*,
углекислый кальций, пластмассы, пшено, кристаллы сахарозы
и т. д.
Этот вопрос изучался в трех направлениях: 1) сохранение*
чистых культур бактерий на адсорбентах; 2) выживание на
адсорбентах патогенных бактерий; 3) выживание почвенных
микроорганизмов при высушивании, хранении и различных
воздействиях на почву.
В общем, адсорбенты явно способствуют выживанию
бактерий, иногда в течение многих лет. В высушенной почве бактерии:
могут сохраняться несколько сотен лет, а судя по динамике их
отмирания во времени, и тысячи лет (Sneath, 1962).
Экспериментально показано, что культуры бактерий сохраняются в почве
многие десятки лет. Например, в 73 образцах воздушно-сухой
почвы через 10 лет количество актиномицетов статистически
достоверно увеличилось на 5% (Agate, Bhat, 1967).
Бактериальные удобрения часто готовят, используя в качестве
98
наполнителя почву, и хранят в воздушно-сухом состоянии, при
этом обычно микроорганизмы сравнительно хорошо сохраняются.
Хранят микроорганизмы и в сухом и во влажном торфе.
Клубеньковые бактерии в почвенной культуре могут
сохраняться в течение 30—45 лет (Jensen, 1961). Отмечена хорошая
выживаемость клубеньковых бактерий в почвенных образцах, а
также в порошке древесного угля и каменного угля нескольких
сортов (некоторые сорта антрацита оказались непригодными для
хранения бактерий), в порошке с активированным углем, в
гранулах гипса.
В песчаной почве при добавлении 20% монтмориллонита
выживаемость быстрорастущих видов клубеньковых бактерий
увеличивалась в 30—40 раз. Выживаемость же медленнорастущих
жлубеньковых бактерий при добавлении монтмориллонита даже
несколько уменьшалась (Bushby, Marshall, 1977). Такое странное
противоположное поведение популяций двух близкородственных
бактерий можно объяснить адсорбцией монтмориллонитом каких-
то специфических физиологически активных веществ, влияющих
на выживание клеток.
Клубеньковые бактерии, заключенные в полиакриламидный
гель (ПААГ), хорошо сохраняются, и метод предлагается для
практического применения, но храниться бактерии должны в
увлажненном состоянии (Dommergues et al., 1978, 1979). В почве
сохраняются не только жизнеспособность микроорганизмов, но
и в ряде случаев их ценные свойства (азотфиксация, образование
антибиотиков). В сохранении культур в почвах большую роль
играет наличие в них глинистых минералов и коллоидов.
Дополнительное внесение гидрофильных коллоидов, обладающих
способностью прочно связывать свободную воду, способствует
сохранению микроорганизмов.
В почвах хорошо сохраняются многие актиномицеты
(Кузнецов и др., 1973), а также грибы (Супрун, 1965; Pridham et al.,
1973). Азотобактер хорошо сохраняется при внесении в почвы,
торф, асбест и другие вещества. При внесении с адсорбентами
азотобактер обычно лучше сохраняется и в почве в полевых
условиях.
При хранении культур с успехом применялись не только
почвы, но и другие адсорбенты. Например, культура Вас, brevis
хорошо сохранялась на пшене и в песке.
В. П. Израильский (1951) установил, что клубеньковые
бактерии хорошо сохраняются на частицах талька и хуже на
частицах мела и песка. Норрис (Norris, 1963) предлагает хранить
клубеньковые бактерии на фарфоровых бусах; десять культур
хорошо сохраняли свои свойства на протяжении 2,5 лет. Маршалл
(Marshall, 1968) изучил сохранение клубеньковых бактерий на
бентоните.
Ацетонобутиловые бактерии в песке сохранялись значительно
дольше (38 лет), чем в сброженном сусле (1—2 года) (Rokusho,
Saito, 1960).
4*
99
Покрытие клеток коллоидами и искусственными
микрокапсулами предохраняло их от неблагоприятного воздействия внешних
факторов, например солнечного света (Andrews, Spence, 1979).
Пленки из метилцеллюлозы также предохраняли клетки бактерий
от гибели при хранении (Suslow, Schroth, 1981).
Thiobacillus ferrooxidans предлагается хранить в смеси песка
и пирита (Ильина и др., 1981). Azotobacter chroococcum в сухой
почве сохранялся в виде цист более 10 лет (Vela, 1974). Адгезия
на хитине предохраняет Vibrio cholerae от воздействия низкого*
рН (Nalin et al., 1979). Вне почвенных агрегатов
нитрифицирующие бактерии значительно более чувствительны к быстрому
высушиванию над Р2О5 или СаС12, чем внутри агрегатов (Nishio,
Furusaka, 1970a, b). Широко применяется хранение бактерий на
силикагеле (Патрикеев и др., 1976; Corona, Rodriguez, 1979;
Thorns, 1979). Адсорбенты (кусочки фильтровальной бумаги,,
ткань) успешно применяются для сохранения и пересылки
испражнений для бактериологического анализа (Козлов, 1968; Р. ЕПпег,.
С. Ellner, 1966).
Причины лучшего сохранения микроорганизмов на
адсорбентах по сравнению с жидкими и агаризованными средами пока не
ясны. Отметим некоторые причины, которые, по нашему мнению,
могут благоприятствовать сохранению микроорганизмов на
адсорбентах.
1. Адсорбенты предохраняют микроорганизмы от чрезмерного
высыхания. Так, Маршалл (Marshall, 1968) установил, что клетки
клубеньковых бактерий покрываются сплошным слоем из частиц
бентонита, причем на клетке адсорбируется очень много
пластинчатых частиц, которые располагаются ребром к поверхности
клеток (на 1 мкм2 поверхности клетки приходится 200 мкм2
поверхности частиц бентонита). Этот слой частиц предохраняет клетки
от потери влаги, с чем, в частности, автор связывает большую
устойчивость клеток к воздействию повышенных температур.
Адсорбенты связывают свободную воду и поддерживают влажность
на постоянном уровне без резких колебаний. Известно, что
резкие колебания влажности могут способствовать гибели клеток.
Скорость отмирания высушенных клеток зависит от количеству
связанной воды в клетках. Связанная вода стабилизирует белок
и нуклеиновые кислоты. Связанной воды должно быть не менее
30 г/100 г белка (Webb, 1933). Инозит может замещать эту воду
и тем самым способствовать сохранению клеток. При потере воды
резко возрастает частота образования мутантов.
2. Сохранению клеток могут способствовать адсорбция и
частичная дезактивация ферментов.
3. Адсорбенты могут связывать и удалять из среды
токсические вещества, образуемые микроорганизмами.
4. Адсорбенты защищают бактерии от действия бактериофагов
и Bdellovibrio spp. (Roper, Marshall, 1979).
5. Адсорбенты предохраняют микроорганизмы от воздействия
ряда неблагоприятных факторов внешней среды. Замедляются
100
процессы диффузии вредных веществ. В почве, особенно сухой,
микроорганизмы переносят значительно большие дозы радиации,
ультрафиолетового облучения. Обработка материалов
дезинфицирующими веществами зависит от пористости обрабатываемого
материала. Для стерилизации пористых тел требуется
значительно более длительная обработка такими стерилизующими агентами,
как окись этилена, хлор и перуксусная кислота. Адсорбированные
клетки переносят более высокие температуры. Адсорбенты
(глинистые минералы) предохраняют микроорганизмы при
повышенном осмотическом давлении.
Таким образом, адсорбенты могут предохранять клетки от
воздействия ряда вредных факторов.
6. В сухой стерильной или нестерильной почве
микроорганизмы хорошо сохраняются, что наряду с отмеченными факторами
обусловлено микрозональностью и гетерогенностью почвы. В
почве всегда имеется некоторое количество микрозон,
физико-химические условия в которых благоприятствуют сохранению клеток.
Особенно хорошо в почве сохраняются почвенные
микроорганизмы. Почва представляет собой наиболее благоприятную и
привычную для них среду, к которой они приспособились.
Микроорганизмы лучше сохраняются в тех почвах, из которых они
выделены.
Микроорганизмы хорошо сохраняются в увлажненных
естественных простерилизованных почвах. Это обусловлено тем, что
почва представляет собой идеальную среду для поддержания
жизнедеятельности микробов. Она всегда содержит полимерные
органические вещества, которые подвергаются медленному
гидролизу благодаря наличию в почве внеклеточных гидролаз, и
клетки, оказываются постоянно обеспеченными легкоиспользуемыми
мономерами, которые служат для поддержания клеточного
обмена. Микрозональность почв создает такие условия, когда
одновременно присутствует некоторое количество микрозон, по своим
условиям благоприятных для развития или сохранения каждого
микроорганизма. В противоположность ранее существовавшему
мнению, что внесенные в почву микроорганизмы быстро погибают,
в настоящее время многочисленными работами установлено, что,
как правило, внесенный микроорганизм сохраняется в почве и
его численность стабилизируется на определенном уровне.
Уровень стабилизации зависит от свойств почвы и от уровня
внесения. В почве погибают только те микроорганизмы, которые
приспособились к развитию в богатых средах и плохо переносят
дефицит питания, или те, для которых резко неблагоприятны
определенные почвенные условия. Наиболее четко это положение
показано на примере с неблагоприятным воздействием на
некоторые бактерии низкого рН.
Действие антимикробных веществ
в присутствии адсорбентов
Выполнено много работ по изучению влияния адсорбентов на
действие самых различных антимикробных веществ на бактерии.
Изучалось действие антисептиков, тяжелых металлов,
антибиотиков, литических ферментов и т. д. Однако однозначного ответа
на вопрос о том, как будет влиять адсорбент на антимикробное
действие вещества, получить не удалось. Для определения
действия этих веществ необходимо установить по крайней мере
следующее: будет ли антимикробное вещество адсорбироваться и при
этом сохранять свою активность по отношению к
микроорганизмам? Следует учитывать взаимное расположение клеток и
адсорбента (рис. 19). Во всех случаях, когда вещество адсорбируется,
I s
Рис. 19. Различные случаи взаимного расположения частиц адсорбентов и
клеток бактерий (объяснения см. в тексте)
но клетки и частицы разделены в пространстве, адсорбент будет
частично или полностью снимать действие токсиканта. При
адгезии клеток на тех же частицах, на которых адсорбировалось
антимикробное вещество, отмечаются и случаи, когда его
действие ослабляется или усиливается. Уменьшение или исчезновение
токсичности наблюдается, когда токсин при адсорбции инактиви-
руется или настолько прочно связывается с адсорбентом, что не
может попасть в клетку. Если токсин адсорбируется внутренними
поверхностями адсорбента (иониты, глинистые минералы типа
монтмориллонита), клетки и токсин тоже оказываются
разделенными в пространстве.
В ряде случаев адсорбированное (иммобилизованное)
токсичное вещество действует только на адгезированные клетки, но не
действует на клетки, расположенные поблизости и находящиеся
в жидкости. Прямой контакт клетки с адсорбированным
веществом может повышать его токсичность (Звягинцев, 1964).
Приведем некоторые примеры.
Мартин и др. (Martin et al., 1976) в опытах со стрептомице-
тами показали, что Са-монтмориллонит связывает токсичные
вещества и оказывает положительное действие на развитие клеток
и тогда, когда он отделен от культурального сосуда полупрони-
102
цаемой мембраной. Это положение было развито дальше в
работах Филипа (Filip, 1978). Каолинит при добавлении его в почву
снимал антагонистическое действие Serratia marcescens на Asper*
gillus niger (Rosenzweig, Stotzky, 1979). Однозначное
заключение о причинах такого влияния сделать трудно, хотя эффект
проявляется весьма четко. Напомним, что Стотцкий доказал, что
распространение некоторых фитопатогенных грибов тесно связано
с минералогическим составом почв.
Адсорбция антибиотика может приводить к его инактивации
или, наоборот, к стабилизации с сохранением активности (Mayama
et al., 1976). Часто адсорбенты способствуют удалению из куль-
туральной среды токсичных веществ. Например, молочную
кислоту можно удалить с помощью анионитов при культивировании
молочнокислых бактерий (Rymaszewski et al., 1975). Уголь
применяется как адсорбент образующихся в культуральной среде
токсинов (James et al., 1979).
Пропитка материалов (катионитов) антимикробными
веществами приводит к их токсичности для микробов (Ежова и др.,
1980).
Мембранные фильтры могут содержать адсорбированные
токсичные вещества, которые сильно воздействуют на адгезирован-
ные бактерии (Tuovinen et al., 1971).
Тяжелые металлы. Добавление в жидкую среду
монтмориллонита или каолинита устраняет токсичное действие кадмия. В
почвах монтмориллонит оказывает защитное действие в отношении
токсичности кадмия, каолинит не эффективен (Babich, Stotzky,
1976).
Адсорбенты могут оказывать очень активное воздействие.
В песчаной почве добавление 500—2000 мг/л свинца ведет к
подавлению дыхания микроорганизмов на 50%. В торфяной почве
с большими внутренними адсорбирующими поверхностями даже
10000 мг/л свинца не влияло на дыхание почвенных
микроорганизмов (Doelman, 1977). Факт связывания почвами металлов и
понижения их токсичности устанавливается во многих работах
(Foully, 1976).
Нужно отметить, что от действия тяжелых металлов (Си2+,
Cd2+) может предохранять и полисахаридная капсула.
Причины влияния адсорбентов
на активность микроорганизмов
Введение твердых адсорбентов в среду для культивирования
бактерий меняет интенсивность и направленность
физиологических и биохимических процессов, осуществляемых бактериями и
их ферментными системами, меняется скорость размножения,
интенсивность нарастания биомассы, размеры и морфология клеток.
Иногда введение адсорбента дает возможность развиваться в
данной среде микроорганизму, который без адсорбента в ней вообще
не развивался. При наличии смешанных культур введение ад-
103
сорбента часто сказывается на степени развития каждой
популяции и соотношении их численности.
Вопрос о влиянии адсорбентов на развитие бактерий имеет
большой общеэкологический и практический интерес, так как в
природе почти всегда микробные популяции развиваются в
присутствии твердых адсорбентов, а в промышленности все больше
и больше отказываются от культивирования микроорганизмов в
жидких средах и переходят к средам, содержащим адсорбенты.
Сейчас интенсивно изучаются процессы, выполняемые так
называемыми «иммобилизованными клетками». Вопрос об
иммобилизованных клетках возник сравнительно недавно, после изучения
иммобилизованных ферментов и ориентируется в основном на эту
область знаний. Но между адгезией (адсорбцией) клеток и их
иммобилизацией нет существенной разницы. При иммобилизации
в полиакриламидный гель (ПААГ) клетки находятся в двух
различных положениях: 1) на поверхности гранул геля и твердых
адсорбентов (а это и есть адгезия клеток); 2) клетки заключены
в гель. Однако и второй случай имеет прямое отношение к
адгезии клеток, так как в природных местообитаниях — воде и почве,
на поверхности корней и слизистой оболочки кишечника
животных микробы также погружены в гель из органических,
минеральных или органоминеральных веществ. В последнее время часто
описывают иммобилизацию бактерий на угле, гидроокисях
металлов, стекле, керамике, силикальците, целлюлозе. Поскольку
это явление традиционно рассматривалось при изучении адгезии
(адсорбции) клеток, то, естественно, введение нового термина для
обозначения старого понятия приводит к путанице. Обычно при
изучении иммобилизации клеток из поля зрения авторов
ускользают работы, выполненные в области адгезии микроорганизмов.
По нашему мнению, основная причина изменений
жизнедеятельности клеток при адгезии заключается в избирательной
адсорбции веществ и создающейся специфике условий на
поверхности раздела твердой фазы и жидкости, и возникновении
специфической микрозоны на этой поверхности раздела фаз. Сами по
себе силы адгезии не оказывают существенного влияния на
развитие бактерий. При рассмотрении специфики условий, которые
создаются для жизнедеятельности клеток в присутствии твердых
частиц, необходимо обратиться к схеме возможных случаев
взаимного расположения клеток и частиц адсорбента (см. рис. 19).
1. При адгезии клеток на поверхности частиц адсорбента
(рис. 19, а) действие адсорбента проявляется весьма сильно.
Клетки оказываются в микрозоне на границе раздела фаз, где
концентрация питательных веществ, ферментов, стимуляторов и
ингибиторов роста значительно отличается от их концентрации в
жидкой среде. Существенное значение будет иметь то, насколько
плотно и прочно прикрепляются бактерии клеточной стенкой,
капсулой, фимбриями, жгутиками, стебельками или другими
выростами (см. рис. 3), происходит ли однослойная или многослойная
адгезия. В ряде случаев в естественных субстратах (в почвах,
104
на поверхности корня и т. д.) клетки могут оказываться частично
или полностью погруженными в органический или минеральный
гель. В описанных случаях клетки будут занимать разные
микрозоны и, находясь на различном расстоянии от поверхности,
будут жить в зонах с разными условиями.
2. Частицы, меньшие по размеру, чем клетки, и близкие к
коллоидным или коллоидные, осаждаются на поверхности клетки
(см. рис. 19,в). В этом случае клетка также оказывается в
специфическом окружении, причем создаются особые условия для
диффузии веществ из жидкости.
3. В случае образования агрегатов из клеток и частиц
адсорбента (рис. 19, г) наличие адсорбента наиболее сильно влияет на
развитие бактерий. Клетки оказываются со всех сторон
окруженными частицами адсорбента, создаются специфические условия
для диффузии всех веществ, в том числе и газов, и влияние
адсорбента проявляется наиболее сильно.
4. Клетки и частицы адсорбента располагаются в жидкой
среде раздельно (см. рис. 19,6). В этом случае адсорбент может
оказывать только косвенное действие, удаляя из среды опреде*
ленные вещества. В одних случаях такими веществами могут
оказаться токсичные вещества, удаление которых может влиять
положительно. В других случаях могут адсорбироваться элементы
питания и стимуляторы роста, удаление которых будет оказывать
отрицательное действие.
Естественно, что при прямом контакте (см. рис. 19, а, в, г) и
при отсутствии такого контакта (см. рис. 19,6) адсорбенты
должны оказывать прямо противоположное действие, что было
доказано опытами разделения частиц и клеток полупроницаемой
мембраной. Адсорбция веществ внутренними поверхностями частиц
(монтмориллонит, ионообменные смолы), куда клетки из-за
малого размера пор проникнуть не могут, будет оказывать иное
действие, чем адсорбция вещества на поверхности
непосредственно в месте прикрепления клеток.
Некоторые вещества, связанные с адсорбентом, могут
оказаться недоступными для адгезированных клеток, что было показано
на примере малых количеств витаминов, аминокислот, токсинов,
тяжелых металлов и т. д. Наоборот, большие количества
адсорбированных веществ, особенно в случае их ионной адсорбции,
оказываются даже более доступными для подвергающихся адгезии
клеток, чем для свободных микроорганизмов. Из приведенных
схем совершенно ясно, что в зависимости от взаимного
расположения клеток и частиц адсорбента последние могут оказывать
совершенно различное действие на активность клеток. К
сожалению, в большинстве работ, касающихся влияния адсорбентов на
микроорганизмы, категории взаимодействия клеток и частиц
адсорбента не устанавливались. Часто не указываются величина
частиц адсорбента и степень адгезии клеток. Различиями во
взаимном расположении клеток и частиц, вероятно, объясняются,
противоречивые результаты, полученные разными исследователя-
105
ми, изучавшими влияние глинистых минералов на интенсивность
дыхания бактерий или на нитрификацию и другие процессы.
Исследователю приходится считаться и с тем фактом, что клетки в
процессе развития могут изменять свое положение, подвергаясь
адсорбции и десорбции.
Действие адсорбентов в первую очередь обусловлено
свойствами их поверхности, изменением концентрации клеток на
поверхности, а также изменениями концентрации и активности
различных веществ, происходящими на границе раздела твердого тела и
жидкости. Клетки, подвергшиеся адгезии, в отличие от свободных
клеток попадают в зону с повышенной концентрацией многих
веществ: катионов, питательных органических субстратов, экзофер-
ментов и других биологически активных веществ, что впервые
было четко сформулировано Зобеллом (ZoBell, 1943) (рис. 20).
Кроме того, влияние адсорбентов определяется степенью
доступности адсорбированных веществ для клеток и спецификой
условий, при которых возможен гетерогенный катализ.
Большое влияние на развитие бактерий оказывает адсорбция
на поверхности самых разнообразных веществ, например
концентрирование на отрицательно заряженных поверхностях катионов
Щ|9 / •г аз Ш 4
Рис. 20. Концентрирование клеток бактерий (/), катионов (2),
субстратов (3), экзоферментов и других биологически активных
веществ (4) на поверхности почвенных частиц
(К+, Са2*, NH4+, микроэлементов, тяжелых металлов). Они
более доступны для адгезированных клеток, чем для свободных. На
поверхности изменяются кислотность среды и
окислительно-восстановительный потенциал, происходит концентрирование одних
органических веществ и уменьшается концентрация других,
создаются совершенно особые условия для активности
экзоферментов. Адсорбенты влияют на распределение в среде питательного
субстрата и продуктов его гидролиза. Важное значение имеет
106
адсорбция физиологически активных веществ — витаминов, анти*
биотиков, стимуляторов роста, аминокислот, токсинов. Эти
вещества в зависимости от химической природы адсорбируются или
остаются в растворе, причем активность адсорбированных
веществ может сохраняться или исчезать.
Развитие бактерий зависит и от соотношения между жидкой,
твердой и газообразной фазами. Бактерии развиваются в
специфических условиях в пленках и капиллярах, причем
первостепенное значение имеет толщина этих пленок и капилляров (рис. 21).
Рассмотрим более подробно, как влияют на развитие
микробов отдельные факторы, меняющиеся на поверхности адсорбента.
Влияние реакции среды. Величина рН на границе раздела
адсорбента и жидкости отличается от рН остального раствора
(McLaren, Seaman, 1968). Значение рН на поверхности раздела
вычисляется по следующей формуле: рНп = рНж + ?/60 (Hartley,
Roe, 1940), где рНп — концентрация Н+ на поверхности
адсорбента, рНш—концентрация Н+ в растворе, ? —
электрокинетический потенциал.
На границе раздела отрицательно заряженного адсорбента и
жидкости рН может быть на 0,5—0,2 единицы ниже, чем в
остальном растворе, что, естественно, влияет на активность адгезиро-
ванных клеток и экзоферментов. Это так называемый «рН-эф-
фект». Специфика рН на границе раздела фаз и ее воздействие
на скорость ферментативных
реакций были показаны Мак-Лареном
еще в 1957 г. Экспериментально в
ряде работ было показано, что
оптимальное значение рН для клеток,
Рис. 21. Клетки бактерий в пленках и в
капиллярах разной толщины:
1 — пленка и капилляры очень тонкие,
клетки прижаты к поверхности; 2 —
пленки и капилляры значительно толще
клеток, могут встречаться и свободные и ад-
гезированные клетки; 3 — пленки и
капилляры во много раз толще клеток,
возможно свободное передвижение клеток
подвергшихся адгезии на отрицательно заряженных частицах, как
бы смещено в щелочную сторону, если о рН поверхности судить по
жидкой фазе (Великанов, Звягинцев, 1968; Звягинцев, 1969), и др.
Об оптимальном рН обычно судили по скорости потребления
субстрата или по интенсивности дыхания.
Изменение рН на границе раздела фаз действует не только
на клетки, но и на адсорбированные экзоферменты, от активности
которых, естественно, зависит жизнедеятельность клеток.
Оптимум рН адсорбированных ферментов также отличается от
оптимума рН свободных ферментов, если судить по рН жидкой фазы.
Мак-Ларен основное значение придает изменению на границе
раздела именно концентрации ионов водорода, а не их активно-
107
сти. Однако в действительности на границе раздела изменяются
и концентрация и активность. Иногда это не учитывают, ссылаясь
на уравнение Гиббса. Согласно уравнению Гиббса при
равновесии фаз, находящихся в прямом контакте, химический
потенциал [I любого индивидуального вещества, входящего в эту систему,
должен иметь одно и то же значение во всей системе. Химический
потенциал связан с активностью следующим уравнением: ^ = ji0 +
+ /?Г1па, где \х — химический потенциал любого индивидуального
компонента, jli0 — химический потенциал данного компонента в
некотором условно принятом состоянии, R — газовая постоянная,
Т — абсолютная температура, а — активность ионов.
В растворе для данного компонента имеем pi = \iq+RT In а\9
для этого же компонента раствора, находящегося в поглощенном
состоянии: \i2 = [io + RT\na2, так как jai = jx2, to отсюда должно
следовать, что ai=«2.
Однако это уравнение справедливо не всегда. Условия
равенства химических потенциалов не выполняются для ряда случаев
гетерогенного равновесия, когда состояние системы определяется
не только давлением, температурой, химическим составом, но и
целым набором других параметров: электрическим
взаимодействием, взаимодействием фаз системы и т. д.
В гетерогенных системах, где на границе фаз имеются скачки
электрических потенциалов (например, суспензия почв и
глинистых минералов), соблюдается не равенство химических
потенциалов (1x1=7^=1x2), а равенство электрохимических потенциалов,
которые являются производными от химических потенциалов:
j]i = |i+Z/4|), где (х — электрохимический потенциал иона, jx —
химический потенциал иона, Z — валентность иона, F — число Фа-
радея, я|) — электростатический потенциал иона.
При установлении равновесия в данной системе и при
постоянном давлении, температуре и общем заряде разность
электрохимических потенциалов фаз равна нулю. Отсюда fmi = |Л2-
Подставим значения электрохимических потенциалов:
[i0+RT\nai + ZF^l = iio + RT\na2 + ZFy2-
Упрощая уравнение, имеем
RT In аг + ZF^ = RT In a2 + ZA|)2;
RT(\na1 — \na%) = ZF(^1—^);
a2
Так как \|>i—-ф2 не равно нулю, ибо существует скачок
потенциала, то и In-^-=7^=0. Отсюда а\фа2, т. е. на поверхности адсор-
бентов происходит не только резкое увеличение количества ионов
(Н+ и др.)> но также изменяется и их активность. Следовательно,
рН-эффект обусловлен суммарным действием повышенной
концентрации и повышенной активности ионов водорода.
108
Влияние окислительно-восстановительного потенциала. На
границе раздела адсорбента и раствора концентрируются не только
лоны водорода, но и разнообразные вещества, составляющие
окислительно-восстановительные системы. В этом отношении
интересны исследования Хаттори и Фурусака (Hattori, Furusaka, 1959 a, b),
изучавших действие на адгезированные клетки микроорганизмов
цистеина, который изменяет окислительно-восстановительный
потенциал на заряженной поверхности.
Граница раздела жидкости и твердого тела является той
микросредой, где клетки легче, чем в остальной жидкости, могут
лзменять условия в благоприятную для своего развития сторону.
Этому безусловно, способствует концентрирование здесь клеток,
происходящее благодаря их адсорбции. Большую роль играет
изменение в этой микросреде значений Eh и рН, которое может
происходить в результате действия регуляторных механизмов
микробных клеток. Активным изменением в благоприятную сторону
окислительно-восстановительных условий объясняется способность
анаэробных микроорганизмов развиваться в средах, содержащих
кислород, при добавлении в них адсорбентов. Этим частично
обусловлено положительное действие адсорбентов на ряд
брожений: ацетонобутиловое, пропионовокислое, молочнокислое,
метановое и др.
Влияние концентрации неорганических катионов. Действие
адсорбированных неорганических катионов наиболее подробно
изучено на примере микроорганизмов, осуществляющих первую
фазу нитрификации. Адсорбированный аммоний обычно
используется микроорганизмами более интенсивно, чем свободный, что
объясняется концентрированием ионов вблизи адсорбированных
клеток.
ЖИДКАЯ ФАЗА ПОЧВЫ
Жидкая фаза почвы (почвенный раствор) обычно
располагается в капиллярах или образует пленки разной толщины.
Капилляры и пленки могут быть значительно толще и значительно
тоньше клеток микроорганизмов (рис. 22). Сравнительно редко после
дождей или полива в почве появляются большие объемы воды,
которые движутся под действием сил гравитации. Для жидкой
фазы почвы характерна микрозональность в отношении
содержащихся в том или ином объеме почвенной влаги растворенных
газов, органических веществ, рН и т. д. Микрозоны на протяжении
некоторого времени могут различаться и по потенциалу влаги
(активности воды). Она может быть различной в течение долгого
времени в разных почвенных слоях или горизонтах.
Жидкая фаза почвы всегда содержит некоторое количество
минеральных, органических и органоминёральных веществ в мо-
лекулярно-растворенном или коллоидном состоянии, а также
растворенных газов.
109
Однако концентрация питательных веществ в почвенном
растворе обычно очень мала, и развитие микроорганизмов в объеме
почвенного раствора происходит сравнительно редко. Обычно они
развиваются не в почвенном растворе, а на поверхности твердых
частиц, где благодаря явлениям адсорбции концентрируются
питательные вещества. Таким
образом, главная функция почвенного
раствора заключается в
обеспечении почвенных
микроорганизмов водой, в регулировании
диффузии газов и только частично в
питании клеток. Снабжение лег-
корастворимыми питательными
веществами обычно проходит два
этапа: 1) перенос питательных
веществ с почвенным раствором
Рис. 22. Пространственное
расположение клеток бактерий (1) и различных
форм воды (2)
на твердую поверхность и концентрирование их на ней; 2)
использование адсорбированных веществ адгезированными микробными
клетками.
Почвенный раствор в сотни и тысячи раз менее
концентрирован по сравнению с обычно применяемыми микробиологическими
средами, например средой Чапека, МПА, КАА. Отсюда возникла
идея о необходимости применения при культивировании
почвенных микроорганизмов очень разбавленных питательных сред,
особенно в тех случаях, когда исследователь хочет приблизиться к
воссозданию естественной обстановки. Конечно, применение
менее концентрированных сред приближает экспериментатора к
естественным экологическим условиям, существующим в почвенном
растворе, но в то же время необходимо иметь в виду, что в
отдельных микрозонах могут и в естественной почве создаваться
высокие концентрации растворенных и нерастворенных
питательных веществ. Примером микрозон первого типа может служить
ризоплана, в которую непрерывно и в большом количестве
поступают корневые выделения, а примером микрозон второго типа —
отмерший корешок растения или погибший земляной червь.
ТЕРМОДИНАМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯ
ПОЧВЕННОЙ ВЛАГИ
{термодинамический потенциал, активность воды]
Условия увлажнения в почве обычно характеризовали
влажностью почвы, выраженной в процентах от ее веса. Однако эта
величина недостаточно характеризует степень доступности воды
для организма. Например, при 20%-ной влажности глинистой и
/°°°^
777777777777777777777777777^
77777,
Ь///////7/
777777777777
У//7//777//7777/7/.
У77777777777,
ПО
песчаной почв степень доступности воды для организмов
совершенно разная. В глинистой почве она будет малой, так как вода
сбудет связана с огромной поверхностью глинистых частиц, а в
песчаной — большой. Возможность объективно оценить
состояние воды в почве и ее влияние на жизнедеятельность
микроорганизмов дает определение потенциала влаги (активности воды),
так как в этом случае состояние воды в почве, растениях,
микроорганизмах, атмосфере, снегу и во льду характеризуется при
помощи единой, физически строго определенной величины —
термодинамического потенциала переноса (Судницын, 1966). Эти
показатели характеризуют степень связанности и
термодинамической подвижности воды в системе, причем они не зависят от
того, связана ли вода с поверхностью почвенных частиц, ионами
солей, макромолекулами или кристаллами льда.
В микробиологии наиболее часто используется термин
активность воды (aw), который характеризует степень связанности ее
молекул и тем самым степень доступности для микроорганизмов.
Активность свободной воды равна единице. При взаимодействии
воды с твердыми поверхностями, катионами и анионами,
молекулами мономеров и полимеров, т. е. любыми гидрофильными
группировками, активность воды становится меньше единицы.
Активность воды определяется по формуле
_-Р ОВ П2
aw~~ Р0 "" 100 ~~" ГЪ-Пз*
где Р — давление водяного пара в исследуемой системе, Р0 —
давление пара над чистой водой, ОВ — относительная влажность
воздуха в системе, Oi — число молей растворителя, П2 — число
молей растворенного вещества.
Часто состояние воды в системе характеризуется потенциалом
влаги. Он характеризуется давлением, которое нужно приложить,
чтобы при данных условиях началось удаление молекул воды из
-системы. Иначе можно сказать, что потенциал влаги измеряется
количеством работы, которая должна быть затрачена для
извлечения воды: ;
р dA
где А — работа, V — объем.
Потенциал чистой воды равен нулю. По отношению к чистой
воде все растворы имеют отрицательные потенциалы, которые
выражаются в отрицательных атмосферах.
Сопоставление различных величин, выражающих
термодинамическое состояние воды, представлено в табл. 14.
Часто водный потенциал выражается в барах (1 бар =
= 106 дин-см2 = 0,987 атм). Через активность воды его можно
выразить следующим образом:
111
Таблица 14
Относительная влажность воздуха, активность воды
и потенциал влаги при 20°
Относительная
влажность, %
100
99
98
97
96
94
90
85 '
aw
1,00
0,99
0,98
0,97
0,96
0,94
0,90
0,85
Потенциал
влаги, атм
0
—13
—27
—41
—54
—82
—140
—214
Относительная
влажность, %
80
75
70
60
50
40
20
10
aw
0,80
0,75
0,70
0,60
0,50
0,40
0,20
0,10
Потенциал
влаги, атм
—297
—383
—475
—680
—923
—1221
—2144
—3067
где Wa — молекулярный вес воды, R — газовая постоянная, Т —
абсолютная температура.
Потенциал воды может быть матричным или осмотическим.
Матричное изменение водного потенциала обусловлено
адсорбцией молекул воды на поверхности почвенных частиц.
Осмотическое изменение водного потенциала происходит в растворе в
результате взаимодействия молекул воды с растворенными
веществами.
Различные микроорганизмы имеют разные границы
активности воды, в которых возможно их развитие (табл. 15). Наиболее
ксерофильными (ксеротолерантными) являются некоторые грибы.
Они могут развиваться при aw=0fi0. Имеется много работ, в
которых утверждается, что те или иные микроорганизмы могут
развиваться при аад<0,60, но пока все эти данные следует
признать недостоверными.
Способность грибов развиваться при низких значениях
активности воды, возможно, связана с их способностью запирать
свободную воду в определенных участках клеток. По данным С. И.
Аксенова (1978), этой способностью обладают эукариотные клетки,
но ее лишены прокариоты. Следует отметить, что ряд
микроорганизмов не развивается не только при низких активностях водыг
но и при слишком высоких (см. табл. 15).
Бактерии, по имеющимся сведениям, являются гигрофилами,
но явное исключение составляют по крайней мере галофилы, для
развития которых необходима низкая активность воды, и нижний
предел их развития лежит в области активности воды 0,75—0,85.
Раньше обычно выделяли и рассматривали следующие формы
воды в почве: 1) гигроскопическая; 2) пленочная; 3)
капиллярная; 4) гравитационная. В настоящее время показано, что
выделение этих форм воды не вполне оправдано, так как границы
между разными формами весьма условны. Однако с позиций экот
112
лога-микробиолога полезно представить себе конкретное
пространственное расположение клеток микроорганизмов и
определенных форм воды (см. рис. 22).
Гигроскопическая вода удерживается на поверхности
почвенных частиц со сравнительно большой силой, которой достаточно,
чтобы удержать движущиеся с большой энергией молекулы воды,.
Таблица 15
Величины активности воды, лимитирующие рост
микроорганизмов (по Д. Кашнер, 1981)
Микроорганизмы
Грибы
Rhizopus nigricans
Penicillium spp.
(8 видов)
Aspergillus f lav us
A. niger
A. amstelodamii
Sporendonema sebi
Xeromyces bisporus*
Бактерии
Bacillus subtilis
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Vibrio metchnikovii
Lactobacillus sp.
Staphylococcus spp.
(14 видов)
Умеренные галофилы
Экстремальные
галофилы
Нижний предел роста,
aw
0,93
0,80—0,90
0,90
0,84(0,96—0,98)
(0,70—0,95)
0,77
0,65
0,949
0,945
0,932
0,995—0,960
0,900
0,860—0,880
0,86—0,98
0,75—0,88
Примечание. В скобках — оптимальные
значения aw.
* Не растет при aw, превышающих 0,97.
находящиеся в газообразном состоянии. Почва насыщается да
максимальной гигроскопичности, когда относительная влажность
воздуха равна 94% (а^ = 0,94). Часто ошибочно считают, что
насыщение до максимальной гигроскопичности происходит при
относительной влажности 100%. Гигроскопическая вода образует
очень тонкий слой, который, вероятно, составляет сотые доли
микрометра, т. е. гораздо тоньше, чем даже самые мелкие клетки
бактерий. Обычно ой в сотни раз тоньше клетки. Пленка
гигроскопической воды покрывает не только почвенные частицы, но и
гидрофильные участки клеток микроорганизмов (см. рис. 22).
Напомним, что ряд биополимеров способен очень сильно гидра-
тироваться, например многие белки адсорбируют 30—40% воды
от своего веса. Многие микроорганизмы развиваются при
содержании воды, гораздо меньшем, чем максимальная
гигроскопическая. По нашему мнению, их следует рассматривать как разви-
113
вающиеся «на суше» (см. рис. 22). Неправильно относить все
микроорганизмы к гидробионтам, как это часто делается в
экологии, когда утверждают, что микробы развиваются в объеме
воды вне зависимости от того, где они находятся — в море или
почве. Можно разделить сухопутный и водный способы развития
микроорганизмов в почве в зависимости от того, идет ли их
развитие в объеме жидкости или в тонкой пленке. Ксерофилы — это
«сухопутные» микроорганизмы, гигрофилы — водные.
Размножение, морфология и метаболизм микроорганизмов, развивающихся
при резком дефиците влаги, весьма своеобразны.
При очень тонких пленках и низкой активности воды можно
предположить возможность развития микроорганизмов за счет
метаболической воды, которая получается в результате
окисления органического вещества внутри клеток: СбН120б+6 02 =
= 6С02+6Н20. Исходя из уравнения можно рассчитать, что на
1 кг использованного сахара образуется 600 г воды.
При влажности воздуха больше 94% начинает формироваться
пленочная вода, причем пленки могут быть значительно толще,
чем при увлажнении до максимальной гигроскопической. Они
могут быть и тоньше микробных клеток, и толще их (см. рис. 21,
22) — от долей микрометра до десятка или даже нескольких
десятков микрометров. Условия развития микроорганизмов в
пленках разной толщины различны, что обусловлено различной
скоростью диффузии газов к клеткам, спецификой условий
диффузии других веществ и т. д. В почве обычно одновременно имеются
пленки самой различной толщины. Толщина пленок зависит от
величины частиц: чем больше частица, тем толще пленка.
Если две пленки соединяются вместе благодаря наличию двух
близко расположенных поверхностей, то образуется капилляр,
заполненный так называемой капиллярной водой. В каждой
почве содержатся капилляры самой различной толщины, длины и
конфигурации. Они могут быть и тоньше самой мелкой микробной
клетки и иметь толщину в десятки и сотни микрометров.
Развитие микроорганизмов в капиллярах разной толщины специфично.
Об этом, в частности, говорят результаты наших опытов по
изучению ряда аэробных, анаэробных и факультативно анаэробных
микроорганизмов в стеклянных капиллярах разной толщины
(Звягинцев, 1973; Звягинцев, Питрюк, 1973). Чем тоньше капилляр,
тем медленнее идет размножение микроорганизмов, причем это
положение относится и к аэробным и к анаэробным бактериям.
Более крупные микроорганизмы (грибы) нуждаются для хорошего
развития в наличии более толстых капилляров, чем более мелкие
микроорганизмы (бактерии). В тонких капиллярах и пленках
клетки мельчают. Возможно, одной из причин мелких размеров
почвенных микроорганизмов по сравнению с водными формами
и с формами, развивающимися на питательных лабораторных
средах, является их развитие в тонких капиллярах и пленках.
Иногда клетки принимают форму капилляра, в котором они
развиваются. Часто в тонких капиллярах и порах клетки лизируются,
114
что было хорошо изучено для клеток, заключенных в полиакри-
ламидиый гель (ПААГ). В настоящее время трудно однозначно
решить вопрос о причинах плохого развития микроорганизмов в
тонких пленках и капиллярах. Вероятно, основную роль играет
специфика диффузии веществ. Для проявления активности
микробов в очень тонких пленках и капиллярах первостепенное
значение имеет влияние изменения активности воды. Однако для
более толстых пленок и капилляров наибольшее значение имеет
скорость подтока к клеткам питательных веществ и оттока
вредных метаболитов.
Гравитационная вода — это та часть воды, которая свободно
передвигается в почве под действием силы тяжести. Это
временная форма воды в почве, которая появляется после дождя или
полива, но быстро исчезает и имеет большее значение для
транспорта веществ, чем для развития микроорганизмов. Установлено,,
что бурное развитие микроорганизмов в почве после выпадения
доадя связано не только с появлением доступной влаги, но и с
тем, что вода несет растворимые органические вещества.
Следует четко дифференцировать: 1) выживаемость в
условиях низкой активности воды; 2) специфику метаболизма в этих
условиях.
Среда обитания микроорганизмов, как уже отмечалось, может
быть прерывистой в пространстве и во времени. В этом
отношении, очевидно, во всех почвах, за исключением неоттаивающих
постоянно мерзлотных, имеются хотя бы кратковременные
периоды с обильным увлажнением, и микробы даже в пустыне могут
после дождя развиваться в условиях высокой активности воды.
Такие периоды в ряде засушливых зон бывают очень редко, и
большую часть времени микроорганизмы находятся в условиях
низкой влажности. При этом они находятся в состоянии анабиоза,
или замедленного метаболизма. К почвам с постоянно низкой
активностью воды относятся солончаки.
Активность воды в системе (в почве) зависит от наличия ряда
веществ, в том числе и растворимых солей. В солевых растворах
активность воды (потенциал влаги) резко падает. В связи с этим
следует отметить, что понятия ксерофилии и осмофилии имеют
по существу один и тот же смысл. В солевых растворах микробы
развиваются как бы в условиях засухи, так как получить воду
для клетки становится трудным. Правда, в солевых растворах на
развитие микроорганизмов влияют два фактора: 1) низкая
активность воды; 2) токсичность высоких концентраций определенных
катионов и анионов для клетки, поэтому развитие
микроорганизмов в солевых растворах даже при одинаковой активности воды
будет зависеть от природы соли.
На земле существует много разнообразных засоленных почв —
солончаков. Разные типы солончаков могут содержать очень
высокие концентрации сульфатов, хлоридов, нитратов, карбонатов.
В ряде солончаков должны развиваться только галофильные
микроорганизмы, которые, как было показано в последнее время,
115
имеют совершенно особое строение и относятся к архебактериям.
Однако систематического изучения галофилов из засоленных почв
до настоящего времени не проводилось, хотя солончаки, по
крайней мере теоретически, представляются более благодатным
объектом для выделения этих форм по сравнению с засоленными
природными водами, из которых они обычно выделяются.
Штаммы одного вида гриба, но выделенные из почв гумидной
и аридной зон, отличаются по способности развиваться при
низкой активности воды (Мирчинк и др., 1978; Иванушкина, 1984).
Необходимо кратко рассмотреть вопрос об устойчивости
почвенных микроорганизмов к высушиванию. Устойчивость к
высушиванию не связана непосредственно с ксерофильностью или с
ксеротолерантностью и сильно выражена у самых различных
групп почвенных микроорганизмов. В природе есть ряд почв,
которые никогда не подвергаются полному высыханию (почвы
под лесами, болотами, почвы тундры). Активность воды в них
зимой в период промерзания низкая. Есть почвы, которые
подвергаются длительному и сильному иссушению (почвы пустыни
и полупустыни). Распахиваемые почвы подвергаются сильному
иссушению по крайней мере с поверхности — это новое
антропогенное воздействие для этих почв, которому они раньше не
подвергались.
Известно, что после высушивания почвенных образцов до
воздушно-сухого состояния определяемое в них количество бактерий
уменьшается в 5—10 раз. Резко уменьшается и количество акти-
номицетов и грибов, но обычно не так, как бактерий. В
высушенных образцах почв меняется качественный состав
микроорганизмов. Считается, что некоторые микроорганизмы, например
некоторые неспороносные палочки, полностью погибают. Однако
последнее утверждение нельзя считать доказанным. Установлено,
что их количество по крайней мере резко снижается и их не
удается учесть, но в большинстве случаев если провести «оживление
лочвы», т. е. почву увлажнить и инкубировать в течение
некоторого времени, то исчезнувшие формы можно обнаружить,
особенно если выбрать благоприятную для их выделения стадию
микробной сукцессии в почве.
Процент гибели микроорганизмов в высушенных образцах не
такой высокий, как считалось ранее (Звягинцев, 1973). Большая
часть клеток при высушивании прочно адгезируется на почвенных
частицах, в почве образуются новые агрегаты, и клетки просто
перестают учитываться обычными методами посева. Однако
применение ультразвуковой или другой предварительной обработки
почвы перед проведением микробиологического анализа,
направленной на дезагрегацию почвы и десорбцию микроорганизмов,
позволяет найти часть этих клеток (иногда до 90%), которые
считались погибшими. Фактическая гибель даже в количественном
отношении, не говоря о качественном составе, оказывается не
такой большой, как это ранее предполагалось. При хранении
воздушно-сухих образцов на протяжении первых двух недель проис-
116
ходит значительное сокращение определяемого методом посева
количества микроорганизмов, а затем оно замедляется. Однако
первоначальное падение больше связано с адсорбцией клеток, чем
с их действительной гибелью. Существует много данных,
подтверждающих, что воздушно-сухая почва является очень хорошей
средой для хранения культур внесенных и тем более для собственно
почвенных.
Причины хорошего сохранения микроорганизмов в воздушно-
сухой почве не совсем ясны, однако можно привести следующие
гипотезы. В почве микроорганизмы попадают в многочисленные
микрозоны, и хотя бы часть из них оказывается благоприятной
для сохранения микробов. В почве поддерживается сравнительно
постоянный уровень относительной влажности (активности воды),
что также может благоприятствовать сохранению
микроорганизмов. Известно, что сохранению микроорганизмов, правда, обычно
в меньшей степени, чем почва, способствует ряд адсорбентов (гли-
HBi, уголь, мел и т. д.). Предполагается, что собственно адсорбция
клеток на твердой поверхности, обволакивание клеток мелкими
органомииеральными частицами, заключение их в тонкие
капилляры и попадание в закрытые пространства, где затруднен обмен
с окружающей средой, будут способствовать выживанию клеток.
В условия засухи микроорганизмы попадают и зимой при
отрицательных температурах. При зимней засухе отрицательное
действие на клетки может оказывать не только недостаток воды,
но еще и тот фактор, что образующиеся кристаллики льда могут
механически разрушать клетки. Однако при морозе создаются
отчасти и более благоприятные условия для выживания, так как
лри низких температурах крайне замедлены все биохимические
процессы. Наши исследования показали, что длительность
сохранения бактерий в замерзших почвах совершенно поразительна
^(Звягинцев и др., 1985). При высевах из постоянно мерзлых почв
(зона «вековой» мерзлоты) обнаружилось, что на 1 г погребенной
почвы, пролежавшей при температуре —10—12° в течение 0,5—
1 млн. лет, обнаруживается 105 клеток бактерий. Если учесть, что
в современных тундровых почвах содержится 106 клеток
бактерий на 1 г, также обнаруживаемых методом посева, то можно
допустить, что за 1 млн. лет количество жизнеспособных клеток
уменьшилось всего в 10 раз и клетки в погребенных почвах могут
сохраняться очень долго. Видимо, не все микроорганизмы
одинаково хорошо переносят длительное хранение в замороженном
состоянии. Эукариотные микроорганизмы (грибы, дрожжи) не
обнаружены. Большинство микроорганизмов составляли коринепо-
добные бактерии. Они сохранились наиболее хорошо, однако
отметим, что они составляют большинство и среди обнаруживаемых
на средах микроорганизмов при посеве из современных тундровых
почв. Бациллы, видимо, также сохраняются весьма хорошо, хотя
их почти не было в изученных почвах, но для почв тундры
вообще характерно незначительное содержание бацилл. Хорошая
выживаемость бацилл в замороженном состоянии доказывается тем,
117
что в одном из специфических образцов погребенных почв было>
обнаружено очень много микроорганизмов этой группы.
Неспороносные бактерии, и в первую очередь псевдомонасы,
встречаются в таком значительном количестве, что можно с уверенностью-
утверждать, что это эндогенная микрофлора, а не случайное
загрязнение.
Однако степень увлажнения почвы влияет на развитие
микроорганизмов не только в связи со степенью доступности воды для
микроорганизмов, но и в связи с тем, что количество воды во
многом определяет газовый режим почв и отдельных микрозон.
Диапазон для максимального роста почвенных аэробных
микроорганизмов очень узок и, с одной стороны, лимитируется
активностью воды, а с другой — недостатком кислорода.
Касаясь способов выражения доступности воды для
микроорганизмов, нужно отметить, что в противоположность принятому
в микробиологии показателю активности воды лучше
пользоваться показателем потенциала влаги, как это делают физиологи
растений, так как изменения этой величины измеряются целыми
числами, а не дробями и более наглядны (см. табл. 14).
РАЗВИТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПЛЕ52КАХ
И КАПИЛЛЯРАХ
Специфика развития микроорганизмов во многом
определяется тем, будут ли они развиваться в пленках или капиллярах и
какова будет толщина этих пространств. Мы предлагаем
следующую классификацию микрозон в зависимости от специфики
условий развития микроорганизмов в пленках и капиллярах разной
толщины.
Капилляры, мкм Пленки, мкм
очень тонкие, <1 очень тонкие, <0,1
тонкие, 1—10 тонкие, 0,1—1
средние, 10—100 средние, 1—10
толстые, >100 толстые, >10
Капилляры и пленки могут быть проточными и непроточными^
располагаться внутри почвенных агрегатов или на их поверхности.
Развитие микроорганизмов в почвах, илах, грунтах обычно
проходит не в большом объеме жидкости, что возможно при
искусственном культивировании микроорганизмов, а в капиллярах,
заполненных водным раствором, или в тонких пленках.
Капилляры и пленки могут быть разной толщины, вплоть до очень
тонких. По данным И. И. Судницына (1966), поры в разных почвах
по размеру распределяются следующим образом: >70 мкм — 10—
36%, 70—5 мкм — 6—20%, <5 мкм — 14—54%, т. е. в почвах
может встречаться большое количество крупных, средних и
мелких пор. Поэтому необходимо иметь твердое представление об
условиях развития микроорганизмов в самых различных по тол-
118
щине и другим свойствам капиллярах и пленках. Следует
отметить, что толстые капилляры часто бывают заполнены воздухом
и только на поверхности их стенок находится пленочная вода.
Специфические условия для развития микроорганизмов в
пленках и капиллярах почти не изучались.
Капилляры могут быть двух родов. К капиллярам первого
рода относятся такие, стенки которых непроницаемы для молекул
и ионов, и заключенные в них клетки бактерий находятся в
условиях сильной изоляции от внешней среды. Это, например,
капилляры из стекла со сплошными стеклянными стенками.
Естественно, условия для развития микроорганизмов в них будут
•особыми.
Ко второму роду относятся капилляры с пористыми стенками,
могущими пропускать молекулы и ионы и, таким образом,
обеспечивающие подток к заключенной в них микробной клетке
субстратов и отток продуктов метаболизма. Поры стенок капилляров
могут быть проницаемыми либо для всех молекул и ионов, либо
только для более мелких из них или отличающихся каким-либо
другим свойством (заряд, гидрофобность). К капиллярам такого
рода следует отнести капилляры в теле животных и растений, где
могут находиться адгезированные бактерии, капилляры в ПААГ
и других гелях, применяемых для иммобилизации клеток,
капиллярные камеры, отделенные полупроницаемой мембраной от
основной массы жидкой среды (Hikuma et al., 1980). Естественно,
развитие микроорганизмов в капиллярах этого рода также будет
специфичным.
В некоторых отношениях и капсула клетки может
рассматриваться как система капилляров, окружающих клетку. Диаметр
пор капсулы Staphylococcus aureus лежит в пределах 50—100 нм
{Kinget al., 1980).
Большая работа проведена в связи с использованием
капиллярных методов Перфильева (Перфильев, Габе, 1961; Аристов-
ская, 1965). Однако в этих опытах не ставили целью сравнить
развитие микроорганизмов в капиллярах различной толщины, и
они обычно проводились в капиллярах очень толстых по
сравнению с размером клеток, например в педоскопах, имеющих
сечение 600x200 мкм.. Иногда в каналах тонких капилляров,
используемых для микроизоляции клеток, изолированные клетки плохо
размножались, и приходилось применять специальные приемы,
чтобы вытолкнуть клетку из канала капилляра. Только в этом
случае клетки начинали размножаться (Перфильев, Габе, 1961).
Косвенными методами обнаружено, что толщина пленок и
капилляров имеет большое значение для проявления
жизнедеятельности микроорганизмов. В опытах с микробусами диаметром
37, 149 и 350 мкм показано, что для развития бактерий и грибов
большое значение имела величина капиллярных пространств,
образующихся между частицами. Активность бактерий была больше
на мелких микробусах, а грибов — на крупных (Parr, Normann,
1964; Parr et al., 1967; Taylor, Parkinson, 1971).
119
В одной из работ было показано, что органическое вещество,,
сосредоточенное в капиллярах меньше 1 мкм, недоступно для
микроорганизмов.
Неблагоприятные условия для развития азотобактера в
тонких пленках и капиллярах отмечали Чапек и Горбоски (Tschapek,
Gorbosky, 1951). F
Слабое развитие микроорганизмов в тонких капиллярах
отмечается и еще в нескольких работах (I. Hattori, 1973;
Звягинцев, 1973). Однако (Messing, Oppermann, 1979) были предложены
специальные материалы из стекла и кордиерита, которые сильно
адгезируют клетки ряда бактерий и имеют поры от 0,8 до 220 мкм.
Больше всего клеток (1010 на 1 г) связывали образцы, имеющие
поры величиной 1—5 мкм. Клетки, адгезированные на таких
материалах, проводили процесс достаточно интенсивно, хотя и
медленнее, чем свободные клетки; положительным было то, что
увеличивался срок их службы.
Иммобилизованные клетки, заключенные в различные сорта
гелей, можно рассматривать как находящиеся в системах из
тонких капилляров. В ряде случаев они не могут размножаться,
обмен их сильно изменен, часто заторможен. Следует учитывать, что
в ряде случаев для проведения определенных биохимических
процессов используются убитые клетки, в которых, однако, продол^
жают работать те или другие ферментные системы.
В тонких пленках микроорганизмы развиваются плохо.
Наиболее хорошее развитие микроорганизмов наблюдается в пленках
Таблица 16
Скорость размножения Staphylococcus aureus
в капиллярах разной толщины
Толщина и глубина
капилляров, мкм
400X150
36X15
25X10
10X5
5X3
1 Количество клеток
начало
опыта
350
230
130
92
50
через сутки
3560
700
410
190
53
Во сколько раз
увеличилось
количество клеток
через сутки
10
3
3
2
1
толщиной от десяти до нескольких десятков микрометров (Webleyv
1947; Ellinger, Quastel, 1948; Новогрудский, 1956).
Наши опыты по культивированию микроорганизмов в
капиллярах Перфильева разной толщины показали, что в тонких
капиллярах создаются специфические условия для развития
микробных клеток. Здесь возникают особые физико-химические условия,
влияющие на развитие клеток. Уже первые исследования, прове-
денные с культурами Staphyloccocus aureus, Saccharomyces vini
показали (Звягинцев, 1970 а), что скорость размножения клеток
в сильной степени зависит от толщины капилляров (табл. 16;
120
рис. 23). Если в толстом капилляре (400X150 мкм) за сутки
количество клеток увеличивалось в 10 раз, а в капиллярах с
каналами толщиной 10x5 мкм удвоилось, то в наиболее тонком
капилляре (5x3 мкм) размножения практически вообще не
происходило.
Аналогичные данные были получены и с другими аэробными
бактериями (Micrococcus sulfureus, Ps. pyocyanea, Ps. fluorescens).
У одних культур в тонких капиллярах скорость размножения
сокращалась больше, у других — меньше.
Проверка найденных закономерностей на факультативно
анаэробных бактериях и бродящих микроорганизмах показала, что
и для этих групп микробов сохраняется отмеченная для аэробов
закономерность. Так, для Saccharomyces vini (табл. 17) через
Таблица 17
Скорость размножения Saccharomyces vini
в капиллярах разной толщины
Толщина и глубина
капилляров, мкм
400X150
80X30
10X5
5X3
Количество клеток
начало
опыта
400
250
200
25
через сутки
2750
1020
405
24
Во сколько раз
увеличилось
количество клеток
через сутки
7
i 4
2
1
сутки в канале толстого капилляра наблюдалось 7-кратное
увеличение количества клеток, а в тонких капиллярах увеличение
не происходило.
Для дышащих дрожжей (Williopsis saturnus) получились
примерно такие же закономерности по скорости размножения, как
и для бродящих (Saccharomyces vini). Скорость размножения
W. saturnus в толстом капилляре была в 4 раза больше, чем в
тонком.
Все испытанные культуры в тонких капиллярах размножались
медленнее; причем чем тоньше был капилляр, тем медленнее шло
размножение. В проточных стеклянных капиллярах (Звягинцев,
Питрюк, 1973) скорость размножения клеток различных
микроорганизмов резко возрастала, но в тонких капиллярах она опять
была гораздо меньше, чем в толстых.
Другой важной особенностью в развитии микроорганизмов в
тонких капиллярах было значительное сокращение длины
палочковидных клеток или уменьшение средней величины клеток
дрожжей. В тонких капиллярах процесс роста клеток тормозился более
интенсивно, че*м процесс деления. Так, средний диаметр клеток
Sacch. vini в тонком капилляре больше, образуется значительно
меньше почек, они быстро отпадают от материнской клетки, и
клетка округляется. Уменьшение размеров клеток отмечено и для
W. saturnus. Однако клетки этого вида в тонком капилляре при-
121
,
№ШЙ.Г... |ДШИЗ
txnmitMjra'^ •• • •-•—•-•¦•-
i
WPiilli и i'.iiw ишшичшшшм , ....
шш«м#; тШтн&ШШШШЩЩФ^
Рис. 23. Развитие бактерий в капиллярах разной
Л — развитие клеток Williopsis saturnus:
1 — в толстом капилляре; 2 — в тонком
толщины:
*
0r m
ш
#***"
^^
*w
1 1
f\ 1
ш>
Б — развитие клеток Thermobacterium cereale: l — в толстом
капилляре зерна формазана отсутствуют; 2 — в тонких капиллярах
видны многочисленные зерна формазана
обретают, наоборот, более вытянутую форму. Укороченность
клеток четко отмечалась для Ser. marcescens. Исключение
представила культура Ps. руосуапеа, клетки которой в тонком капилляре
приобретали удлиненную инволюционную форму.
Для получения более подробных данных о специфике
развития микроорганизмов в капиллярах была изучена способность
культур восстанавливать хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий
(ТТХ) и теллурит калия. Наиболее подробно опыты были
проведены с культурой Thermobacterium cereale. Зерна формазана и
теллура гораздо быстрее и в большем числе появляются в
клетках, заключенных в тонких капиллярах. Они откладывались не
только внутри клеток, но и на их поверхности, и просто в куль-
туральной жидкости. В тонких капиллярах с ТТХ клетки через
несколько дней лизировались, в толстых капиллярах в это же
время они имели нормальный вид.
Отложение формазана можно было наблюдать и в очищенной
от клеток путем центрифугирования культуральной жидкости.
В культуральной жидкости, помещенной в тонкий капилляр, уже
через 2—3 ч появлялось много зерен формазана, в то время как
в толстом капилляре они отсутствовали или появлялись через
сутки. Эти опыты дают основание полагать, что в тонких
капиллярах создаются более восстановительные условия, а возможно,
и какие-то другие, благоприятствующие проявлению активности
дегидрогеназ. В исходной питательной среде, помещенной в
капилляры, за время опытов зерна формазана не образовывались.
Активность и ряда других ферментов в капиллярах резко
изменяется, причем влияние капилляров увеличивается с
уменьшением их диаметра. С уменьшением диаметра капилляров
уменьшалась активность мурамидазы, о которой судили по лизису клеток
Вас. megaterium и Micrococcus luteus.
Опыты по изучению скорости размножения клеток,
помещенных в тонкие пленки питательной среды, нанесенной на
покровные стекла по методу висячей капли, показали, что при толщине
пленки в 1—2 мкм происходит резкое замедление интенсивности
размножения. Это же действие отмечается и для клеток,
расположенных в тонкой пленке жидкости у края висячей капли
больших размеров. При этом клетки, расположенные в центре капли,,
размножаются гораздо быстрее, часто в 10—20 раз. Составлено
уравнение скорости потребления субстратов в микробных пленках
в зависимости от их толщины (Alkinson, Davies, 1974).
Таким образом, развитие микроорганизмов в капиллярах и
пленках весьма своеобразно. В тонких капиллярах, видимо, могут
создаваться более восстановительные условия. Однако специфику
развития микроорганизмов в капиллярах только изменением
окислительно-восстановительного потенциала объяснить нельзя.
Сокращение скорости размножения отмечалось и для культуры
Thermobacterium cereale, которая хорошо развивается в очень
широком диапазоне Eh. Скорость размножения уменьшается у этих
культур и при развитии в тонких пленках, хотя в них условия
124
аэрации лучше, чем в толстой капле питательной среды. При
развитии в капиллярах многие условия оказываются специфичными.
Ранее нами была подробно проанализирована специфика
развития микроорганизмов вблизи твердой поверхности при адсорбции
клеток на этой поверхности. В тонких капиллярах и пленках
условия развития микроорганизмов оказываются еще более
специфичными, чем в большом объеме жидкой среды. На
микроорганизмы, расположенные в капиллярах и пленках, кроме наличия
большей адсорбирующей поверхности оказывает влияние
специфика распределения и диффузии веществ в капиллярах и пленках,,
специфика форм и строения воды и т. д.
Интересно отметить, что при развитии в тонких капиллярах
происходит уменьшение размеров клеток, что наблюдается и в
природной обстановке в почве. Вероятно, одна из причин более-
елких размеров клеток в почве по сравнению с лабораторными
итательными средами заключается в том, что клетки
развиваются в почве в капиллярах и пленках. Величина клеток является
прямой функцией скорости размножения (Бондаренко, 1983).
Поэтому малая величина может быть следствием малой скорости
роста в тонких капиллярах и пленках. Нахождение в тонких
капиллярах может быть одной из причин латентного
(анабиотического) состояния части почвенных микроорганизмов.
КОНЦЕНТРАЦИЯ ИОНОВ ВОДОРОДА (рН)
Концентрация ионов водорода (рН), как известно, оказывает
очень сильное влияние на жизнедеятельность микроорганизмов.
Иногда микроорганизмы не развиваются только из-за того, что
в среде создается неблагоприятное для их развития рН. Для
каждого микроба устанавливаются оптимальные, минимальные и
максимальные значения рН окружающей среды. Однако считают,,
что все микроорганизмы, даже растущие при экстремальных
значениях рН, располагают какими-то механизмами для
поддержания внутриклеточного рН на уровне, близком к нормальным
физиологическим величинам. В почве есть микроорганизмы,
имеющие либо низкий, либо широкий диапазон рН, в котором
возможно их развитие: одним нужна нейтральная, другим — кислая, а
третьим — щелочная среда (табл. 18). Хотя это может показаться
на первый взгляд странным для эколога, из каждой почвы вне
зависимости от ее рН выделяются все группы микроорганизмов,
резко различающихся по их отношению к кислотности. Это
связано с существованием в каждой почве различных микро- и
мезозой, резко различающихся по кислотности. Следует отметить, что
рН водной или солевой вытяжки из почвы дает возможность
судить только об усредненном значении рН. Эта величина,
естественно, не может характеризовать условия существования в
отдельных микрозонах. В зонах с интенсивным выделением С02,.
например на поверхности корней, будут создаваться зоны с более
низкими значениями рН. При внесении извести в кислые почвы
г
125
вокруг гранул удобрения будут создаваться особые микрозоны
с нейтральной реакцией. В кислой почве вблизи разлагающегося
белка может создаваться щелочная среда. В щелочных почвах в
результате локального развития нитрификации могут возникать
микрозоны с кислой реакцией среды. Микробы могут активно
изменять рН в микрозонах. Например, при использовании
белков активное декарбоксилирование аминокислот приводит к на-
Таблица 18
Кардинальные для роста некоторых почвенных микроорганизмов
значения рН
Название микроба
Acetobacter acidophilum
Thiobacillus thiooxidans
Metaliogenium sp.
Phycomyces blakesleanus
Marasmius foetidu
Aspergillus spp., Penicilli-
um spp., Fusarium spp.
Bacillus pasteurii
Agrobacterium radiobacter
РНмин
2,8
0,9
3,5
2,0
2,0
2—3
9,0
РНопт
3,0
2,5
3,0
3,0
5—7
10
6—9
РНмакс
4,3
4,5
5,0
7,0
7,0
10—11
11—12
10—12
Автор
Wiame et al., 1959
Rao, Berger, 1971
Walsh, Mitchell, 1972
Thimann, 1963
Thimann, 1963
Thimann, 1963
Gibson, 1934
Thimann, 1963
коплению щелочных аминов, а активное дезаминирование — к
образованию органических кислот. Микроорганизмы, вызывающие
брожение, могут в зависимости от условий образовывать либо
нейтральные соединения, либо кислоты. Особое рН создается на
поверхности почвенных частиц. Здесь создается большая
концентрация ионов водорода из-за его адсорбции на отрицательно
заряженных поверхностях.
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ
Окислительно-восстановительные условия часто играют
решающую роль в развитии микроорганизмов. Каждый микроорганизм
имеет оптимальные значения Eh для своего развития. Причем в
каждой почве содержатся самые различные группы
микроорганизмов по отношению к окислительно-восстановительным
условиям. Всегда встречаются и соседствуют и аэробы и анаэробы.
Отмечается такая общая закономерность: с увеличением
количества аэробов возрастает и количество анаэробов, что обусловлено
часто устанавливающимися между ними метабиотическими
взаимоотношениями, а также тем, что аэробы потребляют кислород
и, таким образом, создают благоприятные условия для развития
анаэробов. Специфика почвы как среды обитания состоит в том,
что в ней анаэробные и аэробные микрозоны соседствуют и часто
занимают очень небольшие объехмы. Существует мнение, что на
поверхности почвенных агрегатов идут интенсивные аэробные
процессы, благодаря чему внутри агрегатов создаются анаэробные
условия и развиваются анаэробы. Это положение в настоящее
126
время может быть принято только частично. Дело в том, что
большую часть времени микробы на поверхности агрегата
проводят в состоянии покоя или слабого развития. Поэтому аэробы не
поглощают большого количества кислорода и не могут обеспечить
анаэробные условия внутри агрегатов. Однако в краткие периоды
бурного развития микроорганизмов на поверхности агрегатов,,
внутри агрегата действительно будут создаваться анаэробные
условия. Можно разломать или разрезать почвенный агрегат, но,
как правило, там не обнаружится следов восстановительных
процессов. Вопрос о том, насколько распространены в почве
облигатные анаэробы, остается мало изученным, но, видимо, в
почвах они играют менее значительную роль, чем, например, в
рубце жвачных животных.
Анаэробные зоны возникают в результате развития по
соседству аэробных процессов, а не из-за агрегированное™ почвы.
Поэтому в ризоплане возникновение микроаэрофильных или даже
анаэробных условий более вероятно, чем в тех местах почвы,
которые не содержат легкодоступного органического вещества.
Микрофлора ризопланы осуществляет интенсивные процессы
азотфиксации и денитрификации. Таким образом, можно сделать
заключение, что на поверхности корней растений, по крайней мере
в некоторых районах, создаются достаточно восстановительные
условия, необходимые для протекания этих процессов. Однако
если на поверхности корней возникают анаэробные зоны, то
непонятным оказывается вопрос о снабжении корней растений
кислородом. В настоящее время установлено, что снабжение корней
кислородом идет главным образом через почву, а не через ткани
растений, как это считалось ранее. Единственно возможным
условием снабжения корня кислородом представляется
микрозональное распределение скоплений микроорганизмов на
поверхности корня (Звягинцев, 1973; Кириллова, 1983). Таким образом*
одни участки корня интенсивно снабжаются кислородом, а
другие — находятся в условиях недостатка кислорода, выраженного
в разной степени.
Господство в верхних горизонтах почв и подстилке грибов
свидетельствует также о существовании достаточно аэробных
условий в этих почвенных горизонтах. Напомним, что почти все грибы,
за исключением грибов рубца и некоторых дрожжей, — аэробьь
Некоторые из них, однако, в определенных условиях могут
образовывать и кислоты, не доводя процесс окисления до
выделения С02.
Микрозоны с различными окислительно-восстановительными
условиями очень подвижны во времени. Анаэробные зоны
существуют сравнительно недолго. Отмечается следующая
последовательность процессов в микрозоне, обогащенной органическим
веществом. Сначала бурно развивается аэробный процесс и
создается недостаток кислорода. В глубине скопления органического
вещества (обнаружено, что кислород почти не поступает в
колонию гриба или бактерий на расстояние нескольких десятков мик-
127
рометров от поверхности) в качестве источника кислорода
последовательно начинают использоваться нитраты, сульфаты и,
наконец, карбонаты (углекислота), которые превращаются в метан.
Затем жизнь замирает в связи с исчерпанием органического
вещества, и зона превращается в аэробную. Если органическое
вещество было неполностью использовано в анаэробных условиях,
оно продолжает использоваться в аэробной зоне.
Известно, что в почвах могут возникать и длительно
сохраняться обширные зоны, в которых господствуют
восстановительные условия, — глеевые горизонты. В них преобладают
факультативные и облигатные анаэробы. Причина глееобразования —
развитие микроорганизмов в условиях крайне замедленного
поступления кислорода.
Обычно даже нижние горизонты почвы содержат значительное
количество кислорода. Часто насыщены кислородом и грунтовые
воды. Только с большой глубины иногда поступают грунтовые
воды с восстановительными свойствами. В глеевых горизонтах
господствуют анаэробные условия, но есть определенные зоны,
например по ходу корней, в которых создаются аэробные
условия. В почвах нет горизонтов, в которых развивались бы одни
.аэробы или одни анаэробы.
Значение соотношения и сопряженности аэробных и
анаэробных микрозон рассмотрено в работах Г. А. Заварзина (1970, 1976,
1984). В атмосфере содержится много кислорода (21%), а
лимитирующим фактором в развитии аэробных микроорганизмов
кислород становится, когда его содержание падает ниже 1%.
В таких микроаэрофильных условиях развитие микроорганизмов
проходит специфично. В почвах большинство микроорганизмов
развивается в условиях, при которых содержание кислорода при^
ближается к критическому уровню и на определенных стадиях
становится лимитирующим фактором. В естественных условиях
в почве обычно одновременно существуют микрозоны со всей
гаммой перехода условий от аэробных до строго анаэробных.
ГАЗОВАЯ ФАЗА ПОЧВЫ
Почва почти всегда содержит большое количество пор (10—
-60% от объема), частично заполненных водой и частично газами.
-Состав почвенных газов определяется, с одной стороны,
скоростью биохимических процессов, происходящих в почве, с другой —
поступлением газов из атмосферы. Абиотические процессы
газовыделения и связывания газов на фоне перечисленных играют
весьма скромную роль. Оценивая роль газов в почве, В. И.
Вернадский (1926) писал: «Почва, взятая без газов, не есть почва.
Роль почвы в истории земной коры отнюдь не соответствует
тонкому слою, какой она образует на ее поверхности. Но она вполне
^отвечает той огромной активной энергии, которая собрана в ее
живом веществе и которая способна к переносу благодаря про-
128
никающим в почву газам. Говоря о значении биохимических
процессов в почвах и о значении почвы в области биосферы, мы,
другими словами, скрыто указываем на первенствующую роль
газов в почвенных процессах и на значение этих газов в газовом
обмене земной коры».
Раскрытие роли почвенных газов шло главным образом по
пути выяснения интенсивности и значения поглощения почвой
кислорода и выделения углекислого газа. Другие газы мало
изучались. Установлено, что эти процессы идут в огромных
масштабах: потребление кислорода за 1 ч составляет 1000—4000 л/га;
примерно в таких же масштабах выделяется и углекислый газ.
Рассчитано, что запасов кислорода в почве в связи с
интенсивностью его потребления почвенными микроорганизмами и
корнями растений хватило бы всего на 12—48 ч, в некоторых почвах —
на 100 ч, если бы его запас не пополнялся из атмосферы.
Газообмен между воздухом и почвой идет весьма интенсивно. Обычно
в пахотном горизонте за каждый час происходит почти полное
обновление воздуха (Рассел, 1955). Построенная модель
газообмена в системе почва — атмосфера (Гончар-Зайкин и др.,
1981) позволила определить, что главную роль в газообмене
играет диффузия и подчиненную, но для некоторых условий весьма
существенную — конвекция. Последняя в большой степени
связана с разностью температуры почвы и воздуха, изменениями
барометрического давления, влиянием ветра, выпадением осадков и
изменением уровня грунтовой воды и верховодки. Одно время
большое значение придавали так.называемому «дыханию почвы»
по Дояренко (Вершинин и др., 1959). Из-за разновременных
суточных изменений температуры почвы и воздуха почва в
определенное время засасывает атмосферный воздух, а в другое —
как бы выдыхает газы. Однако с помощью прямых опытов и
расчетов было показано, что простая диффузия имеет большее
значение в газообмене, а описанное явление — лишь подчиненное.
Скорость газообмена резко уменьшается при сильном увлажнении
почвы. При переходе от слабоувлажненной до водонасыщенной
почвы она уменьшается в миллион раз. Но даже на больших
глубинах содержится некоторое количество газообразного и
растворенного кислорода, и восстановительные условия наблюдаются
только в некоторых локусах.
Почвенные микроорганизмы и корни растений резко изменяют
газовую фазу почвы. По газовому составу почвенный воздух в
десятки и сотни раз отличается от атмосферного воздуха, причем
такие различия наблюдаются несмотря на то, что, как
отмечалось, почвенный и атмосферный воздух быстро обмениваются. Но
даже этот быстрый обмен не приводит к выравниванию
содержания газов в атмосфере и в почве, т. е. продукция и потребление
газов в почве идут очень быстро. Градиент концентраций между
почвой и атмосферой поддерживается благодаря интенсивной
деятельности почвенной биоты. Почва выступает как мощный
регулятор газового состава атмосферы.
5 Д. Г. Звягинцев
129
Почвенный воздух содержит в 10—100 раз больше углекислоты
и во много раз меньше кислорода, чем атмосферный воздух.
Содержание азота несущественно отличается от атмосферного.
Кроме того, почвенный воздух всегда содержит пары воды и ряд
микрогазов, а также летучие органические вещества, которые в
каждый данный момент хотя и содержатся в очень небольших
количествах, но из-за быстрого круговорота, а также сильного
физиологического действия могут иметь большое значение в
балансе веществ и в экосистеме вообще.
При изучении газового обмена почв обычно опыты ставят по
принципу «черного ящика», когда измеряется только газообмен
между почвой и атмосферой и не определяется истинная
интенсивность процессов, происходящих в самой почве. Например, в
почве происходит образование метана и его частичное
потребление. Интенсивность процесса учитывается только по выделению
метана, т. е. по разности между его образованием и потреблением,
или, другими словами, по превышению процесса газообразования
над потреблением. Такие определения не могут дать
представления об истинных масштабах процесса образования метана и его
потребления. Почвенные микроорганизмы способны, как правило,,
проводить прямо противоположные процессы: образование С02
и его поглощение, связывание атмосферного азота в процессе
азотфиксации и его выделение в процессе денитрификации,
образование водорода или недоокисленных газообразных соединений
азота и их использование. Принцип рассмотрения почвы как
«черного ящика» пригоден для оценки роли почвы в изменении
состава атмосферы, и для некоторых исследований такой подход
вполне достаточен, но он не может дать представления об
интенсивности процессов в почве. Истинная интенсивность процессов
в почве может быть во много раз больше, чем кажется, если о
ней судить только по выделению или поглощению газов почвой.
Большинство работ, выполненных по изучению роли
микроорганизмов в газовом обмене в почве (микрогазы, органические
летучие вещества), посвящено изучению чистых культур и их
способности осуществлять газовые превращения, а также,
отчасти, учету их численности в почвах. Однако эти работы дают
представление только о качественной характеристике процессов
(табл. 19, 20).
Определение интенсивности процессов газообразования и
потребления газов в почве проводится двумя принципиально
разными способами: 1) в природе — естественная, или актуальная,,
активность; 2) в модельных опытах (чаще всего в почвенных
образцах), в которых создаются оптимальные условия для
протекания данного процесса. Часто при таких условиях процессы
проходят в десятки, сотни и тысячи раз интенсивнее, чем в
естественной среде.
Модельные опыты хотя и позволяют выявить потенциальные
возможности почвы и до некоторой степени пригодны для
полуколичественной оценки содержащихся в почве микроорганизмов^
130
Таблица 19
Примеры летучих органических веществ, образуемых микроорганизмами
в аэробных условиях, и их влияние на другие микроорганизмы
(по Stotzky, Schenck, 1976)
Продуцент
Fusarium oxysporum
Rhizopus stolonifer
Trichoderma sp.
Fomes scutellatus
Marasmius oreacles
Pholiota aurea
Clitocybe geotropa
Aeureobasidium pullu-
lans
Agrobacterium radio-
bacter,
A. rhizogenes,
Bacillus cereus,
Enter obacter aero
genes
Escherichia coli,
Micrococcus luteus
Nocardia corallina
Proteus vulgaris
Serratia marcescens
Летучее
органическое
вещество j
альдегиды,
спирты,
органические
кислоты,
эфиры
ацетальде-
гид, этанол,
ацетон,
этилен
цианистый
водород
этанол
неиденти-
фицирован-
ные
Испытуемый
организм
Fusarium
oxysporum
Rhizopus
stolonifer
Cunningha-
mella ele-
gans
различные
грибы и
бактерии
различные
грибы и
бактерии
Armiliaria
mellea
Fusarium
oxysporum, F.
congluti-
nans, Ge-
lasinospo-
ra cerea-
lis, Peni-
cillium
v iridic a-
tum,
Trichoderma
viride,
Zygorhyn-
chus vuil-
leminii
Характер
воздействия
подавляют
прорастание
спор
подавляют
рост грибов, не
оказывали
влияния на
бактерии
подавляют
рост и
спорообразование у
некоторых
грибов, обычно не
влияют на
бактерии
стимулирует
образование
ризоформ
подавляют
рост и
спорообразование,
изменения в
морфологии
колоний и гиф
Примечания
активным
веществом, по-
видимому, был
ацетальдегид
активными
веществами,
по-видимому,
были
ацетальдегид, этанол,
С02
различно
действие
изменяется в
зависимости ит
продуцента и
тест-культуры,
наблюдается
как
стимулирование, так и
подавление;
характер
действия зависит
от
концентрации
¦Ъ*
131
участвующих в процессах газообмена, но совершенно непригодны
для определения реальной интенсивности процессов газообмена^
осуществляющихся в почве в естественных условиях.
Изучение газообмена в почвах затрудняется их
микрозональным строением. Любая почва содержит множество микрозон с
совершенно различным составом газов, в которых развитие
микроорганизмов идет в совершенно разных условиях. Положение о
быстром газообмене между атмосферным и почвенным воздухом
может быть принято только в общей форме и не может быть
распространено на все почвенные микрозоны. Как известно, вну-
Таблица 20
Примеры летучих органических веществ, образуемых
микроорганизмами в анаэробных условиях
(по Stotzky, Schenck, 1976)
Продуцент
Clostridium sp.
Смешанные
бактериальные культуры,
различные чистые культуры
бактерий
Почва с анаэробными
условиями
Летучие органические вещества
муравьиная, уксусная, пропионовая,,
капроновая, изокапроновая,
валериановая, изовалериановая, акриловая, кро-
тоновая кислоты, 2,3-бутандиол,
метанол, этанол, изобутанол, изопентанол,.
ацетоин, диметилсульфид
муравьиная, уксусная, пропионовая,.
масляная, валериановая,
изовалериановая, капроновая, молочная, янтарная
кислоты, уксусный альдегид, ацетоин,.
этиланетат, диацетил, этанол,
2,3-бутандиол и еще ряд неидентифицированных
веществ
метан, этан, этилен, пропилен, бутан,
изобутаи, пропан, бутен, ацетальдегид,
ацетон, метилкетон, метилпропилкетон,
диацетил, этанол, н- и ызо-пропанол,
н- и изо-бутанол, уксусная кислота, ме-
тилмеркаптан, диметилсульфид, диме-
тилдисульфид
три почвенных агрегатов, имеющих диаметр 2000—5000 мкм
(агрономически ценная структура), содержится защемленный
воздух, который с большим трудом подвергается обменным
процессам. Это и дает возможность для развития в близком соседстве
аэробных и анаэробных, метанообразующих и метаниспользующих
микроорганизмов и т. д. Даже небольшое количество влаги в
почве затрудняет газообмен из внутриагрегатных пор, а
большое — и из межагрегатных. Необходимо тщательное изучение
газообмена в этих микрозонах. Почти единственным путем для
этого является имитирование микрозон в макромасштабах.
Обычно берется образец почвы, в него вносится избыточное
количество субстрата, почва увлажняется и помещается при температуре,,
оптимальной для протекания процесса. Таким образом изучали
132
действие летучих органических веществ — фунгистазис и бакте-
риостазис почв. Следует еще раз подчеркнуть, что в таких
случаях воспроизводится не естественное состояние почвенной массы,
а только условия в определенных почвенных зонах в
макромасштабе, т. е. зона определенного типа начинает доминировать.
Естественная почва не представляет собой единую среду
обитания, а состоит из множества самых различных микрозон, где
микробы развиваются относительно изолированно по принципу
комплекса (Звягинцев и др., 1976; Звягинцев, 1978 6). В модельных
опытах при избытке органического вещества комплекс почвенных
микроорганизмов начинает действовать как единое целое.
Микробная система переходит из одной категории в другую: от
микрозонального типа, характерного для почвы, к макрозональному,
например при внесении в весь объем почвы глюкозы. Часто
данные, полученные в искусственных условиях, переносят на всю
почву в целом, в то время как более обоснованно их можно было
бы переносить на отдельные микрозоны.
Почва должна рассматриваться как множество микро- и мезо-
сред обитания микроорганизмов с совершенно различными
условиями в отдельных микрозонах, в том числе и в отношении их
газового режима. Микрозональность в почве дает возможность
одновременно развиваться и аэробам и анаэробам. В разных
микрозонах часто идут прямо противоположные процессы газового
обмена, и связь микрозон между собой, по-видимому, в первую
очередь осуществляется через газовую фазу, наиболее подвижную
по сравнению с другими фазами почвы и с самими
микроорганизмами.
Почвенный воздух всегда содержит некоторое количество
парообразной воды. Она имеет большое значение в
перераспределении воды по отдельным микрозонам и в выравнивании
потенциала влаги во всей почвенной массе. Большую часть времени
почвенный воздух в ряде зон близок к насыщению водяными
парами. Снабжение почвенных микроорганизмов газообразной водой
имеет существенное значение для их развития, особенно в
засушливых районах. Нужно отметить, что значительное количество
почвенных микробов способно активно расти и развиваться в
почве с относительной влажностью менее 100%. При этих
условиях транспорт парообразной воды может обеспечивать ее
поступление в клетки.
Почвенный воздух содержит в десятки и сотни раз больше
углекислого газа и часто во столько же раз меньше кислорода,
чем атмосферный. Однако культивирование почвенных
микроорганизмов обычно производится в атмосферном воздухе
термостатов, и специфика этого экологического фактора не учитывается.
Много внимания уделялось созданию низкого
окислительно-восстановительного потенциала, удалению кислорода при
культивировании анаэробов и меньше — созданию повышенного
содержания С02, которое оказывает существенное влияние на развитие
и морфологию почвенных микроорганизмов (Stotzky, Goos, 1966).
133
После инкубации почвы при повышенном содержании С02
обнаруживается микрофлора, более устойчивая к нему, причем более
вероятна селекция микроорганизмов, нежели их адаптация. Если
посев из почвы культивировать при повышенной концентрации
углекислоты, на чашках развивается больше микроорганизмов,
имеются данные, что меняется и качественный состав выделяемых
микроорганизмов. Высказывается мнение, что преобладание в
почве грибов родов Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Tricho-
derma обусловлено их адаптацией к газовому режиму почвы и
способностью давать в таких условиях обильное
спорообразование. Штаммы грибов из нижних почвенных горизонтов более
устойчивы к повышенным концентрациям С02. Почвенные грибы
более устойчивы к повышенным концентрациям С02 и низким
концентрациям 02, чем аэробные бактерии и актиномицеты (Ва-
bich, Stotzky, 1974).
Под действием повышенной концентрации углекислого газа
изменяется морфология микроорганизмов. Высокая концентрация
углекислоты иногда приводит к дрожжеподобному росту грибов,
что показано, например, для Mucor rouxii, Fusarium sp. При
пониженном содержании 02 и повышенном С02 некоторые бактерии
начинают формировать фимбрии.
Предполагается, что различие в морфологии почвенных и куль-
туральных форм микроорганизмов до некоторой степени связано
со спецификой состава почвенного воздуха. Морфологические
изменения могут вызывать аммиак и ряд летучих органических
соединений.
Газы и летучие органические соединения только частично
поступают в почву извне и главным образом образуются в самой
почве, причем их источником могут быть микроорганизмы,
растения и животные. Наибольшее разнообразие газообразных веществ
в почве образуют микроорганизмы: углекислый газ, окислы
азота, азот, аммиак, сероводород, водород, метан, этан, бутан,
пропан, этилен, пропилен, бутен, еще ряд газообразных
углеводородов. Они проводят превращения соединений металлов. Так,
микробы проводят процессы как образования, так и разрушения
органических соединений ртути. Почвенные микроорганизмы
проводят процесс метилирования и переводят мало токсичную
металлическую ртуть в монометилированную и диметилированную ртуть
CH3Hg+, (CH3hHg, которые отличаются высокой токсичностью
(табл. 21). Образуются также диметилсульфид (CH3)2S, метил-
меркаптан CH3SH, этилмеркаптан C2H5SH и т. д.
Все газы, которые микроорганизмы способны образовывать,
они могут и изменять. Благодаря соседству и многократному
повторению аэробных и анаэробных микрозон, достаточно
плотному расположению микроорганизмов внутри и на поверхности
почвенных агрегатов, а также сложности системы пор в почве,
по которым движутся газы, почва представляет собой весьма
совершенную ловушку для газов (исключение составляют
макрогазы, например С02, пары воды, которых очень много и которые
134
интенсивно не используются микроорганизмами), и нужно думать,
что только небольшой части микрогазов и летучих органических
веществ удается вырваться наружу в атмосферу (Звягинцев,
1973). Поверхность пор капилляров и агрегатов заселена
микроорганизмами, которые имеют возможность весьма совершенно
перехватывать диффундирующие газы (Звягинцев, 1973).
Задержанию газов в почве во многом способствует
действующий здесь принцип дублирования: любой существенный физио-
Таблица 21
Примеры неорганических веществ, превращаемых микроорганизмами
в летучие органические вещества (по Stotzky, Schenck, 1976)
Неорганическое вещество
Ртуть
Теллур
Селен
Мышьяк
Хлор
Бром
Органический
продукт
монометилирован-
ная и диметилиро-
ванная ртуть
диметилтеллурит
диметилселенит
диметилированный
и триметилирован-
ный мышьяк
метилхлорид
метилбромид
Микробы,
осуществляющие превращение
различные
бактерии и грибы
неидентифициро-
ванные почвенные
микробы
Источник микроорганизмов
почвы, осадки,
сточные воды, чистые
культуры образуются в
анаэробных условиях
сточные воды, чистые
культуры
почвы, сточные воды,
чистые культуры
чистые культуры
чистые культуры
чистые культуры
лого-биохимический процесс в почве дублируется
микроорганизмами разных видов. Например, многие микроорганизмы
используют метан, угарный газ, этилен и т. д. Из-за этого, если даже
создаются условия, неблагоприятные для жизнедеятельности
одного микроорганизма, начинают проявлять активность какие-либо
другие микробы, и фактор находится под микробиологическим
контролем. Для случая с газами следует отметить, что
некоторые газы могут использоваться только в аэробных условиях.
Например, использование этилена и окиси углерода идет только
в аэробных условиях. Уместно вспомнить, что почва содержит
одновременно как аэробные, так и анаэробные микрозоны, т. е.
использование газов в обычной почве должно идти достаточно
полно.
Можно думать, что потеря газов, несущих запас энергии,
невыгодна для экосистемы, и обычно такие газы должны
использоваться в ней полностью или почти полностью. Например, метан
во многих случаях выделяется в таких малых концентрациях, при
135
которых он уже не может улавливаться микроорганизмами и
обеспечивать их жизнедеятельность.
Судить о продукции микрогазов в почве (Н2, СО, СН4, H2S)
по их выделению из почвы нельзя. В ряде случаев микрогазы
из почвы выходят, причем в значительных количествах,
например при переувлажнении, когда аэробная зона перестает
соседствовать с анаэробной. Нужно определить судьбы этих газов. Они
могут уходить в верхние слои атмосферы, но могут поглощаться
Другими почвами (другими биогеоценозами). Обмен микрогазами
между разными биогеоценозами может осуществляться.
Предстоит выяснить масштабы этих процессов и установить, можно
ли этот обмен считать правилом или исключением. Вероятно, в
ряде случаев изменение интенсивности выделения микрогазов
почвой может в первую очередь сигнализировать о нарушении
нормальной микробиологической деятельности в биогеоценозе,
например при загрязнении почв.
В условиях сильного антропогенного воздействия почвенные
микроорганизмы не могут справиться с газовой нагрузкой на
почву или справляются с ней, но в ущерб газовому равновесию в
биосфере. Например, количество окиси серы промышленного
происхождения в атмосфере достигло больших концентраций,
особенно вблизи заводов. В глобальном масштабе половина серы
атмосферы антропогенного происхождения. Из-за ее наличия
дождевая вода, выпадающая в ряде промышленных районов,
имеет рН 4. Это приводит к подкислению почвенного раствора,
причем почвенные микроорганизмы не в состоянии восстановить
гомеостатическое состояние в почве по рН и по содержанию серы.
Естественный микробный механизм, который должен восстановить
равновесие в системе, не срабатывает, величина воздействующего
фактора превышает запас прочности (буферности) комплекса
почвенных микроорганизмов. Во многих случаях происходят под-
кисление почвы и вынос кальция. Сказанное в большей степени
относится к естественным экосистемам, например лесным почвам.
В окультуренных почвах такие антропогенные факторы, как
физиологически кислые удобрения, известь или аммиак, оказывают
гораздо большее влияние на свойства почвы, чем кислые
атмосферные осадки. Окись серы — один из самых токсичных газов
для почвенной биоты, хотя сульфатредуцирующие бактерии
всегда содержатся в почве и, казалось бы, могли бы превращать
серную кислоту в сероводород, который, как установлено, в
почвах сразу же связывается с металлами, превращается в сульфиды
и обезвреживается. Однако этого не происходит, вероятно, из-за
недостаточно восстановительных условий, имеющихся в почве.
В противоположность этому закись углерода, которая в
последнее время стала поступать в почвы в гораздо больших
масштабах по сравнению с естественной природой, видимо,
полностью используется почвенными микроорганизмами (бактериями,
грибами). Буферная емкость комплекса почвенных
микроорганизмов в этом отношении оказывается очень большой.
136
Примером нарушения газового равновесия в биосфере может
быть выделение недоокисленных соединений азота в процессах
жизнедеятельности нитрификаторов, денитрификаторов и метано-
окисляющих бактерий при внесении высоких доз азотных
удобрений. При попадании больших количеств азотных соединений
почвенные микроорганизмы реагируют на нарушение гомеостаза
и начинают выбрасывать из почвы азот в атмосферу и грунтовые
воды (денитрификация, нитрификация). Равновесие в почве
восстанавливается, но ценой нарушения баланса в атмосфере и
грунтовых водах. Отсюда ясно виден вред большого количества
связанного азота в биосфере. Лимитирование развития организмов
азотом менее вредно для биосферы, чем его избыток. В этой
связи становится понятной экологическая целесообразность
потери способности к азотфиксации при переходе от прокариот к
эукариотам.
Особо следует остановиться на летучих и газообразных
веществах, образуемых растениями и их корневой системой. Это
различные вещества, оказывающие большое влияние на жизнь почвы
и почвенных микроорганизмов, но насколько велико их действие,
трудно сказать, так как процессы выделения этих веществ
изучены только в искусственных условиях и очень мало известно о
масштабах этих процессов в природе. Органические летучие
вещества прорастающих семян и проростков могут служить
источником углерода для микроорганизмов (бактерии, актиномицеты,
грибы, дрожжи). Однако такой способностью обладают не все
виды микроорганизмов. Короткоцепочечные летучие органические
вещества относительно простой структуры, выделяемые
растениями в изолированное пространство, используются микробами фи-
лосферы, ризопланы и подстилки как источник углерода.
Однако в большинстве работ органические летучие вещества
рассматриваются не как источники углерода, а как стимуляторы
или ингибиторы. Особенно много работ такого рода выполнено
с фитопатогенными грибами. В качестве примера можно привести
некоторые из них.
Многие летучие органические вещества растений влияют на
прорастание спор грибов, а также участвуют в аттракции и
инфекционном процессе (фитопатогенные и микоризные грибы).
Большая роль отводится терпенам и ряду других газообразных
(этилен) и летучих веществ (альдегиды). Установлено, что
прорастание спор Penicillium digetatum подавляется различными
альдегидами (Сб—С9), которые являются летучими
органическими веществами цитрусовых плодов.
Гексеналь из листьев гинкго играет важную роль в
устойчивости этого растения к грибам, этот альдегид токсичен для
грибов. Ингибирующее действие могут оказывать серосодержащие
летучие вещества из растений (метилизотиоцианат, аллилизотио-
цианат, бутилизотиоцианат, метилмеркаптан, диметилсульфид, ди-
метилдисульфид). Ряд гликозидов может разлагаться с
образованием цианистого водорода. Примеров такого рода можно приве-
137
сти множество, так как выполнены сотни работ по изучению
газообразных и летучих веществ растений. Однако все опыты
были смоделированы, и поэтому количество и концентрация этих
веществ в природных условиях остаются неизвестными. В связи
с этим неясно, какую экологическую роль они играют. Между
тем вопрос о роли газов и летучих органических веществ
микробного и растительного происхождения в регулировании жизни в
почве является одним из центральных в экологии почвенных
микроорганизмов.
Газообразные вещества являются первым претендентом на
роль переносчиков информации в экосистеме, так как они могут
передавать информацию наиболее быстро из-за быстрой
диффузии газов.
Исходя из представления о «жесткой» организованности мик-
робоценоза в почве и о наличии в ней всеобщего единого
регулятора, Смит (Smith, 1975) приписал такую общую регулирующую
роль этилену. Однако эта концепция основывалась на
лабораторных опытах, в которых условия микрозоны
воспроизводились в макромасштабах, и, по нашему мнению, этилен вряд ли
может играть существенную и универсальную роль в масштабах
всей массы почвы. К такому заключению приводят следующие
основания.
1. Почва имеет микрозональное строение, и в каждой
микрозоне процессы идут относительно независимо и разновременно
(Звягинцев, 1973, 1978; Звягинцев и др., 1976). Трудно
предположить, что есть моменты, когда вся почвенная масса
насыщается этиленом.
2. В естественной почве этилен почти никогда не
обнаруживается. По крайней мере исследователи, определяющие азотфик-
сацию ацетиленовым методом, всегда проводят контрольные
определения на наличие в почве этилена, но обычно этилена нет,
если почва естественная и не обогащалась органическими
веществами, а также не подвергалась другим сильным воздействиям.
3. Этилен, если он выделяется, используется многочисленными
почвенными микроорганизмами, способными осуществлять этот
процесс, и поэтому не может накапливаться, правда, есть данные,
что этилен не используется в анаэробных условиях.
До сих пор неясен вопрос о фунгистазисе и бактериостазисе
(микробостазисе) в почвах. В ряде работ предполагается, что
это явление может быть обусловлено накоплением этилена или
других летучих органических веществ. В модельных опытах
установлено, что летучие органические вещества могут задерживать
прорастание спор грибов и рост некоторых почвенных
микроорганизмов. Однако насыщение всей массы почвы этими веществами
в природных условиях представляется весьма проблематичным.
Скорее всего в природе микробостазис в первую очередь
объясняется недостатком необходимых питательных веществ.
Добавление питательных веществ, в том числе и летучих органических
веществ, может приводить к снятию микробостазиса. Существен-
138
ным фактором фунгистазиса в природных условиях может быть
недостаток кислорода в определенных микрозонах. Интересная
гипотеза о том, что микробостазис вызывается катаболитной
репрессией, была высказана нами в последнее время (Гузев и др.,
1985). Явление катаболитной репрессии в широком понимании
этого термина состоит в том, что продукт ферментативной
реакции задерживает синтез и подавляет активность фермента.
Например, добавление глюкозы подавляет разложение крахмала
амилазами. Это явление четко проявляется на почвах разных типов.
Очевидно, по типу катаболитной репрессии помимо глюкозы
могут действовать и другие вещества. Нельзя не согласиться с теми
авторами, которые утверждают, что микробостазис может
вызываться рядом причин. В одном случае, например, фунгистазис был
связан просто с накоплением аммония.
Действие летучих органических веществ может в почве
проявляться скорее всего локально. Поскольку эффект этих веществ
зависит от концентрации (стимуляция, нейтрализм, подавление),
очень трудно определить экологическую роль этих веществ, хотя,
как показано в многочисленных работах (Babich, Stotzky, 1974;
Stotzky, Schenck, 1976), эти вещества могут оказывать сильное
действие на активность, динамику популяций и на экологию
микроорганизмов в целом. Пока мы не будем знать интенсивности
процессов образования определенных веществ в нормальной
почве, их значение будет неясным. Следует отметить, что
современные методы (газовая хроматография и др.) дают принципиальную
возможность для изучения интенсивности процессов образования
макрогазов, микрогазов и органических летучих веществ.
Изучение действия э*гих веществ проходило в несколько этапов:
1) установление подавляющего или стимулирующего действия
веществ на чистых культурах без химической идентификации
веществ; 2) химическая идентификация веществ и их
количественное определение в лабораторных условиях; 3) определение
количества и качества летучих органических веществ в почвенных
образцах в лабораторных условиях; 4) такие же определения, но
в почвах в естественных условиях. Последний этап фактически
еще не начинался, но его нужно пройти в ближайшее время.
ПУТИ ИЗУЧЕНИЯ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
И ВЫЗЫВАЕМЫХ ИМИ ПРОЦЕССОВ
В настоящее время наметилось несколько принципиально
различных подходов моделирования почвы как среды обитания
микроорганизмов.
I. Воспроизведение микрозон в макромасштабах.
П. Создание физических моделей почв с применением микро-
бус, ионообменных смол, капилляров, измельченных минералов,
особенно глинистых, полуторных окислов, стерильной почвы и т. д.
III. Моделирование с помощью нестерильных почвенных
образцов или работа с нативными почвами. Применяют два
подхода.
1. Упрощение микрозональности в почве: а) внесение в весь
объем почвы источников углерода или других питательных
веществ; б) инициированное микробное сообщество.
2. Сохранение естественной микрозональности в почве: а)
эксперименты без растений; б) эксперименты с растениями.
I. Воспроизведение микрозон в макромасшуабах. В качестве
такого приема следует рассматривать обычно и широко
применяемые методы посева почвенных микроорганизмов на разнообра^
ные питательные среды. Можно привести массу примеров, когда
создание новых сред и условий культивирования приводило к
выделению из почвы новых микроорганизмов. Собственно таким
путем и были выделены все микроорганизмы из почв.
Элективные среды воспроизводят условия весьма специализированных
микрозон, малоэлективные — условия группы микрозон, к тому
же более широко распространенных.
До настоящего времени больше внимания уделяли подбору
состава питательных сред и меньше внимания обращали на
варьирование условий культивирования. Создавались среды с
различными источниками углерода, азота, с внесением дополнительных
факторов роста, среды для выделения нитрификаторов, денитри-
фикаторов, сульфатредукторов и т. д. Из условий
культивирования в основном учитывалась степень аэрации (аэробные и
анаэробные условия). Такие условия, как полный состав газовой
фазы, температура культивирования, потенциал влаги,
кислотность среды, продолжительность культивирования с* целью
выделения медленнорастущих форм и т. д., мало учитывались.
В последнее время в отношении выделения новых форм резуль-
140
таты, пожалуй, дают новые условия культивирования, например
регулирование газовой фазы (создание строго анаэробных
условий, повышенного содержания углекислого газа, введение в
атмосферу микрогазов — этилена, водорода, углеводородов, закиси
.азота, угарного газа, летучих органических веществ),
культивирование микроорганизмов при низком потенциале влаги, при
низких температурах, в том числе и в замерзшей почве.
Все среды и условия культивирования являются элективными
по отношению к почвенным микроорганизмам. Однако они
отличаются по степени элективности, и в дальнейшем, очевидно,
необходимо создать менее элективные среды и условия, а также
высокоэлективные среды, которые могут дать возможность
выделять определенный вид или даже штамм микроорганизма. Можно
выделить генетически маркированные, например антибиотикоус-
тойчивые, штаммы (см. ниже).
Наибольшее количество микроорганизмов выделяется на
средах с почвенным экстрактом. Конечно, такая среда не может
имитировать всех микрозон, имеющихся в почве. Наибольшее
количество микроорганизмов на ней выделяется по следующим
причинам: 1) среда содержит многообразные источники питания,
хотя и в небольших количествах; 2) микроорганизмы на ней
растут медленно, поэтому быстрорастущие формы не могут
элиминировать медленнорастущие; 3) задается большое время
инкубации, поэтому успевают вырасти и медленнорастущие формы.
В общей форме можно сказать, что на этой среде развиваются
не только г-стратеги, как на богатых питательных средах, но и
К-стратеги. Культивирование микроорганизмов на почвенных
средах в аэробных и анаэробных условиях, при низких и средних
температурах, различной влажности, различном составе газовой
•среды, различных рН может дать возможность сравнительно
полно учесть гетеротрофные микроорганизмы. Однако известно, что
микроорганизмы на почвенных питательных средах растут плохо,
поэтому с ними трудно работать: при пересевах многие из них
погибают. Выделенные микроорганизмы, среди которых явно есть
в новые, остаются неизученными. Обычно это объясняют тем, что
почвенная среда содержала дополнительные факторы роста и
микробы смогли за счет этих факторов роста дать несколько
поколений, а затем рост их прекращается. Однако они дают не
несколько, а десятки и даже сотни поколений. Таким образом,
вряд ли здесь дело в дополнительных факторах роста. Скорее
действуют следующие ограничения: недостаточное время
инкубации при пересевах, плохой подбор состава и концентрации
питательной среды.
Имитация микрозон в макромасштабах дает принципиальную
возможность выделить все почвенные микроорганизмы, изучить
их генетические возможности, определить кинетику роста и т. д.
Однако эти методы не могут дать сведений о том, какие из
генетических возможностей проявляются микроорганизмами
непосредственно в почве в конкретных ситуациях, с какими микро-
141
бами-партнерами они взаимодействуют, какова интенсивность
проводимых ими процессов. Поэтому наряду с рассмотренным
подходом все шире внедряются другие подходы.
И. Физические модели почв с использованием моделей
почвенных частиц. Нельзя сказать, чтобы этот путь был очень
плодотворным, и вряд ли его можно считать генеральным, однако
и он дал достаточно информации о жизни микробов в почве и,
вероятно, еще много даст.
Некоторые авторы пытались имитировать развитие микробов
в почве с помощью использования систем из микробус с резко
различными и строго определенными размерами частиц и
соответственно пор. Была воспроизведена специфика почвы как
системы, разделенной твердыми частицами на определенные ком-
партменты, воспроизводилась величина пор при варьировании
степени заполнения их водой (Parr et al., 1963, 1964, 1967). Было
установлено, что жизнедеятельность микроорганизмов сильно
зависит от величины поровых пространств между частицами. Более
крупные микроорганизмы, такие, как грибы, нуждаются в
большей величине пор, бактерии как более мелкие микроорганизмы
могут довольствоваться и более мелкими порами. Причем, как
было установлено, эта зависимость не может быть объяснена
различиями в кислородном (окислительно-восстановительном)
режиме в системах из разных бус.
Специфику развития микроорганизмов в тонких почвенных
капиллярах успешно имитировали в опытах с проточными и
непроточными стеклянными капиллярами Перфильева (Звягинцев,
1970 а).
В некоторых отношениях почву могут имитировать
ионообменные смолы, особенно катиониты. Опыты со смолами позволили
определить, что на отрицательно заряженных поверхностях
создается более низкое рН, непосредственно влияющее на
развивающиеся на поверхности клетки микроорганизмов. Затем эти
выводы были перенесены на нативную почву. Если бы опыты
сразу ставились на почве, вряд ли обнаруженное явление было
бы открыто, так как в почве оно проявляется менее четко, чем
на смолах.
Очень интересное явление при работе с ионообменными
смолами было открыто в последнее время. Удалось показать, что
ионообменные смолы могут служить конечным акцептором
электронов и клетка может передавать избыток электронов
непосредственно на частицы (Filip, Hattori, 1984). Если это положение
подтвердится, оно сыграет важную роль в понимании специфики
почвы как среды обитания микроорганизмов.
Особенно много исследований было проведено с глинистыми
минералами типа каолинита и монтмориллонита. Глинистые
минералы сильно изменяют метаболизм микроорганизмов. Изучено
влияние моноионных минералов, влияние специфического рН на
поверхности, действие токсических веществ в средах с
минералами, влияние минералов на доступность ряда классов адсорби-
142
рованных веществ и т. д. Некоторые минералы отрицательно
влияют на определенные микроорганизмы. Некоторые фитопато-
генные грибы, например, не развиваются в почвах с
монтмориллонитом (Stotzky, 1970).
Для того чтобы приблизиться к пониманию развития
микроорганизмов в нативной почве, иногда опыты ставили со
стерилизованными почвенными образцами. Стерилизацию осуществляли
разными способами: автоклавированием, стерилизацией сухим
жаром, обработкой окисью этилена и пропилена, 7"лУчами-
Термическая обработка довольно сильно изменяет органическую
и минеральную части почвы. Стерилизация химическими
веществами имеет тот недостаток, что после стерилизации они остаются
в почве в адсорбированном состоянии.
Наиболее приемлемой считается обработка почвы у-лУчами.
Они убивают микроорганизмы, так как разрушают нити ДНК,
но при такой обработке почти полностью сохраняется
ферментативная активность почв, мало изменяются органическое вещество
почвы и ее минеральная часть. Почва, простерилизованная
любым способом, обогащается мертвым органическим веществом —
погибшими микроорганизмами.
Стерилизованная у-лучами почва и торф широко применяются
при производстве нитрагина. В стерильной почве можно очень
сильно повысить титр внесенной популяции клубеньковых
бактерий, чего гораздо труднее достигнуть в нестерильной почве.
Рост популяции проходит иначе, чем в нестерильной почве.
Разные сорта торфа и почв резко отличаются по способности
поддерживать рост популяций клубеньковых бактерий и сохранять эту
популяцию на достаточно высоком уровне в течение
продолжительного времени.
Модель стерильной почвы даст большие и еще
неиспользованные возможности. Сравнивая развитие внесенной популяции
в стерильной и нестерильной почвах, можно определить влияние
естественной микрофлоры почв на динамику развития популяции,
можно вычленить влияние микробиологического фактора на
развитие популяции и определить, чем отличается развитие
непосредственно в почве чистой культуры от развития в комплексе
почвенных микроорганизмов. Большой интерес представляет также
изучение специфики взаимодействия двух или нескольких
искусственно внесенных популяций в стерильной и нестерильной
почвах. Часто приходится изучать специфику роста и развития
культуры в резко отличающихся условиях: стерильной и нестерильной
почвах, жидкой культуре.
III. Моделирование с помощью нестерильных почвенных
образцов или работа .с нативными почвами. Большинство
исследователей пошли не по пути физических моделей почв с различными
типами частиц, а по пути моделирования с образцами нативной
почвы. Этот путь хотя часто и не дает ответа на вопрос о
механизмах изучаемых явлений, зато является более продуктивным в
143
смысле понимания основных законов функционирования
комплекса почвенных микроорганизмов.
Работа с нативными почвенными образцами, помещенными в
лаборатории в контролируемые условия температуры, влажности,
внесения различных веществ, оказывается наиболее продуктивной
и перспективной. При работе с почвой непосредственно в поле
обычно имеется столько неконтролируемых факторов, что
интерпретация результатов крайне затруднена. Именно при работе с
нестерильными нативными почвенными образцами обычно
изучаются азотфиксация и денитрификация, дыхание почв, динамика
микробных популяций в почве, кинетика роста микроорганизмов,
микробная сукцессия.
1. Упрощение микрозональности в почве.
А. Внесение в весь объем почвы источников углерода или
других питательных веществ.
Этот прием в последнее время получил широкое
распространение и оказался самым результативным. В нестерильный
почвенный образец вносится какое-либо вещество, и изучается отклик
почвенных микроорганизмов на такое внесение. Наиболее часто
в почву вносят органические вещества: глюкозу (как один иа
наиболее общих метаболитов), определенные аминокислоты,
органические кислоты, целлюлозу, лигнин, хитин, углеводороды и
т. д. Легкорастворимое вещество распределяется по всем
микрозонам, и гетерогенность микрозон уменьшается. Если вносится
нерастворимое вещество, то появляется необычно много микро-
зон определенного типа, но микрозональность сохраняется в
большей степени. Внесение органического вещества дает возможность
ускорить микробиологические процессы и сделать их более легко
определяемыми. Показателями процессов может быть количество
микроорганизмов, обнаруживаемое прямым методом или
посевом, биомасса микроорганизмов, динамика популяций,
интенсивность определенных процессов — дыхание, азотфиксация,
денитрификация. Этот подход дает возможность быстро и эффективно
определить влияние на развитие микроорганизмов и интенсив^
ность процессов ряда факторов и условий (температуры,
концентрации субстрата, влажности, внесения микроорганизмов,
стрессов и т. д.), а также позволяет составить математические модели
процессов, установить законы, по которым происходит развитие
микроорганизмов в почве. Такие модели составлены для ряда
процессов.
У нас нет возможности рассмотреть эти модели более
подробно. Отметим только, что в почве все процессы идут не так,
как в чистой культуре. Изучение динамики меченых (иммунолю-
минесценция, генетическая маркировка) микробных популяций в
почве дало возможность сделать ряд новых выводов о специфике
почвы как среды обитания (положение о ненасыщенности почвы
микроорганизмами, стабилизации внесенных популяций,
определение границ проявления антибиотического антагонизма и т. д.).
Применяют три модификации метода: 1) исследуется почвен-
144
ный образец, находящийся в стационарных условиях; 2) перко-
ляция или перфузия почвенного образца; 3) проточное
культивирование в почвенной колонке.
Первый способ используется наиболее часто и обычно
оказывается вполне удовлетворительным для получения нужной
информации. Он очень прост по техническому исполнению. Обычно*
почвенный образец помещается в любой сосуд с крышкой.
Проблемой остается вопрос о том, какой величины почвенный
образец необходим для таких исследований. Обычно работают с
образцами 50—100 г, так как считается, что в таких образцах
достаточно хорошо представлены все основные типы микрозон.
При использовании перколяционного метода почвенный
образец подвергается многократному повторному промыванию одним
и тем же циркулирующим раствором. Этот метод особенно
широко и весьма успешно применялся при изучении закономерностей
процесса нитрификации в почве. Повторное промывание почвы
одним и тем же раствором считалось необходимым для того,
чтобы концентрация метаболитов в нем возросла до таких
величин, которые легко можно определить аналитическими методами.
Однако в настоящее время в химии и биохимии разработаны
более эффективные методы концентрирования веществ без
нарушения их состава и структуры. Применение метода перколяции
вряд ли целесообразно. При применении этого метода микробы
развиваются в перколяторе в растворе, а не в почве, поэтому
результаты искажены. Считалось, что перколяция воспроизводит
водный режим некоторых типов почв, однако модель очень
далека от природы. Перколяцию лучше заменить методом
проточного культивирования в почвенной колонке с последующим
концентрированием метаболитов, который часто бывает необходим
при изучении динамики микробного метаболизма, разрушения
микробами минералов с целью предотвращения образования
вторичных минералов и более полного определения продуктов
разрушения минералов и в некоторых других случаях.
Воспроизведение проточных микрозон в макромасштабах также достигается'
с помощью этого метода (Паников, Звягинцев, 1983а, б). Считают,
что проточное культивирование отражает условия, которые
имеются в почвах с промывным режимом, например подзолистые и
дерново-подзолистые. Однако" в протоке процесс обычно идет
долго при постоянной и довольно большой скорости подачи
раствора, чего в природе не бывает.
Б. Инициированное микробное сообщество.
При использовании рассматриваемого подхода на поверхность
нестерильного почвенного образца, помещенного в чашку Петри
в виде почвенной пластинки, наносится крахмал и изучаются
крахмалолитические микроорганизмы (Гузев и др., 1980). Таким
образом, в макромасштабах воспроизводится аэробная
микрозона, обогащенная органическим веществом (крахмалом). С
помощью этого метода удалось установить, что обычно в заданных
узких условиях процесс ведут несколько доминирующих видов.
145
Антропогенные воздействия (удобрения, пестициды, загрязнения
в виде тяжелых металлов и т. д.) независимо от природы
действующего фактора изменяют микрофлору, активно ведущую
процесс в соответствии с общими законами. При увеличивающихся
нагрузках каждый фактор вызывает в микробном сообществе
изменения, соответствующие состоянию системы: гомеостаз, стресс,
развитие резистентных форм и репрессия. Подход дает
возможность определять ряд микробиологических характеристик почв,
в том числе и допустимые нагрузки того или иного фактора на
почву.
2. Сохранение естественной микрозональности
в почве.
Эксперименты с почвенными образцами или с почвами
непосредственно в природе, когда все микрозоны сохраняются в
естественном состоянии, казалось бы, должны быть
предпочтительными. Однако такие исследования очень затруднены по
нескольким причинам. В полевых условиях действует очень сложный
комплекс меняющихся факторов, которые почти невозможно или
трудно контролировать. Почва отличается большой мезогетеро-
генностью, из-за чего получить репрезентативные результаты очень
трудно. Например, наши исследования показали, что обычно
нужно брать 5—10 повторных образцов, которые необходимо
анализировать отдельно. Относительно малая интенсивность
микробиологических процессов в почве без внесения источников питания
делает возможным регистрацию лишь немногих процессов. Пока
наиболее удачными при такой постановке опытов были
исследования интенсивности азотфиксации и денитрификации. Особенно
важно, что были определены масштабы этих процессов в
ризосфере растений, причем в сравнении с контрольной почвой (Ума-
ров, 1986). При изучении микробиологических процессов в почве
с ненарушенной микрозональностью особенно большие надежды
возлагаются на газовый анализ и на газохроматографические
методы. Недостатком такого подхода является то, что
фактически почвенные микроорганизмы не изучались, и такие
исследования скорее можно отнести к «физиологии почв», а не к почвенной
микробиологии.
КОНЦЕПЦИИ СТРОЕНИЯ И
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КОМПЛЕКСА
ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Роль изучения почвенных микроорганизмов в последнее время:
начинает резко возрастать в связи с интенсификацией сельского
хозяйства, а также с изменением и загрязнением биосферы,
которое в настоящее время происходит из-за все усиливающейся
хозяйственной деятельности человека. Необходимо знать законы,
по которым функционируют почвенные микроорганизмы в
естественных экосистемах, определить происходящие в них изменения
и наметить пути их регулирования.
Почвенная микробиология, хотя она по существу
экологическая дисциплина, очень долго развивалась в отрыве от общей
экологии, и в настоящее время одна из главных ее задач —
овладение и творческое применение идей и концепции общей экологии.
Экология — одна из фундаментальных биологических
дисциплин, и таковой во многом ее делает единство основных
экологических законов независимо от того, рассматриваются ли
растения, животные или микроорганизмы, и независимо от специфики
конкретной экосистемы. Подобно принципу биохимического
единства, который сыграл большую роль в развитии современной
биохимии и молекулярной биологии, экология также характеризуется
единством общих законов, хотя в конкретных экосистемах и при
рассмотрении определенных организмов приходится встречаться
и со специфичностью. В задачи почвенной микробиологии входят:
рассмотрение общих экологических закономерностей,
обязательных для всех экосистем и организмов, в том числе и для
микроорганизмов (гомеостаз, сукцессия, биологическая
организованность сообществ и т. д.); рассмотрение специфических законов,
действующих в микробных экосистемах или микробных
компонентах экосистем (наличие специфических функций, например
азотфиксации, способности к разложению определенных классов
органических веществ, способности необычайно быстро
размножаться и осваивать экологическую нишу), а также поиски
специфичности строения и функционирования комплекса почвенных
микроорганизмов (пул, дублирование и т. д.). Последнее
направление является прямой и важнейшей функцией почвенной
микробиологии. Необходимо четкое понимание и формулирование
основных закономерностей и концепции функционирования
почвенных микроорганизмов.
147
Экосистемы отличаются определенной прочностью, которая
выражается в способности поддерживать гомеостаз. С помощью
почвенных микроорганизмов в естественных биогеоценозах такой
гомеостаз осуществляется в отношении поддержания на
постоянном, характерном для данного типа почвы уровне органического
вещества (гумуса), определенного содержания подвижного азота,
фосфора, вероятно, в поддержании определенной, характерной
для данной почвы скорости разрушения и синтеза минералов и
т. д. Однако хозяйственная деятельность человека давно
преодолела пределы прочности, и оказалось, что довольно просто можно
добиться значительной интенсификации процессов, проводимых
почвенными микроорганизмами.
Весь опыт сельского хозяйства показывает, что
микробиологические процессы разложения органических веществ, о которых
можно, например, судить по интенсивности дыхания почвы, резко
интенсифицируются, убыстряется круговорот биогенных
элементов, что до определенных пределов может рассматриваться как
положительное явление, если ставится задача повышения урожая,
так как только молодая система дает большой урожай.
Интенсификация процессов, осуществляемых почвенными
микроорганизмами (разложение органического вещества, денитрификация,
вероятно и азотфикаация), при создании соответствующих условий
достигается довольно легко. Однако такого рода интенсификация
в связи с хозяйственной деятельностью человека часто
оказывается вредной. Происходят чрезмерно быстрое разрушение
органического вещества в осваиваемых торфяниках, превращение
внесенных азотных удобрений в нитраты с последующим их
вымыванием в грунтовые воды и реки, развитие процесса денитрифи-
кации, приводящее к газообразным потерям азота, и т. д.
Таким образом, общий тезис, применявшийся и часто теперь
еще применяемый в почвенной микробиологии «чем больше, тем
лучше» (в отношении количества микроорганизмов,
ферментативной активности почв, скорости разложения клетчатки на зарытых
в почву кусках ткани, накопления аминокислот, дыхания почвы
и т. д.), кажется все более сомнительным. На рассмотрении этого
положения следует остановиться более подробно. Если бы зоолог
или ботаник начал отстаивать подобный тезис, то абсурдность
его стала бы сразу очевидной. Например, чрезмерное развитие
травоядных животных не ведет ни к чему хорошему для
экосистемы. Чрезмерное развитие хищников также ведет к
повреждению экосистемы, а не к ее процветанию. Однако в области
почвенной микробиологии положение «чем больше, тем лучше»
отстаивается до сих пор. Если разобраться подробнее, то дело, как
оказывается, здесь не только в ошибках почвенных
микробиологов, но и в специфике функционирования комплекса почвенных^-
микроорганизмов. Почвоведы-микробиологи, как правило,
определяют не реальное воздействие экологического фактора на
экосистему, а потенциальные возможности микроорганизмов в
экосистеме и потенциальную биологическую активность почв (количе-
148
ство зачатков микроорганизмов, потенциальная ферментативная
активность почв). Эти показатели не характеризуют интенсивность
реально протекающих в природе процессов, а только указывают
на потенциальную способность системы сохранять гомеостаз при
меняющихся внешних воздействиях. Общий запас и большие
потенциальные возможности часто говорят о высокой буферности
системы. Отличие микроорганизмов от высших организмов
состоит в том, что их количество может быть совсем не
пропорционально их реальному воздействию на экосистему и не
пропорционально интенсивности проводимых ими процессов. Количество же
животных и растений, а также их биомасса в гораздо большей
степени пропорциональны их вкладу в круговорот вещества и
энергии в экосистеме.
Большие потенциальные возможности говорят, как правило,
о большей способности системы сохранять равновесие при
изменяющихся внешних воздействиях. В этом отношении экосистемы
с высокой потенциальной биологической активностью могут быть
устойчивее. Однако гипертрофированная полевая (реальная)
биологическая активность скорее ведет к разрушению экосистемы,
чем к ее поддержанию. Для естественных экосистем должен быть
характерен свой оптимум микробиологической реальной
активности, и выход за его пределы как в сторону понижения, так
и в сторону повышения вреден. В этом отношении определение
средней реальной биологической активности, характерной для
данной почвы, крайне необходимо, так как оно позволило бы
устанавливать повреждения в функционировании комплекса
почвенных микроорганизмов. Оптимумы полевой активности в
естественных условиях меняются по сезонам, поэтому определение
среднего оптимума реальной активности весьма затруднительно.
Среднюю потенциальную биологическую активность почв по тому
или другому показателю определить легче, так как эта величина
«более стабильная.
В общем случае колебания численности и биомассы микробных
клеток, а также других показателей биологической активности
представляют собой более или менее плавные отклонения от
определенного минимума, который можно рассматривать как пул,
характерный для данной почвы (например, количество
микроорганизмов, которое почва может поддерживать в наиболее
неблагоприятные для их развития периоды). Величина пула не зависит
•от случайных колебаний температуры, влажности, поступления
растительных остатков, а обусловлена типом почвы с присущими
ему физическими и химическими свойствами, формирующимися
в процессе почвообразования, а также факторами, которые
приводят к изменению свойств почвы за относительно небольшие
промежутки времени и обусловлены, как правило,
антропогенными воздействиями (загрязнения, агротехнические и
агрохимические мероприятия). Верхние пределы количества обусловлены в
значительной мере непрогнозируемыми экологическими
факторами — количеством осадков, изменением температуры почвы, по-
149
ступлением органического вещества. Они могут совпадать аля
разных типов почв. Таким образом, при определении среднего
значения для данного фактора в заданной почве они будут в
большей мере отражать экологические условия периода
наблюдений, чем свойства, присущие данному почвенному типу. Для
определения минимального пула необходимо экспериментально
установить наименьшее значение показателей. Для
дерново-подзолистой почвы для этого необходимо проводить определения не
более 10 сут во время вегетационного периода при ежедневных
определениях (Звягинцев, Голимбет, 1983).
Особо должны быть рассмотрены агроценозы (агроэкосисте-
мы), в которых стремятся интенсифицировать процессы,
поддерживать систему в состоянии молодости для получения большого
количества чистой продукции. В этом случае повышение
актуальной биологической активности — явление необходимое и
положительное, но в определенных пределах. Кроме того, необходимо
рассматривать конкретные микробиологические процессы:
повышение скорости разложения растительных остатков и
органических удобрений в определенных пределах — явление
положительное, а повышение интенсивности нитрификации и денитрификации
при внесении азотных удобрений — вредное. Стратегия развития
экосистем, идущих к климаксным сообществам, и стратегия
сельского хозяйства различны. Если развитие экосистемы ведет к
снижению чистой продукции, то сельское хозяйство стремится к
получению максимального урожая. В связи с этим перестройка
интенсивности микробиологических процессов, протекающих в
почвах, занятых сельскохозяйственными угодьями, — явление
вполне закономерное.
По потенциальной биологической активности мы, вероятно,
должны любой комплекс почвенных микроорганизмов,
находящихся в той или иной почве, рассматривать как климаксный
(самый высокий в биосфере генофонд, потенциально узкая
специализация по экологическим нишам, высокая потенциальная
способность к поддержанию гомеостаза). Однако реализация этих
возможностей будет идти совсем по-разному в зависимости от
условий, и микробный комплекс может функционировать и как
молодая, и как старая экосистема не только в зависимости от
стадии сукцессии высших растений, но и от сезона и конкретных
условий почвенной микрозоны, куда попали те или иные
питательные вещества и создались определенные условия.
Сформулируем некоторые концепции строения и
функционирования комплекса почвенных микроорганизмов, которые
представляются существенными.
Концепция комплекса почвенных микроорганизмов.
Представление о комплексе почвенных микроорганизмов вводится взамен
понятия «микробоценоз», которое является не вполне удачным;"
так как в почве часть микроорганизмов связана с растениями,
часть — с животными и нет функционально единой
изолированной системы микроорганизмов (микробоценоза). «Комплекс» —
150
понятие более нейтральное и не предполагает обязательного
взаимодействия отдельных элементов. Рассматриваемая концепция
отрицает идею о глобальной строгой и жесткой организованности
почвенных микроорганизмов в единую систему на основе средо-
вых гормонов или какими-либо другими способами.
Концепция микробного пула. Гомеостаз в почве
поддерживается с помощью механизмов, основанных в первую очередь на
микробном пуле. В почвах всегда имеется избыточный пул
(запас) микробов, не обеспеченных органическим веществом и
другими элементами питания. Благодаря наличию этих
лимитирующих факторов непрерывное развитие и размножение
микроорганизмов не осуществляются. При глобальном рассмотрении всей
массы почвы первым лимитирующим фактором в развитии
почвенных гетеротрофных микроорганизмов является недостаток
органического вещества, и отчасти других питательных веществ,
особенно фосфора. Температура и влажность в качестве
лимитирующих факторов выступают на протяжении определенных
отрезков времени (зима, летняя засуха), но не влияют на валовую
минерализацию органического вещества. В климаксных системах,
как известно, все синтезируемое в экосистеме органическое
вещество разлагается, и запас органического вещества остается
постоянным.
При построении комплекса почвенных микроорганизмов
выполняется общий закон развития экосистем — сукцессия
движется по пути поддержания единицей энергии все большей биомассы
организмов. Это правило оказывается справедливым и для
почвенных микроорганизмов. Особенно четко это проявляется в том
случае, если потенциальный пул микроорганизмов
рассматривается как климаксная система. Наличие микробного пула является
одним из важнейших факторов среди тех, на которых основано
функционирование комплекса почвенных микроорганизмов. На
протяжении всего развития почвенной микробиологии
представления о численности микроорганизмов в почве, т. е. о ее
микробном пуле, сильно изменились, причем определяемая численность
все время увеличивалась. Сначала применяли метод посева на
питательные среды и, таким образом, учитывали сравнительно
немного микроорганизмов. Количество бактерий определялось
миллионами клеток на 1 г почвы. Применение прямого
микроскопического метода Виноградского позволило учесть в почве в
тысячи раз больше бактерий: от сотен миллионов до 1—2 млрд.
на 1 г почвы. Использование люминесцентной микроскопии в
отраженном свете еще увеличивало учитываемое количество
микроорганизмов. По методу Виноградского часть клеток нельзя было
учесть из-за адсорбции их на почвенных частицах и агрегатах
(Звягинцев, 1973). Электронная микроскопия позволила выявить
в почве ультрамикроскопические формы, и, таким образом,
определяемая численность почвенных микроорганизмов еще возросла
(Никитин, 1964). По нашим данным (Звягинцев, 1978),
количество бактерий в почвах составляет от 1 до 10 млрд., а иногда
151
даже нескольких десятков миллиардов клеток на 1 г почвы,
суммарная длина грибных гиф равняется десяткам, сотням и
довольно часто тысячам метров на 1 г почвы. Кроме того, в почве
находится большое количество гиф актиномицетов, а также более
крупные микроорганизмы: водоросли, простейшие животные,
другие беспозвоночные животные и т. д. Таким образом, пул
микроорганизмов оказывается очень велик как по численности
населяющих почву микроорганизмов, так и по суммарной биомассе. Вес
живой биомассы на 1 га может составлять для бактерий от сотен
до нескольких тысяч килограммов, а для грибов — от сотен
килограммов до десятков тонн на 1 га (Звягинцев, 1978а).
Масса сухих микроорганизмов, единовременно содержащихся
в почве, составляет для богатых почв, по нашим данным, 0,5—
1 т/га (Звягинцев, 1978а; Звягинцев и др., 1976). Чистая
первичная продуктивность сообществ известна и составляет для
продуктивных сообществ 10—20 т/га. По последним определениям, к
чистой первичной продукции, учтенной старыми методами, нужно*
прибавить 20—30% в счет корневых выделений и корневого
отпада, которые почти полностью используются микроорганизмами
ризопланы и ризосферы. Учитывая, что большинство
микроорганизмов в почве представлено гетеротрофами и большая часть
энергии тратится на поддержание биомассы микроорганизмов^
мы приходим к выводу, что можно ожидать в среднем, говоря о
порядках, не более 10 генераций микроорганизмов в год. При
этом считаем, что 50—70% вещества тратится на поддержание.
Пока такие расчеты представляются реалистичными, так как, по
имеющимся данным, только немногие почвенные микроорганизмы
имеют стадии глубокого покоя (споровые бактерии),
большинство же почвенных микроорганизмов во влажных и незамерзших
почвах должно поддерживать свое существование с
непрерывными тратами органических веществ. Отсюда следует важный
вывод — комплекс почвенных микроорганизмов выполняет свои
экологические функции и проводит процессы превращения не
только при росте и размножении микроорганизмов, но, подобно
другим организмам, и в процессе поддержания клеток, на что
тратится большая часть органического вещества. Видимо, для
почвенных микроорганизмов выполняется общее правило
пищевой пирамиды о том, что при переходе от одного трофического
уровня к другому в тела организмов входит примерно только-
одна десятая часть от используемого органического вещества.
Таким образом, расчеты показывают, что почва в целом на
протяжении большей части времени представляет собой среду,,
слабо обеспеченную доступными органическими веществами в
расчете на имеющийся пул микроорганизмов.
В экологическом отношении она резко отличается от таких
местообитаний, как рубец жвачных животных, ротовая полость
или активный ил, в которых проявляются закономерности,
соответствующие проточному культивированию микроорганизмов:
непрерывно поступает большое количество питательных веществ, а-
152
подавляющее большинство микробных клеток находится в
состоянии непрерывного размножения.
Почвы в экологическом отношении представляют совершенно
другой тип местообитания с рассеянным доступным органическим
веществом, но с большим и более разнообразным пулом только в
небольшой своей части активно размножающихся
микроорганизмов. При этом проявляются специфические приспособления для
переживания длительных периодов, неблагоприятных для
развития (способность усваивать вещества из рассеянного состояния,
особая характеристика кинетики роста, способность
адсорбироваться на частицах, где происходит накопление питания).
С экологической точки зрения необходимо выяснить вопрос
о функциях микробного пула, этого важного, по нашему мнению,
приспособления для поддержания гомеостатического состояния в
почве. При этом в понятие гомеостаза входит поддержание
определенного, характерного для данного типа почвы набора
химических и других свойств. Известно, что каждый тип почвы имеет
характерное для него содержание гумуса, ряда нерастворимых
и растворимых органических веществ (полисахаридов, липидов,
<5елков, Сахаров, органических кислот и спиртов, аминокислот,
витаминов и ферментов), ряда неорганических веществ
(нитратов, аммония, подвижного фосфора, закисного и окисного железа),
определенные окислительно-восстановительные условия и рН со
специфическим распределением их по микрозонам. В
поддержании ряда отмеченных факторов большое, а часто и решающее
значение имеет жизнедеятельность микроорганизмов. При
возникновении сдвигов в системе, например поступлении свежего
органического вещества в виде растительных остатков или
внесении азотных удобрений, в процессы их трансформации
включаются микроорганизмы, которые должны привести систему в
состояние равновесия. Большой пул микроорганизмов в почве
необходим по следующим причинам. Горизонтальное и вертикальное
перемещение микроорганизмов в почве затруднено из-за
адсорбции микроорганизмов почвенными частицами и сложности их
передвижения по мелкопористой системе, каковой является почва.
Между тем органическое вещество, как и другие вещества,
поступает в определенные микро- и мезозоны почвы совершенно
случайно. Поэтому, чтобы обеспечить переработку веществ, в
каждой мезо- или даже микрозоне должен быть полный набор
микроорганизмов, необходимых для переработки всех поступающих
в почву веществ. Причем в разное время в данном месте могут
возникнуть аэробная или анаэробная зона, зона с низкими или
относительно высокими температурами, зона с изменяющимися
значениями рН и т. д. Каждый небольшой участок почвы должен
содержать микроорганизмы, не только разлагающие органические
вещества (целлюлозу, лигнин, хитин и др.), но и
осуществляющие другие необходимые процессы: азотфиксацию,
аммонификацию, гидролиз органофосфатов, трансформацию ряда
органических и минеральных соединений, минералов и т. д.
153
Следует отметить, что небольшие по расстоянию миграции
микроорганизмов в почве возможны, причем благодаря наличию
у микробов таксисов они осуществляются целенаправленно.
Микроорганизмы обладают способностью при благоприятных
условиях чрезвычайно быстро размножаться. Однако в природе
процессы происходят на основе имеющихся клеток и только
частично за счет клеток, появляющихся после размножения. Пул
дает микроорганизмам возможность быстрее реагировать на
изменившиеся условия и таким образом способствовать более
тонкому регулированию гомеостаза и быстрейшему его достижению.
Учитывая, что микроорганизмы могут размножаться в
геометрической прогрессии, можно сделать вывод, что первоначальное
содержание микроорганизмов весьма важно для быстрого
достижения достаточного уровня клеток, необходимого для ликвидации
происшедшего в системе сдвига.
В природных условиях (Звягинцев и др., 1976) пул
микроорганизмов особенно увеличивается в тех экосистемах, в которых
условия для протекания микробиологических процессов оказывав
ются неблагоприятными, например в высокогорных почвах, где
лето очень короткое и гидротермические условия неблагоприятны
для развития микроорганизмов. Количество микроорганизмов
велико и в почвах тундры.
Пул почвенных микроорганизмов отличается не только
большой численностью, но и огромным разнообразием. По микробному
генофонду почва, вероятно, самый богатый субстрат. Недаром
при поисках микроорганизмов-продуцентов определенных ценных
веществ (антибиотиков, витаминов, ферментов, аминокислот) в
большинстве случаев обращаются к почве, как наиболее
надежному источнику разнообразных микробов.
Другая важная функция пула состоит в том, что он
обеспечивает выживание каждого вида микроорганизмов. Почва
представляется средой весьма гетерогенной, со множеством
различных' микрозон. Только в части этих микрозон в определенном
интервале времени создаются условия, благоприятные для
выживания определенного микроорганизма. Для того чтобы выживание
микроба в почве стало реальным, очевидно, в начале
неблагоприятного периода общее количество клеток должно быть
большим. В таком случае они будут находиться во многих микрозонах
и хотя бы часть их выживет.
С точки зрения функции в почве следует различать два пула
микроорганизмов: на более высоком уровне — пул, имеющий
существенное значение для микробиологических процессов,
протекающих в почве (в этом случае количество клеток бактерий
должно быть больше 1 млн. на 1 г почвы); пул, обеспечивающий
главным образом выживание определенных видов
микроорганизмов в почве. Последний пул гораздо меньше в отношении
численности клеток, но, возможно, весьма велик в видовом отношении. -
Он не имеет существенного значения в энергетических и
метаболических процессах на данной стадии сукцессии, но может ока-
154
заться необходимым для обеспечения процессов на других
стадиях сукцессии при изменении экологических условий.
Следует отметить, что сама почва как среда обитания
построена таким образом, что она чрезвычайно благоприятна для
выживания пула микроорганизмов (Звягинцев, 1977).
Концепция пула метаболитов. В почве все время
поддерживается пул легкодоступных органических веществ. В почве только
сравнительно небольшое количество зачатков микроорганизмов
находится в состоянии глубокого покоя (эндоспоры бактерий),
зачатки других микроорганизмов (споры грибов и актиномице-
тов) более активно метаболизируют, третьи микроорганизмы
находятся в состоянии вегетативных клеток и хотя и очень
медленно, но непрерывно метаболизируют. Для поддержания
жизнедеятельности они используют внутриклеточные запасы веществ, но
при длительном голодании необходимо также поступление хотя
бы небольших количеств веществ извне. Как показывает опыт,
почва является идеальной средой для поддержания
микроорганизмов. При этом важную роль играет пул внеклеточных
метаболитов, который подобно пулу внутриклеточных метаболитов
способствует выживанию микробных клеток в неблагоприятных
условиях. В почве все время находится некоторое количество
Сахаров, органических кислот и спиртов, аминокислот, пуриновых
и пиримидиновых оснований и т. д. Этот пул имеет большое
значение и не дает им погибнуть в периоды, когда в данную почву
или в данную микрозону не поступают свежие органические
вещества.
В почве имеется определенный механизм для поддержания
пула метаболитов на определенном уровне. Он основывается на
запасе неклеточных иммобилизированных гидролитических
ферментов (Звягинцев, 1977, 1980а, б; 1985), благодаря работе
которых пул простых органических веществ все время пополняется
за счет гидролиза гумуса и других органических полимеров,
имеющихся в почве. Пул гидролитических ферментов обеспечивает
пул простых органических веществ, а последний дает возможность
существовать в почве колоссальному пулу микроорганизмов. Пул
ферментов характеризуется очень большими величинами. При
оптимальных для протекания ферментативного процесса условиях
он может переработать за сутки или несколько суток такое
количество веществ, которое поступает в почву в естественных
условиях за год, об этом свидетельствуют результаты опытов по
определению ферментативной активности почв с помощью обычно
применяемых методов и подсчеты величин возможного
поступления тех или иных веществ в почву за год, например фосфор-
органических соединений, нуклеиновых кислот, белков и т. д.
Ферментов в почве очень много, особенно гидролитических, и,
казалось бы, в почвах не должен накапливаться субстрат, т. е.
биополимеры и другие соединения, которые могут подвергаться
воздействию гидролаз, но это не так. Все дело в том, что на
протяжении длительных отрезков времени существуют крайне не-
155
благоприятные условия для проявления ферментативной
активности (низкие температуры, низкий потенциал влаги). Однако-
самое главное — это разобщенность в почве фермента и
субстрата. Фермент адсорбирован (иммобилизован) в одних микрозонах,,
а субстрат — в других. Иногда адсорбированный субстрат
вообще недоступен для фермента.
Принцип дублирования. Каждый существенный физиолого-био-
химический процесс в почве строится на функционировании
нескольких дублирующих друг друга микроорганизмов. Известно,
что такой важный процесс, как разложение целлюлозы,
осуществляется самыми разными в систематическом отношении
микроорганизмами — грибами, миксобактериями, актиномицетами,.
аэробными и анаэробными бактериями. Причем представители*
многих перечисленных групп находятся в каждой почве. Если
раньше предполагалось, что азотфиксацию осуществляют толька
клубеньковые бактерии, азотобактер и клостридиум, то в
настоящее время с помощью изотопного и ацетиленового методов
показано, что этот процесс проводится очень многими и весьма
различными, правда только прокариотными, микроорганизмами..
Таким образом, этот процесс опять вызывается аэробными и
анаэробными бактериями, автотрофами и гетеротрофами,
сине-зелеными и другими фотосинтезирующими бактериями.
Долгое время процесс нитрификации приписывался
исключительно узкой группе хемолитотрофных нитрифицирующих
бактерий. Однако в настоящее время хорошо изучена так называемая
гетеротрофная нитрификация, которая в широких масштабах
вызывается рядом грибов и гетеротрофных бактерий. Гидролиз
органофосфатов и перевод труднорастворимых фосфатов в
доступную для организмов форму опять же осуществляются разными
группами микроорганизмов. Разнообразнейшие микроорганизмы
участвуют в окислении железа и марганца и в их
восстановлении. Широкий ряд организмов принимает участие в разрушении
силикатов и алюмосиликатов и в синтезе новых минералов.
Представления об узости функции определенных микроорганизмов
были явно преувеличены. Для удобства изучения микроорганизмы
были разбиты на физиологические группы, например азотфикса-
торы, денитрификаторы, нитрификаторы, аммонификаторы, цел-
люлозолитические, сахаролитические, пектинолитические, протео-
литические и т. д. Исследователь, изучив какой-либо процесс,
осуществляемый микроорганизмом и часто являющийся для его
жизнедеятельности только одним из многих необходимых
процессов, называл даже микроорганизм по тому процессу, который был
обнаружен.
Все это имеет свои закономерные исторические причины, но
в дальнейшем вольно или невольно происходила абсолютизация
представлений и складывалось мнение, что Azotobacter spp. —
основной азотфиксатор в почвах, Ps. denitrificans — основной
денитрификатор и Metallogenium sp. — основной рудообразова-
тель. Однако по мере изучения новых микроорганизмов стало
156
ясно, что каждая из перечисленных функций широко
распространена среди почвенных микроорганизмов. Хуже обстоит дело с
множественностью физиологических функций каждого
микроорганизма. В последнее время выяснилось, что нет отдельных
физиологических групп бактерий азотфиксаторов и денитрификато-
ров. Один и тот же микроорганизм проводит тот или иной процесс
в зависимости от конкретных условий окружающей среды. Прнг
наличии органического вещества и недостатке связанного азота
в среде происходит азотфиксация. Если же имеется органическое
вещество при избытке связанного азота и недостатке кислорода —
идет денитрификация. Отметим, что чрезвычайно важно было бы
установить, насколько отличаются
окислительно-восстановительные условия (концентрация кислорода) для протекания этих двух
процессов. Если тот же микроорганизм азотфиксатор-денитрифи-
катор в процессе своего роста использует белки или
аминокислоты, то он становится аммонификатором. Обычно он может
проводить и гетеротрофную нитрификацию. Таким образом,
генетические возможности микробов оказываются весьма обширными^
и скорее нужно говорить о физиологических процессах,
проводимых микроорганизмами, а не о физиологических группах
микробов. Многие микробиологи-экологи считают, что имеются
специфические группы микроорганизмов, использующие определенные
органические вещества. Особенно это касается грибов;
существует мнение о наличии специфических групп сахаролитических^
пектинолитических, целлюлозолитических грибов.
Однако такое деление во многом условно. В отношении саха-
ролитических грибов, нужно заметить, что вообще нет
микроорганизмов, которые не обладали бы гидролазами. Поэтому наряду
с использованием Сахаров и других мономерных органических
соединений сахаролитические грибы могут использовать и
некоторые полимеры, особенно крахмал, белки и т. д. Кроме того„
гидролазы всегда содержатся в почве, и микроорганизмы могут
использовать для своей жизнедеятельности «чужие» гидролазы.
Даже микроорганизм, который обладает специфическими
гидролазами типа целлюлаз, вполне может использовать ряд
мономеров.
Из сказанного, конечно, нельзя делать вывод об отсутствии
физиологических различий между микроорганизмами, однако на
данном этапе развития экологии микроорганизмов особенно
нужно подчеркнуть полифункциональность каждого вида
микроорганизма. Принцип дублирования в проведении определенных физио-
^лого-биохимических процессов широко распространен. Чем
больше дублеров, тем быстрее идет процесс (разложение Сахаров,,
спиртов, органических кислот), чем меньше дублеров, тем
медленнее идет процесс (разложение фенола, анилина, нафталина,,
ряда пестицидов и т. д.).
Принцип дублирования весьма широко действует в почвах и„
очевидно, дает возможность более точно и тонко поддерживать
гомеостаз даже в изменяющихся физико-химических условиях.
157
Принцип дублирования касается того или иного важного
процесса (азотфиксации, нитрификации, разложения целлюлозы, фос-
форорганических соединений), а также синтеза ряда веществ
(различных групп гидролитических ферментов, меланинов и ме-
ланоидов, принимающих важное участие в гумусообразовании,
витаминов и т. д.). Аналогичные процессы происходят в
аэробных и анаэробных условиях, при низких и высоких температурах
разными систематическими группами микроорганизмов.
Принцип дублирования может быть в некоторой степени
распространен и среди низших таксономических групп
микроорганизмов. Например, можно утверждать, что в каждой почве
встречаются и одновременно функционируют виды микроорганизмов-
Дублеров. Таким образом, для почвы, взятой в целом, как бы не
соблюдается правило Гаузе о том, что два вида не могут занимать
одну и ту же нишу в экосистеме. Однако правило Гаузе в
совокупной массе почвы и не должно действовать, так как почва
представляет собой множество экологических ниш, разделенных
в пространстве и во времени. В разных частях почвы как
чрезвычайно структурированного биотопа микробные ассоциации
функционируют относительно изолированно.
Принцип дублирования тесно связан с принципом пула
микроорганизмов.
Принцип обратимости микробиологических процессов. Любой
процесс превращения вещества микроорганизмы ведут в двух
взаимно противоположных направлениях. Обычно
микроорганизмы разлагают органические вещества с выделением С02. Однако
в процессе автотрофной и гетеротрофной фиксаций они связывают
С02 в органические вещества. Микроорганизмы разрушают
белки, целлюлозу, хитин, но они и образуют все эти соединения.
Микробы совершают противоположные процессы — азотфикса-
цию и денитрификацию. Они осуществляют восстановление и
окисление соединений азота, а также окисление и восстановление
всех элементов с переменной валентностью (железа, серы,
марганца, сурьмы, свинца). Иногда противоположные процессы
совершает один и тот же микроорганизм, иногда — разные.
Следует особо подчеркнуть, что в этом удивительном свойстве
Микроорганизмов заложена основа их тонкой способности к под-
Держанию гомеостаза в экосистемах, и в частности в почве.
.Равновесие устанавливается не по принципу простого химического
равновесия, а более сложным образом.
Принцип множественного лимитирования. В почве, взятой в
совокупной массе, благодаря ее микрозональному строению
наблюдается множественное лимитирование, т. е. лимитирование
по нескольким или множеству факторов. В почве почти всегда
имеются микрозоны с недостатком органического вещества, азота,
фосфора, калия, кальция, микроэлементов и т. д. Поэтому иногда
наблюдается такое явление, при котором внесение в почву
любого из этих органических веществ и насыщение им всех микрозон
приводят к развитию в ней дополнительного количества микро-
158
организмов. Вероятно, возможно наличие двойного или даже
множественного лимитирования и в некотором числе отдельных мик-
розон. Последний вопрос в настоящее время исследуется в
экспериментах по проточному культивированию микроорганизмов,,
но для почвы он пока не ясен.
Концепция ненасыщенности комплекса почвенных
микроорганизмов. Правило Бейеринка в отношении микроорганизмов
гласит: «все есть везде» и «среда отбирает». Очевидно, это правило
нельзя понимать в буквальном смысле. Работы ряда авторов, и
особенно советских ученых во главе с Е. Н. Мишустиным (1975),
показали, что для разных почв характерны разные ассоциации
(комплексы доминирующих почвенных микроорганизмов).
Многочисленные исследования показали, что в ряде почв определенные
микроорганизмы не обнаруживаются. Это относится к
азотобактеру, клубеньковым бактериям, ряду актиномицетов и грибов.
Нужно отметить, что существующие микробиологические методы
дают возможность обнаруживать тот или иной микроорганизм
в почве только при довольно высоком уровне его содержания.
Иногда это миллионы, а в лучшем случае тысячи или даже сотни
тысяч клеток на 1 г почвы. Кроме того, во многих случаях клетки
могут не обнаруживаться даже при их большом содержании, что-
обусловлено рядом причин: отсутствием достаточно элективной
среды, незнанием оптимальных условий для выделения,
нахождением клеток в состоянии стресса, адсорбцией клеток
почвенными частицами, существованием данного вида в почве в
измененной форме, наличием у клеток глубокого покоя и катаболит-
ной репрессией, из которых их не удается вывести, помехами при
выделении со стороны сопутствующих микроорганизмов,
мешающим действием твердых почвенных частиц при посеве из малых
разведений и т. д. Таким образом, пока нельзя достаточно
достоверно утверждать, что определенный микроорганизм в данной
почве абсолютно отсутствует. Тем более что для почвы
характерна чрезвычайная мезо- и микрозональность, и микроорганизма
может не быть в одних навесках, отобранных для анализа, но он
может присутствовать в значительных количествах в других
навесках. К сказанному следует прибавить трудности, возникающие
из-за резких сезонных, а также сукцессионных колебаний
(Звягинцев и др., 1984) численности определенных видов.
Неопределенность самого понятия вида микроорганизма также затрудняет
получение точного ответа на вопрос о наличии или отсутствии
микроорганизма в данной почве. Таким образом, проверка
правила Бейеринка в абсолютном его понимании представляется в
настоящее время весьма затруднительной или даже невозможной.
Однако положение о том, что многие виды микроорганизмов если
•и присутствуют, то в очень малом числе, и не встречаются в
количествах, превышающих сотни клеток на 1 г, не вызывает
сомнения. Если определенные микроорганизмы и отсутствуют в
почве, то они должны время от времени привноситься в нее
благодаря широко распространенной воздушной дисперсии почвенных
159
микроорганизмов. Достаточно вспомнить пыльные бури, во время
которых переносятся тысячи тонн почвы, чтобы представить
масштабы перемещения почвенных микроорганизмов. Причем,
насколько установлено, подавляющее большинство их при
перенесении по воздуху с почвенными частицами, а часто и внутри
почвенных агрегатов сохраняет свою жизнеспособность. Таким
образом, каждая почва на Земле на протяжении определенного
отрезка времени, длительность которого, к сожалению, неизвестна
(годы, десятки, сотни, тысячи лет), получает все или почти все
микроорганизмы.
Конкретные условия среды определяют, будут ли эти
принесенные микроорганизмы входить в пул доминирующих или в пул
лереживающих микроорганизмов или вообще будут вымирать.
Очень долго господствовало мнение, что «посторонний
микроорганизм», попадающий в почву, как правило, быстро погибает.
Однако исследования, проведенные в последнее время (Звягин-
дев, Кожевин, 1974; Звягинцев и др., 1978, 1975; Schmidt, 1978;
Linch, 1983; Zvyagintsev, 1984; Zvyagintsev et al., 1981), показали,
что внесенный микроорганизм, которого не было в почве (или
он присутствовал в неопределяемо малом количестве), после
внесения обычно стабилизируется на определенном уровне и долго
сохраняется в почве. При внесении в почву различных видов
микроорганизмов случаи гибели определенного вида отмечаются
довольно редко, причем в первую очередь проявляется
неблагоприятное действие кислотности. В то же время внесенный
микроорганизм никогда не занимает господствующего положения среди
других микроорганизмов.
Это свойство и описывается как «ненасыщенность комплекса
почвенных микроорганизмов». В этот комплекс на довольно
высокой популяционной плотности могут входить новые члены, причем
эти популяции находятся не в состоянии покоя, а в динамическом
равновесии, т. е. постоянно некоторое количество клеток
отмирает и такое же количество появляется вновь. Количественно
определить размеры смертности и рождаемости клеток в популяции
.весьма сложно, но решение этой проблемы позволило бы сделать
популяционные подходы еще более ценными.
Пока о размножении клеток можно только судить
микроскопически или по образованию колоний, относительными методами
определить количество живых и мертвых клеток, косвенными
методами определить время генерации, но ясности в этих вопросах
пока нет.
Вполне возможно, что в ряде случаев мы имеем дело с
покоящимися и переживающими клетками, а не с активно
размножающимися. Это может быть постепенно вымирающая популяция,
причем процесс вымирания растягивается на месяцы и годы..
Известно, что клубеньковые бактерии погибают через 3—5 лет
или, по крайней мере, за это время их численность резко падает.
Способность популяции длительно сохраняться можно
использовать для практических целей. Микроорганизмы могут сохранить-
160
ся, а затем проявить свою активность в специфической
экологической нише, например внутри растения (клубеньковые бактерии,
микоризные грибы, фитопатогены и т. д.). Способность длительно
сохраняться ставит под сомнение целесообразность внесения в
почву каких-либо «полезных» микроорганизмов, которые, как
предполагается, должны проявлять активную деятельность в
почве (свободноживущие азотфиксаторы, микроорганизмы,
разрушающие нефтяные загрязнения). Если бы определенный
микроорганизм мог достигнуть в почве доминирующего положения, он его
достиг бы и без внесения. Особый случай представляет внесение
микроорганизмов одновременно или после изменения общей
экологической обстановки. После изменения параметров экосистемы
внесение микроорганизма может ускорить его появление, однако,
как правило, комплекс почвенных микроорганизмов очень
многообразен, и в нем самом находятся микроорганизмы, которые с
наибольшим эффектом занимают новые экологические ниши. В то
же время внесение одного какого-либо «полезного»
микроорганизма ничего не может дать, так как его ниша заведомо будет
очень ограничена, и он войдет как малая доля в число сотен
видов. Если даже предположить, что он и займет господствующее
положение, что, видимо, происходит очень редко, если вообще
происходит, то это означает гибель экосистемы, т. е. явление,
которое в гидробиологии называют «цветением». При господстве
-одного микроорганизма комплекс почвенных микроорганизмов,
конечно, не может выполнять все многообразие функций, которые
•он берет на себя в естественных биогеоценозах.
В природных сильно загрязненных водах приходится
встречаться с развитием узкой группы видов — «цветением».
Естественно поставить вопрос: возможно ли подобное явление в почве?
Сразу отметим, что в почве микроорганизмы гораздо более
разнообразны, чем в воде. Кроме того, почва представляет собой
множество сред обитания с совершенно разными условиями и с
различными активно действующими микроорганизмами.
Следовательно, для того чтобы вызвать «цветение» почвы, нужно
разрушить ее естественное микробиологическое строение, т. е.
микрозональность. В то же время «цветение» отдельных микрозон, т. е.
развитие в них монокультур или сравнительно немногочисленных
видов, — явление вполне закономерное, например волокно
целлюлозы, разлагаемое миксобактериями, или лигнин, разлагаемый
грибами, и т. д. Обычно среда обитания имеет определенную
емкость, выше которой данная популяция в этой среде не
поднимается. Если вспомнить, что почва является не одной средой
обитания, а множеством микросред, то становится понятным, что в
естественных условиях почва никогда не насыщается до полной
«емкости среды». Если данный микроорганизм достиг пышного
развития в одних микросредах, то в других — его развития нет
или оно очень ограниченное. Емкость среды всегда заполняется,
только для определенных микрозон. Отсюда следует важный
вывод: в почве всегда есть незаполненные микроорганизмами мик-
*g Д. Г. Звягинцев
161
розоны. Из-за этого в почве и сохраняется органическое
вещество.
Концепция пфчвы как множества сред обитания
микроорганизмов. С микробиологических позиций почва представляет собой
крайне гетерогенную среду и не может рассматриваться как
единая однородная среда обитания. Благодаря своей
структурированности и микрозональности она должна рассматриваться как
набор совершенно различных микро- и мезосред, в каждой из
которых создаются совершенно различные и часто прямо
противоположные условия для развития отдельных групп
микроорганизмов. Множество таких микросред может находиться в
каждом грамме почвы. Микро- и мезозоны разделены в пространстве
и во времени. Микроорганизмы — это как раз такие организмы,
которые адаптированы к развитию в микрозонах.
Микроскопические размеры дают им возможность осваивать микросреду.
Способность быстро размножаться и быстро переходить к покою или
крайне замедленному метаболизму дает им возможность за
короткий срок освоить микрозону и выжить при исчерпании запасов
питания. Микрозоны могут быть очень небольшими и занимать
всего несколько десятков или несколько сотен кубических
микрометров. Часто при этом в микрозоне развивается одна
микроколония, состоящая из нескольких десятков клеток одного вида
(Звягинцев, 1973). Иногда такие зоны имеют значительные
размеры, например кусок разлагающихся растительных остатков.
Они могут иметь большую протяженность при небольшой
толщине, например поверхность однородного участка корня (ризо-
плана).
Микрозональность основывается на локальном поступлении
органических остатков и корневых выделений, а также на
микрозональности распределения физико-химических условий
(окислительно-восстановительного потенциала, рН, концентрации
элементов питания и т. д.), минералогических факторов.
Несмотря на огромное количество микроорганизмов,
содержащихся в почве (миллиарды на 1 г), оказывается, что клетки, как
правило, собраны в микроколонии, разделенные пустыми
пространствами, которые по площади в сотни и тысячи раз
превосходят пространства, занятые микроорганизмами. Таким образом,
микроколонии, состоящие из клеток одного или нескольких
видов, могут развиваться сравнительно изолированно. Отсюда
следует важный вывод о том, что в почве часто развиваются чистые
микрокультуры микроорганизмов. Это положение было
подтверждено экспериментально при изучении разных почв с помощью
люминесцентной микроскопии (Звягинцев, 1973). Пространства,
разделяющие микроколонии, настолько велики по сравнению с
размерами самих колоний, что трудно ожидать их тесного
взаимовлияния. Следовательно, изучение чистых культур имеет более
прямое отношение к почвенной микробиологии, чем считалось
ранее. Основной вопрос, который в настоящее время нуждается
в разрешении, следующий: насколько развитие в микрокультуре
162
(микроколонии) соответствует развитию в макрокультуре
(макроколонии)? Если такое соответствие можно признать
достаточно полным, то данные, полученные в лабораторных условиях на
чистых культурах, можно переносить и на почвенные условия.
Если развитие в тонких пленках воды, в капиллярах, а также
просто в микрокультурах отличается (например, есть сведения,
что микрокультуры клостридиума не образуют ботулина), то
необходимо разрабатывать методы для изучения микрокультур.
Конечно, метод чистых культур дает возможность изучать только
генетические возможности культуры, а конкретное фенотипиче-
ское проявление будет зависеть от экологических условий.
В связи с концепцией микрозональности становятся понятными
многие аспекты строения и функционирования комплекса
почвенных микроорганизмов. Один из важных вопросов состоит в связи
микрозональности с широким географическим распространением
каждого вида микроорганизма. Дисперсия микроорганизмов,
особенно воздушная, обеспечивает попадание всех почвенных
микроорганизмов во все почвы. Причем достаточно вспомнить
пыльные бури или масштабы переноса радиоактивных осадков, чтобы
представить возможные масштабы переноса почвенных
микроорганизмов. Если учесть, что среда обитания микроорганизмов
является микросредой, которая может быть прерывистой во времени,
то понятно, что все или почти все почвенные микроорганизмы
могут выживать в некоторых микрозонах любых почв («все есть
всюду» — правило Бейеринка). Однако в глобальных процессах
круговорота веществ существенное экологическое значение будут
иметь не все почвенные микроорганизмы, а только те, которые
многочисленны и проявляют активную жизнедеятельность (пул
высокого уровня). При проведении экологических исследований
в большинстве случаев нет необходимости устанавливать все
существующее в почве разнообразие микроорганизмов, а достаточно
ограничиться установлением доминирующих в важных
экологических процессах форм. Таким образом, критерии доминирования
приобретают первостепенное значение для почвенной
микробиологии, причем имеется в виду не только и не столько численное
доминирование, а доминирование в проведении процессов. В
одних случаях это могут быть такие глобальные процессы, как
разложение целлюлозы или азотфиксация, а в других случаях —
синтез определенного витамина или определенной аминокислоты.
К сожалению, в настоящее время в большинстве случаев
почвоведы-микробиологи могут учитывать только численность
определенных форм микроорганизмов в почве, да и то с большим
трудом и с большими погрешностями. Интенсивность процессов,
вызываемых определенным видом, почти не поддается
определению. Комбинация методов иммунолюминесценции и
авторадиографии позволяет не только видеть клетки определенного штамма
микроорганизма в нестерильной почве, но и оценить активность
каждой обнаруженной при микроскопии клетки (Fliermans,
Schmidt, 1975). Но такие случаи редки, а методики сложны и
-6*
163
трудоемки. В связи с этим часто приходится довольствоваться*
условными критериями численности. Для бактерий может быть
принят условный критерий (Brock, 1966), который гласит, что-
существенное экологическое значение бактерии имеют в том
случае, если число их клеток не менее 1 млн. на 1 мл или 1 г
субстрата, хотя бы в какой-то сезон.
Поиски более редких бактерий могут иметь значение для
индикации и диагностики почв или могут быть полезными в целях
поиска бактерий-продуцентов физиологически активных веществ.
Они имеют значение и для оценки прошлых и будущих сукцессии,,
но мало дают для оценки процессов, происходящих на данном
этапе развития экосистемы. Для грибов, дрожжей, водорослей
и т. д. необходимо разрабатывать свои критерии экологической
значимости, учитывая количество микроорганизмов, их размеры
и интенсивность метаболизма. Поскольку эти организмы по массе*
в 100 раз более крупные, чем бактерии, то для них может быть
принят критерий 10 тыс. на 1 г.
Микрозональность тесно связана с основными механизмами
действия физиологически активных веществ в почве
(антибиотики, токсины, витамины, аминокислоты, стимуляторы и ингибиторы
роста растений). Их экологическое значение для развития
микроорганизмов в микрозонах не вызывает сомнения. В то же
время их глобальная регулирующая роль в масштабах всей почвы,
хотя и провозглашалась рядом авторов, нуждается в дальнейшем:
экспериментальном подтверждении или опровержении. Первое-
место в качестве таких регуляторов, очевидно, могут занимать
газообразные вещества, так как они наиболее быстро
диффундируют и могут передавать информацию, являясь «средовыми
гормонами». Действие физиологически активных веществ, в том
числе газов или летучих органических веществ, в качестве средовых
гормонов легко обнаружить в искусственных условиях, когда в
почву вносятся большие количества органического вещества и она
перестает функционировать как система микросред и действует
как единая система, т. е. переходит в другой тип микробных
экосистем. Такое состояние возможно для больших частей
естественной почвы на небольших отрезках времени, но оно не
характерно для всей массы почвы. В почве имеются определенны^
зоны, функционирующие по другим законам. Прежде всего этод
зона ризопланы и в какой-то мере ризосферы, а также подстилка:;
в лесу, степной войлок, разлагающийся торф и т. д. В этих
случаях можно ожидать и искать большую организованность
процессов, чем в других частях почвы.
Принципы строения и функционирования комплекса
почвенных микроорганизмов, изложенные выше, должны помочь
выработке наиболее правильных подходов при изучении почвенных
микроорганизмов. Они должны использоваться для выработки
критериев целостности и повреждения комплекса почвенных
микроорганизмов, что особенно необходимо в настоящее время в
связи с загрязнением природных экосистем пестицидами, тяжелыми:
164
металлами, избыточным количеством удобрений и т. д. Они также
важны при решении вопросов об искусственном внесении в почву
тех или иных микроорганизмов или регулировании комплекса
почвенных микроорганизмов иными путями.
Люди на земле провели ряд существенных изменений в
природных экосистемах. Одним из таких изменений была распашка
огромных территорий и замена естественных биогеоценозов
искусственными с большой чистой продуктивностью. При этом
потребовалась интенсификация в проведении почвенно-микробиоло-
гических процессов. Основываясь на принципе микробного пула,
можно констатировать, что комплекс почвенных микроорганизмов
по самой своей природе должен легко обеспечить эту задачу.
Другим существенным изменением, особенно в последние
десятилетия, являются химизация сельского хозяйства и
увеличение количества промышленных химических загрязнений почв.
Исходя из описанных принципов, можно сказать, что и к этому
воздействию комплекс почвенных микроорганизмов в
определенной степени подготовлен (достаточно вспомнить имеющийся
огромный микробный генофонд), но введение неприродных
соединений, а также введение веществ в количествах, превышающих
запас прочности почвенной биоты, могут привести к катастрофа
ческим последствиям. Причем в первую очередь это проявляется
на увеличении различных выбросов из почвы, которые могут
оказаться вредными или губительными для ландшафта или даже
биосферы. Наступает разрушение комплекса почвенных
микроорганизмов как системы.
Важным новым открытием, которое должно использоваться в
экологии почвенных микроорганизмов, является кометаболизм у
микроорганизмов. Установлено, что микроорганизмы могут
разрушать ряд труднодоступных веществ, в том числе и
неприродных органических веществ (полимеры, пестициды), когда в среде
имеются легкодоступные органические вещества. Поэтому для
предотвращения накопления в почве пестицидов и других
вредных веществ в почву необходимо вносить органические
удобрения, т. е. открыт новый аспект полезного действия внесения в
почву органических веществ.
Принципы строения и функционирования комплекса
почвенных микроорганизмов должны широко использоваться при
разработке критериев целостности и повреждения этого комплекса в
связи с применением удобрений, пестицидов, загрязнением почвы,
а также при решении вопросов о целесообразности внесения в
почву тех или иных «полезных» микроорганизмов или
регулирования комплекса почвенных микроорганизмов путем изменения
среды обитания.
МИКРОБНАЯ СУКЦЕССИЯ В ПОЧВЕ
Для понимания функционирования комплекса почвенных
микроорганизмов необходимо все исследования проводить в
динамике. Это относится и к определению количества микроорганизмов,
и к определению качественного состава, выделению микробов-
продуцентов физиологически активных веществ и к
ферментативной активности почв. Многие показатели биологической
активности почв настолько динамичны, что их одноразовое определение
только вводит в заблуждение. Показатель полевой биологической
активности почв иногда оказывается настолько изменчивым, что
его не стоит определять, хотя в принципе ясно, что он дает очень
тонкую и точную характеристику места и момента исследования.
Были сделаны попытки увеличить повторность определений,
делать определения в различных точках сравнительно большой
исследуемой площади и т. д. Все это повышает точность
определений, но без учета фактора временной динамики сделать какие-
либо серьезные выводы нельзя. Это стало ясно исследователям
уже довольно давно. В последнее время появилось новое
представление (Звягинцев и др., 1984а, б) о том, что временные
изменения не случайны и обусловлены не только внешними
воздействиями, но во многом определяются внутренними событиями,
происходящими в почве. В системе почва—микроорганизмы
происходят закономерные и планомерные изменения количества и
качества микроорганизмов, направленности и напряженности
микробиологических процессов. Эти события описываются как
микробная сукцессия. При этом под сукцессией понимают
последовательные закономерные изменения в комплексе почвенных
микроорганизмов и в происходящих микробиологических процессах
независимо от того, приведут ли эти изменения (эта сукцессия)
к установлению новой микробной системы или система вернется
в первоначальное состояние. Существование закономерной
микробной сукцессии облегчает изучение временных изменений.
Для изучения микробной сукцессии в почве необходимо было
разработать соответствующие приемы и методы, что и было
выполнено сотрудниками и аспирантами кафедры биологии почв
МГУ (Звягинцев и др., 1984).
Четкое изучение микробной сукцессии в почве в природе
достигается с большим трудом из-за появления ряда непрогнозируе-
166
мых случайных факторов, которые затрудняют получение общей
картины. Изучение сукцессии лучше производить в модельных,
более стабильных, условиях, что достигается при работе с
почвенными образцами, помещенными в лаборатории в
контролируемые условия температуры, влажности и снабжения питательными
веществами. Необходимо создать условия, которые дают начало
протеканию сукцессии, и затем следить за ней при относительно
неизменных внешних условиях. Начало сукцессии может быть
наиболее просто задано увлажнением сухого почвенного образца
или внесением в почву органических веществ, минеральных
удобрений, пестицидов, нефтепродуктов и т. д. ^Конечно, после
изучения простой сукцессии, протекающей при относительно
стабильных внешних условиях, часто необходимо вводить в действие
дополнительные факторы: температурный стресс, внесение
определенной микробной популяции, повторное внесение органического
вещества или добавление другого органического вещества.
Установлено (Звягинцев и др., 1984а, б), что сукцессионные
изменения проходят вполне закономерно, в определенной
последовательности, так, что их можно предсказывать. Основная
ценность такого изучения состоит в том, что оно дает возможность
подойти к разрешению общих проблем регуляции
микробиологической активности почв. Однако имеют значение и определения
особенностей протекания сукцессии в почвах разных типов,
разной степени окультуренности, установление степени гомеостатич-
ности, проявляющейся в разных почвах при воздействии внешних
возмущающих факторов, определении возможных пределов
отклонения от нормы и возможности возврата к норме.
Для наблюдения за микробной сукцессией в почве
используются следующие критерии.
1. Определение в динамике общей численности и биомассы
бактерий с помощью люминесцентно-микроскопического метода
при окрашивании акридином оранжевым.
2. Определение динамики количества бактерий на мясопеп-
тонном агаризованном, разведенном в 10 раз бульоне или на
средах Чапека, Аристовской, Эшби, крахмало-аммиачном агаре.
Опыт показывает, что на всех этих средах выявляются общие
закономерности изменения численности микробов при
определенных воздействиях. Поэтому обычно достаточно использовать одну
из перечисленных сред.
3. Расчет коэффициента /С, показывающего отношение
количества бактерий, определяемых прямым микроскопическим
методом, к количеству бактерий на МПА.
4. Определение динамики численности микроорганизмов на
самых различных питательных средах для аэробных и
анаэробных, литотрофных и гетеротрофных, термофильных, мезофильных
и психрофильных бактерий.
5. Определение прямыми микроскопическими методами длины
мицелия грибов и актиномицетов, а также расчет их биомассы.
Хорошо было бы определять и число и биомассу их спор. Однако
167
для грибов это достигается с большим трудом (Мирчинк, 1976,
1984), так как сложно дифференцировать споры грибов и
почвенные частицы, а споры актиномицетов почти невозможно отличить
от бактерий.
6. Определение количества грибов и актиномицетов методом
посева.
7. Определение коэффициента Z, показывающего отношение
числа зачатков при прямом микроскопическом учете к числу
зачатков, обнаруженных методом посева. Расчет отношения
биомассы грибов к биомассе бактерий.
8. Определение садней радиальной скорости роста грибов и
актиномицетов, выделенных на разных стадиях сукцессии.
9. Метод зондирования, основанный на внесении искусственно
маркированных микробных популяций с целью выяснения их
выживания, поведения и динамики численности в ходе сукцессии и
взаимодействия с развивающимися в процессе сукцессии
почвенными микроорганизмами.
10. Метод зондирования, основанный на внесении двух
популяций и изучении их взаимодействия между собой и с комплексом
почвенных микроорганизмов.
11. Определение интенсивности определенных процессов в
ходе сукцессии (потребление органических источников питания,
интенсивность дыхания, азотфиксация, денитрификация,
образование летучих жирных кислот и т. д.).
12. Определение микробов-антагонистов на разных этапах
сукцессии.
13. Определение доминирующих видов на разных стадиях
сукцессии.
Создавая свои подходы к изучению сукцессии, мы старались
использовать методы, которые не требуют проведения видовой
идентификации микроорганизмов, так как эта работа очень
трудная, требует наличия высококвалифицированных специалистов,
для большинства почвенных бактерий вообще не выполнима.
Наиболее успешно массовая видовая идентификация проводится
на грибах, у которых виды определяются по культуральным и
морфологическим признакам и не нужно определять их
физиологические и биохимические особенности. Однако там, где это
возможно, характеристика изменения видового состава,
определение доминирующих форм на разных этапах, определение
индекса видового разнообразия крайне желательны.
Сукцессионный подход в почвенной микробиологии мало
использовался. Некоторые исследователи пытались проследить
сукцессию почвенных микроорганизмов в связи с сукцессией
растительности. Получены некоторые интересные сведения по
изменению видового состава грибов, но такой подход не
представляется нам особенно перспективным в отношении изучения
принципов функционирования комплекса почвенных микроорганизмов.
Значительно перспективнее изучение сукцессии в мире
микроорганизмов, когда в почве одни микробы во времени сменяются
168
другими. Следует учитывать, что микроорганизмы размножаются
значительно быстрее растений. Скорость их размножения по
меньшей мере в десятки раз больше. Поэтому сукцессионные события,
которые для растений занимают десятки и сотни лет, в мире
почвенных микроорганизмов происходят за несколько месяцев.
Сукцессионные исследования относятся к разряду
биодинамических и во многом объясняют биодинамику почв. Несмотря на
мккрозональность почв, сукцессионные события проходят
синхронно во всей почвенной массе, если агент, вызывающий сукцессию,
действует одновременно во всей почвенной массе (увлажнение,
оттаивание, внесение в почву растворимого органического
вещества).
Традиционный подход к изучению сукцессии предполагает
исследование характера изменения видового состава. В нашей
работе для характеристики микробного комплекса используются
интегральные критерии. Они представляют собой числовые
величины, что удобно для проведения сравнений. При анализе
микроорганизмы разделялись на группы в соответствии с их
экологическими стратегиями. Выделяли два крайних варианта
экологических стратегий: г- и К-стратегии. Первая свойственна
организмам с высокой скоростью роста, стремящимся занять как можно
больше пространства, с нечетким стремлением к определенному
уровню стабилизации, с относительно широкой нишей, с
простыми жизненными циклами, со слабо выраженной зависимостью
скорости роста от популяционной плотности, с широким
диапазоном уровней стабилизации. Они имеют больше шансов
доминировать на ранних, ненасыщенных стадиях колонизации субстрата
за счет высокой продуктивности и широты ниши. В равновесных
ситуациях последних стадий сукцессии преимущество получают
организмы с более высокой способностью к выживанию в
условиях конкуренции, использующие источники питания с высокой
эффективностью, с четким стремлением к определенному уровню
стабилизации, со сложными жизненными циклами, с ярко
выраженной зависимостью скорости роста от популяционной
плотности. Это микроорганизмы, обладающие К-стратегией.
Приведем пример изучения сукцессии микроорганизмов в
почве с использованием: 1) увлажнения без внесения субстрата;
2) увлажнения с внесением глюкозы; 3) увлажнения с внесением
целлюлозы, т. е. воздействий, наиболее типичных для реальных
местообитаний.
Классические методы посевов на обычные питательные среды
дают возможность выявить только небольшую часть почвенных
микроорганизмов. Посев дает преимущественно информацию о
микроорганизмах с r-стратегией. Это быстрорастущие
микроорганизмы, дающие большие колонии за 3—5 дней. Об этом
свидетельствует резкое увеличение численности колоний,
учитываемых на МПА, среде Эшби, крахмало-аммиачном агаре и других
сходных средах после добавления в почву глюкозы или другого
легкодоступного вещества. Отметим, что микробиологи всегда
169
подчеркивали различия в численности микроорганизмов,
вырастающих на обычных питательных средах, перечисленных выше.
Однако более правомерным было бы подчеркнуть не различия,
а сходство. Отмечается такая общая закономерность: если при
определенном воздействии на почву возрастает количество
бактерий, учитываемых на одной среде, то оно увеличивается и на
других средах. Это явление обусловлено следующими причинами.
Все эти среды и условия культивирования сходны, и на разных
средах растут одни и те же или близкие виды бактерий, причем
на этих средах могут расти только r-стратеги. Были сделаны
попытки создания универсальной питательной среды, которая
позволила бы учесть максимальное количество почвенных
микроорганизмов. В качестве такой среды предлагалась среда с
почвенным экстрактом или с почвой. Однако ясно, что посев на
любую среду дает представление о численности только части
микроорганизмов, пищевые потребности и кинетика роста
которых соответствуют условиям, заданным в эксперименте. Причем
метод посева позволяет даже среди микроорганизмов,
удовлетворяющих этим требованиям, выделить лишь доминантные
формы, так как посев производится из определенного разведения
почвенной суспензии и те формы, которых было мало, просто не
попадут в чашку с питательной средой. Если же делать посев из
малых разведений, то получают сплошной рост микроорганизмов,
и редкие формы все равно нельзя учесть. Для их учета нужны
специальные элективные среды.
Более полное представление о численности микроорганизмов
в почвах дают прямые методы, и в частности метод
люминесцентной микроскопии. Электронная микроскопия, по нашему мнению,
пока не дает возможности отличать все микроорганизмы от
коллоидных частиц почвы и не приспособлена для достаточно
точного количественного учета. Прямой микроскопический учет мало
чувствителен к колебаниям численности микробов отдельных
групп, определяемых на той или иной питательной среде, так как
представляет собой сумму множества таких групп. Обычно
численность одной группы увеличивается, другой — уменьшается, а
сумма остается довольно стабильной. Отмеченные особенности
прямого учета не снижают его ценности. Однако прямой метод
и метод посева дают совершенно различную информацию.
Различия прямого метода и метода посева вполне
естественны, и подбор методов определяется целью исследования.
Например, для определения биомассы микробов в почве пригоден
только прямой микроскопический метод, а для описания изменений,
происходящих под действием удобрений или пестицидов, —
метод посева. Однако более перспективным является совместное
использование информации, полученной с помощью обоих
методов (Кожевин, Звягинцев, 1980). Для более наглядного
представления об информации, которую дают два метода, рассмотрим
следующее уравнение:
М1 + М0 = П1 + П2 + Пз + П4 + П5...,
170
где Mj — численность бактерий, учитываемых прямым методом;
М0 — частицы, которые ошибочно учтены как клетки; lli —
бактерии, учтенные на определенной питательной среде, например
МПА; П2 — бактерии, которые могут быть учтены на других
питательных средах; Пз — медленнорастущие и неучитываемые по
этой причине бактерии; ГЦ — бактерии, которые могут
развиваться на используемой питательной среде, но не вырастают из-за
того, что находятся в состоянии стресса; П5 — мертвые клетки,
которые, однако, учитываются при прямой микроскопии.
Было обнаружено, что сукцессию хорошо характеризует
коэффициент К:
Для зрелых сообществ коэффициент К будет возрастать, а
для молодых — уменьшаться. Коэффициент К будет возрастать,
если будут расти компоненты П2 — рост разнообразия
микроорганизмов, Пз — возрастание числа медленнорастущих форм,
П4 — клетки, находящиеся в состоянии стресса, включая
голодание, П5 — число нежизнеспособных клеток. Нарастание всех
указанных свойств характерно для зрелых экосистем (Одум, 1975).
Поэтому высокое К характеризует поздние стадии микробной
сукцессии, где преобладают микроорганизмы с К-стратегией.
Низкое значение К указывает на увеличение доли быстрорастущих
бактерий (r-стратегов), что характерно для начальных этапов
сукцессии. Результаты по изменению коэффициента К (рис. 24, в)
подтверждают положение о возможности его применения для
индикации стадий микробной сукцессии. Уже на седьмые сутки
после внесения глюкозы К резко уменьшается и показатели
численности по данным микроскопии и посева различаются не более
чем в 10—15 раз, а для почв с внесением целлюлозы и для
контрольной почвы данные двух методов различаются в 50—60 раз
при первоначальном различии в 220 раз. Показатель К
постепенно возрастает, что указывает на изменение сообщества и
прохождение стадий сукцессии, причем возрастание более выражено в
вариантах с целлюлозой и с простым увлажнением почвы.
Внесение мономера, полимера и даже простое увлажнение привели
к омоложению системы, наиболее существенному в варианте с
глюкозой.
Для анализа вопроса о более медленном возрастании
коэффициента К в варианте с глюкозой на поздних этапах опыта
исследовалось отношение количества споровых бактерий к общему
числу бактерий, вырастающих при посеве на МПА. Выяснилось,
что здесь высок процент спорообразующих бактерий, а их
доминирование наиболее проявляется после месячного
культивирования почвы с глюкозой. Очевидно, бактериальные эндоспоры
нельзя причислять к микроорганизмам с r-стратегией и при вычислении
коэффициента К нужно ввести поправку. От общей суммы
бактерий, выделяющихся на богатой питательной среде (П1), необ-
171
ходимо вычесть сумму спор. Измененный коэффициент /Си
представлен на рис. 24, г. В варианте с целлюлозой, где количество
спор составляло около 30% и практически не изменялось в
течение опыта, /Си менялся несильно. Иная картина наблюдалась
в случае с внесением глюкозы, где после 35 сут начинается рез-
16 25
50 80
Время, сут
16 25 35
50 60
Время, сут
Рис. 24. Динамика численности почвенных бактерий в черноземе:
а — учет на МПА; б — данные люминесцентной микроскопии; в —
динамика коэффициента К; г — изменение коэффициента К с учетом спорообра-
зующих бактерий.
Внесено: / — глюкоза; 2 — целлюлоза; 3 — простое увлажнение.
Коэффициент К' вычислен с учетом спорообразующих бактерий
кое возрастание /С', которое можно объяснить, если учесть, что
первоначальное внесение глюкозы повлекло за собой сильное
увеличение количества бактерий, обнаруживаемых при посеве, в том
числе и споровых. Затем в ходе сукцессии количество неспоро-
172
образующих бактерий уменьшается, а спорообразующие
сохраняются длительное время в виде спор, и их относительное
количество возрастает к концу опыта. Поэтому информация о внесении
глюкозы отражается в коэффициенте К даже спустя 80 сут от
начала исследования.
Следовательно, коэффициент К является ценным показателем,
но которому можно судить о стадии микробной сукцессии в почве.
Он пригоден также при сравнении микробных сообществ в
различных горизонтах почвенного профиля. Коэффициент К
колеблется от подстилки до верхнего почвенного горизонта от 10—15
до 200—300 и возрастает в нижних горизонтах до 1000—1300
(Лимарь и др., 1975). Результаты изучения динамики
коэффициента К в разных горизонтах чернозема убеждают в том, что
микрофлора гор. Адерн с самого начала более «молодая» по сравнению
с гор. АВ. Это вполне понятно,
поскольку именно в верхние
горизонты поступает растительный
опад и скорость размножения
микроорганизмов здесь
значительно выше по сравнению с
нижележащими горизонтами, что
выражается в закономерном
увеличении значения К вниз по
почвенному профилю. Другими
словами, в верхних горизонтах
почвенного профиля как бы
поддерживаются ранние стадии
сукцессии, а внизу профиля существуют
1дЛ/
/
^ддг Время, сут
I Ш
|^?^
Рис. 25. Четыре типа сукцессии
почвенных бактерий (I—IV):
N — численность бактерий,
учитываемых прямым микроскопическим методом
(/) и методом посева (2);
К — отношение численности бактерий
но прямому методу к численности
бактерий по посеву
Время, сут
Ж
Время, сут
Время, сут
более «зрелые» микробные сообщества.
Теоретически возможны несколько типов сукцессии.
Рассмотрим некоторые из них, наиболее характерные для почвенных
микроорганизмов. Динамика коэффициента К в разных случаях
принципиально отличается (рис. 25).
I тип. Численность микроорганизмов, учитываемых методом
посева, растет на первых этапах сукцессии и постепенно падает
на последующих при почти неизменной численности
микроорганизмов, учитываемых прямым методом. В этом случае более
высокие значения К наблюдаются в поздние сроки, а более низкие —
в начальные. Снижение К в начальные сроки связано с падением
173
разнообразия микроорганизмов в системе, доминированием г-стра-
тегов (быстроразвивающихся форм).
Этот тип сукцессии наблюдается в почвах, инициируемых
увлажнением или внесением легкодоступного субстрата.
II тип. Численность микроорганизмов, учитываемых двумя
методами в начальные сроки, возрастает, а затем сближается.
В подобных системах «зрелые» стадии сукцессии вообще не
достигаются. По этому типу идет сукцессия в ризоплане растений.
III тип. Учитываемая методом посева группа г-стратегов
получает селективные преимущества в системе и становится
главной, разнообразие в сообществе непрерывно падает, коэффициент
К приближается к единице. Такую ситуацию можно наблюдать
в экосистеме, где основная масса бактерий подавляется
введенным извне антибиотиком, а одна из групп бактерий (г-стратегов)
является устойчивой к нему.
IV тип. Селективное преимущество приобретает группа
^-стратегов. Может происходить резкое падение численности всех
групп микроорганизмов, но учитываемая методом посева группа
г.стратегов падает быстрее, чем общая численность. При этом
обилие разнообразие микробов в системе уменьшается, а
коэффициент К растет. Эта ситуация возникает при воздействии на
экосистему экстремальных условий, когда преимущество
получают устойчивые к экстремальным условиям формы (например,,
споры).
За исключением последней ситуации (IV тип сукцессии), во всех
случаях наблюдается взаимосвязь между ростом коэффициента К
и увеличением количества К-стратегов, что позволяет применять
эт0т показатель как индикатор изменений, происходящих в
комплексе почвенных микроорганизмов.
Однако имеются системы, где отсутствуют «поздние» стадии
сукцессии, и нарастание разнообразия здесь связано не с
развитием К-стратегов, а с развитием различных групп г-стратегов;
(система ризопланы). Чтобы иметь точное представление о
направлении сукцессии, нужно знать динамику коэффициента К во
времени (по крайней мере в два последовательных промежутка
времени). Для анализа различных экосистем сопоставление
коэффициентов К должно проводиться с указанием абсолютных
значений численности микроорганизмов и этапа сукцессии, к
которым относятся сопоставляемые значения.
Наряду с характеристикой изменения в процессе сукцессии
аэробных бактерий очень важно изучить изменения,
происходящие с анаэробами. Приведем примеры с сульфатредукторами и
анаэробными целлюлозоразлагающими бактериями (рис. 26).
Внесение глюкозы не способствует активному росту сульфатредуци-
рующих бактерий. Напротив, внесение полимера (целлюлозы)
создает возможность для достижения наибольшей численности
этйх бактерий, причем это увеличение наблюдается на поздних
этапах сукцессии. Максимумы сульфатредукторов и целлюлозо-
разлагающих анаэробов совпадают и приходятся на 35-е сутки.
174
Максимуму бактерий в анаэробной зоне предшествовало
накопление в почве летучих жирных кислот, концентрация которых
достигала наибольшей величины на 16-е сутки. Особенно много их
было в варианте с целлюлозой. Летучие жирные кислоты,
являясь в существенной степени продуктом анаэробной зоны, служат
субстратом для последующих групп в сукцессионной цепи
анаэробных бактерий.
02 7
50 80
Время, сут
Рис. 26. Численность в черноземе
целлюлозоразлагающих (а), суль-
фатредуцирующих (б) и анаэробных
целлюлозоразлагающих (в)
бактерий.
Внесено: / — целлюлоза; 2 —
глюкоза; 3 —- увлажнение без внесения
органического вещества;
N — число клеток на 1 г почвы
Существенно, что развитие микроорганизмов в анаэробной
зоне подтверждает данные, отраженные в коэффициенте /С, о
росте на поздних этапах опыта неучитываемой на МПА части
комплекса почвенных микроорганизмов.
Изучение почвенных грибов и актиномицетов.
Охарактеризовать изменение грибов в процессе сукцессии очень важно, так
как они часто являются главным активным компонентом
почвенной биоты. Актиномицеты в настоящем разделе объединяются с
грибами, так как они также мицелиальные микроорганизмы, и
при изучении грибов и актиномицетов часто можно применять
сходные методические приемы.
Методы изучения грибов и актиномицетов, как и бактерий,
связаны либо с прямой микроскопией почвы, либо с посевами на
питательные среды. Для учета грибов прямым микроскопическим
методом используют метод мембранных фильтров (Burges,
Nicholas, 1961; Мирчинк, 1984). Мы предпочитаем для определения
длины грибного мицелия использовать фазово-контрастную
микроскопию, причем длина грибного мицелия учитывается в тех же
препаратах, приготовленных на предметных стеклах, где ранее
люминесцентным методом были подсчитаны бактерии (Кожевин
175
и др., 1979). Этот метод дает возможность более полно учесть
грибные гифы, так как при применении мембранных фильтров
часть гиф оказывается закрытой почвенными частицами, которые
лежат на фильтре слоем в несколько рядов.
Учет длины гиф актиномицетов проводится на препаратах,,
окрашенных акридином оранжевым, вместе с бактериями.
Посев грибов обычно осуществляется на подкисленную среду
Чапека или другие среды для грибов. Основная трудность при
интерпретации метода посева состоит в том, что нельзя
разграничить колонии, выросшие из мицелия и из спор. Очень
информативным оказалось совокупное использование данных прямого
микроскопического метода и посева на питательную среду.
Необходимо отметить большое (в 5 раз) возрастание длины
мицелия грибов в течение первой недели после внесения в почву
глюкозы. В остальных вариантах наблюдается 1,5—2-кратное
увеличение длины мицелия (рис.27).
Возрастание числа колоний по посеву (см. рис. 27) наступает
либо почти сразу (со 2-х суток), либо после некоторого
небольшого снижения показателя, численности, которое можно
объяснить тем, что в исследованном образце до его увлажнения и
внесения питательных веществ грибы находились в состоянии спор.
2 7 16 25 35
50 80
Время, суш
Рис. 27. Численность микроскопических грибов:
а — длина мицелия грибов, определенная микроскопическим методом (м/г
почвы); б — число колоний на среде Чапека (N — число клеток на 1 г почвы);
в — коэффициент Z (обозначения 1—3 см. рис. 26)
В результате прорастания спор после внесения питательных
веществ снижается устойчивость к воздействию неблагоприятных
факторов, что может приводить к уменьшению суммарной
численности спор и живых гиф, определяемых методом посева. Так или
иначе возрастание численности грибов, по данным обоих методов,
176
после внесения веществ и влаги свидетельствует об «омоложении»
грибной компоненты комплекса почвенных микроорганизмов.
Чем выше возрастает численность грибов по посеву после
внесения питательных веществ, тем медленнее происходит или
совсем не происходит ее снижения на поздних этапах сукцессии. При
резком уменьшении длины мицелия грибов по прямому методу
это может свидетельствовать о начале процесса массового
спорообразования, приуроченного к более поздним стадиям
микробной сукцессии.
Одному и тому же количеству колоний по методу посева могут
соответствовать совершенно различные «состояния» комплекса
почвенных грибов, а сам метод посева еще недостаточно
характеризует их сукцессию, если иметь в виду определение
численности. Точно так же, определяя динамику длины мицелия по
прямому микроскопическому методу, начиная с 25-х суток
невозможно зарегистрировать различий между тремя исследованными
вариантами. Более продуктивным здесь, как и в случае с
бактериями, оказывается нахождение отношения численностей, опре-?
деленных прямым методом и методом посева (коэффициент Z).
При прямом микроскопировании почвенной суспензии учиты-'
ваются число обрывков мицелия и их длина, причем этот метод
не дает возможности дифференцировать живые и мертвые гифы.
Методом посева на среде Чапека учитывается число грибных заг
чатков, т. е. сумма живых обрывков мицелия и спор, которые
могут развиваться на данной среде. Можно записать следующее
уравнение:
У _ а + Ь _ а Ь
а-\-с а-\-с а-\- с '
где а — число обрывков живых гиф сахаролитических грибов;
Ь — число нежизнеспособных гиф и грибов с иными пищевыми
потребностями и низкими скоростями роста; с — число спор.
Член уравнения < 1. Поскольку значения коэффициен-
а-\- с
та Z, полученные в ходе опыта, намного превышали единицу,
данным членом уравнения можно пренебречь, и оно приобретает
более простой вид:
7 мертвые гифы + несахаролитические грибы + медленнорастущие грибы
споры + живые гифы сахаролитических грибов
Поскольку данный коэффициент отражает отношение разных
составляющих комплекса почвенных грибов, естественно
предположить, что он может использоваться для характеристики стадий
грибной сукцессии в почве (рис. 27, в). Возрастание Z в первые
сутки характеризует «омоложение» комплекса почвенных грибов
и связано с резким уменьшением числа спор. Причем менее
резкое возрастание Z в начальный период в варианте с глюкозой
связано с тем, что основное число проросших спор принадлежит
сахаролитическим грибам и довольно мало представителей с ины-
177
ми пищевыми потребностями и мертвого мицелия. Это является
следствием наиболее активного «омоложения» комплекса
микроорганизмов в варианте с глюкозой. Второй период развития
комплекса грибов наблюдается по коэффициенту Z с 16-х суток,
когда регистрируется его уменьшение, связанное с процессом
спорообразования. Более существенное падение Z в варианте с
глюкозой является результатом более массового
спорообразования после обильного развития мицелия.
Рассуждения о причинах изменения показателя Z являются
ориентировочными. Однако важно, что подобное сопоставление
данных двух методов способствует получению дополнительной
информации и позволяет выделить стадии в ходе грибной
сукцессии в почве.
Рассмотрим динамику целлюлозоразлагающих грибов в ходе
сукцессии (рис. 28). Число целлюлозоразлагающих грибов
начинает возрастать с первых же суток и достигает максимума к
16—35-м суткам. Затем
численность грибов падает,
причем здесь, как и при
изучении динамики сахаролитиче-
ских грибов, более
медленное падение соответствует
, Рис. 28. Численность целлюлозо-
80 разлагающих грибов (обозначения
Время, сут 1—3 см. рис. 26)
варианту с более высокой максимальной численностью (вариант
с внесением целлюлозы).
Сопоставление результатов двух методов (прямого микроско-
пирования и посева) при изучении грибов оказывается даже
более продуктивным, чем при исследовании бактерий.
Конечно, возможны и другие подходы при изучении грибов.
С помощью метода посева с успехом изучают видовой состав
почвенных грибов. По мере прохождения сукцессии в почвах на
растительных остатках и на корнях растений выделяются различные
группы грибов. Микологи сделали много подобных описаний
(Garret, 1963; Hering, 1965; Hudson, 1968). Кроме простой
констатации факта наличия тех или иных видов на различных стадиях
сукцессии в почве проводится также оценка структуры
комплекса почвенных грибов по целому ряду параметров: по частоте
встречаемости, обилию видов, устанавливаются доминантные и
случайные формы для каждой стадии сукцессии, индекс видового
разнообразия, сходство и т. д. (Озерская, 1980; Мирчинк, 1984;
Bisset, Parkinson, 1979; Nannipieri et al., 1978). Однако все эти
подходы весьма трудоемки и требуют наличия хорошего
систематика грибов, к тому же видовая структура не вскрывает
закономерностей функционирования комплекса почвенных грибов»
Анализ специфики видового состава — это лишь один из возмож-
178
ных подходов в исследовании сукцессии. Смена видов является
следствием изменения природы процессов, происходящих в почве.
Для понимания стратегии грибов в почве большую ценность
имеют параметры кинетики их роста.
Существует мнение, что грибы с высокой скоростью роста
являются типичными первичными колонизаторами новых
субстратов (Domsch, 1960). Однако детально, с привлечением
конкретных показателей роста этот вопрос почти не обсуждался.
Методика определения обычных параметров кинетики роста бактерий
достаточно разработана (|х, /Cs). Гораздо сложнее обстоит дело
с мицелиальными микроорганизмами, рост которых происходит в
жидкой среде в виде комочков мицелия, что позволяет
определять \i и Ks лишь трудоемкими и не очень точными косвенными
методами (Marshall, Alexander, 1960). Было предложено
определять параметры кинетики роста грибов и актиномицетов на
твердой среде. Этот способ привлекает исследователей еще и тем,,
что рост на твердых средах (формирование колоний) в адгези-
рованном состоянии типичен для микроорганизмов,
развивающихся в почве (Звягинцев, 1973; Звягинцев и др., 1976), а в
настоящее время предполагается изменение параметров роста
микроорганизмов при переходе из свободного в адгезированное
состояние (Trinci, 1970; Hattori, 1972, 1976; Т. Hattori, R. Hattori, 1973).
Грибная колония после очень непродолжительного промежутка
экспоненциального роста переходит к линейному росту (Plomley,
1959; Trinci, 1974), который осуществляется за счет активной
зоны, расположенной аналогично индивидуальной гифе на
периферии колонии (Егунов, 1915; Pirt, 1967; Trinci, Saunders, 1977).
Перт (Pirt, 1967) предложил модель для количественной
характеристики роста колоний мицелиальных микроорганизмов,
выделив в их строении две зоны: центральную и периферическую (до).
Рост колонии идет за счет периферической зоны (до) так, что
колония увеличивается в длину с постоянной скоростью (/Сг)-
/Сг=[хдо,
где |х — удельная скорость роста, до — ширина зоны активного
роста колонии, Кт — радиальная скорость роста колонии,
которая определяется изменением радиуса колонии за единицу
времени.
С целью установления ценности для экологических
исследований показателя Кг изучали рост грибов с различными
экологическими свойствами: Mortierella ramanniana и Mucor
circinelloides. M. circinelloides встречается на первых стадиях разложения
подстилки и преобладает в почвах с высоким содержанием
оргастического вещества. MorL ramanniana выделяется в конце
разложения подстилки и из верхних почвенных горизонтов.
Максимальная радиальная скорость роста (табл. 22) у М.
circinelloides была на порядок выше (0,530 мм/ч), чем у Mort.
ramanniana (0,054 мм/г). Наблюдается определенная зависимость
скорости роста грибов от концентрации субстрата. Так,
максимальная радиальная скорость роста у М. circinelloides наблюда-
179
лась при 10%, а для Mort. ramanniana — при 0,005% глюкозы
в среде, т. е. при резко различных концентрациях субстрата.
Таким образом, показатели скорости роста, определенные для
М. circinelloides и Mort. ramanniana, соответствуют свойствам,
проявляемым этими грибами в природе.
Таблица 22
Зависимость радиальной скорости роста грибов от концентрации глюкозы
Концентрация
глюкозы,
%
0,00
0,001
0,002
0,005
0,010
0,050
Mucor
circinelloides
0,24 ±0,04
0,31 ±0,02
0,33 ±0,02
0,33 ±0,02
0,31 ±0,02
0,32 ±0,02
Mortierella
ramanniana
0,026 ±0,006 i
0,030 ±0,009
0,037 ±0,010
0,054 ±0,0 И
0,048 ±0,014
0,030 ±0,014
Концентрация
глюкозы,
%
0,100
1,000
2,500
5,000
10,000
Mucor
circinelloides
0,29 ±0,02
0,30 ±0,03
0,30 ±0,02
0,36 ±0,02
0,53 ±0,06
Mortierella
ramanniana
0,026 ±0,010
0,023 ±0,008
0,016± 0,005
0,018 ±0,007
Интегральный показатель радиальной скорости роста
комплекса почвенных грибов, выделяющихся на разных этапах
сукцессии, также может служить индикатором стадии сукцессии.
Результаты изучения динамики показателя Кт для сахаролитических
(среда Чапека) и целлюлозолитических грибов (среда Штаппа
и Бортельса с целлюлозой) представлены на рис. 29. Внесение
в почву глюкозы вызывает 4—5-кратное увеличение Кг
сахаролитических грибов, а внесение целлюлозы несколько сокращает
скорость роста данной группы, но увеличивает (в 2—3 раза)
скорость роста целлюлозолитических грибов. Однако Кг целлюлозо-
литиков все-таки значительно ниже, чем у группы
сахаролитических грибов. В ходе сукцессии происходят истощение
питательных субстратов и активизация развития иных группировок, что
ведет к относительному снижению роли двух упомянутых групп
грибов и понижает среднюю радиальную скорость роста.
Следовательно, Кг является параметром, весьма чувствительным к
варьированию условий среды, и характеризует изменение комплекса
почвенных грибов во времени, являясь еще одним важным
показателем стадий микробной сукцессии в почве. Оказалось, что
влияние внесения глюкозы в разных типах почв проявляется
по-разному. Так, при внесении глюкозы в чернозем Кг увеличивается в
4—5 раз, а при внесении в дерново-подзолистую почву — только
в 1,5 раза. Скорее всего это объясняется тем, что эквивалентное
по весу внесение легкодоступного субстрата в различные почвы
приводит к мобилизации имеющихся в них неэквивалентных
резервов питания. Известно, что запас органического вещества в
черноземе значительно больше, чем в дерново-подзолистой почве.
Кроме того, глюкоза при внесении в почву в рассматриваемой
концентрации (0,1%) расходуется очень быстро, за сутки (Па-
ников, Эль-Нага, Звягинцев, 1982). Из приведенных графиков
(рис. 27, а) также следует, что максимальный рост длины мице-
180
ЦО
30
20
10
v^:
527^7*
3470;
7070;
123 456783 10 If
Номер класса по Kr
4
\77-W3
5
58-W5
6
6610Л
1234567 89 10 11
Номер класса по Кг
Рис. 29. Распределение колоний микромицетов в черноземе (а) и в дерново-
подзолистой почве (б) по классам значений радиальной скорости роста и
общее число колоний грибов в 1 г почвы (в).
Варианты: 1, 4 — начальный момент сукцессии; 2 — 7-е сутки после
увлажнения; 3, 5 — 2-е сутки после внесения глюкозы; 6 — 7-е сутки после внесения
глюкозы
лия грибов наблюдается значительно позднее — на 3—7-е сутки.
Глюкоза является более эффективной «затравкой», чем простое
увлажнение или внесение целлюлозы. В процесс включается
также использование собственных почвенных органических веществ.
Большая эффективность глюкозы означает, что в ее присутствии
в почве создаются более высокие концентрации простых
органических соединений, которые и благоприятствуют интенсивному
развитию грибов с высокими значениями радиальной скорости
роста. Поэтому внесение 1%-ного раствора глюкозы в чернозем
и дерново-подзолистую почву вызывает одинаковый по
направлению, но разный по абсолютной величине сдвиг средней
радиальной скорости роста комплекса почвенных микромицетов.
При этом происходит перестройка структуры комплекса,
причем одному и тому же значению Кг в двух почвах может
соответствовать разное распределение микромицетов по скоростям
роста. Для того чтобы изучить это распределение, было выбрано
15 классов значений радиальной скорости роста колоний грибов,
которые захватывали весь диапазон встретившихся в опыте Кт
отдельных колоний.
Сопоставление Кт с распределением микромицетов по
скоростям роста показывает, что одному и тому же /Сг, равному
0,25 мм/ч, которое наблюдается в черноземе на 7-е сутки после
увлажнения, а в дерново-подзолистой почве — на 7-е сутки после
увлажнения и внесения глюкозы, соответствует разное
распределение грибов по классам (см. рис. 29). В дерново-подзолистой
почве доминирует класс с низкими значениями Кт (0,10 мм/ч),.
а в черноземе — класс с более высокими Кг (0,22 мм/ч), что
совпадает со средним Кг. Следовательно, в двух различных типах
почв отмечается неодинаковая структура комплексов
микромицетов по показателям скорости роста. Кроме того, было выяснено,
что низкие значения Кт связаны с преобладанием одного или
нескольких классов медленнорастущих грибов (рис. 29,б,в). Эта
общая для обеих почв закономерность изменяется при переходе
Кт в область высоких значений. В этом случае распределение
колоний по классам в черноземе становится более равномерным.
Среднее значение Кг совпадает или близко к значению Кт класса,
имеющего максимум колоний (см. рис. 29,6).
В обеих почвах была выявлена тенденция к усложнению
структуры, увеличению разнообразия при повышении среднего /Сг.
Оценку разнообразия сообщества проводили с помощью
коэффициента Шеннона по формуле
Н ig2
где pi =——, а N — доля колонии микромицетов 1-го
класса. Более высокому значению Кг соответствует более высокое
значение коэффициента Шеннона (рис. 30).
При посеве на питательную среду учитывается суммарное
182
40
5 20
г
' 10
К 1
¦ /W
/A v
II \^
1 J
II
11
•а , , i
—*
V \
\ \
VJ\
A*S.
J 1 *Т>
0,05 Ot2S 0,45
0,65
0,85
1,05 1,25
Kr, мм/ч
60
50
40
30
20
10
N^-^4
0,05
0,25
0,45
0,65
0,85
J_
TT-a i
1,05 1,25
Kr, мм/ч
10
60
50
40
30
20
10
/\ 1
:/A
/' 4
// j
¦2
I I
^.
"vW л—i
0,05
0,25
0,45
0,65
0,85
1,05 1,25
Kr, мм/ч
Рис. 30. Показатели развития микромицетов:
а — распределение микромицетов по значениям радиальных скоростей
роста в дерново-подзолистой почве на 7-е сутки после внесения глюкозы
(/) и в черноземе после увлажнения (2).
Структура комплекса почвенных грибов при внесении глюкозы в
черноземе (б) и в дерново-подзолистой почве (в) по показателям радиальной
скорости роста в начальный момент времени (1) и при максимальном
значении /Сг,ср (2);
для б: 1 — /Сг,ср-0,13 мм/ч, #=1,3; 2 — tfr,cP = 0,54 Мм/ч, # = 3,3
для в: 1 — /Сг,сР = 0,16 мм/ч, #=1,5; 2 — /Сг,сР = 0,2б мм/ч, #=2,3
количество грибных зачатков (споры, мицелий). Для того чтобы
определить, происходит ли при повышении разнообразия
сообщества развитие всех грибов или только тех, которые имеют
высокие значения Кг, необходимо знать общую численность
грибов, определяемую по методу посева, и распределение колоний
по скорости роста в последовательные промежутки времени.
Часто даже может и не происходить изменений в общем
количестве грибов, но перестройка в комплексе хмикромицетов тем не
менее наблюдается: снижается численность микромицетов с
низкими значениями Кг, а с высокими — увеличивается (см. рис. 29).
При инициации сукцессии происходит прорастание грибных
зачатков всех микромицетов, затем грибы с низкими значениям Кг
подавляются тем сильнее, чем выше нарастает численность грибов
с высокими значениями Кг.
В ходе общей сукцессии микроорганизмов в почве после
обильного развития грибов происходит развитие комплекса почвенных
бактерий и актиномицетов (рис. 31). Почвенные грибы
развиваются на первых этапах микробной сукцессии, и их максимальная
биомасса на два порядка превышает биомассу почвенных
бактерий и актиномицетов, что позволяет считать грибы абсолютными
доминантами. Грибной мицелий обладает на 1—2 порядка
большей линейной скоростью роста (50—1000 мкм/ч) по сравнению
с бактериями (1—10 мкм/ч), грибы более эффективно
колонизуют субстрат. Развитие бактерий и актиномицетов на поздних,
этапах сукцессии обеспечивается за счет использования
отмирающего грибного мицелия. Широко распространенную у
актиномицетов хитиназную активность логично связать с высоким
содержанием хитина в клеточной стенке грибного мицелия.
Все подходы, использованные для грибов, в настоящее время
применяются нами для актиномицетов. Правда, работать с акти-
номицетами сложнее, так как количество их мицелия в почве
определять труднее (Полянская, Звягинцев, 1984). Отметим, что
актиномицеты — очень своеобразная и особая в экологическом
отношении группа почвенных микроорганизмов. Хотя в
систематическом отношении они в настоящее время занимают довольно-
скромное положение как ветвь грамположительных бактерий. Ми-
целиальное строение придает им особые экологические
особенности и делает их отличными от прочих прокариот. От грибов их
отличает то, что они являются прокариотами с более тонким
мицелием и относительно низкой скоростью роста.
Таким образом, показатели Kf Z, Кг являются важными
количественными критериями, которые позволяют регистрировать сук-
цессионные изменения в комплексе почвенных микроорганизмов.
С помощью этих показателей и анализа динамики ряда
микробных группировок оказалось возможным показать, что после
внесения различных органических веществ в одной и той же почве
могут складываться сообщества разной степени зрелости.
Внесение глюкозы создает наиболее незрелую стадию микробной
сукцессии, внесение целлюлозы — более зрелую. По мере удаления
184
ют момента внесения органического вещества в почву возникает все
более зрелая система.
Рассмотрим группировки микроорганизмов и характерные
показатели для почвы, в которую внесены глюкоза или целлюлоза.
Показаны границы варьирования численности микроорганизмов
/4 21
Время, сут
Ца
3,6-
Sfi
3,2
3,0
igc
- 3,0
- V
- 2,2
1,8
1
3
Б
1
^-^ 2 Н
'^Ч. 1 I
-|
j jj
16
Время, сут
Igb
2,6
2А
2,0
26
Рис. 31. Сукцессия бактерий (1), актиномицетов (2) и грибов (3)
в двух разновидностях дерново-подзолистой почвы (А) и в
сероземе (Б):
а — число клеток бактерий на 1 г почвы, Ь — длина мицелия грибов
(м/г), с — длина мицелия актиномицетов (м/г)
различных групп, минимумы и максимумы численности разных
групп микроорганизмов (табл. 23—24). Можно видеть, что I и
II группы резко различны по всем показателям. У этих групп
скорость роста также различна (табл. 25). Результаты
определений показали, что I группа обладает признаками г-стратегии:
185
высокими показателями удельной скорости роста,
приуроченностью максимума развития к начальным этапам (отсутствие
фазы задержки роста), широкой амплитудой колебаний
численности, приуроченностью максимума численности к одному
промежутку времени, которая может рассматриваться как отсутствие
жесткой конкуренции между ними, активным освоением
легкодоступного субстрата, быстротой роста на обычных питательных средах.
Микроорганизмы II группы проявляют свойства, присущие
организмам с К-стратегией.
Показатели К, Z, Кг, преимущественное развитие г-стратегов
указывают на то, что внесение глюкозы сразу же создает более
«молодую» стадию сукцессии в почве по сравнению с целлюлозой,
если проводить сравнение комплексов почвенных
микроорганизмов в начальные моменты времени после внесения органических
веществ. Глюкоза способствует развитию ограниченного числа
преобладающих групп, которые создают наибольшую биомассу.
Внесение целлюлозы способствует развитию более разнообразного
сообщества, о чем можно судить по всем приведенным
показателям.
Указанные количественные критерии могут использоваться в
качестве индикаторов состояния микробного комплекса и этапов
сукцессии. Например, изменения показателя К во времени не
совпадают для сукцессии в почве с внесением глюкозы и целлюлозы.
Вместе с тем наблюдаемая общая картина в обоих вариантах в
полной мере согласуется с представлениями о зависимости этога
коэффициента от времени. Более низкие значения К
регистрируются на первых этапах сукцессии, когда система относительна
проста и идет r-отбор микроорганизмов с высокими скоростями
размножения, о чем, в частности, свидетельствует высокое
значение Кг- Затем наблюдается увеличение К в результате
усложнения системы с проявлением активности другими популяциями. При
этом снижается скорость размножения и соответственно убывает
показатель /Сг. Тот факт, что используемые показатели в
вариантах с мономером и полимером численно резко различаются,
указывает на их высокую вариабельность. Таким образом,
появляется реальная возможность целенаправленного создания в почве
определенного этапа микробной сукцессии.
Динамика в микробной сукцессии маркированных внесенных
микробных популяций. При развитии почвенной микробиологии
«популяционная микробиология» традиционно оставалась в тени.
Почвенные микробиологи обычно стремились охарактеризовать
так называемую биологическую активность почв, т. е. по
возможности все микробное сообщество. Казалось, что именно такой
подход может дать наиболее ценные практические результаты.
Между тем известно, что общая экология изучению популяцион-
ной экологии уделяет очень большое внимание. По этому разделу
написаны специальные учебники.
Почвоведы-микробиологи считали, что экологией популяций
почвенных микроорганизмов нельзя заниматься из-за отсутствия
186
ч
ЛО
Л
S
а>
СП'
¦о
X
О.
а>
.а*
п
X
X
'2
s
X
-о
ч
2
ю
еа
о
5
го
X
X
ев
О.
О
о
й-
X
S
с
с
>»
о.
и
X
оры
2
со
О
чс
о
Ч
и
2
со
О
Ч
2
(целл
ю
н
о
1
а>
09
X
X
?
О
«и
X
X
ев
и
а.
о
«
X
X
а>
внес
а>
поел
2 s
|s
х u
«у
*!
X ^»
н «
X «
Л ft.
г*
X а
Время проявления
максимума, недели
Отношение
минимумов
Отношение
максимумов
Максимальная
численность
Относительный размах
варьирования численности
Абсолютный размах
варьирования
численности
с
>
с
1 u
1 я
1 *
1 *
1 t-
1 u
1 s
С
1 й-
1 н
1 *
1 ее
с
1 я
X
глюкоза
целлюлоза
глюкоза/
целлюлоза
глюкоза/
целлюлоза
глюкоза
целлюлоза
Б/А
глюкоза
(Б)
целлюлоза
(А)
глюкоза
целлюлоза
микроорганизмов
CN Ю
СО *-< -« Tf
~ ~ i ~ iil"
m ю n ь- t^
i-ii i i - ю
~-« СО —* *-« СО
1,29
1,49
1,00
0,83
1,00
0,50
0,90
1,00
i
6,50
2,65
44,6
2,40
0,47
0,60
0,63
0,57
«о со
,=« О -*• ^ О О О
о — ю —« см .—
« 2 " 6 О °°. 6 О N-
О —i Ю О ~м О
CN ^- ^ ^
2 о со 2 о « 2
N ~- CM ~* СО .
Ч 3 об о" Ч ^ о" «
CM CO СМ 00 N-
СО — CN ^ 00
7,7
2,1
2,5
5,2
0,53
0,40
0,50
0,54
17,15
3,15
23,20
3,40
3,25
1,06
0,92
12,30
2,24
1,53
9,40
0,65
6.08
2,65
1,83
22,70
о о ^ <Ь о ^ о
Ч S ^ о" Ч °°- о" ю~
00 N- N- СО 00
О) —> ОО 05
«о от «о от ^*
о о ^ о о w о
ТсоТ— *7 "Г см Т
со со см " со оо * ю
~ со •> о ~ ~ о •>
СО Tf О) СО —«
CN О -н СО 00
со — —«
I группа
Бактерии (посев на
МПА)
Мицелий грибов
(прямой метод), мг
Сахаролитические
грибы (среда Чапека)
Кг сахаролитических
грибов, мм/ч
II группа
Целлюлозоразлагаю-
щие бактерии
Целлюлозоразлагаю-
щие грибы
Кг целлюлозоразлагаю-
щих грибов, мм/ч
Целлюлозоразлагаю-
щие анаэробные
бактерии
187
Таблица 24
Особенности развития двух групп микроорганизмов, выделенных
из чернозема типичного в процессе сукцессии
Признак
Размах варьирования
численности
Отношение размахов
варьирования численности при
внесении простых и
сложных веществ
Субстрат, при котором
достигается максимум
численности группы
Соотношение максимумов
численности, достигаемых
при внесении простого и
сложного веществ
Временная
приуроченность максимума
I группа
более высокий при
внесении в почву глюкозы;
абсолютный размах
варьирования более высокий
более высокое (2,1—7,7)
простое, легкодоступное
вещество (глюкоза)
более высокое (2,5—6,5)
-
при внесении глюкозы —
начальные этапы; при
внесении целлюлозы — более
поздние этапы
И группа
более высокий при
внесении в почву
целлюлозы;
абсолютный размах
варьирования более
низкий
более низкое
(0,4-0,54)
полимер
(целлюлоза)
более низкое
(0,47-0,63)
поздние этапы
после внесения глюкозы
и целлюлозы
Таблица 25
Удельная скорость роста бактерий р (ч-1) и
радиальная скорость роста грибов Кг (мм/ч)
при внесении целлюлозы и глюкозы
Группа микроорганизмов
Бактерии (среда
МПА)
Целлюлозоразлага-
ющие бактерии
Сахаролитические
грибы (среда
Чапека)
Целлюлозоразла-
гающие грибы
Целлюлоза
0,021
0,041
h
0,230
0,320
И-
<г
Глюкоза
0,057
0,021
0,540
0,200
188
методических разработок. Динамику видовой (штаммовой)
микробной популяции также нельзя изучать, так как почва содержит
такое большое количество слабо отличимых видов, что
количественно учесть интересующий исследователя вид невозможно.
Однако это не совсем так. Известно, что некоторые виды бактерий
(многие бациллы, азотобактер, некоторые характерные
пигментированные бактерии, обладающие первичной люминесценцией ак-
тиномицеты и бактерии) можно достаточно точно отличать по<
характеру колоний и количественно учитывать при посеве. Такая
работа вполне возможна и со многими видами грибов,
различающихся по культуральным признакам. Однако появление новых
методов дало начало обширным исследованиям в области популя-
ционной почвенной микробиологии, и стало ясно, что популяцион-
ный подход может дать не меньше, чем изучение микробных
сообществ.
В настоящее время для изучения популяций применяют в:
основном два метода. Особенно ценно их совместное применение.
Первый метод предполагает использование генетически
маркированных популяций, которые можно было бы легко узнавать среди:
многочисленных и разнообразных почвенных микроорганизмов..
Наиболее распространено применение стрептомицинустойчивых
штаммов. Получение таких штаммов обычно требует всего
нескольких недель и достигается путем последовательных пересевов
на среды с повышающимися концентрациями стрептомицина.
Необходимо получить штаммы, устойчивые к 500 мкг стрептомицина
на 1 мл среды, так как на такой среде не растут собственно
почвенные бактерии.
Получив генетически устойчивый маркированный штамм,
вносят его в почву и затем изучают динамику его популяции в
почве. Для этого проводят в последовательные интервалы времени
посевы из почвы на питательную среду со стрептомицином.
Почвенные микроорганизмы на этой среде не могут развиваться, а
испытуемый штамм хорошо растет, т. е. получается элективная
среда для определенного штамма. Конечно, при работе с такими
маркированными штаммами необходимо проверить, не произошло
ли изменение в тех свойствах штамма, которые интересуют
исследователя, например в способности фиксировать азот,
вирулентности и т. д.
Другой метод, широко используемый для изучения
популяций, — иммунолюминесценция (Звягинцев, 1980). Испытуемой
культурой иммунизируют кроликов, получают иммунную
сыворотку, которой обрабатывается почвенный мазок, содержащий
тест-культуру. Препарат обрабатывается антикроличьим гамма-
глобулином, меченным изотиоцианатом флуоресцеина. По
специфическому краевому иммунному свечению среди множества
почвенных микроорганизмов в почвенной суспензии отличают клетка
заданного микроорганизма. С помощью этого метода к
настоящему времени проведено уже много работ с десятками разных:
почвенных микроорганизмов.
189
Первый метод более прост в исполнении, кроме того, он дает
возможность работать при малых плотностях популяций- Имму-
нолюминесцентный метод значительно сложнее. Он пригоден для
работы с достаточно плотными популяциями (более 105~6 клеток
на 1 г почвы) и совершенно необходим при изучении локализации
клеток в почве, их формы и размеров, образования микроколоний,
обнаружения живых клеток по реакции на налидиксовую кислоту
(Кочкина, Кожевии, Звягинцев, 1980). Обширные исследования
динамики популяций различных вносимых в почвы
микроорганизмов (Zvyagintsev, 1984) позволили установить следующие
основные закономерности.
Подавляющее большинство популяций микроорганизмов после
их внесения в почву стабилизируется в ней на определенном
уровне, который может быть ниже или выше уровня внесения.
Только в редких случаях популяция погибает. Гибель отмечалась
у микроорганизмов, которые не могут переносить низких
значений рН, отличаются большой интенсивностью обмена и требуют
непрерывного притока питательных веществ. Популяция обычно
занимает весьма скромное место в комплексе почвенных
микроорганизмов, составляя доли процента от общего количества
микроорганизмов в почве. Если популяцию внести на очень высоком
уровне численности, например 109-10 клеток на 1 г почвы,
численность ее быстро сокращается. Для выживания популяции
большое значение имеет фаза роста, в которой популяция вносится в
почву.
Обычно популяции вносили в стационарной фазе. Известно, что
большинство культур образуют специализированные покоящиеся
клетки, которые более устойчивы при внесении. Стабилизация
популяции связана с установлением динамического равновесия
(часть клеток размножается, часть — отмирает). Это установлено
с помощью иммунолюминесцентной микроскопии, которая
позволяет через некоторое время после внесения популяции
обнаружить в почве группы клеток и микроколонии (сразу после
внесения их не было). Потом изменяется форма клеток, появляется
много двойных клеток и, судя по тесту с налидиксовой кислотой,
появляется довольно много нерастущих «мертвых клеток»
(Кочкина и др., 1980). Однако крайне желательно было бы
определить скорость размножения и скорость отмирания клеток. Пока
это не сделано, поэтому о динамике популяций судить нельзя.
Отметим, что в наших опытах стабилизация отмечалась на
протяжении нескольких месяцев и даже нескольких лет. Известно,
что некоторые популяции, например клубеньковые бактерии,
сохраняются в почве несколько лет, а затем исчезают. Например,
есть данные, что во время роста бобовых в почве было 106 клеток
клубеньковых бактерий на 1 г почвы, через 3 года — 102~3
клеток, а через 5 лет клубеньковые бактерии не обнаруживались.
Отметим, что большинство наших исследований проводилось в
модельных опытах, т. е. почва поддерживалась в лаборатории при
лостоянной температуре и влажности, без резких колебаний гидро-
190
термических и других условий, которые имеют место в природе.
Поэтому выживаемость в природе может отличаться.
Удалось выявить довольно странную закономерность: уровень
стабилизации популяции сильно зависит от уровня внесения. Эта
необычно для популяций растений и животных и может
трактоваться как отсутствие емкости среды по отношению к
определенной микробной популяции. Объяснить это явление можно
рядом причин: клетки чрезвычайно трудно передвигаются в почве
и остаются в тех микрозонах, в которые они попали. Эти
микрозоны оказываются насыщенными микроорганизмами, большего-
количества микробов здесь развиться не может. При большой
дозе внесения клетки оказываются в большем количестве микро-
зон, и, таким образом, популяция стабилизируется на более
высоком уровне. Внесенные клетки не размножаются и не отмирают
сколько-нибудь существенно, а находятся в состоянии
поддержания. Большинство клеток в почве находится в состоянии
поддержания, в более или менее глубоком покое. Обычно уровень
стабилизации близок к уровню внесения.
Зависимость уровня стабилизации от уровня внесения в почве
без растений обнаруживается не только для микроорганизмов с
К-стратегией, но и для г-стратегов. Уровень стабилизации в ризо-
плане не зависит или только слабо зависит от уровня внесения,
особенно у r-стратегов. Это явление можно объяснить тем, что в
ризоплане микробы получают постоянный приток питательных
веществ в виде корневых выделений, и популяция здесь имеет
возможность интенсивно размножаться и осваивать всю среду,
достигая емкости среды.
Судьба внесенной популяции зависит от стадии сукцессии, на
которой производится инокуляция. Некоторые микроорганизмы
лучше приживаются на первых стадиях сукцессии (г-стратеги),.
другие — на последних (К-стратеги).
При изучении взаимодействия в почве двух искусственно
внесенных популяций (Звягинцев и др. 1982) наиболее интересный
и однозначный результат этих исследований состоит в том, что
две популяции, внесенные на уровне 106 клеток на 1 г почвы или
на более высоком уровне, проявляют явное взаимодействие между
собой. Если это микробы-антагонисты, то проявляется
антагонистическое действие. Это действие установлено также для
микробов гидролитиков и негидролитиков, хищников и паразитов.
Расчеты показывают, что при внесении микробов на уровне 10ь
клеток на 1 г на одну внесенную клетку будет приходиться примерно
1000 клеток собственных почвенных бактерий, не считая грибов,,
которых по биомассе будет еще в несколько раз больше, чем
бактерий. На одну клетку будет в среднем приходиться 106 мкм2,
т. е. клетки будут разделены друг от друга большими
расстояниями, которые в десятки раз больше, чем сами клетки.
Очевидно, их взаимодействие в основном обусловлено тем, что при
перенесении с питательной среды они оказываются метаболически
гораздо более активными, чем собственно почвенные микроорганиз-
191
мы. Во всяком случае почва с двумя или несколькими
внесенными популяциями оказывается очень хорошей моделью для
изучения межпопуляционных взаимодействий.
Внесенная популяция во всех исследованных случаях не
влияла на динамику общего числа бактерий, комплекс почвенных
актиномицетов и другие большие группы. Это обусловлено тем,
что учитывается суммарный показатель, который, как уже
отмечалось, более стабилен при различных воздействиях. Кроме того,
-большинство почвенных микроорганизмов находится в неактивном
состоянии, поэтому внесенная популяция на них не влияет или
влияет слабо.
Установлены общие механизмы регулирования плотности
популяции при разных уровнях ее содержания в почве: при
плотностях более 106 клеток на 1 г — антибиоз (антагонизм,
хищничество, паразитизм), и положительные взаимодействия «— при
низких плотностях (например, поддержка за счет гидролаз для
тех микроорганизмов, которые не обладают собственными
гидролазами).
Важным приемом изучения сукцессии почвенных
микроорганизмов можно считать внесение видовых (штаммовых)
популяций. При этом комплекс почвенных микроорганизмов зондируется
разнохарактерными популяциями (К- и r-стратеги). К-стратеги
имеют больше шансов выжить на поздних стадиях сукцессии, а
r-стратеги — на ранних. Поведение внесенной популяции будет
различаться в зависимости от того, в какой стадии сукцессии
находятся собственно почвенные микроорганизмы.
В наших опытах в почву вносили популяции Rhizobium legu-
minosarum и Arthrobacter globiformis (Звягинцев и др., 1981;
Полянская и др., 1981). Артробактер рассматривается как типичный
почвенный микроорганизм (Mulder, 1964), но особенности его
экологии до сих пор окончательно не ясны. Определение его места в
почвенной микробной системе по ряду признаков, выявляемых в
лаборатории, необходимо, но явно недостаточно. Таких
характеристик изучено много, и постоянно прибавляется новая информация
(Ensing, Wolfe, 1964; Clark, 1967; Boulen, Ensing, 1970 a,b; Boulen,
1973; Chapman, Gray, 1981; Барышникова и др., 1980). Вопрос о
том, какие характеристики определяют сохранение данной
популяции в почве, пока не ясен. Выявление главных экологических
особенностей должно строиться на основе изучения популяцион-
ной динамики непосредственно в почве.
Относительно клубеньковых бактерий долгое время
господствовала теория о возможности их существования лишь в тесной
«связи с растениями и быстрой гибели в почве (Стейниер и др.,
1979). В настоящее время экспериментально установлены
размножение клубеньковых бактерий в почве без растений и
продолжительная стабилизация уровня их численности (Звягинцев, Ко-
жевин, 1974; Schmidt, 1973, 1978). Артробактер и клубеньковые
«бактерии при внесении в почву не погибают, и их численность
стабилизируется на определенном уровне.
192
Поведение этих популяций изучали при внесении их в почву
в разные моменты сукцессии, инициированных предварительным
внесением органических веществ и влаги. В качестве показателей
протекания сукцессии использовали коэффициенты К, Z и /Сг.
Предполагалось, что динамика численности исследуемых
популяций после раздельного их внесения на разных этапах сукцессии
в трех вариантах (глюкоза, целлюлоза, контроль) будет зависеть
ют соответствия конкретной популяционной стратегии
суммарному изменению условий в основной массе почвенных микрозон.
Обе популяции проявляют резкие различия в своих стратегиях
(табл. 26). Даже при внесении в почву органического вещества
A. globifortnis не дает вспышки роста. Основной тенденцией его
популяционной динамики остается стремление к поддержанию
определенного уровня численности. Единственный вариант, где
наблюдается кратковременное повышение численности популяции
при высоком уровне внесения,— это условия «зрелой» системы
{16-е сутки после внесения целлюлозы). Вся совокупность свойств
этого микроорганизма свидетельствует о выраженной К-стра-
тегии. Скорость роста не играет решающей роли для его
выживания.
Напротив, клубеньковые бактерии проявляли совсем иные
свойства. Они вели себя как организмы с r-стратегией. Это
проявилось в их способности быстро размножаться за счет внесенного
органического вещества. Наиболее благоприятным для
стабилизации клубеньковых бактерий на более высоком уровне, спустя два
месяца после внесения, оказывается вариант с целлюлозой.
Поскольку клубеньковые бактерии не способны в отличие от артро-
бактера к самостоятельному росту на целлюлозе (Кочкина и др.,
1981), полученные результаты свидетельствуют о значении
метабиоза между ними и почвенными гидролитиками. Метабиоз с
почвенными микроорганизмами можно считать одним из основных
положительных факторов, регулирующих численность
клубеньковых бактерий и способствующих их сохранению в почве. Таким
образом, артробактер и клубеньковые бактерии являются
экологически резко различными микроорганизмами, проявляя
относительно друг друга признаки К- и r-стратегий соответственно. Эти
бактерии занимают разное место в сукцессии микроорганизмов
в почве. Однако обе популяции по их свойствам попадают в
экологическую группу «микрофлоры рассеяния I» (Заварзин, 1970,
1976). Однако, исходя из признаков К- и r-стратегий, при более
детальном подходе оказывается возможной дифференциация в этом
блоке системы Заварзина. Действительно, клубеньковые
бактерии, даже при внесении их в почву на высоком уровне, доминируют
на начальных этапах сукцессии наравне с другими г-стратегами,
представителями которых в почве можно, например, считать саха-
ролитические грибы и псевдомонады.
По мере протекания сукцессии в почве увеличивается число
медленнорастущих микроорганизмов, разлагающих полимеры, а
следовательно, нарастает количество К-стратегов. Артробактер
"7 Д. Г. Звягинцев
193
может функционировать на поздних этапах сукцессии за счет
медленно^) разложения полимеров.
Подводя итоги изучению микробной сукцессии в почве (Звягин»
цев и др., 1984а, б; Кочкина, 1981), нужно подчеркнуть, что
состав доминирующих форм микроорганизмов в почве во времени
непрерывно меняется. На одних стадиях отмечается
преимущественное развитие грибов, на других — достигаются максимумы в
развитии бактерий и актиномицетов. На одних этапах
доминируют г-стратеги, на других — К-стратеги. На разных стадиях
доминируют разные виды. На видовом уровне сукцессия (на
примере сезонных изменений) наиболее подробно исследована на
Таблица 2&
Характеристика особенностей популяций артробактера и клубеньковых
бактерий в почве
Признаки
Скорость размножения
Зависимость наблюдаемой удельной
скорости роста от популяционной
плотности
Популяционная плотность:
а) стремление к определенному
уровню стабилизации
б) отношение начального уровня
внесения к уровню стабилизации
в) изменение популяционной
плотности во времени
Диапазон уровня стабилизации
Показатель стресса на поздних этапах
опыта (отношение численности на
разбавленных и неразбавленных средах)
Возможность существования за счет
веществ, рассеиваемых при разложении
целлюлозы
Влияние внесения органического
вещества в виде мономера или полимера на
численность популяции
Стадия сукцессии, наиболее
благоприятная для развития внесенной
популяции
Артробактер
низкая
резко
выражена
сильно
выражено
более высокое
не выражено
узкий
2
имеется
положительное, но слабо
выражено
поздние
стадии
Клубеньковые
бактерии
высокая
слабо выражена
имеется, но не
резкое
менее высокое
сильно
выражено, может
возрастать в условиях
«экологического
вакуума»
широкий
4
ярко выражена:
очень сильное
положительное
начальные
стадии
грибах (Мирчинк, 1976, 1984), так как у этих микроорганизмов
виды достаточно просто определяются по морфологическим и
культуральным признакам. Для бактерий, как было показано
выше, этот вопрос решается сравнительно просто для
искусственно внесенных в почву маркированных штаммов определенных
видов, но не для собственно почвенных бактерий. В зависимости
от экологической обстановки определенные виды бактерий
получают пышное развитием разные периоды времени.
194
Обычно при изучении почвенных микроорганизмов
исследователь может определить только численное доминирование той или
иной,группы, того или иного вида. Это чисто количественное
доминирование. Однако исследования динамики развития могут
дать сведения и о доминировании в скорости роста, а иногда и в
процессах. Например, если в почву вносится глюкоза и отмечается
обильный рост мицелия грибов, а общее количество бактерий не
увеличивается, можно считать, что большая часть глюкозы
используется грибами. Правда, часть глюкозы идет и на рост бак*
терий, о чем можно судить по сильному увеличению количества
бактерий, развивающихся на средах с глюкозой. Но это
увеличение не сказывается на общем количестве бактерий,
определяемых люминесцентным методом, так как группа бактерий,
развивающихся на среде с глюкозой, составляет только процент от
общего количества бактерий, учитываемых прямым
микроскопическим методом.
В каждый данный момент времени количественный состав
микробов отражает историю развития микроорганизмов в почве
за предыдущий период. Почва «помнит» микробиологические
события, которые в ней происходили до настоящего момента. Они
отражаются прежде всего в пуле определенных групп
микроорганизмов.
Изменения в составе микроорганизмов связаны с тем, что
почва как среда обитания постоянно меняется во времени;
изменяются ее свойства, источники питания, биологическое окружение
и другие условия (температура, влажность,
окислительно-восстановительные условия). При изменении условий почва из своего
богатого микробного пула черпает те микроорганизмы, которые
наилучшим образом растут в данных условиях.
К концу определенного периода, наступающего из-за смены
биотических и абиотических условий, в почве накапливаются
микробы, которые доминировали на протяжении предыдущего
периода. Какие микроорганизмы будут доминировать в
дальнейшем, зависит от условий, но большое значение имеет и
наличный фонд тех или иных форм. Если два микроба могут успешно
развиваться в создавшихся условиях, то, как правило,
доминирующим станет тот, который находился в большем числе в начале
возникновения благоприятных условий (Гузев и др., 1985).
Комплекс почвенных микроорганизмов построен по другим
принципам, чем фитоценоз или совокупность животных. В
частности, в последних двух случаях нет такого количества и столь
долго покоящихся или переживающих форм, как у
микроорганизмов в почве. Микробиолог, определяющий их количество, часто
попадает в положение того незадачливого ботаника, который с
целью определения потока энергии и круговорота веществ
определял бы в определенной экосистеме не количество растений, а
количество семян.
Новые представления о микробной сукцессии в почве застав-
7*
195
ляют по-новому рассмотреть ряд теоретических и практических,
вопросов почвенной микробиологии.
Изучение сукцессии открывает специфические законы
функционирования комплекса почвенных микроорганизмов, например-
такой, как малочисленность доминирующих видов, ведущих
процесс в каждый заданный момент времени. Ход -сукцессии
приводит к колебательному характеру развития микроорганизмов
разных групп в почве. Как уже отмечалось, в почве наблюдаются
достоверные колебания численности микроорганизмов, причины
которых разными исследователями объясняются совершенно
различно. Одна из причин — непрерывно идущая в почве сукцессия
микроорганизмов. Изучение сукцессии, особенно на уровне видов;
(Гузев и др., 1985), дает возможность установить, какие
воздействия (тяжелые металлы, большие дозы удобрений, загрязнения
нефтепродуктами) приводят к изменению доминирующих форм,,
ведущих процесс, и какие еще не приводят к таким изменениям.
Изучение сукцессии дает возможность определять
последовательность и сроки микробных событий в почве. Можно выявить
наиболее и наименее благоприятные сроки роста в почве
определенных групп микроорганизмов. Такой подход дает возможность
устанавливать связи между разными почвенными популяциями
микробов, между почвенными популяциями и искусственно
внесенными микробными популяциями, определить границы проявления:
разных типов межпопуляционных взаимоотношений в
зависимости от плотности популяции и других сукцессионных условий.
Если стоит задача выделения определенного микроорганизма из
почвы, например продуцента антибиотика, нужно учитывать сук-
цессионные события и для успешного выделения часто
необходимо попасть в ту стадию сукцессии, когда наблюдается максимум
в его развитии (Додзин и др., 1987). Если нужно определить
доминирующие микроорганизмы в почве, их определяют в ходе
сукцессии. Если же необходимо определить воздействие
определенного агроприема или пестицида, гораздо более полное
представление можно получить, изучая это действие также в ходе
сукцессии (Зенова, 1986).
Специфика почвы как среды обитания микроорганизмов в
отношении протекания в ней микробной сукцессии проявляется в;
наличии огромного качественного и количественного пула
микроорганизмов, из которого черпаются самые разнообразные и
наиболее подходящие для данных условий виды микроорганизмов.
Отметим, что мезо- и микрозональность в некоторой степени
сглаживает сукцессионные изменения, когда они констатируются,
по определениям в сумме микрозон, так как в изолированных
микрозонах процессы могут идти независимо и разновременно.
Однако если сукцессионные изменения вызываются одновременно
единым фактором (увлажнением, оттаиванием почвы, внесением
органического вещества и т. д.), то они долго сохраняют
одновременность во всей почвенной массе.
ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ
Для разрешения многих вопросов'экологии почвенных
микроорганизмов и биохимии почв необходимо знание биологических
процессов в почвах. Поэтому работы в области биодинамики почв
приобретают особое значение.
Биодинамику определяют, пользуясь самыми различными
микробиологическими (прямой микроскопический подсчет
микроорганизмов разных групп — бактерий, актиномицетов, грибов и
определение количества микроорганизмов на разных питательных
средах), биохимическими (определение ферментативной активности
почв, АТФ, ДНК), физиологическими (физиологический метод
определения биомассы микроорганизмов, определение дыхания
почв) и химическими (определение нитратов, аммиака)
методами. Нельзя отдать предпочтение какому-либо одному методу или
даже группе методов. Они должны быть достаточно
разнообразными, чтобы была возможность разносторонне охарактеризовать
биологические свойства и особенности той или иной почвы. При
изучении биодинамики нужно применять достаточно точные и не
очень трудоемкие методы, так как приходится проводить много
определений.
Методы следует четко делить на две группы: 1) методы
определения действительной, актуальной, природной биологической
активностей почв (полевые методы определения дыхания, азотфик-
сации, денитрификации, некоторые изотопные методы); 2)
методы, определения потенциальной биологической активности почв,
т. е. той активности, которая обнаруживается в лабораторных
условиях при создании оптимальных условий для протекания
данного процесса (определение ферментативной активности почв,
лабораторные методы определения нитрификации, азотфиксации,
денитрификации, дыхания). Ко второй группе методов относятся
\И определение численности микроорганизмов прямыми методами
или посевом, определение ДНК, мурамовой кислоты, хлорофилла,
физиологический метод определения микробное биомассы, так как
они дают возможность определить только потенциальные
возможности микроорганизмов в почве, но не дают возможности сделать
заключение об активной части микроорганизмов в определенный
момент времени. Биодинамика успешно изучается с
использованием обеих групп методов. Актуальная активность более измен-
197
чива и характеризует истинную динамику процессов в почве.
Потенциальная активность более стабильна, но она в меньшей
степени характеризует действительную интенсивность процессов, а
в большей — определенные биологические свойства почвенного
типа.
Биодинамические исследования важны для разрешения
следующих проблем:
1) характеристики биологической активности почв;
2) определения доминирующих видов и частоты встречаемости
видов;
3) определения интенсивности микробиологических процессов;
4) разграничения временных и пространственных колебаний;
5) определения продуктивности микробной биомассы;
6) установления критериев повреждения экосистемы;
7) изучения законов протекания микробной сукцессии в почве;
8) изучения специфики поведения микробных популяций в почве;
9) изучения специфики строения и функционирования комплекса
почвенных микроорганизмов.
Для характеристики биологических показателей необходимо
выяснение внутрисуточных, ежесуточных, ежемесячных и
ежегодных колебаний (Звягинцев, Голимбет, 1979).
Характеристика биологической активности почв. До сих пор
биологические свойства почв не вошли прочно в .характеристику
почвенных типов подобно ряду химических (содержание гумуса,
емкость поглощения, степень насыщенности основаниями,
содержание питательных элементов, рН) и физических (механический
и микроагрегатный состав, пористость, плотность) свойств. Во
многом это обусловлено большой изменчивостью биологических
свойств во времени и в пространстве, причем амплитуда этих
колебаний неизвестна. Нами (Звягинцев, Голимбет, 1979)
установлено, что для дерново-подзолистой почвы количество бактерий,
учтенное с помощью люминесцентной микроскопии по сезонам,
изменялось в 3—5 раз, длина гиф грибов изменялась больше, чем
число бактерий (в 6—10 раз). Ферментативная активность
изменялась в 2—3 раза и являлась наиболее стабильным показателем.
Динамика микробной численности, биомассы и продуктивность
микробных сообществ в почвах. Перспективность динамических
исследований заключается в том, что они позволяют расширить
наше представление о механизмах образования микробной массы,
ее количественном измерении во времени и утилизации в почве,
динамике иммобилизации элементов питания растений в
микробной биомассе. Такой подход к проблеме дает возможность создать
математическую модель и установить строго количественные
закономерности функционирования комплекса почвенных
микроорганизмов.
Биодинамические исследования в почвенной микробиологии
связаны с определением продуктивности микроорганизмов как
функции времени, оценкой зависимости числа микробных клеток
от факторов окружающей среды, установлением параметров, ха-
198
растеризующих динамику численности микроорганизмов, что в
конечном итоге позволит прогнозировать продуктивность
микробной массы в почве, а также относительный вклад различных групп
микроорганизмов (грибы, бактерии, актиномицеты) в общую
биомассу.
Проблема изучения динамики комплекса почвенных
микроорганизмов предполагает как поиск практических подходов в
подобных исследованиях, так и формулировку гипотез, позволяющих
объяснять происхождение и природу тех или иных изменений
численности почвенных микроорганизмов.
Основное требование, необходимое при изучении динамики
численности и биомассы почвенных микроорганизмов,— точность
и достоверность получаемых данных, а они в свою очередь
зависят от того, какие компоненты комплекса почвенных
микроорганизмов учитываются и какими методами осуществляется
подобный учет.
Если относительно недавно многие исследователи считали, что
основной вклад в биомассу почвенных микроорганизмов вносят
бактерии, то разработка и усовершенствование прямых методов
учета грибного мицелия и грибных спор в почве показали (Nagel
de Boois, Jensen, 1971; Dwivedi, Shukla, 1977; Martinez, Romires,
1978), что в большинстве почв биомасса грибов превышает
биомассу бактерий в несколько раз (Звягинцев, Воробьева, 1975;
Звягинцев, 1978а; Witkamp, 1974; Paul, Johnson, 1977; Flanagan, Van
Cleve, 1977) или, по крайней мере, равна ей (Мирчинк, 1984).
Только в почвах рисовников, где часто господствуют анаэробные
условия, биомасса грибов была в 5 раз меньше биомассы
бактерий.
Аналогичные данные получены при использовании косвенных
методов определения грибов путем внесения в почву селективных
ингибиторов дыхания грибов и бактерий (Anderson, Domsch,
1975). Согласно приведенным данным, оценку размеров
микробной массы в почвах нельзя проводить без учета биомассы грибов.
Между тем почвоведы-микробиологи традиционно считали, что
главную часть микробной биомассы в почве составляют бактерии.
Важным моментом при изучении численности и биомассы
микроорганизмов в почвах является выбор метода учета микробных
клеток. Особую сложность в данном случае представляет учет
клеток бактерий. Существующие методы дают весьма различное
значение численности бактериального населения почвы. Наиболее
часто используются методы посева на питательные среды и два
прямых микроскопических метода: Виноградского и
люминесцентной микроскопии. Общеизвестно, что путем посева разведений
^щчвенной суспензии на питательные среды учитывают в
контрольных почвах без растений примерно на три порядка меньше
клеток, чем при прямом подсчете под микроскопом (Звягинцев,
1972; Мишустин, 1975). Из прямых методов предпочтение следует
отдать методу люминесцентной микроскопии, хотя многие
исследования по изучению ежедневной динамики бактерий в почве вы-
199
полнены с помощью метода Виноградского. Основная сложность
в применении метода Виноградского для подсчета клеток
заключается в трудности дифференциации их от почвенных частиц, а
также недоучете адсорбированных клеток, что приводит к
артефактам и, как следствие, к неверной трактовке полученных
результатов. Наиболее стабильные и воспроизводимые результаты
при изучении динамики численности бактерий в почве дает метод
люминесцентной микроскопии.
Кратковременные и сезонные изменения численности
микроорганизмов в почвах. Динамика численности микроорганизмов
включает кратковременные и сезонные изменения численности
как функции времени. Сейчас достаточно полно изучены
изменения числа бактерий в почве (Аристовская, 1972, 1975;
Звягинцев, Голимбет, 1981, 1983). Начаты исследования динамики
численности и биомассы грибов (Демкина, Олейников, 1977;
Звягинцев, Голимбет, 19796; Мирчинк, 1984) и водорослей (Штина,
1974; Рийс, Рахно, 1975). Некоторые работы посвящены
изучению динамики численности других представителей биоты почвы:
простейших (Мавлянова, 1978) и беспозвоночных (Козловская,
1979).
Численность микроорганизмов в зависимости от сезона очень
непостоянна. Кривые изменений числа микробных клеток в
большой степени зависят от типа почвы. Периоды преимущественного
развития бактерий приходятся в разных почвах на разное время
года. Если же обратиться к сезонной динамике содержания
бактерий разных физиологических групп, то оказывается, что
численность каждой из них имеет свои сроки развития, не
совпадающие между собой, и разные для разных типов почв.
В дерново-подзолистой почве наибольшее число аммонифика-
торов приходится на декабрь—январь, денитрификаторов — на
октябрь—ноябрь, нитрификаторов — на октябрь—апрель (Рахно
и др., 1971). В аллювиально-слоистой почве под крупнотравьем
численность микроорганизмов всех групп скачкообразно
возрастает в апреле, количество же аммонификаторов резко
увеличивается в июне. В середине лета наибольшее развитие получают
бактерии, ассимилирующие сложные органические вещества. К
началу зимы возрастает число бактерий, потребляющих
легкорастворимые соединения углерода и азота (Тен Хак Мун, Федорова,
1972). Сезонные количественные изменения численности
микроорганизмов могут быть различны для одного и того же типа
почвы в зависимости от растительного покрова. Численность
бактерий в горно-лесных бурых почвах под ясенем была максимальна
в августе и минимальна в октябре. В тех же почвах под черно-
пихтарником максимум наблюдали в сентябре, минимум — в июне
(Голодяев, 1972). Растительный покров может сглаживать
сезонные колебания. В тяжелоглинистых, медленно прогреваемых
весной почвах максимальное развитие бактерий приурочено к летним
месяцам, в более легких по механическому составу почвах
бактерии лучше развиваются весной (Колчева, 1955). Определенное
200
влияние на сезонную динамику микробиологических процессов
оказывает вертикальная зональность почв, а также обработка
почвы (Алиев, Гаджиев, 1977; Самбурова, 1977).
Кратковременные изменения численности бактерий имеют
сложный характер. Ежедневные колебания численности бактерий
обнаружены практически во всех типах почв — от тундровых
почв^ Крайнего Севера (Паринкина, 1972) до полупустынных почв
Казахстана (Ерфемова, 1975).
На частоту и амплитуду флуктуации численности бактерий
в определенной степени влияют агрохимические и физические
характеристики почвы. В известкованной дерново-подзолистой почве
подъемы численности наблюдали чаще, чем в неизвесткованной
(Багданавичене, 1975). На богарном участке предкавказского
чернозема колебания отличались более резкими подъемами и
спадами, чем на орошаемом участке (Перемузова, 1975).
Интенсивность колебаний численности повышалась при дисковании почвы
(Гайдамакина, 1978). В тяжелосуглинистой почве, лучше
обеспеченной гумусом и азотом по сравнению с супесчаной почвой
дерново-подзолистого типа, также были обнаружены более частые
подъемы численности (Зыкина, 1972). Отмечается снижение
интенсивности колебаний вниз по профилю почвы (Никитина и др.,
1975; Campbell, Biederbeck, 1976), что можно объяснить более
высокими температурами, доступностью источников питания и
лучшей аэрацией в верхних горизонтах почв.
В перечисленных работах сделан акцент лишь на
регистрации ежедневных флуктуации численности бактерий, но отсутствует
достаточно убедительная аргументация того, что полученные
данные достоверны, т. е. определяются только временным фактором.
Однако флуктуации численности могут быть результатом и
методических погрешностей, и влияния других факторов (например,
гетерогенности отбираемых образцов), так как даже при
использовании смешанных образцов невозможно провести отбор из тех
же точек, которые были выбраны при предыдущем определении.
По мнению ряда исследователей, колебания численности
бактерий в почве имеют строго определенный период длительностью
1—2 дня (Егорова, Стефарук, 1975), 2—4 дня (Паринкина, 1972)
или же только часть ежедневных колебаний носит периодический
характер (Никитина, Михайлова, 1976).
Анализ имеющихся в литературе данных показывает, что, хотя
существование кратковременных колебаний числа бактерий в
почвах не вызывает сомнений, спорным остается вопрос об
интенсивности и периодичности наблюдаемых флуктуации. Поскольку
интенсивность колебаний численности дает возможность в
определенной степени определить продуктивность микробной
биомассы, очевидно, что к интерпретации результатов изучения
динамики численности микроорганизмов следует относиться весьма
осторожно. Открытым остается вопрос о природе происхождения
изменений численности микробного населения почв, выявление
механизмов регуляции численности почвенных микроорганизмов и
201
факторов среды, ответственных за регуляцию. Существующие
гипотезы, являющиеся лишь подходами к решению этой проблемы,
не всегда достаточно аргументированы и не лишены такого
существенного недостатка, как расхождение между фактическими
данными и теоретическими предположениями.
Нами (Звягинцев, Голимбет, 1979а, б, 1980; Голимбет, 1980)
были проведены специальные обширные исследования с целью
внесения ясности в вопрос о динамике численности бактерий,
грибного мицелия и ферментативной активности почв, а также
необходимости оценки влияния на динамику времени, пространства
и прочих случайных причин. В этом аспекте важным
представляется выбор соответствующей системы статистической оценки
полученных данных таким образом, чтобы получить возможность
выявления влияния как временного, так и пространственного
фактора на наблюдаемые изменения численности микроорганизмов и
ферментативной активности почв.
Для оценки влияния каждого фактора на изменение
численности микроорганизмов была выбрана иерархическая схема
дисперсионного анализа, разработанная для изучения динамики
численности бактерий в почве методом люминесцентной микроскопии.
Осуществляли построение трехфакторного смешанного
равномерного дисперсионного комплекса.
В качестве факторов, влияющих на результативный признак
(в нашем случае—число клеток в поле зрения микроскопа),
были выбраны следующие.
1. Различное время отбора образцов (фактор А); число
градаций (а) определяется сроками отбора образцов почвы;
градации фиксированные.
2. Неодинаковость проб, отбираемых из почвы в одно и то же
время (фактор В); число градаций фактора (Ь) соответствует
числу отбираемых проб (5—7); градации случайные.
3. Неодинаковость препаратов, которые готовили из каждой
пробы почвы (фактор С); число градаций фактора (с) равно 9
(из расчета приготовления 9 препаратов на одну пробу);
градации случайные.
4. Разные причины, объединяемые в группу случайных
(фактор R).
Значимость каждого фактора определяли по критерию Фишера
(F). Если полученное значение F было больше или равно
приведенному в таблицах значению критерия Фишера, то влияние
любого из факторов на результативный признак считается
значимым.
Данные, полученные при статистической обработке, могут быть
использованы для расчета целесообразного числа проб почвы (Ь),
числа препаратов (с) из каждой пробы и числа подсчитываемых
полей зрения (п) в каждом препарате. Для оценки среднего числа
клеток (х) на одно поле зрения для данной пробы почвы
определяют ошибку среднего Sx:
202
о Sb Sc SR
Sx=— + —+¦ R
be ben
Итак, одна и та же ошибка может быть получена при разных
соотношениях п, с, Ь. С учетом временных затрат на подсчет
клеток в пределах одного поля зрения и на приготовление одного
мазка оптимальное число полей, просматриваемых на одном мазке,
будет следующее:
sr Сс
Sc с/?
где Сс — временные затраты на приготовление одного препарата,
CR — затраты времени в тех же условиях на просмотр одного
поля зрения. Аналогичным образом можно провести расчет
оптимального числа препаратов и числа проб.
Исходя из полученных данных при уровне относительной
погрешности 20% и с уровнем значимости 0,1 необходимо отбирать
5 проб, готовить по 3 препарата для каждой из проб и
просматривать по 20 полей зрения на каждом препарате.
С помощью использования вышеописанного метода
статистической обработки было показано, что большая часть (до 80%)
всех флуктуации, полученных при определении динамики
численности бактерий и грибов за разные промежутки времени,
недостоверна при Ро,95, т. е. эти флуктуации имеют амплитуду
настолько незначительную, что она не выходит за пределы ошибки
опыта. Достоверные флуктуации численности микроорганизмов
обусловлены временем, неодинаковостью отбираемых образцов
(пространственный фактор) и неодинаковостью приготовляемых
препаратов. Последний фактор в ряде случаев вносит
определенный вклад в определяемые изменения численности микробных
клеток, так как, несмотря на тщательное перемешивание почвенной
суспензии в процессе приготовления препарата и фиксированный
объем капли, наносимый на стекло, приготовленные препараты
отличаются друг от друга. Однако степень влияния
неодинаковости препаратов на получаемые результаты может быть сведена к
минимуму (1—4%). Варьирование количества микробных клеток
на разных препаратах, как правило, не превышает варьирования
их числа в параллельно взятых пробах почвы. Но это положение
может быть справедливо не во всех случаях. Если влияние
пространственного фактора незначительно, то влияние на
полученные результаты фактора неодинаковости препаратов становится
/ощутимым. В таких случаях этим фактором не следует
пренебрегать. В работах других исследователей (Аристовская и др., 1977)
также показано, что достоверность более сильного варьирования
численности микроорганизмов в разных образцах по сравнению
с разными препаратами из одного образца доказывается не во
всех случаях.
Важным моментом при проведении биодинамических исследо-
203
ваний являются выявление и количественный учет влияния
пространственного фактора на изменение числа микроорганизмов.
Почва представляет собой гетерогенную среду, которая
характеризуется мозаичностью строения. Все ее свойства —
физические и химические — непрерывно изменяются в пространстве.
Даже на относительно малых пространственных интервалах
количественное и качественное варьирование этих свойств достигает
значительных размеров. При изучении временных изменений
показателей биологической активности почвы пространственная
вариабельность в значительной степени искажает получаемые
результаты.
Существует несколько подходов к устранению влияния
пространственного фактора. Это достигается, во-первых, проведением
динамических исследований в почвенных биометрах —
искусственных системах с использованием просеянной и перемешанной почвы
(Рахно и др., 1971). Причем, как отмечают сами авторы, при
наиболее существенных различиях между данными анализов
параллельных проб различающиеся пробы выбраковывались, что
неправомерно с точки зрения рендомизации отбора образцов. Этот
метод, по нашему мнению, односторонен, так как не отражает
реальных закономерностей, имеющих место в почве, и не позволяет
оценить вклад пространственного фактора во временные изменения
биологической активности почв в природе. Во-вторых, снизить
влияние пространственной неоднородности на результаты изучения
временных изменений показателей биологической активности
можно, используя для анализа смешанные образцы. Однако этот
метод не дает информации о пространственном распределении
микроорганизмов в почве, а также об относительном влиянии
пространственного и временного факторов.
В-третьих, анализ многих индивидуальных образцов почвы в
каждый срок позволяет вычленить истинный вклад
пространственного фактора в изменения численности почвенных
микроорганизмов.
Вклад пространственного фактора весьма значителен и всегда
превышает в процентном выражении вклад фактора времени
(Звягинцев, Голимбет, 1979). Влияние временного фактора
превышало влияние пространственного фактора только в случае
ежемесячных наблюдений за динамикой численности.
Доля пространственного фактора в динамике числа
микробных клеток зависит от сезона. Летом и ранней осенью
пространственный фактор проявлял себя более значительно, чем поздней
осенью и зимой. Очевидно, степень гетерогенности участков почвы
увеличивается вследствие вегетации растений, под влиянием
которых повышается степень неоднородности распределения
микроорганизмов в почве. В других почвах, согласно литературным
данным, может иметь место и обратное соотношение временного и
'пространственного факторов. Так, в почвах тундры (Паринкина,
1979) и солонцах (Ефремова, 1975) влияние фактора времени
велико и превышает влияние фактора пространства в несколько раз.
204
Эти данные по динамике численности бактерий получены при
использовании прямого счета бактерий по методу Виноградского.
Они не совпадают с таковыми, полученными методом
люминесцентной микроскопии. Влияние фактора времени, определенное
последним методом, выше по сравнению с пространственным, что,
ло-видимому, обусловлено недостатками метода Виноградского
(в основном сложностью дифференциации почвенных частиц и
клеток бактерий и недоучетом адсорбированных клеток). Таким
образом, при изучении динамики численности микроорганизмов в
одной и той же почве, но с использованием разных методов учета
клеток можно не получить сопоставимых результатов.
Поскольку существенная часть наблюдаемых изменений числа
микробных клеток обусловлена влиянием пространственного
фактора, возникает проблема разграничения флуктуации
биологической активности, обусловленных временными и
пространственными факторами.
Динамика численности микроорганизмов, трактуемая обычно
как функция времени f(t), должна рассматриваться как функция
времени и пространства f(t, р). Для вычленения влияния
пространственного фактора предлагается использовать понятие
кратности пространственного разброса Rp, которая является функцией
времени, что связано с постоянным изменением совокупности
условий, регулирующих биологическую активность в каждой
точке пространства. Временные же флуктуации численности
обусловлены только теми экологическими факторами, которые равным
образом влияют на все микрозоны почвы. Кратность
пространственного разброса есть отношение максимальной л:тах к
минимальной xmin величине численности микроорганизмов в почве в данный
момент времени:
п *тах
Ар .
*min
Кратность пространственного разброса для каждого периода
наблюдений за динамикой численности микроорганизмов имеет
свои пределы, которые характеризуются относительной
стабильностью. Кратность пространственного разброса в течение 20—
30 дней изменяется в 1,5—3,5 раза вне зависимости от сезона, в
который проводили наблюдения. Варьирование грибной биомассы
в пространстве более значительно — от 1,5 до 7,0 раз. Это может
быть связано с тем, что грибы обладают способностью в первую
очередь использовать попадающий в почву питательный субстрат
в виде соединений растительного происхождения. Поскольку в
почву поступают качественно различные растительные остатки,
в каждой точке пространства рост грибов будет проходить с
различной скоростью.
Для оценки доли влияния пространственного и временного
факторов может быть использована статистическая обработка
результатов. Однако проведение дисперсионного анализа позволяет
установить лишь достоверность полученных изменений, а также
205
выявить в процентном отношении вклад каждого фактора в
динамику биологической активности. Этот подход является
правомерным, но малоперспективным. Рассмотрение кривых изменений
численности микроорганизмов во времени в работах ряда
исследователей не позволяет установить, какая часть изменений
математически достоверна и какая — обусловлена пространственным
фактором. Сложный характер «кривых» не позволяет выявить
какие-либо закономерности в развитии микроорганизмов за
короткие промежутки времени.
Мы предлагаем иной подход к графическому представлению
и обработке полученных результатов, который заключается в
следующем.
1. Данные, полученные при изучении динамики показателей
биологической активности почвы, обрабатывают методом
многофакторного дисперсионного анализа (иерархическая схема) и
определяют, какая часть флуктуации является достоверной.
2. Вместо дискретного графического изображения
численности микроорганизмов как функции времени и пространства
предпочтительно построение непрерывной функции (рис. 32). Такое
Время, дни
Рис. 32. Ежедневная динамика численности бактерий:
/ — первичные данные, 2 — статистически обработанные данные
представление данных позволяет получить более наглядную
картину динамики численности микроорганизмов и облегчает
выявление колебаний, обусловленных только временным фактором.
3. Для устранения на графике колебаний, обусловленных
пространственным фактором, используют показатель кратности
пространственного разброса, т. е. отношение максимального значения
численности микроорганизмов к минимальному в данный момент
времени.
206
Так как RP(t) и X(t, р) (p — пространственный фактор)
являются аддитивными функциями, то с учетом пространственной
вариабельности
*<»-№*],
где X(t) — численность микроорганизмов как функция только
Бремени, X(t, p) — среднее значение численности как функция
времени и пространства.
Пространственная неоднородность существенно завышает
среднюю величину численности микроорганизмов (рис. 33), при этом
число флуктуации X(t, p) больше, чем при X как f(t).
Млрд.
4
Млрд./г почвы
16 24 32 40
Время, дни
48
40 48
Время, дни
Рис. 33. Влияние пространственного фактора на ежедневную
динамику численности бактерий в почве:
1 — без учета, 2 — с учетом пространственного фактора
Из расчетов следует, что фактор пространственной
неоднородности почвенных свойств, отраженный в кратности
пространственного разброса, есть функция времени, и его необходимо
учитывать в течение всего периода наблюдений, а не считать
постоянным, не зависящим от времени, как было предложено в ряде
работ (Никитина и др., 1979). При проведении биодинамических
исследований требуется получение большого количества
цифровых данных, что в значительной степени сказывается как на
представлении этих результатов, так и на их интерпретации.
Изменения численности микроорганизмов являются результирующей
207
воздействия самых различных факторов, поэтому вычленить
каждый в отдельности для исследователя — практически
невозможная задача. Необходимо рассматривать влияние на изменения
числа микробных клеток таких факторов, как время, пространство,,
случайные причины, хотя сами по себе перечисленные категории
не являются факторами, а лишь объединяют группы последних.
Основную трудность, заключающуюся в выделении и
разграничении колебаний численности микроорганизмов, обусловленных
временем, пространственным распределением или случайными
причинами, можно преодолеть при учете влияния неоднородности
в почве бактерий или грибов с помощью многофакторного
дисперсионного анализа и величины кратности пространственного
разброса.
Исследования, проведенные по вышеописанной методике,
позволили установить, что внутрисуточные изменения численности
бактерий и грибов малы и недостоверны во все сезоны, поэтому
при проведении биодинамических исследований в природе их не
нужно учитывать. Отсутствие внутрисуточных колебаний является
косвенным подтверждением того, что действие пространственных
и временных факторов в нашей работе раздельно правильно.
Особый случай представляет внутрисуточная динамика
микробиологических процессов. Она четко прослеживается, особенно в
ризосфере растений.
При ежедневных наблюдениях регистрируются достоверные
колебания численности бактерий и грибов с нерегулярными
периодами и разной амплитудой. Таким образом, разделение
пространственных и временных колебаний еще раз доказало реальное
существование временных колебаний. При теоретическом
рассмотрении вопроса становится очевидным, что колебаний численности
и биомассы микробов в почве может и не быть, несмотря на
активное развитие микроорганизмов: в одних микрозонах численность
увеличивается, в других — убывает, а сумма может оставаться
постоянной. Микробы развиваются в микрозонах, и трудно
представить, чтобы во всех разных микрозонах этот процесс шёл
синхронно. В настоящее время нет возможности точно определить
причины этих колебаний. Наиболее вероятные объяснения этого
явления могут быть сформулированы в виде трех гипотез. 1. Они
связаны с сукцессионными изменениями, происходящими в почве
(Звягинцев и др., 1984); микробная сукцессия в почве начинается
из-за выпадения дождей или поступления свежего органического
вещества, а также резких колебаний температуры (оттаивание-
замерзание почвы). Затем в соответствии с естественным ходом
сукцессии наблюдаются определенные максимумы в развитии
разных групп микроорганизмов: грибов, бактерий, актиномицетов.
2. В системе действуют всеобщие регуляторы роста (хищники,
паразиты, физиологически активные вещества).
3. Действие гидротермических факторов (обсуждение значения
этих факторов см. на с. ПО).
208
Механизмы регуляции численности почвенных
микроорганизмов. На любую экосистему действуют возмущающие факторы;
система обладает внутренней способностью противостоять этим,
факторам, т. е. проявляет гомеостаз. Поведение системы во
времени также представляет собой ряд флуктуации или отклонений
от некоторой равновесной точки. Наиболее просто описывается,
поведение системы при малых отклонениях от положения
равновесия." Возможные типы колебаний в этом случае определяются:
по следующему уравнению:
Xn+\ = kXn,
где Хп — мера различия между истинным и равновесным
значениями численности популяции. Если k<—1, то происходят
расходящиеся колебания, если —1<&<0 — то затухающие, при:
0<&< + 1 — экспоненциальное приближение к равновесию; при
&>-И — экспоненциальное удаление от него (Смит, 1976).
Существуют более сложные типы поведения. К ним относятся:
поведение системы, содержащей предельный цикл, т. е. вместо точки'
равновесия имеют место колебания с постоянной амплитудой;
поведение, при котором периодические колебания вокруг точки
равновесия постепенно уменьшают амплитуду; хаотическое поведение^
представляющее собой непериодическую последовательность
колебаний (Poole, 1977). Кроме того, возможны различные
стохастические • эффекты (случайные возмущения), которые могут
изменять поведение системы. В этом случае наблюдаются
псевдопериодические флуктуации.
Определение типов колебаний численности популяций во
времени на основании экспериментальных данных является мало
перспективным подходом, так как для этого необходимо огромное
числи наблюдений. Поэтому для описания динамики численности
в экологии используют более или менее адекватные модели
реальных природных объектов. Существуют два понятия термина
«модель»: «словесное» описание какого-либо явления, или
концептуальная модель, и математическая, предполагающая
определение тех или иных параметров системы. Каждая из моделей,
может описывать поведение популяции, однако механизмы,
обусловливающие это поведение, часто остаются необъясненными.
В почвенной микробиологии, в частности при изучении
динамики численности бактерий, использовали именно словесные
модели для описания механизмов регуляции численности микробных
популяций в почве. Построение математической модели также
было предпринято, однако предложенная стохастическая модель.
(Тен Хак Мун, Крысанова, 1979) не объясняет причин динамики
численности бактериальных клеток в почве.
Гипотезы, связанные с выяснением механизмов регуляции
численности почвенных бактерий, можно рассмотреть в следующем
порядке.
209
После обнаружения факта кратковременных пульсаций
численности почвенных бактерий многие исследователи склонны были
«считать, что причиной колебаний являются взаимодействия по
типу хищник—жертва или хозяин—паразит. Первые
предположения были основаны на том, что численность бактериальных клеток
при внесении в почву хищника начинает колебаться (Russel,
Hutchinson, 1909). Дальнейшие исследования (Cutler, 1923;
Singh, 1941) показали, что число бактерий снижалось при
внесении в почву простейших. Полученные данные были
использованы для объяснения взаимодействия двух групп
микроорганизмов в почве: быстрый подъем численности бактерий приводит к
увеличению численности питающихся ими простейших. В
результате развития последних происходит снижение количества
бактерий, далее, из-за недостатка пищи снижается количество
простейших, а бактерии снова начинают активно размножаться. При
увеличении числа бактерий вновь создаются благоприятные условия
для развития простейших и т. д. Однако эта гипотеза не
подтвердилась, так как периодические колебания численности были
обнаружены и в почве, лишенной простейших (Thornton, Taylor, 1935).
На современном этапе вновь появились работы,
свидетельствующие о возможной роли простейших в регуляции числа
бактерий в почве (Habte, Alexander, 1977, 1978; Danso, Alexander, 1975;
Cole et al., 1977). При внесении простейших в жидкие среды
наблюдается более резкое падение числа бактерий, чем в почве
(Sardespande et al., 1977). В почве действуют факторы,
защищающие бактерии от выедания простейшими (микрозональность
почвы, адгезия клеток бактерий и простейших, закрытые
пространства внутри структурных отдельностей). Степень защиты жертвы
от выедания хищником зависит от размеров почвенных агрегатов
(Roper, Marshall, 1978).
Численность разных видов бактерий уменьшается при
внесении в почву простейших. Однако бактерии не исчезают полностью,
но их численность устанавливается на уровне 106-7 клеток на 1 г.
Число простейших увеличивается, после чего начинаются их
гибель и переход в цисты (Hable, Alexander, 1978). В почве с
добавлением антибиотика, подавляющего развитие простейших,
число бактериальных клеток оставалось постоянным. Способность
испытанных бактерий сохраняться в исходном количестве в
почве, когда простейшие находятся в подавленном состоянии, и,
наоборот, резко уменьшаться в числе, если они становятся
устойчивыми к антибиотику, послужила основанием для утверждения,
что простейшие — основной регулятор количества почвенных
бактерий, особенно при высоких плотностях популяций.
Универсальность высказанного предположения опровергают работы, в
которых установлены более сложные взаимоотношения простейших и
бактерий (Dent et al., 1976). Обнаружено, что в природных
условиях простейшие не вызывают кратковременных периодических
изменений численности бактерий (Сукацкене, Багданавичене,
1975).
210
Взаимодействия по типу паразит—хозяин могут осуществлять-
в почве бактериофаги и внутриклеточные паразиты рода Bdelio-
vibrio. Распространенность и обширный спектр хозяев, на которые
воздействуют бактериофаги и бделловибрионы, привели к
предположению, что эти паразиты способны в природных субстратах
регулировать размеры бактериальных популяций (Stolp, Starr,,
1963; Потехина, 1973). Экспериментально в лабораторных
условиях было показано, что в течение длительного времени колебания
численности взаимодействующих особей паразит—хозяин имели
сложный нерегулярный характер с непостоянным периодом
(Афиногенова и др., 1978). Очевидно, эти взаимоотношения могут иметь
большое значение для поддержания и регуляции микробных
популяций в природной обстановке, однако выдвинутая гипотеза
имеет ряд неясностей, например влияют ли паразиты на
обитающих в почве потенциальных хозяев, разрушая их, или становятся
сбалансированными компонентами (Никитин, Никитина, 1978).
Взаимодействия в почве по типу хищник—жертва и паразит—
хозяин имеют место, но далеко не всегда правомерно объяснение
наблюдающихся флуктуации численности бактерий только за счет
этих взаимодействий. Проявление этих механизмов особенно
вероятно при очень высоких плотностях популяций.
В связи с изложенным нужно подвергнуть сомнению
универсальность математической модели по типу простейшие—бактерии
(Крысанова, 1979). Автор приписывает к случайным комплекс
всех остальных причин, от которых зависит изменение
численности бактерий, кроме выедания простейшими. Это
предположение основывается на модифицированных экспериментальных
данных (Багданавичене, Лепинис, 1973) о наличии в почве
отрицательной корреляции (г=—0,333) между численностями бактерий
и простейших. Однако коэффициент корреляции даже при его
статистической значимости указывает лишь на то, что связь является
весьма слабой. Не отрицая существования в почве взаимодействий
хищник—жертва, следует отметить, что флуктуации численности
микроорганизмов в почвах скорее всего обусловлены другими
экологическими факторами, к которым прежде всего необходима
отнести питательный субстрат. Эксперименты в хемостате для
трехзвенной системы лимитирующий субстрат — бактерии —
простейшие показывают, что действие субстрата оказывает
решающее влияние на устойчивость системы (Ладыгина, Печуркин, 1973).
Это связано с тем, что усиленное размножение жертв в
отсутствии хищника происходит не вследствие спонтанного стремления
к беспредельному размножению, а как реакция на улучшение
условий питания. Поскольку почва является структурированным
биотопом, трудно предположить, что хищничество или паразитизм
будет сильно влиять на динамику комплекса почвенных
микроорганизмов.
Регуляторами роста и развития микроорганизмов в почве, по
мнению ряда исследователей, могут выступать ингибиторы роста.
Я- П. Худяков (1958) пытался доказать образование в почве осо-
211
бого вещества периодина, обусловливающего периодичность в
развитии почвенных микроорганизмов. Он полагал, что это вещество
образуется всеми микроорганизмами и обусловливает остановку
в их развитии. Затем во время подавления развития микробов оно
окисляется кислородом воздуха, ингибирующее действие
снимается, и наблюдается новый подъем в численности микроорганизмов.
Я. П. Худякову не удалось выделить это вещество и определить
его природу, гипотеза осталась недоказанной. Однако именно он
наиболее подробно с помощью своих оригинальных методов
изучил колебания численности бактерий в почве в зависимости от
влажности, аэрации, типа почв и т. д. Следует отметить, что свою
программу исследований по биодинамике почв Т. В. Аристозская
(1975) строила, исходя из работ Я. П. Худякова.
В дальнейшем, однако, поиск веществ-ингибиторов
переключился на газообразные вещества, которые легко перемещаются в
лочве и, образуясь и улетучиваясь, могут обусловливать колебания
в численности микроорганизмов. Большое внимание было
уделено изучению в почве этилена. Этот газ способны образовывать
очень многие группы почвенных микроорганизмов и он сильно
влияет на развитие многих микроорганизмов. Поэтому этилену отводят
роль важнейшего регулятора микробной активности в почвах.
Автор гипотезы Смит (Smith, 1975) допускал особый вид
сбалансированного взаимодействия между аэробными и анаэробными
микроорганизмами в почве, которое заключается в следующем:
основными продуцентами этилена в почве являются грибы и
анаэробные спорообразующие бактерии — они образуют этилен,
подавляющий активность аэробных микроорганизмов. Потребность
в кислороде падает, последний попадает в анаэробные зоны и
лрепятствует образованию этилена. Затем цикл повторяется.
Равновесное состояние может периодически нарушаться при
поступлении питательных веществ. Гипотеза была подвергнута критике
прежде всего самим автором (Smith, 1978), но исходные ее
положения нашли свое развитие в последующих теоретических
моделях всеобщей регуляции численности микроорганизмов в почве.
Д. И. Никитин и Э. С. Никитина (1978) предлагают гипотезу,
в которой способность к регулированию численности
микроорганизмов отводится окиси этилена. Предполагается, что в основе
авторегуляции лежат три сопряженных механизма: во-первых,
образование микробами этилена, аммиака и других веществ; во-
вторых, окисление этилена идет до окиси этилена, что
затормаживает рост микроорганизмов; в-третьих, аммиак реагирует с окисью
этилена, образуя этаноламин, не являющийся ингибитором роста
бактерий, а окись этилена выводится из микросреды, происходит
восстановление условий, способствующих новому развитию
микроорганизмов. Совокупность этих процессов должна вести к
периодичности развития микроорганизмов в почве. Эта гипотеза
осталась недоказанной.
Таким образом, идея о наличии в почве регуляторов роста
микроорганизмов привлекала многих исследователей, и, вероятно,
212
в ней есть доля истины. Однако глобальность и универсальность
действия таких факторов вызывают большие сомнения.
Существенным возражением против жесткой регуляции
численности является то, что в таком структурированном биотопе, как
почва, вряд ли может действовать какой-либо всеобщий механизм
регуляции. В отдельных микрозонах микробы развиваются
обособленно. Да и результаты по очень частым периодическим
колебаниям (2—5 дней) представляются малоправдоподобными с
энергетической точки зрения. Если результаты подсчета числа
генераций на основе ежесуточных пульсаций числа клеток в почве
(Аристовская, 1972) сопоставить с числом генераций, полученных
«а основании теоретического расчета возможного числа генераций
на основе энергетических соображений, то расчет показывает, что
можно ожидать 10—30 генераций в год, т. е. даже при
исключительно благоприятных условиях период колебаний должен быть
не менее 10 дней. Близкие значения определены другими
авторами (Clark, Paul, 1970; Parkinson et al, 1978).
Отметим, что при регистрации колебаний численности
микроорганизмов в почве, которое обычно проводится с помощью
прямых микроскопических методов, микробы не только должны
погибнуть, но и лизироваться или подвергнуться выеданию
простейшими. Скорость лизиса мертвых клеток в почве неизвестна, но
трудно предположить, что она велика.
Внешние факторы, в особенности поступление питательных
веществ и гидротермические условия, оказывают значительное
влияние на число микроорганизмов в почве. Так, при недостаточной
обеспеченности влагой численность бактерий прямо
пропорционально зависит от влажности почв (Мордкович и др., 1976; Jones,
Kichards, 1977; Nelson, Visser, 1978). Наиболее четко зависимость
численности и биомассы от влажности прослеживается при
выпадении осадков после продолжительной засухи (Campbell, Bieder-
beck, 1976). Продукция микробной биомассы в почвах автоморф-
ной зоны зависит от водного баланса года, от распределения
осадков по месяцам (Никитина, Михайлова, 1976). Влияние
температурного фактора на продуктивность почвенных микроорганизмов
выяснено менее определенно. По данным ряда исследователей
(Jensen, 1934; James, Sutherland, 1940; Greaves, Jones, 1944),
температура почвы не оказывает влияния на численность бактерий,
т. е. не является ограничивающим фактором, так как пределы
выносливости микроорганизмов по отношению к температуре весьма
широки. В определенные промежутки времени численность
бактериальных клеток связана с температурным фактором прямо
пропорциональной зависимостью. Ограничивающее влияние
температуры на микробиологические процессы связано с конкретными
интервалами температур. Например, в зоне подзолистых почв при
температурах выше 7° численность бактерий меньше зависит от
температурного фактора, чем при низких его значениях (Мурдам,
Сирп, 1977). Перепады температур на рост микроорганизмов
оказывают более неблагоприятное воздействие, чем сохранение
213
экстремальных температурных значений в течение длительного
периода (Biederbeck, Campbell, 1971).
Развитие микробов в определенные периоды зависит от
лимитирующего фактора. На юге таким фактором является влага, на
севере — температура почвы. В течение небольших отрезков
времени при неизменных значениях влажности почвы роль
лимитирующего фактора отводится температуре, при постоянных
значениях температур — влажности (Campbell, Biederbeck, 1976).
Отмечаемое отсутствие коррелятивной связи численности
микроорганизмов с гидротермическим режимом почвы (Мурдам и др.,.
1979) указывает на то, что только в экстремальных условиях
температура и влажность становятся основными регуляторами
биологических процессов в почве. В почве, обогащенной питательными
веществами, экстремальный температурный режим в меньшей
степени влияет на численность и биомассу микроорганизмов
(Biederbeck, Campbell, 1971).
Численность бактерий, а также амплитуда и частота
колебаний в значительной степени зависят от сезона (Звягинцев, Голим-
бет, 1979; Голимбет, 1980). Зависимость численности от
температуры является прямо пропорциональной и может быть описана
уравнением
Х=а + ЬТ,
где —1°<Г>20° — интервал температур для дерново-подзолистой
почвы за период наблюдений; Ь — скорость изменения числа
бактерий при изменении температуры на один градус; а —
постоянный параметр.
Такая зависимость сохраняется до тех значений температура
при которых не происходит замерзания почвы.
Однако влияние температурного фактора на развитие
бактерий в почве не всегда значительно. В годы,
характеризующиеся высокой влажностью почвы, численность бактерий не была
связана с температурой пропорциональной зависимостью.
По-видимому, влияние температуры сказывается на ходе ежемесячной
динамики численности бактерий. Влажность является фактором,,
влияющим на число бактерий за более короткие сроки (7—
45 дней). В летние месяцы влажность в значительной мере
определяет интенсивность колебаний численности; в осенне-зимний
период до замерзания почвы количество влаги в ней резко не
меняется, и ее влияние на численность мало. Температура за
непродолжительные промежутки времени изменяется мало, и поэтому
не она обусловливает наблюдаемые колебания числа клеток.
Однако, если температура резко изменяется, например заморозки
летом, число бактерий резко уменьшается.
Таким образом, динамика развития бактерий в почве в
определенной мере подчиняется «закону минимума», т. е.
ограничивается на разных этапах тем фактором, величина которого, резко
изменяясь, будет оказывать влияние на микроорганизмы.
Гидротермические условия оказывают на развитие микроорга-
214
низмов косвенное влияние, замедляя или ускоряя их рост и
размножение, которые в первую очередь зависят от обеспеченности
элементами питания. Главным фактором, определяющим
интенсивность жизнедеятельности микроорганизмов в почве, является
поступление в нее легкодоступных органических веществ.
Влияние на развитие микроорганизмов гидротермических условий
опосредовано, т. е. влажность, температура и аэрация почвы
определяют интенсивность разложения поступающего питательного
субстрата, а следовательно, и скорость размножения
микроорганизмов. Кроме того, увеличение влажности почвы за счет
атмосферных осадков влечет за собой приток в почву питательных веществ,
в том числе и растворимых Сахаров, смываемых с листьев
растений (Boois, Jansen, 1976).
Частые и значительные по амплитуде колебания численности
бактерий в летний период происходят именно после выпадения
осадков. В случае, когда гидротермический режим не меняется,
питательные вещества остаются единственным фактором,
ответственным за изменения численности бактерий. В периоды, в
течение кот/орых не происходит поступления субстрата извне,
колебания численности бактерий, хотя и незначительные по амплитуде,
имеют место. Количество питательного субстрата играет
определенную роль в последующей регуляции роста микробных клеток.
Принимая тот факт, что микроорганизмы в почве пространственно
разобщены, плотность распределения их в почве можно
рассматривать как величину, лимитирующую соотношение двух
процессов: 1) скорость потребления субстрата микроорганизмами; 2)
скорость диффузии субстрата в почве, т. е. динамика численности
микроорганизмов в почве есть результирующая двух независимых
процессов. Можно выделить, как минимум, двоякое действие
питательных веществ на микроорганизмы в почве: 1) размножение
микроорганизмов за счет единовременного поступления
питательного субстрата в почву извне с растительным опадом,
атмосферными осадками и т. д.; 2) увеличение численности при
использовании имеющегося в почве субстрата, попадающего к
микроорганизмам при перераспределении за счет диффузии и других
факторов массопереноса. Этот путь в большей степени зависит от
свойств почвы.
Таким образом, приведенные факты, гипотезы и
предположения могут быть подразделены на две группы. Первую составляют
объяснения пульсаций численности за счет внутренних
механизмов микробного сообщества почвы. Это взаимодействие по типу
хищник—жертва, а также регуляция универсальными ингибиру-
ющими веществами. Вторую группу составляют предположения
о подчинении скорости роста факторам внешней среды
(доступные питательные вещества, гидротермические условия).
В почве изменения численности микроорганизмов
обусловлены в той или иной мере всеми перечисленными причинами.
Динамика популяций описывается двумя процессами, которые
определяют колебания численности во времени; модификацией и ре-
215
гуляцией (Викторов, 1971). Модификация — изменение
численности в результате случайного по отношению к популяции
изменения факторов (питания, влажности, температуры) и
регуляция, которая посредством специальных механизмов (хищничество,
паразитизм и т. д.) нивелирует возникшие флуктуации.
Рассмотрение динамики численности микроорганизмов, по<
Г. А. Викторову, представляется более перспективным в
сравнении с теориями «глобальной» регуляции, рассматривающими ее
как фактор, не нивелирующий, а, наоборот, вызывающий
флуктуации численности. Вместе с тем игнорируют влияние
модифицирующих факторов, хотя последние играют значительную роль в
жизни почвенных микроорганизмов.
Параметры динамики численности микроорганизмов в почве.
Помимо качественного описания динамики численности
микроорганизмов как результирующей действия ряда факторов
необходимо располагать информацией о ее количественной
характеристике.
При описании динамики численности за различные
промежутки времени исследователи обычно ограничиваются лишь частотой
и амплитудой наблюдаемых колебаний или ориентировочным
расчетом числа генераций. Такой подход представляется
односторонним.
Динамика численности и биомассы микроорганизмов в почве —
важный процесс, характеризующий состояние микроорганизмов в
почве, их взаимодействие с окружающей средой. Поэтому
получаемые экспериментально количественные параметры
биодинамических процессов должны быть наполнены экологическим смыслом*
таким образом, чтобы существовала возможность сопоставления
этих параметров, определенных для разных почв и при различных
условиях внешней среды.
Важным параметром является значение минимальной
численности бактерий, фиксируемое для данной почвы за
определенный период наблюдений (Звягинцев, Голимбет, 1981). Какие бы
изменения численности ни происходили, через,то или иное время
число микроорганизмов возвращается к исходному значению,
которое характеризует нижний предел численности почвенных
бактерий, т. е. фоновое содержание, или пул, макроорганизмов. Его*
величина не зависит от флуктуации внешних факторов
(температуры, влажности).
Отклонения от пула в течение коротких периодов (20—
40 дней) обусловлены влиянием внешних факторов (поступления
питательных веществ, гидротермических условий). Однако после
окончания благоприятного действия последних численность
бактерий сокращается и сохраняется на уровне нижнего пула то или
иное время.
Именно величину нижнего пула микроорганизмов, т. е.
нижнюю границу численности, определенную экспериментально,
необходимо принимать во внимание не только при изучении динамики,
но и при определении численности микроорганизмов, характерной.
216
.для определенного почвенного типа. Это связано с тем, что
амплитуда колебаний, соответственно верхний предел численности,
обусловлена в значительной мере непрогнозируемыми
экологическими факторами — выпадением осадков, изменением
температуры почвы, а также сезоном. Максимумы при росте
микроорганизмов в почве могут быть весьма большими и непостоянными.
Верхние границы численности могут перекрываться для разных
почвенных типов. При определении среднего значения
численности микроорганизмов в данной почве они будут в большей мере
отражать экологические условия периода наблюдений, чем
свойства, присущие почвенному типу. Для сопоставления численности
и биомассы микроорганизмов, характерных для разных почв, более
точным представляется сравнение нижних значений этих
величин, что будет как отражать свойства почв, так и учитывать
кратковременные изменения численности и биомассы
микроорганизмов в данной почве.
Важной характеристикой динамики численности микроорганиз-
\ -мов в почве являются амплитуда и период колебаний. Эти пара-
) метры отражают активность пула микроорганизмов и его
способность реагировать на действие возмущающих факторов
внешней среды.
Численность популяций регулируется равновесием между
двумя противоположными тенденциями: внутренним, присущим
данной популяции потенциалом роста и ограничениями,
накладываемыми на этот рост средой, в частности необходимыми
источниками питания.
При наличии питательных веществ число микроорганизмов в
лочве начинает возрастать. По мере роста численности
питательные вещества истощаются, и среда не в состоянии обеспечить
ими на прежнем уровне. Поэтому после достижения некоторого
значения, соответствующего определенному соотношению условий
среды, численность бактериальных клеток начинает сокращаться.
Однако в течение некоторого времени размножение и смертность
бактерий уравновешивают друг друга, и не происходит ни роста,
ни сокращения численности. Это равновесное состояние
соответствует общеэкологическому понятию «емкость среды» (К). При
рассмотрении комплекса почвенных микроорганизмов под
емкостью среды подразумевается та численность, после превышения
которой начинается убыль числа клеток, т. е. максимальное
значение численности, наблюдаемое при выведении комплекса
почвенных микроорганизмов из равновесного состояния. Емкость
почвенной среды — функция времени и зависит от сезона, т. е. от
соотношения внешних факторов.
Необходимо оговориться, что понятие «емкость среды» по
отношению к почвенным организмам весьма относительное и его нужно
применять с большой осторожностью. Как известно, впервые
понятие «емкость среды» было применено для определения количества
травоядных животных, которые могут прокормиться на данной
территории без существенного нарушения травяного покрова и
217
всей экосистемы. Определяя количество микроорганизмов в
почве, можно узнать только число зачатков микроорганизмов,
большая часть из которых находится в покоящемся состоянии, но не
активные популяции (это запас, а не активно размножающиеся
особи). Другое ограничение состоит в том, что почва это не среда
обитания, а множество сред обитания, на что уже указывалось
ранее. Хотя, конечно, можно сказать, что определенное
поступление органических веществ в определенную почву в связи с ее
особенностями и гидротермическими условиями может обеспечить в
определенный период времени определенный максимум в общей
численности бактерий или грибов, а также в количестве целлю-
лозоразрушающих или каких-либо других микроорганизмов,
который и можно считать емкостью среды.
В последнее время начинает ощущаться необходимость
определения емкости почвы по отношению к определенной видовой
(штаммовой) популяции бактерий или грибов.
Видимо, в определенные периоды емкость почвы может быть
очень большой при отсутствии лимитации. Известно, что
популяции могут поддерживаться в почве на уровне 108-9, но недолго.
Механизмы антибиоза опускают их на уровень 106 и ниже. Если:
говорить об общей массе почвы, емкость среды всегда
ограничена в первую очередь каким-либо лимитирующим фактором.
Если микробы выходят за пределы емкости среды, то данный тип
почвы разрушается (например, осваиваемые болота).
В общем, динамику численности и биомассы почвенных
микроорганизмов можно представить следующим образом.
1. В почве находится определенное число микроорганизмов,,
присущее данному почвенному типу. Эту численность можно
рассматривать как пул микроорганизмов, т. е. то содержание их*
которое в состоянии поддерживать почва при отсутствии
благоприятствующих росту факторов внешней среды. Значению пула
соответствует минимальная численность микроорганизмов в
почве, зафиксированная при изучении динамики численности. Ее
можно обозначить как Х0.
2. При воздействии благоприятствующих росту факторов на
пул почвенных микроорганизмов численность последних начинает
расти. Рост будет характеризоваться кажущейся удельной
скоростью jx и будет происходить в течение времени t\.
3. По мере роста микроорганизмов питательный субстрат
будет истощаться, и в какой-то момент времени tk численность их
достигнет равновесного состояния, когда питательных веществ не
будет хватать для дальнейшего размножения. Численность
микроорганизмов, характерная для этого состояния, соответствует
емкости среды (К).
4. После того как питательный субстрат будет исчерпан,,
начнется постепенное отмирание микроорганизмов, которое будет
идти с кажущейся удельной скоростью отмирания К и займет
время t2.
5. Поскольку полного отмирания микроорганизмов в почве не
218
происходит, процесс сокращения численности идет до
определенного ее значения, соответствующего пулу микроорганизмов (Х0).
Дальнейшее развитие микроорганизмов будет зависеть от
модифицирующих факторов: либо начнется новый подъем либо
численность будет соответствовать уровню пула.
Формально процесс роста микроорганизмов можно представить
в виде системы дифференциальных уравнений:
-^-==Xo\i ll — "у") ПРИ t от 'о Д° 'к.
— =Х0Х (-ZL — 1 \ при t от tK до tl9
Xt=K при t = tK,
~-^^К+Х0 (\—Jj±.\ (|a—Л) при t от t0 до t%.
Проведенная формализация позволяет рассчитать кажущиеся
удельные скорости роста и отмирания бактерий, а также
некоторые другие показатели роста: время удвоения, число генераций,
продуктивность. Эти величины являются непостоянными и зависят
как от сезона, так и от конкретного года наблюдений. За
вегетационный период проходит, по-видимому, до двух генераций
каждые 10 дней. Но развитие бактерий не является строго
периодичным, а зависит от случайных поступлений питательного субстрата
в почву, поэтому за одни промежутки времени число генераций
-будет значительно (за 7—10 дней — 2—4 генерации), а за
другие— невелико (за 10 дней—1,5 генерации) (Звягинцев, Голим-
<5ет, 1981). На основании составленного баланса углерода в почве
хвойного леса Паркинсон и др. (Parkinson et al., 1978)
определяют среднее время генерации периодом в 45 дней, т. е. примерно
10 генераций в год. По данным других исследователей (Flanagan.
Van Cleve, 1977), число генераций в год составляет 20.
Теоретический расчет показывает (Звягинцев и др., 1976; Hisset, Gray,
1975; Macdonald, 1979), что, исходя из максимально возможных
величин поступающего в почву питательного субстрата, число
генераций не будет превышать 10—30 в год. По данным некоторых
исследователей, число генераций может составлять от 8 до 18 в
месяц (Зыкина, 1972; Скалой, Пуревдорж, 1978). Вероятно,
последние величины характерны только для относительно небольших
промежутков времени, например вегетационного периода, с
другой стороны, может влиять несовершенство применяемых методов
учета, биометрической обработки, а также недоучет
пространственного распределения бактерий в почве.
Для грибов данные о параметрах роста, рассчитанные на
основании учета кратковременных изменений длины мицелия в почве,
в литературе практически отсутствуют. Кажущиеся удельные
скорости роста и отмирания грибов гораздо выше, чем бактерий, что
может свидетельствовать о ведущей роли грибов в разложении
растительных остатков (Звягинцев, Голимбет, 1983а, б).
219
Важным показателем активности микроорганизмов в почве
является их продуктивность. Сравнение имеющихся в литературе
данных по биомассе и продуктивности микроорганизмов весьма
затруднительно, так как получаемые результаты зависят от
способа учета и условий эксперимента. В качестве приблизительной
оценки можно привести следующие величины (Witkamp, 1974):
общая максимальная продуктивность микроорганизмов в почве
при благоприятных условиях может достигать 1 г/м2 за сутки (при
биомассе микроорганизмов 25 г/м2). При косвенном методе учета
продуктивности на основании изменений численности
микроорганизмов показано, что в летние месяцы в дерново-подзолистой
почве бактерии синтезируют до 0,5 мг биомассы на 1 г почвы, в
зимний период за те же сроки — 0,25 мг, т. е. в два раза меньше.
Продуктивность грибов за тот же срок составляет несколько
десятков миллиграммов на 1 г почвы при биомассе 1—3 мг/г почвы
(Голимбет, 1980). Для других почв этот показатель достигает
63 мг/г почвы (Martinez, Ramires, 1978) или до 70 г/м2 (Wynn-
Williams, 1979), при этом 80% приходится на долю грибов.
Динамика численности почвенных микроорганизмов с точкк
зрения устойчивости биологических сообществ.
Общеэкологические подходы предполагают рассмотрение динамики численности
популяций с точки зрения устойчивости экосистемы в целом.
Совокупность популяций для того, чтобы успешно функционировать,,
должна обладать определенной степенью устойчивости, т. е.
численности популяций не должны испытывать таких колебаний,
которые могут увести далеко от равновесного состояния и даже
разрушить экосистему. Пользуясь более строгим определением,.
можно сказать, что экосистема устойчива, если траектория ее
модели в фазовом пространстве не будет выходить за пределы
заданной ограниченной области при некоторых возмущениях
достаточно широкого спектра (Свирежев, Логофет, 1978). Иначе
говоря, все изменения численности должны иметь определенные
нижние и верхние пределы.
Комплекс почвенных микроорганизмов также должен обладать
определенной степенью устойчивости. Это подтверждается на
примере дерново-подзолистой почвы, в которой все наблюдаемые
колебания численности могут быть сведены к следующим типам:
1) колебания с относительно постоянными амплитудой (кратность
2—3 раза) и периодом (10—20 дней); 2) колебания с большой
амплитудой (4—6 раз) и менее продолжительным периодом (4—
8 дней); 3) в течение определенных промежутков времени
численность бактерий находится на неизменном уровне.
По-видимому, и в первом и в последнем случаях комплекс
почвенных микроорганизмов находится в равновесном устойчивом
состоянии, так как представления об устойчивости предполагают,,
что «равновесие» — это сохранение численности организмов либо
на постоянном уровне, либо путем колебаний фиксированной
амплитуды и частоты (May, 1973). Колеблющаяся таким образом
система постоянно возвращается к определенному устойчивому
220
уровню, которому может соответствовать минимальная
численность бактерий, фиксируемая для периода наблюдений, или пул
бактерий в данной почве.
Очевидно, что для каждой почвы будут существовать свои
верхние и особенно нижние пределы численности. Колебания с
большой амплитудой выводят систему из состояния равновесия,,
однако величина амплитуды, судя по литературным данным,
ограничена для каждой почвы. Математическое моделирование в
экологии предусматривает различные типы колебаний численности,,
о которых было упомянуто выше: от самых простых (затухающих
или расходящихся колебаний) до сложных (с предельным
циклом).
Таким образом, динамика численности и биомассы почвенных
микроорганизмов — вполне закономерный процесс,
обусловленный, с одной стороны, микробными взаимоотношениями,
имеющими место в почве (регулирующие факторы), а с другой —
свойствами самой почвы и влиянием внешних (модифицирующих)
факторов, в особенности гидротермическими условиями и
поступлением доступных питательных веществ. Совокупное влияние
модифицирующих и регулирующих факторов определяет сложность
происходящих в почве изменений численности. Наиболее сложный
характер имеет кратковременная динамика микробной
численности и биомассы, зависящая в основном от поступления в почву
питательного субстрата. Наиболее частые и значительные по
амплитуде колебания происходят при поступлении в почву с дождевой
водой растворимых органических веществ. При отсутствии
питательных веществ амплитуда колебаний численности уменьшается,,
а их период растягивается. В некоторые промежутки времени,
численность микроорганизмов в почве находится на определенном
постоянном уровне. Это значение численности можно
рассматривать как важную характеристику почвы, а именно запас, или пул,,
микроорганизмов, который почва в состоянии поддерживать. Под
действием благоприятных условий внешней среды происходит
увеличение числа клеток и соответственно их массы. Количество его
можно оценить с помощью расчета числа генераций, а также
величины продуктивности. Число генераций микроорганизмов r
почве непостоянно и зависит от периода наблюдений. В среднем,,
исходя из максимально возможных величин поступающего в почву
питательного субстрата, число генераций не превышает, как уже
отмечалось, 10—30 в год.
УПРАВЛЕНИЕ МИКРОБНЫМИ ПОПУЛЯЦИЯМИ
В ПОЧВАХ
Нет ничего более желательного и необходимого для почвенных
микробиологов, чем управление микробными популяциями в
почве. Напомним, что под микробной популяцией мы понимаем
группу микроорганизмов, выполняющих определенную экологическую
функцию и занимающих определенное пространство (Звягинцев
и др., 1976). Как популяцию можно рассматривать группу
микроорганизмов, осуществляющих азотфиксацию, нитрификацию, де-
нитрификацию, разложение целлюлозы, крахмала, лигнина, хитина
или какой-либо другой процесс. При этом популяция может быть
представлена либо только бактериями, как при азотфиксации,
либо и бактериями и грибами, как при разложении целлюлозы.
•Она может быть представлена и аэробными и анаэробными
бактериями, как при азотфиксации. Как популяцию можно
рассматривать и более узкие группы микроорганизмов, например аэробные
азотфиксаторы или только азотобактер. Популяция может быть
представлена определенным видом или штаммом микроорганизма.
Изучение видовых и штаммовых популяций представляется
наиболее перспективным и в последнее время дает наибольшие
результаты.
На определенном этапе развития сельского хозяйства, когда
оно было преимущественно экстенсивным, ставилась задача
интенсификации микробиологических процессов с целью ускорения
круговорота веществ и увеличения поступления питательных
веществ прежде всего из органического вещества почвы.
Выяснилось, что эта цель, хотя бы частично, достигается довольно легко
с помощью обычных агротехнических приемов: вспашки, рыхления
почвы, внесения небольших доз органических и минеральных
удобрений. Наконец, «омоложение» экосистемы, которое происходит
при культивировании сельскохозяйственных монокультур,
приводит к интенсификации микробиологических процессов и к
ускорению круговорота веществ. Однако, естественно, происходит
уменьшение содержания органического вещества в почве, в том числе
и гумуса, что через определенный срок приводит к
неблагоприятным последствиям — ухудшению почвенной структуры,
агрофизических и агрохимических свойств почв, хотя имеют место
временный положительный эффект и увеличение урожая. Особенно четко
и благоприятно интенсификация микробиологических процессов
222
проявляется в первые годы после освоения целинных участков^.
Однако в условиях интенсивного химизированного .земледелия
ускорение микробиологических процессов уже далеко не всегда
является желательным, и появляется настоятельная необходимость
частичного их подавления, прежде всего для сохранения в почве
азотных удобрений и органического вещества, а также
благоприятной структуры и высокой емкости поглощения почвы. Напомним,,
что при освоении торфяников и торфяных почв происходит
настолько интенсивное разложение органического вещества, что слой
торфа уничтожается за несколько десятков лет, а иногда и
быстрее.
Подавление микробиологических процессов представляется
проблемой более сложной, чем их интенсификация. Однако
разрешение этой проблемы также необходимо. Пока она частично-
решается в отношении подавления активности определенных групп
микроорганизмов. Например, для подавления нитрификации и де-
нитрификации с успехом применяют специфические ингибиторы
нитрификации.
Для сохранения органического вещества почвы, вероятно, было
бы целесообразно подавлять прежде всего активность грибов.
Поскольку по современным представлениям грибы являются
главными утилизаторами органических веществ в почве, подавление-
их активности должно оказать сильное воздействие на замедление
скорости разложения органического вещества. Грибы являются
эукариотами, и существует принципиальная возможность
подавления их активности без сильного воздействия на прокариотные
микроорганизмы (бактерии). Функции бактерий более
многообразны и более важны для нормального круговорота многих
питательных элементов, и избирательное подавление активности грибов
представляется оправданным. Однако практические результаты
в этом направлении невелики. Ингибиторы грибов — фунгициды —
применяются пока главным образом для подавления популяций
фитопатогенных грибов.
В перспективе более важны методы, которые позволили :бы
регулировать не только активность широких групп
микроорганизмов, но и узких видовых и штаммовых популяций.
Подходы к изучению такого регулирования будут
рассмотрены ниже.
В последнее время крупные успехи в изучении микробных
популяций были достигнуты при изучении на штаммовом уровне.
Успехи определились новыми появившимися методическими
возможностями — изучением динамики популяций искусственно
внесенных в естественную нестерильную почву генетически
маркированных штаммов микроорганизмов. Пользуясь этим методом,
исследователи заложили основы нового направления в почвенной
микробиологии — популяционной экологии почвенных
микроорганизмов (Звягинцев, 1982). Как известно, популяционная
экология является важным разделом экологии как науки. Однако до
последнего времени в почвенной микробиологии этот раздел был
223
очень мало разработан. Больше занимались изучением экологии
сообществ почвенных микроорганизмов. Для изучения экологии
популяций почвенных микроорганизмов в естественной почве не
-было методов. В настоящее время для этих целей в почвенной
микробиологии широко применяется генетическая маркировка,
маркировка по люминесценции колоний и некоторым другим
культурным признакам, а также иммунолюминесценция.
Однако управление микробными популяциями в почве
остается делом очень сложным, и теоретические основы этого вопроса
почти не рассматривались. Известно, что микробиологи весьма
успешно управляют микробными популяциями при производстве
ряда пищевых продуктов (уксуса, кефира, сыра и т. д.). Хорошо
управляет микробными популяциями техническая микробиология.
Наметились явные успехи в управлении микробными
популяциями при очистке сточных вод (применяются введение чистых и
смешанных культур микроорганизмов, а также изменение состава
микробных комплексов). Радужные перспективы в этом
отношении рисуются геологической микробиологией (выщелачивание
металлов, добыча нефти). В почвенной микробиологии вопрос об
управлении микробными популяциями обстоит значительно
сложнее, чем в отмеченных областях микробиологии. Причина такого
положения заключается прежде всего в отсутствии видов или
штаммов микроорганизмов, которые бы абсолютно доминировали
в проведении определенных экологических процессов в почве (это
положение будет подробно рассмотрено ниже). Здесь отметим
только, что управление микробными популяциями в почве
становится особенно необходимым в условиях интенсивного
химизированного сельского хозяйства и его нужно решать в ближайшее
время (Звягинцев и др., 1986). Если раньше задача
формулировалась как управление имеющимися в почве популяциями или
как интродукция недостающих популяций, то теперь прибавилась
проблема целесообразности или нецелесообразности внесения
мутантов и новых генотипов, создаваемых генной инженерией.
Особенно настойчиво вопрос о введении в почву новых форм
микроорганизмов в настоящее время ставят генные инженеры.
Они мало знакомы с экологией, и им представляется необходимым
разрешить две проблемы: 1) определить, какой микроорганизм
доминирует в осуществлении процесса в почве; 2) определить,
какие полезные свойства необходимо придать этому (этим
немногочисленным) микроорганизму. Генетики и технические
микробиологи, привыкшие работать с чистыми культурами, считают эти
вопросы главными. Однако эколог должен на первое место
поставить вопрос о возможности успешного существования
внесенного микроорганизма и позаботиться о том, чтобы поднять
уровень его численности и активности до такой высоты, чтобы он
мог оказывать реальное воздействие на экосистему.
Рассмотрим последовательно состояние знаний по трем
затронутым вопросам.
Определение доминирующих форм в почве интересовало многих
224
почвоведов-микробиологов. При рассмотрении проблемы сразу
следует подчеркнуть, что для микроорганизмов нет прямой
пропорциональности между количеством и биомассой клеток, с одной
стороны, и их активностью — с другой. Поэтому необходимо четко
разграничивать доминирование численное и доминирование в
проведении определенных экологически важных процессов. Кроме
того, нельзя допускать ошибку, которая постоянно делается
почвенными микробиологами. Установив доминирование той или иной
формы на определенной питательной среде, начинают говорить о
•ее доминировании в почве. Однако такое заключение
необоснованно, так как на любой питательной среде вырастает не более
10%, а обычно 0,1% от общего количества микроорганизмов,
обитающих в почве, или же еще меньше.
В последнее время экспериментально изучается вопрос о
доминировании микроорганизмов в проведении определенных
процессов в почвах. Его нужно рассматривать отдельно для
следующих систем: 1) почва без легкодоступных органических веществ;
2) почва, обогащенная легкодоступными органическими
веществами; 3) ризоплана растений; 4) микробы и беспозвоночные
животные.
В первом случае на определенных питательных средах удается
-выделить численно доминирующие формы. Особенно четко это
¦было показано на спороносных бактериях и ряде других групп
микроорганизмов Е. Н. Мишустиным (1947, 1975). В последние
годы большая работа в этом направлении проведена Т. Г. Мирчинк
(1976, 1982), причем были приняты строгие критерии для
установления степени достоверности полученных результатов. В разных
почвах доминирующие формы различны. Это положение имеет
важное научное значение и является крупным достижением
отечественных микробиологов. Однако эти формы не являются
абсолютными доминантами, и таких доминирующих форм оказывается
много, если определения ведутся среди разных групп бактерий,
актиномицетов, грибов, дрожжей и т. д. Проявляется одна из
важнейших особенностей строения комплекса почвенных
микроорганизмов, заключающаяся в наличии в почве огромного пула самых
разнообразных по функциям и систематическому положению
микроорганизмов, причем каждый процесс дублируется
многочисленными разными микробами (Звягинцев, 1980). Почва без свежих
юрганических остатков и без растений с автохтонной
микрофлорой представляет собой среду, очень благоприятную для
поддержания жизнедеятельности микроорганизмов, но неблагоприятную
для их активного размножения. Это запас большого количества
-самых разных микробов, каждый из которых при возникновении
-благоприятных для его развития условий, т. е. выхода системы
из равновесного состояния, включается в проведение процессов
и возвращает систему в состояние гомеостаза. Нужно отметить,
что в почве без свежего органического вещества относительные
доминанты скорее численные, чем функциональные, так как в
такой почве вообще все превращения осуществляются очень мед-
«8 Д. Г. Звягинцев
225
ленно и главным образом в процессах поддержания, а не
активного роста. Следует подчеркнуть, что в доминанты часто попадают
микроорганизмы, способные давать обильное спорообразование
(аспергиллы, пенициллы), или микробы, дающие устойчивые
переживающие формы (эндоспоры), однако ни те ни другие активных
процессов не ведут.
Численное доминирование покоящихся или переживающих
форм имеет большое значение для их быстрого развития при
появлении благоприятных условий. Из нескольких конкурентов,
которые в принципе могут проводить процесс при заданных
условиях, очень часто побеждает тот, численность которого к началу
возникновения процесса была максимальной (Гузев и др., 1985).
Таким образом, рассмотрев систему, представляющую собой
почву без органического вещества, можно прийти к выводу, что
в ней нет абсолютных доминантов, а есть только относительные,,
но и они доминируют по количеству, а не в проведении процессов.
Если говорить о почве с автохтонной микрофлорой в целом, та
поражает разнообразие встречающихся форм. Комплекс
почвенных микроорганизмов климаксен по своей природе в любой
сформировавшейся почве, включает очень много видов, не имеет
абсолютно доминирующих видов и скорее похож на фитоценоз
тропического дождевого леса с огромным разнообразием видов, чем на
фитоценоз тайги, где четко выделяются абсолютные доминанты.
Сделанное заключение относится не к активно развивающимся
формам, а к общему запасу видов. Однако в каждый данный
момент времени большинство из них находится либо в состоянии
покоя (при низких отрицательных температурах, засухе и т. д.),.
либо представлено переживающими клетками, которые находятся
в состоянии поддержания, но не активного роста. Для избежания
недоразумений следует оговориться, что климаксность комплекса
почвенных микроорганизмов понимается несколько условно в
отношении богатства и разнообразия микробного пула почв, а не в
отношении их одновременного функционирования.. Однако
возможен и другой подход к рассмотрению этого вопроса. При
сравнении комплексов почвенных микроорганизмов в почвах разных
типов или в разных почвенных генетических горизонтах с полным
основанием можно говорить о большей сложности одного
комплекса по сравнению с другим.
Иначе обстоит дело с доминирующими микроорганизмами в
почве, обогащенной легкодоступными органическими веществами*
Исследования, которые мы провели с использованием метода
инициированного микробного сообщества (Гузев и др., 1980;
Звягинцев и др., 1982), показали, что при разложении данного органи-
ческого вещества в определенных условиях (температура, влаж-
ность, концентрация питательных элементов, рН, содержание
токсикантов) выделяются 2—4 доминирующих вида, которые
осуществляют процесс разложения органического вещества. Если
изменить условия, то появляются другие доминирующие виды.
Основных видов, образующих наибольшее количество биомассы, и в
226
этом случае будет немного, что согласуется с выводами С. Н. Ви-
ноградского (1952) и данными, полученными другими методами.
Правда, абсолютное доминирование вида в проведении
определенного процесса сохраняется недолго. В почве с разлагающимся
органическим веществом идет непрерывная сукцессия
микроорганизмов, и через некоторое время одни доминанты сменяются
другими. Таким образом, рассматривая естественную почву, в
которую локально попадают самые различные питательные вещества
(отмершие корешки, тела беспозвоночных, опад), можно сделать
вывод, что, хотя в каждом месте и в данное время имеются
физиологические доминанты, ведущие процесс, в совокупной массе
почвы таких «доминирующих» форм много, т. е. абсолютного
доминирования опять не наблюдается.
Зона ризопланы представляет особый интерес, так как именно
микроорганизмы, находящиеся в непосредственном контакте с
растением, могут оказывать наибольшее влияние на их рост и
развитие. Напомним, что по современным представлениям
микроорганизмы концентрируются только в непосредственной близости от
корня растения. Зона концентрирования бактерий
распространяется на десятки микрометров от поверхности корня.
Концентрирования микроорганизмов в ризосфере в старом понимании этого
термина, т. е. в зоне, отстоящей от корня на расстояние до двух-
трех тысяч микронов (2—3 мм), не происходит. Поэтому, изучая
действие на растение бактерий, следует сосредоточить внимание
на рассмотрении ризопланы или весьма ограниченной по
протяженности ризосферы, которая простирается всего на 100 мкм от
поверхности корня (Звягинцев и др., 1982).
Вопрос о существовании абсолютного доминирования видов в
ризосфере остается открытым и требует дальнейшего самого
пристального изучения. Наиболее перспективным путем его изучения
яам представляется исследование в ризосфере (ризоплане)
динамики искусственно внесенных генетически маркированных
популяций при одновременном учете общего количества бактерий с
помощью прямого люминесцентно-микроскопического метода при
окрашивании бактерий акридином оранжевым, а также
использования метода подсчета на обычных питательных средах. Тогда мы
будем обладать сведениями о действительном количественном
доминировании определенных видов и групп. Те данные, которыми
почвенная микробиология обладает в настоящее время, не дают
возможности однозначно решить вопрос о доминировании в
ризосфере. Однако некоторые сведения имеются. В ризосфере
доминируют неспороносные бактерии, широко представлены и
псевдомонады. Это ценный вывод, но если вспомнить, что большинство
растений обладает микоризой, то вопрос об абсолютном
доминировании неспороносных бактерий становится совсем неочевидным.
Существуют ли абсолютно доминирующие виды или штаммы
среди бактерий? Мы пытались хотя бы частично решить этот вопрос,
внося в ризоплану бобовых и небобовых растений клубеньковые
бактерии и артробактер. Внесенные бактерии после установления
8*
227
стабильного состояния составляли не более 1% или даже 0,1% or
общего количества бактерий, учитываемых на МПА. Интересно и
важно, что внесение маркированной популяции на уровне 10ь и
даже 107 клеток на 1 г не оказывало влияния на динамику бак-
терий, учитываемую прямым счетом (Кириллова и др., 1984;
Звягинцев и др., 1982; Лисичкина и др., 1983). Было высказано
предположение, что артробактеры являются типично почвенными
микроорганизмами и должны элиминироваться из ризопланы. Однако-
наши опыты по внесению артробактера в ризоплану показали, что
этот микроорганизм хотя и не дает обильного размножения, но и.
не исчезает из ризопланы, а стабилизируется в HelL причем на
довольно высоком уровне численности — 105—106 клеток на 1 г
(Кириллова, 1983). Эти и ряд других данных заставляет считать, что
в ризоплане, вероятно, нет абсолютных доминантов. Особый
случай представляют микоризные грибы. Как симбиотические
микроорганизмы, а не просто почвенные они, очевидно, могут
приобретать доминирующее положение.
Рассмотрение вопроса о доминирующих формах в почве
заставляет сделать заключение, что абсолютных доминантов в почве
нет, и именно этим она отличается от всех тех местообитаний, где
удается успешно управлять микробными популяциями.
Отсутствие абсолютных доминантов является принципом строения
комплекса почвенных микроорганизмов и позволяет ему
осуществлять разнообразнейшие функции и поддерживать гомеостаз. ?.сли.
появляются абсолютные доминанты, которые распространяются на
значительный объем почвы, то наступает явление, подобное
«цветению» воды, когда экосистема функционирует ненормально.
«Цветение» почвы, видимо, гораздо труднее вызвать, чем «цветение»-
воды, что связано с наличием в почве гораздо более богатого в
количественном и качественном отношениях пула
микроорганизмов, гораздо большей «микробиологической буферностью» почв,,
их структурированностью.
Таким образом, если в почву вносят определенную популяцию»
микроорганизма, нужно учитывать, что она должна проявлять-
свою активность и воздействовать на экосистему в условиях
отсутствия абсолютного доминирования.
Нелегко ответить и на вопрос: какие ценные свойства следует
придать вносимым популяциям? Теоретически наибольшего
эффекта можно ожидать от внесения микроорганизмов, которые
должны только сохраняться в почве на достаточно высоком
уровне в течение достаточного промежутка времени (клубеньковые
бактерии, микоризные грибы, фитопатогенные микроорганизмы),.
а процессы они будут осуществлять уже в растении, где они
достигнут доминирования. Эти микроорганизмы и дают наиболее
надежные положительные результаты. Основную работу по
фиксации азота клубеньковые бактерии проводят внутри клубеньков,
в корне растения, когда только они одни там и находятся и
полностью доминируют. Почва же в большинстве случаев прекрасно*
выполняет функцию поддержания популяции клубеньковых Оак-
228
терий до момента заражения растения. Иногда количество
бактерий падает в почве до уровня, более низкого, чем необходимо
для успешного заражения бобовых растений, но это
наблюдается только в некоторых случаях. Микориза оказывает очень
сильное действие на рост и урожай растений (Tinker, 1982). Она
эффективно обеспечивает растение фосфором и значительно
улучшает азотное питание растений. Микориза не фиксирует азот, но,
устраняя лимитирование по фосфору, создает лучшие условия и
для азотного снабжения (Dommergues, 1982). Лимитирование ро^
ста азотом, видимо, очень редко встречается в естественных
экосистемах и является больше проблемой сельскохозяйственных
угодий. Микоризные грибы осуществляют свою функцию в симбиозе
с растением, как и клубеньковые бактерии, при явном
доминировании мицелия микоризного гриба и явном доминировании роста
этого гриба по сравнению с почвенными микроорганизмами.
Можно успешно создавать провокационные фоны фитопато-
генных грибов, искусственно внося их в почву для определения
устойчивости нового сорта растения к патогену. И в этом случае
почва выступает как среда для сохранения микроорганизма, д
активное развитие его наблюдается внутри растения.
Значительно сложнее обстоит дело с теми микроорганизмами,
которые хотят внести в почву, чтобы они непосредственно в ней
осуществляли определенный процесс.
Рассмотрим сначала проблему с азотфиксаторами. Существ
вует идея передачи генов азотфиксации доминирующим почвен^
ным бактериям, внесения этих бактерий в почву и обеспечения
за их счет снабжения азотом растения (Klingmuller, 1979).
Однако такая постановка вопроса вызывает ряд возражений.
Во-первых, по существующим в настоящее время представлениям
большинство почвенных прокариот способно осуществлять азотфикса-
цию. Ацетиленовый метод показывает, что 70—80% культур
бактерий, выделяемых из почвы на питательные среды, фиксирует азот
(Умаров, 1986). Поэтому непонятно, зачем к многочисленным
имеющимся в почве азотфиксирующим штаммам добавлять еще
один. Очевидно, это имело бы смысл, если бы он мог занять
доминирующее положение, и ему досталась бы главная часть
органического вещества, и он мог бы фиксировать значительное
количество азота. Однако абсолютного доминирования внесенного
штамма добиться не удается.
В последнее время очень много работ проведено с азоспирил*
лой, которую некоторые исследователи считают почти симбиоти-
ческим организмом. Но убедительных данных о возможности ее
доминирования в ризоплане растений нет, и представления об
образуемом ею симбиозе весьма проблематичны. Отметим, что
каждый из симбионтов имеет ряд генов, которые контролируют
симбиоз. В случае с азоспириллой этого не показано. Если это
симбиотический микроорганизм, он должен иметь специфические
рецепторы и адгезины для прикрепления к корню, тогда его
доминирование может быть избирательным. Рецепторы и адгезины, как
229
известно, детерминируются генетически. В последнее время
появились некоторые работы, которые доказывают генетическую
обусловленность прикрепления азоспириллы к корням проса и
распространяют лектиновую теорию на азоспириллу (Umali-Garcia et al.,
1980; Dazzo, 1984), но эти работы нуждаются в подтверждении.
Азотфиксация — процесс, который в естественной почве
основан на азотфиксирующей активности очень многих бактерий.
Каждый вид фиксирует небольшое количество азота, но в сумме
его фиксируется довольно много (десятки килограммов на
гектар в год). Попытка перестроить комплекс почвеяных
микроорганизмов так, чтобы этот процесс осуществлял одинЧшкроорганизм,
видимо, обречена на неудачу. Внесение лишнего азотфиксатора
также ничего не может дать по сравнению с первоначальным
положением. Другое дело — внесение бактерий, у которых
азотфиксация не подавляется в присутствии больших количеств
азотсодержащих соединений во внешней среде. Таких микробов пока
нет, но их, вероятно, можно создать. Однако их доминирование
трудно будет вызвать. Здесь скорее может помочь плазмида,
передающая соответствующие свойства, которая начала бы
циркулировать во внешней среде от одного микроорганизма к другому.
Роль плазмид в кодировании экологически важных свойств
микроорганизмов в настоящее время хорошо понята, и ее изучению
уделяется очень много внимания. В проблеме имеется и еще одна
трудность, которая состоит в том, что микробы-азотфиксаторы
одновременно являются и денитрификаторами. Поэтому в
определенных условиях среды внесенные азотфиксаторы могут дать
начало денитрификации. Для успешного решения проблемы
улучшения азотного питания растений за счет азотфиксации нужно
учитывать, что по каким-то причинам природа чрезвычайно
«боится» избытка азота в экосистемах. Имеется ряд
микробиологических механизмов для предотвращения накопления избытка азота.
К азотфиксации .способны только прокариоты. Ни грибы ни
высшие растения не могут проводить этот процесс. Уже здесь
заложены основы для предотвращения избыточного накопления азота.
В климаксных растительных сообществах, как известно, почти нет
бобовых растений, которые могли бы в симбиозе с клубеньковыми
бактериями накапливать значительные количества связанного
азота. Хорошо известно поведение почвенных микроорганизмов,
которое проявляется при внесении в почву азотных удобрений. В
действие вступают денитрификаторы и нитрификаторы, которые
быстро удаляют азот в воздух и в грунтовые воды, причем
эффективность их деятельности в этом отношении весьма велика.
Способность сохранять гомеостаз по содержанию в почве связанного
азота обеспечивается с помощью разных микробиологических
процессов — нитрификации, денитрификации, иммобилизации в
клетках, прекращения азотфиксации при наличии азота в среде,
которые достаточно эффективно осуществляются благодаря
наличию в почве микробного пула — большого и разнообразного по
составу (Звягинцев, 1978). Принцип дублирования, по которому
230
строится комплекс почвенных микроорганизмов, делает систему
весьма устойчивой и способной к быстрому устранению избытка
азота. Таким образом, проблема успешного внесения несимбиоти-
ческих микробов-азотфиксаторов представляется весьма трудной.
Сложно обосновать необходимость внесения микробов,
разрушающих труднодоступные органические и минеральные соединения
фосфора (так называемый фосфоробактерин или аналогичные
препараты) или разрушающие силикаты, так как все эти
микроорганизмы есть в любой почве, причем представлены многими и
разнообразными видами.
Какие же микроорганизмы полезно вносить? Первыми
претендентами на эту роль среди свободноживущих микроорганизмов
могут быть микробы-продуценты физиологически активных
веществ, так как они своими выделениями могут сильно
воздействовать на окружающую среду даже в том случае, если они не
доминируют, а занимают достаточно скромное положение. Это могут
быть микробы сверхсинтетики, но они должны быть генетически
стабильными и не ревертировать в дикие штаммы. Не все
микробы, синтезирующие определенные физиологически активные
вещества, присутствуют в почве, по крайней мере в легко
определяемом количестве, поэтому внесение их может быть легко
обосновано. Однако внесение этих микробов следует проводить, если
будет с безусловностью доказано, что физиологически активные
вещества (антибиотики, токсины, ферменты, некоторые
аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, некоторые липиды и
жирные кислоты, поверхностно-активные вещества, стимуляторы
роста растений (гормоны) типа гиббереллина, ауксинов, цитокини-
нов, витамины, летучие органические вещества сильного
биологического действия) играют существенную роль в природных
условиях в межорганизменных связях в экосистемах. В настоящее
время в модельных опытах с обильным внесением в почву
микроба-продуцента и органического вещества с несомненностью
показано, что в таких условиях микробы могут оказывать очень
сильное действие на рост растений. Однако все еще не ясно,
насколько сильно они могут действовать на растения в естественных
условиях (Звягинцев, 1980). Такие исследования необходимы.
К сожалению, в последнее время проведение таких работ
сократилось. Обусловлено это прежде всего методическими
трудностями. Однако в настоящее время разработаны очень точные
методы, например определение в растениях некоторых токсинов и
антибиотиков, которые можно было бы использовать. В ряде
случаев нужно было бы применить метод меченых атомов.
Путем внесения микробов могут решаться и другие проблемы.
Например, применение гербицидоустойчивых или фунгицидоустой-
чивых клубеньковых бактерий на почвах, загрязненных этими
веществами, может дать возможность добиться хорошего
образования клубеньков.
Особого рассмотрения заслуживает вопрос о целесообразности
внесения в почву определенных микробов для борьбы с различ-
231
ными загрязнениями. Такие микробы успешно используются для
очистки сточных вод, причем подбираются культуры в
зависимости от характера загрязнителей (углеводороды, фенолы, анилины
и т. д.). Внесение культур, разлагающих углеводороды, для
очистки почв, загрязненных нефтью или нефтепродуктами, оказалось,
по мнению ряда авторов, мало перспективным, так как в почве
всегда содержатся микробы, способные утилизировать самые
различные углеводороды. Этим почвы отличаются от природных вод
{моря, океаны), где внесение культур углеводородразлагающих
микроорганизмов дает явно положительный результат при очистке
от нефтепродуктов. В почве же, как оказалось, обычно достаточно
создать хорошую аэрацию и внести необходимые питательные
вещества, иногда и легкодоступные источники углерода, которые
служат для развития кометаболизма.
Почвы не содержат микроорганизмов, способных разлагать
некоторые пестициды, или их разложение затягивается на очень
долгий срок. Оказалось, что можно селекционировать культуры,
которые могут проводить такие процессы. Например, выделены
бактерии, разлагающие ДДТ. Однако внесение их в почву не дает
положительного результата. Это и понятно. Из-за отсутствия
доминирования какого-либо микроба в почве внесенный
микроорганизм займет лишь очень небольшое число микрозон и получит
малое количество вещества, оказавшегося в этих микрозонах. Эти
рассуждения особенно относятся к ДДТ, который весьма слабо
растворим и локализован в небольшом числе микрозон.
Таким образом, несмотря на ряд сложностей, стоящих на пути
эффективного внесения в почву популяций микроорганизмов, эта
проблема продолжает быть в почвенной микробиологии одной из
главных.
Для успешного внесения той или другой популяции необходимо
понимать законы ее развития в почве. Для разрешения этого
вопроса в настоящее время наиболее перспективно изучить динамику
в почве искусственно внесенных генетически маркированных,
например антибиотикоустойчивых, популяций. Такие исследования
проведены в разных странах, в том числе и в нашей (Звягинцев,
1982; Звягинцев и др., 1982а, б; Полянская и др., 1983; Лимарь
и др., 1984; Панчишкина и др., 1984; Кожевин, 1976; Полянская,
1978; Кочкина, 1981; Михайлов, 1982). Внесенная популяция в
почве, как правило, не погибает, а достигает уровня динамической
стабилизации. Четкое исключение в экспериментах составили
только две группы: 1) микроорганизмы с высокими тратами на
поддержание. Они не переносят длительного голодания, и срок
полужизни популяций в условиях голодания очень короток; внесение
в почву легкодоступного органического вещества обычно приводит
к их выживанию в почве; 2) микроорганизмы, для которых рН
почвы оказывается слишком низким, а нейтрализация рН
приводит к развитию данных микроорганизмов в почве. Вероятно, есть
еще ряд условий, которые могут вызвать гибель внесенной попу-
ляции в почву, но строго экспериментально их влияние еще не
232
установлено. Обычно же внесенная популяция входит в комплекс
почвенных микроорганизмов и занимает в нем свое место, хотя
процент клеток новой популяции к общему количеству клеток в
почве будет очень невелик даже при высокой дозе внесения
(106—109 клеток на 1 г почвы). Свойство почвы принимать
популяцию, которой в ней не было, объясняется принципом
ненасыщенности почв микроорганизмами (Звягинцев, 1978).
Второе важное свойство внесенной популяции состоит в том,
что уровень стабилизации численности зависит от уровня
внесения. Чем выше уровень внесения, тем выше уровень стабилизации.
Следовательно, чтобы добиться существенного влияния внесенной
популяции на процессы в экосистеме, нужно вносить ее очень
много (6—10 т/га живых микроорганизмов). Тогда они будут
составлять существенную часть от биомассы почвенных микробов.
Но такое внесение, конечно, невозможно по экономическим
соображениям.
Однако имеются пути и для повышения уровня численности
внесенной популяции. Меняя окружающие условия (уровень
содержания питательных веществ, температуру, влажность, рН,
стадию микробной сукцессии в почве), можно добиться повышения
содержания микроорганизмов в почве. Как показали наши
эксперименты, с низкого популяционного уровня (102—103 клеток на
1 г почвы) довольно легко в лабораторных условиях поднять по-
пуляционную плотность на 2—4 порядка. При высокой популяции
онной плотности подъем численности осуществляется с большим
трудом, но также возможен, правда, он происходит обычно в
меньших масштабах. Однако очень трудно удержать популяцию
на уровне больше, чем 106 клеток на 1 г почвы, хотя сама задача
повышения численности оказалась выполнимой (Полянская и др.,
1984). Отметим, что повышение популяционной плотности легче
достигается для микроорганизмов, отличающихся r-стратегией, .и
труднее — для микроорганизмов, представляющих собой К-страте-
гов. Для r-стратегов легче добиться более высокого
популяционного уровня. Напомним, что к r-стратегам относятся организмы,
характеризующиеся высокими темпами размножения,
способностью к популяционным взрывам при появлении «экологического
вакуума», слабовыраженной зависимостью наблюдаемой удельной
скорости роста от популяционной плотности, широким диапазоном
уровней стабилизации, резким изменением популяционной
плотности во времени, наиболее благоприятны для их развития
начальные стадии сукцессии. Микроорганизмы с К-стратегией
приспособлены не к быстрому размножению, а к сохранению
равновесного уровня. Они характеризуются более низкими темпами
размножения, выраженной зависимостью наблюдаемой удельной
скорости роста от плотности популяции, узким диапазоном уровней
стабилизации, малым изменением во времени популяционной
плотности, наиболее благоприятны для их развития поздние
стадии сукцессии.
В процессе изучения взаимодействия внесенных микробных
233
популяций выяснилось новое принципиально важное положение,
которое подтверждает надежды на возможность управления
микробными популяциями в почве. Несмотря на то что по биомассе
внесенные популяции составляют только доли процента от общей
биомассы микроорганизмов, содержащейся в почве, популяции,
внесенные на уровне 105—106 клеток на 1 г почвы, взаимно или
в одностороннем порядке влияют на другую внесенную
популяцию (Полянская, 1978; Звягинцев и др., 1982; Полянская и др.,
1983; Михайлов, 1983). Вероятно, такое взаимодействие, когда на
две взаимодействующие клетки приходится 1000чк^еток
почвенных микробов, возможно в первую очередь через действие
физиологически активных веществ. Задачей дальнейших исследований
является уточнение уровня популяционной плотности, на котором
еще проявляется взаимодействие, причем, вероятно, этот уровень
зависит от типа почвы и других конкретных условий
взаимодействия популяций. В наших исследованиях взаимодействие
осуществлялось через антибиотики (Полянская и др., 1983; Звягинцев
и др., 1982) и ферменты (Полянская, 1978). В последнем случае
была высказана следующая гипотеза: одна популяция
вырабатывает и выделяет во внешнюю среду в почву активные
гидролитические ферменты, а другая, не обладая собственными гидролазами,
использует продукты гидролиза — мономеры, которые образуются
во внешней среде благодаря действию гидролаз микроба
партнера.
Регулируя окружающие условия, можно по намеченной схеме
(рис. 34) поднимать, понижать или поддерживать на определенном
уровне численность определенной популяции в почве. Так, вне-
Рис. 34. Динамика популяции внесенного в
естественную нестерильную почву
микроорганизма:
а — популяция имеет резко выраженный
максимум численности, а затем погибает;
б — популяция имеет резко выраженный
максимум численности, а затем
стабилизируется на достаточно высоком уровне;
в, д — численность популяции
сохраняется на уровне внесения; г — уровень
популяционной плотности повышается после
внесения, и равновесие наступает при
высокой популяционной плотности; N —
численность клеток на 1 г почвы
сение простых источников углерода (глюкоза) дает возможность
поднять численность популяции иногда на 2—4 и даже 5
порядков, т. е. в 100—100 000 раз. Внесение микробов, обладающих
гидролитической активностью, или внесение полимеров (целлюлозы,
хитина) дает возможность не только повысить популяционную
плотность, но и поддержать ее длительное время на высоком
уровне. Удержание популяции на очень высоком уровне (108—
1010 клеток на 1 г почвы) представляется трудным и даже невоз-
Время, сут
234
можным, так как, согласно нашим представлениям, при
повышении уровня популяционной плотности выше 106 клеток начинают
активно действовать механизмы антибиоза (антибиотики,
выедание простейшими, действие паразитов типа бделловибрионов).
Однако кратковременный подъем до этого уровня вполне
достижим. В некоторых случаях можно элиминировать популяцию (см.
рис. 34,а), в других — поддержать ее на высоком уровне
(рис. 34,6).
Изучение общих законов поведения микробных популяций в
почве, определяемое методом искусственного внесения в почву
маркированных популяций, даст ключ к управлению микробными
популяциями в почве и особенно в ризоплане растений.
Литература
Абдрашитова С. А., Илялетдинов А. Н., Мынбаева Б. Н.,
Абдуллина Г. Г. Окисление трехвалентного мышьяка микроорганизмами,
адсорбированными на инертных материалах // Прикл. биохимия и микробиол. —
1982.—Т. 18. —№ 2.
Аксенов СИ. Состояние воды и ее роль в динамике биологических
структур: Автореф. дис... д-ра биол. наук. — М., 1978.
Алиев С. А., Г а д ж и е в Д. А. Влияние вертикальной зональности почв
на сезонную динамику микробиологических процессов // Изв. АН АзССР, сер.
биол. наук.— 1977. — № 1.
Аристовская Т. В. Микробиология подзолистых почв. — М— Л.,
1965.
Аристовская Т. В. Теоретические аспекты проблемы численности,
биомассы и продуктивности почвенных микроорганизмов//Вопросы
численности, биомассы и продуктивности почвенных микроорганизмов. — Л., 1972.
Аристовская Т. В. О некоторых итогах работ по Международной
биологической программе в области почвенной
микробиологии//Закономерности развития почвенных микроорганизмов. — Петрозаводск, 1,975.
Аристовская Т. В., Тен Хак Мун, Ефремова Т. Н.,
Зыкина Л. В., П а р и н к и н а О. М. О методических подходах к изучению
количественных изменений микрофлоры почвы//Почвоведение.— 1977. — № 4.
Афиногенова А. В., Ратнер Е. Н., Ламбина В. А. Колебания
численности бделловибрионов и бактерии-хозяина в двухкомпонентной систе-
ме//Микробиология.— 1978. — Т. 47 — Вып. 2.
Багданавичене 3. П. Динамика изменений численности и биомассы
бактерий в дерново-подзолистой супесчаной почве // Закономерности развития
почвенных микроорганизмов. — Петрозаводск, 1975.
Багданавичене 3. П., Лепинис А. К. Кратковременные
колебания численности и месячная продукция биомассы бактерий в некоторых
почвах Литовской ССР//Труды АН ЛитССР.— 1973. — № 3.
Барышникова Л. М., Быковская С. В., Головлев Е. А.
Отношение коринеподобных бактерий к концентрации органического вещества//
Микробиология. — 1980. — Т. 49. — вып. 6.
Б о г о е в В. М. Количественная оценка численности, биомассы и
биологической активности почвенных микроорганизмов в экосистемах некоторых
природных зон: Автореф. дис... канд. биол. наук. — М., 1981i.
Великанов Л. Л. Адсорбция почвами и глинистыми минералами
микроорганизмов и их метаболитов: Автореф. дис... канд. биол. наук. — М., 1969.
Великанов Л. Л., Звягинцев Д. Г. Развитие бактерий на средах
с адсорбентами при различных значениях рН//Почвоведение.— 1968. — № 1.
Великанов Л. Л., Звягинцев Д. Г. Доступность адсорбированных
235
аминокислот для дефицитных по ним мутантов Е. сой //Биол. науки.— 1968.—
№ 8.
Вернадский В. Н. Очерки геохимии. — Л., 1926.
Вершинин П. В., Мельникова М. К., Мичурин Б. Н. Основы
агрофизики. — Л., 1959.
Викторов Г. А. Трофическая и синтетическая теория динамики
численности популяций насекомых//Зоол. журн. — 1971. — Т. 50. — Вып. 3.
Виленкин Б. Я. Взаимодействующие популяции // Математическое
моделирование в экологии. — М., 1978.
Винберг Г. Г., Яровицына Л. И. Размножение бактерий и
поглощение кислорода в воде//Микробиология.— 1946. — Т. 15. — Вып. 6.
Виноградский С. Н. Микробиология почвы. — М., 1^52.
Гайдамакина Л. Ф. Динамика общей численности помесячная
продукция почвенных микроорганизмов на территории Нижнедонского
стационара//Изв. Сев.-Кавк. науч. центра высш. школы. — 1978.—№ 2.
Гарбара С. В., Ротмистров М. Н. Деструкция гексаметилендиами-
на культурой Bacillus subtilis в среде с глинистыми
минералами//Микробиология.—1982.—Т. 51. — Вып. 2.
Германов Ф. Н. К методике непосредственного счета бактерий в
почве // Микробиология. — 1932.— Т. 1|. — Вып. 4.
Гиляров М. С. Особенности почвы как среды обитания. — М., 1949.
Голимбет В. Е. Временные и пространственные изменения некоторых
показателей биологической активности дерново-подзолистой почвы. Автореф.
дисс... канд. биол. наук. — М., 1980.
Гончар-Зайкин П. П., Дынкин Л. Д., Дынкин С. Д.,
Журавле в О. С. Модель газообмена в системе микроорганизмы — почва —
атмосфера//Моделирование биоценотических процессов. —- М., 1981,.
Головачева Р. С. Прикрепление клеток Sulfobacillus thermosulfidooxi-
dans к поверхности сульфидных минералов//Микробиология.— 1979. — Т. 48.—
Вып. 3.
Голодяев Г. П. Биологическая активность горно-лесных почв Южного
Приморья // Вопросы численности, биомассы и продуктивности почвенных
микроорганизмов. — Л., 1972.
Гузев В. С, Вызов Б. А., Звягинцев Н. Д., Звягинцев Д. Г.
Эффект задержки в регуляции микробного разложения полимеров в почве по
типу катаболитной репрессии//Изв. АН СССР, сер. биол. — 1986. — № 1.
Гузев В. С, На мир X. Ш., Селецкий Г. И., Звягинцев Д. Г.
Влияние минерального азота на конкурентные отношения микроорганизмов в
почве // Вести. Моск. ун-та, сер. почвовед. — 1985. — № 1».
Гузев В. С, Левин С. В., Звягинцев Д. Г. Реакция микробной
системы почв на градиент концентрации тяжелых металлов // Микробиология. —
1985.—Т. 54. — Вып. 3.
Гузев В. С, Б о н д а р е н к о Н. Г., Вызов Б. А., М и р ч и н к Т. Г.,
Звягинцев Д. Г. Структура инициированного микробного сообщества как
интегральный показатель оценки микробиологического состояния
почвы//Микробиология. — 1980. — Т. 49. — Вып. 1.
Гузев В. С, Жарикова Г. Г., Звягинцев Д. Г. Изучение
поверхности микробных клеток методом электрофореза // Микробиология. — 1,972. —
Т. 41. —Вып. 4.
Демкина Т. С, Олейников Р. Р. Сезонная динамика численности
и биомассы микроорганизмов некоторых почв Московской
области//Почвоведение и агрохимия, проблемы и методы. — Пущино, 1977.
Дианова Е. В., Ворошилова А. А. Поглощение бактерий почвой и
его влияние на микробиологическую деятельность // Научно-агроном. журн.—
1,925. —№9.
Додзин М. Е., Кожевин П. А., Полянская Л. М.,
Звягинцев Д. Г. Способ выделения из почвы микроорганизмов — продуцентов
антибиотиков. Авт. свид. — 1987. — № 438001.
Евдокимова Г. А. Динамика численности микроорганизмов в
ризосфере некоторых злаков в условиях Кольского полуострова//Почвоведение.—
1973. — № 12.
236
Евдокимова Г. А. Динамика биологической продуктивности
бактериальных сообществ в ризосфере злаков//Почвоведение.— 1976.— № 12.
Егорова С. В., Стефурак В. П. Динамика численности и биомассы
-бактерий в лесных почвах и влияние на нее влажности, температуры и
удобрений // Динамика микробиологических процессов в почве и обусловливающие
«е факторы. — Ч. II. — Таллин, 19,74.
Егорова С. В., Стефурак В. П. Влияние удобрений на численность,
•биомассу и продуктивность бактерий в горно-лесных почвах Карпат //
Закономерности развития почвенных микроорганизмов. — Петрозаводск, 1975.
Е г у н о в М. А. Законы роста микробных колоний и размножение. — Пг.,
1915.
Ежова Н. М., Заикина Н. А., Шатаева Л. К. Сорбционные
свойства карбоксильных катионитов, обладающих бактериостатическим
действием // Прикл. биохимия и микробиол. — 1980. — Т. 16. — № 3.
Ефремова Т. Н. Динамика кратковременных колебаний численности
«бактерий в некоторых почвах полупустыни//Закономерности развития
почвенных микроорганизмов. — Петрозаводск, 1975,.
Жизнь микробов в экстремальных условиях/Д. Кашнер. — М., 1,981,.
Забродский А. Г., Мовчан А. А. О влиянии адсорбентов на
спиртовое брожение // Биохимия. — 1952. — Т. 1,7. — Вып. 5.
Заварзин Г. А. К понятию микрофлоры рассеяния в круговороте угле-
рода//Журн. общ. биол. — 1970. — № 4.
Заварзин Г. А. Литотрофные микроорганизмы . — М., 1972.
Заварзин Г. А. Экстенсивная микробиология//Изв. АН СССР, сер.
биол. —1976. —№ 1.
Заварзин Г. А. Бактерии и состав атмосферы. — М., 1984.
Загуральская Л. М. Сезонная динамика биологической активности
переходных торфяных почв Карелии//Сезонная динамика почвенных
процессов. — Таллин, 1979.
Звягинцев Д. Г. Адсорбция микроорганизмов поверхностью стекла//
Л Микробиология. — 1959а. — Т. 28. — Вып. h
Звягинцев Д. Г. Об активности бактерий, адсорбированных
почвенными частицами // Микробиология. — 19596. — Т. 28. — Вып. 4.
Звягинцев Д. Г. Опыт применения флуоресцентной микроскопии для
изучения почвенных микроорганизмов//Науч. докл. высш. школы, биол.
науки.—1959в.—№ 2.
Звягинцев Д. Г. Изучение микрофлоры ризосферы с помощью
флуоресцентной микроскопии в отраженном свете // Микробиология. — 1962а. —
Т. 31. —Вып. 1.
Звягинцев Д. Г. К вопросу об адсорбции микроорганизмов
почвенными частицами // Почвоведение. — 1,9626. — № 2.
Звягинцев Д. Г. Влияние катионов на адсорбцию микроорганизмов
поверхностью стекла//Науч. докл. высш. школы, биол. науки.— 1962в.—
№ 2.
Звягинцев Д. Г. Адсорбция микроорганизмов почвами и ее влияние
«а их активность//Микроорганизмы в сельском хозяйстве. — М., 1963.
Звягинцев Д. Г. Влияние антибиотиков, адсорбированных почвенными
частицами, на развитие свободных и адсорбированных микроорганизмов//
Науч. докл. высш. школы, биол. науки. — 1964а. — № Г.
Звягинцев Д. Г. Изучение форм и размеров почвенных
микроорганизмов при помощи флуоресцентной микроскопии//Почвоведение.— 19646.—
№ 3.
Звягинцев Д. Г. Влияние степени увлажнения на количество
микроорганизмов, развивающихся в почве // Вестн. Моск. ун-та, сер. биол.,
почвовед. — 1966. — № 4.
Звягинцев Д. Г. Адсорбция почвами микроорганизмов и ее влияние
на их жизнедеятельность: Автореф. дис... д-ра биол. наук. — М., 1969.
Звягинцев Д. Г. Развитие микроорганизмов в тонких капиллярах и
пленках // Микробиология. — 1970а. — Т. 39. — Вып. 1,.
Звягинцев Д. Г. Оценка количества микроорганизмов в почвах
разных типов // Микроорганизмы в сельском хозяйстве. — М., 1,9706.
237
Звягинцев Д. Г. Методы учета численности микроорганизмов в
почвах//Вопросы численности, биомассы и продуктивности почвенных
микроорганизмов. — Л., 1972.
Звягинцев Д. Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми по^
верхностями. — М., 1973.
Звягинцев Д. Г. Проблемы биохимии почв//Вестн. Моск. ун-та, сер.
почвовед.— 1977. — № L
Звягинцев Д. Г. Биологическая активность почв и шкалы для оценки,
некоторых ее показателей //Почвоведение. — 1978а. — № 6.
Звягинцев Д. Г. Некоторые концепции строения и функционирования
комплекса почвенных микроорганизмов // Вестн. Моск. ун-та, сер. почвовед. —
19786. — № 4.
Звягинцев Д. Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. —
М., 1980а. \
Звягинцев Д. Г. Современные проблемы экологии почвенных
микроорганизмов//Микробиология окружающей среды. — Алма-Ата, 19806.
Звягинцев Д. Г. Динамика микробных популяций в почвах //
Структура и функции микробных сообществ почв с различной антропогенной
нагрузкой.— Киев, 1982.
Звягинцев Д. Г. Проблемы молекулярной биологии в современном;
почвоведении // Почвоведение. — 1985. — № 3.
Звягинцев Д. Г. Значение анабиоза в жизни почвенных
микроорганизмов. «Анабиоз». — Рига, 1987.
Звягинцев Д. Г., Андреева Т. А. Оптимизация условий
предварительной ультразвуковой обработки на установке УЗДН-i перед проведением.
микробиологического анализа//Вестн. Моск. ун-та, сер. почвовед. — 1978.—
№ 2.
Звягинцев Д. Г., Андреева Т. А., Гузева И. С, Коже*
вин П. А. К методике ультразвуковой обработки при количественном учете
почвенных и ризосферных микроорганизмов//Микробиология. — 1976. — Т. 45.—
Вып. 4.
Звягинцев Д. Г., Борисов Б. И., Б о б к о в а Т. С.
Микробиологическое воздействие на поливинилхлоридную изоляцию подземных трубопровод
дов//Вестн. Моск. ун-та, сер. биол., почвовед.— 1971. — № 6.
Звягинцев Д. Г., Великанов Л. Л. Влияние адсорбентов на
активность бактерий, растущих на средах с аминокислотами//Микробиология.—
1968. —Т. 37. —Вып. 6.
Звягинцев Д. Г., Воробьева Е. А., Горчарук Л. М., Ан^
д рее в а Т. А. Сравнительная характеристика активности почв вертикальных
зон//Проблемы и методы биологической диагностики почв. — М., 1976.
Звягинцев Д. Г., Г у з е в В. С, Л е в и н С. В. Изменение комплек- 'J
са почвенных микроорганизмов под воздействием антропогенных нагрузок//
//Проблемы почвоведения. — М., 1986.
Звягинцев Д. Г., Галкина Г. М. Обработка ультразвуком как
способ подготовки почв к микробиологическому анализу//Микробиология.—
1967. —Т. 36—Вып. 6.
Звягинцев Д. Г., Голимбет В. Е. Динамика численности
почвенных бактерий, учитываемых разными методами//Микробиология.— 1979а.—
Т. 48. — Вып. 5.
Звягинцев Д. Г., Голимбет В. Е. Кратковременные изменения
биомассы грибов и бактерий в дерново-подзолистой почве//Микробиология.—
19796. —Т. 48. —Вып. 6.
Звягинцев Д. Г., Голимбет В. Е. О кратковременных изменениях
численности микроорганизмов в почве//Микробиология. — 1981,— Т. 50.—
Вып. 3.
Звягинцев Д. Г., Голимбет В. Е. Биомасса микробов в почве и \/
их активность // С.-х. биология. — 1983а. — № 12. *'
Звягинцев Д. Г., Голимбет В. Е. Динамика микробной
численности, биомассы и продуктивность микробных сообществ в почвах//Успехи
микробиологии. — 19836. — Т. 18.
Звягинцев Д. Г., Гузев В. С. Концентрирование и разделение бак^
238
терий на анионите Дауэкс//Микробиология. — 1971,. — Т. 40. — Вып. 1,.
Звягинцев Д. Г., Гузев В. С, Г уз ев а И. С. Адсорбция
микроорганизмов в связи с этапами их развития // Микробиология. —1977. — Т. 46. —
Вып. 2.
Звягинцев Д. Г., Дмитриев Е. А., Галкина Г. М. Влияние
способа подготовки почвы к микробиологическому анализу на количественный <
учет бактерий // Микробиология. — 1966. — Т. 35. — Вып. 2.
Звягинцев Д. Г., Зенова Г. М., Михайлов В. В. Динамика
численности и структура популяций актиномицетов-антагонистов в почве //
Микробиология. — 1982. — Т. 51. — Вып. 3:.
Звягинцев Д. Г., К о ж е в и н П. А. Изучение динамики популяции
Rhizobium leguminosarum с помощью
иммунолюминесценции//Микробиология. — 1974. — Т. 43. — Вып. 6.
Звягинцев Д. Г., Кожевин П. А., Кириллова Н. П.
Экологическая характеристика ризосферы // Проблемы почвоведения. — М., 1982.
3 в я г и н ц е в Д. Г., Кожевин П. А., К о ч к и н а Г. А.,
Полянская Л. М. Микробная сукцессия в почве и определение экологических
стратегий конкретных популяций // Микробиология. — 1981,. — Т. 50. — Вып. 2.
Звягинцев Д. Г., Кожевин П. А., Малахов В. В. Экологические
проблемы в почвенной микробиологии / Журн. общ. биол.— 1976. — Т. 37.
Звягинцев Д. Г., Кириллова Н. П., Кочкина Г. А.,
Полянская Л. М. Методы изучения микробных сукцессии в почве //
Микроорганизмы как компонент биогеоценоза. — М., 1984а.
Звягинцев Д. Г., Кочкина Г. А., Кожевин П. А. Новые
подходы к изучению сукцессии микроорганизмов в почве//Почвенные организмы
как компоненты биогеоценоза. — М., 19846.
Звягинцев Д. Г., Лукин С. А., Лисичкина Г. А.,
Кожевин П. А. Способ более полного количественного учета микроорганизмов в
лочве // Микробиология. — 1984. — Т. 53. — Вып. 4.
Звягинцев Д. Г., Перцовская А. Ф., Яхнин Е. Д., Авер-
«б а х Э. И. Определение величины адгезии клеток микроорганизмов к твердым
поверхностям // Микробиология. — 1971. — Т. 2. — Вып. 6.
Звягинцев Д. Г., Питрюк А. П. Развитие микроорганизмов в
проточных и непроточных капиллярах разной толщины//Микробиология. — 1973.—
Т. 42. —Вып. 1.
Звягинцев Д. Г., Стасевич Г. А., Кожевин П. А. Определение
плотности клубеньковых бактерий в почве//ДАН СССР.—1982. — Т. 262.—
№ 4.
Звягинцев Д. Г.. Гиличинский Д. А., Благодатский С. А.
л др. Длительность сохранения микроорганизмов в постоянно мерзлых
осадочных породах и погребенных почвах//Микробиология. — 1985. — Т. 54.—
Вып. 1.
Зенова Г. М. Роль метаболитов во взаимодействии микроорганизмов в
-ассоциациях в природных экосистемах//Экологическая роль микробных
метаболитов.— М., 1986.
Зыкина Л. В. Ежедневная динамика численности бактерий в дерново-
подзолистой почве под луговыми угодьями//Вопросы численности биомассы
и продуктивности почвенных микроорганизмов. — Л., 1972.
Иванушкина Н. Е. Влияние температуры и водного потенциала на
рост и развитие почвенных грибов: Автореф. дис... канд. биол. наук. М., 1984.
Израильский В. П. Хранение клубеньковых бактерий в высушенном
состоянии//Труды ВНИИ с.-х. микробиологии.— 1951, — Т. 12.
Ильина К. А., Касенова А. А., Фролова Л. Ф. Способ
хранения культуры Th. ferrooxidans. Авт. св. СССР, кл. С 12 № 1/100 № 859439. —
Имшенецкий А. А. Микробиология целлюлозы. — М., 1953.
Каравайко Г. И. Микробиологические процессы выщелачивания
металлов из руд. Центр международных проектов ГКНТ. — M., 1984, с. 88.
Карпенко В. И., Малашенко Ю. Р., Варламов В. П.,
Рогожин С. В. Иммобилизация клеток метанокисляющих
бактерий//Микробиология. — 1980. — Т. 49. — Вып. 3,
239
Карпинская Н. С. К вопросу о поглощении бактерий в почве // Науч. -
агроном, журн. — 1926. — № 9.
Кестельман В. Н., Бедлинская М. С, Остромухова Л. Г.
Исследование влияния полимерных материалов на процесс ацетонобутилового
брожения //Микробиологический синтез. — 1969. — № 2.
Кириллова Н. П. Динамика численности микробных популяций в
системе почва — растение в условиях модельных опытов: Автореф. дис... канд.
биол. наук. М., 1983.
Кириллова Н. П., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г.
Определение доступной микроорганизмам поверхности почвы при расчетах популяци-
онной плотности // Вестн. Моск. ун-та, сер. почвовед. — 1983. — № 3.
Кириллова Н. П., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г. Динамика
клубеньковых бактерий на корнях проростков гороха//Микробиология.—
1984. —Т. 53. — № 1. \
Кожевин П. А. Люминесцентно-микроскопическое изучение комплекса
микроорганизмов и отдельных микробных популяций в почве: Автореф. дис...
канд. биол. наук. М., 1976.
Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г. Проблема оценки численности
почвенных микроорганизмов//ДАН СССР.—1980. —Т. 250. —№ 2.
Кожевин П. А., Полянская Л. М., Звягинцев Д. Г.
Динамика развития различных микроорганизмов в почве//Микробиология.— 1979.—
Т. 48. — Вып. 2.
Козлов Г. С. Изучение выживаемости дизентерийных и тифозных
микробов в испражнениях, высушенных на фильтровальной
бумаге//Лабораторное дело. — 1968. — № 6.
Козловская Л. С. Некоторые аспекты динамики численности
беспозвоночных в болотных почвах//Сезонная динамика почвенных процессов.—
Таллин, 1979.
Колпакчи А. П., Исаева В. С, Жвирблянская А. Ю.,
Казанцев Э. Н., С е р о в а Е. Н., Р а т т э л ь Н. Н. Закрепление
пивоваренных дрожжей на полимерных материалах//Прикладная биохимия и
микробиология. — 1976. — Т. 12. — № 6.
Колчева Б. А. Микробиологическая характеристика почв Болгарии//
//Природа.—1955. — № 9.
Кондратьева Л. М. О динамике развития бактерий в почвообразую-
щей породе//Сезонная динамика почвенных процессов. — Таллин, 1979.
Костычев С, Рыск о л ьч у к А., Шевцова О. Биохимическое
исследование над Azotobacter agile II Дневник Всесоюзного съезда ботаников.
Л., 1926.
К о ч к и н а Г. А. Сукцессии почвенных микроорганизмов и место в них
конкретных микробных популяций: Автореф. дис... канд. биол. наук, М., 1981.
К о ч к и н а Г. А., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г.,
Морфологические критерии в популяционном анализе клубеньковых бактерий // ДАН
СССР. — 1980. — Т. 255. — № 2.
Кочкина Г. А., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г. Метабиотиче-
ские взаимодействия, способствующие выживанию клубеньковых бактерий в
почве // Микробиология. — 1981. — Т. 50. — Вып. 6.
Красильникова-Крайнова А. И. Адсорбция клубеньковых бак-"
терий различными типами почв и ее влияние на эффективность применения
нитрагина // Учен. зап. Горьковск. ун-та. — 1,954. — Вып. 25.
Крысанова В. П. О применении концепции «хищник — жертва» и
«стохастическая среда» к анализу динамики микробоценозов в почве // Биоди-,
намика и плодородие почвы. — Таллин, 1979.
Крюков В.. Р. Развитие водородных бактерий на твердых поверхно-,
стях//Микробиология. — 1981. — Т. 50. — Вып. 2.
К у р Д и н а Р. М., Б о р у к а е в а М. Р. Влияние наполнителей на
интенсивность микробиологических процессов // Труды Ин-та микробиол., виру-
сол. АН КазССР. — 1962. — Т. 6.
Кузнецов В. Д., Родионова Е. Г., Ян гулов а И. В.,
Семенов С. М. Длительное хранение актиномицетов в виде почвенных культур//
//Антибиотики. —1973. —Т. 18. — № 12.
240
Ладыгина В. П., Печуркин Н. С. Анализ поведения трехзвенногсу
микробного ценоза с учетом непосредственного влияния 1,-го звена на 3-е.
Экспериментальное и математическое моделирование искусственных и природных
экосистем. — Красноярск, 11973;.
Лимарь Т. Е., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г. Сравнение
количества микроорганизмов в почвах разных типов, выявленного с помощью
чашечного метода и люминесцентной микроскопии // Науч. докл. высш. школы
биол. науки.— 1975. — № 9.
Лимарь Т. Е., Полянская Л. М., Кожевин П. А..
Звягинцев Д. Г. Приемы повышения численности клубеньковых бактерий в почве//
// Микробиология. — 1984. — Т. 53. — Вып. 5.
Листичкина Г. А., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г.
Динамика численности Rhizobium japonicum в ризосфере и ризоплане различных
растений // Микробиология. — 1983. — Т. 52. — Вып. 4.
Литвинов Л. С Карбынь Е. М. Наблюдения над влиянием
адсорбентов на энергию брожений//Труды Ин-та физиол. раст им К А
Тимирязева.—1949.—Т. 6.—Вып. 2. ' v
Мавлянова М. И. Динамика накопления почвенными простейшими
биомассы на различных фонах удобрений // Микробиологические основы
повышения плодородия почвы. — Таллин, 1978.
Мехтиев С. Я., Чернобровина Р. М., Пресман Л. М. Сезонные
изменения численности микроорганизмов в почвах Молдавии//Динамика
микробиологических процессов в почве и обусловливающие ее Факторы
Ч. 1. —Таллин, 1974. * * '
Мейсель М. Н., Миролюбова Л. В. Сравнительное
люминесцентное исследование строения бактерий//Изв. АН СССР сер биол —1959
No 6. '
М иненков А. Р. Адсорбция бактерий различными типами почв
Дневник Всесоюзного съезда ботаников. — Л., L928.
Мирчинк Т. Г. Почвенные грибы как компонент биогеоценоза
Почвенные организмы как компонент биогеоценоза. — М., 1984.
Мирчинк Т. Г. Почвенная микология. — М., 1976.
Мирчинк Т. Г., Судницын И. И., Генджиев М. Г
Устойчивость грибов разных местообитаний к различной активности влаги //
Почвоведение.— 1978.—№ 6.
М ихайлов В. В. Взаимодействие популяций актиномицетов в почвах*
Автореф. дис... канд. биол. наук. М., 1982.
Мишустин Е. Н. Эколого-географическая изменчивость почвенных,
бактерий. — М., 1947.
Мишустин Е. Н. Ассоциации почвенных микроорганизмов — М 1975
Мишустин Е. Н. Ценозы почвенных микроорганизмов//Почвенные ор--
ганизмы как компонент биогеоценоза. — М., 1984. г
Мордкович В. Г., Волговинцев В. В., Мордкович Г Д
Шамолин В. А. Сезонный ход трансформации корневых остатков в'чер-
ноземно-луговой почве в связи с динамикой активности гетеротрофов-деструк-
торов//Структура, функционирование и эволюция системы биогеоценозов Ба-
рабы. — Новосибирск, 1#76. — Т. 2.
Москаленко Э. М., Иванов М. В., Нестеров А. И.. Смоль-
янинов Н. Г., Перминов Б Н., Назарченко А. В.
Микробиологическое окисление метана в угле//Экологическая и геохимическая деятельность
микроорганизмов.— Пущино, 1976.
Мурдам Л. А., Рахно П. X., Рыыс О. О. и др. О влиянии
гидротермических условии на почвенные микроорганизмы//Сезонная динамика
почвенных процессов. — Таллин, 1979.
Мурдам Л. А., Сирп Л. К. О биодинамике микробиологических и
биохимических процессов в почвах Эстонской ССР // Проблемы микробиологии
и вирусологии: 7-я конф. молодых ученых. Тез. Докл.— Рига 1977 с 7—9
Н а п л е к о в а Н. Н. Динамика биологической активности дерново-глубо-
кооподзоленных почв Салаира//Динамика микробиологических процессов в
почве и обусловливающие ее факторы. — Таллин, 1974 Ч 1
Непомилуев В. Ф., Мишустин Е. Н., Мосина' Л. В. Сезонные
241
^изменения видового и количественного состава споро«бразующих бактерий
подзолистой почвы Московской области // Изв. ТСХА.— 1974. — Вып. 2.
Неронова Н. М., Иерусалимский Н. Д. Получение витамина
Bi2 при помощи пропионовокислых бактерий по непрерывному
методу//Непрерывное брожение и выращивание микроорганизмов — М., 1960.
Нестеров А. И., Назаренко А. В. Активность метанокисляющих
«бактерий в адсорбированном состоянии//Микробиология..— 1975. — Т. 44.—
Вып. 5.
Нечаева А. С. К вопросу о влиянии коллоидов на размножение
дрожжей // Коллоидный журн. — 1040. — Т. 6. — Вып. 1.
Никитин Д. И. Применение электронной микроскопии для изучения
почвенных суспензий // Почвоведение. — 1964. — № 6. ч
Никитин Д. И., Васильева Л. В., Лохмачева ЬЪА. Новые и
редкие формы почвенных микроорганизмов. — М., 1966.
Никитин Д. И., Никитина Э. С. Процессы самоочищения
окружающей среды и паразиты бактерий. — М., 1978.
Никитина 3. И., Мамитко А. В., Башалханов И. А.
Продуктивность бактериальных сообществ подзолистых со вторым гумусовым
горизонтом почв южнотаежного Прииртышья // Микрофлора почвенных и водных
бассейнов Сибири и Дальнего Востока. — Томск. 1975.
Никитина 3. И., Михайлова Э. Н. Микробиологические режимы
в почвах степных геосистем//Изучение степных геосистем во времени.—
Новосибирск, 1976.
Никитина 3. И., Антоненко А. М., Барыкова Ю. Н., Н а -
лрасникова Е. В. Изучение состава и динамики почвенных
микроорганизмов в природных системах Сибири//Биодинамика и плодородие почвы.—
Таллин, 1979.
Новогрудский Д. М. Почвенная микробиология. — Алма-Ата, 1956.
Огава Хироэ. Способ получения сухих микроорганизмов. Япон. пат.—
1961. — No 22636.
О дум Г. Основы экологии. — М., 1975.
Озерская С. М. Структура комплекса почвенных грибов-микромицетов
двух лесных биогеоценозов зоны смешанных лесов: Автореф. дис ...канд. биол.
иаук, М., 1980.
Оксентьян У. Г. Активность молочнокислых бактерий в связи с
адсорбцией // Микробиология. — 1940. — Т. 9* — Вып. 1.
Олейников Р. Р., Демкина Т. С. Сезонная динамика биомассы
агацелия грибов и бактерий в почве // Микробиологические , основы повышения
ллодородия почвы. — Таллин, 1978.
Омелянский В. Л. Избранные труды.— М., 1953. — Т. 1.
Паников Н. С, Абу Эль-Нага С, Звягинцев Д. Г. Кинетика
разложения глюкозы в почве//Почвоведение. — 1982. — № 8.
Паников Н. С, Звягинцев Д. Г. Значение различных условий
культивирования для физиологических исследований микроорганизмов //
Микробиология. — 1983!а. — Т. 52. — Вып. 1.
Паников Н. С, Звягинцев Д. Г. Кинетический принцип оценки
многообразия типов местообитаний микроорганизмов в почве//ДАН СССР.—
1,9836. —Т. 268. —№ &
Панчишкина М. Б., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г.
Количественное описание динамики клубеньковых бактерий в почвах //
Микробиология. — 1984. — Т. 53.. — Вып. а
Паремузова Л. А. Кратковременное изменение численности бактерий
на орошаемом и богарном участках предкавказского
чернозема//Закономерности развития почвенных микроорганизмов. — Петрозаводск, 1975*
Паринкина О. М. К вопросу о продуктивности микробных сообществ
в некоторых почвах западного Таймыра//Вопросы численности, биомассы и
продуктивности почвенных микроорганизмов.— Л., 1972.
Паринкина О. М. Динамика развития бактериальных сообществ в
почвах южных тундр Таймыра // Биодинамика и плодородие почвы. — Таллин,
1979.
Патрикеев В. В., Ларина О. В., Аксенов С. И. Способ консерва-
242
ции микроорганизмов: А. с. 539070 СССР: С 12С 11/32, С 1.2К 1/08, 1976.
Переверзев В. Н., Логвинова М. М. Динамика численности
микроорганизмов в окультуренном подзоле в условиях Крайнего Севера If
//V съезд Всесоюзного микробиологического общества, Секц. с.-х. микробио^
логии: Тез. докл. — Ереван, 1976.
Перфильев Б. В., Г а б е Д. Р. Капиллярные методы изучения
микроорганизмов. — М.— Л., 1961.
Перцовская А. Ф., Звягинцев Д. Г. Адсорбция бактерий на.
стекле, модифицированных поверхностях стекла и полимерных пленках //
Биологические науки.— 1971i. — Вып. 3,.
Перцовская А. Ф., Филимонова Е. В., Звягинцев Д. Г..
Влияние низкочастотных ультразвуковых колебаний на санитарно-показатель-
ные микроорганизмы // Вести. Моск. ун-та, сер, почвовед. — 1,975. — № 6.
Плевако Е. А. Влияние активных углей на сбраживание нормальных,
паток // Бродильная промышленность. — 1934. — № 5.
Полянская Л. М. Популяция Sir. olivocinereus в почвах разных
типов: Автореф. дис... канд. биол. наук. М., 1978.
Полянская Л. М., Звягинцев Д. Г. Популяционная экология ак~
тиномицетов в почве//Изв. АН СССР, сер. биол.— 1984. — № 5.
Полянская Л. М., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г. Динамика
популяций микробов-антагонистов в нестерильной почве//Микробиология.—
1.983. —Т. 52. —Вып. 1.
I/ Полянская Л. М., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г.
Зависимость динамики численности клубеньковых бактерий в почве от стадии
микробной сукцессии//Микробиология. — 1981. — Т. 50. — Вып. 1„
\у Полянская Л. М., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г. Стимуляция
и элиминирование клубеньковых бактерий в почве при внесении актиномицета
и хитина // Микробиология. — 1984. — Т. 52. — Вып. 6.
Потехина Л. И. Некоторые вопросы количественного учета
микроорганизмов в почве//Проблемы экологии. — Томск. 1973. — Т. 3.
Рассел Э. Почвенные условия и рост растений. — //ИЛ. — М., 1955.
Рахно П. X., Аксель М., Р и й с X. А. Динамика численности
почвенных микроорганизмов и соединений азота в почве. — Таллин, 1971.
Р и й с X. А., Р а х н о П. X. Количественная динамика почвенных
водорослей. — Таллин, 1975).
Риклефс Р. Основы общей экологии. — М., 1979.
Ротмистров М. Н., Ставская С. С, Гарбара С. В., Г воз-
дяк П. И. Дыхание капролактамразрушающих бактерий в присутствии
глинистых минералов//Приклад, биохим. и микробиол.— 1975. — Т. 11. — № 3.
Рубан Е. Л. Физиология и биохимия нитрифицирующих
микроорганизмов.—М., 1961,
Рубенчик Л. И. Азотобактер и его применение в сельском хозяйстве.—
Киев, 1960.
Рубенчик Л. И., Ройзин М. Б., Белянский Ф. М. Адсорбци5
бактерий в солевых водоемах//Микробиология. — 1,934. — Т. 3. — Вып. 1.
Рудаков К. И. Биологические и физико-химические факторы активно
сти микроорганизмов. 1. Факторы активности молочнокислых бактерий // Тр
Всес. ин-та с.-х. микробиол. — 1936. — Т. 8. — Вып. 2.
Самбурова Е. В. Микрофлора почв предгорий Западного Саяна: Ав
тореф. дис... канд. биол. наук. Л., 1977.
Самсонова С. М„ Мунина Л. А., Фильченкова В. И. и Д1
Влияние минерального питания и влажности почвы на динамику развития мк
крофлоры и ферментативную активность почвы//Динамика микробиологиче
ских процессов в почве и обусловливающие ее факторы. — Таллин., 1974. -
Ч. II.
Самцевич С. А. О сезонности и периодичности развития микроорп
низмов в почве //Микробиология. — 1955. — Т. 24. — Вып. 5.
Саникидзе П. С, Гогорикидзе К. И., Гамрелидзе К. I
Динамика биологической активности красноземных почв влажных субтроп
ков СССР // Микробиологические основы повышения плодородия почвы. — Та
лин, 1978.
243
Свирежев Ю. М., Логофет Д. О. Устойчивость биологических
сообществ. — М., 1978.
Скалой И. С, Пуревдорж Б. Азотфиксирующие микроорганизмы,
«биомасса и продуктивность бактерий в пустынных степях Северной Гоби //
Проблемы освоения пустынь. — 1:978. — № 1..
'Смит Дж. Модели в экологии. — М., 1976.
Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов. —
Т. 3. — М., 1979,.
Судницын И. И. Новые методы оценки водно-физических свойств
почвы и влагообеспеченности леса. — М., 1966.
Сукацкене И. К., Багданавичене 3. П. Сезонная динамика
кратковременных колебаний численности ногохвосток и бактерий в дерново-
подзолистой почве Литовской ССР//Проблемы почвенной зоологии.
Материалы V Всесоюз. совещ. — Вильнюс, 1975.
Супрун Т. П. О хранении микроскопических грибов в стецильной
почве // Микробиология. — 1965. — Т. 34. — Вып. 3. ^
Тен Хак Мун, Крысанова В. П. О стохастической модели роста
численности микроорганизмов в почве // Журн. общ. биол. — 1979. — Т. 40. —
№ 3.
Тен Хак Мун, Федорова Л. В. Годовой цикл микробиологических
процессов в местах произрастания крупнотравья на Сахалине//Вопросы
численности, биомассы и продуктивности почвенных микроорганизмов. — Л., 1972.
Торжевский В. И. Сравнительная характеристика эффективности
различных приемов количественного учета микроорганизмов//Вопросы
численности, биомассы и продуктивности почвенных микроорганизмов. — Л., 1972.
Ум аров М. М. Ассоциативная азотфиксация. — М., 1086.
Филип 3. Развитие микроорганизмов и образование гумусовых веществ
а средах с различным содержанием бентонита//Почвоведение.— 1968. — № 9»
Флайг В., Кюстер Э., Хайдер К., Бойтельспахер Г.,
Филип 3., Мартин Дж. Влияние глинистых минералов на образование
гумусовых веществ — продуктов жизнедеятельности почвенных грибов //
Почвоведение.— 1971. — № 6.
Харвей X. В. Современные успехи химии и биологии моря. — М., 1948.
Худяков Н. Н. Адсорбция бактерий почвой и влияние ее на
микробиологические процессы в почве//Почвоведение. — 1926.— № 2.
Худяков Я. П. Периодичность микробиологических процессов в почве
и ее причина // Труды Ин-та микробиол. АН СССР. — 1:958. — Т. 5.
Чистяков Ф. М. К вопросу о влиянии твердой фазы на развитие аце-
тонобутиловых бактерий в жидких средах//Микробиология. — 1932. — Т. L —
Вып. 1.
Ш а м и с Д. Л.. К у р Д и н а Р. М., Зайцева Л. К. Влияние
наполнителей на активность дрожжей рода Saccharomyces//Труды Ин-та микробиол.
и вирусол. АН КазССР. — 1963).
Ш т и н а Э. А. Обзор факторов, обусловливающий динамику почвенных
водорослей//Динамика микробиологических процессов в почве и
обусловливающие ее факторы. — Таллин, 1974. — Ч. I.
Штина Э. А. Формирование альгологических ассоциаций в
почве//Биодинамика и плодородие почвы. — Таллин, 1979.
Щапова Л. Н. Количественная характеристика микрофлоры почв,
рисовых полей Приморья // Вопросы численности, биомассы и продуктивное^
почвенных микроорганизмов. — Л., 1972.
Agate A. D., Bhat J. V. Increase in actinomycetal population of stored
soils//Current Sci. (India). — 1967. — V. 36. — N 6.
Akin D. Evaluation by electron microscopy and anaerobic culture of types
of rumen bacteria associated with digestion of cell walls//Appl. and Environ.
Microbiol. — 1980. — V. 39. — N 1.
A1 b г е с h t W. A., M с С a 11 а Т. М. Nitrification of ammonia adsorbed on
colloidal clay // Proc. Soil Sci. Soc. Amer. — 1937. — V. 2.
Allison F. E., Deutsch J. H„ Roller E. M. Availability of fixed am-
244
monium in soils containing different clay minerals.// Soil Sci. — 1953. — V. 75 —
N 5.
Amin G., Verachtert H. Comparative study of ethanol production by
immobilized cell systems using Zymomonas mobilis or Saccharomyces bayanus //
//Eur. J. Appl. Microbiol, and Biotechnol. — 1982. — V. 14. — N 2.
Andrews R. E., Spence K- D. A microencapsulation system for the pro-
lection of microbial insecticides from sunlight inactivation//Abstrs 79th Annu.
Meet. Amer. Soc. Microbiol. (Los Angeles). — Washington, 1979.
Anderson J. P., Domsch К. Н. Measurement of bacterial and fungal
contributions to respiration of selected agricultural and forest soil J/Can. J.
Microbiol. — 1975. — V. 21. — N 3.
Anderson J. P., Domsch К. Н. A physiological method for the
quantitative measurement of microbial biomass in soils//Soil Biol, and Biochem. —
1978. — V. 10. — N 3.
Arcuri E. J. Continuous ethanol production and cell growth in an immo-
bilized-cell bioreactor employing Zymomonas mobilis//Biotechnol. and Bioeng. —
1982. — V. 24. — N 3.
Atkinson В., D a v i e s I. J. The overall rate of substrate uptake by
microbial films//Trans. Inst. Chem. Eng. — 1974. — V. 52. — N 3.
A u g i e r J., P о с h о n J. La numeration des germs tellurigues par la micro-
.scopie directe en lumiere blanche et en fluorescenceV/ Ann. Inst. Past. — 1958. —
V. 94. — N 5.
A x 1 e у J. H., L e g g J. O. Ammonium fixation in soils and the influence
of potassium on nitrogen availability from nitrate and ammonium sources//Soil
Sci. — 1960. — V. 90. — N 3.
В a b i с h H., S t о t z к у G. Air pollution and microbial ecology [*] Crit. Rev.
Environ. Control. — 1974. — V. 4. — P. 352—421.
Babich H., Stotzky G. Influence of clay minerals on the effects of
cadmium on microorganisms in media and in soil//Abstrs. Annu. Meet. Amer. Soc.
.Microbiol., Atlantic City, N. Y. 1976. — Washington, 1976.
Bahadur K-, Ranganayaki S. The influence of the toxins separated
by adsorption on wood charcoal from the culture of Bacillus polymyxa on the
fermentation of sucrose // Antonie van Leeuwenhaek J. Microbiol., Serol. — 1960.—
V. 26. — N 1.
Bahadur K-, Saroi K. Study of the influence of charcoal on the aceto-
nebutanol fermentation by different strains of Clostridium // Japan. J.
Microbiol. — 1960. — V. 4. — N 1.
В a r d e г R. Dissolved organic carbon from deep waters resists microbial
oxidation/У Nature. — 1968. — V. 220. — N 5164.
Beachey E. D. (ed). Bacterial adherence. Chapmen and Hall, L.—N. Y.,
1980.
Beraud P. Relation entre le volume des recipient de verre et le developpe-
:tnent de certaines levures en milieu mineral//Ann. Inst. Pasteur. — 1969. —
V. 116. -N3.
Berry V. K-, M u r r L. E. Observations of selective attachment of
bacteria on low-grade ore: evidence for direct contact bacteria leaching of sulfide
.minerals//Proc. 34th Annu. Meet. Electron Microsc. Soc. Amer. — Miami Beach.,
1976.
Biederbeck V. O., Campbell C. A. Influence of simulated fall and
spring condition on the soil system//Proc. Soil Sci. Soc. Amer. — 1971. —
V. 35. — P. 474—479.
Bigger J. W., N e 1 s о n J. H. The growth of coliform bacilli in distilled
water//J. Pathol., Bacteriol. — 1941. — V. 53. — N 2.
Binder A., Ghose T. K- Adsorbtion of cellulose by T. viride//l-st Eur.
•Congr. Biothechnol. — FrankfurtyM., — 1978.
Birch H., Friend M. Humus decomposition in east African soils //
Nature, 1956. — V. 178. — N 4531.
Bisset J., Parkinson D. The distribution of fungi in some alpine
soils//Can. Bot. — 1979. — V. 57. — P. 1609—1630.
В i 11 о n G., Marshall К. С (ed.) Adsorption of microorganisms to sur-
iace. — 1980.
245
Bonomo L., Giugliano M., V i s m a r a R. Elimination des nitrates en.
concentration elevees partits bacteriens submerges // Documentation 4. Eur. Ab~
wasser- und Abfall-Sump. EAS. — Munchen, 19Ж
В о о i s H. M., de J a n s e n E. Effect of nutrient in through fall rainter
and of leaf fall upon fungal growth in a forest soil layer//Pedobiologia. —
1976. — V. 16. — N 3.
В о u 1 e n С W. Survival of Arlhrobacter crystallopoietes during prolonged
periods of extreme desiccation//J. Bacteriol. — 1973. — V. 113. — P. 569—577.
В о u 1 e n C. W., E n s i n g J. G. Long-term starvation survival of rod and
spherical cells of Arthrobacter crystallopoietes//J. Bacteriol. — 1970a. — V. 103.—
P. 569—577. .
В о u 1 e n С W., E n s i n g J. G. Intracellular substrates for endogenous me-
tabolism during long-term starvation of rod and spherical cells of Arthrobacter
crystallopoietes J/ J. Bacteriol. — 1970b. — V. 103. — P. 578—587.
В r e d e n C. R., В u s w e 1 A. M. The use of shredded asbestos in methane
fermentation//J. Bacteriol. — 1933. — V. 36. — P. 379—395.
В r i e r 1 e у С. L. Bacterial leaching Ц CRC Critical Rev. in Microbiol. —
1978.
Brock T. D. Principles of microbial ecology. — New Jersey, 1966.
В u r g e s A., Nicholas D. P. Use of soil sections in studying amount of
fungal hyphae in soil//Soil Sci. — 1961. — V. 92. — N 1.
В u s h b у H. V. A., Marshall K. Some factors affecting the survival of
roodnodule bacteria on desiccation//Soil Biol, and Biochem. — 1977. — V. 9. —
N 3.
Bunemann G., Klosterkotter W., Ritzerfeld W. Dber die Wir-
kung anorganischer Staube auf das Wachstrum von Mikroorganismen//Arch.
Hyg. und Bakteriol. — 1963. — Bd 147. — N 1.
Campbell С A., Biederbeck V. O. Soil bacterial changes as affected
by growing season weather condition: a field and laboratory study//Can. J_
Soil Sci. — 1976. — V. 56. — N 3.
С a s i d a L. E. Microorganisms in unamended soil as observed by various
forms о fmicroscopy and staining // Appl. Microbiol. — 1971. — V. 21. —
P. 1040—1045.
Chapman S. J., Gray T. R. G. Endogenous metabolism and macromole-
cular composition of Arthrobacter globiformis // Soil. Biol, Biochem. — 1981. —
V. 13. — P. 11—18.
С h a 11 e r j e e R. K., Dalai R. С Effect of various physicochemical
properties of soils on bacterial cell adsorption//Indian J. Agr. Sci. — 1968. — V. 38.—
N 1.
Clark F. E. Bacteria in soil//Soil biology /Eds. В urges A., Raw F.—L.r
1967.
Clark F. E., Paul E. A. The microflora of grassland//Adv. Agron. —
1970. — V. 22. — P. 375—435.
Cole С V., Anderson R. V., В1 a h a M. An analisis of rhizosphere
saprophage interactions in terrestrial ecosystems // Ecol. Bull. — 1977. —
V. 25. — P. 299—309.
Cooper А. В., Morgan H. W. Interaction between E. coli and allopha-
ne//Soil Biol., Biochem. — 1979. — V. 11. — N 3.
Corona K. C, R о d r i g e z О. М. El uso de la silica gel en la
conservation de cepas bacterianas//Rev. latinoamer. microbiol. — 1979. — V. 21. — N 2.
Corrien G., BlanchereH., Ramirez A. An immobilized yeast
fermentation pilot plant used for production of beer//5th Int. Ferment. Symp. —
Berlin, 1976.
С о r t e z J. Role des argiles dans la biodegradation de deux lipopolysaccha-
rides bacteriens//Oecol. plant. — 1976. — V. 11. — N 3.
Cox D., В a z i n M. Distribution of bacteria in a continuous-flow
nitrification column //Soil Biol., Biochem. — 1980. — V. 12. — N 3.
Cuckert A., Tok H. H., Jacquin F. Biodegradation de polysaccharides
bacteriens adsorbed sur une montmorillonite//Soil Org. Matter Stud — Vienna
1977. — V. 1. — P. 403—411.
Cutler D. W. The action of protozoa and bacteria when inoculated into
246
sterile soil//Ann. Appl. Biol. — 1923. — V. 10. — N 1.
Danso S. K-, Alexander M. Regulation of predation by prey density//
7/Appl. Microbiol. — 1975. — V. 29. — P. 515—521.
Dazzo F. B. Bacterial adhesion to plant root surf aces//Microbial adhesion
and aggregation, Springer-Verlag. — Berlin, 1984.
Dazzo F. В., Truchet G. L. Interaction of lectins and their saccharide
receptors in the Rhizobium-Legume symbiosis//J. Membrane Biol. — 1983. —
V. 73. — P. 1—16.
Dent V. E., Basin M. J., Saunders P. T. Behaviour of Dictiostellium
•discoideus amoebae and E. coli grown together in chemostat culture!// Arch.
Microbiol. — 1976. — V. 109. — N 1, 2.
D i a s F. F., D о n d e г о N. С, F i n s t e i n M. S. Attached growth of
Sphaerotilus and mixed populations in a continuous-flow apparatus//Appl.
Microbiol. — 1968. — V. 16. — N 8.
Dispirit о A. A., Tuovinen O. H., Dugan P. R. Sorption Thiobacil-
ius ferrooxidans to particulate material // Abstr. Ann. Meet. Amer. Soc.
Microbiol. — Washington, 1980.
Doelman P. Effect of lead on the soil microflora//3th Int. Symp. Env.
Biogeochem. — 1977.
Dommergues Y. R. Scarcely explored means of increasing the soil N
pool through biological N2-fixation// 12-th Int. Congr. Soil Scil., Panel
discussion papers. — New Delhi (India), 1982.
Dommergues Y., Diem Hoang Gia, Divies C. Procede microbio-
logique destine a maitriser la reductuvite des plantes cultiveers. — 1978. Pat.
N 7710254.
Dommergues Y., Diem Hoang G., Divies С Polyacrilamide-entrap-
ped Rhizobium as an inoculant for legumes //Appl., Environ. Microbiol. — 1979.—
V. 37. — N 4.
Domsch К. Н. Das Pilzspektrum einer Bodenprobe. II. Nachweis physiolo-
gischer Merkmale//Arch. Microbiol. — 1960. — V. 35. — S. 229—247.
Duncan D. W., T r u s s e 11 P. C, W a 1 d e n С. С Leaching of chalcopy-
*ite with Thiobacillus ferrooxidans I'/ Appl. Microbiol. — 1964. — V. 12. — N 2.
Dun lap C. E., Thomson J., Chiang L. С Treatment processes to
increase cellulose microbial digestibility jj AIChE Symp. Ser. — 1976. — V. 72. —
N 158.
D w i v e d i R. S., S h u к 1 a A. N. Fungal decomposition in relation to
carbon dioxide evolution in a tropical sal forest biome//Proc. Indian Nat. Sci.
Acad. — 1977. — N 1—2.
E 11 i n g e r G., Q u a s t e 1 J. H. Preliminary experiments in the study of
the respiratory activity of microorganisms suspended in thin films of fluid
adhering to solid surfaces//Вiochem J. — 1948. — V. 42. — P. 214—218.
E 11 n e r P. D., E 11 n e r C. J. Survival of bacteria on swabs // J. Bacteri-
ol. — 1966. — V. 91. — N 2.
E n s i n g J. G., Wolfe R. S. Nutritional control of morphogenesis in
Arthrobacter crystallopoietes Ц J. Bacteriol. — 1964. V. 87. — P. 924—932.
Ensminger L. E., Gieseking J. E. Resistance of clay-absorbed
proteins to proteolytic hydrolysis // Soil Sci. — 1942. — V. 53. — N 3.
Erickson A. E. The stability of organic-clay mineral complexes to
enzymatic and chemical reactions//Ph. D. Thesis, Univ. Illinois. — 1948.
Estermann E. F., McLaren A. D. Stimulation of bacterial proteolysis
by absorbents//J. Soil Sci. — 1969. — V. 10. — N 1.
Estermann E. F., Peterson G. H., McLaren A. D. Digestion of
-clay-protein, lignin-protein and silica-protein complexes by enzymes and
bacteria!//Soil Sci. Soc. Amer. Proc. — 1959. — V. 23. — N 1.
Fehrmann R. C, Weaver R. W. Scanning electron microscopy of Rhi-
zobium spp.//Soil Sci. Soc. Amer. J. — 1978. — V. 42. — N 2.
Filip Z. Die Ammonisierungsaktivitat der Bodenmikroflora in einer Urn welt
*nit verschiedenem Bentonitgehalt//Zblt. Bakteriol., Parasitenk., Infektionskrankh.
und Hyg. — 1969. — AM. 2. — Bd 123. — N 6.
Filip Z. Clay minerals as a factor influencing the biochemical activity of
soil microorganisms//Folia microbiologica. — 1973. — V. 18. — P. 56—66.
247
F i 1 i p Z. Wechselbeziehungen zwischen Mikroorganismes und Tonmineralem
und ihre Auswirkung auf die Bodendynamik. Giessen, Habilitationsschrift. — 1975.
Filip Z. Einfluss von Tonmineralen auf die mikrobielle Ausnutzung der
kohlenstoffhaltigen Substanzen und bilding der Biomasse//Ecol. Bull.
(Stockholm). — 1977. — V. 25. — P. 173—181.
Filip Z. Decompostion of polyurethane in a garbage landfill leakage
water and by soil microorganisms//Eur. J. Appl. Microbiol, and Biotechnol. —
197g. _ V. 5. - N 3.
Filip Z., H a 11 о r i T. Utilization of substrates and transformation of
solid substrata//Microbial adhesion and aggregation//K. Marshall. — Berlin,.
1984. ^__.
Flanagan P. W., Van Cleve K. Microbial biomass respiration and
nutrient cycling in a black spruce taiga ecosystem // Ecol. Bull. — 1977. —
N 25.
Fletcher M. The effects of culture concentration and age, time and
temperature on bacterial attachment to polystyrenei//Can. J. Microbiol. — 1977. —
V. 23. N 1.
Fletcher M. A microautoradiographic study of the activity of attached*
and free-living bacteria//Arch. Microbiol. — 1979. — V. 122. — N 3. —
Fletcher M. Comparative physiology of attached and free-living bacteria />/
//Microbial adhesion and aggregation. / Ed. K. Marshall. — Berlin, 1984.
F 1 e i e r m a n s C, Schmidt E. L. Autoradiography and
immunofluorescence combined for autoecological study of single cell activity with Nitrobacter as
a model system//Appl. Microbiol. — 1975. — V. 30. — N 4.
Foully B. Influence du plomb sur la microflora du sol // C. r. Soc. Biol.—
1976. — V. 170(2). P. 389—394.
Francis C, Brinkley F. Biological denitrification of high concentration^
nitrate waste: Pat. 660903, USA, cl. 252/301. I W (G 21 F 9/18). 1977.
Gamble S. J., Edminster T. W., Orcutt F. S. Influence of double-
cut plow mulch tillage on number and activity of microorganisms // Soil Sci.
Soc. Amer. Proc. — 1952. — V. 16. — N 3.
Garret S. D. Soil fungi and soil fertility. Ch. 7. Substrate colonize by soil,
fungi. — Oxford, 1963.
Goldberg S. S., G a i n e у Р. L. Role of surface phenomena in
nitrification //Soil. Sci. — 1955. — V. 80. — N 1.
Greaves J. E., Jones L. M. The influence of temperature on the
microflora of the soil//Soil Sci. — 1944. — V. 58. — P. 377—387.
Greaves M. P., Wilson M. J. The degradation of nucleic acids and
montmorillonite-nucleic acid complexes by soil microorganisms//Soil Biol, Bio-
chem. — 1970. — N 2.
Greenland D. J. The adsorption of sugars by montmorillonite//J. Soii
Sci. — 1956. — V. 7. — P. 329—334.
Habte M., Alexander M. Further evidence for the relation of
bacterial population in soil by protozoa//Arch. Microbiol. — 1977. — V. 113. —
N 3.
Habte M., Alexander M. Protozoan density and the coexistence of
protozoan predators and bacterial prey//Ecology. — 1978. — V. 59. — N 1.
H a 11 a s L. E., Vestal J. R. The growth of Mycobacterium convolutum
on solid n-alkane substrates: effect on cellular lipid composition//Canad. J.
Microbiol. — 1978. — V. 24. — N 10.
Hartley G. S., Roe J. M. Ionic concentrations at surf ace//Trans. Farad*
Soc. — 1940. — V. 36. — N 1.
H a 11 о r i R. Growth of E. coli on the surface of anion-exchange resin ir^
continuous flow system//J. Gen. Appl. Microbiol. — 1972. — V. 18. — P. 319—
330.
H a 11 о r i R. Growth and spore formation of B. subtilis adsorbed on an anio-
nexchange resin//J. Gen. Appl. Microbiol. — 1976. — V. 22. — P. 215—226.
H a 11 о r i T. Microbial life in the soil. — N. Y., 1973.
Hattori Т., Furusaka С Chemical activities of E. coli adsorbed on a
resin «Dowex-I»//Nature. — 1959a. — V. 184. — P. 1566—1567.
Hattori Т., Furusaka С Chemical activities of E. coli adsorbed on a>
248
tfesin//Biochem., Biophys. Acta. — 1959b. — V. 31. — N 2.
H a 11 о г i R., H a 11 о г i T. Effect of a liquid-solid interface on the life of
microorganisms//Ecol. Rev. — 1963. — V. 16. — P. 64—70.
H e r i n g T. F. The succession of fungi in the litter of lake district oak-
wood // Trans. Brit. Mycol. Soc. — 1965. — V. 48. — Part 3.
Heukelekian H., Heller A. J. Relation between food concentration
and surface for bacterial growth//J. Bacteriol. — 1940. — V. 40. — N 4.
Hikuma M., Suzuki H., Yasuda Т., Karube I., Suzuki S. A
rapid electrochemical method for assimilation test of microorganisms // Eur. J. Appl.
-Microbiol., Biotechnol. — 1980. — V. 9. — N 4.
H i г о t a n i F. A slide culture method for tubercle bacilli using egg yolk
as adhesive material//Med. Biol. (Japan). — 1957. — V. 45. — P. 241—249.
Hirsch P., Rheinheimer G. Biology of budding bacteria. V. Budding
bacteria in aquatic habitats: occurence, enrichment and isolation//Arch.
Microbiol. — 1968. — V. 62. — N 4.
H i r t e W. Einige Untersuchungen zur Methodik der Mikrobiologischen Bo-
•denprobenverarbeitung // Zblt. Bakteriol., Parasitenk., Inf. — 1962. — Abt. 2. —
Bd 115. — N 4.
H i s s e t R., Gray T. The role of terrestrial aid aquatic organisms in
decomposition processes//17-th Symp. British Ecol. Soc. — 1975.
Homrighausen E., Rohmer W. Untersuchungen verschiedener Disper-
gierungsverfahren bei der Vorbehandlung zur Fluoreszenzmikroskopischen Keim-
iahlung in Boden//Landwirtsch. Forsch. — 1959. — Bd 12. — N 4.
Hudson H. G. The ecology of fungi on plant remains above the soil //
//The New Phytologist. — 1968. — V. 68. — N 4. — P. 837—875.
Ivarson K- C, Schnitzer M., С о r t e z J. The biodegradability of
nucleic acid bases adsorbed on inorganic and organic soil components // Plant and
Soil. — 1982. — V. 64. — N 3.
James F., Gibson R., Gorman G. Charcoal-yeast extract agar: primary
isolation medium for Legionella pneumophila >// J. Clin. Microbiol. — 1979. —
V. 10. — N 4.
James N., Sutherland M. Fluctuations in numbers of bacteria in soil//
//Cand. J. Res. — 1940. — V. 18. — P. 435—443.
Jensen H. L. Contributions to the microbiology of Australian soil // Proc.
Linn. Soc. N. S. W. — 1934. — V. 59. — P. 101—117.
Jensen H. L. Survival of Rhizobium meliloti in soil culture}//Nature. —
1961. — V. 192. — N 4803.
Johnson G. Production of methane by bacterial action. 1972. Pat. USA,
cl. 195—27 (C 12 d 3/10, С 02 с 1/14), N 3640845.
Jones J. M., Richards B. N. Changes in the microbiology of eucalypt
forest soils following afforestation with exotic pines // Austral. Forest Res. —
1977. — V. 7. — N 4.
К a n g a s M. J., Coleman D. G. Comparison of the five techniques for
the estimation of numbers and activity of bacteria in soil //Bull. Acad. Sci. —
1970. — V. 28. — N 4.
Keya S. O., Alexander M. Factors affecting agrowth of Bdellvibrio on
Rhizobium//Arch. Microbiol. — 1975. — V. 103. — P. 37—43.
King В F., Biel M. L., W i lki n s о n B. J. Facile penetration of the
Staphylococcus aureus capsule by lysostaphin // Infec. and immun. — 1980. —
V. 29. — N 3
Klingmuller W. Genetic engineering for practical application//Natur-
wiss. — 1979. — Bd 66. — S. 182—189.
К о b u s J. Influence of clay minerals on biological activity of sandy soil //
У/Microbiologia. V. I. — Bucuresti, 1970.
Krishnamurti K-, Soman S. V. Studies in the adsorption of bacteria.
Part I. Adsorption of B. subtilis and B. coli by kaolin and charcoal//Proc.
Indian Academy Sci. — 1951. — V. 34. — N 2.
Krogulska В., Mycielski R. Nitrification of industrial waste-water
with high nitrogen concentration in aerated packed-bed reactors//Acta microbiol.
pol. — 1981. — V. 30. — N 3.
249
Krzemieniewski S. Untersuchungen tiber Azotobacter chroococcunv
Beijer//Extr. d. Bull. d. Г Acad. Sci. de Cracovie. — 1908.
Kubista K. Vliv pfidavku 10% bentonity a aerace na mikroorganismy
pfi rozkladu slamy//Sb. Vys. sk zemed. Praze. — 1976. — Ac. 2. — P. 63—70.
Kunc F, Stotzky G. Effect of clay minerals on heterotrophic microbial
activity in soil//Soil Sci. — 1974. — V. 118. — N 3.
Kunc F, Stotzky G. Acceleration of aldenyde decomposition in soil by
montmorillonite//Soil Sci. — 1977. — V. 124. — N 3. —
Kunc F., Stotzky G. Acceleration by montmorillonite of nitrification in
soil//Folia microbiol. — 1980. — V. 25. — N 2.
Kunkee R. E., О ugh C. S. Multiplication and fermentation of Saccharo-
myces cerevisiae under carbon dioxide pressure in wine//Appl. Microbiol. —
1966. - V. 14. — N 4.
La by R. H. The adsorption of amino acids and peptides by montmorillonite
and illite//J. Austral. Agric. Sci. — 1967. — V. 33. — N 2.
Lahav N. Adsorption of sodium bentonite particles on Bacillus subtilis//
//Plant and Soil. — 1962. — V. 17. — N 2.
Lahav N., Key nan A. The influence of bentonite and attapulgite on the
respiration of Bacillus subtilis'//Canad. J. Microbiol. — 1962. — V. 8. — N 4.
Laudelout H., Lambert R., P h a m M. L. Variation saisonniere de la
population microbienns du soil//Rev. ecol. et biol. sol. — 1978. — V. 15. —
N 2.
Lees H., Quastel J. H. Biochemistry of nitrification in soil//Biochem.
j. _ 1946. — V. 40. — P. 803—828.
Lundgreen B. Fluorescein diacetate as a stain of metabolically active
microorganisms in soil//Oikos. — 1981. — V. 36. — P. 17—22.
Lynch J. M. Soil biotechnology. Oxford, 1983.
Lynch D. L., Lynch С. С Resistance of protein-lignin complexes, lignins
and humic acids to microbial attack//Nature. — 1958. — V. 181. — N 4621.
Lynch D. L., Wright L. M., Cotnoir L. J. Breakdown of cellulose
dextrin and gelatin in the presence of attapulgite//Nature. — 1957. — V. 179.—
N 4570.
Mac Rae I. S., Celo J. S. Influence of colloidal iron on the respiration
of a species of the genus Acinetobacter//Appl. Microbiol. — 1975. V. 29. —
N 6.
Macdonald R. M. Population dynamics of the nitrifying bacterium Nit-
rosolobus in soil//J. Appl. Ecol. — 1979. — V. 16. — N 2.
Martin J. P., F i 1 i p Z., Haider K. Effect of montmorillonite and hu-
mate on growth and metabolic activity of some actinomycetes // Soil Biol. Bio-
chem. - 1976. — V. 8. — P. 409—413.
Martinez А. Т., Ramires C. Microfungal biomass and number of pror
pagules in an andosol// Soil Biol. Biochem. — 1978. — V. 10. — N 6.
Marshall К. С The nature of bacterium-clay interaction and its
significance in survival of Rhizobiurn under arid conditions/!/9-th Int. Congr. Soil Sci.
Trans. (Adelaide, Australia). — 1968a. — V. 3. — P. 275—280.
Marshall К. С Interaction between colloidal montmorillonite and cells
of Rhizobiurn species with different ionogenic surfaces//Biochem. Biophys. Acta.—-
1968b. — V. 156. — R 179—186.
Marshall К. С Orientation of clay particles sorbed on bacteria possessing
different ionogenic surfaces//Biochim., Biophys. Acta. — 1969. — V. 193. —
p. 472—474.
Marshall К. С Sorptive interaction between soil particles and
microorganisms//Soil biochemistry. «— 1971. — V. 2.
Marshall К. С Interfaces in microbial ecology. Harvard Univ. Press,
1976.
Marshall К. С (ed,). Microbial adhesion and aggregation. Report of the
Dahlem Workshop. — Berlin, 1984.
Marshall К. С, Alexander M. Growth characteristics of fungi and
actinomycetes/У J. Bacteriol. — 1960. — V. 80. — P. 412—424.
Marshall K. C, Roberts F. J. Influence of fine particle materials on
survival of Rhizobiurn trifolii in sandy soil//Nature (Engl.). — 1963. —
250
V. 198. — N 4878.
May R. M. Stability and complexity in model ecosystems. — N. Y., 1973.
Mayama Т., Kobayashi Т., Okada A. Stabilized antibiotic SF-837
preparation. (Meiji Seika. Kaisha, Ltd). — 1976. — Pat. USA, cl 424 78
(A 61 К 9/36, A 61 К 31/765), N 3962419.
M с С a 11 а Т. M. Behavior of legume bacteria in relation to exchangeable
•calcium and hydrogen ion concentration of the colloidal fraction on the soil//
J/Missouri Agric. Exp. Sta. Res. Bull. — 1937. — V. 256. — P. 1—44.
M с С a 11 а Т. М. The adsorbed ions of colloidal clay as a factor in
nitrogen fixation by Azotobacter // Soil Sci. — 1939. — V. 48. — N 4.
McLaren A. D. Enzyme action in structurally restricted systems//Enzy-
mologia. — 1960. — V. 21. — P. 356—364.
McLaren A. D. Nitrification in soil: systems approaching a steady state//
// Soil Sci. Soc. Amer. Proc. — 1969. — V. 33. — N 4.
McLaren A. D., Estermann E. F. The adsorption and reaction of
enzymes and proteins on kaolinite. III. The isolation of enzyme-substrate
completes//Arch. Biochem., Biochys. — 1956. — V. 61. — P. 158—173.
McLaren A. D., Skujins J. J. Nitrification by Nitrobacter agilis on
surfaces and in soil with respect to hydrogen ion concentration//Canad. J.
Microbiol. — 1963. — V. 9. — N 5.
McLaren A. D., Skujins J. J. The physical environment at
microorganisms in soil // Ecology of Soil Bacteria. — Liverpool, 1967.
McLaren A. D., Seaman G. V. Concerning the surface pH of clays //
У/ Soil Sci. Soc. Amer. Proc. — 1968. — V. 32. — N 1.
Messing R. A., Oppermann R. A. High surface low volume biomass
«composite. (Corning Glass Works). — 1979. — Pat. USA, cl. 195/59, (C 12 В
1/00), N 4153510.
Miura Y. Mechanism of liquid hydrocarbon uptake by microorganisms and
growth kinetics//Avd. Biochem. Eng. — 1978. — V. 9. — P. 31—56.
Monsan P., D u t e u r t г е В., Moll M., D u r a n d G. Use of papain
immobilized on spherosil for beer chillproofingi//J. Food Sci. — 1978. — V. 43. -—
N 2.
Mulder E. G. Arthrobacter 11 Principles and application in aquatic
microbiology / Heukelekian H., Dondero N. С — N. Y., 1964.
Murr L. E., Berry V. K. Direct observations of selective attachment of
bacteria on low-grade sulfide ores and other mineral surfaces // Hydrometallur-
gy. — 1976. — V. 2.
Nagel de Boois H. M., J a n s e n E. The growth of fungal mycelium in
forest soil layers//'Rev. Ecol. Biol. Sol. — 1971 .— V. 8. — N 4.
N a 1 i n D. R., D а у a V., R e i d A., L e v i n e M. M., С i s n e г о s L.
Adsorption and growth of Vibrio cholerae on chitin // Infec. and Immun. — 1970. —
V. 25. — N 2.
N a n n i p i e r i P., Johnson P. L., Paul E. A. Criteria for measurement
of microbial growth and activity in soil//Soil Biol., Biochem. — 1978. — V. 10.—
P. 223—229.
Navarro J. M., D u r a n d G. Modifications de la croissance de Saccharo-
myces uvarum par immobilisation sur support solide//C. r. Acad. Sci. — 1980.—
N 6.
Nelson L. M., V i s s e r A. S. Effect of spring thaw on microorganisms
in an arctic meadow site//Arct. and Alp. Res. — 1978. — V. 10. — N 4.
Neuberg R. E., Sandberg M. Neue Klassen von Stimulatoren der
.alkoholischen Zuckerspaltung // Biochem. Ztschr. — 1921. — Bd 121.
Neufeld R. J., Zajic J. E., Gerson D. F. Cell surface measurements
In hydrocarbon and carbohydrate fermentations//Appl. and Environ. Microbiol.—
1980. — V. 39. — N 3.
N i 1 s s о n L, О h 1 s о n S. Columnar dehitrification of water by immibilized
Pseudomonas denitrificans cells//Eur. J. Appl. Microbiol., Biotechnol. — 1982.—
V. 14. — N 2.
N i о с h I. Seasonal variation of microorganisms in the forest soils in
relation to the vegetations and soil types. Abstr//Soil Sci. and Plant Nutr. -^
1976. — V. 22. — N 1.
251
N i s h i о M., FurusaRa C. Interrelation between the numbers of
nitrifying bacteria and the size of soil particles. Abstr.//Soil Sci. and Plant Nutr. —
1970a. — V. 16. — N 4.
Nishio M., Furusaka C. The distribution of nitrifying bacteria in soil-
aggregates. Abstr.//Soil Sci. and Plant Nutr. — 1970b. — V. 16. — N 4.
Nishio M., Furusaka С The number of nitrite—oxidizing bacteria in
soil percolated with nitrite. Abstr.//Soil Sci. and Plant Nutr. .=^1971. —
V. 17. — N 2.
N о r r i s D. O. A porcelain-bead method for storing Rhizobium // Empire J.
Exptl. Agric. — 1963. — V. 31. — N 123.
Novakova J. Effect of increasing concentrations of clays on the
decomposition of glucose//Ztbl. Bakt. — 1972. — Abt. 2. — Bd 127. — S. 360.
Novakova J. Comparison of kaolinite and bentonite influence on
substrate concentration effect//Zbl. Bakteriol., Parasitenk., Infektionskrankh. un&
Hyg. — 1974. — Abt. 2. — Bd 129. — N 5.
Novakova J. Comparison of the effect of bentonite and kaolinite on the-
mineralization of various concentrations of glucose//Folia microbiol. — 1975. —
V. 20. — N 1.
Novakova J., Ettler P. Effect of clays on soil microorganisms
activity//Zbl. Bakteriol., Parasitenk., Infektionskrankh. und Hyg. — 1974. — Abt. 2.—
Bd 129. — N 1, 2.
О г с u 11 F. S. Methods for more accurately compering plate counts of soil
bacteria/У J. Bacteriol. — 1940. — V. 39.
0rstavick D. Sorption of streptococcus to glass//Acta Path. MicrobioL
Scand., Sect. B. — 1977. — V. 85. — P. 38—46.
Parr J. F., N о г m a n n A. G. Growth and activity of soil microorganisms
in glass microbeads. I. Carbon dioxide evolution//Soil Sci. — 1964. — V. 97. —
N6.
Parr J. F., Parkinson D., Norman A. G. A glass microbead system
for the investigation of soil microorganisms//Nature (Engl.). — 1963. —
V. 200. — N 4912.
Parr J. F., Parkinson D., Norman A. G. Growth and activity of
soil microorganisms in glass microbeads. II. Oxygen uptake and direct
observations/«/Soil Sci. — 1967. — V. 103. — N 5.
Parkinson D., Domsch K- H., Anderson J. P. Die Entwicklung mik-
robieller Biomassen im organischen Horisont eines Fischtenstandortes // EcoL
plant. — 1978. — V. 13. — N 4.
Paul E. A., Johnson R. L. Microscopic counting and
adenosines-triphosphate measurement in determining microbial growth in soils//Appl. and
Environ. Microbiol. — 1977. — V. 34. — N 3.
P e e 1 e Т. С Adsorption of bacteria by soils // Cornel. Univer. AgriculL
Exp. Sta. — 1936.
P e t h i с a B. A. The physical chemistry of cell adhesion // Exp. Cell.
Research., Suppl. — 1961. — V. 8.
P i n с к L. A., Allison F. E. Resistance of a protein-montmorillonite
complex to decomposition by soil microorganisms//Science. — 1951. — V. 114. —
N 2953.
Pi nek L, A., Dyal R. S., A11 i s о n F. E. Protein-montmorillonite
complexes, their preparation and the effects of soil microorganisms on their
decomposition//Soil Sci. — 1954. — V. 78. — N 2.
P i r t S. J. A kinetic study of the mode of growth of surface colonies of
bacteria and fungi//J. Gen. Microbiol. — 1967. — V. 47. — P. 181—197.
P i r t S. J. Estimation of substrate affinities of filamentous fungi from
colony growth rates//J. Gen. Microbiol. — 1973. — V. 75. — P. 245—247.
P lorn ley N. J. B. Formation of the coloni in fungus ChaetomiumУ/ AustraL
J. Biol. Sci. — 1959. — V. 12. — N 1.
Poole R. W. Periodic, pseudoperiodic and chaotic population fluctuations //
//Ecology. — 1977. — V. 58. — N 1.
Prasad M. Vergleichende Untersuchungen uber verschiedene Methoden zur
quantitativen Erfassung der Bodenmikrof lora//Zbl. Bakteriol., Parasitenk., Infek-
tionkskrankh. und Hyg. — 1968. — Abt. 2. — Bd 122. — N 4.
252
Pridham T. G., Lyons A. J., Phrompatima B. Viability of Actino-
mycetales stored in soil//Appl. Microbiol. — 1973. — V. 26. — N 3.
Q u a s t e 1 J. H., W e b 1 e у D. M. The effects of the addition to soil of algi-
nic acid and other form of organic matter on soil aeration // J. Agric. Sci. —
1947. — V. 37. — P. 257—266.
R a h n о P. Mullaeosakeste adsorbeerivast toimest bakteritele // ENSV Tea-
duste Akad. toimetised. Biol. seer. — 1961. — V. 10. — N 4.
Rasmussen L. Yeast cells: growth stimulating effects of particulate
material in dilute nutrient media//С. г. trav. Lab. Carlsberg. — 1974. — V. 40.—
N 10.
R о к u s h о В., S a i t о Y. On the viability of the sand cultures of acetone-
butanol organisms stored for a long period // Bull. Agric. Chem. Soc. Japan. —
I960. — V. 24. — N 7.
Roper M. M., Marshall К. С Effects of a clay mineral on microbial
predation and parasitism of Escherichia coli fj Microbial Ecol. — 1977—1978. —
V. 4. — N 4.
Roper M. M., Marshall К. С The survival of coliform bacteria in
saline sediments // Austral. Water Resour. Counc. Techn. Pap. — 1979. — N 43.
Rosenberg M., Rosenberg E. Role of adherence in growth of Aci-
netobacter calcoaceticus RAG—I on hexadecaneV/J- Bacteriol. — 1981. — V. 148.—>
N 1.
Rosenzweig W. D, Stotzky G. Influence of environmental factors orr
antagonism of fungi by bacteria in soil: clay minerals and pH//Appl. and
Environ. Microbiol. — 1979. — V. 38. -N6.
Russel E. J., Hutchinson H. B. The effect of partial sterilisation of
soil on the production of plant food Ц J. Agric. Sci. — 1909. — V. 3. —
P. 11—114.
R utter P. R., Mel ling Т., Ell wood E., H or wood E. Microbial
adhesion to surfaces. LTD Publisher. — 1981.
Rymaszewski J., Kornacki K-, Kramkowska A. Application of
ion exchangers in removal of lactic acid from medium during cultivation of milk-
bacteria//Acta aliment, pol. — 1975. — V. 1. — N 1.
Salus G. Die Bakterienadsorbtion durch Bolus!//Biochem. Ztschrt. — 1917.—
Bd 84. — H. 5—6.
Sanders W. M. The growth and development of attached stream bacteria.
I. Theoretical growth kinetics of attached stream bacteria//Water Resources.
Res. — 1967. — V. 3. — N 1.
Santoro Т., Stotzky G. Sorption and floculation of clay minerals by
microorganisms and their metabolites//Bacteriol. Proc. — 1966. — RT 26.
Santoro Т., Stotzky G. Sorption between microorganisms and clay
minerals as determined by the electrical sensing zone particle analyzer // Canad. J.
Microbiol. — 1968. — V. 14. — N 4.
Sarathehandra S. U. Nitrification activities of some New Zealand soils-
and the effect of some clay types on nitrification//N. Z. J. Agr. Res. — 1978. —
V. 21. — N 4.
Sardespande J. S., Balesubramanya R. H., Kulkarni J. H.,
Bargyarai D. I. Protozoa in relation to Rhizobium S-12 and Azotobacter
chroococcum in soil//Plant and soil. — 1977. — N 1.
Schmidt E. L. Fluorescent antibody techniques for the study of microbial
ecology//Bull. Ecol. Res. Comm. (Stockholm). — 1973. — V. 17. — P. 67—76.
Schmidt E. L. A ecology'of the legume root nodule bacteria//Interactions
between non-pathogenic soil microorganisms and plants/Y. R. Dommerques,.
S. V. Krupa (Amsterdam). — 1978.
Schreven D. A. Ammonium fixation in clay soils.//Netherl Agric. Sci. —
1968. — N 16.
S с h u 1 e r K. Die vitale Darstelung der Chromatinstrukturen von Bacterium!
coli mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskopes // Naturwiss. — 1954. — Bd 39.
S e i f e r t J. The influence of the soil structure and moisture content on the-
number of bacteria and the degree of nitrification//Folia microbiol. — 1962. —
V. 7. — N 4.
253
S h i v v e r s D. W., Brock T. D. Oxydation o! elemental sulfur by Sulfoto-
&us acidocaldarius // J. Bacterid. — 1973. — V. 114. — P. 706—710.
Singh B. N. Selevtivity in bacterial food amoebae in pure mixed culture
.and in sterilized soil//Ann. Appl. Biol. — 1941. — V. 28. — P. 52—64.
Smith A. M. Ethylene as a critical regulator of microbial activity in
•soil«//Proc. I Int. Congr. JAMS. — 1975. — V. 2. — P. 463—473.
Smith A. M. Ineffectivness of ethylene as a regulator of soil microbial
•activity//Soil Biol, and Biochem. — 1978. — N 4.
Skrdleta V., Hyndrakova A., Nemcova M. Acetylene reduction (di-
rnitrogen fixation) and nitrification in soil as affected by the structural
aggregate size//Folia microbiol. — 1979. — V. 24. — N 5.
Sneath P. H. Longevity of microorganisms//Nature (Engl). — 1962. —
V. 195. — N 4842.
Sohngen N. L. Einfluss von Kolloiden auf mikrobiologische Prozesse//
,//Zblt. Bakteriol., Parasitenk., Infektionkrankh. und Hyg. — 1913. — Abt. 2. —
Bd 38.
Stephenson J. P., Murphy K. L. Kinetics of biological fluidized bed
wastewater denitrification // Progr. Water Technol. — 1980. — V. 12. — N 6.
Stevenson I. L. The effect of sonic vibration on the bacterial plate count
oi soil//Plant and Soil. — 1958. — V. 10. — N 1.
Stohr G. Bestimmung der Bakterienbesatzdichte im Fluoreszenzmikroskop1//
//Zblt. Bakteriol., Parasitenk, Infektionskrankh. und Hyg. — 1970. — Abt. 2. —
Bd 125. — N 4.
S t о 1 p H., Starr M. P. Bdellovibrio bacteriovorus gen. et sp. п., a
predatory, ectoparasitic and bacteriolytic microorganism//Antonie van Leewenhoek J.
Microbiol, and Seroi. — 1963. — V. 29. — P. 217—248.
S t о t z к у G. Influence of clay minerals on microorganisms. II. Effect of
-various clay species, homoionic clays and other particles on bacteria//Canad. J.
Microbiol. — 1966a. — V. 12. — N 4.
Stotzky G. Influence of clay minerals on microorganisms. III. Effect of
particle size, cation exchange, capasity and surface area on bacteria//Canad. J.
Microbiol. — 1966b. — V. 12. — N 6.
Stotzky G., В a b i с h H. Fate of genetically-engineered microbes in
natural environment//Recomb. DNA Tech. Bull. — 1984. — V. 7. — P. 167—191.
Stotzky G., Martin R. T. Soil mineralogy in relation to the spread of
Fusarium wilt of banana in Central America // Plant and Soil. — 1963. —
V. 18. — P. 317—338.
Stotzky G., Rem L. T. Influence of clay minerals on microorganisms. I.
.Montmorillonite and kaolinite on bacteria//Canad. J. Microbiol. — 1966. —
V. 12. — N 3.
Stotzky G., Rem L. T. Influence of clay minerals on microorganisms.
IV. Montmorillonite and kaolinite on fungi!// Canad. J. Microbiol. — 1967. —
"V. 13. — N 11.
Stotzky G., Schenck S. Volatile organic compounds and
microorganisms //Crit. Rev. Microbiol. — 1976. — V. 4. — P. 333—382.
Strugger S. Fluoreszenzmikroskopie und Mikrobiologie. — Hannover,
1949.
S u g i t a H., I s h i d a Y., К a d о t a H. Kinetic analysis of promotive effects
-of kaolin particles on growth of an aquatic bacterium//Bull. Jap. Soc. Sci.
Fish. — 1979. — V. 45. — N 11.
S u i d a n M. Т., Cross W. H., F о n g M. Continuous bioregeneration of
granular activated carbon during the anaerobic degradation of catechol // Progr.
Water Technol. — 1980. — V. 12. — N 6.
S u s 1 о w T. V., S с h г о t h M. N. Bacterial culture preservation in frosen
,and dry-film methylcellulose // Appl. and Environ. Microbiol. — 1981. — V. 42.—
N 5.
T а к а к u w a S., Fujimori Т., I w a s а к i H. Some properties of cell-
sulfur adhesion in Thiobacillus thiooxidans // J. Gen. and Appl. Microbiol. —
1979. — V. 25. — N 1.
T а к a i Y., К a g a w a H., К о b о К. Movement of bacteria by water
percolation in submerged paddy soils. Part 2. On the behaviour of aerobic gramnega-
254
tive bacteria. Abstr // Soil Sci. and Plant Nutr. — 1970. — V. 16. — N 4.
Talibudeen O. Complex formation between montmorillonoid clays an<
amino-acids and proteins//Trans. Faraday Soc. — 1955. — V. 51.
Tanaka H., Dunn I. J. Kinetics of biofilm nitrification//J. Biotechno.
and Bioeng. — 1982. — V. 24. — N 3.
Taylor H. I., Parkinson D. Growth and activity of Penicillium de
cumbens under different environmental conditions in glass microbead media/
//Canad. J. Microbiol. — 1971. — V. 17. — N 7.
Thorns С J. Preservation of mycoplasmas on anhydrous silica gel // J
Appl. Bacteriol. — 1979. — V. 47. — N 1.
Thornton H. G., Taylor С. В. Short period fluctuations in bacteria
numbers in soil//Trans. 3-rd Int. Congr. Soil Sci. (Oxford). — 1935. — V. 1
Tien H., Thayer D. W. Thecellulase system of a Cytophaga species/,
//Can. J. Microbiol. — 1977. — V. 23. — N 9.
Tinker P. B. Mycorrhizas: the present position//12-th Int. Congr. Soi
Sci., Panel discus, papers. New Delhi (India). — 1982.
Trinci A. P. Kinetics of the growth of mycelial pellets of Aspergillus nl
dulans И Arch. Microbiol. — 1970. — V. 70. — P. 225—236.
Trinci A. P. Influence of the width of the peripheral growth zone on the
radial growth rate of fungal colonies on solid media // J. Gen. Microbiol. —
1971. — V. 67. — P. 325—343.
Trinci A. P. A study of the kinetics of hyphal extension and branch
initiation of fungal mycelium //J. Gen. Microbiol. — 1974. — V. 81. — P. 225—
236.
T r i n с i A. P. J., Saunders P. T. Tip growth of fungal hyphae // J. Gen,
Microbiol. — 1977. — V. 103. — P. 243—248.
T r u d i n g e r P. A. The metabolism of inorganic sulphur compounds by
Thiobacilli//Rev. Pure and Appl. Chem. — 1967. — V. 17.
Tschapek M. Adsorcion de lsa bacterias//Cienc. e investig. — 1962. —
V. 18. — N 9—10.
Tschapek M. W., Garbosky A. J. Azotobacter adsorption and its
agronomic importance // Rev. Invest. Agric. — 1951. — V. 5. — N 4.
T u о v i n e n O. H., Niemela S. I., G у 1 e n b e r g H. G. Toxycity of
membrane filters to Thiobacillus firroxidans//Z. allg. Mikrobiol. — 1971. —
V. 11. — N 7.
Turner E. R. The effect of certain adsorbents on the nodulation of clover
plants У/Annals Botany. — 1955. — V. 19. — N 73.
Umali-Garsia M., Hub be 11 D. H., Dazzo F. B. Association of
Azospirillum with grass roots//Appl., Envir. Microbiol. — 1980. — V. 39. —
P. 219—226.
V a n с e 1 I., Stanley S. O., Brown С. М. A microscopical investigation
of the bacterial degradation of wood pulp in a simulated marine environment//
//J. Gen. Microbiol. — 1979. — V. 114. — N 1.
Vela G. R. Survival of Azotobacter in dry soil)//Appl. Microbiol. — 1974.—
V. 28. — N 1.
Verkooyen A. H. M., Van Den Oever A. H. C, Rietema K-
Growth of yeast on n-alkanes. II. Adsorption-desorption phenomena//Biotechnol.
and Bioeng. — 1980. — V. 22. — N 3.
Waksman S. A. Principles of soil microbiology. — L., 1927.
Wallace С. В. Process for biological degradation of organic-containing
waste matter. Bio-Group, Unc. Pat. USA 4297122, 1981.
Watanabe Y., Ishiguro M., Nishidome K. Nitrification kinetics in
a rotating biological disk reactor//Progr. Water Technol. — 1980. — V. 12. —
N 6.
W a t к i n s о n R. J. Interaction of microorganisms with hydrocarbons //
//Hydrocarbons Biotechnol. Proc. Me >t., Canterbury, 1979. — L., 1980.
Webb S. J. The effect of relative humidity and light on air-dried
organisms//J. Appl. Bacteriol. — 1963. — V. 26. — N 3.
Web ley D. M. A technique dor the study of oxygen avaylability to
microorganisms in soi land its possible use as an index of soil aeration //J. Agric.
255
Sci. — 1947. — V. 37. — N 3.
Welch L. F., Scott A. D. Nitrfcaition of fixed ammonium in clay
minerals as affected by added potassium//Soil Sci. — 1960. — V. 90. — N 2.
W i t к a m p M. Direct and indirect counts of fungi and bacteria as indexes
of microbial mass and productivity//Soil Sci. — 1974^^— V. 118. — N 3.
Wodzinski R. S., Larocca D. Bacterial growth kinetics on diphenyl-
inethane and naphthalene-heptamethylnonane mixtures // Appl. and Envirion.
Microbiol. — 1977. — V. 33. — N 3.
W у n n - W i 11 i a m s D. D. Cold tolerant microbial spoilage and
environment. — L., 1979.
Yamagislji H., Furusaka C. Growth of Azotobacter chroococcum in
the medium with colloidally dispersed calcium phosphate gel/У Sci. Repts. Res.
Inst. Tohoku Univ. — 1964. — V. 15. — N 1.
Yoshikawa H., Takiguchi Y. Attached growth of Sphaerotilus natans
in continuous—flow apparatus and its growth inhibition by 9-|3-D-arabinofura-
nosyladenine//Appl. and Environ. Microbiol. — 1979. — V. 38. — N 2.
ZoBell C. E. The effect of solid surfaces upon bacterial activity'//J. Bac-
teriol. — 1943. — V. 46. — 39—56.
ZoBell С. Е., Anderson D. Q. Observations on the multiplication of
bacteria in different volumes of stored sea water and the influence of oxygen
tension and solid surfaces // Biol. Bull. — 1936. — V. 71. — P. 324—342.
Zvyagintsev D. G. Dynamic of microbial populations in soils in the
light of the general concept of soil microorganisms complex functioning//SoiJ
Biology and Conservation of the Biosphere. — Budapest, 1984.
Zvyagintsev D. G., Kozhevin P. A., Kirillova N. P. Ecological
characteristics of rhizosphere//Problems of Soil Science. — M., 1981.