ИФ.СЕЙЦ, ПГ КНЯЗЕВ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ
И. Ф. СЕИЦ, П. Г. КНЯЗЕВ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ
онкология
Руководство для врачей
ЛЕНИНГРАД «МЕДИЦИНА»
Ленинградское отделение 1986
ББК 55.6
С 28
УДК 616-006:577.2) (035)
Рецензенты: Бутенко 3. А. — заведующая отделом молекулярных механизмов
канцеро- и ленкозогенеза Института проблем онкологии им. Р. Е. Кавецкого
АН УССР, чл.-кор. АН УССР доктор мед. наук профессор; Голубев Д. Б. —
заведующий отделом молекулярной биологии и генетики вирусов Всесоюзного
НИИ гриппа М3 СССР, доктор мед. наук профессор.
For summary see page 351.
Иосиф Фридрихович Сейц, Петр Григорьевич Князев
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОНКОЛОГИЯ
Заведующий редакцией Р. С. Горяинова. Редактор Д. Б. Голубев. Редактор изда-
тельства Л. И. Панова. Художественный редактор Н. Д. Наумова. Оформление
художника А. Ю. Колокольцева. Технический редактор Л. Б. Резникова. Корректор
Р. И. Гольдина.
ИБ 3816
Сдано в набор 24.06.86. Подписано в печать 18.09.86. М-25185. Формат бумаги 60 x 90'/ie-
Бумага офсетная № 2. Гарнитура литературная. Печать офсетная. Усл печ л. 22,0. Усл.
кр.-отт. 22.5. Уч.-изд. л. 24.94. Тираж 7000 экз. (11-й завод 1001 7000 экз.). Зак. № 392.
Цена I р. 60 к.
Ленинград, Ордена Трудового Красного Знамени издательство <Меднцнна>.
Ленинградское отделение. 191104, Ленинград, ул. Некрасова. 10.
Отпечатано в типографии № 4 ордена Трудового Красного Знамени Ленинградского
объединения «Техническая книга> им. Евгении Соколовой Союзполнграфпрома при Госу-
дарственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли.
191126, Ленинград. Социалистическая ул., 14 с диапозитивов Ордена Трудового Красного
Знамени Первой типографии издательства «Наука».
199034, Ленинград, В-34, 9 линия, 12
Сейц И. Ф., Князев П. Г.
С 28 Молекулярная онкология: (Руководство для врачей). —
Л.: Медицина, 1986. — 352 с., ил.
Авторы: Сейц И. Ф. — профессор, руководитель лаборатории биохимии
опухолей НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова М3 СССР; Князев П. Г. — ст. научный
сотрудник той же лаборатории.
В руководстве рассмотрен прогресс теоретической онкологии в изучении
химического, вирусного н так называемого спонтанного канцерогенеза с позиций
единого их молекулярного механизма, основанного на концепции онкогенов.
Изложены новейшие данные о существовании в ДНК клеток человека и живот-
ных уникальных генов (протооикогеноа), причинно связанных с этиологией злока-
чественных новообразований, их идентификации, структуре и функции в нормаль-
ных и опухолевых клетках.
Руководство рассчитано на онкологов, молекулярных биологов, иммунологов,
биохимиков, онковирусологов и цитологов.
4116000000-064
039(01)-86
176 86
55.6
•С) Издательство «Медицина», Москва, 1986 г.
ПРЕДИСЛОВИЕ
В результате прогресса новых научных направлений молеку-
лярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии
сделан огромный шаг вперед, что позволяет сейчас задавать при-
роде вопросы, которые ранее ставить было невозможно. Речь
идет о понимании самых фундаментальных основ таких явлений,
как клеточное деление и дифференцировка, а также причин меха-
низма их нарушений. В конкретном приложении к одной из
самых злободневных и волнующих проблем, стоящих перед челове-
чеством, — проблеме злокачественных опухолей — можно гово-
рить о появлении новой науки — молекулярной онкологии. Ее
поразительные успехи в сфере изучения молекулярных механизмов
онкогенеза и молекулярных основ ракового фенотипа связаны
с применением уникальных, присущих ей методов исследования.
Выходящая в свет и предлагаемая читателям книга «Моле-
кулярная онкология» посвящена подведению первых итогов
и изложению достижений указанной молодой науки. В ней четко
прослеживается преемственность основных принципов и постула-
тов классической теоретической онкологии прежде всего в глав-
ных вопросах: полиэтиологичности возникновения опухолей и
многостадийности этого процесса. Однако решения даются уже на
другом уровне организации живой материи — молекулярном.
Данная книга — первая и единственная пока в нашей стране. Она
написана авторами, непосредственно и активно работающими
в данной области, что предопределило глубину осмысления приво-
димых конкретных фактов и конструктивность обобщений. Через
всю книгу проходит мысль об универсальности молекулярных
механизмов онкогенеза. Эта идея естественно вытекает из проводи-
мого авторами анализа новейших исследований основных видов
канцерогенеза: химического, физического, биологического, основа
которых, как убедительно показывают авторы, едина и может быть
выражена в принципиально общих молекулярных терминах. Каж-
дому из этих видов онкогенеза посвящены отдельные главы.
1-я глава обращает читателя к истокам теоретической онкологии,
к ее классическим исследованиям начала нынешнего столетия.
2-я и 3-я главы посвящены соответственно молекулярным меха-
низмам химического и вирусного канцерогенеза. Упомянутые пер-
вые три главы логически предшествуют заключительным — 4-й и
5-й главам — подлинной сердцевине книги. Именно в этих главах
в концентрированном виде представлены факты и идеи, символи-
зирующие суть и дух современной теоретической онкологии —
онкологии молекулярной. Ее достижения вселяют уверенность
в конечной победе человеческого разума над тяжелым недугом.
Член-корреспондент АМН СССР
профессор И. П. Напалков
• •	3
ВВЕДЕНИЕ
Практическая онкология ждет от теоретической и эксперимен-
тальной науки ответов на ряд вопросов, без которых невозможны
ни эффективная диагностика злокачественных опухолей, ни рацио-
нальная терапия. Первый, фундаментальный, вопрос относится
к природе опухолей и их этиологии. Ничто другое не могло бы
оказать большую услугу онкологам, чем внесение ясности в эту
проблему, чего, однако, до сих пор не произошло. Не меньшую
практическую значимость имеет решение и другого вопроса: чем
отличаются раковые клетки от нормальных? Установление ка-
ких-то различий могло бы стать основой как диагностики, так и
терапии злокачественных опухолей. К сожалению, современная
биохимия пока не справилась и с этой задачей.
Экспериментально-теоретические исследования злокачествен-
ных опухолей принесли обильный фактический материал и зна-
чительно расширили наши знания о неоплазмах, однако все еще
не дали объяснения их происхождению у человека, как и не
указали на какие-либо специфические биологические особенности
раковых клеток. Это тем более странно, если учесть, что к решению
онкологических проблем привлечены в настоящее время очень
большие коллективы и самая передовая техника.
Относительный неуспех биохимического исследования опухо-
лей можно объяснить сложностью изучаемого феномена. Малигни-
зация связана с нарушением таких фундаментальных биологиче-
ских явлений, как рост, пролиферация, наследование признаков
в клеточном потомстве. Ни один из этих атрибутов живого не изу-
чен в достаточной мере каждый в отдельности; тем сложнее интер-
претация процесса, являющегося результирующей их совокупных
изменений. Поскольку рост, дифференциация, наследственность
лежат в самой основе жизни, раскрытие феномена рака, вклю-
чающего в себя все эти элементы, может оказаться не менее
сложным, чем уяснение сущности самой жизни.
Если верно, что жизнь отличается от других естественных
процессов тем, что она развивается по программе, то это спра-
ведливо и в отношении неоплазии, поскольку отдельные нозологи-
ческие формы опухолей имеют четкие морфологические, биологи-
ческие, иммунологические и другие характеристики, обусловлен-
ные реализацией строгой генетической программы, привнесенной
в клетку извне или пробужденной к активности измененной (опять-
таки под влиянием окружающей среды) эндогенной информацией.
4
Систематическое биохимическое изучение злокачественных
опухолей проводится уже более 60 лет. В наши дни масштабы
этих исследований особенно велики. Однако сегодня особо впе-
чатляют и вселяют надежды, в первую очередь, новейшие открытия
в области молекулярной биологии опухолей и процесса канцеро-
генеза — направления, которые кратко можно было бы охаракте-
ризовать термином «молекулярная онкология».
Использование молекулярно-биологических, молекулярно-ге-
нетических, генно-инженерных принципов и методов исследования
сделало возможным то, что не было доступным всему комплексу
«старых» наук и даже таким, как классические биохимия, иммуно-
логия, вирусология, генетика, цитология в отдельности. Только
глубокий анализ молекулярных основ трансформации и канцеро-
генеза способствовал прорыву из незнания в знание и обогатил
современную теоретическую онкологию такими открытиями и
понятиями, как онкоген, онкобелок, клеточные протоонкогены
и др. Создается впечатление, что на базе новых открытий моле-
кулярной онкологии окажется возможным построить универсаль-
ную концепцию онкогенеза, объединив в единую теорию раз-
вившиеся раздельно и нередко конфликтовавшие направления
в изучении химического, вирусного, радиационного, спонтанно-
мутационного канцерогенезов.
В предлагаемой читателю книге главное внимание уделено
именно этим новым данным теоретической онкологии и попытке
создать интегральное представление о состоянии и уровне наших
знаний о раке на сегодня.
Следует также подчеркнуть важную роль в подготовке и ста-
новлении указанного современного этапа теоретических знаний
о неоплазмах таких наук, как биохимия и вирусология. Без
успехов этих дисциплин мы не располагали бы тем, чем не без
оснований учение о злокачественных новообразованиях может
гордиться сегодня.
Естественно, книга даже такого объема, как эта, не может
охватить предмет в необходимой полноте и способна дать лишь
общее представление о современных достижениях и тенденциях
развития молекулярной онкологии. Содержание ее представляет
скорее отдельные штрихи, узловые аспекты сложной многоплано-
вой и загадочной картины; контуры границ достигнутого и воз-
можного; первые систематические знания, лежащие на полпути
от созерцания формы к пониманию содержания; примеры драмати-
ческих успехов и неудач отдельных личностей и целых научных
направлений на фоне закономерного и противоречивого истори-
ческого процесса познания.
Вместе с тем приведенные в книге многочисленные оригиналь-
ные работы отражают теоретический и технико-методический
уровень, характер и направленность онкологических исследований.
Выдвигая в центр внимания химические и молекулярные
взаимодействия при онкогенезе, авторы не сочтут свою задачу
5
выполненной, если не создадут у читателя убеждения, что рак
представляет собой в высшей степени сложное биологическое
явление, включающее много больше, чем только вирус, химический
агент или элементарный трансформирующий фактор (онкоген)
каждый в отдельности, что рак, при всей кажущейся его противо-
положности жизни, закономерно вытекает из нее, основан на ее
фундаментальных принципах и ключевых явлениях, таких как рост,
пролиферация, и без них был бы невозможен; что «орудия»,
которыми он оперирует, — суть элементы жизни. В этом, по-види-
мому, диалектика рака как биологического явления. Другими сло-
вами, в условиях постоянного воздействия повреждающих факто-
ров среды, переключающих нередко «плюсы» на «минусы», рак
неотделим от жизни, создавая кажущееся впечатление ее тени.
Тайна рака переплетена с тайной жизни, поскольку оба феномена
покоятся на общих основах — универсальных биологических за-
конах роста, пролиферации. Трудной задачей молекулярной
биологии в этих условиях является выявление точек соприкосно-
вения и пересечения двух процессов, установление границы между
ними. Задача нелегкая. Тем не менее уже имеющийся опыт
и знания молодой науки — молекулярной онкологии — позволяют
смотреть в будущее с оптимизмом.
ГЛАВА 1
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ ВАРБУРГА
И ДРУГИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ
ГИПОТЕЗЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ РАКА
Еще недавно считалось, что ни одна из существующих теорий
рака не отжила свой век. Это объяснялось сравнительной моло-
достью экспериментальной онкологии; как и' всякая молодая
наука, она была богата новыми взглядами и теориями, которые
не успевали еще ни подтвердиться, ни отмереть. Сегодня утверж-
дение о жизненности и актуальности большинства теорий и
гипотез рака представляется сомнительным, особенно в свете
новейших данных о существовании специфических онкогенов и
онкобелков. В этом смысле справедливым кажется замечание
историка науки Уитмена, что идеи, подобно людям, рождаются,
переживают приключения и умирают. Тем не менее историческое
значение идей и концепций, рожденных теоретической онкологией
на первых этапах своего существования, вряд ли может вызывать
сомнение, поскольку роль их в развитии этой науки очевидна.
Именно это обстоятельство побуждает нас дать хотя бы беглый
очерк взглядов на природу и происхождение опухолей, прежде
всего в рамках духа этой книги, т. е. с учетом их биохимических,
метаболических и молекулярно-биологических предпосылок и
аргументов.
К числу такого рода теорий и гипотез можно отнести следую-
щие: 1) теория метаболических нарушений как предпосылки
возникновения рака; 2) теория индукции опухолей химическими
веществами; 3) вирусная теория происхождения опухолей; 4) му-
тационно-генетическая гипотеза; 5) теория онкогена.
Указанным теориям в этой книге будут посвящены целые
самостоятельные разделы. Отдельные аспекты первых четырех
не утратили своего значения и на сегодняшний день. Более
того, некоторые их элементы, по-видимому, войдут в качестве
интегральной части новой универсальной концепции канцероге-
неза, представляемой ныне теорией онкогена. Этот вопрос под-
робнее будет рассмотрен ниже.
Особняком стоит 1-й пункт сделанного выше перечисления.
Идея обменно-химических нарушений как основы возникновения
7
рака представлялась весьма реальной и перспективной. Она была
исключительно популярной несколько десятилетий кряду (30—
70-е годы). Особенно это относится к теории О. Варбурга (О. War-
burg), захватившей воображение многих исследователей и завое-
вавшей ее автору много учеников и последователей. Этот успех
не был случайным. Адекватность метаболической теории истинным
реакциям и процессам в ходе канцерогенеза, казалось, убеди-
тельно подкреплялась новейшими и поразительными открытиями
стремительно развивающейся биохимии того времени, а именно:
расшифровкой цепи дыхания и гликолиза в конкретных терминах
участвующих в них ферментов и коферментов; раскрытием
своеобразных взаимоотношений дыхания и гликолиза в нормаль-
ной и опухолевой клетке; выяснением энзимохимических реакций,
обеспечивающих жизнедеятельность нормальных и неопластиче-
ских клеток энергией; установлением связи этих реакций с конкрет-
ными субклеточными структурно-морфологическими элемен-
тами и др.
Немаловажной причиной успеха, в частности, метаболической
концепции Варбурга было и то, что автор ее сам являлся именно
тем лицом, которому наука была обязана большинством наиболее
значительных и фундаментальных достижений в общей биохимии,
объясняющих многие биологические явления. Достаточно сказать,
что Варбургу принадлежат следующие выдающиеся открытия:
1) установление связи процесса дыхания с нерастворимыми
субклеточными частицами (митохондриями); 2) обнаружение
высокой гликолитической активности раковых клеток как главного
энергетического источника их существования; 3) идентификация
железопорфирина как катализатора утилизации кислорода жи-
выми клетками; 4) открытие флавинмононуклеотида и флавинди-
нуклеотида в качестве простетических групп катализаторов биоло-
гических окислений и выяснение механизма их действия; 5) дока-
зательство роли никотинамида как главного компонента коэнзимов
дегидрогеназ (НАД и НАДФ) и установление механизма действия
и роли последних в метаболических реакциях; 6) изучение энер-
гетики процесса фотосинтеза; 7) расшифровка молекулярного
механизма действия ряда ферментов гликолиза; 8) введение
в экспериментальную биохимию техники срезов тканей, спектро-
фотометрического изучения действия ферментов и коферментов,
манометрии как метода исследования дыхания и гликолиза,
кристаллизации ферментов и др.
ОТТО ВАРБУРГ И ЕГО БИОХИМИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ РАКА
Первое самостоятельное исследование О. Варбурга, опубли-
кованное в 1908 г., касалось энергетики роста. В нем он изучал
изменение в поглощении Ог яйцами морского ежа после оплодотво-
рения. Эти эксперименты привели к важному открытию, что при
оплодотворении скорость поглощения О2 возрастает в 6 раз.
8
Связь данной работы с более поздними исследованиями рака
очевидна: когда нормальная клетка становится раковой, она
растет интенсивно. Поэтому в 1922 г. Варбург стал исследовать
поглощение Ог и обмен раковых клеток. В последующей работе
он занимался фундаментальными аспектами клеточного дыхания
и намеревался объяснить природу катализа в живой материи,
делающего молекулярный кислород способным окислять вещества
в практически нейтральном растворе и при биологической темпе-
ратуре, которые (вещества) стабильны в этих условиях в отноше-
нии кислорода. Варбург нашел, что главные окислительные про-
цессы в биологических объектах всегда связаны с нерастворимыми
частицами, которые он назвал «гранулы», «структуры». В 1913 г.
им были описаны «гранулы» из печеночных клеток как структуры,
ответственные за дыхание. После работ A. Claude, G. Hogeboom
и W. Schneider (40—50-е годы нашего столетия) мы знаем, что
эти морфологические структуры клетки, описанные гистологами
еще в 1890 г., являются митохондриями.
В 1923 г. Варбург обнаружил высокую скорость образования
молочной кислоты раковыми клетками и пришел к заключению,
что способность получать энергию за счет «молочнокислой фермен-
тации» глюкозы и расти за счет энергии этого процесса является
главной биохимической характеристикой раковых клеток. В 1927 г.
Нобелевский комитет оценил эту работу как достойную Нобе-
левской премии и предложил разделить премию между О. Вар-
бургом и J. Fibiger, который сделал якобы открытие, показав
возможность развития рака желудка у крыс, инфицированных
паразитическим червем Spiroptera. Окончательное решение выс-
шего Нобелевского синклита было в пользу одного J. Fibiger.
Ирония судьбы: О. Варбург и J. Fibiger! Последующая оценка
работы J. Fibiger бросила тень на мудрость этого решения,
так как инфекция Spiroptera является лишь одним из многих
возможных раздражающих стимулов, в лучшем случае способ-
ствующих развитию рака, но не его этиологической причиной.
Тем не менее Варбург был удостоен Нобелевской премии
в 1931 г., однако за другую серию исследований, начатых
в 20-е годы. Используя остроумную и совершенно новую технику,
он идентифицировал железопорфирин как катализатор, ответ-
ственный за утилизацию кислорода живыми клетками. Несколько
лет спустя Варбург идентифицировал флавинаденинмононуклео-
тид и флавинадениндинуклеотид в качестве простетических групп
катализаторов биологических окислений и выяснил механизм их
действия. Связанным с этой работой оказалось также открытие
никотинамида как главного компонента коэнзимов дегидрогеназ
(НАД и НАДФ). В 1944 г. Нобелевский комитет вновь признал
Варбурга достойным Нобелевской премии, однако он не получил ее
по причинам, не имеющим отношения к сути дела.
Варбург впервые показал присутствие железа в биологическом
материале и участие его в клеточном дыхании. Сделал это он
9
с помощью цианида, который, как известно, является мощным
ингибитором биологического окисления в результате реакции с тя-
желыми металлами. Он продемонстрировал ускорение окисления
ряда биологических субстратов: лецитина, линолевой кислоты,
цистеина, альдегидов — в присутствии солей железа.
В научной деятельности Варбурга после первой мировой войны
можно выделить 3 главных направления исследований: фотосин-
тез, рак и химическую природу ферментов, ответственных за
биологическое окисление и биологическую трансформацию энер-
гии. Во все эти 3 области биохимии (и биологии вообще) Варбург
внес неоценимый вклад, значительно продвинув методологию и
сделав фундаментальные открытия.
Изучение Варбургом дыхания и гликолиза опухолей. Сначала
несколько общих замечаний по этому циклу работ Варбурга.
Проблема рака увлекала Варбурга еще в студенческие годы.
Он пытался найти биохимические изменения в тканях, когда
нормальная клетка (рост которой контролируется) становится
раковой (рост которой неограничен). Варбург интересовался
вопросом, отличается ли обмен раковых клеток от нормальных
качественно. Он считал необходимым исследовать, в первую оче-
редь, энергетический обмен, так как рост невозможен без поступ-
ления энергии.
В 1923 г. Варбург стал измерять дыхание перевивного рака
Флекснера—Джоблинга крыс, используя технику срезов ткани.
Результат показал, что скорость поглощения кислорода раковыми
клетками не отличалась от таковой — нормальными клетками.
Однако при исследовании образования молочной кислоты было
обнаружено, что раковые клетки легко и с большой скоростью
расщепляют глюкозу до молочной кислоты, значительно большей,
чем это делают печень, почка, поджелудочная или подчелюстная
железы. Скорость образования лактата раковой тканью полностью
обеспечивала ее энергией.
Эти данные были вскоре подтверждены на других типах
неопластических клеток, включая раковые клетки человека.
Особый интерес представило наблюдение Варбурга, что рако-
вые клетки способны интенсивно гликолизировать не только
в анаэробных (что свойственно и нормальным клеткам), но и
в аэробных условиях, т. е. в присутствии кислорода воздуха
[Warburg О., 1926[.
В попытке выяснить, специфичен ли аэробный гликолиз
только для раковых клеток, автор испытывал многие ткани.
Он обнаружил, что все живые ткани, являющиеся метаболически
активными, способны к анаэробному гликолизу, однако подавляю-
щее большинство их не гликолизирует в аэробных условиях.
Последний эффект блокирования гликолиза или брожения со
стороны дыхания получил в честь открывшего его автора термин
«эффект Пастера», «пастеровский эффект» или, как предпочитал
выражаться Варбург, «пастеровская реакция».
ю
Главным исключением в отмечен-
ной Варбургом закономерности при-
сутствия аэробного гликолиза в опу-
холях и отсутствия его в нормальных
тканях оказалась сетчатка глаза, по-
казавшая очень высокую гликолити-
ческую активность в аэробных усло-
виях.
Варбург установил также, что
некоторые нормальные ткани, напри-
мер гематопоэтические (костный
мозг), постепенно развивают аэроб- Рис. ЕСхемауглеводногообмена
ный гликолиз, если они экспозируются
in vitro в нефизиологических усло-
виях. Он сделал из этого опыта заключение, что аэробный глико-
лиз, в частности сетчатки, очень своеобразной и ранимой ткани,
мог быть артефактом в неадекватных условиях in vitro.
В итоге Варбург пришел к заключению, что раковые клетки
отличаются от нераковых, включая растущие эмбриональные
клетки, неспособностью подавлять гликолиз в присутствии кисло-
рода (т. е. имеют неполноценный «пастеровский эффект»).
Осуществленные к тому времени исследования Мейергофа
(О. Meyerhof), казалось, могли объяснить особенности взаимо-
отношений дыхания и гликолиза в раковых клетках. Автор устано-
вил, что в мышце существует определенная связь между скоростью
дыхания и подавлением гликолиза. Как правило, поглощение
одной молекулы Ог предотвращало образование двух молекул
лактата. Это означало, что эффект кислорода не может быть
объяснен (как полагали ранее) полным окислением лактата.
Мейергоф высказал предположение, что ферменты, участвующие
в образовании лактата, функционируют в аэробных условиях,
но что образующийся лактат ресинтезируется обратно в углевод
за счет энергии, обеспечиваемой процессом дыхания. Как известно,
Мейергоф описал углеводный обмен мышцы (рис. 1).
Мейергоф подсчитал, что энергии поглощения одной молекулы
кислорода достаточно для осуществления ресинтеза углевода
из двух молекул лактата.
Открыв высокий аэробный гликолиз раковых клеток, Вар-
бург попытался установить причины неспособности кислорода
подавлять гликолиз в раковых клетках. Его измерения анаэроб-
ного и аэробного гликолиза (образования лактата) различными
тканями и сопоставление этих данных с результатами измерения
поглощения О2 показали, что во многих тканях поглощение
одной молекулы Ог путем дыхания предотвращает появление
двух молекул молочной кислоты. Это — то же количественное
отношение, которое Мейергоф нашел в мышечной ткани. Эф-
фективность дыхания в предотвращении аэробного гликолиза
Варбург выразил следующим уравнением:
и
Анаэробный гликолиз — аэробный гликолиз
Дыхание
и назвал его «коэффициентом Мейергофа». Если гликолиз выра-
жен в единицах образованного лактата, а дыхание — в единицах
поглощения кислорода, то величина коэффициента Мейергофа
обычно равна 2. В раковой ткани Варбург нашел дыхание сни-
женным и энергетически менее эффективным, что позволило ему
сделать заключение о дефектности дыхания раковых клеток
в контролировании аэробного гликолиза.
«Эффект Пастера». В тот период времени знания о путях
гликолиза и глюконеогенеза были весьма ограниченны, что исклю-
чало возможности выяснения вопроса о том, каков механизм
действия дыхания в предотвращении продуктов гликолиза и
осуществлении ресинтеза углевода. В этой обстановке ограни-
ченности необходимых знаний Варбург внес важный вклад
в проблему взаимоотношений дыхания и гликолиза. В 1926 г.
он установил, что связь между дыханием и, как говорил тогда
Варбург, ферментацией может быть нарушена специфическим ин-
гибитором, этилкарбиламином. В основе действия этого соедине-
ния, как показал Варбург, лежит его способность при исполь-
зовании в низких концентрациях, не угнетая дыхания клеток,
индуцировать аэробный гликолиз, т. е. гликолиз в присутствии
кислорода. Иными словами, этилкарбиламин оказался агентом,
нарушающим «пастеровскую реакцию». Поскольку этилкарбил-
амин легко хелатирует с ионами тяжелых металлов и тормозит
другие реакции, катализируемые тяжелыми металлами, Варбург
заключил, что в реализации «пастеровской реакции» участвует
тяжелый металл.
Природа и механизм «пастеровской реакции» долгие годы
оставались необъясненными.
Потребовался длительный отрезок времени для того, чтобы
было достигнуто какое-то приближение к пониманию «пастеров-
ского эффекта». Это было сделано в результате серии работ,
выполненных в лабораториях В. А. Энгельгардта, F. Lynen,
Т. Bucher и др.
Схематично и кратко механизм осуществления «пастеровского
эффекта» может быть представлен на основании современных
данных следующим образом, отличным от их толкования Вар-
бургом.
Считается, что суть дела не в индукции кислородом ресинтеза
продуктов гликолиза. Дыхание, через синтез АТФ, модифицирует
каталитические свойства скоростьограничивающего фермента
гликолиза (или брожения), фосфофруктокиназы. Активность этого
энзима вариабельна и регулируется концентрацией АТФ, АДФ
и неорганического фосфата, равно как и различными другими
метаболитами. Фосфофруктокиназа является «аллостерическим»
ферментом, и «пастеровский эффект» может быть приписан ал-
12
лостерическим свойствам этого фермента: АТФ инактивирует
фосфофруктокиназу, тогда как АДФ и неорганический фосфат
активируют ее. Поскольку дыхание посредством окислительного
фосфорилирования вызывает превращение АДФ и неорганического
фосфата в АТФ, оно (дыхание) снижает активность фосфофрукто-
киназы. Далее, так как этилкарбиламин разобщает окислитель-
ное фосфорилирование [Warburg О., 1926, 1969], он может устра-
нить влияние дыхания на гликолиз. Многие другие «разобщители»
обладают таким же действием [Сейц И. Ф., 1961; Сейц И. Ф.,
Луганова И. С., 1967]. Таким образом, «пастеровский эффект»
(«пастеровская реакция») неразрывно связан с окислительным
фосфорилированием. Так как тяжелые металлы входят в состав
дыхательной цепи клеток, мысль Варбурга об участии их в «пасте-
ровской реакции» представляется в принципе справедливой.
Варбург сохранял интерес к проблеме рака всю свою жизнь.
Он продолжал считать, что потеря нормального дыхания является
ключевым фактором в канцерогенезе. В 1969 г. (в немецком
издании — в 1966 г.) Варбург суммировал свои взгляды, раз-
делив причины болезней на первичные и вторичные. Например,
первичной причиной чумы является чумная бацилла, однако
вторичными причинами чумы являются грязь, крысы и блохи,
которые переносят чумные бациллы от крыс к человеку. Под
первичной причиной болезни он понимал такую, которая обнару-
живается в каждом случае проявления ее.
Рак, согласно Варбургу, больше, чем все другие болезни, имеет
бесчисленные вторичные причины. Почти все они могут вызвать
рак. Однако даже для рака имеется только одна первичная
причина. Суммируя в немногих словах, первичной причиной
рака, по его мнению, является замещение дыхания кислородом
в нормальных клетках тела ферментацией сахара. Все нормальные
клетки организма удовлетворяют свои энергетические потребности
за счет дыхания кислородом, тогда как раковые клетки удовлетво-
ряют свои энергетические потребности в значительной части путем
ферментации. Все нормальныые клетки тела являются, таким
образом, облигатными аэробами, тогда как все раковые клетки —
частичные аэробы. Варбург считал, что с точки зрения фи-
зики и химии жизни эта разница между нормальными и рако-
выми клетками велика. Кислородный газ, донор энергии у растений
и животных, развенчан в раковых клетках и заменен энергию-
производящей реакцией низших живых форм, а именно фермента-
цией глюкозы. Ключом к проблеме рака, по Варбургу, является
энергетика жизни.
Он утверждал, что замещение кислородного дыхания фермен-
тацией является первичной причиной рака. Поэтому все раковые
клетки без исключения должны ферментировать, чего не должно
наблюдаться ни у одной нормально растущей клетки.
Поскольку не существует раковых клеток, дыхание которых
интактно, Варбург считал, что нет смысла дискутировать по поводу
13
возможности предотвращения рака при сохранении дыхания
раковых клеток интактным.
Исходя из этих своих принципиальных установок в отношении
роли дыхания в обеспечении нормального физиологического
состояния, Варбург высказал ряд практических предложений для
предотвращения развития рака в организме. Так, он рекомендо-
вал: 1) поддерживать скорость кровотока столь высокой, чтобы
венозная кровь еще содержала достаточно кислорода; 2) под-
держивать высокую концентрацию гемоглобина в крови; 3) всегда
добавлять в пищу, даже здоровых людей, активные группы дыха-
тельных ферментов и увеличить дозы этих групп при уже развив-
шемся предраковом состоянии. Если в то же время экзогенные
канцерогены строго исключены, тогда, по мнению Варбурга,
большинство заболеваний раком может быть предотвращено уже
сегодня.
Не все из перечисленных взглядов и положений Варбурга
сохраняют силу и разделяются всеми специалистами (особенно
в таком крайнем выражении, как приведено выше). Скорее наобо-
рот, по мере накопления новых фактов некоторые из них утра-
чивают свою доказательную силу. Однако при оценке научного
наследия Варбурга следует четко различать две стороны его твор-
чества: 1) фактические данные; 2) интерпретацию и обобщение
этих данных. Необходимо четко констатировать, что все сделанное
Варбургом экспериментально, абсолютно надежно, достоверно и
ценно. Ни один из полученных им конкретных фактов не опро-
вергнут и не подвергнут сомнению. Все его исследования выпол-
нены на высочайшем теоретическом и технико-методическом
уровне. Иначе дело обстоит со сделанными им обобщениями и
умозаключениями. Нельзя сказать, что они всегда оставались
корректны, хотя в момент выдвижения они представлялись
адекватными экспериментальным результатам. Но с течением
времени при появлении новых данных происходила постепенная
их «девальвациям», эрозия надстроек над фактами, что не всегда
было безболезненно. Известны упорство и даже некоторый консер-
ватизм Варбурга в отстаивании собственных взглядов и положе-
ний, переходившие в отдельных случаях в нетерпимость к оп-
понентам.
Варбург был фанатично предан своим идеям и все возражения
воспринимал как личную обиду. Однако сегодня совершенно
очевидно, что некоторые его теоретические обобщения возникли
в результате большого упрощения. В частности, частичное заме-
щение дыхания гликолизом является лишь одной из многих
характеристик, которые отличают (да и то не всегда) раковые
клетки от нормальных. Варбург игнорировал фундаментальный
биохимический аспект раковой проблемы, а именно механизмы,
ответственные за контролируемый рост нормальных клеток,
которые утрачены в раковых клетках. Несомненно, различия
в энергетическом обмене, открытые Варбургом, важны, однако,
14
будучи таковыми, они находятся на уровне биохимической орга-
низации клетки и недостаточно глубоки, чтобы касаться сердце-
вины проблемы рака, неконтролируемого роста. «Первичная при-
чина рака» Варбурга — замена дыхания гликолизом — может
быть лишь симптомом истинной первичной причины, однако не яв-
ляется таковой сама по себе. Первичную причину следует искать на
уровне контроля генной экспрессии, детали которой пока не
известны.
Таково, в частности, мнение лауреата Нобелевской премии
и в прошлом — коллеги Варбурга по работе Н. Krebs (1972).
Интересно, что Варбург не только провозглашал принципы
профилактики рака, считая, что 80 % случаев этого заболевания
среди людей могли быть предотвращены, если бы все контакты
человека с известными экзогенными канцерогенами были исклю-
чены. Он активно сам лично следовал им, создавая некоторыми
крайностями в проведении их в личной жизни впечатление
у окружающих немалой эксцентричности и странности. Известно
[Krebs Н., 1972], что эксцентричность, например, касалась пищи.
Поскольку для Варбурга было совершенно ясно, что рак может
возникать при действии большого числа химических соединений,
если они апплицируются длительные периоды времени, он стал
исключительно осторожен в приеме пищи, которая обрабатыва-
лась специальными химическими веществами. Он никогда не ел
хлеба из магазинов, если мог избежать этого, а использовал
хлеб, приготовленный в домашних условиях; опасался удобрений,
инсектицидов и пестицидов, в связи с чем выращивал необ-
ходимые овощи, ягоды и фрукты в своем хозяйстве без употреб-
ления этих химикатов; держал кур, уток, гусей, индюшек и
кроликов; приобретал из соседней сельскохозяйственной школы
большие партии молока от специального стада, центрифугировал
его для получения масла и сметаны.
Экспериментальные факты, послужившие основой метаболиче-
ской теории Варбурга. Вряд ли будет ошибкой сказать, что иссле-
дования Варбурга и сотр. положили начало современной биохимии
опухолей. Эти работы овладели умами исследователей, стимулиро-
вали новые энергичные поиски особенностей ракового обмена,
определили направление исследований во многих лабораториях
на много лет вперед.
В серии работ, выполненных с 1923 по 1926 г., Варбург и сотр.
провели глубокое изучение энергетического обмена раковых и не-
которых нормальных тканей [Warburg О., 1926J. Прежде всего
были отмечены чрезвычайно высокая гликолитическая активность
срезов раковых тканей и нормальный или несколько сниженный
уровень дыхания. Срезы крысиной карциномы Флекснера—
Джоблинга, состоящей, главным образом, из эпителиальных кле-
ток, в расчете на 1 мг сухой массы ткани в 1 ч образовывали
из добавленной глюкозы в анаэробных условиях 0,124—0,129 мг
[Warburg О., 1926] молочной кислоты, что составляет более 12 %
15
от сухой массы опухоли и соответствует коэффициенту Qcos =
= 31—32. Значение этого показателя г становится особенно яс-
ным из его сравнения с показателями гликолитической активности
других тканей. Кровь образует за 1 ч молочную кислоту в коли-
честве, соответствующем 0,1 % от ее сухой массы, покоящаяся
мышца—0,06 %, а максимально работающая мышца — 1,5 %.
Раковая ткань, таким образом, продуцирует молочную кислоту
со скоростью, в 124 раза большей, чем кровь, в 20 раз — чем
покоящаяся мышца, и в 8 раз большей, чем работающая мышца.
Варбург и сотр. показали, что способность раковых клеток
перевиваться тесно связана с их способностью к гликолизу.
Утрата раковыми клетками гликолитической активности при-
водит к потере ими способности перевиваться.
Одним из наиболее интересных и важных результатов лабо-
ратории Варбурга является обнаружение в неопластических
клетках аэробного гликолиза. Величина аэробного образования
молочной кислоты опухолями оказалась очень высокой: анаэроб-
ный гликолиз в срезах крысиной карциномы Флекснера—Джоб-
линга колебался в коэффициентах QCo3 между 25 и 40, а гликолиз
в аэробных условиях — 20—36. Варбург приводит средние цифры
соответственно 31 и 25. Поскольку измерения Варбурга пока-
зали, что коэффициент Мейергофа в раковых и нормальных
тканях одинаков, т. е. эффективность дыхания в опухолях сохра-
няется, но в то же время гликолиз раковых клеток непомерно
высок, он решил, что причиной аэробного гликолиза в злокачест-
венных опухолях является количественная недостаточность дыха-
ния по сравнению с гликолизом. Действительно, определение ин-
тенсивности дыхания карциномы дало величину QOf 7,2. Хотя эта
величина не отличается от таковой у некоторых нормальных тка-
ней, она, конечно, низка. При таком соотношении дыхательной
и гликолитической активности клеток возникновение аэробного
гликолиза Варбург считал естественным и неизбежным. Таким
образом, обмен раковых клеток, по Варбургу, представляет собой
сочетание окислительного и гликолитического метаболизма.
Введенный Варбургом коэффициент ——~ыхан~е . опреде-
ляющий число молекул молочной кислоты, образующихся на
каждую молекулу поглощенного кислорода, характеризовал коли-
чественное соотношение двух типов обмена клеток. Для зло-
качественных опухолей, по данным лаборатории Варбурга, этот
коэффициент равен в среднем 3,9. Из указанного соотношения
можно подсчитать количество сахара, расщепленного в процессах
дыхания и гликолиза в условиях их сосуществования. При этом
1 Используются международно принятые обозначения:
Qo — поглощение кислорода в мм1 * 3 за 1 ч инкубации в расчете на 1 мг сухой
массы клеток (ткани);
Qco, — гликолиз в мм3 СО, за 1 ч инкубации на 1 мг сухой массы клеток;
аэробно, Qc6, — анаэробно.
16
следует иметь в виду, что 1 молекула молочной кислоты соответ-
ствует 1 /2 молекулы глюкозы, а 1 молекула кислорода способна
окислить '/б молекулы этого углевода. Если учесть эти заме-
чания, то упомянутый коэффициент придется умножить на 3. В этом
случае получается соотношение ^^^рованный сах ар Для
окисленный сахар	г
вой опухоли оно равно 12. Это значит, что из 13 молекул утили-
зированного в ходе обменных превращений сахара лишь 1 моле-
кула окисляется, а 12 — гликолизируются. Следовательно,
анаэробный обмен абсолютно доминирует в опухолях.
Варбург исследовал и различные человеческие злокачествен-
ные опухоли. В 13 различных видах карцином, содержащих
30—80 % эпителиальных клеток, анаэробное образование молоч-
ной кислоты составляло в среднем Qc^ = 21, т. е. 8,4 % от их сухой
массы. В аэробных условиях гликолиз был меньше: Qco,= 14.
Средняя величина QOi( была равна 5,1. Внеся поправки на «загряз-
нение» испытывавшихся срезов опухолей соединительнотканными
и немалигнизированными эпителиальными элементами, Варбург
получил для карцином человека Qco2 = 41. Это соответствует
образованию молочной кислоты, равному 16,4 % от сухой массы
срезов. Труднее было внести соответствующие поправки для
Qo. и Q< or Однако независимо от истинных абсолютных величин
этих двух коэффициентов соотношение Qco, и QOa, равное 3,1 и
характерное для злокачественного материала, по мнению Вар-
бурга, не должно измениться. Для сарком человека были получены
следующие метаболические коэффициенты: Qco, = 27,9; Qcoa =
= 15,6; Qo, = 4,9. Испытуемый материал в этом случае содержал
лишь 80 % неопластических клеток. Если внести поправки с учетом
этого содержания опухолевых клеток, получаются соответственно
цифры, характеризующие гликолиз: 34,9 и 18,6. Отношение
аэробный гликолиз	q q
	равно
дыхание г
Исследование в лаборатории Варбурга различных добро-
качественных опухолей человека показало, что и в них имеется
аэробный гликолиз. Так, например, в папилломах мочевого пузыря
(почти 100 % эпителиальных клеток) Qco, = 26; Qco, = 16; Qo, =
= 13. Одако доброкачественные опухоли существенно отличались
от раковых тем, что отношение аэробного гликолиза к дыханию
в них никогда не достигало величины 3—4, как в опухолях
злокачественных, а колебалось около 1. Этот факт указывает
на то, что обмен доброкачественных опухолей сдвинут значительно
в сторону окислительного, хотя и занимает промежуточное поло-
жение между нормальными и малигнизированными клетками.
На одну
опухолей
кислоты.
молекулу поглощаемого клетками доброкачественных
кислорода образуется лишь одна молекула молочной
И	аэробный гликолиз п
менно в величине отношения —-------------- Вар-
дыхание	г
2 Заказ ЗНО
17
бург усматривал принципиальное отличие нормальных тканей
и даже доброкачественных опухолей от неоплазм.
В опытах Варбуга и сотр. 3—5-дневный куриный эмбрион (воз-
раст, когда скорость роста эмбриона сопоставима со скоростью
роста крысиной карциномы Флекснера—Джоблинга) показал
весьма высокий анаэробный гликолиз — 0,09 мг молочной кислоты
на 1 мг сухой массы в час, что соответствует образованию
за 1 ч количества, равного 9 % от сухой массы эмбриона. Тем
не менее в аэробных условиях нарастания количества молочной
кислоты почти не наблюдалось (Qco,= U)- Таким образом,
обмен эмбриона является практически аэробным, несмотря на
высокую потенциальную возможность гликолиза, QCo, = 20,6;
QOa эмбриона = 10,2.
Следовательно, высокая гликолитическая активность не явля-
ется исключительной особенностью опухолей, но присуща также
другим растущим тканям и, как мы увидим из дальнейшего
(раздел, посвященный белым клеткам крови), даже нормальным
нерастущим. Существенной разницей является лишь величина
отношения гликолиза к дыханию.
Дыхание нормальных тканей и эмбриона достаточно для исчез-
новения молочной кислоты, а дыхание опухолей — слишком мало
для этого.
Интересны полученные в лаборатории Варбурга данные по
обмену тканей, из которых возникают карциномы и саркомы, —
соответственно эпителия и соединительной ткани. В мышечной
фасции крысы (соединительная ткань) не выявлено уловимых
дыхания и гликолиза. Эпителиальные ткани (печень, почка, под-
желудочная железа, подчелюстная железа, щитовидная железа
и др.), как правило, имели интенсивное дыхание и заметный ана-
эробный гликолиз. Последний, однако, был в покоящемся эпите-
лии примерно в 10 раз меньше, чем в эпителиальной опухоли,
г,	аэробный гликолиз
Величина отношения —£--------------в нормальных эпителиаль-
дыхание	г
ных тканях приближалась к 0, что говорит о чисто окислительном
обмене. Аэробного гликолиза нормальные эпителиальные ткани
не проявляли. Были обнаружены, однако, ткани, в которых глико-
лиз имел место без одновременного состояния роста, а аэробный
гликолиз — без аномального роста. В двух тканях, не достигаю-
щих никогда стационарного состояния: зародышевом эпителии и
вилочковой железе, — был обнаружен анаэробный гликолиз, зна-
чительно более высокий, чем в стационарных тканях. Лимфоидная
ткань, как известно, находится в более лабильном состоянии,
чем зрелые соединительная ткань или эпителий. Соответственно
в ней выше оказался анаэробный гликолиз. Все другие ткани
нестационарного состояния обнаружили также заметный аэроб-
-	аэробный гликолиз „ „„„
ныи гликолиз. Однако отношение —--------------- в них было
дыхание
меньше 1.
18
Гиперпластическое разрастание миндаликов сопровождается
резким увеличением анаэробного и аэробного гликолиза (QCO1
соответственно 18,0 и 9,2). Но и в этом случае отношение
аэробный гликолиз	п.
—--------------составляет лишь 0,94.
дыхание
Очень высокий анаэробный и аэробный гликолиз был обнару-
жен Варбургом в сетчатке: Qco, = 88; Qco, = 45. Эта ткань, на-
ходясь в среде, содержащей сахар, образует за 1 ч такое коли-
чество молочной кислоты, которое равно 35 % от ее сухой массы.
Однако дыхание сетчатки также весьма высокое, QOj = 30,7.
Высокой метаболической активностью характеризуется мозг:
Qco, = 19,1; Qco, = 2,5; Qo, = 10,7. В то же время ни в сетчатке,
аэробный гликолиз
ни в ткани мозга отношение —---------------- не достигает зна-
дыхание
чений этого коэффициента в злокачественных опухолях.
Таким образом, эта особенность — высокий коэффициент
аэробный гликолиз
дыхание
, равный 3—4, — присуща, по данным Варбурга,
только неопластическим тканям.
На основании полученных данных Варбург развил теорию
возникновения опухолей. Согласно его точке зрения, недостаток
кислорода, вызванный теми или другими причинами, является
фактором, служащим первым толчком в смещении обмена клетки
в сторону злокачественности. В результате хронического недо-
статка кислорода часть клеток гибнет, другая же часть — при-
спосабливается к новым условиям, развивает высокую гликолити-
ческую активность, которая восполняет возникший дефицит
энергии.
Указанную идею Варбург разработал значительно более полно
30 лет спустя, вернувшись вновь к изучению проблемы рака.
Этому способствовали новый экспериментальный материал как
самого автора, полученный, главным образом, при исследовании
асцитических раковых клеток мышиной карциномы Эрлиха, так
и данные литературы последних лет, которые были им крити-
чески рассмотрены и использованы для подкрепления своих
взглядов. Весьма обстоятельно свою модифицированную точку
зрения Варбург изложил в обзорах, появившихся в 1954—1956 гг.,
а также в полемике с S. Weinhouse. Основными материалами,
которые дополнительно использовал Варбург, помимо его соб-
ственных, явились следующие: обнаружение факта, что быстро
регенерирующая печень аэробно не образует молочную кислоту;
установление структурных различий в механизме генерации
энергии путем дыхания и гликолиза; результаты изучения дыха-
тельных гранул и выявление их роли в патологии неоплазм;
канцерогенез, вызываемый дыхательными ядами и недостатком
кислорода, и некоторые другие.
Асцитные раковые клетки оказались особенно удобным объек-
том биохимических исследований неопластического материала,
2*
19
так как они практически совершенно не «загрязнены» нераковыми
клетками (почти 100 % чистота). Раковый асцит представляет
собой взвесь индивидуальных раковых клеток, что особенно вы-
годно с точки зрения полноценного снабжения кислородом и
питательными материалами и имеет преимущества перед срезами.
Наконец, очень важно, что асцитные раковые клетки представляют
собой целые неповрежденные клетки, хорошо выдерживающие
встряхивание в сосудах при инкубации. В опытах с асцитными
раковыми клетками, таким образом, исключается влияние фактора
повреждения на результаты исследования, чего нельзя сказать
о срезах и тем более гомогенатах.
Изучение обмена асцитных раковых клеток мыши (карциномы
Эрлиха) в лаборатории Варбурга дало следующие результаты:
QOa = 7; Q^q2 = 30; QCq2=60. Следовательно, индивидуальные
асцитные раковые клетки обладают еще более высокой гликоли-
тической активностью, чем твердые тканевые опухоли. Асцитные
раковые клетки Эрлиха образуют в анаэробных условиях за 1 ч
такое количество молочной кислоты, которое составляет до 30 %
от их собственной сухой массы. Следовательно, несоответствие
между мощной гликолитической активностью неоплазм и их уме-
ренным по интенсивности дыханием в некоторых случаях еще
больше, чем оно представлялось ранее на основании изучения
твердых опухолей.
В связи с этими данными интересны результаты изучения
обмена клеток Эрля. Как известно, раковые клетки мышей удалось
культивировать, причем в двух штаммах — высокой и низкой зло-
качественности. О степени злокачественности судили по проценту
успешных перевивок. Исследования лаборатории D. Burk пока-
зали, что два указанных штамма резко отличаются друг от друга
своим обменом веществ. Штамм более злокачественный имел
высокий уровень гликолиза и меньший уровень дыхания: QCq2 =
= 70; Qcoa = 30; Qo, = 7, т. е. показатели асцитных раковых
клеток; штамм с низкой злокачественностью имел меньший гли-
колиз, но более интенсивное дыхание: Qco = 25; Qco2—Ю;
Qo,= 13.
Опыты с асцитными раковыми клетками и клетками Эрля
говорят в пользу концепции Варбурга, ибо в основе изменения
обмена нормальных клеток в сторону злокачественного перерожде-
ния, согласно Варбургу, лежат повреждение дыхания и возобла-
дание гликолиза. Это повреждение дыхания в условиях организма
может вызываться различными причинами, но главная из них —
затруднение в снабжении кислородом в силу механического
сдавливания сосудов, хронического раздражения, действия ядови-
тых веществ, лучистой энергии и др. Действие всех повреждающих
факторов, по мнению Варбурга, сводится к одному следствию —
повреждению дыхания. Однако не всякое повреждение дыхания
может вызвать рак. Варбург указывал, что повреждение дыхания
должно иметь следующие особенности для того, чтобы оно могло
20
стать канцерогенным фактором: 1) повреждение дыхания должно
быть необратимым, т. е. оставаться после удаления агента, вызвав-
шего нарушение. Варбург постулирует, что дыхание, связанное
с гранулами, остается поврежденным, если оно однажды повреж-
дено, и никогда не возвращается к норме. Повреждение
дыхания может выразиться в уменьшении поглощения кислорода
или в «разобщении» окисления и фосфорилирования; 2) повреж
дение дыхания не должно быть столь большим, чтобы оно привело
к гибели клетки, иначе невозможен отбор. В этом плане Варбург
указывает, что гораздо менее опасны резкий недостаток кисло-
рода или большие концентрации ядов, чем слабое и длительно
продолжающееся воздействие этих факторов; 3) нарушение дыха-
ния должно сохраняться при всех последующих клеточных деле-
ниях, т. е. должно передаваться по наследству; 4) повреждение
дыхания не должно распространяться на гликолиз, последний
должен сохраняться; 5) нарушение дыхания не должно сказы-
ваться на клеточном делении. Только при этих условиях нарушение
дыхания может быть канцерогенным.
Варбург писал, что возникновение раковых клеток немыслимо
без повреждения дыхания: «Keine Krebszelle ohne geschadigte At-
mung». Становление раковых клеток из нормальных, по Вар-
бургу, проходит в два этапа. В первой фазе вследствие различных
причин происходит необратимое повреждение дыхания, после чего
наступает длительный период борьбы пораженных клеток за су-
ществование. Лишь некоторые из поврежденных клеток выжи-
вают. Это те, которые оказались способными восполнить возник-
ший дефицит в энергии за счет развития мощного ферментного
механизма гликолиза. Длительность скрытого периода канцероге-
неза объясняется именно долговременностью процесса отбора
клеток с высокой способностью к гликолизу. Таинственный ла-
тентный период возникновения рака, согласно Варбургу, есть
не что иное, как время, в течение которого путем отбора клеток
увеличивается гликолиз ткани после повреждения дыхания. Нару-
шение дыхания, уменьшение доли энергии, которую клетки полу-
чают за счет этого процесса, связаны с утратой клетками тех
структур, с которыми в норме процесс дыхания связан: умень-
шается число митохондрий в клетке. Преобладание процесса
гликолиза, таким образом, связано с дедифференцировкой.
Варбург не дал четкого определения, что он понимает под
термином «поврежденное дыхание». Однако из всего того, что он
говорил по этому поводу, можно понять, что имеется в виду и
количественная, и качественная неполноценность дыхания. Что
касается количественной недостаточности дыхания, то Варбург
придавал значение не столько абсолютным величинам погло-
щения кислорода, сколько отношению дыхания к гликолизу. Дыха-
ние в раковых клетках не просто мало, оно мало по сравнению
с очень высоким гликолизом. С другой стороны, Варбург полагал,
что дыхание раковых клеток неполноценно и в качественном отно-
21
шении. При этом имелась в виду возможность разобщения по
типу, который им наблюдался в эмбрионе при переносе его
из амниотического мешка в солевой раствор. В амниотическом
мешке, по свидетельству Варбурга, метаболические коэффициенты
эмбриона таковы: QO1— 15; Qco, — 0; Qco, = 25. Следовательно,
в пересчете на возможный ресинтез АТФ это означает: Qat«p = 105;
Qato = 25. В результате разобщения дыхания от фосфорилирова-
ния эти показатели обмена меняются: QOa = 15; Q°b2 = 25 (появ-
ляется аэробный гликолиз); Q^,= 25. Соответственно q2t<x> = 0;
Qat-ф — 25. В расчетах принимается, что поглощение 1 молекулы
кислорода обеспечивает генерацию 7 молекул АТФ, а образование
1 молекулы молочной кислоты— 1 молекулы АТФ (1 мкмоль
АТФ равен 22,4 мм3). На основании этой аналогии с эмбрионом
Варбург допускал возможность того, что коэффициент Qat<x> рако-
вых клеток равен 0. Он даже считал возможным, что первая
фаза канцерогенеза — необратимое повреждение дыхания —
может выражаться не столько в абсолютном уменьшении дыха-
ния, сколько в разобщении дыхания и фосфорилирования при
неизменном общем поглощении кислорода.
В качестве прямого доказательства правильности своих пред-
ставлений о роли нарушения дыхания в канцерогенезе Варбург
приводил данные Н. Goldblatt и G. Cameron (1953). Эти авторы
сумели экспериментально вызвать раковое перерождение, созда-
вая условия недостатка кислорода для ткани. Фибробласты сердца
выращивались в культуре ткани в течение 2‘/г лет. Часть культур
в течение этого срока подвергалась прерывистому лишению кисло-
рода на некоторые отрезки времени. В двух таких культурах из
фибробластов сердца возникли раковые клетки, из которых при
перевивке здоровым крысам развилась трансплантабельная
фибросаркома. В контрольной культуре, которая не подвергалась
ограничению кислорода, раковые клетки не возникли.
Работа Н. Goldblatt и G. Cameron (1953) весьма эффектна, и
естественно, что Варбург придавал ей большое значение. Однако
если продолжительное прерывистое лишение ткани кислорода
рассматривать просто как длительное неспецифическое хрони-
ческое раздражение, вызывающее повреждение, независимо от
природы используемого агента, то эти данные предстанут в ка-
честве лишь косвенного, но не прямого доказательства.
Вернемся, однако, к анализу концепции Варбурга. Согласно
ей, повреждение дыхания в конце концов приводит к резкому
усилению гликолиза. Увеличенный гликолиз, по Варбургу,
столь же присущ раку и так же необходим для его возникновения,
как и неполноценное дыхание. Варбург говорил, что, в отличие
от дыхания, не существует средств, которые могли бы стимули-
ровать гликолиз выше естественно присущего каждой данной
ткани анаэробного уровня. Именно поэтому он считал, что уве-
личение гликолитической активности при превращении нормаль-
ных тканей в злокачественные представляет собой медленный
22
процесс, требующий длительного времени и многих клеточных
поколений. Имеются работы, в которых ход этого увеличения
прослеживается во времени. Наиболее демонстративны в этом
плане исследования D. Burk (1942). Он вырезал часть печени здо-
ровых крыс и исследовал обмен печеночных клеток при регенера-
ции, в ходе которой печень растет стремительнее, чем быстро
растущий рак. D. Burk не обнаружил увеличения гликолиза при
регенерации печеночной ткани. С другой стороны, этот автор
скармливал крысам в течение 200 дней канцерогенный краситель,
в результате чего возникала карцинома печени. Было показано,
что гликолитическая активность при этом медленно увеличивалась
на протяжении 200 дней до уровня, характерного для рака.
Варбург считал, что движущей силой увеличения гликолиза
являлся в данном случае недостаток энергии, вызванный повреж-
дением дыхания.
На основании опытов D. Burk Варбург сделал вывод о том,
что гликолиз клеток не имеет ничего общего с нормальным ростом.
В то же время из работ Варбурга известно, что гликолиз клеток
тела максимален в наиболее ранних стадиях эмбрионального
развития, но постепенно падает по мере дифференциации эмбри-
она. Гликолитическую активность эмбриональных тканей и способ-
ность зрелых высокодифференцированных клеток животных к гли-
колизу Варбург рассматривал как наследие недифференцирован-
ных предков, в свете известной общебиологической закономер-
ности, постулирующей, что онтогенез повторяет филогенез.
Что касается взглядов Варбурга на роль аэробного гликолиза
в опухолях, то в поздних своих работах он продолжал придавать
этому процессу столь же большое значение, как и раньше. Так,
в 1954 г. он констатировал, что со времени его первых работ
по раку (1923 г.), когда эта особенность раковых клеток была
обнаружена впервые, не найдено ни одной злокачественной опу-
холи, которая бы не имела аэробного гликолиза, и не было
обнаружено ни одной нормально растущей ткани, которая, нахо-
дясь в теле животного в условиях нормального кровоснабжения
при достаточном насыщении кислородом, проявляла бы гликолити-
ческую активность. Аэробный гликолиз, согласно Варбургу, явля-
ется свойством всех растущих раковых клеток, тогда как аэробный
гликолиз без роста есть свойство лишь поврежденных клеток.
Если величина анаэробного гликолиза у всех опухолей примерно
одинакова, то интенсивность аэробного гликолиза сильно варьи-
рует. Аэробный гликолиз тем выше, чем вирулентнее рак и чем
быстрее и деструктивнее он растет. Это говорит, по мнению
Варбурга, о том, что управление ростом в организме произво-
дится механизмом, который связан с дыханием кислородом.
Злокачественные опухоли растут неорганизованно, видимо, по-
тому, что они снабжаются энергетическим источником, который
этому управлению не подчиняется. В раковых опухолях дыхание
слишком слабо или неактивно, чтобы блокировать гликолиз.
23
Варбург был крупнейшим знатоком обмена раковых опухолей,
и его биохимическая теория происхождения и особенностей нео-
плазм имеет большую ценность и представляет значительный
интерес. Она увлекла и покорила многих исследователей. Тем
не менее нельзя не сказать, что некоторые положения его кон-
цепции только постулируются, не имея достаточных эксперимен-
тальных оснований; другие — могут толковаться по-разному;
третьи — просто противоречат известным фактам. Естественно,
что в этих условиях концепция Варбурга, наряду с поддержкой
со стороны одних исследователей, вызвала серьезную критику
со стороны других. Эта критика будет рассмотрена несколько
позже. Сейчас же уместно поставить такой вопрос: если мы
откажемся от теории Варбурга, будем ли мы располагать каким-
либо цельным и в какой-то мере экспериментально обоснованным
воззрением, равноценным в теоретическом отношении отвергае-
мым идеям Варбурга? К сожалению, в биохимии, как, впрочем,
и вообще во всей теоретической онкологии, до самого послед-
него времени не было другой столь глубоко и всесторонне раз-
работанной теории, которая могла бы с учетом всех имеющихся
фактов объяснить не только особенности обмена веществ, но и само
происхождение злокачественных опухолей. Другой концепцией та-
кого масштаба и универсальности, как теория Варбурга, биохимия
до последнего времени не располагала.
Независимо от событий, которые последуют, теория Варбурга
продолжает оставаться наиболее продуманной, смелой и богато
экспериментально обоснованной попыткой проникновения в за-
гадку злокачественного роста. До появления концепции онкогенов
достаточно солидной альтернативы ей в биохимии и молекулярной
онкологии не существовало.
Концепции онкогенов будут посвящены в этой книге специаль-
ные главы.
ОБМЕН ВЕЩЕСТВ БЕЛЫХ КЛЕТОК КРОВИ
В СВЕТЕ ТЕОРИИ ВАРБУРГА
Рак и лейкозы представляют, пожалуй, самый серьезный вызов,
брошенный науке природой. Разочаровывающий опыт практи-
ческой борьбы с этими заболеваниями убеждает в том, что успех
может быть достигнут только на основе глубокого познания
фундаментальных особенностей неопластических клеток.
В своей основе проблема злокачественных новообразований
является клеточной проблемой. Первичные импульсы, приводящие
к инициации, а затем к генерализации процесса и часто к траги-
ческому концу, возникают, по-видимому, на уровне клетки и ее
элементов. Поэтому изучение клеток крови и их материнской
субстанции — костного мозга — может дать ценный материал
в понимании существа и природы лейкозного, т. е. неопластиче-
ского, перерождения.
24
Как уже говорилось, проблема аэробного гликолиза и связи
его с ростом и функциями относится к числу тех, от решения
которых в значительной мере может зависеть понимание существа
злокачественного роста. Поскольку считалось (и в этом прояви-
лось большое влияние авторитета Варбурга), что для большинства
тканей животного организма характерно отсутствие аэробного
гликолиза, а злокачественные опухоли наиболее резко отклоня-
ются от этого правила, все случаи сосуществования дыхания
и гликолиза в нераковых тканях заслуживают самого присталь-
ного внимания.
Именно с этой точки зрения лейкоциты уже давно привлекали
к себе внимание исследователей.
Достоинства лейкоцитов в экспериментальном отношении
в значительной мере определяются тем, что они представляют
собой отдельные свободно перемещающиеся неповрежденные
клетки, что имеет ряд преимуществ перед срезами тканей, снаб-
жение клеток которых в опытах in vitro кислородом и питатель-
ными веществами затрудняется.
Кроме того, раневая поверхность срезов ткани может сущест-
венно влиять на характер обмена и вносит неопределенность
в интерпретацию результатов.
Хотя первые исследования химизма и обмена лейкоцитов
были выполнены еще в прошлом столетии и в начале нынешнего,
систематическое биохимическое изучение этих клеток началось
лишь в 30—40-х годах и особенно в последние десятилетия.
Метаболические характеристики отдельных видов лейкоцитов
представляют первостепенный интерес, прежде всего в свете
концепции так называемого ракового обмена Варбурга. Один
из наиболее принципиальных вопросов, которые ставил Варбург
и задавали себе многие другие исследователи, заключался в том,
насколько уникален и специфичен обмен злокачественных опухо-
лей с его аэробным гликолизом, низким уровнем дыхания и высо-
ким анаэробным гликолизом.
Уже сам Варбург констатировал, что аэробный гликолиз при-
сущ не только неоплазмам. Он имеется и в некоторых нераковых
тканях: доброкачественных опухолях, лимфатических железах,
зародышевом эпителии, сетчатке, слизистой оболочке. Варбург
объяснял эти факты существования аэробного гликолиза в не-
раковых тканях двумя причинами. В одних случаях он говорил
о том, что ткани находятся в нестационарном состоянии (активный
рост, пролиферация); в других — что ткани повреждены. Согласно
Варбургу, повреждение представляет собой фактор, необратимо
нарушающий «пастеровский эффект». Тем не менее он видел
существенные различия между обменом раковых клеток, с одной
стороны, и нераковыми тканями, имеющими аэробный гликолиз, —
с другой. Он отметил, что в злокачественных опухолях, как указы-
аэробный гликолиз	о л
валось выше, отношение —--------------- составляет 3—4, тогда
дыхание
25
как в нормальных тканях, имеющих аэробный гликолиз, это
отношение равно примерно 1. До конца своей жизни Варбург
продолжал придерживаться взгляда, что несоответствие между
чрезвычайно высоким гликолизом и низким, как он считал, «по-
врежденным», неполноценным дыханием является наиболее ха-
рактерной чертой, отличающей неоплазмы от нормальных тканей.
Эта точка зрения подвергалась серьезной критике рядом авторов.
Проблема аэробного гликолиза и связи его с ростом и функ-
циями имеет первостепенное значение в понимании биологических
особенностей опухолей, где соотношение дыхания и гликолиза
действительно необычно. Именно с этой точки зрения представ-
ляют интерес и лейкоциты, в которых, как указывалось выше,
также имеются характерные метаболические черты.
Изучение обмена лейкоцитов началось уже в начале этого
века. Была обнаружена способность указанных клеток поглощать
кислород и расщеплять глюкозу до молочной кислоты. Много-
численные данные 20—40-х годов, касающиеся абсолютных вели-
чин дыхания и гликолиза и соотношения этих энергетических
процессов в белых клетках крови, были противоречивы, однако
своеобразие метаболизма этих клеток было установлено довольно
четко: очень интенсивный гликолиз, причем как анаэробный,
так и аэробный, и относительно слабое дыхание. Много исследова-
ний было посвящено особенностям обмена лейкоцитов при лей-
козах.
Подробно история изучения биохимии клеток крови в норме
и при лейкозах рассмотрена в ряде монографий и обзоров, к кото-
рым мы и отсылаем читателей [Сейц И. Ф., 1969].
В этой главе нашего руководства мы подведем лишь общие
итоги этого направления исследований и обсудим значение полу-
ченных данных в свете метаболической теории возникновения
рака и биохимических особенностей злокачественных опухолей.
Суммарные результаты изучения дыхания, гликолиза и их
соотношения в лейкоцитах приведены в табл. 1.
Метаболические показатели, приведенные в табл. 1, выражены
в коэффициентах Варбурга: QO2, Qco?yx. Qco,» имеется в виду,
что Q соответствует 1 мм3 поглощаемого или выделяемого газа:
для дыхания — Ог, для гликолиза — СО2, соответствующих коли-
честву образующейся молочной кислоты на 1 мг сухой массы
клеток в 1 ч. Концентрация клеток в среде была оптимальной —
0,036 мл сырых клеток на 1 мл.
Результаты, приведенные в табл. 1, характеризуют одну из
наиболее важных особенностей обмена лейкоцитов — сравни-
тельно низкое дыхание (особенно в присутствии глюкозы) и весьма
высокую гликолитическую активность. Более того, некоторым
видам белых клеток крови присущ мощный аэробный гликолиз.
В эту категорию попадают, наряду с некоторыми видами лейкоз-
ных клеток, также нормальные гранулоциты крови здоровых людей
(доноров) и лейкоциты больных полицитемией — заболевания,
26
Таблица 1
Дыхание, гликолиз и их соотношение в различных видах лейкоцитов человека
(Сейц И. Ф., Луганова И. С., 1967]
Источник получения лейкоцитов	QOj в от- сутствие глюкозы	Qo, в при- сутствии глюкозы	Qcc^	Qcb,	QE8T	Qcb,
					глюкоза	гч + глюкоза
Доноры	7,5 ±0,5	5,7 ±0,3	18,8± 1,0	31,1 ± 1,1	3,3	5,5
Больные хроническим миелоидным лейко- зом	6,4 ±0,4	5,0 ±0,3	13,2±0,7	23,3 ±0,8	2,6	4,7
Больные полиците- мией	7,1 ±0,5	5,3 ±0,3	15,4 ±0,7	27,6± 1,1	2,9	5,2
Больные хроническим лимфатическим лей- козом	7,9 ±0,5	8,0 ±0,5	0	27,2 ±1,0	0	3,4
Больные острым лей- козом I типа	10,4 ±0,6	8.3 ±0,5	24,0 ± 1,1	29,0 ± 1,2	2,9	3,5
Больные острым лей- козом II типа	9,8 ±0,9	10,0 ±0,8	0	27,3 ±1,3	0	2,7
Лимфоциты здорово- го человека	7,1 ±0,4	7,0 ±0.44	0	25,5 ±2,3	0	3,6
по-видимому, нелейкозной природы. В этом плане все виды лейко-
цитов можно разделить на две метаболические группы: 1) клетки,
обладающие аэробным гликолизом (1 метаболический тип);
2) клетки, не имеющие аэробного гликолиза. Мы увидим в даль-
нейшем, что это деление не является формальным, а имеет глубо-
кий смысл, выражая различные биологические, функциональные и,
по-видимому, генетические особенности этих двух категорий белых
клеток крови.
Как видно из табл. 1, к группе клеток крови с аэробным гли-
колизом принадлежат: нормальные лейкоциты (гранулоциты),
лейкоциты больных полицитемией, лейкоциты больных хрониче-
ским миелоидным лейкозом (миелозом), лейкоциты крови части
больных острым лейкозом (I метаболический тип).
Общие метаболические черты, которые объединяют все эти
клетки в одну группу, следующие: высокий аэробный гликолиз
(т. е. несовершенный «пастеровский эффект») и еще более высокий
анаэробный гликолиз, низкое или сравнительно низкое дыхание,
обратная «пастеровская реакция» (эффект Кребтри) (т. е. все
главные признаки так называемого ракового обмена Варбурга)
и, как было установлено, равноценный синтез АТФ в аэробных
и анаэробных условиях.
Последний признак, кстати говоря, присущ и 2-й группе лейко-
цитов, к которой относятся: нормальные лимфоциты крови, лимфо-
циты больных хроническим лимфатическим лейкозом (лимфа-
денозом), молодые недифференцированные белые клетки крови
2-й большой группы больных острым лейкозом. Все эти клетки
отличаются тем, что они при инкубации in vitro в присутствии
27
Таблица 2
Дыхание и гликолиз ядерных костномозговых клеток
здорового человека и больных лейкозами
[Сейц И. Ф.. 1969|
Источник получения миелокариоцитов	Поглощение О,, мкл/109 клеток за 30 мин	Образование молоч- ной кислоты, аэробно, мг/109 клеток за 30 мин
Здоровые лица Больные хроническим миело- лейкозом Больные острым лейкозом I типа Больные острым лейкозом II типа	373,0±31,0 (10) 350.0 (2) 427,0±46,0 (10) 336,0±35,0 (8)	3,8±0 3 (10) 5.4 (2) 5.8±0.5 (10) 0 (8)
Примечание. В скобках указано число наблюдений.
воздуха молочную кислоту не образуют, т. е. не имеют аэробного
гликолиза.
Тип обмена и морфология лейкоцитов. Можно думать, что
у генетически родственных групп клеток должна существовать
энзимологическая и метаболическая преемственность в силу наи-
более общих принципов и закономерностей филогенетического
и онтогенетического развития. Поэтому сходство энзимохимиче-
ское должно указывать на общность происхождения клеток.
В случае белых клеток крови можно было бы говорить о развитии
двух групп лейкоцитов из двух различных корней — миелоидного
и лимфоидного, существенно отличающихся друг от друга в мета-
болическом и генетическом отношении.
Принципы метаболической классификации белых клеток крови
обусловлены генетической преемственностью и родословной раз-
ных групп клеток. Эти принципы столь фундаментальны, что
перекрывают даже факторы возрастных различий. Независимо
от возраста и степени зрелости, белые клетки крови и костного
мозга относятся к той или другой метаболической категории
в соответствии с их тканевой природой и происхождением.
Приводим таблицу, характеризующую обмен костномозговых
клеток здорового человека (доноры) и больных лейкозами
(табл. 2).
В терминах Q метаболические показатели клеток нормального
костного мозга человека для большого числа случаев были:
Qco, = 13,6; QO2 в присутствии глюкозы — 4,7; в отсутствие
глюкозы — 5,64. Следовательно, клетки костного мозга здорового
человека характеризуются несовершенным «пастеровским эффек-
том» (высокий аэробный гликолиз) и четко выраженной обратной
«пастеровской реакцией» (20%), т. е. признаками, приписывае-
мыми в качестве специфических для раковых клеток.
Существование так называемого ракового обмена в нормаль-
ных гранулоцитах крови и ядерных клетках костного мозга здоро-
28
вого человека, наряду с парадоксальным фактом отсутствия этих
«раковых признаков» в явно неопластических клетках — лимфо-
цитах больных хроническим лимфатическим лейкозом и лимфо-
бластах больных острым лимфатическим лейкозом, — представ-
ляет реально существующий вызов концепции рака Варбурга,
остающийся пока без ответа.
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ КРОВЯНЫХ ПЛАСТИНОК
(ТРОМБОЦИТОВ)
Тромбоциты имеют дыхание и гликолиз, энергия которых
концентрируется в аденозинтрифосфате; они содержат РНК,
белки и свободные аминокислоты, что косвенно указывает на их
потенциальную активность в отношении белкового синтеза; они
богато оснащены самыми разнообразными ферментными систе-
мами, обеспечивающими поддержание жизнедеятельности и функ-
циональной активности.
Следует заметить, однако, что обмен веществ в кровяных
пластинках направлен не столько на восстановление собственных
структур, сколько на осуществление, главным образом всех фаз
процесса свертывания крови.
Белки в тромбоцитах составляют около 60 % от сухой массы.
В значительном количестве они содержат липиды — 19—24 %
от сухой массы; в них много гликогена, различных минеральных
веществ и др.
Подробнее об этом можно прочесть в соответствующих изда-
ниях [Сейц И. Ф., Луганова И. С., 1967; Сейц И. Ф., 1969].
Здесь же мы сосредоточимся, главным образом, на энергетическом
обмене кровяных пластинок по причинам, которые будут ясны
из дальнейшего изложения.
Результаты изучения энергетического обмена тромбоцитов
человека представлены в табл. 3.
Данные табл. 3 показывают, что нормальные (донорские)
кровяные пластинки характеризуются: 1) низкой дыхательной
активностью; 2) весьма невысоким анаэробным гликолизом;
3) высоким аэробным гликолизом. Последний факт говорит о том,
что «пастеровский эффект» в тромбоцитах несовершенен — дыха-
ние не блокирует гликолиз полностью. Кроме того, в кровяных
пластинках имеет место обратная «пастеровская реакция» (эф-
фект Кребтри), достигающая 20—30 %. Все эти метаболические
черты, согласно Варбургу, специфичны для рака. Между тем
их демонстрируют тромбоциты здорового человека. Эти данные
вновь свидетельствуют о несостоятельности концепции Варбурга
о существовании так называемого ракового обмена.
Как видно из табл. 3, энергетический обмен кровяных пласти-
нок больных полицитемией и хроническим миелоидным лейкозом
качественно не отличается от обмена нормальных кровяных пласти-
нок, лишь незначительно варьируя количественно.
29
Таблица 3
Дыхание и гликолиз в тромбоцитах человека
[Сейц И. Ф., Луганова И. С., 1967]
Пробы	Qo,	Q&,	Чсог
Тромбоциты Тромбоциты-)-глюкоза Тромбоциты Тромбоциты 4* глюкоза Тромбоциты Тромбоциты 4- глюкоза	Тромб 4,15±0,36 3,66±0,28 Тромб п о 6,23±0,56 4,46±0,36 Тромб X р о и и ч 6,96±0,58 5,16±0 35	о ц и т ы до 2,60±0,19 13,05±1,13 О Ц И Т Ы б О J лицитеми 2,88±0,17 12,46±0,96 О Ц И Т Ы б О J еским ми( 3,29±0,32 16,50±0,92	норов 20,2±1,76 иных е й 21.0± 1,6 иных “ЛОЗОМ 20,7±1,44
О ПОЛНОЦЕННОСТИ ДЫХАНИЯ НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Смешанному обмену (дыхание и аэробный гликолиз) раковых
клеток уже давно придается особое значение в биологии неоплазм.
Низкое дыхание, высокий анаэробный гликолиз и наличие аэроб-
ного гликолиза часто (со времен Варбурга) рассматриваются
как характерные черты метаболизма злокачественных новообразо-
ваний. На этом фундаменте построена одна из наиболее интерес-
ных биохимических концепций происхождения и специфики обмена
неоплазм — теория Варбурга. В настоящее время, в свете новых
фактов, мы можем значительно полнее и объективнее оценить
эту точку зрения, чем могли это сделать еще некоторое время
назад. Отправной точкой рассуждений Варбурга о происхождении
злокачественных опухолей служил тезис о повреждении дыхания.
Именно в результате возникающей неполноценности — количе-
ственной и качественной (разобщения окисления и фосфорили-
рования) — развивается, по мнению Варбурга, мощный глико-
литический механизм и появляется аэробный гликолиз. Эти явле-
ния в их развитии выражают, согласно Варбургу, процесс зло-
качественного перерождения.
Экспериментальные данные, собранные в этой главе, убеждают,
что это основное положение Варбурга не улавливает существа
ракового обмена и раковой природы. В этом нетрудно убедиться
при рассмотрении табл. 4.
Первыми в табл. 4 стоят карцинома и саркома человека, мета-
болические коэффициенты которых следует считать классическими
для злокачественных опухолей человека (приведены собственные
цифры Варбурга без поправок на «загрязнение» нераковым мате-
риалом). Как видно из таблицы, действительно, для неопласти-
зо
Таблица 4
Дыхание, гликолиз и их соотношение в раковых клетках, лейкоцитах, тромбоцитах
и костном мозге человека
[Сейц И. Ф., 1969]
Клетки	Q5,	Феб,	Vco,	Q?6./Qo,	Qco/Qo,
Карцинома	5,1	14,0	21,0	3,1	4,1
Саркома	4.9	15,6	27,9	3,2	5,7
Карцинома эпителия шейки матки, «поверхностная»	7,6	7,1	22,2	0,9	2,9
Карцинома шейки матки (оро- говевающий плоскоклеточный эпителий)	4,5	3,9	13,1	0,9	2,9
HeLa (культура ткани из кар- циномы шейки матки) Лейкоциты:	6,0	12,0	5,5	2,0	0,9
донора	5,7	18,8	31,1	3,3	5,5
больного хроническим миелолейкозом	5,0	13,2	23,3	2,6	4.7
больного острым лейкозом 1 метаболического типа	10,0	0	27,3	0	2.7
больного острым лейкозом II метаболического типа	8,3	24,0	29,0	2,9	3,5
Тромбоциты донора	3,6	12,6	19,3	3,6	5,4
Костный мозг донора	4,7	13,6	—	2,9	—
* В присутствии глюкозы
ческих клеток характерны сравнительно невысокое дыхание, очень
высокий анаэробный и аэробный гликолиз. Варбург подчеркивал,
что дыхание раковых клеток мало не столько абсолютно, сколько
относительно — по сравнению с гликолизом. Поэтому особое зна-
чение он придавал количественному соотношению гликолиза й
дыхания, что лучше всего выражалось отношением коэффициен-
тов: Qco2 к Qo, и Qcoj-
Как упоминалось выше, по Варбургу, для нормальных тканей
отношение аэробного гликолиза к дыханию не превышает 1, для
злокачественных неоплазм оно равно 3—4. Еще выше в раковых
клетках отношение анаэробного гликолиза к дыханию. Из табл. 4
видно, что именно таковы соотношения гликолиза и дыхания
в карциномах и саркомах человека. Однако, как следует из табл. 4,
так называемая «поверхностная» карцинома эпителия шейки
матки и ороговевающий эпителий карциномы шейки матки имеют
показатели неракового обмена: Qco, = 0,9.
Особый интерес с этой точки зрения представляет обмен
лейкоцитов, тромбоцитов и костного мозга. Как видно из табл. 4,
показатели обмена веществ этих клеточных элементов у здорового
человека почти точно повторяют соответствующие величины,
полученные Варбургом для сарком человека, и сопоставимы также
с показателями обмена карцином человека. Что касается коэффи-
31
циентов Qc6,/QoJ и Qco2/Qoa. то они У лейкоцитов оказались даже
более «раковыми», чем у карцином.
С этой точки зрения были изучены также тромбоциты и костный
мозг, причем получены такие соотношения дыхания и гликолиза,
которые типичны, согласно Варбургу, для неопластических тканей
(см. табл. 4). Таким образом, руководствуясь теорией Варбурга,
мы должны были бы присоединить к числу неопластических
клеток, наряду с лейкоцитами больных хроническим миелозом
и острым лейкозом I метаболического типа, нормальные лейко-
циты, лейкоциты крови больных полицитемией, тромбоциты и
клетки костного мозга здорового человека, но исключить из числа
злокачественных две карциномы шейки матки, лейкоциты крови
и миелокариоциты больных острым лейкозом II метаболического
типа, лимфоциты больных хроническим лимфолейкозом. Полное
противоречие с действительностью!
Сопоставление обмена карцином и сарком человека с обменом
некоторых нормальных и патологических клеток, таким образом,
показывает, что полученные Варбургом характеристики дыхания
и гликолиза неоплазм, абсолютно надежные сами по себе с экс-
периментальной точки зрения, не являются специфичными только
для них. Такой же в принципе (качественно), а в ряде случаев
очень близкий количественно, обмен имеют нормальные грануло-
циты крови, тромбоциты, костный мозг и, возможно, другие клетки.
Следовательно, можно сделать достаточно обоснованный вывод,
что тезис Варбурга о неполноценности дыхания раковых клеток
и связанных с этой недостаточностью дыхания изменениях в глико-
литической активности не оправдывается при более широком
экспериментальном испытании, прежде всего с количественной
стороны. Так, дыхание лейкозных и раковых клеток в ряде случаев
ни абсолютно, ни сравнительно с гликолизом (аэробным и анаэроб-
ным) не является ущербным и не уступает дыханию многих
нормальных клеток.
Не оправдывается тезис о неполноценности неопластических
клеток и в качественном отношении. Исследованиями количествен-
ного содержания и реосинтеза АТФ в асцитных раковых и лейкоз-
ных клетках было показано, что лишено основания и второе
положение Варбурга об энергетической, качественной неполно-
ценности дыхания в злокачественных опухолях. «Разобщения»
между дыханием и фосфорилированием в неоплазмах не суще-
ствует. Это доказывается как прямым анализом содержания и
реосинтеза АТФ в раковых клетках, так и использованием «разоб-
щающих» ядов, которые вызывают в этих клетках, как и в нормаль-
ных, действительное «разобщение», проявляющееся и в нарушении
сопряженного с окислением фосфорилирования, и в полном «сня-
тии» «пастеровского эффекта».
АЭРОБНЫЙ ГЛИКОЛИЗ И «ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ НАПРЯЖЕНИЕ»
Что же позитивного можно извлечь из негативных итогов
критического рассмотрения метаболической теории рака Вар-
бурга?
Если аэробный гликолиз в тех или иных клетках рассматривать
не как проявление патологических изменений, а как результат
напряженной функциональной активности (синтез новой клеточ-
ной массы в раковых клетках, фагоцитоз и амебоидная подвиж-
ность у лейкоцитов и т. д.), приспособленной к возможному
ухудшению снабжения кислородом, то общие черты в координации
дыхания и гликолиза у раковых и некоторых нормальных клеток
найдут объяснение не на патологической, а на нормальной физио-
логической основе. Можно думать, что истинным регулятором
обмена является прежде всего сама физиологическая функция,
хотя она, в свою очередь, покоится на химической основе и регули-
руется влиянием целостного организма. Самым мощным стимулом
ресинтеза АТФ является на уровне клетки усиленное ее рас-
ходование. Именно физиологическая работа, сопровождаемая
значительной затратой богатых энергией фосфорных соединений,
является наиболее мощным стимулятором и регулятором мета-
болизма субстратов. При особенно высокой функциональной
нагрузке расходование АТФ б>дет преобладать над ее ресинтезом
и одного механизма энергии может оказаться недостаточно для
полной загрузки аденилового акцептора, что открывает возмож-
ность включения (в аэробных клетках) или усиления (в клетках
со смешанным обменом) процесса гликолиза. Ухудшение снабже-
ния кислородом может лишь способствовать этому процессу пере-
стройки обмена.
На уровне клетки основным фактором, определяющим кон-
центрацию акцепторов эстерифицируемого фосфата и, таким обра-
зом, соотношение дыхания и гликолиза при нормальном снабжении
питательными материалами, являются условия аэрации и произ-
водимая физиологическая работа. Внеклеточные влияния, прежде
всего гуморального и нервного происхождения, могут осложнять,
но не менять самой природы клеточных механизмов регуляции
обмена. Экстрацеллюлярные импульсы, направленные на клетку,
в основном усиливают или ослабляют генетически обусловленные
элементарные внутриклеточные процессы. Чем сложнее и более
высоко развит организм, тем более специализированы и менее
автаркичны составляющие его клетки, тем сильнее зависимость
внутриклеточных реакций от внеклеточных факторов.
Неопластические клетки отходят от этого принципа контроля
и регуляции нормальных тканей прежде всего в аспекте биологи-
ческом. Их пролиферация и экспансия не коррелируют с функ-
циями и жизнедеятельностью других систем организма. В метабо-
лическом отношении, однако, эта из ряда вон выходящая особен-
ность неоплазм не находит однозначного и закономерного выраже-
з
33
ния. Как мы могли убедиться на основании изложенного выше мате-
риала, коренные качественные метаболические характеристики
(дыхание, гликолиз, их соотношение и др.) могут варьировать
в пределах одного и того же неопластического процесса (лейкозы)
в противоположных направлениях. Черты обмена, часто сопровож-
дающие злокачественный рост, могут быть продемонстрированы
в нормальных, функционально полноценных клетках, например
лейкоцитах, тромбоцитах, миелокариоцитах. Наоборот, присущий
большинству животных тканей чисто окислительный обмен обнару-
живается в недифференцированных лейкоцитах примерно поло-
вины всех больных острым лейкозом и в лимфоцитах больных
хроническим лимфолейкозом.
Создается впечатление, что качественные различия неопласти-
ческих и нормальных клеток в сфере энергетического обмена,
может быть, вообще не будут найдены. В лучшем случае, воз-
можно, придется довольствоваться констатацией сдвигов лишь
количественного характера. Слишком универсально распростра-
ненными, фундаментальными и императивно необходимыми для
всего живого являются процессы продукции энергии, чтобы искать
в них различия в нормальных и патологических клетках. Вряд ли
какой-либо патологический сдвиг в каком-то единичном поколении
клеток (если не в индивидуальной клетке) может преодолеть
«эволюционное давление» многих миллионов лет и наследствен-
ности миллионов поколений предшественников и коренным обра-
зом изменить фундаментальные основы энергетического обмена,
качественно перестроив сложные энзимохимические системы,
выработанные в процессе длительной эволюции, причем изменить
вдруг, в какой-то короткий период существования индивидуаль-
ной клетки. Любые коренные изменения в любой системе должны
быть генетически закреплены, поскольку сама неопластическая
клетка в целом наследственно сохраняет качество злокачествен-
ности.
Единственным возможным объяснением подобного скачко-
образного изменения могла бы быть мутация. Однако если воз-
можность такого события достоверно показана для процесса
превращения протоонкогена в онкоген (см. гл. 4), то никто пока
не продемонстрировал наследственных изменений в энзиматиче-
ской цепи дыхания или гликолиза.
Поскольку основной функцией неопластических клеток явля-
ется их воспроизведение, а материальным субстратом этого про-
цесса служат нуклеиновые кислоты, именно в этой категории
веществ клетки можно было бы в первую очередь ожидать измене-
ний при раковом и лейкозном перерождении в отношении как
химизма, так и обменных превращений. Все остальные реакции
и процессы, в том числе и энергетические, при всей их значимости
для жизнедеятельности клетки являются вторичными, производ-
ными и подчинены основной функции наращивания клеточной
массы и деления. Поэтому менее вероятно появление качественных
34
изменений в этих вторичных процессах, которые являются наи-
более общими рабочими механизмами всего живого, тем более,
что процесс воспроизведения является естественным физиологи-
ческим актом и в нормальных клетках, где он, однако, подчинен
регулирующим влияниям организма. Ввиду того, что процесс
воспроизведения злокачественных клеток не является по своей
природе чем-то качественно новым и необычным также для нор-
мальных клеток, но приобретает лишь неконтролируемый харак-
тер, все другие подсобные аспекты обмена и биохимические меха-
низмы клетки при малигнизации могут и не меняться, во всяком
случае качественно, поскольку они обслуживают процесс, при-
сущий и нормальным клеткам. Можно поэтому ожидать, что
решающие открытия в области выяснения природы неоплазм
придут именно из сферы изучения состава, структуры и превраще-
ния нуклеиновых кислот. Это явилось бы логическим завершением
длительного пути и торжеством того направления мысли, которое
признает изменения в генетическом материале в качестве первич-
ного импульса ракового или лейкозного перерождения.
Собранные в этой главе данные можно истолковать лишь
в том смысле, что ни аэробный гликолиз, ни высокий анаэробный
гликолиз, ни обратная «пастеровская реакция», ни способность
одинаково эффективно осуществлять ресинтез важнейших внутри-
клеточных соединений как в аэробных, так и в анаэробных усло-
виях не являются специфичными для злокачественно перерожден-
ных клеток и тканей и между этими чертами обмена веществ
и малигнизацией отсутствует причинная связь. Это тем более
необходимо подчеркнуть, что до сегодняшнего дня «дух Варбурга»
в теоретической онкологии, его концепция «ракового обмена»
еще не утратили своей притягательной силы и продолжают оказы-
вать гипнотизирующее влияние на многих исследователей. Мы
сказали бы, однако, что популярность метаболической теории
рака Варбурга не столько в собственной ее силе, сколько в сла-
бости и по существу отсутствии хорошо обоснованных альтерна-
тив. Других сильных концепций, выдержавших столь длитель-
ное испытание временем, как теория Варбурга, биохимия за
последние 50 лет не представила.
Такая альтернатива, рожденная совместными успехами моле-
кулярной биологии, молекулярной генетики, генной инженерии,
появилась только в 80-е годы.
ДРУГИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ГИПОТЕЗЫ РАКА
Тот факт, что по мере накопления новых биохимических данных
главные положения концепции Варбурга о специфичности для
опухолей поврежденного дыхания и аэробного гликолиза подвер-
гались все большему сомнению, послужил причиной новых усилий
и новых поисков объяснения природы и особенностей неоплазм,
что привело к появлению новых гипотез и предположений.
з*
35
Гипотеза «конвергенции». В сущности, именно идея
Варбурга о «конвергенции» всех опухолевых клеток в ущербности
дыхания и приобретении всеобщего признака — аэробного глико-
лиза — послужила основой гипотезы «конвергенции» J. Greenstein
(1951). Этот крупный онкобиохимик распространил мысль о при-
обретении опухолями некоторых существенных общих биохимиче-
ских свойств также на энзиматические функции опухолевых кле-
ток. Исходной точкой его рассуждений был факт, что в процессе
канцерогенеза имеет место прогрессирующая дедифференциация,
влекущая за собой специфические последствия. Каждая нор-
мальная клетка характеризуется рядом определенных морфо-
логических и биохимических особенностей, позволяющих выпол-
нять присущие ей и данной ткани физиологические функции.
Это требует, наряду с фундаментальными процессами и реакциями
обмена веществ (энергетика, рост и др.), необходимыми для
обеспечения жизни клетки, ткани и организма, особых специфи-
ческих только для данной клетки и тканей реакций, связанных
со специализированной функцией, участием специфических фер-
ментов, катализирующих отдельные звенья цепей реакций. Раз-
вивающиеся в опухолях дедифференцировка и, вместе с нею,
потеря функции влекут за собой также утрату указанных специ-
фических ферментов. В результате в неоплазмах сохраняются
энзиматические системы, обеспечивающие лишь поддержание
минимально необходимого для выживания — функций поставки
энергии и размножения. Следствием является то, что все опухоли
становятся исключительно похожими, происходит биохимическое
уподобление опухолевых клеток друг другу.
J. Greenstein пришел к заключению, что неоплазмы самого
различного происхождения более сходны (как морфологически,
так и биохимически) друг с другом, чем каждая из них со своей
нормальной тканью, из которой она произошла. Во многих случаях
указанное единообразие находит проявление лишь в количествен-
ном выражении, прежде всего в уменьшении эффективности функ-
циональных реакций при повышении эффективности реакций,
необходимых для простой клеточной репликации. Поэтому экспе-
риментальные исследования в плане теории «конвергенции» каса-
лись, главным образом, попыток осуществить биохимическое
доказательство недостаточности ключевых ферментов функцио-
нального метаболизма и, наоборот, стимуляции энзиматических
систем, связанных с пролиферацией.
С этой точки зрения привлекли внимание исследования фермен-
тов глюконеогенеза и регуляции содержания сахара в крови
в гепатомах. В гликолитическом расщеплении глюкозы важную
роль играют две реакции фосфорилирования, ведущие к образо-
ванию глюкозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата за счет
богатого энергией фосфора АТФ. В противоположность боль-
шинству других реакций этого процесса, они по термодинами-
ческим соображениям являются необратимыми. Дефосфорилиро-
36
вание указанных веществ оказывается возможным благодаря
ферментам глюкозо-6-фосфатазе и фруктозо-1,6-дифосфатазе,
которые в силу этой своей способности занимают ключевое поло-
жение в регуляции содержания сахара в крови и в глюконеогенезе.
Обе фосфатазы не были обнаружены в гепатоме Новикова, тогда
как в медленно растущих гепатомах та и другая фосфатаза
присутствовали, хотя и в уменьшенных количествах. Была про-
демонстрирована связь между активностью фосфатаз и скоростью
роста различных гепатом, что подтверждало дедифференциацию
в направлении потери специфической печеночной функции глюко-
неогенеза и регуляции сахара крови.
Многочисленные исследования подкрепляют суть идеи «конвер-
генции» об увеличенной эффективности анаболических процессов
и активации связанных с ними энзиматических систем. Например,
в гепатоме Новикова, по сравнению с нормальной печенью, актив-
ность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы увеличена, а активность
фосфоглюкомутазы — уменьшена. Освобождение глюкозы и на-
копление гликогена резко снижены.
Следует заметить, однако, что, подобно теории Варбурга,
гипотеза «конвергенции» J. Greenstein не может объяснить меха-
низма злокачественного перерождения. Тем не менее она основана
на многих ценных наблюдениях (с нашей точки зрения, правда,
являющихся побочными по отношению к основному феномену —
нерегулируемости роста) и содержит некоторые новые аспекты
в явлении дедифференцировки тканей при неоплазии.
Во времена J. Greenstein (40—50-е годы настоящего столетия)
как представитель гепатом изучалась главным образом гепатома
Новикова. Ее энзиматический спектр показал очень хорошее
соответствие постулатам гипотезы «конвергенции». Однако первые
несоответствия с нею обнаружились при изучении гепатомы
W. Dunning. Эта гепатома, как было установлено, еще содержит
специфические для печени энзимы (фруктозодифосфатазу, ТПНН-
цитохромредуктазу, триптофанпирролазу), которые в гепатоме
Новикова более не обнаруживаются. С другой стороны, в гепатоме
W. Dunning энзим дезоксицитидилдезаминаза отсутствует, тогда
как в гепатоме Новикова он содержится. Рядом работ на перевив-
ных гепатомах крыс продемонстрировано, что часто биохимиче-
ское многообразие преобладает над единообразием.
В. С. Шапот (1975), оценивая гипотезу «конвергенции», за-
ключает, что идея J. Greenstein об унификации обмена веществ
опухолей различного гистогенеза «. . .верна лишь отчасти. Огром-
ный экспериментальный цатериал, накопленный к настоящему
времени, свидетельствует о существовании и обратной тенден-
ции — фенотип отдельно взятой злокачественной опухоли оказы-
вается уникальным, спектр биохимических характеристик неповто-
римым, включающим в себя каждый раз иные комбинации откло-
нений от нормы». Можно также согласиться с В. С. Шапотом, что
учение о прогрессии L. Foulds (1969) — о независимом, несопря-
37
женном развитии признаков злокачественности позволяет понять
эту вариабельность как закономерную.
В связи с гипотезой «конвергенции», унификацией биохими-
ческих признаков опухолей интересны взгляды известного био-
химика, работающего в области онкологии, Н. Pitot (1974). Рас-
сматривая дифференциацию как трансляционную функцию, он
констатирует, что патологоанатомам морфологические вариации
человеческих неоплазм, даже тех, которые возникли из одного
и того же типа клеток, представлялись очевидными еще с начала
клеточной патологии в середине прошлого века. С момента появле-
ния электронной микроскопии гетерогенность, выявляющаяся и со
световым микроскопом, стала еще более убедительной. Сейчас
ясно, что не существует и не будет найдена какая-то единственная
морфологическая характеристика, специфичная для всех нео-
плазм. Действительно, все биохимические исследования злокаче-
ственных опухолей млекопитающих в конечном счете подтвердили
эти заключения патологоанатомов об исключительной гетеро-
генности как человеческих, так и экспериментальных неоплазм.
Накопившиеся за последние десятилетия биохимические данные
показали, что фенотипическая гетерогенность является правилом,
а не исключением. Это относится к данным, полученным с гепато-
мами, карциномами молочных желез и миеломами. Такая же
фенотипическая вариабельность может быть прослежена и на
состояниях пренеопластических. Гетерогенность наблюдается не
только в активности и регуляции ферментов в неоплазмах, но и
в стабильности РНК-матриц и в характеристиках кругооборота
мембран эндоплазматического ретикулума.
В ранние 60-е годы были проанализированы фенотипы несколь-
ких высокодифференцированных гепатоцеллюлярных карцином.
С того времени в ряде лабораторий было показано, что ни один
из изученных биохимических фенотипов гепатоцеллюлярных кар-
цином не является одним и тем же в индивидуальных опухолях.
Было исследовано более 40 неоплазм, и во всех случаях чем больше
ферментов исследовали, тем очевиднее становилось, что фено-
типически каждая неоплазма является уникальной и отличается
от печени, ткани-родоначальницы. Среди неоплазм варьировали
не только активности четырех исследованных ферментов, но и их
регуляция белками диеты. Характеристика каждой гепатомы была
уникальной.
В других исследованиях энзиматический профиль или био-
химический фенотип как спонтанных, так и перевивных мышиных
гепатом были очень разнообразны. При продолжающихся транс-
плантациях перевивные неоплазмы сохраняли их собственный
неповторимый фенотип — феномен, найденный на гепатоцеллю-
лярных карциномах крыс.
Фенотипическая биохимическая вариабельность была отмечена
и в других неоплазмах: в серии первичных и перевивных карцином
молочной железы, подобно серии гепатоцеллюлярных карцином,
38
каждая неоплазма была биохимически уникальна в отношении
количественного уровня энзимов и механизма регуляции уровня
энзимов со стороны факторов среды.
Хороший пример биохимической гетерогенности в одном классе
неоплазм дают также миеломы. Многие годы белок, продуцируе-
мый этой неоплазмой у одного больного, устойчиво отличался
от других больных со сходными неоплазмами. В большой серии
мышиных миелом белок, образуемый каждой неоплазмой, являлся
характерным для данной опухоли. Описаны вариации в поглоще-
нии 1311 серией экспериментальных опухолей щитовидной железы.
Эти опухоли демонстрируют тот же феномен фенотипической ва-
риабельности, что и в неоплазмах молочной железы и миеломах.
Одной из причин фенотипической изменчивости считают вариа-
бельность времени существования матриц иРНК (информацион-
ных РНК). В качестве стабильной матрицы рассматривают струк-
туру, состоящую из комбинации функционирующей полисомы
и внутриклеточной мембраны. Эта функционирующая, поддаю-
щаяся регуляции транслирующая единица была названа «мемб-
рон» по аналогии с опероном, функционирующей регулируемой
единицей генома. Было показано, что стабильность матриц
(иРНК) зависит от связи их с мембраной. Период жизни белков,
входящих в структуру мемброна, определяет стабильность иРНК.
Срок жизни этих белков в мембронах неоплазм отличается от
нормы, он более продолжителен.
Делеционная гипотеза. При изучении канцеро-
генеза, вызванного азокрасителями, было отмечено связывание
диметиламиноазобензола с цитоплазматическими белками печени.
В ходе канцерогенеза содержание клеточного белка, реагирующего
с красителем, постоянно убывало до полного его исчезновения
в сформировавшейся гепатоме. Было высказано предположение,
что с канцерогеном связываются белки, контролирующие рост.
Потеря, «выпадение» этих регуляторных белков приводит к не-
ограниченному росту. Дальнейшие исследования не внесли ясности
в структуру и значение этой группы белков в химическом канцеро-
генезе.
Несколько позже было показано, что в ходе канцерогенеза
кожи мышей полициклическими углеводородами происходит ана-
логичный процесс связывания и исчезновения белков.
Из этих фактов следовало, что соединение канцерогена с опре-
деленным цитоплазматическим белком вызывает необратимое
изменение или потерю этого белка, что играет якобы решающую
роль в канцерогенезе. Предполагалось, что утрата белка снимала
торможение деления ядра и развязывала злокачественный рост.
Сегодня можно подвести итоги исследований этого направ-
ления и заключить, что до сих пор не удалось привести достаточных
и убедительных доказательств гипотезы «выпадения». Канцеро-
гены связываются не только с белками, но и с другими биохими-
ческими компонентами клетки, в том числе с нуклеиновыми кисло-
39
тами, и именно на эти реакции должно быть обращено самое
пристальное внимание. По-видимому, реакции химических кан-
церогенов с белками играют в канцерогенезе второстепенную
роль.
Вариантом делеционной гипотезы явилась «катаболическая
делеционная» концепция, предполагающая, что в ходе канцеро-
генеза снижаются количественно и «выпадают» ферменты катабо-
лического обмена, в результате чего возникают клеточная гипер-
трофия и неуправляемое клеточное деление. Однако не известно
надежных данных, подтверждающих идею, что делеционные
катаболические ферменты играют критическую роль в инициирую-
щих событиях канцерогенеза.
Гипотезы, обосновывающие ведущую роль
в неоплазии эпигенетических факторов. Ряд
исследователей полагают, что наследуемые и квазинеобратимые
изменения могут происходить в ходе клеточной дифференциации
в многоклеточных организмах без изменения генетической инфор-
мации. С этих позиций, канцерогенез может состоять в относи-
тельно перманентных изменениях в генной экспрессии. Так, эпи-
генетические последствия реакций N-гидрокси-эфиров аминов и
амидов с аминокислотами (например, метионином, цистеином,
тирозином, триптофаном) в белках (репрессорах?) и с гуанином
(или другими основаниями) в различных РНК должны также
рассматриваться в качестве возможной основы канцерогенеза.
Мысль, что такие реакции могли бы результироваться в изменения
генной экспрессии (которые могли бы быть ранними и, возможно,
обратимыми событиями в канцерогенезе), была высказана еще
F. Jacob и J. Monod в 1961 г. Вскоре она получила дальнейшее
развитие и экспериментальное подкрепление в виде демонстрации
существования быстрого эпигеномного действия метилхолантрена
в печени крыс. Были изучены также биохимические реакции
транспортных РНК с N-ацетокси-ацетиламинофлюореном. На
основании этих и других исследований предположили, что опухоли
могут возникать в результате действия потенциально обратимых
аберраций в дифференциации, которые появляются благодаря
модификации транспортных РНК, индуцированных канцеро-
генами. Интенсивное изучение химического канцерогенеза позво-
лило рассматривать этот процесс как наследуемую потерю конт-
роля над клеточной мультипликацией. В данном случае возможны
два механизма: 1) взаимодействие канцерогенов с ДНК воплоща-
ется в изменения генетической информации, содержащейся в мак-
ромолекулах; 2) изменения в специфических белках или рибо-
нуклеиновых кислотах, которые приводят к относительно стабиль-
ным и наследуемым изменениям в генной экспрессии. Оба
механизма пока мало изучены.
В более поздних исследованиях оценивали возможности двух
механизмов химического канцерогенеза: генетического и эпигене-
тического. Под первым подразумеваются соматическая мутация,
40
наследственные изменения в ДНК генома; под вторым — негеном-
ные изменения, ведущие к квазиперманентным изменениям
в транскрипции ДНК и предпочтительной пролиферации пред-
существующих пренеопластических или неопластических клеток.
Указывают, например, что химическая модификация молекулы
ДНК-полимеразы может оказаться достаточной для внесения
критических мут’аций в клеточную ДНК, способствуя возникно-
вению неопластических клеток.
Реакции химических канцерогенов с белками и рибонуклеино-
выми кислотами могут рассматриваться как средства реализации
эпигеномных механизмов канцерогенеза. Один из вариантов его
основывается на модели клеточной дифференциации. Много-
образие экспрессии эмбриональных антигенов и ферментов в хими-
чески индуцированных опухолях представляет собой пример
действия канцерогенов на считывание генетической информации.
Эти изменения в транскрипции могут включать также дерепрессию
части или всего интегрированного генома онковирусов.
Гипотезы аномальной ‘экспрессии генов.
Сдвиги изоэнзимных спектров в опухолях.
S. Weinhouse (1972) на примере экспериментальных гепатом
изучил отклонения в генетической экспрессии, проявляющиеся
в изоэнзимных изменениях. Он усмотрел в результатах исследова-
ний своей и других лабораторий свидетельство того, что мис-
программирование (ошибочное программирование) генетической
информации является общей фенотипической чертой рака, обу-
словливающей аберрантный синтез белка. Своеобразным фено-
меном рака является также появление фетальных белков. Он
указывает на то, что гены, которые были активны в эмбриональной
ткани, но репрессированы в ходе нормального развития, реакти-
вируются при раке. Это — также явление эпигенетического ха-
рактера.
S. Weinhouse (1972) отмечает существенные изменения в экс-
периментальных гепатомах различной степени дифференциации
и скорости роста изоэнзимного спектра ряда ферментов, в част-
ности углеводного обмена. В его лаборатории было открыто
существование среди гексокиназ четырех изоэнзимов, из кото-
рых особый интерес представляет глюкокиназа. Активность этого
фермента меняется весьма характерно в гепатомах с различ-
ной скоростью роста. В медленно растущих, высокодифферен-
цированных гепатомах Морриса у крыс кинетические характе-
ристики как глюкокиназы, так и трех других гексокиназ мало
отличаются от таковых нормальной печени: общая гексокиназная
активность низкая, а активность глюкокиназы — высокая. С умень-
шением степени дифференцировки гепатом активность глюко-
киназы практически исчезает, причем она не увеличивается и от
введения углеводов или инсулина (что имеет место в норме).
Особенно примечательны значительное увеличение гексокиназной
и исчезновение глюкокиназной активностей в быстрорастущих
41
низкодифференцированных гепатомах. Таким образом, в этой
группе опухолей имеют место почти полное исчезновение изозима,
высокоактивного и играющего ключевую физиологическую функ-
цию в нормальной печени, и значительная дерепрессия изозимов,
слабоактивных в зрелой ткани. Обращает на себя внимание
соответствие этих данных таковым для эмбриональной печени.
Характерны изменения в экспериментальных гепатомах изо-
ферментов альдолазы. Известно, что альдолаза В представляет
единственную форму этого фермента в зрелой печени. Этот изозим
активен в отношении фруктозе-1-фосфата, единственного продукта
обмена фруктозы в печени, и поэтому играет роль в метаболизме
фруктозы — важной функции печени. Альдолаза А — единствен-
ная или доминирующая форма фермента в эмбриональной печени.
В ходе эмбрионального развития альдолаза А репрессируется,
а альдолаза В появляется и становится практически единственной
формой фермента после рождения. Как и в случае с глюкокиназой,
альдолаза В является фактически единственной формой альдолазы
в высокодифференцированных гепатомах. С падением степени
дифференциации альдолаза А начинает появляться, и, подобно
гексокиназным изоэнзимам, низкодифференцированные гепатомы
почти полностью теряют альдолазу В, которая замещается высоко-
активным изозимом альдолазы А.
Сходные трансформации происходят в гепатомах с ферментом
пируваткиназой. Этот энзим играет весьма важную роль в энерге-
тическом обмене, он является ключевым в осуществлении ряда
физиологических функций печени. Фермент существует во множе-
ственных формах. Тип II — преобладающая форма в нормальной
печени. Этот изоэнзим важен в функции утилизации глюкозы
и в глюконеогенезе. В гепатомах происходят также серьезные
изменения соотношения различных изоэнзимных форм пируват-
киназы, причем того же характера, что и в случаях с изозимами
гексокиназы и альдолазы. В медленно растущих высокодифферен-
цированных гепатомах (9618 А) активность пируваткиназы
высока, но низка в опухолях средней степени дифференцирован-
ности и практически отсутствует — в быстрорастущих, низко-
дифференцированных. В то же время в последних очень высока
активность изозима 1-формы, которая имеет крайне низкую актив-
ность в нормальной зрелой печени. Любопытно, что в эмбриональ-
ной печени крыс (20 дней) спектр изозимов пируваткиназы вклю-
чает 3 формы (как в крайне злокачественной низкодифферен-
цированной гепатоме Новикова): один—как в нормальной
печени, а главный пик, получаемый при хроматографировании,
соответствует «раковому». Это еще один пример экспрессии
в низкодифференцированных опухолях фетального печеночного
белка, который репрессирован в зрелых гепатоцитах. Известно,
что изозимы а- и /?-форм гликогенфосфорилазы в низкодифферен-
цированных гепатомах кинетически и иммунологически сходны
с таковыми фетальной крысиной печени или мышечной фосфорила-
42
зой. Аналогичные данные получены при изучении изозимов глут-
аминазы и аминотрансфераз разветвленных аминокислот.
Эти примеры демонстрируют общий феномен реактивации
в опухолях генов, которые были репрессированы в процессе
эмбрионального развития.
Рак характеризуется, прежде всего, потерей контроля хозяина
над клеточной пролиферацией. Обратной стороной «медали» явля-
ются нарушение дифференциации и сопутствующие этому измене-
ния в экспрессии отдельных важных в функциональном отношении
генов. Это наглядно демонстрируют экспериментальные гепатомы
различной степени дифференцировки. Примечательно, что среди
молекулярных изменений в таких неоплазмах наблюдаются потеря
ферментов, находящихся под регулирующим влиянием хозяина
и сопряженных с печеночной функцией, и замещение их энзимами
с измененной молекулярной структурой, которые не контролиру-
ются хозяином и сопряжены с эффективной утилизацией мета-
болических «топливных» материалов.
Делалось много попыток найти связь между пролифератив-
ными процессами опухолей и их энзиматическими активностями,
однако безуспешно. Это и понятно, так как простое определение
валовых энзиматических активностей часто не выявляет тонких
и глубоких сдвигов, определяемых измененной молекулярной
структурой отдельных изоэнзимных компонентов. S. Weinhouse
(1972) полагал, что обнаружение утраты клетками регуляторных
изозимов, занимающих ключевое положение в тех или иных
жизненно важных функциях, может внести ясность в механизм
неограниченной пролиферации раковых клеток.
Сходство результатов изучения изоэнзимов при раке с измене-
иями некоторых иммунологических свойств опухолей обращает
на себя внимание. При неоплазии антигены, характеризующие
зрелые дифференцированные ткани, исчезают, тогда как новые
антигены идентифицируются как эмбриональные белки. Очевидно,
это обратная сторона одного процесса: аберрация генной экспрес-
сии характеризуется потерей белков, нормально присутствующих
в зрелой, дифференцированной ткани, и приобретением белков,
содержащихся в низких концентрациях или вообще отсутствую-
щих в зрелой ткани, но присутствующих в фетальной.
Можно ли это миспрограммирование генетической информации
рассматривать как причинное для неопластической трансформа-
ции? Исследования дают на этот вопрос отрицательный ответ,
поскольку несколько высокодифференцированных эксперимен-
тальных гепатом показали изоэнзимные характеристики, практи-
чески идентичные таковым нормальной печени.
В целом оценка результатов исследований изоэнзимов в гепато-
мах разной степени дифференцированности требует осторожности,
так как сходные изменения иногда наблюдаются в ненеопласти-
ческих тканях. Ни антигены, ни изоэнзимы не теряются или
приобретаются, но меняются количественно. Печеночные маркер-
43
ные энзимы, активность которых резко падает в низкодифферен-
цированных гепатомах, также варьируют в норме при пищевых
и гормональных влияниях. Эмбриональные антигены (например,
а-фетоглобулин) определяются в нормальных тканях и могут
количественно нарастать не только при раке, но и в регенерирую-
щей печени [Абелев Г. И., 1971], при гепатите и циррозе, а также
в «пренеопластической» печени вскоре после начала скармливания
канцерогенов.
Интересно, что нормальные крысиные клетки в культуре неиз-
менно проявляют фетальные изозимные характеристики.
Рак, по-видимому, связан с нарушением механизмов, которые
контролируют упорядоченную экспрессию генов в дифференциро-
ванных тканях. В этом заключается молекулярный дефект нео-
плазм. Мы должны знать много больше о нормальном процессе
дифференциации, чтобы понять механизм ее расстройства при
раке.
К сожеланию, эти трюизмы в такой общей форме не очень
приближают нас к раскрытию конкретных механизмов канцеро-
генеза.
ОПУХОЛЬ И ОРГАНИЗМ
Движение экспериментальной и теоретической онкологии от
поверхности к сущности, от общего к частному, от целостного
организма в глубину — к тканям, клеткам, субклеточным элемен-
там и, наконец, реакциям на молекулярном уровне внесло много
нового в познание сущности рака и механизма онкогенеза. Это
движение отражало общий прогресс науки, совершенствование
методических возможностей проникновения в глубинные процессы,
лежащие в основе феномена малигнизации. Однако такое смеще-
ние методологических акцентов имело и некоторые негативные
последствия. Они стали отчетливо проявляться в определенной
дезинтеграции целого, отрыве частных явлений на «нижних эта-
жах» организации живого от состояния, функции и компетенции
целостного организма.
Реакцией на указанные отрицательные явления в общем про-
грессе теоретической онкологии явилось стремление устранить
намечающийся дисбаланс двух противоположных тенденций. Это
нашло выражение в активном развитии за последние годы науч-
ного направления, формулировавшегося как «взаимоотношения
опухоли и организма», или «опухоль и организм». Плодотворность
его очевидна, так как сегодня не требует доказательств положение,
что опухоль не местный процесс, а заболевание всего организма.
Очень активно данное направление развивается в нашей
стране, и большой вклад в его успех внесли Р. Е. Кавецкий (1977,
1981) и его школа: В. Г. Пинчук (1979), А. И. Быкорез и 3. А. Бу-
тенко (1975), К. П. Балицкий, Н. К. Берлинских (1983),
В. М. Дильман (1983). Особенно активно эту проблему раз-
рабатывают В. С. Шапот и соавт. (1975).
44
Мы изложили наиболее значительные теории и гипотезы проис-
хождения и природы рака, основывающиеся на данных класси-
ческой биохимии.
Больше всего внимания было уделено теории Варбурга по той
причине, что она была, по существу, первой попыткой интерпрета-
ции феномена возникновения и особенностей неоплазм с конкрет-
ных биохимических позиций. Кроме того, это было сделано потому,
что теория Варбурга лучше других подкреплена фактами и логи-
ческими обоснованиями. Наконец, эта концепция приобрела и в мо-
мент ее появления, и позже, даже до наших дней, необычайную
популярность и оказала большое влияние как на мышление
онкологов-теоретиков и экспериментаторов, так и на дальнейшие
пути исследований многих лабораторий на десятки лет вперед.
Однако время шло, накапливались новые данные, заставлявшие
взглянуть на те же факты другими глазами. Именно поэтому
много места в данной главе было уделено также критической
оценке точки зрения Варбурга. Эта критика ни в коей мере не
поколебала авторитета этого выдающегося ученого. Все пред-
ставленные им экспериментальные результаты полностью сохра-
няют свою силу. Могут быть изменены лишь акценты и логические
оценки. В историческом плане теория рака Варбурга была и оста-
ется одним из самых оригинальных и впечатляющих усилий,
какие предпринимались кем-либо из биохимиков до сих пор.
Другие биохимические гипотезы злокачественного роста пред-
ставляются нам менее значительными. Однако они — неотъемле-
мая часть истории теоретической онкологии, отражают те или
иные успехи биохимии своего времени и заслуживают вниматель-
ного рассмотрения, тем более, что нам известны примеры «вос-
крешения» забытых взглядов, получивших новое звучание в свете
более поздних открытий.
Наиболее общее заключение, которое может быть сделано
в результате взвешенной оценки всего, чем располагает совре-
менная биохимия в области онкологии, сводится к следующему.
Ни одна из существующих биохимических гипотез, теорий, концеп-
ций не может пока объяснить все стороны сложного феномена
рака, что исключает возможность разработки на их основе научно
обоснованных диагностических тестов и методов лечения зло-
качественных опухолей.
Надежды в этом плане могут быть связаны, по нашему мнению,
только с успехами нового, высшего этапа развития биохимии —
молекулярной биологии, а также молекулярной генетики. Опыт
последних лет, освещенный в последующих главах этой книги,
убеждает в правильности этой мысли.
ГЛАВА 2
БИОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ
ХИМИЧЕСКОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА
Канцерогены можно подразделить на химические, физические
и биологические агенты, экспозиция к которым увеличивает
вероятность возникновения рака. Канцерогены могут действовать
в области первичного контакта, в зоне локализации или накопле-
ния в избирательном органе (органе-мишени), в местах их экскре-
ции или метаболических превращений.
Все большее признание находит точка зрения, что большинство
злокачественных опухолей у человека вызывают химические
канцерогены среды и что эти опухоли в конечном счете могут быть
предотвращены. По оценкам Всемирной организации здраво-
охранения (ВОЗ), более 75 % заболеваний раком у людей обу-
словлены факторами окружающей среды. Полагают даже, что
примерно 80 % рака у человека происходят в результате воздей-
ствия химических веществ [Boyland Е., 1969].
Известный американский онковирусолог, бывший директор
Национального института рака США F. Rauschcr (1962), считает,
что 60—90 % всех заболеваний раком возникают за счет факторов
окружающей среды. Он приводит данные, согласно которым
курение обусловливает примерно 40 % смертности от рака, пище-
вые факторы — 25—30%, профессиональные факторы— 10%.
По данным экспертов-эпидемиологов, 80—90 % раковых опухо-
лей могут быть связаны с факторами среды, причем роль некоторых
агентов как этиологических факторов рака очевидна. Например,
около 30 % смертей от злокачественных опухолей в США связаны
с курением и 27 % смертей от рака обусловлены болезнями пище-
варительного тракта.
Отдельные исследователи указывают на питание как причину
существенных различий в смертности от отдельных видов рака,
например, в США и Японии.
Так, в Японии в 7 раз больше смертельных случаев от рака
желудка, чем в США. Однако в Японии смертность от рака прямой
и толстой кишки встречается в 2 раза реже, чем в США.
В ряде исследований роль специфических канцерогенов окру-
жающей среды была идентифицирована или обоснованно предпо-
ложена. Наиболее документированные данные по канцерогенезу
за счет химических соединений окружающей среды представлены
в отношении табака. Уже в течение нескольких десятилетий по-
дозревали, что интенсивное курение прямо и причинно связано
с хроническими заболеваниями легких и особенно раком. Более
29 ретроспективных эпидемиологических исследований по раку
легких, указавших на причинную роль курения, были опублико-
ваны за период с 1939 по 1964 г. В настоящее время связь рака
легкого с курением считается убедительно доказанной.
46
Имеется также много исследований, показывающих роль
загрязнения воздуха городов в возникновении рака легких. В ат-
мосфере городов установлено присутствие ряда химических кан-
церогенов, причем продемонстрирована более высокая смертность
от рака легких в городах с загрязненным воздухом, чем в сельской
местности.
Сейчас мало сомнений в том, что многие болезни, рассматри-
вавшиеся ранее как спонтанные, в частности рак, вызываются
загрязнением окружающей среды. Они обусловлены экспоненци-
альным возрастанием экспозиции человека к загрязнениям широко
используемых синтетических и других химических соединений (и
продуктов их деградации в воздухе, воде и почве), которые пока
недостаточно токсикологически и экологически охарактеризованы.
Существенную роль играет не поддающаяся контролю профессио-
нальная экспозиция к широкому ряду уже хорошо известных хими-
ческих канцерогенов, в дополнение к тысячам токсикологически
неохарактеризованных синтетических химикалиев.
История обнаружения профессионального канцерогенеза вос-
ходит к наблюдению Персиваля Потта [Pott Р., 1875], впервые
обнаружившего высокую частоту рака мошонки у молодых британ-
ских трубочистов, экспозированных к саже. С тех пор многочислен-
ными авторами описаны и изучены разнообразные профессиональ-
ные формы рака. В их число входят рак мочевого пузыря в ани-
линокрасочной и резиновой промышленности, индуцируемый 2-на-
фтиламином, бензидином, 2-аминотиофенилом и 2-нитрофенилом,
рак легкого у рабочих урановых рудников в Колорадо, у рабочих
коксовых печей, рабочих предприятий по выработке азотистых ип-
ритов в Японии и у рабочих, даже кратковременно соприкасаю-
щихся с бис (хлорметил)-эфиром; рак кожи у рабочих промышлен-
ности сланцевых масел; рак синуса носа у столяров и плотников;
рак легкого и плевральные мезотелиомы у изолировщиков,
строительных рабочих, соприкасающихся с асбестом; рак под-
желудочной железы, а также лимфомы у химиков-органиков;
ангиосаркома печени у рабочих, занимающихся полимеризацион-
ными процессами при изготовлении поливинилхлорида.
По оценкам американских авторов, 60 % (а возможно и 90 %)
из тех 655 000 случаев рака, которые выявлены в США в 1974 г.,
вызваны различными факторами окружающей среды, главным об-
разом разнообразными химическими веществами [Maugh Т.,
1974]. J. Higginson (1982) указывает, что примерно 80 % всех
злокачественных опухолей человека связаны с факторами окру-
жающей среды. Он включает сюда все внешние факторы, имея
в виду курение сигарет, диету и потребление лекарств, а также
загрязнение воздуха и воды, особенности географического место-
жительства и другие социально-культурные факторы.
КАНЦЕРОГЕНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
История исследований рака показывает, что открытия в об-
ласти человеческого канцерогенеза за счет различных хими-
ческих соединений предшествуют изучению этих веществ на экспе-
риментальных животных. Последующие лабораторные исследова-
ния привели к обнаружению большого числа разнообразных
химических канцерогенов. Сегодня обычным является следующий
путь поисков канцерогенов? от эпидемиологических наблюдений
ТГГёстам на животных и затем обратно к человеку. Именно таким
путем, особенно в отношении промышленных факторов, был иден-
тифицирован ряд химикатов в качестве канцерогенных для чело-
века веществ. Специфические канцерогенные компоненты различ-
ных смол, сажи, масел, сигаретного дыма и бетельных орехов пока
не раскрыты. Лучше охарактеризованные канцерогенные для чело-
века химические вещества включают различные ароматические
амины и родственные соединения: 2-нафтиламин, бензидин,
4-аминотиофенил, аурамин, NN-биc(2-xлopэтил)-2-нафтиламин,
бис(2-хлорэтил)сульфид, асбест, некоторые никель- и хромсодер-
жащие канцерогены. Давно в канцерогенном действии на кожу
человека подозреваются мышьяковые соединения, и, согласно со-
временным эпидемиологическим данным, им принадлежит также
определенная роль в этиологии некоторых форм рака дыхательной
системы. Длительное использование фенацетина некоторыми боль-
ными, по-видимому, может индуцировать опухоли почек. Однако
эти агенты не вызывают опухолей у экспериментальных животных.
Афлатоксин и вторичные нитрозамины рассматриваются как
весьма вероятные канцерогены для человека, так как они присут-
ствуют в специфической для него окружающей среде и показали
себя мощными канцерогенами у многих видов животных.
Сейчас признается, что не менее 1000 химических веществ
могут вызывать опухоли у человека и животных, и во много раз
больше веществ подозреваются в этом [Maugh Т., 1974]. Важные
сведения о химических соединениях вообще и химических канцеро-
генных веществах в частности приводит известный специалист
в этой области U. Saffiotti (1982). Этот автор отмечает, что сущест-
вуют большие различия: в общем количестве зарегистрированных
химических соединений (5-10ь); числе химических веществ, к ко-
торым экспозируется человек (6-104—7-104); тех, которые
определялись на канцерогенную активность (4-103—7-103);
соединений, которые при биологическом испытании были иденти-
фицированы как канцерогенные у животных и экспозиции к кото-
рым подвергается человек (3-102—5-102), и теми, наконец,
которые были признаны канцерогенными на основе текущих
эпидемиологических наблюдений.
Профессиональные факторы обусловливают примерно 20—
40 % от общего числа случаев рака. В основном эти данные осно-
вываются на эпидемиологических наблюдениях. U. Saffiotti (1982)
48
приводит следующую оценку количества существующих химиче-
ских веществ и канцерогенов.
Все зарегистрированные химические вещества .	5000000
Все химические вещества, к которым экспозируется
человек ....................................... 60000—70000
Все существующие канцерогены .............. 5000—50000
Все существующие канцерогены, к которым экспо-
зируется человек .	  1000-5000
Химические соединения, испытанные на канцеро-
генность ...	................ .	4000—7000
Испытанные на животных, подозреваемые канцеро-
гены ........................................ 1400—2800
Испытанные на животных, положительно канцеро-
генные ...................................... 800—900
Тест-позитивные канцерогены, к которым экспози-
руется человек ........................... 300—500
Тест-позитивные канцерогены с профессиональной
экспозицией .......	. .	200—300
Канцерогены с позитивными данными для человека	20—40
Из этого следует, что нас окружает бесчисленное количество
химических веществ. Все вокруг нас: одежда, которую мы носим,
пища, которую едим, газеты, журналы, книги, которые мы читаем,
все прочее, питающее современную цивилизацию, — сделано из
химических веществ или при их помощи. С течением времени
в этом, в высшей степени конструктивном, развитии стали обнару-
живаться и негативные стороны, а именно: появились данные
о том, что многие из традиционно используемых в быту и промыш-
ленности соединений токсичны, а иные канцерогенны.
Естественно, встал вопрос о контроле над этой негативной сто-
роной процесса внедрения изделий химической индустрии
и естественных продуктов природы. Сразу же стало ясно, что про-
верка на канцерогенную активность всех известных или даже
только широко используемых химических веществ представляет
задачу нереальную ни физически, ни экономически.
Действительно, по имеющимся достоверным компьютеризиро-
ванным данным [Maugh Т., 1978], на конец 1977 г. в мире заре-
гистрировано 4 039 907 единиц химических соединений, причем
число их возрастает еженедельно на 6000. Компьютерный список
содержит все соединения, упомянутые в литературе начиная
с 1965 г. Естественно, что в настоящее время общее число извест-
ных химических веществ намного больше. Упомянутая машинная
регистрация химикалиев основывается на безупречном компьютер-
ном описании их строения и молекулярной структуры, причем
каждому регистрируемому уникальному соединению автомати-
чески присваивается постоянный идентификационный номер.
Интересны некоторые общие характеристики зарегистрирован-
ных индивидуальных химических веществ. 96 % из них содержат
углерод; усредненное соединение имеет 43 атома, 22 из которых
являются водородом. Такое усредненное статистическое соедине-
ние содержит одну или половину кольцевой системы с восьмью ато-
4
49
мами на кольцо. Примерно 3 400 000 химических веществ являются
органическими соединениями, структура которых полностью иден-
тифицирована, 3 000 000 из них содержат как минимум одну коль-
цевую систему. 59 000 органических веществ не до конца иденти-
фицированы. Картотека содержит также 72 000 сплавов, 120 000 поли-
меров и 10 000 смесей специфических наименований. Из об-
щего числа зарегистрированных химических соединений 33 000 яв-
ляются веществами широкого использования (по другим оцен-
кам — 63 000) и 50 000 — повседневного использования, без вклю-
чения пестицидов, фармакопрепаратов и добавок к пищевым про-
дуктам.
Естественно, что определение безопасности такого числа ве-
ществ, хотя бы только широкого использования, является
практически неосуществимой задачей. Во всяком случае, в 1978 г.
в 98 институтах 20 стран тестировались на канцерогенность только
990 химических соединений, причем стоимость полного тестирова-
ния одного соединения оценивалась в 500 000 фунтов стерлингов.
Процедура требует 50 самцов и 50 самок двух видов животных
и продолжается 24 мес.
Интересные данные за 1974—1975 гг. приводит В. Toth (1975).
По его подсчетам, ежегодно поступает около 200 000 новых хими-
ческих веществ. Если лишь 1 % их представлен в сравнительно
больших количествах, то это значит, что человек ежегодно под-
вергается экспозиции примерно 2000 только новых соединений с не-
известным действием на организм.
К началу 1976 г. во всем мире было исследовано на канцеро-
генную активность более 6000 химических веществ. Из них более
1000 соединений вызывали опухоли у животных и, по-видимому,
способны делать это у человека.
Несмотря на эту статистику и большие усилия, затраченные
после того, как более 200 лет назад печная сажа была идентифици-
рована как причина одного из видов рака, сравнительно мало
известно о тонком механизме химического канцерогенеза. Это объ-
ясняется главным образом тем, что основные усилия направля-
лись до недавнего времени на выявление новых канцерогенов,
а не на изучение механизма их действия. С другой стороны,
концентрация внимания в последние десятилетия на вирусном кан-
церогенезе также отвлекала от более интенсивной разработки
проблемы химического канцерогенеза.
В настоящее время, хотя большие усилия в исследовании хи-
мического канцерогенеза все еще продолжают направляться на
скрининг, новым элементом работы является значительный сдвиг
в сторону молекулярной биологии канцерогенеза. Этому вопросу
будут посвящены специальные разделы данной книги. До этого, од-
нако, необходимо рассмотреть тот богатый опыт, который был на-
коплен экспериментальной онкологией в «домолекулярный» пе-
риод, и прежде всего именно в скрининге. В этом деле имелись
и имеются большие трудности методического и экономического
50
характера, а также обусловленные видовой специфичностью и раз-
личной чувствительностью экспериментальных животных.
Важная информация для проблемы химического канцероге-
неза была получена в результате так называемого US megamouse
experiment [Fishbein L., 1980], который ясно показал, что для
того, чтобы быть обнаруженным, канцероген должен вводиться не-
прерывно, число животных должно быть достаточно велико
(24 000 в упомянутом эксперименте), и продолжительность опыта
должна равняться по крайней мере 24 мес. В противном случае
небольшое увеличение в частоте случаев рака, равно как и раков
с длительным латентным периодом, останутся нераскрытыми.
До сих пор только очень немного опытов по канцерогенезу прово-
дилось в указанных условиях. В связи с этим Международное
агентство по изучению рака (IARC, Лион) дало руководящие ука-
зания для тестирования канцерогенности [IARC. Report 6, 1980].
ХИМИЧЕСКИЕ КАНЦЕРОГЕНЫ
Число известных канцерогенных веществ велико и продолжает
возрастать. Химические канцерогены в настоящее время пред-
ставляют собой обширную группу широко варьирующих по струк-
туре органических и неорганических соединений с видовой и ткане-
вой избирательностью невирусной и нерадиоактивной природы.
Часть этих агентов присутствует в окружающей природе, многие
из них являются продуктами человеческой деятельности —
промышленной и лабораторной, а некоторые канцерогены пред-
ставляют собою метаболиты живых клеток.
Некоторые синтетические (формулы I—VIII) и природные
(формулы IX—XII) канцерогены показаны ниже. Главным обра-
зом благодаря усилиям эпидемиологов и вследствие неосторож-
ности людей в обращении с различными химическими веществами
был выявлен целый ряд химических канцерогенов, причастных
к возникновению рака у человека [Miller J., 1970].
Агент	Мишень
Сажи, смолы, масла	Кожа, легкие
Курение сигарет	Легкие
2-Нафтиламин	Мочевой пузырь
4-Аминобифенил	>	>
Бензидин	>	>
?<1^-бис(2-хлорэтил)-2-нафтиламин	>	>
Бис (2-хлорэтил) сульфид	Легкие
Соединения никеля	Легкие,	носовые	синусы
Соединения хрома	Легкие
Асбест	Легкие,	плевра
К числу первых экспериментальных обоснований канцероген-
ного действия ряда химических соединений относятся исследова-
ния, установившие: индукцию рака кожи у кроликов (1915 г.)
и мышей (1918 г.); индукцию опухолей первым чистым химическим
канцерогеном—1,2,5,6-дибензантраценом (1930 г.); изолирова-
4*
51
7,12-диметил-бенэ(а) антрацен
(9,10-диметил-1,2-бензантрацен)
диметилнитроэамин
v
С2НВ—S—СН2—СН2—СН—СООН
/ш2
этионин
4-нитрохинолин-1-оксид
СС14	vil
Четыреххлористый углерод
С2Нв—О—С— NH„	vill
II 2
О
этил карбамат
Строение некоторых синтетических химических соединений, индуциру-
ющих опухоли у экспериментальных животных
ние канцерогена 3,4-бензпирена из каменноугольной смолы
(1933 г.); индукцию рака печени у крыс о-аминоазотолуолом и
п-диметиламиноазобензолом (1933 и 1936 гг.); индукцию рака мо-
чевого пузыря у собак 2-нафтиламином (1937 г.); стадии инициа-
ции и промоции в канцерогенезе кожи смолой (дегтем) и 3,4-бенз-
пиреном (1941 г.).
Характерной особенностью соединений (см. формулы I—VIII и
IX—XII) является то, что они как таковые неканцерогенны и для
такого действия требуют активации. В этом отношении они отли-
чаются от канцерогенных алкилирующих соединений (формулы
XIII—XVIII).
пирролиэидиновые
алкалоиды
афлатоксин Bi
Д-глюкоэил-О—СН2—N—СН3
i
циказин
сафрол
Некоторые природные соединения, индуцирующие опухоли
у экспериментальных животных
52
1-этиленокси-3,4 -эпоксицикло-
гексан
+
VCH8
CH3(CH2)WCO—N<*v|	XV
^сн2
N-стеароилэтиленимин
+СН2— СН2
"J— | XVI
О~“С%
/3-пропиолактон
О	О
сн3—s—о-р(сн2)*—о—s—сн3 xvn
I	'	I
О	о
1,4 - диметансул ьфоноксибутан
пропансултон
Некоторые алкилирующие агенты, показавшие канцерогенность на эксперимен-
тальных животных
О разнообразии структуры и действии химических канцероге-
нов можно судить по следующему перечислению.
Очень сильный канцероген углеводород 9,10-диметил-1,2-бенз-
антрацен (ДМБА), мультипотентный ароматический амид аце-
тиламинофлюорен (ААФ), аминоазокраситель М-метил-4-амино-
азобензол (МАБ) и нитрозамин диметилнитрозамин (ДМНА) —
каждый из них является представителем больших групп родствен-
ных веществ с различной видо- и тканеспецифичностью. Гетеро-
циклическое соединение 4-нитрохинолин-1-оксид и родственные
ему соединения имеют канцерогенность, сходную с таковой поли-
циклических ароматических углеводородов. Этионин — аминокис-
лота, гепатоканцерогенная для крыс. Четыреххлористый углерод
СС14 является гепатоканцерогеном для мышей, и хомяков. Этил-
карбамат (уретан) — многосторонний канцероген, существенно
отличающийся от перечисленных выше химических веществ по хи-
мической структуре.
Варьирование структур канцерогенных веществ кажется беско-
нечным. В частности, очень своеобразны структуры некоторых
метаболитов грибов и зеленых растений. Такие из них, как афла-
токсин, пирролизидиновые алкалоиды и циказин, обладают очень
сильной гепатоканцерогенной активностью для крыс. Как уже
упоминалось, есть мнение, что афлатоксин является одной из при-
чин высокой частоты первичного рака печени среди местного
(туземного) населения Центральной и Южной Африки и в других
местах.
Наиболее примечательной особенностью канцерогенеза под
влиянием перечисленных выше синтетических и естественных кан-
церогенов является то, что эти вещества как таковые практически
все неканцерогенны, о чем будет подробно говориться ниже.
53
Они, по-видимому, представляют собой преканцерогены, которые
в организме хозяина превращаются в активные структуры и кан-
церогены. В этом отношении они отличаются от канцерогенных
алкилирующих агентов (см. формулы XIII—XVIII). Эти агенты
находятся в их конечных реактивных формах уже при введении жи-
вотным и принимают участие в реакциях замещения, нуклеофиль-
ных, бимолекулярных (SN2), в которых положительный, или
электрофильный, атом в алкилирующем агенте комбинируется с от-
рицательными, или нуклеофильными, атомами атакуемых молекул
в клетках.
Во время введения в ткани эти канцерогенные электрофильные
реагенты встречают нуклеофилы, такие как вода и белки, перед их
вступлением в клетки. Это может частично объяснять то обстоя-
тельство, что алкилирующие агенты оказываются недостаточно
сильными канцерогенами и требуются множественные большие
дозы в отдельных местах ткани, чтобы выявить их канцероген-
ность.
Ряд канцерогенных металлов, например бериллий, кадмий,
кобальт, никель и свинец, составляют другую группу агентов, ко-
торые в их ионной форме являются электрофилами. Органические
электрофильные производные (дериваты) металлов могут также
образовываться in vivo.
Классификация химических канцерогенных веществ. К наибо-
лее активным и распространенным канцерогенам можно отнести
следующие соединения.
1.	Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Ти-
пичными их представителями являются: 7,12-ДМБА, 3,4-бензпирен
(3,4-БП), 20-метилхолантрен (20-МХ) и др. Ежегодно в промыш-
ленных городах в атмосферу выбрасываются много сотен тонн,
например, БП. В то же время несколько микрограммов ПАУ
достаточны для индукции опухолей у животных.
2.	Гетероциклические ароматические углеводороды. К ним от-
носятся такие соединения, как 1,2,5,6-дибензакридин, 1,2,5,6- и
3,4,5,6-дибензкарбазол и др.
3.	Ароматические амины и амиды: 2 нафтиламин (2-НА),
4-аминодифенил, бензидин, 2-аминофлюорен, 2-ацетиламино-
флюорен (2-ААФ) и др.
4.	Аминоазосоединения: ортоаминоазотолуол, 4-диметилами-
ноазобензол (4-ДМАБ) и др.
5.	Нитрозосоединения. Нитрозамины: ДМНА, диэтилнитроз-
амин (ДЭНА), N-метил-М'-нитро N-нитрозогуанидин (МННГ),
нитрозометилмочевина (НММ) и др.
6.	Афлатоксины (Bi и др.)
7.	Прочие: уретан (этилкарбамат), этионин, CCL4, хлорэтил-
амины, тиоацетамид, эпоксиды, лактоны, винилхлорид, металлы,
пластмассы и др.
Одна группа веществ, например ПАУ, обладают, главным обра-
зом, местным действием (кожа, подкожная клетчатка), другим
54
(аминоазосоединения, ароматические амины) свойственно резорб-
тивное действие, они вызывают опухоли в отдаленных от места
введения чувствительных органах.
С другой стороны, все химические канцерогены могут быть раз-
делены на 2 группы по другому принципу: одни являются актив-
ными per se, без предварительной активации (ряд простых алки-
лирующих агентов); другие (их большинство) —нуждаются
в предварительной активации (ароматические углеводороды, аро-
матические амины, афлатоксин Bi и др.).
При рассмотрении структуры всех этих веществ прежде всего
поражают их разнообразная, иногда совершенно различная при-
рода, размер молекул и другие характеристики. Обращает на себя
внимание также химическая инертность многих канцерогенных
веществ, например ПАУ, ароматических аминов, нитрозаминов.
Поначалу все эти противоречия представлялись неразреши-
мыми, вызывали много дискуссий и затрудняли разработку уни-
версальной концепции химического канцерогенеза. Мы увидим
ниже, как эти трудности были преодолены.
Метаболическая активация и реактивность химических кан-
церогенов. Как указывалось выше, практически все химические
канцерогены (как естественные, так и синтетические), кроме
группы канцерогенных алкилирующих соединений, сами по себе
не являются канцерогенными. С этой точки зрения, их следует
рассматривать как преканцерогены, которые в организме живот-
ного или человека подвергаются метаболическим превращениям,
активируются, становятся реактивными структурами.
Поскольку совершенно очевидно, что канцерогенные агенты
вызывают неоплазию путем взаимодействия с тканевыми компо-
нентами, основные усилия в расшифровке механизмов химического
канцерогенеза были направлены, главным образом, на изучение
химической реактивности канцерогенов и их метаболитов. Прежде
всего, пытались установить активные формы, т. е. так называемые
конечные канцерогены. Вторым этапом являлись выяснение
природы взаимодействия этих активных форм канцерогенов с тка-
невыми компонентами и определение последних. Существенно
было установить, с какими молекулярными компонентами клетки
взаимодействие конечных канцерогенов является критическим
в малигнизации и каковы молекулярный механизм и специфика
этого взаимодействия.
В известной мере этапную и основополагающую роль в реше-
нии этих вопросов сыграли исследования J. Miller и Е. Miller. Суть
их концепции заключается в следующем.
Форма химического вещества, которая в конечном счете реаги-
рует с макромолекулами клетки («конечный» канцероген), должна
содержать реактивный электрофильный (т. е. электрондефицит-
ный) атом, который может атаковать многие обогащенные
электронами (нуклеофильные) центры в полинуклеотидах или
белках. К нуклеофильным центрам относятся ионы карбония,
55
свободные радикалы, эпоксиды, катионы ряда металлов, азот
в эфирах гидроксиламинов и гидроксамовых кислот и др.
Все канцерогены, которые сами не являются электрофилами,
в тканях метаболизируются до таковых. Из этого открытия сле-
довало заключение, что основным принципом химического канце-
рогенеза является положение о том, что химическое вещество
для того, чтобы вызвать трансформацию, должно необратимо
реагировать с клеточными макромолекулами. Одним из следствий
такой посылки явилась, между прочим, концепция «выпадения»,
согласно которой в результате необратимого взаимодействия,
в частности азокрасителей с белками, регулирующими рост, эти
канцерогены инактивируют «регуляторные» белки. Они как бы
«выпадают». По иронии судьбы ферменты, чьей первичной функ-
цией в организме являются детоксикация и удаление чужеродных
вредных химических веществ, оказались способными активировать
химические канцерогены, превращать неактивные формы послед-
них в реактивные. Наиболее важными из них являются группа
окислительных ферментов под общим наименованием микросо-
мальных полифункциональных (многоцелевых) оксигеназ. Ими
особенно богаты печень и почки, где чужеродные вещества
накапливаются. В нормальных тканях оксигеназы путем окисления
различных функциональных групп чужеродных веществ делают их
более полярными и создают этим точки присоединения к сахарам и
другим молекулам, способствуя их растворению и экскреции.
Связывание канцерогенов макромолекулами in vivo. Впервые
ковалентное взаимодействие химических канцерогенов с белками
тканей-мишеней было отмечено еще более 30 лет тому назад.
Наиболее раннее сообщение о реакции нуклеиновых кислот с алки-
лирующими агентами in vivo появилось в 1957 г.
Ковалентное связывание остатков химических канцерогенов
с макромолекулами (ДНК, РНК, белки) in vivo в последующем
отмечалось во всех случаях. Аналогичные результаты получены
с печенью, кожей и другими тканями животных, обрабатываемых
химическими канцерогенами: ароматическими аминами, аромати-
ческими полициклическими углеводородами, алкилирующими
агентами и потенциальными алкилирующими агентами. При введе-
нии этих и других химических канцерогенов происходит также
взаимодействие и с другими макромолекулами, например гли-
когеном, и с низкомолекулярными соединениями тканей. Однако
главное внимание обращается на взаимодействие канцерогенов
с нуклеиновыми кислотами и белками в надежде обнаружить
изменения, обусловливающие наследственную утрату клеток над
контролем роста, что характерно для неоплазм.
Что касается роли белков тканей в связывании с канцероге-
нами и последующей индукции опухолей, то интересно отметить,
что первоначально в изучении механизма действия химических
канцерогенных соединений главное внимание обращали не на
нуклеиновые кислоты, а именно на белки. Немаловажную роль
56
в этой области исследования (как и в химиотерапии неоплазм)
сыграл С. Heidelberger. Он совместно с сотрудниками синтези-
ровал первый радиоактивномеченный канцерогенный углеводород.
Синтезировав 1,2,5,6-дибензантрацен—|4С3 (ДБА), эти ав-
торы попытались проследить его метаболическую судьбу у мышей
и показали образование некоторых до того неизвестных хинонов
и других метаболитов. Оказалось, однако, что эта работа была
больше связана с детоксикацией, чем с канцерогенезом. Примерно
в это время Е. Miller и J. Miller, основываясь на своей предыдущей
работе по связыванию гепатоканцерогенных азокрасителей с бел-
ками крысиной печени, с помощью флюоресцентной техники по-
казали, что 3,4-бензпирен прочно связан с белком кожи мыши.
Поскольку уже со времен Эрлиха стало аксиомой, что вещество
должно проявлять свое фармакологическое действие в результате
взаимодействия с тканевым рецептором, открытие Е. Miller и
J. Miller, казалось, вело к объяснению этого механизма. Имея это
в виду, был синтезирован ряд радиоактивномеченных углеводоро-
дов и измерена величина их ковалентного связывания с белками
кожи мыши после поверхностного нанесения. Когда авторы срав-
нили связывание серии меченых углеводородов с растворимыми
и нерастворимыми белками кожи мыши после введения путем кож-
ной аппликации, они обнаружили корреляцию между количеством
связанного углеводорода с растворимыми белками и канцероген-
ной активностью, за исключением 1,2,3,4-ДБА, который связы-
вался интенсивно, но считался неканцерогенным. С помощью
электрофореза в крахмале идентифицировали фракцию, с которой
канцерогенные углеводороды связываются, а неканцерогенные —
не связываются. К тому же имелось очень хорошее соответствие
между связыванием с этой фракцией и канцерогенной активностью
серии соединений.
Эта белковая фракция из кожи мыши имела некоторое сходство
с h-белком крысиной печени, с которым связываются азокрасители
и 2-ААФ. Конъюгаты были детально исследованы и частично очи-
щены. h-Белок кожи мыши легко отделялся от аргиназной актив-
ности.
Это противоречило более ранним данным, согласно которым
связываемый азокрасителями белок в печени может быть иден-
тичен аргиназе.
С помощью изоэлектрического фокусирования группе С. Hei-
delberger удалось очистить h-белок в 560 раз, однако он все еще
не был полностью гомогенным. Относительная молекулярная
масса этого белка была равна 40 000, будучи определенной хрома-
тографией на сефадексе Г-100, и 20 000 — по определению путем
электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом
натрия. Это говорит о том, что белок является димером и состоит
из двух субъединиц.
Литература, посвященная взаимодействию канцерогенов
с белками тканей, велика, и затруднительно ее перечислить полно
57
даже в таком издании, как эта книга. Важно, однако, другое.
Это направление, в общем, не дало ожидаемых результатов, зашло
в тупик, и волна подобных исследований резко спала.
Наоборот, все больше внимания стали обращать на реакции
канцерогенов с нуклеиновыми кислотами и, особенно, с ДНК.
Исследование взаимодействия канцерогенов с ДНК показало, что
радиоактивность из 1,2,5,6-ДБА, связанная с сырой фракцией
ДНК, изолированной из кожи мыши, освобождалась из диализа-
ционного мешка после обработки ДНК ДНКазой. Позже была
продемонстрирована хорошая количественная корреляция между
связыванием серии 3Н-углеводородов с ДНК и их канцерогенной
активностью. Однако другие авторы проделали сходные опыты
со связыванием углеводородов in vivo с эпителиальными клетками
мышиной кожи и не обнаружили такой корреляции. В частности,
неканцерогенный ДВА связывался даже сильнее, чем канцероген-
ный изомер.
Многие тканевые и видовые различия в активности химических
канцерогенов определяются характером и особенностями метабо-
лических реакций, ведущих, с одной стороны, к образованию
реактивных электрофильных форм химических канцерогенов,
с другой стороны — к дезактивации последних или их предшествен-
ников.
В этом свете понятно значение глубокого изучения и понимания
всех молекулярных ступеней превращения преканцерогенов в их
активные формы.
Электрофилы, нуклеофилы, свободные радикалы, эпоксиды,
диолэпоксиды. В настоящее время можно считать надежно уста-
новленным, что, несмотря на различия химической структуры раз-
нообразных канцерогенов, все они метаболизируются in vivo
до сильных электрофильных реагентов, имеющих в принципе об-
щую (валовую) электронную структуру.
В общем виде ситуация такова. Родительский нереактивный
канцероген, или преканцероген, превращается в другую
молекулу, которая сама по себе нереактивна, но стоит уже ближе
к конечной реактивной форме, чем преканцероген. Этот промежу-
точный продукт был назван проксимальным канцерогеном. Он че-
рез другие промежуточные проксимальные канцерогены превраща-
ется в конечный канцероген, который и взаимодействует с тка-
невыми нуклеофилами.
Целесообразно рассмотреть подробнее способы образования и
свойства этих реактивных форм химических канцерогенов — от
промежуточных до конечных.
С. Nagata и соавт. (1980) подчеркивают значение реакций
превращения химических канцерогенов в свободные радикалы.
Они указывают, что такие сильные канцерогены, как БП, 2-окси-
бенз(а)пирен, 7,12-ДМБА, ^№диметил-4-аминоазобензол и их
дериваты, ААФ и НА, легко превращаются в свободные радикалы
после того, как активируются в проксимальные формы. Эти
58
свободные радикалы были достаточно реактивны, чтобы связы-
ваться ковалентно с основаниями нуклеиновых кислот. Было
найдено, что антрацен, который не имеет в своей структуре «бэй-
области» (область «залива»), и 10-аза-бенз(а)пирен, в котором
не ожидается образования диолэпоксидов, активируются до реак-
тивных свободных радикалов.
Эти факторы говорят о том, что метаболически образующиеся
свободные радикалы играют важную роль в химическом канцеро-
генезе.
Упомянутые выше авторы нашли, что все испытанные ими
химические канцерогены метаболически превращаются в свобод-
ные радикалы, что, по их мнению, указывает на возможное значе-
ние гомолитической реакции расщепления связи в образовании
электрондефицитных (электрофильных) свободнорадикальных про-
дуктов и в начальных ступенях канцерогенеза. Роль свободных
радикалов в канцерогенезе подробно рассмотрена в работах
Н. М. Эмануэля (1977).
Как известно, J. Miller (1978) подчеркивает доминирующее
значение гетеролитических реакций (SN2 и SN1—замещения,
нуклеофильных, бимолекулярных и замещения, нуклеофильных,
мономолекулярных — соответственно) во взаимодействии с ну-
клеофилами тканей.
В своей работе С. Nagata и соавт. (1980) рассматривают
возможное участие диолэпоксидов, как содержащих в своей струк-
туре «бэй-область», так и не содержащих ее, в реакциях с нуклеи-
новыми кислотами в клетках и тканях, обработанных БА, 7-МБА
и 7,12-ДМБА.
Ранее авторы нашли, что БП превращается в 6-окси-БП-
радикал после метаболических превращений в 6-гидрокси-БП
в микросомах печени, равно как и в микросомных системах кожи и
легкого животных.
Ниже охарактеризованы пути активации, ведущие к образова-
нию свободных радикалов из многих типов сильных химических
канцерогенов.
Как видно из формул XIX—XXIV, N-гидроксилирование явля-
ется одной из обязательных ступеней в метаболических превраще-
ниях канцерогенных аминоазокрасителей, равно как и гидрокси-
лирование в случае ПАУ.
В дополнение к канцерогенам XIX—XXIV имеются данные, сви-
детельствующие о том, что 4-нитрохинолин-1-оксид, митомицин
и другие хиноновые антибиотики дают начало свободным радика-
лам путем восстановительной активации. Было найдено также,
что прямой канцероген (т. е. действующий непосредственно как
конечный канцероген) МННГ легко превращается в свободноради-
кальную форму без участия ферментов. Все эти наблюдения
говорят в пользу того, что свободные радикалы, образуемые из
химических канцерогенов, участвуют в инициации образования
опухолей.
59
Родительский канцероген
Проксиматная форма
Свободный радикал
К(,М-диметил-4-аминоазобензол
2-НА
Энзиматическое образование свободных радикалов из некоторых сильных химических канцерогенов
ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИЕ АРОМАТИЧЕСКИЕ УГЛЕВОДОРОДЫ
Ранние исследования показали, что главными продуктами ме-
таболических превращений полициклических углеводородов под
влиянием специфических ферментов, содержащихся в микросомах
клеток (подробно об этом см. раздел, посвященный метаболиче-
ским превращениям химических канцерогенов в микросомах),
являются гидроксилированные производные и эпоксиды (формулы
XXV—XXVIII, XXIX, XXX).
В 1950 г. Е. Boyland высказал предположение о том, что
эпоксиды образуются в результате окислительных метаболических
превращений отдельных двойных связей углеводородов. Эти
эпоксиды затем могут или перестраиваться в фенолы, реагировать
с водой, давая дигидродиолы, или, взаимодействуя с глутатионом,
образовывать конъюгаты. Последнее предположение представля-
лось особенно реальным, поскольку эти продукты были известны
как главные метаболиты углеводородов. В свою очередь, эпоксиды
гипотетически соответствовали возможным кандидатам в конеч-
ные канцерогенные формы углеводородов. Таким образом, эпо-
ксиды стали вероятными кандидатами в конечные канцерогены,
и многие исследователи стали рассматривать эпоксиды К-области
ПАУ в качестве ответственных за реакцию с ДНК. Однако эта
точка зрения оспаривалась на том основании, что продукты реак-
ции с ДНК, полученные с этими производными ПАУ, не были
идентичны найденным в опытах при связывании канцерогена in
vivo. Проблема была решена путем идентификации диолэпоксида
БП и демонстрацией того факта, что анти-изомер этого метаболита
реагирует с ДНК, давая тот же продукт, что был получен in vivo.
По заданию J. Miller N. Newman синтезировал эпоксидные
производные К-области некоторых углеводородов. Предполага-
лось, что К-области, места высокой плотности электронов, ассо-
циированные с изолированными фенантреноидными двойными
связями (формулы БП, ДМБД и БА) определяют роль углеводо-
родов в канцерогенезе. Однако эта первая попытка связать
К-область полициклических углеводородов с канцерогенезом
оказалась безуспешной. Эпоксидные продукты синтеза были менее
канцерогенны, чем исходные углеводороды.
Успеха добились Р. Sims и соавт. Эти авторы подтвердили
положение о том, что эпоксиды действительно образуются из ис-
ходных углеводородов под действием микросомальных поли-
функциональных оксидаз, присутствующих в человеческих и жи-
вотных тканях. Более того, в экстрактах из микросом, инкубиро-
ванных с рядом канцерогенов, в частности БП и 7,12-ДМБА, они
обнаружили эпоксиды К-областей этих канцерогенов. Р. Sims
и соавт. синтезировали меченные радиоактивными (тритий) изото-
пами эпоксиды углеводородов и показали, таким образом, при-
частность этих метаболитов к индукции рака. Эпоксиды К-области
полициклических углеводородов оказались электрофильными
61
Метаболические изменения в месте двойной связи К-области бензЬа)антрацена
Бенз(а,)пирен и 7,12-диметилбенз{а} антрацен и их
реактивные эпоксидны формы
реагентами, взаимодействующими с нуклеиновыми кислотами как
in vitro, так и in vivo. Авторы не установили точное место в нуклеи-
новых кислотах, которое взаимодействует с эпоксидами, однако
предварительные их результаты указывали на участие гуаниновых
оснований.
В сотрудничестве с лабораторией С. Heidelberger (Вискон-
синский университет) группа Р. Sims проверила трансформирую-
щую способность эпоксидов К-области углеводородов в культурах
клеток грызунов. Прослеживали возникновение морфологически
ненормальных колоний клеток. Колонии трансформированных кле-
ток изолировали и испытывали на туморогенную активность
62
после введения животным. Результаты этих опытов показали, что
эпоксиды К-области углеводородов были более активны как канце-
рогены, чем исходные соединения, и что гидроксилированные про-
дукты (промежуточные метаболиты ПАУ) были неактивны в ис-
пользованных системах.
Эти исследования убедительно подтвердили, таким образом,
что полициклические углеводороды метаболизируются микросо-
мальными ферментами в активные метаболиты. Однако оставался
неясным механизм, благодаря которому эпоксиды превращают
нормальную клетку в неопластическую.
Канцерогенез и мутагенез. Сведения о существовании химиче-
ского канцерогенеза накапливались параллельно с формированием
идей о роли мутации в возникновении опухолей. Связь мутагенеза
и канцерогенеза обосновывалась давно [Bauer К., 1928; Boveri Т.,
1914, 1929]. Тем не менее до сих пор не все исследователи готовы
рассматривать мутационный процесс как основу механизмов хими-
ческого и физического канцерогенеза. Пока неясно, какие ступени,
обусловленные мутациями, вовлечены в трансформацию. Не были
бесспорно идентифицированы какие-либо клеточные молекулы
в качестве факторов, непосредственно участвующих в индукции
клеточной трансформации. Можно рассчитывать, однако, что в бу-
дущем будут получены более прямые и ясные данные, если
удастся изолировать клеточные мутанты, связанные с трансформа-
цией, и будут идентифицированы клеточные гены и их продукты,
контролирующие нормальный и трансформированный фенотипы.
В любом случае нельзя не заметить появления в последние годы
многочисленных исследований, направленных на выяснение
конкретного молекулярного механизма мутагенеза и его связи
с канцерогенезом. Мысль о связи мутагенеза с канцерогенезом на
основе действия эпоксидов углеводородов привлекала к себе осо-
бое внимание потому, что последние реагируют с ДНК- С. Heidel-
berger попытался эту гипотезу проверить. В опытах с культурами
клеток китайского хомяка он показал мутагенность эпоксидов
[Heidelberger С., 1968, 1973, 1975].
W. Durston и В. Ames (1973) (Калифорнийский университет)
в опытах с бактериями показали, что эпоксиды К-области ПАУ
являются сильными мутагенами, сдвигающими рамки транскрип-
ции. Этот эффект приводит к включению или, наоборот, делении
одного или двух оснований в цепи ДНК, изменяя, таким образом,
последовательность оснований. Было установлено, что эпоксиды
К-зоны ПАУ являются сильными мутагенами. Они вызывают
внедрение или выпадение одного или двух оснований в цепи ДНК,
нарушая триплетный код. Возможно, что планарные молекулы
ПАУ вклиниваются между основаниями нуклеиновых кислот
(интеркалируют) и ковалентно связываются, реагируя с соседними
нуклеофильными центрами оснований.
Ранее существовала довольно умозрительная теория действия
полициклических углеводородов, основанная на способности пла-
63
Рис. 2. Интеркаляция планарных молекул (черные) в ДНК.
нарных молекул углеводородов вклиниваться в ДНК
между парами оснований (рис. 2). Полагали, что этот
процесс интеркаляции вызывает ошибки в реплика-
ции ДНК. Мутации со сдвигом рамки репликации
также, по-видимому, возникают в результате интер-
каляции планарных молекул между парами основа-
ний ДНК. Вклинивание в дочернюю цепь ДНК или
делеция основания влечет сдвиг в считывании рамки триплетных
кодонов в ДНК (схема):
ТРЕ ЛИЗ СЕР ПРО СЕР ЛЕЙ
АЦУ	ААоГ	АГУ	ЦЦА	УЦА	ЦУУ
АЦУ	ААх	ГАГ	УЦЦ	АУЦ	АЦУ
ТРЕ ? ГЛУ СЕР ЛЕЙ ТРЕ
□ интеркалированный эпоксцд
X экстраоснование
Схема. Механизм, включающий репликацию ДНК, благодаря которому
эпоксиды углеводородов могут индуцировать мутации
со сдвигом рамки считывания.
В опытах В. Ames углеводороды и их гидроксилированные
производные были неактивны как мутагены, что соответствует от-
рицательному результату С. Heidelberger при испытании гидрокси-
лированных дериватов углеводородов в клеточных культурах на
образование колоний трансформированных клеток. В. Ames пред-
положил, что мутации, вызываемые эпоксидами, обусловлены ин-
теркаляцией последних, сопровождаемой ковалентной реакцией
между эпоксидной группой углеводорода и соседним нуклео-
фильным центром основания. Результаты работы с некоторыми
акридиновыми производными подтвердили этот механизм мутаций.
Позже В. Ames вместе с J. Miller и Е. Miller показали, что реактив-
ные производные канцерогенных ароматических аминов также
действуют у бактерий как агенты, вызывающие мутации со сдвигом
рамки репликации.
Мута ции подобного рода в биологическомпла не ва жнее многих
других типов мутаций по той причине, что ошьмиГут юлнцл ь noJT-
ную инактивацию сена или серии сопряженных генов. Возникнове-
ние такого типа мутации могло бы поэтому объяснить, почему
некоторые полициклические углеводороды являются столь силь-
ными канцерогенами по сравнению с алифатическими алкилирую-
щими агентами
64
Уже на основании лишь этих данных можно было построить
логическую схему механизма канцерогенеза полициклическими уг-
леводородами. В соответствии с нею углеводород, поглощенный
клеткой, подвергается метаболическим превращениям до реактив-
ных эпоксидов, которые образуются быстрее, чем они могут быть
инактивированы последующим метаболизмом до гидроксилиро-
ванных производных. Если эпоксид интеркалирует в ДНК и фикси-
руется в ней к моменту начала клеточного деления, когда ДНК
реплицируется со скоростью, опережающей деятельность клеточ-
ных репарирующих энзиматических систем, устраняющих углево-
дород и восстанавливающих повреждения ДНК, то образуется
дочерняя ДНК, несущая мутацию, которая уже не будет «узна-
ваться» ферментами репарации ДНК-
Р. Grover (1973) высказал мысль о том, что мутации, индуци-
рованные химическими агентами, могут происходить и в интегри-
рованных вирусных геномах. Он рассматривает это как возможный
механизм активации «онкогенов», которые, возможно, существуют
в, казалось бы, нормальных (во всех других отношениях) клетках.
С другой стороны, этот автор не исключает возможности и того,
что многие спонтанные мутации в клетках млекопитающих также
принадлежат к типу мутаций со сдвигом репликационной рамки,
причем они учащаются при старении по причине возрастающего
дефекта энзиматических систем, репарирующих ДНК, что и объ-
ясняет увеличение частоты рака с возрастом, даже без участия
химических канцерогенов или вирусов.
Мутагенность метаболитов потенциально канцерогенных соеди-
нений находит подтверждение в многочисленных работах. Более
того, на этой основе некоторые авторы пытаются даже объяснить
увеличение частоты заболеваемости злокачественными новообра-
зованиями при старении. Так, М. Baird и L. Birnbaum (1979, 1981)
изучили вопрос, является ли более высокая смертность среди
престарелых результатом увеличенной экспозиции к вездесущим
канцерогенам или ее можно рассматривать как следствие продлен-
ного лаг-периода тех форм рака, которые присущи взрослым,
а именно таких, клинические симптомы которых проявляются в бо-
лее позднем периоде жизни людей.
В исследовании, выполненном в лаборатории этих авторов
несколько ранее, было показано, что обмен в печени ряда фарма-
кологических агентов, включая мышечные релаксанты, бар-
битураты и седативные средства, изменяется у стареющих крыс и
мышей. Поскольку эти соединения метаболизируются, главным
образом, системой микросомальных ферментов, которые метаболи-
зируют также сравнительно инертные родительские канцерогены
до высокореактивных метаболитов, авторы предположили, что
связанные с возрастом изменения в обмене химических канце-
рогенов могут быть одним из факторов, ответственных за увеличе-
ние числа случаев рака с возрастом. Они проверили эту гипотезу
экспериментально путем активации химических канцерогенов
5 Заказ 380
65
до мутагенных форм в биологических испытаниях на модели
Salmonella thyphi murium, разработанной В. Ames и соавт. (1973).
Активация проканцерогенных соединений, 3,4-БП и 2-флюорен-
амина, печеночными гомогенатами из старых самцов крыс и мышей
линий C57BL/6J приводила к увеличенной продукции мутагенных
метаболитов у двух различных линий штаммов Salmonella
по сравнению с активацией тканевыми препаратами, полученными
из более молодых животных. Сходный результат был получен
в опытах с микросомами, очищенными из печеночных гомогенатов.
Эти наблюдения указывают на то, что связанные с возрастом
различия в обмене канцерогенов не являются результатом воз-
растных изменений в немикросомальных системах детоксикации,
которые не способны изменить спектр мутагенных метаболитов,
производимых микросомами, ни качественно, ни количественно.
Результаты исследований указанных авторов показали, что ме-
таболиты химических канцерогенов, образуемые старыми живот-
ными, качественно и количественно отличаются от тех, которые
продуцируются их более молодыми партнерами. По-видимому, по-
лученные данные подкрепляют гипотезу о том, что какая-то доля
более частых случаев рака среди старых клеток является результа-
том связанных с возрастом изменений в обмене химических
канцерогенов.
Теория области «залива». Теория «бэй-области» (области
«залива») предполагает, что если диолэпоксиды ПАУ располага-
ются на угловых бензольных кольцах и при этом эпоксидная группа
образует часть «бэй-области» канцерогенного ПАУ, то они должны
обладать высокой биологической активностью [Jerina D. et al.,
1980]. В соответствии с этим предсказанная авторами химическая
реактивность позиционных изомеров диолэпоксидов бензольного
кольца отдельных углеводородов была параллельна их мутаген-
ности и (или) туморогенности. Тем не менее, хотя относительная
реактивность эпоксидов «бэй-области» серий различных углеводо-
родов давала удовлетворительный индекс туморогенности, авторы
критически важными детерминантами биологической активности
признали также метаболические и стереохимические факторы.
Эта работа D. Jerina и соавт. представляет принципиальный
интерес и поэтому заслуживает более подробного рассмотрения.
К концу 1975 г. указанными авторами были представлены
достаточно надежные доказательства того, что БП-7,8-диол-9,10-
эпоксид является первым конечным канцерогеном, идентифициро-
ванным среди класса ПАУ. Основываясь на концепции диол-
эпоксидов, авторы попытались сформулировать общую концепцию
для объяснения и предсказания канцерогенности или отсутствия
таковой для данного канцерогена и проверить, в какой мере высо-
кая реактивность БП-7,8-диол-9,10-эпоксидов может быть ответ-
ственной за их высокую биологическую активность. Они пришли
к заключению, что для каждого данного полициклического углево-
дорода бензильные позиции на насыщенных бензольных кольцах
66
должны быть наиболее реактив-
ными, если такие позиции обра-
зуют часть «бэй-области» угле-
водорода. Простейшим приме-
ром «бэй-области» может слу-
жить зона между 4-й и 5-й пози-
циями фенантрена (формулы
XXXI и XXXII), а также область
Структура фенантрена (XXXI)
и бенэ(а)антрацена(ХХХЛ)
между 1-й и 12-й позициями бенз (а) антрацена. Такие стерически
стесненные области возникают, если бензольное кольцо вклини-
вается в ПАУ под углом.
Расчеты, основанные на молекулярно-орбитальной теории, по-
зволили предсказать, что позиционный изомер диолэпоксида, в ко-
тором эпоксидная группа образует часть «бэй-области» углево-
дорода, будет более реактивен, чем другие изомерные диолэпо-
ксиды, возможные для данного углеводорода. Именно на этом
основании авторы высказали предположение о том, что диолэпо-
ксиды «бэй-области» могут быть конечными канцерогенами, если
они образуются из туморогенных ПАУ.
Используя молекулярно-орбитальные расчеты, удалось на ос-
новании учета реактивности «бэй-области» диолэпоксидов различ-
ных углеводородов предсказать канцерогенность последних и по-
ставить в закономерный ряд по их канцерогенной активности.
Совпадение оказалось достаточно хорошим.
В последние годы было подтверждено, что теория «бэй-
области» является очень удобной для предсказания структур
конечных канцерогенов различных ПАУ.
Суммируя результаты описанных исследований, можно заклю-
чить, что уровень стабилизации бензильного иона карбония
«бэй-области» позволяет предсказать химическую реактивность
диолэпоксидов (в спонтанных сольволизных реакциях).
Дигидродиолы и диолэпоксиды в активации и детоксикации
ПАУ. В настоящее время широко распространено мнение о том,
что большинство канцерогенов, в том числе и ПАУ, реагируют
ковалентно с клеточными макромолекулами (нуклеиновыми кисло-
тами, белками) и что эти реакции могут участвовать в инициации
малигнизации. Однако, поскольку ПАУ химически инертны, было
признано, что они должны быть предварительно активированы
до электрофильных производных, что является условием их кова-
лентного взаимодействия с нуклеофильными центрами клеточных
макромолекул. Теперь известно, что первичными метаболическими
продуктами ПАУ являются простые диоксиды, которые образуются
при участии микросомальных НАДФ-зависимых монооксигеназ.
Было высказано предположение, что именно эпоксиды, образован-
ные при К-областях (содержащихся в большинстве углеводоро-
дов), являются теми электрофилами, которые играют критическую
роль при химическом канцерогенезе. Было найдено, однако, что
продукты присоединения углеводорода к нуклеозидам нуклеино-
5*
67
Бенз(а) антрацен
Реактивные участки ПАУ
вых кислот, образуемые клетками или тканями при обработке
их ПАУ, не возникают путем взаимодействия с эпоксидами
К-области углеводородов. Было установлено, что простые
эпоксиды метаболизируются далее микросомальным ферментом
эпоксидгидразой до трансдигидродиолов, которые могут, в свою
очередь, превращаться в диолэпоксиды. Стало очевидным, что
диолэпоксиды, образованные из определенных дигидродиолов,
локализованных не в К-области (путем метаболизма соседних
сопряженных двойных связей), вовлечены в реакции с нуклеино-
выми кислотами.
По мнению авторов, соединения такого типа, по-видимому,
становятся конечными канцерогенами.
По теоретическим соображениям, более реактивными хими-
чески и, таким образом, более активными биологически должны
быть эпоксиды, образованные по соседству с «бэй-областью»
в ПАУ (формулы ХХХШ—XXXV), чем эпоксиды, образованные
в других местах молекулы углеводорода. Р. Sims (1980) рас-
смотрел этот вопрос, детально исследовав участие диолэпоксидов
ПАУ двух типов: образованных при «бэй-области» и образованных
в других местах молекул (не в «бэй-области» ПАУ) в реакциях
с нуклеиновыми кислотами, имеющих место в клетках и тканях,
обработанных бенз (а) антраценом, 7-метилбенз (а) антраценом или
7,12-ДМБА.
Автор показал, что слабый канцероген бенз (а) антрацен мета-
болизируется в ряд дигидродиолов и диолэпоксидов. Гидролизаты
ДНК кожи эмбрионов мыши или хомяка, обработанные этим
углеводородом, содержали продукты, возникшие в результате
реакций с нуклеиновой кислотой диолэпоксидов как «бэй-области»
(анти-3,4-диол-1,2-эпоксид), так и не «бэй-области» (анти-8,9-
диол-10,11-эпоксид). Однако лишь последний диолэпоксид участ-
вовал в реакции углеводорода с РНК эмбриональных клеток хо-
мяка. В противоположность этому, активация умеренно активного
канцерогена, 7-метилбенз(а)антрацена, и сильного канцерогена,
7,12-диметилбенз (а)антрацена, в коже мыши включает, по-види-
мому, главным образом 3,4-диол-1,2-эпоксиды, локализован-
ные при «бэй-области» углеводорода.
Р. Sims (1980) приводит следующие схемы метаболических
превращений незамещенного бенз (а) антрацена (см. формулу
XXXIII), 7-метилбенз(а)антрацена (см. формулу XXXIV) и 7,12-
диметилбензантрацена (см. формулу XXXV).
68
XXXIII
5,6-дигидродиол-8,9-эпоксид
Неидентифициро-
ванный гидрокси-
лированный про-
дукт
3,4-дигидродиол-
1,2-эпоксид (пока-
зан анти-изомер)
5,6,8,9-тетра-
гидротетрол
8,9-дигид родиол-
10,11-эпоксид (пока-
зан анти-изомер)
10,11-дигидродиол-
8,9-эпоксид(показан
анти-изомер)
Метаболическое образование дшидродиолов и диолэпоксидов, полученных из бенз(а,)антраи,ена
XXXIV
3,4-дигидродиол
7-метилбенз (<x) антрацен
3,4-диол-1,2-эпоксид
Продукты метаболических превращений 7-метиН1енввхйантрацена.
XXXV
7,12-дибенз(а)антрацен
3.4-диол-!. 2-эпоксид
Метаболическая активация 7,12 -диметилбенз(а,)антрацена
Малоактивный канцероген 7-метилбенз(а)антрацен метаболи-
зируется микросомальными фракциями печени крысы и кожи
мыши (органная культура) в пять возможных транс-дигидродио-
лов [Thakker D. et aL, 1978], причем главными продуктами явля-
ются: К-области-5,6-дигидродиол и не-К-области-1,2-, 3,4-, 8,9-
и 10,11-дигидродиолы и не К-области-3,4- и 8,9-дигидродиолы.
7,12-Диметилбенз (а) антрацен, являющийся сильным канцеро-
геном, метаболизируется микросомальными фракциями как печени
крысы, так и кожи мыши (органная культура) до четырех транс-
дигидродиолов, а именно: 3,4-, 5,6-, 8,9- и 10,11-производных
[Tierney В. et al., 1977]. 3,4-Диол-1,2-эпоксид «бэй-области»
получается при обработке in vitro кожи мыши исходным канце-
рогеном и в опытах in vivo. Не исключено образование и других
продуктов (8,9-диол-10,11 -эпоксид не «бэй-области» и др.).
Была проанализирована реактивность связей С = О в эпоксид-
ных дериватах нескольких циклических углеводородов в свете
представлений о роли этих производных как конечных канцероге-
нов в реакциях с ДНК и РНК тканей. Авторы указывают, что при
этом эпоксидное кольцо раскрывается и взаимодействие происхо-
дит по атому С-10. Они исследовали, в какой степени влияют на
раскрытие эпоксидного кольца следующие 2 фактора: 1) близость
в молекуле двойной связи; 2) интрамолекулярное образование
двойных связей между соответствующим образом ориентирован-
ной гидроксильной группой и эпоксидным кислородом. Было
70
найдено, что, тогда как присутствие двойной связи может очень
значительно усиливать легкость раскрытия эпоксидных связей
С = О, таким эффектом не обладает гидроксильная группа, даже
если она образует водородную связь с эпоксидом. Результаты
этого исследования имеют особое значение в связи с их отноше-
нием к диолэпоксидам, которым приписывается роль конечных
канцерогенов ряда ПАУ.
Вопросами химической структуры активных метаболитов ПАУ
и продуктов их взаимодействия с ДНК активно занимались
также A. Jeffrey и соавт. (1980). Эти авторы исходили из широко
распространенной сейчас концепции, что модификация ДНК хими-
ческими канцерогенами является первым и критически важным
событием в индукции опухолей. Они рассмотрели различные ме-
тоды исследования, химию, конформацию и последствия реакций
с ДНК на примере БП и 7,12 ДМБА. Как уже упоминалось,
метаболическая активация этих углеводородов происходит через
дигидродиолэпоксиды «бэй-области». Главной мишенью атаки
в субклеточных системах и в клеточных культурах тканей человека
и животных, по их данным, является аминогруппа гуанина. Авторы
нашли, что 7-метилбенз(а) пирен метаболизируется до 7,8-ди-
гидродиола и что связывание с ДНК происходит, по-видимому,
через 7,8-дигидродиол-9,10-эпоксид. Авторы приводят предвари-
тельные данные о структуре ДМБА-ДНК-комплекса (аддукта).
Важность такого рода исследований определяется тем, что,
несмотря на интенсивное изучение ПАУ, все еще неясно, как эти
или другие канцерогены осуществляют инициацию цепи событий,
ведущих к раку. Много факторов могут ограничивать способность
соединения экспрессировать этот потенциал. К ним относятся экс-
позиция и поглощение вещества животным, распределение
по тканям, обмен до конечных канцерогенов, стабильность конеч-
ных канцерогенов по отношению к метаболическому или хими-
ческому разрушению до их реакции с ДНК, способность реагиро-
вать с ДНК и возможность реакций с конкурирующими нуклеофи-
лами. Затем могут оказаться критическими такие факторы, как
способность клетки-мишени к репарации повреждения ДНК спо-
собом, исключающим ошибки, или, наоборот, вероятность того,
что модифицированная ДНК пострадает в своей матричной
активности или индуцирует репарацию, склонную к ошибкам,
или другие формы ответа организма хозяина. В терминах вероят-
ности возникновения опухоли важны также и последующая экспо-
зиция хозяина к опухолевым промотерам или другие кофакторы,
и состояние пролиферации или дифференциации данных клеток-
мишеней.
Эта сложность и многогранность феномена индукции опухолей
химическими канцерогенами побудила авторов рассматриваемой
работы заключить, что следует считать маловероятной возмож-
ность разработки какого-то единственного биохимического или
молекулярного критерия для точного предсказания того, будет или
71
не будет то или иное соединение канцерогенным, или для определе-
ния его относительной активности как канцерогена, без рассмотре-
ния других факторов.
Несмотря на такой умеренный пессимизм, A. Jeffrey и соавт.
(1980) активно изучали продукты взаимодействия метаболитов
ПАУ с ДНК и внесли существенный вклад в их химическую рас-
шифровку. Эти авторы проследили путь, которым бензпиренди-
гидродиолэпоксид и родственные соединения ковалентно связы-
ваются с ДНК, и рассмотрели последствия этого взаимодей-
ствия.
Продукты связывания метаболитов ПАУ с компонентами ДНК
(аддукты). В работах упомянутых авторов обоснована следую-
щая структура главных продуктов, ДНК-аддуктов, образованных
в клеточных системах человека и грызунов, экспозированных
к БП (формулы XXXVI, XXXVII).
Методом флюоресцентно-спектрального анализа было пока-
зано, что модифицированная бенз (а) пиреном ДНК содержится
в количестве 1 • 105—106 оснований. Был осуществлен химический
синтез конечных канцерогенов из ряда ПАУ, в частности дигидро-
диолэпоксиды «бэй-области» БП и бенз (а) антрацена. Однако по-
пытки приготовить дигидродиолэпоксид «бэй-области» 7,12-ДМБА
пока были неудачны. Установлено, что один и тот же главный
аддукт — продукт взаимодействия с ДНК, бенз(а)пирендигидро-
диолэпоксид-дезоксигуанозин, образуется и бронхолегочными сег-
ментами, и толстой кишкой человека, и образцами ткани пищевода
при экспозиции с БП. S. Ashurst и G. Cohen (1981) изучали образо-
вание в процессе канцерогенеза продуктов взаимодействия ДНК
кожи мышей с метаболитами БП. Авторы использовали мышей
штамма Swiss, чувствительных к канцерогенезу углеводородом.
Они впервые показали, что аппликация in vivo инициирующей
дозы (200 нмоль) БП на кожу мышей вызывает образование
нескольких, связанных с ДНК, потенциально канцерогенных
продуктов, включая 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетрагид-
робенз(а) пирен-дезоксигуанозин (ДГЭТГ) и 7,8-дигидрокси-9,10-
эпокси-7,8,9,10-тетрагидробенз (а) пирен-дезоксиаденозин. Тем
не менее специфические аддукты, ответственные за инициацию
опухолей, остались неидентифицированными.
Было установлено, что у трех штаммов мышей, имеющих
широко различающиеся чувствительности к индуцируемому поли-
циклическими углеводородами канцерогенезу кожи, образуются
сходные количества ДГЭТГ-БП-дезоксигуанозиновых и ДГЭТГ-
дезоксиаденозиновых продуктов, равно как и таковых, возникаю-
щих из дальнейших метаболитов 9-гидроксибенз (а) пирена. Отно-
шение этих ДНК-аддуктов к канцерогенезу не установлено.
Вопрос о том, какие именно продукты взаимодействия канцеро-
генов с ДНК играют наиболее критическую роль в превращении
нормальной клетки в опухолевую, имеет, понятно, первостепенное
значение как в теоретическом, так и в практическом плане.
72
диолэпоксида с дезоксигуано-
зином
аддукт бенз(а)пирендигидро
диолэпоксида с дезоксиадено-
эином
Структура продуктов связывания (аддунтов)метаболитов бенза-
пирена с компонентами нуклеиновых нислот
Сравнительно легче полному молекулярному анализу под-
даются реакции с ДНК таких классических алкилирующих аген-
тов, как метилметансульфонат и этилметансульфонат, которые
реагируют с ДНК, давая несколько алкилированных оснований.
Однако биологически активными в испытании на бактериофаге
были только агенты, способные образовывать О6-алкилдезоксигуа-
нозиновые «дефекты». Эти повреждения результировались также
в ошибочное считывание генетической информации (мискодинг)
матриц ДНК in vitro и ошибочное включение оснований в кополи-
меры. Органная специфичность таких монофункциональных алки-
лирующих агентов, как диметилнитрозамин и диэтилнитрозамин,
довольно хорошо коррелирует с относительной персистенцией
О6-алкилдезоксигуанозиновых продуктов по сравнению с М7-ал-
килдезоксигуанозиновыми продуктами в ДНК тканей-мишеней
животных.
Этот механизм не столь хорошо понятен для таких широко рас-
пространенных загрязнителей окружающей среды, как полицикли-
ческие ароматические углеводороды. Р. Brookes и R. Newbold
(1980) показали хорошую корреляцию канцерогенной силы серии
ПАУ с величиной их реакции с ДНК- Из этой группы химических
соединений наиболее изучен сильный канцероген БП, который
обильно представлен в выхлопных газах автомашин, сигаретном
дыме, копченой рыбе. Как указывалось выше, таким диолэпокси-
дом «бэй-области», как (±)70,8а-дигидрокси-9а, 10а-эпокси-7,8,-
9,10-тетрагидробенз(а)пирен, приписывается роль конечных кан-
церогенных и мутагенных метаболитов полициклических углеводо-
родов.
Причина, почему эти диолэпоксиды инициируют образование
опухолей, далеко не ясна, однако много усилий предпринимается
для понимания механизма взаимодействия этих реактивных мета-
болитов с нуклеиновыми кислотами, особенно ДНК тканей жи-
вотных, чувствительных к канцерогенному действию этих хими-
ческих агентов.
73
Введение БП животным in vivo или в культуры клеток приводит
к образованию ковалентно связанных продуктов, главный из кото-
рых возникает в реакции 7,8-дигидро-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетра-
гидробенз(а)пирена с экзоциклической аминогруппой дезокси-
гуанозина. Было показано, что образование этого аддукта корре-
лирует с мутагенезом в клетках млекопитающих [Newbold R. et al.,
1977] и канцерогенезом в коже мыши [Cohen G. et al., 1979].
D. Phillips и P. Sims (1978) показали, что существует отчетли-
вая корреляция между канцерогенностью различных ПАУ в коже
мышей и степенью образования их соответствующих связанных
с ДНК аддуктов в этой ткани. Однако они не нашли различий
в качественной или количественной природе аддуктов, 7,12-диме-
тилбенз(а) антрацен-ДНК или 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,-
10-тетрагидробенз(а)пирен-дезоксигуанозин-ДНК, образованных
в коже мышей, чувствительных или относительно резистентных
к канцерогенезу кожи, индуцируемому углеводородами. Поэтому
образование этих продуктов само по себе не объясняет хорошо из-
вестных различий чувствительности этих мышей по отношению
к образованию опухолей кожи под воздействием полициклических
углеводородов.
Одна из возможностей объяснить эти факты состоит в допуще-
нии, что образуются другие, количественно менее представленные
бенз (а) пирен-ДНК-аддукты, которые обладают биологическим
действием, но не улавливаются традиционными хроматографиче-
скими методами.
В соответствующих условиях in vitro многие из производных
бенз(а)пирена могут быть метаболически активированы и дать
начало связанным с ДНК продуктам. Однако in vivo, вследствие
природы аддуктов и канцерогенности и мутагенности диолэпокси-
дов «бэй-области», главное внимание при изучении канцероген-
ности бенз (а) пирена фокусировалось на аддуктах, возникших из
7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетрагидробенз (а) пирена.
Введение жидкостной хроматографии под высоким давлением
для анализа углеводород-дезоксирибонуклеозидных аддуктов
весьма способствовало разделению различных связанных с ДНК
продуктов полициклических углеводородов. Хотя экзоциклическая
аминогруппа дезоксигуанозина является главной мишенью
7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетрагидробенз (а) пирена в ДНК,
несколько других количественно меньших продуктов наблю-
дались in vitro, возникающих в результате атаки ^-позиции
дезоксигуанозина, ^-позиции дезоксицитина, фосфатов ДНК
и реакции с дезоксигуанозином. Последний продукт был далее
охарактеризован как 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетра-
гидробенз (а) пирен, связанный с экзоциклической аминогруппой
дезоксиаденозина. J. Di Giovanny и соавт. (1979) показали, что
для серии полициклических углеводородов опосредуемое эпидер-
мальными гомогенатами связывание последних с полиаденозином,
но не с полигуанозином, коррелирует с канцерогенной силой
74
углеводородов на коже мышей. Образование in vitro бенз(а)-
пирен-дезоксиаденозиновых продуктов наблюдали в ДНК эмбрио-
нальных клеток хомяка и трахеальных трансплантатах крыс,
обработанных в культуре бенз(а)пиреном.
S. Ashurst и G. Cohen (1981) исследовали причины сравнитель-
ной резистентности кожи крыс (Wistar) к канцерогенезу,
индуцированному БП, прослеживая образование БП-дезоксирибо-
нуклеозидных продуктов в ткани кожи после топического нанесе-
ния БП (200 нмоль). Авторы предполагают, что относительная
резистентность кожи крыс (по сравнению с кожей мышей) к канце-
рогенезу БП может быть обусловлена частично более низкой
степенью связывания БП с ДНК и меньшим процентом раствори-
мых в метаноле углеводород-дезоксирибонуклеозидных аддуктов
и аддуктов, образованных из предполагаемого конечного канцеро-
гена БП, 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетрагидробенз(а)-
пирена.
Метаболические превращения бенз(а)пирена. Получены
экспериментальные указания на существование организованного
комплекса мембраносвязанных белков в микросомах, который
способствует образованию конечного канцерогена БП, 7,8-дигид-
родиол-9,10-эпоксида БП. Последний определялся по образованию
тетрола. Установлено, что метаболическая трансформация БП
ведет к образованию разнообразных продуктов, в том числе фено-
лов, дигидродиолов, эпоксидов, хинонов и более полярных соедине-
ний, что можно наблюдать при инкубации микросом печени с БП,
НАДФ и кислородом. Отношение образованных продуктов
варьирует в зависимости от источника энзиматической системы
(различных видов животных, пола, органов), диеты животных,
загрязнителей среды, различных биологических агентов, способ-
ных стимулировать синтез разнообразных гемопротеидов, цито-
хрома Р-450.
Катализатором для активации кислорода, требуемого для
образования многих продуктов обмена бенз(а)пирена, является
семейство мембраносвязанных гемопротеидов, называемых цито-
хромом Р-450.
Этот гемопротеид функционирует вместе с флавопротеином,
названным НАДФН-цитохром Р-450-редуктазой, образуя элек-
тронтранспортную систему, локализованную обычно в эндоплаз-
матическом ретикулуме.
Питпхром Р-450 не г олько служит н качестве моноо к с игеназы
в присутствии кислорода и НАДФН, но оц может также функцио-
нировать как пероксидаза в присутствии органических гидропере-
кисей или перекиси водорода.
Как полагают, окисление бёнз (а) пирена до реактивных диол-
эпоксидов происходит в цепи реакций, включающих начальное
Окисление канцерогена до 7,8-эпоксида, который затем гидратиру-
ется ферментом эпоксидгидразой с образованием 7,8-дигидро-
диола [Deutsch J. et al., 1980]:
75
диол эпоксид I
НАДФН
или НАДН
нао
7,8-эпоксид
ПФО
(-) транс-7,8—диол
связывание
с макромолекулами
мутация, рак
HjO
но-.
НО''
он
(7/8,9)-триол
ПФо- палирункционаяьные оксидазы
ЭГ- эпоксидгидраза
(7,9,10/8)-тетрол
(7,9/8,10)-тетрол
7,8-дигидродиол может окисляться далее, давая 7,8-дигидродиол-
9,10-эпоксид, который реагирует ковалентно с нуклеиновыми кис-
лотами и белками, начиная таким образом каскад событий, резуль-
тируютихся в модификацию ряда клеточных характеристик
[Capdevila J. et al., 1980]. Последовательность реакций в процессе
образования 7,8-дигидродиол-9,10-эпоксида в энзиматической си-
стеме микросом следующая. Молекула БП связывается с активным
центром цитохрома Р-450 (или Р-448), где происходит начальная
76
12
1
12
1
2
трифенил ен(-)
хризен(+)
дибенз(а,с)-
антрацен(+)
бенз(е)пирен (-) дибенз( a, h) антрацен (++)
бенз(а) антрацен (+)
бенз( с) фенантрен (+)
Стрелками указана локализация „б»Й-области4* (области „залива*), в скобках-примерная
относительная канцерогенная активность
Структура некоторых полициклических ароматических углеводородов
и их относительная канцерогенная активность
реакция взаимодействия с кислородом. Образующийся эпоксид
может мигрировать из этого центра в поисках молекулы белка,
эпоксидгидратазы, для превращения в 7,8-дигидродиол. Молекула
последнего должна затем встретиться с незанятой молекулой цито-
хрома Р-450 (Р-448) для последующего окисления в 7,8-дигидро-
диол-9,10-эпоксид. Все эти сложные реакции координированы
во времени и пространстве благодаря организации системы
мембраносвязанных ферментов.
Значение «бэй-области» ПАУ в проявлении их канцерогенной
активности. ПАУ — наиболее распространенные загрязнители ок-
ружающей среды и, в соответствии с имеющимися эпидемиологи-
ческими и экспериментальными данными, могут быть ответственны
за индукцию рака у человека. Биохимические свойства ПАУ, такие
как мутагенность, канцерогенность и ковалентное связывание
с клеточными макромолекулами, предполагает их метаболическую
активацию содержащими цитохром Р-450 энзиматическими систе-
77
мами, метаболизирующими токсические и лекарственные ве-
щества. Обмен ПАУ интенсивно изучался в течение последних
трех десятков лет, и прогресс в понимании путей их активации
обязан в большой степени обнаружению 7,8-диол-9,10-эпоксидов
бенз (а) пирена в качестве главного канцерогенного и мутагенного
метаболита. Эти находки и осуществление молекулярно-орбиталь-
ных расчетов привели к разработке теории «бэй-области> D. Jerina
и соавт. (1976). Диолэпоксиды «бэй-области» некоторых незаме-
щенных ПАУ, таких как хризен, бенз (а) антрацен, дибенз (а) ант-
рацен и бенз (а) фенантрацен, были также расценены как главные
канцерогенные и мутагенные метаболиты. Метилзамещенные ПАУ,
такие как 5-метилхолантрен, 7-метилбензантрацен, 7,12-диметил-
бенз (а)антрацен и 3-метилхолантрен, являются также, по-види-
мому, метаболически активированными по «бэй-области». Однако
есть указание на то, что не все ПАУ, содержащие «бэй-области»,
являются канцерогенными соединениями [Yang S. et al., 1980].
Это объясняется, возможно, тем, что из этих неканцерогенных,
но содержащих «бэй-область» ПАУ в условиях in vivo не образу-
ются диолэпоксиды, локализованные в зоне «бэй-области».
Таким образом, вопрос о роли «бэй-области» ПАУ в молекуляр-
ных механизмах химического канцерогенеза требует дальнейшей
теоретической и экспериментальной разработки.
ДНК и РНК при химическом канцерогенезе. Нуклеофильность
ДНК. Общим принципом взаимодействия ДНК и химических
канцерогенных веществ является реакция нуклеиновой кислоты,
содержащей нуклеофильные центры, с электрофильными активи-
рованными химическими канцерогенами.
Электрофилы для этого должны находиться в виде положитель-
ных ионов или незаряженных молекул с реактивными центрами
при их электрондефицитных атомах [Miller Е., 1978]. Сказанное
Афлатоксин Bt
Ы-гидрокси-1-НА
N-ацетокси -N2 -ААФ
Проксимальные или конечные метаболические электрофиль-
ные формы канцерогенов
78
справедливо как для канцерогенов, активных per se (ряд простых
алкилирующих агентов), так и тех, которые требуют метаболиче-
ской активации (ароматические углеводороды, ароматические
амины, афлатоксин В, и др.).
Среди известных мишеней этих веществ, предположительно
важных для их физиологической активности, находятся нуклеино-
вые кислоты, в которых атакуемыми нуклеофильными центрами
являются, прежде всего, богатые электронами атомы пуриновых
и пиримидиновых оснований (обычно их неспаренная пара
электронов), несущие гетероатомы азотов и кислородов (в некото-
рых случаях и углеродов) и отрицательно заряженные фосфаты.
Эта ситуация привлекает внимание к проблеме нуклеофиль-
ности нуклеиновых кислот и их составляющих, и вследствие
очевидной электронной комплементарности взаимодействующих
единиц можно предположить важную, хотя, может быть, и не ис-
ключительную роль электростатических факторов в этом сродстве
[Pullman В., Pullman А., 1980].
Фундаментальное значение электростатического фактора дей-
ствительно важно, особенно для ранних стадий взаимодействия,
где он определяет специфику и характерные черты реакции
канцерогенов с нуклеиновыми кислотами и их составными частями, i
в частности, в обусловленности следующего правила: сродство I
электрофильных канцерогенов в отношении субстратов возрастает J
как функци~я~ слоЖйости последних. Так, МННГ
o=n—N
сн3
/н
с—n(
II 4NO2
NH
не реагирует с гуанозином, но метилирует гуаниновые остатки при
N-7 и N-3 в поли ((Г), поли (ГЦ) и в ДНК. Аналогично N-метил-
N-нитрозомочевина (НММ)
/СН3
О—N—N'
'С—ЫН,
II 2
О
и диметилсульфат (СНзЦЗО» метилируют N-3-позицию гуанина
в полимерах, но не осуществляют эту реакцию на уровне нуклео-
зидов.
Ариламинирование и арилирование О6-гуанина канцерогеном
N-гидрокси-1-нафтиламином больше в ДНК, чем в поли (Г) или
в денатурированной ДНК, и не происходят с нуклеозидами или
нуклеотидами.
Приведем еще пример.
Реакция канцерогена М-гидрокси-М-2-аминофлюорена, проис-
ходящая, главным образом, при С-8 гуанинового кольца, лучше
протекает с нативной, чем с денатурированной ДНК.
79
i M. Osborne (1976) и другие авторы установили, что главным
местом реакции диолэпоксидов БП с ДНК является 2-аминогруппа
гуанина, хотя в небольшой степени реакция имеет место также
L__в других местах как гуаниновых, так и адениновых молекул.
Эти сведения, однако, не дают возможности полностью понять
молекулярный механизм канцерогенеза полициклическими угле-
водородами. Так, например, ясно, что не все производные углево-
дородов, реагирующие с 2-аминогруппой гуанина, в равной степени
канцерогенны: 7-бромметилбенз(а)пирен и эпоксиды К-области
молекул. Далее, даже с диолэпоксидом БП были отмечены значи-
тельные различия в канцерогенной активности для анти- и син-
изомеров (формулы XXXVIII и XXXIX соответственно) вопреки
факту, что они сходно реагируют с ДНК.
он
XXXVIII
XXXIX
Исследование рибополинуклеотидов, содержащих небольшое
число различных модифицированных нуклеотидов, на адекват-
ность в транскрипции при использовании ДНК-зависимой РНК-
полимеразы в присутствии Мп2+ показало, что если блокировано
нормальное образование водородных связей путем замещения,
то возникает полная надежность в транскрипции.
Согласно классической концепции Уотсона — Крика, недопу-
стимы изменения в определенных позициях, необходимых для об-
разования водородных связей. Так, А (аденин) и У (урацил)
или Т (тимин) имеют две водородные связи, причем N-6 аденина
отдает протон урацилу (Т) и N-3 урацила (Т) отдает протон
N-1 аденина. Любые нарушения этого связывания должны неиз-
бежно вести к менее чем двум требующимся водородным связям.
Сходно с этим гуанин (Г) и цитозин (Ц) спариваются предписан-
ным образом. Если позиции модифицируются в местах иных,
Д чем места образования водородных связей, например при галоге-
к.» визировании пятых позиций пиримидинов, то происходит обрззп-
’вание пар с формально комддёментарными основаниями, хот-я
имеются уловимые (регистрируемые) изменения в температурной
стабильности:-------------------"-----
Исследования В. Singer (1968) по выяснению влияния неболь-
шого числа модифицированных оснований в полинуклеотиде на
транскрипцию имеют более общее значение, в частности, в реше-
нии вопроса о том, что представляет собой мутагенная модифи-
кация.
В результате работы автор заключил, что сбои в транскрипции
могут происходить, если не будет образовываться соответствующее
число водородных связей между нуклеотидами в полинуклеотидах
или в результате стерических препятствий или благодаря
80
Таблица 5
Эффект модифицированных нуклеозидов на транскрипцию;
производные, демонстрирующие полную неадекватность
Модифицированный нуклеозид	Симулируют присутствие •			
	А	г	У	ц
З-Метилцитидин **	+ +	+ +	+ +	+
3-Метил уридин	+ +		+	+
1 -Метиладенозин	+ +	+	+ +	+
О4-Метилуридин			+	+
№-Метил гуанозин	+	+	+ +	
N4-f идроксицитидин	+	+ +	+ +	±
* Частота ошибочного включения варьировала от 50 до 100 %.
З-Этил Ц включает А, У и Ц при транскрипции. Данные получены
анализом ближайшего соседства.
♦* З-Этил Ц включает А, У и Ц при транскрипции.
Примечание. Кополимеры содержали 3—16 % модифицированных
нуклеозидов.
экранированию, равно как и замещению мест образования водо-
родных связей.
Эффект заместителей, блокирующих N-I пуринов и N-3 пи-
римидинов. Это две позиции водородных связей, которые рассматри-
ваются как существенные для спаривания оснований. В данном
случае любой заместитель N-3-уридина, N-3-цитидина или N-1-ци-
тозина, влияющий на образование водородных связей по Уот-
сону—Крику, алкилируя позиции N-1 пуринов или N-3 пиримиди-
нов, должны были бы блокировать транскрипцию. Однако этого не
происходит. JB действительности полимераза продолжает транс-
крипцию с беспорядочным включением иуклггтнлов в транскрипт
(табл. 5)."
Эта тотальная неадекватность напоминает неточность транс-
крипции, наблюдавшуюся в случае, когда частично денатуриро-
ванные альтернативные дезокси поли нуклеотиды транскрибирова-
лись при использовании естественных условий для транскрипции
ДНК- Анализ частоты ближайшего соседства показал, что включе-
ние в транскрипцию ошибочных нуклеотидов действительно имеет
место и что это не является артефактом по вине полимеразы.
Эффект метилирования О4-уридина. О4-Ме-
тилуридин в полинуклеотидах также действует в транскрипции
неадекватно, однако в этом случае возможно образование неустой-
чивой пары Г-О4-алкил. Все другие наблюдавшиеся ошибочные
включения (см. табл. 5) должны происходить с образованием
не более одной водородной связи. Наибольшее искажение — это
образование О4-алкил У. У.
Эффект алкилирования О6-г у а н о з и н а. В по-
следние годы уделялось много внимания образованию и репарации
О6-метилгуанозина и О6-этилгуанозина in vivo, так как образова-
6 Заказ 380
81
Таблица 6
Эффект модифицированных нуклеозидов на транскрипцию
в случае модификации экзоциклических аминогрупп
Модифицированный нуклеозид	Симулируют присутствие			
	А	г	У	ц
1Ч4-Метилцитидин		+-	±	+ +
N4-Ацетил цитидин	—	—	—	+ + + +
N4-Гидроксицитидин	+	+ +	+ +	
1Ч4-Метокси цитиди н	—	—	+ + + +	—
№-Метил гуанозин	+	+	+ +	±
№-Метиладенозин	+ + + +	—	—	—
Nb-Гидроксиметиладенозин	+ + + +	—	—	—
№-Изопентиладенозин	+ + + +	—	—	—
ние О6-алкилгуанозина, по-видимому, коррелирует с канцероген-
ностью алкилирующих агентов. L. Gerchman и D. Ludlum (1973)
показали, что в полинуклеотидах О6-метилгуанозин может транс-
крибироваться, но с ошибками — с неверным включением (миско-
динг) А и У. Данных об искажениях транскрипции с О6-этилгуано-
зином пока не получено.
Эффект алкилирования О2-у ридина. О2-Ури-
дина обычно не требуется для образования водородных связей
с аденозином. Однако, если он замещен, N-3 не может быть более
донором водородной связи. О2-Этилуридин в полинуклеотидах вы-
зывает ошибочное включение гуанозина. Это отличается от то-
тальной неадекватности, находимой в случае, если транскриби-
руются полимеры, содержащие О4-метилуридин. Однако О4-метил-
уридин обладает способностью образовывать две водородные
связи как с Г, так и с А и направлять последние в транскрипт
предпочтительно, тогда как О2-алкилуридин может образовывать
лишь единичную водородную связь.
О2-Этилтимидин, подобно О6-этилдезоксигуанозину, является
главным продуктом реакции ДНК in vivo с этилнитрозомочевиной
(ЭНМ) [Singer В. et al., 1978]. Это производное обладает мута-
генным действием в отношении транскрипции, и его неверное спа-
ривание (миспаринг) может быть дополнительным фактором
в наблюдавшейся высокой канцерогенности этилнитрозомочевины.
Эффект замещения экзоциклических аминогрупп. Была изу-
чена транскрипция полимеров, содержащих заместители при
N4 цитидина, N2 гуанозина и N6 аденозина. Было установлено, что
замещение при N4 в цитидине группами ОН' или ОСНз ведет
к полной неадекватности в транскрипции (табл. 6).
М4-Гидроксицитидин характеризовался тем, что он действовал
не только как У и Ц, но также, хотя и в меньшей степени, симули-
ровал Г и А. Другой результат был получен с М4-метилцитидином.
В этом случае наблюдалось нормальное спаривание модифициро-
ванного нуклеозида, однако иногда оно было ошибочным.
82
Что касается модифицированного цитидина, К4-ацетилцити-
дина, то в соответствии с известными данными о неспособности
ацетильной группы экранировать спаривание оснований по Уот-
сону—Крику, поли(Ц, 70 % М4-ацетилцитозина) направлял
в транскрипцию только ГМФ.
М2-Метилгуанозин направлял в транскрипцию все 4 нуклеотида
с предпочтением к АМФ (см. табл. 5).
М6-3амещенные аденозины резко контрастировали с ^-заме-
тенными цитидинами или №-замещенным гуанозином. Метиль-
ные, гидроксиэтильные и изопентильные заместители не вызы-
вали какого-либо искаженного спаривания.
Таким образом, действительно, адекватность транскрипции при
модификации оснований зависит от образования или невозмож-
ности образования соответствующего числа водородных связей —
в силу ли стерических помех, экранирования, или замещения мест
водоородных связей.
В более широком плане этот структурный и стереохимический
феномен проецируется в мутагенез и, возможно, канцерогенез.
КАНЦЕРОГЕННОСТЬ И МУТАГЕННОСТЬ
В СВЯЗИ С МОДИФИКАЦИЕЙ ДНК
ХИМИЧЕСКИМИ КАНЦЕРОГЕНАМИ
В литературе высказывались интересные мысли о молекулярно-
химическом механизме возникновения мутаций, обусловленных
структурной модификацией ДНК, в свою очередь, индуцированной
химическими канцерогенными агентами. Т. Kakefuda и соавт.
(1980) изучали структурную модификацию и ее влияние на генети-
ческие функции ДНК, вызванные метаболитом БП, диолэпоксидом
этого канцерогена. Ковалентное связывание с ДНК менее чем
0,2 % метаболита заметно не меняло плотности циркулярной ДНК,
судя по подвижности модифицированной ДНК в гелевом электро-
форезе. Было установлено, что диолэпоксид бенз (а) пирена кова-
лентно связан со 2-й аминогруппой гуанинового остатка, ориенти-
рованного диагонально, примерно на 30° к оси спирали, и не обяза-
тельно генерирует сильный эффект скручивания. Увеличенное ко-
личество ковалентного связывания, однако, способно вызвать ку-
мулятивное изменение микроокружения в малой борозде спирали
ДНК, которое может облегчать другие формы взаимодействия
с диолэпоксидом бенз (а) пирена, так же как и связывание с адени-
новыми остатками. Усечение цепей и спонтанная элиминация про-
дуктов присоединения (аддуктов) происходили только при измене-
нии угла вращения ДНК. Эти находки привели авторов к мысли
о многофазном, синергетическом механизме модификации, вызы-
ваемой взаимодействием диолэпоксида с различными структур-
ными компонентами ДНК. Было найдено, что метаболит БП с гидро-
ксилированием в позиции 7,8 способен интеркалировать в ДНК.
Однако интеркаляция диолэпоксида БП, ковалентно связанного
6*
83
с гуаниновым остатком, была признана по ряду причин мало-
вероятной. Единственная молекула диолэпоксида, ковалентно свя-
занная с ДНК плазмиды pBR-322, оказалась достаточной для
блокирования элонгации полинуклеотидной цепи в ходе реплика-
ции in vitro. Новый метод авторов использования опосредуемой
плазмидой мутации в Escherichia coli позволил им анализировать
эффект небольшого числа диолэпоксидов БП, ковалентно связан-
ных с ДНК, на мутации, без токсического действия на клетки
хозяина. Разработанный метод позволяет использовать большие
количества мутировавшей ДНК, клонированной из трансформиро-
ванных клеток, для анализа механизма мутаций, вызванных хими-
ческими канцерогенами, на уровне единичных молекул.
БП представляет собой главное загрязнение окружающей
среды, образуемое в качестве продукта гидролиза горючих мате-
риалов, курения сигарет, побочных отходов промышленности.
Он стабильно остается в атмосфере, почве, воде, компонентах
пищи на всех этапах от сырья и полуфабрикатов до готовых изде-
лий. Статистические исследования указывают на этот ПАУ как
главную причину увеличения заболеваний раком легких.
БП превращается в ряд метаболитов благодаря активности
системы микросомальных ферментов, полифункциональных окси-
даз, содержащих цитохром Р-450 и эпоксидгидратазу. Среди
большого разнообразия продуктов обмена БП, образуемых энзи-
матически, те из них, которые эпоксидированы в положении
2,3; 4,5; 7,8; 9,10, привлекли особое внимание ввиду их сильной
химической реактивности с биологическими макромолекулами.
(± ) г-7,Е8-Дигидрокси-Ь9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидробенз(а) -
пирен (ДЭБП) является метаболитом БП, который образуется
энзиматически и стереоспецифично путем окисления транс-г-7,
Ь8-дигидрокси-7,8-дигидробенз (а) пирена в положениях 9,10.
Было показано, что 7,8-дигидрокси-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидро-
бенз (а) пирен является сильным мутагеном и в то же время, как
считают, представляет собой конечную канцерогенную форму БП
[Huberman Е. et al., 1976; Nagao М. et al., 1978].
Получение синтетических изомеров диолэпоксидов позволило
исследовать взаимодействие изомерного ДЭБП с ДНК как in vitro,
так и in vivo. Основное ковалентное связывание происходит между
углеродом в 10-м положении ДЭБП и 2-аминогруппой гуано-
зиновых остатков. Было идентифицировано связывание также
с N-7 позицией гуанозина, с аденозином в положении N-6 и с фос-
фатными группами ДНК. Следующие феномены были ассоцииро-
ваны с ковалентным связыванием ДЭБП: разрыв нитей, уменьше-
ние плотностей сверхскрученной циркулярной ДНК, локальная
денатурация и ковалентное связывание ДЭБП с интеркаляцией
или без нее. Пока не совсем ясна взаимосвязь между этими различ-
ными типами структурной модификации и их эффектом на генети-
ческие функции ДНК. Молекулярные механизмы, участвующие
в возникновении мутаций и канцерогенезе, не вполне понятны.
84
Установление корреляции между степенью ковалентного связы-
вания полициклических углеводородов с ДНК кожи мыши и их
канцерогенным потенциалом привело к гипотезе о том, что такие
реакции являются важной ступенью в индукции опухолей. В после-
дующие годы эта концепция стала находить признание и рас-
пространяться на другие классы химических канцерогенов.
Основываясь на гипотезе о роли ковалентной реакции ДНК
в канцерогенезе, Р. Brookes и R. Newbold (1980) исследовали
корреляцию между мутациями клеток млекопитающих и канцеро-
генностью веществ. Экспериментальной системой служила индук-
ция резистентных к 8-азогуанину мутаций в HPRT-локусе V79 кле-
ток китайского хомяка. Была испытана на мутагенность серия
эпоксидов—метаболитов углеводородов, которые, как полагают,
реагируют ковалентно с ДНК и могли бы быть мутагенными.
Действительно, оказалось, что все испытанные эпоксиды являются
мутагенными. Однако были обнаружены значительные различия
в их мутагенной эффективности, т. е. мутагенности, отнесенной
к дозе препарата (частота мутаций в расчете на 105 клеток,
мкг, мл) (табл. 7), которые могут быть понятны в терминах ста-
бильности возникших ионов карбония [Newbold R., 1979].
При этом выяснилось, что те соединения, которые имели низкие
значения мутагенной эффективности (соединения XLII—XLVII,
см. табл. 7), были или неканцерогенны, или слабоканцерогенны.
Из этого следует, что сильные канцерогены должны быть эффек-
тивными мутагенами. Однако данные таблицы 7 для соединений
XXXVIII—XLI показывают, что мутагенная эффективность не мо-
жет служить достаточным критерием канцерогенности, так как
анти-бензпирен-диолэпоксид (±), имеющий низкую мутагенную
активность, является более сильным канцерогеном, чем соединения
XXXVIII—XLI, показавшие себя также очень эффективными мута-
генами.
Значительно лучшая корреляция мутагенности с канцерогенной
активностью выявляется, если рассчитывается другой коэффи-
циент эффективности: мутягецчлгть,—отнесенная к переживае-
^iocth. Этот показатель точнее отражает молекулярный механизм
мутационного события. Если принять, что как мутация, так и цито-
токсичность являются результатом повреждения ДНК (что бывает
очень часто, но не всегда), то понятие мутагенной эффективности
становится особенно удобным и значимым. Еще более ценным
могло бы быть понятие абсолютной мутагенной эффективности,
однако для определения ее необходимо вести расчет мутаций
на единицу реакционных актов ДНК, что может быть измерено
лишь с применением таких методов, как радиоизотопная техника,
информация о чем пока далеко не всегда имеется.
Сейчас очевидно, что только анти-БП-эпоксид и его предшест-
венник БП-7,8-дигидродиол (при испытании в клеточной системе)
отклоняются по характеру своего ответа от всех других испытан-
ных соединений; соединения XXXIX—XLI соответствуют соедине-
85
Таблица 7
Мутагенная эффективность серии дериватов углеводородов
(Brookes Р., Newbold R., 1980]
Соединения	Доза, мкг/мл	% пере- живания	Мутаген- ная эф- фектив- ность
	0,1	96	1050
	0,2	92	920
Г клО1 xxxvni	03	63	1290
НО- Х/ЛхА/			
он			
о	0,1	93	270
Jk-AkA	0,5	53	180
Г ТОТОТ xxxix	0,75	20	260
НО-^у^Х/Х^			
ОН			
	0,1	86	260
%. jOO	0,15	68	270
Coo XL			
	0,05	28	1500
	0.1	30	1730
СОи xli			
СН2Вг			
	0,5	88	30
	1.0	75	30
	2 0	40	40
XLn			
о			
	0,5	83	54
	1.0	71	88
ХЬ1П	2.0	14	72
86
Соединения
	Доза, мкг/мл	% пере- живания	Мутаген- ная эф- фектив- ность
	1,0	91	18
XLIV	2,5	56	50
	1.0	80	5
XLV	2,5	63	6
	0,2	100	53
	1.5	98	21
XLVI	4,0	37	37
	0,1	74	52
XLVII	1.0	51	52
нию XLII в отношении слабой канцерогенности. Более того, эта
разница сохраняется и при определении абсолютной мутагенной
эффективности, измеренной с применением производных углеводо-
родов, меченных тритием.
Гипотеза «бэй-области» в объяснении активации углеводоро-
дов основана, главным образом, на данных, полученных с БП, хотя
весьма вероятно, что сходный механизм активации имеет место
и в случае 3-метилхолантрена [King Н. et al., 1977, 1978; Thakker
D. et al., 1978], 7-метилбенз(а)антрацена, 7,12-ДМБА [Dippie A.,
Nebzydoski J., 1978] и бенз (a, h) антрацена [Wood W. et al., 1978].
Поскольку еще несколько лет тому назад меченные тритием
диолэпоксиды углеводородов, кроме БП, не производились,
С. Wigley и соавт. (1979) испытали абсолютную мутагенную
эффективность серии родительских углеводородов в клеточной му-
тационной системе. Продуктом углеводородов в этой клеточной
системе являются диолэпоксидные производные «бэй-области».
Это исследование показало, что нет значительных различий в му-
тагенной эффективности между испытанными углеводородами или
БП и его конечным канцерогенным метаболитом — анти-бенз (а)-
87
Таблица 8
Абсолютная мутагенная эффективность углеводородов и их производных
[Brookes Р., Newbold R., 1980]
Характеристика взаимодействий	Анти- диол- эпок- сид	Син- ди ол- эпок- сид	7Вг- метил- БА	БП	7-метил- БА	ЗМХ	ДМБА	БА
Величина реакции угле- водород-ДНК, мкмоль/ моль фосфора	13	11	15	15	6.5	10,5	9	0
Индуцированная мута- ция (8-аза-Гг), частота на 105 выживших клеток	360	90	90	227	73	169	208	1.2
Абсолютная мутаген- ная эффективность, т. е. индуцированные му- тации, мкмоль/моль фос- фата реакции с ДНК Примечание. БА-бе	28 нз(а)а|	8 гграцен	6 ; ЗМХ	15 — 3-?	11 Летилхолан	16 треи.	23	0
пирендиолэпоксидом, хотя значение для син-изомера было значи-
тельно ниже (табл. 8).
Вариации в канцерогенной активности различных углеводоро-
дов находили отражение, как ранее и предполагалось, в величине
индекса связывания для каждого соединения, т. е. величине реак-
ции ДНК, которая выражалась на единицу метаболизированного
углеводорода.
Различия в мутагенной эффективности син- и анти-бенз(а)-
пирендиолэпоксидов (см. табл. 7 и 8) обусловлены разным выхо-
дом образующегося промутагенного О6-метилгуанина. В свете этих
данных можно предположить, что анти-бенз(а)пирендиолэпоксид
может индуцировать промутагенное повреждение в ДНК, чего
не делает син-изомер. Действительно, ранее сообщалось, что
только анти-изомер дает М7-гуанин-производное в реакции с ДНК
in vitro [King Н. et al., 1973; Osborne M. et al., 1979]. Однако авто-
рам не удалось идентифицировать этот продукт в реакции
бенз (а) пирена или его диолэпоксида in vivo, и остается неясным,
почему N'-гуанин-реакция, которая ведет к депуринизации,
должна вызывать эффективное промутагенное повреждение.
Сопоставление хорошо изученного тотального алкилирования
ДНК клеток и, в частности, в позиции Оь-гуанина ДНК при обра-
ботке метилнитрозомочевиной с действием на ДНК анти-диол-
эпоксида и других углеводородов позволяет предположить, что
и в последнем случае повреждения ДНК анти-диолэпоксидом
осуществляются сходным механизмом метилирования О6-гуанина
ДНК, как и при действии метилнитрозомочевины, что в обоих слу-
чаях индуцирует мутации.
Вышеприведенные данные по механизму канцерогенеза под-
крепляются исследованием J. Frei и соавт. (1978), которые обнару-
жили количественную связь между величиной алкилирования
88
Таблица 9
О6-ДНК тимуса и костного
мозга и выходом тимусных
лимфом у мышей после еди-
ничной инъекции метилнит-
розомочевины или этилнит-
розомочевины.
О корреляции между кан-
церогенностью, мутагенностью
у бактерий и использовании
тестов на эту корреляцию
в качестве прескрининга для
химических агентов окру-
жающей среды написано
много. В случае углеводоро-
дов такие тесты пока мало
ценны вследствие их неаде-
кватной метаболической ак-
тивации в используемых пре-
паратах микросом печени
крысы. Поскольку, однако,
опосредуемая клетками му-
тационная система R. New-
bold и соавт. (1977) не стра-
дает этим недостатком, ока-
залось возможным тестиро-
вать 12 вероятных мономе-
тилбенз (а) антраценов [Bro-
okes Р. et al., 1980].
Указанная группа соеди-
нений особенно удобна тем.
Корреляция между канцерогенностью
и мутагенностью
монометилбенз( а)антраценов
[Brookes Р. et al., 1980J
Соединение	Канцероген- ность	Мутагенность
Незаметен-	0	'43
ный		
1-Метил	0	0
2-Метил	0	1
З-Метил	0	0
4-Метил	0	0
5-Метил	0	0
6-Метил	+ +	9
7-Метил	+ + +	40
8-Метил	+ +	7
9-Метил	0	0
10-Метил	0	0
11 -Метил	0	0
12-Метил	+ + ( + )	12
Примечание Частота индуциро-
ванных мутаций на 10s выживающих кле-
ток после обработки I мкг/мл в течение
48 ч в опосредуемой клетками мутационной
системе.
что все 12 углеводородов были
исследованы не одним, а рядом авторов, а также тем, что серия со-
держит неактивные, слабоактивные и сильные канцерогены. Из
табл. 9 видно, что мутагенная активность в клетках V79 с опосре-
дуемой клетками активацией хорошо соответствует канцероген-
ному потенциалу.
Дальнейшее доказательство значимости V79-HPRT локуса ис-
следовано в работе A. Wood и соавт. (1977), которые сравнили
мутагенность ( + ) и (—) энантиомеров как син-, так и анти-бенз-
(а) пирен-диолэпоксидов в этой системе и в Salmonella thyphi
murium ТА98 и ТА100. Все 4 деривата оказались сильными мута-
генами в бактериальной системе, однако в V79 клетках только
(4-)анти-бенз(а) пирен-диолэпоксид проявил себя эффективным
мутагеном в отношении как кожи, так и легкого мышей.
В связи с отмечаемой многими исследователями корреляцией
мутаций и трансформации интерес представляет также работа
Т. Oesch и соавт. (1980). Эти авторы с помощью 4-нитрохинолин-
N-оксида скоординированно вызывали в мышиных фибробластах
СЗН 10Т1/2 мутации и трансформацию, которые идентично моду-
89
лировались кофеином, что указывало на мутацию как одну из не-
обходимых ступеней в цепи событий, ведущих в конечном счете
к трансформации. При этом был изучен энзиматический контроль
реактивных метаболитов, возникающих из ароматических канце-
рогенов, с помощью бактериальной системы в качестве аналитиче-
ского орудия. Показано, что корреляция бактериальной мутаген-
ности с канцерогенностью БП и четырех главных метаболитов
становится значительно лучше, если эти соединения активированы
интактными гепатоцитами, по сравнению с обычно используемыми
препаратами разрушенных клеток. Данный факт говорит о том, что
сравнительно слабая корреляция между канцерогенностью мета-
болитов БП в целых животных и их мутагенностью в стандартном
тесте В. Ames являлась результатом скорее различий в метабо-
лизме соединений в двух системах, чем различий в биологических
конечных результатах, т. е. мутагенности у бактерий versus и кан-
церогенности у млекопитающих. Добавление и удаление кофакто-
ров или чистых ферментов показали дифференциальную вовлечен-
ность в контроль мутагенно-активных метаболитов исследованных
ароматических канцерогенов монооксигеназы, эпоксидгидролазы,
глутатион-S-трансферазы, УДФ-глюкуронозилтрансферазы и суль-
фотрансферазы.
Сравнение мутаций и трансформации, вызываемых различ-
ными агентами в системах, каждая из которых подходит для
суждения только об одном из двух конечных явлений, страдает
от того недостатка, что любая отмеченная корреляция не может
быть однозначно приписана фундаментальным различиям между
мутациями и трансформацией, так как фармакокинетические раз-
личия между такими феноменами, как мембранная проницаемость,
активация и детоксикация тестируемого соединения, или различия
в репаративных способностях также могли быть ответственными за
такой эффект. Учитывая сказанное, изучение мутаций и трансфор-
мации необходимо вести по возможности в одной и той же системе.
Упомянутые выше авторы так и поступили. Они исследовали в кле-
точной системе, будет ликофеин, известный как ингибитор постре-
пликацирнной репарации ДНК, осуществлять сходную модуляцию
обоих биологических конечных результатов. Авторы изучили
характеристики ответа СЗН 10Т1/2 клеток на экспозицию
к4-нитрохинолин-1-оксиду (НХО). Кривые частоты возникновения
резистентных к оуабину мутантов и трансформантов в этих клет-
ках, индуцированных НХО, были линейны в отношении кон-
центрации агента и не различались по форме или наклону.
Трансформация происходила с примерно в 24 раза большей часто-
той, чем мутации.
Ранее было показано, чточ^^^. имеет различное (ускоряю-
щее, тормозящее или нейтральное^действие на процессы канцеро-
генеза и тератогенеза в интактных животных, на выживаемость,
мутагенез и злокачественную трансформацию клеток в культуре.
Эти эффекты часто приписывали его способности тормозить опре-
90
деленные пути репарации ДНК, возможно, благодаря вмешатель-
ству в снабжение пуриннуклеотидами.
В опытах авторов кофеин слабо влиял или вовсе не влиял ни на
мутации, ни на трансформацию при концентрации НХО, равной
0,1 мкг/мл, но при концентрации 0,3 мкг/мл наблюдался очень
сильный эффект — торможение примерно на 90 % обоих про-
цессов.
Кофеин проявлял удивительный параллелизм в торможении
как мутаций, так и трансформации. Параллельные кривые «доза—
ответ» для индукции мутаций и трансформации также говорили
против различия механизмов этих двух явлений.
Теории соматических мутаций канцерогенеза получили солид-
ную поддержку от выявленной корреляции между химическими
соединениями, являющимися бактериальными мутагенами (в при-
сутствии активирующих систем млекопитающих) и теми соедине-
ниями, которые являются канцерогенами для животных [McCann J.
et al., 1975; McCann J., Ames В., 1976]. Результаты авторов гово-
рят также о том, что мутация является необходимой ступенью
в цепи событий, в конечном счете ведущих к злокачественной
трансформации.
Интересными в работе J. McCann и В. Ames (1976), J. McCann
и соавт. (1975) являются опыты по энзиматическому контролю
реактивных метаболитов ароматических канцерогенов с исполь-
зованием мутагенности как аналитического средства. БП оказался
немутагенным при прямом испытании или после инкубации с гомо-
генатами без дополнительных кофакторов. Однако он становился
сильно мутагенным, если к гомогенату добавлялась НАДФН-ге-
нерирующая система или использовались цельные гепатоциты.
У 3-ОН-БП и 9-ОН-БП обнаружили мутагенную активность
в отсутствие метаболизирующей системы млекопитающих. Дей-
ствие не было сильным, но проявлялось при низких дозах
испытуемых соединений. При более высоких дозах оба фенола
проявили высокую токсичность. Прямой мутагенный эффект гидро-
ксибенз(а) пиренов описан ранее [McCann J., Ames В., 1976;
Glatt Н., Oesch F„ 1976].
Авторы считают, что наблюдавшиеся ими мутагенный и токси-
ческий эффекты у бактерий гидроксибенз (а) пиренов обусловлены
образуемыми спонтанно в условиях испытания производными,
но не исходными родительскими фенолами.
Высокая мутагенность двух фенолов, метаболитов бенз (а) пи-
рена, выявленная и в ряде других исследований, в которых
использовали постмитохондриальный отстой из печени мыши
и крысы, контрастирует с исследованиями по инициации опухолей
и канцерогенности. Однако при исследовании на мутагенность
в условиях цельных неразрушенных клеток млекопитающих, что
необходимо для метаболических превращений, два фенола пока-
зали слабую мутагенность, хотя эффект был воспроизводим и ста-
тистически достоверен.
91
9,10-Дигидродиолбенз(а) пирен даже в самых высоких дозах
был очень слабомутагенен в отсутствие метаболизирующей
системы млекопитающих. Добавление к гомогенатам печеночных
клеток НАДФН-генерирующей системы приводило к активации
9,10-дигидродиола бенз (а) пирена в мутаген. Подобную активацию
9,10-дигидродиолбенз(а)пирена наблюдали также С. Malaveille
и соавт. (1975), которые использовали НАДФН-постмитохонд-
риальную фракцию печени крысы. Однако для эквимутагенного
эффекта требовались более высокие дозы БП-9,10-дигидродиола,
чем БП,3-ОН-БП или 9-ОН-БП. В присутствии интактных
гепатоцитов мутагенность БП-9,10-дигидродиола была ниже, чем
в присутствии НАДФН-гомогената, однако он был все же значи-
тельно мутагенен.
БП-7,8-дигидродиол в отсутствие метаболизирующей системы
не проявлял мутагенной активности.
Соматические мутации как причина рака. Теория соматической
мутации как причины рака существует уже более 100 лет, однако
в своей современной форме она возникла из модели репликации
ДНК благодаря работам J. Watson и F. Crick (1953). В отношении
механизма мутаций эти авторы указали, что, если основания
ДНК во время их репликации находятся случайно, преходяще,
по какой-то причине в «неверных» таутомерных формах, то в этом
случае может получиться измененная последовательность основа-
ний в новой ДНК, обусловливающая потенциальную мутацию.
Известно, что полимеризирующие ДНК ферменты могут нор-
мально обеспечивать точность (адекватность) репликаций,
не «воспринимая» неверные таутомерные формы (Drake J.,
Baltz R., 1976].
Однако вскоре после формулирования этого положения было
высказано мнение о том, что определенные химические модифика-
ции матрицы ДНК могут «фиксировать» аномальные таутомерные
основания и, таким образом, в значительной мере, если не пол-
ностью, предотвращать эту «редакторскую» функцию ферментного
комплекса полимеразы ДНК.
Ранние объяснения механизма этого гипотетического явления
были связаны с возможной генерацией ионизированных форм
оснований путем алкилирования ДНК в положении N-7 гуанина
или N-3 аденина. Против первого предположения говорил тот
факт, что алкилирующие агенты значительно отличались по их
мутагенной силе, которая количественно не коррелировала с их
способностью алкилировать N-7 гуанина (доминирующий нуклео-
фильный центр), и что преходящие (случайные) ионизированные
формы оснований не должны были бы акцептироваться ДНК-поли-
меразой.
Против идеи о роли алкилирования ДНК в положении N-7 гуа-
нина говорила также сравнительно инертная природа этого алки-
лирования, т. е. его неспособность вызывать (провоцировать)
значительный репарационный ответ.
92
Предполагаемое промутагенное оши-
бочное спаривание (мискодинг)
О*-алкилтимина(Т*) с гуанином(Г)
(XLVIH); Ов-алнилгианина(Г*)с ти-
мином (Т)(ХЫХ); 3-метилгуанина
{иминная форма таутпомера)(Г*}
' с тимином (T){L)
З-Алкиладенины казались более важными *в качестве «пора-
жений» в матрице ДНК, так как они стимулировали быстрый
репарационный процесс. Исследования Т. Lindahl и A. Andersson
(1972) показали, что фермент, который осуществляет эту репа-
рацию, является N-гликозилазой. Было установлено, что образова-
ние 3-алкиладенинов вызывает летальное повреждение ДНК.
Кажущийся парадокс в отношении алкилирования гуанина
нашел свое объяснение. Оказалось, что более сильные алкилирую-
щие мутагены и канцерогены могут реагировать при атоме
0-6 дезоксигуанозина (формулы XLVIII—L), причем образую-
щееся сильное мискодирующее основание, О6-метилгуанин, явля-
ется продуктом реакции в ДНК клеток, обработанных метилирую-
щим мутагеном М-метил-М'-нитро-ГМ-нитрозогуанидином.
В последующем была испытана серия алкилирующих канцеро-
генов в плане соотношения доза—ответ в опытах с мышами, у ко-
торых одиночные дозы сильных канцерогенов вызывали тимусные
лимфомы. При этом установили количественную позитивную кор-
реляцию между промутагенным алкилированием при 0-6 гуанина
в ДНК ткани мышей и выходом опухолей [Lawley Р., 1980].
Корреляция между реакциями с ДНК ПАУ и аминов (опосре-
дуемая реактивными метаболитами) и канцерогенной силой не
оказалась, однако, на этом этапе исследований такой очевидной,
как для алкилирующих агентов, хотя сильный канцероген мочевого
пузыря, 2-нафтиламин, как было показано, реагирует при 0-6 гуа-
нина [Kadlubar F., Miller Е., 1978]. Главной реакцией углеводоро-
дов (через эпоксиды), однако, оказалось взаимодействие при
N-2 гуанина [Phillips D., Sims Р., 1978]. Эта позиция является
важной для ароматических аминов (через N-гидроксиметабо-
литы), поскольку N-2-арилированные дериваты персистируют
в ДНК-мишени [Kriek Е., Westra I., 1980].
93
Наиболее привлекательной для объяснения наблюдавшейся
[Newbold R., Brookes F., 1976] способности алкилирующих канце-
рогенов вызывать мутации прямым мискодированием является ги-
потеза, выдвинутая F. Kadlubar (1980). Она основывается на
схеме альтернативного мискодинга, включающей таутомеры кан-
церогенных метаболитов. Согласно схеме в ходе репликации ДНК
одно из гуаниновых оснований могло бы вращать вокруг глико-
зильной связи и принимать син-конфигурацию в спирали ДНК,
допуская, таким образом, аномальное спаривание (по аналогии
с моделью Уотсона—Крика) скорее с другим гуанином, чем с его
нормальным партнером—цитозином (формула LI).
Этим путем ароматические канцерогены встают в один ряд
с сильными алкилирующими канцерогенами как индукторы мута-
ций путем прямого мискодирования.
г*—г
Предполагаемое спаривание син-нонфи-
гу рации гуанина (Г*) с гуанином(Г)
Имеются данные, что эти ошибочные спаривания О4-алкилти-
мина с гуанином и О6-алкилгуанина с тимином обусловливают
сильные промутагенные эффекты; однако 3-метилгуанин не явля-
ется сильным промутагенным основанием (возможно, из-за нор-
мального спаривания с альтернативным иминным таутомером).
Теория соматической мутаций как причины рака увязывает
потребности в инициирующем химическом «ударе» с развиваю-
щимся во времени последующим явлением неясной пока природы.
В этой системе необходимы, по-видимому, множественные про-
мутационные инициирующие события. Эта точка зрения поднимает
ранее широко обсуждавшийся в радиобиологии вопрос о роли
и интерпретации «множественных ударов» и потребности в них.
В этом плане выдвигались два варианта.
Согласно первому речь идет о «множественных ударах»
(поражениях) как причине повреждения ДНК и гибели клетки
[Heidelberger С., 1981].
Второй вариант предусматривает, что единственный «удар»
мог бы инактивировать матрицу ДНК (по типу индуцированного
алкилирования с поперечной сшивкой или индуцированных радиа-
цией двойных разрывов цепи ДНК или тиминовых димеров), од-
нако интенсивный репарационный процесс удалял бы в ряде слу-
чаев летальные количества поврежденных участков ДНК. Более
того, в случае недостаточности этого репарационного механизма
94
пострепликативная репарация могла бы в последующем устранить
остаточное повреждение. Эта вторая точка зрения была солидно
подкреплена изолированием дефектных по репарации мутантов
дрожжей, которые инактивировались дозой УФ-облучения, в 2000
раз меньшей, чем требуемая для дрожжей дикого типа.
Есть и другие примеры мутантов, дефектных по репарации про-
мутационного повреждения. Так, описаны штаммы Escherichia
coli ada-, которые лишены фермента, способного удалять из ДНК
промутагенный О6-метилгуанин, и в несколько тысяч раз более
чувствительны к метилирующим мутагенам, чем бактерии дикого
типа.
Из этих примеров следует, что дополнительные промутаген-
ные «удары», необходимые в канцерогенезе, могут быть интерпре-
тированы как потребность элиминировать репарационные энзимы
или путем насыщения, или посредством химического повреждения
ферментного комплекса.
Как теперь выясняется, фермент, удаляющий О6-метилгуанин
из метилированной канцерогеном ДНК в Е. coli, является демети-
лазой [Olsson М., Lindahl Т., 1980].
Такой простой путь репарации возможен и в эукариотических
клетках. За исключением экспериментально изолированных де-
фектных по репарации мутантов, все испытанные до сих пор клетки
оказались способными удалять потенциально летальный (и, воз-
можно, промутагенный) 3-метиладенин. Распознана уже способ-
ность различных клеток удалять сильный промутагенный О6-ме-
тилгуанин. Указанная способность в различных клетках сильно
варьирует.
В свете этих данных существенное значение в понимании ме-
ханизмов канцерогенеза имеет тот факт, что ткани мыши, в общем,
(кроме печени) являются сравнительно дефектными в способности
удалять это промутагенное основание из ДНК.
При сравнении лимфоидных клеток мыши с человеческими
лимфоцитами периферической крови была выявлена более высокая
эффективность «нормальных» клеток человека в удалении прому-
тагенных повреждений (О6-метилгуанина), чем мышиных, хотя,
как было найдено для человеческих фибробластов, количество
промутагенного основания, удаляемого в сравнительно короткое
время (I ч инкубации), при этом было значительно ограничено.
Данное обстоятельство указывает на необходимость изучения
отдельных индивидуумов в отношении их способности репариро-
вать ДНК для прямого удаления промутагенных повреждений
(или других путей устранения дефекта), так как это может ока-
заться ключевым фактором в определении индивидуальной чув-
ствительности к канцерогенам.
ХИМИЧЕСКИЙ И РАДИАЦИОННЫЙ КАНЦЕРОГЕНЕЗ
В СВЯЗИ С МУТАГЕНЕЗОМ
Различные авторы отмечают определенное качественное и ко-
личественное сходство между радиационным и химическим канце-
рогенезом [Rantonen J., 1982]. Об этом же говорят приведенные
выше литературные данные. Фундаментальные молекулярные ме-
ханизмы радиационного и химического канцерогенезов, пс види-
мому, идентичны (повреждение ДНК). Много данных говорят
в пользу параллельных эффектов радиационного и химического
канцерогенезов. Считается, что как один, так и другой осу-
ществляются в два этапа: индукция и трансформация. Оба про-
цесса предполагают мутагенез, причем речь идет о роли в канцеро-
генезе соматических мутаций. Однако между химическим и радиа-
ционным мутагенезом имеется несколько качественных различий.
Повреждения, вызываемые радиацией, — это, в основном,
хромосомные мутации, тогда как химически индуцированные из-
менения — преимущественно хроматидного типа. В том случае,
когда химические мутагены вызывают хромосомные изменения,
последние появляются, главным образом, после второго и третьего
постэкспозиционного деления. Иными словами, химически индуци-
рованные изменения являются бтсроченными, тогда как индуци-
рованные радиацией хромосомные повреждения оказываются ви-
димыми в первой же метафазе. Сестринские хроматидные обмены
редко наблюдаются после экспозиции к радиации, тогда как ряд
химических мутагенов вызывает их в дозах, намного ниже тех, ко-
торые обусловливают главные аберрации.
Имеется также ряд количественных различий, которые пока-
зывают, что химические мутагены индуцируют летальные повреж-
дения менее часто, а менее серьезные повреждения — более
часто, чем это делает ионизирующая радиация.
Общий ход кривых взаимоотношения доза — ответ как для
химических мутагенов, так и для радиационных — линеен, хотя
могут иметь место некоторые индивидуальные изменения. J. Carver
и соавт. (1979) описали новый метод для сравнения мутагенной
силы химических веществ и радиации. Они показали, что мута-
генная сила а- и 0- радиаций располагается в «середине» разброса
мутагенной активности примерно 20 химических агентов.
Бы то установлено также, что мутагенный потенциал является
реальным «предсказателем» канцерогенности у животных.
Таким образом, данные о сходстве и различии в мутагенности
химических веществ и радиации также могли бы быть важными
для оценки канцерогенного риска у человека.
После первичного повреждения (инициация) клетки транс-
формируются до фенотипа, который имеет признаки, характерные
для опухолей. Критерии для трансформированных радиацией кле-
ток были описаны С. Вогек (1976) и в случае химически индуци-
рованной трансформации — С. Heidelberger (1980). В общем.
96
между морфологическими и биохимическими критериями для кле-
ток, трансформированных рентгеновскими лучами или химиче-
скими веществами, больших различий не имеется.
Комбинированный эффект радиации и химических промотеров,
равно как и химического инициатора и радиации в отношении
к трансформации, был изучен С. Heidelberger (1980) и J. Di Paolo
(1980).
Они документировали увеличение трансформации после экспо-
зиции облученных рентгеновскими лучами клеток к умеренным
(2,5 мкг/мл) дозам БП или после экспозиции обработанных
БП клеток к облучению рентгеновскими лучами от 1,5 до 2,5 Гр.
Уф-облучение не давало такого усиления.
С. Heidelberger (1980) показал как инициацию, так и промо-
цию путем облучения и обработки химическими веществами
в одной и той же системе клеточной культуры (мышиные TI0I/2).
Органическое масло 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат вызы-
вало промоцию трансформации как после химических веществ,
так и после радиации. Важной в этой работе является также
демонстрация как химически индуцированого мутагенеза, так и
трансформации в одной и той же клеточной культуре. Автор изучил
также последовательные стадии канцерогенеза в TI0I/2 клетках
после экспозиции к радиации. Были определены взаимоотно-
шения доза —ответ. Эти находки тесно связывают индуцирован-
ные радиацией и химическими веществами мутации и злокачест-
венную трансформацию. Однако, по мнению С. Heidelberger, де-
лать заключение о прямой связи между ними пока преждевре-
менно.	—
В то же время из этих данных можно заключить, что как
канцерогенные химические вещества, так и радиация могут дей-
ствовать и как инициаторы, и как промотеры друг друга. Это
перекрестное взаимоотношение является центральным для оценки
возникновения рака у человека, который всегда экспозируется
и к мутагенным химическим агентам, и, по крайней мере,к естест-
венному фону радиации.	_____
Оценка возможной канцерогенной активности химических сое-
динений, радиации и биологического риска. Известно, что радиа-
ция вызывает рак практически любой ткани, за исключением
глазных линз и зрелых нейронов. В практике, однако, существует
лишь немного мест и органов, имеющих особый риск возникнове-
ния рака после облучения всего тела низкими дозами радиации.
Известно несколько исследований на животных, которые показали
радиационный канцерогенез в различных органах, но лишь немно-
гие использовали такие шкалы доз, которые позволяют осущест-
вить надежную оценку взаимоотношений доза —ответ, адекватную
для оценки риска для человека.
Наиболее сопоставимой с облучением ситуацией применительно
к человеческому канцерогенезу являются низкодозные, слабо-
ионизирующие экспозиции, которым подвержены большие профес-
7 Заказ 380
97
сиональные или общие популяции. Данные о человеческом раке,
индуцированном радиацией, получены из различных источников
от случайных или медицинских (терапевтических) экспозиций на-
селения. BEIRIII Комитет (1980) проанализировал примерно
50 больных раком различных локализаций. Хотя индуцированный
радиацией рак возможен почти в любой человеческой ткани,
статистически наиболее важными индуцированными радиацией
опухолями на сегодня являются, согласно данным упомянутого
доклада комитета, лейкемия, рак молочной железы, щитовидной
железы, легкого, желудка, кости и кожи.
Из 50 000—60 000 химикатов, существующих в продаже, лишь
небольшая часть (около 7000) были изучены на канцерогенную
активность. Примерно 1500 из них теперь признаны опухолерод-
ными для животных. Мутагенная и канцерогенная активность этих
соединений варьируют в весьма широких пределах с фактором
до I07, начиная с физиологических веществ, таких как гормоны,
и кончая высокореактивными прямыми алкилирующими соедине-
ниями [Fishbein L., 1980; Maugh Т., 1980]. До настоящего времени
IARC расценил по крайней мере 30 химических веществ как
канцерогенные для человека. Из них 20 являются типичными про-
мышленными химикалиями, большинство остальных широко ис-
пользуются в фармацевтической промышленности в здравоохране-
нии или поступают в продажу.
АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИНЫ И АМИДЫ
Многие из ароматических аминов и амидов широко произво-
дятся в промышленности красителей и используются в народном
хозяйстве и в быту. Именно поэтому изучение их возможной канце-
рогенной активности представляется настоятельно необходимым.
К данной группе канцерогенов принадлежат следующие соедине-
ния: 2-НА, 4-аминодифенил, бензидин, 2-аминофлюорен, 2-ацети-
ламинофлюорен (ААФ) и др. Химическая структура некоторых из
них изображена ниже.
Ароматические амины принадлежат к той категории канцеро-
генов, которые обладают резорбтивным действием. Они вызывают
опухоли в отдаленных от места введения чувствительных органах.
Так, 2-нафтиламин вызывает опухоли мочевого пузыря (у собак,
крыс — при введении per os), опухоли печени, саркомы (при вве-
дении мышам подкожно); 4-аминодифенил индуцирует опухоли
мочевого пузыря (при введении собакам per os), опухоли кишеч-
ника, печени, почек (при введении крысам per os) ; бензидин вызы-
вает опухоли печени, цымбаловых желез, толстой кишки, саркомы
на месте введения (крысам подкожно); 2-анетиламинофлюорен
индуцирует опухоли печени и др.
Впервые синтез ароматических аминов осуществил W. Perkin
в 1856 г. С того времени достигнут большой прогресс в их изго-
товлении, однако о действии ароматических аминов было мало
98
1-НА
анилин
о-толуидин
2-нитроанилин
р-толуидин
р-аминобен-
зойная
кислота
бензидин
aNH2
СООН
антраниловая
нислота
4-аминодифениД
4-аминостильбен
известно до 1895 г., когда L. Rehn описал связанное с ними
образование опухолей мочевого пузыря. Некоторые вещества этого
класса проявляют себя как очевидные канцерогены мочевого пу-
зыря человека и многие другие подозреваются в такой активности
[IARC, 1972, 1974, 1975, 1978].
Профессиональная экспозиция, а также лекарственная и кос-
метическая являются наиболее распространенными путями
загрязнения ароматическими аминами у человека.
Метаболическая активация ароматических аминов. Склонность
ароматических аминов и амидов как канцерогенов индуцировать
опухоли в тканях, расположенных далеко от мест введения,
но не в самих этих местах у человека и экспериментальных живот-
ных породила предположение о том, что данные соединения пре-
терпевают метаболическую активацию [Б. Л. Рубенчик, 1977Г
Miller J., 1970], которая приводит к появлению высокореактивных
метаболитов и конечных канцерогенов. Метаболическая активация
и идентификация конечных канцерогенов других ароматических
аминов не так хорошо изучена, как ААФ. Исследование послед-
него стало классическим примером молекулярного анализа хими-
ческого канцерогенеза.
Поэтому нами в первую очередь и подробно будет рассмотрен
именно этот вопрос.
Согласно J. Miller, первые указания на то, что N-гидроксили-
рование является начальной ступенью активации ААФ, были полу-
чены в его лаборатории.
7'
99
Первичная активация канцерогена ААФ путем N-гидроксилирования
Канцерогенен в печени и (или)
других тканях крыс, мышей,
хомяков, кроликов собак, ко-
шек, фазанов
Неактивен у морских свинок
Печеночный
гомогенат
+НАДФН
Печеночный
эндоплазматический
производные, связывающиеся
с нуклеиновыми кислотами и белками
Более канцерогенен, чем ААФ,
особенно в месте аппликации
у крыс, мышей,хомяков, кро-
ликов и морских свинок
Это заключение было затем подтверждено исследованиями
с различными канцерогенными ароматическими аминами и ами-
дами. В некоторых случаях неспособность животных N-гидрокси-
лировать достаточные количества того или иного амида является
решающим фактором, предотвращающим проявление амидом
канцерогенной активности. Так, морская свинка имеет слабую
активность или вообще лишена активности N-гидроксилировать
ААФ, и последний не канцерогенен у этого вида животных, тогда
как N-гидрокси-ААФ вызывает опухоли. Синтетическое N-гид-
роксилирование 7-гидрокси-ААФ, неканцерогенного метаболита
ААФ, превращает его в сильный канцероген для крыс. С другой
стороны, введение N-гидроксигруппы в ароматический амин или
амид не обязательно вызывает превращение его в канцероген.
При этом арильная группа является очень важной детерминантой.
Однако тот факт, что N-гидрокси-ААФ, подобно ААФ, имеет
очень слабую способность реагировать в физиологических усло-
виях с белками или нуклеиновыми кислотами (или их дериватами),
указывает на то, что необходимы дальнейшие метаболические
ступени для превращения N-гидрокси-ААФ в конечные канцеро-
генные и реактивные формы.
Метаболическая активация №метил-4-аминоазобензола in vivo.
Моделью для изучения метаболической активации ароматических
аминов путем этерификации N-гидроксигруппы с образованием
сильных электрофильных реагентов явилось исследование N-ме-
тил-4-аминоазобензола (МАБ), гепатоканцерогенного аминоазо-
красителя. Исходным веществом в этой работе был N-бензоил-
окси-МАБ, синтезированный как возможный предшественник
N-гидрокси-МАБ. Он оказался сильным электрофильным реаген-
том, реагировал неэнзиматически с метионином при нейтральном
pH и давал водорастворимый дериват, который расщепляется
до 3-метилмеркапто-МАБ. Эти наблюдения послужили основа-
100
нием для предположения, что метаболически активной формой
МАБ в печени крыс является эфир N-гидрокси-МАБ.
Дальнейшим подтверждением того, что реактивной формой
МАБ in vivo мог бы быть эфир N-гидрокси-МАБ, стало изучение
характеристик связанных с белком красителей в печени крыс,
получавших с диетой МАБ. Полярные красители, освобождаю-
щиеся при гидролизе белков печени, также могли образовываться
в реакции N-бензоилокси-МАБ с подходящей аминокислотой:
сульфониевый
краситель
Несколько позже было показано, что связанные с нуклеино-
выми кислотами производные, образованные из МАБ в печени
крысы in vivo, также возникают из эфиров N-гидрокси-МАБ или
производных со сходной реактивностью [Miller J., 1970]. Таким
образом, деградация РНК и ДНК из печени крыс, получавших
инъекции меченного 3Н МАБ, дает производные, которые хромато-
графически идентичны соединениям, приготовленным в реакции
N-бензоилокси-МАБ с гуанозином или дезоксигуанозином. По-
следние продукты были охарактеризованы как N-(гуанозин-8-ил)-
МАБ и N-(дезоксигуанозин-8-ил)-МАБ.
Эти исследования структуры конечных продуктов, образован-
ных в реакции дериватов красителей с белками и нуклеиновыми
кислотами in vivo, не установили идентичности реактивных мета-
болитов. Однако предположение, что эфиры N-гидрокси-МАБ
являются метаболическими интермедиатами, подтверждается
сходными реактивностями N-бензоилокси-МАБ и реактивностью
метаболитов in vivo, а также данными, устанавливающими корре-
ляцию образования сернокислого эфира N-гидрокси-ААФ с гепато-
канцерогенностью этой гидроксамовой кислоты (см. ниже).
Метаболическая активация N-гидрокси-ацетиламинофлюорена
in vivo. Расшифровка реактивной формы ААФ была ярким эта-
пом блестящей серии работ J. Miller и Е. Miller в области изуче-
ния химического канцерогенеза. Подобно N-бензоилокси-МАБ,
N-ацетокси-ААФ и N-бензоилокси-ААФ оказались сильными
электрофильными агентами. Они реагировали с метионином и
метионин-пептидами, и образующиеся сульфониевые производные
расщеплялись с образованием смеси 1- и 3-метилмеркапто-ААФ.
Печеночные белки крыс, получавших ААФ или N-гидрокси-ААФ,
давали при обработке щелочью одни и те же О-метилмеркапто-
ацетиламинофлюорены. Связанные с белками производные в пе-
чени крыс, дававшие начало 1- и 3-метилмеркапто-ААФ, объяс-
101
няют образование лишь примерно 15% общих связанных с бел-
ками фторидных дериватов. По аналогии со связанными с белками
формами МАБ в печени крыс и на основании известных данных
о реактивности эфиров N-гидрокси-ААФ естественно предполо-
жить, что в печени крыс, получавших N-гидрокси-ААФ, могут
появляться также фторидные производные гомоцистеина, цисте-
ина, тирозина и триптофана. Это пока в деталях не изучено.
Синтетические эфиры N-гидрокси-ААФ охотно реагируют
с гуаниновыми остатками нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых
кислот и в меньшей мере — с адениновыми остатками.
В противоположность атаке алкилирующих агентов при
N-7-позиции гуанина, исследования Е. Kriek и соавт. (1980) пока-
зали, что эфиры N-гидрокси-ААФ реагируют при С-8-положении.
Поэтому продукты реакции N-ацетокси-ААФ с гуанозином и
дезоксигуанозином были охарактеризованы как №(гуанозин-
8-ил)-ААФ и N-(дезоксигуанозин-8-ил)-ААФ соответственно.
Затем энзиматический гидролиз печеночной рибосомальной РНК
крыс, получавших ААФ или N-гидрокси-ААФ, до нуклеозидного
или нуклеотидного уровня давал производные, хроматографически
неотличимые от N-(гуанозин-8-ил)-ААФ или его 5'-фосфатного
деривата.
Появление производных N- (гуан-8-ил)-2-ацетиламинофлюо-
рена наиболее легко объяснимо с точки зрения реакции эфира
N-гидрокси-ААФ с гуаниновыми остатками в нуклеиновых кис-
лотах.
Сернокислый эфир N-гидрокси ААФ — конечное реактивное
и канцерогенное производное N-гидрокси-ААФ. От 20 до 50 %
введенного N-гидрокси-ААФ экскретируется у крысы с мочой
и желчью в виде О-глюкуронида. Однако этот метаболит сходным
образом экскретируется в больших количествах у других видов,
например мыши, хомяка и кролика, которые значительно менее
чувствительны к канцерогенному действию этой гидроксамовой
кислоты. Данный факт подтвердил положение о том, что О-глюку-
ронид не является ответственным за канцерогенную активность
и реактивность N-гидрокси-ААФ in vivo у крыс, и побуждал искать
другие метаболические формы. Прилагались большие усилия,
чтобы идентифицировать конечную канцерогенную форму ААФ.
Так, пытались оценить возможное значение сернокислых эфиров
N-гидрокси-ААФ в канцерогенной активности и реактивности
in vivo N-гидрокси-ААФ. С этой целью прослеживали корреляцию
между тремя параметрами: 1) активностью печеночной сульфо-
трансферазы; 2) количествами 1- и 3-метилмеркапто-ААФ, осво-
бождаемыми из печеночных белков животных, получавших
N-гидрокси-ААФ; 3) гепатоканцерогенностью N-гидрокси-ААФ
в различных условиях. Была отмечена строгая корреляция между
указанными тремя параметрами. Поэтому печень самцов крыс
значительно более чувствительна к канцерогенной активности
N-гидрокси-ААФ, чем печень крыс-самок или печень самцов
102
Таблица 10
Сравнение активности
печеночной N-гидрокси-ААФ-сульфотрансферазы
и образования in vivo связанных с белками
производных метионил-ААФ у животных, чувствительных
и резистентных к гепатоканцерогенезу N-гидрокси-ААФ
(по J. Miller, 1970)
Вид животного	О-Метионил меркапто-ААФ		Гепатоканце- рогенез N-гидрокси- ААФ
	образуемый печеночной сульфотранс- феразой in vitro (мкг/0 04 мл отстоя ' за 30 мии)	освобожден- ный из пече- ночных белков (мкг/5 г печени) *	
Крыса-самец	23±2	38±9	+ + + + +
Крыса-самка	4 ±0,5	4±1	+
Мышь-самец	<0,5	<1.5	+
Хомяк-самец	<0,5	<0.3	+
Кролик-самец	2 ±0,5	<0,5	—
Морская свинка-самец	<0,3	<0.3	—
* После внутрибрюшинного введения животным.
животных ряда других видов. Подобно этому печень крыс-самцов
имеет более высокие уровни сульфотрансферазной активности
в отношении метионил-ААФ и более высокие уровни связанных
с белками производных метионил-ААФ, чем печень других изучен-
ных видов животных. Эти данные хорошо демонстрируются
в табл. 10.
Печеночный канцерогенез у крыс-самцов, вызываемый ААФ
и его производными, чувствителен к модификации различными
гормональными манипуляциями. У крыс-самцов тиреоилэктпмия,
гипофизэктомия или кастрация Плюс введение эстрогена значи-
тельно тормозили печеночный канцерогенез пос ре летком ААФ
и N-гидрокси-ААФ. Каждое из этих эндокринных нарушений
также снижало сульфотрансферазную активность в отношении
N-гидрокси-ААФ и уменьшало количество связанных с белками
метионил-ААФ-производных в печени крыс, получавших N-гид-
рокси-ААФ.
Соответствие между активностью сульфотрансферазы in vitro
и реактивностью in vivo говорит в пользу того, что ААФ-№сульфат
является главной реактивной формой N-гидрокси ААФ в печени.
Вместе с тем это положение окончательно не доказано.
Канцерогенная активность эфиров N-гидрокси-ААФ и род-
ственных гидроксамовых кислот. При изолировании или синтезе
конечных канцерогенных метаболитов ожидалось, что они будут
проявлять большую канцерогенную активность по отношению
к широкому ряду животных и тканей, чем их родительский пре-
юз
канцероген. Однако также было очевидно, что конечные реактив-
ные метаболиты могут не показать ожидаемой канцерогенной
активности при экзогенном введении, если реактивность этих
веществ тормозит их поступление в клетки. С такой проблемой
исследователи уже сталкивались в тестах с канцерогенными
алкилирующими агентами, и нечто подобное выявлялось при
испытании канцерогенности ААФ-М-сульфата и нескольких синте-
тических нейтральных и жирорастворимых эфиров N-гидрокси-
ААФ. Поэтому в то время, как ААФ-№сульфат серьезно подозре-
вался в гепатоканцерогенезе, вызываемом N-гидрокси-ААФ, этот
эфир индуцировал очень немного опухолей при нанесении на кожу
и в подкожную ткань крысы. По-видимому, высокая реактивность
этого эфира, а также его ионная природа препятствовали вхож-
дению достаточных количеств этого соединения в клетку, по-
скольку до того оно реагирует с внеклеточными и мембранными
компонентами клетки. Положение более благоприятно при испыта-
нии нейтральных и жирорастворимых синтетических эфиров, таких
как N-ацетокси-ААФ и N-бензоилокси-ААФ. Эти соединения, имею-
щие более длительный полупериод существования, проявили себя
более сильными канцерогенами, чем N-гидрокси-ААФ, на месте на-
несения, особенно при подкожном введении крысам. N-гидрокси-
аминофлюорен и 2-нитрозофлюорен оказались менее канцероген-
ными, чем N-ацетокси-ААФ и N-бензоилокси-ААФ в этих условиях,
и сходные дозы ААФ и аминофлуорена не индуцировали опухоли
на месте инъекции. О-Глюкуронид-Ы-гидрокси-ААФ также был
практически неканцерогенен в данных условиях.
Другие эфиры гидроксиламина и гидроксамовых кислот имели
также большую канцерогенную активность на месте подкожного
введения, чем родительские амины или гидроксамовые кислоты.
Так, N-бензоилокси-МАБ оказался активен на месте введения,
тогда как МАБ в этих же условиях был неактивен. Подобно этому
синтетические N-ацетокси-производные 4-ацетиламинобифенила,
2-ацетиламинофенантрена и 4-ацетиламиностильбена индуциро-
вали больше опухолей на месте подкожного введения у крыс,
чем соответствующие N-гидрокси-метаболиты. С другой стороны,
более реактивный (менее стабильный) и ионный сернокислый
эфир №гидрокси-4-ацетиламинобифенила проявил в этих условиях
слабую (или нулевую) канцерогенную активность.
Мутагенная активность N-гидрокси-эфиров ААФ. Так как
наследственные изменения в информации, кодируемой ДНК кле-
ток, нередко экспрессируются фенотипически в виде частичной
или полной утраты контроля над их мультипликацией, сомати-
ческие мутации могут рассматриваться как подходящая теорети-
ческая основа индукции опухолей. В связи с этим проводился
анализ мутагенной активности различных метаболических и син-
тетических производных ААФ и МАБ [Maher V. et al., 1968].
Мутагенность проверяли на очищенной трансформирующей ДНК
из дикого типа Bacillus subtilis, которую экспозировали с испыты-
104
ваемыми соединениями in vitro. Затем ДНК использовали для
трансформации штамма Bacillus subtilis, который лишен гена В
для триптофансинтетазы. Ген В тесно связан с генами, кодирую-
щими синтез индола из антраниловой кислоты, и мутации в этих
последних генах легко выявляются по флюоресценции антрани-
ловой кислоты и по 1-(О-карбоксифениламино)-1-дезоксирибу-
лезе, которые накапливаются в мутантных клетках. Поэтому
частота трансформантов является мерой сохранения гена В,
а частота флюоресцирующих колоний — мерой мутагенности
соединения, к которому экспозируется трансформирующая ДНК
in vitro.
Эфиры N-гидрокси-ААФ инактивировали и вызывали мутации
в трансформирующей ДНК, причем эти два биологических эф-
фекта были пропорциональны друг другу и величине реакции
эфиров с ДНК, судя по плотности обработанной ДНК или по
содержанию в ней |4С из №ацетокси-ААФ-9-|4С. N-Бензоилокси-
МАБ был также мутагенен в этой системе. ААФ, 2-аминофлюорен
и их метаболиты — 2-нитрозофлюорен, N-гидрокси-ААФ, N-гид-
рокси-аминофлюорен, глюкуронид N-гидрокси-ААФ и МАБ —
показали слабую инактивацию трансформирующей ДНК или
индукцию его мутаций. Аналогичное исследование также пока-
зало, что эфиры №гидрокси-4-ацетиламинобифенила, N-гидрокси-
4-ацетиламиностильбена и №гидрокси-2-ацетиламинофлюорена
вызывали инактивацию и мутации трансформирующей ДНК, тогда
как родительские соединения были неактивны в этом тесте [Mil-
ler J., 1970]. Во всех этих случаях химическая реактивность
указанных эфиров была параллельна их инактивирующему и
мутагенному действию на трансформирующую ДНК.
Место атаки канцерогенов в структуре ДНК в этих исследо-
ваниях лаборатории Miller’s не было точно установлено. Вывод,
который сделали авторы из этой серии работ, сводится к следую-
щему. Образующиеся метаболические эфиры канцерогенных
гидроксиламинов и гидроксамовых кислот могут изменять ДНК
таким образом, что вызывают наследственную потерю контроля
над ростом. В то же время авторы отмечают, что мутагенные
потенции изученных эфиров являются следствием их электро-
фильной активности и не обязательно связаны с канцерогенной
активностью.
Вызывает удивление тот факт, что, располагая таким богатым
и оригинальным материалом относительно механизма химического
канцерогенеза, в частности индуцируемого ароматическими ами-
нами и амидами, а также данными по связи канцерогенеза и мута-
генеза, J. Miller склонился к объяснению химического канцеро-
генеза как следствия эпигеномных изменений в клетках и тканях.
В частности, J. Miller указывает, что наследственные и квази-
необратимые изменения, вызываемые N-гидрокси-эфирами ААФ,
имеют место в клеточной дифференциации в многоклеточном
организме без изменений в генетической информации. Он полагает,
105
что канцерогенез может состоять из относительно перманентных
изменений в генной экспрессии. Так, эпигенетические следствия
реакций N-гидрокси-эфиров аминов и амидов с аминокислотами
(например, метионином, цистеином, тирозином и триптофаном)
в белках (репрессорах?) и с гуанином (или другими основаниями)
в рабонуклеиновых кислотах также должны рассматриваться
как возможная основа канцерогенеза [Miller J., 1970].
Конечные химические канцерогены как сильные электрофиль-
ные реактанты. Приведенные выше исследования по реактивности
эфиров N-гидрокси-аминов и амидов и рассмотрение литературы,
касающейся известных или постулируемых реактивных форм дру-
гих химических канцерогенов, позволили J. Miller (1970) выска-
зать предположение о том, что большинство, а возможно, и все
химические канцерогены сами являются сильными электрофиль-
ными реагентами при введении или превращаются in vivo в силь-
ные электрофильные агенты. Предполагается, что эти электро-
фильные реагенты затем инициируют канцерогенный процесс
посредством специфических реакций с нуклеофилами в критически
важных компонентах ткани, таких как нуклеиновые кислоты
и белки. Данные, подтверждающие эту точку зрения на примере
различных алифатических канцерогенов, суммированы ниже.
Алкилирующие агенты были распознаны как электрофильные
реагенты per se, и многочисленные исследования показали их
неэнзиматическую реактивность в физиологических условиях
с нуклеофильными центрами в нуклеиновых кислотах и белках;
сходные реакции имеют место in vivo. Кроме того, химические
канцерогены различных типов превращаются in vivo в алкилирую-
щие агенты энзиматически или неэнзиматически.
Эти потенциальные канцерогенные агенты включают канцеро-
генные нитрозамины и нитрозамиды, которые активируются не-
энзиматически в реакции с сульфгидрильными группами. Есте-
ственно, встречающийся канцероген циказин гидролизуется до
агликона метилазоксиметанола. Это соединение метилирует нук-
леиновые кислоты in vivo и in vitro.
Этилирование РНК и белков в печени крысы происходит как
следствие введения этионина. Если высококанцерогенные пирро-
лизидиновые алкалоиды имеют слабую активность per se, то эти
соединения in vivo превращаются в значительно более сильные
алкилирующие агенты в результате энзиматической дегидрогени-
зации в пирроловые производные. Многосторонний канцероген
уретан дает несколько видов реактивных электрофилов, включая
свободные радикалы, которые могут реагировать с цистеином
и цитозином в РНК in vivo. Свидетельства в пользу образования
алкилирующих производных четыреххлористого углерода полу-
чены в результате демонстрации связанных с белками, и, воз-
можно, нуклеиновыми кислотами продуктов в печени крысы in vivo,
возможными интермедиатами являются свободный радикал или
ион карбония.
106
Канцероген
(преканцероген)
Возможный канцерогенный электрофильный
реантант (конечный канцероген)
Соединения, дающие
алкилирующие агенты:
Диалкилнитрозамины
Алкилирующие агенты:
+ I
Н2С-»-С>
H2i—с=о
CHg
Циказин
СН3—N=N—СН
13О-/Э-глюкозил
нао
жэиматичеснк СН3—N=N~ CH-OH—CHJ
’ПЗИМиТИЧГСп It О |	ф	Д
О
О
Этионин
NH2
с2нв—s—сн2—сн2— сн—соон
АТФ
эноиматичаски вДвНОЗИЛ
?-*с2н;
Пиррол изид иновые
алкалоиды
R—О
СН2—О—СО—R
-2H
•нэнматмчаскм
СН2~НО—СО—R
-N^
R —
Уретан
С2Н5О—СО—NH2 -у*- С2Н3О—СО— nh2
^5, RS—С2Нв
энзиматичеснг С2Н5О—СО—NHOH  ---- Эфиры 
С2НВО—СО—NH
Четырех хлористый углерод
СС14 -С1-;-С1 > CCi; , (СС1~)
Конечные канцерогенные электрофильные реагенты, которые люгут образе
вываться in vivo из различных алифатических канцерогенов
Известные или предполагаемые электрофильные формы раз-
личных ароматических канцерогенов показаны ниже.
Канцероген N-нитрозо-М-фенилмочевина разрушается в воде
в течение немногих минут до иона фенилдиазония, и есть основания
полагать, что этот продукт должен также образовываться in vivo.
Сильный канцероген 4-нитрохинолин-1-оксид восстанавливается
энзиматически в печени крысы и подкожной ткани до 4-гидрокси-
аминохинолин-1-оксида, который является более сильным кан-
церогеном, чем родительское соединение. Даже афлатоксин Bb ко-
торый является очень сильным гепатоканцерогеном у крыс, требует
активации для проявления канцерогенной активности.
107
Канцероген
(преканцероген)
Возможный канцерогенный электрофильный
реагент (конечный канцероген)
Соединения, дающие
арилируюгцие, арил-
амидирующие и род-
ственные агенты
Ароматические амины и производные
ЭНЗИМ.
ЭМЛИМ.
Полициклические ароматические углеводороды
Канцерогенные металлы1
2+	о-»-	2+	24-	2 +
Be .Ci , Со , Pb * N1
Перечислены электрофильные катионы различных
канцерогенных металлов
Возможные реакции катионных радикалов, получающихся in vivo
из ПАУ, с тканевыми нуклеофилами
Выше показаны также ионные электрофильные формы канцеро-
генных металлов. Некоторые из этих ионов металлов реагируют
с гуанином или образуют сравнительно нерастворимые фосфаты.
Ароматические амины и ДНК. Повреждение ДНК связано
с мутагенезом, а экспериментальные данные указывают на то,
что физические и химические мутагены часто являются канцеро-
генами [Ames В. et al., 1973; McCann J. et al., 1975]. Наиболее
убедительные доказательства взаимосвязи между повреждением
ДНК и развитием опухоли дали работы R. Setlow и соавт. (1980).
108
Изменения в ДНК, вызываемые физическими и химическими
агентами, могут быть доказаны с использованием техники щелоч-
ной элюции. Этим методом ДНК элюируется из мембранного
фильтра как функция молекулярной массы. Низкомолекулярные
фрагменты элюируются более быстро, чем высокомолекулярные.
L. Erickson и соавт. (1980) продемонстрировали, что различные
типы модификаций ДНК могут быть определены указанной техни-
кой: однонитчатые и двунитчатые разрывы ДНК и др.
Эту методику характеристики ДНК использовали С. Cesarone
и соавт. (1982) для определения однонитчатых разрывов, возни-
кающих в ДНК после экспозиции in vivo к ароматическим аминам.
Для исследования были отобраны ароматические амины из числа
известных в качестве канцерогенов, таких как бензидин и 2-наф-
тиламин, а также интермедиаты промышленного производства:
1-нафтиламин, анилин, 2-нитроанилин, о-толуидин, п-толуидин,
антраниловая кислота, п-аминобензойная кислота. Ароматические
амины вводили внутрибрюшинно мышам-самцам линии SwissCDl
за 4 ч до забоя в дозах, эквивалентных 2/з их DL50. Профили
элюции ДНК с фильтров показали увеличенную элюцию ДНК
из печени и почки мышей, получавших бензидин, 1- и 2-НА,
о- и п-толуидин. Отмечена хорошая корреляция между повреж-
дением печени, вызванным ароматическими аминами, и данными
канцерогенности и мутагенности. Бензидин, 2-НА, 2-о-толуидин,
4-п-толуидин индуцировали наиболее высокие уровни поврежде-
ния и в эксперименте с животными были канцерогенны. Анилин,
1-НА, 2-нитроанилин, п-аминобензойная кислота и антраниловая
кислота были малоэффективны в отношении повреждения ДНК
и не показали канцерогенности на животных.
Индукция повреждений ДНК является одной из ранних сту-
пеней в химическом канцерогенезе. В этом свете оценка модифи-
каций ДНК, индуцированных in vivo и выявленных довольно
простым методом щелочной элюции, может быть полезной в опре-
делении опасных соединений в окружающей среде.
Метаболизм и активация других ароматических аминов. Акти-
вация 4-монометиламиноазобензола уже рассматривалась выше.
Что касается других ароматических аминов, об их метаболических
превращениях и активации известно меньше.
В общем, эстерификация повышает канцерогенную активность
ароматических аминов. Б. Л. Рубенчик (1977) отмечает, например,
что нейтральные жирорастворимые эфиры уксусной кислоты,
N-гидрокси-ААФ, №гидрокси-4-ацетиламиностильбена и 4-гид-
рокси-4-ацетиламинодифенила более канцерогенны, чем исходные
соединения. Наоборот, сульфаты некоторых из перечисленных
соединений были менее эффективны как канцерогены. Транс-
ацетилирование также рассматривают как путь активации кан-
церогенной активности некоторых ароматических аминов. Энзима-
тически, при участии ацетилкоэнзима А, легко ацетилируются
in vitro 2-аминофлюорен, 4-аминодифенил, 2-аминонафталин.
109
Мало известно о метаболическом превращении и активации
2-нафтиламина. Предполагалась, но позже оспаривалась возмож-
ность N-гидроксилирования 2-нафтиламина in vivo с образованием
М-гидрокси-2-нафтиламина. В качестве конечного канцерогена
2-нафтиламина назывался также бис-(2-аминонафтил) фосфат,
имеющий более высокую канцерогенную активность, чем исходное
соединение. Возможно, что для усиления биологического действия
это вещество нуждается в дальнейшей трансформации. Вряд ли
активным интермедиатом метаболических превращений 2-нафтил-
амина можно рассматривать также 2-амино-1-нафтол.
При всем различии возможных метаболических путей in vivo
ароматических аминов 2 этапа обязательны: 1) N-гидроксили-
рование; 2) эстерификация.
Кроме того, и в случае ароматических аминов остается спра-
ведливой принципиальная схема взаимодействия химических
канцерогенов с макромолекулами клетки: активный электрофил
канцерогенного метаболита реагирует с нуклеофилом конституен-
тов клеток-мишеней.
НИТРОЗАМИНЫ И НИТРОЗАМИДЫ КАК КАНЦЕРОГЕНЫ
В последние годы все большее внимание стала привлекать
группа химических веществ, включающая N-нитрозамины, N-
нитрозамиды и другие менее обширные группы родственных соеди-
нений, у которых обнаружена канцерогенная активность в опытах
с животными. По своей опасности для здоровья человека эта
категория химических веществ выдвигается на первый план,
наряду с повсеместно распространенными полициклическими
ароматическими углеводородами. Сейчас известно более 100 кан-
церогенных нитрозаминов.
Химическая структура канцерогенных нитрозосоединений. При-
меры химической структуры отдельных представителей этого
класса соединений даны ниже.
Мы видим, что метильная группа в нитрозосоединениях мо-
жет быть заменена алкилами высшего порядка, арильным замести-
телем или гетероциклической группой. Двузамещенные N-нит-
розамины могут быть симметричными или асимметричными, а цик-
лические нитрозамины представлены соединениями, в которых
аминоазот образует часть циклической структуры.
Как видно из приведенных формул, нитрозамины являются
N-нитрозосоединениями, которые были хорошо известны химикам-
органикам уже много лет. Они легко образуются в реакции
вторичных аминов с азотистой кислотой (нитрит в кислой среде).
Префикс N используется для отличия их от С-нитрозосоединений,
в которых нитрозная группа присоединена к углеродному атому.
Аминные производные отличаются от нитрозамидов по их
химической стабильности. Первые обычно химически стабильны
в водном растворе в холоде, если содержатся в темноте, тогда
110
♦сн3
/N—N—О
jk *
СН3
CHg—СН2
\n—N—о
СНЯ—СН2
сн3—сн3—сн2—сна
/N—N—О
сн3— сн2— сн2—сн2
N.N-диметил- N.N-диэтилни-
нит розами н
N-дибутилнитрозамин
СН,—СН,
|	/N—N—O
СН2—СН2
трозамин
N-цитрозометил-
анилин
N-нитрозопирролидин
Н-метил-Н-нитрозо-
мочевина
СН,—СН,
/ 2 \
2n—n=o
СН2—СН2
N-нитроэоморфолин
Н *СН3
I	\
N	N—N-=O
*<fH3
О
I
О—S—О
СН3
метилметан-
сульфат
Ы-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидин
*СН3	СНа
।	1 +
О	N +
I	И_
о—S=o	N
i
сн3
*сн3
I
NH
NH
* I
сн3
диметил- диаэометан 1,2-диметил гид разин
сульфат
как последние нестабильны в щелочи и могут разрушаться более
медленно при нейтральном pH. Нитрозопроизводные алкиламидов
легко дают соответствующие диазоалканы при обработке щелочью
и интенсивно использовались для реакций алкилирования в синте-
тической органической химии. Экспозиция N-нитрозосоединений
к ультрафиолетовому свету вызывает разрушение с количествен-
ным выходом нитрата. Это фотохимическое разрушение является
основой одного из методов определения нитрозосоединений.
Интерес к N-нитрозосоединениям обострился с того момента,
когда в 50-х годах при исследовании токсического эффекта было
обнаружено, что простейший представитель нитрозаминов —
ДМНА — обладает канцерогенным действием у крыс.
Последующие исследования показали, что соединения этой
группы агентов являются канцерогенными для широкого круга
животных видов и для разнообразных тканей. Важное научное
и практическое значение имеет способность нитрозосоединений
* Алкильная группа может быть перенесена, однако в случае двузамещенных
соединений только один из заместителей участвует в ковалентной реакции
с молекулами—мишенями. Алкилирование диазометаном включает реакцию
дополнительного водородного атома.
111
вызывать трансплацентарный канцерогенез, всесторонне и глубоко
изученный Н. П. Напалковым и сотр. [Напалков Н. П., 1977; Алек-
сандров В. А., Напалков Н. П., 1981].
Наряду с токсичностью и канцерогенностью, эти агенты явля-
ются также тератогенными [Lawley Р., 1974; Montesano R.,
Bartsch Н., 1976] и мутагенными и могут выраженно влиять
на синтез ДНК, РНК и белка. Попытки дать объяснение этим
биологическим и биохимическим эффектам концентрировались
на механизмах и продуктах их расщепления и последующей
их реакции с клеточными компонентами, особенно с макромолеку7
лами. Как и в случае всех других химических канцерогенов,
эти эффекты опосредуются электрофильными реакциями с клеточ-
ными составляющими [Miller J., 1970], и на этой основе N-нит-
розосоединения могут быть разделены на 2 группы: те, которые
продуцируют электрофилы в ходе спонтанного распада (например,
нитрозамиды), и те, которые химически более стабильны и требуют
метаболической активации для инициации расщепления (как
в случае нитрозаминов). Пути превращений, которые были уста-
новлены для простых алкилирующих агентов, представлены сле-
дующими реакциями (см. стр. 113).
Для данного класса химических канцерогенов характерно,
что распад и удаление продуктов деградации из организма про-
исходит очень быстро по сравнению со временем появления
некоторых поздних биологических эффектов. Далее, количество
агента, которое связывается с клеточными компонентами, исклю-
чительно мало по сравнению с введенным. Указанный факт под-
черкивает значение инициирующих эффектов и иллюстрирует
импульсную природу воздействия этих агентов, особенно в случае
опытов с единичной дозой.
Катализируемый щелочью распад метил нитрозомочевины и
МННГ до алкилирующих интермедиатов происходит in vitro
в отсутствие добавляемых тиолов, что указывает на их способность
алкилировать нуклеиновые кислоты в этих условиях, однако in
vivo алкилирующие интермедиаты образуются, главным образом,
опосредуемым тиолом путем, как указано выше. Действия тиолов
на расщепление НММ не обнаружено.
Наиболее изучены алкилирующие реакции нитрозосоединений
с нуклеофильными центрами в клеточных макромолекулах, глав-
ным образом с нуклеиновыми кислотами. Алкилирование белков
также имеет место. Известны данные, что могут алкилироваться
и жиры. Реакции, иные чем алкилирование, привлекли сравни-
тельно небольшое внимание, однако в некоторых случаях воз-
можны реакции карбомоилирования и др.
До настоящего времени прямо не показана канцерогенность
N-нитрозосоединений у человека. Тем не менее способность чело-
веческой печени метаболизировать диметилнитрозамин до метили-
рующих интермедиатов, которые продуцируют те же продукты
реакций с нуклеиновыми кислотами, что найдены в чувствительных
112
8 Заказ 380
ДИНА
N—N—О
UI
з
Метил и и трозомочевина
Метилнитрозоуретан
H2N
•N—N=O
СН,
J>N—№=О
(а-с-гидроксилирование)
[О]
J N—N=O
HOCH^
гидроксиметил мети л-
нитрозамин
О
МННГ
Н
I сн3
N. /N—N*=O
c^-cr
О
[RSJ
(например,
цистеин)
o2n
С
N
[ОН]
N—N=O
Н
N—N=O
монометил нитроз амин
o2n—
НС НО
S' формальдегид
HNCO
изоцианат
H
[RS]
(например,
цистеин)
СО2
(выдыхается)
(нестабилен) n
CH3—N=N—OH
метилдиазогидроксид
Н
ОН'+ [СН,—N—N +1	ион
d I J метилди а зония
O2N—N
S
Н
NH,
о
N2+'
он метилкарбония
N----СНСООН
тиазолин
нуклеофильные центры
в молекулах-мишенях,
таких как ДНК, РНК,
белки
Распад простых N-нигпроэосоединений. до предполагаемых алкилирующих агентов
к нитрозаминам животных, убедительно указывает, что эти агенты
являются потенциально опасными. Их присутствие в окружающей
среде и образование из неактивных предшественников, поступаю-
щих с пищей, могут быть фактором в индукции по .меньшей мере
80 % человеческих неоплазм, вызванных агентами окружающей
среды [Doll R., 1977]. В свете привлекательности гипотезы генети-
ческого механизма канцерогенеза (т. е. такого, который включает
изменения в последовательности оснований ДНК в качестве
инициирующей ступени) многие исследователи пытались устано-
вить связь между реакциями N-нитрозосоединений и инициацией
образования опухолей. Кроме того, важность алкилированных
нуклеозидов в экспрессии нормальной биологической функции
таких молекул, как тРНК, иРНК, рРНК, и для действия рестрик-
ционных эндонуклеаз на ДНК ясно указывает на возможности
изменения или нарушения функций в результате образования
под воздействием нитрозосоединений чуждых алкилированных
нуклеозидов в ДНК и РНК [Pegg А., 1977].
В связи с этим первоочередной задачей представляется изу-
чение природы изменений, вызываемых N-нитрозосоединениями,
немедленных химических и биологических последствий таких
изменений и их связи с поздними биологическими эффектами.
В ряде обзоров детально рассмотрены вопросы метаболизма
нитрозосоединений [Montesano R., Bartsch Н., 1976], биологи-
ческого алкилирования, особенно различных видов РНК [Pegg А.,
1977], канцерогенеза и мутагенеза [Lawley Р., 1974; Montesano R.,
Bartsch Н., 1976], в которых можно почерпнуть дополнительную
информацию.
Видо-и органоспецифичность действия нитрозаминов. Н. Dnick-
геу и соавт. (1960) во Фрайнбургском университете в 50—
60-е годы систематически изучали связь между химической струк-
турой и канцерогенным действием ряда N-нитрозосоединений.
К концу 60-х годов стало очевидным, что многие нитрозамины
индуцируют рак у крыс и других экспериментальных животных.
Еще более интересно, что нитрозосоединения с различной струк-
турой вызывали опухоли в различных органах.
Примерами этой «органоселективности», или «органотро-
пизма» (термин Н. Druckrey), являются опухоли мочевого пузыря,
вызываемые дибутилнитрозамином, и тенденция несимметричных
нитрозаминов, например N-нитрозометилаланина, индуцировать
опухоли пищевода. Особенно интересно, что N-нитрозометил-
мочевина после повторных внутривенных введений вызывала
большое число опухолей мозга и других частей нервной системы.
Это был первый эффективный экспериментальный метод индукции,
отличающийся от прямого введения химического канцерогена
в мозг, и использовался весьма интенсивно в экспериментальной
невропатологии.
N-Нитрозоэтил мочевина показала значительную способность
индуцировать опухоли нервной системы в потомках матерей крыс,
114
получавших канцероген в течение последней трети беременности.
Демонстрация трансплацентарного канцерогенеза находит анало-
гию в случаях появления рака влагалища у молодых женщин, чьи
матери лечились диэтилстильбэстролом во время беременности.
Индукция опухолей единичными дозами нитрозосоединений
интересна по той причине, что она также наблюдалась после
обработки этими канцерогенами новорожденных и взрослых
животных, а также потому, что нитрозамины (особенно амидные
производные) очень быстро элиминируются из организма. Можно
думать, что все виды испытанных животных, включая обезьян
и других млекопитающих, птиц, амфибий и рыб, являются чувстви-
тельными к индукции опухолей нитрозаминами. Указанный факт
говорит о том, что и для человека нитрозосоединения являются
фактором риска. В этом отношении представляет интерес следую-
щее наблюдение. В начале 60-х годов настоящего столетия в Нор-
вегии была отмечена вспышка жестокой и нередко летальной
болезни овец. Некоторые из них заболевали без видимой причины.
Позже у них обнаруживали тяжелое поражение печени. Исследо-
вания показали, что все пораженные овцы поедали частично
разложившуюся рыбную муку, содержащую в качестве консер-
ванта нитрит. Так как рыба может содержать значительные
количества аминов, включая диметиламин и триметиламин, было
сделано, а затем и подтверждено предположение о том, что при
этом могли бы образовываться нитрозамины. Химический анализ
показал присутствие диметилнитрозамина в муке в количествах,
достаточных для поражения печени у овец.
Эта демонстрация образования токсических количеств мощного
канцерогенного нитрозамина в пище овец привела к мнению,
что подобная ситуация могла бы иметь место и у человека, в пище
которого содержался нитрит в качестве добавки-консерванта.
В Англии такие пищевые продукты включали различное консер-
вированное мясо, как, например, бекон, ветчина и некоторые
сорта сыра. Анализы показали, что небольшие количества нитроз-
аминов присутствуют в этих продуктах, включая диметилнитроз-
амин и N-нитрозопирролидин. Отношение этих фактов к индукции
рака у человека пока трудно оценить.
Другой важный аспект проблемы нитрозаминов приоткрылся
в результате работ J. Sander и соавт. (1971, 1972), которые
показали, что канцерогенные нитрозамины могут образовываться
в кислой среде желудка млекопитающих в присутствии соответ-
ствующих аминов и нитритов. Значение этой работы увеличивается
в результате открытия, что не только вторичные, но и третичные
амины могут нитрозироваться с образованием канцерогенных
нитрозаминов. Никто не сомневается в потенциально вредном
результате такого эндогенного образования нитрозаминов, по-
скольку имеется много сообщений об индукции опухолей у экспери-
ментальных животных при одновременном введении нитритов
и различных вторичных и третичных аминов.
8*
115
Многие N-нитрозосоединения столь же мутагенны, как и кан-
церогенны. Химически нестойкие амидные дериваты, особенно
М-метил-\'-нитро-М-нигрозогуанидин, являются очень эффектив-
ными мутагенами во всех обычных микробных тест-системах,
однако химически более стабильные нитрозамины таковыми не
являются. Эти факты могут быть объяснены широко распро-
страненным взглядом, согласно которому нитрозосоединения сами
по себе не являются биологически активными, но производят
свой эффект через химически реактивные интермедиаты. Послед-
ние могут образовываться как с помощью ферментов, так и без них.
Метаболизм N-нитрозосоединений. Химически стабильные
нитрозосоединения разрушаются в организме быстро после введе-
ния, причем метаболизм осуществляется, главным образом (хотя
и не исключительно), в печени. Связанные с обменом N-нитрозо-
соединений ферменты имеют те же характеристики, что и хорошо
известные группы энзимов (микросомные гидроксилазы), которые
ответственны за обмен большинства соединений, чужеродных
для организма. Эти реакции уменьшают токсичность веществ
и, таким образом, полезны. Но иногда, как в случае с нитрозами-
нами, имеет место обратное, а именно: продукты расщепления
оказываются более токсичными и (или) канцерогенными, чем
родительские соединения.
Имеются некоторые данные, свидетельствующие о том, что
места индукции опухолей нитрозаминами (органотропия) могут
определяться частично присутствием необходимых ферментов
в органах мишенях. Факторы, иные чем энзимная активация,
должны также участвовать в этом процессе, поскольку химически
неустойчивые нитрозоканцерогены могут также проявлять значи-
тельную органоспецифичность. Метаболическая активация их не
требуется. Концепция, что химический агент нередко не является
молекулярной формой, которая индуцирует опухоль, дала начало
новой группе терминов: «преканцероген* — для родительского
соединения; «проксиматный канцероген* — для более канцеро-
генно активных продуктов распада; «конечный канцероген* —
для продукта, который реагируете некоторым критическим клеточ-
ным компонентом и индуцирует таким образом рак.
Хотя N-нитрозосоединения могут действовать, подобно другим
классам химических канцерогенных соединений, как алкилирую-
щие агенты in vivo, образование алкилирующих интермедиатов,
как полагают, общих для нитрозаминов и нитрозамидов, проис-
ходит совершенно различными путями (см. стр. 113). Сравни-
тельно стабильные нитрозамины, которые не являются алкилирую-
щими агентами per se, обычно подвергаются метаболизму путем
гидроксилирования при а-углеродном атоме с образованием
нестабильного алкилгидроксиалкилнитрозамина. Последний рас-
падается спонтанно и ступенеобразно до иона алкилдиазония
и затем до иона карбония, который является предполагаемой
алкилирующей формой. Напротив, нестойкие N-нитрозамиды
116
являются мощными алкилирующими агентами как in vivo, так и
in vitro и генерируют предполагаемые ионы карбония спонтанным,
зависимым от pH гидролизом, который в случае алкилнитроз-
уретанов и алкилнитрозогуанидинов может быть тиолкатализируе-
мым in vivo [Druckrey Н., 1975].
Распространение в тканях и распад N-нитрозосоединений.
В многочисленных исследованиях показано, что немедленно после
введения N-нитрозосоединения равномерно распределяются по
всему организму у крыс и мышей, и, так как нитрозамиды не
нуждаются в метаболической активации, они реагируют в одинако-
вой степени с макромолекулами во всех тканях. Для N-метил-
N'-нитро-М-нитрозогуанидина и N-метилнитрозомочевины мера
реакции зависит от уровня в тканях сульфгидрильных соединений,
которые действуют как катализаторы в распаде этих агентов.
В случае нитрозаминов, несмотря на их начальное равномерное
распределение, реакция с макромолекулами происходит только
в тех тканях, которые содержат цитохром Р-450-зависимые поли-
функциональные оксидазы (называемые также гидроксилазами,
или деметилазами). Ответственными за кратко- и долгосрочные
токсические эффекты нитрозаминов являются продукты их окисли-
тельного обмена, а не сами нитрозамины. Более ранние исследо-
вания, в которых диметил нитроза мин вводился гепатэктомирован-
ным крысам, показали, что главным органом, способным метаболи-
зировать этот агент, является печень. Путем измерения реакции
с тканевыми макромолекулами было показано, что и другие
органы, в частности почка, легкое, селезенка и в меньшей степени
кишечник и поджелудочная железа, также метаболизируют, по
крайней мере, простые нитрозамины.
При сравнительном исследовании полифункциональных окси-
даз тканей различных видов лабораторных грызунов печень во
всех случаях была наиболее активным органом, а удельные актив-
ности почки и легкого были между 15 и 40 % от таковой печени.
У крыс найдена сравнительно бедная метаболизирующая нитроз-
амины активность..^
Алкилирование нитрозаминами изучали также in vitro, исполь-
зуя тканевые срезы различных видов лабораторных животных,
печени и бронхов человека. Во всех случаях была продемонстриро-
вана способность метаболизировать нитрозамины до алкилирую-
щих интермедиатов.
Нитрозамиды разрушаются в организме очень быстро. После
внутривенного введения крысам полупериоды существования
метилнитрозомочевины (100 мг/кг) и этилнитрозомочевины
(200 мг/кг) были около 2 и 5 мин соответственно. Напротив,
распад нитрозаминов происходит намного медленнее, поскольку
включает этапы их метаболизма. Так, для полного метаболизма
диметилнитрозамина, введенного внутрибрюшинно в дозе 6 мг/кг
массы, требуется примерно 3 ч, а введенного парентерально в дозе
30 мг/кг (т. е. меньше, чем DL50) — 6 ч с максимумом связанной
117
радиоактивности через 8 ч. При этих дозах почти 2/з введенной
радиоактивности выдыхалось в виде |4СО2 в первые 12 ч.
Рассчитано, что в обшей печеночной ДНК оказывается в виде
продуктов алкилирования меньше 1/|ООо части введенной дозы.
Диэтилнитрозамин метаболизируется медленнее. При дозе
204 мг/кг массы скорость составляла 8 мг/ч, меньшая доля общей
радиоактивности выдыхалась в виде |4СО2, и значительно большая
фракция дозы экскретировалась с мочой в виде исходного соеди-
нения или как продукты, сохраняющие нитрозогруппу.
Важным наблюдением является то, что N-нитрозосоединения
быстро деградируют в организме до высокореактивных форм
и начальное повреждение клеточных компонентов происходит
поэтому по импульсному типу.
Возможные механизмы действия нитрозаминов. Многие авторы
пытались объяснить механизм действия нитрозаминов, рассматри-
вали роль как неизмененных молекул нитрозосоединений, так и
продуктов их распада.
Неизмененные молекулы. Вначале считали, что
именно неизмененные молекулы нитрозоканцерогенов (а не какой-
либо их метаболит) являются конечными канцерогенами. Извест-
ное подкрепление данная точка зрения получила в результате
наблюдения, что диметилнитрозамин и некоторые другие канцеро-
гены вызывают денатурацию белка. Этот факт подкреплял гипо-
тезу о роли денатурации протеинов в канцерогенезе.
Указанная концепция, однако, трудно согласовывалась с тем
фактом, что при равномерном распределении, например, диметил-
нитрозамина в организме опухоли у крыс индуцируются избира-
тельно в пёчени, почках и легких.
Роль алкилирующих промежуточных мета-
болитов. Тем временем идея алкилирования при канцеро-
генезе, индуцируемом нитрозаминами, получила значительную
поддержку в исследованиях взаимосвязи химической структуры
веществ и их канцерогенных свойств. Была выявлена отчетливая
корреляция между способностью превращаться в промежуточные
алкилирующие агенты и канцерогенной активностью. Однако,
если алифатические нитрозамины удовлетворяли этому правилу,
гетероциклические нитрозамины ему не подчинялись. Например,
N-нитрозоморфолин был высокоактивен как канцероген, но данных
в пользу метаболического расщепления его кольца не было. Без
разрыва кольца циклических нитрозосоединений образования
диазоалкана и других алкилирующих промежуточных продуктов
не происходит.
Следует заметить, однако, что во время этих дискуссий прямых
доказательств невозможности метаболического разрыва кольца
циклических нитрозосоединений не существовало. В конце 60-х го-
дов нашего столетия пришли все же к заключению, что если
алкилирование и имеет причинную связь с канцерогенезом, инду-
цируемым нитрозосоединениями, то реакции с клеточным рецеп-
118
тором должны протекать в критическом месте и в критическое
время.
Белки как клеточная мишень в канцерогенном действии N-нит-
розосоединений. Факт связывания белков с азокрасителями и
полициклическими ароматическими углеводородами послужил
основой возникновения так называемой теории выпадения. В этой
теории первичное значение придавалось именно реакции канцеро-
гена с белками при участии алкилирования белковых сульф-
гидрильных групп.
Вскоре, однако, мощная волна исследований нуклеиновых
кислот как внутриклеточной мишени действия нитрозоканцеро-
генов и других канцерогенных соединений отодвинула аналогич-
ную роль белков в этом процессе на второй план.
Канцерогенез и генетический материал клетки. Взаимодействие
канцерогенов с нуклеиновыми кислотами приобрело особую зна-
чимость особенно в связи с открытием роли этих макромолекул
в сохранении и переносе наследственной информации. Естественно,
что факт неизбежной передачи качества злокачественности от
родительских клеток к дочерним, т. е. генетической обусловлен-
ности неопластического состояния, указывал на роль в этом
процессе нуклеиновых кислот. С другой стороны, с изменением
генетического материала клеток связано и другое важное био-
логическое явление — мутагенез.
Таким образом, в едином комплексе, материальным субстратом
которого являются нуклеиновые кислоты, оказались тесно сплетен-
ными три феномена: действие канцерогенных веществ, неоплазия
и мутагенез.
Предположение о неразрывной связи этих явлений подверглось
самой широкой и глубокой экспериментальной и теоретической
проверке.
Подробно об этих трех аспектах, как позже выяснилось, единой
проблемы уже говорилось и будет еще говориться в соответствую-
щих разделах книги, однако здесь следует сделать некоторые
краткие и общие замечания.
Идея о роли соматических мутаций в канцерогенезе возникла
около 70 лет назад. Т. Bovery (1914, 1929) предположил, что
опухоли обусловлены аномалиями в строении хромосом. Другие
авторы большее значение придавали изменению внехромосомных
генетических элементов. В отношении гипотезы соматических
мутаций как причины онкогенеза высказывались различные
взгляды, и она приобретала самые разнообразные варианты.
Однако, независимо от признания той или иной причины первич-
ного поражения клеток в процессе канцерогенеза, все сходились
в признании того факта, что при трансформации наследуемые
изменения связаны с изменением генетического материала, т. е.
нуклеиновых кислот.
Действие канцерогена на хромосомную ДНК может быть
прямым или опосредованным, косвенным, через ядерные гистоны
119
или иные экстрахромосомальные цитоплазматические компоненты.
Последний вариант соответствует экстрахромосомальной мута-
ционной гипотезе, не предусматривающей для канцерогенеза
обязательных первичных изменений в ДНК и отдающей приоритет
в развитии канцерогенеза изменениям в репрессорах или других
регуляторных молекулах (белках или РНК).
При таких разноречивых и противоречивых мнениях о природе
канцерогенеза не может не вызвать удивления и уважения
предвидение A. Haddow и С. Darlington, которые еще в 1958 г.
высказали мысль о том, что каким бы ни был тонкий химический
механизм действия канцерогенов, большое значение должна иметь
комбинация канцерогенов с генетическим материалом или его
предшественниками путем биологического алкилирования.
Связь канцерогенеза и мутагенеза привлекает пристальное
внимание, и характер действия на клетки нитрозаминов дает
основание для рассмотрения их в единстве. Основным местом
алкилирования является N-7 в гуанине ДНК. В этом ионизирован-
ном состоянии алкилированный гуанин может образовать пару
с тимином вместо цитозина, с которым он спаривается в нормаль-
ных условиях. Этот процесс приводит к замене обычной пары
Г-Ц на А-Т при последующей репликации ДНК. Алкилирование
гуанина и аденина в ДНК вызывает депуринизацию с выходом
из ДНК 7 метилгуанина и 3-алкиладенина. Не исключено, что
этот процесс депуринизации может приводить к мутациям, обу-
словленным делецией пары оснований. Химическая деградация
алкилированной ДНК или действие специфической ДНКазы могут
привести к еще большей делеции генетического материала. Экспе-
риментальные данные соответствуют возможности обоих механиз-
мов соматических мутаций в клетках, где возникает опухоль
после введения однократной дозы нитрозоканцерогена.
Перенос алкилирующей группы. В свете сходства продуктов,
образуемых в клеточных нуклеиновых кислотах при действии,
например, метилнитрозомочевины или диметилнитрозамина, пред-
ставляется вероятным, что один и тот же алкилирующий интер-
медиат вовлечен в реакции как прямых, так и непрямых действую-
щих агентов.
В опытах с меткой дейтерием было показано, что метильная
группа, освобождаемая при окислительном обмене диметилнитроз-
амина, переносится интактной и что сходная ситуация имеет
место и в случае агента прямого действия, М-метил-М'-нитро-
N-нитрозогуанидина. Дальнейшим подтверждением того, что
метильная группа присоединяется путем трансметилирования,
явились опыты, в которых ДНК реагировала одновременно с ме-
тилнитрозомочевиной, меченной в метильной группе с 3Н, и метил-
нитрозомочевиной, меченной в метильной группе с 14С. В каждом
из изолированных продуктов поддерживалось исходное соотноше-
ние изотопов. Из опытов с дейтерированным диэтилнитрозамином
известно, что этильная группа также переносится интактной.
120
Ситуация более сложна для высших алкильных и циклических
нитрозаминов. Показано, что эти нитрозамины не редуцируются
до общих, простых форм. Различия как в их реакции с клеточными
макромолекулами, так и в возможной репарации повреждения,
кстати еще не изученные, могли бы объяснить отличающееся
биологическое действие этих агентов.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НИТРОЗОСОЕДИНЕНИЙ
С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
Взаимодействие N-нитрозосоединений с клеточными нуклеино-
выми кислотами in vivo в количественном отношении обычно
очень невелико. В большинстве случаев около 0,1 % или менее
оснований подвергаются воздействию, и, чтобы определить такие
малые количества, приходится использовать радиоактивномечен-
ные соединения.
Спонтанный или энзимозависимый распад N-нитрозосоедине-
ний освобождает алкилирующий интермедиат, который реагирует
ковалентное разнообразными нуклеофильными центрами в клеточ-
ных компонентах, в том числе нуклеиновых кислотах. Механизмом
этой реакции, по крайней мере частично, являются мономолекуляр-
ное нуклеофильное замещение или реакция, характеризующаяся
высоким сродством алкилирующих форм к атомам кислорода.
По способности реагировать с кислородными атомами алкили-
рующие реагенты могут быть расположены в следующем порядке:
метилметансульфонат, этилметансульфонат, метилнитрозомоче-
вина, этилнитрозомочевина [Lawley Р., 1974]. Эта градация,
наблюдавшаяся для атомов кислорода, не выдерживается для
других мест в нуклеиновых кислотах, и разнообразные факторы
определяют сродство этих других мест (атомов) к алкилирующей
частице.
При сравнении реакций перечисленных агентов обращает на
себя внимание то обстоятельство, что ряд мест, подвергающихся
воздействию в макромолекуле, являются одними и теми же, однако
имеются значительные различия в характере продуктов, которые
образуются в результате разной степени реакции в индивидуаль-
ных местах в нуклеиновой кислоте. Для РНК и ДНК наблюдаю-
щийся ряд продуктов в основном один и тот же, различие заключа-
ется в выявлении 2-О-алкилирования в углеводном компоненте
РНК, а также особенностей в силу присутствия урацила или
тимина. Если, однако, рассматривается тот или иной отдельный
алкилирующий агент, то характер реакции его с РНК и ДНК может
различаться в некоторых аспектах. Например, 3-метиладенин
обычно представлен в большем количестве в ДНК, чем в РНК,
тогда как реакция в первом положении этого основания имеет
тенденцию быть более интенсивной в РНК. При атомах кислорода
гуанина и фосфата продукты реакции образуются более интен-
сивно в ДНК, чем в РНК. То же верно для случая реакций с нуклеи-
121
новыми кислотами этилирующих N-нитрозосоединений по сравне-
нию с таковыми соответствующих метилирующих агентов. Суще-
ственной характеристикой реакций этих соединений является коли-
чество кислородных атомов в нуклеиновых кислотах, которые
служат потенциальной мишенью для атаки алкилирующими аген-
тами. Что касается алкилсульфонатов и сульфатов, то, хотя
характер продуктов остается таким же, относительная степень
реакции при атомах кислорода значительно уменьшена. В опытах
in vitro реакция метилметансульфоната с фосфатом ДНК состав-
ляет лишь 1 % от общих продуктов, тогда как эта цифра для
метилнитрозомочевины составляет 20 % и для этилнитрозомоче-
вины— 70%. Аналогично при Об-позиции в гуанине реакция
с метилметансульфонатом in vitro составляет в молярных пропор-
циях 1 /20 и */зо количества, образованного в реакции с метилнит-
розомочевиной. Таким образом, хотя алкансульфаты реагируют
с нуклеиновыми кислотами, давая продукты того же ряда, что и
продукты с N-нитрозосоединениями, ясно, что имеются сущест-
венные различия в характере образуемых продуктов. Это дает
основание считать, что модификация специфических мест и сте- ’
пень, в которой они подвергаются воздействию, являются важным
аспектом реакций с клеточными нуклеиновыми кислотами, что
может быть более тесно связано с их мутагенным и канцерогенным
действием, чем общий уровень (объем) реакции.
Реакция нитрозаминов с клеточными нуклеиновыми кислотами
зависит от дозы. Например, алкилирование in vitro транспортных
РНК прямо пропорционально концентрации N-нитрозосоединения
и независимо от количества субстрата, безотносительно к тому,
сравнивали ли реакции с метил- или этилнитрозомочевиной. Вве-
дение in vivo диметилнитрозамина в дозах от 0,25 мг/кг массы
также приводит к линейному увеличению метилирования, измеряе-
мого по накоплению 7-метилгуанина, в РНК и ДНК печени крысы
[Pegg A., 1977J. Сравнительная степень реакции с различными
типами нуклеиновых кислот может, однако, варьировать. На-
пример, транспортная РНК метилируется более интенсивно, чем
ДНК в печени, если крысы получали диметилнитрозамин, или
в культивированных клетках млекопитающих, обработанных
№метил-№-нитро-\-нитрозогуанидином, однако в мозговой ткани
№метил-№-нитро-№нитрозогуанидин метилировал рРНК и ДНК
в равной степени. Сходные небольшие различия были отмечены
при метилировании отдельных видов РНК: после обработки метил-
нитрозомочевиной тРНК из подвздошной кишки и почки крысы
метилировалась в одинаковой степени с рРНК в тех же тканях,
однако в мозге и печени тРНК метилировалась в большей степени.
Алкилирование иРНК и ядерной РНК в печени крысы было
небольшим, но достоверным — ниже, чем таковое рРНК, если
использовали диметилнитрозамин, однако алкилирование ядерной
РНК было больше, чем иРНК и рРНК, если использовали метил-
метансульфонат [Pegg А., 1976]. Несколько большие различия
122
наблюдали при сравнении алкилирования митохондриальной ДНК
и ядерной ДНК крысы и хомяка: диметилнитрозамин и метил-
нитрозомочевина метилировали митохондриальную ДНК соответ-
ственно в 2—4*/2 раза и в 3—7 раз больше, чем ядерную ДНК.
Еще большие различия в степени алкилирования клеточных
нуклеиновых кислот имеют место, если сравнивать результаты
для разных органов. Это обусловлено прежде всего варьирующей
способностью отдельных тканей генерировать реактивные интер-
медиаты. Так, агенты типа метилнитрозомочевины, этилнитрозо-
мочевины, метилметансульфоната и этилметансульфоната, кото-
рые не требуют метаболической активации, реагируют с тканевыми
макромолекулами более или менее однородно (единообразно)
по всему организму. С другой стороны, деградация N-метил-
М'-нитро-М-нитрозогуанидина катализируется тиолами, и это
может объяснить, почему нуклеиновые кислоты костного мозга
и тимуса не реагируют или мало реагируют с М-метил-К'-нитро-
N-нитрозогуанидином, тогда как нуклеиновые кислоты желудка,
кишечника и печени легко метилируются. Большие различия
между тканями наблюдали и при использовании диметилнитроз-
амина: у крыс реакция в семенниках была на грани низших
пределов определения, тогда как в тонкой кишке и легком она
была соответственно в 300—450 раз и в 15—17 раз меньше, чем
таковая с клеточными нуклеиновыми кислотами печени. Реакция
в почке была примерно в 8 раз меньше, чем в печени. У хомяка
алкилирование ДНК в печени и легком было соответственно
в 14 и I */2 раза больше, чем в почке. Этилирующие агенты, требую-
щие метаболической активации, также показали сходное рас-
пределение интенсивности реакции с тканевыми нуклеиновыми
кислотами; для диэтилнитрозамина реакция в почке и легком
крысы была в 4 раза меньше, чем в печени, и в тонкой кишке она
была практически неуловимой.
Один важный аспект реакций N-нитрозосоединений касается
значительно большего сродства метилирующих агентов, по срав-
нению с соответствующими этилирующими агентами, к нуклео-
фильным центрам в нуклеиновых кислотах. В опытах in vitro
тРНК алкилируется в 10 раз более интенсивно метил нитрозо-
мочевиной, чем этилнитрозомочевиной, и в опытах in vivo этили-
рующие реагенты заметно менее реактивны, чем соответствующие
метилирующие агенты. Количественное сравнение реакции с пече-
ночной ДНК показывает, что диметилнитрозамин, метилнитрозо-
мочевина и метилметансульфонат образуют соответственно в 170,
50 и 10 раз больше алкилированных продуктов, чем эквимолярные
дозы этилирующих агентов.
Продукты реакции нитрозосоединений с РНК. Помимо алкили-
рования оснований и фосфата, подобная реакция показана также
и для 2-О-рибозы. Транспортные, рибосомальные, информацион-
ные РНК из различных источников, в том числе бактериофагов,
вирусов, бактерий и животных, в опытах in vivo и in vitro не имели
123
особых различий в характере реакции. Решающая роль принад-
лежала, как и в случае с ДНК, природе самого алкилирующего
агента, что следовало из сравнения реакций N-нитрозосоединений
с таковыми алкансульфонатов и сульфатов. Имеется, однако, один
необычный пример: реакция №метил-\'-нитро-\-нитрозогуани-
дина с РНК в интактном вирусе табачной мозаики дает 3-метил-
цитозин и 7-метилгуанин в примерно равных количествах: 35 и
48 % от общих продуктов реакции соответственно, в реакции
со свободной РНК соотношение этих оснований соответственно
равно 7 и 76 %.
Продукты реакции с ДНК. Несмотря на различия в первичной
структуре двух нуклеиновых кислот, места алкилирования в ДНК
те же, что и в РНК, однако есть и определенные отличия в относи-
тельной степени (мере), в которой индивидуальные места подвер-
гаются воздействию, т. е. в характере реакции. Имеется, например,
общая тенденция к алкилированию N3-aTOMa аденина более
легко в ДНК, чем в РНК. Сходно с этим в большей степени алкили-
руются фосфат и Оь-гуанин в ДНК, так что для метилирующих
N-нитрозосоединений О-алкилирование занимает примерно 25 и
15% от общих продуктов в ДНК и РНК соответственно, тогда
как с этилирующими соединениями примерно 75 и 60 % продуктов
являются О-алкилированными. При использовании диэтилнитроз-
амина, однако, доля Об-этилгуанина в ДНК достигает величины,
полученной с этилнитрозомочевиной при очень высоких вводимых
концентрациях. Как и в случае с РНК, имеет место значительное
сходство между реакциями этих агентов в условиях in vitro и
in vivo.
Путем сравнения реакций с алкилсульфонатом и сульфатом
было установлено, что характер взаимодействия определяется
природой используемого агента.
Лимитирующим фактором в реакции нитрозаминов с нуклеино-
выми кислотами клеток является образование алкилирующих
форм, однако на сравнительные количества продуктов реакции,
первично образованных в ДНК, оказывает влияние структура
молекулы субстрата. Исследование алкилирования ДНК или гуа-
ниннуклеозидов и нуклеотидов диэтил-р-хлорэтиламином пока-
зало, что, по сравнению с N7-3tomom в мономере, то же место
в нативной ДНК характеризуется 50-кратным увеличением реак-
тивности к алкилированию; в однонитчатой ДНК реактивность
была снижена в 5—10 раз. С другой стороны, вторичная структура
молекулы, т. е. степень межнитевых водородных связей, может
защищать некоторые места от реакции. Это ясно демонстрируется
в искусственных полинуклеотидах, в которых водородные связи
потенциальных мест реакции частично защищают их от алкилиро-
вания. В однонитчатой ДНК после обработки метилметансульфо-
натом реакция при N*-aTOMe аденина может достигать 20—30 %
от общей реакции, в противоположность 1—5 %, полученным
с нативной ДНК, хотя относительное количество образованного
124
1-метиладенина может быть искусственно увеличено в некоторой
степени благодаря соответствующим потерям 3- и 7-метилпуринов
путем депуринизации в ходе продолжительных периодов реакции.
Биологическое действие продуктов алки-
лирования. Мискодирующие свойства алкили-
рованных оснований. Одно из главных биологических
свойств N-нитрозосоединений — их мутагенность [Lawley Р.,
1974; Montesano R., Bartsch Н., 1976]. Это предполагает, что
индуцированное алкилированием изменение в последовательности
оснований ДНК могло бы быть ответственным за инициацию
неоплазии. В большинстве случаев места алкилирования основа-
ний ДНК локализуются в пределах областей молекулы, подчиня-
ющихся правилу спаривания оснований по Уотсону—Крику.
Данный факт стимулировал исследования по выявлению воз-
можных мискодирующих свойств этих модификаций. Способность
модифицированных оснований вмешиваться в спаривание осно-
ваний зависит, однако, от разнообразных факторов, особенно
от способности к образованию стабильной пары оснований с ком-
плементарными или некомплементарными основаниями. В некото-
рых случаях природа мутаций, вызванная этими агентами, ука-
зывала, какие именно основания ДНК вовлечены.
Поскольку пока еще невозможно изменять мискодирующий
эффект in vivo, были разработаны различные in vitro методы
для бесклеточного синтеза полипептидов или полинуклеотидов
с использованием синтетических матриц, содержащих модифици-
рованные (измененные) основания. Удалось установить, что
присутствие 7-метилгуанина в ДНК не ведет к мискодирующим
событиям. Кроме того, данные опытов in vivo показывали, что
наличие 7-метилгуанина в ДНК обычно не стимулирует процессы
репарации.
Демонстрация алкилирования Оь в гуанине и предсказанное
свойство продукта вызывать ошибочное спаривание породили
гипотезу, что Об-алкилгуанин мог бы иметь отношение к канцеро-
генному и мутагенному эффектам N-нитрозосоединений [Lo-
veless А., 1969]. Это было подкреплено результатами опытов,
в которых кополимеры, содержащие цитидиловую и О6-метил-
гуаниловую кислоты, были использованы как матрицы для РНК-
полимеразы; наблюдавшееся аномальное включение УМФ и
в меньшей степени АМФ привело к заключению, что О6-метил-
гуанин не образует стабильной пары оснований с цитозином.
Однако при использовании индуцированной этилметансульфона-
том реверсии бактериофага было найдено, что частота мутаций,
индуцированных в специфическом локусе для каждого присут-
ствующего О6-этилгуанина, была примерно 0,35. В соответствии
с этой величиной эффективность мискодинга О6-метилгуанина
в кополимерах ДНК была определена и достигала примерно 40 %,
если концентрации мононуклеотидов не ограничивали скорость
полидезоксирибонуклеотидного синтеза. Однако, когда концентра-
125
ция дезоксицитидинтрифосфата была уменьшена, частота миско-
динга увеличивалась.
Хотя наряду с проявлением мискодирующего действия О6-
алкилгуанин может вступать в спаривание с нормальным партне-
ром, этому продукту приписывают биологическую роль в свете
большого числа экспериментальных данных, отмечающих корреля-
цию его образования или персистенции в ДНК некоторых органов
с чувствительностью к индукции опухолей N-нитрозосоединениями
и родственными алкилирующими агентами.
Другой минорный продукт алкилирования гуанина — 3-алкил-
гуанин. Хотя предполагалось образование стабильной пары осно-
ваний между 3-алкилгуанином и тимином, это не было подтвер-
ждено опытами in vitro по мискодингу. Однако демонстрация
факта вырезания этого продукта из ДНК in vivo указывает
на то, что его присутствие в ДНК могло бы быть повреждающим.
Главный цитозиновый продукт, 3-алкилцитозин, как в поли-
рибо-, так и в полидезоксирибонуклеотидных матрицах позволяет
происходить некомплементарному включению УМФ или АМФ
в ходе пол и рибонуклеотидного синтеза. Было подчеркнуто биоло-
гическое значение этого фактора, в частности, в мутации вируса
табачной мозаики.
С другой стороны, заключили, что 3-метилцитозин не миско-
дирует в ДНК-полимеразной системе, так как не обнаруживали
ошибочного включения аденина в продукт, если в качестве мат-
рицы использовали метилированную диметилсульфатом или ме-
тилнитрозомочевиной поли (дезоксигуаниловую — дезоксицити-
диловую кислоту). Возможно, метильная группа в 3-м положении
цитозина, в более суровых условиях репликации ДНК, стерически
предотвращала образование стабильной пары оснований. Хотя
небольшие количества 3-метилцитозина образуются в ДНК in vivo,
неизвестно, является ли это основание объектом активного про-
цесса вырезания; предположение, что алкилирование цитидина
в Оппозиции может вызывать ошибочное спаривание, также
нуждается в подтверждении.
После алкилирования ДНК метилнитрозомочевиной идентифи-
цированы небольшие количества О4-метилтимидина и показано
образование О4-алкилтимидин: гуаниновых пар оснований. Можно
было думать, что О4-метилтимидин также способен мискодировать
в ходе синтеза ДНК. В проведенных опытах степень ошибоч-
ного включения дезокси-ТМФ оказалась прямо пропорциональной
содержанию полимера О4-метилтимидина. Хотя 3-метилтимидин
также присутствовал в этих матрицах, не было указаний на то,
что он ответствен за включение некомплементарных оснований
в опытную систему.
Что касается опытов in vivo, еще не доказано, что алкили-
рование ДНК способно вызывать мискодирование, и пока не
установлено, в какой мере механизмы, обеспечивающие правиль-
ное спаривание, могут элиминировать это нарушение.
126
Алкилирование и репарация повреждений ДНК в канцероген-
ном эффекте. В изучении действия N-нитрозосоединений большую
роль в последние годы сыграли исследования механизмов обра-
зования алкилирующих интермедиатов и их последующего
взаимодействия с клеточными компонентами. Это привело к воз-
никновению гипотезы о том, что многие специфические биологи-
ческие эффекты, вызываемые алкилирующими агентами, обуслов-
лены их реакциями с нуклеиновыми кислотами.
Хотя имеются лишь ограниченные знания о взаимодействии
N-нитрозосоединений с клеточными компонентами, такими как
белки, углеводы и липиды, многие продукты начальной реакции
с нуклеиновыми кислотами теперь хорошо идентифицированы. Эти
исследования ясно показали, что из химических агентов, способ-
ных метилировать или этилировать нуклеиновые кислоты, те,
которые действуют более интенсивно на атомы кислорода, на-
пример N-нитрозосоединения, являются сильными канцерогенами.
Уже известно, что некоторые продукты алкилирования оснований
нуклеиновых кислот являются потенциальными промутагенами,
однако реакция в других местах может иметь сходные эффекты
и требует в этом отношении специальной оценки.
Начальная скорость реакции в этих местах нуклеиновых
кислот может дать лишь частичное объяснение различной ткане-
вой специфичности индивидуальных алкилирующих агентов. Од-
нако обнаружение того факта, что некоторые продукты алкили-
рования ДНК могут избирательно освобождаться из ДНК энзи-
матическими механизмами, направили исследования на выяснение
возможности существования более определенной взаимосвязи
между персистенцией продуктов алкилирования in vivo и ткане-
специфической индукцией опухолей. Указанный подход показал,
что существуют значительные вариации в способности клеток
различных тканей удалять определенные виды алкилирующих про-
дуктов из ДНК и что это могло бы в ряде случаев являться
решающим фактором в индукции опухолей алкилирующими
агентами.
В настоящее время отмечаются лишь полуколичественные за-
кономерности, заключающиеся в том, что главными тканями-
мишенями являются те, в которых специфическое промутагенное
повреждение персистирует длительные периоды времени или оно
накапливается в большей степени. Эта закономерность проявля-
ется особенно четко при сравнении тканей, являющихся мише-
нями, и тканей, не являющихся мишенями, у крыс и хомяков.
В ситуациях, где не наблюдается очевидной корреляции, другие
факторы могут играть значительную роль, однако судьба и функ-
ция других потенциально промутагенных поражений требуют изу-
чения в свете варьирующей способности различных видов и линий
животных репарировать повреждения ДНК.
Пока нет достаточных экспериментальных оснований пред-
полагать, что деалкилазы или какие-то опосредуемые N-глико-
127
зидазой или фосфодиэстеразой ступени участвуют в удалении
продуктов алкилирования из клеток млекопитающих. Однако,
по аналогии с бактериальным энзимом эндонуклеазой II, реакции
депуринизации должны рассматриваться как более предпочтитель-
ные в качестве начального события процесса репарации.
Ситуация еще более усложнилась после установления воз-
можности того, что различные ферменты или системы могут
участвовать на различных уровнях повреждения и общая эффек-
тивность системы вырезания может быть изменена целым рядом
разнообразных факторов. Обстоятельства (условия), которые
позволяют избирательно изменять эффективность процесса репа-
рации, могут предоставить средства более глубокого проникно-
вения в механизм функционирования этих важных ферментных
систем.
В итоге может быть сделан общий вывод о том, что необходимы
дальнейшие исследования для выяснения пути, каким продукты
реакции канцерогенов вызывают проканцерогенные эффекты ДНК
и как они сами распределяются в ДНК.
До сих пор изучение продуктов алкилирования in vivo осно-
вывалось на определении в целых тканях, однако было бы зна-
чительно ценнее выяснить корреляцию между алкилированием
и репарацией в тех субпопуляциях клеток, которые дают начало
опухолям. Дальнейшие успехи в данной области будут зависеть
от разработки чувствительных методов измерения малых ко-
личеств продуктов реакции, например иммунотестов или жид-
костной хроматографии. Это позволит проследить реакции в сре-
зах, препаратах хромосом или в популяциях избранных клеток,
полученных путем фракционирования тканей.
В исследовании канцерогенеза, вызываемого N-нитрозосоеди-
нениями и родственными химическими агентами, изучение меха-
низма и продуктов реакций с нуклеиновыми кислотами послу-
жило необходимой основой дальнейшего прогресса. Главным успе-
хом явилось распознание реакций репарации, которые позволили
объяснить тканевую специфичность канцерогенных агентов. Даль-
нейшее изучение указанных энзиматических систем может иметь
первостепенное значение в понимании молекулярных процессов,
имеющих отношение к инициации канцерогенеза. Хотя эти иссле-
дования находятся в начальной стадии, они ясно демонстрируют
то, что события на молекулярном уровне могут быть скоррели-
рованы с биологическими эффектами in vivo.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В области изучения канцерогенеза, индуцируемого химиче-
скими соединениями, за последние два десятилетия достигнуты
впечатляющие результаты.
Химические соединения (промышленного, бытового назначения
и естественного происхождения) представляют в современном
128
человеческом обществе неотъемлемую часть его существования.
Число зарегистрированных химических веществ исчисляется на
сегодня миллионами и продолжает стремительно увеличиваться
ежегодно. Многие химические агенты, с которыми так или иначе
соприкасается человек, являются опасными для его здоровья
и даже жизни. К таковым относятся вещества, вызывающие зло-
качественные новообразования, — химические канцерогены.
Компетентные специалисты и авторитетные специализирован-
ные международные организации полагают, что 80—90 % всех
злокачественных опухолей у человека могут быть обусловлены
факторами среды, в первую очередь'химическими веществами.
Известно более 1000 химических соединений, вызывающих опу-
холи у животных, причем есть основания подозревать их анало-
гичное действие и на человека.
К наиболее распространенным и активным химическим канце-
рогенам можно отнести следующие: 1) полициклические арома-
тические углеводороды (7,12-диметилбензантрацен, 3,4-бензпирен,
20-метилхолантрен и др.); 2) гетероциклические ароматические
углеводороды (1,2,5,6-дибензакридин,'1,2,5,6- и 3,4,5,6-дибензкар-
базол и др.); 3) ароматические амины (2-нафтиламин, 4-амино-
дифенил, бензидин и др.); 4) аминоазосоединения (ортоамино-
азотолуол, 4-диметиламиноазобензол); 5) нитрозосоединения
(диметилнитрозамин, диэтилнитрозамин, М-метил-№-нитро-1М-
нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина и др.); 6) афлатоксины;
7) прочие (уретан, этионин, СС14, хлорэтиламины, пластмассы,
металлы и др.).
Одни группы веществ, например ПАУ, обладают главным
образом местным действием (кожа, подкожная клетчатка),
другие (аминоазосоедйнения, ароматические амины) оказывают
резорбтивное действие, они вызывают опухоли в отдаленных от
места введения чувствительных органах.
При рассмотрении структуры упомянутых веществ поражают
их разнообразие, иногда совершенно различная природа, раз-
мер молекул, химическая инертность многих из них, иногда отсут-
ствие корреляции между канцерогенной и мутагенной актив-
ностью. Все эти кажущиеся противоречия и парадоксы сейчас
в основном объяснены, в чем немалая заслуга супругов Е. Miller
и J. Miller (США), их учеников и последователей. Суть их
концепции сводится к следующему.
Форма химического вещества, которая в конечном счете реаги-
рует с макромолекулами клетки (так называемый конечный
канцероген), должна содержать реактивный электрофильный
(т. е. электрондефицитный) атом, который может взаимодейст-
вовать со многими нуклеофильными (т. е. обогащенными электро-
нами) центрами в полинуклеотидах и белках. Важные электро-
фильные центры включают: ионы карбония, свободные радикалы,
эпоксиды, некоторые металлические катионы, азот в эфирах
гидроксиламинов и гидроксамовых кислот и др. Все канцерогены,
9
129
которые сами не являются электрофилами, в тканях метаболи-
зируются до таковых.
Особое значение в осуществлении канцерогенного эффекта
химических соединений в настоящее время придается реакции
конечных канцерогенов с нуклеиновыми кислотами. Это объяс-
няется, прежде всего, тем, что нуклеиновые кислоты пред-
ставляют основу генетического материала клетки и всякие нару-
шения в структуре последнего должны повлечь за собой те или
иные наследственные изменения. Это обстоятельство особенно
важно в свете того факта, что на уровне клетки неопласти-
ческое состояние генетически наследуется.
Одним из наиболее важных результатов работ в области
химического канцерогенеза в последние годы явилось заключение
о том, что химические канцерогены требуют активации в теле
хозяина, прежде чем они трансформируют клетку. Стал четко
вырисовываться и основной принцип химического канцерогенеза.
Он сводится к утверждению, что химическое вещество, чтобы
вызвать трансформацию, должно необратимо реагировать с кле-
точными макромолекулами, т. е. ДНК, РНК, белками.
Ряд канцерогенов, например Р-пропиолактон, являются алки-
лирующими агентами и легко реагируют с нуклеиновыми кисло-
тами. Однако большинство канцерогенов представляют собою
сравнительно инертные вещества (ПАУ, ароматические амины,
нитрозамины) и нуждаются в активации. По иронии судьбы эн-
зимы, активирующие в организме химические канцерогены, —
это те же, чьей первичной позитивной функцией являются детокси-
кация и удаление чужеродных химических веществ. Наиболее
важной из них является серия окислительных ферментов под об-
щим названием микросомальных многоцелевых (полифункцио-
нальных) оксигеназ. Ими особенно богаты печень и почки, где
чужеродные вещества накапливаются.
Во многих случаях «конечными» канцерогенами оказались
эпоксидные дериваты так называемой К-зоны (области с высокой
плотностью электронов, связанные с изолированными фенантре-
ноидными двойными связями). Это было показано для ПАУ.
Удалось продемонстрировать, что эпоксиды К-зоны являются
также и мутагенами. Вообще существенную роль в толковании
механизма химического канцерогенеза сыграло доказательство
того факта, что все канцерогены являются, как правило, мута-
генами, т. е. веществами, вызывающими мутации путем модифика-
ции (определенных изменений) структуры ДНК.
Расшифрованы и иные механизмы превращения канцерогенов
из неактивных форм в активные (конечные канцерогены).
Мало известно, что происходит после активации канцерогенов,
однако накапливаются данные о взаимодействии конечных
канцерогенов с нуклеиновыми кислотами. Уже расшифрован ряд
продуктов взаимодействия активных канцерогенов с ДНК. Их
называют аддуктами. В большинстве, они представляют собой
130
алкилированные азотистые основания. Естественно рассматривать
возникновение и действие этих продуктов реакции электрофилов
химических соединений с нуклеофилами нуклеиновых кислот как
причину точковых или иных мутаций. Данная констатация
приобретает особое значение в свете новейших данных теорети-
ческой онкологии о превращении клеточных протоонкогенов
в онкогены. Как будет видно из последующих разделов книги,
именно точковые мутации в определенных позициях оснований
нуклеиновых кислот, в месте локализации клеточных трансфор-
мирующих последовательностей, протоонкогенов, индуцируют цепь
событий, результирующихся в малигнизацию.
В научно экспериментальном плане химические канцерогены
представляют неоценимое средство изучения механизмов канцеро-
генеза. Достаточно сказать, что с их помощью у животных можно
моделировать все основные типы опухолей. Так, например, с по-
мощью лишь одного класса соединений (нитрозаминов) можно
получить: опухоли мочевого пузыря (дибутилнитрозамином), рак
пищевода (N-нитрозометилаланином), опухоли желудка (N-ме-
тил-1Ч'-нитро-1Ч-нитрозогуанидином), опухоли ЦНС (нитрозоме-
тилмочевиной), печени (диэтилнитрозамином, диметилнитрозами-
ном) и др. С помощью нитрозаминов можно вызвать опухоли
у самых разнообразных типов животных: рыб, амфибий, рептилий,
птиц, млекопитающих, включая обезьян.
При всем прогрессе наших знаний в этой области и огромных
усилиях исследователей, занимающихся химическим канцерогене-
зом, нельзя не отметить, однако, что при несомненных конкрет-
ных, частных успехах точный молекулярный механизм действия
канцерогенных веществ все еще не раскрыт. Если уточнить эту
мысль, следует сказать, что много сделано в уяснении отдельных
реакций и процессов первых этапов канцерогенеза — до момента
структурно-химической модификации ДНК, т. е. в расшифровке
метаболической активации канцерогенных агентов и их взаимо-
действия с клеточными макромолекулами. Однако дальнейшее
проникновение в механизм клеточной трансформации и малигниза-
ции замедлилось, если не приостановилось. Все последующие
события, связанные с воплощением химических реакций в био-
логические эффекты трансформации и малигнизации, остаются
нераскрытыми. Нового «прорыва» в теории химического канцеро-
генеза, как и онкогенеза вообще, можно, по-видимому, ожидать
от соприкосновения и взаимопроникновения всей богатой инфор-
мации, полученной в ходе изучения действия химических канцеро-
генных соединений с новейшими достижениями теоретической он-
кологии в других направлениях, особенно в области онковирусо-
логии, молекулярной биологии и молекулярной генетики опухолей,
как и процесса канцерогенеза. Успехи этих направлений теорети-
ческой онкологии привели к открытию так называемых онко-
генов, существование которых, возможно, станет основой разра-
ботки универсальной концепции онкогенеза.
9*
131
ГЛ AB A 3
ВИРУСНЫЙ ОНКОГЕНЕЗ
И ЕГО МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ
Значительный вклад в становление и развитие общей теории
канцерогенеза внесло изучение молекулярных механизмов транс-
формации клеток онкогенными вирусами. Достоинство и преиму-
щество опухолеродных вирусов по сравнению с другими канцеро-
генными агентами в изучении онкогенеза заключаются, во-первых,
в скоротечности индуцируемого ими биологического действия;
во-вторых, в способности опухолеродных вирусов поражать широ-
кий круг позвоночных, а также клеточных популяций; в-третьих,
в относительной простоте генетической структуры этих вирусов,
позволяющей проводить точную молекулярно-биологическую рас-
шифровку механизма индуцируемого вирусами процесса клеточ-
ной трансформации и малигнизации.
Во всех случаях вирусиндуцированного канцерогенеза онко-
генные вирусы внедряют в инфицированную клетку свой геном,
в том числе и трансформирующий ген (вирусный онкоген, v-onc),
продукт которого инициирует и поддерживает трансформирован-
ное состояние клетки-мишени [Альтштейн А. Д., 1973; Vogt Р.,
1972; Todaro G., Huebner R., 1972; Hanafusa H. et al., 1972,
1973, 1974; Hayward W. et al., 1981].
Онковирусология в наши дни представляет собой большую
самостоятельную науку, которая включает учение о двух типах
опухолеродных вирусов, различающихся, в первую очередь,
по химическому составу их генома: 1) ДНК; 2) РНК. Каждая
из этих групп многочисленна, имеет свою специфику биологиче-
ского действия, молекулярного механизма индукции опухолей,
сложности структурной организации вирионов.
Объем и задачи данной книги не позволяют рассмотреть
оба указанных типа онкогенных вирусов. Детальному анализу
подвергнется лишь один из них — РНК, РНК-содержащие опухо-
левые вирусы или ретровирусы. Это объясняется тем, что иссле-
дования, прежде всего, этого типа онковирусов привели к пора-
зительным открытиям последних лет в области понимания моле-
кулярного механизма действия не только онкогенных вирусов,
но и других канцерогенных агентов. Именно в недрах онковирусо-
логии, в частности при изучении онкогенных ретровирусов, роди-
лись современные понятия «онкоген», «онкобелок» и др., которые
составляют фундамент современной теоретической (молекуляр-
ной) онкологии. Тем не менее мы считали необходимым в этой
главе кратко остановиться также на роли вирусов герпеса в воз-
никновении некоторых форм неопластических заболеваний чело-
века.
Содержание ретровирусологии со времени ее зарождения в на-
чале века претерпело серьезные изменения. Поначалу имел место
132
период открытия новых вирусов, период изучения их биологи-
ческого действия и морфологии, а также ультраструктуры.
За последние годы произошел резкий крен в сторону анализа моле-
кулярной структуры вирусных частиц и изучения молекулярного
механизма их биологического действия. Этот второй этап был бы
невозможен без первого, равно как первый был бы лишен логи-
ческого завершения без второго.
Своими успехами онковирусология обязана многим отечест-
венным и иностранным ученым. Исключительное значение имела
деятельность выдающегося советского исследователя Л. А. Зиль-
бера и особенно его идея об интеграции вирусного и клеточного
генетического материала. Плеяда учеников и последователей про-
должает развивать идеи Л. А. Зильбера в современных условиях.
Об успехах отечественной и мировой онковирусологии можно пол-
нее узнать в работах А. М. Дядьковой (1966), Д. Б. Голубева
и М. А. Шлянкевича (1972), А. И. Агеенко (1978), В. А. Кукайн
и соавт. (1981), Н. П. Мазуренко (1962) и, конечно, самого
Л. А. Зильбера и соавт. (1975), а также А. Д. Альтштейна
(1973), 3. А. Бутенко (1975), И. Ф. Сейца и соавт. (1982),
Ф. Л. Киселева и соавт. (1983). Имеется ряд ценных публикаций
и в зарубежной литературе [Weiss R. et al., 1982; Gerard G.,
Grandgenett D., 1980; Besrner P., 1983; Duesberg P., 1983; Rapp F.,
1984, и др.[.
Это обстоятельство избавляет нас от необходимости подробно
излагать отдельные аспекты вирусологии и вирусного онкогенеза
и оправдывает авторов данной книги перед читателями за неиз-
бежную порой лаконичность отдельных разделов книги.
КЛАССИФИКАЦИЯ ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ
Как уже отмечалось, онкогенные (опухолеродные) вирусы
подразделяются, согласно их молекулярной структуре генома,
на две категории: первая, содержащая в качестве генома ДНК;
вторая — РНК [Fenner F., 1975]. Онкогенные вирусы, обладаю-
щие ДНК-геномом, распределяются по нескольким группам, не-
которые члены которых обладают свойствами, позволяющими рас-
сматривать их как действительно онкогенные. Такие вирусы
способны индуцировать опухоли у позвоночных, а также трансфор-
мировать культуры клеток. К ДНК-содержащим онкогенным виру-
сам относятся паповавирусы, аденовирусы, герпесвирусы и вирусы
гепатита (гепаднавирусы) [Tooze J., 1980; Galloway D., McDou-
gal J„ 1983].
Напротив, онкогенные РНК-содержащие вирусы являются чле-
нами одной общей таксономической группы — семейства Retro-
viridae, или ретровирусов [Fenner F., 1975]. Это семейство
включает все вирусы, имеющие в качестве генома РНК и содер-
жащие фермент РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную
транскриптазу).
133
Семейство Retroviridae [Fenner F., 1975] подразделяется на
три подсемейства: 1) Oncovirinae, включающее все онкогенные
и многие неонкогенные, но близкородственные вирусы; 2) Lentivi-
rinae, «медленные» вирусы, такие, например, как визна; 3) Spuina-
virinae, «пенящие» вирусы, которые вызывают у животных перси-
стирующие инфекции без клинических проявлений [Weiss R. et al.,
1982; Brahic M., Haase A., 1981]. «Пенящие» вирусы служат
удобной модельной системой для изучения хронических вирусных
заболеваний. «Медленные» вирусы вызывают специфические
хронические неврологические заболевания [Brahic М., Haase А.,
1981].
ОБЩИЕ СВОЙСТВА РЕТРОВИРУСОВ
Все ретровирусы имеют некоторые общие химические, био-
физические и морфологические свойства, что позволило отнести
их к одному семейству.
Вирионы разных групп ретровирусов имеют сходный хими-
ческий состав. Они содержат примерно 60—70 % белков: в их
числе продукты генов (gag—внутренние структурные белки,
ро! — обратная транскриптаза и env — белки вирусной оболочки);
35—40 % липидов (происходящих из клеточной мембраны);
2—4 % углеводов и примерно 1 % РНК [Levin W., Rosenak М.,
1976; Eisenman R., Vogt V., 1978]. По физико-химическим свойст-
вам различные ретровирусы также весьма однородны. Их плот-
ность в градиентах сахарозы составляет 1,16—1,18 г/мл, а в хло-
риде цезия — 1,16—1,21 г/мл. Ретровирусы чувствительны к раст-
ворителям липидов, детергентам и тепловой инактивации (56 °C,
30 мин), однако они высокорезистентны к УФ- и рентгеновскому
облучению.
По ультраструктуре (морфологии) ретровирусы подразделя-
ются на 4 типа: А, В, С и D [Быковский А. Ф. и др., 1983;
Weiss R. et al., 1982].
Геномная РНК ретровирусов («плюс»-цепь РНК, или поло-
жительный геном) представляет собой 60—705-димерный комп-
лекс двух идентичных субъединиц размером 8—10 тысяч основа-
ний (т. о.), которые по своей структуре соответствуют молекуле
иРНК [Chien V.-H. et al., 1980; Loevinger G., Schochetman G.,
1980]. Кроме геномной РНК, в 60—705-комплекс входят 2 моле-
кулы клеточной тРНК. Так, тРНК пролина обнаружена в вирусах
лейкозов мышей, а также в вирусах лейкозов кошек и сарком
шерстистых обезьян; тРНК триптофана — в вирусах лейкоза птиц;
тРНК лизина — в вирусе рака молочных желез мышей [Gerard G.,
Grandgenett D., 1980]. Каждая молекула геномной РНК имеет
на 5'-конце кэппирующую группу, «шапочку» (гл7 Gppp, cap),
а на З'-конце — полиаденилатный тракт (поли А). Две субъеди-
ницы 60—705-комплекса соединены водородными связями взаимо-
комплементарных 5'-концов, там же располагаются последова-
134
тельности, родственные тРНК-затравке [Keith J. et al., 1974;
Coffin J., 1982].
Геном компетентных по репликации ретровирусов состоит из
следующих идентифицированных областей:
R—короткая последовательность (20—80 нуклеотидов), по-
вторяющаяся на обоих концах вирусной РНК. Она используется
в процессе репликации, обеспечивая перенос вновь синтезирован-
ной цепи (фрагмента) ДНК и ДНК-полимеразы с 5'-конца на
З'-конец генома [Coffin J., 1980; Boone L., Skalka A., 1981];
Us— определяемая как область (80—100 нуклеотидов) уни-
кальных последовательностей, отделяющая R от сайта связывания
затравки (primer-binding—РВ);
РВ(—) —сайт связывания тРНК-затравки для синтеза нега-
тивной цепи ДНК. Он комплементарен 16—19 нуклеотидам
участка затравки З'-терминатора [Coffin J., 1980];
L — нетранслируемые последовательности (около 250 нуклео-
тидов в случае вируса саркомы Рауса — ВСР), предшествующие
кодирующей области для вирусных белков. Они содержат после-
довательности, необходимые для упаковки геномной РНК в вири-
оны. R, Us, РВ(—), большинство или все L являются частью
лидирующих последовательностей, которые лигируются с субге-
номными РНК при помощи сплайсинга (например, с иРНК env
и src) [Coffin J., 1980; Dhar R. et al., 1980; Weiss S. et al., 1981];
gag — область (около 2 т. с.), кодирующая внутренние струк-
турные белки вириона. В результате трансляции этих последова-
тельностей образуется высокомолекулярный полипротеин-пред-
шественник (precursor polypeptide — Рг), который затем подвер-
гается «нарезанию», образуя зрелые белки [Eisenman R., Vogt V.,
1978];
pol — область (около 3 т. о.), кодирующая вирусную РНК-
зависимую ДНК-полимеразу с ее различными энзиматическими
активностями. Трансляция, по-видимому, осуществляется одно-
временно с обоих генов — gag и pol, в результате чего синте-
зируется предшественник с молекулярной массой 180—200 кило-
дальтон (кд), впоследствии подвергающийся процессированию,
образуя один или два полипептида [Gerard G., Grandgenett D.,
1980; Coffin J., 1982];
env — область (около 2 т. о.), кодирующая белки, находящиеся
на поверхности вирусной оболочки. По крайней мере один из них
гликолизирован. Транслируются эти белки на матрице иРНК,
прошедшей сплайсинг. Предшественник, синтезированный на этой
иРНК, также подвергается процессингу в два зрелых белка
[Klementz R., Diggelmann Н., 1978];
src-Последовательность найдена только в ВСР. Эта область
(2,2 т. о.) ответственна за быструю трансформацию инфици-
рованных фибробластов in vitro и не требуется ретровирусу для
репликации. На субгеномной, подвергнутой сплайсингу иРНК
синтезируется фосфопротеин (phosphopolypeptide — рр) с молеку-
135
лярной массой 60 кд, имеющий протеинкиназную активность.
Мутанты, которые утрачивают src-функцию и большую часть гена,
но не весь ген, с высокой частотой возникают в процессе пассиро-
вания вируса на клетках. Эти вирусы получили название дефект-
ных по трансформации (td-мутанты);
PB(-f-) —участок идентифицирован на 5'-конце Из-области,
содержит сайт начала синтеза позитивной цепи вирусной ДНК,
хотя затравка для этой реакции неизвестна. Эта область богата
пуринами и содержит высококонсервативные последовательности,
гомологичные у неродственных ретровирусов [Coffin J., 1982];
Из — область располагается между РВ(-|-) и R недалеко
от З'-конца генома и представлена дважды в интегрированном
и неинтегрированном провирусе. Она варьирует в размере от
0,2 до 1,0 т. о. у различных вирусов. Одна копия Из распола-
гается к 5'-концу сайта инициации транскрипции и содержит
промотер транскрипции [Yamamoto Н. et al., 1980];
U5R — иногда называется как «strong-stop-область»;
LTR — длинный концевой повтор, представляет собой комбина-
цию последовательностей U3RU5 геномной РНК в линейной и
кольцевой формах ДНК провируса.
Порядок расположения трех репликативных генов у всех ретро-
вирусов идентичен: 5' — gag-pol-env — 3' [Coffin J., 1980]. Геном
ряда онкогенных ретровирусов содержит последовательности,
необходимые для проявления их онкогенных свойств. Эти после-
довательности получили название onc-гены (онкогены). Поэтому
расположение генов одного из представителей остротрансфор-
мирующих ретровирусов кур — ВСР может быть представлено
в следующем виде: 5' — gag-pol-env-src — 3'. Однако в опухолях
наиболее часто встречаются ретровирусы с иной локализацией
онкогена в геноме. В этом случае онкогенность ретровируса
сопровождается дефектностью по репродукции вируса в клетках,
поскольку они обычно при этом утрачивают значительные области
генов gag, pol и (или) env, сохраняя неизмененными LTR.
Большинство, если не все онкогены ретровирусов имеют гомо-
логов, т. е. близкородственные последовательности в геноме
нормальных клеток. опс-Специфические последовательности кле-
точного генома топографически не связаны с эндогенными после-
довательностями ретровирусов, что может указывать на необхо-
димость рекомбинационных событий для трансдукции клеточных
онкогенов в вирусный геном. Более подробные сведения о моле-
кулярной структуре онкогенных ретровирусов можно найти в рабо-
тах Ф. Л. Киселева и соавт. (1983) и J. Coffin (1980, 1982).
В структурном отношении организация генома онкогенных
ретровирусов изучена достаточно полно. В ближайшие годы,
по-видимому, основные усилия будут направлены на уточнение
механизмов транскрипции и трансляции вирусной онкогенной ин-
формации, что имеет первостепенное значение для понимания
процесса трансформации клеток этими агентами.
136
РЕПЛИКАЦИЯ РЕТРОВИРУСОВ
Прошло уже около полутора десятков лет, как утвердилось
мнение о необходимости в репродуктивном цикле ретровирусов
стадии промежуточного синтеза ДНК. Различные аспекты
репликационной схемы: РНК-* ДНК-*-РНК-*белок были изучены
за этот период весьма детально. В первую очередь это относится
к механизмам синтеза ДНК-провируса, т. е. к транскрипции
вирусной РНК в ДНК с помощью фермента обратной транскрип-
тазы. В настоящее время исследователи могут проследить бук-
вально по часам ход реализации генетических программ при репро-
дукции ретровирусов. Однако многие молекулярно-биологические
события этого процесса все еще остаются недостаточно ясными.
Н. Temin (1964) первым высказал предположение о том,
что для репродукции и трансформации клеток, инфицированных
ретровирусами, необходим синтез ДНК, и обосновал это пред-
положение экспериментально. В последующем указанное положе-
ние было многократно подтверждено [Bader J., 1965; Baluda М.,
1972]. Решающую роль при этом сыграло открытие в очищенных
вирионах ВСР и других ретровирусов ферментной системы обрат-
ной транскрипции, непосредственно осуществляющей синтез ДНК-
копии генома. Оно явилось прямым доказательством провирусной
гипотезы [Temin Н., Baltimore D., 1972]. Методами молекулярной
гибридизации и трансфекции были получены свидетельства при-
сутствия в геноме клетки-хозяина интегрированного ДНК-про-
вируса, а также установлена его информационная емкость. Ока-
залось, что интегрированный ДНК-провирус содержит весь набор
генов, необходимый как для репродукции вирусных частиц, так
и для трансформации реципиентных клеток [Князев П. Г. и др.,
1976; Baluda М., 1972; Hill М., Hillova J., 1972; Hanafusa Н. et al.,
1974]. Эксперименты по трансфекции подтвердили также воз-
можность синтеза полноценного ДНК-провируса в бесклеточной
системе [Boone L., Skalka А., 1981; Varmus Н., 1982].
Синтез провирусной ДНК. Прежде чем перейти к обсуждению
вопросов образования провирусной ДНК, кратко рассмотрим
структуру и функцию вирусной ДНК-полимеразы, роль и свойства
затравки в этой реакции, а также формы вирусной ДНК, которые
обнаруживаются в инфицированных клетках.
Основными энзиматическими активностями продукта гена pol
являются: ДНК полимераза, способная копировать РНК или
ДНК-матрицы, и так называемая рибонуклеаза Н (РНКаза Н),
гидролизующая РНК в гибридной молекуле РНК:ДНК [Ge-
rard G., Grandgenett D., 1980; Varmus H., 1982].
В структурном отношении и по антигенным свойствам ДНК-
полимеразы различных штаммов ретровирусов отличаются друг от
друга.
ДНК-полимераза вирусов саркомо-лейкозного комплекса птиц
состоит из двух субъединиц: а — 58 кд и 0 — 92 кд [Gerard G.,
137
Grandgenett D., 1980]; анализ пептидных и аминокислотных
последовательностей фермента показал, что а- и 0-субъединицы
гомологичны, однако они в процессе обратной транскрипции
вирусного генома выполняют разную роль. Предполагается, что
0-субъединица обеспечивает взаимодействие фермента с матрицей,
а а — осуществляет транскрипцию. Образование а-субъединицы
происходит в результате процессирования 0-субъединицы протеа-
зой р15, кодируемой геном gag [Ghysdael J. et al., 1981]. В ходе
процессирования 0-субъединицы образуется также В-фрагмент,
функция которого неизвестна. При обработке а-субъединицы
химотрипсином образуется A-фрагмент, с которым связана актив-
ность РНКазы Н. Процесс обратной транскрипции генома ретро-
вирусов птиц сопровождается фосфорилированием 0-субъеди-
ницы, однако влияние этой реакции на функцию фермента не
известно [Gerard G., Grandgenett D., 1980; Moelling К. et al.,
1980].
Уникальность ДНК-полимеразы ретровирусов заключается
в том, что ее природными матрицами являются молекулы РНК.
Однако для реакции обратной транскрипции присутствия матрицы
недостаточно. Образование провируса происходит лишь в том
случае, если в реакции участвуют соответствующие молекулы
РНК-затравки (Harada F. et al., 1979; Varmus H. et al., 1979;
Gerard G., Grandgenett D., 1980]. Как и все известные ДНК-
полимеразы, обратная транскриптаза представляет собой функ-
ционально «затравказависимый» фермент. Наиболее эффектив-
ными затравками для действия фермента оказались синтетические
гомополимерные матрицы (олигодезоксирибонуклеотиды), напри-
мер поли (рЦ), олиго (дГ) и некоторые другие [Gerard G.,
Grandgenett D., 1980; Varmus H., Swanstrom R., 1982]. Естест-
венными же затравками для работы фермента служат определен-
ные тРНК. In vitro в различных системах обратной транскрипции
иРНК вирусов и клеток эукариотов могут использоваться уни-
кальные структурные свойства самих матриц для получения
ДНК транскрипта с их определенного участка. Так, наличие
полиаденилатного тракта на З'-конце иРНК позволяет в присут-
ствии затравки олиго (дТ) синтезировать гетерополимерные
участки, следующие за поли (An) [Gerard G., Grandgenett D.,
1980; Boone L., Skalka A., 1981]. Широкоиспользуемой затравкой
для синтеза высокопредставительной копии гетерологичных иРНК
служат олигонуклеотиды ДНК тимуса теленка (статистические,
усредненные, «rendom primers»).
Большое влияние на процесс транскрипции матрицы оказывают
очистка ДНК-полимеразы от РНКаз, гидролизующих матрицу, и
концентрации каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата в реак-
ции IVarmus Н. et al., 1979; Gerard G., Grandgenett D., 1980].
Функциональная роль РНКазы H в системе ДНК провируса
in vitro и in vivo изучена в меньшей степени. В последнее время
с функцией РНКазы Н стали связывать деградацию РНК-матрицы
138
в процессе синтеза (— )-цепи вирионной ДНК [Varmus Н. et al.,
1979; Gerard G., Grandgenett D., 1980]. В этих исследованиях
было установлено, что олигонуклеотиды, образующиеся в резуль-
тате действия РНКазы Н на гибридные молекулы РНК:ДНК,
могут служить в качестве затравки для синтеза второй, (-|-)-цепи
вирионной ДНК [Boone L., Skalka А., 1981; Varmus Н., Swan-
strom R., 1982]. Вероятно, в условиях in vivo данный фермент
выполняет именно такую роль.
С ДНК-полимеразой вируса миелобластоза птиц ассоцииро-
вана еще одна ферментативная активность, эндонуклеазная. Этот
фермент также располагается в коре вириона, имеет молекулярную
массу 32 кд и является продуктом процессинга р-субъединицы
ДНК-полимеразы, т. е. В-фрагментом [Gerard G., Grandgenett D.,
1980]. Этот важный фермент, связанный с провирусом, вероятнее
всего, участвует в процессе интеграции вирусной ДНК в клеточный
геном [Gerard G., Grandgenett D., 1980; Varmus H., Swanstrom R.,
1982].
Большинство молекул вирусной ДНК, синтезированной in vitro
на субъединице РНК, представляют собой короткие фрагменты
ограниченной части вирусного генома [Varmus Н. et al., 1979].
Иногда удается получить короткие транскрипты, представляющие
в сумме полную копию вирусной или гетерологичной РНК. Это
позволило успешно использовать данный метод для получения
комплементарной ДНК (кДНК) отдельных вирусных и клеточных
генов и успешно осуществить их клонирование [Maniatis Т.
et al., 1976; Boone Н., Skalka А., 1981].
Вирусная ДНК составляет небольшую часть (0,0001 % или
меньше) от всего препарата ДНК инфицированных клеток. Это
существенно затрудняло изучение биосинтетических процессов,
приводящих к образованию ДНК-провируса. Тем не менее в ходе
репродукции ретровирусов в клетке удалось определить 3 основные
формы вирусной ДНК: линейную двухцепочечную, циркулярную
двухцепочечную и ковалентно-интегрированную в геном хозяйской
клетки [Varmus Н. et al., 1979; Varmus Н., 1982].
Эти формы ДНК, как было показано в экспериментах по
трансфекции, содержат всю генетическую информацию, представ-
ленную в субъединице вирионной РНК [Varmus Н., 1982].
Количественно преобладающая линейная форма вирусной
ДНК имеет такие же размеры, как и субъединица вирионной
РНК, т. е. 5—10 тысяч пар оснований (т. п. о.). В принципе —
это полная копия провируса, т. е. ( —)-цепь вирусной ДНК,
включающая отдельные фрагменты (-[-)-цепи вирионной ДНК,
размером от нескольких сот до тысячи пар нуклеотидов. В отдель-
ных случаях эта форма ДНК может быть выявлена в виде
полностью двухцепочечной молекулы, т. е. содержащей как ( —)-
так и ( + )-цепи провируса [Varmus Н. et al., 1979].
В настоящее время известно, что последовательности не-
скольких сот нуклеотидов, расположенных на обоих концах линей-
139
R Us
5' Cap —
---------Il--------
Гены вирионной РНК
R
1--- An 3'
dp________	_______ dp
клеточ- —-4	41	   .	f ~~^—। клеточ-
наяДНК Про моте p	Провирусная ДНК	ная ДНК
Вирусная РНК
Рис. 3. Структура (а) субъединицы геномной РНК ретровирусов и схема (б)
репродукции через ДНК-провирус [Coffin J., 1980; Varmus Н., Swanstrom R., 1982J.
5'Сар — кэппирующая группа; АпЗ' — полиаденилатный тракт; R — короткие последова-
тельности; U5 — уникальные последовательности 5'-коица, которые располагаются между
РВ(—) и R: U,  - уникальные последовательности З'-коипа, расположенные между РВ( + )
и R; ip — инвертированные повторы, обрамляющие LTR с двух сторон; dp — прямые
повторы клеточной ДНК (4—6 п. о.) представлены единичной копией в «неоккупнроваи-
иом» сайте интеграции; детали размеров областей генома ретровирусов и их вариации
даиы в тексте.
ной молекулы вирусной ДНК, повторяются в одинаковой ориен-
тации (концы 5' и 3' однонаправлены). Они получили назва-
ние длинных концевых повторов — LTR [Coffin J., 1982; Temin Н.,
1982; Varmus Н., Swanstrom R., 1982]. LTR содержат после-
довательности, происходящие из гетерополимерных участков 5'- и
З'-концов вирусной субъединицы РНК (рис. 3). Как видно из
рис. 3, в LTR представлены: нуклеотидные последовательности
длиной 250—1200 пар оснований (п. о.), комплементарные уни-
кальной области З'-конца вирионной РНК (Сз-последователь-
ности); короткая единичная копия R-последовательности, обна-
руженная на обоих концах вирусной РНК, и участок длиной
80—120 п. о. уникальной области 5'-конца (Нз-последователь-
ности).
Размеры областей U3 и U5 значительно варьируют у ретро-
вирусов разных видов животных. U5 граничит в З'-направлении
с участком (сайтом), определяющим начало синтеза ( — )-цепи
ДНК, а в 5'-направлении—с R. U3 граничит в 5'-направлении
с участком (сайтом), определяющим начало синтеза ( + )-цепи
вирусной ДНК, а на З'-направлении с R (см. рис. 3). Схемати-
ческое расположение LTR в линейном провирусе можно предста-
вить следующим образом: U3RU5 — вирусные гены — U3RU5
[Kung Н. et al., 1981; Varmus H., Swanstrom R., 1982]. Секвени-
рование клонированных последовательностей LTR показало, что
140
они включают также в свой состав несовершенный инвертиро-
ванный (обратный) повтор длиной 5—22 нуклеотида, который
терминирует структуру LTR с двух сторон [Shimotohno К. et al.,
1980; Kung Н. et al., 1981; Varmus H., Swanstrom R., 1982].
Механизм образования линейной двухцепочечной формы ви-
русной ДНК in vitro в общих чертах изучен. Ряд стадий этого
процесса подтвержден в случае репродукции ретровирусов
в клетке.
Линейная форма ДНК с одинаковой эффективностью синте-
зируется в цитоплазме как ядерных, так и безъядерных клеток,
что свидетельствует о ее цитоплазматическом происхождении
[Varmus Н., 1982; Varmus Н. et al., 1982]. В дальнейшем
линейная ДНК транспортируется в ядро, где происходит превра-
щение линейной формы провируса в кольцевую.
Формирование кольцевого провируса является последним эта-
пом перед интеграцией вирусного и клеточного геномов. Про-
цесс образования кольцевой молекулы хорошо документирован,
и основная роль в нем отводится LTR. Клонирование, а затем
последующее секвенирование вирусной ДНК показали, что она
может содержать один или два LTR (см. рис. 3). В последнем
случае два LTR располагаются в прямом тандемном повторе
[Varmus Н. et al., 1979; Kung Н. et al., 1981; Varmus H.,
Swanstrom R., 1982]. Как правило, циркулярный ДНК-провирус
представляет собой мономер, хотя иногда из инфицированных
ретровирусами клеток удается изолировать и олигомерные струк-
туры [Varmus Н., Swanstrom R., 1982].
Циркулярная ДНК может быть выделена только из ядерной
фракции инфицированных клеток [Varmus Н., Swanstrom R.,
1982]. Вероятно, именно в ядре обеспечивается процесс циркуля-
ризации молекулы провируса.
Открытие циркулярной формы ДНК-провируса ретровирусов
позволило выдвинуть предположение о едином механизме интегра-
ции в геном хозяина генетического материала не только ретро-
вирусов, но и ДНК-содержащих онкогенных вирусов, таких как
паповавирусы, или, например, фага X. Для последнего были
получены строгие доказательства необходимости процесса образо-
вания кольцевой формы молекулы ДНК в период интеграции
провируса в геном хозяина. Однако на сегодня прямых доказа-
тельств существования подобного способа интеграции ретрови-
русной ДНК не существует.
В настоящее время широко распространено мнение, что струк-
тура ДНК-провируса в общих чертах напоминает структуру
транспозонов, т. е. мобильных генетических элементов, обнаружен-
ных у бактерий и у дрозофилы [Георгиев Г. П., 1983; Calos М.,
Miiller J., 1980; Dunsmuir Р. et al., 1980; Shimotohno К. et al.,
1980]. Большинство этих генетических единиц, состоящих из
нескольких тысяч неповторяющихся последовательностей, терми-
нируются прямыми и (или) обратными повторами длиной до
141
нескольких сот оснований. Бактериальный транспозирующий эле-
мент Тп9 по своей генетической структуре напоминает ДНК-
провирус. Структурная информация, состоящая более чем из
1000 п. о., фланкируется прямыми повторами размером 800 п. о.,
которые, в свою очередь, терминируются несовершенным обрат-
ным повтором размером 18—25 п. о. [Calos М., Miiller J.,
1980]. Наиболее интригующая аналогия между транспозонами
и провирусами усматривается в их способе интеграции в ДНК
хозяина. Недавно были получены данные, указывающие на то, что
интеграция провируса в клеточную ДНК сопровождается дуплика-
цией короткого фрагмента, содержащего последовательности
сайта интеграции [Dhar R. et al., 1980; Shimotohno К- et al.,
1980; Swanstrom R. et al., 1981]. Такой же феномен был обнаружен
ранее для бактериальных транспозонов: прямые фланкирующие
повторы, обычно размером 5—9 п. о. приобретаются транспозо-
ном из генома хозяина в процессе транспозиции [Calos М.,
Muller J., 1980; Shimotohno К. et al., 1980]. Аналогичная короткая
дупликация наблюдается в случае транспозиции подвижных
элементов генома дрожжей [Gafner V., Phillipsen Р., 1980]
и дрозофилы [Dunsmuir Р. et al., 1980].
Несмотря на то, что многочисленные экспериментальные дан-
ные свидетельствуют в пользу предпочтительной интеграции про-
вируса в клеточный геном через его кольцевую форму, до сих пор
в этом вопросе остаются сомнения. В частности, в специальных
опытах было показано, что присутствие двух LTR в ДНК про-
вирусе не является обязательным для интеграции последнего в кле-
точный геном, хотя известно, что именно LTR в концевых
положениях ДНК-провируса необходимы для замыкания линейной
формы в кольцевую. Иными словами, процесс интеграции про-
вируса может осуществляться без участия LTR.
Главная функция ДНК-провируса как вирусной матрицы
в клетке состоит в редупликации и обеспечении синтеза вирусных
иРНК, образование которых свидетельствует о начале стадии
экспрессии вирусного генома [Varmus Н., 1982]. Однако, прежде
чем перейти к детальному рассмотрению вопросов редупликации
и синтеза вирусных иРНК, коротко остановимся на некоторых
дополнительных функциях провируса, являющихся следствием
интеграции двух геномов. К ним относятся: мутагенез, промоция
транскрипции клеточной ДНК, онкогенез (активация прото-
онкогенов по механизму инсерции), трансдукция, транспозиция,
делеции и эксцизии.
Мутагенез. Генетические элементы, способные интегри-
роваться в различные участки клеточной ДНК, могут влиять на
экспрессию хозяйских генов. Подобный эффект может достигаться
простым нарушением физической структуры расположения генов
или влиянием на их экспрессию регуляторных элементов, распо-
ложенных в LTR провируса. Примеры указанного феномена
имеются среди фагов-мутаторов или транспозирующих элементов
142
прокариотов [Calos М., Muller J., 1980; Shimotohno К. et al.,
1980]. H. Varmus и соавт. (1981) показали мутационную способ-
ность провирусов в экспериментах по суперинфекции трансфор-
мированных вирусом саркомы Рауса клеток крыс нетрансформи-
рующим вариантом вируса лейкоза мышей. Авторы установили,
что ревертанты, имеющие морфологические характеристики нор-
мальных клеток, содержали гибридный провирус. При этом прови-
рус вируса лейкоза Молони интегрировался внутрь провируса
ВСР в 5'-участок src-гена, что приводило к нарушению экспрессии
онкогена.
Промоция транскрипции клеточной ДНК-
Промоция транскрипции клеточных ДНК и онкогенез имеют,
по-видимому, единый механизм и будут подробно рассмотрены
в гл. 4. Здесь следует лишь указать, что активация транскрипции
хозяйской ДНК, расположенной «вниз по течению» от интегриро-
ванного провируса, под влиянием вирусных LTR наблюдается
как в клетках млекопитающих, трансформированных ВСР, так
и в опухолях, индуцированных вирусами лейкоза птиц. В послед-
нем случае происходит активация протоонкогена с-тус, гомо-
логичного онкогену v-myc вируса миелоцитоматоза кур МС-29,
провирусом вируса лейкоза птиц, интегрирующимся «вверх по те-
чению» от указанного протоонкогена [Collins С. et al., 1980;
Hayward W. et al., 1981].
Онкогенез. В большинстве случаев функция провируса
в онкогенезе заключается в экспрессии его генного продукта
(см. раздел «Вирусные онкогены»). Однако вирусные онкогены
не всегда могут быть обнаружены в провирусе, который инду-
цирует онкогенез. Такие данные позволили высказать предполо-
жение о том, что позиция провируса в хозяйском геноме может
определять малигнизацию клеток-мишеней. Вскоре это положение
было подтверждено данными, полученными W. Havward и соавт.
(1981), а также другими [Rechavi G. et al., 1982].
Трансдукция. В ряде экспериментальных работ были
получены убедительные данные, свидетельствующие о возмож-
ности захвата (трансдукции) клеточных последовательностей
в вирусный геном при пассировании вируса в культурах клеток.
Прежде всего это относится к трансформирующим генам многих
ретровирусов. Механизм трансдукции сложен и до конца не изучен.
Исходя из имеющихся представлений о структуре провируса,
акт захвата клеточных генов, располагающихся рядом с провиру-
сом, маловероятен. Известные в настоящее время принципы
транскрипции провируса и обратной транскрипции вирусной
РНК налагают ряд запретов на реализацию подобного явления.
Тем не менее получены данные, свидетельствующие о том, что
частота акта трансдукции клеточных генов в провирус не столь
редкое явление. Она может даже искусственно повышаться,
например при пассировании ВСР на клетках уток и крыс [Var-
mus Н., Swanstrom R., 1982].
143
Транспозиция. Как уже отмечалось выше, структура
провируса и транспозонов прокариот в общих чертах сходна.
Однако, в отличие от последних, возможность транспозиции прови-
русов экспериментально не подтверждена. Анализ структуры
провирусов многочисленных субклонов клеток, инфицированных
и трансформированных ретровирусами [Shimotohno К. et al.,
1980; Varmus Н. et al., 1981], а также большого числа эндогенных
провирусных последовательностей отдельных особей различных
пород кур и мышей [Astrin S., 1978; Shimotohno К. et al., 1980]
свидетельствует о стабильности интеграции провируса.
Делении и эксцизии. Полные или частичные делении
транспозирующих элементов бактериального генома представляют
собой часто наблюдаемое явление [Varmus Н. et al., 1981].
Подобные делении, приводящие к удалению LTR из провирусов,
обычно левого LTR, часто встречаются среди эндогенных про-
вирусных генов птиц и экзогенных провирусов ALV в опухолях
бурсы, а также в процессе спонтанной реверсии трансфор-
мированных ВСР клеток млекопитающих в нормальный фенотип
[Hayward W. et al., 1981 ].
Эксцизии большей части провируса — также нередкое явле-
ние, наблюдаемое в различных клеточных системах, трансформи-
рованных ретровирусами. С эксцизиями внутренних репликатив-
ных генов исследователи столкнулись при анализе экзогенного
провируса ALV в опухолях бурсы у кур.
В процессе пассирования ряда трансформированных ВСР
клеточных линий крыс, хомяков и мышей также показана эли-
минация провирусных генов, включая src [Киселев Ф. Л. и др.,
1979, 1981; Varmus Н. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982].
В некоторых случаях реверсии клеток в нормальный фенотип
эксцизии сопровождались утратой не только внутренних генов
провируса, но и обоих LTR. Механизм делеций и эксцизий
вирусных генов неизвестен. Остается загадкой, экспрессией
каких генов поддерживается раковый фенотип клеток млеко-
питающих, утративших весь экзогенный провирус, включая
онкоген [Varmus Н. et al., 1981].
Таким образом, первая фаза жизненного цикла ретровирусов
в клетке заканчивается созданием провируса и его интеграцией
в клеточный геном. Доминирует в этом процессе вирускодируемая
ферментная система обратной транскрипции и, по-видимому, инте-
грации. Влияние клеточных факторов на процессы формирования
провируса в этой фазе биологического цикла несущественно.
Напротив, вторая фаза биологического цикла ретровирусов,
которая начинается с экспрессии генов провируса и заканчивается
в большинстве случаев продукцией вирусных частиц, практически
полностью осуществляется ферментными системами клеток. Этот
факт подчеркивает первостепенную важность клеточных элементов
на решающем уровне экспрессии вирусной информации. Клеточ-
ные факторы ответственны за ряд важных этапов репродукции
144
и биологической активности вирусов: синтез и процессинг
ретровирусной иРНК, репликацию самого провируса, синтез и
некоторые ступени процессинга вирусных белков.
Экспрессия вирусного генома. Ретровирусы в процессе эволю-
ции развили сложный механизм, позволяющий их генам экспресси-
роваться в клетке-хозяине. Прежде всего следует отметить раз-
личную молекулярную организацию клеточного и вирусного гено-
мов. В эукариотической клетке гены состоят из отдельных цистро-
нов (экзонов), прерывающихся некодирующими областями
(интронами). Провирусы, напротив, представляют собою мульти-
цистронную генетическую единицу, в которой индивидуальные
цистроны не прерываются некодирующими участками. Это ут-
верждение пока не подтверждено данными полного секвенирова-
ния вирусной ДНК, но находит поддержку в экспериментах
по трансляции вирионных РНК in vitro [Weiss S. et al., 1978]
и секвенированию отдельных вирусных генов [Czernilofsky А.
et al., 1980]. Ферментные системы клеток эукариотов, по-видимому,
не способны осуществлять транскрипцию отдельных генов неза-
висимо друг от друга. Результатом экспрессии любого гена явля-
ется образование про-иРНК, которая затем подвергается про-
цессингу («вырезанию* некодирующих областей) и сплайсингу
(«сшиванию» отдельных кодирующих областей). В дальнейшем
процессированная и сплайсированная иРНК полиаденилируется
на З'-конце, а на 5'-конце присоединяется кэппирующая группа.
Подобный механизм экспрессии генетической информации обнару-
жен у всех ретровирусов животных [Varmus Н., Swanstrom R.,
1982].
В этом плане экспрессия генов зависит от двух факторов:
структуры иРНК, комплементарных вирусным или клеточным
участкам генома, и расщепления первичного продукта трансляции
(полипротеина) на несколько зрелых конечных белков. В ретрови-
русах функционируют оба этих механизма. Субгеномные иРНК,
кодируемые внутренней частью вирусного генома, направляют
синтез белков, которые образуются после «разрезания» первич-
ного продукта трансляции [Eisenman R., Vogt V., 1978] и созре-
вают в ходе процессинга.
Транскрипция ДНК-провируса после его образования осущест-
вляется клеточной РНК-полимеразой II, ответственной также
за синтез клеточных иРНК. Несколько исследовательских групп
установили, что в и3-области LTR провируса находятся промотер
и сайт инициации синтеза вирусных РНК [Yamamoto Т. et al.,
1980; Swanstrom R. et al., 1981]. Последовательности, имеющие
отношение к началу транскрипции провируса, ТАТАААА, обнару-
жены также в клеточных генах [Ziff Е., Evans R., 1978]. Сигнал,
терминирующий транскрипцию, находится рядом с правым U3R-
концом (З'-концом) провируса. Он определенным образом связан
с сигналом полиаденилирования иРНК — AAUAAA [Czerni-
lofsky A. et al., 1980].
10
145
В клетках кур, инфицированных ВСР, обнаружены следующие
классы вирусспецифических иРНК: 38S, 28S и 21S длиной соот-
ветственно 9 т. о., 5,4 т. о. и 3,3 т. о. В клетках, инфицированных
вирусом лейкоза мышей, обнаружено только 2 класса иРНК:
35S и сплайсированная 22—24S [Weiss S. et al., 1978; Varmus H.,
Swanstrom R., 1982]. Продуктом гена gag ВСР является поли-
протеин с молекулярной массой 65—80 кд, транслируемый с иРНК,
неотличимой от субъединицы генома. Терминируется продукт гена
gag кодоном УАГ. Полипротеин (Pr76Bag) модифицируется путем
фосфорилирования и «разрезания» протеазами на мелкие белки
сердцевины (кора) вириона: NH2—р|9-р10-р27-р|2-р15 — СООН
[Eisenman R., Vogt V., 1978; Shealy D. et al., 1980].
Первичным продуктом гена pol является также большой
полипротеин (Prl80gaB ро1), содержащий детерминанты гена gag, —
Pr76gag. Информационная РНК для Prl80gagpo1 (ДНК-полиме-
разы) структурно не отличается от иРНК гена gag. Механизм,
при помощи которого РНК-полимераза II беспрепятственно про-
ходит терминирующий кодон УАГ, неизвестен. Предполагается,
что кодон УАГ в данном случае подвергается сплайсингу. Су-
ществует и другое объяснение подобному феномену, которое до-
пускает сборку вирионов, содержащих 38S РНК (в большинстве
случаев для гена gag и для гена pol), без терминатора [Eisen-
man R., Vogt V., 1978; Klemetz R., Diggelmann H., 1978; Coffin J.,
1980].
Ген env экспрессируется при участии субгеномной 28S РНК,
формирующейся путем сплайсинга. Предшественник белков обо-
лочки вириона gPr92eriv содержит два белка, gp85 и gp37, из чего
можно заключить, что структура гена env для белков такова:
NH2-gp85-gp37-COOH [Lewin J., Rosenak M., 1976; Klemetz R.,
Diggelmann H., 1978; Coffin J., 1982]. Как полагают, в дальнейшем
предшественник gPr92env встраивается в клеточную мембрану,
где он гликолизируется и процессируется до образования глико-
протеидов, входящих в оболочку вирионов.
Синтез опс-специфических иРНК и кодируемых ими белков
будет подробно рассмотрен в следующем разделе этой главы.
Вируспродуцирующие клетки синтезируют два типа вирусных
РНК- иРНК первого типа служат матрицей для трансляции
вирусспецифических белков, участвующих в компоновке вириона.
Другой тип — геномная РНК, которая в дальнейшем может упа-
ковываться в вирусное потомство. Выше было отмечено, что струк-
турные различия среди этих вирусспецифических РНК выявить
пока не удалось. Тем не менее различия могут быть выявлены
функционально. Например, при блокировке синтеза РНК вируса
лейкоза мышей актиномицином Д образование вирусного потом-
ства продолжается, однако вирусные частицы содержат не вирус-
ные, а клеточные иРНК [Levin J., Rosenak М., 1976]. Эти
результаты говорят о том, что геномная РНК и иРНК возникают
из разного пула вирусных РНК.
146
Таким образом, в общих чертах принципы экспрессии ретро-
вирусных генов известны. В будущем предстоит более детально
изучить те области провируса, которые участвуют в регуляции
второй из упомянутых ранее двух фаз экспрессии вирусного
генома. Выше было отмечено, что этот второй этап репродукции
вирусного генома в большей степени зависит от ферментных
систем, метаболизма и других факторов клетки. Действительно,
влияние клеточных факторов на экспрессию генетической инфор-
мации ретровирусов велико. Особое внимание исследователей
в настоящее время привлечено к изучению экспрессии опс-специ-
фических участков (онкогенов) вирусного и клеточного геномов.
Это понятно, так как именно с экспрессией онкогенов включаются
механизмы, приводящие клетку к трансформации. Поскольку
в структурном отношении онкогены существенно отличаются друг
от друга, вполне вероятно, что и механизмы их экспрессии
имеют индивидуальные черты. В целом экспрессию вирусных
онкогенов следует рассматривать как результат активации и
функционирования гибридного генома провируса и клетки.
СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ОНКОГЕНОВ РЕТРОВИРУСОВ
Вирусы, обладающие опс-последовательностями (онкогенами),
были изолированы как минимум от шести видов животных. Срав-
нение опс-областей генома этих вирусов при помощи молекулярной
гибридизации, фингерпринтного анализа олигонуклеотидов и пеп-
тидного картирования соответствующих онкобелков показало, что
более 20 неродственных клеточных генов являются донорами
(прародителями) вирусных онкогенов [Cooper G., 1982; Bishop J.,
1982, 1983; Weinberg R., 1982; Land H. et al., 1983; Swanstrom R.
et al., 1983]. Для того чтобы различать определенные трансфор-
мирующие элементы вирусного генома, стали использовать трех-
буквенные обозначения каждого из онкогенов. Эта номенклатура
опс-последовательностей получила широкое распространение и
принята повсеместно. Обозначение трансформирующих последо-
вательностей происходит от названия вируса, в котором впервые
трансформирующие последовательности были обнаружены, и не
означает их специфичности для клетки-мишени или функции онко-
белка. Поскольку родственные, но неидентичные вирусные онко-
гены часто обнаруживаются в независимых вирусных изолятах,
их название соответствует первоисточнику, к которому добавля-
ется лишь сокращенное наименование вирусного штамма [Coffin J.
et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982].	•
Вирусные и родственные им клеточные последовательности
обозначают следующими сокращениями: «V» — вирусный и «с» —
клеточный онкогены. Если название онкогена представлено без
префикса, то это свидетельствует о его вирусном характере.
В отечественной литературе для обозначения вирусных и клеточ-
ных трансформирующих последовательностей наиболее часто упо-
ю*
147
Таблица II
148
Трансформирующие гены (онкогены)
[Weinberg R., 1983; Bishop J., 1983; Hunter T., 1984]
Онкогены	Источник изолирования	Животное- н китель	Индуцируемая опухоль или злокачественный процесс	Локализация в хромосомах		Онкобелки		
				человека	мыши	Молекулярная масса (кд) и генетическая структура	Локализация	Свойства
src	Вирус саркомы Рауса	Куры	Саркома	20	2	pp60src	Плазмати- ческая мем- брана	Фосфотиро- зинкиназа
yes	Вирус саркомы Яма- гуши	>	»	—	—	P90gagyes	To же	То же
fps (fes)	Вирус саркомы Фуд- жинами	>	>	15gq 24—25	7	P140gag-ips	Цитоплазма	»
	Вирус саркомы Шнайдера	Кошки	»	—	—	P85gag’,es	>	»
abl	Вирус лейкоза мышей Абельсона	Мыши	В-клеточная лимфома	9	2	P120eag’abl	Плазмати- ческая мем- брана	>
	Вирус сарком кошек HZ2—FeSV	Кошки	Саркома	—	—	pgggag-abl	То же	>
ros	Вирус саркомы кур UR 11 Вирус саркомы кошек Гарднера—Рашид	Куры	—	—	—	P68gag ros	»	>
fgr		Кошки	Саркома	—	—	P7Qgag-actin-fgr	—	»
erb-A	Вирус эритробла- стоза птиц, штамм AEV	Куры	Эритроидный лейкоз,саркома	—	—-	P75Rag erb A	—	—
erb-B	То же	>	То же	17	—	gp65erb'B	Плазмати- ческая мем- брана	Фосфопро- теинкиназа
mos	Вирус саркомы мы- шей Молони	Мыши	Саркома	8	4	p37mos	Цитоплазма	(?)
149
raf (mil) Ims Ha-ras 1 Ha-ras 2 * N-ras	Вирус саркомы мы- шей 3611 Вирус саркомы кошек	Мыши, куры Кошки Крысы	Фибросаркома Саркома
	Мак-Доноха		
	Вирус саркомы мы-		
	шей Харвея		
	—		
	—		
Ki-ras 1 **		——	—
Ki-ras 2	Вирус саркомы мы- шей Кирстена	Крысы	Саркома
myc	Вирус птичьего ми- елоцитоматоза МС 29, ОК 10, МН 2, СМ 11	Куры	Карцинома, саркома, ми- елоцитома
	Вирус лейкоза кошек	Кошки	Миелолейкоз
myc + mii c-myc	МН-2, штамм вируса птичьего миелоблас- тоза	Куры Человек	Лейкоз, карци- нома
N-myc	—	—	—
myb	Вирус птичьего ми- елобластоза, штамм AMV	Куры	Миелобластная лейкемия
3	6	P78gag-ra(	—	—
5	—	PI80gag'fms	Цитоплазма	Фосфопро-
		p!20fms		теинкиназа
11	7	p21Ha'ras 1	Плазмати-	Фосфотрео-
			ческая мем-	нинкиназа
X			брана	
/X 1	—	p2lNras	Плазмати-	—
			ческая мем-	
			брана	
12	6	p21Ki ras	Плазмати-	Фосфотрео-
			ческая мем-	нинкиназа
			брана	
8q24	15	pgggag myc	Ядерный	—
		plOOgag myc p] |()8»К-тус	матрикс	
—		P2008ae₽olm>'c	—	—
8		pp62c’n,yc	Ядерный	Фосфопро-
9		pp66c’myc	матрикс	теин
4м 6	10	p45v myb	Ядерный матрикс,	—
			перинукле- арное про- странство	
150
Таблица 11 (окончание)
Онкогены	Источник изолирования	Животное- носитель	Индуцируемая опухоль или злокачественный процесс	Локализация в хромосомах		Онкобелки		
				человека	мыши	Молекулярная масса (кд) и генетическая структура	Локализация	Свойства
myb + ets	Вирус птичьего ми- елобластоза, штамм Е26	»	Эритробластоз	—	—	PI35gagmyb'e,s	—	—
fos	Вирус остеосаркомы, штамм EBJ	Мыши	Саркома	2	—	p55fos	Ядерный матрикс	—
ski	Вирус птичьей сар- комы SK. 770	Куры	»	1	—	—	То же	—
rel	Вирус эндотелиоза птиц, штамм Т	Индюшки	Лимфоидный лейкоз		—	—	—	—
sis	Вирус саркомы шер- стистых обезьян SSV-1 (ASSP)	Обезьяны	Саркомы	22 *	15	p28sis***	Цито- плазма, межклеточ- ное про- странство	—
	Вирус саркомы кошек FeSV (Pl-FeSV)	Кошки	>	—	—	P76gsg-sis	—	
* Псевдоген Ha-ras 2 близкородствен онкогену c-Ha-ras 1. Этот псевдогеи в геноме клеток человека процессирован и содержит ряд
«опал>-кодонов, блокирующих его транскрипцию.
*’ Протоонкоген Ki-ras I до конца не изучен, однако он близкородствен онкогену Ki-ras 2.
Оикобелок p28s,s идентичен В-цепи PDGF — ростового фактора тромбоцитов.
Примечание, р — протеин; Р — полипротеии; префиксом обозначен генетический источник экспрессии.
требляют сокращения онк-ген или онкоген (т. е. вирусный) или
протоонкоген — его клеточный «родственник» [Сейц И. Ф. и др.,
1982; Киселев Ф. Л. и др., 1983].
Общие свойства вирусных онкогенов и онкобелков. Для изу-
чения ретровирусных онкогенов используют различные подходы,
которые основываются прежде всего на особенностях структуры
вирусного генома. К ним относятся генетический анализ раз-
личных мутантов, молекулярная гибридизация, рестрикционное
и гетеродуплексное картирование, молекулярное клонирование,
определение нуклеотидных последовательностей (секвенирова-
ние), анализ РНК-транскриптов в клетках, трансляции геномных
и субгеномных молекул РНК, иммунологическое, пептидное карти-
рование и выявление энзиматических свойств онкобелков.
В табл. 11 суммированы данные, касающиеся свойств ретро-
вирусных онкогенов. Наиболее общим в биологическом плане
свойством вирусных онкогенов является то, что они в подавляю-
щем большинстве случаев у различных видов животных индуци-
руют опухоли. Все индуцируемые вирусными онкогенами нео-
пластические процессы, перечисленные в табл. 11, имеют следую-
щие патоморфологические характеристики: а) саркомы, которые
возникают из соединительнотканных (мезенхимальных) элемен-
тов; б) лейкозы и другие близкие им заболевания, связанные
с трансформацией гемопоэтических клеток; в) карциномы (напри-
мер, рак молочной железы у мышей), встречающиеся исклю-
чительно редко.
Все вирусные онкогены имеют клеточное происхождение,
причем их локализация в хромосомах клеток широко варьирует
в зависимости от природы онкогена и вида животных. В табл. 11
приведена информация, касающаяся только хромосом человека
и мыши, как наиболее изученных в этом отношении объектов.
Еще одним общим свойством онкогенов является необходи-
мость их активации для проявления онкогенной функции. Это
происходит с помощью одного из механизмов, подробно рас-
смотренных в гл. 4. Помимо этих общих свойств, отдельные
ретровирусные онкогены имеют определенные индивидуальные
особенности.
Большинство вирусных онкогенов, идентифицированных в на-
стоящее время, транслируется как часть слитного белка — поли-
протеина (Р), в котором аминотерминальный домен (область
гена, определяющая ту или иную независимую функцию белковой
молекулы) кодируется вирусными репликативными генами (gag
или gag и pol). Это означает, что вирусные и клеточные трансфор-
мирующие белки должны обладать разной структурой и функцией,
так как протоонкогены не связаны с эндогенными вирусными
генами ни в топографическом, ни в функциональном отношении
(см. гл. 5). Некоторые вирусные онкогены могут экспрессировать
уникальные субгеномные иРНК, представляющие только опс-
специфические последовательности (например, src, erb В, myb и,
151
вероятно, mos). В этом случае синтезируются онкобелки, не
содержащие антигенные детерминанты, кодируемые репликатив-
ными генами.
Обнаружен другой класс онкобелков, который синтезируется
на иРНК, равной по размеру геному (например, ras).
Механизмы трансформации клеток при помощи вирусных онко-
белков неизвестны, однако ряд онкобелков обладает общими
свойствами, например протеинкиназной активностью (или тесным
образом с нею связаны), способной фосфорилировать тирозино-
вые остатки. Протеинкиназы онкогенов: src, fms, yes, ros, abl,
fes, erb В и fgr являются фосфопротеинами, содержащими
фосфотирозин или другие фосфорилированные аминокислоты.
Для некоторых онкобелков обнаружена одинаковая локализа-
ция в клетке. Так, например, онкобелки опс-генов src, abl и
семейства ras тесным образом связаны с клеточной мембраной,
a myc, ski, fos и myb — с ядерным матриксом (см. табл. 11).
ОНКОГЕНЫ РЕТРОВИРУСОВ ПТИЦ
Вирус саркомы Рауса был одним из первых ретровирусов кур,
изолированным еще в 1911 г. Раусом (Р. Rous). В геноме
этого вируса классическими методами генетики и молекулярной
биологии был обнаружен и выделен первый онкоген src, а позже
идентифицирован и трансформирующий белок [Stehelin D. et al.,
1976; Linial M., Blair D., 1982]. ВСР является единственным
недефектным штаммом саркомы птиц, способным вызывать близ-
кие по морфологической характеристике саркомы и трансформи-
ровать культуры фибробластов. Из вируса саркомы Рауса изоли-
рованы различные условные (по генам gag, pol и src) и делецион-
ные (по генам pol и env) мутанты, что позволило в деталях
изучить генетику вируса [Bishop J., Varmus Н., 1982]. Это,
в свою очередь, способствовало идентификации онкогена и онко-
белка.
Первый изолят ВСР имел ограниченный круг хозяев и мог
индуцировать саркомы только у некоторых пород цыплят. По-
стоянное пассирование вируса на животных привело к расширению
круга хозяев, варианты вируса приобрели способность индуци-
ровать опухоли у различных видов птиц и даже млекопитающих.
Л. А. Зильбер и И. Н. Крюкова (1957), Г. Я- Свет-Молдавский
и А. С. Скорикова (1957) первыми установили возможность
преодоления естественной резистентности клеток млекопитающих
к вирусу саркомы Рауса (штамм Карра — Зильбера), получив
у инфицированных взрослых крыс геморрагическое заболевание,
заканчивающееся гибелью животного. В последующие годы это
направление исследований плодотворно разрабатывалось в на-
шей стране [Аджигитов Ф. И., 1973; Кузнецов О. К., 1974;
Зильбер Л. А. и др., 1975; Киселев Ф. Л. и др., 1983] и за
рубежом [Свобода Я., 1965]. В этих работах удалось выяснить
152
молекулярные механизмы неспособности ВСР репродуцироваться
в клетках млекопитающих и установить роль экспрессии гена src
в процессе их малигнизации [Киселев Ф. Л. и др., 1983; Collins С.
et al., 1980; Varmus Н. et al., 1981].
src-Онкоген вируса саркомы Рауса. src-Гены различных
штаммов ВСР (включая некоторые независимые изоляты) очень
похожи, но не идентичны друг другу. При помощи гибридиза-
ционного анализа с использованием кДНКзгс значительных
различий между отдельными штаммами не выявлено [Stehe-
lin D. et aL, 1976; Wang L. et al., 1979]. Напротив, детальный
олигонуклеотидный анализ показал небольшие штаммоспецифи-
ческие отличия нуклеотидных последовательностей [Bishop J.,
Varmus Н., 1982], как и иммунологический и структурный анализ
продукта src-гена [Collet М. et al., 1979; Neil J. et aL, 1981;
Bishop J., Varmus H., 1982].
На основании этих данных признается, что все src-гены разных
штаммов ВСР происходят от общего гена-предшественника,
родственного c-src-последовательностям хозяйских клеток.
Нуклеотидные последовательности фрагмента 3 т. п. о. генома
ВСР штаммов Шмидта—Руппина (Ш-Р) и Прага были опреде-
лены полностью [Czernilofsky A. et al., 1980]. Расшифровка
первичной структуры src-гена позволила установить ряд характер-
ных его особенностей: открытая рамка считывания src-гена
ВСР Ш-Р равна 1590 нуклеотидам, что достаточно для кодиро-
вания 530 аминокислот полипептида с молекулярной массой
58,5 кд. Это соответствует молекулярной массе pp60src, опреде-
ленной ранее иммунологическими методами. Кодирующая область
src-гена фланкируется (ограничивается) последовательностями,
содержащими несущественные рамки считывания. Между терми-
нирующим кодоном УАГ env-гена и инициирующим кодоном АУГ
src-гена находятся 400 нуклеотидов нетранслируемых последова-
тельностей. В них присутствуют последовательности, необходимые
для регуляции экспрессии src-гена, такие как акцепторный сайт
для сплайсинга. Аналогичным образом между терминирующим
кодоном src-гена УАГ и Пз-областью также обнаружена нетран-
слируемая зона. Последовательности, фланкирующие src, содер-
жат большой прямой повтор размером в 91 нуклеотид, которые
гомологичны на 86 % прямому повтору, расположенному на
5'-конце этого гена [Bishop J., Varmus Н., 1982].
src-Область ВСР штамма Прага в общих чертах весьма сходна
с таковой ВСР штамма Шмидта—Руппина, однако в деталях она
имеет и некоторые отличия.
Анализ первичной генетической структуры src-гена показал,
что в результате транскрипции этого гена образуется иРНК
с коэффициентом седиментации 21S, содержащая две рамки
считывания. Теоретически генетическая информация nPHKsrc
достаточна, чтобы обеспечить образование двух полипептидов
с молекулярными массами 20 и 60 кд. Образование белка с моле-
153
кулярной массой 20 кд в настоящее время расценивается как мало-
вероятное событие, поскольку его потенциально кодирующие
последовательности не начинаются метиониновым кодоном.
Следовательно, для образования этого белка иРНКбгс должна
содержать дополнительный сигнал сплайсинга, способный сформи-
ровать подходящую единицу трансляции. На основе экспери-
ментальных данных, имеющихся на сегодня, оценить реальность
существования подобного белка в трансформированных клетках
не представляется возможным.
Антисыворотка TBR, полученная от кроликов, несущих опу-
холи, индуцированные ВСР, может быть использована для имму-
нопреципитации белка с молекулярной массой 60 кд (pp60src).
Этот белок обнаружен в вирустрансформированных клетках и
может быть преципитирован только опухолевой антисывороткой,
но не антисывороткой к структурным белкам ВСР [Erikson Е.,
Erikson R., 1980; Sefton В. et al., 1980]. Такой же белок был обна-
ружен в общем продукте трансляции З'-области вирусной РНК
в системе бесклеточного синтеза, что окончательно подтвердило
непосредственную связь pp60src с трансформацией клеток
[Beemon К., Hunter Т., 1978; Bishop J., Varmus Н., 1982].
Своеобразие и структурный полиморфизм были обнаружены
у pp60src различных штаммов ВСР. Во-первых, некоторые образцы
опухолевых антисывороток не реагировали с pp60src, экспресси-
руемыми независимыми изолятами ВСР [Bishop J. et al., 1981].
Во-вторых, src-продукты разных штаммов ВСР отличались как
по размерам, так и по олигопептидным картам [Neil J. et al.,
1981; Bishop J., Varnius H., 1982].
Белок pp60src достаточно хорошо изучен не только в структур-
но-химическом, но и функциональном плане [Bishop J. et al.,
1981]. Этот белок, как и ряд других онкобелков ретровирусов
животных, оказался фосфопротеином, фосфорилированным по
тирозиновому и сериновому остаткам [Bishop J. et al., 1981;
Oppermann H. et al., 1981]. Предполагается, что фосфорилиро-
вание pp60src по тирозиновому остатку осуществляется самим
этим белком (аутокиназная активность), причем процесс не зави-
сит от клеточного циклоаденозинмонофосфата (цАМФ) [Le-
vinson A. et al., 1981]. Напротив, фосфорилирование pp60src по
аминокислоте серину осуществляется цАМФ-зависимой протеин-
киназой клетки-хозяина [Levinson A. et aL, 1981; Bishop J.,
Varmus H., 1982]. Фосфорилирование pp60src играет существенную
роль в регуляции фосфопротеинкиназной функции трансформи-
рующего белка.
Молекулярная топография pp60src. Физико-химическое изуче-
ние трансформирующего белка ВСР показало, что он является
скорее линейной, чем глобулярной молекулой [Sefton В. et aL,
1980; Levinson A. et aL, 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Исполь-
зование ряда методических приемов позволило установить локали-
зацию в pp60src участков, важных в функциональном отношении.
154
В pp60v src имеется два основных сайта фосфорилирования се-
рина: один располагается в 17-й позиции аминокислотных
последовательностей, местоположение другого определено менее
точно. Единичный фосфотирозиновый остаток занимает позицию
419 у ВСР Шмидта—Руппина и 416 — у ВСР Прага. Не исключая
возможной ошибки в определении локализации фосфорилирован-
ного тирозина, ряд авторов подчеркивают, что аминокислотные
последовательности онкобелка, окружающие положение фосфоти-
розина указанных вирусов, идентичны [Levinson A. et al., 1981;
Neil J. et aL, 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Аминокислотные
последовательности, окружающие сайт фосфорилирования тиро-
зина в других белках (включая онкобелки ретровирусов, среднего
Т-антигена вируса полиомы и клеточных белков фосфорилирован-
ных pp60vsrc), также оказались весьма близкими друг другу и
содержат только одну замену, а именно аминокислоты аргинина
на глутамин [Levinson A. et al., 1981; Neil J. et al., 1981 [. По-види-
мому, этот сайт фосфорилирования тирозина «атакуется» одним и
тем же классом протеинкиназ.
Аминотерминальный домен pp60vsrc с молекулярной массой
около 8 кд осуществляет связывание белка с плазматической
мембраной [Levinson A. et al., 1981]. Напротив, карбокситерми-
нальный домен с молекулярной массой 30 кд осуществляет про-
теинкиназную функцию, и активность этого фрагмента белка
значительно выше, чем у нативной формы pp60vsrc. Возможно,
что определенные функции аминотерминального домена ррбО src
(т. е. фосфорилирование серинов) регулируют как кинетическую
характеристику белка, так и субстратоспециальность киназной
активности, вероятно, при помощи аллостерического эффекта
[Bishop J., Varmus Н., 1982].
Локализация pp60' src в клетке. В клетках, трансформирован-
ных ВСР, продукт гена src ассоциирован с рядом субклеточных
компонентов. Исключением в этом отношении является лишь ядро.
Большинство молекул pp60vsrt в инфицированных клетках связано
с плазматическими мембранами, что было определено мето-
дами иммунофлюоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии,
а также посредством биохимических характеристик клеточных
органелл [Willingham М. et al., 1979; Erikson Е., Erikson R.,
1980; Levinson A. et aL, 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Боль-
шое количество трансформирующего белка сосредоточено в обла-
сти контакта плазматических мембран опухолевых клеток друг
с другом и их прикрепления к подложке-субстрату [Willingham
М. et aL, 1979].
Предполагается, что pp60vsrc в клеточной мембране связан
с липидным слоем. Однако этот факт нуждается в уточнении
при помощи методов, не требующих прижизненной фиксации
клеток.
Синтез pp60v src осуществляется на свободных полирибосомах
[Eisenman R., Vogt V., 1978; Bishop J., Varmus H., 1982], и уже
155
через несколько минут после инфекции клеток вирусом белок
можно обнаружить в плазматических мембранах. Процесс транс-
порта онкобелка ВСР от места его первоначального синтеза
до клеточных мембран и других мест в клетке пока не изучен.
Поиск клеточных мишеней pp60vsrc. Получение многократно
очищенного pp60v src позволило приступить к более точному
изучению специфических белков-субстратов его энзиматической
активности в процессе вирусиндуцированной трансформации. Два
таких белка, с молекулярной массой 89 и 50 кд, были идентифици-
рованы в иммунопреципитатах pp60vsrc [Erikson Е., Erikson R.,
1980; Oppermann H. et aL, 1981]. Оба белка формируют физи-
ческий комплекс с онкобелком, и этот факт можно считать доказан-
ным для клеток, инфицированных ВСР и другими ретровирусами,
содержащими онкогены fps и yes [Ghysdael J. et aL, 1981; Hana-
fusa T. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Существование
такого комплекса указанных белков с pp60csrc в неинфицирован-
ных клетках не показано.
Функциональное значение подобного комплекса пока не опре-
делено, однако ряд его, возможно, важных для трансформации
особенностей удалось выявить. Во-первых, этот комплекс обра-
зуется сразу же после завершения синтеза pp60v src, т. е. он перви-
чен и транзиторен. Во-вторых, онкобелок в комплексе фосфорили-
рован, но только по серину. Предполагается, что белок с моле-
кулярной массой 50 кд является одной из мишеней действия
pp60vsrc, поскольку в клетках кур, трансформированных ВСР,
этот белок фосфорилирован по сериновым и тирозиновым остаткам
[Oppermann Н. et al., 1981]. Белок с молекулярной массой 50 кд
представляет собой относительно минорный компонент среди всех
клеточных белков позвоночных, его структура не консервативна
и варьирует у различных видов.
Что касается белка с молекулярной массой 89 кд, то он
является основным представителем цитоплазматической белковой
фракции каждого типа клеток всех позвоночных. В нем не пока-
зано каких-либо различий структуры и сайтов фосфорилирования
у разных видов животных. В трансформированных ретровирусами
клетках белок с молекулярной массой 89 кд фосфорилирован
по серину. Этот же белок образует аналогичные комплексы
с онкобелками, кодируемыми onc-генами fps и yes.
Таким образом, на основании имеющихся данных пока трудно
оценить, какова истинная роль двух указанных белков и их комп-
лексов с онкобелками в процессе трансформации клеток онкоген-
ными вирусами. Одним из первых белков, выявляющимся в транс-
формированных ВСР клетках и фосфорилирующимся in vivo
по тирозиновому остатку, является белок ррЗб кд [Erikson Е.,
Erikson R., 1980]. Этот же белок фосфорилируется по тирозину
протеинкиназами других ретровирусных онкогенов, fps и аЫ
[Ghysdael J. et aL, 1981; Sefton В. et al., 1981]. Имеющейся
в настоящее время информации, в частности о количестве белка
156
с молекулярной массой 36 кд в нормальных и опухолевых клет-
ках, его локализации и т. д., недостаточно, чтобы сделать одно-
значное заключение о роли этого белка в трансформации. Ряд
клеточных белков, еще менее охарактеризованных, также подвер-
гаются фосфорилированию по тирозину протеинкиназой ВСР.
Эти данные свидетельствуют в пользу плейотропности (множе-
ственности) действия протеинкиназ вирусных онкогенов, что
практически не оставляет надежды на возможность обнаружения
в клетке единственной и высокоспецифичной мишени для «атаки»
онкобелками.
Наличие моноспецифических сывороток к индивидуальным
белковым компонентам цитоскелета нормальных и опухолевых
клеток позволило приступить к изучению процессов фосфорилиро-
вания актина, миозина, тубулина, а-актина, филамина, виментина
и винкулина. Из перечисленных белков только винкулин можно
рассматривать как потенциальную мишень действия pp60vsrc
in vivo. Винкулин — белок с молекулярной массой 130 кд —
обнаруживается в участках адгезии клетки к субстрату; вероятно,
он выполняет существенную роль в формировании фенотипа
нормальных клеток [David-Pfeuty Т., Singer S., 1980]. В тран-
сформированных же клетках винкулин в результате фосфорили-
рования протеинкиназой ВСР перераспределяется, что приводит
к нарушению структуры участков адгезии клеточной мембраны
к субстрату. Трансформация клеток, как правило, сопровождается
десятикратным увеличением уровня фосфорилирования винкулина
по тирозиновым остаткам, однако это составляет только 1 %
от общего количества белка в клетке [Sefton В. et aL, 1981].
Использование для трансформации температурочувствительных
мутантов ВСР (ts-мутантов) подтвердило предположение о при-
частности ррбО * к фосфорилированию винкулин^. Куриные
фибробласты, трансформированные температурочувствительным
мутантом ВСР ts68 (вирус имеет ts-мутацию в гене src, что сопро-
вождается утратой pp604 Src способности трансформировать и
поддерживать трансформированный фенотип клеток) при непер-
миссивной температуре (41 °C), имели нормальный фенотип.
Реверсия клеток в нормальный фенотип при сдвиге температуры
с 41 °C до 37 °C сопровождалась упорядочением структур цито-
скелета и снижением уровня фосфорилирования винкулина
по тирозиновым остаткам до нормального [David-Pfeuty Т.,
Singer S., 1980; Sefton В. et al., 1981]. Тем не менее фосфорили-
рование винкулина онкобелком ВСР не может рассматриваться
как прямое доказательство участия винкулина в нарушении
функции цитоскелета клеток. Надо заметить, что изменение ха-
рактера и уровня фосфорилирования винкулина не является
характерной особенностью трансформации клеток и другими
агентами. Так, фосфорилирование винкулина по тирозину не изме-
няется в процессе трансформации клеток химическими канцеро-
генами, онкогенными ДНК-содержащими вирусами и даже виру-
157
сом саркомы кур PRC II, содержащим онкоген fps. Последний факт
особенно удивителен, поскольку v-fps кодирует онкобелок, обла-
дающий протеинкиназной активностью [Hanafusa Т. et al., 1981].
Явная неспособность опс-специфической протеинкиназы, коди-
руемой онкогеном fps, фосфорилировать винкулин пока не имеет
удовлетворительного объяснения, однако эти данные все же
позволили некоторым авторам сделать заключение о косвенном
участии винкулина и белков цитоскелета в трансформации кле-
ток-мишеней. Вероятно, фосфорилирование винкулина может
способствовать объяснению лишь некоторых морфологических
изменений, сопровождающих трансформацию клеток src-геном.
Однако этих фактов все же недостаточно для понимания процессов
утраты клетками контролируемого роста как основной характе-
ристики трансформации и малигнизации.
Значительное внимание исследователей привлекли данные,
свидетельствующие о том, что процесс трансформации куриных
клеток ВСР сопровождается возрастанием уровня фосфорилиро-
вания по тирозину ферментов, участвующих в гликолизе. Это
касается, в первую очередь, таких ферментов, как энолаза, фосфо-
глицератмутаза и лактатдегидрогеназа [Cooper J. et aL, 1983].
В заключение следует упомянуть ряд интригующих данных
о возможности вовлечения продукта гена src и других онкобелков
в процессы фосфорилирования каскада клеточных протеинкиназ,
что в конечном итоге влияет на активность мембранноассоцииро-
ванной Na+/K+ АТФазы. Однако эти сенсационные результаты
следует рассматривать осторожно до получения дополнительных,
хорошо воспроизводимых фактов [Racker Е., 1981; Bishop J.,
Varmus Н., 1982].
Таким образом, все многообразие экспериментальных данных
свидетельствует о том, что pp60v src представляет собою фермент-
тирозиновую фосфопротеинкиназу. Эта энзиматическая актив-
ность играет, по-видимому, ключевую роль в неопластической
трансформации, индуцируемой геном src [Bishop J., Varmus H.,
1982]. Основные мишени действия онкобелка расположены
в цитоплазматических мембранах, структурах цитоскелета клеток
и пока не выявлены в ядерном матриксе. Немаловажно также,
что полученные данные указывают на прямое регуляторное
влияние pp60v src на энергетические (гликолиз) процессы опухоле-
вых клеток. Сопоставление данных исследования химической
структуры pp60v src, его функции и локализации в опухолевой
клетке, а также рассмотрение тех биохимических реакций, которые
могут существенно изменяться в результате фосфорилирования
ферментных систем клеток, позволяют отнести онкобелок ВСР
к мультифункциональным ферментам. pp60vsrc влияет на различ-
ные уровни структурной и генетической организации вирусинфи-
цированной клетки. В результате этого под контроль продукта
экспрессии гена src ВСР попадают: клеточные гены нормального
«репертуара», регуляция их экспрессии (т. е. транскрипция),
158
синтез клеточных белков (трансляция), энергетический обмен
(гликолиз), функция цитоскелета и, наконец, функция клеточной
мембраны, на которую поступают регуляторные экстрацеллюляр-
ные сигналы.
Возможный механизм трансформации клеток src-геном.
В научной литературе обсуждаются две альтернативные схемы
возможного механизма трансформации клеток в результате
«включения» в инфицированной клетке вирусного онкогена src
[Bishop J., Varmus H., 1982]. Первая предполагает, что фосфори-
лирование онкобелком вируса единственной клеточной мишени
может привести к запуску каскада биохимических реакций,
приводящих в конечном счете к формированию злокачественного
фенотипа клетки и росту опухоли. Вторая приписывает непосред-
ственно самому ферменту, продукту гена src, мультифункциональ-
ную роль, имея в виду, что протеинкиназа pp60vsrc действует
одновременно или по определенной системе на ряд белковых
мишеней, например по принципу «важности».
Фосфорилирование многочисленных клеточных мишеней может
повлечь за собой развитие целого ряда биохимических «событий»,
способных, в свою очередь, запускать следующий каскад реакций.
Таким образом, большинство имеющихся данных говорит в пользу
второй альтернативы. Однако в целом наши знания сегодня
не позволяют однозначно оценить те связи, которые существуют
между фосфорилированием конкретных клеточных белков pp60v src
и фенотипическим проявлением процесса, находящего выражение
в малигнизации. Дальнейшее изучение клеточных мишеней дей-
ствия онкобелков является одним из магистральных направлений
молекулярной онкологии, поскольку именно опосредованно через
клеточные мишени можно понять глубину, наиболее полно оха-
рактеризовать развитие событий, в конечном счете приводящих
к злокачественному перерождению.
Онкогены дефектных трансформирующих вирусов. Многие
штаммы разных ретровирусов способны трансформировать
соответствующие культуры клеток и быстро индуцировать злока-
чественные новообразования у экспериментальных животных.
Однако все они, в отличие от ВСР, дефектны по репликации
(рис. 4), и поэтому для их репродукции необходима коинфекция
клеток вирусами-помощниками [Кузнецов О. К-, 1974; Зиль-
бер Л. А. и др., 1975; Unial М., Blair D., 1982]. Многие из дефект-
ных трансформирующих ретровирусов тесно связаны с широким
кругом злокачественных опухолей: саркомами, карциномами,
лимфосаркомами и лейкозами. Для проявления трансформи-
рующей функции указанным вирусам гены и белки вирусов-по-
мощников не требуются.
В связи с тем, что трансформирующие гены вирусов этой
группы находятся в тесной связи с дефектными (символ A [Dues-
berg Р., 1983]) репликативными генами, некоторые из них будут
рассмотрены более подробно.
159
та
gag
R^L|19| 27 ,12,15.
pol
32
env
85 )37| |изВ
Субъединица РНК, ALV
pol
gag
src
Pr76
Pr180
pp60‘rc
ВСР (—), дефектный по
репродукции вирус
саркомы Рауса
Agag
myc
Aenv
iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiimii
МС 29, вирус
миелоцитоматоза птиц
Семейство myc
piigoao-myc
gag	Apo I
P2009,9'rnvc
Pr76
Agag
myc
myc
iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiimi
Aenv
ОК 10, вирус
миелоцитоматоза птиц
mil
Aenv
Agag
Aenv
erb В
erb A
pygSag-erb A
gp65*rb B
gag
pol
myb
МН 2, вирус
миелоцитоматоза птиц,
имеющий два онкогена:
v-myc и v-mil (raf)
AEV, вирус эритробластоза
птиц, имеющий два
онкогена: v-erb А и
v-erb В (гомологичен
рецептору EGF)
AMV, вирус
миелобластоза птиц
Prl80
p45myb
Pr76
Aenv
Agag
myb
P 135 SaS-myb-ets
Е26, вирус
миелобластоза птиц,
несущий два онкогена:
v-myb и v-ets
pi4Q9ag-fps
FuSV, вирус саркомы
кур Фуджинами
Рис. 4. Структура генома дефектных трансформирующих ретровирусов птиц
[Coffin J., 1982J.
Ниже шкалы размеров генов (в т. о.) на первой линии представлена структура генома,
компетентного по репродукции вируса лейкоза птиц (ALV) На других линиях схематически
представлена структура геномов различных трансформирующих изолятов. Заштрихован-
ными прямоугольниками обозначены специфические последовательности и их локализация
в геноме. Незаштрихованные прямоугольники означают размеры делений. Сплошной
черной жирной линией обозначены предполагаемый размер белкового продукта и локализа-
ция его транслируемых последовательностей, кодируемых каждым геном.
160
Механизмы трансформации клеток под действием сливных
(«гибридных»), экспрессируемых в этих системах, онкобелков
изучены значительно хуже, чем для pp60vsrc. Это обусловлено,
в первую очередь, тем, что долгое время не удавалось получить
мутанты дефектных трансформирующих вирусов, несущие темпе-
ратурные или делеционные мутации в онкогенах (как было в слу-
чае с ВСР). Выделение и изучение ряда подобных мутантов
позволили доказать, например, причинную связь трансформи-
рующих последовательностей дефектных вирусов с онкогенезом.
Онкогены дефектных вирусов сарком птиц
(fps, yes и ros). До 1980 г. многие исследователи полагали, что все
независимые изоляты вирусов птиц, индуцирующие саркомы,
являются различными штаммами ВСР. Т. Hanafusa и соавт.
(1981) первыми обнаружили трансформирующие последователь-
ности, которые оказались неидентичными src-гену. В следующие
годы в вирусах сарком птиц была идентифицирована серия онко-
генов, неродственных src и репликативным генам вирусов лейкозов
птиц, — ALV [Hanafusa Т. et al., 1981].
В нашей стране Л. А. Зильбером (1975) и А. М. Дядьковой
(1966) в разные годы был изолирован ряд вирусов, индуцирующих
саркомы, которые также были отнесены к группе ВСР. Предва-
рительный анализ трансформирующего гена саркомы кур штам-
ма 6 (индуцированной ДМБА А. М. Дядьковой) показал, что его
онкоген в структурном отношении близок src-гену, но при этом
имеет и некоторые отличия в рестрикционной карте [Федоров С. Н.
и др., 1984]. Возможно, что в числе других изолятов, полученных
А. М. Дядьковой и Л. А. Зильбером, есть вирусы, несущие иной,
ранее неизвестный онкоген. Это могут показать лишь дальнейшие
молекулярно-биологические исследования.
Онкоген fps. Наиболее хорошо изученные изоляты дефектных
ретровирусов птиц и кошек, содержащие онкоген fps, можно
распределить на 4 группы: 1) вирус Фуджинами (FuSV); 2) ви-
русы группы PRC II; 3) два менее изученных изолята (UR-1 и
16L); 4) вирусы сарком кошек (три изолята: FeSV-ST, FeSV-GA,
FeSV-HZl), содержащие онкоген fes, который оказался близко-
родственным онкогену fps [Hanafusa Т. et al., 1981; Besmer P.,
1983].
Структурная организация генома вируса Фуджинами пред-
ставлена на рис. 4, из которого видно, что трансформирующая
область fps занимает Agag, Apol и, возможно, Aenv участки-ге-
нома. Геном FuSV очень невелик, всего 4,5—5,0 т. о., причем
на долю гена fps приходится 3.2 т. о. [Chien Y.-H., 1980; Besmer Р.,
1983]. Первый уникальный саркомогенный полипротеин gag-one
был идентифицирован именно в FuSV. Этот полипротеин
P140Kagfps содержит антигенные детерминанты белка гена gag
р!9как (рис. 5).
Как видно из рис. 5, все опс-специфические полипротеины
изолятов дефектных вирусов сарком птиц содержат различное
11 Заказ 380
161
ген gag
NH3 -
Pr 76 880 ALV
p19 | ?	p27 pl 2 pl 5 | -COOH
fps
115K P-tyr
P 140 080 fps FuSV,
вируса саркомы
Фу джинами
25 К
Р 105 9a9'fPs
PRS II,
вирус
саркомы кур
р 17о gag-fps
PRS IV,
вирус
саркомы кур
р go gag-yes
вирус
саркомы кур Эша
Рис. 5. Структура полипротеинов дефектных вирусов сарком птиц [Ghysdael J.
et al., 1981 ].
Структура трех продуктов слитных генов Agag-fps н одного gag-yes определена при
помощи пептидного анализа ферментов гндролнзованных белком р15Еа0. Наверху пред-
ставлена организация продукта гена gag Рг76к 'в ВСР. P-tyr — участок фосфорилирования
белка по тирозиновому остатку. Заштрихованная часть прямоугольника означает опс-
специфическую область полипротеина. Горизонтальными стрелками обозначены размеры
фрагментов онкобелков, образующихся после их протеолиза pl5B*B. P-ser — участок
фосфорилирования белка по сериновому остатку. NH2 — аминотермннальная группа белка.
СООН — карбокситермннальная группа белка. К — молекулярная масса белков в кило-
дальтонах.
количество антигенных детерминант белков гена gag. Полипро-
теин pi40KdK fps фосфорилирован в fps-области только по тирози-
новому остатку, а в gag—по серину и треонину [Hanafusa Т.
et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. С иммунным комплексом
FuSV P140RaK fcs ассоциирована протеинкиназа, сходная по своей
энзиматической активности с опс-продуктами других изолятов,
имеющих онкогены fps, а также yes и ros.
Несколько изолятов, несущих онкоген fps, обладают весьма
своеобразным онкогенным эффектом. Вирусы этой группы инду-
цируют миксоматозные опухоли у животных (например, для
сравнения, ВСР индуцирует веретеноклеточные саркомы),
а в культуре клеток вызывают трансформацию с преимуществен-
ным ростом распластанных, но некруглых опухолевых клеток,
продуцирующих большое количество мукоидных продуктов-
162
Характер трансформации клеток продуктом гена fps косвенным
образом свидетельствовал о том, что клеточные мишени, на кото-
рые действует этот онкобелок, могут отличаться от таковых при
действии pp60vsrc.
Однако при сравнительном анализе белков, содержащих фос-
фотирозин в клетках, трансформированных онкогенами src, fps,
yes, выявили сходную картину фосфорилирования семи предпола-
гаемых белков-мишеней соответствующих онкобелков [Cooper J.,
Hunter Т„ 1981].
Как уже отмечалось ранее, основным клеточным белком-ми-
шенью фосфорилирования протеинкиназой pp60vsrc является
ррЗб кд, он же оказался высокофосфорилированным и в случае
действия P140gagfes в клетках, трансформированных FuSV [Coo-
per J., Hunter T., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982] С другой сто-
роны, в клетках, трансформированных PRC II, в противопо-
ложность ВСР и Y73 (v-yes), уровень фосфорилирования винку-
лина потирозиновым остаткам не изменялся [Bishop J., Varmus Н.,
1982].
Онкоген yes. В двух независимых изолятах — вирусе саркомы
Ямагуши (Y73) и вирусе саркомы Эша (ESV) — были иденти-
фицированы трансформирующие последовательности, получившие
название yes. Ретровирус Y73 индуцирует образование в клетках
белка P90gagyes, a ESV — P80gagyes [Kawai S. et al., 1980; Bishop J.,
Varmus H., 1982; Coffin J., 1982]. Оба сливных белка содержат
антигенные детерминанты p!9gag и не содержат p27gag, однако
продукты гидролиза полипротеинов yes оказались у этих двух
вирусов различными, что может косвенно свидетельствовать об их
неполной гомологии [Kawai S. et al., 1980; Bishop J., Varmus H.,
1982].
Характер фосфорилирования белковых мишеней в клетках,
трансформированных вирусами Y73 и ESV, также был различным:
P80gagyes в равной степени хорошо фосфорилировал in vivo белки
как по сериновым, так и по тирозиновым остаткам, тогда как
P90gagyes преимущественно фосфорилировал белки по серину
[Kawai S. et al., 1980; Ghysdael J. et al., 1981]. В обоих случаях
аутофосфорилирование полипротеинов осуществлялось по сход-
ному принципу, однако авторы отмечали наличие фосфорилиро-
ванных остатков серина не в gag-области, а в самом yes. При этом
фосфорилированные сериновые и тирозиновые остатки в опс-спе-
цифической области находились в тесной связи. Сайт фосфорили-
рования тирозина в Agag-yes полипротеине содержал последова-
тельности аминокислот, практически идентичные сайту фосфори-
лирования в белке pp60src [Neil J. et al., 1981].
Таким образом, очевидная идентичность тирозиновых фосфо-
акцепторных сайтов у полипротеинов группы yes с src и fps как
будто свидетельствовала о наличии общих механизмов трансфор-
мации клеток, подробно рассмотренных выше на примере pp60v src.
Однако более глубокое изучение этого вопроса позволило устано-
п*
163
вить, что в числе нескольких клеточных белков, уровень фосфори-
лирования которых возрастает в процессе трансформации клеток
Y73 или ESV, оказался только один винкулин. Это указывало на то,
что механизмы трансформации клеток дефектными саркомными
вирусами птиц и ВСР не совсем идентичны [Kawai S. et aL, 1980;
Bishop J., Varmus H., 1982].
Для интерпретации механизмов трансформации клеток указан-
ными онкогенами необходимы дальнейшее изучение локализации
fps - и yes-трансформирующих белков в клетке, изолирование
вирусных и клеточных мутантов, более четкое определение клеточ-
ных мишеней действия онкобелков.
Онкоген ros. Р. Balduzzi и соавт. (1981) идентифицировали
в ретровирусе UR-2 полипротеин с молекулярной массой 68 кд,
который является продуктом гена gag-onc. Этот онкоген в после-
дующем получил название ros [Balduzzi Р. et al., 1981; Bishop J.,
Varmus H., 1982]. ros-Последовательности не имели гомологии
с известными онкогенами ретровирусов птиц или репликативными
генами ALV. Продукт гена ros P68BaB’ros фосфорилирован in vivo
по сериновым и тирозиновым остаткам. Иммунопреципитаты
P68BaB'ros ассоциированы с цАМФ-независимой протеинкиназой,
которая фосфорилирует преимущественно себя, а также IgG
в иммунном комплексе и а-казеин. Предполагается, что продукт
гена ros может оказаться совершенно необычным ферментом —
протеинкиназой с уникальными энзиматическими свойствами.
Онкоген ski. Е. Stavnezer и соавт. (1981) охарактеризовали
три дефектных по репликации ретровируса: SK 770, SK 780 и
SK 790. Эти вирусы были изолированы из культур клеток, которые
заражали мутантным td ВСР штаммом В77. Все три вируса транс-
формировали только фибробласты кур, а в трансформированных
культурах были обнаружены полипротеины с молекулярной массой
110—125 кд, содержащие Agag и Аро! антигенные детерминанты.
Трансформирующие последовательности, получившие название
ski, не имели гомологии с репликативными генами и с известными
онкогенами ретровирусов птиц [Stavneser Е. et al., 1981; Bishop J.,
Varmus H., 1982].
Протеинкиназная функция полипротеина Pl Ював ро1 skl, по пред-
варительным данным, не зарегистрирована.
Таким образом, изучение дефектных саркомных вирусов птиц
завершилось идентификацией и выделением ряда онкогенов,
отличающихся по структуре и функции от src-гена недефектного
ВСР. Как правило, в независимых изолятах этой группы ретро-
вирусов, полученных от больных злокачественными новообра-
зованиями животных или из культуры клеток, удается реиденти-
фицировать один и тот же онкоген. Более того, вирусы саркомы
кошек (будут рассмотрены ниже) могут содержать онкогены
(например, fes), гомологичные онкогену fps вирусов сарком кур
[Besmer Р., 1983]. Следовательно, ретровирусы разных видов
животных могут захватывать из генома клетки-хозяина гомологич-
164
ные протоонкогены. С одной стороны, этот факт указывает на
ограниченное число протоонкогенов, которые могут быть превра-
щены в вирусные, а с другой — может косвенно свидетельствовать
о сходстве неопластических процессов, возникающих в результате
экспрессии гомологичных онкогенов, но у разных видов животных
(включая человека).
Можно надеяться, что детальное изучение механизмов транс-
формации клеток под действием вирусных онкогенов позволит
выявить общие закономерности процесса малигнизации инфици-
рованных клеток (например, существование аналогичных и высо-
коспецифичных мишеней фосфорилирования и т. д.). Это, в свою
очередь, позволит ответить на вопросы о видоспецифичности
трансформации клеток одинаковым онкогеном и о причастности
экспрессии гомологичных им протоонкогенов к спонтанной и инду-
цированной трансформации тех или иных клеток.
Онкогены дефектных вирусов лейкозов
птиц: myc, mil, myb, ets, erb А и erb В и rel. Вирусные лейкозы
оказались первыми злокачественными заболеваниями животных,
для которых была показана этиологическая связь с переносимыми
биологическими агентами (вирусами).
V. Ellerman,O. Bang [Bishop J., Varmus H., 1982] установили,
что эритролейкозы у цыплят могут быть индуцированы экстрак-
тами бластных клеток крови больных животных. В последующие
десятилетия было выделено большое количество подобных агентов,
и именно с их изучением стали связывать надежды на возможность
понимания механизмов лейкемогенеза у человека.
Онкогены вирусов миелоцитоматозов птиц: тус и mil. К этой
группе ретровирусов относятся МС 29, МН 2, СМ 11 и ОК 10,
которые являются независимыми изолятами; все они индуцируют
похожие неопластические процессы in vivo (миелоцитоматоз,
карциномы и саркомы), трансформируют одинаковый тип клеток
in vitro (гемопоэтические клетки, фибробласты и эпителиальные
клетки) и содержат опс-специфические последовательности,
имеющие значительное родство друг с другом [Sheiness D. et aL,
1980].
Геном МС 29 представлен РНК размером 5,0—5,5 т. о.,
имеющей 65 % гомологии с вирусами лейкозов птиц (см. рис. 4)
[Sheiness D. et al., 1980, 1981; Coffin J., 1982]. Как видно из схемы,
представленной на рис. 4, оба вируса миелоцитоматоза птиц
(МС 29 и ОК Ю) имеют разную (в отношении трансформирующих
участков) композицию генома. МС 29 содержит ряд областей,
идентичных ALV: на 5'-конце участок гомологии равен 1,5 т. о.,
а на З'-конце — 2,0 т. о. Установлено, что области генома Agag,
Aenv и U3 очень сходны у представителей всей группы ретровиру-
сов МС 29 [Sheiness D. et al., 1980, 1981], однако указанные
последовательности не имеют гомологии с опс-специфическим
участком. Онкоген этой группы ретровирусов получил название
v-myc. v-myc вирусов МС 29, ОК 10, СМ 11, по данным моле-
165
кулярной гибридизации, практически идентичны друг другу,
исключением из этой группы является ретровирус МН 2. Онкоген
МН 2 оказался лишь на 70 % идентичен тус-последовательностям
МС 29, и эти различия получили объяснение после идентификации
в геноме ретровируса МН 2 второго онкогена, mil [Jansen Н.
et aL, 1984].
Полипротеины, имеющие отношение к трансформации клеток
ретровирусами этой группы, достаточно хорошо изучены. Так,
например, онкобелок ретровируса МС 29 с молекулярной массой
ПО кд (Р110кав'тус) содержит общие детерминанты, кодируемые
gag-геном и шус-специфической областью. Как отмечалось выше,
значительные отличия генома ретровируса ОК 10 (например,
от МС 29), прежде всего, касались размеров неповрежденных
репликативных генов. Вирусспецифическая ДНК ОК 10 больше,
чем у МС 29, и содержит полный gag и последовательности
Apol-гена, совмещенные с myc-специфическим участком (см.
рис. 4) [Sheiness D. et. aL, 1980; Bishop J., Varmus H., 1982].
В клетках, инфицированных OK 10, выявляются продукт гена gag,
предшественник Pr76gag, а также белок с молекулярной массой
200 кд (P200KaRmyc, содержащий gag-, Apol- и myc-пептиды
[Bishop J., Varmus H., 1982]). По предварительным данным,
эти белки синтезируются на двух независимых иРНК. gag-myc-По-
липротеины группы ретровирусов МС 29 фосфорилированы
по серину в обычных сайтах фосфорилирования белков гена
gag, а в myc-области фосфорилируются как серин, так и треонин
[Ghysdael J. et al., 1981]. Существующие методы анализа не по-
зволяют выявить точную локализацию и степень фосфорилирова-
ния gag-myc-полипротеинов. Тем не менее установлено, что онко-
белки группы онкогенов тус не фосфорилированы по тирозиновым
остаткам и сами по себе не обладают протеинкиназной актив-
ностью [Ghysdael J. et. al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982].
Механизмы трансформации клеток-мишеней полипротеинами
группы онкобелков тус не изучены, и связано это, в первую
очередь, с методическими трудностями определения их энзимати-
ческой активности и локализации в вирустрансформированной
клетке. Стандартное фракционирование клеточных лизатов,
а также иммунофлюоресцентные тесты показали, что Pl 10Ragn,yc
располагаются преимущественно в ядрах клеток перепелок,
трансформированных МС 29 [Bishop J., Varmus Н., 1982].
erb-Онкоген вируса эритробластоза птиц (AEV). Среди всех
онкогенов, дефектных по репликации ретровирусов птиц, наиболее
хорошо изучены генетические локусы AEV, ответственные за
трансформацию эритроидных клеток и фибробластов. Эти локусы
получили символ v-erb. Молекулярно-биологическими и моле-
кулярно-генетическими методами были определены локализация
v-erb в геноме вирусов, размер — 3,0 т. о. [Lai М. et al., 1979]
и получены данные в пользу существования в нем двух доменов
экспрессии (см. рис. 4): v-erb А и v-erb В. Первый кодирует
166
полипротеин P75‘?d‘{erb А, содержащий антигенные детерминанты
генов gag и erb, но лишенный генетической информации по мень-
шей мере половины v-erb [Lai М. et al., 1980].
В клетках, трансформированных AEV, обнаружены 2 типа
иРНК: одна — транскрибированная с полного гена v-erb, дру-
гая— лишь части его, З'-области, т. е. v-erb В [Lai М. et al.,
1979, 1980; Bishop J., Varmus H., 1982].
Пептидное картирование Р75какегЬ показало, что в полипротеин
входит белок gag р!9 и, вероятно, часть белка plO [Bishop J.,
Varmus Н., 1982]. Этот полипротеин фосфорилирован, но распре-
деление фосфоаминокислот определить пока не удалось. Что
касается продукта домена v-erb В, то его идентификация из-за
отсутствия соответствующей сыворотки связана с большими
трудностями.
Продуктами трансляции геномной РНК AEV в бесклеточной
системе белкового синтеза являются два протеина: Р75какегЬ А и
белок с молекулярной массой 44 кд, транслирующийся с З'-обла-
сти геномной РНК [Lai М. et aL, 1980; Beug Н. et aL, 1981], что
указывало на связь экспрессии с v-erb В. Однако антисыворотки
цыплят с опухолями, индуцированными AEV, не реагировали
с онкобелком p44verbB [Lai М. et aL, 1980].
Таким образом, вопрос о природе р44 кд окончательно пока
не решен, и, вместе с тем, неясна роль v-erb В и кодируемого им
белка в онкогенезе, индуцируемом у животных вирусом эритро-
бластоза птиц. Недавно высказано предположение, что v-erb В
является не доменом гена erb, а самостоятельным онкогеном.
Гетеродуплексное картирование протоонкогена в нормальных
клетках кур показало, что c-erb В содержит около 12 экзонов.
В последнее время появились данные, свидетельствующие о том,
что онкоген v-erb В кодирует гликолизированный белок с моле-
кулярной массой 65 кд, обладающий фосфотирозинкиназной
функцией. Этот белок в трансформированных клетках распола-
гается в клеточной мембране. Онкобелок gp65erbB имеет значи-
тельную гомологию с рецептором эпидермального фактора роста
(ЭФР) [Heldin С.-H., Westermark В., 1984]. Указанная гомология
касается внутриклеточного домена рецептора ЭФР, обладающего
также тирозинкиназной активностью [Hunter Т., 1984].
Механизм трансформации клеток-мишеней AEV не изучен.
Пока неясно, имеют ли продукты экспрессии двух доменов свои
специфические мишени трансформации или они действуют в ком-
бинации. Точно известно лишь то, что для трансформации клеток
эритроидного пула необходимы оба домена или оба онкогена
v-erb. Делеционный мутант AEV, утративший онкоген v-erb А,
т. е. способность кодировать полипротеин Р75«аеегЬ А, не был
способен трансформировать клетки эритроидного пула, но этот
вирус эффективно, как дикий штамм, трансформировал куриные
фибробласты [Lai М. et aL, 1980]. По-видимому, Р758акегЬ А
не требуется для трансформации фибробластов. Что касается
167
механизма трансформирующего действия двух онкогенов erb, то,
как полагают ряд авторов, инициирует процесс трансформации
клеток эритроидного пула v-erb В (принадлежащий к семейству
онкогенов src). Напротив, экспрессия онкогена v-erb А блокирует
дифференцировку эритробластов, останавливая этот процесс на
ранних стадиях созревания [Debuire В. et al., 1984]. В клетках,
трансформированных онкогенами v-erb, наблюдается увеличение
приблизительно в 1’/2 раза фосфорилирования некоторых белков
по тирозиновым остаткам; в частности, это касается ррЗб кд
[Bishop J., Varmus Н., 1982]. Киназная активность у полипротеина
P75gaK’ гЬА не обнаружена. Ряд методических трудностей не позво-
лил определить локализацию продуктов экспрессии гена v-erb А
в инфицированных клетках.
Онкогены вирусов миелобластоза птиц (AMV и Е26): v-myb,
v-ets.
Два независимых изолята ретровирусов птиц, AMV и Е26,
содержат онкоген v-myb [Duesberg Р. et al., 1980; Moscovici С.
et aL, 1981 ]. AEV вызывает острый миелобластный лейкоз, а Е26 —
эритроидный лейкоз и, реже, смешанные лейкозы, содержащие
эритроидные и миелоидные клетки [Moscovici С. et al., 1981;
Bishop J., Varmus H., 1982]. В условиях in vitro оба вируса
способны трансформировать макрофаги, однако Е26 в культуре
фибробластов перепелки вызывал изменения морфологии, ча-
стично напоминающие трансформацию.
Эти данные свидетельствовали о том, что структура геномов
AMV и Е26 должна быть различной. На рис. 4 представлена
структура генома AMV штамма BAI. Определение топографии
генов Е26 пока не завершено. Как видно из этого рисунка, геном
AMV содержит неповрежденный ген gag и, вероятно, Apol и
v-myb, который располагается в области env-гена [Duesberg Р.
et al., 1980; Moscovici С. et al., 1981 ]. В соответствии со структурой
генома AMV в инфицированных этим вирусом клетках выявляются
три типа иРНК: для Рг76как, для Рг1808акро1 [Moscovici С. et al.,
1981], а также для онкобелка с молекулярной массой 35 кд
(иРНК 21S). Последние, по-видимому, являются продуктами
экспрессии онкогена myb. Локализация и функция онкобелка 35 кд
в инфицированных AMV клетках неизвестна.
Как указывалось выше, ретровирус Е26 содержит онкоген
v-myb, который, так же как и у AMV, располагается в области
гена env, т. е. на З'-конце вирусной РНК. Было установлено, что
в геноме Е26 онкоген v-myb занимает значительную часть генома,
включая и область gag. Об этом свидетельствовал тот факт,
что онкобелок ретровируса Е26 содержал антигенные детерми-
нанты продуктов гена gag. В клетках, инфицированных Е26,
обнаружен опс-специфический белок с молекулярной массой
130 кд (Р130gaK'myb). Предполагается, что продукт гена myb Е26
синтезируется на иРНК геномного размера, однако детали этого
процесса не установлены [Bishop J., Varmus Н., 1982].
168
Ограниченные данные по структуре генома ретровируса Е26
не могли объяснить, почему этот вирус способен не только индуци-
ровать эритробластоз, но и трансформировать куриные фибро-
бласты. Рядом авторов было высказано предположение о том, что
подобный гетерогенный биологический эффект не может быть
обеспечен только одним геном myb. Они полагали, что в геноме
ретровируса Е26 должен присутствовать еще один, дополнитель-
ный трансформирующий ген. Дальнейшее изучение структуры
генома ретровируса Е26 подтвердило это предсказание и привело
к обнаружению так называемых «дополнительных» трансформи-
рующих последовательностей ets [Laprince D. et al., 1983].
В настоящее время ets относится к самостоятельному онкогену
(v-ets), который в геноме Е26 в 5'-области граничит с геном myb,
а в З'-направлении занимает область гена env. Лучшим доказа-
тельством этому служат факты, полученные после клонирования
онкогена v-ets и определения его нуклеотидных последователь-
ностей. При этом оказалось, что он не имел гомологии с известными
онкогенами ретровирусов позвоночных. Наконец, в нормальных
клетках птиц установлена экспрессия c-ets, которая осуществля-
лась через иРНК-транскрипт независимо от myb-последователь-
ностей.
Таким образом, структуру ДНК-формы генома Е26 можно
представить следующим образом: LTR — gag-myb-ets-env — LTR.
Ген ets, как и все другие трансформирующие последователь-
ности ретровирусов, представлен в виде единичной копии в геноме
многих позвоночных, включая человека [Laprince D., 1983].
Эти данные могут указывать на клеточное происхождение онко-
гена ретровируса Е26 кур. Вирус Е26 превосходил все другие
ретровирусы по количеству трансформирующих генов. Впервые
для объяснения механизма трансформации эритробластов и
фибробластов кур стало возможным использовать схему комби-
нированного взаимодействия двух онкогенов, myb + ets, способных
совместно обеспечить трансформацию фибробластов птиц. Подоб-
ная ситуация кооперативного взаимодействия двух онкогенов,
одновременно присутствующих в генетическом аппарате вируса,
обнаружена впервые.
На основании имеющихся данных о предполагаемом механизме
трансформации клеток эритроидного пула и фибробластов можно
выдвинуть следующие положения: во-первых, ретровирусы живот-
ных способны трансдуцировать в свой геном несколько протоонко-
генов (как минимум два); во-вторых, присутствие в геноме Е26
двух онкогенов говорит о возможности трансформации клеток
в результате экспрессии двух онкогенов, каждый из которых
в отдельности неспособен трансформировать фибробласты птиц и
NIH ЗТЗ. В-третьих, расшифровка генетической структуры Е26
позволяет определить, какое количество и какие формы функций
должны кодировать myb и ets, чтобы трансформировать фибро-
бласты или клетки эритроидного пула.
169
Онкоген вируса ретикулоэндотелиоза штамма T (REV-T) —г el.
Методами молекулярной гибридизации, гетеродуплексного и ре*
стрикционного картирования, а также анализа олигонуклеотид-
ного состава на З'-конце генома REV-Т был идентифицирован
участок длиной 1,5—2,0 т. о. (общий размер генома вируса
5,5 т. о.), ответственный за трансформацию гемопоэтических
клеток в культуре и индукцию лимфоретикулярных неоплазм
В-клеточной природы у животных. Новый онкоген, получивший
название rel, не гомологичен ни репликативным генам вируса-по-
мощника, ни известным онкогенам ретровирусов [Bishop J.,
Varmus Н., 1982; Coffin J., 1982]. Онкоген REV-Т представлен
единичной копией в геноме нормальных клеток индюшек (наиболь-
шая степень родства) и других видов птиц. Информация о про-
дуктах экспрессии гена rel (РНК, белок) минимальна. Высказано
предположение об образовании субгеномной rel иРНК и те!
специфического белка размером 55 кд. Данные предварительные.
ОНКОГЕНЫ РЕТРОВИРУСОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Из различных видов млекопитающих были изолированы
ретровирусы, способные индуцировать солидные опухоли или лей-
козы у чувствительных особей, а также трансформировать куль-
туры клеток [Зильбер Л. А. и др., 1975; Киселев Ф. Л. и др., 1983;
Bishop J., Varmus Н., 1982]. Примечательной особенностью
ретровирусов млекопитающих является то, что все они без исклю-
чения дефектны по репродукции и, подобно дефектным ретрови-
русам птиц, для своего размножения нуждаются в экспрессии
репликативных генов вирусов-помощников. В геноме немногочи-
сленной группы представителей этих ретровирусов были иденти-
фицированы трансформирующие последовательности (онкогены),
с которыми стали связывать тот или иной неопластический процесс.
Перечень онкогенов ретровирусов млекопитающих невелик, однако
некоторые из них, например семейство ras, имеют непосредствен-
ное отношение к возникновению неоплазм у человека. С актива-
цией посредством амплификации гена abi связывают ряд злока-
чественных лимфопролиферативных заболеваний человека. Есть и
другие примеры (см. гл. 5). По этой причине изучение структуры
онкогенов ретровирусов млекопитающих, экспрессии их генетиче-
ской информации в виде онкобелков, а также механизмов транс-
формации клеток вирусами имеет первостепенное значение как
в теоретическом, так и практическом плане.
Онкоген вируса лейкоза Абельсона (Ab-MLV)—abl. Вирус
лейкоза Абельсона (Abelson) был изолирован из мышей, инфици-
рованных вирусом лейкоза Молони (Mo-MLV) и получавших
преднизолон [Baltimore D. et al., 1980]. Для своей репродукции
вирус нуждается в вирусе-помощнике, Mo-MLV. Ab-MLV при вве-
дении мышам индуцирует пре-В-лимфомы, a in vitro трансформи-
рует некоторые линии фибробластов и лимфоидных клеток [Bai-
170
0123456789
j_i_i_i_i_i_i_i	1	i
T.O-
gag
RU*|1512 30 10|
pol	env
____________________।	70	|15|U3R
Ab MLV, вирус лейкоза
Абельсона
P160K
P120K
P100K
P90K
P85K
различные штаммы
mos
illllllllllllllllllllli
Mo-MS V, штамм 124
(вирус саркомь Молони)
p37moi
30 S ras

Ha-MSV, вирус саркомы
мышеи Харвея

P21
ST-FeSV,
вирус саркомы кошек,
штамм Шнеидера-Тиллена
р8о9а9"1®*
Рис. 6. Структура геномов дефектных трансформирующих вирусов млеко-
питающих [Coffin J., 1982J.
Ниже шкалы размеров на первой линии представлена структура генома, компетентного
по репликации вируса лейкоза мышей (MLV); на других линиях даны схемы геномов
различных трансформирующих вирусных изолятов. Маркировка прямоугольника озна-
чает опс-специфические последовательности и их локализацию в геноме. Прямо-
угольниками без маркировки обозначены области делеций. Под некоторыми онко-
генами сплошной черной линией обозначены размер белкового продукта и область
считывания гена.
timore D. et aL, 1980]. Геномная РНК Ab-MLVа имеет размер
5,6 т. о. и в системе бесклеточного синтеза обеспечивает образо-
вание белка Р120Kag abl с молекулярной массой 120 кд [Baltimore D.
et al., 1980; Bishop J., Varmus H., 1982]. Этот белок по своим
размерам идентичен полипротеину, выявляемому в клетках,
трансформированных Ab-MLV, и в клетках, не продуцирующих
вирусное потомство.
Гетеродуплексное картирование РНК Ab-MLV с помощью
комплементарной ДНК Mo-MLV показало, что последователь-
ности 5'-конца (1,25 т. о.) и З'-конца (0,7 т. о.) Ab-MLV принадле-
жат вирусу-помощнику, Mo-MLV. В результате рекомбинацион-
ных событий внутренняя часть генома Mo-MLV размером 6,5 т. о.
в вирусе Ab-MLV заменена на 3,6 т. о. abl-специфические после-
171
довательности (рис. 6). На рисунке показаны также размеры
полипротеинов различных штаммов Ab-MLV, которые варьиро-
вали от P160gagabl до P85gagabl [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Авторы предполагают, что ретровирус, кодирующий опс-полипро-
теин P160gagabl, является исходным штаммом, из которого произо-
шли все остальные. Вирусные варианты, кодирующие полипро-
теины от 100 до 85 кд, сохраняли трансформирующий потенциал
в отношении фибробластов, но утрачивали способность трансфор-
мировать лимфоциты и индуцировать лимфомы и не утрачивали
протеинкиназную активность [Baltimore D. et al., 1980].
В отличие от других ретровирусов млекопитающих, протеин-
киназная активность полипротеинов Ab-MLV и их связь с транс-
формацией и лейкемогенезом хорошо документированы данными,
полученными при изучении различных мутантов.
Последовательности, родственные abl, обнаружены в геноме
нормальных клеток различных видов позвоночных [Baltimore D.
et aL, 1980].
Полипротеин P160gagabl, подобно pp60v src и р21v ras, в трансфор-
мированных клетках связан с цитоплазматическими мембранами
[Bishop J., Varmus Н., 1982]. Удалось установить, что P160gagabl
находится на поверхности клеточной мембраны. Поскольку
gag-детерминанты в онкобелке не выявлялись, было высказано
предположение о его внутриклеточной локализации. gag-Домен
полипротеина в этой необычной конструкции связывается с бел-
ками цитоскелета. Указанные данные позволили сделать заключе-
ние о трансмембранном расположении онкобелков в трансформи-
рованной клетке.
Полипротеин P120gagabl в опухолевых клетках фосфорилирован
исключительно по тирозиновым остаткам, однако клеточные ми-
шени протеинкиназной активности онкобелка не определены
[Sefton В. et aL, 1981]. Информация, которая известна, сводится
к следующему. Как гемопоэтические клетки, так и фибробласты
NIH ЗТЗ, трансформированные Ab-MLV, содержали больше фос-
фотирозина, чем их нормальные гомологи [Sefton В. et aL, 1981].
На этом основании оказалось возможным высказать гипотезу
о том, что механизм трансформации клеток-мишеней ВСР (где
имеет место аналогичное явление) и Ab-MLV идентичен. Вскоре
были получены факты, подтверждающие это предположение.
Трансформация клеток с помощью Ab-MLV увеличивала фосфо-
рилирование по тирозину ррЗбК и винкулина, ранее уже иденти-
фицированных в качестве клеточных мишеней для pp60vsrc
[Cooper J., Hunter T., 1981; Sefton В. et aL, 1981].
В заключение следует отметить важный факт, связанный
с реидентификацией онкогена abl в вирусе саркомы кошек [Bes-
mer Р., 1983]. Биологическое проявление экспрессии онкогена
abl (морфология опухолей) и круг клеток-мишеней у мышей,
инфицированных Ab-MLV, свидетельствовали в пользу того, что
этот вирус и его онкоген проявляют лимфотропное действие
172
(в случае индукции полипротеинов P160gagabl и Р 120gag аЬ|). Напро-
тив, мутации abl-специфической области, сопровождающиеся
уменьшением экспрессируемых полипротеинов до размера менее
100 кд, приводили к потере способности ряда штаммов Ab-MLV
индуцировать пре-В-лимфомы и лимфосаркомы. В свою очередь,
утрата лимфотропной функции онкобелка не изменяла способность
онкогена аЫ трансформировать некоторые клеточные линии
фибробластов. Подтверждением правильности подобного положе-
ния служит факт изоляции вируса саркомы кошек HZ-2 FeSV,
который индуцирует исключительно фибросаркомы [Ashurst S.,
Cohen G., 1981]. Ретровирус HZ-2 FeSV содержит онкоген abl,
кодирующий полипротеин с молекулярной массой Р96как’аЬ1 и
обладающий протеинкиназной активностью. В данном случае
наблюдается уменьшение молекулярной массы опс-специфиче-
ского полипротеина [Besmer Р., 1983]. Вполне вероятно, что уже
в ближайшее время разработка этой интереснейшей модели
вирусного канцерогенеза прольет свет на молекулярный механизм
«тропности» онкогенов опосредованно через их продукты —
онкобелки.
Онкоген вируса саркомы Молони (Mo-MSV) — mos. Mo-MSV
был изолирован в 1966 г. из саркомы мышей, которая возникла
в ответ на введение вируса лейкоза Молони (Mo-MLV) [Bishop J.,
Varmus H., 1982]. Этот вирус был дефектным по репродукции
(вирусом-помощником служит Mo-MLV), индуцировал фибросар-
комы у мышей и трансформировал фибробласты в культуре
клеток. Из оригинального ретровируса был изолирован ряд штам-
мов Mo-MLV, обладавших своеобразными биологическими свой-
ствами. Наиболее хорошо изученным является Mo-MLV,
штамм 124, поскольку продуцирующие его клетки содержали
избыток трансформирующего компонента над вирусом-помощни-
ком в соотношении 30 : 1 [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Организация генома Mo-MLV 124 была изучена при помощи
гетеродуплексного картирования [Bishop J., Varmus Н., 1982]
и последующего полного секвенирования [Reddy Е. et al., 1980].
mos-Последовательности длиной 1,2 т. о. располагаются на
З'-конце генома в области сигнала сплайсинга иРНК (21S)
env-гена, который практически замещен полностью онкогеном.
Исключение составляют 10 нуклеотидов 5'-конца env-гена, выпол-
няющих функцию инициации транскрипции онкогена mos ини-
циирующим кодоном АУГ. Большинство изученных изолятов
вируса саркомы Молони имеют различного характера делеции
в pol-гене, происходящем из вируса-помощника (см. рис. 6).
Как видно из схемы, представленной на рис. 6, некоторые штаммы
Mo-MSV 124 и Gz-MSV) имеют частичные делеции gag-гена
Bishop J., Varmus Н., 1982].
Несмотря на то, что mos-область нескольких штаммов была
клонирована [Reddy Е. et al., 1980; Van Beveren C. et aL, 1981] и
секвенирована, белковый продукт этого гена по-прежнему оконча-
173
тельно не идентифицирован. Трансляция in vitro РНК субгеном-
ного размера, изолированной из вирионов, приводит к образова-
нию серии белковых продуктов [Cremer К. et aL, 1981; Papkoff J.
et al., 1982]. Наибольший из них — белок с молекулярной массой
37 кд, что приблизительно соответствует открытой рамке считы-
вания mos, предсказанной анализом нуклеотидных последователь-
ностей. Размер открытой рамки считывания достаточен для коди-
рования белка с молекулярной массой 40 кд, состоящего из 374—
408 аминокислот [Reddy Е. et al., 1980; Van Beveren C. et al., 1981;
Papkoff J. et al., 1982]. Однако в клетках, трансформированных
MSV, указанный белок не найден. В экспериментах по трансфек-
ции клеток NIH ЗТЗ показано, что mos-специфические фрагменты
ДНК обладали способностью трансформировать реципиентные
клетки [Bishop J., Varmus Н., 1982]. На эффективность трансфор-
мирующего действия клонированного mos существенное влияние
оказывала З'-область генома MSV, гомологичная LTR [Bishop J.,
Varmus Н., 1982]. Присутствие LTR оказалось необходимым
условием успешной трансформации клеток NIH ЗТЗ препаратом
клонированного клеточного гомолога v-mos [Blair D. et al., 1981].
Последующее изучение онкогенного потенциала c-mos позволило
установить наличие в области LTR транскрипционного сигнала
для онкогена mos [Dhar R. et al., 1980]. Однако принцип регуля-
ции экспрессии mos-специфических последовательностей пока
не определен.
Неожиданные результаты были получены при сравнительном
анализе аминокислотных последовательностей теоретически пред-
сказанного р40 К-продукта гена mos с pp60vsrc. Между продуктом
гена mos и карбокситерминальным участком pp60vsrc была обна-
ружена значительная область гомологии. Так, 387—468 амино-
кислотных последовательностей pp60vsrc (из 530) и 227—309 ами-
нокислот р40К (из 374) оказались практически идентичными
[Czernilofsky A. et al., 1980; Reddy Е. et al., 1980; Van Beveren C.,
1981]. Эти результаты свидетельствуют о том, что mos и src имеют
общее происхождение, хотя, по данным гибридизации, подобная
гомология не выявляется. Важно подчеркнуть, что участок гомо-
логии между гипотетическим онкобелком mos и src соответствовал
именно той области pp60v src, которая выполняет протеинкиназную
функцию. Однако в родственную область продукта гена mos
в 419-м положении не входила аминокислота тирозин, являющаяся
мишенью фосфорилирования pp60vsrc в трансформированных
ВСР-клетках [Levinson A. et al., 1981; Bishop J., Varmus Н., 1982].
Несмотря на эти данные, продукт гена mos не обладал тиро-
зинспецифической протеинкиназной активностью в трансформиро-
ванных клетках. Более того, уровень фосфорилирования клеточ-
ных белков в процессе экспрессии mos и трансформации не повы-
шался, а ррЗб кд был фосфорилирован как в нормальных клетках.
В последнее время установлена строгая зависимость синтеза
опухолевого фактора роста от экспрессии онкогена mos [Hel-
174
din С-H., Westermark В., 1984]. Эти данные свидетельствуют
о том, что онкобелок p37v mos прямо или косвенно регулирует
синтез опухолевого фактора роста. Подобная регуляция может
осуществляться на двух уровнях: транскрипционном и трансля-
ционном.
Таким образом, многочисленные данные, касающиеся структуры
mos и его продукта, пока не могут полностью объяснить молеку-
лярный механизм вирусиндуцированной трансформации клеток
мишеней.
Семейство онкогенов вирусов мышиных сарком Кирстена,
Харвей (Ki-MSV, Ha-MSV) — ras. Ki-MSV и На-MSV представ-
ляют собой независимые изоляты родственных, но не идентичных
штаммов дефектных саркомных вирусов мышей [Ellis R. et al.,
1980, 1981]. Эти вирусы выделены из сарком крыс, инокулиро-
ванных вирусом лейкоза Кирстена и вирусом лейкоза Молони
соответственно. Оба вируса индуцируют саркомы и эритролейкозы
у мышей, a in vitro трансформируют фибробласты в культуре
клеток. ДНК-формы геномов этих вирусов существенно отлича-
лись от такового вируса саркомы Молони (см. выше ген-mos).
Дефектные трансформирующие вирусы Ki- и Ha-MSV содер-
жат РНК размером соответственно 7,5 т. о. и 5,5 т. о. (см. рис. 6).
По данным олигонуклеотидного и гетеродуплексного картиро-
вания, геномы этих ретровирусов сходны друг с другом и имеют
родство с вирусом-помощником Mo-MLV [Ellis R. et а!.. 1980;
Coffin J., 1982]. Области родственных последовательностей
с Mo-MLV занимают 1,0 т. о. на З'-конце генома и короткий
участок на 5'-конце [Ellis R. et al., 1980; Coffin J., 1982]. Соб-
ственно трансформирующие последовательности Ki- и Ha-MSV,
получившие название ras, оказались далеко не идентичными.
Клоны ДНК, например pBS-9 и pHiHi-З, содержащие На- и
Ki-ras-последовательности в pBR-322, в жестких условиях гибри-
дизации с образцами ДНК вирусинфицированных клеток прояв-
ляли различные свойства. Проба Ha-ras в инфицированных
клетках гибридизовалась только с Ha-ras-последовательностями,
a Ki-ras — только с Ki-ras [Ellis R. et aL, 1981; Pulciani S. et al.,
1982]. Наличие специфичных зондов-онкогенов позволило вести
более адекватный поиск информационных РНК для ras-онкобел-
ков.
В клетках, зараженных этими вирусами, были обнаружены
РНК, равные полному геному; другие, субгеномные РНК пока
не выявлены. Эти данные указывали на то, что ras-специфический
продукт должен синтезироваться на полной геномной РНК-
Прямое сравнение молекулярных клонированных ДНК-копий
генома На- и Ki-MSV с 30S РНК, обнаруженной в нормальных
клетках крыс, показало, что указанные клоны содержат участки,
не гомологичные 30S РНК (вирусоподобной) и вирусу-помощнику.
Эти последовательности находятся между 750-м и 1650-м нуклео-
тидами в направлении от 5'-конца генома. На рис. 6 указанные
175
последовательности отмечены Ha-ras-специфической штриховкой.
Следует отметить, что только клоны опс-копий генома Ha-MSV,
содержащие указанные последовательности, обладали трансфор-
мирующим потенциалом в экспериментах по трансфекции
[Chang Е. et al., 1980; Bishop J., Varmus H., 1982].
Таким образом, геном вируса саркомы мышей штамма Харвей,
по-видимому, содержит следующие области: 1) короткая последо-
вательность около 2 т. о. на 5'-конце, происходящая из генома
вируса-помощника; 2) участок размером около 0,5 т. о., гомоло-
гичный 30S РНК, происходящий из нормальных клеток крыс;
3) участок размером 0,9 т. о., представляющий собственно Ha-ras;
4) локус 2,9 т. о., гомологичный 30S РНК; и 5) участок 1,0 т. о.,
родственный вирусу-помощнику (см. рис. 6).
Исходя из своеобразной «мозаичности» структуры генома
Ha-MSV, ряд авторов высказали предположение, что геном этого
ретровируса произошел путем как минимум двух рекомбинацион-
ных событий. В результате первого рекомбинационного процесса
был сформирован гибридный вирус: между вирусами лейкоза
мышей MuMLV или Ki-MLV и эндогенным дефектным по репли-
кации вирусом крыс (вирусоподобные частицы VL30). Гибридный
вирус, несущий гены двух лейкозных вирусов грызунов, трансду-
цировал затем соответствующий c-Ha-ras- или c-Ki-ras-онкоген
[Ellis R. et al., 1980, 1981]. При этом c-ras оказался фланкирован
последовательностями 30S РНК нормальных клеток крыс. Очеред-
ность рекомбинационных событий могла быть иной, и установить
ее пока не представляется возможным.
Анализ и обсуждение фактов, касающихся онкогена ras,
затрудняется тем обстоятельством, что эти трансформирующие
последовательности в двух независимых изолятах На- и Ki-MSV
происходят не от одного уникального клеточного гена, а от неболь-
шого семейства генов. Члены этого семейства существенно дивер-
гировали в процессе эволюции, сохранив при этом много общих
признаков. Свойства продуктов онкогенов ras подтверждают
это [Ellis R. et al., 1981 ]. В клетках, трансформированных На- или
Ki-MSV, антисыворотка преципитировала белок с молекулярной
массой 21 кд, идентифицированный как продукт экспрессии
онкогена ras. Белок p21ras оказался фосфорилированным по тре-
ониновым остаткам.
По аналогии с pp60vsrc, опс-продукт гена ras синтезируется
как индивидуальный белок, а не полипротеин, и местом его синтеза
являются свободные полирибосомы [Ellis R. et al., 1981]. Следует
вновь подчеркнуть, что p21ras синтезируется не на субгеномной,
а скорее на геномной иРНК [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Методами иммунофлюоресцентной микроскопии в клетках,
трансформированных Ha-MSV, р21ras выявляется в тесной связи
с клеточными мембранами [Willingham М., 1980]. Белок не обна-
ружен на поверхности инфицированных клеток и не концентри-
руется в области контакта клеток друг с другом, а также в местах
176
их прикрепления к субстрату. По-видимому, не исключено, что
онкобелок ras, подобно продуктам src и аЫ, может действовать и
на периферии клеток [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Можно отметить два примечательных биохимических свойства
p21ras: эффективное связывание гуаниновых нуклеотидов [Scol-
nick Е. et aL, 1979; Shih T. et al., 1980] и аутофосфорилирование
по треониновым остаткам [Shih Т. et aL, 1980]. Вероятно, p21ras
является своеобразной протеинкиназой. Однако обе указанные
энзиматические активности онкобелка ras пока не могут объяснить
механизм трансформации клеток при инфекции На- или Ki-MSV,
поскольку о взаимодействии p2r ras с клеточными мишенями
ничего неизвестно. Предполагается, что p21vras осуществляет
фосфорилирование ряда клеточных рецепторов, например PDGF
и опухолевого фактора роста, влияя, таким образом, на взаимо-
действие рецепторов с факторами. Эта функция несомненно
важна как для трансформации, так и для поддержания малигни-
зированного статуса клеток [Heldin С.-H., Hunter Т., 1984; Wester-
mark В., 1984].
Значительный прогресс в изучении структуры и возможной
функции белка р21v ras в процессе трансформации клеток-мишеней
был обусловлен идентификацией трансформирующих генов в опу-
холях человека. Открытие возможной причинной связи онкобелка
ras с неоплазмами человека потребовало новых подходов для
изучения его природы и функции (см. гл. 5).
Онкогены вирусов сарком кошек (FeSV): fes, fms, sis, abl.
Из спонтанных сарком кошек было изолировано более семи
дефектных саркомных вирусов [Bishop J., Varmus Н., 1982;
Besmer Р., 1983]. РНК вируса саркомы Шнайдера—Тилена
(Snyder—Theilen — ST-FeSV) кодирует полипротеин P85gagfes,
содержащий последовательности аминокислот gag и опс-генов,
последний получил название fes [Besmer Р., 1983]. P85gag fes
является единственным известным продуктом дефектного вируса
ST-FeSV, который включает в свой состав следующие белки гена
gag: pl5, pl2 и частично рЗО, слитый с fes-специфическими после-
довательностями (см. рис. 6). Как видно из рис. 6, геном ST-FeSV
размером 4,5 т. о. содержит fes-специфические последовательности
размером 1,6 т. о., фланкированные участками размером 1,3 т. о.
на 5'-конце и 2,6 т. о. на З'-конце, принадлежащими вирусу-помощ-
нику. •
Препараты РНК двух других изолятов: Гарднера—Арнстейна
(Gardner—Arnstein — GA-FeSV) и Харди—Цукерманна (Har-
dy—Zuckermann — HZ 1-FeSV) также кодировали аналогичные
полипротеины, содержащие gag- и fes-специфические домены,
но молекулярная масса этих продуктов была несколько больше
молекулярной массы полипротеина ST-FeSV. P95gagfes и P96gagfes,
согласно иммунологическим данным, пептидному картированию,
а также гибридизации соответствующих нуклеиновых кислот,
оказались близкородственными белками, принадлежащими к онко-
12 Заказ 380
177
белкам группы fes. Все три онкобелка in vivo фосфорилированы
во многих участках, в том числе по серину, треонину и тирозину
[Besmer Р., 1983).
Онкобелки указанных вирусов обладали протеинкиназной
активностью, катализирующей перенос фосфатной группы с АТФ
к тирозиновым остаткам вирускодируемых белков и тяжелой цепи
IgG. Инкубация антисыворотки TBR (полученной от крольчат
с опухолями, индуцированными ВСР Ш-Р) с иммунным комплек-
сом (ST-FeSV P85gagfes-I- антитела против p30gag) значительно
(в 10—15 раз) усиливала фосфорилирование тяжелой цепи IgG
по тирозиновым остаткам [Bishop J., Varmus Т., 1982; Besmer Р.,
1983]. Эти данные позволили установить общность функциональ-
ных свойств протеинкиназы, кодируемой геном fes, и pp60vsrc.
В клетках, трансформированных ST-FeSV, GA-FeSV и HZI-FeSV,
наблюдается повышение уровня фосфорилирования клеточных
белков по тирозину — в 5—10 раз. Фосфопротеинкиназная актив-
ность мутантов указанных вирусов была чувствительна к темпе-
ратуре, что подтверждает вирусспецифическую природу онкобел-
ков этой группы ретровирусов. Таким образом, по ряду важных
критериев функция онкобелков саркомных вирусов кошек практи-
чески идентична pp60vsrc.
Согласно данным молекулярной гибридизации, fes-последова-
тельности ST-FeSV, GA-FeSV и HZI-FeSV оказались гомологич-
ными онкогену fps-дефектных вирусов сарком кур FuSV и PRC II
[Bishop J., Varmus Н., 1982; Besmer Р., 1983], что в дальнейшем
было подтверждено иммунологическими данными и пептидным
картированием белков [Besmer Р„ 1983]. Более того, определение
нуклеотидных последовательностей fes/fps, вируса сарком кошек
штамма ST-FeSV позволило выявить гомологию некоторых уча-
стков полипептидной цепи онкобелков fes с онкобелками (про-
дуктами генов) src и mos (Bishop J., Varmus H., 1982].
В то же время в геноме других изолятов вирусов сарком
кошек были обнаружены иные трансформирующие последова-
тельности, не гомологичные онкогену fes. Один из них, fms, обна-
ружен в геноме ретровируса Мак-Доноха (McDonough — SM-
FeSV) {Besmer Р., 1983]. РНК SM-FeSV кодирует два поли-
пептида с молекулярными массами 180 и 120 кд. Оба белка содер-
жат гомологичные опс-специфические последовательности амино-
кислот, причем P180KaK’fnis оказался слитным белком с продуктами
гена gag, а р 120fms, напротив, антигенных детерминант гена gag
не содержал. Как Р180gag’,nis, так и р 120fms обладали протеинки-
назной активностью, которая осуществляла специфическое фосфо-
рилирование обоих онкобелков по тирозиновым остаткам [Bis-
hop J., Varmus Н., 1982]. Однако протеинкиназа fms оказалась
неспособной фосфорилировать Р 180gagfn18 и р 120fms in vivo, и, более
того, в клетках, трансформированных SM-FeSV, уровень фосфори-
лирования белков по тирозиновым остаткам не изменялся [Co-
oper J., Hunter Т., 1981 ]. Результаты опытов по фосфорилированию
178
клеточных мишеней ставят под сомнение протеинкиназную
функцию белка, продукта гена fms, а также свидетельствуют
о том, что механизмы трансформации клеток онкогенами fes и
fms, вероятно, различны.
Три других изолята вирусов сарком кошек: штамм Пароди—
Иргенса (Parodi—Irgens— PI-FeSV), Гарднера—Рашид (Gard-
nep — Rasheed — GR-FeSV) и Харди—Цукерманна (HZ2-FeSV),
по-видимому, содержат трансформирующие гены, ранее иденти-
фицированные в геноме двух других ретровирусов млекопи-
тающих. РНК вируса PI-FeSV кодирует полипротеин P76gags,s,
содержащий домен гена gag и последовательности, гомологичные
продукту гена sis (ген sis ранее был выделен из вируса сарком
шерстистых обезьян, см. ниже). Полипротеин P76gags,s не был
фосфорилирован по тирозиновым остаткам и не обладал протеин-
киназной активностью [Besmer Р., 1983].
РНК вируса GR-FeSV кодирует полипротеин с молекулярной
массой 70 кд (P70gagonc), содержащий онкогенные детерминанты
гена gag, актина и опс-специфические последовательности, не род-
ственные известным онкогенам. Трансформирующие последова-
тельности вируса GR-FeSV получили название fgr. Полипротеин
P70gagac,,n'fgr обладал фосфопротеинкиназной активностью, кото-
рая катализировала фосфорилирование клеточных белков по тиро-
зиновым остаткам [Rasheed S. et а!., 1983].
Наконец, в РНК HZ2-FeSV из второго изолята вирусов сарком
кошек обнаружили онкоген аЫ. Геном этого вируса кодировал
полипротеин P96gagabl, свойства и функции которого были описаны
ранее в разделе, посвященном онкогену abl. P96gagabl обладал
протеинкиназной активностью [Besmer Р., 1983].
Таким образом, дефектные вирусы сарком кошек содержат
в своем геноме широкий спектр трансформирующих генов, раз-
личных по структуре, а их продукты — по энзиматической актив-
ности. Большинство саркомных вирусов кошек содержат онкогены
fes, fgr или abl, кодирующие фосфопротеинкиназы, которые
близки по своим энзиматическим свойствам pp60vsrc. Дальнейшие
исследования могут установить сходство механизмов трансформа-
ции фибробластов кошек в результате экспрессии этих онкогенов
по сравнению с таковым под действием гена src ВСР. Каков
механизм трансформирующего действия двух других онкогенов
кошек (fms и sis) — пока неясно.
Онкоген дефектного вируса остеосаркомы мышей (FBJ-
MSV) — fos. Вирус остеосаркомы мышей штамм FBJ индуцирует
у новорожденных животных остеосаркомы с коротким латентным
периодом. В геноме FBJ-MSV были идентифицированы опс-спе-
цифические последовательности, получившие название fos, негомо-
логичные онкогенам ретровирусов животных [Curran Т., Teich N.,
1982]. Клетки, трансформированные FBJ-MSV, содержат опс-спе-
цифический белок P55fos, энзиматические функции которого
12*
179
пока не изучены. Последовательности fos широко представлены
в геноме позвоночных, включая человека [Curran Т., Teich N.,
1982]. В клетках, трансформированных FBJ-MSV, продукт онко-
гена fos выявляется в ядре, однако роль онкобелка в процессе
малигнизации и его клеточные мишени не определены. В настоящее
время протоонкоген c-fos и продукт его экспрессии привлекают
особое внимание, что обусловлено обнаружением непосредствен-
ной связи экспрессии этого гена с регулировкой дифференцировки
клеток, например макрофагов [МйПег R. et al., 1984]. Вероятнее
всего, продукт c-fos вовлечен в процессы начала дифференцировки
макрофагов и фибробластов и регулировку клеточного цикла,
а именно: под его контролем находится переход клеток из Go
в G], т. е. стадию роста и деления.
Онкоген вируса саркомы мышей (MSV-3611) — raf. Онкоген
raf является трансформирующим геном вируса мышиной саркомы,
который индуцирует фибросаркомы у новорожденных мышей
[Rapp U. et aL, 1983]. Данных о его гомологии с известными
онкогенами ретровирусов позвоночных не было до тех пор, пока
не изолировали второй онкоген, mil, в вирусе МН 2, принадлежа-
щем к группе вирусов МС 29. Онкогены mil/mht (его второе
название) и raf оказались близкородственными. Родство двух
новых онкогенов определяется, по-видимому, их общим клеточным
происхождением из клеточного гена c-raf/mil. В одном случае
(для MSV-3611) это был клеточный предшественник (c-raf)
в мышином геноме, а в другом (для МН 2) — клеточный пред-
шественник c-mil в курином геноме [Newmark Р., 1983; Rapp IL
et aL, 1983; Jansen H. et aL, 1984]. И в том, и в другом случаях
два независимых ретровируса трансдуцировали гомологичный
клеточный ген, присутствующий в клетках широкого круга позво-
ночных.
Онкоген вируса саркомы шерстистых обезьян (SSV)—sis.
SSV является единственным трансформирующим ретровирусом,
изолированным от приматов. Характеристика генома этого вируса
сопряжена с большими трудностями, поскольку все образцы
SSV содержат значительное количество вируса-помощника
(SSAV).
С помощью генно-инженерной техники и гетеродуплексного
картирования было установлено, что геном SSV равен 5,5 т. о.
и что он дефектен по всем репликативным генам. Различие
между SSV и SSAV заключалось в единственной замене в З'-обла-
сти участка генома SSAV на фрагмент длиной 1,0 т. о. [Bishop J.,
Varmus Н., 1982; Devare S. et al., 1983]. Онкоген sis, вероятнее
всего, транскрибируется независимо от репликативных генов,
в hPHKs,s, которая обеспечивает синтез белка с молекулярной
массой 28 кд (p28s,s). Продукт онкогена sis располагается в цито-
плазме инфицированных клеток, и он оказался близкородственным
тромбоцитарному фактору роста, PDGF (см. гл. 4) [Doolittle R.,
1981; Doolittle R. et al., 1983].
180
ДНК-провирус SSV был клонирован и полностью секвениро-
ван, что позволило более точно определить возможные участки
регуляции транскрипции онкогена sis и молекулярную массу
гипотетического белка, согласно расположению его рамки счи-
тывания. Как показали эти опыты, геном SSV можно схематически
представить следующим образом: 5' — gag-pol-Aenv-sis-Aenv —
3'. Длинная рамка считывания для v-sis была найдена в env-гене;
этот кодон принадлежит точке инициации транскрипции. В данном
случае трансляция онкобелка инициируется третьим кодоном
(АТГ), который располагается в области env-б'-конца и терми-
нируется кодоном ТГА, расположенным в З'-области гена env.
Такая локализация инициирующего и терминирующего кодонов
v-sis позволяет кодировать образование продукта-полипротеина,
несущего env- и sis-детерминанты. Аналогичная ситуация, когда
несколько env-специфических аминокислот попадают в онкобелок,
была показана для mos. Однако в случае sis прямые данные
о присутствии гибридной формы онкобелка в трансформированных
клетках, как, например, P28envsis, отсутствуют. С помощью компью-
терного анализа, по открытой рамке считывания v-sis определены
аминокислотные последовательности p28s,s. Этот белок гидрофо-
бен, в трансформированных клетках не фосфорилирован и не
является протеинкиназой [Devare S. et. al., 1983].
Вирус эритролейкемии Френд (FEV). FEV индуцирует эритро-
лейкоз у мышей и не трансформирует клетки в культуре [Evans L.
et al., 1979; Bishop J., Varmus H., 1982]. Из ретровирусов, вызы-
вающих у животных острые лейкозы, FEV является исключением:
в его геноме не найдены опс-специфические последовательности.
Сток оригинального образца FEV содержит 3 вируса: FEV-A ви-
рус, индуцирующий анемию; FEV-P — вирус, индуцирующий
полицитемию; Fe-MLV — вирус-помощник. Первые два ретрови-
руса также содержат стоки дефектных штаммов, которые получили
название вирусов, формирующих фокусы селезенки — SFFVA и
SFFVp соответственно. Геномы указанных вирусов представлены
РНК размером 6 т. о. [Evans L. et al., 1979], содержащими после-
довательности экотропного вируса-помощника F-MLV, ксенотроп-
ного MCF и политропного MLV. Прямое сравнение последова-
тельностей SFFVp с MLV показало ряд отличий, касающихся
только частичной делении репликативных генов gag-pol. Однако
в клетках, инфицированных SFFVp, было выявлено присутствие
gP 52 кд вместо gP 70 кд, как у политропного вируса MLV
[Evans L. et al., 1979]. Частичная деления env-области в геноме
SFFVp приводит к возникновению его онкогенных свойств.
Выше приведены данные относительно структуры генома ретро-
вирусов, способных индуцировать неопластическое заболевание
без онкогена и продукта его экспрессии — онкобелка. Нарушение
функции репликативных генов, как, например, в случае env-гена
SFFVp, приводит к превращению «непатогенного» штамма в вирус
эритролейкемии Френд.
181
Вирус рака молочной железы мышей (MMTV). Принципиаль-
ная возможность индукции рака молочных желез у мышей «факто-
ром молока» была показана Дж. Биттнером (J. Bittner) еше
в 1936 г. [Зильбер Л. А. и др., 1975; Weis R. et al., 1983]. Позже
«фактором молока» оказался ретровирус В-типа MMTV.
Дальнейшее изучение этого вируса было сопряжено с большими
методическими трудностями из-за отсутствия подходящих клеточ-
ных систем, позволяющих накапливать вирус в достаточных
количествах для молекулярно-биологических исследований. Лишь
использование методов гибридизации и клонирования генов
позволило уточнить важные принципы репродукции и структуры
генома [Bishop J., Varmus Н., 1982; Nusse R., Varmus H., 1982].
Однако механизмы трансформации клеток эпителия молочной
железы при участии MMTV по-прежнему далеки от завершения.
MMTV представляет собой мультигенное семейство ретровиру-
сов мышей, существующих как в эндогенной (передача верти-
кально, через половые клетки потомству в интегрированном
состоянии), так и в экзогенной форме («фактор молока» Бит-
тнера). Они ассоциированы с большинством мышиных штаммов.
Особое внимание исследователей к этой группе вирусов в послед-
нее время объясняется следующими причинами.
Установлено, что транскрипция генома MMTV находится под
контролем глюкокортикоидных гормонов. Участком генома, через
который осуществляется гормональный контроль экспрессии про-
вируса, является LTR, точнее его из-область [Heidelberger Ch.,
1980]. Дальнейшее изучение влияния глюкокортикоидов на экс-
прессию провируса MMTV привело к открытию необычного
механизма переноса специального рецептора от поверхности
клетки в ядро и его непосредственное взаимодействие с LTR
[Heidelberger Ch., 1980].
Исключительно большие размеры и3-области LTR MMTV
(около 1,2 т. п. о.) позволили высказать предположение о том,
что эта область может осуществлять кодирование определенного
белка. Как показало клонирование С13-области двух MMTV, она
действительно содержит открытую рамку считывания, достаточ-
ную для кодирования полипептида с молекулярной массой около
30—36 кд [Dickson С., Peters G., 1981].
Ранее на субгеномном фрагменте поли (А) РНК MMTV был
показан синтез подобного белка [Coffin J, 1982]. Вероятно,
синтез полипептида, кодируемого LTR, необходим для экспрессии
провируса MMTV и трансформации клеток молочной железы
мышей. Однако это положение требует дополнительных дока-
зательств.
Поскольку трансформирующий ген в геноме MMTV не обна-
ружен, провирусу MMTV в онкогенезе молочной железы отводят
второстепенную роль или роль кофактора. Не исключено, что
ДНК-провирус MMTV активирует локусы протоонкогенов int 1 или
int 2, расположенных в хромосомах 15 и 2 соответственно [Ре-
182
ters G. et al., 1984]. Подобные локусы расположены в геноме
клеток человека, однако их отношение к раку молочной железы
женщин пока неизвестно. Недавно в карциномах молочной железы
мышей, индуцированных метилхолантреном, был идентифициро-
ван трансформирующий ген ras [Sukumar S. et aL, 1983]. Изуче-
ние вопросов активации протоонкогенов, например семейства ras,
в стадии гормонозависимой экспрессии провируса MMTV позволит
определить роль отдельных компонентов этого процесса с малигни-
зацией клетки-мишени. Идентификация в клеточной линии SK-
BR-3 (клетки рака молочной железы человека) трансформирую-
щего гена ras [Князев П. Г. и др., 1984], с-тус [Kozbor D.,
Croce С., 1984], а также выявление в опухолевых клетках молоч-
ных желез женщин «отпечатков пальцев» MMTV [Weiss S. et aL,
1977; Bishop J., Varmus H., 1982] придают этой модели экспери-
ментального и спонтанного канцерогенеза особое значение.
В предыдущих разделах были представлены данные, касаю-
щиеся различных вирусных онкогенов, количество которых превы-
шает в настоящее время 20. Большинство из перечисленных
онкогенов изучены в структурном отношении достаточно полно,
что открывало возможность сравнить их нуклеотидные и амино-
кислотные последовательности соответственно самих генов и их
белков. Такой анализ позволил установить ряд индивидуальных
особенностей онкогенов: для некоторых уникальность структуры
(отсутствие гомологии с другими), для других — полное или
частичное родство с уже известными онкогенами. Будут ли
открыты новые онкогены в ретровирусах или их число лимити-
ровано какими-либо биологическими закономерностями? Выше
отмечалось, что ретровирусы способны захватывать соответст-
вующие клеточные гены у различного вида животных (fps, abl,
sis и др.). Подобная «предпочтительность» к трансдукции ретро-
вирусами определенных клеточных генов свидетельствует об огра-
ниченном числе протоонкогенов, которые служат источником
новых вирусных онкогенов.
Пробчема взаимной кооперации- вирусных онкогенов в про-
цессе трансформации клеток-мишеней возникла относительно
недавно, после открытия двух негомологичных онкогенов в геноме
одного ретровируса. Комбинация двух онкогенов в генетическом
аппарате вируса существенно изменяла круг клеток-мишеней,
подвергающихся трансформации. Так, например, ретровирус Е26,
содержащий онкогены myb и ets, способен индуцировать эритро-
бластоз или смешанные лейкозы. Более того, в некоторых слу-
чаях вирус Е26 вызывает трансформацию фибробластов кур.
Ничего подобного онкоген myb индуцировать самостоятельно
не может. Следовательно, либо онкоген ets контролирует онко-
белок, способный вызывать трансформацию эритробластов или
фибробластов, либо это результат кооперативного взаимодействия
двух онкогенов—myb и ets. Ответ на этот вопрос будет скоро
найден, поскольку другой онкоген, raf, участвующий в образова-
183
нии фибросарком у мышей, оказался гомологичным онкогену mil,
второму онкогену ретровируса птиц МН 2, который содержит
два онкогена — myc + mil — и способен индуцировать гепато-
карциномы и фибросаркомы. Поэтому способность онкогена
raf/mil индуцировать трансформацию фибробластов кур и мышей
может отражать специфичность этого онкогена к конкретной
клетке и определенному типу неопластического превращения.
МЕХАНИЗМЫ ВИРУСНОГО ЛЕЙКОМОГЕНЕЗА
У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА
Молекулярные основы неопластических заболеваний у живот-
ных (обычно это лейкозы), ассоциированные с ретровирусами,
изучены все еще недостаточно. Исключением являются лимфо-
саркомы бурсы цыплят, индуцированные ALV, где показана
активация протоонкогена тус (см. гл. 4).
Эти заболевания индуцируются недефектными вирусами,
которые, по всей видимости, содержат только репликативные
гены. В процессе интеграции вируса лейкоза в геном инфици-
рованной клетки могут возникать весьма своеобразные эффекты,
которые являются дополнительной функцией ДНКгпровируса.
В общих чертах проследить характер взаимодействия ретровируса
(не содержащего онкоген) с клеткой практически невозможно,
поскольку очень трудно разделить эффекты, возникающие в клетке
в процессе репродукции вируса и его интеграции в геном хозяина.
В данной главе проанализировать эти вопросы не представ-
ляется возможным, поэтому мы рекомендуем читателям ряд
обзоров, рассматривающих вирусиндуцируемый лейкомогенез
у животных более подробно [Зильбер-Л. А. и др., 1975; Берлин-
ских Н. К., 1983; Киселев Ф. Л. и др., 1983; Weiss R. et al., 1982].
РОЛЬ ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ
В ВОЗНИКНОВЕНИИ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА
Открытие вирусных и клеточных трансформирующих генов,
индуцирующих злокачественный рост клеток, а также доказатель-
ство клеточного происхождения вирусных онкогенов способство-
вали снижению интереса исследователей к дальнейшему поиску
еще неизвестных вирусов. Это тем более оправданно, так как
за весь 20-летний период работы, начиная с 60-х годов нашего
столетия, из нормальных и опухолевых клеток человека было
выделено лишь небольшое число реальных ретровирусов человека,
не принадлежащих к эндогенным вирусам животных, как, напри-
мер, кошек—RD-114 или обезьян — Мейзона — Пфайзера
(MPMV). Нередко в опухолевых клетках человека выявлялись
следы присутствия отдельных вирусспецифических компонентов,
которые, однако, при детальном рассмотрении не имели ничего
общего ни с эпидемиологией определенного типа опухолей, ни с па-
184
тогенетическим процессом превращения нормальной клетки в опу-
холевую.
Важно подчеркнуть, что роль онкогенных вирусов в происхо-
ждении опухолей человека в период становления онковирусологии
была несколько завышена, что в конечном итоге имело известные
негативные последствия, поскольку ориентировало исследователей
в более узком, вирусологическом направлении.
Недавние вирусологические и эпидемиологические исследова-
ния позволяют рассматривать три группы онкогенных вирусов
в качестве реальных кандидатов на роль этиологических факторов
неопластических заболеваний человека. Это прежде всего ретро-
вирус Т-лимфолейкоза взрослых людей, а также герпесвирусы
и гепадновирусы.
Связь вируса Т-клеточного лимфолейкоза взрослых (HTLV)
с малигнизацией гематопоэтических клеток человека. HTLV —
С-типа экзогенный ретровирус человека — был изолирован
в 1979—1980 гг. из опухолевых клеток взрослых больных Т-кле-
точной лимфомой—лейкемией (ATL) fPoiesz В. et aL, 1981].
Этот инфекционный агент с момента своего открытия «подозре-
вался» в качестве этиологического фактора указанного заболе-
вания человека. Инфекционный процесс, индуцируемый HTLV и
приводящий к развитию Т-клеточной лейкемии, соответствует
классической триаде Коха, за исключением модетьных экспери-
ментов на животных (по этому поводу нет сообщений в литера-
туре) .
HTLV является новым вирусным агентом, индуцирующим зло-
качественные заболевания человека. Он найден у всех больных,
содержащих антитела к вирусным белкам, индуцирует и трансфор-
мирует соответствующие клетки-мишени в культуре. Анализ
эпидемиологических данных свидетельствует о том, что эндеми-
ческая область распространения заболевания, индуцируемого этим
вирусом, ограничивается Японией (южные районы) и Индией.
Следует заметить, что единичные случаи заболевания у англичан
и американцев клинически и гистологически не отличаются от
заболеваний ATL японцев. Увеличение частоты заболеваемости
взрослого населения Т-лимфолейкозом в Японии за последние
30 лет (не менее 100 случаев в год) свидетельствует о том, что
естественная история и эпидемиология распространения HTLV
в достаточной мере еще не изучены.
Использование серологических и молекулярно-биологических
тестов для диагностики ATL и лимфом показало, что районы
ассоциации этих заболеваний с инфекцией HTLV значительно
шире, чем упомянутые, и к ним относятся также Северная и
Южная Америка и Ближний Восток [Weiss R. et. aL, 1982].
Характер взаимодействия HTLV с чувствительной клеткой-
хозяином (Т-лимфоцитом) оказался во многих отношениях
неожиданным [Weiss R. et al., 1982; Sarngadhavan M. et aL, 1983].
До выделения этого вируса подобные факты среди ретровирусов
185
животных не наблюдались. Моноклональные антитела, полученные
против белка р!9, продукта гена gag HTLV, перекрестно реаги-
руют с эпителиальным антигеном тимуса здорового человека.
Поскольку HTLV является экзогенным вирусом, обнаружение
продукта гена gag белка р!9 в нормальном тимусе человека
могло свидетельствовать о том, что этот антиген кодируется
не вирусным, а клеточным геном и попадает белок р!9 в вирион
при сборке вирусных частиц. Однако в дальнейшем высказанное
предположение не подтвердилось. Моноклональные антитела про-
тив белка р!9 реагировали также с предшественником белков
р!9-р24. Подобное обстоятельство указывало на то, что белок р 19,
несомненно, кодируется вирусным геном.
В связи с тем, что нуклеотидные последовательности генома
HTLV определены, можно ожидать, что в ближайшее время вопрос
о взаимодействии гена gag HTLV и белка р19 с антигеном (бел-
ком) тимуса человека будет решен.
Другой внутренний белок вириона HTLV — р24 — также коди-
руется геном gag, однако выявляется он только в индуцированных
и трансформированных Т-лимфоцитах человека. Наличие антител
к р24 в сыворотке крови больных ATL служит диагностическим
тестом вирусной инфекции [Sarngadhavan М. et aL, 1983].
По данным американских и японских исследователей, в 90—
98 % случаев типичных острых лимфолейкозов у взрослых в крови
последних появляются антитела к HTLV (к белкам р19 и р24).
Антитела к белку р24 обнаружены у 30 % родственников больных
ATL, а также у 12 % здоровых доноров в эндемичной по ATL обла-
сти в Японии. 800 проб сывороток крови здоровых доноров, живу-
щих на Европейском континенте, не содержали антител к р24
HTLV [Sarngadhavan М. et aL, 1983].
В конце 1983 г. были получены новые и весьма важные
данные, касающиеся диагностики, лечения и профилактики ATL.
Они свидетельствуют о частичной гомологии генов env и антигенов
гистосовместимости (HLA-1). Подобная генетическая гомология
позволяет сделать вывод о том, что HLA-1 и глюкопротеид ви-
русной оболочки являются гомологичными антигенами, коди-
руемыми вирусным, а не клеточным геномом. Серологический
анализ сывороток крови больных ATL показал, что все больные
имеют нейтрализующие антитела, специфичные для гликопротеи-
дов оболочки HTLV, а следовательно, и для HLA-1 [Sarngadha-
van М. et aL, 1983].
Другим клеточным антигеном, ассоциированным с оболочкой
HTLV, является белок рецептора фактора роста Т-клеток [Sar-
ngadhavan М. et aL, 1983], который может быть распознан
tac-1-моноклональными антителами. В этом случае антиген имеет
клеточное происхождение, он кодируется клеточным геном.
В процессе почкования вириона HTLV этот белок избирательно
захватывается вирионом из клеточной мембраны [Poiesz В. et aL,
1981; Sarngadhavan М. et aL, 1983].
166
Механизм трансформации Т-лимфоцитов HTLV неизвестен.
Предполагается, что интеграция ДНК-провируса HTLV (по анало-
гии с ретровирусами птиц — ALV, не имеющими онкогена, но инду-
цирующими лимфосаркомы бурсы) приводит к активации одного
или нескольких — «каскада» — клеточных протоонкогенов. При
изучении экспрессии с-опс в клеточной линии взрослого больного
острым Т-клеточным лимфолейкозом HUT-102 выявили присут-
ствие иРНК, комплементарных онкогенам v-myc, v-ras и v-sis,
причем экспрессия протоонкогена sis быта обнаружена только
в этой клеточной линии из всех тестируемых гемопоэтических
клеточных линий человека опухолевого и нормального про-
исхождения. Связь интеграции ДНК-провируса с В-1ут-трансфор-
мирующим геном маловероятна, поскольку этот трансформи-
рующий ген является этапным онкогеном трансформации В-кле-
ток птиц и человека.
Роль вирусов герпеса в возникновении некоторых форм нео-
пластических заболеваний человека. Значительный онкологиче-
ский интерес к вирусам группы герпеса человека обусловлен
следующими фактами [Tooze J., 1980; Galloway D., McDougal J.,
1983]:
1.	В некоторых опухолях человека электронно-микроскопиче-
скими и вирусологическими методами были выявлены частицы,
имеющие характерные особенности вирусов группы герпеса;
обнаружена экспрессия вирусных антигенов в опухолевых клетках,
а также выявлены вирусспецифические РНК и ДНК. К этим
опухолям относятся: лимфома Беркитта, назофарингеальный рак
у китайцев (ассоциация с вирусом Эпштейна — Барр — EBV)
и рак шейки матки у женщин (ассоциация с вирусами герпеса
серотипов 1 и 2, HSV-1 и HSV-2).
2.	Зона наибольшего распространения заболеваемости лимфо-
мой Беркитта у африканского населения, проживающего в странах
Центральной Африки, указывала на эндемический характер
возникновения этой опухоли. Об этом же свидетельствуют данные
сероэпидемиологического обследования женщин, больных раком
шейки матки. У больных женщин частота положительного выявле-
ния гуморальных антител к HSV-2 в 2—4 раза выше, чем в конт-
рольных группах здоровых женщин. Частота инфицированности
женщин вирусом группы герпеса простого серотипов 1 и 2 в настоя-
щее время достигает эпидемических масштабов.
3.	Как EBV, так и HSV способны in vitro трансформировать
соответствующие культуры клеток; мишенями для EBV являются
В-лимфоциты человека. Инфекция В-клеток человека сопро-
вождается незлокачественной трансформацией лимфоцитов, т. е.
их иммортализацией. Напротив, инактивированный ультрафиоле-
товым облучением HSV способен трансформировать культуры
фибробластов грызунов, которые сравнительно быстро приобре-
тают раковый фенотип. Отсутствие хорошо охарактеризованных
делеционных мутантов HSV затрудняет определение непосред-
187
ственного участия в трансформации клеток-мишеней вирусинду-
цированных белков. Обнаружение подобных белков в инфициро-
ванных и трансформированных клетках позволило бы определить
конкретный вклад тех или иных вирускодируемых белков в ини-
циацию и поддержание ракового фенотипа клеток.
В настоящее время основное направление молекулярно-био-
логического изучения как геномов EBV и HSV, так и трансформи-
рованных ими клеток направлено на идентификацию трансфор-
мирующих генов вирусов и продуктов их экспрессии в процессе
трансформации клеток-мишеней. В этих исследованиях было
установлено, что трансфекция реципиентных культур только
определенными клонированными фрагментами ДНК геномов HSV
приводит к малигнизации клеток грызунов или иммортализации
В-лимфоцитов в случае с EBV. В процессе вирусиндуцированной
трансформации компетентных клеток наблюдается экспрессия
определенных областей вирусного генома, которая может быть
определена по присутствию вирусспецифических иРНК и соот-
ветствующих вирусных белков-антигенов. Подобные антигены
можно выявить не только в экспериментальной системе, но и
в опухолевых клетках человека. Механизм трансформации В-лим-
фоцитов человека EBV изучен наиболее полно, что позволило
объединить в единое целое несколько молекулярных процессов,
приводящих к формированию лимфомы Беркитта. В малигниза-
ции В-лимфоцитов человека принимает участие «каскад» генети-
ческих элементов, в их числе трансформирующие последова-
тельности EBV, транслокация и экспрессия протоонкогена с-гпус,
а также активация семейства онкогенов ras и, наконец, онкогена
B-lym (см. гл. 5).
Молекулярный механизм малигнизирующего действия вирусов
простого герпеса изучен значительно хуже, хотя трансформирую-
щие области геномов HSV-1 и HSV-2 были определены в несколь-
ких лабораториях [Galloway D., McDougal J., 1983J. Для иденти-
фикации вирусных генов, ответственных за трансформацию,
были использованы следующие подходы.
Традиционными методами молекулярной гибридизации в клет-
ках, трансформированных вирусными частицами, как уже отме-
чалось выше, были выявлены вирусспецифические иРНК и ДНК.
Однако количественно и качественно их содержание менялось
в зависимости от числа пассажей трансформированных клеток.
В таких клетках удается зарегистрировать лишь незначительное
число копий генома HSV или только его часть. Более того, в ДНК
ряда длительно культивируемых клеточных линий, по данным
молекулярной гибридизации, герпесвирусные гены не определя-
лись [Tooze J., 1980). Следует заметить, что в указанных экспери-
ментах для определения небольшого фрагмента вирусного генома,
интегрированного в ДНК малигнизированных клеток, использо-
вали геномную ДНК HSV тотально, а это значительно снижает
чувствительность метода исследования. Что касается определения
188
вирусиндуцированных антигенов, связанных с трансформацией,
то, по предварительным данным, вирусные белки в трансформи-
рованных HSV-клетках кодируются последовательностями, распо-
ложенными в области 0,30—0,41 и 0,58—0,63 усл. ед. карты
вирусного генома. Более совершенным подходом является опреде-
ление трансформирующей активности клонированных фрагментов
генома HSV в отношении различных реципиентных культур клеток.
В этих опытах было показано, что трансформирующие гены
HSV-1 и HSV-2 расположены в различных участках вирусного
генома, хотя локализация остальных репликативных генов этих
вирусов была идентична. В геноме HSV-2 обнаружены два фраг-
мента вирусной ДНК, способных, в зависимости от условий
эксперимента по трансфекции, трансформировать клетки грызу-
нов. Вновь, как и в случае с целыми вирусными частицами, малиг-
низированные клетки в ряде случаев не содержали вирусных
последовательностей, первично инициирующих трансформацию
[Galloway D., McDougal J., 1983].
Остановимся более подробно на характеристике трансформи-
рующих генов HSV-1 и HSV-2.
Трансформирующий ген HSV-1 располагается между 0,31 —
0,42 усл. ед. карты генома и способен трансформировать эмбрио-
нальные культуры клеток хомяков и мышей BALB ЗТЗ. Этот
фрагмент кодирует вирусные белки гликопротеин A/В и VP143,
которые часто выявляются в вирустрансформированных клетках
грызунов. Тем не менее попытки выявить последовательности
трансформирующего гена HSV-1 в ДНК малигнизированных
клеток оказались безуспешными.
Два трансформирующих гена HSV-2 штамма 333, негомоло-
гичные онкогену HSV-1, занимают позиции 0,43—0,58 и 0,58—
0,63 усл. ед. карты генома (фрагменты Bgl II С и Bg II N соответ-
ственно) [Galloway D., McDougal J., 1983]. Трансфекция эмбрио-
нальных клеток хомяков и крыс фрагментом Bgl II N приводила
реципиентные клетки к злокачественной трансформации. Малигни-
ация клеток была стабильной, однако, при наличии лишь части
последовательностей генома Bgl II N-фрагмента HSV-2, вирусин-
дуцируемые белки в указанных линиях клеток не выявлялись.
Для Bgl II С-фрагмента генома HSV-2 установлены две трансфор-
мирующие функции: левая область этого фрагмента индуцировала
иммортализацию реципиентных клеток, тогда как для их злока-
чественной трансформации требовалась трансфекция клеток
целым фрагментом. В дальнейшем при детальном рестрикционном
анализе 7,6 т. п. о. Bgl II N-фрагмента генома HSV-2 было уста-
новлено, что его трансформирующая область представлена более
мелким участком, размером 2,1 т. п. о., который сохранялся
в трансформированных клетках. Вопрос о продукте, кодируемом
указанным фрагментом и принимающем участие в инициации
трансформации, пока не решен однозначно, поскольку в вирус-
трансформированных клетках иРНК, комплементарные 2,1 т. п. о.
189
участку фрагмента Bgl II N, обеспечивали синтез не одного,
а трех белков с молекулярными массами 140 кд, 61 кд и 35—38 кд.
Наиболее вероятным продуктом трансформирующего гена Bgl I N
является белок с молекулярной массой 38 кд, который синтези-
руется в ранний и поздний периоды репродукции вирусного генома
в клетках, инфицированных HSV. Парадоксально, но указанный
белок не выявлялся в клетках грызунов, трансформированных
Bgl II N-фрагментом.
Суммируя данные, полученные на экспериментальных моделях,
можно сделать следующее заключение.
Во-первых, два герпесвируса обоих серотипов — 1 и 2 (HSV-1 и
HSV-2) содержат в своем геноме трансформирующие гены,
способные малигнизировать компетентные клетки. Трансформи-
рующие гены HSV-1 и HSV-2 значительно отличаются друг
от друга.
Во-вторых, вирусспецифические белки, по-видимому, не вовле-
чены в механизм вирусиндуцированной трансформации, а для
поддержания малигнизированного состояния клеток присутствие
в них онкогенов HSV не требуется.
Эти факты указывают на возможную роль онкогенов HSV-1
и HSV-2 в стадии инициации процесса малигнизации, но не в ста-
дии поддержания неопластического состояния.
Идентификация трансформирующих генов HSV-I и HSV-2
открыла возможности более целенаправленного поиска присут-
ствия и экспрессии вирусспецифических генов в клетках рака
шейки матки у женщин. Гибридизацией in situ было установлено,
что лишь ограниченные области генома HSV-2 :0,07—0,40;
0,58—0,63 и 0,82—0,85 [Galloway D., McDougal J., 1983) тран-
скрибируются, причем непостоянно и по-разному у различных
серопозитивных доноров, в вирусспецифические РНК. Это не поз-
волило идентифицировать трансформирующие гены в опухолевых
клетках человека. Правда, имеется сообщение о том, что в 3 из
9 опухолей рака шейки матки были обнаружены последователь-
ности, комплементарные фрагменту Bgl II N. Некоторые из этих
опухолей содержали последовательности фрагмента Bgl II J,
а в ряде опухолевых клеток зарегистрировано присутствие двух
указанных фрагментов генома HSV-2. Эти факты не свидетель-
ствуют о специфичности взаимодействия генома HSV-2 с нормаль-
нм эпителием шейки матки в процессе канцерогенеза [Gal-
loway D., McDougal J., 1983].
В культурах опухолевых клеток человека и животных была
установлена необходимость для поддержания их малигнизирован-
ного статуса персистенции трансформирующих генов ретровирусов
и паповавирусов. Подобная связь между малигнизацией и транс-
формирующими генами HSV-2 пока не определена. Тем не менее
многочисленные данные о взаимодействии генома HSV с ДНК
инфицированных клеток позволили высказать предположение
о причастности герпесвирусных онкогенов к стадии инициации
190
трансформации, но не к поддержанию малигнизированного
состояния клеток (так называемый механизм «hit-and-ran> —
«ударил-убежал>). Открытие протоонкогенов и клеточных транс-
формирующих генов (см. гл. 4 и 5) позволило подвергнуть экспе-
риментальной проверке возможность включения с-опс-генов от-
дельными фрагментами генома HSV-2 по механизму инсерции или
по принципу «hit-and-гап». Следует надеяться, что уже в ближай-
шем будущем подобные данные будут получены, как это сделано
на модели EVB и лимфомы Беркитта.
Другим объяснением необычного характера опухолеродного
действия HSV является то, что эти вирусы могут функциони-
ровать как мутагены. Все вирусы группы герпеса в инфицирован-
ных клетках индуцируют хромосомные аберрации, транслокации
участков хромосомы (например, EBV), причем за подобные
изменения в клетках ответственны именно ранние функции
вирусного генома. Мутагенный эффект HSV не связан с инсерцией
вирусного генома в хозяйскую ДНК- В этой связи значительную
важность приобретают исследования, направленные на иденти-
фикацию вирусных ферментов, способных участвовать в HSV-ин-
дуцированном мутагенезе. Действие таких вирускодируемых
ферментов может быть направлено на деградацию ДНК (напри-
мер, щелочная экзонуклеаза — фосфатаза — или экзонуклеазная
активность, ассоциированная с ДНК-полимеразой), а также на
биохимические реакции, обеспечивающие синтез вирусной и
хозяйской ДНК (например, ДНК-полимераза, рибонуклеотидре-
дуктаза или тимидинкиназа).
Таким образом, механизм малигнизирующего действия HSV
на клетки-мишени еще не установлен. Идентификация трансфор-
мирующих областей геномов HSV-1 и HSV-2, а также обнаружение
в некоторых случаях рака шейки матки присутствия подобных
генов, без продукции, однако, вирусспецифических белков сви-
детельствуют о канцерогенной опасности герпесвирусной инфек-
ции половых путей женщин. Кроме того, они позволяют высказать
ряд рабочих гипотез по поводу природы этого заболевания и
возможного способа действия вирусов простого герпеса на клет-
ки-мишени. Тем не менее полученные данные о вирусах герпеса
пока не раскрывают окончательного хода молекулярных процес-
сов при малигнизации эпителия шейки матки у женщин и связи
герпесвирусов с неоплазиями у людей.
Онковирусология последних лет явилась в известной мере
истоком и одной из основ молекулярной онкологии как в методи-
ческом, так и в теоретическом плане. В процессе изучения моле-
кулярных событий, происходящих при взаимодействии вирусных
генов с клеточным геномом, были открыты важнейшие биологи-
ческие феномены: интеграция геномов; обратный поток генетиче-
ской информации (РНК—►ДНК); трансдукция клеточных генов
в вирусный геном. В конечном счете все это привело к идентифи-
кации особой категории генов многоклеточных организмов,
191
имеющих непосредственное отношение к росту (c-sis, c-ras и
c-erb В), пролиферации (c-ras и с-гпус), дифференцировке (c-los)
и трансформации клеток (все известные вирусные онкогены).
Дальнейшее изучение систем вирус—клетка (или вирусный
онкоген—клетка), а также других экспериментальных моделей
(например, клеточный трансформирующий ген—клетка) будет
направлено, по-видимому, с одной стороны, на углубленное изу-
чение функции онкогенов и их продуктов — онкобелков, а с дру-
гой — на исследование внутриклеточных мест приложения дейст-
вия онкобелков и реакции самой клетки как целого — на втор-
жение чужеродной генетической информации.
В перспективе это позволяет надеяться на открытие основных
биологических принципов феномена малигнизации.
ГЛАВА 4
КЛЕТОЧНЫЕ ОНКОГЕНЫ
ПРОТООНКОГЕНЫ
Разнообразие форм злокачественных опухолей и факторов,
вызывающих их, естественно наводило на мысль о множествен-
ности путей возникновения этих заболеваний и сложности интер-
претации их этиологии. Однако становилось ясным, по крайней
мере, одно важное обстоятельство: на уровне клетки неоплазия —
явление наследственное, и, следовательно, связано оно с измене-
ниями в генетическом материале клеток, т. е. ДНК. Причин рака,
действительно, много, но все они, как вода через горлышко во-
ронки, должны проходить одно критическое русло — ДНК, остав-
ляя в ней какой-то след.
Это стало особенно ясно после открытия онкогенов опухоле-
родных ретровирусов и, более того, доказательства клеточного
происхождения онкогенов. Было установлено, что прародителями
как вирусных, так и невирусных онкогенов являются специфиче-
ские клеточные потенциально трансформирующие последователь-
ности нуклеотидов ДНК клеток, так называемые протоонкогены.
В основе современной теории онкогенеза лежит именно модель,
рассматривающая клеточный онкоген в качестве критически
важного звена в процессе онкогенной трансформации [Альтштейн
А. Д., 1973; Huebner R., Todaro G., 1972; Comings D., 1973].
В соответствии с этой моделью онкоген представляет собой
нормальные («безобидные») последовательности клеточной ДНК,
чья неадекватная (количественная, качественная или временная)
экспрессия (или активация) меняет свойства или функцию
экспрессируемого продукта. Здесь возможны два аспекта фено-
мена: 1) чисто количественные изменения с переходом количества
в иное функциональное качество; 2) качественные изменения:
клеточная последовательность (протоонкоген) меняется под воз-
192
действием различных факторов. Эти два аспекта подробно будут
рассмотрены позже в других разделах книги. В данный же момент
важно сосредоточиться на центральном звене новой схемы канце-
рогенеза за счет активности онкогенов — на клеточных онкогенах.
Косвенное подкрепление этой модели пришло из вирусологии
опухолей. Среди четырех классов онкогенных вирусов, по-види-
мому, три: аденовирусы, паповавирусы и герпесвирусы — приобре-
ли в процессе своей эволюции специфические вирусные генетиче-
ские последовательности, которые они используют для трансфор-
мации инфицированных ими клеток. В противоположность этому,
многие члены четвертого класса онкогенных вирусов — ретро-
вирусов — индуцируют траснформацию путем использования
гена, трансдуцированного в виде клеточных генетических после-
довательностей, чье присутствие в геномах ретровирусов придает
последним трансформирующий потенциал. Инкорпорируя кле-
точный ген в свой геном, вирус высвобождает клеточный ген
из-под контроля клеточных механизмов, которые управляют его
экспрессией в нормальной клеточной хромосоме, и помещает
клеточный ген в систему вирусной регуляторной компетенции.
Кроме этого, будучи ассоциирован с вирусным геномом, клеточный
ген приобретает генетическую мобильность, характерную для
инфекционных вирусов.
Эта интимная связь между ассоциированными с ретровирусом
онкогенами и нормальными клеточными генами наиболее полно
документирована для птичьего вируса саркомы, ВСР.
Из истории открытия клеточных онкогенов. Вирусный ген
ВСР, индуцирующий клеточную трансформацию, был назван src
(сарк.).
Эволюционное происхождение ретровирусных онкогенов было
неясно до открытия положения о том, что ДНК как птиц [Stehe-
lin D. et al., 1976], так и млекопитающих [Spector D. et aL, 1978]
содержат нуклеотидные последовательности, близкородственные
(гомологичные) онкогену src ВСР. Обнаружение этих фактов
вызвало к жизни два предположения: 1) все позвоночные обла-
дают высококонсервативным геном (клеточным src), который
родствен вирусному src и является поэтому потенциально
онкогеном; 2) вирусный src возник путем трансдукции клеточного
src в предшествующий ретровирус.
Когда позже выявлялись новые онкогены, каждый оказывался
имеющим клеточного гомолога, из которого вирусный онкоген,
по-видимому, возник [Bishop J., 1981; Weiss R. et aL, 1982].
Можно думать, что ретровирусные онкогены являются лишь мо-
делью большой группы клеточных генов с онкогенным потенциа-
лом, т. е. «раковыми генами», которые уже фигурируют в медицин-
ской генетике [Knudson А., 1981].
src-ген. Онкоген ВСР был первым из идентифицированных
онкогенов. Важный шаг в его открытии был сделан J. Martin (Ка-
лифорнийский университет), который в 1970 г. идентифицировал
13 Заказ 380
193
температурочувствительный мутант ВСР. Он показал, что темпе-
ратура способна влиять на способность вируса трансформировать
клетки в культуре. С помощью изменения температуры оказалось
возможным вызывать обратимую инактивацию гена. Если куль-
туры клеток, инфицированные температурочувствительным мутан-
том, инкубируются при «пермессивной» температуре (35 °C), то
они трансформируются. Если же температура становится более
высокой — 42 °C («рестриктивной»), то клетки в течение несколь-
ких часов возвращаются к нормальному фенотипу. Однако при
новом понижении температуры они вновь становятся трансформи-
рованными. Суть этих феноменов заключается в следующем:
при «рестриктивной» температуре продукт мутировавшего гена
инактивируется.
Трансформация, таким образом, обусловливается действием
гена, который для того, чтобы поддерживать раковое состояние,
должен экспрессироваться непрерывно. (В большинстве случаев
температура действует не на сам ген, подвергшийся мутации,
а на продукт его экспрессии — белок, который и чувствителен
к температуре).
Ген src вскоре приобрел еще большую реальность благодаря
исследованиям Р. Duesberg, С. Weissmann, М. Billeter и J. Coffin.
Они работали со штаммами ВСР, изолированными Р. Vogt.
Эти штаммы являются «делеционными» мутантами, которые поте-
ряли онкоген и поэтому неспособны индуцировать опухоли
или трансформировать клетки в культуре. Р. Duesberg и С. Weiss-
mann с сотр. фрагментировали геномы «делеционных» мутантов
дикого (онкогенного) типа вирусов ферментом рибонуклеазой.
Путем определения, какой именно фрагмент отсутствует в мутан-
тах, они смогли идентифицировать онкоген как сегмент РНК
вблизи одного конца генома ВСР.
В настоящее время техника генной инженерии позволяет
более точно определять и тестировать онкогены. ДНК теперь
может быть рассечена на фрагменты в специфических сайтах
с помощью набора ферментов — рестрикционных эндонуклеаз.
Отдельные фрагменты могут быть выращены в больших коли-
чествах в бактериях (в составе плазмид), затем реизолированы
и инсертированы в культивируемые клетки, где гены, несомые
ДНК, экспрессируются. Указанным выше путем можно разрезать
вирусную ДНК на куски, которые несут искомый единственный
ген, способный трансформировать клетки благодаря свойству его
кодировать уникальный белковый продукт, трансформирующий
клетку. Именно в это время появилась следующая интерпре-
тация описанных опытов: один ген путем программирования
синтеза одного белка может осуществить изменения, характери-
зующие раковую клетку. Считалось, что узнать такой белок,
понять, как он действует, — значит раскрыть механизм онкогенеза.
Как усложнилась эта ортодоксальная схема в ходе дальнейших
исследований, мы укажем позже.
194
src-Белок. Белок, кодируемый геном src, стал известен благо-
даря работам R. Erickson и соавт. (1980), которые идентифици-
ровали белок, синтезирующийся в пробирке по «инструкциям»
генома дикого типа ВСР, но не образующегося в случае исполь-
зования генома «делеционного» мутанта, лишенного гена src.
Затем они вызвали образование кроличьих антител к предпола-
гаемому src-белку путем индуцирования опухолей у кроликов
с помощью ВСР. Антитела соединялись специфически с белком,
синтезированным in vitro, а также с идентичным белком в клетках,
трансформированных геном src. Это позволило идентифицировать
белок, который кодируется src-геном и ответствен за действие гена.
Белок был назван pp60vsrc («рр» указывает на то, что он является
фосфопротеином; цифра 60 характеризует его молекулярную
массу — 60 кд. v-src указывает на его генетическое происхожде-
ние— вирусный ген src).
Происхождение онкогенов. Одно время полагали, что онко-
генное действие вирусов могло бы рассматриваться как побочное
проявление активности других вирусных генов, чьей главной функ-
цией является участие в продукции новых вирусных частиц.
Теперь ясно, что репликация ретровирусов протекает нормально
в отсутствие онкогенов. Как в этом случае объяснить широкое
распространение онкогенов в ретровирусах и их очевидную
«консервацию» в ходе эволюции? Десятилетние исследования
дали неожиданный ответ: онкогены ретровирусов являются просто
клеточными генами в ином обличье, «пассажирами», подхва-
ченными из животных, в которых вирусы реплицируются. Открытие
того факта, что клетки также содержат онкогены, имеет зна-
чение, далеко выходящее за пределы онковирусологии.
В 1972 г. D. Stehelin, Н. Varmus и J. Bischop решили проверить
«онкогенную гипотезу» R. Huebner и G. Todaro. В поисках единого
механизма объяснения индукции рака многими различными
агентами R. Huebner и G. Todaro предположили, что онкогены
ретровирусов являются частью генетического «багажа» всех кле-
ток, возможно, приобретенного в результате инфекции вирусами
клеток на ранних этапах эволюции. Согласно этому представле-
нию, онкогены безобидны до тех пор, пока остаются в покое.
Когда же они активируются различными канцерогенными аген-
тами — индуцируют в клетках раковый рост. D. Stehelin и соавт.
предполагали, что если гипотеза R. Huebner и G. Todaro (1972)
верна, то src-ген должен присутствовать в ДНК нормальных
клеток и, следовательно, его можно там обнаружить. Но как
практически сделать это, если учесть, что src-ген единичен, а кле-
точных генов в геноме позвоночных содержится десятки
тысяч? Задача, сравнимая с поиском иголки в стоге сена! D. Stehe-
lin пошел по оригинальному пути: он создал так называемую
«пробу» — радиоактивную ДНК, скопированную исключительно
с src-гена с помощью обратной транскриптазы. Скопированная
с src-гена ДНК служила в качестве зонда в поиске клеточной
13*
195
ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, идентичную
(или очень сходную) таковой src. Поиск проводился с помощью
молекулярной гибридизации, в которой цепи нуклеиновой кислоты
(ДНК или РНК) гибридизовались, т. е. образовывали комп-
лексы с родственными участками нуклеиновых кислот.
Поиски увенчались успехом: «проба»—копия гена src—
D. Stehelin гибридизовалась с ДНК клеток неинфицированных
кур и других птиц. D. Spector и соавт. (1978) показали, что род-
ственные src-участки ДНК содержатся и в геномах млекопитаю-
щих, включая человека, и рыб. Было сделано заключение, что все
позвоночные обладают геном, родственным src. Эти данные гово-
рили в пользу теории онкогенов Huebner—Todaro.
Мы так подробно рассказываем об этих экспериментах с c-src
(«с» — означает клеточный) по той причине, что они послужили
фактической основой ядра теории онкогенов, где клеточные гены —
первоисточник двух других главных классов онкогенов: ретро-
вирусных и невирусных опухолевых [Bishop J., 1982].
При более детальном рассмотрении открытого таким образом
у позвоночных клеточного онкогена (c-src) подтвердилось, что
это явно не ретровирусный, а клеточный ген. Такое заключение
следовало из анализа структуры его генома. Было показано, что
белоккодирующая информация c-src рассредоточена в нескольких
отдаленных друг от друга доменах, называемых экзонами, с встав-
ленными между ними участками, интронами. Такая «расщеплен-
ная» структура типична для генов животных, но не генов ретро-
вирусов. Все варианты c-src, найденные у рыб, птиц и млеко-
питающих, близкородственны гену v-src (исключая интроны).
J. Bishop (1982) приводит такую схему структурной организа-
ции клеточного (c-src) и вирусного (v-src) онкогенов src и превра-
щения клеточного src в вирусный (рис. 7). Расщепленный кле-
точный ген c-src состоит из экзонов (черные) и интронов (заштри-
хованные). Клеточный ген каким-то образом «подхватывается»
ретровирусом. Интроны элиминируются, а экзоны, собранные
вместе, инсерцируются в вирусный геном, дополняя геном ВСР.
Кроме src, который кодирует src-белок, в ВСР содержатся гены:
gag (кодирует белок вирусного капсида), pol (обратная тран-
скриптаза), env (кодирует гликопротеиновые шипы вирусной
оболочки). Онкогены других ретровирусов имеют сходное строе-
ние.
Предполагают, что ген src позвоночных пережил долгие
периоды эволюции без большого изменения, что указывает на его
важность для существования видов, в которых он персистирует.
Таинственность c-src возросла с открытием факта, что ген
не только присутствует в нормальных клетках, но также активен
в них, т. е. транскрибируется в иРНК, которая транслируется
в src-белок. Последний, правда, синтезируется в большинстве
клеток в очень малых количествах и по этой причине ранее не под-
давался обнаружению. Однако его удалось обнаружить в опытах
196
с антителами, приготовленными первоначально для выявления
вирусного трансформирующего протеина, pp60vsrc. Клеточный
белок, изолированный с помощью указанных антител, оказался
практически неотличимым от соответствующего вирусного белка
и был назван поэтому pp60csrc. Два указанных белка сходны
по молекулярной массе и химической структуре; оба катализируют
фосфорилирование тирозина и тесно связаны с плазматической
мембраной клеток. Казалось, что эти два белка предназначены
природой для одной и той же функции, хотя один является
вирусным продуктом, а другой — клеточным, один — вызывает
рак (саркому), другой — выполняет в нормальной клетке какую-то
позитивную функцию.
После всех этих данных сомневаться в клеточном происхожде-
нии вирусных онкогенов было невозможно, и дальнейшие исследо-
вания развивались с учетом этого факта.
Результаты изучения c-src явились мощным импульсом
к сообщению, значение которого трудно переоценить. Все 20 из-
вестных на сегодняшний день (1986 г.) ретровирусных онкогенов
имеют своих «двойников» в геномах нормальных клеток всех
изученных видов позвоночных. Большинство этих клеточных
«родственников» вирусных онкогенов подчиняются принципам
организации и функции, впервые установленным для src. Они
имеют структурную организацию скорее клеточных генов, чем
вирусных, «консервативны» (мало отличаются у представителей
разного эволюционного уровня развития), активны в нормальных
клетках. Все это указывает на правильность заключения о том,
что онкогены ретровирусов являются копиями клеточных генов.
По-видимому, клеточные онкогены ассоциировались с предсуще-
ствовавшими геномами ретровирусов в каком-то не очень отдален-
ном прошлом. Не исключено, что подобное копирование клеточных
генов продолжается и сегодня. Более того, этот процесс можно
воспроизвести и в лаборатории. Примером могут служить экспе-
рименты, проведенные Н. Hanafusa и соавт. (1981) (Рокфел-
197
леровский институт, США). Они нашли штаммы ВСР, потерявшие
большую часть гена src (но не весь) и поэтому неспособные
индуцировать характерную саркому у животных. Когда Н. Hana-
fusa и соавт. вводили эти дефектные вирусные штаммы курам
и затем изолировали вирусные частицы, образовавшиеся
в инфицированных клетках, они обнаружили, что ген v-src вируса
был реконструирован, достроен. Генетический материал из гена
c-src рекомбинировался с вирусным геномом, когда вирус репро-
дуцировался в клетках птиц. Вирус, содержащий реконструиро-
ванный указанным образом ген, вновь проявлял полную способ-
ность вызывать опухоли, хотя по крайней мере 3/4 его онкогена
были только что приобретены за счет клеточного гена. Н. Hanafusa
и соавт. повторили подобные опыты на перепелах. Результаты
были те же, что и в опытах на курах.
Эти опыты подтвердили общность функций c-src и v-src.
Однако и они не оценивались всеми исследователями однозначно.
Некоторые требовали еще более прямых доказательств туморо-
генного потенциала клеточных генов.
Такие доказательства были представлены группой J. Vande
Woude (1980) и Е. Scolnick (1981). Авторы использовали технику
генной инженерии для изолирования трех клеточных генов (один
из мышей, два других — из крыс) и прямыми опытами показали,
что данные гены могут индуцировать раковый рост в культуре
клеток. Это удалось сделать путем присоединения к клеточным
генам вирусного «промотера», ДНК-кодируемого сигнала, который
регулирует экспрессию ближайшего к нему гена. Таким образом,
трансформацию осуществлял клеточный ген, получая вирусные
«приказы» работать интенсивнее, чем в норме. Клетки, трансфор-
мированные двумя крысиными клеточными онкогенами, демон-
стрировали образование очень больших количеств белков, кодиро-
вавшихся этими генами.
Установление способности нормальных генов при их актива-
ции (без качественного изменения) вызывать трансформацию
благодаря увеличенному образованию нормального клеточного
белка говорит в пользу гипотезы «дозы», объясняющей канце-
рогенный эффект на основе лишь количественных соотношений
участвующих компонентов. Об этом подробнее будет говориться
ниже.
Что дает открытие клеточных онкогенов. В настоящее время
более чем очевидно, что ретровирусы не являются главной причи-
ной человеческих раков. Тем не менее они указывают путь к пони-
манию главного механизма, лежащего в основе этой болезни.
Широко распространено мнение о том, что рак начинается
с повреждения ДНК, хотя точная природа повреждения не вполне
ясна. Но, независимо от этого, правомерен вопрос: каким образом
повреждение ДНК результируется в рак? Ответ многих исследо-
вателей сводится к утверждению о существовании «раковых
генов», под которыми подразумевались компоненты нормального
198
клеточного генома, чья активность развязывается или ускоряется
различного рода канцерогенами и затем ответственна за поддер-
жание неорганизованного поведения раковых клеток. В этой схеме
раковые гены рассматриваются не как чуждые «незваные гости»,
а как нормальные, важные для жизнедеятельности клетки гены.
Роль канцерогенных агентов сводится к повреждению, превраща-
ющему «союзника» в «противника», возможно, путем поврежде-
ния какого-то второго гена, регулирующего в норме активность
ракового гена. Это — объяснение гипотезы «дозы».
Каково в свете этих данных положение онковирусологов,
связавших свой престиж в объяснении онкогенеза с деятельностью
ретровирусных онкогенов? Перестройка взглядов в этой области
необходима и возможна, тем более, что именно онковирусологи
сами были первыми, создавшими принципиальное понятие «онко-
ген». В своих представлениях они вынуждены подойти к раковым
генам как клеточным онкогенам. Поскольку клеточные онкогены
и как таковые, и в их вирусной форме туморогенны, резонно
рассматривать те и другие как одно и то же.
Таким образом, онкогенная гипотеза была вновь «разыграна»
в том же сюжете, но уже другими «актерами».
В пользу существования клеточных онкогенов и роли их
в индукции опухолей говорят также новейшие исследования ряда
неоплазий иммунной системы (лимфом кур, человека, плазмаци-
том мышей) и опухолей другого гистогенеза, где активация
«молчащих» клеточных генов в силу ли хромосомных трансло-
каций и совмещения клеточного гена с вирусным или клеточным
промотером, или транспозиций, инсерций и других генетических
событий клеточные онкогены начинают активно работать, вызы-
вая образование опухолей. Но об этом подробнее будет сказано
в других разделах книги.
Обозревая события, связанные с открытием клеточных онко-
генов, известный вирусолог — молекулярный онколог J. Bishop
(1982) пишет, что нормальные клетки могут нести семена своего
собственного разрушения в форме раковых генов. Активности
этих генов могут представлять конечный общий путь, которым
многие канцерогены действуют. Раковые гены могут быть не чуже-
родными гостями, а важными конституентами клеточного гене-
тического аппарата, «предающими» клетку, только если их струк-
тура или контроль над ними нарушаются канцерогенами. Наконец,
некоторые из этих генов могут появиться в ретровирусах, где они
поддаются легкой идентификации, манипуляциям и характери-
стике. J. Bishop считает, что то, что было познано из исследования
онкогенов, представляет первый взгляд за занавес, который так
долго скрывал механизм рака. В одном отношении увиденное
является огорчающим, потому что химические механизмы, кото-
рые, по-видимому, сбивают раковые клетки с пути, не отличаются
от механизмов, работающих в нормальных клетках. Это говорит
о том, что разработка рациональной терапевтической стратегии
199
может остаться почти такой же досаждающей, какой она явля-
ется сегодня. Нет пользы изобретать средства, препятствующие
активностям, ответственным за раковый рост, если те же актив-
ности в равной мере необходимы для существования нормальных
клеток. J. Bishop полагает, что онковирусология пережила свою
неудачу найти вирусные агенты рака человека. Вопрос теперь
не в том, вызывают ли вирусы человеческие опухоли (как они,
возможно, могут иногда это делать), а, скорее, как много можно
извлечь из опыта онковирусологии относительно механизма
возникновения человеческих опухолей.
Открытие клеточных онкогенов ставит их в центр новых пред-
ставлений о канцерогенезе, интегрирующих все формы этого про-
цесса в единый универсальный механизм. Ядром служит группа
клеточных генов, необходимых для нормального роста и развития.
Будучи трансплантированы в ретровирусный геном, такие гены
становятся онкогенами. Рак может также возникнуть, если кле-
точный ген подвергается воздействию любым агентом из широкого
круга мутагенов или других канцерогенов (рис. 8).
Практически все, что известно о клеточных онкогенах, пришло
из излучения ретровирусных v-опс-генов. Фактически все иденти-
фицированные к настоящему времени ретровирусные v-onc-гены
были получены путем молекулярного клонирования. Ни один
из v-опс-генов не описан достаточно полно.
Клеточные c-onc-гены распознаются путем установления го-
мологии с v-onc-генами. Ни в одном случае эта гомология не пред-
ставляет всю целостность клеточного гена; трансдукция с-опс
обычно исключает несколько кардинальных черт последнего, в том
числе области, где транскрипция начинается и заканчивается,
интроны и, иногда, части кодирующей области. Границы клеточных
генов, определяемые путем трансфекции, еще более неопре-
деленны, т. е. гены переносятся во фрагментах ДНК, размер
которых вынуждается только потребностью, определяемой тем,
чтобы они включали достаточную часть клеточного гена, обеспе-
чивающую экспрессию и функциональную компетенцию. Даже
нуклеотидное секвенирование не может разрешить неопределен-
ности относительно транскрипционных границ данного гена и раз-
мер кодирующего домена. Между тем адекватно определить
c-onc-гены можно только при условии знания, где транскрипция
и трансляция генов начинаются и где кончаются.
Топографическая вариабельность клеточных онкогенов со-
ответствует таковой у других клеточных генов. Размер их варьи-
рует от немногих т. п. о. до 40 т. п. о. [Goff S. et al., 1980; Venn-
strom В., Bishop J., 1982]. Они могут не иметь интронов, по край-
ней мере в области, трансдуцируемой в ретровирусы, или содержать
их более дюжины. Размер индивидуальных интронов может быть
ничтожно малым (несколько десятков пар оснований) или гигант-
ским (тысячи пар оснований). Клеточные онкогены ведут себя
генетически как классические менделевские локусы.
200
Нормальный рост и развитие
Онкоген
экспрессия
экспрессия
Раковый рост
Рис. 8. Схема превращений и функций клеточного онкогена.
Клеточные онкогены прослежены от примитивных Metazoa до
человека; они сохраняют поразительный консерватизм как струк-
туры, так и функции. Большинство этих генов экспрессируется
в различных тканях и в различное время в ходе роста и развития.
Их функция в нормальных клетках пока недостаточно ясна, хотя
преобладает мнение, что они активны в процессе дифференциа-
ции [Cooper G., 1982; Lane М. et aL, 1982; Bishop J., 1983].
Накапливается все больше данных о том, что клеточные онкогены
участвуют в туморогенезе, какой бы ни была его непосред-
ственная причина. Некоторые из этих генов, по-видимому, могут
участвовать в инициации генеза опухолей, другие— в поддержа-
нии конечного неопластического фенотипа. Однако клеточные
гены скорее всего не являются туморогенными в их нативном
состоянии, ибо для такой роли они должны быть или активи-
рованы до ненормально высокого уровня экспрессии, или мути-
рованы таким образом, чтобы изменить некоторые аспекты их
функции. В настоящее время, при современном уровне знаний,
нельзя с полной определенностью исключить ни один из этих
возможных вариантов.
Выявление и изолирование клеточных онкогенов положили
начало наступлению на механизмы канцерогенеза. Роль и природа
повреждения ДНК теперь могут быть испытаны в прямых опытах
(см. ниже о трансфекции). Ныне можно довольно точно определить
число генетических функций, необходимых для генеза отдельных
типов опухолей. Также могут быть идентифицированы конкретные
гены, ответственные за наследственную предиспозицию к раку.
Учитывая клеточное происхождение вирусных онкогенов,
а также существование как тех, так и других (т. е. клеточных
и вирусных), онковирусологи предположили следующие обозначе-
ния: клеточные гены имеют индекс «с», вирусные — «V»: например,
c-src, v-src, c-ras, v-ras и т. д. [Coffin J. et aL, 1981]. Онкогены,
идентифицированные путем трансфекции, были названы «опухо-
201
левыми генами», «клеточными онкогенами», «трансформирую-
щими генами» или просто «онкогенами». Термин «протоонкоген»
использовался для обозначения или клеточных прародителей
ретровирусных v-опс-генов, или клеточных генов, чье повреждение
дает начало активным онкогенам в опухолевой ДНК [Bishop J.,
1981; Weinberg R., 1982].
Как указывалось выше, эволюционный «консерватизм» клеточ-
ных генов является одной из их характерных черт. Примером
этому может быть тот факт, что активности клеточных онкогенов
из одного и того же типа опухолей, например грызунов и человека,
могут быть инактивированы расщеплением одним и тем же набо-
ром рестрикционных эндонуклеаз. Такие результаты подтвер-
ждают высокую степень структурной гомологии. Однако степень
выраженности ее варьирует от одного онкогена к другому.
Причина этих различий пока неясна. По-видимому, все клеточные
онкогены возникли не позже, чем появились многоклеточные
организмы.
Открытие с-опс-генов у насекомых Drosophila melanogaster
и червя Caenorhabditis elegance [Shilo В., Weinberg R., 1981]
привлекло особое внимание отчасти потому, что теперь представ-
ляется возможным установить момент происхождения этих генов
в значительно более отдаленные времена, чем ранее предполага-
лось. Однако важнее то, что стало возможным произвести слож-
ный генетический анализ на основе функции онкогенов как в нор-
мальных, так и в опухолевых клетках.
Гомологии между ДНК Drosophila, с одной стороны, и v-src,
v-abl и v-ras — с другой распространяются на участки вирусных
онкогенов, которые являются критическими для функций их белко-
вых продуктов. Уже первые результаты нуклеотидного секвениро-
вания указывают, что c-ras-гены Drosophila melanogaster и грызу-
нов являются заметно родственными. Экспрессия в форме инфор-
мационных РНК уже показана для нескольких протоонкогенов
этого вида плодовой мушки; как эмбриональные клетки, так
и ткани ее личинки содержат тирозинспецифическую протеинки-
назу, сходную с таковой, кодируемой онкогеном v-src вируса
саркомы Рауса [Bishop J., 1983].
Обращают на себя внимание странные колебания числа онко-
генов у различных видов позвоночных. Примером может служить
следующее.
1.	Имеется сообщение об обнаружении лишь одного локуса
с-тус у кур, в то время как их содержится более четырех
в ДНК человека. Правда, лишь один локус с-тус человеческой
ДНК очень сходен топографически с куриным, тогда как осталь-
ные родственны мышиному лишь частично.
2.	Семейство c-ras-генов имеет две ветви: одна — трансдуциро-
ванная как v-Ha-ras в мышиный саркомный вирус штамма Харвея
(Harvey), другая — как v-Ki-ras в мышиный саркомный вирус
штамма Кирстена (Kirsten) [Ellis R. et al., 1981]. c-ras-Гены
202
Харвея и Кирстена «разошлись», как две ветви семейства, раз-
вившиеся раздельно из дупликации древнего гена. Если это так,
то родовая дупликация произошла, вероятно, до филогенетиче-
ского рассеивания, породившего насекомых. c-ras-Гены Харвея
и Кирстена распространены среди различных видов по трем
характерным типам: в виде уникальных локусов (например, у кур
и мышей); в виде дупликации в пределах линий Харвея и Кирстена
(у крыс и человека) и в виде в значительной степени амплифи-
цированных семейств генов (у грызуна Mus pohari и китай-
ского хомяка). Как результат дупликаций у крыс и человека
формы ras Харвея и Кирстена представлены двумя локусами;
один — с интронами, другой — без них. Общие топографические
характеристики родственных крысиного и человеческого генов
сходны. Дупликации c-ras Харвея и Кирстена могли возникнуть,
когда сплайсированные варианты исходных генов были транспо-
зированы в новые хромосомные положения. Локус Харвея, содер-
жащий интроны, является наиболее консервированным из c-ras-
локусов: число, размер и локализация экзонов и интронов анало-
гичны у мышей, крыс и человека; нуклеотидные последовательно-
сти экзонов разошлись очень мало от мыши до человека; интроны
также значительно консервированы, хотя намного меньше, чем
экзоны, c-ras Харвея амплифицирован примерно до 10 копий
у Mus pohari (но не в других видах грызунов), c-ras Кирстена —
по крайней мере до 8 копий у китайских (но не сирийских)
хомяков. Механизм амплификации пока неясен.
3.	Менее хорошо изученная генная дупликация четко обнару-
живается в отношении c-src у кур (два локуса) и человека
(два локуса). Две отчетливые формы c-src-белка наблюдали
в некоторых человеческих клетках, однако неясно, кодируются
ли эти белки различными генами.
Каков биологический смысл многочисленных копий генов?
Информация по этому поводу неоднозначна и противоречива.
С одной стороны, все (кроме одного) локусы с-myc в человеческой
ДНК являются неполными и могли бы быть нефункциональными
псевдогенами; одна из двух копий c-src-гена в ДНК кур и человека
имеет, по-видимому, ненормальную структуру, и десятикратная
амплификация c-ras Харвея у Mus pohari не сопровождается
усилением экспрессии гена, как если бы дополнительные копии
являлись «молчащими». С другой стороны, обе формы c-ras Хар-
вея у крыс могут трансформировать клетки в культуре, если
к ним присоединен ретровирусный промотер транскрипции. Дупли-
цированные гены должны все же кодировать активные белки.
Тонкие детали эволюционного консерватизма клеточных генов
стали проясняться благодаря анализу нуклеотидных последо-
вательностей. Варианты c-mos мыши и человека являются, оче-
видно, однокопийными генами, первый — без интронов, второй —
с интронами [Чумаков И. М. и др., 1980]. Внутри кодирующих
областей мышиного и человеческого генов 77 % нуклеотидных
203
последовательностей являются идентичными; дедуцированные
последовательности аминокислот кодируемых белков также род-
ственны (75%). Гены c-fps и c-fes являются птичьими и коша-
чьими вариантами одного и того же генетического локуса. Вирус-
ные формы fps и fes имеют общими 70 % их нуклеотидных после-
довательностей и дедуцированных последовательностей амино-
кислот в кодируемых белках. Консервация такой степени говорит
о действии мощных сил, направленных на сохранение существен-
ных функций. Интересно и в то же время парадоксально, что нет
данных в отношении экспрессии c-mos ни в одном из исследован-
ных видов животных, в то время как с fps/c-fes экспрессируются
в целом ряде нормальных клеток и тканей.
Экспрессия клеточных онкогенов. Поскольку выявление экс-
прессии клеточных онкогенов по кодируемым белкам встречало
трудности, основным методом исследования этого процесса яви-
лось изучение транскрипции онкогенов.
Было установлено, что практически все c-onc-гены транскри-
бируются в РНК в нормальных и опухолевых клетках. Отмечено
лишь одно исключение: не удалось обнаружить транскрипции
c-mos. Этот факт вызывает недоумение, учитывая сильную эво-
люционную консервативность c-mos. Имелись затруднения и с вы-
явлением транскрипции кошачьего гена c-fes, однако аналогичный
ген кур c-fps транскрибируется в ряде тканей и, по-видимому,
транслируется в клетка ряда млекопитающих.
Механизм транскрипции с-опс-генов сходен с таковым других
клеточных генов. Первичный транскрипт содержит интроны, равно
как и экзоны, и затем сплайсируется в серию более мелких
интермедиатов, обнаруживаемых только в ядре. Интроны элими-
нируются полностью из цитоплазматических РНК. Ряд этих цито-
плазматических РНК сейчас идентифицированы как информацион-
ные РНК-транскрипты с c-src, c-erb A, c-erb В [Vennstrom В. et aL,
1982). иРНК была локализована в полирибосомах, а цитоплазма-
тические РНК, представляющие кирстеновский вариант c-ras гена,
были транслированы в аутентичные генные продукты in vitro
[Ellis R. et al., 1982].
На основании исследований транскрипции клеточных онкоге-
нов были сделаны следующие общие заключения [Bishop J., 1983].
I.	Транскрипция с клеточных генов (с-опс) происходит в раз-
личных тканях и у каждого из исследованных видов позвоночных.
Транскрипция c-src и с-тус обнаружена также у Drosophila
melanogaster.
2.	Количества с-опс-специфической РНК в большинстве клеток
исключительно малы (около 1 —10 копий на клетку).
3.	Функция каждого c-onc-гена требуется только для опреде-
ленных тканей.
4.	Каждый c-onc-ген дает начало определенным РНК, размеры
которых, в общем, однозначны в различных типах клеток и в раз-
личных видах животных. Константность этих РНК среди широкого
204
разнообразия видов позвоночных является дополнительным свиде-
тельством в пользу существования селективного давления, которое
сохранило структуру и функцию с-опс-генов.
5.	Многие из иРНК с с-опс-генов по своим размерам явно
больше (в 3 и более раз), чем, казалось бы, требовалось для
кодирования предполагаемых генных продуктов, как если бы
иРНК имели большие нетранслируемые участки. Наиболее драма-
тическим примером в этом роде может служить c-erb В, чьи
зрелые иРНК имеют длину 9 и 12 т. о. (хотя образуемые соответ-
ствующие этим иРНК белки еще не идентифицированы).
6.	Большинство с-опс-генов, по-видимому, образуют единствен-
ную цитоплазматическую РНК в соответствии с ожиданием, что
каждый локус представляет один ген. Однако птичьи эмбрионы
содержат по крайней мере две иРНК, полученные транскрип-
цией с c-erb А, и по крайней мере две, полученные с c-erb В. Каж-
дый из этих клеточных локусов, очевидно, порождает один вирус-
ный ген. Есть основания думать поэтому, что каждый локус
кодирует один белок. Множественность c-erb иРНК обусловлена,
возможно, гетерогенностью в З'-нетранслируемых участках РНК,
как это имеет место, например, в случае информационных РНК
для дигидрофолатредуктазы.
Функции клеточных онкогенов и онкобелков. Для идентифика-
ции клеточных онкобелков сейчас успешно используется стратегия,
разработанная для соответствующих ретровирусных онкобелков.
В частности, антисыворотка, приготовленная против вирусного
трансформирующего белка, как правило, реагирует с гомоло-
гичным клеточным белком. Именно этим путем была идентифи-
цирована группа белков, кодируемых c-onc-генами (табл. 12).
Хотя идентификация генных продуктов не гарантирует иден-
тификации функции, тем не менее при нынешнем уровне знаний
суждение о функции клеточных генов делается по аналогии
с функцией, установленной для продуктов гомологичных генов
ретровирусов.
Трудность в исследовании клеточных онкобелков заключается
в том, что они содержатся в клетках в чрезвычайно малых
количествах. Тем не менее многое о них уже известно, отчасти
благодаря аналогии с соответствующими вирусными онкобелками.
Так, установлено, что как вирусные, так и клеточные онкобелки
обладают протеинкиназной активностью; и те, и другие локали-
зуются на плазматической мембране и группируются в липкие
бляшки — специализированные участки плазматической мем-
браны, которые обеспечивают прилипание культивируемых клеток
к стеклу или пластику. Пока установлен лишь один внутрикле-
точный белок-мишень, с которым взаимодействует онкобелок и ко-
торый является субстратом энзиматической активности, в част-
ности для pp60csrc in vivo, это — содержащийся в значительном
количестве клеточный белок с молекулярной массой 36 000 (р36).
Функция этого белка точно не установлена, хотя известно, что
205
Таблица 12
Белки, кодируемые клеточными онкогенами
(Bishop J., 1983]
Онкоген	Белок, кд	Предполагаемая функция	
		клеточного гена	вирусного род- ственника
c-src	60	Тирозинкиназа	Тирозинкиназа
c-fps	98	»	>
с-аЫ	150		>
c-ras	21	Трсонинкиназа	Трсонинкиназа
(На/Ki) c-fes	92	>	Тирозинкиназа
он может быть присоединен к компонентам цитоскелета (Cooper J.,
Hunter Т., 1981].
Что касается функции pp60c src в физиологии нормальной клетки,
то высказываются следующие предположения.
Фосфорилированию тирозина приписывается участие в кле-
точном ответе на митогенные ростовые факторы (Cooper J., Hun-
ter Т., 1982]. Наиболее ранние события этого ответа происходят
в плазматической мембране. Энзиматическая активность и суб-
клеточная локализация pp60c src поэтому указывают на возможное
участие его в контроле клеточного роста и деления. Однако лишь
косвенные данные свидетельствуют в пользу данного предполо-
жения: ростовые факторы вызывают фосфорилирование тирозина
в белке р36, но ответственная за этот процесс киназа пока не най-
дена, и фосфорилирование pp60rsrc, и усиление его протеинкиназ-
ной активности находятся среди немедленных клеточных ответов
на фактор роста кровяных пластинок (ростовой фактор тромбо-
цитов) .
Два семейства генов c-ras кодируют очень сходные белки
с молекулярной массой около 21 000 (p21c ras) (Langeheim Н. et aL,
1980; Furth M., et aL, 1982]. Эти белки, подобно их вирусным
гомологам (p21vras), активно связывают гуаниннуклеотиды и осу-
ществляют аутофосфорилирование по треонину [Shih Т. et al.,
1980; Scolnick Е. et al., 1981]. Однако не было обнаружено
киназной активности у других белков, и функция ras-белков оста-
ется неустановленной. Как вирусный, так и клеточный p21ras лока-
лизуются на плазматической мембране.
О продуктах других клеточных онкогенов известно меньше.
В отношении продукта с-abl (р!50саЬ|) было показано, что он
отличается по размеру и строению от любого другого, кодируе-
мого несколькими вариантами v-abl, потому, что построен
из частей с-abl и вирусного структурного гена (gag); тем не менее
имеется сходство между фосфопептидными картами белков с-аЫ
и v-abl. Было также найдено, что белковый продукт v-abl присут-
ствует лишь в тимоцитах и других лимфоидных клетках, в то время
206
как продукт транскрипции с-abl, РНК, содержится в широком
круге клеток и тканей. О филогенетическом распределении с-аЫ
не сообщалось, так же как ничего не известно о его функции;
протеинкиназная активность продукта с-abl (подобно таковому
v аЫ) не обнаружена.
Продукты c-fps и c-fes должны представлять гомологичные
белки, так как два гена, как полагают, являются партнерами
у птиц и кошек. Молекулярные массы двух белков отличаются
на 6 кд (см. табп 12). Предполагаемый продукт c-fes (p92ctes)
был найден у крыс и родственных млекопитающих, но не у других
грызунов. Мало что еще известно об этом белке, а также его
функции. Белок, приписываемый c-fps (p98cfps), считается аутен-
тичным продуктом гена, потому что он содержит многочисленные
пептиды, идентифицированные ранее в трансформирующих бел-
ках, кодируемых вариантами v-fps, и проявляет тирозинспецифи-
ческую протеинкиназную активность, подобно вирусным белкам.
Учитывая все имеющиеся данные, было бы преждевременно
сделать вывод о том, что фосфорилирование тирозина белков
является общей или даже типичной функцией клеточных онко-
генов.
Семейства клеточных онкогенов. Структурная организация
ретровирусных онкогенов столь разнообразна, что трудно указать
какой-то единый биохимический механизм их различного действия
и еще труднее представить себе происхождение онкогенов из об-
щего источника. Тем не менее такая мысль напрашивалась
на основании их важнейшей общей биологической способности
вызывать туморогенез. Экспериментальные наблюдения подкре-
пили интуицию, раскрыв две формы родства среди клеточных
онкогенов.
1. Один вид животных может обладать двумя или более
клеточными онкогенами, представляющими одно и то же семей-
ство. Примером может служить семейство c-ras. Харвей- и Кир-
стен-варианты гена ras — родственны лишь отдаленно, если
судить по их нуклеотидным последовательностям, однако кодируе-
мые этими генами белки антигенно весьма сходны и имеют
общими 85 % их аминокислотных последовательностей. Белки,
однако, можно различить серологически, если использовать моно-
клональные антисыворотки [Furth М. et aL, 1982]. Трудности
в идентифицировании и объяснении дупликации клеточных онко-
генов смягчаются благодаря неожиданному родству между явно
различными семействами генов. Например, гены c-src и s-yes
рассматриваются как различные гены, однако их нуклеотидные
последовательности достаточно родственны, чтобы обнаружить
уловимые перекрестные реакции при молекулярной гибридизации
в не слишком жестких условиях.
2. Может существовать семейство или даже суперсемейство
[Doolittle R., 1981] клеточных онкогенов, имеющих единое древ-
нее происхождение. Это стало ясно после установления факта,
207
что несколько различных онкогенов кодируют тирозинспецифи-
ческие тирозинкиназы (см. табл. 12) и указанные ферменты
могут использовать сходный набор клеточных белков в качестве
субстратов [Cooper J., Hunter Т., 1981 ]. В настоящее время анализ
последовательностей аминокислот в продуктах клеточных онкоге-
нов показал более близкое родство онкогенов, чем следовало из их
нуклеотидных последовательностей. При первичной сравнитель-
ной молекулярной гибридизации онкогены src, yes и fps (птичий
и кошачий варианты одного и того же гена) казались структурно
неродственными, хотя все они кодируют протеинкиназы, специ-
фические по тирозину. Однако дедуцированные аминокислотные
последовательности соответствующих белков показали значитель-
ное сходство, особенно в карбокситерминальном домене, который
несет энзиматическую активность pp6Ocsrc [Levinson A. et aL,
1981].
При сравнении с аминокислотной последовательностью
pp60csrc получены следующие степени родства с ним продуктов
других с-опс-генов: yes — 82 %, fps — 40 %, fes — 45 %.
Фосфотирозин составляет всего 0,01 % от общих фосфоамино-
кислот в белках нормальных клеток [Hunter Т., Sefton В., 1980].
Однако организмы могут содержать не менее шести тирозинспе-
цифических тирозинкиназ: c-src, c-yes, c-fps/c-fes, c-abl, рецепто-
ров для эпидермального фактора роста [Buhrow S. et aL, 1982;
Cohen S. et aL, 1983] и, возможно, киназы, активируемые другими
факторами роста [Ek В. et al., 1982; Kasuga М. et aL, 1982;
Nishimura J. et aL, 1982].
Трудно объяснить биологический смысл большого изобилия
ферментов, выполняющих столь редкую модификацию. Возможно
лишь одно предположение: фосфорилирование тирозина играет
какую-то весьма важную роль в ряде процессов развития, в ко-
тором участвует ряд различных киназ, кодируемых отдельными
генами [Bishop J., 1983].
Известны 20 различных ретровирусных онкогенов, причем
каждый имеет соответствующий с-опс. Опыты с трансфекцией
открыли еще около 10 новых онкогенов [Cooper G., 1982; Wein-
berg R., 1982]. Возможен дальнейший рост числа открываемых
онкогенов. Однако количество их не может быть неограниченным.
Все чаще повторяются открытия уже известных онкогенов, причем
некоторые из них найдены более чем у одного вида животного,
и, наоборот, несколько разных онкогенов обнаружены у одного
вида. Возможно, что большинство существующих онкогенов уже
открыто. J. Bishop (1983), равно как и R. Weinberg (1982),
считают, что общее число существующих клеточных онкогенов
должно быть не более 50—100, т. е. примерно то количество,
которое предполагалось несколько ранее для так называемых
раковых генов [Knudson А., 1981].
Локализация клеточных онкогенов в хромосомах. Данный
вопрос изучается активно, и некоторая информация в этом отноше-
2С8
нии уже получена. Так, установлена локализация в хромосомах
человека следующих с-опс-генов [Bishop J., 1983]:
с-аЫ
c-fes
c-fos
c-myc (один локус)
c-ras Harvey (локус с интронами)
c-ras Kirsten (локус с интронами)
c-mos
c-myb
c-sis
c-src
9
15
2
8, сегмент q24
II
12
8
6
22
20
У мышей локализация клеточных онкогенов по хромосомам
следующая: с-abl, c-fps/c-fes и c-src — во 2-й, c-mos—в 4-й.
Свидетельства клеточного происхождения ретровирусных онко-*
генов. Клеточное происхождение онкогенов ретровирусов доказы-
вается следующими фактами: 1) постоянством числа и позиции
каждого клеточного онкогена у любого данного вида, в отличие
от колебаний числа и позиций провирусов для эндогенных ретро-
вирусов; 2) консервативностью клеточных онкогенов на протяже-
нии огромных отрезков времени процесса эволюции, тогда как
гомологии среди эндогенных ретровирусов обнаруживаются
только у ограниченного числа близкородственных видов; 3) при-
сутствием интронов в большинстве клеточных онкогенов — отли-
чительной чертой эукариотных генов, опять-таки в контрасте
с организацией ретровирусных генов; 4) тем, что клеточные гены
и не находятся внутри, и не присоединены к провирусам
эндогенных ретровирусов. Эти данные подтверждаются рядом
работ. Они говорят в пользу того, что ретровирусные онкогены
возникли (и, видимо, продолжают возникать) путем трансдук-
ции клеточных онкогенов в ретровирусные геномы.
Трансдуцированный в вирус путем его рекомбинации с вирус-
ным геномом клеточный онкоген после этого генетического ак-
та более не подконтролен регуляторным механизмам. Он теряет
интроны, отделяется от своих собственных сигналов к инициации
и терминации и включается в геном реплицирующегося ретро-
вируса.
Роль клеточных онкогенов в нормальных клетках. Сам факт
сохранения клеточных онкогенов в практически неизмененном
состоянии на протяжении значительного периода эволюционного
развития говорит в пользу какой-то их важной биологической
функции в клетках существ самого различного уровня сложности.
Высказывались предположения об их роли в дифференциации.
По мнению J. Bishop (1983), в пользу этой идеи говорит следую-
щее.
1.	Наследственное предрасположение к раку у людей ткане-
специфично; если существуют «раковые гены», ответственные
за это предрасположение, то они действуют в совершенно точных
эмбриологических родословных [Knudson А., 1981].
14 Заказ 380
209
2.	Онкогены ретровирусов проявляют тканевую специфичность.
Каждый онкоген индуцирует опухоли только в определенных
органах и трансформирует только определенные клетки в культуре.
Специфичность онкогенов не является просто следствием видовых
границ хозяев. Дифференцированные клетки могут содержать
и экспрессировать онкоген, но противостоять его трансформи-
рующей силе. По-видимому, уязвимые клетки содержат субстраты
для активности онкогена, резистентные клетки — не содержат.
3.	Ретровирусные гены вмешиваются в дифференциацию; v-src
индуцирует неадекватную экспрессию одного эмбрионального гена
и подавляет экспрессию дифференцированных свойств; v-erb и
v-abl блокируют развитие гемопоэтических клеток в их нормаль-
ных путях (эритроидном и лимфоидном), и, в некоторой степени,
v-myb и v-myc могут обратить дифференциацию моноцитных
гемопоэтических клеток.
4.	Клеточные гены, идентифицированные трансфекцией, про-
являют определенную тканевую специфичность: например, c-ras
Харвея — в карциноме мочевого пузыря; c-ras Кирстена — в кар-
циноме легкого и толстой кишки; малоохарактеризованный
c-ras — в нейробластоме; c-ras вариант Кирстена — в фибро-
бластах грызунов, трансформированных метилхолантреном.
В других случаях специфичность была оценена путем определения
чувствительности и инактивации онкогенов в различных опухолях
различными рестрикционными эндонуклеазами. Этим путем было
установлено участие отличающихся друг от друга онкогенов
в пяти различных формах человеческих лейкозов [Lane М. et al.,
1982]. Указанные находки, в свою очередь, подкрепляли предпо-
ложение, что клеточные онкогены, обнаруженные при лейкозах,
являются нормальными стадиеспецифическими детерминантами
гемопоэза.
Что касается участия клеточных онкогенов в процессе диф-
ференциации, то ответ на этот вопрос встречает трудности.
Экспрессия генов, важных в развитии, варьирует от ткани к ткани,
зависит от этапа развития, времени в эмбриогенезе. И действи-
тельно, наблюдали значительные вариации в экспрессии. В част-
ности: 1) экспрессия c-myb выражена в гемопоэтических тканях
и примитивных гемопоэтических опухолевых клетках [Chen J.,
1980; Gonda Т. et al., 1982]; 2) c-myc экспрессируется в самых
разнообразных клетках, хотя в гемопоэтических клетках эта экс-
прессия опять-таки более выражена; 3) экспрессия c-myb и с-тус
резко падает в клетках промиелоцитной лейкемии, которые были
стимулированы к дифференциации в более зрелые формы хими-
ческими агентами; 4) c-erb А и c-erb В транскрибируются диф-
ференциально, первый — в костномозговых клетках, второй —
в эмбриональных фибробластах; 5) у неонатальных мышей
c-fos активно экспрессируется в костях — мишени неопластиче-
ской трансформации онкогеном v-fos; 6) плюрипотентная гемо-
поэтическая клетка, полученная из мышиного костного мозга.
210
содержит исключительно большие количества белка, кодируемого
c-ras Кирстена; 7) в ходе эмбриогенеза мыши экспрессия c-ras
Харвея поддерживается на высоком уровне, экспрессия с-аЫ,
c-fos и некоторых других — варьирует.
Как видно из приведенных данных, в целом картина пестрая.
Во многих случаях экспрессия варьирует коррелятивно с диф-
ференциацией. Однако не во всех случаях методики адекватны
поставленным вопросам. По-видимому, окончательное заключение
о роли клеточных онкогенов в развитии и дифференциации делать
еще преждевременно.
Родство вирусных и клеточных онкогенов. Родство вирусных
и клеточных онкогенов очень велико. Например, нуклеотидные
последовательности v-mos и c-mos (1157 нуклеотидов) различа-
ются только в 25 позициях, а дедуцированная последовательность
аминокислотных последовательностей вирусного и клеточного
белков — только в 11 аминокислотных остатках [Van Beveren С.
et al., 1982]. Вирусный и клеточный варианты myb-генов столь же
близки: среди 1197 нуклеотидов различаются лишь 15, что при-
водит к 11 заменам аминокислот в белковых продуктах этих онко-
генов.
Очень сходны белки, кодируемые соответствующими вирус-
ными и клеточными онкогенами. Так: 1) клеточная и вирусная
формы pp60src имеют одну и ту же молекулярную массу, проявляют
перекрестную антигенную реактивность, дают сходные пептидные
карты, оба ассоциированы с плазматической мембраной, фосфо-
рилированы и имеют одинаково расположенные фосфоамино-
кислоты, с фосфосерином — вблизи аминотерминального конца
и фосфотирозином — в карбокситерминальном домене, оба явля-
ются протеинкиназами, специфичными к тирозину; 2) белки,
кодируемые семейством v-ras и c-ras, также весьма сходны.
Их молекулярная масса равна примерно 21 000. Они имеют,
по крайней мере, некоторые общие антигенные детерминанты,
дают сходные пептидные карты, обладают пока непонятной спо-
собностью связывать гуаниновые нуклеотиды, осуществляют
аутофосфорилирование по треониновым остаткам in vitro, однако
протеинкиназная активность в отношении других белков не выяв-
лена. Ряд других продуктов клеточных онкогенов (c-abl, c-fps,
c-fms и c-fes) имеют сходные иммунологические и биохимиче-
ские характеристики с их вирусными партнерами. В пользу родства
клеточных и вирусных онкогенов говорит также описанный выше
факт восстановления дефектного, делецированного на 2/3 вирус-
ного онкогена, v-src, за счет рекомбинации с клеточным онкогеном
c-src.
Сходство и различия вирусных и клеточных онкогенов. Иссле-
дователи отмечают как сходство, так и определенные различия
онкогенов ретровирусов и их клеточных предшественников. Кле-
точное происхождение вирусных онкогенов было убедительно
подтверждено, в частности, молекулярной гибридизацией кДНК-
14*
211
проб (проб ДНК, комплементарных ретровирусной геномной
РНК), приготовленных с помощью обратной транскриптазы,
и РНК вирусов сарком Харвея, Кирстена, а также Молони,
с клеточной нуклеиновой кислотой. После этого в нормальных
клетках были обнаружены гомологи (протоонкогены) более
десятка других вирусных генбв. Любые представители позво-
ночных содержат в геноме своих клеток прототипы вирусных
онкогенов. Например, клетки птиц содержат 8 прототипов онкоге-
нов двух неродственных таксономических групп птичьих ретро-
вирусов, а также ряд онкогенов неродственных между собою
вирусов млекопитающих, в частности вирусов лейкемии Абельсона
(Abelson), саркомы Молони (Moloney) и саркомы кошек. В то же
время клетки млекопитающих содержат прототипы онкогенов
ретровирусов млекопитающих, а также ретровирусов птиц МС 29,
ВСР, миелобластоза, саркомы Фуджинами (Fujinami). Прототипы
онкогенов ВСР, МС 29, Абельсона и Фуджинами найдены также
у дрозофилы. Таким образом, нормальные клетки позвоночных
(и ряда беспозвоночных) содержат многие, если не все, известные
протоонкогены.
Только с освоением молекулярного клонирования структур-
ное родство клеточных протоонкогенов и вирусных онкогенов
стало совершенно очевидным. Начиная с клеточного прототипа
вируса саркомы Молони, были клонированы большинство прото-
типов известных вирусных онкогенов и сравнены с вирусными
партнерами в гетеродуплексном анализе, рестрикционно-эндо-
нуклеазным картированием, фингерпринтным анализом и путем
установления нуклеотидных последовательностей. Эти сопостав-
ления показали, что те части вирусных онкогенов, которые нерод-
ственны эссенциальным (репликативным) генам ретровирусов,
близкородственны партнерам в нормальных клетках и, что наибо-
лее важно, эти.партнеры в нормальных клетках никак не связаны
с каким-либо эссенциальным геном ретровирусов.
Несмотря на отмеченное родство вирусных и клеточных прото-
типов онкогенов, различия биологических функций тех и других
(малигнизация у первых, позитивная роль в развитии — у вторых)
подразумевают определенное несходство в структуре, т. е. изме-
нения качественного, а не просто количественного характера.
Это понятно и объяснимо, учитывая сложное интронно-экзонное
строение генов эукариот, которое должно существенно упро-
щаться при превращении клеточных генов в простую безинтрон-
ную структуру ретровирусов. Если бы подобного не происходило
и обе категории генов были совершенно идентичны, то единственно
возможным объяснением механизма действия онкогенов могла
быть только «дозная» гипотеза, признающая количественные
изменения онкогенов и их продуктов основой осуществляемого
или туморогенеза.
Как известно, большинство исследователей не придерживаются
этой точки зрения.
212
Итак, вирусные онкогены и их клеточные прототипы струк-
турно отличаются друг от друга. В чем это различие заключается
и каким образом клеточный ген превращается в вирусный?
Современные молекулярно-биологические и молекулярно-гене-
тические данные говорят о том, что многие, если не все, вирус-
ные онкогены отличаются от своих клеточных прототипов в неко-
торой части генетической информации. Это особенно ясно видно
при сравнении гибридных онкогенов и их клеточных прототипов.
Такие онкогены состоят из гибрида двух типов кодирующей
последовательности, одна из которых возникает за счет эссен-
циальных вирионных генов, например гена gag (Agag), другая —
из клеточного локуса (х). Они имеют общую структуру Agag-x
и характеризуются гибридным белковым продуктом. Первый
гибридный ген был идентифицирован для птичьего вируса МС 29.
Этот ген имеет S'gag-область размером около 1,5 т. о. и З'-область,
называемую тус, размером 1,6 т. о., возникающую за счет
клетки. Ген Agag-myc, подобно Agag-x других ретровирусов,
как, например, вируса лейкемии Абельсона, вируса саркомы кошек
и птичьего вируса саркомы Фуджинами, кодирует Agag-x-белки
с возможно трансформирующей функцией (табл. 13). На клони-
рованных вирусных генах и их клеточных прототипах получен
ряд данных, говорящих о том, что вирусные онкогены и кле-
точные протоонкогены не изогенны. Согласно Р. Duesberg (1983),
доступная информация свидетельствует в пользу той точки
зрения, что для придания протоонкогенам, трансдуцируемым
ретровирусами, трансформирующей функции, по-видимому, не-
обходимы какие-то генетические события, возможно делеции,
мутации клеточных последовательностей или дополнение их
вирусспецифической информацией, например Agag.
Трансформирующая способность клеточных онкогенов. Совре-
менная генно-инженерная техника позволяет воспроизвести
в эксперименте исторический процесс трансдукции клеточных
генов с образованием активных онкогенов. Это достигается путем
молекулярного клонирования изолированных клеточных онкоге-
нов, присоединением их к ретровирусным транскрипционным
промотерам для придания им способности активно экспрессиро-
ваться при возвращении изолированных генов обратно в клетки
культуры. Подобный эксперимент позволил создать трансформи-
рующие гены с мышиным c-mos, человеческим и крысиным
c-ras-генами. Успешно использовались локусы c-ras как с интро-
нами, так и без них. Клетки, трансформированные геном c-ras,
синтезируют большое количество белка р21, который кодирован
клеточным онкогеном и является туморогенным у животных.
Имеются, однако, факты, требующие дальнейших исследова-
ний и сопоставления генов с-опс и v-onc. Эти факты следующие.
1.	До сих пор не показано, что активированные гены c-mos
и c-ras являются непосредственно туморогенными у животных,
как это имеет место в опытах с v-mos и v-src.
213
Таблица 13
Идентифицированные онкогены и их вирусные прототипы
[Duesberg Р., 1983]
Онкогенные ретровирусы	Онкогены	Форма рака у животных			Трансформация в клеточной культуре	
		Сар- кома	Карци- нома	Острый лейкоз	Фибро- бласты	Клетки крови
Вирусы птиц						
Саркома Рауса	src	4-	—	—	4-	?
»	Фуджинами	gag-fps	4-	—	—	4-	—
»	Ямагуши	gag-yes	4-	—	—	4-	—
»	Рочестер-2	gag-ros	4-	—	—	4-	—
Миелоцитом атоз МС 29	gag-myc	4-	4-	4-	4-	4-
Карцинома МН 2	gag-mht/myc	4-	4-	4-	4-	+
Птичий эритробластоз	gag-erb A/erb В	4-	4-	4-	4-	+
Миелобластоз и эритро- бластоз	gag-myb-env	—-	—-	4-	—-	+
Е26	gag-amv-ets	—	—	4-	—	4-
Ретикулоэндотелиоз Вирусы млекопитающих	rel	—		4-	—	4-
Мышиная саркома Мо-	mos	4-	—	—	4-	—
ЛОНИ						
Крысиная саркома Хар- вея и Кирстена	ras	4-	—	4-	4-	?
Лейкемия мышей Абельсона	Agag-abl	——	—-	4-	4-	4-
Мышиная остеосаркома FBJ	fos	4-	—	—	4-	?
Кошачья саркома ST и GA	Agag-fes	4-	4-	—	+	—
Кошачья саркома SM	Agag-fms	4-	—	—	4-	—
Саркома обезьян	Aenv-sis	4-	—	—	4-	—
2.	Попытки получить трансформирующие гены путем актива-
ции человеческого c-mos, куриного c-src и куриного с-тус были
пока безуспешны.
3.	Ряд деталей вызывает сомнение в правильности заключения
о том, что белки, кодируемые гомологичными клеточными и вирус-
ными онкогенами, идентичны во всех отношениях. Как следствие
мы должны считаться с возможностью, что эффекты активи-
рованных генов c-mos и c-ras не представляют прототипы того,
как клеточные онкогены могли бы участвовать в туморогенезе.
Наоборот, они отражают лишь специальные экспериментальные
условия, так же как и установленные клеточные линии, чьи фено-
типы особенно уязвимы в отношении неопластической трансфор-
мации, или достижение необычного уровня экспрессии онкогенов.
Тем не менее способность генов c-mos и c-ras трансформировать
клетки в культуре придает значительную силу идее, что клеточ-
ные онкогены представляют собой агенты туморогенеза, иниции-
рующие и поддерживающие малигнизацию.
214
Участие клеточных онкогенов в туморогенезе. В ряде случаев
показано участие клеточных онкогенов в образовании опухолей
животных и человека несколько необычным путем. Ряд примеров
характеризует сложный механизм этого процесса.
1.	Пример опухолеродного действия ретровирусов, не содержа-
щих онкоген [Weiss R. et al., 1982]. Известно, что ретровирусы,
лишенные онкогенов, тем не менее, способны индуцировать В-кле-
точные лимфомы у кур с высокой частотой [Cooper М. et al.,
1978]. Было установлено, что вирусная ДНК в опухолях обычно
интегрируется вблизи ранее идентифицированного клеточного
онкогена, с-myc; как следствие этой инсерции транскрипция
с-myc усиливается в 100 раз [Hayward W. et al., 1981; Payne G.
et al., 1982]. Одним из вариантов механизма этого процесса явля-
ется прямое включение транскрипции с-myc под влиянием вирус-
ного промотера. В других случаях действие вирусной ДНК —
непрямое, путем усиления активности промотера самого вируса.
По-видимому, увеличенная экспрессия с-myc провоцирует и, воз-
можно, поддерживает цепь событий, которые вызывают В-кле-
точные опухоли, индуцируемые лейкозными вирусами. Аналогично
действуют и другие ретровирусы, не содержащие онкогенов, но
вызывающие опухоли. Примерами могут служить В-клеточные
лимфомы, вызываемые у кур синцитиальным вирусом [Noori-
Daloii et al., 1981], почечные карциномы, индуцированные
вирусом, ассоциированные с миелобластозом, эритробластоз, вы-
званный вариантом вируса птичьего лейкоза, и карцинома молоч-
ной железы, индуцированная вирусом опухоли молочной железы
(MMTV) [Nusse R., Varmus H., 1982]. Во всех этих случаях
туморогенез начинается, когда интеграция вирусной ДНК инду-
цирует активность специфического клеточного гена или, в других
случаях, повреждает определенный домен в геноме хозяина.
2.	Клеточные онкогены, выявленные и изолированные путем
трансфекции, вели себя не как нормальные гены. Они индуци-
ровали неопластическую трансформацию без модификации струк-
туры или внутренне присущей им экспрессии, тогда как их парт-
неры, изолированные из нормальной ткани, такой способностью
не отличались [Cooper G., 1982; Weinberg R., 1982, 1982а]. Этот
факт указывает на то, что данные гены участвуют в генезе
опухолей, из которых они были изолированы. Указанная идея
нашла подтверждение, когда активный клеточный онкоген, изо-
лированный из клеток карциномы мочевого пузыря, оказался
геном c-ras Харвея (c-Ha-ras) [Der D. et al., 1982; Parada L.
et al., 1982; Santos E. et al., 1982, 1983]. Все дальнейшие анало-
гичные идентификации указывали на представителей того же
семейства генов, c-ras. Повторное появление c-ras и удивительно,
и пока необъяснимо. Тканеспецифичность не может служить
достаточным объяснением, так как большинство известных опу-
холей имеют эпителиальное происхождение, однако трансформи-
рованные мышиные клетки таковыми не являются, c-ras Харвея
215
экспрессируется на высоких уровнях в ходе мышиного эмбрио-
генеза, создавая впечатление, что он выполняет какую-то уни-
версальную ростовую функцию. Для подобного утверждения
о c-ras Кирстена нет оснований, однако и он причастен к генезу
нескольких форм карцином.
Существуют и другие активные онкогены, например при раз-
личных лейкозах и карциномах молочной железы, остающиеся
пока неидентифицированными и вряд ли являющимися гомоло-
гами уже известных ретровирусных онкогенов. Однако нельзя
не заметить примечательной унификации в обшей панораме онко-
генов: два коренным образом отличающихся экспериментальных
подхода — с одной стороны, прослеживание эволюционного про-
исхождения вирусных онкогенов, с другой — изолирование актив-
ных онкогенов непосредственно из опухолевых клеток — привели
к взаимному перекрыванию, совпадению наборов генов, чьи
свойства предопределяют роль в канцерогенезе.
3.	Открытие того факта, что некоторые формы вирусного
туморогенеза могут начинаться с активации клеточных онкогенов,
явилось импульсом к интенсивному поиску экспрессии этих генов
в клетках человеческих опухолей. Первые результаты поиска уже
имеются; они интригующи, но довольно неопределенны. Следует
сказать, что сама стратегия экспериментов, с нашей точки зрения,
в принципе порочна. Масса клеток, используемая в качестве кон-
троля, часто недоступна, и в большинстве работ, проводящихся
в настоящее время, используются, главным образом, установлен-
ные линии клеток, свойства которых, возможно, существенно
изменились за время после их эксплантации из опухолей. Кроме
того, мы не располагаем пока полным набором онкогенов. Наконец,
что весьма важно, непросто идентифицировать экспрессию, играю-
щую этиологическую роль в неопластической трансформации.
К тому же есть основания полагать, что значительное увеличение
экспрессии активных онкогенов выше нормального уровня не обя-
зательно должно иметь место в человеческих опухолях.
Указанные трудности говорят о том, что в настоящий момент
нельзя рассчитывать на полную ясность в проблеме. Есть еще
немало противоречий. Так, одни исследователи сообщили об уве-
личении экспрессии гена с-myc в различных гемопоэтических
опухолях В-клеточного происхождения [Rovigatti U. et al., 1982],
другие этого не наблюдали [Westin Е. et al., 1982]. Эти исследова-
ния предпринимались в попытке установить, связано ли возникно-
вение всех В-клеточных опухолей как птиц, так и человека
с одним общим генетическим событием. Такая мысль имела опре-
деленное основание, так как увеличенная экспрессия с-myc была
обнаружена у широкого круга опухолей, в том числе в саркомах,
карциномах, меланомах при лейкемиях [Eva A. et aL, 1982;
Westin Е. et al., 1982]. Увеличение было, однако, нестабильным,
спорадическим для каждой отдельной формы опухоли. По крайней
мере в двух случаях — клеточные линии из промиелоцитной
216
лейкемии HL-60 и COLO320 из нейроэндокринной опухоли толстой
кишки — увеличенная экспрессия с-myc обусловлена, по-види-
мому, его многократной амплификацией [Favera R. et al., 1982;
Collins S., Groudine M., 1983]. Значение этих «злоключений»
c-myc для этиологии опухолей пока неясно. Во всяком случае,
активный онкоген, идентифицированный в клетках промиелоцит-
ной лейкемии HL-60, не является геном c-myc [Bishop J., 1983].
Не определен активный онкоген и для COLO320 [Bishop J., 1983 .
Экспрессия c-myb была выявлена при лейкозах всех главных
гемопоэтических линий, однако лишь в сравнительно примитивных
их представителях. Значение этого феномена не вполне ясно,
так как экспрессия c-myb выражена и в нормальных гемопоэти-
ческих клетках [Chen J., 1980; Gonda Т. et al., 1982]. Экспрессия
c-sis, как было установлено, довольно специфична; она имеет
место в саркомах и глиобластомах, но не в различных других
опухолях [Eva A. et al., 1982]. Экспрессия с-abl и c-ras выявлена
в разнообразных опухолевых клетках [Eva A. et al., 1982; Westin Е.
et al., 1982], хотя уровень экспрессии не был определен достаточно
надежно и мог не отличаться от такового соответствующих нор-
мальных клеток.
Подводя итог этой серии исследований, можно заключить,
что полной ясности в вопросе о значении количественных уровней
экспрессии клеточных онкогенов в этиологии опухолей пока нет
и требуются дальнейшие усилия, прежде всего по установлению
в эмбриональных клеточных линиях физиологических функций
специфических клеточных онкогенов и более детальному анализу
структуры и активности индивидуальных генов, подозреваемых
в индукции тех или иных опухолей.
Превращение протоонкогенов в онкогены. В своей нативной
форме клеточные онкогены неспособны трансформировать клетки
[Cooper G. et al., 1980; Oskarsson M. et al., 1980; De Feo D. et al.,
1981; Cooper G., 1982; Weinberg R., 1982]. Этот факт ставит вопрос
о том, каким же образом эти гены становятся онкогенными, будучи
трансдуцированы в геномы ретровирусов, и какие события при-
водят к появлению активных онкогенов, обнаруживаемых в ДНК
опухолевых клеток.
Для объяснения феномена превращения клеточных прото-
онкогенов в активные онкогены предложены два возможных
механизма:
1. Количественный («дозный»). Согласно этому принципу пре-
вращение клеток в неопластические обусловлено избыточной
экспрессией нормальных генов. В результате трансдукции ретро-
вирусами гены попадают под влияние мощных сигналов про-
мотеров вирусного генома, которые способствуют избыточной
экспрессии трансдуцированных генов. Аналогично канцерогены,
повреждающие ДНК, как можно думать, освобождают потен-
циальные онкогены из-под контроля регуляторных элементов кле-
точного генома.
217
2. Качественный принцип. Этот принцип объяснения превра-
щения клеточных генов в активные трансформирующие факторы
подразумевает, что повреждение клеточных генов может изменить
их функцию. В частности, протеинкиназы, кодируемые рядом онко-
генов, могли бы отличаться измененной субстратной специ-
фичностью, которая и определяет их туморогенность. Мутации
в кодирующем домене клеточного онкогена могли бы возникать
в ретровирусном геноме в ходе трансдукции или вслед за ней,
или как следствие повреждения, наносимого клеточной ДНК
канцерогеном.
Ни один из этих двух механизмов не получил безоговорочного
признания. Время от времени появляются новые данные в пользу
как одного, так и другого механизма.
В пользу первого механизма говорят следующие факты:
1) ретровирусные онкогены, такие как v-src и v-ras, обычно
экспрессируются в умеренном избытке, и уменьшение экспрессии
может вызывать реверсию трансформированных клеток к явно
нормальному фенотипу [Porzig К. et al., 1979; Varmus Н. et al.,
1981]; 2) ДНК нормальных клеток содержит онкогены, способные
трансформировать клетки в культуре после активации, вызванной
удалением cis-регуляторов [Cooper G. et al., 1980], или благодаря
инсерции ретровирусных энхенсеров транскрипции; 3) трансфор-
мация клеток в культуре изолированными c-mos и c-ras достига-
лась усилением экспрессии этих генов [Oskarsson М. et al., 1980;
De Feo D. et al., 1981; Chang E. et al., 1982]; 4) клетки карциномы
мочевого пузыря, из которых была изолирована активная форма
c-ras Харвея, и клетки, вторично трансформированные этим изо-
лированным геном, по-видимому, экспрессируют указанный ген
в количествах, выше нормальных [Goldfarb М. et al., 1982;
Parada L. et al., 1982; Santos E. et al., 1982].
Но имеются данные и противоположного характера не меньшей
значимости: 1) господствующее мнение о том, что v-src экспрес-
сируется в клетках, трансформированных ВСР, в избыточных
количествах, может оказаться неверным. Экспрессия этого гена
в трансформированных клетках сильно варьирует и иногда может
снижаться до уровня, лишь в 3—5 раз превышающего экспрессию
c-src; 2) такие онкогены, как v-mos и v-abl, являются, по существу,
токсичными для некоторых клеток, если они экспрессируются даже
в умеренных количествах [Goff S. et al., 1982; Papkoff J. et al.,
1982]. Лишь минимальные количества белка, кодируемого v-mos,
требуются для неопластической трансформации [Papkoff J. et al.,
1982]; 3) попытки трансформировать клетки путем увеличения
экспрессии c-src или с-тус окончились неудачей; 4) экспрессия
по меньшей мере двух активных онкогенов (c-ras Кирстена в кар-
циномах толстой кишки и легкого и неидентифицированный ген
в В-клеточных лимфомах кур) лишь немного увеличена в опухо-
левых клетках, в которых их активность выявляется путем транс-
фекции [Cooper G., 1982; Der D. et al., 1982]; 5) с помощью
218
детального исследования установили небольшие, но потенциально
важные различия между белками, кодируемыми несколькими
клеточными онкогенами и их вирусными партнерами; клеточный
и вирусный варианты pp60src фосфорилированы по разным тиро-
зиновым остаткам и имеют различные аминокислотные последо-
вательности в их карбокситерминальных концах; попытки репа-
рации полных делеций v-src рекомбинацией с c-src не удались,
хотя неудача может отражать помеху скорее в рекомбинации, чем
в свойствах c-src; белки, кодируемые несколькими формами
v-src, фосфорилированы, тогда как клеточные партнеры не фос-
форилированы, так как они лишены треониновых остатков, по ко-
торым происходит фосфорилирование вирусного белка; лишь
вирусная форма аЫ-белка фосфорилируется по тирозину in vivo
и проявляет фосфотрансферазную активность [Ponticelli A. et al.,
1982].
Только дальнейший глубокий анализ клеточных онкогенов,
изолированных из опухолевых клеток, устранит эти неясности.
Объяснить превращение протоонкогенов в онкогены можно лишь
путем установления места и сущности дефектов в клеточных
генах, ответственных за этот процесс. В ряде случаев уже есть
ответы на эти вопросы. Так, показано, что трансформирующая
активность c-ras Харвея в карциноме мочевого пузыря человека
обусловлена точковой мутацией в кодирующем домене гена,
заменой гуанозина на тимидин. Это влечет за собой замену
глицина на валин в аминокислотной последовательности генного
продукта [Reddy Е. et al., 1982; Tabin С. et aL, 1983]; сходная
мутация в той же позиции может быть ответственна за онкоген-
ность вирусных форм ras; аргинин заменяет глицин в случае
v-Ha-ras и серин в той же позиции в случае v-Ki-ras.
Эти данные существенно подкрепляют гипотезу качественных
изменений клеточных генов как причины их превращения в актив-
ные онкогены. Подробнее этот вопрос будет рассмотрен в другом
разделе книги.
ДНК и канцерогенез. Открытие онкогенов клеточных, вирус-
ных, опухолевых, установление изменений в их структуре при пере-
ходе от первых ко вторым и третьим дали прямые доказательства
роли изменений ДНК в инициации онкогенеза. Однако установле-
ние этого факта еще не проясняло, как именно исходные канцеро-
гены осуществляют свое негативное действие. Онкогены, выявляе-
мые трансфекцией, по-видимому, представляют последнюю сту-
пень в цепи событий, вызывающих злокачественные опухоли, в то
время как первые ступени остаются столь же таинственными, как
и ранее. Настоятельной задачей следует считать поиск поврежде-
ний, вызываемых конечными (проксимальными) канцерогенами.
Современная онкологическая литература полна предположе-
ниями о том, как клеточные онкогены могли бы активироваться
благодаря повреждению ДНК [Klein G., 1981; Pall М., 1981].
Все эти предположения сводятся к тому, что дозировка объясняет
219
действие клеточных онкогенов, и поэтому авторы пытаются
объяснить, как именно экспрессия онкогенов могла бы быть
усилена. Все эти идеи могут оказаться весьма спорными, если
«дозная» гипотеза не выдержит натиска потока новых эксперимен-
тальных данных.
Точковые мутации могут действовать или в cis-, или в trans-
позициях. Мутации внутри онкогена или по соседству с ним могут
сделать ген резистентным к негативным регуляторам. Это были бы
доминантные повреждения такого рода, которые возможно реги-
стрировать с помощью трансфекции, если онкоген способен прямо
трансформировать клетки в культуре. Альтернативно мутации
в регуляторных генах могли бы нарушить их активность и осво-
бодить онкогены из-под контроля. Экспрессия онкогена в этом
случае была бы рецессивным повреждением, способным быть обра-
щенным при трансплантации гена в нормальную клетку и поэтому
невидимым при трансфекционном испытании [Bishop J., 1983].
Перестройки ДНК, в противоположность точковым мутациям,
приобрели значительное признание как потенциальная движущая
сила в канцерогенезе [Cairns J., 1981]. Возникающие поврежде-
ния ДНК могут дуплицировать аномалии в регуляции онкогенов.
Альтернативные перестройки ДНК способны перевести ранее
«молчавшие» онкогены в сферу влияния позитивных регуля-
торов путем присоединения этих генов к активным промотерам
транскрипции [Klein G., 1981] или благодаря приближению этих
генов к одному из пока малоизученных регуляторных элементов,
так называемых энхенсеров, или усилителей, транскрипции [Ya-
niv М., 1982]. Энхенсеры, по-видимому, усиливают или даже
пробуждают активность транскрипционных промотеров в обстоя-
тельствах, в которых последние обычно инертны или неактивны
[Capecci М., 1980; Banerji J. et al., 1981; Levinson В. et al., 1982].
Длинные концевые повторы (LTR) ретровирусов'известны одно-
временно и как транскрипционные промотеры [Temin Н., 1982;
Varmus Н., 1982], и как энхенсеры транскрипции [Levinson В.
et al., 1982; Varmus Н., 1982]; эти активности ответственны
за индукцию экспрессии с-тус в ходе генеза В-клеточных опухолей
при инфекции вирусами птичьих лейкозов. Поэтому делались
попытки приписать участие LTR эндогенных ретровирусов в ответе
на химические канцерогены [Kirschmeier Р. et al., 1982]. Пока
попытки доказать это не увенчались успехом. Возможно, правиль-
нее было бы рассматривать LTR просто как одну из форм
семейства энхенсеров, которые, по-видимому, являются интеграль-
ной частью многих, если не всех, транскрипционно-активных зон
в хроматине эукариотических клеток. Любой из этих энхенсеров
мог бы активировать клеточные онкогены.
Интересной попыткой объяснения активации клеточных онко-
генов является идея о роли хромосомных ненормальностей
в качестве генераторов увеличенной онкогенной дозировки
[Klein G., 1981]. Хромосомные дупликации могли бы повышать
220
дозу онкогена и увеличивать действие trans-регуляторов на ген.
Транслокации могли бы пробуждать онкогены путем релокации
их в транскрипционно-активные домены хроматина. Например,
В-клеточные опухоли лимфом Беркитта обычно демонстрируют
транслокации, включающие хромосому 8 и хромосому, несущую
иммуноглобулиновый ген, который активен в опухоли: 2, х-цепи;
14, тяжелые цепи; или 22, Л-цепи. Были высказаны предположения,
что хромосомные транслокации при опухолях Беркитта активи-
руют онкоген на хромосоме 8 путем транспозиции его в окрест-
ности транскрибируемых иммуноглобулиновых генов. На сегодня
человеческой хромосоме 8 приписывают присутствие двух онко-
генов: c-mos и один локус c-myc. c-mos не рассматривается
как виновник генеза В-клеточных опухолей. Обнаружение c-myc
на хромосоме 8 поставило другую проблему, так как стали
предполагать его участие в индукции В-клеточных лимфом пти-
чьими ретровирусами. Действительно, было обнаружено, что c-myc
включается в транслокации между хромосомами 8 и 14 при лим-
фоме Беркитта [Bishop J., 1983]. Релоцированный c-myc непо-
средственно приближен к месту разрыва при транслокации
и в некоторых случаях вплотную присоединен к гену тяжелой
цепи иммуноглобулина. Аналогичным образом транслокации
между хромосомами 12 и 15 при мышиных плазмоцитомах, про-
дуцирующих иммуноглобулин А, помещают c-myc (хромосома 15)
в область гена для a-тяжелых цепей (хромосома 12).
Другие кариотипические ненормальности в человеческих опу-
холях также могут быть скоррелированы с локализацией кле-
точных онкогенов на хромосомах. Примерами могут служить:
c-sis на хромосоме 22 (транслокации при хроническом миело-
идном лейкозе и некоторых В-клеточных опухолях); c-fes на хромо-
соме 15 (транслокации при остром промиелоцитном лейкозе);
c-myb на хромосоме 6 (делеции при Т-клеточном лейкозе и транс-
локации при некоторых аденокарциномах яичников); c-myc на хро-
мосоме 8 (транслокации при остром миелобластном лейкозе).
При транслокациях, включающих хромосомы 8, 15 и 22, гипо-
тетический активатор переносится к онкогену, а не наоборот,
как описано выше для другого вида транслокаций, например
при лимфоме Беркитта.
АКТИВАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ ПРОТООНКОГЕНОВ В ОНКОГЕНЫ
В настоящее время никем не оспаривается тот факт, что ка-
кие-то нормальные клеточные гены, жизненно необходимые для
существования клеток, породили и продолжают порождать как
онкогены остротрансформирующих ретровирусов, так и активные
онкогены опухолей невирусного происхождения. Природа этих
клеточных генов, названных протоонкогенами, подробно рассмот-
рена в предыдущем разделе этой книги. В данном контексте
уместно и целесообразно систематически проанализировать пути
221
превращения их в разрушительные трансформирующие гены,
инициирующие неопластический процесс.
R. Weinberg (1983) выделяет 4 механизма активации кле-
точных протоонкогенов, три из которых включают изменения
клеточной ДНК и один — вмешательство инфекционного ретро-
вируса: 1) точковая мутация в результате действия радиации
или химического канцерогена; при этом изменяется информация
кодируемого белка, который становится способным вызывать
раковый рост; 2) кодирующая область протоонкогена может стать
рекомбинированной, в ходе хромосомной перестройки, с регуля-
торной областью гена иммуноглобулина, что ведет к неадекват-
ной экспрессии генетической информации протоонкогена; 3) ам-
плификация; протоонкоген каким-то образом реплицируется
в множественные копии, и в этом случае результатом является
сверхэкспрессия кодируемого протоонкогеном белка; 4) трансдук-
ция; вирус при инфекции клетки «подхватывает» и уносит из кле-
точного генома клеточную последовательность, содержащую
протоонкоген. Последний может затем активироваться путем
ассоциации с регуляторной областью вирусного генома или
подвергнуться мутации во время переноса из клеток в ретровирус.
Все это верно, но, с нашей точки зрения, более полным
представляется следующее перечисление основных путей актива-
ции клеточных протоонкогенов в онкогены: 1) трансдукция ретро-
вирусами; 2) хромосомные транслокации; 3) инсерции, транспо-
зиции генетического материала; 4) амплификация генов; 5) точко-
вые мутации.
Рассмотрим их более подробно.
Активация клеточных протоонкогенов путем трансдукции
ретровирусами. Отличительной чертой ретровирусных трансфор-
мирующих генов (онкогенов) являются специфические нуклео-
тидные последовательности, которые неродственны их конститу-
тивным репликативным генам, однако близкородственны опре-
деленным последовательностям нормальных клеток. Это сходство
ретровирусных и клеточных трансформирующих генов оказалось
неслучайным, и в результате обстоятельных исследований было
истолковано как указание на генетическую связь тех и других,
где первичными являются гены клеточные, а вторичными —
ретровирусные. В конце концов, исследователи пришли к едино-
душному заключению, что онкогены ретровирусов произошли
за счет клеточных потенциально трансформирующих генов,
в результате редких случайных актов захвата неонкогенными
инфекционными ретровирусами отдельных блоков генетического
материала клеток, в которые вирусы проникают при осуществлении
своего естественного жизненного цикла и с геномом которых их
геном интегрируется. Явление инкорпорирования клеточных генов
в вирусный геном стали называть трансдукцией.
В предыдущих разделах книги уже упоминалось, что переход
заблокированных в зрелой, закончившей дифференциацию клетке
222
генов роста и пролиферации под контроль мощных вирусных
промотеров приводит к их реактивации. Возвращение таких
«раскрепощенных» генов в клетку при очередном цикле вирусной
инфекции в определенных условиях может вести к навязыванию
клетке безудержной пролиферации и в конечном счете — к ее
трансформации.
Эквивалентность специфической функции стимуляции роста
(регулируемого или нерегулируемого) клеточных протоонкогенов
и вирусных онкогенов предопределяет тезис о том, что протоон-
когены фактически являются латентными раковыми генами. Эта их
потенциальная способность реализуется благодаря феномену
трансдукции.
Эти, вначале гипотетические, предположения проверялись экс-
периментально. В частности, исследовалась трансдукция клеточ-
ных генов ретровирусами in vivo и in vitro. Принципиаль-
ным представлялся вопрос: процесс трансдукции только активи-
рует трансформирующие гены или генерирует их?
Принципиальное структурное сходство позволяет рассматри-
вать протоонкогены клеток в качестве функциональных и транс-
дуцируемых эквивалентов вирусных онкогенов. Тем не менее ана-
лиз продуктов-предшественников, показал, что во всех случаях
протоонкогены были изменены, если они становились частью
онкогенных вирусов. Весь процесс, следовательно, должен был
сопровождаться специфическими делециями (выпадением участ-
ков генетического материала) и мутацией. Поэтому естественная
трансдукция не означает полной структурной и функциональной
гомологии.
Одними из известных до сих пор экспериментально воспроиз-
водимых трансдукционных систем являются делеционные (>75 %)
по гену src мутанты вируса саркомы Рауса, способные восста-
навливать трансформирующую функцию в течение 2 мес у 50 % ин-
фицированных кур. Эта естественная трансдукция осуществляется
за счет клеточного npoTO-src-онкогена. Аналогичный процесс
трансдукции описан для онкогена тус в случае восстановления
активности делеционного по этому онкогену ретровируса МС 29
за счет последовательностей прото-myc (с-тус).
Известны также случаи полного восстановления онкогенной
функции за счет клеточных протоонкогенных последовательно-
стей в случаях отсутствия в ВСР полных 5'- и З'-концов гена
src.
Специальные опыты показали, что возможно осуществить
трансформацию in vitro с помощью протоонкогенной ДНК, лиги-
рованной с ретровирусными промотерами. Было установлено, что
ДНК клеточных прототипов вирусов саркомы Молони и Харвея
(соответственно прото-mos и прото-ras) трансформирует мышиные
клетки NIH ЗТЗ, если она лигирована с промотерами этих вирусов.
В последующих опытах было продемонстрировано, что длинные
концевые повторы (LTR, ДКП) функционируют как промотеры.
223
Следует отметить, однако, что специфические трансформи-
рующие активности упомянутых конструкций: промотер сарком-
ного вируса прото-mos/ras — были в 10—200 раз ниже, чем у со-
ответствующих клонов ДНК аутентичных вирусных онкогенов.
Этот факт может отражать определенные различия, но не полное
тождество между вирусными онкогенами и их клеточными про-
мотерами, что естественно, учитывая структурные изменения, пре-
терпеваемые протоонкогенами при превращении в активные онко-
гены в ходе трансдукции ретровирусами. Однако приведенные
опыты подтверждают, во-первых, принципиальное родство ви-
русных онкогенов и их клеточных предшественников и, во-вторых,
факт активации протоонкогенов в результате трансдукции в ретро-
вирусы.
Тем не менее сомнения в том, что активированные клеточные
прототипы идентичны вирусным онкогенам, у ряда исследователей
остаются. Полагают, что активированные протоонкогены недоста-
точны для трансформации клеток у животных, и это соответствует
наблюдениям о повышенной экспрессии, например, гена прото-ras
при ряде нормальных состояний, в частности в развивающихся
мышиных эмбриональных клетках и в регенерирующей печени
крысы. Конечный тест на функциональную гомологию между
вирусными онкогенами и клеточными прототипами может быть
осуществлен только в том случае, если удастся реконструиро-
вать вирусы Молони и Харвея из соответствующих протоонкогенов
и нуклеотидных последовательностей ретровирусного вектора
и испытать на способность индуцировать саркомы у мышей.
Нельзя не отметить также, что, за исключением описанных
опытов с генами прото-mos и прото-ras, лигированными с ретро-
вирусными промотерами, все попытки добиться аналогичного
результата, т. е. трансформации NIH ЗТЗ клеток с другими прото-
онкогенными последовательностями, дали негативные результаты.
Это относится к экспериментам с прото-тус, прото-mos из клеток
человека, прото-src [Duesberg Р., 1983].
Интересно мнение J. Bishop (1983) о механизмах активации
клеточных протоонкогенов путем трансдукции в ретровирусы.
Автор указывает, что в нативной форме клеточные онкогены,
по-видимому, не способны трансформировать клетки. Эту способ-
ность они приобретают при трансдукции в ретровирусы. J. Bishop
рассматривает два возможных объяснения превращения прото-
онкогенов в активные онкогены: 1) количественная избыточ-
ная экспрессия в обычных условиях нормального гена превращает
клетки в неопластический фенотип; трансдукция ретровирусами
помещает гены под мощные сигналы в вирусном геноме и способст-
вует их экспрессии в большом избытке («дозная» гипотеза);
подобно этому канцерогены, повреждающие ДНК, освобождают
потенциал онкогенов от контроля регуляторных элементов; 2) ка-
чественные изменения трансдуцируемого ретровирусами гена:
повреждение клеточного гена может изменять его функцию; на-
224
пример, кодируемые рядом онкогенов белки могли бы иметь
различные субстратные специфичности, обусловливающие их
туморогенность; в ходе трансдукции клеточного онкогена в ретро-
вирус или вслед за нею в онкогене могли бы возникать мутации
в кодирующем домене.
Таким образом, одни авторы считают, что трансдуцированный
ген качественно идентичен клеточному и вызывает трансформацию
лишь благодаря увеличенной экспрессии. Действительно, в ряде
случаев при инфекции опухолеродными ретровирусами показано
резкое нарастание белка, кодируемого с-онкогенами. Но это явле-
ние далеко не всегда имеет место.
Альтернативная, вторая из упомянутых выше, точка зрения
ответственной за трансформацию и образование опухолей при
инфекции онкогенными ретровирусами считает активность качест-
венно измененных при трансдукции клеточных протоонкогенов.
В настоящее время трудно совершенно категорически отдать
предпочтение одной из указанных точек зрения и решительно
отвергнуть другую.
Лично нам более убедительной и солиднее обоснованной пред-
ставляется вторая.
Независимо, однако, от вариантов толкования тонкого молеку-
лярного механизма активации клеточных протоонкогенов при их
трансдукции в ретровирусы, твердоустановленными можно считать
два фундаментальных факта, связанных с этим явлением природы:
1) появление благодаря ему целого класса опухолеродных ретро-
вирусов; 2) активацию широкого спектра уникальных клеточных
генов, выполняющих в клетке в норме какие-то жизненно важные
физиологические функции, обладающих, вместе с тем, потенциаль-
ной трансформирующей способностью. Трансдукция в ретрови-
русы лишает эти гены их первой позитивной функции и освобож-
дает скрытую в них в норме вторую, негативную. Гены роста и
пролиферации предположительно начинают функционировать как
гены раковые.
Что касается конкретного молекулярного механизма трансдук-
ции клеточных генов ретровирусами, то в этом отношении высказы-
ваются лишь гипотезы. Так, предполагается, что трансдукция
осуществляется в две ступени рекомбинации: первая — между
ДНК-формами ретровирусного генома и клеточным геном; вто-
рая — между химерной РНК, транскрибированной с продукта
первого этапа рекомбинации, и РНК-геномом ретровируса [Swan-
strom R. et al., 1983].
При всей биологической значимости феномена трансдукции
в активации клеточных протоонкогенов и появлении грозных
раковых генов он, этот процесс, как упоминалось выше, не яв-
ляется единственным путем, ответственным за трансформацию и
туморогенез. Природа «позаботилась» о многократном дублирова-
нии его другими надежными средствами, молекулярная природа
которых описана ниже.
15 Заказ 380
225
Активация клеточных протоонкогенов в результате хромосом-
ных транслокаций. Под термином «транслокации» имеют в виду
взаимный обмен генетическим материалом посредством реципрок-
ного переноса участков хромосом. Этому процессу в настоящее
время приписывается важная роль в индукции опухолей и изуче-
нию его уделяется все больше внимания. Полагают, что транслока-
ции представляют собою один из важных механизмов активации
клеточных протоонкогенов [Cairns J., 1981; Klein G., 1981]. Было
отмечено, что точки разрыва многих устойчивых перестроек хромо-
сом, характеризующих отдельные типы рака, включают специфи-
ческие бэнды, в которых локализованы различные с-опс-гены.
Хотя рель последних в индукции злокачественных новообразова-
ний у млекопитающих продолжает дискутироваться, возможная
связь между хромосомными аберрациями, изменениями актив-
ности опс-генов и клеточной трансформацией во многих случаях
четко прослеживается. При раке человека наблюдаются следую-
щие 3 главных класса ненормальностей хромосом: реципрокные
транслокации, делеции и дупликации (последние включают дупли-
кации целых хромосом, их сегментов и отдельных последователь-
ностей генов). Каждая из них теперь связывается с предполагае-
мой активностью клеточных онкогенов и индукцией опухолей.
F. Gilbert (1983) утверждает, что во многих, если не во всех
раковых опухолях как туморогенез, так и опухолевая прогрессия
включают множественные генные изменения. Это, по-видимому,
верно и в случае некоторых солидных опухолей детей — ретинобла-
стом, нейробластом и опухолей Вильмса. Каждая из них связана
с хромосомными перестройками, включающими различные специ-
фические фрагменты и для каждой из которых было постулиро-
вано, что требуется изменение, по крайней мере, двух генов.
Большое значение для понимания роли транслокаций в индук-
ции опухолей имели исследования локализации протоонкогенов
в отдельных хромосомах. Установлена хромосомная локализация
следующих клеточных онкогенов у человека: с-abl в хромосоме 9,
c-fes — 15, c-fos — 2, c-myc — 8, c-Ha-ras— II, с-Ki-ras—12,
c-mos — 8, c-myb — 6, c-sis — 22, c-src — 20; у мышей: с-abl в хро-
мосоме 2, c-fos/fes, c-src и c-mos — 4 [Bishop J., 1983].
По данным других авторов [Martinville В. et al., 1983], челове-
ческий онкоген N-ras в клетках промиелоцитной лейкозной линии
HL60 локализован в проксимальной части короткого плеча хромо-
сомы 1; гомологи вирусных ras-генов Харвея и Кирстена — на
хромосомах человека X, 6, II, 12, а клеточный гомолог онкогена
линии EJ — на хромосоме 11 [Martinville В. et al., 1983а].
К настоящему времени хорошо изучен целый ряд хромосомных
транслокаций в связи с различными неопластическими заболева-
ниями. Хромосомный локус, несущий человеческий и мышиный
прото-myc, транслоцируется на одну из нескольких хромосом, ко-
торые несут гены иммуноглобулина, в большинстве мышиных
плазмоцитом и в человеческих линиях В-клеточных лимфом.
226
полученных из лимфом Беркитта и иного типа лимфом. У человека
прото-myc локализуется, как упоминалось выше, на хромосоме 8,
типично транслоцируется на иммуноглобулиновые локусы хро-
мосомы 14 и менее часто — на хромосомы 2 или 22 [Klein G., 1983;
Rowley J., 1983]. Предполагается, что транслокация ведет к акти-
вации прото-myc, побуждая его функционировать как онкоген
в этих опухолях [Dalla-Favera R. et aL, 1983; Marcu R. et al., 1983;
Rowley J., 1983; Shen-Ong G. et al., 1983]. Точка перекреста
варьирует в различных опухолях, однако при транслокации в боль-
шинстве случаев область 5' прото-myc рекомбинирует с областью
5'-гена иммуноглобулина. Во многих, но не всех человеческих и
мышиных лимфомах перекрест имеет место внутри коротких фраг-
ментов последовательности прото-myc. В этих случаях локус
прото-myc перестраивается, что видно по фрагментам ДНК после
обработки рестрикционными эндонуклеазами. Пока нет бесспор-
ных данных об увеличении экспрессии прото-myc после транслока-
ции; сообщаемые по этому поводу данные противоречивы.
Интересно, что транслокации, связанные с человеческими лим-
фомами, не всегда включают локус прото-myc. В некоторых
«неберкиттовских» лимфомах иммуноглобулиновый локус хромо-
сомы 14 рекомбинирует с какими-то неизвестными локусами дру-
гих хромосомных доноров, в частности хромосомы 18 [Yunis J.,
1983].
Другая важная транслокация, затрагивающая вариант хро-
мосомы 22 (филадельфийской хромосомы), встречается в боль-
шинстве случаев хронического миелоидного лейкоза. Она возни-
кает из реципрокной транслокации между хромосомами 22 и
(часто) 9 [Rowley J., 1983]. Хромосома 22 несет легкую цепь
иммуноглобулинового локуса. В нескольких таких случаях прото-
abl, человеческий клеточный прототип онкогена вируса мышиной
лейкемии Абельсона, транслоцируется с хромосомы 9 на 22
[De Klein A. et al., 1982]. Данная транслокация связана с усиленной
экспрессией и амплификацией последовательности прото-abl в кле-
точной линии К-562 миелоидного лейкоза. Важно отметить, что
существуют варианты филадельфийской хромосомы, образую-
щиеся в результате транслокаций с 18 различных хромосом
[Klein G., 1983]. Указанный факт вызывает сомнения в отношении
роли транслокации прото-abl в возникновении лейкемий. Р. Fial-
kow и соавт. (1981) указывают, что транслокации могут быть
поздним событием, которое встречается также в «нормальных»
лимфоцитах, полученных из того же клона, что и лейкемические
клетки. Упомянем еще ряд конкретных исследований, указываю-
щих на роль транслокаций в активации клеточных онкогенов и
на связь перестроек хромосом с раком.
N. Heisterkamp и соавт. (1982) сообщили, что человеческие
клеточные онкогены c-fes и с-abl, локализованные в хромосомах 15
и 9 соответственно, кодируют тирозинспецифические протеинки-
назы, связанные с определенными формами рака человека (острый
15*
227
промиелоцитарный и хронический миелоидный лейкозы и др.).
В той же лаборатории показано, что клеточный онкоген c-sis
человека локализован на хромосоме 22 и что он транслоцируется
при хроническом миелоидном лейкозе на хромосому 9 [Groffen J.
et al., 1983].
J. Erikson и соавт. (1983) исследовали места разрыва в хромо-
сомах 14 и 8 в клетках линии P3HR-1 лимфомы Беркитта и уровень
транскрипции гена с-myc в этих клетках и других линиях клеток
лимфомы Беркитта, используя в качестве контроля человеческие
лимфобластоидные клеточные линии, трансформированные виру-
сом Эпштейна—Барр. Результаты работы показали, что трансло-
кация онкогена с-myc к локусу иммуноглобулинов ведет к его
транскрипционной активации, возможно, как существенной сту-
пени на пути к неоплазии. Авторы установили, что точка разрыва
хромосомы 14 различна в разных линиях клеток лимфомы Бер-
китта. То же относится и к хромосоме 8.
Известно, что клетки лимфомы Беркитта несут специфические
хромосомные транслокации между хромосомами 8 и 14, 2 и 22.
Было показано, что у человека локус тяжелых цепей иммуноглобу-
линов (Н) расположен на хромосоме 14, локус Х-цепей — на
хромосоме 22 и локус х-цепей — на хромосоме 2. При лимфомах
Беркитта область q24->-qter хромосомы 8, по-видимому, трансло-
цирована на одну из хромосом, содержащих гены цепей 1g. Уста-
новлено также, что человеческий гомолог онкогена миелоцитома-
тозного вируса (МС 29) птиц, названный с-myc, локализуется
на хромосоме 8 и транслоцирован в клеточных линиях лимфомы
Беркитта на хромосому 14.
Исследование перестройки мышиного гомолога с-myc в клетках
мышиной плазмоцитомы с хромосомной транслокацией t (12, 15)
показало перестройки онкогена с-myc с последовательностями
CHIg в ряде образцов [Marcu R. et al., 1983]. В плазмоцитомных
клетках наблюдали повышенную транскрипцию транслоцирован-
ного с-myc. Таким образом, хромосомная транслокация в мыши-
ных плазмоцитомах, подобно человеческой лимфоме Беркитта,
включает хромосомы, содержащие гены 1g и онкоген с-тус.
Транслокация между хромосомами 8 и 14 у человека харак-
терна для лимфомы Беркитта. Эта транслокация в какой-то мере
является извращением нормальных активностей клеток-прототи-
пов. Клетки, которые дают начало клеткам лимфомы Беркитта,
секретирующим антитела, в норме осуществляют также функцию
секреции антител. Эта функция в нормальных условиях оказы-
вается возможной в результате перестройки хромосом, содержа-
щих гены антител, в процессе дифференцировки. Подобная пере-
стройка собирает гены антител из сегментов ДНК, рассеянных
в различных хромосомах: 14, 2 и 22. В ходе нормальной дифферен-
цировки клеток, продуцирующих антитела, каждая из этих хромо-
сом подвергается серьезным внутренним перестройкам, в резуль-
тате чего рассредоточенные по разным хромосомам сегменты гена
228
ген
тус
хромосома 8 хромосома 14
антител
ген тус
Рис. 9. Схема превраще-
ния здчровой клетки в ра-
t ковую в результате транс-
локации гена тус в ходе
аберрантного обмена фраг-
ментами хромосом 8 и 14.
гены
антител
антител соединяются вместе. В то же
время указанные процессы активируют
перестройку ДНК так, что на ее основе
производятся большие количества белка.
При извращении этого процесса, что
имеет место в клетках лимфомы Бер-
китта, любая из трех хромосом, содер-
жащих гены антител, вместо конструк-
тивной реорганизации своей собствен-
ной ДНК обменивает некоторую часть
ДНК с хромосомой 8. Данное обстоя-
тельство побудило G. Klein (1981) вы-
сказать предположение о том, что эти
транслокации могли бы не просто акти-
вировать гены антител в нормально пе-
рестроенной ДНК, но, наряду с этим,
активировать протоонкоген на хромо-
соме 8. Такое предположение получило
поддержку в ряде работ, в которых
было продемонстрировано, что действи-
тельно, хромосома 8 содержит некий
протоонкоген, идентифицированный как тус по гомологии с одно-
именным онкогеном вируса миелоцитоматоза, в котором он был
первоначально открыт.
Все описанные события привлекли к гену тус пристальное
внимание и при других лимфомах.
Было показано, что ген тус расположен в хромосоме 8 в клю-
чевой позиции в точке разрыва, где транспонированный фрагмент
этой хромосомы сочленяется с хромосомой 14 в лимфоидных
клетках (рис. 9).
Мнения исследователей в отношении характера влияния акта
транслокации на протоонкоген тус расходятся. Одни считают,
что происходит его активация и соответственно увеличенная
экспрессия, другие постулируют перестройку и качественное изме-
нение в процессе транслокации [Croce С., 1982]. В пользу послед-
ней точки зрения (качественного изменения протоонкогена) гово-
рит и работа G. Shen-Ong и соавт. (1982). Эти авторы уточнили
судьбу транслоцируемого гена с-тус. Они показали, что с-тус и
гены тяжелых цепей иммуноглобулинов находятся в противопо-
ложной ориентации. Кроме того, в каждой из четырех изученных
мышиных плазмоцитом с транслоцированным c-myc G. Shen-Ong и
соавт. нашли транскрипты иРНК на 400 оснований короче, чем
у нормального продукта. Полагают, что один экзон в ходе трансло-
кации был перемещен. Интересно, что увеличения содержания
myc-РНК в результате транслокации отмечено не было. Последний
факт противоречит предположению, что индукция опухоли явля-
ется результатом простого увеличения транскрипции с-тус в его
новом локусе расположения. С другой стороны, имеются данные,
229
что в некоторых линиях лимфом Беркитта и плазмоцитом мышей
перестройки гена c-myc при транслокации не происходит.
Вопрос требует дальнейшего изучения.
Инсерции, транспозиции генетического материала как меха-
низм активации клеточных протоонкогенов. Онкогенез, лейкемо-
генез за счет внесения в клеточный геном лейкозных вирусов,
не содержащих онкогены, мог бы служить примером индукции
опухолей путем инсерции чужеродного генетического материала.
Птичий лейкозный вирус, не содержащий собственного онкогена,
намного менее эффективный в индукции рака, чем остротрансфор-
мирующие вирусы, содержащие онкоген, тем не менее, действовал
онкогенно путем инсерции его собственных генов, в частности
«промотерной» ДНК. Вирусная «промотерная» ДНК, инсерциро-
ванная по соседству с клеточным протоонкогеном, активировала
ген до неестественного и вызывающего рак уровня экспрессии
[Hayward W. et al., 1981 ]. По данным этих авторов, в 6 различных
опухолях вирусный промотер инсерцировался рядом с протоонко-
геном myc. С. Сгосе и соавт. (1984) в своих исследованиях пока-
зали, что инсерция вируса увеличивает экспрессию гена тус,
в частности при лимфомах Беркитта.
Н. Temin (1983) отмечает, что более чем в 85 % вирусиндуциро-
ванных опухолей ДНК ретровирусов птиц интегрируется вблизи
протоонкогена c-myc и иРНК протоонкогенов присутствует в более
высокой концентрации, чем в нормальных клетках.
Примером инсерционного канцерогенеза могут служить также
наблюдения G. Rechavi и соавт. (1982). Авторы исследовали
механизм активации клеточного онкогена c-mos в геноме клеток
мышиной миеломы. Данный ген, c-mos, являющийся прародителем
трансформирующего гена в вирусе мышиной саркомы Молони,
M-MuSV, был ранее охарактеризован в отношении его трансфек-
ционной способности и последовательности нуклеотидов [Fren-
kel A., Fischinger Р., 1976; Canaani Е. et al., 1979]. Было показано,
что клеточная информация, содержащаяся в геноме M-MuSV
(обозначенная v-mos) и, как предполагается, трансдуцированная
из мышиного генома в момент генерации указанного вируса,
состоит из длинной открытой рамки считывания протяженностью
в 369 кодонов. Эта последовательность присоединена в стык
к сегменту из 5 кодонов последовательности вирусного помощника.
Белок с молекулярной массой 37 кд, идентифицированный в вирус-
инфицированных клетках, по-видимому, кодируется именно этой
комбинированной последовательностью из 374 кодонов и непо-
средственно «запускает» клеточную трансформацию. Клеточный
гомолог v-mos (c-mos) содержит участок из 21 кодона, присо-
единенный непосредственно к 5' описанной выше открытой рамки
считывания длиной 369 кодонов. До настоящего времени в нор-
мальной клетке не находили белка, кодируемого этим клеточным
геном. G. Rechavi и соавт. описали молекулярную перестройку
клеточного гена c-mos в мышиной миеломе. Они установили, что
230
активация гена происходит благодаря перестройке в 5'-конце
клеточного гена, включающего делению c-mos и инсерцию
(вставку) небольшого фрагмента ДНК, имеющего структурные
свойства, характерные для IS-элементов (описанных ранее),
транспозабельных элементов бактерий, Mu-фага. Авторы устано-
вили, что в миеломе ген c-mos изменяется таким образом, что
опухолевая иРНК содержит транскрипты, гибридизующиеся
с c-mos-пробой. Перестроенный ген (rc-mos) клонировали в фаге Z
и показали, что он (ген) трансформирует мышиные фибробласты
в тесте на трансфекцию, чего c-mos не делает. Активированный
rc-mos отличается от исходного, c-mos, лишь своим 5'-концом,
где он содержит инсерцированный фрагмент клеточной ДНК
длиной 159 т. о. (килобаз, тысяч оснований), локализованный
непосредственно в 5'-стык с c-mos.
Это наблюдение является, насколько нам известно, первой
демонстрацией активации клеточного онкогена в опухоли невирус-
ного происхождения с помощью механизма, включающего транс-
позицию (инсерцию) ДНК.
В этом же контексте следует рассматривать и «промотерную
гипотезуэ Г. П. Георгиева (1981, 1983), нашедшую более закон-
ченную форму в виде транспозонной теории. С нашей точки
зрения, «промотерная гипотезаэ вносит важный элемент в кон-
цепцию онкогенов, увязывая факт существования клеточных онко-
генов с их активацией путем подстановки под промотеры, объяс-
няя таким образом молекулярный механизм превращения так
называемых молчащих генов в функционально активные.
Еще дальше в толковании идеи транспозонов пошел В. М. Жда-
нов (1984), рассматривая ДНК-провирусы онкорнавирусов как
частный случай и особый класс транспозонов. В. М. Жданов
возвращается к высказанной им же ранее идее о биологической
роли интегрированных онковирусов в происхождении некоторых
клеточных генов, в том числе и принимающих участие в дифферен-
цировке.
Если понимать инсерции и транспозиции генетического мате-
риала в широком генетическом плане, как факторы перестройки
ДНК и, следовательно, мутагенеза, роль этих процессов в канцеро-
генезе следует признать весьма существенной.
Амплификация протоонкогенов как механизм индукции рака.
Родственные виды эукариот, как правило, содержат одно и то же
число копий на клетку гена данной «уникальной последователь-
ности>. В немногих исключениях, например таких, как гены
препроинсулина и глобина, в нескольких родственных видах были
найдены 1 или 2 дополнительные копии на клетку, что указывает
на имевшую место миллионы лет назад амплификацию зародыше-
вой линии в общем прародителе этих генов. Обычно опс-гены
представлены одной копией на гаплоидный геном, хотя крыса
имеет, по крайней мере, 2 различных гена, гомологичных опс-гену
крысиного происхождения вируса мышиной саркомы Харвея
231
(Ha-MuSV). Как исключение у мыши Mus pohari содержится
не менее 10 копий онкогена Ha-MuSV, тогда как большинство
других видов Mus содержат традиционно 1 или 2 копии. Анало-
гично китайские хомячки имеют около 6 копий гена типа Ki MuSV.
Сирийские хомячки содержат по одной копии опс-гена на геном
[Chattopadhyay S. et al., 1982].
Как полагают, в клетках эукариот генная амплификация (ум-
ножение) обусловлена спонтанными и случайными аномалиями
в репликации ДНК. Увеличенная экспрессия является следствием
амплификации, так как последняя предоставляет дополнительные
матрицы для синтеза РНК.
В ряде работ было установлено, что амплификация и увеличен-
ная экспрессия последовательностей протоонкогенов имеют место
в ряде опухолей человека и животных. Это было показано для
ряда опухолевых клеточных линий и исходных опухолей. Особенно
характерны в этом отношении случаи человеческой промиелоцит-
ной лейкемии [Collins S., Groudine М., 1982, 1983; Dalia-Favara R.
et al., 1983] и клеточной линии рака толстой кишки [Alitalo К.
et al., 1983], о чем подробнее речь будет идти ниже.
Некоторые авторы связывают амплификацию клеточных с-опс-
генов и увеличение их экспрессии с возникновением и развитием
злокачественных опухолей. Такое толкование индукции неоплазм
представляет альтернативу другой точке зрения, рассматриваю-
щей возникновение опухолей как результат качественных измене-
ний клеточных генов и, соответственно, продуктов их экспрессии.
Нетрудно понять, что то или иное решение этого вопроса
имеет не только чисто академический интерес, но и первостепенное
практическое значение. В самом деле, если онкогены опухолевые
тождественны протоонкогенам нормальных клеток и тождественны
также кодируемые ими белки, то как диагностика, так и терапия
опухолей в этом случае значительно усложняются, так как глубо-
чайшие биологические различия раковой и нормальной клетки
пришлось бы искать в неуловимо тонких количественных сдвигах.
Действительно, количественный уровень экспрессии онкогенов
в различных опухолях варьирует от равного экспрессии нормаль-
ного клеточного партнера до многократно увеличенного, и можно
только гадать, наблюдая этот феномен, где находится та критиче-.
ская граница, которая отделяет порядок и координацию нормаль-
ной клетки от хаоса и разрушения, свойственных раковой клетке.
Отсутствие качественных биохимических, молекулярно-биоло-
гических и иммунологических особенностей, присущих только ра-
ковым клеткам, затруднило бы, если не исключило, использование
мощных средств и орудий этих передовых дисциплин в диагностике
и лечении опухолей.
При промиелоцитной лейкемии человека амплификация гена
с-тус была обнаружена как в культивированных (линия HL-60),
так и некультивированных клетках [Dalla-Favera R. et al., 1982].
Установлено, что в клетках HL-60 амплифицированные последо-
232
вательности прото-myc локализованы в «doubleminits» структурах
хромосом [Collins S., Groudine М., 1982]. Из этих клеток была
изолирована ДНК, способная трансформировать in vitro клетки
NIH ЗТЗ.
По данным лаборатории R. Gallo [Dalla-Favera R. et al.,
1982; Westin E. et al., 1982], ген myc выявляется в широком круге
человеческих гемопоэтических и иных опухолевых клеток, включая
нормальные фибробласты и лимфоциты периферической крови.
В большинстве клеток myc-иРНК присутствует в виде 1 —10 копий
на клетку. Однако десятикратное увеличение количества РНК
было выявлено в немногих случаях, в частности в одной саркоме,
двух карциномах и двух гемопоэтических линиях клеток.
Наивысшие уровни myc-иРНК присутствовали в клеточной линии
человеческой промиелоцитной лейкемии HL-60. Эта клеточная
линия имеет способность дифференцироваться в зрелые грануло-
циты при индукции некоторыми химическими агентами, например
диметилсульфоксидом или ретиноидной кислотой. Интересно, что
тус-специфические транскрипты были практически неопределимы
в терминально дифференцированных клетках HL-60 [Schwab М.
et al., 1983].
Исследование другого клеточного онкогена, c-Ki-ras, показало,
что он амплифицирован в 30—60 раз в клетках мышиной адрено-
кортикоидной опухоли Y1, причем амплифицированный онкоген
локализуется в «doubleminits> хромосоме (небольшие парные
хроматиновые тельца, лишенные центромеров) и в гомогенно
окрашивающейся хромосомной области. Эти две кариотипические
ненормальности обычно сигнализируют о присутствии амплифици-
рованных генов и часто наблюдались в разнообразных опухолевых
клетках [Barker Р., 1982]. Количества c-Ki-ras-специфической
иРНК и белка, кодируемых амплифицированным геном, соответст-
венно увеличены. Авторы полагают, что амплификация и увели-
ченная экспрессия клеточных онкогенов могут вносить вклад в ге-
нез и (или) поддержание трансформированного состояния, по
крайней мере естественно встречающихся опухолей.
В клетках человеческой нейробластомы IMR-32 обнаружены
амплифицированные участки в коротких плечах хромосомы 1.
Амплификация распространялась на фрагмент протяженностью
3000 п. о. В нормальных клетках исходные для амплификации
последовательности присутствуют в хромосоме 2 и продолжают
оставаться там и в нейробластомных клетках IMR-32. По-види-
мому, амплификация этой последовательности как-то связана с ее
транспозицией на хромосому 1, которая в нейробластомных клет-
ках демонстрирует высокую степень структурных аберраций
[Konda N. et al., 1983]. Амплификация показана также в трех
других линиях нейробластомных клеток.
В лаборатории R. Weinberg [McCoy М. et al., 1983] в клеточных
линиях карцином толстой кишки и легкого показана амплифика-
ция активированного клеточного онкогена c-Ki-ras 2 в 3—5 раз.
233
Заключая обзор данных по амплификации клеточных прото-
онкогенов, нельзя не отметить определенные противоречия, выяв-
ленные при проведении отдельных исследований по этому вопросу.
Так, например, амплификация тус не была обнаружена в 10 све-
жих случаях миелоидного лейкоза и в других клеточных линиях
миелоидного лейкоза, в том числе в клеточной линии К-562
[Collins S., Groudine М., 1982]. Наоборот, в клетках К-562 ампли-
фицирован ген прото-abl [Duesberg Р., 1983]. В то время как
прото-ras амплифицирован в линии клеток мышиной адренокорти-
коидной опухоли [SchwabМ. et al., 1983], 6—10-кратная амплифи-
кация гена прото-Ha-ras наблюдалась в некоторых штаммах
нормальных мышей и хомяков [Chattopadhyay S. et al., 1982].
В НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова М3 СССР С. Н. Фе-
доров и О. М. Серова наблюдали парадоксальное явление: резкую
амплификацию прото-myc в непораженной слизистой оболочке
толстой кишки больного с карциномой этой части кишечника,
тогда как в самой опухоли амплификации указанного гена не на-
блюдалось. Сущность парадокса еще предстоит расшифровать.
Создается впечатление, что между амплификацией протоонкогенов
и канцерогенезом достаточно устойчивой связи не существует.
Активация клеточных протоонкогенов в трансформирующие
онкогены путем точковых мутаций. Рассмотрение в данном разделе
точковых мутаций обособленно от других путей активации прото-
онкогенов не означает, что они являются единственным генетиче-
ским механизмом, осуществляющим превращение нормальных
клеточных генов в онкогены, в то время как изложенные выше
имеют совершенно другую природу. Это не так. Произведенное
нами подразделение процессов активации в известной степени
носит формальный характер и служит облегчению их классифика-
ции.
В действительности практически все без исключения охаракте-
ризованные ранее механизмы активации протоонкогенов затраги-
вают так или иначе ДНК и, таким образом, в конечном итоге
имеют мутационную природу.
В самом деле, что в генетике понимают под мутацией? В мо-
нографии С. Г. Инге-Вечтомова (1983) мутация характеризуется
следующим образом: «Мутация — это генетическое изменение,
приводящее к качественно новому проявлению основных свойств
генетического материала: дискретности, непрерывности или линей-
ности. Таким образом, мутации представляют изменения генов
(генные мутации), ведущие к появлению новых аллелей». Со-
гласно Ж. Бейссон (1976), «мутация, следовательно, в самом
общем смысле представляет собой изменение последовательности
нуклеотидов гена». По определению С. М. Гершензона (1979),
«мутации — это внезапно возникающие стойкие изменения генети-
ческого аппарата, включающие как переход генов из одного
аллельного состояния в другое, так и различные изменения числа
и строения хромосом». К типам мутаций автор относит: 1) измене-
234
ния числа наборов хромосом; 2) изменения числа отдельных
хромосом; 3) перестройки хромосом (сегментные мутации: деле-
нии, дупликации, инверсии, транслокации, транспозиции); 4) ген-
ные (или точечные) мутации. Первые 3 типа мутаций обозначают
под общим названием «хромосомные аберрации».
Приведенные цитаты из авторитетных источников говорят
о том, что практически все рассмотренные нами выше механизмы
активации клеточных протоонкогенов представляют собой тот или
иной вид мутаций: либо на хромосомном, либо на генном уровне,
либо на уровне отдельных нуклеотидов, чем являются точковые
(точечные) мутации. Это относится и к трансдукциям, и трансло-
кациям, и инсерциям, и амплификациям, и точковым мутациям.
Точковые мутации в канцерогенезе привлекли особое внимание
в связи с серией статей по активации онкогенов, появившихся
в конце 1982 г. Проведенные исследования особенно примеча-
тельны в том отношении, что впервые в истории онкологии приуро-
чили сложнейшее биологическое явление — трансформацию и
туморогенез — к конкретному простому молекулярному акту—
замене одного нуклеотида ДНК другим. Исчерпывается ли ука-
занным элементарным молекулярно-генетическим «ходом при-
роды» вся сложность феномена неоплазии? Вряд ли. Однако
в существовании причинно-следственной связи между таинствен-
ным биологическим явлением — раком — и молекулярно-химиче-
ским событием, на уровне ДНК, сомневаться не приходится.
Данная простая схема может обрастать дополнительными фак-
тами и деталями, но принцип, по-видимому, сохранится.
Итак, точковая мутация — это мутация, затрагивающая лишь
один нуклеотид из тысяч. По данным сразу трех лабораторий
(R. Weinberg, М. Barbacid и М. Wigler), она превращает доброка-
чественный протоонкоген в активный онкоген. Рассмотрим подроб-
нее, как это было установлено.
Обработкой рестрикционными эндонуклеазами ДНК опухоли и
гомологичной нормальной ткани расщепили на фрагменты, с по-
мощью техники трансфекции идентифицировали сегменты, содер-
жащие онкоген и протоонкоген, и клонировали те и другие.
Таким образом, исследователи располагали клонированными ва-
риантами обоих генов, поэтому определение характера мутации
и ее точной локализации при современном уровне развития моле-
кулярной биологии и генной инженерии не представляло непреодо-
лимых трудностей и явилось фактически делом техники.
В принципе было сделано следующее.
Исследователи располагали двумя возможностями: 1) опреде-
лить полную нуклеотидную последовательность (что теперь и де-
лается во многих случаях) каждого из генов, имеющих протяжен-
ность около 5000 п. о.; 2) сравнить две последовательности.
Практически более удобным оказался 2-й путь: сначала устано-
вили ту область в генах, которая определяла их критическое
различие. Это осуществили путем генерирования рекомбинантов
235
между частями двух генов, при использовании генно-инженерной
техники, обеспечивающей подобие классического генетического
двойного кроссинговера (рис. 10) [Weinberg R., 1983]. Точковая
мутация, превращающая протоонкоген в активный онкоген в кле-
точной линии EJ карциномы мочевого пузыря человека, была
идентифицирована: выявлением биологически активного (транс-
фекция) сегмента ДНК и секвенированием соответствующих фраг-
ментов ДНК опухолевых и нормальных клеток. Протоонкоген и
онкоген (а) расщепляли эндонуклеазами в одном и том же месте
(б) и сегменты лигировали (в) перекрестно. Рекомбинанты испы-
тывали на трансфекционную активность. «Вырезали» более мелкие
фрагменты (г, д). В наименьших фрагментах (350 нуклеотидов)
устанавливали последовательность оснований и выявляли точку
мутации.
Специфические сегменты, «вырезанные», как указано выше,
из двух генов, соединялись с помощью фермента ДНК-лигазы
с образованием двух гибридных генов, одна часть которых проис-
ходила из онкогена, а другая — из протоонкогена. Гибридные
молекулы испытывали в трансфекционном тесте в культуре мыши-
ных фибробластов линии NIH ЗТЗ, чтобы определить, какая из
них утратила онкогенную активность, а какая приобрела.
Именно таким способом удалось значительно сузить искомую
критическую для неоплазии область после «скрещиваний» все
более мелких сегментов онкогена и его клеточного гомолога —
протоонкогена.
Для онкогена рака мочевого пузыря человека конечным фраг-
ментом ДНК, обеспечивающим трансфекционный эффект, ока-
зался блок из 350 нуклеотидов. При введении его в протоонкоген
последний приобретал онкогенную активность. Соответственно
аналогичный фрагмент протоонкогена, замещающий упомянутый
выше нуклеотидный участок онкогена, лишал молекулу онкогена
трансформирующей активности.
Это означало, что критический дефект, различающий два
близкородственных гена, локализуется в сегменте, состоящем из
350 нуклеотидов. Анализ последовательности нуклеотидов актив-
ного и неактивного вариантов сегмента привел к неожиданному
результату: активность или неактивность 350-нуклеотидной после-
довательности зависела от единственного нуклеотида — гуанин
во фрагменте протоонкогена был заменен на тимин в онкогене.
Следовательно, замена единственного нуклеотида, т. е. точковая
мутация, в 5000-нуклеотидном нормальном человеческом гене
превращала его в онкоген.
Описанная работа была проделана в лаборатории R. Weinberg
на клеточной линии EJ карциномы мочевого пузыря человека
[Tabin С. et al., 1982]. Именно таким способом впервые был
установлен конкретный генетический дефект, ведущий к бесконт-
рольному росту человеческой опухоли. Причиной точковой мута-
ции мог быть любой фактор окружающей среды.
236
онкоген
активный
неактивный
становится неактивен
становится активен
становится неактивен
становится активен
становится неактивен
становится активен
Рис. 10. Превращение протоонкогена клеток мочевого пузыря человека в онкоген
[Weinberg R., I983J (объяснение в тексте).
Поиск мутагенного повреждающего эффекта, активирующего
протоонкогены клетки, не был случайным. Известно много работ
по химическому канцерогенезу, указывающих на устойчивую кор-
реляцию канцерогенной активности соединений с их мутагенной
способностью [McCann J. et al., 1975; McCann J., Ames В., 1976].
Это свидетельствует о том, что ДНК является конечной мишенью
канцерогенной активации. Соответственно стали пытаться иденти-
фицировать и изучить сегменты ДНК в опухолевых клетках,
чье изменение критически важно для онкогенного превращения
[Shin Т. et al., 1979; Cooper G. et al., 1980; Shin T. et al., 1980;
Klein G., 1981]. Учитывалось, что ДНК нормальных клеток не
вызывает трансформацию клеток NIH ЗТЗ in vitro, а ДНК опухо-
левых клеток — часто вызывает. Это явно говорило о существова-
237
нии в ДНК опухолевых клеток онкогенных факторов и об их
отсутствии в клетках нормальных.
Первые указания на присутствие в опухолевых ДНК онкогенно-
активных последовательностей были получены в опытах по изуче-
нию чувствительности биологической активности ДНК к обработке
сайтспецифическими эндонуклеазами [Lane М. et al., 1981;
Shilo В., Weinberg R., 1981].
C. Tabin и соавт. (1982) провели генетическое картирование
функционально измененной области онкогена. Для этого они
осуществили in vitro гомологичную рекомбинацию между клонами
двух генов. Эксперимент предусматривал иссечение рестрикцион-
ного фрагмента из онкогена и использование его для замены
гомологичного блока протоонкогена. Одновременно реципрокная
конструкция была создана путем сплайсинга фрагмента протоон-
когена в онкоген. Полученные рекомбинантные модели были затем
испытаны на трансфекцию. Онкогенная активность гена EJ была
обнаружена во фрагменте, состоящем из 350 нуклеотидов. Указан-
ная область распространялась от первого Xma I эндонуклеазного
сайта до сайта Kpn I. 55 % данной области состоит из первого
кодирующего экзона, 10 % — из 5'-конца до кодирующей области
и 35 % является частью первого интрона.
Разница между 350-нуклеотидными сегментами ДНК нормаль-
ных и опухолевых клеток находилась в области первого экзона,
кодирующего белок р21, на расстоянии 60 нуклеотидов от сайта
расщепления Xma I, в триплете, кодирующем глицин в нормальном
крысином и человеческом c-Ha-ras-генах. Гомологичная последо-
вательность в онкогене EJ кодировала не глицин, а валин. Именно
эта замена глицина была ответственной за изменение функции
продукта онкогена, белка р21.
Другим независимым следствием замены единственного осно-
вания в протоонкогене было изменение в сайтах расщепления
двух различных эндонуклеаз. Последовательность ГЦЦГГЦ со-
держится в протоонкогене и представляет сайт распознавания
эндонуклеазы Nae I. Она имеет также сайт распознавания ЦЦГГ,
специфичный для эндонуклеазы Нра II. Оба этих сайта изменяются
в онкогене на последовательность ГЦЦГТЦ, нераспознаваемую
указанными ферментами.
Замена глицина на валин в белке р21 имеет явно критическое
значение для функции белка, причем, по-видимому, дело не столько
в появлении валина, сколько в исчезновении глицина. Действи-
тельно, анализ, например, продукта онкогена вируса саркомы
Харвея показал его отличие от продукта гомологичного нормаль-
ного клеточного гена лишь в одной аминокислоте: вместо глицина
в нем находится аргинин. В белке, кодируемом онкогеном вируса
саркомы Кирстена, в аналогичной позиции находится серин. Сле-
довательно, независимо от характера аминокислоты, заменяющей
глицин в белке р21, последний проявляет онкогенные свойства.
Все сводится к замене глицина как такового. Чем же отличается
238
эта аминокислота от других, в чем ее уникальность? Высказы-
ваются следующие предположения [Tabin С. et al., 1982].
1. Глицин является единственной аминокислотой, не содержа-
щей боковой цепи. Поэтому он способен участвовать в изгибах,
свертываниях полипептидного скелета белка и дестабилизирует
а-спирали [Cantor С., Schimmel Р., 1980]. Поэтому замена гли-
цина валином или аргинином приводит к резкому изменению
в локальной стереохимической структуре белка.
2. Потеря глицина в остатке 12 (среди 37, кодируемых первыми
экзонами протоонкогена и онкогена) вызывает значительные изме-
нения в важном домене белка р21. Одно следствие этой замены —
конформационный сдвиг в белке, ведущий, в свою очередь, к абер-
рантной миграции при электрофорезе или процессировании р21.
Другое следствие — глубокое влияние на функцию белка р21,
выражающееся в характере взаимодействия последнего с клеточ-
ными мишенями. В принципе описанный феномен можно было бы
сравнить с патологией при серповидно-клеточной анемии, где
замена одной из 574 аминокислот в глобине радикально меняет
свойства гемоглобина в эритроцитах, делая егод нерастворимым
(гемоглобин S) и выпадающим в виде кристаллов. В данном
случае a-цепи двух форм гемоглобина идентичны, а -в 0-цепи
в положении 6 в нормальном гемоглобине находится остаток
глутаминовой кислоты, тогда как в гемоглобине S — остаток
валина. Серповидно-клеточная анемия является молекулярной
болезнью генетического происхождения. Она — результат мута-
ции в молекуле ДНК, кодирующей синтез 0-цепи гемоглобина.
Очень сходное исследование в Национальном раковом инсти-
туте выполнили Е. Reddy и соавт. (1982). Авторы проанализиро-
вали генетические изменения, происходящие в ткани мочевого
пузыря человека при ее неопластическом перерождении, исследо-
вали нормальную ткань и клеточную линию Т24 карциномы
мочевого пузыря, обнаружили точковую мутацию в протоонкогене
при его активации в онкоген. При этом, как и в изложенной выше
работе С. Tabin и соавт. (1982), отмечена замена в результате
мутации гуанина в протоонкогене на тимин в онкогене и, соответст-
венно, замещение глицина в нормальном протоонкобелке р21 на
валин в онкобелке р21, кодируемых соответственно этими генами.
Сравнительный анализ онкогена Т24 рака мочевого пузыря чело-
века в сопоставлении с ретровирусными трансформирующими
генами (онкогенами) показал, что его внутренний фрагмент близ-
кородствен онкогену мышиных саркомных вирусов Харвея и
BALB (v-has/v-bas).
Ранее авторы установили, что плазмида (рТ24-СЗ), содержа-
щая 6,6 т. о. ВатН 1-фрагмент ДНК Т24, была способна трансфор-
мировать клетки NIH ЗТЗ. Трансформирующая активность этой
молекулы была локализована в области 4,6 т. о. Xho I—Sph 1-фраг-
мента ДНК. Чтобы определить точное место мутации, превращаю-
щей пр.отоонкоген в онкоген, Е. Reddy и соавт. сконструировали
239
серию плазмид, в которых фрагменты Т24-трансформирующего
гена были замещены гомологичными нормальными последователь-
ностями гена c-has/bas-1. В реципрокных экспериментах гомоло-
гичная область нормального гена с-has/bas-l была замещена
соответствующими доменами его трансформирующей аллели. За-
мена в плазмиде Т24-СЗ-фрагмента ДНК, локализованного между
сайтами расщепления Xho I и Kpn I, нормальными последователь-
ностями полностью лишала его трансформирующей активности.
Напротив, замена нормальной Xho I-Kpn 1-области ДНК в pbc-
N I (плазмида, содержащая фрагменты клеточного протоонко-
гена) соответствующим доменом плазмиды рТ24-СЗ, генерировала
плазмиду (рХКТ-82), которая трансформировала клетки NIH ЗТЗ.
С помощью этой же генно-инженерной техники обмена рестрик-
ционными фрагментами генов Т24 и c-has/bas авторы еще точнее
локализовали место, ответственное за активацию Т24. Оно было
локализовано в 0,9 т. п; о. Sac I-Kpn I-рестриктазном фрагменте
ДНК рТ24-СЗ и pbc-N I.
Найдено лишь одно изменение нуклеотидов, локализованное
в позиции 655 от места расщепления эндонуклеазой Sac I. Гуанин
нормального гена с-has/bas-l уступил место тимину в онкогене
Т24. Е. Reddy и соавт. пришли к такому же заключению, как и
С. Tabin и соавт., при изучении EJ-онкогена: активация клеточного
с-has/bas-l, нормального протоонкогена, в клетках Т24 человече-
ской карциномы мочевого пузыря вызвана единственной точковой
мутацией.
Было показано также, что мутировавший гуаниновый остаток
является частью гекса нуклеотида ГЦЦГГЦ, который специфи-
чески распознается эндонуклеазой Nae I. Установлено, что Nae I
расщепляет 6,4 т. о. ВагпН I-инсерт плазмиды pbc-N 1 в пяти
местах, приводя к образованию 4 внутренних фрагментов ДНК:
0,2; 0,4; 0,6 и 0,9 т. о., тогда как переваривание этой эндонуклеазой
плазмиды рТ24-СЗ (содержащей онкоген) дает лишь 3 внутрен-
них фрагмента: 0,2; 0,6 и 1,3 т. о. Утрата Nae 1-сайта расщепления
внутри 1,3 т. о.-фрагмента подтверждает местоположение точки
мутации.
Согласно проделанному ранее гетеродуплексному и рестрик-
ционному анализам, первый экзон онкогена Т24 содержит коди-
рующую информацию для 37 аминокислот, находящихся между
позициями 621 и 731. Указанные наблюдения локализовали мути-
ровавший гуаниновый остаток во втором основании триплета
(655-й нуклеотид), кодирующего глицин— 12-й аминокислотный
остаток нормального человеческого белка р21. Замещение гуанина
протоонкогена на тимин в онкогене Т24 приводило к замене
глицина нормального белка на валин онкобелка. Этого оказыва-
лось достаточно для придания трансформирующих свойств ген-
ному продукту онкогена Т24 человека.
Е. Reddy и соавт. (1982) отмечают общее генетическое изме-
нение в человеческом и ретровирусных трансформирующих генах.
240
По их данным, сравнение первых 37 аминокислот белка р21,
кодируемого нормальным геном человека с-has/bas-l, с их ретро-
вирусным партнером показало полную идентичность, кроме пози-
ции 12, т. е. аминокислоты, которая изменена в Т24. В белке р21,
кодируемом Ha-MSV, в этом положении присутствует аргинин,
в р21, кодируемом BALB-MSV, — лизин, а в р21, кодируемом
активированным c-has/bas-1, — валин. Эти данные указывают
на то, что точковая мутация касается 12-го кодона нормальных
генов и, по-видимому, достаточна для приобретения неопласти-
ческих свойств.
N. Tsuchida и соавт. (1982) изучили нуклеотидную последо-
вательность гена v-kis — онкогена Ki-MSV. При сравнении первых
37 аминокислот дедуцированного белка Кирстена р21 с таковыми
белка, кодируемого с-has/bas-l, авторами отмечены 2 изменения:
глицин заменен серином в позиции 12, а глутаминовая кислота —
глутамином в положении 37. Таким образом, изменения в глицино-
вом остатке гена c-kis в позиции 12 активируют данный ген.
Логика этих событий могла бы указывать на то, что и другой
трансформирующий онкоген человека, идентифицированный
в ряде разнообразных человеческих карцином (Kis-2-ген), активи-
ровался с помощью того же механизма, каким возник онкоген
Т24. Поскольку известные трансформирующие белки р21 имеют
в позиции 12 различные аминокислоты, Е. Reddy и соавт. также
считают злокачественные свойства этих белков скорее результатом
элиминирования глицина в их нормальном партнере, чем просто
заменой одной аминокислоты на другую. Глициновые остатки
известны своей способностью изменять а-спиральную структуру
белков. Авторы определили, что N-терминальная часть белка
р21, кодированного геном с-has/bas-l, содержит 2 а-спиральные
области из 10 и 13 аминокислот, соединенные петлей из 7 амино-
кислот. Петлевидная структура придает гибкость при сгибании и
складывании полипептидной молекулы. Если глицин в положении
12 белка р21 заменен валином, то размер петлевой области
уменьшается до двух аминокислот, снижая эластичность струк-
туры белка. При этом также увеличивается спиральная часть
N-терминального домена трансформирующего белка р21 в сторону
от центра сердцевины молекулы.
Таким образом, различие между белками р21, кодируемыми
нормальным геном с-has/bas-l, и онкогеном Т24 носит качествен-
ный характер.
Как видим, исследования С. Tabin и соавт. (1982) и Е. Reddy
и соавт. (1982) очень сходны между собой. Они проведены на
одном виде опухолевого материала (рак мочевого пузыря чело-
века), хотя и на разных клеточных линиях. Обе работы убеди-
тельно демонстрируют роль точковых мутаций в активации клеточ-
ных протоонкогенов в онкогены.
Трансформирующие гены, соответствующие клеточному гомо-
логу (c-Ki-ras) вирусного онкогена v-Ki-ras, выявлены в клеточ-
16 Заказ 380
241
ных линиях, полученных из карцином мочевого пузыря, легкого,
толстой кишки и желчного пузыря, равно как и в биопсийной
ткани из карцином легкого, поджелудочной железы, толстой
кишки и рабдомиосаркомы [Capon D. et al., 1983].
J. Grath и соавт. (1983) показали, что c-Ki-ras 2 потенциально
кодирует 2 различных белка р21 (молекулярная масса 21 000)
путем дифференциального использования двух из пяти его .коди-
рующих экзонов. Оставалось неясным, какой из этих белков
(или оба) обладает трансформирующей активностью.
Как видно из изложенного выше, активация гена c-Ha-ras 1
в клетках Т24 карциномы мочевого пузыря человека, вызванная
изменением одного нуклеотида, дает начало синтезу белка р21,
имеющему одну измененную аминокислоту и отличающемуся иной
электрофоретической подвижностью.
Присутствие белков р2Га* с различными электрофоретическими
подвижностями в двух клеточных линиях карцином легкого и
толстой кишки, содержащих активированные гены c-Ki-ras 2,
равно как и в клетках NIH ЗТЗ, трансформированных ДНК из
этих опухолевых линий, указывало на то, что ген c-Ki-ras 2 мог
быть активирован сходным генетическим поражением. Для иссле-
дования этой возможности D. Capon и соавт. (1983) клонировали
ген c-Ki-ras 2 ДНК из клеточных линий человеческих карцином
легкого (Calu-1) и толстой кишки (SW480), несущих активирован-
ные гены c-Ki-ras 2.
Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что акти-
вация гена в онкоген произошла благодаря двум отдельным
мутациям одного и того же кодона в указанных двух клеточных
линиях. При помещении этих кодирующих элементов клонирован-
ного гена c-Ki-ras 2 под транскрипционный контроль гетерологич-
ной экспрессионной системы были получены данные в пользу той
точки зрения, что наблюдавшиеся структурные мутации являются
необходимыми, а в определенных случаях и достаточными для
придания гену трансформирующей активности.
D. Capon и соавт. установили, что: 1) единственный нуклеотид
в кодоне 12 отличает области ДНК, кодирующие белок р2Г,
триплет ГГТ, кодирующий глицин в позиции 12 продукта нормаль-
ного гена c-Ki-ras 2, становится в результате мутации ГТТ, коди-
рующим валин в клетках SW480 (карцинома толстой кишки), и
ТГТ, кодирующим цистеин в клетках Calu-1 (карцинома легкого);
2) второе различие в нуклеотидах найдено вверх от инициирую-
щего кодона АТГ, что указывает на существование двух различных
трансформирующих аллелей в клеточной линии SW480.
В описанной работе показано, что транскрипты с активиро-
ванных трансформирующих генов клеточных линий карцином
легкого и толстой кишки человека кодируют белки, отличающиеся
друг от друга и от продукта считывания протоонкогена c-Ki-ras 2.
Оба различия находятся в позиции 12 кодируемых белков р21,
где валин и цистеин замещают глицин, присутствующий в нетран-
242
сформирующем белке. Единственная замена аминокислоты в этой
позиции, таким образом, представляет собой общий механизм
активации трансформирующей активности в клеточных онкогенах
ras, выявляемой трансфекцией клеток NIH ЗТЗ. Сходно с этим
высокогомологичные трансформирующие белки р21, кодируемые
мышиными саркомными вирусами Харвея, BALB и Кирстена,
имеют соответственно аргинин, лизин и серин в положении 12.
Мутация, ответственная за активацию клеточных генов, возникла
благодаря трансверсии Г->Т. тогда как в трансформирующих
ретровирусах гены были активированы, по-видимому, благодаря
переходу Г->А, возможно, в результате ошибок при обратной
транскрипции.
Таким образом, исследование клеточных линий карцином
легкого и толстой кишки человека показало, что различные
точковые мутации в одном и том же кодоне могут активировать
клеточный ген c-Ki-ras 2 и поэтому большинство последователь-
ностей информационных РНК, транскрибированных с этого гена,
используют участки 4-го кодирующего экзона, отличающиеся
от вирусного партнера.
D. Capon и соавт. (1983) осуществили анализ последователь-
ностей ДНК активированного онкогена из линии клеток Т24
карциномы мочевого пузыря человека и двух аллелей его нормаль-
ного клеточного прародителя (c-Ha-ras 1). Анализ показал, что
гены содержат, по крайней мере, 4 экзона и только единственная
точковая мутация, находящаяся в 1-м экзоне, различает кодирую-
щую область обеих аллелей нормального гена от их активирован-
ного партнера. Оба варианта гена кодируют белок, который
отличается от соответствующего продукта вирусного гена по
трем аминокислотным остаткам, один из которых, как было пока-
зано ранее, представляет главный сайт фосфорилирования вирус-
ного полипептида.
С момента установления в 1982 г. положения о том, что между
трансформирующим геном клеточной линии человеческого рака
мочевого пузыря и его нетрансформирующим вариантом в нор-
мальных клетках различие заключается лишь в одном нуклеотиде,
началась «охота* за другими примерами подобных изменений.
Не все попытки были успешными. Так, A. Feinberg и соавт. (1983)
не обнаружили точковой мутации в 12-й аминокислоте в продукте
онкогена Ha-ras в 29 различных раковых опухолях человека.
Однако представление об участии точковых мутаций в активиро-
вании клеточных протоонкогенов не было этим поколеблено.
Более того, обнаружили другую мутацию в том же гене клеточной
линии рака легкого человека [Yuasa Y. et al., 1983].
Была изучена активация c-Ha-ras (или c-bas/has), клеточного
гена, из которого, по-видимому, произошел онкоген вируса мыши-
ной саркомы Харвея (Ha-MSV). Его продуктом является белок р21
(21 кд). В клеточных линиях Т24 и EJ карциномы мочевого
пузыря человека точковая мутация изменила 12-ю аминокислоту
16*
243
белка р21 с глицина на валин. В отличие от этого, в продукте
трансформирующего гена c-Ha-ras, изолированного и клонирован-
ного У. Yuasa и соавт. из линии клеток Hs-242 человеческой
карциномы легкого, в позиции 12, как и в норме, обнаружен
глицин. В то же время в 61-м положении вместо присущего
нормальному белку р21 глутамина найден лейцин. Таким образом,
в 1-м экзоне онкогена изменений обнаружено не было, но во 2-м
экзоне имел место генетический дефект, т. е. точковая мутация.
Трансформирующий ген клеточной линии Hs-242 карциномы
легкого человека был клонирован в биологически активной форме
и идентифицирован как c-bas/has (c-Ha-ras).
S. Rasheed и соавт. (1983) определили нуклеотидную после-
довательность онкогена штамма Рашид вируса саркомы крыс
(RaSV). Онкоген кодирует трансформирующий белок р29 (29 кд),
отличающийся от иммунологически родственного ему белка р21
вируса мышиной саркомы Харвея по структуре N-конца и тем, что
имеет дополнительные мутации на карбокси-конце. Крысиный
саркомный вирус штамма Рашид интересен в том отношении,
что возник в клеточных культурах химически индуцированных
опухолей крыс с использованием крысиного лейкемического вируса
(RaLV). Этот вирус отличается от Ha-MuSV и Ki-MuSV тем, что
содержит вирусные и клеточные последовательности только крыси-
ного происхождения. 6,4 т. о.-фрагмент генома RaSV трансформи-
ровал культуру клеток NIH ЗТЗ или крысиные клетки, которые
начинали экспрессировать р29.
Известно, что онкоген Ha-MuSV кодирует белок, в котором
глицин заменен аргинином, а онкоген Ki-MuSV кодирует белок,
где вместо глицина расположен серин. Эти перестановки рассмат-
ривались как главные различия между нормальными и вирусными
онкогенами [Tabin С. et al., 1982; Chang Е. et al., 1982; Parada L.
et al., 1982; Pulciani S. et al., 1982; Reddy E. et al., 1982].
Анализ последовательности субгеномного фрагмента RaSV,
содержащего около 1400 нуклеотидов, кодирующих белок р29,
показал его гомологию с v-Ha-ras, начиная с позиции 724. Однако
были выявлены различия в двух триплетах, кодирующих треонин
и глицин (остатки 40 и 49), вместо аланина и аргинина в пози-
циях 19 и 11, соответственно, белка р21. За исключением четырех
аминокислот и двух измененных аланиновых и аргининовых
кодонов (1150 и 1234), все нуклеотиды и дедуцированные амино-
кислоты, начиная с первого метионина р21 -подобного белка (787),
оказались точно совпадающими с последовательностью v-Ha-ras.
Это гомология включает критическую мутацию аргинина в 12-м
аминокислотном остатке, который в р29 соответствует остатку 71.
4 мутации в последовательности р21 -подобного белка вируса RaSV
представлены аланином, аланином, гистидином и пролином
в остатках 118, 181, 182 и 209 соответственно, по сравнению
с треонином, глицином, аргинином и глутамином в остатках 59,
122, 123 и 150 белка р21, кодируемого v-Ha-ras.
244
К. Shimizu и соавт. (1983) анализировали структуру онкогена
Ki-ras в линии клеток Calu-1 карциномы легкого человека. По их
данным, гомолог вирусного онкогена Кирстен-ras (v-Ha-ras),
найденный в клеточной линии Calu-1 карциномы легкого человека,
имеет интрон-экзонную структуру, сходную с таковой человече-
ского гомолога вирусного гена Харвей-ras (v-Ha-ras). Второй,
потенциально 4-й кодирующий экзон присутствует в Ki-ras-гене
человека, и сходные последовательности найдены в мышином
штамме Кирстена саркомного вируса. Онкоген Calu-1 кодирует
в 12-й аминокислотной позиции цистеин. Это указывает на то, что
ген Calu-1 Ki-ras подвергся мутационной активации в том же
сайте, что и ген Ha-ras человека в клеточной линии карциномы
мочевого пузыря Т24.
Сравнение их предсказанных (рассчитанных по последователь-
ностям нуклеотидов, т. е. дедуцированных) последовательностей
аминокислот говорит о том, что ras-белки имеют «константную»
и «вариабельную» области.
Авторы отмечают, что Ha-ras клеток Т24, Ki-ras карциномы
легкого и толстой кишки, онкоген клеточной линии нейробластомы
SK-N-SH, по-видимому, возникли в результате «активации» путем
соматической мутации соответствующих клеточных ras-генов
[Taparowsky Е., 1973; Reddy Е. et al., 1982; Tabin С. et al., 1982].
Характерно сопоставление родства продуктов генов ras.
1. Наблюдается значительная консервативность всей амино-
кислотной последовательности между гомологичными ras-генами
у отдаленных видов животных. Так, Ha-ras-ген человека отлича-
ется от вирусного Ha-ras-гена, имеющего крысиное происхожде-
ние, лишь тремя (из 189) остатками аминокислот. Сходно с этим
человеческий Ki-ras-ген (состоящий из 4 экзонов: I, II, III и IVa)
отличается от вирусного Ki-ras-гена, также имеющего крысиное
происхождение, лишь 7 из 189 позиций. Авторы считают обнару-
женный консерватизм отражением эволюционного давления на
поддержание физиологической роли продуктов генов ras.
2. Индивидуальные члены семейства генов ras демонстрируют
высокую степень родства на уровне последовательности амино-
кислот 1 —120, 133—163 и 185—189. В этой «константной» области
человеческие Ki-ras и Ha-ras различаются лишь в 7 позициях.
Человеческий ген N-ras демонстрирует сходную консервативность
в той же области. Однако предсказанная последовательность
аминокислот значительно отклоняется в аминокислотах 164—184
и меньше — в области позиций 121 —132. Последняя названа
«вариабельной» областью. У различных видов данная область
проявляет разную степень вариабельности. Так, не отмечено
изменений аминокислот между генами Ha-ras человека и вирусов
в рассматриваемой области, и имеют место лишь небольшие
различия в Ki-ras-генах человека и вирусов. Указанная область
может поэтому определять физиологическую роль индивидуаль-
ных продуктов генов ras.
245
Известно по крайней мере 5 членов семейства ras, экспрессия
которых, по-видимому, важна в контроле роста, развития и
связанной с этими феноменами патологии. Е. Reddy (1983) опреде-
лил полную нуклеотидную последовательность Т24-онкогена кле-
точной линии карциномы мочевого пузыря человека, идентифици-
ровал кодирующие и некодирующие последовательности генома.
Рассчитана последовательность аминокислот белка р21, продукта
трансляции онкогена Т24. Сравнение показало, что приобретение
трансформирующих свойств онкогеном Т24 обязано единственной
точковой мутации в нормальном клеточном гомологе (амино-
кислота в позиции 12). Отмечены и другие различия между
онкогеном Т24 и его нормальным клеточным партнером, а именно
в областях 5'- и З'-некодирующих последовательностей. Однако
эти различия, по-видимому, объясняются полиморфизмом и не
играют значительной роли в процессе трансформации.
Оценивая существующую информацию об активации клеточ-
ных протоонкогенов в онкогены, в частности феномен Т24, Е. Reddy
отмечает, что гетеродуплексный анализ онкогена Т24 и его нор-
мальной аллели в сравнении с онкогенами v-bas и v-has показал,
что предполагаемые кодирующие последовательности этих челове-
ческих генов рассеяны среди четырех экзонов [Goldfarb М. et al.,
1982J. Сравнение нуклеотидной последовательности полной коди-
рующей области онкогена Т24 с таковой нормального гомолога
показало, что на протяжении 1683 оснований, которые составляют
4 экзона и 3 интрона, имеются только 2 изменения оснований —
в позициях 1704 и 2720, лишь одно из которых находится в коди-
рующей области. Эксперименты, в которых использовались реком-
бинанты между онкогеном Т24 и его нормальным гомологом,
показали, что трансформирующее свойство онкогена Т24 и мута-
ция в 12 кодоне взаимосвязаны.
Интересна следующая информация, приводимая Е. Reddy,
о частоте генетических событий в клеточных генах позвоночных.
Сравнение последовательности аминокислот белка р21, кодируе-
мого онкогеном Т24, с их вирусными партнерами показало полную
идентичность, за исключением позиций аминокислоты 12 и 143, по
сравнению с v-bas и позиций аминокислот 12, 59 и 122 — по
сравнению с v-has.
Из этого сравнения следует 2 важных момента: 1) семейство
генов bas/has является высококонсервативным в эволюции
с примерно 1 % отклонений в последовательности аминокислот
белка от мыши до человека. По контрасту, в 0-глобине имеется
18 % отклонений между мышиными и человеческими последова-
тельностями аминокислот. Единственная позиция, где все 3 белка
р21 отличаются в последовательностях, — это 12-я. Нормальный
гомолог крысиного c-has/bas, ген, который, по-видимому, реком-
бинирован с мышиным лейкемическим вирусом Молони, генерируя
Ha-MSV, также имеет глицин в позиции 12, как и его человече-
ский гомолог.
246
Возможно поэтому, что аминокислота в позиции 12 является
«горячей точкой» для точковых мутаций. Однако в протоонкогене
c-has/bas существуют множественные сайты, мутации в которых
могут вести к активации этого гена. Так, как указывалось выше,
У. Yuasa и соавт. (1983) клонировали онкоген семейства c-has/bas
с точковой мутацией вне 1-го экзона.
Приведенные примеры убедительно демонстрируют роль точко-
вых мутаций в активации клеточных онкогенов. Наряду с другими
формами генетических дефектов и перестроек — трансдукциями,
транслокациями, инсерциями, транспозициями, амплификациями,
они являются, по-видимому, важным фактором канцерогенеза.
Естествен вопрос о реальной вероятности в природе точковых
мутаций в уникальных генах, каковыми являются протоонкогены.
Исследование дивергенции онкогенов позволило определить
скорость изменений синонимных кодонов. Была рассчитана ча-
стота порядка (6—7) • 10-9 синонимных замещений на нуклеотид-
ный сайт в год в генах типа препроинсулина и глобина [Myata Т.,
Yasunada Т., 1981; Perucho М., 1981]. В течение 1-го года жизни
человека, со средней популяцией 1012 клеток, подвергающихся
риску, возможны замещения, воздействующие на кодоны в любых
сайтах онкогенов Hs242 (карцинома легкого человека) или Т24
(рак мочевого пузыря человека), в тысячах клеток. Хотя не все
такие замещения оснований могут вести к замене аминокислот,
способной активировать какой-то определенный ген, тем не менее
вероятность подобных событий признается значительной. Соот-
ветственно следует считать достаточно высокой и частоту естест-
венных дефектов критических сайтов внутри клеточных генов и,
как результат, спонтанных раков [Yuasa Y. et al., 1983].
Интересны в этом отношении также рассуждения R. Weinberg
(1982) о связи генетических событий с канцерогенезом.
Он указывает, что непрямые эксперименты свидетельствовали
о центральной роли повреждений ДНК в трансформации, главным
образом, потому, что агенты, повреждающие ДНК, имеют тенден-
цию быть канцерогенными [McCann J., Ames В., 1976]. Однако
было неясно, какие последовательности ДНК должны быть
повреждены, чтобы вызвать трансформацию. В этой связи в основе
дискуссии оказалась модель, провозгласившая клеточный онкоген
в качестве главного звена в процессе онкогенной трансформации
[Todaro G., Huebner R., 1972; Comings D., 1973]. Согласно указан-
ной модели, онкоген возникает из нормальной последовательности
клеточной ДНК, неадекватная активация которой в ходе онко-
генеза придает ей новое качество — трансформирующую спо-
собность. Нарушение регуляции клеточных онкогенов может быть
достигнуто путем перестройки или изменения блоков нормальных
клеточных последовательностей после воздействия канцерогенов
на ДНК.
Авторы показали, что внесение ДНК из мышиных фибробла-
стов, трансформированных 3-метилхолантреном, в нетранс-
247
формированные реципиентные клетки приводило к трансформации
последних [Shih С. et al., 1979]. Наоборот, ДНК из нетрансфор-
мированных фибробластов этого эффекта не производила.
Следовательно, ДНК в первом случае была структурно изменена
под влиянием химического канцерогена, причем в тех областях
клеточного генома, которые могут вызывать трансформирующий
фенотип.
Биологически активные последовательности в трансформи-
рующей ДНК вели себя как дискретные сегменты нуклеотидов.
Эти сегменты могли быть в конечном счете определены обычными
генетическими критериями как гены. Они оказались способны
переноситься из клетки в клетку и, таким образом, соответствовали
генам.
Существенно, что в опытах R. Weinberg и соавт. (1982) проис-
ходила повторная (в четырех независимых экспериментах) акти-
вация одного и того же онкогена в одном и том же сайте ДНК.
Это поднимает принципиальный вопрос. Канцероген может
взаимодействовать со множеством сайтов в клеточном геноме.
Работа с опухолеродными генами человека показала, что
несколько (и, возможно, довольно много) латентных клеточных
онкогенов существуют в геноме, «ожидая» соответствующей
активации. Почему же «немишеневый» агент (канцероген) при
взаимодействии с мультимишеневым геномом повторно активирует
одну и ту же трансформирующую последовательность? По-види-
мому, процесс онкогенной трансформации не следует классическим
моделям мутагенеза. Скорее, ткане- и клеткаспецифические фак-
торы предрасполагают определенные гены к активации, тогда
как другие гены защищены от активации. Одним из таких пред-
располагающих факторов могло бы быть состояние экспрессии
гена в нормальном геноме до канцерогенного «удара».
Известны и другие факты, которые делают невероятным объяс-
нение активации этих генов классическими моделями мутагенеза
[Reznikoff С. et al., 1973; Kennedy A. et al., 1980]. Недавний
пример: трансформация СЗН ЮТ г/2 фибробластов с помощью
рентгеновских лучей.
Работа с канцерогенезом, индуцируемым радиацией, показала,
что не существует пропорциональности между числом клеток,
экспозированных изначально к канцерогену, и числом фокусов
трансформантов, которые появляются в дочерних культурах. Эта
и ранние работы других авторов представляют неортодоксальные
гипотезы механизмов канцерогенеза, несовместимые с теорией
простой мишени генной активации. Одна из таких гипотез про-
возглашает, что не обязательно для канцерогена прямо изменять
мишеневый онкоген в подвергающейся воздействию клетке для
того, чтобы онкоген был активирован в поколениях этой клетки.
Канцероген может индуцировать в клетке некое метаболическое
состояние, чье наличие необходимо для второго события — после-
дующей активации онкогена.
248
Не исключено, что новая нуклеотидная последовательность
возникает много позже после проявления мутагенной активности
канцерогена. Если бы действительно было так, то механизмы,
которые действуют между начальным канцерогенным стимулом
и конечным созданием новых нуклеотидных последовательностей
в клеточных генах, могут остаться невыясненными и после изу-
чения изопированных активированных онкогенов. Можно лишь
надеяться на ошибочность данной гипотезы. Во всяком случае,
большинство имеющихся данных говорит в пользу того, что мута-
генное действие канцерогенов вызывает качественное изменение
структуры клеточных протоонкогенов, которые «соло» (если
для трансформации достаточен один онкоген) или «каскадом»
(если для трансформации необходим ряд онкогенов) вызывают
трансформацию и туморогенез. Таким образом, мутация остается,
независимо от ее конкретных вариантов, главным механизмом
превращения протоонкогенов в онкогены.
ОНКОГЕНЫ, ОНКОБЕЛКИ
И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ФАКТОРЫ РОСТА
Если сам факт участия онкогенов в туморогенезе уже не вызы-
вает сомнений, то механизм их действия все еще остается загадкой.
Твердо установлено, что онкогены кодируют особые белки,
онкобелки, большинство из которых обладает тирозинспецифи-
ческой протеинкиназной активностью. Каков биологический смысл
этого процесса и каково его отношение к онкогенезу? Уникален ли
он для онкобелков?
Несколько лет назад появились первые данные о том, что
неизвестная ранее модификация белков играет определенную роль
в контроле клеточного роста [Kolata G., 1983]. Было обнаружено
важное явление: трансформирующий белок ВСР катализирует
присоединение фосфата к тирозину определенных белков. При этом
выяснилось, что если расположенный на поверхности клеток
рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР) связывает этот
фактор, то рецептор начинает фосфорилировать тирозиновые
остатки белков. Затем онковирусологи установили, что 5 различ-
ных классов РНК-овых опухолеродных вирусов производят транс-
формирующие белки, которые фосфорилируют тирозины. Эти
трансформирующие белки были важны для превращения нор-
мальных клеток в раковые.
В дальнейшем тезис о связи фосфорилирования с контролем
роста еще более укрепился. R. Kahn (США) сообщил, что в случае,
если инсулин связывается со своим рецептором, последний
начинает фосфорилировать тирозины. Как известно, одной из клю-
чевых функций инсулина является стимуляция клеточного роста.
С. Heldin (Швеция) нашла, что ростовой фактор тромбоцитов —
РФТ (PDGF) — связывается со своим рецептором и последний
начинает фосфорилировать тирозин.
249
В результате этих находок был поставлен вопрос о сходстве
и различиях действия вирусных онкобелков, которые индуцируют
бесконтрольный рост, с одной стороны, и ростовых факторов,
вызывающих контролируемый рост, — с другой. В частности,
неясно, фосфорилируют ли они одни и те же или разные белки,
какие клеточные белки фосфорилируются и какое отношение
к контролю роста имеет фосфорилирование тирозина в белках.
Известно, что нормальные клетки содержат ферменты
(киназы), которые фосфорилируют аминокислотные остатки бел-
ков, однако в этом случае присоединение фосфатных групп проис-
ходит, главным образом, по серину или треонину, но не по тиро-
зину. В некоторых случаях это фосфорилирование по серину или
треонину включает или выключает ферменты. Т. Hunter и В. Sefton
(США) показали, что фосфорилирование по тирозину имеет место
и в нормальных клетках, однако в очень малой степени: 1 фосфо-
рилирование тирозина приходится в норме, примерно, на 3000 ак-
тов фосфорилирования серина или треонина. В клетках, транс-
формированных ВСР, фосфорилирование тирозина в белках
возрастает в 5—10 раз. Этот факт косвенно указывал на участие
тирозинкиназы и самого процесса фосфорилирования тирозина
в трансформации.
Последовали новые исследования. Было показано, что гены,
кодирующие упомянутые выше тирозинкиназы в пяти опухоле-
родных ретровирусах, гомологичны между собой более чем
на 50 %. Кроме того, оказалось, что эти вирусные киназы обнару-
живают большое структурное сходство с белком рецепторов ЭФР.
Менее известно о структуре рецепторов инсулина и РФТ.
Интересна и весьма характерна кинетика реакции фосфорили-
рования в случаях ЭФР и РФТ. Т. Hunter и J. Cooper (1980)
показали, что в течение 1 мин после добавления ЭФР к клеткам,
содержащим рецепторы к нему, имеет место увеличение фосфори-
лирования тирозина в клеточных белках. Оно включает фосфори-
лирование и самого рецептора ЭФР, и в одной человеческой
опухолевой клеточной линии — фосфорилирование некоего белка
с молекулярной массой 36 кд, который фосфорилируется также
трансформирующим белком ВСР. Природа этого клеточного белка
мало изучена, но известно, что он локализуется на внутренней
поверхности клеточной мембраны. РФТ также вызывает фосфори-
лирование тирозина в клеточных белках в течение 1—5 мин.
Однако фосфорилированные тирозины оборачиваются очень
быстро: полупериод жизни их в трансформированных клетках
меньше 30 мин.
Факт большой скорости фосфорилирования и дефосфори-
лирования дал основания для спекуляций. В частности, этому
явлению приписывали роль чувствительного сигнала, позволяю-
щего осуществлять тонкую настройку биологических процессов.
Важным различием между ростовыми гормонами и трансформи-
рующими вирусами (их онкобелками) является то, что в случае
250
ростовых гормонов сигнал, заключающийся в фосфорилировании
тирозина, преходящ, транзитен: он существует лишь до тех пор,
пока в окружении присутствуют гормоны и их рецепторы. При
действии трансформирующих вирусов сигнал присутствует все
время, и клетки теряют контроль над пролиферацией.
Изучение фосфорилирования тирозина, индуцированного инсу-
лином, находится на начальной стадии и оставляет пока много
вопросов без ответа. В частности, долго было неясно, не явля-
ется ли сам инсулиновый рецептор киназой или киназа тесно
ассоциирована с ним.
Этот вопрос имеет принципиальное значение в свете известной
связи инсулина с ростовой функцией. Как известно, инсулин связы-
вается со специфическими мембранными рецепторами на поверх-
ности клеток-мишеней и затем регулирует различные метаболи-
ческие процессы. Однако не ясно, как взаимодействие инсулина
с его рецептором результируется в изменения клеточных функций.
Одной из возможностей является действие инсулина путем
стимуляции протеинкиназы или торможения протеинфосфатазы.
Известно, что рецептор инсулина в интактных клетках сам фосфо-
рилирован и степень этого фосфорилирования регулируется
инсулином [Kasuga М.,Karlsson F. et aL, 1982; Kasuga M., Zick Y.
et al., 1982]. Фосфорилирование рецептора инсулина наблюдали
в солюбилизированных плазматических мембранах печени крысы,
причем фосфорилирование происходило по тирозиновым остаткам
[Kasuga М., Zick Y. et aL, 1982]. Уже этот результат указывал
на возможность того, что рецептор инсулина сам является проте-
инкиназой. Исследование R. Roth и D. Cassell (1983) проде-
монстрировало способность высокоочищенных препаратов рецеп-
тора инсулина катализировать фосфорилирование субъединицы
(95 кд) инсулинового рецептора. Это говорит о том, что сам
рецептор инсулина является протеинкиназой.
Добавление инсулина к целым клеткам или солюбилизирован-
ным мембранам, как указывалось выше, увеличивает степень
фосфориливания В-субъединицы рецептора [Kasuga М., Zick Y.
et aL, 1982]. Простейшим объяснением такого результата могло
быть предположение о том, что инсулин стимулирует протеинки-
назную активность рецептора, который, в свою очередь, фосфори-
лирует себя, равно как и другие белки. Эти фосфорилирования
могли бы затем инициировать «каскад» реакций, результирую-
щихся в разнообразные эффекты инсулина. Однако увеличенная
киназная активность инсулинового рецептора может быть недоста-
точной, чтобы индуцировать все известные эффекты инсулина
на клетки. По аналогии, рецептор ЭФР также является протеинки-
назой [Cohen S. et al., 1980, 1982; Buhrow S. et aL, 1982]. Наиболее
интересной была находка, что, хотя расщепленный циан-бромидом
ЭФР был способен индуцировать фосфорилирование своего
рецептора и некоторые краткосрочные эффекты интактного ЭФР,
он не стимулировал клеточное деление. Поэтому еще следует
251
определить, является ли протеинкиназная активность инсулино-
вого рецептора как необходимой, так и достаточной для реали-
зации всех многочисленных эффектов инсулина.
При связывании инсулина с рецептором индуцируется фосфо-
рилирование тирозина. Однако большая часть фосфорилирований
и дефосфорилирований при этом приходится на серины. Какова
роль этого процесса? Какова связь, если она вообще существует,
между действием инсулина и действиями опухолеродных вирусов,
ЭФР и РФТ? Нельзя исключить возможность существования еще
одного фермента — серинкиназы, активируемого при связывании
инсулина с его рецептором. Можно предположить, что тирозин-
киназа включает или выключает другие ферменты, которые фосфо-
рилируют или дефосфорилируют серин. Поскольку в большинстве
раковых клеток резко изменена гликолитическая активность,
представляло бы большой интерес проанализировать связь процес-
сов фосфорилирования и дефосфорилирования киназами под влия-
нием инсулина и его рецепторов с изменением активности клю-
чевых ферментов этого метаболического процесса. Так или иначе,
на сегодня инсулиновый рецептор сходен, по крайней мере in vitro,
с вирусной тирозинкиназой и рецепторами киназных активностей
ЭФР и РФТ.
Следует отметить, что большинство исследователей допускают
существование связей между вирусными тирозинкиназами и рецеп-
торами ростовых гормонов.
Ростовой фактор тромбоцитов (РФТ, PDGF) 1983 год был
отмечен в истории теоретической онкологии, помимо серии вели-
колепных работ с онкогенами человека, еще одним знаменатель-
ным событием — установлением близкого родства, гомологии,
между одним из онкогенов и геном ростового фактора тромбо-
цитов, РФТ, т. е. нормальным клеточным геном, осуществляющим
жизненно важную биологическую функцию в организме человека
и животных.
В концепции онкогенов, при всех ее достоинствах и преиму-
ществах перед другими гипотезами канцерогенеза, существует,
по крайней мере, одно уязвимое звено. Она до сих пор не может
объяснить биологическую роль в организме клеточных генов —
предшественников трансформирующих онкогенов, присутствую-
щих в малоизмененном виде на всех ступенях эволюционного
развития животного мира. Ученые пытались понять, каким обра-
зом необходимые, по всей видимости, в жизнедеятельности
нормальных клеток гены при их минимальном изменении (а иногда,
возможно, и без него, лишь в результате количественного увели-
чения) становятся гибельными для клетки и организма, что это
за клеточные гены, без которых клетка, с одной стороны, не может
существовать, а с другой — не способна противостоять их гибель-
ному воздействию.
Давно высказывалась мысль о том, что клеточные гены, прото-
онкогены, представляют собой гены роста и дифференциации.
252
При небольшом повреждении нормальная функция их (стимуля-
ция роста) в принципе сохраняется, однако перестает подчиняться
контрольным механизмам клетки. Нормальный управляемый
процесс роста и созревания утрачивается и заменяется бесконеч-
ным потоком клеточных делений, при котором клетки не успевают
дифференцироваться, т. е. созреть до состояния, когда они стано-
вятся способными осуществлять присущие им специализированные
физиологические функции.
Эта привлекательная идея получила поддержку многих иссле-
дователей, однако до последнего времени не обогатилась доста-
точно солидными фактическими данными в свою пользу.
Именно в этот момент произошло открытие, которое заслужи-
вает более подробного описания не только ввиду его значимости
для понимания молекулярного механизма онкогенеза, но и
по причине необычности самого его совершения.
Открытие состояло в обнаружении близкого родства онкогена
саркомы шерстистой обезьяны (v-sis) с геном РФТ человека
и, соответственно, бепковых продуктов этих двух, казалось бы,
столь функционально различных генетических элементов. Обна-
ружение негативной, неопластической функции у хорошо изучен-
ного физиологически важного РФТ превращает его в глазах
исследователей в опасного «двуникого януса», способного вызы-
вать не только полезную для организма регенерацию поврежден-
ных тканей, но и индуцировать неограниченную пролиферацию,
ведущую к образованию опухолей. Этот пример демонстрирует,
с одной стороны, ограниченность наших иногда однозначных
оценок биологической роли отдельных компонентов внутренней
среды организма, а с другой — представляет собой поразительный
образец непредсказуемой игры природы. Одно вещество, РФТ,
может выступать в двух совершенно различных ипостасях и осу-
ществлять диаметрально противоположные по своей биологиче-
ской сущности процессы — созидания и гибели. Самое удиви-
тельное в этом примере заключается в том, что и тот, и другой
процессы основаны, в принципе, на одной функции — стимуляции
роста. Этот факт весьма поучителен в том отношении, что
демонстрирует роль факторов более высокого, чем молекулярный,
уровня регуляции, находящихся за пределами молекулярных
взаимодействий членов одной и той же цепи реакций. Коренная
разница реализации «двух лиц» РФТ заключается в том, что одна
и та же функция в одних условиях среды подконтрольна и регу-
лируема, «оперирует» прерывисто, тогда как другая — «работает»
непрерывно, вызывая неудержимую пролиферацию. В то же время
элементарный молекулярный механизм обоих процессов одинаков.
Открытие онкогенных потенций у РФТ является первым и
долгожданным подтверждением упомянутой выше идеи о том, что
именно те клеточные гены, которые участвуют в нормальной
функции роста и пролиферации, служат предшественниками
трансформирующих генов, онкогенов.
253
Теперь следует сказать несколько слов о том, как было открыто
родство одного из онкогенов с геном, кодирующим синтез РФТ,
нормального белка здорового организма.
Произошло следующее [Doolittle R. et al., 1983; Marx J., 1983;
Waterfield M. et al., 1983].
Несколько групп исследователей работали независимо друг
от друга в двух далеко не смежных областях молекулярной биоло-
гии. Одни, прежде всего сотрудники лаборатории S. Aaronson
(Национальный раковый институт, США), изучали онкогены и
онкобелки, в данном случае ген саркомы обезьян, v-sis, и коди-
руемый им онкобелок; другие — в нескольких лабораториях
разных странах — исследовали структуру РФТ, специфического
белка, стимулирующего заживление ран путем регенерации ткани
после повреждения. Те и другие группы авторов опубликовали
результаты своих работ, каждые в отдельности, в 1983 г. и ранее:
S. Aaronson и соавт. (1983) — о последовательности нуклеотидов
в вышеупомянутом онкогене обезьян, v-sis; Н. Antoniades (Гар-
вардский университет), М. Hunkapiller (Калифорнийский техно-
логический институт), М. Waterfield (Лаборатория Королевского
ракового института, Лондон), Т. Deuel (Вашингтонский универ-
ситет), A. Wasteson (Университет Упсала, Швеция) —описали
структуру, функцию и последовательность аминокислот РФТ.
Указанные данные всех этих авторов могли остаться отдель-
ными, не связанными друг с другом публикациями, если бы
не неожиданное вмешательство еще одного лица, лично не зани-
мавшегося экспериментальной работой. R. Doolittle (Калифор-
нийский университет в Сан-Диего) давно интересовался
проблемой эволюции белковых молекул и систематически закла-
дывал в компьютер всю информацию, которая появлялась в мире
по вопросу строения и аминокислотного состава самых различных
белков. После появления в мае 1983 г. в журнале «Science> статьи
Н. Antoniades и М. Hunkapiller о последовательности амино-
кислот РФТ, а также данных лаборатории S. Aaronson о структуре
онкобелка онкогена sis R. Doolittle ввел в компьютер и эту
информацию. Машина выдала исследователю ошеломивший его
результат: саркомный белок обезьян и нормальный РФТ представ-
ляют собой практически идентичные белки, тождество составляло
более 87%. Небольшую разницу (13%) специалисты считают
незначительной и относят за счет различного эволюционного
положения обезьяны и человека.
Получив эти данные, R. Doolittle немедленно связался с упомя-
нутыми коллегами, результатом чего явилась совместная публика-
ция всех упомянутых участников работы.
Другая группа авторов [Waterfield М. et aL, 1983] приводит
несколько иное, чем в статье R. Doolittle и соавт., описание
открытия родства онкогена обезьян и гена РФТ. Однако в прин-
ципе излагаются те же основные факты, это открытие коммен-
тируют также R. Weiss (1983) и С. Stiles (1983).
254
Описанные исследования привели к заключению, что гены,
кодирующие онкобелок саркомы обезьян (онкоген v-sis), с одной
стороны, и нормальный фактор роста кровяных пластинок чело-
века — с другой, гомологичны (родственны). Более того, из этих
данных следовало, что саркомный ген обезьян и ген, кодирующий
ростовой фактор тромбоцитов, произошли от одного и того же или
очень близкородственных клеточных генов.
Благодаря этой работе найдены, наконец, первый нормальный
ген и его продукт, выполняющие жизненно важную физиологи-
ческую функцию и в то же время имеющие прямое структурное
и функциональное родство с одним из известных онкогенов и его
онкобелком, причинно связанными с неопластическим ростом.
Можно думать, что это всего лишь первый из найденных, но далеко
не последний из существующих в природе примеров полипотентных
функций близкородственных или даже идентичных веществ,
используемых природой в прямо противоположных целях: с одной
стороны, обеспечение жизни посредством стимуляции регене-
рации — РФТ (PDGF) и кодирующий его ген, с другой — уничто-
жение жизни путем малигнизации — онкобелок и его ген.
Принципиальное значение описанной выше работы заключа-
ется в демонстрации факта, что по крайней мере один из онко-
генов обусловливает первичную злокачественную трансформацию
путем неадекватной продукции вещества, которое в норме
стимулирует клеточный рост. Если этот первый, нормальный
в обычных условиях, ген стимулирует активную пролиферацию,
т. е. создает необходимый биологический фон для развития неопла-
зии, то один или несколько других онкогенов должны завершать
создание полного ракового фенотипа. Эта модель находится
в полном соответствии с современным пониманием участия
«каскада» онкогенов в канцерогенезе как процессе многоступен-
чатом. Полагают, что каждый отдельный ген «каскада» участвует
в реализации лишь одной из ступеней канцерогенеза.
Интересно, что, по данным S. Aaronson, типы раков, индуци-
руемые у животных саркомным вирусом обезьян (онкоген sis),
очень хорошо соответствуют типам тканей, в которых РФТ стиму-
лирует рост. В общем, это клетки соединительной ткани и в неко-
торых случаях мышечные клетки.
Только что описанная модель канцерогенеза как процесса
многоступенчатого выражает третий (после двух упомянутых
выше) кардинальный принцип современной концепции онкогенов
и является возрожденной на новой молекулярно-генетической
основе идеей о многоступенчатом характере процесса онкогенеза
в том смысле, что в становлении неопластического фенотипа
участвует не один единственный онкоген, осуществляющий всю
цепь молекулярных событий, а «каскад» их, по-видимому, как
минимум два, а возможно и больше. Первоначальное впечатление
об универсальной роли гена «солиста», единственного онкогена,
осуществляющего весь сложный процесс трансформации и тумо-
255
рогенеза так сказать единолично, сложилось в значительной мере
в результате использования в трансфекционном тесте модели
мышиных фибробластов NIH ЗТЗ. Эта линия культивируемых
клеток, как сейчас установлено, не представляет собой полностью
интактные клетки. Она в значительной мере отошла от нормы
в сторону трансформированного фенотипа, и достаточно лишь
небольших дополнительных импульсов, чтобы индуцировать пол-
ностью трансформированный фенотип. Оказалось, что те отдель-
ные онкогены, которые в данной тест-системе легко вызывали
трансформацию, на других клетках, более нативных, не являю-
щихся частично трансформированными (как клетки ЗТЗ),
трансформацию не индуцировали. Добавление второго, а иногда и
третьего онкогена приводило к трансформации. Стало ясно, что
клетки ЗТЗ в силу условий длительного культивирования уже
прошли полпути, если не больше, в формировании трансформи-
рованного фенотипа и не нуждаются в силу этого в ряде онкогенов,
требовавшихся для реализации событий указанной первой поло-
вины пути.
Здесь нет возможности подробнее останавливаться на данном
вопросе. Он требует самостоятельного рассмотрения.
Упомянутое выше исследование, установившее близкое родство
РФТ с онкобелком саркомного вируса обезьян, позволяет думать
о том, что раковый ген может действовать перманентно, включая
тот же ростстимулирующий процесс, который нормально активи-
руется лишь эпизодически во время заживления ран или на ранних
этапах эмбриогенеза и развития. Когда вирус саркомы обезьян
проникает в клетку, он привносит информацию на продукцию РФТ,
клетка синтезирует его и оказывается в состоянии непрерывного
деления.
В связи с особо важным значением открытия новой, неопла-
стической, функции нормального физиологического конституента
живых клеток—РФТ — рассмотрим данные, которые известны
об этом агенте.
Биология РФТ. В нормальных условиях РФТ вырабаты-
вается и сохраняется в тромбоцитах. Сильный стимулятор роста
клеток, он содержится в организме в ограниченном количестве.
Каждая кровяная пластинка человека располагает примерно
1000 молекулами РФТ, находящимися в изолированных специа-
лизированных а-гранулах. Содержимое этих гранул освобожда-
ется в процессе свертывания крови. Человеческая сыворотка
свернувшейся крови несет 15—20 нг/мл РФТ, тогда как обеднен-
ная пластинками плазма, продукт несвернувшейся крови, имеет
концентрацию РФТ, равную 1—2 нг/мл. Фибробластоподобные
клеточные линии, клетки гладких мышц и глиальные клетки тре-
буют для своего оптимального роста in vitro 1—2 нг/мл РФТ.
Эта потребность культивируемых клеток обеспечивается обычно
дополнением культуральной среды сывороткой до уровня
10—20%. Потребность в дополнении стимулирующими рост
256
веществами характерна для соединительнотканных клеток. Эпите-
лиальные клетки, лимфоциты и эндотелиальные клетки могут
одинаково хорошо использовать в качестве дополнительного
фактора среды как плазму, так и сыворотку, тогда как клетки
соединительной ткани — предпочтительно сыворотку.
Филогенетический анализ указывает, что РФТ появился вне-
запно (скачком) или изменился скачкообразно с первыми хордо-
выми и с этого момента функционально законсервировался.
Сыворотка свернувшейся крови от обезьян и ниже по эволюцион-
ной лестнице содержит соединительнотканный митоген, который
эффективно конкурирует с человеческим РФТ за рецепторы.
Сыворотка от туникат и ниже по линии развития позвоночных,
так же как и сыворотка от всех представителей линии развития
членистоногих, не содержит измеримой РФТ-подобной активности.
Обнаружение последней в свернувшейся крови у животных совпа-
дает с появлением регулируемой по уровню давления сосудистой
системой позвоночных. Этот факт рассматривается специалистами
как указание на то, что функцией РФТ in vivo является репарация
сосудистой выстилки.
Биохимия РФТ. Человеческий РФТ был очищен до гомо-
генного состояния и охарактеризован. Он представляет собой
белок основного характера, термостабильный (100 °C), водо-
растворимый. При электрофорезе выявляют несколько фракций,
из которых две главные: РФТ-I (молекулярная масса 31—35 кд)
и РФТ-II (молекулярная масса 28—32 кд). Обе эти главные фрак-
ции представляют собой гликопротеиды, отличающиеся своим
углеводным компонентом. Редуцирующие агенты инактивируют
РФТ-I и РФТ-П и диссоциируют их на субъединицы меньшей
молекулярной массы.
Ген РФТ. Две независимые друг от друга группы исследова-
телей в середине 1983 г. сообщили о том, что вирус саркомы
обезьян, по-видимому, приобрел свой трансформирующий ген
(v-sis) за счет гена или генов, кодирующих РФТ. Белковые про-
дукты этих генов гомологичны. Таким образом, клеточный гомолог
v-sis (т. е. c-sis) может рассматриваться как структурный ген
для РФТ. Человеческий ген c-sis является однокопийным геном,
который был изолирован молекулярным клонированием и отнесен
по его локализации к хромосоме 22. Ген c-sis состоит из 12 000 нук-
леотидных оснований с пятью участками, гомологичными v-sis,
прерываемыми четырьмя интронами (некодирующими участками
генома).
Рецепторы РФТ. Рецепторы РФТ обнаружены в диплоид-
ных человеческих фибробластах, клетках ЗТЗ, клетках артериаль-
ных гладких мышц и других клетках соединительной ткани
у обезьян, мышей, крыс и кур. Эпителиальные клетки, эндотелиаль-
ные клетки и лимфоциты периферической крови не связывали
1251-РФТ. Спектр химического связывания РФТ хорошо совпадает
с митогенетическим спектром его действия. Содержание ренеп-
17 Зака, 380
257
торов в чувствительных клетках колеблется от 40 000 до 400 000
на клетку.
Химически неродственные ростовые факторы (ЭФР, инсулин,
MSA) и другие специфические для кровяных пластинок белки
ни тормозят, ни способствуют образованию комплексов РФТ-ре-
цептор. Курьезно, но обратное неверно. РФТ тормозит связывание
1251-ЭФР и инсулина рецепторами на поверхности фибробластов,
однако способствует усиленному присоединению человеческого
соматомедина. Рецептором РФТ является мембранный белок
с молекулярной массой 164 — 185 кд. Растительные лектины пре-
пятствуют связыванию РФТ, что говорит о содержании в рецеп-
торах РФТ N-ацетилглюкозамина и галактозы. Вслед за образова-
нием комплекса РФТ-рецептор активируется мембранная тирозин-
специфическая протеинкиназа. Это важный факт для понимания
родства вирусного саркомного гена обезьян и гена РФТ, учитывая,
что продуктом трансляции большинства онкогенов являются
онкобелки, обладающие протеинкиназной активностью, причем
именно тирозинспецифической. Более того, по-видимому, сам
рецептор РФТ является субстратом для этой киназы и способен
к аутофосфорилированию, как и в случае с рецептором ЭФР.
Установлено, что период полураспада (Т ’/2) РФТ в клетке
составляет менее 1 ч, в то время как индуцируемое РФТ компетент-
ное состояние исчезает со скоростью (Т 1 /2) 10—20 ч. Следова-
тельно, длительность индуцируемого РФТ компетентного состоя-
ния клетки не отражает длительность взаимодействия РФТ
с клеткой. Установлено, что между 30 мин и 3 ч после добавления
РФТ к культуральной среде чувствительные клетки накапливают
сравнительно стабильный внутриклеточный сигнал, который
опосредует ответ на РФТ.
Исследование с метаболическими ингибиторами показало, что
для генерации этого внутриклеточного сигнала требуется de novo
синтез РНК.
Роль РФТ в канцерогенезе. Предполагается, что РФТ
синтезируется в мегакариоцитах костного мозга, которые являются
родительскими клетками тромбоцитов. Генетические исследования
РФТ позволили заключить, что некоторые соединительнотканные
неоплазмы возникают в результате синтеза и секреции РФТ клет-
ками, которые в норме чувствительны к этому фактору роста.
Такая «паракринная» продукция могла бы генерировать само-
поддерживающуюся, аутомитогенную клеточную массу, согласно
схеме J. De Larco и G. Todaro (1978). Было продемонстрировано,
что 6 человеческих саркомных клеточных линий и 3 из 5 челове-
ческих глиобластомных клеточных линий транскрибируют клеточ-
ный ген c-sis, тогда как этот ген «молчал» в нормальных
фибробластах. Было показано, что человеческая остеосаркомная
клеточная линия секретирует белок, который стимулирует рост
нормальных фибробластов и глиальных клеток. Продуцируемый
остеосаркомными клетками митоген «конкурировал» с 12Ч-РФТ
258
человека за рецепторы и реагировал с антителами против аутен-
тичного РФТ.
Однако соединительнотканная неоплазия отражает нечто
большее, чем аутомитогенный ответ на РФТ. Утрата потребности
роста в РФТ является необходимой, но недостаточной ступенью
в злокачественной трансформации фибробластов. РФТ не стиму-
лирует рост, например, в метилцеллюлозной или мягкоагаровой
суспензии, что присуще трансформации соединительной ткани.
К тому же не все саркомы экспрессируют гены c-sis или v-sis.
Известно также, что онкогены, не идентичные РФТ, также инду-
цируют саркомы. Тем не менее начиная с этого времени роль РФТ
следует оценивать при любом пролиферативном расстройстве,
связанном с экспрессией гена c-sis. Последний локализуется в той
области хромосомы 22, которая реципрокно транслоцируется
с с-abl (хромосома 9) на филадельфийской хромосоме. Человече-
ская Т-клеточная линия (HUT102), которая продуцирует ретро-
вирус человеческой Т-клеточной лейкемии, HTLV, экспрессирует
c-sis. С этой точки зрения было бы интересно выяснить, участ-
вует ли РФТ в патологии хронической миелоидной лейкемии и
грибовидного микоза, которые связаны с филадельфийской
хромосомой и HTLV соответственно.
Итоги и перспективы открытия связи РФТ
с онкобелком саркомного вируса. РФТ является
соединительнотканным митогеном, который был связан с сыво-
роткой свернувшейся крови в процессе эволюции животного мира
по крайней мере уже 300 000 000 лет. Он регулирует экспрессию
«ранних генов» клеточного цикла в нормальных фибробластах.
Индукция указанных «ранних генов» предшествует стимуляции
тирозинспецифической киназы. Предполагаемый структурный
ген для РФТ был приобретен (захвачен) каким-то остротранс-
формирующим ретровирусом и регулярно экспрессируется во мно-
гих соединительнотканных опухолях.
Дальнейшая работа должна показать: 1) придает ли образо-
вание РФТ опухолевыми клетками пролиферативные преимуще-
ства этим клеткам; 2) опосредуют ли тирозинспецифические
фосфорилирования индукцию «ранних генов» клеточного цикла
ростовым фактором тромбоцитов; 3) играют ли продукты ранних
генов клеточного цикла какую-либо функциональную роль
в 10—12-часовой цепи событий, которые кульминируются в репли-
кативном синтезе ДНК и клеточном делении.
Пример с РФТ можно рассматривать в качестве образца
функционирования других вирусных и невирусных онкогенов,
а также их клеточных гомологов. Некоторые из этих генов могли бы
действовать в начале митогенного «каскада» путем индукции
образования факторов аутомитогенного роста; другие — функцио-
нировать внутри «каскада», стимулируя процессы тирозинспеци-
фического фосфорилирования; третьи — быть мутировавшими или
перестроенными гомологами «ранних генов» клеточного цикла.
17*
259
чья экспрессия в нормальных условиях модулируется экстрацел-
люлярными факторами роста.
Открытие родства и связи онкобелков с РФТ, равно как и
кодирующих их генов, рождает много, с одной стороны, интересных
конструктивных мыслей, а с другой — малообоснованных, хотя и
смелых спекуляций.
Можно надеяться, что дальнейшие исследования в этой области
будут способствовать более глубокому и полному пониманию
всей цепи реакций и процессов молекулярного механизма онко-
генеза.
Трансформирующие факторы роста (ТФР). В последнее время
отдельными авторами делаются попытки ввести в концепцию
онкогенов также и трансформирующие факторы роста — ТФР
(Голубев А. Г., Дильман В. М., 1982; Дильман В. М., 1983].
В настоящее время известно довольно много ростовых факторов
(РФ): эпидермальный (ЭФР), фибробластов (ФРФ), нервов
(ФРН), мультипликационный (МФР), соматомедины, тромбо-
цитарный (РФТ). Все эти факторы по характеру действия напо-
минают инсулин, стимулируя перенос глюкозы и аминокислот.
Полагают, что факторы роста имеют отношение к контролю
деления клеток.
Любопытно, что при добавлении ТФР в культуру нормальных
фибробластов последние приобретают фенотип трансформирован-
ных клеток. Однако это действие ТФР обратимо, и при удалении
их из среды клетки возвращаются к исходному нормальному
состоянию. Естественно, что описанный феномен индукции транс-
формированного состояния трансформирующими факторами роста
наводил на мысль о подобии последних онкобелкам. Известно,
что М. Sporn и G. Todaro (1980) высказали мысль о роли проду-
цируемых раковой клеткой ТФР в качестве элементов аутокринной
гормональной секреции. В. М. Дильман (1983) пошел еще дальше
в развитии этой мысли, полагая, что ТФР или внутренний инсули-
низирующий фактор, т. е. сам онкобелок, обеспечивает усиление
транспорта глюкозы и аминокислот (а также других веществ)
в клетку, что, в свою очередь, обеспечивает потребности клетки
в энергетических и пластических материалах. Этим самым
В. М. Дильман как бы заложил метаболическую базу под концеп-
цию онкогенов, объясняя, каким образом изменения метаболизма
приводят к делению клеток. Он рассуждал далее следующим
образом: усиление поступления в клетку глюкозы вызывает
снижение в ней концентрации цАМФ. Последнее сопряжено
с усилением синтеза холестерина и через него со стимуляцией
синтеза ДНК. В результате этой цепи событий клетка делится.
В онкометаболической схеме В. М. Дильмана в центре событий
находится поток глюкозы в клетку. В схеме предусматривается,
что «каскадный сигнал деления» индуцируется потоком глюкозы
[Дильман В. М., 1983]. В данном случае, как нам представляется,
можно говорить о новой модели метаболической гипотезы рака.
260
Однако, как и классическая первая (Варбурга), она в своем
построении лишена первичного побуждающего импульса.
Нам кажется, что в оценке роли ТФР в индукции роста и
неумеренной пролиферации возможны заблуждения в том смысле,
что вторичные процессы могут быть приняты за первичные. Мы
имеем в виду следующее. Как правило, действительно все ТФР
обладают инсулиноподобным действием. Это проявляется прежде
всего в эффективной стимуляции энергетического и пластического
обменов клеток путем усиления потока в клетку питательных
материалов, являющихся одними из основных условий обеспечения
усиленного роста. Однако совершенно очевидно, что эти эффекты
ТФР имеют вторичный, подсобный характер и не имеют отношения
к первичной индукции роста. Нгпервичная роль ТФР в онкогенезе
фактически признается и самим В. М. Дильманом, когда он,
говоря о происхождении этих факторов роста, высказывает пред-
положение, что «онкобелок дерепрессирует продукцию ТФР,
которая в нормальной клетке заблокирована до минимальных
величин» [Дильман В. М., 1983). Кроме того, В. М. Дильман
полагает, что онкоген обеспечивает через ТФР усиление мета-
болических и пластических процессов в клетке.
Следовательно, сначала все-таки онкоген—онкобелок и лишь
затем ТФР.
Таким образом, ТФР находят место в схеме онкогенеза
В. М. Дильмана, но на более позднем этапе процесса, чем онко-
ген—онкобелок. Автор предлагает такую общую схему единого
патогенеза рака: онкоген—трансформирующий белок — ТФР —
метаболизм трансформированной клетки. К сожалению, пока
не известно каких-либо экспериментальных подтверждений такой
схемы.
Если первую часть логического построения В. М. Дильмана
(онкоген—онкобелок) можно считать теоретически обоснованной
и современной наукой экспериментально доказанной, то два
последних звена нуждаются пока в доказательстве. То, что ТФР
существуют — сомнений не вызывает, но каковы их функции
в раковой клетке и какова роль в развитии опухолевого процесса,
пока далеко не ясно. Во всяком случае, если они и участвуют
в онкогенезе, то не в его начале. Что же касается метаболических
особенностей неоплазм, то естественнее всего, как нам кажется,
рассматривать их не как следствие направленного действия ТФР,
а как результат и проявление мало- или недифференцированного
состояния быстропролиферируюших клеток, не успевающих
(вследствие непрерывного деления) дифференцироваться и раз-
вить специализированные функции и субклеточные структуры,
необходимые для нормального окислительного обмена со всеми
его функциональными следствиями. Это сближает в метаболи-
ческом и функциональном плане раковые клетки с эмбриональ-
ными, что и отмечают исследователи, особенно по характеристикам
энергетического обмена.
261
Тем не менее уже сегодня ясно, что ТФР заслуживают присталь-
ного внимания и, по-видимому, они как-то связаны с процессом
онкогенеза. В пользу этого говорит, в частности, исследование
активации эпидермальным фактором роста фосфорилирования
среднего Т-антигена вируса полиомы [Sefton В. et al., 1982].
Было установлено, что ЭФР стимулирует фосфорилирование сред-
него Т-антигена вируса полиомы. Известно, что средний Т-антиген
является главным трансформирующим белком этого вируса,
ответственным за индукцию фенотипа трансформации клеток.
Субфракция среднего Т-антигена ассоциирована с протеинкиназ-
ной активностью, которая фосфорилирует средний Т-антиген
по тирозину. Существует строгая корреляция между уровнем
этой киназной активности и степенью экспрессии трансформиро-
ванного фенотипа клеток. Факт стимуляции эпидермальным факто-
ром роста фосфорилирования среднего Т-антигена указывает
на возможность того, что митогенные факторы регулируют эту
фосфорилирующую активность и, следовательно, онкогенный
эффект. Здесь следует напомнить исследование, в котором было
показано, что pp60csrc, клеточный гомолог трансформирующего
белка (онкобелка) птичьего саркомного вируса, находится в тес-
ной ассоциации с субфракцией среднего Т-антигена, указывая
этим на то, что фосфорилирование тирозина среднего Т-антигена
опосредуется белком pp60c src,T. е. тирозинкиназой [Courtneidge S„
Smith А., 1983].
Участие в разработке проблемы ТФР таких крупных исследо-
вателей, как G. Todaro, позволяет надеяться, что природа и функ-
ция этих интересных и биологически важных элементов живых
систем будут установлены в ближайшем будущем, что и позволит
определить их точное значение и местоположение в процессе
туморогенеза. При нынешнем уровне знаний сделать это трудно.
К исходу 1984 г. положение в области изучения ростовых (РФ),
а в известных условиях — трансформирующих факторов сложи-
лось следующим образом [Heldin С.-H., Westermark В., 1984].
Принимается, что РФ, функционирующие в малигнизирован-
ной клетке как трансформирующие белки, кодируются онкогенами
или, альтернативно, их экспрессия находится под контролем онко-
генов. В ряде случаев РФ функционально выступают как онко-
белки и являются результатом прямого считывания генетической
информации онкогенов. РФ рассматриваются как обязательное
звено в цепи событий, обеспечивающих клеточное деление и муль-
типликацию клеток. В нормальных физиологических условиях
РФ поступают в клетку извне, что обусловливает зависимость
нормальных клеток от РФ добавляемой сыворотки; трансформиро-
ванные клетки отличаются независимостью от экзогенных РФ
благодаря конститутивной способности клеток производить РФ.
Автономный рост неопластических клеток объясняется наличием
в них всех элементов биологической системы пролиферации: онко-
гена, рецепторов РФ, которые служат трансдукторами экстра-
262
или интрацеллюлярного сигнала к ДНК ядра и, возможно, цепью
других членов сигнальной системы. В ряде известных случаев
понятие фактора роста непосредственно смыкается и отождествля-
ется с продуктом трансляции онкогенов (РФТ и др.). Таким
образом, в свете новых данных РФ предстают как трансформирую-
щие белки.
В настоящее время выделяют 3 основные группы Р*Ф: семейство
РФТ, семейство ЭФР и семейство инсулина. Семейство РФТ вклю-
чает: сам РФТ, остеосаркомный РФ, фибробластный РФ, транс-
формирующий белок вируса саркомы обезьян. Семейство ЭФР
включает: сам ЭФР, трансформирующий РФ (ТРФ-а) Семейство
инсулина состоит из: инсулина, инсулиноподобного РФ (ИПРФ I),
или соматомедина С, инсулиноподобного РФ II (ИПРФ II), актив-
ности, стимулирующей мультипликацию (АСМ).
Как правило, эти вещества уже достаточно хорошо охарактери-
зованы, определены их молекулярная масса, молекулярная струк-
тура, последовательность аминокислот. В некоторых случаях
установлено родство между отдельными РФ. Например, пока-
зана значительная гомология В-цепи РФТ с онкобелком —
продуктом экспрессии вируса саркомы обезьян, ТРФ-а — с ЭФР;
ИПРФ I — с проинсулином, АСМ — с ИПРФ II и т. д.
Можно сказать, что все перечисленные выше факторы функ-
ционально аналогичны РФТ. Это, в свою очередь, подразумевает
участие в большинстве опухолей человека c-sis, его активацию.
Не случайны в свете этих данных частые находки иРНК c-sis
в клеточных линиях сарком и глиом человека.
В некоторых случаях было показано, что для трансформации
клеток необходимо совместное действие двух РФ. Так, трансфор-
мирующая активность клеток, инфицированных MuSV, обуслов-
лена, по-видимому, совместным действием двух факторов:
1) ЭФР-подобным (ТФР-а).
2) ТРФ-0, который в комбинации с ЭФР или ТРФ-а индуци-
рует фенотипическую трансформацию, не обладая, однако, мито-
генной активностью сам по себе.
Существенным моментом в понимании функции и биологии РФ
является то обстоятельство, что существует структурная связь
между рецепторами РФ и онкогенами. Так, рецептор ЭФР имеет
значительную аналогию в последовательности аминокислот
с р65ег в, трансформирующим белком вируса птичьего эритро-
бластоза. Около половины секвенированиых пептидов рецептора
ЭФР имели 90 % гомологии с предсказанной последовательностью
р65ег . По-видимому, родоначальник вируса птичьего эритробла-
стоза приобрел часть гена рецептора ЭФР, который кодирует
внутренний домен и трансмембранную часть рецептора, но
не внешний домен, содержащий область связывания ЭФР. Иными
словами, р65сгЬ в соответствует усеченному рецептору ЭФР. Отсут-
ствие регуляторного связывающего ЭФР домена может сопровож-
даться конституционной активацией эффекторного домена.
263
В то же время между РФ и продуктами онкогенов существует
не только структурная, но и функциональная связь. Это положение
подкрепляется наблюдениями, согласно которым несколько рецеп-
торов РФ (РФТ, ЭРФ, инсулин, ИПРФ) и трансформирующих
белков онкогенов (src, yes, fps, fes, ros, abl, fgr) обладают тиро-
зинкиназной активностью. Таким образом, тирозинкиназная
активность, слабая в нормальных клетках (менее 0,1 % от общего
связываемого белком фосфора приходится на тирозин), в неопла-
стических ассоциирована с клеточной пролиферацией, индуциро-
ванной как РФ, так и онкогенными ретровирусами. Киназные
активности рецепторов различных РФ являются, по-видимому,
интегральными частями рецепторных молекул. Их активация ведет
к аутофосфорилированию, а также к фосфорилированию тирозина
других клеточных субстратов.
Между индуцированной ростовыми факторами внутриклеточ-
ной сигнальной системой и стимуляцией синтеза ДНК существует,
по-видимому, непосредственная связь. Митогенетические сигналы,
индуцируемые РФ, передаются от рецепторов далее в клетку и
доходят до ДНК. Предполагают, что определенные активности
клеточных онкогенов участвуют в пострецепторном пути мито-
генных сигналов. По имеющимся данным, в этой функции
участвует и ген c-myc. Добавление РФТ к стационарным клеткам
BALB/c ЗТЗ вызывало уже через 2 ч увеличение в несколько раз
экспрессии c-myc иРНК, как это имело место, например, при добав-
лении митогенов к мышиным лимфоцитам. Поскольку продукт
гена тус является ядерным белком, функцию его можно усматри-
вать в регуляции экспрессии генетической программы, контроли-
рующей клеточную пролиферацию. Известно, что ген тус,
трансдуцированный несколькими ретровирусами, трансформирует
широкое разнообразие клеток-мишеней различного гистогенети-
ческого происхождения. Амплификация и аберрантная экспрессия
гена c-myc наблюдалась в таких злокачественных новообразова-
ниях, как лимфома Беркитта и мелкоклеточная карцинома легкого.
Предполагают, что пострецепторные пути нескольких мито-
генов конвергируют в регуляции экспрессии гена тус и что это
обстоятельство может объяснять большое разнообразие неоплазм
с ненормальной экспрессией этого конкретного онкогена.
Если принять, что фосфорилирование тирозина является важ-
ным для трансмиссии митогенного сигнала РФ, то фосфорили-
рование некоторых ключевых цитоплазматических белков можно
рассматривать как первую внутриклеточную ступень процесса
пролиферации или трансформации. Активные поиски подобных
субстратов уже начались. Так, были идентифицированы опреде-
ленные протеины, которые фосфорилируются после стимуляции
интактных клеток РФТ. Правда, функция их пока не выяснена.
Гипотезируя далее, можно принять, что внутриклеточная
передающая митогенные сигналы система, состыкованная с рецеп-
торами РФ, представляет собой цепь клеточных событий, вклю-
264
чаюших посттранскрипционные модификации специфических
белков и контролируемую экспрессию специфических генов. При-
нимая это, можно предполагать, что неконтролируемая экспрессия
любого регуляторного компонента в указанной цепи могла бы
вести к стимуляции клеточной пролиферации. Поэтому гены для
белков, участвующих во внутриклеточной сигнальной системе,
передающей митогенные импульсы, могли бы действовать как
онкогены в случае, если они неадекватно активируются или
экспрессируются в избыточном количестве или с-тус может со-
ставлять часть такой индуцируемой ростовыми факторами внутри-
клеточной сигнальной системы. Не исключено, что клеточные
гомологи и других онкогенов входят в качестве пока не идентифи-
цированных членов связанной с ростовыми факторами внутри-
клеточной сигнальной системы.
Интересным аспектом неопластической трансформации явля-
ется то, что потребность в нескольких комплементарных онкогенах
[Land Н. et aL, 1983J имеет аналогию в нормальной репликации,
индуцируемой ростовыми факторами. Так, определенные клетки,
например BALB/c ЗТЗ, требуют согласованного действия факторов
компетенции и прогрессии для инициации синтеза ДНК [Pled-
ger W. et aL, 1977; Stiles C. et al., 1979[.
Ряд наблюдений связывают различные онкогены, действующие
на определенных этапах трансформации, с ростовыми факторами,
действующими на различных уровнях инициации и передачи мито-
генного сигнала. Эти связи включают структурные и функциональ-
ные сходства на уровне рецепторов ростовых факторов и воз-
можное участие онкогена в индуцированной ими внутриклеточной
сигнальной системе. Было показано, что экспрессия определенных
онкогенов вызывает эндогенное образование ростовых факторов,
которые затем могут стимулировать продуцирующую клетку
по аутокринному типу.
Все сказанное в целом указывает на то, что эти принципы
могут иметь универсальное приложение в понимании механизма
индукции пролиферации клеток. Любой регуляторный компонент
в цепи событий, связанных с действием нормальных ростовых
факторов, может проявить онкогенный потенциал в случае его
неадекватной экспрессии или активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Практически все испытанные представители многоклеточных,
в том числе позвоночные и человек, содержат специфические
клеточные потенциальные онкогены (протоонкогены), изменение
структуры или усиление экспрессии которых может вести к инициа-
ции туморогенеза и поддержанию неопластического роста.
Первыми были обнаружены трансдукция и превращение кле-
точных генов в онкогены ретровирусами. Затем возможность
появления активных клеточных онкогенов была показана при
265
инсерционном мутагенезе ретровирусами и путем генного переноса,
опосредуемого ДНК.
Как пишет J. Bishop (1983), логика эволюции не позволила бы
сохраниться исключительно только вредоносным генам. Могучие
силы отбора должны были действовать, чтобы обеспечить консер-
ватизм протоонкогенов в ходе создания широкого разнообразия
многоклеточных форм животного мира. Однако нам неизвестно,
почему эти гены закреплялись в эволюции и как это конкретно
происходило, ибо пока мы не знаем биологическую функцию кле-
точных онкогенов. Исследователи знают лишь то, что они экспрес-
сируются в ряде тканей и что они как-то участвуют в росте, диф-
ференциации и развитии. Мало известно и об их биохимических
функциях. Возможно, что кодируемые клеточными протоонко-
генами белки являются компонентами разветвленной всеохваты-
вающей сети, которая контролирует рост индивидуальных клеток
в ходе дифференциации.
Функция клеточных онкогенов в канцерогенезе также не вполне
ясна. Трансдукция этих генов ретровирусами дала 20 различных
активированных протоонкогенов. Все ли они участвуют в онко-
генезе? Принимается, что по крайней мере некоторые из иденти-
фицированных протоонкогенов участвуют в развитии злокачест-
венных опухолей Однако до сих пор нет единого мнения
о механизме этого участия: играет ли роль увеличение количества
генного продукта или качественно меняются структура и функция
клеточных онкогенов. Располагая современными данными, можно
успешно доказывать и то и другое.
В последнее время серьезно встал новый вопрос — достато-
чен ли для осуществления неопластической трансформации один
онкоген или нужен набор их, так называемый «каскад»?
Ведущие теоретики-онкологи все больше склоняются к послед-
нему варианту. Может быть так, что онкогены специализированы,
одни осуществляют инициацию туморогенеза, другие — поддержа-
ние трансформированного состояния. Или можно себе предста-
вить, что «дозный» принцип действия канцерогенов обеспечивает
инициацию, а качественные изменения генов — поддержание
состояния неоплазии. Вопросов пока больше, чем ответов. И по-
требуются время и интенсивная работа для того, чтобы на них
ответить.
Подведем некоторые итоги этого раздела. Создается впечатле-
ние, что в развитии концепции онкогенов складывается ситуация,
напоминающая в некоторых отношениях положение, уже давно
существующее в теории химического канцерогенеза. Она заключа-
ется в том, что в обоих случаях примерно половина общего пути
процесса остается нерасшифрованной. Это свидетельствует о боль-
шой глубине нашего незнания явления при всей значительности
наблюдаемого прогресса. Для химического канцерогенеза — это
часть между образующимися аддуктами ДНК и опухолью; для
действия онкогенов, наоборот, это первая часть процесса канцеро-
266
генеза, до включения известных ныне онкогенов. Новейшие дан-
ные, полученные уже не на «полутрансформированных» (пре-
неопластических) клеточных культурах мышиных фибробластов
N1H ЗТЗ, а на интактных культивированных фибробластах крыс,
продемонстрировали, что большинство известных онкогенов, в пер-
вую очередь семейства ras, являются, так сказать, конечными,
завершающими процесс трансформации онкогенами, но не ини-
циирующими его. Можно думать, что усилия исследователей
сосредоточатся теперь на поисках онкогенов начала пути транс-
формации, т. е. осуществляющих инициацию и первые этапы
процесса. Опыты с полутрансформированными клетками N1H ЗТЗ
хотя и облегчили открытие клеточных и опухолевых онкогенов,
но в то же время создали иллюзию универсального действия
единичных онкогенов, т. е. способности отдельных онкогенов
осуществлять весь процесс трансформации от начала до конца.
Это, по-видимому, в действительности не так. Процесс малигни-
зации — многостадийный процесс, и он, вероятно, требует для
своего осуществления целую цепь последовательно действующих
онкогенов, т. е. их «каскад».
ГЛАВА 5
ОНКОГЕНЫ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
Как уже указывалось в предыдущих главах, открытие вирусных
онкогенов определило главное направление в изучении механизмов
трансформации клеток. При этом прежде всего предстояло отве-
тить на вопрос: что происходит с вирусассоциированными клеточ-
ными онкогенами (протоонкогенами) в процессе превращения
нормальной клетки в опухолевую?
Протоонкогены — определенные локусы клеточной ДНК
(с-опс), способные в результате трансдукции (захвата) в ретро-
вирусный геном превращаться в вирусные онкогены или, после
активации, в клеточные трансформирующие гены [Bishop J., 1982,
1983; Weinberg R., 1983]. В экспериментах по трансфекции не-
активированные протоонкогены оказались неспособными транс-
формировать N1H ЗТЗ и другие клетки-мишени [Newbold R.
et aL, 1977, 1979, 1983; Chang E. et al., 1980; Blair D. et al., 1981;
Land H. et al., 1983; Newmark P., 1983].
В исследованиях последних лет была открыта 2-я группа
онкогенов, ассоциированных с клеткой, которые не имеют аналогов
среди опс-генов известных на сегодняшний день ретровирусов
животных [Diamond A. et al., 1983; Eva A. et aL, 1983; Goubin G.
et al., 1983; Hall A. et al., 1983; Murray M. et al., 1983]. Эти гены
получили название клеточных трансформирующих генов, или
просто онкогенов. Клеточные трансформирующие гены — это
локусы ДНК, которые в результате генетических перестроек или
267
иных активирующих событий приобретают способность транс-
формировать NIH ЗТЗ и некоторые другие реципиентные клетки.
Поскольку нефункционируюшие аналоги (аллели) указанных
генов в нормальных клетках по ряду характеристик отличаются
от «работающих» в экспериментах по трансфекции, их деятельное
состояние стали связывать с активацией, включением [Reddy Е.
et al., 1982; Santos Е. et aL, 1982; Capon D. et aL, 1983a, 1983b;
Land H. et aL, 1983a].
Первоначальные исследования в этой области были направ-
лены на определение молекулярных детерминант (прежде всего
нуклеиновых кислот и ферментов), ответственных за трансформа-
цию клеток, подвергавшихся воздействию канцерогенных веществ
[Weinberg R., 1983]. Схема подобных экспериментов была про-
стой. Образцы ДНК выделяли из опухолей индуцированных
животных химическими канцерогенами, например MX или ДМБА,
или, в других случаях, из клеток, трансформированных in vitro
этими же веществами. Полученные образцы ДНК вводили в соот-
ветствующие нетрансформированные реципиентные культуры и
монослои реципиентных культур просматривали на наличие фоку-
сов роста трансформированных клеток. Появление трансформан-
тов свидетельствовало о присутствии действующей доминантной
трансформирующей информации в испытуемых образцах клеточ-
ной донорской ДНК [Weinberg R., 1982].
Эксперименты по переносу генов (трансфекции) показали,
что образцы ДНК определенных типов химически трансформиро-
ванных клеток несут в своем составе трансформирующие последо-
вательности, онкогены [Shin С. et aL, 1979, 1981; Cooper G., 1980;
Weinberg R., 1982; Cairns J.. Logan J., 1983]. Существование
подобных трансформирующих последовательностей, выявляемых
в экспериментах по трансфекции, в последующем было продемон-
стрировано в ДНК большого количества различных опухолей,
биопсийного материала человека и опухолевых клеточных линий
[Князев П. Г. и др., 1980, 1984; Moelling К. et aL, 1980; Cooper G.,
1982; Colgfarb M. et aL, 1982; Lane M. et aL, 1982; Parada L. et aL,
1982; Pulciani S. et aL, 1982; Weinberg R., 1982; Capon D. et aL.
1983; Diamond A., 1983; Eva A. et aL, 1983; Hall A. et aL, 1983;
McCoy M. et aL, 1983; Shimizu K. et aL, 1983].
Большинство исследователей с целью введения в клетку чуже-
родных образцов ДНК в настоящее время используют кальций-
фосфатную технику, разработанную F. Graham, Е. Van Der Eb
(1973). Стерильные кальциевые преципитаты ДНК более эффек-
тивно захватываются реципиентными клетками. Дальнейшая
судьба чужеродной ДНК, ее транспорт и проникновение в ядро
изучены слабо. Известно, что примерно 2 % введенной ДНК опре-
деленное время персистирует в трансфецированных клетках; этого,
очевидно, оказывается достаточно для процесса интеграции экзо-
генной ДНК с геномом реципиентных клеток [Hill М., Huppert J.,
1970]. Использование кальций-фосфатной техники введения пре-
268
паратов ДНК в клетку существенно повысило эффективность
процедуры трансфекции. Было показано, что эффективность транс-
фекции возрастает с улучшением принципов селекции трансфор-
мантов.
Значительное влияние на результаты трансфекции как метода
обнаружения трансформирующих генов оказывают сами реци-
пиентные клетки. В большинстве экспериментов для определения
трансфор (ирующих генов в ДНК опухолей человека в качестве
реципиентных клеток использовали линию пренеопластических
клеток мышей NIH ЗТЗ. Эти клетки анэуплоидны, постоянно
пролиферируют и, в отличие от нормальных диплоидных фибро-
бластов, имеющих ограниченные сроки культивирования и количе-
ство пассажей, обладают строго выраженной зависимостью проли-
ферации от субстрата роста (подложки) и характеризуются кон-
тактным торможением роста. Более того, у этих клеток обнаружена
исключительно высокая чувствительность к восприятию в соб-
ственный геном и фиксации чужеродной ДНК- Появление фокусов
трансформированных клеток в монослое, а также субстратнезави-
симую пролиферацию клеток N1H ЗТЗ в полужидком агаре стали
использовать в качестве критерия успешной трансфекции. Тем
не,менее по непонятным причинам только 10—20 % испытуемых
образцов ДНК из опухолей и опухолевых клеточных линий оказы-
ваются способными индуцировать трансформацию клеток N1H
ЗТЗ в экспериментах по трансфекции [Pulciani S. et aL, 1982;
Land H. et aL, 1983].
Следует особо отметить, что высокомолекулярные образцы
ДНК из нормальных клеток птиц и человека (контроля) не спо-
собны вызывать трансформацию клеток NIH ЗТЗ. Однако эти же,
но фрагментированные (размер фрагментов 0,5—5,0 т. п. о.)
препараты ДНК лимфоцитов кур и человека индуцируют, правда,
с очень низкой частотой (<0,002 очага трансформации/мкг
ДНК/Ю6 клеток) злокачественную трансформацию реципиентной
культуры [Cooper G., Lane М.-А., 1984; Schafer R. et aL, 1984].
Эти данные свидетельствуют о том, что в принципе в нормальной
клетке существуют гены, способные индуцировать неопластиче-
скую трансформацию.
Молекулярный анализ трансформантов клеток NIH ЗТЗ, полу-
чаемых после трансфекции препаратами ДНК из опухолей чело-
века, значительно упростился после открытия и выделения уни-
кальных клонов умеренно повторяющихся последовательностей
генома человека (семейство Alu, Крп, ВагпН I). Наличие подобных
последовательностей в ДНК трансформантов, определяемых гиб-
ридизацией соответствующих плазмид с ДНК реципиентных кле-
ток, оказалось уникальным маркером переноса человеческой
генетической информации (например, Alu-последовательностей)
в геном мышиных клеток NIH ЗТЗ. Вероятность подобного события
достаточно велика, поскольку в геноме человека примерно
5-105 умеренно повторяющихся Alu-последовательностей при-
269
ходится на единичные копии уникальных генов [Goldfarb М.
et al., 1982]. Как правило, проводятся 2—3 последовательных
цикла трансфекции клеток NIH ЗТЗ для того, чтобы удалить
последовательности донорской ДНК, генетически не связанные
с трансформирующими генами. Сохраняющиеся в 2—3 циклах
трансфекции клеток NIH ЗТЗ последовательности могут быть
использованы в дальнейшем как маркер для молекулярного кло-
нирования уникального фрагмента донорской ДНК, который
связан с трансформацией реципиентных клеток, т. е. включает
клеточный онкоген [Goldfarb М. et al., 1982; Tabin С. et aL, 1982].
Во многих типах неоплазм в процессе превращения нормальных
клеток в опухолевые в структуре их ДНК формируются транс-
формирующие гены (онкогены). К числу подобных опухолей
человека относятся карциномы мочевого пузыря, легкого, молоч-
ной железы, желудка, кишечника, поджелудочной железы, фибро-
и рабдомиосаркомы, глиобластомы, нейробластомы и, наконец,
неоплазмы различных гемопоэтических клеток. Предполагается,
что онкогены, ассоциированные с указанными опухолями, играют
ведущую роль в индукции и поддержании трансформированного
фенотипа клеток, однако молекулярный механизм их участия
в этих процессах все еще остается недостаточно ясным. Известные
экспериментальные данные по трансфекции лишь демонстрируют,
что онкогены опухолей человека могут трансформировать чуже-
родные клетки, в которые они были внесены при помощи техники
переноса генов.
Несколько активных трансформирующих генов, гомологичных
и негомологичных вирусассоциированным протоонкогенам, изоли-
рованы с помощью методики молекулярного клонирования.
КЛЕТОЧНЫЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ (ОНКОГЕНЫ)
ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА,
РОДСТВЕННЫЕ ПРОТООНКОГЕНУ с Ha-ras 1
Перечень опухолей человека и животных, связанных с актива-
цией протоонкогена c-Ha-ras 1, представлен в табл. 14.
Из данных табл. 14 видно, что трансформирующий ген Ha-ras
может быть обнаружен в ДНК широкого круга фенотипически
различных неоплазм млекопитающих. Некоторые из перечислен-
ных форм злокачественных новообразований широко распростра-
нены у человека и представляют серьезную опасность для жизни.
К подобным неоплазмам прежде всего следует отнести рак легкого
у мужчин и рак молочной железы у женщин. Частота возникнове-
ния указанных опухолей за последние годы не снизилась, а, на-
против, возросла.
В этой связи следует отметить, что и отдаленные результаты
лечения данных групп больных (выживаемость) все еще неудов-
летворительны [Блохин Н. Н., Напалков Н. П., 1982; Напал-
ков Н. П. и др., 1982].
270
Таблица 14
Клеточные трансформирующие гены человека и животных,
родственные протоонкогену c-Ha-ras 1
Гистотип опухоли или фено- тип трансформированных клеток	Клеточ- ная линия	Механизм активации			Литературный источник
		Какой кодон поврежден	Измене- ние ну- клеотидов в значи- мом ко- доне	Замена амино- кислоты в белке р-21	
Человек Рак: мочевого пузыря	EJ/T24	12-й	г—т	гл и—► вал	D. Der и соавт.
легкого	или J-82 Hs-242	61-й	А—Т	глю-;*-лей	(1982); М. Goldfarb и соавт. (1982); L. Parada и соавт. (1983); Е. Taparowsky и соавт. (1982). Y. Yuasa
молочной железы	SK-BR-3	Не 12-й	?	?	и соавт. (1983) П. Г. Князев
Нейробластома	I AN-1	Не 12-й	э	?	и соавт. (1984);
Ксенограф злокачест-	Ja-1	Не 12-й	?	?	R Schafer
венной меланомы Спонтанная активация	—	12-й	Г-^А	гли-»-асп	и соавт. (1984) Е. Santos
c-Ha-ras в процессе транс- фекции NIH ЗТЗ-клеток Животное Аденокарциномы мо-		12-й	Г-+А	гл и-*-гл ю	и соавт. (1983) S. Sukumar
.точных желез крыс Bnf/N. индуцированные мет илнитрозомочевиной Рак у кошек и мышей.					и соавт. (1983) A. Balmain,
индуцированный MX или ДМБА					J. Paragnell (1983)
Первый трансформирующий ген человека был обнаружен и
охарактеризован во вторичных трансформантах клеток NIH ЗТЗ,
инфицированных и трансформированных препаратами ДНК,
изолированными из клеточных линий рака мочевого пузыря EJ
[Parada L. et al., 1982], Т24 [Goldfarb M. et al., 1982; Tapa-
rowsky E. et aL, 1982] и J-82 [Der D. et aL, 1982]. Позднее было
установлено, что EJ, Т24 и некоторые другие опухолевые клеточные
линии, например J-82, не представляют собой независимые клеточ-
ные линии [O’Toole C.’et aL, 1983], а являются перекрестно-
контаминированными. Характерной особенностью трансформи-
рующих генов клеток опухолевых линий EJ и Т24 является то,
что они в нескольких циклах трансфекции были устойчиво ассо-
циированы со специфическими для человеческой ДНК Alu-после-
271
довательностями, причем каждый последующий цикл трансфекции
значительно повышал эффективность трансформации клеток
NIH ЗТЗ препаратом ДНК (препараты ДНК брали из фокусов
трансформации последовательных циклов трансфекции). С по-
мощью молекулярного клонирования в бактериофаге, где в ка-
честве «зонда» использовались Alu-последовательности, присут-
ствующие в качестве вставки в pBR-322 (проба BLUR-8), и по-
следующего реклонирования ВашН I фрагмента размером
6,6 т. п. о. в плазмиде pBR-322 трансформирующий ген был
получен в «чистом виде». Последующий сравнительный анализ
и сопоставление плазмид, несущих онкоген pEJ-6,6, а также
онкоген рТ24, с уже известными вирусными онкогенами, позволили
установить, что обнаруженные и изолированные человеческие
онкогены принадлежат к типу трансформирующих генов, родствен-
ных c-Ha-ras 1 [Goldfarb М. et al., 1982; Parada L. et aL, 1982;
Taparowsky E. et al., 1982).
Полностью генетический локус протоонкогена c-Ha-ras 1
(вирусспецифическая область, комплементарная v-Ha-ras-онко-
гену) в донорских препаратах ДНК, а также первичных и вторич-
ных трансформантах представлен рестрикционным Sac I-фрагмен-
том размером 2,9 т. п. о. [Goldfarb М. et aL, 1982; Reddy Е. et aL,
1982]. При этом генетический локус c-Ha-ras 2 протоонкогена
может быть выявлен в Sac 1-фрагменте размером 21,0 т. п. о.
в «мягких» условиях гибридизации [Chang Е. et aL, 1982J.
Методом А. Махат и W. Gilbert (1977) были определены
нуклеотидные последовательности онкогена Т24 [Reddy Е., 1983J,
в последующем методом гетеродуплексного анализа — генетиче-
ская структура этого гена [Capon D. et al., 1983]. В нем были
идентифицированы 4 кодирующие области (экзоны), которые
разобщены тремя некодирующими последовательностями нуклео-
тидов— интронами [Ellis R. et aL, 1980]. Каждая кодирующая
область гена c-Ha-ras 1 рака мочевого пузыря человека содержит
сигналы для сплайсинга иРНК онкогена, а'на З'-конце 4-го экзона
имеет терминирующий кодон функционирования ДНК-зависимой
РНК-полимеразы и сигнал полиаденирования иРНК [Chang Е.
et aL, 1982; Reddy Е. et al., 1982, 1984]. Клонированный из ДНК
клеточной линии Т24 онкоген c-Ha-ras 1 трансформировал клетки
NIH ЗТЗ с высокой эффективностью, в то время как его нормальная
аллель из нормальных клеток плаценты человека в параллельных
экспериментах по трансфекции была неактивна.
Лигирование протоонкогена c-Ha-ras 1 с сильным промотером
также не приводило к его активированию, т. е. способности
трансформировать клетки N1H ЗТЗ. По данным молекулярной
гибридизации, трансфецированный протоонкоген c-Ha-ras 1 ин-
тегрировался в геном реципиентных клеток, при этом уровень
экспрессии химерной структуры — протоонкогена с LTR — суще-
ственно возрастал. Эти эксперименты косвенно свидетельствовали
о том, что активация онкогена ras не связана с повышением уровня
272
экспрессии его генетической информации и увеличением дозы
онкобелка [Chang Е. et aL, 1982].
Генетическое повреждение, ведущее к активации протоонко-
гена c-Ha-ras 1, т. е. проявлению его трансформирующих свойств
в системе NIH ЗТЗ-клеток, как было установлено, связано с единич-
ной точковой мутацией в 35-й позиции 1-го экзона (а именно —
заменой гуанозина на тимидин). Эта замена нуклеотидов в прото-
онкогене сопровождается, в свою очередь, изменением 12-го ко-
дона ГГЦ на ГТЦ с замещением 12-й аминокислоты, глицина,
на валин в продукте онкогена — белке p2l [Reddy Е. et al., 1982;
Tabin С. et aL, 1982; Taparowsky E. et aL, 1982; Capon D. et aL,
1983; Newmark P., 1983J.
Интересно, что вирусные онкогены v-ras (онкоген вируса
саркомы мышей штамм Харвея, происходящий из крысиного
генома) и v-ras/bas (онкоген вируса саркомы мышей BALB/c)
также содержат мутацию в 12-м кодоне для соответствующей
аминокислоты белка р21. В этом случае 12-й кодон ГГА (для
глицина) в протоонкогене c-Ha-ras крысиных клеток заменен
на кодон АГА, кодирующий аргинин [Ellis R. et aL, 1980; Suku-
mar S. et aL, 1983].
Поскольку было установлено, что уровень экспрессии онкогена
c-Ha-ras 1 в клетках рака мочевого пузыря незначительно отли-
чается от такового в нормальных клетках человека, было выдви-
нуто предположение о том, что точковая мутация протоонкогена
приводит к существенным структурно-конформационным измене-
ниям онкобелка р21 семейства ras [Tabin С. et aL, 1982].
Генетическое повреждение протоонкогена c-Ha-ras 1 приводит
при точковой мутации к замене единственного нуклеотида
в 12-м кодоне. Это, в свою очередь, существенно изменяет конфигу-
рацию кодируемого белка р21. Точковую мутацию, расположен-
ную в 12-м кодоне, можно обнаружить при рестрикционном энзи-
матическом анализе структуры самого онкогена (меняются сайты
рестрикции для эндонуклеаз Нра II, Msp I и Nae I). В соответствии
с этими данными физическое картирование онкогенов, определение
изменений их сайтов рестрикции при воздействии ряда эндо-
нуклеаз после генетического повреждения стало важным и эффек-
тивным принципом выявления точковых мутаций или иных гене-
тических перестроек при активации клеточных протоонкогенов
в онкогены (клеточные трансформирующие гены).
Примером использования этого принципа при анализе чело-
веческих онкогенов могут служить исследования ряда лаборато-
рий, выявивших изменения в структуре клеточных протоонкогенов
при малигнизации ткани [Князев П. Г. и др., 1984; Feinberg А.
et aL, 1983; Yuasa Y. et aL, 1983J. С помощью набора специфиче-
ских рестриктаз Нра II, Msp I, Nae I, «узнающих» по изменению
сайта рестрикции характер и место генетического повреждения
[Reddy Е. et aL, 1982], удалось определить как природу вовлечен-
ного в процесс неоплазии онкогена, так и область генетического
18
273
повреждения. Это было осуществлено на примере трех злокачест-
венных опухолей человека: рака молочной железы, нейробла-
стомы, меланомы. Во всех трех опухолях был идентифициро-
ван активированный клеточный ген c-Ha-ras 1 и установлено,
что активация протоонкогена не связана с точковой мутацией
в 12-м кодоне трансформирующих генов.
Эти примеры, как и многие другие аналогичные им и известные
из литературы последних лет, демонстрируют эффективность
комбинации современных молекулярно-биологических и генно-
инженерных методов в анализе молекулярного механизма нео-
пластической трансформации клеток и тканей.
Наличие ферментов, регистрирующих точковую мутацию
в 12-м кодоне трансформирующего гена Ha-ras для белка р21,
открыло возможность проводить широкий скрининг подобных
мутаций в образцах ДНК опухолей человека. Это попытались
сделать, в частности, A. Feinberg и соавт. (1983). Они протестиро-
вали рестриктазами Нра II/Msp I и Nae I ДНК 29 опухолей чело-
века, включая 19 первичных опухолевых тканей легких и 10 первич-
ных карцином мочевого пузыря, на наличие точковой мутации,
обнаруженной ранее в EJ ДНК. Поскольку ни в одном случае
авторы не выявили подобной мутации, было выдвинуто пред-
положение, что 12-й кодон в процессе естественного канцерогенеза
у человека повреждается редко [Feinberg A. et al., 1983]. Эта
работа, однако, не отрицает значения точковых мутаций в актива-
ции клеточных протоонкогенов вообще. Указанные авторы и другие
исследователи отмечают, что в протоонкогене Ha-ras могут
существовать другие кодоны, в которых точковые мутации приво-
дят к активации и проявлению трансформирующих свойств онко-
гена Ha-ras в клетках NIH ЗТЗ.
Вскоре это предложение было подтверждено экспериментально.
Примерно 10% случайно отобранных карцином мочеиспускатель-
ного тракта человека содержат активный (в NIH ЗТЗ-системе)
онкоген Ha-ras. Все образцы ДНК указанных опухолей содержали
c-Ha-ras-локус, имеющий точковую мутацию в 61-м кодоне, что
определено эндонуклеазой рестрикции BstN I [Fujita J. et al.,
1984]. Авторы полагают, что активация протоонкогена c-Ha-ras
имеет место преимущественно в опухолях мочеиспускательного
тракта человека.
К. Shimizu и соавт. (1983) предсказывают возможность суще-
ствования, например, для c-Ki-ras 2-протоонкогена значительного
числа «уязвимых» мест, способных «запускать» канцерогенез при
участии этого онкогена.
Трансформирующий ген клеток рака легкого (опухолевая
линия Hs-242) также оказался близкородственным протоонкогену
c-Ha-ras [Yuasa Y. et al., 1983]. В этом случае генетическим
повреждением, ответственным за трансформирующую активность
белка р21, является точковая мутация во 2-м экзоне (61-й кодон),
что сопровождается изменением А->-Т в 61-м кодоне и соответ-
274
ствующей заменой 61-й аминокислоты, глутамина на лейцин,
в белке р21. При этом 12-й кодон оставался неизмененным и был
идентичен нормальной аллели протоонкогена c-Ha-ras 1 [Yuasa Y.
et al., 1983]. О. Fasano и соавт. (1984) изучили роль точковых
мутаций в активации клонированного протоонкогена человека
c-Ha-ras 1 при бисульфитном мутагенезе. Авторы показали, что
большинство мутаций не превращают протоонкоген в онкоген,
однако мутации, приводящие к единичной замене аминокислот
в положении 12, 13, 59—61 кодируемого белка, активируют
трансформирующий потенциал Ha-ras в отношении клеток N1H
ЗТЗ.
Таким образом, единичная замена аминокислоты в 12-м или
61-м положении в молекуле белка р21, по-видимому, может быть
достаточной для индукции структурных, конформационных и
функциональных изменений, приводящих к проявлению у белка
р21 трансформирующих свойств [Lane М. et aL, 1982; Reddy Е.
et al., 1982J.
Вскоре в исследованиях D. Stacey и Н. F. Kung (1984) были
получены прямые данные, подтверждающие возможность зло-
качественной трансформации клеток NIH ЗТЗ при помощи микро-
инъекции в них онкобелка р21. Онкобелок р21 (продукт экспрессии
онкогена EJ-c-Ha-ras 1) для этих опытов получен генно-инженер-
ным методом в Escherichia coli.
R. Shafer и соавт. (1984) провели скрининг трансформирующей
активности препаратов ДНК ряда неоплазм человека в отношении
клеток NIH ЗТЗ. Образцы ДНК изолировали из различных опухо-
лей, включая меланомы, карциномы молочной железы, пред-
стательной железы, желудка, нейробластомы и некоторых форм
лейкозов. Из 24 препаратов ДНК только три (рак молочной
железы — линия SK-BR-3, меланома — гетеротрансплантат Ja-1
и нейробластома — линия LA-N-1) с высокой эффективностью
трансформировали клетки NIH ЗТЗ (рис. 11 —данные по раку
молочной железы). В двух циклах трансфекции трансформирую-
щий ген меланомы и нейробластомы был ассоциирован с Alu-
последовательностями. Многократные попытки обнаружить Alu-
последовательности в ДНК некоторых клонов первичных и вторич-
ных трансформантов, возникающих от введения ДНК SK-BR-3,
оказались безуспешными. Эти данные свидетельствуют о том,
что не всегда трансформирующие гены ассоциированы с умеренно
повторяющимися последовательностями семейства Alu [Кня-
зев П. Г. и др., 1984; Schafer R. et aL, 1984].
В первичных и вторичных трансформантах клеток NIH ЗТЗ
трех указанных образцов опухолевых ДНК был идентифицирован
протоонкоген c-Ha-ras I [Князев П. Г. и др., 1984]. Трансформи-
рующий ген c-Ha-ras 1 рака молочной железы, меланомы и нейро-
бластомы в двух циклах трансфекции был представлен маркерным
рестрикционным фрагментом Sac I размером 2,9 т. п. о. (рис. 12),
дорожки 2 (контроль положительной трансфекции), 5, 8 и 10.
18*
275
Рис. 11. Морфологическая характеристика пренеопластических
клеток мышей N1H ЗТЗ до (а) и после (б, в) двух циклов транс-
фекции опухолевыми образцами ДНК.
а — реципиентные клетки NIH ЗТЗ; б — первичные трансформанты клеток
NIH ЗТЗ (клон SRSA-1), индуцированные препаратом ДНК клеток рака
молочной железы человека, клеточная линия SK-BR-3; в — вторичные
трансформанты клеток NIH ЗТЗ (клон MS-4), индуцированные препаратом
ДНК клеток SRSA-I, первичного цикла трансфекции. Ув. 200.
Подобный фрагмент не выявлялся в геноме реципиентных NIH
ЗТЗ-клеток (дорожка 3).
Как видно из результатов, представленных на рис. 12, прото-
онкогены c-Ha-ras рака мочевого пузыря, молочной железы,
желудка, нейробластомы и меланомы человека существенно отли-
чались друг от друга во фланкирующей (т. е. прилежащей к онко-
гену) области (см. рис. 12, дорожки 1, 4, 7, 9, 11, 12).
Sac 1-фрагменты донорских образцов ДНК рака мочевого
пузыря и меланомы оказались идентичными (см. рис. 12, дорожки
1 и 4). Однако нуклеотидные последовательности генома опухоле-
вых клеток человека в первичных трансформантах, возникающих
от введения препаратов ДНК EJ, JA-1 (например, клоны клеток
EJ-F5, JASA3), отличаются друг от друга (см. рис. 12, до-
рожки 2 и 5).
Второй цикл трансфекции клеток NIH ЗТЗ сопровождался
существенными изменениями структуры трансформирующего гена
(см. рис. 12, дорожка 6). В препарате ДНК, изолированной из
клона MJ-1, отмечено присутствие дополнительных (к 2,9 т. п. о.)
вирусспецифических Sac 1-фрагментов размерами 3,4 и 21,0 т. п. о.
276
1	2	3	4	5
6	7	8	9	10	11	12 т.п.о.
_	-*—21,7

5,15
Рис. 12. Гибридизация Sac 1-фрагментов ДНК первичных и вторичных транс-
формантов клеток N1H ЗТЗ с c-Ha-ras 1 онкогеном (плазмида) pEJ 6,6.
1 — Sac 1 локус онкогена c-Ha-ras в EJ-клетках рака мочевого пузыря человека.
Фрагмент размером 2,9 т. п. о. содержит последовательности, комплементарные v-Ha-ras-
онкогеиу; 2 — ДНК первичных трансформантов EJ-F5, индуцируемых EJ ДНК; 3 —
ДНК клеток NIH ЗТЗ, в данной постановке эксперимента проба pEJ 6,6 не выявляет
вирусспецифические последовательности, комплементарные эндогенному мышиному с-На-
ras-протоонкогену; 4 — Sac I локус протооикогена c-Ha-ras 1 в ДНК JA-I клеток
злокачественной меланомы человека; 5 — ДНК первичных трансформантов JASA-3. инду-
цируемых ДНК JA-I; 6 — ДНК вторичных трансформантов MJ-I, возникающих от ДНК
JA-I (все три фрагмента: 21 т. п. о., 3, 4 т. п. о. и 2,9 т. п. о. комплементарны v-Ha-ras, что
определено пробой pBS-9; 7 — Sac 1-локус протоонкогена c-Ha-ras I в ДНК LA-N-I
(клетки нейробластомы человека); 8 — ДНК первичных трансформантов LASA-I, инду-
цируемых ДНК LAN-I; 9—Sac I-локус протоонкогена c-Ha-ras I в ДНК SK-BR-3
(клетки рака молочной железы человека); 10—ДНК первичных трансформантов, клон
клеток SRSA-1, индуцируемых ДНК SK-BR-3; II — Sac I-локус протооикогена c-Ha-ras 1
в ДНК HVM (клетки нормальной слизистой оболочки желудка человека); 12 — Sac 1-локус
протооикогена c-Ha-ras 1 в ДНК Са VSt (клетка рака желудка человека). Стрелками
обозначены Sac I-фрагменты донорских препаратов ДНК, содержащих вирусспецифи-
ческне последовательности, комплементарные онкогену v-Ha-ras 2,9 т п. о., и фланкирую-
щие последовательности, комплементарные трансформирующему гену EJ-c-Ha-ras 1
5,15 т. п. о. и 6,0 т. п. о. Локус протооикогена c-Ha-ras 2 в данной постановке эксперимента
не выявляется.
комплементарных v-Ha-ras (проба BS-9). Такие изменения, обна-
руженные во втором цикле трансфекции клеток NIH ЗТЗ, воз-
можно, отражают интеграцию в геном реципиентных клеток допол-
нительных копий онкогена. Дальнейший рестрикционный анализ
показал, что указанные трансформирующие гены человека
(c-Ha-ras 1) не содержали точковой мутации в 12-м кодоне.
Спонтанная активация клонированного протооикогена c-Ha-
ras 1 была обнаружена в ходе экспериментов по трансфекции
клеток NIH ЗТЗ препаратом ДНК плазмиды pBR-322 с вставкой
нормальной аллели c-Ha-ras 1 — оригинальное название прото-
онкогена c-has/bas (human.). В этом случае спонтанная активация
была обусловлена заменой Г -> А все в том же 12-м кодоне c-Ha-
ras 1 протоонкогена для белка р21 [Santos Е. et aL, 1983].
В 13% случаев всех тестированных клеточных линий меланом
человека онкогены семейства ras находились в активированном
состоянии [Albino A. et aL, 1984]. Авторы полагают, что активация
Ha-ras происходит на поздних стадиях прогрессии опухолевых
клеток и она не связана инициацией клеточной трансформации.
Как показал анализ трансформирующей активности препаратов
ДНК (5 образцов) из различных метастазов меланомы -одного
и того же больного, лишь один препарат ДНК был способен
277
вызывать трансформацию клеток NIH ЗТЗ. В трансформантах
удалось идентифицировать онкоген типа Ha-ras. На основании
этих опытов авторы приходят к заключению о том, что активация
онкогена ras не связана причинно с малигнизацией, а является
лишь проявлением гетерогенности меланом человека.
Свойства и функции продукта активированного, а также нор-
мального протоонкогена c-Ha-ras, изучены пока недостаточно
полно. Однако известно, что белок р21 локализуется на внутренней
поверхности цитоплазматических мембран, т. е. его клеточной
мишенью, вероятно, являются белки цитоскелета и белки клеточ-
ных мембран, а именно рецепторы. По-видимому, р21, обладающий
свойствами протеинкиназы, фосфорилирует рецептор для фактора
роста — трансферрина, обеспечивая тем самым независимость
клетки от внешних регуляторных сигналов и ростовых факторов
[Cooper J. et aL, 1984].
Помимо фосфорилирования клеточных мишеней, белок р21,
в котором произошла замена в 12-м положении аминокислоты
глицина на валин, подвергается аутофосфорилированию. Ауто-
фосфорилирование происходит по аминокислоте треонину, рас-
полагающейся в 59-м положении. Нормальный р21 в этом положе-
нии содержит аминокислоту аланин и, соответственно, не способен
к аутофосфорилированию. Значительное увеличение аутофосфори-
лирования онкобелка р21, по-видимому, определяет его биохими-
ческую активность и трансформирующие свойства [Gibbs J. et aL,
1984; McGrath et aL, 1984J.
R. Wierenga и W. Hol (1983) сравнили последовательности
37 остатков аминокислот N-терминального конца белка р21 из
нормальных клеток человека с последовательностью РаР-участка
структурно-родственных энзимов (например, р-гидроксибензоат
гидроксилазы), связывающих, подобно р21 белкам, динуклеотиды.
Этот анализ показал, что аминокислотные остатки позиций 5—33
белка р21 формируют гомологичный указанным белкам-ферментам
РаР-участок, который выполняет существенную роль в связывании
нуклеотидов или динуклеотидов. Авторы разработали трехмерную
модель участка рар белка р21, которая объясняет, почему глицин
в 12-м положении не может быть заменен другим остатком без
нарушения способности трансформирующего белка связывать
нуклеотиды.
Участками связывания дезоксигуанозинтрифосфатов или де-
зоксигуанозиндифосфатов (дГТФ или дГДФ) являются позиции
12—13 и 59—63 белка р21 [Fasano О. et aL, 1984]. Следует отме-
тить, что к белкам, обладающим высоким сродством к дГТФ и
дГДФ, относятся также фактор элонгации, тубулин, трансдуцин
и рецептор эукариотической аденилатциклазы. Однако наиболь-
шее родство обнаружено между онкобелком р21 и фактором
элонгации (50 % гомологии) [Leberman R., Euger U., 1984].
М. Gay и J. Walker (1983) подчеркивают, что аминокислотные
последовательности, окружающие 12-ю позицию аминокислоты
278
в белке р21, имеют частичную гомологию с р-субъединицей мито-
хондриальной АТФазы, и именно в той области полипептидной
цепи, которая, вероятно, принимает участие в связывании нуклео-
тидов.
Дальнейшее уточнение ферментативных свойств онкобелка
р21 показало, что активированный онкобелок, в дополнение к свя-
зыванию дГТФ и дГДФ, демонстрирует ГТФазную активность.
Вероятно, ГТФазная активность избирательно блокируется
точковыми мутациями (например, в 12-м кодоне), приводящими
к проявлению онкогенного потенциала онкобелка р21 [McCrath
et al., 1984]. Получение генно-инженерными методами онко-
белка р21 и его нормального гомолога в Е. coli позволило при-
ступить к детальному изучению их ферментативных активностей
и сопоставить влияние других биологически активных молекул,
принимающих участие в регуляции роста и дифференцировки
клеток, на проявление трансформирующего действия онкобелка.
Т. Kakunage и J. Feramisco (1984) установили, что эпидермальный
фактор роста существенно стимулирует обе ферментативные
функции онкобелка р21, а именно: его связывание с дГТФ и
фосфорилирование онкобелком собственной аминокислоты трео-
нина, а также рецепторов клеточной мембраны для трансферрина
и PDGF.
Все описанные случаи активации Ha-ras-протоонкогена каса-
ются его первого локуса. Активация другого генетического локуса,
c-Ha-ras 2, расположенного в Х-хромосоме клеток человека, пока
никем не показана. Не исключено, что этот локус является псевдо-
геном [O’Brein S. et al., 1983].
Идентификация и изучение механизмов активации протоонко-
генов в опухолях человека существенно ограничены практической
невозможностью получения опухолевого материала строго опре-
деленной стадии малигнизации клетки. Сказанное в особой степени
относится к проблеме получения нормальных, не измененных
клеток-мишеней в качестве контролей. В этой связи важное
значение приобретают хорошо разработанные экспериментальные
системы по индукции опухолей определенной локализации и гисто-
типа канцерогенными веществами. Подобные системы должны
отвечать двум основным требованиям: 1) специфический тип
опухоли должен быть индуцирован в контролируемых эксперимен-
тальных условиях; 2) конкретный тип протоонкогенов должен
быть способен повторно активироваться в каждой опухоли.
S. Sukumar и соавт. (1983) разработали подобную экспери-
ментальную систему и показали, что в каждой из 9 исследованных
карцином молочной железы мышей, индуцированных однократным
введением метилнитрозомочевины 50-дневным самкам крыс линии
Buf/N, активируется протоонкоген c-Ha-ras 1. Молекулярный
анализ одного из этих трансформирующих генов показал, что
12-м кодоном c-Ha-ras 1 вместо ГГА становится ГАА. При этом
в кодируемом белке р21 происходила замена 12-го аминокислот-
279
ного остатка глицина на глутаминовую кислоту. При амино-
кислотном анализе полипептидной цепи, кодируемой вторым экзо-
ном крысиного c-Ha-ras 1, не выявили повреждения 61-й амино-
кислоты. Эти результаты свидетельствуют о том, что опухоли
животных, индуцированные химическим канцерогеном, могут яв-
ляться адекватной моделью изучения роли трансформирующих
генов семейства ras в возникновении опухолей человека [Wein-
berg R., 1982; Sukumar S. et al., 1983J, особенно в случае точковых
мутаций в 12-м‘ кодоне гена Ha-ras.
Метилнитрозомочевина является алкилирующим агентом, пре-
имущественно модифицирующим гуанозиновые остатки ДНК
клеток-мишеней путем метилирования атомов азота и кислорода
соответственно в N7- и О6-положениях. Как следствие этого про-
цесса гуанозиновые остатки могут спариваться с тимидином вместо
дезоксицитозина, что приводит, в свою очередь, к замене основа-
ния ДНК гуанина на аденин (Г-> А). По-видимому, именно таков
механизм злокачественной активации онкогена NMU-Ha-ras
в нормальных клетках эпителия молочной железы крыс, ДНК
которых подвергалась воздействию химического канцерогена
(метилнитрозомочевины NMU) [Sukumar S. et aL, 1983].
В экспериментах на животных было показано, что в опухолях
кожных покровов, индуцированных у мышей MX и ДМБА, также
активируется протоонкоген c-Ha-ras. Механизм генетического
повреждения онкогена Ha-ras в этом случае неизвестен [Bal-
main A., Paragnell J., 1983].
Неожиданные результаты были получены в исследованиях
этих же авторов при изучении онкогенов в доброкачественных
папилломах кожи, индуцированных у мышей ДМБА [Balme п А.
et al., 1984]. В папилломах обнаружена активация онкогена типа
Ha-ras. Авторы полагают, что выяснение типа активации онкогена
Ha-ras может способствовать пониманию механизмов доброкаче-
ственной и злокачественной трансформации. В 5 неродственных
злокачественных опухолях мышей в экспериментах по трансфек-
ции клеток NIH ЗТЗ были идентифицированы разные онкогены
семейства ras [Vonsden К., Marshall С., 1984]. Т-клеточная
лимфома, фибросаркома и гистиоцитарная опухоль (макрофагаль-
ная) содержали активный онкоген типа Ki-ras; в клетках миелоид-
ной лейкемии выявлен Ha-ras, а в клетках карциномы легких —
N-ras. Однако в метастазах указанных опухолей удалось обнару-
жить только онкоген типа Ki-ras.
Протоонкоген c-Ha-ras 1 в нормальных и опухолевых клетках
человека расположен в хромосоме 11 [Martinville В. et al., 1983;
O’Brein S. et aL, 1983; Rowly J., 1983]. Процесс канцерогенеза
у человека, обусловленный активацией Ha-ras, не связан с серьез-
ными изменениями первичной генетической структуры, перестрой-
ками, транслокациями или амплификацией этого протоонкогена
[Yunis J., 1983]. Тем не менее следует отметить, что в опухолевых
клетках человека, например при меланомах, некоторых формах
280
лейкозов, имеются существенные изменения структуры хромо-
сомы 11. Однако специфической связи подобных изменений в этой
хромосоме с активацией c-Ha-ras, а также определенным типом
малигнизации клеток пока не установлено [Gilbert F., 1983; Row-
ley J., 1983|. Более того, в препаратах ДНК из клеток белой крови
больных раком, а также из злокачественных опухолей и опухоле-
вых клеточных линий часто выявляется аллельный вариант
рестрикционных ВатН [-фрагментов локуса онкогена Ha-ras 1.
Обнаруженное изменение не наблюдалось в ДНК здоровых доно-
ров, особенно в семействах с низкой частотой раковых заболева-
ний. Присутствие подобных фрагментов аллельных вариантов
онкогена Ha-ras 1, вероятно, может указывать на чувствительность
(подверженность) людей к возникновению злокачественных за-
болеваний [Krontiris Т. et al., 1985].
КЛЕТОЧНЫЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ
ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА,
РОДСТВЕННЫЕ ПРОТООНКОГЕНУ c-Ki-ras 2
D. Der и соавт. (1982) показали, что трансформанты, полу-
ченные после трансфекции клеток NIH ЗТЗ препаратами ДНК,
изолированными из клеточной линии карциномы легких LX-1,
содержат трансформирующий ген, гомологичный онкогену v-K 
ras. S. Pulciani и соавт. (1982) обнаружили этот же тип транс-
формирующего гена в препаратах ДНК, изолированных из солид-
ных опухолей толстой кишки, легких, поджелудочной железы
и рабдомиосаркомы, а также в клеточных линиях, полученных
из опухолей толстой кишки, легких, поджелудочной железы и
желчного пузыря человека. Перечень опухолей, связанных с акти-
вацией протоонкогена c-Ki-ras 2, представлен в табл. 15.
Эти результаты свидетельствуют в первую очередь о том,
что присутствие трансформирующих генов в ДНК не является
артефактом культивирования опухолевых клеток in vitro, по-
скольку этот же трансформирующий ген обнаружен и в первичных
опухолях, из которых получены опухолевые клеточные линии.
К. Shimizu и соавт. (1983) показали присутствие трансформирую-
щих генов типа Ki-ras в двух карциномах легких (биопсийный
материал) и клеточных линиях опухолей легких [Shimizu К. et al.,
1983]. Рассмотрение механизмов активации протооикогена типа
Ki-ras в опухолях человека, как и в случае с Ha-ras, показало,
что в этом отношении наиболее часто уязвим только один кодон,
а именно 1-й. Активная, трансформирующая форма протооикогена
c-Ki-ras 1 в опухолях человека и животных пока не идентифициро-
вана. В клетках человека этот ген локализован в хромосоме 6,
рядом с протоонкогеном c-myb в области основного гена комплекса
гистосовместимости {O’Brein S. et al., 1983].
A. Eva и S. Aaronson (1983) обнаружили активацию прото-
онкогена c-Ki-ras в двух из четырех мышиных фибросарком.
281
Таблица 15
Клеточные трансформирующие гены человека, родственные протоонкогену
c-Ki-ras 2
		Механизм активации			
Г истотип опухолей	Клеточная линия или	•X а X X	о х	1М ино- го ос- белке	Литературный источник
	номер опухоли	Ь ж « § о о	X to х х О ф to	™ о я Е <« £ о « I о ь.	
		с 2	X х	СО X 1-0.	
Рак легкого	LX-I (клетки)	—		—		D. Der (1982)
Карцинома	1615 (опухоль)	—	—	—	С. Pulciani и соавт. (1982)
» поджелудочной	1189	—	—	—	>
железы	(опухоль)				
Эмбриональная рабдо-	1085		—	—	»
мносаркома	(опухоль)				
Карцинома	А427 и	-—		—	>
легкого	A2I82 (клетки)				
желчного пузыря	А1604 (клетки)	—	——	——	»
толстой кишки	А2233 (клетки)	—	-—	—	>
	1665 (опухоль)	—	—	—	>
	2033 (опухоль)	—	—	—	>
Карцинома:	А1698	—.	—	—	С. Pulciani
мочевыводяших пу- тей (мочевой пузырь)	(клетки)				и соавт. (1984)
толстой кишки	SK-CO-1	—-	-—	—	К. Shimizu и
	(клетки)				соавт. (1983)
легких	SK-Lu-1	—	—	—	К- Shimizu и
	(клетки)				соавт. (1983)
	Calu-1	12-й	г-*т	гл и-►	D. Capon и соавт.
	(клетки)			цис	(1983),
					М. McCoy и соавт.
					(1983); К Shimizu и соавт. (1983)
толстой кишки	SW-480	12-й	г-*т	гли—*	D. Capon
	(клетки)			вал	и соавт. (1983)
Примечание. ( —) — механизм активации протооикогена не изучен
индуцированных метилходантреном. Механизм активации этого
локуса под действием канцерогена пока неизвестен [Eva А.,
Aaronson S., 1983].
Недавно две группы исследователей одновременно построили
первичную генетическую структуру онкогена c-Ki-ras 2 и опре-
делили место генетического повреждения в двух соответствующих
трансформирующих генах, изолированных из клеток карциномы
толстой кишки человека (линия SW-480) и клеточной линии
282
карциномы легкого Calu-1 [Shimizu К. et aL, 1983; Capon D.
et al., 1983]. Клеточная линия карциномы легких Calu-1 содержит
трансформирующий ген c-Ki-ras 2, который кодирует в 12-м по-
ложении белка р21 аминокислоту цистеин вместо глицина. Для
клеточной линии SW-480 D. Capon и соавт. (1983) показали
наличие аминокислоты валина в 12-м положении белка р21.
На основе этих данных можно сделать вывод о том, что акти-
вация протоонкогена c-Ki-ras 2 также связана с повреждением
12-го кодона, как и в случае активации протоонкогена Ha-ras
в клеточных линиях рака мочевого пузыря EJ и Т24. Очевидно,
единичная точковая мутация в онкогене ras и замена 12-й амино-
кислоты в нормальном белке р21 являются «горячей точкой»
в процессе мутационной активации семейства онкогенов ras.
Клеточная линия карциномы легких Calu-1 оказалась гетеро-
зиготной, т. е. содержащей активированный тип, имеющий мута-
цию, и нормальную неповрежденную аллель c-Ki-ras 2. Напротив,
клеточная линия SW-480 (карцинома толстой кишки) имеет мута-
цию в 12-м кодоне обеих аллелей локуса c-Ki-ras 2, которые
транскрибируются в опухолевых клетках приблизительно с одина-
ковой степенью эффективности. Отличия двух аллелей заключа-
ются лишь в единичной замене нуклеотидов в нетранслируемом
участке гена [Shimizu К. et al., 1983; Capon D. et aL, 1983]
K. Shimizu и соавт. высказали предположение о том, что белковый
продукт р21 трансформирующих генов семейства ras, вероятно,
состоит из константной и вариабельной областей. Вариабельная
область может формировать физиологически важный компо-
нент — комбинированный участок, позволяющий каждому новому
продукту гена ras взаимодействовать с различными клеточными
и экстрацеллюлярными мишенями [Land Н. et al., 1983; Shimizu К.
et aL, 1983]. Если предположение авторов правильно, то это
в какой-то мере может объяснить неясности, возникающие при
изучении онкогенов опухолей человека, а именно: почему близко-
родственные в структурном отношении гены семейства ras связаны
с широким кругом фенотипически различных опухолей.
Изученные физико-химические свойства продукта гена c-Ki-
ras 2, белка р21, оказались неотличимыми от продукта гена
c-Ha-ras 1 [Ellis R. et aL, 1981; Tsuchida N. et aL, 1982].
Протоонкоген c-Ki-ras 2, по данным гибридизации in situ
и соматической гибридизации, в нормальных и опухолевых клетках
человека расположен в хромосоме 12. При активации в большин-
стве опухолей человека этот локус не претерпевает видимых
изменений, лишь в некоторых случаях (линия клеток SW-480)
обнаружена амплификация c-Ki-ras 2 [McCoy М. et al., 1983;
McGrath J. et aL, 1983; O’Brein S. et aL, 1983]. Однако следует
подчеркнуть, что ряд злокачественных новообразований человека
связан с существенными перестройками и транслокациями, обна-
руживаемыми в хромосомах 11 и 12 [Gilbert F., 1983; Rowley J.,
1983].
283
КЛЕТОЧНЫЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ЧЕЛОВЕКА,
РОДСТВЕННЫЕ ПРОТООНКОГЕНУ N-ras
К. Shimizu и соавт. (1983) первыми описали новый транс-
формирующий ген, названный ими N-ras, в клетках нейробластомы
человека линии SK-N-SH. Ген оказался слабогомологичным
(по данным гибридизации) онкогенам v-Ha-ras и Ki-ras. Этот тип
трансформирующего гена был изолирован также из клеточной
линии НТ-1090 — фибросаркомы человека, клеточной линии RD —
рабдомиосаркомы человека, а также из клеток промиелоцитарной
лейкемии HL-60 [Hall A. et aL, 1983]. Наконец, ряд авторов
обнаружили трансформирующие гены типа N-ras в клетках лим-
фомы Беркитта, линии AW Ramos, в случае острого миелоидного
лейкоза и в аденокарциноме толстой кишки (табл. 16). Как видно
из табл. 16, онкоген N-ras, как и другие представители семейства
N-ras, связан с довольно широким спектром опухолей человека
[Myata Т., Yasunaga Т., 1983; Eva A. et aL, 1983; Hall A. et al., 1983;
Shimizu К. et aL, 1983]. Гибридизационный анализ препаратов
ДНК донорских опухолевых клеток показал, что их неопластиче-
ское состояние не связано с видимыми генными перестройками
локуса N-ras. Пока не отмечены транслокации или амплификации
этого трансформирующего гена, локализованного в хромосоме I
[Martinville В. et al., 1983].
N-ras представляет собой один из первых клеточных прото-
онкогенов, пока не обнаруженных в ретровирусах животных.
Очевидно, по неизвестным причинам этот локус чем-то неудобен
для трансдукции в ретровирусный геном.
Е. Taparowsky и соавт. (1983) установили, что ген N-ras
в клетках нейробластомы человека имеет единичную точковую
мутацию с заменой нуклеотида в клеточном протоонкогене
в 61-м кодоне для трансформирующего белка р21. Замена Ц—>А
приводит к включению аминокислоты лизина вместо глутамина
(глю—клиз) (см. табл. 16).
Аналогичный тип замены оснований ДНК 61-го кодона N-ras
обнаружен также в клетках фибросаркомы человека линии
НТ-1080 [Brown R. et aL, 1984]. Этот вариант активации онкогенов
семейства ras, касающийся 61-го кодона, был установлен ранее
в трансформирующем гене c-Ha-ras клеточной линии Hs-242,
происходящей из карциномы легкого, где Y. Yuasa и соавт. (1983)
впервые определили замену нуклеотида в 61-м кодоне.
Повреждение, ответственное за активацию онкогена N-ras
клеток рака легкого (клеточная линия SW-1271), также касается
61-го кодона, однако в этом случае впервые выявлена А->Г
замена оснований ДНК. В результате такой замены оснований
61-го кодона N-ras вместо аминокислоты глутамин в 61-м положе-
нии белка р21 присутствует аргинин [Yuasa Y. et aL, 1984].
С учетом известных данных относительная частота изолирования
трансформирующих генов семейства ras в экспериментах по транс-
284
Таблица 16
Клеточные трансформирующиеся гены человека, родственные протоонкогену N-ras
Г истотип опухолей	Клеточная линия	Механизмы активации			Литературный источник
		Повреж- денный кодон	Измене- ния ну- клеоти- дов	Замена амино- кислот- ного ос- татка	
Нейробластома	SK-N-SH	61-й	Ц-А	глю-»-лиз	К- Shimizu и соавт. (1983)
Фибросаркома	НТ 1080	61-й	Ц^А	глю-*лиз	A. Hall и соавт. (1983)
Рабдомиосаркома	RD		—	——	R. Brown и соавт. (1984)
Промиелоцитарная лейкемия	HL-60	—	—	—	М. Murray и соавт. (1983)
Лимфома Беркитта	AW Ramos	—	—	—	То же
Острая миелоидная	—	—	—	—	>
лейкемия					
Аденокарцинома	—	—	—	—	>
толстой кишки					
Острая лимфоидная лейкемия	МО LT-3	—	—	—	A. Eva и соавт (1983)
Аденокарцинома легких	SW-I27I	61-й	А+Г	глю-^арг	Y. Yuasa и соавт. (1984)
Острый миелоидный лейкоз	Клетки костного мозга	—	—	—	С. Gramble и соавт. (1984)
Примечание. (—) — механизм активации протоонкогеиа не изучен
фекции клеток NIH ЗТЗ, а следовательно, и их возможного участия
в индукции неоплазм человека достигает уже примерно 15%
[Pulciani S. et al., 1982]. Одна из возможных причин большей
частоты выявления трансформирующих генов семейства ras в опу-
холях заключается в том, что эти онкогены в силу каких-то своих
естественных особенностей легче, чем другие, обнаруживаются
именно в системе клеток N1H ЗТЗ. Причины этого явления уже
обсуждены нами выше.
Ряд трансформирующих генов, которые не принадлежат
к семейству ras, также могут быть обнаружены в экспериментах
по трансфекции клеток NIH ЗТЗ.
ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ B-lym И Т-1ут
В опытах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ препаратами ДНК
из куриной В-клеточной лимфомы, G. Goubin и соавт. (1983)
выявили трансформирующий ген, неидентичный ранее известным
онкогенам остротрансформирующих ретровирусов животных.
Позже A. Diamond и соавт. (1983) показали, что такой же тип
трансформирующего гена присутствует в 6 клеточных линиях
285
лимфомы Беркитта. В связи с тем, что указанные неопластические
процессы ассоциированы с трансформацией В-лимфоцитов, этот
онкоген получил название B-lym. Геном клеток человека и кур
содержит целое семейство протоонкогенов B-lym (около 6—8 локу-
сов), имеющих значительную гомологию друг с другом [Cooper G.,
1984J. Анализ нуклеотидных последовательностей клонированного
трансформирующего гена и его теоретически построенная модель
онкобелка свидетельствуют о частичной гомологии его аминотер-
минального домена аминокислотных остатков онкобелка с транс-
феррином — белком, участвующим в регуляции (стимуляции)
пролиферации клеток, культивируемых in vitro. Размер транс-
формирующего гена B-lym 1 человека определен. Он меньше
0,95 т. п. о. Активация этого гена в клетках лимфомы Беркитта
не связана с амплификацией или генными перестройками. В кон-
тексте трансформации В-лимфоцитов следует рассматривать
также амплификацию и транслокацию гена c-myc из хромосомы 8
в хромосому 14 или 22, также часто встречающуюся в лимфомах
Беркитта. Вероятно, в неопластический процесс, приводящий
к трансформации В-лимфоцитов и формированию лимфомы Бер-
китта, вовлечены как минимум три трансформирующих гена:
N-ras, c-myc и B-lym 1 [Dalla-Favera R. et aL, 1982; De Klein A.
et al., 1982; Collins S., Groude M., 1982; Klein G., 1983; Murray M.
et aL, 1983; Neuberger M., Calabi F., 1983; Nushikura K. et aL,
1983].
В экспериментах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ препаратами
ДНК из Т-клеточных лимфом человека был выявлен новый, стадие-
специфический онкоген T-lym 1 [Lane М.-А. et aL, 1984]. T-lym I
не имеет гомологии с известными вирусными онкогенами и не гомо-
логичен трансформирующему гену B-lym 1. По предварительным
данным, размер этого онкогена равняется I—2 т. п. о.
НЕИДЕНТИФИЦИРОВАН НЫЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ
М. Lane и соавт. (1982) первыми обнаружили трансформирую-
щие свойства препаратов ДНК из Т- и В-клеточных лимфом
мышей и человека в культуре клеток NIH ЗТЗ. В экспериментах
по трансфекции авторы установили, что трансформирующий
потенциал рестрикционных фрагментов испытуемых препаратов
ДНК различен. Использование эндонуклеаз рестрикции и получае-
мых с их помощью фрагментов ДНК позволило достаточно точно
определить родство трансформирующих генов. Авторы на основе
полученных данных предположили, что на различных стадиях
превращения В-лимфоцитов в опухолевые клетки активируется
несколько трансформирующих генов. Один из них, например
tx-1, участвует, по-видимому, в злокачественной трансформации
лимфоцитов [Cooper G., 1984]. Авторами идентифицировано как
минимум 10 типов трансформирующих последовательностей,
отличающихся по чувствительности или резистентности к отдель-
286
ным рестриктазам, в четырех В- и двух Т-клеточных лимфомах.
При этом онкоген tx-2 оказался связанным с миелолейкозами,
a tx-3 — со зрелыми Т-клеточными неоплазмами. Однако, чтобы
сделать определенные выводы об истинной роли тех или иных
онкогенов, необходима дальнейшая работа, в частности молеку-
лярная характеристика этих потенциальных, специфичных для
определенной стадии дифференцировки трансформирующих генов.
В опытах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ трансформирующие
гены были также обнаружены в препаратах ДНК из опухолей
молочной железы человека и молочных желез мышей, индуциро-
ванных химическим канцерогеном [Lane М. et al., 1981]. Транс-
формирующий потенциал рестрикционных фрагментов ДНК опу-
холей мышей и человека в культуре клеток NIH ЗТЗ был идентич-
ным. Эти данные свидетельствуют о присутствии и активации
в указанных опухолях родственных трансформирующих генов
типа mam или tx-4. Основываясь на данных по чувствительности
трансформирующих последовательностей к эндонуклеазам ре-
стрикции и на их сопоставлении с физической картой протоонко-
гена c-Ha-ras рака мочевого пузыря, авторы сделали вывод об
отличии онкогена рака молочной железы мышей от онкогенов
семейства ras. Однако результаты, полученные позже группами
М. Barbacid [Sukumar S. et aL, 1983] и К. Willecke [Князев П. Г.
и др., 1984; Schafer A. et aL, 1984], свидетельствуют об обратном:
клетки рака молочной железы человека линии SK-BR-3, а также
9 проанализированных опухолей молочной железы крыс, индуци-
рованных метилнитрозомочевиной, содержали в составе ДНК
трансформирующие гены, гомологичные онкогену v-Ha-ras.
Не исключено, что в рассмотренных экспериментах по изуче-
нию и предварительной идентификации трансформирующих генов
рака молочной железы у разных видов животных и некоторых
клеточных линий нет противоречия. В предыдущих разделах
книги уже были приведены данные о возможности обнаружения
нескольких типов онкогенов в клеточных линиях, происходящих
из опухолей одинакового гистотипа (см. табл. 14, 15, 16). D. Becker
и соавт. (1982) сообщили, что антиген gp86 специфическим обра-
зом связан с экспрессией переносимых в трансфекции транс-
формирующих генов карцином молочной железы человека и мы-
шей, обнаруженных М. Lane и соавт. (1981). К сожалению, пока
неясно, является ли гликопротеид gp86 белком, кодируемым экзо-
генным трансформирующим геном, или он производится самими
трансформированными клетками NIH ЗТЗ, т. е. является продук-
том экспрессии эндогенного протоонкогена [Becker D. et al., 1982].
Опухолевые клетки, из которых выделяются препараты ДНК,
содержащие трансформирующие гены, существенно отличаются
от клеток, используемых в качестве реципиентных в экспериментах
по трансфекции. Так, онкогены, происходящие из перечисленных
в табл. 14, 15, 16 опухолей человека и животных, могут транс-
формировать мышиные клетки NIH ЗТЗ. Это является опре-
287
деленным доказательством того, что тот или иной конкретный
онкоген, например EJ-c—Ha-ras, способен трансформировать
клетки генетически неродственных тканей. Последний факт также
указывает и на известный недостаток существующих эксперимен-
тальных подходов. Не исключено, что иной онкоген, трансформи-
рующий, например, только нормальные клетки эпителия мочевого
пузыря человека данным методом, никогда не будет выявлен
в системе клеток NIH ЗТЗ. Вероятно, это может служить еще одним
из объяснений тому факту, что, по данным опытов с трансфекцией
клеток NIH ЗТЗ только около 15—20 % из изученных опухолевых
клеточных линий человека содержат активные онкогены, функ-
ционирующие в данной клеточной системе [Pulciani S. et al., 1982;
Weinberg R., 1982,. Возможно, остальные 80 % опухолей человека
содержат онкогены, которые требуют для их выявления других
чувствительных реципиентных клеток, компетентных к экспрессии
иного уникального онкогена, ответственного за реализацию своего
специфического этапа онкогенеза. В большинстве опытов по транс-
фекции в качестве реципиентных культур используются фибро-
бласты грызунов, которые могут быть нечувствительными к тому
или другому специализированному онкогену. С другой стороны,
у клеток грызунов (гетерологическая модельная система) есть
важное преимущество — в них значительно легче обнаружить
методами молекулярной гибридизации перенесенные и функцио-
нирующие онкогены. Эти гены, как правило, по сайтам рестрикции
отличаются от эндогенных аллелей протоонкогенов. Следует учи-
тывать и тот факт, что некоторые онкогены могут действовать
как рецессивные или как слаботрансформируюшие аллели, не-
выявляемые в используемой в настоящее время постановке экспе-
риментов по трансфекции. Не случайно остаются пока безуспеш-
ными попытки обнаружить трансформирующие гены человека
при использовании в качестве реципиентных клеток диплоидных
фибробластов человека и животных [Князев П. Г. и др., 1980;
Land Н. et aL, 1983,.
Ограничения в поиске и выделении онкогенов человека и
животных, накладываемые современной техникой трансфекции,
могут быть частично преодолены. Одним из новых подходов для
выявления активных трансформирующих генов является изучение
их структуры с помощью гибридизации по Саузерну в различных
модификациях. Использование Саузерн-блот-гибридизации позво-
лило обнаружить измененные (активированные) клеточные прото-
онкогены myc, myb и abl в нескольких типах опухолей человека
и мышей невирусной этиологии [Alitalo К. et aL, 1983; Schwab М.
et al., 1983|. Повреждение указанных онкогенов выражалось
в их амплификации и гиперэкспрессии [Collins S.t Groudine М.,
1982; Newbold R„ Overell R„ 1983).
Еще одной группой неидентифицированных трансформирую-
щих генов, также не связанных с онкогенами ретровирусов млеко-
питающих, являются онкогены нейробластом и глиобластом крыс.
288
индуцированных трансплацентарно этилнитрозомочевиной (Shih С.
et aL, 1981; Huh N. et al., 1983]. После 2—3 циклов трансфекции
клеток NIH ЗТЗ препаратами ДНК, изолированными из нейро-
и глиобластом, возникают очаги независимой от субстрата про-
лиферации, которые уже в 3-м и 4-м циклах трансфекции по своей
морфологии существенно отличаются от исходных реципиентных
клеток [Shih С. et al., 1979]. Трансформирующие гены, получившие
название пен, не имеют пока аналогов среди уже известных
клеточных протоонкогенов. Характерной особенностью трансфор-
мантов клеток NIH ЗТЗ, индуцированных онкогеном пей, является
продукция ими белка с молекулярной массой 185 кд (р!85).
Этот белок обнаружен также в донорских клетках и всегда
каким-то образом связан с онкогеном [Shih С. et aL, 1981].
Суммируя данные по группе трансформирующих генов, обна-
руженных в опытах трансфекции, но не имеющих аналогов среди
ретровирусных онкогенов, можно сделать следующее заключение.
Онкогены пей и mam (tx-4), по-видимому, структурно и био-
логически являются несовместимыми с аппаратом и механизмом
их трансдукции в ретровирусы. Вероятно, дальнейший поиск
трансформирующих генов в химически индуцированных опухолях
разных гистотипов и локализаций приведет к идентификации
новых, еще неизвестных онкогенов.
Завершая этот раздел, следует отметить, что совершенствова-
ние метода трансфекции, его модификации будут способствовать
дальнейшему выявлению онкогенов в опухолях человека и живот-
ных. Ряд авторов, например, эффективно использовали лигиро-
вание донорских клеток ДНК с LTR. В этих опытах впервые
в системе клеток NIH ЗТЗ был выделен из опухолей человека
онкоген raf [Muller R. et aL, 1984]. К весьма перспективным
методам обнаружения и выделения онкогенов следует отнести
данные, полученные Y. Tsujincoto и соавт. (1984). Авторы впервые
клонировали онкоген bcl-1, присутствующий в точке разрыва
хромосомы 11 в клетках В-клеточной лимфомы человека. Этот
онкоген оказался негомологичным известным на сегодня вирусным
и клеточным онкогенам. Вероятно, этот подход позволит иденти-
фицировать серию онкогенов, имеющих общий механизм актива-
ции, ассоциированный с транслокациями.
ВЛИЯНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК
НА ЭКСПРЕССИЮ ОНКОГЕНОВ
Различные механизмы активации клеточных протоонкогенов
в трансформирующие онкогены рассмотрены в одном из предыду-
щих разделов этой книги (гл. 4). Поэтому здесь мы опишем лишь
один дополнительный биологический феномен, также модифици-
рующий трансформирующие гены с далекоидущими функцио-
нальными последствиями. Мы имеем в виду процесс метилирова-
ния ДНК и его роль в экспрессии онкогенов.
19 Заказ 380
289
Благодаря большому числу новых работ с использованием
методов генной инженерии в области изучения механизмов
экспрессии генов были получены важные результаты, положенные
в основу гипотезы о роли метилирования ДНК, в частности
цитозиновых нуклеотидов, в контроле генной активности. Эти
результаты указывали на то, что слабое метилирование клеточных
генов, как правило, сопровождается более активной экспрессией
генетической информации.
Гипотеза постсинтетической (посттранскрипционной) модифи-
кации ДНК как основы клеточной дифференцировки была сфор-
мулирована R. Holliday и J. Pugh (1975). Эти авторы предполо-
жили, что минорное основание б'-метилцитозин, которое обнару-
жено в ДНК всех изученных высших эукариотов, играет важную
роль в процессе транскрипции, поскольку именно метилирование
является сутью посттранскрипционной модификации ДНК. Еще
одним минорным основанием ДНК, подвергающимся метилиро-
ванию, является аденин (после метилирования — 6-метиламино-
пурин). Влияние степени метилирования аденина на процесс
экспрессии генов практически не изучено, поэтому далее будут
рассмотрены вопросы, связанные с метилированием цитозина.
Метилирование цитозина в последовательности б'-ЦГ осуще-
ствляется путем переноса метильной группы СНз от аденозил-
метионина с помощью метилазы (метилтрансферазы) в процессе
репликации ДНК. При этом донор СНз-группы, S-аденозилметио-
нин, превращается в S-аденозилгомоцистеин. Аналогичным обра-
зом происходит процесс превращения аденина в 6-метиламинопу-
рин. Метилтрансфераза функционирует на дуплицирующейся цепи
ДНК таким образом, что вновь синтезированная нить ДНК
в отношении степени метилирования становится идентичной мат-
рице. Именно поэтому метилирование наследуется в процессе
транскрипции ДНК. Однако практически лишь 2—7 % цитозинов
метилировано в ДНК клеток млекопитающих. С другой стороны,
процесс деметилирования сопровождается наследственно закреп-
ленным усилением экспрессии генетической информации.
В 1977 г. J. Christman и соавт. (1977) обнаружили корреляцию
между гипометилированным состоянием ДНК ч экспрессией глоби-
новых генов в клетках мышиной эритролейкемии. Использование
рестрикционных нуклеаз и блот-гибридизации по Саузерну позво-
лило более детально изучить влияние метилирования специфи-
ческих сайтов ДНК на экспрессию генов. Две группы ферментов
(изошизомеры) оказались полезными в этом отношении: а) Нра II,
способная «разрезать» последовательность 5,-Ц(т,-ЦГГ-3,> если
цитозин пары ЦГ не метилирован; Msp 1, способная «разрезать»
ту же последовательность, в которой Ц метилирован в динуклео-
тиде ЦП1Г, но не ЦЦ; б) Hha I, неспособная расщеплять последо-
вательность 5,-ЦГЦпT-3,, если цитозин пары ЦтГ метилирован;
Cfo I, способная «разрезать» ту же последовательность, незави-
симо от метилирования цитозинов этого сайта [Bird А., 1978|.
290
Важные результаты, подтверждающие связь метилирования
ДНК с экспрессией генетической информации и дифференци-
ровкой, были получены при использовании аналога цитозина,
5'-азацитидина (т. е. цитозин, в котором углерод в 5-м положении
заменен на атом азота, вследствие чего он не может быть метили-
рован) .
Рибоза
б'-метил цитозин
Рибоза
5-азацитидин
Р. Jones и S. Taylor (1980) показали, что б'-азацитидин
тормозит метилирование вновь синтезированной ДНК в условиях
культуры клеток. Авторы обнаружили, что присутствие этого
аналога цитозина в клеточной культуре индуцирует в эмбрио-
нальных клетках мышей формирование мышечных клеток. Следо-
вательно, в данном случае снижение уровня метилирования ДНК
прямым образом влияло на миогенную дифференцировку. В по-
следующем изучение связи экспрессии различных генов, например
генов металлотионина и овальбумина с их метилированием под-
твердило это положение.
R. Jaenisch и соавт. (1982) получили результаты, свидетель-
ствующие о существенном влиянии метилирования ДНК на экс-
прессию эндогенных провирусных генов, интегрированных в раз-
личные участки мышиного генома. Провирусные геномы, которые
не экспрессировались и поэтому были неинфекционны в экспери-
ментах по трансфекции, оказались высокометилированными
[Jaenisch R., 1982]. Напротив, удаление метильных групп путем
особого клонирования генов в векторах бактериальных систем
способствовало превращению провирусов в экспрессируемые,
высокоинфекционные [Simon D. et al., 1983].
На сегодня только незначительное число исследований посвя-
щено изучению связи экспрессии протоонкогенов с метилирова-
нием их экзонов и интронов, а также прилежащих и усиливающих
последовательностей. Два протооикогена, c-mos и c-ras, были
изучены в этом отношении более детально, поэтому мы рассмотрим
эти работы подробнее.
Скрининг экспрессии различных протоонкогенов в многочис-
ленных клеточных линиях нормального и опухолевого происхож-
дения показал, что в них не экспрессируется лишь протоонкоген
c-mos. Поэтому ген c-mos можно в принципе отнести к «молчашим>
генам [Blair D. et al., 1981; Watson R. et al., 1982; Muller R„ 1983;
Murray M. et al., 1983]. Тем не менее, экспрессия протооикогена
c-mos была все же обнаружена в клетках злокачественной мела-
19’
291
номы мышей, где отмечены существенные перестройки этого гена,
и в двух опухолевых крысиных клеточных линиях нейроэкто-
дермального происхождения, сериях TV и GV [Huh N. et aL, 19831.
Группа Dino-Dina [Cattoni S. et aL, 1982] изучила метилирован-
ность «молчащего» гена c-mos в клеточных линиях мышей и крыс,
трансформированных вирусом саркомы мышей (несущим онкоген
v-mos) или химическими веществами. Оказалось, что в обоих
случаях протоонкоген c-mos был гиперметилирован, тогда как
v-mos — интегрированный в мышиный геном и экспрессируемый —
был гипометилирован. Для определения степени метилированности
протоонкогена c-mos авторы использовали двойную рестрикцию
образна ДНК разными эндонуклеазами: Sac 1, «вырезающей»
весь c-mos, и Нра II или Msp I, «узнающими» метилирование
цитозина в б'-ЦГ-последовательности [Gattoni S. et aL, 1982].
A. Feinberg и В. Vogeltein (1983), используя генно-инженерную
технику, определили уровень метилирования двух клеточных
протоонкогенов — Ha-ras и Ki-ras — в нескольких аденокарцино-
мах кишечника человека и сопоставили их метилированность
с таковой Ha-ras и Ki-ras в препаратах ДНК прилежащего к опу-
холи нормального эпителия. Авторы обнаружили относительное
гипометилирование протоонкогена в 6 из 8 аденокарцином. Эти же
исследователи показали, что некоторые нормальные гены человека,
например гормона роста и сх-глобина, существенно гипометили-
рованы в ряде карцином кишечника и легких по сравнению
с прилежащими к опухоли здоровыми тканями. Гипометилирова-
ние этих генов было еще более значительным в метастазах опухоли
в селезенку {Feinberg A., Vogelstein В., 1983]. Эти результаты
дают достаточно удовлетворительное объяснение также феномену
ненормального синтеза некоторых гормонов и эмбриональных
белков опухолевыми клетками, причиной которого может быть
гипометилированное состояние соответствующих генов. На основа-
нии этих данных можно предполагать, что ненормальная экспрес-
сия некоторых генов при раке, возможно, является результатом
нарушения процесса метилирования ДНК [Feinberg A., Vogel-
stein В., 1983].
Нам также удалось показать [Huh N. et а!.. 1983] связь
экспрессии генов со степенью их метилирования. Так, было уста-
новлено, что экспрессия Ha-ras в опухолях мозга крыс, индуци-
рованных этилнитрозомочевиной (клеточные линии серий ВТ,
GV и TV) [Laerum D., Rajewsky M , 1975], коррелировала с его
относительным гипометилированием. В эмбриональных клетках
мозга крыс (клетки-мишени), где также имеет место экспрессия
Ha-ras, было отмечено снижение уровня метилирования указан-
ного протоонкогена, о чем судили по результатам действия
рестриктаз Нра II/Msp I, распознающих метилированные и не-
метилированные основания.
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют
в пользу мутационной природы относительного гипометилирования
292
Ha-ras и связанной с этим состоянием активацией его экспрессии
после взаимодействия ДНК клеток-мишеней с этилнитрозомоче-
виной [Huh N. et al., 1983].
Сравнение степени метилированности трансформирующих ге-
нов c-Ha-ras, идентифицированных в трех неоплазмах человека
(злокачественная меланома, рак молочной железы, нейробла-
стома), с таковой у эндогенного мышиного протоонкогена c-Ha-
ras клеток NIH ЗТЗ показало четкие различия. Так, в первичных
трансформантах клеток NIH ЗТЗ, возникающих в результате
трансфекции препаратами ДНК указанных опухолей, обнаружены
высокий уровень экспрессии онкогена c-Ha-ras и его гипометили-
рованное состояние. Напротив, Ha-ras исходных клеток NIH ЗТЗ
не экспрессировался, и было показано его гиперметилированное
состояние [Huh N. et al., 1983].
Высокую чувствительность клеток NIH ЗТЗ мышей к транс-
формирующим генам семейства ras человека и других видов
животных можно объяснить низкой степенью метилирования
рестрикционных сайтов эндонуклеаз Нра II/Msp I, содержащих
б'-ЦГ-последовательности, и поэтому высоким уровнем экспрессии
соответствующего онкогена. Интеграция в процессе трансфекции
гипометилированного онкогена Ha-ras в геном пренеопластических
клеток мышей N1H ЗТЗ приводит к его активной экспрессии.
В результате, синтез белка р21 и его взаимодействие с клеточной
мишенью сопровождаются злокачественной трансформацией реци-
пиентных клеток NIH ЗТЗ, захвативших трансформирующий ген.
В условиях трансформации клеток N1H ЗТЗ переход этих
полутрансформированных клеток в неопластические, возможно,
зависит от функции нескольких, как минимум двух, онкогенов:
экзогенного гипометилированного, вносимого с экстрацеллюляр-
ной ДНК, и активируемого в процессе неопластической транс-
формации собственного эндогенного гипотетического гена, обес-
печивающего пренеопластический фенотип реципиентных клеток
N1H ЗТЗ.
Предложено несколько моделей деметилирования генов (прото-
онкогенов) , что, как уже указывалось выше, приводит к экспрессии
«молчащих» генов. С этой точки зрения мутации и транслокации
можно рассматривать как своеобразный биологический экви-
валент деметилирования гена, влекущего за собой активацию
экспрессии. В первом случае происходит замена 5'-метилцитозина
на другое неметилированное основание ДНК, а во втором — ген
попадает в иное окружение, не контролируемое репрессорами.
Завершая рассмотрение своеобразного механизма активации
и регуляции экспрессии протоонкогенов путем изменения степени
метилированности оснований ДНК, следует подчеркнуть, что раз-
витие состояния гипометилирования ДНК может сопровождаться
также изменением ее конформационных свойств, способствуя
переходу ДНК в форму Z [Toth В., 1975]. Не исключено, что
изменение метилирования ДНК влияет на взаимодействие нуклеи-
293
новой кислоты с гистонами, определяя тем самым способность
отдельных генов к экспрессии.
Можно высказать и другие предположения. Однако на основе
имеющихся в настоящий момент лишь немногочисленных данных
о влиянии метилирования ДНК на экспрессию генетической инфор-
мации трудно сделать однозначное заключение об истинной роли
этого процесса в превращении протоонкогенов в онкогены.
И все же обнаружение связи степени метилирования ДНК
с экспрессией генов, в частности в ходе клеточной дифферен-
цировки и онкогенеза, позволяет уже сегодня лучше понять детали
молекулярного механизма возникновения некоторых форм зло-
качественных новообразований человека, а также спонтанных
и индуцированных опухолей животных.
ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТЬ активации онкогенов
Обнаружение в геноме клеток позвоночных сравнительно
большого числа онкогенов можно толковать двояко. С одной
стороны, этот биологический феномен, казалось бы, соответствует
принципу — каждой опухоли свой онкоген. Это подразумевает
высокую степень тканеспецифичности отдельных онкогенов. С дру-
гой стороны, существование нескольких онкогенов в опухолях
может свидетельствовать о многоэтапном характере процесса
онкогенеза, каждая ступень которого для реализации требует
участия своего специфического агента.
Рассмотрим первый вариант.
Ряд авторов считают, что из всего многообразия протоонко-
генов каждый активируется только в определенном типе ткани
и, следовательно, специализирован на трансформацию конкретных
клеток-мишеней. Эта простая схема активации онкогенов и их
взаимоотношения с неопластическими процессами пока не находят
солидного экспериментального подтверждения. Так, трансфор-
мирующий ген N-ras, который был обнаружен в опытах по транс-
фекции, связан с саркомами, лимфомами, миелолейкозом, раком
толстой кишки и нейробластомами человека [Eva A. et aL, 1983;
Hall A. et al., 1983; Murray M. et al., 1983; Shimizu K. et al., 1983;
Taparowsky A. et al., 1983]. Другой онкоген, c-myc, также вовлечен
в трансформацию широкого круга в этом случае гистогенетически
неродственных клеток и вероятно, активируется при малигнизации
гемопоэтических клеток, клеточных элементов нервной системы,
в частности в нейробластомах (в последнем случае c-myc получил
название N-myc) и в нейроэндокринных опухолях толстой кишки
[Dalla-Favera R. et aL, 1982; Collons S., Groudine M., 1983;
Schwab M. et aL, 1983].
Еще два трансформирующих гена, уже семейства ras, нередко
обнаруживаются в экспериментах по трансфекции; они также свя-
заны с широким спектром гистологических типов опухолей чело-
века и животных.
294
Это может означать, что протоонкогены ras и тус, с одной
стороны, малоспецифичны в отношении гистотипов трансформи-
руемых биологических субстратов, с другой — высокочувстви-
тельны к активации в разнообразных тканях. Иными словами,
оба онкогена способны влиять на поведение широкого круга
нормальных клеток.
Таким образом, отсутствие тканеспецифичности в активации
протоонкогенов семейства генов ras и тус очевидно. Однако
это положение вряд ли может быть распространено на все извест-
ные онкогены. Некоторые новые и пока малоохарактеризованные
онкогены, как было показано, специфически ассоциированы с кон-
кретным типом опухолей. К ним относятся онкоген лимфом кур
и человека В-1ут, стадиеспецифический онкоген T-lym, а также
онкогены mam (tx-4) и neu. В отношении онкогена пей появились
предварительные данные, свидетельствующие о том, что он при-
надлежит к онкогенам семейства src, а именно: neu высоко-
гомологичен v-erb В [Schechter A. L. et aL, 1984]. Наконец,
G. Cooper и соавт. (1982) показали, что в процессе трансформации
В-лимфоцитов, т. е. на последовательных стадиях дифференци-
ровки лимфоидных клеток, активируется несколько онкогенов,
имеющих уникальную природу. Поэтому нам представляется,
что более адекватной схемой активации серии протоонкогенов
и их связи с возникновением и развитием опухолей может быть
следующая. В процессе дифференцировки клеток существуют
разные уровни специализации. Общий уровень характеризуется
низкой степенью дифференцировки клеток, специальный — высо-
кой степенью дифференцировки. Онкогены семейства ras и, воз-
можно, тус можно было бы отнести к онкогенам общего уровня
дифференциации. С их включением должен наступать конечный
этап прогрессии опухоли, многостадийного превращения нормаль-
ной клетки в раковую.
Как видим, это объяснение уже приближается ко второму
варианту толкования множественности онкогенов. Кратко оно
сводится к следующему: онкогенез — многостадийный процесс,
каждая ступень которого осуществляется отдельным специфи-
ческим онкогеном. В этом есть известный параллелизм с процессом
дифференциации, созревания клеток. Он является также много-
ступенчатым процессом, состоящим из последовательного включе-
ния и выключения «каскада» генов. Возможно, указанная анало-
гия неслучайна. Не исключено, как думает G. Cooper (1982),
что в отношении неоплазм лимфоидной природы неуправляемые
гены отдельных этапов дифференцировки суть онкогены, ассо-
циированные с различными стадиями онкогенеза. Эта интересная
мысль привлекла внимание многих исследователей и заслуживает
серьезной экспериментальной проверки.
НЕДОСТАТОЧНОСТЬ ЕДИНИЧНОГО ОНКОГЕНА
ДЛЯ ПОЛНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК
Изучение клеточных онкогенов привело к обнаружению и
выделению ряда важных генов, участвующих в многостадийном
превращении нормальных клеток в опухолевые. Тем не менее
данных об активации протоонкогенов, их локализации в хромо-
сомах и продуктах экспрессии все еще недостаточно для пони-
мания всего комплекса молекулярных событий, имеющих место
при образовании опухолей в организме. Спонтанный или инду-
цированный химическими канцерогенами туморогенез является
не одноактным, а многостадийным и весьма сложным процессом.
Многое говорит в пользу того, что формирование опухолевой
клетки в определенном типе ткани требует активации и функцио-
нирования более чем одного трансформирующего гена. В то же
время активация онкогенов, например относящихся к семейству
ras, происходит как единичное, дискретное событие. В этом же
плане можно рассматривать и транслокацию протоонкогена с-тус
из хромосомы 8 в хромосому 14 при лимфоме Беркитта. Напротив,
процесс деметилирования протоонкогенов можно отнести к собы-
тиям многостадийного, длительного порядка.
Противоречие между многостадийностью процесса канцероге-
неза, с одной стороны, и одностадийностью активации ряда про-
тоонкогенов — с другой наводит на мысль, что активация, напри-
мер, Ha-ras, вероятно, представляет лишь один из этапов посту-
лируемого многостадийного процесса туморогенеза. Результаты
экспериментов по трансфекции клеток N1H ЗТЗ также под-
тверждают данное предположение. Только эти клетки трансфор-
мируются активированным одиночным Ha-ras-геном с такой вы-
сокой эффективностью, и причина подобного феномена в пре-
неопластическом состоянии указанных клеток. Как полагают,
в результате длительного культивирования они уже прошли более
половины пути трансформации, в частности стадию иммортали-
зации и некоторые другие, осуществляемые рядом эндогенных
онкогенов, подойдя к последнему, возможно, уже одностадийному
акту перехода в полностью трансформированное состояние. Такой
этап и осуществляет вносимый извне онкоген ras.
Для проверки высказанного положения исследователи ряда
лабораторий стали использовать для трансфекции геном Ha-ras
другие реципиентные клетки. В этих исследованиях были получены
доказатепьства ограниченности (дефектности) трансформирую-
щей способности отдельного онкогена, функционирующего в оди-
ночку, и свидетельства необходимости кооперативного взаимо-
действия различных онкогенов для осуществления неопласти-
ческой трансформации (Newbold R., Brookes Р., 1976; Land Н.
et al., 1983; Ruley E., 1983].
H. Land и соавт. (1983) в качестве реципиентных для Ha-ras-
онкогена клеток использовали, как уже указывалось в преды-
296
душих разделах книги, вторичные эмбриональные фибробласты
крыс (REF), прошедшие лишь несколько пассажей и мало отли-
чающиеся от полностью «нормальных» клеток. Трансфекция
монослоя REF препаратом онкогена Ha-ras не приводила, как
это имело место в опытах с NIH ЗТЗ-фибробластами, к формиро-
ванию очагов трансформации клеток. Подобные условия транс-
фекции онкогена в системах NIH ЗТЗ или rat 1 приводили к фор-
мированию сотен очагов трансформации монослойных культур.
Специальные опыты показали, что результаты трансфекции за-
висят не столько от трансформирующих свойств онкогена Ha-ras,
сколько от «ответа» реципиентных клеток REF на экзогенный
онкоген. В трансформированных клетках REF онкоген ras не
экспрессировался, т. е. находился в полностью «молчащем»
состоянии. Если эти клетки спустя несколько недель культиви-
рования переносили в полужидкий агар, то в этих условиях через
2— 3 нед наблюдался рост колоний трансформантов. Следова-
тельно, лишь один признак, характеризующий трансформацию
клеток и проявляющийся в субстратиезависимой пролиферации
в агаре, контролировался онкогеном ras (см. гл. 4).
Известно, что в ряде лабораторий изучалась трансформи-
рующая способность препаратов ДНК из опухолей человека
и животных для гомологичных нормальных фибробластов. Как
в ранних исследованиях, так и в более поздних работах все
многочисленные попытки обнаружить в этих условиях трансфор-
мирующий эффектопухолевых образцов ДНК были безуспешными
[Князев П. Г. и др., 1980].
На сегодня известна лишь одна публикация возможной (по-
ложительной) трансформации диплоидных фибробластов чело-
века препаратами ДНК, изопированными из клеточной линии
MOLT-4; эта линия имеет лимфобластоидное происхождение
[Sutherland В., Bennett Р., 1984]. Реципиентные клетки после
трансфекции указанным препаратом ДНК приобретали способ-
ность к субстратиезависимой пролиферации, которая сохранялась
свыше 30 пассажей клеток. Трансформирующий эффект препарата
ДНК MOLT-4 снимался обработкой ДНКазой и некоторыми
эндонуклеазами рестрикции, например Bgl II и ВатН I. Следует
отметить, что в клеточной линии AAOLT-4 ранее в экспериментах
по трансфекции клеток NIH ЗТЗ был идентифицирован трансфор-
мирующий ген ras [Eva A. et al., 1983]. Возможно, что дальнейшие
опыты с этой линией клеток позволят установить роль онкогенов
семейства ras в трансформации первичных фибробластов человека
препаратом ДНК MOLT-4.
В соответствии с идеей недостаточности для полной трансфор-
мации клеток одиночного гена, работающего лишь на конкретном
отдельном этапе злокачественной трансформации клетки, эти
неудачи становятся понятными. Тем не менее использование
в качестве реципиентных клеток NIH ЗТЗ, отличающихся гипер-
чувствительностью к трансформации, можно рассматривать как
297
несомненную удачу, приведшую к выявлению целого ряда онко-
генов и их последующей идентификации.
Таким образом, трансформирующие свойства онкогена Ha-ras
оказались существенно ограниченными в случае испытания в клет-
ках REF. Однако если в качестве реципиентных клеток исполь-
зовались перевивные или иммортализованные («бессмертные»)
культуры, такие как NIH ЗТЗ или rat 1, то последующее введение
в эти культуры онкогена сопровождалось их одностадийной транс-
формацией в полностью злокачественное состояние. Иными сло-
вами, одним из необходимых условий перевиваемости или
иммортализации клеток в условиях культуры является активиза-
ция клеточной функции, способной кооперировать с геном ras
в формировании полностью трансформированного фенотипа.
Следовательно, единичное генетическое событие (точковая
мутация), приводящее к образованию трансформирующих генов
семейства ras, само по себе еще недостаточно для достижения
злокачественного перерождения нормальных фибробластов.
Необходимо другое повреждение (точная природа которого еще
не установлена), способное к кооперированию с трансформи-
рующим геном. В этом случае наступает кажущаяся «односта-
дийная» трансформация фибробластов, что в ее истинной сущ-
ности не противоречит общей модели многоступенчатой природы
канцерогенеза.
Следующий шаг в направлении определения трансформирую-
щей способности активированного онкогена Ha-ras в отношении
первичных фибробластов грызунов был сделан D. Spandidos
и N. Wilkie (1984). Эти авторы установили, что для злокачест-
венной трансформации первичных фибробластов онкогеном
Ha-ras необходимо его лигирование с транскрипционным усили-
телем (enhancer), который существенно усиливает экспрессию
трансформирующего гена. При этом лигирование протоонкогена
c-Ha-ras I с enhancer и последующая трансфекция указанных
реципиентных клеток приводили лишь к иммортализации, но не
трансформации клеток [Spandidos D., Wilkie N., 1984].
КООПЕРИРОВАНИЕ МЕЖДУ ОНКОГЕНАМИ
Как указывалось выше, современная схема канцерогенеза
предполагает «кооперативное» действие нескольких онкогенов,
так называемого «каскада» онкогенов. Ниже этот вопрос рассмат-
ривается более подробно.
Кооперирование между трансформирующими генами и вирус-
ными онкогенами. Взаимодействие ряда онкогенных ДНК-содер-
жащих вирусов (вируса полиомы и аденовирусов) с клетками-ми-
шенями сопровождается индукцией пролиферации инфицирован-
ных клеток. Стабильные клеточные линии (иммортализованные)
были получены также путем трансфекции соответствующих
реципиентных клеток вирусными генами [Houweling A. et al.,
298
1980; Rassoulzadegan M. et aL, 1982]. В последующем эти
довольно специфические изменения клеток стали связывать
с активностью конкретных локусов вирусного генома — онкогенов.
Онкогены ДНК-содержащих вирусов, в отличие от ретровирусных
онкогенов, являются истинно вирусными (подробнее см. гл. 3).
Эти онкогены необходимы для репликации вирусного генома,
т. е. они представляют собой конституционные гены и облигатно
присутствуют в вирусном геноме на всем протяжении эволюции
самих вирусов и эукариотов.
В случае вируса полиомы три различных белка («малый»,
«средний» и «большой» Т-антигены) кодируются «ранней» репли-
кативной областью генома, которая также активна в процессе
вирусной трансформации клеток. Анализ структуры этих генов
показал, что они являются «перекрывающимися» генами внутри
вирусного генома. R. Kamen и соавт. (1981) сконструировали
клоны указанных генов путем попучения их ДНК-копий в реакции
обратной транскрипции трех ранних вирусных иРНК. Определение
биологической активности клонов показало, что они обладают
различными свойствами и эффектами, в результате чего удалось
связать два клона со средним и большим антигенами.
В экспериментах по трансфекции средний антиген индуци-
ровал морфологические изменения и независимую от субстрата
пролиферацию реципиентных клеток, тогда как большой Т-антиген
создавал независимость клеток от сыворотки и длительности
культивирования [Houweling А., 1980]. Эти и другие результаты
имели большое значение для общего понимания механизма транс-
формации и дальнейших исследований данного явления, так
как выявили ряд конкретных критериев трансформации клетки
и определили роль в этом процессе экспрессии разных вирусных
генов. Вероятно, фенотипы «перевиваемости» и «иммортализа-
ции», которые позволяют клеткам «отвечать» на онкоген ras,
связаны с одним или несколькими вирусными онкогенами.
Далее Н. Land и соавт. (1983) показали, что при котранс-
фекции клеток REF онкогенами средним Т и ras фенотип реци-
пиентных культур не отличался от такового при введении лишь
одного гена в отдельности. Однако котрансфекция эмбриональ-
ных фибробластов онкогенами большим Т и ras приводила к кри-
тическим изменениям реципиентных клеток: в культуре REF
быстро появлялись пролиферирующие фокусы трансформирован-
ных клеток. Эти фокусы роста состояли из трансформированных
клеток, формирующих перевиваемые клеточные линии и опухоли
у иммунодефицитных мышей.
Таким образом, в этих экспериментах были получены дока-
зательства недостаточности, «дефектности» одиночного транс-
формирующего гена ras в отношении эмбриональных фибро-
бластов. которые, однако, при действии двух онкогенов (один
из них — v-onc) подвергались полной злокачественной транс-
формации [Land Н. et aL, 1983].
299
Аналогичные результаты кооперативного взаимодействия
онкогенов были получены при изучении трансформирующих
свойств онкогенов и Е1а («ранней области» генома аденовирусов)
в экспериментах по трансфекции нормальных клеток. В этом
случае ген большого антигена вируса полиомы был заменен
на аденовирусный ген Е1а, что сопровождалось также злокачест-
венной трансформацией клеток [Ruley Е., 1983].
Следовательно, в обоих случаях превращение нормальной
клетки в опухолевую достигалось лишь кооперативным взаимо-
действием двух различных генов: одного — клеточного, другого
вирусного.
Подобная схема кооперативной трансформации в процессе
канцерогенеза первичных фибробластов двумя онкогенами нс
является, как теперь стало ясно, абсолютной. Если активирован-
ный (т. е. содержащий точковую мутацию) Ha-ras лигировать
с сильным усилителем, то такая конструкция способна вызывать
малигнизацию первичных фибробластов без кооперации с извест-
ным клеточным или вносимым извне в процессе трансфекции
вторым онкогеном {Spandidos D., Wilkie N., 1984].
Кооперация между геном ras и вторым клеточным онкогеном
в процессах трансформации. В предыдущем разделе были рас-
смотрены экспериментальные данные, свидетельствующие о прин-
ципиальной возможности кооперативного взаимодействия транс-
формирующего гена ras с вирусными онкогенами в процессе
злокачественной трансформации нормальных клеток. Однако эти
результаты не могут рассматриваться как адекватные в тех
случаях канцерогенеза, при которых участие онкогенных вирусов
не зарегистрировано. Особенно это относится к Д НК-содержащим
вирусам, чьи онкогены в геноме нормальных и опухолевых клеток
пока не обнаружены. Неясно также, существуют ли клеточные
гены, подобные большому Т или Е1а, способные кооперировать
с ras в процессе опухолеобразования.
Уже в ранних исследованиях было установлено, что наиболее
вероятным кандидатом на роль второго, дополняющего, гена
является клеточный онкоген тус. Этот онкоген, находящийся
в активированном состоянии (амплификация или транслокация),
довольно часто ассоциирован с трансформирующими генами
семейства ras или B-lym, которые способны самостоятельно,
«соло», трансформировать клетки NIH ЗТЗ. Вероятно, совместное
сосуществование этих активных онкогенов в опухолевых клетках
нейробластом, лимфом и промиелоцитарной лейкемии отражает
ту существенную роль, которую они выполняют совместно в ходе
процесса туморогенеза.
Н. Land и соавт. (1983) в экспериментах по трансфекции
показали, что v-myc при введении в реципиентные клетки NIH ЗТЗ,
rat I или REF не вызывает их трансформации. Однако, когда
клетки REF были трансфецированы двумя клонами ДНК, несу-
щими вставки v-myc и Ha-ras одновременно, быстро выявлялись
300
плотные очаги морфологически трансформированных клеток.
Следовательно, действуя одновременно, тус и ras способны
осуществлять то, что каждый из них в отдельности осуществить
не может. Котрансфецированные клетки в последующем довольно
быстро превращались в стабильно трансформированные, интен-
сивно пролиферирующие культуры. В местах введения таких
клеток иммунодефицитным мышам через 7—10 дней возникали
опухоли [Land Н. et al., 1983].
Эти результаты дают положительный ответ на вопрос о том,
являются ли клеточные онкогены, как и онкогены, обнаруженные
в геноме ДНК-содержащих вирусов, функционально гетероген-
ными. По-видимому, различные онкогены осуществляют в клетке
качественно отличные эффекты. Подобное утверждение требует
переосмысливания понятия «онкоген», которое не может означать
просто ген, индуцирующий морфологические изменения и форми-
рование очагов трансформации. Отдельные онкогены вносят
конкретный частный вклад в различные пути превращения нор-
мальной клетки в опухолевую. Возникает вопрос: сколько различ-
ных онкогенных функций допжно кооперироваться для того, чтобы
превратить клетку-мишень в принципиально другую клетку,
с фенотипом и характеристиками опухолевой? Рассмотренные
выше экспериментальные данные указывают на то-, что достаточно
как минимум экспрессии онкогенов тус и ras. Однако для воз-
никновения истинно опухолевых клеток в организме, вероятно,
требуется экспрессия большего числа онкогенов или просто генов.
Пе исктючено, что поиск третьей, четвертой и других функций
может потребовать от исследователей разработки новых подходов
и методов.
Тем не менее принципы поиска в этой области молекулярной
онкологии уже ясны.
ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ ГЕНОВ
В НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
Онкогены, изолированные из различных ретровирусов позво-
ночных, широко используются в настоящее время как пробы
для обнаружения в геноме человека родственных последователь-
ностей ДНК и, таким образом, выявления потенциальных опухо-
леродных генов (с-опс). Однако один лишь факт присутствия
вирусных двойников в генетическом материале клеток человека
и животных еще не доказывает их причинной роли в возникно-
вении неоплазм, так как указанные гены могут находиться в не-
активном, «молчащем» состоянии, что, вероятно, имеет место
в случае подавляющей массы генов позвоночных. Для реального
функционирования генов, их участия в каком-то биологическом
процессе необходима экспрессия этих генов в виде иРНК и белков.
С точки зрения большинства исследователей, факт экспрессии
онкогенов в геноме человека указывает на их возможную роль
301
в этиологии неоплазм, а изучение экспрессии приобретает перво-
степенное значение.
В этом плане само существование и доступность использова-
ния стандартных ретровирусных онкогенов, позволяющих методом
гибридизации регистрировать присутствие и экспрессию кле-
точных онкогенов, имеют большую ценность. Гибридизация стан-
дартных проб вирусных онкогенов с РНК-продуктами экспрессии
клеточных онкогенов явилась эффективным средством суждения
об активности, функционировании онкогенов — как нормальных
клеточных, так и опухолевых.
Наличие в руках исследователей вирусных онкогенов (в виде
молекулярных зондов) открыло широкие возможности поиска
РНК-транскриптов гомологичных генов в нормальных и опухоле-
вых клетках человека и животных, а также позволило установить
локализацию ряда трансформирующих генов в отдельных хромо-
сомах.
Принципиальная возможность экспрессии онкогенов в фено-
типически «нормальных» клетках впервые была показана в неин-
фицированных фибробластах нескольких видов птиц, которые
содержали РНК-транскрипты, гомологичные v-arc [Spector D.
et aL, 1978]. Экспрессия некоторых протоонкогенов в нормальных
клетках не зарегистрирована, например c-mos [Gattoni S. et aL,
1982; Muller R. et aL, 1982]. Транскрипция большинства других
протоонкогенов в различных нормальных клетках изучена пока
недостаточно. Тем не менее некоторые общие закономерности
экспрессии с-опс-генов, гомологичных онкогенам ретровирусов
птиц, были установлены. Это касается генов c-src, c-myb, c-myc,
c-erb и сводится к следующему; 1) каждый с-опс-ген может транс-
крибироваться в разнообразных клетках и тканях широкого
круга позвоночных; 2) транскрипция любого протоонкогена,
по-видимому, контролируется клетками одной ткани независимо
от другой таким образом, что с-опс-гены экспрессируются в зави-
симости от «потребности» только определенной ткани; 3) тран-
скрипция протоонкогенов не скоординирована с экспрессией
эндогенных генов ретровирусов; 4) размер транскрибируемой
с различных протоонкогенов иРНК в клетках различных видов
позвоночных сходен; 5) в нормальных клетках животных с-опс-
гены — c-src, c-myb, c-myc — транскрибируются в единичные
копии [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Эти принципы экспрессии клеточных онкогенов хорошо согла-
суются с представлениями о том, что каждый генетический локус
протоонхогенов генерирует транскрипты одного гена. Однако
транскрипция гена c-erb в этом отношении является исключе-
нием.
Как минимум 4 типа зрелых иРНК были обнаружены в клетках
разных типов тканей, что свидетельствует о возможности неза-
висимой транскрипции двух доменов этого гена: c-erb А и c-erb В
(см. гл. 3).
302
Важные данные по экспрессии с-опс-генов были получены
при анализе их транскрипции в процессе эмбрио- и онтогенеза
[Miiller R. et aL, 1982; Miiller R., 1983]. В процессе эмбриогенеза
и раннем периоде онтогенеза мышей была обнаружена постоянная
транскрипция протоонкогенов c-Ha-ras и c-Ki-ras, а также тран-
зиторная, в зависимости от типа ткани и стадии развития
эмбриона, экспрессия протоонкогенов c-fos, c-fms и c-abl. Наи-
больший уровень транскрипции c-fos был зарегистрирован в кост-
ной ткани новорожденных мышей, тогда как ген c-fos практи-
чески не экспрессировался в других тканях. Данные особенно
интересны потому, что именно ген v-fos связан с индукцией
остеосарком новорожденных мышей. Авторы подчеркивают, что
препараты костной ткани новорожденных мышей содержат кост-
ный мозг и некоторое количество тканей иного происхождения.
При дополнительном анализе не выявили заметного увеличения
транскрипции c-fos в клетках костного мозга и клетках гемо-
поэтического происхождения. Полученные результаты позволили
авторам впервые установить связь экспрессии протооикогена c-fos
с пролиферацией и дифференцировкой мезенхимальных клеток.
В последующем R. Muller и соавт. (1984) установили, что экс-
прессия c-fos в костном мозге мышей связана именно с макрофа-
гами. Только культуры макрофагов характеризовались повышен-
ным уровнем экспрессии c-fos. Более того, если клетки HL-60
стимулировапи к дифференцировке до макрофагов (например,
диметилсульфоксидом), то уровень экспрессии этого гена, как
правило, возрастал и был максимальным именно в макрофагах.
Следует отметить, что экспрессия других протоонкогенов, c-myc
и c-myb, в процессе дифференцировки клеток HL-60 снижалась
и полностью отсутствовала в макрофагах. Эти данные позволяют
предположить, что c-fos как бы сограничивает» дальнейший
процесс дифференцировки на ее поздних стадиях, a c-myc и c-myb
каким-то образом ассоциированы с пролиферацией кпеток. Про-
тоонкоген c-fos, по-видимому, является первым идентифициро-
ванным геном, тесно связанным с процессом дифференцировки.
Сходные данные были получены в опытах с эксперименталь-
ными миелоидными лейкозами мышей fGonda Th., Metcalf D.,
1984]. Авторы предполагают, что активация экспрессии c-fos
в макрофагах может отражать также их специфическую функцию
на этой стадии дифференцировки.
Транскрипция протооикогена c-fos значительно усиливается
после обработки клеток NIH ЗТЗ, находящихся в стационарной
фазе, фактором роста. Экспрессия c-fos является наиболее бы-
стрым ответом генома клеток на ЭФР, РФТ, ТРА, а-аманитин
и сыворотку крови [Greenberg М., Ziff Е., 1984]. Уже через 15 мин
после стимуляции клеток к росту, например, сывороткой крови
регистрируется экспрессия c-fos, затем а-актина, и лишь через
30 мин возрастает экспрессия c-myc. Вероятно, продукт гена
c-fos принимает участие также в регулировке клеточного цикла.
зоз
Другой протоонкоген, c-abl, как показа пи R. Muller и соавт.
(1983), максимально экспрессируется в среднем периоде эмбрио-
генеза мышей. Сравнительный анализ топографии транскрипции
с-abl позволил авторам установить природу клеток, содержащих
большое количество РНК-транскриптов этого гена. Ими оказались
ткани лимфоидных органов (тимуса и селезенки), что также
может указывать на возможную физиологическую роль с-аЫ
в процессе дифференцировки стволовых клеток лимфоидного ряда.
Авторы указывают на возможную связь между повышенной
экспрессией с-abl в лимфоидных клетках и пре-В-клеточным
лейкозом мышей, который индуцируется интеграцией v-abl онко-
гена, поступающего в геном В-лимфоцитов в составе ДНК-про-
вируса вируса Абельсона мышей.
Неожиданные результаты были получены при анализе транс-
крипции с-abl в половых клетках эмбрионов и взрослых мышей.
Экспрессия c-abl наблюдалась в половых клетках среднего пе-
риода эмбриогенеза мышей, однако очень высокий уровень транс-
крипции этого гена обнаружен в яичках взрослых особей. При
этом выявлялся специфический РНК-транскрипт с молекулярной
массой 3,7 т. о. Существование в половых клетках указанного
аЫ-транскрипта свидетельствует о том, что инициация, термина-
ция и сплайсинг РНК модулируются исключительно тканеспеци-
фическим механизмом [Miilier R., 1982]. Гиперэкспрессия c-abl
в половых клетках не сопровождалась реаранжировкой, трансло-
кацией или амплификацией этого гена.
Влияние экспрессии c-Ha-ras, а также семейства протоонко-
генов ras в целом на физиологические процессы эмбриогенеза
недостаточно ясно, хотя этот ген транскрибируется в эмбрионе
на всех стадиях развития, в экстраэмбриональных тканях, во всех
клеточных линиях тератокарцином и даже в тканях 10-дневных
мышат. Эти результаты позволили авторам высказать предполо-
жение о том, что продукт гена ras необходим на всех этапах
развития, роста и дифференцировки эмбриона [Miilier R., 1983].
Напротив, в тканях взрослого организма подобная корреляция
между пролиферацией клеток и транскрипцией c-ras выявляется
менее отчетливо. Не исключено, что гетерогенность клеточных
популяций в тканях взрослого организма, их разная степень
пролиферации как бы маскируют истинную роль в этом процессе
c-Ha-ras.
Ряд авторов полагают, что в дифференцированной и не про-
лиферирующей клетке протоонкогены не экспрессируются [Mul-
ler R. et al., 1982]. Однако это положение оспаривается боль-
шинством исследователей, и решение вопроса зависит, в первую
очередь, от методических приемов и объектов исследования, т. е.
выбора адекватной клеточной популяции и определения критериев
«завершенности» процесса дифференцировки.
Установление различной транскрипционной активности транс-
формирующих генов в процессе эмбриогенеза и раннем постна-
304
тальном развитии мышей подтверждает широко распространенное
мнение о том, что эти гены вовлечены в контроль процессов
развития, таких как пролиферация и дифференцировка [Bishop J
et aL, 1981; Muller R. et aL, 1982]. В дальнейшем для оконча-
тельного доказательства этого положения, необходимо подтвер-
дить корреляцию между уровнем транскрипции и синтезом в клет-
ках соответствующих онкобелков. Выявление и идентификация
онкобелков в клетке сопряжены с большими методическими
трудностями. Успех зависит, главным образом, от получения
антисывороток, реагирующих с продуктами соответствующих
вирусных онкогенов. Тем не менее 4 онкобелка, кодируемых
протоонкогенами, уже идентифицированы: 1) pp60csrc, 60 кд-
фосфопротеин, кодируемый c-src-геном [Sefton В. et al., 1980];
2) р2Г Ha ras, 21 кд-фосфопротеин, кодируемый c-Ha-ras-геном
[Langeheim Н. et aL, 1980]; 3) p!50c ab , 150 кд, кодируемый,
вероятно, c-abl-геном [Witte О. et aL, 1979], и, наконец, 4) p92c fes,
92 кд, также, вероятно, кодируемый c-fes-геном [Bakker Р., 1982].
Белки ррбО18ГС и p21cHaras были достаточно хорошо изучены;
они оказались практически идентичными их вирусным двойникам
по структуре и функции [Sefton В. et al., 1980; Wierenga R., Hol W.,
1983]. Оба обнаружены в многочисленных тканях разных видов
животных. Остальные клеточные онкобелки пока не изучены.
Несомненная связь транскрипции протоонкогенов с пролифе-
рацией и дифференцировкой клеток, нарушение которых при
малигнизации имеет ключевое значение, настоятельно требует
выявления подобного участия экспрессируемых с-опс-генов
в трансформации клеток и формировании злокачественных опу-
холей в организме человека.
A.	Eva и соавт. (1982) изучили экспрессию c-myc, c-abl, c-sis
и c-fos в клеточных линиях, полученных из карцином, сарком,
меланом, глиобластом и тератокарцином человека. Все эти кле-
точные линии, включая нормальные фибробласты человека,
содержали лишь единичный транскрипт размером 2,7 т. о.,
гомологичный онкогену тус. Авторы отмечают, что размер транс-
крипта с-тус эквивалентен таковому, найденному ранее в клетках
птиц и грызунов. Однако в 4 клеточных линиях, происходящих
из саркомы, 2 карцином и лимфобластного лейкоза, обнаружен
исключительно высокий уровень транскрипции протоонкогена
с-тус. Из 23 клеточных линий опухолей человека в 8 те же авторы
выявили присутствие РНК-транскрипта размером 4,2 т. о.,
родственного c-sis. В большинстве случаев это были саркомы
и глиобластомы, в их числе не оказались лишь карциномы и мела-
номы человека. РНК-транскрипты, родственные bas- и аЫ-пробам,
были обнаружены во всех тестированных опухолевых клеточных
линиях, включая и нормальные фибробласты человека. Однако
обе указанные пробы гибридизировались с одинаковыми РНК-
транскриптами, размерами 7,0, 5,9 и 1,8 т. о. Этот странный
результат авторами не обсуждается, однако он может означать,
20 Заказ 3S0
305
что идентичные по размеру молекулы РНК в клетке могут выяв-
ляться в том случае, когда два онкогена имеют частичную гомо-
логию.
D. Spandidos и I. Kerr (1984) изучили экспрессию онкогенов
семейства ras в нормальной слизистой оболочке толстой и прямой
кишки, а также в предопухолевых полипах и опухолях. Авторы
обнаружили значительное, по сравнению с нормой, повышение
экспрессии онкогена ras в предопухолевых и опухолевых тканях.
Они полагают, что активация онкогенов семейства ras имеет место
в ходе развития опухолей толстой и прямой кишки, однако
повышенная экспрессия этих онкогенов еще недостаточна для
развития процесса канцерогенеза.
Клонированные вирусные онкогены также использовались для
изучения экспрессии трансформирующих генов в опухолевых
клетках гемопоэтического происхождения. Е. Westin и соавт.
(1982) установили, что экспрессия c-myb наблюдается во всех
случаях пролиферации миелобластов. Индукция дифференцировки
клеток HL-60 диметилсульфоксидом приводила к прекращению
транскрипции c-myb. Транскрипты РНК, гомологичные с-аЫ,
c-bas, c-myc и c-sis, выявлялись как в нормальных клетках
костного мозга, так и в бластных клетках больных острыми
лейкозами. Авторы подчеркивают, однако, что экспрессия ука-
занных с-опс-генов не имеет специфической связи с конкретным
неопластическим процессом.
Однако во всех тестированных случаях лимфом, лимфосарком
и лимфолейкозов (независимо от В-, Т- или В/Т-формы) была
обнаружена экспрессия протоонкогена c-erb В. Этот ген был
активен также и в нормальных лимфоцитах периферической
крови [Roy-Burman Р. et al., 1984). Учитывая тот факт, что про-
дукт протоонкогена c-erb В имеет значительную гомологию с ре-
цептором эпидермального фактора роста, эти данные указывают
на существенную роль c-erb В в жизнедеятельности лимфоцитов
человека.
Этот вывод подтверждается дальнейшим скринингом экспрес-
сии протоонкогена c-myc в опухолевом материале больных лейко-
зами. Как показали Р. Rothberg и соавт. (1984), повышенная
экспрессия c-myc обнаружена у 22 больных (из 106). В 17 наблю-
дениях это были острые миелолейкозы, а в 5 — лимфомы. Авторы
обнаружили реаранжировку этого гена в геноме только больных
лимфомами в фазе обострения (лейкемическая стадия). Следо-
вательно, повышенная экспрессия c-myc не обусловлена наблю-
даемыми его генетическими нарушениями, поскольку последние
обнаружены не во всех изученных случаях.
В.	Dale и В. Ozanne (1983) использовали вирусный онкоген
abl для скрининга экспрессии протоонкогена с abl в клетках
больным острым лимфолейкозом. Несмотря на то, что многие
клеточные линии содержали незначительное количество тран-
скриптов РНК c-abl, их количество резко возрастало в тех
306
клеточных линиях, которые имели характеристики пре-В-клеточ-
ных лейкозов мышей.
А. Г. Татосян и соавт. (1983) провели скрининг экспрессии
протоонкогенов в биопсийном материале многих опухолей чело-
века. В этих исследованиях было установлено, что в большинстве
тестированных неоплазм экспрессируются множественные онко-
гены (анализ поли А-РНК).
Изучение экспрессии клеточных трансформирующих генов
в опухолевых клетках фактически только началось. Для некоторых
опухолей человека повышенная транскрипция с-опс-генов может
иметь причинный характер для развития опухоли. В этом плане
можно думать об использовании теста на экспрессию онкогенов
в диагностических целях. В близком будущем, возможно, этот
подход станет неотъемлемой частью общей характеристики того
или иного онкогена.
КАНЦЕРОГЕНЕЗ: «ОДНОУДАРНАЯ КИНЕТИКА»
ИЛИ «КАСКАД ОНКОГЕНОВ»?
Молекулярная онкология, несмотря на свою <юность», успела
занять центральное место в современной теоретической онкологии
благодаря поразительным успехам в расшифровке молекулярного
механизма онкогенеза. Эта, сегодня фактически самостоятельная,
наука представляет естественный сплав, срекомбинант» моле-
кулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии
с онкологией. Указанное утверждение не следует понимать в том
смысле, что первые три играют роль лишь технических приемов,
а последняя, и только она, задает идейно-теоретическую канву.
Молекулярная биология давно вышла за рамки методов
Ее подходы к расшифровке явлений жизни приобрели методо-
логическое значение. Она не только коренным образом изменила
возможности получать ответы на вопросы, задаваемые природе
биологами, медиками, онкологами, но и позволила ставить прин-
ципиально новые, ранее не возникавшие. Доступность анализа
на уровне отдельных генов и их составных частей изменила
характер ряда естественных наук, причем не только в отношении
их методических возможностей, но и в самой научной идеологии,
прежде всего биологии и медицины. Поэтому, обогатившись
за счет методов и принципов молекулярной биологии, теорети-
ческая онкология изменилась качественно, все больше превра-
щаясь в онкологию молекулярную. Именно молекулярно-биоло-
гический подход помог преодолеть тот идейный застой и экспе-
риментальный тупик, которыми характеризовались последние
десятилетия в теоретической онкологии. Открытие онкогенов яви-
лось первым сигналом того, что топтание на месте кончилось
и начался новый этап движения вперед.
Одним из лидеров современной молекулярной онкологии
является стремительно выдвинувшийся в последнее время на
20*
307
первый план экспериментатор и теоретик из Массачусетского
технологического института R. Weinberg. Он с завидной легкостью,
без видимых усилий находит логические объяснения любым новым
фактам, в том числе и собственным. Эта легкость, однако, не вы-
глядит поверхностной спекуляцией. Примером могут служить
его собственные экспериментальные данные и их теоретическое
толкование, представленные в одной из недавних публикаций
[Land Н. et aL, 1983]. R. Weinberg и его сотрудники изучали
роль отдельных онкогенов в интегральном процессе канцерогенеза
на новой трансфекционной тест-системе — крысиных эмбрио-
нальных фибробластах (КЭФ), имеющих перед традиционно
используемыми культурами NIH ЗТЗ-клетками (далее ЗТЗ-клетки)
то преимущество, что они более нативны, не иммортализованы
и не прошли, как последние, половину, если не более, пути
в сторону трансформированного состояния в результате длитель-
ного культивирования. Эта работа R. Weinberg и его сотруд-
ников имеет принципиальное значение и заслуживает подробного
рассмотрения.
Авторы изучали роль одиночных онкогенов и совокупное
действие нескольких из них в процессе частичной и полной
клеточной трансформации. Были избраны два наиболее распро-
страненных в человеческих опухолях и причастных к их развитию
онкогена: ras и тус, а также (в целях выяснения механизма
процесса) гены большого и среднего Т-антигенов полиомы.
Исходными моментами исследования являлись два тезиса:
1) система ЗТЗ-клеток не является адекватной для характеристики
и выяснения механизма полного процесса клеточной трансформа-
ции; 2) канцерогенез является многоступенчатым, а не одно-
стадийным процессом и должен включать участие не одного,
а нескольких специфических трансформирующих генов.
Уже и ранее высказывалось мнение, что ЗТЗ-клетки полу-
трансформированы и уже прошли ряд этапов по пути трансформа-
ции, в которых, возможно, принимали участие несколько онко-
генов, осуществлявшие отдельные этапы процесса: установление
характеристик культуры клеток, иммортализации и т. д. В резуль-
тате и единичные онкогены, даже «конечные», т. е. онкогены
завершающего этапа трансформации, такие как ras, оказываются
эффективными в опытах по трансфекции с ЗТЗ-клетками. Опыты
R. Weinberg и его сотрудников показали, что эмбриональные
фибробласты крысы при трансфекции человеческим онкогеном
ras не превращаются в опухолевые клетки, если до этого клетки
не установлены в культуре и не подверглись иммортализации.
Наоборот, эмбриональные фибробласты становятся тумороген-
ными, если вводится, по крайней мере, еще один онкоген, например
вирусный или клеточный тус, или ген, кодирующий полиомный
большой Т-антиген, вместе с геном ras.
Многочисленные исследования указывали, что канцерогенез
является процессом, включающим несколько независимых ступе-
308
ней. В пользу этого говорят эпидемиологические исследования,
свидетельствующие, что частота рака пропорциональна множест-
венным импульсам протекшей жизни. Данные патологии, в свою
очередь, показывают, что опухоли прогрессивно развивают новые
фенотипы в результате прохождения через серию отдельных
стадий, таких как анаплазия, метаплазия и неоплазия. Более того,
в ряде экспериментальных систем индукция опухоли требует
по меньшей мере двух отличающихся друг от друга стимулов,
а именно инициации и промотера.
На клеточном уровне положение о многоступенчатом харак-
тере трансформации и канцерогенеза менее демонстративно и
кажется менее убедительным. Прежде всего это объясняется
некоторыми опытами с первичными культурами клеток грызунов,
которые могут становиться туморогенными, как это внешне выгля-
дит, в одну ступень после инфекции in vitro опухолеродными
вирусами, например вирусом полиомы или аденовирусами. Но это
лишь кажущееся отклонение от многоступенчатого принципа
канцерогенеза. Недавние исследования показали, что каждый
из упомянутых вирусов несет, по крайней мере, два гена, отчетливо
кодирующих разные функции, каждая из которых должна быть
экспрессирована, чтобы фенотип опухолевой клетки был реали-
зован. На генетическом уровне этот процесс можно представить
как цепь последовательной активации и экспрессии генов, обус-
ловливающих и определяющих в совокупности формирование
опухолевого фенотипа..
Прецеденты, демонстрирующие существование модели мно-
жественных, кооперирующихся и независимо активируемых генов,
известны. Так, индукция бурсовой лимфомы птичьим лейкозным
вирусом требует активации двух отдельных онкогенов в ходе
лимфомогенеза. Ген тус активируется благодаря инсерции по
соседству с ним провируса, тогда как недавно открытый ген B-lym
становится активным благодаря действию другого механизма,
природа которого выясняется. В этом плане в лаборатории
R. Weinberg проведена работа с промиелоцитной лейкемией и
лимфомой Беркитта. В обоих случаях, как оказалось, опухолевые
клетки несли измененные варианты гена тус, равно как и акти-
вированные варианты второго клеточного онкогена, названного
N-ras.
В противоречии с «многоступенчатой» схемой канцерогенеза
находятся опыты с ЗТЗ-клетками, в которых полная трансформа-
ция осуществляется по «одноударному» типу кинетики. Введенный
в них онкоген (в составе ДНК, трансфекция) приводит к появле-
нию множественных копий онкогена в реципиентных фибробла-
стах, хотя для осуществления полной трансформации достаточно
единственной копии онкогена.
Объяснение этого парадокса заключается именно в том, что
ЗТЗ-клетки ведут себя в ответ на онкогены как уже частично
трансформированные. Эти клетки были «установлены» как куль-
309
тура (т. е. адаптированы к бесконечному росту в однослойной
культуре) и затем интенсивно пассированы in vitro. Это уже
предполагало, что они будут отклоняться от нормальных клеток-
мишеней в ответ на онкогены in vivo. Как результат культиви-
рования in vitro ЗТЗ-клетки, по-видимому, приобрели ряд изме-
нений, развиваемых клетками в ходе их опухолевой прогрессии.
Эти изменения могут предрасполагать ЗТЗ-клетки к тумороген-
ному превращению в результате последующего «одноударного»
события. Именно с учетом нежелательной (для оценки сущности
действительного механизма процесса трансформации) возмож-
ности ложной простоты, одноэтапности трансформации, R. Wein-
berg и его сотрудники перешли в своей работе на крысиные
фибробласты, полагая, что эти клетки более соответствуют нор-
мальным мишеням канцерогенного превращения.
Неполная трансформация онкогеном ras. R. Weinberg и его
сотрудники использовали трансформирующий ген, изолированный
из линии клеток EJ карциномы мочевого пузыря человека, как
молекулярный клон pEJ 6,6. Он является вариантом человеческого
клеточного протоонкогена c-Ha-ras 1 и кодирует белок с моле-
кулярной массой 21 кд (р2I).
Этот онкоген близкородствен другим членам семейства ras:
Ki (Кирстен)-ras- и N-ras-онкогенам, которые активны в несколь-
ких различных опухолях.
Оказалось, что активность онкогена EJ-ras ограниченна. Он не
был способен побуждать трансфецированные КЭФ к фокусной
экспансии в плотной монослойной культуре (что мог делать
в ЗТЗ-фибробластах). Трансфецированные КЭФ имели лишь
ограниченную пролиферативную активность и не были тумороген-
ными при введении в организм животного-хозяина. Однако
активности, недостающие у онкогена, могли быть дополнены
клеточными функциями, существовавшими в КЭФ до трансфекции.
Эти факты побудили авторов сделать заключение, что процесс
культивации КЭФ in vitro обеспечивает их функциями, которые
сотрудничают (соучаствуют) с онкогеном EJ-ras в создании
компетентной опухолевой клетки.
Кооперативные эффекты тус и ras. Следующей задачей иссле-
дования R. Weinberg и его сотрудников было установить более
тонкий механизм того, как совместно работают онкоген EJ-ras
и клеточные функции (точнее говоря, кодирующие их клеточные
гены) в создании опухолевой клетки. Возможным таким клеточ-
ным геном был клеточный ген тус. Выше указывалось, что
измененные варианты этого гена сосуществуют и «сотрудничают»
с акивным EJ-ras-онкогеном по меньшей мере в двух человеческих
опухолевых клеточных линиях.
R. Weinberg и сотрудники испытали ген тус в форме онкогена,
несомого вирусом птичьего миелоцитоматоза МС29. Молекуляр-
ный клон его провируса, названный pv-myc, был ранее получен
J. Bishop.
310
2 LTR
gag myc
Высокая степень консервативности гена myc указывает, что
онкоген МС 29, возникнув из птичьего генома, мог бы, тем не менее,
быть способен функционировать и в крысиных клетках. Полный
провирусный клон был получен путем присоединения кольцевого
измененного провирусного клона к дополнительному провирус-
ному сегменту на его правом (3' — провирусном) конце. Это
создало тандемно-дуплицированные сегменты LTR на левом
(5'-проксимальном) и правом (З'-проксимальном) концах прови-
руса. Таким образом, представилась возможность испытать
биологические свойства этих v-myc -клонов. Каждая ДНК нано-
силась на ЗТЗ-клетки, КЭФ (первого или второго цикла) или
отдельно, или вместе с ДНК Ecogpt клона. При этом не наблюдали
эффекта на трансфецированные клетки.
В последующих опытах тестировали действие онкогенов ras
и EJ-ras, введенных вместе в 2° КЭФ. В условиях, в которых
EJ-ras или тус раздельно не оказывали эффекта на многослойные
культуры, два гена совместно вызывали драматические изменения
фенотипа. Быстро растущие фокусы морфологически измененных
клеток становились видимыми в течение 8 дней после трансфекции.
Это резко контрастировало со слабым ростом клеток, несущих
только EJ-ras-ген. Котрансфецированные (ras + myc) клетки были
туморогенными при введении голым мышам или 12-дневным
крысам, давая опухоли, которые росли до размера 1 см в диаметре
за 2 нед после инокуляции. Блот-анализ образцов ДНК из опыт-
ных линий по Саузерну показал присутствие множественных
копий обоих трансфецированных онкогенов, EJ-ras и v-myc.
На основании этих опытов авторы сделали заключение, что
эффекты установления культуры клеток in vitro могут быть вос-
произведены («мимицированы»), по крайней мере частично, путем
введения активного онкогена тус. Как «культивирование», так и
приобретение гена тус делали КЭФ очень чувствительными
к трансформирующему действию гена EJ-ras. Однако разница
между двумя эффектами, как выяснилось, все же существует,
и она была выявлена. EJ-ras-myc-трансфектанты индуцировали
опухоль, которая достигала статического размера 2 см после
3 нед быстрого роста в голых мышах. В противоположность
этому «установленная» культура КЭФ, несущая ген EJ-ras, инду-
цировала опухоли, которые росли, пока не убивали животное.
Опыт был оценен следующим образом: ген тус резко увеличи-
вает проявления фенотипа, создаваемого онкогеном EJ-ras.
однако не способен полностью воспроизводить клеточные при-
знаки, приобретаемые в результате установления культуры и
иммортализации in vitro.
311
Дальнейшие исследования свойств гена тус, позволяющих
ему кооперировать с онкогеном EJ-ras, показали, что длинные
концевые повторы (LTR), несущие как промотеры, так и энхен-
серы, сами по себе не могут быть ответственными за наблю-
даемую активность клона в результате лишь делеции Sac I фраг-
мента величиной 1,6 т. о., располагающегося в белоккодирующих
последовательностях онкогена gag-myc в пределах pSVv-myc
(см. стр. 311). При котрансфекции с ДНК EY-ras-онкогена этот
модифицированный провирус не индуцировал заметного опухоле-
вого фенотипа. Следовательно, активность гена тус зависела
от синтеза части или всего gag myc белка.
Аналогичный результат авторы попучили при использовании
гена тус из мышиной плазмоцитомы.
Комплементационные группы. Способность генов EJ-ras и тус
кооперировать побудила R. Weinberg и его сотрудников испытать
и другие комбинации генов (myc с N-ras и др.).
Активный к тон N-ras был в лаборатории R. Weinberg изоли-
рован из клеток линии HL-60. N-ras и Ha-ras из EJ-линии коди-
руют сходные белки. Как и ожидалось, N-ras вел себя идентично
с Ha-ras-геном в его способности кооперировать с геном тус.
Поэтому оба ras-гена были помещены в одну и ту же группу
комплементации.
Любопытный результат получен в комплементационных опытах
с двумя вирусными генами, кодирующими средний и большой
Т-антигены вируса полиомы, изолированными как отдельные
молекулярные клоны. Эти гены придают культивированным кры-
синым клеткам определенные и различающиеся друг от друга
фенотипы. Средний Т-антиген индуцирует морфологическое изме-
нение и независимость от закрепления на поверхностях, в то
время как большой Т-антиген определяет зависимость от сыво-
ротки и клеточную иммортализацию.
Опыты показали, что трансфекция клона гена среднего Т-анти-
гена (рРуМТ 1) одного или вместе с EJ-ras-ДНК не индуцирует
фокусов в культурах. Наоборот, котрансфекция клона гена сред-
него Т-антигена и клона гена тус вызывала фокусы трансформа-
ции. В опытах на туморогенность эти культуры дали опухоли
у 2 из 5 животных. Таким образом, средний Т-антиген вел себя
сходно, но не идентично с EJ-ras и мог быть включен в ту же
комплементарную группу, что и гены семейства ras.
Трансфекция клона усеченного гена большого Т-антигена
(одного) не оказывала какого-либо действия на морфологию
монослоя 3° КЭФ. Тот же результат дала котрансфекция с тус-
клоном (pSVv-myc). Однако при котрансфекции этого клона
измененного гена большого Т-антигена с EJ-ras появлялись
многочисленные фокусы уже через 10 дней. При инокуляции
фокусов контрансфецированных культур голым мышам появ-
лялись быстрорастущие опухоли. В отличие от опухолей, индуци-
рованных комбинацией myc-EJ-ras, которые останавливались
в росте по достижении 2 см, эти опухоли продолжали расти
до гибели животных.
312
Эти данные показывают, что урезанный большой Т-ген ведет
себя подобно тус в его способности кооперировать с геном ras.
Однако два этих гена функционируют неидентично: тус позволяет
расти опухоли до ограниченного размера, тогда как урезанный
большой Т-ген — до неограниченного роста опухоли.
О чем говорят описанные опыты? Генам тус и ras приписы-
вается участие в индукции многих разнообразных опухолей. Так,
активные ras-онкогены обнаружены в карциномах мочевого
пузыря, толстой кишки, легкого, поджелудочной железы, кожи,
в нейробластомах, саркомах и, по крайней мере, трех гемо-
поэтических неоплазмах. Клеточные гены Ki-ras и Ha-ras кодируют
почти идентичные белки. Анализ последовательностей третьего
члена этого семейства генов, названного N-ras, показал последо-
вательности аминокислот, очень близкие таковым двух других
членов семейства генов. Возможно, что все члены семейства
ras действуют сходно, если не идентично.
Ген тус также вовлечен в развитие ряда опухолей. Он ассо-
циирован с такими гемопоэтическими заболеваниями, как миело-
цитоматоз, миелоидный лейкоз, бурсовая лимфома, лимфома
Беркитта и плазмоцитома. Показано его участие в негемопо-
этических заболеваниях. Вирусы, трансдуцировавшие v-myc-
онкоген, известны своей способностью инициировать карциномы
почек, поджелудочной железы, печени и мезотелиому. Продемон-
стрировано присутствие этого гена в амплифицированном числе
копий в нейроэндокринной опухоли толстой кишки.
Все эти разнообразные и многочисленные данные свидетель-
ствуют о том, что ни один тип гена не является тканеспецифи-
ческим онкогеном, имеющим узкий круг тканевого тропизма.
Напротив, каждый тип гена компетентен в разнообразной кле-
точной среде. Более того, возникновение в корне отличных типов
опухолей, вероятно, зависит от общих молекулярных механизмов,
вовлекающих часто активацию ras- или myc-онкогенов. Многие
ткани проявляют сходное поведение по отношению к этим онко-
генам.
Различные действия генов ras и тус. Онкоген ras способен
изменять морфологию КЭФ в монослоях и может также инду-
цировать рост колоний в мягком агаре. Он, однако, не способен
индуцировать явные фокусы среди плотнорастуших нормальных
клеток. КЭФ, трансформированные ras, проявляют очень ограни-
ченную пролиферативную и туморогенную способность. Это
отличает их от обладающих высокой туморогенной активностью
На- и Ki-мышиных саркомных вирусов, которые трансдуцируют
очень близкородственные гены ras и способны индуцировать
опухоли в соответствии с «одноударной» кинетикой. R. Weinberg
считает, что, возможно, ступени вирусного туморогенеза in vivo
нам менее понятны, чем мы предполагаем, и отдельные этапы
его могут зависеть, помимо экзогенного онкогена, от изменения
каких-то дополнительных клеточных факторов.
В свою очередь, онкоген тус, действуя один, согласно данным
лаборатории R. Weinberg, практически не влияет на морфологию
313
КЭФ. Этот результат не совпадает с данными других авторов
о трансформации фибробластов грызунов птичьими тус-онко-
генами. Здесь необходимы дополнительные исследования.
Некоторые методические вопросы принципиального характера.
Главный вывод рассмотренной выше работы R. Weinberg и его
сотрудников заключается в том, что онкогены ras и тус действуют
по-разному, так как вместе они способны осуществить образование
фенотипов, которые не способны индуцировать порознь. Создается
впечатление, что их способ действия различается качественно
и действие каждого направлено на разные клеточные мишени.
Изучение онкогена тус до последнего времени затруднялось
из-за отсутствия какого-либо индуцированного им в клетках
млекопитающих специфического фенотипа. Возможно, что система
КЭФ R. Weinberg окажется удобной моделью для испытания
тус и других онкогенов.
В исследовании R. Weinberg и сотрудников следует обратить
особое внимание на обнаруженный феномен процессов установле-
ния культуры клеток (establishment) и иммортализации в развитии
функций, которые способны кооперировать с онкогеном ras.
Пока не известно, как много отдельных клеточных функций
требуется для развития полностью туморогенного фенотипа.
Однако похоже на то, что культивированные (established) клетки
несут все необходимые для этого функции, кроме тех, которые
привносят онкоген ras, чье включение производит полную транс-
формацию по типу «одноударной» кинетики.
Культура ЗТЗ-клеток сыграла свою, причем важную, роль.
Она оказатась очень удобной для выявления отдельных онкогенов
методом трансфекции, так как, будучи полутрансформированной,
позволяла выявлять онкогены, способные осуществлять лишь
отдепьные, в большинстве заключитетьные, этапы формирования
неопластического фенотипа. Дальнейшие исследования показали,
однако, что система ЗТЗ-клеток позволяет выявлять лишь огра-
ниченный участок общей цепи событий в канцерогенезе. В этом
свете новая модель бопее нативных крысиных эмбриональных
фибробластов имеет значительное преимущество. Оптиматьным
будет комбинированное использование обеих клеточных систем.
Обязательна ли строгая временная последовательность от-
дельных этапов в многоступенчатом процессе создания опухоле-
вого фенотипа? Оказалось, что это не так. Тот же R. Weinberg
и его сотрудники проделали следующий опыт. Авторы ввели
онкоген c-Ha-ras (EJ) в 2° КЭФ и лишь позже осуществили
установление (культивирование) трансформированных клеток
in vitro. Указанные клетки приобрели туморогенный фенотип.
Это явно указывало на то, что порядок двух событий — приобре-
тение онкогена ras и установление культурального состояния
клеток — не важен для конечного результата.
Опыты с комплементацией онкогенов и схема «многоступен-
чатого» канцерогенеза. Внесение онкогена тус приводит к со-
314
зданию фенотипа, который частично имитирует эффект установле-
ния культивирования клеток in vitro; добавление онкогена ras
придает признаки образования фокусов и туморогенеза. Однако
внесение тус и установление характеристик клеточной культуры
создают идентичные изменения в поведении клеток. Нет прямых
доказательств, что тус способен вызывать иммортализацию
клеток, так же как неизвестно, зависит ли процесс установления
культурального состояния и иммортализации от активации тус-
подобных клеточных генов. Тем не менее оба фактора оперируют
очень сходно. Это позволяет объединить в одну комплементарную
группу тус и функции, связанные с установлением культурального
состояния («готовности»). Присоединение к этому классу гена
большого Т-антигена не является неожиданным, так как данному
гену приписывалось и ранее участие в функциях создания «готов-
ности» и иммортализации. Известны также опыты, указывающие
на кооперирование онкогена ras с Ela-онкогеном аденовируса 5
и на то, что Е1а действует подобно гену большого Т-антигена
полиомы в индукции клеточной иммортализации. Таким образом,
в функциональный класс онкогена тус, гена большого Т-антигена
и генов создания культивированного состояния («готовности»)
следует внести также ген Е1а.
Другой класс трансформирующих онкогенов включает гены
Ha-ras, N-ras и ген среднего Т-антигена полиомы. Этот класс,
участвующий в морфологическом изменении клеток и создании
свойства независимости от закрепления на поверхностях, кодирует
генные продукты, локализующиеся на цитоплазматической
мембране. Наоборот, гены вышеупомянутого пёрвого класса (тус,
большого Т-антигена и Е1а) кодируют белки, связывающиеся
с ядерными структурами.
R. Weinberg считает [Land Н. et aL, 1983], что выявленные
по крайней мере 2 молекулярные ступени в процессе канцеро-
генеза обусловлены активацией ras-подобного и тус-подобного
генов. Пока нет уверенности, что эти две ступени достаточны
для превращения нормальной клетки в полностью компетентную
опухолевую. Видимо, в этом процессе участвуют и другие системы.
О такой возможности говорят следующие факты.
Клетки, несущие онкогены тус и ras, порождают опухоли,
которые достигают большого, но статического (стационарного)
размера. Это контрастирует с клетками, которые приобрели
онкоген ras и подверглись культивации (приобрели состояние
«готовности», establishment). Такие клетки порождают опухоли с,
по-видимому, неограниченной способностью роста, из чего следует,
что процесс «готовности» (культивируемости) клеток, имморта-
лизации ведет к возникновению клеточных функций, помимо
тех, которые осуществляет один лишь тус. В этом случае должен
существовать как минимум третий, отличающийся ген, который
мог бы кооперировать с ras и тус в создании полностью тумо-
рогенного фенотипа.
315
Есть основания думать, что число отдельных ступеней в канце-
рогенезе ограниченно и каждая из них может быть описана на
молекулярном уровне.
Использование методов переноса генов и молекулярного кло-
нирования позволило установить некоторые наиболее важные,
центральные детерминанты ракового процесса. Эти детерми-
нанты — онкогены и их продукты — онкобелки, действующие как
на структуру, так и на функции клеток, влияющие на регуля-
торные механизмы биохимических реакций. Многие из этих
функций онкогенов и онкобелков пока неизвестны, однако при
современном уровне знаний их расшифровка является скорее
делом техники, чем принципа. Подлежат выяснению еще такие
специфические свойства опухолевых клеток, как независимость
от регуляторных сигналов, своеобразие взаимодействия с субт
стратом, независимость от факторов роста, своеобразие энерге-
тического метаболизма и, конечно, неконтролируемость клеточного
деления. Вероятнее всего, многие характерные черты процесса
канцерогенеза могут быть определены в терминах активации
и экспрессии конкретных онкогенов.
Разработка современных методов терапии злокачественных
заболеваний настоятельно требует получения и применения
лекарственных препаратов, которые распознают и блокируют
конкретные мишени, присутствующие только в опухолевых клет-
ках. Эти мишени должны иметь отношение к регуляции клеточного
роста и поведения популяции клеток в целом. Онкогены и их
онкобелки являются хорошими кандидатами в качестве мишеней
для целенаправленной химиотерапии. Поэтому, изучая, как рабо-
тают онкогены и онкобелки отдельных этапов онкогенеза, пред-
ставляется возможным понять, какими должны быть их антаго-
нисты.
За время, прошедшее с момента завершения работы над
рукописью данной книги (середина 1984 г.) до ее появления
в свет (конец 1986 г.), молекулярная онкология продолжала
бурно развиваться, что нашло отражение в огромном количестве
новых публикаций. Последние не только существенно дополняли
и подкрепляли основные положения, изложенные в книге, но
нередко побуждали изменить толкование некоторых частных и
общих явлений в процессе канцерогенеза.
Указанное обстоятельство заставило нас дать хотя бы очень
краткое резюме новых фактов, ставших известными к середине
1986 г. (срок, когда еще было возможно внести в рукопись
какие-то изменения).
Ниже приводится лаконичная сводка этих данных.
Как уже подробно рассматривалось в гл. 3—5, включение
в «работу» протоонкогенов и превращение их в активные онкогены
316
имеют место при вирусном, химическом и так называемом спонтан-
ном (неизвестного происхождения) канцерогенезах, что показано
на примере разнообразных опухолей человека и животных. В ряде
случаев химического канцерогенеза и при анализе опухолей чело-
века продемонстрирована активация протоонкогенов суперсе-
мейства src, например ras, erb В, raf, а также семейства тус
[Cooper G., 1984; Bishop J. М., 1984].
Комбинация функционирующих онкогенов и характер механиз-
мов активации протоонкогенов при вирусном, химическом онкоге-
незе и в злокачественных опухолях человека оказались близкими
и в общих чертах сходными.
Длительное время исследователи не имели информации об
активации онкогенов при радиационном и спонтанном канцероге-
незах у животных. Однако оказалось, что, например, при радиа-
ционном канцерогенезе, в частности в случае индукции лимфом
у мышей у-лучами, происходит активация протоонкогена c-Ki-ras
[Guerrero I. et al., 1984]. Установлено, что активация этого
протоонкогена в лимфомах связана с точковой мутацией в 1-м
экзоне, где происходит замена гуанина на аденин. Следствием
указанной мутации является включение в синтезируемый белок
не глицина, а аспарагиновой кислоты, что существенно меняет
его стереохимию и биологические свойства.
Онкоген типа Ha-ras был обнаружен в «спонтанны^» гепато-
целлюлярных аденомах и карциномах мышей. Препараты ДНК
этих опухолей были активны в тесте на трансфекцию клеток
NIH ЗТЗ, и онкоген активировался в результате точковой мутации
[Reynolds S. et al., 1985].
Новое подтверждение получила гипотеза об общности (род-
стве) генов, с одной стороны, нормальных, контролирующих
пролиферацию и дифференциацию, а с другой — осуществляющих
злокачественный рост. Переход от одной, позитивной, функции
к другой, негативной, обусловлен активацией нормальных клеточ-
ных генов (протоонкогенов) в онкогены в результате уже извест-
ных науке генетических событий на уровне ДНК-
Примерами могут служить протоонкоген c-sis (гомолог онко-
гена v-sis, индуцирующего саркомы у обезьян), продукт которого
идентичен В-цепи ростового фактора тромбоцитов (РФТ) (см.
гл. 4); продукт другого гена — с-В-lym (гомолог онкогена В-1ут,
принимающего участие в малигнизации В-лимфоцитов чело-
века,— лимфома Беркитта и др.) идентичен фактору роста ге-
мопоэтических клеток, трансферрину (см. гл. 5) [Moelling К.,
1985]. Возможный механизм действия этих генов заключается
в том, что неадекватное включение их экспрессии вызывает
аутокринную стимуляцию клеток к пролиферации собственными
онкобелками — факторами роста.
Примером другого свойства продуктов протоонкогенов,
а именно их рецепторной роли может служить функция генов
c-erb В и, по-видимому, c-fms и c-abl, а также некоторых других
317
генов суперсемейства src [Hunter Т., 1985; Moeiling К-, 1985J.
Продукт гена c-erb В — gp68erbB гомологичен внутриклеточному
домену рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР). Глико-
зилированный белок рецептора ЭФР gp 170 кд состоит из 3 частей:
внеклеточного домена, служащего участком связывания рецептора
с факторами роста; трансмембранного домена — участка связи
рецептора с клеточной мембраной; внутриклеточного, протеинки-
назного домена — участка рецептора, осуществляющего фосфо-
рилирование по треониновому остатку клеточной протеинкиназы С
[Hunter Т., 1985; Moeiling К., 1985). Вся схема направленного
переноса сигнала, регулирующего рост клетки, полностью не
изучена, и поэтому неясно, каким образом конкретно онкоген
c-erb участвует в малигнизации. Однако экспериментальные
данные указывают, что этот ген способен трансформировать
клетки NIH ЗТЗ в опытах по трансфекции. Установлено, что он
является онкогеном нейробластом крыс, индуцированных этил-
нитрозомочевиной. Кроме того, оказалось, что экспрессия гена
c-erb В во много раз усилена в злокачественных опухолях мозга
человека глиального происхождения [Liberman Т. A. et al., 1985].
В образцах ДНК этих опухолей при рестрикционном анализе
обнаружены амплификация и реаранжировка протоонкогена c-erb
В, что объясняет усиленную продукцию онкобелка, гомологич-
ного ЭФР. В эпидермоидной карциноме человека (клеточная
линия А 431) также обнаружены гиперэкспрессия, амплификация
и реаранжировка онкогена c-erb В [Ullrich A. et al., 1984; Hel-
din C.-H. et al., 1984; P. Roy-Burman et aL, 1984]. Авторы наблю-
дали повышенную продукцию онкобелка erb В во всех испытанных
клеточных линиях, полученных от больных острыми лимфоидными
(независимо от их В- или Т-природы) и миелоидными лейкозами.
Протоонкоген c-erb В экспрессировался и в лимфоцитах перифери-
ческой крови здоровых людей. Напротив, увеличенная экспрессия
генов с-myc и c-myb была обнаружена лишь в нескольких случаях
неоплазм В-клеточной природы.
Следовательно, аномальная гиперэкспрессия протоонкогенов,
продукты которых имеют трансмембранное расположение в клетке
и обладают протеинкиназной активностью, может приводить
к малигнизации. Процесс этот, по-видимому, тесно связан с нару-
шением регуляторных сигналов, поступающих на клеточную мем-
брану, и с функцией других активированных онкогенов, в част-
ности продукта онкогена ras (онкобелка р21), ГТФ-связывающая
способность которого значительно стимулируется ЭФР [Ка-
mata Т., Feramisco J., 1984]. При этом уровень фосфорилирования
онкобелка р21 также возрастает, что активирует все остальные его
многочисленные функции (см. ниже).
Обязательными участниками «каскада» «работающих» онкоге-
нов являются протоонкогены семейства тус. Так, продукту гена
с-тус — фосфопротеину рр64с П1ус — отводят роль передатчика
(трансмиттера) сигнала от клеточной поверхности (рецептора
318
erb В, способного фосфорилировать этот онкобелок) в ядро
[Heldin С.-H., Westermark В., 1984].
Еще одним важным свойством протоонкогенов и кодируемых
ими белков, связанным с факторами роста, размножения и диф-
ференцировки клеток, является их «включение» в определенные
фазы клеточного цикла и стадии дифференцировки. Было по-
казано, что после воздействия на клетки в фазе Go различных
факторов роста не наступают Gr и S-периоды клеточного цикла,
если не происходит экспрессии протоонкогена c-ras, т. е. продукции
белка р21 [Mulcahy L. S. et al., 1985; Kataoka T. et al., 1985].
Включение экспрессии того или иного протооикогена определяется
природой воздействующего на клетку фактора роста и типом
самой клетки. Это положение особенно четко документировано
на примере активации протоонкогенов c-myc и c-fos. Стимуляция
роста фибробластов NIH ЗТЗ сывороткой крови или очищенными
факторами роста, например ЭФР, РФТ и др., уже через несколько
минут приводила к резкому усилению экспрессии протоонкогена
c-fos и синтезу соответствующего онкобелка. Через 20 мин экспрес-
сия этого гена прекращалась [МйПег К. et al., 1984]. К этому
моменту наблюдалось включение протоонкогенов c-ras и c-myc,
а также гена а-актина. Полагают, что активация экспрессии гена
c-fos является самым ранним генетическим событием в ответ на
стимулирующее воздействие на клетку факторов роста [МйПег R.
et al., 1984]. Воздействие факторов роста на другие клетки,
например амниона или макрофаги, также приводит к наиболее
раннему включению экспрессии протооикогена c-fos. Однако в этих
клетках данный ген функционирует более или менее постоянно.
Результаты позволили предположить, что c-fos в фибробластах
контролирует пролиферацию клетки, а в макрофагах — дифферен-
цировку [Muller R. et al., 1984]. Опыты по трансфекции подтвер-
дили роль c-fos в дифференцировке. Так, введение в культуру
стволовых клеток тератокарциномы (линия F9) гена c-fos в комп-
лексе с промотером человека или мыши приводило к экспрессии
этого протоонкогена, в результате чего клетки изменяли морфоло-
гические свойства и продуцировали специфические маркеры, ха-
рактерные для дифференцированных клеток [Muller R., Wag-
ner Е. F., 1984].
От первоначального мнения об участии гена c-myc в регуляции
клеточного цикла (в частности, его роли в переходе клеток из
периода Go в GJ, основанного на результатах опытов с 0-интерфе-
роном [Einant М. et al., 1985] и на факте усиления его транскрип-
ции под влиянием факторов роста [Thomson О. В. et al., 1985],
позже отказались, сочтя эффекты не обусловленными стадиями
клеточного цикла [Thompson О. В. et al., 1985]. Было показано,
что уровень транскрипции c-myc и количество кодируемого им
белка в клетке не изменяются в течение всего периода клеточного
цикла [Haun S. R et al., 1985]. Авторы пришли к заключению,
что к осуществлению клеточного цикла причастны две категории
319
генов: 1) ген тимидинкиназы и ген гистона Н2Ь, которые экспрес-
сируются в строго определенный период клеточного цикла; 2) гены,
транскрибирующиеся в пролиферирующих клетках в течение всего
клеточного цикла [Thompson О. В. et al.. 1985]. К этой второй
группе можно, по-видимому, отнести и протоонкогены семейства
ras, экспрессирующиеся на протяжении всего клеточного цикла
[Muller R. et aL, 1984].
Ассоциация онкогенов семейства ras с возникновением пода-
вляющего большинства опухолей человека и животных свиде-
тельствует о многофункциональной роли онкобелков p21c ras в па-
тогенезе превращения нормальных клеток в злокачественные
[Weinberg R., 1984; Kraus Н. et al., 1984; Tanabe T. et al., 1985].
Как минимум 50 % первичных опухолей и опухолевых клеточных
линий карцином толстой кишки и легких содержат активный
онкоген c-Ki-ras 2. В несколько большем проценте случаев актив-
ный онкоген c-N-ras выявляется у больных миелолейкозами
[ Kraus Н. et al., 1984].
Получение моноклональных антител [MAbs и MAb RAP-1]
к онкобелку p21Haras, содержащему в 12-м кодоне аминокислоту
валин, позволило провести анализ активации онкогенов этого
семейства радиоиммунологическими методами [Hand Р. Н. et al.,
1984]. Моноклональные антитела к онкобелку, содержащему точ-
ковую мутацию, не взаимодействовали с продуктом экспрессии
нормального протоонкогена c-Ha-ras 1.
В этих исследованиях было установлено, что все карциномы
толстой кишки и молочной железы содержали повышенное коли-
чество онкобелка p21Haras. В подавляющем большинстве указан-
ных опухолей человека моноклональные антитела выявляли ано-
мальный, т. е. содержащий мутацию, онкобелок. Напротив, про-
цесс дисфункциональных изменений протоков молочной железы,
фиброаденоматоз и кистозный фиброаденоматоз не сопровожда-
лись повышением синтеза онкобелка и его мутацией [Hand Р. Н.
et al., 1984]. Аналогичные данные были получены для нормальной
слизистой оболочки толстой кишки. Авторы разработали весьма
перспективный метод для скрининга, а также диагностики при-
сутствия аномального продукта онкогена ras в фиксированных
формалином биопсийных препаратах. Парафиновые срезы биоп-
сийного материала онкологических больных окрашивали посред-
ством иммунопероксидазного метода.
Использование высокочувствительной техники позволило уста-
новить, что уровень экспрессии онкогена ras коррелирует с про-
грессией морфологических признаков злокачественности и глуби-
ной прорастания опухолевых клеток карцином толстой кишки
в стенку кишки.
Наибольшее количество онкобелка р21 выявлялось в инвазив-
ных аденокарциномах и клетках опухолей, прорастающих всю
стенку толстой кишки до перитонеальной оболочки брюшной
полости [Thor A. et al., 1984].
320
В геноме клеток млекопитающих идентифицированы гены,
препятствующие прогрессии опухолевых признаков и метастазиро-
ванию [Wallich R. et al., 1985]. Ими оказались гены, кодирующие
антигены большого комплекса гистосовместимости класса I,
а именно Н-2К. Экспрессия de novo генов Н-2К в опухолевых
клетках приводит к уменьшению признаков их злокачественности
и полному запрещению формирования метастазов у сингенных
животных [Wallich R. et al., 1985]. В данном случае присутствие
Н-2К-антигена позволяет иммунной системе эффективно распоз-
навать опухолевые клетки и препятствовать их диссеминации
в организме. Не исключено, что нарастание концентрации онко-
белка р21с'га® в опухолевых клетках или продукта другого онкогена
реципрокно влияет на экспрессию генов комплекса гистосовмести-
мости.
В последнее время активно изучается, помимо точковых мута-
ций, другой механизм активации экспрессии онкогенов типа Ha-
ras, а именно путем их амплификации. Это явление наблюдали
в ряде опухолей: раке мочевого пузыря [Hayashi К. et al., 1983],
меланоме и раке молочной железы [Bishop J. М., 1984]. Отмечено,
что онкоген типа Ha-ras не только амплифицируется, но и подвер-
гается реаранжировке. Как правило, этот онкоген амплифици-
руется в первичных и вторичных трансформантах клеток NIH ЗТЗ,
индуцированных образцами опухолевых ДНК [Князев П. Г. и др.,
1985; Pulciani S. et aL, 1982].
Большой прогресс отмечается в изучении онкобелков онкогенов
семейства ras. Недавно обнаружены протоонкогены ras в геномах
дрозофилы [Reymond С. D. et al., 1984] и дрожжей [Galwitz D.
et al., 1983]. Встает вопрос об использовании новой информации
в этой области для диагностики злокачественных опухолей.
Всего в настоящее время известно 11 членов протоонкогенов
и онкогенов семейства ras. В их числе: c-Ha-ras 1, v-Ha-ras,
c-Ki-ras 2, v-Ki-ras, c-N-ras, v-Ra-ras, Dras 1 и Dras 2 (Droso-
phila), c-rassc l, c-rassc'2 и YP2 (Yeast) [Tanabe T. et al., 1985].
Присутствие протоонкогенов ras в геноме клеток относительно
просто устроенных организмов, таких, как, например, дрожжи,
значительно упрощало изучение биологической функции продук-
тов их экспрессии и, что особенно важно, позволяло исследовать
участие онкобелков в росте и размножении дрожжевых клеток.
Сложные генетические эксперименты позволили обнаружить
у продуктов генов ras дрожжей новую, ранее неизвестную фермен-
тативную активность, ассоциированную с онкобелком р21,—
обеспечивающую функцию регуляции GTP-зависимой аденилат-
циклазы [Toda Т. et al., 1985]. При этом в экспериментах по
трансфекции клеток дрожжей, дефектных по аденилатциклазной
активности, онкогеном c-Ha-ras человека, было показано, что этот
ген практически полностью компенсировал указанный генетиче-
ский дефект реципиентных клеток. Функционирование в дрожже-
вой клетке онкогена рака мочевого пузыря человека типа Ha-ras
21
321
значительно повышало уровень GTP-зависимой аденилатци-
клазы в клеточных мембранах, а в цитоплазме — сАМР. Однако
трансформанты дрожжевых клеток имели существенно удлинен-
ный С|-период митотического цикла [Kataoka Т. et aL, 1985].
Эти данные позволили авторам предположить, что онкобелок р21
может принимать участие в регулировании аденилатциклазной
активности, а также контролировать переходы клеток млекопи-
тающих из Gr в S-период митотического цикла [Kataoka Т.
et al., 1985].
Семейство клеточных белков, обладающих функцией связыва-
ния гуаниновых оснований (G-связывающие белки), осуществляет
важную роль в трансдукции сигналов, генерируемых от рецепторов
клеточной мембраны. Эти белки, как показал структурный анализ,
представляют собой комплекс, состоящий из трех субъединиц: а, 0,
у [Tanabe Т. et al., 1985]. Именно а-субъединица одного из членов
семейства G-связывающих белков трансдуцина ответственна за
указанную активность. Трансдуцин участвует в передаче визуаль-
ного сигнала с поверхности клеток благодаря образованию комп-
лекса с фотолизированным родопсином и активации с GMP
фосфодиэстеразы. Одной из энзиматических активностей, обнару-
женных у белка р2Г'г“, как уже упоминалось, была именно его
G-связывающая функция. Следовательно, р2Г ras по этой характе-
ристике может быть отнесен к семейству указанных белков. При
сопоставлении первичной структуры онкобелка p2lcras с трансду-
цином оказалось, что он имеет значительную гомологию с а-
субъединицей трансдуцина, а именно в области сайта, ответствен-
ного за связывание dGTP и dGDP [Tanabe Т. et aL, 1985].
Следовательно, онкобелок р2Г ras в процессе трансформации кле-
ток может модифицировать передачу регуляторных сигналов от
клеточной мембраны.
Все эти данные показывают, что белок p21cras принадлежит
к семейству онкобелков с мультифункциональным действием.
В гл. 3 уже отмечалось, что подобное многофункциональное
свойство онкобелка впервые обнаружено у pp60v src, продукта
онкогена v-src. Оба гена — v-src и v-ras — принадлежат к одному
суперсемейству, поскольку происходят от одного родоначального
гена, контролирующего киназную функцию. Онкобелок р2Г'га*
в процессе трансформации клеток, по-видимому, существенно
влияет на биоэнергетику клетки [Kataoka Т. et aL, 1985] и пере-
дачу регуляторного сигнала от клеточной мембраны в ядро [Ta-
nabe Т. et aL, 1985]. Несомненно также и то, что онкобелок
р2Г ras в своем многофункциональном действии в процессе малиг-
низации клетки-мишени кооперирует с функциями других активи-
рованных протоонкогенов [Weinberg R., 1983; Land Н. et aL, 1983,
1984].
В непосредственной связи с аномальной регуляцией транскрип-
ции протоонкогенов, особенно ее усилением, могут находиться
так называемые «усиливающие последовательности» — энхен-
322
серы, которые первоначально были обнаружены в участках вирус-
ных промотеров [Gruss Р. et al., 1983]. Усиливающие последо-
вательности обнаружены в геноме нескольких представителей
паповавирусов и ретровирусов. Хотя строгой гомологии их первич-
ной нуклеотидной последовательности у различных вирусов
не было обнаружено, они имели ряд общих, весьма примечатель-
ных функциональных свойств [Mercola М. et al., 1983]. Во-первых,
усилители действуют на промотеры только в cis. Во-вторых, они
могут влиять как на 5'-, так и на З'-промотеры. В-третьих, усили-
тели работают в любой ориентации в отношении к промотеру и на
значительных расстояниях (10—20 т. п. о.) от промотера. В-чет-
вертых, они могут влиять на гетерологичные промотеры. Актив-
ность клеточных промотеров, например гена В-глобина кроликов,
усиливается более чем в 100 раз в присутствии вирусных усили-
телей. В отношении механизма усиливающего действия энхенсеров
многое остается загадочным. Однако в ряде исследований уста-
новлено, что энхенсер вируса SV40 увеличивает количество
ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанной с ДНК [Treisman R.,
Maniatis Т„ 1985; Weber F., Schaffner W„ 1985].
В настоящее время надежно показано, что в геноме эукариоти-
ческих клеток присутствуют подобные элементы, способные ткане-
специфично влиять на усиление транскрипции определенных генов.
Эффект тканеспецифичен.
У млекопитающих одними из первых изученных в этом отно-
шении генов, имеющих в геноме в области промотеров усилители,
оказались гены иммуноглобулинов [Mercola М. et al., 1983].
Можно предполагать, что транслокации участков хромосом и
реаранжировки в геноме распространяются не только на области
онкогенов, но также на последовательности промотеров и энхенсе-
ров. Это обстоятельство создает дополнительные возможности
активации клеточных генов вообще и протоонкогенов в частности.
Существенное влияние на действие усилителей оказывает их
метилирование. В этой связи процессы деметилирования усили-
телей промотеров протоонкогенов, например c-ras и с-тус, что
имеет место при малигнизации клеток, могут многократно увеличи-
вать их транскрипцию [Feinberg A., Vogelstein В., 1983; Нау-
day А. С. et al., 1984].
Для некоторых стероидных гормонов, например глюкокорти-
коидов, установлен механизм передачи их информации от специфи-
ческого рецептора в геном клетки. Комплекс «стероидный гор-
мон — рецептор», прямо взаимодействуя со специфическими по-
следовательностями ДНК, прилежащими к промотеру, включает
экспрессию строго определенного гена [Beato М. et al., 1983].
Точные данные относительно сайта связывания комплекса
«гормон—рецептор» с ДНК получены для области промотера
ДНК-провируса MMTV. Эти последовательности ДНК-провируса
MMTV оказались усилителем. Аналогичные данные были полу-
чены и для представителей стероидных гормонов (прогестерона и
21*
323
дексаметазона), которые также взаимодействовали с энхенсером.
Точная нуклеотидная последовательность участка связывания
гормона с ДНК не определена, однако оказалась весьма близкой
коровой последовательности, обнаруженной в нескольких энхенсе-
рах вирусов — 5'-GTGGttG-3' [Parker М., 1983]. Ряд авторов
полагают, что перечисленные выше гормоны должны связываться
со строго определенной (специфичной) областью геномной ДНК,
стимулируя один и тот же усилитель. Не исключено, что в случае
гормонозависимых раков роль активаторов протоонкогенов опо-
средованно через усилители играют специфические комплексы
«гормон—рецептор».
Можно думать, что обнаружению усилителей в геноме клеток
млекопитающих, их роли в активации протоонкогенов в процессе
канцерогенеза в будущем будет уделяться особое внимание.
Имеются данные об участии в процессах дифференцировки
последовательностей так называемых «homoe boxes» [Colberg-
Poley A. M. et al., 1985]. Разработка этого направления исследо-
ваний может пролить дополнительный свет на роль сочетанной
экспрессии последовательностей «homoe boxes» и протоонкогенов
в канцерогенезе.
Новейшие данные о генах, контролирующих рост и пролифе-
рацию клеток, протоонкогенах и онкогенах, факторах роста (ФР)
и онкобелках позволяют, пока в общих чертах, рассмотреть рабо-
чую модель малигнизации клеток.
Использование техники культивирования раковых клеток
в средах, не содержащих сыворотку крови, а также получение
очищенных ФР позволили точно определить, какие специализи-
рованные факторы утратили свое стимулирующее действие на
конкретную клеточную популяцию. Подобная утрата зависимости
роста и пролиферации многих раковых клеток от специализиро-
ванных ФР, по-видимому, является одной из общих характеристик
малигнизации [Goustin A. S. et al., 1986]. Независимость раковых
клеток от ФР может обеспечиваться: а) активацией синтеза
белков, аутологичных ФР — «аутокринная активация»; б) обра-
зованием поврежденных (видоизмененных) рецепторов; в) акти-
вацией пострецепторных путей переноса регуляторных сигналов,
что позволяет обходиться раковым клеткам без рецепторов ФР
вообще [Hunter Т., 1986; Goustin A. S. et al., 1986].
В последнее время были получены данные, свидетельствующие
в пользу того, что автономность роста или независимость малиг-
низированных клеток от внеклеточных специализированных ФР
ткани может быть обусловлена перманентной экспрессией неко-
торых протоонкогенов или онкогенов [Stiles Ch., 1985; Martinet V.
et aL, 1986]. Продукты экспрессии последних перенимают функ-
цию внеклеточных факторов и сами по себе являются ФР, или
рецепторами, передающими экстраклеточные регуляторные сиг-
налы. Они могут повышать порог чувствительности к указанным
сигналам, а также выполнять роль внутриклеточных ФР.
324
Несмотря на то, что между продуктами онкогенов — онко-
белками и ФР установлены определенные структурные и функцио-
нальные связи, биологическая (в данном случае трансформи-
рующая) функция ни одного из известных онкобелков до конца
не изучена. Это утверждение справедливо в отношении даже
такого онкобелка, как pp60vsrc, который был получен в чистом
виде еще в 1978 г. и изучен лучше других.
Тем не менее, на основе изучения локализации онкобелков
в клетке (взаимодействия с предполагаемыми мишенями) и иссле-
дования их ферментативной активности достоверно показано, что
онкобелки контролируют или принимают участие в важных про-
цессах жизнедеятельности клеток и организма в целом [Muller R.
et aL, 1984; Hunter T., Cooper J. A., 1985; Zimmerman K- A. et aL,
1986]. Функция протоонкогенов настолько важна, что количе-
ственные или структурные аномалии в них приводят к серьезным
последствиям в росте и дифференцировке стволовых клеток орга-
низма [Heldin С.-H., Westermark R., 1984; Hagag N. et aL, 1986;
Татосян А. Г. и др., 1986].
В ходе выяснения функций тех или иных онкобелков высказано
несколько рабочих гипотез превращения нормальных клеток
в неопластические. Наибольшее распространение и признание
получила концепция, рассматривающая «аутокринную актива-
цию» пролиферации клеток в качестве центрального элемента
трансформации. Первоначально эта концепция была сформули-
рована М. В. Sporn, G. Todaro (1980). Основу аутокринной
модели малигнизации клеток составляет биологически важная
эволюционно-реликтовая функция онкобелков, во многом ана-
логичная эндогенным факторам роста.
Первые и обнадеживающие данные, как уже отмечалось
в гл. 3 и 4, подтверждающие возможность аутокринной функции
онкобелков, были получены при сопоставлении первичной струк-
туры онкобелка p28vs,s и ростового фактора тромбоцитов (РФТ).
Частичный аминокислотный анализ В-цепи РФТ показал, что 109
аминокислот аминотерминального остатка этой цепи практически
идентичны предсказанным аминокислотным последовательностям
онкобелка p28vs,s (остатки 67=175). Только три замены амино-
кислот найдены в указанных последовательностях двух поли-
пептидных цепей [Doolittle R. F. et aL, 1983]. Обнаруженные
замены остатков аминокислот в продукте протооикогена c-sis —
белке p24c s,s человека, которые, как указывалось выше, идентичны
В-цепи РФТ и p28vs,s, могут отражать эволюционные различия
между человеком и обезьяной. Вполне вероятно, что протоонкоген
c-sis и ген РФТ имеют общее происхождение, а именно из одного
родоначального гена, некогда выполнявшего роль эндогенного
фактора роста [Doolittle R. F. et aL, 1983; Ohno S., 1985; Marti-
net V. et aL, 1986].
К этой категории генов относятся также протоонкоген lym 1
человека и средний Т-антиген вируса полиомы, кодирующие
325
белки, гомологичные трансферрину — фактору роста гемопоэти-
ческих клеток и гастрину — фактору роста некоторых эпителиаль-
ных клеток, соответственно [Baldwin G. S., 1985; Roger J. et al.,
1986].
Продукт протоонкогена c-mos будет, очевидно, причислен
к этой же категории — поскольку он оказался гомологичным
высокомолекулярному предшественнику ЭФР [Baldwin G. S.,
Twardzik К., 1985].
Возможный механизм туморогенного действия указанных
онкогенов заключается в том, что неадекватное появление про-
дукта онкогена, при наличии рецептора на клеточной мембране
или внутри клетки, приводит к аномальной стимуляции пролифе-
рации популяции клеток собственным фактором роста. След-
ствием аномальной пролиферации является трансформация кле-
ток, которая, при наличии других комплементирующих факторов
(функций) с этим онкобелком, приводит к малигнизации. Однако
детальный анализ трансформирующей функции аномальных ФР
типа РФТ, трансферрина и гастрина еще предстоит провести,
прежде чем эта категория онкобелков — факторов роста будет
отнесена к истинным трансформирующим факторам и определено
их место в цепи последовательного многостадийного превращения
нормальной клетки в раковую.
Ранее, в начале этого раздела, уже отмечалась рецепторная
роль онкобелков суперсемейства src. Продукты протоонкогенов
и онкогенов этого суперсемейства: c-erb В, c-neu, v-fms, v-abl,
v-ros, c-trk гомологичны внутриклеточному домену (протеинки-
назному) рецепторов различных ФР [Hunter Т., Cooper J. А.,
1985; Martin-Zanca D. et al., 1986]. Напомним, что продукт
протоонкогена c-erb В-гликолизированный белок gp68cerbB
практически идентичен внутриклеточному домену рецептора ЭФР
[Yamamoto Т. et al., 1986]. Продукт онкогена c-neu на 50 %
также гомологичен рецептору ЭФР, при этом наибольшая гомоло-
гия наблюдается в тирозинкиназном домене, в котором 80 %
аминокислотных остатков идентичны указанному рецептору
[Bargmann С. I. et al., 1986]. Полученные данные позволили
авторам высказать предположение, что продукт онкогена c-neu
кодируется геном рецептора пока неизвестного ФР, но близкого
по своей функции ЭФР.
Функция продукта протоонкогена c-fms аналогична. В этом
случае протоонкобелок р 170е fms оказался гомологичен внутрикле-
точному домену рецептора для ФР мононуклеарных макрофагов
[Hunter Т., Cooper J. А., 1985].
Недавно была установлена структура рецептора для стероид-
ных гормонов, обе формы которого и содержат последовательности
аминокислот, обогащенные по цистеину, лизину и аргинину
[Hollenberg S. М. et al., 1986]. Эти последовательности амино-
кислот представляют участок связывания рецептора стероидного
гормона с ДНК. Предсказанные с помощью ЭВМ последова-
326
тельности продукта онкогена c-erb Аа оказались высокогомо-
логичными обеим формам рецептора глюкокортикоидного гормона
в области карбокситерминального домена. Эти данные позволили
высказать предположение о том, что ген рецепторов стероидных
гормонов и протоонкогена c-erb А происходят из одного родо-
начального гена, который выполнял на ранних этапах эволюции
многоклеточных функцию эндогенного ФР [Weinberger С. et al.,
1986]. Гомология между рецептором стероидного гормона и
протоонкогеном c-erb Аа указывает также на существование
нового класса факторов (trans acting factors), взаимодействую-
щих с энхерсерами клеточного генома, иными словами факторами,
регулирующими транскрипцию клеточного генома [Weinberger С.
et aL, 1986].
Продукты других протоонкогенов этого суперсемейства,
например c-ras, c-src и возможно с-myc, также способны моди-
фицировать рецепторы, то есть фосфорилировать по тирозиновым,
сериновым и треониновым остаткам внутриклеточный домен
рецепторов ФР. Известно, что фосфорилирование активирует
внутриклеточный домен рецептора, делая его компетентным
к приему и передаче регуляторного сигнала внутрь клетки.
<Атака> онкобелком рецепторов ФР может в принципе извращать
смысл сигнала ФР. Так, следствием фосфорилирования (взаимо-
действия) рецепторов, например, фактора роста нервных клеток
и интерлейкина-3 онкобелками p21c ras и рр64с тус, является неза-
висимость этих клеток от соответствующих экзогенных факторов
роста [Rapp LJ. R. et al., 1985; Kaczmarek L. et al., 1985; Hagag N.
et al., 1986]. Подобная независимость клеток от экзогенных ФР
может рассматриваться как автономность или трансформация.
Структура продукта онкогена c-mas, предсказанная ЭВМ на
основе первичной последовательности клонированного онкогена
эпидермоидной карциномы человека, значительно отличается от
ранее обнаруженных онкобелков, имеющих связь с плазмати-
ческой мембраной [Young D. et al., 1986]. У продукта этого
онкогена имеется 7 сильно гидрофобных участков, которые могут
быть трансмембранными доменами. Авторы высказали предпо-
ложение, что продукт онкогена mas пересекает плазматическую
мембрану несколько раз. Подобной структурой, по-видимому,
обладает продукт трансформирующего гена вируса Эпштейна—
Барр [Fennewald S. et aL, 1984]. Вероятно, продукт онкогена
mas может быть отнесен к классу белков — рецепторов, имеющих
структурную гомологию с рецепторами ацетилхолина и визуаль-
ного родопсина. D. Young et aL (1986) полагают, что онкобелок
mas является рецептором, активирующим важнейшие пути регу-
ляции роста посредством трансдукции регуляторного сигнала
или мембранного канала. Изучение уникальной структуры и
функции онкобелка mas позволит в будущем установить новые
связи между процессами, контролирующими рост и малигнизацию
клеток.
327
Следовательно, аномальная экспрессия протоонкогенов, про-
дукты которых имеют трансмембранное, а также подмембранное
расположение (c-src) и обладающих протеинкиназной или другой,
пока неизвестной активностью (с-abl, c-fms, c-erb A, c-erb В,
c-ras, c-trk, c-mas и др.) может приводить к злокачественной
трансформации клеток. Процесс этот тесным образом связан
с нарушением регуляторных сигналов, поступающих на клеточную
мембрану, и с аутокринной стимуляцией, нерегулируемой извне,
что ведет к пролиферации клетки-мишени. Возможно, функция
других трансформирующих генов, комплементирующих с данной
категорией онкогенов, завершает процесс малигнизации.
Непосредственным образом с указанной группой онкогенов,
работающих по «аутокринной схеме», связаны гены, продукты
которых участвуют в переносе сигнала от рецепторов ФР внутрь
клетки, в ядро (например, c-ras и с-myc). Продукты этих онко-
генов способны, по-видимому, самостоятельно служить регуля-
торными сигналами или, другими словами, обеспечивать клеткам
независимость от экзогенных ФР. В этом случае онкобелки как бы
сами выполняют роль эндогенных ФР, обеспечивая клетке необхо-
димый побуждающий импульс и переход из Go периода в G кле-
точного цикла [Rapp U. R. et al., 1985; Kaczmarek L. et al., 1985].
К этой категории онкогенов могут быть отнесены, по-видимому,
c-myb, c-fos, c-ski, c-rel [Bishop J. M., 1985], продукты которых
имеют ядерную локализацию [Татосян А. Г. и др., 1986].
Таким образом, превращение нормальных клеток в злокачест-
венные в условиях in vivo и in vitro имеет сложный, кооперативный
характер взаимодействия нескольких функций различных по своей
природе клеточных онкогенезов. В качестве примера кооперации
онкогенов вновь приведем новые данные (см. также гл. 5), полу-
ченные при изучении трансформации первичных клеток животных
и человека при помощи онкогена c-Ha-ras 1. Злокачественная
трансформация первичных фибробластов, трансформированных
онкогеном c-Ha-ras 1, наблюдается лишь в тех клонах, которые
были супертрансфецированы вторым онкогеном: c-myc, N-myc,
р-53, c-int I или обработаны факторами типа ТРА, а также
трансформирующим фактором роста [Land Н. et aL, 1983;
Slamon N. J. et al., 1986; Smith M. R. et al., 1986]. Следует
отметить, что в первичных опухолях чаще всего наблюдается
активация (например, повышенная экспрессия) нескольких
клеточных онкогенов, принадлежащих разным категориям
[Киселев Ф. Л., Спитковский Д. Д., 1986]. В карциномах шейки
матки и легких была обнаружена амплификация двух онкогенов —
c-myc и c-Ki-ras 2 [Rio G. et aL, 1984; Taya Y. et aL, 1984].
В наших исследованиях карцином молочной и щитовидной желез
была выявлена суперамплификация двух онкогенов — c-Ha-ras
и c-myc, которые, как отмечалось, успешно кооперируют в про-
цессе полной неопластической трансформации клеток-мишеней
в экспериментах in vitro [Land Н. et al., 1984; Князев П. Г. и др.,
328
1986; Плужникова Г. Ф. и др., 1986]. Сегодня возможно изучение
вклада в малигнизацию клеток лишь немногих из известных
(а их около 40) клеточных онкогенов. Основные и второстепенные
биохимические события, протекающие в клетке-мишени в резуль-
тате активации протоонкогенов, еще предстоит установить.
Однако, несмотря на всю сложность явления малигнизации,
исследователи получили надежные «инструменты» — онкобелки,
контролирующие малигнизацию, позволяющие в точных хими-
ческих терминах уже в ближайшем будущем описать реакции
их взаимодействия с внутриклеточными мишенями.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подведем некоторые итоги.
Критически мыслящему наблюдателю современная теоретиче-
ская онкология, возможно, представляется деревом цветущим,
но не плодоносящим. Такое впечатление в какой-то мере оправдано
и обусловлено явным дисбалансом огромных интеллектуальных
усилий и материальных вложений, с одной стороны, и скромных
практических выходов — с другой.
Все еще остаются неясными как природа злокачественных
новообразований, так и первичный побудительный импульс, иници-
ирующий неотвратимую цепь событий, заканчивающихся во мно-
гих случаях трагическим исходом. Как следствие этого — отсут-
ствие достаточно эффективных средств ранней диагностики, пре-
дотвращения и лечения указанных заболеваний.
Исторически утвердились и интенсивно разрабатываются
несколько направлений в изучении онкогенеза: химический, био-
логический и радиационный канцерогенезы.
Актуальность первого диктовалась самой жизнью и данными
эпидемиологии. Связь раковых заболеваний со все расширяю-
щимся использованием бытовых и промышленных химических
соединений была реально осязаемой, и опыты на животных убеди-
тельно ее продемонстрировали. Эта область экспериментальной
онкологии достигла таких успехов, что теперь оказывается воз-
можным предсказывать форму и сроки возникновения опухолей
при воздействии тех или иных конкретных химических веществ.
С течением времени выявление канцерогенных свойств хими-
ческих агентов стало лишь делом техники, и наметилось явное
смещение акцентов исследований от рутинного их тестирования
на канцерогенность к изучению механизма онкогенного действия.
В этом деле, наряду со значительными успехами, выявились
и немалые трудности.
Успехи касались чисто химической стороны проблемы: была
установлена необходимость активации исходных канцерогенов,
изучены метаболизм, взаимодействие канцерогенов с клеточными
компонентами, продукты этого взаимодействия.
329
Трудности, не преодоленные и по сей день, определились при
попытке соотнести химические события с биологическими эф-
фектами.
Как описано в гл. 2, самой глубокой распознанной ступенью
в процессе метаболических превращений канцерогенов и взаимо-
действия их с ДНК клеток является образование так называемых
ДНК-аддуктов. Это та граница, к которой приблизились наши
знания в области химического канцерогенеза и пределы которой
до сих пор перейти не удалось, в силу чего главный вопрос
остается нерешенным: что происходит дальше? Каким образом
вторжение осколков химических канцерогенов в ДНК результи-
руется в неконтролируемый рост и трансформацию клеток?
Теория химического канцерогенеза д.пя того чтобы сделать.
новый и решающий шаг вперед, нуждается в каком-то научном
боёытииГ аналогичном по значимости Открытию обратной транс-
КриптазЫ ^Гбнковирусологии. В теории химического канцерогенеза
подобного события пока не произошло. Тем не менее можно
ожидать, что новый импульс дальнейшему плодотворному разви-
тию этого направления теоретической онкологии придаст интегра-
ция его с концепцией онкогенов. На страницах книги упоминались
первые сообщения об активации клеточных трансформирующих
последовательностей (протоонкогенов) под влиянием химических
канцерогенов. Эта новая перспектива обнадеживает и позволяет
думать, что изучение химического канцерогенеза в ближайшем
будущем станет одним из аспектов исследований онкогенов,
а сама идея химического канцерогенеза — одной из составляющих
более общей и универсальной теории онкогенеза, концепции
онкогенов.
В теории биологических факторов онкогенеза, воплощенной
наиболее ярко и убедительно в идее вирусной этиологии опухолей,
за последнее десятилетие наблюдался необыкновенный прогресс
и крутой поворот. Онковирусология достигла в этот период впечат-
ляющих успехов, хотя в то же время потерпела серьезную неудачу
в достижении основной своей цели — поиска и доказательств
существования вирусов, вызывающих рак у человека. Сегодня
реально можно говорить, по-видимому, лишь об одном злокачест-
венном заболевании человека, ассоциированном с онкогенным
ретровирусом (HTLV), а именно Т-клеточной лейкемии. Других
надежных свидетельств связи опухолевых заболеваний человека
с вирусами в настоящее время нет.
Главным успехом онковирусологии наших дней следует считать
открытие онкогенов — дискретных материальных генетических
элементов в структуре ДНК клеток, ответственных за индукцию
злокачественных опухолей у человека и животных. Это направле-
ние исследований является наиболее перспективным в современной
теоретической онкологии.
Как описано в гл. 3, 4 и 5, онкогены обнаружены в геномной
ДНК не только животных, но и человека, а вероятность их участия
ззо
в индукции опухолей продемонстрирована молекулярно-биологи-
ческими и биологическими экспериментами. ,
В целом изучение вирусного канцерогенеза внесло ценный
вклад в теоретическую онкологию и в расшифровку молекулярных
механизмов канцерогенеза, причем концепция онкогенов, рожден-
ная в недрах онковирусологии, возможно, станет фундаментом
универсальной теории онкогенеза.
Говоря о физическом канцерогенезе, обычно имеют в виду
канцерогенез радиационный. При всем его своеобразии он имеет
много общего с онкогенезом, индуцируемым химическими аген-
тами. Как и в случае химического и вирусного канцерогенеза,
первичной мишенью действия проникающей радиации является
ДНК, а происходящие в ней изменения носят мутационный харак-
тер, что служит основой реализации одного из главных путей
активации клеточных протоонкогенов в онкогены. Иными словами,
и в случае данного вида канцерогенеза можно усматривать
проявление того же универсального молекулярного механизма
индукции опухолей — через онкогены, что и при других видах
онкогенеза. Таким образом, перефразируя известную поговорку:
«все дороги ведут в Рим», можно сказать, чтс _« пути к опухоли
ведут через онкоген».
* Данное положение, естественно, еще нуждается в подкрепле-
нии новыми фактами. Тем не менее, как нам кажется, концепция
онкогенов представляет собой в настоящее время единственную
теоретическую платформу, способную объединить на общей основе
главные существующие гипотезы и точки зрения относительно
этиологии опухолей. В первую очередь это относится к таким,
как казалось ранее, взаимоисключающим друг друга научным
направлениям, как теории химического и вирусного канцерогенеза.
Естественно, что в эту же категорию событий укладываются
также представления о мутационной природе неоплазм.
Еще И. М. Сеченов в 1860 г. в тезисах докторской диссертации
писал, что при настоящем состоянии естественных наук единст-
венно возможный принцип патологии есть молекулярный.
Сейчас можно только удивляться этому провидению. Сегодня
молекулярная онкология стоит у порога тайны рака. Именно
ей принадлежат наиболее выдающиеся успехи в области теорети-
ческой онкологии последних лет. К ним можно отнести следующие
достижения: 1) открытие молекулярных причинных факторов
неоплазм — онкогенов и онкобелков; 2) установление клеточного
происхождения онкогенов опухолеродных вирусов и опухолей;
3) доказательство подвижности клеточных, вирусных, опухолевых
трансформирующих генов (онкогенов), возможности переноса
их между клетками, между клетками и вирусами; 4) демонстрация
родства онкогенов с генами пролиферации и дифференциации;
5) клонирование онкогенов и других генетических элементов;
6) разработка концепции онкогенов как универсальной теории
канцерогенеза.
331
Если молекулярная биология в наиболее лаконичной интерпре-
тации может быть охарактеризована как наука, выражающая
и объясняющая сложные общебиологические явления в терминах
свойств и взаимодействия молекул, то молекулярная онкология,
естественно, призвана раскрывать молекулярные механизмы про-
цесса канцерогенеза и особенностей опухолей. В данной книге
сделана попытка подытожить успехи этой молодой науки.
Все величие прогресса в познании опухолей в наше время
можно продемонстрировать, сопоставляя нынешний уровень зна-
ний об опухолях со следующими высказываниями выдающихся
представителей науки прошлого.
Р. Вирхов: «. . .Никто, даже под пыткой, не смог бы сказать,
что же такое на самом деле раковая клетка».
Дж. Гринштейн: «По каким-то непонятным причинам исследо-
вания в области рака стали кладбищем для многих научных
репутаций».
Какой пессимизм, причем в устах передовых людей своего
времени!
Примерно 80 и 40 лет, соответственно, отделяют нас от этих
безрадостных мыслей исследователей, знавших о раке много
больше своих современников. Но какие изменения произошли за
это время!
Мы выражаем надежду, что, закрывая эту книгу, читатель,
подобно ее авторам, отметит, как далеко наука об опухолях шаг-
нула вперед за указанный небольшой исторический срок.
Авторы приносят глубокую благодарность В. П. Калинов-
скому, Л. А. Заозерской, Г. Ф. Плужниковой, Л. И. Кожуховой,
В. М. Норгела за помощь при оформлении книги.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Агеенко А. И. Механизмы вирусного канцерогенеза.—М.: Медицина, 1978.—
384 с.
(Александров В. А., Напалков Н. П.) Alexandrov V. A., Napalkov N. Р. General
regularities of transplacental (prenatal) carcinogenesis. — Biol. Res. in Preg-
nancy, 1981, v. 2, N 4, p. 181 —187.
Альтштейн А. Д. Онкогены опухолеродных вирусов. — Журн. Всесоюзн. хим. об-ва
им. Менделеева, 1973, т. 18, с. 630—638.
Бердинских Н. К- Белоксинтезирующий аппарат клеток при опухолевом росте. —
Киев: Наукова думка. 1983.— 176 с.
Блохин И. Н., Напалков Н. П. Развитие онкологии в СССР. — Вопр. онкол.,
1982. № 12. с. 3—9.
Быкорез А. И., Иващенко Ю. Д. Экспериментальные опухоли желудка. — Киев:
Наукова думка. 1982. — 315 с.
Бутенко 3. А. Молекулярные механизмы лейкогенеза. — В кн.: Механизмы
лейкозогенеза. Киев, 1975, с. 5—29.
Георгиев Г. П. О механизме онкогенеза: «промотерная гипотеза». — Молек. биол.,
1981, вып. I. т. 15, с. 264—273.
Георгиев Г. П. Прыгающие гены, эволюция и канцерогенез. — В кн.: Междунар.
симпозиум по молекулярной биологии. М., 1983, с. 40.
Гершензон С. М. Основы современной генетики. — Киев: Наукова думка, 1979. —
506 с.
Голубев А. Г., Дильман В. М. Онкофакторы (трансформирующие факторы
роста). — Вопр. онкол., 1982, № 5, с. 87—98.
(Greenstein J. Р.) Гринштейн Дж. Биохимия рака. — М.: Иностр, литература,
1951. — 394 с.
Дильман В. М. Эндокринологическая онкология. — Л.: Медицина, 1983. — 408 с.
Дядькова А. М. Фильтрующиеся и нефнльтрующиеся саркомы. — Л.: Медицина,
1966. — 240 с.
Жданов В. М. Канцерогенез: вирусы и транспозоны. — Вопр. онкол., 1984, № 2,
с. 98—104.
Зильбер Л. А., Ирлин И. С., Киселев Ф. Л. Эволюция внрусогенетнческой
теории возникновения опухолей. — М.: Наука, 1975. — 344 с.
Инге-Вечтомов С. Г. Введение в молекулярную генетику. — М.: Высшая школа,
1983. —343 с.
Кавецкий Р. Е. Взаимодействие организма и опухоли. — Киев: Наукова думка,
1977. — 235 с.
Киселев Ф. Л., Татосян А. Г.. Гудков А. В. и др. Молекулярные механизмы
вирусного и невирусного канцерогенеза. — Итоги науки и техники: Вирусоло-
гия, № 10. М., 1983. — 169 с
Князев П. Г., Кузнецов О. К.. Перевозчиков А. П. и др. Перенос генетической
информации онкорнавирусов с помощью ДНК опухолевых клеток. — Вопр.
онкол., 1976, № 1, с. 47—53.
Князев П. Г., Шефер Р., Виллике К. Идентификация трансформирующего
гена Ha-ras в злокачественной меланоме нейробластоме и раке молочной
железы человека. — В кн.: 16-я конф. Федерации европейских биохимических
обществ: Тезисы докладов. М., 1984. — с. 300.
Кукайн Р. А., Муровская М. Ф.. Ильинская Т. И. Эндогенные вирусы. — Рига:
Зинатне, 1981. — 132 с.
Напалков Н. П. Трансплацентарный канцерогенез. — Вести. АМН СССР, 1977,
№ 10, с. 14—19.
Напалков Н. П., Мерабишвили В. М., Церковный Г. Ф.. Преображенская М. Н.
Заболеваемость населения СССР злокачественными новообразованиями за пе-
риод с 1970 по 1980 г. — Вопр. онкол., 1982, № 10, с. 26 —71.
Пинчук В. Г. Современные проблемы экспериментальной и теоретической онко-
логии. — Экспер. онкол., 1979, № 1, с. 5—7.
333
Рубенчик Б. Л. Биохимия канцерогенеза. — Киев: Здоров’я, 1977. — 191 с.
(Сейц И. Ф.) Seitz I. F. The Biochemistry of the Cells of blood and bone
marrow / Ed. 1. N. Kugelmas. — Springfield: C. Thomas Publ., 1969. — 248 p.
Сейц И. Ф.. Князев П. Г., Перевозчиков А. П. и др. Поиск раковых и структурных
вирусных генов в ДНК нормальных и опухолевых клеток человека методом
трансфекции и молекулярной гибридизации. — В кн.; Вирусы рака и лейкоза.
М., 1979, с. 172—175.
Сейц И. Ф., Князев П. Г., Федоров С. Н. Онкогены. Происхождение, распростра-
нение, структура и функции в канцерогенезе. — Вопр. онкол., 1982, № 10,
с. 95—114.
Сейц И. Ф., Луганова И. С. Биохимия клеток крови и костного мозга в норме и при
лейкозах. — Л.: Медицина, 1967. — 331 с.
Татосян А. Г., Галецкий С. А., Киселева Н. П. и др. Анализ экспрессии онкогенов
в опухолях человека. — Докл. АН СССР, 1983, т. 272, № 3, с. 726— 728.
Турусов В. С., Парфенов Ю. Д. Проблема порога в химическом канцерогенезе. —
Вопр. онкол., 1982, № 12, с. 88—97.
Федоров С. И., Татосян А. Г., Князев П. Г. и др. Анализ родства генов вируса
саркомы кур Д6 и вируса саркомы Рауса штамма Прага С. —Вопр. онкол.,
1984, № 2, с. 77—80.
Чумаков И. М., Прасолов В. С., Киселев Л. Л. Последовательности ДНК млекопи-
тающих, родственные гену src вируса саркомы Молони, и их картирование. —
Докл. АН СССР, 1980, т. 252, № 1, с. 232—234.
Шабад Л. М. Эволюция концепций бластомогенеза. — М.: Медицина, 1979. —
286 с.
Шапот В. С. Биохимические аспекты опухолевого роста. — М.: Медицина, 1975. —
304 с.
Эмануэль Н. М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. — М.: Наука,
1977.— 416 с.
Albino A., Le Strange R., Oliff A. et al. Transforming ras genes from human
melanoma: a manifestation of tumor heterogenecity. — Nature, 1984, v. 309,
p. 69—72.
Alitalo K.. Schwab M., Un С. C. et al. Homogeneously staining chromosomal
regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene
(c-onc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. —
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 1707—1711.
Ames B., Durston W. E.. Yamasaki E. et al. Carcinogens are mutagenes: a simple
test system combining liver homogenates for activation and bacteria for
detection. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, v. 10, p. 2281—2285.
Ashurst S. W., Cohen G. M. In vivo formation of benzo (a) pyrene diol epoxide
deoxyadenosine adducts in the skin of mice susceptible to benzo (a) pyrene-
induced carcinogenesis. — Int. J. Cancer, 1981, v. 27, p. 357—364.
Ashurst S. W., Cohen G. M. The formation and persistence of benzo (a) pyrene
metabolite-deoxyribonucleoside adducts in rat skin in vivo. — Int. J Cancer
1981, v. 28, p. 387—392.
Astrin S. M. Endogenous viral genes of the white leghorn chicken: Common site of
residence and sites associated with specific phenotypes of viral gene expres-
sion. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978, v. 75, p. 5941—5945.
Baird M. IF., Birnbaum L. S. Increased production of mutagenic metabolites
of carcinogens by tissues from senescent rodents. — In: The Year Book of
Cancer / Comp. a. ed. by R. L. Clark, R. W. Cumley, R. C. Hickey. Chicago:
London, 1981, p. 331—333.
Balmain A., Paragnell J. B. Mouse skin carcinomas induced in vivo by chemical
carcinogenesis have a transforming Harvey-ras oncogene. — Nature. 1983
v. 303. p. 72—74.
Balmain A., Ramsden M., Bowden G. et al. Activation of the mouse cellular
Harvey-ras gene in cheminally induced benign skin papillomas. — Nature
1984, v. 307, p. 658—661.
Baltimore D., Shields G., Otto G. et al. Structure and expression of the Abelson
murine leukemia virus genome and its relationship to a normal cell gene. —
Gold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1980, v. 44, p. 849—854.
334
Barbacid M., Beemon К., Devare S. Origin and functional properties
of the major gene product of the Snyder-Theilen strain of feline sarcoma
virus. — Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1980, v. 77, p. 5158—5162.
Barker P. E. Double minutes in human tumor cells. — Cancer Genet. Cytogenet.,
1982, v. 5, p. 81—94.
Bauer К. H. Mutationstheorie der Geschwulst-Entstehung. Uebergang von Korper-
zellen in Geschwulst-zellen (lurch Gen-Anderung. — Berlin, 1928, c. 237.
Becker D., Lane M. A., Cooper C. Identification of an antigen associated with
transforming genes of human and mouse mammary carcinomas. — Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 3315—3319.
Beemon Hunter T. Characterization of Rous sarcoma virus src gene products
synthesized in vitro. — J. Virol., 1978, v. 28, p. 551—566.
Beir Report II. The effects on populations of exposure to low levels of ionizing radia-
tion.— Natl. Acad. Sci., Natl. Res. Counsil., Washington, 1980.—638 p.
(Beisson J.) Беиссон Ж- Генетика. — M: Атомиздат, 1976. — 128 c.
Besmer P. Acute transforming feline retroviruses. — In: Carrent Topics in Microbio-
logy and Immunology /Ed. by P. K. Vogt, A. Koprowsky. Berlin; N. Y., 1983,
v. 107, p. 1—27.
Beug H., Graf T., Hayman M. J. Production and characterization of antisera
specific for erb-portion of p75, the presumptive transforming protein of avian
erythroblastosis virus. — Virology, 1981, v. Ill, p. 201—210.
Bird A. P. Use restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation. —
J. Molec. Biol., 1978, v. 118, p. 49—60.
Bishop J. M. Enemies within: the genesis of retrovirus oncogenes. —
Cell, 1981, v. 23, p. 5—6.
Bishop J. M. Oncogenes. — Sci. Am., 1982, N 3, p. 80—93.
Bishop J. M. Retroviruses and cancer genes. — Adv. Cancer Res., 1982, v. 37,
p. 1—32.
Bishop J. M. Cellular oncogenes and retroviruses.—Ann. Rev. Biochem., 1983,
v. 52, p. 301—354.
Bishop J. M., Gonda T., Hughes S. H. et al. The genesis of avian retrovirus
oncogenes.—Maiami Winter Symp., 1981, v. 12, p. 261—273.
Bishop J. M., Varmus H. E. Functions and origins of retroviral transforming
genes. — In: RNA tumor viruses. Molecular Biology of tumor viruses / Ed. by
R. Weiss et al. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., 1982, p. 999—1108.
•Blair D. C., Oskarsson M., Wood T. G. et al. Activation of transforming potential
of a normal cell sequence: a molecular model for oncogenesis. — Science, 1981,
v. 212, p. 941—943.
Borek C. X-ray induced in vitro neoplastic transformation of human diploid cells. —
Nature, 1980, v. 283, p. 776 -778.
Boveri T. The origin of malignant tumors. — Baltimore, 1929.
Brookes P„ Newbold R. F. Biological effects of specific hydrocarbon — DNA
reactions. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental
Effects / Eds. B. Puleman, P. О. P. Ts’o, H. Gelboin. Dordrecht, Boston, London,
1980, v. 13, p. 81—90
Brown R., Marshall Ch., Pennie S. et al. Mechanism of activation of an N-ras gene
in the human fibrosarcoma cell line HT 1080. — EMBO J., 1984, 3, p. 1321 —1326.
Buhrow S. A., Cohen S., Staros J. V. Affinity labeling of the protein kinase associated
with the epidermal growth factor receptor in membrane vesicles from A 431
cells.—J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 4019—4022.
Burnet F. M. Cancer: somatic-genetic considerations. — Adv. Cancer Res., 1978,
v. 28, p. 1—29.
Cairns J. The origin of human cancers. — Nature, 1981, v. 289, p. 353 —357.
Cairns J. a. Logan J. Step by step into carcinogenesis. — Nature, 1983, v. 304,
p. 582—583.
Calos M. P., MUller J. H. Transposable elements. — Cell, 1980, v. 20, p. 579—595.
Canaani E., Robbins C., Aaronson S. A. The transforming gene of Moloney murine
sarcoma virus. — Nature, 1979, v. 282, p. 378—383.
Capecchi M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA
into cultured mammalian. - Cell, 1980. v. 22, p. 479—487.
335
Capon D. J., Seeburg P. H., McGrath J. P. et al. Activation of Ki-ras 2 gene in human
and lung carcinomas by two different point mutations. — Nature, 1983, v. 304,
p. 507—513.
Capon D. J., Chen E. Y., Levinson A. D. et al. Complete nucleotide sequences of
the T24 human bladder carcinoma oncogene and its normal homologue. —
Nature, 1983, v. 302, p. 33—37.
Chang E. H., Ellis R. W'., Scolnick E. M. et al. Transformation by cloned Harvey
murine sarcoma virus DNA: efficiency increased by long terminal repeat
DNA. — Science, v. 210, p. 1249—1251.
Chang E. H., Furth M. E., Scolnick E. M. et al. Tumorigenic transformation of
mammalian cells induced by a normal human gene homologous to the oncogene
of Harvey murine sarcoma virus. — Nature, 1982, v. 297, p. 479—483.
Chang E. H., Gonda M. A., Ellis R. W. et al. Human genome contains four genes
homologous to transforming genes of Harvey and Kirsten murine sarcoma
virus. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982, v. 79, p. 4848—4852.
Chattopadhyay S. K., Chang E. H., Lander M. R. et al. Amplification and rearrange-
met of one genes in mammalian species. — Nature, 1982, v. 296, p. 361—363.
Coffin J. M. Structure of the retroviral genome. — In: RNA tumor viruses. —
Molecular Biology of tumor viruses/Ed. by R. Weiss et al. 2nd ed. Cold Spring
Harbor Lab., 1982, p. 261—368.
Coffin J. M., Varmus H. E., Bishop J. M. et al. Proposal for naming host cell-derived
inserts in retrovirus genomes. — J. Virol., 1981, v. 40, p. 953—957.
Cohen S., Ushino H., Stoscheck C. et al. A native 170.000 epidermal growth factor
receptor-kinase complex from shed plasma membrane vesicles. — J. Biol. Chem.,
1982, v. 257, p. 1523—1531.
Collet M. S., Brugge J. S., Erikson R. L. Characterization of normal avian cell
protein related to the avian sarcoma virus transforming gene product. —
Cell. 1978, v. 15. p. 1363 -1369.
Collet M. S., Erikson E., Erikson R. L. Structural analysis of the avian sarcoma
virus transforming protein: sites of phosphorylation. — J. Virol., 1979, v. 29,
p. 770—781
Collins C. J., Boettiger D., Green T. L. et al. Arrangement of integrated avian sarcoma
virus DNA sequences within the cellular genomes of transformed and revertant
mammalian cells. — J. Virol., 1980, v. 33, p. 760—768.
Collins S.. Groudine M. Amplification of endogenous myc-related DNA sequences
in a human myeloid leukemia cell line. — Nature, 1982, v. 298, p. 679—601.
Collins S. J., Groudine M. Rearrangement and amplification of c-abl sequences in the
human chronic myelogenous leukemia cell line K-562. — Proc. Natl. Acad., Sci.
USA. 1983, v. 80, p. 4813—4817.
Comings D. E. A general theory of carcinogenesis. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1973, v. 70, p. 3324-3328.
Cooper G. M. Cellular transforming genes. — Science, 1982, v. 218, p. 801- 806.
Cooper G. M., Lane M.-A. Cellular transforming genes and oncogenesis. — BBA,
1984, v. 738, 132, p. 9—20.
Cooper G. M., Neiman P. E. Two distinct candidate transforming genes of limphoid
leukosis virus-induced neoplasms. — Nature, 1981, v. 292, p. 857— 858.
Cooper G. M., Okenquist S., Silverman L. Transforming activity of DNA of chemically
transformed and normal cells. — Nature, 1980, v. 284, p. 418—421.
Cooper G. M., Bowen-Pope D. F., Raines E. et al. Similar effects of platek l-derived
growth factor and epidermal growth factor on the phosphorylation of tyrosine
in cellular proteins. — Cell, 1983, v. 31, p. 263—273.
Cooper J. A., Hunter T. Four different classes of retroviruses induce phosphorylation
of tyrosines present similar cellular proteins. — Molec. Cell. Biol., 1981, v. 1,
p. 394 -407.
Cooper J. A., Hunter T. Discrete primary locations of a tyrosine protein kinase and
of three proteins that contain phosphotyrosine in virally transformed chick fibro-
blasts. — J. Cell. Biol., 1982, v. 94, p. 287—296.
Cooper J. A., Reiss N. A., Schwartz R. J. et al. Three glycolytic enzymes are phospho-
rylated at tyrosine in cell transformed by Rous sarcoma virus. - Nature, 1983.
v. 302, p. 218 -223.
336
Courtneidge S. A., Smith A. E. Polyoma virus transforming protein associates with
the product of the c-src cellular gene. — Nature, 1983, v. 303, p. 435—439.
Cremer K., Reddy E. P., Aaranson S. Translational products of Moloney murine sar-
coma virus RNA: identification of proteins endoded by the murine sarcoma virus
src gene. — J. Virol., 1981, v. 38, p. 704—711.
Curran T., Teich N. M. Candidate product of the FBJ murine osteosarcoma virus
oncogene: characterization of a 55.000 dalton phosphoprotein. — J. Virol.,
1982, v. 42, p. 114—122.
Czernilofsky A. P., Levinson A. D., Varmus A. E. et al. Nucleotide sequence of an
avian sarcoma virus oncogene (src) and proposed amino acid sequence for gene
product. — Nature, 1980, v. 287, p. 198 -203.
Dale B.. Ozanne B. Characterization of mouse cellular deoxyribonucleic acid homolo-
gous to Abelson murine leukemia viral-specific sequences. — Molec. Cell. Biol.,
1981, v. 1. p. 731—742.
Dalla-Favera R., Martinotti S., Gallo R. C. Translocation and rearrangements of
the c-myc oncogene locus in human undifferentiated В-cell lymphomas. — Sci-
ence, 1983, v. 219, p. 963—967.
Dalla-Favera R. D., Wong Staal F.. Gallo R. C. One gene amplification in promyelo-
cytic leukemia cell line HL-60 and primary leukemia cells of the same patient. —
Nature, 1982b, v. 299, p. 61—63.
David-Pfeuty T., Singer S. J. Altered distribution of the cytoskeletal proteins vincu-
lin and a-actin in cultured fibroblasts transformed by Rous sarcoma virus. —
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 6687—6691.
De Feo D., Gonda M. A.. Young H. A. et al. Analysis of two divergent rat genomic
clones homologous to the transforming gene of Harvey murine sarcoma virus. —
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 3328-3332.
DeKlein A. Wessel A. D.. Grossveld G. et al. A cellular oncogene is translocated
to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukemia. — Nature, 1982
v. 300, p. 765—767.
DeLarco J., Todaro G. J. Growth factors from murine sarcoma virus-transformed,
cells. — Proc. Nat. Acad. Sci., 1978, v. 75, p. 4001—4005.
Der D. J.. Krontiris T. G., Ceoper G. M. Transforming genes of human bladder
and lung carcinoma cell lines are homologous to the ras gene of Harvey
and Kirsten sarcoma virus. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79,
p. 3637—3640.
Devare S. G., Reddy E. P., Law J. D. et al. Nucleotide sequence of the simian sarcoma
virus genome: demonstration that acquired cellular sequences encode the trans-
forming gene product p 28sil. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80,
p. 731—735.
Dhar R., McClements W. L., Enquist L. W. et al. Nucleotide sequences of integrated
Molony sarcoma provirus long terminal repeats and their host and viral juncti-
ons. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980 v. 77, p. 3937—3941.
Diamond A., Cooper G. M., Ritz J. et al. Identification and molecular cloning of
the human Blym transforming gene activated in Burkitt lymphomas. — Nature,
1983, v. 305, p. 112-116.
Dickson C., Peters G. Protein coding potential of mouse mammary tumor virus
genome RNA as examined by in vitro translation. — J. Virol., 1981, v. 37,
p. 36—47.
DiPaolo J. A. In vitro transformation: interactions of chemical carcinogens and ra-
diation. — In: Biology of radiation carcinogenesis / Eds. J. M. Yuhas, R. W. Ten-
nant, T. D. Regan. N. Y., 1980, p. 235—342.
Doll R. Strategy for delection of cancer hazards to man. — Nature, 1977, v. 265,
p. 589—596.
Doolittle R. F. Similar amino acid sequences: chance or common ancestry? —
Science, 1981, v. 214, p. 149—159.
Doolittle R. F., Hunkapiller M. W., Hood L. E. et al. Simian sarcoma virus one gene,
v-sis, is derived from the gene (or genes) encoding a platelet derived growth
factor. — Science, 1983, v. 221, p. 275—277.
Drake J. W., Baltz R. H. Biochemistry of mutagenesis. — Ann. Rev. Biochem.,
1976, v. 45, p. 11—37.
22
337
Druckrey H. Chemical carcinogenesis on N-nitroso-derivatives. — Gann Monogr.
Cancer Res., 1975, v. 17, p. 107—131.
Duesberg P. H. Retroviral transforming genes in normal cells? — Nature, 1983,
v. 304, p. 219—226.
Duesberg P. H., Bister K., Moscovici C. Genetic structure of avian myoloblastosis
virus, released from transformed myeloblasts as defective virus particles. —
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 5120—5124.
Eastman A., Bresnik E. Persistent binding of 3-methylcholantrene to mouse lung
DNA and its correlation with susceptibility to pulmonary neoplasia. —Cancer
Res., 1979, v. 39, p. 2400—2405.
Eisenman R. N., Vogt V. M. The biosynthesis of oncovirus proteins. — Biochem.
Biophys. Acta, 1978, v. 473, p. 187—239.
Ellis R. W., De Feo D., Furth M. E. et al. Mous cells contain two distinct ras gene
mRNA species that can be translated into a p21 one protein. —Molec. Cell.
Biol., 1982, v. 2, p. 1339—1345.
Ellis R. W., De Feo D., Maryak J. M. et al. Dual evolutionary origin for the rat gene-
tic sequences of Harvey murine sarcoma virus. — J. Virol., 1980, v. 36, p. 408—
420.
Ellis R. W., De Feo D., Shih T. Y. et al. The p 21 src genes of Harvey and Kirsten
sarcoma viruses originate from divergent members of a family of normal verteb-
rate genes. — Nature, 1981, v. 292 p. 506—510.
Ek B., Westermark B.. Wasteson A. et al. Stimulation of tyrosine-specific phosphory-
lation by platelet-derived growth factor. — Nature, 1982, v. 295, p. 419—420.
Erikson E., Erikson R. L. Identification of a cellular protein substrate phosphoryla-
ted by the avian sarcoma virus transforming gene product. — Cell, 1980,
v. 21, p. 829-836.
Erickson L. C., Osieka R., Sharkey N. A. et al. Measurement of DNA damage in
unlabeled mammalial cells analyzed by alkaline elution and a fluorometridc
DNA assay. — Anal. Biochem., 1980, v. 106, p. 169—174.
Erickson J., Rushdi A., Drwirnga H. L. et al. Transcriptional activation of the translo-
cated c-myc oncogene in Burkitt lymphoma. — Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
1983, v. 80, p. 820—824.
Eva A., Aaronson S. A. Frequent activation of c-kis as a transforming gene in
fibrosarcomas induced by methylcholantrene. — Science, 1983, v. 20, p. 995—996.
Eva A., Robbins K. S., Andersen P. R. et al. Cellular genes analogous to retroviral one
genes are transcribed in human tumour cells. — Nature, 1982, v. 295, p. 116.
Eva A., Tronick S. R., Gol R. A. et al. Transforming genes of human hematopoietic
tumors: frequent detection of ras related oncogenes whose activation appears to
be independent of tumor phenotype. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983,
v. 80 p. 4926—4930.
Fasano O., Aldrich T., Tamanoi F. et al. Analysis of the transforming potential of the
human H-ras gene by random mutagenesis. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1984 v. 81, N 13, p. 4008—4012.
Favera R. D., Wong-Slaal F., Gallo R. C. One gene amplification in promyelocytic
leukaemia cell line HL-60 and primary leukaemic cells of the same patient. —
Nature, 1982 v. 299, p. 61—63.
Feinberg A. P., Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes of ras genes of same
human cancer from their normal conterparts. — Nature, 1983, v. 301, p. 89—92.
Feinberg A. P., Vogelstein B., Droller M. J. et al. Mutation affecting the 12th amino
acid of the c-Ha-ras oncogene product occurs infrequently in human cancer. —
Science, 1983, v. 220, p. 1175—1177.
Fialkow P. J., Martin P. J., Najfeld V. et al. Evidens for a multistep pathogenesis of
chronic myelogenous leukemia. — Blood, 1981, v. 58, p. 158—163.
Fishbein L. Potential carcinogenic and mutagenic industrial chemicals. I. Alkylating
agents. — J. Toxic. Environ. Health, 1980, v. 6, p. 5—6.
Fujita J., Yoshida O., Yuasa Y. et al. Ha-ras oncogenes are activated by somatic
alteration in human urinary tract tumors. — Nature, 1984, 309, p. 265—266.
Furth M. E., Davis /. J., Fleurdelys B. et al. Monoclonal antibodies of the p21 products
of the transforming gene of Harvey murine sarcoma virus and of the cellular
ras gene family. — J. Virol., 1982, v. 43, p. 294 —304.
338
Gafner V., Phillipsen P. The yeast transposons Ту 1 generates duplications of target
DNA on insertion. — Nature, 1980, v. 286, p. 414—418.
Galloway D. A., McDougal J. K. The oncogenic potential of herpes simplex viruses:
evidence for a «hit-and-run» mechanism. — Nature, 1983, v. 302, p. 21—24.
Gambke Ch., Singer E., Moroni Ch. et al. Activation N-ras in bone marrow cells
from patient with acute myeloblast leukaemia. — Nature, 1984, v. 307, p. 476—
478.
Gattoni S., Kirschmeier P., Weinstein /. et al. Cellular Moloney murine sarcoma fe-
mes) sequences are hypermethylated and transcriptionally silent in normal
and transformed rodent cells. — Molec. Cell BioL, 1982, v. 1, p. 42—51.
Gay N. J., Walker J. E. Homology between human bladder carcinoma oncogene
product and mitochondrial ATPase. — Nature, 1983, v. 301, p. 262—264.
Gerard G. F., Grandgenett D. P. Retrovirus reverse transcriptase. — In: Molecular
Biology of RNA tumor viruses / Eds. J. Stephenson. N. Y., 1980, p. 345—394.
Ghysdael J., Neil J. C., Vogt P. K. Cleaved of four avian sarcoma virus polyproteins
with virion protease p!5 removes gag sequences and yields large fragments
that function as thyrosine phosphoacceptors in vitro. — Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1981, v. 78, p.
Gibbs Ellis R., Scolnick E. Autophosphorylation of v-Ha-ras p 21 is modulated by
amino acid residue 12. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, p. 2674—2678.
Gilbert F. Chromosomal aberrations and oncogenes. — Nature, 1983, v. 303, p. 475.
Goff S. P., Gilboa E., Witte O. N. et al. Structure of the Abelson murine leukemia
virus genome and the homologous cellular gene: studies with cloned viral
DNA.— Cell, 1980, v. 22, p. 777—785.
Goff S. P., Tabin C. J., Wang J. Y. et al. Transfection of fibroblasts by cloned Abelson
murine leukemia virus DNA and recovery of transmissible virus by recombination
with helper virus. — J. Virol., 1982, v. 41, p. 271— 285.
Goldfarb M., Shimizu K., Perucho M. et al. Isolation and preliminary characteriza-
tion of a human transforming gene from T24 bladder carcinoma cells. —
Nature, 1982, v. 296, p. 404—409.
Gonda Th., Metcalf D. Expression of myb, myc and fos protooncogenes during
the differentiation of a murine myeloid leukemia. — Nature, 1984, 310, p. 249.
Gonda T. J., Sheiness D. K., Bishop J. M. Transcripts from the cellular homologs
of retroviral oncogenes: distribution among chicken tissues. — Molec. Cell.
Biol., 1982, v. 2, p. 617—624.
Goubin G., Goldman D., Nice J. et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of
a transforming gene detected by transfection of chicken В-cell lymphoma
DNA.— Nature, 1983 v. 302, p. 314—319.
Greenberg M., Ziff E. Stimulation of 3T3 cell induces transcription of the c-fos proto-
oncogene.— Nature, 1984, v. 311, p. 433—438.
Groffen J., Heisterkamp N., Stephenson J. R. et al. c-sis is translocated from chromo-
some 22 to chromosome 9. — J. Exp. Med., 1983 v. 158, p. 9—15.
Hall A., Marshall C., Spurr N. et al. Identification of transforming genes in two
human sarcoma cell lines as a new member of the ras gene family located on
chromosome 1. — Nature, 1983, v. 303, p. 396—400.
Hanafusa T., Mathey-Prevet B., Feldman R. A. et al. Mutant Fujinami sarcoma
virus which are temperature-sensitive for cellular transformation and protein
kinase activity. — J. Virol., 1981, v. 38, p. 347—355.
Harada F., Peters G. G., Dahlberg J. E. The primer tRNA for Moloney murine
leukemia virus DNA synthesis. Nucleotide sequence and aminoacylation of
tRNA₽ro. — J. Biol. Chem., 1979, v. 254, p. 10979—10985.
Hayward W. S., Neel B. G., Astrin S. M. Activation of a cellular one gene by promoter
insertion in ALV-induced lymphoid leukosis. — Nature. 1981, v. 290, p. 475—480.
Heidelberger C. Chemical oncogenesis in culture. — Ann. Rev. Biochem., 1975,
v. 44, p. 79—121.
Heidelberger C. Mammalian cell transformation and mammalian cell mutagenesis
in vitro. — J. Environ. Path. Toxicol., 1980, v. 3, 4, p. 69—87.
Heisterkamp N., Groffen J., Stephenson J. R. et al. Chromosomal localization of hu-
man cellular homologues of two viral oncogenes. — Nature, 1982 v. 299, p. 747—
749.
22*
339
“i Heldin С.-H., Westermark B. Growth factors: Mechanism of action and relation to
oncogenes. — Cell, 1984, v. 37, p. 9—20.
Higginson J. Цит. по C. Mastromatteo, 1982.
Huberman E., Sachs L., Yang S. Y. et al. Identification of mutagenic metabolism
of benzo (a) pyrene in mammalian cells. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976,
v. 73, p. 607—611.
Huebner R. J., Todaro G. J. The viral oncogene hypothesis: New evidence. — Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, p. 1009—1015.
Huh N., Knyasev P. G., Schafer R. et al. Expression of the c-ras genes in normal
and ethylnitrosourea (EtNU) — transformed rat brain cells. — Febs Letters,
1983, v. 154, p. 407—410.
Hunter T., Sefton В. M. Transforming gene product of Rous sarcoma virus phosphory-
lates tyrosine. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980 v. 77, p. 1311 —1315.
IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to hu-
mans. — Intern. Agency Cancer Res., Lyon, v. 1, 1972; v. 7, 1974; v. 7, 1975;
v. 10, 1975; v. 16, 1978.
Jaenisch R. Retroviruses and embriogenesis. — Hoppe—Seyler’s Z. Physiol. Chem.,
1982, Bd. 363, S. 1267—1272.
Jansen H. W Lurz R., Bister K- et al. Homologous cell-derived oncogenes in avian
carcinoma virus MH 2 and murine sarcoma virus 3611. — Nature, 1984, v. 207,
p. 281—284.
Jeffrey A. M., Kinoshita T., Santella R. M. et al. The chemistry of polycyclic aromatic
hydrocarbon — DNA adducts. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms
and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts’o, H. Gelboin.
Dordrecht; Boston; London, 1980, v. 13, p. 565—579.
Jerina D. M., Sayer J. M., Thakker D. R. et al. Carci.iogenesity of polycyclic
aromatic hydrocarbons: the bay region theory. — Carcinogenesis: Fundamental
Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts’o,
H. Gelboin. Dordrecht; Boston; London, 1980, v. 13, p. 1 —12.
Jones P. A., Taylor S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methyla-
tion. — Cell, 1980, v. 20, p. 85—93.
Junis J. J. et al. Distinctive chromosomal abnormalities in histologic subtypes
of non-Hodgkin’s lymphoma. — New Engl. J. Med., 1982, v. 307, p. 1231 —1236.
Kadlubar F. F. Transversion mutation hypothesis for chemical carcinogenesis by
№-substitution of guanine in DNA. — Chem. Biol. Interact., 1980, v. 31,
. p. 255—263.
Kadlubar F. F., Miller E. C. Guanine Oe-etylation of DNA by the carcinogen
N-hydroxy- 1-naphtylamine. — Cancer Res., 1978, v. 38, p. 3628—3638.
Kakunaga T. Neoplastic transformation of human diploid fibroblast cells by chemical
carcinogens. — Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1978, v. 75, p. 1334—1338.
Kasuga M., Karlsson F. A., Kahn C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of
the 95.000-dalton subunit of its own receptor. — Science, 1982, v. 215, p. 185.
Kasuga M., Zick Y., Blith D. L. et al. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation
of the insulin receptor in a cellfree system. — Nature, 1982, v. 298, p. 667—669.
Kasuga M., Zick Y., Blith D. et al. Insulin stimulation of phosphorylation of
the p-subunit of the insulin receptor. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 9891—9894.
Kawai S., Yoshida M., Segawa K. et al. Characterization of Y73, an avian sarcoma
virus: a unique transforming gene and its product, a phosphoprotein with pro-
tein kinase activity. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 77, p. 6199—6203.
Kennedy A. R., Fox M., Murphy G. et al. Relationship between X-ray exposure and
malignant transformation in СзН 10T1/2 cells. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1980, v. 77. p. 7262—7266.
King H. IF. S., Osborne M. R., Brookes P. The metabolism and DNA binding of
3 methyl-cholantrene. — Int. J. Cancer, 1977, v. 20, p. 564 —571.
King H. W. S., Osborne M. R., Brookes P. The identification of 3-methylcholantrene-9,
10-dihydrodiol as an intermediate in the binding of 3-methylcholantrene to DNA
in cells in culture. — Chem.-Biol. Interact.. 1978, v. 20, p. 367—371.
King H. W. S., Osborne M. R., Brookes P. The in vitro and in vivo reaction at the N7-
position of guanine of the ultimate carcinogen derived from benzo(a)pvrene.
Chem. Biol. Interact., 1979, v. 24, p. 345—353.
340
Kirschmeier P., Gttoni-Celli S., Dona D. et al. Carcinogen- and radiation-transfor-
med C3H10T '/2 cells contain RNAs homologous to the long terminal repeat
sequence of a murine leukemia virus. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982,
v. 72, p. 2773—2777.
Klein G. The role of gene dosage and genetic transpositions in carcinogenesis. —
Nature, 1981, v. 294, p. 313—318.
Klein G. Specific chromosomal translocations and the genesis of В-cell derived tumo-
urs in mice and men. — Cell, 1983, v. 32, p. 311—315.
Knudson A. G. Human cancer genes. — In: Genes, Chromosomes and Neoplasia/Eds.
F. E. Arrighi, P. N. Rao, E. Stublefield. N. Y.: Press Raven, 1981, p. 453- 462.
Kolata G. Is tyrosine the key to growth control? — Science, 1983, v. 219, p. 377—378.
Konda N., Schreck R., Alt F. et al. Isolation of amplified DNA sequences from
IMR-32 human neuroblastoma cells: Facilitation by fluorescence-activated flow
sorting of metaphase chromosomes. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983,
v. 80, p. 4060 -4073.
Krebs H. Otto Heinrich Warburg. — Biol. mem. fellows Roy. Soc., 1972, v. 18,
p. 629—699.
Kriek E., Westra I. G. Metabolic activation of aromatic amines and amides and
interactions with nucleic acids. — In: Chemical carcinogens and DNA / Eds.
P. L. Grover. New York, 1980, v. 11, p. 1—28.
Krontiris T. G., Cooper G. M. Transforming activity of human tumor DNAs.—
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 1181 —1184.
Krontiris T. G., DiMartino N. A., Cobb M. et al. Unique allelic restriction fragments
of the human Ha-ras locus in leukocyte and tumor DNAs of cancer patients. —
Nature, 1985, v. 313, p. 369—374.
Kumata T., Feramisco J. Epidermal growth factor stimulates guanine nucleotide
binding activity and phosphorylation of ras oncogene proteins. — Nature,
1984 v. 310, p. 145-150.
Land H., Parada L., Weinberg R. A. Tumorogenic conversion of primary embryo
fibroblast requires at least two cooperating oncogenes. — Nature, 1983, v. 304,
p. 596—602.
Land H., Parada L., Weinberg R. A. Cellular oncogenes and multistep carcinogene-
sis. — Science, 1983, v. 222, p. 771—778.
Lai M. M., Hu S. S. F., Vogt P. K. Avian erythroblastosis virus: transformation-
specific sequences from a contiguous segment of 3.25 kb located in the middle of
the 6-kb genome. — Virology, 1979, v. 97, p. 366—377.
Lai M. M. C., Neil J. C., Vogt P. K- Cell-free translation of avian erythroblastosis
virus RNA yields two specific and distanct proteins with molecular weights of
75.000. — Virology, 1980, v. 100, p. 475—483.
Lane M.-A., Sainten A., Cooper G. M. Activation of related transforming genes in
mouse and human mammary carcinomas. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1981, v. 78, p. 5185—5189.
Lane M.-A., Sainten A., Cooper С. M. Stage specific transforming genes of human
and mouse В and T lymphocyte neoplasms. — Cell, 1982, v. 28, p. 873—880.
Lane M.-A., Sainten A.. Doherty K. et al. Isolation and characterization of a stage-
specific transforming gene Tlym-1, from T-cell lymphomas. — Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1984, v. 81, p. 2227—2231.
Langeheim H., Shih T. Y., Scolnick E. M. Identification of a normal vertebrate cell
protein related to the p 21 src of Harvey murine sarcoma virus. — Virology,
1980, v. 106, p. 292—300.
Laprince D., Gegonne A., Cell J. et al. A putative second cell-derived oncogene of the
avian leukaemia retrovirus E 26. —Nature, 1983, v. 306, p. 395—397.
Lawley P. D. DNA as a target of alkylating carcinogens. — Brit. Med. Bull.,
1980, v. 36, p. 19—24.
Leberman R., Euger U. Homologies in the primary structure of GTP-binding
proteins: the nucleotide-binding site of EF-Tu and p 21. — EMBO J., 1984,
v. 3, p. 339—341.
Levin W., Wood A. W., Yagi H. et al. (±)-trans-7,8-dihydrobenze (a) pyrene:
A potent skin carcinogen when applied topically to mice. — Proc. Natl. Acad.
Sci USA, 1976, v. 73, p. 3867—3871.
341
Levinson A. D., Courtneidge S. A., Bishop J. M. Structural and functional
domains of the Rous sarcoma virus transforming protein (pp60srr)—Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 1624—1628.
Levinson B., Khoury G., Vande Woude G. et al. Activation of SV40 genome by
72-base pair tandem repeats of Moloney sarcoma virus. — Nature, 1982,
v. 295, p. 568—572.
Linial M., Blair D. Genetics of retroviruses. — In: RNA tumor viruses. Molecular
Biology of Tumor viruses / Ed. by R. Weiss. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab.,
New York, 1982, v. 649—784.
Maher V. M., Miller E. C., Miller J. A. et al. Mutations and decreases in
density of transforming DNA produced by derivatives of the carcinogens
2-acetyl-aminofluorene and N-methyl-4-aminoazobenzene. — Molec. Phar-
macol., 1968, v. 4, p. 411—426.
Maher V. M., Miller E. C., Miller J. A. et al. Mutations and loss of transforming
activity of Bacillus subtilis DNA after reaction with esters of carcinogenic
N-hydroxy aromatic amides. — Цит. no Miller J. A., 1970.
Maher V. M., Yang L. L., McCormick J. The role of DNA repair in prevention the
cytotoxic and mutagenic effects of carcinogens in human cells. — In: Carcino-
genesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pull-
man, P. О. P. Ts’o, H. Gelboin. Dordrecht; Boston, London, 1980, v. 13,
p. 479 - 490.
Majors J. E., Varmus H. E. Nucleotide sequences at hostproviral junctions for
mouse mammary tumour virus. — Nature, 1981, v. 289, p. 253—258.
Malaveille C., Bartsch H., Grover P. L. et al. Mutagenicity of non-K-region
diols and diol-epoxides of benz(a)antracene and benzo(a)pyrene.—Biochem.
Biophys. Res. Comm., 1975, v. 66, p. 693—700.
Marcu R. B., Harris L. J., Stanton L. V7. et al. Transcriptionally active c-myc
oncogene is contained within NIARD, a DNA sequence associated with chromo-
some translocations in В-cell neoplasia. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983,
v. 80, p. 519—523.
Margison G. P., Capps M. J., O’Connor P. J. Nucleic acid modification by N-
nitrose compounds. Chapter 5. — In: Chemical carcinogenesis and DNA/Ed.
P. L. Grover. N. Y., 1978. v. 1, p. 111 — 159.
Martinville B., Cunningham J. M., Murray M. J. et al. The N-ras oncogene
assigned to the short arm of human chromosome I. — NucL Acide Res.,
1983, v. 11, p. 5267—5271.
Martinville B., Giacolone J., Shih C. et al. Oncogene from human EJ bladder
carcinoma is located on the short arm of chromosome 11.—Science, 1983,
v. 219, p. 498—501.
Marx J. L. Oncogene related to growth factor gene. — Science, 1983, v. 221, p. 248.
Mastromatteo C. Current concepts in occupational carcinogenesis. — In: Prevention
of occupational cancer: Intern. Symp. Occupational safety and health series.
N 46. Intern. Labor. Office. Geneva, 1982, p. 21—46.
Maugh T. H. II. Chemical carcinogenesis: a long neglected field blossoms. — Science,
1974, v. 183, p. 940—944.
Maugh Г. H. II. Chemicals: How many are there? — Science, 1978, v 199, p. 162.
Maugh T. H. Carcinogens in the work place: where to start cleaning up. — Science,
1980, v. 197, p. 1268—1269.
McCann J., Ames B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/
microsome test: assay of 300 chemicals: Discussion. — Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1976, v. 73, p. 950—954.
McCann J., Choi E., Yamasaki E. et al. Detection of carcinogens as mutagens in the
Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Part I. — Proc. NatL Acad.
Sci. USA, 1975, v. 72, p. 5135—5139.
McCormick J. J., Silinskas К. C., Maher V. M. Transformation of diploid human
fibroblasts by chemical carcinogens. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mecha-
nisms and Environmental Effects / Eds. Pullman P. О. P., Ts’o, H. Galboin.
Dordrecht; Boston; London, 1980 v. 13, p. 491 —498.
McCoy M. S., Toole J. T., Cunningham J. M. et al. Characterization of a human
colon/lung carcinoma oncogene. - Nature, 1983, v. 302, p. 79 81.
342
McGrath J., Capon D., Goeddel D. ei al. Comparative biochemical properties of
normal and activated human ras p21 protein. — Nature, 1984, v. 310, p. 644—649.
McGrath J. P., Capon G. J., Smith D. H. et al. Structure and organization of the
human Ki-ras proto-oncogene and a related processed pseudogene. — Nature,
1983, v. 304, p. 501—506.
Miller E. C. Some current perspectives on chemical carcinogenesis in human and
experimental animals: presidential adress. — Cancer Res., 1978, v. 38, p. 1479—
1496.
Miller J. A. Carcinogenesis by Chemicals: An overview — G. H. Clowes memorial
lecture. — Cancer Res., 1970, v. 30, p. 559—576.
Milo G. E., DiPaolo J. A. Neoplastic transformation of human diploid cells in vitro
after chemical carcinogen treatment. — Nature, 1978, v. 275, p. 130—132.
Montesano R., Bartsch H. Mutagenic and carcinogenic N-nitroso compounds: possible
environmental hazards. — Mutat. Res., 1976, v. 32, p. 179—228.
Muller R., Muller D., Guilbert L. Differential expression of c-fos in hematopoietic cells:
correlation with differentiation of monomyelocytic cells in vitro. — EMBO J.,
1984, v. 3, p. 1887—1890.
Muller R.. Salmon D. J.. Tremblay J. M. et al. Differential expression of cellular
oncogenes during pre- and postnatal development of the mouse. — Nature, 1982,
v. 299, p. 640 -644.
Murray M. J., Cunningham J. M., Parada L. F. et al. The HL-60 transforming
sequence: a ras oncogene coexisting with altered myc genes in hematopoetic
tumors. — Cell, 1983, v. 33, p. 749—757.
Nagao M., Sugimura T., Yang S. K- et al. Mutagenicity of optically pure ( —)
trans-7,8-dihydroxy-dihydrobenzo (a) pyrene. — Mutat. Res., 1978, v. 58,
p. 361- 365.
Nagata C., Kodama M., Kimura T. et al. Metabolically generated free radicals
from many types of chemical carcinogens and binding of the radicals with
nucleic acid bases. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Envi-
ronmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts’o, H. Gelboin. Dordrecht;
Boston; London, 1980, v. 13, p. 43—54.
Neil J. C., Ghysdael J., Vogt P. K. et al. Homologous tyrosine phosphorylation
sites in transformation-specific gene products of distinct avian sarcoma vi-
ruses. — Nature, 1981, v. 291, p. 675—677.
Neuberger M. S., Calabi F. Reciprocal chromosome translocation between c-myc
and immunoglobulin y2b genes. — Nature, 1983, v. 305 p. 240—243.
Newbold R. F., Overell R. W'. Fibroblast immortality is a prerequisite for transfor-
mation by EJ c-Ha-ras oncogene. — Nature, 1983, v. 304, p. 648—651.
Newmark P. The rasmatazz of cancer genes. — Nature, 1983, v. 305, p. 470—471.
Newmark P. Viral oncogene permutations. — Nature, 1983, v. 306, p. 426.
Nishimura J., Huang J. S., Denel T F. Platelet-derived growth factor stimulates
tyrosine-specific protein kinase activity in swiss mouse 3T3 cell membranes. —
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 79, p. 4303—4307.
Noori-Daloii M. R., Swift R. A., Kung H. J. et al. Specific integration of REV
proviruses in avian bursal lymphomas. — Nature, 1981, v. 294, p. 574—576.
Nushikura K.. Rushidi A. A., Erickson J. et al. Differential expression of the normal
and of the translocated human c-myc oncogenes in B-cells. — Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 4822—4826.
Nusse R., Varmus H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor
virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. —
Cell, 1982, v. 31, p. 99-109.
O’Brein S. L., Nash W. G., Goodwin J. L. et al. Dispersion of the ras family of
transforming genes to four different chromosomes in man. — Nature, 1983,
v. 302. p. 839 -842.
Oesch T., Clegg J. C. S., Billings R. et al. Enzymic control of reactive meta-
bolites from aromatic carcinogens. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mecha-
nisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts’o, H. Gelboin.
Dordrecht; Boston; London, 1980, v. 13, p. 167—177.
Oesch F.. Glatt H. R., Schmassmann H. U. The apparent ubiquity of epoxide
hydratase in rat organs. Biochem. Pharmacol., 1977, v. 26 p. 603—607.
343
Olsson M., Lindahl T. Repair of alkylated DNA in E. coli; methyl group transfer from
O6-methylguanine to a protein cysteine residue. — J. Biol. Chem., 1980 v. 255,
p. 10569 -10571.
Oppermann H., Levinson A. D., Levintow L. et al. Two cellular proteins that
immunoprecipitate with the transforming protein Rous sarcoma virus —
Virology, 1981, v. 113, p. 736—751.
Oskarsson M., Clements W. L., Blair D. G. et al. Properties of a normal mouse
cell DNA sequence (sarc) homologous to the src sequence of Moloney sarcoma
virus. — Science, 1980, v. 207, p. 1222—1224.
O’Toole С. M., Povey S., Hepburn P. et al. Identity of some human bladder cancer
cell lines. — Nature, 1983, v. 301, p. 429—430.
Pall M. L. Gene-amplification model of carcinogenesis. — Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 1981, v. 78, p. 2465—2468.
Papkoff J., Verma L M., Hunter T. Detection of a transforming gene product
in cells transformed by Moloney murine sarcoma virus. — Cell, 1982, v. 29
p. 417—426.
Parada L. F., Tabin C. J., Shih C. et al. Human EJ bladder carcinoma oncogene is
homologue of Harvey sarcoma virus ras gene. — Nature, 1982, v. 297,
p. 474 -478.
Payne G. S., Bishop J. M., Varmus H. E. Multiple arrangements of viral DNA
and an activated host oncogene in bursal lymphomas. — Nature, 1982, v. 295,
p. 209—217.
Pegg A. E. Alkylation of rat liver DNA by diniethylnitrosamine: effect of dosage on
O6-methylguanine levels. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v. 58, p. 681—685.
Pegg A. E. Formation and metabolism of alkylated nucleosides: Possible role in
carcinogenesis by nitroso-compounds and alkylating agents. — Adv. Cancer
Res., 1977a, v. 25, p. 195—269.
Pegg A. E., Jeckson A. Alkylation of messenger RNA by dimethylnitrosamine. —
Chem. Biol. Interact., 1976, v. 12, p. 279—268.
Perucho M. Human-tumor-derived cell genes contain common and different trans-
forming genes. — Cell, 1981, v. 27, p. 467—476.
Phillips D. H., Sims P. Polycyclic aromatic hydrocarbon metabolites: their reactions
with nucleic acids. — In: Chemical carcinigens and DNA / Eds. P. L. Grover.
N. Y., 1978, v. 2, p. 29—57.
Ponticelli A. S., Whitlock C. A., Rosenberg N. et al. In vivo tyrosine phosphorylations
of the Abelson virus transforming protein are absent in its normal cellular
homolog. — Cell, 1982, v. 29, p. 953—960
Porzig K. J., Robbins R. C., Aaronson S. A. Cellular regulation of mammalian
sarcoma virus expression: a gene regulation model for oncogenesis. — Cell,
1979, v. 16, p. 875 -884.
Pulciani S., Santos E., Lauver A. V. et al. Oncogenes in solid human tumors. —
Nature, 1982, v. 300, p. 539—542.
Pulciani S., Santos E., Lauver D. R. et al. Oncogenes in human tumor cell
lines: Molecular cloning of a transforming gene from human bladder carcinoma
cells. — Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 2845—2849.
Pullman B., Pullman A. Nucleofilicity of DNA. Relation to chemical carcinogenesis. —
In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects /
Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts’o, H. Gelboin. Dordrecht; Boston; London,
1980, v. 13, p. 55- 66.
Rantanen J. Chemical and radiation carcinogenesis. Prevention of occupational
cancer. — In: Intern, symposium. Occupational safety and health series, N 46.
Intern. Labour Office. Geneva, 1982, p. 81— 87.
Rapp U. R., Coldsborough M. D., Mack G. E. et al. Structure and biological
activity of v-raf, a unique oncogene transduced by a retrovirus. — Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1983. v. 80, p. 4218- 4222.
Rasheed S., Norman G. L., Heidecker G. Nucleotide sequence of the Rasheed rat
sarcoma virus oncogene: new mutations. — Science; 1983, v. 221, p. 155—157.
Rassoulzadegan M., Cowie A., Carr A. et al. The roles of individual polyoma
virus early proteins in oncogenic tranformation.	Nature, 1982, v. 300,
p. 713—718.
344
Rechavi G., Givol D., Canaani E. Activation of a cellular oncogene by DNA
rearrangement: possible involvement of an IS-like element — Nature, 1982,
v. 300, p. 607—611.
Reddy E. P. Nucleotide sequence analysis of the T24 human bladder carcinoma
oncogene. — Science, 1983, v. 220, p. 1061—1063.
Reddy E. P., Reynolds R. K., Santos E. et al. A point mutation is responsible for the
acqusition of transforming properties by the T24 human bladder carcinoma
oncogene. — Nature, 1982, v. 300, p. 149—152.
Reddy E. P., Smith M. J., Canaani E. et al. Nucleotide sequence analysis of the
transforming region and large terminal redundancies of Moloney murine sar-
koma virus. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 5234—5237.
Roth R. A., Cassell D. J. Insulin receptor: Evidence that it is a protein kinase. —
Science, 1983, v. 219, p. 299 -301.
Rothberg P., Erisman M., Diehl R. et al. Structure and expression of the oncogene
c-myc in fresh tunior material from patients with hematopoietic malignancies. —
Molec. a. Cell. Biol., 1984, v. 4, p. 1096—1103.
Rous P. A. A sarcoma of the fowl transmissible by on agent separable from the
tumor cells.—J. Exp. Med., 1911, v. 13, p. 397 -411.
Rovigatti U. G., Rogler С. E., Neel B. et al. Expression of endogeneous oncogenes
in tumor cells. — In: 4th Ann. Bristol—Meyers Cancer Symp. Tumor Cell
Heterogeneity: origin and implications / Eds. Abens J. K-, Coffey D. S.,
Baulin S. B. N. Y.; London, 1982, p. 319—330.
Rowley J. D. Human oncogene locations and chromosome aberrations. —
Nature, 1983, v. 301, p. 290 - 291.
Roy-Burman P., Devi B.. Parcer J. Differential expression of c-erb B, c-myc and
c-myb oncogene loci in human lymphomas and leukemias. — Int. J. Cancer,
1984, 32, p. 185-191.
Ruley E. H. Adenovirus early region E1A enables viral and cellular transforming
genes to transform primary cells in culture. — Nature, 1983, v. 304, p. 602- 606.
Saffiotti U. Occupational carcinogenesis in relation to the multifactorial origin
of cancer: Experimental pathology approaches. — In: Prevention of occupational
cancer: Internat. Symp. Occupational Safety and Health series. N 46, Intern.
Labour Office, Geneva, 1982.
Santos E., Reddy E. P., Pulciani S. et al. Spontaneous activation of a human
proto-oncogene. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 4679- 4683.
Santos E., Tronick S. R., Aaronson S. et al. T-24 human bladder carcinoma
oncogene is an activated form of the normal human homologue of BALB-
and Harvey-MSV transforming genes. — Nature, 1982, v. 298, p. 343 -347.
Sarngadhavan M. G., Schuepbach J., Kalyanaraman V. S. et al. Immunological
characterization of the natural antibodies to human T-cell leukemia virus
in human sera. — In: Modern Trends in Human Leukemia V / Ed. by Neth
et al. Berlin et al., 1983, p. 498- 503.
Schafer R., Griegel S., Knyazev P. et al. Transforming activity of DNA from human
melanoma, neuroblastoma, breast carcinoma and from normal human lympho-
cytes.— J. Cell. Bioch., 1984, SuppL P. A., Abstr. o!68.
Schechter A. L., Stern D. F., Vaidyanathan L. et al. The neu oncogene: an erb-B-rela-
ted gene encoding a 185,000 — Mr tumor antigen. — Nature, 1984, v. 312,
p. 513—516.
Schwab M., Alitalo K., Klempnauer К. H. et al. Amplified DNA with limited
homology to myc cellular oncogene is shared by human neuroblastoma cell
lines and a neuroblastoma tumor. — Nature, 1983, v. 305, p. 245—248.
Schwab M., Alitalo K., Varmus H. E. et al. A second oncogene (c-Ki-ras) is
amplified, overexpressed and located within caryotypic abnormalities in mouse
adrenocortical tumour cells. — Nature, 1983, v. 303, p. 497—501.
Scolnick E. M., Weeks M. O., Shih T. Y. et al. Markedly elevated levels of an
endogenous sarc protein in a hematopoietic precursor cell line. — Molec.
Cell. Biol., 1981, v. 1, p. 66—74.
Sefton В. M., Hunter T., Beemon K. Relationship of polypeptide products of the
transforming gene of Rous sarcoma virus and the homologous gene vertebra-
tes. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 2059—2063.
345
Sefton В. M., Hunter Т., Ball D. G. et al. Vinculin: a cytoskeletal target of the
transforming protein of Rous sarcoma virus. — Cell, 1981, v. 24, p. 165—174.
Sefton B., Hunter T., Raschke W. C. Evidence that the Abelson virus protein
functions in vivo as a protein kinase that phosphorylates tyrosine. — Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 1552—1556.
Sefton В. M., Trowbridge I. S., Cooper J. A. et al. The transforming proteins
of Rous sarcoma virus, Harvey sarcoma virus, and Abelson virus contain
tightly bound lipid. — Cell, 1982, v. 31, p. 465—474.
SegavaK., Ito Y. Enhancement of polyoma virus midle T antigen tyrosin phosphoryla-
tion by epidermal growth factor. — Nature, 1983, v. 304, p. 742—744.
Sheiness D., Vennstrom B., Bishop J. M. Virus-specific RNAs in cells infected
by avian myelocytomatosis virus and avian erythroblastosis virus: modes of
oncogene expression. — Cell, 1981, v. 23, p. 291—300.
Shen-Ong G. L. C., Keath E. J., Piccoli S. P. et al. Novel myc oncogene RNA
from abortive immunoglobulin-gene recombination in mouse plasmocytomas. —
Cell, 1982, v. 31, p. 443—452.
Shih C. et al. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced
into mouse fibroblasts. — Nature, 1981, v. 290, p. 261—264.
Shih T. Y., Papageorge A. G., Stokes P. E. et al. Guanine nucleotide-binding
and autophosphorylating activities associated with the р2ГГ£ protein of Harvey
murine sarcoma virus. — Nature, 1980, v. 287, p. 686—691.
Shih C., Shilo B., Goldfarb M. P. et al. Passage of phenotypes of chemically
transformed cells via transfection of DNA and chromatine. — Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1979, v. 76, p. 5714—1718.
Shilo B. Z., Shih С. H., Merrick M. et al. Progress in cloning the transforming gene
from chemically-transformed mouse cells — In: Carcinogenesis: Fundamental
Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts’o,
H. Gelboin. Dordrecht; Boston; London, 1980, v. 13, p. 517—526.
Shilo B., Simon M. Цит. no J. M. Bishop, 1982.
Shilo B„ Weinberg R. A. Unique transforming gene in carcinogentrasformed
mouse cells. — Nature, 1981, v. 289, p. 607—609.
Shilo B. Z., Weinberg R. A. DNA sequences homologous to vertebrate oncogenes
are conserved in Drosophila melanogaster. — Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
1981, v. 78, p. 67—89—6792.
Shimizu K., Birnbaum D.. Ruley M. A. et al. Structure of the Ki-ras gene of the
human lung carcinoma cell line Calu-I. — Nature, 1983, v. 304, p. 497—500.
Shimizu K., Goldfarb M.. Perucho M. et al. Isolation and preliminary characteri-
zation of the transforming gene of a human neuroblastoma cell line. — Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 383—387.
Shimizu K., Goldfarb M., Suard F. et al. Three' human transforming genes
are related to the viral ras oncogenes. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983,
v. 80 p. 2112—2116.
Shimotohno K., Mizutani S., Temin H. M. Sequence of retrovirus provirus resembles
that bacterial transposable elements. — Nature, 1980, v. 285, p. 550—554.
Simon D., Stuhlmann H., Jahner D. et al. Retrovirus genomes methylated by
mammalian but not bacterial methylase are noninfections. — Nature, 1983,
v. 304, p. 275—277.
Spandidos D., Kerr /. Elevated expression of the human ras oncogene family
in premalignant and malignant tumors of the colorectum. — Brit. J. Cancer,
1984, v. 49, p. 681—688.
Spandidos D.. Wilkie N. Malignant transformation of early passage rodent cell by
a single mutated human oncogene. — Nature, 1984, v. 310, p. 469—475.
Spector D. H., Baker B., Varmus H. E. et al. Characteristics of cellular RNA
related to the transforming gene of avian sarcoma viruses. — Cell, 1978,
v. 13, p. 381- 386.
Spector D. H. et al. Uninfected avian cells contain RNA related to the transforming
gene of avian sarcoma viruses. — Cell, 1978, v. 13, p. 371—379.
Spector D. H., Varmus H. E., Bishop J. M. Nucleotide sequences related to the
transforming gene avian sarcoma virus are present in RNA of uninfected
vertebrates. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, p. 4102—4106.
346
Sporn M. В., Todaro G. Autocrine secretion and malignant transforming of
cells. — New Engl. J. Med., 1980, v. 303, p. 878—880.
Slavnezer E., Gerhard D. S., Binary R. C. et al. Generation of transforming
viruses in cultures of chiken fibroblasts infected with an avian leukosis virus. —
J. Virol., 1981, v. 39, p. 920—943.
Stehelin D., Varmus H., Vogt P. K. DNA related to the transforming gene (s)
of avian sarcoma viruses is present in normal avian DNA. — Nature, 1976,
v. 260, p. 170—173.
Stiles C. D. The molecular biology of platelet derived growth factor. — Cell, 1983,
v. 33, p. 653—655.
Sukumar S., Notario V., Martin-Zanca D. et al. Induction of mammary carcinomas
in rats by nitroso-methylurea involves malignant activation of Ha-ras-l locus
by single point mutation. — Nature, 1983, v. 306, p. 658—661.
Sutherland B., Bennett P. Transformation of human cells by DNA transfections. —
Cancer Res., 1984, v. 44, p. 2769—2772.
Swanstrom R., DeLorbe W. J., Bishop J. M. Nucleotide sequence of cloned
unintegrated avian sarcoma repeats similar to those in transposible elements. —
Proc. Natl. Acad. Sci. US, 1981, v. 78, p. 124—128.
Swanstrom R. et al. Transduction of a cellular oncogene: the genesis of Rous
sarcoma virus. — Proc. Natl. Acad. USA, 1983, v. 80, p. 2519—2523.
Tabin C. J., Bradley С. I., Borgmann С. I. et al. Mechanism of activation of a human .
oncogene. — Nature, 1982, v. 300, p. 143—149.
Taparowshy E., Shimizu K., Goldfarb M. et al. Structure and activation of
the human N-ras gene. — Cell, 1983, v. 34, p. 581—586.
Taparowsky E., Evard Y., Fasano O. et al. Activation of T24 bladder carcinoma
transforming gene is linked to a single amino acid change. — Nature, 1982,
v. 300, p. 762—765.
Temin H. Function of the retrovirus long terminal repeat. — Cell. 1982, v. 28, p. 3—5.
Temin H. We still don’t understand cancer. — Cancer, 1983, v. 302, p. 656.
Temin H., Baltimone D. RNA-directed DNA synthesis and DNA tumor viruses. —
Adv. Virus. Res., 1972, v. 17, p. 129—186.
Tooze J. The molecular biology of tumor viruses. Part I. DNA tumor viruses,
2nd ed. Cold Spring Harbor. Laboratory, Cold Spring Harbor; New York, 1980.
Toth B. Synthetic and naturally occuring hydrazynes as possible cancer causative
agents. — Cancer Res., 1975, v. 35, p. 3693—3697.
Tsuchida N., Ryder T., Ohtsubo E. Nucleotide sequence of the oncogene encoding
the p21 transforming protein of Kirsten murine sarcoma virus. — Science,
1982, p. 217, p. 937- 939.
Van Beveren C., Gal les haw J. A., Jonas V. et al. Nucleotide sequence and
formation of the transforming gene of a mouse sarcoma virus. — Nature,
1981, v. 289, p. 258—262.
Van Beveren C., Van Straaten F., Galleshow J. A. et al. Nucleotide sequence of the
genome of a murine sarcoma virus. — Cell, 1982, v. 27, p. 97—108.
Varmus H. E. Form and function of retroviral provirus. — Science, 1982, v. 216,
p. 812—827.
Varmus H. E., Quintrell N., Ortiz S. Retroviruses as mutagenes: Insetrion and
excision of a nontransforming provirus alter expression of a resident trans-
forming provirus. — Cell, 1981, v. 25, p. 23—36.
Varmus H. E., Quintrell N., Wyke J. Revertants of ASV-transformed rat cell line
have los the complete provirus or sustained mutations in src. — Virology,
1981, v. 108, p. 28—46.
Varmus H. E., Shank P. R., Hughes S. E. et al. Synthesis, structure, and
integration of the DNA of RNA tumor viruses. — Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol., 1979, v. 43, p. 851- 864.
Varmus H. E., Swanstrom R. Replication of Retroviruses. — In: RNA tumor viruses /
Eds. R. Weiss et al. Molecular Biology of tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring
Harbor Laboratory, 1982, p. 369—512.
Vennstrom B.. Bishop J. M. Isolation and characterization of chicken DNA
homologous to the two putative oncogenes of avian erythroblastosis virus. —
Cell, 1982, v. 28, p. 135—143.
347
Vonsden К., Marchall C. Three different activated ras genes in mouse tumours:
evidence for oncogene activation during progression of mouse lymphoma. —
EMBO J., 1984 , 3, p. 913—917.
Wang L. H.. Moscovici C., Koress R. E. ei al. Analysis of the src gene of sarcoma
virus generated by recombination between transformation defetive mutants and
quail cellular sequences. — J. ViroL, 1979, v. 32, p. 546—556.
Warburg O. Uber den Stoffwechsel der Tumoren. — Berlin, 1926.
Waterfield W. D., Scrace G. T., Whittle N. et al. Platelet-deriver growth factor is
structurally related to the putative transforming protein p28s,s of simian sarcoma
virus. — Nature, 1983, v. 304, p. 35—39.
Watson J. D., Crick F. H. C. Genetical implications of the structure of DNA. —
Nature, 1953, v. 171, p. 964—967.
Watson R., Oskarsson M., Vande Woude G. F. Human DNA sequences homologous to
the transforming gene (mos) of Moloney murine sarcoma virus. — Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 4078—4082.
Weinberg R. A. Oncogenes of spontaneous and chemically induced tumors. —
Adv. Cancer Res., 1982, v. 36. p. 149—163.
Weinberg R. A. Fewer and fewer oncogenes. — Cell, 1982a, v. 30, p. 3—4.
Weinberg R. A. A molecular basis of cancer. — Scientific American, November,
1983, v. 248, p. 126—142.
Weinberg R. А. Цит. no Bishop J. M., 1982.
. Weiss R. Oncogenes and growth factors. — Nature, 1983, v. 304, p. 12.
Weiss R., Tech N., Varmus H. et al. Molecular biology of tumor viruses. RNA
Tumor viruses. 2nd ed. Cold Spring Harbor; New York, 1982. — 1396 p.
Westin E. H., Won Staal F., Gelman E. P. et al. Expression of cellular homo-
logues of retroviral one genes in human hemopoetic cells. — Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. 1982, v. 79, p. 2490—2493.
* Whitterman A. S. Quantitative theory of oncogenesis. — Adv. Cancer Res., 1978,
v. 27, p. 55—58.
Wierenga R. K.. Hol W. G. /. Predicted nucleotide binding properties of p21
protein and its cancer-associated variant. — Nature, 1983, v. 302, p. 842—844.
Wigley С. B., Newbold R. F., Amos J. et al. Cell mediated mutagenesis in cultured
Chinese hamster cells by polycyclic hydrocarbons: mutagenicity and DNA
reaction related to carcinogenicity in a series of compounds. — Int. J. Cancer.
1979, v. 23. p. 691—696.
Willingham M. C.. Jay G., Pastan I. Localization of the ASV gene product to the
plasma membrane of transformed cells by electron microscopic immunocyto-
chemistry.— Cell, 1979, v. 18, p. 125—134.
Willingham M. C., Pastan I., Smith T. Y. et al. Localization of the src gene
product of the Harvey strain of MSV to the plasma membrane of transformed
cells by electron microscopic immunocytochemistry. —Cell, 1980, v. 19, p. 1005.
Wislocki P. G.. Wood A. W., Chang R. L. et al. Mutagenicity and cytotoxicity
of benzo (a) pyrene arene oxide, phenols, quinones, and dihydrodiols in
bacterial and mamalia cells. — Cancer Res., 1976, v. 36, p. 3350—3357.
Witte O. N., Rosenberg N., Baltimore D. A normal cell protein cross-reactive
to the major Abelson murine leukemia virus gene product. — Nature, 1979,
v. 281, p. 396—398.
Wood A. W., Lewin W., Thomas P. E. et al. Metabolic activation of dibenzo (a)
anthracene and its dihvdrodiols to bacterial mutagens. — Cancer Res., 1978,
v. 38. p. 1967—1973.
Yamamoto T., deCrombrugghe B., Pastan I. Identification of a functional promoter
in the long terminal repeat of Rous sarcoma virus. — Cell, 1980, v. 22,
p. 787—797.
Yang S. K., Chou M. W., Fu P. P. Metabolic and structural requirenments for
the carcinogenic potencies of unsubstituted and methyl-substituted polycyclic
aromatic hydrocarbons. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and
Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts’o, H. Gelboin. Dordrecht;
Boston; London, 1980, v. 13. p. 143 -156.
Yaniv M. Enhancing elements for activation of eukaryotic promoters. Nature,
1982, v. 297, p. 17—18.
348
Yuasa Y., Got R., Chang A. et al. Mechanism of activation of an N-ras oncogene
of SW 1271 human lung carcinoma cells. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984,
81, p. 3670—3674.
Yuasa K, Srivastan S. K., Dunn С. К et al. Acqusition of transforming pro-
perties by alternative point mitations within c-bas/has human proto-onco-
gene. — Nature, 1983, v. 303, p. 775—779.
Yunis J. J. The chromosomal basis of human neoplasia. — Science, 1983, v. 221,
p. 227—236.
Ziff E. B.. Evans R. M. Coincidence of the promoter and capped 5’terminus
of RNA from the adenovirus 2 major late transcription unit. — Cell, 1978,
v. 15, p. 1463—1475.
СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Киселев Ф. Л., Спитковский Д. Д. Онкогены опухолей человека. — Журн. Всесоюзн.
хим. об-ва, 1986, № 3, с. 272—277.
Князев П. Г., Шефер Р., Виллике К., Сейц И. Ф. Идентификация трансформи-
рующего гена Ha-ras в клетках меланомы, нейробластомы и рака молочной
железы человека. — Вопр. онкол., 1985, № 6, с. 77—85.
Agnantis N. Т., Parissi Р., Anagnostakis D. et al. Comparative study of Harvey-RAS
oncogene expression with conventional clinicopathologic parameters of breast
cancer. — Oncology, 1986, vol. 43, p. 36—39.
Colberg-Poley A. M., Voss S. D., Chowdhury K- et al. Structural analysis of murine
genes containing homoe box sequences and their expression in embrional
carcinoma cells. — Nature, 1985, v. 314, p. 713—718.
Conscience J.-F., Verrier B., Martin G. Interleukin-3-dependent expression of the
c-myc and c-fos proto-oncogenes in hemopoietic cell lines. — EMBO J., 1986,
v. 5, p. 317—323.
Einani M., Resnitzky D., Kimichi A. Close link between reduction of c-myc
expression by interferon and Go/G, arrest. — Nature, 1985, v. 313, p. 597- 600.
Guerrero I., Villasante A., Corces V. et al. Activation of c-Ki-ras oncogene by somatic
mutation in mouse lymphomas induced by gamma radiation. — Science, 1984,
v. 225, p. 1159—1162.
Hagag N., Halegona S.. Viola M. Inhibition of growth factor induced differen-
tiation of PC12 cells by microinjection of antibody to ras p21. — Nature.
1986, v. 319, p. 680—682.
Hand P. H., Thor A., IV'underlich D. et al. Monoclonal antibodies of predefined
specificity detect activated ras gene expression in human mammary and
colon carcinomas. — Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, p. 5227—5231.
Hayday A. C.. Gillies S. D., Saito H. et al. Activation of a translocated human
c-myc gene by an enhancer in the immunoglobulin heavy-chain locus. —
Nature, 1984, v. 307, p. 334 -340.
Kamata T., Feramisco J. R. Epidermal growth factor stimulates guanine nucleotide
binding activity and phosphorylation of ras oncogene proteins. — Nature, 1984,
v. 310, p. 147—150.
Kataoka T., Powers S., Cameron S. et al. Functional homology of mammalian and
Yeast RAS genes. — Cell, 1985, v. 40, p. 19 -26.
Kraus M. H.. Yuasa Y., Aaranson S. A position 12-activated H-ras oncogene in all
HS 578t mammary carcinosarcoma cells and but not normal mammary cells
of the same patient. — Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1984, v. 81, p. 5383 —5388.
Krontiris Th. G., DiMartino N. A., Colb M. et al. Human restriction fragment
lenghth polymorphisms and cancer risk assessment.—J. Cell. Bioch., 1986,
v. 30, p. 319-329.
Liberman T. A., Nursbaum H. R., Razon N. et al. Amplification, enhanced expres-
sion and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary human
brain tumours of glial origin. — Nature, 1985, v. 313, p. 144 —147.
Martinet V., Bitterman P. B., Mornex J.-F. et al. Activated human monocytes
express the c-sis proto-oncogene and release a mediator showing PDGF-like
activity. — Nature, 1986, v. 319, p. 158—160.
349
Martin-Zanca D., Hughes S. H.. Barbacid M. A human oncogene formed by fusion
of truncated tropomyosin and protein tyrosine kinase sequences. — Nature,
1986, v. 319, p. 743—748.
Mulcahy L. S., Smith M. R.. Stacey D. W. Requirenment for ras protooncogene
function during serum-stimulated growth of NIH 3T3 cells.—Nature, 1985,
v. 313, p. 341—343.
МйПег R., Bravo R.. Burckhardt J. et al. Induction of c-fos gene and protein by
growth factors precedes activation of c-myc. — Nature, 1984, v. 312, p. 716—720.
Rogers J., Cooper G., Goubin G. et al. Relationship of Blym genes to repeated
sequences. — Nature, 1986, v. 320, p. 579—580.
Sacchi N., Watson D. K., Giertsvan A. H. M. et al. Hu-ets-1 and Hu-ets-2 genes are
translocated in acute leukemias with (4; II) and (8; 21) translocation.—
Science, 1986, v. 231, p. 379—382.
Slamon N. J., Boone T. C., Seeger R. C. et al. Identification and characterization
of the protein encoded by the human H-myc oncogene. — Science, 1986, v. 232,
p. 768—772.
Smith M. R., DeGudicibus S. Stacey D. W. Requirenment for c-ras protein during
viral oncogene transformation. — Nature, 1986, v. 320, p. 540—543.
Tanabe T.. Nukada T., Nishikawa Y. et al. Primary structure of the a-subunit of
transducin and its relationship to ras proteins.— Nature, 1985, v. 315, p. 242—
245.
Thein S. L., Oscier D. G., Flint J. et al. Ha-ras hypervariable alleles in myelodyspla-
sia.— Nature, 1986, v. 321, p. 84—85.
Thompson О. B., Chailoner P. B., Neiman P. E. et al. Levels of c-myc oncogene
mRNA are invariant throughout the cell cycle. — Nature, 1985, v. 314, p. 363—
366.
Wallich R.. Bulbuc N., Hammerling G. J. et al. Abrogation of metastatic properties
of tumour cells by de novo expression of H-2K antigens following H-2 gene
transfection. — Nature, 1985, v. 315, p. 301—305.
Yamamoto T.. Ikawa S., Akiyama T. et al. Similarity of protein encoded by the
human c-erb B-2 gene to epidermal growth factor receptor. — Nature, 1986,
v. 319, p. 230 -234.
Zimmerman K. A., Yancopoulos G. D., Collum’ R. G. et al. Differential expression
of myc family genes during murine development. — Nature, 1986, v. 319,
p. 780—783.
Seitz J. F., Knyazev P. G. Molecular oncology: (manual for doctors) — Lenin-
grad, Medicina, 1986. — p. 352.
Seitz Joseph F., Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of Laboratory
of Cancer Biochemistry, N. N. Petrov Institute of Oncology USSR Ministry
of Health, Leningrad; Knyazev Peter G., Candidate of Medical Sciences, Senior
Research Worker at the same Laboratory.
Molecular oncol >gy is actually the first monograph of this kind published in the
USSR, or abroad. The authors are the first to review volumenous literature and
experimental data in the field of a new branch of science — molecular onco-
logy. A universal concept of oncogenesis has been developed, which offers a common
theoretical interpretation and basis for chemical, physical and biological (viral)
carcenogenesis. The results of the analysis of the data obtained make one feel opti-
mistic when the possibility of a forthcoming solution of the most urgent problem
of to-day — the origin of cancer — is concerned. The book deals with new data on
identification, intracellular localization, molecular structure and origination of
oncogenesis, as well as their action in human and animal tumors. Much attention is
also paid to the «working tools» of oncogenesis, viz. oncoproteins. Perspectives on
using these data for the development of adequate methods of diagnosis and
treatment of neoplasms are also viewed.
There are 14 tables, 12 figures in the book; bibliography includes 391 names.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие. Н. П. Напалков ...	. .	.	3
Введение. И. Ф. Сейц................................................ 4
Глава I. Метаболическая теория Варбурга и другие биохимические гипо-
тезы возникновения рака. И. Ф. Сейц ......	7
Отто Варбург и его биохимическая теория рака ...	8
Обмен веществ белых клеток крови в свете теории Варбурга ...	24
Специфичность обмена веществ кровяных пластинок (тромбоцитов) 29
О полноценности дыхания неопластических клеток .	.	.	.30
Аэробный гликолиз и «функциональное напряжение» . .	33
Другие биохимические	гипотезы рака	  35
Опухоль и организм............................................. 44
Глава 2. Биохимические и молекулярные основы химического канцеро-
генеза. И. Ф. Сейц................................................  46
Канцерогены окружающей среды . .	........................ 48
Химические канцерогены............... .	.	51
Полициклические ароматические углеводороды .	....	61
Канцерогенность и мутагенность в связи с модификацией ДНК химиче-
скими канцерогенами.......................................   .	83
Химический и радиационный канцерогенез в связи с мутагенезом 96
Ароматические амины и амиды...................................  98
Нитрозамины и нитрозамиды как канцерогены .	110
Взаимодействие нитрозосоединений с нуклеиновыми кислотами 121
Заключение.................................................... 128
Глава 3. Вирусный онкогенез и его молекулярные основы. П. Г. Князев,
И. Ф. Сейц.......................................................  132
Классификация онкогенных вирусов .	...	. .	133
Общие свойства ретровирусов . .	.	134
Репликация ретровирусов ...	............ ...	137
Структура и функции онкогенных ретровирусов................... 147
Онкогены ретровирусов птиц ....	152
Онкогены ретровирусов млекопитающих .	............... 170
Механизмы вирусного лейкомогенеза у млекопитающих и человека 184
Роль онкогенных вирусов в возникновении опухолей человека	184
Глава 4. Клеточные онкогены. И. Ф. Сейц .	192
Протоонкогены...................................... 192
Активация клеточных протоонкогенов	в	онкогены	...	221
Онкогены, онкобелки и	трансформирующие	факторы	роста	249
Заключение	.	...............265
Глава 5. Онкогены опухолей человека и животных. П. Г. Князев,
И. Ф. Сейц........................................................ 267
Клеточные трансформирующие гены (онкогены) опухолей человека,
родственные протоонкогену c-Ha-ras 1	.....	270
Клеточные трансформирующие гены опухолей человека, родственные
протоонкогену c-Ki-ras 2 .	. . .	. .	. .	281
Клеточные трансформирующие гены человека, родственные протоонко-
гену N-ras .	............ ...	284
Трансформирующие гены B-Iym и T-lym .	............285
Неидентифицированные трансформирующие гены .	286
Влияние метилирования ДНК на экспрессию онкогенов .	289
Тканеспецифичность активации онкогенов . .	. .	.	294
Недостаточность единичного онкогена для полной трансформации
клеток .	.	....	296
Кооперирование между онкогенами . .	...	298
Экспрессия трансформирующих генов в нормальных и опухолевых
клетках человека ...	...	301
Канцерогенез: «одноударная кинетика» или «каскад онкогенов»? .	307
Заключение. И. Ф. Сейц........................................ 329
Список литературы ................................................ 333