htto://biotex. ibss.ora.ua

IT
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

А. В. ПИНЕВИЧ

МИКРОБИОЛОГИЯ

БИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТОВ

Учебник

Том 2

ИЗДАТЕЛЬСТВО С.-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
ББК 28.4

П32

Рецензенты: д-р биол. наук, проф. А.Д.Харазова (C.-Петерб. гос. ун-т), чл.-кор. РАН,
проф. Ю. В. Гамалей (Ботан. ин-т РАН им. В. Л. Комарова)

Печатается по постановлению
Редакционно-издательского совета
биолого-почвенного факультета
С.-Петербургского государственного университета

Пиневич А. В.

П32 Микробиология. Биология прокариотов: Учебник. В 3 т. Том 2. —СПб.:
Изд-во C.-Петерб. ун-та, 2007.— 331с.

ISBN 978-5-288-04269-0 (т. II)

ISBN 5-288-04056-7

Фундаментальный учебник по микробиологии, впервые издаваемый в С.-Петербурге, ос-
нован на курсах лекций, которые автор читает студентам биолого-почвенного факультета
СПбГУ с начала 1970-х годов. Наряду с классическими сведениями излагаются современные
представления о биологии бактерий и архей. Многие вопросы в нем рассматриваются под
непривычным углом зрения, а некоторые еще не обсуждались в отечественной литературе.
Учебник отражает гигантский прогресс в изучении структурно-функциональной организа-
ции прокариотов, их биоразнообразия и филогении. Одним читателям это расширит кру-
гозор, другим поможет переосмыслить представления о строении прокариотов, их роли в
органической эволюции и биосфере.

Во II томе рассматриваются основы транспорта и метаболизма у прокариотов, хемотро-
фия и фототрофия, углеродная и азотная автотрофия, ключевые биосинтезы. Учебник ре-
комендуется студентам, аспирантам биологических факультетов университетов, может быть
полезен исследователям-микробиологам, а также специалистам в сферах других естествен-
ных наук. Табл. 9. Ил. 100.

ББК 28.4

Дизайн обложки профессора С.-Петербургской академии художеств И. В. Петрова

Издание подготовлено при финансовой поддержке исследовательского гранта

РФФИ 05-04-49621

ISBN 978-5-288-04269-0 (т. II)

ISBN 5-288-04056-7

© А. В. Пиневич, 2007

© Издательство

С.-Петербургского
университета, 2007
ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие.................................................................... 6

ГЛАВА 9. Основы питания прокариотов............................................ 8

9.1.	Клеточный транспорт................................................... 9

9.1.1.	Транспорт через цитоплазматическую мембрану ................... 12

9.1.2.	Транспорт через наружную мембрану.............................. 19

9.2.	Метаболизм........................................................... 25

9.2.1.	Типы метаболизма............................................... 27

9.2.2.	Энергоноситель.................................................. —

9.2.3.	Строительный материал.......................................... 29

9.2.4.	Донор электронов............................................... 31

ГЛАВА 10. Основы энергетического метаболизма.................................. 32

10.1.	Биотрансформаторы.................................................... —

10.2.	Фосфагены........................................................... 36

10.3.	Цитозольные биотрансформаторы....................................... 41

10.4.	Мембранные биотрансформаторы.......................................  44

10.4.1.	Протонофорная система: бактериородопсин....................... 54

10.4.2.	Протонофорная система: протеородопсин......................... 55

10.4.3.	Протонофорная система: бактериальная FoFi-АТФаза/АТФ-синтаза и
археотная АоА1-АТФаза/АТФ-синтаза...................................   56

10.4.4.	Протонофорная система: Р-АТФаза............................... 60

10.4.5.	Протонофорная система: ФФаза/ФФ-синтаза....................... 61

10.4.6.	Протон-электронофорная система: цитохром bci (5б/)-комплекс.... —

10.4.7.	Электронофорные системы: экстрацитоплазматическое окисление «простых»
субстратов............................................................ 65

10.4.8.	Экспортерная система: симпорт Н+ и конечного продукта......... 67

10.4.9.	Импортерно-экспортерная система: антипорт субстрата и продукта его
декарбоксилирования................................................... 68

10.4.10.	Натриевая биоэнергетика...................................... 71

ГЛАВА 11. Хемотрофия.......................................................... 80

11.1.	Терминальные доноры электронов....................................... —

11.2.	Терминальные акцепторы электронов................................... 81

11.2.1.	Молекулярный кислород и его альтернатива...................... 82

11.2.2.	Анаэробное деструктивное сообщество............................ —

11.3.	Брожение............................................................ 85

11.3.1.	Брожение с позиций биоэнергетики; различие между брожением и дыханием 86

11.3.2.	Механизмы образования пирувата при катаболизме углеводов...... 88

11.3.2.1.	Гексозобисфосфатный путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса........ —

11.3.2.2.	Гексозомонофосфатный путь Энтнера-Дудорова............... 91

11.3.2.3.	Гексозомонофосфатный путь Варбурга-Диккенса-Хореккера.... 94

11.3.2.4.	Гексозомонофосфатный путь де Фриза-Стаутамера............ 96

11.3.2.5.	Образование пирувата у архей............................. 98

11.3.3.	Судьба пирувата — основа разнообразия типов брожения......... 101

11.3.4.	Типы брожения................................................ 104

11.3.4.1.	Маслянокислое и ацетонобутиловое брожение................. —
11.3.4.2.	Уксуснокислое брожение.................................... 107

11.3.4.3.	Спиртовое брожение.........................................109

11.3.4.4.	Глицериновое брожение...................................... ПО

11.3.4.5.	Молочнокислое брожение.................................... 111

11.3.4.6.	Муравьинокислое брожение.................................. 113

11.3.4.7.	«Необычные» типы брожения..................................115

11.4.	Дыхание............................................................. 121

11.4.1.	Общие положения.................................................. —

11.4.2.	Органический донор электронов...................................122

11.4.2.1.	Окислительный цикл трикарбоновых кислот, или цикл Кребса...123

11.4.2.2.	Окислительный пентозофосфатный цикл, или цикл Варбурга-Дик-
кенса-Хореккера.....................................................128

11.4.3.	Посредники между органическим донором электронов и дыхательной цепью 132

11.4.4.	Неорганический донор электронов.................................136

11.4.4.1.	Основы хемолитотрофии.................................... 139

11.4.4.2.	Углеродная хемолитотрофия: метанотрофия, метилотрофия и формиа-
тотрофия........................................................... 143

11.4.4.3.	Углеродная хемолитотрофия — карбоксидотрофия................151	.

11.4.4.4.	Водородная хемолитотрофия..................................153

11.4.4.5.	Азотная хемолитотрофия.................................... 157

11.4.4.6.	Серная хемолитотрофия......................................162

11.4.4.7.	Железная хемолитотрофия................................... 167

11.4.4.8.	Марганцевая хемолитотрофия................................ 170

11.4.4.9.	Хемолитотрофия во «второй биосфере» и	«третьей биосфере»...173

11.4.5.	Органические акцепторы электронов................................ —

11.4.5.1.	Экзогенный фумарат.........................................174

11.4.5.2.	Эндогенный фумарат.......................................... —

11.4.5.3.	Экзогенный органический гетеродисульфид................... 177

11.4.5.4.	Эндогенный органический гетеродисульфид:	биосинтез	метана. —

11.4.5.5.	Эндогенный метилен-тетрагидрофолат: биосинтез	ацетата..... 188

11.4.6.	Неорганические акцепторы электронов............................ 192

11.4.6.1.	Аэробные терминальные кислородредуктазы (терминальные оксидазы) 193

11.4.6.2.	Анаэробные терминальные редуктазы......................... 197

ГЛАВА 12. Фототрофия..........................................................214

12.1.	Два способа ассимиляции световой энергии.............................215

12.2.	Два типа светового питания...........................................216

12.3.	Оксигенная фототрофия и аноксигенная фототрофия......................217

12.4.	Парадоксы фототрофии.................................................218

12.5.	Из истории изучения фототрофии...................................... 220

12.6.	Фотосинтетические пигменты.......................................... 222

12.6.1.	Хлорофиллы и хлорофилподобные пигменты......................... 223

12.6.2.	Каротиноиды.....................................................227

12.6.3.	Фикобилины..................................................... 229

12.7.	Светособирающие антенны и реакционные центры........................ 230

12.7.1.	Светособирающие антенны.......................................... —

12.7.2.	Реакционные центры..............................................232

12.7.3.	Аноксигенная фототрофия.........................................234

12.7.3.1.	Пурпурные бактерии, квази-фототрофные бактерии (фила ВХП Рго-
teobacteria) и нитчатые зеленые бактерии (фила BVI Chloroflexi)...... —

12.7.3.2.	Одноклеточные зеленые бактерии (фила BXI Chlorobi) и гелиобактерии
(фила ВХШ Firmicutes)...............................................238

12.7.4.	Оксигенная фототрофия...........................................240

12.7.5.	Факультативно аноксигенная	фототрофия...........................251

12.7.6.	Квази-фототрофия................................................252

12.7.6.1.	Квази-фототрофные бактерии.................................. —

12.7.6.2.	Квази-фототрофные археи................................... 253

12.7.6.3.	Квази-фототрофия во «второй биосфере»..................... 254

ГЛАВА	13. Углеродная автотрофия............................................255

13.1.	Механизмы углеродной автотрофии......................................256
13.2.	Циклы углеродной автотрофии.........................................257

13.2.1.	Восстановительный цикл карбоновых кислот, или цикл Ивенса-Быокенена-
Эрнона................................................................ 258

13.2.2.	/З-Оксипропионатный цикл, или цикл Фукса-Холо..................262

13.2.3.	Рибулозомонофосфатный цикл, или цикл Квайла....................265

13.2.4.	Сериновый цикл, или цикл О’Коннора-Хэнсона.....................267

13.2.5.	Восстановительный пентозофосфатный цикл, или цикл Кельвина-Бенсона-
Бэссема................................................................269

13.2.6.	Сравнение циклов автотрофной ассимиляции углерода............. 275

13.3.	Пути углеродной автотрофии......................................... 278

13.3.1.	Восстановительный ацетил-коэнзимный путь метаногенов, или путь Вулфа. —

13.3.2.	Восстановительный ацетил-коэнзимный путь ацетогенов, или путь Вуда-
Льюнгдала..............................................................279

13.4.	Разнообразие механизмов автотрофной ассимиляции углерода при хемосинтезе и
фотосинтезе............................................................. 281

ГЛАВА 14. Азотная автотрофия................................................ 283

14.1.	Диазотрофы........................................................... —

14.2.	Нитрогеназа.........................................................286

14.2.1.	Строение нитрогеназы...........................................287

14.2.2.	Субстраты и механизм действия нитрогеназы......................290

14.2.3.	Регуляция нитрогеназы..........................................292

14.2.4.	Защита нитрогеназы.............................................293

14.2.5.	Ассимиляция аммония............................................295

ГЛАВА 15. Ключевые биосинтезы................................................298

15.1.	Биосинтез глицеролипидов............................................299

15.1.1.	Биосинтез глицеролипидов у бактерий............................. —

15.1.2.	Биосинтез глицеролипидов у архей...............................304

15.2.	Биосинтез полиизопреноидов..........................................307

15.2.1.	Биосинтез мономера полиизопреноидов — изопентенилдифосфата.....309

15.2.2.	Магистральный путь биосинтеза полиизопреноидов и его ответвления.311

15.3.	Биосинтез тетрапирролов.............................................317

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................323

Предметный указатель.........................................................324
ПРЕДИСЛОВИЕ

Невежество находя в своем смысле простые ка-
менья, принимает их за лучшие алмазы, и за такие
выдает их другим.

Российская азбука для обучения юношества
чтению, напечатанная для общественных школ
по Высочайшему повелению (Санктпетербург, ко-
нец XVIII в.)

Во II томе учебника подробно рассказано о питании бактерий и архей. Что нового
он содержит по сравнению с предшествующими руководствами на эту тему?

Как правило, авторы отечественных учебных изданий по микробиологии уде-
ляют преимущественное внимание гетеротрофному метаболизму, в особенности в
связи с медицинскими или биотехнологическими проблемами.

Наша задача принципиально иная — показать, каким образом прокариоты ис-
пользуют все биологически доступные источники энергии и строительного матери-
ала, и какое это имеет значение для биосферы в целом и человека в частности. За
основу взят тезис о взаимном паритете основных аспектов прокариотного метабо-
лизма, и многие из них в развернутом виде до сих пор не излагались на русском
языке.

После знакомства с транспортными процессами читатель перейдет к изучению
«приходной» части метаболизма—ассимиляции энергии и субстратов. Здесь пер-
вое место по праву занимает автотрофный энергетический метаболизм, связанный
с ассимиляцией энергии света (фототрофия) или неорганических субстратов (хемо-
литотрофия). По биологическому значению следом за ним идет автотрофный кон-
структивный метаболизм, связанный с ассимиляцией неорганического углерода и
молекулярного азота.

Автотрофный метаболизм является уникальным свойством прокариотов. Ядер-
ные организмы осуществляют фототрофию только с помощью своих пластид, про-
изошедших от бактерий. В свою очередь, редко встречающаяся у ядерных организ-
мов хемолитотрофия возможна только благодаря их бактериальным эндоцитобион-
там. В то же время гетеротрофный метаболизм у прокариотов и ядерных организмов
имеет довольно много общих черт.

На «расходной» части метаболизма, связанной с использованием ассимилирован-
ной энергии и субстрата, мы уже останавливались в I томе учебника (см. разделы,
посвященные биогенезу клеточных структур, секреции и подвижности). Во II то-
ме учебника мы возвращаемся к этой теме в разделе, посвященном трофическому
экспорту.
Чтобы процессы питания не воспринимались как транспорт и метаболизм «во-
обще», мы конкретизируем их для отдельных представителей бактерий и архей, а
также применительно к отдельным клеточным структурам. Для лучшего усвоения
материала читателю рекомендуется обращаться к I тому учебника, где подробно
рассмотрены биоразнообразие, систематика и цитология прокариотов.

Там, где речь идет о промежуточном метаболизме, в частности о биосинтезе пер-
вичных и вторичных метаболитов, а также о катаболических процессах, читатель
не встретится с деталями, поскольку в рамках учебника по микробиологии невоз-
можно и не нужно рассматривать все классы биологических соединений и типы
биохимических реакций — конкретные сведения без труда можно найти в стандарт-
ных учебниках по биохимии или справочниках.

Исключение сделано только для биосинтеза фосфолипидов, полиизопреноидов (в
частности, каротиноидов) и тетрапирролов (в частности, хлорофиллов). Они име-
ют исключительно важное значение для функциональной структуры прокариотной
клетки, однако обычно только упоминаются или поверхностно описываются в учеб-
ной литературе.

Автор признателен своим учителям, отечественным и зарубежным коллегам, а
также сотрудникам по кафедре микробиологии СПбГУ. И вновь благодарит своих
близких —жену Т. В. Серговскую и дочь А. А. Пиневич за неоценимую моральную
поддержку и советы, а также помощь в редактировании текста и подготовке иллю-
страций.
ГЛАВА 9

ОСНОВЫ ПИТАНИЯ ПРОКАРИОТОВ

Je regarde 1’organisation comme une qualitd essentielle
a la matiere, циа1кё aussi essentielle que l’6tendue; & j’en
fais la base des facult6s communes & tous les Etres, qui
sont celles de se nourrir, de croitre d’engendrer.

(Я считаю организацию существенным качеством
материи, столь же существенным, что и протяжен-
ность; и я вижу в ней основу таких общих всем суще-
ствам способностей, как способности питаться, расти и
размножаться)

Robinet. De la Nature (1766)

Живые организмы, в том числе прокариоты, представляют собой открытые тер-
модинамические системы, которые обмениваются с внешней средой энергией, хими-
ческими субстратами и информацией.

Для возобновления внутриклеточных ресурсов энергии и химических субстратов
прокариоты используют внешние ресурсы, что в отсутствии лимитирующих факто-
ров позволяет им размножаться в геометрической прогрессии.

Доступ прокариотов к внешним ресурсам энергии и химических субстратов осу-
ществляется путем питания, или трофии (греч. trophe —пища).

Питанием называется совокупность процессов, с помощью которых организмы
используют в своей жизнедеятельности экзогенные энергоносители и строитель-
ные материалы.

При питании организмы расходуют энергию на поглощение питательных суб-
стратов и выведение отработанных продуктов жизнедеятельности.

Питание высших животных представляет собой многоуровневый процесс, осно-
ванный на: а) захвате и измельчении пищи, б) полостном пищеварении, в) эндоцито-
зе жидкого или твердого материала, г) трансмембранном переносе индивидуальных
молекул. Хотя высшие растения и грибы также имеют специализированные органы
субстратного питания, они работают только как поглотительные системы, т. е. по
осмотрофному принципу.

Что касается протистов и прокариотов, то у них питание происходит исключи-
тельно на клеточном уровне и подразделяется на субстратное и энергетическое.
Субстратное питание. Этот тип питания включает в себя два разных по своей
природе процесса:

—	трофический клеточный транспорт (он состоит из доставки в цитоплазмати-
ческий компартмент питательных субстратов, или импорта, и выведения из клетки
продуктов жизнедеятельности, или экспорта)-,

—	метаболизм, который обеспечивает химическое превращение импортирован-
ного материала.

Энергетическое питание. Если в роли энергоносителя выступает органиче-
ское вещество, энергетическое питание состоит из импорта и метаболизма. Если же
энергоносителем служит электромагнитное излучение или окисляемый вне цито-
плазмы неорганический субстрат, то импорт не требуется, и энергетическое питание
сводится к метаболизму.

Ассимиляция и диссимиляция. При энергетическом и субстратном питании
«ничей» энергоноситель и строительный материал «получают собственника» и инте-
грируются в клетку, что обязательно связано с их преобразованием. Данный процесс
происходит благодаря действию метаболических систем и называется ассимиляцией
(от лат. as-similis — самоуподобленный, усвоенный).

Противоположно направленный процесс, когда энергоноситель и строительный
материал теряют свою биологическую индивидуальность, переходя в абиотическое
состояние, называется диссимиляцией (от лат. dis-similis — непохожий, отчуждае-
мый) .

9.1. КЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ

Процессы, связанные с клеточным транспортом, обеспечивают совместное функ-
ционирование отдельных частей клетки, а также ее взаимодействие с внешней сре-
дой. От эффективности клеточного транспорта зависят онтогенез и репродукция, и
поэтому он служит одним из важнейших условий сохранения жизнеспособности.

Прокариоты обладают активным ферментативным аппаратом, и им свойствен-
на осмотрофия (т. е. они впитывают питательные субстраты всей своей клеточной
поверхностью). Неудивительно, что до 10% их генов кодируют белки, участвующие
в клеточном транспорте. Например, у Lactobacillus lactis имеется около 250, а у
Е. coli —около 270 разных транспортеров.

Транспортные системы у прокариотов исключительно разнообразны. Примени-
тельно к ним используется ключевая терминология, предложенная Питером Мит-
челом (Р. Mitchell, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1970 г.) в конце
1950-х годов. В уточненном и дополненном виде она отражает новые, ранее неиз-
вестные явления.

Остановимся на терминах, которые понадобятся при дальнейшем изложении.

Пограничный транспорт и внутренний транспорт. Мы уже не раз под-
черкивали (см. I том учебника), что прокариоты, в отличие от эукариотов, лишены
способности к цитозу. Вследствие этого основные транспортные процессы у бакте-
рий и архей связаны с «поЩтучным» трансмембранным переносом молекул.

Клеточный транспорт (от лат. trans-porto — переносить) у прокариотов подраз-
деляется на пограничный транспорт и внутренний транспорт.

Пограничным транспортом, или просто транспортом называется перемещение
молекул через биологические мембраны.
Внутренний транспорт осуществляется в пределах одного из компартментов —
цитоплазматического или периплазматического. В данном случае транспортиру-
емое соединение, находящееся в свободном виде или связанное с белком-пере-
носчиком, диффундирует соответственно в цитоплазме или периплазме. Вариан-
том внутреннего транспорта является таргетинг (англ, target — мишень), или та-
кое явление, когда молекулярный компонент мембраны или другой внутрикле-
точной структуры целенаправленно доставляется на место своего функциониро-
вания.

Импорт и экспорт. Под импортом в широком смысле слова подразумевается
поступление веществ из окружающей среды в клетку, а под экспортом — выделение
веществ из клетки в окружающую среду.

Экскреция и секреция. Экскреция — это выведение за пределы цитоплазма-
тического компартмента низкомолекулярных соединений, которые больше не нуж-
ны клетке или оказывают на нее вредное воздействие. Примером экскретируемых
веществ являются побочные продукты метаболизма или проникшие в клетку экзо-
генные токсиканты.

Секрецией называется выведение за пределы цитоплазматического компартмен-
та функционально полезных низкомолекулярных или высокомолекулярных соеди-
нений. Они входят в состав экстрацитоплазматических структур (например, в ри-
гидный слой клеточной стенки) или функционируют за пределами цитоплазмати-
ческого компартмента (примером служат сигнальные молекулы, экзоферменты и
экзополисахар иды).

«Downhill»-транспорт и «uphill»-транспорт. Транспорт всегда связан с пе-
рераспределением вещества в пространстве, что приводит к созданию концентраци-
онных градиентов или их выравниванию.

При downhill-транспорте (англ, под гору) экзогенные субстраты переносятся че-
рез мембранный барьер вниз по градиенту концентрации.

В свою очередь, при uphill-транспорте (англ, в гору) экзогенные субстраты пе-
реносятся вверх по градиенту концентрации.

Первичный транспорт и вторичный транспорт. Согласно Питеру Митче-
лу, первичным транспортом называются такие механизмы, при помощи которых
создается трансмембранный электрохимический потенциал катионов Н+ (см. раз-
дел 10.4.1). В свою очередь, вторичным транспортом называется транспорт суб-
стратов за счет этого потенциала.

При использовании термина «первичный транспорт» не всегда ясно, что именно
и как именно транспортируется через мембрану. Классические представления мит-
человой эпохи исходили из существования протонных помп, переносящих катионы
Н+ через мембрану за счет:

—	свободной энергии химического субстрата, окисляемого через дыхательную
электрон-транспортную цепь;

—	свободной энергии видимого света, преобразуемой в химическую с помощью
фотосинтетических реакционных центров;

—	свободной энергии гидролиза АТФ.

Сейчас известно, что трансмембранный электрохимический потенциал катионов
Н+ может быть создан и в отсутствие их прямого переноса через мембрану. Слу-
чается даже, что трансмембранный электрохимический потенциал катионов Н+ со-
здается благодаря системам вторичного транспорта (см. раздел 10.4.1).

Кроме того, оказалось, что помимо протонных помп существуют и натриевые
помпы, которые позволяют запасать энергию в форме трансмембранного электро-
химического потенциала катионов Na+.

Наконец, помимо первичного и вторичного транспорта существует третичный
транспорт, использующий энергию, запасенную в результате вторичного транспорта
(см. ниже).

Все это необходимо иметь в виду при употреблении терминов «первичный транс-
порт» и «вторичный транспорт» в их первоначальном или обновленном смысле.

Диффузионный перенос и активный транспорт. В случае диффузионного
переноса происходит спонтанное выравнивание концентраций химического вещества
между клеткой и окружающей средой. Этот процесс осуществляется по принципу
downhill и протекает без затраты клеточной энергии.

При активном транспорте клетка концентрирует субстрат, создавая его градиент
между цитоплазмой и окружающей средой. Этот процесс требует затраты энергии
и осуществляется по принципу uphill.

Трофический транспорт. Данный тип транспорта связан с проникновением
питательных субстратов (например, сахаров) в периплазматический и цитоплазма-
тический компартменты, а также с выходом отходов питания (например, лактата)
из этих компартментов. Поскольку некоторые транспортные системы обладают об-
ратимым действием, с их помощью одно и то же вещество (опять же лактат) может
поглощаться в качестве питательного субстрата и выделяться в качестве отхода пи-
тания.

Экскреция токсикантов и секреция вторичных метаболитов. Данные
процессы нужно рассматривать отдельно от трофического транспорта. Благодаря
им клетка выделяет проникшие в нее чужеродные токсичные агенты или экспор-
тирует адаптивно синтезированные вторичные метаболиты (см. главу 9.2), которые
играют роль сигнальных молекул, воздействующих на клетку извне.

Характерным примером таких транспортных систем являются белки из суперсемейства RND
(от англ, resistance-nodulation-division), которые обеспечивают отторжение антибиотиков, химиоте-
рапевтических препаратов и катионов тяжелых металлов, а у клубеньковых бактерий — экспорти-
руют липоолигосахаридные Nod-факторы, регулирующие начальную стадию симбиоза с бобовыми
растениями.

Другим примером таких систем служит АсгАВ-То1С — транспортная система, обеспечивающая
множественную лекарственную устойчивость и выброс токсических соединений. Она имеется у
ряда грамотрицательных бактерий (см. I том учебника).

Транспорт макромолекул. Этот вид транспорта также следует рассматри-
вать отдельно от трофического транспорта. В данном случае через мембранные
барьеры или в пределах клеточных компартментов переносятся не низкомолекуляр-
ные субстраты и метаболиты, а макромолекулы, которые выполняют генетическую,
структурную или ферментативную функцию.

Характерными примерами пограничного транспорта макромолекул служат вы-
деление ДНК донором и поглощение ДНК реципиентом при генетической транс-
формации (см. III том учебника), а также секреция белка (см. I том учебника).

Секретируемый белок, например гидролитический фермент, иногда может сам
участвовать в трофическом транспорте, что обеспечивает последний низкомоле-
кулярными субстратами для импорта. В других случаях секретируются белковые
субъединицы ригидных слоев или придаточных структур, токсины и т.д.

В дальнейшем нас в основном будет интересовать трофический импорт.
9.1.1. Транспорт через цитоплазматическую мембрану

Поскольку субстратное питание основано на импорте, остановимся на нем более
подробно (рис. 64).

На уровне СМ действуют два механизма импорта — диффузия и активный транс-
порт.

Диффузия. Диффузионный транспорт приводит к выравниванию концентра-
ций питательного субстрата по обе стороны СМ без затраты энергии, т. е. это down-
hill-транспорт. Иногда можно встретить утверждение, что диффундирующее веще-

цитопл азматиче с кий
компартмент

Рис. 64. Механизмы импорта на уровне цитоплазматической мембраны.

Темным кружком обозначен транспортируемый субстрат. А — диффузионный транс-
порт; Б—Pmf (5т/)-зависимый симпортер; В — Рт/-зависимый симпортер, который ис-
пользует связывающий белок; Г — ABC-пермеаза; Д — перенос группы. ВР — связываю-
щий белок; EI и НРг — цитоплазматические ферменты (компоненты генеральной фосфо-
трансферазной системы); ЕП — мембраносвязанный фермент (специфический транспор-
тер).
ство переходит из области большей концентрации в область меньшей концентрации
под влиянием некой движущей силы. Это неверно, поскольку при диффузии проис-
ходит только статистическое перераспределение молекул, находящихся в хаотиче-
ском движении.

При пассивной диффузии в первую очередь важна степень липофильности суб-
страта, а уже затем — диаметр его молекулы. Липофильные молекулы (напри-
мер, ароматические углеводороды) или амфифильные молекулы (например, этанол)
неспецифически проходят через СМ, растворяясь в ее билипидном матриксе. Раз-
мер молекулы в данном случае несуществен. В отличие от липофильных молекул
гидрофильные молекулы не обладают сродством к билипидному слою и поэтому
могут преодолевать барьер СМ только через белковые каналы, или водные поры.

При облегченной диффузии (рис. 64, А) белковый канал в результате связывания
с субстратом меняет конформацию, что облегчает перенос питательного субстрата
через СМ. Однако клетка не расходует на это свою собственную энергию.

Активный транспорт. Для активного транспорта необходимы уже не диффу-
зионные поры, а пермеазы (синонимы: переносчики, портеры, транслоказы, фаси-
литаторы). Как следует из окончания -аза, пермеазы обладают рядом свойств, сбли-
жающих эти белки с ферментами, хотя они обычно не катализируют химическую
реакцию, т. е. не изменяют структуру своего субстрата.

Прежде всего, пермеазы в той или иной степени специфичны в отношении суб-
страта, и их биосинтез часто осуществляется индуцибельным путем. Кроме того,
некоторые пермеазы способны осуществлять и прямой, и обратный процесс, т. е. им-
порт и экспорт субстратов. Наконец, у пермеаз наблюдаются такие «ферментные»
свойства, как субстратное насыщение, конкурентное ингибирование и аллостериче-
ская регуляция.

Пермеазы могут переносить субстраты по градиенту концентрации или против
него, однако в обоих случаях на это тратятся собственные энергетические ресурсы,
т. е. потенциальная энергия клетки преобразуется в кинетическую энергию субстра-
та.

При освобождении энергии изменяется конформация пермеазы, и субстрат про-
ходит через раскрывающийся канал или по цепочке субстратсвязывающих сайтов.
Пермеазы могут энергизироваться за счет двух разных источников энергии:

—	трансмембранного электрохимического потенциала гидрофильных ионов (см.
разделы 10.3 и 10.4);

—	химического потенциала фосфагена, т. е. растворенного вещества, которое вы-
полняет функцию посредника между процессами, идущими с поглощением энергии,
и процессами, сопровождающимися выделением энергии (см. раздел 10.2).

Энергизация пермеаз при помощи трансмембранного электрохимиче-
ского потенциала. Источником энергии для этого типа транспорта служит транс-
мембранный электрохимический потенциал гидрофильных субстратов, которые мо-
гут быть как неорганическими, так и органическими.

Если источником энергии служит собственный химический или электрохимиче-
ский потенциал субстрата, то такой активный транспорт называется унипортом.

Источником энергии может быть также электрохимический потенциал неорга-
нических катионов —Н+ или Na+ (соответственно, протондвижущая сила Pmf или
натрийдвижущая сила Smf', см. раздел 10.4). Поскольку пермеаза переносит суб-
страт совместно с катионами Н+ или Na+, трансмембранный электрохимический
потенциал этих катионов конвертируется в (электро)химический потенциал пита-
тельного субстрата. Перенос пары катион-субстрат в одном направлении называется
симпортом, а в противоположных направлениях — антипортом.

Наконец, источником энергии для транспорта одного питательного субстрата мо-
жет быть электрохимический потенциал другого питательного субстрата. В процессе
активного транспорта электрохимические потенциалы этих субстратов взаимно кон-
вертируются. Такая транспортная система представляет собой субстрат-субстрат-
ный антипорт.

Энергизация пермеаз при помощи фосфагена. В данном случае источ-
ником энергии для активного транспорта может быть гидролиз АТФ или другого
фосфагена (см. ниже). При активном транспорте химический потенциал фосфагена
конвертируется в химический или электрохимический потенциал транспортируемо-
го субстрата.

Чаще всего при таком виде активного транспорта используется энергия гидро-
лиза АТФ. Пермеазы, осуществляющие этот процесс, называются АВС-пермеазами
(см. ниже).

В более редких случаях для транспорта используется энергия гидролиза более
специфичного фосфагена — фосфоэнолпирувата. Данный процесс связан с последо-
вательным фосфорилированием белковых субъединиц переносчика, или транслока-
зы и завершается фосфорилированием самого субстрата. Поэтому такая система
называется переносом фосфорильной группы, или просто «переносом группы».

Рассмотрим перечисленные транспортные системы по отдельности. При этом мы
будем учитывать, что некоторые типы пермеаз участвуют не только в трофическом
транспорте, но и в других видах транспорта (см. выше). В частности, при помо-
щи ABC-пермеаз бактерии секретируют экзоферменты, пептиды, капсульные поли-
сахариды и Nod-факторы, а также экскретируют антибактериальные препараты,
например антибиотики или катионы тяжелых металлов.

Системы диффузионного транспорта (рис. 64, А). Самой распространен-
ной транспортной системой, через которую осуществляется пассивная диффузия,
является водный канал — аквапорин AqpZ. Он наиболее изучен на примере Е. coli.

Этот белок входит в большое и гетерогенное суперсемейство трансмембранных
каналов, или главных интегральных белков (англ, major intrinsic protein, MIP), ко-
торые существуют у представителей всех трех глобальных доменов. Он имеет мо-
лекулярную массу 23 кДа и состоит из шести трансмембранных си-спиралей; две
субъединицы объединяются в гомодимер. Аквапорин играет важную роль в осморе-
гуляции. Индукция его транскрипции обеспечивает быстрое поступление или быст-
рый выход воды в ответ на резкое изменение осмомолярности окружающей среды.
Именно поэтому аквапорины особенно важны для свободноживущих бактерий и ар-
хей; неслучайно они отсутствуют у внутриклеточных патогенов, например Chlamy-
dia trachomatis, Rickettsia prowazekii и Treponema pallidum.

Примером транспортной системы, служащей для облегченной диффузии, явля-
ется глицериновый фасилитатор GlpF, который имеется у Е. coli. Он избирательно
пропускает внутрь клетки глицерин, однако непроницаем для воды.

Унипортеры. Как уже указывалось, при унипорте активный транспорт осу-
ществляется по градиенту электрохимического потенциала субстрата. Благодаря
этому экспортируются накопленные в цитоплазме заряженные молекулы, которые
не способны диффундировать через мембрану и поэтому нуждаются в пермеазе.
Прокариотные унипортеры очень слабо изучены; возможно, что именно таким пу-
тем экспортируются нуклеотиды.
Однокомпонентные Pmf (5т/)-зависимые симпортеры и антипортеры
(рис. 64, Б). Транслоказы данного типа представляют собой гидрофобные белки,
которые используют хемиосмотическую энергию, т. е. электрохимический потенциал
катионов Н+ или Na+.

Некоторые из них обладают обратимым действием (например, лактатпермеаза,
в зависимости от того, какой градиент преобладает — градиент Н+ или градиент
анионов лактата) и поэтому могут использоваться как для импорта субстрата, так
и для его экспорта.

Pmf (5'тп/)-зависимые импортеры сахаров и аминокислот исключительно широ-
ко распространены и встречаются у представителей всех трех доменов глобального
древа. Их молекулярная масса 40-70 кДа, и они состоят из двенадцати трансмем-
бранных а-спиралей (рис. 65).

В частности, у Е. coli имеются Независимые импортеры арабинозы (АгаЕ), га-
лактозы (GalP), ксилозы (Ху1Е), лактозы (LacY), рамнозы (RhaT) и фукозы (FucP),
а также Ха+-зависимый импортер мелибиозы (Ме1В).

Многие бактерии используют Pmf (5т/)-зависимые импортеры аланина и глици-
на (AGCS), алифатических аминокислот с разветвленной цепью — валина, изолей-
цина и лейцина (LIVCS), глутамата (GltS), а также ароматических гидроксиамино-
кислот — тирозина, треонина и триптофана (НААР).

В отличие от Pmf (5т/)-зависимых симпортеров, которые осуществляют импорт,
Pmf(Smf)-зависимые антипортеры вовлечены в экспорт. В качестве примера мож-
но привести Независимый антипортер RhtB (от англ, resistance to homoserine and
threonine), обеспечивающий у E. coli и других грамотрицательных бактерий экс-
порт гомосерина, который в форме 7-лактона выполняет роль автоиндуктора, или
феромона.

Pmf(5т/)-зависимые симпортеры, использующие связывающий бе-
лок (рис. 64, В). Как уже указывалось, пермеазы растворимых субстратов обра-
зованы полипептидной цепью из двенадцати трансмембранных о-спиралей и не со-
держат вспомогательных субъединиц.

Единственное исключение — это семейство тройственных АТФ-независимых
периплазматических транспортеров (англ. tripartite-ATP-independent periplasmic
transporter, TRAP-T). Они обнаружены у некоторых бактерий, а также у неко-
торых архей. Характерным примером служит DctPQM — Независимый симпор-
тер С4-дикарбоксилатов, в частности, сукцината и глутамата, который имеет-
ся у Rhodobacter capsulatus (класс «Alphaproteobacteria»). В отличие от обычных
мономерных Pmf (5,т/)-зависимых пермеаз он представляет собой гетеротример,
состоящий из негомологичных субъединиц DctMQP (отсюда и происходит на-
звание «тройственный»). Субъединица DctM — это типичный 12-доменный инте-
гральный переносчик, субъединица DctQ — это четырехдоменный интегральный бе-
лок, а субъединица DctP — это периплазматический субстратсвязывающий белок
(англ, binding protein, ВР). Иногда субъединицы М и Q слиты в один 16-доменный
белок.

Функциональная роль TRAP-T окончательно еще не выяснена. У Е. coli эта
пермеаза, скорее всего, импортирует пентозы.

Активный транспорт путем обмена анионов. В данном случае импорт эк-
зогенного субстрата осуществляется за счет электрохимического градиента эндоген-
ного субстрата.

Например, Е. coli содержит транспортеры DcuA и DcuB (от англ, dicarboxylate
uptake), которые попарно в любых комбинациях антипортируют аспартат, малат,
фумарат и сукцинат.

В ряде случаев с помощью субстрат-субстратных импортеров достигается
«неправильный» результат, а именно — создается трансмембранный электрохимиче-
ский потенциал катионов Н+ (по Митчелу, за счет использования этого потенциала
транспортируются субстраты, а здесь наоборот).

Механизм действия таких транслокаторов будет подробно рассмотрен в разделе
10.4.9. В данном случае мы ограничимся примером Ох1Т —оксалат/формиатного
антипортера Oxalobacter formigenes (класс «Betaproteobacteria»}. «Ведущим» суб-
стратом здесь является формиат, а «ведомым» —оксалат.

После проникновения в клетку оксалат декарбоксилируется в формиат. Из-за
того, что равновесие этой реакции сильно смещено в сторону образования формиа-
та, внутриклеточная концентрация последнего на три порядка превышает внутри-
клеточную концентрацию оксалата, т. е. создается направленный наружу градиент
формиата, за счет потенциальной энергии которого в клетку поступает оксалат.

Другими примерами антипортера анионов являются белок UhpT (от англ, uptake
hexose phosphate transporter) и аналогичные ему транспортеры, которые преиму-
щественно обменивают однозарядные органофосфатные анионы на однозарядный
минеральный анион НгРО^-

Такие пермеазы можно рассматривать в качестве систем «третичного» транс-
порта, поскольку они обменивают экзогенный фосфорилированный субстрат на эн-
догенный ортофосфат. Последний предварительно аккумулируется с помощью вто-
ричного Н+-зависимого симпортера Pit (от англ, inorganic phosphate transporter).

Рис. 65. Pmf (Smf )-зависимый импортер сахаров.

Цифрами I—XII обозначены интегральные спирали.

Транспортеры данного типа состоят из двенадцати трансмембранных a-спира-
лей, и в этом отношении они напоминают Pmf (5т/)-зависимые импортеры сахаров
и аминокислот (см. рис. 65).

Индуцибельная система обмена анионов может импортировать разнообразные
фосфорорганические соединения — фосфаты пентоз и гексоз, а также аминопро-
изводные и спиртовые производные сахаров. Обычно эти субстраты вначале де-
фосфорилируются экстрацитоплазматическими фосфатазами, затем импортируют-
ся Pmf (5т/)-зависимыми пермеазами, а уже после этого вновь фосфорилируют-
ся цитоплазматическими киназами. Система обмена анионов «коротко шунтирует»
этот путь и доставляет такие соединения в цитоплазму в неизменном виде, что вы-
годно в энергетическом отношении.

Е. coli и ряд других энтеробактерий имеют две системы обмена анионов — транс-
портер глюкозо-б-фосфата UhpT и транспортер глицерол-3-фосфата GlpT (оба суб-
страта высвобождаются при обновлении клеток кишечного эпителия).

ABC-пермеазы (рис. 64, Г). Мембранные переносчики этого типа являются
одной из наиболее распространенных транспортных систем. Они имеются у про-
кариотов и эукариотов и раздельно обеспечивают активный импорт или активный
экспорт. Примеры ABC-пермеаз, которые совмещали бы обе эти функции, неиз-
вестны.

О значении ABC-пермеаз для прокариотной клетки говорит такой факт — около
2% информационной емкости генома Е. coli отведено генам, кодирующим 80 ва-
риантов данных переносчиков. В случае трофического транспорта АВС-пермеазы
характеризуются высоким сродством к аминокислотам, витаминам, минеральным
ионам, олигопептидам, сахарам и т. д. и создают высокие концентрационные гради-
енты этих субстратов (до пяти порядков).

АВС-пермеазы высококонсервативны и независимо от природы субстрата имеют
стандартную структуру. Они состоят из нескольких мембранных белков и раствори-
мого периплазматического белка-переносчика, который теряется при осмотическом
шоке. Поэтому их второе название — «осмочувствительные периплазматические пер-
меазы».

При действии ABC-пермеаз субстрат реагирует с растворимым субстратсвязы-
вающим белком-переносчиком, содержание которого в периплазме очень велико, и в
таком виде презентируется мембранному компоненту АВС-пермеазы. Последний со-
стоит из двух гидрофобных доменов (по шесть трансмембранных спиралей каждый)
и двух периферических доменов, обладающих АТФазной активностью. В некоторых
случаях АТФ-связывающие домены слиты в один белок, примером чего является
транспортер рибозы Е. coli.

Из-за присутствия в периферическом домене консервативной последовательно-
сти, так называемой АТФ-связывающей кассеты (англ. ATP-binding cassette), эти
транспортеры получили название АВС-пермеаз.

Субстратсвязывающие белки взаимно гетеро логичны, и их молекулярная масса
варьирует в пределах 25-60 кДа.

У грамположительных бактерий и архей, которые не имеют периплазматическо-
го пространства, субстратсвязывающий белок зафиксирован на наружной поверх-
ности СМ.

Сигнал от комплекса субстрат-переносчик передается через трансмембранные
субъединицы на АТФазные субъединицы, что увеличивает их сродство к АТФ. При
взаимодействии с мембранными субъединицами субстрат диссоциирует от связы-
вающего белка. В результате связывания и гидролиза АТФ открывается пора, че-
рез которую субстрат поступает в цитоплазму. Освобожденная энергия релаксирует
комплекс, подготавливая его для очередного цикла.

Характерным примером трофических ABC-транспортеров является гистидин-
пермеаза Salmonella typhimurium. Она состоит из периплазматического связываю-
щего белка HisJ, интегральных субъединиц HisM и HisQ, а также двух АТФ-связы-
вающих периферических субъединиц HisP. Другим примером является транспортер
мальтозы MalEFGK2, в состав которого входит связывающий белок Ма1Е, трансмем-
бранный канал из субъединиц MalF и MalG, а также две АТФазные субъединицы
Ма1К.

Система переноса группы (рис. 64, Д). Единственным примером транспор-
тера данного типа является фосфоэнолпируват-зависимая система транспорта уг-
леводов (англ, phosphoenol pyruvate:sugar phosphotranspherase system, PTS). Судя
по всему, она довольно поздно появилась в ходе эволюции бактерий и имеется в
основном у мезофилов —в частности, она отсутствует у архаичных гипертермофи-
лов Aquifex aeolicus и Thermotoga maritima. Гены фосфотрансферазной системы не
найдены ни в одном из секвенированных геномов архей. Эукариоты этой системой
также не обладают.

С помощью PTS-системы бактерии активно транспортируют моносахариды, ди-
сахариды и многоатомные спирты — глюкозу, лактозу, маннитол, маннозу, сахарозу,
сорбозу, фруктозу, целлобиозу и др.

PTS-система использует свободную энергию интермедиата гликолиза — фосфо-
энолпирувата:

(фосфоэнолпируват\п + (углевод)01Н -» (пируват)^ + (углевод-Р)^,

где in и out — соответственно цитоплазматический и экстрацитоплазматический
компартменты; Р —фосфатная группа.

Данный транспортный процесс исключительно выгоден, поскольку углевод кон-
центрируется в уже фосфорилированном виде и может включаться в биосинтетиче-
ские процессы без дополнительных энергетических затрат.

В состав PTS-системы Е. coli входят:

—	генеральная фосфотрансферазная система, состоящая из цитоплазматических
ферментов EI и НРг;

—	специфичный транспортер, или фермент ЕП, состоящий из периферических
доменов A/В и интегрального домена С (или интегральных доменов C/D).

Фермент EI представляет собой гомодимерный белок (субъединица 65-85 кДа;
ген ptsl). С помощью фосфоэнолпирувата он автофосфорилируется по остатку His-
189.

Фермент НРг (от англ, histidine protein) представляет собой мономерный термо-
стабильный белок (9-10 кДа; ген ptsH). С помощью фермента EI он фосфорилиру-
ется по остатку His-15.

Фермент ЕП существует в нескольких вариантах. Это может быть трехдомен-
ный белок АВС молекулярной массой 65 кДа с сайтами фосфорилирования Cys-384
и His-554 (транспортер маннитола), комплекс из однодоменного белка ЕП-А и двух-
доменного белка ЕП-ВС (транспортер глюкозы), а также комплекс двухдоменного
белка ЕП-АВ с двумя однодоменными белками ЕП-С и EII-D (транспортер манно-
зы).

Интегральный домен С содержит шесть трансмембранных спиралей, а в случае
транспортера маннозы расщеплен на белки С и D, по три спирали каждый. Он
содержит два сайта связывания субстрата (экстрацитоплазматический и цитоплаз-
матический) и служит каналом для его транспортировки. Периферические домены
содержат соответственно первый и второй гистидиновые сайты фосфорилирования.
Фосфорилирование играет двойственную роль в функционировании фермента
ЕП. Во-первых, этим обеспечивается энергия для перемещения сахара через СМ. Во-
вторых, фосфорилированый субстрат имеет очень низкое сродство к транслоказе и
высвобождается в цитоплазму.

9.1.2.	Транспорт через наружную мембрану

Диффузия. Поскольку в ОМ имеются водные поры, или порины она не может
поддерживать на себе электрохимические градиенты катионов Н+ или Na+. Транс-
портные процессы на уровне этой мембраны ограничиваются пассивной диффузией
или облегченной диффузией.

При пассивной диффузии субстрат попадает в периплазматический компартмент
через порины «общего назначения» (англ, general porin; см. I том учебника). Через
их отверстия проходят гидрофильные молекулы не крупнее 600 Да. Однако даже эти
порины проявляют определенную избирательность в отношении транспортируемого
субстрата. Например, Е. coli имеет два порина общего назначения — OmpF и ОтрС
(от англ, outer membrane protein). Они преимущественно пропускают катионы.

При облегченной диффузии субстрат поступает в периплазматический компарт-
мент через «специализированные» порины (англ, specific porin). В данном случае
помимо радиуса отверстия порина важен знак заряда субстрата, и отдельно суще-
ствуют порины для катионов и порины для анионов. Специализированные порины
содержат сайты, связывающие специфические лиганды. Например, порин PhoE про-
являет предпочтение в отношении анионов, в частности неорганического фосфата и
фосфорорганических соединений. Установлено, что такая селективность обеспечи-
вается протонированным радикалом аминокислотного остатка Lys, который высту-
пает в просвет канала порина.

Активный транспорт. Примером активного транспорта на уровне ОМ явля-
ется импорт железа.

Неорганические ионы доставляются в цитоплазматический компартмент специ-
фическими переносчиками. Как правило, клетка имеет сразу несколько таких си-
стем. Они различаются по характеру экспрессии и сродству, или аффинитету к суб-
страту. Конститутивные системы обладают малым аффинитетом и действуют лишь
при значительной концентрации ионов во внешней среде. Индуцибельные системы
обладают высоким аффинитетом и экспрессируются только когда ион находится в
дефиците (особенно если голодание по нему вызывает метаболический стресс).

В бактериальной клетке содержатся 105—106 катионов железа, хотя в некоторых
случаях они накапливаются до 2% сухого веса. При нейтральном pH растворимость
Fe3+ в окружающей среде составляет не свыше 10-18 М (6 • 106 ионов -л"1), т. е. его
количество в свободной форме слишком мало, чтобы обеспечить развитие популя-
ций, плотность которых может достигать 108 —1012 клеток -л-1. Чтобы преодолеть
гигантский разрыв между внутриклеточным и внеклеточным пулами железа, бак-
териям приходится жестко конкурировать друг с другом.

Для этого они могут использовать целых три стратегии:

—	снижение pH окружающей среды, в результате чего повышается раствори-
мость катиона Fe3+;

—	восстановление слаборастворимого катиона Fe3+ в хорошо растворимый кати-
он Fe2+;

—	секреция хелаторов Fe3+, или сидерофоров.
R,\ R1\

C=O	C=O-X|_X

Зх |	+Fe3+—► | Fe(III)

N-O'	N-O”/|'X

R2	R2

гидроксаматы

.О

°x\

С (CHJj NH

CH2	N	^CH

/	H3C-(/ XO" (СН2)з\

NH	O-NZ	C = O

( О О=К I

O=c H3C\ // o’ CH3 NH

\ X /

CH2	(CH2)3“CH

^NH

^C^ch^NH XXO
О t
феррихром

3 x

XCOO’

R1 \ / °' \ I /

C	Fe(ni)

r2 x coo- x |

OOC- CH2 \	O’

c

OOC-CHj^ XCOO"

Ri X / °
c

a - гидроксикарбоксилаты

цитрат

Рис. 66. Главные типы сидерофоров (с примерами).
Чаще всего бактерии пускают в ход последнюю стратегию.

Сидерофоры (греч. sideros — железо и phora —ноша) представляют собой желе-
зоспецифичные лиганды молекулярной массой 500-1000 Да, которые образуют с
железом комплексы, окрашенные в красный цвет. Биосинтез сидерофоров регули-
руется минеральным железом; они выделяются клеткой в условиях лимитирования
железом; в хелатном комплексе с ними Fe3+ специфически рецептируется и достав-
ляется в цитоплазму.

Сидерофоры обладают исключительно высоким аффинитетом по отношению к
катионам Fe3+ — константа образования хелатного комплекса составляет 1023 —1049.
Концентрация выделенных клеткой сидерофоров может быть очень значительной
(до 0,2 г-л-1).

В настоящее время выявлены свыше 500 сидерофоров, в основном бактериально-
го происхождения. Известны сидерофоры грибов и однодольных растений. У архей
сидерофоры пока еще не обнаружены.

Сидерофоры имеются у всех аэробных и факультативно анаэробных бактерий,
однако у строгих анаэробов и аэротолерантных молочнокислых бактерий они отсут-
ствуют.

Молекулярными предшественниками при биосинтезе бактериальных сидерофо-
ров являются обычные аминокислоты (которые связываются в полипептидную цепь
с помощью нерибосомных пептидсинтетаз), а также дигидроксибензоат, И-ацил-М-
гидроксиорнитин и цитрат.

По химическому строению сидерофоры относятся к гидроксаматам, катехолам
или а-гидроксикарбоксилатам (рис. 66). Гены биосинтеза и экспорта сидерофоров
организованы в хромосомные опероны и используют промоторы, которые находят-
ся под контролем глобального регулятора железного гомеостаза Fur (от англ, ferric
uptake regulator). В частности, для получения сидерофора энтеробактина требуются
продукты хромосомных генов ent АВС (синтезируют из хоризмата предшественник
энтеробактина 2,3-дигидроксибензоат) и генов entDEFG (образуют этот сидерофор
из трех молекул 2,3-дигидроксибензоата и одной молекулы L-серина). В других слу-
чаях — примером может служить гидроксаматный аэробактин Е. coli — оперон си-
дерофора содержится в плазмиде Col V.

Наиболее известными представителями вышеуказанных групп сидерофоров слу-
жат соответственно феррихром, энтеробактин и цитрат; во всех случаях железо
находится в центре шести лучевой звезды, образованной тремя парами лигандов.

Бактерии, обладающие грамотрицательным строением, и бактерии с грамполо-
жительным строением используют разные способы доставки хелатного комплекса
железа с сидерофором в цитоплазму.

Поскольку диаметр пор в ОМ грамотрицательных бактерий составляет 600 Да,
имеющий более крупный размер хелатный комплекс вначале взаимодействует с
мембранным рецептором. Затем с помощью эндергонического процесса, в котором
участвует система субъединиц TonB-ExbB-ExbD, комплекс проникает в периплазма-
тический компартмент, где связывается белком-переносчиком. Тот, в свою очередь,
передает хелатный комплекс ABC-транспортеру, расположенному в СМ. Последний
переносит железо в цитоплазму (рис. 67).

Грамположительные бактерии лишены ОМ, и при отсутствии системы TonB-
ExbB-ExbD хелатный комплекс доставляется к ABC-транспортеру с помощью со-
держащегося в СМ липопротеинового рецептора.

Ton-зависимые рецепторы IROMP (от англ, iron-regulated outer membrane pro-
ом

А

СМ

Рис. 67. Импорт железа у грамотрицательных (А) и грамположительных (Б) бакте-
рий (по: Andrews et al., 2003).

ABC — цитоплазматическая субъединица АВС-пермеазы; РВР — периплазматический
связывающий белок; МВР — мембранный связывающий белок; ТопВ, ЕхЬВ и ExbD —
субъединицы межмембранного молекулярного проводника энергии.

tein) содержатся в ОМ и представляют собой специфические пермеазы, которые
индуцируются при железном голодании и обладают высоким аффинитетом по от-
ношению к хелатному комплексу железа с сидерофором. Они имеют сходную струк-
туру с поринами (см. I том учебника). Интегральный С-концевой домен размером
35 х 47 х 70 А образован двадцатью двумя антипараллельными /5-цепями, которые
соединены одиннадцатью длинными экзоплазматическими петлями и десятью ко-
роткими периплазматическими шпильками. N-концевой домен размером около 160
аминокислотных остатков образует гибкую петлю, состоящую из четырех /5-цепей,
чередующихся с короткими си-спиралями. Она играет роль «пробки» и запирает
внутренний канал рецептора диаметром ~4 нм. В отличие от поринов общего на-
значения, пассивно фильтрующих гидрофильные молекулы, Ton-зависимые рецеп-
торы действуют так же, как раскрывающиеся порины, которые энергизируются с
помощью СМ.

Поскольку ОМ свободно проницаема для протонов, она не может самостоятель-
но сопрягать экзергонические и эндергонические процессы. Для того, чтобы перене-
сти через нее хелатный комплекс, необходимо затратить часть энергии протонного
градиента; при этом роль молекулярного проводника энергии выполняет система
TonB-ExbB-ExbD.

Белок ТопВ состоит из 239 аминокислотных остатков. N-концевой домен заяко-
ривает его в СМ. Содержащий пролиновые повторы средний гидрофильный домен
расположен в периплазматическом компартменте. С-концевой домен взаимодейству-
ет с так называемым «ТопВ-боксом», или консервативным гидрофобным доменом
из семи аминокислотных остатков, который расположен на N-конце Топ-зависимого
рецептора ОМ. N-концевой домен белка ЕхЬВ обращен в сторону периплазмати-
ческого компартмента, а белок ExbD заякорен своим N-концевым доменом в СМ.
Стехиометрическое соотношение субъединиц TonB-ExbB-ExbD составляет 1:7:2.

Хотя механизм действия системы TonB-ExbB-ExbD точно не установлен, есть
предположение, что белок ТопВ тесно взаимодействует с комплексом ExbB/ExbD.
При связывании хелатного комплекса с рецептором ОМ последний изменяет свою
конформацию, и через ТопВ-боксы сигнал передается белку ТопВ, а уже от него —
комплексу ExbB/ExbD. Затем в ход вступает петля обратной связи, и хемиосмо-
тический потенциал преобразуется в конформационное изменение белка ТопВ. При
этом С-концевой домен белка ТопВ открывает пробку рецептора, в результате чего
хелатный комплекс проникает в периплазматический компартмент.

Большинство бактерий обладает параллельными системами, каждая из которых
импортирует отдельный хелатный комплекс железа с сидерофором, распознаваемый
своим рецептором. Например, Е. coli штамм К-12 содержит не менее шести рецепто-
ров для импорта восьми хелатных комплексов. Помимо использования собственных
сидерофоров, энтеробактина и цитрата, эта бактерия способна «похищать» сидеро-
форы своих партнеров по экосистеме — феррихром, копроген, родоторуловую кис-
лоту и ферриоксамин.

Чаще всего для импорта железа Е. coli использует три сидерофора — феррихром,
энтеробактин и цитрат. У каждого из них имеется свой собственный рецептор (со-
ответственно, FhuA, FepA и FecA). Они передают хелатные комплексы специализи-
рованным периплазматическим переносчикам, соответственно FhuD, FepB и FecB.
Доставка феррихрома, Ге3+-энтеробактина и Ре3+-цитрата через СМ осуществля-
ется при помощи специализированных ABC-транспортеров, соответственно FhuBC,
FepDGC и FepCDE.

Периплазматический белок-переносчик единовременно переносит только одну
молекулу хелатного комплекса и действует в качестве челнока, с помощью которого
высвободившийся в периплазматический компартмент хелатный комплекс переда-
ется АВС-транспортеру.

В состав ABC-транспортера входят два интегральных пермеазных модуля (2 х
FhuB, FepDG или FepDE) и два периферических АВС-модуля (2 х FepC). В отличие
от Ton-зависимых рецепторов в составе ОМ, ABC-пермеаза менее специфична — на
шесть вариантов рецептора в случае Е. coli приходятся только три варианта транс-
портера. Доставленный в цитоплазму хелатный комплекс диссоциирует в результате
восстановительной реакции Fe3+ + е_ —> Fe2+. Это происходит потому, что сиде-
рофор характеризуется относительно низким сродством к закисному железу. Суще-
ствуют несколько флавин- или ферредоксинзависимых бактериальных ферментов,
обладающих Ре3+-редуктазной активностью.

Особый интерес представляет импорт железа у патогенных бактерий.

Все живые организмы поддерживают содержание свободного железа в цитоплазме и внеклеточ-
ных структурах на крайне низком уровне, чтобы максимально ограничить участие этого металла в
образовании свободных радикалов, повреждающих биомолекулы. В то же время железо является
одним из важнейших микроэлементов и служит компонентом простетических групп многих фер-
ментов, поэтому оно требуется клеткам в довольно большом количестве. Например, в организме
взрослого человека до 3-5 г железа — главным образом в связанной форме. Основная часть внут-
риклеточного железа входит в состав железосвязывающих белков (ферритина, гемосидерина, ге-
ма и гемоглобина). Железо, присутствующее в сыворотке крови млекопитающих, преимуществен-
но связывается гликопротеинами —лактоферрином и трансферрином. Незначительное количество
выделяющегося в сыворотку гемоглобина незамедлительно вступает в комплекс с гаптоглобином
и гемопексином.

Таким образом, несмотря на довольно большой запас железа в организме хозяина, оно суще-
ствует в недоступной бактериям форме (в сыворотке крови здорового человека среднего возраста
концентрация свободного железа составляет всего 10-18М). В острой фазе инфекционного про-
цесса концентрация железа в сыворотке значительно снижается. От действия иммунной системы
часть бактерий погибает, и в кровь высвобождается эндотоксин. Под его влиянием клетки иммун-
ной системы синтезируют цитокины, в частности интерлейкин-1 и а-фактор некроза опухолей. В
результате этого в сыворотке повышается концентрация трансферрина, что приводит к связыва-
нию дополнительного количества железа. Сходный процесс протекает в очаге воспаления, где при
дегрануляции лейкоцитов выделяется апо лактоферрин. Лактоферрин-зависимое лимитирование
бактериальных клеток железом происходит и в фагосомах лейкоцитов.

Следовательно, патогенные бактерии развиваются в организме хозяина в условиях острого ли-
митирования железом. Для того, чтобы инфекционный процесс оказался успешным, они должны
эффективно извлекать железо из внеклеточной среды. Паразит и хозяин начинают остро конкури-
ровать за данный микроэлемент, что позволяет рассматривать бактериальные системы связывания
и импорта железа как самостоятельный фактор вирулентности.

Можно обозначить три стратегии железного питания патогенных бактерий в организме хозя-
ина.

Первая стратегия — это биосинтез и выделение в среду сидерофоров. Патогены преодолевают
лимитирование железом, используя сидерофоры, которые конкурируют с железосвязывающими
белками хозяина. Это очень распространенная стратегия питания железом, как пример можно
привести сидерофоры микобактерий — микобактины и экзохелины. В состав микобактинов входит
остаток салицилата. В зависимости от длины алкильного заместителя микобактины относят к двум
типам с разной полярностью и, следовательно, разной растворимостью в воде. Менее полярные ми-
кобактины, или собственно микобактины ассоциированы с клеточной стенкой, в то время как более
полярные карбоксимикобактины секретируются во внеклеточную среду. Экзохелины представляют
собой олигопептиды и встречаются только у непатогенных микобактерий. Эти соединения синте-
зируются нерибосомным путем с помощью пептидсинтетаз. Некоторые патогенные бактерии не
образуют специфических сидерофоров, и переносчиком железа у них служит цитрат.

Вторая стратегия — это извлечение железа непосредственно из хозяйских железосвязывающих
белков без использования сидерофоров. Например, представители рода Neisseria (возбудители го-
норреи и менингита) способны заимствовать железо из комплекса с лактоферрином и трансферри-
ном. Для этой цели в ОМ существуют индуцибельные рецепторы для связывания лактоферрина и
трансферрина — LfR и TfR. Железосвязывающие белки не проникают в бактериальную клетку, и
оно высвобождается на ее поверхности. Затем его транспорт осуществляется с помощью системы
TonB-ExbB-ExbD, периплазматических связывающих белков и АВС-пермеаз.

Примером бактерии, для которой доступны разные ресурсы железа, служит Haemophilus in-
fluenzae (возбудитель хронических респираторных инфекций), которая извлекает его из гемогло-
бина, а также из комплексов гемоглобин-гаптоглобин, гем-гемопексин и гем-альбумин.

Третья стратегия —это образование гемолизинов. Способность синтезировать и секретировать
в среду протеазы и гемолизины наделяет бактерии гемолитическими свойствами. Типичным пред-
ставителем гемолизинов является а-гемолизин Е. coli. Этот пептид образует поры в СМ эукари-
отных клеток, что приводит к их лизису. С помощью гемолизинов бактерии-гемолитики получают
доступ к запасам гема и гемоглобина в эритроцитах. Данная стратегия очень эффективна, и ее
используют многие патогенные бактерии, поскольку основной пул железа в организме млекопита-
ющих ассоциирован именно с гемом. Бактерия непосредственно поглощает освободившийся гем, а
также может утилизировать его в комлексе с хозяйскими белками, например гемопексином. После
связывания гема или гем-белкового комплекса с Ton-зависимыми рецепторами ОМ свободный гем
доставляется в периплазматический компартмент, а затем без помощи периплазматических связы-
вающих белков транслоцируется АВС-пермеазой через СМ. В цитоплазматическом компартменте
гем разрушается гемоксигеназой, что приводит к высвобождению железа.

9.2. МЕТАБОЛИЗМ

Термин «метаболизм» относится в биологии к разряду базовых. По частоте встре-
чаемости он мог бы поспорить с такими терминами, как «клетка», «фермент» и
«вид».

Обычно указывают, что этот термин впервые ввел в 1878 г. кембриджский про-
фессор Майкл Фостер (М. Foster) в своей книге «А Text-Book of Physiology». Однако
на самом деле Фостер образовал существительное «метаболизм» (англ, metabolism)
от прилагательного «метаболический» (англ, metabolic). В свою очередь, немец-
кий прототип (metabolisch) этого прилагательного использовал еще в 1839 г. Теодор
Шванн (Т. Schwann) в своей книге «Mirkoskopische Untersuchungen fiber die Ueberein-
stimmung in der Struktur und dem Wachstum der Tiere und Pflanzen». Таким образом,
авторство термина «метаболизм» на самом деле принадлежит Шванну.

Греческое слово «метаболизм» (metabole) буквально означает «изменение».
В естествознании для обозначения изменения существует еще один термин — «ме-
таморфоз» (греч. metamorphosis —превращение). В 1842 г. Юстус фон Либих
(J. von Liebig) употребил его в немецком варианте (Metamorphose) в своей книге
«Die organische Chemie in ihrer Anwendung auf Physiologic und Pathologic» именно
для обозначения метаболизма. Однако в настоящее время термин «метаморфоз»
используется не в метаболическом, а в онтогенетическом контексте.

В связи с семантикой термина «метаболизм» упомянем и такой общеизвестный
термин, как «обмен веществ» (нем. Stoffwechsel). Его предложил еще в 1815 г. немец-
кий химик Георг Зигварт (G. С. L. Sigwart). Как и многие другие биологические тер-
мины, пришедшие в русский научный лексикон из классического немецкого есте-
ствознания, термин «обмен веществ» используется до настоящего времени в каче-
стве синонима термина «метаболизм».

Однако метаболизм связан не только с превращениями вещества, но и с превра-
щениями энергии.

Метаболизм — это совокупность клеточных процессов превращения энергии и
субстратов.

Кроме того, метаболизм не является обменом, т. е. пространственным перерас-
пределением вещества. Если на то пошло, «обменом веществ» следовало бы назвать
транспорт, который обычно не связан с превращением перераспределяемого суб-
страта.

Транспорт, включающий в себя поступление вещества из окружающей среды в
клетку (импорт) и перемещение вещества во внеклеточное пространство (экспорт),
не входит составной частью в метаболизм, а только является его предпосылкой и
последствием.

Энергетический метаболизм. Энергетический метаболизм связан с двумя
способами ассимиляции энергии — в форме трансмембранного электрохимического
потенциала при помощи мембранных электрогенераторов и в форме макроэргиче-
ских соединений при помощи цитозольных редокс-ферментов и киназ (см. главу
10).

К сфере энергетического метаболизма еще относится расходование ассимилиро-
ванной энергии в конструктивном метаболизме, мембранном транспорте и двига-
тельных актах, а также в регуляторных процессах.

Конструктивный метаболизм. В отличие от энергетического метаболизма
конструктивный метаболизм представляет собой совокупность реакций биосинтеза и
биодеградации внутриклеточных, импортируемых и экспортируемых органических
молекул.

Когда биосинтез и биодеградация затрагивают незаменимые компоненты клет-
ки — мембранные компартменты, генетические структуры, аппарат трансляции,
транспортные и регуляторные системы —речь идет об обновлении (англ, turnover).

Генеральный метаболизм и специализированный метаболизм. Биосин-
тетическую составляющую конструктивного метаболизма можно подразделить на
первичный метаболизм (англ, primary metabolism) и вторичный метаболизм (англ,
secondary metabolism). В последнее время для обозначения этих процессов начина-
ют использовать более точные термины — «генеральный метаболизм» (англ, general
metabolism) и «специализированный метаболизм» (англ, specialized metabolism).

Генеральный метаболизм — это биосинтез мономеров из стандартных предше-
ственников и биосинтез полимеров из этих мономеров; он необходим для роста и
размножения клеток.

Гены ферментов генерального метаболизма конститутивно экспрессируются в
трофофазе (англ, trophophase; от греч. trophe — питаюсь и phasis — положение), т. е.
по ходу роста и размножения клеток.

К числу генеральных метаболитов, или трофолитов (англ, tropholyte) относятся
нуклеотиды, аминокислоты, моносахариды (пентозы и гексозы), а также важнейшие
интермедиаты метаболических путей — например, пируват и ацетил-СоА.

Специализированный метаболизм — это биосинтез из стандартных предше-
ственников низкомолекулярных нестандартных соединений (до 1,5 кДа), которые
в основном играют роль экзогенных регуляторов; он не является необходимым
условием роста и размножения клеток.

Гены ферментов специализированного метаболизма экспрессируются в идиофазе
(англ, idiophase; от греч. idios — особенный и phasis — положение), т. е. при остановке
роста и размножения клеток.

К числу специализированных метаболитов относятся, в частности, антибиотики
и феромоны.

Специализированные метаболиты, или идиолиты (англ, idiolyte) характеризуют-
ся следующими особенностями:

—	они не нужны для роста;

—	их распространение не универсально и иногда даже видоспецифично;

—	для них характерно большое разнообразие структуры (часто она уникальна),
и они проявляют биологическую активность в качестве сигнальных молекул, фак-
торов роста, ингибиторов, антибиотиков и т. д.;

—	они синтезируются из первичных метаболитов и интермедиатов стандартных
метаболических путей (например, ацетил-СоА) в цепи нестандартных реакций, ко-
торые катализируются ферментами специализированного метаболизма (англ, spe-
cialized metabolism enzymes, SEM);
— их биосинтез кодируется особыми оперонами, которые находятся под контро-
лем регуляторных систем, определяющих момент и уровень экспрессии соответству-
ющих генов.

9.2.1.	Типы метаболизма

По инициативе французского генетика Андре Львова (A.Lwoff) на биохимиче-
ском симпозиуме, проходившем в 1946 г. в Колд Спринг-Харборе (США), был при-
нят алгоритм для классифицикации разных типов питания, и на его основе разра-
ботана унифицированная физиолого-биохимическая терминология. Благодаря сво-
ей логичности и удобству для произношения, она сразу же вошла в биологическую
терминологию и без изменений сохранилась до настоящего времени.

В данной классификации используется набор терминов, составленных из смыс-
ловых приставок фото-, хемо-, авто-, гетеро-, лито- и органо- (по отдельности или по
две-три) с прибавлением стандартного окончания -трофия. Таким способом можно
охарактеризовать любой тип метаболизма, указывая на альтернативный:

—	энергоноситель, который может быть электромагнитным (фототрофия) или
химическим (хемотрофия);

—	строительный материал, который может быть органическим (гетеротрофия)
или неорганическим (автотрофия);

—	донор электронов, который может быть органическим (органотрофия) или
неорганическим (литотрофия).

Живой организм, обладающий конкретным типом метаболизма, обозначается
составным термином с прибавлением окончания -троф (например, литотроф, хемо-
гетеротроф, фотолитоавтотроф).

9.2.2.	Энергоноситель

Чтобы сохранить свою структурную целостность и поддерживать свои физио-
логические процессы, прокариотная клетка постоянно испытывает потребность в
энергии. Хотя эндогенным источником энергии на ограниченное время могут стать
запасные вещества, они всегда вторичны по отношению к экзогенным энергоноси-
телям.

Зависимость прокариотов от разных форм энергии — электромагнитной, химиче-
ской, осмотической, тепловой и гравитационной — носит неоднозначный характер.

В некоторых случаях, находясь в энергетическом поле, прокариотная клетка
может испытывать на себе его воздействие только косвенно. Например, поскольку
удельный вес бактерий обычно близок к единице, они не оседают под воздействи-
ем гравитации. Если бактерия не обладает локомоторной системой, ее положение в
пространстве определяется суммарным импульсным вектором от соударений клет-
ки с молекулами раствора, находящимися в броуновом движении. В то же время
гравитация может изменять положение планктонных форм, действуя через конвек-
ционные токи. Такая энергетическая зависимость случайна и, как правило, не несет
приспособительного значения.

Гораздо чаще зависимость от внешнего источника энергии является прямой. Кон-
кретным примером служит пассивное перемещение бактерий в электрическом поле,
или электрофорез. В конечном счете, это может закончиться иммобилизацией кле-
ток на заряженной поверхности. Такая энергетическая зависимость в разных ситуа-
циях улучшает или ухудшает условия питания. Примером прямой и физиологически
целесообразной энергетической зависимости служит редко встречающаяся у бакте-
рий принудительная ориентация вдоль силовых линий магнитного поля (см. I том
учебника).

Легко заметить, что во всех отмеченных случаях внешняя энергия преобразуется
в механическую. Однако прямое использование энергии не обязательно сопровожда-
ется ее трансформацией. Типичным примером служит перенос тепловой энергии из
окружающей среды внутрь клетки, что повышает кинетическую энергию молекул
и, как следствие этого, скорость ферментативных реакций.

Наконец, живые организмы могут активно трансформировать экзогенную энер-
гию.

Трансформированная энергия (точнее, свободная энергия; см. раздел 10.1) не
обязательно ассимилируется, т. е. интегрируется в клетку, чтобы ее затем можно
было использовать для полезной работы. Характерным примером служит альтер-
нативный путь использования энергии видимого света. При фототрофии после за-
хвата антенными системами она ассимилируется благодаря трансмембранному пе-
реносу протонов электрон-транспортной цепью (см. раздел 12.1). Наряду с этим
свет вызывает конформационные изменения специализированных фоторецепторов,
что порождает каскад сигналов, регулирующих поведенческие акты, в частности
фототаксис.

Ассимиляцией энергии называется активное преобразование свободной энергии
внешних поливариантных энергоносителей в свободную энергию внутреннего уни-
фицированного энергоносителя.

Ассимилированная энергия расходуется при биосинтезах, а также при соверше-
нии осмотической, механической и иной полезной работы.

Живые клетки способны ассимилировать только две формы энергии — световую
энергию, или энергию квантов электромагнитного поля, и химическую энергию, или
энергию электронов в атомах или молекулах химических субстратов (органических
и неорганических).

Ассимиляция энергии квантов электромагнитного поля, поглощенных специа-
лизированными пигментными структурами, называется фототрофией (греч. phos —
свет и trophe — питаюсь). Когда ассимилируется энергия, освобождающаяся при эн-
зиматическом окислении субстратов, такой способ энергетического питания называ-
ется хемотрофией (греч. chemeja — химия и trophe — питаюсь).

Энергетический метаболизм, основанный на окислении неорганических субстра-
тов, носит название хемолитотрофии (греч. chemeja —химия, lithos — камень и tro-
phe— питаюсь). Если же источником энергии служит реакция окисления органиче-
ского субстрата, такой энергетический метаболизм называется хемоорганотрофией
(греч. chemeja — химия, organikos — органический и trophe — питаюсь).

Естественно, что речь идет только о свободной энергии, т. е. о части полной энер-
гии физико-химической системы, например, об энергии реагирующих веществ, ко-
торая преобразуется в ассимилированную энергию или полезную работу.
9.2.3.	Строительный материал

Структурной основой всех живых существ являются органические соединения.

Термин «органический» ввел в 1860-х годах немецкий химик Фридрих Кекуле (F. A. Kekuld von
Stradonitz) для обозначения любых соединений углерода.

В настоящее время органическими называют только такие соединения углерода, которые обла-
дают углеродным скелетом, т. е. в них между атомами углерода существует одинарная или кратная
ковалентная связь. Углеродные скелеты могут быть линейными, циклическими или смешанной
структуры. Минимальный углеродный скелет состоит из двух атомов углерода (примером служит
ацетилен С2Н2). Формально органическим соединением углерода является и карбид кальция СаСг-
В случае линейных цепей длина углеродного скелета достигает >106 атомов (природный каучук).

В свою очередь, к неорганическим соединениям углерода относятся такие, которые либо содер-
жат только один атом углерода, либо содержат несколько атомов углерода, но не имеют углеродно-
го скелета. В этом случае атомы углерода соединены не напрямую, а через атомы кислорода, азота
или серы. Примерами неорганических соединений углерода являются оксид углерода СО, диоксид
углерода СО2, бикарбонат НСО^" и карбонат СО^-, а также метан СН4, его галогенозамещен-
ные (например, хлороформ CHCI3) и кислородные производные (например, метанол СН3ОН, фор-
мальдегид НСНО и формиат НСОО-). Примерами многоуглеродных неорганических соединений
являются диметиловый эфир СН3-О-СН3, тетраметиламмоний (СНз)41М+ и ди мети л сульфоксид
CH3-SO-CH3.

В состав прокариотных клеток входят только органические соединения, т. е. мо-
лекулы с углеродным скелетом (если не принимать во внимание редкие примеры
прижизненной биоминерализации, когда в клетках образуются кристаллы кальци-
та; см. I том учебника).

Для синтеза собственных органических соединений живые существа могут ис-
пользовать готовые органические соединения углерода, неорганические соединения
углерода, а также их смесь.

В конце 1890-х годов немецкий ботаник Вильгельм Пфефер (W. Pfeffer) назвал
биосинтез органических веществ из диоксида углерода или бикарбоната автотро-
фией (греч. autos —сам и trophe — питаюсь). Субстратное питание, при котором в
конструктивных целях используются экзогенные органические молекулы, в свою
очередь, было названо гетеротрофией (греч. eteros — другой и trophe — питаюсь).

В настоящее время оба эти термина требуют уточнения. В частности, необходимо
говорить отдельно об углеродной и азотной автотрофии.

Углеродной автотрофией называется совокупность биосинтетических реак-
ций, приводящих к образованию углеродных скелетов из молекул или химических
групп, не содержащих углерод-углеродных связей.

Субстратами углеродной автотрофии служат диоксид углерода СО2, а также его
«физиологические эквиваленты» формиат НСОО- и бикарбонат НСО3 . За ними, по
возрастающей степени восстановленности, идут оксид углерода СО, формальдегид
НСНО, метанол СН3ОН и метан СН4. Кроме того, субстратом углеродной автотро-
фии может быть «неорганическая» метильная группа, присоединенная через атом
кислорода, азота или серы к другим метильным группам (от одной до трех) или к
многоуглеродному скелету.

В качестве синонима термина «углеродная автотрофия» можно использовать
термин «монокарботрофия» (греч. monos —один, лат. carboneum — уголь, элемент
углерод, и греч. trophe — питаюсь; питание одноуглеродным веществом). Есть и со-
кращенное обозначение этого термина — «Ci-трофия».

Помимо углеродной автотрофии существует азотная автотрофия.
Азотная автотрофия представляет собой совокупность биосинтетических ре-
акций, превращающих молекулярный азот (N2) в аминогруппы органических мо-
лекул (-NH2Y

В качестве синонима термина «азотная автотрофия» английские биохимики
Бернс (R. Burns) и Харди (R. Hardy) предложили в 1970-е годы термин «диазотро-
фия» (греч. dio —два, azoos — безжизненный, элемент азот, и trophe — питаюсь; пи-
тание N2). Существует и сокращенное обозначение этого термина — «Ыг-трофия».

Термин «диазотрофия» лучше классического термина «биологическая фиксация
атмосферного азота», который отражает только начальный этап диазотрофии, свя-
занный с восстановлением азота в аммиак. Что касается сокращенного варианта
«фиксация азота», то ему не хватает определенности — азот можно зафиксировать
с помощью химической реакции или на инертном адсорбенте.

Конструктивные процессы монокарботрофов основаны на использовании фер-
ментов, которые акцептируют одноуглеродные блоки и восстанавливают их до фор-
мильной -СНО, оксиметильной -СН2ОН или метильной -СН3 групп. Соответству-
ющие метаболические системы носят название «циклов» и «путей» автотрофной
ассимиляции углерода. Известен ряд таких систем; они приурочены к разным фи-
логенетическим ветвям прокариотов и будут подробно рассмотрены в главе 13.

Конструктивные процессы диазотрофов складываются из универсальных мета-
болических путей, однако в основе диазотрофии лежит уникальная ферментативная
активность нитрогеназ. С помощью сильного восстановителя и при затрате энергии
АТФ эти ферменты разрывают тройную связь в молекуле N2 (в конечном счете
образуются две молекулы аммиака NH3). Нитрогеназы часто, но не закономерно
встречаются у представителей домена Bacteria и в редких случаях имеются у мета-
ногенных Archaea. У представителей домена Еисагуа нитрогеназы не обнаружены
и, скорее всего, они у них вообще отсутствуют.

Смешанный тип конструктивного углеродного метаболизма называется углерод-
ной миксотрофией (греч. mixis — смешение и trophe —питаюсь). В этом случае ав-
тотрофная ассимиляция одноуглеродных соединений происходит одновременно с
ассимиляцией органических веществ (аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот,
стероидов, моносахаридов и т. д.), используемых при биогенезе надмолекулярных
структур и биосинтезе запасных полимеров.

При органическом питании полимеры расщепляются на моноблоки, а сложные
молекулы — на более простые, что в отдельных случаях завершается полной мине-
рализацией углерода. Совокупность этих процессов называется катаболизмом (греч.
kata — направление движения сверху вниз и metabole— изменение). Когда из неор-
ганического углерода синтезируются простые органические вещества или когда из
моноблоков образуются полимеры, мы говорим об анаболизме (греч. ana — направ-
ление движения снизу вверх и metabole — изменение). Анаболизм и катаболизм —
это взаимосвязанные стороны единой метаболической системы, которые не могут
осуществляться в отрыве друг от друга.

Последовательные этапы катаболических и анаболических превращений образу-
ют системы реакций, или метаболические пути (англ, metabolic pathway). Некоторые
метаболические пути обратимы. В этом случае из поставщиков энергии, конструк-
тивного субстрата и восстановителя они становятся их потребителями.
9.2.4.	Донор электронов

Прежде всего следует уточнить, в какой сфере метаболизма будет использовать-
ся донор — энергетической или конструктивной.

Если экзогенный восстановитель служит источником энергии, последняя ассими-
лируется в форме вещества-фосфагена или в форме трансмембранного электрохи-
мического потенциала (см. главу 10). При этом электроны от восстановителя пере-
даются терминальному акцептору, для обозначения которого существует образный
термин — «сточная труба» для электронов (англ, electron sink).

Если экзогенный восстановитель используется для биосинтезов, электроны пере-
даются эндогенному редокс-агенту (в частности, пиридиннуклеотиду НАДФ). Тот, в
свою очередь, служит восстановителем при биогенезе клеточных структур или при
биосинтезе внеклеточных полимеров (в частности, экзополисахаридов). Сформули-
рованное положение можно иллюстрировать следующим примером.

Реакция автотрофного карбоксилирования органического акцептора (R-H)

R-H + СО2 -> R-COOH

связана с относительно небольшим изменением свободной энергии. Образующаяся
карбоксильная группа (-СООН) менее восстановлена по сравнению с оксиметеновой
(-СНОН-), метиновой (-СН=), метеновой (-СН2—) и метильной (СН3 —) группами,
из которых состоят углеродные скелеты. Поэтому за исключением тех случаев, ко-
гда ассимилируемой одноуглеродной единицей служит формальдегид (НСНО) или
метильная группа, для автотрофной ассимиляции углерода необходимы восстанови-
тельные эквиваленты. Их источником является экзогенный донор электронов. Как
уже указывалось, при его окислении восстанавливаются простетические группы ре-
докс-ферментов — пиридиннуклеотиды (НАД и НАДФ), флавиннуклеотиды (ФАД
и ФМН) и железо-серные центры.

Использование для питания неорганического донора электронов называется ли-
тотрофией, а органического — органотрофией.

Если пул восстановителя пополняется за счет неорганического донора электро-
нов одновременно с использованием энергии света, такой тип метаболизма назы-
вается фотолитотрофией. Когда для фототрофа источником восстановителя в кон-
структивных процессах служит экзогенный органический субстрат, это называется
фотоорганотрофией. Если органический субстрат служит для фототрофа источни-
ком восстановителя и одновременно с этим используется как конструктивный мате-
риал, мы имеем дело с фотогетеротрофией.

При хемолитотрофии неорганический субстрат может быть не только источни-
ком энергии, но и донором электронов в конструктивном метаболизме. В этом случае
речь идет о хемолитоавтотрофии. Если же хемолитотроф использует органическое
вещество как донор электронов для биосинтезов и одновременно с этим — как кон-
структивный субстрат, такой тип питания называется хемолитогетеротрофией.

При хемоорганотрофии окисляемое органическое вещество всегда играет двой-
ственную роль — энергоносителя и донора электронов для биосинтезов. Окисленные
формы кофакторов дегидрогеназ (пиридин- и флавиннуклеотидов) регенерируют-
ся при ассимиляции свободной энергии, а также расходуются в биосинтетических
реакциях.
ГЛАВА 10

ОСНОВЫ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА

Химическая энергия пищи употребляется в орга-
низме для создания свободной энергии структуры, для
построения, возобновления, сохранения этой структу-
ры, а не непосредственно превращается в работу.

Э. С. Бауэр. Теоретическая биология
(Москва-Ленинград, 1935)

Энергетический метаболизм — это совокупность процессов ассимиляции и дисси-
миляции энергии. Ассимиляция энергии заключается в том, что клетка преобразует
свободную энергию экзогенного энергоносителя или запасных полимеров в такую
форму, которая непосредственно поддерживает процессы жизнедеятельности. В со-
стоянии глубокого энергетического стресса клетка может ассимилировать энергию
катаболического распада своих собственных незаменимых компонентов (рибосом,
мембран и ферментов генерального метаболизма). При ассимиляции энергия извле-
кается из вышеуказанных источников, преобразуется и аккумулируется в унифици-
рованной форме.

При диссимиляции энергия переходит в окружающую среду в результате совер-
шения полезной работы или просто рассеивается.

Для преобразования энергии, прежде всего для ее ассимиляции, используются
специализированные молекулярные системы — биотрансформаторы.

10.1. БИОТРАНСФОРМАТОРЫ

Основу биотрансформаторов составляет полипептид или мультиполипептидный
комплекс. Одни из биотрансформаторов находятся в растворенном виде в цитозоле,
другие иммобилизованы на мембранах. Назовем их соответственно цитозольными
биотрансформаторами и мембранными биотрансформаторами.

Цитозольные биотрансформаторы гидрофильны, поскольку на их поверхности
сосредоточены полярные группы. Мембранные биотрансформаторы гидрофобны
снаружи или имеют гидрофобные домены, в результате чего они погружены в ли-
пидный матрикс или заякорены в нем.
Специфика действия биотрансформатора определяется:

—	типом экзогенного энергоносителя;

—	типом эндогенного энергоносителя;

—	анизотропией процесса и участием в нем небелковых структур.

Экзогенный энергоноситель. Цитозольные биотрансформаторы обеспечи-
вают ассимиляцию энергии только органических субстратов (хемоорганотрофия).
Мембранные биотрансформаторы функционально более разнообразны. С их помо-
щью может осуществляться не только хемоорганотрофия, но и ассимиляция энергии
неорганических субстратов (хемолитотрофия), а также ассимиляция энергии света
(фототрофия).

Эндогенный энергоноситель. Ассимиляция энергии —это не самоцель, а
лишь способ временно аккумулировать энергию для ее последующего полезного
использования. Эндогенный энергоноситель существует в динамичной материаль-
ной форме, которая обеспечивает взаимосвязь между процессами, протекающими с
выделением энергии, и процессами, в ходе которых энергия поглощается.

Из химической термодинамики известно, что переход системы из одного энерге-
тического состояния в другое связан с изменением четырех функций этого состоя-
ния— Е, Н, S и G.

Е — это внутренняя энергия, или суммарная потенциальная и кинетическая
энергия всех элементов системы.

Н — это энтальпия, или функция энергетического состояния системы при посто-
янном давлении и постоянной температуре.

S — это энтропия, или термодинамическая функция, характеризующая неупоря-
доченность взаимного расположения элементов системы и хаотичность их движе-
ния.

G — это свободная энергия, или «энергия Гиббса» (J.W. Gibbs; 1839-1903), т. е.
часть внутренней энергии, которая может быть превращена в полезную работу. Из-
менение этой термодинамической функции связано с изменением энергетического
уровня системы и меры ее упорядоченности следующей зависимостью:

△G = АН - TAS',

где Т — температура в градусах по шкале Кельвина.

Для живых систем важно изменение не внутренней, а свободной энергии, по-
скольку от ее запаса зависит способность выполнять полезную работу.

Свободная энергия служит мерой устойчивости системы. Высокие значения G
свойственны неустойчивым системам, которые имеют тенденцию спонтанно перехо-
дить на более низкий энергетический уровень.

Сказанное можно подкрепить примером химических реакций, протекающих в живой клетке.
Если система переходит в более устойчивое состояние, то разница свободной энергии продуктов и
субстратов реакции (AG = СПрод. ~ Gcy6.) имеет отрицательное значение. Такая реакция протека-
ет с выделением энергии, т. е. она термодинамически выгодна. Поскольку освобожденная энергия
может быть использована для полезной работы, реакция выгодна и в биологическом отношении.
Если система переходит в менее устойчивое состояние, разница свободной энергии продуктов и
субстратов реакции имеет положительное значение. Такая реакция термодинамически невыгод-
на; не выгодна она и в биологическом отношении, поскольку для нее необходимо дополнительно
затратить энергию.

В 1940 г. американский химик Чарльз Кориэл (С. D. Coryell) предложил называть
реакции, протекающие с выделением энергии, экзергоническими (англ, exergonic), а
реакции, протекающие с поглощением энергии, эндергоническими (англ, endergonic).

Когда в живых клетках происходят экзергонические реакции (AG < 0), это ред-
ко связано с бесполезным рассеиванием энергии в форме теплоты. Обычно осво-
бождающаяся энергия затрачивается в эндергонических реакциях (AG > 0). Они
энергетически взаимосвязаны с экзергоническими реакциями, т. е. находятся с ними
в «сопряжении» (англ, coupling). Итоговый результат процесса становится экзерго-
ническим.

Если химическая реакция

аА + ЬВ «-> сС + dD

происходит при постоянном давлении и температуре, или в изобарно-изотермиче-
ских условиях, то изменение свободной энергии AG (кДж-моль-1) составляет:

AG = AG° + #Tln[C]c[D]d/[A]a[B]b,

где AG° — изменение свободной энергии в стандартных условиях (концентрация
каждого реагента 1 М, давление 1 бар, температура 25°С); R — универсальная газо-
вая постоянная; Т — абсолютная температура; [А], [В], [С], [D] — молярные концен-
трации субстратов и продуктов реакции; a, 6, с, d — стехиометрическое количество
молекул, участвующих в реакции.

Поскольку в состоянии равновесия AG = 0, значение AG0 составляет:

- #Tin[C]c[D]d/[A]a[B]b = —2,303#TlgK,

где К — константа равновесия, которую можно определить экспериментально при
заданной температуре.

Физико-химические параметры, относительно которых оценивается свободная
энергия в биологических системах, значительно отклоняются от стандартных усло-
вий (прежде всего, концентрация реагирующих веществ << 1 М). Поэтому энер-
гетическую эффективность химических реакций в данном случае принято оцени-
вать не истинным изменением функции свободной энергии (AG°), а изменением
для состояния, отличающегося от стандартного, в частности при pH = 7. Это
«кажущееся» изменение свободной энергии обозначается как AG°'. Если вещества
участвуют в химической реакции в концентрациях, близких к эквимолярным, т. е.
[С]с[D]d/[A]a[В]ь = 1(К = 1), соблюдается равенство AG' — AG°'.

Выражение, с помощью которого рассчитывается стандартное изменение функ-
ции свободной энергии (G0 = — 2, ЗОЗ-RTlgK), носит универсальный характер. Для
конкретного случая, связанного с окислительно-восстановительными превращения-
ми, стандартное изменение свободной энергии рассчитывается по формуле:

AG° = —nFE°,

где п — количество электронов (моль), переданных от донора к акцептору, F — чис-
ло Фарадея (0,09649 кДж-моль-1-мВ-1), Е° — стандартный редокс-потенциал (мВ),
представляющий собой разность электрических потенциалов между окисляющими-
ся и восстанавливающимися компонентами системы.

Для физиологических условий величина AG° принимает кажущееся значение:
AG°' = -nFE°' (Ео/ = Е°- pH = 7).
При окислительно-восстановительном превращении электроны векторно переда-
ются от донора к акцептору. В такой системе, или электрохимической ячейке про-
исходит упорядоченное движение, т. е. она характеризуется низкой энтропией. Чем
меньше энтропия, тем выше уровень свободной энергии, и поэтому окислительно-
восстановительная система способна производить полезную работу.

Итак, ассимиляция энергии играет роль сопрягающего звена между экзергониче-
скими и эндергоническими процессами. В какой же форме энергия ассимилируется
и каким образом осуществляется сопряжение?

Химическая энергия может ассимилироваться в форме химического потенциала
субстрата (фосфагена) или в форме трансмембранного электрохимического потен-
циала катионов Н+ или Na+. Световая энергия может ассимилироваться только в
форме энергии трансмембранного электрохимического потенциала.

Замечательным свойством двух форм ассимилированной энергии является то,
что они взаимно конвертируются, т. е. беспрепятственно преобразуются одна в дру-
гую.

Анизотропия процесса и участие в нем небелковых структур. Сте-
пень упорядоченности цитозольных и мембранных биотрансформаторов существен-
но различается.

В первом случае ассимиляция энергии протекает в изотропной среде. Действие
цитозольных биотрансформаторов не носит векторного характера, оно подчиняется
закономерностям молекулярной кинетики и в первую очередь зависит от диффузи-
онного контакта между растворенными молекулами.

Во втором случае мембранные биотрансформаторы, или генераторы ионных гра-
диентов осуществляют векторный процесс. Для таких систем решающее значение
имеет ориентация по отношению к компартментам, изолированным друг от дру-
га мембраной, а также различие состава двух фаз, разделенных мембраной. Дей-
ствие мембранных биотрансформаторов определяется не диффузионными контак-
тами между молекулярными партнерами, а их упорядоченным и близким взаимным
расположением — вплоть до перекрывания электронных облаков отдельных атомов.
Примером такого биотрансформатора служит фотосинтетический аппарат.

Цитозольные и мембранные биотрансформаторы, как правило, дополнительно
содержат небелковые компоненты. В первую очередь к ним относятся органические
или неорганические кофакторы, а также пигменты. Особое влияние на мембран-
ные биотрансформаторы оказывают фосфолипиды. Их неполярные хвосты фор-
мируют гидрофобное окружение, стабилизирующее структуру биотрансформатора.
В свою очередь, полярные головки липидов определяют взаимодействие мембранно-
го биотрансформатора с его молекулярным окружением и образуют гидрофильную
поверхность, что позволяет цитозольному биотрансформатору перейти в иммобили-
зованное состояние и тем самым повысить уровень своей упорядоченности.

Еще совсем недавно действие цитозольных биотрансформаторов рассматривали
только как изотропный и хаотичный процесс. Однако последние данные свидетель-
ствуют о существовании энзоскелета — физической ассоциации между цитозольны-
ми ферментами (см. I том учебника). Подобным образом, по-видимому, структури-
рован даже молекулярный аппарат гликолиза (см. раздел 11.3.2.1), центральным
звеном которого является цитозольный биотрансформатор.
10.2. ФОСФАГЕНЫ

Химические соединения, в форме которых клетки ассимилируют энергию, из-
вестны под разными названиями—«богатые энергией соединения», «макроэрги-
ческие вещества» и «фосфагены». Термин «богатое энергией соединение» (англ,
energy-rich compound) ввел в начале 1940-х годов американский биохимик Фриц
Липманн (F. Lippmann, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1953 г.).
В специальной литературе на русском языке используется равнозначный тер-
мин «макроэргическое вещество» (греч. makros — большой и ergon —работа),
предложенный в конце 1930-х годов советским биохимиком В. А. Энгельгард-
том.

В начале 1940-х годов Липманн предложил изображать лабильные химические
связи в структурных формулах этих соединений знаком ~. Такие связи часто на-
зывают «богатыми энергией» в отличие от «обычных» связей. Однако это совер-
шенно лишено оснований, поскольку энергия разрыва одинарной химической связи
в молекулах органических соединений примерно одинакова (344 кДж-моль-1 для
связи С-С, 350 кДж-моль-1 для связи С-О, 292 кДж-моль-1 для связи C-N и
360 кДж-моль-1 для связи Р-О).

С биоэнергетической точки зрения очень важно, что в структуре некоторых
(в частности, фосфорилированных) молекул существует стерическое напряжение,
вызванное электростатическим отталкиванием между одноименно заряженными
группировками. Разрыв межатомных связей в таких молекулах, как и разрыв любой
химической связи, требует затраты энергии (т. е. AG > 0). Однако образующиеся
продукты подвергаются изомеризации, нейтрализации и гидратации, в результате
чего общее изменение свободной энергии принимает отрицательное значение. Распад
рассматриваемых соединений представляет собой процесс, при котором изменение
стандартной свободной энергии (AG°) принимает значения в интервале от —7 до
-70 кДж-моль-1. Ближе к нижней границе (по абсолютной величине) располагают-
ся «бедные энергией соединения», а ближе к верхней границе — «богатые энергией
соединения».

Фосфорильный остаток ~ РО3 (сокращенно «Р») мобилизуется путем гид-
ролиза фосфоэфирной связи. При этом изменение свободной энергии принимает
промежуточные значения между -7 и -70 кДж-моль-1. В частности, £±G°'
для реакции АТФ + Н2О —> АДФ + Ф составляет -30 кДж-моль"1. Кро-
ме того, фосфорильный остаток может передаваться от одного фосфоэфира к
другому путем энзиматической реакции «переноса (фосфатной) группы», в ре-
зультате чего экзергонические соединения становятся взаимно конвертируе-
мыми.

«Богатые энергией соединения» могут подвергаться и неферментативному гид-
ролизу. Освобождающаяся энергия при этом переходит в теплоту. В случае полез-
ного использования энергии фосфорильная группа отщепляется ферментативным
путем. Тогда свободная энергия передается другому химическому носителю (не обя-
зательно «богатому энергией») или непосредственно используется для полезной ра-
боты.

Если «богатое энергией соединение» принимает участие в фосфокиназной ре-
акции, его фосфорильная группа переносится на другой субстрат, активируя его.
В отсутствии подходящего акцептора происходит фосфогидролазная реакция, и
фосфорильная группа освобождается в виде аниона ортофосфата (Ф):
субстраТ1~Р + субстратг —* субстрату + субстрат2~Р,

субстрат1~Р + Н2О —> субстрату + Ф.

Путем обратимой мобилизации фосфорильной группы «богатые энергией соеди-
нения» осуществляют сопряжение между эндергоническими и экзергоническими
процессами.

«Богатые энергией соединения» используются в первую очередь для выполнения
осмотической или электрической работы при uphill-транспорте через мембраны. Их
потребителями также служат эндергонические процессы в самой клетке (биосинте-
зы, работа цитоскелета и локомоторных систем, действие сигнальных каскадов).

К числу «богатых энергией соединений» относятся:

—	нуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ, ТТФ, УТФ и ЦТФ);

—	пирофосфат ФФ и конденсированные неорганические фосфаты, или полифос-
фаты (Ф)п;

—	фосфоэнолпируват;

—	О-ацилфосфаты (1,3-бисфосфоглицерат, ацетилфосфат, бутирилфосфат, Дас-
партилфосфат и карбамоилфосфат);

—	N-ацилфосфаты (креатинфосфат и аргининфосфат).

Структурные формулы некоторых из них приводятся на рис. 68.

Чаще всего в роли «богатого энергией соединения» выступает АТФ, хотя вместо
него могут использоваться и другие нуклеозидтрифосфаты (например, для транс-
ляции на рибосомах необходим ГТФ, а для биосинтеза полигликозидов — УТФ).
«Богатым энергией соединением», которое обеспечивает мышечное сокращение у
позвоночных, служит креатинфосфат; перенос фосфорила между ним и АТФ осу-
ществляется с помощью креатинфосфокиназы. В свою очередь, у некоторых бес-
позвоночных этот фермент отсутствует, и в роли «богатого энергией соединения»
выступает аргининфосфат, который с помощью аргининфосфокиназы поддержива-
ется в состоянии химического равновесия с АТФ.

Для того, чтобы в физиологических условиях стать предшественником АТФ, т. е.
находиться с ним в химическом равновесии, соединение с фосфорильной группой
должно иметь свободную энергию гидролиза не ниже -30 кДж-моль-1 (по абсолют-
ному значению).

Из сказанного становится ясно, что термин «богатая энергией связь» обманчив,
и никакого повышенного запасания энергии в структуре АТФ и других «богатых
энергией молекул» не происходит. Истинная биологическая роль этих соединений
заключается в том, что их гидролиз является экзергоническим процессом, т. е. из-
менение свободной энергии принимает отрицательное значение (ДС < 0). Кроме
того, свободная энергия гидролиза в данном случае достаточно высока по абсолют-
ному значению.

Как уже говорилось, свободная энергия является термодинамической функцией
отклонения системы от равновесного состояния, и поэтому при использовании внеш-
него источника энергии равновесие реакции (АДФ + Ф <-> АТФ) смещено в сторону
образования АТФ.

Таким образом, нам следует отказаться от терминов «богатое энергией соедине-
ние» и «макроэргическое вещество», поскольку, как выяснилось, эти молекулы не
обладают повышенным запасом энергии, а только осуществляют сопряжение между
экзергоническими и эндергоническими процессами. Вместо этого мы воспользуемся
термином «фосфаген» (греч. phos — свет и gene — порождаю; несущий энергию).
A

пирофосфат (n = 0)

и конденсированные неорганические фосфаты (n = 1 - 106)

В	соо

С-О-Р

II

сн2
фосфоэнолпируват

Г

Н,С -С-О~р

ацетилфосфат

z/>
оос-сн-сн,-с-о~р
NH3+

Р-аспартилфосфат

z/>
С-О~р

NH3+

карбамоилфосфат

Д	сн3

ООС-СН -N-C-NH-P ООС- CH - (CH,)3-NH-C"NH~P
и ,	।	.	2 3 и ,

nh2	nh3	nh;

креатинфосфат	аргининфосфат

Рис. 68. Примеры «богатых энергией соединений», или фосфагенов.

А — нуклеозидтрифосфаты; Б — конденсированные неорганические фосфаты;
В — энолфосфаты; Г — О-ацилфосфаты; Д — N-ацилфосфаты.
Этот термин был введен в 1927 г. Эгглтонами (Р. Eggleton, G. Р. Eggleton). Исход-
но он обозначал неизвестное фосфорорганическое соединение, которое вскоре бы-
ло идентифицировано как фосфорильное производное креатина — креатинфосфат.
Позднее термин «фосфаген» был распространен на фосфорильные производные ар-
гинина и другие N-фосфорилированные производные гуанидина, которые вместе с
адениловыми нуклеотидами участвуют в реакциях переноса фосфорильной группы.

В нашем случае мы будем пользоваться этим термином не в его первоначальном
узком смысле, а применительно ко всем способам ассимиляции энергии в форме
химического потенциала растворенного субстрата.

Особое место среди фосфагенов занимают адениловые нуклеотиды (АТФ и, в
меньшей степени, ГТФ и УТФ). Изменение свободной энергии при гидролизе их
терминальной или субтерминальной фосфоэфирной связи соответственно составля-
ет:

АТФ + Н20 АДФ + Ф

(AGO/ = —30,5 кДж-моль-1),

АТФ + Н2О -+ АМФ + ФФ,

(AGO/ = —30,5 кДж-моль-1).

Реальный выход свободной энергии во второй реакции несколько больше, по-
скольку химическое равновесие сдвигается вправо благодаря удалению неорганиче-
ского пирофосфата с помощью растворимой пирофосфатазы:

ФФ + Н2О -> 2Ф.

Причина термодинамической неустойчивости АТФ заключается в том, что при
«нормальных» физиологических условиях (в частности, при pH 7) его молекула
представляет собой полианион, несущий четыре диссоциированные гидроксильные
группы (рис. 68, А). Соседние отрицательные заряды электростатически отталкива-
ются, кроме того, между атомами фосфора существует конкурентный резонанс за
восемь неподеленных электронов при атомах кислорода. Из-за этих внутренних вза-
имодействий химические связи -Р-О-Р- испытывают напряжение и легко поддают-
ся гидролизу. Стабильность продуктов гидролиза АТФ (АДФ и АМФ) прогрессивно
увеличивается, что и объясняет экзергоническую энергетику приведенных реакций.

После создания Липманном концепции «богатых энергией соединений» использование АТФ
непосредственно связывали с гидролизом фосфоангидридных связей в активном центре соответ-
ствующего фермента (АТФазы). До начала 1970-х годов предполагали, что количество энергии,
получаемой в ходе реакции гидролиза, определяется только природой связи между фосфорилом
и остальной частью молекулы. Помимо этого существовала точка зрения, что экзергоничность
фосфоиминной связи -N(~P)- в молекуле креатинфосфата, фосфоэнольной связи =С(~Р)- в мо-
лекуле фосфоэнолпирувата, фосфоангидридной связи -О~Р в молекуле АТФ и (Ф)п, а также фос-
фоацильной связи -СОО~Р в молекуле /3-аспартилфосфата одинакова как в ферментосвязанной
форме, так и в растворе. Наконец, направление переноса фосфорила от одного фосфагена к друго-
му объясняли только различием в энергии гидролиза фосфорилированных молекул. В настоящее
время большее значение придается изменению свободной энергии фосфагена еще до гидролиза,
что определяется энергией его связывания и сольватации, а также изменением энтропии в этих
процессах.

Экзергоничность таких фосфагенов, как АТФ, ГТФ, ТТФ, УТФ и ЦТФ объясняется наличи-
ем в их составе остатков фосфорила. Поскольку свободная энергия гидролиза этих нуклеотидов
примерно одинакова, непонятно, в силу каких причин природа выбрала именно АТФ в качестве
главного фосфагена. В. П. Скулачев предположил, что поскольку по сравнению с другими азоти-
стыми основаниями аденин имеет умеренные донор-акцепторные свойства, это расширяет круг
субстратов, с которыми может взаимодействовать АТФ. Кроме того, аденин относительно более
устойчив к действию коротковолнового УФ-излучения, что могло иметь селективные преимущества
на ранних этапах биологической эволюции, когда еще не существовал озоновый экран.

При переносе энергии с помощью АТФ образуются два продукта гидролиза —
АДФ и АМФ. После этого АДФ может быть преобразован в АТФ путем фосфо-
рилирования: АДФ + Ф —> АТФ. В свою очередь, АМФ превращается в АДФ при
помощи аденилаткиназы:

АМФ + АТФ -> 2АДФ.

Из приведенных уравнений реакций следует, что перенос энергии с помощью
АТФ сопровождается взаимными превращениями всех трех аденилатных нуклеоти-
дов (АМФ, АДФ и АТФ). Хотя в качестве энергетической «валюты» все живые ор-
ганизмы используют АТФ, энергетическое состояние клетки определяется не только
концентрацией этого аденилата. Важную роль играет концентрация АДФ и АМФ,
а также ортофосфата.

Концентрация аденилатных нуклеотидов оказывает регуляторное воздействие
на ход биохимических процессов. Активность многих ферментов зависит от соот-
ношений конкурентных аллостерических субстратов —АТФ/АДФ или АТФ/АМФ,
причем тип регуляции может быть как стимулирующим, так и ингибирующим. По-
этому баланс между АТФ, АДФ и АМФ исключительно важен для поддержания
клеточного гомеостаза.

Энергетический статус клетки определяется накоплением фосфоангидридных
связей. В начале 1970-х годов английский биохимик Эткинсон (D.E.Atkinson) пред-
ложил называть соответствующую термодинамическую функцию энергетическим
зарядом (англ, energy charge, ЕС). Он представляет собой усредненное частное от
деления количества гидролизуемых фосфоангидридных связей (число которых в
молекуле АТФ равно двум, а в молекуле АДФ одной), на сумму всех аденилатов:

ЕС = 1/2 (2[АТФ] + [АДФ]) / ([АТФ] + [АДФ] + [АМФ])

или

ЕС = ([АТФ] + 1/2[АДФ])/([АТФ] + [АДФ] + [АМФ]).

Максимальное значение ЕС равно единице (при этом [АДФ] = 0 и [АМФ] = 0;
аденилатный пул состоит только из АТФ). Такое физиологическое состояние харак-
теризуется предельно высоким энергетическим статусом. Минимальное значение ЕС
равно нулю (при этом [АТФ] = 0 и [АДФ] = 0; аденилатный пул состоит только из
АМФ). Такое физиологическое состояние характеризуется предельно низким энер-
гетическим статусом. Регуляторные системы препятствуют наступлению обоих экс-
тремальных энергетических состояний, и в нормально функционирующей клетке ЕС
поддерживается на уровне 0,8-0,9. При ЕС<0,8 скорость синтеза АТФ возрастает,
а при ЕС>0,9 уменьшается, что регулирует использование энергии в физиологи-
ческих процессах и одновременно с этим — ферментативную кинетику образования
АТФ.
Другой термодинамической функцией, характеризующей энергетический статус
клетки, является потенциал фосфорилирования (англ, phosphorylation potential). Он
выражается через константу равновесия К реакции (АДФ + Ф —> АТФ), т. е.:

К= (АТФ)/([АДФ) |ф))-

В отличие от энергетического заряда, потенциал фосфорилирования зависит от
концентрации ортофосфата. Если [Ф] поддерживается на постоянном уровне, то фи-
зиологическое значение двух аденилатов оказывается одинаковым. Подобно энерге-
тическому заряду, потенциал фосфорилирования регулирует активность ферментов,
действующих в узлах метаболических путей.

10.3.	ЦИТОЗОЛЬНЫЕ БИОТРАНСФОРМАТОРЫ

С помощью цитозольных биотрансформаторов химическая энергия ассимилиру-
ется в форме химического потенциала фосфагена (обозначаемого как субстрат~Р).
Фосфагены образуются двумя способами.

Первый способ —это включение ортофосфата (Ф) в состав органической моле-
кулы в ходе ферментативной дегидрогеназной реакции:

субстратна + Аох + Ф —> субстратох~Р + Агеа,

где Аох и Агеа — соответственно окисленный и восстановленный акцептор электро-
нов.

В данном случае свободная энергия ассимилируется в структуре фосфорилиро-
ванной молекулы. Например, при гликолизе в результате окисления 3-фосфогли-
церинового альдегида (СН2ОР-СНОН-СНО) образуется такой фосфаген, как 1,3-
бисфосфоглицерат (СНзОР-СНОН-СОО^Р).

Второй способ образования фосфагена — это замена группы R, присоединенной
лабильной тиоэфирной связью к скелету органической молекулы, на остаток орто-
фосфата:

субстрат~8-К + Ф —> субстрат~Р + HS-R.

Типичным примером служит фосфотрансацетилазная реакция, в результате ко-
торой тиоэфирная связь ацетил-СоА заменяется на фосфоэфирную связь с образо-
ванием такого фосфагена, как ацетилфосфат:

СН з-CO~SCoA + Ф -> СН3-СОО~Р + HS-CoA.

В зависимости от соотношения химических потенциалов фосфагенов между ни-
ми возможен направленный обмен фосфорильной группой. Однако только один фос-
фаген играет роль свободно конвертируемого и универсально распространенного
аккумулятора фосфорила, и этим соединением является АТФ.

Фосфорилирование АДФ на уровне субстрата и АТФ-сопряженные
фосфагены. Для обозначения механизма фосфорилирования путем переноса на
АДФ фосфатной группы от другого фосфагена в отечественной литературе исполь-
зуется крайне неудачный термин «субстратное фосфорилирование» (если вдумать-
ся, то любой биохимический процесс является субстратным, а фосфорилироваться
могут самые разные субстраты).
Следуя международной традиции, мы воспользуемся термином «фосфорилиро-
вание АДФ на уровне субстрата» (англ, substrate-level phosphorylation).

Под этим названием объединяются протекающие в цитозоле однотипные фер-
ментативные реакции, которые представляют собой обменный процесс — АТФ обра-
зуется путем переноса на АДФ фосфорильной группы от другого фосфагена. Реак-
ция катализируется соответствующей киназой, и химическое равновесие смещено в
сторону образования АТФ:

АДФ + субстрат~Р —> АТФ + субстрат.

Фосфорилирование АДФ на уровне субстрата встречается у представителей всех
трех филогенетических доменов.

Существуют несколько разновидностей донора фосфорила. Однако не все они
«богаты энергией» (точнее сказать, реакция их гидролиза обычно низко экзергонич-
на). Кроме того, их физиологическая концентрация недостаточна, чтобы сместить
равновесие реакции в сторону образования АТФ.

Набор соединений, способных в физиологических условиях играть роль донора
фосфорильной группы для АДФ, невелик. Соответственно, существует небольшое
число ферментных систем, обеспечивающих образование АТФ за счет энергии гид-
ролиза других фосфагенов.

Приведем примеры АТФ-сопряженных фосфагенов.

Нуклеозидтрифосфаты. Важнейшим среди них является гуанозинтрифосфат
(ГТФ). Реакция его гидролиза умеренно экзергонична:

ГТФ + Н2О -> ГДФ + Ф

(△Go/ = —33,5 кДж-моль-1).

ГТФ регенерирует АТФ с помощью нуклеозиддифосфаткиназы:

АДФ + ГТФ -> АТФ + ГДФ.

Конденсированные неорганические фосфаты (полифосфаты). Реакция их гидро-
лиза умеренно экзергонична:

(Ф)п + Н2О -> (Ф)п_х + Ф

(△Go/ = —33,5 кДж-моль-1).

Конденсированные неорганические фосфаты регенерируют АТФ с помощью по-
лифосфаткиназы:

АДФ + (Ф)п АТФ + (Ф)п_!.

Ацилфосфаты. Важнейшим среди них является 1,3-бисфосфоглицерат. Реакция
его гидролиза высоко экзергонична:

СН2ОР-СНОН-СОО~Р + Н2О СН2ОР-СНОН-СООН + Ф

(△Go/ = —49,4 кДж-моль-1).
Бисфосфоглицерат служит источником фосфорила в фосфоглицераткиназной
реакции:

АДФ + СН2ОР-СНОН-СОО~Р СН2ОР-СНОН-СООН + АТФ.

Другим ацилфосфатом, свободная энергия гидролиза которого также составляет
около -49,4 кДж-моль-1, является ацетилфосфат. Его фосфорильная группа моби-
лизуется ацетаткиназой:

АДФ + СН3-СОО~Р -> АТФ + СНз-СООН.

Ацетилфосфат образуется из ацетилтиоэфира коэнзима А (ацетил-СоА) с помо-
щью фосфотрансацетилазы:

СН3-CO~SCoA + Ф - СН3-СОО~Р + CoASH.

Энолфосфаты. Важнейшим среди них является фосфоэнолпируват. Реакция его
гидролиза особо экзергонична:

СН2=СО(~Р)-СООН + Н2О -> СНз-СО-СООН + Ф

(△Go/ = —62 кДж-моль-1).

Фосфоэнолпируват регенерирует АТФ в реакции, катализируемой пируваткина-
зой:

АДФ + СН2=СО(~Р)-СООН -> АТФ + СН3-СО-СООН.

Фосфоэнолпируват представляет собой наиболее распространенный донор фос-
форила для АДФ у прокариотов и встречается как у аэробов, так и у анаэробов.

В отличие от фосфоэнолпирувата, ацетилфосфат используется преимущественно
анаэробными бактериями-ферментаторами.

Фосфоэнолпируват и ацетилфосфат, а также 1,3-бисфосфоглицерат образуются
при гликолизе, который является одним из важнейших путей хемогетеротрофного
питания (см. раздел 11.3.2).

Значение цитозольных биотрансформаторов. Цитозольные биотрансфор-
маторы исключительно важны для бактерий, жизнь которых протекает в средах с
низким содержанием экзогенных акцепторов электронов, прежде всего кислорода.

Когда возможность ассимилировать энергию путем аэробного дыхания ограниче-
на ввиду слабого доступа или отсутствия кислорода, возникает острая конкуренция
за альтернативные акцепторы электронов, например сульфат, нитрат и фумарат.
Именно поэтому среди бактерий так широко распространено получение энергии пу-
тем брожений, основанных на гликолизе и анаэробном расщеплении пирувата.

Для архей значение цитозольных биотрансформаторов в качестве систем асси-
миляции энергии в целом невелико. Обычно они используют мембранные биотранс-
форматоры, для которых терминальными акцепторами электронов служит сера или
такое нетривиальное соединение, как гетеродисульфид. Что же касается экстремаль-
но галофильных архей, то в анаэробных условиях они переключаются на квази-
фототрофию (см. раздел 12.7.6).

Следует иметь в виду, что у многих бактерий и архей цитозольные биотрансфор-
маторы функционируют наряду с мембранными.
Например, гликолитический путь предваряет полное окисление пирувата в цик-
ле Кребса, служащего поставщиком восстановленных пиридиновых и флавиновых
нуклеотидов для дыхательной цепи.

10.4.	МЕМБРАННЫЕ БИОТРАНСФОРМАТОРЫ

С помощью мембранных биотрансформаторов химическая или световая энер-
гия первично ассимилируется в форме трансмембранного электрохимического по-
тенциала катионов Н+ или Na+. После этого она используется в эндергонических
процессах, важнейшими из которых являются:

—	биосинтез АТФ или пирофосфата ФФ;

—	импорт питательных субстратов;

—	экспорт продуктов метаболизма;

—	секреция белков;

—	импорт гетерологичной ДНК;

—	плавание при помощи вращающихся жгутиков;

—	скользящее движение.

В соответствии с положениями хемиосмотической теории, электрохимический
потенциал обеспечивает сопряжение эндергонических и экзергонических процессов,
т. е. он выполняет такую же роль, как АТФ в изотропной среде. Перенос энергии
в мембранных системах осуществляется векторным путем, в частности, с помощью
векторных ферментативных реакций.

Мембранное фосфорилирование АДФ. Физиологической альтернативой
фосфорилирования АДФ на уровне субстрата служит мембранное фосфорилиро-
вание АДФ.

Этот векторный способ образования АТФ осуществляется в соответствии с хе-
миосмотическим механизмом, который Питер Митчел постулировал в начале 1960-х
годов. У бактерий мембранное фосфорилирование АДФ происходит на уровне СМ
или ICM. Археи не обладают ICM, и мембранное фосфорилирование АДФ у них
осуществляется только на уровне СМ.

Мембрана играет роль барьера между цитоплазматическим и экзоплазматиче-
ским компартментами и одновременно с этим — роль твердой фазы, которая иммо-
билизует ферментативный аппарат для синтеза АТФ.

Теория хемиосмотического сопряжения представляет собой адаптированный к
биосистемам вариант физико-химической теории электродвижущей силы (э.д.с.),
которую разработал в начале XX в. немецкий химик Вальтер Нернст (W.Nernst,
Нобелевская премия по химии, 1920 г.). В ней э.д.с. рассматривается как функция
электролитического напряжения и осмотического давления в растворе.

Применительно к живым системам свободная энергия двух разделенных мембра-
ной водных растворов электролита, или иондвижущая сила (англ, ion motive force,
Imf), выражается в трансмембранном электрохимическом потенциале этого иона.
Точнее сказать, она состоит из двух компонентов — разности электрических потен-
циалов (△V’) и разности химических потенциалов (Ац). Оба компонента иондвижу-
щей силы удобно выражать в электрических единицах, для чего значение химиче-
ского потенциала делят на число Фарадея. На примере катиона in+ имеем:

Imf = пД/ф + A/z(in+)/F = пАт/> + FT/Fln[in+]out/[in+]jn,
где n — абсолютная величина заряда катиона in+; Л'0 — разность электрических по-
тенциалов; Дд —разность химических потенциалов катиона in+; F — число Фара-
дея; R — универсальная газовая постоянная; Т — абсолютная температура; [in+]out и
[in+]in — молярные концентрации, или активности катиона in+ в экзоплазматической
(out) и цитоплазматической (in) фазах.

В частном случае, когда мембрана изолирует водные фазы с разной активной
кислотностью, т. е. с разной концентрацией протонов, речь идет о протондвижу-
щей силе (англ, proton motive force, Pmf). Преобразуя натуральный логарифм от-
ношения молярных концентраций протонов (ln[ H+]out/ [Н+],п) в единицы pH, по-
лучаем:

Pmf = А^ - 2, ЗРТ/FApH = ZApH.

После подстановки стандартного значения F (см. выше), а также стандартного
значения R (8,3146 Дж-град-1-моль-1) для «физиологической» температуры 25°С
(переведенной в градусы шкалы Кельвина) окончательно получаем величину Pmf
(в милливольтах, мВ):

Pmf = А^ — 59,06ДрН.

Если концентрация протонов в разделенных мембраной компартментах разли-
чается на порядок, АрН=1. Эта разность химических потенциалов при 25°С экви-
валентна разности электрических потенциалов в 59,06 мВ, а при 80°С — 70 мВ.

Пытаясь объяснить способ образования АТФ в митохондриях, Митчел постули-
ровал «хемиосмотический» механизм сопряжения дыхания с фосфорилированием.
В соответствии с этим термином, химический потенциал АТФ (т. е. концентрация
АТФ в митохондриальном матриксе) является производным от осмотического по-
тенциала Н+ (т. е. градиента концентрации Н+), который создается в результате ды-
хания. В дальнейшем хемиосмотический механизм был распространен на пластиды,
а также на клетки хемотрофных и фототрофных прокариотов.

Напомним, что изменение стандартной свободной энергии Гиббса (AG°,
кДж моль-1) в реакции фосфорилирования АДФ —это изменение химического по-
тенциала ортофосфата (Ф):

AG0 = Дд(Ф) = -ДТ1п[АДФ][Ф]/[АТФ].

При субстратзависимом фосфорилировании АДФ фосфорильная группа переносит-
ся от другого фосфагена, и такой процесс зависит от химического потенциала по-
следнего.

При мембранном фосфорилировании молекула АДФ непосредственно присоеди-
няет к себе ортофосфат. В этой реакции источником свободной энергии служит
трансмембранный электрохимический потенциал протонов (Pmf):

AG° = Pmf = А-0 + Ад(Н+)/Д

где Д^ — разность электрических потенциалов, Ад(Н+) — разность химических по-
тенциалов протона.

Митчел предложил рассматривать электрохимический потенциал как форму ас-
симиляции энергии. Он также постулировал, что фосфорилирование АДФ ката-
лизируется «осмоэнзимом», преобразующим свободную энергию электрохимическо-
го потенциала протонов Pmf в свободную энергию потенциала фосфорилирования
Дц(Ф). Наконец, он предположил, что эти формы ассимилированной энергии пре-
вращаются одна в другую:

Д/х(Ф) «-> Pmf.

Преобразование химического потенциала в осмотический потенциал и обратный
процесс осуществляются с помощью митчеловой АТФазы/АТФ-синтазы (см. рис.
74).

Если АТФаза/АТФ-синтаза работает в сторону гидролиза АТФ, каталитический
центр домена Fi связывает АТФ и гидролизует его терминальную фосфоангидрид-
ную связь. За счет этой экзергонической реакции осуществляется эндергонический
процесс — протоны движутся вверх по градиенту потенциальной энергии и пере-
ходят из цитоплазматического компартмента в экзоплазматический компартмент
по каналу внутри домена Fq. В результате этого экзоплазматический компартмент
закисляется, и экзоплазматическая поверхность мембраны становится более элек-
тропозитивной.

В свою очередь, если АТФаза/АТФ-синтаза работает в сторону образования
АТФ, протоны движутся через канал внутри домена Fq вниз по градиенту потен-
циальной энергии. При этом каталитический центр домена Fi связывает субстраты
(АДФ и Ф), и за счет потенциальной энергии протонов образуется терминальная
фосфоангидридная связь АТФ. В результате этого экзоплазматический компарт-
мент защелачивается, и экзоплазматическая поверхность мембраны становится бо-
лее электронегативной.

Направление реакции, которую катализирует АТФаза/АТФ-синтаза, определя-
ется соотношением между потенциалом фосфорилирования Дц(Ф) и Pmf.

Если Дд(Ф) > п х Pmf, где п —число протонов, которые переносятся через
мембрану при гидролизе одной молекулы АТФ (по разным данным, оно составляет
0,5-3,0), то за счет свободной энергии этой реакции создается Pmf. Напротив, когда
Дц(Ф) < п х Pmf, за счет использования энергии протонного градиента из АДФ и
Ф синтезируется АТФ.

Протонтранслоцирующие АТФазы обратимого действия имеются у бактерий
(FoFi-АТФазы/АТФ-синтазы) и архей (AoAi-АТФазы/АТФ-синтазы), а также у
произошедших от бактерий энергоассимилирующих органелл — митохондрий и пла-
стид

Более подробно эти ферменты мы рассмотрим в разделе 10.4.3.

Что касается мембранных АТФаз ядерных клеток (Р-АТФаз плазматической
мембраны и V-АТФаз эндомембран), то они могут только однонаправленно пре-
образовывать свободную энергию АТФ в Pmf.

Зависимость Pmf от кислотности внешней среды и pH-гомеостаз. Ве-
личина Pmf, а также знак и абсолютное значение ее электрического (Д^) и кон-
центрационного (7ДрН) компонентов зависят не только от температуры. На них
еще влияет кислотность окружающей среды и цитоплазмы. В свою очередь, посто-
янство цитоплазматического pH (pH-гомеостаз) зависит от механизмов, создающих
Pmf. Важна также пассивная проницаемость СМ для протонов или катионов Na+ —
в первом случае она выше, чем во втором. Особо критична проницаемость для про-
тонов у термофилов, а также у ацидофилов, которые сталкиваются с колоссальной
(до шести порядков) разностью концентраций этого катиона по двум сторонам мем-
браны.
В результате действия мембранных биотрансформаторов, создающих Pmf, внеш-
няя поверхность СМ всегда заряжается положительно. Внутренняя поверхность СМ
имеет меньший по величине положительный заряд или даже приобретает отрица-
тельный заряд.

Прокариоты-нейтрофилы, например, Е. coli (табл. 9) существуют при pH 5-8,5,
и pH цитоплазмы у них близок к нейтральному. При создании Pmf экзоплазматиче-
ский компартмент закисляется, причем АрН достигает 1,5 и более единиц. Значение
Pmf, ориентированной внутрь клетки, составляет около -170 мВ, и в ней примерно
поровну представлены оба компонента (AV> и ZApH).

Таблица 9. Зависимость Pmf от кислотности внешней среды

Группа (по отношению к кислотности внешней среды)	Физико-химический параметр						
	pHin	pHout	V'in	V’oUt	(V>in - V’out), мВ	ZApH (pHin-pHout), мВ	Pmf, мВ
Нейтрофилы (pH 5-8,5)	7,5	6,0	—	+	-75	90	-165
Ацидофилы (pH 0-5)	6,0	3,0	+	+	-50	180	-230
Алкалифилы (pH 8,5-11,5)	9,0	10,0	—	+	-150	-60	-90

Прокариоты-ацидофилы, например Acidithiobacillus ferrooxidans (табл. 9) разви-
ваются при высокой кислотности среды (pH 0-5). Хотя такие местообитания могут
возникать самым разным путем, экстремально кислые ниши создаются прежде все-
го в результате геотермальной активности. За счет выделения и окисления серы
и сульфида значение pH может даже опуститься ниже 0 (>1 М серной кислоты).
У ацидофилов при сохранении нейтральности внутриклеточной среды АрН дости-
гает трех и более единиц. В результате этого главным компонентом Pmf становится
ZApH, в то время как А-0 имеет относительно небольшое по абсолютной величине
значение. Pmf ориентирована внутрь клетки и составляет около -230 мВ. Внутрен-
няя поверхность СМ несет положительный заряд, что препятствует перемещению
протонов по градиенту их концентрации и способствует сохранению рН-гомеостаза.

Прокариоты-алкалифилы, например, Bacillus firmus (табл. 9) развиваются в ще-
лочной среде (pH 8,5-11,5). Такие условия создаются реже, чем кислые, и особенно
это касается экстремально щелочных ниш. Главным образом речь идет о реликтовых
содовых озерах, pH которых достигает 10,5 и более. Цитоплазматический pH алка-
лифилов сдвинут в сторону щелочных значений. Главным компонентом Pmf здесь
является А^, в то время как ZApH имеет относительно низкое значение и «инвер-
тированное» направление — цитоплазматический pH меньше экзоплазматического.
В данных условиях pH-гомеостаз цитоплазмы обеспечивается Ма+/Н+-антипорте-
ром, с помощью которого внутриклеточные катионы Na+ обмениваются на протоны
из внешней среды. Главным источником энергии для вторичного транспорта служит
Д^, который создается с помощью дыхательной цепи, перекачивающей протоны из
цитоплазмы во внешнюю среду (см. раздел 10.4.6).

Поскольку Pmf алкалифилов имеет низкое значение, тривиальный механизм
фосфорилирования АДФ с помощью Н+-АТФазы/АТФ-синтазы становится мало-
эффективным. Выход из создавшегося положения могут, в принципе, обеспечивать
два компенсаторных энергетических механизма.
В первом случае действует «натриевая» АТФаза/АТФ-синтаза, которая для фос-
форилирования АДФ использует Smf — трансмембранный потенциал катионов Na+
(см. раздел 10.4.10). Однако у большинства алкалифилов нет этого осмоэнзима, а
также нет биотрансформаторов, которые бы ассимилировали энергию в форме Smf.

Во втором случае интенсифицируется работа дыхательной электрон-транспорт-
ной цепи, создающей Pmf, причем нужно, чтобы перекачиваемые протоны не урав-
новешивались с окружающей средой, а каким-то образом концентрировались вблизи
Н+-АТФазы/АТФ-синтазы. Сегодня реальным кажется именно этот механизм, по-
скольку аэробные алкалифилы (особенно экстремальные представители этой груп-
пы) имеют повышенное содержание цитохромов и других компонентов дыхательной
системы.

В связи со сказанным попытаемся выяснить, почему ацидофилы не паразити-
руют на градиенте pH между цитоплазмой и окружающей средой, что фактиче-
ски означало бы жизнь за счет осмотической энергии? Ответ на этот «наивный»
вопрос заключается в том, что градиент pH существует не независимо от клеточ-
ных биотрансформаторов, а только благодаря им. В частности, дыхательные цепи
ацидофилов экскретируют протоны против сильного градиента их концентрации,
что позволяет сохранять pH-гомеостаз. При этом Pmf поддерживается на физио-
логическом уровне путем инверсии (положительный внутри), что достигается в
результате импорта катионов, в частности К+.

Физиологический уровень Pmf или Smf, с одной стороны, определяется пас-
сивной ионной проницаемостью СМ, а с другой стороны — отражает баланс между
экзергоническими и эндергоническими процессами. Конкретнее, имеет место цикл
«сопрягающего» иона (трансмембранный электрохимический потенциал которого
служит посредником между экзергоническими и эндергоническими процессами).
Смысл этого цикла — динамическое равновесие между выделением сопрягающего
иона с помощью мембранных электрогенераторов и поглощением сопрягающего
иона, когда клетка выполняет полезную работу.

Рассмотренные нами варианты «мембранной» энергетической стратегии прока-
риотов представлены на рис. 69.

В случае мезофилов/нейтрофилов, существующих при умеренной температуре
и одновременно с этим —при pH, близком к нейтральному, Pmf создается с по-
мощью дыхательной цепи (рис. 69, А). За счет систем гомеостаза pH цитоплазмы
поддерживается на уровне, близком к нейтральному, и внутренняя поверхность СМ
несет отрицательный заряд. Pmf используется для симпорта экзогенных субстратов
и мембранного фосфорилирования АДФ. Такую стратегию использует, в частности,
Е. coli.

Некоторые термофилы/нейтрофилы, существующие при высокой температуре,
не способны поддерживать Pmf из-за высокой проницаемости СМ для протонов.
Поэтому они запасают энергию в форме Smf с помощью Na+-транслоцирующей
АТФазы/АТФ-синтазы (рис. 69, Б). Такие бактерии решают проблему рН-гомеоста-
за путем незначительных энергетических затрат, и внутренняя поверхность СМ у
них заряжена отрицательно. Smf используется для симпорта экзогенных веществ, в
то время как фосфорилирование АДФ осуществляется на уровне субстрата. Такую
стратегию использует, в частности, Caloramator fervidus (фила ВХШ Firmicutes}.

В случае алкалифилов Pmf создается с помощью дыхательной цепи (рис. 69, В).
Смещенный в сторону щелочных значений pH цитоплазмы поддерживается на го-
меостатическом уровне с помощью Иа+/Н+-антипортера, и внутренняя поверхность
Рис. 69. Разные варианты «мембранной» энергетической стратегии прокариотов (по: Albers
et al., 2001).

А — мезофилы/нейтрофилы; Б — термофилы/нейтрофилы; В — алкалифилы; Г — ацидофи-
лы; S — молекула растворимого субстрата; D — донор электронов для дыхательной цепи; А — ак-
цептор электронов для дыхательной цепи.

СМ имеет отрицательный заряд. Для унипорта экзогенных субстратов используется
△0, а для мембранного фосфорилирования АДФ — ZApH. Такую стратегию исполь-
зует, в частности, В. alcalophilus.

Наконец, ацидофилы создают Pmf с помощью дыхательной цепи (рис. 69, Г).
Путем антипорта внешних катионов К+ и внутренних протонов pH цитоплазмы
поддерживается на уровне, близком к нейтральному. Одновременно с этим внут-
ренняя поверхность СМ приобретает положительный заряд. Pmf используется
для симпорта экзогенных субстратов и мембранного фосфорилирования АДФ. Та-
кую стратегию применяет, в частности, умеренно термофильный археот Picrophilus
oshimae (фила АП Euryarchaeota).

Рассмотрим основные типы мембранных биотрансформаторов. Напомним, что
мембранные биотрансформаторы, создающие Pmf, называются первичными транс-
портерами. В свою очередь, транспортные системы, переносящие субстрат за счет
использования Pmf, называются вторичными транспортерами (см. раздел 9.1).

У эукариотов первичные транспортеры содержатся в СМ, а также в мембра-
нах, образующих цистерны ICM. Источником энергии для первичного транспорта у
них служит гидролиз одного из двух фосфагенов—АТФ или ФФ. В первом случае
реакция катализируется V-АТФазой, во втором случае — протонтранслоцирующей
пирофосфатазой (ФФазой).

У прокариотов первичные транспортеры также содержатся в СМ и могут вхо-
дить в состав ICM (при наличии). Однако по сравнению с эукариотами прокарио-
ты имеют гораздо более широкий спектр биоэнергетических возможностей. Помимо
АТФ-зависимого и ФФ-зависимого механизмов у них выявлены еще несколько типов
мембранных биотрансформаторов (см. табл. 10).

Прежде чем перейти к примерам мембранных биотрансформаторов, отметим,
что в их состав часто входят цитохромы и железо-серные белки, простетические
группы которых содержат соответственно геминовое и негеминовое железо.

Геминовое железо лигандируется атомами азота порфиринового кольца, а вспо-
могательными лигандами служат остатки His и Met. Негеминовое железо входит в
состав [Реп8п]-кластеров, которые лигандируются остатками Cys или одновременно
остатками Cys и His. Аминокислотные лиганды всегда занимают консервативные
позиции в полипептидной цепи апопротеина.

Цитохромы. Термин «цитохром» (греч. kitos —сосуд и chroma — краска; кле-
точный пигмент) предложил в конце XIX в. английский биохимик Дэвид Кейлин
(D. Keilin).

В настоящее время цитохромами называют хромофилированные, т. е. имеющие
окрашенную группировку окислительно-восстановительные ферменты. В зависимо-
сти от молекулярной структуры и локального окружения цитохромов их редокс-
потенциал лежит в пределах от -200 до 4-600 мВ. При работе цитохромов изменяет-
ся редокс-состояние простетической группы — тетрапиррольного хелата железа, что
связано с валентным переходом:

Fe3+ + е~ ~ Fe2+.

Коричневатый цвет цитохромов обусловлен резонансной структурой хромофора,
что позволяет ему интенсивно поглощать кванты длиной волны 600-750 нм.

Цитохромы традиционно обозначают по типу гема — а, Ь, с в порядке убывания
длины волны «дальнего» максимума на разностном спектре поглощения (спектр
окисленной формы вычитается из спектра восстановленной формы). Конкретные
значения составляют 630 нм для цитохрома ад (цитохром d в новой литературе),
600 нм для цитохрома а, 560 нм для цитохрома Ь и 555 нм для цитохрома с. Более
современная классификация цитохромов основана не на этом формальном призна-
ке, а учитывает специфику аминокислотной последовательности апопротеина, тип
простетической группы и способ их взаимодействия.

Простетические группы цитохромов (рис. 70) представляют собой железопорфи-
ноиды, или гемы (греч. aimatos — кровь). Цитохромы а содержат нековалентно свя-
занный гем а, цитохромы Ь — нековалентно связанный протогем IX (гем 6), цито-
хромы с —связанный тиоэфирными связями с апопротеином протогем IX, цитохро-
мы d — нековалентно связанный гем d или сирогем (греч. sideros — железный). Две
последние простетические группы относятся к производным хлорина и имеют вос-
становленную двойную связь соответственно в пиррольных кольцах III и III/IV.
В детализированной номенклатуре цитохромов используется надстрочный или под-
строчный номер, отражающий хронологическую последовательность описания но-
вых членов этого суперсемейства (цитохром ci, цитохром с1, цитохром eg и т. д.), а
гем а

COO" COO-

CH
I

coo- coo-

гем d

сирогем

Рис. 70. Простетические группы цитохромов (гемы).
Таблица 10. Мембранные биотрансформаторы, создающие Pmf

Тип биотрансформатора	Локализация биотрансформатора	Объект-представитель

Протонофорные системы

Бактериородопсин	СМ	Halobacterium salinarium (фила АП Euryarchaeota)
Протеородопсин	—	Кластер SAR-86 (фила ВХП Proteobacteria)
FoFi-АТФаза/АТФ-синтаза	CM, ICM	Escherichia coli  (фила ВХП Proteobacteria)
Р-АТФаза	см	Methanococcus jannaschii (фила All Euryarchaeota)
ФФаза/ФФ-синтаза	CM, ICM	Rhodo spirillum rubrum (фила ВХП Proteobacteria)

Протон-электронофорные системы

НАДН-дегидрогеназа	СМ	Paracoccus denitrificans — (фила ВХП Proteobacteria)
Цитохром bci (Ьб/)-комплекс	CM, ICM	Synechococcus sp. (фила ВХ Cyanobacteria)
Гетеродисульфид-редуктаза	СМ	Methanosarcina barkeri (фила All Euryarchaeota)
Цитохром с-оксидаза	CM, ICM	Rhodobacter sphaeroides (фила ВХП Proteobacteria)

Электронофорные системы

Цитохром bd-оксидаза	СМ	Azotobacter vinelandii (фила ВХП Proteobacteria)
Система экстрацито- плазматического окисления «простых» субстратов	СМ	Achromatium oxaliferum (фила ВХП Proteobacteria)

Системы вторичного транспорта

Лактатпермеаза	СМ	Lactobacillus lactis (фила ВХШ Firmicutes)
Металлофосфат/Н+-симпортер	СМ	Acinetobacter sp.  (фила ВХП Proteobacteria)
Оксалат:формиат-антипортер	см	Oxalobacter formigenes (фила ВХП Proteobacteria)

Обозначение: (-) — локализация неизвестна.

также строчный цифровой индекс, который обозначает длину волны а-максимума
в нанометрах (например, цитохром 6563).

В зависимости от степени гидрофобности и характера распределения гидрофоб-
ных остатков по длине полипептидной цепи (профиля гидропатичности) цитохромы
относят к мембранным и растворимым. Мембраносвязанные цитохромы, в свою оче-
редь, можно подразделить на гидрофобные, амфипатические и периферические.

Железо-серные белки. Эти содержащие [Ееп8п]-кластеры редокс-белки яв-
ляются молекулярными реликтами — они унаследованы современными организма-
ми от анаэробных прокариотов, существовавших еще в докислородную эпоху. Хотя
[Ееп8п]-кластеры участвуют в важнейших окислительно-восстановительных превра-
щениях, они инактивируются в аэробной среде, и поэтому имеются преимущественно
у анаэробов. Для сохранения [Реп8п]-кластеров у аэробов создается редуцирующее
микроокружение или используются разнообразные механизмы структурной, физио-
логической и иной защиты.
Железо-серные белки функционально гетерогенны, однако их [Ееп8п]-кластеры
организованы по единому принципу. Они имеют тетраэдрическую симметрию лиган-
дирования, или нековалентного связывания железа и относятся к четырем основным
типам (рис. 71).

[Ре282]-тип

рубредоксиновый тип

Cys.

>е — S

fl I
I S— Fe

Fe—Cys

Cys

[Fe3S4]-THn

Cys

/Fe —S
S—j-Fe^ Cys
I . S-|—Fe.
Fe— SZ Cys

Cys

[Fe4S4]-Tnn

Puc. 71. Железо-серные кластеры (no: Kiley, Beinert, 2003).

Простейшим типом является [FeiSoJ-кластер, в котором единственный атом же-
леза координирован четырьмя остатками Cys. Основной тип — это моноромбический
[ЕегЗгркластер, на основе которого формируются триромбический [ГезЗ^-кластер
и гексаромбический [Гв484]-кластер.

Большинство [Ееп8п]-кластеров лигандирует атомы неорганической серы, кото-
рую называют кислотолабильной, поскольку при протонной атаке она выщепляется
в виде сульфида.

Подобно гемам, [Ееп8п]-кластеры служат одноэлектронными переносчиками
между партнерами в донор-акцепторной паре, и их окислительно-восстановитель-
ные свойства также определяются белковым окружением.

Среди железо-серных белков, входящих в состав мембранных биотранс-
форматоров, особое место занимают ферредоксины (лат. ferrum — железо и
англ, reduction/oxidation — окисление/восстановление; окислительно-восстанови-
тельный железопротеин). Этот термин предложил в начале 1960-х годов Мортенсон
(L. Е. Mortenson) для обозначения редокс-активного коричневого белка, выделенно-
го из диазотрофной бактерии Clostridium pasteurianum.

Ферредоксины образуют суперсемейство кислых низкомолекулярных (6-13 кДа)
растворимых белков, содержащих [Ееп8п]-кластеры. Собственно ферредоксины об-
ладают высоким по абсолютной величине электронегативным редокс-потенциалом
(порядка -400 мВ), благодаря чему они могут использоваться в качестве сильного
восстановителя или участвовать в окислении низкопотенциальных доноров элек-
тронов. Классификация ферредоксинов учитывает содержание в них негеминового
железа и кислотолабильной серы, величину спинового сигнала (g), окислительно-
восстановительные свойства, источник происхождения, особенность методики пре-
паративного выделения и т.д.

В отдельную группу ферредоксинов входят высокопотенциальные железопротеи-
ны (англ, high-potential iron-sulfur protein; HiPIP), имеющие редокс-потенциал около
+300 мВ. Они функционируют сопряженно с высокопотенциальными цитохромами
с-типа и используются для окисления «слабых» (высокопотенциальных) доноров
электронов. Например, HiPIP пурпурной серной бактерии Chromatium vinosum со-
держит [Рв484]-кластер и выступает в роли акцептора электронов для тиосульфат-
окисляющего фермента.

Классификация мембранных биотрансформаторов, создающих Pmf.
По принципу действия все мембранные биотрансформаторы, создающие Pmf, можно
разбить на три группы:

—	протонофорные системы (греч. phoros — несущий), которые играют роль про-
тонного канала;

—	протон-электронофорные системы, которые транслоцируют протоны и одно-
временно с этим переносят электроны от донора к акцептору, расположенному на
той же самой или на противоположной стороне мембраны;

—	электронофорные системы, переносящие электроны от донора к акцептору,
которые расположены на разных сторонах мембраны; при этом протоны освобож-
даются на экзоплазматической поверхности и заимствуются из цитоплазмы, что
приводит соответственно к закислению экзоплазмы и защелачиванию цитоплазмы.

Кроме того, некоторые бактерии способны создавать Pmf косвенным путем, ис-
пользуя для этого системы вторичного транспорта (см. раздел 9.1.1).

В сответствии с принципом действия такие мембранные биотрансформаторы
можно разбить на две группы:

—	экспортерные системы, которые симпортируют протоны и конечный продукт
метаболизма;

—	импортерно-экспортерные системы, которые антипортируют субстрат и про-
дукт его цитоплазматического декарбоксилирования, что приводит к увеличению
электрического потенциала на экзоплазматической поверхности мембраны за счет
импорта отрицательного заряда или экспорта положительного заряда.

10.4.1.	Протонофорная система: бактериородопсин

Данный светозависимый электрогенератор впервые обнаружили Дитер Эстер-
хельт (D. Oesterhelt) и Вальтер Стекениус (W. Stoeckenius) в 1971 г. у экстремально
галофильного археота Halobacterium salinarium. Подобно многим таксономическим
названиям и терминам, относящимся к археям, термин «бактериородопсин» несет
на себе отпечаток того времени, когда этих микроорганизмов считали бактериями.
Наряду с позже описанным бактериальным протеородопсином бактериородопсин —
наиболее рационально устроенный генератор Pmf.

Белковая часть, или бактериоопсин (27 кДа) состоит из 249 аминокислотных
остатков и образует семь интегральных доменов А-G (рис. 72). Домен G содержит
консервативный остаток Lys-216, с которым ковалентно связан каротиноид ретиналь
(рис. 73). В результате взаимодействия бактериоопсина с ретиналем образуется фи-
олетовый хромопротеин — бактериородопсин.
Рис. 72. Бактериородопсин.

A-G — интегральные спирали.

В молекуле бактериородопсина белок соединен с хромофором через карбоимин-
ную группировку (-CH=N:-), или «шиффово основание» (англ. Schiff base), которое
за счет двух неспаренных электронов при атоме азота может существовать в альтер-
нативных формах — протонированной и депротонированной. При поглощении «зе-
леных» квантов (А=520 нм) бактериородопсин активируется и проходит через серию
короткоживущих возбужденных состояний, которые образуют фотоцикл общей про-
должительностью 2-10“2 с. Свободная энергия запасается путем изменения конфор-
мации полипептидной цепи, а также trans-cis изомеризации ретиналя в положении
13:14 (рис. 73).

В одном из промежуточных возбужденных состояний бактериородопсина шиф-
фово основание депротонируется; протон передается по цепочке аминогрупп и
карбоксильных групп на экзоплазматическую поверхность СМ. Протонированная
форма шиффова основания регенерируется путем заимствования протона из цито-
плазматического компартмента.

Многократное повторение фотоцикла обеспечивает транслокацию протонов в эк-
зоплазму, в результате чего и создается Pmf.

10.4.2.	Протонофорная система: протеородопсин

При проведении PCR-зондирования эуфотической зоны прибрежных вод и сво-
бодной акватории Атлантического и Тихого океанов в 2001 г. Веха (O.Beja) об-
наружил у «фантомных» бактерий ген нового ретинопротеина — протеородопсина.
Рис. 73. Ретиналь.

Показана ось trans-cis изомеризации в положении 13:14.

Обладающие им штаммы относятся к кластеру SAR86, который входит в класс «А1-
phaproteobacteria» (фила ВХП Proteobacteria).

Бактериальный ген протеородопсина высоко гомологичен гену археотного бакте-
риородопсина. Путем трансформации он был введен в хромосому Е. coli, и продукт
его экспрессии оказался сходным с археотным бактериородопсином по третичной
структуре, локализации хромофора, а также временным параметрам фото цикла.
Поскольку бактерии, содержащие протеородопсин, относятся к некультивируемым
формам, неизвестно, следует ли рассматривать их как фотогетеротрофов или как
фотоавтотрофов с уже известным или новым путем ассимиляции неорганическо-
го углерода. Неясно также, являются они истинными фототрофами или это квази-
фототрофы (см. раздел 12.7.6.2).

10.4.3.	Протонофорная система: бактериальная
FoFi-АТФаза/АТФ-синтаза и археотная

А0А1-АТФаза/ АТФ-синтаза

Бактериальная FoFi-АТФаза/АТФ-синтаза (от англ, fraction) имеется у всех бак-
терий, а также у произошедших от них митохондрий и пластид. У хемотрофных
бактерий этот фермент находится в СМ, а у большинства фототрофных бактерий
он входит в состав ICM (в митохондриях и пластидах в состав гомологов ICM —
крист и тилакоидов).

Археотная AoAi-АТФаза/АТФ-синтаза (от лат. Archaea) имеется у всех архей, за
исключением рода Thermoplasma. Поскольку археи не обладают ICM, единственным
местом локализации этого фермента является СМ.

Действие бактериальных FoFi-АТФаз/АТФ-синтаз и археотных AqAi-
АТФаз/АТФ-синтаз обратимо: они преобразуют свободную энергию Pmf в свобод-
ную энергию АТФ или, наоборот, поддерживают Pmf за счет энергии гидролиза
АТФ.
В физиологических условиях FoFi-АТФазы/АТФ-синтазы и AqAi-
АТФазы/АТФ-синтазы преимущественно выполняют роль АТФ-синтаз. В связи с
этим отметим, что хотя мембранное фосфорилирование и не зависит от способа
энергизации мембраны, реакцию, которая сопутствует фототрофии и катализиру-
ется АТФ-синтазой, или фактором сопряжения (англ, coupling factor, CF) упорно
называют «фотосинтетическим фосфорилированием»; в свою очередь, «окислитель-
ным фосфорилированием» называют реакцию, которая сопутствует хемотрофии.

В дальнейшем мы увидим, что помимо протонофорных FqFi-АТФаз/АТФ-
синтаз способностью обратимо трансформировать энергию градиента катионов
(Imf) в энергию АТФ обладают бактериальные Ка+-транслоцирующие FqFi-
АТФазы/АТФ-синтазы (см. раздел 10.4.10).

У эукариотов существует другая филогенетическая группа двухдоменных АТФаз. Это «ваку-
олярные» VoVi-АТФазы (от англ, vacuole). В их состав входят не менее двенадцати субъединиц
Аз : Вз : С : D : Е : F : Gy : Hz : а: d : е: Сб- Вакуолярные АТФазы связаны с мембранами, окружающи-
ми лизосомы, хромаффиновые гранулы и клатриновые пузырьки. В виде исключения, они содер-
жатся в СМ остеокластов позвоночных животных.

Во всех перечисленных случаях фермент обладает однонаправленным действием и за счет
гидролиза АТФ создает Pmf, которая используется для транспорта, сигналинга и поглощения пи-
тательных субстратов.

Мембранные АТФазы у представителей трех филогенетических доменов сходны
по архитектуре и состоят из трех частей: интегрального ионного канала Fo/Ao/Vq,
соединительного стебелька и периферической каталитической головки F1/A1/V1.

Бактериальная FqFi-АТФаза/АТФ-синтаза. Данная протонофорная систе-
ма представляет собой «осмоэнзим», т. е. фермент, преобразующий химическую
энергию в осмотическую. Он либо синтезирует АТФ благодаря использованию Pmf,
либо создает Pmf за счет гидролиза АТФ.

Бактериальная FqFi-АТФаза/АТФ-синтаза, изученная в основном на примере
Е. coli, состоит из двух доменов — интегрального (Fq) и периферического (Fi). Она
имеет суммарную молекулярную массу ~500 кДа и построена из восьми типов субъ-
единиц аз Дз : 7: 5 : £ : а: Ьз : С9-12- По сложности строения она уступает митохондри-
альной АТФ-синтазе (>11 субъединиц).

Интегральный домен Fq (150 кДа) состоит из трех типов субъединиц в соотно-
шении 1:2: (9-12):

—	а (30 кДа; ген афВ);

—	b (17 кДа; ген aipF);

—	с (8,1 кДа; ген afpE; из-за очень высокой гидрофобности названа «протеоли-
пидом»; служит мишенью для ингибитора дициклогексил-карбодиимида, DCCD).

Периферический домен Fi(350 кДа) состоит из пяти субъединиц в соотношении
3:3:1:1:1:

—	а (53-57 кДа; ген aipA);

—	/3 (50-54 кДа; ген afpD);

—	7 (30-38 кДа; ген aipG);

—	5 (15-21 кДа; ген atpH; гомолог митохондриальной субъединицы OSCP, или
фактора чувствительности к олигомицину);

—	е (6-15 кДа; ген atpC).

В интактном комплексе FoFi-АТФазы/АТФ-синтазы морфологически различа-
ются три части — цитоплазматическая головка диаметром ~90А, соединительный
стебелек (диаметр ~50А, длина ~4бА) и мембранное основание. В настоящее время
показано, что стебелек состоит из двух частей: центральной части и внешней части,
образованной Ьг-субъединицами (рис. 74).

Рис. 74- АТФаза/АТФ-синтаза (по: Dimroth, 2000).

Греческими и латинскими буквами обозначены белковые субъ-
единицы. Снизу указано направление вращения ротора при гидро-
лизе АТФ.

Интегральный домен Fo находится в мембране и состоит из диска, образован-
ного с-субъединицами; каждая из них представляет собой а-спиральную шпильку.
Мебранная а-субъединица исключительно гидрофобна и состоит из пяти интеграль-
ных а-спиралей. Димер b-субъединиц взаимодействует с доменом Fi при посредстве
5-субъединицы, локализованной в верхней части цитоплазматической головки сна-
ружи от тримера а/З-субъединиц (рис. 74).

Периферический домен Fi имеет форму неправильного сфероида диаметром
9-9,5 нм и образован гексамером чередующихся а- и /3-субъединиц. Сквозь его внут-
реннюю полость проходит асимметричная 7-субъединица, состоящая из двух вза-
имно перевитых ct-спиралей (рис. 74). Интегральный домен Fo выполняет функцию
канала, который пропускает протоны по градиенту их концентрации.

Периферический домен Fi содержит сайты связывания АТФ, АДФ и неорганиче-
ского фосфата (числом шесть), которые расположены на субъединицах обоего типа.
Каталитические центры, осуществляющие образование или гидролиз АТФ (числом
три), находятся только на /3-субъединицах. Домен Fi относительно слабо связан с
доменом Fq, легко диссоциирует от него в бесклеточных препаратах и тогда стано-
вится растворимой АТФазой. Напротив, в клетке связь между ними прочна. В этом
отношении бактериальный фермент сходен с археотным и отличается от эукариот-
ного, где домены Vi и Vo способны обратимо диссоциировать друг от друга, что
лежит в основе регуляции его активности.

В настоящее время блестяще подтвердилась гипотеза Питера Митчела о том, что двухдомен-
ная АТФаза/АТФ-синтаза представляет собой ротационное устройство, преобразующее энергию
Pmf или энергию гидролиза АТФ в механическую энергию. Другим примером такого биологиче-
ского мотора служит прокариотный жгутик (см. I том учебника). Однако он использует в качестве
источника энергии только Pmf или Smf и не обладает обратимым действием.

Роторная часть домена Fq имеет состав cg-i27£ и представлена диском, состоящим из девяти-
двенадцати идентичных с-субъединиц, от которого отходит ось, образованная 7-субъединицей и е-
субъединицей. Функцию статора выполняют субъединицы аЬ2<5о!б/Зб (рис. 74).

При гидролизе одной молекулы АТФ происходит конформационное изменение оД-субъединиц,
которое создает торзионное усилие, действующее на 7-субъединицу, и она проворачивается внутри
головки F; на 120°, увлекая за собой е-субъединицу вместе с диском 09-12- Это сопровождается
депротонированием четырех с-субъединиц, находящихся напротив а-субъединицы. Как показали
исследования на точечных мутантах, ключевую роль в транслокации протонов выполняют остатки
Arg-210, Glu-219 и His-245 а-субъединицы.

Протонный канал, или «пора» находится на границе раздела между а-субъединицей и с-диском.
Через него протоны переходят в экзоплазматический компартмент, в результате чего создается
Pmf. Таким образом, сопряжение между гидролизом или синтезом АТФ и транслокацией протонов
через мембрану достигается в результате взаимодействия между диском и а-субъединицей домена
F0.

Механизм действия АТФ-синтазы изучен в основном на митохондриях. По-видимому, он такой
же и для прокариотных АТФаз/АТФ-синтаз. Установлено, что при гидролизе АТФ 7-субъединица
вместе с с-субъединицей вращаются против часовой стрелки (если смотреть изнутри клетки). За
один полный оборот 7-субъединицы гидролизуются три молекулы АТФ, причем к.п.д. процесса
преобразования химической энергии в механическую приближается к 100%. При синтезе АТФ
7-субъединица вращается в обратном направлении. Движущей силой служит Pmf, т. е. поворот
7-субъединицы обеспечивается транслокацией протонов через Fo-домен АТФ-синтазы.

Археотная AqAi-АТФаза/АТФ-синтаза. Этот осмоэнзим устроен сложнее
бактериального и содержит субъединицы десяти типов Аз:Вз:С:В:Е:Г:С:Н:1:Кх.

Археотная АоА1-АТФаза/АТФ-синтаза, изученная в основном на примерах
Methanosarcina mazei и Sulfolobus acidocaldarius, состоит из двух доменов — инте-
грального (Ао) и периферического (Ai).

Интегральный домен состоит из IK-субъединиц, причем I-субъединица является
эквивалентом а-субъединицы бактерий. К-субъединица (ее стехиометрическое соот-
ношение с остальными неизвестно) эквивалентна с-субъединице бактерий и образует
диск.

Периферический домен состоит из субъединиц ABCDF (65, 51, 41, 24 и 11 кДа).
Диаметр комплекса A3B3CDF составляет ~90А. Подобно бактериальным оД-субъ-
единицам, АВ-субъединицы выполняют каталитическую функцию.

CDEFG-субъединицы образуют соединительный стебелек (диаметр ~60А, длина
~8бА).

Эволюция мембранных АТФаз. Аминокислотные последовательности ката-
литических субъединиц, входящих в состав прокариотных АТФаз/АТФ-синтаз (оД
и АВ) и эукариотных АТФаз (АВ), гомологичны более чем на 25%, что свидетель-
ствует о происхождении всех двухдоменных АТФаз от общего прототипа.

Субъединицы стебелька у бактерий (75562), архей (CDEFG) и эукариотов
(CDEFGH) различаются более существенно, что говорит о глубокой дивергенции
мембранных АТФаз у представителей трех эволюционных доменов, хотя в це-
лом, судя по набору субъединиц и их первичной структуре, археотная мембранная
АТФаза эволюционно ближе к эукариотному ферменту, чем к бактериальному.
10.4.4.	Протонофорная система: Р-АТФаза

Ферменты, относящиеся к данному суперсемейству, образуют фосфорилирован-
ный промежуточный продукт, или интермедиат. Этим и объясняется их название
(от англ, phosphorylated). Они специфически ингибируются ортованадатом — стери-
ческим аналогом ортофосфата.

Протонофорные Р-АТФазы, входящие в состав СМ, широко распространены у
эукариотов. Они действуют только в направлении гидролиза АТФ.

Эукариотные Р-АТФазы содержат главную каталитическую субъединицу
(>100 кДа), в которой насчитываются до десяти интегральных доменов, и одна-две
вспомогательные некаталитические субъединицы. Большая периферическая петля,
расположенная в главной субъединице между доменами IV и V, содержит активный
центр для гидролиза АТФ (рис. 75). В зависимости от того, фосфорилирован или не
фосфорилирован консервативный сайт Asp в составе этой петли, фермент может на-
ходиться в альтернативных конформационных состояниях — латентном нефосфори-
лированном состоянии Ei (от англ, enzyme) и активированном фосфорилированном
состоянии Е2.

Рис. 75. Р-АТФаза.

I—VIII — интегральные спирали; темными кружками обозначены сайты
фосфорилирования и гидролиза АТФ.

У бактерий представители суперсемейства Р-АТФаз также входят в состав СМ.
Однако вместо того, чтобы обеспечивать АТФ-зависимый экспорт протонов, они
переносят катионы Na+/K+, Са2+, Mg2+ или Си2+.

В полностью секвенированном геноме метаногенного археота Methanococcus jan-
naschii присутствует нуклеотидная последовательность, гомологичная консерва-
тивному участку «эукариотного» гена протонтранслоцирующей Р-АТФазы, одна-
ко еще неизвестно, какова физиологическая функция возможного продукта ее
экспрессии.
10.4.5.	Протонофорная система: ФФаза/ФФ-синтаза

Протонтранслоцирующая «неорганическая» пирофосфатаза имеется в составе
эндомембран у ряда простейших и некоторых Chlorophyceae, а также в тонопласте
высших растений, где она используется наряду с V-АТФазой для закисления этого
компартмента.

У прокариотов протонтранслоцирующая ФФаза встречается довольно редко.
В настоящее время она обнаружена только у фототрофной бактерии Rhodospiril-
lum rubrum и хемотрофных бактерий Syntrophus gentianae и Thermotoga maritima,
а также у некоторых представителей метаногенных и термоацидофильных архей.

Установлено, что у R. rubrum ФФаза входит в состав ICM. Данный фермент ис-
ключительно гидрофобен, что затрудняет его выделение с целью биохимического
анализа. Показано, что ФФаза обладает как пирофосфатазной, так и пирофосфат-
синтазной активностью, т. е. это единственный пример функционального аналога
FqF 1-АТФазы / АТФ-синтазы.

Согласно результатам секвенирования гена ФФазы/ФФ-синтазы, а также по дан-
ным анализа мембранных препаратов R. rubrum, данный фермент существует в
виде гомодимера. Мономер (67-72 кДа) содержит 660-700 аминокислотных остат-
ков и состоит из шестнадцати интегральных доменов. Полярность расположения
ФФазы/ФФ-синтазы в мембране соответствует таковой FoFi-АТФазы/АТФ-синта-
зы, т. е. каталитическая субъединица ориентирована в сторону цитоплазмы. Так же,
как и в случае АТФ, стехиометрия хемиосмотического процесса составляет 0,5-2 Н+
на молекулу фосфагена.

10.4.6.	Протон-электронофорная система:
цитохром bci(bGf)-комплекс

Это важнейший и наиболее распространенный электрогенератор, который игра-
ет роль центрального звена электрон-транспортных цепей. Им обладают все фото-
трофы, а также большинство хемотрофов. В виде исключения цитохром bcifbefy
комплекс отсутствует у некоторых членов семейства Lactobacillaceae, а также у «ав-
тотрофных» (не использующих метанол и ацетат) метаногенных архей.

В состав цитохром bc^bef)-комплекса входят два цитохрома — цитохром 5-типа
и цитохром с-типа, а также железо-серный белок Риске. Поэтому точное название
этого комплекса— «железо-серный белок Риске/цитохром bci (6g/)-комплекс» (англ.
Rieske iron-sulfur protein/cytochrome 6c-complex, RBC). Применительно к цианобак-
териям и пластидам цитохром с называют цитохромом f (от лат. frons — листва).

У цианобактерий цитохром Ь$/-комплекс состоит из четырех субъединиц
(рис. 76):

—	белка Риске (20 кДа; ген petC)\

—	цитохрома 6563 (24 кДа; ген petB\,

—	цитохрома /557 (32 кДа; ген petA)\

—	субъединицы IV (17 кДа; ген petD).

В хромосоме цианобактерии Nostoc sp. гены, кодирующие субъединицы цито-
хром 6б/-комплекса, организованы в опероны pet С А и petBD. У бактерий цитохром
6 кодируется генами-ортологами (гомологичные гены у разных организмов), в то
время как у архей это могут быть гены-паралоги (гомологичные гены в составе
одного и того же генома). Хотя в большинстве случаев гены цитохром 6ci(6g/)-
Рис. 76. Цитохром bc\ (6б/)-комплекс (по: Пиневич, Аверина, 2002).

R, f и IV — белковые субъединицы; L и Н — геминовые группы цитохрома Ь; темный
квадрат—[Ре434]-кластер белка Риске; темный ромб — геминовая группа цитохрома /;
Q — хинон; Qp — хинонный пул; D — растворимый донор электрона.

комплекса экспрессируются конститутивно, в некоторых физиологических услови-
ях он не функционирует, в частности в отсутствии кислорода у облигатно аэробных
бактерий.

Результаты сравнения аминокислотной последовательности апоцитохрома Ь, а
также белка Риске для филогенетически удаленных объектов свидетельствуют об
очень древнем происхождении этого генератора Pmf. Скорее всего, он входил в со-
став биоэнергетической системы прогенота —общего предка доменов Bacteria, Ar-
chaea и Еисагуа (см. I том учебника). В отличие от прокариотов эукариоты в ходе
эволюции не сохранили этот генератор Pmf, и поэтому они используют мембранные
системы ассимиляции энергии, полученные «в приданное» прокариотных эндосим-
бионтов — митохондрий и пластид.

Железо-серный белок Риске и цитохром Ь-типа обладают консервативной струк-
турой, что также характерно для цитохрома ci большинства прокариотов. Однако
известны исключения — цитохром f цианобактерий не гомологичен цитохрому ci.
В свою очередь, гелиобактерия Heliobacillus mobilis обладает нестандартным цито-
хром &с-комплексом, в состав которого входит дигемовый цитохром с. Наконец, у
зеленой серной бактерии Chlorobium limicola в этом комплексе вообще отсутствует
цитохром с.

Цитохром Ьс1(6б/)~комплекс выполняет роль хинол щитохром с-оксидоредукта-
зы, т. е. он передает электроны от восстановленного хинона периферическому, или
«растворимому» цитохрому с.

Механизм работы цитохром &С1(&б/)-комплекса одинаков у бактерий, архей, ми-
тохондрий и пластид — в основе лежит способность хинонов одновременно выпол-
нять функцию электронофора (переносчика электронов) и протонофора (перенос-
чика протонов). Хиноны, входящие в состав хинонного пула, числом до 50 молекул,
не только диффундируют в плоскости мембраны, но и «кувыркаются», переходя из
одного пол у мембранного листка в другой.

Цитохром bci (Ьб/)-комплекс аэробных бактерий и митохондрий окисляет восста-
новленную форму убихинона — убихинол (англ, ubiquinol, UQH2), цианобактерий и
пластид — пластохинол (англ, plastoquinol, PQH2), анаэробных организмов — мена-
хинол (англ, menaquinol, MQH2) (рис. 77). Акцептором электронов служит раство-
римый цитохром с или, в случае цианобактерий и пластид, медьсодержащий белок
пластоцианин. Одновременно с переносом электронов от одного компонента цито-
хром Ьс\(&б/)-комплекса к другому восстановленный хинон транслоцирует протоны
из цитоплазмы в экзоплазму в стехиометрическом соотношении 2Н+/е_.

убихинон-10

менахинон-7

О

О

пластохинон-9

Рис. 11. Хиноны, взаимодействующие с цитохром Ьс1(Ьб/)-комплексом.

В составе цитохром &С1(Ьб/)-комплексов имеются четыре простетические группы,
переносящие электроны. Две из них принадлежат соответственно цитохрому Ci(/)
и белку Риске и имеют высокий редокс-потенциал (> 0 мВ). Две другие входят в
состав дигемового цитохрома Ь и имеют низкий редокс-потенциал (< 0 мВ).

Гипотетический механизм работы цитохром bci(b6^-комплекса, или «Q-цикл»
(от англ, quinone) был предложен Питером Митчелом в 1975-1976 гг.; в настоящее
время он полностью доказан на экспериментальном материале.

В ходе Q-цикла на противоположных концах внутримембранной частицы цито-
хром bci(bef )-комплекса, преимущественно на молекуле апоцитохрома Ь, расположе-
ны два сайта для связывания хинона. Один из них — Qox (от англ, oxidation), или Qp
(от англ, positive) находится близко к экзоплазматической поверхности мембраны.
В этом сайте восстановленный хинон окисляется (QH2 —» Q + 2е_ + 2Н+). Другой
сайт для связывания хинона—Qred (от англ, reduction), или Qn (от англ, negative)
находится близко к цитоплазматической поверхности мембраны. В нем окисленный
хинон восстанавливается (Q + 2е_ + 2Н+ —> QH2).

Восстановленный хинон (QH2) связывается с Qox-сайтом и теряет один за другим
два электрона (рис. 76). Первый из них передается [РегЗгркластеру белка Риске.

Белок Риске представляет собой интегральный железо-серный белок, названный
в честь американского исследователя (J. S. Rieske), который впервые обнаружил его
в митохондриях кардиомиоцитов быка. Он характеризуется высоким значением ре-
докс-потенциала (от +280 до +320 мВ). Лигандами для простетической [ГегЯгргруп-
пы служат остатки His и Cys, что отличает белок Риске от ферредоксинов, у которых
лигандирование [Реп8п]-кластеров осуществляется только через остатки Cys.

От белка Риске электрон передается гему цитохрома Ci(/), имеющему высокий
редокс-потенциал (от +318 до +365 мВ). Тот, в свою очередь, восстанавливает высо-
копотенциальный эпимембранный акцептор — цитохром с или пластоцианин (+400
мВ). В результате первого акта окисления хинон превращается в более низкопотен-
циальный семихинон (QH ), который восстанавливает расположенный по соседству
с Qox-сайтом низкопотенциальный (-150 мВ) гем цитохрома b — (от англ. low).
Последний передает электрон высокопотенциальному (-45 мВ) гему Ьц (от англ,
high), находящемуся на противоположной стороне мембраны поблизости от Qred-
сайта. Наконец, гем Ьц восстанавливает окисленный хинон (Q) в семихинон (QH-),
который временно остается в Qred-caftTe.

За два оборота Q-цикла семихинон превращается в полностью восстановленный
хинон (QH2), который проявляет низкое сродство к Qred-caftTy и переходит в липид-
ную фазу мембраны, где он вливается в смешанный пул окисленных и восстанов-
ленных молекул хинона.

Таким образом, хинон полностью восстанавливается за два полных оборота Q-
цикла. За это время две молекулы QH2 окисляются, два электрона передаются рас-
творимому низкопотенциальному акцептору (цитохрому с или пластоцианину) и че-
тыре протона транслоцируются в экзоплазматическое пространство. Расход QH2
пополняется за счет двухэлектронного восстановления молекулы Q, которая извле-
кается из общего хинонного пула.

При фототрофии QH2 регенерируется неферментативным способом. Это про-
исходит в акцепторном участке фотосинтетического реакционного центра, и элек-
троны спонтанно передаются от молекул хлорофилла, активированных видимым
светом (см. раздел 12.7.2). При хемотрофии QH2 регенерируется в результате фер-
ментативных дегидрогеназных реакций, и электроны передаются от низкопотен-
циальных доноров — экзогенных химических субстратов или эндогенных запасных
веществ.
10.4.7.	Электронофорные системы: экстрацитоплазматическое
окисление «простых» субстратов

Генераторы Pmf, относящиеся к данному типу, используются в разных вариантах
хемолитотрофии у бактерий и архей. Они действуют сходным образом (рис. 78). При
окислении субстрата, находящегося в периплазматическом или экзоплазматическом
пространстве, электроны переносятся к акцептору, расположенному на внутренней
поверхности СМ, которая в результате этого становится более электроотрицатель-
ной. Одновременно с этим экзоплазматический компартмент обогащается протона-
ми. Таким образом, создаются оба компонента электрохимического потенциала —
△V’ и

СМ

2е"

цитоплазматический
компартмент

Рис. 78. Генератор Pmf, действующий по принципу экс-
трацитоплазматического окисления «простых»
субстратов.

D — растворимый донор электронов; А — растворимый
акцептор электронов.

Окисление субстрата называется «экстрацитоплазматическим», если оно проис-
ходит снаружи цитоплазматического компартмента, т. е. в периплазме или в экзо-
плазме (у грамотрицательных бактерий) или в экзоплазме (у грамположительных
бактерий и архей). В свою очередь, ферменты или мультиферментные системы на-
зываются экстрацитоплазматическими, если они растворены в периплазме или эк-
зоплазме, а также если они связаны с внешней поверхностью СМ.

Под «простыми» субстратами подразумеваются простые вещества (например, S0
или Нг), катионы металлов переходной валентности (например, Fe2+ или Мп2+),
многоатомные неорганические катионы (например, NH^), неорганические оксиды
(например, СО), неорганические кислотные остатки (например, S2- или SgOj-), а
также метан (СЩ) и его окисленные производные (например, СН3ОН).

Экстрацитоплазматическое окисление простых субстратов осуществляется с по-
мощью интегральных, периферических или секретируемых дегидрогеназ.

В зависимости от происхождения экзоплазматических протонов можно выделить
три типа реакций, связанных с экстрацитоплазматическим окислением простых суб-
стратов.

В первом случае источником протонов служит сам окисляемый субстрат:

DH2 -> D + 2Н++ 2е",

где D —донор электронов (от англ, donor).

Пример такой реакции — окисление сульфида пурпурной серной бактерией Thio-
capsa roseopersicina или бесцветной серной бактерией Achromatium oxaliferum (см.
раздел 11.4.4.6):
H2S -4 S° + 2H+ + 2e-.

Во втором случае субстрат служит только источником электронов, а источником
протонов становится молекула воды:

D + Н2О -> DO + 2Н+ + 2е".

Подобную реакцию осуществляют бактерии, окисляющие нитрит, в частности
Nitrobacter winogradskyi (см. раздел 11.4.4.5):

NO2 + Н2О -> NO3 + 2Н+ + 2е~.

В третьем случае энзиматическая реакция окисления простого субстрата может
вообще не приводить к высвобождению протонов, как это происходит у тионовой
бактерии Acidithiobacillus ferrooxidans (см. раздел 11.4.4.7):

Fe2+ -» Fe3+ + е“.

Тогда протоны являются продуктом абиотической реакции гидролиза окисного
железа:

Fe3+ + ЗН2О Fe(OH)3 + ЗН+.

Электроны от субстрата векторно переносятся через СМ при помощи металсо-
держащих редокс-центров.

Терминальный акцептор электронов (в том числе, молекулярный кислород) рас-
положен на внутренней стороне СМ. Он восстанавливается редуктазой (в частности
кислородредуктазой, или оксидазой) и одновременно с этим протонируется:

А + 2е" + 2Н+ - АН2,

1/2О2 + 2е- + 2Н+ -> Н2О.

У пурпурной бактерии Rhodobacter capsulatus роль акцептора электронов в анаэ-
робных условиях выполняют свободные протоны в цитоплазме:

2Н+ + 2е"	Н2.

Хотя во всех описанных примерах через мембрану переносятся только электро-
ны, неравновесное осмотическое распределение протонов достигается за счет обога-
щения ими экзоплазматического компартмента.

Особый случай экстрацитоплазматического окисления простых субстратов — это ферментатив-
ное окисление воды. Оно осуществляется кислородвыделяющим комплексом оксигенных фототро-
фов, который расположен на экзоплазматической поверхности тилакоида и катализирует реакцию
(см. раздел 12.7.4):

Н2О -> 1/2О2 + 2Н+ + 2е“.
Реакция окисления молекулы воды не приносит свободной энергии, и чтобы она сдела-
лась экзергоничной (AG0' < 0), необходимо использовать энергию четырех квантов красного
света (см. раздел 12.7.4). Хотя вода не является хемолитотрофным энергоносителем, освобож-
дающиеся при ее окислении протоны создают электрохимический градиент. Из этого следует,
что оксигенную фототрофию можно одновременно рассматривать и как «водяную» хемолито-
трофию.

Протоны (в данном случае главный компонент Pmf — это ДрН) накапливаются внутри тила-
коида в результате действия двух электрогенераторов:

—	цитохром Ьб/-комплекса (со стехиометрией 2Н+/е_);

—	кислородвыделяющего комплекса (со стехиометрией Н+/е_).

Таким образом, при оксигенной фототрофии окисление воды в полости тилакоида обеспечивает
~30% суммарной ассимилированной энергии.

10.4.8.	Экспортерная система: симпорт Н+ и конечного
продукта

Эндогенные продукты метаболизма могут выходить из клетки путем пассивной
диффузии только по градиенту концентрации и только в том случае, если они об-
ладают липофильными свойствами.

В свою очередь, на пути свободной диффузии эндогенных гидрофильных моле-
кул стоит барьер СМ, и поэтому для их экскреции необходимы переносчики-пер-
меазы. Их роль могут выполнять системы активного импорта (см. рис. 64), кото-
рые начинают работать в обратном направлении, если накопление субстрата внутри
клетки делает экспорт термодинамически «выгодным».

При импорте субстрата против его концентрационного градиента симпортер ис-
пользует в качестве движущей силы градиент Н+, направленный внутрь клетки (см.
раздел 9.1.1). В свою очередь, при экспорте эндогенного продукта его концентраци-
онный градиент направлен наружу. Это служит источником энергии для переноса
катионов Н+ против их концентрационного градиента, в результате чего создает-
ся АрН. В такой ситуации А-0 возникает только если транслоцируется суммарный
положительный заряд, т. е. когда экспорт моновалентного аниона сопровождается
транслокацией двух протонов.

Описанный нами механизм создания Pmf используют некоторые представители
ферментирующих бактерий (помимо основного для них способа — за счет гидролиза
АТФ при помощи FoFi-АТФазы).

В качестве примеров можно назвать экспорт лактата у молочнокислой бакте-
рии Lactobacillus lactis, ацетата —у ацетогенной бактерии Syntrophomonas wolfei и
сукцината —у возбудителя «смешанных» брожений Е. coli.

Эндогенный лактат при низких значениях цитоплазматического pH существует
в недиссоциированной форме и выходит из клетки посредством пассивной диффу-
зии. При значениях pH, близких к нейтральному, лактат диссоциирован и может
преодолеть барьер СМ только путем активного переноса. В результате симпорта
лактата вместе с двумя протонами создаются оба компонента Pmf — осмотический
и электрический. По некоторым данным, молочнокислые бактерии обеспечивают
таким путем до 30% энергии Pmf.

К рассмотренному примеру логически примыкает механизм образования Pmf, обнаруженный в
середине 1990-х годов у Acinetobacter sp. (класс «Gammaproteobacteria»). Правда, в данном случае
экспортируется не конечный продукт метаболизма, а запасное вещество. При избытке питательных
субстратов эта бактерия накапливает большое количество неорганических полифосфатов, отрица-
тельный заряд которых нейтрализуется катионами Са2+ и Mg2+ (см. I том учебника). При деполи-
меризации полифосфата образуется электронейтральная молекула металлофосфата МФ (МНРОд):

Мп(Ф)п + Н2О -+ Мп-1(Ф)п-1 + МФ.

Направленный наружу химический градиент «мономерного» металлофосфата, эквивалентный
100 мВ, служит движущей силой для симпорта МФ и цитоплазматического протона. Аналогичный
механизм существует и у других бактерий, например Е. coli.

10.4.9.	Импортерно-экспортерная система:
антипорт субстрата и продукта его декарбоксилирования

Свободную энергию реакции декарбоксилирования органических кислот нельзя
ассимилировать в форме Pmf (но можно ассимилировать в форме Smf-, см. раздел
10.4.10). Тем не менее, энергетический выигрыш можно получить косвенным пу-
тем — благодаря распределению между разными компартментами субстрата и про-
дукта реакции.

Механизм создания Pmf таков: дикарбоновая кислота с помощью активного
транспортера поступает в цитоплазму, где она подвергается декарбоксилированию
по одной из своих карбоксильных групп. Продукт реакции — монокарбоновая кис-
лота — экспортируется тем же самым переносчиком, который в данном случае вы-
ступает в роли электрогенного антипортера. В результате неравноценного обмена
заряда (на один импортируемый двухвалентный анион приходится один экспорти-
руемый одновалентный анион) наружная поверхность СМ становится более элек-
тропозитивной.

В качестве примера можно привести процесс декарбоксилирования оксалата в
формиат, с помощью которого получает энергию Oxalobacter formigenes (рис. 79, А).
При помощи оксалат2-:формиат1--антипортера Ох1Т оксалат доставляется в цито-
плазму. Там путем ацил-тиоэфирного обмена, который катализируется растворимой
ацилтиотрансферазой, оксалат превращается в оксалил-СоА, причем донором СоА
в этой реакции служит формил-СоА.

Растворимая декарбоксилаза молекулярной массой 260 кДа использует в каче-
стве кофермента тиаминпирофосфат, или витамин Bi (см. рис. 89) и декарбокси-
лирует оксалил-СоА в формил-СоА. В свою очередь, под воздействием ацилтио-
трансферазы формил-СоА превращается в формиат. Наконец, в результате антипор-
та одновалентного аниона формиата (НСОО-) и двухвалентного аниона оксалата
(-ООС-СОО-) на наружной поверхности СМ создается более высокий электриче-
ский потенциал.

Поскольку равновесие экзергонической реакции декарбоксилирования оксалата
сильно смещено в сторону образования конечного продукта, а константа равнове-
сия ацилтиотрансферазной реакции равна единице, внутриклеточная концентрация
формиата на целых три порядка превышает внутриклеточную концентрацию ок-
салата. В итоге возникают высокие встречные химические градиенты оксалата и
формиата, что служит источником энергии для создания Аф. Кроме того, при де-
карбоксилировании происходит гетеролитический распад молекулы оксалата (т. е.
электронная пара остается с образующимся формиатом). При спонтанном прото-
нировании формиата протоны заимствуются из цитоплазмы, которая в результате
этого защелачивается. Таким образом, помимо Аф возникает еще и АрН.

Аналогичного результата добиваются молочнокислые бактерии Lactococcus lac-
tis в ходе яблочно-молочнокислого «брожения», когда двухвалентный анион малата
A

CM

цитоплазматический
компартмент

coo~

формил-СоА

C~SCoA
> I _

COO
оксалил-СоА

HC~SCoA

ooc -ch2-ch-coo
NH+3
аспартат^

сн3-сн-соо~
NH+3

аланин^

Рис. 79. Генератор Pmf, действующий по принципу антипорта субстрата и продукта
декарбоксилирования.

А — декарбоксилирование оксалата в формиат; Б — малата в лактат; В — аспар-
тата в аланин; Г — гистидина в гистамин; 1 — ацилтиотрансфераза; 2 — оксалил-СоА-
декарбоксилаза; 3 — малатдекарбоксилаза («малик-энзим»); 4 — аспартатдекарбоксилаза:
5 — гистидиндекарбоксилаза.
(“ООС—СНг—СНОН—COO-) переносится антипортером Ма1Р совместно с продук-
том своего цитоплазматического декарбоксилирования — одновалентным анионом
лактата (СН3—СНОН—СОО-) (рис. 79, Б). В отличие от простого декарбоксилиро-
вания оксалата, малат вначале окислительно декарбоксилируется НАДН-зависимой
малатдекарбоксилазой («малик-энзимом») с образованием пирувата, а затем уже
пируват восстанавливается в лактат. Описываемый процесс происходит на поздних
стадиях ферментации красного вина. В результате снижается кислотность сбражи-
ваемого сусла (двухосновный малат заменяется эквивалентным количеством одно-
основного лактата). Кроме того, содержащийся в красном вине лактат обладает
антисептическими свойствами и приятен на вкус.

Данный механизм создания Pmf также может быть связан с антипортом амино-
кислот. Например, Lactobacillus sp. М3 использует в энергетических целях неиденти-
фицированный аспартат2-:аланин1 “-антипортер в сочетании с цитоплазматической
реакцией декарбоксилирования аспартата (рис. 79, В).

Наконец, Pmf может создаваться не за счет импорта отрицательного заряда, а
путем экспорта положительного заряда. Таким механизмом пользуется молочнокис-
лая бактерия Lactobacillus buchneri, когда импортируемый гистидин декарбоксили-
руется в цитоплазме с образованием гистамина. Имидазольные ядра гистидина и
гистамина находятся на равном уровне протонирования, однако благодаря удале-
нию отрицательно заряженного карбоксила гистамин приобретает дополнительный
(по сравнению с гистидином) положительный заряд. В результате действия элек-
трогенного гистидин1+:гистамин2+-антипортера наружная сторона СМ становится
более электропозитивной (рис. 79, Г).

Можно привести еще ряд примеров аналогичных реакций декарбоксилирования
аминокислот. Это декарбоксилирование глутамата в 7-аминобутират {Lactobacillus
sp.), лизина в кадаверин {Е. coli), орнитина в путресцин {Е. coli}, тирозина в тира-
мин {Pediococcus sp.) и фенилаланина в фенетиламин {Lactobacillus sp.). При этом,
как и в случае L. lactis, клетки импортируют отрицательный заряд. Затем Pmf ис-
пользуется для синтеза АТФ, что в данном случае крайне неудачно называют «де-
карбоксилительным фосфорилированием».

Два особых случая связаны с использованием малата и цитрата умеренно ацидо-
фильной «винной» бактерией Leuconostoc oenos, а также с использованием цитрата
умеренно ацидофильной бактерией Leuconostoc mesenteroides, которая колонизирует
молоко и молочные продукты.

В первом случае поглощение малата или цитрата не сопряжено с экскрецией
конечного продукта, а происходит путем электрогенного унипорта аниона (см. раз-
дел 9.1.1). Нейтральные конечные продукты метаболизма малата или цитрата, в
частности недиссоциированный ацетат, покидают клетку путем пассивной диффу-
зии.

Во втором случае при поступлении цитрата создается Ат/^ в результате обме-
на двухвалентного цитрата на одновалентный лактат с помощью цитратпермеазы
CitP. Однако в отличие от яблочно-молочнокислого «брожения» лактат не является
продуктом прямого декарбоксилирования поглощаемого субстрата, а образуется в
результате серии ферментативных превращений.
10.4.10.	Натриевая биоэнергетика

Итак, мы рассмотрели биотрансформаторы, которые на уровне одной из двух
мембранных структур прокариотной клетки — СМ или ICM — ассимилируют сво-
бодную энергию химического (при хемотрофии) или квантового (при фототрофии)
энергоносителя. Независимо от конкретного механизма общим результатом их дей-
ствия становится трансмембранная разность электрохимических потенциалов Н+,
хотя для этого не обязательно переносить протоны через мембрану.

Напомним, что разность электрохимических потенциалов Н+ складывается из
разности химического потенциала этого катиона по две стороны мембраны (чаще
всего pHin > pHout) и разности электрического потенциала на противоположных
поверхностях мембраны (V>in < V'out)- Протоны, неравновесно распределенные по
двум сторонам мембраны, испытывают на себе сочетанное воздействие этих разно-
стей потенциалов, т. е. протондвижущей силы (Pmf). Она направлена внутрь клетки
и в большинстве случаев составляет приблизительно -100 мВ.

Протоны выполняют функцию главного «сопрягающего» катиона. Только неко-
торые прокариотные организмы могут использовать в качестве сопрягающего иона
катионы Na+.

В данном случае катионы Na+ транслоцируются в окружающую среду через
СМ, в результате чего создается разность электрохимических потенциалов этого
иона, которую В. П. Скулачев назвал «натрийдвижущей силой» (англ, sodium mo-
tive force, Smf). Подобно Pmf, этот источник энергии складывается из разности
химических потенциалов Na+ по две стороны СМ (чаще всего pNajn > pNaout) и
разности электрических потенциалов на противоположных поверхностях мембраны
(V'in < V'out)- Катионы Na+, неравновесно распределенные по двум сторонам СМ,
испытывают на себе общее действие этих разностей потенциалов, т. е. направленной
внутрь клетки натрийдвижущей силы (Smf):

Smf =	+ ЯТ/Пп[ Na+]out/[Na+]in.

Предпосылки для использования Na+ в качестве сопрягающего кати-
она. Действие мембранных биотрансформаторов, с помощью которых прокариоты
ассимилируют энергию на уровне СМ или ICM, чтобы затем использовать ее в эн-
дергонических процессах, связано с поддержанием электрохимического потенциала
катионов Н+ или Na+. Для этого необходимы два предварительных условия —на-
личие внешнего или запасенного источника энергии, а также низкая проницаемость
мембран для этих сопрягающих катионов.

С ростом температуры усиливается подвижность мембранных липидов, что уве-
личивает проницаемость мембран для протонов и мешает поддерживать Pmf на
необходимом уровне. Например, в случае Bacillus subtilis при увеличении темпе-
ратуры от 20 до 50° С проницаемость СМ для протонов возрастает на два поряд-
ка. Некоторые термофилы, в частности В. stearothermophilus, компенсируют утечку
протонов усиленным дыханием. Однако в данных условиях более распространено
запасание энергии в форме Smf (непосредственно или путем конвертирования Pmf
в Smf). Проницаемость для катионов Na+ на несколько порядков ниже, чем для
протонов, что позволяет поддерживать Smf даже при экстремально высоких тем-
пературах.

Выше мы уже говорили о том, что Smf играет важную роль в биоэнергети-
ке алкалифилов. Как правило, у них электрохимический потенциал Na+ создается
вторичными транспортерами и затем расходуется не на синтез АТФ, а на импорт
питательных субстратов, вращение жгутиков и другие эндергонические процессы.
Это позволяет «сэкономить» протоны, сосредоточенные на наружной поверхности
СМ, чтобы их в основном могла бы использовать Н+-АТФаза/АТФ-синтаза.

Мембранные биотрансформаторы, создающие Smf. Таким образом, в ро-
ли сопрягающего иона катионы Na+ могут заменить протоны. Для создания Smj
катионы Na+ обязательно нужно перенести через СМ, и для этого могут использо-
ваться два типа транспортеров (табл. 11):

— «прямые» Na+-транспортеры, которые преобразуют энергию внешнего энер-
гоносителя или запасенного энергоносителя непосредственно в Smf-,

— «непрямые» Па+-транспортеры, действующие по приципу: Pmf —> Smf или по
принципу АТФ —> Smf

Таблица 11. Мембранные биотрансформаторы, создающие Smf

Тип биотрансформатора	Локализация биотрансформатора	Объект-представитель
«Прямые» Na+-транспортеры		
НАДН-дегидрогеназа	СМ	Vibrio alginolyticus (класс « Gammaproteobacteria»)
«Метансинтезирующая»  метил-ЩМРТ:  CoM-S Н- метилтрансфераза	СМ	Methanosarcina barkeri (фила All Euryarchaeota)
« А цетатсинтезирующая »  Ы-метил-ЩМРТ:  C/Fe-SP-метилтрансфераза	СМ	М. barkeri (фила АП Euryarchaeota)
«Ацетатсинтезирующая»  N-метил-Щфолат:  С/Fe-SP-метилтрансфераза	см	Acetobacterium woodii (фила BXIII Firmicutes)
О ксалоацетат- декарбоксилаза	см	Klebsiella pneumoniae (класс «Gammaproteobacteria»)
Метилмалонил-СоА- декарбоксилаза	см	Propionigenium modestum (фила BXXI Fusobacteria)
Малонатдекарбоксилаза	см	Malomonas rubra (класс « Deltaproteobact eria »)
«Непрямые» Na+-транспортеры		

Na+ /Н+-антипортер	CM	Escherichia coli (класс « Gammaproteobacteria»)
На+-транслоцирующая FqFi- АТФаза/ АТФ-синтаза	CM	P. modestum (фила BXXI Fusobacteria)

Прямой Na+ -транспортер — НАДН-дегидрогеназа. Характерным примером яв-
ляется факультативно анаэробная морская бактерия Vibrio alginolyticus. При анаэ-
робном росте она создает Smf благодаря декарбоксилированию оксалоацетата в пи-
руват так же, как это делают энтеробактерии Klebsiella pneumoniae и Salmonella
typhimurium (см. ниже). Однако при аэробном росте Smf образуется с помощью
НАДН-дегидрогеназы, или НАДН:убихинон-оксидоредуктазы (см. раздел 11.4.3).
Этот фермент состоит из субъединиц а (52 кДа), (3 (46 кДа) и 7 (32 кДа), находя-
щихся в стехиометрическом соотношении 2:2:2, и содержит два кофактора—ФМН
и ФАД.

Помимо «прямого» механизма образования Smf с помощью дыхательной цепи
известны примеры нетривиальных «прямых» механизмов. Их особенность состоит в
том, что цитозольные катаболические или анаболические реакции сопровождаются
мембранными реакциями превращения субстрата, в ходе которых свободная энергия
ассимилируется в форме Pmf.

Такие реакции представляют собой либо Ма+-электрогенное трансметилирова-
ние, либо Na+-электро генное декарбоксилирование, т. е. свободная энергия соответ-
ствующих реакций ассимилируется в форме Smf.

Прямой Na+-транспортер — электрогенная трансметилаза. Первый пример
электрогенного трансметилирования, сопряженного с действием Иа+-транспорте-
ра, связан с метаногенезом. Точнее сказать, он связан с одной из промежуточных
реакций на пути биосинтеза метана у метаногенных архей.

Ее катализатором служит мембранная «метансинтезирующая» N-метил-
ЩМРТгСоМ-ЗН-метилтрансфераза. Структура и действие этого фермента будут
рассмотрены в разделе 11.4.5.5. Предполагается, что две субъединицы «метансинте-
зирующей» метилтрансферазы, MtrD и MtrE, непосредственно переносят катионы
Na+ через мембрану.

Коферментом «метансинтезирующей» метилтрансферазы служит кобальтсодер-
жащий тетрапиррол — 5-гидроксибензимидазолилкобамид, он же коррин, или вита-
мин В12 (рис. 80). Другими В12-зависимыми ферментами у прокариотов являются:

Рис. 80. Корриноид (витамин В12).
—	растворимая метионинсинтаза, которая образует метионин из гомоцистеина и
М-метил-Щ фолата;

—	растворимая метилмалонил-СоА-мутаза, которая превращает сукцинил-СоА в
метилмалонил-СоА (см. раздел 11.4.5.2);

—	мембраносвязанная «ацетатсинтезирующая» метилтрансфераза ацетогенных
бактерий (см. раздел 11.4.5.6).

Вторым примером электрогенного трансметилирования, сопряженного с дей-
ствием Na+-транспортера, служит автотрофный биосинтез ацетата. Точнее сказать,
речь идет об одной из промежуточных реакций на пути образования ацетил-СоА у
метаногенных архей и ацетогенных бактерий. Ее катализатором служит лишенная
простетических групп мембраносвязанная «ацетатсинтезирующая» метилтрансфе-
раза (см. раздел 11.4.5.6). Она передает метил от промежуточного переносчика (N-
метил-ЩМРТ у метаногенных архей или Х-метил-Щ фолата у ацетогенных бакте-
рий) корриноид/железо-серному белку (англ. corrinoid/Fe-sulfur protein, C/Fe-SP),
который в качестве простетической группы содержит 5-гидроксибензимидазолилко-
бамид.

Предполагается, что у метаногенных архей и ацетогенных бактерий гомодимер-
ная «ацетатсинтезирующая» метилтрансфераза непосредственно переносит катио-
ны Na+ через мембрану.

Прямой Nа+-транспортер — электрогенная декарбоксилаза. Первым примером
электрогенного декарбоксилирования, сопряженного с действием Na+-транспорте-
ра, является превращение оксалоацетата в пируват (рис. 81). Оно описано у эн-
теробактерий Klebsiella pneumoniae и Salmonella typhimurium, осуществляющих
«необычное» ацетатное брожение, исходным субстратом для которого является цит-
рат (см. раздел 11.3.4.7).

Оксалоацетат образуется из цитрата под действием цитратлиазы. Затем он де-
карбоксилируется в пируват с помощью оксалоацетат-декарбоксил азы, которая экс-
портирует два катиона Na+ в расчете на одну молекулу оксалоацетата. Данный
фермент состоит из трех субъединиц. Амфипатическая а-субъединица (60-65 кДа)
выполняет функцию трансферазы и переносит карбоксил от оксалоацетата на био-
тин, или витамин Н (рис. 82).

Интегральная /3-субъединица (30-35 кДа) катализирует реакцию декарбоксили-
рования карбоксибиотина сопряженно с переносом двух катионов Na+. Третья, вспо-
могательная 7-субъединица представляет собой интегральный белок молекулярной
массой 12-14 кДа.

Образование Smf играет важную роль в питании этих бактерий, т. к. при «элек-
тронейтральном» импорте цитрата этот трехвалентный анион симпортируется с дву-
мя катионами Na+ за счет Smf и одним катионом Н+ за счет Pmf. Поскольку Pmj
создается путем симпортического экспорта протонов совместно с конечными про-
дуктами метаболизма — ацетатом и формиатом (см. раздел 10.4.8), клетка не ис-
пытывает необходимости тратить образованный при брожении АТФ на поглощение
цитрата.

Вторым примером электрогенного декарбоксилирования, сопряженного с дей-
ствием Na+-транспортера, служит превращение экзогенного сукцината в пропионат.
Этот катаболический путь изучен на примере облигатно аэробной бактерии Propi-
onigenium modestum (фила BXXI Fusobacteria). Доставленный в клетку сукцинат
с помощью СоА-трансферазы превращается в сукцинил-СоА, а затем метилмало-
нил-СоА-мутаза превращает сукцинил СоА в метилмалонил-СоА. Точно такие же
COO

сн2
HO-C-COO'

CH,
COO"

цитрат

coo- I ф

СИ2<__.

co
COO“

coo

CH3

ацетат

оксалоацетат

Smf+

COO"

CH3

пируват

CoASH

HCOO-

формиат

C*°
C~SCoA

CH3

ацетил-СоА

H
c"°
*r'O~P

CH3 АДФ АТФ
ацетилфосфат

COO

CH3
ацетат



Puc. 81. Электрогенное декарбоксилирование при ацетатном брожении.

1 — цитратлиаза;	2 — оксалоацетат-декарбоксилаза;	3 — пируват:формиат-лиаза;

4 — фосфотрансацетилаза; 5 — ацетаткиназа.

Рис. 82. Биотин (витамин Н).

Карбоксилированная форма присоединена ковалентной связью к апопротеину.

СО - NH -лиз -► апопротеин
реакции происходят на пути биосинтеза пропионата пропионовокислыми бактери-
ями (см. раздел 11.4.5.2). Однако в данном случае вместо растворимой метилма-
лонил-СоА-карбокситрансферазы используется биотинзависимая мембраносвязан-
ная метилмалонил-СоА-декарбоксилаза. Ее продуктами являются пропионил-СоА
и диоксид углерода (рис. 83). Свободная энергия этой экзергонической реакции
(△Go/ = —27,0 кДж-моль-1) используется для переноса катионов Na+ из цито-
плазмы во внешнюю среду. Роль натриевой помпы играет сама метилмалонил-СоА-
декарбоксилаза — так же, как и оксалоацетат-декарбоксилаза.

СОО"
I

пропионат пропионил-СоА

Рис. 83. Электрогенное декарбоксилирование при превращении экзогенного сукци-
ната в пропионат.

1 — СоА-трансфераза; 2 — метилмалонил-СоА-мутаза; 3 — метилмалонил-СоА-декар-
боксилаза.

Третьим примером электрогенного декарбоксилирования, которое сопряжено с
действием Ха+-транспортера, является превращение экзогенного малоната в ацетат.
Данная реакция служит единственным источником энергии для анаэробных бакте-
рий Malomonas rubra (класс «Deltaproteobacteria»), Sporomusa malonica и S. termitida
(фила BXIII Firmicutes), выделенных соответственно из морских осадков, пресно-
водных илов и кишечника термитов. Кроме перечисленных бактерий данный способ
образования Smf используют Klebsiella oxytoca, К. pneumoniae и Citrobacter diversus
(класс «Gammaproteobacteria»). Детально он представлен на рис. 84. Установлено,
что малонат активируется посредством образования тиоэфира. Однако это происхо-
дит не «тривиальным» путем с помощью CoASH, как в случае метилмалонил-СоА-
декарбоксилазы, а в результате связывания с особым ацилпереносящим белком АСР
(от англ, acyl carrier protein; ген madH}. Предварительно SH-форма этого белка пе-
реводится с целью активации в ацетил-форму при помощи АТФ-зависимой лигазы.
Затем АСР переносится от ацетила на малонат с помощью АСР-трансферазы (ген
madA). Далее карбокситрансфераза (гены madC и madD) передает карбоксильную
группу от малонил-АСР биотинсодержащему белку ВР (от англ, biotin carrier pro-
tein; ген madF), в результате чего регенерируется ацетил-АСР. В конечном счете,
карбокси-форма белка ВР диффундирует к мембране, где ее декарбоксилирует ин-
тегральный белок (ген madB). Эта реакция экзергонична и сопряжена с переносом
катионов Na+ через СМ.

Рис. 84- Электрогенное декарбоксилирование при превращении экзогенного малона-
та в ацетат (по: Dimroth, Schink, 1998).

АСР — ацилпереносящий белок; ВР—биотинсодержащий белок; 1—АСР:ацетат-
лигаза; 2 — ацетил:малонат-АСР-трансфераза; 3 — карбокситрансфераза; 4 — ВР-декар-
боксилаза.

Подчеркнем, что во всех трех случаях «^тУ-декарбоксилирование» (так же, как
и не запасающее энергию декарбоксилирование метилмалонил-СоА у пропионово-
кислых бактерий; см. раздел 11.4.5.2) осуществляется с помощью ферментов, содер-
жащих ковалентно связанный биотин.

Непрямой Na+ -транспортер — Na+/Н+ -антипортер. Резкий сдвиг концентра-
ции катионов Na+ и Н+ в окружающей среде действует на прокариотные клетки
как стрессовый фактор. Поэтому одной из важнейших задач регуляторных систем
служит Na+- и Н+-гомеостатирование, что, в частности, достигается с помощью
Ма+/Н+-антипортеров. Наряду с этим Ма+/Н+-антипортеры могут выполнять за-
дачу непрямого Ма+-транспортера, позволяющего создать Smf за счет Pmf. В неко-
торых случаях, например у алкалифилов, это обеспечивает энергией синтез АТФ,
активный транспорт и подвижность.

Открытые в 1960-е годы Питером Митчелом На+/Н+-антипортеры, входящие
в состав СМ, распространены практически универсально. В случае бактерий их
характерным представителем является антипортер Е. coli — NhaA. Его транскрип-
ция находится под позитивным контролем сенсорного белка NhaR, который взаимо-
действует с Ма+-специфичным промотором Р1; негативный контроль осуществляет
ДНК-связывающий белок — глобальный регулятор H-NS. Подобно другим вторич-
ным транспортерам, белок NhaA состоит из двенадцати трансмембранных сегмен-
тов, связанных между собой гидрофильными «шпильками» (см. рис. 65). В группу
прокариотных Na+/H+-aHTnnopTepoB, которые гомологичны или не гомологичны
NhaA, входят белки NapA, NhaB — D и NhaP.

Непрямой Na+-транспортер — Na+-транслоцирующая FoFi-АТФаза/АТФ-
синтпаза. Как показано на примере Р. modestum, бактерии могут создавать Smf
с помощью «обратимой» ^+-транслоцирующей FoFi-АТФазы/АТФ-синтазы. Этот
осмоэнзим состоит из «стандартного» набора субъединиц, гомологичных субъеди-
ницам Н+-транслоцирующей FoFi-АТФазы/АТФ-синтазы (см. рис. 74). С помощью
генноинженерных методов получен функционально полноценный «гибрид», состоя-
щий из а/?7£-субъединиц Е. coli и abcJ-субъединиц Р. modestum.

Другим примером использования энергии фосфагена для создания Smf служит
Caloramator fervidus (см. рис. 69). При температуре роста СМ этой бактерии об-
ладает повышенной проницаемостью для протонов, и поэтому единственным спо-
собом энергизации систем для импорта питательных субстратов у нее становится
образование Smf за счет гидролиза АТФ с помощью Na+-транслоцирующей FoFi-
АТ Ф аз ы / АТ Ф- синтаз ы.

Пути использования Smf. По аналогии с использованием Pmf, натрийдвижу-
щая сила может обеспечивать энергией таких потребителей, как мембранное фос-
форилирование АДФ и активный транспорт, а также вращение жгутиков и другие
типы подвижности.

Мембранное фосфорилирование АДФ. В случае Р. modestum единственным ис-
точником энергии для синтеза АТФ является Smf, и это осуществляется с помощью
«обратимой» Na+-транслоцирующей FoFi-АТФазы/АТФ-синтазы.

К семейству Na^-АТФаз/ АТФ-синтаз также относится АТФаза/ АТФ-синтаза ав-
тотрофного ацетогена Acetobacterium woodii. Интересно, что в составе этого фермен-
та имеются три типа интегральной «протеолипидной» с-субъединицы (см. раздел
10.4.3) —ci, С2 и сз. Ген субъединицы ci(a^pE'i) гомологичен гену протеолипидной
субъединицы эукариотной VoVi-АТФазы. Таким образом, Na+-АТФаза/АТФ-син-
таза A. woodii является уникальным примером природного «гибрида» прокариотной
и эукариотной мембранных АТФаз.

Если Smf создается с помощью реакции декарбоксилирования (см. табл. 11), а
затем расходуется на синтез АТФ, последний часто называют «декарбоксилитель-
ным фосфорилированием». Такой термин мы уже встречали, когда речь шла о со-
здании Pmf в результате антипорта субстрата и продукта его цитоплазматического
декарбоксилирования (см. раздел 10.4.9).

Активный транспорт. В разделе 9.1.1 мы уже останавливались на примерах
Smf-зависимых симпортеров, которые бывают однокомпонентными или могут до-
полнительно включать в себя связывающие белки.

Обеспечение подвижности. Возможность прямого использования Smf (а не
Pmf) локомоторными системами рассматривается на примере экстремально алка-
лифильных бактерий, обитающих в континентальных содовых озерах, а также на
примере некоторых морских бактерий.

В первом случае, у алкалифильных бацилл, скорость плавания при помощи вра-
щающихся жгутиков экспоненциально растет с увеличением концентрации катионов
Na+ и зависит не от ApNa+, а от А^.

Во втором случае, у морских цианобактерий из рода Synechococcus, обнаружен
уникальный тип плавания при полном отсутствии жгутиков и иных цитологически
выявляемых локомоторных органелл (см. I том учебника). Установлено, что клетки
теряют подвижность при концентрации Na+ <10 мМ и достигают максимальной
скорости перемещения в морской воде 15 мкм-с-1 при концентрации катионов Na+
в пределах 150-250 мМ, что обеспечивает величину Smf> —100 мВ (по абсолютному
значению). Механизм такой подвижности точно неизвестен, скорее всего, он связан
с волнообразным импульсом, который передается от СМ на ОМ.

* * *

Из рассмотренных примеров видно, что в «физиологическом» диапазоне внеш-
них условий у прокариотов реализуются все теоретически возможные варианты
электрогенераторов. Биогенез и действие этих систем зависят от генетически обу-
словленной адаптации бактерии или археота к тому или иному энергоносителю.
Кроме того, для использования конкретного энергоносителя требуется ряд сопут-
ствующих физико-химических и биотических факторов.

В заключение к данному разделу напомним, что прокариотам доступны два ти-
па энергоносителей (химические субстраты и кванты электромагнитного поля), а
затем перейдем1 к рассмотрению двух типов энергетического питания — хемотрофии
и фототрофии.
ГЛАВА 11

ХЕМОТРОФИЯ

Если без предубеждения смотреть на малое рас-
пространение химических познаний между классом об-
разованным, на слабые по сей части успехи нашего
юношества, жаждущего приобретать познания, то сие
должно отнести исключительно к совершенному недо-
статку в способах изучения сей науки.

Г. Гесс. Основания чистой химии
( Санкт-Петербург, 1831)

В большинстве случаев при хемотрофии ассимилируется энергия, освобождаю-
щаяся в ходе окислительно-восстановительных превращений органических или неор-
ганических субстратов. Исключением служат «не-редокс» механизмы, когда Pmf
или Smf создаются в результате реакций декарбоксилирования (см. разделы 10.4.9
и 10.4.10).

Поскольку при хемотрофии электроны переносятся от терминального донора к
терминальному акцептору, метаболический потенциал хемотрофа, выбор им той или
иной ниши для обитания и его конкурентоспособность в конечном счете зависят от
термодинамических и физико-химических характеристик этой окислительно-восста-
новительной пары.

11.1.	ТЕРМИНАЛЬНЫЕ ДОНОРЫ ЭЛЕКТРОНОВ

Терминальный донор электронов (неорганический или органический, в своем
первоначальном виде или после подготовительных превращений) служит субстра-
том для специфических дегидрогеназ.

Хемолитотрофия. Напомним, что использование неорганических веществ в ка-
честве источника энергии называется хемолитотрофией. Она представляет собой
продуктивный процесс, в глобальном масштабе эквивалентный фототрофии. Эти
ассимиляционные механизмы связывают энергетику абиотических систем с биоэнер-
гетикой — подобно тому, как углеродная автотрофия и диазотрофия служат мостом
между неорганической и органической материей.
Хемолитотрофия и фототрофия создают фундамент пищевой пирамиды, и поток
свободной энергии, которую используют живые системы (индивидуальная клетка,
локальная микробиота и глобальный экоценоз), зарождается в популяциях хемоли-
тотрофов и фототрофов.

При хемолитотрофии используется узкий, но гетерогенный круг субстратов, ко-
торые обычно не требуют предварительных превращений.

Хемоорганотрофия. Если источником энергии служит органическое вещество,
то такой вариант хемотрофии называется хемоорганотрофией. В глобальном мас-
штабе хемоорганотрофия представляет собой консументный процесс, при котором
используются и неогенные, и ископаемые продукты фототрофной или хемолито-
трофной ассимиляции неорганического углерода.

Важнейшим источником энергии при бактериальной, археотной и эукариотной
хемоорганотрофии являются полисахариды — прежде всего, целлюлоза и крахмал.
Хемоорганотрофные бактерии и археи предварительно расщепляют их на фрагмен-
ты с помощью внеклеточных полигликозидгидролазных комплексов. Напомним, что
для гидролиза целлюлозы у бактерий имеется специальный экзоплазматический
компартмент — целлюлосома (см. I том учебника).

Образовавшиеся моносахариды и олигосахариды доставляются в цитоплазмати-
ческий компартмент ABC-транспортерами, Рт/-зависимыми пермеазами или фос-
фотрансферазной системой. Олигосахариды гидролизуются до гексоз (галактозы,
глюкозы, маннозы, фруктозы и др.) или пентоз (арабинозы, ксилозы, рибозы и др.).
Эти моносахариды окисляются через генеральные катаболические пути, которые бу-
дут рассмотрены в последующих разделах.

Сахара и спирты также могут частично окисляться в периплазматическом ком-
партменте или в цитоплазме. Для этого используются мембранные или растворимые
дегидрогеназы, которые непосредственно взаимодействуют с дыхательной цепью.
Указанное свойство ярко выражено у бактерий рода Gluconobacter, которые окисля-
ют глицерин, глюкозу, маннит, сорбит, фруктозу, этанол и т. д. до соответствующих
кислот, альдегидов и кетонов.

11.2.	ТЕРМИНАЛЬНЫЕ АКЦЕПТОРЫ ЭЛЕКТРОНОВ

Эффективность хемотрофии во многом зависит от того, каким образом решается
проблема терминального акцептора электронов.

Терминальные акцепторы бывают органические и неорганические.

Органические акцепторы могут иметь как экзогенное, так и эндогенное проис-
хождение. Неорганические акцепторы, за исключением протонов, всегда заимству-
ются из внешней среды.

Экзогенный акцептор. При дыхании ключевая роль принадлежит терминаль-
ной редуктазе. От этого фермента зависит «пропускная способность» электрон-
транспортной цепи. В конкретных метаболических условиях может использоваться
та или иная конститутивная редуктаза или тот или иной представитель из набора
адаптивно синтезируемых редуктаз.

Брожение обычно происходит без участия экзогенного акцептора электронов.
Однако при некоторых «необычных» брожениях (см. раздел 11.3.4.7) необходимы
экзогенные акцепторы, и за них члены микробиоты жестко конкурируют друг с
другом.
Эндогенный акцептор. Чаще всего роль эндогенного акцептора выполняет
один из продуктов катаболизма экзогенного органического субстрата. Примерами
служат классические брожения (см. раздел 11.3), а также дыхание «гетеротроф-
ных», т.е. использующих ацетат метаногенов (см. раздел 11.4.5.5).

Довольно противоречивая ситуация складывается у «автотрофных», т. е. исполь-
зующих Н2/СО2 метаногенов (см. раздел 11.4.5.5) и автотрофных, т.е. использую-
щих Н2/СО2 ацетогенов (см. раздел 11.4.5.6). С одной стороны, они обладают за-
мечательной способностью самостоятельно синтезировать терминальные акцепторы
электронов для дыхательной цепи. По этой причине они не сталкиваются с необхо-
димостью конкурировать за экзогенные акцепторы с другими членами микробиоты.
С другой стороны, самостоятельно синтезировать эндогенные акцепторы невыгод-
но, поскольку на это расходуется часть экзогенного энергоносителя (водорода или
монооксида углерода).

Кроме того, при использовании эндогенного акцептора электронов во внешнюю
среду выделяются конечные продукты — метан и «автотрофный» ацетат. В обоих
случаях это расточительный процесс, связанный с потерей неизрасходованной сво-
бодной энергии.

11.2.1.	Молекулярный кислород и его альтернатива

Из всех терминальных акцепторов электронов молекулярный кислород наиболее
«выгоден» в термодинамическом отношении, поскольку аэробная дыхательная цепь
ассимилирует максимум свободной энергии окисляемых субстратов. Неудивительно,
что в аэробных условиях органические субстраты окисляются преимущественно до
СО2 и Н2О.

Альтернативные акцепторы электронов по объему своих природных ресурсов
уступают молекулярному кислороду, и поэтому эффективность хемотрофии в мик-
роаэробной или анаэробной среде в значительной степени определяется способно-
стью найти эту альтернативу.

При дефиците кислорода или в анаэробных условиях автономию приобретают
бактерии, «сбрасывающие» электроны на интермедиаты брожения. В аналогичном
положении находятся прокариоты, которые сами синтезируют акцептор электронов
для дыхательной цепи (например, метаногенные археи, у которых эту роль выпол-
няет эндогенный гетеродисульфид).

Однако большинство прокариотов с дыхательным типом метаболизма зависит от
присутствия во внешней среде неорганического акцептора электронов.

Значительно реже при дыхании используются экзогенные органические акцеп-
торы (например, фумарат).

11.2.2.	Анаэробное деструктивное сообщество

Этот тип микробиоты характерен для богатых органическим веществом ниш,
в которых запас кислорода уже израсходован. Подобные условия складываются в
затапливаемых почвах, в стратифицированных водоемах ниже зоны хемоклина, в
континентальных подземных гидросистемах, а также в морских и пресноводных
илистых отложениях. Жизнедеятельность этих экосистем обеспечивается, в первую
очередь, поступлением в них извне мортмассы (органического вещества отмерших
организмов, преимущественно растений или животных).
Нисходящая ветвь анаэробной пищевой цепи — это сложный многоэтапный про-
цесс, в котором участвуют несколько специализированных групп прокариотов
(рис. 85).

автотрофные
сульфатредукторы

автотрофные
метаногены

Рис. 85. Схема анаэробного деструктивного сообщества.

Первичные анаэробы. За первый этап диссимиляции органических субстратов
отвечают первичные анаэробы — гидролитики и диссипотрофы

Гидролитики, например бактерии рода Clostridium, концентрируются вокруг
скоплений биополимеров или образуют биопленки на поверхности твердых субстра-
тов. Они кооперативно секретируют комплекс экзоферментов, гидролизующих по-
лигликозиды и полипептиды на олигомеры и мономеры. Полученные низкомолеку-
лярные водорастворимые продукты утилизируются в первую очередь самими гид-
ролитиками.

Диссипотрофы (англ, dissipated — рассредоточенный), например бактерии рода
Syntrophomonas, не секретируют гидролитические ферменты в сколь-нибудь значи-
тельном количестве. Они менее кооперированы друг с другом, чем гидролитики, и
используют накопленные последними продукты распада биополимеров.

Гидролитики и диссипотрофы связаны между собой сетью трофических вза-
имодействий. Гидролитики поставляют диссипотрофам питательные субстраты.
В свою очередь, диссипотрофы не только снабжают гидролитиков факторами роста,
но и снижают до подпорогового уровня концентрацию продуктов гидролитического
расщепления биополимеров, что устраняет эффект ретроингибирования гидролаз.

Первичные анаэробы обладают метаболизмом бродильного типа. Как правило,
они не зависят от внешних акцепторов электронов.
Основными продуктами ферментации мономеров, в первую очередь простых са-
харов, являются летучие карбоновые кислоты (ацетат, бутират, лактат, пропионат,
сукцинат, формиат и др.), низкомолекулярные спирты и кетоны (бутанол, метанол,
пропанол, этанол, диацетил и др.), а также Н2 и СО2. Первичных анаэробов также
называют «ацидогенными» бактериями из-за их способности накапливать кислоты
(рис. 85).

В результате экскреции первичными анаэробами конечных продуктов их жизне-
деятельности во внешней среде образуется пул субстратов. Последние окисляются
вторичными анаэробами, которые отвечают за конечный этап диссимиляции орга-
ники.

Вторичные анаэробы. Эти прокариоты обладают метаболизмом дыхательно-
го типа, и их классифицируют в соответствии с тем, какой донор электронов они
предпочитают.

Магистральным трофическим маршрутом в анаэробном деструктивном сообще-
стве является «ацетатный» путь (рис. 85), поскольку ацетат, наряду с водородом и
формиатом, относится к числу важнейших продуктов ферментации.

Ацетатный путь выбирают гетеротрофные (использующие ацетат) метаногенные
археи и гетеротрофные сульфатредуцирующие бактерии. При помощи СО-дегидро-
геназы они расщепляют ацетат на карбонильную и метильную группы (см. раздел
11.4.5.5). Затем метаногены дыхательным путем диспропорционируют эти субстра-
ты в СО2 и СН4, а гетеротрофные сульфатредукторы — полностью окисляют их до
СО2.

Второй по значению трофический маршрут в анаэробном деструктивном сооб-
ществе — «водородный», поскольку при ферментации постоянно образуется водород.

Водородный путь выбирают «автотрофные», т. е. использующие Н2/СО2 мета-
ногенные археи и автотрофные сульфатредукторы (рис. 85).

Ацетатный и водородный пути не обособлены друг от друга, что связано с жиз-
недеятельностью автотрофных (использующих Н2/СО2) ацетогенных бактерий, ко-
торые передают восстановительные эквиваленты с водородного пути на ацетатный
путь согласно уравнению реакции:

2СО2 + 4Н2 -> СН3СООН + 2Н2О.

Кроме участников ацетатного и водородного путей, к вторичным анаэробам от-
носятся еще две группы микроорганизмов.

Во-первых, это бактерии, полностью окисляющие жирные кислоты посредством
нитратного или сульфатного дыхания.

Во-вторых, это гетеротрофные ацетогенные бактерии, окисляющие жирные кис-
лоты до ацетата и молекулярного водорода (рис. 85). Последний вариант метабо-
лизма реализуется в синтрофной ассоциации с гидрогенотрофами — сульфатреду-
цирующими и нитратредуцирующими бактериями, автотрофными метаногенными
археями и автотрофными ацетогенными бактериями.

В результате автотрофного биосинтеза метана и ацетата продукты ацидогенеза
вступают в реакции, которые протекают на восходящей ветви цикла углерода.

Пространственно-временная структура анаэробного деструктивного
сообщества. Хотя в каждой природной экосистеме обычно присутствуют сразу
несколько акцепторов электронов, их восстановление обособлено в пространстве и
во времени.
Пространственная структура анаэробного деструктивного сообщества изучена
на примере морских и пресноводных донных отложений.

В самых верхних слоях осадков — в условиях остаточного аэробиоза — органика
окисляется с использованием молекулярного кислорода в качестве терминального
акцептора электронов. В нижних слоях, где запас кислорода практически уже ис-
черпан, происходит диссимиляционное восстановление нитрата. Еще глубже восста-
навливается Мп4+, а затем Fe3+. Наконец, в глубинных слоях донных отложений
протекают диссимиляционное восстановление сульфата и метаногенез.

Причина пространственного обособления этих процессов становится понятной,
если учесть, что с глубиной уменьшается концентрация молекулярного кислорода
(соответственно, снижается окислительно-восстановительный потенциал) и увели-
чивается концентрация органических доноров электронов.

Временная структура анаэробного деструктивного сообщества, т. е. очередность
использования перечисленных терминальных акцепторов электронов определяется
сродством к ним редуктазных систем.

Высоким сродством к акцептору обладает нитратредуктаза, и поэтому в верхних
горизонтах донных отложений активно идет восстановление нитрата, а все осталь-
ные дыхательные процессы подавлены. Диссимиляционное восстановление сульфата
и метаногенез не могут происходить одновременно с восстановлением Мп4+ и Fe3+,
поскольку редуктазы, участвующие в этих двух процессах, обладают меньшим срод-
ством к акцепторам электронов, чем метал редуктазы.

Как уже указывалось, первичные анаэробы обладают метаболизмом бродильно-
го типа. В свою очередь, вторичные анаэробы имеют дыхательный тип метаболизма,
основанный на использовании в качестве источника энергии органических или неор-
ганических субстратов.

Брожение и дыхание —это два важнейших метаболических процесса, в основе
которых лежит хемотрофный способ ассимиляции энергии.

Остановимся на них подробно.

11.3.	БРОЖЕНИЕ

Фотосинтез и брожение —это два фундаментальных физиологических процес-
са, которые стали предметом экспериментальных исследований в первой половине
XIX в. Характерными признаками брожения являются турбулентность из-за выде-
ления газообразных продуктов (чем и объясняется метафорическое название этого
феномена; лат. fermentum — закваска, в переносном смысле — душевное волнение),
а также накопление ценных органических соединений.

Со спиртовым брожением человек столкнулся задолго до возникновения земле-
делия и скотоводства, еще в эпоху первобытного собирательства. На протяжении
6 тыс. лет этот процесс использовался при приготовлении пива, а в течение по-
следних 3 тыс. лет — в хлебопечении и виноделии. Развитие скотоводства подари-
ло человечеству продукты молочнокислого брожения. С начала XX в. производ-
ство этанола, бутанола, ацетона, молочной кислоты и ацетальдегида, при котором
используются разные типы брожения, стало краеугольным камнем промышленной
биотехнологии.

В историческом очерке (см. I том учебника) мы уже отмечали, что причинную
связь спиртового брожения с жизнедеятельностью дрожжей-сахаромицетов устано-
вили в конце 1830-х годов французский физик Шарль Каньяр де Латур (C.Cagniard
de Latour), немецкий зоолог Теодор Шванн и немецкий ботаник Фридрих Кютцинг
(F. Kiitzing). В отличие от них сторонники химической теории брожения Юстус фон
Либих (J. von Liebig), Фридрих Велер (F. Wohler) и Йенс Берцелиус (J. J. Berzelius)
считали, что брожение связано с постмортальным разложением белка. К сожале-
нию, эти выдающиеся химики подвергли выводы де Латура, Шванна и Кютцинга
агрессивной антинаучной критике, что на полстолетия затормозило изучение био-
логического смысла брожения.

В середине 1850-х годов Луи Пастер (L. Pasteur) описал молочнокислых бакте-
рий-возбудителей брожения, при котором накапливается лактат. Следом за этим
он открыл процесс маслянокислого брожения, которое вызывают облигатно анаэ-
робные бактерии рода Clostridium.

Данное Пастером определение брожения как жизни без воздуха (фр. «1а fer-
mentation est la vie sans air») имело огромное концептуальное значение, поскольку
ранее такая возможность исключалась в принципе. Кроме того, он впервые указал
на то, что разные формы брожения вызываются специфическими микроорганизма-
ми. Однако, будучи виталистом, он считал, что брожение связано с сохранением
«жизненной силы» и прекращается после смерти возбудителя.

В 1897 г. немецкий ботаник Эдуард Бухнер (Е. Buchner, Нобелевская премия
по химии, 1907 г.) обнаружил, что спиртовое брожение происходит в бесклеточном
препарате дрожжей. Стало ясно, что метаболические процессы можно изучать хи-
мическими методами, и это привело к рождению новой науки — биохимии.

11.3.1.	Брожение с позиций биоэнергетики;
различие между брожением и дыханием

Хотя логическая нить к роли компартментализации в биоэнергетике протягива-
ется еще от опытов Бухнера, даже в наше время сущность брожения часто пытаются
объяснить с позиций конструктивного метаболизма.

Например, в классическом учебнике по общей микробиологии Ганса Шлегеля
(Н. Schlegel) брожение рассматривается как «... метаболический процесс, при кото-
ром регенерируется АТФ, а продукты расщепления органического субстрата мо-
гут служить одновременно и донорами, и акцепторами водорода» (перевод 1985 г.
на русский язык с б-го немецкого издания, стр. 263).

Процитированное определение, к сожалению, не раскрывает механизм ассимиля-
ции энергии при брожении. Кроме того, сюда не укладываются следующие важные
моменты.

Во-первых, АТФ может образовываться не только при брожении, но и за счет
дыхания, а также в результате фототрофии.

Во-вторых, расщепление органического субстрата может дать один и тот же про-
дукт и при брожении, и при дыхании. Примером служат бактерии рода Acetobacter,
превращающие этанол в ацетат. Такой процесс иногда называют «уксуснокислым
брожением». Однако в действительности это типичное дыхание, поскольку электро-
ны, полученные при окислении этанола, затем передаются аэробной дыхательной
цепи.

В третьих, органическое вещество может быть акцептором электронов не толь-
ко при брожении, но и при дыхании — например фумаратном.
В четвертых, при брожении могут использоваться не только органические, но
и неорганические акцепторы электронов — например катионы окисного железа.

Брожение с позиций биоэнергетики. Суть брожения вытекает из основ био-
энергетики. При этом метаболическом процессе энергия ассимилируется с помощью
цитозольных биотрансформаторов.

Брожение — это такой тип хемоорганотрофии, когда энергия ассимилируется
путем фосфорилирования АДФ на уровне субстрата при окислении последнего ци-
тозольными дегидрогеназами, причем электроны передаются эндогенному или эк-
зогенному (не)органическому акцептору, который превращается в специфический
побочный продукт.

При брожении энергия первично ассимилируется в форме фосфагена, например
фосфоэнолпирувата или 1,3-бисфосфоглицерата. После этого происходит фосфори-
лирование АДФ на уровне субстрата.

Энергия, запасенная при брожении в форме АТФ, обеспечивает разнообразные
эндергонические процессы с помощью реакций, которые катализируются АТФазами
и АТФ-киназами.

Прокариотные ферментаторы имеют, наряду с растворимыми АТФазами, мем-
браносвязанные АТ Фазы/АТФ-синтазы. Благодаря этим ферментам энергия гидро-
лиза терминальной фосфоэфирной связи АТФ преобразуется в Pmf. В свою очередь,
Pmf используется в тех эндергонических процессах, которые протекают без участия
АТФ. В качестве примеров можно привести некоторые типы активного транспорта,
а также движение с помощью вращающихся жгутиков.

В самом общем виде энергетическую стратегию брожения можно изобразить сле-
дующим образом:

Брожение —> АТФ —> Pmf —> полезная работа

полезная работа.

Таким образом, при брожении «цитозольная» биоэнергетика первична, а «мем-
бранная» — вторична.

Сравнение брожения с дыханием. Зачастую утверждают, что главное от-
личие дыхания от брожения связано с поглощением кислорода. Это справедливо
лишь для растений и большинства животных, поскольку некоторые ядерные орга-
низмы и очень многие прокариоты используют при дыхании не кислород, а другой
окислитель, например нитрат или сульфат. Другое утверждение, что при брожении
используется только органический акцептор электронов, также несостоятельно. Это
могут быть, в частности, катионы Fe3+ (см. раздел 11.3.4.6).

В действительности коренное различие между брожением и дыханием заключа-
ется не в типе акцептора электронов, а в способе ассимиляции энергии.

Как мы уже выяснили, при брожении энергия первично ассимилируется в форме
АТФ. В отличие от этого при дыхании энергия первично ассимилируется в форме
Pmf. Затем она используется вторичными транспортерами и двигательными систе-
мами, а также преобразуется в химический потенциал АТФ с помощью мембра-
носвязанной АТФазы/АТФ-синтазы. Энергия, которая освобождается при разрыве
терминальной фосфоэфирной связи АТФ растворимыми или мембраносвязанными
АТФазами и АТФ-киназами, в свою очередь, расходуется для полезной работы.
Поэтому в самом общем виде энергетическую стратегию дыхания можно изоб-
разить следующим образом:

Дыхание —> Pmf —► АТФ —> полезная работа

полезная работа.

Таким образом, концептуальное различие между брожением и дыханием заклю-
чается в том, что в этих процессах используются разные биоэнергетические страте-
гии.

11.3.2.	Механизмы образования пирувата
при катаболизме углеводов

Возбудителями брожения могут быть представители всех трех глобальных до-
менов.

В основе реакций, на которых основано большинство типов брожения, лежит ка-
таболизм углеводов. Ключевым продуктом этих биохимических превращений, обес-
печивающих клетку свободной энергией в форме АТФ, служит пировиноградная
кислота (пируват).

Наиболее распространенным механизмом образования пирувата является гек-
созобисфосфатный путь (англ, hexose bisphosphate pathway, НВР).

11.3.2.1.	Гексозобисфосфатный путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса

Этот путь по старой традиции называют гликолизом (греч. glykos — сладкий и
lysis — уничтожение; распад глюкозы).

Гликолиз был первым полностью расшифрованным метаболическим путем. Главная заслу-
га в этом принадлежала когорте выдающихся биохимиков, куда входили немцы Карл Ло-
ман (K.Lomann), Карл Нойберг (С. Neuberg), Густав Эмбден (G. Embden), Отто Мейергоф
(О. F. Meyerhof, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1922 г.), Ганс Эйлер (Н. von Euler-
Chelpin, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1929 г.) и Отто Варбург (О. Н. Warburg,
Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1931 г.); англичанин Артур Харден (A. Harden,
Нобелевская премия по химии, 1929 г.); австро-венгры Якуб Парнас (J. К. Parnas) и супруги Кори
(С. R. Cori, G.T.Cori, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1947 г.).

В память исследователей, которые внесли наибольший вклад в реконструкцию гексозобис-
фосфатного пути, его называют путем Эмбдена-Мейергофа (англ. ЕМ) или Эмбдена-Мейергофа-
Парнаса (англ. ЕМР).

Первоначально гликолиз изучали, используя в качестве объектов ферментирующие дрожжи
(Saccharomyces cerevisiae) и анаэробные мышечные препараты позвоночных. Позднее выяснилось,
что гликолиз и его модификации встречаются у представителей всех трех доменов.

Обобщенная схема гликолиза приведена на рис. 86.

Левая ветвь этого пути (пять ферментативных реакций) несет конструктивный
смысл и заключается в подготовке донора электронов — глицеральдегид-3-фосфа-
та. С этой целью гексоза симметрично активируется с помощью гексокиназы и 6-
фосфофруктокиназы двумя молекулами АТФ (понесенный расход в дальнейшем
компенсируется за счет экзергонических реакций на правой ветви), а затем с помо-
щью альдолазы расщепляется на два Сз-фрагмента. Один — это глицеральдегид-3-
ОН

D-глюкоза

АТФ

АДФ

гексокиназа

ОН
глюкозо-6-фосфат

глицералъдегид-
3-фосфат-
дегидрогеназа

- НАД + Ф
>НАДН

СОО-Р
1
снон
I
СН2ОР

1,3-бисфосфоглицерат

АДФ<

АТФ<

фосфоглюкоизомераза

2^ 3-фосфоглицераткиназа

СОО"

РОН2С СН2ОН
i^°^i
\ НОИ

У—ион
он
фруктозо-6-фосфат

неон
I
СН2ОР

3-фосфогпицерат

фосфоглицеромутаза

АТФ

АДФ

1 СН,ОР

’СО

СОО-
I
НСОР
I
СН2ОН
2-фосфоглицерат

фосфопируватгидратаза

триозо-
фосфат-
изомераза

<сно

Э СН2ОН
диоксиацетонфосфат

соо-
I

С-О~р
II
сн2
фосфоэнолпируват

АДФ
АТФ

пируваткиназа

соо-
I
со

5снон <

* СН2ОР	сн3

глицеральдегид-3-фосфат	пируват

Рис. 86. Гексозобисфосфатный путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (гликолиз).
фосфат. Другой — это диоксиацетон-3-фосфат, и он превращается в глицеральдегид-
3-фосфат с помощью триозофосфатизомеразы.

Из-за того, что при гликолизе шестиуглеродный субстрат расщепляется надвое,
этот путь еще называют «дихотомическим» (от греч. dichotoma — разрезать на две
части).

Правая ветвь гликолитического пути (пять ферментативных реакций) имеет био-
энергетический смысл, поскольку в ней синтезируются два фосфагена.

Один фосфаген (1,3-бисфосфоглицерат) образуется при окислении глицеральде-
гид-3-фосфата—путем включения неорганического фосфата (Ф) в состав триозы.
Другой фосфаген (фосфоэнолпируват) образуется при отщеплении молекулы воды
от 2-фосфоглицерата.

Путем переноса фосфорильной группы от этих фосфагенов происходит фосфо-
рилирование на уровне субстрата двух молекул АДФ.

Кофактором дегидрогеназы, катализирующей ключевую реакцию гликолиза —
превращение глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-бисфосфоглицерат —служит никоти-
намид-адениндинуклеотид (НАД; см. рис. 103), который был впервые выделен Эй-
лером и Варбургом. Его восстановленная форма может использоваться:

—	для образования специфических конечных продуктов (в случае энергетическо-
го метаболизма бродильного типа);

—	для создания Pmf (в случае энергетического метаболизма дыхательного типа);

—	для биосинтетических реакций (в случае конструктивного метаболизма, на-
пример диазотрофии).

Особо обратим внимание на то, что в правую ветвь гликолитического пути вхо-
дят две молекулы глицеральдегид-3-фосфата. Первая молекула этой триозы (атомы
углерода №4, 5 и 6) является прямым продуктом дихотомического расщепления гек-
созы. Вторая молекула этой триозы (атомы углерода №1, 2 и 3) образуется путем
изомеризации другой триозы — диоксиацетонфосфата.

Таким образом, на правой ветви гликолитического пути синтезируются четыре
молекулы АТФ. Поскольку две из них затрачиваются на левой ветви, конечный итог
ассимиляции энергии при гликолизе составляет две молекулы АТФ на молекулу
окисленной гексозы.

Суммарное уравнение гексозобисфосфатного пути записывается следующим об-
разом:

глюкоза + 2АДФ + 2Ф + 2НАД —> 2 х пируват + 2АТФ + 2НАДН + 2Н+.

На основе вышеизложенного мы можем дать следующее определение гексозобис-
фосфатного пути.

Гексозобисфосфатный путь (гликолиз) — это катаболическое превращение глю-
козы в две молекулы пирувата, которое сопровождается восстановлением двух
молекул НАД и фосфорилированием на уровне субстрата четырех молекул АДФ,
причем две молекулы АТФ расходуются в подготовительных киназных реакциях.

Как мы уже отмечали, гликолитический путь служит основой большинства бро-
жений. Однако он может выполнять и альтернативную роль, подготавливая для
дыхательной цепи субстрат — НАДН. Последний образуется как в самом гликолизе,
так и при дальнейшем окислении пирувата.

Необходимо особо подчеркнуть, что конкретные реакции гликолиза и весь гек-
созобисфосфатный путь обратимы (рис. 86). Это, в частности, позволяет при отсут-
ствии готовой глюкозы осуществить глюконеогенез, т. е. синтезировать глюкозу из
триоз, после чего включать ее в состав структурных полимеров (пептидогликана,
липополисахарида), поверхностных слоев (чехла, капсулы), а также откладывать ее
в составе запасного полигликозида.

Регуляция гексозобисфосфатного пути. Классический гексозобисфосфат-
ный путь регулируется на уровне транскрипции (путем изменения паттерна и
скорости экспрессии генов, кодирующих гликолитические ферменты), а также на
посттрансляционном уровне (путем аллостерической модификации уже синтезиро-
ванных гликолитических ферментов).

Особо важен контроль двух однонаправленных реакций гликолиза. Одна из них
катализируется фосфофруктокиназой и связана с превращением фруктозо-6-фос-
фата во фруктозо-1,6-бисфосфат; противоположную реакцию катализирует фрук-
тозе- 1,6-бисфосфат-фосфатаза. Другая реакция катализируется пируваткиназой и
связана с превращением фосфоэнолпирувата в пируват (рис. 86).

При выращивании Е. coli на богатой сахарами среде регулятор транскрипции
FruR, или активатор катаболитной репрессии (англ, catabolite repressor activator,
Сга) реагирует на высокую концентрацию фруктозо-1,6-бисфосфата и усиливает
транскрипцию гена фосфофруктокиназы pfkA, а также гена пируваткиназы pykF.

При наличии сахаров возрастает и активность фосфофруктокиназы, поскольку
повышается концентрация ее субстрата (фруктозо-6-фосфата), а также концентра-
ция ее аллостерического регулятора (фруктозо-1,6-бисфосфата).

В то же время фосфофруктокиназа аллостерически ингибируется АТФ, тогда
как АДФ или АМФ действуют на нее как положительные эффекторы. Этим отчасти
объясняется так называемый «эффект Пастера», или физиологический антагонизм
между дыханием и брожением.

При усиленной аэрации брожение вытесняется дыханием («прямой эффект Па-
стера»). После перехода к аэробиозу синтезируется больше АТФ, в результате чего
аллостерически ингибируется активность фосфофруктокиназы, уменьшается содер-
жание фруктозо-1,6-бисфосфата и, соответственно, уменьшается потребление глю-
козы, т.е. подавляется брожение. Это свойственно всем факультативным бродиль-
щикам —от прокариотов до мышц позвоночных.

В свою очередь, при «обратном эффекте Пастера» на фоне дефицита кислоро-
да падает скорость мембранного фосфорилирования и снижается энергетический
заряд, т. е. уменьшается отношение АТФ к сумме всех трех аденилатов (см. раз-
дел 10.2). В результате этого активируется фосфофруктокиназа и больше глюкозы
окисляется по гликолитическому пути, т. е. брожение стимулируется. Кроме того,
брожение усиливается из-за ослабления конкуренции за АДФ и Ф между фосфори-
лированием на уровне субстрата и мембранным фосфорилированием.

11.3.2.2. Гексозомонофосфатный путь Энтнера—Дудорова

Этот путь, известный также как «2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный путь»
(англ. 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate pathway, KDP), был открыт у Pseudomonas
saccharophila в 1952 г. Энтнером (N. Entner) и Дудоровым (М. Doudoroff). В настоя-
щее время установлено, что он распространен очень широко и встречается у пред-
ставителей всех трех глобальных доменов.

KDP-путь особо характерен для представителей филы ВХП Proteobacteria (84
вида 37 родов, в частности Zymomonas mobilis). Реже им обладают представите-
ли фил ВХШ Firmicutes (восемь видов трех родов, в частности Streptococcus fae-
calls'), BXIV Actinobacteria (пять видов трех родов, в частности Arthrobacter simplex),
BXVII Spirochaetes (Treponema saccharophilum) и BXX Bacteroidetes (три вида трех
родов, например Spirosoma linguale).

В домене Archaea KDP-путь обнаружен у представителей фил AI Crenarchaeota
(четыре вида трех родов, например Sulfolobus solfataricus) и АП Euryarchaeota (пять
видов пяти родов, например Thermoplasma acidophilum).

Наконец, в домене Eucarya KDP-путь выявлен у Aspergillus niger, Entamoeba
histolytica и Penicillium notatum.

Продуктом пути Энтнера-Дудорова, как и при гликолизе, является пируват
(рис. 87).

Точно так же, как при гликолизе, левая ветвь пути Энтнера-Дудорова (пять
ферментативных реакций) имеет конструктивный смысл и заключается в подготов-
ке донора электронов — глицеральдегид-3-фосфата.

Однако из-за отсутствия 6-фосфофруктокиназы симметричная активация гек-
созы оказывается невозможной. Вместо этого гексоза асимметрично активируется
одной молекулой АТФ (понесенный расход компенсируется за счет экзергонических
реакций на правой ветви), в результате чего образуется глюкозо-6-фосфат. НАДФ-
зависимая дегидрогеназа окисляет его в 6-фосфоглюконолактон, а из последнего
под действием фосфоглюконолактоназы образуется 6-фосфоглюконат.

С помощью фосфоглюконат-дегидратазы 6-фосфоглюконат превращается в 2-
кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат, ключевой метаболит цикла Энтнера-Дудорова.
Этот фермент имеет гомодимерную структуру (63 кДа; ген edD), а в качестве про-
стетической группы используется [Реп8п]-кластер.

Далее под действием специфической альдолазы 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюко-
нат расщепляется на две триозы — глицеральдегид-3-фосфат и первую молекулу
пирувата (вторая молекула пирувата образуется на правой ветви). Этот фермент
представляет собой тример (23 кДа; ген edA) и не содержит простетических групп.

Легко заметить, что правая ветвь пути Энтнера-Дудорова полностью совпадает
с гликолитической, т. е. он представляет собой не что иное, как вариант гликолиза.

Однако, в отличие от «классического» гликолиза, в правую ветвь пути Энтнера-
Дудорова вступают не две, а только одна молекула глицеральдегид-3-фосфата (ато-
мы углерода №4, 5и 6), что обеспечивает фосфорилирование на уровне субстрата
только двух молекул АДФ. Поскольку одна из них затрачивается на левой ветви,
конечный итог ассимиляции энергии на пути Энтнера-Дудорова минимален — одна
молекула АТФ на молекулу окисленной гексозы:

глюкоза + АДФ + Ф + НАДФ + НАД —►

2 х пируват + АТФ + НАДФН + НАДН + 2Н+.

Тем не менее, благодаря этому пути многие бактерии, растущие на богатых са-
харами средах, получили возможность быстро накапливать пируват (примерами
служат ассоциированные с растениями представители рода Pseudomonas).

У аэробов путь Энтнера-Дудорова обычно сопровождается окислительным де-
карбоксилированием пирувата (см. раздел 11.3.3), и образующийся ацетил-СоА по-
ступает в цикл Кребса, снабжающий дыхательную цепь донорами электронов — вос-
становленными пиридиновыми (НАДН и НАДФН) и флавиновым (ФАДН2) нуклео-
тидами.
глюкозо-6-фосфат

НАДФ -
НАДФН<

глюкозо-6-фосфат-
дегидрогеназа

гп ЛР

ОН

6-фосфоглюконолактон

фосфоглюконо-
лактоназа

СОО"
I
нс-он

I
но-сн

I
нс-он
I
нс-он

I

СН2ОР
6-фосфоглюконат

фосфоглюконат-
дегидратаза

СОО-
I
со
I
сн2

нс-он
I

нс-он
I
СН2ОР

2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат

глицеральдегид-
3-фосфат-
дегидрогеназа

- НАД + Ф
>НАДН

СОО-Р
I

НС-ОН
I

СН2ОР

1,3-бисфосфоглицерат

АДФ-4--------J 3-фосфоглицерат-

АТф ----------'	киназа

СОО"
I
НС-ОН
I
СН2ОР
3-фосфоглицерат
фосфоглицеро-
мутаза

СОО"
I

НС-ОР
I
СН2ОН
2-фосфоглицерат

фосфопируват-
гидратаза

СОО"
I
С-О~р
II
сн2
фосфоэнолпируват

АДФ -
АТФ<

сно
I
>нс-он
I
СН2ОР

п ируваткиназа

СОО"
I
со

I
сн3

пируват	глицеральдегид-3-фосфат	пируват

Рис. 87. Гексозомонофосфатный путь Энтнера-Дудорова.
Единственным примером, когда путь Энтнера-Дудорова функционирует у анаэ-
робов, является Zymomonas mobilis. В данном случае после декарбоксилирования
пирувата (см. раздел 11.3.3) ацетальдегид используется в качестве ловушки для
электронов и с помощью алкогольдегидрогеназы превращается в этанол.

Z. mobilis встречается преимущественно в тропическом поясе в ассоциации с
растениями, сок которых содержит много глюкозы, сахарозы и фруктозы. Созда-
нию элективных условий для роста этой бактерии способствуют бактерии рода Glu-
conobacter, которые окисляют этот узкий набор сахаров до глюконата. Хотя Z. mo-
bilis дает минимальный для прокариотного организма урожай биомассы в расчете
на моль окисленного субстрата, эта бактерия активно импортирует сахара, и содер-
жание ферментов KDP-пути у нее достигает 50% растворимого белка.

11.3.2.3. Гексозомонофосфатный путь Варбурга-Диккенса-Хореккера

Второе название этого пути — «окислительный пентозофосфатный путь» (англ,
oxidative pentose phosphate pathway, OPP). Он был назван в честь Отто Варбурга,
который внес первоначальный вклад в его изучение в 1930-е годы, и английских
биохимиков Диккенса (F. Dickens) и Хореккера (G. Horecker), которые реконструи-
ровали его в конце 1950-х годов.

Наконец, этот путь называют «апотомическим» (от греч. apotome —отрезать).
В отличие от «дихотомического» гликолиза, где шестиуглеродный субстрат расщеп-
ляется пополам, здесь он подвергается декарбоксилированию.

ОРР-путь используют гетероферментативные молочнокислые бактерии, принад-
лежащие к филе ВХШ Firmicutes.

Подобно гликолизу и пути Энтнера-Дудорова, левая ветвь пути Варбурга-
Диккенса-Хореккера (семь ферментативных реакций) имеет конструктивный смысл
и заключается в подготовке донора электронов — глицеральдегид-3-фосфата. В ре-
зультате его окисления образуется пируват. Однако в данном случае наряду с пи-
руватом образуется ацетилфосфат (рис. 88). Как и пируват, ацетилфосфат может
иметь разную «судьбу», что является основой для разных типов брожения.

Так же, как в пути Энтнера-Дудорова, глюкоза сначала превращается в 6-фос-
фоглюконат. Затем, в отличие от пути Энтнера-Дудорова, 6-фосфоглюконат не де-
гидрируется в 2-кето-З-дезокси-б-фосфоглюконат, а окисляется в З-кето-6-фосфо-
глюконат.

После этого З-кето-6-фосфоглюконат декарбоксилируется с образованием рибу-
лозо-5-фосфата, который эпимеризуется в ксилулозо-5-фосфат.

Наконец, с помощью фосфокетолазы ксилулозо-5-фосфат расщепляется на гли-
церальдегид-3-фосфат и ацетилфосфат (СН3—СОО~Р). Кофактором в данной ре-
акции служит тиаминпирофосфат, или витамин Bi (рис. 89). Он связывает «кетоль-
ную» группу (СН2ОН-СО-) ксилулозо-5-фосфата, которая после отщепления моле-
кулы воды и присоединения неорганического фосфата превращается в ацетилфос-
фат.

Правая ветвь пути Варбурга-Диккенса-Хореккера полностью совпадает с глико-
литической. Поэтому, как и путь Энтнера-Дудорова, этот путь представляет собой
не что иное, как вариант гликолиза.

Однако, в отличие от «классического» гликолиза и аналогично пути Энтнера-
Дудорова, в правую ветвь пути Варбурга-Диккенса-Хореккера вступают не две, а
только одна молекула глицеральдегид-3-фосфата (атомы углерода №4, 5 и 6). Этим
t

COO"
I
HC-OH
I
HO-CH
I
HC-OH
I
HC-OH
I
CH2OP
6-фосфоглюконат
патт__________6-фосфо-

rLAA	> глюконат-

НАДН-^--------' дегидрогеназа

СОО"
I
HC-OH
I
co
I
HC-OH
I
HC-OH
I
CH2OP
З-кето-6-фосфоглюконат

З-кето-6-фосфо-

глицеральдегид-
3-фосфат-
дегидрогеназа

- НАД + Ф

>НАДН

СОО-Р
I

НС-ОН
I
СН2ОР

1,3-бисфосфоглицерат

АДФ<
АТФ<

3-фосфоглицерат-
киназа

СОО"

НС-он

CO2<«---'

глюконат-
декарбоксилаза

СН2ОР
3-фосфоглицерат

СН2ОН

со
I
НС-он

I

НС-он

I
СН2ОР

1фосфоглицеро-
мутаза

рибулозо-5-фосфат

эпимераза

СН2ОН
со
1
но-сн

I
НС-он

I

СН2ОР

СОО"
I
НС-ОР
I
СН2ОН
2-фосфоглицерат

фосфопируват-
гидратаза

СОО"
I
С-О~Р
II
сн2
фосфоэнолпируват

ксилул озо-5-фосфат

СНО
I
нс-он

I
СН2ОР

ацетилфосфат

АДФ

АТФ

глицеральдегид-3-фосфат

пируваткиназа
▼
СОО"

I
со

I
сн3
пируват

Рис. 88. Гексозомонофосфатный путь Варбурга-Диккенса-Хореккера.
Рис. 89. Тиаминпирофосфат (витамин Bi).
Стрелкой указано место присоединения кетольной группы.

обеспечивается фосфорилирование на уровне субстрата только двух молекул АДФ.
Поскольку одна из них затрачивается на левой ветви, конечный итог ассимиляции
энергии на пути Варбурга-Диккенса-Хореккера минимален — одна молекула АТФ
на молекулу окисленной гексозы:

глюкоза + АДФ + 2Ф + 2НАД + НАДФ —>

—> пируват + ацетилфосфат 4- АТФ + 2НАДН + НАДФН + ЩО + 2Н+.

Еще раз напомним, что левая ветвь пути Варбурга-Диккенса-Хореккера до стадии
расщепления ксилулозо-5-фосфата входит составной частью в окислительный пенто-
зофосфатный цикл (см. раздел 11.4.2.2), снабжающий дыхательную цепь донорами
электронов — восстановленными пиридиновыми нуклеотидами.

Кроме того, с помощью пути Варбурга-Диккенса-Хореккера бактерии могут ка-
таболизировать не только гексозы, но и пентозы.

У бактерий, обладающих метаболизмом бродильного типа, гексозомонофос-
фатный путь Варбурга-Диккенса-Хореккера может использоваться наряду с гек-
созобисфосфатным путем. Примером служат факультативные «гетероферментатив-
ные» молочнокислые бактерии, в частности Lactobacillus plantarum.

У бактерий с дыхательным типом метаболизма гексозомонофосфатный путь
Варбурга-Диккенса-Хореккера может использоваться наряду с гексозомонофос-
фатным путем Энтнера-Дудорова. В качестве примера можно назвать фитопато-
гена Xanthomonas campestris.

11.3.2.4. Гексозомонофосфатный путь де Фриза—Стаутамера

Этот путь расшифровали во второй половине 1960-х гг. голландский микробио-
лог де Фриз (W. De Vries) и английский микробиолог Стаутамер (A. Stouthamer). Он
известен также под названием «бифидо-шунт» (англ, bifido shunt). Его используют
«гетероферментативные» молочнокислые бактерии рода Bifidobacterium, принадле-
жащие к филе BXIV Actinobacteria.

Подобно гликолизу, а также путям Энтнера-Дудорова и Варбурга-Диккенса-
Хореккера, левая ветвь бифидо-шунта (семь ферментативных реакций) имеет кон-
структивный смысл и заключается в подготовке донора электронов — глицеральде-
гид-3-фосфата. В результате окисления глицеральдегид-3-фосфата образуется пи-
руват.
Как и в случае пути Варбурга-Диккенса-Хореккера, вторым продуктом бифидо-
шунта является ацетилфосфат. Однако механизм его синтеза имеет существенные
особенности (рис. 90).

D-глюкоза

D-глюкоза



СОО-Р

фруктозо-6-фосфат

фруктозо-6-фосфат-
фосфокетолаза

CHO

фруктозо-6-фосфат

СН3
ацетилфосфат

нс-он

нс-он

СН2ОР
эритрозо-4-фосфат

трансальдолаза

V'H

НС-ОН

глицерольдегид-
3-фосфат-
дегидрогеназа

СОО-Р

снон

СОО-Р

СИ,

ацетилфосфат

— НАД + Ф

>НАДН

сн2он
со

но-сн

СН2ОР
гпицеральдегид-3 -фосфат

нс-он

нс-он

ксилулозо-5-фосфат
фосфокетолаза

нс-он

СН2ОН
со

СН2ОР
седогептулозо-7-фосфат

транскетолаза

сно

нс-он

Ф Н2О НО-СН

нс-он

нс-он

нс-он

СН2ОР

СН,ОР

ксилулозо-5-фосфат рибозо-5-фосфат

пентозофосфат-
изомераза

сно

> нс-он

СН2ОР

1,3-бисфосфоглицерат

АДФ<
АТФ<

ф 3-фосфоглицерат-

—Ф	киназа

СОО"

неон

СН2ОР

3 -фосфоглицерат

1фосфоглицеро-
мутаза

СОО'

НСОР

сн2он

2-фосфоглицерат

4 фосфопируват-
Н2О-<—гидратаза

СОО'

С-О~Р

сн2
фосфоэнолпируват

АДФ -
АТФ<

пируваткиназа

СОО'

со

СН,ОР

сн,

глицеральдегид-3-фосфат пируват

Рис. 90. Гексозомонофосфатный путь де Фриза-Стаутамера (бифидо-шунт).

Глюкоза так же, как при гликолизе, превращается во фруктозо-6-фосфат. Затем
с помощью фосфокетолазы фруктозо-б-фосфат расщепляется на ацетилфосфат и
эритрозо-4-фосфат. Эта реакция аналогична фосфокетолазному расщеплению кси-
лулозо-5-фосфата в пути Варбурга-Диккенса-Хореккера, и кофактором здесь также
служит тиаминпирофосфат.

Затем осуществляется серия из четырех реакций, в которых участвуют эритрозо-
4-фосфат и вторая молекула фруктозо-6-фосфата. Сначала с помощью трансальдо-
лазы от альдозы (эритрозо-4-фосфата) на кетозу (фруктозо-6-фосфат) переносит-
ся формильная, или «альдольная» группа (СНО-); в результате образуются гли-
церальдегид-3-фосфат и седогептулозо-7-фосфат. Затем с помощью транскетолазы
от кетозы (седогептулозо-7-фосфата) на альдозу (глицеральдегид-3-фосфат) пере-
носится «кетольная» группа (СН2ОН-СО-); в результате образуются ксилулозо-5-
фосфат и рибозо-5-фосфат. После этого пентозофосфат-изомераза превращает ри-
бозо-5-фосфат в ксилулозо-5-фосфат. Наконец, ксилулозо-5-фосфат-фосфокетолаза
расщепляет ксилулозо-5-фосфат на ацетилфосфат и глицеральдегид-3-фосфат.

Таким образом, в правую ветвь пути де Фриза-Стаутамера входят две молекулы
глицеральдегид-3-фосфата (атомы углерода №4, 5 и 6), что обеспечивает фосфори-
лирование на уровне субстрата четырех молекул АДФ. Две из них затрачиваются
на левой ветви для асимметричного фосфорилирования двух молекул глюкозы, и
поэтому итог ассимиляции энергии для данного пути минимален — одна молекула
АТФ на молекулу окисленной гексозы:

2 х глюкоза + 2АДФ + 5Ф + 2НАД —»

2 х пируват + 3 х ацетилфосфат + 2АТФ + 2НАДН + ЗН2О + 2Н+.

Однако не следует забывать, что в левой ветви пути де Фриза-Стаутамера обра-
зуются три молекулы ацетилфосфата. С помощью ацетаткиназы они превращаются
в ацетат, в результате чего регенерируется дополнительное количество АТФ:

СН3-СОО~Р + АДФ -> СНз-СОО- + АТФ.

Наконец, благодаря мощным фосфокетолазам, а также наличию трансальдо-
лазной и транскетолазной активности, бифидобактерии могут катаболизировать не
только гексозы, но и пентозы.

11.3.2.5. Образование пирувата у архей

Из-за позднего «пришествия» архей в биологию особенности их углеводного ме-
таболизма оставались неизвестными до начала 1990-х годов.

Основные объекты при изучении механизмов образования пирувата у архей —
это гипертермофилы, имеющие оптимум роста > 80°С. Большинство из них рас-
тет хемогетеротрофно на средах, содержащих полипептиды. Однако встречаются и
сахаролитические формы с метаболизмом дыхательного типа, которые используют
в качестве терминального акцептора электронов кислород (например, Sulfolobus),
серу (например, Thermoproteus) или сульфат (например, Archaeoglobus).

В настоящее время способность к катаболизму углеводов выявлена у восьми
видов из филы AI Crenarchaeota (рода Desulf urococcus, Pyrodictium, Sulfolobus и
Thermoproteus) и у двадцати видов из филы АП Euryarchaeota (рода Archaeoglobus,
Haloarcula, Halobacterium, Halococcus, Haloferax, Pyrococcus, Thermococcus и Thermo-
plasma).

Выяснено, что археи могут образовывать пируват по модифицированному гек-
созобисфосфатному пути или по модифицированному гексозомонофосфатному пути
Энтнера-Дудорова. Интересно, что некоторые ферменты этих путей не гомологич-
ны бактериальным.

У архей гексозомонофосфатный путь Варбурга-Диккенса-Хореккера не найден
и, скорее всего, он у них вообще отсутствует (в частности, не выявлены гены-ор-
тологи глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы). Гек-
созомонофосфатный путь де Фриза-Стаутамера у архей также не обнаружен.

Особенности гексозобисфосфатного пути у архей. Они проявляются на
стадии подготовки глицеральдегид-3-фосфата (рис. 91,А). Прежде всего, наряду с
АТФ-зависимой «бактериальной» гексокиназой может использоваться гетерологич-
ная АДФ-зависимая глюкокиназа. Фосфоглюкоизомераза, превращающая глюкозо-
б-фосфат во фруктозо-6-фосфат, также не родственна бактериальной. Наконец, до-
норами фосфорила для 6-фосфофруктокиназы может быть не только АТФ, но и
АДФ, а также пирофосфат ФФ.

Важнейшей особенностью гексозобисфосфатного пути у архей является способ,
которым глицеральдегид-3-фосфат может быть превращен в 3-фосфоглицерат. На-
ряду с обычным механизмом, когда на уровне субстрата фосфорилируются две мо-
лекулы АДФ, имеется уникальный одноэтапный механизм —без образования 1,3-
бисфосфоглицерата. Катализатором этой реакции является «необратимая» НАДФ-
зависимая или ферредоксинзависимая глицеральдегид-3-фосфат-оксидоредуктаза.
В качестве простетических групп она использует р^ЗД-кластер и вольфрам, лиган-
дированный молекулами птерина (продукта конденсации двух шестичленных азот-
содержащих гетероциклов). При использовании этого механизма выход АТФ равен
нулю, поскольку две молекулы АТФ, образующиеся в результате пируваткиназной
реакции, компенсируют затрату двух молекул АТФ при симметричной активации
гексозы:

глюкоза + 4ФдоХ —> 2 х пируват + 4Фдгес] + 4Н+.

В том случае, когда донором одного из фосфорилов служит пирофосфат ФФ,
конечный итог ассимиляции энергии составляет одну молекулу АТФ на молекулу
окисленной глюкозы.

Особенности гексозомонофосфатного пути Энтнера-Дудорова у ар-
хей. Они проявляются на этапе образования 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконата
(рис. 91, Б). Активация гексозы осуществляется не в начале пути, а только на ста-
дии 2-кето-З-дезоксиглюконата. Вначале НАДФ-зависимая глюкозодегидрогеназа
окисляет нефосфорилированную глюкозу в глюконат, а затем глюконатдегидратаза
превращает его в 2-кето-З-дезоксиглюконат. В итоге энергетический выход такого
«поздно фосфорилирующего» пути Энтнера-Дудорова составляет одну молекулу
АТФ:

глюкоза + НАДФ + НАД + АДФ + Ф
2 х пируват + НАДФН + НАДН + АТФ + 2Н+.

Существует также «нефосфорилирующий» путь Энтнера-Дудорова, когда 2-ке-
то-3-дезокси-глюконат расщепляется уникальной альдолазой на молекулу пирувата
и молекулу глицеральдегида. Затем уникальная НАДФ-зависимая дегидрогеназа
превращает его в глицерат. И, наконец, уникальная киназа превращает глицерат в
2-фосфоглицерат, который поступает в магистральный гликолитический путь. При
использовании такого механизма выход АТФ равен нулю, поскольку одна молекула
Б

АТФ/АДФ^<
АДФ/АМФ	+

глюкозо-6-фосфат

D-глюкоза

НАДФ

НАДФН

глюконат

фрукгозо-6-фосфат

АТФ/ЛДФ/ФФЧ

адф/амф/ф<4

АДФ АТФ

2-кето-З-дезокси-

6-фосфоппоконат

2-кето-З-дезокси-
глюконат

1

X

фруктозо-1,6-бисфосфат

пируват

> глицеральдегид-3-фосфат

пируват

НАДФ^< 2Фд01

НАДФН 4/^2ФДгеа

глицеральдегид

НАДФ

НАДФН

1,3-бисфосфоглицерат
АДФ~>
атф*^4

> 3-фосфоглицерат

глицерат

2-фосфогпицерат

Н2О^

фосфоэнолпируват

АДФ

АТФ

пируват

Рис. 91. Гексозобисфосфатный (А) и гексозомонофосфатный (Б) путь у архей.

1 — глюкокиназа; 2 — 6-фосфофруктокиназа; 3 — глицеральдегид-3-фосфат-оксидоре-
дуктаза; 4 — глюкозодегидрогеназа; 5 — 2-кето-З-дезоксиглюконат-киназа; 6—2-кето-З-
дезоксиглюконат-альдолаза; 7 — глицеральдегид-дегидрогеназа; 8 — глицераткиназа.

АТФ, образующаяся в результате пируваткиназной реакции, компенсирует затрату
одной молекулы АТФ при активации глицерата:

глюкоза + 2НАДФ —> 2 х пируват + 2НАДФН + 2Н+.

Таким образом, кроме образования пирувата итогом катаболизма гексоз являет-
ся синтез восстановителя (НАДН, НАДФН или Фдгес1)- Низкий или нулевой выиг-
рыш АТФ в данном случае не создает энергетической проблемы, поскольку археи
получают энергию главным образом в результате дыхания.
11.3.3.	Судьба пирувата — основа разнообразия типов брожения

При брожении кофакторами дегидрогеназ служат пиридиннуклеотиды — НАД и
НАДФ. Для того, чтобы снова вступить в реакцию, они должны передать электроны
растворимому конечному акцептору.

В качестве него обычно используются продукты окислительно-восстановитель-
ных реакций самого брожения. В результате образуются специфические соединения,
которые выделяются во внешнюю среду, что дает название разным типам брожения
(спиртовое, молочнокислое, ацетонобутиловое и т. д.).

В основе разнообразия типов брожения лежит судьба пирувата. Этот генераль-
ный метаболит одновременно является одним из важнейших промежуточных про-
дуктов брожения.

Существуют четыре пути гетеротрофного, т. е. не связанного с карбоксилирова-
нием превращения пирувата (рис. 92).

Окислительное декарбоксилирование пирувата (рис. 92, А). Оно приво-
дит к образованию ацетил-Со А.

2Фд„ 2ФДто]

CoASH СО2

окислительное
декарбоксилирование

СОО
I
со

I
сн3

CoASH СО2

C~SCoA
I
сн3

ацетил-СоА

CHO
I
сн3

ацетальдегид

пируват

В

восстановление

НАДН НАД

СОО
I
неон

I
сн3
лактат

Г

тиолазное
расщепление

CoASH

C-SCoA

* сн3 + нсоо‘

ацетил-СоА формиат

Рис. 92. Пути гетеротрофного превращения пирувата.

1 — пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза; 2 — пируватдегидрогеназа; 3 — пируват-
декарбоксилаза; 4 — лактатдегидрогеназа; 5 — пируват:формиат-лиаза (тиолаза).
Коэнзим А (рис. 93) является производным пантотеновой кислоты. Он участвует в реакциях
S-ацилирования, прежде всего в реакции S-ацетилирования. Его открыл Фриц Липманн в 1947 г.
Ацетильная форма коэнзима А (ацетил-СоА) является активированной формой ацетата, что поз-
воляет ему участвовать в разнообразных энергетических и конструктивных процессах.

Ферментаторы-бродилыцики окислительно декарбоксилируют пируват с помо-
щью ферредоксинзависимой пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы:

СНз-СО-СОО" + CoASH + 2Фдох -> CH3-CO~SCoA + СО2+ 2Фдге<1.

После этого ацетил-СоА может использоваться для образования ряда конечных
продуктов — например, масляной кислоты при маслянокислом брожении или ацето-
на и бутанола при ацетонобутиловом брожении.

пантотеновая кислота

0-меркапто-
этиламин

СН3
I

СН2 - С — CH-CONH-(СН2)2 -CONH- (СН2)2- SH
1	1	4

сн3 он

сн3
I
со

I

аденозин-3 '-фосфат-5'-пирофосфат

Рис. 93. Коэнзим А.

Стрелкой указано место присоединения ацетильной группы.

Ферредоксин с помощью ферредоксин:НАД-оксидоредуктазы восстанавливает
НАД:

2Фдгеа + НАД -> 2Фдох + НАДН.

В свою очередь, НАДН передает электроны соответствующим предшественни-
кам этих конечных продуктов (см. ниже), которые служат ловушками для электро-
нов.

Альтернативной ловушкой для электронов могут быть протоны:

ФДгес! + 2Н+ —> ФДох + Н2,
где Фдге<1 и ФДох — соответственно восстановленный и окисленный ферредоксин.
Катализатором здесь является гидрогеназа. Благодаря образованию водорода ре-
гулируется баланс эндогенных окислительно-восстановительных реакций, а заодно
редокс-состояние окружающей среды.

Ацетил-СоА в данном случае превращается в ацетилфосфат с помощью фосфо-
трансацетилазы:

СН з-CO~SCoA + Ф	СН3-СОО~Р + CoASH.

Суммарная реакция окислительного декарбоксилирования пирувата с участием
ферредоксинзависимой оксидоредуктазы и фосфотрансацетилазы называется «фос-
форокластическим» распадом (греч. clasis — разламывание):

СНз-СО-СОО- + ФдоХ + Ф -> СНз-СОО~Р + СО2 + Фдге(1.

Дальнейшее превращение ацетилфосфата заключается в том, что он служит до-
нором фосфорильной группы в реакции фосфорилирования АДФ, которая катали-
зируется ацетаткиназой:

СН3-СОО~Р + АДФ -> СНз-СОО" + АТФ.

Такой метаболический путь называется «уксуснокислым брожением». Он встре-
чается у некоторых прокариотов, а также у паразитических протистов.

Забегая вперед, отметим, что у прокариотов с дыхательным типом метаболизма
пируват окислительно декарбоксилируется в ацетил-СоА при помощи НАД-зависи-
мой пируватдегидрогеназы:

СНз-СО-СОО- + CoASH + НАД -» CH3-CO~SCoA + СО2 + НАДН.

После этого ацетил-СоА конденсируется с оксалоацетатом с образованием цит-
рата. Затем из цитрата в системе взаимно сбалансированных реакций образуют-
ся интермедиаты цикла Кребса, в частности изоцитрат, а-кетоглутарат, малат и
сукцинат (см. рис. 101). При их окислении восстанавливаются пиридиновые и фла-
виновые нуклеотиды (НАД и ФАД), которые передают электроны дыхательной
цепи.

Декарбоксилирование пирувата (рис. 92, Б). Оно приводит к образованию
ацетальдегида. Катализатором этой реакции служит пируватдекарбоксилаза.

При спиртовом брожении ловушкой для электронов является ацетальдегид, ко-
торый восстанавливается в этанол НАДН-зависимой алкогольдегидрогеназой:

СН3 - СО - СОО- -> СН3 - СНО + СО2,
СН3 - СНО + 2Н+/2е" -> СН3 - СН2ОН.

Восстановление пирувата (рис. 92, В). Оно приводит к образованию лак-
тата. При молочнокислом брожении пируват, который восстанавливается НАДН-
зависимой лактатдегидрогеназой, непосредственно служит ловушкой для электро-
нов:

СНз-СО-СОО- + 2Н+/2е- - СН3-СНОН-СОО-.
Тиолазное расщепление пирувата (рис. 92, Г). Оно осуществляется с по-
мощью пируват:формиат-лиазы (тиолазы) и приводит к образованию ацетил-СоА и
формиата:

СНз-СО-СОО- + CoASH CH3-CO~SCoA + НСОО”.

Это характерно для муравьинокислого брожения, которое еще называют «бро-
жением смешанного типа».

11.3.4.	Типы брожения

Рассмотрим теперь основные типы брожения в том же порядке, в каком мы
перечисляли основные пути превращения пирувата.

11.3.4.1.	Маслянокислое и ацетонобутиловое брожение

Правильные названия брожений этого типа — «маслянокислотное» и «ацетон-бу-
танольное». Однако, чтобы не нарушать традиции, здесь и в дальнейшем мы будем
использовать привычные термины («молочнокислое», «муравьинокислое», «уксус-
нокислое»).

Возбудители маслянокислого и ацетонобутилового брожения принадлежат к ро-
ду Clostridium (фила ВХШ Firmicutes). Это облигатные анаэробы с метаболизмом
исключительно бродильного типа. Они не содержат цитохромов и других гемопроте-
инов, в частности каталазы, хотя различаются по своей толерантности к кислороду.
В число сбраживаемых ими субстратов входят углеводы, спирты, аминокислоты,
пурины, стероиды и ряд других соединений.

«Сахаролитические» клостридии (например, С. pasteurianwn) добывают сбра-
живаемые субстраты, гидролизуя на мономеры полигликозиды (крахмал, пектины
и целлюлозу). «Протеолитические» клостридии (например, С. histolyticum) исполь-
зуют для этой цели белки и полипептиды. Некоторые клостридии могут быть одно-
временно сахаролитическими и протеолитическими. Для обозначения клостридиев,
сбраживающих азотистые основания, используется неверный термин «пуринолити-
ческие».

Клостридии встречаются почти повсеместно — в почве, илах, на разлагающихся
растительных и животных продуктах, в пищеварительном тракте позвоночных и
насекомых, а также в ранах и глубоко инфицированных мягких тканях человека и
животных.

Маслянокислое и ацетонобутиловое брожения основаны на катаболизме сахаров
по гексозобисфосфатному пути. В данном случае пируват подвергается окислитель-
ному ферредоксинзависимому декарбоксилированию с образованием ацетил-СоА.

Восстановительные эквиваленты передаются от ферредоксина на НАД при по-
мощи растворимой ферредоксин:НАД-оксидоредуктазы. В свою очередь, НАДН от-
дает электроны интермедиатам брожения, к которым относятся сам ацетил-СоА, а
также ацетальдегид, ацетон, бутиральдегид, бутирил-СоА и кротонил-СоА. Конеч-
ными продуктами брожения в разных комбинациях и разных количественных соот-
ношениях становятся диоксид углерода и водород, а также ацетат, ацетон, бутанол,
бутират, изопропанол и этанол (рис. 94).
При избыточном накоплении восстановительных эквивалентов клетка освобож-
дается от них наипростейшим способом — ловушкой для электронов становятся про-
тоны, которые восстанавливаются до молекулярного водорода с помощью Fe-гидро-
геназы (см. раздел 11.4.4.4).

пируват

НАДН

НАД

НАДН НАД

гФДгеа

< 4 Т^О
сн,сноch,-c'SCoA
ацетальдегид (ЦУу ацетил-СоА
НАДН	CoASH

НАД
СН3-СН2ОН
этанол

CoASH

CoASH CqASH

❖° ®

СН3-С-О~Р X X► сн3-соо

ацетилфосфат I у ацетат
АДФ АТФ

ацетат ацетил-СоА

CH3-CO-CH2-C,CSCoA
ацетоацетил-СоА

CHj-CHOH-CH^cXsCoA

2-оксибутирил-СоА

> СН3-СО-СН2-СОО
ацетоацетат
®|*со2
сн3-со-сн3
ацетон

[141



Н2О

ch,-ch=ch-cXscoa

кротонил-СоА

сн3-снон-сн3

изопропанол

СН3-СН2-СН2-СНО<
бутиральдегид

НАД

CoASH

НАДН

НАД
НАДН НАД

CHj-CHrCHrCXsCoA
бутирил-СоА

ацетат 4-

ацетил-СоА

АДФ

СН3-СН2-СН2-СН2ОН сн3- сн2- сн2- соо’ АТФ
бутанол	с

J	бутират

Рис. 94. Маслянокислое и ацетонобутиловое брожение.

1 — пируватдегидрогеназа; 2 — ферредоксин:НАД-оксидоредуктаза; 3 — тиолаза; 4 — 2-окси-
бутирил-СоА-дегидрогеназа; 5 — кротоназа; 6 — бутирил-СоА-дегидрогеназа; 7 — бутиральдегид-
дегидрогеназа; 8 — бутанолдегидрогеназа; 9 — СоА-трансфераза; 10 — ацетальдегид-дегидрогена-
за; 11 — алкогольдегидрогеназа; 12 — фосфотрансацетилаза; 13 — ацетаткиназа; 14 — СоА-транс-
фераза; 15 — ацетоацетат-декарбоксилаза; 16 — изопропанолдегидрогеназа.

Маслянокислое брожение, типичным возбудителем которого является С. Ьи-
tyricum, протекает следующим образом.

Вначале из двух молекул ацетил-СоА с помощью тиолазы образуется активи-
рованный четырехуглеродный скелет —ацетоацетил-СоА. Его дальнейшие превра-
щения сводятся к реакциям дегидратации, восстановления, декарбоксилирования и
дезактивации (путем передачи остатка Со А другому носителю). В результате этих
реакций образуются альдегиды, кетоны и органические кислоты. Некоторые из них
служат ловушками для электронов, другие являются конечными продуктами бро-
жения.

Следом за тиолазой в пути, приводящем к образованию бутирата, участвует
2-оксибутирил-СоА-дегидрогеназа, которая превращает ацетоацетил-СоА в 2-окси-
бутирил-СоА. Затем под действием кротоназы из 2-оксибутирил-СоА образуется
кротонил-СоА. С помощью бутирил-Со А-дегидрогеназы он восстанавливается в бу-
тирил-Со А. Наконец, после переноса остатка Со А на ацетат с помощью СоА-транс-
феразы образуется конечный продукт маслянокислого брожения — бутират. Полу-
ченный в этой реакции ацетил-СоА при помощи фосфотрансацетилазы и ацетатки-
назы превращается в молекулу ацетата. В результате фосфорилирования на уровне
субстрата синтезируется молекула АТФ. Ацетат приобретает остаток Со А от бути-
рил-СоА, и цикл снова повторяется.

Четыре «лишних» электрона удаляются путем образования двух молекул водо-
рода (в гексозобисфосфатном пути восстанавливаются две молекулы НАДН; при
окислении двух молекул пирувата восстанавливаются четыре молекулы ферредок-
сина; две молекулы НАДН затрачиваются на восстановление кротонил-СоА; оста-
ется 2x2 + 1x4 — 2x2 = 4). В конечном счете, маслянокислое брожение протекает
в соответствии с уравнением:

глюкоза -> СН3-СН2-СН2-СОО- + 2СО2 + 2Н2.

Энергетический выход маслянокислого сбраживания глюкозы составляет три
молекулы АТФ (две на стадии гликолиза и одна на стадии регенерации ацетата).

В отличие от маслянокислого брожения, ацетонобутиловое брожение связано с
образованием целой серии конечных продуктов. В случае С. acetobutylicum (еще
одно неправильное название, следовало бы: С. acetonobutylicum) это ацетат, ацетон,
бутанол, бутират, изопропанол и этанол.

Биосинтез указанных продуктов различается по динамике. Вначале образуются
кислоты (ацетат и бутират), а затем более восстановленные нейтральные соединения
(ацетон, бутанол, изопропанол и этанол). Такая двухфазность накопления продук-
тов брожения носит адаптивный характер.

Синтез бутирата из части пула ацетил-СоА происходит так же, как при мас-
лянокислом брожении, и сопровождается фосфорилированием АДФ. Проблема ло-
вушки для электронов решается путем восстановления кротонил-СоА в бутирил-
СоА, а также благодаря выделению молекулярного водорода. Кроме того, восста-
новительные эквиваленты используются на анаболической ветви конструктивного
метаболизма. Другая часть пула ацетил-СоА превращается в ацетат в ходе фосфо-
трансацетил азной и ацетаткиназной реакций, что позволяет ассимилировать допол-
нительную энергию (рис. 94).

Негативным последствием этой фазы является увеличение общей кислотности
среды, что крайне неблагоприятно для развития клостридиев.

Поэтому при затухании роста, когда потребность в АТФ и восстановителе сокра-
щается, ацетонобутиловые клостридии начинают «исправлять положение». Теперь
они накапливают нейтральные продукты, синтез которых не связан с фосфорили-
рованием АДФ. В качестве дополнительной ловушки для электронов используются
протоны, что вызывает благоприятное для бактерий защелачивание окружающей
среды.

Для синтеза этанола используется ацетальдегид, полученный в результате вос-
становления ацетил-СоА с помощью ацетальдегид-дегидрогеназы. Бутанол образу-
ется аналогичным образом —из бутиральдегида, полученного в результате восста-
новления бутирил-СоА.

Ацетон является продуктом декарбоксилирования ацетоацетата, образованного
из ацетоацетил-Со А после переноса остатка СоА на ацетат. В свою очередь, продук-
том восстановления ацетона является изопропанол (рис. 94).

Естественно, что двухфазность ацетонобутилового брожения связана с адаптив-
ным синтезом соответствующих ферментов.

Из-за сложной динамики ацетонобутилового брожения нет смысла изображать
его общим уравнением, а также точно указывать его энергетический выход.

Природное значение маслянокислых и ацетонобутиловых клостридиев опреде-
ляется тем, что они играют роль первичных анаэробов-гидролитиков в анаэробном
деструктивном сообществе (см. раздел 11.2.2). Некоторые из них, например С. pas-
teurianum, являются свободноживущими диазотрофами.

Общеизвестно биологическое значение токсигенных клостридиев, в частности
С. botulinum (агент пищевого ботулизма), С. perfringens (возбудитель газовой ган-
грены) и С. tetani (возбудитель столбняка).

Практическое значение маслянокислых и ацетонобутиловых клостридиев отно-
сительно невелико. В настоящее время АВЕ-ферментация (от англ, acetone-butanol-
ethanol) с использованием мелассы или крахмалсодержащего растительного сырья
значительно уступает по рентабельности химическому синтезу из нефтепродуктов.
Однако в исторической ретроспективе это был первый «настоящий» биотехнологи-
ческий процесс, основанный на применении специально отселектированного штамма
С. butylicum, который выращивался в аксеничных условиях на оптимизированной
питательной среде. В широких масштабах АВЕ-ферментацию впервые осуществил
в 1915-1919 гг. в Канаде и США Хаим Вайцманн (С. Weizmann), что позволило стра-
нам антигерманской коалиции преодолеть дефицит сырья для производства бездым-
ного пороха и авиационного лака.

11.3.4.2.	Уксуснокислое брожение

Правильное название такого брожения — «уксуснокислотное», или «ацетатное».
Говоря о нем, мы должны сделать очень важное смысловое и терминологическое
уточнение.

Образование ацетата в качестве конечного продукта хемотрофии возможно че-
тырьмя различными способами:

—	из глюкозы при уксуснокислом брожении;

—	из глюкозы при уксуснокислом брожении в сочетании с синтезом из
2СО2/8Н+/8е-;

—	из 2CO2/SH+/8е~ при N-метилен-тетрагидрофолатном дыхании (см. раздел
11.4.5.6);

—	из этанола при дыхании в результате неполного окисления этого субстрата с
помощью алкогольдегидрогеназы и ацетальдегид-дегидрогеназы.

Первый способ связан с ассимиляцией энергии в результате фосфорилирования
АДФ на уровне субстрата, а ацетат является главным конечным продуктом.

Второй способ, или «гомоацетатное брожение» и третий способ, или «автотроф-
ный синтез ацетата» частично или полностью связаны с уникальным тетрагидро-
фолатным дыханием, которое мы подробно рассмотрим в разделе 11.4.5.5.
Четвертый способ является частным случаем аэробного дыхания, с помощью
которого представители р. Gluconobacter ассимилируют энергию в форме Pmf.

В данном случае мы рассмотрим только уксуснокислое брожение, которое про-
текает в соответствии с общим уравнением реакции:

глюкоза —» 2СН3СООН + 2СО2 + 4Н2-

Энергетический выигрыш относительно высок и составляет четыре молекулы
АТФ на молекулу катаболизируемой глюкозы.

Однако данный вариант брожения приводит к образованию большого количе-
ства молекулярного водорода, и в случае повышения его парциального давления
создаются термодинамические условия, неблагоприятные для протекания окисли-
тельных реакций. Возникает альтернатива—снизить энергетический выигрыш бро-
жения путем дополнительного образования лактата, формиата и этанола или каким-
то образом нейтрализовать ингибирующее действие молекулярного водорода.

В данном случае бактерии следуют по второму пути и используют широко рас-
пространенный механизм «межвидового переноса водорода», который они реализу-
ют в синтрофной ассоциации с другими бактериями или археями. Такой симбиоз
существует в пищеварительном тракте травоядных животных и древесноядных на-
секомых.

Типичный пример связан с целлюлолитической бактерией Ruminococcus albus
(фила ВХШ Firmicutes), которая является одним из важнейших обитателей рубца
жвачных животных. В результате катаболизма глюкозы образуется пируват, кото-
рый затем подвергается фосфорокластическому расщеплению с выделением моле-
кулярного водорода (рис. 95).

Рис. 95. Уксуснокислое брожение.

1 — ферредоксин:НАД-оксидоредуктаза; 2 — гидрогеназа; 3 — пируват:ферредоксин-
оксидоредуктаза; 4 — фосфотрансацетилаза; 5 — ацетаткиназа; 6 — гидрогеназа; 7 — фума-
ратредуктаза.
Водород незамедлительно потребляется симбиотическими партнерами R. albus.
В качестве них обычно выступают метаногенные археи Methanobrevibacter ruminan-
tium и М. smithii (фила АП Euryarchaeota) или бактерия Wolinella succinogenes
(класс «Epsilonproteobacteria»). В последнем случае водород используется в каче-
стве донора электронов при фумаратном дыхании (см. раздел 11.4.5.3).

Уксуснокислое брожение является важным звеном анаэробной ветви глобально-
го круговорота углерода. В составе внутридоменных или междоменных симбиоти-
ческих ассоциаций оно шунтирует нисходящую или восходящую ветви этого цикла.

11.3.4.3.	Спиртовое брожение

Правильное название такого брожения—«этанольное». При нем происходит
неокислительное декарбоксилирование пирувата с образованием ацетальдегида. По-
следний служит ловушкой для электронов и восстанавливается НАДН-зависимой
алкогольдегидрогеназой в этанол (рис. 96, А). Общее уравнение спиртового броже-
ния:

глюкоза —> 2СН3—СН2ОН + 2СО2.

Энергетический выигрыш от спиртового сбраживания одной молекулы глюкозы
составляет две молекулы АТФ.

Способность к спиртовому брожению относительно редко встречается у бакте-
рий и вообще не обнаружена у архей. Основными примерами этанольных бактерий
являются:

—	мезофилы (20-40°С), осуществляющие «классический» гликолиз (Erwinia
amylovorans, Sarcina ventriculi)-,

—	термофилы (40-65°C), осуществляющие «классический» гликолиз (С. thermo-
cellum, С. thermosaccharolyticum)-,

—	экстремальные термофилы (> 65°С), осуществляющие «классический» гли-
колиз (С. thermohydro sulfuricum, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobium
brockii)-,

—	представители рода Zymomonas, которые катаболизируют моносахариды (глю-
козу, фруктозу) и дисахариды (лактозу, сахарозу) по пути Энтнера-Дудорова.

Хотя спиртовое брожение является базой для получения традиционных пищевых
продуктов (в частности, хлеба и спиртных напитков), этанол в основном использу-
ется как химическое сырье и топливо для двигателей внутреннего сгорания. Еже-
годное производство технического этанола только в европейских странах составляет
более 1,5-106 т, две трети которых синтезируют дрожжи.

Промышленным конкурентом этанола является ацетальдегид, который необхо-
дим при производстве пластмасс, искусственного каучука и фотоматериалов. Чтобы
получить его, предварительно синтезированый этанол приходится окислять «обрат-
но». В последнее время разработан прямой способ производства ацетальдегида с
помощью штаммов Z. mobilis, обладающих пониженной алкогольдегидрогеназной
активностью (в данном случае регенерация НАД осуществляется с помощью НАДН-
оксидазы).

С использованием Z. mobilis производятся традиционные спиртные напитки —
агавовое вино ацтеков (пульке) и продукт его перегонки (текила).
11.3.4.4.	Глицериновое брожение

Правильное название этого брожения — «глицерольное».

В годы первой мировой войны Карл Нойберг, Эльза Рейнфурт (Е. Reinfurth),
Вильгельм Коннштайн (W. Connstem) и Карл Людеке (К. Liidecke) обнаружили, что
при добавлении к бродящему суслу бисульфита натрия дрожжи вместо этанола на-
капливают глицерол.

Механизм этого процесса заключается в том, что ацетальдегид, который обра-
зуется в результате декарбоксилирования пирувата, реагирует с безвредным для
дрожжей бисульфитом с образованием 2-гидроксиэтил-сульфоната натрия:

СНз-СНО + NaHSO3 -> CH3-CHOH-SO3Na.

В отсутствии ацетальдегида роль ловушки для электронов начинает выполнять
диоксиацетонфосфат, восстанавливающийся в 3-фосфоглицерол. Последний дефос-
форилируется с образованием глицерола (рис. 96, Б).

D-глюкоза

D-глюкоза

фруктозо-1,6-бисфосфат

фруктозо-1,6-бисфосфат

глицеральдегид-
3-фосфат

НАД

+ диоксиацетонфосфат

глицеральдегид- ,	,	,

3 фосфат + диоксиацетонФосФат

НАДН

НАДН

НАД

пируват

пируват

,^*CO2

СНО

I
сн3
ацетальдегид

СО

СН2ОН
неон

СН,ОР

связанный
ацетальдегид

NaHSO.

СНО

3-фосфоглицерол

СН

ацетальдегид глицерол

СН2ОН
сн3

свн12о6 —► [СН3СНО] + С3Н.О3 + со2

О 1Z О	L J	J J в J	L

этанол

C6Hi2°6 —► 2С2Н5ОН + 2СО2

Рис. 96. Спиртовое (А) и глицериновое (Б) брожение.

Общее уравнение глицеринового брожения, получившего название «вторая фор-
ма брожения по Нойбергу» («первая форма»—это обычное спиртовое брожение)
выглядит следующим образом:
глюкоза -> СН2ОН-СНОН-СН2ОН + [СН3-СНО] + С02,

где [СН3—СНО] — связанный ацетальдегид.

Так как при глицериновом брожении окисляется только одна молекула триозы,
его энергетический выход равен нулю, т. е. оно не приносит энергетического выиг-
рыша.

Фабричный метод, основанный на второй форме брожения по Нойбергу, позво-
лил, начиная с 1915 г., ежемесячно производить для изготовления взрывчатки до
103 т глицерола. Поскольку традиционные источники глицерола — мыловарение и
гидролиз жиров и масел — полностью не обеспечивали потребности германской во-
енной промышленности, экономически обоснованной альтернативой оказался био-
технологический процесс, разработанный на основе результатов фундаментальных
исследований.

11.3.4.5.	Молочнокислое брожение

Термин, который традиционно используется для обозначения данного типа бро-
жения, неудачен. Вместо него следовало бы говорить «молочнокислотное», или
«лактатное».

При молочнокислом брожении ловушкой для электронов служит пируват, об-
разующийся при катаболизме глюкозы. В результате восстановления пирувата с
помощью НАДН-зависимой лактатдегидрогеназы образуется лактат, и отсюда про-
исходит название данного типа брожения.

Однако при молочнокислом брожении углеводы могут катаболизироваться раз-
ными способами, что сказывается на энергетическом выходе брожения, а также на
качественном и количественном составе конечных продуктов.

В связи с этим традиционно различают «гомоферментативное молочнокис-
лое брожение» и «гетероферментативное молочнокислое брожение». Оба термина
неудачны как тавтологические («ферментативное» означает не фермент, а фермен-
тацию, т. е. брожение). Вместо этого следовало бы говорить «гомолактатное» и «ге-
теро лактатное ».

При гомоферментативном молочнокислом брожении глюкоза катаболизируется
по гексозобисфосфатному пути (см. рис. 86), после чего пируват восстанавливается
в лактат с выходом не менее 90%, что близко теоретическому:

глюкоза -> 2 СНз-СНОН-СОО".

Облигатные гомоферментативные молочнокислые бактерии (Lactobacillus aci-
dophilus, L. delbrueckii, L. salivarius, Sporo lacto bacillus inulinus, Streptococcus lactis и
др.) обладают полным набором ферментов гексозобисфосфатного пути и не способ-
ны катаболизировать сахара иными способами.

У факультативных гетероферментативных молочнокислых бактерий (L. casei, L.
plantarum, L. sake, Leuconostoc mesenteroides и др.) адаптивно не синтезируются, а
у облигатных гетероферментативных молочнокислых бактерий (Lactobacillus brevis,
L. fermentum, L. kefir и др.) отсутствуют два ключевых фермента гексозобисфос-
фатного пути — фруктозо-1,6-бисфосфат-альдолаза и триозофосфатизомераза.

В качестве альтернативы эти бактерии используют гексозомонофосфатный путь
Варбурга-Диккенса-Хореккера (см. рис. 88).
Пируват, как и у гомоферментативных молочнокислых бактерий, восстанавли-
вается до лактата:

СНз-СО-СОО" + 2Н+/2е- -> СН3-СНОН-СОО~.

Ацетилфосфат (другой продукт пути Варбурга-Диккенса-Хореккера) может
подвергаться двум вариантам превращений.

В первом варианте с помощью ацетаткиназы он превращается в ацетат:

СН3-СОО~Р + АДФ -> СН3-СОО- + АТФ.

Во втором варианте ацетилфосфат при помощи фосфотрансацетилазы предвари-
тельно превращается в ацетил-СоА. Затем ацетил-СоА под действием ацетил-СоА-
синтазы восстанавливается в ацетальдегид. И, наконец, из ацетальдегида с помощью
алкогольдегидрогеназы образуется этанол:

СН3-СОО~Р + CoASH -> СН3—CO~SCoA + Ф,

СН3—CO~SCoA + 2Н+/2е- -» СН3-СНО + CoASH,

СН3-СНО + 2Н+/2е~ СН3-СН2ОН.

Первый вариант преимущественно использует L. brevis, а второй — Leuconostoc
mesenteroides.

Общее уравнение гетероферментативного молочнокислого брожения можно
представить в следующем виде:

глюкоза -> СН3-СНОН-СОО- + СН3-СОО-(или СН3-СН2ОН) + СО2.

Какой из указанных вариантов преобладает, зависит от активности энергетиче-
ского метаболизма. Если клетке нужно больше энергии в форме АТФ, преимуще-
ственно используется первый вариант, и весь ацетилфосфат переводится в ацетат.
В этом случае ловушкой для «лишних» электронов становятся не ацетил-СоА и
ацетальдегид, а глюкоза, которая из пятиатомного альдегидоспирта превращается
в шестиатомный спирт — маннитол.

Большинство молочнокислых бактерий принадлежит к филе ВХШ Firmicutes.
Они обладают метаболизмом облигатно бродильного типа, что связано с отсутстви-
ем у них дыхательной цепи. Хотя молочнокислые бактерии не синтезируют пор-
финоиды и лишены каталазы, они являются аэротолерантными анаэробами и даже
нуждаются в небольшом количестве кислорода, который используется ими в био-
синтетических оксигеназных реакциях.

Молочнокислые бактерии характеризуются очень сложными пищевыми потреб-
ностями (им нужны готовые аминокислоты, азотистые основания, витамины) и в
природной среде ассоциированы с высшими растениями. Благодаря способности
гидролизовать лактозу с помощью /3-галактозидазы они вторично колонизируют
кишечник млекопитающих.

Обладая повышенной устойчивостью к бактерицидному лактату, молочнокислые
бактерии создают себе элективные условия на содержащих сахара растительных и
животных субстратах. На этом основаны традиционные и современные методы про-
изводства квашеных молочных, растительных и мясных продуктов (йогурт, силос,
салями и многое другое).
Микробиологическое производство молочной кислоты, используемой в различ-
ных отраслях легкой, пищевой и фармацевтической промышленности, конкурирует
с ее химическим синтезом из лактонитрила, который образуется путем реакции аце-
тальдегида с синильной кислотой.

Особое положение среди гетероферментативных молочнокислых бактерий зани-
мают представители рода Bifidobacterium, относящиеся к филе BXIV Actinobacteria.

Бифидобактерии не имеют ключевого фермента гексозобисфосфатного пути —
фруктозо-1,б-бисфосфат-альдолазы. У них также отсутствует ключевой фермент
гексозомонофосфатного пути Варбурга-Диккенса-Хореккера — глюкозо-б-фосфат-
дегидрогеназа. В качестве альтернативы этим путям они используют бифидо-шунт
(см. рис. 90).

Пируват, как в случае гомоферментативных молочнокислых бактерий, восста-
навливается до лактата:

СНз-СО-СОО- + 2Н+/2е" -> СН3-СНОН-СОО-.

Ацетилфосфат (второй продукт бифидо-шунта) с помощью ацетаткиназы пре-
вращается в ацетат:

СН3-СОО~Р + АДФ -> СНз-СОО- + АТФ.

Таким образом, общее уравнение молочнокислого брожения у бифидобактерий
приобретает вид:

2 х глюкоза -+ 2 СН3—СНОН—СОО" + 3 СНз-СОО".

Бифидобактерии имеют характерную форму бумеранга и очень чувствитель-
ны к кислороду. Типичной средой их обитания является кишечник грудных детей,
вскармливаемых материнским молоком (в коровьем молоке отсутствует N-ацетил-
глюкозамин, который для этих бактерий служит незаменимым фактором роста).
Помимо того их можно выделить из пищеварительного тракта взрослых млекопи-
тающих и пчел, а также из сточных вод, богатых органикой. Для человека они вме-
сте с другими молочнокислыми бактериями являются «пробиотиками», т. е. микро-
организмами, которые при добавлении в пищу поддерживают гомеостаз кишечной
микробиоты и благотворно влияют на иммунный статус. В настоящее время они
широко используются в заквасках для производства молочнокислых продуктов.

11.3.4.6.	Муравьинокислое брожение

Правильное название этого брожения — «муравьинокислотное», или «формиат-
ное». Происхождение этих терминов объясняется тем, что в качестве одного из ко-
нечных продуктов брожения образуется формиат. Поскольку синтез формиата со-
провождается накоплением других кислот (ацетата, лактата и сукцината), такое
брожение также называют брожением «смешанного типа».

Возбудителями муравьинокислого брожения являются Enterobacter, Erwinia,
Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia и другие пред-
ставители бактерий кишечной группы, или сем. Enterobacteriaceae (фила ВХП Рго-
teobacteria).
Для энтеробактерий характерен адаптационно гибкий метаболизм, сочетающий
в себе ассимиляцию энергии с помощью цитозольных и мембранных биотрансфор-
маторов.

В первом случае —при брожении — гексозы катаболизируются по фруктозобис-
фосфатному пути, гексозомонофосфатному пути Энтнера-Дудорова или гексозомо-
нофосфатному пути Варбурга-Диккенса-Хореккера. Дальнейшая судьба пирувата,
приводящая к образованию конечных продуктов брожения, сложна и неоднозначна
(см. ниже).

Во втором случае —при дыхании — пируват и его непосредственный предше-
ственник фосфоэнолпируват полностью окисляются через цикл Кребса. При этом
образуются восстановленные формы пиридиновых (НАД(Ф)Н) и флавинового
(ФАДН2) нуклеотидов, которые служат донорами электронов для дыхательной це-
пи.

При муравьинокислом брожении пируват подвергается тиолатному расщепле-
нию с помощью пируват:формиат-лиазы с образованием формиата и ацетил-СоА
(см. рис. 92). Ацетил-СоА превращается в ацетат в результате фосфотрансацети-
лазной и ацетаткиназной реакций, что позволяет ассимилировать энергию путем
фосфорилирования АДФ на уровне субстрата. Ловушкой для электронов служит
пируват, который восстанавливается в лактат.

В данном случае конечными продуктами муравьинокислого брожения оказыва-
ются формиат и ацетат, и его общее уравнение принимает вид:

глюкоза -> НСОО- + СН3-СОО~ + СНз-СНОН-СОО'.

Энергетический выигрыш от формиатного сбраживания одной молекулы глю-
козы составляет три молекулы АТФ (две на стадии гликолиза и одна на стадии
образования ацетата).

По аналогии с ацетонобутиловыми клостридиями, энтеробактерии переходят от
образования кислот к биосинтезу нейтральных продуктов. Однако при этом они об-
разуют не ацетоацетил-СоА из двух молекул ацетил-СоА, а ацетолактат из двух
молекул пирувата (рис. 97). Ацетолактат при помощи ацетолактат-декарбоксила-
зы превращается в ацетил-метил-карбинол, или ацетоин. После этого ацетоин мо-
жет восстановиться в 2,3-бутандиол или окислиться в диацетил. Еще одним ней-
тральным продуктом муравьинокислого брожения становится этанол, который, как
и при ацетонобутиловом брожении, образуется из ацетил-СоА с помощью ацеталь-
дегид-дегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы. Что касается «лишнего» формиа-
та, то он превращается в диоксид углерода и молекулярный водород в результате
формиат:Н2-лиазной реакции, в которой совместно участвуют формиатдегидроге-
наза и гидрогеназа.

Изложенный сценарий целиком реализуется не у всех энтеробактерий. В част-
ности, Е. coli не может синтезировать ацетоин. Следует подчеркнуть, что таксоно-
мическая дифференциация энтеробактерий во многом основана на образовании в
результате брожения кислот, газов, ацетоина и т. д.

Еще раз отметим, что интермедиаты конструктивных реакций муравьинокисло-
го брожения могут использоваться в альтернативном сценарии хемотрофии — при
дыхании, когда энергия ассимилируется в форме Pmf (см. раздел 11.4).

Рассматриваемый пример особо интересен тем, что в отсутствии кислорода эн-
теробактерии (в частности, Е. со 1г) в состоянии обеспечивать себя как донором, так
и акцептором электронов для анаэробной дыхательной цепи.
глюкоза

НАД НАДН

сукцинат

со2

НАДН НАД

фумарат

Pmf

АТФ

пируват

НАДН НАД

НСОО---

ОН
н3с-с-соо‘
со
сн3
ацетолактат

формиат

NO'3

no2
со2

> лактат

НАДН НАД

СН3 c~SCoA‘@*’ СН3 СНО Q
ацетил-СоА	ацетальдегид

сн3-сн2он
этанол

СО

сн,
НС-он

со

CoASH

сн3
нс-он @

сн3
со
io

СН3-С^.о~р
ацетилфосфат
АДФ
АТФ

ацетат

СН3 НАД НАДН СН3 НАД НАДН СН3

2,3-бутан-
диол

ацетоин

диацетил

Рис. 97. Муравьинокислое брожение (брожение смешанного типа).

1 — пируваткиназа; 2 — фосфоэнолпируват-карбоксилаза; 3 — фумаратредуктаза; 4 — пиру-
ватформиат-лиаза; 5 — лактатдегидрогеназа; 6—ацетальдегид-дегидрогеназа; 7 — алкогольдегид-
рогеназа; 8 — формиатдегидрогеназа; 9 — гидрогеназа; 10 — формиат:нитрат-оксидоредуктаза; 11 —
фосфотрансацетилаза; 12 — ацетаткиназа; 13 — ацетолактат-синтаза; 14 — ацетолактат-декарбоксилаза;
15 — 2,3-бутандиол-дегидрогеназа; 16 — диацетил редуктаза.

В первом случае речь идет о нитратном дыхании, когда терминальным акцеп-
тором электронов является анион нитрата. Донором электронов служит формиат,
который окисляется с помощью формиат:нитрат-оксидоредуктазы, или формиатза-
висимой нитратредуктазы (см. разделы 11.4.4.2 и 11.4.6.2). Помимо восстановления
нитрата, с окислением формиата может быть связано восстановление нитрита.

Во втором случае речь идет о фумаратном дыхании, когда акцептором электро-
нов служит фумарат, а донором электронов — НАДН. Это один из примеров очень
оригинальной биоэнергетической стратегии, когда прокариоты сами синтезируют
для дыхания акцептор электронов. Энтеробактерии за несколько этапов синтезиру-
ют фумарат из фосфоэнолпирувата (см. раздел 11.4.5.3).

Энтеробактерии широко распространены в природе. Они живут в почве (на-
пример, Enterobacter aerogenes) или на растительной мортмассе (например, Serratia
marcescens), могут быть компонентами нормальной микробиоты кишечника чело-
века (например, E.coli), а также фитопатогенами (например, Erwinia carotovora) и
зоопатогенами (например, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi и Shigella dysente-
riae).

11.3.4.7.	«Необычные» типы брожения

Под таким общим названием объединяются несколько разных типов брожения.
Их отличие от уже рассмотренных заключается в том, что используется либо «не
гликолитический» способ образования пирувата, либо «не гликолитическая» ловуш-
ка для электронов.
Сбраживание цитрата. Этот тип брожения осуществляют энтеробактерии
Klebsiella pneumoniae и Salmonella typhimurium при анаэробном росте на цитрате.

С помощью цитратлиазы цитрат расщепляется на ацетат и оксалоацетат (см.
рис. 81). Затем оксалоацетат декарбоксилируется с образованием пирувата, который
под воздействием пируват:формиат-лиазы распадается на формиат и ацетил-СоА.
Из последнего через стадию ацетилфосфата образуется ацетат, что сопровождается
фосфорилированием АДФ на уровне субстрата.

Энергетический выход ацетатного сбраживания цитрата невелик и составляет
одну молекулу АТФ на молекулу окисленного цитрата. Однако на стадии декарбок-
силирования оксалоацетата энергия дополнительно запасается в форме Smf при по-
мощи мембраносвязанной бпотинзависимой оксалоацетат-декарбоксилазы (см. раз-
дел 10.4.10).

Маслянокислое сбраживание глутамата. Выше мы уже говорили о том,
что в качестве сбраживаемых субстратов клостридии могут использовать не только
сахара, но и другие органические соединения. Прежде всего к ним относятся ами-
нокислоты, которые «пептолитические» клостридии в изобилии образуют на суб-
стратах, содержащих белки и полипептиды (мортмасса, раневые зоны, глубоко ин-
фицированные мягкие ткани и т. д.). Поскольку субстратом для брожения служат
не сахара, а аминокислоты, способ образования пирувата не имеет ничего общего с
гликолизом.

В качестве примера рассмотрим уникальное маслянокислое брожение у
С. tetanomorphum, основанное на катаболизме глутамата (рис. 98).

Сперва в результате внутримолекулярной перегруппировки, катализатором кото-
рой служит витамин В12-зависимая (см. рис. 80) глутаматмутаза, глутамат превра-
щается в 2-метиласпартат. Затем под действием 2-метилфумаразы 2-метиласпартат
дезаминируется в 2-метилфумарат. На следующем этапе с помощью 2-метилфума-
рат-гидратазы из 2-метилфумарата образуется 2-метилмалат.

В результате реакции, катализируемой 2-метилмалат-лиазой, 2-метилмалат рас-
щепляется на два фрагмента — ацетат и пируват. Последний с помощью ферредок-
синзависимой пируватдегидрогеназы окислительно декарбоксилируется в ацетил-
СоА.

Из ацетил-СоА при помощи тривиальных реакций маслянокислого брожения в
пять этапов образуется бутират.

Напомним, что для образования бутирата (через стадию ацетоацетил-СоА) тре-
буются две молекулы ацетил-СоА, которые (через стадию пирувата) образуются в
результате расщепления двух молекул 2-метилмалата (рис. 98).

Другой фрагмент 2-метилмалата — две молекулы ацетата — используются по раз-
ному назначению. Одна молекула ацетата становится конечным продуктом броже-
ния. Другая с помощью СоА-трансферазы получает СоА-группу от бутирил-СоА и
превращается в ацетил-СоА. Наконец, с помощью фосфотрансацетилазы и ацетат-
киназы ацетил-СоА превращается во вторую молекулу ацетата. При этом в резуль-
тате фосфорилирования на уровне субстрата синтезируется молекула АТФ.

Общее уравнение маслянокислого брожения, основанного на реакциях превра-
щения глутамата, можно записать следующим образом:

2 х глутамат + 2НдО —> бутират + 2 х ацетат + 2СО 2 + 2NH3.

Энергетический выигрыш в этой реакции очень низкий и составляет всего лишь
одну молекулу АТФ на две молекулы катаболизированной аминокислоты.
х2

х2

х2

СОО
I
hc-nh2

сн2 -
сн2
соо"

СОО

I

hc-nh2

Н3С-СН
соо"

NH3

СОО
I
сн
II
Н3С-С

соо

Н2О

глутамат

2-метиласпартат

2-метилфумарат

х2
СОО"
I
сн2
Н3С-С-ОН
соо"

2-метилмалат

СОО
I
сн2
I 2 <-
сн2
с*°
C~SCoA

СН3
- <
C~SCoA

ацетил-СоА

СН3

СО
I
соо

СОО

1	—> ацетат

СН3

ацетат

бутирил-СоА

CoASH

пируват

бутират

ацетат

Рис. 98. Маслянокислое сбраживание глутамата.

1 — глутаматмутаза; 2 — 2-метилфумараза; 3 — 2-метилфумарат-гидратаза; 4 — 2-метилмалат-лиаза;

5 — пируватдегидрогеназа; 6 — СоА-трансфераза.

Реакция Стикленда. Это совершенно особый путь сбраживания аминокислот,
отличающийся от сбраживания глутамата. Он требует совместного участия двух
разных аминокислот, которые данной бактерией в энергетических целях раздельно
не используются.

Смысл этого пути, открытого в 1934 г. английским биохимиком Стиклендом
(L.H.Stickland) и названного его именем, состоит в том, что одна аминокислота
одновременно выполняет роль источника энергии и донора электронов, а другая
аминокислота — только роль ловушки для электронов.

Аминокислотами-донорами электронов, в частности, могут быть аланин, валин,
лейцин или метионин, а аминокислотами-акцепторами электронов аргинин, глицин,
пролин или триптофан.

Характерным примером реакции Стикленда служит сопряженное окисление-
восстановление аланина и глицина пептолитическим клостридием С. sticklandii
(рис. 99).

Вначале аланин окислительно дезаминируется НАДН-зависимой аланиндегид-
рогеназой. Затем полученный пируват подвергается окислительному декарбоксили-
рованию с помощью пируват:ферредоксин-оксидоредуктазы, в результате чего обра-
зуется ацетил-СоА. После этого под действием фосфотрансацетилазы ацетил-СоА
превращается в ацетилфосфат. Последний с помощью ацетаткиназы передает свою
фосфорильную группу на АДФ, и в результате фосфорилирования на уровне суб-
страта образуется молекула АТФ.

Рис. 99. Реакция Стикленда.

1 — аланиндегидрогеназа; 2 — пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза; 3 — фосфотрансацетилаза; 4 —
ацетаткиназа; 5 — глициндезаминаза.

Две молекулы глицина, используемые в качестве акцептора электронов, подвер-
гаются восстановительному дезаминированию. Катализатором этой нетривиальной
реакции служит «обратимая» глициндезаминаза, которая превращает глицин в аце-
тат, используя в качестве кофакторов НАДН и Фдгеа- Общее уравнение ацетатного
брожения, основанного на реакции Стикленда между аланином и глицином, можно
записать в следующем виде:

аланин + 2 х глицин + Н2О —> 3 х ацетат + СО2 + 3NH3.

Хотя энергетический выигрыш в обоих рассмотренных случаях очень низкий
(одна молекула АТФ соответственно на две и три молекулы катаболизированной
аминокислоты), клостридии, обладающие высокой протеолитической активностью,
извлекают достаточно энергии для того, чтобы активно расти на белковых субстра-
тах.

Люцифераза в качестве ловушки для электронов. Примером необычного
решения проблемы ловушки для электронов являются светящиеся бактерии, кото-
рые в основном принадлежат к морским родам Photobacterium и Vibrio, а также к
сухопутному роду Xenorhabdus (класс «Gammaproteobacteria»). Они автономно жи-
вут в морской воде, развиваются как сапрофиты на трупах животных и могут быть
паразитами членистоногих. Свечение бактерий в симбиозе с рыбами и головоногими
моллюсками играет в поведении их хозяев роль привлекающего или отпугивающего
сигнала.
Светящиеся бактерии осуществляют брожение смешанного типа, и в этом отно-
шении проявляют сходство с энтеробактериями.

Биолюминесценция у разных живых организмов — от насекомых до бактерий —
обеспечивается люциферазами. Это группа гетерологичных монооксигеназ, т. е. фер-
ментов, которые катализируют включение атома кислорода в состав окисляемого
субстрата (см. раздел 11.4.4.2).

Для бактериальной люциферазы субстратами служат относительно простые со-
единения, тесно связанные с первичным метаболизмом, что отличает их от люци-
феринов, которые используются в других системах биолюминесценции.

Реакция, катализируемая бактериальной люциферазой, выглядит следующим
образом:

ФМНН2 + R-CHO + О2 -> ФМН + R-COO- + Н2О + hi/ (490 нм),

где ФМНН2 — восстановленный флавинмононуклеотид (см. рис. 104), a R-CHO —
алифатический альдегид тетрадеканаль (число атомов углерода равно четырнадца-
ти).

Бинарный комплекс ФМНН2 с кислородом взаимодействует с тетрадеканалем, в
результате чего образуется относительно стабильный тройственный комплекс. При
его распаде флавин испускает зеленый квант люминесценции, один из двух атомов
кислорода восстанавливается до Н2О за счет ФМНН2, а другой атом кислорода свя-
зывается с тетрадеканалем с образованием жирной кислоты (рис. 100). В некоторых
случаях свободная энергия передается особым антенным белкам, которые излучают
более длинноволновый (желтый) свет.

пируват01К

Рис. 100. Брожение смешанного типа, сопряженное с биолюминесцен-
цией.

1 — флавинредуктаза; 2 — альдегид-дегидрогеназа; 3 — люцифераза;
R — радикал Н(СН2)1з~•

Восстановленная форма ФМН регенерируется с помощью флавинредуктазы, а
тетрадеканаль — альдегид-дегидрогеназы. В обоих случаях источником электронов
служит НАДН.

Контроль бактериальной люминесценции связан с оценкой бактериями плотно-
сти собственной популяции, по аналогии с контролем биосинтеза ферментов вторич-
ного метаболизма. Стимуляция люминесценции определяется «чувством кворума»
(англ, quorum sensing), при котором клетки образуют и выделяют низкомолеку-
лярный автоиндуктор, или феромон. После достижения пороговой концентрации
он запускает регуляторный каскад, завершающийся ответной реакцией — индукци-
ей оперона lux.

В состав оперона lux входят структурные гены 1ихА и 1ихВ, которые кодируют
оД-субъединицы люциферазы (40 и 30 кДа). Продукты структурных генов luxCDE
отвечают за биосинтез алифатического альдегида — тетрадеканаля. Регуляторные
гены luxG-R обеспечивают адаптивную экспрессию люциферазной системы.

Хотя механизм бактериальной биолюминесценции в целом уже выяснен, ее при-
способительное значение остается загадочным.

Одно из объяснений сводится к тому, что бактерии используют люциферазу в
качестве ловушки для электронов.

Действительно, светящиеся бактерии катаболизируют глюкозу по гексозобис-
фосфатному пути, конечным продуктом которого является пируват. В свободном
состоянии они решают проблему ловушки для электронов с помощью реакций му-
равьинокислого брожения, образуя из пирувата ацетат, ацетоин, лактат, сукцинат,
формиат и этанол. В симбиотическом состоянии пируват в основном экскретируется,
и поэтому он или его производные уже не могут быть ловушками для электронов.
Поскольку при утилизации пирувата хозяйские митохондрии поддерживают пар-
циальное давление кислорода на очень низком уровне, другой возможный способ
регенерации НАД — при помощи НАДН-оксидазы — также бесполезен. В этой си-
туации эффективной ловушкой для электронов становится люциферазная система.
ФМНН2 и алифатический альдегид окисляются в монооксигеназной реакции, после
чего НАДН с помощью флавинредуктазы и альдегид-дегидрогеназы восстанавли-
вает соответственно ФМН и жирную кислоту (рис. 100).

Однако такое объяснение не универсально. В частности, оно не раскрывает роль
биолюминесценции для светящихся бактерий, которые не сбраживают сахара, а рас-
тут за счет нитратного или нитритного дыхания (например, Shewanella woodyi).

Использование неорганических ловушек для электронов. Расссматривая
глицериновое брожение (см. раздел 11.3.4.4), мы убедились в том, что эндогенный
органический акцептор электронов можно заменить искусственным неорганическим
(в данном случае бисульфитом натрия), хотя в энергетическом отношении этот про-
цесс не имеет утилитарного значения.

Существуют и природные неорганические акцепторы. Они используются при
брожении, обеспечивающем реальный энергетический выигрыш. Самыми просты-
ми из них являются протоны, которые с помощью гидрогеназы восстанавливаются
до водорода. Этот пример мы уже рассматривали в связи с реакцией фосфорокла-
стического расщепления пирувата (см. раздел 11.3.3).

Другими примерами природных неорганических акцепторов при брожении яв-
ляются катионы железа и марганца:

2Fe3+ + 2е“	2Fe2+,

Мп4+ + 2е~ -> Мп2+.

Первыми бактериями, для которых продемонстрирована данная способность, бы-
ли С. pasteurianum, Е. coli и Lactobacillus lactis. Это микроаэробы или факультатив-
ные и облигатные анаэробы, сбраживающие углеводы или аминокислоты.

В качестве нетипичного примера можно назвать гомоацетатное сбраживание за-
пасных углеводов нитчатой цианобактерией Microcoleus sp. Часть промежуточного
продукта этой ферментации — формиата — окисляется с помощью катионов закис-
ного железа:

НСОО" + 2Fe3+ СО2 + 2Fe2+ + Н+.

В качестве ловушки электронов могут использоваться и неорганические анионы,
в частности нитрит:

NO7 + 6Н+/6е- + 2Н+ NH+ + 2Н2О.

При бродильной аммонификации нитрита у Е. coli окисление глюкозы, лактата
или жирных кислот сопровождается фосфорилированием АДФ на уровне субстрата.
Редокс-баланс обеспечивается посредством сброса электронов на нитрит, для чего
используется растворимая НАДН-зависимая нитритредуктаза (англ, nitrite reduc-
tase, Nir).

Наконец, некоторые представители экстремально термофильных архей (напри-
мер, Pyrococcus furiosus) при сбраживании углеводов используют в качестве ловуш-
ки для электронов элементную серу, что осуществляется при помощи растворимой
НАД(Ф)Н-зависимой сульфиддегидрогеназы.

На этом месте мы оставляем тему, посвященную механизмам брожения и его
распространению в мире прокариотов, и переходим к другому способу хемотрофной
ассимиляции энергии — дыханию.

11.4.	ДЫХАНИЕ

В отличие от брожения, основанного на цитозольной биоэнергетике, при дыхании
используются механизмы мембранной биоэнергетики (см. раздел 10.4.6).

Дыхание — это такой тип хемотрофии, когда энергия ассимилируется в фор-
ме Pmf и/или Smf при переносе электронов по электрон-транспортной цепи от
субстрата, частично или полностью окисляемого с помощью растворимых или
мембраносвязанных дегидрогеназ, на экзогенный или эндогенный акцептор.

Энергия, первично ассимилированная при дыхании, используется для поддер-
жания эндергонических процессов — в частности, мембранного фосфорилирования,
которое осуществляется с помощью мембраносвязанной АТФазы/АТФ-синтазы.

11.4.1.	Общие положения

При дыхательной органотрофии окисляется органический, а при дыхательной
литотрофии — неорганический субстрат. Способностью к дыхательной органотро-
фии обладают археи, бактерии и произошедшие от бактерий митохондрии. Дыха-
тельная литотрофия встречается только у бактерий и архей.

Отдельные звенья дыхательной цепи служат «сайтами сопряжения», т. е. они
непосредственно создают Pmf или Smf. Природа и число этих сайтов могут раз-
личаться. Центральную роль в транслокации протонов дыхательной цепью играют
цитохром Ь/с(/)-комплекс или его функциональные аналоги.

Дыхание может быть энергетически сопряженным или разобщенным. При энер-
гетически сопряженном дыхании создается Pmf или Smf и их величина достаточна
для того, чтобы поддерживать эндергонические процессы. В конечном счете, это
зависит от величины редокс-потенциала пары: терминальный донор/терминальный
акцептор. При энергетически разобщенном (холостом) дыхании трансмембранный
электрохимический потенциал по той или иной причине не создается или он недо-
статочен для того, чтобы поддерживать эндергонические процессы. В этом случае
свободная энергия окислительно-восстановительной реакции преобразуется в тепло.

Дыхательные цепи у прокариотов исключительно разнообразны. По меткому вы-
сказыванию американского бактериолога Кеннета Нильсона (K.H.Nealson), бакте-
рии «могут окислять через свою дыхательную цепь все, что угодно, при помощи
всего, чего угодно». Мы не знаем, справедливо ли это в отношении архей, однако у
них также выявлены мультивариантные дыхательные цепи.

В любой дыхательной цепи существует донорный («низкопотенциальный») уча-
сток и акцепторный («высокопотенциальный») участок. В качестве доноров элек-
тронов могут использоваться органические или неорганические вещества. Акцепто-
ры электронов также могут быть органическими или неорганическими.

11.4.2.	Органический донор электронов

Катаболизм органических субстратов имеет целью получение энергии, строи-
тельного материала и восстановителя. Он происходит при помощи окислительно-
восстановительных ферментов (дегидрогеназ и оксигеназ), а также благодаря гид-
ролазам, декарбоксилазам, тиолазам и другим ферментам, которые разрушают уг-
леродный скелет органических молекул.

Одним из наиболее распространенных промежуточных продуктов катаболизма
органики является ацетат. Основными источниками его получения служат:

—	«кетогенные» аминокислоты (например, лейцин);

—	жирные кислоты (в результате Д-окисления);

—	моносахара (в результате гликолиза и других путей образования пирувата).

В химическом отношении ацетат относится к очень устойчивым и инертным со-
единениям. Для того, чтобы полностью окислить его до СО2, что дает возможность
получить максимум свободной энергии, необходима ферментативная активация. Че-
рез «богатую энергией» тиоэфирную связь он присоединяется к коэнзиму А с обра-
зованием ацетил-СоА (см. раздел 11.3.3).

Известны два принципиально разных способа окисления ацетил-СоА — нецикли-
ческий и циклический.

Нециклический способ окисления ацетил-СоА. Этот способ встречается
довольно редко. К нему прибегают «ацетокластические» метаногенные археи, а так-
же ацетотрофные сульфатредуцирующие бактерии, в частности представители рода
Desulfotomaculum.

При нециклическом окислении СН3—CO~SCoA расщепляется на метильную
СН3— и карбонильную [СО] группы. Реакцию катализирует СО-дегидрогеназа. Од-
ним из кофакторов этого фермента служит кобальтсодержащий порфиноид, или
корриноид (см. рис. 80).

Образовавшиеся метильная и карбонильная группы порознь окисляются до СО2
(первая — с помощью все той же С О-дегидрогеназы, вторая — в линейном пути, при-
чем кофакторами-переносчиками одноуглеродной группировки у метаногенов слу-
жат тетрагидрометаноптерин и метанофуран, а у сульфатредукторов тетрагидро-
фолат (см. разделы 11.4.5.5, 13.3.1 и 13.3.2):

СНз-CO-SCoA [СО] + СНз-Х,
[CO] + H2O - CO2 + 2H+/2e~,

СНз-Х + 2Н2О -- СООН-Х + 4Н+/4е“ - СО2 + 2Н+/2е",

где X — переносчик одноуглеродной группировки.

Фактически данный процесс представляет собой непрямое окислительное де-
карбоксилирование ацетата.

Циклический способ окисления ацетил-СоА. В отличие от нециклического,
циклический способ распространен исключительно широко, хотя и не универсально.

Его суть заключается в том, что углеродный скелет ацетата «наращивается» пу-
тем присоединения к нему С4-дикарбоновой кислоты (оксалоацетата), и образуется
Св-трикарбоновая кислота (цитрат). В результате серии реакций дегидратации, де-
гидрирования и декарбоксилирования из цитрата вновь образуется оксалоацетат,
т. е. процесс носит циклический характер.

Как и в предыдущем способе, итогом становится непрямое окислительное де-
карбоксилирование ацетата, хотя природа молекулярных превращений совершенно
разная. При нециклическом способе окисляются связанные с коферментами одно-
углеродные группировки, а при циклическом способе окисляются и декарбокисли-
руются свободные дикарбоновые или трикарбоновые кислоты (цитрат, изоцитрат,
а-кетоглутарат, сукцинат и малат).

В соответствии с общим характером процесса, приводящего к полному окисле-
нию активированного ацетата, циклический способ неточно назван «циклом три-
карбоновых кислот» (англ, tricarboxylic acid cycle, ТСА), а по имени исследователя,
который впервые дал его общую схему — циклом Кребса.

11.4.2.1. Окислительный цикл трикарбоновых кислот,
или цикл Кребса

Цикл Кребса (Н. Krebs, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1953 г.)
представляет собой взаимно сбалансированную систему ферментативных реакций,
которые протекают в цитоплазме прокариотной клетки или митохондриальном мат-
риксе (за исключением сукцинатдегидрогеназной реакции, которая катализируется
мембраносвязанным ферментом).

В ходе цикла Кребса ацетильный остаток полностью окисляется до СО2. Полу-
ченные электроны при посредстве пиридинового и флавинового кофакторов (НАД и
ФАД) передаются дыхательной цепи. Наряду с этим происходит фосфорилирование
ГДФ на уровне субстрата с последующей регенерацией АТФ при помощи нуклео-
зиддифосфаткиназы: АДФ + ГТФ —> АТФ + ГДФ.

Таким образом, цикл Кребса является весьма совершенной метаболической «топ-
кой», которая снабжает клетку энергией сразу в двух формах —в форме Pmf и в
форме фосфагена (АТФ).

Наряду с высокоэффективной энергетической функцией цикл Кребса выполняет
очень важную конструктивную роль. Восстановленные формы пиридиннуклеотида
(НАДН) и флавиннуклеотида (ФАДН2) используются при разнообразных биосин-
тезах, а интермедиаты цикла (органические кислоты) служат предшественниками
аминокислот, жирных кислот, моносахаров, полиизопреноидов и тетрапирролов.

Цикл Кребса был реконструирован и подробно изучен в 1930-1960-х годах, вна-
чале на мышечных препаратах животных, а затем на дрожжевых клетках (в ос-
новном, Saccharomyces cerevisiae). Позднее существование этого цикла было дока-
зано у растений и многих бактерий, а также у экстремально галофильных архей,
в частности Halobacterium salinarium (фила АП Euryarchaeota), и у экстремально
термоацидофильных архей, в частности Sulfolobus acidocaldarius (фила AI Сгепат-
chaeota).

Гипотетическую схему окисления углеводов с использованием, в качестве интермедиатов, ди-
карбоновых органических кислот (сукцината, фумарата, малата и оксалоацетата) предложил в
1920 г. шведский биохимик Торстен Тунберг (Т. L. Thunberg). Следом за ним в 1935 г. венгерский
биохимик Альберт фон Сент-Дьердьи (A. Szent-Gyorgyi, Нобелевская премия по физиологии и ме-
дицине, 1937 г.) указал на ключевую роль фумаровой кислоты в мышечном дыхании животных.
Спустя еще два года немецкие биохимики Карл Мартиус (С. Martius) и Франц Кноп (F. Knoop)
предположили, что окисление ацетата происходит путем его ферментативной конденсации с окса-
лоацетатом, и образующийся цитрат при помощи аконитазы превращается в изоцитрат, а затем
окислительно декарбоксилируется в о-кетоглутарат, который, в свою очередь, окислительно де-
карбоксилируется в сукцинат. Одновременно с ними в 1937 г. немецкий биохимик Ганс Кребс и
английский биохимик Уильям Джонсон (W. A. Johnson) установили, что цитрат оказывает стиму-
лирующее воздействие на мышечное дыхание и что продуктами окисления цитрата являются а-
кетоглутарат и сукцинат. Они предположили, что цитрат образуется путем слияния ацетата с ок-
салоацетатом, а затем по цепочке реакций (а-кетоглутарат —» сукцинат —> фумарат —» малат) из
него получается оксалоацетат. На основе этого они постулировали схему циклического окисления
ацетата, позднее названную «циклом Кребса».

Решающую роль сыграло использование радиоизотопа 14С, благодаря которому в 1950 г. немец-
кий биохимик Феодор Линен (F. Lynen, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1964 г.)
доказал, что ацетат окисляется через цикл Кребса.

Идею о необходимости активации ацетата высказал тоже Линен, хотя заслуга открытия в 1945 г.
активирующего коэнзима (СоА) принадлежит Фрицу Липманну. Наконец, в 1952 г. испанский био-
химик Северо Очоа (S. Ochoa, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1959 г.) установил,
что при взаимодействии СоА с пируватом образуется ацетил-СоА, который реагирует с оксалоаце-
татом с образованием цитрата и свободного СоА.

В 1949 г. американские биохимики Юджин Кеннеди (Е. Р. Kennedy) и Альберт Ленинджер
(A. Lehninger) выяснили, что цикл Кребса компартментализован внутри митохондрии.

Реакции цикла Кребса. Ключевой реакцией цикла Кребса является обра-
зование цитрата из ацетил-СоА и оксалоацетата с помощью цитратсинтазы. При
этом гидролизуется «богатая энергией» тиоэфирная связь и освобождается CoASH
(рис. 101). Затем с помощью аконитазы цитрат изомеризуется в изоцитрат; интер-
медиатом в этой реакции является трикарбоновая кислота cis-аконитат.

На следующем этапе изоцитрат окислительно декарбоксилируется в аг-кетоглу-
тарат с помощью НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы. Интермедиатом в этой
реакции является неустойчивая трикарбоновая кислота оксалосукцинат, которая су-
ществует в ферментносвязанной форме.

Затем а-кетоглутарат окислительно декарбоксилируется в сукцинил-СоА при по-
мощи ферментного комплекса а-кетоглутаратдегидрогеназы. Эта реакция также яв-
ляется ключевой. Ее кофакторами служат:

-НАД:

—	коэнзим А;

—	переносчик ацильной группы липоевая (е, т]-димеркаптооктоновая) кислота;

—	переносчик кетольной группы тиаминпирофосфат (рис. 89);

—	катионы Mg2+.

Сукцинил-СоА превращается в сукцинат под действием сукцинил-СоА-синтета-
зы. При этом регенерируется CoASH и (через стадию образования сукцинил фосфа-
та; см. раздел 10.3) фосфорилируется ГДФ.
Далее из сукцината образуется фумарат с помощью мембраносвязанной ФАД-
зависимой сукцинатдегидрогеназы. Полученные электроны прямо передаются уби-
хинонному пулу.

На завершающем этапе стереоспецифичная фумаратгидратаза (фумараза) пре-
вращает фумарат в L-малат, а затем НАД-зависимая малатдегидрогеназа окисляет
малат в оксалоацетат, и цикл замыкается (рис. 101).

| глюкоза"

СО.

пируват

Не, Leu, Lys,
Phe, Тгр, Туг

фосфоэнолпируват

CoASH

[ Asn, Asp^

CH3“C~SCoA
ацетил-СоА

СО

СОО

но-с-соо

CH2

8) COO

оксалоацетат

НАДН О=С

НАД

СОО

жирные кислоты,
полиизопреноиды

ацетил-СоА

H2C-COO

оксалоацетат

н2с-соо’
цитрат X.

Н,О^>Н,О

н2с-соо

но-сн

нс-соо

H2O

СОО

coo

малат

сн.

' COO

CHO
глиоксилат

HO-CH-coo
изоцитрат

►НАД

H2C-COO“

►НАДН
co2

CH
II
CH

сн

COO

[ Phe, Tyr |—► фумарат

o=c-coo

(X - кетоглутарат

ФАДН-

CoASH

СОО

сн

со.

CH
о
SCoA

сукцинил-СоА

гтф гдф 4

, Glu,

>, Pro



| Не, Met, Vai |

Рис. 101. Окислительный цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса).

Пунктиром изображен глиоксилатный шунт. 1 — цитратсинтаза; 2 — аконитаза; 3 — изоцитратде-
гидрогеназа; 4 — а-кетоглутаратдегидрогеназа; 5 — сукцинил-СоА-синтетаза; 6 — сукцинатдегидрогеназа;
7 —фумараза; 8 — малатдегидрогеназа; 9 — изоцитратлиаза; 10 — малатсинтаэа; 11 — фосфоэнолпируват-
карбоксилаза; 12 — пируваткарбоксикиназа; 13 — цитратлиаза.
Следует отметить, что все реакции цикла Кребса, кроме а-кетоглутаратдегидро-
геназной, обратимы.

Таким образом, суммарное уравнение цикла Кребса имеет вид:

ацетил-СоА + Н2О + ЗНАД + ФАД + 5Н+ + ГДФ + Ф —»

2СО2 + CoASH + ЗНАДН + ФАДН2 + ГТФ.

При условии, что свободная энергия Pmf полностью конвертируется в свобод-
ную энергию АТФ, максимальный энергетический выигрыш при окислении одной
молекулы ацетата через цикл Кребса составит 12 молекул АТФ (3x3 за счет окис-
ления дыхательной цепью трех молекул НАДН, 2 за счет окисления дыхательной
цепью одной молекулы ФАДН2 и 1 за счет образования одной молекулы ГТФ).

Биосинтетическаья функция цикла Кребса. Таким образом, окисление ак-
тивированного ацетата до СО2 в цикле Кребса является самым эффективным путем
энергетического метаболизма у гетеротрофных прокариотов. Оно позволяет окис-
лять углеводы, жирные кислоты и аминокислоты путем вступления продуктов их
катаболизма в цикл через ацетатную «горловину» или на стадии интермедиатов.

В свою очередь, цикл Кребса может быть источником субстратов для маги-
стральных биосинтетических путей.

Биосинтетические реакции, потребляющие интермедиаты цикла Кребса, называ-
ются катаплеротическими (англ, catapleurotic; от англ, catabolism и греч. plevra —
боковая сторона; реакции, примыкающие к катаболическому процессу). Примерами
катаплеротических реакций служит глюконеогенез, или биосинтез глюкозы, а также
биосинтез жирных кислот (рис. 101).

Как уже указывалось, почти все реакции цикла Кребса обратимы, и некоторые
его интермедиаты посредством восстановительного аминирования превращаются в
аминокислоты (оксалоацетат в аспартат, а-кетоглутарат в глутамат).

Помимо биосинтеза белков и полипептидов, цикл Кребса может снабжать стро-
ительным материалом и другие ключевые биосинтезы (рис. 101):

—	в результате расщепления цитрата с помощью цитратлиазы образуется ацетил-
СоА, который используется для биосинтеза жирных кислот и полиизопреноидов (см.
разделы 15.1.1 и 15.2);

—	при декарбоксилировании оксалоацетата образуется фосфоэнолпируват, ис-
пользуемый при глюконеогенезе;

—	из а-кетоглутарата образуется глутамат, используемый при биосинтезе тетра-
пирролов (см. раздел 15.3).

Отток интермедиатов цикла Кребса на строительные нужды должен быть вос-
полнен, в противном случае его действие приостановится.

Биосинтетические реакции, компенсирующие отток интермедиатов цикла Креб-
са, называются анаплеротическими (англ, anapleurotic; от англ, anabolism и греч.
plevra — боковая сторона; примыкающие анаболические реакции). К анаплеротиче-
ским реакциям в первую очередь принадлежит биосинтез оксалоацетата из пирувата
с помощью пируваткарбоксикиназы и биосинтез оксалоацетата из фосфоэнолпиру-
вата с помощью фосфоэнолпируват-карбоксилазы:

пируват + СО2 + АТФ —> оксалоацетат + АДФ + Ф,
фосфоэнолпируват + СО2 + Н2О —> оксалоацетат + Ф.
Другими примерами анаплеротических реакций является вхождение в цикл ами-
нокислот — аспартата и аспарагина (на уровне оксалоацетата); тирозина и фенил-
аланина (на уровне фумарата); аргинина, гистидина, глутамата и пролина (на
уровне о-кетоглутарата).

По-видимому, в ходе эволюции метаболических путей цикл Кребса сформировался из отдель-
ных реакций биосинтеза «не-незаменимых» аминокислот. Это означает, что энергетическая функ-
ция цикла Кребса вторична по отношению к его биосинтетической функции.

Интересно, что в ряде случаев у бактерий (примером служат все цианобактерии, а также уксус-
нокислые бактерии р. Gluconobacter') цикл Кребса не замкнут по причине изначального отсутствия
или вторичной потери одного из двух ключевых ферментов, а именно а-кетоглутаратдегидрогена-
зы. В результате этого незамкнутые ветви цикла выполняют только конструктивную нагрузку.

Глиоксилатный шунт (цикл Корнберга). Цикл Кребса служит функцио-
нальным продолжением гликолиза и других путей образования пирувата из гексоз.
В качестве катаболического пути он эффективно действует при росте на углеводах,
особенно в аэробных условиях.

При росте бактерий на ацетате, длинноцепочечных жирных кислотах и углево-
дородах у некоторых бактерий начинает функционировать вариант цикла Кребса —
глиоксилатный шунт, или цикл Корнберга (Н. L. Kornberg). Здесь также из ацетил-
СоА и оксалоацетата образуется цитрат. Затем цитрат изомеризуется в изоцитрат;
интермедиатом в этой реакции также является cis-аконитат.

Дальнейшая судьба изоцитрата иная, чем в цикле Кребса —он не окислительно
декарбоксилируется в о-кетоглутарат, а расщепляется под действием изоцитратли-
азы на глиоксилат (С2) и сукцинат (С4).

Затем при помощи малатсинтазы из глиоксилата и второй молекулы ацетил-
СоА образуется малат. Он обычным путем превращается в оксалоацетат, и цикл
замыкается (рис. 101).

За один оборот глиоксилатного шунта в результате ассимиляции двух молекул
ацетата образуется сукцинат, который используется для биосинтеза оксалоацетата.
Следовательно, глиоксилатный шунт выполняет анаплеротические функции. Наря-
ду с этим он служит источником энергии (за один оборот регенерируется молекула
НАДН).

Таким образом, основной функцией глиоксилатного шунта является быстрая
утилизация субстратов (прежде всего липидов, жирных кислот и углеводородов),
при катаболизме которых образуется ацетил-СоА. Кроме того, происходит накоп-
ление оксалоацетата, используемого для биосинтеза аминокислот. Наконец, глиок-
силатный шунт поставляет материал для биосинтеза глюкозы. Это достигается пу-
тем превращения малата в пируват с помощью «декарбоксилирующей» малатдегид-
рогеназы, а оксалоацетата—в фосфоэнолпируват с помощью фосфоэнолпируват-
карбоксилазы (см. выше).

Кроме бактерий, глиоксилатным шунтом обладают некоторые грибы и растения, накапливаю-
щие запасные липиды; у животных он не обнаружен.

В отличие от цикла Кребса, глиоксилатный шунт локализован не в митохондриях, а в специ-
ализированных органеллах — глиоксисомах. Образующийся сукцинат выходит в цитоплазму, пре-
вращается в оксалоацетат и используется при глюконеогенезе.

Регуляция ферментов глиоксилатного шунта. В отличие от конститутив-
ных ферментов цикла Кребса, ферменты вспомогательного глиоксилатного шунта
индуцибельны. Они не синтезируются при росте на глюкозе, а образуются при по-
падании в среду, где единственным источником углерода служит ацетат (или соеди-
нение, в результате катаболизма которого образуется ацетат).

Если питательная среда содержит глюкозу и ацетат, то наблюдается явление
диауксии —вначале утилизируется глюкоза, а после нее ацетат. Биосинтез изоцит-
ратлиазы и малатсинтазы, ключевых ферментов глиоксилатного шунта, подавлен
в результате так называемой катаболитной репрессии (см. III том учебника). Гены,
ответственные за их биосинтез, активируются только после полного использования
глюкозы.

11.4.2.2. Окислительный пентозофосфатный цикл, или цикл
Варбурга-Диккенса-Хореккера

Наряду с гликолизом, существует второй важнейший способ катаболизма глю-
козы— окислительный пентозофосфатный цикл (англ, oxydative pentose phosphate
cycle, OPC). Он был назван в честь Варбурга, который внес первоначальный вклад
в его изучение в 1930-е годы, а также Диккенса и Хореккера, которые реконструи-
ровали его в конце 1950-х годов.

Другое название этого цикла — «гексозомонофосфатный цикл», поскольку в нем
участвуют монофосфаты С3—С7 сахаров, прежде всего гексоз.

Наконец, существует еще одно название этого цикла — «гексозомонофосфатный
шунт», из которого следует, что он функционально заменяет цикл Кребса.

Окислительный пентозофосфатный цикл осуществляется при помощи цитозоль-
ных ферментов. Он широко распространен у эукариотов, в частности высших жи-
вотных и растений. Среди прокариотов им обладают аэробно дышащие бактерии
с полноценным (например, энтеробактерии из филы ВХП Proteobacteria) или неза-
мкнутым (например, представители филы ВХ Cyanobacteria) циклом Кребса. Функ-
ционирование окислительного пентозофосфатного цикла у архей не показано.

Окислительный пентозофосфатный цикл (ОРС) не следует смешивать с окисли-
тельным пентозофосфатным путем (ОРР), который мы уже рассмотрели в разделе
11.3.2.3. Хотя в окислительном пентозофосфатном пути и в окислительном пенто-
зофосфатном цикле принимают участие несколько общих реакций (см. ниже), на
этом их сходство заканчивается. Линейный путь приводит к образованию побочно-
го продукта — пирувата, а в полностью сбалансированном цикле гексоза окисляется
до СО2, и восстановительные эквиваленты передаются на НАДФ.

Реакции окислительного пентозофосфатного цикла. Цикл Варбурга-
Диккенса-Хореккера можно условно подразделить на две ветви — окислительную
и неокислительную.

На окислительной ветви в цикл поступает молекула глюкозы, которая с помо-
щью гексокиназы превращается в глюкозо-6-фосфат. Еще пять молекул глюкозо-6-
фосфата имеют «эндогенное» происхождение и регенерируются на неокислительной
ветви (рис. 102).

Все шесть молекул глюкозо-6-фосфата окисляются при помощи НАДФ-зависи-
мой (см. рис. 103) глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы. При этом образуется 6-фосфо-
глюконолактон — неустойчивое соединение, которое спонтанно или под воздействи-
ем фосфоглюконолактоназы гидролизуется в б-фосфоглюконат. Нетрудно заметить,
что такие же реакции происходят на пути Энтнера-Дудорова (см. раздел 11.3.2.2).
Следующая реакция окислительной ветви уникальна для данного цикла. Она
катализируется НАДФН-зависимой «декарбоксилирующей» фосфо глюконат-дегид-
рогеназой и приводит к образованию кетопентозы — рибулозо-5-фосфата.

При переходе к неокислительной ветви 6 молекул рибулозо-5-фосфата превраща-
ются в альдокетозу — ксилулозо-5-фосфат (с помощью фосфопентоэпимеразы) или
в альдопентозу — рибозо-5-фосфат (с помощью фосфопентоизомеразы). Все три ти-
па субстратов находятся между собой в динамическом равновесии:

ксилулозо-5-фосфат рибулозо-5-фосфат <-> рибозо-5-фосфат.

На неокислительной ветви они рекомбинируют таким образом, что происходит
регенерация пяти молекул глюкозо-6-фосфата (6С5 = 5Сб).

В полностью сбалансированном цикле из шести молекул рибулозо-5-фосфата об-
разуются четыре молекулы ксилулозо-5-фосфата и две молекулы рибозо-5-фосфата
(рис. 102).

Две из четырех молекул ксилулозо-5-фосфата взаимодействуют с двумя моле-
кулами рибозо-5-фосфата. Реакцию катализирует транскетолаза, переносящая гли-
кольальдегидную группу -НСОН-СНО от рибозо-5-фосфата на ксилулозо-5-фос-
фат. Полученные продукты, две молекулы альдотриозы (глицеральдегид-3-фосфа-
та) и две молекулы кетогептозы (седогептулозо-7-фосфата), превращаются в две
молекулы альдотетрозы (эритрозо-4-фосфата) и две молекулы кетогексозы (фрук-
тозо-6-фосфата). Данную реакцию катализирует трансальдолаза, переносящая ди-
оксиацетоновую группу -СНОН-СО-СН2ОН от седогептулозо-7-фосфата на глице-
ральдегид-3-фосфат.

Две молекулы фруктозо-6-фосфата направляются в начало цикла (рис. 102), а
две молекулы эритрозо-4-фосфата взаимодействуют с двумя оставшимися молекула-
ми ксилулозо-5-фосфата с образованием двух молекул фруктозо-6-фосфата и двух
молекул глицеральдегид-3-фосфата. Эту реакцию катализирует транскетолаза, пе-
реносящая кетоальдегидную группу -СО-СНО от ксилулозо-5-фосфатана эритрозо-
4-фосфат. Таким образом, еще две молекулы фруктозо-6-фосфата направляются в
начало цикла (рис. 102).

Под воздействием триозофосфатизомеразы молекула глицеральдегид-3-фосфата
превращается в молекулу диоксиацетон-3-фосфата, после чего при помощи альдо-
лазы и фосфатазы образуется пятая молекула фруктозо-6-фосфата.

Все пять молекул фруктозо-6-фосфата, полученные на неокислительной ветви,
с помощью гексозофосфатизомеразы превращаются в пять молекул глюкозо-6-фос-
фата и вместе с «экзогенной» молекулой глюкозо-6-фосфата замыкают цикл.

Таким образом, суммарное уравнение цикла Варбурга-Диккенса-Хореккера име-
ет вид:

6 х глюкозо-6-фосфат + 12НАДФ + 7Н2О —>
5 х глюкозо-6-фосфат + 6СО2 + 12НАДФН + Ф.

Функции окислительного пентозофосфатного цикла. У бактерий цикл
Варбурга-Диккенса-Хореккера является эффективным способом получения энер-
гии при катаболизме таких широко распространенных углеродсодержащих субстра-
тов, как глюкоза и глюконат. Подобно циклу Кребса, он снабжает дыхательную
цепь восстановительными эквивалентами (в данном случае НАДФН, а не НАДН),
что позволяет ассимилировать энергию в форме Pmf. Однако, в отличие от цикла
D-глюкоза

I®

X(j глюкозо-6-фосфат <

НАДФ
НАДФН

СН2ОР

J—

<он V = о
но41----г

он

6-фосфо-глюконолактон

нз°>®

▼

СОО"
I
нс-он
I
но-сн

I
нс-он

I

нс-он
I
СН2ОР

6-фосфоглюконат

СН2ОН
с = о

I
но-сн

I
нс-он

I
нс-он

I

СН2ОР

фруктозо-
б-фосфат

фруктозо-1,6-бисфосфат

сн,он	с^„

I 2	I н

с=о *	► нс-он

I	® I

СН2ОР	СН2ОР

диокси-	глицеральдегид-

ацетон-3-фосфат 3-фосфат

	^О	
СН7ОН  1 1		х2

НС-ОН

нс-он

НАДФ
НАДФН

СО2

СН2ОН

С=О

I

НС-ОН

I

нс-он

I

СН2ОР
рибулозо-
5-фосфат

с = о
I
но-сн
I
х4 нс-он

СН2ОР
ксилулозо-
5-фосфат

~ нс-он
х2 '
нс-он

I
нс-он

I

СН2ОР
рибозо-
б-фосфат

с = о

но-сн

нс-он

нс-он

сн2он

глицеральдегид-
3-фосфат

СН2ОР

нс-он

СН2ОР
седогептулозо-
7-фосфат

нс-он

эритрозо-
4-фосфат

СН2ОР

СН2ОН

с = о

но-сн

нс-он

нс-он

СН2ОР
фруктозо-
б-фосфат

Рис. 102. Окислительный пентозофосфатный цикл (цикл Варбурга-Диккенса-
Хореккера).

1 — гексокиназа; 2 — глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа; 3 — фосфоглюконолактоназа;
4 — фосфоглюконат-дегидрогеназа; 5 — фосфопентоэпимераза; 6 — фосфопентоизомераза;
7 — транскетолаза; 8 — трансальдолаза; 9 — триозофосфатизомераза; 10 — альдолаза; 11 —
фосфатаза; 12 — гексозофосфатизомераза.
Кребса, в нем не происходит фосфорилирование нуклеозиддифосфатов. Напротив,
для активации глюкозы затрачивается АТФ.

Потенциальная энергетическая эффективность окислительного пентозофосфат-
ного цикла очень высока —при расчете, что окисление одной молекулы НАДФ дает
три молекулы АТФ, она составляет 36 (3 х 12) молекул АТФ на молекулу нефос-
форилированной глюкозы.

Окислительный пентозофосфатный цикл является связующим звеном при ме-
таболизме гексоз и пентоз, поскольку глицеральдегид-3-фосфат и фруктозо-6-фос-
фат, образующиеся на неокислительной ветви, могут использоваться в гликолитиче-
ском пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Благодаря транскетолазе и трансальдола-
зе бактерии получают возможность катаболизировать пентозы — арабинозу, ксилозу
и рибозу.

Многие восстановительные процессы специфически зависят от НАДФН, и окис-
лительный пентозофосфатный цикл является наиболее эффективным способом его
регенерации у гетеротрофов (12 молекул на одну молекулу полностью окисленной
глюкозы).

Наконец, что особенно важно, окислительный пентозофосфатный цикл служит
источником субстратов для тех биосинтезов, в которых участвуют тетрозы, пентозы
и гептозы:

—	эритрозо-4-фосфат является предшественником шикимовой кислоты, на осно-
ве которой синтезируются ароматические аминокислоты (тирозин и фенилаланин),
а также предшественником гетероциклических витаминов, в частности пиридоксина
(витамина Вб);

—	рибулозо-5-фосфат является предшественником гистидина и триптофана, а
также нуклеотидов и витаминов, в частности рибофлавина (витамина В2); после
превращения в арабинозо-5-фосфат он используется для синтеза кетодезоксиокту-
лозоновой кислоты (КДО), входящей в костяк эндотоксина, или липополисахарида
грамотрицательных бактерий;

—	седогептулозо-7-фосфат используется для образования гептозы, входящей в
состав кор-олигосахарида грамотрицательных бактерий (см. I том учебника).

По-видимому, изначально цикл Варбурга-Диккенса-Хореккера был предназначен для полу-
чения пентоз, необходимых для биосинтеза нуклеиновых кислот. На этом основании его следует
рассматривать как более архаичную метаболическую систему — по сравнению с гликолизом и его
вариантами, которые в основном используются для получения энергии.

Регуляция ферментов цикла Варбурга-Диккенса-Хореккера. В 1980-
1995 гг. были картированы, клонированы и секвенированы гены, кодирующие фер-
менты окислительного пентозофосфатного пути у Е. coli. Выяснилось, что кроме
фосфопентоэпимеразы и транскетолазы все они организованы в моноцистронный
оперон.

За исключением фосфопентоизомеразы все ферменты окислительного пентозо-
фосфатного пути синтезируются конститутивно. Помимо конститутивной фосфо-
пентоизомеразы (RpiA) Е. coli экспрессирует индуцибельную фосфопентоизомера-
зу (RpiB). Последняя появляется только при росте на рибозе или соединениях, при
катаболизме которых образуется рибоза, в частности на аденозине или уридине.
Механизм контроля точно неизвестен, хотя предполагается, что его осуществляет
негативный регулятор RpiR.
Завершая этот раздел, еще раз напомним, что в циклах Кребса и Варбурга-
Диккенса-Хореккера регенерируются восстановленные формы кофакторов дегидро-
геназ — ФАДН2, НАДН и НАДФН. Они служат посредниками между органическим
донором электронов и дыхательной цепью.

11.4.3.	Посредники между органическим донором электронов
и дыхательной цепью

При дыхательной органотрофии энергия с помощью электрон-транспортной цепи
ассимилируется в форме Pmf.

Посредниками между органическим донором электронов и дыхательной цепью
(точнее сказать — посредниками между органическим донором электронов и убихи-
нонным пулом, который взаимодействует с цитохром bc^bef )-комплексом) служат
коферменты дегидрогеназ.

К их числу относятся пиридиновые нуклеотиды НАД(Ф) и флавиновый нуклео-
тид ФАД.

НАД(Ф). В начале 1930-х годов Отто Варбург впервые выделил и получил
в кристаллическом виде важнейшие ферменты метаболизма глюкозы. К концу
1930-х годов он установил, что некоторые из них используют в качестве кофер-
ментов пиридиновые нуклеотиды — НАД, или никотинамид-адениндинуклеотид и
НАДФ, или никотинамид-адениндинуклеотид-фосфат (рис. 103).

Позже выяснилось, что НАД выполняет роль кофермента для самых разнообраз-
ных цитозольных дегидрогеназ и передает электроны, полученные от окисленного
органического субстрата, НАДН-дегидрогеназе, а она — дыхательной цепи.

Что касается НАДФН, то этот кофермент либо неспецифически окисляется
НАДН-дегидрогеназой, либо предварительно восстанавливает НАД в трансгидро-
геназной реакции: НАДФН + НАД —> НАДФ + НАДН.

ФАД. Флавинадениндинуклеотид (рис. 104) открыл и идентифицировал в каче-
стве кофермента в середине 1930-х годов Отто Варбург. Он служит простетической
группой для специфической мембраносвязанной дегидрогеназы — сукцинатдегидро-
геназы (см. ниже), которая катализирует реакцию: сукцинат + ФАД <-> фумарат +
ФАДН2.

НАДН-дегидрогеназа. Ферменты, относящиеся к группе НАДН-дегидрогеназ
(НАДН:хинон-оксидоредуктаз), функционируют в донорном, или низкопотенциаль-
ном участке дыхательной цепи.

В зависимости от наличия или отсутствия сайта сопряжения НАДН-дегидроге-
назы подразделяются на две группы. Те из них, которые имеют сайт сопряжения
(т. е. создают трансмембранный электрохимический потенциал), обозначаются как
НАДН-дегидрогеназы-1, а те, которые не имеют сайта сопряжения — как НАДН-
дегидрогеназы-2.

НАДН-дегидрогеназа-1 встречается у бактерий, архей и митохондрий. Она представляет собой
мультиполипептидный комплекс. Наиболее сложно устроена митохондриальная НАДН-дегидроге-
наза-1, или «комплекс I». Это один из самых больших мембранных комплексов (45 гетерологичных
субъединиц общей молекулярной массой около 103 кДа); из всех компонентов дыхательной цепи
только она еще не подвергалась рентгеноструктурному анализу. Ее простетическими группами
являются нековалентно связанный ФМН и до девяти [ЕепЗп]-кластеров, которые ковалентно вза-
имодействуют с остатками Cys отдельных субъединиц. Митохондриальная НАДН-дегидрогеназа
создает Pmf, но не Smf.
Н 72ё“

НО ОН

Рис. 103. НАД(Ф).

Двойной стрелкой указано место обратимого восстановления/протонирования.

Бактериальные НАДН-дегидрогеназы-1, в разной степени охарактеризованные у Е. coli, Kleb-
siella pneumoniae, Paracoccus denitrificans, Rhodobacter capsulatus и Thermus thermophilus, состо-
ят «только» из 14 субъединиц суммарной молекулярной массой 500 кДа. Анализ бактериальной
НАДН-дегидрогеназы-1 не менее проблематичен, чем для митохондрий. Это связано с нестабиль-
ностью данного фермента in vitro, а также со сложностью получения мутантов, поскольку все его
структурные гены кодируются и регулируются одним опероном. Бактериальная НАДН-дегидро-
геназа-1 может создавать и Pmf, и Smf.

НАДН-дегидрогеназа-2 состоит только из одного полипептида. Она не содержит [Ееп5п]-кла-
стеров и нечувствительна к антагонистам хинонов капсаицину, пиерицидину и ротенону, которые
ингибируют НАДН-дегидрогеназу-1.

Данные про НАДН-дегидрогеназу архей фрагментарны и получены лишь для Halobacterium
salinarium и Sulfolobus acidocaldarius. Неизвестно, способны ли эти археотные ферменты окис-
лять субстрат сопряженно с образованием трансмембранного электрохимического потенциала.
В секвенированных геномах термоацидофильных и метаногенных архей выявлены нуклеотидные
последовательности, сходные со структурными генами НАДН-дегидрогеназы-1. Однако они могут
оказаться псевдогенами, т. е. неэкспрессируемыми участками ДНК, которые гомологичны полно-
ценным бактериальным или митохондриальным генам.

НАДН-дегидрогеназа-1 состоит из двух доменов — мембранного и цитоплазма-
тического. Ее форма варьирует у разных объектов и может быть L-, О- или U-
образной. В функциональном отношении фермент подразделяется на три модуля —
он он

Рис. 104- ФАД (ФМН), присоединенный ковалентной связью к апопротеину.

Пунктирной рамкой выделен обратимо восстанавливающийся участок в сопряженной
изоаллоксазиновой трициклической системе.

НАДН-дегидрогеназный, гидрогеназный и транспортный.

Дегидрогеназный модуль у бактерий представлен субъединицей NuoF (51 кДа)
с двумя простетическими группами — ФМН и [Ге434]-кластером, который обозна-
чается как N3 (рис. 105). Флавиновая группа имеет редокс-потенциал -336 мВ и
служит входными воротами для электронов, поступающих от НАДН. Кроме того,
двухэлектронный донор (НАДН) при посредничестве ФМН приобретает способность
взаимодействовать с одноэлектронным переносчиком ([Ге434]-кластером).

Гидрогеназный модуль называется так поскольку две его субъединицы, восста-
навливающие убихинон, гомологичны двум субъединицам NiFe-гидрогеназы (см.
раздел 11.4.4.4).

В зависимости от источника фермента гидрогеназный модуль содержит разное
количество бинуклеарных [ГегЗгркластеров и тетрануклеарных [Гв484]-кластеров,
которые обозначаются как Nia, Nib, Nic, N2, N4, N6a и N6b. Субъединица NuoE
(24 кДа) связывает бинуклеарный [РегЗгркластер Nia, который имеет редокс-по-
CM

Рис. 105. НАДН-дегидрогеназа (по: Brandt et al., 2003).

NuoB, NuoC, NuoD, NuoE, NuoF, NuoG и Nuol — перифериче-
ские субъединицы; ND1, ND2, ND4 и ND5 — интегральные субъ-
единицы; Nia, Nib, N2, N3, N4, N5, N6a и N6b — железо-серные
кластеры; Q — хинон.

тенциал -370 мВ и используется в качестве вторичного акцептора электронов, по-
ступающих от кластера N3. Субъединица NuoG (75 кДа) содержит бинуклеарный
[ГегЗгркластер Nib и тетрануклеарные [РедБ^-кластеры N4 и N5, ре доке-потенци-
ал которых составляет—250 мВ, из-за чего их называют «изопотенциальными».
В некоторых случаях в полипептидной цепи субъединицы NuoE присутствует до-
полнительный остаток Cys, который присоединяет четвертый кластер —Nic, скорее
всего, бинуклеарного [ЕегЗгртипа. Субъединица Nuol (25 кДа) содержит два тет-
рануклеарных [Ее484]-кластера — N6a и N6b, которые аналогичны [Fe4S4]/[Fe4S4]-
кластерам SFe-ферредоксинов (см. раздел 10.4.1). Электроны от кластера NuoE пе-
редаются по цепочке NuoG —> Nuol —> NuoB (рис. 105).

Каталитический центр гидрогеназного модуля находится на стыке субъединиц
NuoB (30 кДа) и NuoD (49 кДа). Субъединица NuoB гомологична малой субъеди-
нице NiFe-гидрогеназы. Она связывает [Ре434]-кластер N2, редокс-потенциал кото-
рого составляет -150 мВ, и непосредственно восстанавливает убихинон. Субъеди-
ница NuoD гомологична большой субъединице NiFe-гидрогеназы. Она не содержит
простетических групп и только образует «карман» для убихинона.

Восстановленный убихинон поступает в липидный матрикс мембраны, а затем
окисляется цитохром Ьс\-комплексом.

Транспортный модуль, состоящий из гетерологичных гидрофобных субъединиц
ND1, ND2, ND4 и ND5, по-видимому, играет ключевую роль в создании трансмем-
бранного электрохимического потенциала. Механизм, с помощью которого одновре-
менно с восстановлением убихинона через мембрану переносятся протоны или кати-
оны Na+, еще не выяснен. Скорее всего, при восстановлении убихинона кластером
N2 в гидрогеназном модуле возникают конформационные изменения. Они переда-
ются гидрофобным субъединицам, которые произошли от Ха+/Н+-антипортеров и
выступают в качестве протонных помп.

Сукцинатдегидрогеназа. Этот мембраносвязанный фермент (англ, succinate
dehydrogenase, Sdh) имеется у всех аэробных организмов.

Sdh («комплекс II» митохондрий) — это единственный мембраносвязанный фер-
мент цикла Кребса. Его активный центр находится на цитоплазматической стороне
СМ. Эндогенный сукцинат окисляется в фумарат (стандартный редокс-потенциал
пары +113 мВ).

Sdh состоит из растворимой «каталитической» субъединицы SdhA (70 кДа) с
простетической группой ФАД (рис. 104), амфипатической «коннекторной» субъеди-
ницы SdhB (27 кДа) с простетической группой [ЕегЗг] и интегральной «якорной»
субъединицы SdhC (15 кДа) с простетической группой [FenSn]. В некоторых случа-
ях имеется дополнительная «якорная» субъединица SdhD (13 кДа). От сукцината
электроны передаются по цепочке субъединиц SdhA SdhB —> SdhC и затем по-
ступают в убихинонный пул.

Сукцинатдегидрогеназа, наряду с мембраносвязанной фумаратредуктазой (англ, fumarate re-
ductase, Frd; см. раздел 11.4.5.1), имеющейся у факультативных и облигатных анаэробов, принад-
лежит к суперсемейству флавиновых железопротеинов. Если бактерия, например Е. coli, образует
оба фермента, то сукцинатдегидрогеназа репрессируется в анаэробных, а фумаратредуктаза — в
аэробных условиях. Кроме этого, Sdh репрессируется при аэробном росте на глюкозе.

Sdh и Frd катализируют одну и ту же реакцию: сукцинат «-> фумарат + 2е-/2Н+, однако
в первом случае равновесие смещено в сторону окисления сукцината, а во втором — в сторону
восстановления фумарата.

Каталитические субъединицы «аэробной» Sdh и «анаэробной» Frd Е. coli взаимно гомологич-
ны, что указывает на их общее происхождение, хотя они не проявляют иммунологического родства
друг с другом. Они различаются по сродству к сукцинату и фумарату, катализируют реакцию пре-
имущественно в одном из двух противоположных направлений и специфически регулируются на
генном уровне.

Не исключено, что функциональная гетерогенность этих ферментов связана с особенностя-
ми лигандирования [ЕепЗп]-кластеров коннекторными субъединицами SdhB и FrdB. В частности,
бинуклеарный [ЕегЗгркластер субъединицы SdhB лигандируется только тремя остатками Cys, а
четвертым лигандом служит остаток Asp-62. Разнонаправленность действия сукцинатдегидрогена-
зы и фумаратредуктазы также связана с гетерологичной структурой якорных субъединиц SdhCD
и FrdCD.

На этом мы оставляем тему, посвященную органическим донорам электронов
для дыхательной цепи, и переходим к неорганическим донорам.

11.4.4.	Неорганический донор электронов

При дыхательной литотрофии, или хемолитотрофии энергоносителями служат
разнообразные неорганические субстраты, в том числе и углеродсодержащие (ис-
пользование метильной группы и формальдегида метилотрофными бактериями яв-
ляется одним из типов хемолитотрофии).

Хемолитотрофия нередко сопровождается углеродной автотрофией. В этом слу-
чае в конструктивных целях ассимилируются неорганические субстраты — СО2,
НСО^, НСОО-, СО, НСНО, а также «неорганическая» метильная группа соеди-
нений типа СН3—X—R (где X —атом азота, кислорода или серы).

Из истории открытия хемолитотрофии и хемосинтеза. Нитрификация,
или накопление селитры в богатой азотом разлагающейся органике (навозе, пти-
чьем помете, компостных кучах и т. д.) известна с незапамятных времен. Этот спон-
тайный процесс использовался в технике и сельском хозяйстве задолго до того,
как стал понятен его биологический смысл и был изучен его молекулярный ме-
ханизм.

В 1877 г. Шлезинг (Т. Schloesing) и Мюнц (A. Muntz) установили, что нитрификацию вызыва-
ют живые микроорганизмы. Для этого было достаточно проинкубировать опытный и контрольный
(простерилизованный) образец сточной воды или почвы, а затем сравнить количество образовав-
шейся селитры. В начале 1880-х годов Уорингтон (R. Warrington) установил, что нитрификация
происходит в два этапа — сначала аммиак, образующийся при аммонификации, окисляется до нит-
рита, а затем нитрит окисляется до нитрата. Однако физиологический смысл этого процесса оста-
вался загадкой.

В 1886-1888 гг. С. Н. Виноградский провел тщательное микроскопическое наблю-
дение за бесцветной серной бактерией Beggiatoa alba и хламйдобактерией Leptothrix
ochraceae в препаратах типа «висячей капли» и сопоставил их развитие с динами-
кой потребления сероводорода и закисного железа. В результате он пришел к ре-
волюционному выводу, что окисление этих субстратов является физиологическим
эквивалентом дыхания с использованием органических веществ. По предложению
Вильгельма Пфеффера такие биологические реакции были названы аноргоксида-
цией (греч. ап — не, organikos — органический, oxis —кислый; окисление неорганиче-
ских веществ с целью получения энергии). Значение открытия Виноградского было
огромным, поскольку единственным абиогенным источником энергии для живых
организмов до этого считали видимый свет.

Последовательно применяя придуманный им метод элективных сред, Виноград-
ский выделил в 1890 г. хемолитоавтотрофных бактерий Nitrosomonas и Nitrobacter,
для которых источником энергии служит соответственно аммиак и нитрит, а стро-
ительным материалом — диоксид углерода. По аналогии с фотосинтезом, Пфеффер
назвал такой тип питания хемосинтезом (греч. chemeja —химия, synthesis — соеди-
нение; образование органических веществ из неорганических за счет использования
энергии окисления неорганических веществ).

В настоящее время хемосинтезу можно дать следующее определение.

Хемосинтез — это сочетание хемолитотрофии (ассимиляции энергии, осво-
бождающейся при ферментативном окислении неорганического субстрата) с уг-
леродной автотрофией (ассимиляцией неорганических соединений углерода).

Из истории изучения хемолитотрофии у бактерий. Работы С. Н. Вино-
градского с бесцветными серными бактериями, железобактериями и нитрифициру-
ющими бактериями положили начало изучению биоразнообразия хемолитотрофов
и хемосинтетиков.

В начале 1890-х годов В.Т. Шевяков описал одноклеточную серную бактерию Achromatium ox-
aliferum, относящуюся к числу некультивируемых форм (англ, viable but not culturable, VBNC).
В 1907 г. Лаутерборн (R. Lauterborn) выделил другого представителя VBNC — окисляющую серо-
водород нитчатую бактерию Thioploca. Приоритет открытия серуокисляющих тионовых бактерий
из рода Thiobacillus принадлежит Мартинусу Бейеринку (М. Beijerinck), который в 1904 г. сообщил
об их получении в чистой культуре.

В 1931 г. Стикленд установил, что анаэробные сульфатредуцирующие бактерии способны к
водородной хемолитотрофии. Позднее было показано, что энергию окисления водорода могут ас-
симилировать и аэробные бактерии из родов Alcaligenes, Bacillus, Mycobacterium и Pseudomonas.
В 1976 г. Г. А. Заварзин открыл физиологически близких к аэробным водородным бактериям аэроб-
ных карбоксидобактерий, которые используют монооксид углерода в качестве источника энергии и
конструктивного субстрата. Анаэробных карбоксидобактерий описал Зейкус (J. G. Zeikus) в 1983 г.

В середине 1980-х годов Вуд (Н. G. Wood) раскрыл механизм, с помощью которого водородокис-
ляющая бактерия Clostridium thermoaceticum автотрофно синтезирует ацетат. В настоящее время
этот метаболический путь называют «путем Вуда».

Метилотрофных бактерий, использующих метан, метанол или другие одноуглеродные соедине-
ния в качестве источника энергии и конструктивного субстрата, обнаружил Зенген (N. L. Songen) в
1906 г. Однако до 1970-х годов отсутствовали сведения о распространении этих бактерий в природе
и их роли в цикле углерода; были также неизвестны их физиологические свойства и биоразнооб-
разие.

Во второй половине 1970-х годов, в первую очередь благодаря исследованиям Квайла
(J. R. Quayle), были реконструированы два пути автотротрофной ассимиляции формальдегида ме-
тилотрофами — рибулозомонофосфатный путь, или «путь Квайла», и сериновый путь.

До недавнего времени микробное окисление метана рассматривали как облигатно аэробный
процесс. Однако в 2002 г. Михаэлис (W. Michaelis) установил, что микробные маты на дне Черного
моря, образованные археями и сульфатредуцирующими бактериями, окисляют метан в анаэробных
условиях.

Во второй половине 1990-х годов стали поступать сообщения о двух ранее неизвестных типах
бактериальной хемолитотрофии. Ван де Грааф (A. A. van de Graaf) обнаружил процесс анаэробного
окисления аммиака нитритом, теоретическую возможность которого предсказал в 1977 г. австрий-
ский биохимик Энгельберт Брода (Е. Broda). Одновременно с этим Виддель (F. Widdel) открыл
процесс анаэробного окисления закисного железа нитратом.

Из истории изучения хемолитотрофии у архей. В 1776 г. итальянский
физик Алессандро Вольта (A. Volta) описал природное явление, связанное с образо-
ванием «взрывчатого воздуха» в болотах и речных илах. На рубеже XIX-XX вв.
Зенген, В. Л. Омелянский и Хоппе-Зейлер (F. Hoppe-Seyler) установили, что этот
процесс связан с жизнедеятельностью микроорганизмов.

До середины XX в. метаногенов относили к разным группам гетеротрофных бактерий и
интерпретировали метаногенез как облигатно анаэробное «метановое брожение». В частности,
В. Л. Омелянский в 1902 г. предположил, что в качестве исходного субстрата используется цел-
люлоза. Однако в 1967 г. было доказано, что выделенная им культура («Methanobacillus omelian-
skii») представляет собой симбиотическую ассоциацию бактерии, окисляющей этанол до ацетата и
водорода, и метаногенного археота, который восстанавливает углекислоту водородом. Такое взаи-
модействие, или «межвидовой перенос водорода», широко распространено у анаэробов; оно устра-
няет торможение катаболического процесса конечным продуктом и служит одним из краеугольных
камней микробной экологии (см. раздел 11.3.4.2).

В 1936 г. Баркер (Н. A. Barker) выяснил, что метаногенные прокариоты восстанавливают ди-
оксид углерода до метана, используя в качестве донора электронов молекулярный водород или
монооксид углерода. В 1940 г. он доказал это путем радиоуглеродного анализа с применением ко-
роткоживущего изотопа ПС. В 1948 г. Басвелл (А. М. Buswell) и Солло (F.W. Sollo) установили,
что предшественником метана помимо углекислоты может быть метанол или метильная группа
ацетата. В 1956 г. Баркер пришел к выводу, что общим таксономическим признаком этих микро-
организмов служит уникальная способность к образованию метана, и на этом основании отнес их
к «бактериальному» семейству Methanobacteriaceae.

Работа с облигатно анаэробными метаногенами связана с техническими сложностями, и только
в 1947 г. Схнеллен (С. G.T. Р. Schnellen) сумел выделить чистые культуры Methanobacterium formi-
cicum и Methanosarcina barkeri. По методике, которую в 1976 г. разработали Белч (W. Е. Balch) и
Вулф (R. S. Wolfe), метаногенов выращивают на газовой смеси из углекислоты и водорода (1:4) под
давлением 0,2 мПа.

Метаногенные археи подразделяются на две подгруппы — «автотрофные», или «гидрогено-
трофные» (восстанавливающие СОг за счет окисления молекулярного водорода либо формиата)
и «гетеротрофные», или ацетокластические (расщепляющие ацетат). Помимо ацетата субстрата-
ми гетеротрофного метаногенеза могут быть метанол, метилированные амины или метионин (см.
раздел 11.4.5.5).

Используя сравнительно узкий круг субстратов, метаногены занимают разнообразные эколо-
гические ниши: осадки, илы, пресноводные и солоноватые водоемы, гидротермальные источники
и геотермальные поля. Кроме того, они могут вступать в эктосимбиоз с животными (в пище-
варительном тракте широкого круга объектов — от насекомых до млекопитающих) и растениями
(в стволах некоторых видов сем. Salicaceae), а также в эндосимбиоз с анаэробными протистами.
Смит (Р. Н. Smith) и Хангейт (R. Е. Hungate) выделили в 1958 г. из рубца жвачных первого экто-
симбиотического метаногена — Methanobacterium ruminantium. В начале 1980-х годов ван Бругген
(J. J. A. van Bruggen) обнаружил, что Methanobacterium formicicum является факультативным ци-
топлазматическим эндоцитобионтом некоторых амеб и ресничных инфузорий.

Большинство метаногенных архей — это мезофилы, однако среди них встречаются термофиль-
ные и даже гипертермофильные формы. В 1981 г. Штеттер (К. Stetter) выделил из почвы соль-
фатар на побережье Исландии термофила Methanothermus, максимальная температура роста ко-
торого составляет 97°С. Первого морского гипертермофильного метаногена Methanococcus ther-
molithotrophicus, имеющего оптимум роста 85°С, обнаружил Хубер (Н. Huber) в подводных гидро-
термах у побережья Италии в 1982 г.

Фундаментальный путь метаногенеза был расшифрован главным образом в результате пионер-
ских исследований Ральфа Вулфа. В 1960-х годах были идентифицированы уникальные кофак-
торы этого процесса: меркаптоэтансульфонат (СоМ), деазафлавин (F420), тетрагидрометанопте-
рин (F342), кобальт-тетрапиррол (F430), метанофуран и меркаптогептаноил-треонинфосфат (СоВ).
В настоящее время охарактеризованы все ферменты, участвующие в автотрофном биосинтезе ме-
тана из СО2 и Нг- Пять из них получены в виде кристаллических препаратов; определена их
третичная структура и выяснен механизм катализа (см. раздел 11.4.5.5).

Помимо хемолитотрофов-метаногенов существуют хемолитотрофные археи, относящиеся к
сборной группе термоацидофилов. После появления в 1977 г. «археотной» концепции Карла Воза
(С. R. Woese) они вызывают устойчивый интерес, что приводит к открытию все новых и новых
форм. Особенно это касается гипертермофилов, число известных видов которых уже больше сот-
ни (по определению это такие формы, оптимум роста которых составляет 80-100°С; в отличие
от умеренных термофилов они не размножаются при температуре ниже 60°С). Местами обитания
гипертермофилов служат гидротермы и геотермы, а также антропогенные термогидросистемы.

Браэрли (J. A. Brierley) выделил в 1966 г. из кислого горячего источника в Йеллоустоунском
национальном парке (США) первого представителя рода Sulfolobus. Независимо от него Брок
(Т. Brock) получил в 1970 г. ряд изолятов этого серуокисляющего термофильного микроорганизма,
оптимум роста которого около 87° С. Многочисленных представителей гипертермофильных сераза-
висимых (т. е. окисляющих или восстанавливающих элементную серу) ацидофилов, относящихся к
родам Desulf urococcus, Thermococcus, Thermofilum и Thermoproteus, выделил в 1981-1983 гг. Циллиг
(W. Zillig) из наземных и подводных термальных источников, грязевых вулканов и почв сольфатар
на Азорских о-вах и у побережья Исландии.

11.4.4.1. Основы хемолитотрофии

При дыхательной литотрофии энергия ассимилируется в форме Pmf и/или Smf.

Механизм хемолитотрофии. Биохимическая суть хемолитотрофии та же, что
и у хемоорганотрофии — в обоих случаях происходят дегидрогеназные реакции. Од-
нако между этими двумя вариантами хемотрофного метаболизма есть существенные
различия.

Во-первых, при хемолитотрофии свободная энергия ассимилируется только в
форме трансмембранного электрохимического потенциала, тогда как при хемоор-
ганотрофии она может ассимилироваться и в форме трансмембранного электрохи-
мического потенциала, и в форме фосфагена (см. раздел 10.1).

Во-вторых, неорганические субстраты окисляются только за пределами цито-
плазматического компартмента—в соответствии с механизмом экстрацитоплазма-
тического окисления «простых» субстратов (см. раздел 10.4.7), в то время как ор-
ганические субстраты могут окисляться и в цитоплазме, и в периплазме.

Энергетический смысл хемолитотрофии заключается в том, что окисление тер-
минального донора электронов и восстановление терминального акцептора элек-
тронов происходят в разных компартментах — периплазматическом и цитоплазма-
тическом. В результате этих реакций периплазматический компартмент обогащает-
ся протонами, а из цитоплазмы они удаляются, и таким путем создается Pmf (см.
рис. 78).
Необходимые условия для хемолитотрофии. Таковыми являются:

—	энергетическая эффективность экзергонической окислительной реакции (AG0'
должно быть < 0, и по абсолютной величине достаточным, чтобы поддерживать
сопряженные эндергонические процессы);

—	присутствие неорганического субстрата у поверхности СМ или ОМ в концен-
трации, необходимой для оптимальной активности дегидрогеназы (если субстрат
легко подвержен абиотическому окислению, то он должен регенерироваться парт-
нерами хемолитотрофа по экосистеме);

—	гидрофильность неорганического субстрата (если он липофилен, то требуется
транспортная система или иные механизмы, обеспечивающие его контакт с актив-
ным центром дегидрогеназы);

—	резистентность хемолитотрофа к токсическому шоку, который может вызвать
неорганический субстрат или продукты его окисления.

Для одних неорганических субстратов все перечисленные условия соблюдаются,
что приводит к широкому распространению отдельных хемолитотрофных бактерий
(например, тионовых) или архей (например, метаногенных). Другие неорганические
субстраты по тем или иным причинам малодоступны, что ограничивает распростра-
нение соответствующих групп хемолитотрофов. В некоторых случаях рост хемоли-
тотрофов за счет специфической окислительно-восстановительной реакции удается
продемонстрировать только в лабораторных условиях.

Поскольку акцептором электронов в хемолитотрофном процессе не обязательно
служит кислород, скрининг хемолитотрофов в последнее время все чаще прово-
дят в анаэробных нишах. Необходимой (но не достаточной) предпосылкой искомого
процесса служит высокое значение редокс-потенциала предполагаемого акцептора
электронов.

Типы хемолитотрофии. В соответствии с преобладающим типом окисляемого
неорганического субстрата можно назвать несколько групп хемолитотрофных про-
кариотов (табл. 12).

Классические типы хемолитотрофии — углеродная, водородная, азотная, серная,
железная и марганцевая. В настоящее время к ним добавились фосфорная и мы-
шьяковая литотрофия.

Способностью к фосфорной хемолитотрофии обладает штамм FiPS-З, близкий
родственник сульфатредукторов Desulfospira joergensenii и Desulfobacula toluolica.
Он был выделен из осадков венецианской лагуны и растет литоавтотрофно за счет
анаэробного окисления фосфита (фосфор в степени окисления +111) в фосфат (фос-
фор в степени окисления +V).

Акцептором электронов в данной реакции служит сульфат, который восстанав-
ливается до гидросульфида:

4НРОз“ + SOj“ + Н+ -> 4НРО^- + HS",

△Go/ = —91 кДж-моль-1 (для НРОз~).

Экологическое значение этого процесса невелико. Фосфит, который служит про-
межуточным продуктом при микробной деградации фосфоорганических соедине-
ний в отсутствии кислорода, из-за своей нестабильности не может накапливаться в
большом количестве.

К мышьяковой литотрофии способен штамм MLHE-1, который является близким
родственником пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halochloris. Он был выделен
Таблица 12. Типы и распространение хемолитотрофии

Донор электронов	Группа прокариотов	
	Бактерии	Археи
Углеродная хемолитотрофия		
Ci -субстрат:  СН4, СНз-X*-R; НСНО;  НСОО-; СО	Метано- и метил отрофные; формиатокисляющие; карбоксидотрофные	Метилотрофные метаногены
Водородная хемолитотрофия		
н2	Водородные; ацетогены, , карбоксидотрофные	Водородные;  гидрогенотрофные метаногены
Азотная хемолитотрофия		
Ni -субстрат:  NH3; NO^	Нитрифицирующие		*♦
Серная хемолитотрофия		
S- субстрат:  S°; S2-, -SO3-(S)n-SO^;  SQ2-; S2O2“	Бесцветные серные; тионовые	Серазависимые;  Thermoplasma acidophilum
Железная хемолитотрофия		
Fe2+	Железоокисляющие	Ferroplasma acid.iphilum
Марганцевая хемолитотрофия		
Мп2+	Марганецокисляющие	
Фосфорная хемолитотрофия		
Р(Ш)	Штамм FiPS-З (класс « Deltaproteo bacteria»')	—
Мышьяковая хемолитотрофия		
As(III)	Штамм MLHE-1 (класс « Gammaproteobacteria»)	—
Хемолитотрофия с использованием других металлов или металлоидов		
Си+	Acidithiobacillus ferrooxidans	—
Sb(III)	At. ferrooxidans	—
Sn2+	At. ferrooxidans	—
U(IV)	At. ferrooxidans	—

* — атом азота, кислорода или серы; ** —данный тип хемолитотрофии не обнаружен.

из придонного водного слоя озера Моно-Лейк (штат Калифорния, США) и растет
факультативно хемолитоавтотрофно благодаря превращению арсенита (мышьяк в
степени окисления +111) в арсенат (мышьяк в степени окисления +V). Акцептором
электронов в этой реакции служит нитрат, который восстанавливается до нитрита:

H2ASO3 + NO3 —► H2AsO4 + NO2 1
AG°' — —87 кДж-моль-1 (для H2ASO3 ).

Биологическое окисление As (+III) с помощью нитрата — не экзотика, поскольку
содержащие мышьяк минералы постоянно встречаются в золоторудных месторож-
дениях.

Достоверные данные о других типах хемолитотрофии в настоящее время отсут-
ствуют. В 1950-1960 гг. Н.Н.Ляликова по косвенным признакам установила, что
«Stibiobacter senarmontii» использует энергию окисления сурьмы Sb(+UI), входя-
щей в состав аниона антимонита Sb(OH)4 . Однако решающие доказательства суще-
ствования сурьмяной хемолитотрофии не получены. Есть отрывочные указания о
существовании медной и оловяной хемолитотрофии—возможно, что Acidithiobacil-
lus ferrooxidans ассимилирует энергию, освобождающуюся при аэробном окислении
катионов Си+ и Sn2+.

Исчерпывается ли этим список реально существующих, а также теоретически
возможных типов хемолитотрофии?

Установлено, что при дыхании прокариоты могут использовать разнообразные неорганические
акцепторы электронов (см. раздел 11.4.6), к которым, в частности, относятся:

—	металлы переходной валентности (например, Сг, Мо, Тс и V);

—	элементные металлоиды (например, S0 или Те0);

—	ионы металлоидов (например, Se2-);

—	оксианионы, содержащие металлы (например, V и U);

—	оксианионы, содержащие металлоиды (например, Se и Те).

Редокс-системы, имеющие сродство к этим веществам, катализируют обратимые процессы. По-
этому восстановленные формы всех перечисленных субстратов теоретически могут использоваться
и при хемолитотрофии.

В частности, описано бактериальное восстановленияе U(VI) до U(IV), в результате которо-
го образуется нерастворимый осадок уранита UO2- Не исключено, что At. ferrooxidans способна
ассимилировать энергию, освобождающуюся при аэробном или анаэробном окислении U(IV).

Описан также «экзотический» процесс бактериального восстановления аниона теллурита
ТеО2- в элементный теллур, что позволяет допустить возможность утилитарной окислительной
реакции. Хемолитотрофии, основанная на окислении таких металлов, как Cr(III), Tc(IV), Mo(V)
и V(III), или таких металлоидов, как Se°, Se2-, Se(IV) и Те0, существует только гипотетически.
Согласно последним данным, Geobacter metallireducens способен к ванадиевому дыханию, при ко-
тором электроны переносятся на пятивалентный ванадий с образованием аниона ванадила VO2+.
В принципе, возможно использование в биоэнергетических целях обратной окислительной реакции.
Наконец, известны бактерии, способные с помощью технеций (1У)-редуктазы восстанавливать ани-
он пертехната ТсО^" в диоксид технеция ТсОг- Теоретически допустима и обратная реакция, хотя
технеций, который по свойствам сходен с марганцем, в природе не обнаружен (он производится в
препаративном количестве на циклотроне).

Распространение хемолитотрофии. Способностью к хемолитотрофии обла-
дает ряд представителей обоих прокариотных доменов. В настоящее время это свой-
ство обнаружено в двух филах архей — AI Crenarchaeota и АП Euryarchaeota, а также
в шести филах бактерий — BI Aquificae, BVIII Nitrospirae, ВХП Proteobacteria, ВХШ
Firmicutes, BXIV Actinobacteria и BXV Planctomycetes.

Экологическое значение хемолитотрофии. Оценка экологической роли хе-
молитотрофов изменялась по мере того, как микробиология накапливала факты и
приходила к новым теоретическим обобщениям.

В конце XIX в. главным источником аммиака и сульфида в микробных
сообществах считали гниение органических остатков. Неудивительно, что сам
С.Н.Виноградский, а также его последователи рассматривали литотрофию как по-
следствие жизнедеятельности бактерий-деструкторов. Кроме того, литотрофов (за
исключением нитрификаторов) считали гетеротрофами, т. е. принимали их за вто-
ричных продуцентов.

Хотя Виноградский открыл хемолитотрофию в минеральных источниках Страс-
бурга, поступление неорганических доноров электронов из недр Земли в то время
рассматривалось как экзотическое и малозначимое явление.

В почвах, континентальных водоемах, эстуариях рек и на морском шельфе раз-
витие хемолитотрофов действительно вторично по отношению к развитию фотосин-
тетиков, которые являются главными первичными продуцентами, а также по отно-
шению к развитию хемоорганогетеротрофов, которые выполняют роль деструктора
органического вещества.
Время внесло существенные коррективы в первоначальные представления о глобальной эколо-
гии.

Начиная со второй половины XX в. ареной поисков новых форм микроорганизмов стали внешне
«безжизненные» наземные, а также подводные и подземные ниши, где условия часто являются экс-
тремальными. В результате было установлено, что хемосинтетики могут использовать абиогенные
доноры электронов, которые прорываются из земных недр в зоне контакта тектонических плит,
расположенных на суше или на морском дне (Азорские о-ва, Гренландия, п-ов Камчатка и т.д.).
В частности, выяснилось, что в Калифорнийском заливе существует гиперпопуляция бесцветной
серной бактерии Beggiatoa, окисляющей сульфид кислородом или с помощью аниона NO^".

11.4.4.2. Углеродная хемолитотрофии:
метанотрофия, метилотрофия и формиатотрофия

С помощью анаэробного деструктивного сообщества (см. раздел 11.2.2) не менее
50% углерода, накопленного живыми организмами, превращается в метан. Помимо
8-Ю8 т биогенного, ежегодно 5-108 т метана выбрасывается в атмосферу природными
газовыми скважинами. Минорными источниками абиогенного метана служат про-
мышленное производство (5-106 т) и вулканическая деятельность (2-105 т). Однако
метан не накапливается в атмосфере, поскольку непрерывно окисляется аэробными
метанотрофными бактериями в соответствии с общим уравнением:

СН4 + 2О2 -» СО2 + 2Н2О.

В итоге равновесное содержание метана в современной атмосфере составляет
1,4-104 объемных % (впрочем, этого достаточно, чтобы метан стал вторым по зна-
чению, после диоксида углерода, «парниковым» газом).

Помимо метана, при углеродной хемолитотрофии используются его производ-
ные, которые образуют разветвленную цепочку окисления Сi-субстратов:

СНз-X-R

1

СН4 СНзОН -> нсно - нсоон -> со2,

где X —атом азота, кислорода или серы.

Окисление метана в метанол невыгодно с энергетической и конструктивной точек
зрения, поскольку, как станет ясно ниже, при этом расходуется НАД(Ф)Н. Одна-
ко последующие превращения Сi-субстратов с избытком компенсируют понесенные
затраты. Полученные «низкопотенциальные» электроны передаются дыхательной
цепи или используются, вместе с НСНО и СО2, для автотрофных биосинтезов (см.
разделы 13.2.3 и 13.3.1).

Окисление метана. Первая реакция в цепи окислительных превращений мета-
на осуществляется с помощью метанмонооксигеназы (англ, methane monooxygenase,
ММО):

СН4 + О2 + 2НАД(Ф)Н СН3ОН + Н2О + 2НАДФ.

Метанмонооксигеназа является представителем суперсемейства монооксигеназ,
которые катализируют реакцию взаимодействия органических или неорганических
субстратов с молекулярным кислородом.

При помощи этих ферментов один из двух атомов кислорода включается в состав
молекулы субстрата с образованием гидрокси-группы (-ОН), кето-группы (=0) или
эпокси-группы (-О-). Второй атом кислорода восстанавливается низкопотенциаль-
ным донором электронов (чаще всего это НАДН) с образованием молекулы воды:

субстрат + О2 + DH2 —> субстрат-0 + Н2О + D.

Большинство монооксигеназ принадлежит к числу растворимых ферментов, со-
держащих в качестве простетических групп [Реп8п]-кластеры (см. раздел 10.4.1).
Как правило, они состоят из трех-четырех компонентов:

—	гетеродимерного белка (0/37)2 или (о/3)2, который содержит [БегЗгркластеры
и обладает гидроксилазной активностью;

—	мономерной оксидоредуктазы, у которой имеется N-концевой электронтранс-
дуцирующий ферредоксиновый домен и С-концевой редуктазный домен с сайтами
для связывания ФАД и НАДН;

—	сопрягающего эффекторного белка, который лишен простетических групп.

В некоторых случаях в состав растворимых монооксигеназ дополнительно входит
четвертый компонент типа белка Риске, содержащий [РегЭгркластер.

На основе генетических, структурных и энзиматических особенностей различа-
ют четыре группы растворимых «бинуклеарных» железо-монооксигеназ: метанмо-
нооксигеназы, алкенмонооксигеназы, фенолгидроксилазы и четырехкомпонентные
алкен/аренмонооксигеназы.

Метанмонооксигеназа существует в двух формах — растворимой (англ, solu-
ble monooxygenase, sMMO) и мембраносвязанной (англ, particulate monooxygenase,
рММО). Первая из них экспрессируется при медном голодании, вторая представля-
ет собой медьсодержащий белок.

Комплекс sMMO содержит три компонента (рис. 106) — гидроксилазу А, регуля-
торный белок В и НАДН-зависимую оксидоредуктазу С.

Рис. 106. Монооксигеназа (по: Sullivan et al., 1998).

а, /3 и "у — субъединицы белка А; [ЕегЗг] —железо-серный кластер.

Гидроксилаза А представляет собой коричневый белок, состоящий из двух
а-субъединиц (60 кДа; ген ттоХ), двух /3-субъединиц (45 кДа; ген mmoY) и двух
7-субъединиц (20 кДа; ген mmoZ). С помощью остатков His каждая большая субъ-
единица а лигандирует один [ЕегЗгркластер. Функция белка А заключается в акти-
вации метана и кислорода.

Регуляторный бесцветный белок В представляет собой димер идентичных субъ-
единиц (15 кДа; ген ттоВ\ не содержащий ни металлов, ни редокс-активных ко-
факторов. Он действует как эффектор окислительно-восстановительного процесса,
а также влияет на конформацию [ЕедЗгфкластера и редокс-потенциал гидроксилазы.

Оксидоредуктаза С представляет собой коричневый белок, который состоит из
одной субъединицы (45 кДа; ген ттоС) и содержит две простетические группы —
ФАД и [РедЗзркластер. Его функция заключается в том, чтобы восстанавливать
разные акцепторы электронов, связанные с активным центром белка А.

При наличии меди экспрессируется мембраносвязанная рММО, использующая
узкий спектр субстратов. Этот фермент состоит из субъединиц молекулярной мас-
сой 25, 27 и 47 кДа. Биосинтез двух первых из них (гены ртоА и ртоВ) индуцирует-
ся катионами Сн2+. Помимо медного центра, метанмонооксигеназа ММО содержит
неидентифицированный [Fen Sn ]-кластер.

Важно отметить, что метанмонооксигеназа рММО гомологична мембраносвя-
занной аммиакмонооксигеназе АМО (см. раздел 11.4.4.5), и эти ферменты характе-
ризуются взаимно перекрывающейся субстратной специфичностью.

Окисление метильной группы. Эндогенный метанол синтезируется из мета-
на с помощью метанмонооксигеназы. Наряду с ним может использоваться готовый
метанол. В обоих случаях он окисляется до формальдегида при помощи периплаз-
матической метанолдегидрогеназы.

Метанолдегидрогеназа (англ, methanol dehydrogenase, MDH) состоит из двух пар
субъединиц а и /3 молекулярной массой 66 и 67 кДа. В состав комплекса входит
атом кальция, обеспечивающий нековалентное связывание двух молекул пирролхи-
нолин-хинона (англ, pyrrolo quinoline quinone, PQQ) (рис. 107), или метоксатина.
Последний входит в качестве простетической группы во многие хинонпротеиновые
дегидрогеназы, оксидазы и декарбоксилазы и является третьим по значению редокс-
кофактором следом за НАД(Ф) и ФАД.

ноос

pQQ,„	PQQ^

Рис. 107. Метоксатин, или пиррол-хинолин-хинон (PQQ).

Акцептором электронов служит низкопотенциальный цитохром cl (от англ, low
potential). От него электроны передаются разветвленной дыхательной цепи с цито-
хромоксидазами аа^- и &(/-типа (см. раздел 11.4.6.1). В обоих случаях освобождаю-
щаяся энергия ассимилируется в форме Pmf.

Окисление формальдегида. Формальдегид является центральным звеном в
цепочке окисления Ci-соединений. Он используется в энергетическом метаболизме
в качестве субстрата, за счет окисления которого создается Pmf, а также служит
строительным блоком и источником восстановителя для углеродной автотрофии.
Формальдегид образуется с помощью метанолдегидрогеназы или в результате
дегидрогеназного расщепления метилированных субстратов, имеющих общую фор-
мулу СНз—X—R. В качестве примеров таких субстратов можно привести метиламин
СНз—NH2, диметиловый эфир СН3—О—СНз, диметилсульфоксид СН3—SO—СН3, а
также метансульфонат СН3—SO3H и галогенные замещенные метана (бромистый
метил СНзВг, хлористый метилен CH2CI2 и др.).

Из периплазматического компартмента формальдегид с помощью неизвестного
переносчика поступает в цитоплазму, где происходит его окисление. Метаболизм
формальдегида, способного неспецифически реагировать с белками и нуклеиновыми
кислотами, одновременно является и эффективным способом детоксикации этого
вещества.

Существуют несколько путей окисления формальдегида до СО2, с помощью
которых клетка получает восстановительные эквиваленты для дыхательной цепи.
Остановимся только на двух из них, которые хорошо изучены на примере метило-
трофа Methylobacterium extorquens.

В этих путях используются переносчики Сi-блока — тетрагидрометаноптерин и
тетрагидрофолат.

Тетрагидрометаноптерин (англ, tetrahydromethanopterin, Н4МРТ) участвует в
редокс-превращениях Сi-блока. Он связывает (см. рис. 116):

—	формильную группу СНО-, с образованием М-формил-ЩМРТ;

—	метинильную группу =СН-, с образованием М-метинил-ЩМРТ;

—	метиленовую группу -СН2-, с образованием Х-метилен-ЩМРТ;

—	метильную группу СН3-, с образованием Н-метил-ЩМРТ.

Тетрагидрофолат (англ, tetrahydropholate, Щфолат) также участвует в редокс-
превращениях Ci-блока. Он связывает (см. рис. 122):

—	формильную группу СНО-, с образование М-формил-Щфолата;

—	метинильную группу =СН-, с образованием Х-метинил-Щфолата;

—	метиленовую группу -СН2-, с образованием М-метилен-Щфолата;

—	метильную группу СН3-, с образованием Н-метил-Щфолата.

Эти переносчики могут передавать Сi-блок как в окислительном, так и в вос-
становительном направлении.

Позднее мы рассмотрим соответствующие реакции, когда будем говорить о
восстановительном синтезе метильной группы у метаногенных архей (см. раздел
11.4.5.4) и ацетогенных бактерий (см. раздел 11.4.5.5).

Тетрагидрометаноптериновый путь (рис. 108, А). Он начинается с того, что
формальдегид с помощью активирующего фермента связывается с Н4МРТ, в ре-
зультате чего образуется М-метилен-ЩМРТ. После этого с помощью НАД(Ф)-за-
висимой дегидрогеназы Г^-метилен-ЩМРТ окисляется в М-метинил-ЩМРТ. Затем
с помощью циклогидролазы М-метинил-ЩМРТ превращается И-формил-ЩМРТ,
который передает формильную группу неидентифицированному промежуточному
переносчику X, аналогу метанофурана метаногенных архей (см. раздел 11.4.4.5
и рис. 116). Наконец, с помощью формилтрансферазы/гидролазы образуется фор-
миат.

Тетрагидрофолатный путь (рис. 108, Б). Он начинается с того, что формальде-
гид, очень реакционноспособное соединение, спонтанно связывается с Щфолатом,
в результате чего образуется Н-метилен-Щфолат. После этого с помощью НАД(Ф)-
зависимой дегидрогеназы Н-метилен-Щфолат окисляется в Х-метинил-Щфолат.
Затем с помощью циклогидролазы М-метинил-Щфолат превращается N-формил-
Б

нсно

НСНО

/-> Н4 фолат

М-метилен-Н4МРТ

М-метилен-Н4фолат

НАД(Ф)Н
М-метинил-Н4МРТ

НАД(Ф)Н

N-метинил-Ндфолат

И-формил-Н4МРТ

1Ч-формил-Н4фолат

формил-Х

АДФ
АТФ

НСОО

НАД
НАДН

СО2

НСОО

СО2

1



Рис. 108. Тетрагидрометаноптериновый (А) и тетрагидрофолатный (Б) пути окисления формаль-
дегида.

1 — активирующий фермент; 2 — N-метилен-тетрагидрометаноптерин-дегидрогеназа; 3 — циклогидро-
лаза; 4 — формилтрансфераза/гидролаза; 5 — формиатдегидрогеназа; X — неидентифицированный пере-
носчик; 6 — N-метилен-тетрагидрофолат-дегидрогеназа; 7 — циклогидролаза; 8 — N-формил-тетрагидро-
фолатсинтаза; 9 — формиатдегидрогеназа.

Щ фолат. Наконец, с помощью АТФ-зависимой синтазы И-формил-Щфолат рас-
щепляется на формиат и Н4 фолат, что сопровождается фосфорилированием одной
молекулы АДФ.

Оба пути окисления формальдегида — тетрагидрометаноптериновый и тетрагид-
рофолатный— позволяют получить восстановитель в форме НАД(Ф)Н и приводят
к образованию формиата, который затем окисляется до СО2-

Окисление формиата. Окисляющая формиат растворимая «аэробная» НАД-
зависимая формиатдегидрогеназа (англ, formate dehydrogenase, Fdh) состоит из двух
копий а/fl-субъединиц молекулярной массой 5 и 10 кДа. В качестве простетических
групп используются [Ееп8п]-кластеры и ФМН.

Формиатдегидрогеназа катализирует следующую реакцию:

НСОО' -> СО2 + Н+ + 2е".

Полученные восстановительные эквиваленты передаются дыхательной цепи, а
также снабжают электронами метанмонооксигеназу и нитрогеназу (многие метило-
трофы способны к диазотрофии).

Метанотрофы. Метанотрофными (метанокисляющими) называются аэробные
бактерии, которые используют метан в качестве единственного источника энергии
и углерода, поскольку они обладают метанмонооксигеназой. Метанотрофия почти
всегда является облигатной. Хотя в некоторых случаях метанотрофы могут расти
на метаноле, они не растут на других Ci-субстратах (соединениях типа СН3—X—R,
формальдегиде НСНО и формиате НСООН), а также на субстратах, содержащих
связи С—С.

Метанотрофные бактерии используют метан по двойному назначению — в каче-
стве источника энергии и строительного материала.

При диссимиляции метана он полностью окисляется до СО2 и Н2О, а освобож-
дающаяся энергия ассимилируется в форме Pmf.

При ассимиляции метана он окисляется до НСНО и СО2, которые с помощью
автотрофных путей ассимиляции углерода включаются в состав клеточной биомас-
сы.

Обычно говорят о двух типах метанотрофов.

Метанотрофы типа-1 принадлежат к классу « Gammaproteobacteria» (рода Methy-
lobacter, Methylocaldium, Methylococcus, Methylomicrobium, Methylomonas и Methy-
losphaera). Они обладают ICM ламеллярного типа, синтезируют преимущественно
С1б-жирные кислоты и ассимилируют формальдегид через цикл Квайла (см. раздел
13.2.3).

Метанотрофы типа-П принадлежат к классу «Alphaproteobacteria» (рода Methy-
locystis и Methylosinus). Они имеют ICM везикулярного типа, синтезируют преиму-
щественно Сщ-жирные кислоты и ассимилируют формальдегид и СО2 через цикл
О’Коннора-Хэнсона (см. раздел 13.2.4).

Метанотрофные бактерии широко распространены в водоемах и почвах, а так-
же в филлосфере растений, где они составляют до 10% микробной популяции и
достигают численности 107 клеток-мл-1. Они играют важную роль в круговороте
углерода, окисляя метан, образованный в тундре, болотах, затапливаемых почвах,
рисовых полях и морских осадках.

Благодаря способности к диазотрофии они являются одними из важнейших пер-
вичных продуцентов на Земле, а в симбиотических ассоциациях с вестиментифера-
ми и моллюсками служат фундаментом трофической пирамиды «второй» биосферы
(см. I том учебника).

Метанмонооксигеназа обладает релаксированной субстратной специфичностью и
может внедрять атом кислорода в молекулы разнообразных углеводородов — алка-
нов, алкенов, ароматических соединений, галогенных замещенных метана, цикличе-
ских углеводородов и эфиров. Трансформация побочных субстратов метанмоноок-
сигеназы не имеет утилитарного значения для самих метанотрофов. Это типичный
пример кометаболизма (англ, cometabolism). С его помощью в природе и в производ-
ственных установках разрушаются ксенобиотики, в частности производные бензола
и трихлорэтилен.

Анаэробное окисление метана. Микроорганизмы, анаэробно окисляющие ме-
тан, принадлежат к числу некультивируемых. Поэтому механизм этого биологиче-
ского процесса (англ, anaerobic oxydation of methane, AOM) пока еще не ясен.

Возбудителем АОМ является микробный консорциум. Он состоит из архей, при-
надлежащих к сем. Methanosarcinales (фила АП Euryarchaeota), и сульфатредуци-
рующих бактерий Desulfococcus и Desulfosarcina (класс «Deltaproteobacteria»). Они
образуют конусообразные маты по краю Черноморского шельфа на глубине 35-
800 м.
Метан окисляется эквимолекулярно с восстановлением сульфата, причем в ре-
зультате защелачивания среды образуется карбонат кальция:

СН4 + SO^“ + Са2+ СаСОз + H2S + Н20.

Свободная энергия данной реакции составляет-25 кДж-моль-1 метана (немного,
но достаточно для медленного роста).

АОМ является важным звеном круговорота углерода в анаэробной среде, по-
скольку продукты этого процесса, карбонат и сульфид, могут использоваться пур-
пурными и тионовыми бактериями на восходящей ветви цикла.

Метилотрофы. «Метилотрофными» называются аэробные бактерии, которые
не могут использовать метан в качестве единственного источника энергии и угле-
рода, поскольку у них нет метанмонооксигеназы. Облигатные метилотрофы растут
только на метаноле, галогенных замещенных метана и соединениях типа СН3—X—R.
Факультативные метилотрофы могут использовать формальдегид или формиат, а
также субстраты, содержащие связи С—С.

При росте на Сi-соединениях (кроме формиата) метилотрофные бактерии ас-
симилируют формальдегид через цикл Квайла (см. раздел 13.2.3) или через цикл
О’Коннора-Хэнсона (см. раздел 13.2.4). Иногда они могут использовать сразу оба
цикла, а в случае Meth,у lophilus methylotrophus — еще и цикл Кельвина-Бенсона-
Бэссема (см. раздел 13.2.5).

Метилотрофные бактерии принадлежат к двум филам — ВХП Proteobacteria и
BXIII Firmicutes. В частности, к ним относятся Acetobacter methanolicus, Methylobac-
terium extorquens, Paracoccus denitrificans, Xanthobacter autotrophicus (класс «А1-
phaproteobacteria»), Methylophilus methylotrophus (класс «Betaproteobacteria»), Amy-
colatopsis methanolica, Methylobacillus flagellatus и Mycobacterium gastri (фила BXIII
Firmicutes).

Благодаря ферментативному аппарату, позволяющему использовать «неоргани-
ческую» метильную группу в составе разнообразных природных субстратов и ксено-
биотиков, метилотрофы играют важную роль в глобальном круговороте углерода.
Как и для метанотрофов, для них характерна способность к диазотрофии. В биотех-
нологии они обеспечивают биоремедиацию и служат ценным источником кормовой
биомассы (препарат «прутин»).

Формиатотрофы. В отличие от метанотрофов и метилотрофов, использующих
формиат как одно из звеньев в цепочке окисления метана и его производных, суще-
ствуют облигатные формиатотрофы, для которых этот субстрат служит единствен-
ным источником энергии и углерода, а также факультативные формиатотрофы,
растущие на субстратах с химическими связями С—С.

В природных экосистемах формиат накапливается в основном в качестве:

—	промежуточного или конечного продукта брожений (с помощью пиру-
ват:формиат-лиазы; см. раздел 11.3.3);

—	промежуточного продукта окисления С i-соединений метанотрофами и мети-
лотрофами (с помощью систем окисления формальдегида; см. выше);

—	первичного продукта ассимиляции СО2 автотрофными ацетогенными бакте-
риями (с помощью «синтезирующей» формиатдегидрогеназы; см. раздел 11.4.5.5).

Хемолитотрофное окисление формиата происходит в аэробных и анаэробных
условиях и катализируется растворимыми или мембраносвязанными формиатдегид-
рогеназами.
Растворимые НАД(Ф)-зависимые формиатдегидрогеназы. Они передают элек-
троны аэробной или анаэробной дыхательной цепи. Как уже отмечалось, простети-
ческими группами этих ферментов являются [Ееп8п]-кластеры и ФМН.

В качестве соответствующих примеров можно назвать «аэробную» формиатде-
гидрогеназу метанотрофов или метилотрофов, а также «анаэробную» формиатде-
гидрогеназу Desulfitobacterium sp. (фила ВХШ Firmicutes'), которая передает элек-
троны через дыхательную цепь терминальному акцептору — арсенату (см. раздел
11.4.6.2).

Мембраносвязанные формиатдегидрогеназы, не зависящие от НАД(Ф). Они
имеются у факультативных и облигатных анаэробов и окисляют формиат, который
образуется при катаболизме пирувата. Электроны поступают непосредственно в ды-
хательную цепь. В данном случае фермент содержит не только [Ге434]-кластеры, но
и геминовое железо, а также молибденовый кофактор, относящийся к группе «бакто-
птеринов» — молибдоптерин-гуанидин-динуклеотид (англ, molybdopterin guanidine
dinucleotide, MGD) (рис. 109).

Рис. 109. Молибдоптерин-гуанидин-динуклеотид (MGD) и
молибдоптерин-цитидин-динуклеотид (MCD).

У факультативно анаэробной энтеробактерии Е. coli образуются две сходные по
строению, но различающиеся по характеру своей экспрессии молибдоптерин-зави-
симые формиатдегидрогеназы. Это аэробная формиатдегидрогеназа Fdh-О и анаэ-
робная формиатдегидрогеназа Fdh-N.

Анаэробная формиатдегидрогеназа Fdh-N (от англ, nitrate), или FdnGHI явля-
ется компонентом нитратредуктазной системы (см. раздел 11.4.6.2). Ее молекула
имеет грибовидную форму, а ее размер составляет 12,5x15 А. С периферической
а-субъединицей (100 кДа; ген fdnG) связан один [Fe4S4]-Kластер и две молекулы
кофактора MGD, которые с помощью четырех сй-тиолатных групп лигандируют
атом молибдена в активном центре. Остаток редкой аминокислоты селеноцистеина
SeCys дополнительно лигандирует атом молибдена, который получает электроны
непосредственно от формиата. Амфипатическая /3-субъединица (35 кДа; ген fdnH')
состоит из одного трансмембранного домена. Она содержит четыре [Ге434]-класте-
ра, которые получают элёктроны от [Ре484]-кластера на а-субъединице и передают
их /3-субъединице. Интегральная 7-субъединица (25 кДа; ген fdnl) представляет со-
бой дигемовый цитохром 5556. Она состоит из четырех трансмембранных спиралей
и на своей цитоплазматической стороне образует сайт для связывания менахинона
MQ. Гем Ьр (от англ, periplasmic), координированный остатками His в положениях
57/155, находится на периплазматической стороне мембраны и получает электроны
от /7-субъединицы. Гем Ьс (от англ, cytoplasmic) координирован остатками His в по-
ложениях 18/169, расположен на цитоплазматической стороне и передает электроны
менахинону.

В то время как растворимые формиатдегидрогеназы действуют в направлении
окисления формиата, мембраносвязанные формиатдегидрогеназы обладают обра-
тимым действием. В частности, с их помощью автотрофные ацетогенные бактерии
синтезируют формиат из СО2 и Н2 (см. раздел 11.4.5.5).

Облигатные формиатотрофы ассимилируют экзогенный СО2 или эндогенный
СО2, полученный с помощью формиатдегидрогеназы, в цикле Кельвина-Бенсона-
Бэссема (см. раздел 13.2.5).

Благодаря низкой величине редокс-потенциала пары НСОО~/СО2 (-420 мВ)
бактерии имеют возможность с высокой эффективностью ассимилировать свобод-
ную энергию реакции окисления формиата. Хемолитотрофное окисление формиа-
та, сопряженное с углеродной автотрофией, является важным звеном в круговороте
углерода. Кроме того, окисление формиата, в особенности в анаэробных условиях,
предотвращает закисление среды из-за накопления этого широко распространенного
продукта брожения.

11.4.4.3.	Углеродная хемолитотрофия — карбоксидотрофия

Главными источниками монооксида углерода, или угарного газа (СО) являются
техногенные процессы и тропосферная реакция между метаном и гидроксильным
радикалом СН4 + ОН- —» СО + 5Н (1,5-109 т/год). В гораздо меньших количествах,
примерно 3-108 т/год, он выделяется: а) подводными гидротермами; б) в качестве
побочного продукта при катаболизме хлорофилла у океанического фитопланктона
и высших растений; в) при природных пожарах.

Равновесное содержание СО в атмосферном воздухе не превышает 10-7 объем-
ных %, поскольку он окисляется абиотическим путем в тропосферной реакции СО
-Ь ОН- —> СО2 + Н, а также в результате жизнедеятельности СО-окисляющих бак-
терий.

СО-окисляющие бактерии, или карбоксидобактерии принадлежат к филам ВХН
Proteobacteria {Bradyrhizobium japonicum, Carbophilus carboxidus, Oligotropha car-
boxidovorans, Rhizobium sp., Zavarzinia compransoris), BXIH Firmicutes {Bacillus
schlegelii) и BXIV Actinobacteria {Arthrobacter sp., Streptomyces sp.). Некоторые из
них хемолитоавтотрофы, другие способны к миксотрофии или хемогетеротрофии.
Хемолитоавтотрофные бактерии, использующие СО в качестве источника энер-
гии, называются «карбоксидотрофными». Большинство из них одновременно про-
являет способность к водородной хемолитотрофии (см. ниже). Примечательно, что
при карбоксидотрофии монооксид углерода служит не только энергетическим, но и
конструктивным субстратом, поскольку при его окислении С О-дегидрогеназой об-
разуется эндогенный диоксид углерода:

СО + [О:]	2е" + СО2.

Ключевая реакция энергетического метаболизма карбоксидотрофов — это окис-
ление СО, которое катализируется «энергетической» СО-дегидрогеназой.

«Энергетическая» С О-дегидрогеназа. Ферменты, объединенные под общим
названием «СО-дегидрогеназы» (англ. СО-dehydrogenase, COD), катализируют три
реакции — они могут синтезировать ацетил-СоА, расщеплять ацетил-СоА и окис-
лять СО. В результате этого они могут участвовать и в конструктивном, и в энер-
гетическом метаболизме.

«Конструктивные» СО-дегидрогеназы существуют у архей и бактерий. Эти железоникелевые
ферменты, или Fe/Ni-COD обладают обратимым действием. Гидрогенотрофные метаногены (см.
раздел 11.4.5.4) с их помощью синтезируют ацетил-СоА из метильной группы, карбонильной груп-
пы и СоА:

[СНз-] + [СО] + CoASH СНз-CO-SCoA.

Ацетокластические метаногены с их помощью расщепляют ацетил-СоА на метильную группу,
карбонильную группу и СоА:

СНз-CO~SCoA	[СНз-] + [СО] + CoASH.

Конструктивные Ni/Fe-COD бактерий также обладают обратимым действием. У гомоацетоген-
ных бактерий они синтезируют ацетил-СоА из метильной группы, карбонильной группы и СоА (см.
раздел 11.4.5.5). У ацетотрофных сульфатредукторов они расщепляют ацетил-СоА на метильную
группу, карбонильную группу и СоА.

«Энергетические» COD имеются только у бактерий и обладают однонаправлен-
ным действием. Они участвуют в дыхании и катализируют прямую реакцию окис-
ления монооксида углерода.

У анаэробных факультативных хемолитотрофов (например, пурпурной бактерии
Rhodocyclus gelatinosus) энергетическая COD содержит два кофактора — никель и
негеминовое железо. Этот мембраносвязанный фермент работает в комплексе с во-
дородобразующей гидрогеназой (см. раздел 11.4.4.4):

СО + Н2О -> СО2 + Н2.

В результате экзергонической реакции (ДС0' = —20 кДж-моль-1) энергия асси-
милируется в форме Pmf.

У аэробных карбоксидотрофов энергетическая COD содержит три кофактора —
молибден, негеминовое железо и флавин. Этот индуцибельный мембраносвязанный
фермент катализирует реакцию:

СО + Н2О + А —> СО2 + АН2,

где А — акцептор электронов.

У аэробной карбоксидобактерий Oligotropha carboxydovorans в состав энергетиче-
ской COD входит большая L (англ, large; 86 кДа), средняя М (англ, medium; 34 кДа)
и малая S (англ, small; 17 кДа) субъединицы, каждая из которых представлена в
двух копиях. Структурные гены этого фермента находятся на плазмиде.

В качестве простетической группы, непосредственно участвующей в окисле-
нии монооксида углерода, используется бактоптерин — молибдоптерин-цитидин-
динуклеотид (англ, molybdopterin cytidine dinucleotide, MCD; рис. 109). Помимо
MCD, в состав энергетической COD входят два [БегЗгркластера и две молекулы
ФАД.

Другим примером бактоптерина является молибдоптерин-гуанидин-динуклеотид
MGD (см. раздел 11.4.4.2 и рис. 109), который выполняет роль кофактора формиат-
дегидрогеназы, N-формил-МЕ-дегидрогеназы и диметил сульфоксид-редуктазы. Мо-
либдоптерины с более простым строением встречаются у Еисагуа, в частности в роли
кофактора сульфитоксидазы и ксантиноксидазы.

От СО электроны передаются акцептору — убихинону, а от него цитохром Ь/с-
комплексу. Роль терминальной оксидазы выполняет цитохром 6563. Благодаря ис-
ключительно высокому сродству к кислороду он постоянно находится в окисленном
состоянии и не связывается с монооксидом углерода, чем и объясняется резистент-
ность дыхательной цепи карбоксидобактерий к этому крайне ядовитому веществу
(угарному газу).

В некоторых случаях у аэробных карбоксидотрофов терминальным акцептором
электронов служит анион NO3 , т. е. они осуществляют нитратзависимое дыхание
(см. раздел 11.4.6.2).

Карбоксидотрофные бактерии сочетают хемолитотрофию с автотрофией по уг-
лероду. В качестве одноуглеродного блока они используют СО2, который ассимили-
руется в цикле Кельвина-Бенсона-Бэссема (см. раздел 13.2.5).

Значение карбоксидотрофных бактерий и других прокариотов, обладающих
COD, состоит в том, что они участвуют в глобальном цикле углерода. В частно-
сти, они контролируют содержание монооксида углерода в атмосфере.

Нельзя не упомянуть о том, что способность окислять монооксид углерода про-
являют и метанотрофные бактерии. Однако у них эта реакция не связана с асси-
миляцией энергии. Просто их метанмонооксигеназа обладает релаксированной суб-
стратной специфичностью (см. раздел 11.4.4.2).

11.4.4.4.	Водородная хемолитотрофии

Молекулярный водород — повсеместно распространенный субстрат, однако в ат-
мосфере, водоемах и почвах он присутствует в следовых количествах (1-50 мПа).
Приведенные цифры отражают равновесную концентрацию водорода, а не его ва-
ловое образование и потребление, которое ежегодно составляет 2-108 т. Глобальный
пул водорода все время пополняется благодаря геохимическим и антропогенным
процессам, а также в результате жизнедеятельности фототрофов и хемогетеротро-
фов-ферментаторов .

Водород представляет собой наименее специфичный из всех субстратов хемоли-
тотрофии. Использование водорода является самым распространенным типом хемо-
литотрофии, причем большинство водородокисляющих литотрофов способно адап-
тивно переходить на фототрофию или хемогетеротрофию. Кроме того, водород мо-
гут окислять и многие облигатно хемогетеротрофные микроорганизмы, однако это
не связано с ассимиляцией освобождающейся энергии.
Истинно водородные хемолитотрофы крайне редки. Примерами служат бакте-
рии Calderobacterium hydrogenophilum и Hydrogenobacter thermophilus, а также археот
Acidianus inf emus.

В филогенетическом и таксономическом планах водородные литотрофы исклю-
чительно гетерогенны: к ним относится ряд представителей бактериальных фи л BI
Aquificae, ВХП Proteobacteria и ВХШ Firmicutes, а также археотных фил AI Сгепаг-
chaeota и АП Euryarchaeota.

Окисление водорода может происходить как в аэробных, так и в анаэробных
условиях.

Термином «водородные» обозначают бактерий и архей, растущих благодаря
энергии окисления молекулярного водорода молекулярным кислородом (реакция
гремучего газа):

Н2 + 1/2О2 -* Н2О.

Гораздо реже водородные бактерии и археи используют для окисления водорода
другие акцепторы электронов, например сульфат:

4Н2 + SO^“ - 4Н2О + S2".

К числу аэробных водородных бактерий принадлежат, в частности, Aquifex ру-
rophilus, Calderobacterium hydrogenophilum, Hydrogenobacter thermophilus (фила BI
Aquificae)', Acidithiobacillus ferrooxidans, Alcaligenes eutrophus, Paracoccus denitrifi-
cans, Ralstonia eutropha (фила BXII Proteobacteria)', Bacillus tusciae (фила BXIII
Firmicutes) и Nocardia autotrophica (фила BXIV Actinobacteria). Характерным
представителем анаэробных водородных бактерий является Desulfobacterium ther-
molithotrophicum (фила ВХП Proteobacteria).

Примером аэробных водородных архей служит Metallosphaera sedula (фила AI
Crenarchaeota), а анаэробных — Acidianus infernus (фила AI Crenarchaeota).

Водородные прокариоты часто сочетают хемолитотрофию с углеродной авто-
трофией или миксотрофией (см. раздел 13.1). В качестве универсального одноугле-
родного блока ими используется СО2, который ассимилируется в цикле Кельвина-
Бенсона-Бэссема (примером служат A. ferroxidans, A. eutrophus, В. tusciae, D. ther-
molithotrophicum, N. autotrophica, P. denitrificans и R. eutropha) или в цикле Ивенса-
Бьюкенена-Эрнона (примером служат A. pyrophilus, С. hydrogenophilum и Н. ther-
mophilus). Механизм автотрофной ассимиляции углерода у водородных архей еще
не выяснен.

Способностью к водородной хемолитотрофии обладают и многие карбоксидо-
трофные бактерии, а также гомоацетогенные бактерии и гидрогенотрофные мета-
ногенные археи (см. разделы 11.4.4.3, 11.4.5.5 и 11.4.5.4). Однако по отношению к
ним не используют термин «водородные».

В свою очередь, некоторые водородные бактерии (например, N. autotrophica) спо-
собны к углеродной хемолитотрофии и могут окислять «неорганическую» метиль-
ную группу или формиат. Таким образом, у водородных хемолитотрофов и углерод-
ных хемолитотрофов проявляется встречная субстратная специфичность. Позднее
мы увидим, что это явление, хотя и в более слабой степени, наблюдается у сер-
ных, железных и марганцевых хемолитотрофов. Максимальную специфичность в
отношении «своего» энергоносителя проявляют азотные хемолитотрофы.
Водородные хемолитоавтотрофы выполняют важную роль первичных продуцен-
тов в наземных и подводных гидротермах — экстремальных нишах с повышенной
геохимической активностью. Велика их роль и в анаэробном деструктивном сообще-
стве (см. раздел 11.2.2). Следует добавить, что водородные хемолитотрофы участву-
ют в устойчивых трофических ассоциациях в качестве компонентов цианобактери-
альных матов, а также в качестве симбионтов инфузорий и погонофоров. Наконец,
штаммы A. eutrophus являются перспективными продуцентами кормовой биомас-
сы и уже используются в промышленности для получения биогенных пластмасс,
отходы которых при попадании в окружающую среду быстро подвергаются биоде-
струкции (см. I том учебника).

Гидрогеназа. Чтобы понять метаболический смысл и механизм биологического
окисления водорода, остановимся на гидрогеназах (Н2азах). Эти ферменты, или
дегидрогеназы водорода катализируют реакцию:

Н2 2Н+ + 2е“.

Гидрогеназы представляют собой легко травмируемые кислородом коричневые
белки, имеющие широкий максимум поглощения в сине-зеленой части видимого
спектра (350-400 нм). Они состоят из нескольких субъединиц и обычно содержат
металлокластеры двух типов. Стандартный «транспортный» [Fe2S2]-, [FeaS^- или
[Ее484]-кластер переносит электроны между редокс-партнером гидрогеназы и ее ак-
тивным центром. Индивидуальный «каталитический» [Ееп8п]-кластер входит в со-
став активного центра. Он имеет редокс-потенциал -420 мВ и обратимо активирует
водород. В активный центр железоникелевых гидрогеназ, или FeNi-гидрогеназ кро-
ме железа входит никель.

Согласно результатам молекулярного секвенирования, стандартные «транспорт-
ные» субъединицы взаимно гомологичны и входят в общее суперсемейство с раство-
римыми ферредоксинами. В то же время индивидуальные «каталитические» субъ-
единицы (число которых составляет две-шесть и даже больше) взаимно гетероло-
гичны, поэтому соответствующие гидрогеназы относятся к разным группам. Третью
обособленную группу составляют «неметаллические» гидрогеназы без простетиче-
ских групп, имеющиеся у некоторых метаногенов.

В функциональном отношении гидрогеназы подразделяются на «конструктив-
ные» и «энергетические».

Конструктивные гидрогеназы — это цитозольные ферменты. Хотя в бесклеточных препаратах
они обладают обратимым действием, in situ они обеспечивают только поглощение или только вы-
деление молекулярного водорода. Физиологическая функция конструктивных гидрогеназ заклю-
чается в том, чтобы получать восстановительные эквиваленты из молекулярного водорода или
расходовать избыточные восстановительные эквиваленты на его образование.

Энергетические гидрогеназы — это мембраносвязанные комплексы, которые катализируют
только прямую реакцию и создают Pmf. Гидрогеназы этого типа служат примером электроге-
нератора, использующего механизм экстрацитоплазматического окисления «простых» субстратов.

Гидрогеназные реакции с противоположным направлением вектора равновесия реакции про-
странственно разобщены. Окисление водорода происходит в периплазматическом компартменте
или на уровне ICM, а образование водорода —в цитозоле.

Важное различие мембранных и периплазматических гидрогеназ от цитозольных заключается
в том, что ферменты обоих типов синтезируются в виде предшественника с сигнальным пептидом
из 30-70 аминокислотных остатков, причем характерный мотив R-R-X-F-X-K на N-конце малой
каталитической субъединицы распознается экспортными Tat-системами (см. I том учебника).

Реакции с участием молекулярного водорода входят во многие метаболические пути, причем
некоторые прокариоты имеют сразу несколько гидрогеназ, выполняющих разные функции.
Бактерии-ферментаторы (например, Clostridium sp.) образуют молекулярный водород, избав-
ляясь таким путем от лишних восстановительных эквивалентов:

D(2e") + 2Н+ —» D + Н2,

где D — донор электронов.

Прокариоты с дыхательным типом метаболизма, а также фототрофные бактерии могут ис-
пользовать водород в качестве донора электронов для электрон-транспортной цепи:

Н2 2Н+/2е-,

Q + 2Н+/2е“ QH2,

где Q —хинон, взаимодействующий с цитохром bci (6б/^-комплексом.

Диазотрофы при помощи гидрогеназ утилизируют водород, который образуется в результате
восстановления протонов при помощи нитрогеназы:

N2 + 8[Н+/е~] + 16MgAT<P + 2Н+ -> 2NH+ + Н2 + 161У^АДФ + 16Ф,
Н2 -> 2Н++ 2е“.

Наиболее распространены железоникелевые гидрогеназы. Лучше всего они изу-
чены у представителей филы ВХП Proteobacteria. Это гетеродимеры субъединиц а/3,
имеющих молекулярную массу 60 и 30 кДа. Большая каталитическая субъединица
связывает биметаллический NiFe-кластер. Малая субъединица связывает до трех
[Ееп8п]-кластеров, переносящих электроны. Ген большой субъединицы обозначает-
ся как hupL (от англ, hydrogen uptake) или синонимами — hoxG (от англ, hydrogen
oxidation), hydL (от англ, hydrogenase) и т. д. Ген малой субъединицы обозначается
как hupS или синонимами — hoxK, hydS и т. д. Помимо этого существуют несколько
вспомогательных hup-, или /гот-генов, продукты которых участвуют в процессинге
«структурного» гетеродимера а(3, а также hyp-гены (от англ, hydrogen pleiotropic),
обеспечивающие включение СО, CN- и Ni2+/Fe2+ в активный центр. Далее, су-
ществуют регуляторные гены, контролирующие экспрессию структурных. Для био-
генеза железоникелевых гидрогеназ необходимы дополнительные гены, отвечающие
за импорт катионов Ni2+, в частности hoxN. Все перечисленные гены сгруппированы
на хромосоме или мегаплазмиде.

Железоникелевые гидрогеназы имеются у многих бактерий и архей; у эукари-
отов они отсутствуют. Рассмотрим несколько типов железоникелевых гидрогеназ,
различающихся по локализации и физиологической функции.

Мембраносвязанные uptake-гидрогеназы (англ, uptake — поглощение; окисляющие
водород). Активные центры этих гидрогеназ ориентированы в периплазматическое
пространство. Электроны передаются через цитохром b-типа, который одновременно
служит докинг-площадкой для фермента, хинонному пулу, а от него — терминально-
му акцептору (О2, NO^, SO^- или фумарату). Особое место среди гидрогеназ этой
группы занимает VhoGA-гидрогеназа метаногенных архей, передающая электроны
гетеродисульфид-редуктазе при участии цитохрома b и метанофеназина (см. раздел
11.4.5.4).

Мембраносвязанные uptake-гидрогеназы цианобактерий. Они способствуют ути-
лизации водорода, образуемого нитрогеназой.

Растворимые F420-восстанавливающие гидрогеназы. Они имеются у гидроге-
нотрофных метаногенных архей, которые не обладают цитохромами и растут на
СО2/Н2 или формиате. Эти ферменты окисляют водород и передают электроны 5-
деазафлавину, или коэнзиму F420, который используется при восстановлении СО2
до метана (см. раздел 11.4.5.4). Они кодируются опероном frhADGB и состоят из
двух каталитических субъединиц — большой FrhA и малой FrhG. Вспомогательная
субъединица FrhB связывает фактор F4120. Продуктом гена frhD служит протеаза,
обеспечивающая посттрансляционный процессинг субъединиц AGB.

Растворимые тетрамерные бифункциональные гидрогеназы гипертермофиль-
ных архей. Их примером служит «сульфогидрогеназа» гипертермофильного архео-
та Pyrococcus furiosus. Она может восстанавливать S0 за счет окисления Нг или ис-
пользовать Н+ в качестве акцептора электронов для поддержания редокс-баланса
при сбраживании органических субстратов. Этот тетрамерный фермент состоит из
каталитических субъединиц ад и вспомогательных субъединиц Ду.

Растворимые НАД-сопряженные обратимые гидрогеназы. Это гетеротетраме-
ры, состоящие из двух димерных субкомплексов. Первый субкомплекс, или «диафо-
раза» (гены hoxF и hoxU) взаимодействует с редокс-партнерами и содержит сайты
для связывания НАД, ФМН и [Ееп8п]-кластеров. Второй субкомплекс (гены hoxH и
hoxY) — это собственно железоникелевая гидрогеназа. Такие конститутивные гид-
рогеназы имеются у диазотрофных и недиазотрофных штаммов цианобактерий.
Их физиологическая роль заключается в удалении лишних «низкопотенциальных»
электронов или получении восстановителя для энергетического и конструктивного
метаболизма.

Мембраносвязанные водородобразующие гидрогеназы. Представители этой груп-
пы железоникелевых гидрогеназ сопрягают окисление ацетата, монооксида углерода
или формиата с восстановлением 2Н+ до Нг. Физиологический смысл этой реакции
заключается в ассимиляции энергии в форме Pmf. Характерным примером слу-
жит гидрогеназный компонент формиат:Нг-лиазы, которая экспрессируется Е. coli
в условиях строгого анаэробиоза и катализирует реакцию:

СОО" + 2Н+ - СО2 + Н2.

Каталитические субъединицы этой гидрогеназы (HycGE) — это периферические
белки. Остальные компоненты формиат:Н2-лиазного комплекса выполняют роль ин-
тегральной докинг-площадки, а также переносят электроны от формиатдегидроге-
назы к гидрогеназе.

В отличие от гетеродимерных железоникелевых гидрогеназ, Fe-гидрогеназы
встречаются только у некоторых представителей Bacteria и Еисагуа, но не обна-
ружены у архей. Это мономеры (реже олигомеры), молекулярная масса которых
находится в пределах 50-120 кДа. Они содержат единственную субъединицу с кон-
сервативным доменом из 350 аминокислотных остатков, связывающим [ЕедЗ^-кла-
стер. Характерная функция гидрогеназ этого типа — участие, совместно с ферредок-
сином, в фосфорокластической реакции расщепления пирувата у некоторых анаэ-
робов, например С. pasteurianum (см. раздел 11.3.3).

11.4.4.5.	Азотная хемолитотрофия

Азотная хемолитотрофия, при которой донором электронов служит аммиак или
нитрит, встречается только у бактерий (см. табл. 12).

Глобальными источниками аммиака служат:

-	дезаминирование аминокислот при распаде' белков (катаболическая аммони-
фикация);
—	восстановление нитрата с целью последующего аминирования кетокислот (ас-
симиляционная нитратредукция);

—	диазотрофия.

Значительный вклад вносят также геохимическая активность и антропогенные
процессы.

Нитрит в заметных количествах в природной среде не накапливается и образует-
ся в качестве побочного продукта жизнедеятельности «нитрозобактерий» (которые
катализируют превращение NH3 —> NO2 )• В синтрофной симбиотической ассоциа-
ции с ними находятся нитритокисляющие «нитробактерии» (которые катализируют
превращение NO2 —> NO3 ).

Главным субстратом азотной хемолитотрофии, или «автотрофной» нитрифика-
ции является аммиак, который окисляется до нитрата. При низком парциальном
давлении кислорода в качестве побочных продуктов образуются газообразные окси-
ды азота NO и NO2.

Автотрофная нитрификация состоит из двух фаз: (1) NH3 —* NO2 , (2) NO2 —>
NO3 . За них отвечают две разные группы бактерий — окисляющие аммиак нитрозо-
бактерии (англ, ammonia oxidizing bacteria, АОВ) и окисляющие нитрит нитробак-
терии (англ, nitrite oxidizing bacteria, NOB).

Первая фаза нитрификации. Окисление аммиака происходит в почвах и во-
доемах в аэробных условиях или на границе раздела оксичной и аноксичной зон.
Нитрозобактерии, или возбудители первой фазы нитрификации принадлежат к
классу «Betaproteobacteria». Они облигатные аэробы, хотя и могут адаптировать-
ся к недостатку кислорода.

Аммиак превращается в нитрит в результате двух последовательных реакций.
Сначала из него образуется гидрокси л амин:

NH3 + О2 + DH2 -» NH2OH + Н2О + D,

где D — донор электронов.

Реакцию катализирует мембраносвязанная мультисубъединичная медьсодержа-
щая аммиакмонооксигеназа (англ, ammonia monooxygenase, АМО). Донором двух
электронов в этой эндергонической реакции служит цитохром bei-комплекс.

Затем гидроксил амин превращается в нитрит в экзергонической реакции, кото-
рую катализирует периплазматическая гидроксиламин-дегидрогеназа, или гидрок-
силамин-оксидоредуктаза (англ, hydroxylamine oxidoreductase, НАО):

NH2OH + Н2О -> HNO2 + 4Н+/4е-.

НАО представляет собой гетеротример (оД)з молекулярной массой 200 кДа и в
качестве простетических групп содержит гемы с-типа.

При окислении гидроксиламина в периплазматическое пространство высвобож-
даются четыре протона, что создает Pmf в соответствии с механизмом экстраци-
топлазматического окисления «простых» субстратов. От гидроксиламин-оксидоре-
дуктазы четыре электрона поступают на цитохром be i-комплекс (при посредстве
растворимого цитохрома с554 и периферического цитохрома с552). От него два элек-
трона передаются аммиакмонооксигеназе, а два электрона — цитохромоксидазе ааз,
в результате чего дополнительно создается Pmf (см. раздел 11.4.6.1):

2Н+/2е- + 1/20з Н2О.
Суммируя все три реакции первой фазы нитрификации, получаем:

NH3 4- 3/2О2 -> HNO2 + Н2О.

Помимо собственно нитрификаторов, аэробное окисление аммиака могут вызы-
вать метанотрофные бактерии, что связано с широкой субстратной специфичностью
мембраносвязанной метанмонооксигеназы рММО.

Некоторые представители родов Alcaligenes, Arthrobacter, Pseudomonas и др., а
также ряд плесневых грибов (Aspergillus sp., Penicillium sp. и др.) обнаруживают
способность к «гетеротрофной» нитрификации. Однако этот процесс не обеспечи-
вает клетку энергией, и его физиологическое значение до сих пор неясно.

Вторая фаза нитрификации. Нитробактерии, или возбудители второй фа-
зы нитрификации полифилетичны и принадлежат к классам «Alphaproteobacteria»
(Nitrobacter sp.), « Gammaproteobacteria» (Nitrococcus sp.) и « Deltaproteobacteria» (Ni-
trospina sp.), а также к филе ВVIII Nitrospirae. Данную реакцию катализирует мем-
браносвязанная нитритдегидрогеназа, или «нитрит-оксидоредуктаза» (англ nitrite
oxidoreductase, NOR):

NO2 + Н2О NO3 + 2Н+/2е-.

NOR содержит в качестве простетических групп [Реп8п]-кластеры и молибдопте-
рин (см. рис. 109). Она передает электроны цитохром bci-комплексу, а тот цитохро-
моксидазе аа3, в результате чего создается Pmf.

В отличие от первой фазы вторая фаза нитрификации — это обратимый процесс,
и с помощью NOR нитрат может восстанавливаться в нитрит за счет органических
субстратов.

Анаэробное окисление аммиака. На рубеже XX-XXI вв. было открыто важ-
ное звено в биогеохимическом цикле азота — процесс анаэробного окисления амми-
ака, или «Апатшох» (от англ, anaerobic ammonia oxidation). Отвечающие за него
пресноводные формы с условными именами Candidatus «Brocadia anammoxidans» и
Candidatus «Kuenenia stuttgartiensis» были впервые обнаружены в 1995-2000 гг. в
иле анаэробных очистных сооружений. Природный представитель этой группы, на-
званный Candidatus «Scalindua sorokinii», был найден в 2002 г. в бассейне Черного
моря ниже аноксичной зоны. Все они относятся к филе BXV Planctomycetes.

Анаэробное окисление аммиака происходит в анаммоксосоме — органелле, зани-
мающей до 30% внутреннего объема клетки (см. I том учебника). Она обладает
высокой электронной плотностью, поскольку содержит много белка и окружена
унитарной мембраной из уникальных липидов «леддеранов» (англ, ladder — лестни-
ца). Гидрофобные радикалы леддеранов (см. I том учебника) представляют собой
Сго-спирты или Сго-кислоты с восьмиуглеродной линейной цепью, к которой присо-
единяется «лестница» из пяти циклобутановых или трех циклобутановых и одного
циклогексанового остатка. Такие радикалы образуют простой эфир с метанолом или
глицеролом, а также смешанный (простой и сложный) эфир с глицеролом. Напом-
ним, что простые эфиры глицерола типичны для архей; у бактерий они встречаются
крайне редко и, кроме данного случая, описаны только у некоторых термофилов и
сульфатредукторов (см. I том учебника). Плотно упакованные леддераны созда-
ют непроницаемый барьер для диффузии высокотоксичного гидразина NH2—NH2,
который является ключевым интермедиатом в процессе анаэробного окисления ам-
миака.
Мембрана анаммоксосомы содержит три фермента — гидразингидролазу, гидра-
зиндегидрогеназу и нитритредуктазу (рис. ПО).

Рис. 110. Анаэробное окисление аммиака в анаммоксосоме.

НН — гидразингидролаза; HZO — гидразиндегидрогеназа; NR — нит-
ритредуктаза.

Гидразингидролаза (англ, hydrazine hydrolase, НН) катализирует реакцию меж-
ду аммиаком, находящимся в анаммоксосоме, и гидроксиламином, находящимся в
цитоплазме:

NH3 + NH2OH NH2-NH2 + Н2О.

Гидразин, который в результате этой реакции накапливается в полости анаммок-
сосомы, окисляется анаэробной дыхательной цепью, состоящей из гидразиндегид-
рогеназы (англ, hydrazine oxidizing enzyme, HZO) и нитритредуктазы (англ, nitrite
reducing enzyme, NR).

При четырехэлектронном окислении молекулы гидразина внутри анаммоксосо-
мы появляются четыре протона (механизм создания Pmf путем экстрацитоплазма-
тического окисления «простых» субстратов):

NH2-NH2 N2 + 4е-/4Н+.

В свою очередь, для образования молекулы гидроксиламина и молекулы воды
из цитоплазмы заимствуются пять протонов:
NO^ + 4е~ + 5Н+ -> NH2OH + Н20.

Гидроксиламин выделяется в цитоплазму, замыкая приведенную цепочку реак-
ций. Суммарная реакция анаэробного окисления аммиака:

NH3 + NO2 + Н+ N2 + 2Н2О.

В мембране анаммоксосомы содержится АТФ-синтаза, которая сопрягает пере-
нос протонов в цитоплазму с фосфорилированием АДФ. Таким образом, анаммок-
сосома является уникальным дыхательным компартментом и в функциональном
отношении выполняет в прокариотной клетке ту же роль, которую выполняет в
эукариотной клетке симбиогенная органелла—митохондрия.

Источником нитрита для планктомицетов из группы «Апаттох» служит либо
окисление аммиака на границе раздела между оксичной и аноксичной зонами, ли-
бо анаэробная нитратредукция. Эти биохимические процессы вызывают партнеры
планктомицетов по эко ценозу, которые снабжают их нитритом, а заодно защищают
их от кислорода.

Помимо планктомицетов анаэробное окисление аммиака могут осуществлять
нитрификаторы (например, Nitrosomonas eutropha). В качестве окислителя они, ско-
рее всего, используют N2O4 — димерную форму оксида азота NO2, который является
одним из побочных продуктов аэробного окисления аммиака:

2NH3 + 2N2O4 -> HNO2 + 1/2N2 + 4NO + Н+/е- + 2Н2О.

Возможно, что нитрификаторы способны также окислять аммиак нитритом, как
делают планктомицеты из группы «Апаттох». Хотя такой процесс приносит мало
энергии, он позволяет выжить в анаэробных условиях.

Нитрификация и анаэробное окисление аммиака имеют очень важное значение
для природных и антропогенных экосистем.

Нитрификация приводит в основном к негативным последствиям, что связано с
токсичным воздействием аниона нитрата на людей и животных, а также с цвете-
нием водоемов. Внесенный в почву в виде удобрения аммонийный азот переводится
в более подвижную нитратную форму и легко удаляется с дренажируемых полей.
Кроме того, в результате накопления нитрата лесные почвы закисляются, что вы-
зывает «кислые» дожди. Образование нитрата на поверхности производственных
сооружений, жилых строений и памятников культуры вызывает их коррозию и ме-
ханическое разрушение. Побочными продуктами нитрификация являются газооб-
разные вещества, в частности монооксид азота NO. Он разрушает озоновый экран,
а также совместно с диоксидом углерода и метаном вызывает парниковый эффект,
приводящий к глобальному потеплению (см. также раздел 11.4.6.2).

В то же время нитрификация отчасти полезна, поскольку она препятствует за-
грязнению окружающей среды токсичным аммонием. Благодаря тому, что амми-
акмонооксигеназа обладает широкой субстратной специфичностью, она окисляет
техногенные поллютанты — рекальцитрантные алифатические, ароматические и га-
лоароматические соединения.

Анаэробное окисление аммиака в целом позитивно, поскольку азот выделяется
в атмосферу в инертной форме, без негативного накопления нитрата в водоемах и
почве.

При азотной хемолитотрофии автотрофная ассимиляция углерода осуществля-
ется в цикле Кельвина-Бенсона-Бэссема (см. раздел 13.2.5).
11.4.4.6. Серная хемолитотрофии

Серная хемолитотрофии встречается как у бактерий, так и у архей (см. табл.
12). Источником энергии для нее служит элементная сера (S0), а также восстанов-
ленные неорганические соединения серы (англ, reduced inorganic sulfur compounds,
RISC). К их числу относятся политионаты, сульфид, сульфит и тиосульфат. Основ-
ным ресурсом перечисленных субстратов служат геохимические процессы, а также
энергетический и конструктивный метаболизм бактерий и архей. Кроме того, они
образуются техногенным путем.

Молекула RISC может отдавать много электронов (восемь при окислении суль-
фида S2- в сульфат ЗОд-). Электроны поступают в дыхательную цепь на уровне
цитохром bci-комплекса, что позволяет синтезировать несколько молекул АТФ в
расчете на молекулу окисленного субстрата.

В настоящее время реконструированы биохимические пути, которые использу-
ются прокариотами при окислении элементной серы и RISC.

Фототрофные бактерии (например, Chlorobium sp. и Chromatium sp.) использу-
ют электроны, полученные от элементной серы и RISC для восстановления НАД(Ф)
и ферредоксина, необходимых для автотрофной ассимиляции углерода и азота. До-
вольно редко фототрофы факультативно переходят на хемолитотрофию и начинают
использовать элементную серу и RISC в качестве энергетического субстрата.

Хемолитотрофные бактерии (например, Acidithiobacillus sp. и Beggiatoa sp.), а
также хемолитотрофные археи (Acidianus sp. и Sulfolobus sp.) ассимилируют энер-
гию окисления элементной серы или RISC.

Кроме того, прокариоты могут использовать электроны, полученные от элемент-
ной серы и RISC, в конструктивных восстановительных процессах. Серные прока-
риоты нередко сочетают хемолитотрофию с углеродной автотрофией или миксотро-
фией (см. раздел 13.1). Неорганический углерод ассимилируется в цикле Кельвина-
Бенсона-Бэссема (например, у Acidithiobacillus ferrooxidans и Beggiatoa sp.) или в
цикле Ивенса-Бьюкенена-Эрнона (например, у Acidianus sp. и Sulfolobus sp.). Меха-
низм автотрофной ассимиляции углерода у большинства экстремофильных серных
архей еще не выяснен.

Поскольку при окислении RISC филогенетически далекие друг от друга мик-
роорганизмы катализируют одни и те же реакции, напрашивается вывод, что это
очень древний биохимический процесс, который был независимо унаследован раз-
ными прокариотами от общего предка-прогенота. Согласно двум другим сценариям,
способность окислять серу и RISC могла быть приобретена в результате конвергент-
ной эволюции или «горизонтального» переноса генов.

Окисление элементной серы и растворимых RISC. Важнейшей формой
RISC в почвах и водоемах служит сульфид S2-.

Окисление сульфита SOg-, тиосульфата [S-ЗОз]2-, симметричных политионатов
“ЗОз — (S)n—SO3 (где п>1), асимметричных политионатов H-(S)n—SO3 (где п>2) и
полисульфанов (S)2“ (где п>2), а также «элементной» серы (S0) имеет подчиненное
значение.

Наиболее стабильной формой элементной серы S0 являются кольцевые молекулы
из восьми атомов (Sg), образующие орторомбические кристаллы.

Окисление элементной серы 3°(3з). Оно протекает в соответствии с суммарным
уравнением:

Sg + 8O2 + 8Н2О —> 8H2SO4.
Катализатором этой реакции служит оксигеназа, использующая в качестве ко-
фактора глутатион (см. раздел 11.4.5.3). Роль восстановленного глутатиона (GS-)
заключается в образовании глутатион-полисульфана GSSg :

S8 + GS” - GSSg ,
GSSg + O2 + H2O -* GSS7 + SOf" + 2H+.

В результате нуклеофильной атаки глутатиона на частицы орторомбической се-
ры из них выщепляются растворимые полисульфановые цепи GSSg , которые про-
никают в периплазматическое пространство. Там они окисляются с помощью окси-
геназы, расположенной на наружной поверхности СМ.

Чтобы избежать нерационального выделения глутатиона в окружающее про-
странство, клетки должны вступить в прямой контакт с частицами S8. Поэтому
при росте на среде с орторомбической серой изменяется набор адгезинов, в част-
ности адаптивно синтезируется жгутиковый белок с молекулярной массой 40 кДа.
Прикрепление к минералу осуществляется через его SH-группы, которые образуют
с серой дисульфидную связь.

Окисление сульфида S2~. Сульфид накапливается в нейтральной и щелочной
среде. Его окисление осуществляется с помощью периплазматической сульфидде-
гидрогеназы, которая использует в качестве кофакторов цитохромы с-типа или хи-
ноны. Первичным продуктом окисления сульфида обычно называют атомарную
«элементную» серу S° (другое обозначение—[S]). Однако этот термин не следует
воспринимать буквально. Истинная атомарная сера нестабильна и высокореактив-
на. Скорее всего, интермедиатами при окислении сульфида являются полисульфаны
(Sn)2-.

Окисление недиссоциированного сероводорода H2S. Сероводород преимуществен-
но накапливается в кислой среде и окисляется в соответствии с уравнением:

H2S + l/2O2 —> S0 + Н2О.

Энзиматической механизм этой реакции еще не установлен — скорее всего, на
промежуточном этапе образуется связанный с СМ сульфид-сульфогидрильный ком-
плекс [RSS“ ]. Кроме того, поскольку сероводород спонтанно окисляется молекуляр-
ным кислородом, реакция может идти и неферментативным путем.

Образовавшаяся в результате окисления сероводорода элементная сера откла-
дывается в виде глобул в периплазматическом компартменте. Эти гидрофильные
включения (см. I том учебника) состоят из длинноцепочечных симметричных по-
литионатов -SO3 — (S)n— SO3 или асимметричных политионатов H-(S)n—SO3 , при-
крепленных к гидрофобному ядру из кольцевых молекул S8. Элементная сера, очень
слабо растворяющаяся в воде, обратимо переходит в состав политионата:

S8 + HSO3 «-> H-(S)8—SO3 .

По мере надобности она окисляется до сульфита согласно уравнению реакции:

S° + О2 + Н2О - SO3 + 2Н+.

Окисление тиосульфата [S-SO3]2- и полисульфанов (S)2-. Оно осуществляется
с помощью S-оксигеназы, или «S-окисляющего фермента».
Тиосульфат стабилен преимущественно при нейтральном и щелочных значени-
ях pH. В асимметричной молекуле тиосульфата различаются наружный (сульфано-
вый**) и внутренний (сульфанильный*) атомы серы. Сульфановый атом тиосуль-
фата или полисульфана превращается в сульфит через стадию образования проме-
жуточного продукта [S], эквивалентного элементной сере:

[**s-*so3]2- SO2~ + [S].

После этого [S] окисляется до сульфита.

Образование сульфита из [S] строгими аэробами не сопряжено с работой дыха-
тельной цепи, тогда как у анаэробов (примером служит тионовая бактерия Thiobacil-
lus denitrificans) происходит серазависимое восстановление цитохромов:

[S] + ЗН2О -> SO^“ + 6Н+ + бе".

Окисление политионатов. Политионаты преимущественно устойчивы в кислых
растворах. Симметричные политионаты -SO3 — (S)n—SO3 (имеющие две терминаль-
ные сульфанильные группы) и асимметричные политионаты H-(S)n —SO3 (имеющие
одну терминальную сульфанильную группу) образуются при окислении полисуль-
фанов. Дитионат -SO3—SO3 к числу политионатов не относится.

Наибольший биологический интерес представляют тритионат -SO3—S-SO3 и
тетратионат -SO3 —(S)2—SO3 .

При окислении тритионата тритионат-дегидрогеназой в числе прочих продуктов
образуется тиосульфат:

2S30g~ + 2Н2О -> 2S2O^- + 2SO^“ + 4Н+.

После этого тиосульфат окисляется молекулярным кислородом до тетратионата
с помощью тиосульфат-дегидрогеназы:

2S2O2-+ 1/2О2 + 2Н+ S4O^ + Н2О.

Ключевой промежуточный метаболит, тетратионат, расщепляется тетратионат-
гидро лазой, в результате чего регенерируется тиосульфат и образуется элементная
сера:

S4O2- + Н2О -4 S2O2- + [S] + SO2" + 2Н+.

В свою очередь, [S] окисляется до сульфита.

Все рассмотренные реакции локализуются в периплазматическом компартменте,
и перечисленные ферменты метаболизма RISC адаптированы к низким значениям
pH.

Окисление сульфита. Сульфит является сильным восстановителем (редокс-по-
тенциал пары SO2-/ SO2- равен -515 мВ). Хотя он токсичен и обладает широким
спектром антимикробного действия, некоторые бактерии могут использовать его в
качестве единственного источника энергии для хемолитотрофного роста.

Сульфит, образующийся в результате метаболизма RISC, может неферментатив-
но окисляться в сульфат молекулярным кислородом:

SO2" + 1/2О2 —> SO2".
Однако физиологически важно только окисление сульфита с помощью фермен-
тов, что позволяет решить сразу две задачи — удалить этот токсикант и использо-
вать его как донор электронов.

Известны два ферментативных пути окисления сульфита (рис. 111). Первый из
них, прямой путь, связан с использованием сульфит:акцептор-оксидоредуктазы (sul-
fite:acceptor oxidoreductase, SOR). В анаэробных условиях одним из возможных ак-
цепторов электронов служит катион Fe3+, и реакцию осуществляет мембраносвя-
занная сульфит:Ее3+-оксидоредуктаза:

SO^“ + 2Fe3+ + Н2О -» SO^' + 2Fe2+ + 2Н+.

Сульфит:акцептор-оксидоредуктаза тионовой бактерии Acidithiobacillus ferroox-
idans представляет собой гетероолигомер (650 кДа; субъединицы 59 и 61 кДа).

НО ОН

но он

АТФ

АДФ

Рис. 111. Прямой и непрямой путь ферментативного окисления сульфита (по: Kappler, Dahl,
2001).

АФС — аденозин-5 -фосфосульфат; 1 — сульфит:акцептор-оксидоредуктаза; 2 — АФС-редук-
таза; 3 — АТФ-сульфурилаза; 4 — АДФ-сульфурилаза.
У At. thiooxidans она имеет другой субъединичный состав (400 кДа; субъединицы
62, 70 и 74 кДа). В обоих случаях фермент не содержит простетических групп.

Второй, непрямой путь, заключается в АМФ-зависимом окислении сульфи-
та с промежуточным образованием аденозин-5'-фосфосульфата (АФС) (рис. 111).
Этот путь продемонстрирован у тионовых бактерий Thiobacillus denitrificans и
Т. thioparus. Вначале под действием АФС-редуктазы из сульфита и АМФ образуется
АФС. Сульфатная группа заменяется на фосфорильную при помощи АДФ:сульфат-
аденилилтрансферазы (АДФ-сульфурилазы). В результате образуется АДФ. Затем
происходит аденилаткиназная реакция: 2АДФ —> АТФ + АМФ. Сульфатная группа
также может быть заменена на пирофосфатную с помощью АТФ:сульфат-адени-
лилтрансферазы (АТФ-сульфурилазы). В результате образуется АТФ.

В обоих случаях энергия окисления сульфита ассимилируется в форме фосфа-
гена (АФС). Обычно это называют «субстратным фосфорилированием», что прин-
ципиально неверно, поскольку здесь не происходит субстратное фосфорилирование
АДФ. На самом деле это второй способ образования фосфагена — когда фосфорил
замещает группу, присоединенную к субстрату лабильной тиоэфирной связью (см.
раздел 10.3).

Конечный продукт разветвленной цепи превращений соединений серы - это ани-
он сульфата и эквивалентное количество свободных протонов, т. е. серная кислота,
при накоплении которой снижается pH среды.

Окисление нерастворимых сульфидных минералов. Из неорганических
серусодержащих субстратов наиболее восстановлены и, следовательно, наиболее бо-
гаты энергией сульфиды. Природные запасы сульфида образуют сульфидные ми-
нералы—пирит FeS2, сфалерит ZnS, халькопирит CuFeS2 и другие. Однако суль-
фиды большинства металлов слабо растворяются в воде. Поэтому для окисления
сульфидных руд бактерии прибегают к помощи двух специальных механизмов —
«сульфанового» и «тиосульфатного».

Сульфоновый механизм. Он используется при окислении кислоторастворимых
сульфидов — например, сульфида цинка. В данном случае действующими агентами
служат протоны или катионы железа.

При протонной атаке из сульфидного минерала освобождается в раствор катион
металла (М2+). Образующийся одновременно с этим сероводород окисляется внача-
ле до элементной серы, а затем до сульфата:

MS + 2Н+ -> М2+ + H2S,
H2S + 1/2О2 S° + Н2О,
S° + 3/2О2 + Н2О SO^~ + 2Н+.

Полисульфановый минерал подвергается двойному воздействию со стороны
Fe3+:

M2(S)n + 2Fe3+ -» 2М++ (S)2" + 2Fe2+,
(S)2- + 2Fe3+ - [(S)n_i]2- + S° + 2Fe2+.

Элементная сера затем окисляется до сульфата; в свою очередь, бактерии окис-
ляют катион Fe2+ до Fe3+ (или это происходит в результате абиотической реакции).
Следует отметить, что микробное выщелачивание путем окисления сульфидных ми-
нералов катионом Fe3+ лежит в основе гидрометаллургии — промышленного процес-
са, с помощью которого из бедных руд и заброшенных выработок дешевым способом
получают медь и другие металлы.
Тиосульфатный механизм. Он используется для окисления не растворимых в
кислоте сульфидных минералов, например широко распространенного пирита FeS2-

Особое значение пирита для At. ferrooxidans обусловлено тем, что этот неоргани-
ческий субстрат является богатым источником энергии. Действительно, поскольку
сера в нем находится в степени окисления -1, а железо в степени окисления +2,
реакция FeS2 —►—> Fe3+ + 2SO2- дает 15 электронов (2S- —> 2S6+ + 2х7е_; Fe2+ —*
Fe3+ + е_; 2x7+1 = 15). В данном случае катион Fe3+ действует как окислительный
агент, однако образуется не полисульфан, а тиосульфат:

FeS2 + 6Fe3++ ЗН2О 7Fe2+ + S2O^- + 6Н+.

В присутствии Fe3+ тиосульфат нестабилен и окисляется до тетратионата, одного
из важнейших интермедиатов в цикле превращений неорганической серы:

2S2O2' + 2Fe3+ - S4O|“ + 2Fe2+,

S4O2~ + H2O -> S2O2- + SOj" + S° + 2H+.

11.4.4.7.	Железная хемолитотрофия

Железная хемолитотрофия встречается у бактерий и архей. Экзергоническая
реакция окисления железа может поддерживать эндергонические процессы, в част-
ности автотрофную ассимиляцию СОг- Однако бывают случаи, когда окисление
субстратного железа не имеет энергетического значения, т. е. является «холостым».
Таким путем устраняются токсичные формы кислорода, а накапливающиеся в по-
кровных структурах соединения Fe3+ выполняют механопротекторную роль.

Способность аэробно окислять Fe2+ (не обязательно с целью получения энергии)
широко распространена в домене Bacteria. Значительная часть железоокисляющих
бактерий представлена ацидофилами, обитающими в кислых источниках или техно-
генных экосистемах, таких, как воды затопленных шахт и отвалы угольной породы
или шлака. Некоторые из них окисляют не только водорастворимые соли Fe2+, но и
сульфидные минералы, в частности пирит, что лежит в основе их использования для
биологического выщелачивания металлов. Вторую крупную экологическую группу
Fe2+-окисляющих бактерий составляют нейтрофилы, процветающие в богатых вос-
становленным железом морских и пресноводных экосистемах.

Согласно результатам секвенирования 16S рРНК, железные хемолитотрофы по-
лифилетичны и принадлежат к нескольким сильно дивергировавшим филам бакте-
рий. Самыми известными примерами служат Leptospirillum ferrooxidans (фила BVIII
Nitrospirae), Gallionella ferruginea и Acidithiobacillus ferrooxidans (класс «Betapro-
teobacteria»), а также Sulfobacillus thermosulfidooxidans (филаВХШ Firmicutes). Они
обладают грамотрицательным или грамположительным морфотипом, разнообразны
морфологически и гетерогенны в метаболическом плане. Способность к углеродной
автотрофии у железных литотрофов наблюдается довольно редко (примером слу-
жит At. ferrooxidans), в основном это хемолитогетеротрофы или углеродные миксо-
трофы.

Стандартный окислительно-восстановительный потенциал пары Fe2+/Fe3+ ра-
вен +200 мВ. Изменение стандартной свободной энергии AG0 для реакции Fe2+ —>
Fe3+ + е~ можно рассчитать по формуле AG° = —nFE° (оно относительно невелико
и составляет -74,4 кДж-моль-1).
«Физиологическую» величину AGO/, отражающую количество ассимилируемой
энергии, которая преобразуется в полезную работу (например, при фосфорили-
ровании АДФ), можно определить только экспериментальным путем, и по абсо-
лютному значению она меньше, чем AG0. Таким образом, хемолитотрофные Fe2+-
окисляющие бактерии могут развиваться только в богатых восстановленным желе-
зом средах.

Существенным ограничителем для использования Fe2+ в качестве донора элек-
тронов служит содержание этого катиона в растворе. В аэробных условиях соеди-
нения Fe2+ устойчивы в кислой среде, тогда как при значениях pH, близких к
нейтральному, катион Fe2+ окисляется кислородом воздуха. Поэтому все извест-
ные хемолитотрофные железоокисляющие бактерии либо относятся к облигатным
ацидофилам — как Acidithiobacillus ferrooxidans и Leptospirillum ferrooxidans, либо
предпочитают микроаэробные условия — как Gallionella ferruginea.

Механизм аэробной железной литотрофии детально изучен на примере At. fer-
rooxidans, которая окисляет Fe2+ согласно уравнению реакции:

4Fe2+ + О2 + 4Н+ -> 4Fe3+ + 2Н2О.

Компоненты дыхательной цепи переносят электроны от Fe2+ к кислороду
(рис. 112). В окислении железа участвуют продукты генов cycl, сус2, rus, coxA-D и
открытой рамки считывания ORF1. Они объединены в оперон и котранскрибируют-
ся в составе полицистронной мРНК. Первым звеном электрон-транспортной цепи яв-
ляется связанная с ОМ «Ре2+-оксидаза» (правильное название — Fe-дегидрогеназа,
поскольку этот фермент не передает электроны непосредственно кислороду).

Ре2+-оксидаза представляет собой высокомолекулярный цитохром с (ген сус2).
Данные молекулярного секвенирования говорят о том, что он находится за преде-
лами цитоплазматического компартмента — препротеин содержит сигнальную по-
следовательность, которая при секреции отрезается лидер-пептидазой. Высокое

ОМ	см

Рис. 112. Перенос электронов от железа к кислороду с участием Ре2+-оксидазы (по:
Appia-Ayme et al., 1999).

HiPIP — высокопотенциальный железопротеин.
содержание полярных аминокислот делает этот цитохром устойчивым в кислой
среде.

Ре2+-оксидаза передает электроны растворимому высокопотенциальному желе-
зопротеину или растворимому периплазматическому медьсодержащему белку ру-
стицианину, который кодируется геном rus. Тот, в свою очередь, восстанавливает
продукт гена cycl — периплазматический цитохром с552 (04). Последний взаимо-
действует с локализованной в СМ цитохромоксидазой ааз, которая переносит элек-
троны на молекулярный кислород. В результате работы железоокисляющей дыха-
тельной цепи создается Pmf.

Ассимилированная энергия частично расходуется на пополнение пула АТФ, ко-
торый необходим для ассимиляции СО2 в цикле Кельвина-Бенсона-Бэссема. По-
мимо АТФ для хемолитоавтотрофного роста нужны восстановительные эквива-
ленты. Однако поскольку редокс-потенциал пары Fe2+/Fe3+ выше, чем у пары
НАД(Ф)/НАД(Ф)Н (соответственно +200 и -320 мВ), образование восстановлен-
ных пиридиннуклеотидов путем прямой передачи электронов от железа находится
под термодинамическим запретом.

Чтобы бактерии могли получить восстановитель, часть энергии Pmf использу-
ется для «обращения» транспорта электронов. В этом случае цитохром с552 восста-
навливает не цитохромоксидазу ааз, а цитохром ftci-комплекс. Последний передает
электроны мембраносвязанной НАДН-дегидрогеназе (NDH-1).

Направление потока электронов по одному из альтернативных путей зависит от величины со-
отношения АТФ/АДФ. При высокой интенсивности конструктивного метаболизма, в частности,
при активном синтезе белка энергия Pmf расходуется главным образом на восстановление НАД.
В этих условиях устанавливается низкое соотношение АТФ/АДФ. По мере расходования пула ами-
нокислот синтез белка приостанавливается, однако АТФ некоторое время продолжает накапли-
ваться, что увеличивает соотношение АТФ/АДФ. Высокий энергетический заряд инактивирует
цитохромоксидазу, в результате чего Pmf снижается. В этих условиях АТФаза гидролизует АТФ,
что сопровождается выходом протонов из цитоплазматического компартмента. За счет энергии
Pmf происходит «обращенный» транспорт электронов, благодаря чему синтезируется НАДН. Это
продолжается до тех пор, пока концентрация АТФ не снизится до порогового значения, ингиби-
рование цитохромоксидазы не прекратится, и направление транспорта электронов не сменится на
противоположное. Таким образом, при аэробном росте At. ferrooxidans на среде, содержащей Fe2+,
чередуются прямой и обращенный транспорт электронов, что удовлетворяет потребности клетки
как в АТФ, так и в восстановительных эквивалентах.

Железо в качестве субстрата при анаэробной хемолитотрофии. На заре суще-
ствования биосферы, еще до приобретения архаическими цианобактериями способ-
ности окислять воду с образованием кислорода, биогенные акцепторы электронов
были в дефиците. В тот период анаэробное окисление Fe2+ имело гораздо большее
значение, чем в современную геохронологическую эпоху.

В природных экосистемах при значениях pH, близких к нейтральному, соеди-
нения железа существуют главным образом в виде редокс-пар Ве(ОН)з/Те2+ или,
если в среде накапливается бикарбонат, в виде Ве(ОН)з/(НСОз /ВеСОз). Их редокс-
потенциалы равны соответственно -236 и +200 мВ.

Редокс-потенциал для всех четырех сопряженных пар пути восстановления нит-
рата NO3 —> NO2 —> NO —> N2O —> N2 существенно выше этих значений. Он равен
+430 мВ (для пары NO7/NO2 ), +350 мВ (для пары NO2/NO), +1180 мВ (для пары
NO/N2O) и +1350 мВ (для пары N2O/N2). Поэтому при окислении Ге2+свободную
энергию можно ассимилировать за счет восстановления нитрата.

Известен ряд представителей классов «Betaproteobacteria» и «Gammaproteobacte-
ria», которые растут хемолитотрофно с использованием Fe2+ в качестве единствен-
ного источника энергии. Акцептором электронов служит нитрат и он восстанавли-
вается до молекулярного азота:

10FeCO3 + 2NO3 + 24Н2О -> 10Fe(OH)3 + N2 + ЮНСО3 + 8Н+.

Энергетический выход приведенной реакции относительно невелик, и поэтому
она имеет физиологический смысл лишь при высокой концентрации Fe2+ в экосисте-
ме. Несмотря на широкое распространение железоокисляющих бактерий в анаэроб-
ном деструктивном сообществе, этот процесс имеет подчиненный характер по срав-
нению с «ацетатным» и «водородным» трофическими путями (см. раздел 11.2.2).

В целом необходимо отметить, что железо как субстрат литотрофии относитель-
но бедно энергией. Во-первых, при окислении оно дает лишь один электрон (для
сравнения, окисление сульфида до сульфата дает восемь электронов). Во-вторых,
электроны поступают в дыхательную цепь на уровне цитохрома с (не цитохрома Ь,
как в случае RISC), что сокращает число точек сопряжения до одной и сводит к
минимуму количество синтезируемых молекул АТФ (0,2-0,3) в расчете на молекулу
окисляемого субстрата. Железные литотрофы вынуждены компенсировать энер-
гетическую неэффективность Fe2+ экстенсивным способом, перерабатывая очень
большое количество этого субстрата. Поэтому в их среде обитания накапливаются
нерастворимые оксиды и гидроксиды Fe3+, имеющие характерный охристый цвет.

11.4.4.8.	Марганцевая хемолитотрофии

В отличие от железной хемолитотрофии, марганцевая хемолитотрофии возмож-
на только у бактерий и только в аэробных условиях. Примеры марганцевой хемо-
литотрофии у архей неизвестны.

Бактерии, окисляющие Fe2+, могут окислять и Мп2+. Однако в природе эти про-
цессы обычно разобщены из-за того, что окисление катиона Мп2+ происходит при
pH 6-8, когда последний химически стабилен, а катион Fe2+, напротив, неустойчив.

Большинство Мп2+-окисляющих бактерий относится к филе ВХП Proteobacteria.
Хотя окислять марганец (не обязательно с целью получения энергии) могут многие
гетеротрофные формы, до сих пор не описан ни один марганцевый хемолитоавто-
троф. Наиболее вероятными марганцевыми хемолитотрофами являются представи-
тели семейства Pseudomonadaceae (класс «Gammaproteobacteria»). В частности, это
морские штаммы Pseudomonas sp. В-16 и S-36 и пресноводные штаммы МпВ-1 и
GB-1, а также группа Мп2+-окисляющих бактерий, отнесенная к семейству «Side-
rocapsaceae».

Окислительно-восстановительный потенциал пары Мп2+/МпО2 очень высокий
(+1228 мВ). Соответственно, рассчетная стандартная свободная энергия AG° реак-
ции

Мп2+ + 1/2О2 + Н2О -> MnO2 + 2Н+

составляет -237 кДж-моль-1.

Как и в случае Fe2+, величину АС?0' можно определить экспериментальным пу-
тем. Хотя она составляет только -70 кДж-моль-1, этого достаточно для хемолито-
трофного роста, и Мп2+-окисляющие бактерии могут развиваться даже в бедных
восстановленным марганцем экосистемах.
Биоэнергетическое окисление Мп2+ подразумевает, что в нем участвует элек-
трон-транспортная цепь, и свободная энергия ассимилируется в форме Pmf.

Марганец окисляется «Мп2+-оксидазой», связанной с ОМ (рис. ИЗ). Правильное
название этого фермента — Мп2+-дегидрогеназа/оксигеназа, поскольку он получает
электроны от субстрата, однако не передает их непосредственно кислороду (в ходе
реакции вода освобождает протоны, а атом кислорода присоединяется к субстрату).

Рис. 113. Перенос электронов от марганца к кислороду с участием Мп2+-оксидазы
(по: Brouwers et al., 2000).

Установлено, что в окислении марганца участвует периплазматический фактор,
который является посредником между Mn-оксидазой и цитохромом с. Последний, в
свою очередь, передает электроны цитохромоксидазе аа^. В результате взаимодей-
ствия Мп-оксидазы с электрон-транспортной цепью создается Pmf.

Идентифицированы гены, кодирующие Mn-оксидазу Bacillus sp. SG-1, Leptothrix
discophora, Pedomicrobium sp. и Pseudomonas putida GB-1. Продукты их экспрессии
относят к суперсемейству медьсодержащих оксидаз.

Данные ферменты содержат «купредоксиновые» центры I, II и III типа, которые различаются
по характеру и расположению лигандов.

В центре I типа (рис. 114) атом меди координирован тремя лигандами — двумя атомами азота
и одним атомом серы, которые входят в состав боковых радикалов двух остатков His и остатка
Cys (расположены в экваториальной области апопротеина). Возможна дополнительная координа-
ция атома меди четвертым лигандом — атомом серы бокового радикала остатка Met (расположен
вне экваториальной области). Центры I типа выполняют функцию межмолекулярного переноса
электронов.

Атом меди в центре II типа (рис. 114) координирован четырьмя планарно расположенными
N- или О-лигандами, которые представлены остатками His и молекулами воды. Функция этих
центров — каталитическое окисление субстрата.

Атомы меди в центре III типа (рис. 114) образуют кластер, компоненты которого координиро-
ваны четырьмя расположенными в одной плоскости N- или О-лигандами, причем один из атомов
кислорода участвует в образовании ковалентной связи между атомами меди. Функцией центров
III типа является перенос атомов кислорода.

Типичная медьсодержащая оксидаза состоит из трех купредоксиновых доменов, каждый из
которых образован восемью антипараллельными /3-цепями. Особенностью таких оксидаз являет-
ся близкое расположение центров II и III типа, в результате чего образуется «центр IV типа»
(рис. 114). Вблизи этого кластера находится центр I типа, что обеспечивает эффективный внут-
римолекулярный перенос электрона. Центр I типа участвует в четырех последовательных актах
переноса электрона на «центр IV типа», который передает кислороду сразу четыре электрона.

Б

III тип

Рис. 1Ц. Мононуклеарные и бинуклеарные (А) и тринуклеарные (Б) «купредокси-
новые» центры медьсодержащих оксидаз (по: Brouwers et al., 2000).

L — атомы азота или кислорода, выполняющие роль лигандов.

IV тип

Молекулярно-генетические свойства Мп2+-оксидазы изучены на примере пресно-
водной бактерии Pseudomonas putida GB-1. Фермент является типичной медьсодер-
жащей оксидазой и локализован в ОМ. В составе ее оперона имеются два гена: ситА
(кодирует апопротеин фермента) и ситВ (регулирует скорость роста культуры). Бе-
лок Cum А содержит сигнальную последовательность, удаляемую при секреции.

Роль Мп2+-оксидазы не ограничивается обеспечением марганцевой хемолитотро-
фии, поскольку она может косвенно участвовать и в окислении многих органиче-
ских субстратов. Окисленные формы марганца (особенно Мп3+) действуют как хи-
мические реагенты, разрушающие ароматические соединения. Вероятно, первичной
функцией медьсодержащих оксидаз было именно окисление рекальцитрантных суб-
стратов.

Системы окисления Мп2+ (в том числе абиотические) очень разнообразны, и
его биологический смысл может различаться у разных микроорганизмов. Поэто-
му крайне трудно доказать, что бактерия является марганцевым хемолитотрофом.
В любом случае, как и при окислении железа, в среде в изобилии появляются нерас-
творимые оксиды и гидрооксиды марганца, имеющие характерный охристый цвет.
11.4.4.9.	Хемолитотрофии во «второй биосфере» и «третьей биосфере»

Альтернативой космической энергии, или квантового излучения Солнца являет-
ся внутренняя энергия Земли. Иными словами, инфракрасный свет, или геотермаль-
ное тепло может обеспечивать фототрофию в недрах нашей планеты, а поступающие
на земную поверхность неорганические субстраты могут обеспечивать хемолитотро-
фию.

«Вторая биосфера». В начале 1980-х годов на океаническом дне в зонах кон-
такта тектонических плит на глубине 1,5-3 км были обнаружены гидротермаль-
ные источники, вокруг которых развиваются популяции беспозвоночных животных
(моллюсков Bathymodiolus и Calyptogena, а также вестиментифер Riftia). Источни-
ком питания для них служит первичная продукция эндоцитобионтов — окисляющих
серу хемолитоавтотрофных бактерий. В 1990-е годы вокруг донных выбросов при-
родного газа были обнаружены колонии двустворчатых моллюсков и других беспо-
звоночных, которые используют продукты автотрофного биосинтеза эндоцитобио-
тических бактерий, аэробно окисляющих метан.

Бедные видами экосистемы «второй биосферы» зависят только от локальных
геологических ресурсов неорганического субстрата, служащего источником энергии.
В результате этого подводные «оазисы жизни» существуют независимо от главной,
«первой» биосферы.

«Третья биосфера». В толще земной коры недавно были обнаружены мик-
робные сообщества, которые не зависят от притока источников органического угле-
рода с земной поверхности. Нишей для таких оазисов «третьей биосферы» служит
рудное тело пирита FeS2- Установлено, что в эти автономные ассоциации входят
железоокисляющие бактерии, принадлежащие к родам Lepto spirillum (фила BVIII
Nitrospirae), Sulfobacillus (фила BXIII Firmicutes) и Acidimicrobium (фила BXIV
Actinobacteria), а также железоокисляющие археи, относящиеся к роду Ferroplasma
(фила АП Euryarchaeota).

11.4.5. Органические акцепторы электронов

Эффективность работы дыхательной цепи зависит от пропускной способности ее
конечного звена — терминальной редуктазы, взаимодействующей с терминальным
акцептором электронов. При этом особо важны два встречных обстоятельства:

—	доступность акцептора электронов, т. е. его концентрация (если он раствори-
мый) или способность клетки преодолеть расстояние до него (если он нераствори-
мый) ;

—	сродство активного центра редуктазы к акцептору электронов.

Кроме того, очень важное значение имеет физиологическая целесообразность
использования того или иного акцептора электронов. На первый взгляд, очевидно
преимущество неорганических акцепторов, поскольку органику выгоднее окислять,
чем восстанавливать. Однако в реальных условиях выбор акцептора зависит от вза-
имоотношений, складывающихся в микробиоте.

Существуют примеры очень эффективной адаптации к органическому акцепто-
ру электронов, например фумарату, если его образует партнер по трофической ас-
социации. В других случаях выгоден эндогенный синтез органического акцептора,
причем это можно делать как гетеротрофным, так и автотрофным способом.
11.4.5.1.	Экзогенный фумарат

Фумаратное дыхание широко распространено у бактерий, окисляющих с помо-
щью «первичных» дегидрогеназ разнообразью доноры электронов — дигидрооротат,
молекулярный водород, НАДН, формиат, 3-фосфоглицерат и т. д. К ним, в частно-
сти, относятся энтеробактерии из родов Escherichia, Klebsiella, Proteus и Salmonella
(класс «Gammaproteobacteria»), Vibrio succinogenes (класс «Gammaproteobacteria»),
Wolinella succinogenes (класс «Epsilonproteobacteria», а также Bacteroides succino-
genes (фила BXXII Bacteroidetes).

Молекулярный механизм фумаратного дыхания лучше всего изучен на примере
бактерии Wolinella succinogenes, которая была впервые выделена в начале 1960-х го-
дов из коровьего рубца. В данном случае в качестве доноров электронов выступают
формиат или водород.

При фумаратном дыхании Pmf создается таким же путем, как и при дыхатель-
ной аммонификации нитрита (см. ниже), хотя фумарат является менее сильным
окислителем, чем нитрит — стандартный редокс-потенциал пары фумарат/сукцинат
составляет +30 мВ, а пары NO2/NH^ равен +340 мВ. В донорном участке дыха-
тельной цепи в обоих случаях используется одна и та же формиатдегидрогеназа или
гидрогеназа.

Главное различие фумаратной и нитритной дыхательных систем связано с при-
родой терминальной редуктазы — при фумаратном дыхании взамен дыхательной
нитритредуктазы используется фумаратредуктаза.

Фумаратредуктаза W. succinogenes состоит из обращенной в цитоплазму боль-
шой каталитической субъединицы (FrdA; 70 кДа), амфипатической субъединицы
(FrdB; 27 кДа) и гидрофобной субъединицы (FrdC; 15 кДа). Субъединица FrdA со-
держит простетическую группу ФАД, ковалентно присоединенную к остатку His-44
(см. рис. 104). «Коннекторная» субъединица FrdB содержит [РегЗгркластер, [ГезЗд]-
кластер и [Рв484]-кластер, лигандированные остатками Cys. Гидрофобная «якор-
ная» субъединица FrdC представляет собой содержащий две геминовые группы, или
«дигемовый» цитохром Ь, который состоит из трех интегральных спиралей по 25
аминокислотных остатков каждая. В отдельных случаях, например у Е. coli, имеет-
ся вторая «якорная» субъединица (FrdD, 13 кДа).

Электроны от субстрата передаются менахинонному пулу, а затем последова-
тельно переносятся простетическими группами субъединиц FrdC, FrdB и FrdA на
фумарат.

Дигемовые цитохромы b входят, помимо фумаратредуктазы, в состав мембра-
носвязанной uptake NiFe-гидрогеназы, нитратредуктазы, нитритредуктазы, сукци-
натдегидрогеназы, формиатдегидрогеназы и цитохром 6с1(£>б/)-комплекса. Эти ге-
терологичные белки различаются по способу лигандирования гемов, ориентации в
мембране и характеру взаимодействия с хинонным пулом. В частности, дигемовый
цитохром Ь, входящий в состав фумаратредуктазы Frd, окисляет хинон на периплаз-
матической стороне мембраны. В отличие от него дигемовый цитохром Ь, входящий
в состав цитохром bcifbe/)-комплекса, окисляет и восстанавливает хинон на двух
противоположных сторонах мембраны (см. раздел 10.4.6).

11.4.5.2.	Эндогенный фумарат

Биосинтез пропионата. Биосинтез пропионовой кислоты с ее выделением
во внешнюю среду обычно называют «пропионовым брожением». Однако на самом
деле этот процесс представляет собой анаэробное дыхание, при котором в качестве
терминального акцептора электронов используется эндогенный фумарат.

Члены сборной группы пропионовокислых бактерий (правильно будет — «пропи-
оновокислотных») принадлежат к филам ВХШ Firmicutes (Clostridium propionicum,
Selenomonas ruminantium, Veillonella alcalesens и др.) и BXIV Actinobacteria (Mi-
cromonospora carbonacea, Propionibacterium freudenreichii и др.). Главной нишей для
них является пищеварительный тракт жвачных животных и термитов. Некоторые
пропионовокислые бактерии используются в промышленности (для получения ви-
тамина В12 и швейцарского сыра). В то же время при развитии на кожных покровах
человека они служат причиной локальных воспалений.

Пропионовокислые бактерии катаболизируют гексозы по гексозобисфосфатному
пути (см. раздел 11.3.2.1). Кроме того, с помощью лактатдегидрогеназы они могут
окислять экзогенный лактат до пирувата.

Биосинтез пропионовой кислоты служит отдельным примером «судьбы» пиру-
вата, когда этот продукт гликолитического пути используется при биосинтезе эндо-
генного акцептора электронов для дыхания. На это у пропионовокислых бактерий
предназначен цикл метилмалонила-СоА, побочным продуктом которого является
пропионат (рис. 115).

Вначале пируват карбоксилируется метилмалонил-СоА-карбокситрансферазой
с образованием оксалоацетата. Эту ключевую реакцию биосинтеза пропионата в
1960 г. открыл Вуд, хотя способность бактерий из рода Propionibacterium асси-
милировать СО2 он обнаружил вместе с Беркманом (С. Н. Werkman) еще в сере-
дине 1930-х годов. Впоследствии оказалось, что «гетеротрофное» карбоксилирова-
ние с помощью биотинзависимых транскарбоксилаз широко используется в ана-
болических путях прокариотов и эукариотов (например, при биосинтезе жирных
кислот).

Переносчиком карбонильной группы является ковалентно связанный кофер-
мент—биотин, или витамин Н (см. рис. 82). Образовавшийся оксалоацетат восста-
навливается до малата, который затем дегидрируется в фумарат. Теперь настает
черед мембранной фумаратредуктазы (см. раздел 11.4.5.1), и благодаря фумарат-
ному дыханию создается Pmf.

Сукцинат, полученный в результате восстановления фумарата, активируется при
помощи СоА-трансферазы, причем в качестве донора СоА используется пропионил-
СоА. Затем под действием метилмалонил-СоА-мутазы сукцинил-СоА превращается
в метилмалонил-СоА; при этом в качестве коэнзима используется витамин В12 (см.
рис. 80). На завершающей стадии цикла метилмалонил-СоА-карбокситрансфераза
переносит карбоксильную группу [-СОО-] на пируват, и метилмалонил-СоА
превращается в пропионил-СоА, который затем служит донором СоА-группы
для сукцината. Дезактивированный пропионат выделяется в окружающую
среду.

Пропионогенез — это особый тип анаэробного дыхания, когда акцептором элек-
тронов служит эндогенный фумарат, образующийся в комплексном пути энерге-
тического и конструктивного метаболизма, побочным продуктом которого явля-
ется пропионат.

Интересно, что метилмалонил-СоА-цикл, связанный с выделением пропионата и
сопровождающийся фумаратным дыханием, встречается не только у бактерий, но и
у некоторых круглых и кольчатых червей, способных жить в анаэробных условиях
(например, Ascaris lumbricoides и Arenicola marina).
НВР-путь

СОО"

сн2

сн3

пропионат

С-°

Y ~SCoA

сн2 ◄--

со2

CoASH

СН3 1
пропионил-СоА г ж
। SCJo.A
нс-сн3

Icoo'l
метилмалонил-СоА

СОО"

сн2
соо"

С-°

У ~SCoA

сн2

малат

СОО"

СН

Н20

сн2
соо"

СН

* сукцинил-СоА

СОО"

2

СОО"

фумарат

сн2

1	- НАД

СОО

НАДН

сукцинат

Pmf

Рис. 115. Эндогенное фумаратное дыхание, сопровождающееся биосинтезом пропи-
оната (метилмалонил-СоА-цикл).

1 — метилмалонил-СоА-карбокситрансфераза; 2 — малатдегидрогеназа; 3 — фумарат-
гидратаза; 4 — фумаратредуктаза; 5 — СоА-трансфераза; 6 — метилмалонил-СоА-мутаза;
[-СОО-] — карбоксибиотин.

В заключение отметим, что метилмалонил-СоА-карбокситрансфераза может
действовать и в обратном направлении, в результате чего пропионил-СоА через ста-
дию образования метилмалонил-СоА превращается в сукцинил-СоА. Такой меха-
низм позволяет некоторым бактериям (например, Rhizobium) включать в анаболи-
ческие пути остаток пропионата, образующийся в результате расщепления жирных
кислот с нечетным числом атомов углерода, а также таких аминокислот, как валин
и изолейцин.

Биосинтез сукцината. Сукцинат, или янтарная кислота является одним из
продуктов метаболизма энтеробактерий, в частности Е. coli, которые альтернативно
ассимилируют энергию — путем брожения смешанного типа (см. раздел 11.3.4.6) и
путем аэробного или анаэробного дыхания.
При фумаратном дыхании фосфоэнолпируват «гетеротрофно» карбоксилиру-
ется с помощью фосфоэнолпируват-карбоксилазы, в результате чего образуется
оксалоацетат. Затем оксалоацетат восстанавливается в малат с помощью НАДН-
зависимой малатдегидрогеназы, а малат превращается в фумарат с помощью фу-
маратгидратазы (см. рис. 115).

Дыхательная цепь, в состав которой входит мембраносвязанная фумаратредук-
таза (см. раздел 11.4.5.1), создает Pmf и восстанавливает фумарат до сукцината.

11.4.5.3.	Экзогенный органический гетеродисульфид

В редких случаях при дыхании в качестве терминального акцептора электронов
используются экзогенные органические гомодисульфиды или гетеродисульфиды со
структурой соответственно R-SS-R или R-SS-Ri.

Например, для мезофильной бактерии Desulfuromonas acetoxidans и гипертермо-
фильного археота Pyrobaculum islandicum такими акцепторами могут быть экзоген-
ный цистин:

-OOC-CHNH+-CH2-SS-CH2-CHNH+-COO- + 2Н+/2е- ->
2 х -OOC-CHNH+-CH2-SH

или окисленная форма экзогенного глутатиона:

-ooc-chnh+-(ch2)2-conh-ch-conh-ch2-coo-

I
сн2

S
S

сн2

-OOC-CHNH+-(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-COO-
+2Н+/2е~ -

2 X -OOC-CHNH+-(CH2)2-CONH-CH-CONH-CH2-COO-

сн2

SH.

11.4.5.4. Эндогенный органический гетеродисульфид:
биосинтез метана

Метаногенные археи из филы АП Euryarchaeota обладают уникальной способно-
стью использовать в качестве терминального акцептора электронов не экзогенный,
а эндогенный органический гетеродисульфид.
Физиологический смысл многоэтапного пути биосинтеза метана состоит в том,
чтобы синтезировать органический гетеродисульфид CoB-SS-CoM, который послу-
жит эндогенным акцептором электронов при анаэробном дыхании:

CoB-SS-CoM + 2е-+ 2Н+ -> CoB-SH + CoM-SH.

Микробное образование метана является очень важным звеном в цикле углерода. С ним ас-
социирован завершающий этап анаэробного распада органики при дефиците таких терминальных
акцепторов, как сульфат или нитрат. Не менее 1% растительной биомассы, образующейся в резуль-
тате фотосинтетической ассимиляции неорганического углерода, ежегодно превращается в 109 т
метана. По примерным расчетам, в морских осадках и толще вечной мерзлоты хранятся колоссаль-
ные залежи метана (до 1013 т) в виде твердых газогидратов. За последнее столетие концентрация
атмосферного метана возросла почти в 2,5 раза, что усилило парниковый эффект и привело к
глобальному потеплению.

Значение метаногенов также заключается в том, что они окисляют водород и ацетат, предот-
вращая их вредное накопление в анаэробных экосистемах.

Существуют два способа метаногенеза— «автотрофный» («гидрогенотрофный»)
и «гетеротрофный».

Облигатно гидрогенотрофные метаногены используют СО2/Н2, а также
физиологические эквиваленты этой пары субстратов —СО/Н2О или форми-
ат НСОО~/Н+. К ним относятся представители порядков Methanobacteriales,
Methanococcales, Methanomicrobiales и Methanopyrales.

Факультативно гетеротрофные метаногены обладают более широкими метаболи-
ческими возможностями. Они также могут использовать СО2/Н2, но при дефиците
водорода получают восстановитель благодаря окислению Сi-субстратов— метанола,
метилированных аминов и метилированных тиолов. Кроме того, они могут окис-
лять Сг-субстрат — ацетат. Одноуглеродные соединения окисляются с образовани-
ем восстановленной формы коэнзима F420 (см. ниже), а электроны, полученные при
окислении ацетата, восстанавливают ферредоксин. К этой группе относятся пред-
ставители порядка Methanosarcinales.

Применительно к метаногенезу в литературе часто используются два термина —
«метановое брожение» и «углекислотное дыхание».

Они оба ошибочны. Метаногенез ни в коем случае нельзя считать метановым
брожением, хотя он и связан с интенсивным газообразованием, а также происходит
в анаэробных условиях. В отличие от цитозольных брожений, этот процесс частично
протекает на уровне СМ, и энергия первично ассимилируется не путем фосфорили-
рования АДФ на уровне субстрата, а в форме Pmf и Smf.

В свою очередь, метаногенез нельзя называть углекислотным дыханием, по-
скольку диоксид углерода не служит терминальным акцептором электронов для
электрон-транспортной цепи. На самом деле СО2 при помощи цитозольных фермен-
тов восстанавливается в конструктивном пути до метильной группы, и на это расхо-
дуется Pmf. И все же метаногенез попадает под определение дыхания — электроны
от окисляемых субстратов передаются эндогенному акцептору (гетеродисульфиду)
через электрон-транспортную цепь, локализованную в СМ, а энергия ассимилиру-
ется в форме Pmf и Smf.

В отличие от дыхания хемогетеротрофов, при котором субстрат окисляется ци-
тозольными дегидрогеназами, в метаногенезе участвуют и мембраносвязанные де-
гидрогеназы — гидрогеназа и дегидрогеназа монооксида углерода. Кроме того, при
метаногенезе используется не экзогенный, а эндогенный терминальный акцептор
электронов. Но суть процессов, происходящих в экзергонической фазе дыхания и
метаногенеза, одна и та же.

Метаногенез — это особый тип анаэробного дыхания, когда акцептором элек-
тронов служит эндогенный гетеродисульфид, образующийся в комплексном пути
энергетического и конструктивного метаболизма, побочным продуктом которого
является метан.

Таким образом, метаногенез представляет собой тесно взаимосвязанную систему
реакций конструктивного и энергетического метаболизма.

Образование богатого энергией метана (стандартная энтальпия полного окисле-
ния метана составляет -882 кДж-моль-1), который не используется самими мета-
ногенами, производит впечатление процесса, расточительного с биоэнергетической
точки зрения.

Действительно, промежуточные этапы биосинтеза метана, начиная с акцепти-
рования углекислоты, представляют собой эндергонические реакции. Однако «цель
оправдывает средства» — на завершающем этапе метаногенеза, когда часть метиль-
ных групп переносится на СоМ, а затем восстанавливается до метана, археи получа-
ют возможность ассимилировать энергию, освобождающуюся при окислении экзо-
генного донора электронов (в частности, водорода). Остальные метильные группы
используются при автотрофном биосинтезе ацетата в «пути Вулфа» (см. раздел
13.3.1).

Благодаря тому, что одна из групп архей в ходе эволюции приобрела гетероди-
сульф идредуктазу, возник глобальный механизм, обеспечивающий отток электро-
нов при анаэробном окислении водорода или монооксида углерода. За счет способ-
ности не только синтезировать, но и расщеплять ацетат гетеротрофные метаноге-
ны регулируют уровень накопления этого ключевого метаболита в анаэробных эко-
системах.

Биохимия метаногенеза во многом уникальна, и в первую очередь это касается
используемых коферментов.

Одни из них играют роль переносчиков С i-группы в разной степени
восстановленности — от формила до метила (рис. 116). К ним относятся ме-
танофуран (англ, methanofuran, MF), тетрагидрометаноптерин (англ, tetrahy-
dromethanopterin, Н4МРТ) и 2-меркапто-этансульфонат, или коэнзим М (англ.
2-mercaptoethanesulfonate, СоМ).

Другие кофакторы играют роль доноров электронов (рис. 117). Это 5-
деазафлавин, или коэнзим F420 (англ. 5-deazaflavin), 7-меркапто-гептаноил-треонин-
фосфат, или коэнзим В (англ. 2-mercaptoheptanoylthreonine phosphate, СоВ) и мета-
нофеназин (англ, methanophenasine, МР).

Еще совсем недавно MF, Н4МРТ, СоМ и F420 считали уникальными для метаногенеза. Однако
в последнее время выяснилось, что они могут участвовать в реакциях генерального и специали-
зированного метаболизма у других прокариотов и даже у эукариотов. Примерами служат сераза-
висимый археот Archaeoglobus fulgidus, бактерии Methylobacterium extorquens, Mycobacterium sp.,
Nocardioides simplex, Rhodococcus rhodochrous, Streptomyces sp., Synechococcus sp. и Xanthobacter
sp., а также зеленая водоросль Scenedesmus acutus.

Мы уже упоминали Н4МРТ в связи с одним из двух путей окисления формиата у
метилотрофной бактерии М. extorquens (см. раздел 11.4.4.2). Поскольку некоторые
ЩМРТ-зависимые ферменты метилотрофов и метаногенов (например, циклогидро-
метанофуран (MF)

N-карбокси-МР

N-формил-МР

CHO HN—Rj

тетрагидрометаноптерин (H4MPT)

N-формил-НдМРТ

Ы-метинил-Н4МРТ

Ы-метилен-Н4МРТ

ГП	ITM—

N-метил-Н4МРТ

коэнзим M (CoM-SH)

Рис. 116. Кофакторы, используемые для переноса Ci-группы при метаногенезе и окислении
формал 1.ДС1 ида.

R — 4,5-дикарбоксиоктандиоил-глутамил-глутамил-парааминоэтил-феноксиметил; Ri —
фенил-рибитил-рибитилфосфат-гидроксиглутарат (фенил-рибитил-рибитил в случае окисления
формальдегида).
коэнзим F420

коэнзим В (CoB-SH)

Рис. 117. Кофакторы, используемые для переноса электронов при метаногенезе.

R— рибитилфосфат-лактил-глутамил-глутамат. Пунктирной рамкой выделен обрати-
мо восстанавливающийся участок в сопряженной трициклической системе.

лаза) взаимно гомологичны, в ходе эволюции они могли быть переданы от архей к
бактериям путем «горизонтального» переноса генов.

Автотрофный, или гидрогенотрофный метаногенез. Данный процесс про-

текает в соответствии с суммарным уравнением:

С02 + 4Н2 -4 СН4 + 2Н2О.

Система реакций автотрофного метаногенеза, или «цепь Вулфа» (R. S. Wolfe)
состоит из четырех сопряженных циклов (рис. 118).

Цикл I. MF спонтанно акцептирует молекулу СО2, в результате чего образуется
N-Kap6oKCH-MF.

N-Kap6oKCH-MF восстанавливается в М-формил-МР. Катализатором служит
мембраносвязанная М-формил-МР-дегидрогеназа, которая получает электроны
co

Vho

2e|

>

CH.

Hdr
2e

MF

N-карбокси-МР

-Pmf
H2O
N-формил-МР

F43o H4MPT

Шб

Hd

S-метил-

Ы-формил-Н4МРТ

CoB-SH

Ша A

N-метини л-Н4МРТ

CoM-SH р-метил-Н4МРу._2е-	Frh

Pmf

Smf N-метилен-

2e

H4MPT

H



© n

Frh H2

Puc. 118. «Гидрогенотрофный» путь метаногенеза. I, II, Ша и Illb — промежуточные циклы.

MF — метанофуран; Vht, Frh и Vho — гидрогеназы; Pmf — протонный градиент; Smf — натри-
евый градиент; F420 — коэнзим F420; СоМ — коэнзим М; СоВ — коэнзим В; F430—коэнзим F430;
Hd — гетеродисульфид; Hdr — гетеродисульфид-редуктаза; 1 — М-формил-МГ-дегидрогеназа; 2 — N-фор-
мил-метанофуран:Н4МРТ-формилтрансфераза; 3 — циклогидролаза; 4 — М-метилен-ШМРТ-дегидроге-
наза; 5 — М-метилен-ЩМРТ-редуктаза; 6 — М-метил-ЩМРТгСоМ-ЗН-метилтрансфераза; 7 — S-метил-
СоМ-редуктаза.

от мембраносвязанной гидрогеназы. В этой эндергонической реакции (ДС?0' =
16 кДж-моль-1) расходуется Pmf или Smf.

N-форми л-MF-дегидрогеназа, выделенная из Methanosarcina barkeri, состоит из пяти субъ-
единиц и в качестве простетических групп использует несколько [Ее484]-кластеров, а также мо-
либденовый кофактор — MGD (см. рис. 109). Гены, кодирующие этот фермент, образуют оперон
fmdEFACDB. Субъединица FmdB содержит молибденовый активный центр и один [Рв434]-кластер;
с субъединицей FmdF связаны восемь [Ре434]-кластеров.

Водород окисляется мембраносвязанной гидрогеназой, которую кодирует оперон vht. Ее гемсо-
держащая субъединица VhtC через серию [Ге4 34]-кластеров, расположенных на субъединице FmdF
М-формил-МЕ-дегидрогеназы, передает электроны каталитической субъединице FmdB. Поскольку
редокс-потенциал субъединицы FmdF ниже, чем редокс-потенциал субъединицы VhtC, происходит
«обращенный» транспорт электронов: VhtC + е_ —► FmdF (источником энергии для этого служит
Pmf или Smf).

Многие гидрогенотрофные метаногены могут использовать в качестве субстра-
та для метаногенеза не только водород, но и формиат (представители порядка
Methanosarcinales такой способностью не обладают):

4 НСООН СН4 + ЗСО2 + 2Н2О.

Формиат окисляется с помощью мембранной формиатдегидрогеназы, имеющей
большое сходство с формиатдегидрогеназой Fdh-N (см. раздел 11.4.6.2). Этот фер-
мент состоит из амфипатических субъединиц, простетическими группами которых
служат молибдоптерин и [Ре434]-кластеры. При окислении формиата образуется вос-
становленная форма коэнзима F420, а также молекула СО2, поступающая в основной
путь метаногенеза.

Цикл II. N-формил-МР передает формильную группу другому переносчику —
Н4МРТ.

Данную реакцию катализирует растворимая ^формил-метанофуран:Н4МРТ-
формилтрансфераза (англ. formylmethanofuran:H4MPT formyltransferase, Ftr). Ее
единственная субъединица молекулярной массой 32 кДа не имеет гомологов сре-
ди всех известных ферментов.

N-формил-ЩМРТ с помощью растворимой N-метинил-ЩМРТ-циклогидрола-
зы (англ. methenyl-H4MPT cyclohydrolase, Meh) превращается в Х-метинил-Н4МРТ.
Первичная структура единственной субъединицы этого фермента молекулярной
массой 35 кДа уникальна.

Затем N-метинил-ЩМРТ с помощью растворимой N-метилен-ЩМРТ-дегидро-
геназы (англ. methylene-H4MPT dehydrogenase, Mdh) восстанавливается в N-
метилен-Н4МРТ.

Наконец, N-метилен-ЩМРТ с помощью растворимой N-метилен-ЩМРТ-редук-
тазы (англ. methylene-H4MPT reductase, Мег) восстанавливается в №метил-Н4МРТ.
Ее единственная субъединица гомологична белкам, входящим в суперсемейство «де-
азафлавинзависимых» дегидрогеназ других архей и ряда бактерий.

На обоих этапах ферментативного восстановления кофактором служит де-
азафлавин F42o (редокс-потенциал -360 мВ). Он получает электроны от раство-
римой «восстанавливающей F42o» гидрогеназы Frh, которая кодируется опероном
frhADGB. Большая каталитическая субъединица FrhА содержит железоникелевый
центр, лигандированный консервативными мотивами R-X-C-X-X-C-X-X-X-H (на
N-конце) и D-P-C-X-X-C-X-X-H/R (на С-конце). Малая каталитическая субъеди-
ница FrhG содержит два-три [Ее484]-кластера. Субъединица FrhB связывает F42o и
один [Ре434]-кластер.

Цикл Ша. N-метил-ЩМРТ передает метильную группу терминальному пе-
реносчику — восстановленной форме СоМ (CoM-SH). Катализатором этой реак-
ции служит мембраносвязанная Х-метил-Н4МРТ:СоМ-ЗН-метилтрансфераза (англ.
methyl-H4MPT:CoM-SH-methyltransferase, Mtr). В состав этого фермента входят:

—	гидрофобные субъединицы MtrB (12 кДа), MtrC (24 кДа), MtrD (20 кДа),
MtrF (12 кДа) и MtrG (13 кДа);

—	амфипатические субъединицы MtrE (28 кДа) и MtrH (34 кДа);

—	амфипатическая субъединица MtrА (23 кДа), с которой связаны две простети-
ческие группы 5-гидроксибензимидазолил-кобамида, или витамина В12 (см. рис. 80).
Редокс-потенциал пары Со3+/Со+ составляет -426 мВ. По последним данным, ме-
тилтрансфераза также содержит [Ре434]-кластер с редокс-потенциалом -215 мВ.
Данная реакция экзергонична (&G°' = — 29 кДж-моль-1), причем свободная энер-
гия ассимилируется в форме Smf.

Полученный СНз—S-CoM подвергается восстановительному деметилированию.
Катализатором этой реакции служит растворимая S-метил-СоМ-редуктаза (англ.
metyl-S-CoM reductase, Мег). Она представляет собой гексамер «2/^272 молекулярной
массой 300 кДа и в качестве простетических групп содержит две молекулы никель-
порфиноида F43o (рис. 119).
соон

Рис. 119. F430, или никельпорфиноид (кофактор S-метил-СоМ-редуктазы).

Особенностью коэнзима F430 является то, что это самый восстановленный из всех
биологически важных металпорфиноидов, т. е. он содержит наименее протяженную
систему двойных связей (рис. 120).

Предполагается, что коэнзим F430 образует промежуточное никельорганическое
соединение с СН3—S-CoM и донором электронов — восстановленной формой СоВ

Рис. 120. Биологически важные метал порфиноиды. Система сопряженных двойных
связей выделена жирной линией.

А — хлорофилл; Б—протохлорофиллид; В — гем цитохромов; Г — сирогем; Д — кор-
риноид; Е — никельпорфиноид.
(CoB-SH). Продуктами этой реакции являются молекула СН4 и гетеродисульфид
CoB-SS-CoM (англ, heterodisulfide, Hd).

Цикл Шб. На заключительном этапе гетеродисульфид Hd восстанавливается
мембранным донор:гетеродисульфид-оксидоредуктазным комплексом. В этой экзер-
гоничной реакции (ДС0' = —40 кДж-моль-1) свободная энергия ассимилируется в
форме Pmf, и регенерируются CoB-SH и CoM-SH.

Донор:дисульфид-оксидоредуктазный комплекс (рис. 121) состоит из трех функ-
циональных блоков:

—	гетеродисульфид-редуктазы;

—	метанофеназинного пула;

—	электрон-донорной системы.

Гетеродисульфид-редуктаза представляет собой гетеродимер субъединиц HdrD
и HdrE (сокр. англ, heterodisulfide reductase; 50 и 25 кДа). Каталитическая субъ-
единица HdrD использует в качестве коферментов два [Ге484]-кластера с ре-
докс-потенциалами -100 и -400 мВ. Субъединица HdrE представляет собой ци-
тохром, содержащий два гема Ь, редокс-потенциалы которых составляют -23 и
-180 мВ.

Механизм действия гетеродисульфид-редуктазы аналогичен механизму действия
цитохром ЬсЦЬв/)-комплекса, или Q-циклу (см. раздел 10.4.6). При переносе элек-
тронов от высокопотенциального гема Ь к функциональному аналогу хинона — ме-
танофеназину— из цитоплазмы поглощаются протоны. Когда восстановленный ме-
натофеназин отдает электроны низкопотенциальному гему Ь, протоны высвобожда-
ются в экзоплазму. Стехиометрия этого процесса составляет Н+/е~.

Метанофеназинный пул получает электроны от донорной системы (железонике-
левой гидрогеназы или Е42о-зависимой гидрогеназы) и восстанавливает гетероди-
сульфид-редуктазу.

Донором электронов при гидрогенотрофном метаногенезе служит «не восстанав-
ливающая F420» железоникелевая гидрогеназа (рис. 121). Она кодируется генами
vhoGAC и гомологична бактериальной uptake-гидрогеназе. Большая субъединица
(VhoA; 60 кДа) содержит каталитический железоникелевый центр, малая субъеди-
ница (VhoG; 40 кДа) связывает [Ее484]-кластер. Ген vhoC кодирует интегральный
дигемовый цитохром Ь-типа, который получает электроны от субъединиц VhoAG и
передает их метанофеназинному пулу.

Гетеротрофный метаногенез (метилотрофный вариант). При «метило-
трофном» метаногенезе донором электронов для гетеродисульфид-редуктазы слу-
жит протонтранслоцирующая Р42о-дегидрогеназа (рис. 121). Она гомологична бак-
териальной НАДН:хинон-оксидоредуктазе, или НАДН-дегидрогеназе-1. У метано-
генов М. barkeri и Methanolobus tindarius данный комплекс кодируется генным кла-
стером fpoABCDHIJKLMN0. Амфипатические структурные субъединицы FpoDBCI
имеют молекулярную массу 40, 22, 20 и 16 кДа. Ген пятой структурной единицы, пе-
риферического белка (37 кДа), расположенного на внутренней поверхности СМ, не
входит в состав/ро-оперона и находится в другом участке хромосомы. Субъединицы
FpoAHJKLMN расположены в гидрофобном ядре фермента и, видимо, образуют ка-
нал, по которому протоны из цитоплазмы транслоцируются в периплазматический
компартмент.

В качестве простетических групп F420-дегидрогеназа использует ФАД и несколь-
ко [Гв484]-кластеров. Связанный ФАД выполняет роль молекулярного «переключа-
теля» между двухэлектровным переносчиком F420 и одноэлектронными переносчи-
CM

Рис. 121. Факультативно гетеротрофный метаногенез. Суперкомплекс, состо-
ящий из гетеродисульфид-редуктазы и «восстанавливающей F420»
гидрогеназы (вверху), и суперкомплекс, состоящий из гетеродисуль-
фид-редуктазы и «не восстанавливающей F420» гидрогеназы (внизу)
(по: Deppenmeier et al., 1999).

HdrD и HdrE — субъединицы гетеродисульфид-редуктазы; VhoA, VhoC и
VhoG — субъединицы гидрогеназы; F420 — коэнзим F420; [Fe4S4]—железо-сер-
ный кластер; МР — метаноптерин; СоВ — коэнзим В; СоМ — коэнзим М; [Ni/Fe] —
водородокисляющий сайт.

ками—[Ге434]-кластерами, по цепи которых восстановительные эквиваленты пере-
даются метанофеназинному пулу.

Представители пор. Methanosarcinales получают восстановительные эквивален-
ты путем окисления С i-субстратов —метанола, метилированных аминов и метили-
рованных тиолов. Они в изобилии накапливаются на дне морей и солоноватых во-
доемов при анаэробном разложении мортмассы фитопланктона и водных растений,
содержащих осмопротекторы (бетаин, диметилсульфанил-пропионат, триметилами-
ноксид, производные холина и др.). Метанол частично используется в качестве ис-
точника одноуглеродной группы для образования метана, а частично окисляется с
выделением СО2:

ЗСН3ОН + 6Н+/бе- ЗСН4 + ЗН2О,

СН3ОН + Н20 -> С02 + 6Н+/6е-.
Суммируя две реакции, получаем:

4СН3ОН -> ЗСН4 + СО2 + 2Н2О.

Таким образом, при «метанольном» метаногенезе происходит диспропорциони-
рование четырех молекул метанола. Три из них восстанавливаются до метана, а
четвертая окисляется до СО2.

При восстановлении метанола метильная группа переносится на СоМ с участи-
ем растворимой метилтрансферазы, которая состоит из субъединиц MtaA, MtaB и
MtaC (последняя в качестве простетической группы содержит Ni-порфиноид F430;
см. рис. 119).

При окислении метанола его метильная группа в несколько этапов окисляется
до СО2. Для этого используются обратимые реакции восстановительного пути ме-
таногенеза. Однако на сей раз они идут в окислительном направлении:

—	М-метил-Н4МРТ:СоМ-ЗН-метилтрансферазная реакция осуществляется с ис-
пользованием энергии Smf-,

—	при окислении М-метил-ЩМРТ и М-метилен-ЩМРТ регенерируется восста-
новленная форма коэнзима F42o;

—	на завершающем этапе при участии М-формил-МГ-дегидрогеназы образуется
С02 и регенерируется MF (последняя реакция сопряжена с ассимиляцией энергии
в форме Pmf и Smf).

При использовании других С i-субстратов — метилированных аминов и метили-
рованных тиолов — метильная группа с помощью корриноидзависимой метилтранс-
феразы Mtt в два этапа переносится на СоМ:

(CH3)3N + MttC - (CH3)2NH + CH3-MttC,

CH3-MttC + CoM-SH -» MttC + CH3-S-CoM.

Гетеротрофный метаногенез (ацетотрофный вариант). Представители по-
рядка Methanosarcinales могут получать восстановительные эквиваленты из ацета-
та. При этом основная часть биогенного метана образуется в результате суммарной
реакции:

СНзСООН СН4 + СО2.

Вначале ацетат активируется ацетокиназой, а затем с помощью фосфотрансаце-
тилазы превращается в ацетил-СоА:

СНзСОО- + АТФ -> СН3СОО~Р + АДФ,

СН3СОО~Р + CoA-SH - CH3CO~SCoA + Ф.

После этого СО-дегидрогеназа/ацетил-СоА-синтаза разрывает связь С-С и связь
C~S в молекуле CH3CO~SCoA. Этот фермент обладает обратимым действием и
может синтезировать ацетат из двух молекул СО2 (см. разделы 13.3.1 и 13.3.2).

При расщеплении ацетата электроны передаются ферредоксину, метильная груп-
па переносится на Н4МРТ, а карбонильная группа окисляется до СО2.

От ферредоксина электроны поступают на мембраносвязанную гидрогеназу Ech.
В ее состав входят интегральные субъединицы EchА и EchB, а также обращенные в
цитоплазму периферические субъединицы EchC-F. Субъединица EchE гомологична
большой субъединице бактериальной гидрогеназы VhoA и содержит железоникеле-
вый центр, а с субъединицами EchD и EchF связаны [РедЗ^-кластеры. Гидрогеназа
Ech через метанофеназинный пул взаимодействует с гетеродисульфид-редуктазой.

Сi-группа преобразуется в метан в ходе стандартных реакций восстановитель-
ного пути.

Различие механизмов ассимиляции энергии у облигатно гидрогено-
трофных и факультативно гетеротрофных метаногенов. Детали механизма
ассимиляции энергии у облигатно гидрогенотрофных метаногенов отличаются от та-
ковых у факультативно гетеротрофных представителей порядка Methanosarcinales.

Прежде всего, у облигатных гидрогенотрофов отсутствуют цитохромы Ь- и с-
типа — таким образом, гетеродисульфид-редуктаза не содержит геминовых групп, и
они функционально заменяются [Гв434]-кластерами. В качестве донора электронов
облигатные гидрогенотрофы используют мембраносвязанную Е42о-дегидрогеназу, а
не мембранную железоникелевую гидрогеназу. В свою очередь, терминальным доно-
ром электронов у них служит растворимая «восстанавливающая F420» гидрогеназа
Frh.

11.4.5.5. Эндогенный метилен-тетрагидрофолат:
биосинтез ацетата

Четвертый пример использования эндогенного органического акцептора при ды-
хании связан с ацетогенными бактериями.

Ацетат образуется при неполном окислении органических субстратов в ходе брожения. Этот
вопрос мы уже рассматривали в разделе 11.3.4.2. Кроме того, ацетат является побочным продуктом
неполного окисления органических субстратов при дыхании уксуснокислых бактерий.

Наряду с этим до 10% ацетата образуют ацетогенные бактерии, которые подразделяются на
две группы — «гомоацетогенные» и «автотрофные ацетогенные».

Гомоацетогенные бактерии (например, Moorella thermoacetica) используют в ка-
честве исходного субстрата целлюлозу или простые сахара и образуют из них ацетат
в результате двух суммарных реакций:

Глюкоза 2СН3СООН + 2СО2 + 8Н+/8е",

2СО2 + 8Н+/8е- СН3СООН + 2Н2О.

Первая реакция соответствует уксуснокислому брожению (гликолиз в сочетании
с образованием при помощи декарбоксилирующей пируват: ферредоксин-оксидоре-
дуктазы двух молекул ацетата из двух молекул пирувата; см. разделы 11.3.2.1 и
11.3.3). Вторая реакция соответствует восстановительному биосинтезу третьей моле-
кулы ацетата из двух молекул СО2 за счет 4Н+/4е~ (продукта гликолиза) и 4Н+/4е“
(продукта пируватферредоксин-оксидоредуктазной реакции). Суммирование этих
двух реакций дает итоговое уравнение гомоацетогенеза:

С6Н12О6 - ЗСНзСООН.

Автотрофные ацетогенные бактерии (например, Moorella thermoautotrophica)
восстанавливают СО2 молекулярным водородом:
2СО2 + 4Н2 СНзСООН + 2Н2О.

В качестве альтернативного окисляемого субстрата (а также источника углеро-
да) может использоваться СО.

Эти облигатно анаэробные бактерии живут в морских и пресноводных осад-
ках, почвах, затопленных полях, очистных сооружениях, а также в пищевари-
тельном тракте насекомых, жвачных животных и человека. Большинство из них
относится к филе ВХШ Firmicutes {Acetobacterium woodii, Acetogenium koivui,
Moorella thermoacetica, M. thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Sporomusa
ovata и др.).

К автотрофным ацетогенам можно причислить и некоторых сульфатредуциру-
ющих бактерий, например Acetitomaculum orumonis (фила ВХШ Firmicutes).

Автотрофные ацетогены играют важную роль в анаэробных деструктивных со-
обществах, особенно если в них ограничивается развитие сульфатредукторов. Кроме
того, они утилизируют СО2 и водород, которые образуются при сбраживании цел-
люлозы в пищеварительном тракте термитов и жвачных животных. В результате
ежегодно до 1,2-109 т ацетата поглощается кишечным эпителием, что обеспечивает
макроорганизмы дополнительным питанием.

Гибкая физиология позволяет многим автотрофным ацетогенам переключаться
на хемоорганогетеротрофию, а также окислять рекальцитрантные соединения, в том
числе лигнин и ксенобиотики.

При автотрофном ацетогенезе энергия первично ассимилируется в трех фор-
мах— Pmf, Smf и АТФ, а в «линейной» системе сопряженных реакций с тремя
встроенными циклами, или «пути Вуда-Льюнгдала» (Н. G. Wood-L. G. Ljungdahl),
из двух молекул СО2 образуется ацетил-СоА.

Сначала СО2 восстанавливается до формиата формиатдегидрогеназой, кофак-
тором которой является молибдоптерин MGD (см. рис. 109). Затем формиат акти-
вируется АТФ и при помощи N-формил-тетрагидрофолат-синтазы связывается с
тетрагидрофолатом (Щфолатом, рис. 122). Тетрагидрофолат является гомологом
тетрагидрометаноптерина и также служит переносчиком Сi-группы.

Цикл I. Х-метинил-Щфолат-циклогидролаза отщепляет от Х-формил-Щфолата
молекулу Н2О с образованием М-метинил-Щфолата (рис. 123). Затем N-метинил-
Щфолат восстанавливается М-метилен-Щфолат-дегидрогеназой в N-метилен-
Щ фол ат.

Х-метилен-Щфолат служит эндогенным акцептором электронов для N-метилен-
Щфолат-редуктазы, ассимилирующей энергию в форме Pmf Этот мембранный био-
трансформатор взаимодействует с менахинонным пулом и по механизму действия
аналогичен цитохром ЬсЦЬв/)-комплексу. Продуктом восстановления является
М-метил-Ндфолат.

На всех восстановительных этапах электроны поступают от молекулярного во-
дорода, который активируется мембраносвязанной гидрогеназой.

Цикл II. При помощи метилтрансферазы метильная группа, связанная с
Ндфолатом, передается железо-серному белку C/Fe-SP (от англ. corrinoid/Fe-sulfur
protein), содержащему в качестве простетической группы кобальт-порфиноид —
5-гидроксибензимидазолилкобамид (см. рис. 80).

При реакции трансметилирования свободная энергия ассимилируется в форме
Smf.
Н4фолат

Ы-формил-Н4фолат

Рис. 122. Тетрагидрофолат, используемый в качестве переносчика Ci-группы (в раз-
ной степени восстановленности) при ацетогенезе или окислении формальде-
гида.

R — бензоат-глутамил.

Ы-метинил-Н4фолат

Ы-метилен-Н4фолат

Ы-метил-Н4фолат
co2

l2

формиат
АТФ

Н4фолат

М-формил-Н4фолат

+Smf

C/Fe-SP

COD/AS

H2O

М-метинил-Н4фолат

(5) I <-2е Hyd

М-метилен-Н4фолат

М-метил-Н4фолат

метил-C/Fe-SP

метил-COD/AS

III

CoASH

[CO]

Н

Н.

l2

H2O

ацетил-СоА

АДФ-----

АТФ<----

ацетат

Рис. 123. Автотрофный путь ацетогенеза, или путь Вуда-Льюнгдала.

I—III — промежуточные циклы; Hyd — гидрогеназа; Pmf — протонный градиент;
Smf — натриевый градиент; [FenS„]—железо-серный кластер; C/Fe-SP — железо-серный
белок, содержащий корриноид в качестве простетической группы; COD/AS—де-
гидрогеназа оксида углерода/ацетил-СоА-синтаза; [СО] — карбонильная группа или
молекула монооксида углерода; СоА — коэнзим А; 1 — ГЧ-формил-Щфолат-синтаза;
2 — М-метинил-Н4фолат-циклогидролаза; 3 — М-метилен-Щфолат- дегидрогеназа; 4 —
М-метилен-Щфолат-редуктаза; 5 — метилтрансфераза.

Цикл III. Белок C/Fe-SP передает метильную группу СО-дегидрогеназе/ацетил-
СоА-синтазе (англ. COD/AS). Она образует ацетил-СоА, используя в качестве ко-
субстратов карбонильную группу [СО] и CoASH. Важнейшие свойства этого фер-
мента будут описаны в разделе 13.3.2.
Ацетил-СоА превращается в ацетилфосфат, в результате чего регенерируется
CoASH. Затем ацетилфосфат передает свой фосфорильный остаток АДФ, и в ре-
зультате субстратного фосфорилирования образуется АТФ. В конечном счете, неак-
тивированный ацетат покидает клетку.

На основе вышеизложенного можно дать следующее определение для механизма
хемолитотрофного синтеза ацетата.

Автотрофный ацетогенез — это комплекс реакций конструктивного и энерге-
тического метаболизма, когда в результате окисления водорода энергия ассими-
лируется в форме Pmf и Smf (путем N-метилен-тетрагидрофолатного дыхания
и трансметилирования), а также в форме АТФ (путем фосфорилирования АДФ
на уровне субстрата); в качестве побочного продукта образуется ацетат (из ме-
тильной группы и карбонильной группы).

Интересно, что биологический механизм синтеза ацетата сходен с каталитическим процессом,
который применяется в химической промышленности. Речь идет о так называемом «процессе Мон-
санто» (англ. Monsanto process; по названию лаборатории, где он был разработан). В качестве
исходного сырья используются метанол и монооксид углерода, а катализатором служит карбони-
лированный йодид родия RhJ2 (рис. 124). Вначале метанол реагирует с йодистым водородом и пре-
вращается в йодистый метил. Затем йодистый метил связывается с карбонилированным родиевым
катализатором. После этого к ним присоединяется монооксид углерода. В результате миграции ме-
тильной группы образуется ацетильно-родиевый интермедиат, который распадается на йодистый
ацетил и свободный катализатор. Наконец, после гидролиза йодистого ацетила образуются ацетат
и йодистый водород.

Таким образом, в промышленности ацетил образуется на родиевом катализаторе (в природе
это железоникелевый кофактор СО-дегидрогеназы), а его переносчиком служит йодид (в природе
это СоА).

сн3-с

Н2О

СН3-С

Rh(CO)I2 СН31
\ Н2О

СНз С Rh(CO)I3

СН3ОН

СН3- Rh(CO)L
СО

CH3-Rh(CO)2I3

Рис. 124. Схема реакций, используемых в производственном процессе Monsanto для
химического синтеза ацетата (по: Ragsdale, 1991).

На этом мы заканчиваем обзор важнейших органических акцепторов электро-
нов, которые используются дыхательной цепью бактерий и архей, и переходим к
неорганическим акцепторам.

11.4.6. Неорганические акцепторы электронов

Природные ресурсы неорганических акцепторов электронов для дыхательной це-
пи гораздо шире и богаче, чем ресурсы органических акцепторов. Однако даже они
никогда не бывают в избытке — например, содержание доступного кислорода слу-
жит лимитирующим фактором для энергетического метаболизма. Поэтому к ис-
пользованию неорганических акцепторов привлекаются клеточные системы с раз-
ным уровнем сложности.

Простейшая стратегия адаптации к неорганическому акцептору электронов —
это экспрессия дублирующих кислородредуктаз, и позже мы рассмотрим это явле-
ние на примере Azotobacter vinelandii.

Одним из наиболее курьезных решений проблемы неорганического акцептора
электронов является запасание впрок в том случае, если его источник находит-
ся на значительном удалении от клетки. Уникальным примером служат перио-
дические «вылазки» серной бактерии Thioploca chileae за нитратом, который на-
капливается в нитратной вакуоли (см. I том учебника). Такая стратегия основа-
на уже не на экспрессии отдельной молекулярной системы, а требует сложного
комплекса структурно-функциональных, регуляторных и локомоторных приспособ-
лений.

11.4.6.1.	Аэробные терминальные кислородредуктазы
(терминальные оксидазы)

В современной биосфере важнейшим из неорганических акцепторов электронов
является молекулярный кислород, который активируется с помощью терминальных
кислородредуктаз.

Терминальные кислородредуктазы (терминальные оксидазы) — это наиболее от-
ветственные компоненты аэробной дыхательной цепи, поскольку от них зависит
к.п.д. аэробного дыхания.

Терминальные оксидазы восстанавливают молекулу О2 с образованием двух мо-
лекул Н2О. Для этого используются четыре электрона, полученные от периплазма-
тического одноэлектронного донора («высокопотенциального» цитохрома или желе-
зопротеина) или от мембраносвязанного двухэлектронного донора (хинола), а также
четыре протона:

О2 + 4е" + 4Н+	2Н2О.

Окислительно-восстановительная реакция сопряжена с переносом еще четырех
протонов из цитоплазматического компартмента в периплазматический, в результа-
те чего создается Pmf.

Большинство терминальных оксидаз бактерий и архей принадлежит к суперсе-
мейству геминовых медьсодержащих кислородредуктаз. Его представители разли-
чаются по составу белковых субъединиц (чаще всего их две — I и II, хотя бывает
четыре), а также простетических групп и металлических кофакторов. Кроме того,
они используют разные доноры электронов.

Для обозначения кислородредуктаз применяют буквенные индексы, обозначаю-
щие тип гема в составе фермента, что дает разные полигемовые комбинации — аа^,
&2, Ьаз, ЬЬз, сааз, сЬЬз и т. д. (см. раздел 10.4.1 и рис. 70).

Наиболее консервативной и важнейшей в функциональном отношении является
субъединица I. Она содержит две простетические группы, лигандированные кон-
сервативными остатками His в положениях 94, 276, 325, 326, 411 и 413. Одна про-
стетическая группа представляет собой гем, другая — уникальный биметаллический
центр, состоящий из гема и катиона меди (отсюда название «геминовые медьсодер-
жащие кислородредуктазы»). Гем передает электроны биметаллическому центру, в
котором и происходит ферментативная реакция.
Медьсодержащие кислородредуктазы можно подразделить на два типа — Сох и FixP.

Кислородредуктазы Cox-типа (от англ, cytochrome oxidase) содержат субъединицу I и допол-
нительную субъединицу, которая состоит из одной-двух трансмембранных спиралей и перифери-
ческого домена. К этому типу кислородредуктаз принадлежат цитохром с-оксидаза ааз и HiPIP-
оксидаза, окисляющая «высокопотенциальные» железопротеины. Периферический домен их до-
полнительной субъединицы связывает бинуклеарный медный кластер и в некоторых случаях гем.
К медьсодержащим кислородредуктазам Сох-типа принадлежит и хинолоксидаза. Перифериче-
ский домен ее дополнительной субъединицы лишен простетических групп. Примером хинолокси-
даз служит кислородредуктаза о, ее субъединица I содержит гемы 6555 и 6562. Этот фермент часто
называют «цитохромом о», что приводит к терминологической путанице — буква «о» обозначает
не тип гема, а служит сокращением от слова «кислород» (англ, oxygen). Данный фермент выпол-
няет роль главной кислородредуктазы в клетках, растущих при высоком парциальном давлении
кислорода.

Кислородредуктазы FixP-типа (название происходит от гена их дигемовой субъединицы —
fixP), или цитохромоксидазы сЬЬз сильно дивергировали с кислородредуктазами Сох-типа. По-
мимо субъединицы I в их состав входят две дополнительные субъединицы, которые связывают
соответственно гем с и два гема Ь. Эти ферменты обнаружены только у некоторых пурпурных
бактерий, а также у хемотрофных бактерий из родов Bacteroides, Cytophaga и Flexibacter.

Цитохром с-оксидаза ааз. У бактерий и архей цитохром с-оксидаза ааз со-
стоит из трех субъединиц— «каталитической» субъединицы CoxI, «донорной» субъ-
единицы CoxII и субъединицы СохШ, одновременно выполняющей «якорную» и
регуляторную функции (рис. 125). Их молекулярная масса 30-60 кДа, и они содер-
жат несколько трансмембранных доменов, соединенных гидрофильными шпилька-
ми, выступающими на обе поверхности мембраны. Цитохромоксидаза ааз содержит
четыре кофактора — гем а, гем аз, бинуклеарный медный кластер Спдх2 и моно-
нуклеарный медный кластер Сив-

Каталитическая субъединица I связывает три кофактора (гем а, гем аз и Сив).
Консервативные остатки His определяют пространственное расположение металла.
Донорная субъединица II содержит два кофактора Сид, которые непосредственно
взаимодействуют с растворимым цитохромом с. На стыке субъединиц I и II лока-
лизуются два вспомогательных кофактора—Са2+ и Mg2+. Якорная субъединица
СохШ не обладает ни простетическими группами, ни металлическими кофактора-
ми.

При ферментативной реакции активный центр аз /Сив получает через гем а два
электрона от кластера Сид х 2 и присоединяет к себе молекулярный кислород. По-
следний восстанавливается до пероксида, который в виде аддукта сохраняет связь
с ферментом, пока не восстанавливается в две молекулы воды. Этот процесс вклю-
чает в себя промежуточную стадию образования дважды протонированного трех-
электронного продукта с разорванной связью между атомами кислорода. Молекулы
воды in statu nascendi лигандируются катионом Mg2+, расположенным на расстоя-
нии 13А от активного центра.

Протоны, необходимые для образования воды, поступают из цитоплазмы. Другие
протоны переносятся в экзоплазматическое пространство. Стехиометрия процесса
составляет Н+/е_.

В общих чертах известно, как цитохром с-оксидаза ааз восстанавливает кислород и создает
Pmf. Внутри субъединицы CoxI находятся два канала для протонов — К и D (рис. 125). «Суб-
стратные» протоны (от англ, water — вода), которые используются для образования воды,
проходят по каналу К. «К» соответствует кодовому обозначению лизина (остаток Lys-362 выпол-
няет в этом транспортном процессе ключевую роль). В свою очередь, «осмотические» протоны
Нр (от англ, pumping — перекачивание) поступают по каналу D. «D» соответствует кодовому обо-
значению аспарагиновой кислоты (остаток Asp-132 выполняет ключевую роль в создании Рт/).
CM

цитоплазматический
компартмент

Рис. 125. Цитохром с-оксидаза ааз (по: Mills et al., 1998).

CoxI, CoxII и СохШ — белковые субъединицы; Сид и Сиц — медные
центры; К и D — каналы для транспорта протонов; II (у— протон, кото-
рый используется для образования молекулы воды; Нр — протон, который
транслоцируется в периплазматический компартмент.

На дне канала D расположен остаток Glu-286, который служит «выпускным клапаном» для про-
тонов.

Механизм сопряжения окислительно-восстановительной реакции с переносом протонов через
мембрану неизвестен. В частности, не установлено, где именно расположен канал для выхода про-
тонов.

Возможны два варианта механизма сопряжения: прямой и непрямой. В первом случае по ана-
логии с работой Q-цикла перенос протонов связан с (де)протонированием редокс-сайтов или их
лигандов. Во втором случае он происходит без участия редокс-сайтов или их лигандов и вызван
дистанционными конформационными изменениями в апопротеинах.

Термоацидофильный археот Sulfolobus acidocaldarius, принадлежащий к филе AI
Crenarchaeota, обладает гибридной терминальной кислородредуктазой SoxABCD.
У субъединиц этого фермента существуют гомологи и в составе цитохром с-оксидазы
ааз, и в составе цитохром bci(be/)-комплекса.

В то время как бактерии и археи используют разные варианты кислородредуктаз
Cox-типа, митохондрии содержат только цитохром с-оксидазу ааз  В нее входят до
13 субъединиц (напомним, что ее прокариотные аналоги содержат не более четырех
субъединиц). Высокогидрофобные крупные субъединицы I—III кодируются геномом
самой органеллы. Малые, менее гидрофобные субъединицы (5-15 кДа) кодируются
ядерным геномом и выполняют регуляторную роль.

Кислородредуктаза bd. Как мы уже говорили, большинство терминальных
оксидаз прокариотного типа, в том числе митохондриальная цитохром с-оксидаза,
принадлежит к суперсемейству медьсодержащих кислородредуктаз, которые пере-
носят протоны со стехиометрией Н+/е~.
Помимо них существуют гетерологичные, не содержащие меди терминальные
оксидазы, которые создают Pmf в отсутствии переноса протонов. В настоящее вре-
мя из ферментов данной группы охарактеризованы не чувствительные к цианиду
цитохром ^(/-комплексы Е. coli и Azotobacter vinelandii.

Цитохром М-комплекс Е. coli состоит из двух субъединиц (36 и 48 кДа). Более
крупная из них (субъединица I) состоит из семи интегральных доменов и обладает
сайтом для связывания восстановленного убихинона-8. Она содержит простетиче-
скую группу — гем 6558 (+150 мВ), которую лигандируют консервативные остатки
His-19 и His-186. Меньшая по размеру субъединица II состоит из восьми интеграль-
ных доменов. С ней связаны две простетические группы —гем 6595 (+150 мВ), иг-
рающий роль промежуточного переносчика электронов, и гем d (+250 мВ), который
непосредственно реагирует с молекулярным кислородом.

Цитохром 6^-комплекс действует как хинолоксидаза. При окислении QH2 на
экзоплазматической поверхности мембраны освобождаются два протона (рис. 126).
В свою очередь, для восстановления молекулы кислорода до двух молекул воды
из цитоплазмы заимствуются четыре протона. Таким образом, когда цитохром bd-
оксидаза. переносит через мембрану четыре электрона, четыре протона появляются в
экзоплазме и четыре протона удаляются из цитоплазмы, что эквивалентно трансло-
кации протонов со стехиометрией Н+/е-; при этом возникает «положительный сна-
ружи» трансмембранный электрохимический потенциал величиной около +180 мВ.

СМ

цитоплазматический
компартмент

Рис. 126. Кислород редуктаза bd (по: Jiinemann, 1997).

Q — хинон.

Дублирующие кислородредуктазы и разветвленные дыхательные це-
пи. Бактерии часто имеют больше, чем одну терминальную оксидазу, которые
функционально дублируют друг друга. Благодаря альтернативной экспрессии ок-
сидаз клетки адаптируются к разной концентрации кислорода. При одновременной
экспрессии оксидаз поток электронов к кислороду от донора — хинола, цитохрома
или HiPIP — разделяется, в результате чего дыхательные цепи становятся разветв-
ленными.

Физиологический смысл дифференциальной экспрессии кислородредуктаз, обла-
дающих разным сродством к молекулярному кислороду, заключается в том, чтобы
дыхание происходило и при низком, и при высоком содержании акцептора электро-
нов. Кроме того, кислород восстанавливается до воды, что предотвращает накопле-
ние его токсичных радикалов, вызывающих окислительный стресс (это называется
«дыхательной защитой»). В частности, кислородредуктаза bd обладает очень высо-
ким сродством к кислороду, и с ее помощью бактерии могут ассимилировать энер-
гию в микроаэробных условиях. При мутационной потере цитохром &</-комплекса
Е. coli лишается дыхательной защиты и приобретает повышенную чувствительность
к окислительному стрессу.

Диазотрофная бактерия A. vinelandii обладает самой активной дыхательной це-
пью. Это позволяет не только снабжать нитрогеназу энергией, но и предохраняет
фермент от инактивации кислородом. Кислородредуктаза bd этой бактерии актив-
нее синтезируется при сильной аэрации. Дублирующая ее кислородредуктаза о, на-
против, доминирует при недостатке кислорода. Интересно, что у Е. coli наблюдается
противоположный паттерн регуляции — биогенез кислородредуктазы bd индуциру-
ется в микроаэробных условиях, тогда как кислородредуктаза о преимущественно
образуется при высоком парциальном давлении кислорода.

Экспрессия кислородредуктаз bd и о контролируется глобальными системами ре-
гуляции аэробного и анаэробного дыхания — Аге и Fnr. При кислородном голодании
Е. coli активность кислородредуктазы bd изменяется не так сильно, как активность
кислородредуктазы о — в первом случае она возрастает в два-три раза, а во втором
случае в 100-200 раз.

11.4.6.2.	Анаэробные терминальные редуктазы

Современная биосфера существует при сочетании локальных макро- и микро-
ниш, где накапливается молекулярный кислород и устанавливаются динамические
градиенты его концентрации (или он отсутствует).

Большинство прокариотов, населяющих аэрируемую поверхностную зону суши и
водоемов, принадлежит к аэробам. В свою очередь, большинство аэробов использует
при дыхании молекулярный кислород, и он активируется кислородредуктазами (см.
раздел 11.4.6.1).

Оказавшись в аноксичных условиях, аэробы испытывают кислородный стресс,
при котором индуцируются альтернативные дыхательные системы. Главную роль в
них играют анаэробные дыхательные редуктазы. Эти ферменты не только активи-
руют молекулы терминального неорганического или органического акцептора, слу-
жащие ловушкой для электронов, но и способствуют ассимиляции энергии в форме
Рт/.

Помимо дыхательных аэробов и факультативных дыхательных анаэробов суще-
ствует множество дыхательных анаэробов. Успехи «подводной» и «подземной» мик-
робиологии перечеркнули старею точку зрения о пространственном доминировании
аэробных ниш, а также о том, что аэробы преобладают в спектре биоразнообразия
прокариотов и численно доминируют над анаэробами. Однако из-за методических
трудностей анаэробные бактерии и археи изучены хуже, чем аэробные.

Дыхательные анаэробы довольно редко ограничиваются только одним типом
терминального акцептора — они способны переключаться с одного акцептора на дру-
гой в зависимости от их присутствия и концентрации во внешней среде.

Среди терминальных неорганических акцепторов, используемых дыхательны-
ми анаэробами, есть широко распространенные, например «классические» нитрат
и сульфат. Однако встречаются и «экзотические» акцепторы, например теллурит.

Несмотря на неравноценное значение терминальных неорганических акцепторов,
все они с помощью бактерий вовлекаются в глобальный геохимический круговорот.

Некоторые токсичные акцепторы, в частности селенат, в результате дыхания
обезвреживаются, что имеет большое значение для биоремедиации.

Наконец, бактерии, дышащие металлами или оксианионами металлоидов, имеют
практическое значение как источники сырья для электронной промышленности.

Нитратное дыхание. В анаэробных условиях некоторые бактерии переходят
на нитратное или на нитритное дыхание.

При нитратном дыхании нитрат восстанавливается в нитрит с помощью дыха-
тельной нитратредуктазы:

NO3 + 2е~ + 2Н+ -> NO7 + Н2О.

Существуют два типа дыхательных нитратредуктаз — периплазматическая нит-
ратредуктаза Nap (от англ, nitrate reductase, periplasmic) и мембраносвязанные нит-
ратредуктазы NarGHI и NarZYV (от англ, nitrate reductase).

Периплазматическая дыхательная нитратредуктаза Nap состоит из субъединиц
NapA (75 кДа) и NapB (15 кДа). Ее кофакторы —молибдоптерин, [Ре434]-кластеры
и гемы с. Функция этого фермента, получающего электроны от хинонов при посред-
стве амфипатического тетрагемового цитохрома с (NapC), заключается в поддержа-
нии редокс-гомеостаза при переходе к анаэробному росту.

Мембраносвязанная дыхательная нитратредуктаза NarGHI входит в состав нит-
ратзависимой дыхательной цепи, которая изучена на примере Е. coli и Paracoccus
denitrificans. Она состоит из двух функциональных блоков — донорного, или фор-
миатдегидрогеназы (см. раздел 11.4.4.2), и акцепторного, или дыхательной нит-
ратредуктазы. Они взаимодействуют друг с другом с помощью менахинонного пула
(рис. 127).

Формиатдегидрогеназный блок сходен по составу субъединиц с мембраносвязан-
ной формиатдегидрогеназой Fdh-N и содержит такие же кофакторы (см. раздел
11.4.4.2). Однако по сравнению с ней он зеркально ориентирован в СМ и не восста-
навливает менахинон, а окисляет его.

Мембраносвязанная нитратредуктаза NarGHI состоит из следующих субъединиц
(рис. 127):

—	периферической а-субъединицы (125 кДа; ген narG), которая содержит один
[Ре434]-кластер и два кофактора MGD (см. рис. 109);

—	амфипатической /3-субъединицы (50 кДа; ген пагН), которая содержит четыре
[Ее484]-кластера или один [Рез34]-кластер и три [Рв484]-кластера;

—	интегральной 7-субъединицы с пятью трансмембранными спиралями (20 кДа;
ген narl), которая содержит гемы 6ц (от англ, low potential; +20 мВ) и Ьц (от англ,
high potential; +120 мВ), лигандированные остатками His в положениях 55, 66, 187 и
205 и расположенные соответственно на периплазматической и цитоплазматической
стороне СМ.

СМ

FdhA FdhB FdhC

Nari NarH NarG

цитоплазматический
компартмент

Рис. 127. Суперкомплекс, состоящий из формиатдегидрогеназы (вверху) и «дыха-
тельной» нитратредуктазы (внизу) (по: Jormakka et al., 2003).

Nari, NarH и NarG — субъединицы нитратредуктазы; FdhA, FdhB и FdhC — субъеди-
ницы формиатдегидрогеназы; MGD — молибдоптерин-гуанидин-динуклеотид; [Fe4S4] —
железо-серный кластер; MQ — менахинон.

Гены narGHI сгруппированы на хромосоме Е. coli в локусе chlC вместе с другими структур-
ными и регуляторными генами метаболизма нитрата. В частности, ген narJ кодирует шаперон
(25 кДа), ответственный за созревание и сборку субъединиц NarGHI. Продуктом гена патК яв-
ляется интегральный белок, обеспечивающий экскрецию токсичного нитрита. Гены narL и пагХ
кодируют белки двухкомпонентной сигнальной системы, участвующей в нитрат/нитрит-зависимой
регуляции генной активности.

Механизм взаимодействия формиатдегидрогеназы Fdh-N и нитратредуктазы
NarGHI схематически представлен на рис. 127. Электроны, полученные при окис-
лении формиата (-420 мВ) А-субъединицей FdhN, восстанавливают менахинон
(-75 мВ), который расположен на цитоплазматической стороне мембраны. При
этом из цитоплазмы поглощаются два протона. Восстановленный менахинон диф-
фундирует на периплазматическую сторону мембраны, окисляется 7-субъединицей
NarGHI и отдает два протона в периплазматический компартмент. Электроны через
/3-субъединицу NarGHI переносятся на а-субъединицу, молибденовый центр кото-
рой восстанавливает нитрат в нитрит с поглощением двух протонов из цитоплазма-
тического компартмента. В данном случае два компонента Pmf —электрический
и осмотический — создаются при действии электрон-протонофорной окислительно-
восстановительной петли.

Помимо NarGHI, энтеробактерия Е. coli образует вторую мембраносвязанную
дыхательную нитратредуктазу NarZYV, которая также состоит из субъединиц а/Зу
и также использует в качестве кофактора молибдоптерин. Она синтезируется в
небольшом количестве независимо от парциального давления кислорода и исполь-
зуется при переходе к анаэробному росту.

Нитритное дыхание: дыхательная аммонификация нитрита. Нитрит, об-
разующийся при нитратзависимом дыхании, далее используется при нитритзависи-
мом дыхании. При этом он может восстанавливаться в аммиак или в молекулярный
азот:

NO? NH+,
NO7 ->->-* N2.

Первый процесс называется «дыхательной аммонификацией нитрита», а вто-
рой — «дыхательной денитрификацией». Они никогда не осуществляются одновре-
менно одним и тем же микроорганизмом.

Дыхательная аммонификация нитрита отличается от дыхательной денитрифи-
кации тем, что при ней нитрит превращается в аммиак за один этап, без образования
свободных промежуточных продуктов. Электроны от окисляемого субстрата, глав-
ным образом формиата или Н2, переносятся на дыхательную нитритредуктазу через
менахинонный пул.

Дыхательная аммонификация нитрита и дыхательная денитрификация имеют
глобальное значение. В первом случае связанный азот переходит из более подвиж-
ной формы в менее подвижную, поскольку катион аммония сильнее связывается
почвенными коллоидами, чем анионы нитрата или нитрита. Во втором случае азот
благодаря диазотрофии возвращается в биологический цикл.

Индуцибельная нитритзависимая дыхательная цепь изучена на примере анаэ-
робной бактерии W. succinogenes. Она состоит из донорного и акцепторного блоков.
Акцепторный блок — это нитритредуктаза, а донорный блок — это формиатдегидро-
геназа (см. раздел 11.4.4.2) или гидрогеназа (см. раздел 11.4.4.4). Подобно донорно-
му и акцепторному блокам нитратредуктазы, они сопрягаются через менахинонный
пул и заякориваются в СМ при помощи цитохромов Ь и с (рис. 128). Центры для
окисления формиата или водорода, а также центры для восстановления нитрита
ориентированы в периплазматический компартмент. Электрический и осмотический
компоненты Pmf создаются при действии электрон-протонофорной петли.

Дыхательная нитритредуктаза катализирует реакцию восстановления нитритно-
го аниона:

N07 + 6Н+/6е- + 2Н+ NH++ 2Н2О.

По аналогии с дыхательной нитратредуктазой, дыхательная нитритедуктаза бы-
вает периплазматической и мембраносвязанной.

Периплазматическая дыхательная нитритредуктаза Nir (от англ, nitrite reduc-
tase), или цитохром cd 1-нитритредуктаза представляет собой растворимый димер
идентичных субъединиц NirS, содержащих гемы с и d±. Этот фермент получает элек-
троны от хинонов с помощью интегрального тетрагемового цитохромома с (NirT).
Подобно периплазматической нитратредуктазе, функция периплазматической нит-
ритредуктазы заключается в поддержании редокс-гомеостаз а при переходе к анаэ-
робному росту.
CM

MQ MQH2

2H+

NrfA NrfH
2Н<

no; + ------

8Н+ Л гем с

гем с

nh4 +

2Н2О

<1

MQH2 MQ

[Ni/Fe] [Fe4SJ Д."”*

2Н

2Н

х2

«2

HydB HydA HydC

цитопл азматиче ский

компартмент

Рис. 128. Суперкомплекс, состоящий из формиатдегидрогеназы (сверху), «дыхательной» нитритре-
дуктазы (посередине) и гидрогеназы (снизу) (по: Simon, 2002).

NrfA и NrfH — субъединицы нитритредуктазы; FdhA, FdhB и FdhC — субъединицы формиатдегидро-
геназы; HydB, HydA и HydC — субъединицы гидрогеназы; MGD — молибдоптерин-гуанидин-динуклеотид;
[Fe4S4] — железо-серный кластер; MQ — менахинон; [Ni/Fe] — водородокисляюгций сайт.

Мембраносвязанная дыхательная нитритредуктаза Nrf (от англ, nitrite reducing
factor), или цитохром с-нитритредуктаза состоит из периферической и интеграль-
ной субъединиц. Периферическая субъединица NfrA (45 кДа) представляет собой
цитохром с552, который содержит пять ковалентно связанных гемов. Она синтези-
руется в виде препротеина с сигнальной последовательностью из 22 аминокислотных
остатков и доставляется в периплазматический компартмент при помощи генераль-
ной экспортной Sec-системы. Атом железа первой геминовой группы лигандирован
остатком Lys-134, входящим в состав мотива С-Х-Х-С-К. Каждый атом железа
второй-пятой геминовой группы лигандирован двумя остатками His. Порфириновые
кольца второй и третьей геминовой группы, а также четвертой и пятой геминовой
группы взаимно перпендикулярны и образуют «локоть» (англ, diheme elbow motif).
Порфириновые кольца третьей и четвертой геминовой группы взаимно параллель-
ны и сложены в «стопку» (англ, heme stacking motif). Активный центр субъединицы
NfrA получает электроны от субъединицы NfrH и восстанавливает нитрит в аммиак
с образованием связанных интермедиатов —NO и NH2OH.

«Якорная» субъединица NrfH (20 кДа) представляет собой тстрагемовый ци-
тохром с; геминовые группы лигандируются остатками His, которые входят в мо-
тив С-Х-Х-С-Н. Она относится к амфипатическим цитохромам, которые передают
электроны от хинонного пула растворимым или периферическим оксидоредуктазам.
В эту группу цитохромов также входят ранее упомянутые тетрагемовый цитохром
NapC (донор электронов для периплазматической нитратредуктазы) и цитохром
NirT (донор электронов для периплазматической нитритредуктазы).

«Нитритредуктазная» формиатдегидрогеназа FdhABC в случае W. succinogenes
имеет такую же структуру, как «нитратредуктазная» формиатдегидрогеназа Fdh-N,
имеющаяся у Е. coli. Периферическая каталитическая субъединица FdhA содержит
молибдоптерин и [РедЗ^-кластер; амфипатическая субъединица FdhB три или че-
тыре [Ве484]-кластера и один [Вез84]-кластер. Интегральная «якорная» субъединица
FdhC представляет собой дигемовый цитохром Ь и восстанавливает менахинон.

«Нитритредуктазная» гидрогеназа является членом суперсемейства мембрано-
связанных uptake NiFe-гидрогеназ (см. раздел 11.4.4.4). Фермент состоит из перифе-
рической субъединицы HydB, амфипатической субъединицы HydA и интегральной
субъединицы HydC. На субъединице HydB расположен никелевый центр, окисляю-
щий водород. Субъединица HydA содержит три [Неп8п]-кластера и передает электро-
ны от субъединицы HydB субъединице HydC. «Якорная» субъединица HydC пред-
ставляет собой дигемовый цитохром Ь; она состоит из четырех трансмембранных
спиралей и содержит сайт для восстановления менахинона. Структурные субъеди-
ницы HydABC кодируются первыми тремя генами оперона hydABCDE. Продукт
четвертого гена hydD, по-видимому, является протеазой, которая участвует в про-
цессинге субъединицы HydB. Функция продукта пятого гена hydE неизвестна.

Дыхательнаья денитрификация. В результате этого процесса, проходящего в
три этапа, нитрит превращается в молекулярный азот:

NO2 —> NO —► N2O N2.

Ферменты, катализирующие эти этапы (NO-образующая нитритредуктаза, ре-
дуктаза NO и редуктаза N2O), последовательно индуцируются при переходе к анаэ-
робиозу.

При дыхательной денитрификации регистрируются промежуточные газообраз-
ные продукты — окись азота NO и закись азота N2O. В последнее время эти соедине-
ния привлекают повышенный интерес как разрушители озонового экрана. Наряду с
диоксидом углерода и метаном они выполняют роль парниковых газов (англ, green-
house gas), задерживающих инфракрасное излучение, что служит одной из причин
глобального потепления. Кроме того, NO является ключевым сигнальным субстра-
том у млекопитающих, хотя влияние микробных симбионтов на его содержание в
макроорганизме не показано.

Наконец, дыхательная денитрификация представляет интерес в связи с акту-
альными задачами биоремедиации. Если аэрация в очистных сооружениях поддер-
живается на низком уровне, то накопление нитрата может привести к анаэробной
эвтрификации. Однако с помощью дыхательной денитрификации азот удаляется из
сточных вод и поступает в атмосферу.

Механизм дыхательной денитрификации изучен на примере Achromobacter су-
cloclastes, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas aureofaciens и ряда других грамот-
рицательных бактерий.

Как и при дыхательной аммонификации нитрита, дыхательной денитрификации предшествует
образование нитрита. Еще недавно предлагались две конкурирующие гипотезы о механизме его
дальнейшего восстановления.
Согласно первой гипотезе, NO^" превращается в N2O с помощью нитритредуктазы без образо-
вания NO в качестве свободного интермедиата (прямой путь).

Согласно второй гипотезе, нитритредуктаза и редуктаза окиси азота последовательно превра-
щают NO^ в NO и N2O (непрямой путь). В настоящее время с применением биохимических и
генетических методов доказано, что верна именно она, и NO действительно служит не только
обязательным, но и важнейшим интермедиатом дыхательной денитрификации.

Нитритредуктазы Nir, участвующие в дыхательной денитрификации, отличаются от выше-
рассмотренных «аммонифицирующих» мембранных нитритредуктаз и представляют собой медь-
содержащие белки (36 кДа). Это либо гомотримеры, либо гомодимерные дигемовые цитохромы
cd 1-типа (60 кДа). В обоих случаях Nir локализованы в периплазматическом компартменте.

Редуктаза окиси азота (англ, nitric oxide reductase, Nor) представляет собой мем-
браносвязанный гетеродимер (гены погС и погВ), который действует аналогично
цитохром &С1-комплексу и в ходе восстановительного превращения NO —> N2O транс-
лоцирует протоны со стехиометрией 0,5H+/NO.

Редуктаза закиси азота (англ, nitrous oxide reductase, Nos) восстанавливает N2O
в N2. Этот фермент локализован в периплазматическом компартменте.

Кислородная регуляция анаэробного дыхания. Ключевую роль в генетической регуля-
ции энтеробактерий и псевдомонад играет однокомпонентный регулятор транскрипции — Fnr (от
англ, fumarate and nitrate reductase regulation). Этот регуляторный белок может действовать как
главный активатор генов анаэробного дыхания, как репрессор генов аэробного метаболизма и как
авторепрессор.

Регулятор Fnr представляет собой растворимый белок, снабженный [Ге434]-кластером и актив-
ный в димерной форме. Его мономер (30 кДа) состоит из:

—	«сенсорного» N-концевого домена (50 аминокислотных остатков);

—	аллостерического центрального домена (содержит сайт Gly-85 для активации РНК-
полимеразы и сайт Asp-154 для димеризации);

-	ДНК-связывающего С-концевого домена.

[Ге434]-кластер имеет редокс-потенциал -700 мВ и окисляется молекулярным кислородом с
образованием [Рез34]-кластера или [Гв232]-кластера, которые сохраняют связь с апопротеином, од-
нако уже не могут обеспечить его димеризацию. Если контакт с кислородом продолжается, то
простетическая группа отщепляется от апопротеина. Напротив, после восстановления железосер-
ного кластера неактивный мономер изменяет свою конформацию, димеризуется и приобретает
способность взаимодействовать с ДНК.

Сайт в ДНК для связывания регуляторного белка Fnr, или «Fnr-бокс» образован инверти-
рованным повтором TTGAT. .. АТСАА, который соседствует с Fnr-активируемыми промоторами.
Запуск транскрипции обеспечивается не только прямым связыванием Fnr с этим локусом ДНК, но
и белок-белковым взаимодействием между сайтом Gly-85 центрального домена Fnr и субъединицей
570 РНК-полимеразы. В результате этих взаимодействий каскадно активируется транскрипция ге-
нов анаэробного метаболизма. При негативной регуляции (например, происходящей в отношении
гена ndh НАДН-дегидрогеназы II, авторегулируемого гена fnr и др.) Fnr-бокс находится слишком
близко от промотора, и Fnr аллостерически блокирует РНК-полимеразу.

Нитратная и нитритная регуляция анаэробного дыхания. Е. coli обладает двумя гомо-
логичными и взаимодействующими друг с другом двухкомпонентными сигнальными системами,
которые регулируют нитрат- и нитритзависимую экспрессию генов. Они состоят из проводников
сигнала (NarX и NarQ) и регуляторов ответа (NarL и NarP).

Белки NarX и NarQ реагируют на присутствие соответственно нитрата и нитрита в периплазма-
тическом компартменте. Они обладают характерной для сенсорных киназ топологией — на N-конце
полипептидной цепи находятся два трансмембранных домена, разделенные периплазматическим
доменом из 120 аминокислотных остатков. Трансмембранные домены состоят из гидрофобных
субдоменов по 20 аминокислотных остатков, фланкированных полярными субдоменами из 20 ами-
нокислотных остатков. На С-конце полипептидной цепи находится большой цитоплазматический
домен из 420 аминокислотных остатков. При взаимодействии «P-боксов» периплазматических до-
менов белков NarX и NarQ с анионами NO^" и NO^" изменение конформации передается через
трансмембранный домен соответствующим цитоплазматическим доменам, которые в результате
этого автофосфорилируются по консервативным остаткам His-399 или His-370. Фосфорилирован-
ные проводники сигнала NarX и NarQ, в свою очередь, фосфорилируют по остаткам Asp-59 раство-
римые регуляторы ответа NarL и NarP (25 кДа). В результате этого регуляторы ответа изменяют
свою конформацию и приобретают способность связываться с регуляторными участками оперо-
нов-мишеней, а также непосредственно взаимодействовать с РНК-полимеразой. Обратная связь
обеспечивается фосфатазной активностью белков NarX и NarQ. Она по-разному проявляется в
отношении NarL~P и NarP~P и зависит от присутствия в окружающей среде анионов NO; и
NO;.

Регулятор транскрипции Nar влияет на экспрессию не менее 12 оперонов, в том числе — на
экспрессию оперона формиатдегидрогеназы (JdnGHI), фумаратредуктазы (frdABCD'), периплаз-
матической нитратредуктазы (парАВС) и мембраносвязанной нитратредуктазы (narGHIJ).

Хлоратное и перхлоратное дыхание. Оксианионы хлората СЮ; и перхло-
рата СЮд , в которых хлор находится в степени окисления соответственно +5 и +7,
являются более эффективными акцепторами электронов, чем молекулярный кисло-
род. Например, изменение свободной энергии ДС?О/ при реакциях:

СН зСОО" + 4/ЗСЮ3 + ОН- -> 2НСО; + Н2О + 4/ЗС1-,
ОН 3СОО- + 2О2 + ОН- -> 2НСО3 + Н2О

составляет соответственно -132 и -110 кДж-(моль электронов)-1.

Оксианион хлората СЮ; имеет искусственное происхождение и попадает в окружающую сре-
ду вместе с отходами текстильной и бумажной промышленности, а также с бытовыми сточными
водами, которые содержат отбеливающие средства. Хлорат токсичен для многих водных растений.
Оксианион перхлората СЮ;, за исключением уникальных минеральных залежей в Чили, также
имеет искусственное происхождение и загрязняет окружающую среду в результате производства
боеприпасов, ракетного топлива, осушителей и пестицидов. Его присутствие в питьевой воде на-
рушает образование тиреоидных гормонов и приводит к смертельным патологиям костного мозга.
Поэтому способность ряда бактерий устранять хлорат и перхлорат имеет важное значение для
биоремедиации.

В настоящее время выявлен ряд хемогетеротрофных бактерий, которые исполь-
зуют оксианионы С1(+5) и С1(+7) в качестве терминальных акцепторов электронов
при дыхании:

С1О7 + 6Н+/6е- Cl" + ЗН2О,
СЮ; + 8Н+/8е- -> С1- + 4Н2О.

Самыми распространенными из них являются Dechloromonas agitata, Dechloro-
soma suillum, Ideonella dechloratans (класс «Betaproteobacteria») и Wolinella succino-
genes (класс «Epsilonproteobacteria»).

Хлоратное и перхлоратное дыхание наблюдается у одних и тех же бактерий
и обеспечивается соответствующими редуктазами, по-видимому, сходными с нит-
ратреду ктазой.

Загрязнение среды оксианионами хлора началось не более 100 лет назад, и уди-
вительно, насколько быстро бактерии приобрели способность использовать их при
дыхании. Предполагается, что в основе хлоратредуктазной и перхлоратредуктазной
систем лежит модифицированная нитратредуктазная система, гены которой были
приобретены от штаммов Pseudomonas путем «горизонтального» переноса.

Сульфатное дыхание. Бактерии и археи, восстанавливающие сульфат, ши-
роко распространены в илах, а также в симбиотических анаэробных нишах. Они
являются ключевым звеном природного цикла серы. При сульфатном дыхании мо-
гут окисляться неорганические и органические субстраты, прежде всего водород и
ацетат.
Ацетотрофные сульфатредукторы, в частности Desulfobacterium sp., Desulfoccus
sp. и Desulf о sarcina sp. действуют по аналогии с ацетотрофными метаногенами (см.
раздел 11.4.5.4) — расщепляют ацетил-СоА при помощи СО-дегидрогеназы. Продук-
ты этой реакции, метильная и карбонильная группа, окисляются через дыхательную
цепь.

Раньше считали, что сульфатредуцирующие прокариоты способны окислять
только очень узкий круг органических веществ. Однако в настоящее время установ-
лено, что их субстратами служат многие ароматические соединения и ксенобиотики.

Мезофильные аспорогенные представители этой группы бактерий относятся в
первую очередь к роду Desulfovibrio. Дыхание у них называют «сульфатным», од-
нако на самом деле нужно говорить «сульфатзависимое», поскольку терминальным
акцептором электронов служит не сульфат, а его активированное производное —
аденозинфосфосульфат (АФС).

АФС (см. рис. 111) образуется в эндергонической реакции, которая катализиру-
ется цитоплазматической сульфат-аденилил-трансферазой (АТФ-сульфурилазой):

SO^“ + АТФ -> АФС + ФФ.

Следом за этим АФС восстанавливается дыхательной АФС-редуктазой до суль-
фита, а сульфит восстанавливается дыхательной сульфитредуктазой до сульфида:

АФС + 2Н+/2е-	80з“ + Н2О + АМФ,

SO^- + бН+/6е~ -> S2" + ЗН2О.

Донорами электронов в обеих восстановительных реакциях могут быть моле-
кулярный водород, катионы металлов переходной валентности (например, Fe3+), а
также органические субстраты (лактат, пируват, углеводороды и др.).

АФС-зависимая дыхательная цепь Desulfovibrio sp. служит типичным примером
системы мембранной ассимиляции энергии с помощью экстрацитоплазматического
окисления «простых» субстратов (см. раздел 10.4.7).

АФС-зависимая дыхательная цепь Desulfovibrio sp. схематически представлена
на рис. 129. Первичным источником электронов для восстановления АФС служит
молекулярный водород, который окисляется гидрогеназой.

Периплазматическая гидрогеназа существует в растворимом виде или связана
с наружной поверхностью СМ. Она представляет собой гетеродимер большой (62
кДа) и малой (28 кДа) субъединиц и содержит каталитический центр с атомом
никеля, а также один [РезЗ^-кластер или два [Ге484]-кластера. Значительно реже
встречаются периплазматическая Fe-гидрогеназа и Ni/Fe/Se-гидрогеназа. Гидроге-
наза непосредственно или через растворимый тетрагемовый цитохром сз передает
электроны комплексу Ншс (от англ, heme multisubunit complex), который служит
центральным звеном дыхательной цепи и сопрягает гидрогеназную реакцию с АФС-
редуктазной реакцией.

В состав /zmc-оперона входят гены, кодирующие белок Нтс (55 кДа) и пять
открытых рамок считывания — Orf2 (40 кДа), Orf3 (43 кДа), Orf4 (6 кДа), Orf5
(25 кДа) и Orf6 (53 кДа). Белок Нтс состоит из четырех молекул тетрагемового
цитохрома сз. Субъединица Orf2 — это трансмембранный редокс-белок, содержащий
один [Гез84]-кластер и три [Ге484]-кластера. Субъединицы Orf3 Orf5 представляют
собой интегральные белки, лишенные простетических групп. Наконец, субъединица
Рис. 129. Сульфатзависимая дыхательная цепь (по: Voordouw, 1995).

Orf2, Orf3, Orf4, Orf5 и Orf6 — субъединицы аденозинфосфосульфат-редуктазы и суль-
фитредуктазы; Нтс— эпимембранный 16-гемовый цитохром с; сз — растворимый тет-
рагемовый цитохром с; Hyd — гидрогеназа; [Fe4S4] —железо-серный кластер.

Orf6 —это периферический белок, расположенный на внутренней поверхности СМ
и содержащий несколько [Fe4S4]-K ластеров.

От белка Нтс электроны передаются белку Orf6 (через мембраносвязанные субъ-
единицы Orf3-Orf5 или через белок Orf2), а от него растворимым белкам — дыха-
тельной АФС-редуктазе или дыхательной сульфитредуктазе Dsr (от англ, dissimila-
tory sulfite reductase). Последняя представляет собой тетрамер, состоящий из двух
а-субъединиц (50 кДа; ген dsrА) и двух /3-субъединиц (40 кДа; ген dsrB). Просте-
тической группой служит сирогем (см. рис. 70). Гены dsrА В высококонсервативны
и, видимо, унаследованы бактериями и археями от общего предка-прогенота.

Серное дыхание. Способность восстанавливать элементную серу при дыха-
тельном окислении водорода или органических субстратов широко распространена
среди мезофильных и термофильных бактерий, а также среди гипертермофильных
архей.

Поскольку при умеренной температуре элементная сера S0 очень слабо растворя-
ется в воде (5 мкг-л-1 при 25°С), к наружной поверхности СМ вместо нее поступает
полисульфан (полисульфид), который образуется в результате нуклеофильной ата-
ки гидросульфида на циклические молекулы орторомбической серы, или серного
цвета:

S8 + HS- S?" + н+.

Таким образом, истинным акцептором электронов при серном дыхании является
не сера, а полисульфан. При взаимодействии с дыхательной цепью от него отщеп-
ляется атом серы, который восстанавливается до гидросульфида:

S?- + 2е" + Н+ -4	+ HS~.

Анаэробная дыхательная цепь, катализирующая восстановление полисульфана с
использованием водорода или формиата в качестве первичных доноров электронов,
изучена на примере W. succinogenes. Она состоит из двух мембраносвязанных фер-
ментов — полисульфанредуктазы Psr (от англ, polysulfane reductase) и гидрогеназы
или из полисульфанредуктазы и формиатдегидрогеназы (рис. 130). Каталитические
центры этих ферментов находятся на периплазматической поверхности СМ.

Рис. 130. Редуктаза серы (по: Hedderich et al., 1999).

HydBAC — субъединицы никельзависимой гидрогеназы; PsrABC —
субъединицы полисульфанредуктазы; Sud — сульфиддегидрогеназа;
MQi,—связанный менахинон; MGD — молибдоптерин-гуанидин-динук-
леотид.

Полисульфанредуктаза состоит из субъединиц PsrABC. Периферическая субъ-
единица PsrA (80 кДа) гомологична субъединицам молибденсодержащих оксидоре-
дуктаз, в частности субъединице FdhA формиатдегидрогеназы Е. coli. Ее просте-
тическими группами служат две молекулы молибдоптерина и один [Ее484]-кластер.
Амфипатическая субъединица PsrB (20 кДа) содержит четыре [ЕепЗп]-кластера. Ин-
тегральная «якорная» субъединица PsrC (35 кДа) представляет собой дигемовый
цитохром Ь.

«Полисульфановая» гидрогеназа — это та же HydBAC, которая участвует в нит-
ритном или фумаратном дыхании, а «полисульфановая» формиатдегидрогеназа —
та же Fdh, которая используется при нитратном, нитритном и фумаратном дыхании.

Механизм, с помощью которого при серном дыхании создается Pmf, неизвестен. По аналогии с
другими типами анаэробного дыхания, первичная дегидрогеназа должна быть сопряжена с редук-
тазой с помощью свободно диффундирующих молекул менахинона, однако проблема заключается
в том, что стандартный редокс-потенциал последнего выше, чем у полисульфана (соответственно
-75 и -260 мВ). Остается предположить, что при серном дыхании менахинон непосредственно вхо-
дит в состав комплекса Psr. Возможно, что якорная субъединица PsrC каким-то образом участвует
в передаче электронов от гидрогеназы к полисульфанредуктазе, используя менахинон в качестве
простетической группы, получающей электроны от субъединицы HydC.
С комплексом Psr тесно взаимодействует периплазматический белок Sud (от
англ, sulfide dehydrogenase), состоящий из двух идентичных субъединиц (14 кДа)
и не содержащий простетических групп. Он выполняет роль полисульфан:8°-
трансферазы — отщепляет от полисульфана атом серы, который попадает в актив-
ный центр Psr и там восстанавливается до гидросульфида.

Серное дыхание гипертермофильных архей мало изучено, однако известно, что
оно имеет ряд специфических черт. В частности, в состав дыхательной цепи Ру-
rodictium brockii входит железоникелевая гидрогеназа с двумя субъединицами (65
и 45 кДа), уникальный неидентифицированный хинон и мембранный цитохром с
(15 кДа). Терминальным акцептором электронов служит элементная сера, раствори-
мость которой в воде возрастает с повышением температуры. Сера диффундирует в
цитоплазму и через промежуточную стадию образования полисульфана восстанав-
ливается неидентифицированной редуктазой. В случае Р. abyssii комплекс H2:S°-
оксидоредуктазы состоит по меньшей мере из девяти субъединиц, в том числе из
двух цитохромов Ь и одного цитохрома с (30 кДа).

Селенатное дыхание. Селен — это металлоид, по химическим свойствам сход-
ный с серой.

Несмотря на его низкое содержание в земной коре (10-4%, 21-е место) селен распространен
очень широко и образует ряд минералов, например феррозелит. Антропогенными источниками
накопления селена становится сжигание сланцев, углей и нефти, а также загрязнение водоемов
пестицидами, отходами полупроводниковой промышленности и т. д. В качестве микроэлемента се-
лен входит в состав аминокислот селенометионина и селеноцистеина, а также служит кофактором
некоторых ферментов, например СО-дегидрогеназы. В то же время в концентрации свыше 10-6М
оксианионы селена вызывают смертельные отравления или врожденные уродства (тератогенное
действие). Оксианионы селена являются сильными окислителями. В частности, редокс-потенциал
пары SeO^/SeOg- равен +425 мВ, и как акцептор электронов селенат занимает промежуточное
положение между марганцем и нитратом.

Прокариоты восстанавливают селенат SeO^- в селенит SeO^- или селенит в эле-
ментный селен, что обезвреживает этот токсичный элемент и является важным эта-
пом его биогеохимического цикла:

Н2 + 8еОд~ —> Н2О + SeO^-, Д(9О' = —15,5 кДж-(моль электронов)-1,
ЗН2 + SeOg- —> ЗН2О + Se°, ДС0' = —8,9 кДж-(моль электронов)-1.

В настоящее время известно около 15 видов бактерий, которые окисляют мо-
лекулярный водород или органические субстраты, восстанавливая селенат в селе-
нит. К ним относятся, в частности, Thauera selenatis (класс «Betaproteobacteria») и
Sulfo spirillum barnesii (класс «Epsilonproteobacteria»), а также Bacillus arsenicosele-
natis и Desulfotomaculum auripigmentum (фила ВХП Firmicutes). Среди архей этим
свойством обладают некоторые термоацидофилы (фила AI Crenarchaeota), а также
экстремальные галофилы (фила АП Euryarchaeota).

Примером бактерии, которая восстанавливает селенит до элементного селена,
служит В. selenitireducens.

Селенат и селенит восстанавливаются соответствующими редуктазами дыха-
тельной цепи, расположенной в СМ. В результате образуются красные внеклеточные
микросферы (0,3 мкм) элементного селена, состоящие из цепочек по 3-12 атомов.
Похожие микросферы образуются в цитоплазме в результате восстановительной де-
токсикации селена (при высокой концентрации во внешней среде он неспецифически
импортируется при помощи сульфатпермеазы или нитратпермеазы).
Диссимиляционная селенатредуктаза Т. selenatis состоит из субъединиц а
(96 кДа), /3 (40 кДа) и 7 (23 кДа). В качестве кофакторов она использует молиб-
ден и |Ееп8п]-кластеры, а также геминовое железо (субъединица 7 — это цитохром
b-типа). Селенатредуктаза S. barnesii отличается от нее по субъединичному составу
(82, 53, 34 и 21 кДа), однако у нее тоже есть молибденовый кофактор.

Арсенатное дыхание. Как и селен, мышьяк по химическим свойствам сходен
с серой.

При низком содержании в земной коре (2-10-4%) мышьяк, тем не менее, является обычным
компонентом вулканических пород и морских осадков, а также образует ряд минералов, в част-
ности арсенопирит. Как и для селена, антропогенными источниками его накопления служит сжи-
гание сланцев, углей и нефти, загрязнение водоемов пестицидами и отходами полупроводнико-
вой промышленности и т. д. Оксианионы мышьяка очень токсичны и вызывают генерализованные
отравления — арсеникозы. Оксианионы мышьяка — хорошие окислители. Редокс-потепциал пары
AsO^/AsOg- равен +139 мВ, и как акцептор электронов арсенат занимает промежуточное поло-
жение между селенатом и сульфатом.

Прокариоты восстанавливают арсенатный (AsO^-) или арсенитный (AsO^-) ок-
сианион до мышьяка, что обезвреживает данный элемент и является важным этапом
его биогеохимического цикла:

4Н2 + AsO?-

ЗН2 + AsOg

4НгО + As0, AGO/ — —5,5 кДж-(моль электронов) \
—> ЗН2О + As0, AG0' = —2,6 кДж-(моль электронов)-1.

Большинство бактерий, восстанавливающих оксианионы мышьяка, способно вос-
станавливать и оксианионы селена. Многие из них анаэробно растут на природных
минералах мышьяка. В частности, это S. barnesii (класс «Epsilonproteobacteria»), а
также В. arsenicoselenatis и D. auripigmentum (фила BXIII Firmicutes'). Обособлен-
ное положение занимает единственный представитель филы BV Chrysiogenetes —
Chrysiogenium arsenatis.

Арсенат и арсенит восстанавливаются соответствующими редуктазами дыха-
тельной цепи, расположенной в СМ. Арсенатредуктаза S. barnesii содержит субъ-
единицы а (65 кДа), /3 (31 кДа) и 7 (22 кДа). По аналогии с селенатредуктазой, ма-
лая субъединица — это цитохром Ь-типа. Арсенатредуктаза С. arsenatis состоит из
двух субъединиц (87 и 29 кДа). В качестве кофакторов в обоих случаях используют-
ся молибден, цинк, геминовое железо и [Реп8п]-кластеры. Анализ аминокислотной
последовательности большой субъединицы арсенатредуктазы С. arsenatis показал
ее высокую гомологию с другими молибденсодержащими дыхательными фермента-
ми — полисульфидредуктазой W. succinigenes и формиатдегидрогеназой Е. coli.

В отличие от мембраносвязанных арсенатредуктаз, существуют растворимые
арсенатредуктазы, функция которых заключается в детоксикации проникшего в
клетку мышьяка путем его «холостого» окисления. Они кодируются хромосомным,
плазмидным или транспозонным опероном ars, в состав которого входят гены arsA
(АТФаза), arsB (экспортер арсенита), arsС (растворимая арсенатредуктаза), arsD
и arsR (регуляторные белки).

Теллуритное дыхание. По химическим свойствам теллур также сходен с се-
рой.

Содержание теллура в земной коре (210~7%) на три порядка меньше, чем мышьяка. В ви-
де элементного металлоида он сопровождает серу, а в валентном состоянии Te(IV) образует тел-
луритные минералы меди, свинца, серебра или сурьмы. Оксианионами теллура часто обогаще-
ны сточные воды промышленных предприятий. Оксианион теллурита (ТеОд-) обладает силь-
ными окислительными свойствами и токсичен для бактерий в концентрации >10 мкг мл-1.
В случае проникновения в клетку резистентные штаммы обезвреживают его путем экскреции, ме-
тилирования или комплексообразования. Квази-фототрофные бактерии, например Erythromicro-
Ыит ramosum, восстанавливают теллурит в инертный элементный теллур, игольчатые кристаллы
которого откладываются в цитоплазме:

ТеОд- + 6Н+/6е“ — Те0 + ЗН2О.

Эффективным способом детоксикации теллурита служит теллуритное дыхание,
к которому, в частности, способны Thermus thermophilus (фила BIV «Deinococcus-
Thermus»), Agrobacterium tumefaciens (класс «Alphaproteobacteria»') и Pseudomonas
aeruginosa (класс «Gammaproteobacteria»). Локализация образующихся микрокри-
сталлов элементного теллура зависит от того, как ориентирован активный центр
терминальной редуктазы (см. раздел 11.4.6.1). При использовании медьсодержащей
редуктазы Сох-типа (активный центр ближе к наружной поверхности СМ) и ре-
дуктазы М-типа (активный центр ближе к внутренней поверхности СМ) кристаллы
теллурита образуются соответственно в периплазматическом и цитоплазматическом
компартментах.

Считается, что свойство бактерий извлекать теллур из раствора и накапливать
его на поверхности или внутри клеток в будущем найдет применение при производ-
стве полупроводников.

Металзависимое дыхание. Изучая анаэробную ветвь цикла углерода, а также
учитывая окислительно-восстановительные свойства катионов железа и марганца,
исследователи в области микробной экологии и биоэнергетики уже давно склоня-
лись к мысли о том, что существуют бактерии, окисляющие органические субстраты
сопряженно с восстановлением металлов.

Первое доказательство было получено в конце 1980-х годов, когда из заилен-
ных почв и донных осадков была выделена факультативно анаэробная бактерия
Shewanella oneidensis, метаболизм которой относится к дыхательному типу. В каче-
стве терминального акцептора электронов она использует трехвалентное железо —
Fe(III) и четырехвалентный марганец —Mn(IV).

В дальнейшем оказалось, что «дышащие металлами» бактерии и археи явля-
ются существенным компонентом глобальной микробиоты. Они заселяют большин-
ство анаэробных ниш и выполняют роль ответственного звена в циклах биогенных
элементов. Большинство бактерий, осуществляющих диссимиляционное восстанов-
ление железа и марганца, относится к двум филам — BIX Deferribacteres и ВХП
Proteobacteria. Обладающие этим свойством археи принадлежат к филам AI Cren-
archaeota и АП Euryarchaeota.

В отличие от аэробного дыхания, когда акцептором электронов служит свободно
диффундирующий кислород, при дыхательном восстановлении железа и марганца
экзоплазматический терминальный акцептор находится в нерастворимом состоянии.
Это создает проблему «дистанционной» доставки электронов от поверхности СМ.

Цитохромзависимое восстановление Fe(III) и Mn(IV) у Geobacter sulfurreducens.
Основным средством, с помощью которого электроны доставляются к нераствори-
мым оксидам этих металлов, являются специализированные цитохромы. При ана-
лизе генома Geobacter sulfurreducens (класс «Deltaproteobacteria») была выявлена
генная дупликация, состоящая из двух кластеров, по три гена в каждом. Один из
них кодирует локализованный в ОМ полигемовый цитохром с-типа (ОшсВ), который
экспрессируется при росте на среде с Fe (III) и выполняет функцию железоредукта-
зы. Другой железоредуктазой является недавно обнаруженный у G. sulfurreducens
мультиферментный комплекс (300 кДа), ассоциированный с ОМ. В его состав входит
моногемовый цитохром с-типа FerA (90 кДа), имеющий редокс-потенциал -100 мВ,
что позволяет ему восстанавливать железо. В обоих случаях для восстановления
Fe(III) требуется периплазматический посредник, который сопрягает процессы, про-
исходящие на СМ и на ОМ. Роль такого посредника выполняет тригемовый цито-
хром су (ген ррсА), а также недавно обнаруженный у G. sulfurreducens цитохром Сз.
Последний не только восстанавливает Fe (III) при помощи цитохрома ОтсВ, но и
взаимодействует с альтернативными акцепторами электронов, к которым относятся
Mn(IV), молекулярный кислород и элементная сера (за счет мультивариантности
терминального участка дыхательной цепи может происходить адаптационная смена
дыхательных систем). Цитохром сз накапливается в количестве до 5% суммарно-
го клеточного белка и, имея небольшой размер, секретируется во внешнюю среду,
где его концентрация достигает 200 нМ. Этот переносчик способен восстанавливать
ферригидрит без участия цитохрома ОтсВ. Хотя такая стратегия расточительна,
она эффективна в том случае, если на поверхности оксида железа формируется
биопленка. В результате удается, во-первых, сконцентрировать молекулы восстанов-
ленного цитохрома Сз в ограниченном пространстве, а во-вторых, легко регенери-
ровать его окисленную форму. Внеклеточный цитохром Сз может выступать в роли
межвидового переносчика электронов в синтрофных ассоциациях. Примером слу-
жит совместный рост G. sulfurreducens и Wolinella succinogenes на среде с ацетатом
в качестве донора и нитратом в качестве акцептора электронов. Нитратредуктаза
W. succinogenes восстанавливает нитрат в результате окисления растворимого ци-
тохрома сз, который секретируется клетками G. sulfurreducens. Таким образом, ци-
тохром сз сочетает функцию железоредуктазы и функцию переносчика электронов
между электрон-транспортными цепями, принадлежащими разным бактериям.

Цитохромзависимое восстановление Fe(III) и Mn(IV) у Shewanella oneidensis.
Благодаря высокой пластичности своих метаболических путей представители ро-
да Shewanella (класс «Gammaproteobacteria») широко распространены в природных
экосистемах. Например, S. oneidensis использует в качестве донора электронов моле-
кулярный водород и разнообразные органические соединения (аминокислоты, лак-
тат, пируват, формиат и т. д.). Выбор среди акцепторов электронов также широк —
помимо Fe(III) и Mn(IV), восстанавливаются молекулярный кислород, нитрат, тио-
сульфат, фумарат, элементная сера, Cr(VI) и U(VI). По аналогии с представите-
лями рода Geobacter компоненты электрон-транспортной цепи, восстанавливающие
Fe(III) и Mn(IV), локализованы в обеих мембранах клеточной оболочки. В зависи-
мости от типа донора электроны поступают в энергетическую систему на уровне
той или иной дегидрогеназы - например, НАДН-дегидрогеназы или формиатде-
гидрогеназы. Следующий этап, приводящий к восстановлению Fe(III) и Mn(IV) —
это перенос электронов к менахинону, а он передает электроны цитохромам, кото-
рые либо связаны с СМ, либо находятся в периплазматическом пространстве, либо
входят в состав ОМ. В настоящее время описан ряд периплазматических цитохро-
мов, участвующих в восстановлении Fe(III) и Mn(IV) — цитохромы С4-типа (СутА,
MtrА) и цитохром сз-типа (CctA). В состав ОМ у S. oneidensis входят цитохро-
мы, выполняющие функцию железоредуктазы и марганецредуктазы (цитохром с,
ОтсА и ОтсВ). Для S. oneidensis получена серия точечных мутантов, у которых
избирательно подавлена функция одной из альтернативных редуктаз. Оказалось,
что можно заблокировать восстановление Fe(III), сохранив нормальную марганец-
редуктазную активность, и наоборот. Таким образом, несмотря на частичное пере-
крывание этих активностей, Fe(III) и Mn(IV) могут восстанавливаться совершенно
разными ферментами.

Железоредуктаза и марганецредуктаза связаны с ОМ, и поэтому нужна транс-
портная система, которая обеспечивает их секрецию в периплазматический ком-
партмент с последующей интеграцией в эту мембрану.

Установлено, что в экспорте железоредуктазы и марганецредуктазы участвует
специализированная Sec-зависимая секреторная система II (см. I том учебника).
Кроме того, у S. oneidensis в составе ОМ имеется белок MtrB, который сам по себе
не обладает редуктазной активностью, однако необходим для восстановления Fe(III)
и Mn(IV). При нарушении структуры гена mtrB две редуктазы — ОшсА и ОтсВ —
начинают встраиваться не в ОМ, а в СМ и неправильно ориентируются по отно-
шению к клеточной поверхности. Скорее всего, белок MtrB отвечает за интеграцию
обоих цитохромов в ОМ.

В середине 2005 г. пришло сообщение об уникальном дистанционном средстве доставки элек-
тронов на нерастворимые оксиды металлов «по проводам». Данные, полученные группой исследо-
вателей из Массачусеттского университета (США), свидетельствуют о том, что G. sulfurreducens
использует в качестве токопроводящего устройства адгезионные фимбрии (см. I том учебника). В
недалеком будущем с помощью генноинженерных методов можно будет контролировать физиче-
ские свойства этих органелл, их длину, а также уровень их экспрессии. Практическое использо-
вание жестких и ультратонких (3-5 нм X 10 мкм) самособирающихся нитей открывает большие
перспективы для наноэлектроники.

Восстановление металлов, входящих в состав растворимых оксиионов. В
1990 г. Н. Н. Ляликова выделила из сточных вод металлургических предприятий и из
морской воды на Курильских о-вах два новых вида факультативно анаэробных бак-
терий— «Pseudomonas vanadiumreductans» и «Р. isachenkovii» (класс «Gammapro-
teobacteria»), которые в качестве терминального акцептора электронов используют
пятивалентный ванадий. Восстановление ванадия до четырехвалентного и трехва-
лентного состояния протекает в две стадии. Сначала растворимый оксианион ме-
таванадата восстанавливается до растворимого оксикатиона ванадила, а затем из
ванадила образуется нерастворимый оксид ванадия:

VO3 + е" + 4Н+ -> VO2+ + 2Н2О,
2VO2+ + 2е" + Н2О -э V2O3 + 2Н+.

Окисляемыми субстратами служат сахара и аминокислоты, а также Н2 или СО.

Другим примером восстановления металлов, входящих в состав растворимых
оксиионов, служит реакция восстановления U(VI) в U(IV), которую обнаружил в
1991 г. американский бактериолог Лавли (D.Lovley). Ее осуществляют железовос-
станавливающие бактерии Alteromonas putrefaciens (класс «Gammaproteobacteria»)
и Geobacter metallireducens GS-15 (класс «Deltaproteobacteria»). Они распространены
в илах техногенных аномалий, приуроченных к разработкам этого редкого металла,
а также к отходам атомной энергетики. Шестивалентный уран в составе раство-
римого катиона уранила ио*+ или аниона диураната U2O(OH)22 превращается в
нерастворимый диоксид урана UO2. Донором электронов служит ацетат, и при реак-
ции освобождается вдвое больше энергии, чем при использовании железа в качестве
акцептора электронов:
СНзСОСГ + 4U(VI) + 4Н2О 4U(IV) + 2НСО3 + 9Н+.

Перевод урана в иммобилизованное состояние имеет большое практическое зна-
чение. С одной стороны, так формируются биогенные урановые руды, а с другой
стороны — из воды удаляются вредные примеси этого металла.

В свете современных проблем ремедиации большой интерес представляют бактерии, способ-
ные к диссимиляционному восстановлению таких высокотоксичных и подвижных металлов, как
Cr(VI) и Hg(II). Также привлекают внимание Ag(I)-, Au(III)-, Co(III)-, Cu(II)-, Mo(VI)-, Np(V)-,
Pd(II)-, Pu(IV)- и Тс(УИ)-редукторы. Однако все они очень слабо изучены, и связь дыхательного
метаболизма с восстановлением этих металлов, особенно актинидов и продуктов ядерного распада,
не доказана.

На этом мы завершаем тему хемотрофии и переходим к альтернативному типу
энергетического метаболизма — фототрофии.
ГЛАВА 12

ФОТОТРОФИЯ

Хлорофилловое зерно — тот фокус, та точка в ми-
ровом пространстве, где солнечный луч, превращаясь
в химическую энергию, становится источником всей
жизни на земле.

К. А. Тимирязев. Наука и демократия
(Москва, 1920)

Приступая к обсуждению темы, посвященной фототрофии, мы должны четко
разграничить два понятия — «фотосинтез» и «фототрофия». В первом случае речь
идет о комплексной ассимиляции световой энергии и неорганического углерода с
использованием неорганического донора электронов; для обозначения такого типа
питания существует более точный термин «фотолитоавтотрофия». Во втором случае
подразумевается только энергетическая составляющая метаболизма, связанного с
ассимиляцией световой энергии.

Особенность фототрофных биотрансформаторов заключается в том, что они пре-
образуют физический энергоноситель (кванты электромагнитного поля) в электро-
химический энергоноситель (Pmf). В отличие от лимитированных ресурсов химиче-
ского субстрата, от которых зависит хемотрофия, свет представляет собой практи-
чески неисчерпаемый абиогенный источник энергии. Именно он обеспечивает пер-
вичную продукцию в основании пищевой пирамиды.

При фототрофии электромагнитная энергия предварительно преобразуется в
химическую. Уникальность этого способа ассимиляции энергии заключается в
том, что в результате фотофизического процесса (поглощения квантов света
и миграции возбужденного состояния между пигментными молекулами) образу-
ется возобновляемый субстрат — возбужденный хлорофилл. При его окислении с
помощью электрон-транспортной цепи создается Pmf.

Электрон-транспортная цепь, участвующая в фототрофии, бывает двух типов. В
одном случае она «циклическая», т. е. замкнута в кольцо. Ей не нужны экзогенные
доноры электронов, и она не синтезирует восстановитель. В другом случае электрон-
транспортная цепь «нециклическая». Она окисляет экзогенный донор электронов и
образует восстановитель, который используется для конструктивных процессов. В
обоих случаях в состав электрон-транспортной цепи входят цитохром &С1(5б/)-ком-
плекс и хинонный пул. В отличие от хемотрофии при фототрофии хинон восстанав-
ливается не дегидрогеназами, которые окисляют органические или неорганические
субстраты, а получает электроны от активированного светом пигмента — хлорофил-
ла.

Для того, чтобы воспользоваться донорными свойствами возбужденного хло-
рофилла, помимо цитохром bci(be/)-комплекса необходима система, состоящая из
фоторецепторов, переносчиков электронов и ряда кофакторов.

Таким образом, хотя фотосинтетический аппарат и является светозависимым
электрогенератором, функционально он эквивалентен дыхательной цепи. В обоих
случаях Pmf создается цитохром bci(be/)-комплексом. Более того, фототрофию
можно рассматривать как вариант дыхательной хемотрофии, когда возобновляе-
мым донором электронов является хлорофилл.

Способность к фототрофии проявляют представители пяти фил филогенетиче-
ского домена Bacteria:

—	зеленые нитчатые бактерии (фила BVI Chloroflexi)-,

—	цианобактерии (фила ВХ Cyanobacteria)-,

—	зеленые одноклеточные бактерии (фила BXI Chlorobi)-,

—	пурпурные бактерии (фила ВХП Proteobacteria)-,

—	гелиобактерии (фила ВХШ Firmicutes).

Они неравноценно представлены в биосфере как в отношении биоразнообразия,
так и в отношении занимаемых ниш, общей численности и временной динамики
развития.

Археи не способны к фототрофии. Тем не менее, у некоторых представителей
филы АП Euryarchaeota при энергетическом стрессе адаптивно синтезируется свето-
зависимый биотрансформатор — бактериородопсин. Он действует по тому же прин-
ципу, что и обычный фотосинтетический аппарат — преобразует экзогенный физи-
ческий энергоноситель (кванты электромагнитного поля) в эндогенный электрохи-
мический энергоноситель (Pmf). Однако этот биотрансформатор имеет другую мо-
лекулярную природу по сравнению с фотосинтетическим аппаратом и отличается
от последнего по механизму действия.

12.1.	ДВА СПОСОБА АССИМИЛЯЦИИ
СВЕТОВОЙ ЭНЕРГИИ

Для преобразования световой энергии в Pmf существуют два типа мембранных
биотрансформаторов. Оба используют эффект спонтанной релаксации возбужден-
ных светом фоторецепторных систем.

В первом случае биотрансформатором является молекула хромопротеина — ин-
тегрального белка, с которым ковалентно связана молекула каротиноида. До недав-
него времени считалось, что этот механизм имеется только у некоторых предста-
вителей домена Archaea. Однако сейчас выяснилось, что он встречается и у бакте-
рий. Молекула каротинопротеина (бактериородопсина у архей и протеородопсина у
бактерий) поглощает квант видимого света и преобразует полученную свободную
энергию в Pmf. Это значит, что она совмещает две функции — фоторецептора и
электрогенератора.
Во втором случае биотрансформатором является мультиполипептидный фото-
синтетический аппарат. Он состоит из хромопротеинов и/или белков, нековалентно
связывающих пигмент, а также бесцветных полипептидов и небелковых кофакторов.
Данный механизм уникален для филогенетического домена Bacteria. Его специфика
в том, что функции фоторецептора и электрогенератора выполняют разные струк-
туры.

Функцию фоторецептора выполняет интегральный или периферический свето-
собирающий комплекс (англ, light harvesting complex, LHC). Его второе название —
светособирающая антенна (англ, light harvesting antenna). Это мультимолекуляр-
ный агрегат, состоящий из пигментов, ковалентно или нековалентно связанных со
специализированными белками, или апопротеинами.

Функцию электрогенератора выполняют две соединенные последовательно друг
с другом электрон-транспортные цепи. Одна из них расположена внутри интеграль-
ной частицы — реакционного центра (англ, reaction centre, RC). Другая представля-
ет собой цитохром bci(bcf)-комплекс.

12.2.	ДВА ТИПА СВЕТОВОГО ПИТАНИЯ

Существуют два типа светового питания — истинная фототрофия и квази-фото-
трофия.

Истинная фототрофия. При истинной фототрофии метаболические потреб-
ности бактерии полностью удовлетворяются путем ассимиляции световой энергии,
и биогенез фотосинтетического аппарата сопряжен с клеточным ростом.

В ответ на изменение интенсивности света и/или его спектрального состава
клетки «фотоакклиматизируются». Смысл фотоакклиматизации (англ, photoaccli-
mation) заключается в том, чтобы с помощью регуляторных механизмов, действу-
ющих на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровне, так
перестроить фотосинтетический аппарат, чтобы в новых условиях светового пита-
ния сделать фототрофию максимально эффективной.

Фотосинтетический аппарат, как правило, выявляется на ультраструктурном
уровне — по присутствию в клетке ICM и эпимембранных частиц, например фико-
билисом или хлоросом (см. ниже). На спектрах поглощения интактных клеток, кле-
точных гомогенатов и пигментных экстрактов регистрируются характерные макси-
мумы хлорофилла, а также каротиноидов и других вспомогательных фотосинтети-
ческих пигментов. Рост облигатных фототрофов замедляется при недостатке света
и прекращается в темноте. На слабом свету и в темноте для получения ограничен-
ного количества энергии расходуются фосфагены — АТФ и (Ф)п, а также запасные
полигликозиды. У штаммов, способных к факультативной хемотрофии, темновой
рост за счет экзогенных (почти всегда органических) субстратов потенциально не
ограничен. Фототрофия сочетается с углеродной автотрофией, реже — с углеродной
гетеротрофией, и во многих случаях — с диазотрофией.

Квази-фототрофия. Этот тип светового питания наблюдается у некоторых хе-
могетеротрофных бактерий, а также у экстремально галофильных архей в условиях
энергетического стресса, когда они по той или иной причине не могут создавать Pmf
посредством аэробного дыхания.

Ингибирование дыхания может быть вызвано либо дефицитом донора электро-
нов (субстратное голодание у бактерий), либо дефицитом акцептора электронов
(аноксия у архей). В обоих случаях образуется «портативный» фотосинтетический
аппарат. С его помощью прокариоты получают немного энергии, используемой для
репарационных процессов и для поддержания осмотического дисбаланса с окружа-
ющей средой, а также для сохранения минимального пула метаболитов вплоть до
того момента, когда снова создадутся условия для хемотрофного роста.

Фотосинтетический аппарат у квази-фототрофных бактерий слабо выражен, и
его трудно зарегистрировать с помощью стандартных морфологических и физиоло-
го-биохимических методов (например, удельное содержание бактериохлорофилла а
на два порядка меньше по сравнению с истинной фототрофией).

Независимо от интенсивности и спектрального состава света антенные комплек-
сы квази-фототрофных бактерий сохраняют один и тот же состав, и у них не на-
блюдается явление фотоакклиматизации. При квази-фототрофии клетки не растут,
а только сохраняют жизнеспособность. Наконец, квази-фототрофия никогда не со-
четается с автотрофией по углероду (т. е. не бывает «квази-фотосинтеза»).

12.3.	ОКСИГЕННАЯ ФОТОТРОФИЯ
И АНОКСИГЕННАЯ ФОТОТРОФИЯ

Обычно говорят о двух типах фототрофии — оксигенной и аноксигенной. Такое
подразделение формально учитывает, входит ли в число побочных продуктов нецик-
лической электрон-транспортной цепи молекулярный кислород. Однако на самом
деле речь идет о глубоких различиях в молекулярной организации фотосинтетиче-
ского аппарата.

Оксигенная фототрофия. При оксигенной (греч. oxis — кислый и genea — рож-
дение; образующий кислород) фототрофии донором электронов для нециклической
электрон-транспортной цепи служит Нг О, и побочным продуктом является Ог-

Оксигенная фототрофия свойственна всем представителям филы ВХ Cyanobac-
teria (и только им).

Аноксигенная фототрофия. При аноксигенной (греч. ап — не, oxis — кислый
и genea — рождение; не образующий кислород) фототрофии донорами электронов
для нециклической электрон-транспортной цепи служат разнообразные органиче-
ские или неорганические вещества. Однако вода никогда не входит в их число,
поскольку в геномах аноксигенных фототрофных бактерий отсутствует ген psbO,
который кодирует главный компонент кислородвыделяющего комплекса — марга-
нецстабилизирующий белок.

Аноксигенные фототрофы имеются в филах BVI Chloroflexi, BXI Chlorobi, ВХП
Proteobacteria и BXIII Firmicutes.

Эволюционная связь между оксигенной фототрофией и аноксигенной
фототрофией. Об эволюционной связи между двумя формами фототрофии или
разными вариантами аноксигенной фототрофии можно судить по наличию (или
отсутствию) гомологии апопротеинов в реакционных центрах или светособирающих
антеннах.

Реакционные центры очень консервативны, что облегчает реконструкцию их эво-
люционной истории. Показано, что апопротеины реакционного центра первой фо-
тосистемы (ФС1) у представителей филы ВХ Cyanobacteria гомологичны апопроте-
инам реакционного центра у представителей филы BXI Chlorobi и филы BXIII Fir-
micutes. Сходным образом, апопротеины реакционного центра второй фотосистемы
(ФСП) у представителей филы ВХ Cyanobacteria гомологичны апопротеинам реак-
ционного центра у представителей филы BVI Chloroflexi и филы ВХП Proteobacteria.
Для объяснения этих фактов предложены гипотетические сценарии эволюции фо-
тосинтетического аппарата (см. ниже).

Цианобактерии обладают разнообразными светособирающими антеннами, кото-
рые не гомологичны друг другу, а также не гомологичны светособирающим антен-
нам аноксигенных фототрофных бактерий, которые, в свою очередь, не гомологич-
ны друг другу. Это свидетельствует об их независимом эволюционном происхожде-
нии (см. ниже).

12.4.	ПАРАДОКСЫ ФОТОТРОФИИ

Наша планета находится в относительной близости от Солнца, и световой поток
на дневной поверхности достигает 1017 квант-с-1-см-2. Однако ассимиляция, каза-
лось бы, столь богатого и легкодоступного источника энергии не проходит гладко и
сопровождается рядом негативных явлений.

«Теневые» стороны фототрофии. Прежде всего, изобилие света даже на
открытом месте только кажущееся (см. раздел 12.7.1). Из-за ультрадного (дневно-
го), циркадного (суточного) или сезонного колебания, а также из-за экранирования
абиотическими материалами и биологическими конкурентами доступность солнеч-
ного света для конкретного потребителя может резко сокращаться.

Кроме того, сама по себе фототрофия имеет несколько «теневых» сторон.

Во-первых, зависимость от света является критическим фактором выживания
для облигатных фототрофов, поскольку в темноте они погибают, когда истощаются
запасные субстраты.

Во-вторых, на биосинтез фотосинтетического аппарата затрачивается много кон-
структивного материала, и он лимитирован внешними ресурсами макро- и микро-
элементов (в особенности азота и железа).

В третьих, под воздействием света фотосинтетические пигменты переходят в воз-
бужденное состояние, которое лишь частично дезактивируется путем создания Pmf.
Альтернативной ловушкой для избыточной энергии служит молекулярный кисло-
род. В результате его восстановления образуются такие реактивные соединения, как
синглетный кислород и гидроксильный радикал. Они атакуют внутриклеточные ми-
шени и вызывают окислительный стресс, что может привести к повреждению мик-
роорганизма и даже к его гибели.

Вопреки всем этим негативным явлениям, фототрофные бактерии очень широко
распространены в современной биосфере.

Оксигенные фототрофные бактерии, или цианобактерии встречаются в большин-
стве ниш и часто образуют гиперпопуляции — цветения.

В отличие от них, аноксигенные фототрофные бактерии приурочены в основ-
ном к анаэробным нишам, хотя пурпурные несерные бактерии, которые являются
факультативными анаэробами, достаточно широко распространены. По замечанию
голландского микробиолога Корнелиса Ван Ниля (С. van Niel), «Они присутству-
ют почти в любом образце почвы или воды с мелководья». Однако даже в стоячей
воде, где интенсивно разлагаются органические остатки, популяции аноксигенных
фототрофных бактерий обычно не видны невооруженным глазом. Небольшие цве-
тения пурпурных и зеленых серных бактерий встречаются в анаэробных зонах рек,
канав и прудов, а также в стоячей воде лесов и ботанических садов. Но в основном
они развиваются в зоне хемоклина озер, где в летне-осенний период скапливается
сероводород.

Что же касается облигатных анаэробов, то они находят для себя анаэробные
микрониши, даже находясь в аэробном макроокружении. Например, гелиобакте-
рии впервые были выделены из почвы у подножия ствола клена в штате Индиана
(США).

Специфика отношения аноксигенных фототрофных бактерий к моле-
кулярному кислороду. Причина облигатного или факультативного анаэробиоза
аноксигенных фототрофных бактерий заключается в том, что молекулярный кис-
лород специфически регулирует биогенез их фотосинтетического аппарата.

Молекулярный механизм этого явления сложен, и многое в нем еще не ясно. Установлено,
что при низком парциальном давлении кислорода у пурпурных бактерий повышается уровень
транскрипции двух фотосинтетических оперонов — puf (гены полипептидов реакционного центра
и внутренней антенны LHI, а также гены, отвечающие за сборку этих структур) и рис (структурные
и регуляторные гены периферической антенны LHII). На примере Rhodobacter sp. показано, что с
промоторными участками генов в первом из этих оперонов связываются белки РРВР (от англ, ри/
promoter-binding protein), которые при высоком парциальном давлении кислорода действуют как
репрессоры транскрипции. Прочность связи РРВР с промотором зависит от уровня фосфорилиро-
вания этих белков, а тот, в свою очередь, контролируется двухкомпонентной сигнальной системой
RegB/RegA (мембранная киназа в качестве сенсора и цитоплазматическая киназа в качестве регу-
лятора ответа).

Таким образом, в присутствии кислорода биогенез аноксигенного фотосинтети-
ческого аппарата блокируется. После трех последовательных делений его размер со-
кращается почти на порядок. Клетки начинают испытывать энергетический стресс,
и вынуждены переключаться на альтернативную хемотрофную энергетику. Адап-
тивный переход на хемолитотрофию (за счет водорода или монооксида углерода)
встречается исключительно редко. Обычно же встает проблема доступности орга-
нического субстрата-энергоносителя, который может быть экзогенным или эндоген-
ным.

Факультативно аэробные аноксигенные фототрофные бактерии — зеленые нит-
чатые бактерии из филы ВVI Chloroflexi и пурпурные несерные бактерии из филы
ВХП Proteobacteria — наделены транспортными системами, которые позволяют им
использовать экзогенные органические субстраты и неограниченно долго расти за
счет аэробного дыхания. При этом они депигментируются. С уменьшением парци-
ального давления кислорода биогенез фотосинтетического аппарата возобновляется.

Как отметил еще Эрвин Эсмарх (Е. von Esmarch), который в 1886 г. получил первую чистую
культуру Rhodospirillum rubrum из трупа мыши, разложившегося в сосуде с водопроводной во-
дой, по мере врастания в желатиновые пластины желтовато-серые колонии этой факультативно
хемотрофной бактерии приобретают насыщенный винный цвет.

Репрессия биогенеза фотосинтетических комплексов при высоком парциальном давлении кис-
лорода физиологически целесообразна. Во-первых, на свету для пигментированных клеток высок
риск окислительного стресса. Во-вторых, при дыхании нет смысла расходовать энергию на биоге-
нез фотосинтетического аппарата. Однако если парциальное давление кислорода опускается ниже
порогового уровня, биогенез фотосинтетического аппарата дерепрессируется даже в темноте.

Облигатно анаэробные аноксигенные фототрофные бактерии — одноклеточные
зеленые бактерии из филы BXI Chlorobi и гелиобактерии из филы BXIII Firmi-
cutes — не обладают системами для импорта органики и поэтому являются строги-
ми автотрофами. Естественно, что эти бактерии погибают после истощения своих
внутренних питательных ресурсов.

12.5.	ИЗ ИСТОРИИ ИЗУЧЕНИЯ ФОТОТРОФИИ

Только бактерии и произошедшие от них фототрофные органеллы-пластиды об-
ладают хлорофильными фоторецепторами, которые позволяют им ассимилировать
световую энергию. Следовательно, фототрофия — это, по сути, бактериальный фе-
номен. Однако впервые он был изучен не на культурах бактерий, а на высших
растениях. Кроме того, вначале предметом исследований была не фототрофия, а
основанный на ней путь автотрофной ассимиляции углерода (фотосинтез).

Способность растений накапливать на свету органические вещества была от-
крыта в конце XVIII—начале XIX вв., однако сам термин «фотосинтез» (греч.
phos — свет, synthesis — соединение частей) был предложен американским физио-
логом Чарльзом Барнсом (С. R. Barnes) только в 1893 г. Еще через четыре года
Вильгельм Пфеффер обозначил ассимиляцию диоксида углерода термином «авто-
трофия».

О том, что растение продуктивно взаимодействует своими листьями с солнечным
светом, догадывались еще первооткрыватели фотосинтеза — англичанин Пристли
(J.Pristley) и голландец Инген-Хуз (J. Ingen-Housz).

В 1817 г. французские химики Пельтье (Р. J. Peletier) и Каванту (J. В. Caventou)
выделили из листьев зеленый пигмент и назвали его хлорофиллом (от греч. chloros —
зеленый и phyllon — лист).

Мысль о том, что растение преобразует поглощенную энергию в химический по-
тенциал, впервые высказали в 1847 г. немецкие физики Майер (R. Мауег) и фон
Гельмгольц (Н. von Helmholtz). В 1875 г. К. А. Тимирязев с помощью химического
микроанализа доказал, что максимальное выделение кислорода и максимальное на-
копление крахмала наблюдаются в красных лучах, т. е. в той спектральной области,
где хлорофилл сильнее всего поглощает видимый свет. Это означало, что фотосин-
тез подчиняется первому началу термодинамики, или закону сохранения энергии.

Американский биохимик Рабен (S.Ruben) в 1943 г. предположил, что при фо-
тосинтезе неорганический фосфат включается в состав органических соединений.
Через пять лет его соотечественники Гест (Н. Gest) и Кэмен (М.Kamen) доказа-
ли это в опытах на зеленой водоросли Chlorella pyrenoidosa и пурпурной бактерии
Rhodospirillum rubrum, используя радиоизотоп 32Р. Другой американец, Френкель
(A. Frenkel) обнаружил в 1954 г. феномен синтеза АТФ из АДФ и неорганического
фосфата на свету, или фотофосфорилирование.

Концепция фототрофии приобрела завершенный вид в начале 1960-х годов, когда
Питер Митчел разработал теорию хемиосмотического сопряжения электрон-транс-
портных процессов с фосфорилированием АДФ. Одно из следствий этой теории
гласило, что при фототрофии электромагнитная энергия первично ассимилируется
не в форме АТФ или другого фосфагена, а в форме трансмембранного электрохи-
мического потенциала — Pmf (см. раздел 10.4).

До конца XIX в. световое питание считалось уникальным свойством зеле-
ных растений. В свою очередь, фотосинтез не мыслили без выделения кислоро-
да. Это предубеждение не развеялось даже после того, как 1880-е годы Энгель-
ман (Т. Engelmann) обнаружил, что пурпурные бактерии проявляют положитель-
ный фототаксис. До начала XX в. этих аноксигенных фототрофов принимали за
пигментированных хемотрофов. Даже гениальный первооткрыватель хемосинтеза
С. Н. Виноградский, который наряду с бесцветными серными бактериями описал их
пурпурных аналогов, «проглядел» феномен аноксигенной фототрофии.

Первое свидетельство того, что пурпурные бактерии не выделяют кислород и мо-
гут ассимилировать органические соединения на свету, получил Молиш (Н. Molish)
в 1907 г. В середине 1920-х годов Будер (J.Buder) окончательно доказал, что фото-
синтез возможен без выделения кислорода.

В начале 1930-х годов Ван Ниль предложил унифицированную теорию фотосин-
теза, согласно которой диоксид углерода восстанавливается «активным водородом»
(Н+/е_), образующимся при светозависимом окислении воды:

Н2О + nxhi/ -> Н+/е- + ОН-,

СО2 + 4[Н+/е"] -> (-НСОН-) + Н2О,

где (-НСОН-) означает повторяющуюся группировку в молекуле углевода.

То, что для восстановления углекислоты помимо донора электронов требуется
АТФ, установил Френкель в начале 1950-х годов.

После открытия фотофосфорилирования потеряло смысл противопоставление
«растительного» оксигенного фотосинтеза и «бактериального» аноксигенного фо-
тосинтеза. Однако цианобактерий до конца 1960-х годов продолжали объединять с
водорослями лишь на том основании, что те и другие при фотосинтезе образуют
кислород.

Ван Ниль и ученые, разделявшие его взгляды, недооценивали биоэнергетику как
главный аспект фотосинтеза. Кроме того, разницу между оксигенным и аноксиген-
ным фотосинтезом они видели в судьбе гидроксильного радикала ОН- (его считали
продуктом одноэлектронного окисления Н2О, хотя на самом деле вода окисляет-
ся при помощи четырехэлектронного механизма; см. раздел 12.7.4). Считалось, что
при оксигенном фотосинтезе гидроксильный радикал превращается в воду и кисло-
род под воздействием каталазы (4ОН- —> 2Н2О + О2), тогда как при аноксигенном
фотосинтезе он восстанавливается пероксидазой до воды за счет вспомогательных
неорганических или органических доноров электронов (2ОН- + DH2 —> 2Н2О + D).

Хотя Ван Ниль ошибся, приняв воду за универсального донора электронов при
фототрофии, он вывел правильное Суммарное уравнение:

СО2 + 2H2D + nxhz/ (-НСОН-) + 2D + Н2О,

где H2D и D соответственно обозначают восстановленную и окисленную формы до-
нора электронов.

В частном случае, при оксигенном фотосинтезе, восстановителем служит гидрид
кислорода (Н2О):

СО2 + Н2О + nxhz/ (-НСОН-) + О2.

Во второй половине XX в. сложилось представление о двух фазах фотосинтеза.
В первой, световой фазе, энергия квантов улавливается пигментными системами и
преобразуется в химическую «ассимилирующую силу» (англ, assimilatory power) —
свободную энергию АТФ и низкопотенциального донора электронов, в частности
НАДФН. Во второй, темновой фазе, ассимилирующая сила используется для вос-
становления фосфоглицерата (продукта ферментативной реакции акцептирования
СО2). Продукты восстановления, триозы, превращаются в гексозы, а те — в запас-
ные полигликозиды.

Со временем выяснилось, что истинный характер процессов, протекающих на
световой стадии фотосинтеза, не соответствует ее названию. В частности, реге-
нерация АТФ (фосфорилирование) и регенерация НАДФН (НАДФ:донор-оксидо-
редуктазная реакция)—это индифферентные к свету энзиматические процессы.
Кроме того, оказалось, что восстановительный пентозофосфатный путь, или цикл
Кельвина-Бенсона-Бэссема (см. раздел 13.2.5), который представляет собой си-
стему ферментативных реакций, обеспечивающих автотрофный биосинтез триоз и
регенерацию акцептора СО2 (1,5-рибулозобисфосфата), не уникален для фототро-
фов. Многие хемолитотрофы, которые извлекают ассимилирующую силу из реак-
ций окисления неорганических субстратов, также используют этот цикл в своем
конструктивном метаболизме.

12.6.	ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПИГМЕНТЫ

Физической основой фототрофии служат хромофоры (греч. chroma — краска и
phoreo — носить) — небольшие органические молекулы, которые благодаря резонанс-
ному строению своих внешних электронных оболочек интенсивно поглощают свет в
интервале длин волн 300-1200 нм и поэтому ярко окрашены.

Хромофоры действуют в составе фотосинтетического аппарата не автономно, а
совместно с полипептидами, которые называются «апопротеинами» — по аналогии
с белковой частью ферментов (греч. аро —из и protos — важнейший, в данном слу-
чае — протеин; состоящий из белка).

В результате взаимодействия хромофоров и апопротеинов образуются либо хро-
мопротеины, либо пигмент-белковые комплексы. В хромопротеине между хромофо-
ром и апопротеином существует ковалентная связь. В пигмент-белковом комплексе
хромофор связан с апопротеином нековалентно.

Использование одного и того же термина «апопротеин» применительно к пигмен-
там фототрофов и дегидрогеназам хемотрофов, неслучайно. Специфические фер-
менты позволяют хемотрофам расти на элективных химических средах. Точно так
же специфические пигменты позволяют фототрофам адаптироваться к элективным
участкам солнечного спектра. В обоих случаях возникает конкуренция за энергию,
что приводит к доминированию более приспособленных членов микробиоты над ме-
нее приспособленными.

Апопротеины фотосинтетических пигментов принадлежат к нескольким гетеро-
логичным молекулярным семействам. Структура апопротеина в большей степени,
чем тип хромофора, определяет организацию фотосинтетического аппарата.

В ходе эволюции сайты для связывания хромофоров подвергались жесткому се-
лекционному давлению, что привело к образованию нескольких типов консерватив-
ных пигмент-белковых комплексов и хромопротеинов.

Разнообразие хромофоров. Хромофоры не только принадлежат к разным
классам химических соединений, но и представлены набором молекулярных гомо-
логов и изомеров.

По своей химической природе хромофоры подразделяются на три группы:

—	металпорфиноиды (хлорофиллы и хлорофилподобные пигменты);

—	полиизопреноиды (каротиноиды);

—	линейные тетрапирролы (фикобилины).
Молекулы хлорофиллов и хлорофилподобных пигментов обладают резонансной
тетрапиррольной структурой и содержат четыре лиганда для атома металла (Mg
или Zn). Благодаря этому они сильно поглощают свет в синей и красной частях
спектра, соответственно при длине волны 350-450 и 650-750 нм. Каротиноиды обла-
дают резонансной полиеновой структурой, и их абсорбционный максимум лежит в
сине-зеленой части спектра при длине волны 350-500 нм. Фикобилины обладают ре-
зонансной тетрапиррольной структурой, что позволяет им поглощать свет с длиной
волны 500-650 нм.

Хлорофиллы и хлорофилподобные пигменты образуют с апопротеинами пиг-
мент-белковые комплексы, стабилизированные ионными, координационными и гид-
рофобными связями, а также ближними силами Ван-дер-Ваальса; особую роль иг-
рают остатки His. Каротиноидные хромофоры могут связываться с апопротеином
двумя способами — нековалентно (через остатки His) и ковалентно (через остатки
Lys); во втором случае образуются интегральные хромопротеины — каротинопроте-
ины. Фикобилиновые хромофоры ковалентно связываются с апопротеинами (через
остатки Cys), в результате чего образуются растворимые хромопротеины — фикоби-
липротеины.

Наиболее распространены тройственные хлорофилл-каротиноид-белковые ком-
плексы. Как правило, они гидрофобны и являются интегральными компонентами
СМ или ICM.

12.6.1. Хлорофиллы и хлорофилподобные пигменты

Эти металпорфиноиды в функциональном отношении уникальны, поскольку
некоторые из них в возбужденном состоянии передают электроны электрон-транс-
портной цепи, следствием чего становится запасание энергии в форме Pmf.

Строение хлорофиллов. Химическая структура хлорофилла а была установ-
лена в 1910-е годы немецким химиком Рихардом Вильштеттером (R. Willstatter, Но-
белевская премия по химии, 1915 г.).

В настоящее время обнаружены одиннадцать хлорофиллов (табл. 13 и рис. 131).
Они принадлежат к общему молекулярному семейству, хотя по традиции хлорофил-
лы цианобактерий и пластид называют собственно хлорофиллами, а хлорофиллы
аноксигенных фототрофных бактерий — «бактериохлорофиллами».

Хлорофиллы образуются в генеральном пути биосинтеза порфиноидов (см. раз-
дел 15.3) и являются производными хлорофиллиновой кислоты. Ее порфириновое
ядро состоит из пиррольных колец I—IV, связанных между собой в макроцикл с
помощью метинильных мостиков (—СН=), которые обозначаются как а, /3, у и
6. Сложный эфир хлорофиллиновой кислоты называется феофитином. Если хло-
рофиллиновая кислота двухосновная, то первый спирт присоединяется к пропио-
нильному остатку при пиррольном кольце IV, а второй — к карбоксилу при цикло-
пентановом кольце V. Первый спирт содержит полиизопреноидный радикал —С15-
фарнезил, Сго-геранилгеранил, Сго-фитодиенил или алкильный радикал стеарил.
Вторым спиртом всегда является метанол. Если хлорофиллиновая кислота одноос-
новная (в случае бактериохлорофиллов с, d и е), то сложноэфирная группировка
при кольце V отсутствует. Феофитин с хелатированным атомом металла (Mg или
Zn) — это и есть хлорофилл. Буквенные обозначения (а, b и т. д.) отражают хроноло-
гическую последовательность описания разных молекулярных форм хлорофиллов.
Таблица 13. Структурные и оптические особенности магний-порфиноидов
фототрофных бактерий

Mg-порфиноид	R2	R-з	R4	R5	R7	<5	^тах (нм)*
Хлорофилл							
Бактериохло- рофилл а**	-CO-СНз	-СНз	-С2Н5	—	Фитил, геранилге- ранил	-Н	350, 750
Бактериохло- рофилл Ъ	-CO-СНз	-СНз	=СН-СН3	—	Фитил, фитадиенил	-Н	350, 800
Бактериохло- рофилл с***	-СНОН-  -СНз	СНз	-С2Н5,  -С3Н7, -С4Н9	-СНз С2Н5	Фарнезил, стеарил	-СНз	425,650
Бактериохло- рофилл d***	-СНОН- СНз	СНз -C3H7,	-С2Н5, -С2Н5  -с4н9  -С5Нц	-СНз	Фарнезил	-Н	425, 650
Бактериохло- рофилл е***	-СНОН- СНз	-СНО	-С2Н5,  -С3Н7,  -С4Н9	-с2н5	Фарнезил	-СНз	425, 650
Бактериохло- рофилл д	-СН=СН2	-СНз	=СН-СН3	—	Геранилге- ранил	-Н	375, 770
Хлорофилл а	-СН=СН2	-СНз	-С2Н5	—	Фитил	-Н	430, 662
Хлорофилл 02	-СН=СН2	-СНз	-сн=сн2	—	Фитил	-Н	450, 675
Хлорофилл b	-сн=сн2	-СНО	-С2Н5	—	Фитил	-Н	457, 646
Хлорофилл 62	-сн=сн2	-СНО	-СН=СН2	—	Фитил	-Н	475, 650
Хлорофилл d	-СНО	-СНз	-С2Н5	—	Фитил	-Н	400, 455, 697
П ротохлорофи л л и д * * * *							
2,4-дивинил- протохлоро- филлид	-СН=СН2	-СНз	-сн=сн2		-Н	-Н	438, 625
Хлорофилл C1	-сн=сн2	-СНз	-С2Н5	—	-Н	-н	446, 628
Хлорофилл C2	-сн=сн2	-СНз	-сн=сн2	—	-Н	-н	450, 630

* —в ацетоновом или эфирном экстракте (для хлорофиллов 02 и 62 —in situ); ** — Zn-
порфиноид в случае Acidiphilium rubram-, *** — в положении 10 атом Н; **** — в положении 7:8
двойная связь, в положении 7 акрил -СН=СН-СООН.

Главные и вспомогательные хлорофиллы. В зависимости от выполняемой
ими функции хлорофиллы подразделяются на главные и вспомогательные.

Главные хлорофиллы входят в состав реакционных центров, вспомогательные —
в состав светособирающих комплексов.

Известны шесть главных хлорофиллов — хлорофилл а, хлорофилл d, бактерио-
хлорофилл а, Zn-содержащий бактериохлорофилл а, бактериохлорофилл b и бакте-
риохлорофилл д.

В середине 40-х годов XX в. Мэнинг (W.M.Manning) сообщил о том, что в талломах крас-
ных водорослей содержится «хлорофилл d», якобы отличающийся по структуре и спектральным
свойствам от хлорофиллов а-с. В дальнейшем выяснилось, что это был артефактный продукт,
образующийся из хлорофилла а в ходе его выделения. Настоящий хлорфилл d имеется только у
цианобактерии Acaryochloris marina, что было доказано с помощью точных физико-химических
методов.

Цинксодержащий бактериохлорофилл а был обнаружен во второй половине 1990-х годов у
обитателей шахтных сточных вод — ацидофильных аэробных фототрофных бактерий Acidiphilium
rubrum и Acidisphaera rubrifaciens.
Рис. 131. Общая формула хлорофиллов.

I—IV — пиррольные кольца; V — циклопентановое коль-
цо; а — <5 — метинильные мостики; 1—10 — атомы углерода, к
которым присоединены боковые радикалы; R2-R4 и R7 —
боковые радикалы.

Вспомогательных хлорофиллов и хлорофилподобных пигментов также несколь-
ко. У аноксигенных пурпурных и аэробных фототрофных бактерий один и тот же
бактериохлорофилл (а или 6) входит в качестве главного хлорофилла в реакционный
центр, а в качестве вспомогательного хлорофилла —в светособирающий комплекс.
Аноксигенные гелиобактерии не обладают вспомогательными хлорофиллами и све-
тособирающими комплексами; у них имеется только антенна реакционного центра,
содержащая бактериохлорофилл д. В отличие от них аноксигенные зеленые бакте-
рии содержат вспомогательные бактериохлорофиллы с, d или е (табл. 13).

Большинство цианобактерий в нормальных физиологических условиях не обра-
зует вспомогательных хлорофиллов. Однако при стрессах, вызванных ярким светом
или голоданием по железу, у них появляются минорные антенны, в состав которых
входит хлорофилл а. У цианобактерий-прохлорофитов обнаружено несколько вспо-
могательных магнийпорфиноидов:

—	хлорофилл 6;

—	2,4-дивинил-хлорофилл а (хлорофилл аг);

—	2,4-дивинил-хлорофилл Ь (хлорофилл Ьг);

—	хлорофилл d\

—	хлорофилподобные Mg-тетрапирролы (дивинил-протохлорофиллид, хлоро-
филл Ci и хлорофилл сг).

Фотофизика и фотохимия хлорофиллов. Внешняя электронная сфера пор-
фиринового кольца содержит систему конъюгированных двойных связей, образо-
ванных делокализованными тг-электронами. Поглощение света в синей части спек-
тра обеспечивается резонансной порфириновой структурой, в то время как близкое
ему по интенсивности поглощение в красной части спектра связано с присутствием
лигандированного катиона магния.

В квантовой химии энергетическое (основное или возбужденное) состояние молекулы выра-
жается «индексом мультиплетности» по формуле: 2 х |£СПиновых чисел| + 1. В невозбужденной
пигментной молекуле, содержащей резонансную систему из четного количества делокализован-
ных р-электронов, сумма спиновых чисел равна нулю, и индекс мультиплетности равен единице
(2x0 + 1 = 1). Это состояние называется «синглетным» (лат. singularis — одинарный). В молекуле
хлорофилла или каротиноида основное состояние является синглетным и обозначается как 1So (от
англ, state — состояние).

При поглощении кванта видимого света (в случае хлорофилла это «красный» или «синий»
квант, что соответствует двум главным максимумам на спектре этого пигмента — 700 и 400 нм)
электрон переходит на более высокие свободные орбитали. Поскольку ориентация его спина при
этом не изменяется, возникают соответственно первое и второе возбужденные синглетные состоя-
ния, которые обозначаются как и 1Sj (рис. 132). «Время жизни» электрона в состоянии
составляет примерно 10“12 с. При очень плотной упаковке пигментов электронные облака инди-
видуальных молекул частично перекрываются, и возбужденное состояние передается между ними
путем так называемой «внутрисистемной», или синглет-синглетной конверсии:

пигментпCS?;) + пигментп+i(1So) —* пигментп(18о) + пигментп-|-1 CS^)-

В результате этого энергия направленно мигрирует по антенне и примерно через 10”10 с по-
падает в реакционный центр.

Рис. 132. Энергетические состояния пигментной молекулы.

г5о —основное синглетное состояние; 1SJ и — первое и второе воз-
бужденные синглетные состояния; 3S* — возбужденное триплетное состоя-
ние; Qi —Q3 — рассеивание энергии в виде тепла; Ьрфл — рассеивание энер-
гии в виде кванта флуоресценции.

При избытке короткоживущих возбужденных состояний часть энергии рассеивается в виде
тепла, и пигмент переходит в более долгоживущее возбужденное состояние iS*. Находясь в нем,
хлорофилл реакционного центра может вступить в фотохимическую реакцию в качестве донора
электронов. В этом и заключается его продуктивная функция при фототрофии.

В качестве альтернативы хлорофилл непродуктивно рассеивает избыточную энергию в тепло
или отдает ее путем высвечивания кванта флуоресценции (Ьифл).

При накоплении состояний 1S* электрон может переходить на более низкую орбиталь путем
«межсистемной», или синглет-триплетной конверсии (с обращением спина). В этом возбужденном
состоянии сумма спиновых чисел равна единице, и индекс мультиплетности равен трем (2x1 + 1 =
3). Это состояние называется «триплетным» (лат. triplex — тройной) и обозначается как 3S*. Время
жизни пигмента в нем особенно велико (10-3 с). Это позволяет хлорофиллу взаимодействовать
с диффундирующими молекулами, например молекулярным кислородом (в основном состоянии
кислород триплетен):

Зхлорофилл* + 3С>2 —► Хлорофилл + гО2.

В результате этого кислород активируется, что служит одной из причин окислительного стрес-
са (см. III том учебника).
12.6.2.	Каротиноиды

Наряду с хлорофиллами любой фотосинетический аппарат обязательно содер-
жит каротиноиды (греч. caroton — морковь и eidos — подобие; как пигменты у мор-
кови). Они бесцветны или имеют желто-красную окраску разного оттенка при мак-
симуме поглощения 450-470 нм.

Эти полиеновые соединения распространены универсально. Помимо выполнения
антенной функции окрашенные каротиноиды служат фактором защиты от окисли-
тельного стресса. Это важно для всех аэробных организмов и тем более важно для
оксигенных фототрофов, поскольку они сами образуют кислород. Поэтому мутации,
блокирующие образование окрашенных каротиноидов из бесцветных предшествен-
ников, у оксигенных фототрофов летальны.

Строение каротиноидов. Химическую структуру каротиноидов расшифрова-
ли в 1930-е годы швейцарский биохимик Пауль Каррер (Р. Каггег, Нобелевская пре-
мия по химии, 1937 г.) и австрийский химик Рихард Кун (R. Kuhn, Нобелевская пре-
мия по химии, 1938 г.). Основу молекулы каротиноида составляет изопреновая груп-
па— изомер метилбутадиена (изопрена) с двойной связью, перемещенной в среднее
положение:

СН2=С(СН3)-СН=СН2 -СН2-С(СН3)=СН-СН2-.

Таким образом, каротиноиды представляют собой отдельную группу полиизопре-
ноидов (см. раздел 15.2). Большинство из них относится к октапреноидам (восемь
изопреновых единиц, т. е. 40 атомов углерода). Помимо этого встречаются «апока-
ротиноиды» с укороченным углеродным скелетом, а также «гомокаротиноиды», или
высшие каротиноиды, которые содержат более восьми изопреновых единиц. Окра-
шенные каротиноиды имеют систему сопряженных двойных связей, и чем она про-
тяженнее, тем интенсивнее окраска пигмента.

Каротиноиды подразделяют на две основные группы. Каротины (от лат. саго —
мякоть) — это ациклические, терминально моноциклические и терминально бицик-
лические полиизопреноиды. Ксантофиллы (греч. xanthos — желтый, phyllon — лист)
представляют собой кислородсодержащие производные каротинов, в которых име-
ются эпокси (-О-), гидрокси (-ОН), кето (-СО-), метокси (-ОСН3) или формильные
(-СНО) группы.

С4о-каротиноиды синтезируются путем сшивания двух С2о-предшественников
способом «голова к голове» и в основном имеют £гап$-конфигурацию. Углеродные
атомы нумеруются начиная с обоих концов молекулы по направлению к ее 15:15х
центру (рис. 133).

Различают ациклические каротиноиды («^-каротиноиды») и циклические каро-
тиноиды. Последние содержат концевые циклогексеновые кольца с двойной связью
в положении 5:6 («/?-каротиноиды») или 4:5 («^-каротиноиды»); циклопентановые
кольца («к-каротиноиды»); арильные кольца с метильными заместителями в поло-
жениях 1,2,5 («^-каротиноиды») или 1,2,3 («^-каротиноиды»).

В настоящее время известно до 700 каротиноидов. Некоторые группы фототроф-
ных бактерий содержат специфический набор каротиноидов. В частности, пурпур-
ные бактерии образуют только ациклические каротиноиды. Цианобактерии синте-
зируют уникальные гликозилированные каротиноиды — миксоксантофилл и осцил-
локсантин, а также кетокаротиноиды — кантаксантин и эхиненон.
17	18	19	20

СН3О*и I 5I	7 о! 11	1з1 15.

ф,ф

16	2	4	6	8	10	12	14 15' Т Т Т Г^ОСНз

спириллоксантин (Rhodospirillum rubrum)

рамноза

НО	18

миксоксантофилл (Anabaena sp.)

К, К

капсорубин (Rhodobacter capsulatus)

окенон (Chromatium okenii)

Рис. 133. Примеры каротиноидов у аноксигеных и оксигенных фототрофных бактерий.
ф, (3, к- и Х'конЦевые группы (см. в тексте).

На рис. 133 приводятся примеры каротиноидов у аноксигенных и оксигенных
фототрофных бактерий.

Фотофизика каротиноидов. От возбужденной молекулы каротиноида энер-
гия путем синглет-синглетной конверсии (см. выше) передается хлорофиллу, нахо-
дящемуся в основном состоянии:

каротиноид + hz/ —> каротиноид*,
каротиноид* + Хлорофилл —> 1 каротиноид + Хлорофилл*.
Гарантией эффективности этого процесса служит тесное пространственное рас-
положение молекул каротиноида и хлорофилла. Как следствие, их электронные об-
лака частично перекрываются и попадают в резонанс. Соседние молекулы хлоро-
филла обмениваются возбужденным синглетным состоянием за 10-12 с. Энергия
возбуждения мигрирует по антенне и достигает реакционного центра, где происхо-
дят первичные фотохимические процессы.

12.6.3.	Фикобилины

Эти хромофоры близки по строению к тетрапиррольным пигментам животного
происхождения — биливердину и билирубину, которые образуются при катаболиз-
ме гема эритроцитов и входят в состав желчи (греч. phycos — морская трава и лат.
bills — желчь). Фикобилины имеются только у цианобактерий и пластид водорос-
лей из классов Cryptophyceae, Glaucocystophyceae и Rhodophyceae. Описаны четыре
группы фикобилинов —фикоцианобилины, фикоэритробилины, фикоуробилины и
фикобиливиолины.

Апопротеины фикобилинов — это слабокислые гидрофильные белки, по струк-
туре сходные с глобинами. Они состоят из гомологичных субъединиц а и (3 (15 и
17 кДа). Билиновые хромофоры присоединяются к апопротеинам через тиоэфир-
ные мостики, которые образуются между винильными радикалами при пирроль-
ных кольцах I и/или IV и сульфогидрильными группами остатков Cys (рис. 134).
Положения цистеинильных сайтов оптимизированы в процессе эволюции и высоко-
консервативны.

полипептидная цепь

Рис. 134- Фикобилиновый хромофор, связанный ковалентной связью с отстатком
цистеина.

I-IV — пиррольные кольца.

Хромопротеины, обладающие фикобилиновыми хромофорами, называются фи-
кобилипротеинами. Высокое относительное содержание фикобилипротеинов обеспе-
чивает специфическую окраску клеток цианобактерий. В частности, багряный цвет
объясняется накоплением фикоэритрина (греч. phykos — морская трава и erythros —
красный), а голубой — фикоцианина (греч. phycos — морская трава, kyaneos —си-
ний).

Помимо фикоэритрина и фикоцианина существуют еще семь вариантов фикоби-
липротеинов, которые различаются своими апопротеинами и хромофорными груп-
пами (аллофикоцианин, аллофикоцианин В и др.). Набор хромофоров, их локали-
зация в полипептидной цепи, а также взаимодействие белковых субъединиц опре-
деляют спектральные свойства конкретной фикобилипротеиновой светособирающей
антенны.

12.7.	СВЕТОСОБИРАЮЩИЕ АНТЕННЫ
И РЕАКЦИОННЫЕ ЦЕНТРЫ

Светособирающие антенны могут состоять или из пигмент-белковых комплексов,
или из хромопротеинов. Пигмент реакционного центра всегда находится в комплексе
с белком.

Выше мы уже говорили о том, что светособирающие антенны преобразуют энер-
гию квантов света в возбужденное состояние электронных облаков. От периферии
антенны возбужденное состояние мигрирует к ее центральной части (кору), а отту-
да — к реакционному центру.

Получив возбужденное состояние от светособирающей антенны, реакционный
центр его дезактивирует. Это осуществляется путем фотохимической окислительно-
восстановительной реакции, в которой первичный донор (активированный антен-
ной хлорофилл) отдает электрон первичному акцептору. От первичного акцептора
электроны передаются по цепи переносчиков к терминальному акцептору, который
расположен на противоположной стороне реакционного центра. Восстановленный
терминальный акцептор покидает реакционный центр и переходит в билипидный
слой мембраны или в цитоплазму.

Существуют два типа терминальных акцепторов. В первом случае терминаль-
ным акцептором служит хинон; он непосредственно окисляется цитохром бсДЬе/)-
комплексом, в результате чего создается Pmf (см. раздел 10.4.6). Во втором слу-
чае терминальным акцептором служит ферредоксин. Через посредников, роль ко-
торых выполняют пиридиннуклеотиды НАД(Ф), он передает электроны цитохром
Ьс1(Ьв/)-комплексу. Ферредоксин также может быть использован в качестве восста-
новителя в конструктивных процессах.

12.7.1.	Светособирающие антенны

Для чего фототрофам понадобились светособирающие антенны? Субъективный
опыт обманчиво подсказывает нам, что на земной поверхности более чем достаточ-
но света. Будь так на самом деле, хлорофилл реакционного центра самостоятельно
поглощал бы кванты света, переходил в возбужденное состояние и, находясь в нем,
выступал бы в роли восстановителя. Однако это происходит только при очень силь-
ном искусственном освещении (>105 лк), которое разрушительно воздействует на
фотосинтетический аппарат. При естественном освещении (<104 лк) такой процесс
возможен, но маловероятен.

Сказанное можно подтвердить несложным расчетом на примере оксигенного фотосинтетиче-
ского аппарата.

Частота актов поглощения квантов света молекулой пигмента (п) равна:

n = 4-10_21oN^^,

где а = 2,Зе (е — молярный коэффициент экстинкции), — величина светового потока
(квант-с-1 -см-2).
При ярком дневном освещении световой поток (N^) не превышает 1017квантс—1 см—2. Зна-
чение коэффициента а для хлорофилла а составляет ЗЮ4. Таким образом, согласно приведенной
формуле, молекула хлорофилла за одну секунду может поглотить только 12 квантов.

Еще в 1930-е годы Эмерсон (R.Emerson) экспериментально установил, что при 25°С элемен-
тарная фотосинтетическая реакция (2НгО —» 4Н+ + 4е_ + Ог) занимает по времени 210-2 с.
Поскольку для переноса одного электрона по электрон-транспортной цепи реакционные центры
ФС1 и ФСП поглощают каждый по одному кванту, на образование одной молекулы кислорода ухо-
дит 8 (4x2) квантов. Следовательно, для элементарной фотосинтетической реакции нужно, чтобы
за 2-10“2 с были поглощены 8 квантов (т.е. 400 квантов с-1). Напомним, что одна молекула хло-
рофилла поглощает всего 12 квантов в секунду. Таким образом, транспорт электронов только в
том случае не будет лимитироваться светом, если в фоторецепторном акте примет участие свето-
собирающая антенна, размер которой составляет как минимум 35 молекул хлорофилла (400:12).

С размером антенны неразрывно связано понятие «размер фотосинтетической единицы»
(англ, photosynthetic unit size, PSU size). Так обозначается количество молекул антенного пиг-
мента, в первую очередь антенного хлорофилла, которое приходится на молекулу хлорофилла,
выполняющего роль первичного донора в реакционном центре. У разных фототрофов эта величи-
на составляет от нескольких десятков до нескольких десятков тысяч.

Светособирающие антенны поглощают кванты света длиной волны 400-700 нм и
энергией 1-3,5 эВ. Возбужденное синглетное состояние (см. рис. 139) мигрирует по
антенне путем синглет-синглетного переноса и достигает хлорофилла реакционного
центра через 1О-10 с.

Тип реакционного центра и тип светособирающей антенны служат критерием
биоразнообразия фототрофных бактерий и определяют нишу, которую они занима-
ют.

Тип светособирающей антенны зависит от многих факторов:

—	первичной и вторичной структуры апопротеина;

—	профиля гидропатичности полипептидной цепи (ее взаимодействия с билипид-
ным слоем мембраны, в зависимости от этого различают интегральные и перифе-
рические антенны);

—	позиции сайтов для связывания хромофоров;

—	структуры хромофора;

—	способа сборки антенны из отдельных субъединиц;

—	расположения антенны относительно реакционного центра;

—	связи антенны с СМ или ICM;

—	ориентации надмембранной антенны относительно цитоплазматического ком-
партмента;

—	способности антенны адаптивно изменять свой состав при фотоакклиматиза-
ции.

Если антенна структурно совмещается с реакционным центром, ее называют «ан-
тенной реакционного центра» (англ, core antenna). Во всех остальных случаях ан-
тенна и реакционный центр обособлены друг от друга, и тогда антенна называется
светособирающим комплексом (англ, light-harvesting complex, LHC).

Светособирающий комплекс подразделяется на внутреннюю антенну (англ, in-
ternal antenna) и периферическую антенну (англ, peripheral antenna). Внутренняя
антенна занимает проксимальное положение по отношению к реакционному центру
и имеет постоянный состав. Периферическая антенна занимает дистальное поло-
жение по отношению к реакционному центру и может изменять свое строение при
фотоакклиматизации, когда клетка приспосабливается к использованию света дру-
гой интенсивности и/или другого спектрального состава. В некоторых случаях она
даже обладает механической подвижностью в плоскости мембраны, что позволяет
ей реориентироваться по отношению к реакционному центру (феномен так называ-
емой «мобильной антенны»).

12.7.2.	Реакционные центры

Когда хлорофилл реакционного центра переходит в возбужденное состояние, он
становится сильным восстановителем и спонтанно окисляется. Электрон передает-
ся по градиенту потенциальной энергии через цепь переносчиков к терминальному
акцептору. В результате пополняется мембранный или цитоплазматический пул вос-
становителя, соответственно хинона или ферредоксина.

Окисленный первичный донор является сильным окислителем. Возникшая в нем
электронная вакансия заполняется электроном, поступающим от цитохром bci(bef)-
комплекса или от неорганического субстрата, который используется в качестве эк-
зогенного донора электронов. В обоих случаях электрон передается по градиенту
потенциальной энергии.

Как показал молекулярно-генетический анализ фототрофных бактерий и пла-
стид, реакционные центры эволюционно консервативны. Все их известные варианты
сводятся к двум основным типам — RCI и RCII (табл. 14).

Реакционный центр RCI-типа. Этот реакционный центр также называют ре-
акционным центром [FenSn]-Tnna, поскольку терминальным акцептором электронов
в нем служит железо-серный кластер.

RCI используется в качестве единственного реакционного центра одноклеточ-
ными зелеными бактериями (фила BXI Chlorobi) и гелиобактериями (фила ВХШ
Firmicutes). Кроме того, RCI входит в состав ФС1 у оксигенных фототрофов — ци-
анобактерий (фила ВХ Cyanobacteria) и произошедших от них пластид.

Строение RCI было реконструировано в середине 1990-х годов на основе резуль-
татов рентген-структурного анализа; модельным объектом послужила одноклеточ-
ная цианобактерия Synechococcus sp. РСС 6301.

RCI образован двумя гомологичными «тяжелыми» (80 кДа) полипептидами, ко-
торые произошли от одного эволюционного предшественника. Партнеры в таком
«гетеродимере» состоят из одиннадцати трансмембранных доменов каждый.

Первичным донором электронов служат две кооперированные молекулы хлоро-
филла, или «димер первичного донора». Терминальным акцептором является «свя-
занный», или входящий в состав реакционного центра ферредоксин. Экзоплазма-
тическая сторона RCI имеет высокий (+500 мВ), а цитоплазматическая сторона
низкий (-500 мВ) редокс-потенциал.

Помимо двух-четырех специализированных молекул хлорофилла, участвующих
в окислительно-восстановительных реакциях, RCI содержит разное количество (до
ста) молекул антенного хлорофилла. Функцию апопротеинов антенны реакционного
центра выполняют шесть N-концевых доменов у обоих партнеров гетеродимера.

Реакционный центр RCII-типа. Его еще называют реакционным центром
Q-типа, поскольку терминальным акцептором электронов в данном случае служит
хинон.

RCII используется в качестве единственного реакционного центра нитчатыми
зелеными бактериями (фила ВVI Chloroflexi), а также пурпурными и квази-фото-
трофными бактериями (фила ВХП Proteobacteria). Кроме того, RCII входит в состав
ФСП у оксигенных фототрофов—цианобактерий (фила ВХ Cyanobacteria) и про-
изошедших от них пластид.
Таблица 14- Реакционные центры, фотосистемы и их апопротеины

Фила	Реакционный центр		Фотосистема		Апопротеин			
					Реакционного центра		Антенны реакционного центра	
	I	П	I	II	I	И	I	И
Аноксигенные бактерии								
BVI  Chloroflexi	—	RCII	—	GbRC*	—	L/M**	—	—
BXI  Chlorobi	RCI	—	PSC***	—	(PscA)2	—	(PscA)2	—
ВХП  Proteo- bacteria	—	RCII	—	PbRC****	—	L/M	—	—
ВХШ  Firmicutes	RCI	—	pgH*****	—	(PshA)2	—	(PshA)2	—
Оксигенные бактерии								
ВХ  Cyano- bacteria	RCI	RCII	PSI	PSII	PsaA/ PsaB	D1/D2	PsaA/ PsaB	СР43/  CP47

* — комплекс реакционного центра нитчатых зеленых бактерий (от англ, green filamentous bac-
teria reaction centre complex); ** — легкая (от англ, light) и средняя (от англ, medium) субъединицы;
*** — фотосистема одноклеточных зеленых бактерий (от англ, photosystem of Chlorobium)-, ****—
комплекс реакционного центра пурпурных бактерий (от англ, purple bacteria reaction centre com-
plex); *****—фотосистема гелиобактерий (от англ, photosystem of heliobacteria).

Строение RCII было реконструировано в середине 1980-х годов на основе резуль-
татов рентген-структурного анализа; модельным объектом послужила содержащая
бактериохлорофилл b пурпурная несерная бактерия Rhodopseudomonas viridis.

RCII образован двумя гомологичными «легкими» (40 кДа) полипептидами, ко-
торые произошли от одного эволюционного предшественника. Партнеры в таком
«гетеродимере» состоят из пяти трансмембранных доменов каждый.

Первичным донором электронов служат две кооперированные молекулы хлоро-
филла, или «димер первичного донора». Терминальным акцептором является хи-
нон. Экзоплазматическая сторона RCI имеет высокий (от +500 до +1000 мВ), а
цитоплазматическая сторона низкий (-100 мВ) редокс-потенциал.

У зеленых нитчатых и пурпурных бактерий гетеродимер RCII лишен светособи-
рающих хлорофиллов, и их единственная фотосистема не обладает антенной реак-
ционного центра. У оксигенных фототрофов роль апопротеинов антенны реакцион-
ного центра ФСП выполняют две дополнительные субъединицы, каждая из которых
состоит из шести трансмембранных доменов и связывает до двадцати молекул хло-
рофилла.

Филогения реакционных центров. В результате молекулярного секвениро-
вания установлено, что субъединицы гетеродимера L/M (реакционный центр нит-
чатых зеленых, пурпурных и квази-фототрофных бактерий) гомологичны субъеди-
ницам гетеродимера D1/D2 (реакционный центр ФСП).

В свою очередь, субъединицы D1/D2 и субъединицы антенны реакционного цен-
тра ФСП гомологичны соответственно пяти С-концевым и шести N-концевым доме-
нам гетеродимера RCI.

Предполагается, что в ходе эволюции архаичная субъединица, имевшая 11 (5+6)
трансмембранных доменов, фрагментировалась на субъединицу из пяти доменов и
субъединицу из шести доменов. Первая из них дала начало субъединицам L/М и
D1/D2, а вторая — субъединице антенны реакционного центра ФСП. Таким образом,
все реакционные центры связаны между собой общим эволюционным происхожде-
нием.

12.7.3.	Аноксигенная фототрофия

Аноксигенные фототрофные бактерии принадлежат к четырем филам (BVI
Chloroflexi, BXI Chlorobi, ВХП Proteobacteria и BXIII Firmicutes).

Одни из них содержат реакционный центр RCI-типа, другие — RCII-типа. Эти ре-
акционные центры обслуживаются разнообразными антеннами, которые состоят из
интегральных или периферических хлорофилл-каротиноид-белковых комплексов.

Размер фотосинтетической единицы у аноксигенных фототрофов варьирует
от нескольких десятков (у гелиобактерий и некоторых пурпурных бактерий) до
нескольких десятков тысяч (у некоторых зеленых бактерий). В первом случае мы
имеем дело со «светолюбивыми», а во втором случае —с «теневыносливыми» мик-
роорганизмами, которые заселяют разные этажи эуфотической зоны водоемов.

12.7.3.1.	Пурпурные бактерии, квази-фототрофные бактерии
(фила ВХП Proteobacteria) и нитчатые зеленые бактерии

(фила ВVI Chloroflexi)

У пурпурных и квази-фототрофных бактерий фотосинтетический аппарат ча-
ще всего входит в состав модульных элементов ICM — хроматофоров сферической,
трубчатой, пластинчатой или дисковидной формы (см. I том учебника). Некото-
рые виды (например, Rhodospirillum tenue) хроматофоров не образуют, и их фото-
синтетический аппарат сосредоточен в СМ. Светособрающие антенные комплексы
пурпурных бактерий только интегральные.

Нитчатые зеленые бактерии, за редкими исключениями, не образуют ICM, и
их фотосинтетический аппарат входит в состав СМ. Помимо интегральной антен-
ны они содержат периферическую антенну — хлоросому (не имеют хлоросом только
Heliothrix oregonensis и Roseiflexus castenholzii).

Реакционный центр. У перечисленных бактерий он принадлежит к RCII-типу,
выполняет роль цитохром:хинон-оксидоредуктазы и состоит из трех субъединиц,
каждая из которых представлена единственной копией:

—	L (от англ, light — легкий);

—	М (от англ, medium — средний);

—	Н (от англ, heavy — тяжелый).

Субъединицы L (18 кДа; ген pufL) и М (21 кДа; ген puf М) содержат по пять
трансмембранных о-спиралей. Субъединица Н (17 кДа; ген puhA) названа «тяже-
лой» из-за самой высокой электрофоретической подвижности, хотя в действитель-
ности из трех субъединиц она наименьшая и состоит из единственной трансмем-
бранной а-спирали, а также из цитоплазматического С-концевого домена, который
кэппирует цитоплазматические домены L/M-субъединиц.

Гетеродимер субъединиц L/М связывает десять кофакторов, а именно:

—	четыре молекулы бактериохлорофилла а или 6;

—	две молекулы бактериофеофитина а или 6;
—	две молекулы убихинона-10 или менахинона-8;

—	атом негеминового железа, лигандированный остатками His и выполняющий
структурную роль;

—	молекулу каротиноида (моно-сгз-спириллоксантина), защищающую реакцион-
ный центр от фотоокисления.

У пурпурных бактерий существуют два варианта RCII. В одном из них
(у Rhodobacter sphaeroides) донором электрона служит растворимый цитохром с
(рис. 135, А). В другом (Thermochromatium tepidum или Blastochloris viridis) донор
электрона — это полуинтегральный тетрагемовый цитохром с (рис. 135, Б).

Рис. 135. Реакционный центр пурпурных бактерий (по: Пиневич, Аверина, 2002).

А — комплекс из трех субъединиц; Б — комплекс из четырех субъединиц; L, М и Н —
субъединицы реакционного центра; гем сх4—тетрагемовый цитохром с; Р870 — первич-
ный донор; Вь-бактериохлорофилл активной ветви; Вм-бактериохлорофилл неактивной
ветви; РЬь-бактериофеофитин активной ветви; РЬм-бактериофеофитин неактивной вет-
ви; QA-«nepBH4Hbift> хинон; Qb — «вторичный» хинон; Fe — атом железа; Q — хинон, свя-
зывающий реакционный центр с хинонным пулом; с552 — растворимый цитохром с.

По данным рентген-кристаллографии препаратов RCII, полученных из хромато-
форов В. viridis, гетеродимер L/M обладает билатеральной квази-симметрией, ори-
ентируется перпендикулярно к поверхности мембраны и связывает две ветви кофак-
торов-переносчиков. Физиологически активна только та из них, которая приурочена
к L-субъединице.

Две из четырех молекул бактериохлорофилла лежат на оси симметрии гетероди-
мера L/M у экзоплазматической поверхности мембраны. Благодаря своему близко-
му взаимному расположению они образуют кооперативную резонансную структуру,
или «димер». Это первичный донор —Р870* (от англ, pigment — пигмент). Цифра
обозначает положение плеча у главного максимума на спекте поглощения (в нм).
После окисления первичного донора плечо исчезает и вновь появляется при запол-
нении электронной вакансии.

Третья молекула бактериохлорофилла Bl (от англ, bacteriochlorophyll и left —
левый) входит в состав физиологически активной левой ветви. Она выполняет роль
промежуточного акцептора и за 10-12 с получает электрон от возбужденного ди-
мера Р870* (-750 мВ). Окисленный первичный донор Р870+ (+480 мВ) за 3-10“7 с
заполняет свою электронную вакансию электроном, полученным либо от «раство-
римого» моногемового цитохрома с552 (сг) с редокс-потенциалом +400 мВ, либо
от тетрагемового цитохрома с (редокс-потенциалы соответственно -60, +20, +320 и
+380 мВ). Первый из них связан с экзоплазматическим доменом М-субъединицы
нековалентно, второй — ковалентно через тиоэфирный мостик.

Восстановленный акцептор Bl через 2-10-11с передает электрон первичному ак-
цептору— бактериофеофитину PIil (-400 мВ). Тот, в свою очередь, за 2-10“10 с
восстанавливает молекулу «первичного» хинона Qa, которая взаимодействует с М-
субъединицей (-110 мВ). Наконец, Qa через 10-4 с передает электрон «вторичному»
хинону Qb, который связан с L-субъединицей и выполняет роль терминального ак-
цептора (-10 мВ). После повторного восстановления Qb он протонируется через вод-
ный канал, сообщающийся с цитоплазматическим компартментом, теряет сродство
к реакционному центру и переходит в хинонный пул (см. раздел 10.4.6). Освободив-
шееся место занимает одна из молекул окисленного хинона.

На примере R. sphaeroides показано, что два реакционных центра RCII образу-
ют функциональный суперкомплекс с цитохром Ьс\-комплексом и одной молекулой
цитохрома С2.

Антенные комплексы. Реакционный центр пурпурных и квази-фототрофных
бактерий получает энергию от интегральных светособирающих комплексов — прок-
симального LHI и дистального LHII.

Комплекс LHI окружает реакционный центр. За исключением некоторых му-
тантов, его присутствие обязательно. Комплекс LHII расположен с внешней сторо-
ны комплекса LHI и передает ему поглощенную энергию. У некоторых пурпурных
бактерий, например Rhodospirillum rubrum, он отсутствует. Молекулярное строение
антенных комплексов у пурпурных бактерий изучено для видов, содержащих бак-
териохлорофилл а (870-890 нм). Сведения для Rhodopseudomonas viridis и других
видов, содержащих бактериохлорофилл b (1020 нм), ограниченны и противоречивы.

Проксимальный комплекс LHI обозначается как В870 (от англ, bulk — преобла-
дающий). Цифра соответствует положению (в нм) главного «дальнего» красного
максимума на спектре поглощения. Апопротеины этого комплекса — взаимно гомо-
логичные полипептиды а (6,5 кДа; ген pufA) и (3 (5,5 кДа; ген pufB). Они состоят
из 50-60 аминокислотных остатков и образуют по одному интегральному домену.
Гетеродимер а/3 содержит две молекулы бактериохлорофилла а (870 нм) и две мо-
лекулы каротиноида (рис. 136, А). Сайтами для связывания обоих пигментов слу-
жат консервативные остатки His-32 (си) и His-38 (/?). Шесть гетеродимеров образуют
разомкнутое кольцо, что позволяет молекулам хинона перемещаться между реак-
ционным центром и цитохром 6с i-комплексом (рис. 136, Б).

Периферический комплекс LHII обозначается как В800-850. Цифры соответству-
ют положению (в нм) двух главных «дальних» красных максимумов на спектре по-
Рис. 136. Светособирающая антенна пурпурных бактерий.

А — интеграция антенны в мембрану (в разрезе); Б — организация фотосинтетической едини-
цы (в плоскости мембраны); LHI и LHII — проксимальная и периферическая антенны; а и (3 —
апопротеины; RC — реакционный центр; Ьс — цитохром Ьс-комплекс; Бхл — бактериохлорофилл.

глощения. Апопротеины этого комплекса — взаимно гомологичные полипептиды а
(6,5 кДа; ген рисА) и /3 (5,5 кДа; ген рисВ). Гетеродимер &(3 связывает две молекулы
бактериохлорофилла а (850 нм), одну молекулу бактериохлорофилла а (800 нм) и
одну молекулу каротиноида (рис. 136, А).

На один гексамер комплекса LHCI у R. capsulatus приходится восемь-девять ком-
плексов LHCII (рис. 136, Б). Конкретное соотношение варьирует у разных пурпур-
ных бактерий, кроме того, у одного и того же штамма оно зависит от интенсивности
света — на ярком свету уменьшается относительная доля комплекса LHCII.

Реакционный центр нитчатых зеленых бактерий получает энергию от интеграль-
ных антенных комплексов, работающих в сочетании с перферической антенной —
хлоросомой (см. ниже).
12.7.3.2.	Одноклеточные зеленые бактерии (фила BXI Chlorobi)
и гелиобактерии (фила BXIII Firmicutes)

Эти бактерии никогда не образуют ICM, и их фотосинтетический аппарат содер-
жится в СМ. Подобно нитчатым зеленым бактериям, одноклеточные зеленые бакте-
рии содержат антенны двух типов — интегральную и периферическую (хлоросому).
Гелиобактерии не обладают светособирающим комплексом, и обходятся только од-
ной антенной реакционного центра (см. раздел 12.7.1).

Реакционный центр. У одноклеточных зеленых бактерий реакционный центр
принадлежит к RCI-типу и образован гомодимером «тяжелых» интегральных по-
липептидов PscA молекулярной массой 80 кДа (рис. 137, А). Каждый из них со-
стоит из одиннадцати трансмембранных доменов и связывает до двадцати моле-
кул бактериохлорофилла и до трех молекул каротиноида. Первичный донор Р840*
(-1000 мВ) представлен «димером» бактериохлорофилла а. Редокс-потенциал пары
Р840+/Р800 составляет +500 мВ. Предполагаемый первичный акцептор — это эте-

см

PscD

PscC

PscA

гем с

гем с

PscA

[Fe4SJ

[Fe4S4]

PscB

Рис. 137. Реакционные центры одноклеточных зеленых бактерий (А) и гелиобакте-
рий (Б) (по: Пиневич, 2005).

PscA и PshA — интегральные субъединицы; Р840 и Р798 — первичные доноры;
СЫ — хлорофилл a; Cho — 4-гидроксиэтил-хлорофилл а; [Fe4S4] — железо-серный кластер;
PscC — цитохром с; PscB — терминальный акцептор (растворимый ферредоксин); PscD —
периферическая субъединица, лишенная простетической группы.
рифицированный фарнезолом хлорофилл а (хлорофилл аббЗ). Промежуточными
переносчиками электронов служат от одного до трех [Ре484]-центров. Вопрос о том,
входит ли в число кофакторов реакционного центра связанный хинон, остается дис-
куссионным. Роль терминального акцептора электронов выполняет периферическая
субъединица PscB — связанный ферредоксин, обладающий двумя [Ре484]-центрами.
Он гомологичен субъединице PsaC, которая у цианобактерий и пластид входит в
состав ФС1 (см. ниже). В качестве донора электронов для Р840+ (+1100 мВ) ис-
пользуется парная субъединица PscC — амфипатический цитохром cz (20 кДа).

Реакционный центр гелиобактерий (рис. 137, Б) образован гомодимером тяже-
лых интегральных полипептидов PshA (80 кДа). Оба состоят из одиннадцати транс-
мембранных доменов и связывают по шестнадцать молекул бактериохлорофилла д.
Первичный донор Р798* (-1000 мВ) представлен «димером» бактериохлорофилла д.
Редокс-потенциал пары Р798+/Р798 составляет +500 мВ. Наиболее вероятным пер-
вичным акцептором является 4-гидроксиэтил-хлорофилл а. Промежуточными пе-
реносчиками, как и у одноклеточных зеленых бактерий, являются один-три ^6484]-
центра. Роль терминального акцептора электронов, скорее всего, выполняет «свя-
занный» ферредоксин, содержащий два [Ре484]-центра. В качестве донора электро-
нов для Р798+ (+110 мВ) используется амфипатический липопротеин — цитохром
с553. На один реакционный центр приходятся не менее двух его молекул. Пул моле-
кул цитохрома с553 состоит из нескольких форм с редокс-потенциалами от -90 до
+215 мВ. У Heliobacillus mobilis молекулярные массы двух форм цитохрома с553 со-
ставляют 18 и 50 кДа. В свою очередь, у Heliobacterium gestii выявлены три формы
цитохрома с553 молекулярными массами 18, 32 и 42 кДа. Гены низкомолекулярной
формы цитохрома с553 у двух этих видов взаимно гомологичны.

Антенные комплексы. Реакционный центр одноклеточных зеленых бактерий
получает энергию от системы интегральных и периферических антенн. Перифери-
ческая антенна, хлоросома, у одноклеточных зеленых бактерий охарактеризована
лучше, чем у нитчатых Chloroflexi.

Хлоросома представляет собой компартмент высотой 12-60, шириной 25-100 и
длиной 25-250 нм, прикрепленный к внутренней поверхности СМ (рис. 138). Она
окружена однослойной неунитарной мембраной толщиной 2-3 нм, состоящей из
моногалактозил-диглицерида. Внутри она заполнена агрегатами пигмент-белково-
го комплекса В750, содержащего бактериохлорофилл с, d или е (некоторые виды,
например Chlorobium vibrioforme одновременно содержат бактериохлорофиллы с и
d).

Белковые субъединицы комплекса В750 имеют молекулярную массу 5,5 кДа и
связывают по семь молекул бактериохлорофилла. Субъединицы объединяются в
гексамеры размером 5x10 нм, гексамеры —в продольно лежащие «стержни» (англ,
rod) диаметром 5-10 нм и числом 10-30.

Всего в состав хлоросомы может входить до 104 молекул бактериохлорофилла.
Каждая хлоросома взаимодействует с 5-10 реакционными центрами.

Размер хлоросомы не изменяется в онтогенезе, хотя варьирует у разных видов.
Количество хлоросом, от нескольких десятков до двух-трех сотен на клетку, нахо-
дится в обратной зависимости от интенсивности освещения.

Интегральная антенна одноклеточных зеленых бактерий состоит из тримеров
белка молекулярной массой 40 кДа, который связывает по семь молекул бактерио-
хлорофилла а (В808). Это так называемый «белок FMO» (от первых букв фамилий
его первооткрывателей — R. Е. Fenna, В. W. Matthews и J. М. Olson).
В808

(40 кДа-БМО/7Бхл а)

Рис. 138. Хлоросома.

В750 — периферическая антенна; В800 — промежуточная антенна; В808 — проксимальная ан-
тенна; RC — реакционный центр; FMO — белок FMO; Бхл — бактериохлорофилл.

В основании хлоросомы располагается так называемая базальная пластинка
(англ, baseplate) толщиной 5-6 нм. Она имеет паракристаллическое строение и со-
стоит из гидрофильного белка молекулярной массой 30 кДа, связывающего семь
молекул бактериохлорофилла а (В800).

Базальная пластинка выполняет роль посредника, а возможно и распределителя
энергии между хлоросомой и интегральными антеннами, связанными с отдельными
реакционными центрами.

12.7.4.	Оксигенная фоторофия

Главный прорыв в изучении оксигенной фототрофии был совершен только по-
сле освоения методов культивирования цианобактерий, получения их мутантов и
разработки для них систем генетической рекомбинации. До этого с целью изучения
молекулярных основ оксигенной фототрофии использовали изолированные хлоро-
пласты.

В 1937 г. американский биохимик Робин Хилл (R. Hill) открыл химическую реакцию, позднее
названную в честь него «реакцией Хилла». Она происходит на свету при условии, что в инкуба-
ционную среду, не содержащую никаких других доноров электронов кроме воды, вносится искус-
ственный акцептор электронов (например, Fe3+). Побочным продуктом реакции Хилла является
молекулярный кислород:

Н2О + А -» АН2 + 1/2О2.

Детали сложных физических и биохимических процессов, скрывающихся за этим простым
уравнением, прояснились только через 20 лет. На протяжении 1950-1960 гг. были идентифицирова-
ны промежуточные переносчики электронов от воды к искусственному акцептору и установлена по-
следовательность их взаимодействия. Важнейшим шагом вперед стало открытие цепи окислитель-
но-восстановительных реакций, протекающих согласно так называемой «Z-схеме» (см. рис. 139).
В интактных клетках акцептором электронов при светозависимом окислении воды служит НАДФ,
восстановленная форма которого используется при ассимиляции СОз-

В конце 1950-х годов группа американских исследователей под руководством Эмерсона обна-
ружила парадоксальный эффект — вызывающий слабую реакцию Хилла «дальний» красный свет
(А > 700 нм) усиливает фотосинтетическую эффективность действия «ближнего» красного света
(А <700 нм). Тщательно изучив это явление, Хилл и Бендал (R. Bendall) в 1960 г. предположили,
что у оксигенных фототрофов существуют две сопряженные фотохимические реакции, которые
катализируются соответственно «коротковолновой» и «длинноволновой» фотосистемами. Общее
уравнение оксигенного фотосинтеза выглядит следующим образом:

СО2 4" 2Н2О + 4ht/i+ 4hi/2 —* [СН2О] + Н2О + 02-

Исследования, проведенные в начале 1960-х годов на красной водоросли Porphyridium стиеп-
tum, показали, что «дальний» красный свет (А ~700 нм) активирует редокс-систему, окисляющую
цитохром /. В то же время «ближний» красный свет (А ~680 нм) используется редокс-системой,
которая восстанавливает цитохром f. Позднее эти редокс-системы получили название фотосистем
(ФС) I и II. Путем их фракционирования было показано, что «дальний» красный свет действи-
тельно вызывает реакции, происходящие в ФС1, а «ближний» красный свет — в ФСП.

В середине 1970-х годов сложилось представление о том, что после поглощения «ближних»
красных квантов электроны передаются внутри ФСП от компонента Y компоненту Q, а для регене-
рации компонента Y используются электроны, полученные при ферментативном окислении воды.
Компонент Q через цепь переносчиков, одним из которых является цитохром /, передает элек-
троны компоненту Р700, входящему в состав ФС1. В свою очередь, после поглощения «дальних»
красных квантов электроны передаются внутри ФС1 от компонента Р700 компоненту X, который
используется для восстановления НАДФ.

Первая фотосистема. ФС1 работает по принципу светозависимой цитохром
Сб(пластоцианин):ферредоксин-оксидоредуктазы. Иными словами, она переносит
электроны от донора (цитохрома &б или пластоцианина), связанного с экзоплаз-
матической поверхностью мембраны, к акцептору (ферредоксину), который взаи-
модействует с цитоплазматической поверхностью.

ФС1 очень консервативна — у разных цианобактерий аминокислотные последова-
тельности ее интегральных полипептидов гомологичны на 75%. Как уже отмечалось,
по внутреннему строению она сходна с реакционными центрами одноклеточных зе-
леных бактерий и гелиобактерий.

ФС1 имеет молекулярную массу 340 кДа. Этот интегральный пигмент-белковый
комплекс состоит из одиннадцати полипептидов, ~100 молекул антенного хлоро-
филла а и 10-25 молекул /3-каротина.

В состав ФС1 входят шесть переносчиков электронов (рис. 140):

—	первичный донор Р700 (от англ, pigment), «димер» из двух близко располо-
женных молекул хлорофилла а или хлорофилла ф

—	первичный акцептор Ло (от англ, acceptor), «мономерная» молекула хлоро-
филла а;

—	промежуточный акцептор Ai, молекула филлохинона;

—	вторичные акцепторы Fx, Fa и Fb (от англ, ferredoxin), [РедБ^-кластеры.

Минимальной функциональной единицей является монокомплекс ФС1, хотя in
situ они объединяются в тримеры.

Во второй половине 1990-х годов немецкий исследователь Петра Фромме
(Р. Fromme) получила кристаллические препараты ФС1 одноклеточной цианобак-
терии Synechococcus sp., что позволило реконструировать ее трехмерную модель с
уровнем разрешения 3,бА.
Рис. 139. Электрон-транспортная цепь оксигенных фототрофных бактерий (по: Пи-
невич, Аверина, 2002).

PSI — первая фотосистема; PSII — вторая фотосистема; Р700* и Р680*—возбужден-
ные первичные доноры; Р700+ и Р680+—окисленные первичные доноры; Ao, Aj, F%,
Fa и Fb—переносчики электрона в первой фотосистеме; Fd — растворимый ферредок-
син; Ph, Qa и QB-переносчики электрона во второй фотосистеме; Fe—«структурный»
атом железа; Мп — марганцевый кластер кислородвыделяющего комплекса; Yz —остаток
Tyr-161, PQ — пластохиноиный пул; Ьц, Ьн, f и R— простетические группы цитохром b^f-
комплекса; с553 — растворимый цитохром с.
Выяснилось, что каркас ФС1 образован гетеродимером «больших» субъединиц —
PsaA и PsaB (83 и 82,4 кДа). Каждая из них состоит из одиннадцати трансмембран-
ных петель, причем десятая петля содержит консервативные His-сайты, от которых
зависит расположение первичного донора Р700* (-750 мВ). Гетеродимер PsaA/PsaB
связывает первый из трех вторичных акцепторов (Fx), а также первичный и про-
межуточный акцепторы Ао и Ai (рис. 140).

Рис. 140. Первая фотосистема (по: Пиневич, Аверина, 2002).

А и В — гетеродимер интегральных субъединиц; С, D, Е, F, I, J, К,
L и М — вспомогательные субъединицы; Р700 — первичный донор; Ao, Ai
и Fx — переносчики электрона; Fa и Fo — простетические группы терми-
нального акцептора; Fd — растворимый ферредоксин; Рс — пластоцианин.
В скобках — Мг (кДа).

ФС1 снабжен собственной антенной реакционного центра, в состав которой вхо-
дят до ста молекул хлорофилла а (в случае A. marina вместо них используется
примерно равное количество молекул хлорофилла d). Помимо хлорофилла, антенна
реакционного центра ФС1 содержит 14 молекул /3-каротина, тогда как во внутренних
и периферических антеннах преобладают ксантофиллы.

В состав ФС1 дополнительно входят малые субъединицы C-F (8-16 кДа). Пе-
риферические субъединицы PsaC, PsaD и PsaE расположены на цитоплазматиче-
ской поверхности. Субъединица PsaC связывает [Ге484]-кластеры Fa/Fb, в то время
как субъединица PsaD образует докинг-площадку для ферредоксина. Субъединица
PsaE, скорее всего, отвечает за ориентацию субъединиц PsaC и PsaD по отношению
к гетеродимеру PsaA/PsaB. Четвертая малая субъединица PsaF расположена на эк-
зоплазматической стороне мембраны и образует докинг-площадку для цитохрома
Сб или медьсодержащего переносчика — пластоцианина.

К числу компонентов ФС1 также относятся пять малых гидрофобных полипеп-
тидов— Psal (4 кДа), PsaJ (4 кДа), PsaK (8 кДа), PsaL (17 кДа) и PsaM (3 кДа). Они
стабилизируют структуру всего комплекса и отвечают за его агрегацию в тримеры.

Реакционный центр ФС1 специфически возбуждается «дальним» красным све-
том (>700 нм), после чего передает электроны переносчикам, расположенным на ци-
топлазматической поверхности мембраны. В свою очередь, вакансию в акцепторном
участке ФС1 (редокс-потенциал пары Р700+/Р700 составляет +500 мВ) заполняет
электрон, поступающий от цитохром be /-комплекса через переносчики, расположен-
ные на экзоплазматической поверхности.

Вторая фотосистема. Реакционный центр ФСП специфически возбуждает-
ся «ближним» красным светом (<680 нм) и в этом состоянии становится доно-
ром электронов для цитохром Ьв/-комплекса. Иными словами, он действует как
НгОгпластохинон-оксидоредуктаза. Эта светозависимая ферментная система пере-
дает электроны от кислородвыделяющего комплекса, расположенного на экзоплаз-
матической стороне мембраны, пластохинону на цитоплазматической стороне.

ФСП состоит из двух компонентов — реакционного центра и кислородвыделяю-
щего комплекса.

Пространственную модель ФСП построил англичанин Джеймс Барбер (J. Barber)
в 1999 г. на основе результатов лазерной спектрофотометрии и электронной кристал-
лографии препаратов, выделенных из фотогетеротрофного штамма одноклеточной
цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Для сравнения использовались ранее по-
лученные данные рентген-диффрактометрии реакционных центров, изолированных
из Blastochloris viridis и других пурпурных бактерий.

ФСП цианобактерий in situ существует в виде мономера или димера. Мономер-
ный комплекс образован интегральными и периферическими белками PsbA-W, каж-
дый из которых содержит от одной до шести интрамембранных петель (рис. 141).
Каркас ФСП состоит из гетеродимера гомологичных полипептидов PsbA (38 кДа)
и PsbD (39,4 кДа). Они обозначаются как D1 и D2 (от англ, diffuse), поскольку
при SDS-электрофорезе образуют размытые полосы. Эти полипептиды содержат по
пять трансмембранных петель и сообща связывают четыре простетические группы,
переносящие электроны:

—	первичный донор Р680 (от англ, pigment), «мономерную» молекулу хлорофил-
ла

—	первичный акцептор Ph (от англ, pheophytin), феофитин а;

—	вторичные акцепторы Q\ и Qb (от англ, quinone), две молекулы менахинона.

Помимо первичного донора Р680, в состав ядра ФСП входит квази-симметрич-
ный ему «мономер» хлорофилла а. К центральным молекулам хлорофилла а до-
бавляются еще две квази-симметричные им молекулы, причем одна играет роль
промежуточного акцептора, получающего электроны от возбужденной молекулы
первичного донора Р680*. В ядре ФСП обнаружены еще две периферические моле-
кулы хлорофилла а, функция которых не установлена.

Роль посредника между катион-радикалом первичного донора Р680+- и кисло-
родвыделяющим комплексом выполняет аминокислотный остаток Tyr-161 (Yz), вхо-
дящий в состав полипептидной субъединицы PsbA. Функцию марганецсвязывающе-
го белка также выполняет эта субъединица (рис. 141).

Лигандами для первичного донора Р680 служат два аминокислотных остатка:
Рис. 141. Вторая фотосистема (по: Пиневич, Аверина, 2002).

А и D — гетеродимер интегральных субъединиц; С и В — субъединицы
кор-антенны; Е и F — вспомогательные субъединицы; Р, О и Q — субъеди-
ницы кислородвыделяющего комплекса; Мп — марганцевый кластер кис-
лородвыделяюгцего комплекса; Yz—остаток Туг-161; Р680 — первичный
донор; Ph, Qa и Qb — переносчики электрона; Fe — атом железа. В скоб-
ках— Мг (кДа).

His-198, входящий в состав субъединицы PsbA, и His-197, входящий в состав субъеди-
ницы PsbB. Аминокислотный остаток Trp-253 (Yd), входящий в состав субъединицы
PsbB, переносит электрон от первичного акцептора Ph к хинону Qa- Взаимодей-
ствие между «первичным» хиноном Qa и «вторичным» хиноном Qb обеспечивается
катионом негеминового железа Fe2+, который связан с субъединицей PsbA.

Антенна реакционного центра ФСП состоит из гидрофобных полипептидов
PsbC (50 кДа) и PsbB (56 кДа), у каждого из которых по шесть трансмембран-
ных петель. Поскольку «кажущаяся», т. е. определенная с помощью электрофореза,
масса этих полипептидов равна 43 и 47 кДа, их обозначают как СР43 и СР47 (от
англ, chlorophyll protein). Эти полипептиды связывают по 20-25 молекул хлорофил-
ла а и по четыре-пять молекул Д каротина. Помимо того, что субъединица PsbB
является частью антенны реакционного центра ФСП, она дополнительно взаимодей-
ствует с полипептидом PsbO, который стабилизирует марганцевый кластер кисло-
родвыделяющего комплекса. Антенная субъединица PsbC также бифункциональна
и заодно заякоривает ФСП в билипидном слое.

Помимо полипептидов PsbAD и PsbCB, в состав ФСП входят интегральные субъ-
единицы PsbE и PsbF (апоцитохромы 6559), а также несколько полипептидов, лока-
лизованных на экзоплазматической поверхности мембраны. Из них особенно важна
субъединица PsbO (26,5 кДа), или марганецстабилизирующий белок (англ, man-
ganese stabilizing protein, MSP). От него зависит работа кислородвыделяющего ком-
плекса, хотя сам он непосредственно не участвует в окислении воды.

В состав ФСП дополнительно входит цитохром с550 и набор низкомолекулярных
полипептидов, в частности субъединицы PsbH-N, PsbR, PsbT и PsbW (< 10 кДа).
У цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 интегральный полипептид PsbJ (4кДа)
обеспечивает сборку и стабильность ФСП. Функция остальных субъединиц пока еще
не установлена.

Кислородеыделяющий комплекс. С энзимологической точки зрения ФСП
представляет собой частный случай дегидрогеназной системы. В качестве доно-
ра электронов она использует воду, а в качестве акцептора электронов цитохром
bci(be/)-комплекс, т. е. это Нг О-дегидрогеназа.

Данный фермент уникален, поскольку в живой природе не существует других
механизмов для окисления воды, а у фототрофов не бывает других светозависимых
дегидрогеназ.

При дегидрировании воды в качестве побочного продукта образуется молекулярный кислород:

2Н2О -» 4Н+ + 4е“ + О2,

что имеет сразу несколько глобальных биологических последствий.

Во-первых, молекулярный кислород используется в энергетическом метаболизме аэробно ды-
шащими прокариотами и митохондриями в качестве субстрата для терминальных редуктаз. Его
ресурсы в верхних слоях земной коры и поверхностном слое водоемов богаче по сравнению с дру-
гими акцепторами электронов.

Во-вторых, в ходе оксигеназных реакций один или два атома кислорода присоединяются к
органическим молекулам, образуя их окисленные производные, которые играют ключевую роль в
энергетическом и/или конструктивном метаболизме. Примерами служит окисление метана в мета-
нол метанотрофными бактериями (см. раздел 11.4.4.2) и образование ксантофиллов из каротинов
(см. раздел 15.2.2).

В третьих, молекулярный кислород выступает в качестве сигнальной молекулы — хемоэф-
фектора при аэротаксисе бактерий и архей, а также в качестве регулятора биогенеза фотосинте-
тического аппарата у пурпурных и зеленых аноксигенных бактерий (см. раздел 12.4).

В четвертых, молекулярный кислород является фактором окислительного стресса у всех жи-
вых организмов. По образному выражению американского бактериолога Волка (С.Р.Wolk), «Ци-
анобактерии за 2,2 млрд лет замусорили нашу планету токсичным побочным продуктом фотоза-
висимого окисления воды». Однако этот мусор послужил одним из важнейших факторов органи-
ческой эволюции. В современную геохронологическую эпоху он обеспечивает квази-стационарное
состояние биосферы и жизнедеятельность облигатно аэробных организмов, в том числе человека.

Окисление воды оксигенными фототрофами, совместно с рибулозобисфосфат-карбоксилазной
реакцией у автотрофов по углероду и нитрогеназной реакцией у диазотрофов — это «три кита», на
которых держится современная биосфера.

Н2О-дегидрогеназную реакцию способны осуществлять только представители филы ВХ
Cyanobacteria и их эволюционные родственники — пластиды. Окончательное объяснение механиз-
ма окисления воды входит в число важнейших задач физико-химической биологии. Расшифровка
структуры марганцевого кластера кислородвыделяющего комплекса откроет перспективы для ре-
гулирования фотосинтеза и позволит создать искусственные аналоги биологических систем, транс-
формирующих световую энергию в химическую.

Функциональным ядром кислородвыделяющего комплекса (англ, oxygen-evolving
complex, ОЕС) является марганцевый кластер с лигандной сферой, в состав которой
входят анионы С1- и катионы Са2+. Другим ключевым компонентом ОЕС служит
консервативный аминокислотный остаток Туг-161 (Yz), входящий в состав полипеп-
тидной субъединицы PsbA. Он участвует в переносе электронов от воды к катион-
радикалу первичного донора Р680+-.

Дегидрогеназная реакция окисления воды уникальна, поскольку для того, что-
бы она произошла, необходимо фотохимическим путем накопить четыре окисли-
тельных эквивалента. Затем две молекулы воды теряют сразу четыре электрона с
образованием связи кислород-кислород:

RCII/OEC + 4Ьр -> (RCII + 4е~) + ОЕС4+,
ОЕС4+ + 2Н2О -> ОЕС + 4Н+ + О2.

Источником энергии для окисления воды служит неферментативная реакция,
связанная с превращением возбужденного первичного донора хР680* в катион-ра-
дикал Р680+-. Сильные электрон-акцепторные свойства этой молекулы (редокс-по-
тенциал пары Р680+-/Р680 составляет +1000 мВ) позволяют использовать воду в
качестве донора электронов, хотя она очень устойчива к окислению (редокс-потен-
циал пары Н2О/О2 равен +820 мВ).

Рис. 142. Марганцевый кластер кислородвыделяющего комплекса
(по: Пиневич, Аверина, 2002).

Механизм окисления воды был расшифрован на основе классических опытов французского
биохимика Пьера Жолио (Р. Joliot). В 1960-е годы он установил, что зеленые водоросли и изолиро-
ванные хлоропласты выделяют кислород в ответ на каждую четвертую по счету вспышку света.
Согласно теоретической модели, названной по имени предложившего ее американского биохимика
Биссела Кока (В. Кок), «часами Кока», для выделения одной молекулы кислорода ФСП должна
поглотить подряд четыре кванта света, четыре раза перейти в возбужденное состояние и четыре
раза передать электрон цитохром Ьв/-комплексу. При этом ОЕС накапливает четыре окислитель-
ных эквивалента. Поочередно сменяющие друг друга редокс-состояния ОЕС обозначаются как So —
S4 (от англ, state — состояние).
Смена S-состояний обеспечивается разделением зарядов между первичным донором (хлоро-
филлом :Р680*) и первичным акцептором (феофитином Ph). Этот фотохимический акт необра-
тим, поскольку электрон сразу же переходит от первичного акцептора к вторичным акцепторам
Qa/Qb- Вакансия в молекуле первичного донора (Р680+ ) заполняется электроном, поступающим
от редокс-активного остатка Туг-161 (Yz), который входит в состав полипетидной цепи субъеди-
ницы PsbA. Этот посредник использует в качестве восстановителя комплекс ОЕС, а тот, в свою
очередь, получает электроны от молекулы воды. Таким образом, ОЕС осуществляет серийное вос-
становление Р680+- по схеме «один электрон на один поглощенный фотон», используя в качестве
промежуточного переносчика катион-радикал Y^-.

Каталитический центр ОЕС представляет собой четырехатомный марганцевый кластер, или
двойной «димер» (рис. 142). На протяжении Sn-цикла в нем происходят четыре последовательных
редокс-перехода (рис. 143):

So -> Si(3-1CT5 с) — S2(10-4 с) -> S3(3-10-4 с) — S4(10~3 с).

So — это максимально восстановленное, a S4 — максимально окисленное состояние (цифровые
индексы промежуточных состояний Si—S3 указывают на количество положительных зарядов).

Эволюционное происхождение ОЕС неизвестно; трудно допустить, что реакционный центр
ФСП и система накопления положительного заряда Sq—>—> S4 одновременно появились у предка
оксигенных фототрофных бактерий. Высказываются предположения, что Р680+- вначале получал

/Их

Мп3+^	^Мп3+ е- Мп4+\	^Мп3+ е- Н+Мп4+ ^Ы^Мп3+

I	°	Н2О /	I	°	Н2О У	I	°	он

I	о	ОН	hVi	|	о	ОН	hv2	|	о	ОН

Мп4+\	/Мп4+	Мп4+\	^Мп4+	Мп4+\	/Мп4+

ХОХ	ХОХ |	ХОХ |

RCI	R+C1	R+CI

/°\ /°\

Мп+ Мп+	Мп + Мп3+

I	°	Н2О	I °	i

о	/ х °	1

I	п	Н2°	*	'	|	ХОЧ	?

4+ /	\ « 4+ О2 2Н2О -4+ /	\ « 4+

Мп .	, Мп 2	2 Мп .	. Мп

хох	хо^

RCI	RC1

So	S4

Рис. 143. Светозависимые редокс-превращения марганцевого кластера кислородвы-
деляющего комплекса, или S-цикл (по: Пиневич, Аверина, 2002).

So-S4 — стадии цикла. Рамкой (стадия S3) обозначено радикальное состояние атома
кислорода в оксо-мостике.
электроны от более сильного восстановителя, например пероксида водорода. В пользу этого гово-
рит структурное сходство между двухатомным активным центром марганецсодержащих каталаз
и половиной четырехатомного марганцевого кластера ОЕС.

Светособирающие антенны. Как мы уже говорили, при аноксигенной фото-
трофии в состав фотосинтетического аппарата входит реакционный центр какого-
либо одного типа в комбинации с различными светособирающими антеннами. При
оксигенной фототрофии используется не один, а два взаимодействующих реакцион-
ных центра в комбинации с различными светособирающими антеннами.

Периферическая антенна цианобактерий называется фикобилисомой, сокращен-
но ФБС (англ, phycobilisome, PBS). Цианобактерии-прохлорофиты содержат либо
только интегральные антенны (например, Prochlorothrix hollandica), либо интеграль-
ные антенны в сочетании с ФБС (например, A. marina).

ФБС представляет собой частицу размером 12x32 — 24x70 нм, которая образу-
ет параллельные ряды на цитоплазматической поверхности тилакоидов (ICM ци-
анобактерий). ФБС имеет молекулярную массу 7-103—104 кДа и состоит из модулей
первого порядка — тримеров (се/3)з, второго порядка — гексамеров 2(а/3)з и третьего
порядка — цилиндров [(си/3)з]4 и стержней [2(оД)з]2-б- Типичная ФБС подразделя-
ется на два морфологических домена — ядро из двух-трех цилиндров и перифери-
ческую часть из шести стержней (рис. 144). Цилиндр образуется из четырех три-
меров аллофикоцианина. В свою очередь, стержень представляет собой агрегат из
двух-шести гексамеров. Проксимальные гексамеры всегда содержат длинноволно-
вую форму фикоцианина, в то время как дистальные гексамеры у разных объек-
тов состоят из фикоэритрина, фикоэритроцианина или «коротковолновой» (<645
нм) формы фикоцианина. Упорядоченное геометрическое расположение этих пиг-
ментов способствует тому, что энергия направленно мигрирует от молекул с более
коротковолновым максимумом поглощения к молекулам с более длинноволновым
максимумом:

фикоэритрин (560 нм) —> фикоэритроцианин (575 нм) —> фикоцианин (645 нм)
—»аллофикоцианин (660 нм) —> хлорофилл а (680 нм).

Состав стержней ФБС изменяется путем фотоакклиматизации, при которой используются три
стратегии:

—	общая для фототрофов «экстенсивная» стратегия (размер антенны находится в обратной
зависимости от величины светового потока, т. е. стержни укорачиваются на ярком и удлинняются
на слабом свету);

—	свойственная многим оксигенным фототрофам «кинетическая» стратегия (с помощью про-
теинкиназной системы, разрыхляющей связь ФБС с мембраной, антенна вступает в сопряжение с
той фотосистемой, которая в данный момент больше нуждается в энергии);

—	уникальная «цветовая» стратегия, или комплементарная хроматическая адаптация (изме-
няется состав периферической части ФБС, что обеспечивает поглощение квантов доминирующей
цветовой группы, т. е. при избытке красных квантов синтезируется фикоцианин, а при избытке
зеленых квантов — фикоэритрин).

Помимо а- и /3-субъединиц в состав ФБС входят бесцветные линкерные полипеп-
тиды (англ, link — связь) молекулярной массой 10-40 кДа. Стержневые линкеры Lr
(от англ, rod — стержень) обеспечивают сборку гексамеров и их объединение друг
с другом; входящие в состав ядра линкеры Lc (от англ, core) — сборку тримеров;
линкеры Lrc — прикрепление стержней к ядру. Наряду с бесцветными линкерами
Рис. 144. Фикобилисома.

ФС1 и ФСП — фотосистемы; а и (3 — апопротеины.

существует минорный высокомолекулярный линкер АрсЕ (120 кДа). Этот хромопро-
теин отвечает за агрегацию тримеров кора в цилиндры и ассоциацию кора с «диме-
ром» ФСП, в связи с чем его обозначают как линкер Ьсм (от англ, core-membrane).
Линкер АрсЕ имеет мультидоменный состав и обладает сложной пространствен-
ной конфигурацией. В него входят: а) петлевой домен, погруженный в ядро ФСП;
б) фикобилипротеиновый домен, встроенный в тример кора; в) три линкерных до-
мена, прикрепляющие соседние тримеры кора друг к другу; г) три плечевых доме-
на, один из которых соединяет вместе тримеры цилиндра, а два других связывают
между собой отдельные цилиндры. Линкер Ьсм служит терминальным каналом, по
которому до 75% энергии, поглощенной ФБС, передается ФСП.

У одноклеточной цианобактерии Gloeobacter violaceus, принадлежащей к наибо-
лее архаичной ветви эволюционного древа Cyanobacteria, обнаружены уникальные
ФБС цилиндрической формы. Они расположены на внутренней поверхности СМ и
состоят из пучка стержней, по восемь-десять гексамеров каждый.

Некоторые прохлорофиты (в частности, A. marina) также содержат нестандарт-
ные ФБС. Субъединицы фикоцианина и аллофикоцианина (22-58 кДа) объединены
в гетерогексамеры. Агрегат из четырех гексамеров образует тороидальную «мини-
ФБС» размером 1,3x26 нм (103 кДа).

В отличие от собственно цианобактерий, у которых имеется только один хлоро-
филл-хлорофилл а, прохлорофиты содержат хотя бы один вспомогательный хло-
рофилл. При этом фикобилипротеины у них либо отсутствуют, либо образуются в
очень небольшом количестве.

К группе прохлорофитов, которые морфологически не отличаются от собственно цианобакте-
рий, относятся три одноклеточных вида (Prochloron didemni, Prochlorococcus marinus и A. marina)
и два нитчатых вида (Prochlorothrix hollandica и «Р. scandica»). Фотосистемы прохлорофитов и
собственно цианобактерий имеют идентичное строение. Главными антенными пигментами является
хлорофилл а или d (Д. marina). В состав интегральной антенны помимо хлорофиллов а и b могут
входить хлорофиллы Q2 и бг, а также хлорофилл a-подобный пигмент. Некоторые прохлорофиты
содержат интегральный хлорофилл d-белковый комплекс в сочетании с ФБС (Д. marina).
Прохлорофитов поначалу считали эволюционными предшественниками хлоропластов. В даль-
нейшем выяснилось, что апопротеины их хлорофилл а/5-белковых комплексов гомологичны апо-
протеинам хлорофилл a-содержащей антенны СР43', образующейся у цианобактерий при голода-
нии по железу, а те апопротеины, в свою очередь, гомологичны пластидным субъединицам PsbCB.
Получается, что хлорофилл a/b-белковые комплексы прохлорофитов и хлоропластов дивергиро-
вали от антенных апопротеинов ФСП цианобактерий.

Р. marinus —это единственный оксигенный фототроф, светособирающими пигментами у ко-
торого являются хлорофиллы аг и 62 • Кроме того, он образует хлорофилл с-подобный пигмент,
а также фикоэритрин (который в качестве главного хромофора содержит фикоуробилин-подоб-
ный тетрапиррол). Прохлорококки, живущие в верхнем и нижнем этажах эуфотической зоны
на глубине до 250 м, сильно различаются по относительному содержанию антенных пигментов.
В частности, соотношение хлорофилл 02^2 у них варьирует в пределах 1-10. У разных штаммов
прохлорококков при фотоакклиматизации изменяется не только пигментный, но и полипептидный
состав светособирающей антенны. Экотипы, адаптированные к слабой освещенности, содержат
семь генов, кодирующих разные апопротеины, а экотипы, адаптированные к сильной освещенно-
сти, только один такой ген.

12.7.5.	Факультативно аноксигенная фототрофия

Так называется адаптивный переход цианобактерий от оксигенной к аноксиген-
ной фототрофии. Он связан с обратимой инактивацией кислородвыделяющего ком-
плекса и использованием вместо воды альтернативного донора электронов, чаще
всего сульфида.

Факультативно аноксигенную фототрофию открыл в 1975 г. американский мик-
робиолог Ричард Кастенхольц (R. W. Castenholz). Вначале это явление рассматри-
вали как реликтовый процесс и считали, что оно отражает промежуточный этап
эволюции фотосинтетических систем —от аноксигенной фототрофии к оксигенной.
Однако в дальнейшем выяснилось, что такой сценарий не согласуется с истинной фи-
логенией фототрофных бактерий. Факультативно аноксигенные цианобактерии —
это не реликтовые формы с архаичными реакционными центрами и светособираю-
щими антеннами, а резистентные к сульфиду «модернизированные» штаммы. Они
обладают специализированной ферментной системой, которая использует сульфид
в качестве донора электронов для ФСП.

У большинства цианобактерий инактивация ФСП приводит к подавлению све-
тозависимого метаболизма. Однако некоторые штаммы могут использовать альтер-
нативные доноры электронов, для окисления которых не требуется участие ФСП.
В результате этого они переходят на аноксигенную фототрофию, при которой функ-
ционирует только ФС1, а донором электронов служит сульфид. Помимо сульфида
донорами электронов могут быть другие соединения серы, в частности димеркапто-
пропанол.

Сульфид ингибирует оксигенную фототрофию, непосредственно воздействуя на ОЕС. Анион
HS- не способен пассивно проходить через СМ, однако сероводород, находящийся с ним в химиче-
ском равновесии, беспрепятственно достигает свои мишени. Хотя первопричиной факультативно
аноксигенной фототрофии служит ингибирование ФСП, все дальнейшее развитие событий можно
рассматривать как нормальный физиологический процесс, связанный с адаптивным переходом на
использование сульфида в качестве альтернативного донора электронов.

В отличие от большинства живых организмов, некоторые штаммы цианобактерий не только
переносят сульфидный стресс, но и могут утилизировать этот токсичный агент. В одних случа-
ях активность ФСП подавляется полностью, но ФС1 не затрагивается, и вместе с ней начинают
функционировать белковые факторы, индуцированные сульфидом. В других случаях, даже при
высоком содержании сульфида в окружающей среде, аноксигенная фототрофия сочетается с ок-
сигенной.
Наиболее известный пример факультативно аноксигенной цианобактерии — это
«Oscillatoria limnetica», выделенная из обогащенного сульфидом гиполимниона оз.
Солар-Лейк на Синайском полуострове. Она может использовать сульфид в ка-
честве донора электронов и образовывать побочный метаболический продукт, эле-
ментную серу, которая в виде глобул откладывается на поверхности клетки. Суль-
фид окисляется флавопротеином — сульфид:пластохинон-оксидоредуктазой (англ,
sulfide:plastoquinone oxidoreductase, SOR). Этот фермент имеет молекулярную массу
57 кДа и активен в мембраносвязанной форме. Электроны от сульфида поступают в
электрон-транспортную цепь на уровне хинонного пула и цитохром be/-комплекса.

Помимо «О. limnetica», факультативно аноксигенная фототрофия выявлена у
нитчатых цианобактерий родов Lyngbya и Phormidium, у одноклеточной цианобак-
терии р. Synechocystis, а также у нитчатого прохлорофита Р. hollandica.

Способность цианобактерий к факультативно аноксигенной фототрофии позво-
ляет им доминировать в весенне-летний период в мелких эвтрофицированных озерах
регионов с теплым климатом, когда в гиполимнионе активно протекает анаэроб-
ная деструкция органики. В осенне-зимний период «О. limnetica» снова переходит
к оксигенной фототрофии, что наряду с сезонной сукцессией обитателей водоема
обеспечивает круглогодичное развитие этой цианобактерии.

12.7.6.	Квази-фототрофия

Термин «квази-фототрофия» (англ, quasi-phototrophy) ввел в 1993 г. американ-
ский бактериолог Ховард Гест.

В настоящее время этот адаптивный механизм, служащий для ассимиляции све-
товой энергии, обнаружен у некоторых хемотрофных бактерий и архей.

Напомним, что для большинства фототрофных бактерий свет служит главным
энергоносителем, хотя все они используют в качестве энергоносителя запасные ве-
щества, а некоторые способны к факультативной хемотрофии.

У квази-фототрофов соотношение фототрофии и хемотрофии изменяется на про-
тивоположное, и главным способом ассимиляции энергии становится хемотрофия.

12.7.6.1.	Квази-фототрофные бактерии

В первую очередь к ним относятся так называемые «аэробные аноксигенные
фототрофные бактерии» (англ, aerobic anoxygenic phototrophic bacteria; APB). Они
представлены двумя морскими (Erythrobacter sp. и Roseobacter sp.) и шестью прес-
новодными (Acidiphilium sp., Erythromicrobium sp., Erythromonas sp., Porphyrobacter
sp., Roseococcus sp. и Sandaracinobacter sp.) видами. Все они принадлежат к филе
ВХП Proteobacteria.

«Аэробными» этих бактерий назвают потому, что у них фотосинтетический ап-
парат образуется только в аэробных условиях, тогда как у большинства аноксиген-
ных фототрофных бактерий биогенез пигмент-белковых комплексов в присутствии
молекулярного кислорода подавлен (см. раздел 12.4). Вторым условием биогенеза
фотосинтетического аппарата у АРВ служит попеременное нахождение на свету и в
темноте. Наконец, в отличие от большинства аноксигенных фототрофных бактерий,
электрон-транспортная цепь у АРВ работает только в аэробных условиях.

Переход к фототрофии у АРВ представляет собой сложно регулируемый про-
цесс. Поскольку в норме они живут за счет катаболизма углеводов и аминокислот,
поводом для смены энергетической стратегии, по-видимому, служит истощение этих
питательных субстратов.

Кроме АРВ к числу квази-фототрофных бактерий относятся «фотосинтетиче-
ские клубеньковые бактерии»—представители р. Bradyrhizobium. Они вступают
в эндоцитобиотические ассоциации с тропическими бобовыми растениями родов
Aeschynomene, Sesbania и др. В отличие от тривиальных клубеньковых бактерий,
живущих на корнях травянистых бобовых, они поселяются в железках, расположен-
ных в нижней части деревянистого стебля.

До сих пор неизвестно, в чем заключается физиологический смысл квази-фото-
трофии у фотосинтетических клубеньковых бактерий. Можно предположить, что
это связано с необходимостью в ускоренной регенерации АТФ для такого энергоем-
кого процесса, как диазотрофия.

Фотосинтетический аппарат, образующийся у АРВ и фотосинтетических клу-
беньковых бактерий, по морфологии и молекулярному строению не отличается
от фотосинтетического аппарата аноксигенных фототрофных бактерий из клас-
сов «Alphaproteobacteria», «Betaproteobacteria» и «Gammaproteobacteria». Его основ-
ные компоненты (антенный комплекс LHCI/LHCII, реакционный центр RCII-типа,
электрон-транспортная цепь и АТФ-синтаза) содержатся в везикулярных модулях
ICM — хроматофорах.

Особый случай бактериальной квази-фототрофии связан с использованием од-
нокомпонентной протонной помпы — протеородопсина (см. раздел 10.4.2).

12.7.6.2.	Квази-фототрофные археи

Помимо квази-фототрофных бактерий, способностью к квази-фототрофии об-
ладают экстремально галофильные археи из филы АП Euryarchaeota (см. раздел
10.4.1). Однако, в отличие от аэробных фототрофных бактерий и фотосинтетических
клубеньковых бактерий, они используют не трехкомпонентный фотосинтетический
аппарат (состоящий из антенны, реакционного центра и электрон-транспортной це-
пи), а мономолекулярный светозависимый протонофор —бактериородопсин.

Механизм создания Pmf у экстремально галофильных архей исследован на мем-
бранных везикулах, липосомах с имплантированным в них бактериородопсином и
других моделях. Установлено, что импульсное освещение клеток, помещенных в бу-
ферный раствор, сопровождается фосфорилированием.

Хотя утилитарное значение квази-фототрофии для экстремально галофильных
архей в природных местообитаниях не доказано, можно предположить, что они (как
и квази-фототрофные бактерии) используют адаптивную биоэнергетическую стра-
тегию— переходят на альтернативный энергоноситель. Однако в данном случае спе-
цифика квази-фототрофии состоит в том, что она вызвана не истощением питатель-
ных субстратов, а недостатком кислорода, т. е. дыхательная цепь инактивируется в
акцепторном, а не донорном участке.

Экстремально галофильные археи живут в хорошо прогреваемых гипергалин-
ных водоемах, где содержание растворенного кислорода подвержено сезонным ко-
лебаниям и в жаркое время года снижается до минимального уровня. Поскольку у
них, за немногими исключениями, отсутствуют механизмы анаэробного дыхания и
брожения, квази-фототрофия становится основным способом выживания при энер-
гетическом стрессе.
12.7.6.3.	Квази-фототрофия во «второй биосфере»

Тема «второй биосферы» (см. I том учебника) зазвучала по-новому после того,
как в 1999 г. В. В. Юрков (V. V. Yurkov) и Джеймс Битти (J. Т. Beatty) выделили из
гидротермального источника, расположенного на глубине до 2 км на склоне подвод-
ного хребта Хуан де Фука в северо-восточной части Тихого океана, новую бактерию
Citromicrobium bathyomarinum.

Инфракрасное излучение, или геотермальный свет (А > 850 нм) активирует ан-
тенный комплекс этой бактерии, который содержит бактериохлорофилл а. Одна-
ко кванты электромагнитного поля используются здесь в качестве второстепенного
энергоносителя, а главным остаются органические субстраты.

Конструктивный метаболизм С. bathyomarinum относится к хемоорганотрофно-
му или факультативно фотогетеротрофному типу. Таким образом, эта бактерия,
подобно хемолитотрофам «второй биосферы» может непосредственно использовать
внутреннюю энергию Земли.

* * *

Завершая на этом тему фототрофии, мы должны подчеркнуть три важнейших
обстоятельства, касающихся значения данного процесса для жизни на Земле, роли
прокариотов в качестве его биологических носителей и истинного разнообразия его
молекулярных механизмов:

—	по своей биоэнергетической сути фототрофия есть исключительно «бактери-
альное» свойство, ядерные клетки приобрели его вместе с цианобактериальными
симбионтами;

—	фототрофия это не поздний продукт органической эволюции, а архаический
процесс, появившийся у древнейших цианобактерий, которые, по-видимому, были
среди пионеров органической жизни;

—	фототрофия осуществляется при помощи фотосинтетического аппарата не од-
ного, а нескольких молекулярных типов; наиболее распространенный и самый из-
вестный из них, оксигенный фотосинтетический аппарат, должен рассматриваться
лишь как primus inter pares (лат. — первый среди равных).
ГЛАВА 13

УГЛЕРОДНАЯ АВТОТРОФИЯ

Все живое вещество в конечном счете в значитель-
ной части своей массы происходит из угольной кислоты
атмосферы или из угольной кислоты, растворенной в
воде, так как это единственные источники, из которых
оно извлекает ему углерод.

В. Н. Вернадский. Очерки геохимии. Лекции, про-
читанные в Академии наук в Петрограде в 1921 г.

Углеродная автотрофия находится в эпицентре субстратного питания. От спо-
собности синтезировать органические вещества (которые непосредственно исполь-
зуются в качестве строительного материала или запасаются для целей энергетиче-
ского и/или конструктивного метаболизма) зависят биоразнообразие, численность
и, в конечном счете, глобальная роль углеродных автотрофов.

При фотосинтезе углеродная автотрофия сочетается с фототрофией, или асси-
миляцией свободной энергии квантов электромагнитного поля. При хемосинтезе она
сочетается с хемолитотрофией, или ассимиляцией энергии, освобождающейся при
окислении неорганических субстратов.

Два типа автотрофного питания, фотосинтез и хемосинтез, обеспечивают про-
кариотам независимость от экзогенных органических субстратов. Благодаря своей
трофической автономии фото- и хемосинтезирующие прокариоты распространены
практически повсеместно и достигают высокой численности там, где их развитие не
ограничивается условиями внешней среды, прежде всего ресурсами энергии и неор-
ганического углерода. Характерным примером служат «цветения» цианобактерий.

На первый взгляд, это должно привести к абсолютному биосферному домини-
рованию фото- и хемосинтетиков, однако в действительности это не так. Напротив,
биоразнообразие облигатных фото- и хемосинтезирующих прокариотов (например,
цианобактерий и нитрификаторов) уступает биоразнообразию прокариотов, облада-
ющих метаболизмом смешанного типа (фотомиксотрофов, хемолитомиксотрофов,
фотогетеротрофов и хемолитогетеротрофов), у которых использование энергии све-
та или энергии неорганических субстратов по-разному сочетается с утилизацией
органических веществ. Оно тем более уступает биоразнообразию факультативных
или облигатных хемоорганогетеротрофов.
Здесь нет противоречия — углеродная миксотрофия или углеродная гетеротро-
фия физиологически гибче, чем облигатная углеродная автотрофия, которая пара-
доксально сочетает в себе «самостоятельность» с «неполноценностью».

Облигатные углеродные автотрофы по той или иной причине не способны использовать экзо-
генные органические субстраты или же отравляются продуктами их катаболизма. Такой дефект
у них генетически детерминирован. В разных случаях это связано:

—	с отсутствием одного или нескольких ключевых ферментов, участвующих в катаболизме
органических субстратов (например, а-кетоглутаратдегидрогеназы — ключевого фермента цикла
Кребса; см. раздел 11.4.2.1);

—	с отсутствием регуляции активности ключевых катаболических ферментов на уровне тран-
скрипции (например, глюкозо-6-Р-дегидрогеназа, ключевой фермент гексозомонофосфатного пути
Варбурга-Диккенса-Хоррекера, синтезируется конститутивно и в небольшом количестве, незави-
симо от концентрации глюкозы во внешней среде; см. раздел 11.3.2.3);

—	с отсутствием транспортных систем, доставляющих в цитоплазматический компартмент ор-
ганические субстраты (например, нет фосфотрансферазной системы, используемой для импорта
сахаров; см. раздел 9.1.1);

—	с отсутствием транспортных систем для экскреции побочных продуктов катаболизма органи-
ческих субстратов (например, пирувата, накопление которого в цитоплазме приводит к эндогенной
интоксикации).

Итак, углеродные автотрофы, которые расположены в основании пищевой пира-
миды, менее разнообразны по сравнению с прокариотными консументами. Однако
это не означает, что углеродная автотрофия сводится к единственному биохимиче-
скому механизму.

13.1.	МЕХАНИЗМЫ УГЛЕРОДНОЙ АВТОТРОФИИ

Углеродная автотрофия осуществляется при помощи разных механизмов. По фи-
зиологической сути они равноценны, однако в разной степени представлены в мире
прокариотов.

Для строгого доказательства того, что исследуемый объект обладает тем или иным механизмом
углеродной автотрофии, требуется выполнить целый ряд условий:

—	иметь в своем распоряжении чистую культуру;

—	показать, что рост является автотрофным или миксотрофным;

—	молекулярно-биологическим способом (доказательство наличия гена) и биохимическим спо-
собом (наблюдение за специфической реакцией) выявить ключевой фермент;

—	на основе изотопных, колориметрических или хроматографических методов идентифициро-
вать продукт ассимиляции неорганического углерода;

—	доказать, что данный механизм углеродной автотрофии является единственным или сочета-
ется с другими механизмами.

Ниже мы убедимся в том, что соблюсти все эти условия трудно, и не всегда это удается сделать.

Углеродная автотрофия основана на системе взаимосвязанных анаболических
реакций.

Вначале С i-блок ковалентно соединяется с органическим акцептором или другим
С1-блоком, причем в подавляющем большинстве случаев это происходит фермента-
тивным путем.

Специфика механизма углеродной автотрофии связана прежде всего с типами
С1-блока, органического акцептора и «конденсирующего» фермента. В частности,
от исходного уровня восстановленности С i-блока зависит, потребуется ли восстано-
витель при осуществлении того или иного типа углеродной автотрофии. В одних
случаях для активации образующихся интермедиатов может расходоваться энер-
гия АТФ, а в других случаях это не нужно. Наконец, при использовании разных
механизмов углеродной автотрофии образуются разные типы конечных продуктов.

Тип акцептора для Ci-блока. Среди механизмов ассимиляции неорганиче-
ского углерода различают циклы и пути.

Биохимический смысл цикла (англ, cycle) заключается в том, что акцептором
Ci-блока служит органическое соединение, которое включается в состав продукта
ассимиляции и поэтому должно возобновляться. В настоящее время известны пять
циклов автотрофной ассимиляции углерода:

—	цикл Ивенса-Бьюкенена-Эрнона;

—	цикл Фукса-Холо;

—	цикл Квайла;

—	цикл О’Коннора-Хэнсона;

—	цикл Кельвина-Бенсона-Бэссема.

Напротив, биохимический смысл пути (англ, pathway) заключается в том, что
органические акцепторы не включаются в состав продукта ассимиляции, а лишь
выполняют роль переносчика Сi-блока на отдельных этапах его восстановления,
после чего он конденсируется с другим Сi-блоком (или два Сi-блока соединяются
непосредственно, без участия акцептора). В настоящее время известны два пути
автотрофной ассимиляции углерода:

—	путь Вулфа;

—	путь Вуда-Льюнгдала.

Тип акцептируемого Ci-блока. Мы уже говорили о том, что Ci-блоки, ис-
пользуемые при углеродной автотрофии, различаются по степени восстановленности
углерода (см. раздел 9.2.3).

Максимально окислен углерод в диоксиде (СО2) и его физиологическом эквива-
ленте, бикарбонате (НСО3 ). Менее окислен углерод в карбоксиде (СО), еще мень-
ше—в формальдегиде (НСНО), тогда как в метильной группе, входящей в состав
метана или соединений типа СН3—Х-R (где X —атом азота, кислорода или серы),
он наиболее восстановлен.

Уровень восстановленности углерода в органических молекулах соответствует
уровню восстановленности углерода в формальдегиде или метильной группе. По-
этому при использовании в качестве С i-блока соединений приведенного ряда по-
требность в доноре электронов прогрессивно убывает.

Связь с энергетическим метаболизмом. Хотя все известные системы уг-
леродной автотрофии преследуют одну и ту же цель — биосинтез органических ве-
ществ из неорганических, они различаются по метаболической стратегии.

Прежде всего, циклы углеродной автотрофии затрачивают энергию, а пути уг-
леродной автотрофии поставляют энергию.

13.2.	ЦИКЛЫ УГЛЕРОДНОЙ АВТОТРОФИИ

Циклы углеродной автотрофии всегда затрачивают метаболическую энергию для
активации акцептора Сi-блока, а также (если требуется) с целью активации неко-
торых интермедиатов. При этом расходуется только одна из двух форм ассимили-
рованной энергии — энергия фосфагена, причем только АТФ.
Регенерация АТФ осуществляется при помощи АТФ-синтазы. Для этого исполь-
зуется энергия, предварительно ассимилированная при фототрофии или хемолито-
трофии в форме Pmf(Smf).

Циклы углеродной автотрофии различаются по «энергоемкости». Среди них есть
и относительно высокозатратные, и те, которые потребляют относительно меньше
энергии.

Рассмотрим подробно каждый из них, особо обращая внимание на следующие
вопросы:

—	распространение цикла в мире прокариотов;

—	ключевые ферменты цикла;

—	промежуточные реакции цикла;

—	расход энергии;

—	природа восстановителя и его расход;

—	конечный продукт цикла;

—	предполагаемое место цикла в эволюции метаболических систем.

В завершение мы приведем сводную характеристику всех известных циклов для
того, чтобы сделать более удобным сравнение их специфики, а также физиологиче-
ской эффективности.

13.2.1	Восстановительный цикл карбоновых кислот,
или цикл Ивенса-Бьюкенена-Эрнона

Гипотеза о возможности функционирования восстановительного цикла карбоно-
вых кислот была выдвинута в 1966 г. на основе исследований, проведенных амери-
канскими микробиологами Ивенсом (М. С. W. Evans), Бьюкененом (В. В. Buchanan)
и Эрноном (D. I. Arnon) на зеленой аноксигенной фототрофной бактерии Chlorobium
limicola (фила BXI Chlorobi). Однако решающие фактические доказательства его су-
ществования были получены только в 1980 г. в опытах немецкого биохимика Георга
Фукса (G. Fuchs) с использованием меченых атомов.

Помимо С. limicola этот цикл обнаружен у хемолитотрофных бактерий, в част-
ности водородных бактерий Aquifex pyrophilus и Hydrogenobacter thermophilus (фила
BI Aquificae), а также у сульфатредуцирующих бактерий, например Desulfobacter
(фила ВХП Proteobacteria).

Кроме того, он встречается у хемолитотрофного археота Sulfolobus acidocaldarius,
окисляющего серу кислородом, и Thermoproteus neutrophilus, восстанавливающего
серу водородом (фила AI Crenarchaeota).

Цикл Ивенса-Бьюкенена-Эрнона оказался первым примером цикла автотроф-
ной ассимиляции углерода, который прокариоты используют вместо классического
цикла Кельвина-Бенсона-Бэссема (см. раздел 13.2.5). Его часто называют «обра-
щенным циклом Кребса». Это справедливо лишь с оговоркой. Действительно, в
цикл Ивенса-Бьюкенена-Эрнона входят те же обратимые реакции, что и в цикл
Кребса, и он может быть «запущен в обратную сторону» для окисления ацетата
у той же бактерии. Однако в него входят две уникальные необратимые реакции —
АТФ-цитратлиазная и а-кетоглутарат-синтазная.

Пируватдекарбоксилазная реакция с участием ферредоксина, приводящая к расщеплению пи-
рувата в бесклеточных препаратах диазотрофной бактерии Clostridium, pasteurianum, была обнару-
жена Мортенсоном в 1962 г. Обратную реакцию, которая катализируется пируватсинтазой, открыл
Бьюкенен в 1964 г.:
ацетил-СоА + СО2 + 2Fdred + 2Н+ —► пируват + СоА + 2Fdox.

Вначале она была обнаружена у хемогетеротрофных почвенных бактерий из р. Clostridium.
Через два года ее нашли у аноксигенных фототрофов Chlorobium limicola, Chromatium vinosum и
Rhodospirillum rubrum.

Вместе с аналогичной реакцией ферредоксинзависимого карбоксилирования сукцинил-СоА,
катализатором которой является а-кетоглутарат-синтаза

сукцинил-СоА + СО2 + 2Fdred + 2Н+ —♦ а-кетоглутарат + СоА + 2Fdox,
пируватсинтазная реакция служит основой для особого цикла ассимиляции неорганического угле-
рода — восстановительного цикла карбоновых кислот.

В зависимости от имеющихся у клетки ресурсов восстановителя и АТФ, а также
в соответствии с общей направленностью биосинтетических процессов цикл Ивенса-
Бьюкенена-Эрнона может протекать по основному или длинношунтированному ва-
рианту (рис. 145).

Основной вариант. В данном случае цикл «начинается» с оксалоацетата, ко-
торый под воздействием НАДН-зависимой малатдегидрогеназы восстанавливается
в L-малат. Затем стереоспецифичная фумаратгидратаза (фумараза) преобразует L-
малат в фумарат. Далее из фумарата с помощью мембраносвязанной ФАДЩ-зави-
симой сукцинатдегидрогеназы образуется сукцинат (электроны для восстановления
ФАД поступают из убихинонного пула).

На следующем этапе сукцинат с помощью сукцинил-СоА-синтетазы превращает-
ся в сукцинил-СоА. Для этого используется CoASH и гидролизуется одна молекула
АТФ.

Ключевой реакцией цикла Ивенса-Бьюкенена-Эрнона является восстановитель-
ное карбоксилирование сукцинил-СоА, в результате чего образуется а-кетоглута-
рат. Специфическим восстановителем в данной реакции служит Fdred, а терминаль-
ным донором электронов для его возобновления — сульфид (S2-) или тиосульфат
(S2O32-).

После этого а-кетоглутарат восстановительно карбоксилируется в изоцитрат.
В качестве донора электронов используется НАДФН, который регенерируется в
НАДФ:ферредоксин-оксидоредуктазной реакции.

Затем с помощью аконитатгидратазы изоцитрат изомеризуется в цитрат; интер-
медиатом в этой реакции является трикарбоновая кислота сгз-аконитат.

Вторая ключевая реакция цикла Ивенса-Быокенена-Эрнона — это расщепление
цитрата на ацетил-СоА и оксалоацетат, которое осуществляется при помощи АТФ-
цитратлиазы. При этом используется CoASH и гидролизуется одна молекула АТФ
(рис. 145).

АТФ-цитратлиаза, катализирующая расщепление цитрата на оксалоацетат и ацетил-СоА (со-
гласно уравнению реакции: АТФ + цитрат + СоА —> оксалоацетат + ацетилСоА + АДФ + Ф),
широко распространена у эукариотов, в частности животных, растений и плесневых грибов.

Обнаружить АТФ-цитратлиазу в клетках С. limicola не удавалось в течение пятнадцати лет
(что ставило под сомнение само существование замкнутого восстановительного цикла карбоновых
кислот), пока Р. Н. Ивановский не выяснил, что для сохранения активности этого фермента на
всех этапах выделения необходимо использовать восстановительный агент дитиотреитол (англ,
dithiothreitol) в относительно высокой (>5 мМ) концентрации.

Прокариотная АТФ-цитратлиаза имеет молекулярную массу 240 кДа и в качестве кофактора
использует катионы Mg2+.
АДФ+Ф

пируват

----► | Ala, глюкоза]

фосфоэнолпируват

СО2



ацетил-СоА

жирные кислоты,
полиизопреноиды

НО-СН

НС-СОО

I

НО-СН-СОО-

изоцитрат

н2с-соо
сн2

Рис. 145. Восстановительный цикл карбоновых кислот, или цикл Ивенса-Бьюкенена-Эрнона.

1 — АТФ-цитратлиаза; 2 — аконитатгидратаза; 3 — изоцитратдегидрогеназа; 4 — а-кетоглутаратсинта-
за; 5 — сукцинил-СоА-синтаза; 6 — сукцинатдегидрогеназа; 7 — фумаратгидратаза; 8 — малатдегидрогена-
за; 9 — пируватсинтаза; 10 — фосфоэнолпируваткарбоксилаза.
Таким образом, в основном варианте цикла Ивенса-Бьюкенена-Эрнона проис-
ходят два карбоксилирования (С4 —> С5 и С5 —> Сб), в результате чего образуется
цитрат. Цитрат расщепляется на двухуглеродный конечный продукт, ацетил-СоА,
и при этом регенерируется оксалоацетат. Общее уравнение цикла в данном случае
выглядит следующим образом:

2СО2 + 2Fdred + НАДФН + НАДН + ФАДН2 + 2АТФ + CoASH
ацетил-СоА + 2Fdox + НАДФ + НАД + ФАД + 2АДФ + 2Ф + Н2О.

Ацетил-СоА-шунт. В отличие от основного варианта цикла Ивенса-
Бьюкенена-Эрнона, в шунтированном варианте все «начинается» с ацетил-СоА. По
ходу цикла происходят четыре карбоксилирования (С2 —> С3, С3 —> С4, С4 —> С5
и С5 —» Сб). Два первых карбоксилирования (С2 —> С3, С3 —> С4), отсутствующие
в основном варианте цикла, связаны соответственно с превращением ацетил-СоА в
пируват и фосфоэнолпирувата в оксалоацетат. Остальные два карбоксилирования
такие же, как в основном варианте цикла (С4 —► С5 и С5 —+ Сб).

При расщеплении цитрата образуется четырехуглеродный конечный продукт —
оксалоацетат — и регенерируется ацетил-СоА. Общее уравнение цикла в данном слу-
чае выглядит следующим образом:

4СО2 + 4Fdred + НАДФН 4- НАДН + ФАДН2 + ЗАТФ + CoASH
оксалоацетат + 4Fdox + НАДФ + НАД + ФАД + ЗАДФ + ЗФ + Н2О.

Таким образом, в цикле Ивенса-Бьюкенена-Эрнона в роли Ci-блока выступает
СО2, и используются четыре органических акцептора — двухуглеродный (ацетил-
Со А), трехуглеродный (фосфоэнолпируват), четырехуглеродный (сукцинил-СоА) и
пятиуглеродный (а-кетоглутарат). В цикле участвуют три типа низкопотенциально-
го восстановителя: Fdred (-420 мВ), НАДФН (-320 мВ), НАДН (-320 мВ) и ФАДН2
(-120 мВ), а также 2-3 молекулы АТФ на одну молекулу образующегося органиче-
ского продукта.

Оксалоацетат, конечный продукт основного варианта цикла Ивенса-Бьюкенена-
Эрнона, и его интермедиаты служат предшественниками при биосинтезе двух ами-
нокислот— аспарагиновой и глутаминовой, а также используются при биосинтезе
жирных кислот и полиизопреноидов (см. разделы 15.1.1 и 15.2.1). Шунтированный
вариант позволяет дополнительно синтезировать аланин из пирувата и осуществ-
лять глюконеогенез.

Эволюционные взаимоотношения восстановительного цикла карбоно-
вых кислот (цикла Ивенса-Бьюкенена-Эрнона) и окислительного цикла
карбоновых кислот (цикла Кребса). Мы уже упоминали о том, что ацетатсин-
тезирующий цикл Ивенса-Бьюкенена-Эрнона рассматривают как обращенный цикл
Кребса, в котором происходит полное окисление ацетата, (см. раздел 11.4.2.1). Одна-
ко так можно сказать, лишь имея в виду онтогенез. Филогенетическое взаимоотно-
шение этих циклов, по-видимому, противоположное, т. е. цикл Ивенса-Бьюкенена-
Эрнона был эволюционным предтечей цикла Кребса.

Высказываются несколько общих доводов в пользу данного предположения. Во-первых, цикл
Ивенса-Бьюкенена-Эрнона существует у наиболее архаичных бактерий, а также встречается у ар-
хей, что позволяет считать его свойством общего предка двух прокариотных доменов. Во-вторых,
на смену умозрительным построениям А. И. Опарина-Дж. Холдейна (J. Haldane) об эволюционной
первичности гетеротрофного питания приходит идея об эволюционной первичности углеродной
автотрофии. В третьих, цикл Ивенса-Бьюкенена-Эрнона, основанный на ферредоксинзависимом
карбоксилировании, может функционировать только у облигатно анаэробных прокариотов, кото-
рые занимают редуцирующие ниши реликтового типа. В четвертых, завершенный цикл Кребса
широко распространен у филогенетически «молодых» бактерий-консументов.

Выяснить эволюционную иерархию метаболических систем намного сложнее,
чем воссоздать эволюционное древо путем оценки гомологии рДНК. Одной из при-
чин служит относительная легкость горизонтального переноса генов домашнего хо-
зяйства (см. I том учебника) как на внутридоменном уровне, так и между отдель-
ными доменами.

13.2.2.	/З-Оксипропионатный цикл, или цикл Фукса—Холо

По современным данным, такой цикл углеродной автотрофии встречается до-
вольно редко. Он обнаружен у зеленой нитчатой бактерии Chloroflexus aurantiacus
(фила ВVI Chloroflexi), а также у трех представителей филы AI Crenarchaeota —
Acidianus infernus, Metallosphaera sedula и Sulfolobus metallicus.

В 1989 г. немецкий микробиолог Холо (Н. Holo) обнаружил, что при фотоав-
тотрофном росте С. aurantiacus клетки экскретируют в культуральную среду (3-
оксипропионат. Это позволило предположить, что /3-оксипропионат служит интер-
медиатом в ранее неизвестном цикле ассимиляции неорганического углерода. За
период 1992-2002 гг. немецкий биохимик Фукс в общих чертах реконструировал си-
стему реакций, лежащих в основе данного цикла. Ценный вклад в его изучение внес
русский микробиолог Р. Н. Ивановский.

Этот цикл имеет три основные особенности, по которым он принципиально от-
личается от других механизмов углеродной автотрофии:

—	во-первых, малонил-СоА за два этапа восстанавливается в Доксипропионат, а
затем за три этапа превращается в пропионил-СоА (рис. 146);

—	во-вторых, продуктом цикла является глиоксилат, который образуется в ре-
зультате асимметричного расщепления малил-СоА (вторым продуктом расщепле-
ния является ацетил-СоА);

—	в третьих, окончательно не выяснена дальнейшая судьба продукта ассимиля-
ции (глиоксилата).

Цикл «начинается» с того, что ацетил-СоА карбоксилируется биотинзависимой
(см. рис. 82) ацетил-СоА-карбоксилазой. При этом используется энергия гидролиза
АТФ. Образовавшийся малонил-СоА восстанавливается в /3-оксипропионат. По это-
му промежуточному продукту весь цикл несправедливо называется «/3-оксипропио-
натным», или «3-гидроксипропионатным». Правильно было бы использовать термин
«малонил-СоА-цикл», по первому продукту акцептирования неорганического угле-
рода в форме бикарбоната (НСО^).

Уникальный фермент цикла Фукса-Холо, бифункциональная малонил-СоА-редуктаза, рабо-
тает в два этапа. Сначала образуется свободный полуальдегид малоновой кислоты, а затем он
восстанавливается в /3-оксипропионат. В обоих случаях расходуется НАДФН (рис. 146). Фермент
представляет собой гомодимер молекулярной массой 300 кДа; предполагают, что большой С-кон-
цевой домен обладает альдегиддегидрогеназной, а малый N-концевой домен — алкогольдегидро-
геназной активностью. Малонил-СоА-редуктаза не содержит кофакторов, однако стимулируется
катионами Fe2+ и Mg2+.

Образование пропионил-СоА из /3-оксипропионата осуществляется с помощью
coo

2НАДФН

(г

2НАДФ4^

НСО3"

АТФ

Г^О АДФ+Ф
। SCoA
СН2

СОО"
малонил-СоА

CoASH

СН2ОН
I
сн2

I

соо"

Р-окси-пропионат

АТФ

CoASH
НАДФН

НАДФ

АМФ+ФФ

Н2О

СН3

сно

глиоксил ат

сн3-с^о ,
J SCoA

ацетил-СоА

coo"

НО-СН

СН2

С*°
~SCoA

мал ил-СоА

АН

СОО"

сн2

сн2

с*°
~SCoA

сукцинил-СоА

СН

СН2
с*°
~SCoA
пропионил-СоА
нсо3"

АТФ АДФ+Ф

НС - СОО

С*°
~SCoA
метилмалонил-СоА

Рис. 146. /?-оксипропионатный цикл, или цикл Фукса-Холо (по: Hiigler et al., 2002).

1 — ацетил-СоА-карбоксилаза; 2 — малонил-СоА-редуктаза; 3 — /3-оксипропионил-СоА-синте-
таза; 4 — /3-оксипропионил-СоА-дегидратаза; 5 — акрилоил-СоА-редуктаза; 6 — пропионил-СоА-
карбоксилаза; 7 — метилмалонил-СоА-эпимераза; 8 — метилмалонил-СоА-мутаза; 9 — сукцинил-
СоА:Ь-малат-СоА-трансфераза; 10 — сукцинатдегидрогеназа; 11—фумаратгидратаза; 12 — L-ма-
лил-СоА-лиаза.

трех ферментов. Вначале под воздействием синтазы он переводится в активирован-
ную форму —/3-оксипропионил-Со А (с использованием АТФ, который гидролизу-
ется до АМФ и пирофосфата). Затем дегидратаза отщепляет воду от /3-оксипро-
пионил-СоА, и образуется акрилоил-СоА. Наконец, НАДФН-зависимая редуктаза
восстанавливает акрилоил-СоА в пропионил-СоА.

Пропионил-СоА карбоксилируется в метилмалонил-СоА, для чего используется
вторая молекула бикарбоната и гидролизуется третья молекула АТФ.

Затем метилмалонил-СоА изомеризуется в сукцинил-СоА с помощью двух фер-
ментов — эпимеразы и мутазы. Этот путь тривиален, поскольку с его помощью мно-
гие прокариоты ассимилируют пропионат.
Из сукцинил-СоА в три этапа образуется малил-СоА. Сперва СоА передается
от сукцинил-СоА на L-малат. Образовавшийся сукцинат обычным путем окисля-
ется в фумарат с помощью сукцинатдегидрогеназы (акцептор электронов еще не
идентифицирован). Фумарат гидратируется в L-малат, который получает СоА от
сукцинил-СоА.

Наконец, малил-СоА с помощью лиазы расщепляется на ацетил-СоА и глиокси-
лат, и цикл замыкается.

Общее уравнение цикла выглядит следующим образом:

2НСО3 + ЗАТФ + ЗНАДФН + А ->

НСНО + 2АДФ + АМФ + 2Ф + ФФ + ЗНАДФ + АН2 + Н2О + 2ОН",

где А — неидентифицированный акцептор электронов.

Мы уже говорили о том, что путь включения глиоксилата в клеточный материал окончательно
не выяснен. Предположение, что он восстановительно аминируется в глицин, было скоро отверг-
нуто.

В 2002 г. группа Фукса получила данные о том, что ассимиляция глиоксилата протекает за
несколько этапов (рис. 147).

Вначале при помощи синтазы он конденсируется с пропионил-СоА с образованием метилмалил-
СоА. После этого дегидратаза отщепляет воду от метилмалил-СоА, и образуется мезаконил-СоА.
Затем мезаконил-СоА превращается в цитрамалил-СоА при помощи мезаконат:цитрамалат-СоА-
трансферазы и мезаконатгидратазы. На последнем этапе лиаза расщепляет цитрамалил-СоА на
ацетил-СоА и пируват. Полученные продукты тривиальным путем превращаются в аминокислоты,
жирные кислоты и моносахара.

СОО

оос

СОО
I +

сно

СИз (

СН, —
с*°
~SCoA

нс-он

глиоксилат пропионил-СоА

Н3С-СН

С*°

V-SCoA н2О
метилмалил-СоА

Н3С

Н
ч z
С
II
С
'sc*°
~SCoA

мезаконил-СоА

с^о
T~SCoA
сн2

н3с-с-он

СОО"

Н2О

цитрамалил-СоА

сн3-с*° .

J ЬСоА
ацетил-СоА

СН3-С^ОО

пируват

Рис. 147. Путь ассимиляции глиоксилата у Chloroflexus aurantiacus (по: Herter et al., 2002).

1 — метилмалил-СоА-синтаза; 2 — мезаконил-СоА-гидратаза; 3 — мезаконат:цитрамалат-СоА-транс-
фераза; 4 — мезаконатгидратаза; 5 — цитрамалил-СоА-лиаза.

В 1993 г. Р. Н. Ивановский предложил схему альтернативного цикла автотрофной
ассимиляции углерода, осуществляемого С. aurantiacus. В данном случае ацетил-
СоА восстановительно карбоксилируется в пируват, который затем превращается в
малат (см. рис. 145, реакции 9, 10 и 8). На завершающей стадии малат расщепляется
на ацетил-СоА и глиоксилат.
13.2.3.	Рибулозомонофосфатный цикл, или цикл Квай л а

Рибулозомонофосфатный цикл существует у Methylobacter capsulatus, Methylococ-
cus capsulatus, Methylomonas rubrum и других метанотрофов типа-1, которые при-
надлежат к филе ВХП Proteobacteria (см. раздел 11.4.4.2). Основные детали этого
цикла были выявлены с начала 1960-х годов английскими микробиологами из Шеф-
филда и Варвика, прежде всего Квайлом (J.R. Quayle) и его сотрудниками.

В цикле Квайла клеточный углерод является продуктом ассимиляции формаль-
дегида НСНО, т. е. неорганического субстрата, уровень восстановленности углерода
в котором соответствует таковому в молекуле углевода (СН2О)П-

В природных условиях данный субстрат образуется в результате монооксигеназного окисления
метана с последующим дегидрированием метанола (см. раздел 11.4.4.2).

Формальдегид — это высоко реакционноспособное соединение, и он токсичен для всех живых
организмов. Однако метанотрофы адаптированы к формальдегиду, поскольку способны быстро
его утилизировать.

Формальдегид используется в метаболизме метанотрофов одновременно в качестве источника
энергии и строительного материала.

Рибулозомонофосфатный цикл состоит из трех основных этапов:

—	акцептирование Сц-блока;

—	расщепление продукта акцептирования;

—	регенерация акцептора.

Первый этап осуществляется путем конденсации трех молекул формальдегида с
тремя молекулами рибулозо-5-фосфата, в результате чего образуются три молеку-
лы гексозы — В-эритро-Ь-глицеро-3-гексулозо-6-фосфата (рис. 148). Путем изомери-
зации они превращаются в три молекулы фруктозо-6-фосфата.

Одна из трех молекул фруктозо-6-фосфата изомеризуется в глюкозо-6-фосфат.
В результате уже знакомых нам реакций окислительного гексозомонофосфатного
пути Энтнера-Дудорова (см. раздел 11.3.2.2 и рис. 87) глюкозо-6-фосфат превраща-
ется в 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат, из которого под воздействием альдола-
зы образуются молекула пирувата и молекула глицеральдегид-3-фосфата. Пируват
фосфорилируется в фосфоэнолпируват, а тот, в свою очередь, гидратируется в 2-
фосфоглицерат. Это соединение является продуктом цикла, и оно используется для
образования клеточного материала.

Две оставшиеся молекулы фруктозо-6-фосфата (2хСб) вместе с молекулой гли-
церальдегид-3-фосфата (Сз) используются для регенерации акцептора (3xCs). Это
осуществляется в ходе реакций, уже знакомых нам по окислительному гексозомоно-
фосфатному пути Варбурга-Диккенса-Хореккера (см. раздел 11.3.2.3 и рис. 102) —
транскетолазной, трансальдолазной, фосфопентоэпимеразной и фосфопентоизоме-
разной.

Общее уравнение цикла Квайла выглядит следующим образом:

ЗНСНО + НАД + АТФ + Н2О —> 2-фосфоглицерат + НАДН + АМФ + Ф.

Интермедиатами цикла являются трех-семи углеродные сахара. Примечательно,
что в нем не расходуется, а образуется восстановитель (НАДН), который использу-
ется в конструктивных процессах.

У факультативных метанотрофов типа-1 имеется альтернативный, более редкий вариант рибу-
лозомонофосфатного цикла.
хЗ

хз

хз

Х1

СОО"

нс-он

с = о

НС-он

СН2ОН

хз
|нсно|

нс-он

нс-он —

1 а
нс-он

СН2ОР
рибулозо-5-фосфат

СН2ОН

с=о

НО-СН

НС-он

СН,ОР

ксилулозо-
5-фосфат

«о

нс-он

НС-он

нс-он

СН2ОР

СН2ОН

СН2ОН

соо

с=о

СН2ОР

D-эритро-
L-глицеро-
3-гексулозо-
б-фосфат

^О

НС-он

НО-СН

НС-он

СН2ОР

НО-СН

с = о	с — о

I НАД НАДН 7

* НС-он

НС-он

СН,ОР

>зо-
Ьат

Н2О

сн2

нс-он

НД_ОН

4г nC Un

Н2° СН2ОР

СН3

соо

2-кето-З-дезокси-

6-фосфоглюконат

пируват

АТФ
АМФ+Ф

с = о

НС-он

НС-он

глицер-
альдегид-
3-фосфат

СН2ОР

СН2ОН

V'H
НС-он

Х1

НО-СН

с = о

нс-он

НС-он

фруктозо-
6-фосфат

СН2ОР

СН2ОН

НС-он

СН2ОР

СН2ОН

НО-СН

нс-он

/ нс-он

СН2ОР

Х1

С~Р
II
сн2
фосфоэнол-
пируват

Н2О

соо

НС-ОР

СН2ОН

2-фосфо-
глицерат

продукты
цикла

седогептул030-
7-фосфат

эритрозо-
4-фосфат

фруктозо-
6-фосфат

с = о





с = о

СН2ОН	
с = о /	
1	/	
НО-СН	/  |	F	' V'H *
нс-он	нс-он
СН2ОР	СН2ОР

ксилулозо- глицеральдегид-

5-фосфат 3-фосфат

Рис. Ц8. Рибулозомонофосфатный цикл, или цикл Квайла.

1 — 3-гексулозофосфат-синтаза; 2 — фосфо-3-гексулоизомераза; 3 — фосфоглюкоизомераза; 4 — глю-
козо-6-фосфат-дегидрогеназа; 5 — фосфоглюконат-дегидратаза; 6 — альдолаза; 7 — фосфоэнолпируват-
синтетаза; 8 — фосфопируват-гидратаза; 9 — транскетолаза; 10 — трансальдолаза; 11 — фосфопентоэпиме-
раза; 12 — фосфопентоизомераза.
Одна из трех молекул фруктозо-6-фосфата не окисляется в 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат,
а фосфорилируется во фруктозо-1,6-бисфосфат. Затем, как при гликолизе (см. раздел 11.3.2.1 и
рис. 86), она расщепляется альдолазой на глицеральдегид-3-фосфат и диоксиацетонфосфат.

Диоксиацетонфосфат окисляется в 1,3-бисфосфоглицерат, а тот превращается в 2-фосфоглице-
рат (при этом фосфорилируется молекула АДФ). Две оставшиеся молекулы фруктозо-6-фосфата
вместе с молекулой глицеральдегид-3-фосфата используются для регенерации акцептора — рибу-
лозомонофосфата.

Общее уравнение цикла Квайла в данном случае выглядит следующим образом:

ЗНСНО + НАД + Н2О + Ф —+ 2-фосфоглицерат + НАДН.

Необходимо подчеркнуть, что в этом варианте цикла Квайла не расходуется, а образуется
восстановитель (НАДН), а энергия АТФ вообще не затрачивается.

Несостоятельную идею о том, что растения образуют углеводы путем кон-
денсации формальдегида, впервые высказал немецкий химик Адольф фон Байер
(А. Bayer, Нобелевская премия по химии, 1905 г.). Русский химик А. М. Бутлеров в
начале 1860-х годов синтезировал из формальдегида сахароподобное вещество, ко-
торое он назвал «метиленитаном». И хотя впоследствии оказалось, что путь углеро-
да в растительном фотосинтезе совершенно иной, а использование формальдегида
метанотрофами не приводит к прямому образованию гексоз, перед нами один из
любопытных примеров диалектики естествознания.

13.2.4.	Сериновый цикл, или цикл О’Коннора-Хэнсона

Сериновый цикл имеется у Methylocystis sp., Methylosinus trichosporium,
Methylovibrio soehngenii и других факультативных метанотрофов типа-П, которые
принадлежат к филе ВХП Proteobacteria (см. раздел 11.4.4.2).

Ключевой фермент этого цикла, оксипируват-редуктаза, был впервые обнару-
жен Квайлом в 1970 г. Однако «персональное» название сериновый цикл получил в
честь английских биохимиков О’Коннора (М. L. O’Connor) и Хэнсона (R. S. Hanson),
которые в 1970-1980 гг. внесли решающий вклад в изучение энзимологии метано-
трофов типа-П. В частности, они охарактеризовали другой ключевой фермент этого
цикла — серин-оксиметил-трансферазу.

Как и в рибулозомонофосфатном цикле Квайла, в сериновом цикле О’Коннора-
Хэнсона ассимилируется формальдегид. Однако помимо него используется еще один
Ci-блок, а именно СО2.

Формальдегид первоначально акцептируется неферментативным путем. Акцеп-
тором служит тетрагидрофолат, в результате чего образуется М-формил-Щфолат
(см. рис. 122).

Первый энзиматический шаг осуществляется при помощи ключевого фермен-
та— серин-оксиметил-трансферазы, переносящего формильную группу от N-фор-
мил-Щфолата на глицин с образованием серина (рис. 149). Этот фермент тривиален,
его использует для биосинтеза серина и пуриновых оснований большинство бакте-
рий, но только у метанотрофов он занимает центральное место в конструктивном
метаболизме.

Аминогруппа от серина передается глиоксилату. Катализатором этой реакции
служит серингглиоксилат-аминотрансфераза, а ее продуктами — соответственно ок-
сипируват и глицин.

Вторым ключевым ферментом данного цикла служит растворимая НАДН-зави-
симая оксипируват-редуктаза, восстанавливающая оксипируват в глицерат. Затем
х2|нсно|

но-сн

сн,
с*°
~SCoA

малил-СоА

CoASH

СОО’

НО-СН

х2 нс-он

СН2ОН
глицерат
0Л-АТФ
/^>АДФ
СОО"

с=о

CO2J СОО’ ®

х2 нс-op

/ СН2ОН

2-фосфоглицерат

HjC-COO’ А'
НО-С -СОО’

Н2С -СОО
цитрат

СОО
оксалоацетат

С~Р
— II
сн2
фосфоэнол-
пируват

НАД

Н,О

СОО’

продукты
цикла

н

н,о

Н,С - СОО’

НАДН 1
НО-СН

СН,

СОО’
малат

НС-СОО

II

но-с-СОО
изоцитрат

СОО

Н2О

сн

СОО’
— I
сно
глиоксилат

соо’
I
сн2

сн2

* соо’

сукцинат

и /
СН

I .
соо

@ фумарат

1>АДН,
ФАД

Рис. 149. Сериновый цикл, или цикл О’Коннора-Хэнсона.

I — основной (восстановительный) цикл; II — вспомогательный (окислительный) цикл; 1—серин-
оксиметил-трансфераза; 2 — серингглиоксилат-аминотрансфераза; 3 — оксипируват-редуктаза; 4 — глице-
раткиназа; 5 — фосфопируват-гидратаза; 6— фосфоэнолпируват-карбоксилаза; 7 — малатдегидрогеназа;
8 — малат-тиокиназа; 9 — малил-СоА-лиаза; 10 — цитратсинтаза; 11 — аконитаза; 12 — изоцитратлиаза;
13 — сукцинатдегидрогеназа; 14 — фумараза; 15 — малатдегидрогеназа.
глицерат фосфорилируется в 2-фосфоглицерат, который частично идет на образо-
вание продуктов цикла, а частично используется для регенерации акцептора фор-
мильной группы — глицина (рис. 149).

Из второй молекулы 2-фосфоглицерата под воздействием фосфопируват-гидра-
тазы образуется фосфоэнолпируват, который карбоксилируется в оксалоацетат, а
тот восстанавливается в малат. Затем малат переводится в активированную фор-
му — малил-СоА. Под воздействием лиазы малил-СоА расщепляется на ацетил-СоА
и глиоксилат, и цикл замыкается.

Способ образования второй молекулы глиоксилата долго оставался под вопросом. В конце кон-
цов выяснилось, что для этого другой продукт малил-СоА-лиазной реакции — ацетил-СоА — «про-
пускается» через окислительный цикл карбоновых кислот (рис. 149, II). Этот вспомогательный
цикл у метанотрофов состоит из тривиальных реакций, уже знакомых нам по описанию циклов
Кребса и Ивенса-Бьюкенена—Эрнона. В результате него образуется ключевой интермедиат сери-
нового цикла — глиоксилат. Кроме того, выигрывается восстановитель в форме НАДН и ФАДНг-

Интермедиатами цикла О’Коннора-Хэнсона являются аминокислоты глицин и
серин, а также предшественник аспарагиновой кислоты — оксалоацетат. Другой ин-
термедиат, ацетил-СоА, расходуется при биосинтезе жирных кислот и полиизопре-
ноидов.

Общее уравнение цикла О’Коннора-Хэнсона выглядит следующим образом:

2НСНО + СО2 + 2НАДН + ФАД + ЗАТФ ->
2-фосфоглицерат + 2НАД + ФАДН2 + ЗАДФ + 2Ф.

После превращения 2-фосфоглицерата в 3-фосфоглицерат он может использо-
ваться в разнообразных биосинтезах, в том числе при глюконеогенезе.

13.2.5.	Восстановительный пентозофосфатный цикл,
или цикл Кельвина—Бенсона-Бэссема

По своему значению для первичной продукции данный цикл занимает ведущее
положение в биосфере. Среди всех циклов и путей автотрофной ассимиляции уг-
лерода он распространен наиболее широко. Он универсален для всех типов асси-
милирующих пластид. У прокариотов, помимо фототрофных и хемолитотрофных
представителей филы ВХП Proteobacteria, он имеется у всех представителей филы
ВХ Cyanobacteria и, возможно, у некоторых экстремально галофильных и экстре-
мально термофильных архей.

RuBisCO. Ключевым ферментом цикла Кельвина-Бенсона-Бэссема являет-
ся бифункциональная рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа (англ, ribu-
lose 1,5-bisphosphate car boxy lase/oxygenase, RuBisCO). В первом томе учебника мы
уже останавливались на некоторых особенностях этого фермента, в частности рас-
сматривали его компартментализацию в карбоксисомах.

У разных живых организмов существуют две молекулярные формы RuBisCO —
I и II. Форма I состоит из восьми больших (англ, large, L; 55 кДа) и восьми ма-
лых (англ, small, S; 15 кДа) субъединиц. Форма II состоит только из двух больших
субъединиц, которые сильно отличаются по аминокислотной последовательности от
больших субъединиц формы I.
В настоящее время секвенированы около 800 индивидуальных генов rbcL, и на основе полу-
ченных данных построено филогенетическое древо RuBisCO. Форма I представлена на нем двумя
ветвями — «зеленой» (цианобактерии, ряд аДу-протеобактерий, пластиды зеленых водорослей) и
«красной» (ряд оД-протеобактерий, пластиды криптофитных и бурых водорослей). Форма II пред-
ставлена отдельной ветвью (ряд а/?7-протеобактерий, пластиды динофлагеллят). Таким образом,
филогения RuBisCO по результатам секвенирования гена rbcL не согласуется с филогенией ее вла-
дельцев, реконструированной на основе анализа последовательности гена 16S рРНК (см. I том
учебника). Возможно, что в ходе эволюции ген rbcL подвергался «горизонтальному» переносу.

Форма II в аэробных условиях неэффективна, поскольку ее сродство по отношению к СОг зна-
чительно меньше, чем по отношению к О2. Это дает основание считать форму II более архаичной,
и, вероятно, она была эволюционным предшественником формы I.

RuBisCO впервые выделили как «фракцию I» из листьев табака в 1947 г. амери-
канские биохимики Уилдмэн (S. G. Wildman) и Боннэр (J. Bonner). Через несколько
лет американские биохимики Кельвин (М. Calvin, Нобелевская премия по химии,
1961 г.), Бенсон (A. A. Benson) и Бэссем (J. A.Bassham), а также их английские кол-
леги Рэкер (E.Racker) и Хореккер (В. L. Horecker) установили, что этот фермент ка-
тализирует реакцию карбоксилирования рибулозо-1,5-бисфосфата с последующим
расщеплением шестиуглеродного интермедиата на две молекулы 3-фосфоглицера-
та.

В начале 1970-х годов американские биохимики Огрен (W. L. Ogren) и Тол-
берт (N.E.Tolbert) выяснили, что, наряду с карбоксилазной активностью, рибуло-
зо-1,5-бисфосфат-карбоксилаза обладает оксигеназной активностью — рибулозо-1,5-
бисфосфат присоединяет молекулу кислорода, и затем пятиуглеродный интермеди-
ат расщепляется на молекулу 3-фосфоглицерата и молекулу 2-фосфогликолата.

При взаимодействии высокореактивной 2,3-эндиольной формы рибулозо-1,5-бис-
фосфата (см. ниже) с RuBisCO образуются не только интермедиаты карбоксилазной
и оксигеназной реакций, но и ряд минорных продуктов — рибулозо 1,5-бисфосфат и
ксилулозо-1,5-бисфосфат (в результате протонирования в положении 3), а также
3-кетоарабинитол-1,5-бисфосфат (в результате протонирования в положении 2).

Благодаря способности одновременно катализировать карбоксилазную и окси-
геназную реакции RuBisCO является главным действующим лицом в двух взаим-
но конкурирующих физиологических процессах — цикле восстановления углерода и
цикле окисления углерода.

Первый цикл лежит в основе глобальной первичной продукции, и благодаря ему
СО2 используется для биосинтеза углеводов (одновременно с этим газообразный
СО2 удаляется из атмосферы, что уменьшает парниковый эффект). Второй цикл
физиологически непродуктивен и резко снижает эффективность автотрофного ро-
ста, однако он неизбежен в аэробных условиях.

Соотношение восстановительного и окислительного циклов варьирует у разных
организмов и определяется способностью RuBisCO взаимодействовать преимуще-
ственно с СО2 или О2 (фактор субстратной специфичности т), а также зависит от
клеточных механизмов, концентрирующих СО2 в зоне активного центра.

Из-за оксигеназной реакции может теряться до 50% связанного углерода, хотя
существуют физиологические механизмы, препятствующие этому негативному яв-
лению (см. ниже).

Недостаток RuBiSCO заключается не только в способности катализировать физиологически
непродуктивную оксигеназную реакцию. Для этого фермента характерно очень низкое сродство
к главному субстрату, СО2 (Кт >150 мкМ). Наконец, это самый «медленный» из всех известных
ферментов. Его молярная активность (частное от деления максимальной скорости реакции Vmax,
выраженной в молях переработанного субстрата-мин-1 на число молей фермента) составляет ~50.
Иными словами, одна молекула RuBisCO за одну секунду «фиксирует» только одну молекулу
СОг- Для сравнения укажем, что молярная активность одного из самых эффективных ферментов,
карбоангидразы (катализирует реакцию СО2 + ОН- ♦-» НСО^), составляет ~ЗЮ7. Очень низкое
«число оборотов» RuBisCO компенсируется высоким удельным содержанием этого фермента в
прокариотных клетках и пластидах (до 50% растворимого белка), что в пересчете на его глобальное
количество составляет 108 т, или по 20 кг на каждого жителя Земли.

Карбоксилазная реакция (рис. 150, А) осуществляется в пять этапов:

—	спонтанная энолизация, связанная с депротонированием в положении 3 и по-
явлением нуклеофильного центра в положении 2, в результате чего образуется вы-
сокореактивная 2,3-эндиольная форма рибулозо-1,5-бисфосфата;

—	ферментативное карбоксилирование 2,3-эндиольной формы рибулозо-1,5-бис-
фосфата с образованием шестиуглеродного интермедиата, 2-карбокси-З-кето-D-
арабинитол-1,5-бисфосфата (англ. 2-carboxy-3-keto-D-arabinitol 1,5-bisphosphate,
СК АВР);

—	спонтанная гидратация 3-кето-формы СКАВР, в результате чего образуется
следующий шестиуглеродный интермедиат, 2-карбокси-З-ди-ол-D-рибитол-1,5-бис-
фосфат (англ. 2-carboxy-3-di-ol-ribitol 1,5-bisphosphate, CDRBP);

—	спонтанное расщепление CDRBP, приводящее к образованию карбоаниона
3-фосфоглицерата в положении 2, а также молекулы 3-фосфоглицерата;

—	спонтанное протонирование карбоаниона, в результате чего образуется вторая
молекула 3-фосфоглицерата.

Помимо того, что RuBisCO связывает СО2 в карбоксилазной реакции, этот фер-
мент в обязательном порядке активируется «не субстратным» АСО2, который об-
разует карбамат с остатком Lys-201 в составе L-субъединицы: RuBisCO-NH^ +
аСО2 -> RuBisCO-NH-ACOO~ + 2Н+. Эта регуляторная реакция требует присут-
ствия катионов Mg2+ и катализируется RuBisCO-активазой.

Оксигеназная реакция (рис. 150, Б) осуществляется в три этапа:

—	спонтанная энолизация, связанная с депротонированием в положении 3 и по-
явлением нуклеофильного центра в положении 2;

—	ферментативное оксигенирование 2,3-эндиольной формы рибулозо-1,5-бисфос-
фата с образованием пятиуглеродного интермедиата, 2-перокси-3-кето-О-рибитол-
1,5-бисфосфата (англ. 2-регоху-3-keto-D-ribitol 1,5-bisphosphate, PKRB);

—	спонтанное расщепление PKRB, приводящее к образованию молекулы 2-фос-
фогликолата и молекулы 3-фосфоглицерата.

Оксигеназная реакция, которую катализирует RuBisCO, происходит без участия кофакторов,
которые обычно требуются для активации кислорода (в частности, редокс-активных металличе-
ских центров; см. раздел 11.4.6.1). Как уже указывалось, ее предпосылкой служит высокая реак-
ционная способность 2,3-эндиольной формы рибулозо-1,5-бисфосфата.

Молекула кислорода в невозбужденном состоянии триплетна (поскольку она содержит два
неспаренных электрона с одинаковыми спинами), и поэтому ее непосредственное присоединение
по ковалентной связи, образованной электронами с противоположными спинами, находится под
спиновым запретом. В случае RuBisCO проблема инверсии спина, по-видимому, решается путем
промежуточного образования свободных радикалов рибулозо-1,5-бисфосфата и молекулярного кис-
лорода.

Цикл восстановления углерода. Основные его детали были реконструирова-
ны в 1946-1956 гг. Мелвином Кельвином с сотрудниками.
СН2ОР
с = о

HC-OH

HC-OH

СН2ОР
рибулозо-
,5-бисфосфат

СН2ОР

СН2ОР
но-с-соо"

HC-OH

с-он

II

с-он

СН2ОР
 *

c=o

HC-OH

СН2ОР

СКАВР

Н2О

HO-C-OH

CH,OP

СН2ОР

CDRBP

HO-c-coo

HC-OH

СН2ОР н
но-с-соо"
е

3-фосфо-
глицерат
(карбо-
анион)

coo

HC-OH

СН2ОР

3-фосфо-
глицерат

СН2ОР
нс-он

coo

3-фосфо-
глицерат

рибупозо- /
,5-бисфосфат I
(2,3-эндиол)

И

СН,ОР
I *

СН2ОР
соо-

HO-C-O-O

c = o

HC-OH

coo

2-фосфо-
гликолат

A

CH,OP

PKRB

HC-OH

Б

СН2ОР

3-фосфо-
глицерат

Рис. 150. Карбоксилазная (А) и оксигеназная (Б) реакции, осуществляемые
рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксил азой/оксигеназой.

СКАВР — 2-карбокси-3-кето-О-арабинитол-1,5-бисфосфат; CDRBP — 2-карбокси-З-
ди-ол-Б-рибитол- 1,5-бисфосфат; PKRB — 2-перокси-3-кето-В-рибитол- 1,5-бисфосфат.

Он начинается с того, что три молекулы рибулозо-1,5-бисфосфата карбоксилиру-
ются при помощи RuBisCO, и образуются шесть молекул 3-фосфоглицерата, кото-
рые фосфорилируются киназой в шесть молекул 1,3-бисфосфоглицерата (рис. 151).
После этого НАДФ-зависимая дегидрогеназа восстанавливает их в шесть молекул
глицеральдегид-3-фосфата. Одна из них покидает цикл и используется при биосин-
тезе клеточного материала.

Остальные пять молекул глицеральдегид-3-фосфата (5хСз) расходуются для ре-
генерации акцептора (3xCs). Это происходит в ходе реакций, уже знакомых нам по
гликолизу (см. раздел 11.3.2.1 и рис. 86), а также по окислительному гексозомоно-
фосфатному пути Варбурга-Диккенса-Хореккера (см. раздел 11.3.2.3 и рис. 102) —
альдолазной, транскетолазной, фосфопентоэпимеразной и фосфопентоизомеразной.

Общее уравнение цикла Кельвина-Бенсона-Бэссема выглядит следующим обра-
зом:

ЗСО2 + 6НАДФН + 9 АТФ + 12Н+ ->
глицеральдегид-3-фосфат + 6НАДФ + 9АДФ + 8Ф + ЗН2О.

Продукт цикла, глицеральдегид-3-фосфат, может использоваться в разнообраз-
ных биосинтезах, в первую очередь при глюконеогенезе.

Цикл окисления углерода. Как уже отмечалось, в результате оксиге-
назной реакции RuBisCO поглощается кислород, а углерод выделяется в ви-
хЗ	хЗ

сн2он

с=о
I

НС-он

I

НС-он
I

CHjOP

АТФ АДФ

СН2ОР
с=о

I
НС-он

I
НС-он

I

СН2ОР

продукты
цикла

хЗ хб х 6	хб

1сог1	АТФ АДФ	НАДФН НАДФ

coo I 4 coo-vp	ctH /

> HC-OH —St ► HC-OH	нс-он '

1	®	1	(W 1

+ СН2ОР	СН2ОР '+ ▼ ▼ СН2ОР

Н2О 2Н	ЗН Н2ОФ

Рис. 151. Восстановительный пентозофосфатный цикл, или цикл Кельвина-Бенсона-
Бэссема.

1 — фосфорибулокиназа; 2 — рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа; 3 — фосфо-
глицерат-киназа; 4 — триозофосфат-дегидрогеназа; 5 — триозофосфат-изомераза; 6 — альдолаза;

7 — фосфатаза; 8 — транскетолаза; 9 — фосфопентоэпимераза; 10 — фосфопентоизомераза.
де С02. По этим признакам газообмена данный процесс у фотосинтетиков на-
зван фотодыханием (англ, photorespiration), а у хемосинтетиков хемодыханием
(англ, chemorespiration).

У так называемых «Сз-растений» фотодыхание усиливается при относитель-
но низком содержании СО2 и относительно высоком содержании кислорода. Этот
процесс компартментализован сразу в трех органеллах —хлоропласте, пероксисоме
и митохондрии. До 75% образовавшегося 2-фосфогликолата возвращаются в цикл
Кельвина-Бенсона-Бэссема с помощью энергозависимого «гликолатного» пути.

В самом общем виде последовательность событий при фотодыхании выглядит следующим об-
разом. Образовавшийся в хлоропласте 2-фосфогликолат дефосфорилируется в гликолат, который
экспортируется в пероксисому. Там он при помощи оксидазы превращается в глиоксилат, который
переаминируется с серином с образованием глицина. Затем глицин экспортируется в митохондрию,
где из двух его молекул (с потерей СОг и NH3) образуется молекула серина. Из митохондрии серин
экспортируется в пероксисому, где он переаминируется с глицином и превращается в гидрокси-
пируват. Гидроксипируват восстанавливается в глицерат, который экспортируется в хлоропласт.
Наконец, глицерат превращается в 3-фосфоглицерат, и тот направляется в восстановительный
цикл.

В отличие от большинства растений, прокариоты обладают эффективными ме-
ханизмами для концентрирования СО2, и поэтому у них скорость карбоксилазной
реакции выше, чем оксигеназной. Тем не менее, в аэробных условиях наряду с
3-фосфоглицератом всегда образуется 2-фосфогликолат, что приводит к неизбеж-
ной потере акцептированного углерода.

Гликолатный путь у прокариотов выражен слабо или вообще отсутствует. Вме-
сто него функционирует другой механизм, лучше всего изученный у цианобактерий
(рис. 152).

Под воздействием фосфатазы 2-фосфогликолат теряет фосфорильную группу и
либо экскретируется, либо окисляется особой дегидрогеназой в глиоксилат, который
частично экскретируется, а частично взаимодействует с гликолатом с образованием
тартронового полуальдегида. Последний восстанавливается в глицерат, а тот фос-
форилируется в 3-фосфоглицерат, который поступает в восстановительный цикл.

Цикл Кельвина—Бенсона—Бэссема у архей. Вопрос о существовании дан-
ного цикла у архей еще открыт. В 1990 г. у экстермального галофила Halobacterium
mediterranei (фила АП Euryarchaeota) были обнаружены два ключевых фермента
этого цикла — фосфорибулокиназа и RuBisCO, но их активность оказалась крайне
низкой. В 2003 г. было показано, что гипертермофилы Pyrodictium abyssii и Р. ос-
cultum (фила AI Crenarchaeota) содержат термостабильную RuBisCO. Однако у них
не удалось выявить второй ключевой фермент — фосфорибулокиназу.

Эволюционные взаимоотношения цикла Кельвина—Бенсона—Бэссема,
цикла Варбурга-Диккенса-Хореккера и цикла Квайла. По аналогии с вос-
становительным циклом трикарбоновых кислот Ивенса-Бьюкенена-Эрнона, кото-
рый рассматривают как обращенный окислительный цикл трикарбоновых кислот
Кребса (см. раздел 13.2.1), восстановительный пентозофосфатный цикл Кельвина-
Бенсона-Бэссема считают обращенным пентозофосфатным циклом Варбурга-
Диккенса-Хореккера. Это справедливо лишь в онтогенетическом плане. Фило-
генетическое взаимоотношение этих циклов, по-видимому, противоположно, т. е.
цикл Кельвина-Бенсона-Бэссема был эволюционным предтечей цикла Варбурга-
Диккенса-Хореккера.
<

coo

CH2OP
c=o

I

HC-OH

I

HC-OH
I

CH2OP
рибулозо-

I

HC-OH
I
CH2OP

3-фосфо-
глицерат

coo"
I
CH2OP

coo"

I
HC-OH

I
CH2OH

глицерат

1,5-бисфосфат

2-фосфогликолат

|экскреция| <

COO
I
CH2OH

coo"

I

HC-OH

гликолат

тартроновый
полуальдегид

НАД(Ф)Н

НАД(Ф) Q
НАД(Ф)Н

COO
1
C^H

глиоксилат

экскреция

Рис. 152. Пути углерода при фотодыхании и хемодыхании.

1 — рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа; 2 — фосфогликолат-фосфатаза; 3 — гликолат-
дегидрогеназа; 4 — синтаза тартронового полуальдегида; 5 — глицератдегидрогеназа; 6 — глицераткиназа.

Существуют два основных довода в пользу данного предположения. Во-первых, ключевые фер-
менты цикла Кельвина-Бенсона-Бэссема имеются у наиболее архаичных бактерий (в частности,
цианобактерий), а также у архей, что позволяет считать его физиологическим свойством общего
предка двух прокариотных доменов. Во-вторых, судя по глобальному родословному древу (см. I
том учебника), более архаичные бактерии — преимущественно автотрофы, а менее архаичные бак-
терии — преимущественно гетеротрофы.

Эволюционная иерархия рибулозобисфосфатного цикла Кельвина-Бенсона-Бэссема и рибуло-
зомонофосфатного цикла Квайла также стоит под вопросом. Поскольку в первом из них исполь-
зуется более сложный ферментативный аппарат, предполагается, что этот цикл был эволюционно
вторичным.

13.2.6. Сравнение циклов автотрофной ассимиляции углерода

Таким образом, в настоящее время известны пять циклов автотрофной ассими-
ляции углерода (табл. 15).

Два из них, а именно восстановительный цикл карбоновых кислот и рибуло-
Таблица 15. Важнейшие характеристики циклов автотрофной ассимиляции углерода

Цикл	Распростра- нение	Акцептор С1-блока	Ci- блок	Конеч- ный продукт	Затрата энергии (моль АТФ на моль конечного продукта)	Затрата восстано- вителя (моль е~ на моль конечного продукта)
Ивенса- Бьюкенена- Эрнона (основной вариант)	Aquifex pyrophilus, Hydrogenobacter thermophilus (BI Aquificae);  Chlorobium limicola (BXI Chlorobi), Desulfobacter sp. (BXII Proteobacteria); Sulfolobus acdocaldarius, Thermoproteus neutrophilus (AI Crenarchaeota)	Сукцинил- СоА;  а-кетоглута- рат	СО2	Ацетил-СоА	2	8
Ивенса- Бьюкенена- Эрнона (ацетил- СоА-шунт)	To же	Сукцинил- СоА;  а-кетоглута- рат	СО2	Оксало- ацетат	3	10
Фукса- Холо	Chloroflexus aurantia- cus (BVI Chloroflexi); Acidianus infemus, Metallosphaera sedu- la, Sulfolobus metalli- cus (AI Crenarchaeo- ta)	Ацетил-СоА, пропионил- СоА	НС07	Глиоксилат	3	6
Квайла (основной вариант)	Methylobacter capsu- latus, Methylococcus capsulatus,	Methy-  lomonas rubrum и др. метанотрофы типа-1 (ВХП Proteobacteria)	Рибулозо- 5-фосфат	НСНО	2-фосфогли- церат	1	0
Квайла (альтерна- тивный ва- риант)	То же	Рибулозо- 5-фосфат	НСНО	2-фосфогли- церат	0	0
О’Коннора-  Хэнсона	Methylocystis sp., Ме- thylosinus trichospo- rium, Methylovibrio soehngenii и др. метанотрофы типа-П (ВХП Proteobacteria)	Глицин, фосфоэнол- пируват	НСНО, со2	2-фосфогли- церат	3	6
Кельвина- Бенсона- Бэссема	ВХ Cyanobacteria (все представители); ВХП Proteobacteria (фототрофные и хемолитотрофные представители)	Рибулозо- 1,5-бисфос- фат	со2	Глицер- альдегид- 3-фосфат	9	12
зомонофосфатный цикл, существуют в альтернативных вариантах. Возможно, что
альтернативными вариантами представлен еще один цикл, Доксипропионатный.

Не исключено, что помимо рассмотренных циклов в природе существуют и дру-
гие. В этом плане особо интересны экстремально термофильные археи. Есть данные,
указывающие на возможность того, что у Sulfolobus brierleyi имеется особый вариант
восстановительного цикла карбоновых кислот.

Распространение. Самым распространенным является цикл Кельвина-
Бенсона-Бэссема. За ним с большим отрывом следуют циклы Квайла, О’Коннора-
Хэнсона и Ивенса-Бьюкенена-Эрнона. Самым редким, по-видимому, является цикл
Фукса-Холо.

Акцепторы Сi-блока. Формально их можно отнести к трем группам:

—	неактивированные аминокислоты (глицин, а-кетоглутарат);

—	СоА-активированные органические кислоты (ацетил-СоА, пропионил-СоА,
сукцинил-СоА);

—	фосфорил-активированные органические кислоты и сахара (фосфоэнолпиру-
ват, рибулозо-5-фосфат, рибулозо-1,5-бисфосфат).

Как видно из приведенного перечня, в большинстве случаев активация акцепто-
ра необходима. Реже она не нужна (при восстановительном карбоксилировании а-
кетоглутарата или оксиметилировании глицина).

Ci-блоки. Как известно, углеродные автотрофы могут использовать в качестве
энергетических и конструктивных субстратов разнообразные Сi-соединения. Сте-
пень восстановленности углерода в этих субстратах возрастает в ряду СО2(НСО^,
НСОО") —> СО —► НСНО СН3—.

Однако непосредственное акцептирование С i-блока осуществляется только в
трех формах: СО2, НСО3 и НСНО. Поскольку в последнем случае углерод находит-
ся на уровне восстановленности в углеводе, это предопределяет тип образующегося
конечного продукта, а также затраты энергии и восстановителя на его образование.

Конечные продукты. В ходе циклов автотрофной ассимиляции углерода мо-
гут образовываться три типа конечных продуктов, которые идут на построение раз-
ного клеточного материала:

—	ацетил-СоА (используется для биосинтеза жирных кислот и полиизопренои-
дов);

—	глиоксилат и оксалоацетат (используются для биосинтеза жирных кислот, по-
лиизопреноидов и аминокислот);

—	2-фосфоглицерат и глицеральдегид-3-фосфат (используются для биосинтеза
углеводов).

В первом и втором случаях существуют предпосылки для активного синтеза бел-
ка и, следовательно, для быстрого роста и размножения. В третьем случае создаются
условия для запасания резервных полигликозидов.

Затраты энергии. Самым «расточительным» является цикл Кельвина-
Бенсона-Бэссема (9 молекул АТФ на одну молекулу конечного продукта). В осталь-
ных случаях расход АТФ составляет 1-3 молекулы. Особое положение занимает
альтернативный вариант цикла Квайла, протекающий с нулевым балансом энергии
(расход одной молекулы АТФ на фосфорилирование фруктозо-6-фосфата компен-
сируется фосфорилированием одной молекулы АДФ на уровне субстрата).

Затраты восстановителя. Наибольшее количество низкопотенциальных элек-
тронов (в расчете на молекулу конечного продукта) затрачивается в цикле
Кельвина-Бенсона-Бэссема (12). За ним следуют циклы Ивенса-Бьюкенена-Эрнона
(8-10), Фукса-Холо и О’Коннора-Хэнсона (по 6). Цикл Квайла вообще является
«нерасточительным», поскольку в нем не расходуется восстановитель.

Простое утилитарное объяснение, почему бактерия или археот обладают тем
или иным циклом, отсутствует. Например, самый неэффективный цикл Кельвина-
Бенсона-Бэссема распространен наиболее широко. По-видимому, решающее значе-
ние имеет не тип используемого цикла, а комплекс эволюционно приобретенных
физиологических свойств, позволяющих прокариотным организмам занимать опре-
деленные экологические ниши.

13.3.	ПУТИ УГЛЕРОДНОЙ АВТОТРОФИИ

За счет катаболических процессов, например брожения, энергия ассимилируется.
Это очевидно и не нуждается в комментариях.

В свою очередь, общеизвестно, что анаболические процессы, например фотосин-
тез, требуют энергетических затрат. Поэтому предположение о том, что энергию при
углеродной автотрофии можно не расходовать, а наоборот —извлекать, на первый
взгляд, кажется парадоксальным.

Однако существуют два механизма углеродной автотрофии, когда при ассимиля-
ции Ci-блоков прокариоты не только не расходуют энергию, но, напротив, получают
энергетический выигрыш.

13.	3.1. Восстановительный ацетил-коэнзимный путь
метаногенов, или путь Вулфа

Этот путь имеется у метаногенных архей (фила АП Euryarchaeota). Кроме то-
го, им обладают автотрофные сульфатредуцирующие археи, относящиеся к роду
Archaeoglobus (фила АП Euryarchaeota).

Основные этапы глобального метаболического пути метаногенеза, где конструк-
тивные процессы тесно переплетены с энергетическими, были выяснены в 1960-е
годы американским биохимиком Ральфом Вулфом.

Чтобы не повторяться, мы отсылаем читателя к разделу 11.4.5.4, в котором уже
были рассмотрены промежуточные реакции пути Вулфа, позволяющие метаноген-
ным археям ассимилировать энергию в форме Pmf и Smf.

С формальной точки зрения автотрофный ацетогенез — это простейший путь
сборки «минимальной» органической молекулы из двух Ci-блоков: метильной
[СНз—] и карбонильной группы [СО]:

СО2 + 6Н+/6е- -> [СН3-]

+ CoASH }-> СНзСО-SCoA.

СО2 + 2Н+/2е" -> [СО]

У метаногенных архей для восстановления обеих молекул СО2 используется мо-
лекулярный водород.

Источником метильной группы служит конечный продукт из II цикла «гидроге-
нотрофного» метаногенеза — N-метил-ЩМРТ (см. раздел 11.4.5.4, а также рис. 116
и 118). От него метильная группа передается белку C/Fe-SP (см. раздел 11.4.5.5),
который представляет собой гетеродимер субъединиц молекулярной массой 60 и
58 кДа. С большой субъединицей связан один [Ее484]-кластер, а с малой — коррино-
ид, сходный по строению с кобальт-порфиноидным кофактором Х-метил-ЩМРТ:
CoM-SH-метилтрансферазы (см. рис. 80). Атом кобальта непосредственно служит
мишенью для метилирования.

Передача метильной группы происходит при помощи Ы-метил-ЩМРТ:
C/Fe-SP-метилтрансферазы — гомодимерного белка, не имеющего простетических
групп. Как и в случае Ы-метил-ЩМРТгСоМ-ЗН-метилтрансферазной реакции, эта
реакция экзергонична, и свободная энергия ассимилируется в форме Smf (см. раз-
дел 10.4.10).

Источником карбонильной группы служит бифункциональный фермент
СО-дегидрогеназа. Он одновременно с этим выполняет функцию ацетил-СоА-син-
тазы (англ. СО dehydrogenase/acetyl-CoA synthase, COD/AS).

Этот фермент может действовать и в катаболическом направлении, расщепляя ацетат на ме-
тильную и карбонильную группы (вторая затем окисляется до СО2)- Таким путем используют
ацетат в качестве ростового субстрата ацетотрофные, или ацетокластические метаногенные археи,
а также гетеротрофные сульфатредуцирующие бактерии.

COD/AS имеет гетеротримерную структуру (<т/?)з- Молекулярная масса субъ-
единиц составляет 89 и 19 кДа. На каждый мономер а/3 приходится два [Fe4 341-
кластера и два [ГезК134]-кластера.

COD/AS превращает СО2 в ферментносвязанную карбонильную группу. Восста-
новление осуществляется с помощью ферредоксина, а тот получает электроны от
uptake-гидрогеназы (см. раздел 11.4.4.4). Альтернативным источником карбониль-
ной группы может быть свободный монооксид углерода СО.

Предполагается, что COD/AS содержит три сайта (X, Y и Z), предназначенные
соответственно для метильной группы, карбонильной группы и CoASH. В конечном
счете, из двух Ci-блоков и CoASH образуется СНзСО~8СоА.

Общее уравнение пути автотрофного ацетогенеза выглядит следующим образом:

2СО2 + 8Н+/8е" + CoASH -> CH3CO~SCoA + ЗН2О.

В дальнейшем с помощью ферредоксинзависимой пируватсинтазы ацетил-СоА
восстановительно карбоксилируется в пируват (см. раздел 13.2.1).

Если иметь в виду расход восстановителя, то автотрофный ацетогенез — это до-
вольно «расточительный» путь, поскольку в нем расходуются 8 молей высокопо-
тенциальных электронов в расчете на моль конечного продукта. Однако физиоло-
гическая эффективность данного пути повышается за счет того, что в нем попутно
ассимилируется энергия в форме Smf.

13.	3.2. Восстановительный ацетил-коэнзимный путь
ацетогенов, или путь Вуда—Льюнгдала

Этот автотрофный путь биосинтеза ацетата имеется у облигатно анаэробных
хемолитотрофных бактерий и, возможно, у термоацидофильных архей. Он был рас-
шифрован американскими микробиологами Вудом и Люнгдалом (L. С. L. Ljungdahl)
в середине 1980-х годов при изучении облигатно анаэробной бактерии Clostridium
thermoaceticum (фила BXIII Firmicutes). В настоящее время показано, что этот путь
широко распространен у сильно дивергировавших бактерий, относящихся к филам
ВХШ Firmicutes (Acetitomaculum, Acetobacterium, Acetohalobium, Acetonema, Calo-
ramator, Clostridium, Desulfobacterium, Eubacterium, Moorella, Natroniella, Oxobacter,
Ruminococcus, Sporomusa, Syntrophococcus, Thermoanaerobacter), BXVII Spirochaetes
(Treponema) и BXIX Acidobacteria (Holophaga).

Во избежание повторов мы, как и в предыдущем случае, отсылаем читателя к
разделу 11.4.5.5, где уже были рассмотрены промежуточные реакции, с помощью
которых ацетогены ассимилируют энергию.

Принцип биосинтеза ацетил-СоА у ацетогенных бактерий аналогичен принципу
биосинтеза метана у метаногенных архей. Это сборка «минимальной» органической
молекулы из двух Ci-блоков: метильной группы [СН3—] и карбонильной группы
[СО].

Более того, конкретными деталями путь Вуда-Льюнгдала напоминает путь Ву-
да.

В обоих случаях диоксид углерода, акцептированный в виде карбоксильной груп-
пы, за три этапа восстанавливается до метильной группы (см. рис. 123):

(1)	СОО" + Н+/2е- -СНО + Н2О, -СНО =СН- + Н2О;

(2)	=СН- + 2Н+/2е~ -> -СН2-;

(3)	-СН2- + 2Н+/2е"	-СН3.

В обоих случаях карбонильная группа образуется путем восстановления водоро-
дом диоксида углерода или, в качестве альтернативы, путем ассимиляции свобод-
ного монооксида углерода.

Однако, в отличие от метаногенов, которые используют для переноса Ci-группы
три переносчика поочередно (метанофуран, тетрагидрометаноптерин и СоМ; см.
рис. 116), у ацетогенов переносчик Ci-группы только один (тетрагидрофолат; см.
рис. 122).

При биосинтезе ацетата ацетогенами, как и при биосинтезе ацетата метаногена-
ми, происходит реакция трансметилирования. Во время нее тоже ассимилируется
энергия в форме Smf. Донором электронов при ацетогенезе, как и при метаногенезе,
служит Н2, который окисляется с помощью ир^а/се-гидрогеназы.

COD/AS ацетогенов имеет тримерный состав (оД)з, молекулярная масса субъ-
единиц составляет 77 и 71 кДа. На мономер а(3 приходятся два [Рв484]-кластера, два
[Еез№84]-кластера и один атом цинка. Гены, кодирующие две субъединицы, входят
в состав геномного островка, отвечающего за автотрофный биосинтез ацетата.

Донором метильного фрагмента для биосинтеза ацетата является гомолог белка
C/Fe-SP метаногенов, который состоит из субъединиц молекулярной массой 55 и 34
кДа. Однако он получает метильную группу с помощью метилтрансферазы не от
М-метил-ЩМРТ, а от И-метил-Щфолата.

Ацетил-СоА-путь ацетогенов, как и ацетил-СоА-путь метаногенов, завершает-
ся образованием ацетил-СоА. Однако «судьба» этого конечного продукта различна.
Метаногены полезно используют весь эндогенный ацетат, тогда как ацетогены ча-
стично выделяют его в окружающую среду.
13.4.	РАЗНООБРАЗИЕ МЕХАНИЗМОВ
АВТОТРОФНОЙ АССИМИЛЯЦИИ УГЛЕРОДА
ПРИ ХЕМОСИНТЕЗЕ И ФОТОСИНТЕЗЕ

Если мы еще раз проанализируем содержимое таблицы 15, то увидим, что хе-
молитотрофия сочетается с пятью циклами автотрофной ассимиляции углерода, а
фототрофия — только с тремя циклами (у фототрофов отсутствует цикл Квайла и
цикл О’Коннора-Хэнсона).

С чем связана неспособность фототрофов ассимилировать формальдегид? Может быть, ре-
шающее значение имеет принадлежность к аэробам? Ведь метанотрофы, которые получают фор-
мальдегид из метана —это облигатно аэробные бактерии (см. раздел 11.4.4.2). В то же время един-
ственными аэробами среди фототрофов являются цианобактерии, однако они пользуются циклом
Кельвина-Бенсона-Бэссема. Если исходить из гипотезы, что рибулозобисфосфатный цикл в ходе
эволюции произошел от рибулозомонофосфатного (см. раздел 13.2.5), возникает и другое предпо-
ложение: архаичные цианобактерии могли ассимилировать формальдегид, а их потомки утратили
это свойство.

Однако истинная причина, скорее всего, заключается в том, что метанотрофы стали исполь-
зовать в конструктивных целях один из промежуточных продуктов энергетического метаболизма,
формальдегид, причем фактором отбора в данном случае оказались экзогенные ресурсы метана.
Цианобактерии сделали ставку на фототрофию и использование пусть «невыгодного», но свободно
доступного конструктивного субстрата, диоксида углерода.

Что касается путей автотрофной ассимиляции углерода, то ими обладают толь-
ко две группы прокариотов: гидрогенотрофные метаногенные археи и ацетогенные
бактерии.

Причина отсутствия этих путей у фототрофов, видимо, та же самая, что и причина отсутствия
у них циклов Квайла и О’Коннора-Хэнсона.

Автотрофный биосинтез ацетата основан на водородной литотрофии и использовании в кон-
структивных целях одного из промежуточных продуктов энергетического метаболизма (в случае
метаногенов это М-метил-ЩМРТ, а в случае ацетогенов — N-метил-Щфолат). В то же время у
фототрофов энергетический метаболизм связан с использованием фоторецепторных систем и он
предоставляет широкие возможности для «невыгодной» ассимиляции диоксида углерода.

Таким образом, можно сделать окончательный вывод, что механизмы углеродной
автотрофии при хемосинтезе более разнообразны, чем при фотосинтезе.

В связи с вопросом о двух формах RuBisCO (см раздел 13.2.5) мы говорили о
том, что молекулярная филогения не позволяет реконструировать эволюционную
связь между путями конструктивного метаболизма.

В частности, бывает так, что близкородственные организмы обладают разны-
ми механизмами углеродной автотрофии. Например, виды Desulfobacter используют
восстановительный цикл карбоновых кислот, а виды Desulfobacterium — восстанови-
тельный ацетилкоэнзимный путь, хотя те и другие относятся к классу «Deltapro-
teobacteria». В то же время, ацетилкоэнзимный путь имеется у представителей раз-
ных порядков филы АП Euryarchaeota.

В большинстве случаев в разные циклы входят одни и те же обратимые реакции,
а те, в свою очередь, катализируются ферментами, гены которых могли передавать-
ся «горизонтальным» путем.

В завершение данного раздела следует отметить, что иногда (правда, исключи-
тельно редко) один и тот же микроорганизм не ограничивается единственным цик-
лом автотрофной ассимиляции углерода. Например, Methylococcus capsulatus штамм
Bath одновременно обладает ключевыми ферментами сразу трех циклов —цикла
Квайла, О’Коннора-Хэнсона и Кельвина-Бенсона-Бэссема.

* * *

На этом мы оставляем тему, посвященную углеродной автотрофии, и перехо-
дим к другому типу трофической автономии прокариотных организмов, а именно
к азотной автотрофии.
ГЛАВА 14

АЗОТНАЯ АВТОТРОФИЯ

The alder, whose fat shadow nourisheth — each plant
set neere to him long flourisheth.

(Ольха, что кормит землю своей тучной сенью —
близ от нее все долго и пышно растет).

William Browne of Tavistock (1613)

Азот принадлежит к числу незаменимых биогенных элементов. Он входит в уни-
версально распространенные макромолекулы — нуклеиновые кислоты и белки, пред-
ставляя соответственно 13 и 15% их молекулярной массы.

Все живые организмы подразделяются на азотных гетеротрофов и азотных ав-
тотрофов. Первые получают связанный азот в составе органических веществ или
простых минеральных ионов — аммония (NH^) и нитрата (NO3 ). Вторые обладают
способностью самостоятельно превращать молекулярный азот (N2) в аммоний, а за-
тем путем аминирования внедрять его в скелет органических молекул. Напомним,
что такой процесс известен под названиями «азотная автотрофия», или «диазотро-
фия», а прокариотные организмы, которые его осуществляют, называются диазо-
трофами (см. раздел 9.2.3).

Диазотрофы обеспечивают самих себя связанным азотом, а также обогащают
им окружающий экоценоз. Это происходит либо путем использования их мортмассы
другими живыми организмами, либо благодаря экспорту аммиака или аминокислот.

Ярким примером трофических взаимоотношений, основанных на диазотрофии, является «ак-
тиноризоидный» внутриклеточный симбиоз с участием актинобактерии Frankia (табл. 16), которая
образует клубеньки на корнях более чем двухсот видов двудольных растений из родов Alnus, Са-
suarina, Ceanothus, Comptonia, Eleagnus и Myrica. Побочным результатом этого симбиоза является
повышение плодородия окружающей почвы, и поэтому неслучайно в качестве эпиграфа к данной
главе взяты поэтические строки Уильяма Брауна.

14. 1. ДИАЗОТРОФЫ

Азотные автотрофы, или диазотрофы ежегодно связывают ~1,5-108 т газообраз-
ного азота, что в полтора раза превышает общий результат азотфиксации в ходе
природных абиотических процессов и на основе химической промышленности. Бла-
годаря диазотрофам инертный азот, поступающий в атмосферу при дыхательной
денитрификации (см. раздел 11.4.6.2), возвращается в биологический круговорот.
Таблица 16. Диазотрофы и их свойства, существенные для диазотрофии

Фила	Род(а) с диазотрофными представителями	Метаболизм	Отношение к кислороду	Способ существо- вания
BVI Chloroflexi	Oscillochloris	Фотолитоавто- троф (анокси- генный)	Анаэроб	Свободножи- вущий
ВХ Cyanobacteria	Anabaena, Anabaenopsis, Aphanizomenon, Calothrix, Chlorogloeopsis, Chroococcidiopsis, Cyanospira, Cyanothece, Cylindrospermum, Cylindrospermopsis, Dermocarpa, Fischerella, Gloeocapsa, Gloeothece, Leptolyngbya, Lyngbya, Microcoleus, Myxosarcina, Pleurocapsa, Nodularia, Nostoc, Nostochopsis, Oscillatoria, Plectonema, Pseudanabaena, Rivularia, Scytonema, Stigonema, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Tolypothrix, Trichodesmium, Xenococcus	Фотолитоавто- трофы (окси- генные)	Аэробы	Свободножи- вущие или экзоцито- бионты
BXI Chlorobi	Chlorobium, Chloroherpeton	Фотолитоавто- трофы (анокси- генные)	Анаэробы	Свободножи- вущие
ВХП Proteobacteria	Amoebobacter, Chromatium, Ectothiorhodospira, Lamprobacter, Rhodobacter, Rhodocyclus, Rhodomicrob ium, Rhodopila, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Thiocapsa, Thiocystis	Фотолитоавто- трофы или фото- органогетеротро- фы (аноксиген- ные)	Анаэробы	Свободножи- вущие
	Bradyrhizobium	Квази-фототроф (аноксигенный)	Аэроб	Эндоцито- бионт
Окончание табл. 16

Фила	Род(а) с диазотрофными представителями	Метаболизм	Отношение к кислороду	Способ существо- вания
ВХП Proteobacteria	Beggiatoa, Methylobacter, Methylococcus, Methylocystis, Methylomonas, Methylosinus, Thiobacillus	Хемолитоавто- трофы	Аэробы	Свободножи- вущие
ВХП Proteobacteria	Acetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, A quaspiril lum, Azomonas, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Beijerinckia, Bradyrhizobium, Campylobacter, Citrobacter, Derxia, Desulfobacter, Desulfovibrio, Enterobacter, Erwinia, Herbaspiril lum, Klebsiella, Mycoplana, Pseudomonas, Rhizobium, Vibrio, Xanthobacter	Хемооргано- гетеротрофы	Аэробы, фа- культативные анаэробы или анаэробы	Свободножи- вущие, экэо- цитобионты или эндоцито- бионты
ВХШ Firmicutes	Heliobacillus, Heliobacterium, Heliophilum, Heliorestis	Фотолитогетеро- трофы (аноксигенные)	Анаэробы	Свободножи- вущие
	Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Mycobacterium, Propionispira	Хемооргано- гетеротрофы	Анаэробы или факультатив- ные анаэробы	Свободножи- вущие
BXIV Actinobacteria	Frankia	Хемооргано- гетеротроф	Аэроб	Эндоцито- бионт
АП Euryarchaeota	Methanobacterium, Methanocaldococcus, Methanococcus, Methanolobus, Methanosarcina, Methano spirillum	Хемолитоавто- трофы	Анаэробы	Свободножи- вущие

Разрыв прочной тройной связи в молекуле N2 происходит в очень жесткой фи-
зико-химической среде. В частности, оксиды азота образуются при сильных элек-
трических разрядах, а синтез аммиака в производственном процессе Фрица Габера
(F. Haber, Нобелевская премия по химии, 1918 г.) протекает при давлении 10-100
мПа и температуре 400-600°С в присутствии железного катализатора.

В природе не существует ферментативного процесса, который позволял бы пе-
реводить атмосферный азот в оксиды. Однако есть ферментативный процесс, при-
водящий к восстановлению молекулярного азота. Он осуществляется в мягких фи-
зиологических условиях с помощью специфичных по отношению к молекулярному
азоту ферментов —N2аз, или нитрогеназ (англ, nitrogenase; от nitrogenium — латин-
ское название химического элемента азота).

Нитрогеназа является ключевым ферментом диазотрофии. Чаще всего ее гены
расположены на хромосоме; они высококонсервативны и гомологичны у эволюци-
онно дистанцированных объектов, даже у представителей разных доменов, что ука-
зывает на высокую вероятность их «горизонтального» переноса.

В 1885 г. немецкие агрохимики Гельригель (Н. Hellriegel) и Вильфарт (H.Wilfarth) устано-
вили, что бобовые растения могут расти в отсутствии азотных удобрений, довольствуясь атмо-
сферным азотом, который «фиксируют» почвенные микроорганизмы. В 1888 г. голландский мик-
робиолог Мартинус Бейеринк доказал мутуалистическую природу этой ассоциации и впервые
выделил прокариотных эндоцитобионтов — клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. В 1902 г.
С. Н. Виноградский открыл первого представителя свободноживущих анаэробных диазотрофов,
почвенную бактерию Clostridium pasteurianum, и тогда же Бейеринк и Ван Дельден (A. van Delden)
обнаружили первого представителя свободноживущих аэробных диазотрофов, почвенную бакте-
рию Azotobacter chroococcum.

В 1928 г. Древис (К. Drewes) впервые показал, что цианобактерии (в ту пору их еще называли
«сине-зелеными водорослями») могут использовать атмосферный азот. К середине 1950-х годов
Фогг (G. Fogg) установил, что способностью к диазотрофии обладают около двадцати видов нит-
чатых цианобактерий, образующих гетероцисты. Примерно в это же время Ховард Гест выяснил,
что диазотрофия распространена и у аноксигенных фототрофов — пурпурных бактерий.

На протяжении 1960-х годов было установлено, что диазотрофами могут быть не только ци-
анобактерии, образующие гетероцисты, но и ряд нитчатых цианобактерий, не образующих гетеро-
цист, а также некоторые одноклеточные цианобактерии.

Список диазотрофов постепенно расширялся, и в 1984 г. он пополнился двумя видами метано-
генных архей — Methanococcus thermolithotrophicus и Methanosarcina barkeri, а позднее и другими.

Критериями, определяющими способность к диазотрофии (реализованную или
потенциальную), являются:

—	рост на среде без связанного азота;

—	положительный тест на биосинтез этилена из ацетилена;

—	включение метки из 15N2;

—	связывание молекулярных зондов (ДНК-гибридизация in situ, иммуноэлек-
тронная микроскопия);

—	положительная PCR-реакция с использованием праймеров для структурных
генов нитрогеназы.

В настоящее время по одному или нескольким из этих критериев к диазотрофам
можно отнести представителей девяносто семи прокариотных родов (девятнадцати
родов аноксигенных фототрофных бактерий, тридцати четырех родов цианобакте-
рий, одного рода квази-фототрофных бактерий, семи родов хемолитоавтотрофных
бактерий, тридцати родов хемоорганогетеротрофных бактерий и шести родов мета-
ногенных архей (табл. 16).

14.2. НИТРОГЕНАЗА

Главным субстратом нитрогеназы является молекулярный азот, который она вос-
станавливает до двух молекул аммиака (N2 + 6Н+/6е“ —> 2NH3). Для этой реакции
нужен сильный восстановитель, пул которого пополняется в процессах литотрофии
и органотрофии (см. раздел 9.2.4).

Обычно таким восстановителем является железо-серный белок ферредоксин (см.
раздел 10.4). У цианобактерий при железном голодании взамен образуется кислый
флавопротеин — флаводоксин (англ, flavodoxin, Flvd). Он имеет молекулярную мас-
су 18 кДа и в качестве простетической группы содержит ФМН (см. рис. 105). По-
добно ферредоксину, флаводоксин является сильным восстановителем, и редокс-
потенциал его восстановленной формы варьирует от -370 до -450 мВ.

Кроме того, для действия нитрогеназы необходима энергия, освобождающаяся
при гидролизе АТФ. Побочным субстратом нитрогеназы служат протоны, т.е. этот
фермент одновременно выполняет роль гидрогеназы, на что уходят ~25% всего из-
расходованного восстановителя и энергии.

Суммарное уравнение смешанной нитрогеназно-гидрогеназной реакции выгля-
дит следующим образом:

N2 + 8Н+/8е~+ 16Ь^АТФ + 2Н+ -> 2NHJ + Н2 + 16MgAДФ + 16Ф.

Обязательными условиями для функционирования нитрогеназы являются:

—	образование бинарного комплекса, состоящего из двух чувствительных к кис-
лороду металлопротеинов;

—	отсутствие кислорода или предотвращение его контакта с нитрогеназой;

—	поступление молекулярного азота;

—	использование сильного восстановителя (-400 мВ);

—	использование АТФ в форме магниевой соли (MgАТФ).

Биосинтез нитрогеназы, а также снабжение ее восстановителем и энергией требу-
ют значительных метаболических затрат, которые оправданны только в отсутствии
связанного азота и при условии, что этот чувствительный к кислороду фермент не
требует слишком интенсивного обновления. Поэтому неудивительно, что экспрессия
структурных генов находится под жестким регуляторным контролем.

14.2.1. Строение нитрогеназы

Все известные в настоящее время нитрогеназы представляют собой коричневые
растворимые бинарные металлопротеины.

Первый компонент нитрогеназы называется «динитрогеназой» (англ, dinitroge-
nase). Именно он содержит активный центр, восстанавливающий субстрат(ы). Вто-
рой компонент нитрогеназы называется «редуктазой динитрогеназы» (англ, dini-
trogenase reductase). Его функция — снабжать динитрогеназу низкопотенциальными
электронами.

В природе существуют, по меньшей мере, три нитрогеназы (одна основная и
две «альтернативные»). Все они кодируются гомологичными структурными генами,
однако различаются по ферментативным свойствам.

Нитрогеназа-1, или «молибденовая» нитрогеназа. Эта нитрогеназа имеет-
ся у подавляющего большинства диазотрофов. Лучше всего она охарактеризована
на примере энтеробактерии Klebsiella pneumoniae (рис. 153).

Редуктаза динитрогеназы, она же «железопротеин» или «Fe-белок» (англ. Fe-
protein), представляет собой гомодимер, состоящий из двух 7-субъединиц (30 кДа;
ген nifH). Fe-белок содержит один [Ге434]-кластер, который лигандируется четырь-
мя консервативными аминокислотными остатками Cys-9?7i, Cys-9?72, Cys-1327i и
Cys-13272. Этот кластер переносит за один раз по электрону и существует в степенях
окисления +1/+2 (редокс-потенциал пары -350 мВ).
Fe-белок

lx

Cys97y2

Cysl32y2 S---Fe

Cysl32Yl S^F\

Cys97yl

[Ре484]-кластер

Cysl54a4 s \

Fe'A \	<

MoFe-белок

2x

Cys95₽4s S—Cys88a

Р-кластер

2X

, \\ re

/ FaQ

* ~-Z '	&

Cysl53₽ / S
О

Serl880Z

F\
Cys70₽

8e

"O2CCH2CH;

CH2CO2"

C-o ,S-Fe

SsFe-S

MoFe-кластер

zC
О

Mo-S Fe-S-Fe S Fe-Cys275(X

His442(X

S-Fe4SZFe-S

N2 + 8H+

2NH3 + H2

Puc. 153. Железо-серные кластеры, входящие в состав нитрогеназы, и редокс-
превращения с их участием (по: Dean et al., 1993).

Греческие буквы указывают на принадлежность аминокислотных остатков к субъ-
единицам Fe-белка или MoFe-белка, арабские цифры — положение в полипептидной цепи.

Динитрогеназа в данном случае обозначается как «молибден-железопротеин»,
или «MoFe-белок» (англ. MoFe-protein). MoFe-белок представляет собой гетеротет-
рамер, состоящий из двух а-субъединиц (60 кДа; ген nifD) и двух /3-субъединиц (60
кДа; ген nifK). Он содержит два [FesSsJ-^acTepa (или P-кластера; от англ, paired —
двойной) и два гетерометаллических [FeyMoSgJ-KnacTepa. P-кластер лигандируется
шестью консервативными аминокислотными остатками Cys-62ai, Cys-88a, Cys-154a,
Cys-70/3, Cys-95/3 и Cys-153/3, а также консервативным аминокислотным остатком
Ser-188/3. MoFe-кластер содержит органический компонент в виде аминокислотного
остатка гомоцитрата (2-оксо-1,2,4-трикарбоксибутановой кислоты) и лигандируется
двумя консервативными аминокислотными остатками Cys-275a и His-442a:. MoFe-
кластер переносит за один раз по электрону и существует в степенях окисления
+2/+3 (редокс-потенциал от -320 до -430 мВ).

Молибденовые нитрогеназы высококонсервативны. В модельном опыте можно
реконструировать активный голокомплекс, комбинируя динитрогеназу и редуктазу
динитрогеназы, выделенные из совершенно разных объектов.

Нитрогеназа-2, или «ванадиевая» нитрогеназа. При делеции структурных
генов nifHDK и/или в отсутствии в среде молибдена некоторые диазотрофные бак-
терии, например Azotobacter vinelandii, A. chroococcum, Anabaena sp. ATCC 29413 и
C. pasteurianum, а также археот Methanosarcina barkeri экспрессируют альтернатив-
ную нитрогеназу-2, или «ванадиевую» нитрогеназу.

В данном случае динитрогеназа-2, или «VFe-белок» представляет собой гетеро-
гексамер из двух о-субъединиц (60 кДа; ген vnfD] от англ, vanadium nitrogen fixa-
tion), двух Дсубъединиц (60 кДа; ген vnfK) и двух дополнительных 5-субъединиц
(13 кДа; ген vnfG). Динитрогеназа-2, по-видимому, содержит два двойных [FegSg]-
кластера и один гетерометаллический [FeyVSgJ-^acTep. Редуктаза динитрогеназы-
2, или димерный Fe-белок (30 кДа; ген vnfH) содержит один [ГедЗ^-кластер.

Нитрогеназа-3, или «железная» нитрогеназа. При делеции структурных
генов nifHDK и/или при одновременном отсутствии в среде молибдена и ванадия
A. vinelandii, а также пурпурная бактерия Rhodobacter capsulatus экспрессируют
альтернативную нитрогеназу-3, или «железную» нитрогеназу. В данном случае ди-
нитрогеназа состоит из двух о-субъединиц (60 кДа; ген anfD-, от англ, alternative
nitrogen fixation), двух /3-субъединиц (60 кДа; ген anfK) и двух дополнительных 5-
субъединиц (15 кДа; ген anfG). Динитрогеназа-3, скорее всего, содержит три двой-
ных [ГезЗвркластера. Редуктаза динитрогеназы-3, или димерный Fe-белок (30 кДа;
ген anfH) содержит один [Ре434]-кластер.

Генетика диазотрофии. Наиболее изученным в генетическом отношении диазотрофом яв-
ляется бактерия К. pneumoniae. В ее хромосоме имеется участок размером 23 т.п.н., представля-
ющий собой пг/-регулон (от англ, nitrogen fixation), т. е. кластер из двадцати генов диазотрофии,
объединенных в семь оперонов. Помимо структурных генов нитрогеназы (nifHDK), сюда отно-
сятся:

—	гены, отвечающие за активацию Fe-белка (nifM), за биосинтез [FeyMoSgj-KnacTepa
(nifQVBENH) и за поступление низкопотенциальных электронов (nifJF);

—	гены, кодирующие фактор созревания Fe-белка (т/М);

—	позитивный регулятор (nifA)-,

—	негативный регулятор (m/L);

—	несколько открытых рамок считывания (nifT, nifY, nifU, nifS и nifZ).

Аналогичным образом организованы пг/-регулоны у A. vinelandii и A. chroococcum.

Нитрогеназный кластер в хромосоме цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120 имеет следую-
щую структуру: nifB-fdxN-nifS-nifU-nifH-nifD-nifK-nifE-nifN-nifX-ORF3-nifW-ORFl-ORF2-fdxH
(гены fdxH и fdxN кодируют два ферредоксина, первый из которых передает электроны нитрогена-
зе). Все эти гены объединены, как минимум, в четыре оперона— nifВ-fdxN-nifSU, nifHDK, ORF1-
OR.F2 и fdxH.

Как уже указывалось, гены субъединиц нитрогеназы и гены биосинтеза металлокластеров нит-
рогеназы высококонсервативны, причем некоторые из них — это гены-паралоги, возникшие в ре-
зультате дупликации с последующей позиционной реорганизацией. Их эволюционное происхожде-
ние неизвестно, хотя ген nifU (iscU), ответственный за биосинтез железосерных кластеров, явно
принадлежит к числу предковых.
14.2.2.	Субстраты и механизм действия нитрогеназы

Нитрогеназа способна одновременно восстанавливать три «физиологических»
субстрата.

Важнейший из них —это молекулярный азот (Иг)- В итоге его восстановления
образуется две молекулы аммиака NH3. Они спонтанно протонируются, превраща-
ясь в два катиона аммония NH^ (N2 + 6Н+/6е_ —> 2NH3; 2NH3 + 2Н+ —> 2NH4 ).

Второй физиологический субстрат нитрогеназы — это протоны (Н+). В резуль-
тате их восстановления образуется молекулярный водород (2Н+ + 2е-	Н2). Вос-

становление протонов всегда идет бок о бок с восстановлением молекулярного азота
и происходит даже при давлении последнего >5-103 кПа (50 атм). Это физиологи-
чески непродуктивный процесс, и лишь благодаря тому, что образующийся водород
окисляется с помощью 1ф£аА;е-гидрогеназы (см. раздел 11.4.4.4), диазотрофным бак-
териям удается частично восполнить потерю энергии и восстановителя.

Минорный физиологический субстрат нитрогеназы — это молекулярный водород
(Н2). В активном центре нитрогеназы он расщепляется на два атома водорода, после
чего каждый из них восстанавливается до молекулы водорода (Н2 —> 2Н; 2Н +
2Н+/2е_	2Н2). При экспериментальном использовании тяжелого дейтерия (D)

вместо легкого протия (Н) продуктом такой обменно-восстановительной реакции
становится «гибридный» водород (D2 —> 2D; 2D + 2Н+/2е“ —» 2HD).

В качестве «нефизиологических» субстратов нитрогеназы используется ряд низ-
комолекулярных соединений, содержащих двойную или тройную связь между ато-
мами азота и/или углерода. Это азид N3 , ацетилен С2Н2, диазирин СН2 <(N=N),
метилизоцианид СН3—CN, оксид азота N2O, цианамид H2N-CN, цианид CN-,
циклопропен СН2 <(СН=СН) и этилен С2Н4 (последний только в случае Мо-неза-
висимых нитрогеназ).

В методическом плане наибольший интерес представляет восстановление ацети-
лена в этилен и этилена в этан, содержание которых можно с высокой точностью
измерить на газовом хроматографе.

Когда Мо-нитрогеназа использует молекулярный азот и/или побочные субстра-
ты, она последовательно катализирует три окислительно-восстановительные реак-
ции:

—	одноэлектронное восстановление Fe-белка низкопотенциальными редокс-бел-
ками ферредоксином или флаводоксином (in vivo) или дитионитом (in vitro);

—	перенос электрона от Fe-белка к MoFe-белку, сопряженный с гидролизом двух
молекул MgATO;

—	восстановление субстратов, связанных с MoFe-белком.

При действии Мо-нитрогеназы в оптимальных условиях на образование из моле-
кулы N2 двух молекул NH3 расходуются шесть «низкопотенциальных» электронов и
16 молекул MgАТФ, причем побочным продуктом обязательно становится молекула
водорода.

Модель функционирования Мо-нитрогеназы, наиболее аргументированная тео-
ретически и лучше всего объясняющая эмпирические данные, была разработана в
первой половине 1980-х годов. В ее основе лежат два взаимосвязанных цикла редокс-
превращений— «Fe-цикл» и «MoFe-цикл».

Fe-цикл (рис. 154). Он обеспечивает перенос одного электрона от восстанов-
ленного Fe-белка к MoFe-белку.
На первом этапе (рис. 154,1) восстановленный комплекс Ее-белок(1У^АТФ)2 свя-
зывается с MoFe-белком. Ассоциация двух компонентов нитрогеназы является от-
носительно медленным процессом и занимает ~0,15 с.

На втором этапе (рис. 154, 3) происходит гидролиз двух молекул MgATO, и сра-
зу после этого — перенос одного электрона на MoFe-белок, причем при комнатной
температуре данные процессы необратимы.

(М§АТФ)2 связывается с консервативным мотивом G-X-G-X-X-G-K-S в молекуле Fe-бел-
ка. За счет энергии, освобождающейся при гидролизе терминальной фосфоангидридной связи в
двух молекулах АТФ, апопротеин изменяет свою конформацию. Благодаря этому редокс-потен-
циал [Fe4S4]-кластера понижается до -450 мВ, т. е. Fe-белок приобретает более сильные восстано-
вительные свойства. Это очень существенный момент. Он объясняет, почему для биологического
восстановления молекулярного азота необходима энергия (ведь, как известно, «химическая» реак-
ция N2 + ЗН2 —* 2NH3 экзергонична).

1

Fe-бел OK(MgATO)2 + MoFe-белок 4	k Ре-белок(К^АТФ)2МоРе-белок

П0Х + 21^АДФ

Dred + 2МёАТФ

3	т

Ре-белокох(^^АДФ)2 + MoFe-6enoKred + 2Ф <=► Fe-бeлoкox(MgAДФ + Ф)2МоРе-белокге(1

Рис. 154- «Fe-цикл», или редокс-цикл редуктазы динитрогеназы (по: Thorneley,
Lowe, 1985).

D — донор электрона.

Третий этап (рис. 154, <?) является лимитирующим по скорости. Он связан с обра-
тимой диссоциацией Ре-белка(А^АДФ)2(2Ф) из комплекса с восстановленным MoFe-
белком.

На завершающем четвертом этапе (рис. 154, 4) происходит восстановление Fe-
бе лка(К^АДФ)2, после чего две молекулы ]\^АДФ освобождаются, а их место за-
нимают две молекулы ]^АТФ. Предполагается, что данная схема справедлива и по
отношению к V-нитрогеназе.

MoFe-цикл (рис. 155). Он состоит из восьми последовательных восстанови-
тельных стадий. Каждая из них сопряжена с отдельным Fe-циклом, который вы-
полняет роль донора электронов.

Двойные [FegSsJ-кластеры, или P-кластеры, видимо, не участвуют в связыва-
нии и восстановлении молекулы N2, а только передают электроны реакционным
центрам — гетерометаллическим [РеуМоЗд^кластерам. Связи Fe-H, временно обра-
зующиеся в [Ре7МоЗд]-кластерах, накапливают восстановительные эквиваленты, в
то время как молибден служит участком связывания и активации молекулярного
азота.

Молекула N2 поочередно присоединяет к себе три пары Н+/е“. В конечном сче-
те, высвобождаются две молекулы NH3. Наиболее вероятным интермедиатом этого
------------e4=n-nh2

pH 0 или pH 14

e7-nh2

e"/H+

E6=NH

NH3

e5=n-nh3+

Puc. 155. «MoFe-цикл», или цикл восстановления молекулы N2 с помощью динитро-
геназы (по: Thorneley, Lowe, 1985).

Ei—Е7 — промежуточные состояния динитрогеназы.

восстановительного процесса служит связанный гидрид азота (=N-NH2), из кото-
рого под воздействием кислот или щелочей образуется гидразин NH2—NH2.

Тот факт, что существуют три разные нитрогеназы, использующие соответствен-
но Fe/Mo, Fe/V или только Fe, наводит на мысль, что во всех случаях ядром актив-
ного центра является именно железо.

14.2.3.	Регуляция нитрогеназы

Нитрогеназа служит мишенью для разнообразных регуляторных воздействий.
Некоторые из них носят общий характер (например, при «железном стрессе»), дру-
гие специфичны (например, при молибденовом голодании). Наибольшее значение
имеет негативная регуляция нитрогеназы связанным азотом, а также кислородом.

Негативная регуляция нитрогеназы связанным азотом. Все диазотро-
фы по соображениям метаболической экономии предпочитают молекулярному азоту
связанный азот, входящий в состав минеральных ионов или органических молекул,
например аминокислот.

Биосинтез нитрогеназы начинает репрессироваться, когда содержание связанно-
го азота в окружающей среде превышает специфичную для данного объекта мини-
мальную величину (в случае аммония или нитрата пороговая концентрация состав-
ляет ~5 мМ). Кроме того, биосинтез нитрогеназы регулируется эндогенным аммо-
нием. Это осуществляется на транскрипционном уровне через посредство ключевой
системы ассимиляции аммония GS-GOGAT (см. ниже).

Активность уже имеющейся нитрогеназы регулируется аммонием за счет пост-
транскрипционной модификации структуры а-субъединиц, из которых состоит ре-
дуктаза динитрогеназы.
Негативная регуляция кислородом. Мощным негативным регулятором нит-
рогеназы является молекулярный кислород. Еще в начале 1930-х годов на примере
свободноживущих диазотрофов из рода Azotobacter было показано, что количество
ассимилированного молекулярного азота возрастает на порядок при двадцатикрат-
ном уменьшении парциального давления кислорода (от 20 до 1 кПа, соответственно
от 2-Ю-1 до 10-2 атм).

В начале 1970-х годов выяснилось, что факультативные анаэробы (например,
Bacillus polymyxa и Klebsiella pneumoniae) или микроаэрофилы (например, Mycobac-
terium flavum) образуют нитрогеназу только в анаэробных или микроаэробных усло-
виях, т.е. без кислорода или при его низком парциальном давлении. В аэробной среде
эти бактерии могут расти только на среде, содержащей связанный азот.

14.2.4.	Защита нитрогеназы

Причина негативного воздействия кислорода заключается в том, что он:

—	репрессирует биосинтез апопротеинов нитрогеназы (гены nifHDK), взаимодей-
ствуя с регуляторным опероном nifAD,

—	разрушает нитрогеназу за счет индуцированного протеолиза ее апопротеинов,
а также путем окисления ее простетических групп, железо-серных кластеров.

Первые опыты с бесклеточными препаратами диазотрофов, проведенные в начале 1960-х го-
дов, указывали на восстановительный характер процесса, а также на то, что отвечающие за него
ферментные системы крайне чувствительны к кислороду. Прямые доказательства этого были по-
лучены в середине 1960-х годов в опытах с очищенной нитрогеназой, которая инактивировалась
в аэробных условиях независимо от того, был ли ее источником облигатный анаэроб (например,
Clostridium pasteurianum) или облигатный аэроб (например, Azotobacter vinelandii).

Нитрогеназа чувствительна к кислороду независимо от типа метаболизма у конкретного ди-
азотрофа. Например, и аноксигенные, и оксигенные фототрофы эффективнее ассимилируют N2
при низкой концентрации экзогенного кислорода (для последних дополнительную проблему пред-
ставляет эндогенный кислород).

Кислород необратимо инактивирует оба компонента нитрогеназы. Особенно чув-
ствительна к нему редуктаза динитрогеназы, которая наполовину инактивируется
на воздухе за 0,5-2 мин; у более устойчивой динитрогеназы это происходит за 5-10
мин.

Окислительное и дестабилизирующее действие на нитрогеназу оказывает не
«обычный» кислород, а его активные формы, участвующие в окислительном стрессе
(англ, reactive oxygen species, ROS; см. Ill том учебника). К ним относятся синглет-
ный кислород гО2*, супероксидный анион-радикал О2 •, пероксид водорода Н2О2 и
гидроксильный радикал ОН-. При их взаимодействии с апопротеинами нитрогена-
зы образуются сшивки Cys-Cys и Туг-Туг, а отдельные аминокислотные остатки
превращаются в карбонильные производные. Мишенью супероксидного анион-ра-
дикала являются [Ееп8п]-кластеры и MoFe-кластеры.

Таким образом, нитрогеназа и кодирующие ее генные структуры негативно регу-
лируются или повреждаются при контакте с кислородом. Вне его влияния оказыва-
ются только те диазотрофы, которые относятся к облигатным анаэробам и занимают
бескислородные, или аноксичные ниши. Те диазотрофы, которые являются факуль-
тативными анаэробами, микроаэрофилами или аэробами, а также цианобактерии-
биопродуценты кислорода вынуждены использовать механизмы, так или иначе за-
щищающие нитрогеназу от кислорода.
Механизмы защиты нитрогеназы. Как мы уже отмечали, нитрогеназа имеет
консервативную структуру и универсально чувствительна по отношению к кисло-
роду. В то же время механизмы защиты нитрогеназы очень разнообразны, причем
многие диазотрофы обладают не одним, а двумя или несколькими из них.

Контроль диффузии кислорода. Это простейший механизм защиты нитрогеназы. Он направлен
на то, чтобы уменьшить парциальное давление кислорода с помощью барьера на пути его проник-
новения в клетку из окружающей среды. Некоторые свободноживущие диазотрофные бактерии
защищаются от притока кислорода за счет образования толстой капсулы, как Derxia gummosa.
У нитчатых цианобактерий в оболочке гетероцисты имеется практически непроницаемый для кис-
лорода «ламинарный» слой, состоящий из уникальных гликолипидов. Диффузия кислорода в ге-
тероцисту из соседней вегетативной клетки контролируется тем, что они соприкасаются узким
каналом (7-10-2 мкм2), который закрыт цианофициновой «пробкой».

Физиологическая защита. Под этим названием объединяются разные способы, с помощью ко-
торых клетки уменьшают концентрацию кислорода и/или ROS.

Первичная защита основана на удалении ROS, которые образуются фотосинтетическими и
дыхательными системами при одноэлектронном восстановлении кислорода в прямой зависимости
от его внутриклеточного парциального давления (см. III том учебника). К числу антиоксидантных
ферментов относятся:

—	супероксиддисмутаза (реакция 20^- + 2Н+ —> Н2О2 + О2);

—	каталаза (реакция 2Н2О2 —> 2НгО + О2);

—	пероксидаза (реакция Н2О2 + DH2 —* 2Н2О + D),
где D — донор электронов.

Далее следует так называемая «дыхательная» защита. В частности, Azotobacter sp. отвеча-
ет на увеличение парциального давления кислорода усилением аэробного дыхания, что позволяет
одновременно решить две задачи — связать кислород и ассимилировать больше энергии, необхо-
димой для восстановления азота. Другой пример использования дыхательной защиты связан с
гетероцистой, для которой характерна высокая скорость эндогенного дыхания.

Наконец, у всех аэробных диазотрофов имеется uptafce-гидрогеназа. Этот фермент катализи-
рует окисление водорода (реакция Нг —» 2Н+ + 2е~; см. раздел 11.4.4.4). Полученные электроны
поступают в дыхательную цепь и восстанавливают кислород в соответствии с уравнением реак-
ции гремучего газа 2Нг + Ог —> 2НгО. Скорость этой реакции не уступает скорости эндогенного
дыхания за счет органических субстратов. С помощью upfafce-гидрогеназы аэробные диазотрофы
разом решают три задачи: (1) связывают кислород, т.е. используют дыхательную защиту; (2) ком-
пенсируют потерю восстановителя и энергии, которая вызвана «паразитическим» восстановлением
Н+ до Нг под действием нитрогеназы (см. раздел 14.2.2); (3) удаляют водород, который способен
ингибировать нитрогеназу.

Конформационная защита. В условиях кислородного стресса у некоторых диазотрофов, на-
пример Azotobacter sp., дыхательная защита иногда становится неэффективной, и нитрогеназа
инактивируется. Однако после удаления кислорода не требуется синтез этого фермента de novo.
В данном случае происходит только временная инактивация. Это связано с обратимым изменени-
ем конформации нитрогеназы, находящейся в комплексе с защитным ЕегЗг-ферредоксином, или
«железо-серным белком-П Шетна» (назван по имени немецкого биохимика R.Shehtna, который
впервые выделил его в 1968 г. из Л. vinelandii). С помощью защитного белка-П Шетна редуктаза
динитрогеназы переходит в окисленную форму, после чего образуется устойчивый к кислороду
окисленный комплекс. При восстановлении комплекса он диссоциирует на нативную нитрогеназу
и белок-П Шетна, и тогда нитрогеназная активность возобновляется.

Временная (темпоральная) защита. Она имеется у диазотрофных цианобактерий, которые
осуществляют два антагонистичных процесса — диазотрофию и биосинтез кислорода при оксиген-
ной фототрофии. Для выхода из, казалось бы, тупиковой ситуации эти процессы необходимо «раз-
вести» в пространстве или во времени.

По пути компартментализационной защиты пошли нитчатые цианобактерии, образующие ге-
тероцисты (в этих дифференцированных клетках ФСП не функционирует или вообще отсутствует,
в результате чего они не образуют кислород).

По пути темпоральной защиты пошли одноклеточные цианобактерии, а также нитчатые ци-
анобактерии, не способные дифференцировать гетероцисты. Они осуществляют темпоральную за-
щиту одним из двух способов. В первом случае (у одноклеточных штаммов, например Synechococcus
sp.) пик образования кислорода при оксигенной фототрофии приурочен к началу, а пик диазо-
трофии — к концу клеточного цикла. Во втором случае (у одноклеточных, а также у нитчатых
штаммов, например Plectonema sp.) диазотрофия происходит в темноте в отсутствии фототрофии;
источником восстановителя и энергии служат запасные полисахариды, накопленные в предшеству-
ющий световой период.

В наиболее сложном положении оказались те цианобактерии, которым приходит-
ся защищать нитрогеназу и от атмосферного, и от эндогенного кислорода. Поэтому
они используют сразу несколько систем защиты нитрогеназы.

Помимо перечисленных механизмов защиты нитрогеназы можно назвать еще
один, которым обладают нитчатые, не образующие гетероцист штаммы цианобак-
терий (например, Plectonema sp.). Он также относится к физиологической защите
и заключается в том, что клетки начинают использовать другой тип биоэнерге-
тики. Чтобы не выделять кислород на свету, они либо переходят от оксигенной
фототрофии на фототрофию аноксигенного типа (или на фотогетеротрофию), ли-
бо от фототрофии на хемогетеротрофию аэробного дыхательного или бродильного
типа.

14.2.5. Ассимиляция аммония

Из двух минеральных ионов, аммония и нитрата, первый является предпочти-
тельным. Именно в этой степени восстановленности (-3) азот входит в состав боль-
шинства биомолекул. Чтобы превратить анион нитрата (азот в степени восстанов-
ленности +5) в аммоний, требуются восемь электронов.

Представители всех трех филогенетических доменов используют для ассимиля-
ции эндогенного или экзогенного аммония две ферментные системы — глутаминсин-
тетазную/глутаматсинтазную (GS-GOGAT) и глутаматдегидрогеназную (GDH).

Первая из них обладает высоким, а вторая — низким сродством к катиону
NH4 . Некоторые микроорганизмы, в частности пурпурная бактерия Rhodo spirillum
rubrum, содержат обе эти системы, другие только одну. Облигатно симбиотические
бактерии (например, Borrelia burgdorferi, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma geni-
talium, Rickettsia prowazekii и Ureaplasma urealyticum) лишены обеих систем и полу-
чают готовые продукты ассимиляции аммония от своих хозяев.

Ферменты, участвующие в системах GS-GOGAT и GDH, высококонсервативны.
Одинаковые молекулярные формы встречаются у филогенетически удаленных объ-
ектов, и поэтому высока вероятность «горизонтального» переноса соответствующих
генов.

Помимо GS-GOGAT и GDH, в ассимиляции аммония могут участвовать и дру-
гие ферментные системы, в частности аланиндегидрогеназная (восстановительное
аминирование пирувата в аланин) и фумаразная (прямое аминирование фумарата в
аспартат). Они слабо изучены и, скорее всего, выполняют в ассимиляции аммония
минорную роль.

Глутаминсинтетаза/глутаматсинтаза (GS-GOGAT). Эта двухкомпонент-
ная система широко распространена и у прокариотов, и у ядерных организмов.

Глутаминсинтетаза (англ, glutamine synthetase, GS) играет центральную роль
в ассимиляции аммония. Она переносит катион NH4 на глутамат с образованием
глутамина:

L-глутамат + NH^ + АТФ —> L-глутамин + АДФ + Ф + Н2О.
У прокариотов этот фермент имеет молекулярную массу ~600 кДа и состоит из
двенадцати идентичных субъединиц. Они попарно образуют шесть активных цен-
тров и каждый из них лигандирует два катиона Мп2+. Ядерные организмы, в част-
ности высшие растения, содержат две разные глутаминсинтетазы, обе молекуляр-
ной массой ~400 кДа. Хлоропластный фермент кодируется единственным геном и
состоит из восьми идентичных субъединиц, а цитозольный — 4-6 генами и может
экспрессироваться в форме гомооктамера или гетерооктамера.

Глутамин:а-кетоглутарат-аминотрансфераза (англ. glutamine:2-oxoglutarate ami-
notransferase, GOG АТ) переносит аминогруппу от глутамина на а-кетоглутаровую
кислоту с образованием двух молекул глутамата. В ходе этой реакции расходуют-
ся восстановительные эквиваленты донора DH2, в роли которого могут выступать
НАДН, НАДФН или Fdred:

L-глутамин + а-кетоглутарат + DH2 —> 2 х L-глутамат + D.

У прокариотов этот фермент обычно представляет собой мономер молекулярной
массой 150-250 кДа. Простетические группы у него отсутствуют, либо в качестве
них используются ФАД, ФМН или Гез84-кластер. У растений имеются две изофер-
ментные формы GOGAT, которые локализуются в пластидах разных тканей и в
качестве восстановителя используют НАД(Ф)Н или Fdred-

Таким образом глутаминсинтетаза/глутаматсинтаза (GS-GOGAT) действует
циклически в соответствии с суммарным уравнением:

NH^ + а-кетоглутарат + DH2 + АТФ L-глутамат + D + АДФ + Ф + Н2О.

У трихомных цианобактерий при низком содержании связанного азота в окружающей среде
образуются гетероцисты, или терминально дифференцированные клетки, в которых синтезируется
нитрогеназа и создаются оптимальные условия для ее функционирования.

В данном случае компоненты цикла GS-GOGAT компартментализованы в клетках двух типов.
Глутаминсинтетаза сосредоточена в гетероцистах, а глутаматсинтаза — в соседствующих с ними
вегетативных клетках. Физиологический смысл данного явления заключается в том, что гетероци-
сты являются гетеротрофными клетками. Поэтому они должны импортировать акцептор аммония
(глутамат) из автотрофных вегетативных клеток. Последние, в свою очередь, образуют кислород,
что не позволяет им синтезировать нитрогеназу и исключает возможность ее функционирования.
Поэтому они импортируют из гетероцист связанный азот (в форме глутамина).

Такая же компартментализация наблюдается у актинобактерий рода Frankia, которые образу-
ют «везикулы» — функциональные аналоги гетероцист.

Глутаматдегидрогеназа (GDH). Эта однокомпонентная система обнаруже-
на и у прокариотов, и у ядерных организмов. Хотя она менее распространена, чем
система GS-GOGAT, до открытия последней ее считали ключевым ферментом ас-
симиляции аммония.

Глутаматдегидрогеназа (англ, glutamate dehydrogenase, GDH) катализирует об-
ратимую реакцию восстановительного аминирования си-кетоглутарата или окисли-
тельного дезаминирования глутамата:

а-кетоглутарат + NH4 + НАД(Ф)Н <-> L-глутамат + НАД(Ф) + Н2О.

GDH преимущественно катализирует реакцию дезаминирования и снабжает
цикл Кребса а-кетоглутаратом. Тем не менее, у многих бактерий скорость восста-
новительной реакции выше, чем окислительной. В частности, у одноклеточной ци-
анобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 активность «аминирующей» GDH не уступа-
ет активности GS, а у экстремально термофильного археота Thermococcus profundus
содержание этого фермента достигает ~10% суммарного клеточного белка.

У прокариотов GDH представляет собой тетрамер или гексамер молекулярной
массой 200-300 кДа, лишенный простетических групп. Реже это негеминовый метал-
лопротеин. Стимулирующий эффект на него оказывают катионы Са2+. У растений
этот фермент содержится в митохондриях, пластидах или цитозоле.
ГЛАВА 15

КЛЮЧЕВЫЕ БИОСИНТЕЗЫ

Синтез органического вещества является одним из
основных звеньев в той цепи физико-химических про-
цессов, из которых слагается круговорот органического
вещества на земле.

В. Н. Любименко. Материя и растение
(Ленинград, 1924)

Следует уточнить, что подразумевается под «ключевыми» биосинтезами, и о
каких мы расскажем в этой главе.

В первую очередь, это биосинтез генеральных метаболитов. Напомним, что тер-
мин «генеральные метаболиты» обозначает интермедиаты магистральных метабо-
лических путей, а также универсальные моноблоки, из которых образуются главней-
шие биомолекулы (см. раздел 9.2). Среди них первенствуют нуклеотиды, аминокис-
лоты, моносахара (глюкоза и рибоза) и органические кислоты (пируват и ацетил-
Со А). Однако мы не станем рассматривать пути биосинтеза нуклеотидов и ами-
нокислот, поскольку они стандартны для всех живых организмов, и их описание
можно найти в любом учебнике по биохимии, а также справочниках, снабженных
«метаболическими картами». Что касается разнообразных, а порой уникальных пу-
тей образования пирувата и ацетил-СоА у прокариотов, то мы уже останавливались
на этом вопросе (глава 11).

В число ключевых биосинтезов входит также биосинтез биополимеров — белков,
нуклеиновых кислот и полигликозидов из соответствующих генеральных метаболи-
тов — аминокислот, нуклеотидов и моносахаров. Механизм трансляции изложен в
разделе, посвященном прокариотным рибосомам (см. I том учебника), репликацию
и транскрипцию мы обсудим в III томе. Наконец, основные сведения о биосинтезе
полигликозидов приведены в I томе учебника, где речь шла о полимерах клеточной
стенки, чехла и капсулы, а также о метаболизме запасных углеводов.

Мы специально остановимся на трех классах биомолекул, которые играют клю-
чевую роль в функциональной организации живой клетки. Это мембранные глице-
ролипиды, полиизопреноиды и тетрапирролы. Сведения о биосинтезе, разнообразии
и функциях этих биомолекул были впервые получены и пополняются главным об-
разом благодаря использованию бактерий в качестве экспериментальных моделей.
Среди этих биомолекул много таких, которые не встречаются у эукариотных орга-
низмов или были приобретены ими в качестве компонента прокариотных эндосим-
бионтов. На биосинтезе этих ключевых биомолекул мы остановимся еще и потому,
что данная тема, как правило, игнорируется в учебной литературе или освещается
в самых общих чертах на основе устаревших сведений.

Во II томе учебника рассматриваются углеродная и азотная автотрофия, а также ключевые
биосинтезы, однако отсутствует специальная глава, посвященная обновлению надмолекулярных
структур и катаболизму экзогенных субстратов и запасных веществ.

Причина в том, что данные вопросы обсуждаются в связи с разными аспектами цитологии
прокариотов (см. I том учебника) и клеточного питания (глава 11). Тем не менее, мы еще уде-
лим внимание процессам катаболизма в III томе учебника, когда будем говорить про онтогенез и
экологию прокариотов.

Начнем с глицеролипидов. Это они формируют гидрофобное ядро мембранных
структур, отвечающих за важнейшие «операционные» функции прокариотной клет-
ки, в частности за ее энергетический метаболизм.

15.1. БИОСИНТЕЗ ГЛИЦЕРОЛИПИДОВ

Еще раз напомним о принципиальных различиях между глицеролипидами архей,
с одной стороны, и глицеролипидами бактерий и эукариотов, с другой стороны (см.
I том учебника).

Археи обладают тремя уникальными особенностями структуры мембранных гли-
церо липидов:

—	гидрофобные хвосты представляют собой не терминально разветвленные или
неразветвленные жирные кислоты (как в полярных липидах Bacteria и Еисагуа),
а регулярно разветвленные С2о-> С25-, С40- или Сбо-полиизопреноидные спирты, в
которых соседние метильные группы разделены пятью или четырьмя атомами уг-
лерода;

—	глицерол имеет не sn- 1,2-конфигурацию (как в полярных липидах Bacteria и
Eucarya), а $п-2,3-конфигурацию;

—	гидрофобный хвост связан с глицеролом не сложной эфирной (как в большин-
стве полярных липидов у Bacteria и Еисагуа), а простой эфирной связью.

Естественно, что биосинтез уникальных глицеролипидов, имеющихся у архей,
осуществляется иным способом, чем у бактерий.

15.1.1. Биосинтез глицеролипидов у бактерий

Основой двойного липидного слоя бактериальных мембран служат глицероли-
пиды. Роль гидрофобных хвостов в них выполняют жирные кислоты. Важнейшими
глицеролипидами, в частности у Е. coli, являются фосфатидилэтаноламин (70-80%),
фосфатидилглицерол (15-20%) и кардиолипин (5%).

Наряду со своей основной функцией, фосфатидилглицерол используется для био-
синтеза липопротеинов и периплазматических олигосахаридов (см. I том учебника).

Ряд ферментов, участвующих в биосинтезе жирных кислот, служит мишенью
для антибиотиков и химиотерапевтических препаратов (см. ниже). Эти вещества
используются в медицинских целях, в частности для борьбы с туберкулезом.
Биосинтез насыщенных жирных кислот. Большинство живых организ-
мов способно самостоятельно вырабатывать длинноцепочечные жирные кисло-
ты. Для этого они используют ферментный комплекс, состоящий из ацетил-СоА-
карбоксилазы и синтазы жирных кислот. В качестве ключевого продукта образуется
неразветвленная насыщенная пальмитиновая кислота (Cie). Ее производными яв-
ляются другие жирные кислоты, в том числе ненасыщенные, гидроксилсодержащие
и с числом атомов углерода >16.

Магистральный путь биосинтеза жирных кислот был выяснен в конце 1960-х годов на примере
Е. coli прежде всего благодаря пионерским исследованиям Конрада Блоха (К. Bloch, Нобелевская
премия по физиологии и медицине, 1973 г.). Он осуществляется с помощью двух ферментных
систем — ацетил-Со А-карбокси л азной и синтазной.

Ацетил-СоА-карбоксилаза. На исходном этапе ацетил-СоА-карбоксилаза (англ. acetyl-CoA
carboxylase, ACC) осуществляет АТФ-зависимое карбоксилирование затравки-праймера — ацетил-
СоА. В результате этого образуется удлинитель цепи — малонил-СоА:

CH3-CO~SCoA + НСО7 + АТФ -OOC-CH2-CO~SCoA + АДФ + Ф.

У Е. coli АСС состоит из четырех типов субъединиц:

—	белкового переносчика АссВ молекулярной массой 17 кДа, ковалентно связывающего
карбоксибиотин (см. рис. 82);

—	биотинкарбоксилазы АссС (субъединицы 33 и 49 кДа), карбоксилирующей биотин;

—	карбоксилтрансферазы AccAD молекулярной массой 35 кДа, переносящей карбоксильную
группу от карбоксибиотина на ацетил-СоА.

Синтаза жирных кислот. После образования малонил-СоА в дело вступает синтаза жирных
кислот (англ, fatty acid synthase, FAS). Она проводит несколько раундов «конденсации», т. е. над-
страивает алифатическую цепь, начиная с затравки-праймера (ацетил-СоА), за счет очередного
С2-блока. Каждый раз в качестве удлинителя цепи выступает малонил-АСР. Затем происходит
восстановление кетогруппы, дегидратация и восстановление двойной связи. Синтаза FAS бывает
двух типов — FASI и FASII.

Синтаза FASI имеется у всех эукариотов, а также у некоторых бактерий. Она представляет
собой один или два (у грибов и Corynebacterium ammoniagenes) мультифункциональных белка,
содержащих несколько активных центров.

Синтаза FASII имеется у большинства бактерий. Это растворимый мультиэнзимный комплекс,
компоненты которого содержат по одному активному центру и сгруппированы вокруг ацилперено-
сящего белка АСР (8,5 кДа). Интермедиаты пути биосинтеза жирных кислот образуют тиоэфирную
связь с простетической группой АСР — 4'-фосфопантотеновой кислотой (см. рис. 93). Последняя
присоединена к аминокислотному остатку Ser-36 и передается на апопротеин от коэнзима А при
помощи АСР-синтазы.

Сначала ацетил-СоА:АСР-трансацилаза (32 кДа) переносит ацетильную группу от ацетил-СоА
на АСР:

СНз- CO~SCoA + ACP-SH — CH3-CO~SACP + CoASH.

Аналогичным образом, малонил-СоА:АСР-трансацилаза передает малонильную группу на
АСР:

-OOC-CH2-CO~SCoA + ACP-SH -OOC-CH2-CO~SACP + CoASH.

Затем при помощи /3-кетоацил-АСР-синтазы III (33 кДа) из ацетил-АСР и малонил-АСР обра-
зуется ацетоацетил-АСР. В качестве «платы» за образование четырехуглеродного скелета из акти-
вированного двухуглеродного акцептора (ацетила) и активированного трехуглеродного ацильного
остатка (малонила) выделяется молекула диоксида углерода:

СН3-CO~SACP + -OOC-CH2-CO~SACP	СН3—СО-СН2—CO~SACP + ACP-SH + CO2.

После этого /3-кетоацил-АСР-редуктаза (26 кДа) превращает ацетоацетил-АСР в /3-окси-
бутирил-АСР:
CH3-CO-CH2-CO~SACP + НАДФН -> CH3-CHOH-CH2-CO~SACP + НАДФ.

В свою очередь, из /3-оксибутирил-АСР при помощи дегидратазы (17 кДа) образуется trans-
кротонил-АСР:

CH3-CHOH-CH2-CO~SACP -> CH3-CH=CH-CO~SACP + Н2О.

После этого эноил-АСР-редуктаза (28 кДа), чувствительная к химиотерапевтическим препара-
там диазоборину, триклозану и этионамиду, восстанавливает Zrans-кротонил-АСР в бутирил-АСР:

CH3-CH=CH-CO~SACP + НАДФН — CH3-CH2-CH2-CO~SACP + НАДФ.

На следующем этапе бутирил-АСР взаимодействует с малонил-АСР, в результате чего обра-
зуется бутироацетил-АСР. В качестве «платы» за конденсацию выделяется молекула СО2. Пу-
тем восстановления кетогруппы, дегидратации окси-производного и восстановления двойной связи
бутироацетил-АСР превращается в гексаноил-АСР. На следующем этапе гексаноил-АСР взаимо-
действует с малонил-АСР и т. д. За элонгацию цепи отвечают «конденсирующие» ферменты —
/3-кетоацил-синтазы I, II и III (англ. ketoacyl-ACP synthase, KAS). Они чувствительны к антибио-
тикам церуленину и тиолактомицину, а также к химиотерапевтическому препарату изониазиду.

За семь раундов, на каждом из которых растущая алифатическая цепь взаимодействует с
очередной молекулой малонил-АСР, образуется пальмитиновая кислота (С1б). На этом элонгация
специфически блокируется, и ацил-АСР подвергается деацилированию:

CH3-(CH2)i4-CO~SACP + Н2О -> CH3-(CH2)i4-COOH + ACP-SH.

Итоговое уравнение реакции биосинтеза пальмитиновой кислоты выглядит следующим обра-
зом:

ацетил-СоА + 7 х малонил-СоА + 14НАДФН —>
пальмитиновая кислота + 7СО2 + 14НАДФ + 8C0ASH + 6Н2О.

Длинноцепочечные жирные кислоты с нечетным числом атомов углерода (С15) и (С17), кото-
рые характерны для многих анаэробов, образуются при помощи специфических ацетил-СоА:АСР-
трансацилаз. В качестве праймера здесь используется не ацетил-СоА, а пропионил-СоА.

Некоторые бактерии, например Butyrivibrio sp. S2, не способны синтезировать
длинноцепочечные жирные кислоты. Для роста таких природных ауксотрофов необ-
ходимы готовые жирные кислоты (в свободном виде или в составе глицеролипидов).

Биосинтез ненасыщенных жирных кислот. Среди мононенасыщенных
жирных кислот у бактерий преобладает сгз-вакценовая кислота (Cis) с двойной
связью в положении 11:12.

Двойную связь в молекулу жирной кислоты можно ввести двумя путями.

«Анаэробный» путь. Он характерен для большинства бактерий (не обязательно анаэробных)
и в нем не используется кислород.

Двойная связь вводится в ходе элонгации алифатической цепи на стадии Сщ-продукта. В ре-
зультате дегидратации в положении 2:3 образуется 2,3-£г«7гз-деканоил-АСР:

CH3-(CH2)6-CO-CH2-CO~SACP

CH3-(CH2)6-CHOH-CH2-CO~SACP (/3-окси-деканоил-АСР)
СН3 —(СН2)б—СН=СН—CO~SACP (2,3-£гап5-деканоил-АСР).

Затем двойная связь восстанавливается, и биосинтез продолжается до получения насыщенной
жирной кислоты с цепью той или иной длины.

Однако в том случае, когда нужно получить мононенасыщенную жирную кислоту, /3-окси-
деканоил-АСР превращается с помощью стереоспецифической дегидратазы/изомеразы (19 кДа) в
3,4- cis-деканоил- АСР:
CH3-(CH2)6-CHOH-CH2-CO~SACP (Докси-деканоил-АСР) ->
CH3-(CH2)5-CH=CH-CH2-CO~SACP (3,4-сгз-деканоил-АСР).

Такой продукт не может быть восстановлен при помощи обычных редуктаз. Поэтому эноил-
редуктазная реакция пропускается, двойная связь остается интактной, и процесс элонгации цепи
продолжается, как обычно, путем взаимодействия с новыми молекулами малонил-АСР:

CH3-(CH2)5-CH=CH-CH2-CO~SACP

CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)7-CO~SACP (сгз-пальмитолеил-SACP) ->->
CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)9-CO~SACP (сгз-вакценоил-SACP).

«Аэробный» путь. Он имеется у многих аэробных бактерий, и в нем принимает участие кис-
лород.

В данном случае cis-двойная связь вводится в алифатическую цепь при помощи специфической
мембранной десатуразы. Электроны переносятся от насыщенной жирной кислоты через НАДФН
на молекулярный кислород по короткой мембранной электрон-транспортной цепи, в состав которой
входят флавопротеин и цитохром 5-типа. Общее уравнение реакции: О2 + 4Н+/4е~ -> 2Н2О.
Благодаря этому пути бактерии могут изменять степень насыщенности своих мембранных жирных
кислот, уже находящихся в составе фосфолипида, т. е. пост-биосинтетически.

Бактерии редко образуют полиненасыщенные жирные кислоты, и механизм введения кратных
двойных связей почти не изучен.

Биосинтез разветвленных жирных кислот. У многих бактерий встречают-
ся терминально разветвленные жирные кислоты, обладающие изо-конфигурацией
(R— СН3СН3) или антеизо-конфигурацией (R—СН3С2Н5).

Их биосинтез осуществляется при помощи трансацилаз, которые используют в
качестве праймера не ацетил-СоА, а короткие разветвленные эфиры коэнзима А
(изобутирил-СоА, изовалерил-СоА и /?-метилбутирил-СоА). Эти праймеры, в свою
очередь, образуются путем дезаминирования и окислительного декарбоксилирова-
ния аминокислот (соответственно валина, лейцина и изолейцина).

Магистральный путь биосинтеза фосфолипидов. Бактерии синтезируют
фосфолипиды при помощи интегральных или периферических ферментов, распо-
ложенных в СМ. Поскольку активные центры взаимодействуют с растворимыми
субстратами, биосинтез фосфолипидов происходит на внутренней поверхности СМ.
Для образования двойного липидного слоя необходимо переместить часть вновь син-
тезированных молекул липида в наружный полумембранный листок. Для этого су-
ществуют специальные ферменты — флиппазы (см. I том учебника).

Первым шагом на пути биосинтеза фосфолипидов является превращение sn-глицерола в sn-
глицерол-3-фосфат, которое осуществляется с помощью глицеролкиназы. Альтернативный спо-
соб получения sn-глицерол-З-фосфата — это восстановление диоксиацетон-3-фосфата НАДФН-
зависимой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой (рис. 156).

Затем глицерол-3-фосфат-ацилтрансфераза вводит в положение 1 первый остаток жирной кис-
лоты, полученный от АСР. Другая глицерол-3-фосфат-ацилтрансфераза вводит второй остаток
жирной кислоты в положение 2, в результате чего образуется ключевой интермедиат — фосфати-
дная кислота, которая служит общим предшественником бактериальных фосфолипидов. Обычно
она присутствует в следовых количествах, поскольку соответствующая синтаза быстро превращает
ее в липонуклеотид — ЦДФ-диацилглицерол.

ЦДФ-диацилглицерол дает начало двум ветвям генерального пути, которые приводят к образо-
ванию трех важнейших бактериальных глицеролипидов — цвиттерионного фосфатидилэтанолами-
на, анионного фосфатидилглицерола и анионного дифосфатидилдиглицерола, или кардиолипина
(см. I том учебника).

Для образования фосфатидилэтаноламина требуются тоже две реакции. Вначале ЦДФ-
диацилглицерол с помощью фосфатидилсерин-синтазы превращается в фосфатидилсерин. Вслед
за этим фосфатидилсерин декарбоксилируется в фосфатидилэтаноламин.
г—он

но-

-он

АТФ АДФ

ОН НАДН НАД
но- <<	-

ОР

г- ОН
о =

-ОР

.ул-глицерол

jn-ппщерол-
3-фосфат

диоксиацетон-
3-фосфат

ЦМФ холин

L-OP

1 -ацилгпицерол-3-фосфат

фосфатидная кислота

'-О-ЦДФ

ЦЦФ-Ди ацил глицерол

дл-глицерол-З-фосфат
^ЦМФ

lo-p-ch2- сн-соо

фосфатидилсерин

£с-°^

г°-<

®к>со2

’	^о

Г°-C-R

о- R1

- О - Р - СН2- сн2- NH*

L ОР- сн2- снон - СН2ОР
фосфатидилпгицерол-фосфат

| фосфатидилэтаноламин |

г°-<

/снз

I- о - Р - сн2- сн2- n+£ сн3

| фосфатидилхолин |

СН3

о.

*2

С-О-

г°-<

L-ОР-сн2- снон - сн2он

| фосфатидилглицерол |

фосфатидилглицерол

ппщерол

иОР-СН2- СНОН-СН2-ОР^

| кардиолипин |







Рис. 156. Магистральный путь биосинтеза фосфолипидов у бактерий.

1 — глицеролкиназа; 2 — глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа; 3 и 4 — глицерол-3-фосфат-ацилтрансфе-
разы; 5 — ЦДФ-диацилглицеролсинтаза; 6 — фосфатидилсерин-синтаза; 7 — фосфатидилсерин-декарбок-
силаза; 8 — фосфатидилхолин-синтаза; 9 — фосфатидилглицеролфосфат-синтаза; 10 — фосфатидилглице-
ролфосфат-фосфатаза; 11 —кардиолипинсинтаза.
Для образования фосфатидилглицерола требуются тоже две реакции. Сперва ЦДФ-
диацилглицерол с помощью фосфатидилглицеролфосфат-синтазы превращается в фосфатидил-
глицерол-фосфат. Продукт этой реакции дефосфорилируется с образованием фосфатидилглице-
рола. В свою очередь, кардиолипин синтезируется из двух молекул фосфатидилглицерола с помо-
щью кардиолипинсинтазы. Эта реакция уникальна для бактерий (у эукариотов донором второго
диацилглицерола служит ЦДФ-диацил глицерол).

Фосфатидилхолин, или лецитин, который является важнейшим мембранным фосфолипидом
эукариотов, довольно редко встречается у бактерий (характерными примерами служат симбионты
растений, относящиеся к родам Agrobacterium и Rhizobium). Он образуется за один этап из ЦДФ-
диацилглицерола и холина с помощью фосфатидилхолин-синтазы (рис. 156).

В условиях фосфатного стресса, наступающего при фосфорном голодании, мем-
бранные фосфолипиды замещаются (по крайней мере, частично) особыми диацил-
глицеролами, роль полярных головок в которых выполняют гликозильные, в том
числе сульфатированные, остатки. К их числу относятся галактоза, глюкоза и ман-
ноза, которые встречаются по отдельности или образуют разные связи друг с дру-
гом.

15.1.2.	Биосинтез глицеролипидов у архей

Археи одновременно обладают глобальным малонил- Со А путем для биосинтеза
жирных кислот (см. раздел 15.1.1) и глобальным мевалонатным путем для биосин-
теза полиизопреноидов (см. раздел 15.2.1).

В качестве гидрофобных хвостов в мембранные липиды архей входят только по-
лиизопреноидные спирты, в то время как все остальные живые организмы исполь-
зуют для этого жирные кислоты и очень редко — не полиизопреноидные спирты.

Хотя археи и синтезируют небольшое количество жирных кислот, последние со-
держатся в мембранах в свободном виде, а не в качестве компонента глицеролипи-
дов.

Чтобы не повторяться и не погружаться в детали, мы отсылаем читателя к I
тому учебника, где уже рассматривались структура и свойства липидов у архей.
Остановимся только на биосинтезе.

Важнейшими и уникальными этапами биосинтеза археотных глицеролипидов яв-
ляются:

—	образование фитанильных гидрофобных хвостов;

—	образование 3-моноалкенил-«п-глицерол-1-фосфата;

—	присоединение полярных групп к преархетидной кислоте;

—	образование 2,3-дифитанил-диглицерида (археола);

—	образование 2,3,2',3'-дибифитанил-тетраглицерида (кальдархеола).

Помимо этого, биосинтез археотных глицеролипидов включает в себя следующие
уникальные этапы:

—	образование циклопентановых колец внутри полиизопреноидной цепи;

—	образование девятиатомного спирта (кальдитола).

Образование фитанильных гидрофобных хвостов. Как показали опыты
по включению [1- 13С]- или [2-13С]-ацетата в липидную фракцию клеток метаноген-
ных архей Methano spirillum hungatei и Methanothrix soehngenii, фитанол образуется
в мевалонатном пути (см. раздел 15.2.1). Кроме того, на примере Methanobacterium
thermoautotrophicum и М. thermoformicicum установлено, что наращивание полиизо-
преноидной цепи происходит при помощи классического элонгирующего фермента —
пренилтрансферазы I.
АТФ

|—ОН
но-

-он

^л-глицерол

АТФ АДФ

01— он НАД НАДН 0 он НАДН НАД ©СНО

НО-0

©Lop

о = ©

©LOp

ноЧ©
©LOp

@|-ОН

©-ОН
РО-1©

м-глицерол-	диоксиацетон-	глицеральдегид-

3-фосфат	3-фосфат	3-фосфат

л’л-глицерол-
1-фосфат

А

° ^АхА^хА/чА

-о~хАухА^хА/чА

2,3-диалкенил-
5л-глицерол-
1-фосфат
(преархетидная кислота)

преархеол

Х(Р)О-1

археол

Х(Р)О-!

Рис. 157. Пути биосинтеза глицеролипидов у архей (по: Koga et al., 1993).

А — экстремальные галофилы. В — метаногены и термоацидофилы. GGDP — геранил-
геранил-дифосфат, X — полярная группа.
Образование З-моноалкенил-вп-глицерол-1-фосфата. 3-моноалкенил-sn-
глицерол-1-фосфат, или простой моноэфир глицерола и фитанола является цен-
тральным интермедиатом на пути биосинтеза археотных глицеролипидов.

В составе моноэфира, а также образующегося из него диэфира глицерол присутствует в 2,3-
sn-конфигурации (рис. 157). В результате глицеролипиды архей имеют разную стереохимию с 1,2-
sn-глицеролипидами бактерий и эукариотов. Первые являются правовращающими L-изомерами, а
вторые — левовращающими D-изомерами (см. I том учебника).

Способ, посредством которого образуется З-моноалкенил-зп-глицерол-1-фосфат, варьирует у
разных групп архей.

Экстремально галофильные археи (рис. 157, А). На примере Halobacterium sp. выяснено, что
в результате АТФ-зависимой киназной реакции из sn-глицерола образуется зп-глицерол-З-фосфат.
Затем события разворачиваются по двум сценариям.

В одном случае sn-глицерол-З-фосфат взаимодействует с геранилгеранил-дифосфатом (GGDP,
см. раздел 15.2.2) с образованием З-моноалкенил-зп-глицерол- 1-фосфата. В ходе этой реакции про-
исходит инверсия (разворот) гидроксила, занимающего положение зп-2.

В другом случае происходят три реакции. Предварительно sn-глицерол-З-фосфат окис-
ляется в диоксиацетон-3-фосфат (который может быть получен и путем восстановле-
ния глицеральдегид-3-фосфата). Диоксиацетон-З-фосфат образует с GGDP простой эфир —
1-моноалкенил-диоксиацетонфосфат. Путем восстановления этого эфира образуется 3-моноалке-
нил-зп-гяицерол-1-фосфат. В ходе реакции происходит инверсия гидроксила, занимающего поло-
жение зп-2.

Метаногенные и экстремально термофильные археи (рис. 157, Б). На примере Methanobac-
terium sp. и Sulfolobus sp. показано, что в результате альтернативной АТФ-зависимой киназной
реакции sn-глицерол превращается в sn-глицерол- 1-фосфат. Затем зп-глицерол-1-фосфат взаимо-
действует с GGDP, в результате чего образуется З-моноалкенил-зп-глицерол-1-фосфат.

После добавления к 3-моноалкенил-sn-глицерол-1-фосфату второй молекулы
GGDP из него образуется 2,3-диалкенил-зп-глицерол-1-фосфат, или преархетидная
кислота (англ, pre-archaetidic acid).

Присоединение полярных головок к преархетидной кислоте. На данном
этапе в положение 1 вводятся заряженные или электронейтральные полярные голов-
ки. Они присоединяются к глицеролу напрямую или через фосфорильный остаток.
К их числу относятся глицерол, глицеросульфат, глицерофосфат, серин и этанол-
амин, а также полиолы и простые сахара (см. I том учебника).

Образование 2,3-дифитанил-диглицерида (археола). На этапе образова-
ния археола из преархеола происходит множественное восстановление двойных свя-
зей. В результате этого геранил-геранильные радикалы превращаются в фитаниль-
ные. Необходимо подчеркнуть, что гидрирование двойных связей редко встречается
в биологических системах. Обычно происходит противоположно направленный про-
цесс— увеличение количества двойных связей (десатурация).

Образование 2,3,2',3'-дибифитанил-тетраглицерида (кальдархеола).
Простейший тетраэфир, или 2,3,2/,3'-дибифитанил-тетраглицерид синтезируется за
счет образования ковалентной связи между фитанильными хвостами двух молекул
2,3-дифитанил-диглицерида.

Способ, которым сшиваются друг с другом две Сго-полиизопреновые цепи, не
знает аналогий в биохимии полиизопреноидов, поскольку при образовании С40-
предшественника каротиноидов — фитоина — две молекулы GGDP соединяются спо-
собом «голова к голове». Здесь же два фитанила соединяются способом «хвост к
хвосту».

Образование циклопентановых колец внутри полиизопреноидной це-
пи. Механизм, посредством которого в бифитанильные цепи вводятся циклопен-
тановые кольца, неизвестен. Однако регулярность расположения указывает на то,
что они образуются в аксиальносимметричном тетраэфире, а не на стадии свобод-
ных С20- или Сдо-хвостов, еще не присоединенных к глицеролу. Напоминаем, что
максимальное число таких колец достигает восьми (см. I том учебника).

Биосинтез девятиатомного полиола (кальдитола). Девятиатомный каль-
дитол образуется путем слияния триозы (глицеральдегида или диоксиацетона) и
гексозы (глюкозы или фруктозы) с последующим восстановлением кетогрупы в
спиртовую.

15.2.	БИОСИНТЕЗ ПОЛИИЗОПРЕНОИДОВ

Полиизопреноиды представляют собой гидрофобные соединения, которые в
большинстве случаев содержат систему сопряженных двойных связей. Благодаря
особенностям своей молекулярной структуры они выполняют ряд важнейших био-
логических функций:

—	формируют унитарные биомембраны (только у архей) или дополнительно ста-
билизируют их (у всех живых организмов);

—	универсально предохраняют субклеточные структуры от окислительного
стресса;

—	используются в качестве вспомогательных пигментов, входя в состав светосо-
бирающих антенных комплексов;

—	образуют гидрофобный домен, или хвост молекулы (бактерио)хлорофилла;

—	обеспечивают индивидуальную окраску, выступая в роли одного из факторов
поведенческой адаптации у высших организмов, а также способствуют расселению
низших организмов (примером служат плодовые тела миксобактерий).

Полиизопреноиды можно формально рассматривать в качестве продуктов поли-
меризации изопрена (метилбутадиена) с появлением двойной связи на центральной
оси мономера:

п х [СН2=С(СНз)-СН=СН2] [-СН2-С(СН3)=СН-СН2-]П.

При сборке полиизопреновой цепи в качестве мономера используется, вопреки
названию, не изопреновая группа, а ее активированный предшественник — изопен-
тенилдифосфат (англ, isopentenyl diphosphate, IDP):

СН2=С(СН3 )-СН2 - СН2 - ОРР.

По завершении сборки полиизопреновая цепь подвергается дополнительным пре-
вращениям, важнейшие из которых — изменение степени насыщенности и циклиза-
ция.

Изменение степени насыщенности. Полиизопреновая цепь либо десатури-
руется (т. е. в ней появляются дополнительные двойные связи), либо сатурируется
(т.е. двойные связи превращаются в одинарные).

В первом случае одинарная связь между соседними изопреновыми группами пре-
вращается в двойную:

[-СН2-С(СН3)-СН-СН2-СН2-С(СН3)=СН-СН2-] ->
[-СН2-С(СН3)=СН-СН=СН-С(СН3)=СН-СН2-] + 2Н+/2е-.
Такую стратегию процессинга полиизопреноидов в той или иной степени исполь-
зуют все живые организмы, когда они синтезируют каротиноиды и их производные.

Во втором случае двойные связи в соседних изопреновых группах превращаются
в одинарные:

[-СН2-С(СН3)=СН-СН2-СН2-С(СН3)=СН-СН2-] + 4Н+/4е-
[-СН2-СН(СН3)-СН2-СН2-СН2-СН(СН3)-СН2-СН2-].

Такой стратегией процессинга полиизопреноидов пользуются только археи при
образовании гидрофобных хвостов своих уникальных мембранных липидов.

Циклизация. В полиизопреноидной цепи могут содержаться отдельно распо-
ложенные внутренние кольца (в кальдархеолах архей; см. I том учебника), а также
терминальные циклопентановые кольца (в к-каротиноидах), циклогексановые коль-
ца (в (3- и е-каротиноидах) или арильные кольца (в 99- и ^-каротиноидах).

Альтернативный вариант циклизации — это образование сотовидных тетрацик-
лических или пентациклических структур, которые называются соответственно сте-
роидами и гопаноидами (см. I том учебника).

Введение заместителей. В качестве боковых заместителей в полиизопреноиды
могут вводиться различные кислородсодержащие группы (гидрокси-, кето-, эпокси-,
метокси-, формил-, карбокси- и гликозидная).

Классификация полиизопреноидов. Полиизопреноиды можно подразделить
на каротиноиды и не-каротиноиды.

Каротиноиды состоят из восьми или большего числа изопреновых единиц. В их
основе лежит центрально-симметричная структура. Согласно классическому опре-
делению, данному Паулем Каррером, каротиноидами называются такие полиизопре-
ноиды, у которых две центральные метильные группы разделены шестью атомами
углерода, а прочие соседствующие метильные группы — пятью атомами углерода
(см. рис. 133).

He-каротиноиды имеют в своей основе асимметричную структуру. Они могут
быть ациклическими, могут содержать внутри цепи изолированные циклопентано-
вые кольца (оба случая связаны с гидрофобными хвостами полярных липидов архей;
см. I том учебника), могут содержать терминальное арильное кольцо (хиноны; см.
рис. 77), а также могут состоять из трех-четырех конденсированных циклогексано-
вых колец, сросшихся с одним циклопентановым кольцом (гопаноиды и стероиды).

Каротиноиды. Каротиноиды в основном гидрофобны. Поэтому они чаще всего
входят в состав гидрофобного ядра унитарной мембраны или нековалентно связы-
ваются с белками. У (ан)оксигенных фототрофных бактерий они образуют трой-
ственные (бактерио)хлорофилл-каротиноид-белковые комплексы. У хемотрофных
бактерий функции каротиноидов менее специфичны. Они, прежде всего, связаны
со структурной стабилизацией мембран, а также их защитой от окислительного по-
вреждения.

В разделе 12.6, посвященном фотосинтетическим пигментам, мы уже кратко оха-
рактеризовали каротиноиды. Теперь нам предстоит более подробно рассмотреть их
свойства, а также остановиться на путях их биосинтеза.

Каротиноиды — это наиболее распространенные природные пигменты, которые придают инди-
видуальную окраску или расцветку большинству прокариотных организмов, протистов, растений,
грибов и животных.
Цвет каротиноидов зависит от числа сопряженных двойных связей, по мере увеличения ко-
торого максимум поглощения сдвигается в длинноволновую часть видимого спектра. Количество
сопряженных двойных связей увеличивается на ранних этапах биосинтеза каротиноидов, причем
чем «старше» каротиноид, тем сильнее он окрашен и тем «краснее». Поздние этапы биосинтеза
окрашенных каротиноидов связаны с их «доработкой» путем образования циклических групп на
одном или обоих концах молекулы, а также за счет добавления к полиизопреновому скелету кисло-
родсодержащих заместителей (см. выше). Результатом является обогащение спектральных свойств
и исключительное разнообразие структуры природных каротиноидов (>700 молекулярных форм).

Окрашенные каротиноиды служат незаменимыми компонентами фотосинтетического аппарата
как бактериородопсинового, так и хлорофильного типа (см. главу 12). При этом они выполняют
три основные функции.

Функция вспомогательного светособирающего, или антенного пигмента. На свету кароти-
ноиды поглощают кванты в сине-зеленой части спектра (400-550 нм), переходят в возбужденное
состояние и путем электромагнитного резонанса возбуждают молекулы (бактерио) хлорофилла,
удаленные от них на расстояние <5А.

Структурная функция. Каротиноиды участвуют в процессе самосборки фотосинтетических
пигмент-белковых комплексов, а затем поддерживают их в нативном состоянии.

Защитная функция. Мы уже говорили о том (см. раздел 12.6.1), что при избыточном накоп-
лении возбужденных синглетных молекул хлорофилла они переходят в долгоживущее триплет-
ное состояние и начинают физически взаимодействовать с молекулярным кислородом. При этом
неактивный триплетный кислород (3Ог) переходит в активное синглетное состояние ^Оз), что
становится причиной окислительного стресса и фотоповреждения. Каротиноиды способны пере-
хватывать возбужденные синглетные и триплетные состояния хлорофилла, а также возбужденное
синглетное состояние кислорода. В результате они сами переходят в возбужденное синглетное или
триплетное состояние, а затем избыточная энергия освобождается в виде квантов флуоресценции
или рассеивается в форме тепла (подробнее см. III том учебника). Для того, чтобы эти процессы
стали достаточно эффективными, в молекуле каротиноида должно быть не менее семи сопряжен-
ных двойных связей, т. е. он должен быть окрашен.

15.2.1.	Биосинтез мономера полиизопреноидов —
изопентенилдифосфата

Известны два разных пути биосинтеза IDP (рис. 158). Первый, так называемый
«мевалонатный» путь был открыт в 1960-е годы Феодором Линеном при изучении
биосинтеза холестерола. В настоящее время показано, что такой путь реализуется у
архей, а также в цитозоле животных и высших растений.

Мевалонатый путь (рис. 158, А). В данном случае исходным субстратом служит
ацетил-СоА.

Из двух молекул ацетил-СоА с помощью ацетил-СоА-ацетилтрансферазы об-
разуется ацетоацетил-СоА. После присоединения к нему третьей молекулы аце-
тил-СоА он превращается в З-окси-З-метил-глутарил-СоА (англ. 3-hydroxy-3-methyl-
glutaryl-CoA, HMG-CoA). Затем НАДФН-зависимая HMG-CoA-редуктаза восста-
навливает З-гидрокси-З-метил-глутарил-СоА в 3,5-диоксо-3-метил-пентановую, или
мевалоновую кислоту (англ, mevalonic acid). С помощью мевалонаткиназы, а затем
фосфомевалонат-киназы мевалоновая кислота превращается в мевалонилдифос-
фат. В конечном счете, из мевалонилдифосфата под воздействием АТФ-зависимой
мевалонилдифосфат-декарбоксилазы образуется IDP.

После открытия мевалонатного пути решили, что он универсален для всех жи-
вых организмов. Однако в начале 1990-х годов выяснилось, что бактерии (в част-
ности, Е. coli) не включают меченый ацетат в полиизопреноиды. Это указывало на
существование альтернативного пути биосинтеза IDP.

Альтернативный путь (рис. 158, Б). Первую реакцию альтернативного «не-
мевалонатного» пути обнаружил в 1996 г. у Е. coli немецкий биохимик Ромер
A

Б

ацетил-СоА

SCoA

пируват

ацето-
ацетил-СоА

HMG-CoA

мевалонат

CoASH

ацетил-СоА

CoASH

ацетил-СоА

CoASH

НО.

НАДФН
НАДФ

[ СН2ОН
соо"

„ р- 2АТФ
®®^2АДФ

но,

мевалонил-РР

I СН2ОРР
соо"

Н,О

АТФ

АДФ+Ф

IDP

СН2ОРР

DXP

ОНС ^СН2ОР
он

ОН

НАДФН
НАДФ

глицер-
альдегид-3-
фосфат

MECDP

HMBDP

О

О

Рис. 158. Пути биосинтеза IDP, или изопреновой группы (по: Koyama, 2002).

А — мевалонатный путь. HMG-CoA — З-окси-З-метил-глутарил-СоА; IDP — изопентенилдифосфат;
1—ацетил-СоА-ацетилтрансфераза; 2 — HMG-CoA-синтаза; 3 — HMG-CoA-редуктаза; 4 — мевалонат-
киназа; 5 — фосфомевалонат-киназа; 6 — мевалонилдифосфат-декарбоксилаза. Б — альтернативный
путь. DXP — 1-дезокси-Б-ксилулозо-5-фосфат; ЦТФ, ЦДФ и ЦМФ — цитидинтрифосфат, цитидинди-
фосфат и цитидинмонофосфат; МЕР — 2-метил-О-эритритол-4-фосфат; ME — 2-метил-О-эритритол;
MECDP — 2-метил-О-эритритол-2,4-циклодифосфат; HMBDP — 1-окси-2-метил-2-бутенил-4-дифосфат;
1 — DXP-синтаза; 2 — DXP-редуктоизомераза; 3 — МЕР-цитидилтрансфераза; 4 — ЦДФ-МЕ-киназа;
5 — MECDP-синтаза; 6 — HMBDP-синтаза.
(M. Rohmer). Остальные изучил японский молекулярный биолог Кояма (Т. Koyama).
В настоящее время показано, что этот путь используют многие бактерии, а также
зеленые водоросли, хлоропласты высших растений и некоторые протисты (в част-
ности, Plasmodium sp.).

В данном случае исходными субстратами служат неактивированный пируват
и глицеральдегид-3-фосфат, которые конденсируются с образованием 1-дезокси-О-
ксилулозо-5-фосфата (англ. l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate, DXP). Реакция включа-
ет в себя декарбокси л ировение, и ее катализирует DXP-синтаза, которая использует
в качестве кофактора тиамин (см. рис. 89), а также катионы Mg2+ и Мп2+.

На втором этапе сопряженно происходят восстановление и изомеризация
DXP с образованием 2-метил-О-эритритол-4-фосфата (англ. 2-methyl-D-erythritol-
4-phosphate, МЕР). Эту реакцию катализирует DXP-редуктоизомераза.

DXP-редуктоизомераза широко распространена у многих бактерий, в том числе патогенов,
а также у растений, однако она отсутствует у животных, в частности млекопитающих. Специ-
фическим ингибитором этого фермента служит антибиотик фозмидомицин. Он и антибиотики с
аналогичным механизмом действия являются сильнодействующими агентами против грамположи-
тельных и грамотрицательных бактерий, а также перспективными гербицидами.

Третья реакция альтернативного пути связана с переносом МЕР на цитидин-
трифосфат с образованием (цитидин-5'-дифосфо)-2-метил-О-эритритола, или ЦДФ-
МЕ. Эту реакцию катализирует МЕР-цитидинтрифосфат-трансфераза. На четвер-
том этапе ПДФ-МЕ-киназа фосфорилирует ME в положении 2. После этого от ЦДФ-
МЕ-2-фосфата отщепляется ЦМФ. При этом из ME образуется цикло-фосфодиэфир
(англ. 2-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate, MECDP). Катализатором реакции
служит MECDP-синтаза. На шестом этапе MECDP превращается в ацикличе-
ский дифосфат — 1-окси-2-метил-2-бутенил-4-дифосфат (англ. l-hydroxy-2-methyl-2-
butenyl-4-diphosphate, HMBDP). На последнем этапе HMBDP превращается в IDP.
Эту реакцию катализирует еще не идентифицированный фермент, который кодиру-
ется геном lytB.

15.2.2.	Магистральный путь биосинтеза полиизопреноидов
и его ответвления

Магистральный путь биосинтеза полиизопреноидов универсален для представи-
телей доменов Bacteria, Archaea и Еисагуа. Это дает основание считать, что они
унаследовали его от гипотетического общего предка-прогенота (см. I том учебника).

Ферменты, участвующие в магистральном пути биосинтеза полиизопреноидов
(рис. 159), высококонсервативны. Их гены у прокариотов расположены на хромо-
соме. У ядерных организмов они находятся в ядре, а у растений — частью в ядре,
частью в пластидах.

Первый шаг в расшифровке пути биосинтеза каротиноидов и объяснении их биологической
роли совершил французский микробиолог Стэниер (R. Y. Stanier). При изучении в 1955 г. «сине-
зеленого» мутанта Rhodobacter sphaeroides R-26 он установил, что окрашенные каротиноиды обра-
зуются в результате десатурации бесцветных предшественников и оказывают защитное действие
против окислительного фотоповреждения.

Следующим крупным шагом были исследования американского генетика Мерса (В.Marrs),
который в начале 1980-х годов разработал системы для изучения генетической рекомбинации у
пурпурных бактерий из класса «Alphaproteobacteria», а также работы японского генетика Мисавы
(N.Misawa), который в начале 1980-х годов реконструировал пути биосинтеза каротиноидов у фито-
патогенной бактерии Erwinia herbicola и изучил экспрессию гетерологичных генов каротиногенеза
в клетках Е. coli.

Хотя мономером при сборке полиизопреновой цепи служит IDP, в каче-
стве затравки-праймера используется не он сам, а продукт его изомеризации —
диметилаллил-дифосфат (англ, dimethylallyl diphosphate, DMADP):

СН2=С(СН3)-СН2-СН2-ОРР (СН3)2С=СН-СН2-ОРР.

Диметилаллил-трансфераза переносит IDP на DMADP с образованием геранил-
дифосфата (англ, geranyl diphosphate, GDP). При этом двойная связь в IDP пере-
мещается из терминального положения в среднее:

СН2=С(СН3)-СН2-СН2- -> -СН2-С(СН3)=СН-СН2-.

Таким образом, GDP состоит из двух изопреновых групп:

СН3-С(СН3)=СН-СН2- и -СН2-С(СН3)=СН-СН2-.

GDP и эквивалентный ему десятиуглеродный блок, входящий в состав диизопреноидов, или
дипреноидов называются монотерпенами (от греч. terebinthos — скипидарное дерево). Пятнадца-
тиуглеродные трипреноиды называются соответственно сесквитерпенами (от лат. sesqui — в пол-
тора раза), двадцатиуглеродные тетрапреноиды—дитерпенами, двадцатипятиуглеродные пента-
преноиды — сестерпенами, тридцатиуглеродные гексапреноиды — тритерпенами, тридцатипятиуг-
леродные гептапреноиды — дитерсестерпенами, сорокауглеродные октапреноиды—тетратерпена-
ми и т. д., а в целом для обозначения полиизопреноидов есть синоним — терпеноиды.

Дальнейшие этапы биосинтеза полиизопреноидов заключаются, в первую оче-
редь, в наращивании цепи новыми мономерами IDP при помощи элонгирующих
ферментов — пренилтрансфераз, или синтаз. В результате могут образовываться как
cis-, так и irans-изомеры.

В настоящий момент охарактеризовано до шестнадцати пренилтрансфераз, относящихся к че-
тырем основным группам. Эти ферменты образуют полиизопреновые цепи с разной конфигурацией
и разным количеством атомов углерода — от п=10 (гераниол) до п>5-103 (натуральный каучук).

Пренилтрансферазы I синтезируют Zrans-полиизопреноиды с относительно короткой цепью (от
Cis до С2о)-

Пренилтрансферазы II образуют trans-цепи средней длины (от С25 до С35).

Пренилтрансферазы III обеспечивают образование длинноцепочечных trans-продуктов (С40 и
выше).

С помощью пренилтрансфераз IV типа образуются длинноцепочечные мульти-сгз-продукты.
Для действия элонгирующих ферментов всех четырех типов требуются катионы Mg2+ и Мп2+.

Пренилтрансфераза I (синтаза I) отвечает за удлинение цепи в такой после-
довательности: Сю (GDP) —> Cis (фарнезилдифосфат; англ, farnesyl diphosphate,
FDP) —> C2q (геранилгеранил-дифосфат; англ, geranylgeranyl diphosphate, GGDP).
Присоединение каждого нового остатка IDP происходит способом «хвост к голове»
(рис. 159).

Затем эта строгая последовательность прерывается, и фитоинсинтаза CrtB со-
единяет две молекулы GGDP по способу «голова к голове». В результате образу-
ется первый тетратерпен — бесцветный С4о-каротиноид ТбДб'-сгз-фитоин, который
DMADP

(C5) .

CH2OPP ®

CH,OPP IDp
(C5)

GDP
(C10)

ФФ

H2O

CH2OP

фарнезол, фарнезанол, фарнезан
С30-каротиноиды (сквален и др.)
хиноны

ундекапренол, долихол
сквален, сквалан, гопаноиды,

стероиды

С40-, С45-, С50-каротиноиды

Рис. 159. Магистральный путь биосинтеза полиизопреноидов.

IDP — изопентенилдифосфат; DMADP — диметилаллил-дифосфат; GDP — геранил-
дифосфат; FDP — фарнезилдифосфат; GGDP — геранилгеранил-дифосфат; PPDP —
префитоин-дифосфат; 1 — IDP-изомераза; 2 — DMADP-трансфераза; 3 — FDP-синтаза;
4 — GGDP-синтаза; 5 — фитоинсинтаза.

содержит только три сопряженные двойные связи (принцип нумерации атомов уг-
лерода в молекуле полиизопреноидов указан в разделе 12.6.2 и изображен на рис.
133). Следует отметить, что большинство природных каротиноидов — это полные
irans-изомеры. Важнейшим исключением является фитоин. Он обычно существует
в форме 15,15'-сг5-изомера.

Предшественником фитоина служит нестабильный интермедиат — префитоин-
дифосфат (англ, prephytoene diphosphate, PPDP). Его образование представляет
собой первую реакцию, специфичную для пути биосинтеза С4о-каротиноидов.

Путем дальнейших молекулярных преобразований из фитоина образуются С40-,
С45- и Cso-каротиноиды (см. ниже).

Первая боковая ветвь (от FDP). Продуктами этой ветви становятся исклю-
чительно важные в биологическом отношении сесквитерпены, тритерпены и высшие
терпеноиды.

Прежде всего, из FDP образуются два Cis-спирта. Первый из них — это нена-
сыщенный спирт фарнезол. Он выполняет роль гидрофобного хвоста в молекуле
бактериохлорофиллов с-е (см. раздел 12.6.1). Второй спирт —это насыщенный фар-
незанол. Он выполняет роль гидрофобного хвоста в одном из вариантов полярных
липидов у экстремально галофильных архей. Наконец, из FDP образуется насыщен-
ный углеводород фарнезан, который относится к числу неполярных липидов у архей
(см. I том учебника).

Кроме того, на боковой ветви начинается так называемый Сзо-путь. Синтаза
CrtM соединяет две молекулы FDP способом «голова к голове», в результате чего
образуется первый тритерпен —дегидросквален, или диапофитоин («фитоин, уко-
роченный с обоих концов»). Его производными являются:

—	Сзо-каротиноиды, в частности сквален; он редко встречается у бактерий (при-
мерами служат Heliobacterium sp. и Staphylococcus sp.), однако у архей это харак-
терный мембранный липид;

—	хиноны; они входят в состав цитохром Ъсх(Ъ&/)-комплекса и содержат от семи
до десяти изопреновых групп (см. раздел 10.4.6 и рис. 77);

—	полиеновые спирты ундекапренол и долихол; первый из них содержит одинна-
дцать изопреновых групп (С55) и у прокариотов служит переносчиком субъединиц
муреина, псевдомуреина и капсульных полисахаридов (см. I том учебника); второй
содержит от четырнадцати до двадцати двух изопреновых групп (С70—Сцо) и у
эукариотов служит переносчиком олигосахаридов, которые используются при био-
синтезе поверхностных гликопротеинов.

Из сквалена синтезируются неполярные липиды разной степени восстановленно-
сти, вплоть до предельного углеводорода сквалана (характерен для архей).

Кроме того, сквален служит предшественником для биосинтеза двух классов
циклических терпеноидных липидов — тетрациклических стероидов (типичны для
эукариотов, однако редко встречаются у прокариотов) и пентациклических гопано-
идов (широко распространены у бактерий, но не встречаются у архей и эукариотов).

Вторая боковая ветвь (от GGDP). Хотя продукты этой ветви не столь мно-
гообразны, как у первой, их биологическое значение также велико.

GGDP служит предшественником при образовании ненасыщенных Сзо-спиртов,
которые содержат соответственно четыре, две и одну двойную связь. Первый
спирт — это геранилгераниол, который выполняет роль гидрофобного хвоста бакте-
риохлорофилла д. Второй спирт —это фитодиенол, он образует гидрофобный хвост
бактериохлорофилла Ь. Третий спирт —это фитол, входящий в качестве гидрофоб-
ного хвоста в состав бактериохлорофиллов а и Ь, а также хлорофиллов а, а2, Ь, 62 и
d (см. раздел 12.6.1).

Путем полной сатурации из GGDP синтезируется спирт фитанол. Он служит
боковым радикалом в полярных липидах архей (см. I том учебника).

Биосинтез ациклических и циклических каротиноидов. Большинство
природных каротиноидов — это С4о-каротиноиды. Редки и мало изучены С35-
каротиноиды, которые образуются путем конденсации FDP и GGDP, а также го-
мокаротиноиды (С> 40).

Как уже указывалось, путь биосинтеза С4о-каротиноидов начинается с 15,IS7-
сгв-фитоина, содержащего три сопряженные двойные связи (рис. 160). Десатурация
фитоина сопровождается спонтанной изомеризацией с образованием полных trans-
продуктов.

фитоин

®^2Н+/2е

фитофлуин

нейроспорин

каротин

{Erwinia herbicola)

2Н+/2е"

гидроксинейроспорин

сфероидин

(Rhodobacter sphaeroides)

Н3СО

спириллоксантин

(Rhodospirillum rubrum)

ОСНз

Рис. 160. Путь биосинтеза Сдо-каротиноидов.

Фитоин для удобства изображен в 15—15-trans конфигурации. 1—десатураза Crtl; 2 — гидратаза
CrtC; 3 — десатураза CrtD; 4 — метилаза CrtF; 5 — циклаза CrtY.

Вначале бесцветный фитоин трижды десатурируется и через стадию желтовато-
го ^-каротина (семь сопряженных двойных связей) превращается в бледно-желтый
нейроспорин (девять сопряженных двойных связей). Катализатором этой реакциц
служат фитоиндесатуразы.
В ходе эволюции появились два негомологичных типа фитоиндесатураз. У большинства бак-
терий, архей и грибов имеются НАДФ- или ФАД-зависимые фитоиндесатуразы Crtl. Отдельный
кластер образуют пластохинон-зависимые фитоиндесатуразы — фитоиндесатураза CrtP цианобак-
терий и фитоиндесатураза Pds водорослей и высших растений.

Фитоиндесатуразы Crtl вводят в фитоин три двойные связи (с образованием нейроспорина
в случае Rhodobacter sphaeroides) или четыре двойные связи (с образованием ликопина в случае
Erwinia herbicola и Rhodospirillum rubrum').

Фитоиндесатуразы CrtP и Pds вводят только две двойные связи (с образованием ^-каротина).
Для превращения ^-каротина в нейроспорин, а нейроспорина в ликопин, т. е. для введения
соответственно третьей и четвертой двойной связи, требуются особые £-каротин десату разы
(£-каротиндесатураза CrtQb цианобактерий и растительная £-каротиндесатураза Zds).

На стадии нейроспорина магистральный путь биосинтеза каротиноидов разветв-
ляется (рис. 160).

Ликопиновая ветвь. У одних бактерий, например Е. herbicola, R. acidophila и
R. rubrum, а также у растений нейроспорин еще раз десатурируется. В результа-
те образуется розовый ликопин, содержащий одиннадцать сопряженных двойных
связей.

Ациклические производные ликопина характерны для пурпурных бактерий. Они
синтезируются с помощью гидратазы CrtC, десатуразы CrtD и мети лазы CrtF. Эти
ферменты образуют двойные связи в положениях 3:4 и 3':4', а также вводят чет-
вертичные гидроксильные и оксиметильные группы в положения 1 и 1'. Интерме-
диатами пути, который заканчивается образованием ярко-красного спириллоксан-
тина (тринадцать сопряженных двойных связей), являются минорные каротинои-
ды родопин, 3,4-дидегидрородопин, ангидрородовибрин, родовибрин и монодеметил-
спирилло ксантин.

Циклические производные ликопина, или каротины содержат /3-иононовые или
с-иононовые концевые группы. Самым распространенным каротиноидом у Bacteria,
Archaea и Еисагуа является /3-каротин, содержащий две концевые /3-иононовые груп-
пы. В результате /3-циклизации на одном конце молекулы ликопин превращается в
7-каротин. Его дополнительная /3-циклизация приводит к образованию /3-каротина
(рис. 160).

Существуют, по крайней мере, три Дликопинциклазы. Одна — это «классическая» гомодимер-
ная CrtY-циклаза, которая имеется у хемотрофных бактерий. Другая — это гомодимерная CrtL-
циклаза цианобактерий и растений. Третья — это гетеродимерная CrtYcd-циклаза, обнаруженная
у некоторых актинобактерий и археота Sulfolobus acidocaldarius.

Альтернативная (гидроксинейроспориновая) ветвь. У других бактерий, напри-
мер R. sphaeroides, нейроспорин с помощью гидратазы CrtC превращается в гидрок-
синейроспорин. Затем, как и при синтезе спириллоксантина в ликопиновой ветви,
десатураза CrtD образует двойную связь в положении 3:4, а метилаза CrtF вводит
четвертичную метильную группу в положение 1. По контрасту с симметричным спи-
риллоксантином, конечным продуктом является асимметричный сфероидин. Этот
красный каротиноид содержит одиннадцать сопряженных двойных связей. Интер-
медиатом на пути его образования является минорный каротиноид деметилсферои-
Дин.

Оранжевый, коричневый и красный цвет, которым обладают популяции пурпурных бактерий,
находит два объяснения. Во-первых, у них относительно много ярко окрашенных каротиноидов
(до 60% содержания бактериохлорофилла). Во-вторых, in situ главные максимумы бактериохло-
рофиллов а или b лежат в инфракрасной части спектра (соответственно около 800 и 900 нм), и
поэтому эти пигменты имеют бледно-голубой цвет. Для сравнения отметим, что для бактериохло-
рофиллов с, d и д, а также для всех хлорофиллов характерны более коротковолновые главные
максимумы (порядка 700 нм), и эти пигменты по цвету сине-зеленые. Поэтому в случае низкого
содержания вспомогательных пигментов, в частности каротиноидов, популяции зеленых бактерий,
гелиобактерий и цианобактерий приобретают зеленую окраску.

Биосинтез ксантофиллов. Ксантофиллы, или кислородсодержащие кароти-
ноиды образуются в результате появления в молекуле каротина одного или несколь-
ких атомов кислорода в составе гидроксильной группы, кетогруппы, формильной
группы или оксиметильной группы.

У пурпурных бактерий ксантофиллы синтезируются в анаэробных условиях пу-
тем гидратации двойных связей в положениях 1:2 и 1':2' (см. выше) или внутри
цепи; кетогруппы появляются в результате окисления гидроксильных групп. Фор-
мильные и метоксильные группы образуются при помощи монооксигеназ только в
аэробных условиях.

У цианобактерий после гидроксилирования в положениях 3 и 3' <а-каротина или
/5-каротина образуются характерные ксантофиллы /^-криптоксантин и зеаксантин.
Для действия гидроксилаз необходим молекулярный кислород и катионы Fe2+. Ке-
токаротиноиды пурпурных бактерий синтезируются при помощи монооксигеназ, ко-
торые вводят атом кислорода в положения 2 или 4 (см. рис. 133).

К числу ксантофиллов формально можно отнести и гликозидные каротиноиды
(см. рис. 133). Они синтезируются при помощи соответствующих гликозилаз — на-
пример, зеаксантингликозилаза превращает зеаксантин в моно- или дигликозиды.

15.3.	БИОСИНТЕЗ ТЕТРАПИРРОЛОВ

Тетрапирролы содержат более или менее протяженную систему двойных связей
(см. рис. 120) и поглощают свет в видимой части спектра. Многие из них образуют
порфириновый макроцикл, способный лигандировать катионы металлов или неболь-
шие органические молекулы. Благодаря этим особенностям молекулярной структу-
ры тетрапирролы могут выполнять разнообразные и исключительно важные био-
логические функции:

—	поглощать видимый свет при фототрофии и фотоповедении, т. е. выступать в
роли фоторецептора (бактериохлорофиллы, хлорофиллы и фикобилины фотосин-
тетических светособирающих антенн, а также фитохромы);

—	сопрягать фотофизические процессы с фотохимическими, т. е. выступать в ро-
ли фотосенсибилизаторов (хлорофилл или бактериохлорофилл в качестве первич-
ного донора фотосинтетического реакционного центра);

—	векторно переносить электроны, т. е выступать в роли компонентов электрон-
транспортных цепей (бактериохлорофиллы и хлорофиллы фотосинтетических ре-
акционных центров, а также гемы цитохромов);

—	переносить метильную группу, т. е. выступать в роли кофактора трансметилаз
(коррин, F43o).

Тетрапирролы синтезируются с помощью ферментативных реакций, которые
принадлежат к одному и тому же разветвленному метаболическому пути.

Главными модельными объектами при изучении биосинтеза тетрапирролов и его
общей регуляции послужили представители класса «Alphaproteobacteria». Сравни-
тельные исследования, проведенные на цианобактериях, зеленых водорослях и выс-
ших растениях, показали, что важнейшие этапы этого пути и катализирующие их
ферменты стандартны для всех живых организмов. У прокариотов гены ферментов,
с помощью которых образуются конечные продукты пути биосинтеза тетрапирро-
лов, расположены на хромосоме. У ядерных организмов они находятся в ядре, а у
растений — частью в ядре, частью в пластидах.

Биосинтез ALA — предшественника тетрапирролов. Универсальным
предшественником тетрапирролов служит 5-аминолевулиновая, или 5-аминолевули-
новая кислота (англ. 5-aminolevulinic acid, ALA). Пурпурные бактерии из класса
«Alphaproteobacteria», некоторые бактерии из филы ВХШ Firmicutes, а также гри-
бы синтезируют ALA путем конденсации глицина с сукцинил-СоА. В то же время
большинство бактерий, а также археи, водоросли и высшие растения образуют ALA
из глутаминовой кислоты (рис. 161, А). Особенностью этого пути является участие в
нем tPHKg1u, которая присоединяется к глутаминовой кислоте и тем самым ее ак-
тивирует. Катализатором реакции служит Lrny-TPHKGlu-cnnTa3a. Следует подчерк-
нуть, что РНК крайне редко участвует в энзиматических процессах, не приводящих
к образованию пептидной связи.

С помощью НАДФН-зависимой Рглу-тРНКС1и-редуктазы активированный глу-
тамат восстанавливается до полуальдегида (англ, glutamate semialdehyde, GSA). Эта
реакция происходит только в присутствии катионов Mg2+. На заключительном эта-
пе аминогруппа GSA переносится из положения 4 в положение 5, в результате чего
образуется ALA. Кофактором этой аминотрансферазной реакции является пиридок-
сальфосфат (рис. 162), который представляет собой альдегидное производное спирта
пиридоксола, или витамина Bg. Между альдегидной группой пиридоксальфосфата и
переносимой им аминогруппой временно образуется шиффово основание (см. раздел
10.4.1, а также рис. 73). Возможно, что все три фермента, участвующие в синтезе
ALA, входят в один мультиферментный комплекс.

Биосинтез протопорфирина IX. Вначале восемь молекул ALA попар-
но конденсируются друг с другом с образованием четырех пиррольных ко-
лец порфобилиногена (рис. 161, Б). Катализатором этой реакции служит Mg2+-
зависимая ALA-дегидратаза. Затем четыре молекулы порфобилиногена одновре-
менно дезаминируются, и из них получается нестабильный ациклический тет-
рапиррол — гидроксиметилбилан. Данную реакцию катализирует порфобилиноген-
дезаминаза, а ее кофактором является димер порфобилиногена. Следом за
этим гидроксиметилбилан при помощи уропорфириноген Ш-синтазы, или «ко-
синтазы» превращается в макроциклический тетрапиррол — уропорфириноген III.
Дезаминаза и косинтаза, скорее всего, образуют бинарный функциональный
комплекс.

Уропорфириноген III служит предшественником для трех исключительно важных металпор-
финоидов.

Во-первых, это Fe-порфиноид — сирогем (один из двух вариантов гема, входящего в качестве
простетической группы в состав цитохрома d\ см. раздел 10.4.1, а также рис. 70).

Во-вторых, это Со-порфиноид — коррин (простетическая группа трансметилаз у метаногенных
архей и ацетогенных бактерий; см. разделы 11.4.5.4 и 11.4.5.5, а также рис. 80).

В третьих, это Ni-порфиноид — F430 (простетическая группа метил-СоМ редуктазы у метано-
генных архей; см. раздел 11.4.5.4, а также рис. 119).

Реакции, приводящие к образованию этих производных уропорфириногена III, включают в
себя: (1) метилирование порфиринового ядра в положениях 1 и 3; (2) окисление прекоррина II
до тетрагидропорфирина; (3) восстановление макроцикла с максимальным уменьшением протя-
A

Glu
COO	COO - tPHK	CHO

1	+ Glu	1	+	1	+

HC - NH3 tPHK H2O HC - NH3 НАДФН НАДФ НС - NH3

1 1 1

ch2 ——►	CHz —► CH*

1	г Я	I	Я Glu 1

CH2 АТФ АДФ+Ф сн2	tPHK CH2

coo”	coo-	coo-

Glu

L my	L глу-тРНК	GSA

h2c - NH^

c =o
l
ch2

ch2

coo-

ALA

протопорфирин IX

уропорфириноген III

Рис. 161. Пути биосинтеза 5-аминолевулиновой кислоты (А) и протопорфирина IX (Б).

А: 1 — Ьглу-тРНКс1и-синтаза; 2 — Ьглу-тРНКс1и-редуктаза; 3 — GSA-аминотрансфераза. Б: 1 — ALA-
дегидратаза; 2 — порфобилиноген-дезаминаза; 3 — уропорфириноген Ш-синтаза (косинтаза); 4 — уропор-
фириноген Ш-декарбоксилаза; 5 — оксидаза/декарбоксилаза; 6 — протопорфириноген 1Х-оксидаза.
женности системы сопряженных двойных связей в случае F430 (см. рис. 120); (4) хелатирование
катионов Fe2+, Со2+ и Ni2+ при помощи соответствующих хелатаз.

Из уропорфириногена III через две промежуточные стадии образуется протопор-
фирин IX.

Сначала под воздействием декарбоксилазы, которая удаляет карбоксильные
группы в положениях 1, 3, 5 и 8, уропорфириноген III превращается в копропорфи-
риноген III. Декарбоксилирование начинается с пиррольного кольца IV и продол-
жается по часовой стрелке, т.е. последовательно в положениях 8 —> 1—> 3 —> 5.

Рис. 162. Пиридоксальфосфат.

Стрелкой указано место присоединения аминогруппы.

Следом за этим оксидаза/декарбоксилаза окислительно декарбоксилирует про-
пионильные группы в положениях 2 и 4. Все они превращаются в винильные, в
результате чего образуется протопорфириноген IX. Реакция протекает либо при уча-
стии молекулярного кислорода, либо в анаэробных условиях.

В завершение всего протопорфириноген IX-оксидаза образует метинильные мо-
стики в положениях и 8, а также двойные связи в положениях 3:4 и 7:8.
В результате этого образуется протопорфирин IX, который содержит систему сопря-
женных двойных связей и имеет красную окраску. Он служит предшественником
при биосинтезе гемов, фикобилинов и (бактерио)хлорофиллов.

Биосинтез гемов. Ветвь железопорфиноидов, или гемов начинается (за исклю-
чением сирогема) с превращения протопорфирина IX в протогем.

Затем протогем-ферролиаза, или Ре2+-хелатаза катализирует образование ком-
плекса между протопорфирином IX и катионом Fe2+. Кофакторами этой реакции
служат катионы Со2+ и Zn2+. После этого из протогема образуются гемы a-d (см.
рис. 70).

Биосинтез фикобилинов. Фикобилины представляют собой квази-цикличе-
ские тетрапирролы в виде разрезанного кольца, которые не хелатируют катионы
металлов (см. раздел 12.6.3). При связывании с апопротеином оно распрямляется, и
образуется линейный тетрапиррол (см. рис. 134).

В образовании фикобилинов из протогема участвуют гемоксигеназы, редуктазы
и изомеразы.

Первый этап на пути биосинтеза фикобилинов катализируется двухкомпонентной ферментной
системой, состоящей из гемоксигеназы и НАДФ- или ферредоксинзависимой редуктазы. Гемокси-
геназа размыкает порфириновый макроцикл протогема по метинильному мостику а между I и IV
пиррольными кольцами, в результате чего образуется желчеподобный пигмент — биливердин 1Ха.
Затем редуктаза I восстанавливает метинильный мостик между III и IV пиррольными кольцами,
и биливердин IXq превращается в 15,16-дигидробиливердин 1Ха.
На втором этапе редуктаза II восстанавливает I пиррольное кольцо, и из 15,16-
дигидробиливердина 1Ха образуется 37-фикоэритробилин. При помощи редуктазы III, которая вос-
станавливает винильную группу при IV пиррольном кольце в этильную, BZ-фикоэритробилин пре-
вращается в SZ-фикоцианобилин. 37-изомеры фикобилинов нестабильны, и поэтому фикобилин-
этилидеи-cis/trans-изомераза трансформирует их соответственно в ЗЕ-фикоэритробилин и ЗЕ-
фикоцианобилин.

Для того, чтобы ковалентно присоединить фикобилин к апопротеину, использу-
ются специальные лигазы. Например, фикоцианобилин связывается через I пирроль-
ное кольцо с аминокислотным остатком Cys-84, входящим в состав а-субъединицы
(см. раздел 12.6.3, а также рис. 134).

Биосинтез (бактерио)хлорофиллов. Ветвь магнийпорфиноидов, или хло-
рофиллов начинается с превращения протопорфирина IX в 2,4-дивинил-
протохлорофиллид (рис. 163). Образование комплекса между протопорфирином IX
и катионом Mg2+ катализирует АТФ-зависимая М§2+-хелатаза. Катион Mg2+ по-
ступает в виде соли MgАТФ, которая служит субстратом для большинства киназ.

Вторая реакция —это метилирование пропионильной группы в положении 6, что
приводит к образованию монометилового эфира Mg-протопорфирина IX. Метильная
группа поступает от Я-аденозил-Ь-метионина, который при этом превращается в S-
аденозил-гомоцистеин. Катализатором реакции служит S-aдeнoзил-L-мeтиoнин:Mg-
протопорфирин 1Х-метилтрансфераза.

Этапы образования циклопентанового кольца V и восстановления винильной группы при II
кольце в этильную изучены не так хорошо, как предыдущие.

В частности, предполагается, что замыкание кольца V происходит при участии циклазной
системы, по аналогии с механизмом /3-окисления жирных кислот. Последовательность событий
состоит из дегидрирования, гидратации и окисления гидроксильной группы при /3-углеродном
атоме остатка пропионовой кислоты, который находится в положении 6 и этерифицирован ме-
танолом. Промежуточными продуктами на пути образования 2,4-дивинил-протохлорофиллида
являются 6-метил-/3-гидроксипропионил-К^-протопорфирин IX и 6-метил-/3-кетопропионил-Ь/^-
протопорфирин IX. Циклазная система требует присутствия кислорода, НАДФ и катионов Fe2+.

Производными 2,4-дивинил-протохлорофиллида ЯВЛЯЮТСЯ хлорофиллы Щ И С2
(см. табл. 13), которыми обладают бурые и другие «хромофитные» водоросли, а
также цианобактерии-прохлорофиты Prochloron didemni и Prochlorococcus marinus.

После восстановления винильной группы в положении 4 из 2,4-дивинил-
протохлорофиллида образуется протохлорофиллид. Затем светозависимая
НАДФ:протохлорофиллид-оксидоредуктаза (это может быть и «темновой», расхо-
дующий АТФ фермент) превращает протохлорофиллид в хлорофиллид а, который
имеется у всех оксигенных фототрофных бактерий.

Путем модификации хлорофиллида а образуются бактериохлорофиллы а-д (см.
табл. 13, а также раздел 12.7.3). Ими обладают пурпурные бактерии, зеленые бак-
терии и гелиобактерии.

В 1996 г. группа японских исследователей, возглавляемая Вакао (N. Wakao), обнаружила, что
аэробная фототрофная бактерия Acidiphilium rubrum вместо Mg-содержащего бактериохлорофил-
ла а образует Zn-содержащий бактериохлорофилл а. В 2000 г. Вакао и его сотрудники описали
вторую бактерию, которая образует Zn-содержащий бактериохлорофилл а — Acidisphaera rubri-
faciens. Этот пигмент более стабилен, чем Mg-содержащие (бактерио)хлорофиллы, которые в кис-
лой среде феофитинизируются, т.е. теряют лигандированный катион Mg2+. По-видимому, цинк
спонтанно замещает магний на одном из этапов биосинтеза бактериохлорофилла после образова-
ния 2,4-дивинил-протохлорофиллида. Однако как это происходит, еще не ясно.
протопорфирин IX

2,4-дивинил-протохлорофиллид

хлорофиллы

С] и с2

хлорофиллы bind

Рис. 163. Путь биосинтеза производных протопорфирина IX.

1 — Mg2,-xeлaтaзa; 2 — 3-аденозил-Ь-метионин:1У^-протопорфирин lX-метилтрансфераза; 3 — цикла-
за; 4 — 4-винилредуктаза; 5 — оксидоредуктаза; 6 — хлорофилл а-синтаза; 7 — GG-редуктаза.

Для превращения хлорофиллида а в хлорофилл а требуются еще несколько до-
полнительных реакций. Вначале он этерифицируется полиизопреноидным спиртом
геранилгераниолом; при этом роль донора выполняет GGDP. Затем геранилгера-
нильный остаток последовательно восстанавливается по двойным связям в положе-
ниях б, 10 и 14, в результате чего образуется фитольный хвост. Промежуточными
продуктами при восстановлении GG являются б-дигидро-GG, 6,10-тетрагидро-СС и
6,10,14-гексагидро-СС. Хлорофилл а-синтаза и GG-редуктаза действуют в составе
единого комплекса, а восстановителем служит НАДФН.

Производными хлорофилла а являются хлорофиллы b и d. АТФ-зависимое
образование хлорофилла Ь у цианобактерий-прохлорофитов Prochlorococcus mari-
nus, Prochloron didemni и Prochlorothrix sp. осуществляется при помощи хлоро-
филл а-оксигеназы. Она окисляет метильную группу кольца II в формильную. По-
видимому, эта реакция обратима, хотя существование пула взаимно превращающих-
ся молекул хлорофиллов а и b не доказано. Скорее всего, хлорофилл а служит пред-
шественником и для хлорофилла d (см. табл. 13), которым обладает цианобактерия-
прохлорофит Acaryochloris marina.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Завершая на этом II том учебника, мы хотим подвести краткий итог всему ска-
занному.

Знакомство с общими принципами и конкретными деталями метаболизма бак-
терий и архей свидетельствует об исключительном разнообразии и адаптационной
лабильности метаболических систем, имеющихся у прокариотов. Некоторые уни-
кальны, и знание о них будет полезно каждому, кто интересуется клеточной физио-
логией.

Читатель мог убедиться в том, что прокариоты обладают системами ассимиля-
ции энергии и неорганического углерода, которых нет у эукариотов. Поэтому когда
последние путем эндосимбиоза приобрели митохондрии и пластиды, это обеспечи-
ло колоссальный биологический прогресс протистов, а за ними и многоклеточных
организмов, вплоть до высших приматов.

До сих пор мы мало говорили о том, как устроена и по каким законам функци-
онирует «командная система» прокариотной клетки, которая управляет их цитоло-
гией и физиологией, обеспечивает их взаимодействие с окружающей абиотической
средой, а также определяет характер их взаимоотношений между собой и с другими
живыми организмами.

Ответы на поставленные вопросы дает последний, III том учебника, посвящен-
ный цитогенетике и онтогенезу. Кроме того, в нем рассматриваются автоэкология,
синэкология и популяционная биология прокариотов.

Последней темой трехтомного издания является биотехнология. Решение прак-
тических задач в свое время дало мощный импульс фундаментальной микробиоло-
гии. Прокариоты играют в биотехнологии решающую роль, человечество широко
пользуется их дарами и впредь может рассчитывать на их щедрость.
предметный указатель

Автотрофия 29

— азотная 283-296. См. также Диазотро-
фия

---определение 30

— углеродная 255-282

---определение 29

---путь 257

---цикл 257

Аденилаткиназа 40, 166

Аденозиндифосфат (АДФ) 41-45

Аденозинтрифосфат (АТФ) 37-41

Аденозинфосфосульфат (АФС) 166, 205

Аденозинфосфосульфат-редуктаза (АФС-
редуктаза) 205

Аквапорин 14

Алкалифил 47

Алкогольдегидрогеназа 94, 103, 109

Альдолаза 88

5-Аминолевулиновая кислота (ALA) 317

— биосинтез 317

Аммиак 157

— окисление 158

---анаэробное 159

---аэробное 158. См. также Нитрифика-
ция

Аммиакмонооксигеназа 158

Аммоний 295

— ассимиляция 295-296

Анаболизм 30

—	определение 30

Анаммоксосома 159

Анаплеротическая реакция 126

Анаэроб 82

—	вторичный 84

—	первичный 83. См. также Ацидогенная
бактерия

Анаэробное деструктивное сообщество 82-85

Апопротеин 217, 222

Археол 305

Ассимилирующая сила 221

Ассимиляция 214-296

—	определение 9

АТФаза/АТФ-синтаза 56-59

—	археотная 59

—	бактериальная 57-59

Р-АТФаза 60

V-АТФаза 57

Ацетальдегид 106, 109

Ацетат 122

Ацетаткиназа 103, 106, 112, 113

Ацетил-коэнзим А (ацетил-СоА) 101

— автотрофный биосинтез 188

----у архей 278. См. также Путь Вулфа

----у бактерий 189-192. См. также Путь
Вуда-Льюнгдала

— окисление 122

----нециклическое 122

— —циклическое 123. См. также Окис-
лительный цикл трикарбоновых кислот;
Цикл Кребса

Ацетил-СоА-карбоксилаза 262, 299

Ацетил-СоА-синтаза 279, 280. См. также
Дегидрогеназа монооксида углерода (СО-
дегидрогеназа)

Ацетилфосфат 43, 94, 97, 112

Ацетоацетил-коэнзим А (ацетоацетил-СоА)
105

Ацетоин 114

Ацетолактат 114

Ацидогенная бактерия 84. См. также Анаэ-
роб, первичный

Ацидофил 47

Ацилпереносящий белок (АСР) 77, 299

Ацилфосфат 42

Аэробная фототрофная бактерия (АРВ) 224,
252, 320

Бактериородопсин 54

Бактериохлорофилл 224

— биосинтез 320

Бактоптерин 150. См. также Молибдопте-
рин-гуанидин-динуклеотид (MGD)

Белок Риске 64

Белок FMO 239

Биолюминесценция 120. См. также Люци-
фераза

Биотин 74, 175. См. также Витамин Н

Биотрансформатор 32-79

— мембранный 32, 35, 44-79

— определение 32

— цитозольный 32, 35, 41-44
Бифидобактерия 113

Бифидо-шунт 96-98. См. также Гексозомо-
нофосфатный путь де Фриза-Стаутамера
Брожение 85-88, 104-121

—ацетонобутиловое 106-107

— глицериновое 110

— маслянокислое 104-106

— молочнокислое 111-113

----гетероферментативное 111

----гомоферментативное 111

— муравьинокислое 113. См. также Броже-
ние, смешанного типа

— необычное 115-121. См. также Глутамат,
сбраживание; Реакция Стикленда; Цит-
рат, сбраживание

—	определение 87

—	отличие от дыхания 87

— с использованием неорганического акцеп-
тора электронов 120

—	смешанного типа ИЗ. См. также Броже-
ние, муравьинокислое

—	спиртовое 109

—	уксуснокислое 107

— формы по Нойбергу 110

Витамин Bi 68, 94, 98. См также Тиамин-
пирофосфат

Витамин Вб 317. См. также Пиридоксаль-
фосфат

Витамин В12 73, 116, 175 См. также Кор-
риноид

Витамин Н 74, 175. См. также Биотин

Водород 153

— образование 153, 156

— окисление 153-157. См. также Хемолито-
трофия, водородная

----анаэробное 154

----аэробное 154

Восстановительный пентозофосфатный
цикл 269-275. См. также Цикл
Кельвина-Бенсона-Бэссема

—	цикл восстановления углерода 271

—	цикл окисления углерода 272

—	у архей 274

Восстановительный цикл карбоновых кис-
лот 258-262. См. также Цикл Ивенса-
Бьюкенена-Эрнона

Восстановленное неорганическое соединение
серы (RISC) 162

Вторая биосфера 148, 173, 254

Высокопотенциальный железопротеин

(HiPIP) 54. См. также Железо-серный
белок

Гексозобисфосфатный путь Эмбдена-Мей-
ергофа-Парнаса 88-91. См. также Гли-
колиз

—	определение 90

—	регуляция 91

—	у архей 99

Гексозомонофосфатный путь 91-101

—	Варбурга-Диккенса-Хореккера 94-96

—	де Фриза-Стаутамера 96-98. См. также
Бифидо-шунт

—	Энтнера-Дудорова 91-94

--у архей 99

Гексокиназа 88, 128

Гем 50

—	биосинтез 319

Генеральный метаболизм 26. См. также
Первичный метаболизм

Генеральный метаболит 26. См. также
Первичный метаболит

Гетеродисульфид 177

—	экзогенный 177

—	эндогенный 177

Гетеродисульфидредуктаза 185

Гетеротрофия 29

—	определение 29

Гетеротрофное карбоксилирование 175

Гидразингидролаза 160

Гидразиндегидрогеназа 160

Гидрогеназа 155-157

Гидролитик 83

Гидрометаллургия 166

Гликолат 274

Гликолиз 88-91. См. также Гексозобис-
фосфатный путь Эмбдена-Мейергофа-
Парнаса

Глиоксилат 127, 262

—	автотрофный биосинтез 262. См. также
/З-Оксипропионатный цикл; Цикл Фукса-
Холо

Глиоксилатный шунт 127. См. также Цикл
Корнберга

Глицеральдегид-З-фосфат 88, 90. См. так-
же З-Фосфоглицериновый альдегид

Глицеролипид 298-306

—	биосинтез у архей 303-306

—	биосинтез у бактерий 298-303

Глутамат 116

—	сбраживание 116. См. также Брожение,
необычное

Глутаматдегидрогеназа 296

Глутаминсинтетаза/глутаматсинтаза 295

Глутатион 163, 177

Гуанозиндифосфат (ГДФ) 123

Гуанозинтрифосфат (ГТФ) 42

Деазафлавин 181. См. также Коэнзим F420

Дегидрогеназа монооксида углерода (СО-
дегидрогеназа) 152, 187, 191

Денитрификация 200. См. также Дыхание,
нитритное

Диазотроф 284

Диазотрофия 30. См. также Автотрофия,
азотная

Диауксия 128

Диафораза 157

Диметилаллил-дифосфат (DMADP) 311

Диоксиацетонфосфат 90
Диссимиляция 9

—	определение 9

Диссипотроф 83

Дыхание 121-213

—	анаэробное 197

--регуляция 203

—	арсенатное 209

—	аэробное 193

—	гетеродисул ьфидное 179

—	металзависимое 210

—	N-мети л-тетрагидрофол атное 192

—	нитратное 198. См. также Дыхательная
нитратредукция

—	нитритное 200. См. также Дыхатель-
ная аммонификация нитрита; Дыхатель-
ная денитрификация

—	определение 121

—	селенатное 208

—	серное 206

—	сульфатное 204. См. также Дыхательная
сульфатредукция

—	теллуритное 209

—	фумаратное 174

—	хлоратное и перхлоратное 204

Дыхательная аммонификация нитрита 200.
См. также Дыхание, нитритное

Дыхательная денитрификация 202. См.
также Дыхание, нитритное

Дыхательная нитратредуктаза 198. См.
также Нитратредуктаза

Дыхательная нитратредукция 198. См так-
же Дыхание, нитратное

Дыхательная нитритредуктаза 200. См.
также Нитритредуктаза

Дыхательная сульфатредукция 204. См.
также Дыхание, сульфатное

Дыхательная цепь 121, 132

—	разветвленная 196

Железо-серный белок 52

—	ферредоксин 53

—	Шетна 294

—	C/Fe-SP 189

—	HiPIP 54, 168

Железо-серный кластер 53, 134, 155, 205, 287

Жирная кислота 298

—	биосинтез 299-301

Идиофаза 26

Изопентенилдифосфат (IDP) 306

— биосинтез 308

--альтернативный путь 308

--мевалонатный путь 308

Изоцитратлиаза 127

Кальдархеол 305

Кальдитол 306

Карбоксидотрофия 151. См. также Хемо-
литотрофия, углеродная

Каротин 227

/3-Каротин 315

Каротиноид 227-229, 307

—	биосинтез 313

—	строение 227

—	функции 308

Катаболизм 30

—	определение 30

К атап л еретическая реакция 126

Квази-фототрофия 216, 252-254

—	у архей 253

—	у бактерий 252

а-Кетоглутаратдегидрогеназа 124

а-Кетоглутаратсинтаза 259

Киназа 42

Кислород 193, 219, 246

—	активная форма (ROS) 293

—	регуляторное влияние на фототрофных
бактерий 219

Кислородвыделяющий комплекс 246-248

Кислородредуктаза 193. См. также Терми-
нальная оксидаза

—	дублирующая 196

—	ааз 194. См. также Цитохром с-оксидаза

—	bd 195

Кометаболизм 148

Корриноид 73, 116, 175. См. также Вита-
мин В12

Коэнзим

—	А 102

—	В 181. См. также 2-Меркапто-гептаноил-
треонинфосфат

—	F420 181. См. также Деазафлавин

—	F430 184. См. также Никель-порфиноид

—	М 180. См. также 2-Меркапто-
этансульфонат

Ксантофилл 227

—	биосинтез 316

Лактатдегидрогеназа 103, 111

Леддеран 159

Ликопин 315

/З-Ликопинциклаза 315

Линкерный полипептид 249

Литотрофия 31

Люцифераза 118. См. также Биолюминес-
ценция

Макроэргическое вещество 36. См. также
Фосфаген

Малатдегидрогеназа 125, 259

—	декарбоксилирующая 70. См. также Ма-
лик-энзим

Малатсинтаза 127

Малик-энзим 70. См. также Малатдегид-
рогенгаза, декарбоксилирующая

Малонил-СоА-редуктаза 262

Мевалоновая кислота 308

Межвидовой перенос водорода 108, 138

Менахинон 63, 199

Менахинонный пул 199

2-Меркапто-гептаноил-треонинфосфат 181.

См. также Коэнзим В
2-Меркапто-этансульфонат 180. См. также
Коэнзим М

Метаболизм 25-31

—	конструктивный 26

—	определение 25

—	первичный 26. См. также Генеральный
метаболизм

—	вторичный 26. См. также Специализиро-
ванный метаболизм

—	энергетический 25, 32-79

Метаболит 26

—	первичный 26. См. также Генеральный
метаболит

—	вторичный 26. См. также Специализиро-
ванный метаболит

Метан 138, 143, 178

— биосинтез 139. См. также Метаногенез

---автотрофный 138, 181

---гетеротрофный 138, 185

---кофакторы 139, 179-181

---механизм 179

— окисление 143. См. также Хемолитотро-
фия, углеродная

---анаэробное 148

---аэробное 143. См. также Метанотро-
фия

Метанмонооксигеназа (ММО) 144

Метаногенез 179. См. также Метан, био-
синтез

Метанол 145, 186

— окисление 145. См. также Метанолдегид-
рогеназа; Метилотрофия

Метанолдегидрогеназа 145

Метаноптерин (МРТ) 146

Метанотроф 147

— типа-1 148

—	типа-П 148

Метанотрофия 143. См. также Метан,
окисление, аэробное

Метанофеназин 181

Метанофуран (MF) 180

Метилмалонил-СоА-декарбоксилаза 76

Метилмалонил-СоА-карбокситрансфераза
175

Метилмалонил-СоА-цикл 175. См. также
Пропионат, биосинтез

Метилотрофия 149. См. также Метанол,
окисление

Метилтрансфераза 73, 183, 189

Метоксатин 145

Миксотрофия 30

—	определение 30

Молибдоптерин-гуанидин-динуклеотид
(MGD) 150, 153, 198. См. также Бак-
топтерин

Молибдоптерин-цитидин-динуклеотид
(MCD) 153

НАДН-дегидрогеназа 72, 132-136

Натриевая биоэнергетика 71-79

Натрийдвижущая сила (Sm/) 71. См. так-
же Трансмембранный электрохимиче-
ский потенциал, катионов Na+

Нейтрофил 48

Низкопотенциальный железопротеин 54.

См. также Железо-серный белок, HiPIP

Никель-порфиноид 184. См. также Коэн-
зим F430

Никотинамид-адениндинуклеотид (НАД)
90, 132

Никотинамид-адениндинуклеотид-фосфат
(НАДФ) 132

Нитратредуктаза 115, 198. См. также Ды-
хательная нитратредуктаза

Нитрит 158, 200

—	окисление 159. См. также Нитрифика-
ция, вторая фаза

Нитритредуктаза 160, 200. См. также Ды-
хательная нитритредуктаза

Нитрификация 158. См. также Аммиак,
окисление, аэробное; Хемолитотрофия,
азотная

—	вторая фаза 159

—	значение 161

—	первая фаза 158

Нитрогеназа 286-295

—	альтернативная 289

—	защита от кислорода 293

—	механизм действия 290-291

—	регуляция 292

—	строение 287

—	субстраты 289

Нуклеозидтрифосфат 37, 42

Обновление 26

Обращенный транспорт электронов 169, 182

Окислительный гексозомонофосфатный
путь 94-96. См. также Путь Варбурга-
Диккенса-Хореккера

Окислительный пентозофосфатный цикл
128-132. См. также Цикл Варбурга-
Диккенса-Хореккера

Окислительный стресс 197, 226, 293, 308

Окислительный цикл трикарбоновых кислот
123-128. См. также Цикл Кребса

Оксалоацетат 123, 261

Оксалоацетат-декарбоксилаза 74

Fe2+ -оксидаза 168

Мп2+-оксидаза 171

ДОксипропионатный цикл 262-264. См.
также Цикл Фукса-Холо

Органическое соединение 29

Органотрофия 31

—	определение 31

Осмотрофия 8

Парниковый газ 143, 202

Парниковый эффект 161, 178, 202, 270

Первичный метаболизм 26. См. также Ге-
неральный метаболизм
Первичный метаболит 26. См. также Гене-
ральный метаболит

Перенос группы 18

Пермеаза 13

-АВС 17, 21-23

Пиридоксальфосфат 317. См. также Вита-
мин Вб

Пирофосфат 37, 39

Пирофосфатаза 61. См. также ФФаза/ФФ-
синтаза

Пируват 101

—	автотрофный биосинтез 259

—	восстановление 103

—	гетеротрофное образование у архей 99

—	декарбоксилирование 103

—	окислительное декарбоксилирование 101

—	тиолазное расщепление 104

—	фосфорокластическое расщепление 103,
157

Пируват-карбоксикиназа 126

Пируватсинтаза 258

Питание 8-31

—	определение 8

—	субстратное 9

—	энергетическое 9

Полиизопреноид 306

—	биосинтез 310-316

—	функции 306

Полисульфан 163, 207

—	восстановление 207

—	окисление 163. См. также Хемолитотро-
фия, серная

Полисульфанредуктаза 207

Политионат 164

—	окисление 164

Полифосфат 42

Порин 19

—	общего назначения 19

—	специализированный 19

Потенциал фосфорилирования 41

Преархетидная кислота 305

Пренилтрансфераза 311

Пробиотик 113

Пропионат 174

— биосинтез 174. См. также Метилмало-
нил- Со А-цикл

Протеородопсин 55

Протондвижущая сила (Ртп/) 45. См. так-
же Трансмембранный электрохимиче-
ский потенциал, протонов

Протопорфирин IX 317

Прохлорофит 250, 321

Процесс Monsanto 192

Путь Варбурга-Диккенса-Хореккера 94-96.
См. также Окислительный гексозомо-
нофосфатный путь

Путь Вуда-Льюнгдала 279. См. также
Ацетил-коэнзим А, автотрофный биосин-
тез, у бактерий

Путь Вулфа. 278 См. также Ацетил-
коэнзим А, автотрофный биосинтез, у ар-
хей

Реакционный центр 216, 232

—	первичный акцептор 230

—	первичный донор 230

—	терминальный акцептор 230

—	типа RCI 232, 238

—	типа RCII 232, 235

Реакция Стикленда 117. См. также Броже-
ние, необычное

Ремедиация 198, 202, 213

Ретиналь 54

Рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксил аза/окси-
геназа (RuBisCO) 269

—	карбоксилазная реакция 271

—	оксигеназная реакция 271

Рибулозомонофосфатный цикл 265-267. См.
также Цикл Квайла

Рибулозо-5-фосфат 129

Светособирающая антенна 216, 230

—	зеленых бактерий 239. См. также Хлоро-
сома

—	оксигенных фототрофных бактерий 249

—	пурпурных бактерий 236

Свободная энергия 33

—	кажущееся изменение 34

—	определение 33

—	стандартное изменение 34

Сера 162

—	восстановление 206. См. также Дыхание,
серное

—	окисление 162. См. также Хемолитотро-
фия, серная

Сериновый цикл 267-269. См. также Цикл
О ’Коннора-Хэнсона

Серин-оксиметил-трансфераза 267

Сероводород 163

—	окисление 163. См. также Хемолитотро-
фия, серная

Сидерофор 21

Синглетное состояние 226

Синтаза жирных кислот 299

Сирогем 50, 206, 317

Сквален 313

Специализированный метаболизм 26. См.
также Вторичный метаболизм

Специализированный метаболит 26. См.
также Вторичный метаболит

Субстратное фосфорилирование 41-43. См.
также Фосфорилирование АДФ на
уровне субстрата

Сукцинат 74

—	биосинтез 176

Сукцинатдегидрогеназа 125, 136

Сукцинил-СоА-синтетаза 124

Сульфатредукция 204. См. также Дыха-
ние, сульфатное; Дыхательная сульфат-
редукция
Сульфид 163

—	образование 204. См. также Сульфатре-
дукция

—	окисление 163. См. также Фототро-
фия, аноксигенная; Фототрофия, факуль-
тативно аноксигенная; Хемолитотрофии,
серная

Сульфидный минерал 166

—	окисление 166

Сульфит 164

—	окисление 164. См. также Хемолитотро-
фия, серная

Таргетинг 10

Терминальная оксидаза 193. См. также
Кислородредуктаза

Терминальная редуктаза 193, 197

—	анаэробная 197

—	аэробная 193-197. См. также Кислород-
редуктаза; Терминальная оксидаза

Тетрагидрометаноптерин (НдМРТ) 146

Тетрагидрофолат (Ндфолат) 146, 190

Тетрапиррол 316

—	биосинтез 316-322

Тетратионат 164

—	окисление 164. См. также Хемолитотро-
фия, серная

Тиаминпирофосфат 68, 94, 98. См. также
Витамин Bi

Тиосульфат 163

—	окисление 163. См. также Хемолитотро-
фия, серная

Трансальдолаза 98, 129

Трансгидрогеназная реакция 132

Транскетолаза 98, 129

Трансмембранный электрохимический по-
тенциал 44

—	катионов Na+ 71. См. также Натрийдви-
жущая сила (Smf)

—	протонов 45. См. также Протондвижу-
щая сила (Pmf)

Транспорт 9-25

—	активный 13-19

—	антипорт 15, 68-70, 78

—	внутренний 10

—	вторичный 10

—	диффузия 11, 12, 14

—	— облегченная 13

--пассивная 13

—	импорт 10

--аминокислот 15

--железа 19-25

--сахаров 15

—	макромолекул 11

—	первичный 10

—	пограничный 9

—	секреция 11

—	симпорт 15

—	третичный 11, 16

—	трофический 11

—	унипорт 14

—	через СМ 12-19

—	через ОМ 19-25

—	экскреция 11

—	экспорт 10

—	downhill 10

— uphill 10

Третья биосфера 173

Триплетное состояние 226

Трофофаза 26

Убихинон 63

Убихинонный пул 64

Фарнезан 313

Фарнезол 313

Феофитин 223

Ферредоксин 53. См. также Железо-сер-
ный белок

Фикобилин 229, 319

Фикобилипротеин 229

Фикобилисома 249

Фитанол 313

Фитоин 311

Фитоиндесатураза 315

Флавинадениндинуклеотид (ФАД) 132, 185

Флавинаденинмононуклеотид (ФМН) 119,
134, 147

Флаводоксин 286

Формальдегид 145, 267

—	ассимиляция 267. См. также Рибулозо-
монофосфатный цикл; Цикл Квайла

—	окисление 145-147

Формиат 147

—	окисление 147

--автотрофное 147. См также Хемоли-
тотрофия, углеродная; Формиатотрофия

—	—гетеротрофное 115

Формиатдегидрогеназа 147, 150, 182, 199

Формиатотроф 149

Формиатотрофия 149. См. также Формиат,
окисление, автотрофное

Фосфаген 36-41. См. также Макроэргиче-
ское вещество

З-Фосфоглицериновый альдегид 88, 90. См.
также Глицеральдегид-З-фосфат

Фосфо кетолаза 94, 97

Фосфолипид 301

—	биосинтез у архей 303-306

—	биосинтез у бактерий 301-303

Фосфорил 36

Фосфорилирование АДФ 41, 56

—	мембранное 44-46

—	на уровне субстрата 41-43. См. также
Субстратное фосфорилирование

Фосфофруктокиназа 91

Фосфоэнолпируват 18, 43

Фосфоэнолпируват-карбоксилаза 126

Фотоакклиматизация 216, 231, 249

Фотосенсибилизатор 316

Фотосинтез 214, 220
— определение 214

Фотосинтетическая единица 231

Фотосинтетическая клубеньковая бактерия
253

Фотосистема 241

— вторая (ФСП) 244-246

— первая (ФС1) 241-244

Фототрофия 28, 214-254

— аноксигенная 217, 234-240

— оксигенная 217, 240-251

— факультативно аноксигенная 251

Фумаратгидратаза 125, 259

Фумаратредуктаза 136, 174

ФФаза/ФФ-синтаза 61. См. также Пиро-
фосфатаза

Хемиосмотический механизм 44, 45
Хемолитотрофия 80, 136-173

— азотная 157-161. См. также Аммиак,
окисление

— водородная 153-157. См. также Водород,
окисление

— железная 167-170

— марганцевая 170-172

— механизм 139

— определение 28

— серная 162-167. См. также Полисуль-
фан, окисление; Сера, окисление; Серо-
водород, окисление; Сульфид, окисление;
Сульфит, окисление; Тетратионат, окис-
ление; Тиосульфат, окисление

— углеродная 143-153. См. также Карбок-
сидотрофия; Метанотрофия; Метилотро-
фия; Формиатотрофия

Хемоорганотрофия 81

—	определение 81

Хемосинтез 137

—	определение 137

Хемотрофия 80-213

—	определение 27

Хинон 313

Хинонный пул 64

Хлоросома 239. См. также Светособираю-
щая антенна, зеленых бактерий

Хлорофилл 220, 223-226

—	биосинтез 320

—	главный 223

— вспомогательный 224

Хромофор 222

Q-Цикл 64

Цикл Варбурга-Диккенса-Хорреккера 128-
132. См. также Окислительный пенто-
зофосфатный цикл

Цикл Ивенса-Бьюкенена-Эрнона 258-262.

См. также Восстановительный цикл
карбоновых кислот

Цикл Квайла 265-267. См. также Рибуло-
зомонофосфатный цикл

Цикл Кельвина-Бенсона-Бэссема 269-275.
См. также Восстановительный пентозо-
фосфатный цикл

Цикл О’Коннора-Хэнсона 267-269. См.
также Сериновый цикл

Цикл Корнберга 127. См. также Глиокси-
латный шунт

Цикл Кребса 123-128. См. также Окисли-
тельный цикл трикарбоновых кислот

Цикл Фукса-Холо 262-264. См. также (3-
Оксипропионатный цикл

Цитохром 50-52

— дигемовый 62, 63, 151, 174, 203

— пентагемовый 201

— тетрагемовый 198, 200, 205, 235

— тригемовый 211

Цитохром bci (Ьб/)-комплекс 61-64

Цитохром с-оксидаза 194. См. также Кис-
лородредуктаза, ааз

Цитрат 74

— сбраживание 74, 116. См. также Броже-
ние, необычное

Цитратлиаза 74, 116, 259

Цитратсинтаза 124

Шиффово основание 55

Экзергоническая реакция 34

Экстрацитоплазматическое окисление про-
стых субстратов 65-67, 139

Эндергоническая реакция 34

Энергетический заряд 40

Энолфосфат 43

Энтальпия 33

Энтропия 33

Эффект Пастера 91
Учебное издание

Александр Васильевич Пиневич

МИКРОБИОЛОГИЯ
БИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТОВ

Учебник

Том II

Директор издательства Р. В. Светлов

Главный редактор Т. Н. Пескова

Верстка Е. М. Воронковой

Подписано в печать 01.03.2007. Формат 70x100 1/i6-

Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 26,8. Тираж 1000 экз. Заказ №111.

Издательство СПбГУ.

199004, С.-Петербург, В.О., 6-я линия, 11/21
Тел. (812) 328-96-17; факс (812) 328-44-22
E-mail: editor@unipress.ru
www.unipress.ru

По вопросам реализации обращаться по адресу:
С.-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 11/21, к. 21
Телефоны: 328-77-63, 325-31-76
E-mail: post@unipress.ru

Типография Издательства СПбГУ.

199061, С.-Петербург, Средний пр., 41
Широкий выбор научной, образовательной, справочной
литературы в объединенной книготорговой сети
«Книги университетских издательств»

в Санкт-Петербурге:

Книготорговая сеть Издательства СПбГУ

Магазин № 1 «Vita Nova»:

Университетская наб., 7/9

Тел.328-96-91;

E-mail: vitanova@itl3850.spb.edu

Филиал № 2:

Петродворец, Университетский пр., 28

Тел.428-45-91

Филиал № 3:

В. О., 1-я линия, 26
Тел.328-80-40

Филиал № 5:

Петродворец, Ульяновская ул., 1
(физический факультет)

Филиал № 6 «АКМЭ»:

В.О., Менделеевская линия, дом. 5
(здание исторического и философского факультетов)

Филиал № 7:

В. О., наб. Макарова, 6
(факультет психологии)

Филиал № 8:

Университетская наб., 11
(в холле филологического факультета)

Книжный магазин «Александрийская библиотека»

Наб. р. Фонтанки, 15 (здание РХГА)