Автор: Волина Е.Г.
Теги: физиология сравнительная физиология медицинская микробиология и паразитология биология микробиология
ISBN: 5-225-04818-8
Год: 2004
Текст
Учебная литература для студентов медицинских вузов
Е.Г.Волина, Л.Е.Саруханова
ОСНОВЫ ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ, ИММУНОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ
Рекомендуется Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для иностранных студентов медицинских вузов
Москва “Медицина”
2004
УДК 612.017.1 + 579.2 + 578(075.8)
ББК 52.64
В67
Рецензенты: С. А. Дратвин, д-р мед. наук, профессор, академик РАМТН; Р. Н. Реброва, д-р мед. наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ; Р. И. Коноплева, канд. мед. наук, доцент, зав. кафедрой микробиологии Рязанского государственного медицинского университета им. И. П. Павлова
Волина Е. Г., Саруханова Л. Е.
В67 Основы общей микробиологии, иммунологии и вирусологии: Учебное пособие.— М.: Медицина, 2004.— 256 с.: ил. (Учеб. лит. Для студентов мед. вузов) ISBN 5-225-04818-8
Учебное пособие написано в соответствии с программой подготовки студентов по специальностям: «Лечебное дело», «Фармация» и «Стоматология» — и на основе курса лекций, читаемых на медицинском факультете РУДН. Включает современные сведения по биологии микроорганизмов, факторам их патогенности, строению и функционированию иммунной системы. Состоит из 4 разделов: общая микробиология, инфекция, основы учения об иммунитете, общая вирусология.
Для студентов-иностранцев высших медицинских учебных заведений России.
ББК 52.64
ISBN 5-225-04818-8
© Е. Г. Волина, Л. Е. Саруханова, 2004
Все права авторов защищены. Ни одна часть этого издания не может быть занесена в память компьютера либо воспроизведена любым способом без предварительного письменного разрешения издателя.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие............................................... 8
Введение.................................................. 9
Раздел I
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Глава
Глава
Глава
1. Краткий очерк истории развития микробиологии . . .
2. Принципы систематики и классификации бактерий
3. Морфология микроорганизмов..................
3.1. Морфология бактерий.....................
3.2. Строение бактериальной клетки ..........
3.3. Морфология грибов. Принципы классифика-
Глава
ции .....................................
3.4. Простейшие. Морфология. Принципы классификации ......................................
4. Физиология бактерий .........................
4.1. Химический состав бактериальной клетки . . .
4.2. Питание бактерий.........................
4.3. Дыхание бактерий.........................
4.4. Рост и размножение бактерий..............
4.5. Пигментообразование. Светящиеся и аромато-
Глава
образующие бактерии.....................
5. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы
Глава
5.1. Взаимоотношения микроорганизмов..........
5.2. Асептика, антисептика, стерилизация, дезин-
фекция ...................................
6. Роль микроорганизмов в природе и их распростране-
Глава
ние .........................................
6.1. Распространение микроорганизмов в природе
6.2. Микрофлора тела человека и животных . . . .
7. Микробиология животного и растительного лекарственного сырья..................................
7.1. Микробиология животного лекарственного сы-
Глава
Глава
рья ......................................
7.2. Микробиология растительного лекарственного сырья .........................................
8. Санитарная микробиология......................
9. Химиотерапевтические препараты. Антибиотики . . .
9.1. Общая характеристика антибиотиков и их классификация..................................
9.2. Действие антибиотиков на микроорганизмы
9.3. Осложнения при антибиотикотерапии . . . .
11
17
21
21
24
33
37
42
42
43
51
53
55
56
58
60
65
68
70
77
77
79
86
88
90
94
о
9.4. Механизмы формирования антибиотикорези-
стентности у бактерий....................... 98
9.5. Принципы получения антибиотиков...........101
Глава 10. Генетика микроорганизмов......................107
Раздел II ИНФЕКЦИЯ
1 лава Глава Глава
Глава Глава
Глава
Глава
Глава
Глава
11. Патогенность микроорганизмов............
12. Роль макроорганизма в инфекционном процессе
13. Характеристика инфекционного процесса . . .
13.1. Формы инфекционного процесса . . . .
Раздел III
ОСНОВЫ УЧЕНИЯ ОБ ИММУНИТЕТЕ
14. Краткий очерк истории развития иммунологии . . . .
15. Факторы и механизмы иммунитета...............
15.1. Виды и формы иммунитета.................
15.2. Факторы неспецифической резистентности
15.3. Антигены................................
16. Иммунная система.........................
16.1. Органы иммунной системы ............
17. Формы иммунного ответа...................
17.1. Гуморальный иммунный ответ..........
17.2. Иммуноглобулины.....................
17.3. Клеточный иммунный ответ............
17.4. Цитокины............................
17.5. Иммунологическая толерантность.........
17.6. Реакции гиперчувствительности..........
18. Оценка иммунного статуса человека ..........
19. Прикладные аспекты инфекционной иммунологии
19.1. Иммунодиагностика инфекционных болезней
19.2. Иммунопрофилактика инфекционных болез-
ней ...................................
19.3. Иммунотерапия инфекционных болезней
Раздел IV
ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ
20. Строение вирусов, взаимодействие с клеткой. Принципы классификации...............................
20.1. Цитопатическое действие вирусов.........
21. Генетика и формы изменчивости вирусов........
22. Вирусная инфекция ...........................
22.1. Антигены вирусов .......................
22.2. Особенности противовирусного иммунитета
22.3. Иммунодиагностика вирусных инфекций . . .
23. Бактериофаги.................................
118
125
127
128
131
135
135
137
145
151
151
154
156
157
163
165
166
168
172
174
175
186
192
195
201
207
210
212
213
219
ПРИЛОЖЕНИЯ
1. Микрофлора желудочно-кишечного тракта человека .... 226
2. Содержание микроорганизмов в кишечнике человека в норме..................................................226
3. Нормативы безопасности питьевой воды в эпидемическом отношении по микробиологическим и пар а зито логическим показателям............................................227
4. Критерии оценки микробной обсемененности воздуха помещений аптек............................................228
5. Пробиотики — препараты нормофлоры..................228
6. Основные цитокины..................................231
7. Диагностическое значение изменения лейкограммы при патологических процессах, сопровождающихся иммунной не-д о статочностью ......................................235
8. Карта иммунологического обследования (тесты 1-го уровня) 236
9. Календарь профилактических прививок России (2002) . . . 237
10. Перечень зарубежных вакцин и иммуноглобулинов, зарегистрированных в Российской Федерации.....................238
Контрольные вопросы для самоподготовки студентов.......240
Словарь терминов.......................................249
ПРЕДИСЛОВИЕ
Подготовка будущих врачей, стоматологов, фармацевтов предусматривает прохождение курса общей и частной микробиологии, вирусологии и иммунологии.
Следует отметить, что в каждой специальности знание этой дисциплины необходимо для формирования представлений об этиологии и патогенезе инфекционных заболеваний, методах их диагностики и профилактики, молекулярнобиологических аспектах антибиотикотерапии и биотехнологии, а также о действии окружающей среды на микроорганизмы.
В медицинских вузах нашей страны обучаются иностранные студенты, для которых усвоение материала связано с рядом объективных трудностей. Одной из них является недостаточное знание русского языка, особенно на начальных курсах (I—III). Как раз на этот период и приходится прохождение такой сложной дисциплины, как микробиология. Основываясь на собственном, более чем 30-летнем опыте работы на кафедре микробиологии Российского университета дружбы народов, авторы постарались учесть специфику преподавания студентам-иностранцам и в максимально допустимой краткой форме представить необходимый материал, освещающий основные вопросы общей микробиологии, иммунологии и вирусологии.
В тексте даны пояснения некоторых слов и терминов, введены главы, необходимые для будущих фармацевтов (микробиология лекарственного сырья), расширен раздел «Химиотерапевтические препараты и антибиотики», в котором более подробно описаны принципы отбора продуцентов и получения препаратов. Для специалистов-стоматологов подробно дан состав микрофлоры ротовой полости. Сознательно сокращен материал, касающийся роли микроорганизмов в круговороте веществ в природе, и в качестве примера приведены лишь превращения углерода и азота, поскольку эти вопросы уже ранее обсуждались на занятиях по биологии.
Вместе с тем мы постарались затронуть основные темы, касающиеся инфекции и иммунитета с учетом наблюдающегося во всем мире роста заболеваний, связанных с нарушением функций иммунной системы.
Авторы с благодарностью примут все замечания и пожелания по материалу, изложенному в книге.
ВВЕДЕНИЕ
Микробиология — наука о мельчайших живых организмах-микробах. Свое название она получила от греческих слов micros — малый, bios — жизнь, logos — учение. Микробиология изучает строение микроорганизмов, их свойства и процессы, вызываемые микробами в организме человека, животных, растений, в различных объектах окружающей среды, а также систематику, генетику и экологию многочисленных представителей микромира.
Невидимые невооруженным глазом микроорганизмы окружают нас повсюду. Среди них есть патогенные, вызывающие заболевания человека, животных и растений; сапрофитные, осуществляющие круговорот веществ в природе, создающие ценное химическое, лекарственное и пищевое сырье, и условно-патогенные, способные стать патогенными при определенных условиях.
Микробиология — обширная научная дисциплина, подразделяемая на общую, медицинскую, санитарную, ветеринарную, сельскохозяйственную, промышленную и космическую.
Общая микробиология изучает морфологию, физиологобиохимические, генетические свойства микроорганизмов, их связи, распространение и роль в природе.
Медицинская микробиология решает вопросы, связанные с возбудителями инфекционных болезней человека. В зависимости от объектов исследования выделяют бактериологию (науку о бактериях), вирусологию (учение о вирусах), протозоологию (изучение простейших), микологию (объект изучения — грибы), иммунологию (наука о механизмах защиты организма от патогенных агентов).
К медицинской микробиологии относят фармацевтическую микробиологию, задачами которой стали создание средств и методов защиты лекарственного сырья и препаратов от разрушительного действия контаминирующих их микроорганизмов, усовершенствование эффективности методов асептики, антисептики и дезинфекции.
Санитарная микробиология ставит своей целью изучение микроорганизмов окружающей среды, оказывающих отрица- . тельное воздействие на ее объекты, организмы, и разрабатывает методы их индикации и обезвреживания.
Ветеринарная микробиология наиболее тесно связана по це
лям и задачам с медицинской. Объектами ее исследования служат возбудители заболеваний животных. Некоторые из них могут одновременно стать причиной болезней человека.
Промышленная микробиология (техническая) изучает микроорганизмы, используемые в производстве пищевых продуктов, лекарственных препаратов, химического сырья, биотоплива, при выделении редких и цветных металлов из руд.
Она включает в себя современную отрасль — биотехнологию и занимается также процессами очистки окружающей среды от загрязнений с использованием микроорганизмов. Промышленная микробиология с биотехнологией используют новейшие достижения генной инженерии.
Сельскохозяйственная микробиология исследует микроорганизмы, участвующие в круговоротах веществ в природе, создании почв и повышении плодородия. Сферой ее деятельности являются также бактериальные удобрения и разработка биологических методов борьбы с вредителями сельского хозяйства.
Космическая микробиология — новая отрасль. Она возникла и стала развиваться в 60-е годы XX в., после запуска первых искусственных спутников Земли и космических кораблей. Целью ее исследований стало изучение влияния космических излучений и невесомости на микроорганизмы, а также изменения нормофлоры космонавтов. В перспективе космическая микробиология будет заниматься исследованием микрофлоры других планет.
Раздел I
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Глава 1
КРАТКИЙ ОЧЕРК ИСТОРИИ РАЗВИТИЯ МИКРОБИОЛОГИИ
Задолго до открытия микроорганизмов люди сталкивались с процессами, вызываемыми микроорганизмами, в повседневной жизни. Они приготовляли вино из виноградного сока, хлеб из теста, молочнокислые продукты и т. д.
В трудах врачей древности в I—V в. до н.э. высказывались гипотезы о живой природе возбудителей заразных болезней.
«Днем рождения» микробиологии можно считать 1676 г. В голландском городе Делфте Антони ван Левенгук впервые увидел микроорганизмы. Он не был медиком, а обучался немного торговому делу и служил стражем судебной палаты. В его обязанности входили топка печи и уборка помещения. В свободное время он увлекался шлифованием стекол и с их помощью рассматривал окружающие мелкие объекты: капельки воды, уксуса, зубной налет, настои трав и др. Именно в них он впервые увидел «мелких зверушек». Так
Левенгук называл обнаруженных им подвижных существ. Любознательный наблюдатель тщательно зарисовывал все увиденное и отсылал рисунки с комментариями в Лондонское королевское общество. В 170 письмах, которые хранятся в Англии, представлены изображения всех форм бактерий — от шаровидных до извитых. Русский царь Петр I посетил Левенгука, беседовал с ним и привез в Россию первый микроскоп, подаренный ему голландцем.
Обнаруженные А. Левенгуком «зверушки» привлекли внимание естествоиспытате-ных с )ан и постави-
Антони ван Левенгук (1632— 1723)
Луи Пастер (1822—1895)
ли огромное количество вопросов, касающихся особенностей жизни новых живых существ.
Важнейшие открытия в микробиологии принадлежат французскому ученому Луи Пастеру (1822—1895). Природа щедро одарила этого человека. Химик по образованию, Л. Пастер имел степени бакалавра математических наук и литературы, обладал талантом художника-портретиста. Все это помогало ему в научной деятельности.
Пастер заложил основы нового направления в микробиологии — физиологического, доказав роль микроорганизм ов как воз буд ител е й многих биохимических процессов и заболеваний человека и животных.
После установления причин брожения вина сферой интересов ученого становятся микроорганизмы. Он показал, что каждый тип брожения (спиртовое, молочнокислое и др.) имеет своих возбудителей. Им открыто явление анаэробиоза, опровергнута возможность самопроизвольного зарождения живого, доказана микробная природа процессов гниения, введено в практику микробиологии множество методов исследования.
Изучение Л. Пастером возбудителей заболеваний началось с работы с насекомыми. Он установил, что причиной гибели шелковичных червей являются микроорганизмы и для предотвращения заболеваний необходимы профилактические меры. Открытие инфекционных болезней у насекомых послужило базой для разработки в дальнейшем биологических методов борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений.
Пастера по праву считают создателем медицинской микробиологии. Им открыта причина «родильной горячки», уносившей жизни рожениц; заложены основы асептики, антисептики, дезинфекции. Разработаны принципы аттенуации (ослабления вирулентности) патогенных штаммов микроорганизмов, что легло в основу иммунопрофилактики инфекционных болезней. В его лаборатории были впервые приготовлены живые аттенуированные вакцины для профилактики холеры кур, краснухи свиней, сибирской язвы у животных.
Имя Луи Пастера стало известно во всем мире после созда-
Роберт Кох (1843-1910)
ния вакцины против бешенства, спасшей жизни сотням людей, укушенных больными животными. Несмотря на успехи, путь Пастера в науке был трудным и требовал невероятного трудолюбия и мужества. Преодолев все, Пастер заслужил признание. В 1888 г. на народные средства, собранные по подписке в разных странах, в Париже был построен научно-исследовательский институт, первым директором которого стал Л. Пастер. Сейчас этот институт носит имя великого ученого. Уважение к заслугам и личности Луи Пастера лучше всего выражено в надписи на памятной медали, врученной ему 22 декабря 1892 г.: «Пастеру в день его семидесятилетия—- благодарные наука и человечество». Во всем мире именем великого французского исследователя названы научные и лечебные учреждения.
Прогрессу медицинской микробиологии способствовали открытия немецкого врача Роберта Коха (1843—1910). Разработанные в его лаборатории плотные питательные среды, способы окрашивания препаратов анилиновыми красителями, выделения чистых культур, а также микрофотографирования вывели микробиологию на новый методический уровень.
Основной целью исследований Р. Коха стало изучение патогенных микроорганизмов. В 1876 г. был опубликован его труд о сибирской язве, содержащий новые представления об этиологии и профилактике этого опасного заболевания. 24 марта 1882 г. Р. Кох сообщил об открытии возбудителя туберкулеза, а годом позже — о выделении чистой культуры холерного вибриона. Несмотря на то что в настоящее время возбудитель туберкулеза называется Mycobacterium tuberculosis, а холерный вибрион — Vibrio cholerae, они известны во всем мире как «палочка Коха» и «вибрион Коха». В 1905 г. Р. Кох был удостоен Нобелевской премии за открытия в области медицины.
Л. Пастер и Р. Кох создали в своих странах крупные школы микробиологов. В институте у Л. Пастера работал русский ученый И. И. Мечников (1845—1916) — создатель учения о фагоцитозе, организатор первой в России бактериологической станции в Одессе. Он занимался также изучением патогенеза
И. И. Мечников (1845—1916)
Н. Ф. Гамалея (1859—1949)
холеры, сифилиса; проблемами старения (связывая старение с деятельностью гнилостных бактерий кишечника). В 1908 г. за разработку клеточной теории иммунитета И. И. Мечников вместе с Паулем Эрлихом (1854— 1915) — создателем теории гуморального иммунитета был удостоен Нобелевской премии. Их открытия стали основой для развития иммунологического направления в микробиологии.
Одним из соратников И. И. Мечникова был Н. Ф. Гамалея (1859—1949). В 27 лет он был командирован из России к Пастеру, где изучал метод приготовления вакцины против бешенства. Гамалея работал затем с возбудителями холеры, туберкулеза, руководил после отъезда Мечникова за границу одесской школой микробиологов. Пастер высоко оценивал профессиональные качества Н. Ф. Гамалеи и способствовал созданию в России станций прививок от бешенства.
Л. С. Ценковскому (1822— 1887) отводят роль одного из основателей отечественной микробиологии. Он изучал не только бактерии, но и простейших и грибы. Им бы-
ла получена вакцина против сибирской язвы.
С. Н. Виноградский (1858— 1953) около 30 лет проработал в Пастеровском институте. Ему принадлежат первые открытия в области почвенной микробиологии. Он выделил микроорганизмы, способные из неорганических веществ синтезировать органические, и назвал их автотрофными, обнаружил бактерии, фиксирующие азот атмосферы.
Учеником С. Н. Виноградского был В. Л. Омелянский
(1867—1928) — один из пионеров технической микробиологии.
Открытием века стали исследования Д. И. Ивановского (1864—1920), обнаружившего первый вирус — вирус табачной мозаики, вызывающий поражение растения. С этого момента — 1892 г.— началось формирование вирусологии, В области новой науки работали выдающиеся ученые мира.
Среди них У, Стэнли — нобелевский лауреат, получивший кристаллы вируса табачной мозаики и установивший белково-нуклеиновую
Д. И Ивановский (1864—1920)
природу вирусов. Канадский микробиолог Д ’ Эре лль, открывший в 1917 г. бактериофаг, Л. А. Зильбер (1894—1966) — автор вирусогенетической теории происхождения опухолей, А. Сэбин, Д. Солк, М. П. Чумаков, А. А. Смородинцев, создавшие в 50—60-х годах XX в. вакцины против полиомиелита, резко снизившие заболеваемость этой тяжелой инфекцией.
В 1928 г. английский врач Александр Флеминг открыл пенициллин. В 1940 г. его соотечественники Г. Флори и Э. Чейн получили лечебный препарат этого первого антибиотика. За годы Второй мировой войны были выделены новые антибиотики из различных групп микроорганизмов. 3. В. Ермольева получила пенициллин из другого вида гриба — Penicillium; Г. Ф. Гаузе и М. Г. Бражникова выделили из бактерии Bacillus brevis грамицидин С; 3. Ваксман из лучистого грибка актино-мицета получил стрептомицин. Наступила эра антибиотиков. Медицина получила в свое распоряжение мощное оружие для борьбы с патогенными микроорганизмами. XX в. был ознаменован новыми открытиями в области иммунологии, вирусоло
гии, генетики и появлением имен новых исследователей.
В истории микробиологии есть героические страницы. Многие ученые в разное время и в разных странах проводили опыты по самозаражению возбудителями опасных инфекций, проверяли на себе эффективность и безвредность новых лекарственных препаратов, вакцин, сывороток. Они пытались детально изучить пути передачи, патогенез, клинику, способы профилактики и лечения заболеваний. Имена некоторых из них известны. Это самоотверженные, мужественные люди и пытливые исследователи. Русский врач Данила Самойлович
Д. С. Самойлович (1744—1805)
В. С. Киктенко (1910-1995)
(1744—1805) заражал себя гноем из бубона больного чумой, чтобы доказать роль микроба в этиологии заболевания и возможность предохранения от него с помощью’прививки — вариоляции. К. Петгенкофер, Д. К. Заболотный, И. Г. Савченко, И. И. Мечников проводили опыты по самозаражению холерой. Г. Н. Минх (1845— 1903) вводил себе кровь больного возвратным тифом, заболел и после выздоровления доказал, что возбудитель находится в крови. О. О. Мо-чутковский с той же целью заражал себя кровью больного сыпным тифом. В годы Великой Отечественной войны опыты по заражению туляремией проводил на себе В. С. Киктенко (1910-1995). В этот период он руководил эпидемиологической службой фронта.
После окончания войны В. С. Киктенко вернулся к прерванным им исследованиям по лептоспирозу, которые принесли ему международное признание. С 1961 по 1995 г. он возглавлял кафедру микробиологии медицинского факультета РУДН.
Действие вакцин испытывали на себе Н. Ф. Гамалея (вакцина против бешенства), А. Сэбин (вакцина против полиомиелита), Г. Н. Габричевский (неоднократно ис-
пытывал новые, полученные им и его сотрудниками препараты) и многие другие.
В коротком очерке истории развития микробиологии упомянуты лишь некоторые ученые. Более подробно мы пытались рассказать об определяющих этапах развития науки. Имена многих исследователей повторяются в микробиологи
ческих учреждениях ежедневно: например, когда производят посевы в чашки Петри (Роберт Петри был сотрудником Р. Коха), выполняют тиндализацию питательных сред (этот метод ввел Джон Тиндаль). Имена исследователей-первооткрывателей носят и микроорганизмы. Риккетсия Провачека — возбудитель сыпного тифа — названа так в честь американца Р. Риккетса и чеха С. Провачека, заплативших своими жизнями за открытие и изучение возбудителя опасного заболевания. Оба ученых погибли в разные годы от сыпного тифа.
Заслуги многих поколений микробиологов позволили ликвидировать или значительно снизить уровень заболеваемости при некоторых инфекциях, организовать производство лекарственных и биологических препаратов и разработать методы диагностики, профилактики и лечения болезней, вызванных микроорганизмами.
Микробиология тесно связана с другими направлениями медицины и отраслями науки. Постоянны ее связи с хирургией, дерматовенерологией, терапией, эпидемиологией, стоматологией, фармакологией и др. Микробиология сотрудничает с пищевой, химической, нефтедобывающей отраслями промышленности. Этот перечень можно было бы продолжить. В нашем учебнике мы подробнее остановимся на вопросах общей медицинской микробиологии, иммунологии и вирусологии.
Глава 2
ПРИНЦИПЫ СИСТЕМАТИКИ И КЛАССИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
Объектами изучения микробиологии являются представители трех «царств» — Procariotae, к которому относятся бактерии, Eucariotae, включающего грибы (Mycota) и простейших (Protozoa), и Vira, объединяющего вирусы.
Общий признак всех микроорганизмов — очень мелкие размеры. Они невидимы простым глазом и обнаруживаются при помощи микроскопа.
Величину бактерий измеряют в микрометрах (1 мм — 1000 мкм), а размеры органелл микроорганизмов выражают в нанометрах (1 мкм — 1000 нм). При электронной микроскопии используют еще более мелкие единицы — ангстремы (1 мм — 10 000 000 А).
Систематика и классификация микроорганизмов с целью распределения их по группам — таксонам проводится с учетом совокупности признаков и свойств: морфологических, тинк-ториальных (способности окрашиваться красителями), куль
туральных, физиолого-биохимических, антигенных, организации генома. Дифференциальными признаками служат также подвижность, спорообразование, чувствительность к бактериофагам и др.
Методы изучения микроорганизмов. При изучении микроорганизмов используют ряд методов:
1. Бактериоскопический (микроскопический). С помощью микроскопа в специально приготовленных препаратах изучают форму, структуру, размер, подвижность, тинкториальные свойства. Используются различные типы микроскопов — световой, фазово-контрастный, темнопольный, люминесцентный и электронный.
2. Бактериологический метод предусматривает посев микроорганизмов на питательные среды, изоляцию отдельных видов в чистой культуре, изучение характера их роста и идентификацию.
3. Биохимический метод дает информацию о ферментативных свойствах.
4. Серологический метод используется в целях изучения антигенной структуры микроорганизма.
5. Биологический метод, основанный на введении экспериментальным животным или растениям выделенных микроорганизмов или их метаболитов, устанавливает наличие или отсутствие у них патогенности (способности вызывать заболевание). В тех случаях, когда идентификация с помощью перечисленных методов затруднена, современная микробиология использует ряд методов молекулярно-генетического контроля: молекулярных генных зондов, полимеразную цепную реакцию и др.
Каждый изученный микроорганизм занимает свое место в системе классификации, где существуют такие таксономические категории, как царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и др.
Одна из основных категорий для микроорганизмов — вид.
В понятие о виде входит представление о нем как об «эволюционно сложившейся совокупности микроорганизмов, имеющих общее происхождение, единый генотип и сходные признаки и свойства, проявляющиеся в стандартных условиях».
Близкие виды объединяют в роды. Семейства состоят из родов, а несколько семейств входит в порядок.
Кроме этого, постоянно используются такие понятия, как чистая культура, штамм, клон, вариант.
Клон — потомство клеток микроорганизмов, полученных из одной клетки или одной споры. Это генетически идентичные и фенотипически однородные культуры. Клоны можно выделить путем культивирования изолированной клетки или спо
ры на питательной среде. При этом обычно используют неселективные среды и проводят на них многократные пересевы клонируемых культур.
Чистая культура — это совокупность микроорганизмов одного вида или варианта, полученная из одной изолированной колонии.
Штамм — чистая культура, выделенная из определенного источника (организма человека, животных, окружающей среды). Штаммы или обозначают номерами, или указывают источник их выделения (вода, почва, кишечник и т. д.), или географическое название места, из которого он был изолирован (вирус гриппа «Гонконг»).
В некоторых случаях для того, чтобы подчеркнуть определенные различия особей одного вида, используют понятие «вариант», сокращенно «вар». Выделяют морфовары — морфологические варианты, хемовары — имеющие химические различия; серовары различаются по антигенной структуре, био-вары — по физиолого-биохимическим свойствам, фаговары — по отношению к бактериофагам.
Название микроорганизма выражают двумя словами, которые пишут по-латыни. Первое — это название рода, начинающееся с прописной (заглавной, большой) буквы. Второе слово обозначает видовое название и пишется со строчной (маленькой) буквы. Такое обозначение принято во всем мире, например Staphylococcus aureus — золотистый стафилококк; Escherichia coli — кишечная палочка.
Названия таксонов, которые занимают в систематике место выше рода, выражают одним словом, например семейство Еп-terobacteriaceae, порядок Actinomycetales, «царство» Vira.
Важнейшим, основополагающим признаком систематики и классификации является тип организации клетки. Все микроорганизмы делятся на прокариоты и эукариоты. Бактерии относятся к царству прокариот, а грибы и простейшие — к царству эукариот. Принципиальное различие этих царств заключено в самих названиях. Эукариоты — истинноядерные (от ей — полностью и karion — ядро) говорит о том, что у представителей этого таксона ядро обособлено оболочкой от цитоплазмы и органелл клетки.
Прокариоты (от лат. pro — вместо и греч. karion — ядро) имеют ДНК, не отделенную оболочкой. Эукариоты содержат также мембранные органеллы, которых нет у прокариот, т. е. клетки эукариот имеют более высокий уровень организации. В табл. 2.1 приведены некоторые принципиальные различия между эу- и прокариотами.
По классификации Берджи (1989), бактерии в царстве прокариот делятся на 4 отдела: 1 — Gracilicutes, включающий грамотрицательные бактерии с тонкой клеточной стенкой; 2 — Firmicutes — грамположительные бактерии с толстой стен-
Таблица 2.1. Некоторые основные различия строения клеток эукариот и прокариот
Структуры и свойства клеток
Представители
ДНК
Цитоплазма
Прокариоты
Эукариоты
Митохондрии Аппарат Гольджи Эндоплазматическая сеть
РНК и белки
Органеллы движения
Лизосомы
Мезосомы Деление клеток Метаболизм
Эндоспоры как способ сохранения в неблагоприятных условиях
Бактерии
Кольцевая, в цитоплазме нет ядерной мембраны
Отсутствует цитоскелет, нет цитоплазматических течений Нет
» »
Синтезируются в одном компартменте
Жгутики
Нет Есть Бинарное Аэробный или анаэробный У бацилл
Животные, растения, грибы, простейшие Организована в хромосомы и окружена ядерной мембраной Есть
»
»
»
РНК синтезируется в ядре, синтез белков — в цитоплазме Жгутики, псевдоподии, реснички Есть
Нет
Митоз или мейоз
Аэробный, редко анаэробный
Нет
кой; 3 — Tenericutes, к которому относятся микоплазмы, мягкие, нежные, лишенные ригидной клеточной стенки.
Mendosicutes — архебакгерии с дефектной клеточной стенкой, различающиеся строением рибосом, мембран и рибосомальной РНК.
В первом отделе представлено 16 групп бактерий, во втором — 14, в третьем — 1, подразделяющаяся на 2 подгруппы, и в четвертом — 5.
В дальнейшем мы остановимся на более подробном описа-
нии представителей тех царств и групп микроорганизмов, сре
ди которых встречаются виды, патогенные для человека и животных. Это бактерии, грибы, простейшие и вирусы. Классификация грибов, простейших и вирусов приводится в соответ
ствующих разделах.
Глава 3
МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
3.1. Морфология бактерий
Самую многочисленную группу прокариот представляют собственно бактерии. По форме они подразделяются на шаровидные, палочковидные и извитые (рис. 3.1).
I. Шаровидные — кокки (от лат. coccus — зерно) имеют форму шариков. В зависимости от их расположения различают:
моно- или микрококки (micrococcus), характеризующиеся беспорядочным одиночным расположением;
диплококки (diplococcus) — парные кокки;
тетракокки (tetracoccus), состоящие из четырех кокков. Такое расположение обусловлено делением в двух взаимно перпендикулярных плоскостях;
стрептококки (streptococcus), располагающиеся в виде цепочек;
стафилококки (staphylococcus), похожие на гроздья винограда и образующие скопления клеток без определенной системы;
Шаровидные
Тетракокки Стрептококки Стафилококки Сарцины
Монококки Диплококки
Палочковидные
Бациллы
Бактерии
Извитые
Вибрионы
Спирохеты
Спириллы
Рис. 3.1. Морфология бактерий.
Рис. 3.2. Деление кокков [по М J Pelczar, R D Reid, 1981]
А —диплококки, Б — стрептококки, В — тетракокки, Г — стафилококки, Д — сарцины
сардины (sarcma) — кокки, соединенные в виде пакетов (кубиков) Деление происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях (рис 3 2)
II Палочковидные микроорганизмы подразделяются на бактерии и бациллы
Бактерии (bacterium) не образуют спор, а бациллы (bacillus) образуют Палочковидные бактерии имеют различные размеры и могут располагаться поодиночке, парами (диплобактерии или диплобациллы), цепочками (стрептобактерии или стреп-тобациллы)
Споры у бацилл образуются только при неблагоприятных условиях внешней среды (недостатке питательных веществ, воздействии температуры, изменении pH среды и т д) Они не являются способом размножения, а служат для сохранения вида Спорообразующие бактерии делятся на бациллы и клостридии Последние формируют крупные споры, диаметр которых превышает ширину клетки, что приводит к изменению ее формы Клостридии по типу дыхания являются анаэробами
Ill Извитые формы
вибрионы (от лат vibrio — изгибаюсь) похожи по форме на запятую,
спириллы (от лат spira — виток) имеют несколько завитков в виде спирали
Кроме перечисленных, обнаружены бактерии, клетки которых имеют треугольную, квадратную, тарелковидную форму Из природных субстратов выделены бактерии червеобразной и звездчатой форм Встречаются нитчатые и ветвящиеся бактерии Причиной полиморфизма могут стать воздействия внешней среды, а также различные стадии роста микроорганизмов Перечисленные нетипичные формы встречаются обычно среди сапрофитных бактерий Для патогенных наибо
лее характерны шаровидные, палочковидные и извитые клетки
К бактериям относятся также
• спирохеты (от лат spira — виток, изгиб и chaite — волосы), представляющие собой длинную, извитую клетку Состоят из осевой нити, выполняющей локомоторную (двигательную) и опорную функции; цитоплазмы, цитоплазматической мембраны, оболочки и нуклеоида Осевая нить содержит фибриллы В цитоплазме расположены включения, типичные для прокариот,— нуклеоид, рибосомы, мезосомы и др Протоплазма спиралевидная Спирохеты совершают поступательные, сгибательные и вращательные движения Среди спирохет есть патогенные К ним относятся возбудители сифилиса, лептоспироза, возвратного тифа (рис 3 3),
• риккетсии (nckettsia) — мелкие полиморфные клетки
кокковидной, палочковидной кетсии — облигатные внутриклеточные паразиты, не растущие на питательных средах Для их культивирования используют организм животного, куриные эмбрионы и культуру тканей Среди риккетсий есть виды, патогенные для человека (возбудитель сыпного тифа и др ) Название они получили в честь американского исследователя Риккетса;
Рис. 3.3. Морфология спирохет
А — спирохета, Б — лептоспира, В — кристиспира, Г — трепонема
или нитевидной формы Рик-
• хламидии (от греч. chlamydia — плащ, мантия) — мелкие бактериоподобные клетки, облигатные внутриклеточные паразиты, не культивируемые на питательных средах. Существуют определенные стадии развития хламидий. Инфекционная форма называется элементарным тельцем. Это стадия покоя в период перехода из одной клетки в другую, от одного хозяина к другому. При попадании в клетки хламидии начинают превращаться в ретикулярные тельца и могут делиться. Цитоплазматические включения, которые образуются в результате деления, называются микроколониями. В них созревают элементарные тельца. Они окружены общей оболочкой — хламидой. Проникновение хламидий в клетку осуществляется путем фагоцитоза. После образования микроколоний клетка-хозяин разрушается и элементарные тельца выходят наружу. Хламидии вызывают такие заболевания, как трахома, орнитоз и др.;
• микоплазмы — мелкие полиморфные прокариоты, лишенные ригидной клеточной стенки. Образуют на плотной питательной среде колонии, похожие на «яичницу-глазунью» с непрозрачным центром и прозрачным круглым контуром. Морфологически неоднородны: имеют вид мелких овальных или крупных шаровидных клеток. Иногда встречаются ветвящиеся формы. Вызывают заболевания дыхательных путей и урогенитальной сферы. Мало устойчивы во внешней среде;
• актиномицеты — лучистые грибки (от греч. actis —луч и mykes — гриб). Бактерии, сходные по морфологии с грибами. Образуют мицелий и способны делиться путем фрагментации мицелия на отдельные клетки, а также путем спорообразования. Споры образуются на концах воздушного мицелия. Вызывают заболевания человека и животных (актиномикоз). В пораженном организме образуют друзы — видоизмененный мицелий.
3.2. Строение бактериальной клетки
Капсула — наружный защитный слой (рис. 3.4). Капсула расположена снаружи клеточной стенки бактерии. Ее толщина и химический состав неодинаковы у бактерий различных видов. Иногда капсула в несколько раз превышает по толщине клетку. В некоторых случаях она очень тонкая. В зависимости от толщины и консистенции различают макро- и микрокапсулы и слизистые чехлы. Макрокапсула хорошо видна в световом микроскопе (рис. 3.5), а микрокапсулу можно обнаружить только при электронно-микроскопическом исследовании. Бесструктурное, аморфное вещество, окружающее клетку, называют слизистым чехлом.
Обычно капсулы представлены полисахаридами. В некоторых случаях вместе с полисахаридами присутствуют полипептиды, белки, мукополисахариды и липополисахариды.
1
Рис. 3.4. Строение бактериальной клетки.
1 — капсула; 2 — клеточная стенка; 3 — периплазма с перегородками; 4 — цитоплазматическая мембрана; 5 — мезосомы; 6 — нуклеоид; 7 — плазмиды; 8 — жгутик; 9 — рибосомы; 10 — включения серы; 11 — липидные включения;
12 — фимбрии (ворсинки, пили); 13 — полисахаридные включения.
Капсулы выполняют ряд функций. Они защищают клетку от неблагоприятных внешних воздействий. С их помощью некоторые бактерии более прочно присоединяются к субстрату. Например, постоянный обитатель ротовой полости Streptococcus mutans приклеивается с помощью капсулы к поверхности зубов и образует «бляшки». Вещества бактериальных капсул обладают антигенными свойствами. Так, серотипирование пневмококков проводят на основании антигенных особенностей капсул. Для некоторых сапрофитных микроорганизмов
Рис. 3.5. Капсулы у бактерий.
(азотобактера) капсульные вещества служат дополнительным источником питания. Капсулы относят также к факторам патогенности. Их утрата приводит к снижению или потере бактерией вирулентности.
Способностью к капсулообразованию обладают не все бактерии, и она не является постоянным признаком. Патогенные бактерии образуют капсулу в микроорганизме и утрачивают ее при культивировании в бессывороточных питательных средах.
Клеточная стенка — поверхностная структура. Она представляет собой внешнюю оболочку, окружающую бактерии. Выполняет функции защиты от внешней среды, поддерживает и сохраняет форму клетки и участвует в транспорте питательных веществ и продуктов метаболизма.
Структура и химический состав клеточной стенки постоянны для определенного вида и служат дифференциальными признаками.
По химическому составу клеточная стенка — сложный биогетерополимер. Основной компонент в ней представлен гликопептидом, который известен под разными названиями: муреиновый комплекс (он же муреин), пептидогликан, мукопеп-тид. Чаще всего в литературе употребляют термины пептидогликан или муреин. Свое название муреин получил от латинского слова murus (стенка). Этот гетерополимер специфичен для прокариот. Он построен на основе чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных вместе с помощью р-1,4-гликозидных связей. К N-ацетилмурамовой кислоте присоединяется пептидная часть, состоящая из аминокислот (от 3 до 6) в L- и D-формах. В зависимости от количества и состава кислот в пептидной части различают хемотипы.
Муреин придает стенке прочность, содержит положительные и отрицательные заряды и играет определенную роль во взаимодействии клетки с иммунной системой макроорганизма. Муреин проявляет неспецифический адъювантный эффект, усиливая иммунный ответ на введение антигена.
На муреин оказывают отрицательное воздействие литические ферменты, а также антибиотики. В 1884 г. датский исследователь Христиан Грам предложил метод, который стали применять в микробиологии для окраски бактерий. Этот метод включает последовательную обработку клеток генциан-виолетом (красителем триметилфенилового ряда) — йодом спиртом — водой — фуксином. По отношению к окраске по Граму все бактерии делятся на грамположительные (грампо-зитивные) и грамотрицательные (грамнегативные). Первые приобретают в итоге сине-фиолетовую окраску, поскольку
прочно удерживают комплекс генцианвиолет — йод и не обесцвечиваются после обработки препарата спиртом. В отличие от них грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом и их докрашивают фуксином в яркий розовый цвет. Окраска по Граму является важным дифференциально-диагностическим признаком бактерий. Конечный результат окраски зависит от строения и химического состава клеточной стенки.
Рассмотрим более подробно эти различия грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий.
Муреин содержится в оболочках каждой из групп, но его количество и толщина слоя неодинаковы. У грамположитель-ных микроорганизмов муреин многослойный и занимает от 50 до 80 % клеточной стенки. Грамотрицательные бактерии имеют однослойный муреин, составляющий только 1—10% массы клеточной стенки.
Отличительная особенность клеточной стенки грамполо-жительных микроорганизмов состоит в том, что в ней содержатся тейхоевые кислоты. Это полимерные соединения, связанные с муреином. Интересно, что оба названия: «муреин» и «тейхоевая» — переводятся как «стенка», «стеночная». В первом случае это перевод с латинского, а во втором — с греческого языка. Здесь нет никакого противоречия, поскольку оба компонента входят в состав одной и той же структуры и название соответствует их «адресу». Многослойность пептидогликана у грамположительных бактерий обусловлена его связью с тейхоевыми кислотами.
Стенка грамотрицательных бактерий содержит сложный полимерный липополисахаридный слой (ЛПС). Над ним расположен слой липопротеида. Здесь же локализованы специализированные белки-порины, проходящие через ЛПС и участвующие в процессе транспорта веществ.
Липополисахарид обладает токсическими и антигенными свойствами. Он обеспечивает клетке меньшую проницаемость.
Специфика организации клеточной стенки бактерий определяет не только их цвет при окраске по Граму, но и степень устойчивости к воздействию ряда факторов, в частности к антибиотикам.
В клеточной стенке некоторых бактерий (возбудителя туберкулеза, лепры) находится миколовая кислота, обеспечивающая этим микроорганизмам устойчивость к кислотам.
Обычно клеточная стенка тесно прилегает к цитоплазматической мембране. Иногда между ними находится пространство, называемое периплазмой или периплазматическим пространством. В нем содержатся ферменты. Периплазма обычно встречается у грамотрицательных бактерий. Ее толщина составляет не более 10 нм.
В некоторых случаях на поверхности клеточной стенки
грамположительных бактерий присутствуют молекулы белков, выполняющих ряд функций у различных микроорганизмов. У стрептококков нередко встречаются белковые ворсинки М-протеина, участвующие в адгезии, прикреплении к клеткам эпителия, склеивающие стрептококки между собой. Белок «А» у стафилококков способен вызывать агглютинацию эритроцитов, препятствовать фагоцитозу и др. Указанные белки, несмотря на их расположение и форму, не считаются структурными элементами клеток.
Существуют микроорганизмы, не имеющие клеточной стенки. Причины ее отсутствия могут быть разными. У микоплазм это видовой, врожденный признак. Клетки могут полностью или частично утратить клеточную стенку под действием ряда факторов. Впервые это явление было отмечено сотрудниками Института имени Д. Листера в Англии. Микроорганизмам, лишенным клеточной стенки, дали название L-форм по первой букве названия (листеровский институт). Превращение бактерий в L-форму часто происходит под действием таких антибиотиков, как пенициллин. L-формы образуют грамположительные и грамотрицательные бактерии. Они могут длительно выживать в организме и на питательных средах, полиморфны (в виде нитей, шаров), имеют разные размеры — от 0,7 до 50 мкм. Могут размножаться, причем не только делением, как все бактерии, но и почкованием, и путем шизогонии. Способны к длительной персистенции в макроорганизме. Биохимическая активность, антигенные свойства и вирулентность L-форм снижены, а резистентность к действию антибиотиков и антител выше, чем у исходных клеток. Образование L-форм меняет морфологию бактерий, способность окрашиваться обычными методами, физиолого-биохимические свойства. Их можно образно сравнить с человеком, сделавшим пластическую операцию, после которой он становится неузнаваемым. Подобная «неузнаваемость» L-форм создает трудности при диагностике заболеваний, требует новых тестов и методов выделения и идентификации.
Есть нестабильные и стабильные L-формы. Первые восстанавливают клеточную стенку, как только прекращается действие трансформирующего фактора, а вторые утрачивают способность к реверсии. Клетки с полностью утраченной клеточной стенкой называют протопластами, а с не полностью разрушенной — сферопластами.
Протопласты и сферопласты имеют ряд сходных признаков, которые заключаются в том, что они образуются под действием пенициллина, лизоцима и других факторов, действующих на пептидогликан бактериальной клетки. Обе формы способны некоторое время переживать и даже размножаться в средах с повышенным осмотическим давлением и ревертиро-вать (возвращаться) к исходному морфологическому типу при 28
устранении индуцирующего фактора и культивировании в среде с желатиной или другими стабилизаторами.
Различия состоят в том, что протопласты образуют грампо-ложительные бактерии, а сферопласты — грамотрицательные. Кроме того, протопласты, у которых клеточная стенка отсутствует полностью, имеют шаровидную форму и резистентны к действию фагов, антител и антибиотиков.
Сферопласты за счет частично утраченной клеточной стенки приобретают сферическую или полусферическую форму и не утрачивают чувствительности к перечисленным выше факторам.
Цитоплазматическая мембрана прилегает к клеточной стенке с внутренней стороны и отграничивает цитоплазму. Ее разрушение влечет за собой гибель клетки. У прокариотных микроорганизмов мембрана выполняет защитную, метаболическую функции, участвует в процессе деления клеток и в спорообразовании.
От 15 до 30% (иногда до 50%) трехслойной цитоплазматической мембраны составляют белки. Большая их часть представлена фосфолипидами. В ней содержатся также углеводы и малые количества РНК. Условия обитания во внешней среде и условия культивирования на питательных средах влияют на химический состав цитоплазматической мембраны, в которой сосредоточены ферменты, участвующие в процессах питания и дыхания. В сторону цитоплазмы от нее отходят особые образования — мезосомы. Функции мезосом до конца не выяснены, но полагают, что они участвуют в тех же процессах, что и ЦПМ.
У сапрофитных фотосинтезирующих бактерий в цитоплазматической мембране располагаются особые системы, имеющие вид трубочек, пузырьков, пластинок. Это хромофоры и тилакоиды. Они могут появляться и исчезать в зависимости от освещенности: например, в темноте исчезают, а на свету появляются.
Цитоплазма — коллоидная система, состоящая из белков, углеводов, жиров, минеральных веществ, ДНК и РНК. В цитоплазме бактерий разных видов могут содержаться гликоген, сера, кальций, крахмалоподобный волютин и др. Химический состав протоплазмы — дополнительный дифференциальный признак. Некоторые включения выявляются специальными методами окраски. В частности, при окраске по Нейссеру обнаруживаются зерна волютина, расположенные биполярно на концах клетки возбудителя дифтерии. В отличие от эукариот цитоплазма бактерий не имеет отдельных изолированных участков — компартментов.
Рибосомы — рибонуклеопротеидные частицы с константой седиментации 70. Константа седиментации — величина, характеризующая скорость оседания частиц при центрифугиро-
н
Сахар
Аденин
Тимин
Сахар
Н—N
= N
Н
Н—N
Сахар
Цитозин
Гуанин
N —Н
Б
Рис. 3.6. Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
А — двойная спираль молекулы ДНК; Б — азотистые основания, соединенные связями
вании в определенных условиях. Каждая рибосома состоит из 2 субъединиц разной величины и скорости оседания. Рибосомы участвуют в синтезе белка, перед началом которого субъединицы объединяются в одну частицу.
Генетический материал бактериальной клетки представлен ДНК. Его называют также геномом клетки, ядерным аппаратом, нуклеоидом. Геном у прокариот не имеет мембраны и представляет собой компактное образование, содержащее двухнитевую молекулу ДНК, расположенную в виде кольца. ДНК клетки часто называют бактериальной хромосомой. В состав ДНК входит 4 азотистых основания: аденин, гуанин, тимин и цитозин (рис. 3.6). Они соединены в молекуле водородными связями и образуют пары — аденин + тимин (А+Т), гуанин + цитозин (Г+Ц). Для дифференциации видов микроорганизмов используют методы, позволяющие определить процентное содержание Г+Ц в молекуле ДНК, в которой закодирована вся генетическая информация клетки.
Плазмиды представляют собой внехромосомные молекулы
Рис. 3.7. Типы расположения жгутиков у бактерий.
1 — монотрих; 2 — лофотрих; 3, 4 — ам-фитрихи; 5 — перитрих [по Е. Н. Кондратьевой, 1972, G. Schlegel, 1972].
двуспиральной ДНК, расположенные в цитоплазме. Они имеют маленькую молекулярную массу. ДНК плазмиды связана с белком. Известно несколько типов плазмид, каждая из которых выполняет определенные функции (подробно о плазмидах читайте в главе 10).
Жгутики — органоиды движения. Они состоят из базального тела, локализованного в цитоплазматической мембране, крюка и нити. Жгутики проходят через клеточную стенку и располагаются снаружи клетки в виде нитей. В состав жгутиков входит белок флагеллин, обладающий антигенностью, специфичностью (Н-антиген). В зависимости от количества жгутиков и их расположения подвижные бактерии подразделяют на монотрихи (один жгутик расположен на конце клетки); лофотрихи (пучок из нескольких жгутиков, сосредоточенных на одном из концов клетки), амфитрихи (по одному или пучками жгутики расположены биполярно на концах клетки), перитрихи (жгутики расположены по всей поверхности клетки) (рис. 3.7).
В некоторых случаях наблюдается смешанное жгутикова-ние. Оно характерно, в частности, для псевдомонад и вибрионов. При изменении условий среды у обычных монотрихов-вибрионов могут появиться жгутики на боковой (латеральной) поверхности клетки. Описано также латеральное жгутикова-ние (жгутики расположены на одной из боковых поверхностей клетки) или смешанное полярно-перитрихиальное (жгутики располагаются по всей поверхности, а один из них, большей длины,— на одном из концов клетки).
Скорость движения у бактерий неодинакова. Достаточно быстро передвигаются спириллы, вибрионы. Скорость последних доходит до 100 мкм в 1 с. На звание чемпиона может претендовать холерный вибрион, способный проплыть 80 см (!) за час. Наличие жгутиков, их расположение, структура антигенов — важные диагностические признаки.
Помимо движения с помощью жгутиков, отмечено «скольжение». Его механизм изучен недостаточно. Бактерии способ
ны двигаться под воздействием некоторых факторов или веществ. Это так называемый таксис. Движение может быть направлено как в сторону раздражителя (положительный таксис), так и от него (отрицательный таксис). Различают аэро-, хемо-, фото-, термо-, гидро-, гео-, магнето- и другие таксисы.
Ворсинки (фимбрии, пили) в виде выростов располагаются на поверхности клетки, но не участвуют в движении. Известно несколько типов ворсинок. Одни из них помогают бактериям прикрепляться к субстрату (адгезироваться), другие участвуют в процессе конъюгации.
Спора образуется у бацилл, представляет стадию покоя. Одна клетка превращается в одну спору. Спорообразование не является способом размножения, это приспособление для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды.
Процесс спорообразования проходит последовательно, в несколько стадий, и занимает несколько часов. К факторам, индуцирующим спорообразование, относятся изменения температуры, pH, недостаток питательных веществ, действие ток- а сических продуктов и др.
Вначале в клетке изменяется морфология нуклеоида. ДНК концентрируется в компактную структуру, которая отходит к одному из полюсов клетки. В этом месте формируется проспора. Часть цитоплазмы клетки вместе с хромосомой отделяется цитоплазматической мембраной, покрывается второй оболочкой, и проспора совершенно изолируется от мембраны материнской клетки. Вслед за этим между двумя слоями мембраны проспоры образуется слой муреина. Он несколько отличается от муреина клеточной стенки. Синтезируется толстый слой оболочки споры (кортекс). Снаружи кортекс покрыт дополнительной толстой, рыхлой оболочкой. После этого вегетативная клетка разрушается. Процесс спорообразования протекает в течение 18—20 ч. Спора попадает во внешнюю среду и сохраняется там длительное время. При создании благоприятных условий спора прорастает в вегетативную клетку в течение 4—5 ч (рис. 3.8). Споры могут располагаться в центре клетки (центрально), на одном из концов (терминально) или ближе к одному из концов (субтерминально). Иногда при спорообразовании диаметр споры превышает ширину клетки и образует вздутия. Такие бактерии называют клостридиями. Устойчивость спор очень высока. Они выдерживают кипячение в течение нескольких часов, не погибают под действием дезинфицирующих средств, способны сохраняться во внешней среде (особенно в почве) десятки и сотни лет. На дне озера в Миннесоте обнаружили споры, возраст которых составил 7500 лет, а в образцах соли девонских, пермских и силурийских месторождений выделены жизнеспо-
Популяция клеток
Вегетативная клетка
Проспора
Зрелая спора
Вегетативная клетка
Прорастание споры
Деление клеток
Рис. 3.8. Спорообразование у бактерий.
А — процесс спорообразования; Б — превращение споры в вегетативную клетку.
собные споры сапрофитных бактерий, возраст которых 600 млн лет. Некоторые патогенные бактерии образуют споры, которые также способны очень долго сохраняться в окружающей среде и, попадая затем в организм человека, вызывать заболевания (споры сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены, ботулизма и др.).
3.3. Морфология грибов. Принципы классификации
Грибы (Fungi) представляют собой обширную группу эукариотических микроорганизмов, в составе которой известно свыше 100 000 видов. Повсеместное распространение грибов, способность существовать в почвах разного типа, воде природных источников, отличающихся степенью засоленности и показателями pH, в организмах человека, животных и растений обусловлены особенностями их морфологии, структуры, физиологии и способами размножения. Среди грибов насчитывается до 400 видов, патогенных для человека.
Клетка гриба построена по типу эукариотической, но имеет некоторые особенности. Она носит название гиф, сплетение гифов представляет собой мицелий, который может быть как одноклеточным, так и многоклеточным. В первом случае гифы не имеют перегородок и представляют собой несептированный мицелий. Разделенный на отдельные клетки перего
родками мицелий называется септированным. По характеру роста разделяют субстратный мицелий, который стелется по поверхности субстрата, и воздушный, приподнимающийся над ним.
Клеточная стенка грибов более жесткая, чем у бактерий. В ее состав входят целлюлоза, хитин, глюкан, белки, липиды. Аналогично клеточной стенке бактерий она выполняет защитную, структурную и транспортную функции.
В цитоплазме локализованы органеллы, свойственные эукариотам. Ядро грибов дифференцировано, покрыто ядерной оболочкой, имеет ядрышки. Особенностью является то, что клетки некоторых грибов содержат не одно, а несколько ядер.
В цитоплазме, помимо органелл, часто обнаруживаются волютин, гликоген, жиры.
Грибы размножаются несколькими способами: вегетативным, бесполым, половым, почкованием.
Вегетативный способ размножения такой же, как у растений. Именно поэтому грибы иногда относят к низшим растениям. Отдельные кусочки мицелия или единичные гифы, попадая на субстрат, разрастаются в мицелий (грибницу).
Бесполое размножение осуществляется с помощью многочисленных спор, вызревающих на специальных органах спо-роношения. Следует подчеркнуть, что название «спора» встречается при характеристике как бацилл, так и грибов. Однако у последних спора не является приспособлением для сохранения вида в неблагоприятных условиях, а служит способом размножения и обеспечивает грибам распространение на большие расстояния (споры переносятся ветром, водой, людьми и животными, на поверхности тела или одежды которых они могут адсорбироваться).
Органы спороношения имеют различную морфологию (рис. 3.9). Так, у грибов рода Mucor на гифах воздушного мицелия образуются вздутия в виде шариков, внутри которых формируются и вызревают споры (эндоспоры). Вздутия на концах мицелия носят название спорангиев. После созревания спор спорангий разрывается, и они попадают во внешнюю среду, где на субстратах дают начало мицелию.
У некоторых аскомицетов (аспергиллов) на конце воздушного мицелия формируются другой формы спороносцы — ко-нидиеносцы. Они также представляют собой шарообразные выросты, но на них снаружи располагаются многочисленные выросты — стеригмы, похожие на иголки у ежа, и на них образуются экзоспоры. По мере созревания терминальные споры отпадают (отшнуровываются). Такие споры называются конидиями. Конидиеносцы рода Penicillium имеют форму кисти.
Высшие грибы способны к половому размножению. Образование спор происходит при этом в различных по форме
Рис. 3.9. Морфология грибов.
1 — спорангий гриба рода Mucor с эндоспорами; 2 — конидиеносец с конидиями у гриба рода Aspergillus; 3 — гриб рода Pemcillium: а — многоклеточный мицелий, б — конидиеносец со стеригмами, в —конидии, 4 — почкующиеся дрожжи
структурах, формирующихся после мейоза. Например, аско-мицеты имеют специальные сумки —аски. Споры, которые находятся в них, называют аскоспорами. Результатом полового
размножения являются также зигоспоры, базидиоспоры и др. Половое размножение свойственно высшим грибам.
Дрожжи и дрожжеподобные грибы могут делиться почкованием, образуя множество новых клеток. У них же наблюдается бинарное деление.
На плотных питательных средах грибы образуют колонии различного типа. Они имеют мелкие, средние и крупные (иногда одна колония занимает всю поверхность чашки Петри) размеры. Поверхность колоний бывает слизистой, кожистой, пленчатой, зернистой, мучнистой, пушистой. Каждый из вас постоянно встречается с такими колониями, образуемыми грибами на заплесневевших продуктах, поверхности растений, почвы и других субстратах. Грибы синтезируют различные по химической природе и составу пигменты. Разнообразен спектр таких пигментов: желтые, оранжевые, красные, розовые, синие, зеленые и др. Морфология колоний и цвет пигмента учитываются при идентификации грибов.
Большинство грибов имеет аэробный тип дыхания. Исключение составляет небольшое количество видов, способных жить в анаэробных условиях (дрожжи). Источниками питания * служат разнообразные по структуре углеводы (гексозы, пентозы, крахмал и др.), аминокислоты, азотистые основания и др. Некоторые грибы могут использовать клетчатку. Ферментативная активность у грибов высокая и различается у представителей разных видов.
Грибы могут жить в широком диапазоне pH среды, но все патогенные активнее растут при pH 4,5—6,0. Грибы всех видов лучше переносят более кислые среды, чем бактерии.
Высокое осмотическое давление в клетках грибов (до 300 атм) позволяет некоторым видам существовать в субстратах с высокой концентрацией солей.
Классификация грибов построена на основании изучения строения мицелия (одноклеточный или многоклеточный), органов спороношения, способов размножения, физиолого-биохимических свойств и особенностей генома.
В настоящее время существует несколько классификаций грибов. Основные таксономические единицы, выделяемые в них,— семейство, класс, подкласс, род и вид. Наиболее часто в литературе приводится классификация, в которой к «царству» грибов (Mycota), подразделенному на 2 отдела — Myxomi-cota — слизевики и истинные грибы — Eumycota, относят 7 классов: Chytridiomycetes, Hyphochytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes. Патогенные для человека грибы относятся к 4 классам: Ascomycetes, Oomycetes, Zygomycetes и Deuteromycetes.
Среди них грибы — возбудители плесневых микозов (Mucor Aspergillus, Penicillium), дрожжеподобные грибы Candida — возбудители кандидамикозов, нередко возникающих на фоне
лечения антибактериальными препаратами широкого спектра действия. Грибы рода Trichophyton, Microsporum, Achorion вызывают поражения кожи, волос, ногтей. Серьезную угрозу для жизни и здоровья людей представляют возбудители глубоких микозов (роды Coccidioides, Hystoplasma и др.).
В ряде случаев медицинские работники сталкиваются с неинфекционными заболеваниями, вызванными грибами, продуцирующими токсины. Это тяжелые отравления, возникающие при употреблении в пищу несъедобных грибов (мухоморы, бледная поганка), а также токсинов, которые попадают в продукты из растений, пораженных фитопатогенными грибами. Например, грибы рода Fusarium, поражающие злаки, вызывают фузариотоксикозы. Токсин не инактивируется даже при воздействии высокой температуры при выпечке хлеба из зерен, пораженных фузариозом.
Фармацевтическая промышленность использует некоторые грибы и продукты их метаболизма, в том числе токсины, для получения лекарственных препаратов (спорынья). Грибы являются продуцентами антибиотиков (пенициллин и др.). Промышленная микробиология использует грибы в процессах приготовления пищевых продуктов (пива, хлеба, молочнокислых продуктов), для получения ферментов, витаминов и других необходимых веществ. Велика роль грибов в экологии. Они осуществляют процессы минерализации сложных органических веществ и выполняют «санитарные функции» при очистке почв, водоемов от микроорганизмов, составляя им конкуренцию, и разлагают вредные вещества, накапливающиеся в окружающей среде (пестициды, промышленные и бытовые отходы и др.).
3.4. Простей
in
классификации
ие. Морфология. Принципы
Простейшие (Protozoa) — крупные одноклеточные микроскопические организмы, размер которых составляет от 10 до 50 мкм и более, распространенные повсеместно: в почве, воде, живых организмах, растениях. Известно более 30 тыс. видов простейших.
Простейшие обладают всеми органеллами, присущими эукариотическим клеткам.
В цитоплазме располагаются ядро, окруженное ядерной оболочкой (дифференцированное), эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, митохондрии, рибосомы, лизосомы, вакуоли, запасные питательные вещества.
Цитоплазма представляет собой гелиеподобный водный раствор, в котором содержатся белки, ферменты, микроэлементы, органические соединения и др. Различаются наружный (эктоплазма) и внутренний (эндоплазма) слой. Эктоплаз-
ма представляет собой более тонкий, плотный и гомогенный по сравнению с эндоплазмой участок цитоплазмы. Периферическая часть эктоплазмы образует плотную мембрану — пелликулу, которая выполняет защитную, опорную функции и участвует в транспорте питательных веществ и продуктов метаболизма. В состав мембраны входят липиды и белки. Их количество и соотношения варьируют у разных видов. В пелликуле некоторых сапрофитных простейших обнаружены кремний, стронций, кальций, придающие ей большую плотность.
Движение простейших осуществляется при помощи псевдоподий, жгутиков и ресничек.
Псевдоподии (ложноножки) появляются только при движении, не имеют постоянной формы и в результате перетекания протоплазмы образуют временные выросты на поверхности клетки. Скорость движения у различных видов неодинакова. Например, патогенная Entamoeba histolytica (возбудитель амебной дизентерии) вытягивает длинную псевдоподию, в которую перетекает протоплазма, и амеба как бы делает «большой шаг». Кишечная сапрофитная амеба (Entamoeba coli) образует небольшую псевдоподию, в которую перетекает протоплазма. Затем в другой стороне клетки образуется новая псевдоподия, и движение при этом выглядит, как «топтание на месте».
Жгутики покрыты мембраной, состоят из трубочек (аксо-нем) и имеют белковый состав, отличающийся от такового у бактерий. С помощью базального тельца они связаны с цитоплазмой (у трипаносом, лейшманий).
Некоторые простейшие (трипаносомы) имеют ундулирую-щую мембрану, способствующую передвижению. Она проходит вдоль тела клетки трихомонад и трипаносом.
Реснички устроены по типу жгутиков, но значительно короче и покрывают всю поверхность клетки (у инфузорий, балантидий).
Как и некоторые бактерии, отдельные виды простейших могут передвигаться путем скольжения, механизм которого пока неясен.
У трипаносом есть кинетопласт. Он представляет собой скопление ДНК, заключенное в крупную митохондрию, расположенную около основания жгутика.
Цитоскелет простейших состоит из белковых фибрилл или филаментных пучков — более толстых образований и микротрубочек. Состав белков в них различается. Цитоскелет играет роль в «перетеканиях» цитоплазмы и ее органелл и в делении клетки.
Ядро окружено двухслойной, пронизанной порами оболочкой и содержит одно или несколько ядрышек. Большинство простейших имеет одно ядро, но встречаются и многоядерные клетки. Тип организации ДНК ядра варьирует у представите -38
лей разных типов простейших от линейных до кольцевидных хромосом. В состав ядра входят также ядерные белки типа гистонов. Деление ядра может идти путем как митоза, так и мейоза.
Структура и функции рибосом, митохондрий, лизосом, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи у простейших аналогичны таким же структурам других эукариот.
Вместе с тем у простейших есть органеллы, отличающие их от других истинноядерных микроорганизмов.
В специальных органеллах — пероксисомах содержатся ферменты, расщепляющие перекись водорода. Это особенно важно для анаэробных простейших, у которых нет фермента каталазы, расщепляющего перекись, оказывающую губительное действие на клетку.
Пульсирующие вакуоли способствуют поддержанию и регуляции осмотического давления в клетке и удалению из нее продуктов метаболизма.
У простейших, представляющих собой наиболее примитивно организованных одноклеточных животных, присутствуют элементы дифференцировки органелл: выделительные, пищевые и пищеварительные вакуоли, ротовая щель, подобие глотки, выделительные вакуоли, анальные поры. Например, амебы могут с помощью пищевой вакуоли втягивать в себя участок мембраны с находящимися в ней частичками питательных веществ, которые попали в клетку путем фагоцитоза. Затем вакуоль с пищей отделяется от мембраны и превращается в своеобразный «орган переваривания» — пищеварительную вакуоль. Здесь с участием лизосомных ферментов происходит расщепление питательных веществ.
Существуют простейшие, у которых есть подобие ротовой полости в виде углубления, переходящее в короткую глотку. Такое углубление называется цитостом. Особенно отчетливо оно выражено у балантидий — паразитов толстого кишечника. На заднем конце этого же простейшего находится анальная пора — цитопрокт.
Фиксация на субстратах осуществляется с помощью выростов-стебельков, присосок и за счет выделения слизи, которая как бы «приклеивает» клетку. По типу питания простейших разделяют на автотрофы и гетеротрофы. Большинство автотрофов является фототрофами, так как у них есть хлоропласты, содержащие зеленый пигмент — хлорофилл, участвующий в процессе фотосинтеза.
У гетеротрофных простейших наблюдается в отличие от прокариот смешанный — галофитный и голозойный тип питания, характерный для животных. Одни особи используют при этом мертвые органические остатки, а другие путем фагоцитоза захватывают более мелкие живые организмы. Иногда при микроскопическом изучении простейших в их клетках можно
Рис, 3.10. Морфология патогенных простейших.
1 — дизентерийная амеба; 2 — лямблии; 3 — балантидии; 4 — трипаносома; 5 — малярийный плазмодий (изменение морфологии в цикле бесполого размножения в эритроцитах — шизогонии); 6 — трихомонады; 7 — лейшмании.
обнаружить разнообразные по морфологии бактерии и мелкие простейшие.
Механизмы питания заключаются в пассивном и активном транспорте, пиноцитозе и фагоцитозе.
Среди простейших, особенно сапрофитных, преобладают аэробы, но паразитические виды, некоторые симбионты, обитатели глубоких почвенных горизонтов и водоемов представляют собой облигатных анаэробов.
Размножение простейших осуществляется бесполым и половым путями. Бесполое размножение может проходить путем продольного или поперечного деления клетки, множественного деления (примером служит шизогония малярийного плазмодия), почкования (у некоторых инфузорий).
Половое размножение осуществляется способом копуляции (слияния клеток) или конъюгации (обмен генетическим материалом). В некоторых случаях половой и бесполый путь воспроизведения составляет единый жизненный цикл. Так, малярийные плазмодии в организме человека размножаются бесполым, а в организме переносчика-комара — половым способом.
Многие простейшие в неблагоприятных условиях образуют покоящиеся формы — цисты, обладающие высокой устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. Цистообразование является одним из этапов жизненного цикла. Цисты служат и формой распространения возбудителей некоторых протозойных заболеваний (амебиаза).
Классификация простейших периодически пересматривается, так как не выработаны единые критерии, на основании которых определялась бы их таксономическая принадлежность.
В настоящее время на основании классификации, предложенной в 1981 г. Международным комитетом по систематике и эволюции простейших, выделяют 7 типов: Sarcomastigopho-га, Labirinthomorfa, Apicomplexa, Microspora, Ascetospora, Myxozoa и Ciliophora.
Некоторые из типов подразделены на подтипы. Основные таксономические разряды — тип, подтип, класс, семейство, род, вид.
Патогенными для человека являются представители 1-го, 3-го и 7-го типов. К 1-му типу Sarcomastigophora к классу Sarcodina (ложноножки) относится возбудитель амебной дизентерии — Entamoeba histolytica, к классу Zoomastigophora — возбудитель лямблиоза — Lamblia intestinales, возбудители трипаносомозов — Tripanosoma gambiense, Т. rhodesiense, Т. cruzi, трихомоноза — Trichomonas vaginalis, лейшманиозов — Leishmania tropica, L. braziliensis, L. mexicana, L. donovani. К 3-му типу — Apicomplexa, классу Sporozoa принадлежат возбудители малярии 4 видов — Plasmodium vivax, Pl.malari-ае, Pl.falciparum, Pl.ovale и возбудитель токсоплазмоза — Toxoplasma gondii. К 7-му типу Ciliophora, классу Kinetofragmi-nophores относят возбудителя балантидиаза Balantidium coli (рис. 3.10).
Глава 4 ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ
Физиология микроорганизмов изучает процессы питания, дыхания, роста и размножения, воздействие факторов внешней среды и взаимоотношения между представителями микромира.
Физиолого-биохимические свойства учитываются при классификации микроорганизмов, при проведении диагностики, профилактики и лечения заболеваний, вызванных патогенными бактериями. Знание физиологических особенностей необходимо для создания оптимальных условий культивирования штаммов — продуцентов аминокислот, ферментов, витаминов, антибиотиков, вакцин и др. Понимание экологических процессов, происходящих в природе, также требует изучения физиологии микроорганизмов, составляющих биоценозы в различных эпитопах (почве, воде, организмах человека, животных и растений). Знание физиологии микроорганизмов необходимо для выявления взаимосвязи структуры и функции бактериальной клетки. Известно, что процессы, происходящие в микробной клетке, зависят от тех химических элементов и веществ, которые входят в ее состав.
4.1. Химический состав бактериальной клетки
Микробная клетка состоит из тех же химических элементов, что и клетки животных и растений.
Содержание воды в вегетативных клетках колеблется от 75 до 85%. Все питательные вещества поступают в клетку с водой, и с ней же выводятся наружу продукты обмена. В спорах воды меньше — от 40 до 50 %.
Вода находится в бактериальной клетке в свободном состоянии или связана с ее составными частями.
В сухом веществе бактерий 50—80% приходится на долю белков. Они представлены нуклеопротеидами (белками, соединенными с нуклеиновыми кислотами), липопротеидами, глико- и хромопротеидами. Белковую природу имеют ферменты и многие токсины.
Содержание нуклеиновых кислот составляет 10—30% от сухого веса и зависит от вида бактерии.
Углеводы содержатся в количестве 12—18% и служат в основном источником энергии.
В энергетическом обмене участвуют также липиды. В клетках различных бактерий их от 0,2 до 40%. Некоторые липиды вместе с белками входят в состав токсинов.
Из основных химических элементов клетки на долю углерода приходится 50%, кислорода — 20%, азота—14%, водорода — 8 %, фосфора — 3 % и серы — 1 %. Кроме них, бакте-
Таблица 4.1. Главные функции химических элементов клетки
Элемент
Функция
Водород Кислород
Углерод Азот
Сера
Фосфор
Калий Магний
Марганец Кальций Железо Кобальт Медь, цинк Молибден
Кремний
Входит в состав Н3О и органических веществ клетки
Входит в состав Н2О, О2-акцептор электронов у аэробных микроорганизмов
Основной элемент в органических веществах клетки Входит в состав белков, нуклеиновых кислот, коферментов
Входит в состав белков (в некоторых аминокислотах) и коферментов
Содержится в нуклеиновых кислотах, фосфолипидах, коферментах
Один из главных катионов клетки, кофактор
Входит в состав бактериохлорофилла у фотосинтезирующих бактерий; служит активатором ряда ферментов Входит в Входит в Входит в Входит в Входят в Входит в тазы) Входит в
состав состав состав состав состав состав
ряда ферментов ряда ферментов цитохромов и белков витамина В12 и его производных некоторых ферментов некоторых ферментов (нитратредук-
состав
клеточной стенки некоторых бактерий
рии содержат калий, кальций, магний, марганец, железо, кобальт, медь, цинк, железо, молибден и другие элементы. В табл. 4.1 указаны основные функции, которые выполняет каждый химический компонент.
«Совокупность процессов превращения веществ и энергии, направленных на сохранение и воспроизведение жизни», называют обменом веществ, или метаболизмом. Он включает два основных процесса — анаболизм и катаболизм.
Анаболизм — это конструктивный метаболизм, при котором происходят реакции синтеза молекул клетки микроорганизма. Для осуществления процесса построения клетки необходима энергия. Бактерии получают ее в процессе катаболизма — энергетического обмена. Энергия выделяется при расщеплении питательных веществ — белков, липидов, углеводов и др. Эти процессы могут происходить в аэробных или анаэробных условиях. Катаболизм и анаболизм взаимосвязаны.
4.2. Питание бактерий
Источники питания и энергии (трофические системы бактерий). Микроорганизмы используют самые разнообразные источники питания и энергии. Питательной средой для патоген
ных микроорганизмов служат вещества организма, в котором он обитает и вызывает заболевания. Сапрофитные (не вызывающие заболевания) бактерии всеядны. Некоторые из них способны, поселяясь на горных породах, использовать минералы как источник питания. Сапрофиты утилизируют животные и растительные остатки, продукты нефтяной и химической промышленности и многое другое. В зависимости от пищевых и энергетических потребностей микроорганизмы делятся на различные группы.
По источнику энергии:
• фототрофы (фотосинтезирующие) способны использовать энергию солнечного света. Этим свойством обладают некоторые сапрофитные бактерии, в клетках которых находятся пигменты, подобные хлорофилу зеленых растений, например пурпурные и зеленые бактерии;
• хемотрофы (хемосинтезирующие) получают энергию из различных химических веществ в процессе окислительно-восстановительных реакций;
• по источнику углерода:
• автотрофные (сами себя питающие, от лат. autos — сам, trophe — питание) получают углерод из углекислого газа атмосферы;
• гетеротрофные (от лат. heteros — другой) — «питающиеся за счет других», используют различные углеродсодержащие органические соединения — гексозы, спирты, углеводороды. Гетеротрофы подразделяют на сапрофиты (питаются мертвым органическим веществом) и паразиты, или паратрофы. Они пользуются готовыми органическими веществами живых организмов.
Каждая из групп подразделяется еще и в зависимости от природы окисляемого субстрата. Его называют также донором электронов (донором водорода). Различают микроорганизмы органотрофы и литотрофы. Органотрофы потребляют органические, а литотрофы — неорганические источники энергии.
Микроорганизмы, которые могут синтезировать сами все необходимые органические соединения, называют прототро-фами. От них отличаются ауксотрофы, которые нуждаются в одном или более готовых соединениях: например, если говорят, что штамм микроорганизма ауксотрофен по тимину, то это значит, что в среду для его культивирования необходимо добавлять указанную аминокислоту.
Таким образом, для характеристики типа питания учитывают сочетание признаков: источник энергии и углерода, природу донора электронов, например фотоорганолитогетеротро-фы или фотоорганоавтотрофы. Патогенные микроорганизмы ассимилируют в основном готовые азотсодержащие органические соединения (белки, аминокислоты).
Поступление питательных веществ в клетку. Все элементы,
из которых состоит клетка, бактерии получают в виде питательных веществ. У живых существ известно 2 способа питания — голозойный и голофитный. Первый характерен для животных, которые захватывают кусочки пищи и переваривают их в пищеварительном тракте. Голофитный способ (всасывание водорастворимых питательных веществ) существует у микроорганизмов, в частности у бактерий.
Механизм поступления питательных веществ в клетку. Поступление питательных веществ происходит у бактерий через всю поверхность клетки. При этом в цитоплазму могут поступать очень мелкие молекулы в растворенном виде. Сложные вещества сначала подвергаются расщеплению за пределами клетки с помощью экзоферментов, выделяемых бактериями. Экзоферменты превращают сложные органические и минеральные вещества в простые и готовят небольшие «кусочки пищи», способные пройти через клеточные мембраны. Существует несколько способов проникновения питательных веществ в клетку.
1. Пассивная диффузия. Вещества проходят через клеточные мембраны под действием разности концентраций внутри и вне клетки. При этом способе не расходуется энергия.
2. Облегченная диффузия. В ней принимают участие специальные транспортные белки — пермеазы. Каждая пермеаза адсорбирует определенные молекулы питательного вещества на наружной стороне цитоплазматической мембраны, вступает с ним во временную связь и переносит его через мембрану, оставляя вещество в цитоплазме. Освободившись от одной молекулы, пермеаза возвращается за следующей. Это можно сравнить с переправой с одного берега реки на другой на лодке или пароме. Облегченная диффузия также не связана с энергетическими затратами.
3. Активный транспорт. Отличается от облегченной диффузии тем, что при аналогичном способе переноса питательных веществ тратится определенная энергия. Питательные вещества проникают в клетку даже в том случае, когда их концентрация в клетке превышает концентрацию в окружающей среде.
4. Перенос групп (транслокация) отличается от активного транспорта тем, что в процессе переноса молекула вещества подвергается химической перестройке. Выход веществ из клетки осуществляется аналогичными способами.
Ферменты бактерий. Огромную роль в жизнедеятельности бактерий играют ферменты. Они являются биологическими катализаторами реакций и не входят в состав конечных продуктов. Ферменты участвуют в процессах метаболизма бактерий. Ферменты могут состоять из одного компонента — белка (трипсин, пепсин, уреаза) или быть многокомпонентными. В таком случае к белку присоединена простетическая группа
Таблица 4.2. Классификация ферментов
•i
Класс ферментов
Катализируемые реакции
Оксидоредуктазы Трансферазы Гидролазы
Лиазы
Изомеразы Лигазы
Окислительно-восстановительные
Перенос отдельных частей или целых молекул
Расщепление и синтез белков, жиров и других веществ с участием Н2О
Отщепление или присоединение групп с образованием двойных связей
Превращение органических соединений в изомеры Синтез сложных органических веществ из простых
(кофермент). Небелковая часть представлена несложными органическими веществами или металлами: например, железо входит в состав каталазы и пероксидазы; молибден — в нит-ратредуктазу. Органические простетические группы включают тиамин, рибофлавин и другие витамины. Ферменты, которые образуются постоянно, независимо от условий среды, называются конститутивными. В отличие от них индуцибельные ферменты зависят от субстрата, который стимулирует их образование.
Многие ферменты связаны со структурами микробной клетки — клеточной стенкой, цитоплазматической мембраной. Экзоферменты выделяются в окружающую среду, а эндо— катализируют реакции, протекающие в клетке. Ряд ферментов выполняет защитную функцию. Так, пенициллиназа инактивирует антибиотик пенициллин (см. раздел 1, глава 9). Кроме ферментов обмена, микробы вырабатывают ферменты агрессии. Они способствуют проникновению патогенных микробов в макроорганизм и воздействуют на отдельные компоненты в клетках (см. раздел «Инфекция»). Главное свойство ферментов — специфичность катализируемых ими реакций. Ферменты принадлежат к 6 классам. В табл. 4.2 представлены классы ферментов и реакции, в которых они участвуют.
Ферментативные свойства микроорганизмов изучают с целью идентификации и дифференциации видов бактерий. Для этого используют дифференциально-диагностические среды («пестрый» ряд Гисса, среды Левина, Эндо и др.).
Для ускоренной идентификации выделенных чистых культур применяются наборы коммерческих тест-систем. Они позволяют быстро и надежно определить ферментативные свойства микроорганизмов. Тест-системы представляют собой наборы микропробирок или микроконтейнеров с определенными субстратами, дисками или полосками бумаги, пропитанными различными ингредиентами, наборы индикаторных карандашей и др. Использование таких систем значительно со
кращает время анализа. Ниже приводятся некоторые из наиболее часто используемых в практике микробиологических исследований микросистем.
1. Система «Enterotub» позволяет определить 9 признаков (сбраживание лактозы, глюкозы, дульцита, образование индола и сероводорода, утилизация цитрата, мочевины, фенилаланина, декарбоксилирование лизина). Система представляет собой пластиковую трубку, разделенную на 8 камер с питательными средами, содержащими индикаторы. Посевным материалом является изолированная колония бактерий с чашки первичного посева.
2. Система АР1-20Е — пластиковая полоска с 20 микроконтейнерами, в которых имеется набор сухих индикаторных питательных сред. В их составе дифференцирующие аминокислоты, углеводы, желатин, мочевина, реактивы на сероводород, индол, ацетоин и др.
3, Система Micro Id включает 15 биохимических тестов для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae и представляет собой набор бумажных индикаторных дисков, размещенных в лунках пластикового лотка.
4. Набор Patho Tec Rapid ID состоит из бумажных полосок, снабженных индикаторными поясками для выявления ферментов или конечных продуктов обмена веществ. Этот набор позволяет определить до 10 признаков в течение 1—4 ч.
5. Система Minitec выполнена из пластмассовой пластинки с 12 лунками, в которые помещают диски, пропитанные различными субстратами. Стерильными пипетками в каждую лунку вносят суспензию испытуемой культуры бактерий в бульоне Minitec. После инкубации в термостате в течение 18— 24 ч проводят учет результатов.
6. Углеводные бумажные диски (УВД) позволяют определять сахаролитическую активность микроорганизмов.
7. Системы индикаторные бумажные (СИБ) используются для ускоренной диагностики энтеробактерий и холерных вибрионов. Это диски или полоски бумаги, пропитанные различными субстратами (углеводами, аминокислотами) и индикаторами. Наша промышленность выпускает несколько таких систем разного целевого назначения. Например, набор № 2А (малый) включает 9 тестов и предназначен для межвидовой дифференциации энтеробактерий. Набор № 2Б (расширенный) состоит из 25 субстратов с индикаторами для видовой дифференциации энтеробактерий.
Микроорганизмы служат источниками для получения ферментов, необходимых для ряда отраслей промышленности и медицины. Некоторые виды образуют ферменты, которые нигде в природе больше не обнаруживаются (танназа, целлюлаза, кератиназа, гидрогеназа и др.). Микробное происхождение имеют ферменты, катализирующие, например, окисление ме-
танола и цианида. Многие ферментные препараты применяют для лечения заболеваний. Например, лактаза помогает больным с нарушением функций желудочно-кишечного тракта, а металлопротеиназы используют в стоматологической практике для удаления бляшек с зубов.
Питательные среды. Для выделения микроорганизмов из исследуемого материала, сохранения и поддержания роста применяют питательные среды. От их состава и свойств во многом зависят результаты исследований.
Питательные среды различаются по происхождению. Естественные среды — это природные продукты (мясо, молоко, картофель и др.). Искусственные среды могут быть приготовлены на естественной основе (молочно-солевой, картофельный агар, мясопептонный бульон и др.) с добавлением дополнительных компонентов. Кроме того, разработан ряд синтетических сред, приготовленных из химически чистых веществ. Эти среды стандартны, не зависят от свойств естественных компонентов, состав которых может варьировать. В частности, молоко, мясо различных видов животных и даже животных одного и того же вида различаются по содержанию в них белков, жиров, углеводов и многих других ингредиентов.
По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными. Для получения полужидких и плотных (твердых) сред в них, как правило, добавляют агар-агар (полисахарид, полученный из морских водорослей) или иногда желатин — животный белок. Указанные вещества добавляют в горячие растворы питательных веществ и затем охлаждают. Среды при этом уплотняются. Полужидкие среды содержат 0,3—0,8% агар-агара, а плотные — 1—2(3) %.
По составу среды делятся на простые и сложные. К простым относятся мясопептонный бульон, мясопептонный агар. Их часто используют как основу для получения сложных сред, внося в них дополнительные ингредиенты. Среды классифицируют по назначению'.
• универсальные — пригодные для выращивания большинства микроорганизмов;
• специальные — применяемые для культивирования отдельных групп или видов микроорганизмов;
• элективные (обогащенные) или избирательные, обеспечивающие преимущественный рост определенного вида или штамма. При этом рост сопутствующей микрофлоры подавляется;
• селективные — позволяют проводить отбор микроорганизмов с определенными признаками, закрепляя их наследственно;
• дифференциально-диагностические: с их помощью определяют ферментативные свойства микроорганизмов;
• консервирующие среды используют для отбора и транс-
портировки исследуемого материала, содержащего микроорганизмы. Нередко их называют транспортными средами, они предотвращают быстрое отмирание микроорганизмов.
Все питательные среды должны отвечать ряду необходимых требований:
• содержать все необходимые для данного микроорганизма питательные вещества;
• иметь оптимальную величину pH для определенных видов микроорганизмов. Это очень важное условие. Большинство микроорганизмов хорошо растет при слабощелочных значениях pH (7,2—7,4), Грибы лучше развиваются в кислой среде (оптимум pH 4,5—6). Есть бактерии, требующие в среде щелочных условий. Так, холерный вибрион растет при pH 8— 8,2;
• быть изотоничными, т. е. осмотическое давление должно быть одинаковым. Для микроорганизмов это соответствует 0,5 % раствору поваренной соли;
• обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны;
• непременным условием для среды является стерильность.
Ранее говорилось о том, что вирусы и риккетсии не растут на питательных средах. Для их культивирования необходимы организм животного, куриный эмбрион или культура клеток (рис. 4.1). Культура клеток была введена в вирусологическую
1
Рис. 4.1. Способы заражения куриного эмбриона.
1 — в амнион; 2 — в аллантоисную полость; 3 — в желточный мешок [по Л. Б. Борисову, 1979].
Рис. 4.2. Приготовление культуры клеток методом трипсинизации ткани.
1 — измельчение ткани; 2 — трипсинизация; 3 — фильтрование взвеси клеток через марлю; 4 — отсасывание раствора трипсина над осадком клеток; 5 — подсчет клеток в счетной камере; 6 — посев клеток во флаконы; 7 — введение во флаконы питательной среды, обеспечивающей рост клеток.
практику в 50-х годах XX в. По способу приготовления различают 3 вида: первичные (они же первично трипсинизирован-ные), перевиваемые и полуперевиваемые. Культура клеток представляет собой клетки животных тканей, выращенные на стеклянной или пластмассовой поверхности в питательной среде. Первичные клетки готовят из эмбриональной ткани различных видов животных и птиц (рис. 4.2).
Исходный материал обрабатывают трипсином для разрушения соединительной межклеточной ткани элементов и получения изолированных клеток. Эти клетки помещают затем в пробирки или другую посуду с питательной средой, обеспечивающей им рост и размножение. Затем на выросшую культуру клеток наносят вирусы, которые проникают в клетки и воспроизводятся в них.
Перевиваемые культуры получают в основном из опухолевых клеток. Они способны размножаться в течение более длительного срока, чем первичные. Перевиваемые культуры не используют, как правило, для культивирования вакцинных штаммов вирусов. Существует опасность внесения таким образом в организм вакцинируемого человека онкогенных вирусов.
Полуперевиваемые культуры получают из диплоидных клеток, имеющих двойной набор хромосом — фибробластов человеческого эмбриона. Они имеют преимущество перед другими культурами тем, что выдерживают длительное культивирование (до 100 генераций).
Присутствие вирусов в культурах клеток вызывает различ
ные изменения в них: деструкции, образование симпластов (многоядерных клеток) и телец включения, нарушение нормального ритма деления и др. Эти нарушения носят название «цитопатическое действие» (ЦПД) или «цитопатический эффект» (ЦПЭ) вируса. Для культивирования клеток используют среды сложного состава, некоторые из них содержат индикаторы (среда Игла, среда 199 и др.).
4.3. Дыхание бактерий
Микроорганизмы получают энергию, необходимую для жизнедеятельности, в виде АТФ в процессе биологического окисления — дыхания.
Процесс, в котором атомы или молекулы теряют электроны, называется окислением, а обратный процесс (присоединение электронов) — восстановлением. Дыхание у микроорганизмов представлено рядом сопряженных окислительно-восстановительных реакций. При этом ни электроны, ни атомы водорода, отщепляясь от одного химического соединения, не накапливаются в среде. Они присоединяются (акцептируются) другим химическим соединением. Такое вещество называется акцептором.
По типу дыхания микроорганизмы подразделяются на аэробные, анаэробные и факультативно анаэробные (рис. 4.3).
Аэробные микроорганизмы нуждаются в присутствии свободного молекулярного
кислорода воздуха; О2 является акцептором отнятых у субстрата электронов. Такие микроорганизмы называют также облигатными аэробами.
Микроаэрофилы нуждаются в минимальном количестве свободного кислорода. Облигатным анаэробам также необходим кислород, но не свободный, а связан-
Рис. 4.3. Характер роста микроорганизмов в жидких питательных средах в зависимости от типа дыхания.
1 — аэробы; 2 — анаэробы; 3 — факультативные анаэробы; 4 — микроаэрофилы.
12 3 4
Дыхательная цепь
Рис. 4.4. Типы брожения.
ный. Они получают энергию при расщеплении кислородсодержащих веществ. Акцепторами электронов служат некоторые неорганические соединения, например сульфаты, нитраты. Такое дыхание называют соответственно анаэробным сульфатным или анаэробным нитратным.
Акцепторами электронов могут быть и органические вещества, образующиеся в результате брожения. При таком процессе происходит расщепление органических веществ с образованием промежуточных продуктов, которые акцептируют электроны. Известны спиртовое, молочнокислое, маслянокислое и другие типы брожения (рис. 4.4). Каждый из этих процессов идет при участии различных видов специализированных микроорганизмов. Следует отметить, что присутствие молекулярного кислорода в среде приводит к образованию
токсичных для анаэробных микроорганизмов перекисей и вызывает их гибель.
Факультативные анаэробы способны получать энергию аэробным или анаэробным путем, в зависимости от источника кислорода. Среди патогенных микроорганизмов есть и анаэробы, и аэробы, и факультативные анаэробы. Тип дыхания необходимо учитывать при проведении лабораторных исследований возбудителей заболеваний, при лечении некоторых инфекций (газовая гангрена, столбняк). Этот признак позволяет создать необходимые оптимальные условия аэрации для культивирования микроорганизмов при производстве антибиотиков, ферментов и других препаратов.
4.4. Рост и размножение бактерий
Под ростом бактерий понимают увеличение размеров клетки. Он протекает очень быстро — в течение нескольких минут. После того как бактерии достигают взрослого состояния, наблюдается процесс размножения.
I Размножение — способность микроорганизмов к воспроизведению, при котором увеличивается количество особей.
Бактерии размножаются простым поперечным делением. Клетка в благоприятных условиях делится каждые 20— 30 мин. Из одной материнской клетки появляются две дочерние.
I Время от возникновения клетки до ее деления называется временем генерации.
Ученые подсчитали, что если бы возбудителю холеры — холерному вибриону — создать условия беспрепятственного размножения, то за 48 ч деления количество клеток выражалось бы числом 22 с 42 нулями (2242). Общая масса этих клеток была бы в 4000 раз больше массы земного шара. Однако в природе размножение микробов не может продолжаться неограниченно, поскольку на этот процесс воздействует множество факторов. Одним из них является накопление в питательных средах продуктов обмена бактерий, которые вызывают гибель клеток и истощение питательных веществ.
Размножение бактерий имеет свои закономерности. При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается последовательная смена отдельных фаз развития популяции. В 1942 г. Ж. Моно из Пастеровского института изобразил графически «кривую» роста бактерий (рис. 4.5).
1. Лаг-фаза — микробные клетки при посеве в питательную среду адаптируются к новым условиям и некоторое время не размножаются. Число бактерий в этой фазе не увеличивается.
2. Лог-фаза (логарифмическая, экспоненциальная) отлича-
О
о
Лаг- | фаза ।
Стационарная фаза
Экспоненциальная фаза
Фаза отмирания
Время
Рис. 4.5. Кривая роста бактериальной культуры
ется максимальной скоростью размножения клеток и увеличением их количества.
3. Стационарная фаза — концентрация бактериальных клеток в среде остается постоянной. Это объясняется тем, что количество вновь появляющихся клеток почти равно количеству отмирающих.
4. Фаза отмирания. При постепенном истощении питательной среды и накоплении в ней токсичных продуктов обмена клетки постепенно отмирают.
Продолжительность каждой фазы может варьировать в зависимости от вида бактерий и условий культивирования.
На плотных питательных средах микробы образуют различные по форме и величине колонии, которые состоят из скопления особей одного вида.
Морфология колоний изучается макроскопически (их рассматривают не вооруженным оптикой глазом). Принимают во внимание такие признаки, как величина колонии, поверхность, рельеф, цвет, выпуклость, прозрачность. При приготовлении мазков из бактерий, содержащихся в колонии, обращают внимание на консистенцию и способность эмульгироваться в физиологическом растворе. Кроме того, помещая чашку Петри с ростом микроорганизма под микроскоп, изучают форму края колонии. Различают S- и R-формы колоний. Первые имеют правильную круглую форму, гладкую поверхность, ровные края. R-формы отличаются неправильной формой колоний, шероховатой поверхностью (иногда складчатой, морщинистой), их края могут быть фестончатыми, зубчатыми и др. Совокупность признаков морфологии колоний является очень важным критерием и учитывается при идентификации микроорганизмов. Например, колонии возбудителя чумы име
ют R-форму и похожи на кружевной платочек, брошенный на поверхность плотной среды. Возбудитель холеры образует мелкие, правильной формы прозрачные колонии (S-формы).
Внешний вид колонии может изменяться в зависимости от условий культивирования. Появление разных типов колоний при культивировании на плотной среде может быть обусловлено диссоциацией (см. главу 10). Это особая форма изменчивости, в основе которой лежат мутации. Чаще всего при этом происходит превращение S-форм в R-формы. Значительно реже R-формы колоний ревертируют в S-форму. При диссоциации меняется не только форма колонии, но и ряд других свойств микроорганизма (агглютинабельность, подвижность, ферментативная активность, вирулентность и др.).
В жидких средах микробы растут, вызывая общее помутнение, образуя пленки на поверхности или осадок.
4.5. Пигментообразование. Светящиеся и ароматообразующие бактерии
Некоторые виды бактерий и грибов образуют пигменты. Если пигмент растворим в воде, то питательная среда окрашивается. У некоторых бактерий пигменты не выделяются во внешнюю среду и окрашивают только колонию.
С пигментообразованием связаны легенды и суеверия. В литературе описан один из таких случаев. В 332 г. до н.э. при осаде города Тироса армия Александра Македонского была охвачена страхом. На хлебе появились красные пятна, похожие на кровь. Солдаты посчитали, что это плохое предзнаменование. Однако придворный мудрец истолковал его как знак богов, которые предрекают гибель войск в осажденной крепости. Такое толкование вселило в солдат боевой дух. Сражение было выиграно. Спустя много веков была открыта тайна «кровавых пятен». Их причиной была бактерия Serratia marcescens, синтезирующая в клетке пигмент красного цвета продигиозан.
Микробные пигменты бывают разных цветов. В частности, Pseudomonas aeruginosa известна медикам под названием «синегнойная палочка». Она выделяет пигмент сине-зеленого цвета. Гнойное отделяемое из тканей больных, пораженных этим микроорганизмом, и перевязочный материал окрашены в такой цвет. Стафилококки способны образовывать пигменты оранжевого, лимонно-желтого и белого цветов. Раньше этот признак был одним из основных при идентификации стафилококков. Пигментообразование свойственно многим видам грибов.
Некоторые бактерии и грибы выделяют летучие ароматические вещества. При культивировании таких микроорганизмов ощущается определенный запах. Например, туберкулезные палочки пахнут медом, а уже знакомая нам синегнойная па
лочка распространяет сладкий цветочный запах. От присутствия некоторых ароматических веществ, образуемых микроорганизмами, зависят запахи вина, сыров, молочных продуктов.
В природе существуют микроорганизмы, способные светиться. Это явление связано с тем, что они выделяют вещества, светящиеся при соединении с кислородом воздуха. Чаще всего светящиеся микроорганизмы обитают в соленой воде. Они могут адсорбироваться на поверхности тела рыб, мелких ракообразных, растений и даже на продуктах. Свечение, которое многие из нас наблюдали в вечернее и ночное время на морях, океанах, в лесу, связано с такими микроорганизмами.
Глава 5
ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ
На жизнедеятельность микроорганизмов оказывают влияние физические, химические и биологические факторы. Из физических следует отметить прежде всего температурные воздействия. По отношению к температуре микроорганизмы делятся на 3 основные группы: психрофильные, мезофильные и термофильные. В различных литературных источниках приведены несколько различающиеся данные. В связи с этим нами приводятся средние показатели оптимальных температур.
1. Психрофильные (холодолюбивые). Хорошо размножаются при пониженной температуре (10—15 °C). Их название произошло от греч. psichros — холод. Психрофилы выдерживают крайне низкие температуры. Они были выделены даже из образцов льда Антарктиды. Среди патогенных встречаются некоторые виды холодолюбивых клебсиелл, иерсиний, псевдомонад.
2. Мезофильные. Самая обширная группа микроорганизмов. Оптимальная температура роста равна температуре тела теплокровных животных (30—37 °C). Среди патогенных преобладают мезофильные микроорганизмы.
3. Термофильные (теплолюбивые). Для них оптимальная температура лежит в пределах 50—70 °C. Среди патогенных термофилы не обнаружены. Существуют в природе так называемые экстремальные термофилы. Это обитатели горячих источников с температурой более 90 °C.
Микроорганизмы обладают различной устойчивостью к высушиванию. Некоторые (сальмонеллы, трепонемы, гонококки, менингококки) погибают при высушивании через несколько минут или часов. Возбудитель туберкулеза сохраняется при высушивании в течение 3 мес, а в сухой мокроте больных — до 10 мес. Споры не теряют при высушивании своей жизнеспо
собности длительное время (месяцы, годы). Эти свойства мик
роорганизмов позволяют им сохраняться в течение определенного времени в окружающей среде. Устойчивость микроорганизмов учитывается при производстве микробных препаратов (например, вакцин) с длительным сроком хранения.
Действие света. Прямые солнечные лучи обладают губительным действием на микроорганизмы. Некоторые фотосинтезирующие бактерии (пурпурные, зеленые) переносят воздействие света легко.
Действие радиации, ультразвука, давления. Бактерии и гри-
бы чувствительны к радиации, но в меньшей степени, чем
животные и растения. Ионизирующая радиация повреждает геном клетки микроорганизмов, и ее эффект зависит от вида
радиации и ее дозы.
Ультрафиолетовые лучи используют в борьбе с микроорганизмами. С помощью ультрафиолета стерилизуют воздух в операционных, перевязочных и других помещениях лечебных учреждений.
Бактерицидным действием обладает ультразвук. Он дейст-
вует на цитоплазматические структуры при определенных частотах и вызывает гибель клеток.
Значительно легче микроорганизмы переносят высокое давление: некоторые из них способны выдержать до 3000— 5000 атм. Споры бактерий сохраняли жизнеспособность при воздействии на них давления в 20 000 атм. Изменения осмотического давления (повышение или понижение) вызывают гибель микроорганизмов в результате осмотического шока.
Действие химических веществ. Химические вещества в зависимости от концентрации, времени воздействия, температуры и др. оказывают различное влияние на микроорганизмы. Они действуют на определенные структуры в клетке. Жирные кислоты, мыла нарушают функцию цитоплазматической мембраны. Фенол, крезол и их производные повреждают клеточную стенку и белки. Некоторые красители (генциановый фиолетовый, бриллиантовый зеленый, трипафлавин, риванол) могут задерживать рост бактерий. Соли тяжелых металлов: свинца, меди, серебра, ртути — вызывают коагуляцию белка. Вещества типа хлора и его производных ингибируют ферментные системы бактерий.
В качестве противомикробных средств в медицинской практике применяют йод, перманганат калия, перекись водорода, формалин, спирт и др. Микроорганизмы подвержены действию биологических факторов. Некоторые из них способны прекратить рост и размножение, т. е. оказать бактериостатическое действие. Другие вызывают гибель микроорганизмов (бактерицидное действие). К биологическим факторам относятся антибиотики, бактериоцины, ферменты, токсины, органические кислоты, продуцируемые микроорганизмами. В мак
роорганизме патогенные виды испытывают влияние ферментов, лизоцима, комплемента и других факторов, образуемых его клетками.
5.1. Взаимоотношения микроорганизмов
В естественных природных условиях (средах обитания): почве, воде, воздухе, животных и растительных организмах — формируются определенные взаимоотношения микроорганизмов. Они могут носить мирный характер и даже способствовать нормальной жизни микробов в сообществе. Примером таких отношений могут служить симбиоз, метабиоз, мутуализм, сателлизм, синергизм.
Симбиоз — сожительство различных видов микроорганизмов, приносящее им взаимную пользу.
Мутуализ — форма симбиоза, при которой партнеры извлекают взаимную пользу. Формы симбиотических взаимоотношений могут быть различными. Так, лишайники представляют собой симбиоз грибов и водорослей либо фотосинтезирующих бактерий. При этом гриб защищает их от внешней среды — «предоставляет квартиру», а его симбионты снабжают гриб питательными веществами.
Метабиоз — тип взаимоотношений, когда один вид микроорганизмов создает условия для жизнедеятельности другого. Аэробы, поглощая кислород, создают возможность для роста анаэробов
Синергизм характеризуется усилением физиологических функций существующих вместе видов в микробной ассоциации (дрожжи и молочнокислые бактерии активнее осуществляют процесс молочнокислого брожения).
Нейтрализм — отношения, когда обитающие вместе виды микроорганизмов не оказывают друг на друга никакого влияния.
Сателлизм (сателлит—спутник). При таких взаимоотношениях некоторые виды микроорганизмов живут вместе с другими, не причиняя им вреда, как бы сопровождают их, находясь в одном биотопе. При этом сателлиты улучшают свой рост, располагаясь рядом с хозяином.
Комменсализм — форма сосуществования, при которой один из партнеров извлекает пользу для себя, не причиняя вреда другим членам популяции, например микробные ассоциации нормофлоры тела человека.
Помимо рассмотренных взаимовыгодных, «добрососедских» отношений, в микробных ассоциациях существует борьба за место обитания, источники пищи, кислорода и др. Примерами таких взаимоотношений являются антагонизм, паразитизм и хищничество.
Антагонизм — взаимное противодействие микроорганизмов, подавление одних видов микроорганизмов другими. Ан-
Рис. 5.1. Бактерия Bdellovibno bactenovorus, паразитирующая на других бактериях
А —цикл роста в бактерии-хозяине, Б — бактерии Erwinia carotovora, пораженные Bdellovibno, х2200, В — начальная стадия поражения псевдомонады; х20 ООО [по Н Stolp, 1968]
тагонистические взаимоотношения могут проявляться по-разному. Антибиоз — вариант антагонизма, при котором микроорганизмы выделяют в окружающую среду биологически активные вещества — антибиотики, которые ингибируют рост конкурентов или вызывают их гибель. Примером могут служить колицины, продуцируемые рядом энтеробактерий.
Паразитизм — вид сожительства, при котором один микроорганизм (паразит) живет за счет другого и наносит ему вред. К этой группе относятся бактериофаги, для которых клетки микроорганизма служат не только местом обитания, но и «строительным материалом» для собственного воспроизведения.
Хищничество — способ существования, при котором некоторые виды микроорганизмов ведут себя, как животные-хищники. Примером может служить изогнутая палочка Bdellovi-brio (рис. 5.1). Она прикрепляется к своей будущей жертве, проникает через клеточную стенку в бактерию и растет там в длину до тех пор, пока не израсходует все питательные вещества. Затем делится, выходит наружу и подстерегает новую бактерию. Этот микроорганизм-хищник представляет опасность для псевдомонад и энтеробактерий. Амебы также «охотятся» на более мелких простейших и бактерии.
Любые взаимодействия микроорганизмов основываются на принципах симбиоза или антагонизма. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы постоянно учитывается в практической деятельности микробиологов, врачей, фармацевтов. Эти факторы используются в борьбе с вредными микроорганизмами .
Совокупность воздействия физических, химических, биологических факторов и характер взаимоотношений между микроорганизмами формирует, регулирует и определяет видовой и количественный состав их сообществ (микробиоценозов).
5.2. Асептика, антисептика, стерилизация, дезинфекция
Введение в медицинскую практику методов асептики, антисептики, стерилизации и дезинфекции связано с исследованиями двух выдающихся ученых —Луи Пастера и Джозефа Листера.
Во Франции в XIX в. женщины погибали от так называемой «родильной горячки». Смертность была очень высокой. Есть сведения о том, что каждая пятая роженица умирала от этого заболевания. Пастер установил, что возбудителем инфекции является стрептококк, а его распространению способствуют врачи. Проводя различные манипуляции с больными, они переносят возбудителя, который попадает на их руки, инструменты, перевязочный материал, к здоровым женщинам.
Выводы Пастера поддержал английский хирург Д. Листер. Он начал оперировать больных, распыляя в воздухе карболовую кислоту и обрабатывая ею инструменты. При этом значительно снизилось количество гнойных осложнений. В 1867 г. Листер опубликовал статью «Об антисептическом принципе в хирургической практике». 27 декабря 1892 г. Листер приехал на празднование 70-летнего юбилея Л. Пастера. В приветственной речи он сказал: «Пастер сорвал у нас с глаз повязку, веками мешавшую нам видеть сущность инфекционных болезней».
I Асептика (от лат. septicos — вызывающий нагноение). Асептика — предупреждение нагноения.
Это система профилактических мероприятий, направленных на предупреждение возможного попадания микроорганизмов в органы и ткани больного при операциях, перевязках, эндоскопии и других методах инструментального исследования. Основная цель — создание безмикробной (гнотобиологической) зоны или зоны с резко сниженным содержанием микроорганизмов в местах нахождения больных. Асептика включает стерилизацию, специальную обработку рук медперсонала, соблюдение правил и приемов работы при проведении медицинских манипуляций. Специальные инструкции регламентируют особый санитарно-гигиенический режим в лечебных учреждениях, микробиологических лабораториях и аптеках.
Антисептика (anti — против, septicos — нагноение). Антисептика направлена на уничтожение микроорганизмов, проникших в макроорганизм и представляющих угрозу для здоровья человека.
Для этой цели используют механические, физические, химические и биологические методы.
Механические методы применяют для удаления попавших в рану инородных тел (стекло, металлические стружки и др.). Рану промывают, вскрывают гнойные очаги, иссекают некротизированные участки ткани и др. Физическая антисептика предусматривает использование гипертонических растворов для удаления из раны микробов и их токсинов, применение сухого тепла, ультразвука, ультрафиолетового и лазерного излучений, токов высокой частоты и др.
Химическая антисептика связана с местным или общим применением химических веществ, обладающих бактериостатическим или бактерицидным действием. Биологические методы антисептики предусматривают использование бактериофагов, антитоксинов, препаратов крови, средств активной иммунизации, ферментов и др.
Антисептика может быть местной (локальной), когда на
поврежденную ткань накладывают аппликации, мази, присыпки и т. д. Общая антисептика осуществляется при введении (чаще парентерально) препаратов, поступающих в организм и распространяющихся в нем.
В микробиологической практике методам асептики и антисептики уделяется особое внимание. Лабораторная работа проводится с использованием стерильной посуды и питательных сред. Микробиологические, лечебные учреждения, аптеки оснащены приборами и оборудованием для обеспечения стерильных условий работы.
Стерилизация (обеспложивание), т. е. полное освобождение объектов от микроорганизмов. При этом погибают как вегетативные формы микроорганизмов, так и споры.
Стерилизацию проводят для освобождения от микробов
питательных сред, перевязочного материала и инструментов, лабораторной посуды и другого оборудования, пищевых продуктов. Для каждого конкретного объекта выбирают такой способ стерилизации, чтобы освобождение от микроорганизмов не привело к порче самого материала. Например, при температуре выше ПО °C сахара, содержащиеся в среде, кара
мелизуются.
Существуют физические, химические и биологические ме-
тоды стерилизации.
Из
изических методов наиболее часто
используют воздействие на микроорганизмы высоких температур. К ним относятся.
• Прокаливание в пламени горелки (фламбирование). При этом погибают и вегетативные, и споровые формы микроорганизмов. Прокаливанием стерилизуют мелкие металлические предметы с нережущими поверхностями. Под действием огня режущая поверхность становится тупой. Метод фламбирования пригоден для обработки бактериологической петли, пин
цета.
• Кипячение производят в специальных металлических стерилизаторах в течение 30—45 мин. В воду добавляют 1 % раствор бикарбоната натрия. Кипячением можно стерилизовать шприцы, иглы. Вегетативные клетки погибают быстро, а для уничтожения спор время кипячения продлевают. Следует отметить, что в настоящее время медицинские учреждения почти полностью перешли на работу с разовыми шприцами и кипячение используется редко.
• Стерилизация сухим жаром проводится в сухожаровом шкафу (печи Пастера) (рис. 5.2). Этот прибор похож на духовку газовой или электрической плиты. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду. Температура 160—180 °C, время 1,5—2 ч.
• Стерилизация текучим паром осуществляется в аппарате Коха или в автоклаве с открытой крышкой. Аппарат Коха представляет собой металлический цилиндр с асбестовым покрыти-
Рис. 5.2. Оборудование для стерилизации. г
1 — печь Пастера; 2 — аппарат Коха; 3 — фильтры; 4 — автоклав вертикальный; 5 — автоклав горизонтальный.
ем (см. рис. 5.2). В крышке есть отверстие для выхода пара. На дно аппарата наливают воду, а на подставку, расположенную над водой, устанавливают стерилизуемый материал. Аппарат Коха помещают на обогреватель, и при кипячении воды пар поднимается вверх и выходит через отверстие крышки (течет). Температура не поднимается выше 100 °C. Такой способ стерилизации приводит к гибели только вегетативных форм.
• Для того чтобы освободиться от спор, проводят дробную стерилизацию (тиндализацию). Этот метод был предложен Тиндалем в 1877 г.
Материал сначала обрабатывают в течение 20—40 мин в аппарате Коха, затем оставляют на 24 ч при комнатной температуре. Споры за это время превращаются в вегетативные клетки. На следующий день стерилизацию повторяют. Дробным методом в течение 3 дней стерилизуют питательные среды и лекарственные препараты, в состав которых входят вещества, портящиеся при нагревании выше 100 °C. Среды, содержащие сыворотки, кровь и другие термолабильные компоненты, обрабатывают также дробно при температуре 56—58 °C в течение 1 ч.
• Пастеризация — способ стерилизации, при котором погибают только вегетативные формы некоторых патогенных бактерий. Это однократный прогрев при температуре 50— 60 °C в течение 35—40 мин или при 70—80 °C 10—15 мин. Чем выше температура, тем меньше время пастеризации. Таким способом обрабатывают пищевые продукты, не подлежащие длительному хранению (молоко, фруктовые соки и напитки, молочные изделия и др.). Пастеризация проводится для уничтожения, в частности, возбудителей кишечных инфекций. В пастеризованных продуктах сохраняются споры.
• Стерилизация паром под давлением производится в автоклаве (см. рис. 5.2). Метод основан на воздействии на стерилизуемые материалы насыщенного водяного пара при давлении выше атмосферного. При автоклавировании погибают все формы микроорганизмов. Правильный выбор режима автоклавирования позволяет применять его для обработки практически всех сред и инструментов. Исключения составляют объекты, о которых упоминалось выше.
Паром под давлением стерилизуют питательные среды, инструменты, посуду, перевязочный материал. В автоклаве обезвреживают инфицированный материал. Режимы стерилизации могут быть различными. Давление 0,5 атм соответствует температуре 11ГС, 1 атм — 121 °C, 2 атм — 134 °C. К работе с автоклавом (аппаратом под давлением) допускаются лица, прошедшие специальную подготовку.
Фильтрование — механический способ стерилизации без применения температурного воздействия. Так стерилизуют, например, термочувствительные жидкости, из которых необходимо удалить микроорганизмы. Поры фильтров очень мелкие и задерживают бактерии. В микробиологической практике используют асбестовые, целлюлозные, фарфоровые фильтры. Однако вирусы проходят через бактериальные фильтры.
К физическим методам стерилизации относят также обработку материалов рентгеновскими, ультрафиолетовыми, у-лу-чами.
Химические методы. Действие химических веществ на микроорганизмы уже обсуждалось ранее. В зависимости от природы и дозы химические вещества могут вызывать гибель 64
микроорганизмов. Наиболее часто они используются для уничтожения патогенных микроорганизмов в окружающей среде (дезинфекция).
Например, таким способом обеззараживают предметы, бывшие в употреблении больных с инфекционными заболеваниями. Дезинфекцию проводят в медицинских учреждениях всех профилей. С этой целью используют дезинфицирующие растворы, так называемые дезинфектанты (растворы формалина, хлорной воды, карболовой кислоты, хлорамин, хлороформ, йодоформ и др.). Для обработки кожи рук медперсонала используют спирт и другие вещества.
Аппаратуру с зеркальными или оптическими частями и изделия из пластмасс стерилизуют в специальных камерах газообразными веществами (этиленом, пропиленом, формальдегидом, озоном и др.).
В фармакологической практике рекомендуется добавление 0,3% фенола к лекарственным препаратам, неустойчивым к температурному воздействию. 50—70% спирт применяют как стерилизующий агент при изготовлении настоек и жидких экстрактов из лекарственных трав. Хлороформ и хинозол используют для обеззараживания белковых жидкостей, в том числе иммунных сывороток.
Химические методы стерилизации питательных сред могут вызвать изменения их свойств и сделать непригодными для культивирования микроорганизмов, поэтому их применение крайне ограничено.
Биологические методы стерилизации основаны преимущественно на применении антибиотиков. Ими пропитывают иногда перевязочный материал, добавляют их в пищевые продукты для предохранения от порчи, в питательные среды для культивирования клеток в вирусологической практике.
Глава 6
РОЛЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
В ПРИРОДЕ И ИХ РАСПРОСТРАНЕНИЕ
Микроорганизмы выполняют важнейшие функции преобразования сложных органических веществ в простые минеральные формы, доступные растениям. Они играют ведущую роль в круговоротах азота, углерода, серы, железа и других элементов.
Круговорот углерода. Углерод входит в состав всех живых организмов. Растения потребляют его из углекислого газа атмосферы. Если бы запасы СО2 не пополнялись, то их количества хватило бы для обеспечения жизни растений на 40— 50 лет. Этого не происходит, так как в воздух постоянно по-
СО2 Фотосинтез
Растения
Растительные остатки
Атмосфера
Дыхание
Обмен
СО2 Дыхание
Животные
Животные остатки
Минерализация
Вулканы (извержения)
Осад ки
Почва
Уголь Нефть Газ Торф
Микроорганизмы аэробные и анаэробные
Минерализация
Океаны (растения, животные, фотосинтез, дыхание, минерализация)
Рис. 6.1. Круговорот углерода в биосфере.
ступают новые количества СО2 (рис. 6.1). Его источником служат вулканические газы, минеральные воды, продукты сгорания древесины, торфа, угля, нефти. СО2 поступает в атмосферу и при выветривании горных пород. Живые организмы выделяют углекислый газ при дыхании. Но основными поставщиками углерода являются микроорганизмы различных видов. Они осуществляют превращение сложных углеродсодержащих веществ в аэробных и анаэробных условиях. При этом вместе с основными продуктами процесса (кислотами, спиртами и др.) выделяется СО2. В каждом превращении углеродсодержащих веществ принимают участие высокоспециализированные микроорганизмы, обладающие необходимыми ферментными системами.
Круговорот азота. Азот — важнейший элемент клетки. Все живые организмы добывают его по-разному. Человек и животные потребляют азот в виде растительных и животных белков, а растения берут из почвы в форме водорастворимых минеральных соединений. Преобразование азотсодержащих ор-
IP'
ганических соединений в почве осуществляют микроорганиз-мы. На схеме представлен процесс круговорота азота. Он похож на «комбинированную эстафету» в спорте, где на одном этапе выступают бегуны, а на следующем — пловцы и т. д.
Здесь также один этап превращений азотсодержащего вещества ведут одни виды микроорганизмов, а следующие — другие (рис. 6.2).
Сначала аммонифицирующие микроорганизмы осуществляют разложение белка и «передают» выделившийся в результате аммиак нитрифицирующим бактериям. Идет процесс нитрификации, который заканчивается образованием нитритов и нитратов. Их преобразуют в свободный газообразный азот денитрифицирующие бактерии. Появление свободного азота включает в работу азотфиксирующие бактерии, которые превращают его в белок собственных клеток.
Круговорот азота •— яркий пример метабиоза, когда продукт жизнедеятельности одних микробов служит источником питания для других.
Микроорганизмы способны превращать соединения серы, железа и других элементов.
Вместе с тем способность микроорганизмов использовать в качестве источника питания самые разнообразные вещества может привести к отрицательным результатам. Под действием микроорганизмов портятся продукты питания, лекарственное животное и растительное сырье и готовые формы. Известны случаи разрушения деревянных строений, подземных частей зданий, металлических конструкций, трубопроводов и др. В странах с тропическим климатом от микробного разрушения страдают даже автомобили.
Наибольшую угрозу представляют патогенные микроорганизмы, вызывающие заболевания людей, животных и растений.
На протяжении своего существования человечество научилось использовать микроорганизмы и продукты их синтеза в практических целях, С их помощью готовят молочнокислые продукты, хлеб, вино и др. Разработаны технологии микробного производства многих химических веществ (ацетона, уксуса, бутанола и др.). Микроорганизмы используются как продуценты антибиотиков, вакцин, ферментов, витаминов. В этих процессах применяют современные методы, в том числе генную инженерию.
Микроорганизмы позволяют решить некоторые задачи улучшения экологии окружающей среды — очистку сточных вод, превращение отходов в биогаз, освобождение водоемов от нефтяных загрязнений и многое другое.
Для того чтобы представить видовой и количественный состав и функции представителей микромира, необходимо подробнее познакомиться с местами их обитания в окружающей среде.
6Л. Распространение микроорганизмов в природе
Микроорганизмы распространены повсюду: в почве, воде, воздухе, растительных и животных организмах. Они образуют сообщества — микробиоценозы. Места их обитания (почва, вода, воздух, организмы) называются биотопами.
Микроорганизмы почвы. Наибольший видовой и количественный состав микроорганизмов обнаруживается в почве. Здесь есть все условия для их существования: разнообразие питательных веществ, влажность, температура и др. Наибольшее количество микрофлоры обитает на глубине 10—20 см.
На ее состав и численность влияют природно-климатические условия, свойства почвы, глубина, обработка. Так, в хорошо обработанной удобренной почве в 1 гектаре живая масса микроорганизмов превышает б т.
Основные обитатели почвы — сапрофитные микроорганизмы, осуществляющие процессы круговорота веществ, о которых упоминалось раньше.
Почва неблагоприятна для жизни патогенных микроорганизмов. Исключение составляют отдельные виды патогенных грибов.
Тем не менее патогенные микроорганизмы попадают в почву из организма людей и животных, со сточными бытовыми и промышленными водами, с мусором и другими отходами. Большинство неспорообразующих микроорганизмов быстро погибает в неблагоприятных для них условиях почвы. Однако некоторые виды довольно долго сохраняются в ней. Например, возбудители бактериальной дизентерии выживают в течение 10 дней и более (до 9 мес); возбудитель туберкулеза — от 3 до 7 мес и дольше.
Споры возбудителей ряда заболеваний (столбняка, газовой гангрены, ботулизма) не теряют жизнеспособности в течение нескольких лет. Споры возбудителя сибирской язвы в захороненных трупах выживают десятки лет. Существует прямая зависимость между уровнем заболеваемости людей кишечными инфекциями и плохим санитарным состоянием почвы.
Микрофлора воды. В воде существуют благоприятные условия для жизни сапрофитных микроорганизмов. Численность и состав микробных ценозов в воде зависят от тех же факторов, что и в почве. Дополнительными характеристиками для воды являются также скорость течения в водоемах и степень их солености. Многие водные микроорганизмы живут в экстремальных условиях. Их обнаруживают на глубинах свыше 10 тыс. м (в Тихом океане), в водах термальных источников и даже в Мертвом море. Особенно много микроорганизмов в стоячей воде и в илистых отложениях на дне, где содержится большое количество органических веществ.
Аналогично почве, вода может служить источником инфекции и фактором распространения возбудителей заболеваний. Большинство патогенных микроорганизмов не размножается, а только выживает в воде. Некоторые виды способны к размножению в водной среде. В частности, холерные вибрионы Эль-Тор могут не только длительно жить, но даже размножаться в теплой воде прибрежной зоны. Они сохраняются также в течение нескольких месяцев в организмах рыб и ракообразных. Известны вспышки лептоспироза, связанные с купанием в зараженных возбудителем водоемах. Водный путь передачи характерен для шигелл Флекснера — возбудителей бактериальной дизентерии. Через воду могут распространяться возбудители брюшного тифа, полиомиелита, гепатита А, энтеровирусы и др.
Микрофлора воздуха. Воздух в отличие от почвы и воды не является благоприятной средой для микроорганизмов. Вместе с тем в нем обнаруживают различные виды бактерий и грибов, которые могут сохраняться там в течение определенного времени. Микроорганизмы попадают в воздух из почвы, воды, с выдыхаемым воздухом и каплями слизи от людей и животных. Количественный и видовой состав микрофлоры воздуха зависит от времени года, погодно-климатических условий, наличия промышленных предприятий, расположения населенного пункта и других факторов. Обсемененность микроорганизмами воздуха помещений зависит от санитарного состояния, освещенности, частоты проветривания. Через воздух распространяются возбудители туберкулеза, чумы, кори, натуральной оспы, дифтерии, ветряной оспы, гриппа, скарлатины и др. В воздухе операционных и родильных залов не допускается наличие гемолитических стафило- и стрептококков.
Изготовление стерильных лекарственных форм в аптеках
проводят в отдельном асептическом блоке. Вход в него осуществляется через специальный тамбур —шлюз (коридор), чтобы не допустить попадания загрязненного воздуха из других помещений аптеки. Фармацевты работают в наглухо закрытых (хирургических) халатах, бахилах, шапочках. Рот и нос закрывают четырехслойной маской, которая должна меняться через каждые 4 ч. В аптеках проводится ежедневная влажная уборка с использованием дезинфицирующих средств.
Микрофлора пищевых продуктов. Патогенные микроорганизмы могут также передаваться через пищевые продукты. Инфицирование может происходить на всех этапах приготовления продуктов и пищи. Источниками такой инфекции, как бруцеллез, служат молоко и мясо больных животных. Патогенные бактерии и грибы могут попасть на продукты из почвы, воды, воздуха, с рук людей при обработке и приготовлении пищи. Распространению микроорганизмов способствуют и некоторые насекомые, в частности мухи. Сроки выживания на продуктах зависят от множества факторов: вида микроорганизма, его формы (вегетативная или споровая), консистенции продукта, его состава, pH и др. На предприятиях пищевой промышленности ведется постоянный контроль за качеством продуктов, отсутствием в них патогенных микроорганизмов и их токсинов. Сапрофитные микроорганизмы, попадая на продукты, могут вызвать их порчу.
6.2. Микрофлора тела человека и животных
Изучение микрофлоры тела человека, которую называют также нормальной микрофлорой (нормофлорой), началось на ранних этапах становления микробиологии. Известны исследования И. И. Мечникова, связывавшего проблемы старения с гнилостной микрофлорой кишечника. Значение нор-мофлоры организма человека отмечено в работах П. В. Цик-линской (1859—1932). Она стала первой женщиной, получившей звание профессора микробиологии, и заведовала кафедрой микробиологии на Высших женских курсах в Москве.
Микрофлора человека представлена разнообразными микроорганизмами. Их совокупность называют эубиозом или эумикробиозом, а отдельные виды — эубиотиками. Различают резидентную (постоянную для данного биотопа) и тран-зиторную (непостоянную) микрофлору, занесенную из других биотопов или внешней среды микрофлору. Некоторые исследователи называют постоянную микрофлору ауто-хтонной, а среди транзиторной выделяют аллохтонную (из другого биотопа организма) и заносную (попавшую из внешней среды).
В составе нормофлоры обнаружены сапрофитные и условно-патогенные микроорганизмы. Наряду с представителями нормальной микрофлоры в организме человека встречаются патогенные виды бактерий, грибов и вирусов.
Плод, стерильный во время беременности, контаминируется при прохождении по родовым путям, а затем после рождения — микроорганизмами окружающей среды. К возрасту 3 мес состав микрофлоры ребенка представлен теми же видами, что и у взрослого.
Микрофлора кожи. На коже чаще всего обнаруживаются сардины, непатогенные стафилококки, стрептококки, дрожжи и
дрожжеподобные грибы, пропионовые бактерии, коринебак-терии, коринеформные бактерии. В складках кожи, протоках сальных и потовых желез обитают анаэробные сапрофиты. Субстратом для питания микроорганизмов кожи служат чешуйки эпителия, выделения потовых и сальных желез. Тран-зиторная микрофлора попадает из внешней среды. Ее состав зависит нередко от рода работы человека. Так, у лиц, занимающихся обработкой почвы, на кожу рук попадают почвенные микроорганизмы. Подобных примеров можно привести немало. Таким же образом на кожу могут попасть и патогенные виды, например, при разделке туш, обработке кожи и меха животных, больных сибирской язвой. Нормальная, неповрежденная кожа служит барьером, препятствующим проникновению микробов внутрь организма. Количественный и видовой состав микрофлоры различается на отдельных участках и зависит от возраста человека, его пола и общего состояния кожи. В некоторых случаях состав микрофлоры кожи определяют перед операциями у больных. Обследуются работники детских, лечебных и пищевых предприятий.
Микрофлора глаз. Глазница, внутренняя среда глазного яблока обычно стерильны. Лизоцим, содержащийся в слезах, обладает бактерицидным действием. В небольших количествах представлена микрофлора конъюнктивы. Здесь могут присутствовать нейссерии и коринебактерии (непатогенные), сарци-ны и сапрофитные стафилококки. Увеличение количества видов и появление патогенных микробов отмечено при заболеваниях глаз.
Микрофлора дыхательных путей. Большая часть микроорганизмов, попадающих при дыхании вместе с воздухом, задерживается в верхних дыхательных путях. Этому способствуют слизь, реснички эпителия, секреторные иммуноглобулины, лизоцим.
Альвеолы легких и бронхи в норме стерильны. В носоглотке чаще всего встречаются стафилококки и стрептококки, дифтероиды, нейссерии, среди которых могут быть и патогенные, например возбудители дифтерии, менингита, пневмонии и др. На миндалинах постоянно обнаруживаются кокки и ко-ринебактерии. Некоторые патогенные кокки вызывают ангину, тонзиллит.
Микрофлора ротовой полости. Лучше всего характеризует этот биотоп запись, сделанная А. ван Левенгуком: «Меня посетили благородные дамы, которым очень хотелось посмотреть на маленьких змеек в капле уксуса. Однако некоторым из них эти змейки показались настолько отталкивающими, что они поклялись никогда больше не брать уксуса в рот. Но что бы сказали эти дамы, узнав, что в налете только одного их зуба таких существ больше, чем в целом королевстве?».
Действительно, ротовая полость — один из наиболее заселенных биотопов человеческого организма (табл. 6.1). Она обеспечивает хорошие условия для развития многих микроорганизмов. Щелочная реакция слюны, входящие в ее состав белки, липиды, аминокислоты, углеводы, минеральные вещества, влажность, температура способствуют жизнедеятельности аэробных и анаэробных бактерий, спирохет, грибов, простейших, вирусов. В полости рта насчитывается около 400 видов. Количество микробных клеток составляет в 1 мл слюны от 104 до 109. Резидентная микрофлора представлена грампо-ложительными кокками — Streptococcus mutans, S.sanguis, S.mitis, S.salivarius. Из кокковой микрофлоры обитателями ротовой полости являются пептострептококки, а также грамотрицательные анаэробные вейлонеллы шаровидной формы. Многообразны бактериальные и бациллярные формы. Среди них бифидо- и лактобактерии, нейссерии, коринебактерии, пропионобактерии, лептотрихи и фузобактерии. В ротовой полости обитают также бактероиды, дрожжеподобные грибы (кандида), спирохеты, актиномицеты. Среди спирохет чаще встречается Treponema denticola. Видовой и количественный состав этого биотопа изменяется в зависимости от возраста, иммунного статуса организма, состояния зубов (наличия кариеса, зубных протезов и др.), а также от питания и гигиены полости рта. В составе транзиторной микрофлоры встречаются патогенные виды. Они могут попадать в полость рта из других биотопов (носоглотки, кишечника), а могут быть занесены из окружающей среды.
Микрофлора желудка. Желудок при нормальном функцио-
Таблица 6.1. Микроорганизмы, составляющие основной пейзаж резидентной микрофлоры полости рта
Род
Вид
Морфо- Окраска логия по Граму
Тип дыхания
Streptococcus
Peptostrepto-coccus
Veillonella Lactobacillus
Bifidobacterium
Fusobac terium
Leptotrichia Porphyromonas Prevotella Bacteroides
С о ry neb ac terium
Actinomyces
Neisseria
Treponema
Borrelia
Mycoplasma
S.mutans, S.mitis, S.sanguis, S.saliva-rius
P.anaerobius, P.mi-cros, P.parvulus, P.productus
V.parvula
L.casei, L.delbrue-ckii
B.bifidum
F.necrophorum, F.nucleatum, F.plautii
L.buccalis P.gingivalis P. mel aninogenica B.fragilis Классификация недостаточно разработана A.naeslundii, A.odontolyticus, A.viscosus, A.israelii Классификация недостаточно разработана T.denticola и др.
В. buccalis M.salivarium, M.orale
То же
» »
» »
» »
» »
» »
» »
Нитевидные
Кокки
Извитые
То же Полиморфные
Кокки
»
»
Палочки
Г-
I г—
Аэробы, факультативные анаэробы Анаэробы
»
Анаэробы, факультативные анаэробы, аэробы Анаэробы
»
»
»
»
Аэробы, факультативные анаэробы То же
» »
Анаэробы
То же
Факультативно-анаэробные, аэробные
нировании — неблагоприятная среда для микроорганизмов. Кислая среда желудочного сока оказывает бактерицидное действие на многие виды нормофлоры и патогенов и создает естественный барьер на пути их проникновения в кишечник. В частности, холерные вибрионы нередко погибают в желудке, не доходя до тонкого кишечника — основного места их лока-
лизации. При нормальной или повышенной кислотности видовой состав аналогичен составу микрофлоры ротовой полости, но представлен очень малым количеством особей (не более 103 в 1 мл содержимого желудка). Изменение величины pH среды при некоторых заболеваниях может привести к тому, что в желудок, а затем и в кишечник проникнут патогенные микроорганизмы. Так, у больных гастритом обнаруживаются виды, обитающие в кишечнике. Аналогичные явления происходят при смене диеты. При язвенной болезни желудка и гастритах в желудке появляются бактерии рода Helicobacter.
Микрофлора кишечника. В различных отделах кишечника общее содержание микроорганизмов и их видовой состав варьируют.
Тонкий кишечник заселен бифидо- и лактобактериями, клостридиями, анаэробными кокками. Микроорганизмов здесь больше, чем в желудке. По мере продвижения в нижние отделы количественный и видовой состав микрофлоры увеличивается. В тощей и подвздошной кишке, кроме указанных выше микроорганизмов, присутствуют стрептококки, дифте-роиды, грибы. Количество микробных клеток в 1 г содержимого этих отделов кишечника увеличивается до 103—105.
Наиболее заселена толстая кишка. Кроме видов, обитающих в верхних отделах кишечника, в ней обнаруживаются ак-тиномицеты и простейшие. В больших количествах содержатся кишечная палочка и бактерии группы кишечной палочки — энтеробактер, цитробактер, клебсиеллы, протей. Здесь же обитают анаэробные клостридии, синегнойная палочка, пропионовые бактерии, стафилококки, простейшие, грибы, вирусы и др.
В толстом кишечнике доминируют бактероиды и бифидобактерии. Количество особей в 1 г содержимого дистальных отделов доходит до показателей 1011—1013 и даже 1014. На формирование микрофлоры кишечника оказывают влияние возраст человека, диеты, сопутствующие заболевания, антибио-тикотерапия и др. У здоровых людей соотношение различных видов сбалансировано. Такое состояние равновесия называют эубиозом. У больных могут наблюдаться явления дисбиоза (дисбактериоза), вызванные обычно условно-патогенными микроорганизмами. При этом нарушается соотношение отдельных видов микроорганизмов, вплоть до полной гибели некоторых из них (Приложения 1, 2).
Нормофлора кишечника выполняет ряд положительных функций. Находящиеся там лакто- и бифидобактерии продуцируют молочную кислоту и поддерживают pH среды, препятствующую росту гнилостных и некоторых патогенных бактерий. Ряд видов синтезирует антибиотические вещества, подавляя конкурентов. Есть микроорганизмы, способные разрушать токсичные и канцерогенные соединения. Нормофлора желу-
дочно-кишечного тракта участвует в образовании «слизистого барьера». В его состав входят слизь, которая обволакивает стенки кишечника, иммуноглобулин А и микрофлора. Этот слой выполняет защитную функцию.
Существует такое понятие, как «колонизационная резистентность», в которой нормофлора кишечника играет важнейшую роль. Именно она вместе с защитными факторами макроорганизма обеспечивает постоянство микробиоценоза в биотопе (эубиоз), о котором говорилось выше. Анаэробные лактобактерии и бифидобактерии выполняют основную функцию в создании и поддержании колонизационной резистентности кишечника. Они препятствуют адгезии патогенных микроорганизмов к эпителию кишечника и обладают набором антагонистических факторов (ферментов, бактериоцинов, химических метаболитов). При нарушении эубиоза проводят «селективную деконтаминацию» — избирательное устранение нежелательных видов аэробных микроорганизмов. Для этого назначают специальные препараты, подавляющие их рост и
размножение.
Микрофлора желчного пузыря и желчных путей. В норме в
этих биотопах микрофлора отсутствует, поскольку желчь об
ладает сильным бактерицидным действием. Обнаружить мик
роорганизмы можно только в тех случаях, когда человек страдает заболеваниями, возбудители которых устойчивы к желчи и могут даже обитать в желчном пузыре или желчных путях. Например, возбудитель брюшного тифа Salmonella typhi может в течение длительного времени находиться в указанных биотопах у хронических носителей. У больных холециститом выявляют условно-патогенные клебсиеллы, энтеро- и коли-бактерии, грибы кандида, стафилококки.
Микрофлора мочеполовой системы. Почки, мочеточники, мочевой пузырь у здоровых людей не содержат микроорганизмов. На наружных половых органах локализуются сапрофитные микобактерии смегмы. По морфологии они похожи на туберкулезные палочки. Вместе с ними встречаются стафилококки, коринебактерии, микоплазмы, фузобактерии. При заболеваниях мочеполовой системы с мочой выделяются пато
генные микроорганизмы.
Микрофлора влагалища. В составе микрофлоры влагалища постоянно присутствуют лактобациллы, коринебактерии, непатогенные трепонемы, энтеробактерии и др. Среди лактобацилл особого внимания заслуживает палочка Дедерлейна. Она появляется в микрофлоре влагалища в период половой зрелости женщин. По количеству палочек Дедерлейна в сочетании с другими микроорганизмами и значением pH среды различают 4 степени чистоты влагалища:
I — много палочек Дедерлейна, другая микрофлора отсутствует; pH 4—4,5;
II — большое количество палочек Дедерлейна, появляются грамположительные кокки, лейкоциты отсутствуют; pH 5— 5,5;
III — малое количество палочек Дедерлейна; многообразие видов бактерий с преобладанием грамположительных кокков, присутствуют лейкоциты; pH 6—7,2;
IV — палочки Дедерлейна отсутствуют; большое количество стафилококков, стрептококков, энтеробактерий, лейкоцитов; pH 7,2-7,5.
Для женщин детородного возраста нормой считаются I и II степени чистоты; III и IV характерны для менопаузы или некоторых заболеваний.
С учетом важной роли микрофлоры в жизни человека в
медицинскую практику широко внедряются препараты, получившие название эубиотиков или пробиотиков (последнее употребляется чаще). Далее приводятся сведения о некото
рых препаратах, использование которых дает положительные результаты в профилактике и лечении дисбиозов (Приложение 5).
Микрофлора тела животных. Микробный пейзаж тела животных во многом совпадает с таковым у человека. Не вдаваясь в детали, считаем целесообразным остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях микрофлоры тела
животных.
Микрофлора кожи и шерсти. Зависит от вида животного, его местообитания и питания. Это необходимо учитывать при приготовлении некоторых фармацевтических препаратов, основой для которых является животное сырье. Например, в
шерсти и на коже могут присутствовать почвенные и водные микроорганизмы (аммонифицирующие бактерии), которые
очень быстро вызывают порчу животного сырья.
Микрофлора желудочно-кишечного тракта. Различные отде-
лы заселены неравномерно, и здесь четко прослеживаются те же закономерности, что и в кишечнике человека. По мере удаления от желудка увеличивается видовой и количественный состав микроорганизмов, достигающий максимума в тол
стом кишечнике.
У некоторых жвачных травоядных животных (коровы, буй-
волы) желудок состоит из нескольких отделов. Один из них
называется рубцом. У людей и других животных подобного
отдела нет. Рубец является органом первичной переработки грубых волокнистых кормов (травы). В нем обитает от 1О10 до 1011 клеток бактерий и до 106 простейших. Последние представлены более чем 150 видами. Переваривание корма в рубце идет не под влиянием ферментов организма животного, а под действием ферментов микроорганизмов. Эту функцию выполняют многочисленные целлюлозоразрушающие анаэробные бактерии. Микроорганизмы рубца находятся в симбиотиче
ских отношениях с организмом жвачного животного и образуют особую экологическую систему.
Отличительной особенностью микрофлоры тела животных является содержание у них некоторых микроорганизмов, характерных для микрофлоры почвы: сенной палочки, целлюлозоразрушающих анаэробных бактерий и бацилл, картофельной палочки и некоторых видов грибов. Очень часто указанные микроорганизмы присутствуют в составе микрофлоры растений.
Глава 7
МИКРОБИОЛОГИЯ ЖИВОТНОГО И РАСТИТЕЛЬНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СЫРЬЯ
7.1. Микробиология животного лекарственного сырья
Лекарственные средства животного происхождения называются органопрепаратами. В фармацевтической промышленности для их производства используют различные органы и ткани животных: гипофиз, паращитовидные и поджелудочную железы, плаценту, кровь, слизистые оболочки, надпочечники, печень и т. д.
К органопрепаратам относят препараты группы гормонов, ферментов, аминокислот, витаминов, фосфорсодержащие. Широкое применение в медицине нашли панкреатин, пепсин. Они используются для лечения многих заболеваний, связанных с нарушением функции пищеварения, печени и поджелудочной железы. Тиреоидин применяют в эндокринологии. Сосудосуживающим, кровоостанавливающим и стимулирующим деятельность сердечно-сосудистой системы свойствами обладает адреналин. Этот препарат получают из надпочечников крупного рогатого скота. Больные сахарным диабетом постоянно используют инсулин, приготовляемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней. Органопрепараты выпускают в виде экстрактов, таблеток, растворов, мазей и т. д.
Животное сырье может быть контаминировано микроорганизмами на всех этапах приготовления и хранения. Микробы могут попасть в исходное сырье из внешней среды. Кроме того, как уже указывалось ранее, каждый биотоп тела животного содержит нормальную микрофлору. Различные виды микроорганизмов, составляющие ее, могут попасть в сырье и вызвать его порчу.
Существуют специальные санитарно-ветеринарные правила убоя животных и взятия у них органов и тканей. Животные
должны быть здоровы. Использование в качестве доноров больных животных недопустимо, так как патогенные микроорганизмы, попавшие при этом в лекарственное сырье, могут стать причиной заболевания людей. Значение при выборе животных имеют их масса тела и возраст.
Производство органопрепаратов обычно сосредоточено на бойнях и мясокомбинатах либо в непосредственной близости к ним. Это связано с тем, что многие ткани и органы быстро теряют свои биологические свойства и являются скоропортящимися продуктами. При длительной транспортировке сырья к месту переработки повышается риск загрязнения посторонней микрофлорой. Если нет возможности обработать сырье на месте, его консервируют замораживанием при температуре — 8—12 °C и ниже. При таком способе удается сохранить необходимые вещества и защитить сырье от порчи под действием микроорганизмов. Иногда для консервации используют этанол или ацетон. Ранее мы уже обсуждали особенности микрофлоры тела животных и обращали внимание на то, что ее состав и количество зависят от вида животного, его местообитания и кормления. Внешний вид животного, его фенотип во многом определяют нормофлору кожи и наружных покровов. Известно, например, что есть короткошерстные и длинношерстные животные. У последних микроорганизмы попадают в более комфортные условия. Длинная шерсть лучше защищает их от дождя, холода, ветра. Сама площадь, которую могут занять микробы, больше, чем у короткошерстных. У животных одного и того же вида, обитающих в почве на разных глубинах (кроты, землеройки и др.), состав микрофлоры варьирует. Чем глубже под слоем почвы обитает животное, тем больше анаэробных микроорганизмов адсорбируется на его покровах.
Аналогично почвенным обитателям, водные млекопитающие несут на своей коже и шерсти бактерии, грибы и простейшие, соседствующие с ними в водоеме.
Животное лекарственное сырье может быть загрязнено микроорганизмами не только при убое, но и при разделке туши, препарировании органов, измельчении, в процессе приготовления препаратов и т. д. Источниками микроорганизмов могут стать не только воздух или вода, но и посуда, аппаратура, растворы. Нельзя исключить роль переработчиков и фармацевтов в инфицировании лекарственного сырья и готовых форм. Микроорганизмы могут передаваться через руки, выделяться при кашле, чиханье и т. д. Собственная микрофлора тела животных из одного биотопа может быть перенесена в другой.
Неправильные условия хранения готовой продукции (органопрепаратов), при которых в них попадают микроорганизмы, делает их непригодными к применению.
Содержащиеся в животном сырье жиры, белки, углеводы представляют прекрасную питательную среду для микроорганизмов.
Признаками порчи животного лекарственного сырья являются изменение внешнего вида, цвета, консистенции, неприятный запах и др. Готовые лекарственные органопрепараты в зависимости от формы могут также изменяться под действием микроорганизмов: например, настойки мутнеют, в них могут образовываться осадки или поверхностные пленки. Такие проявления зависят от типа дыхания микробов, вызвавших порчу лекарства. Так же как исходное сырье, готовые формы могут изменять цвет, консистенцию, запах и т. д. В случаях контаминирования сырья или готовых препаратов грибами на них иногда обнаруживаются мицелий и споры. Не допускается содержание микроорганизмов в лекарственных формах, предназначенных для парентерального введения. В некоторых таблетированных препаратах, порошках допускается присутствие сапрофитных микроорганизмов. Их количественное содержание определяется бактериоскопическим и бактериологическим методами. Для предотвращения порчи лекарственного животного сырья и готовых органопрепаратов на всех предприятиях по его переработке и приготовлению, включая аптеки, необходимо соблюдать санитарные требования к помещениям, оборудованию, личной гигиене сотрудников и условиям хранения.
7.2. Микробиология растительного лекарственного сырья
С древних времен люди собирали растения и использовали их для лечения самых разнообразных заболеваний. Целебные травы прикладывали к гноящимся ранам, ожоговым поверхностям, готовили из них настои и отвары. Римский врач и фармацевт Клавдий Гален (131—201 гг. н.э.) впервые выдвинул положение о том, что в лекарственном сырье растительного и животного происхождения есть вещества полезные и бесполезные. Полезные оказывают лечебное действие, а бесполезные просто находятся вместе с первыми в животных и растительных тканях. Так, в фармакологической практике стали применять препараты, изготовляемые из растительного и животного сырья. Их называют галеновыми в честь ученого древности. Среди фармпрепаратов галеновые органопрепараты растительного происхождения занимают одно из ведущих мест. Они выпускаются в разнообразных формах: в виде сборов, настоев и отваров, капель, таблеток, экстрактов, сиропов, мазей, капсул и т. д. Все указанные лекарства готовят либо из высушенных, либо из живых растений. В 1928 г. российский ученый Б. П. Токин установил, что некоторые растения выде
ляют летучие вещества с бактерицидным действием на многие микроорганизмы. Эти вещества получили название «фитонциды» (от лат. phito — лист, ciedo — убивающий) и были отнесены к антибиотикам растительного происхождения.
Прежде чем рассматривать процессы, происходящие при заготовке, переработке и хранении растительного лекарственного сырья и препаратов из него, необходимо познакомиться с микрофлорой растений.
Известно, что растения состоят из двух основных частей — надземной и подземной. Надземные части растений располагаются над поверхностью почвы (стебли, листья, цветы, плоды). Микроорганизмы, расположенные на них, получили название эпифитных (от слов epi — на и phi ton — лист). Питательных веществ, необходимых микроорганизмам, на надземной части растений мало. Поэтому состав эпифитной микрофлоры скуден и однообразен. До 80% составляют бактерии родов Erwinia и Pseudomonas. Встречаются в небольших количествах свободноживущие азотфиксирующие бактерии рода Azotobacter. Грибы представлены в основном родами Pencillium, Fusarium, Mucor, Saccharomyces. Встречаются спорообразующие бактерии и актиномицеты. Количественный и видовой состав эпифитной микрофлоры может изменяться в зависимости от условий, в которых растут растения. Большая роль отводится при этом температуре и влажности окружающей среды, а также близости городских и сельских строений, свалок, различных предприятий, автострад и др. Микробные ассоциации надземной части растений зависят от строения листьев, цветов, стеблей, плодов. Скоплению микроорганизмов способствуют шероховатости, бороздки на листьях, наличие ворсинок, выделение клейких и восковидных секретов и др. Например, семена, которые вызревают в специальных «закрытых» органах (бобах, коробочках, стручках), практически стерильны. На гладких восковидных листьях также крайне мало микроорганизмов. Они легко смываются дождем или сдуваются ветром. Эпифитные микроорганизмы не приносят вреда растениям и создают барьер для проникновения фитопатогенных видов. При механическом повреждении надземных частей растений или при попадании патогенных микроорганизмов растения могут заболеть и погибнуть.
Корневая система большинства растений располагается под землей. Микроорганизмы, окружающие корневую систему, называют микрофлорой зоны корня. В ней можно дифференцировать микрофлору ризопланы и ризосферы. Ризоплана расположена непосредственно на поверхности корней, а ризосфера отдалена от корня на расстояние до 5 мм. Обычно всю микрофлору растений, расположенную в почве, называют ризосферной. Как известно, почва является благоприятным эпи
топом для жизни микроорганизмов, особенно сапрофитных. В большом количестве здесь представлены аммонифицирующие, нитрифицирующие, азотфиксирующие бактерии. Среди них — Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Azotobacter, Nitro-bacter, Nitrozomonas, анаэробные клостридии (непатогенные), анаэробные целлюлозоразрушающие и многие другие. Вокруг корней нередко обнаруживаются грибы. Их мицелий тесно переплетается с корнями растений, входит с ними в симбиоз и образует микоризу — грибокорень (от греч. mykes — гриб и rhiza — корень). Некоторые грибы, особенно базидиальные, образуют микоризу с корнями определенных растений. Любители сбора грибов знают, что подосиновики следует искать под осинами, а подберезовики — под березами. В составе ризосферной микрофлоры содержатся сапрофитные виды. Однако возможно проникновение через корни и фитопатоген-ных микроорганизмов.
Следует также обратить внимание на возможность попадания на растения микроорганизмов, патогенных для человека и животных. В почву с отбросами, навозом, компостом, сточными водами попадают вегетативные формы и споры патогенных микроорганизмов. Они адсорбируются на разных частях растений и могут таким образом попасть в лекарственное растительное сырье.
Фитопатогенные бактерии, грибы, актиномицеты, вирусы вызывают заболевания растений. В зависимости от таксономического положения возбудителя различают бактериозы, микозы, актиномикозы и вирусные поражения растений. Инфекционные заболевания растений быстро распространяются и нередко приводят к их гибели. Проявления заболеваний микробной этиологии у растений разнообразны: это пятнистость и скручивание листьев, некрозы, гнили, наросты в виде опухолей и др. (рис. 7.1). Локализация фитопатогенных микроорганизмов многообразна. В некоторых случаях избирательно поражаются листья, плоды, стебли, корни, цветы. В других — все растение целиком.
Больные растения непригодны в качестве лекарственного сырья. У них происходят изменения в составе действующих веществ; резко уменьшается их количество, снижается качество, а в некоторых случаях даже накапливаются вредные для макроорганизма элементы.
С учетом всего вышеизложенного необходимо предупреждать те негативные явления, которые могут привести к порче лекарственного сырья, и соблюдать определенные правила при заготовке, переработке и хранении лекарственного растительного сырья и готовых форм. Сбор лекарственных растений производят в сухую погоду, поскольку увеличение влажности приводит к возрастанию микробного числа.
Наибольшее количество патогенных для человека и живот-
И I
Рис. 7.1. Поражения растений, вызываемые
роорганизмами .
1 — скручивание листьев; 2 — наросты в виде опухолей; 3 — некроз; 4 — рожки спорыньи на колосе; 5 — гнили; 6 — пятнистость листа (мозаика)
итопатогенными мик-
ных микроорганизмов находится на поверхности растений, обитающих в загрязненных местах (свалки, пастбища, поля орошения, автомагистрали и др.).
Вблизи автотрасс и промышленных предприятий на растения попадают вредные токсичные вещества. Поэтому сбор лекарственных растений необходимо производить в экологически благополучных зонах.
Лекарственное сырье, также как и животное, может быть контаминировано микроорганизмами из внешней среды и собственной микрофлорой, переходящей при переработке из
одной части растения в другую (с листьев на цветы или стебли; с корней — на надземные части и т. д.).
Во время обработки источником обсеменения лекарственных растений могут стать вода, нестерильная посуда и аппаратура, персонал, участвующий в процессах заготовки и приготовления растительных препаратов. Следует отметить, что на срезанных растениях микроорганизмы размножаются быстрее, чем на живых, растущих. В высушенном сырье микроорганизмы не размножаются, так как не могут питаться в отсутствие воды.
При неправильном хранении растительное сырье может подвергнуться микробной порче. Этому процессу способствует увеличение влажности и температуры. Измельчение растений также убыстряет размножение на них микрофлоры, так как поверхность повреждения увеличивается.
Нарушение условий хранения вызывает постепенную замену Erwinia herbicola неспорообразующими пигментированными палочками. Если заготовленная масса уложена плотно, то создаются условия для развития термостабильных анаэробных видов микроорганизмов и идет постепенный разогрев растительной массы. При этом быстро разрушаются биологически активные компоненты растений. Одновременно с анаэробами появляются плесневые грибы и актиномицеты. С повышением температуры разогрева растительного сырья выше 40— 50 °C увеличивается число термофильных бактерий и бацилл, которые постепенно вытесняют все другие виды. При этом травы теряют первоначальную структуру и портятся. Готовить из них препараты нельзя, поскольку микроорганизмы разрушают фармакологически ценные компоненты.
Среди фитопатогенных микроорганизмов особенно опасны виды, продуцирующие токсины, например грибы фузариум, стахиботрис, спорынья и др. Их попадание в организм человека и животных может привести к тяжелым последствиям. Гриб Fusarium sporotrichiella синтезирует токсин, устойчивость которого столь велика, что он не инактивируется после обмолота и выпечки хлеба из пораженного им зерна. Он вызывает некротическую ангину. Издавна известна спорынья, поражающая хлебные злаки (см. рис. 7.1). Употребление хлеба, приготовленного из зараженных зерен ржи, вызывало судороги и получило название «злые корчи», или «эрготизм». В 1129 г. в Париже от эрготизма скончались 14 000 человек. Однако с зерен, пораженных спорыньей, собирают рожки гриба для приготовления фармпрепаратов. Эрготоксин, содержащийся в спорынье, используют при получении лекарств для акушерской практики.
В аптеках сотрудниками санитарно-эпидемиологической службы периодически проводится микробиологический контроль за состоянием санитарного режима. С этой целью ис
следуют воздух производственных помещений, смывы с рук персонала, смывы с аппаратуры и посуды, дистиллированную воду, лекарственное сырье и готовые формы.
Признаками микробной порчи препаратов, приготовленных из растений, являются изменение их цвета, консистенции, запаха, наличие пленок и осадков.
В готовых лекарственных формах способны размножаться спорообразующие и неспорообразующие бактерии, некоторые грибы и дрожжи, кишечная палочка и др. В частности, входящие в состав эпифитной и ризосферной микрофлоры сенная, картофельная палочки, плесневые грибы, некоторые дрожжи, сарцины и другие виды микроорганизмов выдерживают добавление к галеновым препаратам небольших концентраций йода, салициловой кислоты и других химических веществ.
Микробиологический контроль лекарственного животного и растительного сырья и препаратов из него проводится на основании установленных Государственным фармакопейным комитетом правил. С 1 января 2002 г. были внесены изменения в статью 2 «Методы микробиологического контроля лекарственных средств». В соответствии с ними установлены допустимые нормы содержания в сырье и препаратах некоторых микроорганизмов. В табл. 7.1 представлены требования к микробиологической чистоте лекарственных препаратов.
Таблица 7.1. Допустимые нормы содержания микроорганизмов в сырье и готовых препаратах
Категория
Применение
Рекомендуемые нормы для Гос-фармакопеи XII издания
Для парентерального введения Глазные лекарственные средства Для нанесения на открытые раны и ожоги
Другие лекарственные средства, к которым предъявляется требование «стерильность»
Для применения местно, транс-дермально
Для применения интраваги-нально
Для введения в полости
Для введения в дыхательные пути (за исключением тех лекарственных средств, которые должны быть стерильными)
Стерильность
Общее число аэробных бактерий и грибов (суммарно) — не более 102 в 1 г или 1 мл
Отсутствие бактерий семейства Enterobacteriaceae в 1 г или 1 мл
Отсутствие Pseudomonas в 1 мл или 1 г
Отсутствие Staphylococcus aureus в 1 г или 1 мл
Категория
Применение
Рекомендуемые нормы для Гос-фармакопеи XII издания
4
Для приема внутрь или введения ректально
Лекарственные растительные средства или лекарственное сырье «ангро», применяемые в виде настоев и отваров, приготовленных с использованием термической обработки
Лекарственные растительные средства или растительное сырье «ангро», применяемые без термической обработки
Отсутствие Escherichia coli в 1 г или 1 мл
Отсутствие Salmonella в 10 г или 10 мл
Отсутствие Pseudomonas aeruginosa в 1 г или 1 мл Отсутствие Staphylococcus aureus в 1 г или 1 мл Enterobacteriaceae не более 10 в 1 г или 1 мл
Общее число аэробных бактерий не более 107 в 1 г или 1 мл
Общее число грибов не более 105 в 1 г или 1 мл Escherichia coli не более 102 в 1 г или 1 мл
Общее число аэробных бактерий не более 105 Общее число грибов не более 104 в 1 г или 1 мл Отсутствие E.coli в 1 г или 1 мл
Отсутствие Salmonella в 10 г или 10 мл
Enterobacteriaceae не более 103 в 1 г или 1 мл
Примечание, 1. При обнаружении других условно-патогенных бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и вспомогательного материала не соответствует требованиям по по-
казателю «Микробиологическая чистота».
2. «Ангро» — в больших объемах, в больших упаковках (от gros).
ранц.— еп
Испытания лекарственных средств на наличие кишечной палочки и сальмонелл проводят с использованием сред: лактозного бульона, агара Эндо, агара Симмонса, бульона Хот-тингера, селенитовой среды, висмут-сульфитного агара.
Грибы выделяют на среде Сабуро.
Pseudomonas aeruginosa (синегнойную палочку) выделяют на МПА с фурагином, 0,1 % цетримидом. Для выделения стафилококка используют МПА, кровяной или молочно-солевой агар.
Глава 8
САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Санитарная микробиология изучает микрофлору окружающей среды с целью гигиенической оценки всех ее объектов (почвы, воды, воздуха, пищевых продуктов и др.) как возможных источников и путей передачи инфекций. Эта отрасль науки разрабатывает методы индикации и обезвреживания патогенных и условно-патогенных микроорганизмов во внешней среде, устанавливает допустимые нормы содержания различных групп и видов в объектах внешней среды, контролирует выполнение установленных микробных стандартов в воде, воздухе различных помещений, пищевых, лекарственных и других продуктах, определяет систему мер, направленных на обеззараживание указанных объектов. В ее функции входит также наблюдение за санитарным режимом лечебных учреждений, аптек, предприятий различных видов производства.
Патогенные микроорганизмы выявляют в объектах внешней среды чаще всего для того, чтобы оценить эпидемиологическую ситуацию и принять необходимые меры для ликвидации источников инфекции. Например, в зонах активного земледелия почвенные пробы исследуют на содержание в них спор возбудителей столбняка. В очагах такой особо опасной инфекции, как чума, постоянно функционируют станции, обследующие места обитания грызунов для выявления возбудителей заболевания. При вспышках кишечных инфекций в поле зрения санитарных микробиологов попадают водоисточники, пищевые продукты, лица, занятые производством продуктов питания и их реализацией.
Существует понятие «санитарно-показательные микроорганизмы». Их определяют как косвенный показатель возможного присутствия патогенных микроорганизмов.
Известно, что кишечная палочка, энтерококки и другие непатогенные бактерии постоянно обитают в кишечнике теплокровных животных, в том числе и человека. Их присутствие в почве, воде и других объектах внешней среды свидетельствует о том, что они загрязнены фекалиями. Это значит, что вместе с испражнениями больных людей во внешнюю среду могли попасть патогенные микроорганизмы (возбудители гепатита А, кишечных инфекций и др.). Для каждого объекта внешней среды существуют свои санитарно-показательные виды микроорганизмов.
Исследования почвы. Оценка санитарного состояния почвы проводится на основании:
• установления общего микробного числа (общего количества микроорганизмов в 1 г почвенного образца);
• выявления санитарно-показательных микроорганизмов.
Для почвы такими являются БГКП (бактерии группы кишечной палочки). Их в настоящее время называют колиформными бактериями (от названия Escherichia coli — кишечная палочка). Колиформные бактерии имеют палочковидную форму, грамотрицательные не обладают оксидазной активностью, не образуют спор, ферментируют лактозу и глюкозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37 °C в течение 24—48 ч.
Среди колиформных бактерий выделяют группу термотолерантных (термоустойчивых) бактерий (ТКБ). Они обладают теми же признаками, что и другие бактерии группы кишечной палочки, но отличительной особенностью является их способность ферментировать лактозу при более высокой температуре (44 °C). Эти бактерии обозначают иногда как ФКП-фекальные кишечные палочки. Среди них к виду Escherichia coli относят только те бактерии, которые не растут на цитратной среде.
Следует отметить, что, несмотря на название «бактерии группы кишечной палочки», здесь объединены не только эше-рихии, но и клебсиеллы, цитробактер, энтеробактер, обладающие перечисленными выше свойствами и признаками.
Энтерококки и фекальные кишечные палочки очень быстро погибают в окружающей среде, и поэтому обнаружение этих микроорганизмов в почве, воде свидетельствует о свежем фекальном загрязнении.
Санитарно-показательным микроорганизмом в почве служит и спорообразующая палочка Clostridium perfringens.
Исследование воды. Для оценки санитарного состояния воды определяют общее микробное число (ОМЧ), общее количество санитарно-показательных колиформных микроорганизмов (ОКБ), присутствие сульфитредуцирующих клостридий, коли-фаги (как показатель наличия кишечной палочки).
• Для определения общего микробного числа 1 мл исследуемой воды (в некоторых случаях предварительно готовят разведения и используют также 1 мл соответствующего разведения) высевают на питательный агар, после культивирования в термостате при температуре 37 °C в течение 24 ч подсчитывают общее число выросших колоний и определяют число КОЕ (колониеобразующих микроорганизмов в 1 мл исследуемой воды). В тех случаях, когда высев на питательную среду производят из разведений, количество выросших колоний умножают на показатель степени разведения.
• Общее количество колиформных бактерий — ОКБ (как санитарный показатель) определяют методом мембранных фильтров. При этом исследуемый объем воды (при исследовании питьевой воды проверяют 3 объема по 100 мл), фильтруют через мембранный фильтр, который затем помещают на среду Эндо и инкубируют при 37 °C в термостате в течение 24 ч. Колиформные бактерии разлагают лактозу и на среде
Эндо образуют колонии интенсивного розового цвета. На фильтре подсчитывают количество выросших окрашенных колоний. Микроорганизмы, выделенные из колоний, окрашивают по Граму и проверяют на наличие оксидазной активности и ферментацию лактозы.
• Сульфитредуцирующие клостридии определяют при выращивании на железосульфитном агаре при температуре 44 °C в течение 16—18 ч.
• Коли-фаги — вирусы, способные лизировать кишечную палочку, выявляются на основании формирования зон лизиса бактериального газона (образование негативных колоний) через 18 ч инкубирования проб при температуре 37 °C.
В Приложении 3 приведены нормативные данные по со-
держанию микроорганизмов в воде.
Исследование воздуха. Санитарное состояние воздуха оце-
нивают на основании определения общего микробного числа (количество микроорганизмов в 1 м3). Кроме того, выявляют
санитарно-показательные виды. Для воздуха таковыми служат
гемолитические стрептококки и стафилококки (зеленящий
стрептококк, р-гемолитическии стрептококк и гемолитиче
ский стафилококк). Присутствие указанных микроорганизмов
в воздухе свидетельствует о санитарном неблагополучии тех объектов, из которых они были выделены. Недопустимо со
держание патогенных кокков в воздухе хирургических, ожоговых и других лечебных помещений.
Санитарно-бактериологическим исследованиям подлежат смывы с рук медперсонала и работников пищевых предприятий, объектов общественного питания. В указанных учреждениях проводят также обследование посуды, инструментов, поверхности столов и т. д. На всех предприятиях пищевой и фармацевтической промышленности осуществляют постоянный санитарный контроль на всех этапах переработки исходных материалов, выпуска и хранения готовой продукции. Санитарномикробиологический контроль за объектами внешней среды является необходимой и очень важной мерой, предотвращающей заболевания и способствующей сохранению здоровья людей и улучшению экологии. В Приложении 4 приведены критерии оценки микробной обсемененности воздуха помещений аптек.
Глава 9
ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ
ПРЕПАРАТЫ. АНТИБИОТИКИ
Постоянно встречаясь с заболеваниями, наносящими огромный вред здоровью, а нередко и жизни людей, ученые разных стран искали средства для борьбы с ними. История этих поисков начинается с древних времен. Известны попытки Гале
на (II в.) использовать для лечения больных препараты, приготовленные из трав и органов животных. Ибн Сина (Авиценна), Парацельс также применяли самые разнообразные средства для восстановления здоровья своих пациентов. Среди этих лекарственных препаратов использовались не только растительные и животные, но и химические вещества: ртуть, сера, свинец и др. Именно химические вещества стали привлекать внимание исследователей в начале XX в.
Одним из основоположников науки химиотерапии стал немецкий ученый Пауль Эрлих, синтезировавший в 1909 г. препарат, известный сначала как соединение № 606. Позже он был назван сальварсаном. Этот препарат представлял собой соединение мышьяка и с успехом был применен при лечении человека, страдающего сифилисом. Номер 606 был присвоен сальварсану не случайно. До этого Эрлих путем синтеза получил 605 соединений мышьяка, которые обладали различными недостатками и не могли быть использованы для лечения. Через 3 года после сальварсана был создан неосальварсан (914-й вариант синтезируемого мышьяковистого соединения). Мы приводим историю открытия новых препаратов для того, чтобы подчеркнуть огромный труд и настойчивость исследователя в достижении цели.
Работы Эрлиха стимулировали развитие нового направления в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний. Вслед за мышьяковистыми соединениями в практику лечебных учреждений был введен открытый в 1935 г. Г. Домагком красный стрептоцид (анилиновый краситель пронтозил). В. Бетина в своей книге рассказывает о том, что первым пациентом Домагка стал его собственный сын, поранивший иглой руку. Начавшееся воспаление, вызванное стрептококком, не удавалось ликвидировать никакими средствами, и тогда был впервые применен стрептоцид.
В организме он расщеплялся с выделением активной фракции — сульфаниламида. Стрептоцид стал первым в группе сульфаниламидных препаратов.
Позднее были синтезированы такие хорошо известные и широко применяемые химиотерапевтические препараты, как оксихинолины, хинолоны, нитрофурановые и др.
Производные нитрофурана (фурацилин, фуразолидон и др.) оказывают действие на грамположительные и грамотри-цательные бактерии и хламидии, а также трихомонады. Ряд препаратов обладает избирательным действием против возбудителя туберкулеза (фтивазид и др.). Ремантадин, ацикловир применяются для лечения вирусных инфекций.
Особое внимание привлекает группа препаратов, объединяемых под названием «антибиотики», с которой мы познакомимся более подробно.
9.1. Общая характеристика антибиотиков
и их классификация
Новое направление в микробиологии и медицине — получение и применение антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний — началось с 1929 г. В Лондонской больнице святой Марии врач Александр Флеминг просматривал чашки с ростом патогенного стафилококка. На одной из них выросла плесень. Необычным было то, что в тех местах, где росли плесневые грибы, исчезли колонии кокков. Флеминг был не первым исследователем, который столкнулся с проявлением микробного антагонизма. Значительно раньше (в 70-х годах XIX в.) Д. Сандерс, В. А. Манассеин, А. Г. Полотебнов, Т. Хексли, В. Бабес, И. И. Мечников, Б. Гозио и др. отмеча
ли, что некоторые микроорганизмы могут в процессе своего развития образовывать вещества, которые препятствуют росту других микроорганизмов. Однако эти наблюдения не получили дальнейшего развития. Заслуга А. Флеминга состоит в том, что он выделил культуру гриба Penicillium notatum, вырастил ее в питательной среде и установил, что вещество, содержащееся в культуральной жидкости, способно убивать не только стафилококки, но и стрептококки, коринебактерии дифтерии и бациллы сибирской язвы. Выделить активное начало в виде препарата удалось только в 1940 г. Говарду Флори и Эрнсту Чейну в Оксфорде.
Сороковые годы XX в. были ознаменованы открытием новых препаратов. В 1942 г. из другого вида гриба рода Penicillium в СССР 3. В. Ермольева получила пенициллин, отличаю-
А. Флеминг (1881 — 1951)
щийся от пенициллина Флеминга. В том же году российские исследователи Г. Ф. Гаузе и М. Г. Бражникова выделили грамицидин из бактерии Bacillus brevis. В 1943 г. микробиолог из США С. Ваксман получил первый антимикробный препарат из актиномицета и назвал его стрептомицином. Эти открытия явились началом эры антибиотиков. К настоящему времени открыто и изучено несколько тысяч антибиотиков, многие из которых применяются в медицине для лечения различных инфекционных заболеваний. Кстати, назва-
3. В. Ермольева (1898—1974)
С. А. Ваксман (1888-1973)
ние «антибиотики» (anti — против, bios — жизнь) дал этой группе препаратов С. Ваксман.
Антибиотики — специфические продукты жизнедеятельности микроорганизмов, обладающие активностью по отношению к определенным организмам — бактериям, грибам, актиномицетам. Антибиотики задерживают либо подавляют их рост.
Существует несколько классификаций, основанных на разных признаках и свойствах антибиотических препаратов.
Следует отметить, что за годы изучения антибиотиков изменилось представление о них. Раньше к антибиотикам причисляли только природные продукты, образуемые микроорганизмами. Затем появились полусинтетические и синтетические препараты.
В настоящее время не придерживаются требования об обязательном микробном или другом природном происхождении антибиотика. Лекарственные препараты природного или химического происхождения, обладающие избирательной активностью в отношении микроорганизмов различных групп, называют антимикробными препаратами (АМП).
Существует несколько классификаций, основанных на разных признаках и свойствах антибиотических препаратов.
I. По происхождению (табл. 9.1).
Происхождение
Организмы-продуценты
Препараты
Природные микробные
Бактерии
Грибы
Актиномицеты
Природные растительные
Природные животного происхождения
Простейшие
Вирусы
Низшие растения (лишайники)
Высшие растения
Животные, теплокровные, позвоночные
Животные холоднокровные, позвоночные
Насекомые
Полу синтетические (комбинированный способ получения)
Синтетические
Природные организмы-продуценты образуют «предшественники» будущего препарата, к которым присоединяют химические вещества, изменяющие химическую структуру антибиотика и свойства
Химические вещества
Грамицидин, полимиксины, тиротрицин Пенициллины, трихо-тецин, циклоспорины Стрептомицин, тетрациклин, актиномицины Круцин
Интерферон
Усниновая кислота
Фитонциды
Лизоцим, эритрин, спермин
Экмолин, скваламин
Иридомирмецин, педе-рин
Ациламинопеницилл и-ны, бромтетрациклин
Левомицетин, фторхи-нолоны, оксазалиди-ноны
II. По химической структуре антибиотики подразделяют на:
1. Бета-лактамные (пенициллины, цефалоспорины, кефзол и др.).
2. Тетрациклины (тетрациклин и его производные).
3. Аминогликозиды (стрептомицин, канамицин, гентамицин и др.).
4. Макролиды (эритромицин, олеандомицин и др.).
5. Полипептиды (полимиксины и др.).
6. Полиеновые (нистатин, амфотерицин В).
7. Рифамицины (рифампицин и др.).
8. Дополнительную группу (левомицетин, линкомицин, гризео-фульвин).
В таблицах и тексте упоминается для примера название 1— 3 препаратов. Кроме перечисленных существуют антибиотики
другого химического состава, а также те, у которых он еще до конца не определен.
III. По механизму действия различают несколько групп антибиотиков. Под механизмом действия понимают те структуры или компоненты клетки (мишени), на которые направлено действие препарата.
1. Антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины).
2. Нарушающие функции цитоплазматической мембраны микроорганизмов (полимиксины, нистатин, леворин).
3. Антибиотики — ингибиторы синтеза белков (тетрациклины, стрептомицин).
4. Антибиотики — ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот ДНК или РНК (актиномицины, рубомицин).
5. Антибиотики — ингибиторы синтеза пуринов и пиримидинов (азасерин, саркомицин).
6. Ингибиторы дыхания (антимицины, усниновая кислота).
7. Ингибиторы окислительного фосфорилирования (валиноми-цин, грамицидины).
8. Антибиотики, обладающие антиметаболитными свойствами (фураномицин и др.).
9. Анти биотики-иммуномодуляторы (брунеомицин, рубомицин).
IV. По спектру действия антибиотики подразделяют на:
1. Антибактериальные, эффективные при действии на бактерии. Среди них:
— препараты широкого спектра действия, они активны по отношению ко многим грамположительным и грамотрицательным бактериям;
— препараты узкого спектра действия; действуют избирательно на определенные группы бактерий:
• на грамположительные (цефалоспорины);
• на грамотрицательные (полимиксины);
• противотуберкулезные антибиотики (стрептомицин, канами-цин, циклосерин).
2. Противогрибковые (антифунгальные) — от слов anti — против, fungi — грибы). Само название этой группы говорит о том, что они оказывают воздействие на грибы. Среди них также есть антибиотики узкого (нистатин) и широкого (амфотерицин В) спектра действия.
3. Антипротозойные антибиотики. Число этих препаратов невелико. Примером может служить фумагиллин — противоамебный антибиотик.
4. Противоопухолевые антибиотики обладают цитотоксическим действием и используются в онкологии (рубомицин, актиномицин С, брунеомицин).
5. Противовирусные препараты. Среди противовирусных природных антибиотиков некоторые авторы приводят интерферон (его продуцируют клетки макро организма под действием вирусов или бактерий).
Существует также ряд препаратов, полученных путем химического синтеза: ацикловир, ремантадин, азидотимидин и др.
9.2. Действие антибиотиков на микроорганизмы
Антибиотики оказывают на микроорганизмы бактериостатическое или бактерицидное действие. В первом случае микробы приостанавливают свой рост и размножение, а во втором — погибают.
Антибактериальная активность антибиотиков выражается в единицах действия (ЕД), соответствующих действию определенной весовой части химически чистого препарата на тест-микроб. Для большинства антибиотиков 1 ЕД = 1 мкг хими
чески чистого вещества.
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют различными методами. Наиболее распространены ме-
тоды серийных разведений и дисков.
Метод серийных разведений.
Готовят основной раствор
препарата, содержащий определенное количество единиц, например 100 ЕД в 1 мл. Затем в ряд пробирок наливают по 1 мл стерильного мясопептонного бульона (МПБ). В первую пробирку с МПБ вносят 1 мл основного раствора препарата, затем последовательно переносят по 1 мл во вторую, третью и т. д. пробирки. При этом каждое следующее разведение содержит вдвое меньше антибиотика, чем в предыдущей пробирке. Затем в каждую пробирку с разведением антибиотика вносят одинаковое количество испытуемой тест-культуры микроорганизма. Контролем служат 2 пробирки. В одной из них МПБ + микроорганизм, в другой — МПБ + антибиотик. Посевы инкубируют 18—24 ч в термостате при температуре 37 °C, затем учитывают результаты (рис. 9.1). Минимальная концентрация антибиотика, при которой подавляется размножение бактерий (среда в пробирке остается прозрачной), называется бактериостатической дозой.
Бактерицидная доза — наименьшая концентрация антибиотика, вызывающая полную гибель микроорганизмов. Бактерицидные дозы определяют при высеве из тех пробирок с разведениями антибиотика, где не было видимого роста. На плотной питательной среде не должны расти колонии микроорга
низма.
Серийные разведения можно делать также, используя полужидкий агар. Концентрация антибиотика, при которой в пробирке нет признаков роста микроорганизма (пробирка прозрачна), считается минимальной подавляющей концентрацией (МПК). В последующих разведениях с меньшим содержанием препарата должен быть рост микроорганизма (пробирки мутные).
Метод дисков. На поверхность питательной среды в чашки Петри засевают «газоном» (вся поверхность чашки должна быть равномерно покрыта ростом микроба) исследуемую чистую культуру микроорганизма. Посев проводят шпателем, за-
123456789 10
Рис. 9.1. Определение чувствительности микроорганизма к антибиотикам методом серийных разведений.
В пробирках 1—3 отсутствие роста свидетельствует об ингибирующем действии антибиотика на бактерии. В пробирках 4—10 — помутнение за счет роста микроорганизма.
тем на поверхность посева на расстоянии друг от друга накладывают бумажные диски одинакового диаметра, пропитанные различными антибиотиками. Посевы выдерживают в термостате в течение 16—24 ч и учитывают результаты. Вокруг дисков с антибиотиками образуются зоны отсутствия роста (прозрачные) (рис. 9.2). Измеряют диаметр зон и делают вывод об антибиотической активности препарата по отношению к испытуемому микроорганизму. Диаметр менее 10 мм указывает на отсутствие активности, 10—15 мм —на слабую активность; 20—25 мм и более — на возможность использования препарата для лечения заболеваний, вызванных данным микроорганизмом. У высокоактивных препаратов диаметр зоны задержки роста составляет 25—35 мм.
В настоящее время созданы автоматизированные бактериологические анализаторы, позволяющие не только дифференцировать микроорганизмы по ферментативным свойствам, но и определять их чувствительность к антибиотикам (до 40 препаратов).
Следует отметить, что такие системы пока не внедрены в практику всех исследовательских лабораторий, поэтому метод дисков остается на сегодня наиболее широко применяемым.
Рис. 9.2. Определение чувствительности к антибиоти-
кам методом дисков. Тем-
ные зоны вокруг дисков — отсутствие роста микроорганизма.
1—4 —диски с разными антибиотиками.
Требования к антимикробным препаратам'.
• избирательная высокая активность;
• отсутствие или медленное развитие устойчивости возбудителя к препарату;
• сохранение антимикробного эффекта в жидкостях и тканях макроорганизма; низкий уровень инактивации в сыворотке крови;
• хорошее всасывание, распределение и выведение препарата, обеспечивающие терапевтические концентрации в крови, тканях и жидкостях макроорганизма;
• удобная лекарственная форма применения для различных возрастных групп.
9.3. Осложнения при антибиотикотерапии
Ошибки и неудачи антибиотикотерапии могут быть вызваны различными причинами: неправильным определением оптимальных доз (превышение или уменьшение дозы); неправильным выбором антибиотика. Не показано, например, назначение антибиотиков при вирусных инфекциях (исключение составляют некоторые препараты химического синтеза типа ремантадина), лихорадочных состояниях неясной этиологии.
Следует постоянно помнить о том, что антибиотики оказывают действие как на микро-, так и на макроорганизм. Остановимся более подробно на том, в чем выражаются эти действия и какие последствия они могут вызвать.
Побочное действие антибиотиков на макроорганизм. К осложнениям антибиотикотерапии относятся опасные для жиз
ни пациента и неопасные реакции.
Такое деление было предложено И. А. Кассирским и Ю. И. Милевской в 1966 г.
1. Опасными для жизни считаются анафилактический шок, отек гортани. Для предупреждения этого осложнения необходимо выяснить, не было ли у больного ранее реакции на препарат, провести в случае необходимости внутрикожную пробу, при положительной реакции заменить антибиотик на другой.
2. Неопасные для жизни реакции (зуд, аллергия, риниты, временное снижение слуха и др.).
3. Возникновение грибковых заболеваний. Чаще всего это кандидамикозы. Они могут возникнуть у лиц, длительно принимающих антибактериальные антибиотики широкого спектра действия. При этом погибает не только возбудитель инфекции, но и нормальная бактериальная флора организма. Грибы начинают быстро размножаться в отсутствие конкурентов. Для предотвращения подобных осложнений антибиотики широкого спектра действия назначают вместе с противогрибковыми, а затем нормализуют состав микрофлоры с помощью препаратов-пробиотиков.
4. Дисбиозы возникают нередко под действием ряда антибиотиков. Особенно характерны такие осложнения при лечении больных антибактериальными препаратами широкого спектра действия. Выше уже упоминалось о том, что наступают качественные и количественные изменения в составе нор-мофлоры.
5. Токсические реакции. Они обусловлены дозами препарата, состоянием больного и способами введения антибиотика. Токсические реакции могут привести к поражению печени, почек, слухового нерва и др. Для предупреждения таких осложнений выбор препарата и его назначение должны проводиться с учетом всех данных анамнеза больного. Например, не следует применять стрептомицин для лечения пациентов со сниженным слухом.
6. Действие на иммунную систему. Некоторые препараты оказывают иммунодепрессивное действие. Например, левомицетин подавляет антителообразование. В трансплантологии специально используют некоторые антибиотики, чтобы препятствовать отторжению органов или тканей (циклоспорин А). У больных снижение иммунитета под действием антибиотиков может вызвать рецидивы или реинфекции при некоторых инфекционных заболеваниях (брюшной тиф, скарлатина).
7. Феномен Герц-Гейнера. При лечении ударными дозами антибиотиков наступает массовая гибель микробов. При этом
выделяется большое количество эндотоксинов и продуктов микробного метаболизма, что утяжеляет заболевание в первые часы от начала лечения.
9.4. Механизмы формирования антибиотикорезистентности у бактерий
Как уже указывалось, антибиотики могут оказывать на микроорганизмы бактериостатическое или бактерицидное действие, именно поэтому эти препараты находят широкое применение при лечении инфекционных заболеваний. Вместе с тем использование антибиотиков связано с рядом отрицательных последствий. Под действием антибиотиков микроорганизмы могут изменять морфологические, культуральные, ферментативные, антигенные, биологические и другие свойства, а также оказывать действие и на геном микробной клетки.
Появление атипичных свойств у микроорганизма создает трудности при диагностике заболеваний. Особенно часто сталкиваются врачи с резистентными к антибиотикам формами микроорганизмов, что может отражаться на состоянии больных, удлиняя срок течения заболевания и степень его тяжести .
Антибиотикорезистентность может быть природной (видовой) и приобретенной.
Для природной устойчивости характерно отсутствие у микроорганизмов мишеней, на которые направлено действие препаратов. Примером могут служить микоплазмы, не имеющие ригидной клеточной стенки, поэтому пенициллин и другие препараты, ингибиторы синтеза клеточной стенки не оказывают на них действия, в данном случае отсутствие мишени — врожденный видовой признак.
Приобретенная устойчивость обусловлена мутационно-рекомбинационными изменениями генного аппарата микроорганизмов. Наиболее часто приобретенная устойчивость проявляется в преобразовании самой мишени: инактивации антибиотика, эффлюксе (активном выведении антибиотика), нарушении проницаемости внешних структур, формировании «метаболического шунта».
В результате мутаций гены, отвечающие за синтез ферментов, белков, структурных компонентов и т. д., изменяют их свойства и делают недоступными для антибиотика. Свойство антибиотикорезистентности может быть передано при рекомбинациях.
Большую роль в формировании приобретенной лекарственной устойчивости и ее передаче играют плазмиды резистентности (R-плазмиды). Они кодируют резистентность к одному или нескольким антимикробным препаратам. Им 98
свойственна межвидовая и межродовая передача этого признака.
Модификация мишени. Одним из примеров служат пени-циллинсвязывающие белки (ПСБ), которые участвуют в синтезе клеточной стенки бактерий. Именно на них и направлено действие р-лактамных антибиотиков. Основная активная часть молекулы пенициллина представлена р-лактамным кольцом. В результате различных воздействий на клетку микроорганизма нередко появляются мутанты с измененными ПСБ, на которые пенициллин и другие р-лактамные препараты уже не могут оказать действия, поскольку изменилась мишень. Подобным изменениям могут подвергаться и другие мишени — рибосомальные белки, мембраны и т. д. И если вспомнить о механизме действия различных антибиотиков, то легко понять, какие из них не смогут оказать действия на из
менившуюся мишень.
Инактивация антибиотика. Антибиотикоустойчивость может формироваться путем инактивации препаратов с помощью индуцированных ферментов. Некоторые микроорганизмы способны продуцировать ферменты, разрушающие антибиотики. До 60—80% стафилококков образует р-лактамазы, разрушающие р-лактамное кольцо пенициллина (отсюда и другое название этих ферментов — «пенициллиназы»). Известны амидазы, инактивирующие цефалоспорины; хлорамфени-колгидролазы, разрушающие хлорамфеникол. Некоторые микроорганизмы вырабатывают ферменты против нескольких антибиотиков и формируют полирезистентность. Образование ферментов, разрушающих антибиотики, может кодироваться как хромосомными, так и плазмидными генами. Известно, что у стафилококков синтез р-лактамазы детерминируется плазмидой.
Эффлюкс-активное выведение антибиотика из микробной
клетки осуществляется специальными транспортными системами, которые кодируются определенными генами. Например, у синегнойной палочки, пневмококка mef-ген отвечает за вывод из клетки некоторых макролидных антибиотиков. В результате концентрация препарата в клетке понижается и он не представляет опасности для бактерии.
Нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки. Примером могут служить штаммы микроорганизмов, утратившие в результате мутаций способность образовывать белки-порины. С их потерей клетка теряет проницаемость, но приобретает устойчивость к антибиотику, перед которым как бы «закрываются двери».
Формирование «метаболического шунта» (от англ, chunte — ответвление). В некоторых случаях микроорганизмы приобретают гены, кодирующие определенные этапы метаболического пути клетки, устойчивые к действию антибиотиков. Метабо
лизм идет по «обходному пути», и антибиотик не может его ингибировать. Часто такие гены резистентных ферментов входят в состав транспозонов.
Таким образом, следует обратить внимание на тот факт, что механизмы формирования резистентности к антибиотикам у бактерий неодинаковы. У одних наиболее часто выражена инактивация препаратов за счет синтеза ферментов, разрушающих его; у других — способность активно выводить антибиотик из клетки. Многие бактерии в борьбе с антибиотиками используют сразу несколько механизмов, которыми обладают.
Резистентность к антибиотикам является естественным биологическим ответом микроорганизма на их применение. В борьбе за сохранение собственной жизни микроорганизмы выработали и продолжают вырабатывать новые механизмы защиты. Антибиотикорезистентные микроорганизмы представляют серьезную угрозу для здоровья человека. Проблема антибиотикорезистентности имеет большое социально-экономическое значение.
В настоящее время выделяют несколько уровней резистентности — локальный, региональный и глобальный. Локальный касается вопросов формирования резистентности микроорганизмов к антибиотикам в конкретных лечебных учреждениях. Региональный уровень затрагивает проблему формирования антибиотикорезистентных микроорганизмов на территории отдельной страны. Глобальный уровень затрагивает все страны мира. Известно, что стафилококки, синегнойная палочка, стрептококки, гонококки стремительно вырабатывают устойчивость к антимикробным препаратам в лечебных учреждениях разных стран. В связи с этим идет постоянная работа над поиском путей преодоления антибиотикорезистентности. Некоторые из решений мы сейчас рассмотрим.
Пути преодоления лекарственной устойчивости:
• сократить использование антибиотиков с профилактической целью;
• периодически менять набор препаратов, применяемых для лечения инфекционных заболеваний в пределах одного лечебного учреждения;
• увеличивать лечебные дозы антибиотиков в допустимых пределах, чтобы не вызвать отрицательного воздействия на макроорганизм. При этом для создания максимально высоких концентраций препарата вводить его в очаг поражения (внутриплевральное, внутрисуставное введение и т. д.). При этом достигается «доставка» антибиотика к месту локализации возбудителя заболевания и обеспечивается лучший терапевтический эффект;
• пролонгирование (продление) действия препарата иммобилизацией его на определенных носителях. Такими носителями могут быть полимерные соединения, например антибиотик аурантин, обладающий противоопухолевым действием, при обычном способе введения сохраняет активность в течение 3 ч. Если адсорбировать его на носителе, то время увеличивается до 7 сут;
• возможно использование антибиотиков в сочетании с другими препаратами: ферментами, другими антибиотиками и т. д. Известно, что клавулановая кислота ингибирует р-лакта-мазы микробов и ее добавление к антибиотикам позволяет преодолеть резистентность микроорганизмов;
• ограничить применение антибиотиков в ветеринарии; не добавлять в корм сельскохозяйственных животных с целью увеличения их роста и массы антибиотики, применяемые в медицинской практике; это относится и к пищевой промышленности. Для консервирования продуктов не использовать антибиотики, предназначенные для лечения.
9.5. Принципы получения антибиотиков
1 . Биологический синтез. Таким методом получают антибиотики природного происхождения (из бактерий, грибов, ак-тиномицетов и др.). В производстве можно выделить несколько этапов:
— выделение из окружающей среды штамма-продуцента. Для этого отбирают образцы почв, воды, других субстратов и при посеве их на питательные среды выделяют чистые культуры различных видов микроорганизмов;
— проверка антагонистических свойств выделенных чистых культур по отношению к стандартному набору тест-организ-мов. Это делается таким образом: в середине чашки Петри полосой засевают чистую культуру испытуемого микроорга-низма-антибиотикопродуцента. К нему перпендикулярно подсевают слева и справа различные штаммы бактерий и грибов, входящие в набор тест-организмов, помещают в термостат и выращивают. Смотрят характер роста на чашках. В тех случаях, когда испытуемая культура обладает антагонистическим действием, рост тест-организма в непосредственной близости от роста этой культуры отсутствует. Для дальнейшей работы выбирают только те штаммы, которые обладают антагонистическими свойствами.
На схеме 9.1 показано, что на основании результатов определения антагонистических свойств трех чистых культур микроорганизмов для дальнейшей работы выбран штамм под номером 3.
Существуют и другие методы выявления потенциального организма — продуцента антибиотика, например с помощью
Схема 9.1. ПОДБОР ШТАММОВ—ПРОДУЦЕНТОВ АНТИБИОТИКОВ
А—разведения образца почвы и посев на питательную среду; Б—выделение чистой культуры микроорганизма; В, Г — проверка антагонистических свойств чистых культур.
«агаровых блочков», которые вырезают из чашек Петри с предварительно выращенными на них культурами микроорганизмов. Такие «блочки» диаметром около 1 см помещают на поверхность агара с засеянным на нем тест-организмом.
С выбранными штаммами предполагаемых продуцентов работают в дальнейшем по пунктам, приведенным ниже.
— Идентификация чистой культуры продуцента будущего антибиотика.
— Подбор условий культивирования штамма-продуцента.
— Выделение и очистка антибиотика.
— Изучение спектра действия «in vitro».
— Изучение химического состава и идентификация полученного антибиотика.
— Изучение фармакологических свойств выделенного антибиотика.
— Испытание химиотерапевтической эффективности.
При положительных результатах, полученных в лабораторных условиях, составляется лабораторный регламент — документ, в котором отражены оптимальные методы и режимы
Производства антибиотиков. Следует указать на тот факт, что «дикие штаммы», выделенные из природных источников, обладают обычно очень низкой активностью и малым выходом антибиотического вещества, поэтому в лабораторных условиях их активность и продуктивность повышают методами биосинтеза, индуцированного мутагенеза и селекции. Современная антибиотическая промышленность использует не «дикие», а уже доработанные штаммы-продуценты.
Перспективные штаммы-процуценты после лабораторных испытаний передаются для промышленного производства.
2. Химический синтез. Изучение структуры антибиотиков позволяет получать некоторые из них путем химического синтеза. Одним из первых препаратов стал левомицетин. К настоящему времени химическим путем получено большое количество эффективных антимикробных препаратов (фторхи-нолоны, оксазолидиноны и др.).
3. Комбинированный способ. Включает I и II. Именно так получают полусинтетические антибиотики. Для того чтобы лучше понять, рассмотрим принцип получения препаратов пенициллинового ряда. Химическая структура пенициллина представлена на рис. 9.3. С момента посева гриба — продуцен-
Рис. 9.3. Химическая структура пенициллина.
та пенициллина до окончательного построения молекулы антибиотика проходит не менее 2—3 сут. В некоторых случаях процесс занимает 6—7 сут. При этом идут постепенное присоединение и включение в молекулу отдельных химических элементов, так называемых предшественников пенициллина. Если добавлять на определенных этапах синтеза будущего пенициллина различные химические вещества, то можно изменить структуру молекулы и свойства препарата. Способ назван комбинированным, поскольку используется природный штамм-продуцент, к которому добавляют химические вещества. Так, меняя радикал (табл. 9.2), получили полусинтетические антибиотики пенициллинового ряда. Комбинированный способ получения чаще других используется в производственных условиях. Таким методом были получены антибиотики разных поколений. Каждое следующее поколение отличается от первого и предыдущих структурой и свойствами.
Таблица 9.2. Пенициллины, полученные в результате смешанного (биологического и химического) синтеза (полусинтетические пенициллины)
Тип пенициллина
Общепринятое название
Строение радикала (R)
Кислотоустойчивые препараты
а - Феноксиэтил пенициллин
Фенетицил-лин
а-Феноксипропилпеницил-лин
Пропицил-лин
а-Феноксибензилпеницил-лин
Фенбени-циллин
Пенициллиназоустойчивые препараты
2,6-Диметоксифенилпени-циллин
Метициллин
Кислото- и пенициллиназоустойчивые препараты
5-Метил-3-фенил-4-изо-ксиазолилпенициллин
2-Этокси-1 -нафтилпеницил-лин
Оксациллин
Нафциллин
Продолжение
Кислотоустойчивые и широкоспектровые препараты
a- D- (-) Аминобензилпенициллин
Ампициллин
Практическое использование антибиотиков:
• для лечения инфекционных заболеваний человека, животных и растений используют большое количество антибиотических препаратов, основываясь на спектре их биологического действия. Противоопухолевые антибиотики используют в онкологии;
• для профилактики заболеваний антибиотики применяют обычно в эпидемических очагах и среди контактных лиц;
• антибиотики могут быть использованы для выделения чистой культуры возбудителя заболевания в лабораторной диагностике в тех случаях, когда исследуемый материл содержит большое количество посторонней микрофлоры, рост которой необходимо ингибировать. При этом выбирают антибиотик, к которому предполагаемый возбудитель заболевания резистентен.
В дальнейшем, после выделения чистой культуры, определяют спектр ее чувствительности к антибиотикам с целью правильного выбора препарата для лечения:
Аллергические реакции
Антибиотикорезистентная микрофлора
Продукты животноводства, содержащие антибиотики
Патогенные микроорганизмы
Патогенные микроорганизмы резистентные к антибиотикам
Антибиотики
Непатогенные микроорганизмы с R-фактором
Перенос R-фактора
Профилактическая обработка
Рис. 9.4. Последствия применения антибиотиков в животноводстве для человека.
г* *
• антибиотики применяют в животноводстве для ускорения роста и увеличения массы тела животных в виде добавок к кормам (например, корсеотрицин, низин, монексин);
• антибиотики в пищевой и консервной промышленности используют для предохранения сырья и готовой продукции от микробной порчи. Так, антибиотик низин добавляют при консервировании овощей, рыбы, мяса, сыров и других продуктов. Антибиотиками иногда пропитывают упаковочный материал для хранения скоропортящихся продуктов. Не допускается применение для вышеуказанных целей антибиотических препаратов, используемых для лечения заболеваний человека и животных в связи с опасностью формирования резистентных форм микроорганизмов (рис. 9.4).
Глава 10
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
Способность к самовоспроизведению живых организмов с сохранением специфических свойств родительских особей на протяжении ряда поколений составляет понятие наследственности. Наследственная информация микроорганизмов содержится в хромосоме (нуклеоиде) бактерий и представлена двухцепочечной молекулой ДНК, замкнутой в кольцо. Эта молекула ДНК содержит до 5000 генов, включает (3—5) • 106 пар оснований, имеет молекулярную массу (1,7—2,8) • 109 дальтон и составляет 3 % от сухой массы клетки. Молекула ДНК имеет длину 1000—1300 мкм и в цитоплазме бактерий находится в многократно свернутом и плотно «упакованном» виде.
У бактерий обычно находится только одна молекула ДНК, деление и удвоение которой предшествует делению клетки. Однако установлено, что репликация ДНК и деление клеток иногда не совпадают по времени, что приводит к появлению нескольких копий ДНК в одной клетке.
В некоторых бактериях вне хромосомы обнаруживают стабильно наследуемые, способные к автономной репликации дополнительные молекулы ДНК. Их называют плазмидами.
Плазмиды не являются структурами, жизненно необходимыми клетке. Однако приобретение плазмид сопровождается появлением новых свойств, которые обеспечивают клетке лучшую адаптацию к условиям существования. Количество ДНК в плазмиде в 20—1000 раз меньше, чем в хромосоме. Молекула плазмидной ДНК двунитевая кольцевидной или линейной формы. Способность самостоятельно, независимо от ДНК хромосомы, самокопироваться (реплицироваться) обеспечивает возможность присутствия в 1 клетке нескольких копий плазмид, находящихся в автономном, не связанном с хромосомой состоянии. В некоторых случаях плазмиды могут встраиваться, интегрировать в хромосому бактерии и в последующем удваиваться вместе с ней.
Совокупность всех генетических компонентов клетки, локализованных в хромосоме и в виде самостоятельных структур в цитоплазме (плазмиды, фаги), которые были получены по наследству, определяет генотип микроорганизмов. Записанная в них сумма морфологических признаков и физиологических функций проявляется в фенотипе.
Плазмиды могут самостоятельно перемещаться из одной клетки в другую, подобно инфекционному агенту, и в этих случаях они называются конъюгативными или трансмиссивными и имеют специальный фактор передачи «tra-оперон». Пе
редача плазмид может осуществляться внутри вида, среди микроорганизмов разных видов и родов, что имеет важное значение в их эволюции. Такая передача получила название горизонтального переноса генов. Некоторые плазмиды не способны самостоятельно переходить от одной особи к другой. Их называют неконъюгативными (нетрансмиссивными) плазмидами, но они могут быть перенесены из клетки в клетку трансмиссивными плазмидами или бактериофагами.
Утрата клеткой плазмид не нарушает ее жизнеспособности. Известны следующие плазмиды.
— F-плазмида (от англ, fertility — плодовитость), которая контролирует синтез F-пилей (секс-пилей) у бактерий-доноров, способность к конъюгации и переносу генов хромосомы от донора к реципиенту. F-пили образуют конъюгационный мостик между двумя особями бактерий при спаривании. F-плазмида может находиться в клетке в автономном состоянии и такая бактерия называется Р+-штаммом. Эта плазмида может быть встроена в хромосому клетки, такой штамм называется Hfr-штаммом (от англ, high frequency of recombination — высокая частота рекомбинации). Независимо от локализации в клетке F-плазмиды она является конъюгативной и обеспечивает бактерии способность быть донором при прямом контакте с особью без плазмиды (реципиентом).
— R-плазмида (от англ, resistance — устойчивость) детерминирует устойчивость к антибиотикам, сульфаниламидам и другим антибактериальным препаратам, солям тяжелых металлов (ртути, никелю и др.). В одной плазмиде может быть несколько (3—10) детерминант резистентности, контролирующих устойчивость к разным антимикробным агентам. В этом случае бактерии приобретают множественную лекарственную устойчивость.
— Col-плазмида обеспечивает микроорганизмам способность к синтезу бактерицинов — белковых продуктов, вызывающих гибель особей гомологичного или близкородственного вида. В зависимости от бактерий-продуцентов выделяют колицины, пестицины, туберкулоцины, стафилоцины и др. Например, колицины ингибируют размножение патогенных энтеробактерий, стафилоцины — стафилококков.
— Ent-плазмиды (от англ, enterotoxin — энтеротоксин) кодируют синтез энтеротоксина патогенными бактериями кишечной группы.
— Н1у-плазмиды детерминируют выработку бактериями гемолизина и гемотоксина, которые включены в группу факторов патогенности.
— Vir-плазмиды контролируют поверхностный антиген вирулентности и летальный токсин.
— Плазмиды, кодирующие образование адгезинов (пилей, поверхностных антигенов К-88, К-99 у E.coli и др.).
—- Криптические плазмиды (скрытые) содержат гены, которые не проявляются в фенотипических признаках.
Бактерии могут иметь в своем составе как одну плазмиду и ее копии, так и комплекс из двух и более разных плазмид в одной клетке. Вероятно, такие полиплазмидные системы обеспечивают бактериальным клеткам значительные селективные преимущества в определенных условиях среды обитания по сравнению с бесплазмидными и одноплазмидными.
Плазмиды, которые находятся у бактерии в автономном состоянии, могут быть элиминированы (выведены) из нее путем обработки акридиновым красителем или детергентами. Утрата плазмид естественным или искусственным путем приводит к утрате бактерией одного или нескольких признаков.
Приобретение новых и утрата уже имеющихся признаков связаны с изменчивостью микроорганизмов. Различают две формы изменчивости.
1. Модификационную (ненасле дуемую, фенотипическую, адаптационную), которая возникает как приспособительная реакция при изменениях среды обитания и характеризуется появлением временных, не закрепленных в генотипе свойств и их быстрой утратой. Такая форма изменчивости встречается часто и касается одновременно всех клеток популяции.
2. Наследуемую (генотипическую), которая появляется в результате мутаций или генетических рекомбинаций и сопровождается нарушениями генетического кода. В этом случае изменения затрагивают лишь отдельные клетки в составе популяции. Приобретенные признаки передаются потомству и благодаря им, в силу лучшей адаптации к условиям существования, клетки с новыми признаками постепенно вытесняют клетки исходного штамма.
Мутация — это стойкое «скачкообразное изменение наследственного признака» [де Фриз, 1903] в связи с изменениями в первичной структуре собственной ДНК микроорганизма, что приводит к изменению его генотипа.
Измениться может любой ген независимо от его локализации, в результате чего возникает внутрихромосомная или вне-хромосомная (плазмидная) мутация. Изменения происходят за счет ошибки при копировании наследственной информации. Приобретение нового признака или утрата старого родительского проявляется в фенотипе. Мутации по происхождению могут быть:
1) спонтанными — возникают без известного или направленного воздействия извне, обычно под влиянием природных факторов;
2) индуцированными, которые возникают под влиянием специальных факторов — ультрафиолетовых лучей, ионизирующей радиации, аналогов оснований ДНК (бромурацил), алки-
лирующих агентов (например, диметил сульфата), азотис кислоты, акридиновых красителей и других веществ, получп^-ших название мутагенов. Спектры их действий различны по механизму и точке приложения.
При мутациях важную роль играют мигрирующие генетические элементы клетки — Is (инсерционные)-элементы и транспозоны (Tn-элементы). Их называют биологическими мутагенами. Они представляют собой отдельные участки ДНК, способные перемещаться в пределах одной хромосомы, или от одной хромосомы к другой, или между хромосомой и плазмидой. Эти элементы не обнаружены в клетке в свободном состоянии и не могут самостоятельно реплицироваться, а удваиваются лишь в составе хромосомы. Их способность к миграции индуцирует мутации различного типа: делеции (потери), инверсии (перевороты, нарушения порядка генов), дупликации (удвоения, амплификации), транспозиции (перемещения) и др. Возникают перестройки целых фрагментов ДНК, такие мутации получили название хромосомных.
Мутации могут быть генными (точковыми), так как связаны с изменением только одного нуклеотида ДНК. Они возникают в результате замены одной пары азотистых оснований другой, при вставке дополнительного нуклеотида или его утрате. В результате этих мутаций вместо одной аминокислоты синтезируется другая или возникает нонсенс-мутация (бессмысленная). У таких мутантов может произойти репарация (восстановление исходной структуры) ДНК или обратная мутация. В процессах репарации участвуют системы специальных ферментов, которые распознают поврежденный участок спирали ДНК, вырезают его, синтезируют и встраивают в молекулу ДНК новый. «Истинная» обратная мутация полностью восстанавливает исходный генотип клетки, измененный при первичной, прямой мутации. Это сопровождается восстановлением исходного фенотипа. Возврат к первоначальному фенотипу возможен при супрессорной мутации, которая происходит в другом гене, но ее результат нейтрализует эффект первичной мутации.
В конечном итоге исход мутации зависит от ряда факторов, таких как вид микроорганизма, природа мутагена, условия окружающей среды. Мутации могут быть благоприятны для микроорганизма, но если происходит утрата важной функции клетки они вредны или даже легальны.
Мутации выявляют, изучая фенотипические свойства микроорганизмов. Они могут касаться изменения морфологических, биохимических, антигенных и других признаков клетки. Например, если результатом мутации явилась потеря способности синтезировать какой-либо фермент, клетка становится зависимой от присутствия в среде определенных факторов роста. Это фенотипическое проявление мутации называется ауксотрофностъю. Исходный вариант («дикий тип») не испы-110
тывал потребности в этом факторе роста и назывался прото-
трофным.
Одной из форм мутаций является диссоциация, которая со-
провождается появлением в популяции особей, образующих необычные формы колоний. Так, S-формы колоний (от англ, smooth — гладкий) характеризуются круглой формой, ровны
ми краями, гладкой, блестящей, выпуклой поверхностью. Такие колонии образованы большинством энтеробактерий, выделенных от больного человека. В период выздоровления могут появляться колонии неправильной формы, более крупных размеров, с неровными краями и шероховатой матовой поверхностью. Такие колонии получили название R-форм (от англ, rough — шероховатый). Между этими формами колоний могут быть переходные 0-формы (мутные), D-формы (карликовые) и др. Появление S-R-диссоциации связывают с утра
той генов, контролирующих синтез поверхностных антигенов (Н-, К-антигенов и др.), или вставкой внехромосомных факторов — профагов, плазмид, транспозонов и др. (рис. 10.1). Диссоциации сопровождаются изменением и других свойств бактерий: утратой капсулы, снижением ферментативной ак
тивности , вирулентности, токсигенности, иммуногенности, чувствительности к бактериофагам и др.
Не менее важными для микроорганизмов являются формы
изменчивости, относящиеся к генетическим рекомбинаци
ям. Суть этих процессов состоит в том, что часть генетиче-
ского материала клетки-донора переносится в реципиент-ную клетку, в результате чего образуется рекомбинантная хромосома и возникает клетка с признаками обоих родительских особей. К образованию рекомбинантных хромосом у бактерий ведут 3 процесса: трансформация, трансдукция и конъюгация.
Трансформация (от лат. transformatio — превращение) — способ передачи генетической информации путем внедрения фрагмента свободной растворимой ДНК, выделенной из клетки-донора, в бактерию-реципиент.
Явление трансформации было открыто Ф. Гриффитом (1928) у пневмококка (рис. 10.2), а природа трансформирующего начала в виде молекулы ДНК — английскими бактериологами О. Эвери и соавт, (1944). На возможность и активность трансформации влияют компетентность бактерии-реципиента и свойства ДНК донора.
Компетентность — это способность клеток поглощать ДНК бактерии-донора и включать ее в состав своей хромосомы. Эта способность кратковременна, зависит от физиологического состояния клетки-реципиента и присутствия в ее мембране специальных белков. У некоторых бактерий компе-
Рис. 10.1. Диссоциация у бактерий.
А — S- и R-формы колоний у сальмонелл; Б — S- и О-формы колоний у лептоспир (фото авторов).
тентность достигает максимума в конце экспоненциальной фазы размножения. В компетентные клетки может проникать любая ДНК, однако рекомбинация наступает, если это высо-кополимерная двухцепочечная ДНК близкородственных ви-
ж
S-штамм
Погибает
Рис. 10.2. Эксперимент Гриффита по трансформации у пневмококков [по Г. Стент, 1974].
А —мышь, которой введена культура патогенного инкапсулированного S-штамма пневмококков, погибает; Б — мышь, которой введена культура непатогенного бескапсульного R-мутанта пневмококка, не погибает; В — мышь, получившая инъекцию культуры S-штамма, убитого нагреванием, не погибает; Г — мышь, получившая при инъекции смесь живой культуры R-мутанта и убитой нагреванием культуры S-штамма, погибает; в ее крови присутствуют живые S-формы бактерии.
Дов. При трансформации бактерии-реципиенту могут передаваться такие признаки, как вирулентность, способность к кап-сулообразованию, устойчивость к антибиотикам, прототроф-ность и другие признаки.
Трансдукция (от лат. transductio — перенос, перемещение) — способ передачи генетической информации от бактерии-донора к бактерии-реципиенту с помощью умеренного фага.
Различают 3 вида трансдукции:
1) общая, неспецифическая трансдукция. Она обусловлена тем, что в процессе репродукции фага в клетке любой случайный фрагмент ДНК бактерии может быть включен в состав фаговой частицы. При проникновении в новую реципиент-ную бактерию фаг высвобождает фрагмент ДНК бактерии-донора, который может включаться в гомологичную область ДНК клетки-реципиента;
2) специфическая трансдукция происходит, если при выходе из ДНК лизогенной клетки-донора профаг включает в свою ДНК определенные расположенные рядом гены хромосомы бактерии. При этом часть генов ДНК профага остается в хромосоме бактерии. В результате образуется дефектный, транс-дуцирующий фаг. При взаимодействии с реципиентной бактерией такой дефектный фаг встраивается в хромосому вместе с генами ДНК клетки-донора, образуя мерозиготу, и наделяет бактерию и ее потомство новыми признаками;
3) абортивная трансдукция происходит, если принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не интегрирует в хромосому реципиента, а остается в его цитоплазме. Здесь он может функционировать в автономном состоянии. При делении таких клеток происходят постепенное разбавление и утрата трансдуцированного фрагмента ДНК донора.
Трансдукция была впервые выявлена Дж.Ледербергом и со-авт. (1951) в клетках S.typhimurium. В последующем это явление было обнаружено у многих других бактерий (стафилококков, вибрионов, шигелл и др.).
Конъюгация (от лат. conjugatio — соединение) — способ передачи генетического материала путем непосредственного контакта двух физиологически полноценных клеток. Процесс конъюгации контролируется плазмидой фертильности (F-плазмидой, фактором переноса; см. выше).
Бактерии-доноры содержат F-плазмиду и образуют на поверхности половые ворсинки (F-pili), способные формировать между клетками цитоплазматические мостики, по которым осуществляется передача генетического материала (рис. 10.3). Автономно расположенная в цитоплазме клетки-донора F-плазмида в случае конъюгации целиком переходит в реци-пиентную клетку. В клетке-доноре, как правило, сохраняются копии F-плазмиды и она не утрачивает своей донорской роли в дальнейшем. Реципиентные клетки при получении плазмиды превращаются в Р+-клетки, образуют F-pili и сами становятся донорами.
При интеграции плазмиды фертильности в бактериальную хромосому образуются Hfr-клетки, обладающие высокой частотой рекомбинации. Такие плазмиды способны передавать реципиенту фрагменты хромосомы донора во время конъюга-114
рис. 10.3. Образование конъюга- _
ционного мостика между бакте-рией-донором и бактерией-реци-пиентом [по Р. Стейниер и др., 1979]. .
ции. При этом одна нить хро- \
мосомы клетки-донора раз- V
рывается и превращается в \
линейную форму. Эта нить от %
точки начала переноса — О- 1
точки (от англ, origin — нача- 1
ло) начинает движение по конъюгационному мостику в клетку-реципиент. Фактор '|МИ|мк ?
фертильности остается на дистальном конце от точки начала переноса. Конъюгаци-онный мостик очень непрочный, легко рвется, поэтому фактор фертильности, как правило, не переносится в клетку-реципиент. Образовав-
шийся рекомбинант сохраняет состояние F+, а донор — свое генетическое постоянство F- (рис. 10.4).
Интеграция F-фактора в хромосому обратима. При этом иногда происходит захват небольшой группы генов хромосомы и образуется F-фактор. Такой фактор фертильности способен автономно размножаться и переноситься в реципиент-ные клетки. В этом случае с помощью F'-фактора происходит передача сцепленных с ним генов одной бактерии в другую. Данный процесс получил название F-дукции или секс-дукции.
Явление конъюгации было впервые описано Д. И. Ледер-бергом и Э. Тейтумом (1946) у E.coli К-12.
Изучение генетики и форм изменчивости микроорганизмов имеет важное биологическое и практическое (прикладное) значение.
Несомненный интерес представляет изучение механизмов передачи патогенных свойств у микроорганизмов и устойчивости к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам на генетическом уровне. Формирование L-форм, возникших в результате изменчивости бактерий, играет важную роль в развитии персистирующих форм инфекции. Их обнаружение затруднено, и это стимулировало изыскание новых методов диагностики.
Разработаны методы молекулярно-генетического анализа (полимеразная цепная реакция, методы генного зондирования и др.), позволяющие быстро и надежно выявлять любые фор-
Клетка-донор Hfr
о
Рис. 10.4. Процесс конъюгации у бактерий (стрелками показаны 1— 6-й этапы переноса генов при конъюгации) [по М. J. Pelczar, R. D. Reid, 1981].
A — фактор фертильности; ПО О — различные гены хромосомы
мы патогенных микроорганизмов. Они уже широко внедрены в практику здравоохранения.
Многократным воздействием мутагенных факторов и ступенчатым отбором удалось выделить мутанты микроорганизмов, активно продуцирующие многие антибиотики (эритромицин, олеандомицин и др.). Так, например, у мутантных штаммов грибов получен выход пенициллина в 10 тыс. раз выше по сравнению с исходными природными продуцентами этого антибиотика. В производстве витамина В12 используют бактерии-мутанты, которые выделяют в 5 тыс. раз больше витамина, чем соответствующие природные штаммы. При этом значительно понижается стоимость конечных продуктов.
Перенос генов в гетерогенные системы и возможность получения кодируемых этими генами белков гормонов, ферментов, антигенов вакцин и других биологически активных веществ привели к рождению нового направления в генетике и биотехнологии — генной инженерии. Уже сконструированы и используются в микробиологической промышленности штаммы — суперпродуценты целевых продуктов. К ним относятся продуценты интерферона, интерлейкинов, инсулина, гормона роста, ферментов, белков ВИЧ и др. Например, ме-
годами генетического манипулирования создан штамм Е coll — продуцент L-треонина и L-триптофана С целью количественного увеличения выхода ферментов в штаммы-продуценты вводят множество копий генов с помощью плазмид или трансдуцирующих фагов Так, из фильтрата актиномицетов рода Streptomyces получают стрептокиназу, которая растворяет кровяные сгустки Сконструирован штамм Е coll, который секретирует урокиназу Этот фермент участвует в превращении плазминогена в плазмин, разрушающий фибрин — основную составную часть кровяных сгустков Урокиназа и стрептокиназа необходимы для лечения таких болезней, как инсульт, инфаркт, легочная эмболия
Это далеко не полный перечень успехов биотехнологии на основе использования методов генной инженерии
iiiii
Раздел II
ИНФЕКЦИЯ
Инфекция (от лат.
infectio — заражение) рассматривается
как совокупность приспособительных (адаптационных) ре-
акций макроорганизма, развивающихся в результате взаимодействия с патогенными или условно-патогенными (при определенных ситуациях) микроорганизмами. Аналогичный процесс, вызываемый простейшими, называется инвазией. Инфекция относится к универсальным биологиче-
ским явлениям и встречается на всех уровнях и у всех форм органической материи. Взаимодействие микро- и макроорганизмов обусловливает развитие инфекционного процесса, который проявляется по-разному: от бессимптомного носительства до тяжелого инфекционного заболевания, иногда со смертельным исходом.
В развитии инфекционного процесса можно выделить несколько стадий:
• проникновение микроба в макроорганизм, адгезию (прикрепление) к чувствительным клеткам и их колонизацию;
• нарушение гомеостаза в результате жизнедеятельности и размножения микроба;
• формирование защитных реакций макроорганизма, направленных на нейтрализацию микроба, его токсинов и ферментов агрессии;
• восстановление гомеостаза (выздоровление) и приобретение макроорганизмом невосприимчивости к повторному заражению этим микробом, т. е. формирование иммунитета.
По какому пути пойдет развитие инфекционного процесса, зависит от 3 основных факторов:
• свойств микроорганизма и его количества;
• степени восприимчивости макроорганизма-хозяина;
• факторов внешней среды и социальных факторов, оказывающих влияние на исход взаимодействия первых двух.
Глава 11
ПАТОГЕННОСТЬ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Патогенность (от лат. pathos — страдание, genos — рождение) характеризует потенциальную способность микроорганизма вызывать инфекционный процесс. Патогенность является ви
довым признаком микробов, развившимся в процессе эволюции и закрепленным генетически. Этот признак важен в таксономическом отношении, так как позволяет подразделить их на облигатно (строго) патогенные, условно-патогенные и сапрофитные.
Облигатно патогенные (болезнетворные) микроорганизмы (патогены) в силу чрезвычайной пластичности своего генетического материала адаптировались к паразитированию в макроорганизме и способны вызывать инфекционную болезнь.
Условно-патогенные микроорганизмы — это группа разнообразных видов, большинство из которых являются нормальными обитателями кожных и слизистых покровов человека и животных. Причиной болезни они становятся тогда, когда проникают во внутреннюю среду организма, обычно пассивно, в больших количествах, на фоне резкого снижения общего и местного иммунитета. Они обладают слабыми агрессивными свойствами и часто проникают в организм при медицинских манипуляциях, повреждениях кожи и слизистых. Такие микроорганизмы активно циркулируют в больничных учреждениях, поэтому называются «госпитальными» или микробами-оппортунистами. Они проявляют повышенную устойчивость к антимикробным и дезинфицирующим препаратам, УФ-лучам.
Сапрофиты (от лат. sapros — мертвый) — это микроорганизмы, которые широко распространены в объектах внешней среды (почве, воде, на предметах, на покровах человека, животных или растений), где питаются мертвыми органическими веществами. Некоторые сапрофиты, например легионеллы, сарцины, при определенных условиях (иммунодефицит и др.) способны вызывать инфекционный процесс.
Способность патогенных микроорганизмов размножаться и развиваться в макроорганизме-хозяине зависит от наличия у них специализированных структурных или функциональных молекул. По своему назначению они разделяются на:
• факторы инвазивности (англ, invasive), которые способствуют проникновению и распространению патогенов в тканях макроорганизма;
• факторы адгезии и колонизации (от англ, adhesion — сцепление, склеивание, присоединение; colonize — колонизация, заселение);
• факторы агрессии, которые обеспечивают устойчивость микробов к действию защитных реакций организма-хозяина (фагоцитозу, активности лизоцима, комплемента, антител и др.);
• токсические факторы.
Механизмы реализации действия этих факторов различны. Для преодоления защитных структур макроорганизма (кожи, слизистых оболочек) бактерии выделяют ферменты. Они спо
собствуют диффузии (лат. diffusio — распространение, рассеивание) микробов во внутреннюю среду организма за счет специфического расщепления субстратов, покрывающих барьерные ткани. К этим ферментам инвазивности относят бактериальные гиалуронидазу, нейраминидазу, коллагеназу, фибринолизин, лецитиназу С, протеазы и др. Важным фактором инвазивности являются жгутики, которые обеспечивают микроорганизмам подвижность и быстрое проникновение в ткани.
Адгезия и колонизация являются пусковыми механизмами инфекционного процесса. Адгезия происходит в результате комплементарного (специфического) взаимодействия особых молекулярных структур (адгезинов), расположенных на поверхности микробов, с рецепторами клеток макроорганизма. У грамотрицательных бактерий функцию адгезинов выполняют пили и основные белки наружной мембраны, у грамполо-жительных — белки клеточной стенки и липотейхоевые кислоты. Прикрепившись к субстрату, бактерии колонизируют поверхности участков кожи или слизистых оболочек. Адгезия обусловливает и органотропность микробов, т. е. способность к размножению и заселению только определенных тканей и органов. Например, возбудители гонореи размножаются на цилиндрическом эпителии урогенитального тракта. При отсутствии адгезии инфекционный процесс не развивается.
Некоторые микроорганизмы способы пенетрироватъ (penetrate — проникать внутрь) в эукариотическую клетку (эпителиальную, эндотелиальную, лейкоцит, макрофаг и др.), размножаться в ней, вызывая разрушение и распространение патологического процесса. Например, шигеллы способны пенетри-ровать в эпителиоциты, риккетсии — в эндотелиоциты.
Макроорганизм различными способами противостоит размножению и распространению патогенных микроорганизмов. Для подавления неспецифических (фагоцитоз, опсонизация и др.) и специфических (антитела) защитных реакций организма бактерии используют особые структурные элементы и физиологические реакции. К последним относят антифагоци-тарные, антилизоцимные, антиопсонические и другие факторы.
Функцию защиты выполняют:
• капсулы из экстрацеллюлярных веществ бактерий (полисахаридные, полипетидные), например, у пневмококков, гемофильных бактерий и др.;
• специфические белки клеточной стенки (А-протеин у золотистого стафилококка, М-протеин и фимбрии у патогенных стрептококков);
• белки, ассоциированные с липополисахаридом (ЛПС) грамотрицательных бактерий;
• Vi-антиген сальмонелл;
• антихемотаксические факторы, подавляющие хемотаксис макрофагов, например корд-фактор туберкулезных бактерий;
• ферменты агрессии: например, протеазы разрушают иммуноглобулины, коагулаза свертывает плазму крови, которая экранирует (закрывает) поверхность бактерии, гемолизин разрушает оболочки эритроцитов.
Важнейшими факторами патогенности являются токсины микроорганизмов, которые повреждают ткани макроорганизма и играют главную роль в патогенезе инфекционных заболеваний. По физико-химическим и биологическим свойствам бактериальные токсины условно делятся на экзотоксины и
эндотоксины.
Экзотоксины — это белковые вещества, секретируемые живыми бактериями, термолабильные (разрушаются при 58— 60 °C) или термостабильные (разрушаются при 40—100 °C), обладают высокой токсичностью. Примером термолабильного экзотоксина является дифтерийный, а термостабильного — столбнячный токсин. Они характеризуются выраженной специфичностью токсического действия. Их выделяют грамполо-жительные и грамотрицательные бактерии. Свойство бактерий вырабатывать и секретировать во внешнюю среду экзотокси
ны называется токсигенностью.
Молекула экзотоксина состоит из двух полипептидных цепей. Один полипептид выполняет транспортную (рецепторную) функцию и обеспечивает связь молекулы токсина и рецепторов чувствительной клетки. Второй полипептид осуществляет токсическую (активаторную) функцию. Он проникает внутрь клетки хозяина и блокирует жизненно важные метаболические процессы. Строение активатора каждого токсина уникально, и, вероятно, этим объясняется специфичность действия экзотоксина.
Некоторые бактерии образуют протоксины, которые состоят из единой полипептидной цепи и секретируются в нетоксичной форме. Под действием протеолитических ферментов они переходят в активную бифункциональную структуру и осуществляют токсическую функцию.
Экзотоксины обладают выраженной иммуногенностью и вызывают выработку в макроорганизме токсиннейтрализую-щих антител (антитоксинов).
Под влиянием формалина, нагревания, действия света и других факторов токсичность утрачивается, но при этом сохраняется иммуногенность. Это свойство экзотоксинов используют для получения анатоксинов (от лат. ana — отрицание, toxin — токсин), которые применяют для активной иммунопрофилактики токсинемических инфекций.
По механизму действия выделяют четыре типа экзотоксинов:
цитотоксины, к которым относят энтеротоксины (проду-
цируют S.aureus, C.perfringens), антиэлонгаторы, которые на
рушают процесс наращивания (элонгации) полипептидной цепи на рибосоме (дифтерийный гистотоксин), дермонекро-токсины (продуцируют S.pyogenes, Р.aeruginosa и др.). Все они блокируют синтез белка на субклеточном уровне;
• мембранотоксины характеризуются способностью повы-
шать проницаемость поверхностных мембран эритроцитов
(различные гемолизины) и лейкоцитов (лейкоцидины), что приводит к разрушению этих клеток. Такие токсины обнаружива-
ют у S.aureus, S.pyogenes, S.pneumoniae и др.;
токсины — функциональные блокаторы. К ним принадле-
жат токсикоблокаторы и нейротоксины. Токсикоблокаторы
способны активировать клеточную аденилатциклазу, повы
шать проницаемость сосудов и увеличивать выход жидкости, ионов натрия и хлоридов в просвет кишечника, что приводит к развитию диареи. Этим свойством обладают энтеротоксины, холероген. Нейротоксины обладают повышенным сродством к нервной ткани, и их действие связано с извращением процессов передачи нервных импульсов в отдельных звеньях ЦНС, периферической, симпатической нервной системы. Токсины такого типа секретируют C.tetani, C.botulinum;
• эксфолиатины и эритрогенины выделяют некоторые штаммы S.aureus и S.pyogenes, вызывающие скарлатину.
По связи с бактериальной клеткой и активности секреции экзотоксинов различают несколько классов бактерий, например:
• класс Л —бактерии, активно секретирующие экзотоксины во внешнюю среду (дифтерийный гистотоксин, летальный токсин);
• класс В — экзотоксин секретируется во внешнюю среду частично, оставаясь связанным с микробной клеткой (тетаноспазмин, нейротоксин);
• класс С — экзотоксин связан с микробной клеткой и попадает во внешнюю среду при аутолизе (цитотоксины, энтеротоксины, нефротоксины).
Эндотоксины — это токсичные субстанции, образующие сложный макромолекулярный комплекс из липополисахаридов (ЛПС) и белков клеточной стенки грамотрицательных бактерий (Salmonella, Shigella, Escherichia и др.). Высвобождение эндотоксина возможно только после гибели бактерии. ЛПС является носителем основных биологических свойств эндотоксина и в комплексе с белком определяет антигенную активность бактерий, так как входит в состав соматического антигена. Эндотоксины термостабильны, менее токсичны, чем экзотоксины, не обладают специфичностью действия. Независимо от видовой принадлежности бактерий эндотоксины имеют сходную структуру и химический состав. Их токсические эффекты сопровождаются температурной реакцией в связи с тем, что под действием ЛПС высвобождаются эндо
генные пирогенные вещества из лейкоцитов и макрофагов, которые непосредственно действуют на центр терморегуляции в ЦНС, а биологическая активность связана в основном с липидом А.
Эндотоксины имеют низкую чувствительность к действию фенола, спирта, кислот и других химических веществ. При обработке формалином не переходят в анатоксин. Эндотоксины являются слабыми иммуногенами, а иммунные сыворотки, полученные на эти токсины, не могут полностью блокировать их токсические эффекты.
Патогенность микроорганизмов в пределах вида может меняться. Степенью, мерой патогенности является вирулентность (от лат. virulentus — ядовитый). Она характеризует индивидуальное качество определенного штамма патогенного микроба. Вирулентность — признак непостоянный; может увеличиваться или уменьшаться при определенных условиях. Штаммы одного и того же вида бактерий по вирулентности могут быть высоко-, умеренно, слабовирулентными или ави-рулентными (невирулентными). Высоковирулентные штаммы вызывают более тяжелые заболевания и быстро распространяются среди людей. Изменения вирулентности могут быть итогом модификационной изменчивости в результате временного подавления транскрипции ряда генов. Например, это наблюдают у штаммов, длительно культивируемых в неблагоприятных условиях. Снижение вирулентности у этих штаммов является нестабильным, и пересев на элективные среды сопровождается возвратом вирулентных свойств. Генотипические варианты изменения вирулентности возникают при мутациях или рекомбинациях генетического материала. Они являются стойкими и передаются последующим поколениям. Повысить вирулентность можно, например, многократными пассажами через организм восприимчивых животных или методами генной инженерии.
Стойкое ослабление вирулентности патогенных бактерий используют при изготовлении вакцинных препаратов. Для этого используют биологические (например, добавление гомологичных иммунных сывороток к питательным средам и др.), химические (добавление фенола, сулемы и др.) и физические (высушивание, обработка УВЧ и др.) методы.
Для количественного выражения вирулентности применяют условные единицы, которые определяют экспериментальным путем:
• минимальная смертельная доза (ДЛМ) (DLM — dosis letalis minima) — это минимальное количество бактерий, которое способно вызвать гибель 95 % экспериментальных животных;
• 50% смертельная доза — Щ!^ (LD50 — dosis letalis 50%) — это минимальное количество микробов, при введении которых наступает гибель 50 % экспериментальных животных;
• инфицирующая доза 50% ИД50 (Ш50 — infective dosis 50%) — минимальное количество бактерий, вызывающих развитие инфекционной болезни у 50 % экспериментальных животных.
Косвенные данные о вирулентности могут быть получены путем качественного и количественного определения факторов патогенности (токсиногенности, наличия капсульных антигенов, определения ферментов агрессии: гемолизина, лецитиназы, фосфатазы и др., выявления адгезинов).
Патогенность бактерий определяется генами, входящими в состав хромосомных и мобильных генетических элементов — плазмид, транспозонов, умеренных бактериофагов.
В составе геномов некоторых бактерий обнаружены особые зоны, где сконцентрированы генетические элементы, ответственные за патогенность. Они получили название «островов» (от англ, island — остров) патогенности, если фрагмент ДНК содержит 10 200 тыс. пар нуклеотидов (т. п.н.), или «островков» (от англ, islets — маленький остров) — если размер фрагмента ДНК включает 1—10 т. п.н. Эти фрагменты ДНК способны распространяться среди родственных патогенных и непатогенных видов бактерий путем генетических рекомбинаций, так как могут входить в состав генома фагов, транспозонов или плазмид. Вероятно, такой механизм горизонтального переноса генетической информации лежит в основе формирования новых вирулентных штаммов.
В одной бактериальной клетке может находиться одна плазмида, детерминирующая патогенность, или комплекс нескольких различных плазмид. Например, известны полиплазмиды E.coli, которые детерминируют синтез энтеротоксинов (ST и LT) и антигенов колонизации. Такие полиплазмиды влияют на степень патогенности бактерий и обусловливают тяжесть заболевания.
Экспрессия генов вирулентности не является конститутивной. Она зависит от условий внешней среды и ее температуры, вне- или внутриклеточного расположения микроорганизмов и других факторов. Известно, что гены вирулентности «включаются» в организме хозяина и «выключаются», если микроб переходит во внешнюю среду. Например, генетическая система «теплового шока» включается в разгар инфекционной болезни при высокой температуре, и тогда вирулентность достигает максимальных значений.
Национальный институт здоровья США (2001) рекомендует классификацию микроорганизмов по степени их биологической опасности для человека. Выделяют четыре группы на основе следующих характеристик:
• I группа включает микроорганизмы, которые не вызывают заболеваний у взрослых здоровых людей. К этой группе относятся непатогенные и некоторые условно-патогенные 124
микроорганизмы: E.coli К-12, В. subtilis, аденоассоциирован-ные вирусы I—IV групп и др.;
• II группа — микроорганизмы, способные вызывать заболевания. Характер течения этих болезней зависит от путей проникновения патогенов в организм человека (инокулятив-ный, инвазионный пути или другой способ пенетрации кожных покровов или слизистых оболочек). Исходы таких болезней, как правило, благоприятны. К этой группе относятся бактерии — возбудители коклюша, сибирской язвы, дифтерии, иерсиниоза, хеликобактериоза; боррелии, хламидии, листерии, микоплазмы и др.; грибы —родов Blastomyces, Cryptococcus и др., простейшие — родов Babesia, Coccidia, Toxoplasma, Leichmania, Trypanosoma и др., вирусы; аденовирусы, цитомегаловирусы, полиовирусы и др.
• III группа — микроорганизмы особой опасности, способные вызывать тяжелые или даже смертельные болезни у человека, которые могут распространяться в виде эпидемий. Обладают высокой опасностью для индивидуума (человека), но низкой социальной опасностью. К этой группе относятся бактерии — Yersinia pestis, Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis, а также представители родов Brucella, Francisella, Rickettsia и др., некоторые виды грибов, вирусов и прионы;
• IV группа — микроорганизмы, чрезвычайно опасные как для индивидуумов (особенно для лиц, занимающихся лабораторными исследованиями), так и в социальном, общественном отношении. Эти патогены требуют особых мер, ограничивающих их распространение. Они могут быть причиной обширных эпидемических катастроф. Это главным образом вирусы Эбола, Марбург, Ласса, Мачупо, относящиеся к разным семействам и вызывающие геморрагические лихорадки, возбудитель крымско-конголезской лихорадки и др.
В нашей стране принята иная классификация микроорганизмов по степени их биологической опасности для человека.
Глава 12
РОЛЬ МАКРООРГАНИЗМА
В ИНФЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ
В возникновении инфекционного процесса исключительно важное, иногда решающее значение имеют состояние макроорганизма, его особенности и характер взаимодействия с патогенными микроорганизмами.
Основным фактором инфекционного процесса является восприимчивость к патогенному микробу, т. е. способность макроорганизма реагировать на внедрение инфекционного агента развитием любой формы инфекционного процесса.
Если микроб попадает в резистентный организм, инфекция не может возникнуть, так как микроб не находит условий для своего размножения и погибает под действием защитных сил организма.
Восприимчивость может быть видовой, присущей всему данному виду, и индивидуальной, зависящей от состояния каждого индивидуума. Видовая восприимчивость обусловлена генетически. Существуют заболевания, которыми болеют только определенные виды животных, и они же являются основным резервуаром возбудителя. Их называют зоонозными. Инфекционные болезни, к которым восприимчив только человек, называют антропонозными. Человек в этих случаях является единственным резервуаром возбудителя. Если заболевание передается человеку от больных животных или носителей, их называют зооантропонозными. В некоторых случаях свободноживущие микроорганизмы, естественной средой обитания которых является внешняя среда (почва, вода), могут при попадании в организм человека или животного вызывать инфекционный процесс. Такие инфекции получили название сапронозов (от sapros — мертвый). К ним относят кло-стридиозы, легионеллез, листериоз и др.
Индивидуальная восприимчивость макроорганизма к патогенному микробу зависит от ряда факторов:
• степени вирулентности микроорганизма;
• дозы (количества) возбудителя, проникшего в организм. При внедрении малого количества бактерий инфекционная болезнь может не развиться. Например, для развития дизентерии Флекснера необходимо, чтобы в организм проникло не менее 100 бактерий;
• входных ворот инфекции. Они определяются теми тканями и органами, через которые в организм проникает патогенный микроб. Например, цилиндрический эпителий слизистой оболочки урогенитального тракта является входными воротами для гонококков, хламидий;
• состояния естественного иммунитета, общей физиологической реактивности организма.
ного процесса. Действие факторов окружающей среды (температура, атмосферное давление, солнечная радиация, влажность) во многом определяет развитие инфекционного процесса. Под их влиянием могут изменяться как свойства микроорганизма, его устойчивость и сроки выживаемости во внешней среде, так и резистентность макроорганизма.
Миграция населения, состояние окружающей среды, благоустройство жилых помещений, характер водоснабжения, пути удаления сточных вод и твердых отбросов и способы их обезвреживания, гигиена питания и прочие социальные фак-
торы играют важную роль в распространении возбудителей инфекций, изменении их свойств, а также в восприимчивости организма человека к патогенным микроорганизмам. При этом состояние макроорганизма, активность его иммунной системы имеют решающее значение в возникновении и исходе инфекционного процесса, а свойства микроорганизма определяют специфичность этого процесса.
Глава 13
ХАРАКТЕРИСТИКА ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА
Течение инфекционного процесса проявляется по-разному. Различают бессимптомное, легкое, среднетяжелое и тяжелое
течение. При наличии клинических проявлений (симптомов)
говорят об инфекционной болезни. Основные свойства инфек
ционных болезней:
• специфичность — способность вызывать определенную инфекционную болезнь. Инфекционные болезни подразделяются на бактериозы, в том числе спирохетозы, риккетсиозы, хламидиозы, микоплазмозы, вирусные, протозойные, грибковые (микозы) инфекции;
• заразительность (контагиозность), т. е. способность передаваться от больного человека или животного здоровому. Индивидуум, от которого инфекция передается здоровому человеку, называется источником инфекции (или резервуаром,
если патогенные микроорганизмы локализованы в организме животных или объектах внешней среды);
• способность к широкому, иногда быстрому распространению среди населения (например, грипп). Массовое распространение инфекционной болезни, происходящей от одного источника, называется эпидемией (от греч. epidemia — дословно «полюдье» — распространяется среди людей). Некоторые болезни принимают интенсивное и очень широкое распространение, захватывая весь земной шар или несколько континентов. В этом случае говорят о возникновении пандемии (от греч. pandemia — всенародная). Единичные случаи инфекционного заболевания, не связанные друг с другом, называют спорадическими (от греч. sporadicos — случайный, единичный).
Способ, при помощи которого микроорганизм передается от источника инфекции к здоровому восприимчивому субъекту, называется механизмом передачи патогенных микробов. Различают воздушно-капельный, воздушно-пылевой, фекальнооральный, контактный, трансмиссивный, вертикальный (от матери к плоду) и другие механизмы передачи.
Объекты внешней среды, которые обеспечивают доставку
микроорганизмов от источника инфекции к здоровому человеку, являются факторами передачи. Например, при фекально-оральном механизме наиболее частыми путями передачи являются водный и пищевой, так как вода и пища загрязняются испражнениями (фекалиями) больного и проникают к здоровому через рот при их употреблении. Рот в этом случае будет являться входными воротами инфекции;
• цикличность течения инфекционной болезни, которая обусловлена последовательной сменой периодов ее развития.
Основные периоды развития инфекционной болезни:
1) инкубационный период — время от момента проникновения микроба в организм до появления первых признаков заболевания, что связано с размножением, накоплением микробов и их токсинов;
2) продромальный период следует за инкубационным, является коротким по времени периодом проявления начальных неспецифических симптомов болезни;
3) период выраженных клинических симптомов (острый период), специфических для каждой инфекционной болезни;
4) период реконвалесценции (выздоровления), который характеризуется постепенным исчезновением болезненных проявлений, улучшением общего состояния и полным восстановлением гомеостаза. Иногда после выздоровления человек может остаться носителем патогенных микробов в течение длительного времени (до нескольких десятков лет). Такое состояние называется бактерионосительством. Если оно продолжается до трех месяцев после выздоровления, его называют острым, а если больше трех месяцев — хроническим;
• в процессе инфекционного заболевания развивается специфический иммунитет, который обеспечивает невосприимчивость к повторному заражению этим же микроорганизмом. Напряженность и продолжительность иммунитета значительно варьируют и зависят как от вида и свойств возбудителя, так и от состояния макроорганизма.
13.1. Формы инфекционного процесса
В зависимости от происхождения, путей внедрения и распространения в организме инфекционные процессы могут быть:
• экзогенными, когда инфекционный патогенный агент поступает в макроорганизм извне, из окружающей среды;
• эндогенными, если причиной развития инфекции является представитель условно-патогенной микрофлоры самого макроорганизма. Обычно такие процессы возникают у лиц с иммунодефицитами;
• аутоинфекциями, возникающими при заносе возбудителей из одного биотопа макроорганизма в другой.
По длительности течения выделяют острые (протекают кратковременно, например грипп, корь, холера), подострые (имеют более продолжительное течение) и хронические (продолжаются месяцы, годы, например туберкулез, бруцеллез, трипаносомоз и др.) инфекции. При хронических инфекциях возбудитель длительно сохраняется и персистирует (от лат. persistere — оставаться, упорствовать, переживать) в организме.
В зависимости от распространения выделяют очаговые (локализованные) формы инфекционного процесса, когда возбудители сосредоточены только в одном ограниченном местном очаге, и генерализованные, если происходит распространение возбудителей по лимфатическим путям или гематогенно. К генерализованным формам инфекционных процессов относятся бактериемия, сепсис и септикопиемия. При бактериемии микробы циркулируют в крови, но не могут там размножаться. Под влиянием бактерицидных свойств крови они разрушаются и высвобождают эндотоксины, что приводит к интоксикации. Бактериемия часто является одним из звеньев инфекционного процесса. Например, бактериемия характерна для брюшного тифа, бруцеллеза, лептоспироза и др. Сепсис характеризуется тем, что возбудители подавляют бактерицидные свойства крови, активно размножаются и разносятся по всему организму. Сепсис часто является результатом генерализации очаговых инфекционных процессов, которые сопровождаются развитием иммунодефицитов. Например, сепсис часто возникает при стрептококковых, стафилококковых, менингококковых инфекциях, кандидозе и др. Когда входные ворота возбудителя неизвестны, такая форма называется септицемией. Если результатом сепсиса является формирование вторичных локальных гнойных очагов в различных внутренних органах и возбудитель продолжает циркулировать в крови, то такая форма генерализованной инфекции называется септикопиемией.
Инфекционный процесс, вызванный только одним видом микроорганизмов, называется моноинфекцией.
Смешанная (микст-) инфекция возникает при одновременном заражении двумя-тремя видами возбудителей.
Нередко моноинфекции осложняются вторичной инфекцией, вызванной другим микробом. Например, при гриппе может возникнуть пневмония, вызванная стрептококками.
В зависимости от места инфицирования выделяют внеболъ-ничные, внутрибольничные, природно-очаговые и другие инфекции.
Повторное заражение тем же видом микроба, который вызвал заболевание в прошлом и которое завершилось в то время полным выздоровлением, называют реинфекцией. Это возможно в том случае, если перенесенная инфекция не сопро
вождалась формированием стойкого и продолжительного иммунитета. Например, реинфекция может быть после перенесенной дизентерии, гонореи.
Для хронических болезней характерно чередование периодов выраженных клинических проявлений и скрытых фаз, которые называют ремиссией. В период ремиссии возбудитель сохраняется в организме и может выделяться в окружающую среду, поэтому инфицированные лица в период ремиссии становятся источником инфекции и представляют эпидемическую опасность.
Период ремиссии у таких больных обычно завершается возвратом симптомов болезни за счет оставшихся в организме возбудителей. Такое явление называется рецидивом.
Суперинфекцией называют повторное заражение инфицированного лица тем же микробом, который вызвал первичное инфицирование, но оно не успело закончиться. Например, повторное инфицирование возможно при туберкулезе или сифилисе.
Раздел III
ОСНОВЫ УЧЕНИЯ ОБ ИММУНИТЕТЕ
Глава 14 КРАТКИЙ ОЧЕРК ИСТОРИИ
РАЗВИТИЯ ИММУНОЛОГИИ
Иммунология (от лат. immunity — невосприимчивость, неприкосновенность, logos — наука) — наука об охране генетического постоянства внутренней среды организма.
В случае нарушения этой охраны развиваются частые инфекционные болезни, аутоиммунные реакции, онкологиче
ские процессы.
Отсюда следует, что распознавание и уничтожение чуждых, проникших извне (например, различных микроорганизмов) или образовавшихся в самом организме генетически измененных клеток является основной функцией иммунной
системы.
Развитие иммунологии как науки охватывает длительный период, в котором можно условно выделить два этапа. Первый связан с развитием инфекционной иммунологии, второй — с распространением основных положений иммунитета на неинфекционные процессы (трансплантационный и противоопухолевый иммунитет) и созданием единой общебиологической теории иммунитета.
Истоки учения об иммунитете восходят к глубокой древности и связаны с наблюдениями того, что многие, прежде всего детские, болезни, такие как корь, ветряная оспа, паротит и др., не повторяются. В этот период для создания невосприимчивости стали использовать методы вариоляции. После внедрения английским сельским врачом Э. Дженнером нового способа предохранения от натуральной оспы появился метод вакцинации. Э. Дженнера иногда называют «прародителем»
иммунологии.
Однако, получив вакцину для защиты от оспы, он не сфор-
мулировал общих принципов создания невосприимчивости против любых других инфекций.
Развитие иммунологии началось с работ выдающегося французского ученого Л. Пастера (1881). Он и его ученики нашли методы ослабления (аттенуации) вирулентных свойств
микроорганизмов, создали с их помощью вакцины и объяснили механизм формирования иммунитета при введении вакцин. И. И. Мечников (1882) обнаружил феномен фагоцитоза и
Э. Дженнер (1749—1823)
сформулировал та. В это же
клеточную (фагоцитарную) теорию иммуните-
время французские исследователи Э. Ру и
А. Иерсен (1888) установили способность возбудителя дифте-
рии выделять особый токсин, для нейтрализации которого немецкий ученый Э. Беринг и японский исследователь С. Кита-
зато (1890) разработали способ получения противодифтерий-
ной антитоксической иммунной сыворотки. В России такая сы-
воротка была приготовлена Г. Н. Габричевским (1894). Были
получены антитоксические сыворотки для лечения ботулизма, газовой анаэробной инфекции и др. Возникла гуморальная теория иммунитета, основоположником которой был немецкий исследователь П. Эрлих.
Начался период активной специфической профилактики инфекционных болезней. Были получены новые вакцины из ослабленных живых микроорганизмов для профилактики туберкулеза (1919), чумы (1931), желтой лихорадки (1936), туляремии (1939), полиомиелита (1954) и др. Был разработан ме
тод приготовления анатоксинов, которые использовали для профилактики дифтерии и столбняка. Были внедрены новые методы диагностики инфекционных болезней, основанные на взаимодействии антигена — антитела.
В 40-х годах XX столетия стало развиваться новое направление в иммунологии, связанное с пересадками органов и тканей. Оно получило название трансплантационного иммуни
тета. Начало его изучению положили работы Ж. Борде и Н. Я. Чистовича (коллеги И. И. Мечникова), которые установили, что чужеродные эритроциты и сыворотки стимулируют выработку антител. Вскоре К. Ландштейнер (1900) обнаружил группы крови и разработал учение о тканевых изоантиге
нах.
Английский ученый П. Медовар (1945) выдвинул постулат о том, что иммунитет защищает не только от микроорганизмов, но и от клеток или тканей генетически чужеродного организма. Было четко сформулировано, что процесс отторжения трансплантированных чужеродных тканей обусловлен иммунологическими механизмами. Возникли новые
представления о злокачественных новообразованиях, специфических опухолевых антигенах {Зильбер Л. А., 1944], противоопухолевом иммунитете, новых методах лечения опухолей и аллергий.
П. Медовар и соавт. (1953) и чешский исследователь М. Гашек (I960), изучая трансплантацион-н ый иммунитет, независи
мо друг от друга открыли
явление иммунологической
толерантности как проявле
ние терпимости к чужеродному, генетически отличному от «своего». Австралийский ученый Ф. М. Бернет с коллегами (1949) установил,
Э. Ру (1853-1933)
П. Эрлих (1854-1915)
что толерантность можно вы-
звать искусственно путем введения чужеродного антигена животному до рождения. За это учение П. Медовару и
Л. А. Зильбер (1894-1966)
Ф. М. Бернет (1899-1985)
М. Бернету было присвоено звание лауреатов Нобелевской премии.
Закономерности наследования антигенной специфичности, генетический контроль иммунного ответа, генетиче-
ские аспекты несовместимости тканей при пересадках и проблемы гомеостаза соматических клеток макроорганизма изучает новая отрасль иммунологии — иммуногенетика.
Развитие иммунологии продолжается, и на современном этапе изучена организация иммунной системы, выявлены роль тимуса в формировании клеточных популяций (Т-и В-лимфоцитов), механизмы их функционирования, кооперативные взаимоотношения между основными клетками иммунной системы, установлена структура антител (Д. Эдельман, Р. Портер).
Открыты новые феномены клеточного иммунитета (цито-патогенное действие, аллогенная ингибиция, явление бласттрансформации и др.).
Создано учение о гиперчувствительности и иммунодефицитах.
Изучены формы иммунного ответа и факторы неспецифической защиты.
Разработаны теории иммунитета.
Создание единой общебиологической теории иммунитета
открыло путь к использованию его в борьбе за здоровое долголетие, взяв за основу мощные природные ресурсы конституциональной защиты в борьбе против инфекционных и многих других болезней человека и
животных.
Глава 15
ФАКТОРЫ И МЕХАНИЗМЫ ИММУНИТЕТА
Иммунитет (от лат. immunitas — неприкосновенный, находящийся под защитой, освобождение, избавление от болезни) — это система биологической защиты внутренней среды многоклеточного организма (гомеостаза) от генетически чужеродных веществ экзогенной и эндогенной природы.
Эта система обеспечивает структурную и функциональную целостность организмов определенного вида в течение их жизни. Генетически чужеродные вещества («не свои») поступают в организм извне в виде патогенных микроорганизмов и гельминтов, их токсинов, белков и других компонентов, иногда в виде трансплантируемых тканей или органов. «Чужими» могут стать отжившие, мутировавшие или поврежденные клетки собственного организма.
Функциями системы защиты, получившей название иммунной системы, являются распознавание таких чужеродных агентов и специфическое реагирование на них.
15.1. Виды и формы иммунитета
Иммунитет — явление многокомпонентное и многообразное в своих механизмах и проявлениях (схема 15.1).
Известно два основных механизма защиты.
• Первый обусловлен действием врожденных, конститутивных факторов неспецифической резистентности (от лат. ге-sistentia — сопротивление) и контролируется генетическими механизмами (врожденный, видовой иммунитет). Они обеспечивают неселективный по отношению к чужеродному агенту характер ответа. Это значит, что свойства такого агента не имеют значения. Так, например, человек невосприимчив к возбудителям чумки собак, холеры кур, а животные нечувствительны к шигеллам, гонококку и другим микроорганизмам, патогенным для человека.
• Второй определяется защитными механизмами, которые протекают с участием лимфатической системы. Они лежат в основе формирования приобретенного в течение жизни индивидуального адаптивного (приобретенного) иммунитета. Такой иммунитет характеризуется развитием специфических реакций иммунной системы на конкретный чужеродный агент (т. е. является индуцибельным) в виде образования иммуноглобулинов или сенсибилизированных лимфоцитов. Эти факторы обладают высокой активностью и специфичностью действия. В зависимости от способов формирования различают несколько форм приобретенного индивидуального иммунитета.
Схема 15.1. ВИДЫ И ФОРМЫ ИММУНИТЕТА
Приобретенный иммунитет может формироваться как результат перенесенной инфекционной болезни, и тогда он называется естественным активным (постинфекционным). Его продолжительность составляет от нескольких недель и месяцев (после дизентерии, гонореи и др.) до нескольких лет (после кори, дифтерии и др.). Иногда он может возникать в результате скрытой инфекции или носительства (например, путем «бытовой» иммунизации при менингококковой инфекции). Выделяют виды приобретенного иммунитета:
• антимикробный вырабатывается после перенесенной бактериальной инфекции (чумы, брюшного тифа и др.);
• антитоксический формируется в результате перенесенной токсикоинфекции (столбняка, ботулизма, дифтерии и др.);
• антивирусный — после вирусных инфекций (кори, паротита, полиомиелита и др.);
• антипротистный — после инфекций, вызванных простейшими;
• антифунгальный — после грибковых заболеваний.
В ряде случаев после инфекционного заболевания происходит полное освобождение макроорганизма от возбудителей. Такой иммунитет называют стерильным. Иммунитет, при ко
тором возбудители сохраняются на неопределенно долгий срок в организме клинически здоровых людей, перенесших заболевание, называют нестерильным.
Приобретенный иммунитет передается от матери к ребенку через плаценту в период внутриутробного развития и обеспечивается иммуноглобулинами. Он называется естественным пассивным (трансплацентарным). Продолжительность его 3-4 мес, но он может пролонгироваться при грудном вскармливании детей, так как антитела содержатся и в молоке матери. Значение такого иммунитета велико. Он обеспечивает невосприимчивость грудных детей к инфекционным болезням.
Приобретенный искусственный иммунитет возникает в результате иммунизации. Различают активную и пассивную формы искусственного иммунитета. Активный искусственный иммунитет развивается после введения в организм ослабленных или убитых микроорганизмов либо их обезвреженных токсинов. При этом в организме теплокровных происходит активная перестройка, направленная на образование веществ, губительно действующих на возбудителя и его токсины, происходит изменение свойств клеток, уничтожающих микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Продолжительность этого иммунитета от 1 года до 3—7 лет.
Пассивный искусственный иммунитет возникает при введении в организм готовых антител, которые содержатся в сыворотках специально иммунизированных определенными видами возбудителей животных (иммунные сыворотки), или их получают из сывороток переболевших людей (иммуноглобулины). Этот вид иммунитета возникает сразу после введения антител, но сохраняется всего 15—20 дней, затем антитела разрушаются и выводятся из организма.
15.2. Факторы неспецифической резистентности
Факторы неспецифической резистентности (защиты), которые обеспечивают неселективный характер ответа на антиген и являются наиболее стабильной формой невосприимчивости, обусловлены врожденными биологическими особенностями вида. Они реагируют на чужеродный агент стереотипно и независимо от его природы. Основные механизмы неспецифической защиты формируются под контролем генома в процессе развития организма и связаны с естественно-физиологическими реакциями широкого спектра — механическими, химическими и биологическими.
Среди факторов неспецифической резистентности выделяют:
• ареактивность клеток макроорганизма к патогенным микроорганизмам и токсинам, обусловленную генотипом и
связанную с отсутствием на поверхности таких клеток рецепторов для адгезии патогенного агента;
• барьерную функцию кожи и слизистых оболочек, которая обеспечивается отторжением клеток эпителия кожи и актив
ными движениями ресничек мерцательного эпителия слизистых оболочек. Кроме того, она обусловлена выделением экзосекретов потовых и сальных желез кожи, специфических ингибиторов, лизоцима, кислой средой желудочного содержимого и другими агентами. Биологические факторы защиты на этом уровне обусловлены губительным воздействием нормальной микрофлоры кожи и слизистых покровов на патогенные
микроорганизмы;
• температурную реакцию, при которой прекращается размножение большинства патогенных бактерий. Так, например, устойчивость кур к возбудителю сибирской язвы (В. anthracis) обусловлена тем, что температура их тела находится в пределах 41—42 °C, при которой бактерии не способны к самовос-
производству;
• клеточные и гуморальные факторы организма.
В случае проникновения патогенов в организм включаются
гуморальные
акторы, к которым относятся белки системы
комплемента, пропердин, лизины, фибронектин, система цитокинов (интерлейкины, интерфероны и др.)- Развиваются сосудистые реакции в виде быстрого локального отека в очаге
повреждения, что задерживает микроорганизмы и не пропускает их во внутреннюю среду. В крови появляются белки острой фазы — С-реактивный протеин и маннансвязывающий лектин, которые обладают способностью взаимодействовать с бактериями и другими возбудителями. В этом случае усиливаются их захват и поглощение фагоцитирующими клетками,
т. е. происходит опсонизация патогенов, а эти гуморальные
факторы играют роль опсонинов.
К клеточным факторам не специфической защиты относят-
ся тучные клетки, лейкоциты, макрофаги, естественные (натуральные) киллерные клетки (NK-клетки, от англ, «natural killer»).
Тучные клетки — это большие тканевые клетки, в которых
находятся цитоплазматические гранулы, содержащие гепарин и биологически активные вещества типа гистамина, серотонина. При дегрануляции тучные клетки выделяют особые веще
ства, являющиеся медиаторами воспалительных процессов (лейкотриены и ряд цитокинов). Медиаторы повышают проницаемость сосудистых стенок, что позволяет комплементу и клеткам выходить в ткани очага поражения. Все это сдерживает проникновение патогенов во внутреннюю среду организма.
NK-клетки представляют собой крупные лимфоциты, не имеющие маркеров Т- или В-клеток и способные спонтанно, без предварительного контакта убивать опухолевые и виру-
синфицированные клетки. В периферической крови на их долю приходится до 10% от всех мононуклеарных клеток. NK-
клетки локализованы главным образом в печени, красной пульпе селезенки, слизистых оболочках.
Лейкоциты содержат мощные бактерицидные факторы и обеспечивают первичный или доиммунный фагоцитоз микробных клеток. Такие лейкоциты называют фагоцитами (фагоцитирующими клетками). Они представлены моноцитами, полиморфно-ядерными нейтрофилами и макрофагами.
Фагоцитоз — биологическое явление, основанное на узна-
вании, захвате, поглощении и переработке чужеродных веществ эукариотической клеткой. Объектами для фагоцитоза являются микроорганизмы, собственные отмирающие клетки организма, синтетические частицы и др. Фагоцитами являются полиморфно-ядерные лейкоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), моноциты и фиксированные макрофаги — альвеолярные, перитонеальные, купферовские клетки, дендритные клетки селезенки и лимфатических узлов, клетки Лан
герганса и др.
В процессе фагоцитоза (от греч. phago — пожираю, cytos — клетки) различают несколько стадий (рис. 15.1):
• приближение фагоцита к чужеродному корпускулярному объекту (клетке);
• адсорбция объекта на поверхности фагоцита;
• поглощение объекта;
• разрушение фагоцитированного объекта.
Первая фаза фагоцитоза осуществляется за счет положительного хемотаксиса.
Адсорбция происходит путем связывания чужеродного объекта рецепторами фагоцита.
Третья фаза осуществляется следующим образом.
Фагоцит обхватывает адсорбированный объект своей наружной мембраной и втягивает (инвагинирует) его внутрь клетки. Здесь образуется фагосома, которая затем сливается с лизосомами фагоцита. Формируется фаголизосома. Лизосомы представляют собой специфические гранулы, содержащие бактерицидные ферменты (лизоцим, кислые гидролазы и др.).
Специальные ферменты участвуют в образовании активных свободных радикалов О2 и Н2О2.
На заключительном этапе фагоцитоза происходит лизис поглощенных объектов до низкомолекулярных соединений.
Такой фагоцитоз протекает без участия специфических гуморальных факторов защиты и получил название доиммунного (первичного) фагоцитоза. Именно этот вариант фагоцитоза впервые описан И. И. Мечниковым (1883) как фактор неспецифической защиты организма.
Результатом фагоцитоза является либо гибель чужеродных клеток {завершенный фагоцитоз), либо выживание и размно-
Адсорбция бактерии
Лизосома
Образование фагосомы
Слияние лизосомы с фагосомой
Разрушение и лизис бактерии
Выброс продуктов лизиса микроба
Рис. 15.1. Фагоцитоз [по А. Ройту и др., 2000, в модификации авторов].
жение захваченных клеток (незавершенный фагоцитоз). Незавершенный фагоцитоз представляет собой один из механизмов длительной персистенции (переживания) патогенных агентов в макроорганизме и хронизации инфекционных процессов. Такой фагоцитоз чаще протекает в нейтрофилах и завершается их гибелью. Незавершенный фагоцитоз выявлен при туберкулезе, бруцеллезе, гонорее, иерсиниозах и других инфекционных процессах.
Повышение скорости и эффективности фагоцитарной реакции возможно при участии неспецифических и специфических гуморальных белков, которые получили название опсонинов. К ним относят белки системы комплемента СЗЬ и С4Ь,
белки острой фазы, IgG, IgM и др. Опсонины имеют химическое сродство к некоторым компонентам клеточной стенки микроорганизмов, связываются с ними, а затем такие комплексы легко фагоцитируются потому, что фагоциты имеют специальные рецепторы для молекул опсонинов. Кооперация различных опсонинов сыворотки крови и фагоцитов составляет опсонофагоцитарную систему организма. Оценку опсони-ческой активности сыворотки крови проводят путем определения океанического индекса или опсонофагоцитарного индекса, которые характеризуют влияние опсонинов на поглощение или лизис микроорганизмов фагоцитами. Фагоцитоз, в котором принимают участие специфические (IgG, IgM) белки-опсонины, называют иммунным.
Система комплемента (лат. complementum — дополнение, средство пополнения) — это группа белков сыворотки крови, которые принимают участие в реакциях неспецифической защиты: лизиса клеток, хемотаксиса, фагоцитоза, активации тучных клеток и др. Белки комплемента относятся к глобулинам или гликопротеинам. Они вырабатываются макрофагами, лейкоцитами, гепатоцитами и составляют 5—10% всех белков крови.
Система комплемента представлена 20—26 белками сыворотки крови, которые циркулируют в виде отдельных фракций (комплексов), различаются по физико-химическим свойствам и обозначаются символами Cl, С2, СЗ ... С9 и др. Хорошо изучены свойства и функция основных 9 компонентов комплемента.
В крови все компоненты циркулируют в неактивной форме, в виде коэнзимов. Активация белков комплемента (т. е. сборка фракций в единое целое) осуществляется специфическими иммунными и неспецифическими факторами в процессе многоступенчатых превращений. При этом каждый компонент комплемента катализирует активность следующего. Этим обеспечиваются последовательность, каскадность вступления компонентов комплемента в реакции.
Белки системы комплемента участвуют в активации лейкоцитов, развитии воспалительных процессов, лизисе клеток-мишеней и, прикрепляясь к поверхности клеточных мембран бактерий, способны опсонизировать («одевать») их, стимулируя фагоцитоз (рис. 15.2).
Известно 3 пути активации системы комплемента: альтернативный, классический и лектиновый (табл. 15.1, схема 15.2).
Наиболее важным компонентом комплемента является СЗ, который расщепляется конвертазой, образующейся при любом пути активации, на фрагменты СЗа и СЗЬ. Фрагмент СЗЬ участвует в образовании С5-конвертазы. Это является начальным этапом формирования мембранолитического комплекса.
При альтернативном пути комплемент может активировать-
Фагоцит
Иммунный комплекс
Бактерия Сзь |Сзь
Опсонизация
Комплемент
Клетка-мишень
Фагоцит
Рис. 15.2. Три главные функции комплемента в воспалительном процессе [по А. Ройту и др., 2000].
1 — опсонизация («одевание») комплементом микроорганизмов и иммунных комплексов для их распознавания клетками, экспрессирующими рецепторы к комплементу; 2 — лизис клеток-мишеней; 3 — активация фагоцитов, включая макрофаги и нейтрофилы.
Лизис
Активация
□
ся полисахаридами, липиполисахаридами бактерий, вирусами и другими антигенами без участия антител. Инициатором процесса является компонент СЗЬ, который связывается с поверхностными молекулами микроорганизмов. Далее при участии ряда ферментов и белка пропердина этот комплекс активирует компонент С5, который прикрепляется к мембране клетки-мишени. Затем на нем образуется мембраноатакующий комплекс (МАК) из компонентов С6—С9. Процесс завершается перфорацией мембраны и лизисом микробных клеток. Именно этот путь запуска каскада комплементарных белков имеет место на ранних стадиях инфекционного процесса, когда специфические факторы иммунитета (антитела) еще не выработаны. Кроме того, компонент СЗЬ, связываясь с по-
Схема 15.2. КЛАССИЧЕСКИМ И АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ПУТИ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА
Классический путь
Комплекс антиген—антитело
Альтернативный путь
Г
Антиген
Активация С1, С2, С4
Активация СЗ, вспомогательных факторов В, D, белка пропердина
Конвертаза СЗ
верхностью бактерий, может выполнять роль опсонина, усиливая фагоцитоз.
Классический путь активации комплемента запускается и протекает с участием комплекса антиген—антитело. Молекулы IgM и некоторые фракции IgG в комплексе антиген—антитело имеют специальные места, которые способны связать компонент С1 комплемента. Молекула С1 состоит из 8 субъединиц, одна из которых является активной протеазой. Она
Таблица 15.1. Активаторы комплемента
Активаторы комплемента
Путь активации комплемента
альтернативный
классический
лектиновый
Иммуноглобулины Микроорганизмы
Прочие
Многие бактерии, вирусы, простейшие, грибы Полисахариды (например, агароза)
Комплексы IgM, IgG с антигенами Антигены микроорганизмов в комплексе с 1g Полианионы — ДНК, липид А, кардиолипин и др.
Различные бактерии
Биополимеры с концевыми остатками маннозы
участвует в расщеплении компонентов С2 и С4 с образованием СЗ-конвертазы классического пути, которая активирует компонент С5 и обеспечивает формирование мембраноатакующего комплекса С6—С9, как при альтернативном пути.
Лектиновый путь активации комплемента обусловлен присутствием в крови особого кальцийзависимого сахаросвязывающего протеина — маннансвязывающего лектина (МСЛ). Этот протеин способен связывать остатки маннозы на поверхности микробных клеток, что приводит к активации протеазы, расщепляющей компоненты С2 и С4. Это запускает процесс формирования лизирующего мембрану комплекса, как при классическом пути активации комплемента. Некоторые
исследователи рассматривают этот путь как вариант классиче
ского пути.
В процессе расщепления компонентов С5 и СЗ образуются малые фрагменты С5а и СЗа, которые служат медиаторами воспалительной реакции и инициируют развитие анафилактических реакций с участием тучных клеток, нейтрофилов и моноцитов. Эти компоненты получили название анафилатокси-
нов комплемента.
Активность комплемента и концентрация отдельных его компонентов в организме человека могут увеличиваться или уменьшаться при различных патологических состояниях. Могут быть и наследственные дефициты. Содержание комплемента в сыворотках животных зависит от вида, возраста, сезо
на и даже времени суток.
Наиболее высокий и стабильный уровень комплемента отмечен у морских свинок, поэтому в качестве источника комплемента используют нативную или лиофилизированную сыворотку крови этих животных. Белки системы комплемента очень лабильны. Они быстро разрушаются при хранении при комнатной температуре, действии света, ультрафиолетовых лучей, протеаз, растворов кислот или щелочей, удалении ионов Са++ и Mg++. Прогревание сыворотки при 56 °C в течение 30 мин приводит к разрушению комплемента, и такая сыворотка называется инактивированной.
Количественное содержание компонентов комплемента в периферической крови определяют как один из показателей активности гуморального иммунитета. У здоровых лиц содержание компонента С1 составляет 180 мкг/мл, С2 — 20 мкг/мл, С4 — 600 мкг/мл, СЗ — 13 001 мкг/мл.
Воспаление как важнейшее проявление иммунитета развивается в ответ на повреждение тканей (прежде всего покровных) и направлено на локализацию и уничтожение микроорганизмов, которые проникли в организм. В основе воспалительной реакции лежит комплекс гуморальных и клеточных факторов неспецифической резистентности. Клинически воспаление проявляется покраснением, отеком, болью, локальным повы
шением температуры, нарушением функции поврежденного органа или ткани.
Центральную роль в развитии воспаления играют сосудистые реакции и клетки системы мононуклеарных фагоцитов: нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты, макрофаги и тучные клетки. При повреждении клеток и тканей, кроме того, высвобождаются различные медиаторы: гистамин, серотонин, простагландины и лейкотриены, кинины, белки острой фазы, в том числе С-реактивный белок, и др., которые играют важную роль в развитии воспалительных реакций.
Бактерии, проникшие в организм при повреждении, и продукты их жизнедеятельности активируют свертывающую систему крови, систему комплемента и клетки макрофагально-мононуклеарной системы. Происходит образование сгустков крови, что предупреждает распространение возбудителей с кровью и лимфой и препятствует генерализации процесса. При активации системы комплемента образуется мембраноатакующий комплекс (МАК), который лизирует микроорганизмы или опсонизирует их. Последнее усиливает способность фагоцитирующих клеток поглощать и переваривать микроорганизмы.
Характер течения и исход воспалительного процесса зависят от многих факторов: природы и интенсивности действия чужеродного агента, формы воспалительного процесса (альте-ративное, экссудативное, пролиферативное), его локализации, состояния иммунной системы и др. Если воспаление не завершается в течение нескольких дней, оно становится хроническим и тогда развивается иммунное воспаление с участием макрофагов и Т-лимфоцитов.
15.3. Антигены
Антигенами (от лат. anti — против, genos — род) называют генетически чужеродные вещества, которые при введении во внутреннюю среду организма способны вызывать иммунный ответ в виде образования антител или иммунных Т-лимфоцитов и взаимодействовать с ними. Антиген считается инициатором всех реакций приобретенного иммунитета. Основные свойства антигена — иммуногенность и специфичность. Антигенами являются структурные и химические элементы клеток и продукты их метаболизма.
Иммуногенность — способность индуцировать иммунный ответ.
Специфичность — способность антигена вступать в реакции взаимодействия со специфичными к нему антителами или активированными (примированными) лимфоцитами, что приводит в итоге к нейтрализации этого антигена.
Иммуногенность определяется: *
• чужеродностью, т.е. вещество должно распознаваться иммунной системой как «не свое». При этом чем меньше выражено генетическое родство между организмом и вводимым веществом, тем лучшим иммуногеном оно является;
• молекулярной массой, которая должна быть не менее 5— 10 кД. Чем больше молекулярная масса антигена, тем сильнее будет иммунный ответ;
• химической природой. Антигены могут быть белками, полисахаридами, полипептидами, фосфолипидами, нуклеиновыми кислотами и др.
В зависимости от химической природы и молекулярной массы антигены могут быть полными (иммуногенными) и неполными (их называют гаптенами).
Полные антигены (иммуногены) индуцируют специфический иммунный ответ и вступают в реакции взаимодействия с антителами и активированными (примированными) Т-лимфоцитами. К ним относятся высокомолекулярные вещества — белки, полисахариды, гликопротеины, липополисахариды, липопротеины, нуклеопротеины и корпускулярные формы (микроорганизмы, чужеродные клетки и др.). Антигены могут быть экзогенной природы или эндогенными. К эндогенным антигенам относятся собственные клетки организма с измененным геномом и образуемые ими продукты. Такие антигены получили название аутоантигенов.
Гаптены — это простые химические соединения малой молекулярной массы: дисахара, липиды, пептиды, нуклеиновые кислоты и др. Они не обладают иммуногенностью, но имеют высокий уровень специфичности при взаимодействии с продуктами иммунного ответа (антителами и Т-лимфоцитами). Если гаптен соединить с белком, он приобретает свойство иммуногенности (т. е. становится полным). В этом сложном комплексе именно гаптен определяет его специфичность.
Полугаптены образуются при соединении неорганических веществ (йод, бром, азот и др.) с белком. Такие комплексы могут вызывать образование антител, специфичных к неорганическим соединениям.
Проантигены являются аллергенами-гаптенами или неантигенными веществами (сульфаниламиды, антибиотики, фенолфталеин и др.). При соединении с белками макроорганизма они способны вызывать состояние сенсибилизации и развитие аллергических реакций.
Классификация основных типов антигенов приведена ниже. Все антигены на своей поверхности имеют выступающие концевые молекулы, которые называются антигенными детерминантами, или эпитопами. Именно с ними взаимодействуют антитела или антигенраспознающие рецепторы лимфоцитов. Корпускулярные антигены имеют несколько эпитопов, поэто
му их называют поливалентными. Гаптены имеют один эпитоп и являются одновалентными.
Способ включения иммунной системы в ответ на проникновение чужеродного антигена различен. В связи с этим выделяют тимусзависимые и тимуснезависимые антигены. Полноценное развитие специфического иммунного ответа на тимусзависимые антигены возможно только в присутствии Т-лимфоцитов. Тимуснезависимые антигены (в основном полисахариды) обеспечивают иммунный ответ без участия Т-лимфоцитов.
В некоторых случаях микробы продуцируют особые вещества, которые получили название суперантигенов. Они способны связываться с Т-лимфоцитами без помощи антигенпред-ставляющих клеток (АПК) и минуя их активные центры. Такое связывание вызывает поликлональную активацию Т-лимфоцитов. Они секретируют избыточное количество цитокинов, что вызывает синдром общей интоксикации в организме. Затем такие активированные Т-лимфоциты погибают путем апоптоза (запрограммированная гибель клеток). Обычно суперантигены активируют 2—20% периферических Т-лимфоцитов, и их запрограммированная гибель после активации приводит к развитию иммунодефицита. Суперантигенами для Т-лимфоцитов являются энтеротоксины стафилококков, токсин синдрома токсического шока, суперантигены ВИЧ (вируса иммунодефицита), вируса бешенства и др.
Все существующие в природе клетки — от вирусной частицы до клеток человеческого организма — представлены в виде мозаики (смеси) антигенов. Огромное количество существующих антигенов классифицируют на основе происхождения (естественные, искусственные, синтетические), химической природы (белки, углеводы, нуклеиновые кислоты, липиды и др.), генетических признаков [аутоантигены, аллоантигены (изоантигены), ксеноантигены].
Классификация основных типов антигенов (АГ)
Название АГ
Полные АГ:
• корпускулярные
• растворимые АГ
Гаптены
Характеристика АГ
Целые клетки и крупные частицы: микроорганизмы, эритроциты, измененные клетки организма Белки, полисахариды, ЛПС, эндо- и экзотоксины и др.
Простые органические соединения с малой молекулярной массой — пептиды, дисахара, НК, липиды и др. Не являются иммуногенами, но обладают специфичностью
Название АГ
Аллергены
Синтетические АГ
Аутоантигены
Аллоантигены (изоантигены) Ксеноантигены Г етероантигены (перекрестно реагирующие) Опухолевые АГ ( о нко антиге ны) Вирусспецифиче-ские АГ Суперантигены
Характеристика АГ
АГ внешней среды — пыли, пиши, пыльцы растений и др., вызывающие повышенную реактивность
Искусственно синтезированные полимеры аминокислот, углеводов
Нативные (неизмененные) АГ собственных клеток или межклеточного вещества
АГ других особей этого же вида
АГ особей другого вида
Общие АГ у организмов разных таксономических групп (антиген Форсмана, групповые АГ крови и др.)
Аномальные АГ на мембранах клеток в результате злокачественной трансформации
Вирус специфические АГ на мембранах инфицированных вирусом клеток
Некоторые патогенные микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности
Антигенный спектр микроорганизмов разнообразен и выражается антигенной формулой, т. е. символами в виде букв или цифр. Например, антигенная формула бактерии брюшного тифа представлена антигенами 9, 12, Vi, d.
В зависимости от локализации у бактерий различают следующие антигены (рис, 15.3):
• капсульные (К-АГ) расположены наиболее поверхностно и представлены полисахаридами, полипептидами или белками. Такие антигены имеют пневмококки, сальмонеллы, сибиреязвенная бацилла и др. К капсульным антигенам относится антиген вирулентности (Vi-антиген), который обычно обнаруживают у высоковирулентных энтеробактерий;
• жгутиковые (Н-АГ) имеют подвижные бактерии. Н-АГ является белком флагеллином, легко разрушается при нагревании, но сохраняет свои свойства после обработки фенолом;
• соматические (О-АГ) локализованы на поверхности клеточной стенки. О-АГ у грамотрицательных бактерий состоят из липополисахаридов, к которым присоединены олигосаха-ридные цепочки, обеспечивающие его специфичность. О-АГ термостабильны, сохраняют свои свойства после обработки спиртом и формалином, но разрушаются фенолом. У многих грамположительных бактерий тейхоевые кислоты выполняют функцию О-АГ;
• цитоплазматические АГ являются белковыми и нуклеопротеидными компонентами цитоплазмы клеток, липопротеидами мембранных структур;
ГШ ❖ 0 )о® Соматические АГ ^^/ГГП/Г||11 (О-АГ) Л// /И/ Цитоплазматические (Д/ АГ AZ _ ___ Жгутиковые АГ > (Н-АГ) — Капсульные АГ (К-АГ) Vi-АГ
Д О Н □ Жгутиковые антигены (Н-АГ) 'TT-L IT Капсульные антигены (К-АГ)
Соматические антигены (О-АГ)
--------Vi-антигены (Vi-АГ)
Цитоплазматические антигены
Рис. 15.3. Антигены бактериальной клетки [по М. J. Pelczar, R. D. Reid, 1981, в модификации авторов].
• внеклеточные АГ являются экзопродуктами бактерий белковой природы (экзотоксины, ферменты агрессии: ДНКаза, протеазы, стрептокиназа и др.).
Комплекс антигенов целых микробных клеток и экзотоксины бактерий являются полными антигенами и стимулируют реакции иммунного ответа. По степени специфичности антигены микроорганизмов делят на групповые, к которым относят родоспецифические (общие для рода) и межродовые (общие для разных родов) или видоспецифические (общие для вида), и се-роварианпгные, От последних зависят неоднородность вида и существование внутри вида отдельных антигенных вариантов.
Антигенное строение тканей человека и животных также сложно. Каждая клетка является комплексной антигенной системой. Различают антигены видоспецифические, содержащиеся в сыворотке крови, печени, селезенке и других органах, и аллоантигены (изоантигены), по которым отдельные индивидуумы различаются между собой. К этим антигенам относят эритроцитарную систему АВО (систему групп крови), систему Rh (резус)-фактора, антигены главного комплекса гистосовме-
2
Рис. 15.4. Структура молекул МНС-I и -II [по Р. М. Хаитову и др., 2000].
А —молекулы МНС-1 — трансмембранные гетеродимеры: большая цепь имеет три внеклеточных домена (аь а2, а3); «клефт» для связывания пептида формирует два терминальных домена цепи (at и ct2); р2-цепь малого размера в мембрану не пенетрирует, ее называют микроглобулином. Б — молекулы МНС-Il — трансмембранные гетеродимеры: полипептидные цепи (ah а2 и р2) равновелики, обе пенетрируют мембрану; «клефт» для связывания пептидов формирует внешние домены обеих цепей.
1 — пептид-антиген в комплексе с молекулами МНС-1; 2 — пептид-антиген в комплексе с молекулами МНС-П.
стимости (ГКГС), или, как его еще называют, МНС (от англ, major histocompatibility complex), и др.
Антигены МНС уникальны для каждого организма и определяют его биологическую индивидуальность. По химической структуре и функциональному назначению МНС подразделяют на два класса:
• антигены (молекулы) I класса МНС представлены в разных количествах на поверхности всех ядросодержащих клеток. Больше всего их на лимфоцитах и лейкоцитах. Они являются тканевыми антигенами и играют важную роль в процессах отторжения пересаженных аллогенных тканей. Кроме того, они представляют чужеродный антиген (обычно вирусный) для избирательного уничтожения киллерными клетками. По химической природе это гликопротеины клеточных мембран, которые состоят из двух полипептидных цепей — тяжелой а-цепи с большой молекулярной массой и легкой p-цепи с меньшей молекулярной массой. Тяжелая цепь проникает через мембрану клетки. Она нековалентно связана с легкой цепью, которая не является трансмембранной (рис. 15.4, А);
• антигены (молекулы) II класса МНС находятся на мембране иммунокомпетентных клеток — макрофагов, моноцитов, В-лимфоцитов, активированных Т-клеток, дендритных клеток и др. Эти клеточные молекулы участвуют в пр е дета вл е-150
Таблица 15.2. Степень участия молекул МНС в некоторых иммунных реакциях
Функциональная активность
Антигены
МНС-1
Антигены
мнс-п
Индукция образования антител Представление антигена для киллерных клеток — CD8 Т-лимфоцитов
Представление антигена для CD4 Т-хелперов Интенсивность отторжения аллотрансплантата
нии Т-лимфоцитам чужеродного антигена в иммуногенной форме для распознавания. Они состоят из двух трансмембранных микроглобулинов почти равной молекулярной массы (рис. 15.4, В).
Генетический контроль развития и функционирования иммунной системы осуществляется комплексом генов МНС, который состоит из 4—106пар нуклеотидов ДНК (около 50 генов), локализованных в хромосоме б. Именно они формируют антигенную индивидуальность каждой особи определенного вида. Гены МНС делятся на 3 класса:
— гены I класса контролируют экспрессию (выход на поверхность клеток) антигенов I класса МНС;
— гены II класса контролируют антигены II класса МНС;
— гены III класса контролируют синтез иммунорегулятор-ных цитокинов (факторы некроза опухолей) и некоторых компонентов комплемента.
Степень участия молекул МНС в некоторых иммунных реакциях приведена в табл. 15.2.
Глава 16
ИММУННАЯ СИСТЕМА
16.1. Органы иммунной системы
Иммунная система определяет характер и силу иммунного ответа на экзогенные антигены и собственные генетически измененные клетки и представляет собой сложную многокомпонентную систему лимфоидных органов, тканей и клеток, которые неравномерно расположены по всему организму.
Выделяют центральные и периферические органы иммунной системы. К центральным органам относят костный мозг (bone marrow) и вилочковую железу (тимус — thymus). Их называют центральными, потому что именно в них происходят созрева
ние и дифференцировка лимфоцитов — лимфопоэз. Они регулируют и контролируют работу периферического аппарата иммунной системы.
Иммунный ответ организма реализуется только с участием этих специализированных клеток — лимфоцитов, которые являются главными, центральными клетками иммунной системы и ответственны за реализацию клеточного и гуморального звена иммунитета. В организме взрослого человека содержится около 1013 лимфоцитов.
Костный мозг — орган кроветворения. Из него ежесуточно выходят в циркуляцию стволовые клетки, среди которых есть и предшественники лимфоцитов (пре-лимфоциты). Здесь же из полипотентной стволовой клетки образуются и другие иммунокомпетентные клетки — нормальные киллерные (NK) и дендритные. В костном мозге проходят дифференцировку все лейкоциты крови и образуются нейтрофилы, моноциты/мак-рофаги, эозинофилы, базофилы, тучные клетки, участвующие в иммунном ответе в качестве помощников лимфоцитов. На завершающей стадии иммунного ответа к ним подключаются эритроциты, которые транспортируют образовавшиеся иммунные комплексы антигена с антителом и комплементом в печень и селезенку для фагоцитоза и разрушения.
В костном мозге из пре-В-лимфоцита формируется незрелый В-лимфоцит (В-клетка), на поверхности которого экспрессирован иммуноглобулиновый рецептор (IgM), но отсутствует рецептор IgD (он появляется позднее у зрелых В-клеток периферии). Рецептор IgM обладает узкой специализацией и способен реагировать только с одним антигенным эпитопом.
В-лимфоциты первоначально получили свое наименование по первой букве латинского названия сумки Фабрициуса («bursa Fabricii») у птиц, где формируются клетки этого типа. В последующем было установлено, что аналогичную функцию у человека выполняет костный мозг.
В-лифоциты являются компонентами В-системы иммунитета, с участием которой осуществляется гуморальная форма иммунного ответа.
В костном мозге в дальнейшем происходит селекция В-лимфоцитов. Она проявляется в следующем: клоны В-лимфо-цитов, несущие IgM-рецепторы к своим собственным антигенам (аутоантигены), уничтожаются путем апоптоза (запрограммированная гибель) в костном мозге или приходят в состояние ареактивности.
Апоптоз (греч. apoproegrnena — то, что должно быть отвергнуто в споре, или опадающие листья осенью) означает биологический механизм гибели клеток путем активации внутриклеточных ферментов, которые повреждают митохонд
рии и вызывают деградацию ДНК и ядра с последующим распадом. Остатки клетки фагоцитируются. При этом клетка погибает без вреда для окружающих тканей.
После апоптоза в костном мозге остаются активными те В-клетки, которые способны реагировать только на чужеродные антигены. Они являются незрелыми, наивными (от англ, naive — наивный), функционально не подготовленными, так как еще не контактировали с чужеродными антигенами. Эти В-клетки мигрируют по кровеносным сосудам в периферические лимфоидные органы.
В тимусе из клеток-предшественников происходят созревание и дифференцировка Т-лимфоцитов (Т-клеток). В дальнейшем они обеспечивают клеточную форму иммунного ответа.
Здесь у Т-лимфоцитов формируется антигенраспознающий
Т-клеточный рецептор (ТКР) и дополнительные белковые мо
лекулы (корецепторы). Они делят Т-клетки на субпопуляции:
Т-киллеры/супрессоры, на поверхности которых экспрессиру
ется корецептор CD8, и Т-хелперы/индукторы с корецептором CD4. Корецепторы — это особые белки клеточной мембраны,
которые усиливают взаимодействие ТКР с антигеном и участвуют в передаче сигнала внутрь клетки. Формируется множество клонов Т-клеток (тимоциты), и среди них отбираются
только те, которые могут взаимодействовать с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Происходит апоптоз тимоцитов, способных реагировать на собственные антигены (аутоантигены) или несущих на своей поверхности агрессивную информацию. В результате вилочковую железу каждые сутки покидает 8,5 млн зрелых Т-лимфоцитов, что составляет только 3—5% от всех образовавшихся тимоцитов. Выжившие Т-клетки мигрируют на периферию, и до встречи
с антигеном их называют наивными, неиммунными.
Среди лимфоцитов периферической крови человека Т-лимфоциты составляют 55—60 %, В-лимфоциты — 25—30 % и 10—20 % —это нулевые лимфоциты, которые не прошли дифференцировку и являются, вероятно, клетками-предшественниками.
На поверхности лимфоцитов, покидающих центральные органы иммунной системы, имеется целый набор адгезивных молекул: селектины, интегрины, адгезины суперсемейства иммуноглобулинов, homing-рецепторы (от англ, home —дом, т. е. место дальнейшего расположения). Аналогичные рецепторы находятся на поверхности клеток периферических лимфоидных органов и тканей, которые заселяются такими лимфоцитами. Это обеспечивает дифференцированное, строго
определенное размещение наивных лимфоцитов в периферических органах иммунной системы.
Периферическая лимфоидная ткань представлена:
• селезенкой;
• лимфатическими узлами;
• лимфоидной тканью, ассоциированной со слизистыми оболочками (MALT — mucosal-associated lymphoid tissue) желудочно-кишечного тракта (GALT — gut-associated lymphoid tissue) — миндалин, аденоидов, пейеровых бляшек, аппендикса; бронхов и бронхиол (BALT —bronchial-associated lymphoid tissue);
• лимфоидной тканью, ассоциированной с кожей (SALT — skin-associated lymphoid tissue);
• субпопуляциями лимфоцитов в печени — нормальных киллеров (NK), Т-лимфоцитов, макрофагов;
• периферической кровью, которая является транспортнокоммуникационной системой.
В периферических лимфоидных органах мигрирующие сюда наивные лимфоциты либо вступают во взаимодействие с чужеродными антигенами, либо включаются в процесс рециркуляции. Лимфоциты, которые активируются после контакта с антигеном и цитокинами, называют примированными (активированными).
Процесс дифференцировки лимфоцитов в периферических органах иммунной системы после встречи с антигеном называют иммуногенезом.
Рециркуляция наивных лимфоцитов заключается в их миграции из крови в ткани и из тканей в кровь сквозь стенку сосудов под контролем адгезивных рецепторов. Если наивные лимфоциты не вступили в контакт с антигеном, они по эфферентным лимфатическим сосудам попадают в грудной проток, а из него возвращаются в кровоток через левую подключичную вену. Подавляющее большинство рециркулирующих лимфоцитов представлено долгоживущими Т-лимфоцитами. Полный цикл рециркуляции Т-клеток занимает 24 ч; В-клетки живут от нескольких дней до нескольких недель. Исключением являются Т- и В-клетки памяти, продолжительность жизни которых достигает 20 лет и более.
Глава 17 ФОРМЫ ИММУННОГО ОТВЕТА
Проникновение антигенчужеродных агентов в организм вызывает развитие иммунного ответа, который включает следующие этапы:
• распознавание антигена наивными Т- и В-лимфоцитами;
• пролиферацию и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов
Рис. 17.1. Процессинг антигена [по А. Ройту и др., 2000].
-1 Абсорбция и проникновение в клетку
АПК
Частичное расщепление в фаголизосомах
Молекула МНС
Реэкспрессия антигена на поверхности
клетки
до зрелых эффекторных клеток как ответную реакцию на антиген;
• нейтрализацию и уничтожение антигена.
Распознавание чужеродного антигена происходит следующим образом. Антигенпрезентирующие клетки, к которым относят дендритные клетки, макрофаги, клетки Лангерганса и В-лимфоциты, захватывают антиген. Они обеспечивают расщепление антигена до пептидов длиной не более 20 аминокислот. Антигенные пептиды связываются молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса и представляются на поверхности клеток. Это явление получило название процессинга антигена (рис. 17.1).
Т-лимфоциты взаимодействуют с таким процессированным антигеном только в комплексе с молекулой МНС на поверхности антигенпрезентирующей клетки. В дальнейшем происходит развитие реакций межклеточных взаимодействий, которые опосредуются цитокинами (см. раздел 17.4) — медиаторами иммунного ответа. Важную роль играет интерлейкин-2 (IL-2). Он обеспечивает созревание и дифференцировку Т-лимфоцитов. При этом наивные CD4 Т-клетки дифференцируются в Тн1-клетки воспаления и хелперные Тн2-клетки (клетки-помощники), a CD8 Т-лимфоциты — в цитотоксические (ЦТЛ, или Т-киллеры).
Трансформация В-клеток в зрелые сопровождается экспрессией на поверхности двух иммуноглобулинов — IgM и IgD.
Активированные (зрелые) Т- и В-лимфоциты обеспечивают заключительную стадию процесса путем нейтрализации и уничтожения антигена.
Сила и характер иммунного ответа зависят как от свойств, дозы антигена, способа его проникновения, длительности присутствия в организме, так и от реакции иммунной системы и механизмов ее регуляции.
В настоящее время известны следующие варианты иммунного ответа:
• гуморальный иммунитет, основанный на выработке иммуноглобулинов;
• клеточный иммунитет, в основе которого — продукция эффекторных Т-лимфоцитов;
• иммунологическая память;
• иммунологическая гиперреактивность;
• иммунологическая толерантность.
17.1. Гуморальный иммунный ответ
Гуморальный иммунный ответ осуществляется путем выработки антител (иммуноглобулинов) к чужеродному антигену (от лат. humor — жидкость). Они циркулируют в жидкостях организма и обеспечивают нейтрализацию антигена.
На поверхности В-лимфоцитов находится иммуноглобулиновый рецептор (sig — superficial Ig). Именно он распознает, захватывает и переносит антиген внутрь клетки. Происходит внутриклеточное расщепление антигена с образованием пептидов. Они в комплексе с молекулами II класса МНС выносятся на поверхность В-клетки, обеспечивая процессинг антигена и представляя его в иммуногенной форме. Развитие дальнейших событий зависит от характера антигена.
Тимусзависимые антигены (TD — thymus depending-anti-gens) для выработки антител нуждаются в помощи Т-хелпер-ных лимфоцитов.
Комплекс антигенный пептид+молекула МНС II класса распознается и связывается с Т-хелпером (Тн2) с помощью Т-клеточного рецептора (ТКР) и корецепторных (CD4, CD28) молекул — адгезинов. Эти процессы сопровождаются активной секрецией цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИНФ и др.), которые стимулируют процесс размножения В-лимфоцита и образования клона плазматических клеток, вырабатывающих иммуноглобулины только на данный антиген.
Иммунный ответ на тимуснезависимые антигены (ЛПС, бактериальные полисахариды, высокополимерные белки и др.) осуществляется без участия CD4 Т-хелперов. В этом процессе участвуют только В-клетки, имеющие антигенрас-познающий иммуноглобулиновый рецептор. При этом иммунный ответ развивается быстро, обычно в ранние сроки инфекции, но является менее совершенным. Без участия Т-хел-перных клеток продуцируются антитела только одного изотипа (IgM). Аффинность (сила связывания) этих антител низкая, и не образуются клетки памяти.
Процесс образования антител происходит в лимфоидной ткани.
17.2. Иммуноглобулины
Иммуноглобулины (антитела) — особые белки сыворотки крови, которые продуцируются плазматическими клетками в ответ на проникновение чужеродного антигена и способны к специфическому взаимодействию с этим антигеном.
Впервые немецкий бактериолог Э. Беринг и японский исследователь Ш. Китазато в 1890 г. обнаружили особые свойства антитоксической сыворотки, которые выражались в способности нейтрализовать активность дифтерийного токсина. Позже немецкий иммунолог П. Эрлих (1891) использовал термин «антитело» для обозначения этого нейтрализующего вещества антитоксической сыворотки. Р. Потеру (Англия) и Д. Эдельману (США) (1959—1970) удалось полностью расшифровать химическую структуру и выявить функциональную активность некоторых антител. За эту работу они были удостоены Нобелевской премии.
Установлено, что антитела являются гликопротеинами сыворотки крови, сосредоточены в у-глобулиновой фракции и имеют глобулярную вторичную структуру. А. Тизелиус и Э. Кебот в 1937 г. опубликовали первую работу по электрофорезу сыворотки крови и констатировали значительное увеличение у-глобулиновой фракции после иммунизации кроликов антигеном. Современное название белков этой фракции — иммуноглобулины (1g). Количество иммуноглобулинов составляет примерно 30% всех белков сыворотки крови. Скорость их образования плазматическими клетками велика: за 1 с вырабатывается 1000—1500 молекул.
У млекопитающих обнаружено 5 классов иммуноглобулинов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Кроме, того, IgG имеет 4 субкласса—Gl, G2, G3, G4, a IgA 2 субкласса —Al и А2. Классы и субклассы, вместе взятые, называют изотипами иммуноглобулинов. Таким образом, изотипов 9. В пределах изотипа у отдельных особей выявляют различающиеся варианты иммуноглобулинов с измененной аминокислотной последовательностью в тяжелых цепях, которые получили название аллотипов. Следовательно, аллотипы отражают индивидуальную антигенную характеристику антител.
У антител, специфичных к антигенным детерминантам, конструкция активных центров неодинакова за счет наличия разнообразных аминокислот в гипервариабельных областях. Это обеспечивает уникальность антигенсвязывающего участка молекулы иммуноглобулина, названного идиотипом (idious — уникальный, не такой как все) антитела. Следовательно, идиотип антитела — это отражение специфичности антитела по отношению к антигену. Все молекулы 1g, выделяемые отдельными лимфоцитами и его потомками (клоном), имеют
Рис. 17.2. Общая схема строения IgG 1 [по А. Ройту и др., 2000].
одинаковый идиотип и обозначаются как моноклональные антитела. К этому уникальному участку также можно получить антитела, которые называются антиидиотипическими. Эти антитела образуются в норме и могут участвовать в регуляции иммунного ответа.
Таким образом, в молекуле 1g различают 3 типа антигенных детерминант — изотипические, аллотипические, идиотипические. Эти детерминанты определяют специфичность антител (около 1016—109 вариантов) по отношению к разнообразным антигенам. Антигенное разнообразие молекул 1g генетически детерминировано.
Иммуноглобулины характеризуются общим типом строения. Наиболее просто устроена молекула IgG (рис. 17.2). Она состоит из четырех полипептидных цепей — двух тяжелых Н-цепей (от англ, heavy — тяжелый), каждая из которых имеет молекулярную массу (м.м.) 50 кД и содержит около 450 аминокислотных остатков, и двух L —легких (от light — легкий). Легкая цепь имеет по 212 остатков аминокислот с м.м. 25 кД. Четыре цепи соединены между собой в единую молекулу дисульфидными связями.
Каждая легкая и тяжелая цепь имеет вариабельную V-об-ласть (англ, variable region) с выраженным разнообразием аминокислотного состава, что обеспечивает специфичность молекулы 1g, и константную С-область (от англ, constant region). Все области подразделяются на гомологичные участки (домены). Домен содержит 110 аминокислотных остатков. У легких цепей обнаружено 2 домена: один — в V-области, второй — в С-зоне. Каждая тяжелая цепь имеет 4 домена: один V-домен, три С-домена — Сн1, Сн2, СнЗ. Между Сн1- и Сн2-доменами находится шарнирная зона, которая обеспечивает подвижность Fab-фрагмента. Сн2-домен является местом связывания комплемента, СнЗ-домен способен взаимодействовать с Fc-
рецепторами на поверхности иммунокомпетентных клеток (нейтрофилов, макрофагов, моноцитов).
По специфичности и способности связывать антиген в каждой молекуле выделяют 3 фрагмента. Два из них являются антигенсвязывающими Fab-фрагментами (от англ, antigen binding) и способны реагировать с чужеродным антигеном. Fab-фрагмент локализован в V-области молекулы 1g. Третий фрагмент, константный Fc-фрагмент (от англ, constant — постоянный, неизменный), расположен в С-области молекулы Ig. Он строго идентичен у молекул одинаковых изотипов и неспецифичен по отношению к антигену. Этот фрагмент взаимодействует с различными компонентами иммунной системы (фагоцитами, комплементом).
Молекулы иммуноглобулинов присутствуют в организме в растворимой форме в крови и других биологических жидкостях, на мембране В-лимфоцита в составе трансмембранного рецептора для антигена и других клеток.
Основными биологическими функциями иммуноглобулинов являются связывание антигенов и их нейтрализация, опсонизация корпускулярных антигенов и подготовка их к поглощению фагоцитами, нейтрализация токсинов и ферментов, участие в лизисе микроорганизмов и собственных измененных клеток, активация комплемента.
Иммуноглобулины G (IgG) имеют мол. массу 160 кД, константу седиментации 7S (т. е. являются микроглобулинами), и составляют 75—80% от общего количества иммуноглобулинов в организме человека. Они способны проходить через плаценту и после рождения ребенка в течение 4—6 мес обеспечивать надежную защиту от возбудителей инфекционных болезней, формируя естественный пассивный (трансплацентарный) иммунитет. Действие IgG проявляется на поздних этапах первичного и в процессе вторичного иммунного ответа, т. е. после распознавания антигена, проникшего в организм повторно. Они участвуют в различных реакциях иммунитета, опсонизации корпускулярных антигенов, фиксируют и активируют комплемент.
Иммуноглобулины М (IgM) встречаются в свободной форме в виде пентамерной молекулы, состоящей из 5 молекул IgG, объединенных J-цепью (от англ, join — соединять, присоединять), т. е. они состоят из 10 пар легких и тяжелых цепей. Мономерная форма этого Ig выполняет функцию антигенрас-познающего рецептора на поверхности В-лимфоцитов. В сыворотке крови человека доля IgM составляет 10%. Они имеют м.м. 900 кД, константу седиментации 19S (являются макроглобулинами), термостабильны, не проходят через плаценту. К их основной биологической функции относится мощная антибактериальная защита, которая выражается в лизисе клеток в присутствии комплемента. Особенно активны Ig этого
класса в отношении грамотрицательных бактерий: шигелл, сальмонелл, патогенных эшерихий, вибрионов. Вместе с гуморальными факторами естественной резистентности они обусловливают бактерицидную активность крови. В процессе первичного иммунного ответа это первые, наиболее ранние Ig-
Иммуноглобулины A (IgA) составляют около 10—15 % от об-щего количества иммуноглобулинов в крови. Однако основная их часть содержится в секретах слизистых оболочек. Структурной особенностью иммуноглобулинов этого класса является способность образовывать мономерные, димерные, реже три- и мультимерные молекулы благодаря наличию J-це-пи и секреторного компонента. Поэтому выделяют сывороточные IgA — мономеры и секреторные slgA, которые представлены на поверхности эпителиальных клеток димерными молекулами с секреторным S-компонентом. Наличие секреторного компонента придает молекуле устойчивость к действию протеолитических ферментов. В зависимости от этого м.м. IgA составляет 150—450 кД. Они термостабильны, не проходят через плаценту. Функционально эти иммуноглобулины выступают в качестве первой линии защиты на слизистых оболочках и обеспечивают местный иммунитет. Вероятно, они участвуют в регуляции видового и количественного состава микрофлоры слизистых оболочек. Присутствие IgA в молозиве поддерживает иммунитет новорожденных.
Иммуноглобулины Е (IgE) представляют собой мономеры с м.м. 190 кД, константой седиментации 8S, термолабильны. Их количество в крови незначительно. Функциональная активность проявляется в развитии аллергических реакций, так как они способны взаимодействовать своими Fc-фраг-ментами с тучными клетками и базофилами. В результате такого взаимодействия тучные клетки секретируют вазоактивные амины, что и приводит к развитию аллергических реакций.
Иммуноглобулины D (IgD) обнаруживаются в сыворотке крови в небольшом количестве. Молекулы этого иммуноглобулина экспрессированы на поверхности активированных зрелых В-лимфоцитов вместе с мономерными молекулами IgM и выполняют регулирующие функции.
В сыворотке крови здорового человека Ig обнаружены в следующих количествах (мг/100 мл): IgG — 1000—1500, IgM — 60—180, IgA - 100-400, IgE-0,1, IgD - 3-5.
Конститутивные (нормальные) иммуноглобулины являются аутоантителами, т. е. направлены против молекул собственного организма. Они относятся у взрослых индивидуумов в основном к IgG, реже к IgM, IgA. Эти антитела способны связывать множество различных антигенов эндо- и экзогенной природы. Они участвуют в поддержании гомеостаза, защите 160
против инфекций, удалении из организма отживших клеток, в представлении антигенов Т-клеткам, индукции синтеза противовоспалительных цитокинов и др.
Иммуноглобулины могут взаимодействовать с антигенами разной химической природы: пептидами, углеводами, полифосфатами и др. Их важным свойством является способность
вступать в контакт и связывать цельные, нативные молекулы
антигена в неизмененном виде. Сродство между антигенами и
иммуноглобулинами характеризуют аффинность и авидность.
Аффинность (степень сродства) — это сила связывания между
одним антигенным эпитопом и одним активным центром антитела. Авидность связи антигена с антителом — это сила связи цельной молекулы антигена (всех его эпитопов) с антиген-связывающими центрами цельной молекулы антитела. Связы
вание антигена с антителом основывается на тесном контакте, который обеспечивается ван-дер-ваальсовыми силами (через облако электронов), водородными связями, электростатическим притяжением или гидрофобными связями. Соединения из антигенов и антител называют иммунными комплексами. Обычно они фагоцитируются моноцитами, нейтрофилами, эозинофилами и др. либо связываются через рецепторы комплемента с эритроцитами, попадают с ними в печень или селезенку, где фагоцитируются местными клетками. В некоторых случаях иммунные комплексы циркулируют в крови длительно и вызывают воспалительное поражение органов или
подавляют иммунитет.
Динамика образования антител при первичном и повторном
введении антигена различна (рис. 17.3). При первичном вве
дении антигена выделяют:
• латентную (индуктивную) фазу, в течение которой происходят захват макрофагом, переработка и представление антигена Т-хелперным клеткам, размножение специфического клона В-лимфоцитов и трансформация в плазматические клетки, начало выработки антител. Продолжительность этой фазы составляет 3—5 дней. В этот период антитела в крови не обнаруживаются;
• логарифмическую фазу, которая характеризуется поступлением антител в кровь и лимфу, увеличением количества плазмоцитов и геометрическим ростом (в десятки раз) количества антител. Продолжительность этой фазы составляет 7— 15 сут;
• стационарную фазу продолжительностью 15—30 сут, во время которой количество антител достигает максимума и стабилизируется;
• фазу снижения уровня антител, что происходит в результате гибели плазмоцитов ранней генерации. Остаточный низкий уровень антител может сохраняться длительное время — до нескольких месяцев.
1-е введение антигена
2-е введение антигена
Случайное попадание малой дозы антигена в организм через несколько месяцев или лет
Рис. 17.3. Первичный иммунный ответ (1), вторичный иммунный ответ (2) и ответ иммунологической памяти (3) [по Р М Хаитову и др , 2000]
В ходе первичного иммунного ответа плазмоциты переключаются на синтез антител разных классов. В начале иммунного ответа синтезируются IgM, а позже появляются IgG
Динамика иммунного ответа при повторном проникновении антигена в организм имеет следующие особенности: латентная фаза короче (от нескольких часов до 2 дней), логарифмическая фаза продолжительнее, скорость прироста анти
тел и их уровень выше.
В последующих фазах количество антител снижается медленно, иногда в течение нескольких лет. С первых часов появляются антитела класса IgG.
Указанные различия в динамике иммунного ответа объяс-
няются феноменом иммунологической памяти. При иммунном
ответе некоторые В-лимфоциты не дифференцируются в
плазмоциты-антителопродуценты, а сохраняются в лимфоидной ткани как клетки памяти. При повторном поступлении антигена количество их быстро увеличивается и формируются клоны плазматических клеток, которые обеспечивают высокоэффективный вторичный ответ
Примером такого типа иммунного ответа является реакция на повторное введение вакцины (ревакцинация), что стимулирует иммунологическую память. Поствакцинальный и постинфекционный иммунитет также поддерживается иммунологической памятью.
Все Т-лимфоциты, вовлеченные в реакции иммунного ответа, так же как и В-клетки, способны формировать клетки памяти и обеспечивать более эффективный и ускоренный ответ (по вторичному типу). В иммунных реакциях, где эффекторные функции выполняют макрофаги, иммунологическая память создается исключительно Т-хелперами.
17.3. Клеточный иммунный ответ
Клеточный иммунный ответ обеспечивается Т-системой иммунитета и характеризуется разрушением чужеродных антигенов с участием Т-лимфоцитов (рис. 17.4). В этом случае молекулы антигена, представленные на поверхности клеток-мишеней или АПК (макрофаги, дендритные клетки или В-клетки) в комплексе с молекулами I класса МНС, уничтожаются при прямом взаимодействии со специальными цитотоксическими лимфоцитами — ЦТЛ (их иногда называют Т-киллерами или CD8 Т-клетками). Гибель клеток, несущих чужеродный антиген (вирусинфицированных, опухолевых, клеток трансплантированных тканей), происходит путем так называемого «летального удара». Этот процесс характеризуется повышением проницаемости клеточных мембран, нарушением баланса натрий-калиевого насоса, увеличением активности лимфотоксинов (р-ФНО), избыточным проникновением воды через мембрану. Результатом является лизис клетки-мишени. Следует отметить, что ЦТЛ разобщается с клеткой-мишенью до наступления «летального удара» и остается неповрежденным и способным к повторному цитолитическому действию. При вторичном проникновении в организм этого же патогена развиваются реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Следовательно, формирующийся клеточный иммунный ответ, так же как и гуморальный, ха-
Рис. 17.4. Распознавание антигена Т-клеткой [по А Ройту и др , 2000]
МНС- молекула, презентирующая антигенный пептид
Антигенный пептид, связанный с МНС-молекулой
T-клеточный рецептор, распознающий МНС-молекулу и пептидный фрагмент антигена
Таблица 17.1. Некоторые основные CD-маркеры и их функции
CD-антиген
Основные экспрессирующие клетки
Основные функции
CD2
CD3
CD4
CD5
CD8
CD14
CD16
CD19
Тимоциты, Т-клетки, NK-клетки
Т -лимфоциты
Маркер субпопуляции
Т-лимфоцитов, моноциты/ макрофаги, эозинофилы Тимоциты, Т-лимфоциты, В-1 - лимфоциты
Маркер субпопуляции Т-лимфоцитов — ЦТЛ Моноциты/макрофаги NK-клетки, нейтрофилы, макрофаги
В-лимфоциты
CD20
В-лимфоциты
CD21
Зрелые В-лимфоциты, дендритные клетки
CD23
CD25
CD30
CD35
CD40
CD64
CD118
CD 154
Зрелые В-клетки, макрофаги, эозинофилы, тромбоциты, дендритные клетки Активированные Т-и В-клетки, моноциты Активированные Т-и В-клетки, NK-клетки, моноциты
Эритроциты, В-клетки, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и др.
В-клетки, макрофаги Моноциты, макрофаги Многие клетки организма Активированные CD4 Т-клетки
Активация Т-лимфоцитов
Антигенное распознавание Молекула адгезии, передача сигнала, корецептор для ТКР
Молекула адгезии
» »
Рецептор для ЛПС Клеточная цитотоксичность, активация фагоцитоза Молекула адгезии, компонент корецепторного комплекса Активация и регуляция В-клеток
Активация В-клеток, рецептор для компонента комплемента C3d
Регуляция синтеза IgE
Рецептор для ИЛ-2
Пролиферация Т- и В-лимфоцитов, участие в сигнале к апоптозу
Рецептор для компонентов комплемента, опосредует фагоцитоз
Рецептор для В-клеток Рецептор для IgG
Рецептор для интерферонов Активация В-лимфоцитов
рактеризуется специфичностью и развитием иммунологической памяти.
В том случае, когда чужеродный антиген-пептид представлен в комплексе с молекулой II класса МНС, в реакции взаимодействия вступают CD4 Т-клетки воспаления (Тн1) либо CD4 Т-хелперы (Тн2). CD4 Т-клетки воспаления (Тн1) активируют макрофаги, усиливая процессы внутриклеточного переваривания (уничтожения) патогена. Такой процесс имеет место при некоторых инфекциях, возбу-
дители которых избегают обычного внутриклеточного кил-линга в фаголизосомах макрофагов (возбудители чумы, лепры, туберкулеза).
Если в процесс взаимодействия вступают CD4 Т-хелперы (Тн2), иммунный ответ протекает по типу гуморального. Многообразие реакций клеток иммунной системы обеспечивается специфичными поверхностными молекулами-антигенами (маркерами), объединенными под общим названием кластеры дифференциации (CD — claster of differentiation). Их наличие позволяет определить принадлежность клетки к определенной субпопуляции (табл. 17.1).
Субпопуляционный состав клеток на основе определения CD-маркеров проводится с помощью моноклональных антител методом лазерной проточной цитофлюориметрии.
17.4. Цитокины
В иммунном ответе регуляторами межклеточных взаимодействий являются цитокины. Они вырабатываются различными клетками иммунной системы, имеют белковую природу, растворимы в жидкостях организма, действуют через специальные рецепторы на поверхности клеточных мембран, неспецифичны к антигенам. Их активность взаимосвязана и проявляется по типу цитокинового каскада (каждый цитокин активирует последующий). Так, если один цитокин действует на клетку, он стимулирует выработку этой клеткой других цитокинов.
По характеру биологического действия и структурной организации выделяют несколько групп цитокинов.
1. Гемопоэтины — факторы роста клеток. К ним относят интерлейкины (ИЛ), которые продуцируются активированными Т- и В-лимфоцитами, макрофагами, клетками стромы тимуса. Функциональная активность этих медиаторов имеет разнонаправленный характер. Интерлейкины (ИЛ-2—ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-13, ИЛ-15) обеспечивают стимуляцию роста, дифференцировку и активацию Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток, макрофагов, гранулоцитов и моноцитов, усиление активности тучных клеток и др.
К этой же группе гемопоэтинов относят колониестимулирующие факторы (КСФ), которые контролируют созревание, пролиферацию и активацию клеток иммунной системы (гранулоцитов, моноцитов, макрофагов).
2. Интерфероны (ИФН) принимают разностороннее участие в регуляции иммунного ответа, обладают противовирусной активностью (см. раздел 22.1).
3. Факторы некроза опухоли (ФНО-ос и ФНО-р) получили такое название потому, что способны лизировать некоторые опухоли. Стимулируют процессы адгезии, антителообразова-
ния и активность мононуклеарных клеток. Секретируются активированными макрофагами.
4. Хемокины привлекают в очаг воспаления лейкоциты, моноциты и лимфоциты из крови. К хемокинам относят ИЛ-8, макрофагингибирующий фактор (МИФ) и др.
Основные цитокины представлены в Приложении 6.
17.5. Иммунологическая толерантность
Иммунологическая толерантность (от лат. tolerantia — терпе
ние, терпеливость) — это состояние ареактивности иммун
ной системы, специфической «неотвечаемости» организма
только на определенные антигены. При этом сохранена способность к иммунному ответу на любые другие антигены. Следовательно, толерантность специфична по отноше
нию к тому антигену, который ее вызвал.
Выделяют два варианта проявления этого феномена:
• естественную толерантность, когда состояние ареактивности формируется к «своему», т. е. к антигенам собственных тканей;
• индуцированную толерантность к «чужому» антигену — чужеродным клеткам, белкам, полисахаридам, гаптенам и др.
Как иммунологический феномен толерантность экспериментально обоснована английским исследователем П. Медоваром (1953) и чешским ученым М. Гашеком в 1963 г. Они воспроизводили состояние иммунологической толерантности на животных в период внутриутробного развития и новорожденное™. Их опыты подтвердили гипотезу австралийского иммунолога Ф. Бернета о том, что в эмбриональном периоде формируется способность не отвечать на «свои» антигены.
В настоящее время установлено, что при нормальных физиологических процессах происходит истощение (разрушение путем апоптоза) клонов лимфоидных клеток, способных реагировать с аутоантигенами. Элиминация таких клонов Т-лимфоцитов происходит в тимусе, а В-лимфоцитов, способных продуцировать антитела к собственным антигенам,— в костном мозге. Например, в тимусе погибает 95% тимоцитов (незрелых Т-клеток), способных распознавать аутоантиген в комплексе с молекулами МНС. Это явление получило название отрицательной селекции клеток в тимусе. Аналогичная селекция имеет место в костном мозге по отношению к В-клеткам.
Благодаря этому феномену иммунная система может дифференцировать «свое» и «чужое» и противостоять иммунному самоуничтожению.
Индуцированная иммунологическая толерантность может возникать в любом периоде жизни при контакте иммунной системы (в частности, макрофагов, Т- и В- лимфоцитов) с чу
жеродным антигеном. Однако феномен иммунологической толерантности легче всего воспроизвести в период эмбрионального развития. Иммунная система признает «своим» антиген, который контактировал с ней в эмбриональный период.
Толерантность проявляется в снижении или отсутствии синтеза иммуноглобулинов, уменьшении интенсивности или отсутствии реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), неспособности к элиминации вирусов, замедлении отторжения трансплантата и др. Роль макрофагов может проявляться в неспособности поглощать антигены (особенно растворимые) или обеспечивать их процессинг. В этом случае иммунная система не распознает антиген как чужой, а воспринимает его как свой собственный и иммунный ответ не развивается. Антигены, индуцирующие иммунологическую толерантность, называются толерогенами. Поддержание толерантности, возникшей в эмбриональном или в любом другом периоде, требует присутствия толерогена в организме. Например, состояние толерантности к чужеродным эритроцитам, индуцированное в эмбриональном периоде, продолжается до тех пор, пока в организме присутствует данный антиген. Прекращение поступления этого антигена ведет к утрате толерантности.
В формировании иммунологической толерантности участвуют разные механизмы:
• супрессорный механизм, при котором угнетение клона периферических Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток осуществляется лимфоцитами-супрессорами (CD8 Т-клетками) с помощью цитокинов. Роль индукторов супрессорных клеток может играть антиген, введенный в организм в малой дозе (низкодозо-вая толерантность);
• клонально-дефицитный механизм, характеризующийся уничтожением клона клеток — предшественников В-лимфоцитов в присутствии избытка антигена-толерогена. Введение чужеродного антигена в эмбриональном периоде приводит и к клональной элиминации Т-клеток.
В целом иммунологическая толерантность является одним из механизмов сохранения индивидуальной клеточной целостности организма. При нарушении толерантности (срыв толерантности, спонтанная утрата толерантности) развиваются аутоиммунные заболевания (миокардиты, красная волчанка, ревматоидный артрит и др.), при которых происходит разрушение собственных клеток и тканей аутоантителами или Т-клетками, примированными к собственным антигенам.
В организме млекопитающих имеются органы и ткани, к которым отсутствует естественная толерантность (мозг, глаза, семенники, щитовидная железа, надпочечники и др.). Это
объясняется тем, что в период эмбрионального развития они не имели контакта с лимфоидными органами и клетками. Отсутствует контакт указанных органов с иммунокомпетентными клетками и в постнатальном онтогенезе. Поэтому их называют «забарьерными». При повреждении этих органов может развиваться нормальный иммунный ответ как защитная реакция против антигенов данных тканей, получившая название иммунной аутоагрессии.
17.6. Реакции гиперчувствительности
Синонимом реакций гиперчувствительности является аллергия (от греч. alios — другой, ergon — действие).
Аллергия является одной из форм иммунного ответа и характеризуется высокой специфичностью с развитием сенсибилизации и накоплением в организме иммуноглобулинов или CD4 Т-лимфоцитов воспаления. В результате происходит повышение чувствительности к аллергену, и при его повторном проникновении возникает аллергическое заболевание.
Оно характеризуется развитием интенсивного воспалительного процесса в результате действия иммунных механизмов, т. е. эти реакции всегда являются повреждающими.
Антигены, вызывающие реакции гиперчувствительности, называются аллергенами. Они имеют невысокую молекулярную массу, легко растворимы, способны проникать в организм через неповрежденную кожу и слизистые оболочки в очень малых дозах и вызывать развитие аллергии. Аллергенами могут быть: 1) полные антигены белковой природы: пищевые продукты (яйца, молоко, орехи, моллюски и др.); яды пчел, ос; гормоны; сыворотки животных; ферментные препараты (стрептокиназа и др.); латекс; компоненты домашней пыли (клещи, грибы и др.); пыльца трав и деревьев; компоненты вакцин и др.; 2) гаптены: антибиотики, витамины, цитостатики и др. Их делят на инфекционные и неинфекционные. Аллергены могут быть экзогенного (поступают в организм извне) и эндогенного (аутоаллергены) происхождения. Последние образуются в организме и представляют собой комплекс из продуктов метаболизма экзоаллергена и белков собственных тканей организма. К этой группе относятся и клетки организма с измененной антигенной специфичностью.
На основе различий в механизмах развития выделяют 2 типа аллергических реакций:
• реакции гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ), или В-зависимые аллергии, развитие которых обусловлено выработкой антител разных классов. Эти реакции проявляются через 20—30 мин после повторной встречи с аллергеном.
Таблица 17.2. Типы реакций гиперчувствительности
Признаки различий
Антиген
Гиперчувствительность немедленного типа замедленного типа Сывороточные и дру- Некоторые микроорганизмы, гаптены, трансплантационные анти-
Антитела в крови
Сроки проявления положительных внутрикожных проб Иммунный ответ формируется с участием Гистологическая картина
Пассивный перенос (сывороткой) Адоптивный перенос (лимфоидными клетками)
Десенсибилизация Клинические проявления
гие растворимые белки, пыльца растений и другие аллергены Присутствуют
Несколько минут
В-лимфоцитов
Полиморфно-ядерные лейкоциты, экссудация
Возможен
»
Успешна
Анафилаксия, сывороточная болезнь, аллергический ринит, атопическая бронхиальная астма, феномен Артюса
гены
Отсутствуют или не играют роли 24-48 ч
Т-лимфоцитов
М он онукл е ар но - макр о-фатальная инфильтрация
Невозможен
Возможен
Невозможна
Развитие болезни (туберкулез, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, лейшманиоз и др.), трансплантационные реакции
Состояние специфической сенсибилизации может быть передано интактному организму с сывороткой крови;
• реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), или Т-зависимые аллергии, обусловлены присутствием в организме сенсибилизированных иммунокомпетентных клеток — CD4 Т-лимфоцитов. Патологический процесс при этом развивается через 24—48 ч после повторного попадания аллергена. Гиперчувствительность этого типа можно передать интактному организму только путем введения взвеси сенсибилизированных лимфоцитов донора.
В настоящее время выделяют четыре типа таких иммуноал-лергических реакций [по Cell Р., Coombs R., 1962]. Типы 1—3 относятся к ГНТ, тип 4 — к ГЗТ (табл. 17.2; рис. 17.5).
1-й тип — анафилактическая реакция (от греч. ana — обратный, filaxis — защита), которая впервые была описана французскими учеными Ш. Рише и Ж. Портье (1902). Реакция
опосредованный лизис
Тип II
Антиген клеточной поверхности
Цитотоксическое действие
Рис. 17.5. Четыре типа реакций гиперчувствительности [по А. Ройту и др., 2000].
Тип IV
Медиаторы воспаления
Цитокины
Активированный макрофаг
обусловлена выработкой антител класса IgE при первичном контакте с аллергеном. IgE-антитела способны фиксироваться Fc-фрагментом на поверхности базофилов в крови и тучных клеток в тканях. Это обеспечивает сенсибилизацию организма. В результате взаимодействия IgE-антител с повторно проникшим аллергеном происходит активация базофилов и тучных клеток, что сопровождается выделением из их гранул клеточных медиаторов — гистамина, серотонина, гепарина, лейкотриенов, простагландинов, ферментов и цитокинов. Ме
диаторы вызывают развитие немедленных аллергических и анафилактических (разрушающих) реакций: спазм гладких мышц (главным образом бронхов и желудочно-кишечного тракта), расширение сосудов, падение артериального давления (АД), повышение проницаемости сосудистых стенок, выпот жидкой части крови в ткани, увеличение секреции слизи и др. Хемокины из гранул тучных клеток обеспечивают приток лейкоцитов в очаг развития реакции.
У некоторых лиц выявлена генетическая предрасположенность к развитию аллергических реакций такого типа, которая проявляется в повышенной способности к выработке IgE, что получило название атопия (от греч. atopia — странность).
К аллергическим реакциям, обусловленным выработкой IgE, относят анафилактический шок (например, на пенициллин, лошадиную антитоксическую сыворотку), аллергический ринит, атопическую бронхиальную астму, аллергические дерматиты, пищевую и лекарственную аллергию и др.
Для предотвращения развития аллергических реакций у сенсибилизированных лиц применяют метод десенсибилизации. Он заключается во введении специфического аллергена в определенных возрастающих дозах в организм. Происходит выработка IgG и IgA, которые блокируют аллерген и препятствуют его соединению с IgE.
2-й тип — цитотоксические реакции. В них участвуют антитела классов IgG, IgM и IgA, фиксированные на различных клетках. Комплексы антиген—антитело способны связывать и активировать систему комплемента по классическому типу. Результатом такого взаимодействия является комплементзави-симый цитолиз клеток. Такой механизм повреждения имеет место при некоторых формах лекарственной аллергии, в развитии стрептококкового гломерулонефрита и при некоторых аутоиммунных заболеваниях.
3-й тип — иммунокомплексные реакции, которые возникают, когда в организме образуются иммунные комплексы (ИК), состоящие из растворимого антигена, связанного с IgG-анти-телами (реже с IgM) и комплементом. Данные ИК фиксируются на Fc- и СЗ-рецепторах иммунокомпетентных клеток. И К способны проникать в ткани, откладываться вокруг сосудов, на синовиальных оболочках суставов, базальной мембране почечного эпителия и др. Это приводит к развитию аллергического воспаления, кровоизлияниям и некрозу. Поражения носят местный (феномен Артюса) или общий (сывороточная болезнь) характер. Иммунокомплексные реакции часто развиваются при избытке антигенов или антител, при дефекте фагоцитарной системы.
И К образуются при многих вирусных и бактериальных ин-фекциях — гепатите В, бруцеллезе, малярии, стрептококковой инфекции и др.
4-й тип — клеточно-опосредованные реакции. Их особенность состоит в том, что взаимодействие осуществляется между антигеном и предварительно сенсибилизированными иммунокомпетентными клетками (Т-хелперами, Т-супрессо-рами, макрофагами, клетками памяти). Клетки, активированные антигеном, вырабатывают различные медиаторы (цитокины), которые и вызывают воспаление. Данный тип реакций был впервые выявлен немецким бактериологом Р. Кохом в опытах на зараженных туберкулезом животных и получил название туберкулинового теста. Он используется с диагностической целью для выявления заболеваний туберкулезом. Аналогичные реакции развиваются и при других инфекциях — бактериальных (бруцеллезе, туляремии, гонорее, сифилисе и др.), вирусных (герпетической, коревой), грибковых (кандидозы) и протозойных (лейшманиозы, трипаносо-мозы и др.).
Глава 18
ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА ЧЕЛОВЕКА
Иммунный статус характеризует функциональное состояние иммунной системы человека в конкретный период времени. Он определяется совокупностью показателей врожденных (конституциональных) факторов защиты (факторов естественной резистентности) и специфических реакций иммунной системы.
Изучение иммунного статуса используют для выявления механизмов нестандартного (необычного) клинического течения инфекционных болезней и в качестве прогностического критерия при инфекционной патологии.
Для его характеристики определяют качественные и количественные показатели активности иммунной системы и им-мунорегуляторных механизмов межклеточных взаимодействий в иммунном ответе.
В случае выявления нарушений в системе иммунитета необходимо проведение иммунокоррекции, конечная цель которой — структурная и функциональная нормализация системы иммунитета.
Впервые стройная рабочая методология оценки состояния иммунной системы была разработана в 1984 г. российским академиком Р. В. Петровым. Основные методы анализа иммунного статуса представлены в виде системы двухуровневого обследования пациентов. Они предусматривают применение клинических (жалобы больного, история заболевания, условия жизни и профессиональной деятельности, отягощенная 172
наследственность, вредные привычки и др.), лабораторных и инструментальных методов обследования.
Тесты 1-го уровня скрининговые, позволяют выявлять грубые нарушения в работе иммунной системы. Из лабораторных
тестов используют:
• общеклинический анализ крови с обязательным исследованием лейкоцитарной формулы (Приложение 7);
• определение активности фагоцитоза по интенсивности хемотаксиса, поглощения микробов фагоцитами и способно
сти к их уничтожению;
• оценку В-системы иммунитета путем определения классов иммуноглобулинов — IgG, IgM, IgA, IgE, подсчетом абсолютного и относительного числа В-лимфоцитов в перифери
ческой крови;
• оценку Т-системы иммунитета на основе определения
общего количества лимфоцитов, абсолютного числа и про
центного содержания зрелых Т-лимфоцитов
Могут быть использованы и другие тесты (Приложение 8).
Тесты 2-го уровня включают более сложные методы клини-
ческой и лабораторной оценки функционального состояния иммунной системы;
• количественное определение двух основных субпопуляций Т-лимфоцитов: Т-хелперов/индукторов и Т-киллеров/су-прессоров на основе выявления мембранных маркеров (кластеров дифференциации — молекул CD) методом лазерной проточной цитофлюориметрии;
• определение экспрессии молекул адгезии на поверхностной мембране нейтрофилов;
• оценку пролиферативной способности лимфоцитов на основные митогены (митоз — непрямое деление клетки, genes — порождающий): фитогемагглютинин и конкавалин А;
• определение субклассов иммуноглобулинов;
• определение белков острой фазы: маннансвязывающего лектина и С-реактивного протеина;
• определение белков системы комплемента;
• оценку продукции цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5 и т. д., гамма-интерферона, ФИО и др.);
• определение присутствия аутоантител;
• постановку кожных тестов для выявления разных форм гиперчувствительности и др.
При нарушениях в любом звене иммунной системы возникают иммунодефицитные состояния. Различают первичные (врожденные) и вторичные (приобретенные) иммунодефициты.
Первичные иммунодефициты (ПИД) относятся к наследственным заболеваниям и обусловлены наличием дефектов в генах (например, мутаций), которые контролируют работу иммунной системы. Главным клиническим признаком ПИД является инфекционный синдром — повышенная восприимчивость к пато
генным и условно-патогенным (оппортунистическим) микроорганизмам, тяжелое течение инфекционных болезней, хрони-зация инфекций и др. ПИД классифицируют на основании того или иного дефекта в иммунной системе и различают:
• синдромы с дефицитом антител: агаммаглобулинемия Брутона, селективный дефицит IgA, селективный дефицит иммуноглобулинов, транзиторная гипогаммаглобулинемия у детей и др.;
• синдромы с дефицитом Т-лимфоцитов: синдром Ди Джорджи (аплазия тимуса), синдром «голых лимфоцитов» (отсутствие CD4 Т-клеток) и др.;
• синдромы с дефицитом компонентов комплемента: наследственный ангионевротический отек (дефект компонента С1), болезни иммунных комплексов (дефицит С1—С4) и др.;
• синдромы с дефектами фагоцитов: хроническая гранулематозная болезнь и др., характеризующиеся отсутствием фагоцитарной активности у нейтрофилов и макрофагов;
• синдромы с отсутствием функциональной активности NK (например, при герпес-инфекции);
• синдромы с дефектами молекул адгезии и др.
Вторичные (приобретенные) иммунодефициты (ВИД) возникают в результате воздействия факторов внешней среды на клетки иммунной системы. Среди них выделяют агенты, вызывающие обратимые иммунодефициты. К ним относят голодание, болезни обмена веществ (диабет и др.), ожоговую болезнь, психические депрессии, инфекционные болезни. К индукторам, вызывающим необратимые иммунодефициты, относят ВИЧ-инфекцию, суперантигены вирусов (кори, краснухи, герпеса, гепатитов и др.), бактерий (стафилококки, микобактерии и др.) и грибов (коксидиомицеты и др.), ионизирующую радиацию в запороговых дозах, некоторые злокачественные опухоли и др.
Глава 19
ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ
ИНФЕКЦИОННОЙ ИММУНОЛОГИИ
С теоретическими достижениями иммунологии тесно связаны крупнейшие достижения в области иммунодиагностики, иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней. Для этих целей используют биологические препараты, общими характерными особенностями которых являются специфичность действия и направленность против микроорганизмов определенного вида. Количество специфических биологических препаратов достаточно велико, методики их приготовления и требования, предъявляемые к ним, различны.
19Л. Иммунодиагностика инфекционных болезней
При инфекционных заболеваниях во внутренней среде организма присутствуют возбудитель и его продукты (антигены, токсины, ферменты). Ответная реакция организма на присутствие таких чужеродных агентов выражается в образовании антител или иммунных лимфоцитов. Возможность обнаружения специальными методами любого из участников иммунного ответа лежит в основе иммунодиагностики инфекционных болезней.
С этой целью широко используют иммунохимические методы, которые называют также серологическими (от лат. serum — сыворотка), для обнаружения антител или антигенов микроорганизмов в биологических нативных материалах, полученных от больных лиц. Эти методы в зависимости от характера и состояния антигена можно объединить в несколько групп:
• прямые методы взаимодействия и визуального определения результатов реакции антиген—антитело: реакции агглютинации, преципитации, лизиса и связывания комплемента;
• методы пассивной агглютинации с использованием носителей антигена или антитела (реакции со свидетелями). К ним относят реакции пассивной гемагглютинации, латекс-агг-лютинации, коагглютинации и др.;
• реакции, основанные на использовании различных меток для одного из участников взаимодействия антиген—антитело (ферментных, флюоресцирующих, радиоизотопных и др.). В зависимости от использованной метки эти тесты называются иммуноферментным анализом (ИФА), реакцией иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунологическим тестом (РИТ) и др. Выбор реакции для диагностики обусловлен ее специфичностью и чувствительностью.
Специфичность характеризуется способностью АГ реагировать только с гомологичным АТ, чувствительность — мини-мальным количеством антигенов (или антител), которое возможно выявить с помощью данной реакции.
Прямые реакции взаимодействия антигена с антителом осуществляются в две фазы — специфическую и неспецифическую. Первая, специфическая, фаза характеризуется комплементарным взаимодействием антигена с антителом с образованием иммунного комплекса. Он визуально не определяется, но в присутствии изотонического раствора образует агломераты, которые выпадают в осадок и хорошо различимы визуально,— это вторая неспецифическая фаза реакции. В зависимости от состояния антигена видимая неспецифическая фаза образования иммунного агломерата проявляется различно, что объясняет разнообразие этих реакций (рис. 19.1).
Реакции агглютинации обусловлены склеиванием целых
Антиген
Реактивы
Иммунная сыворотка
Суспензия бактерий
Агглютинирующая
Экстракт из бактерий
Преципитирующая
Комплемент
Взвесь бактерий
Лизирующая
Ингредиенты
Диагностическая система
Индикаторная система
Взвесь Гемолитическая эритроцитов сыворотка
Антиген Сыворотка Комплемент (исследуемая)
Рис. 19.1, Различные варианты серологических реакций.
176
Учет результатов макроскопически
Учет результатов микроскопически
Агрегация (склеивание) и седиментация
Суспензия бактерий гомогенная
Склеивание бактерий
Нет склеивания бактерий
или
Кольцо Преципитация
преципитата
отсутствует
или
Лизис бактерий
Нет лизиса
Агломерация молекул преципитиногена
Агломерация отсутствует
Лизис Живые
бактерий подвижные
бактерии
или
Эритроциты
или
Нет гемолиза
Гемолиз эритроцитов (лаковая кровь)
Эритроциты разрушены
микробных клеток (агглютиногенов) гомологичными антителами (агглютининами) в присутствии электролитов. В результате образуются хорошо видимые хлопья агглютината, который выпадает в растворе в виде осадка. Существуют различные модификации постановки реакций агглютинации в зависимости от целей исследований.
• Для идентификации чистой культуры микроорганизмов (агглютиногена), выделенной из материала больного, используют реакции агглютинации на стекле или в пробирках (развернутая реакция агглютинации типа Грубера). Антитела для этих реакций (классов IgM или IgG) содержатся в диагностических агглютинирующих сыворотках, полученных путем им-; мунизации кроликов определенными видами бактерий. Видовые агглютинирующие сыворотки используют для постановки ориентировочной реакции на стекле и развернутой реакции агглютинации (типа Грубера). Последняя ставится в агглюти-национных пробирках с разведением сыворотки в физиологическом растворе до титра, который указан на этикетке препарата. Титр сыворотки — это наибольшее ее разведение (или наименьшее количество антител), при котором реакция агглютинации будет положительной только с гомологичным антигеном. Например, если титр брюшнотифозной видовой сыворотки равен 1:12 800, это значит, что чистая культура бактерий от больного будет идентифицирована как брюшнотифозная только в том случае, если реакция агглютинации будет положительна во всех разведениях сыворотки, включая 1 : 12 800. С адсорбированной или монорецепторной агглютинирующей сывороткой ограничиваются постановкой реакции на стекле. Это обусловлено тем, что такие сыворотки не содержат перекрестно реагирующих групповых антител.
• Для обнаружения антител в сыворотке крови больного применяют развернутую реакцию агглютинации (типа Видаля). В качестве антигена в этой реакции используют диагно-стикум, который готовят из взвеси убитых бактерий определенного вида. Количество антител выражают в титре. Обнаружение антител является косвенным свидетельством присутствия антигена в организме в данный период времени. Поэтому диагностически достоверным считается четырехкратное и более увеличение титров антител при вторичной постановке теста через 7—10 дней (исследование так называемых «парных» сывороток).
• Реакция Кумбса (антиглобулиповый тест) (рис. 19.2) применяется для выявления неполных (блокирующих) антител. Такое название эти антитела получили в связи с тем, что они имеют один активный центр для связывания с антигеном. Неполные антитела образуются в значительном количестве в организме человека при некоторых хронических инфекциях (бруцеллез, туберкулез, шигеллез и др.), при неинфекционных 178
Рис. 19.2. Реакция Кумбса.
I этап — взаимодействие антигена (АГ) с неполными антителами (Ат). II этап — связывание комплексом АГ+Am (неполное) с антителами антиглобулиновой сыворотки, которые являются бивалентными. АтАГС — антитела антиглобулиновой сыворотки.
патологических состояниях: резус-конфликте, аутоиммунных болезнях (красная волчанка, ревматоидный артрит, васкулиты и др.). Обнаружение неполных антител имеет важное значение в диагностике таких болезней. Взаимодействие неполных антител с антигеном in vitro не приводит к образованию макроагрегатов, выявляемых визуально. Поэтому в реакцию Кумбса включают дополнительный компонент — антиглобулино-вую сыворотку. Ее получают путем иммунизации кроликов человеческим глобулином. Эта сыворотка содержит бивалентные антитела к глобулинам человека, в том числе и к неполным антителам.
Реакция Кумбса проводится в два этапа. На первом этапе происходит взаимодействие антигена с неполными антителами. Результат этого взаимодействия не виден. На втором этапе комплекс антиген + неполное антитело соединяется анти-
глобулиновым бивалентным антителом Последнее может связать две молекулы неполных антител, которые адсорбированы на антигене В результате образуются хорошо видимые макроконгломераты.
Разработаны две методики проведения реакции Кумбса — прямая, описанная выше, и непрямая При постановке непрямой реакции используют эритроцитарный диагностикум, представляющий собой взвесь эритроцитов, на поверхности которых адсорбирован антиген. Результатом такого варианта реакции Кумбса будет агглютинация эритроцитов.
Реакции преципитации протекают с участием антигена — преципитиногена. который является молекулярным продуктом разрушенных клеток микроорганизмов и хорошо растворим в физиологическом растворе без образования помутнения. Таким антигеном могут быть бактериальный белок, полисахарид, вытяжки из инфицированных органов и др. Степень разведения преципитиногена обычно велика —1.1 млн и более. Результатом взаимодействия такого антигена с антителами-преципитинами является выпадение мелкозернистого осадка или образование кольца (иммунного преципитата) на границе их контакта. Реакции преципитации являются в основном качественными методами исследования и характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Существует несколько модификаций постановки реакции:
• реакция кольцепреципитации (термоиммунопреципитации) — наслаивание раствора антигена на преципитирующую сыворотку в специальных преципитационных пробирках. На границе соприкосновения антигена и антитела в положительных случаях образуется кольцо помутнения Примером может являться реакция Асколи, которая используется для выявления сибиреязвенного антигена,
• реакции преципитации в геле (рис 19.3) Выделяют несколько вариантов постановки таких тестов:
1) двойная радиальная иммунодиффузия по О. Ouchterlony (1948) заключается в следующем: на предметное стекло нано-
Рис. 19.3. Реакция преципитации в геле [по М J Pelczar, R D Reid, 1981]
А, В, С, D — культуры токсигенных дифтерийных бактерий, выделенные от больных, XY — полоска фильтровальной бумаги, обработанная противодифтерийной сывороткой
сят тонким слоем агаровый гель, в котором делают лунки Одну лунку заполняют раствором антигена, другую — антителом. Диффундируя в агар, они в месте встречи образуют одну или несколько линий преципитата в виде белых полос;
2) реакция радиальной иммунодиффузии по G. Mancini (1965) используется для количественного определения иммуноглобулинов разных классов, компонентов системы комплемента в сыворотке и др. Принцип метода состоит в следующем: на твердую основу (стеклянную или полистироловую пластинку) наносят слой агара с моноспецифической антисывороткой к одному из классов иммуноглобулинов (антитело). В этом слое делают лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку пациента, содержащую Ig разных классов (антиген). Антиген из лунок диффундирует в гель, где встречается с гомологичными антителами, что сопровождается образованием зоны помутнения в агаре (преципитат). Площадь этой зоны прямо пропорциональна количеству внесенного в лунки антигена (т е. количеству иммуноглобулина определенного класса), который высчитывают по калибровочной кривой;
• методы иммуноэлектрофореза используются для выявления антигенов или антител в том случае, если миграция компонентов иммунного комплекса проходит в электрическом поле. Используют методы простого, ракетного или встречного иммуноэлектрофореза.
Реакция лизиса проявляется растворением (лизисом) микроорганизмов или других клеток в результате взаимодействия с антителом в присутствии комплемента. Антитела, вызывающие лизис клеток, называют лизинами: бактериолизинами (разрушают бактерии), спирохетолизинами (разрушают спирохеты), гемолизинами (лизируют эритроциты) и др. Реакции лизиса используются с целью определения вида возбудителей инфекционного заболевания или обнаружения антител в сыворотке крови пациентов. Реакцию ставят в пробирке или на животных. Например, морских свинок используют для проведения феномена Исаева—Пфейфера с целью идентификации холерного вибриона. В пробирочных тестах применяют иммунные сыворотки, инактивированные прогреванием на водяной бане при 37 °C в течение 30 мин для разрушения комплемента, который затем вносят в строго определенном количестве.
В течении реакции лизиса выделяют несколько фаз, которые можно наблюдать под микроскопом*
• потеря подвижности микроорганизмами;
• набухание клеток;
• распад и растворение клеток.
Весь этот процесс занимает 15—20 мин.
Важное значение имеет реакция гемолиза — растворение эритроцитов при взаимодействии с антителами-гежшшзинялш
в присутствии комплемента. Гемолизины получают путем иммунизации кроликов эритроцитами животного другого вида (например, эритроцитами барана). Полученная сыворотка, содержащая гемолизины, называется гемолитической. Реакция гемолиза проявляется растворением (гемолизом) эритроцитов барана, при этом взвесь эритроцитов в физиологическом растворе превращается в прозрачную ярко-красную жидкость (лаковую кровь).
Реакция гемолиза ввиду своей демонстративности получила широкое распространение в лабораторной практике. Ее используют для определения титра комплемента и как индикаторную систему в реакции связывания комплемента (РСК).
Реакция связывания комплемента (РСК) применяется для обнаружения антител в сыворотке крови или для выявления антигена в материале от больного. Она основана на том, что при взаимодействии антигена с антителом образуется комплекс, который адсорбирует (связывает) комплемент. Однако этот феномен протекает в пробирке без видимых проявлений. Для выявления результатов реакции в качестве индикаторной системы используют реакцию гемолиза. Таким образом, в РСК используют две системы: специфическую, в которой определяют возможность образования иммунного комплекса антитело + антиген + комплемент, и индикаторную, гемолитическую систему, которая состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки. Проведение реакции включает две фазы. В первой фазе проводят раздельную инкубацию специфического и индикаторного комплексов. Во второй фазе смешивают указанные комплексы, что позволяет определить локализацию комплемента по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов. Так, если имеет место соответствие антигена и антитела, происходит связывание этим комплексом комплемента. Реакция гемолиза при этом будет отрицательной, так как в гемолитической системе отсутствует свободный комплемент. Если же соответствия между антигеном и антителом нет, комплемент свяжется гемолитической системой, результатом чего будет гемолиз эритроцитов.
РСК широко применяется в диагностике инфекционных болезней — сыпного тифа, туберкулеза, сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде-Жангу), протозойных и вирусных инфекций.
Реакция нейтрализации токсина антитоксином основана на способности антител (иммуноглобулинов) нейтрализовать биологическую активность экзотоксинов микроорганизмов. Экзотоксины продуцируют многие виды бактерий (дифтерийная палочка, возбудители столбняка, газовой гангрены и др.). Они являются активными иммуногенами, которые индуцируют выработку в организме токсиннейтрализующих антител (антитоксинов). Обнаружение антитоксинов в сыворотке кро-182
+Ат
1
+АГ
2
Рис. 19.4. Схема приготовления диагностикума и проведения реакций пассивной агглютинации [по В. И. Покровскому и др., 1993]. 1 — сенсибилизация эритроцитов антителом; 2 — агглютинация.
ви больного, а также качественное и количественное определение выделяемого бактериями экзотоксина, присутствие токсина в биологических жидкостях проводится в реакции нейтрализации токсина антитоксином. Для этого смесь иммунной сыворотки и токсина инкубируют в термостате в течение 30—60 мин, а затем вводят чувствительному животному. Если токсин нейтрализован антитоксином, то не происходит заболевания и гибели животного. Для контроля второму животному вводят смесь токсина и нормальной неиммунной сыворотки. Это животное погибает от действия токсина.
Методы пассивной агглютинации. Принцип этих методов состоит в использовании различных неспецифических частиц (эритроцитов, латекса, клеток стафилококка, частиц бентонита, микрокапсул и др.), на поверхности которых адсорбированы молекулы известной специфичности — антигены или антитела. При наличии в растворе комплементарных частиц (антител или антигенов) эти частицы пассивно, за счет взаимодействия специфических компонентов, образуют хорошо определяемые визуально агрегаты (рис. 19.4).
Реакции этого типа отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать их для ранней диагностики инфекционных болезней. В практике широко применяются реакции трех типов: реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА/РНГА), реакции латекс-агглютинации (РЛА) и реакции коагглютинации.
В реакции РПГА в качестве носителей антигена или антитела используют эритроциты животных, в результате чего получают соответственно антигенный или антительный эритроци-
тарный диагностикум. При постановке реакции с целью обнаружения антител эритроцитарный диагностикум, на поверхности которого имеются антигены известного микроба, смешивают в равных количествах с сывороткой больного в разных разведениях. При положительной реакции происходит пассивная агглютинация эритроцитов и наблюдается осадок красного цвета. Аналогичным образом проводятся исследования на выявление и идентификацию антигенов бактерий с использованием антительного эритроцитарного диагностикума.
Возможно использование феномена ингибирования (торможения) РПГА. В этом случае перед внесением эритроцитарного антигенного диагностикума стандартную известную сыворотку инкубируют с исследуемым материалом от больного, затем центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость, с которой проводят следующий этап реакции. При снижении титра сыворотки в четыре и более раз констатируют наличие в исследуемом образце соответствующего антигена.
Реакции коагглютинации и латекс-агглютинации проводят аналогичным образом. Различия касаются лишь методик приготовления диагностикумов. В реакции коагглютинации используют антительный диагностикум. Его готовят из клеток стафилококков (штамм Cowan), к поверхностному белку А которых присоединены молекулы антител через фрагмент Fc IgG.
При получении латексных диагностикумов используют химическое связывание белковых молекул (антител или антигенов) с полимерными микрокапсулами или их взаимодействие, основанное на гидрофобных силах. Латексные микрокапсулы могут быть окрашены в различные цвета (голубой, красный, оранжевый и др.). Это облегчает учет результатов, так как образующийся в положительных случаях осадок в виде яркого «перевернутого зонтика» хорошо виден.
Реакции, основанные на использовании меченых антител или антигенов. Реакция иммунофлюоресценции прямая (РИФ) используется как метод экспресс-диагностики для выявления антигена в исследуемом материале от больных. Метод состоит в обработке фиксированного на стекле материала, содержащего антиген, гомологичной иммунной сывороткой, конъюгированной с флюорохромом. Учет результатов проводят в люминесцентном микроскопе (ЛЮМе). В положительных случаях по периферии объекта появляется светящаяся окрашенная кайма. Недостатком метода является необходимость получения большого количества стандартных люминесцирующих сывороток против различных микроорганизмов.
Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) основана на применении антиглобулиновой (антивидовой) сыворотки, меченной флюорохромом. Она ставится в два этапа. На первом этапе фиксированный антиген обрабатывают обычной 184
Б В
Рис. 19.5. Твердофазный иммуноферментный и радиоиммунный методы [по А. Г. Букринской, 1986].
А — прямой метод; Б — непрямой метод; В — конкурентный метод при сорбции антител; Г — конкурентный метод при сорбции антигена; звездочкой обозначено меченое антитело или меченый антиген.
иммунной сывороткой. На втором этапе к прореагировавшему иммунному комплексу добавляют люминесцирующую сыворотку против глобулинов того вида животного, сыворотка которого была использована на первом этапе. Результат учитывают, как и при РИФ.
Иммуноферментный анализ (ИФА) — это иммунологическая реакция специфического взаимодействия антигена и антитела, в которой в качестве индикатора используются молекулы фермента (пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и др.). В основе этого теста лежит способность маркерного фермента расщеплять субстрат — ортофенилендиамин для пероксидазы хрена или паранитрофенилфосфат для щелочной фосфатазы и вызывать изменение цвета реактивной среды. Названные ферменты обладают уникальным свойством модифицировать одновременно большое количество молекул субстрата, что приводит к усилению чувствительности иммунологической реакции. Маркерным ферментом могут быть помечены антимикробные или антивидовые антитела, что предполагает использование разных методик проведения анализа: твердофазный ИФА, сэндвич-метод ИФА и др. Компоненты иммунного комплекса выявляются с помощью специального принтера — ридера типа «мультискан» и др.
Радиоиммунологический анализ (РИА) основан на выявлении иммунных комплексов с помощью радиоактивной метки, введенной в состав одного из компонентов реакции — антигена или антитела. Для приготовления конъюгатов антител или антигенов с радиоактивными изотопами наиболее широко используется радиоактивный йод (1251 или 1311). РИА является качественным и количественным методом определения одного из участников иммунного комплекса. Количественное определение проводится с помощью счетчиков радиоактивности. Разработано несколько методик проведения РИА, но наиболее доступным и демонстративным является твердофазный радиоиммунологический анализ. Его проведение возможно в разных вариантах: метод простого сэндвича, двойной сэндвич, модифицированный двойной сэндвич и др. (рис. 19.5). При проведении этих тестов роль твердой фазы выполняют плоские пластины адсорбента, лунки полистирольных планшетов, крупные по размерам частицы. Антиген или антитело, а в последующем и весь иммунный комплекс, который образуется в ходе проведения теста, изначально адсорбируется или ковалентно иммобилизуется на твердой фазе. РИА используется с целью выявления антигенов микроорганизмов, иммуноглобулинов, гормонов, ферментов и др. Он считается одним из наиболее чувствительных иммунохимических методов и позволяет обнаружить 0,1—10 нг белка в пробе.
19.2. Иммунопрофилактика инфекционных болезней
То, что инфекционные болезни не повторяются, было замечено еще врачами древних времен и направило их мысли на поиски способов искусственного предупреждения таких болезней. До нашего времени дошло много сведений о мероприятиях по профилактике оспы. Так, например, в Китае (XI в. до н.э.) для предупреждения оспы вдували в нос порошок, приготовленный из корок, покрывающих язвочки и снятых с больных в период выздоровления. Были известны способы, которыми пользовались для защиты от оспы в Индии, Грузии, Персии и других восточных странах. Содержимым оспенных пузырьков, взятых от больных с легкой формой болезни («оспенной материей»), пропитывали вату, которую вносили в нос. Пропитывали кусочки ткани и привязывали их к различным участкам тела, затем снимали при первых признаках болезни. Такие прививки — вариоляции многие переносили легко, но часть привитых заболевали и умирали. К первой попытке искусственной иммунизации относятся и опыты русского врача Данилы Самойловича (1771), который вводил себе в кожу материал из чумных бубонов выздоравливающих людей.
Огромное значение в разработке методов профилактики инфекционных болезней имели работы английского врача
Эдуарда Дженнера (1796). Для предохранения людей от оспы он применил вирус оспы коров, который, как мы знаем это теперь, имеет общие антигены с возбудителем оспы человека. В результате полученных положительных результатов он предложил назвать метод предохранения от инфекционных заболеваний вакцинацией, а используемые для этого препараты — вакцинами (от англ, vacca — корова). Однако Дженнер не сумел объяснить это явление и создать теорию иммунитета.
Научные основы иммунопрофилактики были заложены Л. Пастером в 1881 г., почти через 100 лет после работ Э. Дженнера. В результате своих опытов Л. Пастер пришел к заключению о возможности предупреждения инфекционных заболеваний путем предварительных прививок маловирулентных культур микроорганизмов. Он разработал методы ослабления (аттенуации) вирулентных бактерий и получения вакцинных штаммов.
Следовательно, вакцины — это биопрепараты, приготовленные из микробов или их антигенов, которые применяются для профилактики инфекционных заболеваний. На введение вакцины организм отвечает формированием искусственного активного иммунитета, обусловленного выработкой антител или примированных лимфоцитов. Среди них множество анти-генреактивных В- и Т- клеток памяти. Способы приготовления вакцин разнообразны и зависят от микроорганизмов и их антигенной активности. Общие требования, которым должны удовлетворять вакцинные препараты:
• высокая иммуногенность и способность индуцировать активный и продолжительный иммунитет;
• полная безвредность для человека;
• низкая реактогенность;
• стабильность при хранении.
По способу приготовления вакцин и состояния иммуногенных фракций выделяют следующие типы вакцин:
• живые вакцины, приготовленные из живых аттенуированных штаммов микроорганизмов;
• убитые (корпускулярные) вакцины, которые содержат инактивированные разными способами микроорганизмы;
• субклеточные и субвирионные (химические) вакцины из высокоочищенных антигенов;
• вакцины, сконструированные на основе методов биотехнологии: синтетические вакцины на основе олигопептидов и олигосахаридов; генно-инженерные вакцины и антиидиотипи-ческие вакцины на основе продуктов синтеза рекомбинантных систем; ДНК-вакцины.
Вакцины, которые содержат живые микроорганизмы (живые вакцины), являются высокоэффективными профилактическими препаратами. Это обусловлено тем, что вакцинные штаммы способны размножаться (приживаться) в организме
человека, приводя к развитию бессимптомной или слабо выраженной инфекции (вакцинальная инфекция), которая, однако, никогда не приобретает характера типичного заболевания для данного микроба.
Штаммы для приготовления живых вакцин могут быть получены различными путями:
• дженнеровским методом подбора генетически близких видов микроорганизмов. Эти вакцины получили название дивергентных. Таким путем были получены оспенная вакцина, вакцина для профилактики сыпного тифа из риккетсий возбудителей крысиного тифа (R.typhi);
• пастеровским методом отбора мутантов с ослабленной вирулентностью, которые возникают под воздействием необычной для микроба температуры культивирования, изменения состава питательной среды, антител, антибиотиков, в результате пассирования через организм животных и др. Такими способами были получены вакцины для профилактики туберкулеза (вакцина БЦЖ), чумы, туляремии, сибирской язвы, бруцеллеза, Ку-лихорадки и др. Пастер путем длительного пассирования через мозг кролика вируса уличного бешенства (133 пассажа), выделенного от больной собаки, получил фиксированный вирус бешенства (virus fixe), который применяется при изготовлении антирабической вакцины;
• методом генной инженерии, встраивая в геном (ДНК) вакцинного штамма ген чужеродного антигена. Такие препараты называют векторными рекомбинантными вакцинами. Эти вакцины индуцируют иммунитет к векторному вакцинному штамму и новому встроенному чужеродному гену. Примером вакцины этого типа является оспенная вакцина, в которую введен ген, кодирующий антиген HBs гепатита В.
Получение вакцинных штаммов представляет большие трудности, так как в ряде случаев происходят полная утрата вирулентности, сапрофитизация штаммов. Это сопровождается потерей иммуногенности. Штамм может быть использован в качестве вакцинного только в том случае, если он снизил вирулентность до определенного предела, закрепил ее в геноме, ни при каких условиях не может возвратиться (реверсировать) в исходное высоковирулентное состояние и сохранил иммуногенность.
Живые вакцины обладают рядом преимуществ перед вакцинами других типов: они обеспечивают высокую напряженность, прочность и длительность иммунитета (от 1 года до 7 лет); их вводят в организм однократно и простыми методами—через рот, через верхние дыхательные пути, накожно, подкожно.
Убитые вакцины готовят из инактивированных высоковирулентных и высокоиммуногенных штаммов микроорганизмов. Их называют также корпускулярными, так как они со
держат целые убитые бактериальные клетки или вирионы. Для инактивации применяют способы, которые незначительно изменяют их антигенную структуру: нагревание при температуре 56—58 °C в течение 1 ч, добавление формалина, фенола, ацетона, спирта, облучение ультрафиолетовыми лучами, обработку ультразвуком и др. Эффективность убитых вакцин в целом ниже, чем живых. Их вводят обычно подкожно 2— 3 раза с интервалом в 10 дней с последующей ревакцинацией через 1 нед — 3 года. Убитые вакцины применяют для профилактики брюшного тифа, коклюша, лептоспироза и др.
Аутовакцины — вакцины из убитых бактерий, выделенных от конкретного больного. Они используются в лечебных целях. Их терапевтический эффект обусловлен дополнительной стимуляцией иммунной системы. Хороший результат таких вакцин отмечен при заболеваниях кожи кокковой этиологии (при хроническом фурункулезе, пиодермиях и др.).
Субклеточные и субвирионные вакцины (прежнее их название — химические) представляют собой наиболее активные по иммунологическим свойствам антигенные компоненты микробных клеток (протективные антигены). Они извлекаются химическими методами, например методом ферментативного переваривания с помощью трипсина с последующим осаждением спиртом или сернокислым аммонием и очисткой диализом. Выделенные таким способом антигены сорбируются на адъювантах, которые неспецифически усиливают иммунный ответ, образуют депо антигенов и стабилизируют их. Депонированный антиген обеспечивает длительное (пролонгированное) воздействие на организм. К адъювантам относят гидроокись алюминия, фосфат кальция, водно-масляные эмульсии (неполный адъювант Фрейнда), липосомы, полиионы и др.
К субклеточным вакцинам относятся менингококковые и пневмококковые вакцины, приготовленные из высокоочи-щенных полисахаридных антигенов капсул, вакцины для профилактики брюшного тифа (на основе Vi-антигена), дизентерии. Субвирионной является гриппозная вакцина на основе гемагглютинина и нейраминидазы.
В зависимости от количества антигенов готовят моно-, ди-, три-, тетра- или поливакцины. Используют комбинированные (из нескольких различных бактерий) и ассоциированные вакцины, состоящие из убитых бактерий и анатоксинов (например, химическая сорбированная тифо-паратифозно-столбняч-ная вакцина).
Анатоксины (ап — отрицание, toxo — отравляю) — это препараты, которые получают из бактериальных экзотоксинов. Они полностью лишены токсических свойств, но сохраняют иммуногенность. При введении в организм индуцируют выработку иммуноглобулинов — антитоксинов. Метод получения анатоксина предложил в 1923 г. французский ученый Рамон.
Для получения анатоксина в фильтрат питательного бульона, в котором выращивали бактерии—продуценты экзотоксина, добавляют 0,3—0,4% раствор формалина и выдерживают 3— 4 нед в термостате при 37—40 °C. Анатоксины готовят в виде препаратов, адсорбированных на адъювантах. Они часто входят в состав ассоциированных вакцин. Анатоксины применяют для профилактики дифтерии, столбняка, стафилококковой инфекции и др.
Все перечисленные выше вакцинные препараты и анатоксины условно относят к категории традиционных. Эти вакцины обладают одним существенным недостатком: они не могут обеспечить развитие иммунитета у всех вакцинированных. Это связано с тем, что они содержат тимусзависимые антигены и иммунный ответ обусловлен индивидуальной иммунореактивностью организма. Способность организма к иммунному
ответу детерминирована специальными генами и передается по наследству. Человеческая популяция гетерогенна по иммунореактивности. На один и тот же антиген лица одного генотипа отвечают формированием высокого иммунного ответа, а другого генотипа — слабого. С другой стороны, индивидуум
может высоко реагировать на один антиген и не отвечать на другие. Генетический контроль силы иммунного ответа (immune response) осуществляют особые гены. Имеются 1г-гены высокого ответа к определенным антигенам и Ir-гены низкого ответа к ним.
Решение проблемы лежит в плоскости создания особых вакцинных препаратов нового типа, способных индуцировать высокий иммунный ответ и у генетически низкоотвечающих особей.
К препаратам нового типа относятся синтетические вакци-
ны на основе олигопептидов и олигосахаридов. Такие вакцины
представляют собой комплексные макромолекулы, состоящие
из антигенной детерминанты, полученной искусственным пу
тем, адъюванта и неприродных полимерных носителей антигена — иммунопотенциаторов. Последние обеспечивают фено
типическую коррекцию генного контроля иммунного ответа и обусловливают Т-независимость и Ir-независимость иммунных реакций.
Прообразом такой синтетической вакцины является вакцина против мышиного тифа, предложенная Р. Петровым и со-авт. (1983), которая представляет собой макромолекулярный комплекс из синтетического полимерного носителя и полисахарида сальмонелл. Подобные синтетические вакцины разрабатываются для профилактики некоторых кишечных инфекций (сальмонеллеза, коли-бактериоза).
Создание искусственных антигенов стало практически реальным благодаря успехам биоорганической химии. Однако, несмотря на целый ряд важных достоинств этих вакцин, все
еще не решена проблема создания неприродных синтетических иммунопотенциаторов. Предложенные впервые Р. Петровым и соавт. (1974) препараты синтетических полиэлектролитов, обладающие сильными иммуностимулирующими свойствами, оказались недеградируемыми, невыводимыми из организма. В последние годы наметился прогресс в решении этой проблемы и были синтезированы препараты «Градекс» и «По-лиоксидоний», лишенные этого недостатка. Можно надеяться, что усилия по разработке синтетических вакцин будут успешны в будущем.
Генно-инженерные вакцины получают с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Принцип создания таких вакцин состоит в возможности выделения гена, кодирующего протек-тивные антигены микроорганизма, который встраивается в геном вирусов, бактерий или эукариотных клеток. При размножении таких клеток наряду с собственными антигенами нарабатываются антигены, необходимые для получения вакцины. Преимуществом таких вакцин является возможность получения только тех антигенов, которые необходимы для индукции иммунитета. Они не содержат балластных веществ или токсичных неконтролируемых примесей. В настоящее время разработано два вида генно-инженерных вакцин — субъединичные и живые. Наработка заданных антигенов трансформированными микробными и эукариотическими клетками стала возможной благодаря расшифровке генов, кодирующих наиболее важные антигенные комплексы возбудителей болезней. Первым генно-инженерным препаратом, разрешенным к практическому применению, стала субъединичная вакцина для профилактики гепатита В (на основе HBs-антигена), полученная из антигенов этого вируса, выделяемых рекомбинантными дрожжевыми клетками. Ведутся работы по созданию аналогичных вакцин для профилактики коклюша, хламидиоза, бруцеллеза, гонореи, менингококковой инфекции и др.
ДНК-вакцины — это особая группа вакцинных препаратов, находящихся на стадии экспериментального исследования. Использование ДНК для индукции иммунитета является, по определению ВОЗ, «иммунизацией нуклеиновыми кислотами». Wolff и соавт. (1990) одними из первых сообщили о введении в организм животных плазмиды, кодирующей синтез (3-галактозидазы и других ферментов, и наличии экспрессии генов этой плазмиды in vivo (в организме). ДНК-вакцины состоят из рекомбинантных ДНК-плазмид, содержащих последовательности нуклеотидов, кодирующих белки—антигены бактерий, вирусов или опухолевых клеток. В состав этих плазмид дополнительно входят сильный эукариотический промотор, сигналы полиаденилирования и терминации транскрипции. Плазмиду вводят в E.coli, где она копируется, затем плазмидные копии ДНК очищают. В водном растворе такие
плазмидные ДНК вводят в макроорганизм разными способами (внутримышечно, внутривенно, подкожно и пр,). Они проникают в легкие (наподобие вирусов) и, используя клеточные ферменты, синтезируют белки-антигены, на которые организм развивает гуморальный и клеточный иммунный ответ. При этом ДНК-вакцина обеспечивает формирование специфических лимфоцитов памяти.
К настоящему времени проведены экспериментальные исследования по применению плазмидных вакцин при гриппе, бешенстве, лихорадке Эбола, гепатите В, герпес-вирусной инфекции и др. Они продемонстрировали широкие возможности ДНК-иммунизации для индукции иммунитета у млекопитающих и птиц.
В приложениях 9 и 10 представлены календарь профилактических прививок и перечень зарубежных иммунопрепаратов, зарегистрированных в РФ.
19.3. Иммунотерапия инфекционных болезней
Основой иммунотерапии инфекционных болезней является возможность быстро создать защиту путем введения в организм специфических иммуноглобулинов. Они накапливаются в сыворотках людей и животных в результате контакта с антигенами микроорганизмов и способны нейтрализовать действие патогенных возбудителей и токсических продуктов их жизнедеятельности. Впервые иммунную сыворотку для лечения использовал немецкий ученый Э. Беринг. За создание противодифтерийной сыворотки он был удостоен в 1901 г. Нобелевской премии.
В зависимости от источника получения различают гетерологичные (от животных) иммунные сыворотки и гомологичные (от человека) иммуноглобулины.
Гетерологичные иммунные сыворотки готовят путем гипериммунизации животных (лошадей, ослов, волов и др.) анатоксином или другими антигенами микроорганизмов по специальным схемам. Затем из полученных от животных нативных сывороток выделяют фракции глобулинов (главным образом гамма- и бета-глобулины), содержащие антитела. Эти фракции очищают от балластных белков различными методами, например обработкой протеолитическими ферментами и диализом (метод диаферм) с целью уменьшения возможных побочных реакций.
Введение иммунных сывороток формирует немедленный пассивный иммунитет, продолжительность которого 2—4 нед. Это позволяет использовать их для экстренной профилактики и лечения инфекционных болезней.
По направленности действия такие гетерологичные лечебно-профилактические сыворотки делят на:
• антитоксические сыворотки, которые используются при лечении токсикоинфекций, так как они способны нейтрализовать действие соответствующих токсинов, например сыворотки против экзотоксинов возбудителей дифтерии, столбняка, ботулизма, холеры и др. Силу антитоксических сывороток измеряют в международных единицах (ME), соответствующих минимальному количеству сыворотки, способному нейтрализовать стандартную единицу (дозу) токсина;
• антибактериальные сыворотки, действующим началом которых является комплекс антител — агглютининов, бактериолизинов и опсонинов. Они способствуют фагоцитозу и лизису микробных клеток в организме. Однако эти сыворотки обладают малой эффективностью и способны вызывать тяжелые осложнения. В настоящее время в связи с широким использованием высокоэффективных химиопрепаратов и антибиотиков они применяются редко. В практике используют противосибиреязвенную, противолептоспирозную, противо-стафилококковую иммунные сыворотки и др.;
• антивирусные сыворотки, которые способны инактивировать вирусы. Их используют для лечения и профилактики тяжелых вирусных инфекций: клещевого энцефалита, бешенства, кори, гриппа, гепатитов и др.
Иммуноглобулины, получаемые из крови животных, имеют один существенный недостаток, связанный с их гетерогенностью.
Введение в организм таких сывороток может сопровождаться развитием угрожающих жизни реакций (анафилактический шок, сывороточная болезнь и др.) в связи с их сенсибилизирующим действием. Поэтому перед введением гетерогенных сывороток необходимо определить индивидуальную чувствительность организма к белкам животного-донора (обычно лошади) путем постановки внутрикожной пробы. Для этого нормальную лошадиную сыворотку, разведенную 1:100, вводят внутрикожно в ладонную поверхность предплечья в количестве 0,1 мл. Через 20 мин учитывают результат. При отрицательной пробе иммунную сыворотку вводят по методу Безред-ки: 0,1 мл подкожно и через 30 мин всю лечебную дозу внутримышечно или внутривенно.
При положительной внутрикожной пробе такую лечебную сыворотку вводят только по безусловным показаниям под наблюдением врача и с применением противошоковых мероприятий. Проводят десенсибилизацию дробным введением вначале лошадиной сыворотки, разведенной 1 : 100, в дозах 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мл с интервалом в 20 мин; затем вводят цельную иммунную сыворотку в объемах 0,1; 0,2 мл, а затем всю оставшуюся лечебную дозу с промежутками в 20 мин.
Этого недостатка лишены гомологичные иммуноглобули
ны, которые получают из сыворотки людей. Кроме того, такие антитела циркулируют в крови дольше (4—-5 нед), чем гетерогенные. Иммуноглобулины получают из донорской, плацентарной или абортной крови человека. Выпускают противо-коревой (нормальный) иммуноглобулин, который готовят из смеси сывороток крови разных людей. Он содержит антитела против возбудителей кори, гриппа, полиомиелита, коклюша, дифтерии и других бактериальных и вирусных инфекций, которыми они переболели в прошлом. Группа иммуноглобулинов направленного действия содержит антитела против конкретного возбудителя. Их получают от гипериммунизированных вакциной или анатоксином доноров. Например, в настоящее время медицинской промышленностью выпускаются иммуноглобулины против гриппа, столбняка, клещевого энцефалита и др.
Раздел IV
ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ
Глава 20
СТРОЕНИЕ ВИРУСОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С КЛЕТКОЙ. ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ
Царство Vira представлено вирусами. Это особая группа живых существ, отличающихся как от прокариотов, так и от эукариотов.
Вирусы были открыты в 1892 г. русским ученым Д. И. Ивановским при изучении мозаичной болезни табака. Такое название заболевание получило потому, что на листьях больных растений беспорядочно располагались пятна темно-и светло-зеленого цветов. Для проведения эксперимента Д. И. Ивановский использовал сок, полученный из предварительно измельченных листьев табака, пораженных мозаикой. Микроскопия капелек сока не дала никаких результатов: бактерии или другие организмы в них отсутствовали. Однако через 2 нед после нанесения исследуемого отжима из листьев на здоровые растения табака на них появлялась пятнистость. Ученый профильтровал сок через бактериальный фильтр Шамберлана и снова повторил опыт. После фильтрации инфекционные свойства сока сохранились. Выделить неизвестный инфекционный агент не удалось и при посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды. На основании проведенных исследований Д. И. Ивановский пришел к выводу о том, что «табачная мозаика» является инфекционным заболеванием, ее возбудитель имеет очень мелкие размеры и не растет на питательных средах. Он назвал его «фильтрующиеся бактерии». В 1898 г. аналогичные результаты были получены голландским ученым Мартином Бейеринком, который считал, что «табачную мозаику» вызывают не бактерии, а некое жидкое заразное начало — фильтрующиеся вирусы. размножающиеся только в живых органах растений. Долгое время название «фильтрующиеся вирусы» использовали при описании возбудителей вирусных заболеваний человека, животных и растений. Затем эту уникальную группу микроорганизмов стали обозначать только одним словом — вирусы.
Интересным историческим фактом является то, что задолго до открытия вирусов были созданы первые вакцины, предупреждающие вызываемые ими заболевания. Вакцина про
тив натуральной оспы была предложена Э. Дженнером в 1796 г. (почти на 100 лет раньше). За семь лет до открытия Д. И. Ивановского Л. Пастер спасал от бешенства с помощью антирабической вакцины людей, пострадавших от укусов больных животных. Д. И. Ивановский также сделал правильные выводы относительно существования вирусов, не видя их. Лишь в 1939 г. группа ученых под руководством Фукса впервые получила электронно-микроскопический «портрет» вируса табачной мозаики.
Конец XIX и начало XX в. ознаменовались открытием вирусов — возбудителей заболеваний человека и животных: ящура, натуральной оспы, желтой лихорадки, бешенства, полиомиелита и др. В 40—50-х годах XX в. были разработаны методы культивирования вирусов, а в 60—70-е годы вирусологические исследования вышли на молекулярный уровень. К настоящему времени вирусология сформировалась как самостоятельное направление микробиологии. Разработаны методы диагностики, профилактики и лечения многих вирусных болезней. Получена новая информация относительно строения, химического состава, функций и особенностей организмов, относящихся к царству вирусов.
Основные отличия вирусов от других представителей микромира состоят в крайне малых размерах (15—400 нм), наличии только одного типа нуклеиновой кислоты—ДНК или РНК, особенностях структурной организации, способе воспроизведения и культивирования, облигатном внутриклеточном паразитизме.
Геном вируса может быть представлен или ДНК, или РНК (рис. 20.1). При этом структура и молекулярная масса нуклеиновых кислот чрезвычайно разнообразны. Различается и количество нуклеотидов. Вирус оспы содержит 230 000 нуклеотидов, а вирус герпеса — 150 000.
Около 80% изученных вирусов содержат РНК различной структуры — однонитчатой, линейной, фрагментированной и кольцевой, а также двунитчатой. Аналогично ДНК, РНК вирусов различаются по количеству нуклеотидов и молекулярной массе.
Нуклеиновая кислота заключена в белковую оболочку — капсид (от греч. capsa —ящик). В 1935 г. американский биохимик У. М. Стенли получил кристаллы вируса табачной мозаики и выявил белково-нуклеиновую природу вирусов. Это открытие было отмечено Нобелевской премией.
Капсид состоит из субъединиц — капсомеров (от греч. meros — часть). Количество капсомеров и их расположение определяют размеры и тип симметрии (форму) вируса. Так, вирус полиомиелита имеет сферическую форму, вирус бешенства — пулевидную, многие бактериофаги — сперматозоидную.
ДНК-содержащие вирусы
Poxviridae
Herpesviridae Adenoviridae
Papovaviridae Parvoviridae Hepadnaviridae
РНК- содержащие вирусы
Paramyxoviridae
Orthomyxoviridae
Bunyaviridae Arenaviridae Coronaviridae
Picornaviridae Caliciviridae Togaviridae Flaviviridae
Рис. 20.1. Строение и относительные размеры вирионов вирусов человека.
Просто организованные вирусы содержат небольшое количество белков, а сложно устроенные (вирус оспы)—до 30 белков
У некоторых вирусов есть дополнительная оболочка — суперкапсид. Она располагается поверх капсида и представлена липопротеидами В основном это фосфолипиды или холестерин.
Суперкапсид формируется при выходе вируса из клетки и представляет собой часть мембраны клетки-хозяина Он образуется у вирусов, которые покидают клетку путем почкования. При воздействии эфира суперкапсид разрушается В суперкапсиде могут находиться белковые выросты в виде шипов (спикулы) или нитей, которые распознают клеточные рецепторы, связываются с ними и, таким образом, обеспечивают проникновение вируса в клетку. Количество шипов и их тип у вирусов неодинаковы. Например, вирус гриппа имеет шипы двух типов, а рабдовирусы — одного. Шипы представлены гликопротеидами с разной молекулярной массой и обладают антигенными свойствами.
Гликопротеиды иногда включают и углеводные компоненты. Чаще всего сахарные остатки, обнаруживаемые в вирусных белках, содержат сахарозу, маннозу, галактозу, фруктозу, глюкозамин, нейраминовую кислоту. Набор углеводного компонента зависит от клетки-хозяина.
Белки, входящие в состав вируса, выполняют различные задачи и разделяются на структурные и функциональные.
Структурные защищают нуклеиновую кислоту, образуя капсид Часть из них выполняет «адресную функцию» — распознает по рецепторам клетку-хозяина.
У вирусов отсутствуют белоксинтезирующие системы В 60-х—начале 70-х годов были открыты некоторые ферменты.
Функциональные белки являются ферментами, принимающими участие в процессе репликации вируса Среди них различают группу, катализирующую проникновение вирусной ДНК и РНК в клетку и выход образовавшихся вирионов из нее (лизоцим, АТФаза, нейраминидаза, гемагглютинин). К другой группе относятся ферменты, участвующие в процессах репликации и транскрипции, например ДНК- и РНК-полиме-разы. Их называют вирионными в отличие от ферментов, структура которых закодирована в вирусном геноме (вирусин-дуцированные ферменты).
Вирусы существуют в форме вириона — внеклеточной и вируса — внутриклеточной формы. Они обладают уникальным способом воспроизведения — дизъюнктивным (раздельным). Репродукция вируса проходит в несколько стадий: адсорбции, проникновения вируса в клетку, «раздевания вириона», транскрипции и репликации вирусных геномов, сборки вириона (рис. 20 2).
Инфицирующий вирус
Капсид
Прикрепление
Рецептор
Ядро
Выход из клетки
Нуклеиновая кислота
путем отлочковывания
(приобретение оболочки) Оболочка
Клетка-
хозяин
Сборка
Капсиды образуются вокруг нуклеиновой кислоты
Проникновение
Репликация
Синтез вирусной мРНК (с использованием собственной или клеточной полимеразы) синтез белка для новых капсидов синтез вирусной нуклеиновой кислоты
Раздевание
Сбрасывание
капсида
Рис. 20.2. Проникновение в клетку и репродукция вируса [по А Ройту и др , 2000]
I. Стадия адсорбции —с помощью рецепторов — прикрепительных белков, например гликопротеиновых шипов или нитей, вирусы адсорбируются на клетках и прикрепляются к клеточным рецепторам.
2. Проникновение вируса в клетку Может происходить двумя способами: виропексисом, когда участок плазматической мембраны клетки, на котором адсорбирован вирус, инвагини-руется, вокруг вируса образуется вакуоль и он проникает в клетку Другой способ проникновения осуществляется за счет слияния оболочки вируса с мембраной клетки-хозяина Вирус
попадает либо в цитоплазму клетки, либо в дальнейшем проникает в ядро.
3. «Раздевание вириона». Эта стадия получила такое название потому, что проникший в клетку вирус ведет себя как вошедший в помещение гость: снимает верхнюю одежду. Вирус освобождается от капсида и суперкапсида. Происходит его депротеинизация, начавшаяся уже в I и II стадиях. Освободившаяся от оболочки нуклеиновая кислота готова к следующей стадии взаимодействия с клеткой.
4. Транскрипция и репликация вирусных геномов. Известно, что транскрипция — это переписывание ДНК на РНК по законам генетического кода. Продуктом транскрипции в клетках являются информационные РНК. Эти РНК передают генетическую информацию к рибосомам, осуществляющим синтез белка. С учетом особенностей организации вирусов, имеющих только один тип нуклеиновой кислоты, передача информации определяется строением вирусного генома. Например, у ДНК-содержащих вирусов, репродуцирующихся в ядре клетки, в транскрипции участвует полимераза клетки. При этом передача информации идет по пути: ДНК — РНК — белок. Вирусы, репродуцирующиеся в цитоплазме, осуществляют транскрипцию с помощью собственной ДНК-полимеразы. РНК-содер-жащие вирусы могут передавать информацию непосредственно с генома на рибосомы либо синтезировать сначала информационную РНК и осуществлять передачу информации с ее помощью. В первом случае путь более прост: РНК-белок. Такие вирусы называют РНК-плюс (РНК+). Вирусы РНК-минус (РНК—) переписывают информацию по-другому: РНК-иРНК-белок. Наиболее сложно процесс передачи информации осуществляют ретровирусы — возбудители «медленных инфекций», к которым относится вирус иммунодефицита человека—ВИЧ. РНК сначала с помощью фермента обратной транскриптазы переписывается на ДНК, которая интегрирует с геномом клетки и в его составе переписывается на РНК, транслирующую затем информацию на рибосомы: РНК-ДНК- иРНК-белок.
5. Стадия сборки вирионов. Образовавшиеся в разных отделах клетки вирусные белки и нуклеиновые кислоты сначала собираются в одном месте — своеобразном «сборочном цехе». «Узнавая друг друга», они образуют путем самосборки капсо-меры, окружающие затем вирусный геном.
6. Выход вирусных частиц из клетки. Выход готовых вирионов осуществляется по-разному. Вирусы, не содержащие липопротеидной оболочки («голые вирусы»), устроенные более просто, выходят из клетки «путем взрыва». Клетка при этом полностью разрушается, и одномоментно в окружающую среду попадает большое количество вирионов. Путем взрыва выходят из клетки вирусы полиомиелита, гепатита А и др. Более 200
сложно организованные вирусы (вирус гриппа и др.), имеющие суперкапсид, покидают клетку хозяина постепенно, не дожидаясь ее гибели. Этот выход осуществляется путем почкования.
Почкование свойственно вирусам гриппа, кори и др. Сборка таких вирусов, начинаясь внутри клетки, постепенно переходит на плазматическую мембрану. Здесь формируются суперкапсидные гликопротеиды. Этот участок клеточной мембраны выпячивается кнаружи в виде почки, внутри которой находится заключенная в капсид нуклеиновая кислота. Почка постепенно отделяется от клетки и попадает во внешнюю среду в виде вириона.
Вирусы могут интегрировать свою нуклеиновую кислоту в клеточный геном. Такой процесс называется вирогенией. Вирус существует при этом в форме провируса. Такое взаимодействие геномов может вызвать трансформацию клеток хозяина, что наблюдается при заболеваниях, вызванных онкогенными вирусами.
20.1. Цитопатическое действие вирусов
Клетки, зараженные вирусами, подвергаются различным изменениям. Они проявляются в виде так называемого цшпо-патического эффекта (ЦПЭ) или цитопатического действия (ЦПД). Оба названия применяются при обозначении видимых под микроскопом изменений морфологии клетки, которые вызывают вирусы. Наиболее часто применяется термин ЦПД. Вирусы могут привести к следующим изменениям в клетке (рис. 20.3):
• образованию включений (тельца включения);
• деструкции клетки;
• образованию симпластов;
• трансформации клетки.
Образование включений. Вирусные включения в клетках, называемые также «тельцами включения», характеризуют иногда как «фабрики вирусов», в которых происходят репликация геномов и сборка вирусных частиц. В некоторых случаях включения состоят из материала самой клетки, инфицированной вирусами. Расположение включений (в ядре или цитоплазме), их форма, величина разнообразны. Так, вирус бешенства образует включения в цитоплазме (тельца Бабеша— Негри, вирусы оспы формируют околоядерные включения — тельца Гварниери, аденовирусы скапливаются в ядре).
Деструкция клетки обусловлена рядом причин. Вирусы могут повреждать клеточные структуры, лизосомы, воздействовать на метаболические процессы клетки и др. Деструкция клетки начинается, как правило, с ее пролиферации и заканчивается нарушением структуры и даже гибелью.
Мнмйа
Рис. 20.3. Различные типы исходов взаимодействия вируса с клеткой.
1 — нормальная неинфицированная клетка; 2 — формирование цитоплазматических включений; 3—деструкция клетки; 4 —симпласт (многоядерная клетка); 5 — трансформация клетки; 6 — продукция вируса без видимых изменений морфологии клетки.
Образование симпластов, Цитопатический эффект может выражаться в образовании многоядерных клеток. Он обусловлен действием вирусов на клеточные мембраны, в результате чего клетки сливаются и образуют симпласты (синцитии). Та
кие многоядерные клетки формируются под воздействием вирусов герпеса, кори, эпидемического паротита и др.
Трансформация клетки. Под действием вирусов нарушаются сбалансированный рост и деление клеток. В результате образуются разрастания клеточной ткани в виде опухолей. Трансформирующими свойствами обладают онкогенные вирусы.
Все варианты ЦПД обнаруживаются при микроскопировании препаратов из культур клеток, зараженных вирусами. Кроме того, присутствие вирусов в клетке можно обнаружить методами гемадсорбции и цветной пробы. В первом случае эритроциты адсорбируются находящимися в клетке вирусами. Это позволяет провести индикацию вирусов даже в тех случаях, когда нет видимых признаков ЦПД.
Цветная проба заключается в том, что культуры клеток выращивают на питательных средах с индикаторами. Клетки, зараженные вирусами, не изменяют цвета питательной среды, так как у них нарушен метаболизм. Клетки, не содержащие вирусов, выделяют продукты метаболизма, и индикатор реагирует на их появление изменением цвета.
Вирусы не культивируются на питательных средах. Для их накопления используют методы заражения животных, выращивание в куриных эмбрионах и культуре клеток. Наиболее часто используемой моделью являются куриные эмбрионы, которые в 1928—1929 гг. Гудпасчер, Вудруф и Бедцинг предложили использовать для накопления вирусов. Такой способ имеет преимущество, поскольку ткани эмбриона представляют собой питательный субстрат, а скорлупа яиц — стерильный сосуд. В 1952 г. Д. Эндерс, Т. Уэллер, Ф. Роббинс получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Использование этого метода позволило выделить новые вирусы, получить клонированные культуры и изучить взаимодействие вирусов с клетками, в результате чего происходят различные структурные и функциональные нарушения клетки-хозяина. Более подробно о культивировании вирусов читайте в главе 4.2.
Классификацию вирусов проводят на основании изучения
ряда признаков:
1) типа нуклеиновой кислоты;
2) структуры ДНК или РНК;
3) наличия суперкапсида;
4) размера, морфологии вириона, типа симметрии, числа капсо-меров;
5) чувствительности к эфиру;
6) места воспроизведения в клетке;
7) стратегии вирусного генома;
8) круга поражаемых хозяев;
9) антигенных свойств;
10) способа передачи.
Вирусы на основании перечисленных признаков делятся на подцарства, семейства, роды. Понятие о виде пока не исполь-
зуется, так как не имеет четкой формулировки. У вирусов выделено более 55 семейств, к 19 из них принадлежат вирусы человека и животных. Некоторые семейства делятся на подсемейства. В табл. 20.1 представлены некоторые таксономические признаки важнейших семейств вирусов человека и животных.
Таблица 20.1. Классификация вирусов, вызывающих заболевания
человека и животных
Семейство
Род
Тип нуклеиновой кислоты
Наличие суперкапсида
Представители (важнейшие)
Picomaviridae
Enterovirus
Caliciviridae
Reoviridae
Cardio virus
Rinovirus Aphtovirus Calicivirus Reovirus
Rotavirus Orbivirus
Retroviridae
Подсемейства: Oncovirinae Lentivirinae Spumaviri-nae
Togaviridae
Oncovirus
Lentivirus
Flaviviridae
Alphavirus
Rubivirus Pestivirus
Flavivirus
Bunyaviridae
Arenaviridae
Bunyavirus Phi eb о virus Nairobivirus Uukuvirus Hantavirus
Arenavirus
РНК
РНК
РНК
РНК
РНК
РНК
РНК
РНК
Нет
»
»
»
»
Вирусы полиомиелита, гепатита, Экхо, Коксаки
Вирус энцефаломиокардита
Риновирусы человека
Вирус ящура
Вирус Норфолк Реовирус человека
I типа
Ротавирусы
Орбивирусы
Вирусы Т-клеточного лейкоза
ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)
Вирус карельской лихорадки
Вирус краснухи
Вирус желтой лихорадки, лихорадки Денге, клещевого энцефалита, японского энцефалита, омской геморрагической лихорадки Вирус Буньямвера, крымской геморрагической и москитной лихорадки, геморрагической лихорадки с почечным синдромом Вирус лимфоцитарного хориоменингита Вирус Ласса, вирус Мачупо
Продолжение
Семейство Род Тип нуклеиновой кислоты Наличие суперкапсида Представители (важнейшие)
Rhabdoviridae Vesiculovirus Lyssavirus РНК Есть Вирус везикулярного стоматита Вирус бешенства
Coronaviridae Coronavirus РНК » Коронавирус человека
Paramyxoviri-dae Paramyxovirus Morbillivirus Pneumovirus РНК » Вирус парагриппа человека типа 1 Вирус кори Респираторно - синти-циальный вирус
Orthomyxoviri-dae Вирусы гриппа A Вирусы гриппа В РНК » Вирусы гриппа H2N2
Filoviridae Filovirus РНК » Вирус Марбург и Эбола
Adenoviridae Mastadenovirus Aviadenovi-rus ДНК Нет 41 тип аденовирусов человека 9 серотипов аденовирусов птиц
Papovaviridae Papovavirus Papillomavirus Polyomavirus . ДНК » Вирус папилломы, бородавок Вирус полиомы
Herpesviridae Подсемейства: Alpha-her-pesvirinae Beta-herpes-virinae Gamma-hcr-pesvirinae ДНК Есть Вирус простого и опоясывающего герпеса, ветряной оспы Вирус цитомегалии Вирус Эпштейна-Барр
Hepadnaviridae Poxviridae Подсемейства: Chordopox-virinae Entomopox-virinae Hepadnavirus Othopoxvirus Parapoxvirus Avipoxvirus Capripoxvirus Leporipoxvi-rus Suipoxvirus ДНК ДНК » » Вирус гепатита В Вирус натуральной оспы, вирусы оспы позвоночных (коров, обезьян и др.) Вирусы оспы насекомых
Parvoviridae Parvovirus Densovirus Dependovirus ДНК » Аденоассоциирован-ные вирусы человека
Вироиды открыты Т. О. Дайнером в 1972 г. Они вызывают
заболевания растений, похожие по симптомам и характеру повреждений на болезни, возбудителями которых являются фи-топатогенные вирусы. До настоящего времени вироиды остаются малоизученной группой инфекционных агентов. Известно, что они представляют собой очень небольшие (от 300 до 400 нуклеотидов) молекулы суперспирализованной РНК коль
цевидной формы. Вироиды не обладают антигенными свойствами; отличаются от вирусов тем, что устойчивы к действию высокой температуры, излучениям, формалину и противовирусным препаратам. Остается открытым вопрос об их воспро
изведении, природе, происхождении и распространении.
Прионы — возбудители некоторых заболеваний человека и животных. Их относят иногда к так называемым неканоническим вирусам. Прионы представляют собой высокоустойчивый белок, способный проникать в клетки и действовать на определенные гены. Есть данные о том, что они имеют форму фибрилл, не индуцируют образование антител. Прионы обладают высокой степенью устойчивости к действию высоких температур, УФ-лучам, радиации, формалину, нуклеазам. Фенол и эфир вызывают их разрушение.
Некоторые исследователи предполагают, что прионы могут иметь в своем составе мельчайшие молекулы ДНК. Основанием для этого послужило то, что прионы инактивируются ДНКазой и нечувствительны к РНКазе. Однако все это требует детального изучения и в настоящий момент является лишь гипотезой. Прионы пока не удалось обнаружить и при электронно-микроскопических исследованиях.
Клетки, инфицированные прионами, вырабатывают особый белок и вызывают губчатое перерождение клеток ЦНС. В результате перерожденные клетки погибают. Полагают, что прионы являются возбудителями ряда заболеваний человека и животных. У животных они вызывают скрепи овец, энцефалопатию коров, энцефалопатию норок и медленные, хронические заболевания оленей и лосей в неволе.
Считают, что прионы являются возбудителями ряда «медленных инфекций», характеризующихся длительными периодами инкубации и развития болезни, очень слабым иммунным ответом и летальным исходом. Среди «медленных инфекций» человека, причиной которых считают прионы, известны куру — «смеющаяся смерть», болезнь Крейтцфельда-Якоба, синдром Герстманна—Шильдера, амиотрофический лейкоспонгиоз.
Болезнь куру известна давно. Она поражала некоторые племена в Новой Гвинее, у которых был принят ритуальный каннибализм, т. е. поедание органов (в основном мозга) умерших родственников. Это заболевание больше известно под на
званием «смеющаяся смерть», поскольку поражение централь
ной нервной системы вызывало ряд психических изменений. Вначале появлялись первые признаки нарушения координации, затем они нарастали, и у больных нарушалась походка, появлялись повышенное возбуждение и беспричинный смех. Через полтора—два года заболевание заканчивалось смертью.
Причиной заболевания Крейтцфельда—Якоба также считаются прионы. Как и при других «медленных инфекциях», поражается ЦНС. В 1996 г. в Англии были отмечены случаи заболевания людей, употреблявших мясо коров, больных губчатой энцефалопатией («бешенством» коров). Это дает основание предположить, что прионы способны преодолевать видовые барьеры и вызывать одновременно заболевания человека и животных. В последнее время высказаны предположения о том, что прионы являются этиологическими агентами шизофрении, миопатии и других заболеваний человека. Все это требует глубокого изучения. На сегодняшний день прионы представляют одну из наиболее загадочных групп инфекционных агентов.
Глава 21
ГЕНЕТИКА И ФОРМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВИРУСОВ
Геном вирусов содержит только один тип нуклеиновой кислоты — либо ДНК, либо РНК. Он является гаплоидным и может
быть представлен двухнитевыми или однонитевыми молекулами ДНК или РНК. НК имеют линейное или кольцевое распо
ложение молекулы. Молекула РНК, кроме того, может быть непрерывной или сегментированной (например, вирус гриппа имеет РНК из 8 сегментов). Особое положение занимают рет
ровирусы, геном которых имеет диплоидный набор одноните-вых РНК (табл. 21.1).
Нуклеиновые кислоты в составе зрелого вириона достаточно стабильны. Основные процессы, которые приводят к изме
нению свойств вирусов, протекают в клетке-мишени.
У вирусов выделяют, как и у бактерий, ненаследуемые и
наследуемые, генотипические формы изменчивости.
К ненаследуемым (фенотипическим) формам относятся:
модификации, вызываемые клеткой-хозяином. Их осуще-
ствляют клеточные ферменты, которые вызывают изменения в химическом составе поверхностных антигенов. Модифика
ции лежат в основе адаптации вирусов к новому хозяину;
• комплементация (complement— дополнение) наблюдается при смешанной инфекции клетки двумя вирусами. Она может быть двусторонней, если взаимодействуют два дефектных вируса, которые не способны к самостоятельной репродукции.
Таблица 21.1. Типы организации вирусных геномов
Тип нуклеиновой кислоты
Организация молекул вирусных НК
Представители
ДНК-вирусы
РНК-вирусы
Линейная однонитевая Кольцевая однонитевая Линейная двунитевая Двунитевая с замкнутыми концами Двунитевая кольцевая с однонитевым участком Линейная однонитевая
Линейная сегментированная однонитевая Кольцевая сегментированная однонитевая Сегментированная двунитевая
Линейная однонитевая с диплоидным геномом
Парвовирусы
Некоторые фаги
Аденовирусы, герпес-вирусы Вирус оспы
Вирус гепатита В
Пикорнавирусы, парамиксовирусы, рабдовирусы, тога-вирус ы
Ортомиксовирусы, аренавирусы
Буньявирусы
Реовирусы
Ретровирусы
В этом случае вирусы снабжают друг друга недостающими компонентами (обычно функциональными или структурными белками). Генотип вирусов при этом не изменяется. При од
носторонней комплементации один из вирусов-партнеров
обеспечивает себя и своего дефектного партнера-сателлита необходимыми для репродукции элементами. Этот тип взаи
модействия встречается как у близкородственных, так и у
принадлежащих к разным семействам вирусов. Например, вирус гепатита В обеспечивает себя и дельта-вирус наружным белком — HBs-антигеном;
енотипическое смешивание (маскирование) возникает
при смешанных инфекциях, когда геном одного вируса встраивается в капсид другого. Например, геном ВИЧ (вируса иммунодефицита человека) в процессе персистенции в орга
низме может покрываться оболочкой герпес-вируса. Такой вирус получил название псевдовируса. Новая оболочка позво
ляет ему расширить спектр чувствительных клеток.
К наследуемым формам изменчивости вирусов относят:
• мутации. Они затрагивают геном одного вируса, независимо от типа нуклеиновой кислоты. Механизм формирования мутаций, их варианты и последствия для вирусов аналогичны таковым у бактерий;
• рекомбинации генов, которые возникают, если в клетку-мишень проникает не один вирус, а несколько. Происходит
смешанная инфекция, и между вирусами возможен обмен генетическим материалом. Новые вирусы-рекомбинанты получают свойства от разных родительских особей;
• пересортировка генов является одним из вариантов рекомбинаций. Она возникает при взаимодействии вирусов с
сегментированными геномами. Например, у вируса гриппа типа А геном состоит из 8 фрагментов однонитевой РНК. При одновременной репродукции в клетке-мишени двух разных вирусов этого типа (например, один из них — вирус гриппа человека, другой — птиц) может происходить обмен целыми фрагментами генов. Важно лишь, чтобы у зрелого вируса их набор был полным, т. е. геном содержал бы 8 фрагментов. Такая пересортировка генов приводит к существенным изме
нениям свойств вирусов;
• кросс-реактивная
(перекрестная реактивация) — вариант
рекомбинации, который возникает при взаимодействии в клет
ке-мишени полноценного вируса и дефектного штамма с час
тичным повреждением генома. В этом случае возможна реком
бинация неповрежденных участков генома дефектного вируса
с геномом полноценного штамма. В результате образуются пол
ноценные дочерние особи со свойствами обоих родителей;
множественная реактивация возможна в случае инфици-
рования клетки дефектными вирусами, у которых повреждены разные гены. Процесс генетической рекомбинации приводит к дополнению генов и формированию неповрежденных виру
сов, идентичных родительским;
• гетерозиготность наблюдается в том случае, если в клетке-мишени присутствует два разных штамма вируса и в процессе формирования дочерних вирионов появляются особи, содержащие два разных генома.
В табл. 21.2 приведены в сравнительном аспекте формы изменчивости бактерий и вирусов.
Таблица 21.2. Формы изменчивости микроорганизмов
Тип изменчивости
Формы изменчивости бактерий
Формы изменчивости вирусов
Ненаследуемая (фенотипическая)
Наследуемая (генотипическая)
Модификации
Мутации, диссоциации, генетические рекомбинации:
трансформация, трансдукция, конъюгация
Модификации, комплементация, фенотипическое смешивание Мутации, рекомбинации, пересортировка генов, кросс -реактивация, множественная реактивация, гетерозиготность
Изучение нуклеотидных последовательностей НК вирусов широко используется в диагностике. Разработаны высокочувствительные специфические методы молекулярной гибридизации, которые позволяют обнаружить единичные копии генов в клеточной популяции.
Глава 22 ВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ
Взаимодействие вирусов с клетками макроорганизма может приводить к различным последствиям: тяжелым повреждениям и разрушениям клеток, длительному инфицированию клеток без видимых повреждений, трансформации и др. Характер их взаимодействий зависит от ряда факторов:
• вида вирусов;
• патогенности и степени вирулентности вирусов. Патогенность вирусов — генетический признак, обусловленный соотношением вирусных генов. Фенотипическим проявлением патогенности является вирулентность. Для ее характеристики используется определение 50% инфицирующей дозы (ИД50) и 50% летальной дозы (ЛД50). ИД50 — это количество вируса (или его разведение), инфицирующее 50% клеточной культуры. ЛД50 — количество вирусов (или его разведение), при котором погибает 50 % пораженных клеток культуры или инфицированных животных;
• дозы вирусов;
• входных ворот. Ими могут быть верхние дыхательные пути (ортомиксовирусы, аденовирусы, риновирусы и др.), ротовая полость (энтеровирусы, реовирусы и др.), поврежденная кожа и слизистые оболочки (арбовирусы, рабдовирусы) и др.;
• тропизма вирусов к определенным клеткам и тканям, который обеспечивается специфическими рецепторами;
• характера взаимодействия с чувствительной клеткой;
• скорости размножения вируса и распространения его в организме.
Выделяют несколько основных путей распространения, которые используют вирусы, репродуцирующиеся в организме,— лимфогенный, гематогенный, нейрогенный. Скорость распространения вирусов определяет длительность инкубационного периода;
• реакции организма на внедрение вируса и степени эффективности защитных реакций.
Пути проникновения вирусов в организм определяются локализацией чувствительных клеток и механизмом передачи. Выделяют воздушно-капельный, алиментарный, трансмиссивный, контактный (через поврежденную и неповрежденную кожу), половой, парентеральный и вертикальный пути пере
дачи вирусов. Одни вирусы используют строго определенный путь проникновения в организм, что связано со способностью к репродукции в строго определенных клетках. Другие пользуются разными путями, так как могут взаимодействовать с разными клеточными системами. Ниже приведены сведения о путях проникновения в организм ряда вирусов.
Пути проникновения вирусов в организм
Путь проникновения вирусов
Представители
Воздушно-капельный Алиментарный Трансмиссивный
Контактный Половой П арентеральный Вертикальный
Ортомиксовирусы, парамиксовирусы, риновиру-сы, аденовирусы, реовирусы и др.
Энтеровирусы, ротавирусы
Арбовирусы — буньявирусы, ареновирусы, тога-вирусы и др.
Паповавирусы, рабдовирусы
Герпес-вирусы, паповавирусы
Гепаднавирусы, ретровирусы
Ретровирусы, тогавирусы (вирусы краснухи), герпес-вирусы и др.
Инфекционная болезнь, которая развивается в результате проникновения вирусов в организм, так же как и бактериальные инфекции, характеризуется цикличностью (см. раздел 11, глава 13).
Вирусные инфекции на уровне макроорганизма могут проявляться в разных формах. Выделяют очаговые (вирусы репродуцируются в клетках непосредственно у входных ворот, где и развивается патологическая картина) и генерализованные инфекции.
Течение вирусных инфекций может быть острым, с кратковременным пребыванием патогена в организме. Острая инфекция протекает с выделением вирусов во внешнюю среду. Она может закончиться выздоровлением или гибелью макроорганизма. Выздоровление сопровождается полной элиминацией вирусов из организма. Возможна длительная персистенция (от лат. persistentia — упорство, постоянство) вируса в макроорганизме, при которой взаимоотношения между вирусом и клеткой относительно стабильны. Вирусная персистенция может проявляться в трех формах (табл. 22.1):
• латентная инфекция — бессимптомная инфекция, при которой репродукция и выделение вируса во внешнюю среду происходят не постоянно, а лишь спорадически. Под воздействием некоторых факторов внешней среды может наступить активация такого вируса, что приводит к развитию острой
Таблица 22.1. Формы взаимодействия вируса с макроорганизмом [по В. А. Зуеву, 1988]
Течение вирусной инфекции
Время пребывания вируса в организме
кратковременное
продолжительное (персистенция)
Бессимптомное
Клинически выраженное
Инаппарантная инфекция
Острая »
Латентная инфекция
Хроническая »
Медленная »
формы инфекционного процесса. Латентную инфекцию могут вызывать вирусы герпеса, онковирусы;
• хроническая инфекция характеризуется поддержанием патологического процесса в течение длительного периода времени с наличием слабо выраженных клинических проявлений. Ремиссии чередуются с периодами обострений на протяжении нескольких недель или месяцев. При этом вирус постоянно выделяется во внешнюю среду. К хроническим относятся аденовирусная инфекция, хронические формы гепатитов;
• медленные вирусные инфекции с необычно продолжительным инкубационным периодом (до нескольких лет), медленно прогрессирующим течением патологических процессов, которые заканчиваются летально. Возбудителями медленных инфекций являются вирусы и прионы. К медленным инфекциям вирусной этиологии относятся ВИЧ-инфекция и СПИД, прогрессирующая врожденная краснуха, цитомегаловирусное поражение мозга и др. Прионы являются возбудителями болезни Крейтцфельда—-Якоба, амиотрофического лейкоспонгиоза, куру и др.
Активация персистирующего вируса в организме может сопровождаться изменением характера течения инфекционного процесса с развитием острой или рецидивирующей хронической формы.
22.1. Антигены вирусов
Антигены вирусов входят в состав вириона или являются ви-
русиндуцированными и находятся на поверхности или внутри инфицированной клетки. Антигенными свойствами обладают белки, гликопротеиды, липопротеиды, ферменты вирионов. В составе вирионов простых вирусов имеется 1—2 антигена, которые могут значительно различаться по антигенной специфичности. Этим обусловлено наличие у них множества сероваров. Например, у энтеровирусов выявлено от 2 до 34 сероваров.
Вирионы сложных вирусов содержат нуклеокапсидные и поверхностные антигены. Поверхностные антигены обладают
большей иммуногенностью и вариабельностью (например, гемагглютинин и нейраминидаза вируса гриппа типа А). В состав суперкапсидов часто включаются мембранные белки клеток-мишеней, в результате формируется антигенная или молекулярная мимикрия паразита к хозяину. Это снижает или извращает иммунный ответ, так как возможно образование гетероспецифических антител, реагирующих с поверхностными структурами клеток макроорганизма.
Антигенные детерминанты вирусов расположены поверхностно, где наиболее доступны взаимодействию с антителами. Они определяют родовую, видовую, вариантную и штаммовую специфичность.
Вирусиндуцированные антигены образованы функциональными белками (ферментами), синтезируемыми в клетке на ранних стадиях репродукции вирусов.
22-2. Особенности противовирусного иммунитета
Защитные реакции организма, которые развиваются при вирусных инфекциях, направлены на подавление репродукции вирусов в клетках и нейтрализацию токсичных продуктов, образующихся при этом. Клетка, инфицированная вирусом, обеспечивает ему защиту от действия многих факторов иммунной системы. В то же время она экспрессирует на своей поверхности чужеродные антигены и сама становится объектом атаки NK-клеток или ЦТЛ.
Выделяют три уровня возможного ингибирования вирусов:
• в месте входных ворот, где на внеклеточную форму (вирион) действуют факторы врожденной резистентности и пред-существующие секреторные IgA;
• проникновение вируса в чувствительную клетку включает синтез особого противовирусного белка — интерферона (ИФН);
• в процессе вирусной инфекции происходит выработка иммуноглобулинов. Они участвуют в процессах элиминации вирионов при переходе из одной клетки в другую.
Ниже подробно рассматриваются все эти взаимодействия (рис. 22.1).
Неспецифическая противовирусная защита осуществляется факторами естественной резистентности. Имеют значение барьерные ткани (кожа и слизистые оболочки), лизоцим, системы комплемента и пропердина, ингибиторы вирусной активности (а- и p-ингибиторы), температурная реакция (тормозит репродукцию вирусов), выделительная система (почки, мерцательный эпителий верхних дыхательных путей) и др.
Наибольшее значение среди этих факторов имеет индукция интерферонов разных типов как система внутриклеточной за-
©
©
Опсонизация антителами и комплементом для макрофагального фагоцитоза с использованием рецепторов к Fcv и комплементу
©
Прони кновен и е
|дд
НК
Зараженная [ клетка
Интерфероны
©
Защита от заражения других клеток
IgM
IgG
Компле-мент
Выход
Зараженная клетка
©
----
И Вирус
© ©©
АЗКЦ
НК
- ® &
0
Рис. 22.1. Механизмы противовирусного иммунитета [по А. Ройту и др., 2000].
щиты макроорганизма. Интерферон был открыт вирусологами А. Айзексом и Д. Линдеманом (1957) при изучении явления интерференции вирусов. Они установили, что резистентность клеток к повторному заражению разными вирусами обеспечивается особым растворимым белковым веществом клеток. Оно оказалось гликопротеином с низкой молекулярной массой, которое было ими названо интерфероном (ИФН) от англ, interfere with, что значит мешать, так как именно ИФН не позволяет вирусу реплицироваться в клетке. Основная роль ИФН — сохранение постоянства клеточного гомеостаза.
ИФН характеризуются высокой видовой активностью в отношении тканей организма хозяина. Они действуют в клетках того вида млекопитающих, от которого происходят. Так, например, ИФН мышей проявляет противовирусные свойства в организме мышей или культурах мышиных клеток. ИФН человека действует в организме человека и неактивен в организме других млекопитающих. Синтез ИФН закодирован в генетическом аппарате практически любой клетки организма, и все клетки способны его синтезировать.
Механизм действия ИФН на вирусы является опосредованным. ИФН активируют гены, которые контролируют выработку белков с антивирусной активностью (например, про-теинкиназы). Они нарушают сборку белковых молекул вируса (рис. 22.2).
Было установлено существование трех типов ИФН с широким спектром действия — антивирусным, противоопухолевым и иммуномодулирующим. Выделяют:
Интерферон
•* Ядро
Включение системы аденилатциклазы
Активные молекулы интерферона
Рецептор
интерферона
+ Двухцепочечная РНК
Активация
Вирусная инфекция подавлена
Активация расщепления вирусной ДНК эндонуклеазой (вирус разрушается)
ДНК
> Биосинтез протеинкиназы
• еинтерферонаф• (вирус не образуется)
Рис. 22.2. Действие интерферона.
• ИФНа, или лейкоцитарный ИФН. Взаимодействует с клетками организма, несущими рецептор CD118. Основная функция проявляется в повышении экспрессии молекул МНС I класса. Это способствует распознаванию и уничтожению ви-русинфицированных клеток ЦТЛ, индукции противовирусных белков, которые подавляют репликацию вирусов и тормозят пролиферацию собственных клеток организма, в том числе опухолевых, и повышению литического потенциала NK-клеток;
• ИФН$, или фибробластный ИФН. Функция аналогична функции ИФНа;
• ИФНу, или иммунный ИФН. Выделяется иммунными Т-лимфоцитами разных субпопуляций: CD4 Т-клетками воспаления, CD8 ЦТЛ и NK-клетками. Состоит из 143 остатков аминокислот. Взаимодействует с мембранным рецептором CD119 на поверхности клеток. Многофункционален. Активатор макрофагов, участвует в развитии гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Усиливает активность ЦТЛ и NK-клеток и способствует развитию противовирусного иммунитета. Активирует экспрессию молекул МНС I и II классов, что помогает представлению на поверхности инфицированных клеток организма антигенов внутриклеточных паразитов (вирусов, риккетсий, хламидий и др.) для Т-лимфоцитов.
ИФН относится к группе индуцибельных белков и вырабатывается в клетках, инфицированных вирусами, бактериями с внутриклеточным паразитизмом, простейшими, эндо- и экзотоксинами микроорганизмов, вакцинами, синтетическими сополимерами и др. Установлена возможность стимуляции синтеза этого цитокина небольшими дозами видоспецифичных ИФН. Выявлены индукторы интерферона, которые могут быть использованы для увеличения синтеза организмом собственного эндогенного ИФН. К ним относятся природные и синтетические соединения, например очищенная двухцепочечная РНК (ларифан), ароматические углеводороды (амик-син), полимеры (полудан) и др.
Широкий спектр активности ИФН позволяет использовать их для профилактики и лечения многих заболеваний вирусной и бактериальной природы, болезней злокачественного роста и нарушений в системе иммунитета. Для этой цели используют ИФН 1-го поколения (природные человеческие лейкоцитарные) и рекомбинантные ИФН 2-го поколения. Рекомбинантный лейкоцитарный ИФН получают методами генной инженерии в прокариотических клетках (кишечной палочке).
Факторы неспецифической резистентности включаются немедленно после проникновения вирусов и обусловливают быстрое выздоровление больных при острых вирусных инфекциях.
Доиммунный фагоцитоз при вирусных инфекциях носит, как правило, незавершенный характер. Это объясняется способностью вирусов оставаться резистентными к разрушающему действию ферментных систем макрофагов и репродуцироваться внутри них. Фагоциты в этих случаях защищают вирусы от действия ингибиторов, интерферона (ИФН), антител. С другой стороны, фагоциты разносят вирусы по организму, способствуя генерализации инфекции и переходу ее в хроническую форму.
Приобретенный иммунитет формируется в процессе инфекции и может быть гуморальным и клеточным.
Гуморальный иммунитет обеспечивается иммуноглобулинами классов М, G, А. Их протективное действие проявляется в блокировании процессов взаимодействия вирусов с клетками-мишенями и препятствует проникновению вирусов в них.
При острых, вирусных инфекциях антитела формируются обычно на 6—8-й день, т. е. к концу болезни. Организм отвечает на внедрение вирусов образованием вируснейтрализую-щих и/или комплементсвязывающих антител. Их обнаружение имеет значение для ретроспективной диагностики. Основная роль таких антител — защита от повторного заражения.
Поэтому уровень иммуноглобулинов в крови является надежным показателем резистентности организма к некоторым острым вирусным инфекциям (кори, паротиту, полиомиелиту и др.). При многих вирусных инфекциях (гриппе, ОРВИ, полиомиелите, ротавирусных инфекциях и др.) большое значение имеет индукция местного иммунитета слизистых оболочек дыхательных путей и пищеварительного тракта. Такой иммунитет создает секреторный иммуноглобулин А.
Клеточные иммунные механизмы являются основными при вирусных инфекциях. Они осуществляются цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ) с маркером дифференциации CD8 с участием Т-хелперов, NK-клетками и макрофагами. ЦТЛ распознают и уничтожают клетки, инфицированные вирусом. Т-хелперы активируют и обеспечивают дифференцировку и пролиферацию ЦТЛ. Мононуклеарные макрофаги поглощают иммунные комплексы, состоящие из вирусов и адсорбированных антител. NK-клетки уничтожают инфицированные вирусом клетки без участия антител и Т-хелперов.
К особенностям формирования иммунитета при вирусных инфекциях относится феномен антигенной детерминанты или «первородного антигенного греха», выявленный при повторном инфицировании вирусом гриппа. Он заключается в том, что при повторном заболевании гриппом появляются антитела к вирусу, присутствующему в организме в данное время. Одновременно стимулируется выработка антител к вирусу, который вызвал заболевание в прошлом и давно покинул организм.
Отмечена способность вирусных патогенов «ускользать» от иммунологического надзора организма. К механизмам такого «ускользания» относятся:
• интеграция вируса в геном клетки-хозяина. Этим свойством обладают ДНК-вирусы и ретровирусы;
• способность переходить из клетки в клетку, минуя внеклеточное пространство. Вирусы используют цитоплазматические мостики (вирус герпеса) или вызывают слияние соседних клеток с образованием гигантских многоядерных симпластов или синцития (вирусы кори, ВИЧ);
• ингибирование экспрессии комплекса молекула МНС I класса + вирусный пептид на мембранах клеток;
• антигенные вариации у вирусов, которые обусловлены мутациями. В таком случае формируются варианты вирусов, устойчивые к действию антител. Например, ВИЧ при репродукции допускает ошибки при транскрипции РНК—ДНК, что приводит к изменению антигенных детерминант гликопротеида Gp-120. С новым антигеном уже не будут взаимодействовать антитела, которые образовались ранее;
• способность вирусов индуцировать избыточное количество поверхностных антигенов, которые связывают циркулирующие противовирусные антитела до их встречи с вирионами. Например, в процессе репродукции ВИЧ синтезируется избыточное количество поверхностного Gp-120-антигена, который блокирует вируснейтрализующие антитела.
Описаны и другие механизмы, охраняющие вирусы от действия защитных факторов.
При развитии вирусных инфекций происходят нарушения фагоцитарной реакции. Выше было отмечено, что доиммун-ный фагоцитоз имеет незавершенный характер. В иммунном организме мононуклеарные фагоциты фиксируют через Fc-рецептор и поглощают иммунные комплексы (IgG + вирус) Эти комплексы (ИК) в мононуклеарах под действием ферментов и кислого pH фагосом расщепляются. Вирус выходит в цитоплазму макрофага и там реплицируется. Данный феномен получил название парадоксального усиления репродукции вируса. Он приводит к гибели макрофагов. Такой способностью обладают вирусы герпеса, Эпштейна—Барр, гриппа, ВИЧ и др.
Вирусы способны инфицировать, нарушать функциональные свойства и разрушать Т- и В-лимфоциты. Происходят уменьшение количества Т-клеток, нарушение кооперации Т-и В-лимфоцитов с формированием иммунодефицита, например, при ВИЧ-инфекции, герпес-вирусной инфекции и др.
Перечисленные механизмы способствуют длительной персистенции вирусов в организме с формированием латентных, хронических и медленных вирусных инфекций.
Формирующиеся феномены иммунологического реагирования направлены против возбудителей, но нередко именно они приводят к повреждению органов и тканей макроорганизма. К таким явлениям относят:
• развитие болезней иммунных комплексов. Вирусы, взаимодействуя с антителами класса IgG, способны образовывать иммунные комплексы (ИК). Если они образуются в крови, то ИК циркулируют по всему организму и могут образовывать депо в различных тканях и органах. Они активируют систему комплемента и Тн1-клетки воспаления (CD4 — Т-лимфоциты), в местах их скопления развиваются местные воспалительные процессы. Например, при цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ) ИК депонируются в почках, при гепатите В — в суставах, почках, капиллярах кожи. Это приводит к развитию артритов, нефритов, васкулитов;
• формирование аутоиммунных реакций в результате деструкции (разрушения) клеток макроорганизма в процессе вирусной инфекции. Появляются антигенно измененные клеточные структуры, которые воспринимаются иммунной системой организма как чужеродные. В итоге индуцируется иммун-218
ный ответ в виде образования антител и примированных Т-лимфоцитов, которые способны реагировать с антигенами нормальных клеток. При этом возможно образование антител против собственных иммуноглобулинов. Возникают аутоиммунные реакции, которые являются частыми осложнениями вирусных инфекций, например развитие орхита при вирусном паротите, миокардита при некоторых энтеровирусных инфекциях.
Таким образом, приобретенный иммунитет, который формируется при вирусных инфекциях, может:
• защищать от повторных заболеваний многие годы или всю жизнь;
• утрачиваться через несколько месяцев, поэтому возможны повторные случаи заболевания (например, вирус гриппа типа В);
• вызывать феномен парадоксального усиления репродукции вирусов;
• обусловливать персистенцию вирусов и появление рецидивов (вирусы герпеса, аденовирусы);
• способствовать развитию аутоиммунных реакций;
• формировать болезни иммунных комплексов.
22.3. Иммунодиагностика вирусных инфекций
Специфичность взаимодействия антигенных детерминант вирусов с иммуноглобулинами используют в целях диагностики вирусных инфекций. Короткий инкубационный и непродолжительный период клинически выраженных проявлений большинства вирусных болезней вызывают необходимость использования методов ускоренной (экспресс) диагностики. В этих целях для идентификации вирусов или их антигенов непосредственно в исследуемом материале от больного разработаны следующие серологические методы: реакции иммунофлюоресценции (прямая — РИФ, непрямая — РНИФ), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция нейтрализации (PH), реакция связывания комплемента (РСК), имму-ноферментный анализ (ИФА) в разных модификациях и др.
Антитела накапливаются в сыворотке крови больного обычно к концу первой недели, когда инфекционный процесс переходит в стадию реконвалесценции. Поэтому серологические методы, которые используют для обнаружения антител, должны быть высокочувствительными и специфичными. Исследуют парные сыворотки. Первый анализ проводят на 5— 6-й день болезни, а повторный — через 2—3 нед. Достоверным считается четырехкратное увеличение титров антител при повторном анализе. Таким образом, окончательные результаты имеют в основном ретроспективное значение. Свежее инфицирование можно установить путем определения изотипов
(классов) иммуноглобулинов. Известно, что IgM являются индикаторами свежего первичного инфицирования, a IgG обнаруживаются в период реконвалесценции или при вторичном иммунном ответе. Для выявления антител используют РТГА, РСК, ИФА, РИФ или РНИФ, радиоиммунный анализ (РИА) И др.
Иммунопрофилактику и иммунотерапию вирусных инфекций проводят, используя вакцины и иммунные противовирусные сыворотки (подробно см. раздел 19.1).
Противовирусные химиотерапевтические препараты (ремантадин А, амантадин, ацикловир, метисазон, зеффикс, арбидол, интерфероны, в том числе генно-инженерные и др.) применяют с целью лечения и профилактики. Они оказывают действие на разные этапы репродукции вирусов.
Гла
а 23
БАКТЕРИОФАГИ
Бактериофаги (фаги) — вирусы бактерий. Они проникают в клетки бактерий и других микроорганизмов и вызывают их гибель.
Бактериофаги были открыты канадским ученым Ф. д’Эр-релем в 1917 г. при исследовании материала от больных дизентерией. В фильтрате испражнений был обнаружен агент, который растворял дизентерийные бактерии. Неоднократно повторив опыты, исследователь предположил, что растворение микробных клеток вызвано организмом, похожим на вирус. До д’Эрреля подобные наблюдения были сделаны Ф. Ту-ортом — английским микробиологом. Еще раньше с явлением растворения бактерий сталкивался русский ученый Н. Ф. Гамалея. Однако д’Эррель сумел выделить «лизирующий агент» в фильтрат и назвал его бактериофагом (от греч. phagos — пожирающий). Явление растворения (лизиса) клеток бактерий фагом получило название бактериофагии.
Позже бактериофаги были обнаружены в других микроорганизмах — актиномицетах (актинофаги), грибах (микофаги). В зависимости от того, из каких бактерий выделяют фаги, различают фаги кишечной палочки, фаги холерного вибриона, фаги брюшнотифозной палочки, фаги стафилококков и т. д.
Фаги, как и все вирусы, являются строгими внутриклеточными паразитами. В связи с этим выделяют две формы существования фагов:
1) элементарную фаговую частицу (внеклеточная, нераз-множающаяся, покоящаяся форма фага);
2) вегетативную, внутриклеточную форму, представленную только нуклеиновой кислотой.
II
Воротничок
A
Чехол
Головка сДНК-
Хвостовые Базальная
пластинка
нити
ШШШШШШШШШШШМШШ/М 'Ш/L
Рис. 23.1. Бактериофаг.
I — различные формы фагов: А — нитевидная; Б — головка с отростком и сократимым чехлом; В — головка с несократимым отростком; Г — головка с коротким отростком. II: А — строение фага; Б— фаг после инъекции ДНК. III — взаимодействие фага с клеткой: 1 — приближение фага к клетке; 2 — адсорбция; 3—5 — сокращение чехла фага и введение ДНК фага в клетку.
Строение фагов. Элементарная фаговая частица в большинстве случаев по форме похожа на головастика (сперматозоидная форма). Она состоит из головки и хвостика, или отростка. Аналогично другим вирусам генетический материал представлен только одной нуклеиновой кислотой—ДНК или РНК (реже). Нуклеиновая кислота окружена белковой оболочкой — капсидом. Вместе они составляют головку фага.
Отросток устроен довольно сложно. В нем различают полый стержень, окруженный сократительным чехлом из белков. Стержень заканчивается пластиной с шипами и отходящими от них нитями (антеннами) или ворсинками, с помощью которых фаг плотно прикрепляется к бактериальной клетке. В базальной пластине и шипах некоторых фагов содержится лизоцим.
Фаги различаются по форме и величине. Размеры головок
крупных фагов — от 50 до 90, а мелких — от 20 до 30 нанометров (см. рис. 23.1).
Длина хвостовых отростков составляет от 100 до 200 нанометров. У некоторых фагов отросток не сокращается.
Известны также фаги, не имеющие отростка. В зависимости от формы и строения ДНК или РНК, капсида и отростка различают 5 морфологических типов фага: 1, 2 и 3-й типы имеют двунитчатую ДНК; 4-й тип — однонитчатую ДНК или РНК и 5-й тип — однонитчатую РНК.
По форме эти организмы бывают нитевидными, сферическими, сложной кубической симметрии.
Бактериофаги не видны в обычном световом микроскопе, и их строение изучают с помощью электронной микроскопии.
Свойства фагов. Фаги достаточно устойчивы к воздействию высокой температуры. Большинство из них переносит нагревание до 60—65 °C и даже до 70 °C.
Фаги хорошо выдерживают низкие температуры. Они не погибают при замораживании до —185 °C. Фаги также длительно сохраняются при высушивании, воздействии 0,5 % раствора сулемы, 1 % раствора фенола и растворов щелочей.
Вместе с тем растворы кислот, 1 % формалина, ультрафиолетовые лучи, ионизирующая радиация убивают фаги через несколько минут.
Распространение фагов. Фаги широко распространены в природе. Они встречаются там, где имеются бактерии: в организме людей и животных, в пищевых продуктах, в объектах внешней среды. В водах рек, морей и сточных водах часто в большом количестве содержатся фаги патогенных микробов (холерные, дизентерийные, сальмонеллезные и др.).
Взаимодействие фага с клеткой. Фаги, как и любые другие вирусы, не могут размножаться и расти на питательных средах. Они размножаются (репродуцируются) внутри клетки-хозяина. Такими клетками являются бактерии различных видов, актиномицеты, грибы.
Процесс воспроизведения фага очень сложен. Схематично он может быть представлен в виде следующих последовательных этапов (рис. 23.1).
• Стадия адсорбции. Фаг адсорбируется на клеточной стенке микроорганизма, где имеются специфические рецепторы. Нити отростка прикрепляются к таким рецепторам. Следует подчеркнуть, что процесс адсорбции фага высокоспецифичен. Он зависит от расположения и химического состава рецепторов. На протопластах, лишенных клеточной стенки, фаги не адсорбируются. При избытке фага на одной бактериальной клетке может адсорбироваться более 100 частиц.
• Проникновение фагов в чувствительную клетку. После адсорбции фага происходит сокращение чехла хвостового отростка. Его стержень продвигается через рыхлые слои клеточ-222
ной стенки и разрушает их фаговым ферментом — лизоцимом. Затем сокращаются белки головки фага и в клетку инъецируется (впрыскивается) фаговая нуклеиновая кислота. Белки оболочки фага остаются снаружи клетки. После проникновения нуклеиновой кислоты фага в клетку-хозяина эта клетка становится иммунной к суперинфекции этим фагом. Другие фаги, адсорбировавшиеся на клетке, не проникают в нее.
• Образование внутри клетки новых фаговых частиц. Это сложный, многоступенчатый процесс. Фаговый геном в зависимости от строения нуклеиновой кислоты взаимодействует с различными участками клеточной ДНК. Процесс взаимодействия фагового генома с ДНК клетки происходит при участии специального белка. Его называют «белком-лоцманом». (На морских и речных судах существует профессия лоцман. Эти специалисты осуществляют наблюдение и проводят корабли через наиболее трудные участки пути.) Так же как у вирусов, процесс воспроизведения фаговых частиц в клетке имеет дисъюнктивный (разобщенный) характер. На заключительном этапе этой стадии происходит сборка фагов. Синтезированные отдельно нуклеиновая кислота фага, капсид и отросток соединяются в единую частицу вириона.
• Разрушение бактериальной клетки и выход зрелых фагов. Продолжительность процесса образования новых фаговых частиц зависит от вида фага и бактерии, состава питательной среды, температуры культивирования. Он может занимать время от нескольких минут до нескольких часов. Фаги, которые вызывают разрушение бактерий, называют вирулентными. Жизненный цикл такого фага является продуктивной инфекцией. Бывает и абортивная инфекция, когда взаимодействие фага с клеткой прерывается на любой из стадий и фаг погибает.
Размножение фагов происходит только в молодых, жизнеспособных клетках микроорганизмов. Разрушение бактерий фагом можно наблюдать в жидких и плотных питательных средах. В жидких средах это выражается в просветлении бульонной культуры в связи с лизисом (растворением) бактериальных клеток. На плотных питательных средах растворение бактерий происходит только в тех местах, на которые попали капельки фага. Через 1 сут здесь появляются так называемые стерильные пятна, т. е. прозрачные зоны отсутствия роста.
Количество вновь образовавшихся фагов (урожайность фага) колеблется от нескольких десятков до нескольких сотен и выражается титром фага. Титр фага — это количество фаговых частиц в единице объема исследуемого образца. Фаг титруют в жидких или на плотных средах с использованием строго специфичных видов бактерий.
Титр фага выражают двумя показателями: количеством активных корпускул бактериофага в 1 мл исследуемой жидкости
и величиной наибольшего разведения жидкости, при котором бактериофаги проявляют свое литическое действие при десятикратном разведении.
Обычно фаги титруют на плотных питательных средах методами агаровых слоев (метод Грациа) или Аппельмана (в жидкой среде).
Одно из основных свойств фага — высокая специфичность. По спектру действия на бактерии различают:
• видовые (моновалентные) фаги. Они взаимодействуют только с определенным видом бактерий. Например, фаги, размножающиеся в клетках возбудителя брюшного тифа, называются брюшнотифозными фагами. Такие фаги используют для определения вида бактерий, выделенных от больных;
• типовые фаги. Это фаги, лизирующие только определенные штаммы или варианты бактерий конкретного вида. Например, отдельные штаммы той же брюшнотифозной палочки лизируются разными типовыми фагами. Типовые фаги применяют для установления внутривидовых различий — определения фаготипа бактерий. Это важно в практике эпидемиологических исследований для установления источника инфекции;
• поливалентные фаги лизируют клетки родственных видов бактерий. Например, поливалентные дизентерийные фаги способны лизировать дизентерийные бактерии различных видов (Флекснера, Зонне, Бойда и др.).
В отличие от вирулентных фагов, разрушающих бактерии, существуют фаги, по-другому взаимодействующие с клеткой. В ряде случаев проникновение генома фага в клетку сопровождается тем, что он встраивается в хромосому бактериальной клетки и сосуществует с ней долгое время, не вызывая гибели. Такие фаги называют умеренными, а нуклеиновая кислота фага, ассоциированная с хромосомой бактериальной клетки,— профагом.
Бактериальные клетки, содержащие профаг, называют лизогенными. Процесс сосуществования генома фага и бактериальной клетки получил название лизогении. Лизогенные бактерии становятся устойчивыми к последующему заражению одноименным фагом. Состояние лизогении стойко передается по наследству. У лизогенных бактерий изменены некоторые свойства (морфология колоний, способность продуцировать токсины и др.). Изменение свойств клетки под действием генов, находящихся в геноме умеренного бактериофага, называют фаговой конверсией.
Под действием различных факторов (УФ- и рентгеновского облучений, химических веществ, температуры и др.) профаг может выходить из хромосомы клетки и вызывать ее лизис. Нередко при таком «уходе» геном фага захватывает близлежащие гены хромосомы бактерии. Проникая в другую бактериальную клетку, такой бактериофаг может передать ей новые 224
признаки. Такой фаг называют трансдуцирующилц а процесс
передачи генетической информации с помощью бактериофага — трансдукцией. Более подробно явление трансдукции из
ложено в разделе «Генетика микроорганизмов».
Практическое применение бактериофагов. Бактериофаги по-
стоянно используются в целях диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний. В целях диагностики
фаги используют для:
• определения вида микроорганизмов, выделенных от больных;
• выделения специфического бактериофага из исследуемого материала больного;
• фаготипирования выделенной бактерии для определения источника инфекции;
• определения загрязненности патогенными бактериями объектов окружающей среды путем обнаружения соответствующих фагов в воде, почве, пищевых продуктах и др.
Фагопрофилактика. Обычно ее проводят в эпидемических очагах и среди контактных лиц. Поскольку фаги воспроизводятся только в специфичных для них микроорганизмах, для профилактики заболевания фаги назначают только тем лицам, которые были в контакте с больным или с инфицированным материалом и могли, таким образом, подвергнуться зараже
нию.
Фаготерапия. Фаги применяют с лечебной целью. Их можно вводить различными способами. Например, при дизентерии, брюшном тифе, сальмонеллезах фаги применяют перорально вместе с другими терапевтическими лечебными препаратами. В некоторых случаях фаги наносят на пораженные микроорганизмами поверхности или вводят в полости. Примером могут служить стафилококковые гнойные инфекции.
Лечебно-профилактические бактериофаги выпускаются медицинской промышленностью в виде жидких или таблетированных форм с указанием способа применения (перорально, для введения в полость). Введенный в организм бактериофаг сохраняется в нем недолго, поэтому при необходимости его вводят повторно.
Фаги, как уже указывалось выше, могут участвовать в передаче генетической информации, и поэтому они нашли применение в генной инженерии.
ПРИЛОЖЕНИЯ
• Приложение 1
Микрофлора желудочно-кишечного тракта человека1
Совокупное число бактерий Желудок 0-103* Тощая кишка 0-105 Слепая кишка 103-10’ Прямая кишка 10'°—1012
Аэробные и
факультативные бактерии
II
Колиформные Стрептококки Стафилококки Лактобациллы Г рибы
0-1 о2
0-1 о3
0-1 о2
0-1 о3
0-1 о2
0-1 о3
0-1 о4
0—103
0-1 о4
0-1 о2
102-107 102—ю7 102—105 102—10s 102—104
104-1010 105-10‘° 104—10’ 10s—1010
104—106
Анаэробные бактерии
Бактероидес Бифидобактерии Стрептококки Клостридии Эубактерии
Редки Редки Редки Редки Редки
0-103
0-104
0—103 Редки Редки
103—107 103—109 102-106 102-104 Редки
10'°—ю12 10s—ю1* 1010—1012 106-10" ю’-ю12
* Совокупное число бактерий в 1 мл или 1 г содержимого кишечника.
1 Simon G. L., Gorbach S. L. Intestinal microflora: Symposium of intestinal infections // Med. Clin. North. Amer. - 1982. - Vol. 66, N 6. - P. 557.
Приложение 2
Содержание микроорганизмов в кишечнике человека в норме
Тип микрофлоры
Количество микроорганизмов в 1 мл содержимого
у детей у взрослых
Бифидоподобные Бактероидоподобные
Анаэробные кокки Прочие анаэробы Клостридии Лактобактерии Кишечная палочка Фекальные стрептококки
Облигатная
10’-10'° 10’-10'°
108-10’
До 10’
До 103
>108 108—10'° До 106
>108 10’—10'° 108-10’ До 10’ До 105 106— 1 о7 106— 1 о7 До 106
Тип микрофлоры
Количество микроорганизмов в 1 мл содержимого
у детей
у взрослых
Факультативная
Кишечная палочка (E.coli): гемолизирующая метаболически неактивная Стафилококки
Протей
Клебсиелла (K.pneumoniae, K.oxyloca)
Enterobacter aerogenes Синегнойная палочка
Грибы кандида (Candida spp.) Прочие микроорганизмы
О До 10 % 0 0
0 До 101 2 3 0 0
До 103
0
До 10 % До 103 0
0
До 103 0 0
До 103
Приложение 3
Нормативы безопасности питьевой воды в эпидемическом отношении по микробиологическим и паразитологическим показателям (по методическим указаниям «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды» МУК 4.2.1018-01)
Показатель
Единица измерения
Нормативы
Термотолерантные колиформные бактерии Общее количество колиформных бактерий2 Общее микробное число2
К олиф аги3
Споры сульфитредуци-
рующих клостридий4
Цисты лямблий3
Число бактерий в 100 мл1 То же
Число образующих колонии бактерий в 1 мл Число бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 100 мл
Спор в 20 мл
Цист в 50 л
Отсутствие бактерий
То же
Не более 50 колоний Отсутствие коли фагов
Отсутствие клостридий
Отсутствие цист
1 Трехкратно исследуют по 100 мл отобранной пробы воды.
2 Превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водоразбора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 мес, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год.
3 Определяют только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть.
4 Определение проводят при оценке эффективности технологии обработки воды.
Критерии оценки микробной обсемененности воздуха помещений аптек
Помещение
Условия работы
Общее количество колоний микроорганизмов в 1 м3 воздуха
Количество золотистого стафилококка в 1 м3 воздуха
Количество плесневых и дрожже-подобных грибов в 1 м3 воздуха
Асептический блок, стерилизационная (чистая половина) Ассистентская, фасовочная, де-фектарная, материальная Моечная
Зал обслуживания
До работы
После работы До работы После работы
Во время работы
То же
Не более 500
» » 1000
» » 750
» » 1000
Не должно быть в 250 л То же
» »
» »
Не должно быть в 250 л То же
» »
» »
» » 1000 » » До 12
» » 1500 До 100 До 20
Приложение 5
Пробиотики — препараты нормофлоры
Пробиотики — препараты нормальной микрофлоры тела человека. Их готовят на основе чистых культур микроорганизмов, входящих в состав нормофлоры. Пробиотики (их иногда называют эубио-тиками) широко используются для восстановления нормофлоры кишечника, лечения острых кишечных инфекций, пищевых токсико-инфекций, дисбиозов. Их применяют также после ряда операций (постгастрорезекционные расстройства, состояния после холецистэктомии и др.). Некоторые пробиотики дают хороший терапевтический эффект при лечении ожоговых и раневых поверхностей. Препараты нормофлоры используют в гинекологии для профилактики и лечения клинически выраженных дисбактериозов женских гениталий, коль
питов, связанных с гонококковой, трихомонадной и другими инфекциями. Их назначают при подготовке к плановым операциям и предродовой подготовке беременных из групп риска с воспалительными заболеваниями.
Пробиотики являются незаменимыми средствами для восстановления количественного и качественного состава микрофлоры после окончания курса антибиотикотерапии. В ряде случаев их добавляют в состав смесей для лечебного питания (в том числе в состав молочных продуктов для детей в возрасте до 1 года). Ниже приведены сведения о наиболее распространенных препаратах нормофлоры, поступаю
щих в аптечную сеть.
• Колибактерин приготовлен из лиофильно высушенной массы
живых микробных клеток кишечной палочки — штамма Escherichia coli М-17. Лечебный эффект обусловлен антагонистическим действием штамма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Выпускается в ампулах и флаконах, а также в таблетках. Применяется для лечения дисбактериоза и кишечных инфекций.
• Споробактерин жидкий представляет собой взвесь биомассы живых бацилл Bacillus subtilis 534, которые выделяют антибактериальное вещество широкого спектра действия, подавляющее патогенные и условно-патогенные бактерии, не угнетая нормофлору кишечника. Продуцирует также протеолитические ферменты, лизоцим, липазы, амилазы и тем самым способствует перевариванию и усвоению
пищи, очищению ран, воспалительных очагов от некротизированных тканей. Применяется для лечения острых бактериальных кишечных инфекций, дисбактериозов, хирургических инфекций мягких тканей, остеомиелита, а также для профилактики и лечения осложнений, вы
званных условно-патогенными микроорганизмами, в хирургической
и акушерско-гинекологической практике.
Бифидумбактерин. Содержит лиофильно высушенную массу
живых клеток Bifidumbacterium bifidum штаммов № 1, 791 или ЛВА-
3. Бифидобактерии обладают высокой антагонистической активно
стью против многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Препарат выпускается в форме порошка, таблеток, капсул, суппозиториев. Применение бифидумб актер ина позволяет нормали
зовать деятельность желудочно-кишечного тракта, улучшить обменные процессы, повысить не специфическую резистентность организма. Бифидумбактерин применяют для лечения кишечных инфекций, дисбактериозов, в комплексе с другими препаратами используют для лечения больных (особенно детей) пневмонией, сепсисом и другими гнойно-воспалительными инфекционными заболеваниями. В акушерстве и гинекологии бифидумбактерин используют для лечения и профилактики дисбактериозов, вагинозов и кольпитов различной этиологии, а также маститов у кормящих матерей.
• Пробифор — новая лекарственная форма бифидумбактерина, содержащая в одном порошке в 10 раз больше клеток бифидобактерий. Применяется аналогично бифидумбакгерину для лечения кишечных инфекций и дисбактериозов, а также после абдоминальных
операций.
Бифидумбактерин-100. Таблетированный препарат из бифидо-
бактерий. Один из вариантов препарата бифидумбактерина. Приме-
няется аналогично.
Бифиформ. Содержит чистые культуры бактерий двух видов в
равных соотношениях: Bifidobacterium longum и Enterococcus faecium.
Выпускается в капсулах. В препарат введена также сухая молочная закваска, и он может быть использован для приготовления молочнокислого продукта для лечебного питания. Применяется для преду-
преждения и лечения кишечных расстройств и нормализации микро-
флоры кишечника.
Бификол. Приготовлен из лиофильно высушенной в среде
культивирования микробной массы живых антагонистически активных штаммов Bifidobacterium bifidum I и Escherichia coli М-17. Вы
пускается в таблетках, флаконах и капсулах. Применяется для лечения больных хроническими колитами разной этиологии на фоне дисбактериоза и реконвалесцентов после острых кишечных инфекций с дисфункцией кишечника.
и лизоцим. Антагонистическая активность бифидобактерий в сочета-
нии с лизоцимом — естественным фактором защиты усиливает действие препарата. Применяется для профилактики и лечения дисбактериоза различного генеза, лечения острых кишечных инфекций и острых и хронических воспалительных заболеваний желудочно-ки-
шечного тракта.
• Бактисубтил. Выпускается в капсулах. Содержит споры Bacillus cereus штамм IP5832. Показан при лечении кишечных расстройств различной этиологии, особенно дисбактериоза вследствие лечения антибиотиками.
• Линекс — комбинированный препарат из 3 компонентов микробной флоры различных отделов кишечника: Bifidobacterium intantis var. liberorum, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium. Выпускается в капсулах. Живые лиофилизированные бактерии указанных видов резистентны к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам. Линекс применяют при дисбактериозах. Можно назначать линекс в сочетании с антибиотиками, поскольку штаммы-пробиотики
устойчивы к ним.
• Энтерол 250. Под таким названием препарат поступает в аптеки. Более известен в мире как «Сахаромицес буларди» — это непатентованное международное название. Основной компонент — лиофилизированные клетки дрожжей Saccharomyces boulardii. Выпускается в капсулах и порошках. Рекомендован для лечения и профилак
тики кишечных расстройств различной этиологии.
• Гастрофарм. Содержит лиофильно высушенные живые клетки Lactobacillus bulgaricus штамм 51/1 В-51, продукты жизнедеятельности которых (молочная, яблочная кислоты, нуклеиновые кислоты, полипептиды, полисахариды, белки) оказывают благоприятное воздействие на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта. Рекомендуется применять гастрофарм для лечения гастритов, язвенной бо
лезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Выпускается в таблетках.
• Ацил акт представляет собой микробную массу живых, лиофильно высушенных бактерий Lactobacillus acidophilus, обладающих антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микробов. Выпускается в свечах. Рекомендуется для ле-
чения клинически выраженных дисбактериозов женских гениталий.
СКБ «Наринэ» — сухая биомасса культуры «Наринэ». Лиофили-
зированная биомасса живых клеток Lactobacillus acidophilus Еч 317/ 402. Выпускается в капсулах. Применяется для лечения кишечных
инфекций, дисбактериоза, а также в виде водных растворов наружно для лечения ожоговых ран и гнойных раневых поверхностей. Штамм обладает высокой антибиотической активностью. Кроме того, содер
жащиеся в капсулах микроорганизмы вносят в качестве закваски в молоко для получения молочнокислого продукта для детского лечебного питания (грудные дети) и для взрослых с заболеваниями желудочно-кишечного тракта.
Основные цитокины
[по А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл, 2000]
Цитокин
Клетки иммунной системы — продуценты
Другие клетки
Главные клетки-мишени
Основные эффекты
ИЛ-1а, ил-ip
ИЛ-2
ИЛ-3
ИЛ-4
ИЛ-5
ИЛ-6
ИЛ-7
ИЛ-8
ИЛ-9
Макрофаги, БГЛ, В-клетки
Эндотелий, фибробласты, астроциты и др.
Т-клетки
Т-клетки
Т-клетки
Т-клетки
Т-клетки, В-клетки
Моноциты
Т-клетки
Стволовые клетки
Фибробласты, макрофаги Стромальные клетки костного мозга Фибробласты
Т-клетки, В-клетки, макрофаги, эндотелий, клетки тканей
Т-клетки
В-клетки, Т-клетки
В-клетки
В-клетки, гепатоциты
Пре-В-клетки, Т-клетки
Нейтрофилы, базофилы, Т-клетки, карати-ноциты
Активация лимфоцитов, стимуляция макрофагов, усиление адгезии лейкоцитов/эндо-телиальных клеток, гипертермия, продукция белков острой фазы Пролиферация и дифференцировка Т-кле-ток, активация цитотоксических лимфоцитов и макрофагов Полипотентный колониестимулирующий фактор
Фактор роста В-клеток, селекция изотипов — стимуляция синтеза IgE и IgGl Фактор роста и дифференцировки В-клеток, стимуляция синтеза (селекция) IgA Дифференцировка В-клеток, индукция синтеза белков острой фазы Пролиферация В- и Т-клеток
Хемотаксис, ангиогенез, выделение супероксидного радикала, дегрануляция
Повышение выживаемости Т-клеток, активация тучных клеток, синергичное действие с эритропоэтином
Цитокин
ИЛ-10
ИЛ-11
ИЛ-12
ИЛ-13
ИЛ-14
ИЛ-15
ИЛ-16
ИЛ-17
ИЛ-18
ФНОа
Клетки иммунной систе-мы — продуценты
Т-клетки
Моноциты Активированные Т-клетки
Т-клетки
Моноциты
Эозинофилы, Т-клетки CD8+ Т-лимфоциты CD4+
М акрофа-ги, тучные клетки, лимфоциты
Другие клетки
Стромальные клетки костного мозга
Эпителий, мышечные клетки
Гепатоциты
Главные клетки-мишени
Тх1-клетки
Гемопоэтические предшественники остеокластов
Т-клетки
Моноциты, В-клетки
Т-клетки, активированные В-клетки Т-клетки CD4+
Эпителий, фибробласты, эндотелий
Мононук-леары периферической крови Макрофаги, гранулоциты, клетки тканей
Основные эффекты
Ингибирование синтеза цитокинов Образование остеокластов, колониестимулирующий фактор, повышение числа тромбоцитов in vivo, подавление продукции провос-палительных цитокинов
Индукция Тх1-клеток
Рост и дифференцировка В-клеток, подавление продукции про-воспалительных цитокинов
Стимулирует пролиферацию активированных В-клеток, ингибирует секрецию 1g Пролиферация
Хемотаксис Т-клеток CD4+
Высвобождение ИЛ-6, ИЛ-8, Г-КСФ, ПГЕ2, повышение уровня ICAM-1, стимуляция способности фибробластов поддерживать рост СО34+-предшест-венников Индуцирует продукцию ИФу, повышает активность НК-клеток
Активация макрофагов, гранулоцитов и цитотоксических клеток, усиление адгезии лейкоцитов/энд отели-
Цитокин
Клетки иммунной системы — продуценты
Другие клетки
Главные клетки-мишени
Основные эффекты
ФНОр (ЛТ) ИФа
ИФр
ИФу
М-КСФ
Г-КСФ
ГМ-КСФ
MIF
Лимфоциты Лейкоциты
Т-клетки, НК-клетки
Моноциты
Макрофаги Т-клет-ки, макрофаги
Т-клетки
Эпителий, фибробласты
Фибробласты, эпителий
Эпителий, фибробласты
Эндотелий, фибробласты Фибробласты Эндотелий, фибробласты
Клетки тканей
Клетки тканей, лейкоциты
Лейкоциты, клетки тканей, Тх2-клетки
Стволовые клетки
Макрофаги
альных клеток, кахексия, гипертермия, индукция синтеза белков острой фазы, стимуляция ангиогенеза, повышение продукции МНС-антигенов класса II
Аналогично ФНОа
Индукция синтеза МНС-антигенов класса I, антивирусный эффект, стимуляция НК-клеток, антипролифе-ративный эффект, стимуляция продукции ИЛ-12 и функций Тх1-клеток
Индукция синтеза МНС-антигенов класса I, противовирусный и антипролифератив-ный эффекты Индукция синтеза МНС-антигенов классов I и II, активация макрофагов, адгезия клеток эндотелия/лим-фоцитов, синтез цитокинов макрофагами, противовирусный и а нтипр олиф ер ативный (Тх1 -клетки) эффекты Пролиферация предшественников макрофагов
f
Стимуляция деления и дифференцировки Активатор пролиферации предшественников гранулоцитов и макрофагов Торможение миграции
Клетки иммун-Цитокин ной систе мы — про дуценты
MCP-I Моноци- Эпитеты лий
Другие клетки
Главные клетки-мишени
Основные эффекты
М1Р-1а
Т-клетки, моноциты , нейтрофилы
RANTES Т-клетки
Эотаксин
IP-10
Моноциты То же
Фибробласты
Моноциты, Т-клетки, тучные клетки, базофилы, стволовые клетки Моноциты, Т- и В-клетки, НК-клетки, тучные клетки, эозинофилы, дендритные клетки, стволовые
клетки Моноциты, Т-клетки, НК-клетки, эозинофилы, базофилы, дендритные клетки Эозинофилы
Т-клетки, НК-клетки, эндотелиальные клетки
Хемотаксис, адгезия, высвобождение гистамина, подавление колони е образования
Хемотаксис, вспышка клеточного дыхания, адгезия, подавление колониеобразования
Хемотаксис, высвобождение гистамина
Хемотаксис
Хемотаксис, цитолитическая активность, подавление ангиогенеза
Сокращения: ИЛ — интерлейкин; ФИО — фактор некроза опухолей; ИФ —
интерферон; М-КСФ — макрофагальный колониестимулирующий фактор; Г-
КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; ГМ-КСФ — гра-
нулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий
фактор; M1F — фак-
si
тор, ингибирующий миграцию макрофагов; МСР — хемотаксический белок макрофагов; MIP—воспалительный белок макрофагов; RANTES, от Regulat-
ed on Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted хемокин, выделяемый неиммунными T-клетками при активации.
Диагностическое значение изменения лейкограммы при патологических процессах, сопровождающихся иммунной недостаточностью
[цит. по К. А. Лебедеву, И. Д. Понякиной, 1990]
Показатель
Нейтрофильный лейкоз
Лимфоцитарный лейкоз
Моноцитарный лейкоцитоз
Лейкопения за счет нейтропении
Лейкопения за счет лимфопении Моноцитоз
Моно цитопения Нейтрофилия без сдвига влево (палочкоядерная нейтрофилия 1—5 %) Нейтрофилия с умеренным сдвигом влево (палочкоядерная нейтрофилия более 5 %) Нейтрофилия с выра-
женным сдвигом влево Нейтропения со сдвигом вправо
Эозинофилия (более
5 %)
Патологический процесс, заболевание
Острые инфекционные и хронические заболевания
Приступы протозойных инфекций Хронический и острый миелолейкоз Злокачественные новообразования Процессы, происходящие в ранний послеоперационный период
Острые кровопотери
Ожоги
Радиационное поражение (ранняя фаза) Воспалительные заболевания (последняя фаза)
Некоторые инфекции (коклюш, паротит)
Хроническая лучевая болезнь Инфекционный мононуклеоз Моноцитарный лейкоз Гельминтоз ы
Эозинофильная инфильтрация органов
(пневмония)
Тяжелые воспалительные заболевания
(сепсис)
Авитаминозы (цинга, пеллагра)
Хроническая бензольная интоксикация
Дефицит витамина В12
Лучевая болезнь (тяжелая форма) Цитостатическая болезнь
Острые и хронические инфекции Инфекционный мононуклеоз
Тяжелые септические процессы Тяжелые септические процессы Ранние стадии неосложненных опухолей
Местные инфекционные процессы Затяжной сепсис
Распадающиеся опухоли
Обширные воспалительные процессы
В12-дефицитные анемии и другие авитаминозы
Кахексия, голодание
Разгар инфекционных заболеваний
Глистная инвазия
Показатель
Эозинопения
Базофилия
Патологический процесс, заболевание
Аллергические заболевания
Начало воспалительного процесса Интоксикация тяжелыми металлами Эритродермия
Приложение 8
Карта иммунологического обследования (тесты 1-го уровня)
Ф. И. О. больного
Возраст
Диагноз:
Показатель
Лейкоциты
Нейтрофилы:
палочкоядерные
сегментоядерные
Лимфоциты
Эозинофилы
Базофилы
Моноциты
Фагоциты
IgG
IgA
IgM
IgE
Компоненты комплемента:
СЗ
С4
CD3
CD2
CD4
CD8
CD16
В-лимфоциты
Единица измерения
кл/мкл
%
кл/мкл
% кл/мкл
% кл/мкл
%
кл/мкл
% кл/мкл
%
кл/мкл
% мг% мг% мг% МЕ/мл
мг% мг%
% абс. число
%
абс. число
% абс. число
% абс. число
% абс. число
% абс. число
Норма
Дата обследования
4000-7000
1-5 40-300 47-72 2000-4000 19-37 1600-2400 0,5-5,0 20-300
0-1 0-70
3-6 90—300 40-82 700-2200 70-350 50-250 До 120
85—93 12-36 55-80 800-2000
68—88 1100-2500
31-49 600-1600
19-37 300-800
5-19 100-340
5-19 120-270
Показатель Единица измерения Норма Дата обследования
HLA-DR CD4/CD8 % абс. число 5-15 100-500 1,2-2,5
Приложение 9
Календарь профилактических прививок России (2002)
[по В. К. Таточенко, Н. А. Озерецковскому, 2003]
Возраст
Наименование прививки
12 ч
3—7-й день i мес
3 мес
4,5 мес
6 мес
12 мес
18 мес
20 мес
6 лет
7 лет
13 лет
14 лет
Взрослые
Первая вакцинация — гепатит В1 2 3 4
Вакцинация — туберкулез6
Вторая вакцинация — гепатит В
Первая вакцинация — дифтерия, коклюш, столбняк, полиомиелит
Вторая вакцинация — дифтерия, коклюш, столбняк, полиомиелит
Третья —дифтерия, коклюш, столбняк, полиомиелит Третья вакцинация — гепатит В
Вакцинация — корь, эпидемический паротит, краснуха5 Первая ревакцинация — дифтерия, коклюш, столбняк, полиомиелит
Вторая ревакцинация — полиомиелит
Вторая вакцинация — корь, эпидемический паротит, краснуха5
Вторая ревакцинация — дифтерия и столбняк
Первая ревакцинация — туберкулез3,6
Вакцинация против вирусного гепатита В7
Вакцинация против краснухи (девочки)
Третья ревакцинация— дифтерия, столбняк, полиомиелит
Ревакцинация — туберкулез4,6
Ревакцинация — дифтерия и столбняк каждые 10 лет после последней ревакцинации
1 Прививки в рамках Национального календаря проводят вакцинами отечественного и зарубежного производства, зарегистрированными и разрешенными к применению в установленном порядке.
2 Детей, родившихся от матерей—носителей вируса гепатита В или больных гепатитом В в 111 триместре беременности, прививают по схеме 0—1—2— 12 мес.
3 Ревакцинируют детей, не инфицированных туберкулезом, с отрицательной реакцией Манту.
4 Ревакцинируют детей, не инфицированных туберкулезом, с отрицательной реакцией Манту, не получивших прививку в 7 лет.
5 При отсутствии комбинированных вакцин прививки против кори, эпиде-
мического паротита и краснухи проводят в один день разными шприцами в
разные участки тела.
6 Все препараты, применяемые в рамках Национального календаря, положенные по возрасту, можно вводить одновременно разными шприцами в разные участки тела. Однако во избежание контаминации недопустимо совмещение в один день прививки против туберкулеза с другими парентеральными манипуляциями.
7 Вакцинацию против гепатита В в 13 лет проводят детям, ранее не привитым по схеме 0—1—6 мес.
Приложение 10
Перечень зарубежных вакцин и иммуноглобулинов, зарегистрированных в Российской Федерации (на январь 2003 г.)
[по В. К. Таточенко, Н. А. Озерецковскому, 2003]
Русское название
Фирменное название
Профилактика
«Авентис Пастер» (Франция)
Аваксим
Акт-Хи б
Avaxim
Act-HIB
Ваксигрипп
Д. Т Вакс Имовакс Д. Т.
Адюльт Имовакс Полно
Vaxigrip DT Vax Imovax D. T. Adult
Imovax Polio
Имогам Раж
Менинго A+C
Пневмо 23
Полно Сэбнн Веро
Рувакс
Рудивакс
Тетракок 05
Тнфим Вен
IMOGAM Rabies Meningo A+C vaccine
Pneumo 23
Vaccine Sabin Poli-omielitique
Rouvax
Rudi vax
Tetracoq 05
Typhim Vi
Гепатит A
Гемофильная инфекция типа b
Грипп
Дифтерия и столбняк <6 лет
Дифтерия, столбняк > 6 лет
Полиомиелит — инактивированная
Бешенство — ИГ
Менингококковая инфекция А+С
Пневмококковая инфекция
Полиомиелит (живая)
Корь
Краснуха
КДС + полиомиелит
Брюшной тиф
«Бакстер» (Австрия)
ФСМЕ-Иммун ин-жект ФСМЕ-Булин Эндо бул ин
FSME-Immun inject
FSME-Bulin
Endobulin
Клещевой энцефалит
Клещевой энцефалит — ИГ ИГ для внутривенного введения
Г епатект
Приорикс Твинрикс* Тританрикс*
Биотест фарма Гмбх (ФРГ)
| Hepatect | Иммуноглобулин В ГВ
«ГлаксоСмитКляйн» (Англия)
Pnorix
Twinrix
Tritanrix
Корь, краснуха, паротит Гепатит А + гепатит В КДС + гепатит В
Русское название
Фирменное название
Профилактика
Флюарикс Хаврикс 720 Хаврикс 1440 Хиберикс*
Энджерикс В Эрвевакс
Агриппал SI Бегривак Рабипур Энцепур для взрослых Энцепур для детей
Эувакс В
В акта ММР НВ-Вакс
Краснушная вакцина
Вакцина против кори, паротита и краснухи
Инфлювак
Шанвак-В
Эбербиовак
Fluarix
Havrix 720
Havrix 1440
Hiberics
Engerix-B
Ervevax
Грипп
Гепатит А у детей
Гепатит А у взрослых
Гемофильная инфекция типа
В
Гепатит В
Краснуха
«Кайрон-Беринг» (Германия)
Agrippal SI Begrivac Rabipur Encepur
Грипп
»
Бешенство
Клещевой энцефалит (более 12 лет)
Клещевой энцефалит (1—11 лет)
«L G Кемикал Лтд» (Корея)
| Euvax | Гепатит В
«Мерк Шарп и Доум» (США)
Vaqta
M-M-R II
H-B-VAX II
Гепатит А
Корь, паротит и краснуха
Гепатит В
«Серум Инститьют» (Индия)
Краснуха
Корь, краснуха, паротит
«Солвей Фарма» (Голландия)
| Influvac | Грипп
«Шанта Биотекникс ПВТ Лтд»
| Shanvac В | Гепатит В
«Эбер Биотек» (Куба)
Heberbiovac НВ Гепатит В
* В настоящее время проходят регистрацию.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ СТУДЕНТОВ к
Систематика и классификация бактерий. Морфология бактерий грибов, простейших
1. Какие методы используют при изучении морфологии микроорганизмов?
2. На основании каких признаков определяют таксономическое положение бактерий?
3. Перечислите основные таксономические системы бактерий.
4. Что такое клон, чистая культура, штамм?
5. На основании каких свойств или признаков выделяют варианты бактериальных культур?
6. В чем состоят различия клеток эукариот и прокариот?
7. Какие функции в бактериальной клетке выполняют капсула, клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана?
8. С помощью каких органелл передвигают бактерии?
9. Как располагаются жгутики у монстриков, лофотрихов, амфитрихов и перитрихов?
10. В чем состоят особенности строения нуклеоида бактериальной клетки?
11. При каких условиях наблюдается процесс капсулообразования у бактерий (сапрофитных и патогенных)?
12. Какие структурные элементы клетки бактерий определяют окраску по Г раму?
13. Укажите различия в структуре и составе клеточной стенки грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий.
14. Какую роль играют бактериальные споры и как они образуются?
15. Что такое L-формы бактерий?
16. Отметьте черты сходства и различия между протопластами и сферопла-стами.
17. Назовите основные формы бактерий.
18. Перечислите бактерии шаровидной формы.
19. В чем состоят различия у бактерий и бацилл?
20. Назовите патогенные диплококки.
21. Перечислите бактерии, имеющие изогнутую форму.
22. Назовите известные вам патогенные бактерии, имеющие изогнутую форму.
23. К какому царству — эукариот или прокариот — относятся грибы?
24. Отметьте особенности строения клеточной стенки у грибов.
25. Перечислите способны размножения грибов.
26. В чем заключается способ размножения грибов почкованием?
27. Как называется клетка у грибов?
28, Что такое мицелий?
29. Какие признаки учитывают при классификации грибов?
30, Перечислите различия высших и низших грибов.
31. В чем заключаются различия в функциях спор у бактерий и грибов?
32. Отметьте различия в строении органов бесполого размножения у грибов рода Mucor, Penicillium и Aspergillus.
33. Какое количество ядер содержат клетки грибов?
34. Какой мицелий называется септированным?
35. Перечислите основные таксономические системы в классификации грибов.
36. К какому классу относится большинство патогенных грибов?
37. К какому царству относятся простейшие?
38. Охарактеризуйте тип строения клетки простейших.
39. Что такое пелликула?
40. С помощью каких органелл передвигаются простейшие?
41. Перечислите структурные особенности клетки простейших.
42. Какую роль играет циста в жизненном цикле некоторых простейших?
43. Какие структуры клетки простейших аналогичны или близки к структурам многоклеточных животных организмов?
44. Перечислите способы размножения различных простейших.
45. Назовите простейших, патогенных для человека.
Физиология бактерий
1. Как называются бактерии, которые в качестве источника энергии используют солнечный свет?
2. В чем различия катаболизма и анаболизма?
3. Найдите различия между автотрофными и гетеротрофными микроорганизмами.
4. Перечислите основные химические элементы, входящие в состав бактериальной клетки.
5. Каковы различия в источниках питания паразитов и сапрофитов?
6. Какие бактерии называют ауксотрофными?
7. Охарактеризуйте пути поступления питательных веществ в клетку бактерии.
8. В чем заключается функция пермеаз?
9. Определите различия между пассивной и облегченной диффузией.
10. Какую роль играют экзоферменты в питании бактерий?
11. Укажите путь размножения проникновения питательных веществ в клетку, при котором требуется затрата энергии.
12. Чем различаются конститутивные и индуцибельные ферменты?
13. С какой целью проводят изучение сахаролитических и протеолитических свойств микроорганизмов?
14. Как подразделяют бактерии по типу дыхания?
15. Назовите тип дыхания, при котором акцептором электронов служит свободный молекулярный кислород.
16. Определите различия между облигатными и факультативными анаэробами.
17. Какие соединения акцептируют электроны при брожении?
18. Приведите примеры естественных и искусственных питательных сред.
19. Какой ингредиент и в каком количестве добавляют для получения плотной питательной среды?
20. Назовите микроорганизмы, которые не культивируются на искусственных питательных средах.
21. С какой целью используют дифференциально-диагностические среды?
22. Как классифицируют питательные среды по назначению?
23. Дайте определение росту и размножению бактериальной клетки.
24. Каким способом размножаются бактерии?
25. Что называют временем генерации?
26. Перечислите последовательность фаз при выращивании бактерий в жидкой питательной среде (в статической культуре).
27. Перечислите признаки, характеризующие колонию бактерий.
28. Охарактеризуйте признаки роста бактерий на жидких питательных средах.
29. Назовите прибор, с помощью которого создаются анаэробные условия.
30. Какие признаки характеризуют S- и R-формы колоний?
31. Какие требования предъявляются к составу питательных сред?
Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы
1. Какие группы микроорганизмов выделяют в зависимости от показателей оптимальной температуры их роста?
2. Перечислите методы стерилизации с помощью высокой температуры.
3. Укажите объекты, подлежащие пастеризации, температуру, при которой
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10. И.
12.
13.
ее проводят, и продолжительность.
Какие питательные среды стерилизуют дробным методом?
В каком аппарате проводят стерилизацию сухим жаром?
В каких случаях применяют метод тиндализации?
Укажите температуру, которая создается в автоклаве при давлении 0,5
атм.
Перечислите физические методы стерилизации.
Назовите несколько химических веществ, наиболее часто применяемых для дезинфекции.
Как влияет на микроорганизмы изменение влажности окружающей среды?
Что такое асептика?
С именами каких ученых связано введение методов асептики в медицинскую практику?
Что такое антисептика?
Назовите формы (типы) взаимоотношений между различными группами
микроорганизмов.
Какая форма взаимоотношений между организмами называется симбио-
зом?
Приведите пример метабиоза в отношениях микроорганизмов.
Какие микроорганизмы называют комменсалами?
При какой форме взаимоотношений один из видов микроорганизма усиливает активность другого вида?
Перечислите типы антагонистических взаимоотношений между микро-
организмами.
Какое давление оказывает существенное влияние на бактерии — атмо-
сферное или осмотическое?
Роль микроорганизмов в природе и их распространение
Какую роль играют микроорганизмы в круговороте углерода?
Перечислите последовательность этапов превращения азотсодержащих веществ микроорганизмами (круговорот азота).
Какая форма взаимоотношений между организмами проявляется в про-
цессе круговорота азота?
Какую роль играет нормальная микрофлора тела в жизни человека?
Укажите различия между резидентной и транзиторной микрофлорой че
ловека.
Какие факторы влияют на изменение видового и количественного состава нормофлоры человека?
Какие различия в составе микрофлоры отмечаются в различных отделах кишечника?
Чем обусловлено незначительное содержание микроорганизмов в желудке?
В состав какого биотопа организма человека входят микроорганизмы, обеспечивающие колонизационную резистентность?
Что такое селективная деконтаминация?
Какие микроорганизмы — аэробные или анаэробные — удаляют из биотопа при селективной деконтаминации?
Что такое эубиоз?
Какие изменения происходят при дисбиозе?
Определите различия между дисбиозом и дисбактериозом.
15. Какие препараты назначают для восстановления нормальной микрофлоры?
16. Назовите несколько наиболее распространенных эубиотиков.
17. Существуют ли различия между эубиотиками и пробиотиками?
18. Как называются препараты, приготовленные из микроорганизмов, входящих в состав нормофлоры?
Микробиология животного и растительного лекарственного сырья
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Назовите несколько лекарственных препаратов, приготовленных из животного сырья.
Какие препараты получили название "галеновые"?
Разрешается ли использование органов и тканей, полученных от больных животных, для приготовления лекарственного сырья и препаратов? На каких этапах приготовления лекарственных форм из животного сырья существует опасность его загрязнения?
Зависит ли состав микрофлоры животного от его вида?
Какие микроорганизмы относят к эпифитным?
Назовите различия ризосферы и ризопланы?
Отчего зависит состав эпифитной микрофлоры растений?
Как называется симбиоз мицелия грибов с корневой системой растений? Бактерии какого вида доминируют в составе эпифитной микрофлоры? Какие микроорганизмы называют фитопатогенными?
Приведите примеры поражения растений фитопатогенными микроорга
низмами.
Какие правила необходимо соблюдать при сборе, транспортировке и хранении растительного лекарственного сырья?
По каким признакам можно определить испорченное лекарственное животное и растительное сырье и готовые формы?
Назовите допустимое количество микроорганизмов в лекарственных препаратах растительного происхождения, выпускаемых в таблетированной форме.
Какие препараты, приготовленные из животного и растительного сырья, должны быть стерильными?
Санитарная микробиология
1. Назовите цели и задачи санитарной микробиологии.
2. Какие микроорганизмы называют санитарно-показательными?
3. Дайте характеристику БГКП (бактерий группы кишечной палочки) и назовите виды микроорганизмов, входящих в эту группу.
4. Наличие каких бактерий свидетельствует о свежем фекальном загрязнении воды?
5. Какие показатели определяют при санитарно-микробиологическом исследовании воды?
6. Что такое "микробное число” и как его определяют?
7. Какой метод используют для выявления БГКП в воде?
8. Для каких целей используют методы Коха и Кротова?
9. Назовите санитарно-показательные микроорганизмы, по наличию которых в воздухе можно оценить его чистоту?
10. В чем заключается аспирационный метод и с какой целью его используют?
11. На каких средах культивируют БГКП?
12. Какие объекты и предметы подлежат исследованию в помещениях аптек при санитарко-микробиологическом контроле?
Антимикробные препараты (антибиотики)
1. Назовите имя исследователя, открытие которого послужило основой для получения антибиотиков.
2. В каком году был получен препарат "Пенициллин"?
3. Дайте классификацию антибиотиков по их биологическому происхождению.
4. Назовите несколько антибиотиков, выделенных из актиномицетов.
5. Какой микроорганизм является продуцентом первого выделенного антибиотика?
6. Какие антибиотики продуцируются животными организмами?
7. Что такое фитонциды?
8. Дайте классификацию антибиотиков по механизму действия.
9. С какой целью применяют антибиотики в медицине и ветеринарии?
10. Охарактеризуйте бактериостатическое и бактерицидное действие антибиотиков.
11. Какими методами определяют чувствительность микроорганизмов к антибиотикам?
12. Назовите диаметр зоны задержки роста микроорганизма, чувствительного к антибиотику?
13. Какой диаметр зоны задержки роста свидетельствует об отсутствии чувствительности к нему микроорганизма?
14. Дайте классификацию антибиотиков по химическому составу.
15. Как различаются антибиотики по спектру действия?
16. Перечислите несколько антибиотиков широкого спектра действия.
17. Охарактеризуйте способы получения антибиотиков.
18. Каким способом получают антибиотики 1-го, 2-го, 3-го и последующих поколений?
19. Назовите несколько противогрибковых антибиотиков.
20. Действие каких антибиотиков приводит к образованию L-форм бактерий?
21. Укажите последовательность основных этапов получения антибиотиков из природных продуцентов.
22. Назовите осложнения, наиболее часто возникающие в макроорганизме при лечении антибиотиками.
23. Какие изменения возникают у микроорганизма при воздействии на него антибиотиков?
24. С какими формами изменчивости связано появление резистентных форм микроорганизмов?
25. Какими способами микроорганизм защищается от воздействия антибиотиков?
26. Какую роль играет пенициллиназа?
27. Что такое "эффлюкс"?
28. Назовите плазмиды, участвующие в формировании антибиотикорезистентных микроорганизмов.
29. Перечислите пути преодоления антибиотикоустойчивости микроорганизмов.
30. Каким образом предупреждают развитие кандидомикоза у больных при лечении их антибактериальными препаратами широкого спектра действия?
Г енетика
1. Назовите структурный элемент бактериальной клетки, в котором закодирована наследственная информация.
2. Как называются внехромосомные кольцевые молекулы ДНК?
3. Какую роль в клетке бактерий выполняют транспозоны?
4. Какие функции выполняют плазмиды?
5. Дайте характеристику F- и R-плазмид.
6. Что такое модификации и как они проявляются у микроорганизмов?
7. Найдите различия между спонтанными и индуцированными мутациями.
8. Приведите примеры хромосомных мутаций и объясните механизм их образования .
9. Что такое R—S-диссоциация и в чем она проявляется?
10. Что такое мутагены? Приведите примеры.
11. Перечислите виды рекомбинаций у бактерий.
12. Как осуществляется передача генетической информации при трансформации?
13. Какой вид рекомбинации осуществляется с помощью бактериофагов?
14. Какие клетки выполняют функцию донора при конъюгации?
15. Дайте характеристику Hfr-штаммов бактерий.
16. Какой процесс кодируют плазмиды бактериоциногении?
17. В чем состоят различия фенотипической и генотипической изменчивости?
18. Чем обусловлены модификационные изменения у вирусов?
19. Что представляет собой явление генетической реактивации вирусов?
20. Приведите пример фенотипического смешивания вирусов.
21. Что такое генная инженерия?
22. Приведите примеры практического применения достижений современной генетики и генной инженерии.
Ин
екция и иммунитет
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
Что такое иммунитет?
Назовите виды (формы) иммунитета.
Какой вид иммунитета вырабатывается после перенесенного заболевания?
Какой вид иммунитета вырабатывается после введения вакцины?
Какой вид иммунитета вырабатывается после введения иммунной сыворотки?
Перечислите факторы и механизмы неспецифической резистентности
макроорганизма.
Назовите клетки макроорганизма, обладающие фагоцитарной активно
стью.
Как классифицируют Т-лимфоциты по их функциональным особенностям?
Какие клетки продуцируют антитела?
Какой иммунитет называется антитоксическим?
Чем обусловливается иммунологическая память?
Перечислите формы иммунного ответа.
Что такое антиген?
Назовите виды антигенов.
Перечислите основные свойства полноценного антигена.
Укажите основные свойства гаптена.
Назовите антигены бактерий.
Какова природа антител?
Перечислите классы иммуноглобулинов.
Какие иммуноглобулины первыми синтезируются в организме после инфицирования?
Назовите ученого, впервые описавшего явление фагоцитоза.
Перечислите стадии фагоцитоза.
Назовите виды фагоцитоза.
Какие иммунные сыворотки используются для идентификации выделенной чистой культуры в реакции агглютинации?
Что такое диагностикум?
С какой целью применяется реакция связывания комплемента?
Назовите ингредиенты реакции связывания комплемента.
Какая иммунная реакция применяется для определения токсигенности культуры микроорганизмов?
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
Укажите признаки положительной реакции преципитации в геле.
С какой целью применяют реакцию преципитации?
Укажите основные свойства и признаки преципитиногена.
С какой целью применяют реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации?
Что такое эритроцитарный диагностикум и для какой цели его используют?
Назовите ингредиенты реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации.
Назовите препараты, применяемые для активной иммунизации.
Что такое анатоксин и каким способом его приготавливают?
Какие бактериальные препараты применяют для пассивной иммунизации?
Какой бактерийный препарат готовят из экзотоксинов бактерий?
Укажите продолжительность защитного действия иммунных сывороток,
введенных в организм человека.
Перечислите принципы получения живых вакцин.
Перечислите виды вакцинных препаратов.
Какие бактерийные препараты применяют для диагностики инфекционных заболеваний?
Какие препараты применяют для профилактики инфекционных болезней?
Какие бактерийные препараты применяют для лечения инфекционных
болезней?
Перечислите типы реакций агглютинации.
Перечислите типы реакций агглютинации с использованием носителей
антигенов или антител.
47. Перечислите типы реакций преципитации.
48. Назовите типы реакций лизиса.
49. Для какой цели используют реакцию бактериолизиса?
50. Назовите стадии реакции бактериолизиса.
51. Что такое иммунологическая память?
52. Что такое аллергия?
53. Назовите типы аллергических реакций.
54. Назовите реакции гиперчувствительности немедленного типа.
55. Назовите реакции гиперчувствительности замедленного типа.
56. Какие факторы иммунитета обусловливают гиперчувствительность немедленного типа?
57. Какие факторы иммунитета обусловливают гиперчувствительность замедленного типа?
58. Как выявляют состояние постинфекционной гиперчувствительности к возбудителю?
59. Какие иммуноглобулины синтезируются на высоте первичного иммунного ответа и при повторном введении антигена?
60. Чем отличается реакция латекс-агглютинации от реакции агглютинации?
61. Что представляет собой латексный антигенный диагностикум?
62. Для какой цели используется реакция иммунодиффузии по Манчини?
63. Какая иммунологическая реакция используется для определения количе
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
ства иммуноглобулинов в сыворотке крови человека?
Перечислите иммунокомпетентные клетки и укажите их функции.
По каким причинам происходит изменение количества Т-лимфоцитов в периферической крови?
Какое количество Т-, В- и недифференцированных лимфоцитов содер
жится в периферической крови здоровых людей?
Что такое патогенность микроорганизмов?
Что такое вирулентность микроорганизмов?
В каких единицах выражают вирулентность микроорганизмов?
С какими свойствами связана патогенность микроорганизмов?
Какие ферменты обусловливают инвазивные свойства бактерий?
Что такое адгезия бактерий?
Какие токсины продуцируют патогенные микроорганизмы?
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
ПО.
Какова химическая природа экзотоксинов?
Какова химическая природа эндотоксинов?
Перечислите основные свойства экзотоксинов.
Перечислите основные свойства эндотоксинов.
Под действием каких факторов экзотоксины переходят в анатоксины?
Что такое доза инфекции?
Что такое входные ворота инфекции?
Перечислите факторы, ослабляющие защитные функции макроорга
низма.
Перечислите последовательность периодов острого инфекционного заболевания.
Какие микроорганизмы называются условно-патогенными? Приведите примеры.
Что такое аутоинфекция?
Что такое очаговая (местная) инфекция?
Что такое генерализованная (общая) инфекция?
Что такое бактериемия?
В чем различия септицемии и септикопиемии?
Что такое токсинемия?
Какие формы инфекции различают по числу инфицирующих агентов?
Как классифицируют инфекционные болезни по степени их распространения?
Что такое вторичная инфекция?
Что такое реинфекция?
Что такое суперинфекция?
Что такое рецидив?
Что такое бактерионосительство?
Назовите пути передачи возбудителей инфекционных болезней.
Какие инфекции называют антропонозами?
Какие инфекции называют зооантропонозами?
Что такое источник инфекции?
Какова длительность хронического бактерионосительства?
Какова длительность острого бактерионосительства?
Что такое микстинфекция?
Что такое эпидемия?
Что такое пандемия?
Что такое эндемическое распространение инфекционного заболевания?
Какие инфекционные заболевания называют природно-очаговыми?
Как различают инфекционные заболевания по длительности течения? Перечислите возможные механизмы передачи инфекции.
Что такое персистенция возбудителя инфекционной болезни?
Общая вирусология
1. Назовите имя исследователя, которому принадлежит открытие вирусов.
2. Какой вирус был открыт первым и когда это произошло?
3. В каких формах существуют вирусы внутри клетки и вне ее?
4. Какие нуклеиновые кислоты содержат вирусы?
5. Что такое капсид и какую химическую природу он имеет?
6. Что такое капсомеры?
7. В каких единицах измеряют размеры вирионов?
8. На основании каких признаков классифицируют вирусы?
9. Чем различаются простые и сложные вирионы?
10. Что такое суперкапсид?
11. Какие типы ДНК существуют у вирусов?
12. Какие типы структурной организации РНК существуют у вирусов?
13. Какие функции осуществляют ферменты вирусов и в каких процессах участвуют?
14. Каким способом размножаются вирусы?
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
Что такое дизъюнктивное размножение?
Назовите последовательность стадий взаимодействия вируса с клеткой.
Какую форму имеют "прикрепительные" белки?
Каким способом происходит проникновение вируса в клетку-хозяина?
Что такое депротеинизация вириона и где она происходит?
Какими путями вирусы выходят из клетки?
Что такое вирогения?
Перечислите способы культивирования вирусов.
Перечислите возможные исходы взаимодействия вируса с клеткой.
Что такое ЦПД (ЦПЭ)?
Назовите имя ученого, открывшего явление бактериофагии.
К какой группе микроорганизмов принадлежат бактериофаги?
Перечислите структурные элементы бактериофага.
Что такое вирулентный фаг.
Что такое умеренный фаг?
Перечислите этапы взаимодействия бактериофага с клеткой.
Какие фаги вызывают явление лизогении?
Что такое профаг?
Назовите формы изменчивости, при которых бактериофаг является носителем генетической информации.
Для каких целей используют бактериофаги в медицине?
Для каких целей используют бактериофаг в диагностике инфекционных заболеваний?
С какой целью проводят фаготипирование чистой культуры возбудителя заболевания?
В каких случаях бактериофаги используют в целях профилактики инфек-
ционных заболеваний?
Что такое титр фага?
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ
Агар (агар-агар) - agar (е, f, s) — полисахаридный продукт, который получают из морских водорослей и используют для уплотнения питательных сред.
Адъювант — adjuvant (е, f), adjuvante (s) — вспомогательное вещество, которое при соединении с антигеном образует депо и усиливает иммунный ответ.
Агглютинация — agglutination (е, f), agglutinacion (s) — процесс склеивания микробных клеток (агглютиногенов) под действием специфических антител (агглютининов) в присутствии электролита.
Адаптация — adaptation (е, f), adaptacion (s) — приспособительная реакция к изменениям в среде обитания, которая проявляется в изменении признаков
или свойств микроорганизмов.
Аллергены — allergen (е), allergen (f), allergeno (s) — легкорастворимые вещества (полные антигены или гаптены) с небольшой молекулярной массой, вызывающие реакции гиперчувствительности (аллергию).
Аллергия — allergy (е), allergic (f), alleigia (s) — форма иммунного ответа при повторном контакте с аллергенами, обусловленная накоплением имму-
ноглобулинов или Т-лимфоцитов.
Аммонификация — ammonification (е, f), ammonificacion (s) — один из эта
пов круговорота азота в природе, на котором происходит разложение азотсодержащих органических веществ (белков) с выделением аммиака и его солей
под действием ферментов микроорганизмов.
Анатоксины (токсоиды) — anatoxin, toxoid, formol toxoid (e), anatoxine (f), toxoide (s) — микробные токсины, которые потеряли токсические свойства после обработки формалином и инкубации при температуре 37—40 °C в тече-
ние 3—4 нед. Анатоксины сохраняют антигенные свойства, иммуногенность и
применяются для активной иммунопрофилактики токсикоинфекций.
Анафилаксия — anafilaxis (е), anafilaxie (f), anafilaxia (s) — особая форма ал
лергии, которая обусловлена иммуноглобулинами класса Е.
Анаэробы — anaerobes (е), anaerobies (f), anaerobios (s) — микроорганизмы, которые получают энергию вследствие расщепления питательных веществ без доступа свободного молекулярного кислорода воздуха. Различают анаэробы облигатные (строгие) и факультативные, которые способны извлекать энергию окислительным (аэробным) и анаэробным (бродильным) путями.
Анаэростат — anaerostat (е), anaerostate (f), anaerostate (s) — прибор для
культивирования анаэробных микроорганизмов.
Анергия — anergy (е), anergie (f), anergia (s) — состояние неотвечаемости на
антиген.
Антибиотики — antibiotics (е), antibiotiques (f), antibidticos (s) — химиотерапевтические вещества природного, полусинтетического или синтетического происхождения, которые обладают способностью угнетать рост и размножение микроорганизмов или вызывать их гибель.
Антигены — antigens (е), antigenes (0» antigenos (s) — генетически чужеродные вещества, которые при проникновении в макроорганизм индуцируют иммунный ответ и взаимодействуют с антителами или со специфическими
рецепторами иммунокомпетентных клеток.
* Термины в словаре расположены в алфавитном порядке с переводом на английский (е), французский (f) и испанский (s) языки и объяснениями их значения на русском языке.
Антисептика — antisepsis (е), antisepsie (f), antiseptica (s) — борьба с проникшей в организм инфекцией различными методами.
Антитела (иммуноглобулины) — antibodies (е), anticorps (f), anticuerpos (s) — белки сыворотки крови, которые продуцируются организмом в ответ на воздействие антигена и способны вступать с ним в специфическую реакцию взаимодействия.
Антитоксины — antitoxins (е), antitoxines (f), antitoxinas (s) — антитела про-
тив токсинов.
Апоптоз — apoptosis (е, s), apoptose (f) — биологический механизм гибели клеток макроорганизма.
Асептика — aseptic (е), asepsie (f), asepticos (s) — система профилактических мероприятий, направленных на предупреждение попадания микробов в органы и ткани больного при медицинских манипуляциях.
Аттенуация — attenuation (е), attenuation (f), atenuacion (s) — снижение вирулентности штаммов патогенных микроорганизмов различными способами. Используется при приготовлении вакцинных препаратов.
Ауксотроф — auxotroph (е), auxotrophe (f), auxotrofo (s) — бактерия, которая утратила способность синтезировать какой-либо фермент и требует внесения в питательную среду определенных веществ, которые не способна синтезировать сама.
Аутовакцина — autovaccine (е), autovaccin (f), autovacuna (s) — антигенный препарат, который готовят из штаммов микроорганизмов, выделенных от конкретного больного. Используют для лечения этого же больного.
Аутоинфекция — autoinfection (е, f), self-infection (е), autoinfeccion (s) — возникает при заносе возбудителя из одного биотопа макроорганизма в другой.
Аутотроф — autotroph (е), autotrophe (f), autotrofo (s) — бактерия, которая в качестве источника углерода и азота использует природные неорганические вещества (углекислый газ атмосферы, молекулярный азот, аммонийные соли, нитраты, нитриты и др.) для построения органических соединений собственной клетки.
Аффинность (степень родства) — affinity (е), affinite (f), afinidad (s)--прочность связи между одним активным центром антигена и связывающим его участком антитела.
Аэробы — aerobes (е), aerobies (f), aerobios (s) — микроорганизмы, которые получают энергию, используя свободный молекулярный кислород воздуха.
Бактериемия — bacteriemia (е), bacteriemie (f), bacteremia (s) — один из вариантов инфекционного процесса, при котором микроорганизмы циркулиру
ют в крови, но не размножаются в ней.
Бактерионоситель — carrier (е), porteur agent de contaminacion (f), portador (s) — макроорганизм, в котором при наличии патогенных микробов отсутст-
вуют патологические изменения в органах и тканях. Различают здоровых но-
сителей и реконвалесцентных (после перенесенного заболевания).
Бактериофаг — bacteriophage (е), bacteriophage (f), bacteriofago (s) — вирус
бактерий.
Бактерицидное (действие) — bactericidal (е), bactericide (f), bacteri-cida (s) — способность различных факторов вызывать гибель микроорганизмов.
Бляшка (зубная) — collection, aggregation (е), hatch (f), colleccion agregacion (s) — пленка, которая покрывает поверхность зуба и состоит из бактериальных полисахаридов, микроорганизмов (стрептококков, лактобацилл, бактероидов и др.) и элементов слюны. Играет защитную роль, но может стать начальным этапом образования кариеса.
Вакцинация — vaccination (е, f), vacunacion (s) — введение вакцины с целью создания искусственного активного иммунитета.
Вид - species (е), espece (f), especie (s) — таксономическая категория в систематике микроорганизмов.
Вироиды — viroids (е), viroides (f), viroidos (s) — инфекционные агенты, не имеющие белковой оболочки и состоящие из молекулы РНК.
Вирулентность — virulence (е, 0, virulencia (s) — степень, мера патогенности бактерий. Количественным выражением вирулентности являются: ДЛМ — минимальная смертельная доза, ЛД50 ~ 50% летальная доза.
Гаптен — hapten (е), haptene (f), haptene (s) — неполный антиген.
Гемагглютинация — haemagglutination (е), hemagglutination (f), hemagluti-nacion (s) — склеивание эритроцитов. Различают прямую (несерологическую) реакцию при взаимодействии эритроцитов и некоторых микроорганизмов, непрямую (пассивную) серологическую реакцию при взаимодействии эритроцитов, на поверхности которых адсорбированы антигены или антитела, с комплементарными молекулами антител или антигенов соответственно.
Гемокультура — haemoculture (е), hemoculture (f), hemocultura (s) — культура микроорганизмов, выделенных из крови.
Гемолиз — haemolysis (е), hemolyse (f), hemolisis (s) — процесс разрушения (лизиса) эритроцитов.
Ген — gene (е), gene (f), gene (s) — наименьший участок ДНК, обеспечивающий передачу признаков потомству (единица наследственности).
Геном — genom (е), genomie (f), genomio (s) — совокупность всех генов
клетки.
Генетическая рекомбинация — genetic recombination (е), recombinacion genetique (0, recombinacion genetica (s) — форма изменчивости, при которой из генетического материала двух особей образуется новый геном и возникает клетка, имеющая свойства обоих родителей. Различают трансформацию,
трансдукцию и конъюгацию.
Гетеротрофы — heterotrophs (е), heterotrophes (f), heterotrofas (s) — бакте-
рии, которые в качестве питательных веществ используют органические соединения и получают из них углерод или азот.
Гиперчувствительность — hypersensibility (е), hypersensibilite (0, hipersensibi-lidad (s) — повышенная чувствительность к антигенам-аллергенам. Выделяют
гиперчувствительность замедленного и немедленного типов.
Дезинфекция — desinfection (е), desinfection (0, desinfeccion (s) — уничтоже-
ние патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды различными ме
тодами.
Дисбактериоз (дисбиоз) — dysbacteriosis (е), dysbacteriose (f), disbacteriosis (s),— состояние, при котором происходят изменения в качественном и количественном составе микрофлоры определенного биотопа макроорганизма.
Иммунитет — immunity (е), immunite (0, inmunidad (s) — система биологической защиты внутренней среды многоклеточного организма от генетически чужеродных агентов экзогенной и эндогенной природы. Обусловлен факторами гуморальной и клеточной защиты.
Иммунный комплекс — immune complex (е), complex refractaire (f), complejo inmune (s) — комплекс антигенов.
Инвазивность — invasiveness (e), invasition (f), invasicion (s) — факторы патогенности, которые обеспечивают проникновение и распространение пато
генных микроорганизмов в макроорганизме.
Интерлейкины —- interleukins (е), interleuquinos (s) — группа цитокинов.
Интерфероны — interferons (е), interferons (0, interferonos (s) — группа цитокинов, обеспечивающая внутриклеточную защиту макроорганизма. Важ-
нейшая система противовирусной защиты.
Источник инфекции — source of infection (е), source d’infection (f), fuente de
la infection (s) — источник возбудителей заболевания (инфицированный чело
век, животное или растение), от которого патогенные микроорганизмы пере
даются восприимчивому организму.
Кариес зубной — caries of the teeth, dental caries (e), carie dentaire (0, caries dentales (s) — процесс разрушения твердых тканей зуба.
Клон —cion (е), clone (0, clono (s) — потомство одной бактериальной клетки.
Комменсализм — commensalism (е, f), commensalismo (s) — форма сосуществования микроорганизмов, при которой один из видов извлекает пользу для себя, не причиняя вреда другим членам сообщества.
Комплемент — complement, alexin (е), complement (f), complemento (s)— группа белков сыворотки крови, участвующих в реакциях неспецифической защиты макроорганизма.
Латекс — latex (е, f), latez (s) — частицы из природного каучука или полимеризованного полистирола, которые используют в качестве носителя антигенов или антител при постановке серологических реакций.
Лейкоцидины — leukocidins (е), leucocidines (f), leucocidinas (s) — ферменты агрессии микроорганизмов, разрушающие лейкоциты.
Лизогения — lysogeny (е), lysogenie (f), lisogenia (s) — интеграция нуклеиновой кислоты бактериофага в геном бактерии.
Лизосомы — lysosomes (е, f), lisosomas (s) — органоиды эукариотных клеток, выполняющие функции внутриклеточного пищеварения. Активно участвуют в процессе фагоцитоза.
Лизоцим — lysozyme (е, f), lisocima (s) — фермент, который вызывает лизис бактерий путем разрушения пептидогликана клеточной стенки.
Липополисахариды (ЛПС) — lipopolysaccharides — LPS (е, f), lipopolisacari-dos (s) — входят в состав наружной мембраны грамотрицательных бактерий, обладают высокой токсичностью (обусловленной липидом А) и антигенными свойствами (О-антиген полисахаридной природы).
L-формы бактерий—L-forms, spheroplasts (е), L-formes (f), esferoplastos (s) — бактерии, частично или полностью лишенные клеточной стенки в результате воздействия некоторых факторов (антибиотиков, антител, солей и др.).
Макрофаги — macrophages (е, f), macrofagos (s) — клетки системы моно-нуклеарных фагоцитов, которые обеспечивают течение реакций фагоцитоза и презентации антигена Т-клеткам.
Мезосомы — mesosomes (е, f), mesosomas (s) — структуры прокариот, образованные инвагинацией цитоплазматической мембраны в цитоплазму. Участвуют в процессах метаболизма в клетках. Предполагают, что их функция близка к функции митохондрий эукариот.
Мезофильные микроорганизмы (мезофилы) — mesophiles (е, f), mesofilos (s) — с оптимальной температурой роста — 35—37 “С.
Метабиоз — metabiosis (е, f), metabioso (s) — тип взаимоотношений между микроорганизмами, при котором один вид создает благоприятные условия для жизни другого вида (аэробы — анаэробы).
Метаболизм микроорганизмов — metabolism (е), metabolisme (f), metabolis-mo (s) — обмен веществ у микробов. Включает конструктивный метаболизм (анаболизм), при котором происходят реакции синтеза молекул клетки, и энергетический (катаболизм), в процессе которого клетка получает энергию.
Механизм передачи инфекции — mechanism of transmission (transfer) of an infection (e), mecanisme de transmission de Г infection (f), mecanismo transmision de la infeccion (s) — способ передачи патогенного микроба от источника инфекции здоровому восприимчивому организму.
Микозы — mycosis (е), mycoses (f), mycosas (s) — заболевания, вызываемые патогенными грибами.
Микоплазмы — mycoplasma (е, s), mycoplasmes (f) — грамотрицательные микроорганизмы, которые не имеют ригидной клеточной стенки.
Микроаэрофилы — microaerophiles (е, f), microaerofilas (s) — микроорганизмы, которые нуждаются в незначительном количестве молекулярного кислорода, но не живут в анаэробных условиях.
Микрофлора нормальная (нормофлора) — normal body flora (е), microflore normal (f), microflora normal (s) — микробные ассоциации, которые обитают в органах и тканях макроорганизма (биотопах). Различают нормофлору резидентную (аутохтонную) — постоянную для данного биотопа и транзиторную
(аллохтонную) — непостоянную, занесенную из другого биотопа или внешней среды.
Мицелий — mycelium (е), mycdlium (f), micelio (s) — образован скоплением гифов грибов.
Мутагенные агенты — mutagenic agent (е), mutagene (f), agente mutagenico (s) — факторы физической, химической или биологической природы, которые вызывают мутации у микроорганизмов.
Мутант — mutant (е, f), mutante (s) — микроорганизм, свойства которого в результате мутаций отличаются от родительских.
Мутуализм — mutualism (t), mutualisme (f), mutualismo (s) — форма симбиоза, при которой продукт метаболизма одного биологического вида используется другим.
Н-антиген — H-antigen (е), H-antigene (f), H-antigeno (s) — жгутиковый ан-
тиген бактерий.
Нитрификация — nitrification
(е, I), nitrificacion (s) — процесс окисления
аммиака до нитритов и нитратов в аэробных условиях.
Нозокомиальные инфекции (внутрибольничные, госпитальные) — hospital
nosocomial infection (е), infection hospitalier, nosocomial (f), infeccion nosocomial
(s) — инфекции, заражение которыми происходит в медицинских учреждениях. Возбудителями являются условно-патогенные микроорганизмы (микробы-оппортунисты).
О-антиген — O-antigen (е), O-antigene (f), O-antigeno (s) — соматический антиген бактерий, локализованный в клеточной стенке, цитоплазме и мембранах.
Оппортунистические микробы — opportunistic microorganisms (е), microorbes opportunistiques (f), oportunismo de los microorganismos (s) — условно-патогенные микроорганизмы.
Паразитизм — parasitism (e), parasitisme (f), parasitismo (s) — форма межвидовых отношений, при которой один микроорганизм (паразит) живет за счет другого и наносит ему вред.
Пастеризация — pasteurization (е), pasteurisation (f), pasteurizacion (s) — один из методов стерилизации.
Патогенность — pathogenicity (е), pathogenicite (f), patogenicidad (s) — потенциальная способность микроорганизма вызывать инфекционный процесс.
Пили (фимбрии, ворсинки) — pili, fimbriae (е), franges, poils (f), fimbrillas (s) — нитевидные выросты цитоплазмы на поверхности некоторых бактерий. Выделяют секс-пил и, которые участвуют в процессах конъюгации, и фимбрии (пили) общего типа, функцией которых является адгезия (прилипание) к субстрату.
Плазматическая клетка — plasmocyte (е, f), celula plasmatica (s) — В-клетка, продуцирующая антитела, на конечной стадии дифференциации.
Плазмида — plasmid (е, f), episoma (s) — стабильно наследуемая, способная к автономной репликации дополнительная внехромосомная молекула ДНК у
микроорганизмов.
Презентация антигена — antigen’s presintation (е), presentation d’antigene (f), presentacion del antegen (s) — представление антигена в доступной для распознавания лимфоцитами форме на поверхности антигенпрезентирующих кле
ток.
Прионы — prions (е, f), priones (s) — инфекционные агенты белковой природы, возбудители некоторых медленных инфекций.
Протопласты — protoplasts (е), protoplastes (f), protoplastos (s) — грамполо-жительные микроорганизмы, полностью лишенные клеточной стенки в ре-
зультате разрушения пептидогликана под действием лизоцима, антибиотиков
и других факторов.
Прототрофы — prototrophs (е), prototrophes (f), prototrofos (s) — микроорга
низмы, которые могут самостоятельно синтезировать все необходимые им ор
ганические соединения.
Профаг — prophage (е, f), profago (s) — нуклеиновая кислота умеренного фага, ассоциированная с хромосомой бактериальной клетки.
Психрофильные микроорганизмы (холодолюбивые) — psychrophiles (е, f), psicrofilas (s) —с оптимальной температурой роста — 10—15 "С.
Реактогенность (вакцин) — reactogene (f) — свойство вакцинных штаммов вызывать послепрививочные реакции и осложнения.
Ревакцинация — revaccination (е), revactination (f), revacunacion (s) — повторное введение вакцины.
Ремиссия — remission (е), remission (f), remision (s) — скрытая фаза инфекционной болезни, при которой возбудитель сохраняется в организме.
Рецидив — recidivum (е), recidive (f), recidivo (s) — возврат симптомов болезни после ремиссии.
Сапрофиты — saprophytes (е, f), saprofitos (s) — микроорганизмы, которые питаются мертвыми органическими веществами.
Саттелитизм — satellitism (е, f), satelitismo (s) — тип взаимоотношений ме-
жду микроорганизмами, при котором разные виды живут вместе, не причиняя вреда друг другу. При этом микробы-саттелиты улучшают свой рост, на
ходясь рядом с хозяином.
Сепсис — sepsis, septicemia (е), septicemie (f), septicemia (s) — инфекция, при которой возбудитель размножается в кровеносной и лимфатической сис
темах.
Симбиоз — symbiosis (е), symbiose (f), simbiosis (s) — межвидовые отношения, при которых взаимную пользу получают члены сообщества.
Синергизм — synergism (е), synergie (f), sinergismo (s) — усиление физиологических функций существующих вместе видов в микробной ассоциации.
Стерилизация — sterilization (е), sterilisation (f), esterilizacion (s) — процесс полного уничтожения вегетативных и споровых форм микроорганизмов.
Суперантиген — superantigen (е), superantigene (f), superantigeno (s) — анти-
гены патогенных микроорганизмов и продукты их жизнедеятельности, стиму-
лирующие образование избыточного количества Т-лимфоцитов с продукцией
большого количества интерлейкина-2, который вызывает выраженный токси-
ческий эффект.
Суперинфекция — superinfection (е, f), superinfeccion (s) — повторное зара-
жение больного тем же видом возбудителя.
Сыворотки иммунные — immune serum (е), serum refractaire (f), suero inmune (s) — препараты, которые получают путем гипериммунизации животных анти-
генами по специальным схемам.
Сывороточная болезнь — serum-disease, serum-sickness, serum-reaction (e), maladie du serum (f), enfermedad de suero (s) — одна из форм гиперчувствительности немедленного типа.
Таксис — taxis (е, f) — направленное движение бактерий, вызванное определенными индукторами (эффекторами).
Термостат — thermostat (е, f), termostato (s) — аппарат для поддержания по-
стоянной температуры среды для культивирования микроорганизмов.
Термофильные микроорганизмы (теплолюбивые) — thermophiles (е, f), ter-
mofilas (s) — с оптимальной температурой роста от 45 °C и выше.
Тиндализация — tyndallization (е), tyndallisation (f), tyndalizacion (s) — спо-
соб стерилизации.
Токсемия, токсинемия — toxaemia, toxinemia (е), toxemie, toxinhemie (f), toxemia (s) — циркуляция микробных токсинов в крови теплокровных.
Токсигенность — toxigenisity (е), toxinogenese (f), toxigenidad (s) — способ-
ность микроорганизмов продуцировать экзотоксины.
Толерантность иммунологическая — toleration (е), tolerance (f), tolerancia (s) — состояние ареактивности иммунной системы по отношению к определенным антигенам.
Тропизм — tropism (е), tropisme (f), tropismo (s) — свойство патогенных
микроорганизмов избирать в качестве среды обитания определенные организмы, органы или ткани.
Фаговая конверсия — phage conversion (е), conversion lysogenique (f), conversion lisogenico (s) — изменение свойств микроорганизмов в результате лизо-генизации клетки профагом.
Фагоцитоз — phagocytosis (е), phagocytose (f), fagocitosis (s) — процесс адсорбции, захвата, поглощения и переработки чужеродных агентов эукариотической клеткой.
Фитопатогенные микробы — phytopathogenes microbes (е), microbes phytopathogenes (f), microorganismos fitopatogenos (s) — виды, вызывающие инфекционные заболевания растений.
Хроническая инфекция — chronic infection (е), infection chronique (f), infec-ci6n cronica (s) — инфекционное заболевание, отличающееся длительным те
чением.
Цитокины — cytokines (е, f), cytoquinas (s) — белковые молекулы, которые участвуют в регуляции межклеточных взаимодействий в иммунном ответе.
Чистая культура — pure culture (е), culture pure (f), culture pure (s) — совокупность микробов одного вида.
Штамм — strain (е), souche (f), stockvacuna (s) — чистая культура микроорганизма, выделенная из определенного источника.
Экзотоксин — endotoxin (е), exotoxine (f), ecsotoxina (s) — белковое вещество, которое вырабатывают микроорганизмы и выделяют во внешнюю среду.
Эндотоксин — endotoxin (е), endotoxine (0, endotoxina (s) — липополисахаридная токсическая субстанция (ЛПС) грамотрицательных микроорганизмов. Высвобождается после гибели и разрушения клетки.
Эпитоп —epitop (е), epitope (f), epitopo (s) — участок антигена, который взаимодействует со связывающим его центром антитела или Т-клеточного ре-
цептора.
Эпифиты — epiphyts (е), epiphytes (f), epifitos (s) — микроорганизмы, кото
рые постоянно обитают на надземной частью растения.
Эубиоз — eubiosis (е), eubiose (f), eubioso (s) — совокупность микроорганизмов (микробиоценозов), которые населяют биотопы тела здорового человека.
J
Учебное пособие'
ЕЛЕНА ГРИГОРЬЕВНА ВОЛИНА, ЛАРИСА ЕВСТАФИЕВНА САРУХАНОВА
Основы общей микробиологии, иммунологии и вирусологии
Зав. редакцией Т. ГК Осокина Научный редактор Л. П. Блинкова Художественный редактор С. М. Лымина Технический редактор В. И. Табенская Корректор М. П. Молокова
Сдано в набор 10.03.2004. Подписано к печати 19.04.2004. Формат бумаги 60 х 9О‘/16. Бумага офсетная № 1. Гарнитура Таймс. Печать офсетная. Усл. печ. л. 16,0. Усл. кр.-отт. 16,0.
Уч.-изд. л. 16,61. Тираж 3000 экз.
Заказ № 0403890.
ОАО «Издательство «Медицина». 101990, Москва, Петроверигский пер., 6/8.
Отпечатано в полном соответствии
с качеством предоставленного оригинал-макета в ОАО «Ярославский полиграфкомбинат» 150049, Ярославль, ул. Свободы, 97.