Клиническая биохимия (Пособие для врачей-лаборантов) - Колб В.Г., Камышников В.С.

Глава I. Методы исследования белкового обмена

Методы определения общего белка в сыворотке крови

Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге

Определение белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом

Глава III. Определение остаточного азота и его компонентов

Определение мочевины в сыворотке крови и в моче по цветной реакции с диацетилмонооксимом

Определение мочевины в сыворотке крови уреазным методом по реакции с фенол-гипохлоритом

Определение мочевины крови уреазным методом по реакции с реактивом Несслера

Методы определения креатинина и креатина в крови и моче

Клубочковая фильтрация и канальцевая реабсорбция

Определение коэффициента очищения от мочевины

Определение индикана в сыворотке крови и моче

Глава IV. Методы изучения активности ферментов

Методы определения аспартат- и аланин-аминотрансфераз в сыворотке крови

Определение активности α-амилазы в сыворотке крови и моче

Определение общей активности лактатдегидрогеназы
Методы определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови

Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови экспресс-методом с применением индикаторной бумаги

Определение сахара в крови по методу Хагедорна и Йенсена

Изучение углеводного обмена методом нагрузок

Проба с двойной нагрузкой по Штауб — Трауготту

Глава VI. Методы изучения углеводсодержащих белков и их компонентов в крови

Определение гексоз в сыворотке крови орциновым методом после гидролиза серной кислотой

Определение серомукоида в сыворотке крови по содержанию в нем гексоз

Турбидиметрический метод определения серомукоидов в сыворотке крови

Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином

Глава VII. Методы изучения обмена липидов

Определение триглицеридов в сыворотке крови по цветной реакции с хромотроповой кислотой

Состав и свойства липопротеидов сыворотки крови

Глава VIII. Исследование пигментного обмена

Определение билирубина в малом объеме сыворотки крови

Построение калибровочной кривой для определения билирубина сыворотки крови

Глава IX. Исследование минерального обмена

Определение общего кальция в сыворотке крови спектрофотометрическим методом, основанным на реакции с глиоксаль-бис-[2-оксианилом]

Определение кальция в сыворотке крови титрометрическим методом с применением мурексида

Определение ионов хлора в крови, моче и спинномозговой жидкости

Определение ионов хлора в сыворотке крови, моче и спинномозговой жидкости меркуриметрическим методом с индикатором дифенилкарбазоном

Железо и трансферрин. Методы определения железа в сыворотке крови

Орто-фенантролиновый метод определения железа в сыворотке крови по Г. Матсубара

Глава X. Исследование гормонально-медиаторного обмена

Методы изучения состояния коры надпочечников

Определение кортикостероидов в периферической крови

Физиологические колебания концентрации кортикостероидов в плазме крови

О методах определения метилированных продуктов обмена катехоламинов в моче

Исследование системы серотонин-5-гидроксииндолуксусная кислота

Определение 5-гидроксииндолуксусной кислоты в моче

Исследование системы гистамин — гистаминаза

Определение активности гистаминазы в сыворотке крови

Глава XI. Способы очистки некоторых реактивов
Проба на наличие в этаноле альдегидов

Освобождение от альдегидов
Очистка хлороформа

Автор: Колб В.Г. Камышников В.С.

Теги: материальные основы жизни биохимия молекулярная биология биофизика клиническая медицина лабораторная диагностика пособие для врачей

Год: 1976

Похожие

Практикум по физической, коллоидной и биологической химии

Биохимия. Практикум

Руководство к практическим занятиям по биохимии

Практикум по общей биохимии

Текст

АЯ
Я

В. Г. КОЛБ, профессор
В. С. КАМЫШНИКОВ,
кандидат медицинских наук
КЛИНИЧЕСКАЯ
БИОХИМИЯ
(Пособие для врачей-лаборантов)
Издательство «Беларусь»
Минск 1976

6I6M
К 60
УДК 577.1(031)
Книга отражает современный уровень исследования в клинике ферментов,
белкового, углеводного, липидного, пигментного, минерального и гормонально-
медиаторного обменов.
В ней, наряду с изложением апробированных на кафедре клинической ла¬
бораторной диагностики БелГИУВа унифицированных методов, приведен ряд
других методик, расширяющих возможности биохимического обследования
больного. При описании каждого способа определения выделяются принцип
метода, список и порядок приготовления реактивов, ход определения, способ
выражения результатов (расчет) и нормы. В каждой главе содержатся обзоры
существующих методов исследования, в которых объясняется целесообразность
применения унифицированных методик. Даны толкования изменениям биохи¬
мических показателей при ряде патологических и некоторых физиологических
состояниях. Специальные разделы посвящены более углубленной диагностике
нарушений углеводного обмена и выделительной функции почек с описанием
тестов толерантности к глюкозе и фильтрационно-реабсорбционных проб.
Работа иллюстрирована рисунками, таблицами, приведены библиографиче¬
ский и предметный указатели.
Рассчитана на врачей-лаборантов и клиницистов различных профилей,
(6) Издательство «Беларусь», 1976

ПРЕДИСЛОВИЕ
В последние годы неизмеримо возросло значение клиниче¬
ской биохимии как прикладной науки, открывшей возможности
распознавания различных форм заболеваний благодаря выяв¬
лению биохимических нарушений в организме больного челове¬
ка. Использование методов биохимического обследования не
только совершенствует лабораторную диагностику болезней, но
и позволяет оценить влияние разнообразных лечебных меро¬
приятий на течение патологического процесса, его прогноз.
Именно этим объясняется тот большой интерес, который про¬
являют врачи всех специальностей к использованию современ¬
ных достижений клинической биохимии в практической меди¬
цине. Широкое стремление к освоению новых биохимических
методов исследования повлекло за собой внедрение в практику
множества вариантов однотипных методик с различными спо¬
собами выражения результатов, что не могло не усложнить со¬
поставление и интерпретацию лабораторных анализов, выпол¬
ненных в различных лечебных учреждениях. Это отчасти и
послужило основанием к проведению унификации различных
лабораторных тестов.
Благодаря длительной и кропотливой работе, проделанной
по инициативе главных специалистов и научно-методических
центров по лабораторному делу, обществом врачей-лаборантоз,
сотрудниками ряда научно-исследовательских институтов, проб¬
лемных лабораторий, из всего многообразия методов были вы¬
браны единые, т. е. удовлетворяющие в научно-медицинском и
экономическом отношении. Они утверждены приказами минист¬
ра здравоохранения СССР от 11 апреля 1972 г. и 15 октября
1974 г., являются обязательными для исполнения во всех лабо¬
раториях нашей страны.
Унификация, улучшив и облегчив работу клинико-диагности¬
ческих лабораторий, не только расширила возможности преем¬
3

ственности в обследовании больного, но и позволила ввести
единые нормы (часто существенно отличающиеся от старых).
Изменения, происшедшие за последние годы в области биохи¬
мического обследования больных, нашли отражение в настоя¬
щей книге.
Отдельные разделы посвящены исследованию белково-азо¬
тистого, углеводного, липидного, пигментного, минерального,
гормонально-медиаторного обменов и клинической ферменто¬
логии. Подробному изложению методики исследования пред¬
шествует описание целесообразности использования отобранных
методов. Дана клиническая трактовка лабораторных анализов.
Учитывая невозможность одновременного перехода всех кли¬
нико-диагностических лабораторий страны к унифицированным
методам исследования, приведены почти равноценные им и ста¬
рые методы.
Все приводимые в книге методы апробированы авторами на
кафедре клинической лабораторной диагностики Белорусскою
государственного института усовершенствования врачей. Даны
многочисленные методические указания, описаны возможные
источники ошибок при практическом осуществлении тех или
иных методов, рекомендованы допустимые модификации. Под¬
робно изложены особенности приготовления реактивов, выпол¬
нение самого биохимического исследования и способы выраже¬
ния полученных данных.
Выход книги в значительной мере ускорит внедрение в
практику здравоохранения унифицированных методов исследо¬
вания.
В книге отражен многолетний опыт научной и педагогиче¬
ской работы авторов в области клинической биохимии, содер¬
жатся новейшие литературные данные, касающиеся не только
техники исполнения анализа, но и трактовки полученных ре¬
зультатов.

Глава I
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
БЕЛКОВОГО ОБМЕНА
ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА
И БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ
Белки представляют собой высокомолекулярные органиче¬
ские азотсодержащие соединения, которые играют решающую
роль во всех процессах и явлениях жизни. С ними связаны пи¬
щеварение, раздражимость, сократимость, движение, способ¬
ность к размножению и другие функции организма.
Они условно делятся на две большие группы: простые, или
протеины, и сложные, или протеиды. Простые белки состоят
только из аминокислот, соединенных друг с другом пептидной
связью. Сложные белки содержат кроме аминокислот другие,
небелковые соединения (углеводы, липиды, нуклеиновые кисло¬
ты и др.), представляющие собой так называемые простетиче-
ские группы.
По форме молекул белки подразделяются на фибриллярные
(составляющие многие плотные ткани) и глобулярные. К по¬
следним и относятся белки плазмы крови, представленные в
основном альбуминами и глобулинами. Суммарное их количе¬
ство определяется как общий белок плазмы крови.
Определение общего белка в сыворотке крови имеет важ¬
ное значение для диагностики ряда патологических состояний,
сопровождающихся синдромом гипер- или гипопротеинемии.
Знание величины этого показателя позволяет к тому же произ¬
вести расчет концентрации различных фракций белков крови
(альбуминов, глобулинов: a,i, a2, Р, у, и др.) в абсолютных про¬
центах (г%).
Такой способ оценки протеинограммы дает гораздо больше
информации о состоянии белкового обмена, чем обычно при¬
меняемое выражение белковых фракций в относительных про¬
центах.
б

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ОБЩЕГО БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Все известные способы определения общего белка сы¬
воротки крови подразделяются на следующие основные
группы:
1) азотометрические, основывающиеся на установлении ко¬
личества белкового азота (к ним относится классический метод
Кьельдаля (1883) и его различные модификации);
2) состоящие в определении удельного веса сыворотки
(плазмы);
3) весовые (гравиметрические), когда белки сыворотки кро¬
ви осаждают, высушивают до постоянного веса и взвешивают
на аналитических весах;
4) рефрактометрические;
5) колориметрические, основывающиеся на «цветных» реак¬
циях белков с определенными реактивами (из них наиболее
широкое применение нашла биуретовая реакция. В методе Лоу¬
ри наряду с биуретовой применяется реакция Фолина на аро¬
матические аминокислоты, что значительно повышает чувстви¬
тельность определения);
6) нефелометрические, в которых количество белка опреде¬
ляется по степени помутнения, производимого определенными
реактивами;
7) поляриметрические;
8) спектрофотометрические, заключающиеся в измерении
степени светопоглощения в ультрафиолетовой области (200—■
220 или 280 нм).
При использовании азотометрических способов исходят из
того, что белки содержат в среднем 16% азота. Поэтому полу¬
ченную при определении содержания белкового азота величину
умножают на 6,25 (100 : 16). Следует иметь в виду, что кроме
белкового азота сыворотка крови всегда содержит остаточный
азот. К тому же фактор пересчета 6,25 является неточным, так
как процент содержания азота в различных белковых молеку¬
лах колеблется от 14 до 19, что вызывает отклонение этого
коэффициента в пределах от 5,31 до 8,1. Поэтому данный метод
не может быть использован в клинико-диагностических лабора¬
ториях для определения общего белка.
Методы, основанные на определении удельного веса сыво¬
ротки крови (способом падающей капли), не точны, так как
удельный вес зависит не только от содержания белков, но и
других веществ, находящихся в плазме. Рефрактометрический
способ определения общего белка также несовершенен. Даже в
норме часть рефракции (преломление луча света при прохож¬
дении через оптически неоднородные среды) обусловливается
другими составными частями сыворотки, в частности минераль¬
ными веществами, углеводами. При некоторых патологических
состояниях содержание указанных компонентов увеличивается,
6

что приводит к значительным ошибкам при исследовании жел¬
тушных и хилезных сывороток, а также сывороток больных
сахарным диабетом и уремией.
Весовые методы являются весьма трудоемкими (необходи¬
мо отделить белок от небелковых веществ и идеально его обез¬
водить), требуется большое количество сыворотки.
Из колориметрических способов определения общего белка
особого внимания заслуживают биуретовые методы. Их главное
достоинство — в специфичности определения, поскольку биуре-
товая реакция (состоящая в появлении фиолетового окрашива¬
ния за счет образования комплексов между ионами меди и пе¬
птидными связями) зависит от присутствия белка. На нее не
влияет наличие в крови ароматических аминокислот (тирозина,
триптофана), фенолов, мочевой кислоты. Данный метод по пра¬
ву считается самым специфичным, весьма точным и практиче¬
ски доступным.
Более чувствительный метод Лоури обладает рядом сущест¬
венных недостатков, состоящих в малой специфичности (сво¬
бодные ароматические аминокислоты и некоторые другие соеди¬
нения дают характерную окраску с реактивом Фолина) и слож¬
ности приготовления основного реагента.
Другие колориметрические методы, как и нефелометриче-
ские, поляриметрические, спектрофотометрические, не получили
широкого распространения для определения общего белка в сы¬
воротке крови.
Учитывая вышеизложенное в качестве унифицированного
выбран биуретовый метод определения общего белка в сыво¬
ротке крови.
Определение общего белка
сыворотки крови по биуретовой реакции
Принцип. Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой
медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый
цвет.
Реактивы: 1. 0,9% раствор хлористого натрия (0,9 г NaCl на
100 мл дистиллированной воды).
2. 0,2 н. раствор едкого натра, свободный от углекислого га¬
за (20 мл 1 н. раствора NaOH доводят до 100 мл прокипяченной
дистиллированной водой).
3. Биуретовый реактив. 4,5 г сегнетовой соли (КНаС4Н406)
растворяют в 40 мл. 0,2 н. NaOH. После растворения прибавля¬
ют 1,5 г CuS04 ■ 5 Н20 и 0,5 г KI. Раствор доливают до 100 мл
0,2 н. NaOH. Хранить в темном месте (или в посуде из темного
стекла). Реактив пригоден около месяца.
4. 0,5% раствор йодистого калия в 0,2 н. растворе едкого
натра (0,5 г KI растворяют в 100 мл 0,2 н. NaOH). Хранить в
посуде из темного стекла не более двух недель.
7

ТАБЛИЦА 1
Данные к построению калибровочного графика
для определения общего белка сыворотки крови
№ пробирки
Стандартный
раствор б<!лка,
мл
0,9% NaCi,
мл
Содержание
белка в пробе,
г
Концентра¬
ция, г%
1
0,4
0,6
0,04
4
2
0,6
0,4
0,06
6
3
0,8
0,2
0,08
8
4
1,0
—
0,10
10
5. Рабочий раствор биуретового реактива. 20 мл биуретово-
го реактива (3) смешивают с 80 мл раствора KI (4). Хранить
в темноте не больше двух недель.
6. Стандартный 10 г% раствор альбумина (из человеческой
или бычьей сыворотки) в 0,9% NaCl. 1 г альбумина растворяют
(в небольшом цилиндре или точной мерной пробирке) в 6—7 мл
0,9% NaCl и доводят конечный объем физиологическим раство¬
ром до 10 мл. 1 мл стандартного раствора содержит 0,1 г белка.
Ход определения. К 5 мл рабочего раствора биуретового
реактива добавляют, избегая образования пены, 0,1 мл сыво¬
ротки крови. Через 30 мин, самое позднее через 1 ч, пробу ко-
лориметрируют на ФЭКе в кювете шириной 10 мм при зеленом
светофильтре (имеющем максимум пропускания 540—560 нм,
лучше 546 нм) против контроля, который готовят путем добав¬
ления к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива 0,1 мл
0,9% NaCl (практически раствор NaCl можно и не добавлять).
Расчет ведут по калибровочной кривой.
Построение калибровочного графика. Из 10 г% стандартно¬
го раствора белка готовят рабочие стандартные растворы, как
указано в таблице 1 (0,1 мл основного стандартного раствора
содержит 0,01 г белка). Из каждого разведения берут по 0,1 мл
рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5 мл ра¬
бочего биуретового реактива. Через 30—60 мин экстинкцию
стандартных проб замеряют на ФЭКе против контроля (см. ход
определения).
Калибровочную кривую можно строить лишь после того,
как будет уверенность в том, что метод достаточно налажен.
При этом для каждой концентрации стандартного раствора
нужно сделать не менее чем 3—5 (обычно 5—10) определений.
Всего этим методом исследуют 2—3 серии стандартных окра¬
шенных растворов.
При построении калибровочной кривой серию стандартных
растворов обрабатывают так же, как и опытные пробы. Изме¬

рения оптической плотно¬
сти стандартных раство¬
ров начинают с растворов
наименьшей концентра¬
ции. Средние значения оп¬
тической плотности (соот¬
ветствующие различным
концентрациям) наносят
па миллиметровую бума¬
гу. На оси абсцисс (гори¬
зонтальной) с соблюде¬
нием одинаковых интер¬
валов равномерно откла¬
дывают значения концен¬
трации стандартных рас¬
творов белка; на оси ор¬
динат (вертикальной) —
соответствующие им вели¬
чины оптической плотно¬
сти. Масштаб выбирают так, чтобы кривая располагалась под
углом~45°. Затем хорошо отточенным карандашом наносят
среднее значение экстинкции из нескольких определений и че¬
рез полученные точки (а кое-где и между ними) проводят пря¬
мую линию. При этом удобно пользоваться прозрачной линей¬
кой (рис. 1). Если точка значительно выходит за пределы
линии, то пробы переделывают.
При оценке результатов, чтобы каждый раз не восстанавли¬
вать и не опускать перпендикуляры к оси ординат (оптической
плотности) и к оси абсцисс (концентраций), следует составить
таблицу пересчета (градуировочную таблицу, или калибровоч¬
ный график), в которой напротив наиболее часто встречающих¬
ся значений экстинкций приводят соответствующие величины
концентрации.
Калибровочную кривую нужно время от времени проверять.
При этом все точки строить заново нет смысла. Достаточно
взять несколько концентраций и посмотреть, укладываются ли
их точки на прежней калибровочной кривой. Если да, то кри¬
вую не переделывают.
Нормальные значения концентрации общего белка: в сыво¬
ротке крови в г%: у взрослых — 6,5—8,5, у детей до 6 лет —
5,6—8,5, у новорожденных — 5,3—8,9; в моче — 25—70 мг/сут-
ки. в ликворе — 15—45 мг%.
Примечания: 1. Описанным способом (без предвари¬
тельной концентрации) белок в моче и ликворе не определя¬
ется.
2. По данным А. Каракашова (1968), калибровочная кри¬
вая по биуретовому методу показывает линейную зависимость
до Е=0,5 (около 10 г% белка), что совпадает с данными дру¬
гих авторов.
Рис. 1. Пример построения кали¬
бровочной кривой для определения
общего белка сыворотки крови.
9

Поэтому при содержании белка в сыворотке больше 10 г%
сыворотку разводят физиологическим раствором (обычно по¬
полам), берут 0,1 мл смеси и полученный результат умножают
на коэффициент разведения (2).
3. Все реактивы, используемые в методике, следует готовить
на прокипяченной дистиллированной воде.
Клинико-диагностическое значение определения общего
белка. При оценке содержания общего белка в сыворотке (плаз¬
ме) крови пользуются понятиями нормопротеинемия (нормаль¬
ное содержание общего белка), гипопротеинемия (пониженная
концентрация общего белка) и гиперпротеинемия (его повышен¬
ное содержание).
Изменения концентрации общего белка могут носить абсо¬
лютный и относительный характер. Последний обычно наблю¬
дается при изменении объема крови (плазмы). Так, гидремия
(нагрузка водой, водное отравление) приводит к относительной
гипопротеинемии, дегидратация (обезвоживание) — к относи¬
тельной гиперпротеинемии. Дегидратация может скрыть абсо¬
лютную гипопротеинемию под маской нормальных цифр.
Для того чтобы отличить абсолютные изменения концентра¬
ции белков плазмы от относительных, необходимо определить
объем плазмы или привести исследование с помощью гемато-
крита. Ориентировочные данные можно получить, определив
количество эритроцитов и гемоглобина.
Наиболее частыми причинами развития гипопротеинемиче-
ского синдрома являются следующие состояния:
1. Недостаточное поступление белка пищи, наблюдаемое
обычно при недоедании, голодании, опухоли, сужении пищево¬
да, нарушении функции желудочно-кишечного тракта (вслед¬
ствие ухудшения переваривания и всасывания белковых компо¬
нентов пищевых продуктов), например, при продолжительных
воспалительных процессах кишечника.
По мнению А. А. Покровского, даже несбалансированный
аминокислотный состав пищи может иногда приводить к гипо¬
протеинемии.
Для обеспечения нормальных процессов жизнедеятельности
организм утилизирует альбуминовую фракцию белков плазмы
крови. При усиленном расходовании альбуминов (в основном
обусловливающих онкотическое давление крови) развиваются
так называемые голодные или кахектические отеки. Вообще
говоря, всякое уменьшение содержания белка в плазме кроБи
ниже 5 г% часто сопровождается гипопротеинемическими оте¬
ками тканей.
2. Понижение процессов биосинтеза белка, причинами кото¬
рого чаще всего бывают хронические паренхиматозные гепати¬
ты, сопровождающиеся выраженными цирротическими измене¬
ниями, а также интоксикации от некоторых химических ве¬
ществ; острые и хронические заболевания, длительные нагнои-
тельные процессы, злокачественные новообразования, тяжелые
10

тиреотоксикозы и т. д. Все это сказывается на подавлении про-
теосинтетической функции печени. Пораженные же печеночные
клетки, являющиеся местом образования альбуминов, фибри¬
ногена, части глобулинов, оказываются не в состоянии синтези¬
ровать эти белки плазмы крови в достаточном количестве,
вследствие чего и развивается гипопротеинемия, обусловленная
в основном гипоальбуминемией и гипофибриногенемией.
3. Потеря белка организмом при острых и хронических кро¬
вотечениях, при резко увеличенной проницаемости капиллярных
стенок (при токсическом их поражении, когда белки крови вы¬
ходят в ткани), при кровоизлияниях, образовании обширных
экссудатов, выпотов в серозные полости, отеках.
Выход белков (главным образом альбуминов) из русла кро¬
ви происходит при нарушении почечного фильтра вследствие
органических заболеваний почек (особенно нефрозах и амилои-
дозах), при которых белок почти всегда обнаруживается в мо¬
че, а также при ожогах.
Как уже упоминалось, альбумины и глобулины не выходят
из кровяного русла равномерно: в большем количестве выде¬
ляются мелкодисперсные альбумины, поэтому уменьшение
концентрации общего белка в плазме крови обусловливается
главным образом гипоальбуминемией.
4. Дефектопротеинемии, т. е. иногда встречающиеся у боль¬
ных нарушения в синтезе белков крови, например, анальбуми-
немия, врожденное отсутствие или недостаточное содержание
церулоплазмина в плазме крови при болезни Вильсона.
5. Нередко пониженные величины содержания белка в плаз¬
ме крови отмечаются у женщин в период лактации и послед¬
них месяцев беременности.
Гиперпротеинемия—явление сравнительно редкое. Кратко¬
временная относительная гиперпротеинемия наблюдается при
сгущении крови из-за значительных потерь жидкости, что бы¬
вает при профузных поносах, усиленном потоотделении, неукро¬
тимой рвоте, несахарном диабете, при холере, непроходимости
кишечника, генерализованном перитоните, тяжелых ожогах, ли¬
шении воды.
Незначительная абсолютная гиперпротеинемия встречается
при инфекционном или токсическом раздражении ретикуло-эн-
дотелиальной системы, в клетках которой синтезируются гло¬
булины. Это наблюдается, в частности, при хроническом поли¬
артрите и некоторых хронических воспалительных процессах.
Стойкая гиперпротеинемия до 12 г% и выше отмечается при
миеломной болезни (плазмацитоме), макроглобулинемии
Вальденштрема, при которых в плоских костях черепа появля¬
ются дополнительные очаги образования «ненормальных», па¬
тологических белков — парапротеинов. Поэтому при получении
больших цифр содержания общего белка в плазме крови боль¬
ного следует обследовать дополнительно на выявление этих
форм патологии.
11

Из сказанного следует, что гипопротеинемия связана почти
всегда с гипоальбуминемией, а гиперпротеинемия — с гипергло-
булинемией. Абсолютное повышение количества альбуминов в
сыворотке до сих пор не наблюдалось.
Гипоальбуминемию организм компенсирует гиперглобули-
немией (даже если нет раздражения ретикуло-эндотелиальной
системы) для того, чтобы сохранить уровень коллоидно-осмоти¬
ческого давления. Напротив, увеличение глобулинов компенси¬
руется гипоальбуминемией. В сущности, при различных забо¬
леваниях организм реагирует сравнительно однообразными
изменениями в основных белковых фракциях. Вот почему для
клинициста гораздо важнее установить изменения в соотноше¬
нии самих глобулиновых компонентов, чем отметить сдвиг в
альбуминово-глобулиновом коэффициенте.
Важное диагностическое значение имеет выяснение количе¬
ственных взаимоотношений между отдельными фракциями сы¬
воротки крови. Их изучение позволяет произвести дифферен¬
циацию заболеваний даже тогда, когда содержание общего
белка в сыворотке оказывается неизмененным. Для определе¬
ния белковых фракций крови разработаны многочисленные ме¬
тоды, среди которых большее распространение в клинико-диаг¬
ностических лабораториях получил электрофорез на бумаге.
Определение белковых фракций
сыворотки крови методом электрофореза на бумаге
Принцип метода основан на том, что под влиянием постоян¬
ного электрического поля белки сыворотки, обладающие элект¬
рическим зарядом, движутся по смоченной буферным раство¬
ром бумаге со скоростью, во многом зависящей от величины
заряда и молекулярного веса частиц. Вследствие этого белки
сыворотки крови разделяются обычно на 5 фракций: альбуми¬
ны и глобулины си, а2, |3, у.
К настоящему времени предложено много самых различных
аппаратов для электрофореза на бумаге. Однако общие требо¬
вания к приборам и процессу проведения электрофореза одни и
те же. Наиболее важные из них следующие:
1. Источник постоянного тока должен давать хорошо сгла¬
женный ток силой 50—100 мА при напряжении 180—400 в.
2. Камера, в которой проводят электрофорез, должна отве¬
чать нескольким условиям:
а) создавать и поддерживать определенную влажность воз¬
духа для предохранения бумаги от высыхания;
б) ее желательно охлаждать: нагревание бумаги приводит
к усиленному испарению буферного раствора в середине поло¬
сы и с краев ленты, что обусловливает изменение формы пятен
фракций белков после их электрофоретического разделения;
12

в) буферный раствор в разных отделах камеры должен
иметь одинаковый уровень, для избежания перелива через лен¬
ту за счет сифонного действия;
г) концы бумажных полос нельзя погружать в буферный
раствор, в котором находятся электроды. Электрическая связь
между лентами и электродами устанавливается посредством
фитильков из ваты, марли или бумажных полосок, смоченных
буферным раствором; этим устраняется передача изменений
pH буфера в то пространство, в которое погружены ленты.
3. Полоса бумаги может быть расположена горизонтально
(горизонтальный электрофорез) или под углом (вертикальный
электрофорез). В первом случае получаются лучшие результа¬
ты. Важно, чтобы бумажная лента была хорошо натянута.
Желательно, чтобы связывающий обе ванны мостик имел ши¬
пы для укладывания на них полосок. Это предотвращает обра¬
зование тонкого капиллярного слоя буферного раствора между
полоской фильтровальной (хроматографической) бумаги и
пластиной, в значительной мере ухудшающего качество элект¬
рофоретического разделения.
4. Большое значение имеет также качество фильтровальной
бумаги. Она должна быть однородной и плотной (хроматогра¬
фическая) .
В качестве носителя чаще всего используют фильтроваль¬
ную бумагу Ленинградской бумажной фабрики № 2 им. Воло¬
дарского, марки «хроматографическая быстрая» или «хромато¬
графическая медленная». Избрав сорт бумаги, нельзя его
менять, так как полученные результаты несколько зависят от ее
разновидности. Если обработку производят денситометром, то
рекомендуется брать быстро впитывающую бумагу, в осталь¬
ных случаях предпочтительнее пользоваться бумагой для мед¬
ленного впитывания (марки «М»). Она имеет гладкую лицевую
и рубчатую обратную стороны. При внимательном рассмотре¬
нии обратной стороны можно заметить грубые и крупные штри¬
хи, идущие параллельно более длинной стороне листа бумаги.
Эти штрихи отражают ход волокон целлюлозы. Бумажные
полоски, применяемые для электрофореза 3,5X40 см или др.,
нарезают таким образом, чтобы волокна целлюлозы шли вдоль
полосок. Благодаря этому каждая полоска бумаги представля¬
ет собой систему продольно идущих капилляров, что способст¬
вует продвижению белков (и других веществ) и препятствует
их растеканию к краям полоски. Кроме того, такая лента, в
отличие от полоски с поперечным ходом волокон целлюлозы,
меньше деформируется при увлажнении и высыхании. На од¬
ном из концов каждой полоски простым карандашом отмечают
номер анализа и дату забора крови для исследования.
Направление хода волокон целлюлозы в бумаге можно опре¬
делить и по растеканию на ней капли воды, принимающей
форму эллипса, длинник которого и соответствует распростра¬
нению волокон целлюлозы.
13

5. Буферные растворы. Для достижения электрофоретиче¬
ского фракционирования большое значение имеет pH буфер¬
ного раствора, так как от этого зависят знак и величина элек¬
трического заряда молекул белков. Существенное влияние ока¬
зывает также ионная сила буферной смеси.
В качестве электролита (буферного раствора) обычно при¬
меняют вероналовый (веронал-мединаловый), веронал-ацетат-
ный, мединаловый буфер. Реже используют боратный, фосфат¬
ный и другие буферные смеси. В последнее время для целей
разделения белков все шире используют трис-буфер.
Наибольшее применение получили следующие буферные
растворы:
а) вероналовый (веронал-мединаловый) буфер с pH 8,6.
Для приготовления буфера 10,32 г мединала (натриевая соль
веронала) растворяют в химическом стакане емкостью 500 мл
в 300 мл дистиллированной воды. После растворения мединала
сюда же прибавляют 1,84 г веронала и, помешивая, нагревают
на водяной бане до его растворения. После охлаждения (до
комнатной температуры) раствор полностью переносят в мер¬
ную колбу емкостью 1000 мл. Для этого химический стакан
несколько раз смывают дистиллированной водой, сливая раст¬
вор в мерную колбу. Остывший раствор доводят до метки и
определяют pH;
б) веронал-ацетатный буфер с pH 8,6. В 30 мл дистиллиро¬
ванной воды растворяют 8,71 г веронала, 1,89 г едкого натра
и 6,48 г уксуснокислого натрия (CH3COONa). Приливают к
раствору 60 мл 0,1М раствора соляной кислоты и доводят
объем дистиллированной водой до 1 л.
А. С. Циркина, JT. И. Кальнова, Н. Г. Шевченко (1969) ре¬
комендуют свой способ приготовления веронал-ацетатного бу¬
фера pH 8,6 ионной силы 0,1. Для его получения 120 мл 0,4 н.
раствора NaOH, 4 г веронала, 1,43 мл ледяной уксусной кисло¬
ты вносят в мерную колбу емкостью 1 л, содержащую 300 мл
воды, и после растворения всех ингредиентов доводят дистил¬
лированной водой до метки;
в) некоторые другие авторы добивались хороших результа¬
тов, применяя в повседневной работе мединаловый буфер с pH
7,6. Для его приготовления 11,5 г мединала растворяют в 1 л
воды;
г) очень хорошее разделение сыворотки (9 фракций) удает¬
ся получить при использовании трис-буфера pH 8,9. В 1 л дис¬
тиллированной воды растворяют 60,5 г триоксиметиламиноме-
тана (трис), 6 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)
и 4,6 г борной кислоты.
Подготовка к проведению электрофореза. Камеру для
электрофореза устанавливают строго горизонтально (при помо¬
щи вмонтированных в ее дно установочных винтов). Пластинки
с электродами отсоединяют от камеры. Кюветы прибора запол¬
няют буферным раствором таким образом, чтобы уровень жид¬
14

кости в них был одинаков, и оба отделения каждой кюветы
соединяют друг с другом при помощи полоски фильтровальной
бумаги. Укрепляют пластинки с электродами. На мостик, свя¬
зывающий обе кюветы, помещают полоски хроматографической
бумаги, следя за тем, чтобы они были равномерно натянуты.
Необходимо, чтобы концы бумажных полос оказались погру¬
женными в буферный раствор, во внутренние отделения элект¬
родных кювет. Затем прибор закрывают крышкой и дают бу¬
мажным полосам пропитаться буферным раствором, после
этого крышку снова снимают и на заранее отмеченные у катода
участки бумаги наносят сыворотку (иногда на расстоянии 2 см
от середины полоски в сторону катода). Этот метод про¬
питывания бумаги буферным раствором обычно дает весь¬
ма хорошие результаты электрофоретического разделения
белков сыворотки крови. Однако на практике в целях эко¬
номии времени ленты обычно смачивают в буфере и слегка
высушивают, отжимая их между листами фильтровальной
бумаги.
Нанесение сыворотки. На узкий край шлифованного стекла
(покровного, предметного) или полоски отмытой рентгеновской
пленки наносят из 0,1 мл микропипетки 0,01 мл (или 0,005 мл)
свежеполученной (негемолизированной) сыворотки. Апплика¬
тор приставляют нижним ребром к увлажненной бумаге и по¬
сле впитывания сыворотки отнимают. Нужно следить за тем,
чтобы между боковыми гранями аппликатора и краями полос
оставался промежуток шириной 5—6 мм.
Наносить сыворотку на бумагу можно и непосредственно из
пипетки (в виде поперечной полоски). В том и другом случаях
нужно соблюдать следующие правила: если сыворотку наносят
при помощи микропипетки на 0,1 мл, в нее насасывают сыво¬
ротку до метки 0,085. Пипетку зажимают между пальцами в
вертикальном положении, причем верхнее ее отверстие не сле¬
дует закрывать пальцем. Небольшое количество сыворотки,
находящееся в пипетке, не вытекает из нее, так как жидкость
удерживается капиллярными силами. Слегка касаясь бумаги
нижним краем пипетки, водят ее взад и вперед по бумажной
полосе в поперечном направлении (не доводя пипетку на 2 мм
до каждого края), пока мениск сыворотки не опустится до мет¬
ки 0,095. Весьма удобно наносить сыворотку автоматической
микропипеткой.
Допустимо окрашивание сыворотки перед ее нанесением
на полосу хроматографической бумаги. Для этого к 0,5 мл «сы¬
воротки добавляют несколько крупинок (проще на кончике
стеклянной иглы) порошка бром-фенолового синего. По пере¬
мещению пятна красителя, связывающегося прежде всего с
альбуминами, можно визуально следить за миграцией пятен.
После нанесения сыворотки крышку камеры плотно закры¬
вают, включают прибор и через бумажные полоски начинают
пропускать постоянный электрический ток.
15

Проведение электрофореза. Электрофоретическое разделе¬
ние белков сыворотки крови проводят при комнатной темпера¬
туре и градиенте потенциалов от 3 до 8 в на 1 см длины бу¬
мажной полоски. Сила тока, зависящая от величины подавае¬
мого напряжения, разновидности и pH буферного раствора,
толщины бумаги и температуры, при которой происходит элек¬
трофоретическое разделение, не должна превышать 0,1—0,3 мА
на каждый 1 см поперечного сечения бумажной полосы (плот¬
ность тока), Оптимальное время электрофореза подбирают
опытным путем. Обычно оно составляет 7—12—16—20 ч.
По окончании электрофореза отключают источник постоян¬
ного тока, из камеры извлекают бумажные полоски, прикреп¬
ляют их на деревянные рамки или развешивают на стеклянные
палочки. Затем помещают в горячий сушильный шкаф так,
чтобы полоски не соприкасались ни между собою, ни с метал¬
лическими стенками и деталями шкафа (это предохраняет
электрофореграммы от смазывания фракций).
Ленты высушивают в шкафу при 95—105° С в течение 10—
15 мин, но не более 20—30 мин. Поскольку связывание краски
белками при последующей обработке зависит от условий фик¬
сации (температуры, времени прогревания), необходимо строго
соблюдать их постоянство.
Окраска электрофореграмм. После фиксации сухие ленты
кладут в развернутом виде на дно плоских эмалированных кю¬
вет. При окрашивании и при отмывании электрофореграммы
нельзя класть друг на друга и сворачивать. Окраску белковых
фракций раствором бромфенолового синего производят, погру¬
жая бумажные полосы на определенное время в кювету с
красящим раствором.
Для выявления белков электрофореграммы обычно окра¬
шивают растворами, содержащими бромфеноловый синий,
кислотный сине-черный, амидочерный 10 В и другие красители.
1. Красящий раствор с бромфеноловым синим и сулемой:
бромфенолового синего (индикатор)—0,5 г, сулемы—10 г,
уксусной кислоты (ледяной) — 20 мл, воды дистиллирован¬
ной — 980 мл. 10 г сулемы растворяют в небольшом количестве
кипящей дистиллированной воды, добавляют 20 мл ледяной
уксусной кислоты и 0,5 г растертого в порошок бромфенолово¬
го синего, взбалтывают, охлаждают и доводят до метки в мер¬
ной колбе на 1000 мл, после чего фильтруют; светлый раствор
имеет яркий насыщенный вишнево-красный цвет.
2. Красящий раствор с бромфеноловым синим и сернокис¬
лым цинком:
а) бромфенолового синего (индикатор)—0,1 г, кристалли¬
ческого сернокислого цинка — 50 г, уксусной кислоты (ледя¬
ной) — 50 мл, воды дистиллированной — 900 мл. Способ
приготовления тот же, что в случае с сулемой, однако об¬
работка в этом красящем растворе осуществляется в течение
ночи;
16

б) бромфенолового синего (индикатор)—0,5 г, кристал¬
лического сернокислого цинка — 10 г, уксусной кислоты (ледя¬
ной) — 20 мл, воды дистиллированной — 500 мл. Способ при¬
готовления аналогичен описанному выше, время обработки по¬
лос составляет 30 мин.
3. Красящий раствор с кислотным сине-черным красителем
(краска, аналогичная амидо-черному 10 В): кислотного сине¬
черного красителя — 0,2 г, уксусной кислоты (ледяной) —
100 мл, метилового спирта — 900 мл. 0,2 г кислотно-сине-черно-
го красителя растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты и
доводят до 1000 мл метиловым спиртом, либо 0,2 г красителя
растворяют в смеси 100 мл уксусной кислоты и 900 мл мети¬
лового спирта.
4. Если используется амидо-черный 10 В, то 100 мг краски
растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют
900 мл метилового спирта.
Сухие ленты окрашивают этими красителями в течение
30 мин.
Примечание: сулема, сульфат цинка и уксусная кисло¬
та необходимы в качестве фиксаторов.
Затем фореграммы отмывают от несвязавшейся с белком
краски в нескольких сменах (обычно 3—5) отмывающего рас¬
твора — до последней «бесцветной» порции, т. е. пока фон лент
не сделается белым, а раствор промывной жидкости не переста¬
нет окрашиваться в желтый цвет.
Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязав¬
шейся с белком краски (отмывающие растворы) имеют разный
состав (в зависимости от применявшегося красителя):
а) при окраске бромфеноловым синим применяют 2%
раствор уксусной кислоты (получаемый добавлением к 20 мл
ледяной уксусной кислоты 980 мл дистиллированной или водо¬
проводной воды);
б) для амидо-черного 10 В (или сине-черного красителя)
используют смесь следующего состава: уксусной кислоты (ле¬
дяной) — 100 мл, фенола (расплавленного) — 40 мл, воды г,о-
допроводной — 860 мл.
Отмытые ленты высушивают на воздухе при комнатной тем¬
пературе (желательно в затемненном месте, если в качестве
красителя использовали бромфеноловый сйний). В последнем
случае для получения более интенсивной окраски фракций вы¬
сушенные ленты проводят над открытой бутылкой с концентри¬
рованным раствором аммиака. Пары аммиака нейтрализуют
остатки уксусной кислоты. При этом пятна белковых фракций
из слабо-зеленых превращаются в ярко-синие. Сухие окрашен¬
ные электрофореграммы хранят ватемноте.
Дальнейшую количественную обработку электрофореграмм
производят извлечением краски из бумаги (элюция) с после¬
дующим измерением оптической плотности на фотоэлектроко¬
лориметре либо с помощью денситометра.
17

В случае денситометрии в проходящем свете ленты пропи¬
тывают просветляющей жидкостью. Смоченную ленту промока¬
ют между листами фильтровальной бумаги и вставляют в ден¬
ситометр таким Образом, чтобы против щели камеры находился
неокрашенный участок. Писчик денситометра настраивают ка
нуль и включают протягивающее и записывающее устройство.
Записанная на денситометре кривая позволяет судить о числе
фракций и о содержании в них белка. Для этого кривую делят
на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Ве¬
личина площади каждого участка пропорциональна количеству
краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотноше¬
ние между этими площадями вычисляют по весу вырезанных
участков бумаги, взвешенных на торсионных весах. Общий вес
всех участков принимают за 100% или же за содержание об¬
щего белка в плазме в г% и вычисляют, какой процент по от¬
ношению к нему составляет вес каждого участка (фракции).
Если денситометр снабжен планиметром, то учет результа¬
тов еще более облегчается.
Для просветления электрофореграмм перед обработкой их
на денситометре применяют обычно следующие жидкости:
а) вазелиновое масло; б) 10% раствор а-бромнафталина в ва¬
зелиновом масле (90 мл вазелинового масла смешивают с 10 мл
а-бромнафталина).
При элюировании определяют величину экстинкции каждой
фракции и общую сумму экстинкций, которую принимают за
100% (выражая результаты в относительных процентах) или же
за величину содержания общего белка (если результаты содер¬
жания отдельных белковых фракций хотят выразить в абсолют¬
ных процентах, т. е. г%).
Сухие электрофореграммы разрезают по числу фракций,
ориентируясь на самый светлый участок между ними. Полоску
каждой фракции помещают в отдельную пробирку и заливают
3 мл элюирующего раствора. К альбуминовой фракции добав¬
ляют 9 мл этого раствора, на основании чего величину оптиче¬
ской плотности первой пробирки умножают на 3. Можно в
каждую пробирку вносить и по 5 мл элюирующего раствора.
Контролем служит участок фореграмм, не содержащий белка.
Содержимое пробирок осторожно встряхивают и оставляют в
затемненном месте на 30 мин (лучше на 40 мин— 1 ч). (Опре¬
деление плотности испытуемых растворов производят на фото¬
электроколориметре любого типа при зеленом светофильтре.
В контрольные кюветы наливают элюирующий раствор, по
которому устанавливают нулевое положение гальвано¬
метра.
Растворы для элюции краски из окрашенных электрофоре¬
грамм (экстрагирующие растворы) имеют следующий состав:
а) для извлечения бромфенолового синего применяют
0,01 н. раствор едкого натра (0,4 г NaOH растворяют в 1000 мл
дистиллированной воды). Лучше использовать 5% раствор кар-
18

бопата натрия (№2СОз), так как он дает более устойчивую ок¬
раску, чем раствор едкого натра;
б) для извлечения кислотного сине-черного красителя берут
0,1 н. раствор едкого натра (NaOH).
Определение процентного соотношения белковых фракций
методом элюирования с последующим фотометрированием счи¬
тается более точным, чем проведение его с помощью денсито¬
метра.
Расчет. Сумма цифр оптических плотностей составляет
100%, а каждая фракция — X от 100.
Пример. Оптическая плотность (Е) фракции альбуминов
0,52, глобулинов: ai — 0,02, сц — 0,05, Р — 0,10, у— 0,15, в сум¬
ме равна 0,84 (100%), тогда 0,52 от 100 составит X, Х=(0,52Х
XI00)/0,84 = 61,9%.
Следовательно, альбумины составляют 61,9%. Подобным же
образом рассчитывают процентное содержание всех остальных
фракций. Полученный ответ выражают в относительных про¬
центах.
Следует отметить, что более правильным считается выра¬
жение результатов не в относительных, а в абсолютных процен¬
тах (г%). К нему можно прийти, если сумму экстинкций всех
фракций отнести к концентрации общего белка сыворотки кро¬
ви. Тогда, пользуясь аналогичным расчетом, легко найти дей¬
ствительную концентрацию альбуминов и всех подфракций гло¬
булинов.
Пример. Общее количество белка в сыворотке крови 8,2 г%.
Сумма экстинкций всех фракций составляет 0,84. На долю аль¬
буминов приходится 0,52 ед оптической плотности. Если Е=0,84
соответствует 8,2%, то Е = 0,52 — X.
Отсюда: Х= (8,2 • 0,52)/0,84 = 5,07 г%, т. е. концентрация аль¬
буминов в сыворотке крови равна 5,07 г%. Зная концентрацию
общего белка плазмы (сыворотки) крови больного, легко пере¬
вести относительные проценты в абсолютные по решению про¬
порции: 100—8,2, 61,9—X, тогда Х= (61,9 • 8,2)/100 = 5,07 г%.
Для лучшего запоминания норм процентного содержания
перечисленных глобулиновых фракций сыворотки крови нами
рекомендуется исходить из ряда чисел: 4±1, 8±1, 10+2, 16±4,
где 4, 8, 10, 16 — средние величины концентрации a- Р-, у-гло-
булинов, а числа с ± — отклонения. Для ai-глобулинов они
составляют от 3 до 5, для остальных фракций — 7+9; 8+12;
12+20.
Весьма перспективным является проведение электрофореза
белков сыворотки крови на ацетилцеллюлозных пленках.
Замена ими бумажных полос позволяет сократить время элек¬
трофоретического деления белков сыворотки крови с 7—20 ч.
до 60—80 мин. При нанесении 0,001—0,002 мл (1—2 мкл) сы¬
воротки выявляются в виде резко очерченных полос на прозрач¬
ном фоне фракции преальбумина, альбумина, три фракции а-
глобулинов, две фракции Р-глобулинов и у-глобулины (всего
19

ТАБЛИЦА 2
Содержание белковых фракций
в сыворотке крови здоровых людей
Средние показатели по разным авторам
В. Г.
Колб
г.
В. Троицкий
А. А. По¬
кровский
Белковые
фракции
М±т
М±т
М+ш
Колебания
п
относи¬
тельный %
абсолютный %
п
относитель¬
ный %
относитель¬
ный %
Альбумины
Глобулины
100
61,5 ±0,70
4,97 ±0,07
25
60,0 ±0,03
56,6—66,8
а1
100
5,5 ± 0,21
0,45 ±0,02
25
3,0 ±0,1
3,0—5,6
а2
100
6,7 ±0,20
0,56 ±0,02
25
3,0 ±0,3
6,9—10,5
Р
100
9,2 ± 0,24
0,76 ±0,02
25
10,0 ± 1,0
7,3—12,5
V
100
16,8± 0,34
1,39 ±0,03
25
16,0 ± 1,5
12,8—19,0
Примечание: п — число испытуемых; М — среднее арифмети¬
ческое; m — средняя сшибка среднего арифметического.
8 фракций вместо 5 обнаруживаемых на бумаге). Прозрачность
полос облегчает их денситометрическое определение.
Получает все более широкое применение в клинике метод
диск-электрофореза в полиакриламидном геле, позволяющий
получать до нескольких десятков фракций белков. Хорошо за¬
рекомендовали себя отечественные и венгерские приборы для
электрофореза в полиакриламидном геле, поступающие с на¬
борами реактивов. Описание методов электрофореза белков
можно найти в прилагаемой к прибору инструкции и в ряде
монографий (Г. Маурер, 1971; Э. Г. Ларский, 1971).
Большинство количественных методов оценки электрофоре¬
грамм в полиакриламиде включает сканирование нативных,
различно обработанных гелей и фотоотпечатков. Мы для реги¬
стрирования результатов разделения белков в полиакриламиде
пользуемся прибором (микроденситометр), собранным на базе
микроскопа, источника высоковольтного стабилизированного
напряжения типа ВС-22, ФЭУ-35, усилителя постоянного тока
типа И-37, согласованного с самописцем типа Н-37,
При отсутствии в лаборатории аппарата для электрофореза
можно пользоваться иным методом определения белковых
фракций, основанным на их осаждении нейтральными солями
с последующим турбидиметрическим измерением степени по¬
мутнения на ФЭКе.
20

Определение белковых фракций
сыворотки крови турбидиметрическим методом
Принцип метода основан на том, что фосфатные растворы
определенной концентрации осаждают с образованием очень
мелкой взвеси различные белковые фракции сыворотки крови.
По степени мутности растворов (устанавливаемой с помощью
фотоэлектроколориметра) судят о концентрации белков в ис¬
следуемом материале.
Реактивы. 1. Основной раствор фосфатного буфера.
33,5 г NaOH растворяют в 400 мл дистиллированной воды,
добавляют 226,8 г КН2РО4, встряхивают и размешивают до пол¬
ного растворения. Охлаждают до комнатной температуры и до¬
водят водой до объема 500 мл (в мерной колбе) или же до
667,5 г (лучше по весу).
2. Разведенные растворы фосфатного буфера.
Определенную навеску основного раствора фосфатного бу¬
фера доводят дистиллированной водой до метки в мерной кол¬
бе на 100 мл.
Раствор 1 получают доведением 123,5 г, раствор 2— 100 г,
раствор 3 — 94,5 г, раствор 4 — 78,5 г, раствор 5 — 65 г основ¬
ного раствора фосфатного буфера дистиллированной водой до
объема 100 мл.
Примечание: при добавлении воды к навескам основ¬
ного фосфатного буфера растворы необходимо тщательно раз¬
мешивать.
Если рабочие растворы фосфатного буфера всегда готовят
в одном и том же мерном цилиндре (на 100 мл), на нем можно
сделать метки, соответствующие вышеуказанным навескам ос¬
новного раствора фосфатного буфера. Этот способ приготовле¬
ния рабочих растворов более удобен и быстр, хотя несколько
менее точен. Он требует точного приготовления основного рас¬
твора фосфатного буфера.
При хранении разведенных растворов с целью предупрежде¬
ния бактериального загрязнения рекомендуется к ним добав¬
лять по 1 капле хлороформа.
Ход определения. В штатив помещают 7 пробирок (емко¬
стью 10 мл), обозначенных цифрами 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6; в 0 про¬
бирку отмеривают 10 мл дистиллированной воды, а в пробирки
5, 4, 3, 2, 1 — по 5 мл соответствующих разведенных растворов
фосфатного буфера. В 6-ю пробирку вносят 0,5 мл сыворотки,
0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного раствора
фосфатного буфера. Содержимое пробирки смешивают 5—6-
кратным переворачиванием ее, избегая образования при этом
пузырьков воздуха. Затем в 1, 2, 3, 4 и 5-ю пробирки переносят
по 0,5 мл полученной смеси, а в 0 пробирку добавляют 1 мл ее.
Содержимое каждой пробирки осторожно перемешивают и че¬
рез 15 мин замеряют оптическую плотность 5, 4, 3, 2 и 1 раство¬
ров при красном светофильтре на левом измерительном бара¬
21

бане ФЭК-М, ФЭК-Н-57 (или единственном измерительном ба¬
рабане ФЭКов новых конструкций), в кюветах шириной
10 мм. Раствор нулевой пробирки, приготовленный в двойном
объеме, служит контролем, по которому устанавливают нуле¬
вую точку прибора.
Примечание: перед нефелометрическим определением
содержимое пробирок необходимо еще раз тщательно переме¬
шать, осторожно поднимая со дна осадок.
Расчет 1. Вычисляют показатель оптической плотности (Е)
альбуминов, он равен: Е пробы 1-й—Е пробы 2-й.
2. Вычисляют показатель Е ai-глобулинов. Для этого из по¬
казателя Е 2-й пробы вычитают показатель Е 3-й пробы.
3. Вычисляют показатель Е а.2-глобулинов. Для этого из
показателя Е 3-й пробы вычитают показатель Е 4-й пробы.
4. Вычисляют показатель Е Р-глобулинов. Из показателя Е
4-й пробы вычитают показатель Е 5-й пробы.
5. Показатель Е 6-й пробы является показателем Е Y-глобу-
линов.
6. Вычисляют содержание каждой фракции в относительных
или в абсолютных процентах.
Пример расчета: Е 1-й пробы — 78, Е 2-й — 35, Е 3-й — 30,
Е 4-й — 24, Е 5-й — 13; 1. Е альбуминов 78—35 = 43, глобулины:
2. Е а, 35-30 = 5, 3. Е а2 30-24=6, 4. Е р 24-13=11, 5. Е у= 13.
Полученную сумму экстинкций фракций 78 принимаем за 100%,
43 — за Х%, тогда Х= (100 • 43)/78 = 55,1 % альбуминов.
Для выражения результата в абсолютных процентах сумму
экстинкций принимаем за содержание общего белка, опре¬
деленного биуретовым методом, тогда показатель экстинк-
ции каждой фракции будет соответствовать ее концентрации
в г%.
Норма та же, что и при определении фракций белков мето¬
дом электрофореза.
Примечание: для облегчения расчета нулевые знаки в
показаниях экстинкций не учитываются.
Клинико-диагностическое значение. В норме альбумино-гло-
булиновое соотношение (А/Г коэффициент) составляет 1,2—2.
Величина этого показателя значительно снижается при хро¬
нических диффузных поражениях печени (хроническом гепати¬
те и циррозе), а также при инфекционных заболеваниях, вос¬
палениях, лихорадке, пневмонии, плевритах, туберкулезе, эндо¬
кардите, злокачественных процессах, плазмацитоме, амилои-
дозе.
В диагностике заболеваний гораздо большее значение име¬
ет комплексная оценка изменений всех выявленных на хрома¬
тографической бумаге фракций белков. В связи с этим выде¬
ляют следующие типы электрофореграмм:
1. Острого воспалительного процесса. Характеризуется вы¬
раженным уменьшением содержания альбуминов и возраста¬
нием фракций ai- и аг-глобулинов; в более поздние стадии обыч¬
22

но отмечается увеличение уровня Y-глобулинов. Этот тип элек¬
трофореграмм характерен для начальных стадий пневмоний,
острых полиартритов, экссудативного туберкулеза легких, ост¬
рых инфекционных заболеваний, сепсиса, обширного свежего
инфаркта миокарда.
2. Подострого, хронического воспаления. Отличается уме¬
ренным уменьшением фракции альбуминов и выраженным уве¬
личением а2- и Y-глобулинов. Этот тип электрофореграмм ха¬
рактерен для поздней стадии пневмоний, хронического тубер¬
кулеза легких, хронического эндокардита, холецистита, цистита
и пиелита.
3. Нефротического симптомокомплекса. При этом типе от¬
мечается значительное уменьшение содержания альбуминов,
повышение а2- и Р-глобулинов при умеренном снижении уровня
Y-глобулинов. Этот тип электрофореграмм характерен для гену-
инного или липоидного нефроза, амилоидного нефроза, нефри¬
тов, нефросклероза, токсикозов беременности, терминальных
стадий туберкулеза легких, кахексий и ряда других заболе¬
ваний.
4. Злокачественных новообразований: характеризуется рез¬
ким снижением содержания альбуминов при значительном уве¬
личении всех глобулиновых фракций. Наиболее высокого подъ¬
ема достигает возрастание Р-глобулинов. Этот тип фореграмм
обнаруживается при метастических новообразованиях с различ¬
ной локализацией первичной опухоли.
5. Y-глобулиновых плазмацитом. Отличается значительным
уменьшением содержания альбуминов, а2- и Р-глобулинов при
увеличении Y-глобулинов. Этот тип электрофореграмм характе¬
рен для Y-плазмацитом, макроглобулинемии и некоторых рети-
кулезов.
6. Pi-глобулиновых плазмацитом. Является характерным
уменьшение альбуминов и большинства глобулиновых фракций.
Только фракция Pi-глобулинов претерпевает резкое избиратель¬
ное увеличение. Данный тип электрофореграмм присущ Pi-плаз-
мацитомам, Pi-плазмаклеточной лейкемии и макроглобулинемии
Вальденштрема.
7. Гепатитов. Ему свойственно умеренное уменьшение содер¬
жания альбуминов, увеличение уровня Y-глобулинов, а также
некоторое увеличение Р-глобулинов. Этот тип электрофоре¬
грамм характерен для гепатитов, последствий токсического по¬
вреждения печени, гемолитических процессов, некоторых форм
полиартритов и дерматозов, некоторых лейкемий и злокачест¬
венных новообразований кроветворного и лимфатического аппа¬
рата.
8. Цирроза печени. Характеризуется значительным сниже¬
нием содержания альбуминов при сильном увеличении у-гло-
булиновой фракции, основание которой (на денситограмме)
расширяется. Этот тип электрофореграмм выявляется при цир¬
розах печени, тяжелых формах индуративного туберкулеза лег¬
23

ких, sepsis lenta, некоторых формах хронического полиартрита
и коллагенозов.
9. Механической желтухи. При нем отмечается уменьшение
уровня альбуминов и умеренное увеличение содержания а2-, Р-
и у-глобулинов. Последний тип электрофореграмм характерен
для обтурационной желтухи, а также для желтух, вызванных
развитием рака желчевыводящих путей и головки поджелудоч¬
ной железы, что приводит к механическому препятствию оттока
желчи.

Глава II
ПРОБЫ КОЛЛОИДОУСТОЙЧИВОСТИ
В клинико-диагностических лабораториях широко использу¬
ют методы, при которых простыми коллоидными реакциями
косвенно обнаруживаются изменения в составе белков сыворот¬
ки крови (диспротеинемические тесты). Все эти методы основы¬
ваются на изменениях, наступающих в коллоидной устойчиво¬
сти сыворотки, поэтому и получили известность под названием
проб коллоидной устойчивости (или проб на лабильность бел¬
ков сыворотки). Поскольку нарушение коллоидной устойчиво¬
сти сыворотки под действием какого-либо реактива выражает¬
ся сначала коагуляцией (склеиванием), а затем флокуляцией
(осаждением), коллоидно-устойчивые пробы именуются неред¬
ко коагуляционными или флокуляционными (коллоидно-осадоч¬
ными) .
Коллоидно-химическая сущность флокуляционных проб не
вполне ясна. Известно, что флокуляция (коагуляция, осажде¬
ние) обычно наступает: 1) при уменьшении электрического за¬
ряда коллоидных частиц; 2) при уменьшении содержания гид-
ратационной воды в коллоидных частицах и 3) при увеличении
размеров коллоидных частиц.
В пробе Вельтмана, например, используют коагуляцию за
счет уменьшения электрического заряда частиц при действии
электролитов (СаС12 и CdS04). Этот способ флокуляции явля¬
ется одним из наиболее распространенных.
Флокуляция коллоидных растворов вследствие уменьшения
сольватационной оболочки вызывается действием ацетона, ал¬
коголя, концентрированных растворов электролитов и др.
Весьма часто встречается коагуляция, вызываемая увели¬
чением размеров коллоидных частиц. Она наступает при дена¬
турации от действия солей тяжелых металлов (ртути, свинца),
некоторых органических кислот (трихлоруксусной, сульфосали-
циловой) и других, а также сильного нагревания. При этом бел¬
25

ки изменяются не только как коллоиды, но и как химические
структуры. Лабильность сывороточных белков во многом зави¬
сит от соотношения между альбуминами (гидрофильными, за¬
щитными коллоидами) и глобулинами. Установлено, что поло¬
жительный результат коллоидно-химических проб чаще всего
вызывается количественными изменениями в глобулиновых
фракциях (а, р, у), или изменением соотношения альбуми¬
ны/глобулины, т. е. он связан с увеличением содержания гло¬
булинов либо с уменьшением уровня альбуминов. При не от¬
личающейся от нормы величине глобулинов или нормальном
коэффициенте альбумины/глобулины определенное значение
имеет увеличение более грубо дисперсных подфракций (у-гло-
булинов) в глобулиновой системе.
Пробы коллоидоустойчивости, благодаря своей несложной
технике, получили чрезвычайно широкое распространение. Это
чаще всего применяемые при исследованиях функции печени.
Флокуляционные пробы производят обыкновенно с сыво¬
роткой. Плазму используют редко, а в некоторых пробах (Вель-
тмана) она вовсе не может быть употреблена.
КОАГУЛЯЦИОННАЯ ЛЕНТА ВЕЛЬТМАНА
При постановке оригинальной пробы Вельтмана (1930) из
основного раствора хлористого кальция (СаС12 • 6Н20) готовят
11 разведений в следующих концентрациях: в 1 пробирке 0,1%,
во II—0,09, в III —0,08, в IV —0,07, в V — 0,06, в VI — 0,05,
в VII—0,04, в VII 1/2 — 0,035, в VIII —0,03, в IX —0,02, в
X —0,01%.
В каждую пробирку вносят 0,1 мл сыворотки и 5 мл рабо¬
чего раствора хлористого кальция. Пробирки помещают в ки¬
пящую водяную баню на 15 мин, затем отмечают флокуляцию.
В норме коагуляционная лента начинается с первой пробир¬
ки и кончается 6—7 пробирками (Вельтман VI или VII проби¬
рок). Эта реакция требует большого количества сыворотки,
реактивов и посуды, проба занимает около 30 мин.
Тейфль при разработке своей модификации реакции Вельт¬
мана исходит из того, что непродолжительное кипячение на
открытом пламени дает такие же результаты, как и 15-минутное
кипячение в водяной бане по Вельтману.
В методе Тейфля используется один рабочий раствор CaCI?
(0,5%), а количество сыворотки составляет 0,1 мл вместо 1,1 мл
(в методике Вельтмана).
Исходя из вышеизложенного проба Вельтмана в модифи¬
кации Тейфля утверждена в качестве унифицированной.
26

ПРОБА ВЕЛЬТМАНА В МОДИФИКАЦИИ ТЕЙФЛЯ
Принцип. Реакция основана на том, что белки сыворотки
крови в результате нагревания и действия раствора хлористого
кальция определенной концентрации выпадают в виде хлопьев
(происходит нарушение коллоидной устойчивости).
Реактивы. 0,5% раствор СаС12 • 6Н20.
Раствор готовят из 10% раствора кристаллического хлори¬
стого кальция (СаС12*6Н20) или 5% СаС12 (безводного) раз¬
ведением его в 20 раз.
В качестве этого основного раствора может быть использо¬
ван ампулированный раствор хлористого кальция (для внут¬
ривенных введений). При его отсутствии рекомендуется готовить
из кристаллического хлористого кальция растворы с удельным
весом 1,040 (последний определяется ареометром). Процентную
концентрацию можно установить и рефрактометрически (по
специальным таблицам).
Ход определения. К 4,9 мл воды прибавляют 0,1 мл сыво¬
ротки, раствор перемешивают опрокидыванием пробирки (при
этом ее можно закрывать большим пальцем) и прибавляют
0,1 мл 0,5% СаС12 (из пипетки на 1 мл или из капельницы, если
объем каждой капли соответствует 0,05 мл). Содержимое про¬
бирки встряхивают и нагревают над пламенем спиртовки до
однократного вскипания смеси. Затем пробирку охлаждают и
смотрят через нее на свет. Если хлопьев в пробирке не обна¬
руживается, то в нее добавляют еще 0,1 мл СаС12 и раствор
вновь нагревают до кипения. В норме коагуляция наступает
при прибавлении 0,4—0,5 мл раствора хлористого кальция.
Примечание: сыворотка для исследования должна
быть свежей (хранящейся не более 24 ч от момента взятия),
без следов гемолиза.
Клинико-диагностическое значение. Реакция коагуляции с
хлористым кальцием (по Вельтману) может изменяться в двух
направлениях: в сторону укорочения коагуляционной ленты
или ее удлинения. Главные причины, которые ведут к удлине¬
нию полосы (коагуляция при добавлении менее 0,4 мл СаС12,
или наступающая более чем в седьмой пробирке), это фиброз¬
ные и пролиферативные процессы, паренхимные повреждения
печени и гемолитические состояния. Сдвиг вправо отмечается
при болезни Боткина, циррозах, острой желтой атрофии печени,
малярии, после переливания крови, аутогемотерапии и при
многих воспалительных заболеваниях (пневмонии, плеврите,
туберкулезе легких). Считают, что удлинение коагуляционной
полосы обусловлено повышением содержания углобулинов,
снижающих стабильность сыворотки.
Укорочение коагуляционной полосы (сдвиг влево от 5-й до
1-й пробирки или прибавление более 0,5 мл СаС12) обнаружи¬
вается при острых воспалительных и экссудативных процессах,
когда увеличивается количество а- и Р-глобулинов и за счет
27

этого повышается стабильность сыворотки: в экссудативной
фазе ревматизма, активном процессе туберкулеза легких, неф¬
розах, макроглобулинемии Вальденштрема, а2-, |3-плазмоцнто-
ме, злокачественных опухолях, экссудативном перитоните,
некрозах, больших потерях жидкости, острых инфекционных
заболеваниях. Крайнее укорочение коагуляционной ленты (от¬
рицательная проба) наблюдается при остром ревматизме.
СУЛЕМОВАЯ ПРОБА
Сулемовая проба (сулемово-осадочная реакция) относится
к группе реакций Таката (1925). Последняя заключается в том,
что при взаимодействии раствора сулемы и карбоната натрия
с сывороткой крови появляются хлопья.
Постановка этой пробы требует значительного количестр.а
сыворотки, не менее 4-х пробирок и занимает продолжительное
время (сутки). Поэтому она в настоящее время заменена более
простой пробой по Гринстедту, которая утверждена в качестве
унифицированного метода.
СУЛЕМОВО-ОСАДОЧНАЯ РЕАКЦИЯ
(СУЛЕМОВАЯ ПРОБА ПО ГРИНСТЕДТУ)
Принцип. Сулема в присутствии мелкодисперсных коллои¬
дов (белков) образует коллоидный раствор солей ртути. На¬
рушение дисперсности белковых фракций сыворотки крови вы¬
зывает осаждение грубодисперсных частиц.
Реактивы. 1. 0,1% раствор сулемы. Готовят из кристалли¬
ческой сулемы, растворяя соль в горячей дистиллированной
воде.
2. 0,85% раствор хлористого натрия.
Ход определения. К 0,5 мл негемолизированной сыворотки
крови добавляют 1 мл физиологического раствора и титруют
0,1% раствором сулемы из микробюретки или пипетки емко¬
стью 2 мл. Вначале раствор приливают по каплям в быстрой
последовательности, пока не произойдет первоначальное обра¬
тимое помутнение, затем медленно, по каплям, до появления
стойкого помутнения так, чтобы через вертикальный слой жид¬
кости нельзя было прочитать газетный текст (остерегаться об¬
разования пузырьков воздуха!).
Результаты сулемовой реакции выражают количеством мл
раствора сулемы, израсходованного на титрование.
Норма: у здоровых людей на титрование идет 1,6—2,2 мл
сулемы.
Если на титрование уходит меньшее количество сулемы, ре¬
акция расценивается как положительная.
28

Клинико-диагностическое значение пробы вытекает из ее
коллоидно-химической сущности, обусловленной изменением
отношения альбумины/глобулины (вероятно, за счет абсолют¬
ного или относительного увеличения Р- и у-глобулинов — наи¬
более грубодисперсных фракций). Можно допустить, что поло¬
жительный результат пробы вызывается появлением в крови
ненормальных белков (так называемых таката-протеинов). По¬
ложительная проба Таката встречается при ряде патологиче¬
ских состояний: заболеваниях печени (при болезни Боткина
сулемовая проба составляет около 1 мл, приходя к норме при
выздоровлении), хроническом нефрите, нефрозе, пневмонии,
туберкулезе легких, миеломе, инфекционных заболеваниях и др.
Следует помнить, что положительная реакция без повышенной
температуры больного чаще всего свидетельствует о поражении
печени. Положительная проба, сопровождающаяся повышенной
температурой больного, встречается, главным образом, при
хронических инфекционных заболеваниях и является выраже¬
нием неспецифического раздражения ретикуло-эндотелиальной
системы.
ТИМОЛОВАЯ ПРОБА
Тимоловая проба, предложенная в 1944 г. Маклаганом, ос¬
нована на определении степени помутнения при взаимодейст¬
вии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналовом
буфере.
Химическая сущность тимоловой пробы окончательно не
выяснена. Многие авторы полагают, что проба является поло¬
жительной при уменьшении альбуминов и увеличении Р- и у-гло-
булинов и связанных с Р-глобулинами липидов (липопротеи-
дов). Считают, что причиной помутнения является взаимодей¬
ствие коллоидных частиц тимола и некоторых крупнодисперс¬
ных белков: у-глобулинов и Р-липопротеидов. По представлению
Маклагана эта реакция связана с образованием глобулин-ти-
мол-липидного комплекса (содержащего 40% глобулинов, 32%
тимола, 18% холестерина и 10% фосфолипидов).
Все известные к настоящему времени пробы тимолового по¬
мутнения отличаются в основном способом приготовления бу¬
ферного раствора. Если в оригинальной методике Маклагана
тимол растворяют в веронал-мединаловом буфере при его на¬
гревании (что приводит к частичному окислению тимола), то
в утвержденном в качестве унифицированного методе Хуэрго
и Поппер тимол предварительно растворяют в этаноле, а затем
добавляют к барбитуратовому буферу (по Маклагану). Такой
способ растворения предохраняет тимол от разрушения.
29

ТИМОЛОВАЯ ПРОБА ПО ХУЭРГО И ПОППЕР
Принцип. При взаимодействии сыворотки с тимолово-веро-
налозым буфером появляется мутность вследствие образова¬
ния глобулино-тимоло-фосфолипидного комплекса.
Реактивы. 1. 10% спиртовой раствор тимола. 10 г очищен¬
ного тимола растворяют в 100 мл 96° этилового спирта в мер¬
ной колбе.
Очистка тимола. 100 г тимола растворяют в 100 мл
96° этилового спирта, фильтруют. К фильтрату прибавляют 1 л
холодной дистиллированной воды, сильно встряхивают и остав¬
ляют стоять на 20 мин. Затем фильтруют; кристаллы, оставши¬
еся на фильтре, промывают 2 раза холодной дистиллированной
водой, сушат — вначале на фильтровальной бумаге, потом в
течение 2—3 дней в эксикаторе над безводным хлористым каль¬
цием — до постоянного веса.
2. Буферный раствор. 2,76 г веронала (точно!) и 2,06 г ме¬
динала (веронала натрия) растворяют в 1 л дистиллированной
воды. Хранят в холодном месте, при появлении осадка раствор
не годен к употреблению.
3. Тимолово-вероналовый буфер. В мерной колбе на 100 мл
смешивают 80 мл буферного раствора и 1 мл 10% спиртового
раствора тимола, встряхивают и доливают буферным раствором
до метки; pH=7,55.
4. Приготовление стандартного раствора:
а) 0,0962 н. раствор хлористого бария. 1,175 г кристалличе¬
ского ВаС12 • 2 Н20 растворяют в 100 мл воды в мерной колбе;
б) 0,2 н. раствор H2S04;
в) суспензия BaS04: 3 мл 0,0962 н. раствора ВаС12 вливают
в мерную колбу на 100 мл и доводят объем 0,2 н. H2SO4 при
температуре +10° С (при этой температуре размеры частиц
преципитированного BaS04 дают относительно стабильный ре¬
зультат) .
Ход определения. К 6 мл тимолово-вероналового буферного
раствора прибавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки,
оставляют стоять 30 мин, затем фотометрируют при 660 нм про¬
тив буферного раствора в кюветах с толщиной слоя 10 мм.
Реакцию проводят при температуре +25° С. Расчет ведут по
калибровочной кривой.
Построение калибровочной кривой. Из стандартного раство¬
ра (суспензии BaS04) готовят разведения (получаемые его раз¬
бавлением 0,2 н. H2S04), соответствующие единицам помутне¬
ния по Shank и Haagland (S—Н).
Так, 1,35 мл суспензии и 4,65 мл 0,2 н. H2S04 соответствует
5 S-Н помутнения; 2,70 мл суспензии и 3,30 мл кислоты —
10 S-H; 5,40 мл суспензии и 0,60 мл кислоты — 20 S-Н по¬
мутнения.
Стандартные разведения смешивают, хорошо встряхивают
и тотчас фотометрируют при длине волны 660 нм (630
30

690 нм — красный светофильтр) против воды в 10 мм кюветах.
По полученным данным строят калибровочную кривую.
Норма—0—4 ед. (S-H)
Примечание: Важным условием получения точных дан¬
ных является взятие крови натощак: алиментарная гиперлипе-
мия существенно влияет на результаты исследования. Для того,
чтобы освободиться от искажений, Маклаган рекомендует
брать две пробы и в одну из них добавить 2 капли концентри¬
рованной НС1. При этом белки растворяются (на жиры кислота
не действует). Обе пробы фотометрируются: проба с добав¬
ленной кислотой служит компенсирующей жидкостью.
При постановке пробы сыворотка не обязательно должна
быть свежей. Она может стоять несколько дней. По мнению
некоторых авторов, умеренный гемолиз не отражается на ре¬
зультатах исследования.
Тимоловая проба, проводимая набором реактивов Био-ЛА-
Тест (Чехословакия), осуществляется методом, практически
ничем не отличающимся от унифицированного способа Хуэрго
и Поппер (см. инструкцию, прилагаемую к набору реактивов).
Следует отметить, что для получения более точных резуль-.
татов нефелометрирование опытных и стандартных проб нуж¬
но проводить в кюветах шириной не 10, а 5 мм (иначе кюветы
отечественных фотоэлектроколориметров окажутся заполнен¬
ными не полностью, что может повлечь за собой грубую техни¬
ческую ошибку определения).
Можно брать вдвое большие объемы сыворотки и рабочего
буферного раствора (0,1 мл и 6 мл соответственно) с последу¬
ющим нефелометрированием суспензии в кюветах шириной
10 мм. Но в этом случае вдвое сократится общее число опреде¬
лений, на которое рассчитан набор реактивов.
Клинико-диагностическое значение. Тимоловая проба более
пригодна для функционального исследования печени, чем дру¬
гие коллоидно-устойчивые пробы. Считают, что она положи¬
тельна в 90—100% случаев болезни Боткина (уже в преджел-
тушной ее стадии и при безжелтушной форме) и при токсическом
гепатите. Реакция положительна при послегепатитном и постне-
кротическом, особенно желтушном циррозе (в отличие от дру¬
гих форм циррозов), при коллагеновых заболеваниях, малярии
и вирусных инфекциях. При механической желтухе она (в 75%
случаев) отрицательна, что имеет дифференциально-диагности¬
ческое значение.
При механической желтухе проба становится положитель¬
ной лишь в случае, если процесс осложняется паренхиматоз¬
ным гепатитом. Для дифференциации механической желтухи
от паренхиматозной большое значение имеет применение тимо¬
ловой пробы с пробой Бурштейна (на Р- и пре-Р-липопротеиды).
При паренхиматозной желтухе обе пробы положительны,
при механической желтухе тимоловая проба отрицательна, про¬
ба Бурштейна — резко положительна.

Глава III
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОГО АЗОТА
И ЕГО КОМПОНЕНТОВ
Под остаточным азотом понимают небелковый азот, т. е.
азот, который остается в центрифугате (фильтрате) сыворотки
крови (или другой биологической жидкости) после осаждения
белков действием трихлоруксусной, фосфорномолибденовой или
фосфорновольфрамовой (вольфрамовой) кислоты. Это все сум¬
марные азотистые компоненты крови, за исключением азота
белковой фракции.
Остаточноазотную фракцию составляют: азот мочевины,
аминокислот, креатинина, креатина, мочевой кислоты и других
продуктов белкового обмена (табл. 3).
Из таблицы 3 видно, что мочевина является главной состав¬
ной частью остаточноазотной фракции (на ее долю приходится
более V2 всего остаточного азота). На втором месте стоят ами¬
нокислоты (доля их азота составляет около Ч\ от всего оста¬
точного азота). Разность между остаточным азотом и азотом
мочевины составляет так называемый резидуальный азот. Это
понятие охватывает всю остаточноазотную фракцию без азота
мочевины. Основной фракцией резидуального азота являются
аминокислоты.
Методы определения остаточного азота в сыворотке крови
делятся на две основные группы: азотометрические и гипобро-
митные.
Для установления количественного содержания азота всех
исследуемых фракций азотометрическим способом безбелковый
фильтрат (центрифугат) крови подвергают минерализации при
нагревании (в присутствии катализатора) с концентрированной
серной кислотой, благодаря чему весь остаточный азот перехо¬
дит в форму азота сернокислого аммония. После перегонки это¬
го азота в чашках Конвея, в замкнутом пространстве которых
происходит разложение аммиачных солей крепкой щелочью и
связывание освобожденного аммиака титрованным раствором
32

ТАБЛИЦА 3
Содержание остаточного азота
и его компонентов в сыворотке крови здорового человека
Нормальные
Содержания
азота каждой
Показатель
величины,
фракции от
мг%
всего остаточ¬
ного азота, %
Остаточный азот
20—40
100
Мочевина
15—50
50 (46—60)
Аминоазот (азот аминокислот)
2.0—4,3
25
Мочевая кислота
2—4
4
Креатин
1—4
5 I7-
2,5/
Креатинин
0,5—2,0
Индикан
0,022—0,08
0,5
Аммиак (цельная кровь)
0,03—0,06
Остальные небелковые вещества (поли¬
13
пептиды, нуклеотиды, эрготионеин и др.)
Ксантопротеиновая реакция
20 ед.
серной кислоты или другим способом, количество остаточного
азота определяется либо путем титрования (с индикатором Та-
широ) остатка непрореагировавшей с аммиаком серной кислоты
(А. А. Покровский, 1969), либо колориметрическим методом с
использованием одной из трех реакций: 1) с реактивом Нессле-
ра; 2) фенилгипохлоритной реакции; 3) реакции с нингид-
рином.
При взаимодействии аммиака с реактивом Несслера обра¬
зуются продукты желтого цвета. Данная реакция весьма чувст¬
вительна, однако недостатком метода являются сложность при¬
готовления реактива Несслера, его нестойкость, влияние на ход
реакции множества других факторов.
В основе фенолгипохлоритного метода лежит способность
аммиака вступать в реакцию с гипохлоритом, что приводит к
образованию хлорамина. Последний, реагируя с фенолом, дает
образование индофенолового соединения синего цвета. Некото¬
рые авторы считают, что этот способ определения аммиака не
особенно точен; сложным и громоздким является приготовление
самого гипохлорита.
Большой чувствительностью отличается нингидриновый ме¬
тод.
2 Зак. 2615
33

В целях упрощения азстометрических методов определения
остаточного азота некоторые авторы предлагают опустить этап
диффузии аммиака и проводить прямое колориметрическое
определение остаточного азота (Асель). Правда, исключение
процесса перегонки приводит к возрастанию ошибки метода до
10%. Несмотря на это, метод Аселя благодаря своей простоте
нашел довольно широкое распространение в клинико-диагности¬
ческих лабораториях. Он утвержден как унифицированный.
Гипобромитные методы определения остаточного азота ос¬
нованы на способности гипобромита разрушаться при действии
на азотистые соединения безбелкового фильтрата. Остаток не¬
прореагировавшего гипобромита выявляется йодометрическиз
путем титрования контроля и опыта тиосульфатом (гипосуль¬
фитом)— метод Раппопорта и Эйхгорна — или путем прямого
колориметрического определения выделившегося в опытной и
контрольной пробирках йода (Нательсон, 1961; Г. Н. Сербина
и др., 1970).
В качестве унифицированного предлагается более доступ¬
ный титрометрический вариант гипобромитного метода.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОГО АЗОТА
КРОВИ ГИПОБРОМИТНЫМ МЕТОДОМ
(МЕТОД РАППОПОРТА — ЭЙХГОРНА)
Принцип. Белки сыворотки крови осаждаются. На азотистые
соединения центрифугата (фильтрата) воздействуют щелочным
раствором гипобромита, остаток которого определяется йодо¬
метрически. Разность в количестве гипосульфита, пошедшего
на титрование контроля и опыта, выраженная в мл и умножен¬
ная на коэффициент пересчета, дает концентрацию азота в мг%.
Реактивы. 1. Осаждающий раствор. В мерную колбу емко¬
стью 1000 мл вливают 44,8 мл 10% раствора вольфрамовокис¬
лого натрия, добавляют 2 г лимоннокислого натрия и 6,4 г сер¬
нокислого натрия. Все ингредиенты растворяют приблизительно
в 800 мл воды (при комнатной температуре или при нагревании
в струе горячей воды), прибавляют 44,8 мл 1 н. раствора сер¬
ной кислоты и 2 г сернокислого кадмия (CdS04), после чего
доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл.
Осадитель можно готовить и без сульфата кадмия, однако
результаты при этом получаются менее точные, поскольку кад¬
мий осаждает серные соединения крови, способные связывать
часть брома.
При наличии в лаборатории фосфорновольфрамовой кисло¬
ты осадитель может быть приготовлен по следующей прописи:
2,5 г фосфорновольфрамовой кислоты и 2,5 г безводного серно¬
кислого натрия растворяют в небольшом объеме воды, добав¬
ляют 2,5 мл концентрированной H2S04 и доводят объем дистил¬
лированной водой до 500 мл.
34

2. Дезаминирующий гипобромитный раствор. Он состоит из
смеси реактивов А и В.
Реактив А состоит из растворов Ai, А2 и Аз.
jPacTBOp Ai: 42,25 г борной кислоты и 12,8 г NaOH растворя¬
ют в 250 мл воды, смесь кипятят в течение 30 мин и после
охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 500 мл.
Раствор Аг: насыщенный ( — 5%) раствор фтористого
натрия. 5 г фтористого натрия растворяют в 100 мл горя¬
чей воды и горячий раствор фильтруют через бумажный
фильтр.
Раствор Аз: 2,7% раствор NaOH.
Реактив А: 250 мл раствора Ai смешивают с 150 мл раство¬
ра Аг и с 50 мл раствора Аз, т. е. в соотношении 5:3: 1. Смесь
хорошо сохраняется. Борная кислота связывает сахар в крови,
редуцирующие свойства которого мешали бы опыту. В присут¬
ствии ионов борной кислоты гипобромит не влияет даже на не¬
большие количества глюкозы.
Реактив В: в колбе емкостью 100 мл, содержащей 50 мл во¬
ды, растворяют 2 г бромистого калия (КВг), прибавляют 0,8 г
(0,25 мл) чистого брома (его удобно брать шприцем), взбалты¬
вают до растворения и доводят объем дистиллированной водой
до 100 мл.
Раствор сохраняется 7, максимум 10 дней. При его приготов¬
лении нужно соблюдать большую осторожность, учитывая ядо¬
витость брома. Все работы с ним следует проводить под тягой,
в перчатках, фартуке, защитных очках.
Раствор 2 — гипобромитный раствор — получают непосред¬
ственно перед опытом, смешивая 9 частей реактива А и 1 часть
реактива В.
3. 0,005 н. раствор гипосульфита натрия (Na2S203). Для его
получения 5 мл 0,1 н. раствора гипосульфита (тиосульфата)
натрия доводят свежепрокипяченной и охлажденной без досту¬
па СОг дистиллированной водой до 100 мл (в мерной колбе).
Исходный (0,1 н.) раствор лучше всего готовить из фиксанала.
При его отсутствии 2,4819 г. кристаллической соли (Na2S203*
* 5НгО) растворяют в небольшом объеме дистиллированной во¬
ды, количественно полностью переносят в мерную колбу на
100 мл и доводят водой до метки.
4. Кристаллический KI или 10% раствор йодистого калия.
Раствор хранят в темной посуде в холодильнике.
5. 0,25% раствор крахмала (можно пользоваться 0,2% или
1% раствором).
6. 18% раствор соляной кислоты. Концентрированную НС1
удельного веса 1,19 разводят пополам дистиллированной водой.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1 мл
Дистиллированной воды, 0,1 мл сыворотки или крови (взятой
Йз пальца) и 4 мл осадителя (реактив 1), смешивают и через
10—15 мин центрифугируют в течение 5—10 мин. За это время
готовят рабочий раствор гипобромита.
I*
35

В небольшой стаканчик или в колбочку отбирают 4 мл цент-
рифугата, добавляют (лучше моровской пипеткой) 5 мл рабо¬
чего раствора гипобромита, содержимое взбалтывают и остав¬
ляют стоять на 1—2 мин. Добавляют 0,2 мл 10% раствора KI
или несколько кристалликов йодистого калия. Затем прибав¬
ляют 3 мл 18% раствора НС1, взбалтывают и титруют 0,005 н.
раствором гипосульфита натрия до слабо желтого цвета. До¬
бавляют 2—3 капли 0,25% раствора крахмала и титруют далее
до обесцвечивания.
Одновременно с опытом ставят контроль, содержащий 4 мл
осадителя, 5 мл гипобромита, 0,2 мл 10% KI, 3 мл 18% НС1.
Контрольную пробу титруют также до обесцвечивания. Лучше
ставить два контроля: один из них титруют в начале, дру¬
гой — в конце опыта, затем берут среднее значение. Для полу¬
чения более точных результатов следует ставить параллельные
пробы.
Разность в количестве мл гипосульфита, израсходованного
на титрование контрольной (К) и опытной (О) проб, умножают
на коэффициент (30) и дают ответ мг%: (К-О) -30 = остаточ-
ный азот, мг%.
При титровании 0,005 н. раствором гипосульфита коэффици¬
ент равен 30, на контроль должно идти от 8,5 до 10 мл гипо¬
сульфита. Если на титрование контрольной пробы идет мень¬
шее количество раствора гипосульфита, то он более крепок, ли¬
бо в реактив В нужно добавить несколько капель чистого брома.
Примечания: 1. Начиная с этапа отбора центрифугата
можно использовать половинные объемы растворов, умножая
полученный результат на коэффициент 60.
2. Допускается титрование производить 0,01 н. раствором
гипосульфита. При этом полученные значения нужно умножать
на коэффициент 59,6.
Норма остаточного азота в крови 20—40 мг%.
Клинико-диагностическое значение. Большинство авторов
считает нормальным содержание остаточного азота в цельной
крови или в сыворотке у взрослых 20—40 мг%, но и 50 мг% еще
не считается патологическим, поскольку некоторые физиологи¬
ческие факторы (прием богатой азотистыми веществами пищи,
сухоядение, предродовое состояние и пр.) могут сказываться
на повышении концентрации остаточного азота крови. Однако
чаще всего повышение остаточного азота крови является сви¬
детельством нарушения нормальных взаимоотношений между
образованием и выведением продуктов азотистого метаболиз¬
ма из организма.
Увеличение концентрации остаточного азота свыше 40—■
50 мг% обозначается термином «азотемия». По своему характе¬
ру последняя может быть абсолютной (связанной с действи¬
тельным накоплением в крови компонентов остаточного азота)
и относительной (обусловленной, например, обезвоживанием,
дегидратацией).
36

Абсолютная азотемия вызывается либо задержкой азотистых
шлаков, либо усиленным их образованием.
почечная (ретенционная)
Абсолютная/^
Азотемия ^внепочечная (продукционная, ретенционная)
Относительная (дегидратационная).
Ретенционная азотемия наблюдается при нарушении выде¬
лительной способности почек. Отсюда определение остаточного
азота приобрело большое значение при почечных заболеваниях
(острых и особенно хронических нефритах). Большинство авто¬
ров разделяет мнение, что повышение остаточного азота до
100 мг% и выше является очень плохим признаком. И все же
следует помнить, что в острых случаях заболевания повышение
остаточного азота может быть преходящим (тогда задержка
шлаков носит не стойкий, а временный характер). Следователь¬
но, для правильного толкования цифр остаточного азота в
каждом отдельном случае нужно делать повторное исследова¬
ние крови на остаточный азот. Азотемия при острых нефритах,
как правило, является следствием анурии. В случаях хрониче¬
ского нефрита стойкая азотемия указывает на развившуюся
недостаточность почек. Степень повышения остаточного азота
при этом коррелируется тяжестью патологического процесса.
Определение в крови остаточного азота может иметь диффе¬
ренциально-диагностическое значение в случае гипертонии: при
почечной гипертонии остаточный азот повышен, при эссенциаль-
ной — в пределах нормы.
Продукционная азотемия, как правило, наблюдается при
усиленном распаде белков; умеренное увеличение остаточного
азота отмечается у больных злокачественными новообразова¬
ниями. Это повышение идет параллельно степени кахексии.
Важно отметить, что при этом состоянии процентное отноше¬
ние азота мочевины ко всему остаточному азоту бывает умень¬
шено в противоположность азотемии почечного происхождения,
при которой оно бывает повышено. Повышение остаточного
азота наблюдается и при кахексии неракового происхождения,
вызванной, например, туберкулезом, диабетом, тяжелыми цир¬
розами печени.
При крупозной пневмонии остаточный азот повышен с пер¬
вых дней болезни и продолжает нарастать до последнего дня
высокой температуры, повышение остаточного азота идет за
счет увеличения главным образом полипептидной фракции и
обусловлено преимущественно тканевым и в меньшей степени
почечным факторами. Первые признаки столбняка сопровожда¬
ются непрерывным нарастанием в сыворотке крови остаточного
азота.
Повышенное содержание остаточного азота отмечено также
при острой желтой атрофии печени, сердечной недостаточности,
37

прекоматозной стадии диабета, инфекционных заболеваниях,
сопровождающихся лихорадкой (с прогрессирующим распадом
тканей), например при сыпном тифе, дифтерии, скарлатине,
пневмониях, нередко при острой закупорке кишок, перитонитах,
хирургическом шоке, гипертрофии предстательной железы, по¬
дагре, гипофункции надпочечников, а также при отравлении
четыреххлористым углеродом, хлороформом, мышьяком, фосфо¬
ром, щелочами.
Интересные отношения установлены между остаточным азол
том и хлоридами крови. Показано, что обеднение организма
солью сопровождается прогрессивной азотемией. Эта так назы¬
ваемая «хлорипривная азотемия» отмечается у больных с неф¬
ритом, протекающим без отеков (в ответ на хлоропению для
компенсации осмотического давления увеличивается концентра¬
ция остаточного азота; вполне понятно, что применение ахло-
ридной диеты в этих случаях противопоказано). В послеопера¬
ционном периоде для борьбы с гипохлоремией и азотемией
больным вводят внутривенно раствор хлористого натрия.
Относительная азотемия наблюдается при сгущении крови
при профузных поносах, усиленном потоотделении (в жарких
странах, горячих цехах), при отравлении газами и пр. Пони¬
жение содержания остаточного азота в крови наблюдается при
недостаточном питании, иногда при беременности, при которой
отмечены также и нормальные цифры его.
Поскольку в норме более 50% остаточного азота приходит¬
ся на долю мочевины, остановимся на характеристике сущест¬
вующих методов определения этой, главной фракции небелко¬
вого азота.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ
Мочевина представляет собой диамид угольной кислоты, об¬
разующийся в печени при обезвреживании аммиака. Молеку¬
лярный вес ее 60 углеродных единиц (у. е.). Из них 28 у. е. при¬
ходится на долю двух атомов азота, входящих в состав моле¬
кулы мочевины. Следовательно, при необходимости сопостав¬
ления концентрации остаточного азота с содержанием азота
мочевины концентрацию последней следует разделить на 2,14
(60:28). Только при получении таких, соизмеримых величин
возможно нахождение процента содержания азота мочевииы
от всего остаточного азота, что имеет очень большое значение
для дифференциации поражений печени и почек.
Основные группы методов определения мочевины подразде¬
ляются на:
1) газометрические или гипобромитные; 2) ксантгидроло-
вые; 3) диацетилмонооксимные; 4) гипохлоритные; 5) уреазные
методы; 6) прочие: с р-диметиламинобензальдегидом (реактив
Эрлиха) и с изонитропропиофеноном, с диметилгликоксимом.
38

Известны также полуколичественные, ориентировочные ме¬
тоды определения мочевины с помощью реактивной бумаги.
Объемно-гипобромитные методы выдающегося русского компо¬
зитора и химика Л. П. Бородина и его модификации основаны
на разложении мочевины гипобромитом натрия в щелочной
среде CO(NH2)2 + 3 NaBr0 = N2+C02 + 3 NaBr+2 Н20.
Выделяющаяся углекислота поглощается раствором, свобод¬
ным остается только азот, объем которого измеряется. Метод
не специфичен, так как гипобромит реагирует не только с мо¬
чевиной, но и с другими компонентами остаточного азота, содер¬
жащими аминогруппы. На определение требуется большое ко¬
личество крови и брома (весьма токсичного реактива), иногда
не удается точно замерить объем выделившегося газа из-за
прилипания пузырьков к стенкам аппарата. Сам же стеклян¬
ный прибор, в котором производят определение, часто выходит
из строя вследствие хрупкости. Известно много веществ, обра¬
зующих с мочевиной окрашенные соединения. На этом прин¬
ципе основан ряд колориметрических методов. Так, гетероцик¬
лический спирт ксантгидрол вступает в соединение с мочевиной,
Образуя осадок — диксантилмочевину. В дальнейшем мочевину
можно определить различными способами: гравиметрическим
(высушиванием и взвешиванием), нефелометрическим, колори¬
метрическим (осадок растворяется в 50% серной кислоте,
в результате возникает цветная реакция) и титрометриче¬
ским.
Ксантгидроловые методы более точны, чем гипобромитные,
однако в клинико-диагностических лабораториях их применяют
редко из-за большой трудоемкости и дефицитности реактивов.
Наиболее распространенными являются колориметрические
методы, основанные на реакции Фирона — взаимодействии мо¬
чевины с диацетилмонооксимом с образованием окрашенных
продуктов. Для повышения чувствительности и стабилизации
цвета реактива предложен ряд модификаций метода с введе¬
нием в реакцию разных веществ: триптофана и нитритов, фени-
лантраниловой кислоты, антипирина, персульфата калия, тио-
семикарбазида и солей железа. Последняя модификация была
положена в основу определения мочевины при помощи готовых
наборов реактивов, выпускаемой фирмой «Лахема» (ЧССР).
Преимуществом метода, основанного на реакции Фирона,
является его простота: на все определение требуется 15—1
20 мин. Причем, для анализа может быть использована капил¬
лярная кровь.
Фенолгипохлоритный метод Д. А. Рашкован, состоящий в
появлении характерной окраски при взаимодействии мочевины
с гипохлоритом натрия и фенолом, не нашел широкого приме-
йения в клинико-диагностических лабораториях из-за трудности
приготовления фенолгипохлоритного реактива и по ряду других
причин (различный оттенок окраски опытных и контрольных
проб, частое появление мути при добавлении НС1 и пр.).
39

Наиболее точными и специфичными методами определения
мочевины являются ферментативные с использованием уреазы.
Последнюю можно получить из тыквенных или арбузных семе¬
чек, соевой муки, однако лучше использовать кристаллический
препарат уреазы. Этот фермент очень стойкий, его можно хра¬
нить длительное время.
Заслуживает внимания быстрое ориентировочное (полуко-
личественное) определение мочевины с помощью реактивней
бумаги (Уреатест и др.).
Из всего многообразия методов исследования концентрации
мочевины в биологических жидкостях в качестве унифициро¬
ванных утверждены: 1) экспресс-метод — определение мочеви¬
ны с применением реактивной бумаги «Уреатест»; 2) диацетил-
монооксимный — весьма простой (позволяющий провести все.
исследование капиллярной крови в течение 15—20 мин), чувст¬
вительный и достаточно специфичный (им определяется моче¬
вина с помощью набора реактивов, поставляемых чешской фир¬
мой «Лахема»); 3) ферментативный (как наиболее специфич¬
ный)— с кристаллическим препаратом уреазы.
При невозможности по какой-либо причине наладить в ла¬
боратории один из перечисленных унифицированных методов
мы предлагаем освоить простой уреазный способ определения
мочевины, в котором можно использовать фермент, содержа¬
щийся в семечках арбуза или тыквы. Этот метод можно при¬
менить в любой лаборатории.
Определение ферментативным методом основано на гидроли¬
зе мочевины уреазой с образованием аммиака, по количеству
которого и судят о содержании в биологической жидкости мо¬
чевины.
Аммиак, в свою очередь, можно определить колориметриче¬
ски с реактивом Несслера или фенолгипохлоритным реактивом
Бертлота.
Определение мочевины
в сыворотке крови экспресс-методом
с применением реактивной бумаги «Уреатест»
Определение мочевины в сыворотке крови проводят соответ¬
ственно инструкции по применению реактивной бумаги «Уреа¬
тест». Последняя представляет собой полоски хроматографиче¬
ской бумаги размером 120X10 мм, пропитанные растворами
фермента и индикатора. Зоны их нанесения разделены красной
парафиновой полоской. При определении бумажку следует дер¬
жать за свободный конец.
Метод основан на специфичном действии фермента уреазы
расщеплять мочевину с выделением аммиака. Выделившийся
аммиак окрашивает индикатор в голубой цвет. Высота окра¬
шенной зоны в мм пропорциональна концентрации мочевины в
40

мг%, что определяется по кривой, приложенной к комплекту.
С помощью реактивной бумаги можно определить от 20 до
250 мг% мочевины в сыворотке крови. Комплект содержит
20 шт реактивных бумажек, график и инструкцию.
Ход определения. Сыворотку крови разводят дистиллирован¬
ной водой 1:1. На конец бумажки, пропитанной ферментом,
на расстоянии 3 мм от красной парафиновой полосы мерной
пипеткой наносят 0,03 мл приготовленной сыворотки крови.
Быстро вносят бумажку в чистую сухую пробирку, герметиче¬
ски закрывают пробкой и оставляют на 20 мин при 37° С в тер¬
мостате или на 20 мин при 20° С. Затем измеряют высоту ин¬
дикаторной зоны, окрашенной в голубой цвет. По приложенно¬
му графику находят содержание мочевины в мг%, соответству¬
ющее результатам измерения в мм.
В случае использования крови или неразбавленной сыво¬
ротки результат надо делить на 2. Хранить в сухом, темном,
прохладном месте. Срок годности 8 месяцев со дня выпуска.
Определение мочевины
в сыворотке крови и в моче
по цветной реакции с диацетилмонооксимом
Принцип. Мочевина образует с диацетилмонооксимом в кис¬
лой среде в присутствии тиосемикарбазида и солей железа
окрашенные вещества, интенсивность окраски которых пропор¬
циональна содержанию мочевины в сыворотке крови и в моче.
Реактивы. 1. 10% раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 2,5% водный раствор диацетилмонооксима (реактив
стоек).
3. 0,25% водный раствор тиосемикарбазида или 0,32% вод¬
ный раствор солянокислого тиосемикарбазида. Оба реактива
стабильны при хранении в темной посуде при комнатной тем¬
пературе.
4. Раствор хлорного железа.
Основной (5%) раствор хлорного железа. 5 г хлорного
железа растворяют в 100 мл дистиллированной воды и подкис¬
ляют добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты.
Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного же¬
леза: 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до
100 мл дистиллированной водой, затем добавляют 8 мл кон¬
центрированной серной кислоты и 1 мл 85% ортофосфорной кис¬
лоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2-х недель.
5. Цветной реактив.
К 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют
20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5% диацетилмонооксима
и 0,25 мл 0,25% тиосемикарбазида. Цветной реагент готовят
каждый раз перед употреблением.
6. Стандартный раствор мочевины.
41

1 г мочевины растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Из этого основного раствора готовят рабочий (100 мг%) стан¬
дартный раствор разведением основного в 10 раз.
Согласно приказа М3 СССР об унификации (1972, № 290,
с. 69—70) рекомендуется сразу готовить 100 мг% раствор мо¬
чевины на 0,2% растворе бензойной кислоты (0,2 г кристалли¬
ческой бензойной кислоты растворяют в 100 мл дистиллиро¬
ванной воды при интенсивном перемешивании и нагревании на
водяной бане).
Стандарт, приготовленный на растворе бензойной кис¬
лоты, более стабилен, чем водный. При работе оба раствора
должны давать небольшие колебания экстинкции. В про¬
тивном случае следует приготовить новый стандартный рас¬
твор.
1 мл стандартного раствора содержит 1 мг мочевины.
Ход определения мочевины в сыворотке крови. В центри¬
фужную пробирку вносят 0,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл
сыворотки и 1 мл 10% раствора трихлоруксусиой кислоты, со¬
держимое ее смешивают. Через 15—20 мин смесь центрифуги¬
руют.
В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и
5 мл смеси цветного реактива (5). Пробирку выдерживают в
кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем охлаждают в те¬
чение 2—3 мин под водопроводной водой. Измерение проводят
на фотоэлектроколориметре при длине волны 500—560 нм (зе¬
леный светофильтр), против контрольной пробы в кювете с
толщиной слоя 10 мм.
Контрольную пробу ставят так же как опытную, но вместо
надосадочной жидкости берут 0,5 мл дистиллированной воды.
В стандартную пробу вносят вместо сыворотки 0,2 мл
100 мг% стандартного раствора мочевины.
Допустим и второй вариант постановки стандартной пробы,
при которой в пробирку вносят 0,05 мл рабочего стандартного
раствора, 0,25 мл 100% раствора трихлоруксусиой кислоты,
0,2 мл дистиллированной еоды и сразу 5 мл цветного реактива.
Этот способ, несмотря на большую простоту, отличается не¬
сколько меньшей точностью из-за трудности взятия пипеткой
ровно 0,05 мл жидкости.
В обоих случаях расчет производят по формуле:
Х = Еоп/Ест • 100,
где X—концентрация мочевины, мг%;
Еоп — экстинкция опытной пробы;
Ест — экстинкция стандартной пробы;
100 — концентрация мочевины (мг%) в стандартном раст¬
воре.
Определение мочевины в моче. Перед исследованием про¬
фильтрованную мочу (взятую из суточного ее количества) раз¬
водят физиологическим раствором в соотношении 1 :25 или
1 •: 50. Определение проводят способом, аналогичным для сы¬
42

воротки крови, с той лишь разницей, что вместо сыворотки
берут 0,2 мл разведенной мочи.
Параллельно обрабатывают стандартную пробу, как и для
определения мочевины в сыворотке крови.
Расчет мочевины на суточное количество мочи производят
по следующей формуле:
V Сет ■ Е0п • а • К
Лг/сутки - Ест . б . 1000 ’
где X — количество мочевины в суточной моче, г;
Еоп — экстинкция опытной пробы;
Ест —экстинкция стандартной пробы;
Сет — количество мочеЕины в стандартной пробе, 0,05 мг?
а — суточное количество мочи, мл;
б — количество мочи (мл), взятое для анализа;
К — коэффициент разведения мочи;
1000 — коэффициент перевода величины экскреции мочевины
из мг в г.
Норма содержания мочевины в сыворотке крови—15—
50 мг%, в суточном объеме мочи — 20—35 г.
Примечания: 1. Ввиду неустойчивости получаемой ок¬
раски измерение экстинкции следует проводить не позже чем
через 15 мин после охлаждения проб.
2. Из-за неустойчивости окрашенного комплекса мочевины
с диацетилмонооксимом и зависимости окраски от условий на¬
гревания, калибровочный график строить не рекомендуется.
3. При содержании мочевины в сыворотке крови выше
100 мг% сыворотку разводят физиологическим раствором, а ре¬
зультаты умножают на коэффициент разведения.
4. При определении содержания мочевины в моче, начиная
с величины экстинкции 0,13—0,15, следует увеличить разведе¬
ние мочи.
5. Пересчет показателей мочевины на содержание азота в
мочевине проводят путем умножения на фактор 0,466 (или де¬
лением на 2,14).
Определение мочевины
в сыворотке крови уреазным методом
по реакции с фенол-гипохлоритом
Принцип. Мочевина под действием уреазы разлагается на
углекислый газ и аммиак. Аммиак определяют колориметри¬
чески по образованию окрашенных продуктов с гипохлоритом
и фенолом.
Реактивы. 1. Раствор ЭДТА — динатриевой соли этилендиа-
минтетрауксусной кислоты (трилон «Б», селектон, хелатон,
комплексон III, версен). 1 г ЭДТА растворяют в 90 мл дистил¬
43

лированной воды, доводят pH до 6 5 н. раствором едкого нат¬
ра и доливают водой до 100 мл. Раствор используют для
приготовления раствора уреазы.
2. Раствор уреазы с pH 6. Берут 0,02 г уреазы, растворяют
в 50 мл раствора ЭДТА, проверяют pH. Отечественная уреаза
выпускается с активностью 870 ед Sumner на 1 г белка. Уреаза
с активностью 800—1000 ед Sumner на 1 г белка пригодна для
реакции.
Уреазу хранят в холодильнике в плотно закрытой упаковке.
Раствор уреазы стабилен в течение месяца при хранении в хо¬
лодильнике в посуде с плотно закрытой пробкой.
3. Раствор фенола и нитропруссида натрия (цветной реак¬
тив). 0,25 г нитропруссида натрия чистый для'анализа (чда)
растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл
или 54 г фенола (чда) и доливают дистиллированной водой до
2 л. Раствор стабилен в течение месяца при хранении в холо¬
дильнике в посуде из темного стекла,
4. Основной раствор гипохлорита (NaOCl). 100 г хлорной из¬
вести (СаОСЬ) размешивают в течение 15 мин с 170 мл дистил¬
лированной воды, затем прибавляют, непрерывно помешивая,
раствор из 170 мл дистиллированной воды и 70 г углекислого
натрия (Na2C03). Масса сначала густеет, потом разжижается.
Оставляют стоять до следующего дня. Надосадочную жидкость
(гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый
дистиллированной водой фильтр. Хранят в холодильнике, в по¬
суде из темного стекла. Срок годности раствора — 1—2 месяца.
Определение активности хлора. 1 мл основного раствора ги¬
похлорита натрия смешивают с 100 мл дистиллированной во¬
ды. К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свежеприготовлен¬
ного 5% раствора йодистого калия (KI) и 10 мл 6 н. раствора
НС1. Титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия. Как только
раствор приобретает слабо желтую окраску, добавляют 10 ка¬
пель 1% раствора крахмала и титруют до обесцвечивания.
Концентрацию гипохлорита натрия рассчитывают по хлору:
концентрация активного хлора в г на 100 мл гипохлорита нат¬
рия равна а-0,709, а — количество мл тиосульфата натрия, по¬
шедших на титрование; 0,709 — коэффициент пересчета 1 мл
тиосульфата натрия в г% хлора.
После установления концентрации активного хлора основ¬
ной раствор гипохлорита натрия разводят так, чтобы концент¬
рация хлора равнялась 0,5 г%. Этот раствор смешивают с рав¬
ным объемом 5 н. раствора едкого натра и используют для
реакции. Активность хлора проверяют не реже 1 раза в две не¬
дели.
5. 0,1 н. раствор тиосульфата натрия. 25 г кристаллического
тиосульфата натрия (Na2S2C>3 • 5Н20) растворяют в 1 л дис¬
тиллированной воды.
6. 5 н. раствор едкого натра.
7. 6 н. раствор соляной кислоты.
44

8. 5% раствор йодистого калия.
9. Стандартный раствор мочевины. 40 мг высушенной до по¬
стоянного веса мочевины растворяют в мерной колбе в 100 мл
0,2% раствора бензойной кислоты. 1 мл раствора мочевины со¬
держит 0,4 мг мочевины (мочевину можно растворять в дистил¬
лированной воде, но раствор будет менее стабилен). Раствор
хранят в холодильнике.
10. 0,2% раствор бензойной кислоты. 0,2 г кристаллической
бензойной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды
при интенсивном перемешивании и нагревании до полного рас¬
творения кристаллов.
Ход опередения. Опытная проба. 0,5 мл раствора уреазы
вносят в пробирку с притертой пробкой, добавляют 0,02 мл сы¬
воротки. Пробирки закрывают пробками и инкубируют 15 мин
при 37° С. После инкубации добавляют 10 мл цветного реакти¬
ва (раствора фенола и нитропруссида натрия) и 1 мл раствора
гипохлорита натрия. Перемешивают и оставляют на 20 мин при
37° С. Через 10 мин измеряют экстинкцию на ФЭКе в кювете с
толщиной слоя 10 мм при длине волны 500—560 нм (зеленый
светофильтр) против контрольной пробы. Окраска стабильна в
течение нескольких часов.
Контрольную пробу ставят как опытную, но вместо сыво¬
ротки берут дистиллированную воду. Стандартную пробу об¬
рабатывают как опытную, но вместо сыворотки берут калибро¬
вочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях, что
и опытную, против контрольной пробы.
Расчет ведут по формуле:
концентрация мочевины, мг% = Е1/Е2 • 40,
где Ei — экстинкция опытной пробы;
Ег — экстинкция стандартной пробы;
40 — концентрация стандартного раствора мочеви¬
ны, мг%.
В норме содержание мочевины в сыворотке крови составля¬
ет 20—50 мг%. Для пересчета результатов на азот мочевины
концентрацию мочевины в мг% делят на 2,14.
Примечания. 1. Построение калибровочного графика
не рекомендуется, так как интенсивность окраски проб зависит
от условий опыта. Поэтому правильнее обрабатывать стандарт¬
ные пробы одновременно с опытными и вести расчет по фор¬
муле.
2. Серия проб не должна превышать 10.
3. Если сыворотка мутная или окрашенная, то ставят допол¬
нительную контрольную пробу, в которую добавляют сыворотку
и все реактивы без инкубации. Экстинкцию этой контрольной
пробы вычитают из опытной.
45

Определение мочевины крови уреазным методом
по реакции с реактивом Несслера
Принцип метода основан на разложении мочевины крови
или сыворотки ферментом уреазой с последующим определени¬
ем колориметрическим способом (с использованием реактива
Несслера) образующегося в результате реакции аммиака.
Реактивы. 1. Препарат уреазы: а) очищают 3—4 семечка
арбуза, извлеченные зерна растирают в ступке, сначала в 1 мл,
затем в 10 мл воды. Полученную эмульсию фильтруют. В се¬
мечках ферментативная активность сохраняется более 2-х лет.
Вместо арбузных семечек можно пользоваться и тыквенными;
б) сухая соевая мука (10—12 мг на пробу).
2. 7,5% раствор кристаллического сульфата цинка.
3. 1,5% раствор едкого натра.
Проверка титров растворов 2 и 3: на титрование 10 мл 7,5%
раствора сульфата цинка в присутствии фенолфталеина (в ка¬
честве индикатора) должно пойти 10,8—11,2 мл 1,5% раство¬
ра NaOH.
4. 0,2% сегнетова соль (К№С4Н406— виннокислый К, Na).
5. Реактив Несслера.
6. Стандартный раствор мочевины 30 мг% (30 мг мочевины
в 100 мл воды).
Ход определения. В две пробирки: опытную и стандартную
вносят по 1,5 мл дистиллированной воды. Затем в опытную до¬
бавляют 0,1 мл крови или сыворотки, а в стандартную — 0,1 мл
30 мг% раствора мочевины, после чего в каждую из пробирок
приливают по 0,5 мл препарата уреазы, полученного из арбуз¬
ных семечек, или добавляют по 10—12 мг сухой соевой муки.
Содержимое пробирок перемешивают, плотно закрывают кор¬
ковыми пробками, выдерживают 20 мин в водяной бане (или в
термостате) при +37° С, охлаждают водой и добавляют в каж¬
дую пробирку по 0,2 мл 7,5% раствора ZnS04 и по 0,2 мл 1,5%
раствора NaOH. После тщательного перемешивания производят
центрифугирование (до получения прозрачной надосадочной
жидкости), из каждой пробы отбирают по 1,25 мл центрифуга-
та, который переносят в две другие чистые пробирки. В них до¬
бавляют по 2,25 мл 0,2% раствора сегнетовой соли и по 0,5 мл
реактива Несслера. Содержимое пробирок перемешивают и ко-
лориметрируют на ФЭКе при синем светофильтре, в кювете
шириной 5 мм против воды (1) или контроля (2).
Контрольную пробу ставят путем добавления к 1,25 мл дис¬
тиллированной воды 2,25 мл 0,2% раствора сегнетовой соли и
0.5.мл реактива Несслера.
Расчет ведут путем решений пропорций 1 и 2:
1. (Ео-Ек) — X мг%, (Ес-Ек) —30 м г %,
тогда Х= (Ео —Ек)/(Ес —Ек) -30 мг% = а мг%.
2. Ео —X мг%, Ес —30 мг%, тогда Х=Ео/Ес*30 мг% = а мг%,
где Ес — экстинкция стандарта;
46

ТАБЛИЦА 4
Процент азота мочевины в остаточном азоте
Остаточный азот, мг%
Содержание азота мочевины, %
20—40
46—60
40—60
50—75
60—100
60—88
100—150
70—91
Выше 150
75—95
Ео — экстинкция опыта;
Ек — экстинкция контроля.
Норма содержания мочевины в сыворотке крови — 20—
40 мг%.
Клинико-диагностическое значение. При трактовке результа¬
тов анализа следует исходить из того, что диета с низким со¬
держанием белка может уменьшить концентрацию мочевины в
крови до 12 мг% (при норме 20—40 мг%) и наоборот, избыточ¬
ное питание азотистыми продуктами повышает уровень мочеви¬
ны до 50 мг%. Диета, бедная ионами хлора, также нередко
приводит к повышению концентрации мочевины. Поэтому боль¬
шинство авторов считает колебание концентрации мочевины
15ч-50 мг% физиологически допустимым. Однако существует
мнение, что всякое повышение мочевины в крови выше 40 мг%
нужно рассматривать выходящим за пределы нормы, так как
едва ли какой-либо пищевой режим способен поднять содер¬
жание мочевины крови выше этого уровня при отсутствии вы¬
делительных расстройств.
Из других физиологических состояний следует отметить бе¬
ременность, при которой концентрация мочевины в крови часто
падает ниже 20 мг%.
В клинике определение концентрации мочевины приобрело
наибольшее значение для диагностики заболеваний почек.
Е. М. Тареев считает, что по количеству мочевины в крови
можно скорее распознать начальную степень почечной недос¬
таточности, чем по величине суммарного остаточного азота, ибо
мочевина составляет именно ту часть остаточного азота, кото¬
рая в наибольшей степени задерживается в крови при ухудше¬
нии функции почек. К тому же определение мочевины техниче¬
ски проще и быстрее, чем остаточного азота.
В таблице 4 отражены данные о процентном содержании
азота мочевины в общей массе остаточного азота при хрониче¬
ских формах заболеваний почек.
47

Как видно из таблицы 4, при почечной патологии мочевина
нарастает в гораздо большей степени, чем все остальные ком¬
поненты остаточного азота.
Если в норме азот мочевины сыворотки составляет около
50% всего остаточного азота, то при почечной недостаточности
он может увеличиваться до 90%. Поэтому для дифференциаль¬
ной диагностики поражений почек от заболеваний печени, со¬
провождающихся глубокими дистрофическими изменениями,
используется коэффициент urea ratio — как важный показатель
почечной (и печеночной) функции.
Urea ratio —азот мочевины/остаточный азот - 100.
В норме этот показатель колеблется от 48 до 60%, при хро¬
нических нефритах он возрастает до 90% и более. При острых
нефритах уремия наступает быстро и, как правило, бывает
следствием анурии. Задержка азотистых соединений в крови
наблюдается обычно при гломерулонефритах и почти не обна¬
руживается при нефрозах.
Определение мочевины (или остаточного азота) в крови по¬
зволяет дифференцировать уремические состояния от псевдо-
уремических. Так, если при клинической картине уремическою
припадка у гипертоника содержание остаточного азота или
мочевины в крови нормально, ясно, что это не уремия. При по¬
чечной гипертонии мочевина в крови повышена. При эссенци-
альной гипертонии азотистая фракция в крови нормальна.
Знание концентрации мочевины позволяет составить пред¬
ставление и о прогнозе заболевания.
Повышение уровня мочевины в сыворотке крови наблюдает¬
ся не только при почечной недостаточности, но и при ряде дру¬
гих патологических состояний: рефлекторной анурии, камнях и
злокачественных новообразованиях в мочевыводящих путях,
предстательной железе, отравлении сулемой, болезни Аддисона,
усиленном распаде белков (при острой желтой атрофии
печени, тяжелых инфекционных заболеваниях: брюшном тифе,
холере и др.), непроходимости кишечника (илеусе), перитони¬
те, шоке, ожогах, обеднении организма ионами хлора (хлори-
привная азотемия, уремия), а также при дизентерии, обезво¬
живании (в последнем случае уремия носит не абсолютный, а
относительный характер).
Поскольку мочевина образуется главным образом в печени
(существует взгляд, что синтезировать мочевину в небольших
количествах могут и другие ткани), вполне понятно, что при ее
заболеваниях в первую очередь страдает мочевинообразователь¬
ная функция. Поэтому при паренхиматозной желтухе, острой
дистрофии печени, декомпенсированном циррозе уровень моче¬
вины в крови уменьшается, хотя концентрация остаточного
азота при этом может не изменяться или даже несколько уве¬
личиваться (за счет возрастания содержания азота аминокис¬
лот и аммиака). Особенно показательно в этом отношении из¬
менение коэффициента urea ratio, который резко снижается (в
48

противоположность значительному повышению при недостаточ¬
ности почек).
Повышенное содержание мочевины в моче отмечается при
злокачественной анемии, лихорадке, гиперпротеиновой диете,
после приема салицилатов, хинина, при отравлении фосфором;
пониженное — при уремии, нефрите, ацидозе, паренхиматозной
желтухе, острой дистрофии печени, прогрессирующем циррозе.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНИНА
И КРЕАТИНА В КРОВИ И МОЧЕ
Существующие методы определения креатинина (креатина)
в крови и моче делятся на:
1. Колориметрические. 1. С пикриновой кислотой. Методы
этой группы основаны на реакции Яффе и различаются между
собой по способу осаждения белков плазмы или сыворотки.
Последнее может быть осуществлено: а) вольфраматом натрия
(Фолин, By, 1919); б) пикриновой кислотой (Поппер и др.,
1937); в) трихлоруксусиой кислотой (Б. Е. Берхин, 1954).
2. С 3,5-динитробензойной кислотой.
3. С ортонитробензальдегидом и «-нафтолом.
II. Ферментативные. 1. Определение креатинина при помо¬
щи почвенных бактерий, разлагающих креатинин.
2. Определение с ферментом креатинфосфокиназой.
Наиболее точными и специфичными являются ферментатив¬
ные методы определения креатинина. Однако все они сложны,
требуют большого количества дорогостоящих реактивов и аппа¬
ратуры. Поэтому их применение в лабораторной практике не¬
целесообразно.
Из колориметрических методов самыми специфичными явля¬
ются методы с применением ортонитробензальдегида. Принцип
их состоит в превращении креатинина в метилгуанидин, кото¬
рый определяется реакцией для гуанидиновых производных.
Однако она требует большого количества дефицитных реакти¬
вов: ортонитробензальдегида, а-нафтола, брома, мочевины.
К тому же эта реакция протекает длительно, а основанные на
ней методы отличаются трудоемкостью.
Очень большое распространение получила реакция Яффе,
открытая автором в 1886 г. Суть ее сводится к тому, что при до¬
бавлении к креатинину пикриновой кислоты в щелочной среде
появляется оранжево-красное окрашивание, обусловленное об¬
разованием таутомера пикрата креатинина.
К сожалению, методы, основанные на реакции Яффе, недос¬
таточно специфичны, поскольку ими определяются и содержа¬
щиеся в сыворотке крови «псевдокреатининовые» хромогены.
Среди них наибольшее значение имеют глюкоза, ацетон, ацето-
уксусная и пировиноградная кислота. Эти продукты могут
обусловливать кажущееся повышение уровня сывороточного
49

креатинина, поэтому определение указанным методом креати¬
нина в крови и моче больных сахарным диабетом оказывается
весьма неточным.
Замечено, что при нагревании с белком пикриновая кислота
восстанавливается в пикраминовую (красного цвета). Различ¬
ные другие восстановители, в том числе и глюкоза, также спо¬
собны превращать пикриновую кислоту в пикраминовую.
Содержание неспецифических хромогенов в сыворотке крови
значительно больше, чем в моче, что может сказаться на рас¬
чете клиренса креатинина.
В связи с этим большое значение приобрел вопрос о специ¬
фичности методов определения креатинина в биологических
жидкостях. Как выяснилось, последняя во многом зависит от
природы осадителя белков сыворотки крови.
В методе Поппер осаждение белков производят пикриновой
кислотой, что, по мнению ряда авторов, позволяет получать бо¬
лее точные результаты, чем в случае осаждения белков воль-
фраматом натрия или трихлоруксусиой кислотой. Видимо, пи¬
криновая кислота осаждает и часть креатининоподобных хромо¬
генов, дающих цветную реакцию Яффе. Клиренс креатинина,
определенный по методу Поппера, более правильно отражает
истинную величину клубочковой фильтрации. Найденная по
методу Поппера с соавторами величина клубочковой фильтра¬
ции практически ничем не отличалась от значений клиренса
инулина (А. К. Мерзон, 1970).
Учитывая все вышеизложенное, в качестве унифицирован¬
ного метода для определения концентрации креатинина в крови
и моче предложен метод Поппера с соавторами, основанный на
реакции Яффе.
Определение концентрации креатинина
в сыворотке крови и в моче по цветной реакции Яффе
(метод Поппера и др.)
Принцип. Креатинин реагирует с пикриновой кислотой с об¬
разованием в щелочной среде окрашенных соединений. Интен¬
сивность окраски пропорциональна концентрации креатинина.
Реактивы. 1. Насыщенный (~2%) раствор пикриновой кис¬
лоты. Готовят растворением 2 г пикриновой кислоты в 100 мл
горячей (70—80° С) дистиллированной воды (при нагревании
в водяной бане). Раствор оставляют на сутки при комнатной
температуре (для осаждения нерастворившейся пикриновой
кислоты), после чего его фильтруют. Продажная пикриновая
кислота содержит 15—20% воды, однако сушить ее не следует:
взрывоопасно! К тому же, пикриновая кислота представляет
собой сильный яд. Обращаться с нею нужно осторожно.
2. Основной стандартный раствор креатинина—100 мг%.
100 мг креатинина растворяют в 100 мл 0,1 н. раствора соляной
50

кислоты. Хранят в холодильнике, в посуде с притертой проб¬
кой.
Для определения креатинина сыворотки крови рабочий
стандартный раствор (1 мг%) получают разведением основного
раствора дистиллированной водой в 100 раз. 1 мл рабочего
раствора креатинина содержит 0,01 мг креатинина. Этот раст¬
вор не стоек.
3. 10% раствор едкого натра.
4. 0,1 н. раствор соляной кислоты.
Ход определения креатинина в сыворотке крови. 2 мл сыво¬
ротки смешивают в пробирке с 6 мл прозрачного насыщенного
раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин пробирку помеща¬
ют на 15—20 с в кипящую водяную баню, затем содержимое
пробирки центрифугируют (или фильтруют).
К 4 мл центрифугата добавляют 0,2 мл 10% раствора NaOH
и тщательно смешивают. Иногда после подщелачивания
раствор мутнеет вследствие выпадения следов фосфатов.
В этом случае его следует еще раз отцентрифугировать.
Затем раствор доводят до объема 10 мл дистиллированной
водой.
Через 10 мин пробу колориметрируют при зеленом свето¬
фильтре (длина волны 530 нм; 500—560 нм) в кювете с рабо¬
чей шириной 20 мм против контрольной пробы. Интенсивность
окраски не изменяется в течение часа.
Контрольная проба. К 3 мл насыщенного раствора пикрино¬
вой кислоты добавляют 0,2 мл 10% раствора NaOH и доводят
объем дистиллированной водой до 10 мл.
Стандартную пробу отрабатывают точно так же, как и опыт¬
ную, с той лишь разницей, что вместо сыворотки берут 2 мл ра¬
бочего (1 мг%) раствора стандарта; пробу при этом не центри¬
фугируют.
Постановку стандартной пробы можно упростить, если иск¬
лючить этап отбора половинного объема исходного раствора и
сразу к 1 мл рабочего стандартного раствора креатинина доба¬
вить 3 мл пикриновой кислоты, 0,2 мл 10% раствора NaOH и
5,8 мл дистиллированной воды.
Расчет концентрации креатина производят по формуле:
X мг% креатинина = Еоп/Ест • 1 мг%,
где X — содержание креатинина в сыворотке крови, мг%;
Еоп — экстинкция опытной пробы;
Ест — экстинкция стандартной пробы;
1 мг% — концентрация креатинина в стандартной пробе.
Расчет концентрации креатинина в сыворотке крови может
быть произведен по калибровочной кривой (табл. 5).
Измерения экстинкции производят в тех же условиях, что и
рпытные пробы. Показания ФЭКа откладывают на оси орди¬
нат, а значение концентрации креатинина — на оси абсцисс.
Прямолинейная зависимость сохраняется при концентрации
креатинина от 0,3 до 5 мг%.
51

ТАБЛИЦА 5
Данные к построению
калибровочной кривой для определения креатинина
№
проби¬
рок
Рабочий
стандарт¬
ный раст¬
вор креа¬
тинина, мл
Содержа¬
ние креа¬
тинина,
мг в пробе
Концентрация
креатинина,
мг% в пробе
сыворотки
Раствор
пикрино¬
вой кис¬
лоты, мл
10%
раствор
NaOH,
мл
Дистиллиро¬
ванная вода
1
0,4
0,004
0,4
3,0
0,2
2
0,8
0,008
0,8
3,0
0,2
3
1,6
0,016
1,6
3,0
0,2
До объема
4
2,4
0,024
2,4
3,0
0,2
10 мл
5
3,2
0,032
3,2
3,0
0,2
6
4,0
0,040
4,0
3,0
0,2
Ход определения креатинина в моче. В мерной колбе или в
цилиндре объемом 100 мл смешивают 0,5 мл мочи (из суточно¬
го количества) с 3 мл раствора пикриновой кислоты. Смесб
тщательно встряхивают и добавляют к ней 0,2 мл 10% раствора
едкого натра. Выдерживают при комнатной температуре в те¬
чение 10 мин, доводят дистиллированной водой до объема
100 мл. Экстинкцию измеряют против контроля на ФЭКе в кю¬
вете с толщиной слоя 10 мм при зеленом светофильтре (длина
волны 530 нм; 500—560 нм).
Контроль. К 3 мл раствора пикриновой кислоты добавляют
0,2 мл 10% раствора NaOH и полученный объем доводят дистил¬
лированной водой до 100 мл.
Стандартная проба. К 0,5 мл основного (100 мг%) стандарт¬
ного раствора (содержащего 0,5 мг креатинина) прибавляют
3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 10% раствора ед¬
кого натра. Далее пробы обрабатывают, как опытные.
Расчет концентрации и суточной экскреции креатинина про¬
изводят по соответствующим формулам (1 и 2).
1. X мг% креатинина = Еоп/Ест • 100 мг%,
где X — концентрация креатинина в моче;
Еоп — экстинкция опытной пробы;
Ест — экстинкция стандартной пробы;
100 мг%—концентрация основного стандартного раствора
креатинина.
Формулу 1 используют при расчете клиренса креатинина.
2. Х= (Сет • Еоп • Д)/Ест • а,
где X — количество креатинина в суточной моче, мг;
Сет — количество креатинина в стандартной пробе, 0,5 мг;
Еоп — экстинкция опытной пробы;
Ест — экстинкция стандартной пробы;
52

Д — суточное количество мочи, мл;
а — количество мочи, взятое для анализа, 0,5 мл.
После подставления в формулу значения Сст=0,5 мг и а=»
= 0,5 мл получим:
Х= (0,5 • Еоп • Д)/(Ест • 0,5) =Еоп/Ест • Д.
Для выражения значений суточной экскреции креатинина в
граммах следует пользоваться формулой:
Хг/сутки= (Еоп • Д)/(Ест • 1000),
где 1000 — коэффициент перевода мг в г.
Норма. Содержание креатинина в суточной моче составляет
0,5—2 г; в сыворотке крови: у женщин — 0,5—^ 1 мг%, у муж¬
чин— 0,5—1,15 мг%.
Примечания. 1. Если концентрация креатинина в сы¬
воротке крови выше 4 мг%, то сыворотку следует развести фи¬
зиологическим раствором, результат умножить на соответству¬
ющее разведение.
2. Измерение следует проводить не позже, чем через 20 мин
после прибавления едкого натра.
3. В качестве консервантов для мочи можно применять ти¬
мол и толуол, которые не мешают определению креатинина.
4. Белок не мешает определению креатинина при его содер¬
жании до 1,5 г на 100 мл мочи. При большем содержании бел¬
ка его необходимо удалить до анализа.
5. При определении содержания креатинина (начиная с ве¬
личины экстинкции 0,22—0,25) мочу следует разводить, а ре¬
зультаты умножать на разведение.
Определение креатина в крови и моче
Определение креатина в крови и моче основывается на его
свойстве превращаться гидролитическим путем в креатинин.
Зная исходное содержание креатинина в пробе и то количество
его, которое определяется в аналогичной пробе после превра¬
щения в ней креатина в креатинин, по приросту концентрации
последнего, можно судить о таковой креатина. Из количества
креатинина, полученного при определении суммы креатин-креа-
тинин, вычитают количество параллельно исследуемого свобод¬
ного креатинина и полученную разность умножают на 1,16
(1,159)—коэффициент перевода креатинина в креатин. Он
представляет собой отношение молекулярных весов креатина
(131 у. е.) и креатинина (113 у. е.), т. е. 131/113=1,16. Ответ
дают в цифрах креатина. В норме в сыворотке крови обнару¬
живается 1—4 мг% креатина. В моче взрослых людей он от¬
сутствует.
Для перевода креатина в креатинин нагревают его при вы¬
сокой температуре в присутствии соляной кислоты. Так, при
определении креатина в моче к 0,5 мл ее добавляют равный
объем 0,5 н. НС1. Пробирку закрывают пробкой и выдерживают
53

1—2 ч в сушильном шкафу при температуре +60° С. После из¬
влечения пробирки из шкафа ее содержимое нейтрализуют
добавлением нескольких капель 25% раствора NaOH, исполь¬
зуя' в качестве индикатора pH красную лакмусовую бумажку.
Содержимое пробирки сливают в мерную колбу, в которой про¬
изводят определение креатинина методом, основанным на реак¬
ции Яффе.
Превращение креатина в его ангидрид возможно и при под-
кислении небольшого объема мочи концентрированной НС1 и
прогреванием пробы в кипящей водяной бане в течение 3 мин.
Креатин сыворотки переходит в креатинин также при выдер¬
живании подкисленной (2 н. НС1) пробы в сушильном шкафу,
нагретом до +130° С в течение 20 минут.
Следовательно, применяемые иногда на практике методы
определения креатина (еще не унифицированные) отличаются
от способов определения креатинина лишь тем, что включают
в себя предварительный этап гидролитического превращения
креатина в креатинин. Но при этом требуется параллельное
определение креатинина.
Клинико-диагностическое значение определения креатинина
и креатина. Креатининемия является ценным диагностическим
признаком уремии, но, по мнению большинства авторов, не мо¬
жет служить показателем для ранней диагностики заболеваний
почек, поскольку нарушение выделения креатинина почками
наблюдается лишь при далеко зашедших патологических про¬
цессах в них.
Однако некоторые исследователи полагают, что содержание
креатинина при острых нефритах и нефрозах, а также при на¬
чинающейся недостаточности почек в результате нефросклеро-
за может быть повышено в крови даже прежде, чем наблюда¬
ется увеличение остаточного азота, и увеличение креатинина
можно считать ранним показателем почечной недостаточности.
Устойчивое повышение креатинина в крови аналогично повы¬
шению уровня мочевины указывает на нарушение работы по¬
чечного фильтра.
Для диагностики поражения почек гораздо большее значе¬
ние имеет расчет клиренса креатинина (мочевины). Осущест¬
вить его становится возможным, исходя из знания концентра¬
ции этих компонентов остаточного азота в крови и в моче.
Повышенные величины креатинина в сыворотке крови отме¬
чаются не только при почечной недостаточности и прогресси¬
рующих диффузных заболеваниях почек, но также при заку¬
порке мочевых путей, кишечной непроходимости (илеусе), тя¬
желом диабете, декомпенсации сердца, острой желтой атрофии
печени, механической желтухе, гипофункции надпочечников,
хлорипривной азотемии, голодании и беременности. Азотемия
при простатите не дает повышения креатинина. Пониженные
величины креатинина отмечаются при анемии, после введенния
АКТГ.
54

Содержание креатинина в моче зависит от питания. Поми¬
мо эндогенного креатинина в моче содержится креатинин экзо¬
генный, поступающий из мясной пищи. Повышенные величины
его в моче наблюдаются при усиленной мышечной работе, ли¬
хорадочных состояниях (при которых происходит более интен¬
сивный распад белков протоплазмы), пневмонии, недостаточ¬
ности печени. Пониженные величины наблюдаются при мышеч¬
ной атрофии, дегенерации почек, амилоидозе почек, лейкемии.
Повышенные величины содержания креатина в сыворотке
обнаруживаются при мышечной дистрофии, непроходимости
кишечника (илеусе), декомпенсации сердца, нефрите, ревмато¬
идном артрите, гипертиреозе.
Креатин в моче здорового взрослого человека, как правило,
отсутствует, появление его в моче называется креатинурией.
Возникновение ее не всегда связано с какой-либо патологией.
Так, у маленьких детей и подростков моча всегда содержит
креатин. В определяемых количествах он появляется в моче при
безуглеводной диете, заживлении обширных переломов, значи¬
тельных оперативных вмешательствах, после родов (при инво¬
люции матки).
Повышенные величины креатина мочи обнаруживаются так¬
же при некоторых заболеваниях, связанных с нарушениями в
обмене креатина (при миопатиях, авиатаминозе Е, диабете, го¬
лодании). Креатинурия обычно наблюдается при усиленном
распаде тканей. Так, при мышечной дистрофии креатинина в
коче содержится значительно меньше, чем обычно, и наряду
с этим резко повышается концентрация креатина. Усиленная
экскреция креатина отмечается у кастратов, евнухов, при па¬
ренхиматозных гепатитах и некоторых других заболеваниях.
Параллельное определение у одного и того же больного кон¬
центрации креатинина (или мочевины) в крови и моче значи¬
тельно расширяет возможности исследования функционального
ростояния почек, поскольку позволяет получать надежную ин¬
формацию об интенсивности основных функций нефрона: фильт¬
рации, реабсорбции, секреции, а также почечного кровообра¬
щения.
Эти методы основаны на сравнении содержания определен¬
ных веществ в крови и моче, а потому были названы геморе-
нальными пробами.
Для характеристики очистительной способности почек поль¬
зуются условным показателем, который называется коэффици¬
ентом очищения («клиренс» американских авторов). Допус¬
тим, что имеется вещество, концентрация которого в моче равна
U, а в плазме— Р. Пусть диурез в 1 мин равен У. Тогда в 1 мин
С мочой выделится U У данного вещества. Если эту величину
разделить на концентрацию вещества в плазме, получим объем
плазмы (С), который содержит U У вещества, тогда С = иУ/Р.
Величина С и есть коэффициент очищения (клиренс), кото¬
рый показывает, какой объем плазмы полностью очищается от
55

данного вещества в 1 мин. Разумеется, эта величина носит ус¬
ловный характер, так как в большинстве случаев очищению (но
не полному) подвергается больше плазмы. Если искать реаль¬
ный смысл, то коэффициент очищения — это тот объем плазмы,
который содержит выделяемое почками за 1 мин количество
вещества. Но это не снижает ценности клиренса, как показате¬
ля очистительной способности почек по отношению к данному
веществу.
Величина U/Р показывает, во сколько раз концентрируется
данное вещество в почках, и называется концентрационным ин¬
дексом (К). Поэтому приведенную выше формулу можно выра¬
зить С = К • У.
КЛУБОЧКОВАЯ ФИЛЬТРАЦИЯ
И КАНАЛЬЦЕВАЯ РЕАБСОРБЦИЯ
Сущность метода и его варианты.
Рассмотренное понятие о коэффициенте очищения позволя¬
ет дать количественную оценку основным процессам, происхо¬
дящим в нефроне, и прежде всего начальному процессу — клу¬
бочковой фильтрации.
Допустим, что вещество а, находящееся в плазме в концент¬
рации Ра, фильтруется вместе с плазмой в клубочках, совер¬
шенно не реабсорбируясь и не секретируясь в канальцах. В ре¬
зультате реабсорбции воды моча сгущается, и концентрация
данного вещества в ней оказывается Ua. Тогда в моче, выделен¬
ной в единицу времени, должно содержаться столько вещества,
сколько его за такое же время профильтровалось с первичной
мочой, т. е. Uay = PaF, где У — диурез в мл в 1 мин, a F—
фильтрация в мл в 1 мин. Отсюда: F=Ua/Pa-y.
Сравнивая эту формулу с приведенной формулой очищения,
видим, что их правые части равны. Следовательно, фильтрация
равна коэффициенту очищения вещества.
По разности между объемами профильтровавшейся в 1 мин
жидкости и выделенной за это время мочи легко вычислить
объем реабсорбированной воды; его обычно выражают в про¬
центах к фильтрации (R%), R=(F-y)/F- 100.
Приведенную формулу можно преобразовать, поставив вме¬
сто F произведение КУ, где К — концентрационный индекс дан¬
ного вещества; тогда R% = (КУ—У)/КУ • 100 = У (К— I) /КУ • 100 =
= (К—1)/К • 100.
Следовательно, для вычисления реабсорбции достаточно
исходить из знания величины концентрационного индекса, что
значительно упрощает расчет реабсорбции. Этим способом мож¬
но вычислять процент реабсорбции, исходя лишь из величин
концентрации исследуемого вещества в крови и моче. Поэтому,
если исследователя не интересует фильтрация, становится не¬
нужным точный сбор мочи.
56

Изучению веществ, которые выделяются почками исключи¬
тельно путем фильтрации и удовлетворяют некоторым дополни¬
тельным требованиям (не распадаются и не синтезируются в
почках, не оказывают побочного действия), посвящена обшир¬
ная литература. Для определения фильтрации Ребергом был
предложен креатинин — нормальный компонент плазмы, в свя¬
зи с чем такое определение нередко называют пробой Реберга.
Е. М. Тареевым и Н. А. Ратнер (1936) было показано, что
эндогенный креатинин не секретируется канальцами, поэтому
величины фильтрации, полученные в этих условиях, оказыва¬
ются идентичными вычисленным по инулину (этому классиче¬
скому веществу для определения фильтрации).
Учитывая относительное постоянство концентрации эндоген¬
ного креатинина в крови, ряд авторов ограничивается лишь
определением его суточной фильтрации, затем по концентрации
креатинина в суточной порции мочи находят концентрацион¬
ный индекс и умножают его на суточный диурез в литрах.
Этот простой способ во многих случаях, например, при дли¬
тельном контроле за функцией почек, является весьма рацио¬
нальным.
Проба Реберга
Проведение пробы. Исследуемый натощак выпивает 400—
500 мл воды или слабого чая и мочится (эту порцию мочи не
исследуют и выливают). Время мочеиспускания точно отмеча¬
ют. Ровно через 1 ч собирают мочу (полностью). В середине
этого часа пунктируют локтевую вену и получают 5—8 мл кро¬
ви. По объему собранной мочи устанавливают минутный диу¬
рез. В крови и моче определяют концентрацию креатинина.
Фильтрацию и реабсорбцию рассчитывают по формулам:
Клубочковая фильтрация, мл/мин= (концентрации креати¬
нина в моче, мг%/концентрацию креатинина в крови, мг%)-ми¬
нутный диурез в мл.
Реабсорбция, %=[(клубочковой фильтрации —минутный диу¬
рез)/клубочковую фильтрацию] • 100, или R% = (K — I)/K* 100,
где К — концентрационный индекс.
Клубочковая фильтрация в норме составляет 80—
120 мл/мин, реабсорбция — 97—99%.
Определение коэффициента очищения от мочевины
Коэффициент очищения от мочевины несколько ниже вели¬
чины фильтрации, так как в отличие от рассмотренных выше
веществ, применяемых для определения фильтрации, мочевина
частично реабсорбируется (вернее, подвергается обратной диф-
57

фузии) в канальцах. В связи с этим коэффициент очищения
мочевины практически не зависит от величины диуреза только
в том случае, если последний достаточно высок (не менее 2 мл
в 1 мин для человека). Тогда он может являться мерой фильт¬
рации, составляя около 2/з ее величины. Определенный при этих
условиях клиренс получил известность под названием «макси¬
мального». В остальных случаях чем ниже диурез, тем меньше
получаемая величина, так как при замедленном токе мочи по
канальцам мочевина активней диффундирует в перитубулярную1
жидкость, где ее концентрация ниже. Поэтому в клинике при
среднем и умеренно низком диурезе пользуются видоизменен¬
ной формулой, в которой вместо минутного диуреза ставится
его квадратный корень. Величина очищения становится услов¬
ной и получает название «стандартной».
Проведение пробы такое же, как и при определении коэф¬
фициента очищения от креатинина (см. описание пробы Ре¬
берга) .
При диурезе, превышающем 2 мл, рассчитывают «макси¬
мальный» клиренс мочевины (Смаке) по формуле:
и^очев. \т,
макс. — —5 • v»
*мочев.
при минутном диурезе, не превышающем 2 мл, определяет¬
ся «стандартный» (Сстанд.) клиренс мочевины по формуле;
Г _ UM04eB. i/v"
Чланд. — п ' V v I
* мочев#
где U — концентрация мочевины в моче, мг%;
Р — концентрация мочевины в плазме (сыворотке) крови,
мг%;
V — диурез в мл в 1 мин;
W—квадратный корень из величины минутного диуреза.
В норме «максимальный» клиренс мочевины составляет 64—
99 мл/мин, в среднем 75 мл/мин; «стандартный» клиренс моче¬
вины — 40—63 мл/мин, в среднем 54 мл/мин.
Вышеуказанные средние величины принимаются за 100%.
Степень отклонения от них является показателем функции по¬
чек. У здоровых показатели клиренса мочевины не бывают ни¬
же 75%.
Установлено, что мочевина, проходя по канальцам, реабсор-
бируется в количестве не менее 25—40%. В связи с этим коэф¬
фициент очищения от мочевины может служить показателем
фильтрации только в известной степени, при условиях, исклю¬
чающих усиление канальцевой реабсорбции мочевины (олигу-
рическая фаза острого нефрита, нефротический синдром, острая
почечная недостаточность, сердечная и сосудистая недостаточ¬
ность).
58

АМИННЫЙ АЗОТ
Свободный аминный азот (аминоазот) представляет собой
азот свободных аминокислот, содержащихся в сыворотке (плаз¬
ме) крови (в отличие от общего аминного азота, включающего
также азот сложных полипептидов и белков).
Для определения аминоазота применяют ряд методов:
а) формоловое титрование по Серенсену, основанное на тит¬
ровании карбоксильных групп аминокислот щелочью после
предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом;
б) газометрическое определение по выделению свободного
азота при действии азотистой кислотой на первичные группы
аминокислот.
Газометрическое определение аминоазота (проводимое в ап¬
парате Цуверкалова) имеет ряд преимуществ перед методом
формолового титрования;
в) способность аминокислот реагировать со взвесью фосфа¬
та меди с образованием медных комплексов, количественно
разлагающихся диэтилдитиокарбаматом натрия с развитием
желтого окрашивания;
г) определение аминоазота по реакции аминокислот с нин-
гидрином (самый распространенный метод).
Повышенное содержание аминокислот в крови можно от¬
крыть и по уровню так называемого «резидуального азота» (ос¬
таточный азот минус азот мочевины). Как известно, увеличение
резидуального азота связано главным образом с увеличением
аминокислот в крови.
Определение свободного аминного азота
в сыворотке крови (по методу
Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой)
Принцип. Содержание азота определяется колориметрически
(по интенсивности окрашивания с нингидриновым реактивом).
Реактивы. 1. 0,04 н. раствор уксусной кислоты (0,23 мл ле¬
дяной СНзСООН на 100 мл воды);
2. 1% водный раствор нингидрина.
Ход определения складывается из нескольких этапов:
1. Осаждение белков. Центрифужную пробирку с внесенны¬
ми в нее 0,5 мл сыворотки и 0,5 мл 0,04 н. раствора СНзСООН
прикрывают пробкой и помещают в холодную водяную баню,
которую доводят до кипения. Пробы прогревают в водяной
бане в течение 5 мин (время отмечают с момента закипа¬
ния). Затем пробирки охлаждают и содержимое их филь¬
труют.
2. Фильтрование. К содержимому пробирок добавляется по
1 мл дистиллированной воды и после перемешивания тонкой
59

стеклянной палочкой производят фильтрование через гладкий
бумажный фильтр. Пробирку и осадок на фильтре промывают
еще 2 раза по 1 мл водой, после чего основной фильтрат и обе
промывные воды объединяются в одну пробирку с меткой, со¬
ответствующей 10 мл.
3. Цветная реакция с нингидрином. К полученному фильтра¬
ту добавляют 0,5 мл 1% водного раствора нингидрина, содер¬
жимое пробы перемешивают и на 20 мин помещают в кипящую
водяную баню. По истечении срока прогревания пробирку
охлаждают в токе водопроводной воды, оставляют стоять 5 мин
при комнатной температуре и доводят дистиллированной водой
до 10 мл (по метке на пробирке).
Одновременно ставят контроль на реактивы. К 3 мл дистил¬
лированной воды добавляют 0,5 мл 0,04 н. раствора СН3СООН,
0,5 мл 1% водного раствора нингидрина и после перемешивания
раствор 20 мин прогревают на кипящей водяной бане, охлажда¬
ют и доводят водой до 10 мл.
Примечание. Из практики установлено, что в качестве
контроля можно использовать обычную дистиллированную воду.
4. Колориметрия. Оптическая плотность замеряется обычно
на правом барабане ФЭКа, при зеленом светофильтре (длина
волны 536 нм) в кювете с шириной слоя 5 мм, против контроль¬
ной пробы или воды.
5. Расчет. По калибровочной кривой, построенной по азоту
аланина, находят количество мкг азота, соответствующее полу¬
ченным значениям экстинкций. Для перевода результатов в
мг% найденное количество мкг азота умножают на 200 и делят
на 1000, т. е. умножают на 0,2 (в случае, если берут 0,5 мл ис¬
следуемой сыворотки).
Пример. Экстинкция пробы составляет 0,212, а мкг азота,
найденные по прилагаемой градуировочной таблице,— 16,42.
Отсюда, концентрация аминного азота представляет величину,
найденную путем умножения 16,42-0,2 = 3,284 мг% аминного
азота.
Аналогичный результат можно получить при решении сле¬
дующей пропорции: 0,5 мл сыв, —16,42 мкг, 100 мл сыв. —X,
где Х= (16,42- 100)/0,5 = 3284 мкг%=3,284 мг%.
Норма, установленная на 60 донорах (В. Г. Колб), состав¬
ляет 2,96±0,10 мг%, по данным Е. С. Трускавецкого, пределы
колебаний составляют 2—4,3 мг%, при среднем значении кон¬
центрации 2,9 мг%.
Клинико-диагностическое значение. По данным А. А. По¬
кровского, возрастание уровня аминокислот происходит после
приема белков с пищей, причем возвращение к исходному уров¬
ню происходит в течение 4 ч. Что касается экскреции аминокис¬
лот с мочой, то почечный порог для аминокислот снижается во
время беременности. У новорожденных обычно имеется амино-
ацидурия, которая постепенно исчезает. При избыточном по¬
треблении мяса увеличивается экскреция гистидина и метилгис-
60

ТАБЛИЦА 6
Градуировочная таблица для определения аминного азота
(ФЭК, кювета шириной 5 мм)
экст.
мкг
мг%
экст.
мкг
мг%
ЭКСТ.
МКГ
мг%
экст.
мкг
№Г%
0,005
6,30
1,26
0,130
12,39
2,48
0,255
18,48
3,70
0,380
24,50
4,90
0,010
6,58
1,32
0,135
12,60
2,52
0,260
18,76
3,75
0,385
24,78
4,96
0,015
6,79
1,36
0,140
12,88
2,58
0,265
18,97
3,79
0,390
25,06
5,01
0,020
7,00
1,40
0,145
13,09
2,62
0,270
19,18
3,84
0,395
25,27
5,05
0,025
7,28
1,46
0,150
13,37
2,67
0,275
19,39
3,88
0,400
25,48
5,10
0,030
7,49
1,50
0,155
13,65
2,73
0,280
19,67
3,93
0,405
25,76
5,15
0,035
7,77
1,55
0,160
13,86
2,77
0,285
19,88
3,98
0,410
26,04
5,21
0,040
7,98
1,60
0,165
14,07
2,81
0,290
20,16
4,03
0,415
26,25
5,25
0,045
8,26
1,65
0,170
14,28
2,86
0,295
20,37
4,07
0,420
26,46
5,29
0,050
8,54
1,71
0,175
14,56
2,91
0,300
20,65
4,13
0,425
26,70
5,34
0,055
8,75
1,75
0,180
14,84
2,97
0,305
20,86
4,17
0,430
27,02
5,40
0,060
8,96
1,79
0,185
15,05
3,01
0,310
21,14
4,23
0,435
27,23
5,45
0,065
9,24
1,85
0,190
15,26
3,05
0,315
21,35
4,27
0,440
27,44
5,49
0,070
9,52
1,90
0,195
15,54
3,11
0,320
21,56
4,31
0,445
27,65
5,53
0,075
9,73
1,95
0,200
15,82
3,16
0,325
21,84
4,37
0,450
27,93
5,59
0,080
9,94
1,99
0,205
16,03
3,21
0,330
22,12
4,42
0,455
28,14
5,63
0,085
10,22
2,04
0,210
16,24
3,25
0,335
22,33
4,47
0,460
28,42
5,68
0,090
10,43
2,09
0,215
16,52
3,30
0,340
22,61
4,52
0,465
28,70
5,74
0,095
10,71
2,14
0,220
16,73
3,35
0,345
22,82
4,56
0,470
28,91
5,78
0,100
10,92
2,18
0,225
17,01
3,40
0,350
23,10
4,62
0,475
29,12
5,82
0,105
11,20
2,24
0,230
17,22
3,44
0,355
23,31
4,66
0,480
29,40
5,88
0,110
11,41
2,28
0,235
17,50
3,50
0,360
23,52
4,70
0,485
29,68
5,94
0,115
11,69
2,34
0,240
17,78
3,56
0,365
23,80
4,76
0,490
29,89
5,98
0,120
11,90
2,38
0,245
17,99
3,60
0,370
28,08
4,82
0,495
30,10
6,02
0,125
12,18
2,44
0,250
18,20
3,64
0,375
24,29
4,86
0,500
30,38
6,08
тидина, при недостаточном питании — р-аминоизомасляной кис¬
лоты.
Увеличение содержания аминокислот в крови наблюдается
при печеночной коме, эпидемическом гепатите и острой желтой
атрофии печени, при отравлении фосфором, фенилгидразином,
четыреххлористым углеродом, хлороформом, при квашиоркоре,
61

желтой лихорадке, эклампсии, истощающих поносах, при тяже¬
лых ожогах, шоке, после кровотечений, при сахарном диабете
с кетозом; легкое повышение может быть при острых инфекци¬
ях, гипертиреоидизме, сердечной недостаточности с застойными
явлениями, в некоторых случаях анемии, после введения АК.ТГ,
кортизона, при миелоидной лейкемии; при фенилкетонурии воз¬
растает содержание фенилаланина.
Уменьшение уровня аминокислот наблюдается при нефро¬
зах, после введения глюкозы, инсулина, гормона роста, андро¬
генов.
МОЧЕВАЯ КИСЛОТА
Мочевая кислота является главным продуктом обмена пу¬
риновых оснований, входящих в состав сложных белков нуклео-
протеидов, и является 2-6-8-триоксипурином.
Качественной реакцией на мочевую кислоту служит мурек-
сидная проба, основанная на образовании мурексида-аммоний-
ной соли пурпуровой кислоты, окрашенной в пурпурно-красный
цвет.
Количественное определение мочевой кислоты в крови и мо¬
че связано со значительными методическими трудностями.
В’ клинико-диагностических лабораториях для определения мо¬
чевой кислоты чаще пользуются ее способностью восстанавли¬
вать фосфорновольфрамовый реактив Фолина с образованием
продуктов, окрашенных в синий цвет. Применение наиболее
точного и специфичного энзиматического метода определения
мочевой кислоты сдерживается в связи с дефицитом уриказы.
Однако, как показала И. И. Никитина (1972), весьма близкие
к нему результаты получаются при использовании простого
спектрофотометрического метода, основывающегося на погло¬
щении мочевой кислотой ультрафиолетовых лучей в узкой зо¬
не — 282—295 нм.
Определение мочевой кислоты
по методу Мюллера — Зейферта
Принцип метода основан на колориметрировании окрашен¬
ных продуктов, образующихся при восстановлении фосфорно¬
вольфрамового реактива мочевой кислотой.
Реактивы. 1. Реактив Фолина.
100 г химически чистого (х. ч.) вольфрамата натрия раство¬
ряют в 750 мл дистиллированной воды в колбе Эрленмейера и
при постоянном помешивании добавляют 80 мл 85% х. ч. орто-
фосфорной кислоты (Н3РО4). Затем содержимое колбы кипятят
£ обратным холодильником в течение 4—6 ч. При этом раствор
из желтоватого становится бесцветным. Если раствор не обес-
62

ТАБЛИЦА 7
Данные для определения мочевой кислоты
Реактивы
Опыт
Стандарт
Центрифугат, соответствующий 0,5 мл сыво¬
ротки
1,5 мл

Стандартный рабочий раствор
—
0,5 мл
Трихлоруксусная кислота
—
0,5 мл
Дистиллированная вода
—
0,5 мл
Насыщенный раствор соды (Na2C03)
0,7 мл
0,7 мл
Реактив Фолина
1 капля
1 капля
двечивается (что бывает редко), прибавляют небольшое коли¬
чество брома (1—2 капли). Для удаления его избытка раствор
следует прокипятить 10—15 мин. Из колбы Эрленмейера раст¬
вор переливают в мерную колбу и доводят дистиллированной
водой до метки 1 л. Реактив стоек.
2. 20% трихлоруксусная кислота.
3. Стандартный раствор мочевой кислоты. Для его приготов¬
ления на аналитических весах отвешивают 100 мг мочевой кис¬
лоты и всю навеску переносят в колбу на 500 мл. Затем в нее
приливают 25 мл 0,5% раствора углекислого лития (Li2C03),
25 мл дистиллированной воды и после растворения мочевой кис¬
лоты доводят объем дистиллированной водой до метки, предва¬
рительно прибавив для стойкости 12,5 мл формалина. Раствор
стоек около месяца.
Из основного (20 мг%) стандартного раствора готовят
2 мг% рабочий раствор, разводя основной в 10 раз. Рабочий
раствор нестойкий и может сохраняться лишь в течение 2—
3 дней. 1 мл его содержит 0,2 мг мочевой кислоты.
4. Насыщенный раствор углекислого натрия (Na2C03).
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1,5 мл
сыворотки, 1,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл 20% три-
хлоруксусной кислоты. Содержимое пробы тщательно переме¬
шивают и через 30 мин центрифугируют. Дальнейший порядок
работы показан в таблице 7.
Через 10 мин обе пробы колориметрируют на ФЭКе при
зеленом светофильтре, в кювете шириной 5 мм, против воды.
Расчет производят по формуле Сх= (Сст • Е0п)/Ест,
где Сх — концентрация мочевой кислоты в сыворотке, мг%;
Сст—концентрация мочевой кислоты в стандартной пробе;
Еоп — оптическая плотность опытной пробы;
Ест — оптическая плотность стандартной пробы.
63

П р имечания. 1. Расчет можно проводить и по калиб¬
ровочной кривой. Для ее построения готовят стандартный раст¬
вор мочевой кислоты: к 500 мг мочевой кислоты, внесенной в
мерную колбу на 500 мл, добавляют 75 мл 0,4% раствора угле¬
кислого лития, 20 мл 35% раствора формальдегида и около
250 мл воды. Смесь тщательно перемешивают, приливают
6,25 мл 2 н. H2S04 и доводят дистиллированной водой до метки.
Полученный стандартный раствор мочевой кислоты имеет кон¬
центрацию 100 мг%. При хранении в холодильнике он стоек в
течение нескольких недель.
Калибровочную кривую строят путем приготовления из ос¬
новного стандартного раствора серии разведений с концентра¬
цией 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 мг% мочевой кислоты.
2. Перед анализом больной 3 дня не должен принимать пи¬
щу, содержащую пуриновые основания и жиры.
Норма содержания мочевой кислоты в сыворотке крови 2^
4 мг%.
При наличии в лаборатории спектрофотометра типа СФ-4,
СФ-4А, СФ-16, «Спектромом» и др. мы рекомендуем проводить
определения мочевой кислоты по Маримонт и Лондон (1964).
В широкую пробирку (2,5X9 см) вносят 0,3 мл сыворотки,
пробирку помещают на 2 мин в кипящую водяную баню. После
охлаждения в нее добавляют 3 мл воды и сгусток экстрагируют
при 37° в течение 1 ч. Весь объем жидкости вводят в кювету от
спектрофотометра и выделяют длину волны 289 нм. Концентра¬
цию мочевой кислоты рассчитывают по калибровочной кривой,
которую строят по общеизвестным принципам с проведением
через все этапы метода вместо 0,3 мл сыворотки раствора стан¬
дарта с концентрацией 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 мг% мочевой кислоты
(приготовление стандартного раствора см. в описании преды¬
дущего метода).
Клинико-диагностическое значение. Определение концентра¬
ции мочевой кислоты имеет особое значение для диагностики
начальных стадий поражения почек и подагры.
Считают, что при поражении клубочков почки (острый, и
хронический нефрит, первично и вторично сморщенная почка)
в первую очередь страдает выделение мочевой кислоты и инди-
кана, вследствие чего наблюдается гиперурикемия; при очаго¬
вых нефритах и нефрозах выделение мочевой кислоты не нару¬
шается.
Гиперурикемия может быть и непочечного происхождения.
Уже указывалось, что резкое увеличение концентрации моче¬
вой кислоты наблюдается при подагре — заболевании, связан¬
ной с нарушением обмена нуклеопротеидов. При нем наблю¬
дается отложение солей мочевой кислоты в суставах и в раз¬
личных тканях тела. Уменьшение экскреции мочевой кислоты
способствует большему ее накоплению в плазме крови.
Много мочевой кислоты определяется в крови и моче при
патологических состояниях, связанных с усиленным распадом
64

нуклеопротеидов: лейкозах, лейкемии после облучения рентге¬
новыми лучами, лейкопении, полицитемии, эритремии, гемоли¬
тической желтухе, злокачественной анемии в стадии ремиссии,
злокачественных новообразованиях, а также при сердечной и
печеночной недостаточности, диабете, голодании, усиленном по¬
треблении жирной пищи, аллергии, гипертрофии предстатель¬
ной железы, илеусе, артрите, ацидозе, пневмонии в стадии
резорбции, отравлении свинцом и угарным газом.
Поэтому Е. М. Тареев считает увеличение содержания мо¬
чевой кислоты в крови неспецифическим почечным показате¬
лем, совпадающим с заболеванием почек лишь в 30% случаев.
Понижение содержания кислоты в сыворотке отмечается
при анемии, после приема пиперазина, атофана, салицилатов
и АКТГ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДИКАНА
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ
Индикан представляет собой калиевую или натриевую соль
индоксилсерной кислоты, образующейся в печени при обезвре¬
живании индола.
Подобно другим ядовитым веществам, индол появляется в
кишечнике при гниении белков. Так, из ароматических амино¬
кислот тирозина образуется фенол и крезол, триптофана — ин¬
дол и скатол. Всасываясь из кишечника в кровь, они попадают
в печень, где обезвреживаются путем соединения с серной и
глюкуроновой кислотами. При этом из индола образуются
индоксилсерная и индоксилглюкуроновая кислоты, а из скатола
соответственно скатоксилсерная и скатоксилглюкуроновая кис¬
лоты.
Принцип. Метод определения индикана основан на гидроли¬
зе его соляной кислотой с последующим окислением хлорным
железом образующегося индоксила и тимола в индиголигнон —
соединение розово-фиолетового цвета.
Реактивы. 1. 20% трихлоруксусная кислота.
2. Хлороформ.
3. 5% раствор тимола в 96° этиловом спирте.
4. Реактив Жоллес: 0,5 г хлорного железа растворяют в
100 мл концентрированной НС1, удельного веса 1,19 (использу¬
ют свежеприготовленный раствор).
Ход определения в крови. К 1,5 мл сыворотки прибавляют
1,5 мл 20% трихлоруксусиой кислоты и через 10 мин смесь
центрифугируют. Полученную надосадочную жидкость осторож¬
но сливают в градуированную пробирку, прибавляют 7 капель
5% тимолового спирта и реактив Жоллес в количестве, равном
объему центрифугата. Смесь выдерживают при комнатной тем¬
пературе в течение 20 мин, затем приливают 2 мл хлороформа
для извлечения тимол-индиголигнона. Содержимое пробирки
8 Зак. 2615
65

тщательно перемешивают (избегая образования эмульсии при
слишком сильном взбалтывании) и оставляют стоять на 2 ч
(лучше на сутки). В норме заметить окраску нижнего, хлоро¬
формного слоя почти невозможно. Установлено, что при едва
заметном фиолетовом окрашивании хлороформа содержание
индикана приблизительно равно 0,022 мг%. При более сильном
окрашивании (от нежного розово-фиолетового до ясного крас¬
но-фиолетового) органическую фазу жидкости разбавляют хло¬
роформом до исчезновения окраски. Для этого слой хлорофор¬
ма переносят обычной пипеткой в мерный цилиндр (на 25 мл),
в который и прибавляют чистый хлороформ до исчезновения
окраски. Содержание индикана в пробирке со следами краски
соответствует величине, получаемой умножением 0,022 на раз-
ведение— частное от деления конечного объема хлороформа
на начальный его объем.
Например, если для обесцвечивания понадобилось 7 мл хло¬
роформа, а так как первоначальный его объем был 2 мл, то
разведение составит 9 : 2 = 4,5. Содержание индикана в этом
случае равно 0,099.
В норме содержание индикана в крови колеблется в преде¬
лах от 0,022 до 0,08 мг%.
Ход определения индикана в моче. 20 мл мочи смешивают
с 10 мл раствора уксуснокислого свинца (10%) и после встря¬
хивания смесь фильтруют. К 10 мл фильтрата добавляют 1 мл
тимолового раствора и 10 мл реактива Жоллес. Через 15 мин
приливают несколько капель хлороформа, взбалтывают и про¬
изводят отсчет.
Оценка. При наличии индикана уже в норме появляется ро¬
зово-фиолетовое окрашивание хлороформа, интенсивность ко¬
торого при выраженной индиканурии повышается до ясно вы¬
раженного красно-фиолетового цвета.
Клинико-диагностическое значение. Определение индикана
оказывается весьма полезным в начальных стадиях развития
почечной недостаточности, когда уровень остаточного азота еще
может быть и не увеличенным. Считают, что индиканемия слу¬
жит более чувствительной реакцией на недостаточность почек,
чем азотемия, так как в определенной стадии болезни почки
перестают пропускать более крупные молекулы индикана и по¬
следний накапливается в крови; молекулы же мочевины, на¬
против, в этой стадии легко проходят через почку и в крови
могут не задерживаться. Поэтому определение индикана в
крови имеет самостоятельное диагностическое значение и его
следует производить параллельно с определением остаточного
азота во всех случаях, где подозревается недостаточность функ¬
ции почек.
Индиканемия наблюдается, как правило, при гломерулоне-
фрите, однако при очаговом гломерулонефрите реакция на ин-
дикан в сыворотке может быть отрицательной. Отсутствие ин-
диканемии и азотемии свидетельствует о неповрежденной
66

функции почечной ткани, несмотря на наличие очагового гло-
Ыерулонефрита. При острых нефритах индиканемия не имеет
прогностического значения. При хронических нефритах, напро¬
тив, она прогностически неблагоприятна.
Действительно, содержание индикана изменяется больше
всего при хронических нефропатиях. При острых нефропатиях
t явлениями недостаточности почек количество индикана в кро¬
ви повышается мало. В случае же нефропатии с явлениями
Сморщивания почки количество индикана повышается раньше
увеличения количества остаточного азота или мочевины. В этом
ценность определения индикана. Замечено, что большое коли¬
чество индикана при низком содержании остаточного азота или
мочевины указывает на гораздо большую недостаточность по¬
чек, чем высокий уровень мочевины или остаточного азота при
небольшом количестве индикана. В хронической стадии нефри¬
та, когда количество остаточного азота еще не увеличено и
концентрационная функция почки еще сохранена, содержание
индикана может быть уже слегка повышено. Особенно же вы¬
ражена индиканемия при явлениях абсолютной недостаточно¬
сти почек, ведущих к развитию азотемии (уремии). Как прави¬
ло, реакция на индикан резко положительна в предуремической
и уремической стадиях нефрита.
Следует помнить, что увеличение концентрации индикана в
сыворотке крови может наблюдаться при пониженной кислот¬
ности желудка, запорах, завороте кишок, ущемленной грыже и
различных других видах кишечной непроходимости, когда соз¬
даются условия для усиления гнилостных процессов в кишеч¬
нике, а также при усиленном разложении белков в организме
(опухоли, эмпиемы, бронхоэктазии, абсцессы и пр.).
КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
Ксантопротеиновая реакция используется для обнаружения
ароматических аминокислот: фенилаланина, тирозина, трипто¬
фана; ее дают и некоторые другие соединения, например фенол.
Принцип. При нитровании бензольного кольца циклических
аминокислот (триптофана, фенилаланина, тирозина) образуют¬
ся соединения желтого цвета (ксантопротеиновая реакция), ко¬
торый при подщелачивании среды переходит в оранжевый.
Реакция нитрования может быть представлена следующей
схемой: тирозин-► динитротирозин (желтого цвета)->натриевая
соль динитротирозина (оранжевого цвета).
Реактивы. 1. 20% раствор трихлоруксусиой кислоты.
2. Концентрированная азотная кислота (удельный вес 1,4).
3. 33% раствор едкого натра.
Ход определения. К 2 мл сыворотки крови прибавляют 2 мл
воды и 2 мл 20% трихлоруксусиой кислоты (для осаждения
белков). Смесь центрифугируют. К 2 мл надосадочной жидко¬
з*
67

сти приливают 0,5 мл концентрированной HN03, содержимое
пробирки кипятят 1 мин, охлаждают водопроводной водой и
прибавляют 1,5 мл 33% раствора NaOH.
При положительной реакции наблюдается пожелтение раст¬
вора, тем более интенсивное, чем более высокое содержание
ароматических веществ определяется в сыворотке крови. Сте¬
пень реакции отмечают крестом от + до + + + +.
Для объективной оценки результатов окрашенный в желтый
цвет прозрачный раствор колориметрируют при фиолетовом
светофильтре (максимум пропускания 436 нм) в кювете с рабо¬
чей шириной 10 мм против воды (используемой в качестве конт¬
роля).
Клинико-диагностическое значение. Положительная реакция
наблюдается при накоплении в крови веществ ароматического
ряда, образующихся из индола и фенола. Это чаще всего встре¬
чается при завороте кишок, когда в кровь попадает большее
количество продуктов кишечного гниения, а также при гангрене
легких, острой атрофии и циррозах печени, злокачественных
опухолях, пернициозной анемии. Положительная проба отме¬
чается и при тиреотоксикозах, тяжелой декомпенсации сердца,
эндокардите. Реакция бывает положительной при подострых и
хронических заболеваниях почек, при резкой олигурии, в том
числе и нефритической. При остром нефрите ксантопротеиновая
реакция может быть только слабо положительной. Если при
остром нефрите ксантопротеиновая реакция дает резкое усиле¬
ние, это указывает на переход его в подострую форму и на
злокачественное течение.
Наиболее характерна ксантопротеиновая реакция для гло-
мерулонефритов и уремического состояния. При истинной
уремии ксантопротеиновая реакция всегда положительна. При
некоторых доброкачественных склерозах она остается отрица¬
тельной, так же как и при небольших очаговых поражениях
почечной паренхимы. При туберкулезе почек положительная
ксантопротеиновая реакция указывает на распространенное по¬
ражение обеих почек. Она бывает положительной при отравле¬
нии фенолами, а также после приема больших доз салицилатов.

Глава IV
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
При унификации ферментативных методов исследования
исходили из двух моментов: 1) выбора оптимальных способов
определения активности энзимов (удовлетворяющих научно-ме-
дицинским и экономическим требованиям) и 2) выражения ре¬
зультатов только в мкМ (мкг, редко мг) разрушенного субстра¬
та (или образовавшегося в результате его расщепления продук¬
та) в пересчете на 1 мл сыворотки (мочи, спинномозговой
жидкости) за время инкубации 1 ч при +37° С.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
АКТИВНОСТИ АЛЬДОЛАЗ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Альдолазы (ферменты, принимающие участие в гликолити-
ческом расщеплении глюкозы) относятся к классу лиаз. В че¬
ловеческом организме они представлены двумя энзимами.
Фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза катализирует обратимую
реакцию расщепления фруктозо-1,6-дифосфата на две фосфо-
триозы — фосфоглицериновый альдегид и монофосфат диокси-
ФДФ-А
ацетона: фруктозо-1,6-дифосфат ^ фосфодиоксиацетон-f
НОН
+3-фосфоглицериновый альдегид.
Оптимум действия энзима находится в пределах pH 7—9.
Фермент обнаруживается во всех органах и тканях человека
и животных. Наибольшая активность его определяется в ске¬
летной мускулатуре, сердечной мышце и печени. Активность
фруктозо-дифосфатальдолазы в эритроцитах в 100 раз выше,
чем в сыворотке крови, в связи с чем даже следы гемолиза мо¬
гут значительно исказить результаты анализа.
69

Фруктозо-1-фосфатальдолаза (кетозо-1-фосфатальдолаза)
катализирует реакцию расщепления фруктозо-1-монофосфата
на глицериновый альдегид и диоксиацетонфосфат.
Ф-1-Ф-А
Фруктозо-1-фосфат —— фосфодиоксиацетон + глицерино-
НОН
вый альдегид.
Фермент специфичен для печени. Незначительная его актив¬
ность обнаружена также в почках и мозговой ткани.
Альдолаза крови относительно термостабильна. Кровь мо¬
жет быть оставлена при комнатной температуре для свертыва¬
ния и центрифугирования на несколько часов. Активность фер¬
мента сохраняется неизменной при хранении сыворотки при
температуре 0—4° С в течение 3—4 дней.
Существует несколько методов определения активности аль-
долазы, в основу которых положены различные принципы.
Метод, основанный на исследовании активности альдолазы
по щелочелабильному фосфору триозофосфатов, является тру¬
доемким, требует серии контрольных определений неорганиче¬
ского и щелочелабильного фосфора в пробах.
Спектрофотометрический метод, предложенный Варбургом
и Христианом, основан на оптическом тесте Варбурга. По сте*
пени превращения НАД • Нг в НАД в присутствии лактатдегид-
рогенезы определяется концентрация фосфодиоксиацетона и тем
самым — активность альдолазы. Метод сложен, для его выпол¬
нения требуется внесение в инкубационную смесь ферментов й
коферментов.
Колориметрические методы изучения активности альдолаз
проще и доступнее, так как наша промышленность выпускает
специальные наборы реактивов для определения активности
фруктозо-1,6-дифосфат альдолазы по цветной реакции с 2,4-ди-
нитрофенилгидразином.
Определение активности
фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы в сыворотке
крови (метод В. И. Товарницкого, Е. Н. Волуйской
в модификации В. А. Ананьева и В. В. Обуховой)
Описываемый колориметрический метод достаточно точен,
сравнительно прост и требует для своего выполнения очень не¬
большого количества сыворотки (0,1 мл). Гемолиз, иногда даже
небольшой, может существенно завысить результаты определе¬
ния (из-за значительного содержания ФДФ-А в эритроцитах),
с чем приходится считаться при взятии крови из пальца.
Принцип. Фруктозо-1,6-дифосфатальдол аза катализирует
реакцию расщепления субстрата (фруктозо-1,6-дифосфата),
продукты распада которого (триозофосфаты) образуют с 2,4-
70

динитрофенилгидразином гидразон, имеющий в щелочной среде
коричневатое окрашивание. По интенсивности окраски, опре¬
деляемой колориметрически, судят об активности фермента.
Реактивы. 1. Фруктозодифосфат (ФДФ), переведенный из
бариевой соли в натриевую. Для ее приготовления 270 мг ба¬
риевой соли фруктозодифосфата растворяют в 3,5 мл 1 н. раст¬
вора НС1 (получаемой доведением водой 8,5 мл концентриро¬
ванной НС1 до 100 мл). К этому раствору прибавляют 1 мл
14% (1 М) раствора безводного сульфата натрия. Выпавший
осадок сернокислого бария удаляют центрифугированием. Над-
осадочную жидкость проверяют на полноту осаждения ионов
бария добавлением к центрифугату 1 капли 14% раствора сер¬
нокислого натрия. Помутнение раствора свидетельствует о не¬
достаточно полном осаждении ионов бария. Прозрачную жид¬
кость сливают в мерную 25 мл колбу, подщелачивают 3%
раствором NaOH до pH 7,4—7,6, пользуясь индикатором бром-
тимоловым синим. При этом значении pH появляется синее (не
зеленоватое!) окрашивание. После установления pH объем
раствора доводят дистиллированной водой до метки. При этом
получается приблизительно 0,02 М раствор натриевой соли
фруктозодифосфата. Этот раствор при добавлении к нему не¬
скольких капель толуола сохраняется в холодильнике от 2-х
недель до 1 месяца. Его разливают во флаконы от пеницилли¬
на и хранят в замороженном состоянии. Перед употреблением
оттаивают.
2. 0,1% раствор 2,4-динитрофенилгидразина.
Растворяют 0,1 г реактива в 100 мл 2 н. НС1. Для приготов¬
ления последней 17 мл концентрированной НС1 (уд. веса 1,19)
доводят дистиллированной водой до 100 мл (растворение идет
медленно, при подогревании в водяной бане; раствор фильтру¬
ют и хранят в темной склянке в холодильнике при +4° С).
3. 0,56 М раствор гидразинсульфата.
В мерной колбе на 100 мл в небольшом количестве воды
растворяют 7,3 г соли и, при постоянном взбалтывании, под¬
щелачивают раствор 3% NaOH (70—80 мл) до pH 7,4, после
чего объем его доводят дистиллированной водой до метки. Не¬
которые авторы рекомендуют для подщелачивания пользовать¬
ся 33% раствором NaOH (гидразинсульфат может быть кислый,
основной, нейтральный. Предпочтительнее пользоваться основ¬
ным гидразинсульфатом).
4. 0,002 М раствор монойодуксусной кислоты.
Растворяют 0,04 г кислоты в 80—90 мл дистиллированной
воды, доводят 3% раствором NaOH до pH 7,4 (см. п. 8) и добав¬
ляют дистиллированной воды до 100 мл. Хранят в темной склян¬
ке в холодильнике при +4 °С.
5. 10% раствор трихлоруксусиой кислоты.
6. 3% раствор NaOH.
7. 0,5% раствор двууглекислой соды (NaHC03).
8. 0,04% раствор бромтимолового синего (индикатор).
71

ТАБЛ И Ц А 8
Данные для приготовления смесей,
вносимых в опытную и контрольную пробы, мл
Реактивы
Первая смесь,
вносимая в
контрольную
пробу
Вторая
смесь, вно¬
симая в
опытную
пробу
Двууглекислая сода
1,00(4)
1,00
Г идразинсульфат
0,25(1)
0,25
Монойодуксусная кислота
0,25(1)
0,25
Дистиллированная вода
0,25(1)
0,25
Фруктозодифосфат
—
0,25
0,01 г индикатора растворяют в 3,2 мл 0,02% раствора NaOH
и доводят водой до 25 мл (или 0,1 г бром-тимолового синего
растворяют в 32 мл 0,2% раствора едкого натра и доводят дис¬
тиллированной водой до 250 мл). Этим раствором индикатора
пользуются при подщелачивании растворов 1, 3 и 4 до pH 7,4—
7,6. После каждого прибавления щелочи на предметное стекло
наносят каплю раствора и каплю индикатора. Добавляют NaOH
в раствор до тех пор, пока капля не окрасится в синий
цвет.
Примечание. Растворы 2,4-динитрофенилгидразина,
гидразинсульфата, монойодуксусной кислоты обязательно хра¬
нят в темном прохладном месте. Если pH их оказывается боль¬
ше 7,4, то гидразинсульфат подкисляют раствором H2S04,
ФДФ — раствором 2 н. НС1, монойодуксусную — раствором ук¬
сусной кислоты.
Ход определения. Готовят смеси компонентов как указано
в таблице 8.
Для удобства их приготовления рекомендуется сначала за¬
готовить в большом количестве первую смесь, исходя, напри¬
мер, из соотношения цифр, заключенных в скобки (табл. 8).
А. В. Сучков, Н. В. Привалова, Н. Б. Еникеева предлагают
растворы двууглекислой соды, гидразина и монойодуксусной
кислоты брать в следующем соотношении: 100 мл раствора
NaHC03, 25 мл раствора гидразина, 25 мл раствора монойодук¬
сусной кислоты и 25 мл дистиллированной воды. Полученную
смесь хранят в холодильнике при +4°С.
Непосредственно перед определением приготовляют вторую
смесь, состоящую из 0,25 мл раствора ФДФ и 1,75 мл первой
смеси.
Ввиду того, что реакция проходит за очень непродолжитель¬
ное время, можно обходиться и без монойодуксусной кислоты
72

(заменив ее соответствующим объемом дистиллированной воды
или 0,5% раствором двууглекислой соды).
Для постановки опытной пробы в центрифужную пробирку
вносят 0,1 мл сыворотки и добавляют 0,2 мл второй смеси.
Контроль ставят путем приливания к 0,1 мл сыворотки 0,175 мл
первой смеси (без раствора ФДФ). Все пробирки опыта и конт¬
роля помещают в термостат при +37° С на 1 ч. После инкуба¬
ции в контрольные пробирки добавляют по 0,025 мл раствора
ФДФ. Дальнейший ход реакции для опытной и контрольной
проб идет одинаково. Белки осаждают добавлением 0,3 мл 10%
трихлоруксусиой кислоты. Пробирки центрифугируют до полу¬
чения прозрачной надосадочной жидкости (этот этап может
быть исключен) и после добавления в них 0,6 мл 3% раствора
NaOH оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем
приливают по 0,6 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, про¬
бы помещают на 10 мин в термостат или водяную баню при
+ 37 °С (их можно оставлять и при комнатной температуре),
добавляют 4,2 мл 3% NaOH и сразу же колориметрируют на
ФЭКе при зеленом светофильтре (530—540 нм) в кюветах с
рабочей шириной 5 мм. Из показаний опыта вычитают показа¬
ния контроля и выражают активность альдолазы в условных
единицах, представляющих величину экстинкции, умноженную
на 100.
По микрометоду В. А. Ананьева и В. Р. Обуховой в норме
активность фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы в сыворотке крови
не превышает 3—8 ед.
Клинико-диагностическое значение. ФДФ-А-фермент, обна¬
руживающий высокую активность в скелетной мускулатуре,
миокарде, печени, мозге, легких, эритроцитах. При глубоких
дистрофических процессах в мышечной системе значительно
увеличивается содержание данного энзима в сыворотке крови.
При остром приступе миоглобинурии активность фермента мо¬
жет возрастать в 100 раз против нормы, постепенно спадая по
мере стихания процесса. Значительное увеличение активности
ФДФ-А наблюдается при прогрессивной мышечной дистрофии,
дерматомиозите, миозите, в то время как сходные по клиниче¬
ской картине нервно-мышечные и другие заболевания (нервно-
мышечная атрофия, миостения, полиомиелит, бульбарные па¬
раличи) не дают гиперферментемии.
При мелкоочаговом инфаркте миокарда гиперальдолаземия
наблюдается у 25—40% больных. Она наступает через 5—6 ч от
начала болезни, достигая максимальной величины на 2—
3-е сутки. Нормализация теста происходит на 4—5-й день.
При крупноочаговом инфаркте миокарда повышение актив¬
ности альдолазы встречается у 50—72% больных. Начало подъ¬
ема активности и максимальная величина ее наблюдается в те
же сроки, что и при мелкоочаговом инфаркте, но степень ги-
перальдолаземии выше и нормализация показателя происходит
позднее (7—8-й день).
73

Затяжной характер повышения активности ФДФ-А может
рассматриваться как следствие повторных инфарктов.
В отличие от них при острой очаговой дистрофии сердца
активность этого фермента повышается лишь у единичных боль¬
ных в течение первых двух суток заболевания. Стенокардия же
не сопровождается изменением активности альдолазы.
При остром гепатите (болезни Боткина) в 90% случаев об¬
наруживается 5—20-кратное повышение активности фруктозо-
дифосфатальдолазы. Важно отметить, что она возрастает за¬
долго (от 3 дней до 2 недель) до проявления клинических
симптомов заболевания, достигая максимума в первые 5 дней
желтушного периода. Затем происходит ее постепенное сниже¬
ние, более быстрое при легком течении, чем при среднетяжелом
и тяжелом. У детей нормализация ферментативных показателей
происходит быстрее, чем у взрослых. Длительная гиперфермен-
темия свидетельствует о затяжном течении заболевания. Сле¬
дует помнить, что активность фермента увеличивается не только
при желтушной, но и при безжелтушной форме заболевания,
Отсюда становится понятным большое значение определения
сывороточной альдолазы не только для ранней диагностики ге¬
патита и распознавания безжелтушных форм, но и для преду¬
преждения переливания больным крови доноров, страдающих
латентным гепатитом. При хроническом гепатите и циррозе
печени активность ФДФ-А обычно не отличается от нормы. Ев
увеличение всегда является показателем обострения процесса.
Нормальные или незначительные повышения величины фер¬
ментной активности отмечаются при механической желтухе й
воспалительных заболеваниях желчевыводящих путей.
Поражение же печени гепатотропными ядами (например,
ССЦ) приводит к резкому возрастанию активности фруктозб-
дифосфатальдолазы в сыворотке крови. Повышением активно¬
сти альдолазы сопровождаются некоторые опухолевые заболе¬
вания и миелолейкоз.
Менее значительно возрастает активность ФДФ-А в сыво¬
ротке крови при остром панкреатите, гемолитических анемиях,
инфаркте легкого, тяжелых пневмониях, экземе, нейродермите
и ревмокардите.
Определение активности
фруктозо-1 -фосфатальдолазы
(метод Шапиро в модификации Д. М. Брагинского)
Принцип метода не отличается от такового при определении
фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы. Разница сводится лишь к то¬
му, что в качестве субстрата вместо фруктозодифосфата ис¬
пользуют фруктозомонофосфат (ФМФ).
Реактивы те же, что и в методе определения активности
фруктозо-1,6-дифосфальдол азы (кроме фруктозодифосфата)»
74

Субстратом является 0,1 М раствор натриевой соли фрукто¬
зо-1-фосфорной кислоты. Готовят его следующим способом:
494 мг бариевой соли фруктозо-1-фосфорной кислоты поме¬
щают в центрифужную пробирку и (при размешивании стек¬
лянной палочкой) растворяют в 5—7 мл дистиллированной во¬
ды. Для осаждения ионов бария к раствору приливают по
каплям 1,1 —1,2 мл 12% раствора сульфата натрия, размешивая
стеклянной палочкой образовавшиеся хлопья. Смесь тщательно
центрифугируют (10—15 мин при 1500—2500 об/мин) и, не сли¬
чая жидкости с осадка, проверяют полноту осаждения ионов
бария прибавлением к надосадочной жидкости нескольких ка¬
пель 12% раствора сульфата натрия. При появлении мути цент¬
рифугирование повторить! Для полного осаждения ионов бария
рбычно требуется 1,3—1,5 мл 12% раствора сульфата натрия.
Свободную от ионов бария надосадочную жидкость слить в
мерную посуду и довести общий объем дистиллированной водей
до 12,5 мл. Полученный 0,1 М раствор натриевой соли фрукто-
80-1-фосфорной кислоты годен при хранении в рефрижераторе
не более 2—3 недель.
Его разливают в чистые сухие флакончики от пенициллина
и хранят в замороженном состоянии.
При работе с венгерским препаратом его растворение произ¬
водят в кислой среде, создаваемой добавлением нескольких ка¬
пель 10—20% раствора соляной кислоты при постоянном поме¬
шивании содержимого пробирки стеклянной палочкой. Далее
по вышеописанному способу проводят осаждение ионов бария
сернокислым натрием. Свободную от ионов бария надосадоч¬
ную жидкость подщелачивают 3% раствором едкого натра до
pH 7,4 (под контролем индикатора бром-тимолового синего —
см. ниже) и доводят общий объем дистиллированной водой до
12,5 мл.
Ход определения тот же, что и в методе исследования ак¬
тивности фруктозодифосфатальдолазы. Но время инкубации
ферментсубстратной смеси составляет не 1 ч, а 2 ч.
Сравнение хода анализа при определении активности обоих
ферментов приведено в таблице 9.
Контроль. К 0,1 мл испытуемой сыворотки добавляют
0,175 мл смеси реактивов без раствора фруктозомонофосфата.
Пробу инкубируют в течение 2 часов, после чего прибавляют
0,025 мл раствора ФМФ.
Норма. Активность фруктозо-1-фосфатальдолазы (Ф-1-Ф-А)
в сыворотке крови здоровых людей указанным методом обычно
не обнаруживается. Лишь в отдельных случаях отмечаются по¬
казатели до 1 ед. Поэтому за норму приняты показатели
0—1 ед.
Клинико-диагностическое значение. Активность Ф-1-Ф-А с
большим постоянством повышается уже в ранние сроки болез¬
ни Боткина. Поскольку гемолиз существенно не влияет на ре¬
зультат исследования (благодаря чему допускается взятие кро-
75

ТАБЛИЦА 9
Ход определения активности фруктозоди-
и фруктозомонофосфатальдолазы в сыворотке крови
Ход определения активности в сыворотке крови
1,6-дифосфата льдолазы
1
1-монофосфатальдолазы
II
0,1 мл сыворотки крови
0,2 мл смеси реактивов и суб¬
страта (ФМФ)
в течение 2 ч при ^37° С
1. Берут 0,1 мл сыворотки (не-
гемолизированной)
2. Добавляют 0,2 мл смеси реак¬
тивов и субстрата (ФДФ)
3. Инкубируют в термостате в
течение 1 ч при + 37° С
4. Добавляют 0,3 мл 10% раствора трихлоруксусиой кислоты
5. Центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин
6. Добавляют 0,6 мл 3% раствора едкого натра
7. Оставляют на 10 мин при комнатной температуре
8. Добавляют 0,6 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина
9. Нагревают в водяной бане при + 38° С в течение 10 мин
10. Добавляют 4,2 мл 3% раствора едкого натра
11. Колориметрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре
Контроль. Берут 0,1 мл испытуемой сыворотки и добавляют
0,175 мл смеси реактивов без раствора: в I фруктозодифосфата, во II-
без раствора фруктозомонофосфата. После инкубации в контроль¬
ную пробу в I вносят 0,025 мл раствора ФДФ, во II — 0,025 мл
раствора ФМФ.
ви из пальца), применение этой пробы с целью обследования
контактных лиц в очаге инфекции имеет большое преимущество
перед фруктозо-1,6-дифосфатальдолазной (ФДФ-А) пробой.
При болезни Боткина активность Ф-1-Ф-А в начале заболевания
достигает 7-20-40 ед и более. С увеличением сроков заболевания
нормализация повышенных показателей этого фермента насту¬
пает позднее, чем показателей ФДФ-А. При рецидивах и обост¬
рениях болезни Боткина активность фермента вновь повыша¬
ется, а при затяжном течении обычно долгое время не приходит
к норме.
Для токсического гепатита и обострений хронического гепа¬
тита характерны высокие показатели Ф-1-Ф-А. При циррозе пе¬
чени заметное повышение активности фермента отмечается
редко. При механических желтухах на почве новообразований
или заболеваний желчевыводящих путей показатели фермента
остаются нормальными или незначительно повышаются (не
более 2—5. ед). Заметное изменение их обычно связано с вто¬
ричным вовлечением печени в патологический процесс.
76

Гемолитические анемии и функциональные гипербилируби-
немии не сопровождаются повышением активности фермента.
Таким образом, проба является довольно специфическим
индикатором поражения паренхимы печени. Заболевания, не
связанные с поражением печени, сопровождаются нормальными
показателями активности Ф-1-Ф-А.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ
АМИНОТРАНСФЕРАЗ (ТРАНСАДОИНАЗ)
При участии аминотрансфераз в организме человека осу¬
ществляются процессы переаминирования (обратимого пере¬
носа аминогрупп аминокислот на кетокислоты). Наибольшее
значение имеет определение активности аспартат-аминотран-
сферазы и аланин-аминотрансферазы. Эти ферменты обладают
большой каталитической активностью и широко распространены
в различных органах и тканях: печени, мышце сердца, скелет¬
ной мускулатуре, почках и др.
Аспартат-аминотрансфераза (АсТ) катализирует реакцию:
Глютаминовая » Щавелевоуксусная->Аспарагиновая . а-кетоглута-
кислота кислота ч- кислота ^ ровая кислота
Аланин-аминотрансфераза (АлТ) катализирует реакцию:
Глютаминовая к Пировиноградная ->• а-аланин ^ а-кетоглутаровая
кислота ^ кислота <- ^ кислота
Методы определения аспартат-
и аланин-аминотрансфераз в сыворотке крови
Существующие методы определения активности аминотран¬
сфераз в сыворотке крови можно разделить на две основные
группы: колориметрические и спектрофотометрические.
В основе спектрофотометрических методов лежит использо¬
вание оптического теста Варбурга. Эти методы являются наи¬
более специфичными и точными для определения активности
аминотрансфераз в сыворотке крови. Однако применение труд¬
нодоступных и дорогостоящих реактивов, а также необходи¬
мость измерения результатов на спектрофотометре не дают
возможности широкого использования этих методов в клини¬
ческих лабораториях.
Группа колориметрических методов основана на образова¬
нии окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной
кислоты, освобождающегося в результате реакции переамини¬
рования. Интенсивность окраски пропорциональна активности
фермента.
Пировиноградная кислота+ динитрофенилгидразин = дини-
трофенилгидразон пировиноградной кислоты.
77

Динитрофенилгидразоновые методы впервые были предло¬
жены в 1950 г. Тангази, Уайт, Умбрайт. У нас в стране они по¬
лучили известность в модификации Пасхиной.
В последние годы появился значительно облегченный и
упрощенный метод Райтмана и Френкеля, основанный на том
же принципе, но имеющий перед ним ряд преимуществ, состоя¬
щих в исключении из хода определения активности ферментовз
1) перевода щавелевоуксусной кислоты в пировиноградную с
применением анилина; 2) экстракции 2,4-ДНФ-гидразона пиру-
вата толуолом. Метод Райтмана нашел весьма широкое приме¬
нение за рубежом. Будучи технически простым, он, вместе С
тем, выявляет изменения активности фермента при различных
заболеваниях и дает воспроизводимые результаты.
Азометоды основаны на образовании цветного соединения
между щавелевоуксусной кислотой и 6-бензамидо-4-метоксито-
луидиндиазониевым хлоридом. Колориметрические методы этой
группы просты и при наличии соответствующих, все еще дефи¬
цитных реактивов могут быть использованы для быстрого ори¬
ентировочного определения активности аспартатаминотрансфе-
разы.
Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод
определения активности аминотрансфераз
в сыворотке крови (Райтман, Френкель, 1957)
Принцип. В результате переаминирования, происходящего
под действием АсТ и АлТ, образуются щавелевоуксусная и пи-
ровиноградная кислоты. Щавелевоуксусная кислота способна в
процессе ферментативной реакции превращаться в пировино¬
градную кислоту. При добавлении кислого 2,4-динитрофенил-
гидразина энзиматический процесс останавливается и образу¬
ется гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелоч¬
ной среде дает окрашивание, интенсивность которого
пропорционально количеству образовавшейся пировиноградной
кислоты.
Реактивы. 1. 0,1 М фосфатный буфер, pH = 7,4.
Для получения этого буферного раствора смешивают 840 мл
0,1 М растзора двузамещенного фосфата натрия Na2HP04*2 Н20
(готовят путем растворения 17,4 г кристаллической соли в 1 л
дистиллированной воды. Двузамещенный фосфорнокислый нат¬
рий, содержащий две молекулы воды, получают путем двух¬
суточного выветривания на воздухе кристаллической соли, со¬
держащей обычно 12 молекул воды. Соль предварительно рас¬
тирают в ступке в порошок) и 160 мл 0,1 М раствора безводного
однозамещенного фосфата калия КН2РО4 (для приготовления
которого 13,6 г КН2РО4 растворяют в 1 л дистиллированной
воды).
78

Полученный буферный раствор с индикатором бром-тимоло-
вым синим (0,04% раствор) должен давать голубую окраску.
В качестве консерванта к нему можно добавить 5—10 мл хлоро¬
форма.
2. 0,04% раствор бром-тимолового синего.
100 мг индикатора растворяют в ступке с 3,2 мл 0,05 н.
раствора едкого натра. После растворения смывают водой в
мерную колбу емкостью 250 мл и доводят водой до метки.
3. Субстратный раствор для определения аспартат-амино-
трансферазы: 29,2 мг а-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г ДЛ-ас-
парагиновой кислоты (при использовании вместо ДЛ-аспара-
гиновой кислоты Л-аспарагиновой, а вместо ДЛ-аланина —
Л-аланина, навеску субстрата следует уменьшить вдвое) взве¬
шивают на аналитических весах и растворяют в 1 н. растворе
NaOH. Едкий натр приливают осторожно, небольшими порция¬
ми до полного растворения осадка и до получения pH 7,4 (для
измерения pH используется универсальная индикаторная бу¬
мага с небольшими интервалами измерения или рН-метр).
Раствор переливают в мерную колбу емкостью 100 мл, ополас¬
кивают посуду 0,1 М фосфатным буфером pH 7,4 и доводят им
объем до метки колбы. Буферный раствор тщательно переме¬
шивают, прибавляют 1 каплю хлороформа и сохраняют в хо¬
лодильнике в замороженном состоянии (предварительно разлив
его во флакончики из-под пенициллина). Перед употреблением
замороженный раствор должен полностью оттаять.
4. Субстратный раствор для определения активности ала-
нин-аминотрансферазы: 29,2 мг а-кетоглутаровой кислоты и
1,78 г ДЛ-аланина (0,89 г Л-аланина) отвешивают на аналити¬
ческих весах. Дальнейшую работу проводят по указаниям, дан¬
ным для первого субстратного раствора (реактив 3).
5. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитро-
фенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 н. рас¬
твора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После
того как раствор остынет, доводят объем соляной кислотой до
100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хра¬
нят в посуде из темного стекла в холодильнике. Годен в тече¬
ние 1 года.
6. 0,4 н. NaOH, свободный от карбонатов.
Реактив можно приготовить из 50% раствора NaOH, раз¬
бавляя его свежекипяченой водой, свободной от карбонатов, до
получения раствора с удельным весом 1,016 при 20° С или с
удельным весом 1,018 при 15° С. Однако предпочтительнее его
готовить из фиксанала. Сосуды с реактивом и дистиллирован¬
ной водой закрывают пробками с поглотительными трубками,
наполненными натронной известью или гидроокисью бария.
7. Стандартный раствор пировинограднокислого натрия
(CH3COCOONa). 11 мг точно взвешенного кристаллического пи-
рувата натрия (белого цвета) растворяют в небольшом коли¬
честве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу ем¬
79

костью 100 мл и доводят объем дистиллированной водой до
метки. 1 мл раствора содержит 110 мкг пирувата натрия, что
соответствует 88 мкг пировиноградной кислоты. Раствор ис¬
пользуют для построения калибровочного графика.
Ход определения аспартат-аминотрансферазы (АсТ).
Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного
раствора и прогревают при +37° С в течение 5 мин (в практи¬
ке лабораторной работы предварительный этап прогревания
пробы нередко опускают). Затем добавляют 0,1 мл испытуемой
сыворотки и пробирку помещают в термостат при +37° С на
60 мин. Прибавляют 0,5 мл динитрофенилгидразинового рас¬
твора и пробы выдерживают в течение 20 мин при комнатной
температуре для развития реакции. Затем приливают 5 мл
0,4 н. NaOH, тщательно перемешивают и оставляют при ком¬
натной температуре на 10 мин для развития окраски. Оптиче¬
скую плотность измеряют на фотоэлектроколориметре с зеле¬
ным фильтром (530 нм, 500—560) в кювете с рабочей шириной
10 мм против контрольной пробы на реактивы.
Контрольная проба на реактивы содержит все ингредиенты
опытной пробы, за исключением сыворотки крови. Вместо нее
берут 0,1 мл дистиллированной воды. Контрольную пробу ин¬
кубируют в тех же условиях, что и опытную.
Авторы (Райтман, Френкель, 1957) оригинального метода
предлагают ставить контрольные пробы на каждую сыворотку.
Контрольные пробы ставят как опытные, но раствор 2,4-динит-
рофенилгидразина добавляют до инкубации. Постановка конт¬
роля на каждую сыворотку дает возможность получать более
точные результаты.
Ход определения аланин-аминотрансферазы (АлТ).
В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для опре¬
деления АлТ, затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и
помещают на 30 мин в термостат для инкубации при +37° С.
Дальнейший ход анализа осуществляется так же, как и при
определении АсТ.
Расчет аминотрансферазной активности сыворотки произво¬
дят по калибровочному графику, показывающему зависимость
оптической плотности от содержания пировиноградной кис¬
лоты.
Найденную по нему величину (количество мкг пировино¬
градной кислоты) умножают на 10, получают число ед фер¬
мента в 1 мл сыворотки (1 ед соответствует такой активности
фермента, которая способна в данных условиях опыта образо¬
вывать 1 мкг пировиноградной кислоты).
При вычислении активности фермента необходимо учиты¬
вать и разведение сыворотки.
Построение калибровочной кривой. В пробирки наливают
ингредиенты, указанные в таблице 10, перемешивают их, добав¬
ляют по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина и через 20 мин при¬
ливают по 5 мл 0,4 н. раствора NaOH. Затем пробы колоримет-
80

ТАБЛИЦА 10
Данные к построению калибровочного графика
для определения активности аминотрансфераз
JV? проби¬
Стандартный раствор пирувата
натрия
Дистил-
лирован-
Количество мкМ пи¬
ровиноградной кис¬
рок
мл
содержание пирови¬
ноградной кислоты
ная вода,
мл
лоты на 1 мл сыво¬
ротки за 1 ч инку¬
бации
мкг
мкМ
АсТ
АлТ
1
0,05
4,4
0,05
0,55
0,5
1,0
2
0,10
Оо
00
0,10
0,50
1,0
2,0
3
0,15
13,2
0,15
0,45
1,5
3,0
4
0,20
17,7
0,20
0,40
2,0
4,0
5
0,25
22,0
0,25
0,35
2,5
5,0
6
0,30
26,4
0,30
0,30
3,0
6,0
рируют с зеленым светофильтром (530 нм) в кюветах с рабо¬
чей шириной 10 мм против контрольной пробы, в которую
вместо раствора пировиноградной кислоты добавляют дистил¬
лированную воду.
При построении калибровочного графика на оси ординат
откладывают найденную величину оптической плотности, на
оси абсцисс—соответствующее ей содержание пировиноград-
ной кислоты в мкМ или в мкг (в последнем случае полученный
результат умножают на 10).
Начиная с величины экстинкции 0,30, график, как правило,
отклоняется от прямой. В целях соблюдения прямой пропор¬
циональности между концентрацией вещества и оптической
плотностью при получении экстинкции выше 0,30 эти сыворотки
(с большой ферментативной активностью) следует разводить
какой-либо инактивированной сывороткой или 5% раствором
альбумина, приготовленным на физиологическом растворе. По¬
лученные результаты нужно умножить на разведение.
В сыворотке крови здоровых людей содержание АсТ, най¬
денное при помощи данного метода, колеблется в пределах
8—40 ед, а содержание АлТ — в пределах 5—30 ед.
Пересчет активности фермента в мкМ пировиноградной кис¬
лоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение
1 ч при +37° С (как этого требует приказ об унификации),
производят по калибровочной кривой или по следующим фор¬
мулам:
1) (а • 10)/88 = для аспартат-аминотрансферазы;
2) (а • 2 • 10)/88=для аланин-аминотрансферазы,
81

где а — количество мкг пировиноградной кислоты, найденное
по калибровочному графику;
88 — вес 1 мкМ пировиноградной кислоты, мкг;
2 — коэффициент пересчета на 1 ч инкубации;
10 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки;
(а • 2 • 10) =ед активности для АлТ.
Активность аспартат-аминотрансферазы составляет в нор¬
ме 0,1—0,45 мкМ пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки
за 1 ч инкубации при +37° С.
Активность аланин-аминотрансферазы в норме составляет
0,1—0,68 мкМ пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за
1 ч инкубации при +37° С.
Примечания. 1. Сыворотка не должна быть гемолизи-
рована. При хранении ее в рефрижераторе активность фермен¬
та не снижается в течение 1—2 дней.
2. Авторы метода Райтман и Френкель (1957) рекомендуют
строить калибровочную кривую по изменению оптической плот¬
ности, связанной с увеличением концентрации пирувата и соот¬
ветственно снижением концентрации а-кетоглутарата, изме¬
ренной с помощью их динитрофенилгидразонов. Л. Н. Делек¬
торская и другие предлагают наиболее распространенный и
упрощенный метод построения калибровочного графика —
только по пировинограднокислому натрию.
3. Согласно исследованиям Н. И. Панченко, Н. К. Маслен¬
никовой и Э. С. Коган (1974), следует избегать разведения «па¬
тологических» сывороток более чем в 10 раз. В противном слу¬
чае сказывается «эффект разведения»: непропорциональное
увеличение активности фермента. Так, при разбавлении сыво¬
ротки больных острым гепатитом 1 : 200 она возрастает (в рас¬
чете на неразведенную сыворотку) для АсТ в 28, для АлТ —
в 55 раз.
При определении активности АлТ рекомендуется проводить
инкубацию сыворотки в течение 1 ч, а не 30 мин, поскольку в
этом случае полученный результат следует умножать на 2. По¬
следнее тоже может привести к более высоким показателям
активности АлТ, так как для этого энзима зависимость между
временем инкубации и активностью не прямо пропорциональна.
Клинико-диагностическое значение. Определение активности
аминотрансфераз в сыворотке крови имеет исключительно важ¬
ное значение для диагностики и дифференциальной диагности¬
ки болезней печени. При болезни Боткина активность амино¬
трансфераз повышается с большим постоянством в очень ранние
сроки — еще до появления желтухи. Резкое увеличение актив¬
ности фермента наблюдается и при безжелтушной форме забо¬
левания. В связи с этим проба находит широкое применение при
обследовании контактных лиц в очаге инфекции. При болезни
Боткина большей чувствительностью отличается аланин-амино-
трансфе^азная проба, которая в первые 10—15 дней болезни
(5—10 дней от начала желтухи) практически во всех случаях
82

бывает повышенной. С увеличением сроков заболевания актив¬
ность аминотрансфераз постепенно снижается, обычно быстрее
при легком течении болезни Боткина, чем при среднетяжелом
н тяжелом. У детей отмечается более ранняя нормализация.
При затяжном течении заболевания наблюдается длительная
гиперферментемия; при рецидивах и обострениях активность
йминотрасфераз вновь повышается. Проба в определенной сте¬
пени служит критерием полноты выздоровления, однако при
дистрофии печени активность аминотрансфераз может быстро
снижаться, несмотря на ухудшение течения болезни.
При токсическом гепатите и обострении хронического гепа¬
тита часто отмечаются высокие цифры ферментативной актив¬
ности.
Цирроз печени даже в активной фазе не сопровождается
значительной гиперферментемией.
При механических желтухах на почве новообразований или
заболеваний желчевыводящих путей активность аминотрансфе¬
раз чаще всего нормальна или незначительно повышена. Повы¬
шенные показатели обычно свидетельствуют о вторичном вовле¬
чении печени в патологический процесс (холецистогепатите,
холангиогепатите, обширных метастазах опухоли в печень
и др.). Для гемолитических анемий и фукнциональных
гипербилирубинемий характерны нормальные показа¬
тели.
Таким образом, определение активности аминотрансфераз в
сыворотке крови является тонким индикатором остроты и ак¬
тивности патологического процесса в печени.
Не менее важное значение имеет определение активности
трансаминаз и для диагностики заболеваний сердца. При ин¬
фаркте миокарда в 95% всех случаев содержание аспартат-
аминотрансферазы (АсТ) повышено. Возрастание активности
наступает через 4—6 ч. Оно четко выражено спустя 24—36 ч
и лишь на 3—7-й день активность ферментов снижается до нор¬
мы. Повышение активности АсТ и лактатдегидрогеназы наблю¬
дается при таких инфарктах миокарда, которые не диагности¬
руются электрокардиографически.
Повышение актизности фермента при инфаркте легкого на¬
блюдается в случаях, когда заболевание сопровождается пере¬
грузкой правой половины сердца и застоем в печени.
Крупноочаговые поражения миокарда дают среднее повы¬
шение Act — 136 ед (при максимальном повышении до 289 ед).
АлТ — 99 ед (при максимальном повышении до 167 ед).
При мелкоочаговом поражении, по данным С. Р. Белоус и
Ф. Л. Салимон, среднее арифметическое для АсТ составляет
62 ед, для АлТ — 56 ед при норме: для АсТ — 45 ед и для
АлТ — 35 ед. Авторы отмечают, что умеренное повышение ак¬
тивности аминотрансфераз наблюдалось у обследованных ими
больных с пароксизмальной тахикардией, гипертоническими
кризами.
83

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФОСФАТАЗ
Фосфатазы — ферменты, отщепляющие остаток фосфорной
кислоты от ее органических эфирных соединений. Их можно
разделить на фосфомоноэстеразы и фосфодиэстеразы. Первые
гидролизуют простые эфиры фосфорной кислоты. В зависимости
от pH, при котором проявляется их наибольшая ферментатив¬
ная активность, различают «кислую» и «щелочную» фосфа¬
тазы.
Термином «щелочная фосфатаза» (фосфомоноэстераза 1)
обозначается целый ряд ферментов с оптимумом активности
при pH от 8,6 до 10,1. Сильным активатором ее являются ионы
магния.
Щелочная фосфатаза содержится практически во всех тка¬
нях человеческого организма. Особенно много ее обнаружива¬
ется в костной ткани, паренхиме печени, почек, предстательной,
молочной железе и клетках слизистой оболочки кишечника.
Печень удаляет фермент с желчью. Содержание щелочной
фосфатазы у детей в 1,5—2 раза выше, чем у взрослых.
«Кислая фосфатаза» представляет собой смесь трех фермен¬
тов, обозначаемых римскими цифрами — II, III, IV. Фосфомо¬
ноэстераза II (оптимум действия при pH 4,6) в противополож¬
ность остальным кислым фосфатазам сильно ингибируется
тартратом; ионы магния на нее не влияют.
Фосфомоноэстераза II содержится главным образом в пред¬
стательной железе. Активность кислой фосфатазы в сыворотке
крови человека не велика. Кислая фосфатаза III (pH 3,4—4,4)
находится в печени и других паренхиматозных органах, кислая
фосфатаза IV (pH 5,2—6,2)—в эритроцитах.
Щелочная фосфатаза сыворотки крови стабильна, поэтому
сыворотка может храниться при комнатной температуре (лучше
в холодильнике) в течение нескольких дней.
Кислая фосфатаза при комнатной температуре быстро теря¬
ет свою активность. В связи с этим кровь рекомендуется центри¬
фугировать тотчас после ее взятия. К тому же, при определении
кислой фосфатазы в сыворотке крови следует остерегаться
гемолиза. Ее следует хранить в замороженном состоянии.
Методы определения фосфатаз в сыворотке крови различа¬
ются по используемому субстрату (табл. 11) и состоят в опре¬
делении отщепившегося в результате ферментативного гидро¬
лиза неорганического фосфора или органического остатка.
Методы определения щелочной и кислой фосфатазы разли¬
чаются только по pH используемого буферного раствора.
Наибольшее распространение в клинических лабораториях
для определения активности фосфатаз в сыворотке крови име¬
ют методы: 1) Боданского и 2) Кинга, Армстронга. В последние
годы за рубежом и в лабораториях Советского Союза все чаще
стали применять паранитрофенилфосфатный метод определе¬
ния активности фосфатаз в сыворотке крови.
84

ТАБЛИЦА И
Методы определения фосфатаз в сыворотке крови
Используемый субстрат
Авторы методов
Год опуб-
ликования
методики
Натриевый |3-глицерофосфат
Боданский
1933
Кей
1930
Ши повара и сотрудники
1942
Динатриевый фенилфосфат
Кинг и Армстронг
1934
Кинд и Кинг
1954
Динатриевый р-нитрофенилфос-
Бессея, Лоури, Брок
1946
фат
Шлыгина и Михлин
1955
Покровский и сотрудники
1964
Р-нафтилфосфат
Селигмен и сотрудники
1951
Фенолфталеиндифосфат
Хеггинс, Толалей
1945
Фенол фталеинмонофосфат
Бабсон и сотрудники
1966
Тимолфталеинмонофосфат
Колеман и Строже
1966
Метод Боданского основан на ферментативном гидролизе
Р-глицерофосфата с освобождением неорганического фосфора,
определяемого колориметрически.
Метод Кинга и Армстронга основан на ферментативном гид¬
ролизе фенилфосфата. Освобожденный в результате реакции
фенол определяют колориметрически с реактивом Фолина.
Метод Бессея, Лоури, Брока основан на ферментативном
гидролизе р-нитрофенилфосфата. Освобожденный р-нитрофенол
в щелочной среде имеет желтое окрашивание. Р-нитрофенилфос-
фат, используемый в качестве субстрата в методе Бессея и со¬
трудников, обладает большей субстратной специфичностью к
щелочной фосфатазе, чем другие субстраты. Щелочная фосфа-
таза расщепляет его на 15% быстрее, чем динатриевый фенил-
фосфат, в 3 раза быстрее, чем p-глицерофосфат, и в 30 раз
быстрее, чем фенолфталеиндифосфат.
В ряде лабораторий проводили сравнение методов опреде¬
ления активности фосфатаз в сыворотке крови. Многие авторы
отмечают высокую чувствительность и точность метода Бессея
и сотрудников. По точности и чувствительности он не уступает
методам Боданского и Кинга-Армстронга.
При использовании р-нитрофенилфосфатного метода, кроме
преимуществ, касающихся специфичности используемого суб¬
страта, требуется, по сравнению с другими методами, меньшей
затраты времени и небольшого количества реактивов, поскольку
85

определение активности фермента этим способом основано не
на специальной реакции, а на измерении интенсивности окраски
р-нитрофенола, образующегося в результате ферментативного
гидролиза.
Динатриевый р-нитрофенилфосфат производится отечествен¬
ной промышленностью. Высокая чувствительность и относитель¬
ная простота метода послужили основанием для утверждения
его в качестве унифицированного при определении активности
щелочной фосфатазы в сыворотке крови.
Вторым унифицированным методом определения активности
фосфатаз является способ Боданского.
Определение активности
щелочной фосфатазы в сыворотке крови
по гидролизу р-нитрофенилфосфата
(метод Бессея, Лоури, Брока)
Принцип. Субстрат — р-нитрофенилфосфат натрия — гид¬
ролизуется ферментом сыворотки с образованием р-нитро¬
фенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание.
Интенсивность окраски пропорциональна активности фер¬
мента.
Реактивы. 1. Субстратный раствор: 0,4% раствор р-нитро¬
фенилфосфата натрия в 0,001 н. растворе соляной кислоты pH
6,5—8,0.
Так как в продаже чаще имеется бариевая соль р-нитро¬
фенилфосфата, то перевод ее в натриевую осуществляется сле¬
дующим образом: к навеске р-нитрофенилфосфата бария, соот¬
ветствующей получению 0,9% раствора и помещенной в фарфо¬
ровую ступку, добавляют небольшими порциями 0,001 н. раствор
соляной кислоты при постоянном растирании соли в течение
10 мин. Добавлением насыщенного раствора сернокислого нат¬
рия (1 мл на 100 мл раствора) бариевую соль переводят в нат¬
риевую. Через 5 мин полученный раствор р-нитрофенилфосфата
натрия фильтруют в делительную воронку, где его взбалтывают
с равным объемом водонасыщенного, бутанола (для удаления
р-нитрофенола). После разделения слоев жидкости в делитель¬
ной воронке (вверху бутанол, внизу — постепенно обесцвечива¬
ющийся субстратный раствор) бутанол выливают, а субстрат¬
ный раствор подвергают описанной выше процедуре еще 2—
3 раза, пока он не станет совершенно бесцветным. После
бутанола производят экстракцию водонасыщенным эфиром
1—2 раза.
Реактив не должен содержать свободного р-нитрофенола,
отсутствие которого в субстратном растворе проверяется сле¬
дующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют
10 мл 0,02 н. NaOH и колориметрируют на ФЭКе при свето¬
фильтре с длиной волны 415 нм (фиолетовый фильтр); экстинк-
86

ция должна быть меньше 0,08. Если экстинкция больше этой
величины, необходимо удалить свободный р-нитрофенол.
Для этого реактив экстрагируют 2 или 3 раза равными объе¬
мами бутилового спирта и 1 раз — эфиром. Затем удаляют сле¬
ды эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир
должны иметь нейтральную реакции. Если реактив не выдер¬
гивает указанный тест, то экстрагирование повторяют. Хранят
раствор в холодильнике в замороженном состоянии в течение
нескольких недель.
Р-нитрофенилфосфат фирмы Эстман содержит около 50%
инертного материала. Поэтому нужно использовать двойное ко¬
личество этого препарата. Можно перекристаллизовать препа¬
рат, растворяя его в горячем 87% спирте.
Хранят раствор в холодильнике в течение 2—3 недель.
2. Буферный раствор.
0,05 М глициновый буфер с добавлением катализатора
MgCl2 — 95 мг/л. 375 мг глицина и 10 мг MgCl2 • 6 Н20 растворя¬
ют в 42 мл 0,1 н. раствора NaOH и доводят объем дистиллиро¬
ванной водой до 100 мл.
Вместо глицинового буфера можно использовать 0,05 М ве-
роналовый буфер, pH 10,5, с добавлением хлористого магния
95 мг/л. Реактив хранят в холодильнике.
3. Субстратно-буферный раствор для определения активно¬
сти щелочной фосфатазы готовят смешиванием равных частей
растворов 1 и 2. pH данного раствора должен быть 10,5. Если
необходимо, pH доводят раствором НС1 или NaOH. При смеши¬
вании 2 мл раствора 3 с 10 мл 0,02 н. раствора NaOH реактив
не должен давать экстинкцию при колориметрии на ФЭКе
более 0,1 (толщина слоя 10 мм, длина волны 416, 400—
420 нм). В противном случае раствор не годен или подле¬
жит реэкстрагированию бутанолом или эфиром. После экс¬
тракции необходимо снова устанавливать pH. Хранят реактив
в холодильнике в течение 2—3 дней (лучше в замороженном
виде).
4. 0,02 н. раствор едкого натра. Раствор готовят на дистил¬
лированной воде, освобожденной от углекислого газа путем
предварительного кипячения.
5. Стандартный раствор р-нитрофенола (5* 10-5 М).
Растворяют 69,6 мг химически чистого р-нитрофенола в
0,02 н. растворе NaOH и доводят этим же раствором объем до
100 мл. 1 мл этого основного раствора, содержащего 5 мкМ
р-нитрофенола, доводят 0,02 н. раствором NaOH до 100,0 мл.
1 мл полученного рабочего раствора содержит 0,05 мкМ р-нит¬
рофенола.
Ход определения. В опытные и контрольные пробирки вносят
по 1 мл субстратно-буферного раствора, прогревают при темпе¬
ратуре +37° С в течение 5 мин, затем в опытные пробирки до¬
бавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержимое пробирок переме¬
шивают и инкубируют в течение 30 мин при +37° С.
87

ТАБЛИЦА 12
Данные к построению калибровочного графика
для определения активности щелочной фосфатазы
Стандартный раствор р-нитрофенола
№ про¬
бирок
в мл
содержание р-нитро¬
фенола в пробе, мкМ
0,02 н.
NaOH, мл
Ед. Бессея,
Лоури, Брока
1
1,0
0,05
10,1
1
2
2,0
0,10
9,1
2
3
3,0
0,15
8,1
3
4
5,0
0,25
6,1
5
5
7,0
0,35
4,1
7
После инкубации пробирки переносят в водяную баню со
льдом, в контрольные пробы добавляют по 0,1 мл сыворотки,
затем во все пробирки интенсивной струей (для лучшего пере¬
мешивания реактивов) вносится по 10 мл 0,02 н. раствора
NaOH. Через 3—5 мин пробы колориметрируют на фотоэлектро¬
колориметре при длине волны 400—420 нм (фиолетовый
фильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм, против соответствую¬
щего контроля. Контроль ставится на каждую сыворотку.
Расчет. Находят разность экстинкций опытной и контроль¬
ной проб и по калибровочной кривой получают результаты, вы¬
раженные в мкМ р-нитрофенола, высвобожденного из натрие¬
вой соли р-нитрофенилфосфата под действием содержащейся в
0,1 мл сыворотки крови щелочной фосфатазы за 30 мин хода
ферментной реакции. При пересчете на 1 мл сыворотки и дли¬
тельность реакции 1 ч количество мкМ р-нитрофенола умножа¬
ют на 10 и на 2. При этом получают ответ в мкМ р-нитрофено¬
ла (на 1 мл/ч). Активность фермента, образующего в указан¬
ных условиях 1 мкМ р-нитрофенола, соответствует 1 ед Бессея,
Лоури, Брока. Таким образом, выраженная в ед Бессея актив¬
ность щелочной фосфатазы численно равна количеству мкМ
р-нитрофенола, которое выделилось бы в процесс часовой реак¬
ции при взаимодействии субстрата с 1 мл сыворотки.
Построение калибровочной кривой. 1, 2, 3, 5 и 7 мл рабоче¬
го стандартного раствора, содержащего соответственно 0,05;
0,10; 0,15; 0,25 и 0,35 мкМ р-нитрофенола, с помощью 0,02 н.
раствора NaOH доводят до объема 11,1 мл (табл. 12) и измеря¬
ют оптическую плотность против 0,02 н. раствора NaOH. Строят
кривую, откладывая на оси ординат значения экстинкции, а на
оси абсцисс — количество мкМ р-нитрофенола.
В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке кро-

ви взрослых равна 1,0—3,0 мкМ, детей 1,0—6,0 мкМ р-нитро-
фенола, освобожденного 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации
(ед Бессея — Лоури — Брока).
Примечание. Сыворотка не должна быть гемолизиро-
вана. Кровь для исследования нужно брать через несколько
дней после прекращения приема сульфаниламидов и антибиоти¬
ков.
Определение активности щелочной фосфомоноэстеразы в сы¬
воротке крови набором реактивов Био-ЛА-Тест (Чехословакия)
представляет собой унифицированный метод определения ак¬
тивности щелочной фосфатазы.
Нам хочется лишь отметить, что при пользовании набором
реактивов для получения правильных результатов следует брать
раствора щелочи на 1 мл больше того объема, который реко¬
мендуется использовать при постановке опытных и стандарт¬
ных проб. Только при этом условии можно достичь полного за¬
полнения кювет с шириной слоя 10 мм.
Оценку результатов нужно производить в единицах Бес¬
сея — Лоури — Брока, а не в международных единицах.
Определение активности
щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови
по гидролизу (3-глицерофосфата (метод Бодански)
Принцип. Под действием фермента сыворотки крови Р-гли¬
церофосфат натрия подвергается гидролизу с освобождением
неорганического фосфора, по которому и судят об активности
данного энзима.
Реактивы. 1. Исходный раствор Р-глицерофосфата.
В мерную колбу на 100 мл вносят 1 г натриевой соли Р-гли¬
церофосфата и 0,85 г барбитуровокислого натрия (мединала),
приливают около 30 мл дистиллированной воды и после пол¬
ного растворения указанных реактивов объем полученного
раствора доводят дистиллированной водой до метки; для кон¬
сервации к нему приливают около 3 мл толуола.
Раствор сохраняют в темном флаконе в холодильнике, мо¬
жет быть использован в течение 10—15 дней.
2. Щелочной раствор Р-глицерофосфата.
В мерную колбу на 100 мл вносят 50 мл исходного раствора
Р-глицерофосфата, 2,8 мл 0,1 н. раствора NaOH и после провер¬
ки pH (который должен равняться 8,6) объем раствора дово¬
дят дистиллированной водой до метки; наслаивают около 3 мл
толуола. Раствор может храниться в холодильнике в течение
10 дней.
3. Кислый раствор Р-глицерофосфата.
В мерную колбу на 100 мл вносят 50 мл исходного раствора
Р-глицерофосфата, 5 мл 1 н. уксусной кислоты и после доведе¬
ния объема раствора до метки дистиллированной водой прили¬
89

вают около 3 мл толуола; pH раствора должен составлять
5,0±0,1. Полученный раствор сохраняют в холодильнике.
4. 2,5% молибденовый раствор.
2,5 г молибденовокислого аммония растворяют в 60 мл дис¬
тиллированной воды и фильтруют в мерную колбу на 100 мл.
В другом сосуде готовят раствор серной кислоты путем добав¬
ления к 25 мл дистиллированной воды 7,5 мл концентрирован¬
ной H2S04. Второй раствор соединяют с первым и по охлажде¬
нии его объем доводят дистиллированной водой до метки. Рас¬
твор следует менять раз в месяц; он не пригоден к работе, если
на дне образуется осадок.
5. 0,1 н. раствор соляной кислоты (готовят из фиксанала).
6. 1% раствор аскорбиновой кислоты, приготавливаемый пе¬
ред работой на 0,1 н. растворе соляной кислоты (1 г аскорби¬
новой кислоты растворяют в 100 мл 0,1 н. НС1).
7. 0,1 н. раствор NaOH (готовят из фиксанала).
8. 1 н. раствор уксусной кислоты.
9. 10% раствор трихлоруксусной кислоты.
10. Основной стандартный раствор фосфора.
Отвешивают на аналитических весах 0,4394 г химически
чистого однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РО4),
предварительно высушенного до постоянного веса в эксикаторе
над серной кислотой. Навеску количественно полностью пере¬
носят в мерную колбу на 100 мл, растворяют в небольшом
объеме воды и доводят дистиллированной водой до метки. Для
консервации в приготовленный раствор добавляют несколько
капель хлороформа.
Перед употреблением этот основной раствор разбавляют
дистиллированной водой в 100 раз: 1 мл основного раствора
вливают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки;
1 мл полученного рабочего раствора стандарта содержит 0,01 мг
фосфора.
Ход определения щелочной и кислой фосфатаз. В 4 пробир¬
ки: 2 опытных (для определения активности щелочной и кис¬
лой фосфатаз) и 2 контрольных (используемых для установле¬
ния содержания в сыворотке неорганического фосфора) прили¬
вают по 1 мл соответствующего (щелочного и кислого) раствора
Р-глицерофосфата (табл. 13). Первые две пробирки на не¬
сколько минут помещают в водяную баню или термостат
(+37° С) для прогревания раствора субстрата. Затем осторож¬
но, избегая образования пузырьков воздуха, в пробирки вно¬
сят по 0,1 мл свежевзятой сыворотки и полученную фермент-
субстратную смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре
+ 37° С (учитывая, что активность кислой фосфатазы в нор¬
мальной крови обычно весьма незначительна, иногда гидролиз
соответствующей пробы проводят в течение 3 ч; полученный же
результат делят на 3).
Время термостатирования опытных проб может быть ис¬
пользовано для определения содержания неорганического фос-
90

ТАБЛИЦА 13
Данные для определения
щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови
Пробирки
Щелочной
глицерофос-
1 фат, мл
Кислый гли¬
церофосфат,
мл
Термостат,
мин +370 С
Сыворотка,
мл
ЙР-
н „
н +
10%ТХУ, мл
Сыворотка,
мл
Центрифуги¬
рование,
10 мин
Центрифугат,
мл
Молибдено¬
вый раствор,
мл
1 % аскорби¬
новая кисло¬
та, мл
Щелоч- Пх
1
—
5
0,1
1
1,1
—
Через
1,5
1
1
ная Кх
1
—
—
—
(1)
1,1
0,1
5 мин
1,5
1
1
Кислая П2
—
1
5
0,1
1
1,1
—
1,5
1
1
к2
—
1
—
—
(1)
1,1
0,1
1,5
1
1
фора в контрольных пробирках. Для этого к 1 мл щелочного
(или кислого) раствора Р-глицерофосфата приливают 1,1 мл
10% раствора трихлоруксусиой кислоты, после чего добавляют
0,1 мл той же сыворотки; пробы взбалтывают и через несколь¬
ко мин фильтруют или центрифугируют.
К 1,5 мл отобранного фильтрата (центрифугата) добавляют
1 мл молибденового раствора, 1 мл 1% раствора аскорбиновой
кислоты, пробы выдерживают в течение 10 мин при комнатной
температуре, после этого колориметрируют при красном свето¬
фильтре в кювете с рабочей шириной 5 мм против дистиллиро¬
ванной воды.
Расчет активности щелочной и кислой фосфатазы произво¬
дят по калибровочной кривой, для построения которой в 6 про¬
бирок приливают 0,6; 1,2; 2,4; 3,6; 4,8 и 6 мл стандартного ра¬
бочего раствора неорганического фосфора (табл. 14), содержа¬
щего соответственно 0,006; 0,012; 0,024; 0,036; 0,048 и 0,06 мг
фосфора.
Во все пробирки добавляют по 2,5 мл 10% раствора три-
хлоруксусной кислоты, затем такое количество дистиллирован¬
ной воды, чтобы общий объем в каждой пробирке стал равен
9 мл (соответственно добавляют 5,9; 5,3; 4,1; 2,9; 1,7; 0,5 мл
дистиллированной воды).
Из каждой пробирки отбирают по 1,5 мл раствора, добав¬
ляют по 1 мл молибденового раствора, по 1 мл 1% раствора
аскорбиновой кислоты и спустя 10 мин после прибавления мо¬
либденового реактива пробу колориметрируют в кювете с тол¬
щиной рабочего слоя 5 мм при красном светофильтре против
дистиллированной воды.
Через 10 мин после прибавления молибденового реактива
пробы колориметрируют на ФЭКе при красном светофильтре
в кювете толщиной 5 мм против воды.
91

ТАБЛИЦА 14
Данные к построению
калибровочной кривой для определения активности фосфатаз
Реактивы
Номера пробирок
1
2
3
4
5
6
Рабочий раствор Р, мл
0,6
1,2
2,4
3,6
4,8
6,0
содержание фосфора, мг
0,006
0,012
0,024
0,036
0,048
0,06
10% ТХУ, мл
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
Вода дистиллированная, мл
5,9
5,3
4,1
2,9
1,7
0,5
Объем отобранной (пссле
перемешивания) смеси, мл
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
К содержимому всех про¬
бирок добавляют:
молибденовый раствор, мл
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1% аскорбиновую кислоту,
мл
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
При построении калибровочного графика на оси абсцисс от¬
кладывают содержание фосфора в 1,5 мл раствора (составляю¬
щее для 1, 2, 3, 4, 5 и 6-й проб соответственно 0,001; 0,002;
0,004; 0,006; 0,008; 0,010 мг неорганического фосфора), а на
оси ординат отмечают соответствующие им значения экстинк-
ции.
В качестве ед масштаба на оси абсцисс желательно брать не
менее 20 мм, в этом случае график получается более крупный,
а возможная ошибка, связанная с его построением, умень¬
шается.
Активность фосфатазы выражается количеством мг неорга¬
нического фосфора, образующегося в результате деятельности
всей фосфатазы, заключенной в 100 мл сыворотки (ед Бодан¬
ского) .
Для этого по калибровочной кривой рассчитывают число мг
неорганического фосфора, содержащегося в опытных (П1 и Пг)
и контрольных (Ki и К2) пробах. Затем, вычтя из результатов
опытных проб количество неорганического фосфора, найденное
в контрольных пробирках, определяют то количество фосфора,
которое освободилось в результате деятельности фосфатазы,
заключенной в 0,1 мл сыворотки. Очевидно, под влиянием фер¬
ментативной активности фосфатазы, заключенной в 100 мл сы¬
воротки, неорганического фосфора выделилось бы в 1000 раз
больше.
Отсюда, расчет активности щелочной (1) и кислой (2) фос¬
фатаз производят по следующим формулам:
92

1) (FIi — Ki) -1000 = a ед Боданского (BE);
2) (П2-К2) • 1000= а ед Боданского (BE),
где fli, П2 (Ki, K2)—количество неорганического фосфора, со¬
держащегося в опытных (и контрольных) пробах;
1000 — коэффициент пересчета;
а — количество ед Боданского (BE).
В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке взро¬
слых людей составляет 2—5 ед Боданского, у детей — 5—12 ед.
Активность кислой фосфатазы в сыворотке крови взрослых
и детей колеблется в пределах от 0,1 до 0,55 BE.
Приведенный способ выражения активности фосфатаз (в ед
Боданского) является устаревшим. Приказ об унификации
лабораторных методов исследования требует выражения актив¬
ности этих ферментов по количеству выделенного неорганиче¬
ского фосфора (в мкМ) при действии на субстрат 1 мл сыво¬
ротки за время инкубации 1 ч при +37° С.
Пересчет активности фермента в мкМ неорганического фос¬
фора, образовавшегося при инкубации 1 мл сыворотки в тече¬
ние 1 ч при +37° С, производят по следующей формуле:
(а - 10- 1000)/31,
где а — количество мг неорганического фосфора, найденное
по калибровочному графику;
10 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки;
1000 — коэффициент пересчета неорганического фосфора в мкг;
31 —вес 1 мкМ неорганического фосфора в мкг.
В норме активность щелочной фосфатазы составляет (у
взрослых) 0,5—1,3 мкМ неорганического фосфора на 1 мл сы¬
воротки за 1 ч инкубации при температуре +37° С.
Активность кислой фосфатазы 0,025—0,12 мкМ на 1 мл сы¬
воротки за 1 ч инкубации при +37° С.
Примечание. Для исследования активности фосфатаз
кровь нужно брать утром, натощак и через несколько дней по¬
сле прекращения приема сульфаниламидных препаратов и ан¬
тибиотиков.
Анализ должен быть произведен не позже, чем через 24 ч
после взятия крови.
Не рекомендуется вести определение в сыворотке с призна¬
ками гемолиза.
Клинико-диагностическое значение. Увеличение активности
щелочной фосфатазы встречается, главным образом, при двух
видах патологии: костных заболеваниях, связанных с пролифе¬
рацией остеобластов, и при заболеваниях, сопровождающихся
явлениями холестаза.
Исследование активности щелочной фосфатазы приобрело
особенно большое значение в детском возрасте, так как актив¬
ность этого фермента, как правило, повышается при рахите,
причем еще до появления клинических симптомов заболевания
и раньше снижения неорганического фосфора в крови. Актив¬
ность щелочной фосфатазы повышена на протяжении всего пе¬
93

риода заболевания и выравнивается после затихания клиниче¬
ских симптомов рахита.
Путем определения щелочной фосфатазы удается выявить
скрытые формы рахита, а при систематическом обследовании и
предрахитические стадии заболевания. Повышение активности
фосфатаз в данном случае надо рассматривать как компенса¬
торный механизм обеспечения потребностей организма в неор¬
ганических фосфатах.
Гиперфосфатаземия встречается также при распаде костной
ткани — гиперпаратиреоидизме, болезни Педжета, карциноме
костной ткани (болезни Реклингаузена); часто отмечается па¬
раллелизм между высокими показателями активности фермента
и истончением скелета.
Изменение щелочной фосфатазы наблюдается при саркоме
костей, отмечено повышение активности фермента в случае пре¬
обладания остеобластических процессов и снижение — при ос-
теолитическом течении. Это подтверждается наблюдением нор¬
мального уровня активности щелочной фосфатазы в крови при
опухолях костей без новообразования костной ткани (остеомы,
хондромы, гигантоклеточная опухоль, множественная миело-
ма и др.).
Не повышается активность фермента в крови также при де¬
структивном характере повреждения костей.
Метастазирование опухолей в кости приводит к повышению
активности щелочной фосфатазы, но еще больший подъем ак¬
тивности фермента наблюдается при метастазировании в пе¬
чень.
При заболеваниях-печени, сопровождающихся повреждени¬
ем паренхимы (вирусный гепатит, саркоидоз, туберкулез, ами-
лоидоз и лимфогранулематоз), наблюдается умеренное нараста¬
ние активности щелочной фосфатазы. Особенно резкое повы¬
шение активности щелочной фосфатазы отмечается при желтой
атрофии.
Повышается активность щелочной фосфатазы также при об-
турационной (механической) желтухе.
Повышение активности щелочной фосфатазы отмечено и при
заболеваниях мышц.
Лейкемия, в большей степени миелоидная, сопровождается
умеренным повышением активности щелочной фосфатазы кро¬
ви. По-видимому, здесь имеет место выход фермента из разру¬
шающихся лейкоцитов в кровь.
Наблюдаются также гипофосфатаземии (уменьшение ак¬
тивности щелочной фосфатазы крови), которые сопровождают
ослабление остеобластических процессов (гипотиреоз, гипови¬
таминоз С, старческий остеопороз, анемия Кули).
Описано самостоятельное заболевание — эссенциальная, или
идиопатическая, гипофосфатазия, протекающая в виде тяжело¬
го рахита. Это — энзимопатия, обусловленная врожденным не¬
достаточным содержанием фермента в остеобластах костей.
94

Определение кислых фосфатаз используется для диагности¬
ки новообразований предстательной железы. Повышение актив¬
ности кислой фосфатазы при нормальном уровне щелочной ука¬
зывает на новообразования в железе. Однако в начальной ста¬
дии рака предстательной железы активность фосфатазы может
находиться в пределах нормы. Статистически установлено, что
повышение активности энзима встречается лишь в ‘Д части
случаев первичного рака предстательной железы. Активность
фермента особенно повышается при метастазировании рака
предстательной железы. При введении тестостерона («прово¬
кационные» пробы) частота положительных фосфатазных проб
повышается.
При метастазе карциномы предстательной железы в кости
может нарастать и активность щелочной фосфатазы.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ
а-АМИЛАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ
Амилаза (диастаза)—фермент, осуществляющий гидроли¬
тическое расщепление полисахаридов (крахмала, гликогена и
других продуктов, содержащих три и более остатков глюкозы)
до декстринов и мальтозы.
Процесс распада полисахаридов, происходящий по месту
а-1,4-глюкозидных связей, включает в себя ряд стадий: крах¬
мал -*■ эритродекстрины -* ахродекстрины ->■ мальтотетроза -*
мальтоза -*■ глюкоза. Конечный продукт действия амилазы не
дает цветной реакции с йодом.
Наиболее богаты амилазой поджелудочная и слюнные же¬
лезы. Амилаза крови происходит, главным образом, из подже¬
лудочной железы.
Существующие методы определения активности а-амилазы
в сыворотке крови делятся на две основные группы:
1. Сахарифицирующие, основанные на определении образу¬
ющихся из крахмала сахаров по редуцирующему действию глю¬
козы и мальтозы.
2. Амилокластические, основанные на определении остатка
нерасщепленного крахмала по степени интенсивности его реак¬
ции с йодом. Молекулы декстринов, имеющие 30 гексозных
остатков, дают с йодом синюю окраску; молекулы, состоящие
из 8—12 остатков — красную; молекулы же, состоящие из 4—
5 гексозных остатков, окрашивания не дают.
По мнению многих авторов, амилокластические методы яв¬
ляются более специфичными и чувствительными, чем сахари¬
фицирующие. Из них наиболее удобными для практической
работы являются микрометоды Смита и Роэ, а также Каравея
(со стойким субстратом), которые и предлагаются в качестве
унифицированных.
95

Определение активности а-амилазы (диастазы)
Ь сыворотке крови и моче амилокластическим методом
Принцип метода основан на колориметрическом определе¬
нии концентрации крахмала до и после его ферментативного
гидролиза.
Реактивы. 1. 2% раствор крахмала.
2 г «растворимого» крахмала (например, для колоримет¬
рии) тщательно растирают в ступке с небольшим количеством
(8—10 мл) воды. Полученную суспензию тонкой струей влива¬
ют (при постоянном помешивании) в кипящую в отдельном
сосуде воду (около 100 мл), доводят объем до 100 мл и кипя¬
тят еще несколько минут до получения почти прозрачного рас¬
твора. После охлаждения раствор годен к употреблению. Его
можно хранить в холодильнике в течение 5—7 дней.
Предпочтительно, согласно «Приказу об унификации», еже¬
дневно готовить 2% раствор крахмала в объеме 10 мл (200 мг
крахмала суспендируют в 1 мл холодной воды, затем добавля¬
ют 6—7 мл горячей дистиллированной воды; колбу погружают
в кипящую водяную баню до полного растворения крахмала и
доводят дистиллированной водой до 10 мл). Субстрат должен
быть прозрачным, готовится ежедневно, так как в нем быстро
разводятся грибки и бактерии.
2. 0,1 М фосфатный буфер рН=7,2.
Готовят (желательно ежедневно) путем смешивания 72 мл
0,1 М раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия соста¬
ва Na2HP04,2H20 (17,4 г/л) с 28 мл 0,1 М раствора однозаме-
щенного фосфорнокислого калия КН2РО4, полученного раство¬
рением 13,6 г безводной соли в 1 л воды. Исходные растворы
могут храниться в холодильнике в течение 10—15 дней.
Кристаллогидрат Na2HP04'2H20 может быть получен из со¬
ли с большим содержанием кристаллизационной воды путем
двухсуточного выветривания ее при комнатной температуре
(для этого растиранием в фарфоровой ступке крупные кристал¬
лы превращают в мелкие и тонким слоем распределяют их на
чистом листе фильтровальной бумаги).
3. 3% раствор NaCl.
4. 1 н. раствор НС1.
5. 0,1 н. раствор йода.
При отсутствии фиксанала его готовят следующим обра¬
зом:
3 г KI растворяют в 25 мл дистиллированной воды, в кото¬
рую вносят 1,27 г кристаллического йода; после этого объем
раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл. При хра¬
нении в темноте раствор стоек длительное время.
Ход определения. В две пробирки (опытную и контрольную)
вносят по 0,5 мл раствора крахмала, 0,3 мл фосфатного буфера
и 0,1 мл 3% раствора NaCl. После 10 мин прогревания при
+ 37° С в опытную пробирку добавляют 0,1 мл сыворотки (или
96

профильтрованной мочи в разведении 1 : 10 или 1 : 100), содер¬
жимое ее хорошо перемешивают и термостатируют точно
30 мин при +37° С. Инкубацию смеси прерывают добавлением
ОД мл 1 н. раствора соляной кислоты (при этом pH становится
ниже 2, что приводит к прекращению действия амилазы). За¬
тем 0,2 мл содержимого пробирки переносят в 50 мл мерную
колбу, в которую предварительно помещают 40 мл воды, 0,5 мл
соляной кислоты, 0,1 мл раствора йода и, после размешивания,
доводят объем дистиллированной водой до метки.
Контрольную пробу (для измерения начальной экстинкции
крахмала) обрабатывают точно так же, как опытную, но соля¬
ную кислоту прибавляют до инкубации (т. е. 0,1 мл исследуе¬
мого материала — сыворотки или разведенной мочи — вносят
только после добавления в пробирку 0,1 мл I н. раствора соля¬
ной кислоты).
Опытную и контрольную пробы колориметрируют тотчас же
на ФЭКе, при красном светофильтре (длина волны 630—
690 нм) в 10 мм кювете, против воды.
До недавнего времени активность фермента было принято
выражать в амилазных (диастатических) единицах на 100 мл
сыворотки (или мочи) при инкубации в течение 30 мин. При
этом способе оценки энзиматической активности расчет ведут
исходя из того, что 1 ед диастазы (амилазы) соответствует
расщеплению 10 мг крахмала.
В связи с этим активность диастазы (амилазы) определит¬
ся формулой:
(Еконтр. Пробы Еопытн. пробы) ■ Ю • 1000
Еконтр. Пробы ■ 10 '
где 10 — в числителе — количество мг крахмала, введенно¬
го в опытную и контрольную пробу;
1000 — коэффициент пересчета активности фермента на
100 мл сыворотки;
10 — в знаменателе — коэффициент пересчета на ед диа¬
стазы (амилазы).
После сокращения формула приобретает следующий вид:
Еконтр. пробы Еопытн. пробы
• 1000 = а ед амилазы.
^контр. пробы
В случае использования разведенной мочи полученный ре¬
зультат умножают на коэффициент разведения.
В норме активность амилазы крови равна 80—120 ед, диас¬
тазы мочи — до 400 ед.
Согласно унификации расчет активности этих ферментов
следует проводить по формуле:
Еконтр. пробы Еопытн. пробы
р 10-20 = мг крахмала, гидролизо-
Е'контр. пробы
ванного 1 мл сыворотки или мочи за 1 ч инкубации при +37° С,
4 Зак. 2615 97

где 10 — количество мг крахмала, введенного в опытную и
контрольную пробы;
20 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки или мочи
за 1 ч инкубации.
При расчете активности фермента в моче результаты следу¬
ет умножить на соответствующее разведение.
Нормальные показатели активности фермента для сыворот¬
ки крови—16—30 мг, мочи — 28—160 мг (в среднем 107±
±5,1 мг) крахмала, гидролизованного 1 мл биологической жид¬
кости за 1 ч инкубации при +37° С.
Примечания. 1. Для определения активности а-амила¬
зы рекомендуется исследовать свежую сыворотку и мочу (хотя
и существует мнение, что активность амилазы в сыворотке кро¬
ви при комнатной температуре остается без изменений в тече¬
ние нескольких дней). Однако, по данным Л. П. Делекторской,
активность фермента лучше определять сразу после взятия
проб, так как хранение сыворотки при комнатной температуре
и в холодильнике при +4° С приводило к снижению активности
фермента. Слабый гемолиз не мешает исследованию. Лимонно¬
кислую и щавелевоуксусную плазмы употреблять нельзя, так
как соли лимонной и щавелевой кислот ингибируют активность
фермента.
2. Интенсивность окраски йодно-крахмального раствора, со¬
держащегося в колбочке, обратно пропорциональна темпера¬
туре. Поэтому надо следить за тем, чтобы в опытной и конт¬
рольной пробах во время цветной реакции температура была
постоянной.
3. Профильтрованную мочу можно использовать и неразве-
денной. Однако при активности фермента выше 140 мг гидро¬
лизованного крахмала мочу следует развести (или укоротить
период инкубации), что соответственно должно учитываться в
расчете активности ферментов. При высокой гиперферментемии
мочу нужно разводить в 100 раз.
4. Нормальные показатели активности фермента для сыво¬
ротки крови и мочи желательно проверять на донорах для каж¬
дой лаборатории.
5. При определении амилазной активности необходимо учи¬
тывать, что слюна содержит в 1000 и 10 000 раз больше фер¬
мента, чем сыворотка. Пот также обладает амилазной активно¬
стью. Так, при перемешивании проб, закрытых большим паль¬
цем, у разных лиц активность амилазы возрастала на 25—80%.
Определение активности а-амилазы
со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея)
Принцип метода амилокластический.
Реактивы. 1. Раствор субстрата: кипятят 13,3 г безводного
двухзамещенного фосфорнокислого натрия и 4,3 г бензойной
98

кислоты с 250 мл воды. Суспендируют 0,2 г растворимого крах¬
мала в небольшом количестве холодной воды и вводят в кипя¬
щую смесь. Кипятят 1 мин. Охлаждают и доводят водой до
500 мл. Раствор устойчив при комнатной температуре. Он дол¬
жен сохранять прозрачность.
2. 0,1 н. основной раствор йода, который может быть полу¬
чен следующими способами: а) из фиксанала; б) из кристал¬
лического йода и йодистого калия: 30 г KI растворяют в 250 мл
дистиллированной воды, туда же вносят 12,7 г йода и доводят
объем дистиллированной водой до 1000 мл. Полученный рас¬
твор (Люголя) хранят в темноте. Он стоек; в) из йодата калия
и йодистого калия: 3,567 г йодноватокислого калия (КЮз) и
45 г KI растворяют в 800 мл воды и медленно, при помешива¬
нии, добавляют 9 мл концентрированной соляной кислоты, а за¬
тем доводят объем до 1000 мл.
3. Рабочий (0,01 н.) раствор йода: 25 г фтористого калия
растворяют в 350 мл воды, добавляют 50 мл основного раствора
йода и доливают водой до объема 500 мл. Годность раствора
около 2 месяцев, при условии хранения в посуде из темного
стекла, в холодильнике. Если в рабочий раствор йода не добав¬
лять фтористого калия, то его следует готовить ежедневно.
Ход определения. В 2 колбочки емкостью 50 мл (опытную
и контрольную) отмеривают по 5 мл крахмального субстрата.
Опытную пробу прогревают при +37° С в течение 5 мин, после
этого к ней добавляют 0,1 мл сыворотки или профильтрованной
мочи. Содержимое пробирки перемешивают и инкубируют в те¬
чение 7,5 мин в водяной бане при температуре +37° С. Сразу
же после прогревания опытной пробы в обе колбочки добавля¬
ют по 5 мл рабочего раствора йода. Объем реактивов в кол¬
бочках доводят дистиллированной водой до 50 мл и немедлен¬
но замеряют экстинкцию растворов при красном светофильтре
(длина волны 630—690 нм) в кювете шириной 10 мм.
Расчет активности производят по формуле:
Еконтр- пробы Е0ПЫТН. пртбы * 2 • 80
Е =количеству крахмала в мг,
Е-КОНТр. Пробы
гидролизованного 1 мл биологической жидкости за 1 ч инку¬
бации при +37° С,
где 2 — количество крахмала, введенного в опытную и конт¬
рольную пробы, мг;
80 — коэффициент пересчета на 1 мл биологической жид¬
кости и 1 ч инкубации.
Норма та же, что в методе Смит и Роэ.
Клинико-диагностическое значение определения амилазы
(крови) и диастазы (мочи). Повышение активности амилазы
встречается, главным образом, при заболеваниях поджелудоч¬
ной железы. При остром панкреатите активность фермента кро¬
ви и мочи увеличивается в 10—30 раз. Гиперамилаземия насту¬
пает непосредственно после начала заболевания, достигает
максимума к 12—24 ч, после чего быстро снижается и приходит
99

к норме на 2—6-й день. Обычно гиперамилазурия длится доль¬
ше, чем увеличение активности фермента в сыворотке. Встре¬
чаются острые панкреатиты без повышения активности фермен¬
та (в частности, при тотальном панкреонекрозе).
Хронические панкреатиты, рак поджелудочной железы не
приводят к резкому повышению активности амилазы крови и
для их диагностики применяют так называемые провокацион¬
ные пробы. Амилазная активность может быть увеличена при
делом ряде заболеваний, имеющих сходную клиническую кар¬
тину с острым панкреатитом: остром аппендиците, перитоните,
перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки
(когда в процесс вовлекается и двенадцатиперстная кишка).
При перитонитах повышение амилазной активности является
следствием развития образующих амилазу бактерий. Обычно
активность фермента при указанных заболеваниях повышается
в 3—5 раз.
Следовательно, резко выраженная гиперамилаземия позво¬
ляет отдифференцировать острый панкреатит не только от хро¬
нических заболеваний поджелудочной железы, но и от других
заболеваний, в том числе и от острых приступов желчнокамен¬
ной болезни.
Почти всегда амилаземия сопровождается амилазурией, но
определение активности амилазы мочи является менее точным
показателем диагностики, так как выход амилазы в мочу свя¬
зан с функцией почек.
Повышение активности амилазы в сыворотке крови при хро¬
нических заболеваниях почек и острых уремиях можно объяс¬
нить уменьшением или отсутствием выделения фермента через
почки.
Определение активности амилазы в крови и моче может дать
некоторые указания о функциональном состоянии почечного
фильтра. При нефрозах, гломерулонефритах и т. п. активность
амилазы повышена, в то время как в моче она резко снижается.
Коэффициент: активность амилазы крови/активность амилазы
мочи может служить показателем функциональной полноцен¬
ности почечного фильтра.
Другим заболеванием, при котором наблюдается значитель¬
ное повышение активности амилазы в крови, являются пароти¬
ты, но ясная клиническая картина заболевания дает возмож¬
ность дифференцировать гиперамилаземию. Введение корти¬
зона или АКТГ повышает активность фермента в несколько
раз.
При заболеваниях печени (гепатиты, циррозы, интоксика¬
ции, злокачественные опухоли и их метастазы в печень) наблю¬
дается снижение амилазной активности крови. Гипоамилаземия
отмечается также при обширных ожогах кожи, сахарном диа¬
бете, гипотиреозах, заболеваниях с общим расстройством пи¬
тания и падением веса (острые, особенно токсические, диспеп¬
сии), кахексии.
100

Определение общей активности
лактатдегидрогеназы
Лактатдегидрогеназа — гликолитический фермент, обрати¬
мо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную
кислоту. Для лактатдегидрогеназы в качестве промежуточного
акцептора водорода требуется НАД.
Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, может
быть представлена в следующем виде:
L-лактат НАД лактатдегидрогеназа пируват ^ ндд . ^
Фермент широко распространен в организме человека. По
степени убывания активности энзима органы и ткани могут
быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, ске¬
летные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, лег¬
кие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько раз¬
личных белков (изоэнзимов), обладающих каталитическими
свойствами этого фермента. Изменения в строении белковой
части изоферментов обусловливают их различные физико-хими¬
ческие свойства, что в частности сказывается в неодинаковой
электрофоретической подвижности разновидностей этого фер¬
мента в агаровом, крахмальном, полиакриламидном и других
гелях. В сыворотке крови обнаружено пять изоэнзимов лактат¬
дегидрогеназы: ЛДП, ЛДГ2, ЛДГз, ЛДГ4, ЛДГ5, располагаю¬
щихся в геле в порядке убывания их электрофоретической по¬
движности. Установлено, что фракция ЛДП происходит в ос¬
новном из ткани сердца, ЛДГ5 — из печени. В отличие от
последней ЛДП обладают устойчивостью к действию мочевины.
Лактатдегидрогеназа содержится не только в сыворотке, но
и в значительном количестве в эритроцитах, поэтому сыворот¬
ка, используемая для анализа, должна быть свежей, лишенной
следов гемолиза.
Исследование общей активности фермента характеризует
интенсивность окислительно-восстановительных процессов ор¬
ганизма, а определение активности отдельных изоэнзимов ЛДГ
способствует диагностике некоторых заболеваний сердца, пе¬
чени и других органов.
Методы определения активности
лактатдегидрогеназы в сыворотке крови
1. Спектрофотометрические, основанные на различии спект¬
ров поглощения окисленной и восстановленной форм НАД (оп¬
тический тест Варбурга).
2. Колориметрические. К их числу относятся:
а) динитрофенилгидразиновые методы, основанные на опре¬
делении пировиноградной кислоты с помощью 2,4-динитрофе-
нилгидразина;
101

б) редоксиндикаторные методы, основанные на превращении
бесцветной, окисленной формы тетразолиевых солей в окрашен¬
ную, редуцированную форму за счет окисления восстановлен¬
ного молочной кислотой НАД • Нг.
Спектрофотометрические методы связаны с применением
дефицитных реактивов и с измерением результатов на
спектрофотометре; поэтому, несмотря на свою точность, они
не могут быть рекомендованы для клинических лаборато¬
рий.
Более удобны для практического применения колориметри¬
ческие методы. Из них самым простым, чувствительным и тре¬
бующим наименьшего расхода дефицитных реактивов является
динитрофенилгидразиновый метод Нательсона, основанный на
определении непрореагировавшей пировиноградной кислоты с
помощью 2,4-динитрофенилгидразина. К сожалению, из-за
трудности получения стабильных растворов пировиноградной
кислоты метод Нательсона не может быть рекомендован как
унифицированный.
Из колориметрических методов наиболее точным является
метод Севела и Товарек, основанный на окислении лак¬
тата в пируват в присутствии лактатдегидрогеназы и НАД.
Поэтому он и предлагается как унифицированный для опре¬
деления активности лактатдегидрогеназы в сыворотке
крови.
Редоксииндикаторные методы точны и технически просты,
но требуют большого количества труднодоступных реактивов,
поэтому в клинических лабораториях Советского Союза их поч¬
ти не применяют.
Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод
определения активности лактатдегидрогеназы
в сыворотке крови (по Севела и Товарек)
Принцип. L-лактат в щелочной среде в присутствии лактат¬
дегидрогеназы сыворотки и добавленного НАД окисляется в
пируват. По степени его образования и судят об активности
фермента.
Реактивы. 1. 0,45 М раствор молочнокислого натрия. В мер¬
ную колбу емкостью 100 мл вносят 5 мл 80% молочной кислоты
(или 10 мл 40%) и нейтрализуют ее 2 н. раствором едкого натра
до слабощелочной реакции (рН-7,5) по фенолфталеину (слабо¬
розовая окраска). Объем доводят дистиллированной водой до
100 мл.
2. 0,03 М раствор пирофосфорнокислого натрия рН-8,8;
6,69 г Na4P207- ЮН20 растворяют в 50 мл воды, устанавливают
pH -8,8 с помощью 1 н. раствора соляной кислоты и доводят
объем до 500 мл дистиллированной водой. Реактив стабилен в
течение месяца при хранении в холодильнике.
102

3. Раствор НАД: 3 мг НАД (х. ч.) растворяют в 1 мл
дистиллированной воды (из расчета 0,6 мг на пробу). Рас¬
твор стабилен в течение 4-х недель при хранении в холодиль¬
нике.
4. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина. 19,8 мг 2,4-динитро-
фенилгидразина растворяют в небольшом количестве 1 н. рас¬
твора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После
охлаждения доводят объем 1 н. раствором соляной кислоты до
100 мл. На следующий день реактив фильтруют. Раствор хра¬
нят в посуде из темного стекла. Раствор стабилен в течение
I года.
5. 0,4 н. раствор едкого натра.
6. 1 н. раствор соляной кислоты.
7. Стандартный раствор пировинограднокислого натрия.
II мг кристаллического пировинограднокислого натрия раство¬
ряют в небольшом количестве дистиллированной воды, перено¬
сят в мерную колбу, емкостью 100 мл, и доводят объем раство¬
ра до метки дистиллированной водой.
1 мл раствора содержит ГО мкг пирувата натрия, что соот¬
ветствует 88 мкг пировиноградной кислоты.
Рабочий стандартный раствор готовят разведением основ¬
ного в 10 раз дистиллированной водой. 1 мл рабочего раствора
содержит 8,8 мкг пировиноградной кислоты.
Ход определения. 0,1 мл сыворотки, разведенной 1 5 2, сме¬
шивают с 0,3 мл раствора НАД и прогревают 5 мин при +37° С.
Затем добавляют 0,8 мл 0,03 М раствора пирофосфорнокислого
натрия и 0,2 мл 0,45 М раствора молочнокислого натрия, пред¬
варительно прогретых при +37°. Смесь инкубируют при +37°
в течение 15 мин. Тотчас же после инкубации в пробу до¬
бавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и вы¬
держивают ее 20 мин при комнатной температуре. Затем
вносят 5 мл 0,4 н. раствора едкого натра, содержимое пробир¬
ки перемешивают и через 10 мин измеряют экстинкцию на
ФЭКе в кювете с толщиной слоя 10 мм при зеленом Свето¬
фильтре (длина волны 500—560 нм) против контрольной
пробы.
Контрольную пробу ставят как опытную, но разведенную
1 {2 сыворотку добавляют после инкубации.
Расчет активности производят по калибровочному графику.
Активность лактатдегидрогеназы выражают в микромолях пи¬
ровиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл
сыворотки в течение 1 ч при +37° С.
Построение калибровочного графика. Из рабочего стандарт¬
ного раствора пировинограднокислого натрия готовят ряд раз-
ведений, как указано в таблице 15. Затем в пробирки прили¬
вают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее
стандартные пробы обрабатывают как опытные.
Контрольную пробу ставят как стандартную, но вместо
стандартного раствора добавляют дистиллированную воду.
103

ТАБЛИЦА 15
Данные к построению калибровочного графика
для определения активности лактатдегидрогеназы
в сыворотке крови
Рабочий стан¬
дартный рас¬
твор пирувата
натрия, мл
0,03 М раст¬
вор пирофос-
форнокислого
натрия, мл
Дистил¬
лирован¬
ная вода,
мл
Содержание пирови¬
ноградной кислоты
в стандартной пробе
Активность
в мкМ пиро¬
виноградной
кислоты на
1 мл сыво¬
ротки в ч
мкг
мкМ
0,1
0,8
0,5
0,88
0,01
1,2
0,2
0,8
0,4
1,76
0,02
2,4
0,4
0,8
0,2
3,52
0,04
4,8
0,6
0,8
—
5,28
0,06
7,2
0,8
0,6
—
7,04
0,08
9,6
Пересчет активности лактатдегидрогеназы в мкМ пйровино-
градной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при
+ 37° С производят по формулам 1 или 2.
Активность лактатадегидрогеназы в мкМ /мл/ч =
= (Ci • 30 • 4)/88(1) или = С2- 30-4(2),
где Ci — мкг пировиноградной кислоты в стандартной пробе;
Сг — мкМ пировиноградной кислоты в стандартной пробе;
30 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки;
4 — коэффициент пересчета на 1 ч инкубации;
88 — вес 1 мкМ пировиноградной кислоты, мкг.
Прямолинейная зависимость между концентрацией пирови¬
ноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0
до 10 мкМ/мл/ч.
Нормальные величины активности общей ЛДГ в сыворотке
крови от 0,8 до 4 мкМ пировиноградной кислоты на 1 мл сыво¬
ротки за 1 ч инкубации при 37° С.
Примечания. 1. Сыворотка крови не должна быть ге-
молизирована.
2. Для исследования рекомендуется использовать свежую
сыворотку.
3. Щавелевоуксусную плазму употреблять не рекомендует¬
ся, так как соли щавелевой кислоты ингибируют фермент.
Пользуясь данным методом, можно определять и мочевино¬
стабильную фракцию ЛДГ.
Определение активности мочевиностабильной фракции ЛДГ
в сыворотке крови.
Принцип метода основывается на свойстве мочевины почти
на 100% ингибировать активность ЛДП. При параллельном
104

определении активности общей ЛДГ рассчитывают процент со¬
держания стабильной к мочевине фракции.
Реактивы те же, что и в предыдущем методе. Дополнитель¬
но используют раствор мочевины на 0,03 М растворе пирофос-
форнокислого натрия. Готовится растворением 14,4 г мочевины
в 100 мл пирофосфорнокислого натрия, pH 8,8.
Ход определения активности общей и мочевиностабильной
фракции ЛДГ отличается следующими особенностями:
1. В методике определения активности мочевиностабильной
фракции ЛДГ применяют раствор пирофосфата натрия, содер¬
жащий мочевину.
2. Первый этап этого метода состоит в следующем: 0,1 мл
сыворотки, разведенной .1 : 2, тщательно смешивают с 0,8 мл
0,03 М раствора пирофосфорнокислого натрия, содержащего мо¬
чевину, и с 0,3 мл раствора НАД. Преинкубацию проводят в
течение 1 ч при +25° С, закрыв пробирку крышкой. Затем в
пробирку добавляют 0Л2 мл 0,45 М раствора молочной кислоты
и инкубируют смесь 15 мин при +37° С.
3. В методике определения активности общей ЛДГ не при¬
меняют этап предварительного прогревания растворов при тем¬
пературе + 37° С и после сливания реактивов комнатной темпе¬
ратуры сразу же проводят инкубацию в течение 15 мин при
температуре +37° С.
В остальном оба метода не отличаются от описанного выше.
Расчет сводится к установлению процентного содержания
мочевиностабильной ЛДГ по отношению к общей.
По литературным данным в норме мочевиностабильная ЛДГ
составляет 25—36% от общей ЛДГ.
Примечания. Те же, что и к методике определения ак¬
тивности общей ЛДГ. Кроме того, следует отметить, что: 1) для
получения точных результатов нужно строго воспроизводить
указанные условия инактивации мочевиной (концентрация
растворов, температура, время инкубации); 2) процент термо¬
стабильной фракции ЛДГ от общей активности фермента в нор¬
ме следует проверять на донорах в каждой лаборатории.
Клинико-диагностическое значение. Активность лактатдегид¬
рогеназы в сыворотке крови возрастает при повреждении мио¬
карда, лейкозах, почечных заболеваниях, гемолитической, сер¬
повидноклеточной анемиях, тромбоцитопениях, инфекционных
мононуклеозах, а также прогрессивной мышечной дистро¬
фии.
Все заболевания, протекающие с некрозом тканей (инфаркт
миокарда, некротические поражения почек, гепатиты, панкреа¬
титы, опухоли) как правило, сопровождаются резким повыше¬
нием активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови.
При остром гепатите активность лактатдегидрогеназы в сы¬
воротке крови повышена в первые недели желтушного периода,
при легкой и среднетяжелой формах заболевания активность
фермента возвращается к нормальному уровню довольно быст¬
105

ро. При заболеваниях печени процент мочевиностабильной
фракции ЛДГ падает (<20).
По имеющимся наблюдениям (Нательсон), у больных ин¬
фарктом миокарда повышение активности фермента в сыворот¬
ке крови отмечается через 8—10 ч после начала приступа, до¬
стигая максимума через 24—28 ч. Активность остается повы¬
шенной на протяжении первой недели заболевания. К 8—9-му
дню активность лактатдегидрогеназы нормализуется. Подчер¬
кивается, что активность сывороточной лактатдегидрогеназы
при инфаркте миокарда дольше сохраняется повышенной, чем
активность других ферментов. Ценность определения данного
фермента особенно велика в неясных случаях заболевания, при
нетипичной клинической и электрокардиографической картине.
При стенокардии активность лактатдегидрогеназы в сыворотке
крови не увеличивается. Инфаркт миокарда сопровождается
возрастанием (>40) процента мочевиностабильной фракции
ЛДГ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ
В крови человека содержится два вида холинэстераз: аце-
тилхолинэстераза, локализующаяся в эритроцитах, и холинэс-
тераза, находящаяся в сыворотке крови. Оба фермента расщеп¬
ляют эфиры холина на холин и соответствующую кислоту и
отличаются своей специфичностью. Так, ацетилхолинэстераза
гидролизует только ацетилхолин, за что этот фермент раньше
называли специфической, или истинной холинэстеразой.
Холинэстераза же способна расщеплять наряду с ацетил-
холином и бутирилхолин (причем в 2 раза быстрее, чем ацетил¬
холин). Поэтому ее иногда называют бутирилхолинэстеразой,
или ложной, сывороточной холинэстеразой. Последняя синтези¬
руется в печени, в связи с чем степень активности холинэстеразы
крови служит тестом, отражающим функциональное состояние
печени. Определение активности истинной холинэстеразы в
нервной и других тканях организма может дать определенное
представление о функциональном состоянии холинэнергического
звена вегетативной и соматической нервной системы.
Фермент относительно стабилен. Сыворотка, разведенная
физиологическим раствором, и гемолизированные эритроциты
могут храниться около 4-х дней при температуре 2—6° С без
заметной потери активности энзима.
Существующие методы определения активности холинэсте¬
раз делятся на: 1) биологические — неразрушенным и подверг¬
шимся предварительной обработке исследуемой сывороткой
ацетилхолином воздействуют на мышцу животного. По разни¬
це в степени реакции мышцы судят о количестве ацетилхолина,
подвергшегося гидролизу холинэстеразой;
2) химические и биохимические, основанные на:
106

а) точном измерении количества уксусной кислоты, образо¬
вавшейся за определенный промежуток времени при разложе¬
нии холинэстера под влиянием холинэстеразы: для этого ис¬
пользуют манометрические, титрометрические, фотометрические,
электрометрические и кондуктометрические способы определе¬
ния выделившейся СНзСООН;
б) установлении количества разложившегося ацетилхолина
за определенный промежуток времени, что определяют с по¬
мощью различного рода колориметрических методик;
в) реакции со специфическими субстратами, при гидролизе
которых образуются вещества, определяемые колориметри¬
чески;
г) спектрофотометрическом исследовании в ультрафиолето¬
вой части спектра количества гидролизованного бензоилхолина.
Бензоилхолин имеет максимум поглощения в области 240 нм,
а продукты его расщепления ультрафиолетовые лучи не погло¬
щают. Следовательно, по степени уменьшения абсорбции света
можно судить об активности холинэстеразы.
В качестве унифицированных предлагаются: колориметри¬
ческий метод, основанный на измерении количества уксусной
кислоты, образующейся при ферментативном расщеплении аце¬
тилхолина, и экспресс-метод определения активности холинэс¬
теразы в сыворотке крови с применением индикаторной бумаги.
Определение активности сывороточной
холинэстеразы колориметрическим методом
Принцип. Под действием холинэстеразы происходит гидро¬
лиз ацетилхолинхлорида с образованием уксусной кислоты и
холина. Уксусная кислота сдвигает pH буферного раствора, что
устанавливается с помощью индикатора по изменению цвета
буферного раствора.
Реактивы: 1. 0,9 М раствор ацетилхолинхлорида. 1,67 г аце¬
тилхолинхлорида растворяют в 10 мл воды. Раствор хранят в
холодильнике. Он годен в течение 6—7 дней (из-за гигроско¬
пичности открытую ампулу с ацетилхолинхлоридом хранят в
эксикаторе).
2. Вероналовый буфер, pH 8,4. 1,5450 г натриевой соли ве¬
ронала (мединала) растворяют в 500 мл дистиллированной во¬
ды, добавляют 9 мл 0,1 н. соляной кислоты и 150 мл раствора
индикатора. Объем доводят дистиллированной водой до 1 л.
Буфер хранят в холодильнике в защищенном от света месте.
Он годен в течение месяца.
3. Индикатор — феноловый красный. Зона перемены окрас¬
ки индикатора (от желтой к красной) лежит в пределах pH
6,8—8,4. 0,1 г сухого индикатора растирают в ступке с 5,7 мл
0,05 н. раствора едкого натра и после растворения объем дово¬
дят дистиллированной водой до 25 мл. Из полученного 0,4%
107

Т АБ Л И Ц А 16
Разведения 0,1 н. раствора уксусной кислоты
для построения калибровочного графика
МкМ уксусной кислоты
№ про¬
бирок
0,1 н. раст¬
вор уксусной
кислоты, мл
Дистиллиро¬
ванная вода,
мл
в стандарт¬
ной пробе
в пересчете на 1 мл
сыворотки и на 1 ч
инкубации при
температуре + 37° С
1
2
8
4
80
2
4
6
8
160
3
6
4
12
240
4
8
2
16
320
5
9
1
18
360
раствора готовят 0,01% раствор разведением его дистиллирован¬
ной водой в 40 раз.
4. 0,7% водный раствор прозерина. 0,7 г прозерина раство¬
ряют в 100 мл дистиллированной воды.
5. 0,1 н. раствор уксусной кислоты. Готовят из фиксанала
или путем доведения дистиллированной водой 5,68 мл (6 г) ле¬
дяной уксусной кислоты до 1000 мл (в мерной колбе).
Ход определения. В пробирку вносят 5 мл вероналового бу¬
фера, 0,2 мл дистиллированной воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь
прогревают при температуре +37° С в течение 5 мин. Затем
добавляют 0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и инкубируют
в течение 30 мин при температуре +37° С. После инкубации
добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Зкстинкцию измеряют
на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 5 мм при зеленом свето¬
фильтре (длина волны 500—560 нм). Колориметрирование мож¬
но проводить в течение 1 ч.
Контроль ставят как опыт, но раствор прозерина добавляют
вместе с ацетилхолинхлоридом. Из экстинкции контроля вычи¬
тают экстинкцию опыта. Расчет ведут по калибровочному гра¬
фику. Активность холинэстеразы рассчитывают в мкМ уксусной
кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации.
Построение калибровочного графика. Из 0,1 н. раствора ук¬
сусной кислоты готовят разведения, как указано в таблице 16.
Из каждого полученного раствора отбирают по 0,2 мл, смеши¬
вают с 5 мл буфера, 0,1 мл сыворотки, прогревают 5 мин при
температуре +37° С, затем добавляют 0,2 мл прозерина, 0,2 мл
ацетилхолинхлорида, смесь инкубируют в течение 30 мин при
температуре +37° С и быстро охлаждают. Измерение экстинк¬
ции проводят при условиях колориметрирования опытных проб.
Контроль ставят как опыт, но вместо стандартных растворов
108

используют дистиллированную воду. Из экстинкции контроля
вычитают экстинкцию стандартной пробы. Полученную разницу
экстинкции откладывают на оси ординат, количество мкМ ук¬
сусной кислоты — на оси абсцисс.
Норма активности холинэстеразы в сыворотке крови — 160—
340 мкМ уксусной кислоты за 1 ч инкубации на 1 мл сыворотки
при температуре +37° С.
Определение активности холинэстеразы
в сыворотке крови экспресс-методом с применением
индикаторной бумаги
Холинэстеразная индикаторная бумага представляет собой
полоску хроматографической бумаги, размером 65X10 мм, с ли¬
нией перфорации, отделяющей конец индикаторной бумаги,
пропитанный ацетилхолином и индикатором, меняющим цвет
в зависимости от pH среды. После контакта исследуемой сыво¬
ротки с индикаторной бумагой под влиянием холинэстеразы
наступает гидролиз ацетилхолина и освобождается уксусная
кислота, которая изменяет pH и цвет индикатора. Реакция
должна продолжаться до тех пор, пока pH достигнет опреде¬
ленного уровня, а соответствующий этому цвет индикаторной
бумаги не сравняется с цветом эталона.
Мерой активности холинэстеразы является время (в мин),
на протяжении которого под влиянием исследуемой сыворотки
произойдет изменение цвета индикаторной бумаги вплоть до
совпадения с цветом эталона.
Ход определения. Микропипеткой наносят 0,05 мл сыворот¬
ки крови на поверхность чистого предметного стекла (оно дол¬
жно лежать на белой бумаге для создания фона).
На каплю сыворотки, находящуюся на предметном стекле,
помещают пропитанный конец индикаторной бумаги до грани¬
цы с линией перфорации. Затем быстро накладывают второе
предметное стекло, слегка прижимая его с целью равномерного
распределения сыворотки в полоске индикаторной бумаги.
Верхнее стекло не следует снимать, чтобы не вызвать высыха¬
ния бумаги. Рядом кладут эталон, представляющий собой по¬
лоску бумаги с желто-зеленым цветом.
Определение нужно проводить при комнатной температу¬
ре—18—22° С.
Индикаторная бумага в сухом виде имеет желтый цвет; по¬
сле контакта с сывороткой цвет ее становится темно-зеленым
или сине-зеленым, на протяжении реакции меняется в преде¬
лах различных оттенков зеленого цвета и в конце определения
сравнивается с желто-зеленым цветом бумаги-эталона.
Отсчет времени ведут с момента контакта индикаторной бу¬
маги с сывороткой до момента, когда цвет бумаги сравняется
с цветом эталона. Время от 7-й до 21-й мин соответствует нор-
109

ТАБЛИЦА 17
Изменение активности холинэстеразы
при различных заболеваниях (по данным разных авторов)
Заболевание
Активность холинэстеразы
Эпидемический гепатит
В зависимости от степени поврежде¬
ния паренхимы печени может сни¬
жаться в сильной степени
Застойные явления в пече¬
ни, холецистит, холангит,
желчнокаменная болезнь,
холецистопатия
Резко понижена (при застойных явле¬
ниях). Снижена в зависимости от
степени инфекционного или токсичес¬
кого поражения паренхимы печени
Механическая желтуха
Снижается только при поражении
паренхимы печени
Карцинома различной лока¬
лизации
Умеренно или резко снижена
Миелома, плазмацитома,
лимфогранулематоз
Большей частью понижена
Нефротический синдром
Повышена
Экссудативный энтерит
В отдельных случаях повышена
Рахит
Понижена
Травма черепа
»
Недостаточность околощи-
товидных желез
»
Коллагенозные заболевания
»
Бронхиальная астма
Повышена
Гипертония
»
Миома матки
»
Ревматизм
Понижена
мальной активности холинэстеразы; время меньше 6 мин — по¬
вышенной активности, и, наконец, время от 21 до 60 и больше
мин свидетельствует о резком снижении активности фермента.
Расхождение результатов в параллельных определениях —
не больше 1 мин.
Клинико-диагностическое значение. В связи с тем, что син¬
тез холинэстеразы (так же как и альбуминов) происходит в
печеночных клетках, гипохолинэстераземия, как правило, на¬
блюдается при заболеваниях печени. Степень снижения актив¬
ности фермента в сыворотке крови отражает тяжесть и распро¬
страненность поражения печеночных клеток. Весьма низкий
110

уровень холинэстеразной активности отмечается при распро¬
страненных злокачественных новообразованиях печени. Однако
и острые гепатиты, в том числе и болезнь Боткина, а также
хронические заболевания печени сопровождаются уменьшени¬
ем активности фермента. У больных с механической желтухой
снижение активности холинэстеразы свидетельствует о вовлече¬
нии в процесс паренхимы печени. Закономерным является
уменьшение активности сывороточной холинэстеразы при бел¬
ковой недостаточности, кахектических состояниях и других
вследствие нарушения протеосинтетической функции печени.
Снижение активности фермента отмечается при инфаркте мио¬
карда, отравлении фосфорорганическими соединениями, инсек¬
тицидами, миорелаксантами и как врожденное заболевание (эс-
сенциальная гипохолинэстераземия, дисхолинэстераземия).
Определение холинэстеразной активности крови имеет боль¬
шое значение в хирургической клинике при применении миоре-
лаксантов. Резкое снижение активности холинэстеразы в этих
случаях может привести к тяжелому холинэргическому шоку.
В некоторых случаях отмечается повышение активности хо¬
линэстеразы. К таким патологическим состояниям относятся
гипертоническая болезнь, миомы матки, язвенная болезнь, хо¬
рея Хаттингтона. При тяжелых нефритах содержание холинэс¬
теразы может повышаться в 3 раза. Ожирение также приводит
к повышению уровня холинэстеразы. Увеличение активности
сывороточной холинэстеразы может иметь место при нефрозах.
Причиной этого увеличения является повышение скорости про¬
цессов синтеза белка в печени, связанное со значительными
потерями белков сыворотки крови с мочой.
В литературе имеется большое количество исследований,
посвященных изучению уровня холинэстеразы при различных
заболеваниях (табл. 17).

Глава V
ИЗУЧЕНИЕ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА
Для диагностики целого ряда заболеваний (к числу кото¬
рых прежде всего следует отнести сахарный диабет, патологи¬
ческие состояния, связанные с недостаточностью функции пече¬
ни и почек, некоторые эндокринные заболевания, новообразо¬
вания мозга, поджелудочной железы и надпочечников, гипови¬
таминоз В1, а также ряд наследственных аферментозов) важно
иметь объективное представление о состоянии углеводного об¬
мена, кардинальным показателем которого служит содержание
сахара в крови. Под последним обычно подразумевают только
глюкозу. Ее концентрация в крови взрослого человека состав¬
ляет 60—100 мг%. Наряду с глюкозой, в крови содержится так¬
же фруктоза (0,5—5 мг%), гликоген (10—15 мг%) и связанные
с белками полисахариды. Однако к исследованию концентрации
других сахаров и гликогена прибегают значительно реже. Соот¬
ветствующую диагностическую ценность представляют также
определения молочной и пировиноградной кислот, активности
ряда ферментов углеводного обмена и др.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРА В КРОВИ
I. Редуктометрические методы, основанные на свойстве са¬
хара восстанавливать в щелочной среде соли тяжелых метал¬
лов.
К ним относятся: 1. Титрометрический метод Хагедорна и
Иенсена (1923), в котором используется свойство сахаров вос¬
станавливать при кипячении в щелочной среде железосинеро¬
дистый калий (красную кровяную соль) в железистосинероди¬
стый калий (желтую кровяную соль). По степени этого восста¬
новления титрометрически определяют концентрацию сахара в
крови. Однако ввиду того, что в крови присутствует ряд соеди¬
нений, не относящихся к углеводам, но обладающих восстано¬
112

вительными свойствами (мочевая кислота, глютатион, креати-
нин), полученный результат включает всю сумму восстанавли¬
вающих соединений, содержащихся в крови, и получаемое
редуктометрическими методами количество сахара в крови ока¬
зывается значительно выше истинного количества глюкозы.
В этом состоит недостаток всех редуктометрических методов.
Но они, тем не менее, сохраняют свое клиническое значение,
поскольку разность между «кажущимся» сахаром крови и «ис¬
тинной» глюкозой (так называемая остаточная редукция) у
одного и того же лица есть величина постоянная, не зависящая,
в частности, от введения инсулина или приема глюкозы. Однако
данные методы недостаточно специфичны и не точны, а также
трудоемки (вследствие использования большого количества ре¬
активов) .
2. Колориметрические методы, основанные на определении
степени окраски соединений, образующихся в результате раз¬
личных «цветных» реакций:
а) метод Сомоджи (1933), в котором используется способ¬
ность глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди в закись
меди, превращающей, в свою очередь, арсено-молибденовую
кислоту в молибденовую лазурь. Этот метод неспецифичен, тру¬
доемок и в настоящее время редко применяется в клинико-диаг¬
ностических лабораториях;
б) метод Фолина-Ву (1919), состоящий в определении
окраски молибдена синего, который образуется в результате
восстановления тартрата меди в окись меди. Последняя, взаи¬
модействуя с молибдотустенговой кислотой, дает цветную реак¬
цию. Метод относительно прост: отрицательной стороной его
является то, что между имеющейся в крови глюкозой и полу¬
чаемой окраской не существует строгой пропорциональности;
в) метод Крезелиус — Зейферт (Крезелиус, Зейферт, 1928,
1942) основан на восстановлении пикриновой кислоты в пикра-
миновую с последующим ее колориметрированием. Метод
быстр, но не очень точен. Ошибка может превышать 10—20%.
В связи с этим указанный метод имеет ориентировочное значе¬
ние. Им можно пользоваться для определения уровня сахара в
крови при профилактических осмотрах;
г) метод с антроновым реактивом по Моррису (1948) и по
Роэ (1955). Антроновый метод заключается в колориметриро-
вании цветного комплекса, образующегося в результате соеди¬
нения антрона с углеводами. Точные результаты могут быть
получены только при наличии чистейших реактивов и соблюде¬
нии постоянной температуры;
д) орто-толуидиновый метод Гультмана в модификации
Хиваринена — Никкила (1962), состоящий в определении ин¬
тенсивности окрашивания раствора, возникающего при взаимо¬
действии орто-толуидина с глюкозой. Этот метод специфичен и
точен, дает возможность определять только «истинную» глюко¬
зу и поэтому предлагается в качестве унифицированного.
113

II. Энзиматический (глюкозооксидазный) метод Нельсона
(1940), основанный на каталитическом действии фермента глю-
козооксидазы. Из методов этой группы наиболее широкое при¬
менение получил глюкозооксидазный метод определения
глюкозы в крови по И. С. Лукомской и В. К. Городецкому
(1961).
Согласно приказу об унификации, в качестве унифициро¬
ванных предлагаются три метода: орто-толуидиновый, глюкозо¬
оксидазный и метод Хагедорна — Йенсена. Последний может
использоваться лишь в лабораториях, не располагающих фото¬
электроколориметрами.
Определение сахара в крови и в моче
по цветной реакции с орто-толуидином
Принцип. Глюкоза при нагревании с орто-толуидином в
растворе уксусной кислоты дает зеленое окрашивание, интен¬
сивность которого (прямо пропорциональная концентрации са¬
хара в крови) определяется колориметрически.
Реактивы. 1. Орто-толуидин, очищенный путем перегонки
(с использованием электроплитки с асбестовой сеткой или пе¬
сочной бани). Реактив должен иметь слегка желтоватую окрас¬
ку. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла без дос¬
тупа воздуха.
Предпочтительнее орто-толуидин перегонять под вакуумом,
так как при температуре кипения (+200, 2° С) происходит его
разложение. При Р = 80 мм рт. ст. температура кипения орто-
толуидина равна 121° С, в связи с чем становится возможным
получить бесцветный реактив. Перегонке подлежит орто-толуи¬
дин желтого или коричневого цвета.
2. Ледяная уксусная кислота, х. ч.
3. 3% раствор трихлоруксусной кислоты.
4. Тиомочевина.
5. Орто-толуидиновый реактив.
0,15 г (1,5 г) тиомочевины растворяют в 94 мл (940 мл) ле¬
дяной уксусной кислоты и смешивают с 6 мл (60 мл) бесцвет¬
ного или слегка желтоватого орто-толуидина. Реактив стоек.
Хранят на холоду. Можно пользоваться готовым орто-толуи-
диновым реактивом Харьковского химфармзавода.
6. Стандартный раствор глюкозы, 500 мг%.
В мерной колбе на 100 мл растворяют 500 мг высушенной
до постоянного веса при t°+100°C глюкозы в 0,2% растворе
бензойной кислоты.
Раствор бензойной кислоты готовят следующим образом:
0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в неболь¬
шом количестве воды, нагревая на водяной бане до полного
растворения. После охлаждения до комнатной температуры
переносят в мерную колбу на 100 мл и доливают до метки дис¬
114

тиллированной водой. Бензойная кислота увеличивает стабиль¬
ность стандартного раствора глюкозы.
Можно также пользоваться водным раствором глюкозы, од¬
нако время хранения такого стандарта значительно меньше.
Экстинкция стандарта не должна давать резких колебаний, в
противном случае необходимо приготовить новый стандарт.
Хранить в холодильнике.
Ход определения. В центрифужную (или серологическую)
пробирку наливают 0,9 мл 3% трихлоруксусиой кислоты и вы¬
дувают на стенку ее 0,1 мл крови, взятой микропипеткой из
пальца. Взбалтывают, центрифугируют. К 0,5 мл центрифугата
добавляют 4,5 мл орто-толуидинового реактива. Пробирку со
рмесью помещают в кипящую водяную баню на 8 мин(!) и сра¬
зу охлаждают под водопроводной водой до комнатной темпе¬
ратуры. Колориметрируют на ФЭКе против контрольной пробы
или воды (так как экстинкция контрольной пробы на реактивы
практически равна нулю), в кювете шириной 10 мм при красном
(600—650 нм) или желтом (595 нм) светофильтре.
При постановке контрольной пробы (в чем нет необходимо¬
сти) к 4,5 мл орто-толуидинового реактива добавляют 0,5 мл
трихлоруксусиой кислоты. Далее лробу обрабатывают как
опытную.
М. Е. Халецкий и Ф. М. Колерно (1972), обобщив опыт
5-летнего использования этого метода в клинической практике
(всего проведено более 8000 исследований сахара в крови), ре¬
комендуют к 0,5 мл надосадочной жидкости добавлять 2 мл ор¬
то-толуидинового реактива, а фотометрирование проводить в
5 мм кювете при желтом светофильтре.
Примечали е: После кипячения изредка содержимое
пробирок бывает мутноватым. В таких случаях пробы необхо¬
димо вновь отцентрифугировать 10 мин, затем отобрать и про-
колориметрировать надосадочную жидкость.
Описанным способом может быть определен сахар и в спин¬
номозговой жидкости.
Стандартная проба. Стандартные пробы ставят как опыт¬
ные, но вместо сыворотки берут стандартный раствор глюкозы
с концентрацией 100 мг% (300 или 500 мг% в случае высокого
содержания сахара в крови).
Расчет ведут по формуле:
С • Е
Соп = —^р,—— = мг% глюкозы,
ЬСт
где Соп — концентрация глюкозы в опытной пробе;
Сст—концентрация глюкозы в стандартной пробе близ¬
кая к физиологической (100 мг%);
Еоп — оптическая плотность опытной пробы;
Ест — оптическая плотность раствора стандарта.
115

Этот вариант расчета дает наиболее точные результаты, по¬
скольку при нем устраняется разнообразное влияние различных
факторов, сказывающихся в процессе обработки опытных проб.
Однако при четко отработанной технике выполнения иссле¬
дования, строгом соблюдении постоянства условий на всех эта¬
пах определения (в наибольшей степени это касается стандар¬
тизации условий прогревания в ходе анализа) расчет можно
производить по калибровочным кривым или с использованием
коэффициента пересчета.
Построение калибровочной кривой. Из основного стандарт¬
ного раствора глюкозы (1000 мг%) берут 8, 10, 20, 30, 40 мл и
доводят объем 0,2% раствором бензойной кислоты до 100 мл.
Полученные таким путем рабочие стандартные растворы содер¬
жат соответственно 80, 100, 200, 300, 400 мг% глюкозы.
Стандартные пробы обрабатываются, как опытные. Измере¬
ния производят на ФЭКе против воды (или контроля на реак¬
тивы) в кювете шириной 10 мм при красном (или желтом)
светофильтре. Полученные значения используют для построе¬
ния калибровочной кривой.
Закон Бера сохраняется при концентрации глюкозы в сыво¬
ротке крови в пределах от 50 до 400 мг%. При содержании
глюкозы в концентрации более 400 мг% исходное количество
уменьшают в 2 раза и исследование повторяют.
Из полученной калибровочной кривой может быть рассчитан
фактор пересчета. Тогда для определения концентрации глюко¬
зы (в мг%) используют следующую формулу.
Глюкоза в мг% =экстинкции • константу (фактор пересчета).
Для расчета константы определяют экстинкцию различных
концентраций глюкозы (100, 200, 300, 400 мг%).
Константу вычисляют по формуле:
К=концентрация глюкозы/экстинкцию.
Полученные для каждой экстинкции константы складывают,
после этого находят их среднее значение.
При пользовании другой серией орто-толуидина необходимо
каждый раз готовить новую калибровочную кривую. Учитывая
это обстоятельство, а также большую сложность соблюдения
строгого постоянства условий, мы не рекомендуем рассчитывать
концентрацию глюкозы по калибровочной кривой.
В норме содержание глюкозы составляет: в цельной кро¬
ви— 60—100 мг%, плазме — 60—110 мг7о.
Определение глюкозы в моче. После проведения качествен¬
ной пробы на содержание глюкозы мочу разводят в 2—10 раз
в зависимости от характера реакции.
0,1 мл разведенной мочи смешивают с 4,5 мл орто-толуиди-
нового реактива и далее пробы обрабатывают, как опытные при
определении глюкозы в крови.
При расчете надо учитывать соответствующее разведение
мочи.
В норме моча содержит следы глюкозы..
116

Примечание. Наличие белка в моче не влияет на опре¬
деление глюкозы.
Определение глюкозы орто-толуидиновым методом в крови,
спинномозговой жидкости и моче, проводимое набором реакти¬
вов Био-ЛА-Тест (Чехословакия), подробно изложено в прила¬
гаемой к реактивам инструкции.
В целях экономии реактивов предпочтительно пользоваться
ультрамикрометодом.
Замечено, что при пользовании орто-толуидиновым методом
у диабетиков иногда получаются слишком низкие цифры саха¬
ра в крови (по сравнению с методом Хагедорна — Йенсена),
и что галактоза тоже дает окраску подобно глюкозе.
Этим методом не выявляются высокие цифры сахара в кро¬
ви, по-видимому из-за недостаточности содержания самого
реактива в пробе. Для того чтобы выйти из этого положения,
нами рекомендуется в пробу вводить меньшее количество ис¬
следуемой биологической жидкости. При пользовании, напри¬
мер, ультрамикрометодом объем центрифугата (0,25 мл) раз¬
водят вдвое физиологическим раствором и из полученного объе¬
ма раствора (0,5 мл) отбирают половинное его количество
(0,25 мл), которое и пропускают через всю методику. Полу¬
ченный результат умножают на 2.
Не следует пользоваться сывороткой крови: при стоянии со¬
держание сахара в ней резко падает.
Определение глюкозы в крови,
плазме (сыворотке) и спинномозговой жидкости
глюкозооксидазным методом
Принцип. Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксида-
зы окисляется кислородом воздуха с образованием в ходе ре¬
акции перекиси водорода. Перекись водорода окисляет о-толи-
дин с образованием окрашенного соединения, интенсивность
окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы.
Реактивы. 1. Кристаллический препарат глюкозооксидазы
(Р-Д — глюкоза: оксидоредуктаза, 1.1.3.4). Отечественная глю-
козооксидаза выпускается обычно с активностью, в основном
60—120 тыс. глюкозооксидазных ед на 1 г препарата. Хранят в
холодильнике в герметической упаковке.
2. Кристаллический препарат пероксидазы (перекись водо¬
рода: оксидоредуктаза, 1.2.1,7). Пероксидаза фирмы «Reanab
(ВНР) со степенью очистки 0,6 (R. Z.) пригодна для определе¬
ния глюкозы. Хранят в холодильнике в герметической упаковке.
3. 0,9% раствор хлористого натрия.
4. 0,25 М раствор уксуснокислого натрия. 17 г кристалличе¬
ского уксуснокислого натрия (CH3COONa • 3 Н20) растворяют в
мерной колбе на 500 мл в небольшом количестве воды и дово¬
дят дистиллированной водой до метки.
117

5. 0,25 М раствор уксусной кислоты. В мерную колбу на
500 мл наливают небольшое количество воды, добавляют
7,75 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем дистилли¬
рованной водой до метки.
6. 0,25 М ацетатный буфер, pH 4,8. 0,25 М раствор уксус¬
нокислого натрия смешивают с 0,25 М раствором уксусной кис¬
лоты в соотношении 6 : 4. Проверяют pH на приборе рН-метре.
Буферный раствор стабилен при хранении в холодильнике в те¬
чение месяца.
7. 5% раствор сернокислого цинка. 50 г кристаллического
сернокислого цинка (ZnS04-7H20) растворяют в 1 л дистилли¬
рованной воды. Раствор стабилен. Хранят при комнатной тем¬
пературе.
8. 0,3 н. раствор едкого натра.
Растворы сернокислого цинка и едкого натра берут для ре¬
акции в эквивалентных количествах, т. е. они должны нейтра¬
лизовать друг друга. Для этого раствор сернокислого цинка
титруют раствором едкого натра до нейтральной реакции по
фенолфталеину (слабо-розовая окраска). Если на титрование
пошло равное количество растворов, то они пригодны для ре¬
акции.
9. Орто-толидин (азоамин синий К; 3,3-диметилбензидин),
чда. Имеющийся в продаже о-толидин перекристаллизовывают
из горячего абсолютного этилового спирта добавлением дистил¬
лированной воды с последующим быстрым отсасыванием вы¬
павших кристаллов на воронке Бюхнера и высушиванием о-то-
лидина в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием.
10. Абсолютный этиловый спирт (полученный в лаборато¬
рии или коммерческий).
И. 1% раствор о-толидина в абсолютном этиловом спирте.
1 г о-толидина растворяют в небольшом количестве теплого
этилового спирта. После охлаждения доводят объем этиловым
спиртом до 100 мл. Раствор стабилен в течение нескольких ме¬
сяцев при хранении в холодильнике в плотно закрытой посуде
из темного стекла.
12. Энзимо-хромогенный реактив. В мерную колбу на 500 мл
помещают 300—400 мл 0,25 М ацетатного буфера, pH 4,8,
добавляют 10 мг глюкозооксидазы (навеска взята из расчета
активности глюкозооксидазы — 92 000 ед на 1 г препарата; при
применении препарата с другой активностью фермента соответ¬
ственно будет меняться величина навески), перемешивают до
полного растворения, добавляют 5 мг пероксидазы- Смесь пе¬
ремешивают до полного растворения. Добавляют 5 мл 1% раст¬
вора о-толидина и доводят объем до метки ацетатным буфером,
фильтруют. Реактив стабилен в течение 3—4 недель при хра¬
нений в холодильнике в плотно закрытой посуде из темного
стекла.
Свежеприготовленный реактив бесцветен или окрашен в сла¬
бо-зеленый цвет. Годен к употреблению через 2 ч после приго¬
118

товления, Если реактив имеет интенсивно зеленый цвет, то это
свидетельствует о загрязнении о-толидина. В этом случае о-то-
лидин необходимо перекристаллизовать.
13. 0,2% раствор бензойной кислоты. Раствор готовят при
нагревании.
14. Стандартный раствор Д-глюкозы в 0,2% Д-растворе бен¬
зойной кислоты.
Высушенную до постоянного веса при 37° С Д-глюкозу хра¬
нят в эксикаторе. 500 мг глюкозы растворяют в мерной колбе
на 100 мл в 0,2% растворе бензойной кислоты. Оставляют сто¬
ять на свету в течение 12—16 ч. 1 мл стандартного раствора
содержит 5 мг глюкозы.
Ход определения. Опытная проба. В центрифужную пробир¬
ку помещают 1,1 мл 0,9% раствора хлористого натрия, добав¬
ляют 0,1 мл крови (плазмы, сыворотки или спинномозговой
жидкости), несколько раз промывают пипетку, приливают
0,4 мл 5% раствора сернокислого цинка и 0,4 мл 0,3 М раство¬
ра едкого натра. Тщательно перемешивают и через 10 мин
центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 мин. Тотчас же
сливают надосадочную жидкость'.
К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл энзимо-хро-
могенного реактива, доведенного предварительно до комнатной
температуры. Осторожно перемешивают и на 20—23-й мин из¬
меряют экстинкцию на фотоэлектроколориметре в кювете с
толщиной слоя 10 мм при длине волны 625 нм (красный свето¬
фильтр) против контрольной пробы.
Контрольная проба. К 1 мл дистиллированной воды до¬
бавляют 3 мл энзимо-хромогенного реактива.
Серия не должна превышать 10—15 проб; при этом надо
строго соблюдать, чтобы время с момента добавления энзимо¬
хромогенного реактива до измерения было во всех пробах оди¬
наковым.
Расчет производят по формуле: С ол — Еоп /Ест ‘Сет,
где Соп — концентрация глюкозы в крови, мг%;
Сет — концентрация глюкозы в стандартном растворе, мг%
(100 мг7о);
Еоп — экстинкция опытной пробы;
Ест — экстинкция стандартной пробы.
Поскольку результаты определений зависят в значительной
степени от условий опыта, то стандартную пробу ставят парал¬
лельно с опытной и обрабатывают ее так же, как и опытную.
На 1 серию ставят 1 стандартную пробу. Линейная зависимость
между оптической плотностью и концентрацией глюкозы сохра¬
няется от 0 до 400 мг%.
Нормальные величины концентрации глюкозы в крови —
56—94 мг%, в плазме и сыворотке — 55—100 мг%, в спинно¬
мозговой жидкости — 50—70 мг%.
Примечания. 1. Цельную кровь необходимо исследо¬
вать немедленно после взятия.
119

2. В каждую последующую пробу серии энзимо-хромоген-
ный реактив добавляют с интервалом в 1 мин.
3. Для получения более точных результатов время максиму¬
ма окрашивания (20—23 мин) устанавливают в каждой серии
определений по нарастанию экстинкции первой опытной пробы.
4. За 3 дня до исследования нужно исключить прием аскор¬
биновой кислоты, антибиотиков тетрациклинового ряда.
Определение сахара в крови
по методу Хагедорна и Йенсена
Принцип. Метод основан на свойстве сахара восстанавли¬
вать железосинеродистый калий (красную кровяную соль) в
железистосинеродистый калий (желтую кровяную соль) при
кипячении в щелочной среде. Железистосинеродистый калий
осаждается в виде двойной цинк-калиевой соли, а избыток не¬
восстановленного железосинеродистого калия определяется
йодометрически. Свободный йод, выделившийся в количестве
эквивалентном избытку железосинеродистого калия, оттитро-
вывают гипосульфитом. По количеству израсходованного раст¬
вора гипосульфита вычисляют при помощи таблицы содержание
сахара в крови.
Реактивы. 1. 0,45% раствор кристаллического сернокислого
цинка (ZnS04 • 7 Н20). Раствор готовят из 45% основного раст¬
вора каждые 7—10 дней. Используют крупные кристаллы сер¬
нокислого цинка, чтобы состав его отвечал формуле. Выветрен¬
ный сульфат цинка для этой цели не пригоден.
2. 0,1 н. раствор едкого натра.
3. Безводный углекислый натрий (Na2C03). 10,6 г прокален¬
ной при +250° С в песчаной бане и охлажденной в эксикаторе
соли взвешивают на аптечных весах.
4. 0,005 н. содово-щелочной раствор красной кровяной соли
(реактив Хагедорна).
Учитывая, что молекулярный вес красной кровяной соли со¬
ставляет 329,2 у. е., для приготовления 1 л раствора следовало
бы взять 329,2:200=1,646 г. Однако практически берут не¬
сколько большую навеску, а именно 1,65 г, поскольку в воде
присутствуют редуцирующие вещества, вступающие в реакцию
с определенной частью железосинеродистого калия. Красную
кровяную соль отвешивают на аналитических весах. Навеску
железосинеродистого калия и 10,6 г безводного углекислого
натрия (реактив № 3) растворяют порознь, после чего объеди¬
няют в мерной колбе и доводят дистиллированной водой объ¬
ем до 1 л. Титр красной кровяной соли остается стабильным в
течение двух месяцев.
5. Хлорцинкйодистый раствор (тройная смесь). Отвешива¬
ют 250 г хлористого натрия и 50 г кристаллического сернокис¬
лого цинка. Обе навески помещают в цилиндр на 1 лр налива¬
120

ют 400—500 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают
и после полного растворения доливают водой до метки 1 л.
Раствор фильтруют. Он стоек. Перед употреблением к части
раствора прибавляют такое количество йодистого калия, чтобы
получить 2,5% раствор, т. е. 2,5 г йодистого калия растворяют
в двойной смеси в мерной колбе на 100 мл.
6. 3% раствор уксусной кислоты.
7. 1% раствор крахмала (растворимого) в насыщенном раст¬
воре хлористого натрия. Раствор стоек.
8. 0,1 н. раствор гипосульфита (тиосульфата) натрия. Гото¬
вят из фиксанала или путем навески. На аптечных весах отве¬
шивают 25 г гипосульфита (Na2S203 * 5Н20) и растворяют в 1 л
свежепрокипяченой и охлажденной до комнатной температуры
воды. Раствор хранят в склянке темного стекла с притертой
пробкой. Спустя две недели устанавливают титр гипосульфита
с помощью 0,1 н. раствора К2Сг207.
9. 0,005 н. раствор гипосульфита. Его готовят перед работой
из 0,1 н. раствора гипосульфита. Для этого 5 мл 0,1 н. раство¬
ра отмеривают пипеткой в мерную колбу на 100 мл и доводят
объем до метки дистиллированной водой. Если раствор 0,1 н.
гипосульфита имеет коэффициент поправки (К), то для приго¬
товления 0,005 н. раствора гипосульфита нужно брать не 5 мл,
а 5 : К. Титр приготовленного раствора можно проверять по
0,005 н. раствору КЮз или 0,005 н. раствору красной кровяной
соли.
Проверка титра 0,1 н. и 0,005 н. раствора гипосульфита.
Реактивы. 1. 0,1 н. раствор двухромовокислого калия —
К2Сг207. Для приготовления 1 л 0,1 н. раствора К2СГ2О7 (моле¬
кулярный вес 294,189 у. е.) на аналитических весах отвешивают
4,9031 г вещества, растворяют в дистиллированной воде в мер¬
ной колбе на 1 л. Раствор стоек. Для проверки титра гипосуль¬
фита поступают следующим образом. В колбу на 100 мл пипет¬
кой отмеривают 10 мл 0,1 н. раствора К2Сг207, 40 мл воды, 10 мл
20% раствора серной кислоты и 10 мл 10% раствора йодистого
калия. Хорошо перемешивают, колбу закрывают часовым стек¬
лом и оставляют стоять 3—5 мин до полного выделения йода.
Раствор в колбе титруют гипосульфитом до светло-желтого цве¬
та. Затем добавляют 4 капли 1% раствора крахмала и титруют
гипосульфитом вновь до исчезновения синего оттенка. Раствор
получается зеленовато-голубого цвета.
2. 0,005 н. раствор КЮз (йодата калия). На аналитических
весах отвешивают 0,1782 г КЮз, предварительно высушенного
и доведенного до постоянного веса. Навеску растворяют в колбе
на 1 л. Для проверки титра гипосульфита берут 2 мл 0,005 н.
раствора КЮз, прибавляют 2 мл тройной смеси, 2 мл 3% ук¬
сусной кислоты и полученную смесь титруют раствором гипо¬
сульфита до слабо-желтого цвета, затем добавляют 2 капли
1% раствора крахмала и титруют до обесцвечивания. Рассчи¬
тывают фактор поправки.
121

Ход определения. В 4 химические пробирки (2 — для опыта,
2 — для контроля на реактивы) наливают по 5 мл 0,45% раст¬
вора сернокислого цинка и по 1 мл 0,1 н. раствора едкого натра,
В микропипетку набирают 0,1 мл крови из пальца и выдувают
в пробирку со смесью . Микропипетку 3 раза промывают со¬
держимым пробирки. Для взятия крови во вторую пробирку
микропипетку промывают дистиллированной водой, остаток
которой выдувают. Затем все пробирки ставят в кипящую водя¬
ную баню на 3 мин, после этого содержимое пробирок встряхи¬
вают и, не охлаждая, фильтруют в стаканчик через воронку с
ватой (вата должна заполнять нижнюю треть воронки) или бу¬
мажным фильтром. Вату или бумажный фильтр предварительно
смачивают небольшим количеством воды, стеклянной палочкой
утрамбовывают вату, отжимают избыток воды палочкой или
ладонью. Воду сливают. Каждую пробирку промывают дважды
3 мл дистиллированной воды. Промывные воды сливают через
те же фильтры в стаканчики. Затем в каждый стаканчик при¬
ливают пипеткой по 2 мл 0,005 н. раствора красной кровяной
соли. Стаканчики ставят в кипящую водяную баню на 15 мин,
отсчитывая время с момента закипания воды после погружения
стаканчиков. Через 15 мин пробирки вынимают, охлаждают и
в каждый из стаканчиков приливают по 2 мл тройной смеси,
по 2 мл 3% уксусной кислоты и по 2—3 капли крахмала. Тит¬
руют 0,005 н. раствором гипосульфита из микробюретки до ис¬
чезновения синего окрашивания.
Расчет можно произвести исходя из того, что 1 мл 0,005 н.
раствора красной кровяной соли окисляет 0,177 мг глюкозы
или по таблице, предложенной Хагедорном и Иенсеном и со¬
ставленной ими для 0,005 н. раствора гипосульфита.
Количество сахара находят по таблице в зависимости от
объема 0,005 н. раствора гипосульфита, пошедшего на титро¬
вание. В первой графе таблицы 18 указаны целые и десятые
доли мл 0,005 н. раствора гипосульфита; продолжая соответ¬
ственно горизонтальную графу, находят количество мг сахара
крови, эквивалентное объему гипосульфита, пошедшего на ти¬
трование, с учетом долей мл.
Из количества сахара, найденного для крови, вычитают то
количество сахара, которое соответствует восстанавливающему
действию самих реактивов. Разность указывает на содержание
сахара в 0,1 мл крови. Для пересчета сахара на 100 мл крови
полученное количество умножают на 1000.
Пример. На титрование опыта пошло 1,45 мл 0,005 н.
Na2S203, на контроль— 1,98. Пользуясь таблицей, находим, что
1,45 мл раствора гипосульфита соответствует содержанию
0,097 мг сахара в 0,1 мл крови, а 1,98—0,003. Отсюда, концен¬
трация сахара в крови составляет 0,094- 1000=94 мг%.
Если раствор 0,005 н. гипосульфита имеет поправку, то ко¬
личество его, ушедшее на титрование, предварительно пересчи¬
тывают путем умножения на поправку.
122

Норма содержания сахара в крови — 80—120 мг%.
Определение сахара при концентрации его в крови выше
350 мг%. При большом содержании сахара в крови 2 мл крас¬
ной кровяной соли бывает недостаточно, поэтому при нагрева¬
нии фильтрата с K3[Fe(CN)6] через 15 мин или раньше проис¬
ходит обесцвечивание раствора. В этом случае приливают еще
2 мл 0,005 н. раствора железосинеродистого калия и снова ста¬
вят в баню на 15 мин. Далее продолжают работу так, как ука¬
зано выше.
Пример. Допустим, что на титрование 4 мл раствора крас¬
ной кровяной соли пошло 1,23 мл гипосульфита, а на конт¬
роль— 1,93 мл гипосульфита.
Из 4 мл железосинеродистого калия восстановилось 2 мл
красной кровяной соли, что соответствует по таблице 385 мг%
сахара. А на остальные 2 мл пошло 1,23 мл гипосульфита, эк¬
вивалентных содержанию сахара в концентрации 136 мг%
(см. табл. 17). Итого 385+136=521 мг%. Вычитаем данные кон¬
трольной пробы, получим: 521 — 12 = 509 мг%.
Примечания. 1. Приготовление фильтров для опреде¬
ления сахара. Вату кладут в чистую эмалированную кастрюлю
или большую фарфоровую чашку, заливают дистиллированной
водой и кипятят в течение 1 ч (вата все время должна быть
покрыта водой). После этого воду сливают, заливают вторично
дистиллированной водой и кипятят еще 1 ч. Затем чисто вымы¬
тыми руками отжимают ее и сушат в термостате или в сушиль¬
ном шкафу, прикрыв бумагой, чтобы не пылилась.
Хранят отмытую вату в плотно закрытой банке. Если нет
отмытой ваты, можно пользоваться обыкновенными фильтра¬
ми, предварительно хорошо промыв их горячей дистиллиро¬
ванной водой. Фильтры заливают горячей водой, которую после
охлаждения сливают, заливая новой порцией горячей воды. Так
повторяют до тех пор, пока вода не станет прозрачной. Затем
фильтры сушат, как вату. Фильтрами можно пользоваться,
если на контрольный опыт идут обычные (для контроля: см.
п. 3 примечания) цифры гипосульфита.
Тщательно отмытые беззольные фильтры не имеют никаких
преимуществ перед ватой, но фильтрование через них идет
обычно медленней.
2. При отсутствии предварительно заготовленной ваты мож¬
но использовать обычную необработанную вату, троекратно
промыв ее перед определением (в воронке) кипящей дистилли¬
рованной водой.
3. Титрование начинают всегда с контроля. На последний
должно уйти в соответствии со взятыми 2 мл реактива Хаге¬
дорна около 2 мл раствора гипосульфита натрия (не менее
1,85 мл), причем разница между параллельными определения¬
ми не должна превышать 0,02—0,03 мл. Затем оттитровывают
опытную пробу, на которую при нормальном содержании са¬
хара в крови идет обычно 1,5—1,4 мл раствора гипосульфита.
123

4. Очень часто бывает, что уже налаженная методика оп¬
ределения сахара вдруг начинает давать неверные цифры; при
этом или цифры сахара в контрольном растворе слишком ве¬
лики (на его титрование идет 1,6—1,7 мл гипосульфита), или
цифры сахара в опытном растворе слишком малы (на титро¬
вание опыта идет 1,6—1,7 мл гипосульфита), или слишком
большая разница между параллельными пробами. Последнее
явление зависит чаще всего от недостаточной тщательности в
мытье посуды. В этих случаях требуется заново перемыть все
пробирки, стаканчики, воронки и особенно тщательно отмыть
их от хромовой смеси, если ее употребляли для мытья посуды.
Хромовая смесь является окислителем (подобно красной кро¬
вяной соли) и присутствие ее хотя бы в виде следов искажает
результаты анализа.
Расхождение в параллельных пробах может зависеть так¬
же от недостаточно тщательного взятия крови микропипеткой
в смысле доведения до метки и пр. Наконец, может быть при¬
бавлено слишком мало сухого К1 (как указано выше, его дол¬
жен быть избыток).
При получении низких цифр сахара крови ошибку следует
искать в плохом качестве ZnS04, NaOH и в разложившемся K.I.
Иногда при слишком долгом стоянии портится реактив Хаге-
дорна. Чтобы его проверить, следует раньше выверить гипосуль¬
фит. По выверенному гипосульфиту легко проверить реактив
Хагедорна. Для этого берут 2 мл реактива Хагедорна и произ¬
водят все манипуляции, как при определении контроля после
кипячения его в течение 15 мин, т. е. прибавляют смесь ZnS04,
NaCl и К1, 3% уксусную кислоту, каплю 1% раствора крахмала'
в тех же количествах, как описано выше, и титруют 0,005 н.
гипосульфитом.
5. Взятую для анализа на сахар кровь следует, возможно,
скорее прокипятить, так как при стоянии сахар разлагается.
6. Прокипяченная и профильтрованная через воронку кровь
может быть оставлена до следующего дня.
7. После прибавления реактива Хагедорна опыт следует
доводить до конца.
Клинико-диагностическое значение. В цельной крови здоро¬
вого взрослого человека концентрация сахара составляет 80—
120 мг% (по Хагедорну — Иенсену). Основным его компонентом
является глюкоза, содержащаяся в крови в концентрации 50—
95 мг%. Наряду с этим в крови в незначительном количестве
имеются и другие сахара — фруктоза, галактоза, пентозы.
На содержание сахара в крови оказывают влияние самые
разнообразные физиологические и патологические процессы.
Увеличение концентрации глюкозы в крови — гипергликемия —
наблюдается обычно при следующих состояниях:
1) сахарном диабете, остром панкреатите, панкреатических
циррозах (эти заболевания дают гипергликемию, связанную с
недостатком в организме инсулина);
124

ТАБЛИЦА 18
Данные для расчета содержания сахара в крови
Гипосульфит (мл)
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,0
0,385
0,382
0,379
0,376
0,373
0,370
0,367
0,364
0,361
0,358
0,1
0,355
0,352
0,350
0,348
0,345
0,343
0,341
0,338
0,336
0,333
0,2
0,331
0,329
0,327
0,325
0,323
0,321
0,318
0,316
0,314
0,312
0,3
0,310
0,308
0,306
0,304
0,302
0,300
0,298
0,296
0,294
0,292
0,4
0,290
0,288
0,286
0,284
0,282
0,280
0,278
0,276
0,274
0,272
0,5
0,270
0,268
0,266
0,264
0,262
0,260
0,259
0,257
0,255
0,253
0,6
0,251
0,249
0,247
0,245
0,243
0,241
0,240
0,238
0,236
0,234
0,7
0,232
0,230
0,228
0,226
0,224
0,222
0,221
0,219
0,217
0,215
0,8
0,213
0,211
0,209
0,208
0,206
0,204
0,202
0,200
0,199
0,197
0,9
0,195
0,193
0,191
0,190
0,188
0,186
0,184
0,182
0,181
0,179
1,0
0,177
0,175
0,173
0,172
0,170
0,168
0,166
0,164
0,163
0,161
1,1
0,159
0,157
0,155
0,154
0,152
0,150
0,148
0,146
0,145
0,143
1,2
0,141
0,139
0,138
0,136
0,134
0,132
0,131
0,129
0,127
0,125
1,3
0,124
0,122
0,120
0,119
0,117
0,115
0,113
0,111
0,110
0,108
1,4
0,106
0,104
0,102
0,101
0,099
0,097
0,095
0,093
0,092
0,090
1,5
0,088
0,086
0,084
0,083
0,081
0,079
0,077
0,075
0,074
0,072
1,6
0,070
0,068
0,066
0,065
0,063
0,061
0,059
0,057
0,056
0,054
1,7
0,052
0,050
0,048
0,047
0,045
0,043
0,041
0,039
0,038
0,036
1,8
0,034
0,032
0,031
0,029
0,027
0,025
0,024
0,022
0,020
0,019
1,9
0,017
0,015
0,014
0,012
0,010
0,008
0,007
0,005
0,003
0,002

2) токсическом, травматическом, механическом раздраже¬
нии центральной нервной системы. Травмы, опухоли мозга, а
также эпилепсия, менингит, отравления окисью углерода, си¬
нильной кислотой, эфиром, ртутью дают так называемую цен¬
тральную (нервную) гипергликемию;
3) при повышении гормональной деятельности щитовидной
железы, коры и мозгового слоя надпочечников, гипофиза;
4) после обильного приема с пищей углеводов — алиментар¬
ная гипергликемия;
5) при сильных эмоциях и психическом возбуждении.
Уменьшение уровня глюкозы в крови — гипогликемия —
встречается при:
1) передозировке инсулина (при лечении сахарного диабе¬
та) ;
2) заболеваниях почек, когда нарушается процесс реаб¬
сорбции в канальцах;
3) плохом всасывании углеводов вследствие заболевания
тонкого кишечника;
4) иногда при сердечной недостаточности;
5) недостаточной гормональной деятельности перечислен¬
ных выше желез внутренней секреции;
6) при спленомегалии (у детей);
7) отравлении фосфором, бензолом, хлороформом;
8) после больших потерь крови;
9) при гиперфункции островков Лангерганса поджелудоч¬
ной железы (аденомы, гиперплазии, гипертрофии);
10) при несбалансированной диете (неправильном соотно¬
шении пищевых веществ), от недоедания и голода — алимен¬
тарная гипогликемия.
Среди заболеваний, связанных с нарушением обмена угле¬
водов, следует отметить наследственную непереносимость фрук¬
тозы и эссенциальную фруктоземию.
Наследственная непереносимость фруктозы — довольно ча¬
стое и весьма тяжелое заболевание, которое обнаруживается
при переводе детей на смешанное вскармливание и проявляет¬
ся судорогами, рвотой, потерей сознания, тяжелыми пораже¬
ниями печени и почек, большей частью со смертельным исхо¬
дом.
Непереносимость фруктозы связана с отсутствием в печени,
почках и слизистой кишечника фруктозо-1-фосфат-альдолазы и
значительным снижением активности фруктозо-1,6-дифосфат-
альдолазы.
Эссенциальная фруктоземия — доброкачественная врожден¬
ная аномалия обмена фруктозы, связанная с недостаточной ак¬
тивностью фруктокиназы.
Содержание фруктозы в крови повышается при заболевани¬
ях печени, при ее наследственной недостаточности.
Алиментарная фруктоземия часто наступает (обычно у де¬
тей) после обильного приема фруктозы с пищей.
126

ИЗУЧЕНИЕ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА
МЕТОДОМ НАГРУЗОК
Исследование углеводного обмена в клинике обычно начи¬
нают с анализа мочи на присутствие сахара и кетоновых тел,
поскольку появление последних тесно связано с нарушениями
углеводного обмена; кроме того, производят определение содер¬
жания сахара в крови.
Установлено, что у одного и того же человека в разные дни
колебания концентрации сахара натощак находятся в преде¬
лах ±10-f-15 мг%. Более резкие отклонения обычно наблюда¬
ются при чрезмерно лабильном состоянии вегетативной нерв¬
ной системы и должны рассматриваться как проявление нару¬
шения ее тонуса.
Изменения состояния вегетативной нервной системы могут
наблюдаться и у здоровых людей: особенно у юношей и детей,
что свидетельствует о неустойчивости и повышенной возбуди¬
мости в этом возрасте их нервной системы. Данное обстоятель¬
ство необходимо учитывать при выборе контрольной группы
для сравнения нормального и патологического состояния угле¬
водного обмена при том или другом заболевании.
Если в результате исследований обнаружено повышение
концентрации сахара в крови и наличие сахара и кетоновых
тел в моче, то этого оказывается достаточно для подтвержде¬
ния диагноза диабета. Заболевания других внутренних орга¬
нов не дают всей триады: гипергликемии, глюкозурии и нали¬
чия кетоновых тел, так как присутствие последних свидетель¬
ствует о грубых нарушениях не только углеводного, но и
жирового обмена, что имеет место при заболевании поджелу¬
дочной железы.
В случае же, если результаты анализов мочи и крови ока¬
зываются нормальными, то более углубленное исследование
углеводного обмена производится при помощи так называемой
сахарной нагрузки.
Проба с сахарной нагрузкой (однократная) заключается в
следующем. Утром натощак у больного берут кровь из пальца
для определения содержания сахара, после чего ему дают вы¬
пить заранее приготовленный раствор 100 или 50 г глюкозы
(обычно ограничиваются 50 г) в 200 мл теплой кипяченой воды
или жидкого чая (исходя из расчета 1 г глюкозы на 1 кг веса
тела). Глюкоза может быть заменена сахаром. В этом случае
расчет строят из соотношения: 3 или 1,5 г сахара на 1 кг веса.
Время, в течение которого обследуемый больной пьет рас¬
твор, не должно превышать 5 мин, затем через 0,5 ч (иногда
через 15 мин) у него берут из пальца кровь для определения
сахара. Эту процедуру повторяют вновь через полчаса, затем
через 1 ч и еще через 1 ч после взятия крови.
Что касается длительности проведения пробы, то ее произ¬
водят в течение 3 ч после приема сахара в том случае, если
больному было дано 100 г глюкозы, и в течение 2,5 ч — если
127

ТАБЛИЦА 19
Данные для проведения однократной сахарной нагрузки
№ п.п укола в палец
1
2
3
№ п.п забора крови
1 2
3 4
5 6
Промежутки времени между забо¬
рами крови, в ч
0+0,5+
0,5+0,5+
0,5+0,5
Общее время исследования, ч.
мин.
0 0,5
0 30
1,0 1,5
60 90
2,0 2,5
120 150
№ п.п исследования
per os
50 г
ГЛКЖОЕЫ
1 2
3 4
5 6
П римечание, 4-й забор крови проводить не обязательно.
было дано 50 г. В последнем случае между исследованиями
крови на сахар надо делать получасовые промежутки на про¬
тяжении выполнения всей пробы.
Учитывая то обстоятельство, что из одного и того же укола
иглой (пером) в палец можно производить забор крови дваж¬
ды (в промежутки через полчаса), нами рекомендуется оправ¬
давшая себя на практике следующая схема проведения одно¬
кратной сахарной нагрузки (табл. 19).
У детей сахарную нагрузку проводят так же, как и у взрос¬
лых, изменяя лишь только дозы вводимой глюкозы. Так, детям
в возрасте от 1,5 до 3 лет следует давать глюкозу, исходя из
соотношения 2 г/кг; от 3 до 12 лет— 1,75 г/кг; после 12 лет —
1,25 г/кг. Детям достаточно давать ; > 25 г глюкозы.
На основании полученных данных строят кривую, отклады¬
вая на вертикальной оси концентрацию сахара в мг%, а на
горизонтальной — время, в мин или ч.
Гликемические кривые у детей имеют тот же характер, что
и у взрослых, с тем лишь отличием, что повышение концентра¬
ции сахара в крови у детей достигает меньших величин.
Анализ гликемических кривых. У здорового человека уже
через 15 мин после приема глюкозы наблюдается увеличение
концентрации сахара в крови, которое достигает максимума к
первому часу (между 30-й и 60-й мин). После этого начинается
снижение содержания сахара, которое ко второму часу наблю¬
дения (120 мин) может у здорового человека снизиться до ис¬
ходной цифры, т. е. до уровня глюкозы, отмечавшегося нато¬
щак, или не достичь его, оставаясь повышенным, или же упасть
ниже исходной цифры. К 3 ч наблюдения при всех трех описан¬
ных вариантах уровень сахара в крови достигает исходной
цифры.
128

Рис. 2. Гликемические кривые здоровых лю¬
дей:
/ — однократная нагрузка глюкозой; 2 — двукрат¬
ная нагрузка глюкозой (положительный эффект
Штауба —• Трауготта); 3—проба с адреналином;
4 — проба с инсулином.
В конце пробы у больного собирают мочу для исследования
на наличие сахара. Установлено, что сахар в моче у здоровых
людей при этой нагрузке приблизительно в половине случаев
не появляется вовсе, либо отмечается только в момент наи¬
большего повышения его в крови, т. е. между 30—60 мин. Если
в моче обнаруживается сахар, то в большинстве случаев эго
свидетельствует о той или иной форме эндокринной глюкозу-
рии. Из неэндокринных заболеваний только тяжелое пораже¬
ние печени может привести к появлению глюкозы в моче при
проведении данной пробы и то в небольших количествах. Сум¬
мируя старые и современные данные по изучению гликемиче-
ской кривой, можно расчленить ее на ряд отрезков, что позво¬
ляет провести дифференцированную их оценку (рис. 2).
Патофизиологические механизмы,
обусловливающие динамику изменения концентрации
сахара крови после углеводной нагрузки
1. Первый подъем уровня сахара после введения углеводов
отражает силу рефлекторного раздражения симпатических нер¬
вов, возникающего при попадании глюкозы в пищеварительный
5 Зак. 2615
129

канал. При этом в зависимости от тонуса симпатической нерв¬
ной системы содержание сахара может повышаться (или пони¬
жаться) в известных пределах даже у здорового человека.
2. Дальнейшее повышение концентрации сахара, как пра¬
вило, зависит от быстроты всасывания углеводов (определяе¬
мого, в частности, состоянием кишечной стенки), функции пече¬
ни и всех остальных периферических органов. У здорового че¬
ловека содержание сахара в крови через час после приема
нагрузки на 50—75% превышает уровень сахара крови натощак.
3. Нисходящее колено гликемической кривой отражает про¬
дукцию инсулина и зависит от состояния парасимпатической
нервной системы, функции поджелудочной железы, печени и
других органов. Этот отрезок гликемической кривой носит на¬
звание гипогликемической фазы.
4. Последняя точка на гликемической кривой, определяемая
через 2,5—3 ч, зависит от равновесия всех участвующих систем.
В норме она должна совпадать с цифрой содержания сахара
в крови натощак.
Для трактовки гликемических кривых (складывающейся из
оценки высоты подъема уровня сахара в крови и характера его
падения) было предложено вычислять различные коэффициен¬
ты. Один из них, называемый гликемическим коэффициентом
Бодуэна, представляет собой отношение цифры наибольшего
повышения содержания сахара крови к исходной, т. е. к цифре
сахара натощак: К = В/А,
где В — максимальный уровень сахара;
А — исходный уровень сахара;
К — частное от деления максимальной цифры сахара после
нагрузки на исходную величину ее натощак.
В норме коэффициент Бодуэна равен 1,3—1,4—1,5 (по
Франку — 1,6).
Пример: Первоначальное содержание сахара в крови боль¬
ного составляет 100 мг%, после нагрузки максимальное содер¬
жание оказалось равным 150 мг%. Отсюда гликемический ко¬
эффициент (150 : 100) = 1,5.
А. А. Покровский и сотрудники приводят иной способ рас¬
чета коэффициента Бодуэна, предлагая выражать его в про¬
центах:
(В - А) • 100
^Бодуэна д '
где В — максимальный уровень сахара;
А — исходный уровень.
У здорового человека коэффициент Бодуэна равен прибли¬
зительно 50% (максимальное отклонение до 75%). Величины
выше 80%, как правило, свидетельствуют о патологии углевод¬
ного обмена.
Следует вычислять и постгликемический коэффициент Ра-
фальского. Он представляет собой частное от деления цифры
130

содержания сахара через 2 ч после нагрузки на исходную циф¬
ру (величину содержания сахара натощак).
КРафа льского = С/А,
где С — самый низкий уровень сахара (определяемый через
2 ч);
А — исходный уровень сахара.
У здорового человека коэффициент Рафальского ниже 1
или равен 1; считают, что в норме этот постгликемический ко¬
эффициент составляет 0,9—1,04.
Пример. Первоначальное (исходное) содержание сахара в
крови больного составляет 100 мг%, через 2 ч после нагрузки —
104 мг%.
Постгликемический коэффициент равен 104/100=1,04.
Увеличение коэффициента говорит о нарушении обмена
углеводов.
Однако следует помнить, что не столько эти коэффициенты,
сколько сам тип гликемической кривой в целом определяет нор¬
мальное или патологическое состояние углеводного обмена.
При проведении сахарной нагрузки следует иметь в виду те
факторы, которые могут оказывать влияние на характер гли¬
кемической кривой.
Прежде всего возникает вопрос, имеет ли значение количе¬
ство вводимой глюкозы. Данные большинства авторов показы¬
вают, что величина сахарной нагрузки существенно не влияет
на характер гликемической кривой. Однако есть против этого
и возражения, указывающие на определенную зависимость вы¬
соты подъема сахара крови от количества вводимых углево¬
дов. Опыт работы В. Н. Топарской показал, что хотя количе¬
ство глюкозы и влияет на высоту подъема сахара в крови, но
характер, или, как говорят, тип кривой, при этом сохраняется
прежним. Все же при динамических исследованиях желательно
проводить сахарную нагрузку с одним и тем же количеством
глюкозы, чтобы можно было получать более сравнимые резуль¬
таты.
По данным некоторых авторов, при построении сахарной
кривой нет никакой необходимости исследовать кровь больного
через каждые полчаса, так как характер кривой от введения
этих дополнительных цифр в основном не изменяется, посколь¬
ку он определяется теми процессами, которые выявляют себя
в названных 4-х пунктах гликемической кривой.
Не представляет сомнения известное влияние характера
предшествующего питания на тип сахарной кривой, вернее, на
высоту ее подъема. Показано, что при преимущественно угле¬
водной диете наблюдаются гликемические кривые, наиболее
низкие в смысле максимального подъема (определяемого че¬
рез 1 ч), при преимущественно жировой диете — наиболее вы¬
сокие, при белковом же питании занимают среднее положе¬
ние между первыми двумя. Имеет значение и длительность
предшествующего голодания.
5*
131

Рис. 3. Гликемические кривые при некоторых видах па¬
тологии при однократной нагрузке глюкозой:
/ — норма; 2 — при диабете; 3—при заболеваниях печени; 4 —
при гипертиреозе и вегетоневрозе; 5 — при микседеме и кишеч¬
ном инфантилизме; 6 — при гиперинсулинизме.
Клиническое значение. На рис. 3 представлены гликемиче¬
ские кривые при патологии. Из их рассмотрения видно, что
при сахарном диабете уровень сахара крови натощак бывает
повышенным, нарастание гликемической кривой происходит
медленнее, достигая через 60—150 мин значительной величины
(более чем на 80% выше исходного уровня сахара крови). Сни¬
жение же кривой затягивается, гипогликемическая фаза спада
за время проведения пробы обычно не выявляется (отсутству¬
ет). Нагрузка глюкозой сопровождается в большинстве случа¬
ев появлением сахара в моче. Чем тяжелее диабет, тем позже
достигает максимум гликемии и тем он выше. Понижение кри¬
вой происходит очень медленно, чаще оно растягивается на
3—4 ч. Все порции мочи, как правило, содержат сахар. Подоб¬
ный характер кривой можно объяснить нарушением выделения
инсулина, что влечет за собой замедление отложения гликоге¬
на и торможение окисления глюкозы.
Повреждение печени характеризуется быстро нарастающей
гликемической кривой в результате ослабления ассимиляцион¬
ной способности печени. Однако максимальный подъем не до¬
стигает таких величин, как при диабете.
132

Заболевания щитовидной железы, связанные с ее гипер¬
функцией, характеризуются гликемическими кривыми с более
быстрым, чем в норме, нарастанием концентрации сахара, что,
возможно, связано с более интенсивным обменом веществ и
возбуждением симпатического отдела вегетативной нервной си¬
стемы.
При гиперфункции передней доли гипофиза (болезнь Ицен-
ко— Кушинга, акромегалия) и коры надпочечников, феохромо-
цитоме, поражениях центральной нервной системы, вегетатив¬
ных расстройствах, при инфекционных заболеваниях (ревма¬
тизм, дифтерия, тифы, дизентерия, сепсис, бронхопневмонии),
а также при анемиях и токсикозах (токсикозы беременных,
+иреотоксикоз и др.) наблюдаются гликемические кривые со
значительным подъемом и замедленным возвращением к нор¬
ме. Возможно, это обусловлено нарушением гликогенообразо-
вйтельной функции печени. Подобное явление можно наблю¬
дать и при панкреатитах. Гипергликемия может сопровождать¬
ся глюкозурией, особенно , в тех случаях, когда содержание
сахара в крови превышает почечный порог (при упомянутых вы¬
ше патологических состояниях почечный порог для глюкозы
может и снижаться).
При аденоме Лангергансовых островков, гипотиреозе, бо¬
лезни Аддисона характерными являются низкий исходный уро¬
вень, низкая вершина кривой и высокий постгликемический ко¬
эффициент. Особенно выраженные кривые такого типа обычно
наблюдаются при гиперинсулинизме, энцефалите и некоторых
других состояниях. Глюкоза при этом может появляться в
моче в результате ренальной глюкозурии.
Применение двукратной нагрузки глюкозой, нагрузка ад¬
реналином, инсулином, комбинированные нагрузки инсулином,
глюкагоном, кортизоном, АКТГ и глюкозой позволяют обнару¬
жить скрытые формы сахарного диабета, нарушение функции
печени и эндокринных желез. Пищевые нагрузки крахмалом
дают такую же картину, как и нагрузки глюкозой, но несколь¬
ко более растянутую во времени.
Двукратную нагрузку глюкозой (двойная сахарная нагруз¬
ка) применяют в основном для диагностики скрыто протекаю¬
щего сахарного диабета.
Проба с двойной нагрузкой
по Штауб—Трауготту
Принцип. Если здоровому человеку в период падения уров¬
ня сахара крови, т. е. в момент, когда продукция собственного
инсулина особенно высока, повторно ввести такое же количе¬
ство сахара, то новое повышение его концентрации в крови ока¬
жется значительно меньше первого подъема или будет вообще
отсутствовать. Это так называемый положительный эффект
133

Штауб — Трауготта. Отсутст¬
вие повышения зависит от
интенсивности продукции ин¬
сулина поджелудочной же¬
лезой. У больных сахарным
диабетом, у которых остров¬
ки Лангерганса поджелудоч¬
ной железы выделяют лишь
незначительное количество
инсулина, после второго вве¬
дения сахара наблюдается
столь же выраженное или
даже еще более сильное по¬
вышение его концентрации в
крови, чем после первой на¬
грузки углеводами. Это —
отрицательный эффект Шта¬
уб— Трауготта (рис. 4).
Методика. В 8 ч. утра, на¬
тощак, определяют содержа¬
ние сахара в крови. Сразу же
после определения больному
дают 50 г (страдающим са¬
харным диабетом — 20—
30 г) глюкозы, растворенной
в 200 мл теплой воды.
Определение сахара в крови проводят через 0,5; 1; 1,5; 2;
3, а иногда 4—5 ч. Через 1,5 ч после первого приема сахара,
т. е. в 9 ч 30 мин, больной получает еще 50 г (или 20—30 г)
глюкозы в 200 мл теплой воды или чая.
В некоторых случаях ко времени взятия крови у больного
берут мочу для исследования на содержание в ней сахара.
Во время проведения пробы больной не должен принимать
пищи.
0 0,5 1,01,5 2,0
5,0 Шд
Рис. 4. Проба Штауб — Трауготта
у здорового человека (А) и у боль¬
ного сахарным диабетом (Б).
Проба Экстона — Розе
У испытуемого натощак определяют сахар крови и дают
принять 50 г глюкозы, растворенной в 350 мл воды. Через
30 мин вторично определяют уровень сахара и вновь дают вы¬
пить 50 г глюкозы в растворе. Дальнейший ход определения
ничем не отличается от проведения однократной сахарной на¬
грузки.
Клиническое значение. Эти пробы имеют особую ценность
для выявления скрытых форм сахарного диабета, диагностика
которых облегчается установлением отрицательного эффекта
Штауб — Трауготта, т. е. обнаружением увеличения содержа¬
ния сахара в крови после второго приема глюкозы. Отрицатель¬
134

ный эффект Штауб—Трауготта может наблюдаться и при
некоторых заболеваниях центральной нервной системы, печени,
а также при гипертиреозах, острых инфекциях, тучности.
Для диагностики нарушения обмена веществ при диабете
важно наличие следующих критериев: 1) чрезвычайно высокая
вершина сахарной кривой и 2) оставшийся повышенным уро¬
вень сахара крови через 3 ч после приема первой порции глю¬
козы, т. е. отсутствие возврата уровня сахара крови к величи¬
нам, наблюдаемым натощак.
При проведении сахарных нагрузок следует помнить, что
количество принятого внутрь сахара в довольно широких пре¬
делах (от 0,5 до 2 г на 1 кг веса тела) не играет решающей ро¬
ли в отношении высоты и длительности гипергликемии. Однако
на кривые всасывания могут оказывать влияние:
а) замедленное опорожнение желудка, анацидность и ха¬
рактер предшествующего питания. Целесообразно в течение
3 дней до проведения нагрузки назначать пищу, содержащую
достаточное количество углеводов, но не слишком богатую бел¬
ками и жирами;
б) никотин, кофеин, физические и психические нагрузки;
в) состояние погоды.

Глава VI,
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ
И ИХ КОМПОНЕНТОВ В КРОВИ
Углевод содержащие белки являются обширным классом
соединений, единая классификация которых до сих пор не
установилась. А. Ц. Анасашвили (1968) подразделяет углевод¬
содержащие белки на две большие группы: мукопротеиды и
гликопротеиды.
Мукопротеиды представляют собой белки, простетическими
группами которых являются аминополисахариды (гликозами-
ногликаны), состоящие из аминосахаров, гексуроновых и сер¬
ной кислот. Эти углеводсодержащие белки имеют сильно вы¬
раженные кислотные свойства благодаря наличию большого
числа карбоксильных групп и остатков серной кислоты. К ним
принадлежат: гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты,
кератосульфат, гепарин, гепаритинсульфат и сульфогиалуро-
новая кислота. Связь между белками и аминополисахаридами
в соединениях данной группы является непрочной, чем, веро¬
ятно, и обусловлено их участие в регуляции тканевой проницае¬
мости.
Гликопротеиды являются белками, прочно связанными с
аминополисахаридами, не содержащих уроновых кислот и
сульфатов. В состав их простетической группы входят гексозы,
гексозамины, фукозы и сиаловые кислоты. Наличие последних
придает гликопротеидам слабо выраженные кислотные свой¬
ства. Наиболее известными представителями веществ этой
группы являются: различные ферменты (холинэстераза, церу-
лоплазмин), гормоны (гонадотропин, эритропоэтин), группо¬
специфические субстанции крови, протромбин, фибриноген,
Y-глобулины, уромукопротеиды, плевромукопротеиды, гаптогло-
бин, трансферрин и др.
В настоящее время считается вполне обоснованным выделе¬
ние из этой группы веществ подгруппы серогликоидов (серому-
коидов) для обозначения гликопротеидных веществ, раствори¬
мых в хлорной кислоте.
136

В клинической практике наиболее распространено определе¬
ние углеводсодержащих белков сыворотки крови по одному из
входящих в их состав компонентов: гексозам, гексозаминам,
фукозе, сиаловым кислотам или же по способности давать ре¬
акцию «йодная кислота — реактив Шиффа».
Получили известность также методы определения углевод¬
но-белковых комплексов по их белковой части (турбидиметри-
ческие, по тирозину белка и др.).
Все перечисленные группы методов дают косвенное пред¬
ставление о содержании гликопротеидов в сыворотке крови. Из
них наиболее приемлемыми для клинико-диагностических лабо¬
раторий следует считать определение гексоз, связанных с бел¬
ками, методами с использованием триптофана и орцина. Эти
способы хорошо зарекомендовали себя на практике. Исследо¬
вание содержания гексозамина (глюкозамина) связано с при¬
менением дефицитных реактивов (ацетилацетона, стандарта
гексозамина), к тому же для определения необходимо большое
количество сыворотки (5 мл). Метод определения фукозы
прост, однако требует наличия спектрофотометра.
Исследование содержания сиаловых кислот приобрело са¬
мостоятельное значение и в настоящее время составляет боль¬
шую главу клинической биохимии.
На основании изложенного нами для определения глико¬
протеидов в сыворотке крови рекомендуется два метода: орци-
новый (унифицированный) и метод с применением триптофана.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА
ГЛИКОПРОТЕИДОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРИПТОФАНА
Принцип. Гликопротеиды сыворотки крови при нагревании
с концентрированной H2S04 подвергаются гидролитическому
расщеплению, продукты которого в присутствии триптофана
дают окрашенные в синий цвет соединения. Реакция проводит¬
ся при участии борной кислоты, необходимой для увеличения
интенсивности фиолетовой окраски и подавления паразитирую¬
щего окрашивания, которое может развиться в процессе реак¬
ции.
Реактивы. 1. Абсолютный этиловый спирт.
2. Борно-серный раствор, состоящий из 770 мл концентриро¬
ванной х. ч. H2S04, 230 мл дистиллированной воды и 50 г бор¬
ной кислоты.
3. Раствор триптофана. 1 г триптофана растворяют в 100 мл
дистиллированной воды при нагревании до начинающегося
кипения (предпочтительнее использовать Jl-триптофан, а не
ДЛ его форму, так как первая лучше растворима в воде; к то¬
му же растворы Л-триптофана остаются более стабильными
при хранении на холоду).
137

4. Эталонный раствор 0,1 г% маннозы. Этот раствор в при¬
сутствии нескольких капель толуола можно хранить в холо¬
дильнике в течение нескольких часов.
Ход определения. Всю реакцию проводят в одной пробирке.
Она складывается из нескольких этапов:
а) осаждение гликопротеидов и белков. На дно пробирки
помещают 0,05 мл сыворотки, прибавляют 10 мл абсолютного
спирта и содержимое пробирки взбалтывают, после этого пробу
оставляют при комнатной температуре на 15 мин. Затем цен¬
трифугируют при 2500 об/мин в течение 10 мин, спирт удаляют
осторожным сливанием, стараясь не потерять при этом ни ча¬
стицы осадка;
б) гидролиз и цветная реакция. Осадок растворяют в 1 мл
дистиллированной воды и быстро приливают в пробирку 7 мл
борно-серного раствора, после этого пробирку немедленно по¬
гружают в ледяную воду (или охлаждают холодной водопро¬
водной водой). Через 5 мин прибавляют 1 мл раствора трипто¬
фана.
Чтобы избежать появления побочного желтого цвета, важно
тотчас перемешать жидкости. Для этого рекомендуется пропу¬
стить несколько пузырьков воздуха у дна пробирки (через ка¬
пиллярную трубочку). После охлаждения смеси в ледяной воде
пробирки переносят в кипящую водяную баню точно на
20 мин, причем через 10 мин необходимо еще раз перемешать
реактивы продуванием нескольких пузырьков воздуха у дна
пробирки. Тотчас после извлечения пробирки из кипящей во¬
дяной бани ее помещают на 5 мин в ледяную (или холодную
водопроводную) воду, а затем на 30 мин оставляют при ком¬
натной температуре.
Параллельно опытной ставят контрольную пробу путем при¬
бавления к 1 мл дистиллированной воды 7 мл борно-серного
раствора. В дальнейшем ход определения тот же, что и при
постановке опытных проб;
в) фотометрирование. Оптическую плотность измеряют на
ФЭКе при зеленом светофильтре (максимум абсорбции состав¬
ляет 520 нм) в кювете шириной 5 мм. От экстинкции опытной
вычитают оптическую плотность контрольной пробы. Получен¬
ные значения экстинкций переводят по калибровочной кривой
в соответствующие количества маннозы.
Построение калибровочной кривой (табл. 20). Готовят 0,1%
раствор маннозы путем растворения 100 мг ее в 100 мл дистил¬
лированной воды. В 1 мл полученного раствора содержится
1 мг (или 1000 мкг) маннозы, а в 2 мл — 2000 мкг (раствор I).
2 мл раствора маннозы (I) доводят дистиллированной во¬
дой до объема 20 мл. 10 мл полученного рабочего раствора со¬
держат 1000 мкг маннозы, а 1 мл— 100 мкг (раствор II).
К 1 мл каждого рабочего разведения стандарта добавляют
7 мл борно-серного раствора, после чего пробу колориментри-
руют.
138

ТАБЛИЦА 20
Данные для построения калибровочной кривой
№ пробы
Раствор манно¬
зы II (№1—10)
и 1(№11—15)
Дистиллиро¬
ванная вода,
мл
Содержание маннозы
мкг (числитель) в объ¬
еме пробы мл
(знаменатель)
Содержание
маннозы в
мкг в 1 мл
пробы
1
0,5
4,5
50/5
10
2
1,0
4,0
100/5
20
3
0,9
2,1
90/3
30
4
2,0
3,0
200/5
40
5
2,0
2,0
200/4
Е0
6
2,4
1,6
240/4
60
7
2,1
0,9
210/3
70
8
2,4
0,6
240/3
80
9
2,7
0,3
270/3
90
10
1,0
—
100/1
100
11
1,1
8,9
1100/10
110
12
1,2
8,8
1200/10
120
13
1,3
8,7
1300/10
130
14
1,4
8,6
1400/10
140
15
1,5
8,5
1500/10
150
Ответ выражается в мг%.
Концентрацию маннозы рассчитывают по формуле*
а • 2 = мг%,
где а — количество мкг маннозы, найденное по калибровочной
кривой;
2 — коэффициент пересчета в мг% маннозы.
Поскольку для определения используют 0,05 мл сыворотки,
а ответ дают в мг%, для расчета содержания гликопротеидов
в 100 мл сыворотки полученную по калибровочной кривой ве¬
личину умножают на 2000 и делят на 1000 (для перевода мкг
в мг).
Например: 50 мкг-2= 100 мг%, 70 мкг *2= 140 мг%.
Примечание. Возможные причины ошибок:
1. H2S04 должна быть чистой. Не годится та*серная кислота,
которая при нагревании с триптофаном дает желтое окраши¬
вание.
2. Растворы триптофана годны к работе в течение 8—■
10 дней. Цвет, появляющийся от применения старых растворов,
139

слабее окраски, возникающей при использовании свежих реак¬
тивов, особенно при высоком содержании гликопротеидов в
крови.
При работе с ДЛ-триптофаном раствор нужно использовать
сразу же после его приготовления.
Нормальное содержание гликопротеидов в сыворотке крови,
изученное В. Г. Колб у 35 доноров, колеблется от 120 до
160 мг%, составляя в среднем 140 мг%.
Клинико-диагностическое значение. Количество гликопроте¬
идов возрастает при: туберкулезе, плевритах, пневмониях, ост¬
ром ревматизме, гломерулонефритах, диабете, инфаркте
миокарда, подагре, раке, а также при остром и хроническом
лейкозе, миеломе, лимфосаркоме и некоторых других заболе¬
ваниях.
Исследования, проводимые в динамике, позволяют судить
о течении болезни и терапевтическом эффекте.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕКСОЗ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
ОРЦИНОВЫМ МЕТОДОМ
ПОСЛЕ ГИДРОЛИЗА СЕРНОЙ КИСЛОТОЙ
Принцип. Гликопротеиды, содержащие гексозы, выделяют
из сыворотки крови 96° этанолом. Освобожденные в результа¬
те гидролиза гексозы образуют с орциновым реактивом розовое
окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содер¬
жанию гексоз.
Реактивы. 1. 96° этиловый спирт;
2. 0,1 н. раствор едкого натра;
3. Серная кислота концентрированная (для пробы Саваля);
4. Орциновый реактив. Смешивают 7,5 объема реактива А
(60 мл концентрированной серной кислоты + 40 мл воды)
с 1 объемом реактива Б (1,6 г кристаллического орцина в
100 мл воды), готовят перед употреблением. Реактив А стоек,
раствор Б можно хранить в темноте в течение 1 месяца.
5. Стандартный 100 мг% раствор гексоз, состоящий из га¬
лактозы и маннозы. Для его приготовления 50 мг галактозы
и 50 мг маннозы растворяют в мерной колбе на 100 мл в не¬
большом количестве дистиллированной воды и доводят водой
до метки.
Ход определения. К 0,1 мл сыворотки добавляют 5 мл 96°
этанола, перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин. За¬
тем центрифугат сливают, пробирки опрокидывают на 30—60 с
на фильтровальную бумагу, повторно растворяют осадок в
5 мл 96° этилового спирта, центрифугируют, надосадочную
жидкость вновь сливают. Белковый осадок растворяют в 1 мл
0,1 н. раствора едкого натра, добавляют 8,5 мл орцинового ре¬
актива, содержимое пробирок хорошо перемешивают путем их
140

ТАБЛИЦА 21
Данные к построению калибровочной кривой
для определения гликопротеидов по содержанию гексоз
№ пробирок
Стандартный
раствор галакто¬
зы и маннозы, мг
0,1 н. раст¬
вор едкого
натра, мл
Орциновый
реактив, мл
Концентрация
гексоз, мг%
1
0,05
0,95
8,5
50
2
0,10
0,90
8,5
100
3
0,15
0,85
8,5
150
4
0,20
0,80
8,5
200
5
0,25
0,75
8,5
250
6
0,30
0,70
8,5
300
переворачивания и помещают в водяную баню при 80° С точно
на 15 мин. Следует избегать попадания на пробирки дневйого
света. Затем пробирки охлаждают в воде со льдом (или в про¬
точной воде из водопроводного крана) в течение 5 мин, после
чего пробы колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофиль¬
тром (при длине волны 500—560 нм) в кювете с толщиной слоя
10 мм против контрольной пробы.
Контрольную пробу готовят путем добавления к 1 мл 0,1 н.
раствора едкого натра 8,5 мл ординового реактива. Далее про¬
бу обрабатывают как опытную.
Расчет производят по калибровочному графику или по фор¬
муле Сх = Е0п/Ест • 100 (мг%).
Построение калибровочного графика. Из основного стан¬
дартного раствора делают разведения (табл. 21). Стандартные
пробы обрабатывают как опытные. Калибровочную кривую
строят по общеизвестным принципам.
При расчете по формуле пользуются стандартным раство¬
ром 2 (100 мг%).
Примечание. Для получения хорошо воспроизводимых
результатов необходимо "точное соблюдение времени и условий
гидролиза белков. Например, температура в водяной бане дол¬
жна быть строго постоянной в течение всего периода прогрева¬
ния. Кроме того, определенное значение имеет качество серной
кислоты и орцина. Последний очищают перекристаллизацией.
Для этого орцин растворяют, нагревая на водяной бане до
60—65° С. При этом вода, присутствующая в препарате, выпа-
ривается. Остаток перекристаллизовывают из бензола с добав¬
лением активированного угля.
В норме концентрация гексоз, связанных с белком, состав¬
ляет в сыворотке крови 105—115 мг%.
141

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРОМУКОИДОВ
(СЕРОГЛИКОИДОВ)
Под этим названием объединена группа гликопротеидов,
которые не осаждаются хлорной, трихлоруксусиой и сульфоса-
лициловой кислотами. Указанное свойство серомукоидов и по¬
ложено в основу их количественного определения.
Для исследования содержания этой фракции гликопротеи¬
дов в сыворотке крови в качестве унифицированного предло¬
жен орциновый метод определения серомукоидов. Из других
методик привлекает своей простотой нефелометрический способ
определения суммарных серомукоидов в сыворотке крови но
Хуэрго, который, правда, по точности исследования уступает
орциновому методу.
Определение серомукоида
в сыворотке крови по содержанию в нем гексоз
Принцип метода основан на выделении серомукоида фос¬
форно-вольфрамовой кислотой из хлорного фильтрата сыворот¬
ки крови и количественном определении в нем гексоз орциновым
методом (по вышеописанному способу).
Реактивы те же, что и в описанном орциновом методе оп¬
ределения гексоз, связанных с белками.
Дополнительно используют: 1. 6% раствор хлорной кислоты
(НС104).
Способ расчета количества концентрированной хлорной ки¬
слоты, необходимого для приготовления раствора любой дру¬
гой (меньшей) концентрации приведен при описании турбиди-
метрического метода определения серомукоидов в сыворотке
крови (с. 143—144).
2. 5% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты, приготов¬
ленный на 2 н. растворе соляной кислоты.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1 мл
сыворотки крови и 1 мл дистиллированной воды; после пере¬
мешивания приливают 2 мл 6% раствора хлорной кислоты (по
стенке пробирки), смесь тщательно перемешивают стеклянной
палочкой. Через 10 мин пробу центрифугируют в течение
10 мин при 3000—4000 об/мин. Надосадочную жидкость пол¬
ностью сливают в другую центрифужную пробирку, в которую
добавляют 2 мл 5% раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты.
После встряхивания осадок серомукоида отделяют центрифу¬
гированием (в течение 5 мин). Надосадочную жидкость сли¬
вают, к осадку прибавляют 2 мл 96° этилового спирта, содержи¬
мое пробирки хорошо взбалтывают и центрифугируют 10 мин.
Центрифугат вновь сливают, осадок растворяют в 1 мл 0,1 н.
едкого натра, добавляют 8,5 мл орцинового реактива, переме¬
шивают и ставят в водяную баню при температуре +80° С точ¬
но на 15 мин. Следует избегать попадания прямого дневного
142

ТАБЛИЦА 22
Данные к построению калибровочного графика
для определения серомукоида по содержанию гексоз
№ пробирок
Стандартный
раствор галакто¬
зы и маннозы, мл
0,1 н. раст¬
вор едкого
натра, мл
Орциновый
реактив, мл
Концентрация
гексоз, мг%
1
0,10
0,90
8,5
10
2
0,20
0,80
8,5
20
о
О
0,25
0,75
8,5
25
4
0,30
0,70
8,5
30
5
0,40
0,60
8,5
40
6
0,50
0,50
8,5
50
света на пробирки. Затем пробирки охлаждают в течение
5 мин в холодной водопроводной воде (или в воде со льдом),
после этого измеряют экстинкцию пробы при зеленом свето¬
фильтре (длина волны 500—560 нм) в кюветах с толщиной
слоя 10 мм против контрольной пробы.
Контрольная проба. К 1 мл 0,1 н. едкого натра добавляют
8,5 мл орцинового реактива, перемешивают и далее пробу об¬
рабатывают как опытную.
Расчет производят по калибровочному графику или по фор¬
муле.
Построение калибровочного графика. Из основного раство¬
ра готовят разведения (табл. 22). Стандартные пробы обраба¬
тывают как опытные.
При расчете по формуле Сх = Е0п/ЕСт • 20 (мг%) используют
стандартный раствор 2.
В норме концентрация серомукоида в крови, определенная
по гексозам, составляет 22—28 мг%.
Турбидиметрический метод определения
серомукоидов в сыворотке крови
Принцип. При добавлении к сыворотке крови раствора хлор¬
ной кислоты белки выпадают в осадок, а серомукоиды остают¬
ся в растворе, из которого они могут быть выделены путем их
осаждения фосфорновольфрамовой кислотой. По степени по¬
мутнения раствора и судят о содержании серомукоидов в ис¬
следуемом материале.
Реактивы. 1. 0,85% раствор хлористого натрия.
2. 1,8 М раствор (18%) хлорной кислоты (НСЮ4). Указан¬
ная концентрация хлорной кислоты соответствует содержанию
143

180,84 г ее в 1л или 18,084 г в 100 мл раствора. На основании
этого рассуждения и строят расчет.
Допустим, что концентрация хлорной кислоты — 57,81%.
Это значит, что в 100 г раствора содержится 57,81 г чистой кис¬
лоты.
Решаем пропорцию: 57,81 — 100, 18,084 — X, тогда Х=
= (18,084* 100)/57,81 =31,28 г, т. е. 18,084 г чистой кислоты со¬
держится в 31,28 г ее 57,81% раствора. Чтобы перевести весовые
единицы в объемные, нужно 31,28 г разделить на удельный вес
кислоты (вес 1 мл раствора), который находится по соответ¬
ствующей таблице справочника или с помощью ареометра.
В данном случае он равен 1,510. 31,28/1,510 = 20,7 мл.
Итак, для приготовления 1,8 М раствора хлорной кислоты
из 57,81% ее раствора необходимо взять 20,7 мл НСЮ4 и довести
объем дистиллированной водой до 100 мл.
3. 5% раствор фосфорновольфрамовой кислоты, приготов¬
ленной на 2 н. соляной кислоте.
Ход определения. 0,5 мл сыворотки смешивают с 4,5 мл фи¬
зиологического раствора и добавляют по каплям 2,5 мл 1,8 М
раствора НС104, хорошо перемешивают стеклянной палочкой,
оставляют на 10 мин при комнатной температуре, фильтруют
через обеззоленный фильтр (синяя полоска) или центрифуги¬
руют 15 мин при 2000—2500 об/мин.
Отмеривают 5 мл фильтрата (центрифугата), перемешивают
с 1 мл фосфорновольфрамовой кислоты и через 15 мин измеря¬
ют мутность на ФЭКе (в случае работы на ФЭК-М использу¬
ют красный светофильтр, при работе на ФЭК-Н-57 — ставят
специальный светофильтр для нефелометрических определений)
в кювете шириной 10 мм против контроля (для получения
которого смешивают 3,3 мл физ. раствора, 1,7 мл раствора
НС104 и 1 мл фосфорновольфрамовой кислоты). Результат вы-
р!ажают в ед оптической плотности.
Норма содержания серомукоидов в сыворотке крови —
0,130—0,200.
Методические замечания. Ваймер, Квинн (1958), изучив
влияние на депротеинизацию белков сыворотки (при определе¬
нии серомукоидов) хлорной кислоты различной концентрации,
нашли, что наилучшим эффектом обладает 0,6 н. раствор НС104.
Кроме того, установлено, что фильтровальная бумага адсор¬
бирует от 6,5 до 19% сывороточных серомукоидов (в зависимо¬
сти от сорта бумаги). Это делает необходимым замену филь¬
трования при проведении сывороточных серомукоидов центри¬
фугированием.
Клинико-диагностическое значение. Содержание серомуко-
ида увеличивается у больных с желтушным синдромом на поч¬
ве новообразований, при обострениях хронического холецистита,
а также при деструктивной форме туберкулеза легких, ревма¬
тизме и других заболеваниях.
Оно снижается при инфекционном гепатите.
144

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИАЛОВЫХ КИСЛОТ
Нейраминовая кислота и ее ацилированные производные
(так называемые сиаловые кислоты) являются нормальными
компонентами тканей и биологических жидкостей организма и
животных. В свободном виде они присутствуют в крови, ликво¬
ре, слизистой оболочке желудка, щитовидной железе и других
органах. Они обнаруживаются и в составе олигосахаридов (му-
коидов слюны, гликопротеидов кожи, фетуина, а-гликопротеи-
дов сыворотки, орозомукоида и т. д.). Занимая концевое поло¬
жение в молекулах гликопротеидов, они легко отщепляются от
них под действием ферментов микроорганизмов и разрушаю¬
щихся клеток. При инфекционных, аллергических состояниях
и некробиотических процессах наступает нарушение тканевого
метаболизма с деполимеризацией гликопротеиновых комплек¬
сов. В результате этих изменений в сыворотке крови появляют¬
ся в большом количестве продукты расщепления белково-угле¬
водных комплексов и, в связи с этим, резко нарастает содержа¬
ние сиаловых кислот.
В литературе описано несколько методов определения сиа¬
ловых кислот в крови. Получивший широкое распространение
в клинико-диагностических лабораториях дифениламиновьтй
метод является мало специфичным и часто дает завышенные
результаты. Метод Гесса, в котором в качестве реактива ис¬
пользуется смесь концентрированных уксусной и серной кислот,
более специфичен, но менее чувствителен. Методы Аминова и
Уоррена с тиобарбитуровой кислотой в настоящее время явля¬
ются самыми специфичными и чувствительными, однако для
выполнения серийных анализов в клинико-диагностических ла¬
бораториях они мало пригодны из-за своей трудоемкости. Наи¬
более приемлемым для клинических определений нейрамино-
вой кислоты в крови является резорциновый метод Свеннер-
хольма, отличающийся простотой, достаточной чувствительно¬
стью и хорошей воспроизводимостью.
Для определения сиаловых кислот в сыворотке крови в ка¬
честве унифицированных предлагаются два метода: 1) резор¬
циновый и 2) метод Гесса, основанный на реакции с уксусно¬
сернокислым реактивом.
Проба на сиаловые кислоты по методу Гесса
Принцип. Безбелковый фильтрат сыворотки подвергается
гидролизу. В результате его из состава мукопротеинов выделя¬
ются сиаловые кислоты, которые с раствором кислот в кипящей
водяной бане дают цветную реакцию.
Реактивы. 1. 10% раствор трихлоруксусиой кислоты.
2. 5% раствор серной кислоты в ледяной уксусной кислоте
(для приготовления его к 95 частям ледяной уксусной кислоты
145

ТАБЛИЦА 23
Данные к построению
калибровочной кривой для определения сиаловых кислот
Рабочие стандартные растворы
№ пробирок
основной стандарт¬
ный раствор N-аце¬
тилнейраминовой
кислоты, мл
дистиллирован¬
ная вода, мл
Концентрация
N-ацетилнейра¬
миновой кислоты
в опыте, мг%
1
0,10
0,30
25,0
2
0,15
0,25
37,5
3
0,20
0,20
50,0
4
0,25
0,15
62,5
5
0,30
0,10
75,0
6
0,40
—
100,0
приливают 5 частей концентрированной серной кислоты).
3. Основной (50 мг%) водный раствор стандарта — N-аце-
тилнейраминовой кислоты.
Ход определения. В центрифужную пробирку наливают
1 мл сыворотки крови и при осторожном встряхивании добав¬
ляют 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку
помещают точно на 5 мин в кипящую водяную баню, затем
охлаждают (обычно путем помещения пробирки на 5 мин в ле¬
дяную баню или в холодную водопроводную воду), центрифу¬
гируют 5 мин при 1000—2000 об/мин. К 0,4 мл отобранной над-
осадочной жидкости добавляют 5 мл уксусно-сернокислой
смеси и пробы повторно прогревают в кипящей водяной бане в
течение 30 мин. При этом бесцветный раствор постепенно пере¬
ходит в красно-фиолетовый. После охлаждения в ледяной воде
(5 мин) или под краном в струе холодной водопроводной воды
пробы колориметрируют. Определение ведут на ФЭКе с зеле¬
ным светофильтром в кювете шириной 10 мм, на правом бара¬
бане. В качестве контроля используют 5% раствор серной кис¬
лоты в ледяной уксусной кислоте. Отсчет снимают по красной
шкале (оптических плотностей). Результат выражают либо в
условных единицах (при отсутствии стандарта), для этого по¬
лученную величину экстинкции умножают на 1000 (иногда of-
вет дают непосредственно в значениях оптической плотности),
либо в значениях концентрации N-ацетилнейраминовой кисло¬
ты. В последнем случае расчет ведут по калибровочному гра¬
фику.
Построение калибровочного графика. Из основного стан¬
дартного раствора N-ацетилнейраминовой кислоты готовят ра¬
бочие растворы (табл. 23).
146

К растворам прибавляют 5 мл уксусносернокислого реакти¬
ва и обрабатывают их, как опытные пробы.
Норма— 135—200 (условных ед),
или 62—73 мг% N-ацетилнейраминовой кислоты.
Примечание. Кровь для анализа следует брать нато¬
щак, определение вести в тот же день.
Определение сиаловых кислот
в сыворотке крови по реакции с резорцином
Принцип. При добавлении трихлоруксусной кислоты к сы¬
воротке крови и последующем нагревании пробы происходит
мягкий гидролиз гликопротеидов с отщеплением нейраминовой
кислоты, которая затем вступает в реакцию с раствором резор¬
цина (в солянокислой среде) с образованием хромогена синего
цвета.
Реактивы. 1. Резорциновый реактив. Готовят в мерной колбе
на 100 мл. 200 мг резорцина растворяют в 10 мл дистиллиро¬
ванной воды, добавляют 80 мл концентрированной соляной
кислоты (d= 1,19) и 0,25 мл 0,1 М раствора сернокислой меди
(0,399 г безводного CuS04 растворяют в 25 мл дистиллирован¬
ной воды). Полученный объем доводят водой до 100 мл. Реак¬
тив годен в течение месяца при хранении в холодильнике. Его
можно использовать не ранее чем через 4 часа после приготов¬
ления.
2. Реактив для экстракции окрашенного продукта. 85 мл
бутилацетата смешивают с 15 мл бутилового спирта.
3. 5% раствор трихлоруксусной кислоты.
4. Основной (50 мг%) водный раствор N-ацетилнейрамино¬
вой кислоты. 1 мл этого стандартного раствора содержит 0,5 мг
N-ацетилнейраминовой кислоты.
Ход определения. К 0,1 мл сыворотки прибавляют 1,9 мл
5% раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают, гидроли¬
зуют в кипящей водяной бане 7 мин. За это время происходит
мягкий гидролиз белков сыворотки крови, приводящий к отде¬
лению главным образом нейраминовой кислоты, располагаю¬
щейся на конце углеводных простетических групп гликопроте¬
идов. Охлаждают (в проточной воде), фильтруют через бумаж¬
ный фильтр. К 0,5 мл прозрачного фильтрата (что соответству¬
ет 0,025 мл сыворотки) добавляют 0,5 мл дистиллированной
воды. Для контроля берут 1 мл дистиллированной воды.
В каждую пробирку прибавляют по 1 мл резорцинового реак¬
тива и пробу помещают на 15 мин в кипящую водяную баню
(пробирки прикрывают пробками для уменьшения испарения),
охлаждают, добавляют по 3 мл бутилацетата (для экстракции).
Встряхивают, оставляют стоять на 15 мин для расслоения фаз.
Верхний окрашенный слой отсасывают и колориметрируют на
147

ТАБЛИЦА 24
Данные к построению
калибровочной кривой для определения сиаловых кислот
№ про¬
Основной стандарт¬
ный раствор N-аце¬
Дистиллиро¬
Концентрация N-ацетилней¬
раминовой кислоты
бирок
тилнейраминовой
кислоты, мл
ванная вода,
мл
в рабочем
растворе, мг%
в опытной
пробе, м?%
1
0,1
0,9
5
20
2
0,2
0,8
10
40
3
0,3
0,7
15
60
4
0,4
0,6
20
80
5
0,5
0,5
25
100
ФЭКе при желтом светофильтре 575—590 нм в кювете шири¬
ной 5 мм против контроля.
Построение калибровочного графика. Из основного стан¬
дартного раствора N-ацетилнейраминовой кислоты готовят раз¬
ведения, как указано в таблице 24.
Из каждого рабочего стандартного раствора с указанной в
таблице концентрацией берут 0,1 мл, вносят в пробирки, со¬
держащие 0,9 мл дистиллированной воды, в которые затем до¬
бавляют по 1 мл резорцинового реактива. Далее стандартные
пробы обрабатывают, как опытные.
В связи с тем что испытуемого раствора в стандартную про¬
бу берут в 4 раза больше, чем в опыт (0,1 мл — в стандарт,
0,025 мл — в опыт), для расчета концентрации опытной пробы
концентрацию рабочего стандартного раствора соответственно
умножают на 4.
В норме концентрация сиаловых кислот в сыворотке крови,
выраженная в мг% N-ацетилнейраминовой кислоты, колеблется
в пределах от 62 до 73 мг%, составляя в среднем 65 мг%.
Преимущество данного метода перед многими другими со¬
стоит в том, что в присутствии резорцина и Си++ синюю окрас¬
ку дает только сиаловая кислота, тогда как глюкоза, манноза,
галактоза образуют продукты желтого цвета, остающиеся в
водной среде при экстракции смесью бутил ацетата с бутано-
лом.
Клинико-диагностическое значение. Количество нейрамино-
вых кислот в крови резко увеличивается при опухолях голов¬
ного мозга, инфаркте миокарда. Оно возрастает также при ту¬
беркулезе, раковых опухолях, эндокардите, лейкемии, лимфо¬
гранулематозе, нефрозе, остеомиелите и других заболеваниях.
При активном туберкулёзе, например, содержание нейрамино-
148

вых кислот составляет 178 мг%, при подостром бактериальном
эндокардите— 102 мг%, при далеко зашедшей раковой опухо¬
ли— 142 мг%. Увеличивается их концентрация также при за¬
болеваниях, связанных с поражением паренхимы печени, кол-
лагенозах и некоторых других, протекающих с деструкцией со¬
единительной ткани.
Снижение содержания нейраминовых кислот отмечено при
пернициозной анемии, гемохроматозе, болезни Вильсона и де¬
генеративных процессах в центральной нервной системе.
В моче нейраминовая кислота обнаруживается лишь при
протеинурии.

Глава VII
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОБМЕНА ЛИПИДОВ
Все возрастающее распространение среди населения боль¬
шинства развитых стран мира заболеваний, связанных с нару¬
шением липидного обмена (атеросклероза, ожирения и некото¬
рых других), с каждым годом заставляет уделять больше вни¬
мания их лабораторной диагностике. Эта потребность стано¬
вится тем более настоятельной, если учесть, что без исследова¬
ния показателей липидного обмена весьма затруднительно со¬
ставить объективное представление и о' функциональной спо¬
собности целого ряда жизненно важных органов (например
печени, почек) при самых различных заболеваниях.
Основным биологическим материалом для проведения био¬
химической диагностики нарушения состояния обмена жиров и
липоидов (жироподобных веществ) является кровь больного.
Ее главными липидными компонентами являются: свободный
холестерин и его эфиры, фосфолипиды, триглицериды, или ней¬
тральные жиры, а также неэстерифицированные жирные кис¬
лоты. Кроме того, следует упомянуть ацетальфосфатиды (плаз-
малогены), сфингомиелины и ряд продуктов межуточного об¬
мена, среди которых первостепенное диагностическое значение
имеют так называемые кетоновые тела. Содержание важнейших
липидных фракций в плазме крови представлено в таблице 25.
ИССЛЕДОВАНИЕ
ОБЩИХ ЛИПИДОВ И ИХ ФРАКЦИЙ
Для количественного определения общих липидов в сыво¬
ротке крови предложено множество способов, среди которых
можно выделить следующие группы.
I группа — гравиметрические методы, состоящие в экстрак¬
ции липидов сыворотки каким-либо растворителем, очистке ли-
150

ТАБЛИЦА 25
Липидные компоненты плазмы крови
Липидные фракции
Содержание
в мг%
Общие липиды
400—800
Нейтральные жиры
0—200
В том числе:
глицерин
0—20
жирные кислоты
0—175
Неэстерифицированные жирные кислоты
20—50
Фосфолипиды
150—250
А цетал ьфосфатид ы
5—10
Сфингомиелины
10—30
Эфиры холестерина
225
В том числе:
жирные кислоты
95
холестерин
90—135
Свободный холестерин
40—70
Общий холестерин
150—250
а-липопротеиды (25—30%)
220
Р-липопротеиды (75—70%)
400
пидного экстракта, высушивании и взвешивании сухого остат¬
ка на аналитических весах. Эти методы точны, однако весьма
сложны, требуют определенных навыков, большого количества
исходного материала, оборудования, много времени. В более
простых модификациях гравиметрических методов ошибка до¬
стигает 10—20%.
II группа — окислительные методы, в которых применяется
окисление липидов бихроматом калия или хромовой кислотой
с последующим титрометрическим либо колориметрическим ис¬
следованием. Они требуют высокой техники и исключительной
чистоты при проведении исследования.
III группа — методы, основанные на свойстве липидов сы¬
воротки избирательно окрашиваться Суданом черным. Они
удобны, просты, технически не сложны, но отличаются плохой
воспроизводимостью.
IV группа — методы, основанные на сравнении степени мут¬
ности стандартного и исследуемого растворов. В нефелометри-
ческом методе (Кункель с соавторами, 1948) общие липиды
151

определяются при взаимодействии сыворотки и реактива, со¬
стоящего из фенола и хлористого натрия. По точности метод
приближается к гравиметрическому.
V группа — методы, в которых используется описанная в
1937 г. Чаброл и Чаронат цветная реакция продуктов распада
ненасыщенных липидов с реактивом, состоящим из ванилина,
фосфорной и серной кислот.
Механизм реакции заключается в следующем: ненасыщен¬
ные липиды реагируют с серной кислотой при нагревании с
образованием карбониевого аниона; фосфорная кислота эсте-
рифицирует ОН-группу ванилина; карбониевый ион взаимодей¬
ствует с активированной карбонильной группой фосфата вани¬
лина, образуя стабилизированный окрашенный комплекс. Золь-
нер и Кирш в 1962 г. предложили основанный на этой реакции
метод определения липидов в сыворотке крови, который в даль¬
нейшем был усовершенствован Ю. А. Барышковым с соавтора¬
ми, Кнайт с соавторами и др.
Большинство авторов, применяющих для определения об¬
щих липидов реакцию с сульфофосфованилиновым реактивом,
отмечает, что она высокочувствительна и технически проста.
Метод дает достаточно воспроизводимые результаты. Он наи¬
более пригоден для применения в широкой лабораторной прак¬
тике. Поэтому из всех существующих способов определения
общих липидов в сыворотке крови в качестве унифицированно¬
го принята описанная ниже модификация двух методов: Золь-
нер и Кирш (1966) и Кнайт с соавторами (1972).
Определение общих липидов
в сыворотке крови по цветной реакции
с сульфофосфованилиновым реактивом
Принцип. Продукты распада ненасыщенных липидов обра¬
зуют с реактивом, состоящим из серной, ортофосфорной кислот
и ванилина, соединение, интенсивность окраски которого про¬
порциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.
Реактивы. 1. Серная кислота, концентрированная, для про¬
бы Саваля.
2. Ортофосфорная кислота, концентрированная.
3. 0,6% водный раствор ванилина. 0,6 г ванилина раство¬
ряют в небольшом количестве дистиллированной воды при на¬
гревании на водяной бане; после охлаждения объем доводят
до 100 мл. Раствор стабилен при хранении при комнатной тем¬
пературе.
4. Фосфорнованилиновая смесь. 4 части концентрированной
ортофосфорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6% раствора
ванилина. Смесь хранят в посуде из темного стекла при ком¬
натной температуре.
5. Хлороформ, х. ч. или «для наркоза».
152

ТАБЛИЦА 26
Данные к построению калибровочного графика
для определения общих липидов в сыворотке крови
№ пробирок
Основной стандарт¬
ный раствор трио¬
леина, мл
Хлороформ, мл
Концентрация общих
липидов, мг%
1
0,17
0,83
200
2
0,33
0,67
400
3
0,50
0,50
600
4
0,67
0,33
800
5
0,83
0,17
1000
6
1,00
—
1200
6. Основной (1200 мг%) стандартный раствор триолеина.
На аналитических весах взвешивают в бюксе 1200 мг триолеи¬
на, навеску переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят
объем хлороформом до метки. Раствор хранят в холодильни¬
ке, в посуде из темного стекла с притертой пробкой.
Ход определения. Опытная проба. К 0,05 мл сыворотки при¬
бавляют 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержи¬
мое пробирки тщательно перемешивают и помещают на 10 мин
в кипящую водяную баню. Пробирки вынимают и сразу же
охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры.
Из каждой пробирки отбирают по 0,2 мл смеси, которую пере¬
носят в другую пробирку, содержащую 3 мл фосфорнованили¬
новой смеси. После тщательного перемешивания пробы остав¬
ляют на 45 мин в темноте при комнатной температуре. Экстин-
кцию измеряют на фотоэлектроколориметре при зеленом све¬
тофильтре (длина волны 500—560 нм) в кювете с толщиной
слоя 5 мм против контрольной пробы.
Контрольную пробу ставят как опытную, но вместо сыво¬
ротки берут 0,05 мл воды.
Расчет производят по калибровочному графику или по фор¬
муле (норма—400—800 мг%).
Построение калибровочного графика. Из основного готовят
рабочие стандартные растворы (табл. 26).
Из каждого разведения берут по 0,05 мл рабочего стандарт¬
ного раствора и далее пробы обрабатывают, как опытные. По
полученным данным строят калибровочный график. Прямоли¬
нейная зависимость между содержанием общих липидов и оп¬
тической плотностью сохраняется до 1200 мг%.
Расчет по формуле: общие липиды в мг% = Е0п/НСт • Сст,
где Е — экстинкция опытных и стандартных проб;
С — концентрация основного стандартного раствора
(1200 м г %).
153

Примечания. 1. Исследование проводить натощак!
2. Сыворотку можно хранить в холодильнике в течение 3—
6 дней (не замораживая).
3. При концентрации общих липидов выше 1200 мг% сыво¬
ротку следует развести дистиллированной водой, а результат
умножить на разведение.
4. Посуду, применяемую для определения общих липидов,
нужно мыть отдельно. Необходимо тщательно прополоскать ее
дистиллированной водой и спиртом.
Клинико-диагностическое значение определения общих ли¬
пидов в сыворотке крови. Как физиологическое явление уве¬
личение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наступа¬
ет через 1—4 ч после принятия пищи. Оно выражено тем силь¬
нее, чем ниже уровень липидов в крови натощак.
Концентрация липидов в крови изменяется и при целом ряде
патологических состояний. Так, у больных диабетом, наряду с
гипергликемией, отмечается резко выраженная гиперлипемия
(нередко до 1000—2000 мг%). При липоидном нефрозе содер¬
жание липидов в крови достигает еще более высоких цифр (до
1000—5000 мг%). Гиперлипемия — постоянное явление при
билиарном циррозе печени и у больных острым гепатитом (осо¬
бенно в период проявления желтухи). Повышенное содержание
липидов в крови, как правило, обнаруживается и у лиц, стра¬
дающих острым или хроническим нефритом, в случае, если за¬
болевание сопровождается отеками.
Содержание общих липидов в сыворотке крови увеличива¬
ется при эссенциальной гиперлипемии, ожирении, атеросклеро¬
зе, часто у больных ишемической болезнью сердца, а также при
гипотиреозе, панкреатите, злоупотреблении алкоголем.
Для разделения общих липидов на составляющие их ком¬
поненты весьма удобно использование методов тонкослойной
хроматографии. Однако необходимость в приготовлении пла¬
стин с тонким слоем силикагеля и сложность учета выделяе¬
мых фракций сдерживает их широкое применение в клинико-
диагностических лабораториях. Поэтому для определения фрак¬
ций липидов большое применение нашли различные химические
методы.
Из всех компонентов липидного спектра сыворотки крови,
пожалуй, наибольший интерес представляет определение содер¬
жания общего холестерина крови и его эстерифицированной
формы.
ХОЛЕСТЕРИН
Холестерин представляет собой вторичный одноатомный
ароматический спирт, в молекуле которого имеется общее всем
стеринам полициклическое ядро циклопентанпергидрофенан-
трена.
154

Он обнаруживается во всех тканях и жидкостях человече¬
ского организма как в свободном состоянии, так и в виде слож¬
ных его эфиров — соединений спиртовой группы холестерина
с жирными кислотами, чаще стеариновой, пальмитиновой, оле¬
иновой. Эстерифицированная форма составляет, главным обра¬
зом, мембраны клеток (липидные оболочки). Особенно мно¬
го холестерина содержится в нервной ткани, коре надпочечни¬
ков, половых железах и пузырной желчи.
Колебания концентрации холестерина крови в норме во
многом зависят от физиологического состояния организма. Так,
у женщин в предменструальном периоде содержание холестери¬
на в крови повышается, а затем, во время менструаций, опять
падает, что, по-видимому, зависит от усиления в определенные
периоды менструального цикла синтеза холестерина в желтом
теле. При беременности, когда желтое тело (содержащее осо¬
бенно много холестерина) существует в течение долгого време¬
ни, уровень холестерина составляет 175—230 мг%. Временное
повышение содержания холестерина в крови может наступить
и при введении с пищей продуктов, богатых холестерином
(яичный желток, мозг, печень, почки, сливочное масло).
Свободный и эстерифицированный холестерин составляют
фракцию общего холестерина.
Методы определения общего холестерина подразделяются
на:
I. Колориметрические. Насчитывается около 150 колоримет¬
рических методов, основывающихся на реакциях образования
цветных комплексов:
1. Реакция Либерман — Бурхард (Либерман, 1885; Бурхард,
1890), при которой холестерин, взаимодействуя с уксусным ан¬
гидридом, уксусной и концентрированной серной кислотами,
дает изумрудно-зеленое окрашивание.
2. Реакция Калиани — Златкис — Зак, состоящая в появле¬
нии фиолетового окрашивания при взаимодействии холестерина
с хлористым железом, уксусной и серной кислотами.
3. Реакция Чугаева (1900), для которой характерно возник¬
новение красного окрашивания при взаимодействии холесте¬
рина с ацетилхлоридом и хлористым цинком.
4. Реакция Биоля и Крофта: появление красного окрашива¬
ния при взаимодействии холестерина с персульфатом калия,
уксусной и серной кислотами.
5. Реакция Ригли (1964): образование комплекса фиолето¬
вого цвета при взаимодействии холестерина с реактивом, со¬
стоящим из серной кислоты и метилового спирта.
II. Нефелометрические методы, основанные на сравнении
степени мутности стандартного и исследуемого растворов.
III. Титрометрические методы.
IV. Флюориметрические методы, позволяющие определять
холестерин в микрообъемах сыворотки крови (например в
0,02 мл ее).
155

V. Газохроматографические и хроматографические методы.
VI. Гравиметрические методы.
Для определения общего холестерина в клинико-диагности¬
ческих лабораториях применяются, главным образом, колори¬
метрические методы, основанные на первых двух реакциях:
Либерман — Бурхард и Калиани — Златкис — Зак.
Методы, состоящие в использовании предложенной более
80 лет тому назад реакции Либерман — Бурхард, условно
можно разделить на непрямые и прямые. Непрямые методы
получили свое название оттого, что определение холестерина
по ним проводят лишь после извлечения из сыворотки холесте¬
ринового экстракта.
В нашей стране наиболее широкое признание из непрямых
методов получили методики Энгельгарда — Смирновой и Рап¬
попорт — Энгельберга.
В прямых же методах холестерин предварительно не экстра¬
гируют, а цветную реакцию проводят непосредственно с сыво¬
роткой крови. Из них заслуживают внимания методы Илька,
Мрскоса и Товарека и Златкис — Зака.
Метод Илька и метод Мрскоса и Товарека (отличающийся
от первого применением сульфосалициловой кислоты, усили¬
вающей диспергирующее белки действие уксусного ангидрида)
равнозначны по точности и по техническому исполнению. В ка¬
честве основного унифицированного утвержден метод Илька
(в силу его большой популярности и в связи с тем, что риж¬
ский завод «Реагент» наладил широкий выпуск готовых набо¬
ров для определения холестерина по этому способу).
Метод определения общего холестерина
в сыворотке крови, основанный на реакции
Либерман — Бурхард (метод Илька)
Принцип. Холестерин в присутствии уксусного ангидрида и
смеси уксусной и серной кислот дает зеленое окрашивание.
Реактивы. 1. Реактив Либерман — Бурхард, представляю¬
щий смесь одной части ледяной уксусной кислоты, 5 частей ук¬
сусного ангидрида и одной части концентрированной серной
кислоты, выдерживающей пробу Саваля. Ввиду того что реак¬
ция идет с выделением тепла, колбу постоянно охлаждают, а
серную кислоту добавляют в нее в последнюю очередь, очень
медленно, при постоянном помешивании. Полученная смесь
должна быть прозрачной бесцветной или слегка желтоватой.
Ее переливают в склянку темного стекла с притертой пробкой
и хранят в холодильнике. При несоблюдении последовательно¬
сти добавления реактивов и без охлаждения колбы смесь полу¬
чается темно-желтой и, следовательно, является не пригодной
к употреблению.
156

ТАБЛИЦА 27
Данные к построению
калибровочного графика для определения холестерина
№ про¬
бирок
Количество стан¬
дартного раствора
холестерина, мл
Количество
реактива 1,
мл
Количество хо¬
лестерина в про¬
бе, мг
Концентрация
холестерина,
мг%
1
0,05
2,15
0,09
90
2
0,10
2,10
0,18
180
3
0,15
2,05
0,27
270
4
0,20
2,00
0,36
360
5
0,25
1,95
0,45
450
2. Стандартный (180 мг%) раствор холестерина. На анали¬
тических весах отвешивают 180 мг холестерина, навеску рас¬
творяют в 2,5 мл хлороформа, количественно полностью пере¬
носят в мерную колбу емкостью 100 мл, объем которой дово¬
дят до метки абсолютным этиловым спиртом. Приготовленный
раствор хранят в склянке темного стекла с притертой проб¬
кой (с дополнительной герметизацией парафином) в хо¬
лодильнике. 1 мл его содержит 1,8 мг холестерина. Раст¬
вор нестойкий.
3. Абсолютный этанол (приготовление его описано в гла¬
ве XI, с. 301).
4. Хлороформ, х. ч. или для наркоза.
Ход определения. К 2,1 мл реактива Либерман — Бурхард
(1) осторожно, очень медленно добавляют 0,1 мл негемолизи-
рованной сыворотки так, чтобы она стекала по стенке пробир¬
ки. Пробирку при этом энергично встряхивают 10—12 раз, пос¬
ле чего термостатируют 20 мин при +37° С. Затем колоримет-
рируют против реактива 1 на ФЭКе при красном светофильтре
(630—690 нм) в кювете шириной 5 мм.
Построение калибровочного графика. Из стандартного рас¬
твора холестерина готовят ряд разведений (табл. 27).
Полученные стандартные пробы обрабатывают так же, как
и опытные, т. е. энергично встряхивают, помещают в термо¬
стат, после чего колориметрируют. Калибровочный график
строят по цифрам экстинкций приготовленных стандартных
растворов.
Для перевода величины содержания холестерина в стан¬
дартной пробе, выраженной в мг, в значения концентрации
(в м г %) общее количество холестерина, заключенное в каждой
из стандартных проб, умножают на 1000, так как сыворотку
в опыт берут 0,1 мл, а расчет ведут на 100 мл ее.
157

Примечания; 1. Все пробирки и пипетки должны быть
сухими.
2. Сыворотка крови не должна иметь следов гемолиза.
3. Появление мути может быть вызвано только наличием
воды в реактиве или в посуде.
4. Сыворотку надо добавлять очень медленно, по стенке
пробирки: только тогда получается чистое изумрудное окра¬
шивание. При быстром приливании сыворотки появляется при¬
месь желтого цвета и в связи с этим возникают более высокие
значения экстинкций.
5. Смесь нужно обязательно термостатировать (как это ре¬
комендует Ильк), а не оставлять при комнатной температуре
на 20 мин, в противном случае могут получиться более низкие
показатели оптической плотности.
Норма содержания холестерина в сыворотке крови—115—
240 мг% (в среднем 165 мг%).
Микрометод прямого определения
свободного и общего холестерина
в сыворотке крови (по Н. Станкевичене)
Принцип раздельного определения свободного и общего хо¬
лестерина основан на реакции взаимодействия цветного реак¬
тива с холестерином одной и той же пробы сыворотки крови
при различных температурных условиях.
Реактивы. 1. Цветной реактив. Для его приготовления заго¬
товляют 0,1% раствор хлорного железа (FeCl3* 6Н20) в ледяной
уксусной кислоте, свободной от окисляющих веществ и альде¬
гидов (см. примечание).
3 части полученного раствора смешивают с 2 частями кон¬
центрированной серной кислоты (х. ч.) и охлаждают до ком¬
натной температуры. Хранят в склянке с притертой пробкой
(для предохранения содержимого от влаги воздуха). Реактив
годен к употреблению в течение 3-х месяцев.
2. Стандартный раствор холестерина (200 мг%).
100 мг чистого холестерина растворяют в небольшом коли¬
честве ледяной уксусной кислоты, охлаждают и доводят объем
до 50 мл.
Метод включает в себя два этапа: вначале определяется
свободный холестерин, потом — суммарное количество свобод¬
ного и связанного холестерина.
Ход определения. В пробирку отмеривают 2 мл цветного ре¬
актива, после чего пипеткой Сали (микропипеткой) осторожно
наносят на стенку пробирки 0,02 (или 0,04) мл сыворотки или
плазмы крови (без следов гемолиза!). Содержимое пробы хо¬
рошо перемешивают и оставляют стоять на 1 ч при +20° С (!).
Измерение оптической плотности производят на ФЭКе в кюве¬
те шириной 5 мм, при зеленом светофильтре (560 нм) против
158

цветного реактива. После определения экстинкции свободного
холестерина реакционную смесь не выливают, а используют
для дальнейшего определения.
Пробирку помещают в кипящую водяную баню до того вре¬
мени, пока вода в бане, перестав кипеть после погружения в
нее пробирок, вновь закипит (на что уходит обычно 30—60 с).
Пробирки извлекают, охлаждают до комнатной температуры
и определяют на фотоэлектроколориметре экстннкцию общего
холестерина аналогичным способом.
Параллельно обрабатывают 0,02 (0,04) мл стандартного
раствора холестерина.
Расчет строят по формуле:
Е свободного (общего) холестерина в пробе • 200 (мг%)
Е стандарта '
Пример. Предположим, что при колориметрировании опыт¬
ных и стандар^тных проб получены следующие значения опти¬
ческой плотности: 0,14 — экстинкция (Е) стандарта (200 мг%
раствора холестерина);
0,08 — экстинкция свободного холестерина пробы;
0,24 — экстинкция общего холестерина пробы.
Тогда концентрация свободного холестерина составит (0,08 •
* 200)/0,14=114 мг%, а концентрация общего холестерина —
(0,24-200)/0,14 = 342 мг%.
В норме содержание общего холестерина у людей старше
30 лет колеблется в пределах 150—250 мг%, свободного холе¬
стерина 40—90 мг% (составляя примерно 1/3 от общего холе¬
стерина).
Примечания. 1. Приготовление гидрата хлорного же¬
леза.
а) FeCl3 ‘ 6 Н20 можно получить, дав безводной соли рас¬
плыться на воздухе, поместив ее после этого на длительное вре¬
мя в эксикатор, где она выдерживается над концентрированной
H2S04.
б) по Энгелю, для получения весьма чистого препарата
хлорного железа продукт обрабатывают газообразным хлори¬
стым водородом; при этом соль расплывается. Прозрачную
жидкость сливают с осадка основной соли и помещают в экси¬
катор над твердым КОН, где она вскоре затвердевает в кри¬
сталлическую массу.
2. Освобождение уксусной кислоты от альдегидов.
В промышленной уксусной кислоте постоянно присутствует
небольшое количество альдегидов, которые с некоторыми ком¬
понентами сыворотки крови способны легко образовывать гид-
роксамовые кислоты. Эти же соединения с хлорным железом да¬
ют красное окрашивание (Анджели — Римини реакция), что мо¬
жет завысить результаты определения холестерина в сыворот¬
ке крови.
159

Чтобы получить ледяную уксусную кислоту, свободную от
альдегидов, к ней добавляют сухой порошок перманганата ка¬
лия КМп04 и после тщательного размешивания плотно закры¬
вают стеклянной пробкой, оставляя стоять на несколько суток.
Затем ледяную уксусную кислоту перегоняют (температура ки¬
пения ее +118,1° С). В ходе дистилляции первую и последнюю
порцию уксусной кислоты отбрасывают.
Клинико-диагностическое значение. Холестерин может на¬
капливаться в крови в больших количествах при нарушении
жирового обмена. Длительная гиперхолестеринемия при изме¬
ненных условиях растворимости холестерина приводит к раз¬
витию атеросклероза вследствие отложения в стенках артерий
преимущественно связанного холестерина с последующим обра¬
зованием атероматозных бляшек. Резко увеличивается содер¬
жание холестерина и в органах, подвергающихся жировому пе¬
рерождению.
Увеличение концентрации холестерина (гиперхолестерине¬
мия) отмечается также при механической желтухе, нефрите и
нефрозах, сопровождаемых отеками, сифилисе, гипотиреозе, ави¬
таминозе группы «В» и т. д. Очень высокое содержание холе¬
стерина в крови наблюдается при сахарном диабете и липоид-
ном нефрозе, достигая 1000 мг% и выше.
Уменьшение концентрации холестерина (гипохолестерине-
мия) обнаружено при анемиях, туберкулезе, лихорадочных со¬
стояниях, сыпном тифе, гипертиреозе, голодании, раковой ка¬
хексии, паренхиматозной желтухе, поражении центральной
нервной системы.
Состояние эндокринного баланса в организме оказывает су¬
щественное влияние на уровень холестерина в крови. Так, вве¬
дение инсулина снижает содержание холестерина. Аналогичное
действие производит и гормон щитовидной железы: при недо¬
статочности функции щитовидной железы наблюдается гипер¬
холестеринемия. Лечение же больных микседемой гормональ¬
ными препаратами щитовидной железы ведет к снижению
концентрации холестерина в крови. Кастрация вызывает гипер-
холестеринемию, при этом введение половых гормонов уменьша¬
ет уровень холестерина в крови.
Определение различных фракций холестерина (общего, сво¬
бодного, связанного) значительно расширяет диагностические
возможности исследования липйдного обмена. Считают, что
установление коэффициента эстерификации (т. е. отношения
эфирно-связанного к общему холестерину, в норме составляю¬
щего 0,6—0,8, или 60—80%) служит важной функциональной
пробой печени, в которой происходит образование эфиров холе¬
стерина. Он снижается уже при малейших признаках патологии
печени. При механических желтухах возрастает уровень либо
одного свободного холестерина, либо свободного и связанного.
Понижение содержания эфиров холестерина имеет место при
гепатитах, причем это снижение пропорционально степени нару¬
160

шения функции печени, резкое же уменьшение их содержания
является плохим прогностическим симптомом и говорит о на¬
ступлении недостаточности печени.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩИХ
ФОСФОЛИПИДОВ В КРОВИ
Фосфолипиды (фосфатиды) представляют собой группу ли¬
пидов, содержащих помимо фосфорной кислоты (в качестве
обязательного компонента) также спирт (обычно глицерин),
жирные кислоты и азотистые основания. По природе спирта
фосфолипиды можно разделить на фосфоглицериды, фосфо-
сфингозины и фосфоинозитиды.
В то время, когда не было известно о существовании от¬
дельных фракций фосфолипидов, общие фосфолипиды отождест¬
влялись с лецитином. В настоящее же время доказано, что ле¬
цитин составляет хотя и большую (66±9%), но все-таки часть
фосфолипидов, включающих в себя также сфингомиелин (22±
±5%), лизолецитин (9±7%) и кефалин (3+1%); поэтому в
клинической практике правильнее говорить об определении не
лецитина, а общих фосфолипидов.
Об общей концентрации фосфолипидов обычно судят по
содержанию в них липидного фосфора, на долю которого при¬
ходится 4% молекулярного веса фосфолипидов. Поэтому, умно¬
жая найденное в результате исследования количество липидно¬
го фосфора на 25, рассчитывают содержание общих фосфоли¬
пидов.
Липидный фосфор может быть определен либо в липидном
экстракте, либо после осаждения белков сыворотки трихлорук-
сусной кислотой. В последнем случае вместе с белками осаж¬
даются и фосфолипиды. Полученный осадок используется для
определения в нем содержания фосфора (метод Зильверсмита
и Дэвиса и различные его модификации).
Обычно результаты определения липидного фосфора по его
содержанию в белковом осадке оказываются ниже, чем при
анализе липидного экстракта, поскольку в экстракт переходит
и ряд других соединений.
Из органических растворителей для получения липидного
экстракта пользуются спирто-эфирной смесью Блюра или ме-
таиольной смесью Фольча.
В качестве унифицированного предложен метод определения
общих фосфолипидов сыворотки по содержанию общего фосфо¬
ра в липоппотеидах, осаждаемых трихлоруксусиой кислотой
(метод Зильверсмита и Дэвис, 1950), так как он более прост,
чем метод Блюра, менее трудоемок и занимает при этом мень¬
ше времени.
6 Зак. 2615
161

Определение общих фосфолипидов
d сыворотке крови по содержанию в них фосфора
Принцип. Фосфолипиды осаждаются трихлоруксусной кис¬
лотой (вместе с белками крови). В полученном осадке колори¬
метрически определяется содержание фосфора.
Реактивы. 1. 10% раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 57% раствор хлорной (HCIO4) кислоты. Можно брать рас¬
твор любой другой близкой концентрации НС104.
3. 4% раствор молибденовокислого аммония.
4 г измельченного химически чистого молибдата аммония рас¬
творяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор сохраняется
в холодном месте в течение нескольких недель.
4.Основной раствор аминонафтолсульфоновой кислоты — эи-
коногена. Для его приготовления в 100—150 мл дистиллирован¬
ной воды растворяют (полностью) 30 г бисульфита натрия
(NaHS03), после чего в раствор добавляют 0,5 г эйконогена.
Раствор помешивают стеклянной палочкой до полного раство¬
рения эйконогена. Отдельно в небольшом количестве воды рас¬
творяют 6 г безводного сульфита натрия. Оба раствор?, смеши¬
вают и объем доводят водой до 250 мл. Через 2—3 ч раствор
фильтруют. Хранят в холодильнике и посуде из темного стекла.
Реактив стоек в течение месяца. Перед определением 10 мл
осиозного раствора разводят дистиллированной водой в 2,5 ра¬
за. При отсутствии эйконогена в качестве восстанавливающего
реактива можно воспользоваться раствором аскорбиновой кис¬
лоты или гидрохинона (см. примечание).
5. Основной стандартный раствор однозамещенного фосфор¬
но-кислого калия.
4,39 г К2НРО4, высушенного до постоянного веса при темпе¬
ратуре + 120° С, (5,75 г К2НРО4 • 3 НгО), растворяют в 1 л ди¬
стиллированной воды, добавляют 1 каплю хлороформа (в каче¬
стве консерванта).
В 1 мл полученного раствора содержится 1 мг фосфора.
6. Рабочий стандартный раствор готовят разведением основ¬
ного стандартного раствора фосфата в 100 раз. 1 мл его содер¬
жит 0,01 мг фосфора.
Оба раствора хранят в холодильнике.
Ход определения. 0,2 мл сыворотки помещают в пробирку,
содержащую 3 мл воды. Добавляют 3 мл 10% трихлоруксусной
кислоты (первые 1,5 мл по каплям, встряхивая пробирку, ос¬
тальные более быстро). Оставляют стоять на 1—2 мин, затем
центрифугируют несколько (3—5) мин до образования осадка.
Надосадочную жидкость сливают и переворачивают пробирку,
пока не стечет вся жидкость. К осадку добавляют 1 мл 57%
НСЮ4 и для ровного кипения 1—2 стеклянные бусинки. Пробир¬
ку прогревают в песчаной (температура +180° С) бане или на
прокаленном листе асбеста (положенном на электроплитку) до
обесцвечивания смеси. Опыт нашей работы показывает, что
162

лучше всего пробирки ставить в холодную песчаную баню и
лишь потом ее нагревать: это, как правило, позволяет исклю¬
чить «стрельбу» пробирок. Рекомендуется наблюдать за про¬
цессом, пока не пройдет образование пены. Сразу же после
сжигания в пробирки добавляют 5 мл воды. Во время описан¬
ной выше реакции готовят контроль на реактивы, содержащий
0,8 мл 57% НСЮ4, и три стандарта, содержащих по 0,8 мл
57% НС104 и по 2 мл рабочего фосфатного стандарта. Контроль¬
ную и стандартную пробы доводят водой до 6 мл.
Пробы располагаются в следующем порядке: контрольная,
2 стандартные, опытная, стандартная.
В каждую пробирку прибавляют по 1 мл 4% молибдата ам¬
мония, перемешивают и приливают по 1 мл раствора эйконоге¬
на, доводя объем водой до 10 мл. Содержимое пробирок вновь
перемешивают. Через 20 мин после добавления эйконогена про¬
бы колориметрируют при красном светофильтре в кювете шири¬
ной 10 мм против контроля.
I-, п о , , Еоп 0,02 • 100 Е0п in
Расчбт. Липоидныи фосфор— g * q g *
=мг%,
где 0,02 — количество мг фосфора, содержащего в 2 мл стан¬
дарта (1 мл рабочего стандартного раствора содер¬
жит 0,01 мг Р);
0,2 — объем сыворотки или плазмы, мл.
Умножением содержания липоидного фосфора на 25 полу¬
чают значения концентрации фосфолипидов.
Для выражения результата в мг% прибегают к расчету по
следующей формуле:
п Еоп • Сст(0,02) • 500 • 25 Еоп осл л. л.
Сх = —^ CTV - ■ • 250 = мг% общих фосфо-
CqT ст
рипидов,
где 500 — коэффициент, используемый для расчета концентра¬
ции фосфора в мг% (т. е. для выражения содержа¬
ния фосфора в 100 мл сыворотки);
25 — коэффициент пересчета концентрации фосфора в кон¬
центрацию общих фосфолипидов.
Примечание. При отсутствии эйконогена определение
фосфора можно проводить с другими восстанавливающими ве¬
ществами, например, с 1% водным раствором аскорбиновой кис¬
лоты (готовят перед употреблением) или с 1% раствором гид¬
рохинона. Эйконоген может быть заменен и метолом.
У здоровых взрослых людей концентрация липоидного фос¬
фора составляет от 6,1 до 14,5 мг%, среднее — 9,2 мг%.
Клинико-диагностическое значение. Повышение уровня фос¬
фолипидов в сыворотке крови наблюдается: при тяжелой фор¬
ме сахарного диабета, нефрозах, хронических нефритах, эссен-
циальной гиперлипемии, застойной желтухе, постгеморрагиче-
ских анемиях, печеночной коме и др.
Снижение уровня фосфолипидов отмечается: при атероскле¬
6*
163

розе, малокровии, острых лихорадочных состояниях, алимен¬
тарной дистрофии, истощении и т. д. При атеросклерозе коэф¬
фициент фосфолипиды/холестерии понижается.
В последние годы все большее внимание уделяется опре¬
делению триглицеридов в сыворотке крови, для чего использу¬
ются: косвенные (вычислительные), химические, энзиматиче¬
ские и хроматографические методы. Первые основываются на
разнице результатов оп : -гения различных липидных фрак¬
ций (общих липидов, холестерина, фосфатидов). Применение
этих методов ограничено, так как они сложны, включают много
операций, каждая из которых может быть источником ошибок.
Все химические методы, состоящие в экстракции липидов, ад¬
сорбции фосфолипидов, гидролизе триглицеридов с освобожде¬
нием глицерина, окислении его до формальдегида и колоримет¬
рическом определении формальдегида, различают лишь по
используемой цветной реакции. Для этой цели обычно приме¬
няют две реакции: с хромотроповой кислотой (реакция Лам¬
берт и Нейш, на которой основаны равнозначные методы Карл¬
сона и Гандель, Зильверсмит) и с ацетилацетоном (предло¬
женная Гантшем). Энзиматические методы, основывающиеся
на определении глицерина после щелочного омыления жиров
сыворотки удобны (исключают экстракцию липидов, адсорб¬
цию фосфолипидов), специфичны и исключительно точны, но
требуют много дефицитных и дорогостоящих реактивов. Хрома¬
тографические способы определения позволяют выявлять наря¬
ду с триглицеридами многие другие фракции общих липидов.
У нас сложилось представление, что наиболее удобным для
использования в клинико-диагностических лабораториях явля¬
ется описанная ниже модификация метода Гандель и Зильвер¬
смит.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО ЦВЕТНОЙ РЕАКЦИИ
С ХРОМОТРОПОВОЙ КИСЛОТОЙ
Принцип. Триглицериды гидролизуются с освобождением
глицерина, который окисляется перйодатом натрия до формаль¬
дегида. Образующиеся при этом йодаты и непрореагировавшие
перйодаты восстанавливаются избытком бисульфита натрия,
после чего формальдегид определяют по цветной реакции с хро¬
мотроповой кислотой.
Реактивы. 1. Хлороформ х. ч. или для наркоза.
2. Метанол, х. ч.
3. 0,4% спиртовой (этанольный) раствор КОН (готовят ех
tempore).
4. 0,5% раствор перйодата натрия (натрия йоднокислого,
NaI04). 0,5 г перйодата натрия растворяют в мерной колбе на
100 мл в небольшом количестве воды и доводят дистиллирован¬
ной водой до метки. Раствор стабилен около года при хранении
при комнатной температуре в посуде из темного стекла.
164

5. 5% раствор бисульфита натрия. 5 г бисульфита натрия
(или метабисульфита натрия) растворяют в 100 мл дистиллиро¬
ванной воды. Реактив стабилен при хранении при комнатной
температуре в течение месяца.
6. Раствор хромотроповой кислоты. 1 г чистой динатриевой
соли хромотроповой кислоты (1,8-диоксинафталин-3,6-дисульфо-
новой кислоты динатриевой соли) растворяют в 100 мл дистил¬
лированной воды; раствор фильтруют, добавляют 300 мл кон¬
центрированной серной кислоты и 150 мл дистиллированной во¬
ды. Реактив стабилен в течение 3-х недель при хранении в холо¬
дильнике, в посуде из темного стекла.
7. 0,7 М раствор серной кислоты. К небольшому количеству
дистиллированной воды, внесенной в мерную колбу на 100 мл,
добавляют 3,7 мл серной кислоты, смешивают и после охлаж¬
дения доводят объем дистиллированной водой до метки.
8. Кремниевая кислота водная, очищенная и активирован¬
ная. К 500 г кремниевой кислоты (водной, ч. или ч. д. а.) до¬
бавляют 2 л дистиллированной воды, тщательно размешивают
и оставляют стоять полученную суспензию на 1 ч. Верхний слой
отсасывают водоструйным насосом, нижний слой фильтруют
(фильтрование можно производить и сразу). Кремниевую кис¬
лоту промывают 3 раза абсолютным метанолом и несколько
раз хлороформом. Очищенную кремниевую кислоту активируют
в сушильном шкафу при температуре +110° С в течение 12 ч.
Хранят в герметично закрытой посуде. Перед работой кремние¬
вую кислоту вновь активируют в течение 1 ч при температуре
+ 100° С.
9. Основной стандартный раствор трибутирина (200 мг%).
200 мг трибутирина растворяют в небольшом количестве хлоро¬
форма в мерной колбе на 100 мл и доводят хлороформом до
метки.
Ход определения. Опытная проба. В пробирку с притертой
пробкой вносят 0,5 г активированной кремниевой кислоты,
0,5 мл сыворотки (или плазмы) и 10 мл хлороформа. Смесь
энергично встряхивают и оставляют при комнатной температу¬
ре на ночь или на сутки (можно и на 4 ч). Затем содержимое
цробирки еще раз встряхивают и фильтруют через бумагу, про¬
мытую хлороформом. Экстракт выпаривают досуха и растворя¬
ют его в 0,5 мл добавленного хлороформа. Начиная с этого эта¬
па ставят стандартную и контрольную пробы, внося в отдель¬
ные, чистые пробирки 0,5 мл раствора стандарта и 0,5 мл
хлороформа (соответственно). В каждую пробирку добавляют
по 0,5 мл 0,4% раствора КОН и содержимое их помещают на
20 мин в водяную баню, нагретую до температуры +60, +70° С.
После этого в пробирки вносят по 0,5 мл 0,7 М раствора H2S04
и помещают их (на половину длины) в кипящую водяную баню
до тех пор, пока не исчезнет запах алкоголя (на что обычно
уходит 20 мин). Пробирки охлаждают и добавляют в каждую
из них 0,05 мл (1 каплю) 0,5% раствора перйодата натрия,
165

встряхивают, и через 10 мин вносят по 1 капле 5% раствора
бисульфита натрия, еще раз перемешав содержимое пробирки.
Спустя 10 мин добавляют по 5 мл хромотроповой кислоты и
пробирки энергично встряхивают (пока раствор не станет про¬
зрачным). Затем их помещают на 30 мин в кипящую водяную
баню для развития окраски, интенсивность которой измеряют
против контроля на реактивы в кювете ФЭКа шириной 3 мм
при зеленом светофильтре (500—560 нм).
Расчет производят по формуле:
Содержание триглицеридов в мг=Е0п/Ест '200,
где Еоп и Ест—экстинкция опытной и стандартной проб;
200 — концентрация стандартного раствора трибутирина
в мг%.
Норма содержания триглицеридов в сыворотке крови — 50—
150 мг%.
Примечания. 1. Исследование необходимо проводить
строго натощак после 12-часового голодания.
2. Пробирки для работы должны быть абсолютно чистыми
и сухими. Необходимо после обычного мытья тщательно про¬
поласкивать их дистиллированной водой и спиртом (этанолом
или метанолом).
Клинико-диагностическое значение. Увеличение концентра¬
ции нейтральных жиров (гипертриглицеридемия) наблюдается
при эссенциальной гиперлипемии и при первичной (семейной)
гиперлипопротеидемии. Считают, что определение триглицери¬
дов является одним из решающих показателей для диагностики
отдельных типов врожденного нарушения обмена липидов.
Симптоматическое увеличение концентрации триглицеридов
наблюдается при беременности, диабете, панкреатите, нефроти¬
ческом синдроме, гипотиреозе, жировой инфильтоации и при
ряде других заболеваний печени (желчный ц::рроз), при атеро¬
склерозе.
СОСТАВ И СВОЙСТВА
ЛИПОПРОТЕИДОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ
Большинство липидов обнаруживаются в крови не в свобод¬
ном состоянии, а в составе белково-липидных комплексов
(представленных, в частности, хиломикронами, а-, Р-липопро-
теидами), для разделения которых с успехом могут быть ис¬
пользованы, например, методы электрофореза. Состав и некото¬
рые константы липопротеидов сыворотки крови отражены в
таблице 28. Фракции липопротеидов отличаются не только мо¬
лекулярным весом, но и процентным содержанием отдельных
липидных компонентов. Так, для а-липопротеидов, содержащих
большое количество белка, характерен и более высокий удель¬
ный вес. Что касается р- и пре-Р-липопротеидов, то в связи со
166

ТАБЛИЦА 23
Состав и некоторые свойства
липопротеидов сыворотки крови
Типы липопротеидоп
52
а-липопроте-
иды (ЛВП)
В-липопроте-
иды (ЛНГ1)
пре-0-липопро-
теиды (ЛОНП)
И
§ О
* а.
X !й
Удельный вес
1,063—1,21
1,01 — 1.063
1,01—0,93
0,93
Молекулярный вес
липопротеидов
от 180 ООО
до 380 000
2 200 000
3 000 000—
128 000 000
—
Размер молекул и
частиц, А
70—100
100—300
2000
>2000
Всего белков, %
50—57
21—22
5—12
2
Всего липидов, %
43—50
78—79
88—95
98
Свободный холесте¬
рин, %
2—3
8—10
3—5
2
Эстерифицированный
холестерин, %
19—20
36—37
10—13
4—5
Фосфолипиды, %
Холестерин (общий)
фосфолипиды
22—24
1,0
20—22
2,3
13—20
0,9
4—7
1,1
Триглицериды, %
4—8
11 — 12
Е0—60
84—87
значительным содержанием в них липидов (достигающим
95% от всего молекулярного веса) удельный вес их оказыва¬
ется сравнительно низким, поэтому становится возможным
разделение упомянутых липопротеидных фракций различными
методами.
Для выделения отдельных фракций липопротеидов широко
используются методы электрофореза на бумаге, ацетилцеллю¬
лозе, а также в агаровом, крахмальном, полиакриламидном
гелях. Разделение липопротеидов (ЛП) предварительно окра¬
шенной сыворотки крови методом дискового электрофореза в
4-слойном полиакриламидном геле (по Е. Я. Маграчевой, 1973)
позволяет выявить до 6 фракций Л П. При этом хиломикроны
остаются на старте, затем следует отсутствующая в норме
фракция пре-Р-ЛП. На границе 3 и 5% гелей располагаются
1—2 полосы Р-ЛП.
При электрофорезе в полиакриламидном геле пре-Р-ЛП
движутся медленнее, чем Р-ЛП (в отличие от электрофореза на
бумаге, агарозе и крахмале, где пре-Р-ЛП находятся между
Р-ЛП и а-ЛП). На границе 5—10% гелей расположены 2 поло¬
сы а-ЛП, а самая нижняя полоса, слабо окрашенная, пред¬
ставляет собой комплекс альбумина с неэстерифицированными
жирными кислотами. Количественный учет всех выявленных
167

фракций нами производился путем обработки денситограмм,
полученных при записи диск-электрофореграмм липопроте-
идов сыворотки крови на микроденситометре в проходящем
свете.
Липопротеиды могут быть разделены и путем ультра¬
центрифугирования в солевых растворах различной плотности.
При этом выделяются хиломикроны и липопротеиды разной
плотности: очень низкой (ЛОНГ1, пре-р-липопротеиды), низкой
(ЛНП-Р-липопротеиды), высокой (ЛВП, а-липопротеиды) и др.
Применяется также алкогольное фракционирование липо-
протеидов при низкой температуре (этаноловый метод Кона и
его модификации).
Для обнаружения хиломикронов ВОЗ рекомендует метод
наблюдения или выдерживания плазмы (1971). Он основывает¬
ся на том, что при содержании хиломикронов или пре-Р-липо-
протеидов (ЛОНП) в плазме в концентрации 300 мг% и более
из-за рассеяния частицами света проба делается мутной или
приобретает молочную окраску. Если плазму содержать в про¬
бирке при 0—4° С в течение 18—24 ч, то хиломикроны подни¬
маются на поверхность, образуя видимый слой кремообразного
вещества. Пре-Р-липопротеиды (ЛОНП) остаются во взвешен¬
ном состоянии, что делает пробу мутной во всем объеме про¬
бирки, и это диффузная мутность свидетельствует о повышен¬
ной концентрации пре-Р-липопротеидов (ЛОНП).
Иммунохимические методы определения липопротеидов, ра-
диоиммунное определение и изоэлектрическое фокусирование
большого распространения не получили.
Гораздо большее применение нашли химические (турбиди-
метрические) методы определения концентрации липопротеи¬
дов.
Большинство из них основывается на образовании гепарин-
липопротеинового комплекса, способного осаждаться без де¬
натурации в присутствии некоторых электролитов: хлористого
кальция (Бурштейн и Самай, 1956) или хлористого марганца
(О. Н. Никольская и В. П. Тихонов, 1968). В первом случае
осаждаются почти чистые Р-липопротеиды, во втором — вся
фракция липопротеидов. По разнице этих определений можно
найти содержание а-липопротеидов. Наибольший интерес для
клиники представляет весьма простой и доступный любой ла¬
боратории турбидиметрический метод определения Р-липопро-
теидов по Бурштейну и Самай, который в настоящее время
является унифицированным. Нужно лишь отметить, что по
мнению ряда авторов гепарин способен осаждать не только
Р-, но и пре-Р-липопротеиды (и даже хиломикроны). Кроме не¬
го, в качестве осаждающего средства можно применять декст-
ран-сульфат, амилопектин, поливинилпирроладин и другие ве¬
щества. Однако эти методы не получили широкого распростра¬
нения.
К турбидиметрическим способам относятся и непрямые ме¬
168

тоды определения липопротеидов, которые цключают в себя
определение Р-липопротеидов по Бурштейну и Самай и холесте¬
рина — по реакции Либермана — Бурхарда (метод Илька с сотр.
и др.) - Применение в них различных коэффициентов часто при¬
водит к ошибочным результатам.
Разделение липопротеидов
методом электрофореза на бумаге
Техника постановки электрофореза липопротеидов на бума¬
ге мало чем отличается от таковой, используемой при электро¬
форетическом разделении белков. Однако для фракционирова¬
ния липопротеидов берут в 2—3 раза большее количество сыво¬
ротки, поскольку липиды окрашиваются труднее, чем белки.
Обычно для проведения электрофореза рекомендуется упот¬
реблять 0,05 мл сыворотки. Желательно ставить две параллель-
ные пробы, из которых одна служит для выявления белков (что
облегчает установление липопротеиновых фракций).
После высушивания бумажных лент их окрашивают раство¬
рами различных жирных красителей, каковыми являются, на*
пример, судан черный, судан II, III, IV, осмиевая кислота и др.
В лабораториях преимущественно используют судан черный Б.
Большую часть красителей применяют в 50—60% водноспирто¬
вом растворе.
В последнее время ряд авторов предлагает прибавлять кра¬
ситель (судан черный) к испытуемой сыворотке перед прове¬
дением бумажного электрофореза.
В липопротеидограмме, полученной методом электрофореза
на бумаге, обычно различают три основных зоны.
Первая зона находится в месте расположения а-глобулинов
(а-липопротеиды), вторая — в области Р-глобулинов (р-липо-
протеиды), третья — недалеко от черты нанесения сыворотки
(в зоне у-глобулинов). Последняя содержит хило-и липомикро-
ны, которые не передвигаются под влиянием электрофореза, и
называется липидным остатком.
Во фракции а-липопротеинов сосредотачивается около
2/з фосфолипидов и около 40% холестерина; во фракции Р-липо-
протеидов находится около 60% холестерина и около Уз фос¬
фолипидов. Липидный остаток представлен преимущественно
нейтральными жирами. Примечательно, что добавление к веро-
нал-мединаловому буферному раствору pH 8,6 (с. 170) 1% (от
объема буфера) кристаллического человеческого альбумина и
трилона Б (из расчета 0,37 г на 1 л раствора) улучшает каче¬
ство разделения, позволяя получить и фракцию пре-Р-ЛП. Весь¬
ма хорошее разделение происходит и при применении буфера
ТЭБ (трис-ЭДТА-борная кислота), в особенности, если к нему
добавить И/о бычьего альбумина.
169

Определение липопротеидов
в сыворотке крови методом электрофореза
ка бумаге (по Свану, 1953; Л. К. Бауман,
1961 в видоизменении В. Г. Колб, 1970)
Принцип метода сводится к электрофоретическому разделе¬
нию на фракции предварительно окрашенных Суданом черным
липопротеидов сыворотки крови с последующим определением
оптической плотности извлеченной краски и вычислением про¬
центного соотношения между а- и Р-липопротеидами.
Реактивы. 1. Веронал-мединаловый буфер pH 8,6; 10,32 г
мединала и 1,84 г веронала растворяют в 1 л дистиллирован¬
ной воды.
2. Насыщенный раствор Судана черного; 100 мг Судана чер¬
ного растворяют в 3 мл 96° этилового спирта (хранить в темной
склянке на холоду).
3. Смесь абсолютного этилового спирта с ледяной уксусной
кислотой в отношении 4:1.
4. Бумага ленинградской бумажной фабрики № 2 имени Во¬
лодарского «хроматографическая быстрая» или др.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл
свежеполученной (негемолизированной) сыворотки и добавля¬
ют 0,05 мл раствора Судана черного. При необходимости можно
увеличить или уменьшить количество сыворотки для анализа,
но соотношение 10 : 1 должно быть строго соблюдено. Пробу
перемешивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре.
Окрашенную сыворотку центрифугируют при 2500 об/мин в те¬
чение 30 мин, сливают с осадка и 0,05 мл ее наносят у катода,
на горизонтально расположенные полоски хроматографической
бумаги шириной 5 см, так, чтобы сыворотку не доводить до кра¬
ев ленты на 1 см. Лучше наносить окрашенную сыворотку ка
смоченные в веронал-мединаловом растворе ленты, просушен¬
ные между двумя листами фильтровальной бумаги.
Камеру закрывают и аппарат включают в сеть. Электрофо¬
рез проводят при напряжении 250—300 вольт и силе тока
0,25 шА на 1 см ширины полоски бумаги в течение 4—4,5 ч до
четкого разделения липопротеидов на фракции. По окончании
электрофореза ленты сушат на воздухе, затем в течение 15 мин
выдерживают в сушильном шкафу, предварительно нагретом
до +100° С. Вырезают первые две фракции (а- и Р-липопротеи-
ды) и измельчают на маленькие кусочки. Такой же кусочек
фона ленты берут для контрольной пробы. Каждую фракцию и
контроль переносят в отдельные пробирки, которые заливают
5 мл смеси этанола с уксусной кислотой и выдерживают в тече¬
ние 1 ч (периодически встряхивая). Колориметрируют на спект¬
рофотометре или ФЭКе при длине волны 595 нм в кювете ши¬
риной 5 мм. При отсутствии в ФЭКе желтого светофильтра (с
максимумом пропускания 595 нм) можно использовать крас¬
ный. Сумму экстинкций двух фракций принимают за 100%, а
170

каждой — за X. Результат выражается в относительных про¬
центах.
По данным В. Г. Колб, средние значения содержания а- и
Р-липопротеидов (при определении у 33 доноров) составляют
соответственно 28,5% и 71,5%.
Определение содержания
^-липопротеидов сыворотки крови
турбидиметрическим методом (по Бурштейну и Самай)
Принцип метода. В присутствии СаС12 и гепарина нарушает¬
ся коллоидная устойчивость белков сыворотки крови, в связи с
чем осаждаются почти чистые Р-липопротеиды. Считают, что
гепарин способен образовывать с Р-липоиротеидами комплекс,
который под действием хлористого кальция выпадает в осадок.
По степени помутнения раствора и судят о концентрации Р-ли¬
попротеидов в сыворотке.
Реактивы. 1. 0,28% (0,025 М) раствор СаС12. Этот раствор
может быть приготовлен из обычного ампульного раствора хло¬
ристого кальция путем доведения 9,7 мл истинно 10% СаС12
(19,4 мл 5% СаС12) дистиллированно!" водой до 350 мл. Следует
помнить, что большинство ампул содержат в себе 10% раствор
кристаллического хлористого кальция (СаС12 • 6Н20), который
фактически является 5% (к 1 мл 10% раствора добавляют 17 мл
воды).
2. Гепарин активностью 1000 ед в 1 мл (1% раствор).
Ход определения. В правую и левую кюветы фотоэлектро¬
колориметра (шириной 5 мм) вносят по 2 мл 0,28% раствора
СаС12 и, после прогревания прибора, устанавливают нулевую
точку ФЭКа при красном светофильтре (720 нм). Затем в пра¬
вую кювету приливают 0,2 мл сыворотки и после перемешива¬
ния стеклянной палочкой или полоской рентгеновской пленки
содержимого кюветы отмечают экстинкцию, которая обычно со¬
ставляет 0,01; 0,02; 0,03. Потом в эту же кювету добавляют
0,04 мл гепарина и после повторного перемешивания через
4 мин вновь отмечают экстинкцию (время засекают секундо¬
мером) .
Расчет. Результат выражают в ед экстинкции (Е = Еоп—Ен)
или в условных фотометрических ед, получаемых путем умно¬
жения значений экстинкции на 100.
В норме содержания p-липопротеидов в ед экстинкции со¬
ставляет 0,35—0,55 или 35—55 условных ед.
Примечания. 1. Кровь для исследования нужно брать
обязательно натощак.
2. Сыворотка стойка в течение 2-х суток при хранении ее в
холодильнике или при комнатной температуре.
3. В случае, если при измерении экстинкции не хватает шка¬
лы правого барабана, определение можно вести в 0,1 мл сыво¬
171

ротки (при последующем умножении конечного результата на
2) или на левом Оараоане Ф^К-М, Фс)К-Н-5/.
4. При исследовании линемических сывороток следует из¬
мерять мутность до и после добавления гепарина. Во всех ос¬
тальных случаях из показаний экстинкции опытных проб сразу
же вычитают 0,02 (среднее значение показания контрольной
пробы) или же от конечного результата, выраженного в услов¬
ных ед, отнимают 2 фотометрические ед. Это относится и к
желтушным сывороткам, которые благодаря значительному
разбавлению дают такую же поправку — 0,02 (2 ед).
Клинико-диагностическое значение исследования липопро¬
теидов в сыворотке крови. Установление у больного вида нару¬
шения липопротеидного обмена, т. е. типа гиперлипопротеиде-
мии, должно проводиться в соответствии с классификацией
Д. Фредриксона и соавторов (1965, 1971), в основу которой
положены не только характер фракционного распределения
липопротеидов, но и содержание в сыворотке больного тригли¬
церидов и холестерина. По классификации выделяют 5 типов
отклонения липидного обмена от нормы.
Тип 1 — гилерхиломикронемия — характеризуется наличием
большого количества хиломикронов, нормальным или слегка
повышенным содержанием пре-Р-липопротеидов и резким уве¬
личением уровня триглицеридов. Клинически проявляется ксан-
томатозом. Встречается редко, преимущественно в детском воз¬
расте. При стоянии в течение суток при температуре +4° С
«молочная» сыворотка становится прозрачной с обильным
«сливкообразным» слоем хиломикронов сверху (тест для обна¬
ружения хиломикронов: положителен, если хиломикроны или
ЛОНП (пре-Р-липопротеиды) присутствуют в пробе в концент¬
рации 300 мг% и более).
Тип II — гипер-р-липопротеидемия — обусловлен высоким
содержанием в крови Р-липопротеидов. Распадается на подти¬
пы П-а и П-б. Первый характеризуется высоким уровнем Р-ли¬
попротеидов, нормальным содержанием пре-Р-липопротеидов, а
также повышением уровня холестерина при нормальном содер¬
жании триглицеридов; второй сопровождается увеличением
содержания Р-липопротеидов, пре-Р-липопротеидов, холестери¬
на и триглицеридов.
Клинически тип II проявляется атеросклеротическими нару¬
шениями.
Тип III — гипер-Р и гипер-пре-Р-липопротеидемия. Эта «ши¬
рокополосная» Р-липопротеидемия сопровождается повышением
уровня холестерина и триглицеридов. Часто обнаруживается у
больных атеросклерозом, сочетающимся с развитием коронар¬
ной недостаточности.
Тип IV — гипер-пре-Р-липопротеидемия — обусловлен зна¬
чительным увеличением пре-Р-липопротеидов. Характеризуется
также повышением уровня триглицеридов при нормальном или
слегка увеличенном содержании холестерина. Выявляется у
172

больных диабетом, ожирением, ишемической болезнью
сердца.
Тип V — гипер-пре-Р-липопротеидемия с хиломикронеми¬
ей — характеризуется увеличением богатых триглицеридами
пре-Р-липопротеидов и хиломикронов. Содержание холестерина
и триглицеридов в крови увеличивается. При стоянии сыворот¬
ка расслаивается на верхний — сливкообразный, и нижний —
мутный, слои. Обнаруживается у больных, страдающих ксанто-
матозом, иногда выявляется и при скрытом диабете. Ишемиче¬
ской болезни при этом типе не наблюдается.
Типы гиперлипопротеидемии весьма удобно определить, ис¬
пользуя метод электрофореза липопротеидов в полиакриламид¬
ном геле (по Е. Я. Маграчевой, 1973) в фабричном приборе,
выпускаемом фирмой «Реанал» (Венгрия). Оценку результатам
разделения можно давать визуально (описательно) или, луч¬
ше, регистрируя их на микроденситометре.
Однако при отсутствии специальной аппаратуры типы ги¬
перлипопротеидемии можно определять и косвенно, по содер¬
жанию холестерина и триглицеридов в сыворотке крови, учи¬
тывая при этом, что около 40% холестерина приходится на Р-
липопротеиды, а 50—60% и 84—87% триглицеридов — на пре-Р-
липопротеиды и хиломикроны соответственно (табл. 28). Типи-
рованию может помочь и метод наблюдения или выдерживания
плазмы.
Не потеряли своего прежнего значения для диагностики
обнаруживаемые изменения в содержании а- и Р-липопротеи-
дов.
Так, уменьшение содержания а-липопротеидов наблюдается
при острых гепатитах, циррозах печени и застойных желтухах.
В последнем случае оно выражено настолько резко, что может
привести к полному исчезновению а-фракции.
Увеличение уровня а-липопротеидов наблюдается иногда при
хроническом гепатите.
Увеличение содержания Р-липопротеидов — наиболее часто
встречающееся в липограмме отклонение от нормы. Оно отме¬
чается при атеросклерозе, интрагепатальном застое желчи, ме¬
ханической желтухе, безжелтушных и некоторых острых гепа¬
титах, диабете, гипотиреозе, мононуклеозе, Pi-плазмацитоме,
при резких гипопротеинемиях, гликогеновой болезни, ксанто-
матозе и др.
Уменьшение Р-липопротеиновой фракции описано при р2-
плазмацитоме.
Увеличение липидного остатка наблюдается при алиментар¬
ной гиперлипемии и в особенности при эссенциальной гиперли-
пемии.
Повышение уровня липопротеидов в крови тесно связано с
гиперхолестеринемией, поскольку холестерин входит в состав,
главным образом, Р-липопротеидов.
Диспротеинемическая проба Бурштейна имеет значение не
173

только при гиперлнпемических состояниях, но и как функцио¬
нальная печеночная проба. При сопоставлении с тимоловой этот
показатель, несмотря на свою неспецифичность, особенно це¬
нен. Тимоловая проба более чувствительна к расстройствам в
начальной фазе, а проба Бурштейна — в конечной фазе острого
гепатита. Особое значение имеет липопротеиновая проба для
оценки постгепатитных состояний. В этом случае она часто яв¬
ляется единственной флокуляционной пробой, улавливающей
повреждение печени. В сочетании с тимоловой пробой она име¬
ет большое значение для дифференциации механической жел¬
тухи от паренхиматозной. При паренхиматозной желтухе обе
пробы положительны (либо тимоловая проба положительна, а
проба на Р-липопротеиды отрицательна), при механической
желтухе тимоловая проба отрицательна (если нет вторичного
гепатита), проба Бурштейна — резко положительна.

Глава VIII.
ИССЛЕДОВАНИЕ
ПИГМЕНТНОГО ОБМЕНА
Современными методами исследования доказано, что срок
жизни эритроцитов в среднем составляет 110—130 дней. По
окончании этого периода они разрушаются в клетках ретикуло-
эндотелиальной системы костного мозга, печени, селезенки и
некоторых других органов. Процессу распада подвергается и
содержащийся в эритроцитах гемоглобин.
Вначале происходит разрыв метинового мостика между I и
II пиррольным ядром порфиринового кольца с одновременным
окислением двухвалентного железа в трехвалентное. Образую¬
щийся таким образом пигмент зеленого цвета получил назва¬
ние вердоглобин (вердогемоглобин, холеглобин, псевдогемо¬
глобин). Дальнейшие превращения приводят к потере вердо-
глобином железа и глобина, в результате происходит разверты¬
вание порфиринового кольца в цепь и образование желчного
пигмента зеленого цвета — биливердина. Почти весь биливер-
дин ферментативным путем восстанавливается в основной
и важнейший красно-желтый пигмент желчи — билирубин, яв¬
ляющийся нормальной составной частью сыворотки крови. Этот
свободный (несвязанный) билирубин в силу нерастворимости
в воде не переходит в мочу и дает непрямую реакцию ван деи
Берга (т. е. реагирует с диазореактивом лишь после предвари¬
тельного растворения в спирте). Следовательно, непрямой би¬
лирубин представляет собой свободный билирубин. Последний
в клетках печени под влиянием фермента трансферазы связы¬
вается с глюкуроновой кислотой, что сообщает ему хорошую
растворимость в воде. Благодаря этому связанный билирубин
легко выделяется с мочой и реагирует с диазореактивом сразу
же после прибавления его к сыворотке желтушных больных.
Установлено, что связанный билирубин (прямой) состоит из
двух пигментов: моно- и диглюкуронида; последний составляет
75—80% выделяемого желчью пигмента. Таким образом, били-
рубинглюкурониды представляют собой прямой билирубин.
175

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
В настоящее время для определения билирубина в сыворот¬
ке крови используются:
1. Колориметрические диазометоды, основанные на образо¬
вании азобилирубина (красно-розового цвета) при добавлении
к сыворотке диазофенилсульфонозой кислоты (и других диазо¬
соединений). К ним относятся:
1. Метод ван ден Берга.
2. Методы с использованием акселераторных веществ, обла¬
дающих свойством ускорять реакцию между свободным били¬
рубином и диазореактивом в водной среде путем повышения
растворимости или каталитическим способом. В качестве аксе¬
лераторов используются: метиловый спирт, кофеин и бензоат
натрия, кофеин и мочевина, бензоат натрия и мочевина, ацета-
мид (дифилин), уксусная кислота.
II. Спектрофотометрические методы, основанные :;а том, что
общий билирубин дает характерную абсорбционную зону при
450—460 нм.
III. Хроматографические методы.
IV. Методы, основанные на распределении фракций били¬
рубина в различных растворителях.
Большинство колориметрических методов определения би¬
лирубина основано на реакции ван ден Берга (1916). Она про¬
текает в две стадии. Вначале под воздействием соляной кисло¬
ты разрывается тетрапироловая цепь и образуется 2 дипирро¬
ла. Затем 2 дипирроловых производных диазотируются диазо-
фенилсульфоновой кислотой с образованием азобилирубина.
Оригинальным методом ван ден Берга устанавливается
лишь характер реакции (прямая, непрямая, замедленная), т. е.
отмечается преобладание в сыворотке крови того или иного
билирубина.
Метод Иендрашека, Клеггорна и Грофа дает возможность
фракционно определять содержание билирубина. Он прост, удо¬
бен на практике, не связан с применением дефицитных реакти¬
вов и является наиболее приемлемым для практических лабо¬
раторий.
Разделение билирубина на фракции (ди-, моноглюкурониды)
методом хроматографии или с использованием органических
растворителей позволяет подойти к более глубокой оценке про¬
цессов, происходящих в печени. Однако сложность их техни¬
ческого исполнения затрудняет применение указанных методов
в клинической практике.
Определение рекомендуется проводить сразу же после забо¬
ра проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Ге¬
молиз сыворотки снижает количество билирубина пропорцио¬
нально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка
крови не должна быть гемолизирована.
176

Для избежания ошибки, связанной с появлением мутности,
рекомендуется ставить контроль на каждую сыворотку.
В качестве унифицированного метода для определения би¬
лирубина и его фракций в сыворотке крови предлагается метод
Йендрашека, Клеггорна и Грофа с измерением оптической плот¬
ности азопигмента в нейтральной или слабокислой среде при
зеленом светофильтре (530 нм).
Завод «Реагент» (г. Рига) освоил широкое производство
наборов для определения билирубина в сыворотке крови по ме¬
тоду Йендрашека, Клеггорна, Грофа. Помимо выбора наибо¬
лее приемлемого метода определения билирубина необходимо
было унифицировать и построение калибровочных кривых.
В качестве стандарта лучше всего использовать билирубин,
выпускаемый фирмами «Мерк» (ФРГ) и «Лахема»
(ЧССР).
На окраску билирубина оказывает существенное влияние
наличие в пробе белка, поэтому все стандартные растворы би¬
лирубина должны содержать белок. Правда, в поддержании
постоянной концентрации белка нет особой необходимости, по¬
скольку окраска азобилирубина не меняется даже при 50-крат¬
ном разведении белка. Цвет азобмлирубина в белковых раство¬
рах оказывается интенсивнее, чем окраска билирубина в сла¬
бых щелочных растворах. Поэтому способы приготовления
билирубинового стандарта в белковых растворах являются
наиболее правильными. К ним относится приготовление били¬
рубинового стандарта в буферированной сыворотке человека по
Шеллонг и Венде.
Очень простой и удобный способ приготовления билируби¬
нового стандарта предлагается Комиссией по стандартизации
и автоматизации биохимических исследовательских методов
Чехословакии.
Фирмой «Лахема» выпускаются готовые наборы, содержа¬
щие препараты лиофилизированного билирубина и альбумина.
Билирубин растворяется в 2% растворе альбумина.
Описание построения калибровочной кривой по Шеллонг и
Венде и способом, предложенным Комиссией по стандартиза¬
ции в ЧССР, приведено при изложении метода колориметриче¬
ского определения билирубина и его фракций.
Определение содержания билирубина
и его фракций в сыворотке крови
колориметрическим диазометодом
(Йендрашик, Клеггорн, Гроф)
Принцип. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с
азотисто-кислым натрием образуется диазофенилсульфоновая
кислота, которая, реагируя со связанным билирубином сыво¬
ротки, дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности
177

его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую
реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового ре¬
актива несвязанный билирубин переходит в растворимое дис¬
социированное состояние, благодаря чему он также дает розо¬
во-фиолетовое окрашивание со смесью диазореактивов. По
интенсивности последнего фотоколориметрически определяют
концентрацию общего билирубина. По разнице между общим
и связанным билирубином находят содержание несвязанного
билирубина, дающего непрямую реакцию.
Реактивы. 1. Кофеиновый реактив.
5 г чистого кофеина, 7,5 г бензойно-кислого натрия (C6HS
COONa), 12,5 г кристаллического уксуснокислого натрия
(СНзСОСЖа) растворяют в 90 мл дистиллированной воды, на¬
гревают до 50—60° С и хорошо перемешивают. После охлаж¬
дения доводят дистиллированной водой до 100 мл (некоторые
авторы рекомендуют доводить объем до 200 мл или до 1 л).
Раствор годен в течение 2-х недель.
2. Физиологический раствор (0,9% раствор NaCl).
3. Диазосмесь: а) диазореактив I. 5 г сульфаниловой кисло¬
ты растворяют при подогревании в 300—400 мл дистиллирован¬
ной воды, прибавляют 15 мл концентрированной соляной кис¬
лоты (уд. веса 1,19). Если сульфаниловая кислота полностью не
растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают.
Только после полного растворения сульфаниловой кислоты и
охлаждения раствора объем колбы доводят дистиллированной
водой до 1 л. Реактив стойкий, хранится в посуде из темного
стекла;
б) диазореактив II. 0,5% раствор азотистокислого натрия
(NaN02). Реактив нестойкий, хранится в склянке темного стек¬
ла около 2—3 недель. Первым признаком его непригодности
служит появление желтого оттенка.
Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл
диазореактива II.
Ход определения. В 3 пробирки (для определения общего,
связанного билирубина и постановки контроля на цвет сыворот¬
ки) вводят реактивы согласно схемы (табл. 29).
При определении общего билирубина пробу для развития
окраски оставляют стоять на 20 мин. При дальнейшем стоянии
окраска не изменяется.
Для определения связанного билирубина колориметрирова-
ние следует проводить спустя 5—10 мин после добавления диа¬
зосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает
свободный билирубин.
Контроль на мутность сыворотки ставят для каждого опыта.
Колориметрируют на фотоэлектроколориметре при зеленом
светофильтре (длина волны 500—560 нм) в кювете шириной
5 мм.
Расчет производят по калибровочному графику. Находят
содержание общего и связанного билирубина в мг%. Для опре-
178

ТАБЛИЦА 29
Данные для определения билирубина в сыворотке крови
Реактивы, мл
Обший би¬
лирубин
Связанный
билирубин
Контроль
Сыворотка
0.50
0.50
0,50
Кофеиновый реактив
1,75
—
1,75
Физиологический раствор
—
1,75
0,25
Диазосмесь
0,25
0,25
—
деления уровня несвязанного (свободного) билирубина из об¬
щего его содержания вычитают показатель связанного билиру¬
бина в сыворотке крови.
В норме содержание общего билирубина составляет 0,5—
1,2 мг%. Из него 75% приходится на долю свободного билиру¬
бина.
Средние величины содержания различных фракций били¬
рубина: общий билирубин — 0,65 мг%, связанный — 0,15 мг%,
свободный — 0,50 мг%.
Примечания. 1. Некоторые авторы рекомендуют после
развития окраски (перед этапом колориметрирования) добав¬
лять в пробы по 3 капли 30% NaOH; цвет раствора при этом из¬
меняется на зеленый (при большой концентрации щелочи — на
синий), часто наблюдается исчезновение мутности. Пробы с по¬
лученной окраской следует колориметрирсвать при красном
светофильтре.
2. В случае большой концентрации билирубина сыворотку
следует развести физиологическим раствором в 2 раза.
Определение билирубина
в малом объеме сыворотки крови
При выявлении гипербилирубинемий у новорожденных в
роддомах, в детских учреждениях можно применять микроме¬
тод в модификации Т. Б. Доброседовой и А. С. Циркиной.
Количество сыворотки, необходимое для определения обще¬
го, связанного и свободного билирубина, составляет 0,4 мл. Сы¬
воротку разводят равным объемом физиологического раствора.
Дальнейшее определение проводят по схеме (табл. 30).
Колориметрию и расчет производят так же, как это реко¬
мендуется в унифицированном методе определения; поскольку
сыворотки взято в опыт 0,125 мл, полученный результат умно¬
жают на 4 (чтобы учесть разведение).
Примечание. Реактивы готовят так же, как и в унифи¬
цированном методе Иендрашек, Клеггорн, Гроф.
179

ТАБЛИЦА 30
Данные для определения
билирубина в малом объеме в сыворотке крови
Реактивы, мл
Общий би¬
лирубин
Билирубин
связанный
Контроль
Сыворотка, разведенная физиологиче¬
ским раствором 1 : 1
0,25
0,25
0,25
Кофеиновый реактив
2,00
—
2,00
Физиологический раствор
—
2,00
0,25
Диазссмесь
0,25
0,25
—
Итого . . .
2,50
2,50
2,50
Норма содержания общего билирубина в сыворотке крови
до 1,2 мг%, из которого до 25% может составлять связанный
билирубин.
Построение калибровочной кривой
для определения билирубина сыворотки крови
I. Метод Шеллонг и Венде (1960) с использованием стаби¬
лизирующего свойства белка сыворотки крови.
Реактивы для построения калибровочной кривой.
1. 15 мл свежей негемолизированной сыворотки практически
здорового человека (или смесь сывороток здоровых доноров).
2. Основной стандартный раствор билирубина.
В колбе емкостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина
(имеющийся в продаже билирубин является непрямо реаги¬
рующим) в 30—35 мл 0,1 М раствора углекислого натрия
(10,6 г безводного №гСОз доводят до 1 л дистиллированной
водой). Хорошо взбалтывают, не допуская образования
пузырьков. Доводят до метки 0,1 М раствором Na2C03 и не¬
сколько раз перемешивают. Полученный раствор (80 мг%)
стоек в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем
происходит окисление билирубина.
3. Рабочий раствор билирубина.
К 7 мл свежей негемолизированной сыворотки добавляют
1 мл свежеприготовленного 80 мг% раствора билирубина и
0,05 мл (1 каплю) 4 н. раствора уксусной кислоты (22,6 мл
ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллирован¬
ной водой). Хорошо перемешивают. При этом выделяются пу¬
зырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в холодильни¬
ке не более суток. Этот раствор содержит точно на 10 мг%
билирубина больше, чем его находится в сыворотке, взятой для
180

приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах коли¬
чество билирубина, содержащееся в этой сыворотке, при стан¬
дартизации пользуются соответствующей компенсационной
жидкостью.
Компенсационная жидкость. Для ее приготовления смеши¬
вают 7 мл той же сыворотки, которую используют для приго¬
товления рабочего раствора стандарта билирубина, 1 мл 0,1 М
раствора Na2C03 и 0,05 мл (1 каплю) 4 н. раствора уксусной
кислоты.
Для построения калибровочной кривой обычно используют
5—6 разведений с различным содержанием билирубина
(табл. 31).
Стандартные пробы (0,5 мл) обрабатывают параллельно,
по вышеописанному унифицированному методу, причем пробы
одинаковой концентрации исследуются 4—5 раз; из данных
всех определений выводят среднее значение экстинкции для
рабочего раствора билирубина какой-либо одной концентрации.
При построении калибровочного графика к каждой пробе
добавляют по 1,75 мл кофеинового реактива, так как в качест¬
ве стандлрта используют свободный билирубин. Контролем слу¬
жит компенсационная жидкость, из которой готовят разведения
аналогично стандартным пробам (табл. 31), т. е. берут 0,05;
0,10; 0,15; 0,20; 0,25 мл ее и доводят физиологическим раство¬
ром объем до 0,5 мл. Далее их обрабатывают как опытные (или
стандартные) пробы.
Калибровочную кривую строят, откладывая на оси ординат
разность оптических плотностей опытных и контрольных проб,
а на оси абсцисс — соответствующие концентрации билирубина
в мг%.
II. Построение калибровочной кривой по методу, предложен¬
ному Комиссией по стандартизации и автоматизации биохими-
ТАБЛИЦА31
Данные для построения
калибровочной кривой по методу Шеллонг и Венде
№ пробирок
Рабочий раст¬
вор билиру¬
бина, мл
Физиологи¬
ческий раст¬
вор, мл
Количество били¬
рубина (мг) в
пробе (0,5 мл)
Концентрация
билирубина,
мг%
1
0,05
0,45
0,005
1
2
0,10
0,40
0,010
2
3
0,15
0,35
0,015
3
4
0,20
0,30
0,020
4
5
0,25
0,25
0,025
5
181

ческих методов {ЧССР), осуществляется по инструкции, прила¬
гаемой к набору реактивов.
Клинико-диагностическое значение. Определение общего
билирубина и его фракций имеет большое клиническое значе¬
ние. Отмечено, что желтуха появляется тогда, когда уровень
билирубина в крови превышает 1,6—2 мг% (И. Тодо-
ров, 1968).
При печеночных желтухах (гепатиты, циррозы) в крови от¬
мечается резкое увеличение содержания связанного билируби¬
на (часто в основном за счет моноглюкуронидбилирубина, что
является неблагоприятным признаком), происходящее главным
образом от разрушения печеночных клеток. Некоторое возрас¬
тание количества свободного билирубина наступает вследствие
нарушения функции печени (уменьшение активности трансглю-
куронидазы и других ферментных систем, участвующих в глю-
куронидировании).
Значительное увеличение содержания связанного билируби¬
на сыворотки при механических (застойных) желтухах обуслов¬
лено переполнением желчных путей вследствие закупорки, раз¬
рыва их и последующего перехода желчи в рус/о кроЕи.
Резкое возрастание количества свободного билирубина при
гемолитической желтухе происходит за счет гемолиза, приво¬
дящего к усиленному образованию билирубина.

Глава IX
ИССЛЕДОВАНИЕ
МИНЕРАЛЬНОГО ОБМЕНА
Все элементы, входящие в состав человеческого тела, по
предложению В. И. Вернадского принято делить на макроэле¬
менты, содержание которых достигает 10-2% и выше (калий,
натрий, кальций, магний, железо, алюминий и др.), микроэле¬
менты— от 10_3 до 10-5% (цинк, медь, марганец, литий, йод
и др.) и ультрамикроэлементы— 10-5% и менее (золото, ртуть,
радий и другие радиоактивные элементы).
В диагностических целях очень важно определять в различ¬
ных биологических жидкостях электролиты (катионы, анионы).
Среди макроэлементов особого внимания заслуживает исследо¬
вание содержания натрия и калия в эритроцитах и плазме
крови. Для определения концентрации этих электролитов ис¬
пользуются:
1. Химические методы: а) определение натрия гравиметри¬
ческим, титрометрическим, колориметрическим способами;
б) определение калия комплексонометрическим титровани¬
ем, колориметрическим и др. методами.
2. Пламенная спектрофотометрия: а) атомно-эмиссионная
спектрофотометрия;
б) атомно-абсорбционная фотометрия.
3. Рентгеновская спектроскопия.
4. Нейтронактивационный анализ.
5. Потенциометрическое определение.
6. Пламенная фотометрия.
Химические методы определения натрия, основанные на
осаждении его сложной тройной солью уранил-марганца-нат-
рия-ацетата или уранил-магния-натрия-ацетата, трудоемки и
he точны.
Большинство химических методов определения калия осно¬
вывается на образовании сложных комплексных солей. Калий
чаще всего осаждают в форме: 1) кобальтинитрита, из которого
183

затем выделяют кобальтат; последний титруют с помощью
комплексона (двунатрпевсй соли этилендиаминтэтраацетата) в
присутствии мурексида;. 2) купрогексанитрита: при этом о
содержании калия судят по количеству связанного нит¬
рита.
Наиболее надежными из химических методов определения
калия в биологических жидкостях являются методы комплексо-
нометрического титрования.
Метод атомно-эмиссионной спектрофотометрии основан на
испускании света атомами под действием высокой температуры
и света. Он сложен, трудоемок, требует значительной затраты
времени.
Метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии основан на
поглощении света атомами исследуемого элемента. Преимуще¬
ствами его являются простота проведения анализа, малая тру¬
доемкость, высокая чувствительность и точность, большая про¬
изводительность.
Все эти способы определения калия требуют дорогой аппа¬
ратуры.
Методы рентгеновской спектроскопии, нейтронактивацион-
ный анализ отличаются простотой техники и более высокой
чувствительностью, чем другие, однако они не получили широ¬
кого распространения из-за необходимости использования очень
высокой температуры.
При потенциометрическом определении калия и натрия так¬
же нужна специальная аппаратура.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛЕКТРОЛИТОВ
МЕТОДОМ ПЛАМЕННОЙ ФОТОМЕТРИИ
Метод пламенной фотометрии основан на способности эле¬
ментов возбуждаться и испускать лучи света определенной дли¬
ны волны при сжигании солей минеральных веществ в пламе¬
ни. Излучения различных элементов выделяются посредством
специальных светофильтров. Попадая на фотоэлемент, свето¬
вой поток возбуждает фототок, который регистрируется гальва¬
нометром.
Пламенная фотометрия характеризуется высокой точно¬
стью, чувствительностью, быстротой (если химические методы
занимают 1,5 ч, то пламенная фотометрия — всего 10 мин), на¬
дежностью, простотой определения, что очень важно при мас¬
совых исследованиях. Особое преимущество заключается в том,
что для анализа требуется минимальное количество исследуе¬
мого материала, которое может быть недостаточным для
определения химическими методами. Благодаря этому стали
возможными исследования минерального обмена в детской
практике, хирургии (искусственная почка), при динамическом
наблюдении в процессе лечения.
184

Поэтому в качестве унифицированных для определения нат¬
рия и калия в биологических жидкостях предлагаются методы
пламенной фотометрии (с построением калибровочных кри¬
вых). В низкотемпературном пламени (1200° С) практически
возбуждаются лишь атомы щелочных и щелочноземельных ме¬
таллов (смесь: светильный газ — воздух). В высокотемператур¬
ном пламени (2300° С — смесь ацетилен — кислород воздуха;
2500—2700° С — водород — кислород, 3000—3500° С — ацети¬
лен— кислород) возбуждаются также атомы ряда тяжелых
металлов.
Определение концентрации исследуемого элемента можно
проводить двумя способами: непосредственным — по данным
измерения абсолютной интенсивности излучения, или же по
методу внутреннего стандарта, при котором излучение иссле¬
дуемого элемента сравнивается с излучением другого элемента,
добавляемого к пробе в определенной концентрации и служа¬
щего внутренним стандартом (элементом сравнения).
Применение метода внутреннего стандарта до некоторой
степени уменьшает величину погрешностей, вызываемых разли¬
чием состава анализируемого и стандартного растворов, изме¬
нением режима сгорания аэрозоля. Во все пробы и в калибро¬
вочные растворы вводят всегда одинаковое количество родст¬
венного элемента (элемента сравнения)—лития. При
построении калибровочных графиков на оси ординат отклады¬
вают не показания прибора по исследуемому катиону, а отно¬
шение показаний по этому элементу к показаниям по литию;
на ось абсцисс наносят значения концентрации изучаемого ка¬
тиона (натрия или калия). Определение методом внутреннего
стандарта можно проводить только на приборах, имеющих све¬
тофильтр для лития.
Поэтому на практике в стандартные растворы, кроме иссле¬
дуемого электролита, вводят некоторые другие компоненты
биологических жидкостей в их естественных концентрациях.
Так, при приготовлении стандартных растворов для определе¬
ния натрия в моче (в противоположность исследованию плаз¬
мы крови) в их состав вводят калий, так как величина отно¬
шения K/Na в моче значительно выше, чем в плазме крови.
Принципы определения К и Na в биологических жидкостях
методом пламенной фотометрии. Определение ионов К и Na
в цельной крови не может служить достаточно достоверным
показателем минерального обмена, так как сдвиги, происходя¬
щие в содержании электролитов в форменных элементах и в
сыворотке крови, часто идут в противоположных направлениях.
В связи с этим более правильно определять концентрацию
электролитов в плазме крови.
Исследование плазмы крови. Как известно, концентрация
калия в эритроцитах значительно превышает таковую в плаз¬
ме крови. Поэтому калий выходит из эритроцитов даже через
неповрежденную оболочку. Исходя из этого, определение уров¬
185

ня калил в плазме следует проводить не позже 3Л—1 ч после
взятия крови.
Исследование интересующих компонентов проводят в раз¬
веденных водных растворах плазмы крови и отцентрифугиро-
ванной суточной моче. При этом можно использовать следую¬
щие разведения: для определения в крови натрия — 1 : 100; ка¬
лия — 1:10, 1 : 20 и 1 : 100; кальция — 1:10 или 1 :20; натрия
и калия в моче — 1 : 200. Спинномозговую жидкость, экссудаты,
транссудаты разводят, как и плазму. Желудочный сок разбав¬
ляют дистиллированной водой в 50 раз и затем делают разве¬
дения, как и при определении сыворотки.
Основные стандартные растворы готовят из дважды пере-
кристаллизованных химически чистых солей хлористого нат¬
рия, хлористого калия и углекислого кальция, высушенных до
постоянного веса (NaCl можно прокалить и охладить в эксика¬
торе).
Стандартные растворы готовят, исходя из используемого
разведения биологической жидкости. Для компенсации ионно¬
го воздействия в стандартные растворы для калия добавляют
натрий. Стандартные растворы для натрия однокомпонентны,
так как содержание калия и кальция после разведения прак¬
тически не влияет на результаты исследования.
Приготовление основных стандартных растворов. 1. 100 мг%
раствор натрия.
2,5418 г хлористого натрия х. ч., высушенного до постоянно¬
го веса, вносят в мерную колбу емкостью 1000 мл, растворяют
и доводят до метки дистиллированной водой. 1 мл раствора со¬
держит 1 мг натрия.
2. 100 мг% раствор калия.
1,9069 г хлористого калия х. ч., высушенного до постоянного
веса, вносят в мерную колбу емкостью 1000 мл, растворяют и
доводят до метки дистиллированной водой. 1 мл раствора со¬
держит 1 мг калия.
3. 100 мг% раствор кальция.
2,4970 г углекислого кальция х. ч., высушенного при 100—
120° С до постоянного веса, растворяют в 50 мл 1 н. раствора
соляной кислоты и доводят дистиллированной водой до 1000 мл
в мерной колбе. 1 мл этого раствора содержит 1 мг кальция.
Рабочие стандартные растворы для определения калия в
плазме крови готовят, исходя из среднего уровня калия в плаз¬
ме (18 мг%) и натрия (310 мг%), а также используемого раз¬
ведения плазмы (1 :20): в 5 мерных колб емкостью 100 мл
вносят соответственно 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 мл раствора калия,
затем в каждую из них добавляют по 16,5 мл основного стан¬
дартного раствора хлористого натрия и указанное в таблице 32
количество раствора углекислого кальция.
Рабочие стандартные растворы для определения натрия в
плазме крови готовят, учитывая используемое разведение плаз¬
мы (1: 100) и средний уровень в ней натрия (310 мг%): в 7 мер-
186

ТАБЛИЦА 32
Данные к приготовлению рабочих стандартных растворов
для определения калия в плазме крови
Основные стандарт¬
ные растворы, мл
Дистил¬
лирован¬
ия вода,
до 100 мл
Концентрация, мг%
калия
кальция
КС1
NaCl
СаСОэ
в рабочем
растворе
в плазме
с учетом
разведе¬
ния 1 : 20
в рабочем
растворе
в плазме
с уметом
разведе¬
ния 1 : 20
0,6
16,5
0,2
82,7
0,6
12
0,2
4
0,8
16,5
0,4
82,3
0,8
16
0,4
8
1.0
16,5
0,5
82,0
1,0
20
0,5
10
1,2
16,5
0,6
81,7
1,2
24
0,6
12
1,4
16,5
0,8
81,3
1,4
28
0,8
16
ТАБЛИЦА 33
Данные к приготовлению рабочих стандартных растворов
для определения натрия в плазме крови
Основной стан¬
дартный раствор
NaCl, мл
Дистиллирован¬
ная вода, мл
Концентрация натрия, в мг%
в стандартном
растворе
с учетом разведения
плазмы в 100 раз
2,6
97,4
2,6
260
2,8
97,2
2,8
280
3,0
97,0
3,0
300
3,4
96,6
3.4
340
3,8
96,2
3,8
380
4,0
96,0
4,0
400
4,2
95,8
4,2
420
ных колб емкостью 100 мл вносят соответственно 2,6; 2,8; 3,0;
3,4; 3,8; 4,0; 4,2 мл раствора натрия и доводят до метки дистил¬
лированной водой (табл. 33).
Однокомпонентный характер рабочих стандартных раство¬
ров натрия объясняется тем, что в плазме крови калия и каль¬
ция содержится значительно меньше, чем натрия, и их присут¬
ствие практически не влияет на результаты исследования.
Эритроциты. Содержание калия и натрия в эритроцитах
можно определить двумя способами — прямым и косвенным.
187

ТАБЛИЦА 34
Данные к приготовлению рабочих стандартных растворов
для определения калия в эритроцитах
Основной стан¬
дартный раствор
КС1, мл
Дистиллирован¬
ная вода, до мл
Концентрация калия, мг%
в стандартном
растворе
с учетом разве¬
дения эритроци¬
тов 1 : 260
1,1
100
1,1
286
1,2
100
1,2
312
1,3
100
1,3
338
1,4
100
1,4
354
1,5
100
1,5
390
1,6
100
1,6
416
При косвенном — вычисляют разницу мекду содержанием
электролитов в цельной крови и плазме. Предпочтительнее
электролиты определять непосредственно в эритроцитах (пря¬
мым путем). В качестве антикоагулянта обычно используют
гепарин, добавляемый из расчета 1 капля (0,02 мг) на 5—10 мл
крови; можно также распылять мелкодисперсный порошок ща¬
велевокислого аммония (оксалата аммония) на стенках цент¬
рифужной пробирки.
Гепаринизированную кровь центрифугируют, отделяют плаз¬
му, эритроциты гемолизируют и используют для анализа.
ТАБЛИЦА 35
Данные к приготовлению рабочих стандартных растворов
для определения натрия в эритроцитах
Основной стандартный
Дистиллиро¬
ванная вода,
Концентрация натрия, мг%
раствор, мл
в стандартном
с учетом разве¬
NaCl
КС1
до мл
растворе
дения эритроци¬
тов 1 : 26
0,4
14
100
0,4
10,4
0,5
14
100
0,5
13,0
1,0
14
100
1,0
26,0
1,5
14
100
1,5
39,0
2,0
14
100
2,0
52,0
2,5
14
100
2,5
65,0
188

Существует много модификаций, касающихся режимов цент¬
рифугировать и способов гемолиза эритроцитов. Последний
вызывают различными методами:
1) дистиллированной водой;
2) раствором уксусной кислоты с последующим разведением
дистиллированной водой;
3) замораживанием в холодильнике с последующим быст¬
рым размораживанием. После двух замораживаний наступает
полный гемолиз.
В зависимости от времени и скорости центрифугирования
концентрация ионов калия и натрия в эритроцитах меняется в
широких пределах: для калия — от 300 мг% (нижние границы)
до 412,4 мг% (верхние границы); для натрия — от 26 мг% до
80 мг%.
Центрифугирование необходимо прозодить в строго опреде¬
ленных условиях (количество об/мин, продолжительность цент¬
рифугирования). Оптимальным режимом центрифугирования
следует считать центрифугирование в течение 15 мин при
3000 об/мин, затем плазму с верхним слоем эритроцитов отса¬
сывают и проводят вторичное центрифугирование в течение
30 мин при 3000 об/мин.
Эритроциты гемолизируют дистиллированной водой и раз¬
водят: для определения натрия — 1 : 26, а для определения ка¬
лия — 1 : 260. Приготовление рабочих стандартных растворов
для определения калия и натрия в эритроцитах показано в таб¬
лицах 34 и 35.
Моча. Для исследования электролитов в моче из отмеренно¬
го суточного ее количества отбирают около 100—150 мл. Мочу
центрифугируют и разводят в 200 раз.
Стандартные растворы
для исследования калия и натрия в моче
Рабочие стандартные растворы для определения калия в
моче готовят, исходя из применяемого разведения мочи (1 : 200)
и среднего уровня в ней калия (200 мг%) и натрия (350 мг%).
В 5 мерных колб емкостью 100 мл вносят соответственно 0,2;
0,5; 1,0; 1,5; 2 мл раствора калия, в каждую из них добавляют
по 1,75 мл раствора натрия, после чего доводят объем дистил¬
лированной водой до метки (табл. 36).
Рабочие стандартные растворы для определения натрия в
моче готовят так же, исходя из разведения мочи (1 : 200) и
среднего содержания в ней натрия (350 мг%) и калия
(200 мг%). В 6 мерных колб емкостью 100 мл вносят соответ¬
ственно 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 мл раствора натрия, в каждую
добавляют по 1 мл раствора калия и доводят до метки дистил¬
лированной водой (табл. 37).
189

ТАБЛИЦА 30
Данные к приготовлению рабочих стандартных растворов
для определения калия в моче
Основной стандартный
раствор, мл
Дистиллиро¬
ванная вода,
до мл
Концентрация калия, мг%
в стандартном
растворе
с учетом разве¬
дения мочи 1 : 200
КС1
NaCl
0,2
1,75
100
0,2
40
0,5
1,75
100
0,5
100
1,0
1,75
100
1,0
200
1,5
1,75
100
1,5
300
2,0
1,75
100
2,0
400
Для повседневного построения калибровочных кривых для
разных биологических жидкостей требуется много времени и
определенных навыков в работе. Это не совсем удобно при про¬
ведении срочных анализов плазмы, эритроцитов, мочи, диали¬
зата и т. д.
В. Г. Бариновым (1973) предложен упрощенный вариант ка¬
либровки пламенного фотометра. Метод заключается в сле¬
дующем.
Для каждой из биологических жидкостей (плазмы, эритро¬
цитов, мочи) готовят основные и рабочие стандартные раство¬
ры по общепринятым способам. Аппарат настраивают на стан¬
дартный режим работы, поочередно пропускают рабочие раст¬
воры для определения калия и натрия в плазме, эритроцитах
ТАБЛИЦА 37
Данные к приготовлению рабочих стандартных растворов
для определения натрия в моче
Основной стандартный
Дистиллиро¬
ванная вода,
Концентрация натрия, мг%
раствор, мл
в стандартном
с учетом разве¬
NaCl
KCl
до мл
растворе
дения мочи 1 : 200
0,2
1,0
100
0,2
40
0,5
1,0
100
0,5
100
1,0
1,0
100
1,0
200
2,0
1,0
100
2,0
400
3,0
1,0
100
3,0
600
4,0
l.o
100
4,0
800
190

и моче. Однократно выводят кривые для перечисленных выше
жидкостей. Полученные кривые взаимно контролируют друг
друга и отражают настройку аппарата, что дает возможность
в дальнейшем отказаться от выведения повседневных кривых
для каждого биологического субстрата отдельно и пользоваться
только стандартным раствором для плазмы. Таким образом,
чтобы произвести исследование электролитов в плазме, эритро¬
цитах и моче, достаточно осуществить юстировку аппарата по
стандартному раствору для плазмы, после чего произвести
определение солей в соответствующей биологической жидкости.
Колориметрический микрометод
определения калия в плазме
(сыворотке) крови (по Н. Назарову)
Принцип. Ионы калия в присутствии ионов свинца, меди и
ЫО^образуют нерастворимый в воде осадок (купрогексанитрит
калия-свинца), который растворяют в смесч риванола и ледя¬
ной уксусной кислоты. Определяют оптичсскую плотность полу¬
ченного раствора, прямо пропорциональную количеству ионов
NO^-. Для вычисления уровня калия используют постоянный
коэффициент, рассчитанный, исходя из соотношения N07 и К+
в образовавшемся соединении.
Реактивы. 1. 5% раствор кристаллического ацетата натрия
(CH3C00Na • 3 Н20).
2. Смесь растворов ацетата меди [Си(СН3С00)2-Н20] и аце¬
тата свинца [РЬ(СН3С00)2 • ЗН20]. Отвешивают в колбу 7,5 г
кристаллического ацетата меди и 2 г кристаллического ацетата
свинца, добавляют 150 мл дистиллированной воды. Смесь на¬
гревают до кипения и после охлаждения фильтруют.
3. Кристаллический нитрит натрия.
4. Нитрит натрия в растворе ацетата меди и ацетата свин¬
ца. К 2 мл раствора 2 добавляют 250 мг нитрита натрия.
5. 0,5% раствор риванола.
6. Ледяная уксусная кислота.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл
раствора ацетата натрия (реактив 1), 0,1 мл исследуемой плаз¬
мы (сыворотки) крови и 0,5 мл раствора 4. Содержимое про¬
бирки хорошо перемешивают стеклянной палочкой, потирая ее
0 внутренние стенки пробирки в течение 5 мин, оставляют на
1 ч, после чего центрифугируют 10 мин (!) при 1500 об/мин. Со¬
вершенно прозрачную надосадочную жидкость сливают, а в
пробирку добавляют 1 мл раствора ацетата натрия (реак¬
тив 1), перемешивают стеклянной палочкой, центрифугируют
и тщательно сливают надосадочную жидкость. Аналогичное
промывание раствором ацетата натрия повторяют еще раз
(лучше осадок промывать 3—4 раза, пока он не станет совер¬
шенно белым, без малейшей примеси голубизны!). Затем к
191

осадку добавляют 1 мл раствора риванола и 2 мл ледяной ук¬
сусной кислоты. Смесь перемешивают той же палочкой и, до¬
бавляя дистиллированную воду, переносят в мерную колбу (или
цилиндр) на 25 мл, доводя до метки. Хорошо перемен.и
колориметрируют при зеленом светофильтре (540 нм) в K.Ji-ете
шириной 10 мм против воды.
Пример. При расчете пользуются формулой:
Смг% =Е • 36,
где Е — показатель экстинкции;
36 — постоянный коэффициент;
С — концентрация калия в плазме (сыворотке) крови, мг%.
Данный метод характеризуется простотой приготовления реак¬
тивов, их стойкостью, а также высокой точностью и микроха¬
рактером самого исследования.
Поскольку содержание калия в эритроцитах намного выше,
чем в сыворотке, то исследуемая сыворотка не должна иметь
даже следов гемолиза. Причем сыворотка должка быть выделе¬
на не позже, чем через 2 ч после взятия крови.
Следует заметить, что принятый обычно в клиниках способ
выражения результатов в мг% является не совсем удачным,
поскольку он не позволяет сравнивать между собой количества
катионов и анионов и изучать взаимоотношения между ними.
В связи с этим более правильно оценивать концентрацию ионов
в мэкв/л. Для перевода одного способа выражения концентра¬
ции в другой существуют специальные формулы, факторы пе¬
ресчета, таблицы и номограммы, одна из которых приведена
на рис. 5.
В норме концентрация калия у взрослых практически здо¬
ровых людей составляет в цельной крови 150—250 мг%
(38,4—64,0 мэкв/л), в сыворотке (плазме)— 14—24 мг% (3,8—
6,2 мэкв/л), в эритроцитах — 310—440 мг% (79,4—112,6
мэкв/л).
Клинико-диагностическое значение исследования содержа¬
ния калия в крови. Гипокалиемия приводит к тяжелым наруше¬
ниям в организме человека. При ней наступают слабость и ги¬
потония мышечной ткани, а в некоторых тяжелых случаях
исчезают рефлексы, появляются вялые параличи. Наступают
нарушения в области пищеварительного тракта: отмечается по¬
теря аппетита, рвота, ослабление перистальтики вплоть до па¬
ралитического илеуса. Сердечно-сосудистая система реагирует
расширением сердца, тахикардией, появлением систолического
шума.
Гиперкалиемия сопровождается сердечными симптомами:
коллапсом, тахи- и брадикардией, часто аритмиями. При кон¬
центрациях 40 мг% ( = 10 мэкв/л) наступает внутрижелудоч-
ковая блокада с мерцанием желудочков. При гиперкалиемии
порядка 50 мг% (=13 мэкв/л) сердце останавливается в диас¬
толе. Изменения в электрокардиограмме наступают, когда кон¬
центрация калия падает ниже 12 мг% ( = 3 мэкв/л) или под-
192

Натрий Калий Кальций Магнии щелочность Хлориды Фосфор
мг%/м.эк£/л мг%/мж8/л мгЪ/н.зф мгУо/м.зкб/л qqhX%w мг%мзф мгКпзкф
200
190 - =
80
0,435
2,30
0,256
3,91
25-
6
0 20-
-5
0 '
■4
я 10-
-3
2
5-
'
-1
-30
25^
го-
15-
ю-
0,7-
-25
-10
0.5
0,822
1,21
110 :
г 50
100-
90-.
-
740
80j
70-
tJO
60-
Г->-
<,й~
:20
30-
29-
40
10-
Г
4 -
ч—
Шз_
0,449
2,23
Коэффициент для перечисления: мг%(одъемнХ)8цзкд/л;
м.зщл S мг%(о$ъемн.\)
Рис. 5. Номограмма для перечисления концентрации важней¬
ших электролитов в сыворотке из мг% (или об %) в мэкв/л
и обратно.
нимается выше 24—27 мг% ( = 6—7 мэкв/л). Гиперкалиемия
кроет в себе больше опасностей, чем гипокалиемия, так как
может быстро наступить прекращение деятельности сердца.
Гипокалиемии отмечаются:
1. При недостаточном приеме калия с пищей, например по¬
сле тяжелых операций и др.
2. При усиленном выделении калия с мочой: например при
гиперфункции коры надпочечников и передней доли гипофиза,
при первичном альдостеронизме (синдром Конна), при вторич¬
ном альдостеронизме, при усиленной секреции антидиуретичес-
кого гормона, передозировке АКТГ, препаратов коры надпо¬
чечников и др.
3. При рвотах и алкалозе. Желудочный сок содержит калия
в 3—5 раз больше, чем сыворотка крови, поэтому при рвотах
наступает значительная потеря калия, которая приводит к ги-
покалиемическому состоянию (до 6 мг% = 1,5 мэкв/л). Сопут¬
ствующий алкалоз увеличивает эту гипокалиемию. При алка¬
лозах, для того чтобы сохранить Н+-ион, организм усиленно
выделяет с мочой К+.
7 Зак. 2615
193

4. При поносах и ацидозах. При тяжелых поносах, особенно
при токсикозах, организм теряет много внеклеточной жидкости.
Для сохранения осмотического давления при этих состояниях
из клеток начинают поступать ионы калия, которые быстро вы¬
деляются почками, вследствие чего и наступает гипокалия.
Место вышедшего из клеток калия занимает натрий и насту¬
пает ацидоз. При оценке результатов следует помнить о том,
что гипокалиемия не всегда отождествляется с гипокалией,
т. е. уровень калия в крови не всегда показывает содержание
калия в тканях: при гипокалии может существовать и гипер-
калиемия. Это обусловлено тем, что при сгущении крови
может возникнуть относительная гиперкалпэмия; к тому же,
при нарушении функции почек (уменьшение объема плазмы!)
и олигурии выделение калия еще более затрудняется, что при¬
водит к гиперкалиемии.
Токсикозы детского возраста, как правило, протекают со
значительной гипокалиемией. Поэтому при них рекомендуется
вводить калий, но только после восстановления функции почек,
так как введение калия при нарушенной функции почек может
привести к гиперкалиемии. К гипокалиемии приводят не только
ацидоз, сопутствующий токсикозам, но и другие формы ацидо¬
за, так как в этом случае происходит переход Н+ -иона в клет¬
ку, выделение К+ в экстрацеллюлярную (внеклеточную) жид¬
кость с последующим выделением из организма.
5. При сахарном диабете. При диабете гипокалиемия возни¬
кает вследствие нескольких причин. С одной стороны, это аци¬
доз и обезвоживание, с другой —нарушение углеводного обме¬
на клетки, поскольку для правильного обмена углеводов необ¬
ходим калий, а он выходит в экстрацеллюлярную жидкость.
Введение в организм инсулина при диабете только увеличивает
существующую гипокалиемию — за счет улучшения углеводного
обмена в клетке. Однако вследствие поглощения дополнитель¬
ного количества калия и без того бедной этим элементом крови
наступает резкая гипокалиемия. Некоторые авторы наблюдали
падение калия до 2 мг%, приводившее к смерти. Поэтому все¬
гда необходимо вместе с инсулином вводить достаточное коли¬
чество калия.
6. При парентеральном введении жидкостей, не содержащих
калий, как например, растворов поваренной соли, глюкозы
и др. Это приводит к «вымыванию» калия из клеток, к гипо¬
калии и гипокалиемии.
7. При гормонально обусловленной гипокалиемии вследствие
повышенного выделения альдостерона, АКТГ, антидиуретина.
8. При пароксизмальном параличе мышц гипокалиемия тес¬
но связана с заболеванием. В этих случаях наблюдали падение
калия до 8 мг%.
Гиперкалиемия встречается реже гипокалиемии. Наиболее
важные состояния, связанные с гиперкалиемией, следующие:
1. Увеличенный прием калия, приводящий к гиперкалиемии
194

только при нарушенной функции почек. Поэтому введение раст¬
воров, богатых калием, особенно опасно при недостаточности
почек.
2. Повышенный распад клеток и тканей (гемолитические
анемии, опухоли, некрозы и др.). При этом калий разрушен¬
ных клеток поступает в кровь.
3. Почечная недостаточность, например различные формы
олигурии, анурии, хронических нефритов. В этих случаях ги-
перкалиемия появляется вследствие нарушенного выделения
калия.
4. Обезвоживание. Количество калия в крови увеличива¬
ется.
5. Анафилактический шок, вероятно, вследствие нарушения
ионного обмена мембраны клеток.
6. Гипофункция коры надпочечников (болезнь Аддисона).
Гиперкалиемия может сопровождаться гиперкалией (по¬
чечная недостаточность, гипокортицизм) или гипокалией (деги¬
дратация).
Количество натрия в крови у взрослых и детей практически
одинаково. Оно составляет 160—225 мг% (70,0—98,0 мэкв/л)
для цельной крови; 310—350 мг% (135,0—152 мэкв/л) для сы¬
воротки (плазмы) и 40—50 мг% (17,4—21,7 мэкв/л) для эри¬
троцитов. Клиническими симптомами гипонатриемии явля-ютоя
апатия, потеря аппетита, тошнота, рвота, нарушения рефлексов,
taxHKapfli^, психозы, анурия, гипотония, потеря сознания.
Различают абсолютные и относительные гипонатриемии.
Абсолютные гипонатриемии приводят к так называемому
синдрому солевой недостаточности. Встречаются при поносах,
рвоте, усиленном потении, при недостаточности почек, при вы¬
делении отечной жидкости, при острой недостаточности надпо¬
чечников, кровоизлияниях, при некоторых диабетных ацидозах.
Относительная гипонатриемия бывает при введении в
организм большого количества жидкости, не содержащей элект¬
ролитов, что приводит к разведению плазмы. Наступлению та¬
кого состояния способствует недостаток поваренной соли в пи¬
ще и нарушение функции почек.
Гипсрнатриемия клинически сопровождается тяжелым со¬
стоянием, повышением температуры и тахикардией.
Первичным при появлении гипернатриемии является потеря
воды. Встречается при больших диурезах, неконтролируемом
сахарном диабете, ограниченном приеме жидкости, гиперкор-
тицизме и др.
КАЛЬЦИЙ
Кальций сыворотки крови находится в формах: 1) свобод¬
ного, ионизированного кальция; 2) связанного с белками, не¬
диффундирующего кальция; 3) в форме кальция недиссоцииро-
7*
195

ванного, но способного к диффузии через полупроницаемые
мембраны. Эритроциты содержат приблизительно 1 мг%
(0,5 мэкв/л) Са, лейкоциты — около 5 мг% (2,5 мэкв/л), сыво¬
ротка— 9—12 мг% (4,5—6,0 мэкв/л), цельная кровь — 5—
7 мг% (2,5—3,5 мэкв/л). Диагностическое значение имеет
определение кальция только в плазме (сыворотке), где его кон¬
центрация более постоянна.
Методы определения
кальция в сыворотке крови
Большинство применяемых ранее методов определения об¬
щего кальция в крови основано на осаждении его в форме ща¬
велевокислой соли с последующим определением осадка грави¬
метрическим, колориметрическим или, чаще всего, титрометри¬
ческим (перманганатометрическим) способами. Эта группа
методов отличается сравнительно сложной для клинических ус¬
ловий техникой, большой трудоемкостью и многочисленными
источниками ошибок (происходящих в основном из-за много¬
кратного промывания осадка).
Получили также известность методы определения кальция
посредством его осаждения пикролоновой, хлоранилиновой кис¬
лотами, но они не приобрели широкого распространения.
Колориметрические ализариновые методы точны, требуют
небольших количеств сыворотки, однако сравнительно трудо¬
емки.
Предприятие «Лахема» (ЧССР) предлагает использовать
для определения общего кальция спектрофотометрический ме¬
тод, основанный на «цветной» реакции с глиоксаль-бис-[2-окси-
анилом] (реактивом ГБОА). Проведение ее затрудняется малой
растворимостью ГБОА в водных растворах, а также нестабиль¬
ностью образующегося комплекса в щелочной среде (оптималь¬
ные условия для протекания реакции создаются при pH 11,0—
12,6). Достаточную растворимость ГБОА в щелочных растворах
обеспечивает добавка метанола или этанола. В неводных сре¬
дах разрушение комплекса происходит несколько позднее, чем
в воде: считают, что он стабилен в течение 15 мин. Фирма Био-
Ла-Тест поставляет в нашу страну наборы реактивов для оп¬
ределения кальция указанным методом.
Определение кальция сыворотки на пламенном фотометре
не так удобно, как — калия и натрия. Оно требует более высо¬
ких температур и в большей степени, чем определение К+ и
Na+, зависит от содержания других ионов в сыворотке.
В настоящее время наиболее широко применяемым в кли¬
нике методом является комплексонометрическое определение
кальция в сыворотке крови. В большинстве случаев оно сводит¬
ся к прямому титрованию разведенной сыворотки комплексоно¬
вым раствором, при подходящей реакции (pH) и индикаторе.
196

При определении кальция в качестве комплексона чаще
всего используют двунатриевую соль этилендиаминтетрауксус-
ной кислоты (трилон Б, комплексон III, хелатон III, версен), а
в качестве индикаторов мурексид, флуорексон, кальред, эрио-
кром черный Т и др.
Неудобство титрометрических методов состоит в том, что ин¬
дикаторный переход мурексида не резок. Чтобы сделать опре¬
деление объективным, некоторые авторы проводят титрование
фотометрически.
Определение общего кальция
в сыворотче крови спектрофотометрическим методом,
основанным на реакции с глиоксаль-бис-[2-оксианилом]
Принцип. Реактив ГБОА образует с ионами кальция в ще¬
лочной среде комплекс красного цвета, интенсивность которого
определяется фотометрически.
Реактивы. 1. 0,4 н. раствор NaOH (готовят из фиксанала
или из 50% NaOH).
2. Метанол, очищенный дистилляцией.
3. 0,1 % раствор глиоксаль-бис- [2-оксианила] (ГБОА) в ме¬
таноле.
4. Эталонный (10 мг%) раствор кальция.
Углекислый кальций (СаС03) высушивают при температуре
100—120° С. 0,125 г СаСОз растворяют при нагревании в 30—
40 мл 0,1 н. раствора НС1. Охлаждают, переливают в колбу на
500 мл и доводят объем до метки водой.
Ход определения. В чистую пробирку вносят 1 мл дистилли¬
рованной воды, 0,02 мл свежей сыворотки и добавляют 2 мл
раствора ГБОА. Перемешивают и оставляют на 30 мин (более
длительное стояние не мешает определению) при комнатной
температуре. Затем добавляют 0,5 мл раствора едкого натра и
содержимое пробирки вновь перемешивают. Одновременно ста¬
вят контроль на реактивы (что не обязательно) и пробу с эта¬
лонным раствором (0,02 мл его пропускают через всю методи¬
ку). Измерение должны проводить в промежутке между 5 и
15 мин с момента добавления щелочи. Экстинкцию опыта и
эталонного раствора измеряют по отношению к дистиллирован¬
ной воде (или контролю) в кюветах шириной 10 мм при зеле¬
ном светофильтре (длина волны 540 нм). Оценку результатов
проводят по формуле:
Еоп/Еэт-10 = мг% Са++,
где Еоп — экстинкция опыта;
Еэт — экстинкция эталона;
10 — концентрация раствора кальция в мг%.
Расчет можно проводить и по калибровочной кривой, по¬
строенной для интервала концентраций 1 —12 мг% Са++. Точ¬
ность калибровочной кривой необходимо периодически контро¬
197

лировать. Норма содержания кальция в сыворотке крови 9—
12 мг% (4,5—6 мэкв/л).
Определение кальций-ионов в биологическом материале на¬
бором химикатов Био-Ла-Тест с реактивом ГБОА (глиоксаль-
бис-[2-оксианила]) осуществляется унифицированным методом
по инструкции, прилагаемой к набору.
Определение кальция в сыворотке крови
титрометрическим методом с применением муречсида
Принцип. Мурексид образует с ионами кальция в щелочной
среде комплексное соединение, окрашенное в красно-фиолето¬
вый или бледно-розовый цвет (в зависимости от концентрации).
При титровании раствором более сильного комплексообразова-
теля этот комплекс разрушается, и связанный мурексид вновь
освобождается, что приводит к появлению его натуральной ок¬
раски (фиолетовой или бледно-сиреневой).
Реактивы: 1. Раствор комплексообразователя.
0,665 г комплексона III (синонимы: трилон Б, ЭДТА, вер-
сен, хелатон III, селектон и др.) количественно полностью пе¬
реносят в мерную колбу емкостью 1 л и доводят дистиллиро¬
ванной водой до метки.
2. 9 н. раствор NaOH.
36 г NaOH растворяют в небольшом объеме воды, переносят в
100 миллилитровую мерную колбу и доводят дистиллированной
водой до метки.
3. Мурексид, смешанный с NaCl в соотношении 1 : 50 и стер¬
тый в тонкий порошок (тереть в фарфоровой ступке 20—30 мин
до пылеобразного состояния). Хранить в полиэтиленовой посу¬
де или в парафинированных бутылочках.
Ход определения. В маленькую коническую колбу вносят
50 мл дистиллированной воды, 0,4 мл 9 н. раствора NaOH и
прибавляют на кончике ножа несколько крупинок мурексида.
Тотчас появляется бледно-сиреневая окраска, обусловленная
цветом самого индикатора. Объем пробы делят пополам: одна
часть раствора служит эталоном окраски мурексида, другая
используется для постановки опытной пробы. К ней добавляют
1 мл сыворотки крови, что приводит к появлению бледно-розо¬
вого окрашивания, обусловленного образованием кальциево-
мурексидного комплекса. Раствор немедленно титруют комп-
лексоном III до возвращения прежней окраски индикатора (ус¬
тановление конца титрования облегчается сопоставлением
окраски опытной и холостой проб).
Расчет ведут по формуле:
С мг% =7,2 • количество мл пошедшего на титрование комп¬
лексообразователя. 4
Для выражения результатов в мэкв/л найденную величи¬
ну (X мг%) делят на 2.
198

Примечание. Все реактивы лучше готовить на биди-
стиллированной воде.
Норма: Содержание кальция в сыворотке крови — 9—
12 мг% (4,5—6,0 мэкв/л).
Клинико-диагностическое значение. Гиперкальциемия быва¬
ет физиологической и патологической. Физиологическая гипер¬
кальциемия имеет место у новорожденных после 4-го дня жиз¬
ни, у недоношенных, а также после принятия пищи (алиментар¬
ная гиперкальциемия).
В патологических условиях гиперкальциемия встречается
при гиперпаратнреоидизме (до 29 мг% = 14,5 мэкв/л), гипер-
витамикозе Д, особенно при назначении чрезмерных доз вита¬
мина Д; аддисоновой болезни, синдроме Иценко — Кушинга,
акромегалии, лейкозах, гангренах, перитонитах (вследствие
распада клеток, содержащих кальций), при сердечной недоста¬
точности (вследствие повышения СОг крови), при желтухе
и др.
Выделяется также идиопатическая гиперкальциемия у груд¬
ных детей (12—17 мг%; 6—8,5 мэкв/л).
Гипокальциемия гораздо чаще встречается, чем гиперкаль¬
циемия. Особенно большое значение в детском возрасте имеет
гипокальциемия при спазмофилии (тетании). Это уменьшение
вызывает целый ряд симптомов, наблюдаемых при спазмофи¬
лии (повышенная нервная возбудимость и др.). При явной
спазмофилии уровень кальция в крови падает до 6 мг%
(3 мэкв/л) и ниже. При скрытой форме спазмофилии уровень
кальция варьирует между 6—8 мг% (3—4 мэкв/л). Необхо¬
димо также помнить, что некоторые формы спазмофилии про¬
текают без уменьшения количества кальция в сыворотке. При
спазмофилии падение уровня кальция в сыворотке происходит,
главным образом, за счет ионизированного кальция.
Второе место по важности занимает гипокальциемия ранне¬
го детства при рахите. Однако снижение концентрации каль¬
ция в сыворотке крови, как правило, весьма незначительное
(до 8,5 мг%; 4,25 мэкв/л), в связи с чем оно не имеет боль¬
шого клинического значения.
Гипокальциемией сопровождаются и некоторые заболевания
почек, особенно хронические. При нефрозах гипокальциемия
возникает вследствие резкого уменьшения белков в сыворотке
(гипопротеинемическая гипокальциемия). В этих случаях уро¬
вень кальция в крови может снизиться до 5—6 мг% (2,5—
3 мэкв/л) и могут появиться симптомы тетании. При хрони¬
ческих нефритах уменьшение кальция (до 5—7 мг%; 2,5—
3,5 мэкв/л) появляется вследствие повышения уровня фосфо¬
ра (до 20 мг%; 10 мэкв/л), вызываемого фосфорной задерж¬
кой.
Гипокальциемия встречается также при гипопаратиреоидиз-
ме, поносах, целиакии, остром панкреатите, гипонатриемиях
и т. д.
199

Следует заметить, что гипокальциемия при бронхопневмо¬
нии — почти постоянный симптом, причем степень ее соответ¬
ствует тяжести процесса.
ИССЛЕДОВАНИЕ МАГНИЯ
В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ,
ЭРИТРОЦИТАХ, В МОЧЕ
Методы определения содержания магния можно разделить
на следующие группы.
I. Химические методы:
1) титрометрические:
а) комплексонометрическое титрование, которое подразде¬
ляется на визуальное и фотоэлектрическое;
2) колориметрические, основывающиеся на реакциях с мо-
либдатом, титановым желтым и с магоном.
II. Методы пламенной фотометрии.
III. Метод пламенной спектрофотометрии (атомно-абсорб¬
ционный) .
IV. Спектрографические.
V. Флюорометрические.
В методах комплексонометрического титрования использу¬
ется комплексом III (трилон Б); в качестве индикатора приме¬
няют эриохром черный, хром темно-синий, мурексид, каль-
цепн.
Методом комплексонометрического титрования определяют
суммарное содержание кальция и магния и количество кальция;
концентрацию магния находят по разности двух определений.
Эти методы (визуальные и фотометрические) не точны,
потому не могут использоваться в качестве унифициро¬
ванных.
Колориметрические методы можно разделить на прямые и
непрямые. Первые основаны на образовании окрашенных сое¬
динений магния в щелочных растворах с титановым желтым и
другими веществами.
В непрямых методах содержание магния рассчитывают по
количеству связанного реактива. По точности и простоте пря¬
мые методы имеют предпочтение перед непрямыми. Из прямых
методов наиболее чувствительны те, которые основываются на
цветной реакции магния с титановым желтым (Колгофф, 1927)
и магоном (Боон, 1962).
Методы этой группы различаются по способу осаждения
белков.
Определение магния методом фотометрии пламени не полу¬
чило распространения, так как оно возможно лишь на фотомет¬
рах, имеющих светофильтр для магния; присутствие других
щелочных и щелочно-земельных металлов мешает определению
этого элемента.
200

В последние годы получило распространение определение
магния атомно-абсорбцион-ным методом. Одним из основных
преимуществ его является простота и высокая чувствитель¬
ность. Однако в клинических исследованиях этот метод приме¬
няется еще сравнительно мало, из-за дороговизны аппа¬
ратуры.
Спектрографический и люминесцентный методы определе¬
ния магния с 8-оксихинолином, реактивом «люмомагнезон
ИРЕА» и др. труднодоступны для использования в широкой
клинической практике.
Таким образом, в качестве унифицированных рекомендуют¬
ся два метода определения магния: по цветной реакции с тита¬
новым желтым и с магоном.
Определение магния в сыворотке
(плазме) крови и эритроцитах
по цветной реакции с титановым желтым
Принцип. Магний реагирует с титановым желтым в щелоч¬
ной среде с образованием окрашенных соединений. Интенсив¬
ность окраски пропорциональна концентрации магния.
Реактивы. 1. 10% раствор вольфрамовокислого натрия.
2. 0,67 н. раствор серной кислоты.
3. 6% раствор едкого натра.
4. 0,2 н. раствор едкого натра.
5. 2% раствор солянокислого гидроксиламина. Хранят в
склянке из темного стекла.
6. 0,075% раствор титанового желтого.
18,7 мг титанового желтого растворяют в небольшом количестве
дистиллированной воды в мерной колбе на 25 мл и доводят
дистиллированной водой до метки. Хранят в склянке из темного
стекла в холодильнике, срок хранения — 10 дней.
7. 0,1% раствор метилового красного в 95° этаноле.
8. Стандартный раствор. 205 мг кристаллического сернокис¬
лого магния (х. ч.) (MgS04*7H20) растворяют в небольшом
количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и
доводят дистиллированной водой до метки. 1 мл этого 2 мг%
раствора содержит 0,02 мг магния.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 2 мл
дистиллированной воды, 1 мл сыворотки (плазмы), 1 мл 10%
раствора вольфрамовокислого натрия, содержимое пробирки
смешивают, добавляют 1 мл 0,67 н. раствора серной кислоты
и вновь тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Че¬
рез 15 мин пробу центрифугируют при 3,5—4 тыс. об/мин. в
речение 10 мин (или фильтруют через бумажный фильтр). Цен-
трифугат (фильтрат) должен быть прозрачным. К 2,5 мл цен-
трифугата (фильтрата), перенесенным в мерную центрифужную
пробирку на 10 мл, добавляют 1 каплю индикатора — метило-
201

ТАБЛИЦА 38
Данные для построения
калибровочного графика на магний
Основной стан¬
дартный раствор,
ил
Количество Mg в
основном стандарт¬
ном растворе, мг
Дистиллирован¬
ная вода, до мл
Концентрация Mg
в пробе, мг%
0,25
0,005
6
1
0,50
0,010
6
2
0,75
0,015
6
3
1,00
0,020
6
4
1,25
0,025
6
5
1,50
0,030
6
6
вого красного и нейтрализуют 0,2 н. раствором едкого натра до
появления желтой окраски.
К раствору добавляют 1 мл 2% гидроксиламина, 1 мл
0,075% титанового желтого и 2 мл 6% едкого натра. Затем
раствор доводят до объема 10 мл дистиллированной водой,
экстинкцию измеряют в кювете с толщиной слоя 10 мм при
длине волны 500—560 нм. (зеленый светофильтр) против кон¬
троля.
Контроль ставят параллельно с опытом, беря вместо сыво¬
ротки дистиллированную воду.
Расчет производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из основного стан¬
дартного раствора готовят разведения, как указано в табл. 38.
Основной стандартный раствор 2 мг%.
Добавляют 1 мл 2% раствора гидроксиламина, 1 мл 0,075%
раствора титанового желтого и 2 мл 6% едкого натра.
Производят измерение оптической плотности при условиях
опытных проб.
По литературным данным, содержание магния в норме в
сыворотке и плазме составляет 1,7—2,4 мг%, или 1,5—
2,0 мэкв/л (для пересчета мэкв/л в мг% следует цифровой
показатель в мэкв/л умножить на коэффициент 1,21; для пе¬
ревода мг% в мэкв/л пользуются показателем 0,822 или но¬
мограммой, рис. 5).
Определение магния в эритроцитах
Гепаринизированную кровь центрифугируют в течение
30 мин при 3000 об/мин. К 0,5 мл (1 объем) эритроцитной
массы добавляют 2,5 мл (5 объемов) дистиллированной воды;
202

после гемолиза добавляют 1 мл (2 объема) 0,67 н. H2S04, 1 мл
(2 объема) 10% раствора вольфрамовокислого натрия. Тща¬
тельно перемешивают, через 15 мин фильтруют. Далее опреде¬
ление ведут так же, как в центрифугате (фильтрате) сыворот¬
ки (плазмы).
Определение магния в сыворотке (плазме) крови и в моче
по цветной реакции с магоном производят готовым набором
реактивов, выпускаемым фирмой «Лахема» (ЧССР). (См. ин¬
струкцию, прилагаемую к набору реактивов Био-Ла-Тест).
Клинико-диагностическое значение. При токсемии беремен¬
ных, раке, хронической сердечной недостаточности, остром и
хроническом панкреатите наблюдается выраженное снижение
содержания магния в сыворотке крови.
Увеличение содержания магния в сыворотке наблюдается
при ануриях, хронической почечной недостаточности и при по¬
ражении почек, сопровождаемом гиперкалиемией. Суточная
потребность организма человека в магнии составляет около
10 мг/кг веса тела и обычно покрывается за счет пищевых про¬
дуктов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ ХЛОРА В КРОВИ,
МОЧЕ И СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ
Хлор находится в организме преимущественно в ионизиро¬
ванном состоянии, в виде аниона солей Na, К, Са, Mg и т. д.,
и играет большую роль в создании осмотического давления,
участвует в поддержании кислотно-щелочного равновесия.
В крови хлор встречается, главным образом, в виде хлористо¬
го натрия. Его содержание в эритроцитах почти в 2 раза мень¬
ше, чем в плазме крови. Хлориды выводятся из организма в
основном (на 90%) с мочой, а также с потом и калом.
Методы определения хлорид-ионов
I. Осадочные методы (аргентометрические) основаны на
способности ионов серебра образовывать с ионами хлора нера¬
створимые соли. Количество осаждающего вещества эквива¬
лентно содержанию хлорид-ионов. Конец реакции устанавли¬
вается по прекращению выпадения осадка или с помощью ин¬
дикатора.
Осадочные методы включают в себя: осаждение белка,
осаждение хлора и взаимодействие его с индикатором. В за¬
висимости от того, какое вещество применяется в качестве
осаждающего реактива или индикатора, осадочные методы
можно разделить на следующие группы:
1. Методы, основанные на принципе Мора. Белок осажда¬
ется спиртом, ионы хлора титруют азотнокислым серебром, ин¬
203

дикатором является К2СЮ4. В конечной точке образуется оса¬
док коричневого цвета.
2. Методы обратного титрования, основанные на принципе
Фольгарда. Белок осаждается любым кислым осадителем, ионы
хлора осаждают серебром, его избыток титруют раствором ро¬
данистой соли; в качестве индикатора применяют железоамми¬
ачные квасцы. В конечной точке титрования жидкость окраши¬
вается 2 красноватый цвет.
3. Методы, основанные на оса:хденли ионов хлора йодно¬
кислым серебром. Белок осаждается фосфорной, вольфрамовой
п другими кислотами, смесь встряхивают с избытком твердого
йодата серебра и фильтруют. Образуется осадок AgCl, а раст¬
воренный йод определяется титрометрически или колориметри¬
чески.
4. Методы с применением адсорбционных индикаторов (ди-
хлорфлуоресцеина, эозина). Эти индикаторы адсорбируются в
виде анионов на положительно заряженной поверхности хло¬
рида серебра. Адсорбционный индикатор и тот же индикатор
в растворе различаются по цвету.
II. Ртутнометрические методы, в которых хлориды титруют¬
ся непосредственно азотнокислой ртутью. По израсходованному
количеству ее определяется концентрация хлорид-ионов.
Из методов этой группы наиболее широкое распространение
получил метод Шэлса (1941) и его модификации.
III. Колориметрические методы, основанные на образова¬
нии цветных соединений хлора с различными реактивами: тио-
ционатом ртути и ртутным хлор-анилатом.
IV. Электрохимические методы исследования.
V. Методы, основанные на окислительно-восстановительных
реакциях.
VI. Изотопные методы.
Метод Мора (1856) основан на образовании в конечной точ¬
ке титрования хромата серебра (оранжево-красного цвета).
Недостатки методов, использующих принцип Мора, состоят
в том, что:
1) окраска, появляющаяся в конечной точке титрозания, не¬
четкая;
2) титрование нужно проводить в нейтральной среде;
3) моча не должна содержать белок и органические веще¬
ства, например, пурины, которые тоже осаждаются азотнокис¬
лым серебром. По методам, основанным на принципе Фольгар¬
да, в отличие от метода Мора, можно титровать даже сравни¬
тельно кислые растворы. Однако им также присущи многие
недостатки.
Иодометрические методы более чувствительны, чем метод
Фольгарда, однако на окраску раствора и «нерастворимость»
йодата серебра могут влиять изменения концентрации, кислот^
ности, температуры растворов, наличие небольшой примеси
хлоридов в воде, реактивах и т. д.
204

Из методов с адсорбционным индикатором наибольшее рас¬
пространение получили методы с применением дихлорфлуорес-
цеина (Франко, Клейн, 1951).
Преимущество метода заключается в контрастном переходе
окраски из зеленой в розовую при титровании азотнокислым
серебром.
Недостатки: 1) при применении адсорбционных индикаторов
важным условием является величина pH; 2) для получения
более точных результатов необходимо проводить титрование
при минимальном освещении; 3) необходима точная концен¬
трация индикатора, так как при его излишке раствор окраши¬
вается в желтый цвет, что делает неясным изменение окраски.
Из группы ртутнометрических методов широкое распростра¬
нение получил метод О. Шалее и С. Шалее (1941), в котором
используется в качестве индикатора спиртовой раствор дифе-
нилкарбазона. Метод технически прост, точен, занимает мало
времени, потому наиболее удобен для применения в клинико-
диагностических лабораториях.
Очень точными и удобными являются электрохимические
методы исследования хлора, однако они требуют специальной
аппаратуры, что затрудняет их широкое применение в прак¬
тике.
Методы, основанные на окислительно-восстановительных ре¬
акциях, микродиффузионный метод Конвея (1950), изотопные
методы большого распространения не получили.
На основании вышеизложенного в качестве унифицирован¬
ного предложен меркуриметрический метод определения хлора
в сыворотке крови, моче и спинномозговой жидкости с приме¬
нением в качестве индикатора дифенилкарбазона.
Определение ионов хлора в сыворотке крови,
моче и спинномозговой жидкости
меркуриметрическим методом с индикатором
дифенилкарбазоном
Принцип. Хлориды биологических жидкостей титруют нит¬
ратом ртути, применяя в качестве индикатора дифенилкарба-
зон. В эквивалентной точке избыток нитрата ртути образует с
индикатором комплекс, окрашенный в сине-лиловый цвет.
Реактивы. 1. Раствор азотнокислой ртути.
2,0 г азотнокислой ртути Hg(N03)2 ■ 2Н20 х. ч. растворяют в
200 мл дистиллированной воды, добавляют точно 20 мл 2 н.
HNO3 и разводят водой до 1 л. Раствор стойкий.
2. Раствор индикатора.
100 мг дифенилкарбазона растворяют в 100 мл 96° этанола.
Раствор хранят в темной склянке в холодильнике в течение ме¬
сяца.
3. 2 н. раствор азотной кислоты. 14 мл HNO3 доводят до
100 мл дистиллированной водой.
205

4. 0,01 н. стандартный раствор хлора.
584,5 мг NaCl х. ч., высушенного до постоянного веса при
температуре +120° С, растворяют в небольшом количестве ди¬
стиллированной воды и доводят объем до 1 л. 1 мл этого рас¬
твора содержит 0,01 м.экв хлора.
Ход определения. В небольшой стаканчик помещают 1,8 мл
дистиллированной воды, добавляют 0,2 мл исследуемой биоло¬
гической жидкости, 4 капли индикатора и титруют азотнокис¬
лой ртутью из 2 мл пипетки (или, лучше, из микробюретки с
делениями на 0,01 мл) до появления сине-фиолетового окра¬
шивания (перемена окраски в конечной точке титрования от¬
четливо заметна).
Для стандартизации раствора азотнокислой ртути к 2 мл
стандартного раствора хлористого натрия добавляют 4 капли
раствора индикатора и титруют раствором азотнокислой рту¬
ти, как и опыт.
0,02 • А • 5 ■ 1000 А • 100
Расчет: мэкв хлора в 1 л= g g .
где 0,02 — мэкв хлора в 2 мл стандартного раствора хлори¬
стого натрия;
5' 1000 — коэффициент пересчета на 1000 мл биологиче¬
ской жидкости;
А — количество раствора азотнокислой ртути, израсходо¬
ванное на титрование опыта;
Б — количество азотнокислой ртути, израсходованное на
титрование стандартного раствора хлористого натрия.
Для удобства в работе количество раствора азотнокислой
ртути, израсходованное на титрование опыта (А), можно умно¬
жить на фактор (Ф), который равен 100/Б, так как количество
раствора азотнокислой ртути, пошедшее на титрование стан¬
дарта NaCl, является величиной постоянной (в течение не¬
скольких дней).
Примечание. 1. Раствор азотнокислой ртути можно го¬
товить из красной окиси ртути. Для этого 1,083 г красной оки¬
си ртути растворяют в 11 мл концентрированной азотной кис¬
лоты и доливают водой до 1000 мл. Раствор стойкий.
2. Раствор индикатора должен иметь оранжево-красную
окраску. Реактив нужно менять, если окраска становится жел¬
той или вишнево-красной, так как в этом случае он не дает от¬
четливой конечной точки титрования.
3. Удаление белков усиливает изменение цвета в конечной
точке титрования, но оно не является обязательным. При этом
результаты определения на 1—2 мэкв/л превышают те, кото¬
рые получаются с фильтратом сыворотки.
4. Если моча имеет щелочную реакцию (рН>8), необходи¬
мо ее подкислить разведенной азотной кислотой до слабо кис¬
лой реакции.
Содержание хлора (хлорид-ионов) в сыворотке крови прак¬
тически здоровых людей составляют 95—110 мэкв/л (340-^
206

390 мг%), в спинномозговой жидкости— 120—130 мэкв/л
(425—460 мг%), в моче—170—210 мэкв/л (600—
740 мг%).
Определение в биологических жидкостях хлоридов (хлор-
ионов) титрометрическим методом с индикатором дифенилкар-
базоном очень удобно производить с использованием набора
реактивов Био-Ла-Тест (на 1000 микроопределений), см. при¬
лагаемую к реактивам инструкцию.
Клинико-диагностическое значение. Относительная гипер-
хлорсмия отмечается при обеззоживании, вызванном недоста¬
точным поступлением жидкости (но не при дегидратации, обус¬
ловленной потерей жидкости при поносах и рвоте).
При далеко зашедших заболеваниях почек (нефритах, неф¬
розах, нефросклерозах) наступает задержка соли вследствие не¬
достаточной депурационной способности почек. В целях сни¬
жения осмотического давления организм стремится: увеличить
количество внеклеточной жидкости (развиваются отеки), выде¬
лять большое количество соли вместе с потом, увеличить по¬
ступление хлоридов во внутриклеточное пространство, задер¬
жать хлориды в костной системе, в коже и других тканях (су¬
хая форма задержки). В случае, если компенсационные меха¬
низмы перестают справляться со своей задачей, наступает не
относительная, а абсолютная гиперхлоремия.
Гиперхлоремия наблюдается также при поступлении с пи¬
щей большого количества хлоридов, гиперхлоремических аци¬
дозах, при респираторном алкалозе, декомпенсации сердца.
Гипохлоремия отмечается при формах обезвоживания, свя¬
занных с поносами и, особенно, рвотой. Любая продолжитель¬
ная рвота, даже если она не связана с обезвоживанием, дово¬
дит до гипохлоремии. Особенно ярко выражено уменьшение
хлоридов при стенозе привратника. В этих случаях уровень
хлоридов в сыворотке обычно падает до 300 мг%.
При почечных заболеваниях (особенно почечном диабете)
также может появиться тяжелая гипохлоремия.
Любая ярко выраженная гипохлоремия может привести к
компенсационному повышению остаточноазотных фракций
(хлорипривная азотемия), вследствие стремления организма
сохранить постоянство осмотического давления.
Гипохлоремию вызывает также респираторный ацидоз, оте¬
ки и экссудаты (отечная задержка), пневмонии (сухая задерж¬
ка), инфекционные заболевания (токсическая дифтерия, коли¬
ты), диабетический кетоз, водное отравление и др.
Отравление сулемой вызывает переход хлоридов из крови в
ткани, при этом развивается гипохлоремия, не связанная с обед¬
нением организма хлором.
При бронхопневмонии гипохлоремия ярче всего выражена
в кульминационной фазе заболевания. Во время кризиса коли¬
чество хлоридов увеличивается и приходит к норме одновре¬
менно с выздоровлением.
207

НЕОРГАНИЧЕСКИЙ ФОСФОР
Общий фосфор крови представлен кислоторастворимой и
кислотонерастворимой фракциями. Первая образована: неор¬
ганическим фосфором,'пирофосфатами (АТФ, АДФ и др.), гек-
созофосфатами, глицерофосфатами и т. д. В состав минераль¬
ного кислотонерастворимого фосфора входят фосфор фосфоли¬
пидов и нуклеиновый, или белковый фосфор. При определений
путем минерализации липоидного и нуклеинового фосфора ор¬
ганический фосфор переводят в .неорганический. Для определе¬
ния последнего предложены спектрофотеметркческие, колори¬
метрические, пламеннофотометрические, комплексонометриче-
ские методы. Из нкх наибольшее распространение получили
колориметрические методики, основанные на определении фос¬
фора в виде синего фосфорномолибденового комплекса, полу¬
чившего название молибденовой сини. Принцип метода заклю¬
чается во взаимодействии фосфора с молибденовой кислотой
с образованием фосфорномолибденовой кислоты, которая вос¬
станавливается в присутствии избытка молибдата до синего
фосфорномолибденового комплекса. Химизм образования мо¬
либденовой сини до сих пор еще окончательно не выяснен.
В качестве восстановителей для образования молибденовой
сини применяются гидрохинон, эйконоген (1-амино-2-нафтол-
4-сульфоновая кислота), двухлористое олово, амидол (2,4-диа-
минофенолгидрохлорид), аскорбиновая кислота, тиомочевина.
Из перечисленных способов в нашей стране чаще пользуют¬
ся методами с применением в качестве восстанавливающих
веществ гидрохинона, аскорбиновой кислоты и эйконогена, за
рубежом — методами с использованием эйконогена и двухлори¬
стого олова.
Самым чувствительным является метод с применением дву¬
хлористого олова. Недостатком его является неудобство рабо¬
ты с этим восстановителем из-за узких пределов допустимой
кислотности. Кроме того, по сравнению с другими методиками
он более сложен и при работе иногда появляется помутнение
молибденовой сини.
Метод с применением аскорбиновой кислоты в качестве вос¬
становителя обладает большей точностью и чувствительностью.
Недостатком его является то, что некоторые вещества в опреде¬
ленных концентрациях (уксуснокислый, сернокислый Na,
хлористый Na, соли мышьяка и др.) могут инактировать
аскорбиновую кислоту, менять кислотность среды и мешать об¬
разованию фосфорномолибденового комплекса. Кроме того, ас¬
корбиновая кислста при нарушении условия опыта может вос¬
станавливать молибденовую кислоту в отсутствии фосфора.
Из методов, применяющих в качестве восстанавливающего
вещества эйконоген, используется способ Фишке, Субаров’а
(1925) и его модификации. Этот метод точный, его можно при¬
менять в широких пределах изменения количества фосфора,
208

окраска появляется быстро и держится долго. Он является на¬
иболее приемлемым для определения неорганического фосфо¬
ра в сыворотке крови.
Метод с гидрохиноном несколько уступает предыдущему в
отношении точности, а также стабильности реактива (гидрохи¬
нон быстро разлагается, в связи с чем реактив нужно готовить
перед употреблением).
Учитывая все вышеизложенное, в качестве унифицирован¬
ного рекомендуется колориметрический метод определения не¬
органического фосфора с восстанавливающим веществом-эйко-
ногеном.
Определение неорганического фосфора
в сыворотке крови л моче по восстановлению
фосфорномолибденовой кислоты
Принцип. После осаждения белков в центрифугате остается
неорганический фосфор, который при взаимодействии с молиб¬
деновой кислотой образует фосфорномолибденовую кислоту.
Последняя восстанавливается эйконогеном до синего фосфор¬
номолибденового комплекса. Интенсивность окраски прямо про¬
порциональна концентрации неорганического фосфора в био¬
логическом субстрате.
Реактивы. 1. 10% раствор трихлоруксусной кислоты.
2. 5% раствор молибденовокислого аммония в 5 н. серной
кислоте. 5 г молибденовокислого аммония доводят до 100 мл
5 н. раствором H2S04 при постоянном помешивании до полного
растворения.
3. 5 н. H2S04. Готовят добавлением к 860 мл дистилли¬
рованной воды 140 мл концентрированной H2S04 уд. веса 1,84.
4. Раствор аминонафтолсульфоновой кислоты (эйконоге¬
на). 6 г кислого сернистокислого натрия (бисульфита натрия
NaHS03) или метабисульфита натрия (Na2S205) растворяют
полностью в 20—25 мл воды, после чего в раствор добавляют
0,1 г эйконогена. Эйконоген растворяется медленно, при по¬
мешивании стеклянной палочкой. Отдельно в небольшом коли¬
честве воды растворяют 1,2 г безводного сернистокислого нат¬
рия (сульфита натрия Na2SOs). Оба раствора смешивают и объ¬
ем доводят до 50 мл дистиллированной водой. Через 2—3 ч
раствор фильтруют. Хранят в холодильнике, в посуде из тем¬
ного стекла.
5. Основной стандартный раствор однозамещенного фосфор¬
нокислого калия, высушенного до постоянного веса при 120° С.
0,4389 г КН2Р04 растворяют в дистиллированной воде в мер¬
ной колбе на 100 мл. 1 мл этого раствора содержит 1 мг Р.
Из основного готовят рабочий раствор с содержанием
0,02 мг фосфора в 1 мл. Для этого 2 мл основного стандартного
раствора фосфора доводят дистиллированной водой в мерной
колбе до 100 мл.
209

ТАБЛИЦА 39
Данные для построения калибровочной кривой
№ про¬
бирок
Раствор, мл
Дистилли¬
рованная
вода, мл
Содержание фосфора
в пробе
рабочий
стандарт¬
ный
трихлор-
уксусной
кислоты
молибде¬
новокисло¬
го аммония
эйко¬
ногена
мг
МГ%
1
0,5
2,5
1,0
0,2
3,8
0,01
2
2
1,0
2,5
1,0
0,2
3,3
0,02
4
3
2,0
2,5
1,0
0,2
2,3
0,03
6
4
3,0
2,5
1,0
0,2
1,3
0,04
8
5
4,0
2,5
1,0
0,2
0,3
0,05
10
Ход определения. 1 мл сыворотки смешивают с 4 мл дистил¬
лированной воды и 5 мл трихлоруксусиой кислоты. Через
10 мин пробу центрифугируют. К 5 мл центрифугата добавляют
1 мл молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена
и 1,8 мл дистиллированной воды. Через 20 мин стояния при
комнатной температуре пробы колориметрируют против конт¬
роля в кювете шириной 10 мм при красном светофильтре (с по¬
лосой пропускания 630—690 нм).
Контроль ставят, как опыт, но вместо центрифугата берут
2,5 мл трихлоруксусиой кислоты и 2,5 мл дистиллированной
воды.
Расчет производят по калибровочной кривой.
Построение калибровочной кривой. Из рабочего стандарт¬
ного раствора готовят разведения (табл. 39).
После 20-минутного стояния пробы колориметрируют как
опыт против контроля на реактивы.
Примечания. 1. При отсутствии эйконогена можно ис¬
пользовать 1% раствор аскорбиновой кислоты, приготовленный
перед работой на 0,1 н. раствора соляной кислоты.
2. При определении неорганического фосфора в моче ее раз¬
водят в 10 раз и дальнейшую обработку разведенной мочи про¬
водят аналогично сыворотке.
Нормальное содержание неорганического фосфора в сыво¬
ротке крови взрослого человека составляет 2—4 мг% (1,2—
2,3 мэкв/л), в моче — 0,6—1,2 г/сутки.
Летом количество фосфора оказывается несколько больше,
чем зимой.
Уровень фосфора зависит: П от функции парашитовидных
желез, 2) щитовидных желез, 3) регулирующего действия ви¬
тамина Д, 4) функции почек.
Клинико-диагностическое значение. Гиперфосфатемия встре¬
чается при почечной недостаточности, гипопаратиреоидизме,
акромегалии, диабете, кетозе, приеме больших доз витамина Д,
210

ультрафиолетовом облучении, в некоторых случаях при адди*
соновой болезни, при спазмофилии, болезни Иденко — Кушин¬
га. Гиперфосфатемия при нефритах и нефрозах (10—20 мг%,
5,8—11,6 мэкв/л) является одним из неблагоприятных прогно¬
стических признаков; эти заболевания часто сопровождаются
понижением резервной щелочности. Увеличение содержания
фосфатов в крови наблюдается при токсикозах беременности.
Гиперфосфатемией сопровождается период заживления кост¬
ных переломов, что является благоприятным признаком. Мы¬
шечная работа приводит к повышению содержания неорганиче¬
ских фосфатов в результате расщепления органических фосфор¬
ных соединений (АТФ).
Гипофосфатемия в детском возрасте часто наблюдается при
рахите. Очень важно, что снижение уровня неорганического
фосфора в сыворотке крови отмечается в ранней стадии рахита
(0,6—3,0 мг%, 0,35—1,75 мэкв/л), когда клинические сим¬
птомы еще недостаточно выражены. Гипофосфатемия при рахи¬
те может перейти в гиперфосфатемию, что нередко сопровожда¬
ется явлениями спазмофилии. Снижение содержания фосфатов
в крови наблюдается при остеомаляции, пеллагре, длительном
лечении инсулином и хлористым кальцием. Гипофосфатемия
часто наблюдается у новорожденных, при гиперпаратиреоидиз-
ме, гиперинсулинизме, микседеме. Гипофосфатемия может быть
и алиментарного происхождения вследствие потребления бед¬
ной фосфатами пищи и нарушения всасывания фосфатов в ки¬
шечнике.
Для диагностики различных патологических состояний важ¬
ное значение имеет установление количественного соотношения
между содержанием кальция и неорганического фосфора в кро¬
ви. Нормально этот коэффициент (Са/Р) у детей равен 1,9—2,
а при рахите он повышается до 3 и больше. При рахите коли¬
чество выделяемого с мочой фосфора увеличивается в 2—10 раз
по сравнению с нормой. Повышение выделения фосфатов с мо¬
чой отмечается при распаде клеток (например, при лейкозах,
гипертиреозе, диабете, менингите).
Снижение выделения фосфатов с мочой можно наблюдать
при туберкулезе, лихорадочных состояниях, острой желтой ат¬
рофии печени, при недостаточной функции почек, акромегалии.
ЖЕЛЕЗО И ТРАНСФЕРРИН.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЖЕЛЕЗА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Первым реактивом, примененным в 1927 г. для определения
железа в сыворотке крови, был роданит калия. Метод, осно¬
ванный на его использовании, оказался очень несовершенным:
интенсивность окраски комплексного соединения железа с ро-
данитом уменьшалась уже через 15 мин, а само окрашивание
во многом зависело от примесей (например, фосфатов). В даль¬
211

нейшем для определения железа был применен орто-фенантро-
лин. Этот органический реагент дает с железом комплекс, ко¬
торый сохраняется в растворе несколько месяцев.
В 1951 г. Казе предложил новый реактив на железо — ба-
то-фенантролин, по чувствительности в 2 раза превышающий
орто-фенантролин.
Известен ряд методов с применением бато-фенантролина в
качестве комплексообразователя. Они отличаются друг от дру¬
га приготовлением бато-фенантролинового реактива, способами
выделения железа из белкового комплекса, доведением необхо¬
димой для цветной реакции концентрации водородных ионов,
а также методами восстановления железа.
Для выделения железа из связанного состояния рекоменду¬
ется применять 1,2% или 7,5% (2 н.) соляную кислоту. Однако
ее прибавление разбавляет раствор, снижая концентрацию же¬
леза и, следовательно, уменьшает точность метода. Прогрева¬
ние смеси сыворотки с трихлоруксусной кислотой до +95° С
приводит к полному отделению железа от трансферрина, по¬
этому предварительное прибавление соляной кислоты излишне.
Необходимая концентрация водородных ионов (pH 4,8—5,0)
создается обычно ацетатом аммония или ацетатом натрия.
В качестве восстановителя могут быть использованы гидрокси-
ламин, тиогликолевая кислота, гидрохинон, гидразин. Генри с
соавторами, стремясь к уменьшению объемов смеси, использу¬
ют насыщенный раствор сульфата гидразина. Этот восстанови¬
тель отличается стойкостью.
Бато-фенантролин нерастворим в воде. Поэтому его либо
растворяют в алкоголе, либо применяют сульфонированное
производное, способное растворяться в воде. Триндер (1956),
использовав в своей работе сульфонированное соединение ба¬
то-фенантролина, показал, что молярный коэффициент пога¬
шения этого комплекса выше молярного коэффициента ком¬
плекса железа с несульфонированным бато-фенантролином. По
методу Генри с соавторами сульфонирование бато-фенантроли¬
на производят при помощи хлорсульфоновой кислоты.
Известны также дипирридиловые и трипирридиловые мето¬
ды определения железа. Однако по своей чувствительности они
не превосходят орто- и бато-фенантролиновые. Поскольку бато-
фенантролин в настоящее время доступен, решено в качестве
унифицированного использовать метод с применением этого
реактива.
Бато-фенантролиновый метод
определения железа сыворотки крови
Принцип. Определение сывороточного железа основано на
его освобождении из белкового комплекса и проведении после¬
дующей реакции с бато-фенантролином.
Реактивы. 1. 20% раствор трихлоруксусной кислоты.
212

2. 70% раствор уксуснокислого аммония. К 70 г ацетата ам¬
мония добавляют 30 мл воды.
3. Насыщенный раствор сульфата гидразина. Для его при¬
готовления 2,5 г соли растворяют в 100 мл воды. Хранят при
комнатной температуре в посуде из темного стекла.
4. Раствор бато-фенантролина (4,7-дифенил-1,10-фенантро-
лина). Его готовят следующим образом: 100 мг бато-фенантро¬
лина помещают в пробирку, в которую прибавляют 0,5 мл
хлорсульфоновой кислоты. Смесь кипятят 30 с, охлаждают и
к ней медленно прибавляют 10 мл дважды дистиллированной
воды, после 20-минутного прогревания в кипящей водяной бане
смесь переносят в 200-миллилитровую колбу, в которую добав¬
ляют 100 мл воды, pH раствора доводят до 4 (20% едким нат¬
ром) и добавляют бидистиллированной воды до объема мер¬
ной колбы (200 мл).
5. Стандартный раствор с содержанием 100 мкг железа в
1 мл. Готовят из соли Мора (NH4)2Fe(S04)a • 6 НгО: 0,7032 г соли
растворяют в 5 мл 0,3 н. раствора НС1, после чего доводят
объем до 1 л бидистиллированной водой (подкисленной 1 мл
концентрированной H2S04). Рабочий стандартный раствор же¬
леза получают разведением основного в 50 раз подкисленной
водой. Он содержит 2 мкг/мл железа.
Ход определения. В пробирку вносят 2 мл сыворотки, 2,5 мл
бидистиллированной воды и 1,5 мл 20% раствора трихлорук¬
сусной кислоты, свободной от примеси железа. После переме¬
шивания содержимое помещают на 15 мин в водяную баню при
температуре +90—95° С. Смесь центрифугируют при 2000 об/мин
в течение 20 мин и отделяют 4 мл верхнего слоя, к нему при¬
бавляют 0,35 мл 70% раствора ацетата аммония и 0,3 мл на¬
сыщенного раствора сульфата гидразина. Экстинкцию измеря¬
ют на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (при
длине волны 500—560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Затем прибавляют 0,4 мл раствора бато-фенантролина. Повтор¬
ную фотометрию проводят через 40 мин. В случаях, если не
удается отобрать 4 мл надосадочной жидкости, к полученному
количеству центрифугата добавляют необходимый (для дове¬
дения до 4 мл) объем бидистиллированной воды.
Параллельно ставят контрольную пробу. Смешивают 1 мл
трихлоруксусной кислоты, 3 мл воды, прибавляют 0,35 мл 70%
раствора уксуснокислого аммония, 0,3 мл насыщенного раство¬
ра сернокислого гидразина. Экстинкцию измеряют при тех же
условиях, что и опытные пробы. Через 40 мин к контрольной
пробе так же, как и к опытной, добавляют 0,4 мл раствора бато-
фенантролина и повторно измеряют экстинкцию при тех же
условиях.
Стандартная проба. К 2 мл рабочего стандартного раствора
(е ^концентрацией железа 2 мкг/мл и общим его содержанием
во^ взятом объеме 4 мкг) прибавляют 1 мл бидистиллированной
воды, 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, 0,35 мл
213

70% раствора уксуснокислого аммония, 0,3 мл насыщенного
раствора сернокислого гидразина. Далее стандартную пробу
обрабатывают и измеряют как опытную.
Расчет. Из результатов отсчета, полученного после прибав¬
ления бато-фенантролина, вычитают результаты исследования
до прибавления этого реактива. Расчет производят по формуле:
(Аоп — Ак) / (Act — Ак) • 300,
где Аоп — разность между окончательным и предварительным
отсчетом в проводимом исследовании;
Act — то же самос для стандартного раствора;
A.f — то же самое для контрольной пробы;
300 — коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки (4Х
Х100)/1,33.
Если после центрифугирования не удается получить 4 мл
недосадочной жидкости, полученное количество доводят биди-
стиллированной водой до 4 мл. В этих случаях вместо коэффи¬
циента 300 используют другой коэффициент расчета К=300+
+ 50 (4,0 —В),
где К — коэффициент расчета.
В — количество мл центрифугата, взятое для реакции.
Общая формула расчета следующая:
■ д0П~5к • 300 + (4,0 - В) • 50.
Аст Ак
Прямолинейная зависимость между оптической плотностью
и концентрацией железа сохраняется до концентрации
1000 мкг%.
В норме содержание железа сыворотки колеблется от 70 до
170 мкг%. В среднем оно равно 123±7 мкг%. У женщин содер¬
жание железа сыворотки несколько ниже, чем у мужчин.
Примечания. 1. Железо следует определять лишь в
сыворотке, не содержащей следов гемолиза.
2. Кровь следует брать в специальную пробирку, пропарен¬
ную или тщательно вымытую (после обработки хромовой сме¬
сью либо азотной кислотой) бидистиллированной водой, высу¬
шенную и покрытую фольгой.
3. Посуду промывают 5 н. раствором HCI и ополаскивают
бидистиллированной водой.
4. Больной, у которого берут кровь, не должен принимать
препаратов железа по крайней мере 5 дней (!). В противном
случае могут быть получены завышенные результаты.
5. Не следует забывать о необходимости употреблять в рас¬
твор только дважды дистиллированную воду.
Орто-фенантролиновый метод
определения железа в сыворотке крови по Г. Матсубара
В дополнение к описанному, нами рекомендуется подкупаю¬
щий своей простотой и хорошей воспроизводимостью метод оп¬
ределения железа по Т. Матсубара (1961), который может
214

быть налажен в лаборатории при отсутствии в ней бато-фенан-
тролина. Принцип метода сводится к освобождению железа из
белкового комплекса, восстановлению его аскорбиновой кисло¬
той и последующему определению по цветной реакции с орто-
фенантролином.
Ход определения: к 2 мл сыворотки добавляют 1 мл биди-
стиллированной воды, 1 мл 0,1 н. НС1 и, после перемешивания,
пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре. За¬
тем прибавляют 1 мл 20% ТХУ и через 20 мин смесь центрифу¬
гируют при 1500 об/мин в течение 30 мин. К 2 мл центрифугата
добавляют 1 мл раствора аскорбиновой кислоты (готовящегося
ex tempore растворением 8 мг кислоты в 50 мл бидистиллиро-
ванной воды, хранить в темном месте!) и 1 мл 1% раствора
орто-фенантролина (к 100 мг орто-фенантролина «ч» добавля¬
ют 10 мл бидистиллированной воды с 4 каплями концентри¬
рованной H2S04 х. ч.). Через 30 мин пробу колориметрируют на
ФЭКе при зеленом светофильтре (500—560 нм), в кювете ши¬
риной 10 мм против контроля, который ставится путем добав¬
ления к 3 мл бидистиллированной воды 1 мл 0,1 н. НС1 и 1 мл
20% ТХУ. В дальнейшем его обрабатывают как опыт.
Расчет производят по формуле: Соп = Еоп/ЕРТ '200,
где Е — экстинкция опытных и стандартных проб;
С — концентрация железа в сыворотке в мкг%;
200—концентрация железа в стандартной пробе в мкг%.
Для этого готовят основной стандартный раствор железа,
как описано в предыдущем методе. 1 мл его содержит 100 мкг
железа. Затем его разводят в 50 раз и получают рабочее раз-
ведение с концентрацией 2 мкг/мл или 200 мкг%. При про¬
ведении стандартной пробы вместо сыворотки берут 2 мл это¬
го рабочего стандартного раствора, который пропускают через
всю методику.
Примечания. Те же, что и к бато-фенантролиновому
методу определения сывороточного железа.
По данным автора, нормальное содержание сывороточного
железа составляет 80—120 мкг%.
Определяемое в сыворотке железо связано с особым белком
Pi-глобулиновой фракции — трансферрином. В норме этот бе¬
лок насыщен железом лишь на 30%. Максимальное количество
железа, которое может присоединять трансферрин до своего
насыщения, обозначается как общая железосвязывающая спо¬
собность сыворотки крови (ОЖСС). Она дает представление
о содержании трансферрина в организме. Очевидно, ОЖСС
складывается из насыщенной железом части трансферрина (со¬
держание сывороточного железа) и ненасыщенной — НЖСС.
Отношение связанного в трансферрине железа к общему пред¬
ставляет собой коэффициент насыщения трансферрина. Опре¬
деление сывороточного железа, ОЖСС, НЖСС и коэффициен¬
та насыщения трансферрина помогает оценить функциональное
состояние эритропоэза.
215

По данным ряда авторов, содержание сывороточного железа
в норме составляет 80—120 мкг%, свободного трансферрина —
150—230 мкг%, обшего трансферрина — 300—400 мкг%.
Все указанные показатели могут быть найдены при парал¬
лельном определении содержания сывороточного железа и
трансферрина по приводимой методике:
К 1 мл сыворотки крови добавляют 2 мл рабочего раствора
соли Мора (в 1 мл которого содержится 5 мкг железа, раство¬
ренного в 0,005 и. НС1). Содержимое пробы тщательно переме¬
шивают и через 3 мин добавляют 100 мг MgC03 (для адсорбции
несвязавшегося железа). Полученную взвесь в течение 1 ч
встряхивают в Шуттель-аппарате. Пробы центрифугируют
5 мин при 3000 об/мин. Центрифугат сливают в чистую пробир¬
ку и в 2 мл его определяют железо по описанной методике.
Приготовление реактивов. 1. Исходный раствор соли Мора
с содержанием 100 мкг железа в 1 мл готовят следующим об¬
разом: 0,7032 г соли Мора растворяют в 1 л бидистиллирован¬
ной воды, подкисленной 1 мл фиксанальной серной кислоты.
1 мл полученного основного раствора содержит 100 мкг же¬
леза.
2. Раствор соли Мора с содержанием 5 мкг железа в 1 мл.
В колбу на 100 мл вносят 5 мл исходного раствора соли Мора
и объем доводят 0,005 н. раствором НС1 до метки (или прили¬
вают 95 мл 0,005 н. раствора НС1).
3. 0,005 н. раствор НС1. К 5 мл 0,1 н. раствора НС1 добавля¬
ют 95 мл бидистиллированной воды.
4. Порошок MgC03 (добавляют по 100 мг в пробу).
Уровень железа в сыворотке крови зависит от многих при¬
чин: количества усвоенного пищевого железа, способности
костного мозга утилизировать железо для построения гемогло¬
бина, интенсивности физиологического распада железосодержа¬
щих белков и некоторых других причин.
Клинико-диагностическое значение. Содержание железа сы¬
воротки значительно снижается при железодефицитной анемии,
независимо от причины ее вызывающей. ОЖСС либо нормаль¬
на, либо даже несколько выше нормы (за счет компенсаторно
повышенного синтеза трансферрина и некоторого удлинения
продолжительности жизни этого белка). НЖСС резко увеличе¬
на. Процент насыщения железом трансферрина уменьшается.
Снижение содержания железа сыворотки наблюдается так¬
же при анемиях, связанных с воспалением, гнойной септиче¬
ской инфекцией и интоксикацией, с остеомиелитом, ревматиз¬
мом, ревматоидным полиартритом. Однако в перечисленных
случаях уровень сывороточного железа снижается менее зна¬
чительно, составляя 40—60% от нормы. ОЖСС нормальна, в
тяжелых случаях несколько снижена. НЖСС обычно увеличи¬
вается. В связи с указанными изменениями общей и ненасы¬
щенной железосвязывающей способности сыворотки процент
насыщения железом трансферрина часто снижен.
216

При ан-емии Аддисон — Бирмера, большинстве гемолитиче¬
ских анемий содержание железа сыворотки нормально или не¬
сколько выше нормы. Исключение составляет гемолитическая
анемия Маркиафава — Микели, при которой уровень железа
сыворотки понижен. При ней в связи с постоянным внутрисо-
судистым гемолизом имеется постоянное выведение железа с
мочой.
Содержание железа в плазме (сыворотке) крови снижено
при ахилических анемиях, уремии, карциноматозе, гнойных и
септических заболеваниях, а также инфаркте миокарда.
Высокое содержание железа сыворотки имеет место либо
при недостаточном использовании железа, либо при его повы¬
шенном поступлении в организм. Последнее наблюдается при
первичном гемохроматозе, при котором из-за наследственного
нарушения механизма, ограничивающего всасывание железа в
желудочно-кишечном тракте, в организм поступает огромное
количество железа. Поэтому при гемохроматозе содержание
железа в сыворотке оказывается резко увеличенным. ОЖСС
несколько снижена. НЖСС часто почти не выявляется. Про¬
цент насыщения велик (обычно составляет 85%).
Недостаточное использование железа для образования фер-
ритина наблюдается при заболеваниях печени (хронических
гепатитах, циррозах), при которых обычно повышено содержа¬
ние сывороточного железа.
Высокое содержание железа в сыворотке отмечается при
так называемых сидероахрестических анемиях: при них посту¬
пающее в костный мозг железо не используется в должной ме¬
ре для эритропоэза.
Недостаточное использование железа чаще всего связано с
ферментативными нарушениями синтеза гема (наследственная
сидероахрестическая анемия, рефрактерная сидеробластная
приобретенная анемия, связанная со свинцовой интоксика¬
цией).
Высокий уровень сывороточного железа наблюдается также
при талассемиях, повышенное — при всех формах желтух. Кон¬
центрацию сывороточного железа следует проверять при всех
гипохромных анемиях для дифференциации железодефицитных
анемий от сидероахрестических, которые протекают так же, как
и железодефицитные — с гипохромией.
Содержание железа является также важным показателем
для суждения о динамике лечения больных железодефицитной
анемией.
МЕДЬ И ЦЕРУЛОПЛАЗМИН
Микроэлемент медь обнаруживается как в эритроцитах, так
;и в плазме крови. Около 90% меди входит в состав церуло-
плазмина (Си-а2-глобулинового комплекса), незначительная же
часть меди находится в свободном состоянии. Медь играет важ-
217

ную биологическую роль, так как она входит в состав ряда фер¬
ментов, участвует в обмене витаминов, гормонов, белков (в том
числе и гемоглобина), углеводов, а также в некоторых иммуи-
ных процессах.
Определение меди в сыворотке крови
методом Шмидта в модификации
А. Г. Рахманкулова и И. А. Коптевой.
Принцип. Содержание меди в сыворотке крови определяет¬
ся по интенсивности желтой окраски, развивающейся при вза¬
имодействии меди с комплексообразователем — диэтилдитио-
карбаматом натрия.
Реактивы. 1. 20% раствор трихлоруксусиой кислоты.
2. 4% раствор пирофосфата натрия (Na4P207).
3. Концентрированный (25%) раствор NH4OH.
4. 1% раствор диэтилдитиокарбамата натрия.
1 г. диэтилдитиокарбамата вносят в мерную колбу емко¬
стью 100 мл, в которую затем добавляют дистиллированную во¬
ду до метки (комплексообразователь растворяется плохо).
Раствор фильтруют, переливают в темную бутыль и хранят в
холодильнике не более месяца.
Ход определения. К 2 мл сыворотки добавляют 5 мл дваж¬
ды дистиллированной воды, 3 мл 20% раствора трихлоруксус-
ной кислоты, перемешивают и через 10 мин центрифугируют в
течение 30 мин при 4000—5000 об/мин до получения прозрачно¬
го центрифугата. Отсасывают 5 мл надосадочной жидкости и
добавляют к ней 1 мл 4% раствора пирофосфата натрия,
0,5 мл концентрированного раствора аммиака, 1 мл 1% раство¬
ра диэтилдитиокарбамата натрия и встряхивают 15—20 с. Окра¬
шенные в желтый цвет растворы колориметрируют в кюве¬
тах с толщиной слоя 20 мм при синем светофильтре. Парал¬
лельно ставят один на всю серию опытных проб контроль, в
котором вместо 2 мл сыворотки используют 2 мл воды.
Расчет производят по формуле или по калибровочной кри¬
вой. Для ее построения 0,3928 г кристаллической сернокислой
меди (CuS04 • 5 Н20) растворяют в 1 л бидистиллированной во¬
ды. 1 мл полученного раствора содержит 100 мкг меди. Из это¬
го основного раствора путем разведения его в 125—50 раз
готовят рабочие растворы с содержанием меди 0,8—
2 мкг/мл.
При расчете по формуле (С0п, мкг%=Е0п/ЕСт • 100) 1 мл ос¬
новного стандартного раствора доводят до 100 мл бидистилли¬
рованной водой и 2 мл полученного рабочего раствора стандар¬
та (с концентрацией 1 мкг/мл или 100 мкг%) пропускают вме¬
сто сыворотки через всю процедуру анализа.
Норма содержания меди в сыворотке крови: 70—140 мкг%,
в среднем 120 мкг%.
218

Определение церулоплазмина в сыворотке крови
модифицированным методом Ревина
(С. В. Бестужева, В. Г. Колб)
Принцип метода основан на окислении р-фенилендиамина
при участии церулоплазмина. Ферментативная реакция оста¬
навливается добавлением фтористого натрия. По оптической
плотности образующихся продуктов судят о концентрации це¬
рулоплазмина.
Реактивы. 1. 0,5% водный раствор солянокислого р-фени¬
лендиамина. Готовят из продажного препарата, который хранят
в холодильнике в склянке из темного стекла.
2. 0,4 М ацетатный буфер, pH 5,5. Готовят из двух исход¬
ных растворов (а и б):
а) 54,44 г ацетата натрия растворяют в 1 л дистиллирован¬
ной воды;
б) 22,6 мл ледяной уксусной кислоты доводят дистиллиро¬
ванной водой до 1 л.
Полученные растворы смешивают в отношении 9:1. Буфер
нужно готовить в большом количестве, например в объеме 1 л,
добавлением к 900 мл раствора а 100 мл раствора б. Буферный
раствор хранят в холодильнике.
3. 3% раствор фтористого натрия. Продажный препарат рас¬
творяют в дистиллированной воде, осадок отфильтровывают.
Готовят в небольшом количестве.
Ход определения. В обычные химические пробирки вносят
по 0,1 мл сыворотки (без следов гемолиза). В одну из проби¬
рок, служащую контролем (она может содержать любую дру¬
гую сыворотку), добавляют 2 мл раствора фтористого натрия
(с целью инактивации ферментативной активности церулоплаз¬
мина). Затем во все пробирки вносят по 8 мл ацетатного буфе¬
ра и по 1 мл раствора р-фенилендиамина (используемого в ка¬
честве субстрата). Пробирки встряхивают и помещают на 1 ч
в водяную баню с температурой +37° С. После инкубации во
все пробирки, за исключением контрольной, добавляют по 2 мл
раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемеши¬
вают и переносят в холодильник, где выдерживают в течение
30 мин при +4° С. Пробы колориметрируют против контроля
(бледно-розовой окраски) в кюветах с шириной слоя 10 мм
при зеленом светофильтре (530 нм).
Умножая значения оптической плотности на коэффициент
пересчета 87,5 получают величину концентрации церулоплазми¬
на в мг%.
В норме содержание церулоплазмина в сыворотке крови со¬
ставляет 27,0± 1,44 мг%.
Примечание. Сыворотка может храниться в холодиль¬
нике в течение нескольких дней без изменения активности це¬
рулоплазмина.
Клинико-диагностическое значение. Резкое нарушение обме-
219

на меди наблюдается при анемиях, когда значительно повыша¬
ется ее содержание в крови при уменьшении количества депони¬
рованной меди в печеночной ткани. При лечении гипохромной
анемии у детей, а также анемии от кровопотерь и хронической
анемии у женщин медь в сочетании с кобальтом является цен¬
ным лечебным препаратом. В процессе клинической практики
выявлено, что в ряде случаев возникновение и развитие анемии
связано с недостатком меди в продуктах питания.
Педиатрам хорошо известна физиологическая анемия детей
на первом году их жизни, зависящая от одностороннего молоч¬
ного вскармливания. В этом периоде у детей снижается уро¬
вень гемоглобина, падает количество эритроцитов, уменьшается
цветной показатель. Позднее, когда ребенок начинает получать
более разнообразную пищу с достаточным содержанием железа
и меди, явления гипохромной анемии обычно проходят. Али¬
ментарные анемии, вызванные недостатком меди и железа в
диете, могут встречаться у детей и в более позднем возрасте.
Показано, что при функциональных маточных кровотече¬
ниях последние прекращаются, как правило, с момента насы¬
щения организма медью.
Гиперкупремия и гиперцерулоплазминемия наблюдается у
лиц, страдающих пернициозной анемией, в остром периоде ин¬
фекций, протекающих с лихорадкой и распадом клеточных эле¬
ментов, при заболеваниях печени: гепатитах, циррозах и меха¬
нических (но не паренхиматозных) желтухах, у больных лей¬
козами, ревматизмом, инфекционным неспецифическим поли¬
артритом, пневмонией, острой дизентерией, злокачественными
опухолями, туберкулезом, а также при беременности. Отмече¬
но 2—3-кратное повышение в крови церулоплазмина у боль¬
ных сифилисом нервной системы. Изменение метаболизма меди
выявлено и при других заболеваниях центральной нервной си¬
стемы. Наиболее яркой иллюстрацией причастности меди к
заболеваниям нервной системы может служить болезнь Виль¬
сона — гепатолентикулярная дегенерация. При этом заболева¬
нии заметно увеличивается содержание меди в печени, голов¬
ном мозгу, а также ее выведение с мочой. Одновременно в
плазме крови уменьшено общее содержание меди и особенно
церулоплазмина. Многие авторы болезнь Вильсона объясняют
нарушением обмена меди, а падение уровня церулоплазмина в
крови связывают с врожденной недостаточностью синтеза это¬
го металлопротеида в печени. Всасывание меди при этом за¬
болевании повышено, и медь в ионной форме наводняет ткани.
Избыток ионной меди становится таким образом этиопатогене-
тическим фактором заболевания. При шизофрении также об¬
наружено нарушение обмена меди, связанное с накоплением
ее в некоторых тканях.
Гипоцерулоплазминемия имеет место не только при болёё^
ни Вильсона, но и при нефротическом синдроме, а также у
новорожденных.
22G

Глава X,
ИССЛЕДОВАНИЕ
ГОРМОНАЛЬНО-МЕДИАТОРНОГО ОБМЕНА
СТРУКТУРА
И ФУНКЦИЯ НАДПОЧЕЧНИКОВ
Надпочечники представляют собой парные эндокринные
железы, расположенные у верхних полюсов почек. Их вес у
человека составляет 6—12 г. Каждая надпочечная железа со¬
стоит из двух слоев — внутреннего, мозгового, возникающего
из симпатического ганглия и в онтогенетическом отношении
представляющего часть симпатической нервной системы, и на¬
ружного, коркового, образующегося из мезодермальной ткани,
из которой развивается также закладка гонад. Этим и объяс¬
няется химическое сродство гормонов коры надпочечников с
половыми гормонами. Таким образом, надпочечник представ¬
ляет собой соединение двух самостоятельных эндокринных же¬
лез, гормоны которых по химическому строению и действию
резко отличаются друг от друга.
На корковый слой надпочечников приходится более поло¬
вины (2/3) веса железы. Вырабатываемые ею гормоны обес¬
печивают нормальный ход процессов углеводного, жирового,
белкового обменов, равновесие электролитов в организме и
половую функцию. Они также участвуют в регуляции деятель¬
ности почек, кровяного давления, функции центральной нерв¬
ной системы, реакции организма на «стресс» (вызванной, на-,
пример, травмой, инфекцией, колебаниями температуры), в
формировании воспалительной реакции тканей.
По своей химической природе гормоны коры надпочечни¬
ков являются стероидами. В их основе лежит углеводород цик-
лопентанпергидрофенантрен, состоящий из трех шестичленных
и одного пятичленного колец. Это и обусловливает схожесть
химического строения с половыми гормонами, холестерином,
провитаминами Д, желчными кислотами, также являющимися
производными циклопентанпергидрофенантрена. Общее назва¬
ние гормонов коры надпочечников — кортикоиды (или кортико-
идные гормоны, кортикостероиды). В настоящее время число
выделенных из надпочечников стероидов достигло 41. Однако
в большинстве своем эти стероиды являются биологически не¬
221

активными и лишь 8 соединений обладают способностью в той
или иной степени воспроизводить действие экстракта коры над¬
почечников. Так, наружный слой (клубочковый) продуцирует
минералокортикоиды; средний (пучковый) — глюкокортикои-
ды; внутренний (сетчатый) слой — половые гормоны (преиму¬
щественно мужские). Однако половые гормоны коры надпочеч¬
ников в норме имеют не очень большое значение. Вещества,
вырабатываемые внутренней зоной коры надпочечников, и, в
частности, прогестерон, являются промежуточными продуктами
обмена кортикостероидов, и в этом состоит их большое значе¬
ние. Продуцируемые корой надпочечников стероидные гормоны
делятся на 3 большие группы:
1) так называемые собственные гормоны,
2) 17-кетостероиды андрогенного действия,
3) женские половые гормоны.
Собственно гормоны коры надпочечников немногочисленны.
Их можно разделить на две группы: 1) глюкокортикоиды;
2) минералокортикоиды. Все они являются производными пре-
гнана и аллопрегнана.
В первую группу входят кортикостерон, дегидрокортикосте-
рон, гидрокортизон и кортизон. Все натуральные адренокорти-
костероидные гормоны, за исключением альдостерона, имеют ту
же самую основную структуру, что и кортикостерон. Они отли¬
чаются лишь наличием или отсутствием кислорода или ОН-
группы у С-11 и С-17.
Эти гормоны влияют не только на углеводный, но и на бел¬
ковый и водно-минеральный обмен.
Вторую группу составляют минералокортикоиды альдосте-
рон и дезоксикортикостерон, оказывающие выраженное влияние
на водно-солевой обмен. Причем альдостерон (электрокортин,
регулирующий электролитный обмен) в 30—100 раз активнее
ДОКа в отношении минерального обмена, на углеводный же
обмен он действует лишь в 3 раза слабее, чем кортизон. Таким
образом, альдостерону принадлежит ведущая роль в регуляции
натриевого обмена.
Проведенными рядом авторов исследованиями выявлено,
что до 80% общего количества кортикостероидоз, выделяемых
надпочечниками, приходится на долю двух стеооидов — корти-
костерона и 17-оксикортикостерона; около 1—2% —на долю по¬
стоянно присутствующего в надпочечниковой крови альдосте¬
рона.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
СОСТОЯНИЯ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ
Самые достоверные сведения о секреции кортикостероидов
могут быть получены с помощью меченых гормонов. Для этого
меченые по углероду (С14) или водороду (Н3) стероиды вводят
222

в индикаторных дозах в кровоток, затем через определенные
интервалы времени химическими методами определяют в крови
содержание гормона и удельную радиоактивность выделенного
в чистом виде стероида. К сожалению, подобные методические
приемы настолько сложны, что в обычных клинических лабо¬
раториях их, как правило, не используют.
До недавнего времени для определения содержания гормо¬
нов или их метаболитов в крови и моче использовались био¬
логические способы. В клинике о количестве глюкокортнкоидов
судили по эозикопенической реакции, о количестве мииерало-
кортикоидов — по состоянию водно-солевого баланса. В насто¬
ящее время основными методами определения кортикостерои¬
дов стали химические, основанные на реакциях химических
реагентов с выделенными в сравнительно чистом виде корти¬
костероидами, и физико-химические методы, в основе которых
используются физические и физико-химические свойства стеро¬
идов (растворимость, возгоняемость, полярографические, опти¬
ческие свойства и др.).
Все методы определения стероидов включают экстракцию
их из биологических жидкостей и тканей, очистку и последую¬
щее количественное определение.
Известно, что основное количество метаболитов кортикосте¬
роидов выводится из организма в виде конъюгатов с глюкуро-
новой или серной кислотой. Поэтому в большинстве методов
перед экстракцией применяется этап гидролиза, он может быть
осуществлен в кислой или щелочной среде в условиях нагре¬
вания или на холоду. Более щадящими условиями освобожде¬
ния стероидных соединений является сольволиз конъюгатов,
т. е. расщепление их органическим растворителем в отсутствие
воды. Его проводят при комнатной температуре в присутствии
катализатора (какой-либо кислоты).
Высокоспецифический ферментативный гидролиз конъюга¬
тов при помощи Р-глюкуронидазы остается до сих пор наилуч¬
шим способом определения глюкуронидов стероидов.
По окончании гидролиза свободные стероиды экстрагируют
органическими растворителями: хлороформом, этилацетатом,
метиленхлоридом. При экстракции плазмы ацетоном, метано¬
лом или этанолом экстрагируются не только стероиды, но и
липиды, которые далее отделяют перераспределением между
гексаном и 70% метанолом.
Полученные экстракты стероидов очищают промыванием
раствором NaOH и водой. Далее их обезвоживают Na2S04 (или
вымораживанием) и используют для количественного опреде¬
ления.
Количественное определение стероидных гормонов основы¬
вается на реакциях с определенными химическими веществами
отдельных группировок молекулы стероида; поэтому все реак¬
ции, используемые для определения кортикостероидных гормо¬
нов, специфичны не для отдельной молекулы, а для групп соеди¬
223

нений. Это групповое определение обычно бывает достаточным
для клинических целей. При более детальных исследованиях
каждое соединение выделяют в чистом виде с помощью различ¬
ных хроматографических методов или методов противоточного
распределения; количество индивидуальных соединений опреде¬
ляют соответствующей реакцией.
Для оценки функционального состояния коры надпочечни¬
ков часто используется определение суммарного содержания
нейтральных 17-КС. Однако в эту фракцию входят соединения,
различные по происхождению (из надпочечников, половых же¬
лез) и с различной биологической активностью. Большинство
17-КС мочи, таких как андростерон и этиохоланолон, являются
продуктами обмена стероидов, образующимися в печени из де-
гидроэпиандростерона, секретируемого надпочечниками, и из
тестостерона, гормона семенников. В связи с этим результаты
суммарного определения 17-КС малоспецифичны, что еще бо¬
лее снижает ценность метода.
Среди методов группового определения стероидов в послед¬
ние годы все более широкое применение находят флюориметри-
ческие способы. Благодаря высокой чувствительности и просто¬
те исследования они позволяют использовать небольшие объе¬
мы крови или мочи и тем самым дают возможность увеличить
число анализов, что особенно существенно при определении
функционального состояния надпочечников по данным содер¬
жания гормонов в плазме.
Методы определения
кортикостероидов в клинике
Наиболее доступным в лабораториях тестом для суждения
о функции коры надпочечников является определение нейтраль¬
ных 17-кетостерсидов в моче. К группе нейтральных 17-кето-
стероидов (17-КС) относятся производные андростана. Их
объединяет общий признак — наличие кетонной группировки у
углеродного атома в 17 положении.
7з 17-КС у мужчин происходит из тестостерона (образую¬
щегося в интерстициальных клетках семенников), а 2/з — в сет¬
чатой зоне коры надпочечников. У женщин они в основном сек-
ретируются корой надпочечников. Поэтому у мужчин отмеча¬
ется большая продукция 17-КС, чем у женщин. Следовательно,
изучение экскреции с мочой только общих нейтральных 17-КС
не позволяет судить о глюкокортикоидной функции коры над¬
почечников. Вместе с тем определение общих 17-кетостероидов
в моче не может полностью характеризовать интенсивность
андрогенной функции половых желез. И все же для суммарной
оценки деятельности коры надпочечников, особенно при дина¬
мическом наблюдении за ней в процессе лечения стероидными
гормонами, при сопоставлении с данными о выделении 17-окси-
224

кортикостероидов эта проба может быть использована в клини¬
ке. Более точные сведения получают, блокируя функцию коры
надпочечников дексаметазоном и стимулируя ее АКТГ.
Методы определения 17-КС включают следующие этапы:
1) сбор и хранение материала; 2) гидролиз связанных 17-КС;
3) экстракцию освобожденных 17-КС; 4) очистку экстракта;
5) выпаривание растворителя; 6) количественное определение.
Существующие методы определения 17-кетостероидов раз¬
личаются в основном на последнем своем этапе. В зависимости
от этого их можно разделить на: 1) биологические и 2) химиче¬
ские (колориметрические). Для определения фракционного со¬
става 17-КС могут быть использованы другие методы, основы¬
вающиеся на: 1) осаждении З-Р-фракции дигитонином; 2) по¬
лярографии; 3) распределительной колончатой хроматографии;
4) бумажной хроматографии; 5) тонкослойной хроматографии;
6) газо-жидкостной хроматографии.
Сбор и хранение материала. Материалом для исследования
служит суточная моча, поскольку выделение 17-кетостероидов
в физиологических условиях подвержено значительным колеба¬
ниям. Суточный (циркадный) ритм состоит в наиболее высоком
их выделении утром, более низком — вечером и минималь¬
ном — ночью. Для определения гормонов мочу собирают без
консерванта и хранят в холодном месте (в холодильнике при
О—12° С). Хорошими консервантами для предохранения ее от
развития микрофлоры являются добавляемые из расчета на
100 мл мочи: 1) 10 мг тиомерсала; 2) 1 мл 10% (вес/объем)
раствора мертиолата; 3) 1 мл хлороформа; 4) 10 мл то¬
луола.
В клинических лабораториях наиболее часто применяемым
консервантом служит хлороформ. Считают, что в таких
условиях моча может сохраняться в течение нескольких
недель.
Гидролиз. В практической работе клинико-диагностических
лабораторий наиболее пригодным способом для высвобождения
связанных форм 17-КС является метод горячего кислотного гид¬
ролиза с использованием концентрированной соляной и ледя¬
ной уксусной кислот.
Экстракция. Свободные и освобожденные при помощи гид¬
ролиза 17-кетостероиды экстрагируют из исследуемого мате¬
риала при помощи органических растворителей: этилацетата,
этиленхлорида, бензола, тетрагидрофурана, тетрахлорметана,
дихлорэтана, диэтилового эфира, метиленхлорида.
Из всех перечисленных органических растворителей, приме¬
няемых для экстракции 17-КС, особого внимания заслуживает
этиловый эфир: он дешев, с трудом образует эмульсии, не тре¬
бует для выпаривания интенсивного нагревания, хорошо экст¬
рагирует 17-кетостероиды, наименее токсичен.
Экстракцию можно проводить в делительных воронках, в
эрленмейеровских колбах с притертыми пробками (что проще
ViS Зак. 2615
225

и доступнее), а также в специальных экстракторах (последние
не имеют особых преимуществ).
Очистка экстракта. Кроме «истинных» 17-кетостероидов в
моче содержится большое количество неспецифических хромо¬
генов, которые экстрагируются органическими растворителями
вместе со стероидами.
Для их удаления экстракт обрабатывают чаще всего раст¬
вором NaOH (10 мл 10% или 2—3 н. NaOH) либо добавлением
кусочков щелочи в количестве 2—5 г с последующим фильтро¬
ванием. Удобнее пользоваться не сухим NaOH, а его раствором,
так как при этом исключается этап фильтрования.
Щелочную фазу удаляют при промывании экстракта дис¬
тиллированной водой. Наилучшим способом освобождения от
неспецифического материала при определении 17-КС в моче
является добавление в нее перед гидролизом формальдегида и
очистка экстракта промыванием раствором NaOH. Очищенные
экстракты 17-КС выпариваются. В сухом остатке проводят ко¬
личественное определение 17-КС.
Количественное определение. Наиболее распространенными
химическими способами количественной оценки содержания
17-КС являются колориметрические методы. Колориметриче¬
ское определение нейтральных 17-КС основано на взаимодейст¬
вии последних с мета-динитробензолом в щелочной среде, что
приводит к образованию комплексов фиолетовой или красно¬
фиолетовой окраски, имеющих максимум поглощения при
520 нм.
Существует множество модификаций реакции Циммермана.
Однако можно выделить три основных ее варианта:
1. Метод Каллоу и другие (1938) с растворами, приготовлен¬
ными на абсолютном спирте.
2. Метод Голтоф и Кох (1940) с водно-алкогольными раство¬
рителями и разведением реакционной смеси спиртом.
3. Метод Циммерман (1952) с водно-алкогольными раство¬
рителями и экстракцией цветного комплекса в органический
растворитель (хлороформ или эфир) с последующим фильтро¬
ванием через бумажный фильтр для снятия эмульсии.
Реакция с мета-динитробензолом зависит от щелочности
среды, концентрации м-динитробензола, температуры и време¬
ни проведения. Наилучшие условия для нее создаются при ин¬
кубации смеси этанольного экстракта, м-динитробензола и
спиртового раствора КОН в темноте в водяной бане с темпе¬
ратурой + 25° С или при комнатной температуре в течение 1 ч.
Основным недостатком реакции Циммермана с экстракцией
комплекса органическим растворителем является образование
стойких эмульсий, для избавления от которых требуется фильт¬
рование через бумажный фильтр или центрифугирование.
М. А. Крехова модифицировала эту реакцию, подобрав опти¬
мальные количества реактивов, спирта и хлороформа; она за¬
менила процедуру фильтрования хлороформного экстракта че¬
226

рез бумажный фидьтр смешиванием его с небольшим количест¬
вом спирта, что, правда, не позволяет освобождаться от эмуль¬
сии, но повышает стабильность окраски. Специфические хромо¬
гены, окрашенные в лиловый цвет, переходят в хлороформный
(нижний) слой, а неспецифическая окраска (желто-коричневая,
коричневая) остается в верхнем, водноспиртовом слое, который
затем удаляют.
Таким образом, наиболее специфичной и удобной для уни¬
фицированного метода определения 17-кетостероидов является
реакция Циммермана в модификации М. А. Креховой. Ее ис¬
пользуют в нижеприведенном унифицированном методе.
Определение 17-кетостероидов в моче
по реакции с мета-динитробензолом
(колориметрический метод Н. В. Самосудовой
и Ж. Ж. Басс, 1967)
Принцип метода основан на количественном измерении спе¬
цифически окрашенных в фиолетовый цвет экстрагированных
хромогенов, образующихся в результате реакции 17-кетостерои¬
дов с мета-динитробензолом в щелочной среде.
Реактивы. 1. Этиловый эфир, свободный от перекисей (мож¬
но использовать эфир для наркоза).
2. Абсолютный этанол, очищенный от альдегидов и кетонов,
свежеприготовленный (с. 301—302).
3. Концентрированная соляная кислота, уд. вес 1,19.
4. Ледяная уксусная кислота.
5. 10% раствор едкого натра.
6. 5 н. раствор едкого кали в метаноле.
7. 2% спиртовой раствор перекристаллизованного мета-ди¬
нитробензола.
8. Метанол, дважды перегнанный по способу, описанному
для хлороформа в главе XI.
9. Хлороформ, очищенный от примесей (с. 302). Можно ис¬
пользовать хлороформ для наркоза.
10. 40% раствор формальдегида (формалин). Раствор раз¬
водят в отношении 1 : 5 дистиллированной водой.
11. Стандарты кетостероидов: кристаллические дегидроэпи-
андростерон и андростерон.
Проба на наличие перекисей. 200 мл эфира выпаривают на
водяной бане, остаток растворяют в 2 мл абсолютного этанола.
К 0,2 мл полученного раствора добавляют 0,2 мл 2% спиртового
раствора м-динитробензола и 3 н. спиртового раствора едкого
кали. При отсутствии перекисей не должно появляться более
интенсивной окраски, чем при прибавлении 0,005 г (5 мг) крис¬
таллического 17-кетостероида. Обнаруженные перекиси удаля¬
ют перемешиванием эфира с 10% серным железом в 1 н. раст¬
227

воре серной кислоты с последующим промыванием водой.
Эфир хранят в доверху наполненных флаконах из темного
стекла.
Перекристаллизация мета-динитробензола. 10 г мета-дини-
тробензола растворяют в 375 мл 96° этанола и нагревают до
+40° С. К раствору прибавляют около 50 мл 2 н. едкого натра
и оставляют стоять 5 мин. Смесь охлаждают и прибавляют к
ней при помешивании 1,25 л дистиллированной воды. Затем
раствор фильтруют через воронку Бюхнера и промывают мета¬
динитробензол на фильтре абсолютным этанолом (1 раз 60 мл
и 2 раза по 40 мл).
Мета-динитробензол считается чистым, если он имеет точку
плавления +90,5—+91° С.
Реактив 1,3-dinitrobenzole (meta) reinst фирмы Veb-Berlin-
Chemie-Berlin-Adershof не нуждается в перекристаллизации.
Примечание. Кристаллизацию следует проводить очень
быстро, чтобы образовывались мелкие кристаллы (так как боль¬
шие плохо растворяются в спирте). Полученные мелкие игло¬
видные кристаллы должны иметь указанную выше температуру
плавления.
Проба на чистоту мета-динитробензола. 2% спиртовой рас¬
твор мета-динитробензола (полученный растворением 400 мг
мета-динитробензола в 20 мл абсолютного этанола) не должен
давать окраски в течение 1 ч после прибавления равного объе¬
ма 3 н. раствора едкого кали. Используемый в качества реакти¬
ва 2% спиртовой раствор мета-динитробензола хранят в тем¬
ной склянке с притертой пробкой.
Приготовление 5 н. раствора едкого кали в метиловом спир¬
те. Применяемый в качестве растворителя метиловый спирт де¬
лает реактив более устойчивым при хранении.
28 г едкого кали доводят до 100 мл метиловым спиртом, по¬
сле чего раствор немедленно фильтруют (щелочь нельзя остав¬
лять неотфильтрованной, потому что при этом в спиртовом
растворе щелочи образуются желтоокрашенные продукты, в ре¬
зультате получаются высокие значения контроля). После фильт¬
рования щелочь титруют 0,1 н. соляной кислотой с метилоран¬
жем. Реактив хранят в темной запарафинированной склянке г
холодильнике. Он годен в течение 1—1,5 месяца.
Стандартные растворы дегидроэпиандростерона или андро-
стерона готовят в концентрации 100 мкг/мл, для этого 5 мг
стандарта растворяют в 50 мл абсолютного этанола. Раствор
хранят в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой.
Он устойчив в течение нескольких месяцев.
Ход определения включает в себя несколько этапов.
Гидролиз мочи. К помещенным в коническую (на 70—
100 мл) колбу 20 мл мочи (взятой из суточного ее количества)
прибавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты, 1 мл ле¬
дяной уксусной кислоты и 0,2 мл раствора формальдегида.
Смесь перемешивают, колбу накрывают воронкой (или, лучше,
228

каплеуловителем) и помещают в кипящую водяную баню на
15 мин. После этого колбу охлаждают под струей холодной
водопроводной воды и содержимое ее переносят в делительную
воронку.
Экстракция и очистка экстракта. Экстракцию производят
эфиром (2 раза по 10 мл) в течение 1 —1,5 мин. Нижний слой
мочи удаляют. Эфирные экстракты объединяют, промывают тре¬
мя порциями по 10 мл 10% раствора едкого натра (по 3 мин).
Можно использовать и сухой едкий натр, добавляя его в коли¬
честве 2—5 г. В этом случае экстракт необходимо либо про¬
фильтровать, либо слить в другую колбу. Щелочную фазу, со¬
держащую экстрогены и кислые вещества, удаляют и экстракт
промывают 1 раз 10 мл дистиллированной воды. Воду тщатель¬
но отделяют, эфирный экстракт порциями переносят в центри¬
фужную пробирку и выпаривают на теплой (не выше +50° С)
водяной бане. Сухие экстракты (при формальдегидном спо¬
собе они должны быть бесцветными) на этом этапе
можно оставить для определения до следующего дня в
холодильнике.
Количественное определение основано на реакции Циммер¬
мана в модификации М. А. Крехозой.
К сухому остатку прибавляют 0,2 мл абсолютного этано¬
ла, 0,2 мл 5 н. раствора едкого кали в метаноле и 0,2 мл 2%
спиртового раствора мета-динитробензола. Смесь тщательно
перемешивают и оставляют для развития окраски на 1 ч (в
темноте!) при комнатной температуре. По окончании инкуба¬
ции добавляют 3 мл 50% водного этанола и 2 мл хлороформа;
смесь энергично встряхивают. Окрашенные в лиловый цвет
продукты переходят в нижний, хлороформный слой, а неспеци¬
фическая окраска — желто-коричневая или коричневая —
остается в верхнем, спиртоводном слое. Через 1—2 мин верх¬
ний слой удаляют отсасыванием пастеровской пипеткой с
помощью водоструйного насоса (или, при отсутствии последне¬
го, другим способом). Отсасывание производят медленно, тща¬
тельно собирая капли водного слоя со стенок пробирки. Необ¬
ходимо при этом соблюдать осторожность, чтобы не засосать
в капилляр хлороформный слой.
В хлороформный слой добавляют 1 мл абсолютного этанола.
После перемешивания интенсивность окраски измеряют на
ФЭКе при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр)
против контроля, в кюветах с толщиной слоя 5 мм, которые за¬
крывают крышками.
Окраска стабильна в течение 1 ч, однако со временем ин¬
тенсивность ее несколько снижается. По данным М. А. Крехо-
вой, через 1 ч она оказывается слабее уже на 10—15%. В связи
с этим, каждая серия определений не должна включать в себя
более 10—15 проб.
Контроль. В 2 пробирки приливают по 0,2 мл абсолютного
этанола, по 0,2 мл 5 н. раствора едкого кали в метаноле и по
6 Зак. 2615
229

0,2 мл 2% спиртового раствора мета-динитробензола. Смесь пе¬
ремешивают и далее обрабатывают, как опыт.
Расчет ведут по формуле или по калибровочному графику.
При расчете по формуле параллельно опытным пробам через
процедуру анализа пропускают 0,5 мл основного стандартного
раствора, содержащего 50 мкг андростерона или дегидроэпиан-
дростерона (приготовление см. с. 228).
Расчет по формуле: Х= (Еоп • а • 50)/ (Ест -20 • 1000),
где X — экскреция 17-КС с мочой, мг/сутки;
50 — содержание (в мкг) андростерона или дегидроэпиан-
дростерона в стандартной пробе;
Еоп и Ест — экстинкция опытной и стандартной проб;
а —диурез, мл/сутки;
20 — количество взятой в опыт мочи, мл;
1000 — коэффициент пересчета, используемый для перевода
мкг в мг.
После сокращения получаем упрощенную формулу:
Х= (Еоп • а)/(Ест • 400).
Расчет по калибровочному графику: Х= (С • а)/(20 * 1000),
где С — рассчитанное по калибровочному графику содержание
17-КС в пробе (выраженное в мкг стандарта андросте¬
рона или дегидроэпиандростерона).
Остальные обозначения те же.
Схему построения калибровочного графика см. с. 231.
При больших концентрациях 17-КС (свыше 100 мкг в пробе)
может быть 2 пути при проведении измерений:
1) провести установку «0» по контролю и просмотр опытной
пробы в кюветах шириной ке 5, а 1 мм, чем как бы достигается
разведение в 5 раз;
2) развести мочу физиологическим раствором,
В формулу расчета ввести поправочный коэффициент на
разведение.
Примечание. 1. Возможно проведение исследования и
без добавления формальдегида перед гидролизом, но при этом
получаются окрашенные экстракты.
2. Перед исследованием 17-КС необходимо исключить не ме¬
нее чем за 2 недели прием тестостерона.
Следующие лекарства также мешают исследованию: мепро¬
бамат, хлордиазепексид (либриум, элениум), метиприлон (но-
лудар), паральдегид, феназопиридин гидрохлорид (пиридиум),
хлорпромазан, апрезолин, декамфетамин, диамокс, ацетоламид,
дигитоксин, хлортиазид.
3. Мочу можно собирать без консервантов, хранят ее в хо¬
лодильнике. К суточному количеству мочи для предотвращения
развития микрофлоры рекомендуется добавлять: 1 мл хлоро¬
форма или 10 мл толуола.
230

ТАБЛИЦА 40
Экскреция 17-КС с мочой у мужчин и женщин
в зависимости от возраста (М±т, мг/сутки)
Возраст (годы)
Мужчины
Женщины
18—40
18,29 ±0,47
10,49 ±0,35
50—59
11,09 ±0,67
8,23 ±0,21
60—64
10,39 ±0,64
8,23 ±0,40
65—69
9,62 ± 0,64
7,78 + 0,60
70—74
9,57+0,55
7,90 ±0,55
75—79
9,01 ±0,57
6,29 + 0,57
80—84
6,10±0,35
6,03 ±0,55
85—89
5,67 + 0,62
5,41 + 0,53
90 и старше
5,76± 0,64
5,12 ±0,04
В этих условиях мочу до анализа можно хранить в течение
нескольких недель.
4. Построение калибровочного графика. Пропускают через
метод стандарт андростерона (дегидроэпиандростерона) в ко¬
личестве от 0,1 до 1,0 мл основного раствора (соответствующие
10, 20, 30 мкг и т. д. до 100 мкг). Линейная зависимость сохра¬
няется до концентрации стандарта 100 мкг/мл.
В норме экскреция 17-КС у мужчин составляет 12,83±
±0,8 мг/сутки с колебаниями от 6,6 до 23,4 мг/сутки; у жен¬
щин— 10,61 ±0,66 мг/сутки, с колебаниями от 6,4 до 18,02
мг/сутки.
Приводим зависимость экскреции 17-КС от возраста у маль¬
чиков: новорожденные — 0,1—0,5 мг/сутки; 4—7 лет — 0,7—2,4;
7—12 лет — 1,8—5; 12—15 лет — 5—10 мг/сутки.
Величины экскреции 17-КС с мочой у здоровых мужчин и
женщин в различные возрастные периоды представлены в таб¬
лице 40.
Клинико-диагностическое значение определения 17-КС в мо¬
че. Уровень экскреции 17-КС у девочек и мальчиков до 6-лет¬
него возраста не превышает 3—4 мг/сутки. К 12 годам экскре¬
ция достигает приблизительно 5—10 мг/сутки, причем у маль¬
чиков она оказывается несколько выше, чем у девочек. Макси¬
мальной величины экскреция у мужчин и женщин наблюдается
в 25-летнем возрасте, после чего начинается медленное ее сни¬
жение; в 80-летнем возрасте она становится равной экскреции
детей в 12-летнем возрасте.
в*
231

Выделение 17-КС несколько выше в часы бодрствования,
чем в часы сна. Всякого рода состояния напряжения (стресс)
характеризуются повышением экскреции 17-КС, однако оно
значительно менее выражено, чем наблюдаемое в этих случаях
повышение выделения кортикостероидов.
Понятно, что при исследовании содержания 17-КС в мо¬
че полученные результаты необходимо всегда сравнивать с со¬
ответствующей возрастной нормой. При этом следует учитывать
недавно перенесенные травмы, ослабление общего состояния
организма и другие факторы, могущие повлиять на содержание
17-КС.
При болезни Аддисона экскреция 17-КС очень низка и со¬
ставляет не более '/з—Vs нормальной величины. Уровень 17-КС
понижен при гипотиреозе, тяжелых формах болезни печени
(циррозе), синдроме остаточных гонад, анорхизме.
Содержание 17-КС практически равно нулю при пангипо-
питуитаризме (болезнь Симмондса), при гипофизарном карли¬
ковом росте и, как уже отмечалось, очень часто при аддисоно¬
вой болезни.
Опухоль надпочечников, которая может проявиться как син¬
дром Иценко— Кушинга, или как вирильный (адреногениталь-
ный) синдром, характеризуется, как правило, повышенным со¬
держанием в моче 17-КС, особенно, если опухоль проявляет
вирилизующее действие. В этих случаях величины около
100 мг/сутки являются обычными. При раке коры надпочечни¬
ков уровень общих 17-КС чаще всего увеличивается в 2—10 раз,
достигая иногда 300 мг/сутки. Метастазирующая раковая опу¬
холь надпочечников может обусловить экскрецию, равную
1000 мг 17-КС в сутки. Если же раковая опухоль надпочечни¬
ков проявляется как синдром Иценко — Кушинга, повышение
экскреции 17-КС выражено значительно слабее, чем при ви-
рильном синдроме.
Гиперплазия надпочечников, под которой подразумевают
увеличение желез без неопластических образований, также мо¬
жет проявляться или вирильным синдромом и повышенной экс¬
крецией 17-КС (30—100 мг), или синдромом Иценко — Кушин¬
га. В последнем случае экскреция 17-КС, как правило, находит¬
ся в пределах нормы или слегка повышена. Для этого вида
патологии характерным является повышение экскреции корти¬
костероидов. Различают, кроме того, врожденную гиперплазию,
встречающуюся у обоих полов, чаще у девочек. Нарушения
возникают в период эмбриональной жизни. Характеризуются
они повышенным выделением 17-КС и нарушением путей син¬
теза кортикостероидов.
Синдром Иценко — Кушинга без анатомических изменений
в надпочечнике, как правило, сопровождается нормальными
величинами экскреции 17-КС.
232

Определение кортикостероидов в моче
Кортикостероиды выделяются с мочой в свободном виде
лишь в небольшом количестве (составляющем примерно 3,7%
всего объема экскреции стероидных гормонов и их производ¬
ных). Большая часть гормонов выделяется в виде метаболитов,
представленных, главным образом, конъюгатами кортикостерои¬
дов с глюкуроновой, серной, фосфорной кислотами и липидами.
Методы исследования кортикостероидов можно разделить
на две большие группы: биологические и физико-химические.
Они основываются либо на 1) определении отдельной группи¬
ровки в структуре кортикостероидов и их дериватов, либо на
2) определении каждого из кортикостероидов или их метабо¬
литов.
Клинико-диагностической лаборатории под силу лишь часть
методов I группы. Для определения кортикостероидов в моче
используются в основном физико-химические методы исследо¬
вания, в частности фотометрические.
Наиболее распрестраненными и ценными из колориметриче¬
ских методов являются те, которые основаны на реакции 17,
21-диокси-20-кетостероидов с фенилгидразином, приводящей к
образованию окрашенных соединений — гидразонов-хромогенов
Портера — Сильбера. Группа этих стероидов составляет основ¬
ную часть метаболитов (80—90%), экскретируемых с мочой.
Она включает в себя, главным образом, гидрокортизон (корти¬
зол), кортизон, 17-окси-11-дезоксикортикостерон, а также тет¬
рагидропроизводные кортикостероидов — тетрагидрокортизол
и тетрагидрокортизон. Эти соединения находятся в моче как в
свободной, так и в связанной форме. Их определение позволяет
судить о количестве глюкокортикоидов, вырабатываемых ко¬
рой надпочечников за сутки, и о степени их связывания в
печени.
Существует множество модификаций методов определения
17-ОКС в моче. Все они включают следующие этапы: 1) сбор и
хранение материала, 2) экстракцию стероидов из мочи,
3) очистку экстрактов, 4) количественное определение.
Сбор и хранение материала. Для оценки глюкокортикоидной
функции коры надпочечников необходимо проводить исследова¬
ние в порции мочи, взятой из суточного ее количества. Колеба¬
ния экскреции 17-ОКС в течение дня очень велики. Показано,
что наивысшая концентрация 17-ОКС в моче обнаруживается в
8, 11 и 14 ч, а наименьшая — в 2 и 5 ч (суточный ритм выделе¬
ния 17-ОКС).
При исследовании концентрации 17-ОКС рекомендуется ис¬
ключить следующие лекарства: фенстиазин, дигиталис, барби¬
тураты, мепробамат, транквилизаторы гидразиповой структу¬
ры, амфетамин, олеандомицин, ингибиторы моноаминоксидазы,
поскольку они мешают проведению цветной реакции с фенил¬
гидразином.
233

Для консервации мочи в нее добавляют бактериостатиче-
скне агенты (предпочтительнее — хлороформ) в количествах,
указанных в методе определения 17-КС. Для исследования мо¬
чу следует хранить в холодильнике (при температуре +2—
+4° С), ее можно заморозить, Дву- и трехкратное оттаивание
мочи не влияет на величину определения суммарных 17-ОКС.
Экстракция кортикостероидов из мочи. Для освобождения
кортикостероидов из связанных форм используются: а) фермен¬
тативный гидролиз и б) кислотный гидролиз на холоду и при
нагревании. Кислотный гидролиз приводит к очень быстрому
разрушению 17-ОКС. Кроме того, при нем очень часто образу¬
ются соединения-артефакты.
Наиболее специфичным считается ферментативный гидролиз
Р-глюкуронидазой.
Свободные и освобожденные в результате гидролиза из
конъюгированного состояния 17-ОКС хорошо экстрагируются
хлороформом, этилацетатом, этилендихлоридом, метилендихло-
ридом. При экстракции эти растворители легко образуют
эмульсии, поэтому их используют в значительно больших коли¬
чествах по отношению к объему мочи, например, в следующих
соотношениях — 2 : 1, 3 : 1.
Предпочтительнее применять метилендихлорид, так как он
более стабилен, долго сохраняется при комнатной температуре,
в то время как этилендихлорид, хлороформ можно использо¬
вать без очистки в течение нескольких дней.
Очистку экстракта чаще всего производят слабым раство¬
ром щелочи, которая удаляет эстрогены, пигменты и кислоты.
Ее следует проводить очень быстро, так как при длительном
взаимодействии со щелочью часть стероидов разрушается. Из¬
быток щелочи удаляется промывкой водой, от следоз которой
освобождаются встряхиванием с безводным сульфатом натрия.
Из всех способов количественного определения кортикосте¬
роидов наилучшим является метод, основанный на реакции
17,21-диокси-20-кетостероидов с фенилгидразином.
Определение 17-оксикортикостероидов в моче
по реакции с фенилгидразином после ферментативного
гидролиза (метод Silber, Porter,1957 в модификации
Н. А. Юдаева и М. А. Креховой, 1960)
Принцип метода основан на измерении количества окра¬
шенных веществ, образующихся в результате реакции между
фенилгидразином и 17,21-диокси-ацетоновой группировкой мо¬
лекулы стероида в кислой среде. Глюкурониды 17,21-диокси-
20-кетостероидов освобождаются из связанного состояния путем
ферментативного гидролиза Р-глюкуронидазой.
Реактивы. 1. Хлороформ, х. ч. свежеперегнанный.
Вместо хлороформа можно использовать в тех же количествах
234

метиленхлорид. Способы их очистки описаны в главе XI. Хлоро¬
форм должен быть тщательно очищен. Лучшие результаты до¬
стигаются при применении хлороформа для наркоза. Для опре¬
деления 17-ОКС в моче бывает достаточно одной перегонки
этого хлороформа над безводным углекислым натрием (добав¬
ляемого в количестве 30—40 г на 1 л хлороформа). Первые и
последние 30—40 мл хлороформа при перегонке удаляют.
2. 0,1 н. раствор едкого натра.
3. 2 н. раствор едкого натра.
4. Солянокислый фенилгидразин, дважды перекристаллизо-
ванный из спирта; последнюю перекристаллизацию проводят
из очищенного этилового спирта.
5—10 г вещества растворяют в 30—40 мл этанола при нагре¬
вании, непрерывно встряхивая сосуд круговыми движениями и
периодически делая перерывы на 20—30 сек. Охлаждают вна¬
чале при комнатной температуре, а затем в холодильнике (не
менее 1 ч) до полной кристаллизации. Кристаллы переносят в
бюхнеровскую воронку с двумя бумажными фильтрами, высу¬
шивают под вакуумом, который создается в колбе Бунзена.
Процедуру повторяют от начала до конца второй раз. Высуши¬
вают фенилгидразин до постоянного веса, хранят в темноте в
эксикаторе в течение 2—3 месяцев.
5. Разбавленная серная кислота. 310 мл концентрированной
серной кислоты (выдерживающей пробу Саваля) приливают
осторожно к 190 мл дистиллированной воды.
6. Серно-спиртовой реактив. 100 мл разбавленной серной
кислоты смешивают с 150 мл абсолютного, свежеотогнанного
этилового спирта.
7. Этиловый спирт очищенный. Способ очистки и проверки
его на пригодность приводится в главе XI.
8. Фенилгидразиновый реактив. 21,7 мг солянокислого фе-
нилгидразина, дважды перекристаллизованного из спирта, рас¬
творяют в 50 мл спиртового раствора серной кислоты.
9. Ацетатный буфер pH 4,5. 5,79 г уксуснокислого натрия
(СНзСООЫа) растворяют в 10 мл дистиллированной воды, до¬
бавляют 3,25 мл ледяной уксусной кислоты и смесь доводят до
1 л дистиллированной водой.
10. Стандартный раствор кортизона или гидрокортизона
(20 мкг в 1 мл). Навеску в 1 мг стандарта растворяют в 50 мл
дважды отогнанного метанола или хлороформа. Стандартный
раствор хранят в стеклянной посуде, обернутой черной, свето¬
непроницаемой бумагой, в холодильнике.
11. Безводный сернокислый натрий ч. д. а. или х. ч.
12. 2 н. раствор соляной кислоты.
13. Р-глюкуронидаза, с активностью не менее 100 000 ед в
1 г препарата.
14. Метанол, дважды отогнанный.
Приготовление раствора Р-глюкуронидазы. Перед анализом
навеску порошка Р-глюкуропидазы, содержащую 500 ед актив¬
235

ности на 1 мл мочи, растворяют в центрифужной пробирке в
11 мл дистиллированной воды, периодически помешивая в те¬
чение 30 мин. Центрифугированием при 3000 об/мин в течение
1—2 мин отделяют осадок. Общее количество фермента гото¬
вят в соответствии с количеством мочи, подлежащей обработке.
Раствор готовят перед употреблением. Порошок хранят в холо¬
дильнике в посуде с притертой пробкой.
Ход определения. Измеряют суточное количество мочи и от¬
бирают 50 мл ее. pH мочи доводят до 6,5, добавляя каплями
2 н. едкий натр или 2 н. соляную кислоту (при этом допустимо
пользоваться универсальной индикаторной бумагой). Из этой
пробы в две эрленмейеровские колбы вносят по 10 мл подкис¬
ленной мочи (для определения свободных 17-ОКС). К ним до¬
бавляют по 5 мл ацетатного буфера и пробы помещают в
холодильник до следующего дня для дальнейшей обработки.
Затем в эрленмейровские колбы отбирают еще две пробы по
5 мл (для определения связанных 17-ОКС). Эти пробы кипятят
(на электрической плитке) в течение 5 мин для удаления инги¬
битора фермента, прикрывая их воронками, чтобы не выпари¬
валась вода. После этого охлаждают их до комнатной темпера¬
туры и добавляют к каждой пробе по 5 мл ацетатного буфера,
по 5 мл раствора Р-глюкуронидазы. Пробы ставят в термостат
на 16—18—20 ч при температуре +37° С.
Экстракция кортикостероидов из мочи хлороформом. Все
4 пробы мочи (2 колбы мочи без гидролиза и 2 — после гидро¬
лиза) переносят в делительные воронки (емкостью 150 мл) и
добавляют к ним по 75 мл (5-кратный объем) очищенного и
дважды перегнанного хлороформа. При отсутствии делитель¬
ных воронок экстракционные процедуры можно проводить в
самих колбах. Хлороформ вливают порциями, обмывая им внут¬
ренние стенки колбы (для более полного использования мочи).
Делительные воронки плотно закрывают пробками, энергично
встряхивают в течение 2-х минут и оставляют в штативах для
расслаивания фаз. Затем удаляют верхний слой мочи обычным
сливанием (если экстракцию проводят в делительных воронках)
или осторожным отсасыванием капиллярной пипеткой с по¬
мощью водоструйного насоса, начиная с проб без гидролиза.
Энергичным встряхиванием промывают хлороформные экст¬
ракты сначала 7,5 мл 0,1 н. раствора едкого натра, затем (по¬
сле расслаивания фаз) 3 мл воды. После встряхивания в тече¬
ние 15 с верхний слой удаляют. Для освобождения от остатков
воды к пробам прибавляют по 2 г безводного сернокислого
натрия. Колбы плотно закрывают пробками и вновь встряхи¬
вают. Ставят в холодильник на 2 ч (или до следующего дня).
После этого отмеривают цилиндром в чистые круглодонные
колбы с притертыми пробками по 50 мл каждого хлороформно¬
го экстракта (2/з от цельного количества), осторожно сливая
хлороформ с осадка или отфильтровывая его от порошка сер¬
нокислого натрия.
236

Экстракция хлороформных экстрактов мочи и стандарта
фенилгидразиновым реактивом и развитие окраски. Из имею¬
щихся двух проб мочи без гидролиза и двух проб мочи после
гидролиза каждая первая проба будет служить контролем ка
неспецифическую окраску, развивающуюся от действия серной
кислоты. Поэтому к каждой первой пробе приливают по 4 мл
спиртового раствора серной кислоты без фенилгидразина, а к
каждой второй пробе и стандарту (1 мл стандартного раствора
выпаривают досуха, затем растворяют в 50 мл хлороформа)
прибавляют по 4 мл спиртового раствора серной кислоты с фе¬
нилгидразином. Все колбы плотно закрывают притертыми проб¬
ками и энергично встряхивают в течение 2-х минут. Оставляют
в штативе для расслаивания фаз, затем капиллярной пипеткой,
соединенной с водоструйным насосом, отсасывают нижний хло¬
роформный слой (из-за опасности отсосать верхний слой перед
опусканием пипетки в раствор зажимают каучуковый шланг,
соединяющий пипетку с водоструйным насосом; отпускают
шланг только тогда, когда пипетка коснется дна колбы). Для
развития окраски все пробы с реактивами инкубируют в водя¬
ной бане при +60° С в течение 20 мин, затем охлаждают в во¬
допроводной воде.
Измерение интенсивности окраски производят на спектро¬
фотометре типа СФ-4 (СФ-4А и др.) при длине волны 410 нм
в кюветах с толщиной слоя 10 мм (общий объем кюветы 4 мл)
или на ФЭКе с синим светофильтром против чистого реакти¬
ва—спиртового раствора серной кислоты. Оптическую плот¬
ность опытных проб и стандартного раствора измеряют путем
сравнения с оптической плотностью спиртового раствора сер¬
ной кислоты с фенилгидразином.
Расчет. Сначала рассчитывают количество свободных
17-ОКС.
Содержание свободных 17-ОКС в пробе (без гидролиза)
высчитывают, исходя из соотношения:
Ci/(Ei —Е2) =С/Ез,
где Ci — количество 17-ОКС в мкг в пробе без гидролиза;
Ei—оптическая плотность опытной пробы без гидролиза;
Ег — оптическая плотность контрольной пробы без гидро¬
лиза;
Ез — оптическая плотность стандарта (за вычетом экстинк¬
ции контроля к стандартной пробе);
С — количество стандарта в мкг.
Если отношение С/Ез выразить через Q, то формула приоб¬
ретет вид Ci = (Ei — Ег) • Q.
Количество свободных 17-ОКС в суточной моче рассчиты¬
вают по формуле:
v Ci • a Ci • 3 ■ а
= 10 • 2/3 • 1000 ’ ИЛИ 10 • 2 • 1000 ’
где X— количество свободных 17-ОКС в суточной моче, мг;
237

с
Jq —количество свободных 17-ОКС в 1 мл мочи (10 — ко¬
личество мочи в мл в пробе, 2/3 количество хлоро¬
формного экстракта, взятого для анализа);
а — суточное количество мочи, мл;
1000—коэффициент для перевода из мкг в мг.
Количество суммарных 17-ОКС в мкг в пробе рассчитыва¬
ют по той же формуле, что и для свободных:
С2 = (Епробы с гидролизом ЕКОНТрОЛЯ после гидролиза) " Q*
Количество суммарных 17-ОКС в суточной моче в мг рас¬
считывают по формуле:
Cj • a Cg • 3 • а
X = =—тгтк—или
5 • 2/3 • 1000’ 5 • 2 • 1000 ’
где X — количество суммарных 17-ОКС в суточной моче, мг;
С2
^ t 2/з —количество суммарных 17-ОКС в 1 мл мочи.
В норме уровень суточной экскреции свободных 17-ОКС
колеблется от 0,04 до 0,28 мг/сутки, в среднем составляя
0,14 мг/сутки. Содержание суммарных 17-ОКС в суточной моче
варьирует от 1,31 до 7,39 мг, составляя в среднем 3,7 мг.
Как видно, на долю свободных 17-ОКС в моче приходится
от 1 до 7% от общего их количества.
Клинико-диагностическое значение определения кортикосте¬
роидов и продуктов их превращения в моче. Известно, что гид¬
рокортизон в неизмененном виде выделяется с мочой в коли¬
честве, не превышающем 1%. Основная масса экскретируется
в виде различных продуктов его превращения. Методом Сил-
бера и Портера у здоровых людей определяется около 4 мг
кортикостероидов в суточном количестве мочи. Однако для
оценки состояния коры надпочечников исследование содержа¬
ния 17-ОКС в моче должно быть проведено многократно. Это
связано с тем, что у людей наблюдаются значительные коле¬
бания суточной экскреции 17-ОКС. При интерпретации резуль¬
татов анализа необходимо их сравнивать с нормативами соот¬
ветствующих возрастных групп. В таблице 41 представлены
величины суточной экскреции 17-ОКС у людей различного воз¬
растного состава.
Значительное увеличение экскреции с мочой свободных и
связанных 17-ОКС (иногда до 70 мг/сутки) наблюдается у
больных с синдромом и болезнью Иценко — Кушинга. При ви-
рильном синдроме (включая адреногенитальный) выделение
17-ОКС повышено, однако величины экскреции оказываются
ниже, чем при синдроме и болезни Иценко — Кушинга.
При болезни Аддисона, пангипопитуитаризме выделение
17-ОКС значительно снижается, величины экскреции при этих
патологических состояниях часто близки к нулю.
238

ТАБЛИЦА 41
Экскреция суммарных 17-ОКС с мочой у здоровых людей
различного возраста (по Н. В. Свечниковой и В. И. Беккер, 1970)
Возраст (годы)
Экскреция суммарных 17-ОКС, мг/сутки
мужчины
женщины
20—40
4,83 ±0,36
4,60 ±0,37
50—59
5,37 i 0,32
4,96± 0,26
60—64
4,74 ±0,40
4,43 ±0,37
65—69
4,52 ±0,45
4,19 ±0,42
70—74
4,49 ±0,43
3,66 ±0,39
75—79
4,46 ±0,48
3,34 ±0,39
80—84
3,51 ±0,39
2,75 ± 0,40
85—89
2,63 ±0,42
2,42 ±0,18
90 и старше
2,41 ±0,27
3,71 ±0,19
Экскреция стероидов с мочой, как и концентрация их в кро¬
ви, повышается при всех состояниях стресса, причем степень
повышения зависит от силы воздействия, которому подвергает¬
ся организм.
Исследовалась экскреция 17-ОКС при бронхиальной астме,
крапивнице, полиморфной эритеме, остром суставном ревма¬
тизме, генерализованной эритематозной волчанке, псориазной
артропатии, анкилозирующем спондилите и ревматоидной пур¬
пуре. При всех указанных заболеваниях экскреция 17-ОКС ос¬
тается в пределах нормы, за исключением ревматоидной пур¬
пуры, при которой наблюдалось повышение экскреции стерои¬
дов. Однако авторы отмечают у обследованных больных
изменчивость величин экскреции и отсутствие реакции надпо¬
чечников на АКТГ.
Изменение соотношения экскретируемых количеств свобод¬
ных и связанных кортикостероидов может свидетельствовать
о наличии того или иного патологического процесса: так, при
многих заболеваниях (печени, почек и др.) уровень свободных
17-ОКС значительно увеличивается, а связанных уменьшается,
что указывает на нарушение процессов метаболизма кортико¬
стероидов.
Определение клиренса кортикостероидов является важным
тестом при оценке функциональной активности коры надпочеч¬
ников при наличии органических или функциональных нару¬
шений в деятельности почек.
239

Изучение экскреции 17-ОКС с мочой при применении функ¬
циональных проб и нагрузок позволяет более полно оценить
состояние гипофизарно-надпочечниковой системы.
Как и при определении кортикостероидов в крови, в сомни¬
тельных случаях следует прибегать к стимуляции надпочечни¬
ков с помощью АКТГ. Обычно этот тест занимает несколько
дней. В течение двух дней устанавливается секреция без стиму¬
ляции, затем дважды в сутки внутримышечно вводят по 20 ед
АКТГ в течение 4 дней (можно вводить 40 ед АКТГ с пролон¬
гированным действием). Очевидно, при этом наблюдается повы¬
шение экскреции у здоровых людей, практическое отсутствие
повышения экскреции у больных аддисоновой болезнью и рез¬
кое повышение экскреции у больных с синдромом Иценко— Ку¬
шинга. При исследовании беременных женщин была обнаруже¬
на повышенная экскреция 17-кетогенных стероидов, кото¬
рая достигла к концу беременности 17,5 мг/сутки. В пер¬
вые сутки после родов отмечался дополнительный подъем
до 40 мг. На вторые сутки наблюдалось снижение до
9,9 мг.
Определение кортикостероидов
в периферической крови
Весьма важным тестом в диагностике ряда эндокринных за¬
болеваний является определение кортикостероидов в перифери¬
ческой крови.
Среди физико-химических способов их исследования выде¬
ляют следующие основные группы:
1. Методы определения неконъюгированных кортикостерои¬
дов.
2. Методы определения метаболитов кортикостероидов (пар¬
ных соединений с глюкуроновой кислотой).
3. Методы определения белковосвязанных и свободных кор¬
тикостероидов.
Для изучения содержания гормонов в крови (так же, как и
в случае определения их в моче) применяют способы, основы¬
вающиеся на реакционной способности отдельных группировок
молекул кортикостероидов, и методы выделения отдельных гор¬
монов (гидрокортизона, кортикостерона, тетрагидросоединений
и т. д.).
Обе группы методов определения концентрации кортикосте¬
роидов в плазме крови включают в себя:
1. Сбор и хранение материала.
2. Выделение из него кортикостероидов (экстракция, очист¬
ка экстракта).
3. Количественное определение.
Сбор и хранение материала. Для определения кортикосте¬
роидов используют плазму, а не цельную кровь (при определе¬
240

нии кортикостероидов в последней большие трудности пред¬
ставляет очистка экстракта от пигментов).
При взятии крови на исследование кортикостероидов необхо¬
димо соблюдать ряд условий.
1. Устранить все факторы, вызывающие состояние напря¬
жения (стресс).
2. Перед назначением исследования на несколько дней ис¬
ключить прием некоторых лекарств: глюкокортикоидов (на 5—
7 дней), фенотиазина, дигиталиса, барбитуратов, мепробамата,
транквилизаторов гидразиновой структуры, амфетамина, олеан-
домицина, ингибиторов моноаминоксидазы.
3. Для предотвращения влияния липидов на процесс очист¬
ки и экстракции производить взятие крови натощак.
4. Ввиду имеющегося суточного ритма в содержании корти¬
костероидов в крови следует стандартизировать время забора
крови (желательно брать кровь в 8—9 ч утра).
5. В качестве антикоагулянта лучше всего использовать ге¬
парин (1—2 капли неразведенного гепарина фирмы «Рихтер»).
Применение цитрата натрия может помешать количественно¬
му определению кортикостероидов по реакции Портер — Силь-
бёр.
6. Если нет возможности немедленно отделить плазму, кровь
следует хранить в холодильнике.
Плазму отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в
течение 30 мин. Ее можно хранить в холодильнике в заморо¬
женном состоянии в течение 2—3 дней без потерь кортикосте¬
роидов.
7. До проведения анализа необходимо иметь сведения о со¬
стоянии функции печени и почек у данного больного, что необ¬
ходимо для последующей трактовки полученных результатов.
Выделение кортикостероидов. Экстракция в СН2С12 и СНС13.
Очистка экстракта. Полученный экстракт наряду с кортико¬
стероидами содержит значительные количества различных при¬
месей — липидов, пигментов. Поэтому перед применением лю¬
бого из методов количественного определения гормонов необ¬
ходима дальнейшая очистка экстракта. Для этого обычно при¬
бегают к следующим способам:
1. Последовательной промывке экстракта слабыми раствора¬
ми щелочи (0,1 н. NaOH; 0,2 н. Na2C03).
2. Разделению стероидов и примесей между полярными и не¬
полярными растворителями.
3. Хроматографическим методам выделения стероидов.
Количественное определение кортикостероидов в экстракте.
Для клиники бывает достаточным определения общих кортико¬
стероидов в плазме колориметрическими методами. В основе
их лежат:
1. Реакция с фенилгидразином (наиболее специфичная).
2. Реакция с 2,4-денитрофенилгидразином в кислом рас¬
творе.
241

3. Реакция восстановления солями тетразолия (на 20,21-а-
кетоловую группу).
4. Реакция с гидразидом изоникотиновой кислоты.
Флюоримегрические методы основываются на способности
стероидов флуоресцировать в растворах, крепкой серной кис¬
лоты и этилового спирта. Причем 95% всей флуоресцен¬
ции в плазме приходится на долю кортизола и кортикосте-
рона.
Эти методы определения кортикостероидов в плазме обла¬
дают целым рядом преимуществ:
1) они просты, 2) обладают высокой чувствительностью (для
исследования требуется небольшое количество крови), 3) позво¬
ляют в течение рабочего дня выполнить большое количество
анализов, 4) ответ для клиники может быть дан в течение
3—4 ч.
Таким образом, флуорометрический метод определения сум¬
марного количества кортизола и кортикостерона в плазме кро¬
ви с успехом может быть использован для оценки состояния
системы гипофиз — кора надпочечников.
Полярографические, энзиматические методы, методы с ис¬
пользованием радиоактивных изотопов, тонкослойной и газо¬
жидкостной хроматографии не нашли широкого распростране¬
ния в клинико-диагностических лабораториях из-за своей слож¬
ности.
Для суммарной оценки функции коры надпочечников доста¬
точно определения неконъюгированных 11-ОКС или свободных
17-ОКС с использованием в качестве унифицированных мето¬
дов флюориметрического способа определения суммарного со¬
держания кортизола и кортикостерона, а также метода Порте¬
ра — Силбера, основанного на спектрофотометрическом опре¬
делении глюкокортикоидов по реакции с фенилгидразином.
Определение 11-оксикортикостероидоа в плазме крови
по их флуоресценции в серноспиртовом реактиве
(Ю. А. Панков, И. Я. Усватова, 1965)
Принцип. Выделенные экстракцией из плазмы крови корти¬
костероиды, имеющие гидроксилы при 11 и 21-м углеродных
атомах и Д4-3-кетогруппировку в кольце А, обнаруживают флуо¬
ресценцию после обработки проб смесью концентрированной
серной кислоты и этилового спирта.
Реактивы. 1. Гексан, дважды отогнанный в колбе с дефлег¬
матором.
2. Метиленхлорид или хлороформ (способ их очистки приво¬
дится в главе XI). Если предварительной проверкой выявлено,
что метиленхлорид достаточно хороший, то его не подвергают
указанной обработке, а только дважды перегоняют с дефлегма¬
тором; отбирают фракцию, кипящую при +48° С. Можно поль¬
242

зоваться и хлороформом для наркоза, поскольку он не нужда¬
ется в дополнительной очистке.
3. 0,2 н. раствор углекислого натрия.
4. Этиловый спирт, дважды перегнанный.
5. Концентрированная серная кислота, выдерживающая про¬
бу Саваля.
6. Реактив, вызывающий флуоресценцию кортикостерои¬
дов — смесь концентрированной серной кислоты и этилового
спирта в отношении 3:1.
7. Стандартные растворы гидрокортизона и кортикостерона.
Концентрация и соотношение этих гормонов по возможности
должны быть близкими к их содержанию в исследуемой плазме
крови. При определении 11-оксикортикостероидов в плазме ис¬
пользуют две стандартные пробы; первая в 100 мл раствора
содержит 20 мкг гидрокортизона и 5 мкг кортикостерона
(25 мкг%), вторая — 40 мкг гидрокортизона и 10 мкг кортико¬
стерона (50 мкг%).
Стандартные пробы готовят следующим образом: навеску
кортикостероидов растворяют в 10—15 каплях спирта, объем
раствора доводят водой до нужной концентрации и хранят в
холодильнике (стандартные пробы подвергают той же об¬
работке, что и опытные. При этом объем стандартных и
опытных проб, взятых для определения, должен быть одина¬
ковым).
Ход определения. 2,0—2,5 мл крови собирают в пробирку,
содержащую гепарин в качестве антикоагулянта. Плазму от¬
деляют от эритроцитов центрифугированием при 3000 об/мин в
течение 20 мин. Ее можно хранить в холодильнике в течение не¬
скольких дней.
В мерную пробирку с притертой пробкой помещают 1 мл
плазмы и добавляют к ней 3 мл гексана. После энергичного
встряхивания в течение 1 мин гексан отсасывают пастеровской
пипеткой, соединенной с водоструйным насосом, а остаток гек¬
сана удаляют отгонкой в вакууме на водяной бане при +40° С.
К плазме приливают 10 мл метиленхлорида (или хлороформа)
и после встряхивания в течение 1 мин плазму отсасывают тем
же способом, что и гексан. Экстракт промывают по 1 мин сна¬
чала 0,5 мл 0,2 н. раствора карбоната натрия, затем 0,5 мл дис¬
тиллированной воды, которые также удаляют отсасыванием с
помощью пастеровской пипетки, соединенной с вакуумным
насосом.
8 мл метиленхлоридного (хлороформного) экстракта пере¬
носят в чистую пробирку на 15—20 мл с притертой пробкой,
куда добавляют 2,5 мл {или другой объем, необходимый для
полного заполнения кюветы) смеси концентрированной серной
кислоты и этилового спирта (3: 1), приготовленной перед упо¬
треблением. После встряхивания в течение 1 мин метиленхлорид
(хлороформ) удаляют и через час флуоресценцию проб изме¬
ряют на флюориметре.
243

Для постановки контрольной пробы вместо плазмы крови
через всю методику проводят 1 мл воды. В качестве контроля
можно пользоваться также чистой кислотно-этанольной смесью.
Флюориметрия осуществляется при использовании двух длин
волн: 475 нм (для возбуждения флуоресценции) и 530—550 нм
(для выделения максимума спектра флуоресценции).
Расчет производят по формуле: Х = Фоп/Фст 'Сет,
где X — определяемая концентрация кортикостероидов в плаз¬
ме (в мкг%);
Фон и Фет — флуоресценция опытной и стандартной проб
(выражаемая числом делений регистрирующе¬
го прибора);
Сет — концентрация кортикостероидов в стандартной про¬
бе в мкг/100 мл (мкг%).
В плазме периферической крови в норме содержится 21,4±
±0,7 мкг% 11-оксикортикостероидов; пределы колебаний со¬
ставляют от 13 до 23 мкг%.
Физиологические колебания
концентрации кортикостероидов в плазме крови
Основные данные о содержании кортикостероидов в плазме
крови человека были получены с помощью методов, в основе
которых лежит реакция Портера и Силбера. К сожалению, они
остаются все еще трудно доступными из-за громоздкости и не¬
обходимости располагать специальным оборудованием (спек¬
трофотометром, кварцевой микрокюветой и др.).
Содержание кортикостероидов в плазме новорожденных
очень невелико, в некоторых случаях оно практически неизме¬
римо. Но уже через 3—5 недель после рождения концентрация
кортикостероидов в крови детей практически не отличается от
таковой у взрослых. По другим данным, у детей наблюдается
несколько более низкий уровень 17-оксикортикостероидов при
более высокой концентрации кортикостерона.
У взрослых людей уровень глюкокортикоидов в перифериче¬
ской крови выше, чем у детей. Зависимости содержания 11-ОКС
в плазме от возраста не обнаружено. В таблице 42 отражено со¬
держание 17-ОКС в плазме здоровых взрослых людей различ¬
ного возраста.
Средняя величина содержания 17-ОКС в крови, согласно
данным большинства авторов, равна 12 мкг%. При иссле¬
довании большого числа здоровых людей Блисс и др. (1954)
наблюдали колебания концентрации 17-ОКС от 3 до
26 мкг%.
Из данных приведенной таблицы следует, что при оценке
величины содержания кортикостероидов в плазме крови необхо¬
димо учитывать возраст, пол обследуемых, а также колебания
концентрации кортикостероидов в течение дня: при исследова-
244

ТАБЛИЦА 42
Концентрация 17-ОКС в плазме
периферической крови здоровых взрослых людей (в мкг%)
Концентрация 17-ОКС
в плазме крови, мкг%
Возраст в годах
мужчины
женщины
20—40
12,30 t0.85
11,91 ± 0,58
50—59
16,35 ±0,96
12,71 ±1,07
60—64
11,61 ±0,71
11,15 ± 0,76
65—69
10,37 ±0,81
10,53 ±0,96
70—74
10,36 ±0,99
10,00 ±0,89
75—79
9,27 ±0,81
8,68 ±1,02
80—84
8,96+0,68
6,97 ±0,77
85—89
8,35 ±0,51
5,99 ±0,93
90 и старше
8,80 ±1,36
5,73 ±0,67
нии в течение суток более высокие цифры содержания 17-ОКС
в плазме были получены в утренние часы.
К концу нормально протекающей беременности наблюдает¬
ся увеличение уровня свободных 17-ОКС и неконъюгированных
11-ОКС в 2—4 раза по сравнению с их содержанием у здоро¬
вых небеременных женщин. По данным многих исследователей,
у женщин в третий триместр беременности отмечается повыше¬
ние содержания кортикостероидов в плазме до 35—50 мкг%.
У беременных женщин, в крови которых содержание кортико¬
стероидов достигает 50 мкг%, введение АК'ГГ может повысить
их уровень до 110 мкг%.
Концентрация 17-ОКС и 11-ОКС в плазме увеличивается в
состоянии острого напряжения (при сильных эмоциональных
реакциях, волнении, нервном возбуждении). Так, у больных
еще до начала операции наблюдается повышение количества
кортикостероидов. В процессе хирургического вмешательства
происходит дальнейшее повышение их уровня. Величина подъ¬
ема зависит от тяжести и длительности операции. Через сутки
или двое после оперативного вмешательства уровень кортико¬
стероидов крови обычно возвращается к норме. Отмечено так¬
же, что введение АКТГ непосредственно после операции вызы¬
вает дополнительное повышение уровня кортикостероидов в
крови. Повышение уровня кортикостероидов в крови наблюда¬
ется не только при психических, но и при физических на¬
пряжениях (во время мышечной работы), а также перед
смертью.
245

Клинико-диагностическое значение определения кортикосте¬
роидов в плазме крови. Отмечено значительное увеличение
концентрации 17-ОКС в плазме при болезни Иценко — Кушин¬
га, а также гиперплазии, аденоме, раке коры надпочечников
(синдром Иценко — Кушинга). Последний характеризуется вы¬
соким содержанием кортикостероидов, достигающим, по дан¬
ным некоторых авторов, 107 мкг%. Двустороннее субтотальное
удаление надпочечников приводит обычно к снижению уровня
кортикостероидов до нормального. При адренобластоме, вири-
лизующей гиперплазии и вирилизующей опухоли надпочечни¬
ка содержание как свободных, так и связанных 17-ОКС в плаз¬
ме крови лежит в пределах нормы и введение АКТГ не вызы¬
вает существенного подъема уровня последних. Двустороннее
субтотальное удаление надпочечников у больных гиперплазией
приводит к тому, что реакция на АКТГ становится менее выра¬
женной, чем до операции.
При болезни Аддисона, вторичной хронической надпочечни¬
ковой недостаточности, а также некоторых формах адрено-ге-
нитального синдрома уровень 17-ОКС и 11-ОКС в плазме сни¬
жается в 2,5—3 раза по сравнению с нормой. У лиц, страдаю¬
щих болезнью Аддисона, содержание кортикостероидов в крови
часто оказывается близким к нулю. Вместе с тем описаны слу¬
чаи аддисоновой болезни с нормальным содержанием кортико¬
стероидов в крови. У больных с гипофункцией гипофиза и
вследствие этого с недостаточностью надпочечников также на¬
блюдается пониженный уровень кортикостероидов.
Снижение концентрации 11-ОКС отмечается у больных с не¬
специфическим инфекционным полиартритом, бронхиальной
астмой.
У больных хроническим гепатитом, циррозом печени, ревма¬
тоидным артритом, спондилитом, остеоартритом и подагрой со¬
держание свободных 17-ОКС в плазме близко к норме, конъ¬
югированные же 17-ОКС представлены в очень малых коли¬
чествах.
Параллельное определение свободных 17-ОКС в плазме кро¬
ви и в моче дает возможность более полно оценить функцио¬
нальное состояние коры надпочечников при хронических забо¬
леваниях печени. При тяжелых циррозах экскреция свободных
17-ОКС с мочой повышена, в то время как концентрация их в
плазме снижена.
При заболеваниях почек с развитием хронической почечной
недостаточности концентрация суммарных 17-ОКС в плазме
близка к нормальной, содержание же конъюгатов 17-ОКС зна¬
чительно снижено. При этом суточная экскреция с мочой сво¬
бодных 17-ОКС значительно увеличена, что связано со сниже¬
нием канальциевой реабсорбции и с нарушением процессов
связывания 17-ОКС глюкуроновой кислотой.
Однако не всегда по уровню кортикостероидов в крови мож¬
но судить о секреторной деятельности надпочечников. Так,при
£46

гипотиреозе и циррозах печени концентрация кортикостероидов
в крови может быть нормальной, в то время как экскреция сте¬
роидов с мочой сильно понижена.
Таким образом, концентрация кортикостероидов в плазме
периферической крови во многом зависит от состояния процес¬
сов метаболизма и выведения.
Исследование кортикостероидов в периферической крови яв¬
ляется необходимым тестом для осуществления контроля за
состоянием коры надпочечников при лечении стероидными пре¬
паратами. Следует, однако, помнить, что для правильной оцен¬
ки функции коры надпочечников при лечении стероидными пре¬
паратами определение содержания в крови кортикостероидов
можно проводить не ранее, чем через 5—7 дней после отмены
препарата.
ИССЛЕДОВАНИЕ ОБМЕНА КАТЕХОЛАМИНОВ
К катехоламинам относится группа аминов, в молекулах ко¬
торых содержится ядро катехола (диоксифенильное кольцо,
называемое также пирокатехином или ортодиоксибензолом).
Наибольшее биологическое значение среди них имеют три
соединения: адреналин [Р-(3,4-дигидроксифенил)-Р-гидрокси-
N-метил-этиламин, метиламиноэтанолпирокатехин, эпинефрин];
норадреналин [Р- (3,4-дигидроксифенил) -Р-гидрокси-этиламин,
аминоэтанолпирокатехин, называемый также артеренолом или
норэпинефрином]; дофамин [Р-3,4-дигидроксифенил-этиламин,
окситирамин].
Адреналин уже с начала XX в. известен как гормон мозгово¬
го слоя надпочечников. Он синтезируется в особых секреторных
клетках — адреналиноцитах хромаффинной ткани (включаю¬
щей в себя мозговое вещество надпочечников, параганглии, ор¬
ганы Цуккеркандля).
Норадреналин также вырабатывается в секреторных клет¬
ках (норадреналиноцитах) мозгового слоя надпочечников. Зна¬
чительная часть его метилируется в надпочечниках в адрена¬
лин. Другим источником норадреналина является симпатиче¬
ская нервная ткань, именно с ней связана функция норадрена¬
лина как медиатора симпатической нервной системы.
Дофамин является предшественником норадреналина в про¬
цессе биосинтеза. Как и норадреналин, он — медиатор симпа¬
тической нервной системы. В мозговой ткани основное количе¬
ство дофамина локализуется в corpus striatum, в базальных
ганглиях putamen, nucleus caudatum, substantia nigra. В централь¬
ной нервной системе дофамин выполняет роль двигательного
медиатора. Большое количество дофамина содержится в лег¬
ких, кишечнике, печени, т. е. в органах, имеющих слабую сим¬
патическую иннервацию. Функциональное значение высокого
его содержания в этих тканях остается пока еще не известным.
247

Основной путь образования катехоламинов в организме
следующий: фенилаланин -* тирозин диоксифенилаланин
(ДОФА) — дофамин - норадреналин - адреналин.
Содержание катехоламинов в биологических жидкостях не¬
велико. В 1 л плазмы периферической венозной крови здоро¬
вого человека содержится в общей сложности около 1 мкг ка¬
техоламинов.
За сутки с мочой экскретируется до 15 мкг адреналина,
10—40 мкг норадреналина, 100—766 мкг дофамина и 10—
110 мкг ДОФА.
При нормальной функции почек изучение экскреции кате¬
холаминов и ДОФА с мочой является адекватным методом
оценки состояния системы катехоламинов — симпато-адренало-
вой системы. Вот почему методы определения катехоламинов в
моче все шире входят в практику клинико-диагностических ла¬
бораторий.
Известны биологические, колориметрические, полярографи¬
ческие, хроматографические и флюориметрические методы ис¬
следования катехоламинов. Из них наиболее совершенными
считаются флюориметрические способы определения этих гор¬
монов-медиаторов. Первая их группа, берущая свое начало от
работ Лунда (1949), основана на образовании тригидроксиин-
долов (адренолютина, норадренолютина).
Тригидроксииндоловый метод считается самым специфич¬
ным из всех химических методов определения катехоламинов,
поскольку им определяются только те дигидроксифенолы, кото¬
рые имеют боковую цепь строго определенной конфигурации.
Вторая группа методов, основанная на измерении флуорес¬
ценции продуктов конденсации катехоламинов с этилендиами-
ном (Вайль — Малербе, Боне, 1952), является гораздо менее
специфичной: многие вещества катехоловой структуры, в част¬
ности гидрокситирамин и дигидроксифенилуксусная кислота,
также могут образовывать светящиеся конденсаты. Кстати, это
обстоятельство позволило некоторым авторам по разнице меж¬
ду величинами, полученными при работе с этилендиаминовыми
и тригидроксииндоловыми методами, определять дофамин.
Для дифференциации катехоламинов можно использовать
как различную степень их окисления при разных значениях pH,
так и различия в максимумах возбуждения и флуоресценции
образующихся при окислении катехоламинов флуорофоров.
Как видно, наиболее чувствительным и специфичным- мето¬
дом дифференцирования и количественного определения кате¬
холаминов является тригидроксииндоловый флуорометрический
метод, который в определенных вариантах предлагается для
использования в клинико-диагностических лабораториях в ка¬
честве унифицированного.
Флюориметрические методы определения катехоламинов
включают 3 основных этапа:
1) сбор и хранение материала,
248

2) выделение из него катехоламинов,
3) их дифференцированное количественное определение.
Сбор и хранение биологических жидкостей. Для стабилиза¬
ции катехоламинов в крови необходимо соблюдать тщательное
охлаждение. Сбор мочи производят в посуду из темного стекла
в присутствии консервантов, обеспечивающих сохранение кате¬
холаминов либо благодаря подкислению среды, либо путем
предохранения их от окисления.
Из всех известных консервантов наиболее пригодными сле¬
дует считать кислоты. При хранении подкисленной (до pH 3)
мочи в замороженном состоянии в холодильнике катехоламины
сохраняются без потерь 2—3 дня.
Выделение и экстракция катехоламинов. Для выделения ка¬
техоламинов из мочи и очистки их от примесей используется
принцип адсорбционной или ионообменной хроматографии.
С целью освобождения катехоламинов из связанного состояния
(до 60% норадреналина находится в моче в конъюгированной
форме) предварительно применяют этап гидролиза.
Гидролиз мочи. Для гидролитического расщепления конъ¬
югатов катехоламинов рекомендуется кипячение ее при pH < 1.
Гидролиз связанных форм катехоламинов можно осущест¬
влять при обработке ее |3-глюкуронидазой и фенолсульфатдзой,
однако широкого применения этот метод не получил.
Адсорбция. В щелочной среде катехоламины хорошо адсор¬
бируются на окиси алюминия (А!20з). Высокой адсорбционной
способностью по отношению к катехоламинам обладает гидро¬
окись алюминия А1(ОН)з. При работе с окисью алюминия чаще
всего применяют колоночную хроматографию. Наибольший
выход добавленных катехоламинов дают образцы окиси алю¬
миния, обработанной кипячением с соляной кислотой (по Брок¬
ману). отмытой до нейтральной реакции с последующим вы¬
сушиванием при температуре 120—200°.
Для полноты адсорбции чрезвычайно важно точно соблю¬
дать pH в пределах 8,2—8,5, причем перед доведением pH не¬
обходимо удалить соли тяжелых металлов. Наиболее пригод¬
ным для связывания ионоз тяжелых металлов и для предотвра¬
щения выпадения фосфатов следует считать комплексен —
этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и ее натриевые
или калийные соли (хелатон, селектон Бг). Добавление ЭДТА
облегчает адсорбцию катехоламинов на окиси алюминия и пред¬
отвращает их от разрушения в щелочной среде. Выход ка¬
техоламинов с обработанной кислотой окиси алюминия, по дан¬
ным различных авторов, составляет 75—100%.
Хроматографию на ионообменных смолах также успешно
применяют для экстракции и очистки катехоламинов из физио¬
логических жидкостей. При использовании ионообменных смол
(амберлитс-в, дауэксов) обработку анализируемых биологиче¬
ских жидкостей производят в среде с pH около 6,5, т. е.
в условиях, предохраняющих катехоламины от разрушения.
9 Зак. 2615
249

Элюция катехоламинов с окиси алюминия, дауэксов и ам-
берлитов осуществляется некоторыми органическими и неорга¬
ническими кислотами.
Следующие этапы методов включают образование флуорес¬
цирующих продуктов и, как было отмечено, различаются в
тригидроксииндоловых и этилендиаминовых методах.
Образование лютинов и измерение их флуоресценции. Для
образования лютинов в качестве окислителя можно использо¬
вать красную кровяную соль, двуокись марганца и персуль¬
фат калия. При работе с йодом оптимальным является окисле¬
ние в течение 30 с, а при использовании красной кровяной соли
требуется длительность окисления 2—4 мин.
Добавление смеси NaOH и аскорбиновой кислоты приводит
к образованию флуоресцирующих лютинов.
Продукты окисления катехоламинов, способные флуоресци¬
ровать (в щелочной среде), быстро разрушаются щелочью.
Для их стабилизации при-меняют раствор аскорбиновой кисло¬
ты, который должен быть свежеприготовленным. В присут¬
ствии аскорбиновой кислоты аминолютины стабильны в тече¬
ние примерно часа, этого времени достаточно для проведения
флуорометрии.
Образующийся при окислении йодом диоксииндол дофами¬
на приобретает свойства флуорофора после проведения фото¬
химической реакции. Последнее осуществляется облучением
светом ртутной лампы с максимумом излучения 245 ммк в те¬
чение 10 мин, при нагревании в водяной бане при +45° С в тече¬
ние 30 мин или в кипящей водяной бане в течение 40 мин. По¬
следние варианты образования флуорофора более приемлемы,
так как они обусловливают проведение реакции в более мягких
условиях. К тому же, для ее осуществления не требуется
специальных кварцевых кювет (поскольку кюветы из обыч¬
ного химического стекла задерживают ультрафиолетовые
лучи).
Дифференциация катехоламинов может осуществляться ли¬
бо путем использования способности катехоламинов макси¬
мально окисляться при разных значениях pH среды, либо по
разнице спектральных характеристик образующихся лютиноз.
Обычно применяют сочетание обоих этих принципов.
Определение адреналина и норадреналина в моче
флуориметрическим методом после дифференциального
окисления йодом при различных значениях pH
(В. В. Меньшиков, 1961)
Принцип. Катехоламины выделяют из мочи, доведенной до
pH 8,2-8,5, путем колоночной хроматографии из окиси алю¬
миния, элюируют 0,25 н. раствором уксусной кислоты, диффе¬
ренцируют путем окисления йодом при разных значениях pH
250

(4,6 и 7,2). Интенсивность флуоресценции регистрируют на
флуориметре.
Реактивы. 1. Этилендиаминтетрауксусная кислота или ее
двунатриевая соль (ЭДТА, трилон Б, хелатон, селектон Бг, вер-
сен, комплексон III).
2. 2 н. раствор серной кислоты. Готовят из фиксанала или
путем доведения 27,8 мл 95,6% H2S04 (51,26 г) до 1 л дистил¬
лированной водой.
3. 1 н. раствор едкого натра (готовят из фиксанала).
4. Окись алюминия, очищенная по методу Брокмана. 500 г
х. ч. окиси алюминия для удаления ионов тяжелых металлов
кипятят с соблюдением максимума предосторожности в тече¬
ние 20 мин с 2 л 2 н. раствора соляной кислоты. Тщательно
встряхивая, охлаждают на воздухе, дают отстояться, сливают
надосадочную (пожелтевшую) жидкость в колбу, вливают но¬
вую порцию (2 л) соляной кислоты, отстаивают 10 минут и
сливают. Добавляют к осадку 1 л бидистиллированной воды,
переносят смесь на воронку Бюхнера, где окись алюминия про¬
мывают бидистиллированной водой до pH промывных вод 6.
Окись алюминия высушивают в фарфоровой ступке в сушиль¬
ном шкафу в течение 3—4 ч при температуре 120—200° С. Хра¬
нят в темной склянке с притертой пробкой.
Второй способ очистки окиси алюминия — по методу Jorg,
Buchner в модификации В. М. Демченко: окись алюминия
(200 г) отмывают в первом цикле 400 мл дистиллированной во¬
ды с помощью стеклянной мешалки с электроприводом (ско¬
рость — 4000 об/мин) в течение 1 мин, затем 2 мин отстаивают,
надосадочную жидкость сливают; для полного отмывания про¬
водят 12 циклов с дистиллированной водой.
Окись алюминия просушивают в муфельной печи сначала
в течение 2 ч при температуре +200°, а затем 3 ч при +400° С.
Выход адреналина при использовании обработанной таким об¬
разом окиси алюминия составляет 96%.
5. Стеклянная вата (применяют в случае, если использу¬
ют хроматографические колонки типа «б»). Вату заливают
2 н. раствором едкого натра и оставляют на сутки. Затем ще¬
лочь сливают, вату несколько раз промывают дистиллирован¬
ной водой и заливают 2 н. раствором соляной кислоты. Через
сутки кислоту сливают, вату отмывают несколько раз в дистил¬
лированной воде до нейтральной реакции промывных вод, об¬
рабатывают 2 раза бидистиллированной водой и сушат на
воздухе. Вату хранят в склянке с притертой пробкой.
6. Вата хирургическая.
7. Фильтровальная бумага.
8. 0,25 н. раствор уксусной кислоты (7,5 г или 8,25 мл ле¬
дяной уксусной кислоты на 500 мл раствора).
9. I М раствор х. ч. трифосфата натрия (Na3P04 • 12 НЮ).
38 г кристаллической соли растворяют в 175 мл воды для по¬
лучения стойкого 22% раствора. Необходимое количество три-
s’* 251

фосфата натрия определяют эмпирически после приготовления
каждой партии раствора. Собирают 5—10 элюатов мочи, раз¬
ливают по 2 мл в 2 пробирки. В первую пробирку добавляют
микропипеткой (под контролем рН-метра) раствор трифосфата
до pH 4,6, во вторую — до pH 7,2. Среднее из 5—10 определе¬
ний и будет тем количеством трифосфата, которое необходимо
для получения соответствующего значения pH.
10. Ацетатный буфер, pH 4,6: смесь 260 мл 1,21% уксусной
кислоты и 240 мл 2,74% уксуснокислого натрия. Буфер хранят
в холодильнике.
11. 50% раствор уксуснокислого натрия с добавлением не¬
скольких капель ледяной уксусной кислоты до pH 7,2.
12. 0,01 н. раствор йода. Готовят непосредственно перед
употреблением из 0,1 н. раствора. 0,1 н. раствор приготовля¬
ют из фиксанала.
13. 0,1 н. раствор гипосульфита натрия (24,8 г гипосульфи¬
та на 1 л раствора). Предпочтительнее готовить из фиксанала.
14. 1% раствор аскорбиновой кислоты. Готовят непосредст¬
венно перед употреблением (100 мг аскорбиновой кислоты, х. ч.
на 10 мл раствора). Аскорбиновая кислота пригодна только
белого цвета. Раствор хранят в бутылочке темного стекла.
15. 30% раствор едкого натра.
16. Стандарты адреналина и норадреналина. Сухие стан¬
дарты [адреналин и норадреналин в виде свободного основания
пли соли винно-каменной кислоты — битартраты (гидротартра-
ты) или хлориды] хранят в эксикаторе, обернутом в черную
бумагу, в сухом месте; на дно эксикатора кладут поглоти¬
тель — гидрат окиси кальция (гашеную известь) или хлори¬
стый кальций. Раствор стандарта № 1 — 1000 мкг/мл (основ¬
ной) хранят в холодильнике в течение не более 1 месяца в по¬
суде из темного стекла. Навеску стандарта— 10 мг основания
катехоламинов (навески солей рассчитывают по их молекуляр¬
ному весу) растворяют в бюксе или на часовом стекле в 4—5
каплях концентрированной соляной кислоты, переносят в мер¬
ную колбу на 10 мл (или в точно отградуированную пробир¬
ку) и доводят до метки бидистиллированной водой.
В день опыта готовят: раствор № 2 (5 мкг/мл) — 0,5 мл
1 н. раствора соляной кислоты и 0,25 мл раствора № 1 доводят
до 50 мл бидистиллированной водой;
раствор № 3 (0,1 мкг/мл) — 1 мл раствора № 2 доводят до
50 мл 0,25 н. уксусной кислотой. Этот раствор является рабо¬
чим.
17. Универсальная индикаторная бумага.
18. Раствор эозина в концентрации 0,1 мкг/мл. Готовят на
бидистиллированиой воде, полученной в стеклянном бидистил¬
ляторе.
Перед работой необходимо подготовить хроматографические
колонки, которые бы обеспечивали скорость прохождения
жидкости 1—2 мл/мин. Они бывают нескольких типов:
252

Тип а: внутренний диаметр колонки 10 мм, канал длиной
10—15 см, резервуар емкостью 40—50 мл. На дно колонки плот¬
но укладывают небольшой кусочек хирургической ваты, поверх
которой помещают кусочек фильтровальной бумаги и 1 г оки¬
си алюминия (нужное количество окиси алюминия удобнее от¬
мерять, пользуясь одной и той же градуированной пробиркой:
по метке на стекле).
Тип б: колонка с краном. Внутренний диаметр 8 мм, длина
канала—17 см, объем резервуара — 50 мл. На дно колонки,
над краном, кладут кусочек обработанной стеклянной ваты,
поверх которой насыпают 1 г окиси алюминия.
Тип в: колонка с краном. Внутренний диаметр—12 мм,
длина— 15 см, объем резервуара — 50 мл. Над краном колон¬
ки кладут пористый стеклянный фильтр Шот № 1, поверх ко¬
торого помещают кусочек фильтровальной бумаги и насыпают
1 г окиси алюминия.
Колонку типа а для обеспечения скорости прохождения
жидкости нужно соединить с системой, подключенной к ваку¬
умному насосу; устройства колонок типа бив обеспечивают
нужную скорость прохождения жидкости без вакуума.
Пр имечание. Мы применяли колонки, которые, будучи
устроены без кранов, допускали возможность регулирования
скорости прохождения через них растворов. Вакуум в системе
создается ртом и поддерживается некоторое время путем пере¬
жатия резиновой трубки, связанной с колбой Эрленмейера.
Благодаря применению небольшой гребенки (с тремя отрост¬
ками) становится возможным регулировать ток жидкости сра¬
зу в нескольких колонках. Достоинством этого типа колонок
является отсутствие в них стеклянного крана, требующего для
смазки вазелина, могущего давать неспецифическую флуорес¬
ценцию.
Ход определения. Перед сбором мочи на исследование кате¬
холаминов нужно за 2—3 дня до анализа исключить из пищи
некоторые продукты: бананы, ананасы, сыр, крепкий чай, кофе,
а также следующие лекарства: антибиотики тетрациклинового
ряда, хинин, хинидин, альдомет, резерпин, исмелин, седуксен,
элениум, мелипрамин, психотропные вещества тиазинового ря¬
да, адреноблокаторы, ингибиторы моноаминоксидазы.
Обследуемому необходимо предоставить полный покой (ис¬
ключить инструментальные исследования, факторы, которые
могут вызвать физическое или эмоциональное напряжение).
Определение катехоламинов возможно как в суточной, так
и в порционной моче. Для расчета необходимо точно за¬
фиксировать количество мочи и время, за которое она со¬
брана.
В посуду для сбора суточной мочи добавляют для консер¬
вации 2 н. раствор серной кислоты из расчета приблизительно
10 мл кислоты на 100 мл мочи (80—100 мл). Порционную мочу
измеряют и добавляют к ней консервант в указанных пропор¬
253

циях. Подкисленную мочу можно хранить в холодильнике в те¬
чение 2—3 суток.
Выделение катехоламинов из мочи. К 25 мл мочи прибавля¬
ют 0,5 г ЭДТА и доводят pH до 8,2—8,5 с помощью 1 н. раство¬
ра NaOH (контролируя pH по индикаторной бумаге). Мочу
помещают в колонку (любого образца) с окисью алюминия,
предварительно промыв адсорбент 10—15 мл бидистиллирован¬
ной воды. Если используют колонку с краном, то мочу помеща¬
ют в нее при закрытом кране. Окись алюминия перемешивают
стеклянной палочкой и после ее оседания открывают кран или
создают в системе вакуум при использовании бескрановых ко¬
лонок. После прохождения мочи адсорбент вновь промывают
бидистиллированной водой (10—15 мл).
Элюция. Катехоламины элюируют с адсорбента 10 мл
0,25 н. раствора уксусной кислоты (двумя порциями по 5 мл),
после добавления 1-й порции перемешивают стеклянной палоч¬
кой адсорбент с кислотой.
Окисление и дифференцирование катехоламинов. Элюат
разливают по 2 мл в 3 пробирки; для дифференцирования ка¬
техоламинов по кислотности сред в пробирку № 2 приливают
1 мл ацетатного буфера с pH 4,6 и раствор трифосфата натрия
в количестве, найденном эмпирически для данной пробы
(—0,2 мл). Для стабилизации pH в пробирку № 3 наливают
0,5 мл раствора pH 7,2 и трифосфата натрия (~0,6 мл). В про¬
бирках № 2 и 3 окисляют катехоламины добавлением 5 капель
0,01 н. раствора йода (перемешивают в течение 30 с). Через
30 с йод нейтрализуют добавлением 2 капель 0,1 н. раствора
гипосульфита натрия; спустя 3—5 мин во все 3 пробирки до¬
бавляют для образования лютинов по 5 капель 1 % свежепри¬
готовленного раствора аскорбиновой кислоты, 3 капли 30%
раствора едкого натра и бидистиллированной воды до
объема 10 мл (после добавления каждого реактива тща¬
тельно встряхивать!). После доведения до метки «10» со¬
держимое перемешивают стеклянной палочкой с лопа¬
точкой.
Флюорометрия. Просмотр проб начинают с пробирки № 1,
служащей контролем. Раствор помещают, в кювету флюори-
метра; при нажатии клавиши прибора проба в кювете освеща¬
ется ультрафиолетовым светом, который проходит через пер¬
вичный светофильтр (УФС-3, УФС-6, интерференционный) с
максимумом пропускания 365 нм; вторичным светофильтром
(интерференционным или комбинацией интерференционного
желто-зеленого и голубого) выделяется максимальная длина
волны флуоресценции (538 нм), свет флуоресценции преобра¬
зуется фотоэлементом или фотоумножителем в электрический
ток, который регистрируется чувствительным гальванометром.
Разность показаний второй и первой проб соответствует числу
делений, приходящихся на адреналин, а третьей и четвертой —
на норадреналин (в мл пробы).
254

Расчет осуществляют по калибровочному графику стандарт¬
ных растворов катехоламинов, обработанных так же, как и
опытные пробы. Количество катехоламинов, выделенное за
сутки или за 1 мин, вычисляют по формулам:
для отдельных порций мочи: (с • 2а‘)Д=мкг/мин,
для суточного количества мочю с • 2а = мкг/сутки,
где с — содержание адреналина или норадреналина в мкг/мл,
найденное для данного числа делений по графику;
а’ — количество мочи за определенный период времени
(порционная моча);
а — суточное количество мочи;
t — отрезок времени, которому соответствует данная пор¬
ция мочи.
Первоначальный вид формула (для суточной мочи) приоб¬
ретает в результате сокращений из следующей формулы:
(с- 10 • 10 - а)/(2 • 25),
где с и а — значения, указанные ранее;
2 — количество элюата в мл, взятое в пробу;
25 — количество мочи, взятое в пробу;
10 — общее количество элюата;
10 — общий объем проб по окончании окисления.
Построение калибровочного графика. Для построения кали¬
бровочного графика разливают рабочие (стандартные) раство¬
ры адреналина и норадреналина в несколько рядов пробирок
в таких количествах, чтобы по окончании окисления получить
следующие концентрации катехоламинов: 0,005 мкг/мл;
0,01 мкг/мл; 0,02 мкг/мл.., Для этого в первые пробирки нали¬
вают 0,5 мл стандартного раствора № 3 и 1,5 мл 0,25 н. уксус¬
ной кислоты, во вторые пробирки — 1 мл стандартного раство¬
ра № 3 и 1 мл 0,25 н. уксусной кислоты и т. д. Разливают
трифосфат натрия и буферные растворы так, как это описано
для элюатов мочи, и так же их окисляют.
Пробы просматривают против контроля (см. ход определе¬
ния). Для каждой концентрации стандартного раствора берут
среднее значение из нескольких определений. Измеряют свече¬
ние бидистиллированной воды и раствора эозина в концентра¬
ции 0,1 мкг/мл. Показания флюориметра фиксируют. При после¬
дующих измерениях после включения прибора его чувствитель¬
ность устанавливают на ту же величину по бидистиллирован¬
ной воде или по 0,1 мкг/мл раствора эозина, что и при выведе¬
нии калибровочного графика.
Нормальные величины экскреции составляют для адрена¬
лина от 3 до 15 мкг/сутки, в среднем — 7 мкг/'сутки; для нор¬
адреналина — от 10 до 40 мкг/сутки, в среднем — 25 мкг/сутки.
255

Определение адреналина, норадреналина,
дофамина и диоксифенилаланина (ДОФА)
в одной порции мочи (Э. LLI. Матлина, 3. М. Киселева,
И. Э. Софиева, 1965)
Принцип. Катехоламины (адреналин, норадреналин, дофа¬
мин) и ДОФА выделяют из мочи путем колоночной хроматогра¬
фии на окиси алюминия. Катехоламины и почти половина ад¬
сорбированного ДОФА элюируются 0,25 н. раствором уксусной
кислоты. Оставшийся на адсорбенте ДОФА снимают 1 н. рас¬
твором соляной кислоты. Дифференцирование катехоламинов
осуществляют путем окисления феррицианидом калия при раз¬
личных значениях pH и по различным наборам светофильтров
при флуорометрии. Дофамин дифференцируют путем исполь¬
зования другого окислителя — йода.
Реактивы. 1. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
2. 2 н. раствор соляной кислоты.
3. Окись алюминия, очищенная соляной кислотой по Брок¬
ману или по Jorg, Buchner в модификации В. М. Демченко (опи¬
сано в предыдущем методе).
4. 5 н. едкий натр.
5. 0,25 н. уксусная кислота.
6. 1 н. соляная кислота.
7. 0,1 М фосфатный буфер pH 4,2.
6.8 г КН2РО4 растворяют в небольшом количестве бидистилли¬
рованной воды и доводят объем до 500 мл в мерной колбе, до¬
бавляют несколько капель 1 н. соляной кислоты.
8. 0,1 М фосфатный буфер pH 6,2:
а) готовят раствор однозамещенного фосфата калия, как
описано в п. 7;
б) готовят раствор двузамещенного фосфата натрия —
35.8 г Na2HP04 на 1 л раствора.
Смешивают 60 частей раствора а и 20 частей раствора б.
Буферные растворы хранят в холодильнике не более не¬
дели.
9. Феррицианид калия х. ч. (красная кровяная соль). Пе¬
ред употреблением из него готовят 0,25% раствор.
10. 0,2% раствор аскорбиновой кислоты на 5 н. едком нат¬
ре (щелочной аскорбинат натрия). Готовят перед употребле¬
нием.
11. 0,02 н. водный раствор йода. Готовят перед употребле¬
нием из 0,1 н. раствора: 2 мл 0,1 н. раствора йода, приготовлен¬
ного из фиксанала, доводят бидистиллированной водой до объе¬
ма 10 мл.
При отсутствии фиксанала 0,02 н. раствор йода можно по¬
лучить путем растворения 254 мг йода и 5 г йодистого калия
в 5 мл воды с последующим доведением водой до 100 мл.
12. 5 н. раствор уксусной кислоты. Готовят из х. ч. ледяной
уксусной кислоты в зависимости от ее удельного веса.
256

13. Сульфит натрия, х. ч., кристаллический (Na2S03-7 Н20).
Перед употреблением готовят два раствора: 500 мг сульфита
натрия растворяют в 1 мл воды — водный сульфит; 500 мг суль¬
фита натрия растворяют в 1 мл воды и доводят до 10 мл 5 н.
едким натром (щелочной сульфит).
14. Стандартные растворы адреналина, норадреналина,
ДОФА и дофамина. Основные растворы готовят так же, как и
в предыдущем методе. Из них путем последовательных разве¬
дений получают стандартный рабочий раствор (3) для адрена¬
лина, норадреналина и ДОФА с концентрацией 1 или 0,8 мкг/мл
на бидистиллированной воде. Для дофамина раствор № 3 име¬
ет концентрацию 1 мкг/мл.
15. 1 н. раствор NH4OH (15,3 мл концентрированного амми¬
ака на 100 мл раствора).
16. Универсальная индикаторная бумага.
17. Обеззоленные бумажные фильтры.
Для проведения флуорометрического определения необхо¬
димы следующие наборы светофильтров:
I набор: первичный светофильтр с максимумом пропуска¬
ния 436 нм, вторичный (типа ЖС-18) с широким максимумом
пропускания, начиная от 550 нм (для адреналина и норадре-
иалина).
II набор: первичный светофильтр с максимумом пропуска¬
ния 360 нм (УФС-3), вторичный — тот же, что и в I наборе
(для адреналина, норадреналина и ДОФА).
III набор: первичный светофильтр — 360 нм, вторичный
436 нм (для дофамина).
Примечание. В нашей работе суммарная флуоресцен¬
ция адреналина, норадреналина и ДОФА вызывалась длиной
волны 365 нм (спектральная линия ртутной лампы), выделен¬
ной интерференционным светофильтром с соответствующим
максимумом пропускания. При измерении флуоресценции ис¬
пользовался вторичный интерференционный светофильтр с мак¬
симумом пропускания 526 нм.
При выборе светофильтров для измерения флуоресценции
производного дофамина (5,6-диоксииндола) мы, исходя из
анализа его спектров возбуждения, а также указаний В. J1. Кар-
дышева и других авторов, в качестве первичного светофильтра
использовали фильтр УФС-2, скрещенный с БС-12 (для отсече¬
ния ультрафиолетовой области спектра до 240 нм), вторичным
служил сине-голубой светофильтр с широким максимумом про¬
пускания: 420—440 нм.
Ход определения. Сбор и хранение мочи производят так же,
как и в предыдущем методе. Мочу фильтруют через бумажный
фильтр. Отмеряют мерным цилиндром 17,5 мл фильтрата и до¬
бавляют к нему 250 мг ЭДТА, pH мочи доводят до 8,2—8,5.
Выделение катехоламинов из мочи. Для адсорбции готовят
хроматографическую колонку, на дно которой кладут кусочек
стеклянной ваты (с целью задержки окиси алюминия) и 1 г
257

окиси алюминия. Через колонку пропускают 10 мл воды, за¬
тем мочу. Скорость прохождения мочи должна составлять
1—2 мл в мин. Далее, через колонку пропускают 7 мл воды с
1 каплей 0,5 н. раствора аммиака. Остатки промывных вод
удаляют с конца колонки кусочком фильтровальной бумаги.
Элюцию осуществляют в два этапа.
Вначале ее проводят 0,25 н. уксусной кислотой; при этом с
адсорбента снимают адреналин, норадреналин, дофамин и час¬
тично ДОФА (в среднем 45%); затем 1 н. соляной кислотой,
которая элюирует оставшееся количество ДОФА. Уксуснокис¬
лый элюат собирают двумя порциями по 3,5 мл каждая. После
добавления первой порции при закрытом кране колонки стек¬
лянной палочкой перемешивают окись алюминия и дают ей
осесть. Кран открывают и элюат собирают в центрифужную
пробирку. Вторую порцию уксуснокислого элюата собирают в
ту же пробирку без помешивания.
Последнюю элюцию проводят 1 н. соляной кислотой также
двумя порциями по 1,75 мл каждая. После добавления первой
порции осадок перемешивают. Полученные элюаты можно хра¬
нить в холодильнике не больше одного дня.
Окисление с образованием флуоресцирующих продуктов.
Уксуснокислый элюат доводят до pH 4,2 1—2 каплями 1 н.
аммиака и затем отбирают по 1 мл в контрольные и опытные
пробы, в которые предварительно помещают по 1 мл 0,1 М
фосфатного буфера с pH 4,2. Затем оставшееся количество элю¬
ата доводят до pH 6,2, учитывают количество аммиака, пошед¬
шее на титрование, и в две пробы отбирают количество раство¬
ра, соответствующее 1 мл элюата. В эти пробы предварительно
помещают по 1 мл 0,1 М фосфатного буфера с pH 6,2.
Солянокислый элюат также доводят 1 н. аммиаком до pH
6,2 в мерных пробирках, затем добавляют воды до 7 мл. Из
этих растворов в опытную и контрольную пробы отбирают по
1 мл, предварительно поместив в эти пробы по 1 мл 0,1 М фос¬
фатного раствора с pH 6,2. Три полученные опытные пробы
уксуснокислого элюата с pH 6,2 и 4,2 и солянокислого элюата
окисляют 0,1 мл 0,25% феррицианида калия в течение 4 мин
(контрольные пробы не окисляют), затем добавляют как в
опытные, так и в контрольную пробы по 1 мл щелочного аскор-
бината.
Через 3 мин все пробы доводят водой до 10 мл, а в конт¬
рольные пробы добавляют по 0,1 мл 0,25% феррицианида ка¬
лия. Для большей стабилизации флуоресценции опытные и
контрольные пробы в период измерения флуоресценции охлаж¬
дают на льду.
Измерение флуоресценции и расчет содержания адренали¬
на, норадреналина и ДОФА. Ставят I набор светофильтров
(I—436 нм, II — 550 нм) и просматривают контрольные и
опытные пробы с pH 4,2 и 6,2, содержащие адреналин, норад¬
реналин и уксуснокислый ДОФА. В этих услозиях флуоресци¬
258

руют при pH 4,2 только адреналин, при pH 6,2 — адреналин
и норадреналин. Затем меняют первичный светофильтр на
УФС-3 и просматривают пробы с pH 6,2, содержащие адрена¬
лин, норадреналин и ДОФА (в этих условиях флуоресцируют
все вещества) и пробы солянокислого элюата, окисленного при
pH 6,2. Регистрируют разницу флуоресценции опытных и кон¬
трольных проб.
6 - 7 • 10 • а
Экскреция адреналина, мкг/сутки= g . 5 . iqqq ’
где 6 — флуоресценция (например в делениях шкалы прибо¬
ра) адреналина в 1 мл измеряемой пробы;
Е — флуоресценция 1 нг адреналина в мл пробы (в усло¬
виях измерения выводят по калибровке прибора);
7 — количество элюата;
10 — разведение элюата при окислении;
а — суточное количество мочи;
17,5 — количество мочи, взятое в опыт;
1000 — коэффициент для перевода из нг в мкг.
Примечание. Количество элюата и мочи выражается
в объемных единицах— мл.
После соответствующих сокращений формула приобретает
следующий вид:
Экскреция адреналина, мкг/сутки = ~ ^ ~'qqq >
8 • 4 • а
^кскреция норадреналина, мкг/сутки = _ iqqq’
где 8= (14 —6) —флуоресценция (в делениях шкалы прибора)
норадреналина (при pH 4,2 и 6,2 в условиях метода свечение
адреналина одинаково);
Ei — флуоресценция 1 нг норадреналина в условиях опыта.
Флуоресценция ДОФА уксуснокислого (X) рассчитывают
следующим образом (в данном примере):
v on (6 ■ Е2 8 ■ Е3)
Ё ’
где 32 — флуоресценция адреналина, норадреналина и ДОФА
уксуснокислого (в делениях шкалы прибора) при све¬
тофильтрах 360—550 нм;
Ег — флуоресценция 1 нг/мл стандарта адреналина, окис¬
ленного, при светофильтрах 360—550 нм и pH 6,2;
Ез — флуоресценция 1 нг/мл стандарта норадреналина при
pH 6,2 и при светофильтрах 360—550 нм.
Общая флуоресценция ДОФА (уксуснокислый и солянокис¬
лый элюаты) равна 124-X.
, (12 X) • 4 • а
Экскреция ДОФА, мкг/сутки= —^ .
где 12 — флуоресценция (в делениях шкалы прибора) ДОФА
солянокислого;
259

Е4 — флуоресценция 1 нг/мл ДОФА при pH 6,2 и свето¬
фильтрах 360—550 нм.
Определение дофамина. Для определения дофамина количе¬
ство уксуснокислого элюата, доведенного до pH 6,2 и соответ¬
ствующее 1 мл исходного элюата, добавляют к 0,5 мл 0,1 М
фосфатного буфера с pH 6,2 в опытную и контрольную пробы.
Объем доводят водой до 3,5 мл и окисляют каждую пробу
0,2 мл 0,02 н. йода в течение 4 мин. Затем к опытной пробе до¬
бавляют 0,5 мл щелочного сульфита, а в контрольную пробу
вносят 0,45 мл 5 н. раствора щелочи. Через 7 мин во все про¬
бы помещают по 0,7 мл 5 н. уксусной кислоты и содержимое
пробирок тщательно взбалтывают.
Пробы облучают кварцевой лампой в течение 15 мин или
прогревают в водяной бане при температуре +45° С в течение
30 мин и после добавления в контрольные пробы по 0,05 мл
водного сульфита измеряют флюоресценцию раствора в квар¬
цевой кювете. По нашему мнению, более предпочтителен ва¬
риант обработки проб с прогреванием в водяной бане. Для из¬
мерения флуоресценции используют первичный светофильтр с
максимумом пропускания 360 нм и вторичный, имеющий мак¬
симум пропускания 436 нм.
Расчет содержания дофамина. Разница между величинами
свечения опытной и контрольной проб представляет собой флу¬
оресценцию, обусловленную суммарным свечением дофамина
и ДОФА (в уксуснокислом элюате). Допустим, что она равна
20 делениям. Флуоресценцию ДОФА, в условиях определения
дофамина (окисление йодом и регистрация при светофильтрах
360—436 нм), рассчитывают по формуле:
Е5 • 1000 ’
где X — указанная ранее флуоресценция ДОФА уксуснокислого
при окислении его феррицианидом калия, при свето¬
фильтрах 360—550 нм;
Е4 — флуоресценция 1 нг/мл ДОФА в тех же условиях;
Еб — флуоресценция 1 мкг/мл ДОФА при окислении Ь и
при светофильтрах 360—436 нм;
1000 — коэффициент для перевода из нг в мкг.
Тогда на долю дофамина (в нашем примере) приходится:
Экскреция дофамина, мкг/сутки =
где Еб — флуоресценция 1 мкг/мл стандарта дофамина, окис¬
ленного Ь при светофильтрах 360—436 нм;
5 — разведение элюата при окислении.
X • Е4
Е6 • 17,5
260

Если исследование проводят в порционной моче, то резуль¬
тат необходимо разделить на время в минутах (ответ полу¬
чают в мкг/мин).
Построение калибровочного графика. На каждую пробу бе¬
рут 2 пробирки (опытную и контрольную), в которые разлива¬
ют стандартные растворы адреналина, норадреналина и ДОФА
в таких количествах, чтобы концентрация веществ по оконча¬
нии окисления была равной 20, 10 и 5 нг/мл. На каждую кон¬
центрацию берут несколько параллельных проб. Недостающее
до 2 мл количество дополняют буферным раствором с pH 4,2
и 6,2. Далее пробы окисляют феррицианидом калия, как опи¬
сано выше, и просматривают при тех же наборах светофиль¬
тров. При этом должны быть получены приблизительно такие
результаты:
1. 1 нг/мл адреналина при pH 4,2 и 6,2 и светофильтрах
436—550 и 360—550 нм дает примерно одинаковую флуорес¬
ценцию.
2. Флуоресценция норадреналина при pH 4,2 незначитель¬
на, при pH 6,2 и светофильтрах 436—550 нм — почти в 2 раза
меньше флуоресценции адреналина, а при светофильтрах 360—
550 нм — равна ей.
3. Интенсивность флуоресценции ДОФА при окислении фер¬
рицианидом калия, pH 6,2 и светофильтрах 360—550 нм при¬
мерно в 2 раза меньше флуоресценции адреналина и норадре¬
налина в тех же условиях.
Стандартные растворы дофамина и ДОФА разливают в 2
пробирки (опытную и контрольную) в количествах: 1 мл, 0,5 мл,
0,25 мл, соответствующих концентрации 0,2 мкг/мл, 0,1 мкг/мл,
0,05 мкг/мл, недостающий объем до 1 мл дополняют буфером
с pH 6,2.
Пробы окисляют йодом так же, как описано выше, и реги¬
стрируют флуоресценцию при светофильтрах 360—436 нм. Флу¬
оресценция дофамина и ДОФА близки. Ориентировочные ве¬
личины интенсивности свечения для пробы с концентрацией
0,2 мкг/мл составляют 15—18 делений для дофамина и И —
13 делений для ДОФА (при измерении флуоресценции на
приборах типа ФМ-1, Флюм, ИФ-1, «БИАН» и модифициро¬
ванных по схеме Есикова и Шарова приборах типа ЭФ-3,
ЭФ-ЗМ).
Примечания. 1. Нам кажется, что удобнее делать рас¬
чет не на 1 мл пробы, а на содержимое всей пробы (пример
этого расчета мы приводим ниже). В нашем флюориметре ис¬
пользовались стандартные прямоугольные кварцевые кюветы
от спектрофотометра типа СФ-4 (СФ-4А) общим объемом 4 мл.
Поэтому мы при окислении элюата добавляли всего лишь 1 мл
бидистиллированной воды к содержимому пробирки, содержа¬
щей 1 мл фосфатного буфера, 1 мл элюата и 1 мл раствора
аскорбиновой кислоты. Вместе с 0,1 мл раствора феррицианида
калия общий объем пробы составил 4 мл. Очевидно, в каждом
261

конкретном случае определения целесообразнее применять тот
общий объем раствора, который соответствует кювете флюори-
метра (если она рассчитана на 10 мл, лучше всего использовать
10 мл окисленного раствора, если на 7 мл — 7 мл раствора
и т. д.).
2. Расчет содержания адреналина, норадреналина и ДОФА
в уксуснокислом элюате можно производить путем решения
трех уравнений с тремя неизвестными.
Mji2 = 0,25 • A; M.Q 2 = 0,25 • А ф 0,1 НА;
М| 2 = 0,24 • А 0,24 • НА ф 0,12Д; Н§>2= 0,12 Д.
В этих уравнениях Mg_2, Мд>2 соответственно обознача¬
ют показания флюориметра для уксуснокислого элюата, изме¬
ренного при первом наборе светофильтров с pH 6,2 и 4,2 и при
втором наборе светофильтров с pH 6,2. Коэффициенты при А,
НА и Д соответствуют показаниям флюориметра для 1 нг (на¬
нограмма) адреналина, норадреналина и ДОФА в опытной
пробе.
В солянокислом элюате определяют содержание ДОФА
2
(Д) по вышеприведенной формуле, где Не(2—показание флюо¬
риметра для солянокислого элюата, измеренного при втором
наборе светофильтров и окисленного при pH 6,2. Д — искомое
содержание ДОФА в нг на опытную пробу; 0,12 — показания
флюориметра для 1 нг ДОФА в опытной пробе. Приведенные
коэффициенты — величины, найденные Э. LLI. Матлиной и со¬
трудниками для использованного ими метода; в наших усло¬
виях определения были получены другие коэффициенты. Впол¬
не понятно, что эти цифры могут быть применены только для
иллюстрации способа расчета. Путем суммирования содержа¬
ния ДОФА в уксуснокислом и солянокислом элюатах рассчи¬
тывают общее содержание.
Отсюда: Анг = Л^1,2 /0,25; Mg 2 = Анг 0,1 НА;
мб,2 = м4,2 + 0*1 НА; мб,2 — м4.2 = °*1 НА; 0,25 ■ А = X;
НА= (М* >2 —MJ 2)/0,1; М| 2 — X = 0,1 НА;
М§(2 = (0,24 • А), т. е. Y -f (0,24 • X), т. е. Z ^ 0,12 Д;
М| 2 = Y + z+ 0,12 Д;
М§ 2 = Y - Z =0,12 Д; Д = (М§>2 - Y - Z)/0,12;
Дсол — Н6 2/0,12; Д = Дуке Дсол»
Q — (0,011 • Д), т. е. В = 0,015 ДА; ДА = (Q — В)/0,015.
Q —В = 0,015 ДА, где 0,011 и 0,015 — коэффициенты, найден¬
ные для ДОФА (Д) и дофамина (ДА) в соответствующих ус¬
ловиях определения; Q — показания флюориметра.
262

Формула расчета (общая)!
КАв моче= (КАв пробе • 0,4 • Д) /1000 = ...мкг/сутки,
где КАв моче — суточная экскреция с мочой адреналина, нор¬
адреналина, дофамина и ДОФА, выраженная в мкг или
мкг/сутки;
КА в пробе — рассчитанное по вышеприведенным формулам
содержание в пробе адреналина, норадреналина, дофамина и
ДОФА, нг;,
0,4 — коэффициент, получаемый делением 7 (общий объем
пробы, мл) на 17,5 (объем взятой на анализ мочи, мл);
Д — диурез, мл;
1000 — коэффициент перевода нг в мкг (в 1 мкг— 1000 нг).
Например, в случае определения адреналина формула для
расчета суточной экскреции этого катехоламина примет вид:
(А • 0,4 • Д)/1000 = экскреции катехоламина, мкг/сутки,
где А — содержание адреналина в пробе (в нг), найденное по
одной из вышеприведенных формул.
Катехоламины и ДОФА у здоровых людей экскретируются
в следующих количествах (пределы колебаний): адреналин —
2,2—8 мкг/сутки, норадреналин — 8—40, дофамин— 112—450,
ДОФА — 8—111 мкг/сутки.
При исследовании 62 практически здоровых людей нами
были получены показатели, полностью соответствующие при¬
веденным литературным данным. Так, экскреция ДОФА соста¬
вила 56±2,29 мкг/сутки, дофамина — 252,30±0,25, норадрена¬
лина— 27,51 ±1,29, адреналина — 6,55±0,25 мкг/сутки.
О МЕТОДАХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
МЕТИЛИРОВАННЫХ
ПРОДУКТОВ ОБМЕНА КАТЕХОЛАМИНОВ В МОЧЕ
Главными конечными продуктами биологической и биохи¬
мической инактивации адреналина, норадреналина и дофамина
является З-метокси-4-гидроксиминдальная (ванилил-миндаль-
ная, ВМК) и З-метокси-4-гидроксифенилуксусная (гомованили-
новая, ГВК) кислота. Эти метаболиты образуются при окси-
метилировании и окислительном дезаминировании катехо¬
ламинов.
Методы их определения включают следующие этапы: 1) сбор
материала, 2) гидролиз и экстракцию, 3) разделение метабо¬
литов, 4) количественное определение.
Этапы сбора материала и гидролиза мало чем отличаются
от описанных для катехоламинов.
Экстракция проводится чаще всего этилацетатом. Для даль¬
нейшего электрофоретического или хроматографического ис¬
следований, этилацетатный экстракт обычно выпаривают досу¬
ха в небольшом токе воздуха при +40—50° С.
Электрофорез мочевых продуктов обмена катехоламинов
проводят в буферах с малой ионной силой: либо в пиридиновом
263

(пиридин-уксусная кислота-вода = 30 : 4 : 996), либо в ацетат¬
ном буфере с pH 6 (состоящем из 5 мл ледяной уксусной кис¬
лоты и 995 мл воды).
Применяется высоковольтный электрофорез с напряжением
2000 в (Штудниц, Хансон, 1959), 1900—2000 в (Цайсель, 1961),
2500—3000 в (Иошинага, Итон и др., 1961), 5000 в (В. С. Ка¬
мышников, 1971) и силой тока соответственно 100 мА, 35—
60 мА, 8—12 мА, 4—6 мА на полосу.
Длительность электрофоретического разделения варьирует
от 1,5 до 3 ч. Необходимо охлаждение полос хроматографиче¬
ской бумаги до температуры 0—4° С.
Клайн и Чернаик (1961) проводили электрофоретическое
разделение с силой тока в 0,5 мА на ленту в течение 17 ч, на¬
пряжением в 300—400 в. Ванилил-миндальная кислота в усло¬
виях последнего метода продвигается от места нанесения при¬
мерно на половину пути к аноду.
Методы тонкослойной хроматографии пока еще не нашли
широкого практического применения в клиниках.
Количественное определение метаболитов катехоламинов
производят различными способами. Для выявления этих ве¬
ществ на хроматограммах и фореграммах используют способ¬
ность их образовывать ярко окрашенные соединения с диазо-
тированным р-нитроанилином, диазотированной сульфаниловой
кислотой, 2,6-дихлорхинонхлорамидом. Окрашенные пятна за¬
тем элюируют и исследуют спектрофотометрически. Элюцию
диазосоединений после обработки р-нитроанилином чаще всего
производят метанольной щелочью, спектрофотометрирование
ведут при 520—550 нм.
Как кислые, так и основные метаболиты могут быть под¬
вергнуты окислению перйодатом натрия или феррицианидом
калия, в результате 90—100% этих продуктов переводятся в
ванилин, содержание которого учитывается спектрофотомегри-
чески при 350—360 нм.
Некоторые авторы хроматограммы и фореграммы подвер¬
гают денситометрии с последующим планиметрическим иссле¬
дованием.
При изучении многих из описанных методик (с помощью
доступных нам приборов и реактивов) создается впечатление,
что из методов разделения продуктов обмена катехоламинов в
моче наиболее быстрым и поэтому наиболее удобным для кли¬
нико-диагностических лабораторий является высоковольтный
электрофорез. Он дает возможность провести определение от
начала до конца в течение одного рабочего дня. Этим методом
более четко выделяется фракция ванилил-миндальной кислоты.
В то же время, при отсутствии специального аппарата для вы¬
соковольтного электрофореза, можно применять электрофорез
и при более низком напряжении, порядка 300—400 в. В этом
случае результаты исследования могут быть получены на сле¬
дующие сутки.
264

Определение ванилил-миндальной кислоты
с использованием электрофореза на бумаге
(В. В. Меньшиков, Т. Д. Большакова, 1966)
Принцип. Содержащиеся в моче фенольные кислоты экс¬
трагируют уксусно-этиловым эфиром, этилацетат упаривают,
сухой экстракт растворяют в небольшом объеме абсолютного
этанола и наносят на полосу хроматографической бумаги для
электрофоретического разделения. Пятно ВМК выявляют ок¬
раской диазотированным р-нитроанилином, элюируют мета-
нольной щелочью и проводят колориметрическое определение.
Реактивы. 1. 3 н. НС1 и 1 н. НС1 (готовят из фиксаналов).
2. Этиалацетат.
3. Насыщенный раствор NaCl.
4. Абсолютный этанол.
5. Раствор для электрофореза рН = 6 (готовят доведением
дистиллированной водой 5 мл ледяной уксусной кислоты до 1 л
в мерной колбе).
6. Диазотированный р-нитроанилин:
а) смесь, состоящая из 0,5 г р-нитроанилина, 10 мл концен¬
трированной НС1 и 490 мл воды (готовят при нагревании).
Для приготовления раствора берут бюкс, в котором на ана¬
литических весах взвешивают нужное количество р-нитроани¬
лина, вливают туда соответствующий объем концентрированной
соляной кислоты и устанавливают бюкс на горячую плитку
(работу проводить под тягой), растворяя р-нитроанилин энер¬
гичным помешиванием раствора стеклянной палочкой. После
полного растворения содержимое бюкса количественно перено¬
сят в мерную колбу (через стеклянную воронку, многократно
обмывая водой внутренние стенки бюкса). Полученный раствор
хранят в холодильнике.
б) 0,2% раствор NaN02 (хранят в холодильнике).
в) 10% раствор КгСОз (хранят в холодильнике).
Перед употреблением готовят смесь холодных растворов:
1 объем (а) + 1 объем (б), через 4—5 мин — 2 объема (в).
Смесь годна 1,5 мин (примечания, с. 269).
7. Раствор метанольной щелочи; готовят перед употребле¬
нием из расчета 4 мл на пробу путем сливания 2-х частей ме¬
танола и 1 части 2% раствора Na2C03 (примечания, с. 269).
8. Стандарт ВМК: основной водный раствор с концентраци¬
ей 100 мкг в 1 мл; для построения калибровочной кривой 0,01;
0.02; 0,03; 0,04 мл этого раствора, содержащего соответственно
1, 2, 3, 4 мкг стандарта, пропускают через всю методику (допу¬
стимо наносить навеску ВМК сразу же на полосы хроматогра¬
фической бумаги).
Ход определения. Для исследования отбирают 1 мл мочи в
пробирку или колбочку с притертой пробкой. С помощью 1 н.
НС1 доводят пробы до pH 1,0, для очистки от примесей добав¬
ляют 1 мл насыщенного раствора NaCl.
265

ВМК экстрагируют двумя порциями этилацетата по 4 мл,
каждый раз встряхивая содержимое пробирки (колбочки) в те¬
чение 1 мин, и дают отстояться 20 мин. Этилацетатный слой оба
раза сливают в другую колбочку, затем высушивают досуха в
легком токе воздуха в водяной бане при +40—50° С.
Сухой остаток растворяют в 0,2 мл абсолютного этанола
(2-мя порциями по 0,1 мл, обмывая стенки колбочки) и перено¬
сят микропипеткой на ленту из хроматографической бумаги
шириной 4 см, длиной 43 см на участке шириной в 1 см, в 13,5—
14,5 см от катодного конца ленты.
Лента предварительно должна быть смочена раствором для
электрофореза и натянута в аппарате для электрофореза. Элек¬
трофорез проводят в камерах отечественного производства в
ацетатном растворе; сила тока — 1 мА на ленту с напряжением
380—420 в в течение 18 ч. Через 18 ч ленты фиксируют в те¬
чение 30 мин в сушильном шкафу при +80° С, опрыскивают
свежеприготовленным красителем — диазотированным р-нитро-
гнилином. Затем сушат на воздухе в течение 1—2 ч. Ванилил-
миндальная кислота проявляется в виде фиолетовой полоски
в 12—14 см от места нанесения к аноду. Эту полоску выреза¬
ют, помещают в пробирку и элюируют в течение 1 ч (за это
время 2—3 раза энергично встряхнуть пробы) 4 мл метаноль-
ной щелочи.
Затем производят спектрофотометрию пурпурного элюата
ВМК при 520 нм или фотоэлектроколориметрию на ФЭКе с зе¬
леным светофильтром. В обоих случаях используют кюветы с
толщиной слоя 10 мм.
В качестве контроля используют элюат из опрысканного ку¬
сочка ленты шириной в 1 см, не содержащего фракций мочи.
Показатели контроля вычитают из показателей опыта, по
калибровочной кривой определяют количество ВМК в мкг
в 1 мл исследуемой мочи, и полученный результат умножают
на диурез в мл. Содержание ВМК в моче выражают в мг в сут¬
ки или, что удобнее для отдельных порций мочи, в мкг на мг
креатинина. Этим методом открывают 88,1% добавленного к
пробам мочи стандарта ВМК, расхождение параллельных проб
в среднем составляет +3,79%.
Нормальные величины экскреции ванилил-миндальной кис¬
лоты— 0,7—3,8, в среднем 1,92 ±0,17 мг/сутки или 0,6—3,0,
в среднем 1,77±0,15 мкг/мг креатинина.
Метод одновременного определения
в моче ванилил-миндальной, 5-оксииндолуксусной кислот
и тирамина (В. С. Камышников, 1971)
Принцип. После приготовления этанольного экстракта фе¬
нольных кислот часть раствора наносят на полосу хроматогра¬
фической бумаги для определения ВМК методом высоковольт¬
266

ного электрофореза, а в оставшемся количестве экстракта оп¬
ределяют 5-ОИУК путем добавления к нему ре’агентов на этот
метаболит. Освобожденный от кислых продуктов остаток мочи
используется для определения в нем тирамина флюориметри-
ческим методом.
Реактивы для определения ВМК те же (см. с. 265), приго¬
товление остальных реактивов описано в тексте и на с. 284
(при описании унифицированного метода определения 5-ОИУК
в моче).
Ход определения. Для исследования в пробирку отбирают
1.5 мл мочи (с pH 1) из суточного ее количества, добавляют
1.5 мл насыщенного раствора NaCl. Экстракцию производят
дважды порциями этилацетата по 4 мл с встряхиванием в те¬
чение 1 мин. После каждой экстракции верхний прозрачный
этилацетатный слой отбирают в широкую пробирку с пробкой,
через которую под давлением продувают ток воздуха. Затем
в той же пробирке производят выпаривание экстракта на водя¬
ной бане при температуре +47° С, на что требуется около
10 мин.
Сухой остаток растворяют в 0,15 мл абсолютного этанола
при тщательном смывании стенок пробирки. Из этого объема
сразу же отсасывают микропипеткой 0,05 мл раствора и нано¬
сят на середину подготовленной (предварительно смоченной
буфером и отжатой) полосы хроматографической бумаги «Ле¬
нинградская быстрая» длиной 46 см и шириной 4 см (можг:о
использовать и бумагу других марок).
Электрофорез проводят в растворе уксусной кислоты ионной
силы 0,25 и pH 3 при градиенте потенциала 100 в/см и силе
тока 1,0—1,5 мА/см в течение 1,5 ч. Температура пластины,
охлаждающей бумажные полосы, при этих параметрах тока не
должна превышать +14° С.
После проявления фракций диазотитрованным р-нитроани¬
лином и высушивания фореграмм в токе воздуха, нагретого до
80° С, ванилил-миндальную кислоту, выявляемую по стандарту
в виде полоски фиолетового цвета, элюируют метаноль-
ной щелочью и проводят спектрофотометрию (или коло¬
риметрию на микрофотометре типа МКМФ-1) при длине
волны 525 нм. Для контроля элюируют метанольной ще¬
лочью часть опрысканного красителем чистого участка фо-
реграммы. Показатели контроля вычитают из показателей
проб опыта.
В остатке экстракта определяют 5-оксииндолуксусную кис¬
лоту (5-ОИУК). Для этого к нему добавляют 2,9 мл дистилли¬
рованной воды, 0,3 мл 0,1% этанольного раствора а-нитрозо-
Р-нафтола и 0,3 мл нитрозо-кислотного реактива (приготавли¬
ваемого перед употреблением из расчета 0,2 мл 2,5% NaN02
на 5 мл 1 н. H2S04). После прогревания пробы в течение 7 мин
на водяной бане (той же, которую используют для приготовле¬
ния сухих экстрактов) и удаления избытка а.-нитрозо-Р-нафто-
267

ла встряхиванием с 3 мл этилацетата нижнюю окрашенную вод¬
ную фазу сначала переносят в обычную пробирку, затем спек-
трофотометрируют при той же длине волны — 52*5 нм.
Наряду с опытными пробами ставится контроль на реакти¬
вы, для чего в чистую сухую пробирку (для выпаривания эк¬
страктов) приливают 3 мл дистиллированной воды, 0,3 мл ни-
трозо-нафтольного и 0,3 мл нитрозо-кислотного реактивов.
В дальнейшем контрольную пробу обрабатывают так же, как
опытную.
В остатке же мочи с удаленными из нее кислыми продукта¬
ми определяют тирамин. Для этого в пробирку добавляют не¬
сколько капель 1 н. NH4OH и 0,5 мл боратного буфера pH 10
(31,4 г борной кислоты растворяют в 1 л воды и добавляют
примерно 67 мл 30% раствора NaOH). Остаток мочи промыва¬
ют дважды порциями этилацетата по 4 мл со встряхиванием
пробирки в течение 1 мин. После разделения фаз прозрачный
верхний слой органического экстрагента отсасывают, все коли¬
чество эфира объединяют и промывают сначала двумя, а затем
одним мл 0,2 н. НС1 в течение 1 мин при энергичном встряхи¬
вании.
Нижнюю водную фазу, содержащую тирамин, переносят в
другую пробирку, в которую добавляют 0,5 мл ct-нитрозо-Р-наф-
тола, используемого для определения 5-оксииндолуксусной кис¬
лоты, и 0,5 мл нитрозо-кислотного реактива (готовящегося пе¬
ред употреблением смешиванием 5 мл разбавленной в 5 раз
концентрированной азотной кислоты и 0,1 мл 25% NaN02).
Для образования флуоресцирующего комплекса пробирку
прогревают в водяной бане при той же температуре +47° С
в течение 30 мин.
Избыток а-нитрозо-Р-нафтола удаляют прибавлением к рас¬
твору 4 мл дихлорэтана.
Почти бесцветную водную фазу отсасывают в центрифуж¬
ную пробирку и флюориметрируют, используя интерференци¬
онные светофильтры с максимумами пропускания 440 и 526 нм.
По нашим данным, в норме суточная экскреция тирамина
составляет 231,26± 11,78 мкг.
Для оценки результатов учитывают (по калибровочной кри¬
вой) содержание ВМК в 0,5 мл, 5-ОИУК — в 1 мл, тирамина —
в 1,5 мл мочи, суточный диурез.
Возможно применение дополнительной очистки экстракта
при определении 5-ОИУК.
В случае использования варианта метода с очисткой хлоро¬
формом (обследование больных с заболеваниями, при которых
наблюдается нарушение обмена аминокислот триптофана, ти¬
розина, фенилаланина и др.) к 3 мл водного раствора, содер¬
жащего экстракт из 1 мл мочи, приливают 2 мл хлороформа.
Смесь энергично встряхивают в течение 1 мин. Содержимое
переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют при
3000 об/мин в течение 15 мин. Водную фазу переносят в другую
268

пробирку и с ней проводят реакцию с а-нитрозо-Р-нафТольным
и нитрозо-кислотным реактивами по вышеописанному способу.
Расхождение параллельных проб при включении этапа очистки
хлороформом варьирует от 0,33 до 7,67%, составляя в среднем
4,73%.
Примечания (к методике определения ВМК).
Остановимся на рассмотрении тех моментов технического
исполнения методики, от которых во многом зависит правиль¬
ность получаемых результатов.
Этап приготовления реактивов. Все 3 раствора, используе¬
мые для приготовления диазотированного р-нитроанилина, сле¬
дует хранить при +4° С и возобновлять каждые 4 недели. Не¬
посредственно перед употреблением смешивают равные части
растворов р-нитроанилина и нитрита натрия (после добавления
нитрита раствор р-нитроанилина почти полностью обесцвечи¬
вается) и приливают две части раствора карбоната натрия
(после добавления которого должна вновь появиться прежняя
желтая окраска р-нитроанилина). Эта смесь должна быть упо¬
треблена в течение 2-х мин.
В литературе (А. Я. Рево. Органическая химия. М., 1962,
с. 290) имеются указания о том, что «...диазотированный р-ни-
троанилин может сохраняться при комнатной температуре до¬
вольно продолжительное время, что делает удобным примене¬
ние его в качестве диазореактива».
Раствор для элюции нужно готовить путем постепенного,
по каплям прибавления к раствору карбоната натрия двойного
объема метанола (чтобы избежать выпадения хлопьев углекис¬
лого натрия, вследствие гораздо меньшей растворимости кар¬
боната натрия в метаноле, чем в воде).
Экстракционные процедуры. Сухой экстракт (по Штудни-
цу, растворенный в этаноле) почти неограниченно долго хра¬
нится в хорошо закупоренной посуде в холодильнике, что поз¬
воляет прервать методику на этом этапе.
Хранение фореграмм. Не обработанная диазо-реагентом бу¬
мажная полоса может сохраняться, будучи защищенной от
света и полностью изолированной от паров фенола (!) не более
2—3 дней.
Обработка фореграмм. После окрашивания бумажных по¬
лос раствором диазотированного р-нитроанилина фракция ВМК
должна быть элюирована в течение 3 ч (включая и время суш¬
ки бумаги в струе холодного воздуха). Через 4 ч окраска «пу¬
стых» проб (фона) становится интенсивнее, вследствие чего
получаются более высокие значения экстинкции. Следовательно,
элюцию надо произвести в течение 3 ч после окрашивания фо¬
реграмм диазотированным р-нитроанилином.
Исследование стабильности ВМК мочи. По данным Штуд-
ница (1960), хранение проб одной и той же мочи при комнат¬
ной температуре и при + 4° С как в подкисленном, так и не в
подкисленном состоянии в течение 8 дней не сказывается на
269

определении количественного содержания ВМК. Не играет
роли, подкислена моча или нет. Установлено, что хранение под¬
кисленной мочи в замороженном состоянии при —20° С в тече¬
ние 7 месяцев (и даже 3-х лет) практически не сказывается
на результатах анализа.
При определении ВМК мочи нужно исключить из пищи ба¬
наны (содержащие большое количество норадреналина), а так¬
же некоторые лекарственные препараты: кофеин, салициловую
кислоту и некоторые другие, могущие извратить результаты
анализа.
Клинико-диагностическое значение исследования катехола¬
минов, их предшественников и метаболитов. При интерпрета¬
ции результатов анализа экскреции катехоламинов с мочой
необходимо помнить, что выделение катехоламинов изменяется
с возрастом. Возрастная динамика экскреции катехоламинов и
ДОФА представлена в таблицах 43, 44.
Экскреция адреналина у мужчин и женщин почти одинако¬
ва во всех возрастных группах, за исключением 12—15 лет
(у мальчиков выше, чем у девочек) и 41—50 лет (у мужчин
выше, чем у женщин).
Выделение норадреналина до возраста 8—11 лет почти оди¬
наково; в дальнейшем оно возрастает у девочек и превышает
экскрецию медиатора у мальчиков. И в последующие периоды
выделение его у женщин выше, чем у мужчин.
Выделение ДОФА во все периоды у женщин выше, чем у
мужчин, а дофамина — в периоды с 12 до 30 и с 51 до 60 лет.
При исследовании экскреции катехоламинов с порционной
мочой необходимо учитывать, что в утренние и дневные перио¬
ды суток выделение катехоламинов, как правило, выше, чем
ночью (табл. 45).
Суточная периодика экскреции катехоламинов у детей пер¬
вого полугодия жизни такова: максимум выделения адренали¬
на приходится на дневные часы; норадреналин обнаруживает
два пика выделения — с 9 до 12 ч дня и с 18 до 21 ч. Мини¬
мальная экскреция норадреналина с постоянством отмечается
между 3—6, 15—16 и 21—24 ч. Во втором полугодии жизни
максимальный подъем уровня выделения адреналина отмеча¬
ется в утренние часы — с 6 до 9 ч. Минимум экскреции адре¬
налина — в ночное время. Суточная динамика выделения нор¬
адреналина такова же, как и в первом полугодии.
Курение, физическая нагрузка, эмоциональный стресс вы¬
зывают повышение экскреции катехоламинов с мочой.
Рассмотрение основных путей биосинтеза и катаболизма
катехоламинов позволяет прийти к выводу, что для наиболее
полного суждения о состоянии симпато-адреналовой системы
у больного необходимо исследовать по возможности все основ¬
ные звенья метаболизма катехоламинов — от их предшествен¬
ников до гомованилиновой и ванилил-миндальной кислот. Толь¬
ко тогда можно судить о резервных возможностях симпато-
270

ТАБЛИЦА 43
Выделение катехоламинов с мочой (мкг/сутки)
у здоровых детей первого года жизни
(данные Т. М. Кафар-Заде, 1969, метод Euler, Lishajko, 1959;
В. О. Осинский, 1957; В. В. Меньшикова, 1961)
Возраст (месяцы)
Адреналин М±т
Норадреналин М±т
1
0,25 ± 0 02
0,39 + 0,01
2
0,23 + 0,02
0,44 + 0,03
3
0,34 ±0,02
0,56 + 0,03
4
0,42 ± 0,02
0,67 + 0,04
5
0,44 + 0,02
0,73 + 0,03
6
0,46 + 0,02
7
0,54 + 0,02
0,83 ±0,04
8
0,56 + 0,02
0,92+0,04
9
0,59 + 0,02
1,03 + 0,04
10
0,59 + 0,02
1,05 ± 0,04
11
0,62 + 0,02
1,16 ± 0,05
12
0,66 + 0,02
1,07 ±0,05
адреналовой системы, активности ее гормонального и медиа-
торного звеньев и общем объеме образующихся в организме
гормонов-медиаторов.
Разумеется, результаты биохимического исследования дол¬
жны быть подкреплены и данными клинического наблюдения,
так как было бы весьма односторонне изучать одни лишь по¬
казатели обмена катехоламинов, не учитывая при этом степе¬
ни чувствительности организма больного к их влиянию.
В этом смысле заслуживает всяческого одобрения пропа¬
гандируемый Г. Н. Кассилем и Э. Ш. Матлиной метод функцио¬
нальных проб, позволяющий «встряхнуть» у больного парасим¬
патическую и симпатическую CHCTeMyt с тем чтобы составить
представление о границах гомеостаза.
Вообще же участие симпатико-адреналовой системы в меха¬
низмах нейро-гуморальной регуляции настолько многогранно,
что требует детального освещения.
Уже давно было высказано предположение о том, что в раз¬
витии реакции «напряжения» (стресс) в организме и активации
при этом системы гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников
ведущая роль принадлежит адреналину.
Возникновение диэнцефального синдрома и других заболе¬
ваний связано с изменением количественного содержания в ор-
271

ТАБЛИЦА 44
Показатели экскреции (мкг/сутки) катехоламинов и ДОФА
с мочой у здоровых людей разного возраста
(данные Т. Д. Большаковой и др., 1969)
Возраст
Адреналин
М±т
Норадреналин
М±т
Дофамин М + т
ДОФА М±т
До 1 месяца
0,4 ±0,1
1,3 ±0,2
15,0 ±2,6

11 месяцев
2,5 ±0,3
5,0 ±0,6
53,0 ±5,9
12,5 ± 1,2
1—3 года
5,0 ± 0,3
6,5 ±0,5
64,4 ±4,2
17,0 ± 1,4
4—7 лет
4,3 ±0,4
10,9 ± 1,7
68,6 ±10,3
—
8—11 »
6,2 ±0,6
16,4 ± 2,6
82,3 ±14,5
—
12—15 »
6,9 ±1,0
25,8 ±4,6
124,2 ±27,9
—
16—20 »
6,5 ±0,3
17,3 ±0,8
251,2 ±21,8
51,1 ±4,2
21—30 »
5,6 ±0,3
20,4 ± 1,9
324,1 ±28,6
48,8 ±4,6
31—40 »
5,4 ±0,3
17,9 ± 0,3
322,5 ±27,5
51,3 ± 4,4
41—50 »
7,9 ±0,8
15,2 ±2,8
300,0± 17,3
40,4 ± 10,8
51 —60 »
3,5 ±0,4
14,0 ± 1,7
383,3 ±57,6
31,8 ±5,5
ТАБЛИЦА 45
Динамика выделения катехоламинов и ДОФА в мг/мин
с мочой здоровых взрослых людей в течение суток
Время
суток
Адреналин
Норадреналин
Дофамин
ДОФА
Данные Э. Ш. Матлиной,
3. М. Киселевой,
Л. Э. Софиевой (1965)
7—11 ч.
4,8 ±0,64
15,6 ± 1,8
261,0 ± 39,0
38,0 ±5,5
11—15 »
6,0 ± 1,2
12,2 ±2,1
234,0 ±34,0
38,0 ±8,2
15—21 »
4,5 ±0,63
17,0 ±2,4
281,0 ± 39,0
32,1 ±5,2
21—7 »
1,7 ±0,35
8,4 ±1,6
162,0 ±40,0
33,0 + 9,3
Данные В. В. Меньшикова (1931)
День
7,5 ±1,1
30,9 ±3,5

—
(от 4,2 до 11,5)
(от 17,0 до 41,6)
—
--
Ночь
1,96 ±0,84
11,3 ±4,25
—
—
(от 0,3 до 5,86)
(от 2,3 до 30,4)

—
272

ганизме адреналина, норадреналина, их предшественников и
метаболитов. Что же касается «извращения» обмена катехола¬
минов, то оно часто рассматривается в нервной и психиатри¬
ческой клинике.
Многочисленными исследованиями в области биохимии био¬
генных аминов показана большая роль этих соединений в дея¬
тельности центральной нервной системы. В настоящее время
не вызывает сомнения, что как сами катехоламины, так и их
обмен тесно связаны прежде всего с функциональным состоя¬
нием головного мозга. Катехоламины являются активными
участниками нервных процессов, и нарушение их обмена может
играть существенную роль в развитии нервных и психических
заболеваний.
В результате многочисленных исследований доказана важ¬
ная и даже ключевая позиция обмена катехоламинов в разви¬
тии нарушений двигательного автоматизма и мышечного тону¬
са (паркинсонизм), эмоциональной сферы (аффективная пато¬
логия), высших форм целенаправленной деятельности и мыш¬
ления (шизофрения).
Нарушения в регуляции мышечного тонуса и двигательных
автоматизмов (патология экстрапирамидной системы, клиниче¬
ски проявляющаяся в синдроме паркинсонизма) сопровожда¬
ются выраженными изменениями в обмене катехоламинов, в
основном на уровне дофамина. При паркинсонизме концентра¬
ция дофамина в головном мозгу резко падает (в черной суб¬
станции составляет только 15% от наблюдаемой в норме), в то
время как содержание норадреналина снижается в значитель¬
но меньшей степени.
Тесная связь симпатико-адреналовой системы с состоянием
эмоциональной сферы обусловливает значительный интерес к
изучению катехоламинов при аффективной патологии. Пока¬
зано, что при такой выраженной патологии эмоциональной сфе¬
ры, как маниакально-депрессивный психоз, выделение катехо¬
ламинов резко меняется в зависимости от фазы заболевания —
в депрессивной фазе значительно увеличивается суточная эк¬
скреция адреналина и снижается выделение норадреналина,
для маниакального состояния характерным является много¬
кратное увеличение экскреции норадреналина. Отмечено зна¬
чительное снижение урор,ня адреналина в случаях умственной
отсталости. Недостаточная функция мозгового вещества надпо¬
чечников и низкий уровень адреналина в крови может привести
к нарколепсии и нарушению смены сна и бодрствования.
Изучение процессов превращения катехоламинов и роли
возникающих при этом метаболитов приобретает особое значе¬
ние в биохимии шизофрении.
Не менее актуальна для современной клиники проблема
изучения катехоламинов и при сердечно-сосудистых заболева¬
ниях, что можно проиллюстрировать на примере гипертонии и
коронарной недостаточности.
273

В схеме патогенеза гипертонической болезни катехоламинам
справедливо отводят роль промежуточного звена в становлении
гипертонического состояния. Это предположение подтвержда¬
ется выявлением отчетливого повышения содержания катехо¬
ламинов в организме больного во время гипертонических кри¬
зов.
Исследования последних лет показали, что роль катехола¬
минов в патогенезе сердечно-сосудистой недостаточности имеет
связь не только с нарушением доставки крови к сердцу, но и
с изменением биохимических процессов в нем.
Рааб выдвинул концепцию о способности катехоламинов
интенсифицировать поглощение кислорода тканью миокарда,
что не удовлетворяется недостаточным повышением коронар¬
ного кровотока. В этих условиях энергетическая активность
сердца падает, возникает гипоксия миокарда с накоплением
молочной кислоты.
Выделение катехоламинов повышено в периоды кризов ги¬
пертонической болезни, в острый период инфаркта миокарда,
при приступах стенокардии.
Из приведенных примеров, иллюстрирующих патогенез этих
двух важнейших сердечно-сосудистых заболеваний, видно, на¬
сколько значительную роль имеет проблема катехоламинов для
клиники. Она представляется тем более важной, если учесть,
что катехоламинам принадлежит существенная роль и в раз¬
витии атеросклероза.
Гипотоническая болезнь также сопровождается выраженны¬
ми нарушениями в обмене упомянутых гормонов-медиаторов и
их предшественников. Так, рядом авторов отмечено резкое
уменьшение экскреции дофамина при этом заболевании, что на¬
водит на мысль о какой-то поломке в цепи биосинтеза факто¬
ров, способствующих поддержанию на должном уровне кро¬
вяного давления.
Вообще говоря, роль катехоламинов в организме настолько
многогранна, что она сказывается не только в генезе целою
ряда нервно-психических и терапевтических заболеваний. Тон¬
кое исследование обмена гормонов-медиаторов способствует
правильной диагностике многих хирургических заболеваний и
выбору наиболее рациональной тактики ведения больного как
при осуществлении сложных полостных операций, с примене¬
нием гипотермии и искусственного кровообращения, так и при
даче различных видов наркоза.
При исследовании больного с так называемой «эссенциаль-
ной» гипертонией всегда следует помнить о случаях феохромо-
цитомы — гормонально активной опухоли мозгового вещества
надпочечников. Феохромоцитома, как правило, сопровождается
значительным увеличением продукции катехоламинов. Содер¬
жание катехоламинов при этом в десятки раз превосходит тот
небольшой подъем, который наблюдается в период кризов при
гипертонической болезни, что и позволяет с высокой степенью
274

достоверности отдифференцировать феохромоцитому от гипер¬
тонической болезни и диэнцефальных кризов. Часто исследова¬
ние катехоламинов является единственным тестом, позволяю¬
щим поставить диагноз феохромоцитомы и симпатоганглиоб-
ластомы.
Изучение реакции симпатико-адреналовой системы при опе¬
рациях на открытом сердце в условиях искусственного крово¬
обращения и гипотермии позволило раскрыть одну из причин
неблагоприятных влияний на организм больного процесса со¬
гревания. Оказалось, что оно приводит к столь резкому увели¬
чению содержания катехоламинов в крови, что становится впол¬
не понятным их гистотоксическое действие, приводящее очень
часто к летальному исходу. В связи со сказанным биохимика¬
ми было предложено проводить поэтапное согревание больного,
в целях уменьшения реакции симпатико-адреналовой системы.
И это дало блестящий клинический эффект.
Интересные корреляции между уровнем кровяного давления
и катехоламинемией были установлены и при аддисоновой бо¬
лезни, не говоря уже о феохромоцитоме.
Жировое перерождение печени от действия четыреххлори¬
стого углерода в значительной мере обусловлено повреждаю¬
щим действием катехоламинов на паренхиму печени. Увели¬
чение экскреции катехоламинов обнаружено также при гепати¬
тах и циррозах печени, при обострениях язвенной болезни
желудка и двенадцатиперстной кишки. Нарушение экстреторной
функции почек не может не привести к задержке катехолами¬
нов в крови, в связи с чем оно может иметь значение в патоге¬
незе уремии. Остро протекающие инфекционные заболевания:
различной этиологии токсические диспепсии и другие нередко
сопровождаются коллаптоидным состоянием за счет поражения
хромаффинной ткани. Да и сама лихорадка, считают, обуслов¬
лена изменением соотношения адреналина и норадреналина в
определенных центрах головного мозга. При коллагенозах вы¬
деление катехоламинов снижается. Острые лейкозы у детей со¬
провождаются полной дегенерацией хромаффинной ткани с ис¬
чезновением реакции на катехоламины.
Таким образом, катехоламины занимают «почетное» место
в патогенезе многих заболеваний.
Для того чтобы показать роль катехоламинов в патологии,
нами произвольно были взяты некоторые нозологические фор¬
мы из самых различных областей медицины: психиатрии, не¬
врологии, терапии, хирургии, эндокринологии. Мы совсем не
останавливались на легочных заболеваниях, например бронхи¬
альной астме, когда адреналин, благодаря своему выраженно¬
му десенсибилизирующему действию, часто оказывается един¬
ственным средством, облегчающим состояние больного (повы¬
шение уровня экскреции катехоламинов обнаружено в период
приступов бронхиальной астмы и в астматическом состоянии).
Нами были оставлены без внимания случаи тонзилло-кардиаль-
275

ного синдрома, заболевания печени, почек, крови, поражения
желудочно-кишечного тракта, опухоли неэндокринных органов,
инфекционные заболевания,— в патогенезе которых катехола¬
минам тоже принадлежит немаловажная роль.
ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ
СЕРОТОНИН-5-ГИДРОКСИИНДОЛУКСУСНАЯ КИСЛОТА
Весьма важным гуморальным регулятором, принимающим
активное участие в осуществлении процессов гомеостеза, явля¬
ется 5-гидрокситриптамин. Это вещество, содержащееся в кро¬
ви в ничтожно малой концентрации, в отличие от других био¬
генных аминов (тирамина, гистамина, триптамина) обладает
выраженным сосудосуживающим действием. Названное в силу
этого серотонином, оно, как оказалось, ничем не отличается от
обнаруженного Эрспамер энтерамина и открытого Цукер тром-
ботонина.
Установление важной роли серотонина в проявлении многих
физиологических процессов потребовало разработки специфич¬
ных методов количественного определения этого амина в био¬
логическом материале.
Один из наиболее чувствительных методов количественного
определения серотонина — биологический — основывается на
способности 5-гидрокситриптамина вызывать сокращение глад¬
кой мускулатуры (толстой кишки, желудка, рога матки и т. д.)
у экспериментальных животных. К сожалению, ему присущи
все обычные для биологических методов недостатки: неболь¬
шая специфичность, различная чувствительность тест-объекта,
трудности, связанные с необходимостью содержания в услови¬
ях клиники лабораторных животных.
Колориметрические методы определения серотонина и род¬
ственных ему аминов обусловлены их способностью образовы¬
вать с а-нитрозо-Р-нафтолом окрашенные соединения, обладаю¬
щие максимальной абсорбцией при 540 нм. Ввиду необходи¬
мости значительных количеств субстрата для получения
достаточно интенсивной окраски, эти методы наибольшее при¬
менение нашли при определении содержания 5-ОИУК в моче и
для контроля за интенсивностью протекания соответствующих
ферментных реакций в тканях.
В последние годы в практику биохимического исследования
вошли методы, основанные на способности серотонина в опре¬
деленных условиях испускать свет флуоресценции. В нейтраль¬
ных и слабокислых растворах максимум спектра флуоресцен¬
ции 5-гидроксииндолов приходится на 330 нм при ее возбуж¬
дении ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 295 нм (без
поправок). При повышении кислотности (путем добавления
соляной кислоты) интенсивность флуоресценции при 330 нм
276

падает и одновременно появляется новый максимум ее при
550 нм (без поправок).
Наиболее широко распространенный способ определения
содержания серотонина в тканях состоит в экстракции его н-
бутанолом из насыщенных солью подщелоченных тканевых
гомогенатов: при добавлении к н-бутанолу гептана и подкисле-
нии среды серотонин снова переводится в водную фазу. После
этого проводят флуорометрический анализ подкисленного рас¬
твора серотонина с учетом флуоресценции соответствующего
стандарта и реактивов. Следует отметить, что классический
флуоресцентный метод (Бодански и сотрудники, 1958; Вейсбах,
Воолкес, Юденфренд, 1958; Юденфренд, 1963) труднодоступен
(требует интерференционного светофильтра на 296 нм и квар¬
цевой оптики) -и может дать ошибочные результаты при нали¬
чии в среде 5-метокситриптамина и N-метильных производных.
В 1965 г. Снидер и соавторы разработали новый метод опреде¬
ления серотонина, основанный на переводе его во флуорофор
путем конденсации 5-окситриптамина с нингидрином и прове¬
дением последующей флюориметрии при длинах волн: возбуж¬
дения — 380 нм и флюоресценции — 490—500 нм. Преимущест¬
вом этого метода являются его большая доступность, более вы¬
сокая специфичность: различные производные триптамина
(такие как 5-метокси-, 4- и 6-окси, N-замещенные), мелатонин,
а также 5-гидрокситриптофан, 5-гидроксииндолуксусная кисло¬
та и многие другие вещества не определяются этим методом.
Последний был значительно усовершенствован В. И. Кулинским
и Л. С. Костюковской.
И все же, на наш взляд, наиболее приемлемым для исполь¬
зования в клинико-диагностических лабораториях является вы¬
сокоспецифичный метод, основывающийся на способности
о-фталевого альдегида образовывать флюоресцирующие ком¬
плексы с 3,5-замещенными индолами. Чувствительность этой
реакции значительно повышается в присутствии Л-цистеина.
Этот сравнительно нетрудоемкий метод требует для проведения
исследования (при использовании стандартного флюориметра)
не более 2 ч. Приводим его описание (Е. Б. Лобода, Ю. А. Ма¬
каров, 1974) в нашей модификации.
Определение серотонина в крови
флюориметрическим методом с орто-фталевым
альдегидом
Реактивы. 1. 20% раствор трихлоруксусной кислоты.
2. н-Бутанол, промытый 1 н. щелочью NaOH, 1 н. соляной
кислотой, 3 раза дистиллированной водой и перегнанный.
3. н-Гептан, промытый 1 н. щелочью NaOH, 1 н. соляной кис¬
лотой, 3 раза дистиллированной водой и перегнанный.
4. 0,1% раствор цистеина в 0,1 н. НС1.
277

5. 0,004% раствор о-фталевого альдегида в концентриро¬
ванной НС1.
Вначале готовят основной, маточный, 0,4% раствор: 40 мг
о-фталевого альдегида растворяют в 10 мл концентрирован¬
ной НС1. Раствор хранят в замороженном состоянии.
Из основного (0,4%) раствора готовят рабочий (0,004%)
разбавлением первого в 100 раз: 0,1 мл 0,4%) раствора доводят
концентрированной НС1 до 10 мл, получая тем самым 0,004%
раствор о-фталевого альдегида.
6. Стандартный раствор серотонина.
Приготовление стандартного раствора серотонина-креати-
нин-сульфата. Основной раствор готовят в концентрации
60 мкг/мл, или 6000 мкг в 100 мл. Следовательно, для его по¬
лучения необходимо 6 мг серотонин-креатинин-сульфата
растворить в 100 мл бидистиллированной воды. Основ¬
ной раствор серотонина хранят в замороженном состоя¬
нии.
Из основного готовят рабочий раствор разбавлением перво¬
го в 100 раз: к 0,1 мл основного раствора добавляют 9,9 мл
воды. Этот рабочий раствор содержит 0,6 мкг/мл серотонина
креатинин-сульфата, или 0,26 мкг/мл серотонина-основания
(1 мг основания серотонина соответствует 2,3 мг серотонина-
креатинин-сульфата). Следовательно, в 1 мл содержится
0,26 мкг серотонина-основания, в 0,1 мл — 0,026 мкг основания
серотонина.
Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.
Ход определения. К 1 мл плазмы (или цельной крови) до¬
бавляют 1 мл трихлоруксусной кислоты, пробу центрифугиру¬
ют. Надосадочную жидкость переносят в пробирку с притертой
пробкой, содержащую 2,5 мл н-бутанола, смесь энергично встря¬
хивают (в руках или шуттель-аппарате) в течение 5 мин, затем
центрифугируют (5 мин при 3000 об/мин). н-Бутанол отсасы¬
вают и переносят в пробирку, содержащую 3 мл бидистилли¬
рованной воды, 0,1 мл рабочего раствора цистеина и 5 мл н-геп-
тана. Пробирку энергично встряхивают 5 мин и центрифуги¬
руют в течение 5 мин при 3000 об/мин.
Водную фазу переносят в обычную пробирку с 1,8 мл рас¬
твора о-фталевого альдегида, которую прогревают в течение
15 мин в кипящей водяной бане. После охлаждения измеряют
флуоресценцию при длинах волн 360 и 480 нм. В случае, если
после охлаждения опытные пробы становятся мутными, их сле¬
дует перенести в полиэтиленовые пробирки и отцентрифугиро-
вать.
Контрольную пробу ставят путем добавления к смеси, со¬
стоящей из 3 мл воды и 0,1 мл раствора цистеина, 1,8 мл о-фта¬
левого альдегида с последующим ее прогреванием и охлажде¬
нием.
Стандартную пробу готовят путем добавления к смеси, со¬
стоящей из 3 мл воды и 0,1 мл раствора цистеина, 0,1 мл ра¬
278

бочего раствора серотонина, 1,8 мл о-фталевого альдегида с
последующим прогреванием и охлаждением.
Расчет производят по формуле:
ХМКГ/МЛ= (Фоп • 0,026)/Фст,
где X — концентрация серотонин-основания в пробе, мкг/мл;
Фоп — показания флюориметра для опытной пробы;
Фет — показания флюориметра для стандартной пробы.
Норма см. с. 290. В литературе широко обсуждается вопрос
о преимуществах определения серотонина в тех или иных ком¬
понентах крови. Большинство авторов сходится на том, что
лучше исследовать не цельную кровь или сыворотку, а плазму,
так как в присутствии эритроцитов происходит потеря боль¬
шого количества серотонина. Для сохранения последнего очень
важно брать кровь в полиэтиленовые пробирки, не применяя
при этом способ освобождения серотонина из тромбоцитов пу¬
тем замораживания и оттаивания плазмы. Взятие крови в поли¬
этиленовые пробирки не приводит к массивному разрушению
тромбоцитов и эритроцитов, что позволяет определить содер¬
жание свободного серотонина в плазме.
Определение
5-гидроксииндолуксусной кислоты в моче
Главным конечным метаболитом серотонина является 5-ок-
сииндолуксусная кислота (5-ОИУК).
Схематично образование этого катаболита можно предста¬
вить следующим образом:
моноаминоксидаза
5-гидрокситриптамин * 5-гидроксиинделаце-
альдегиддегидрогеназа
тальдегид -> 5-гидроксииндолуксусная кис¬
лота.
Методы изучения экскреции с мочой 5-ОИУК значительно
проще методов определения концентрации серотонина в крови.
Вместе с тем они являются достаточно адекватными для оцен¬
ки продукции серотонина в организме.
I. Флюориметрические методы основываются на: 1) реакции
образования флуорофоров в слабокислой или нейтральной сре¬
де. При ней максимум спектра флуоресценции 5-0„ИУК прихо¬
дится на длину волны 330 нм при возбуждении свечения уль¬
трафиолетовыми лучами с длиной волны 295 нм;
2) реакции образования флуорофоров в сильно кислой сре¬
де. При этом максимум флуоресценции при возбуждении уль¬
трафиолетовым светом сдвигается в видимую область спектра
(550 нм);
3) реакции с орто-фталевым альдегидом.
279

II. Колориметрические методы основаны на способности ин¬
долов давать окраску с различными соединениями: ксантгидро-
лом, диазотированной сульфаниловой кислотой, нафтохиноном,
ванилином, а-нитрозо-Р-нафтолом (Юденфренд, 1955; Сьёерд-
сма и другие, 1955; Пирс, 1956; Мак-Фарлан, 1956). Из всех
перечисленных реакций наиболее широко используется свойство
индолов реагировать с а-нитрозо-Р-нафтолом. 5-ОИУК при вза¬
имодействии с ним в определенных условиях образует окрашен¬
ное соединение (сиренево-розового цвета), имеющее характер¬
ный спектр абсорбции с максимумом поглощения при 530—
540 нм. На этом принципе основан предложенный Сьёердсма
в 1955 г. полуколичественный метод определения 5-ОИУК в
моче.
В 1955 г. Юденфренд и соавторы предложили колориметри¬
ческий метод определения 5-ОИУК,. состоящий в первоначаль¬
ной обработке мочи 2,4-динитрофенилгидразином (для удале¬
ния кетокислот), последующей экстракции в хлороформ индол-
уксусной и других мешающих определению 5-ОИУК продук¬
тов, насыщении мочи хлористым натрием (для увеличения ко¬
эффициента распределения 5-ОИУК между водой и диэтиловым
эфиром), экстракции 5-ОИУК эфиром с последующим возвра¬
щением ее в фосфатный буфер (pH 7,0) и проведением реакции
с а-нитрозо-Р-нафтолом (в присутствии азотистой кислоты).
Образующиеся при этом продукты (сиренево-розового цвета)
выявляются лишь после добавления уксусноэтилового эфира.
Интенсивность полученной окраски измеряют на спектрофото¬
метре или ФЭКе при длине волны 530—540 нм.
В 1958 г. Пирс предложил модификацию метода Мак-Фар-
лана и др. (1956), заключающуюся в том, что 5-ОИУК экстра¬
гировали из 5 мл подкисленной и насыщенной сухим NaCl мочи
25 мл эфира; 20 мл эфирного слоя отсасывали и выпаривали
досуха; сухой экстракт растворяли в 4 мл воды и с ним про¬
водили «цветную» реакцию с а-нитрозо-р-нафтолом. Процент
выхода стандарта 5-ОИУК в методе Пирса составлял 80—85%.
В. С. Камышников изменил этот метод, повысив его специ¬
фичность. Автор уменьшил количество исследуемой мочи
(1,5 мл вместо 5 мл) и доказал, что этилацетат лучше экстра¬
гирует 5-ОИУК, чем диэтиловый эфир. Этилацетатный экстракт
выпаривали досуха, затем растворяли в абсолютном этаноле,
что облегчало перевод 5-ОИУК в водную фазу; объем экстрак¬
та доводили водой до 3 мл, и с водной фазой проводили реак¬
цию с а-нитрозо-Р-нафтолом в присутствии нитрозо-кислотного
реактива. В результате процент выхода стандарта повысился
до 93,4%, а расхождение параллельных проб не превышало
1,8%. В дальнейшем В. С. Камышников предложил проводить
дополнительную очистку водного экстракта хлороформом.
По данным автора, при очистке водного экстракта хлоро¬
формом процент выхода стандарта не намного, но все-таки не¬
сколько снижается, составляя в среднем 86,46%. Этап очистки
2S0

экстракта хлороформом может быть применен в случае обсле¬
дования больных с заболеваниями, при которых наблюдается
нарушение обмена аминокислот: триптофана, тирозина, фенил¬
аланина и др., что, вполне понятно, может отразиться на ре¬
зультатах исследования 5-ОИУК в моче. Сравнивая два вари¬
анта метода (с очисткой и без очистки экстракта хлороформом),
В. С. Камышников показал, что они оба выявляют одинаковую
направленность изменений экскреции 5-ОИУК с мочой. Это поз¬
воляет отдать предпочтение первому, более простому методу
определения 5-ОИУК, требующему к тому же в 2—3 раза мень¬
шего расхода реактивов, чем метод Юденфренда и других
(1955). Однако для количественного определения 5-ОИУК, по
методу В. С. Камышникова, больше подходит спектрофотометр
(или микроэлектрофотоколориметр), что несколько затрудняет
его использование в практике работы обычной клинико-диагно¬
стической лаборатории.
III. Хроматографические методы заключаются в том, что
эфирный или этилацетатный экстракт 5-ОИУК наносят в виде
пятна на полосу бумаги или на пластинку с носителем — цел¬
люлозой, силикагелем (тонкослойная хроматография). После
проведения одно- или двунаправленной хроматографии в соль-
вентных системах хроматограммы высушивают, а затем прояв¬
ляют. Участок, соответствующий 5-ОИУК, либо вырезают (при
бумажной), либо соскабливают (при тонкослойной хромато¬
графии) для проведения последующей элюции. В элюате коло¬
риметрически определяют 5-ОИУК.
IV. Электрофоретические методы, как и хроматографиче¬
ские, дают возможность не только определять 5-гидроксииндол-
уксусную кислоту, но и выявлять метаболиты катехоламинов
(в частности, ванилил-миндальную кислоту).
К сожалению, они остаются все еще труднодоступными для
широкого практического применения.
Из приведенного обзора видно, что в настоящее время наи¬
более пригодными для определения 5-гидроксииндолуксусной
кислоты являются колориметрические методы Юденфренда с
соавторами (1955) и В. С. Камышникова (1968). Эти методы
просты, позволяют в течение небольшого промежутка времени
выполнить большое количество анализов, обладают высокой
специфичностью и чувствительностью. Они утверждены в ка¬
честве унифицированных.
Перед сбором мочи необходимо исключить из пищи (по
меньшей мере за 3 дня до исследования) продукты, содержа¬
щие большое количество серотонина, а именно: грецкие орехи,
бананы, томаты, ананасы, смородину, сливы, крыжовник, теля¬
тину, печенку, сыр и продукты, содержащие сою.
В качестве консерванта используют 10 мл 5 н. НС1 (на
1000—2000 мл мочи), а также смесь, состоящую из 3 мл толу¬
ола и 25 мл ледяной уксусной кислоты, либо 10% серную кис¬
лоту. добавляемую к моче в соотношении 1 : 10.
10 Зак. 2615
281

Моча с консервантом, подкисленная до pH 1—2, может хра¬
ниться до исследования в холодильнике в течение нескольких
дней.
Определение
5-гидроксииндолуксусной кислоты в моче
по реакции с а-нитрозо-р-нафтолом
(Юденфренд, Титус, Вайссбах, 1955)
Принцип. Метод основан на реакции связывания нитрозо-
нафтола с веществами группы индола, что сопровождается раз¬
витием окраски, интенсивность которой пропорциональна со¬
держанию 5-ОИУК в моче.
Реактивы. 1. Хлороформ, х. ч., перегнанный.
2. Этиловый эфир, х. ч., промытый 1 раз 0,1% раствором
сернокислого железа для удаления перекисей и 2 раза дистил¬
лированной водой.
3. Уксусноэтиловый эфир, х. ч.
4. 0,5 н. фосфатный буфер, pH 7. Хранят в холодильнике.
5. 0,1% раствор а-нитрозо-Р-нафтола в обезвоженном и ото¬
гнанном 2 раза этиловом спирте. Раствор хранят в холодиль¬
нике.
6. Этиловый спирт, обезвоженный расплавленным едким
кали, добавленным из расчета 5 г КОН на 500 мл этанола.
Смесь оставляют на 10—14 дней, после чего спирт дважды от¬
гоняют.
7. 0,5% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2 н. соляной
кислоте.
8. 2 н. серная кислота (готовят из фиксанала).
9. 2,5% раствор азотистокислого натрия (NaN02). Хранят в
холодильнике.
10. Нитрозо-реактив. Готовят непосредственно перед упот¬
реблением. К 5 мл 2 н. серной кислоты прибавляют 2 мл 2,5%
раствора азотистокислого натрия.
11. NaCl, х. ч.
12. Стандартный раствор 5-ОИУК.
Готовят основной раствор 5-ОИУК в концентрации 100 мкг/мл.
10 мг взвешенной на аналитических весах (в бюксе или
часовом стекле) кристаллической 5-ОИУК растворяют в не¬
большом объеме дистиллированной воды, переносят в мерную
колбу на 100 мл и доводят объем дистиллированной водой до
100 мл. Раствор хранят в холодильнике.
Ход определения. 6 мл мочи помещают в делительную (на
50—100 мл) воронку, приливают 6 мл 0,5% раствора 2,4-дини¬
трофенилгидразина, содержимое воронки слегка встряхивают
и оставляют на 30 мин. Затем прибавляют 20 мл хлороформа
и смесь встряхивают 5 мин, отстаивают в течение 2—5 мин,
центрифугируют, хлороформ сливают через кран делительной
282

воронки, добавляют чистый хлороформ, и эту процедуру по¬
вторяют вновь.
10 мл водной фазы переносят в делительную воронку, до¬
бавляют 4 г хлористого натрия и 25 мл этилового эфира, встря¬
хивают 15 мин и центрифугируют. 20 мл эфирного экстракта
переносят в другую пробирку, в которую приливают 2,5 мл
фосфатного буфера с pH 7.
2 мл водной фазы отсасывают со дна пробирки, переносят
в чистую пробирку со шлифом на 15—20 мл, прибавляют 1 мл
0,1% раствора а-нитрозо-Р-нафтола, встряхивают, затем добав¬
ляют 1 мл нитрозо-реактива (свежеприготовленного!), хорошо
встряхивают и помещают в водяную баню с температурой
+ 37° С на 10 мин.
К каждой пробе добавляют 5 мл этилацетата, встряхивают,
слой этилацетата удаляют отсасыванием и вновь повторяют
процедуру. После отстаивания водную фазу осторожно пере¬
носят с помощью пастеровской пипетки в кювету шириной
10 мм. Раствор колориметрируют против контроля при длине
волны 540 нм (зеленый светофильтр).
Контроль. 6 мл дистиллированной воды обрабатывают, как
опыт.
Расчет ведут по калибровочному графику.
Построение калибровочной кривой. Из основного стандарт¬
ного раствора готовят ряд разведений с концентрацией: 10, 25,
50, 75 и 100 мкг/мл. Стандартные растворы обрабатывают так
же, как и опытные.
Вычисление экскреции 5-ОИУК в суточной моче (в мг/сутки)
производят по формуле:
(с • а)/(б • 1000),
где с — содержание 5-ОИУК в мкг в пробе;
а — суточное количество мочи, мл;
б — количество мочи, взятое в пробу, мл;
1000— коэффициент пересчета на мг.
Величину экскреции 5-ОИУК с порционной мочой (в
мкг/час) определяют по формуле:
(с • а’)/(б • f),
где а’ — количество порционной мочи, мл;
t — время сбора мочи, ч;
остальные обозначения те же.
В норме у взрослых людей суточная экскреция 5-ОИУК со¬
ставляет в среднем 4,9±0,28 мг/сутки. Величина почасовой
экскреции колеблется в течение суток в пределах 165—
330 мкг/ч.
Примечания. 1. Необходимо тщательно доводить pH
фосфатного буфера до 7, так как при несоблюдении этого усло¬
вия обмечаются большие потери 5-ОИУК.
2. Прямо пропорциональная зависимость между содержа¬
нием 5-ОИУК в моче и оптической плотностью сохраняется в
ю*
283

пределах концентрации до 100 мкг/мл. При более высоких зна¬
чениях мочу следует развести дистиллированной водой, а ре¬
зультат — умножить на разведение.
Определение
5-гидроксииндолуксусной кислоты в моче
по реакции с а-нитрозо-|3-нафтолом
(В. С. Камышников, 1968)
Принцип. 5-ОИУК экстрагируют этилацетатом из подкис¬
ленной до pH 1 и насыщенной NaCl мочи, экстракт выпарива¬
ют досуха, остаток растворяют сначала в этаноле, способствую¬
щему лучшему переходу 5-ОИУК в водную среду, затем в воде
и в водной фазе проводят «цветную» реакцию с нитрозо-наф-
тольным реактивом. Избыток а-нитрозо-Р-нафтола и другие про¬
дукты удаляют экстракцией этилацетатом, после чего измеря¬
ют оптическую плотность хромофоров, прямо пропорциональ¬
ную содержанию 5-ОИУК в моче.
Реактивы. 1. 1 н. раствор H2S04.
2. Насыщенный раствор х. ч. NaCl.
3. Хлороформ, х. ч., 1 раз перегнанный.
4. Уксусноэтиловый эфир, х. ч.
5. 0,1% раствор а-нитрозо-Р-нафтола в обезвоженном и ото¬
гнанном 2 раза этиловом спирте. Раствор хранят на холоду.
6. Этиловый спирт, обезвоженный едким кали (как в пре¬
дыдущем методе, см. с. 282).
7. 2,5% раствор азотистокислого натрия (NaN02). Хранят в
холодильнике.
8. Нитрозо-кислотный реактив. Готовят перед употреблени¬
ем смешиванием 0,2 мл 2,5% раствора азотистокислого натрия
и 5 мл 1 н. серной кислоты.
9. Стандартный раствор 5-ОИУК (основной, 10 мг%). 5 мг
кристаллической 5-ОИУК растворяют в небольшом объеме
дистиллированной воды, переносят в мерную колбу на 50 мл
и доводят объем дистиллированной водой до 50 мл. В 1 мл это¬
го раствора содержится 100 мкг 5-ОИУК (100 мкг/мл). Хранят
в холодильнике.
Ход определения. В пробирку с притертой пробкой вносят
1 мл подкисленной до pH 1 мочи, 1 мл насыщенного раствора
NaCl и после перемешивания производят экстракцию 5-ОИУК
уксусноэтиловым эфиром. Последнюю проводят дважды путем
добавления к водной фазе этилацетата порциями по 4 мл с по¬
следующим встряхиванием в течение 1 мин. После каждой экс¬
тракции верхний прозрачный этилацетатный слой переносят в
широкую пробирку, в которой затем производят выпаривание
объединенного экстракта. Пробирку закрывают пробкой с дву¬
мя (короткой и длинной) стеклянными трубками, помещают
в водяную баню, нагретую до +47° С, и через пробирку проду¬
284

вают ток воздуха (выпаривание экстракта можно производить
и любым другим способом). Сухой остаток растворяют в 0,1 мл
абсолютного этанола, тщательно смывая при этом стенки про¬
бирки. Затем к этанольному экстракту добавляют 2,9 мл ди¬
стиллированной воды, 0,3 мл раствора а-нитрозо-|3-нафтола и
0,3 мл нитрозо-кислотного реактива. После перемешивания про¬
бы прогревают на водяной бане при температуре +47° С в те¬
чение 7 мин. К еще горячему раствору (сразу же после извле¬
чения пробирки из водяной бани) приливают 3 мл этилацетата.
Содержимое пробирок тщательно взбалтывают. После разделе¬
ния фаз нижний слой, имеющий сиренево-розовую окраску, от¬
сасывают и измеряют экстинкцию на спектрофотометре (или
микрофотоколориметре).
Спектрофотометрию проводят в кюветах с толщиной слоя
10 мм при длине волны 525 нм. Под кюветы подкладывают
пластинку из плексигласа толщиной 3 мм для уверенной реги¬
страции экстинкции малых объемов растворов. При спектро-
фотометрии «О» прибора устанавливают по контролю. При
микрофотоколориметрии (на приборе типа МКМФ-1) исполь¬
зуют кюветы-пробирки диаметром 15 мм.
Приготовление контрольных проб. К серии опытных проб
готовят контроль на воду и на реактивы. Для этого 1 мл воды
пропускают через все этапы метода так же, как это описано
для мочи.
Расчет ведут по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. К 1 мл основного стан¬
дартного раствора (содержащего 100 мкг 5-ОИУК в 1 мл) при¬
ливают 9 мл дистиллированной воды. В 1 мл полученного раз¬
ведения находится 10 мкг 5-ОИУК. В пробирки для экстрак¬
ции вносят 2 мл воды и последовательно добавляют 0,2; 0,4;
0,6; 0,8; 1 и 1 мл рабочего стандартного раствора, что соответ¬
ствует внесению в пробы, 2, 4, 6, 8 и 10 мкг 5-ОИУК. Общий
объем всех проб (за исключением последней) доводят до 3 мл,
после чего в этих же пробирках определяется 5-ОИУК путем
добавления нитрозо-нафтольного и нитрозокислотного реакти¬
вов, последующего прогревания и колориметрирования (см. хсд
определения).
Суточную экскрецию 5-ОИУК вычисляют по формуле:
(С • а)/1000 = экскреция 5-ОИУК, мг/сутки,
где С — найденное по калибровочному графику содержание
5-ОИУК в пробе, мкг;
а — суточное количество мочи, мл;
1000 — коэффициент пересчета, мг.
Для определения содержания 5-ОИУК в порционной моче
расчет производят по формуле: (С • а’)Д = выделение 5-ОИУК,
мкг/ч,
где а’ — количество порционной мочи, мл;
t — время сбора мочи, ч;
остальные обозначения те же.
285

Методическое замечание. В случае применения варианта
метода с очисткой хлороформом (для этого варианта в перечнё
реактивов указан хлороформ) к 3 мл водного раствора, содер¬
жащего экстракт из 1 мл мочи, приливают 2 мл хлороформа.
Смесь энергично встряхивают в течение 1 мин. Содержимое
переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при
3000 об/мин в течение 15 мин. Водную фазу отбирают в другую
пробирку, в которой проводят реакцию с а-нитрозо-р-нафтоль-
ным и нитрозо-кислотным реактивами.
Расхождение параллельных проб при исключении этапа
очистки хлороформом варьирует от 0,33% до 7,67%, составляя
в среднем 4,73%.
Клинико-диагностическое значение исследования обмена се¬
ротонина. В настоящее время не представляет сомнения, что
серотонин имеет очень тесное отношение к регуляции функции
гемостатического гомеостаза. Последний определяется состоя¬
нием проницаемости, резистентности сосудов, активностью
свертывающей и противосвертывающей системы крови и, на¬
конец, функцией гемопоэза, на которые этот биогенный амин
способен оказывать влияние. А. А. Багдасаров и другие по¬
казали, что восстановление гемостаза от переливания тромбо-
цитарной массы наблюдается лишь при нормализации уровня
серотонина в крови. Г. А. Чернов и Л. Д. Орлова считают, что
при заболеваниях системы крови между степенью выраженно¬
сти геморрагического синдрома и серотонинемией имеются кор¬
релятивные отношения. Так, при болезни Верльгофа в момент
обильных кровотечений серотонин почти полностью исчезает из
крови. Нами установлено уменьшение содержания 5-окситрип-
тамина в крови и 5-ОИУК в суточном количестве мочи у боль¬
ных острым лейкозом, хроническим миело- и лимфолейкозом
в период разгара заболевания и в терминальной стадии, что
говорит о глубоком нарушении обмена серотонина при указан¬
ных формах патологии. Улучшение клинического состояния
больных сопровождается тенденцией к нормализации метабо¬
лизма серотонина. Об этом же свидетельствуют и данные дру¬
гих авторов.
Значительное возрастание концентрации серотонина в крови
отмечается при карциноидном синдроме. Исследованиями
В. В. Меньшикова, Л. С. Бассалык и Г. А. Шапиро показано,
что при типичном карциноидном синдроме содержание серото¬
нина в крови возрастало более чем в 100 раз, достигая циф¬
ры 5,2 мкг/мл. Характерно, что во время прилива концентрация
серотонина в крови повышалась, после прилива снижалась до
исходного уровня.
Понижение уровня серотонина в крови характерно также
для паренхиматозных заболеваний печени и для воспалитель¬
ных процессов в желчном пузыре. Есть основание предпола¬
гать, что понижение концентрации серотонина в крови при ге¬
патитах связано с дефицитом витамина Вб и со снижением ак-
286

ТАБЛИЦА 46
Содержание 5-ОИУК в суточной моче
Авторы
Экскреция 5-ОИУК,
мг/сутки
Юденфренд и др. (1955)
2—8
Л. С. Бассалык (1965)
4,9 ±0,28
В. С. Камышников (1968)
5,0 ±0,65
тивности фермента окситриптофандекарбоксилазы, необходимо¬
го для синтеза 5-гидрокситриптамина.
Выделение 5-ОИУК с мочой у здоровых людей, по данным
разных авторов, представлено в таблице 46.
Достоверных различий в экскреции 5-ОИУК у мужчин и
женщин не выявлено.
По данным Л. С. Бассалык (1965), у детей в возрасте от 1
до 15 лет экскреция 5-ОИУК достоверно ниже (в среднем
3,4±0,07 мг в сутки, с пределами колебаний от 2 до 6 мг/сутки),
чем у взрослых людей (4,9±0,28 мг/сутки; пределы колебаний
варьируют от 2 до 10 мг/сутки). Эмерих и Шаф (1968) отмети¬
ли снижение в 2 разй выделения 5-ОИУК у лиц в возрасте от
50 до 99 лет. Так, по данным этих авторов, у людей в возрасте
от 1 до 45 лет экскреция 5-ОИУК в среднем составляла
5,11 мг/сутки, в то время как у людей в возрасте 50—59 лет —
3 мг/сутки. В период менструации экскреция с мочой 5-ОИУК
возрастает в 2—3 раза.
Таким образом, при оценке величин экскреции 5-ОИУК не¬
обходимо учитывать возраст обследуемого. Если исследуется
выделение 5-ОИУК с порционной мочой, нужно учитывать су¬
точный ритм экскреции этого метаболита. В дневные часы (осо¬
бенно утром) его экскреция выше, чем вечером и ночью. У бе¬
ременных в III триместре также наблюдается увеличение экс¬
креции 5-ОИУК с мочой.
Как уже указывалось, определение содержания 5-ОИУК в
моче является важным тестом в диагностике карциноидного
синдрома. Карциноид — гормонально активная опухоль, разви¬
вающаяся из энтерохромаффинной ткани и секретирующая в
больших количествах серотонин. Чаще всего встречаются кар-
циноцды тонкого кишечника, бронхов, яичников. Небольшая по
размерам опухоль может давать обширные метастазы, обычно
в печень. Для клинической картины гормонально активного
карциноида характерны кризы, сопровождающиеся приливами
с появлением на лице и туловище «фляшей» — ггятен с синюш¬
287

ным оттенком, бронхоспазмы, диарея, пеллагроподобный дер¬
матоз, поражение клапанов сердца (главным образом, право¬
го) .
Значение определения 5-ОИУК в моче для диагностики, про¬
гноза и наблюдения за течением этого заболевания чрезвычай¬
но велико. Кирбергер (1966) считает, что величины экскреции
5-ОИУК с мочой от 10 до 25 мг/сутки подозрительны, а свыше
25 мг/сутки — доказательны. Известны случаи, когда выделе¬
ние 5-ОИУК с мочой достигало 1000 и более мг/сутки. В 1966 г.
Л. С. Бассалык с соавторами описан случай злокачественного
течения карциноидной опухоли с азотемией. При этом выде¬
ление 5-ОИУК составило 400 мкг/мл мочи вместо 4 мкг/мл
в норме.
Гиперпродукция серотонина при карциноиде служит пред¬
посылкой повышенного выделения 5-ОИУК. Следует помнить
лишь, что величина экскреции 5-ОИУК еще не свидетельствует
о размерах опухоли, наличии и степени метастазирования: опи¬
саны случаи маленьких, локализованных овариальных карци-
ноидов с большим количеством метастазов, но с небольшим по¬
вышением экскреции 5-ОИУК. Вместе с тем даже небольшое
увеличение выделения 5-ОИУК с мочой может быть ранним
симптомом этого тяжелого заболевания. В тех случаях, когда
серотонин сразу поступает в большой круг кровообращения,
увеличенная экскреция 5-ОИУК часто является первым сим¬
птомом, предшествующим клиническому проявлению карцино-
идного синдрома.
При карциноиде кишечника серотонин сначала проходит че¬
рез печень, где он инактивируется. При метастазах злокачест¬
венного карциноида в печень в моче находят огромное количе¬
ство 5-ОИУК, что служит поздним, прогностически неблагопри¬
ятным симптомом.
Нормальная экскреция 5-ОИУК еще не исключает карцино-
идный синдром. Продукция серотонина опухолью и выброс
5-ОИУК в мочу могут значительно колебаться. Поэтому, при
клиническом исследовании определение 5-ОИУК в моче должно
выполняться многократно. Оно является диагностическим те¬
стом и при наблюдении за больным после удаления опухоли.
Высокая концентрация 5-ОИУК в моче после операции свиде¬
тельствует о неполном удалении опухоли или о ее метастазах.
Нормализация экскреции 5-ОИУК также не является доказа¬
тельством полного удаления опухоли или отсутствия метаста¬
зов. К определенному заключению можно прийти лишь на ос¬
новании регулярного исследования содержания 5-ОИУК в
моче.
Увеличение выделения 5-ОИУК с мочой наблюдается и при
другой гормонально активной опухоли — феохромоцитоме
(Л. С. Бассалык, 1965). По данным автора, выделение 5-ОИУК
при ней колеблется от 5,7 до 24,4 мг/сутки (в среднем состав¬
ляя 11,3±1,2 мг/сутки). Резкое повышение экскреции 5-ОИУК
288

наблюдается при кризах феохромоцитомы (1132 мкг/ч в момент
криза).
Увеличение выделения 5-ОИУК отмечается у некоторых
больных инфарктом миокарда в первые сутки после его воз¬
никновения: указывается на высокие показатели выделения
5-ОИУК у больных с острой коронарной недостаточностью, осо¬
бенно в первые 4 ч после развития инфаркта. Это, очевидно,
можно связать с освобождением из тромбоцитов (при образо¬
вании тромба) большого количества серотонина, что, естест¬
венно, сказывается на увеличении выделения 5-ОИУК. У боль¬
ных гипертонической болезнью, нелеченых резерпином, выде¬
ление кислоты оставалось в пределах нормы, хотя некоторые
авторы отмечали небольшое повышение ее экскреции в первой
стадии гипертонической болезни, а также в периоды гиперто¬
нических кризов. При атеросклерозе и выраженной стенокар¬
дии отмечено малое увеличение экскреции 5-ОИУК. Это дает
основание предполагать, что серотонин не участвует в патоге¬
незе упомянутых заболеваний. Л. С. Бассалык с соавторами не
нашли увеличения выделения 5-ОИУК у группы больных с
гастритами, язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной
кишки. Отмечено увеличение выделения 5-ОИУК в первые часы
после операции на сердце.
Значительное повышение экскреции 5-ОИУК зарегистриро¬
вано у больных со злокачественными опухолями (злокачест¬
венные новообразования предстательной железы, иноперабиль-
ная опухоль прямой кишки, ретикулосаркома) и заболевания¬
ми крови. Как указывают Бойленд и М. О. Раушенбах, это
может быть объяснено тем, что в процессе опухолевого роста
определенную роль, вероятно, играет нарушение обмена трип¬
тофана, из которого синтезируется серотонин.
Клинические наблюдения указывают на повышенное выде¬
ление 5-ОИУК с мочой больных при аллергических состояни¬
ях, осложненных инфекцией, и больных туберкулезом, особенно
при лечении изониазидом. Обнаружено понижение экскреции
5-ОИУК у больных, страдающих ревматоидным артритом. Су¬
щественно нарушается обмен серотонина при злокачественном
пролиферативном росте; при этом значительно возрастает вы¬
деление 5-ОИУК с мочой. Нарушено выделение 5-ОИУК при
почечной форме гипертонической болезни. Значительно повы¬
шена экскреция 5-ОИУК с мочой больных тромбофлебитом,
что, вероятно, связано с высвобождением серотонина в резуль¬
тате образования тромба.
По-видимому, выделение 5-ОИУК увеличивается при пора¬
жении тонкого кишечника, но не отклоняется от нормы при
различных колитах. Отмечено усиление экскреции 5-ОИУК с
мочой шизофреников в период нарастания психотической сим-
патоматики.
Снижение экскреции 5-ОИУК обнаружено при коллагено-
зах.
289

ТАБЛИЦА 47
Содержание серотонина в крови и 5-ОИУК в моче
у здоровых людей и у больных различными заболеваниями
Группа обследованных
Число
слу-
час в
Серотонин,
мкг/мл
5-ОИУК,
мг/сутки
или мкг/ч
Здоровые
£6
0,044 ±0,009
4,9 ±0,28
Больные различными заболевани¬
ями:
феохромоцитома
17
0,13±0,20
11,3 ± 1,2
адренокортикальная опухоль
до операции
4
—
8,9 ±0,8
состояние после удаления адре-
нокортикальной опухоли
4
—
6,6 ±0,8
опухоли системы дыхания
11
0,11 ±0,02
4,5
рак желудка
15
0,05 ± 0,01
4,9
меланосаркома глаза с мета¬
стазами в печень
1
0,12
16,9
рак прямой кишки
2
0,14
15,6
карциноидный синдром
3
1,74; 1,5;
0,31
15,0; 67,0;
167,7
хронический миелолейкоэ
4
—
10,4 ± 1,6
опухоль почки
1
—
8,0
опухоль головного мозга
1
—
5
рак простаты
1
—
16,8
рак грудной железы
2
—
4,2
гипертоническая болезнь II сте¬
пени
62
0,042 ±0,007
5,4 ±0,23
почечная гипертония
6
—
5,4 ±0,6
инфаркт миокарда, 1-й день
14
0,022 ±0,002
395,1 ±58,4*
стенокардия
23
0,083 ±0,012
252,0 ±19,5*
болезнь Иценко—Кушинга (ак¬
тивная фаза)
68
0,100 ±0,006
9,0 ±0,4
* Почасовая экскреция в мкг в ч.
Изменение выделения 5-ОИУК с мочой наблюдается при
заболеваниях печени. Экскреция метаболита возрастает при
гепатитах и значительно снижается в случаях цирроза печени,
особенно при тяжелых его формах.
Исследованием выделения 5-ОИУК. у детей показано, что
при геморрагическом васкулите экскреция кислоты резко воз¬
растает в острой стадии заболевания.
290

У детей с дискинезиями кишечника и наклонностью к ги¬
пермоторике в половине случаев отмечено увеличение экскре¬
ции 5-ОИУК, что, по всей вероятности, может свидетельство¬
вать об участии серотонина в патогенезе указанных наруше¬
ний. Неудивительно поэтому, что при карциноидном синдроме
одним из проявлений увеличения содержания серотонина в кро¬
ви является диаррея.
Изменение обмена серотонина при ряде патологических со¬
стояний приведено в таблице 47.
ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ
ГИСТАМИН — ГИСТАМИНАЗА
Биогенный амин гистамин представляет собой продукт, об¬
разующийся при декарбоксилировании гистидина.
Все известные в настоящее время методы определения ги¬
стамина включают два основных этапа:
1) экстракцию гистамина,
2) количественное его определение.
Осаждение белков обычно производят трихлоруксусной или
хлорной кислотой, что позволяет высвободить из связанного
состояния почти весь гистамин. При добавлении кислоты к кро¬
ви или ткани необходимо тщательное перемешивание для пред¬
отвращения образования грубого преципитата (или даже ком¬
ков); последнее практически исключает возможность полного
реагирования исследуемой ткани с кислотой. Преципитат уда¬
ляют центрифугированием либо фильтрованием. Надосадочную
жидкость можно хранить в течение длительного времени без
потерь, так как низкий pH способствует сохранению гистамина.
Полученные экстракты встряхивают с н-бутанолом в таких
условиях (высокий pH, большая концентрация солей), при ко¬
торых гистамин как свободное основание переходит в бутаноль-
ную фазу. Гистамин удаляют из бутанола путем адсорбции на
ионообменнике и элюируют разведенной соляной кислотой (вод¬
ным или спиртовым раствором).
Примеси легко отделяют экстракцией эфиром из водных
растворов, pH которых доводят до 12. Исследованиями ряда
авторов показано, что более целесообразно использование для
экстракции гистамина смеси, состоящей из н-бутанола и хло¬
роформа, которая значительно лучше экстрагирует гистамин,
чем один бутанол и, к тому же, в меньшей степени экстрагиру¬
ет примеси.
Используемые для выделения гистамина методы бумажной,
газовой, тонкослойной хроматографии, а также способы уль¬
трафильтрации и электродиализа сложны для применения в
клинико-диагностических лабораториях.
В основу биологических методов определения гистамина по¬
ложены следующие тестобъекты: артериальное давление (АД);
291

толстая кишка морской свинки; сосуды почек (гистамин в
очень низких концентрациях вызывает расширение сосудов поч¬
ки, не влияя на общее кровяное давление); развитие бронхо¬
спазма у морских свинок.
Химические методы основаны на взаимодействии определен¬
ных реактивов с функциональными группировками, входящими
в состав молекулы гистамина. Таковыми являются: имидазоль-
ное кольцо, первичный алифатический амин, 1,4-диамино-1-
бутен.
Из колориметрических способов наиболее чувствительными
являются методы определения гистамина по реакции с его пер¬
вичной аминогруппой (2,5-диметокситетрагидрофурановые). Из
них на первом месте стоит метод с применением 4-диметилцин-
намальдегида.
Метод, предложенный С. М. Розенталем и X. Ш. Табором
(1948), основан на колориметрическом измерении количеств
гистамина посредством проведения диазореакции с р-нитроани-
лином. Заслуживает внимания и метод И. А. Крюковой
(1965), в основе которого лежит реакция образования ком¬
плекса голубого цвета при взаимодействии нингидрина с
гистамином. Колориметрические методы обладают рядом не¬
достатков, главным из которых является малая чувствитель¬
ность.
Самыми совершенными справедливо считаются флуоромет-
рические методы определения. Они сочетают в себе чувстви¬
тельность биологического анализа с удобством химического.
Известны две их разновидности.
1. Метод, основанный на реакции первичных аминогрупп
с ацетоацетальдегиддиметилацеталем в присутствии формаль¬
дегида. Флуороген, интенсивность свечения которого измеряет¬
ся при первичной длине волны 405 нм, вторичной — 485 нм,
стабилен в течение 15 мин. Между концентрацией флуорогена
и интенсивностью его свечения существует хорошая линейная
зависимость. Однако этот метод недостаточно специфичен: пер¬
вичные алифатические и ароматические амины, аминокислоты
и пептиды, а также белки связывают флуороген.
2. Второй флуорометрический метод основан на реакции
конденсации гистамина с о-фталевым альдегидом, в результате
которой образуется сильно флуоресцирующее соединение, име¬
ющее максимум спектра возбуждения при 365 нм и максимум
спектра флуоресценции при 450 нм. Эта реакция является чрез¬
вычайно специфичной для незамещенных имидазолэтиламинов.
Принцип флюориметрического анализа был разработан Шором
и др. (1959).
Ортофтальальдегидный метод обладает высокой избира¬
тельностью: гистидин, аргинин, агматин, спермин, спермидин
хоть и образуют флуорогены с орто-фталевым альдегидом, од¬
нако ни один из этих конденсатов не дает столь интенсивной
флуоресценции, как гистамин.
292

С. А. Мещеряковой (1971) была разработана усовершенство¬
ванная модификация флуорометрического метода Шор и дру¬
гих для определения гистамина в крови.
Обоснование выбора метода. Биологические методы явля¬
ются мало пригодными для повседневного определения гиста¬
мина в клинико-диагностической лаборатории: они требуют
большого количества животных и длительной стандартизации
тест-объектов, хотя и до сих пор их с успехом применяют в це¬
лом ряде лабораторий мира.
Из химических методов на первое место следует поставить
флуорометрический ортофтальальдегидный метод, как наибо¬
лее специфичный, чувствительный, быстрый и требующий не¬
большого количества крови. В настоящее время он использу¬
ется в качестве унифицированного.
Определение гистамина в цельной крови
по флуоресценции продуктов, образующихся
при реакции с орто-фталевым альдегидом
(модификация метода С. А. Мещеряковой)
Принцип. Гистамин экстрагируют из крови хлорной кисло¬
той, очищают от примесей путем экстракции смесью бутанола
и хлороформа, переводят в водную фазу, с которой проводят
реакцию конденсации с орто-фтальальдегидным реактивом.
Конденсат стабилизируют фосфорной кислотой и флуоромет-
рируют.
Реактивы. 1. 1,34% водный раствор оксалата натрия (щаве¬
левоуксуснокислого натрия). Хранят в темной бутыле при ком¬
натной температуре. Добавляют из расчета 0,1 мл на 1 мл
крови.
2. Хлорная кислота концентрированная (57% и др.) х. ч.
Из нее готовят 1 н. и 0,4 н. водные растворы. Для получения
1 н. (0,4н.) раствора 11,05 мл (4,59 мл) 57,81 % НСЮ4 вносят в
мерную колбу на 100 мл и доводят водой до метки.
3. н-Бутанол х. ч. (фракция+116,5—118,5°).
4. Хлороформ х. ч., перегнанный два раза, или хлороформ
для наркоза.
5. Бутанол-хлороформная смесь в объемном соотношении
3 : 2 (готовят перед употреблением).
6. Абсолютный метиловый спирт (можно пользоваться
дважды перегнанным метанолом).
7. 5 н. водный раствор едкого натра (его предпочтительнее
хранить в полиэтиленовой посуде).
8. NaCl кристаллический х. ч.
9. 0,1 н. водный раствор едкого натра, насыщенный хлори¬
стым натрием. Хлористый натрий добавляют к 0,1 н. раствору
NaOH так, чтобы образовался избыток твердого NaCl.
293

10. 1 н. раствор едкого натра (он лучше сохраняется в по¬
лиэтиленовой бутыли).
11. 0,1 н. раствор соляной кислоты.
12. 1,4 М водный раствор ортофосфорной кислоты (17,294 мл
85% раствора фосфорной кислоты доводят до 100 мл водой).
13. Орто-фталевый альдегид (с температурой плавления
кристаллов +40—+60° С; продажный препарат рекомендуется
перекристаллизовать из лигроина). Из него приготовляют
0,1% раствор в метаноле. Метанольный раствор стабилен в те¬
чение минимум двух недель, если хранить его в холодильнике
(лучше в морозильной камере) в темной склянке с притертой
пробкой.
14. Стандарт гистамина (основание или дигидрохлорид).
Кристаллический гистамин дигидрохлорид (C5H9N3 • 2 НС1) со¬
держит 60,5% гистаминового основания. Стандарт следует хра¬
нить в сосуде с притертой пробкой в темноте, в эксикаторе, на
дне которого находится поглотитель.
Из кристаллического препарата готовят его основной рас¬
твор (100 мкг/мл) путем растворения 5 мг основания (или
5- 1,63=8,15 мг дигидрохлорида) гистамина в 50 мл 0,4 н. хлор¬
ной кислоты (хранить в замороженном состоянии). Перед упо¬
треблением из основного готовят рабочий раствор 1 (10 мкг/мл)
прибавлением к 1 мл основного раствора гистамина 9 мл 0,4 и.
НСЮ«. Для того чтобы более точно отобрать 0,1; 0,5; 1 мкг ги¬
стамина в стандартные пробы, мы рекомендуем приготовить из
него рабочий раствор II с концентрацией 1 мкг/мл. Он может
быть получен добавлением к 1 мл первого рабочего раствора
9 мл 0,4 н. хлорной кислоты.
15. Трижды дистиллированная вода. Последний раз она дол¬
жна быть перегнана обязательно в стеклянном дистилляторе
над марганцевокислым калием.
Ход определения. В пробирки емкостью 15—30 мл вносят по
4 мл оксалатной крови и такой же объем 1 н. раствора хлорной
кислоты. Тщательно закрыв их стеклянными или полиэтилено¬
выми пробками, смесь перемешивают в течение 10 мин в шут-
тель-аппарате (или энергично встряхивают руками 3 мин),
после чего пробы центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. 4 мл
надосадочной жидкости переносят в такие же пробирки, содер¬
жащие 0,5 мл 5 н. раствора едкого натра, 1,5 г хлористого нат¬
рия и 10 мл смеси бутанол-хлороформ в соотношении 3:2.
Содержимое пробирок энергично встряхивают руками 3 мин
(время отмечают по секундомеру) и центрифугируют при
4000 об/мин в течение 5 мин. Нижнюю водную фазу отсасывают
(лучше с помощью пипетки, соединенной со шприцем) и сли¬
вают. Затем в пробирки вносят по 5 мл 0,1 н. раствора NaOH
с NaCl (для удаления гистидина). Пробирки энергично встря¬
хивают руками в течение 3 мин. Пробы вновь центрифугируют
5 мин при 4000 об/мин. После разделения фаз весь верхний
(органический) слой переносят с помощью системы шприц-
294

пипетка в другие такие же пробирки, в которые приливают по
5 мл 0,1 н. раствора НС1. Их хорошо закрывают пробками и
смесь энергично встряхивают руками в течение 3 мин. Пробы
центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. Верхний водный слой
(раствор соляной кислоты) с помощью системы шприц-пипет-
ка (или другим способом) практически полностью отсасывают
и переносят в обычную пробирку, в которую добавляют 0,5 мл
1 н. NaOH и 0,12 мл раствора орто-фталевого альдегида. Через
4 мин добавляют 0,2 мл Н3РО4. Пробы флуорометрируют, све¬
чение образовавшегося конденсата возбуждают светом с дли¬
ной волны 365 нм, а измеряют при светофильтре с максимумом
пропускания 460 нм. Флуороген стоек 30 мин.
Примечание. Все работы по определению гистамина следует
проводить под тягой.
Контроль. 4 мл 1 н. хлорной кислоты (используемой вместо
крови) пропускают через все этапы метода.
Стандарт. Параллельно опытным и контрольным пробам
обрабатывают рабочий стандартный раствор гистамина, в 4 мл
которого заключается 0,1; 0,5; 1 мкг основания гистамина, что
соответствует содержанию в указанном объеме 0,1; 0,5; 1 мл
рабочего раствора II. Недостающий до 4 мл объем доводят
0,4 н. раствором хлорной кислоты.
Сначала измеряют величину свечения контрольной, затем
1—2 стандартных и опытных проб.
Линейная зависимость между интенсивностью флуоресцен¬
ции и концентрацией гистамина обнаруживается в пределах
от 0,005 до 0,5 мкг гистамина.
Расчет осуществляют по калибровочной кривой, которая
строится по общеизвестным принципам, или по формуле:
содержание гистамина в мкг/мл крови= (Фо • С)/(Фс • 4),
где Фо — разность в показаниях опытной и контрольной проб
(выражаемая числом делений шкалы прибо¬
ра);
Фс — разность показаний стандартной и контрольной проб;
С — содержание гистамина (в мкг) в 4 мл стандартного
раствора;
4 — коэффициент пересчета на содержание гистамина в
1 мл крови.
В норме содержание гистамина в крови здоровых людей,
по данным С. А. Мещеряковой и др., составляет 0,02—
0,08 мкг/мл.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ
ГИСТАМИНАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
В большинстве методов об активности гистаминазы в сы¬
воротке крови судят по убыли субстрата, добавленного в ин¬
кубационную смесь. Количество оставшегося гистамина опре¬
295

деляют чаще всего биологическим, колориметрическим или
флюориметрическим методом.
В 1973 г. А. Г. Класон и А. Б. Райцис опубликовали чув¬
ствительный и специфичный метод определения гистаминазы,
основанный на образовании способного флуоресцировать кон¬
денсата гистамина с орто-фталевым альдегидом. После апро¬
бации этой методики нами были внесены в ход анализа изме¬
нения, которые сделали метод еще более надежным и простым
в исполнении. Приводим его описание.
Реактивы те же, что и в методе определения гистамина в
сыворотке крови (см. с. 293, 294). Кроме того, требуются:
1. 0,2 М фосфатный буфер, pH 7,2.
Для его приготовления смешивают 72 мл 0,2 М раствора
Na2HP04 и 28 мл 0,2 М раствора NaH2P04.
0,2 М раствор двузамещенного фосфата натрия получают
растворением 7,12 г кристаллической соли состава Na2HP04*
■ 2 Н20 в 200 мл воды.
Для приготовления 0,2 М раствора однозамещенного фос¬
фата натрия 6,24 г кристаллогидрата NaH2P04-2H20 растворя¬
ют в 200 мл воды.
При отсутствии солей указанного состава можно сделать
соответствующий пересчет, исходя из соотношения молекуляр¬
ных весов разных кристаллогидратов (или кристаллогидрата
и безводной соли). Следует помнить о том, что кристаллогид¬
раты, содержащие 12 молекул воды, легко выветриваются на
воздухе, превращаясь в кристаллогидраты состава Na2HP04 •
• 2 Н20, поэтому для исключения ошибок при приготовлении
буферного раствора их обычно частично обезвоживают путем
выдерживания тонко растертого порошка кристаллической соли
в течение 2-х суток на воздухе.
2. 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ).
3. Основной раствор гистамина: 100 мкг/мл (16,5 мг дихло¬
рида гистамина или 10 мг основания растворяют в 100 мл
воды).
Перед инкубацией готовят рабочий раствор гистамина, для
чего к 0,5 мл основного его раствора прибавляют (в пробирке)
2 мл дистиллированной воды. Из полученного (2,5 мл) объема
(достаточного для постановки 3 опытных и 1—2 контрольных
проб) отбирают по 0,5 мл рабочего раствора гистамина в опыт¬
ные пробы; оставшийся в пробирке раствор (0,5—1,0 мл) по¬
мещают в морозильник холодильника и после завершения сро¬
ка инкубации (см. ход определения) его извлекают из холо¬
дильника и оттаивают. 0,5 мл раствора (10 мкг основания ги¬
стамина) вносят в контрольную пробу.
Лабораторное оборудование то же, что и в методе опреде¬
ления гистамина. Кроме того, для проведения инкубации ис¬
пользуют плоскодонные конические колбочки на 15—30 мл, за¬
крывающиеся пробками с пропущенными через них двумя стек¬
лянными трубками (одной короткой, другой — более длинной).
296

Такое устройство позволяет продувать через колбочки кисло¬
род. Для инкубации лучше всего применять сосудики от аппа¬
рата Варбурга.
Ход определения. В колбы для инкубации вносят по 2,9 мл
фосфатного буфера и 0,5 мл (1,0 мл) исследуемой сыворотки.
В опытные пробы добавляют по 0,5 мл (10 мкг) рабочего рас¬
твора гистамина. Содержимое колбочек продувают кислородом
и помещают на сутки в термостат при +37°С (оставшийся в
пробирке рабочий раствор гистамина замораживают в холо¬
дильнике). После инкубации во все колбочки добавляют по
5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а в контрольную про¬
бу вносят 0,5 мл размороженного раствора гистамина (10 мкг).
Через 5 мин содержимое колбочек переносят в центрифужные
пробирки и центрифугируют в течение 15 мин при 4000 об/мин.
4 мл надосадочной жидкости переносят в закрывающиеся стек¬
лянными или полиэтиленовыми пробками пробирки (емкостью
около 20 мл), содержащие 0,5 мл 5 н. раствора едкого натра,
1,5 г хлористого натрия и 10 мл смеси бутанол-хлороформа в
соотношении 3 :2. Содержимое пробирок энергично встряхива¬
ют руками 3 мин (время отмечают по секундомеру) и центри¬
фугируют при 4000 об/мин в течение 5 мин. Нижнюю водную
фазу отсасывают (лучше — с помощью пипетки, соединенной
со шприцем) и сливают. Затем в пробирки вносят по 5 мл
0,1 н. раствора NaOH с NaCl (для удаления гистидина). Про¬
бирки энергично встряхивают руками в течение 3 мин. Пробы
вновь центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. После разделе¬
ния фаз весь верхний (органический) слой переносят с помощью
системы шприц-пипетка в другие такие же пробирки, в которые
приливают по 5 мл 0,1 н. раствора НС1. Их хорошо закрывают
пробками и смесь энергично встряхивают руками в течение
3 мин. Пробы центрифугируют 5 мин при 4000 об/мин. Верхний
водный слой (раствор соляной кислоты) с помощью системы
шприц-пипетка (или другим способом) практически полностью
отсасывают и переносят в обычную пробирку, в которую добав¬
ляют 0,5 мл 1 н. NaOH и 0,12 мл раствора орто-фталевого аль¬
дегида. Через 4 мин добавляют 0,2 мл Н3РО4. Пробы флуоро-
метрируют: свечение образовавшегося конденсата возбуждают
светом с длиной волны 365 нм, а измеряют при светофильтре
с максимумом пропускания 460 нм. Флуороген стоек 30 мин.
В контроле на реактивы (его можно и не ставить) меняется
порядок добавления раствора, а именно: орто-фталевый альде¬
гид вносят после добавления фосфорной кислоты.
Примечание. Все работы по определению гистамина
следует проводить под тягой.
Активность гистаминазы вычисляют по формуле:
^(фк —фд]_- 10 • 2(1) = Хмкг/мл/ч,
где Фк — показание контрольной пробы (с вычетом контроля на
297

реактивы);
Фо — показание опытной пробы (с вычетом контроля на
реактивы);
10 — количество гистамина в растворе (в мкг),.внесенного
в контрольную и опытные пробы;
2/1/ — коэффициент пересчета активности гистаминазы на
1 мл сыворотки;
24 — коэффициент пересчета на 1 ч инкубации.
В норме активность гистаминазы в сыворотке крови, по дан¬
ным А. Г. Класон и А. Б. Райцис, составляет 0,27±0,24 мкг/
мл/ч.
Известно, что в процессах инактивации этого амина значи¬
тельную роль играет также гистаминопексическая активность
крови (ГПА). В Советском Союзе и за рубежом для опреде¬
ления ГПА преимущественно пользуются методом Перит — За-
борта, основанном, как и метод исследования активности ги¬
стаминазы, на определении убыли гистамина, добавленного к
сыворотке крови или к ткани.
Количество оставшегося гистамина определяют одним из
вышеупомянутых методов — биологическим, колориметриче¬
ским или флюориметрическим (в настоящее время предпочте¬
ние отдают последнему).
Клинико-диагностическое значение исследования системы
гистамин — гистаминаза. С момента открытия гистамина нако¬
пилось достаточно большое количество фактов, свидетельству¬
ющих о важной роли этого биогенного амина в проявлении мно¬
гих физиологических процессов. Так, гистамин является одним
из участников нейро-гуморальной регуляции тонуса кровенос¬
ных сосудов и органов с гладкой мускулатурой (показано, что
освобождающийся гистамин вызывает снижение артериального
давления), он резко повышает проницаемость капилляров, ак¬
тивизирует секрецию пищеварительных и деятельность экскре¬
торных желез, обусловливает спазм гладкомышечных органов
и т. д. Кроме того, в настоящее время выявлен ряд патологи¬
ческих процессов, в генезе которых большое значение имеет
избыточное накопление гистамина в тканях: различные аллер¬
гические состояния, процессы склерозирования внутренних
органов и пр. Наряду с этим установлено, что многие патоген¬
ные факторы (гипоксия, травмы, эмоциональные напряжения,
проникающая радиация и т. д.) ведут к освобождению большо¬
го количества гистамина.
Содержание гистамина в крови определяется состоянием
биосинтеза, депонирования, секреции, взаимодействия с эффек-
торными органами, инактивации и выведения этого биогенного
амина из организма. Лишь комплексное изучение всех обмен¬
ных процессов может дать известное представление о системе
гистамина.
Нужно сказать, что у одного и того же человека колебания
уровня гистамина в крови в течение года незначительны. Не
298

обнаружено достоверных различий в содержании гистамина в
зависимости от пола и возраста; правда, у взрослых отмеча¬
ется тенденция к более высокому содержанию гистамина в кро¬
ви по сравнению с детьми; в детском же возрасте у мальчиков
обнаружено несколько более высокое содержание гистамина,
чем у девочек.
При нормально протекающей беременности к 26—30 неде¬
лям уровень гистамина в крови увеличивается в 20—25 раз.
Небезынтересно отметить, что у беременных в III триместре
активность гистаминазы более чем в 200 раз превышает норму.
Повышение содержания гистамина в крови обнаружено при
таких воздействиях, как охлаждение, перегревание, влияние
рентгеновских лучей и ионизирующей радиации, облучение уль¬
трафиолетовыми лучами. Предполагают, что увеличение кон¬
центрации гистамина в крози при этом связано с усиленным
его высвобождением из мест образования. Неудивительно по¬
этому, что чрезвычайно высокие количества гистамина в крови
обнаружены при тех заболеваниях, которые характеризуются
повышенным егр образованием (например, в гистаминоцитах):
мастоцитоме и лейкемии. Особенное большое содержание ги¬
стамина выявлено при злокачественной мастоцитоме. Часго
встречающаяся пигментная крапивница сопровождается повы¬
шенным образованием гистамина.
При миелоидном лейкозе также обнаруживаются очень
большие концентрации гистамина в крови (до 100—115 мкг%),
причем огромные цифры выявляются как при лейкемических,
так и при алейкемических формах заболевания. По мнению
Гингольд (1968), определение содержания гистамина в крови
важно для ранней диагностики хронического миелоидного лей¬
коза.
Трудно переоценить значение исследования содержания
гистамина в крови при различных клинических формах аллер¬
гии. Так, при бронхиальной астме концентрация гистамина зна¬
чительно повышена на высоте и после приступа. В межприступ-
ном периоде она хотя и ниже, чем в предыдущие периоды, од¬
нако все еще значительно превышает нормальный уровень. При
длительном лечении стероидными и антигистаминными препа¬
ратами больных бронхиальной астмой уровень гистамина в
крови в межприступном периоде снижается до нормального.
У больных ревматоидным артритом, а также с различными
другими формами ревматизма повышенное содержание гиста¬
мина в крови наблюдается во всех фазах заболевания, но осо¬
бенно оно велико в фазе выраженной активности.
По данным Н. Я. Рязанова (1966), П. Н. Юренева и соав¬
торов (1968), у больных с лекарственной аллергией уровень
гистамина в крови достигает 38—47 мкг%, а в некоторых слу¬
чаях— даже 112 мкг%.
Он повышается также при аллергической риносинусопатии,
отеке Квинке.
299

Концентрация гистамина в цельной крови значительно уве¬
личивается у больных ангионевротической формой стенокардии
и особенно в первые 3—6 дней после развития инфаркта мио¬
карда.
Повышение уровня гистамина в крови при эпидемическом
гепатите, циррозе печени может играть определенную роль в
развитии аллергических проявлений при этих заболеваниях и
в патогенезе язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, до¬
вольно часто наблюдаемых у больных с заболеваниями пече¬
ни. У больных язвенной болезнью выявлена тенденция к уве¬
личению концентрации гистамина в крови.
Работами В. И. Успенского показана важная роль резко
выраженной гистаминемии у больных силикозом легких.
Высокий уровень гистамина обнаружен также при поздних
токсикозах беременности.

Глава XI
СПОСОБЫ ОЧИСТКИ
НЕКОТОРЫХ РЕАКТИВОВ
ПРИГОТОВЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОГО ЭТАНОЛА
Абсолютный этанол готовят в колбе с обратным холодиль¬
ником из 90—96° этанола кипячением его в течение 12 ч с не¬
гашеной известью (СаО) или окисью бария (ВаО), добавляе¬
мых из расчета 10 г на каждые 100 мл жидкости. Полученный
путем последующей отгонки (с применением прямого холодиль¬
ника) абсолютный этанол должен иметь температуру кипения
+78,3° С. Приготовленный таким способом этанол вполне при¬
годен для проведения гормональных исследований.
В методике определения холестерина по Ильку для абсолю-
тирования этилового спирта используют безводный сульфат
меди, который получают прокаливанием кристаллической соли
(медного купороса) при +120° С в сушильном шкафу при пе¬
риодическом перемешивании. Безводный сульфат меди хранят
в герметически закрытых банках. Порошок сернокислой меди
заливают 96° этиловым спиртом, хорошо перемешивают и ос¬
тавляют на 3—4 дня. Ежедневно перемешивают. Находящиеся
в осадке частицы со временем приобретают синий цвет (за счет
образования кристаллогидратов). Затем спирт сливают и за¬
сыпают новой порцией безводного сульфата меди. Это все
продолжают до тех пор, пока цвет осадка не будет изме¬
няться. Спирт сливают и фильтруют.
ПРОБА НА НАЛИЧИЕ В ЭТАНОЛЕ АЛЬДЕГИДОВ
К 5 мл этанола добавляют 0,2 мл раствора марганцевокис¬
лого калия (1 :5000). После перемешивания смесь, имеющую
розовую окраску, оставляют стоять 20 мин. Исчезновение розо¬
вой окраски указывает на присутствие альдегидов.
301

ОСВОБОЖДЕНИЕ ОТ АЛЬДЕГИДОВ
Первый способ. К 1 л абсолютного этанола добавляют
2 г солянокислого 2,4-динитрофенилгидразина и 0,5 мл концен¬
трированной соляной кислоты, закрывают пробкой, оставляют
стоять 48 ч в темноте при периодическом встряхивании, после
чего этанол отгоняют.
Второй способ. В отдельной посуде растворяют 7 г азотно¬
кислого серебра и 15 г едкого кали в 100 мл горячего этанола.
Полученный раствор прибавляют к 4 л абсолютного этанола,
встряхивают и оставляют стоять в защищенном от света месте.
Отгоняют, первые 70 мл и последние 200 мл дистиллята отбра¬
сывают.
Абсолютный этанол хранят в сосуде с притертой пробкой в
эксикаторе, над поглотителем.
ОЧИСТКА ХЛОРОФОРМА
Очистка хлороформа может быть проведена по способу,
описанному Н. А. Юдаевым (1961).
В темную бутыль или коническую колбу на 2 л помещают
1 л хлороформа и 50 мл концентрированной серной кислоты.
Если очистку проводят в колбе, ее закрывают светонепроницае¬
мым колпаком. Встряхивают в течение 5—6 ч. Серную кислоту
отсасывают, добавляют 50—100 мл воды, несколько раз встря¬
хивают бутыль круговыми движениями и затем воду отсасыва¬
ют пипеткой, присоединенной к водоструйному насосу. Отмы¬
тый таким способом хлороформ можно оставить на ночь. На
следующий день в бутыль с хлороформом вливают 50—100 мл
концентрированного раствора аммиака, встряхивают несколько
часов, аммиак отсасывают и хлороформ вновь промывают во¬
дой. Добавляют 50—70 мл 50% раствора серной кислоты и
встряхивают 1,5—3 ч. Кислоту отсасывают, хлороформ промы¬
вают водой и 60 мин перемешивают с насыщенным раствором
углекислого натрия (все материалы для промывания берут в
количестве в 10 раз меньшем, чем объем хлороформа). Раствор
соды тщательно отсасывают и осушают хлороформ безводной
содой или сернокислым натрием (добавляемых из расчета 30—
40 г на 1л хлороформа) в течение 12—18 ч. Осушенный рас¬
твор дважды перегоняют, нагревая хлороформ на водяной бане
(желательно использовать перегонный аппарат на шлифах).
При отсутствии такого аппарата все соединения можно сделать
на корковых пробках, тщательно обернув их станиолью. Пер¬
вые и последние 30—40 мл хлороформа при перегонке уда¬
ляют.
Если после перегонки хлороформ остается мутным,, это зна¬
чит, что перед дистилляцией он был плохо осушен. Небольшое
количество безводного углекислого натрия просветляет его, и
302

такой хлороформ можно использовать для экстракции. Всю
обработку следует проводить в полной темноте, для этого ис¬
пользуемую стеклянную посуду обертывают черной светонепро¬
ницаемой бумагой. Очищенный этим способом хлороформ мож¬
но хранить в темноте в течение месяца.
Следует однако заметить, что, как установлено Я. М. Ми-
лославским и другими (1969), проводимая обычно «предвари¬
тельная очистка хлороформа не только не нужна, но даже вред¬
на, ибо в процессе очистки хлороформ не очищается, а загряз¬
няется». «Очевидно — пишут авторы—практически к решению
о необходимости очистки хлороформа следует подходить каж¬
дый раз индивидуально. При получении каждой новой партии
хлороформа его нужно проверить на степень загрязнения после
двукратной перегонки, но без очистки. Если он не дает цветной
реакции с фенилгидразиновым реактивом, то, очевидно, его
можно использовать без сложной очистки».
ОЧИСТКА МЕТИЛЕНХЛОРИДА
1 л метиленхлорида встряхивают в течение суток со 100 мл
1 н. раствора едкого натра. После разделения метиленхлорид
встряхивают 2 ч со 100 мл дистиллированной воды, затем 2 ч
с 200 мл концентрированной серной кислоты. После промыва¬
ния дистиллированной водой в течение часа метиленхлорид
обезвоживают 12 ч безводной содой и дважды отгоняют в кол¬
бе с дефлегматором.
Очищенный таким образом метиленхлорид хранят в посуде
с притертой пробкой в темноте.
Если предварительная проверка показала, что метиленхло¬
рид достаточно хороший, то его не подвергают указанной обра¬
ботке, а только дважды перегоняют с дефлегматором.

ЛИТЕРАТУРА
Анасашвили А. Ц. Гликопротеиды сыворотки крови и мо¬
чи. М., «Медицина», 1968, с. 228.
Баринов В. Г. Определение калия и натрия в плазме, моче и
эритроцитах с помощью юстировки аппарата пламенного фотометра.
Лаб. дело, 1973, № 7. с. 435—436.
Бассалык Л. С. и др. Случай карциноидного синдрома с азо¬
темией, закончившийся летально. Проблемы эндокринологии и гор¬
монотерапии, 1966, № 3, с. 48—50.
Бауман Л. К. К вопросу об определении липидов сыворотки
крови. Лаб. дело, 1961, № 11, с. 30—33.
Г о р ж е й ш и Я. Основы клинической биохимии. Прага, «Меди¬
цина», 1967, с. 680. >
Ефимова Е*. А. Определение железа в сыворотке крови орто-
фенантролиновым микрометодом. Лаб. дело, 1963, № 5, с. 19—21.
Иванов И. И., Коровкин Б. Ф., Маркелов И. М.
Введение в клиническую энзимологию. Л., «Медицина», 1974, с. 277.
Камышников В. С. Метод одновременного определения в
одной порции мочи ванилил-миндальной и 5-оксииндолуксусной кис¬
лот. Здравоохр. Белоруссии, 1968, № 6, с. 78—79.
Камышников В. С. К методам исследования биогенных
аминов и состоянию их обмена при лейкозах. Автореф. дисс. канд.
Минск, 1970.
Колб В. Г. Биохимические аспекты реактивности организма
при туберкулезе. Минск, «Беларусь», 1971, с. 144.
Колб В. Г., Камышников В. С. Методические указания
по клинической биохимии для врачей-лаборантов. Минск, 1971, ч. III,
с. 152, 1972, ч. IV, с. 196; 1974, ч. V, с. 226.
Матлина Э. Ш., Киселева 3. М., Софиева И. Э. Ме¬
тод определения адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА в од¬
ной порции мочи. В кн.: Методы исследования некоторых гормонов и
медиаторов. М., «1ММИ», 1965, с. 25—32.
Меньшиков В. В. Об определении катехоламинов в моче.
Лаб. дело, 1961, № 4, с. 18—21.
Меньшиков В. В., Большакова Т. Д. Определение ва¬
нилил-миндальной кислоты с использованием электрофореза на бумаге.
В кн.: Методы клинической биохимии гормонов и медиаторов. М.,
«1ММИ», 1966, с. 60—61.
304

Милославский Я. М. и др. О путях повышения точности
и некотором упрощении методики определения 17-оксикортикостерои-
дов в плазме крови по Силберу и Портер в модификации И. А. Юда-
сва и Ю. А. Панкова. В кн.: Труды по новой аппаратуре и методикам,
в. 8. Новые методы исследования гормонов и других биологически ак¬
тивных веществ. М, «1ММИ», 1969, с. 74—82.
Панченко Н. И., Масленникова Н. К., Коган Э. С.
О влиянии разведения сыворотки на результаты определения амино¬
трансфераз по методу Райтмана и Френкеля. Лаб. дело, 1974, № 8,
с. 503—504.
Пономарева Е. Д. и др. Пособие для практических занятий
по клинической биохимии для врачей-лаборантов. М., «ЦОЛИУВ»,
1969, с. 94.
Рапопорт С. М. Медицинская биохимия. М., «Медицина»,
1966, с. 892.
С а м о с у д о в а Н. В., Басс Ж. Ж. Определение общего и
фракционного состава 17-кетостероидов мочи методом тонкослойной
хроматографии. В кн.: Труды по новой аппаратуре и методикам. 1967,
№ 5, с. 42.
Станкевичене В. Н. Официальный бюллетень Комитета по
делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР. 1969,
№3, с. 111.
Товар ницкий В. И., Вол у иска я Е. Н. Ранняя диагно¬
стика болезни Боткина (эпидемического гепатита) биохимическим ме¬
тодом. Лаб. дело, 1955, № 6, с. 7—9.
Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педи¬
атрии. София, «Медицина и физкультура», 1968, с. 1064.
Топарская В. Н. Физиология и патология углеводного, ли¬
пидного и белкового обмена. М., «Медицина», 1970, с. 248.
Ю д а е в Н. А. Химические методы определения стероидных гор¬
монов в биологических жидкостях. М., «Медгиз», 1961, с. 172.
Биохимические методы исследования в клинике. Под ред.
А. А. Покровского. М., «Медицина», 1969, с. 652.
Введение в клиническую биохимию. Под ред. И. И. Иванова.
Л., «Медицина», 1969, с. 494.
Справочник по функциональной диагностике. Под ред. И. А.
Кассирского. М., «Медицина», 1970, с. 848.
Методические указания по применению унифицированных клини¬
ческих лабораторных методов исследований. Под ред. В. В. Мень¬
шикова. М., «JV13СССР», 1973, с. 174.

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Адреналин 247
Азот аминный 59
Азот остаточный 32, 33
Альдолазы 69
Амилаза 95
Аминотрансферазы 77
Белок общий 5
Белковые фракции 12
Билирубин 175
Ванилил-миндальная кислота 263
Вельтмана проба 26
Г идроксииндоуксусная кислота
(5-ОИУК) 276
Гексозы 136, 137
Гесса проба 145
Гистамин 291
Гиетаминаза 291, 295
Гликопротеиды 136, 137
Диоксифенилаланин 248
Дофамин 248
Железо 211
Индикан 65
Калий 183, 185
Кальций 195
Катехоламины 247
Кортикостероиды мочи 233
Кортикостероиды крови 240
Креатинии 49
Креатин 49, 53, 54
Лактатдегидрогеназа 101
Липиды 150
Липопротеиды 166
Магний 200
Медь 217
Метиленхлорид 303
Мочевая кислота 33, 62
Мочевина 33, 38
Норадреналин 247
Пигментный обмен, исследование
175
Пробы коллоидоустойчивости 25
Проба с сахарной нагрузкой 127,
133
Проба Бурштейна и Самай 171
Проба Реберга 57
Реакция ксантопротеиновая 33,
67
Реакция Яффе 112
Сахар крови и мочи 112
Серомукоиды 142
Серотонин 276
Сиаловые кислоты 145
Сулем'овая проба 28
Тимоловая проба 29, 30
Тирамин 266
Трансферрин 215, 216
Фосфатазы 84, 89, 93
Фосфолипиды 151, 161
Фосфор неорганический 208
Холестерин 151, 154
Холинэстераза 106
Хлор крови, мочи, спинномозго¬
вой жидкости 203
Хлороформ, очистка 302
Церулоплазмин 217
Этанол, очистка 302
306

ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие , 3
Глава I. Методы исследования белкового обмена ... 5
Исследование общего белка и белковых фракций сыворотки
крови 5
Методы определения общего белка в сыворотке крови ... 6
Определение общего белка сыворотки крови по биурето-
вой реакции 7
Определение белковых фракций сыворотки крови методом
электрофореза на бумаге 12
Определение белковых фракций сыворотки крови турбиди-
метрическим методом 21
Глава II, Пробы коллоидоустойчивости 25
Коагуляционная лента Вельтмана 26
Проба Вельтмана в модификации Тейфля ...... 27
Сулемовая проба 28
Сулемово-осадочная реакция (сулемовая проба по Гринстедту) 28
Тимоловая проба 29
Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер 30
Глава III. Определение остаточного азота и его компонентов 32
Определение остаточного азота крови гипобромитным методом
(метод Раппопорта — Эйхгорна) 3-1
Методы определения мочевины * 38
Определение мочевины в сыворотке крови экспресс-мето¬
дом с применением реактивной бумаги «Уреатест» . . 40
Определение мочевины в сыворотке крови и в моче по
цветной реакции с диацетилмонооксимом 41
Определение мочевины в сыворотке крови уреазным мето¬
дом пег реакции с фенол-гипохлоритом 43
Определение мочевины крови уреазным методом по реак¬
ции с реактивом Несслера 46
Методы определения креатинина и креатина в крови и моче . 49
Определение концентрации креатинина в сыворотке крови
и в моче по цветной реакции Яффе (метод Поппера и др.) 50
Определение креатина в крови и моче 53
Клубочковая фильтрация и канальцевая реабсорбция ... 56
Проба Реберга . 57
Определение коэффициента очищения от мочевины. , . 57
307

Аминный азот 59
Определение свободного аминного азота в сыворотке кро¬
ви (по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулко-
вой) 59
Мочевая кислота 62
Определение мочевой кислоты по методу Мюллера — Зей-
ферта 63
Определение индикана в сыворотке крови и моче .... 65
Ксантопротеиновая реакция 67
Глава IV. Методы изучения активности ферментов , . 69
Методы определения активности альдолаз в сыворотке крови 69
Определение активности фруктозо-1, 6-дифосфатальдолазы
в сыворотке крови (метод В. И. Товарницкого, Е. Н- Волуй-
ской в модификации В. А. Ананьева и В. В. Обуховой) . . 79
Определение активности фруктозо-1-фосфатальдолазы (ме¬
тод Шапиро в модификации Д. М. Брагинского) ... 74
Определение активности аминотрансфераз (трансаминаз) . 77
Методы определения аспартат- и аланйн-амин'отрансфераз
в сыворотке крови ..... 77
Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод
определения активности аминотрансфераз в сыворотке
крови (Райтман, Френкель, 1957) 78
Определение активности фосфатаз ........ 84
Определение активности щелочной фосфатазы в сыворот¬
ке крови по гидролизу р-нитрофенилфосфата (метод Бес-
сея, Лоури, Брока) 86
Определение активности щелочной и кислой фосфатаз в сы¬
воротке крови по гидролизу p-глицерофосфата (метод Бо-
дански) 89
Определение активности а-амилазы в сыворотке крови и моче 95
Определение активности а-амилазы (диастазы) в сыво¬
ротке крови и моче амилокластическим методом ... 96
Определение активности а-амилазы со стойким крахмаль¬
ным субстратом (метод Каравея) 98
Определение общей активности лактатдегидрогеназы . . 101
Методы определения активности лактатдегидрогеназы в
сыворотке крови 101
Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод оп¬
ределения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке
крови (по Севела и Товарек) 102
Определение активности холинэстераз 106
Определение активности сывороточной холинэстеразы ко¬
лориметрическим методом 107
Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови
экспресс-методом с применением индикаторной бумаги , 109
Глава V. Изучение углеводного обмена 112
Определение сахара в крови 112
Определение сахара в крови и в моче по цветной реакции
с орто-толуидином 114
Определение глюкозы в крови, плазме (сыворотке) и спин¬
номозговой жидкости глюкозооксидазным методом . . 117
Определение сахара в крови по методу Хагедорна и
Иенсена 120
308

Изучение углеводного обмена методом нагрузок .... 127
Патофизиологические механизмы, обусловливающие дина¬
мику изменения концентрации сахара крови после углевод¬
ной нагрузкц 129
Проба с двойной нагрузкой по Штауб — Трауготту . . 133
Проба Экстона — Розе 134
Глава VI. Методы изучения углеводсодержащих белков и
их компонентов в крови 136
Определение общего количества гликопротеидов в сыворотке
крови с использованием триптофана 137
Определение гексоз в сыворотке крови орциновым методом по¬
сле гидролиза серной кислотой 140
Определение серомукоидов (серогликоидов) .... 142
Определение серомукоида в сыворотке крови по содержа¬
нию в нем гексоз 142
Турбидиметрический метод определения серомукоидов в
сыворотке крови 143
Методы определения сиаловых кислот 145
Проба на сиаловые кислоты по методу Гесса .... 145
Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реак¬
ции с резорцином 147
Глава VII. Методы изучения обмена липидов . , . . 150
Исследование общих липидов и их фракций 150
Определение общих липидов в сыворотке крови по цвет¬
ной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом . . 152
Холестерин 154
Метод определения общего холестерина в сыворотке крови,
основанный на реакции Либерман — Бурхард (метод
Илька) 156
Микрометод прямого определения свободного и общего
холестерина в сыворотке крови (по Н. Станкевичене) . 158
Определение общих фосфолипидов в крови 161
Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови по
содержанию в них фосфора 162
Определение триглицеридов в сыворотке крови по цветной
реакции с хромотроповой кислотой 164
Состав и свойства липопротеидов сыворотки крови . . . 166
Разделение липопротеидов методом электрофореза на бу¬
маге 169
Определение липопротеидов в сыворотке крови методом
электрофореза на бумаге (по Свану, 1953; Л. К. Бауман,
1961 в видоизменении В. Г. Колб, 1970) 170
Определение содержания Р-липопротеидов сыворотки кро¬
ви турбидиметрическим методом (по Бурштейну и Самай) 171
Глава VIII. Исследование пигментного обмена . . . 175
Методы определения билирубина р сыворотке крови . . . 176
Определение содержания билирубина и его фракций в сы¬
воротке крови колориметрическим диазометодом (Йендра-
шик, Клеггорн, Гроф) 177
Определение билирубина в малом объеме сыворотки крови 179
Построение калибровочной кривой для определения били¬
рубина сыворотки крови 180
Глава IX. Исследование минерального обмена . . 183
Определение электролитов методам пламенной фотометрии . 184
309

Стандартные растворы для исследования калия и натрия
в моче 189
Колориметрический микрометод определения калия в плаз¬
ме (сыворотке) крови (по Н. Лазарову) 191
Кальцин 195
Методы определения кальция в сыворотке крови . . . 196
Определение общего кальция в сыворотке крови спектрофо¬
тометрическим методом, основанным на реакции с глиок-
саль-бис-[2-оксианилом] 197
Определение кальция в сыворотке крови титрометрическим
методом с применением мурексида 198
Исследование магния в сыворотке (плазме) крови, эритроци¬
тах, в моче 200
Определение магния в сыворотке (плазме) крови и эритро¬
цитах по цветной реакции с титановым желтым . „ . 201
Определение магния в эритроцитах 202
Определение ионов хлора в крови, моче и спинномозговой жид¬
кости 203
Методы определения хлорид-ионов 203
Определение ионов хлора в сыворотке крови, моче и спин¬
номозговой жидкости меркуриметрическим методом с инди¬
катором дифенилкарбазоном . 205
Неорганический фосфор 208
Определение неорганического фосфора в сыворотке крови
и моче по восстановлению фосфорномолибденовой кислоты 209
Железо и трансферрин. Методы определения железа в сыво¬
ротке крови 211
Бато-фенантролиновый метод определения железа сыворот¬
ки крови 212
Орто-фенантролиновый метод определения железа в сыво¬
ротке крови по Г. Матсубара , 214
Медь и церулоплазмин . 217
Определение меди в сыворотке крови методом Шмидта в
модификации А. Г. Рахманкулова и И. А. Коптевой . . 218
Определение церулоплазмина в сыворотке крови модифи¬
цированным методом Ревина (С. В. Бестужева, В. Г. Колб) 219
Глава X. Исследование гормонально-медиаторного обмена 221
Структура и функция надпочечников 221
Методы изучения состояния коры надпочечников .... 222
Методы определения кортикостероидов в клинике . . . 224
Определение 17-кетостероидов в моче по реакции с мета¬
динитробензолом (колориметрический метод Н. В. Самосу-
довой и Ж. Ж. Басс, 1967) 227
Определение кортикостероидов в моче ...... 233
Определение 17-оксикортикостероидов в моче по реакции с
фенилгидразином после ферментативного гидролиза (Sil-
ber, Porter, 1957 в модификации Н. А. Юдаева и М. А. Кре-
ховой, 1960) 234
Определение кортикостероидов в периферической крови . 240
Определение 11-оксикортикостероидов в плазме крови по
их флуоресценции в серноспиртовом реактиве (Ю. А. Пан¬
ков, И. Я. Усватова, 1965) 242
Физиологические колебания концентрации кортикостерои¬
дов в плазме крови 244
Исследование обмена катехоламинов* 247
310

Определение адреналина и норадреналина в моче флуори-
метрическим методом после дифференциального окисления
йодом при различных значениях pH (В. В. Меньшиков,
1961) .... 250
Определение адреналина, норадреналина, дофамина и ди-
оксифенилаланина (ДОФА) в одной порции мочи
(Э. Ш. Матлина, 3. М. Киселева, И. Э. Софиева, 1965) . 256
О методах определения метилированных продуктов обмена ка¬
техоламинов в моче , , . . . 263
Определение ванилил-миндальной кислоты с использова¬
нием электрофореза на бумаге (В. В. Меньшиков,
Т. Д. Большакова, 1966) 265
Метод одновременного определения в моче ванилил-мин¬
дальной, 5-оксииндолуксусной кислот и тирамина (В. С. Ка¬
мышников, 1971) 266
Исследование системы серотонин-5-гидроксииндолуксусная
кислота 276
Определение серотонина в крови флюориметрическим мето¬
дом с орто-фталевым альдегидом ....... 277
Определение 5-гидроксииндолуксусной кислоты в моче . 279
Определение 5-гидроксииндолуксусной кислоты в моче по
реакции с а-нитрозо-Р-нафтолом (Юденфренд, Титус,
Вайссбах, 1955) 282
Определение 5-гидроксииндолуксусной кислоты в моче по
реакции с а-нитрозо-Р-нафтолом (В. С. Камышников,
1968) 284
Исследование системы гистамин — гистаминаза 291
Определение гистамина в цельной крови по флуоресцен¬
ции продуктов, образующихся при реакции с орто-фтале¬
вым альдегидом (модификация метода С. А. Мещеряковой) 293
Определение активности гистаминазы в сыворотке крови . . 295
Глава XI. Способы очистки некоторых реактивов 301
Приготовление абсолютного этанола 301
Проба на наличие в этаноле альдегидов 301
Освобождение от альдегидов 302
Очистка хлороформа 302
Очистка метиленхлорида , 303
Литература 304
Предметный указатель 30G

Владимир Гаврилович Колб,
Владимир Семенович Камышников
КЛИНИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ
Редактор О. В/ Гутковская. Художник В. Л. Милевский. Худо¬
жественный редактор В. П. Безмен. Технический редактор
Я. С. Шляшинская. Корректор Р. И. Мовшович.
АГ 10553. Сдано в набор 4/IX 1975 г. Подп. к печати 12/II 1976 г.
Тираж 42 000 экз. Формат 84Х1 Ов'/зг- Бумага тип. № 1. Уел. печ.
л. 16,38. Уч.-изд. л. 19,5. Зак. 2615. Цена 1 руб. 19 коп.
Издательство «Беларусь» Государственного комитета Совета
Министров Белорусской ССР по делам издательств, полиграфии
и книжной торговли. Минск, Ленинский проспект, 79.
Полиграфический комбинат им. Я. Коласа Государственного
комитета Совета Министров Белорусской ССР по делам изда¬
тельств, полиграфии и книжной торговли. Минск, Красная, 23,