МетодыбиохимическогоисследованиярастенийИзд. 2-е, переработанное
и дополненноеПод редакциейд-ра биолог. наук А. И. ЕРМАКОВАJI єни нг рад, издательство *Ко л ос». 197 2
631.8М54УДК 361.19А. И. ЕРМАКОВ. В. В. АРАСИМОВИЧ, М. И. СМИРНОВА-
ИКОННИКОВА, Н. П. ЯРОШ. Г. А. ЛУКОВНИКОВА.Методы биохимического исследования расте
М54 ний. Изд. 2-е. перераб. и доп. Под ред. д*ра биол
наук А. И. Ермакова. Л.. «Колос». Ленингр
отд-ние, 1972.456 с. с пл. 5900 экз. 2 р. 10 к.11а обороте тит. л. авт.: А. И. Ермаков. В. В. Араспм<
вич. М. И. Смирнова-Иконникова и др.Книга япляется методическим руководством, рассчитанным ш
ши роки А круг (тучных работников, сотрудников химических лабора
торий опытных станциЛ и пищевод промышленности, а также на прс
подавателей н студентов старших курсов биологических и с -х. вуэог
и техникумов. 15 глав книги посвящены методам определения коли
чес таенного содержания и качественного состава различных химичг
ских веществ семян, плодов и вегетативных органов культурны'
рлетениА.44-I	631. Ь53-72
ПредисловиеПервое издание руководства «Методы биохимического иссле¬
дования растении» вышло в свет в 1952 г. За этот период хими¬
ческие, физические и биологические науки достигли больших
успехов. Это нашло отражение и в методах исследования и био¬
химического анализа растений. В настоящее время широкое раз¬
витие получили биохимические и фнзиолого-бнохнмические ла¬
боратории в сельскохозяйственных л селекционных учрежде¬
ниях, расположенных в различных климатических зонах нашей
страны. Многие важнейшие задачи в области растениеводства,
селекции и промышленности, перерабатывающей продукты рас¬
тениеводства, не могут успешно решаться без биохимических ис¬
следований и соответствующих оценок этих продуктов. Методы
биохимического исследования являются важным звеном в по¬
знании разнообразия химического состава и биохимических осо¬
бенностей видов и сортов культурных растений.Настоящая книга составлена для самостоятельной работы
широкого круга биологов-химиков, работников опытных и науч¬
но-исследовательских учреждений, связанных с изучением и ана¬
лизами растительных объектов и продуктов биосинтеза расте¬
ний.Во втором издании книги все методы изложены по общему
плаиу и многие из них —более лаконично, чем они излагались
в первом издании. Это было вызвано необходимостью сокра¬
щения общего объема книги при существенном пополнении ее
новыми методами.Как и прежде, авторы стремились увязать методы анализа
с характером биохимических изменений видов и сортов, а также
с зависимостью количественных и качественных изменений ве- .
ществ от условий выращнвания. В связи с этим каждая глава
начинается кратким обзором особенностей веществ и методов
их анализа.Для определения каждого важнейшего вещества во многих
случаях приведено описание 2—3 методов с учетом возможно¬
стей и характера оборудования отдельных лабораторий. Методы,
приводимые в настоящем издании, как правило, были широко
апробированы в лабораториях биохимии Всесоюзного института
растениеводства и его опытных станций. Многие методы приве¬
дены в полумикро- и микромодификацнях и в форме, технически
более удобной для их выполнения.Описание аппаратуры и установок для анализов и правила
работы с различными измерительными приборами даются здесь
с меньшей детализацией, чем в нервом издании книги. Это объяс¬
няется тем, что в течение последних лет опубликован ряд руко¬
водств по применению для биохимических исследований различ-3
ПЫХ Приборов, многие пз которых снабжены специальными инст¬
рукциями.В последней главе киши приведены наиболее \потребитель¬
ные способы очистки и обезвоживания важнейших растворите¬
лей и способы приготовления некоторых реакгивоа.Для удобства пользования данным руководством оно снаб¬
жено кратким предметным указателем и, как н прежде, списком
литературы по общим вопросам биохимических исследовании.При изложении методов, как правило, применяются для обо¬
значения различных мер объема, длины, веса и других физико¬
химических величин новые единицы измерения но системе СП.Авторы надеются, что данная книга будет способствовать
расширению знании в области биохимии растении, а также ока¬
жет бнологам-химнкам существенную помощь н решении раз¬
личных задач селекции растении по улучшению качества \ ро¬
жая сельскохозяйственных культур.Участие отдельных авторов в подготовке данного руковод¬
ства отражено в оглавлении книги.
Средние пробы
культурных растений
и подготовка их
/лава i к анализу*Способы отбора средних пробВили культурных растений представлены многообразными но
біюлої ическим и хозяйственным свойствам сортами и формами.
Биохимические свойства существенно различаются не только
\ ра«ны\ форм культурных растений в пределах одного вида,
но даже у отдельных растений одного и того Же сорта, чю яв¬
ляется основанием для селекции на химический состав. Условия
выращивания также влияют на содержание и даже качесшо хи¬
мических веществ н неодинаково изменяют химический сосіав
у различных культур и сортов. Плоды и семена, а также вегета¬
тивные органы (листья, корпи, клубни и др.) па одном и том же
растении отличаются биохимическими показателями в зависи¬
мое г.! о! их расположения и развития. Следовательно, сравнение
химического состава различных культур и сортов должно прово¬
дить, н с учетом указанной изменчивости.При биохимическом изучении растительного материала не
могут быть оставлены без внимания изменения, происходящие в
процессе самого химического анализа. Биохимическими метода¬
ми учитывают биологические свойств і изучаемых объектов и
происходящие в них химические процессы. Поэтому исключи¬
тельное значение имеют методы отбора, составления и подт-
твки проб для химического анализа. Отбор н сосывление сред¬
них проб зависят не юлько от обьекта, но и от задачи, которую
разрешаеі каждый конкретный анализ (например, изучение
upoiuccoB образования пли накопления веществ, оценка сорта
m хозяйственных посевов, сравнительная оценка образцов в
мелкоДз'ЛЯночных посевах, оценка селекционного материала при
ірупиовом или индивидуальном отборах и т. д.).Приемы взятия и составления пробы при оценке качества се¬
мян пли нітеїативньїх органов различны. Величина пробы при
анали іе хозяйственных посевов отличается от проб при индиви¬
дуальном анализе. Неодинаков должен быть потход при опенке
ueiетагинно размножаемых и размножаемых семенами сортов иКуЛЬТур. ПрЧ ВЫборе УСЛОВИЙ ПрОВ''ДеННЯ ПОЛеВЫХ ОПЫТОВ Hi*-О
обходимо обеспечить сравнимость результатов биохимического
анализа.При ответе на возникший вопрос о том, сколько надо иметь
семян или плодов для определения тех или других веществ,
необходимо исходить из поставленных задач и из закономерно¬
стей биохимической изменчивости культурных растений. Общее
весовое количество материала, нужное для составления достовер¬
ной средней пробы, зависит от приемов сбора н от количества
представленных в ней растений, причем абсолютная величина
пробы может резко отличаться. Например, семена льна в коли¬
честве от 400 до 1200 весят 5 г; такой же вес 5 г —имеет
только половина грецкого ореха, по анализу которой, конечно,
невозможно судить о составе урожая всего дерева.Таким образом, все сказанное выше приводит к выводу, что
при составлении средних проб надо исходить не столько из за¬
кона больших чисел, сколько чз знания биологии и биохимии
растений.Один из простых и достоверных приемов составления средних
проб основан на правильном взятии их непосредственно с расте¬
ний с учетом условий их выращивания. Этот подход исключает
необходимость обращения с большим весовым количеством уро¬
жая таких культур., как корнеплоды и другие крупноплодные
растения.Необходимым условием для правильной химической харак¬
теристики и -воспроизводимости результатов анализа зерна, се¬
мян, плодов, листьев и т. д. по малой навеске (которые упо¬
требляются для анализа) является правильное взятие средних
проб и подготовка их к анализу.Средние пробы семян зерновых,
масличных и бобовых культурВ практике опытных и селекционных учреждений отбирают
образцы проб семян главным образом для оценки отдельных
растений, урожая семян с малых делянок, а также для «ма¬
лого» или «большого» сортоиспытания.Отбор проб с отдельных мелкосемянных растений. Растения
должны выращиваться в одинаковых условиях, чтобы каждое
растение имело равные возможности для роста и развития, а
влияние микроусловин и других факторов на результаты ана¬
лиза было бы минимальным. Семена (зерно) с обмолоченного
растения ( без включения семян подгонов) рассыпают на бумаге
в один слой в виде квадрата и делят на 4 части по диагонали.
Семена, находящиеся в противоположных треугольниках, соби¬
рают для анализа в пакеты. Половина или треть урожая семян
с одного растения вполне отражает свойства всего урожая взя¬
того растения.6
При обмолоте семян с отдельных растении бобовых культур
следят, чтобы зеленые бобы верхних ярусов (гороха, фасоли и
др.) в анализ не попадали.Отбор проб с мелкоделяночных посевов (0,5—0,2 м2). Для
биохимической характеристики семян образцов, выращенных на
небольших делянках, следует иметь данные з среднем для двух
повторностей, а также для сравнения данных анализа по стан¬
дартному образцу, высеваемому либо через делянку (на участ¬
ках, не выровненных по рельефу, плодородию и другим усло¬
виям), либо реже, но не менее как через 10 метровых делянок.
Урожай семян (зерна) перемешивают, делят по объму на 2 части,
рассыпают на бумаге, подравнивают в квадрат и делят по диаго¬
налям на 4 части. Семена, заключенные в двух противоположных
треугольниках, собирают и, если необходимо, повторяют деле¬
ние но способу «квадрата».Таким образом отбирают пробу семян весом около 50 г, но
не менее 25 г. Дальнейшее деление допускается, когда зерно
хотя бы грубо размельчено. Если посев произведен по другим
схемам (широкорядный) и общая площадь, занятая одним
сортом, мала и нет повторностей, то принцип отбора проб оста¬
ется таким же, как при мелкоделяиочной схеме посева (просо,
сорго).Общий вес пробы крупносемяиных культур (бобовые,
кукуруза, подсолнечник, клещевина, хлопчатник и др.) дол¬
жен быть около 100 г. но не менее 50 г. Необходимо, чтобы
средняя проба семян пропашных культур из коллекцион¬
ных и селекционных посевов была собрана не менее как с 20—
25 растений.Отбор проб семян с более крупных делянок. Различные опы¬
ты, а также сортоиспытание и размножение обычно производят
на сравнительно крупных делянках с многократной повтор¬
ностью; їв этом случае получаемые данные химического анализа
испытуемых сортов могут сравниваться без относителыюго^сопо-
ставления со стандартом. Отбор средней пробы может быть сде¬
лан одним из следующих приемов.1.	Семена после обмолота всех повторностей тщательно пере¬
лопачивают, рассыпают равномерным слоем на брезенте и по
диагоналям через равные промежутки в 10—12 местах берут
совком пробы, которые ссыпают в один пакет. Отобранная таким
образом проба в некоторых случаях может весить несколько
килограммов. Такую генеральную пробу удобно уменьшить на
делителе Гусева (или на другом аппарате) до 200—250 г. По¬
следнюю пробу не следует делить без предварительного грубого
измельчения семян. Из грубо измельченного материала берут
навески 5—10 г и тонко измельчают.2.	Семена с каждой повторности пересыпают в отдельные
мешки и из каждого берут совком по 500—700 г семян в один
пакет, а затем их делят, как указано выше, до 100—250 г. Вес7
средней пробы крупносемянных растений должен быть не менее
100-150 г.Проба семян подсолнечника, клещевины, арахиса, хлоп¬
чатника и других культур должна быть около 500 г с уче¬
том того, что 20—40% веса семян и бобов составляет обо¬
лочка.Семена хлопчатника трудно перемешиваются, поэтому сред¬
нюю пробу лучше отбирать из различных мест разложенных
ровным слоем семян на брезенте, а в поле —с различных
растений.Действие делителя конструкции Гусева основано на свобод¬
ном падении зерна. Зерно насыпают в верхнюю воронку /
(рис. 1 а) и затем открывают заслонку 2. По отводным трубкамРяс. 1. Делители семян.о —делитель Гусем (объяснение я тексте), б — делитель ДЭК-1 (Лабор.ВНР).зерно расходится в 2 приемных сосуда. Следовательно, первона¬
чальное количество зерна делят сначала на 2 части. Затем, зер¬
но, находящееся в одном сосуде, пересыпают в верхнюю ворон¬
ку и продолжают делить до необходимой величины. Аппарат кон¬
струкции Гусева является одновременно смесителем и дели¬
телем.Делитель (ДЭК-1), изготовляемый в Венгерской Народной
Республике, делит пробу в 2—3 кг сразу до 200—300 г. Этот при¬
бор (рис. 1 б) предназначен для выделения средней пробы се¬
мян зерновых и других культур. Семена насыпают в бункер
делителя, н они при вращении прибора попадают в барабан
с наклонной осью вращения. Здесь зерно (семена) перемеши¬
ваются и высыпаются равномерно в 10 чашек, которые располо¬
жены на подвижной стойке делителя. Чашки заполняются за
несколько оборотов стойки.я II
Подготовка семян к анализуИзмельчение и обрушивание семян. Отобранные средние
пробы зерна (семян) отделяют от различных примесей, измель¬
чают, обеспечивая однородность материала. Измельчение прово¬
дят на лабораторных мельницах в 2 приема. Вначале, при раз¬
мельчении крупносемянных культур, делают грубый помол, а
запм отбирают меньшую часть и в 2—3 приема превращают
в тонкий помол. Для химических определений следует измель¬
чить материал до размера частиц 0,50—1 мм. Более тонкий по¬
мол необходим при употреблении небольших навесок (менее
200 .иг), что достигается многократным помолом на мельнице
тина «Пируэт» и использованием тонких сит или специальных
мельниц.Измельченный материал снабжают необходимой этикеткой и
хранят в банках, закрытых притертыми или резиновыми пробка¬
ми. или в алюминиевых бюксах. Масличные семена размельчают
незадолго перед анализом и хранят недолго, защищая от света
и окисления. В семенах различных сортов относительный про¬
цент кожуры значительно изменяется, а химический состав заро¬
дышей с эндоспермом, также существенно различается (у кру¬
пяных, масличных и других растений), и поэтому часто анали¬
зируют только освобожденные от оболочек семена. Содержание
оболочек в семенах представляет селекционный и практический
интерес. Обрушивание семян и очистку ядер от оболочек совме¬
щают с определением веса 100—1000 семян и процентного со¬
держания оболочек (лузги). Для этой цели из проб семян
отсчитывают 2 порции по 50—200 семян, взвешивают их,
затем снимают оболочку (см. отделение оболочки). Для ос¬
вобождения семян от плодовых оболочек их пропускают
через дисковую мельницу, отрегулированную так, чтобы
оболочка отделялась, а ядро оставалось целым. Затем вбо-
лочк\- отвеивают при помощи классификатора семян или
фена.При оценке сортов крупносемянных культур по биохимиче¬
ским показателям приходится иметь дело не с целым зерном,
а с обрушенной его частью (крупой). Получение такого мате¬
риала при отсутствии специальных лабораторных приборов для
обрушивания 25—50 г зерна представляет большие трудности.
Не меньшие трудности представляет снятие оболочки семян V
таких масличных культур, как подсолнечник и хлопчатник.
В этих случаях пользуются размельчителем тканей для обруши¬
вания семян (рис. 2)| что значительно облегчает труд. С помо¬
щью размельчителя можно снимать оболочку н у бобовых куль¬
тур (горох, люпин), а также у трудно обмолачиваемых зерновых
(некоторые виды пшеницы, овса). Удаление оболочек необхо¬
димо, когда они дают дополнительную окраску при различных
колориметрических определениях.9
Отделение оболочек семян проса, сорго, гречихи. Для обру¬
шивания этих семян в размельчнтеле заменяют 2 вращающихся
ножа на один, но иной формы (рис. 2, 2). Этот нож изготов¬
ляется из полоски нержавеющей стали шириной 12—15 .ил*, дли¬
ной 12 см. В середине полоски делается отверстие для крепления
на вращающемся стержне в стакане размельчителя. Конец по¬
лоски, изогнутый вниз, отстоит от дна стакана на 4 мм. Для от¬
деления оболочки от семян их насы¬
пают в стакан размельчнтеля пор¬
циями по 20 г, закрывают стакан
крышкой и включают мотор размельчи-
теля на первую скорость (1500обДшш)
на 15 секунд. Семена при этом подни¬
маются со дна и вращаются в стакане.
Пластинка ударяет по семенам и сби¬
вает с них оболочку, которая вра¬
щается в зоне выше ножа, а ядра се¬
мян падают на дно и также вра¬
щаются, но. как правило, тоже выше
ножа. Продолжительность вращения
навески семян должна контролиро¬
ваться песочными часами или секун¬
домером, иначе обрушенные семена
(ядра) разбиваются на мелкие части.Затем оболочку отделяют при по¬
мощи классификатора семян (типа
КСП-1) или обычным способом. Пе¬
ред отвеиванием целесообразно про¬
сеять мелкие частицы через сито и
собрать их для учета.Размельчнтель типа «Пируэт» так¬
же может быть использован для уда¬
ления оболочек. Для этого необходимо
уменьшить число оборотов, включив
прибор на 220 в через реостат. При отсутствии последнего
можно включить прибор через трансформатор на напряжение
127 в.Отделение оболочек семян хлопчатника, подсолнечника и
риса. В этом случае используется размельчнтель, у которого
вращающаяся часть, служащая для разбнвания и отделения
оболочек, имеет примерно такую же форму, однако толщина по¬
лоски больше — 3 мм и нижний конец ее отстоит от дна стакана
размельчнтеля на 5 мм. Прибор включается через реостат, по¬
ложение которого нужно отрегулировать так, чтобы ядра семян
не разбивались на мелкие части. Каждый раз на дно стеклян¬
ного сосуда насыпают порции семян по 20 г (берут по объему);
продолжительность работы прибора должна быть не более 15—
20 секунд. Необходимое качество обработки семян регулируется10Рис. 2. Размельчнтель (го-могеппэптор) тканей./ — толстостенный стакан на
стекла или пластмассы. 7 —
двухлопастной кож. приводи*
Mblft в движение мотором.
J — корпус с заключенным мо¬
тором. 4 — переключатель ско¬
рости. S — крышка.
положением и формой рабочей полоски, числом оборотов мото¬
ра, продолжительностью работы размельчнтеля, постоянчо оди¬
наковыми навесками.Для семян некоторых культур для отделения оболочек мож¬
но использовать и ножи, имеющиеся в макроизмельчителе, но
во избежание получения мелко раздробленного зерна следует
надеть на одну пли две лопасти кусочки резиновых трубок.Определение процента кожуры и плодовой оболочки (лузги).
Для отделения лузги у подсолнечника отсчитывают пробы по
100 или 200 семян и взвешивают их на технических весах. После
этого помещают в стакан размельчнтеля, приспособленный для
отделения оболочек, и включают в сеть на 15—20 секунд. По исте¬
чении этого времени пробу пересыпают на тонкую резиновую
пластинку и надавливанием резиновой пробкой освобождают от
оболочек ядра тех семян, у которых оболочка треснула, но не
отделилась. Оболочку отвеивают при помощи вышеупомянутого
классификатора семян (КСП-1). Ядра собирают в бюкси н
взвешивают. Потерн оболочек н ядра в виде пыли бывают не¬
значительными.Для определения процентного содержания оболочек у семян
хлопчатника 100 шт. семян взвешивают, помещают в стакан ма-
кро из мельчи тел я и на одну минуту включают мотор на первое
деление (4 тыс. об/мин). Ядро семян выбирают, а целые семена
вновь помещают в сосуд. Операцию повторяют еще 2 раза. Та¬
ким образом, общее время, необходимое для снятия оболочки
семян хлопчатника в макронзмельчнтеле, составляет 3 минуты.
При определении процента оболочки с помощью макроизмельчи¬
теля у таких мелкосемянных культур, как просо, следует брать
навеску семян не менее 20 г.Процент кожуры (оболочек) в семенах равен произведению
веса кожуры на 100 и разделенному на величину навески семян.
Если в навеске было известно число семян, то легко рассчитать
вес 100 и 1000 семян.Щелочный метод определения пленчатостй зерна ячменя по
Д. С. Омарову. Плеичатость зерна ячменя колеблется в пре¬
делах от 7 до 17% в зависимости от сорта, условий выращива¬
ния и крупности зерна.Сущность метода определения пленчатостй зерна ячменя со¬
стоит в том, что при непродолжительной замочке в растворе
щелочи, доводимом до кипения, происходит отделение пленок
от зерновки, а по разности веса проб исходного зерна и зерна с
удаленными пленками устанавливают пленчатость.Реактивы и аппаратура: 1) 3%-ный раствор NaOH; 2) колбы на
50—100 см\ 3) чашки Петри; 4) бюксы.Ход анализа. Навески по 5 4; 0,01 г помещают в конические
колбы объемом 50—75 см\ При этом битые, щуплые, голые, гни¬
лые. изъеденные зерна исключают. В 2 колбы приливают 25 г.к3П
З	%-ного раствора едкого натра (NaOH), после взбалтывания
колбы с навесками ставят на электроплитку и доводят раствор
до бурного кипения. Затем колбы снимают, охлаждают до 50—
60°, закрывают резиновой пробкой и энергично взбалтывают, до¬
ливают водой и взбалтывание продолжают до полного отделения
пленок. Зерно в колбах 2—3 раза промывают водой, продолжая
взбалтывание. Все процедуры проводят быстро, при сливании
раствора и промывной воды удаляют также отделившиеся плен¬
ки. Затем зерно переносят в чашки Петри, удаляют отдельные
оставшиеся пленки и подсушивают фильтровальной бумагой.Две навески исходного зерна н две навески с отделенными
пленками помещают в бюксы, сушат прн температуре 100° в
течение часа и затем взвешивают с точностью до 0,01* г. По раз¬
ности веса исходного зерна и зерна без пленок вычисляют вес
пленок. Пленчатость (х) в процентах находят по формуле:а - 100где: а — вес пленок (в г),н — навески исходного зерна (в г).Средние пробы овощейДля изучения индивидуальной изменчивости химического со¬
става овощных культур необходимо, чтобы растения находились
в одинаковых условиях произрастания. Поэтому для взятия проб
выбирают наиболее выровненные, однородные участки и отдель¬
ные экземпляры растений берут через определенные промежутки
на делянке или в рядке, не выбирая.Плоды или клубни (томата, перца, баклажана, картофеля
и др.) следует брать с растений через 6—10 экземпляров, бах¬
чевые, особенно тыквы, — через 3—5 растений. Для суждения
об индивидуальной изменчивости должно быть проанализиро¬
вано не менее 10 растений, но предпочтительно иметь данные
по большому числу (25). В состав средней пробы берут весь
урожай растения (корнеплодные, луковые, капусты), у которых
урожаем является один используемый орган.В средние пробы картофеля, батата, топинамбура и других
культур берут половину клубней от каждого растения.Отоор проб с небольших делянок. Прн оценке коллекцион¬
ного и мел кодел я ночного посева средняя проба составляется из
урожая не менее чем от 10 растений каждого сорта. С каждого
растения берут по 2—3 плода многоплодных культур (томат,
перец, баклажан, картофель, батат н др.).Общий вес средних проб для обычного химического анализа
из мелкоделяночиых посевов должен быть не менее 1 кг. Если
плоды, клубни, корнеплоды мелкие, то число растений или пло¬
дов, отбираемых с одного растения, увеличивают.12
Отбор проб с более крупных площадей. Среднюю пробу бе¬
рут так же, как указано выше. Если имеются повторности, то
проба составляется для двух повторностей; с каждой повтор¬
ности необходимо собрать урожай не менее чем с 20 растений.
При выборе растений для средней пробы делянку делят двумя
диагоналями м сбор урожая проводят с растений, расположенных
по диагоналям (за исключением бракованных растений). Одно¬
временно таким же образом собирают урожай сорта, который
служит стандартом.Общая величина средней пробы должна быть не менее 3 кг
(для крупноплодных — не менее 10 кг) и должна составлять для
томатов и картофеля не менее 40—50 плодов и клубней, перца
60—80 стручков, огурцов, кабачков, баклажанов 35—40 плодов»
лука и чеснока 20—25 луковиц, бахчевых и капусты — 20 пло¬
дов и кочанов, а вес средней пробы листовых овощей должен
составлять не менее 1,5 кг.При большом количестве повторностей овощи собирают по
диагоналям с 3—5 растений от каждой повторности.Для оценки кочанной и цветной капусты, а также крупно¬
плодных бахчевых берут по 5—6 кочанов или плодов с каждой
повторности.Среднюю пробу картофеля, топинамбура и батата состав¬
ляют от 5 кустов с каждой повторности. Объединенную пробу
рассыпают в квадрат и делят диагоналями на 4 части. Из двух
противоположных частей квадрата берут пробу урожая расте¬
ний и еще раз делят. Полученная проба должна составлять 3—4	кг.Среднюю пробу зеленой массы листовых овощей (шпината,
щавеля, салата, укропа и др.) отбирают в одинаковой фазе
роста, до выбрасывания стрелки. Отбор пробы производят по
двум повторностям, по диагонали. В период до бутонизации
срезают половину листьев от каждого растения таким образом,
чтобы вошли верхние, нижние и средние листья. Общий вес
пробы должен быть не менее 2,5 кг.Средние пробы плодов и ягодЕсли отдельные сорта семечковых (яблони, груши, айвы),
цитрусовых, граната, хурмы и других культур, аналогичных по
величине плодов, представлены 1—3 деревьями, то при оценке
их химического состава лучше делать анализы урожая отдель¬
ных деревьев, так как для характеристики сортов такого количе¬
ства деревьев недостаточно. Для оценки плодов отдельных де¬
ревьев необходимо иметь 15—20 плодов, отобранных из общего
урожая дерева, куда должны войти крупные, мелкие и средние
плоды, а также плоды с освещенной и затененной частей дерева
(с разных ярусов кроны). Общий вес средней пробы мелкоплод¬
ных плодов должен быть не меньше 1 кг.13
Аналогичным образом берут пробы косточковых культур
(сливы, черешнн, вишни, кизила, абрикоса и др.).Среднюю пробу урожаев ягодных культур (земляники,
малины, крыжовника, смородины, винограда) составляют, как
правило, с 10 растений. Пробы для анализа собирают в период
массового созревания с разных сторон растения. При этом обя¬
зательно принимаются во внимание урожаи отдельных растений,
т. е. в пробу берут плоды пропорционально от низкоурожайных
и высокоурожайных растений. Обший вес средней пробы ягод
должен быть не менее 1 кг.Сбор проб винограда производят в период массовой
уборки, причем гроздья берут с различных сторон куста по от¬
ношению к странам света и с различных ярусов куста. Нельзя
оценивать по средним пробам сорта, растущие на разных скло¬
нах (южных, северных).Для сортов винограда, используемых в виноделии, кроме
анализа в обычном состоянии — полной зрелости плодов, тре¬
буется несколько последовательных определений сахара и кис¬
лотности в период, предшествующий полному созреванию,
а иногда и по достижении созревания.Отбор пробы урожая масличных орехоплодных
(грецкого ореха, фундука, миндаля, фисташки) производят так¬
же с учетом условий выращивания, фаз развития и других приз¬
наков. После просушки и очистки орехов от наружного около¬
плодника урожай каждого дерева ссыпают вместе, пробу пере¬
мешивают, раскладывают в форме квадрата, делят двумя диа¬
гоналями «а 4 треугольника. Для средней пробы берут орехи,
заключенные в двух противоположных треугольниках, уменьшая
пробу до веса 1000 г. Орехов в пробе должно быть не менее
100 шт.Отдельные деревья грецкого ореха и фисташки могут пред¬
ставлять самостоятельный интерес, и поэтому следует характе¬
ризовать плоды каждого дерева. С небольших молодых деревьев
для анализа следует брать не менее 25 орехов.Для оценки сортов древесных ai кустарниковых плодовых от¬
бор проб производят по средним пробам, собранным не менее
чем с 10 растений, растущих по различным участкам больших
садов, и не менее чем с 5 растений, растущих на однородных,
выровненных участках.Общее количество плодов в каждой средней пробе должно
быть не менее 50—60, общий вес средней пробы для мелкоплод¬
ных сортов—не менее 1,5—2 кг. Оценку химического состава
урожая различных сортов производят по нескольким годам уро¬
жая.Для каждой группы сортов ранних н поздних сроков созре¬
вания один сорт принимается в качестве образца для сравнения
или индивидуальной оценки; в качестве стандарта выбираются
определенные растения.14
Оценку химического состава всех плодов культур производят
по наиболее типичным сборам, например в период массового
созревания. Плоды ряда субтропических культур (цитрусовых»
японской хурмы, маслины), а также зимние сорта яблок и груш
достигают полного созревания после снятия с деревьев. В связи
с этим оценку таких сортов производят в 2 срока — вскоре после
съема и после некоторого периода хранения, продолжительность
которого зависит от сорта и определяется по максимальной са¬
харистости сорта и по другим признакам.Подготовка проб овощей
и плодов к анализуВсе плоды и овощи перед анализом превращают в однооб¬
разное, измельченное состояние с помощью различных лабора¬
торных размельчителей. Средние пробы овощей и плодов, посту¬
пившие в анализ, очищают от всяких внешних загрязнений. Так,
перед измельчением капусты удаляют верхний слой зеленых и
загрязненных листьев, кочерыги также удаляют (если требуется,
их анализируют отдельно). У репчатого лука удаляют верхние,
отмершие чешуи.Клубни картофеля, корнеплоды (брюквы, свеклы, моркови и
др.) промывают в воде и очищают щеткой или куском паралона,
а затем просушивают на воздухе.Плоды (яблоки, груши, сливы, айву, абрикосы, вишни, пер¬
сики, японскую хурму) размельчают без улалешія кожицы. Из
яблок и груш удаляют чешуйчатую ткань, служащую ложем для
семян (она богата пектином и гемицеллюлозами). Эту ткань с
семенами можно удалить при помощи сверла для пробок.Для отделения косточек у черешни, ВИШНИ, К2!3!!Ла, сливы их
плоды помещают в размельчите.™ тканей (рис. 2), и после того,
как мякоть превратится в гомогенную массу, косточки отделяют,
пропуская размельченную массу через редкое капроновое сито.С плодов апельсина и мандарина удаляют кожуру, плотно
прилегающую к мякоти. Анализ кожуры производят отдельно.
Орехи очищают от плотной оболочки и анализируют ядро.С плодов арбуза, дыни, тыквы снимают корковый слой, не
употребляемый в пищу, и исследуют только съедобную часть,
отделив ее от семян.Томаты, перцы, баклажаны, огруцы анализируют с семенами
(при этом процент семян необходимо учитывать). В тех спе¬
циальных случаях, когда нужно иметь данные анализа для од¬
ной мякоти, семена тщательно выделяют из анализируемой мас¬
сы. Удаляют и семена из плодов бахчевых (а также семечковых,
винограда, цитрусовых, косточковых и т. д.). Для отделения
семян следует пользоваться ейтами из капрона, через которые
пропускают или протирают мезгу.15
Отобранная средняя проба некоторых объектов слишком
громоздка, и для анализа нет нужды измельчать всю среднюю
пробу. Поэтому из нее составляют меньшую по объему и весу
лабораторную пробу, но так, чтобы в ней были пред*
ставлены все компоненты исходного образца. Для капусты, на¬
пример, берут только по четверти нлн меньшей части от каждого
кочана или головки, стеблеплода. У листовой капусты обрывают
листья с одной стороны растений. Так же поступают с брюссель¬
ской «капустой. Отобранные части растений грубо измельчают
на шинковке <и отсюда берут около 1—2 кг для последующего
измельчения и анализа. От арбузов и дынь берут только по '/>
пли Ч* плода. Эти части плодов разрезают на более мелкие
части, перемешивают и из общей массы берут 1—2 кг для из¬
мельчения. У крупных корнеплодов (брюквы, турнепса) также
берут 'A или '/в часть от каждого корнеплода.Плоды тыквы (в том числе и кабачка) достигают очень круп¬
ных размеров и в состоянии полной зрелости находятся в ча¬
стичном одеревенении. Их следует расіпшіть на сегменты в
6—8 см по окружности плода (от плодоножки) н для составле¬
ния пробы взять по нескольку сегментов от каждой зоны плода.Среднюю пробу таких листовых овощей, как шпинат, салат,
укроп и пр., удобнее измельчать целиком. Если хотят уменьшить
лабораторную пробу, то измельченный материал после тщатель¬
ного перемешивания рассыпают на дне большого кристаллиза¬
тора и разделяют по диагоналям на 4 равные части. Берут 2
противоположные части, перемешивают, и если нужно, повторяют
разделение таким же образом.Измельчение удобно производить на размельчителе тканей
(рис. 2) или на универсальном кухонном комбайне, имеющем
различные приспособления для размельчения. Размельчитель
тканей удобно использовать для овощных и ягодных культур,
содержащих большое количество воды в тканях и имеющих не
очень плотную (огурцы) или сочную (томаты, ягодные куль¬
туры) мякоть.Очень существенным показателем при оценке видов и сортов
является средний вес 1; 10 или 100 шт. плодов или используемых
в пищу органов овощных растений. Поэтому перед тем, как при¬
ступить к измельчению и подготовке образцов к анализу, про¬
изводят взвешивание и подсчет числа плодов, корней и т. п.Средние пробы
кормовых растенийХорошо взятые средние пробы кормовых трав для химиче¬
ского анализа обеспечивают достоверность результатов и пра¬
вильную оценку* образцов. При взятии проб для биохимической
оценки необходимо принимать *во внимание не только условия
выращивания (чистоту и равномерность травостоя), но и фазу16
роста, состояние развития и степень облиственности. По харак¬
теру вегетативной массы все главнейшие кормовые культуры
можно разделить на 2 группы: с большой зеленой лнстостебель-
ной массой (клевер, люцерна) и с малой листостебелыюй массой
(тимофеевка, костер и др.). Главное условие правильного взя¬
тия полевой пробы — отбор растений в таком соотношении,
чтобы взятая проба вполне отображала химический состав
материала.Отбор проб вегетативной массы отдельных растений. Дляправильной оценки химического состава отдельных растений по¬
следние должны быть выращены в одинаковых условиях. Расте¬
ния срезают в одно и то же время —в 8—10 часов. Сразу после
дождя или полива пробы брать не следует. У силыюкусристых
растений с большой листостебельной массой (люцерны, клевера,
мятлика, овсяницы) срезают около */з куста, а у некоторых зла¬
ковых (тимофеевки, костра)—не менее !/г куста. Свежие рас¬
тения помещают в пакеты, изготовленные из водонепроницае¬
мых пленок, и снабжают этикеткой с необходимыми сведениями.Отбор проб с небольших делянок. На мелкоделяночных по¬
севах, которые должны быть как минимум в двух повторностях,
срезают от '/а до '/г куста и не менее как с 10 растений в разных
местах делянки каждой повторности. Злаковые срезают целиком.Другой прием сбора состоит в том, что по диагонали срезают
не менее 10 растений через одинаковые интервалы или через
один рядок на делянке в каждой повторности. Для сравнения
различных образцов необходимо иметь данные по стандартному
образцу, который высевают через каждые 5—10 образцов и также
берут пробы для анализов.Отбор проб с более крупных площадей. Пробы растений от¬
бирают со всех повторностей опыта. На каждой повторности по
диагонали срезают по V* куста от 10—15 растений и помещают
в мешки (лучше из водонепроницаемого материала). В дальней¬
шем для анализа поступают пробы от каждой повторности или
средняя проба со всех повторностей.Сбор растений на значительных площадях рядового и гнез¬
дового посевов производят по двум диагоналям участка. По
каждой диагонали через равные промежутки срезают по '/з—'Л
куста от каждых 10—15 растений, что доставит пробы 20—30
растений. Уменьшение объема пробы допустимо после предвари¬
тельного грубого измельчения образца.Большое внимание должно быть уделено составлению сред¬
них проб листостебельной массы тачнх растений, как кукуруза,
сорго, подсолнечник, топинамбур, кормовая капуста и другие
однолетние растения, используемые для кормовых целей. В этих
случаях срезают на высоте 10—12 см от земли 10 растений.
Отобранные образцы, перевязанные и снабженные этикеткой
с необходимыми сведениями, должны сразу же поступать в ла¬
бораторию для подготовки к анализу.
Для уменьшения веса взятых растений каждое из них разре¬
зают вдоль на 2 части, одну из которых употребляют для анализа.Дальнейшее деление пробы допускается только после из¬
мельчения всех проб на отрезки длиной 1,5—2 см.Подготовка проб
кормовых растений к анализуСреднюю пробу растений, взятую в поле в тот же день, об¬
рабатывают в зависимости от целей изучения и предполагаемых
анализов. Для химической оценки высушенных образцов (сена)
по общему содержанию химических веществ срезанные растения
в виде снопов (лучше в капроновой сетке) подвешивают на
укрепленных жердях в крытых помещениях. Когда растения до¬
стигнут воздушно-сухого состояния, их помещают в марлевые
мешки. Применение марлевых мешков необходимо для того, что¬
бы предупредить потери листьев высушенных растений. Однако
часто необходимо знать содержание сухих веществ в листосте¬
бел ьноА массе; в этом случае взвешивают пробы (снопы) перед
сушкой и после высушивания до воздушно сухого состояния
и, определив содержание влаги в сене, вычисляют в исходном
образце содержание сухих веществ в процентах (стр. 26).Для анализа отдельных органов растения их сразу разделяют
на части (работу ведут в тени) и каждую часть высушивают
в марлевом мешке; стебли прн этом лучше разрезать на части.Для оценки химического состава растений в свежем виде
взятые образцы (пробы) немедленно измельчают и приступают
к их обработке, направленной к прекращению деятельности фер¬
ментов. Под влиянием различных ферментов в срезанных расте¬
ниях происходит распад белковых веществ, полисахаридов и дру¬
гих соединений, что не позволяет получить правильного представ¬
ления о первоначальном химическом составе взятых образцов.Для этого измельченные на стеблерезке или другим путем
пробы помещают рыхлым слоем в кюветы (эмалированные) или
алюминиевые пластины н прогревают в стерилизаторном шкафу
и здесь же высушивают. Можно обрабатывать также паром,
поместив листостебельную массу в алюминиевых ситах (диаметр
18—20 см) на 10—15 минут над кипящей водой в большую
кастрюлю. После этого потерявшую тургор листостебельную
массу высушивают в термостате (с вентиляцией или без нее).Высушенные до воздушно-сухого состояния пробы листосте¬
бельной массы перед размельчением до необходимого помола
подсушивают в течение 3—4 часов при 45° и еще в теплом состоя¬
нии размельчают на мельнице или мясорубке до грубого помо¬
ла затем отделяют часть последнего и размельчают до более
тонкого помола на мельнице типа «Пируэт». Измельченный ма¬
териал хранят в стеклянных банках с пробкой или в пакетах
из поливиниловой пленки в эксикаторах.1S
Средние пробы каучуконосных
и дубильных растений
и подготовка их к анализуСпособ взятия средней пробы каучуконосных и дубильных рас¬
тений для анализа зависит от распределения каучука или тан-
нидов в органах и тканях растений.Каучуконосные растения накапливают каучук в паренхим¬
ных клетках листьев, стеблей или корней (ваточник, золотарник,
гваюла и др.). Ваточник, кроме того, имеет в стеблях и череш¬
ках листьев нечленистые млечники, в которых также отклады¬
вается каучук, но в форме латекса. Содержание каучука у ли¬
стовых и паренхимных каучуконосов зависит от возраста ли¬
стьев, степени инсоляции растений и пр. Старые листья содержат
обычно больше каучука, чем молодые. Хорошо освещенные ра¬
стения содержат больше каучука, чем выросшие в тени. Следо¬
вательно, при составлении средней пробы паренхимных и листо¬
вых каучуконосов необходимо учитывать условия их роста, воз¬
раст, состояние развития растений и пр. Подробная методика
отбора проб для анализа корневых каучуконосных растений из¬
ложена в первом издании этой кннги *.Дубильные вещества, или танннды, широко распространены
в растениях; они образуются и накапливаются в листьях, обо¬
лочках семян и плодов, в коре стеблей и корней травянистых н
древесных растений.При отборе средних проб дубильных растений, растущих на
плантациях или в диком состоянии, необходимо принимать во
внимание условия их роста, особенно освещенность или затенен¬
ность, возраст и характер образования и накопления дубиль¬
ных веществ в различных частях растений. Все танниды раст¬
воримы в холодной воде и гидролизуются под влиянием фермен¬
тов плесневых грибов. Поэтому дубильное сырье нужно хорошо
высушивать и предохранять от увлажнения и плесневеиня.Сушат дубильный материал в тени и при невысоких темпе¬
ратурах, так как действие солнечных лучей снижает процент
дубильных веществ, а высокая температура усиливает окисле¬
ние их с образованием нерастворимых фракций. Обычно перед
высушиванием материал подвяливают в тени до 20—30% влаж¬
ности, а затеи досушивают при 50—60° до воздушно-сухого со¬
стояния. Хорошо высушенный материал должен быть ломким
и не гнуться в руках при надавливании. Во время высушивания
материал необходимо несколько раз переворачивать для равно¬
мерной аэрации. Листья (скумпии, нарезанные листья бадана и
пр.) сушат на деревянных настилах с просветами (для аэрации).•А. И. Ермаков, В. В. Ар ас и мов нч. М. II. С м и р и о в а-ll к о и-
ii и к о в а. П. К. М у р р н. Методы биохимического исследования растений.
Ссльхозгиэ. 1952.19
Определение
содержания воды
в растительных
глава и объектах*Значение содержания воды
при биохимической оценкеСодержание воды, или степень оводнснности, является важ¬
ным показателем физиологического состояния растений. Опре¬
деление содержания воды в растительных объектах тождест¬
венно определению содержания в них сухого вещества, так как
остаток растительной массы (после определения количества со¬
державшейся в них влаги) и является сухим веществом. Содер¬
жанке воды (или сухого вещества) имеет большое значение при
сравнительной оценке качества сорта, приемов выращивания ра¬
стений, повышающих их урожай. Следовательно, точное опреде¬
ление содержания воды необходимо для оценки качества уро¬
жая и особенности плодовых, овощных и кормовых растений.
Содержание воды в семенах зависит от особенностей их состава
и относительной влажности и температуры воздуха и других
условий созревания и хранения. Обычно результаты химиче¬
ских анализов относят к сухому веществу.Вода в растительных объектах находится в трех формах: в
виде свободной, слабо связанной и прочно связанной воды.
Свойства этих форм резко различны. Свободная вода способ¬
на замерзать при температуре около 0° н служит растворителем
различных веществ. Эта иода является более подвижной, чем
связанная вода. Последняя очень прочно соединена с коллоид¬
ными веществами, образует наружную водяную оболочку колло¬
идов и не является растворителем. Слабо связанная вода замер¬
зает при более низкой температуре. В процессе роста и развития
растений, прн созревании плодов и семян изменяется соотноше¬
ние между свободной и связанной водой. Уменьшение КОЛИЧЄСТП.І
связанной воды может служить признаком изменения (старения)
коллоидной системы. В листьях засухоустойчивых или морозо¬
стойких сортов повышено содержание связанной воды. Раз¬
дельное определение свободной и связанной воды представ¬
ляет большой интерес. Содержание свободной воды подвержено
большим изменениям в различных органах, особенно в ли¬
стьях.20
Содержание воды в ядрах масличных семян всегда меньше,
чем в семенах зерновых, бобовых и других немаслмчных расте¬
ний. Чем больше масла в ядре семян, тем меньше в них воды
(табл. I). Так называемое критическое содержание воды (после
превышения которого наступает энергичное дыхание семян) в
масличных семенах значительно ниже, чем в немасличных се¬
менах. Однако, если рассчитать содержание воды на гидрофиль¬
ную часть масличных семян (исключив масло), то процент воды
в различных покоящихся масличных семенах практически не
будет отличаться от крахмалисто-белковых. В воздушно-сухих
семенах связанная вода составляет значительно больший про¬
цент.ТАБЛішА i	Содержание воды в овощах, плодах а семе¬мах различных растений(в процентах на сырое вещество)К\'ЛЬТ\ри (плоды
її ьорнсімоли)BojjКультуры (сем«нэ)ВолОгурцы, томаты, баклажаны.Горох, фасоль, бобы, нут,10-17стручковый перец 	92—1*7вигиа, чечевица	Пшеница, рожь, ячмень, овес.Брюква, морковь, свекла сто-м>- <г>10-16ЛОВЗЯпросо, гречиха, кукуруза . .Картофель, батат, цикорий.72—К>Соя, лен, горчица, рапс . . .5-9пастернак 	Арахис, кунжут, клещевина.4-6Яблоки, груши, сливы, абри-подсолнечник 	КОСЫ •••••••»«•»•70-90Травы (листостебельная мас-70-88Черешня, вишня, персик, кры¬76-<Южовник, смородина черная . .В свежих овощах н плодах находится главным образом сво¬
бодная вода. При наличии большого процента свободной воды
процессы обмена протекают наиболее активно. Овощи (корне- и
клубнеплоды) состоят не менее чем на 75—80% (по весу) из
воды.Правильное определение содержания воды зависит не только
от методов самого анализа, но и от способов составления и под¬
готовки пробы исследуемого растительного материала.Было бы, например, неверно оценивать сорта овощей по со¬
держанию воды, если уборка их произведена в один и тот же
срок, а анализ выполнен через различные периоды хранения.
Сравнительный анализ отдельных сортов необходимо произво¬
дить в один и ют же срок, причем один из этих сортов должен
служить в качестве стандарта н повторяться в посеве.Нели доставка проб к месту анализа занимает 2—3 часа, то
взятые пробы помещают в поливиниловые пакеты для предо¬
хранения от потерь волы. Пакеты с пробами взвешивают на
месте составления проб и повторяют взвешивание в лаборато¬
рии (для внесения поправок на содержание воды).
Определение содержания
вооы в семенахОпределение общего содержания воды. Метод основан на
измерении определенной массы (веса) семян до и после высуши¬
вания в сушильном шкафу при 100—105° до постоянного веса.Вода в семенах различного физиологического состояния на¬
ходится в свободном и связанном виде. Свободная вода более
подвижна, нежели связанная, которая удерживается коллоидными
и другими веществами с различной степенью прочности. В про¬
цессе прорастания, роста и созревания семян изменяется соотно¬
шение между свободной и связанной водой. В воздушно-сухих
семенах связанная вода составляет значительный процент. Ниже
приведен метод определения общего содержания воды.Для этого берут из средней пробы по 2,5—5 г свежеразмо-
лотого (до крупного помола или в муку) зерна в сухие и взве-
шанные бюксы (лучше одного размера, что обеспечит одинаковую
толщину слоя материала). Затем бюксы закрывают крышками и
взвешивают с точностью до 0,5—1 мг. Взвешивание может быть
ускорено, если в бюксы насыпать изучаемый материал равными
объемами при помощи стаканчика или пробирки с меткой.Бюксы ставят в термостат вместе со снятыми с них крыш¬
ками и сушат 4—6 часов при 100—103°. Затем бюксы закрывают
крышками н охлаждают в эксикаторе; охлажденные бюксы взве¬
шивают на тех же весах. .После этого вновь сушат их в термоста¬
те 2 часа, вынимают, охлаждают и взвешивают. Обычно прн
этом разница во взвешивании составляет не более 2 мг. Вычисле¬
ние процента воды производят по формуле:где: д: — процент воды;а — вес павески до высушивания;
в i — вес навески после высушивания.При наличии сушильных шкафов с хорошо действующими тер¬
морегуляторами сушку проводят, используя вечернее и ночное вре¬
мя (с 17 до 10 часов), прн температуре 80—85°, а затем, повы¬
сив температуру до 105°, дополнительно сушат в течение часа.
Опыт показал, что за этот период происходит полное высушива¬
ние материала.Средние пробы мелких семян (мака, рапса, горчицы, проса,
сорго и др.) сушить можно без предварительного их измельче¬
ния в обычных условиях. Этим избегают возможных ошибок за
счет окислення масла. Крупные масличные семена грубо измель¬
чают и сушат прн 100—105° в течение 3—4 часов, а затем,
после дополнительной сушки в течение часа, охлаждения
в эксикаторе и последующего взвешивания, убеждаются22
в полноте высушивания. Расхождения между параллельны¬
ми определениями не должны быть больше 2% (относи¬
тельных).Определение воды в эфирномасличных семенах. В семенах,
содержащих до 1% эфирного масла, количество воды опреде¬
ляют высушиванием в термостате. Такой способ определения во¬
ды не дает совершенно точных результатов, так как при сушке
вместе с водяными парами частично улету¬
чивается и эфирное масло. Поэтому для бо¬
лее точного определения содержания воды
применяют следующий способ.В семенах, содержащих больше 1%
эфирного масла, определение воды произ¬
водят в приборах Дина и Старка или в ана¬
логичных приборах. По этому же методу
определяют воду в масличных семенах, со¬
держащих сильно высыхающие масла (см.
ниже). Принцип метода основан на пере¬
гонке двух несмешивающихся жидкостей,
каждая из которых сохраняет свойственную
ей упругость пара. Упругость пара такой
смеси будет равна сумме упругости паров
каждой жидкости. Поэтому температура
кипения этой смеси всегда ниже темпера¬
туры кипения каждой жидкости в отдель¬
ности. Для определения волы пригодны
ЖИДКОСТИ с плотностью ниже плотности
воды. Обычно для перегонки применяют
прогретый для удаления воды тракторный
лигроин, керосин или автобензнн, из кото¬
рого отогнаны фракции, кипящие при тем¬
пературе ниже 95°.Прибор Дина и Старка (рис. 3). При¬
бор состоит из трех частей: металлической
или стеклянной круглодонной короткогор-
лой колбы 2 объемом 500 см', стеклянного
холодильника 3 и приемника-ловушки /
с измерительной трубкой. Стеклянный при¬
емник представляет собой градуированную
пробирку с краном или без крана на конце.Приемник градуирован от 1 до 5 (или 10)
см* через 0,2 см3, а от 0 до 1 см1 — через 0,05 см3. Градуировка
и проверка приемника производится при 20°. К верхней части
градуированной пробирки на расстоянии 40—50 мм от верхнего
края пригнана под углом 60° отводная трубка, которая на рассто¬
янии 40 мм отогнута вниз и идет параллельно градуированной
ловушке. Длина ловушки 150—200 мм, диаметр 15 мм. длина от¬
водной трубки 150—200 мм, диаметр 12—14 мм. Точность опре-Рис. 3. Современная
модель прибора Дина
и Старка (объяснение
в тексте).
деления воды по этому методу зависит от точности градуировки
измерительной трубки и общего измеряемого количества воды.Работа с прибором начинается с того» что отвешивают по
10—12 4:0,01 г свежензмельченных до грубого помола семян «
высыпают в металлическую колбу, в которую наливают 200 сиг3
лигроина или другой гидрофобной жидкости, туда же помещают
несколько кусочков пемзы, но лучше — обрезки Платины. Соеди¬
няют части аппарата, пропускают воду через холодильник и
колбу нагревают на песчаной бане или другим прибором.Перегонку ведут так, чтобы в ловушку падало по 2—4 капли
в секунду. Если в трубке холодильника иод конец отгонки задер¬
живаются капли воды, то эту воду сталкивают стеклянной па¬
лочкой с резиновым наконечником или непродолжительным бо¬
лее сильным кипячением. Обычно перегонка длится около часа,
и ее прекращают, когда объем воды в приемнике перестает уве¬
личиваться и верхний слой растворителя в ловушке становится
прозрачным. Если растворитель в приемнике остается мутным,
то приемник помещают на 20—30 минут в горячую воду (для
осветления), охлаждают до комнатной температуры и только
после этого делают оїсчетьі. Процент воды (л) в образце вычис¬
ляют по формуле:0,998 - 100а
х 	н	*где: 0,998 — плотность воды при 20°:
в —объем воды;
н — навеска.Для серийных определений могут быть собраны агрегаты из
нескольких приборов. Лучше к каждому прибору иметь по
2 приемника.Этим методом можно также оиоеделять количество воды в
богатых водой материалах (плодах и вегетативных органах) и
в товарных образцах растительных и животных масел.Определение воды в плодах,
овощах и картофелеКоличественное содержание воды в богатых ею растительных
материалах является очень важным показателем. Обычно на¬
вески подготовленного свежего материала сушат до воздушно¬
сухого состояния в >словиях, исключающих закисание, а затем
уже досушивают до постоянного веса, избегая подгорания.В каждую из 2 -3 плоских чашек Коха или Пегри берут на
технических весах навески свежеразмельченной и тщательно пе¬
ремешанной массы (мезги) по 25 или 50^0,01 г. Обычно каж¬
дую чашку заранее взвешивают с точностью до 0,01 г и вес ее
записывают на матовой боковой поверхности, сделанной при по*24
мощи наждачного бруска. Для неоднородного по структуре ма¬
териала навеску следует увеличить до 100 г, что способствует
уменьшению расхождений цифр между параллельными опреде¬
лениями. Взвешенные чашки с навесками помещают в сушиль¬
ный шкаф,* предварительно нагретый до 120°, и прогревают 20—
25 минут для инактивации ферментов. Затем температуру пони¬
жают до 100°, и по истечении 2—3 часов сушки материал в чаш¬
ках Коха принимает консистенцию густой массы. Дальнейшую
сушку навесок производят при температуре 80—85° (с 17—18
часов до 9 часов утра следующего дня). Утром поднимают тем¬
пературу в сушильном шкафу до 100° и сушат еще 1,5—2 часа,
после чего чашки переставляют для охлаждения в эксикатор и
затем быстро взвешивают на технических весах с точностью до
0,01 г. Для контроля полноты высушивания ставят в термостат
несколько чашек Коха с сухим веществом и подсушивают еще
час; вновь охлаждают и взвешивают. Если между первым и
вторым взвешиванием изменений в весе нет или они составляют
несколько сотых грамма, то сушку считают законченной для всей
партии.Разница в весе между чашками с высушенной навеской и пу¬
стой дает процентное содержание воды, если была взята сырая
навеска в 100 г; если навеска 50 г, результат надо удвоить, а
при навеске 25 г — учетверить.Определение сухого вещества является очень важным и от¬
ветственным процессом. Поэтому эти определения следует де¬
лать в трех повторностях в тех случаях, когда исследуемый ма¬
териал имеет неоднородную структуру (лнстостебельная масса
и др.).При массовых определениях влажности необходимо иметь3—4 сушильных шкафа. В начале сушки следует избегать пони¬
женных температур (до 50°), так как в сильно загруженных су¬
шильных шкафах возможны не только автолитнческие, но и
микробиологические процессы, вызывающие брожение и гние¬
ние. Для ускорения обезвоживания удобнее пользоваться су¬
шильными шкафами с принудительной вентиляцией.Вычисление процента сухого вещества (х) производят по
формуле:где: н —навеска сырой мякоти до высушивания ( в г);«j — навеска после высушивания (в г).Например, в чашку Петрн помещено 50 г размельченных кор¬
неплодов моркови. Вес чашки с навеской после высушивания*	Обычно на каждую полку ставят чашки с навесками в один ярус, а за¬
тем. после подсушивания, ставят в два яруса, чтобы повысить пропускную
способность сушильного шкафа.25
53,45 г, а вес пустой чашки 47,17 г. Тогда 53,45—47,17 = 6,28 г,
что соответствует содержанию сухого вещества в навеске, а в
процентах будет 6,28 X 2 = 12,56.Для количественного определения воды в овощах, плодах и
ягодах, не имеющих плотной структуры (томаты, малина и др.),
среднюю пробу размельчают и перемешивают на размельчителе
тканей, отвешивают на техноаналнтических весах по 25 —50 г и
помещают их в чашки Коха или кристаллизаторы. При этом
каждый кристаллизатор снабжается стеклянной палочкой (вес
ее входит в вес тары) для перемешивания материала во время
просушки, так как обычно образуется корка и материал не про¬
сыхает.Определение воды
в вегетативных частях
растенийДля определения воды в свежеубранной зеленой лнстосте¬
бельной массе материал размельчают электрической стеблерез¬
кой или в деревянной чашке сечкой, хорошо перемешивают и из
обшей массы берут 2 параллельные навески по 25—50 г на тех-
ноаналнтическнх весах в чашки Коха, кристаллизаторы или фар¬
форовые чашки диаметром 9—10 см.Чашки Коха с навесками помещают на 20—30 минут в су¬
шильный шкаф, прогретый до 120—130°, а затем высушивают
при 105° в течение 4—6 часов. Далее поступают так, как сказано
выше (стр. 25).Определение воды в воздушно-сухом лнстостебельном мате¬
риале производят так же, как в семенах.Навески, взятые после измельчения, сушат сразу при темпе¬
ратуре 100—105°.Если воздушно-сухой материал не был размельчен перед кон¬
сервированием и находится в виде снопов, то его грубо измель¬
чают на механической стеблерезке или садовыми секаторами.
Затем перемешивают, отделяют половину или меньшую часть и
ее размельчают до более мелкого состояния, пропуская через
лабораторную мельницу или мясорубку.Рефрактометрический метод
определения сухого веществаМетод основан на неодинаковом преломлении луча света,
проходящего через растворы различной концентрации. Чем выше
концентрация веществ в растворе, тем больше показатели пре¬
ломления. Для быстрого нахождения процента сухих веществ по
показателям преломления составлены специальные таблицы.26
Точность определения колеблется около 0,2%. Этим методом
можно бистро определять концентрацию сухих веществ в соках
плодов, ягод, корнеплодов, а также в вытяжках.Аппаратура: 1) рефрактометр, размел ьчитель тканей, лабораторный пресс;
2) мясорубка, сокоотжатель или терка: 3) чашка или стеклянный кристал¬
лизатор; 4) сверло (бур) для взятия проб в виде «свечей» диаметром
10—15 мм; 5) бюксы или банки.Определение сухого вещества в соке корнеплодов. Из сред¬
ней пробы свежих корнеплодов (по крайней мере 10 корней) по
главной оси вырезают '/« корня. Все это измельчают на мясо¬
рубке, перемешивают и из части мезги прессом отжимают сок
и фильтруют его.Для оценки отдельных корнеплодов при отборе на повышен¬
ное содержание сухого вещества из каждого корня отобранной
партии берут пробы (в виде «свечи», сверлом для пробок) под
углом около 60° к главной оси корня *. Эту пробу тотчас же рас¬
тирают на терке, под которую подложено стекло или резиновая
пластинка. Мезгу собирают пипеткой в бюксы или широкие уко¬
роченные пробирки с обрезанным носиком или трубочкой, на
один конец которой надевается резиновая груша, а в другой
вставляется ватная пробка-фильтр, и набирают I—2 сл/3 прозрач¬
ного сока. Не следует применять отжимание сока корнеплодов
через марлю, так как это всегда приводит к попаданию мельчай¬
ших песчинок на призмы рефрактометра и к его порче. Пипеткой
наносят несколько капель сока на призму рефрактометра (см.
рис. 4). Выдерживают 1—2 минуты, чтобы слой испытуемого
сока принял температуру, при которой проводится определение
(около 20°), и, доведя поворотом винта до четкой границы раз¬
дела поля на 2 части (темную или серую и светлую), делают от¬
счет. Граница раздела должна быть резкой, без переходов. Из
сделанных 3—5 отсчетов вычисляют средний показатель прелом¬
ления. Для каждого образца сока проводят 2 последовательных
определения. Показатель преломления зависит от температуры,
поэтому прн каждом определении записывают температуру, ко¬
торая поддерживается на уровне комнатной при помощи ульт¬
ратермостата (рис. 5) или другим способом. Так как таблицы
составлены для показателей преломления прн 20°, то в случае
отсчета при температурах ниже пли выше на каждый градус
вносят поправку. Например, при 22° показатель был равен
1.3500, что соответствует 12% сухого вещества, поправка4-0.13%, следовательно в соке содержится 12,13% сухого веще¬
ства.Определение сухого вещества в соке томатов, арбузов, дынь.Из приготовленной измельченной средней пробы берут около
100 г вещества и прессом или руками через ткань отжимают сок*	После взятия пробы корни могут быть сохранены для посадки.27
в фарфоровую чашку или стеклянный кристаллизатор. Отжатый
сок перемешивают, фильтруют через бумажный складчатый
фильтр в колбочку или набирают чистый сок стеклянной трубкой
с ватным фильтром (см. рнс. 31). Первые порции сока не упо¬
требляют, оставляя дли анализа только прозрачный сок, который
держат в закрытых колбочках.Определение показателей преломления обычно производят
при комнатной температуре, при электрическом или дневном
свете.Для каждого образца сока делают 2 определения, нз которых
вычисляют среднее и вносят поправку на темперагуру. Затем
в таблице по полученному показателю преломления находят со¬
держание сухих веществ. Десятые доли процента вычисляют
интерполяцией.таблица 2	Определение содержания сухого веществав растворе по найденному показателю пре¬
ломления при 20а
(е процентах сахарозы.)30*"DПроцент
сухого 1МШСС1М20П°Процентсухого•ешестм20”ППроцентсухого■ешестмЖпОПроцентсухого•ешестм1.334411,344881,3557151,3672221.335921,346491.3572161.3689231.337431,3479101.3590171,3706241.338841.349«и1.3605181.3723251.340351.3510121.3622191,3740261,341861.3526131.3638201,3758271.343371.3541141.36552!1.377528В соке растворены главным образом сахара (сахароза, глю¬
коза и др.) и меньше других соединений (органических кислот
и их солей, аминокислот, белковых и пектиновых веществ), по¬
этому этот метод применяется в селекции на сахаристость. Метод
не является точным, однако при наличии большой индивидуаль¬
ной и групповой изменчивости им можно достигнуть хороших ре¬
зультатов.Необходимо указать, что данные получают несколько преуве¬
личенными не только за счет растворимых других органических
веществ, но и за счет связанной воды, которая не входит в со¬
став сока, а удерживается поверхностными частями коллоидов.Примечание. Помимо вышеописанных способов сушки, существуют
методы, позволяющие получать результаты содержания воды через 15—
20 млнут, даже в объектах, очень богатых водой. К таким методам прежде
всего относятся следующие.1.	Радиационное высушивание веществ в открытых алюминиевых стакан¬
чиках инфракрасной лампой мощностью 250—500 вт. Принцип определения28
сухого вещества основан на сильном (Поглощении инфракрасных лучей во*
доґі, благодаря чему она быстро нагревается и испаряется. -2.	Высушивание током высокой частоты. При этом навеска помещается
между электродами и равномерно прогревается по всей толщине, что позво¬
ляет сократить время сушки до трех минут.Определение связанной водыИз существующих методов определения связанной воды реф¬
рактометрический метод наиболее удобен. Принцип метода осно¬
ван на том, что определенная навеска изучаемых объектов поме¬
щается в гипертонический раствор сахарозы известной концент¬
рации. После пребывания навески в таком растворе его концент¬
рация уменьшится за счет извлеченной из навески свободной и
слабо связанной воды. Прочно связанная вода удерживается в
клетке и может быть вычислена по разности между общим коли¬
чеством воды и перешедшей в раствор свободной воды.Реактивы и аппаратура: I) рефрактометр ИРФ-22 или другой марки
(лучше прецизионный); 2) 26—30%-ныЛ раствор сахарозы; 3) конические
колбы на '100 сл3; 4) стеклянные бюксы.Ход анализа. Из свежеиарезанной пробы (дольками или
кружками 1—2 мм толщиной) корнеплодов, плотномясых пло¬
дов или высечки листьев отвешивают около 10 г и помещают в
колбы на 100 см\ в которые прилито по 25 см3 раствора сахара
25- или 30%-іной крепости). Концентрация должна быть точно
определена рефрактометром. Колбы с раствором сахара предва¬
рительно взвешивают, а после добавления навесок исследуемого
материала еще раз взвешивают на точных весах и по разности
узнают точный вес взятой навески и раствора.Затем колбы с раствором и погруженным в него материалом
выдерживают 2 часа (материал должен быть покрыт раствором).
По истечении срока содержимое перемешивают стеклянной па¬
лочкой, дают отстояться и отбирают несколько капель для опре¬
деления концентрации сахара при помощи рефрактометра (о тех*
пике определения см. на стр. 32). После этого по показателю
преломления (табл. 2) находят процент сахара. Одновременно
в отдельных навесках высушиванием до постоянного веса прн
температуре 100—105° определяют содержание воды н вычис¬
ляют, как указано на стр. 25.Количество свободной воды в процентах (д?) вычисляют по
формуле:100(А -В) • В
А=	W-H	•где: А —процент сахарозы в растворе (до опыта);£ — процент сахарозы в опытном растворе после выдержи¬
вания в нем навески;В — вес исходного раствора (в г);
н — навеска исследуемого материала.29
Количество связанно»! воды в процентах находят но разности
между общим содержанием воды и содержанием свободной волы
в процентах на сырое вещество.Рефрактометр ИРФ-22 (рис. 4) служит для определения по¬
казателей преломления в интервале 1,3—1.7 с точностью до
2*10-\ Это более удобный в работе прибор, чем рефрактометр
Аббе. Он состоит из следующих главных частей: корпуса I. на ко¬
тором смонтирована измерительная головка, состоящая из двухРис. 4. Обший рид рефрактометра ИРФ-22 (объяснениев тексте).полушарий, служащих оправами измерительной и осветительной
призм 2, зрительной трубы 3 с отсчетным устройством и термо¬
метра 4. Показатель преломления изучаемых веществ зависит
от температуры, поэтому необходимая температура поддержи¬
вается при пропускании воды через камеры в оправах призм
Очень облегчается регулировка температуры во время опреде¬
лений подачей тока воды универсальными термостатами (типа
Хеплера или Вобсера, рис. 5).Измерительная головка рефрактометра жестко соединена со
шкалой отсчетного устройства, которая помещается внутри кор¬
пуса прибора. Для установления границы раздела и совмещения30
Рис. 5. Универсальные термостаты,
о —Вобсера, 6 - Хо'ілсрз
ее с перекрестием сетки можно наклонять измерительную го¬
ловку до 60°, вращая маховичок, которым находится с противо¬
положной стороны.Для определения показателя преломления сначала включают
нагрев воды в ультратермостате, регулируют температуру и ско¬
рость прохождения воды через рефрактометр так, чтобы термо-
метр, находящийся на выходе волы, показывал около 20 1°.
Затем открывают верхнюю часть головкн и наносят на поверх¬
ность измерительной призмы 3—4 капли жидкости. Осторожно
закрыв головку, наблюдают в окно, чтобы жидкость заполнялаРис. 6. Вид поля и шкалы через оку¬
ляр рефрактометра ИРФ-22.Спраде — поле разделено на 2 частії -
светлую и темную, слева —на шкале пи¬
лен показатель. рааныП 1.6179.зазор между призмами. Зеркало устанавливают так, чгобы свет
от источника через окно равномерно освещал поле зрения, и в
таком положенин его закрепляют винтом. Определения на при¬
боре производят в белом свете. Наблюдая в окуляр трубы и
вращая маховичок, находят границу раздела света н* тени;
устранение окраски на границе раздела достигается вращением
маховичка, расположенного между трубой и измерительными
призмами. На рис. 6 показано поле рефрактометра ИРФ-22 при
отсчете показателя преломления жидкости и соответствующее
его значение (слева).
Определение
активной
глава /// кислотности*Биологическое значение
активной кислотностиОсобенности активной кислотности у различных растений.Скорость различных биохимических процессов управляется
активной кислотностью среды. Многие ферментативные про¬
цессы в растениях регулируются реакцией среды, которая соз¬
дается в результате поступления и образования различных ве¬
ществ (минеральных солей, органических кислот).Культурные растения и их сорта в процессе своего формиро¬
вания (как бнолопическнх особей) приспособились к определен¬
ной активной кислотности почвы. Например, сорта, сложившиеся
в условиях длительного выращивания на кислых почвах, слабо
реагируют на известкование почв; сорта, сформировавшиеся при
выращивании на нейтральных почвах, сильно реагируют на из¬
весткование кислых почв.Концентрация водородных ионов у различных видов и сор¬
тов существенно различается. Плоды и ягоды имеют более вы¬
сокую концентрацию водородных ионов, чем овощи.Точный метод определения концентрации водородных ионов
может быть использован не только для характеристики культур
и сортов, но и для контроля над происходящими изменениями в
растительных материалах в процессе их переработки. В измель¬
ченных корнеплодах свеклы и других растений, листьях шпината
и подсолнечника наблюдаются сдвиги pH в нейтральную и ще¬
лочную сторону в процессе хранения свежей мезги и отжатого
сока.По характеру и быстроте сдвигов в концентрациях водо¬
родных ионов в свежеизмельченных частях растений или хра¬
нившихся в течение какого-то времени можно судить о сортовых
различиях.Эти различия связаны с характером окислительно-восстано¬
вительных и других процессов, поэтому точное определение pH
дает возможность быстро установить происходящие изменения.Следует также подчеркнуть большое значение определетій
pH для различных биохимических методов, например прн изу-2 Заказ Nk 40133
таблица э	Активная кислотность (pH) соков плодови овощейПлоды и я годыpHОвощиpHСлива, алыча, яблоки се¬
верных районов 	Груши, яблоки южных рай-оНОВЧерная и красная смороди¬
на, вишня, малина, лесныеЯГОДЫ •••••••«■«Лимон, клюква	3.2—1.1
3.6-4,63 —3,6
2,1—3,2Корнеплоды, свекла столо¬
вая, морковь, брюква,
редисКартофель, кочанная ка¬
пуста 	Огурцы, дыня, тыква, са¬
харная свекла 	Томаты 	5.8—6,45.8—6,35.9—6,9
4,1-4,6чении и определении ферментов, витаминов, белков и других
веществ.Понятие об истинной кислотности. Вода и водные растворы
диссоциирующих веществ в той или иной степени ионизированы.
В воде непрерывно протекают процессы диссоциации воды на
водородный и гидроксильный ионы и обратное соединение этих
ионов їв недисСоцинроваиные молекулы вэды. Скорость распаде¬
ния воды на ионы пропорциональна действующей массе реаги¬
рующих молекул воды, а скорость образования воды из ее ионов
пропорциональна произведению действующих масс реагирующих
ионов.Это состояние выражается формулой:~ IH ]. [ОНЧ
А" |НаО| •где: К — константа диссоциации, а символы, взятые в квадрат¬
ные скобки, здесь и в дальнейшем изложении выражают кон¬
центрацию.В чистой воде содержится одинаковое численное количество
водородных и гидроксильных ионов. Кислоты в водных раство¬
рах диссоциируют на водородный ион в отрицательно заряжен¬
ный остаток кислоты. От концентрации водородных ионов зави¬
сит истинная кислотность, или щелочность среды. Концентрацию
водородных ионов принято обозначать символом pH. Численное
выражение pH представляет десятичный логарифм числа, пока¬
зывающего количество водородных ионов в граммах на I &к3.
При этом отрицательный знак опущен. Так, содержание водород¬
ных ионов в 1 дм3 0,1 н. раствора уксусной кислоты равно
0,00136 г, или 1,36-10-3. Логарифм этого числа составит 0,1335—
— 3 = —2,86.Если количество водородных ионов выражено в граммах на
1 дм\ например 0,000347, то pH определяют так: Н = 3,47* 1(М,
lg Н = lg 3,47-fig 10-^ - 0,5403 — 4 = —3,4597, или pH 3,46.34
С увеличением абсолютной величины pH количество водород¬
ных ионов в 1 дм3 уменьшается: так, в 1 дм3 при pH 2 содер¬
жится 0,01 г, а при pH 6—только 0,000 001 г ионов водорода.Обычно приходится иметь дело с растворами не крепче нор¬
мальных, т. е. содержащими не более 1 г водородных ионов в1	дм3, что по действию соответствует 1 грамм-атому водорода.
У нормальных растворов pH может быть в пределах от 0 до 14.Для воды константа диссоциации (К) равняется произведе¬
нию концентрации ионов водорода и гидроксила; она выража¬
ется числом 10“,4*н. В чистой воде, имеющей нейтральную реак¬
цию, содержится равное количество Н«НО, т. е. по 10~7 07. От¬
сюда pH для воды будет (!g 10-7,07) = —7 lg 10=7. Следова¬
тельно, в 1 дм3 воды находится 0,0000001 грамм-иона водорода.
В нейтральных растворах количество водородных и гидроксиль¬
ных ионов одинаково, и pH будет равно 7.Понятие о буферностн. Измерение pH растворов сильных
кислот в присутствии слабых концентраций солей этих кислот
показывает, что при разбавлении растворов концентрация водо¬
родных ионов изменяется мало. Совсем иное наблюдается для
растворов слабых кислот и их солей. Величина pH слабых кис¬
лот в значительной степени зависит от присутствия в растворе
щелочных солей этих кислот. Прибавление щелочных солей в
растворы слабых кислот может изменить pH на несколько еди¬
ниц от pH первоначального раствора. Величина Н* соответст¬
вующая сильнокислотной реакции, может быть достигнута при¬
бавлением кислот, а более сильная щелочная среда устанавли¬
вается прибавлением более сильных оснований и их солей. Все
эти смеси называют буферными растворами, или буферными
смесями.Смеси кислот с их солями (буферные смеси) обладают важ¬
ным свойством, состоящим в устойчивом сохранении Н* прн силь¬
ных разведениях. Например, при разбавлении нормального раст¬
вора соляной кислоты 1:100 pH изменяется от 1 до 3, для уксус¬
ной кислоты—от 2,86 до 3,86, при таком же разведении буфер¬
ной ацетатной смеси pH изменяется от 4,63 до 4,73 (или только
на 0,10 единицы pH). Это свойство представляет большую прак¬
тическую ценность. Однако буферзюе действие этих разбав¬
ленных растворов понижается. Всякий буферный раствор может
поглотить (нейтрализовать) только известное предельное коли¬
чество кислоты или щелочи, т. е. обладает определенной буфер¬
ной емкостью. Емкость буфера будет тем больше, чем больше
молей буферного вещества будет содержаться в данном растворе.
Вытяжки , из некоторых растительных объектов обладают значи¬
тельной буферностью.Необходимо отметить, что pH вытяжек или суспензий (на¬
пример, зерна) изменяется в относительно узких пределах вслед¬
ствие большой буферной способности белковых веществ и фос¬
фатов.2*35
Определение концентрации
водородных ионов (рп)Общие сведения. Для определения pH существуют различ¬
ные методы, основанные на электрометрических и колориметри¬
ческих принципах. Существующие в настоящее время при¬
боры— потенциометры, титрометры, рН-метры, позволяют про¬
изводить определение pH достаточно быстро и точно (с точ¬
ностью до 0,01).Из колориметрических методов удобны для пользования
методы с индикаторными бумажками, пропитанными раствором
индикаторов, или с набором индикаторных карандашей. Эти
методы отличаются широкой возможностью применения в тех
случаях, когда точность определения pH достаточна — до 0,1—
0,2, так как ошибка в определении pH возможна в этих преде¬
лах. Например, при концентрации ионов водорода (Н* = 10~7
или pH = 7) ошибки в определении pH от 0,01 до 0,30 дают сле¬
дующие отклонения концентрации водорода от истинной:pHОшибки pHОшибки в гОшибки в процентах6,990,011,023-10-72.36,940.041.10*10-»106.860,151,42* IO-»42,96,700,302.00* 10-7100В ряде случаев точность определения величины pH вполне
достаточна до 0,1—0,2. При изучении биохимических процессов
требуется большая точность. Необходимость определения кон¬
центрации водородных ионов возникает в различных объектах:
в соке плодов, листьев, корнеплодов, в вытяжках из размель¬
ченных семян и других органов. Перед получением сока или
вытяжки необходимо остановить или снизить деятельность фер¬
ментов. Для приготовления вытяжек из семян берут навеску
муки 10 г. смешивают с 100 см3 горячей дистиллированной
воды и нагревают до кипения. После часа стояния хорошо
взбалтывают, дают отстояться и набирают пипеткой с обрезан¬
ным и оплавленным кончнком, в который вставлен плотный
тампон (для фильтрования нескольких куб. сантиметров экс¬
тракта). Листья, плоды, клубни измельчают на мясорубке или
другим приспособлением и указанной выше пипеткой отбирают
20—30 см3 сока. Удобно бывает предварительно отжать мезгу.
Раствор или сок наливают в химический стаканчик на 50—
100 см* (удобнее пользоваться пробиркой с конусовидным
дном).Определение pH с помощью индикаторных бумажек. Инди¬
каторные бумажки бывают двух типов. Так, завод «Реагент» •
(г. Рига) изготовляет универсальные индикаторные бумажки
под названием «Рифан», которые рассчитаны для определения
pH в широком диапазоне — от 1 до 10°. Они соединены в кни¬36
жечку. на обложке которой с внутренней стороны имеется цвет¬
ная шкала для сравнения. Эта универсальная индикаторная
бумага служит для приближенного определения pH. С этой
целью полоску бумаги погружают в раствор, вынимают и сразу
сравнивают полученную окраску со шкалой. Бумажки «Рифан»
второго типа рассчитаны для более точного определения pH.
Они имеют цветные полоски, около которых стоят цифры, ука¬
зывающие значение pH. Эти бумажки по 100 шт. упакованы
п пластмассовые цилиндрические коробочки и рассчитаны на
измерения в узких диапазонах чувствительности (1,8—3,6; 3,6—
5.7; 5,7—7,4; 7,4—8,8 и так до pH 12,4—13,6).Для определения концентрации водородных ионов индика¬
торную бумажку погружают в раствор до полного смачивания и
затем цвет средней окрашенной полоски (без цифр) сравни¬
вают с цветной шкалой, имеющей цифровые значения. Совпаде¬
ние окраски индикаторной полоски со шкалой указывает вели¬
чину pH.•Пример определения. Еслн в процессе определения pH найдено
совпадение с оттенком, соответствующим крайне низкому или крайне высо¬
кому. то для определения истинного pH берут индикаторную бумажку, со¬
ответствующую более высокому или низкому pH. Сравнивая изменившуюся
окраску бумажек, убеждаются, в каких границах совпадает оттенок шкалы
pH с окраской индикаторной полоски.В ЧССР выпускаются индикаторные бумажки под названием «Фан».
Они упакованы л плоские коробочки кз пластмассы размером 8—9 см.
В разных коробочках находятся индикаторные бумажки с чувствительностью
п узких интервалах, которая обозначена сбоку, например от 1,9—3.2;
3.2—5.4 и так до бумажек с чувствительностью и интервале pH 9,5—14.Метод индикаторных бумажек применим для приготовления
растворов с определенными границами pH, для быстрых ориен¬
тировочных определений в полевых условиях и экспедициях, для
быстрых, но приближенных определений pH а соках и мезге,
особенно при наличии небольших проб материала. Точность
метода не превышает 0,1. Для изучения биохимических процес¬
сов необходимо применять более точные методы.Электрометрическое определение pH. Метод основан на оп¬
ределении потенциала между электродом, насыщенным водоро¬
дом н жидкостью, имеющей водородные ионы, где и возникает
скачок потенциала, зависящий от концентрации последних. По¬
тенциал электрода можно определить с помощью другого элек¬
трода, имеющего постоянный потенциал. Если соединить 2 элек¬
трода, то получится элемент, электродвижущую силу которого
можно измерить. Обычно неизвестную разность потенциалов
уравновешивают противоположно направленной известной.Определение pH с помощью прибора рН-метра ЛПУ-01.
Этот прибор с датчиком ДЛ-01 предназначен для определения
активности водородных ионов в водных средах в пределах pH
от 2 до 14. Прибор ЛПУ-01 можно применять в качестве высо¬
коомного милливольтметра. В его конструкции предусмотрено37
ручное и автоматическое исправление показаний при изменении
температуры от 0 до 100° опытного раствора. К прибору
ЛПУ-01 может быть подключен автоматический потенциометр
для регистрации показаний. Чувствительность прибора не ниже
pH 0,01 в узком диапазоне измерения. Более высокой чувстви¬
тельностью обладает другой прибор — рН-метр-милливольтметр
ЛПМ-60М.Рис. 7. Потенциометр ЛПУ-01 (электродная схема).і — стеклянный электрод, 2 — жидкость, заполняющая по¬
лость электрода. 3 — проточны А электрод, 4 — пористая
пластинка. 5 —опытиыЛ раствор. € — вспомогательный элек¬
трод, 7 — pH-метр; £ и £ г — разность потенциалов.Для определения величины pH потенциометром ЛПУ-01 ис¬
пользуется электродная система со стеклянным электродом;
электродвижущая сила последнего зависит от активности водо¬
родных ионов в исследуемом растворе. На рис. 7 показана
схема измерения таким прибором. При опускании электрода
с шариком из литиевого стекла в растворе происходит обмен
ионами между поверхностью шарика электрода и раствором;
при этом ионы лития замещаются ионами водорода и стеклян¬
ный электрод приобретает свойства водородного электрода.
Между поверхностью стекла и исследуемым раствором возни¬36
кает разность потенциалов Ех, величина которой зависит от
активности водородных ионов в растворе.Описание прибора ЛЛУ'ОІ. Элементы измерительных частей
прибора и его электронный усилитель находятся в металличе¬
ском корпусе. Все управление прибором выведено на переднюю
панель. Шкала прибора дана в единицах pH и милливольтах.
Датчик рассчитан также для крепления электродов и сосуда
с раствором для измерения pH. Все части датчика собраны на
штативе, в верхней части которого установлен проточный вспо-
могательный электрод. Наконечник последнего и стеклянный
электрод крепятся к кронштейну зажимами. В качестве проточ-
ного вспомогательного электрода используется хлорсеребряный
электрод. Насыщенный раствор хлористого калия должен мед¬
ленно вытекать (20 см3 в сутки) из полиэтиленового сосуда по
резиновой трубке и наконечнику в исследуемый раствор. При
этом создается четкая граница между раствором хлористого
калия и раствором, в котором надо определить pH. В полиэти¬
леновом сосуде с раствором хлористого калия должно быть
небольшое количество его кристаллов. Для измерения pH в
объемах до I см3 в комплекте датчика имеется электролитиче¬
ский контакт для микроизмерений (подробное описание отдель¬
ных частей см. в инструкции по эксплуатации прибора).При заполнении насыщенным раствором хлористого калия
проточного электрода следят за тем, чтобы в трубке электрода
ие было пузырьков воздуха, которые могут нарушить электри¬
ческий контакт.Проверка показаний прибора. После установки (включая
заземление) прибора и подключения датчика проводят проверку
рН-метра ЛПУ-01 по стандартным буферным растворам, кото¬
рые приготовляют из химически чистых реактивов. Для рН-мет-
рии выпускаются фиксоналы. Прибор включают в сеть и по
истечении 30-минутного прогрева погружают электроды в стан¬
дартный буферный раствор (pH 4). Последний наливают в ста¬
кан на 200 слг\ Затем левой рукой сдвигают столик на датчик и
отводят влево на 90°, стакан с раствором в правой руке под¬
ставляют под электроды, а левой рукой повертывают столик
под электроды и ставят стакан. Столик устанавливают на такой
высоте, чтобы электроды при измерении находились в растворе
на глубине 20—40 мм. Электроды предварительно тщательно
промывают дистиллированной водой, а затем высушивают
фильтровальной бумагой. Включают прибор на диапазон изме¬
рения pH 2—6 и устанавливают указатель температурного кор¬
ректора против отметки, соответствующей температуре буфер¬
ного раствора. Ручкой «настройка по буферному раствору»
надо установить стрелку измерительного прибора на шкале
назначения pH 4, затем проверить показание прибора со стан¬
дартным буферным раствором pH 1,68 (на диапазоне —2 4-2)
pH 3,56 и 4 (на диапазоне 2—6) и остальных диапазонах. При39
этим ошибки измерения pH по пяти стандартным буферным
растворам (1,68; 3,56; 4; 6,88; 9,22) не должны превышать
pH 0,04. Желательно измерения проводить при температурах
20 ±5°.При измерении pH в растительных объектах (соках) доста¬
точно проверить прибор по одному буферному раствору, так
как pH соков н экстрактов меняется в небольших пределах
(pH 3—6). и для этого используют буферный раствор, вели¬
чина pH которого лежит в диапазоне pH изучаемых объектов.
В первые несколько дней использования прибора или нового
стеклянного электрода проверку производят ежедневно, а в по¬
следующей работе проверка по буферным растворам прово¬
дится раз в неделю. При появлении пленок на электродах их
удаляют промывкой органическими растворителями, раство¬
рами кислот и щелочей, после чего тщательно промывают дис¬
тиллированной водой.Бели при электрометрическом определении pH объем иссле¬
дуемого раствора составляет около 1—2 см\ используют нако¬
нечник электролитического контакта и настройку прибора по
буферным растворам производят так, как указано выше.
Определение
активности
глава tv ферментов*Особенности ферментов
и методов их определенияФерменты являются специфическими высокомолекулярными
белковыми веществами, которые синтезируются в клетках под
контролем дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) ядер, хло-
ропластов и митохондрий. Они катализируют все реакции
обмена веществ в растениях. Растворимые ферменты — это суб¬
клеточные компоненты растительных клеток. Известно, что в
клетках различного тина содержание отдельных ферментов ко¬
леблется от долей процента до нескольких процентов от общего
количества растворимого белка. От ферментов зависит скорость
и направление многих биохимических процессов, вся энергетика
клетки. Ферментативными процессами характеризуются осо¬
бенности обмена веществ у растений разных видов. С их дей¬
ствием связаны различные физиологические н хозяйственные
признаки: засухоустойчивость, скороспелость, урожайность, са¬
харистость плодов и овощей, масличность и белковость семян.
Без изучения деятельности ферментов и их специфичности
нельзя ноняіь изменчивости химического состава растений,
хотя особенность видов и сортов определяется и регулируется
ДНК.Ряд ферментов представляет собой компонентные системы,
построенные по типу сложных белков, активность которых
определяется простетнческой группой. В состав простетическнх
групп ряда ферментов входят витамины и различные металлы.
Так. активная группа фермента* карбокенлазы представляет
собой соединение тиамина (В\) с фосфорной кислотой
и т. п.Активность и специфичность действия ферментов зависит от
различных факторов, в первую очередь от концентрации суб¬
страта, активной кислотности среды (pH), температуры и пр.
При определении активности ферментов нужно иметь в виду,
что каждый фермент характеризуется определенными интерва*
лами величин pH и температуры, прн которых он проявляет
наибольшую активность и устойчивость.41
Ферменты весьма чувствительны к воздействию кислот, ще¬
лочей, солей тяжелых металлов и к нагреванию. Даже кратко¬
временное кипячение ферментного раствора разрушает некото¬
рые ферменты и прекращает их действие. В сухом раститель¬
ном материале, например в зерне, ферменты иногда бывают
весьма устойчивы. В растворенном состоянии большинство фер¬
ментов неспособно сохранять активность, если их не хранить при
низких температурах. Следует, однако, отметить, что в отноше¬
нии стабильности ферменты могут отличаться один от другого
весьма значительно. Некоторые из них, подобно каталазе и ле-
роксидазе, относительно устойчивы. Если процесс по определе¬
нию ферментов продолжается несколько часов, то необходимо
прибавление антисептиков, в противном случае фермент может
быть разрушен микроорганизмами или же результат опыта
может быть замаскирован действием микроорганизмов на суб¬
страт.Количество фермента, присутствующего в любой момент вре¬
мени в клетке, определяется не только относительными скоро¬
стями их синтеза и распада, но и концентрациями различного
рода активаторов и ингибиторов. Изменение активности фермен¬
тов происходит по типу обратной связи путем ингибирования их
продуктами реакции. Так, фосфатазы многих растений ингиби¬
руются фосфатом. Возможно, регулирование активности некото¬
рых ферментов определяется содержанием кофермента.Новообразование ферментов в зависимости от субстрата в
среде называют индукцией ферментов. Так, В. Л. Крето-
вич и 3. Г. Евстигнеева установили, что аммиак индуцирует
новообразования глютаминсинтетазы (например, у гороха),
нитраты — новообразование нитратредуктазы. На индукцию по¬
следних у культурных растений указывают примеры резкого
увеличения активности ферментов в ответ на изменение условий
окружающей среды. Так, в алейроновом слое прорастающих
семян злаков содержание ряда гидролитических ферментов на¬
ходится под контролем гибберелловой кислоты, образуемой
зародышем. В настоящее время известно, что ткани высших
растений (например, корни кукурузы) выделяют в окружаю¬
щую среду ряд ферментов.Для определения ферментов критерием служит их специфи¬
ческая активность, поскольку они часто находятся в клетках в
небольшой концентрации и по другим химическим реакциям не
отличаются заметно от остальных белков. Основанное на этом
принципе определение легко выполнимо, так как ферменты
сохраняют свою активность при очень большом разведении.
Даже в случаях уже изолированных ферментов, когда их хими¬
ческие и физические свойства могут быть хорошо изучены,
легче определить их активность, чем фермент как таковой.Для учета действия ферментов наблюдают при помощи ка¬
чественных или количественных реакций либо за исчезновением42
вещества, ла которое фермент действует (субстрат), либо за по¬
явлением продуктов реакции.Одним из методов изучения действия ферментов в живых тка¬
нях является прием, получивший название в а к у у м-и н ф и л ь-
трации. Он позволяет наблюдать и количественно измерять
в живых неповрежденных тканях как гидролитические, так и
синтетические превращения веществ.Для качественного или количественного определения фер¬
ментов наряду с химическими могут быть использованы и фи¬
зические методы. Из них наиболее употребительны методы,
основанные на наблюдении за изменением вязкости, вращения
плоскости поляризации, показателя преломления, электропро¬
водности, мутности и поверхностного натяжения.Концентрацию ферментов обычло выражают в мерах, опре¬
деляющих их активность. Часто активность выражают в произ¬
вольно выбранных ферментных единицах на единицу веса ана¬
лизируемого объекта. Измерение активности производят при
определенных условиях (концентрация субстрата, температура
и pH), протекающих за короткий отрезок времени, пока нет су¬
щественных изменений в составе реакционной смеси.Согласно правилам, рекомендовааным Международной ко¬
миссией Биохимического союза в І 961 г., за единицу любого фер¬
мента принимается такое его количество, которое способствует
(при оптимальных условиях) превращению 1 микромоля
(*кМ) субстрата за одну минуту.Специфическая активность ферментного препарата (ткани,
органа) выражают числом единиц фермента на 1 или 100 мг
белка. Следовательно, одновременно необходимо проводить
определение белка.Многочисленные исследования культурных и дикорастущих
растений по изменчивости активности различных ферментов
показали, что уровень активности ферментов в том или ином
растении, как и общий их химический состав (регулируемый
отдельными ферментами), является величиной весьма изменчи¬
вой, зависящей от воздействия внешних условий на растения, от
их наследственных свойств, фазы развития, спелости н т. д. Это
обстоятельство необходимо всегда иметь в виду при исследова¬
нии сельскохозяйственных культур.Не только между различными видами, но и в пределах од¬
ного н того же вида разница в активности ферментов может
достичь очень больших величин.По современным представлениям, ферменты в клетках нахо¬
дятся в растворе микрогетерогенной среды, на поверхности ор-
г а н ел л клетки и в клеточной стенке.При определении активности ферментов следует учитывать
изменения, происходящие в растении при повреждении насе¬
комыми, грибными болезнями, а также при подвяливании в
процессе подготовки к анализу.43
Определение активностикатализы«Каталаза (Н. Ф. 1.11.1.6) * относится* к сложным ферментам,
состоящим из белкового комплекса и так называемой простети-ческой группы, содержащей
железо. Специфическое дейст¬
вие определяется характером
белкового компонента. Сущ¬
ность действия каталазы со¬
стоит в разрушении перекиси
водорода на кислород и воду
(2H202 = 2Hj0 + 02).Метод газометрического оп¬
ределения активности фермен¬
та заключается в улавливании
и измерении объема выделив¬
шегося кислорода после при¬
бавления к водному экстракту
каталазы перекиси водорода.
Метод прост в выполнении и
применим для определения ка-
талазы в суспензиях и экстрак¬
тах из семян, а также листьев
и других вегетативных орга¬
нов. При соблюдении идентич¬
ных условий дает хорошие
сравнимые результаты.Реактивы и аппаратура: 1) пере¬
кись водорода крепостью мс ниже 3%
(за 10—12 часов до употребления
этот раствор нейтрализуют, прибав¬
ляя около I г CaCOj на 100 см*
раствора и хорошо перемешивают);
2) углекислый кальций; 3) толченое
п промытое стекло; 4) прибор для
определения каталазы по кислороду
с комплектом реакционных сосудов-
баночек диаметром 6 см. высотой
до горлышка 5 см и диаметром гор*
лышка 3 см (рнс. 8); 5) секундомер;6)	термометр (точностью до 0,2°);7)	мерные колбочки на 100 и 200 см1:8)	баня.Описание прибора для оп¬
ределения каталазы. Как пока¬
зано на рис. 8, прибор состоит из двух параллельно укреплен¬
ных на штативе бюреток на 50 или 100 см\ диаметром 10—* Н. Ф. — номенклатура ферментов.44Рис. 8. Прибор для газометрнческого
определения каталазы.I — сосуд для выполнения реакции со ста¬
канчиком для перекиси водорода. * — hv
мерительная трубка, 3 — «груша» с раство¬
ром кяслоты« 4 — трубка для облегчения
установки уровня.
12 мм. соединенных в суженной части резиновыми трубочками
с трехконечной «гребенкой» (изготовленной из тройника). Тре¬
тий конец «гребенки» соединен резиновой трубкой со стеклянной
грушей. Таким образом, получается система сообщающихся со¬
судов. Бюретка с отчетливыми делениями служит для измере¬
ния объемов газа. Вторая бюретка или стеклянная трубка
служит для быстрой и правильной установки уровня газа прн
отсчете. Бюретка для измерения в верхней части закрыта рези¬
новой пробкой, в которой сделано отверстие и вставлен малень¬
кий тройник. На другой конец этого тройника надет кусочек тол¬
стостенной эластичной резиновой трубки и винтовой зажим.
Средний конец тройника, слегка изогнутый, соединен с длинной
резиновой трубкой, на другой конец которой надета стеклянная
трубочка с резиновой пробкой. Эта пробка служит для закры¬
вания реактивной баночки, в которую перед определением на¬
ливают экстракт фермента; в нее же помещают стаканчик с оп¬
ределенным объемом перекиси водорода.Воронку и измерительную часть аппарата наполняют
5%-ным раствором серной кислоты. Серная кислота уменьшает
растворимость газов в воде и препятствует размножению водо¬
рослей и грибов. Уровень этой жидкости в аппарате устанавли¬
вают на нуле. Это достигается закреплением кольца, на кото¬
ром находится «груша», на постоянной высоте. Все отверстия
для сообщения с воздухом должны быть закрыты ватными
пробками или предохранены от попадания пыли и от излишнего
испарения. Перед измерением все части аппарата проверяют на
герметичность.Ход анализа. Приготовление вытяжек из семян.
Берут навески по 1 + 0,01 г свежеизмельченных (в день опреде¬
ления) семян в стаканчики или укороченные широкие пробирки,
затем переносят в фарфоровую ступку, к навеске добавляют
0,5 г СаСОз, немного стеклянного песка н 5—10 см3 дистилли¬
рованной воды. Навеску тщательно растирают, после этого ко¬
личественно переносят в мерную колбу на 100 см3 через широ¬
кую воронку. Ступку с пестиком несколько раз споласкивают
водой из пипетки и колбу после перемешивания доливают водой
до метки и оставляют стоять 3—4 часа. Активность свежепри¬
готовленного экстракта в течение этого периода после нараста¬
ния стабилизируется. Можно в ряде случаев удлинить срок на¬
стаивания (экстракции) так, чтобы оно протекало на холоду
в течение вечера и ночи. Это удобно при работе с сериями об¬
разцов и наличии холодильного шкафа. Утром следующего дня
приступают к определению в той последовательности, в какой
приготовлялись вытяжки.Приготовление суспензии и вытяжек из
листьев, клубней, корнеплодов. Листья, как правило,
отличаются высоким содержанием этого фермента. Ввиду боль¬
шой неоднородности этих объектов навески для приготовления45
вытяжек берут с учетом их анатомических и морфологических
особенностей. Для анализа берут по 10 ±0,01 г высечек или
нарезанных частиц в 1 см, тщательно перемешанных. Навески
растирают со стеклянным песком, смешанным с 0,5 г СаСОз,
затем добавляют 10 см3 воды и снова тщательно растирают до
однородной массы. После этого растертую массу еще разбав¬
ляют водой и количественно переносят в колбу на 250 см*, до¬
водят до метки и настаивают в течение 3—4 часов. После этого
суспензия (болтушка) пригодна для определения фермента.По истечении срока настаивания, после хорошего встряхива¬
ния, суспензию фильтруют через бумажные фильтры или цен¬
трифугируют для получения прозрачных вытяжек.Определение ферментов в суспензиях или
центрифугатах. В толстостенные баночки, подобранные к
прибору, отмеривают по 10 см3 центрифугата или «болтушки»
вместе со взвесью (для получения однородной взвеси и воспро¬
изводимых результатов набирать пробу надо сразу после тща¬
тельного взбалтывания). Затем добавляют туда же 10 см3 воды
и ставят при помощи пинцета маленький стаканчик с 5 см3
3%-ной перекиси водорода или другой концентрации, но в та¬
ком объеме, чтобы прн разложении перекиси водорода выделя¬
лось 68—70 см3 кислорода.Средняя начальная концентрация перекиси водорода в реак¬
тивной баночке в общей смеси составит 0,8%. Горлышко ба¬
ночки закрывают пробкой с трубкой, соединенной с измери¬
тельной бюреткой прибора, устанавливают баночку в баию
при 20°. Проверяют и регулируют уровень жидкости в приборе,
закрывают сообщение с воздухом винтовым зажимом и опу¬
скают «грушу» в нижнее положение. После этого вращатель¬
ным движением опрокидывает стаканчик с перекисью водорода
в банке и в этот же момент пускают секундомер; в течение
10 секунд содержимое банки взбалтывают (вращаіельньїм дви¬
жением). Баночку опять опускают в водяную баню при 20Р.
Для уничтожения вспенивания смеси рекомендуется добав¬
лять 1—2 капли толуола.Выделяющийся кислород определяют через кажды 3 минуты,
поднимая «грушу» до соответствующего уровня за 10 секунд
до отсчета. Отсчет делают ровно через 3; 6; 9 минут. После
каждого отсчета реактивную смесь перемешивают в течение10	секунд.Титр перекиси водорода может быть определен при помощи
прибора непосредственно по объему кислорода, выделившемуся
прн 30-мннутиой реакции в присутствии каталазм. Для этого
поступают точно так же, как при определении активности фер¬
мента. Чтобы определить, какой объем кислорода может быть
получен из взятой перекиси водорода, применяют для ее разло¬
жения масличные семена (льна, подсолнечника и др.), обла¬
дающие высокой активностью каталазы. При использовании46
болтушек активность фермента значительно выше, чем в том же
объеме центрифугата.Активность каталазы выражают в куб. сантиметрах кисло*
рода, которые выделяются ферментом 1 г семян за 1; 3 или
6 минут.Определение активности
пероксидазыПероксндаза (Н. Ф. 1.11.1.7) играет большую роль в про*
цессе дыхания растений. Наиболее распространенными субстра*
тами, на которые действует пероксндаза в тканях растений, яв¬
ляются полифенолы в свободном состоянии или о форме разно*
образных соединений (глнкозпды, дубильные вещества) и
ароматические амины. Окисление тех или иных соединении пе*
роксидаза осуществляет с помощью перекиси водорода или ка*
ких-либо органических перекисей, в том числе перекиси ненасы¬
щенных жирных кислот и каротина.Метод основан на определении скорости реакции окисления
бензидина до образования синего продукта окисления опреде*
ленной концентрации, заранее устанавливаемой на фотоэлек¬
троколориметре *.Реактивы и аппаратура: I) ацетатный буфер pH 4.7; 2) раствор бензи¬
дине на ацетатном буфере (в керную колбу на 200 см1 наливают примерно
100 см1 дистиллированной ооды, прибавляют 2,3 см1 ледяной уксусной кис¬
лоты и 184 мг бензидина; колбу нагревают на водяной бане прн 60°, по¬
стоянно взбалтывая; после полного растворения бензидина а колбу добав¬
ляют 5.45 г уксуснокислого натрия, охлаждают и доводят дистиллированной
водой до метки); 3) 3%-ная перекись водорода; 4) фотоэлехтроколориметр
ФЭК-М (см. рис. 27); 5) центрифуга; 6) секундомер.Ход анализа. Навеску растительного материала 200—500 мг
тонко растирают в фарфоровой ступке с водой или ацетатным
буфером pH 4,7 и переносят в мерную колбу емкостью 50 сж3.
После 10 минут настаивания вытяжку центрифугируют при
4000 обімин. Определение активности фермента можно произ¬
водить непосредственно во взвеси без центрифугирования или
фильтрования. Для измерения активности лучше брать такое
разведение вытяжки, чтобы изменение окраски происходило за
20—50 секунд.В 2 кварцевые кюветы (2 см) приливают по 2 см3 фермент¬
ной вытяжки или центрифугата, 2 см3 бензидина, 2 см3 воды.
Измерение производят на фотоэлектроколориметре при крас¬
ном светофильтре. Вначале устанавливают нулевую точку, за¬
тем правым барабаном отводят стрелцу гальванометра в край¬
нее правое положение (£ = 0,125 или 0,250). В левую кювету*	А. Н. Бояркин. Биохимия, вып. 6, 1951.47
наливают 2 см3 воды, а в правую (опытную) 2 см3 перекиси
водорода из пипетки с широким отверстием. С внесением первой
капли включают секундомер. После вливіння раствора пере¬
киси водорода стрелка гальванометра начинает двигаться от
края шкалы к нулевому делению. Секундомер останавливают,
когда стрелка достигает нулевого деления.По найденной скорости реакции вычисляют активность фер¬
мента (Л):Е (а • б • в)А с' tгде: Е — экстинкция = 0,125;а — отношение количества жидкости, взятой для приготов¬
ления вытяжки (в куб. сантиметрах к весу сырой тка¬
ни, взятой в граммах);
б — степень дополнительного разведения вытяжки после
центрифугирования;
в —степень постоянного разведения вытяжки в реакцион¬
ной смеси (в кювете);
с — толщина слоя (2 см);/ — время (в секундах).Определение активности
полифенолоксидазыПолифенолокоидаза, или о-дифенолоксидаза, или тирозиназа
(Н. Ф. 1.10.3.1) так же, как и пероксндаза, играет важнейшую
роль в дыхании растений, катализируя реакцию окисления по-
лнфенолов. Система «полифенолтздннон» является промежуточ¬
ным звеном при окислении органических соединений в процессе
дыхания растений. Этот фермент катализирует окисление в при¬
сутствии молекулярного кислорода не только разнообразных
полифенолов, но и монофенолов (в частности, тирозина), о-ди-
фенолов с образованием соответствующих хинонов. Установ¬
лено, что в зависимости от того, из какого источника получена
полифенолоксидаза, способность ее к окислению о-дифенолов,
полнфенолов и монофенолов различна.Метод основан на измерении активности фермента по ско¬
рости образования сине-фиолетовой окраски окисленного ди-
метил-н-фенилеидиамина.Реактивы и аппаратура: 1) 0,02%-ны ft раствор днметнл-л-фенилендна-
мхка (20 мг «а 100 см3 дистиллированной воды) или 0.02%-ный раствор
ларафениленднамнна иа 0,01 н. щавелевой кислоте; 2) раствор 0.01 н. ща¬
велевой кислоты; 3) 1%-ный раствор лирохатехииа (I г в 100 см1 0.01 н.
щавелевой кислоты); 4) фосфатный буфер pH 7.4; 5) ФЭК-М (с»г рис. 27).Ход анализа*. Навеску (0,5 или 1+0,001 г) растительного
материала тонко измельчают в фарфоровой ступке в присут-*	А. Н. Бояркин. Тр. Ин-та физиологии растений им. К. А. Тимиря¬
зева, т. 8, вып. 2, 1954.48
ствин буфера (pH 7,4), переносят в мерную колбу на 50 см3 и
доводят тем же буфером до метки. Определение активности
фермента производят либо непосредственно во взвеси, либо
после центрифугирования или фильтрования. В 2 кварцевые
кюветы фотоэлектроколориметра приливают компоненты реак¬
ционной смеси в следующем порядке: 2 см3 вытяжки, 2 см*
дистиллированной воды, 2 см* раствора диметил-л-парафени-
лендиамнна. Кюветы ставят в фотоэлектроколориметр н уста¬
навливают нулевую точку при оранжевом (или красном) свето¬
фильтре. Затем, как и в случае определения'пероксидазы, отво¬
дят правым барабаном стрелку гальванометра в правое положе¬
ние (£ = 0,125). После этого в контрольную кювету (слева)
приливают 2 см3 0,01 и. раствора щавелевой кислоты, а в опыт¬
ную (справа)—2 см3 раствора пирокатехина в 0,01 н. щавеле¬
вой кислоте. Сразу же включают секундомер. После вливания
раствора пирокатехина стрелка начинает двигаться от края
шкалы к нулевому делению со скоростью, зависящей от актив¬
ности фермента в вытяжке. В тот момент, когда стрелка дости¬
гает нулевого деления, секундомер останавливают. Активность
полифенолоксидазы вычисляют по формуле, приведенной для
вычисления активности пероксидазы, и выражают в условных
елншшах, на 1 г ткани или белка.Определение активности
аскорбинатоксидазыАскорбішатоксидаза (Н.Ф. 1.10.3.3)—фермент, катализи¬
рующий окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбино-
вую. В состав этого фермента входит медь (0,24%).Наиболее активная аскорбииатоксидаза обнаружена в ка¬
пусте. огурцах, тыкве, кабачках. Активность этого фермента
можно определять по интенсивности поглощения кислорода
(в аппарате Варбурга), по измерению путем титрования ос¬
татка неокисленной аскорбиновой кислоты в среде и спектрофо-
тометрнчески. Ниже приводится описание двух последних мето¬
дов.Определение активности аскорбинатоксидазы по измерению
остатка неокисленной аскорбиновой кислоты. Этот метод мо¬
дифицирован Л. К. Островской.Реактивы и аппаратура: 1) буферная смесь Мак-ИльвеЛна, pH 6 (см.
стр. 440); 2) раствор аскорбиновой кислоты (І мг в I см1)-, 3) 5%-ныГ|
раствор ыетафосфорноА кислоты; 4) 0,001 н. раствор иодата калия — KIOj
(навеску 0,3568 г иодата. высушенного в течение двух часов при 102°,
растворяют в воде в мерной колбе объемом I с)м2\ в другую колбу на 1 дм*
берут 100 см5 и доводят водой до мерной черты; 5) 0,001 н. раствор
2,6-днхлорфиіол индофенола— краска Тильманса (отвешивают на небольшом
чнеовом стекле 60 мг сухой краски, переносят в мерную колбу на 200 смs,49
прибавляют J00 см3 дистиллированной поды її 4—5 капель 0.01 н. щелочи;
взбалтывают в течение 10 минут, доводят дистиллированной водой до метки
и фильтруют в сухую колбу); 6) 1%-ныЛ раствор крахмала; 7) мнкробт-
ретк8 с градуировкой 0,01 см3, емкостью 5 см*; 8) центрифуга.Ход анализа. Навеску листьев 1—2 г (в зависимости от ак¬
тивности фермента) помещают в фарфоровую ступку и тща¬
тельно измельчают в присутствии буферной смеси Мак-Иль-
вейна, pH 6. Растертую массу переносят в мерную колбу на 25
или 50 см3, доводят буфером до метки и перемешивают, В кони¬
ческую колбочку на 50 см3 вносят 2 см3 полученной вытяжки
(гомогената. центрифугата или фильтрата), содержащей фер¬
мент, и приливают 2 см3 раствора аскорбиновой кислоты.
Колбы с содержимым выдерживают при температуре 25 или
30° в течение часа. По окончании времени экспозиции реакцию
прекращают, добавляя 2 см3 5%-ного раствора метафосфор-
ной кислоты. Одновременно готовят контрольные пробы. Для
этого в конические колбы вносят 2 см3 суспензии, 2 см>
5%-ной метафосфорной кислоты и в последнюю очередь—2	см3 аскорбиновой кислоты. Остаток неокнеленной аскорби¬
новой кислоты титруют 0,001 и. раствором 2,6-дихлорфенолин-
дофенола, титр которого предварительно устанавливают (см.
стр. 89), или 0,001 и. раствором иодата (1 см3 0,001 н. КЮ»
равен 0,088 мг аскорбиновой кислоты). В последнем случае
титрование ведут до появления синей окраски в присутствии
кристаллика (5—10 мг) KI и нескольких капель крахмала.
Активность фермента (х), выраженную в миллиграммах окис¬
ленной аскорбиновой кислоты на 1 г сырой ткани, вычисляют
по формуле:(а — в) • Т • V,*=——н—.
где: а — количество куб. сантиметров 0,001 и. раствора 2,6-дн-
хлорфеиолиндофенола (или иодата), израсходован¬
ного на титрование контрольной пробы;
в —число куб. сантиметров 0,001 н. 2,6-дихлорфеиолиндо¬
фенола (л л и иодата), израсходованного на титрова¬
ние опытной пробы;Г—титр краски (или иодата);
w i—общий объем вытяжки;Vi — объем вытяжки, взятый для титрования;
н — навеска вещества (в г).Для пересчета на 100 мг белка производят определение бел¬
кового азота в листьях.Спектрофотометрическое определение активности аскорби-
натоксидазы (по Арригони). В методе использовано свойство
аскорбиновой кислоты поглощать максимум света при длине
волны 265 нм. Об активности фермента судят по уменьшению50
величины оптической плотности, учитывая, что степень окис¬
ления аскорбиновой кислоты пропорциональна количеству фер¬
мента.Реактивы и аппаратура: 1) фосфатный буфер, pH 7,3—7,4; 2) раствор
KCI б-1(Н М; 3) раствор MgSO« б-Ю-^М; 4) раствор аскорбиновой кис¬
лоты 5-НН5 М; 5) спектрофотометр СФ-4А (см. рве. 9).Ход анализа. Навеску листьев 1 + 0,001 г тщательно расти¬
рают в фарфоровой ступке и переносят в мерную колбу на
50 см*.В опытную кювету вносят 0,1 см* ферментной вытяжки
(центрифугата), 0,1 см3 раствора KCI, 0,1 см3 раствора
MgSO<, 0,7 см3 аскорбиновой кислоты и 2 см3 фосфатного бу¬
фера. В контрольную кювету вносят 2,3 см* фосфатного бу¬
фера и 0,7 см3 аскорбиновой кислоты. Сразу измеряют оптиче¬
скую плотность опытного раствора. Затем измерение повто¬
ряют через определенный промежуток времени (через одну ми¬
нуту) в течение 5—6 минут.Активность фермента (х), выраженную в единицах опти¬
ческой плотности за минуту на 1 г ткани (или на 100 мг
белка), вычисляют по формуле:D — D\
х~ t • н •где: О —оптическая плотность раствора в начале определе¬
ния;Di — оптическая плотность раствора через определенный
промежуток времени;/—время;н — навеска в расчете на объем, взятый для спектрофо-
тометрирования.Спектрофотометрический
метод определения
активности цитохромоксидазыЦнтохромоксидаза (Н. Ф. 1.9.3.1) играет большую роль в
процессе дыхания и фотосинтеза растений. Этот фермент в ка¬
честве активной группы содержит гематин. В настоящее время
имеются данные, согласно которым в очищенном препарате
цитохромоксидазы, кроме железа гема, имеется и медь. Пред¬
полагают, что она является необходимым компонентом в про¬
цессе синтеза самого гема. Цнтохромоксидаза осуществляет
окисление восстановленных цитохромов. Основой каталитиче¬
ской функции данного фермента является способность железа
обратимо окисляться и восстанавливаться, отдавая и приобре¬
тая электроны.51
Цнтохромоксидаза не только участвует в процессе дыхання
эмбриональных тканей в ранние фазы развития растений, но и
принимает активное участие в дыхании тканей взрослых рас¬
тений, являясь главным ферментом дыхания. Цитохромокси-
даза найдена в листьях капусты, томатов, винограда, клубнях
картофеля, корнях свеклы, моркови и др.Рис. 9. Спектрофотометр СФ-4А (объяснение в тексте).Спектрофотометрнческин метод определения активности
цитохромоксидазы основан на измерении плотности раствора
восстановленного цитохрома с, имеющего максимум поглоще-
нин при 550 нм. Падение плотности раствора при 550 нм за
определенный промежуток времени служит показателем актив¬
ности фермента.Ниже приведено описание метода в модификации Б. А. Ру¬
бина, И. А. Чернавиной и А.В. Михеевой *.Реактивы и аппаратура: I) фосфатный буфер. 0,15 М; pH 7,4; 2) вос¬
становленный раствор цитохрома с (исходный раствор цитохрома с с кон¬
центрацией 1.58-10—7 М в 1 см* разбавляют фосфатным буфером, pH 7.4 в
отношении 3 см* раствора цытохрома с с 17 см5 буфера и затем восстанав¬
ливают небольшим количеством гидросульфита — 20 мг: избыток гидросуль¬
фита удаляют встряхиванием в течение 5 минут; восстановление цито¬
хрома является важным моментом; проверка степени восстановления может
быть проведена иг спектрофотометре по Смиту **; 3) ферроцнанид калия —
K»Fe(CN)«; 4) центрифуга; 5) спектрофотометр СФ-4А.Описание кварцевого спектрофотометра СФ-4А и работа
с ним. Этот прибор отечественного производства (рис. 9) яв¬
ляется удобным и точным для различных количественных оп¬
ределений. Он позволяет измерять оптическую плотность ит 105 % 5 I9&6"И д' ЧсР,,авииа* А- в- Михеева. ДАН СССР.
L. S ш і I h. Mcth. Biochcm.. v. 2. 1956.f>2
пропускание света окрашенных и бесцветных растворов» а
также твердых прозрачных веществ в области спектра от 220
до 1110 нм. Прибор состоит из усилителя, отсчетного устрой-
сіва и монохроматора. Основные элементы монохроматора —
кварцевая призма, зеркальный объектив и щели — помещены
внутри чугунного корпуса, закрытого кожухом. Кварцевая
призма укреплена в оправе, ось которой с помощью специаль¬
ного механизма соединена со шкалой / длин волн. Поворот
призмы (установка необходимой длины волны) осуществляется
вращением рукоятки 2.Корпус соединен с кюветной камерой. В кюветной камере
находится каретка, в которой устанавливается держатель с
кюветами или твердыми образцами. С помощью рукоятки 12
каретку можно перемещать так, что в одном положении луч
будет проходить через кювету с растворителем, а в другом —
через исследуемый раствор. Для работы с прямоугольными
кюветами и твердыми образцами каретка имеет 4 фиксирован-
пых положения: 1; 2; 3 и 4-е, а при работе с цилиндрическими
кюветами—1 и 4-е положения. Между корпусом прибора н
кюветной камерой помещен блок //, в котором смонтировано
плоское зеркало, направляющее свет на входную щель моно¬
хроматора. В нижней части блока установлен движок с филь¬
трами, поглощающими рассеянный свет. Движок устанавли¬
вается против щели в трех фиксируемых положениях: в пер¬
вом положении (движок не выдвинут) на пути луча находится
оправа, в которую можно установить любой фильтр, во вто¬
ром положении — фильтр УФС-2 (для работы при 320—380 нм),
в третьем — фильтр ОС* 14 (для работы при 590—700 нм).Фотоэлементы помещены в герметизированной камере, пе¬
реключение их производится рукояткой 13. В положении,
когда рукоятка не выдвинута, на пути луча устанавливается
сурьмяно-цезиевый фотоэлемент (для измерений в области
220—650 мм), а при выдвинутой рукоятке — кислородно-цезие¬
вый фотоэлемент (для измерений в области спектра 600—
1100 нм).В приборе используются 3 источника света: водородная
лампа — для измерений в области спектра 220—350 нм, лампа
накаливания — для измерения в области спектра 320—1100 нм
її ртутная лампа — для проверки градуировки.Работа с прибором начинается с включения источника
света (лампы накаливания или водородной) согласно прила¬
гаемой к прибору инструкции, где указан режим работы ламп.
Рукоятку переключателя чувствительности 5 ставят в одно из
положений—1; 2; 3 и 4, что соответствует работе со щелями
разной величины. Затем устанавливают требуемую длину
волны вращением рукоятки 2 в сторону увеличения длины
волны. В зависимости от области спектра, в которой будуі
вестись измерения, устанавливают в рабочее положение53
«сурьмяно-цезиевый или кислородно-цезиевый фотоэлемент и
соответствующие светофильтры (УФС-2 или ОС-14). Поме¬
щают кювету с растворителем и испытуемым раствором в кю-
ветиую камеру. Перемещением каретки устанавливают кювету
с растворителем таким образом, чтобы луч света проходил
через нее (положение 1). Прл закрытом фотоэлементе (пере¬
ключатель 7— в положении «выкл.») вращением рукояток
грубой 8 и плавной /5 регулировки темнового тока приводят
стрелку миллиамперметра 6 в нулевое положение. Затем вклю¬
чают фотоэлемент, открыв шторку-переключатель І4.
Стрелку снова приводят к нулю изменением ширины щели 9
и 10 и более точно потенциометром чувствительности 4. Далее
передвигают каретку таким образом, чтобы на пути луча был
установлен исследуемый образец, и приступают непосред¬
ственно к измерению. Для этого переводят переключатель 7
прибора в положение XI и вращением рукоятки отсчетного
потенциометра 3 приводят стрелку в нулевое положение. По
шкале делают отсчеты величины оптической плотности или
пропускания. Если при измерении переключатель 7 находится
в положении X 0,1, то снятый по шкале пропускания отсчет
нужно умножить на 0,1, а к показанию оптической плотности
прибавить 1.Ход анализа. Навеску растительного материала 200—
300 мг тщательно растирают в охлажденной ступке с холод¬
ным фосфатным буфером, pH 7,4. Растертую массу переносят
в мерную колбу емкостью 50 см3 н доводят фосфатным буфе¬
ром до метки. Вытяжку центрифугируют в течение 15 минут
при 2000—3000 обімин. Для определений используют охлаж¬
денный центрифугат. Все операции до спектрофотометрирова-
15ня лучше проводить в холодной и темной комнате. В кювету
спектрофотометра вносят 1,5 см3 вытяжки, прибавляют 1,5 см3
восстановленного цитохрома с и определяют оптическую плот¬
ность при 550 нм. Первый отсчет снимают через минуту после
приливання восстановленного цитохрома с и затем через каж¬
дую минуту в течение 10 минут. По истечении этого времени
для полного окисления цитохрома с в кювету добавляют кри¬
сталлик красной кровяной соли (ферроцианид калия) и вновь
измеряют плотность раствора при 550 нм.Об активности цитохромоксидазы судят по уменьшению
логарифма молярной концентрации восстановленного цито¬
хрома с в единицу времени. Расчет производят по формуле:. Ir (О, — D3) — lg (/>> — Di)А-іде: А — активность цитохромоксидазы, выраженная в условных
единицах;Di — оптическая плотность исследуемого раствора в пер¬
вую минуту опыта;.54
Da—плотность раствора в последнюю минуту опыта;D% — плотность раствора после добавлення ферроцианида-,
калия;
t — время.Определение активности
липоксигеназыМетод основан на измерении поглощения кислорода реак¬
ционной смесью. Максимум действия липоксигеназы (И. Ф.
1.13.1.13) злаков находится при pH 7, а липоксигеназы сои —
при pH 9.Реактивы и аппаратура: 1) линолеоая кислота (удобно получить из под*
'Солнечного масла) или масло; 2) 20%-ныП раствор КОН; 3) фосфатный
буфер, pH 6,8; 4) аппарат Варбурга.Описание аппарата Варбурга (рис. 10а). Важной частью
аппарата является градуированная U-образная капиллярная
манометрическая трубка, один конец которой открыт, а дру¬
гой сообщается с воздухом посредством крана и имеет от-
росток, изогнутый под углом (рис. 106). Трубку заполняют
подкрашенной жидкостью Броди (плоти. 1,033), которую гото¬
вят растворением 4,6 г хлористого натрия и 1 г холеиновокис-
кого натрия в 100 см3 дистиллированной воды с добавлением
нескольких капель спиртового раствора (20%) тимола. Для
окраски жидкости добавляют немного кислого фуксина или
флуоресцина. Давление в 1 атм соответствует столбу жидкости
10000 мм. Оба колена манометра соединяются внизу в одну
трубку, на которую надета каучуковая трубка 2, закрытая
пробкой и имеющая приспособление для регулировки уровня
жидкости Броди в обоих коленах (винтовой зажим 3). Боко¬
вой отросток правого колена манометра служит для соедине¬
ния с реакционным сосудиком 4, в котором происходит фер¬
ментативная реакция. Реакционный сосудик имеет боковое
ответвление 6 и впаянный в дно центральный стаканчик 5.
Сосудики погружены в ванну большой емкости, а манометры за¬
крепляются снаружи. В ванне на протяжении всего опыта поддер¬
живается строго определенная температура, обычно 25 или 304:
+ 0,02°. В аппарате Варбурга постоянная температура обеспе~
чивается ультратермостатом. Установка рабочей температуры
производится при помощи контактного термометра с регули¬
ровкой по контрольному термометру.Модель ВА 0110 позволяет одновременно производить 14
определений.Ход анализа. Отвешивают 2—3 г навески материала и рас¬
тирают с фосфатным буфером (pH 6,8) в соотношении 1:5
или 1:10. Затем в основную часть сосудика Варбурга прили¬
вают 2 см3 опытной пробы (гомогената), а в боковую его часть55
наливают 1 см3 суспензии натриевой соли лииолевой кислоты,
которую готовят перед употреблением. Для этого энергично
встряхивают 0,20 см3 лииолевой кислоты с 5,8 см3 0,1 н.
раствора КОН. 20 слР фосфатного буфера, pH 6,3 и 34 см3
дистиллированной воды. В 1 ел3 такого субстрата содержится
3.3 мг лииолевой кислоты —pH 7. Далее в центральную частьРис. 10. Аппарат Вар¬
бурга.а — общнП вид. 6 — мано-
метрическая трубка с сосу¬
диком (слепа — оид спереди,
сирова — ішд сбоку: объяс¬
нение в тексте).прибора приливают 0,3 си/3 20%*ного раствора КОН для
улавливания углекислоты. Объем жидкости в основном сосу¬
дике доводят водой до 5 см3. После этого сосудики соединяют
с манометром и выдерживают в бане аппарата 20 минут до вы¬
равнивания температуры. Закрыв верхние краны манометров и
наклонив их, переливают субстрат в основную часть сосудика
и затем включают качание на определенный срок. Одновре-56
мешю устанавливают контрольные приборчики с нанометрами,
причем вместо субстрата в боковую часть сосудика наливают
I см3 воды; в остальном поступают так, как и с опытным.Показания манометров снимают через определенное число
минут (5—10). Активность фермента выражают а куб. санти¬
метрах поглощенного кислорода на 100 мг белка или на 1 г
сухой массы за условный промежуток времени.Примечание. Общее количество газа л сосудике a начале опреде¬
ления равно количеству, которое находится в газовой среде и л раствори¬
мом виде в жидкости! В конце определения количество газа повышается
и мениск жидкости в трубке смещается на величину /< Для шчислеиин
объема газа, выделившегося при реакции, надо знать консгзату (К) каж¬
дого сосудика. Точвый объем сосудиков узнают <по весу объема ртути (или
воды), пошедшей на заполнение сосудиков, и объема нанометра до нулевой
точки. Зная объем 1 г ртути при определенной температуре, вычисляют
исходный объем сосудика. Константу (К) сосудиков вычисляют по фор¬
муле:273К = l(t», — v«) -у ~ t’2 • «І: fi..где: Р|— общий исходный объем реакционного сосудика и капиллярной
трубки до «нулевой точхн»;Vi — объем взятой жидкости в сосудик;Т — температура термостатной бани (если температура oiрегулирована
иа 25°. то Т = 273 + 25 - 298);а — растворимость газов (ел**) в 1 см1 воды (раствориуосгь кисло
рода при 25° равна 0.028, углехислоты — 0,739;Ро — давление, равное 10000 juju столба жидкости Броди.Определение активности
дегидрогеназДегидрогеназы катализируют реакцию отнятия водорода от
субстрата (дегидрирование), производя таким образом его
окисление. Различают анаэробные дегидрогеназы (первичные
дегидрогеназы), которые переносят водород на промежуточ¬
ные акцепторы (хинонподобные соединения или флавиновые
ферменты), и аэробные дегидрогеназы, которые передают от¬
нятый от окисляемого субстрата водород непосредственно
кислороду воздуха.Коферментами анаэробных дегидрогеназ являются нико-
тинамидадениндинуклеотнд (сокращенно НАД) к ннкотнн-
амндадениндинуклеотидфосфат (сокращенно НАДФ). В зависи¬
мости от химической природы окисляемого субстрата дегидро¬
геназы носят соответствующее название — сукцннатдегидроге-
наза, малатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и т. д. Эти фер¬
менты широко распространены в растениях.Наиболее распространенными методами определения ана¬
эробных дегидрогеназ являются колориметрические, маномет¬
рические, спектрофотометрическис.57
Колориметрический метод определения активности дегидро¬
геназ с трифенилтетразолиеи хлористым. Метод определения
специфических дегидрогеназ по А. Ф. Сысоеву и Т. С. Красном
пригоден для массовых анализов*. Принцип метода основан
на способности 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлористого при вос¬
становлении переходить в окрашенный формазан. Интенсив¬
ность окраски определяют на фотоэлектроколориметре.Реактиви и аппаратура: 1) фосфатный буфер, pH 7,8 (2%-ный раствор
К}НР04, содержащий 0.1 % желатина и 0,2% MgCls. доводят 2%-льііі раство¬
ром КгНРО* до оН 7,8); 2) I %-ныА раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хло¬
ристого (ИХ); 3) субстратный раствор (раствор 0,2 М донатора водорода;
в качестве последнего используют одно из веществ: яблочную, лимонную,
янтарную, глутаминовую кислоты, этиловый апнрт, глюкозу и т. д.; растворы
органических кислот нейтрализуют КОН по фенолфталеину; перед опреде¬
лением смешивают равные объемы ТТХ н субстратного раствора); 4) конт¬
рольный раствор (бессубстратные дегидрогеназы, получают смешиванием
равных объемов ТТХ и фосфатного буфера); 5) растворитель для формаэани
(к 95 см* этилового спирта прибавляют 5 см3 98%-ной уксусной кислоты);
6) раствор для восстановления ТТХ pH 8,8 (готовят 5%-ный раствор аскор¬
биновой кислоты в 3%-ном растворе К*НРО«, содержащем 0,1% желатина
я 042% MgCl(): 7) фотоэлектроколориметр; 8) вакуумный эксикатор; 9) ва¬
куумный насос.Ход анализа. Навеску растительного материала 1 ± 0,001 г
помешают в охлажденную фарфоровую ступку, добавляют
0,1 г толченого стекла, б см3 фосфатного буфера, pH 7,8 и тща¬
тельно растирают. Полученную взвесь переносят в пробирку н
помещают в стакан со льдом.Для определения активности одной дегидрогеназы в пробирки
(опытные я контрольные) наливают по 1 см* полученной взвеси.
В опытные пробирки добавляют 0,2 см3 субстратной смеси, а в
контрольные пробирки — 0,2 сл(3 раствора для контроля. При
работе с зелеными частями растения взвесь (вытяжка) окра¬
шена. поэтому ставят второй контроль. В этом случае к 1 см3
взвеси добавляют 0,2 см3 фосфатного буфера. Содержимое про¬
бирок перемешивают вращением. Пробирки ставят в металли¬
ческий штатив и помещают в вакуум-эксикатор. Затем вакуум¬
ным насосом откачивают воздух до 10—12 мм давления ртут¬
ного столба. После откачки воздуха эксикатор накрывают све-
тонепроннцаемым чехлом (лучше иметь специальный деревян¬
ный футляр для работы с вакуум-эксикаторами) и оставляют на1.5	часа при температуре 20—21°. В случае низкой активности
время инкубации следует увеличить. По истечении времени ин¬
кубации к содержимому пробирок добавляют по 5 см3 рас¬
творителя для формазана. Содержимое пробирок взбалтываютii	фильтруют окрашенный раствор через маленький бумажный
•фильтр. После этого измеряют интенсивность окраски на фото¬
электроколориметре при зеленом светофильтре в кювете (10мм).*	А. Ф. Сысоев, Т. С. Красная. Научно-технический бюллетень
Всесоюзного селекционно-генетического ин-та. вып. VII, Одесса, 1967.3*
Для вычисления специфической дегидрогеназной актив ноет st
из показания оптической плотности опыта вычитают показание
контрольной «пробы (бессубстратные дегидрогненазы), а при
определении в зеленом материале — также показания второго
контроля. Активность фермента выражают в единицах экстннк-
цин или в микрограммах восстановленного тетраэолня, для чего
строят калибровочный график.При построении калибровочного графика для получения
восстановленного трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) берут5	пробирок и вносят в каждую по 1 см* 5%-його раствора ас¬
корбиновой кислоты (см. реактив 6). Затем в каждую пробирку
прибавляют по 0,2 см* раствора ТТХ с содержанием в указан¬
ном объеме 0,2; 0,4; 0.6; 0,8; 1 мг ТТХ. Для этого предвари¬
тельно готовят растворы трифенилтетразолия различной кон¬
центрации (от 0,1 до 0,5%). Содержимое пробирок нагревают до
кипения и оставляют в темном месте на 20 минут. Затем в каж¬
дую пробирку добавляют 5 см* растворителя для формазана,
перемешивают и фильтруют в другие сухие пробирки и, нако¬
нец, колориметрируют на ФЭК-М при зеленом светофильтре
в кювете 10 мм. На основе полученных данных строят калибро¬
вочный график, откладывая на оси абсцисс содержание ТТХ,
а на оси ординат—оптическую плотность растворов.Модификации методов определения дегидрогеназ в трубках
Тунберга с использованием ТТХ см. у П. Джорджеску и Е. Пэу-
песку*.Манометрический метод определения активности дегидроге¬
наз. Активность дегидрогеназ органических кислот цикла Креб¬
са можно определять в аппарате Варбурга, в котором метиле¬
новая синь, восстановленная отнятым от субстрата водородом,
окисляется кислородом воздуха. По количеству поглощенного
молекулярного кислорода в системе судят об активности фер¬
мента.Реактивы: I) фосфатный буфер, pH 7.9; 2) субетрпт-трикярбонопая кис¬
лота, предварительно нейтрализованная содой до конечной концентрации
0.02 М; 3) раствор метиленовой еннн 1:25000; 4) 0.005 М раствор KCN;
5) 20%-вый раствор КОН.Ход анализа. Берут навеску листьев 0,3 + 0,0001 г и разре¬
зают острой бритвой. Срезы толщиной около 1 мм промывают
проточной водопроводной водой, затем загружают в сосудик
Варбурга. В центральный объем сосудика (см. рис. 106) нали¬
вают 0,4 см3 КОН, а в основной — 2 см3 фосфатного буфера и0,2 см* KCN. В боковую часть сосуда наливают 0,5 см* метиле¬
новой сини и 0,5 см* субстрата. Контролем служат сосудики, в
боковой отросток которых вместо субстрата наливают воду.
После того как сосудики загружены, их соединяют с маномет¬*	П. Джорджеску и Е. Пэ у песку. Бнохнынческио методы диаг¬
ноза и исследования. 1963.
рами, помешают в термостатную ванну, выдерживая в ней в
течение 15 минут с открытыми кранами манометров. После
этого содержимое боковых отростков приливают к буферу с на¬
ходящимися в нем срезами листьев. Через минуту устанавли¬
вают при открытом кране уровень жидкости Броди в правом
колене манометра на 150 мм, закрывают кран и отмечают ис¬
ходное положение мениска в левом колене манометра. Первый
отсчет проводят спустя 30 минут. Измерение ведут в течение1.5	часов.При расчетах специфической активности дегидрогеназ вы¬
читают количество кислорода, поглощенного в сосудиках, не со¬
держащих субстрата. Активность выражают в куб. миллиметрах
поглощенного кислорода на 1 г сырого веса или на 100 мг
белка.Спектрофотометрический метод определения активности
глютаматдегидрогеназы. Слектрофотометрические методы опре¬
деления активности дегидрогеназ основаны на том, что НАД и
НАДФ не поглощают свет при длине волны 340 нм, в то время
как НАД* На и НАДФ Нг обладают этой способностью.Об	активности глютаматдегидрогеназы можно судить по
уменьшению количества НАД-Нг при восстановительном амини-
рованнн а-кетоглютарата ионом аммония или по увеличению
количества НАД*Н* при окислительном дезаминировании глю¬
таминовой кислоты. В зависимости от целей исследования опре¬
деляют активность связанной или свободной глютаматдегидроге¬
назы *.Навеску 1—2 г свежей растительной ткани или предвари¬
тельно замороженной сухим льдом (корни, листья) растирают
в ступке с равным количеством 0,01 М фосфатного буфера, pH
7,4. При растирании растительного материала добавляют ци¬
стеїні (1 мг/г сырой массы) или восстановленный глютатнон
(1 мг/г сырой массы) и диэтилдитиокарбомат (1 мг/г сырой
массы). Растирание проводят в холодной комнате (при +2°).
Полученный гемогенат отжимают через 4 слоя марли и центри¬
фугируют при 18 000 g в течение 20 минут. Надосадочную
жидкость используют для определения активности фермента.1.	При определении активности глютаматдегидрогеназы по
реакции восстановительного аминировання а-кетоглютаровой
кислоты в опытную кювету вносят: 25 мкМ а-кетоглютарата ка¬
лия, 0,36 мкМ НАД-Иї, 6 мкМ амида никотиновой кислоты и2.5	см3 0,01 М фосфатного буфера до конечного значения pH
среды 7.6—7,7. К опытной пробе добавляют 0,15 cjh33MNH4C1.
Ферментный препарат вносят в количестве 0.05—0,2 см8 в зави¬
симости от активности глютаматдегидрогеназы в изучаемом
объекте. Общий объем реакционной смеси 3,2 см3. Контрольная*	В. И. Яковлева, В. Л. К р с т о в и ч. М. К. Гильманов. Биохи¬
мия, т. 29, вып. 3, 1964.60
лроба состоит из той же реакционной смеси, но вместо NH4Cl
добавляют 0,15 см3 HjO.2.	При определении активности глютаматдегндрогеназы по
окислительному дезаминированию глютаминовой кислоты опыт¬
ная реакционная смесь содержит: 25 мкМ глютаминовой кис*
лоты, нейтрализованной КОИ, 0,36 мкЬХ НАД*, 6 мкУі амида
никотиновой кислоты, 2,4 смг фосфатного буфера и 0,05—0,2 см*
ферментного препарата (pH реакционной смеси 8,3). В кон¬
трольную кювету вместо глютаминовой кислоты прибавляют
соответствующее количество воды.Измерение оптической плотности ведут на спектрофотометре
при 340 нм в кювете 1 см в течение 5 минут (замеры через
каждую минуту). За единицу активности глютаматдегидроге-
назы принимают такое количество фермента, которое произво¬
дит изменение оптической плотности на 0,001 в минуту X 1000.
Удельную активность выражают в единицах активности фер¬
мента на I мг белка, который определяют по Лоури.Определение активности
нитратредуктазыЭтот фермент (Н. Ф. 1.6.6.2) катализирует реакцию восста¬
новления нитратов до нитритов. Колориметрические методы оп¬
ределения активности фермента (in vitro и in vivo) являются
наиболее распространенными. Они основаны иа учете количе¬
ства нитрита, образовавшегося за определенный промежуток
времени. При определении активности очищенных препаратов
фермента используют и спектрофотометрические методы*.
Ниже приводится метод** определения нитратредуктазы (in
vivo), не требующий добавления НАД-Нг. необходимого при
определении фермента другими методами.Реактивы и аппаратура: I) раствор 0.06 М фосфатного буфера,
pH 7; 2) раствор 0.1 М яблочной кислоты: 3) раствор 0,1 М KNO»; 4) су-
хоЛ реактив Грисса (тщательно растирают в фарфоровой ступке смесь 0.1 г
а-нафтиламнна, 1 г сульфанпловой кислоты и 9 г винной кислоты, затем
растворяют в 100 см* дистиллированной воды н храият не более месяца
в темной герметической склянке); 5) образцовый раствор ннтрнта (раство¬
ряют 0,4927 « NaNOa в дистиллированной воде в мерной холбе на 1 дм*
и храият В( темной склянке; I см} этого раствора содержит 0.1 мг азота или
0,33 мг NOs; из этого раствора в день определения готовят рабочий раствор,
который содержит в 1 см* 0.001 мг азота или 0,0033 мг NOj); 6) трубки
Тунберга; 7) вакуумный насос; 8) ФЭК-М.Ход анализа. Растительный материал (листья, корни) режут
на тонкие кусочки примерно размером 2X3 мм. Отвешивают•	R. Н. Н a g с ш а п, D. P. Hucklcsby. Methods in Enzymology,
vol. XXIII, part. A.. 1971, pp. 491—503.•• E. G. Mulder, R. Boxma. W. L. Van Veen. Plant and soil.
X. 4, 1959.61
1 i 0,001 г нарезанных кусочков и помещают в трубку Тунберга
(рис. 11), куда добавляют 5 см3 0,06 М фосфатного буфера,
1 см3 0,1 М яблочной кислоты, предварительно нейтрализован¬
ный КОН, 1 см3 0,1 М KNOa и 2 см3 НаО. Проводят вакуум-
инфильтрацию, сначала откачивают воздух, а затем медленно
его впускают. Далее опять из трубок откачивают воздух и ос¬
тавляют на 30 минут при 37°. После этого реакцию прекращают,
добавляя 1 см3 ледяной уксусной кислоты, и раствор освет¬
ляют 3 см3 насыщенного раствора (NH^sSO*. В контрольную
пробирку приливают к навеске то же самое, что и в опытную,но перед эвакуацией воздуха сразу
добавляют 1 см3 ледяной уксусной
кислоты. Содержимое опытных и кон¬
трольных пробирок фильтруют. В за¬
висимости от концентрации нитрита
объем фильтрата можно либо довести
до 15 см3, либо сразу, не разбавляя,
использовать для определения нитрит-
ного азота. Для определения нитритов
берут 5 см3 раствора, добавляют 2 см3
реактива Грнсса и измеряют оптиче¬
скую плотность окрашенного раствора
на ФЭК-М с зеленым светофильтром
в кювете с толщиной слоя 5 мм. Из
показаний опытного раствора вычи¬
тают контрольный.Для вычисления содержания N0^
строят калибровочный график. С этой
целью в отдельные пробирки прили¬
вают рабочий раствор нитрита натрия
(в см3)’ 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 и приливают дистиллированнойводы до 5 см3. Концентрация NOT нитрита в каждой пробирке
будет соответственно 0,33; 0,66; 0,99; 1,32; 1,65 мкг в 1 см'.Активность фермента выражают в микрограммах NOr ни¬
трита, образовавшегося за 30 минут на 100 мг белка.Рис. 11. Трубки Тунберга нанормальных шлифах (н. ш.)./ — пробирка с тубусом. 2 —
пробка-сосуд.Определение активностилипазыФермент липаза (Н.Ф.3.1.1.3) расщепляет масла на глице¬
рин и жирные кислоты. По существующей классификации, этот
фермент принадлежит к гндролазам, действующим на сложно¬
эфирные связи карбоновых кислот.В покоящихся масличных семенах находятся различные
липазы, проявляющие активность в кислой (pH 4,7—5) или в
щелочной среде (pH 8). Поэтому следует различать кислую ли¬
пазу и щелочную.62
Метод определения активности их основан на титровании
раствором щелочи жирных кислот, образовавшихся по реакции:
С3Н5 (OCOR) 3 -Ь ЗН,0 С3Н5 (ОН )3 + 3RCOOH при действии
фермента на масло в слабокислой нлн щелочной среде.Реактивы и аппаратура: 1) ацетатный буфер. pH -1.7 (готоаят. смеши¬
вая равные объемы растворов и. уксусной кислоты и н. уксуснокислого нат¬
рия или аммония н 2 объема воды); 2) щелочный буфер (боратиый, pH 8,5);3)	0.2 н. раствор щелочи; 4) 1%-ный раствор тнмолфталеика в спирте;5)	этиловый сплрт и эфир; 6) толуол; 7) масло растительное; 8) автомати*
ческая мешалка; 9) колбы «а 100 см* с притертыми лробками.Ход анализа. Отвешивают по 2,5 -f 0,01 г свежеразмельчен-
ных семян в небольшие ступки и тщательно растирают с 1 см3
чистого подсолнечного масла и 5 см3 кислого или щелочного
буфера. Затем переносят растертую массу в конические колбы
на 100 см\ смывая остатки со ступки 5 см3 воды. После добав¬
ления 5 капель толуола колбы тщательно перемешивают на
автоматической мешалке, закрывают лробками и ставят на 20—
24 часа в термостат при 30°. По истечении этого времени в
колбы приливают по 50 см3 смеси спирта с эфиром (4:1). Дают
отстояться и титруют 0,2 н. спиртовой щелочью в присутствии
0,5 см* тимолфталеина (при светлых экстратах можно приме¬
нить фенолфталеин).Контрольные пробы. Для контрольных проб берут
также по 2 навески материала и поступают с ними таким же
образом, как с опытными пробами, и не ставят в термостат—
сразу же приступают к титрованию.Из результатов титрования опытных проб вычитают резуль¬
таты титрования контрольных. Активность кислой липазы выра¬
жают в куб. сантиметрах 041 н. щелочи, пошедшей на нейтра¬
лизацию жирных кислот, образовавшихся под влиянием дей¬
ствия липазь^на 10 г семян или на 100 лее белка.Приготовление чистого масла. Подсолнечное
масло (прессовое) в количестве 250—500 г взбалтывают в дели¬
тельной воронке с 2%-ным водным раствором щелочи, дают от¬
стояться. Щелочной раствор сливают. Промывают несколько
раз дистиллированной водой (до отрицательной реакции с фе¬
нолфталеином). Затем отстаивают, сушат, пропуская через ко¬
лонку с хлористым кальцием. Для получения слабо окрашен¬
ного масла пропускают его через колонку со смесью окиси алю¬
миния и углекислого магния, взятых в соотношении 2:1.Определение активности
фермента Ъ-глюкозидазыр-глюкозндаза (Н.Ф. 3.2.1.21) широко распространена в
листьях и семенах, особенно у растений, содержащих цианоген-
ные глюкоз иды. Этот фермент расщепляет р-глюкозндные связи
амигдалина, линамарнна и др.63
При измельчении растительных тканей, содержащих циано
генный глюкозид, выделяется синильная кислота.Во многих случаях необходимо бывает учесть активності
этого фермента. Она может быть определена одновременно с ак
тивностью р-глюкозидазы. Для одновременного учета актив¬
ности р-глюкозидазной и цианогенной в качестве субстрата удо*
бен раствор амигдалина. В этом случае наиболее удобно актив¬
ность р-глюкозидазы учитывать по приросту восстанавливаю¬
щей способности, связанной с отщеплением глюкозы, а циано¬
генное действие — по накоплению синильной кислоты.✓Реактивы и аппаратура: 1) 1%-ный раствор амигдалина (в случае учета
только р-глюкозидазы «применяют раствор арбутина или салицина; 0,57 г
салицина растворяют в 100 см* ацетатного буфера, pH 4.7); 2) мерные колбы
на 50 н 100 до; 3) фарфоровая ступка диаметром 10 см.Ход анализа. Берут навески 1—2 г семян или 2,5 г листьев,
тщательно растирают в фарфоровой ступке с 5 см3 воды и
1—2 г стеклянного песка. Затем с водой переносят все в колбу,
общий объем доводят до 50 или 100 см*. Приготовленные таким
образом взвеси (болтушки) служат в качестве растворов фер¬
мента, которые прибавляют к раствору глюкозида.В 2 колбы на 100 см3 приливают по 5 см3 раствора глюко-
зила и ло 20 см3 болтушки. Для контрольных определений ис¬
пользуют 2 другие колбы, в которые приливают ло 20 с.«3 бол¬
тушки, нагревают и кипятят с обратным холодильником в тече¬
ние 10—15 минут; после охлаждения приливают по 5 с.и3 ра¬
сі вора глюкозида. Все колбы закрывают резиновой пробкой с
укрепленной внутри пикриновой бумажкой (см. «Определение
цианогенных глюкозидов», стр. 360) и ставят в термостат
на 4—18 часов при 25°.Разведение ферментной вытяжки или болтушки и время дей¬
ствия фермента подбирают так, чтобы в определяемой пробе
оставалось до 50% гклюкозида от взятого исходного количества.
При отсутствии глюкозида в субстрате нельзя делать заключе¬
ния об активности фермента. По истечении установленного вре¬
мени действие фермента прекращают прибавлением 2 см3
10%-ной серной кислоты.Активность цианогенного фермента определяют ло измене¬
нию окраски пикриновой бумажки, сравнивая окраску со стан¬
дартной шкалой (стр. 360), а по приросту сахара, образующе¬
гося в результате гидролиза глюкозида, определяют р-глюкози-
дазу. Сахар определяют по микрометоду (стр. 145). Разница в
содержании сахара между опытными и контрольными пробами
получается тем больше, чем выше активность р-глюкозидазы
при одних и тех же условиях проведения опыта.Действие фермента выражают в микромолях глюкозы и си¬
нильной кислоты, полученной при действии ферментов за 1 час.
на 100 мг белка или в миллиграммах на 1 г взятого для иссле¬
дования материала.64
Определение активности
амилазыПод действием амилаз в растениях происходит гидролиз
высокополимерного углевода — крахмала с образованием дек-
стринов и мальтозы. В растениях встречаются а* и р-амилазы.
Особенно большое количество амилаз образуется при прора-
стани семян, богатых крахмалом. Эти 2 фермента различаются
между собой по характеру их действия на компоненты крах¬
мала—амилозу н амилопектин. р-амнлаза (Н.Ф.3.1.1.2) рас¬
щепляет амилозу нацело, превращая ее в мальтозу, а а мил опек-
тнн расщепляется под действием этого фермента на мальтозу
п декстрины. Последние в дальнейшем гидролизуются а-амила-
зой с образованием декстринов с меньшим молекулярным ве¬
сом. Под действием а-амилазы (Н.Ф.3.2.1.1) происходит мед¬
ленное образование мальтозы. При одновременном действии
а- и р-амнлазы крахмал гидролизуется на 95%.Методы определения активности амилазы основаны либо на
учете количества сахара, образовавшегося под действием фер¬
мента на крахмал, либо на учете количества ие расщепленного
ферментом крахмала, который определяют фотометрически
после обработки раствором иода *.Раздельное количественное определение активности ами¬
лазы основано на различной термолабильности а- и р-амилаз.
р-амилаза разрушается нагреванием до 70°. при этом а-амилаза
сохраняет свою активность. Некоторое снижение активности
а-амилазы, которое может происходить в таких условиях, прак¬
тического значения не имеет.Реактипы г/ аппаратура: І) цнтрашый б)фер. pH 5.6; 2) 2%-нын рястпор
крахмала, растворимого в воде (2 г крахмала, размешанного п 20 c.w' хо¬
лодной воды, выливают в 80 см* кипящей воды; после этого нагревают на
кинянкй водяной бане до просветления раствора): 3) 0.1 и. тнтропанный
рястпор перманганата; 4) растворы Фелиига (см. стр. 137); 5) подяная баня
с терморегулятором: 6) термостат.Ход анализа. Приготовление ферментной вы¬
тяжки. Навеску 5 г предварительно тонко измельченного на
мельнице типа* «Пируэт» зерна (муки) помещают в коническую
колбу на 100 см*, приливают 50 см3 дистиллированной воды,
хорошо перемешивают и оставляют стоять при комнатной тем¬
пературе в течение 30 минут, периодически встряхивая. Затем
содержимое колбы фильтруют через плотный складчатый
фильтр; первые порции мутного фильтрата возвращают на
фильтр. При трудном фильтровании можно сочетать центрифу¬
гирование и фильтрование.Определение активности а-амилазы. В 4 кониче¬
ские колбы емкостью 100 см3 (2 опытные и 2 контрольные) вно-•	В. В. Ю р к е в и ч. Г. Т. Козырева. М. И. Д е р г а ч е в а. Приклад¬
ная биохимия и микробиология, т. 3. вып. 2, 1967, стр. 157.3 Зама .W 40165
сят по 5 см3 ферментной вытяжки (фильтрата). Растворы в кол¬
бах нагревают в течение 15 минут на водяной бане при темпе¬
ратуре 70° (дЪпускаются колебания температуры не более 0,5е),
затем быстро охлаждают в сосуде с холодной водой или под
краном. При таком прогревании 0-амилаза полностью инакти¬
вируется, а u-амилаза сохраняет свою активность. После охлаж¬
дения во все 4 колбы добавляют по 5 см3 цитратного буфера,
pH 5,6. В 2 контрольные колбы сразу прибавляют по 20 см3 ра¬
створа Фелинга, 10 см3 2%-ного раствора крахмала и опреде¬
ляют сахара по Бертрану (стр. 136). Две другие опытные
колбы с содержимым нагревают в водяной бане при темпера¬
туре 40° в течение 10 минут, после чего в колбы прибавляют
по 10 см3 2%-ного раствора крахмала, предварительно подогре¬
того также до 40°. Точно замечают время и выдерживают в во¬
дяной бане «или в предварительно нагретом термостате при тем¬
пературе 40° в течение 30 минут. После этого к смеси прибав¬
ляют 20 см* раствора Фелинга и определяют количество маль¬
тозы, образовавшейся под действием фермента на крахмал.Определение суммарной активности а- и
р-амнлаз. В мерную колбу емкостью 200 см3 вводят 5 см3
исходной ферментной вытяжки (фильтрата) и объем доводят
до метки дистиллированной водой. В 4 конические колбы
на 100 см3 вносят по 5 см2 разбавленной ферментной вытяжки
и прибавляют ло 5 см3 цитратного буфера, pH 5,6. В 2 контроль¬
ные колбы сразу прибавляют 20 см3 раствора Фелинга и 10 см3
2%-ного раствора крахмала. Опытные колбы без предваритель¬
ного прогревания при температуре 70° выдерживают на водя¬
ной бане в течение 10 минут при 40° и далее поступают так, как
описано выше, при определении активности а-амилазы.Вычисление результатов. Вычисление производят
по средним данным из двух параллельных определений сахаров
как в опыте, так н в контроле. Из средних данных титрования
опытных растворов вычитают средние данные титрования кон¬
троля.Действие обоих ферментов выражают в миллиграммах маль¬
тозы, образовавшейся лод действием фермента в условиях
опыта, на 1 г зерна (муки) или на 100 мг белка. •Активность р-амилазы определяют по разности между сум¬
марной активностью а- и р-амнлаз и активностью а-амилазы.Определение активности
фосфорилазыФосфорнлаза катализирует превращение крахмала в глю*
козо-1-фосфат в присутствии неорганического фосфата. Эта
реакция обратима. Однако фосфорнлаза синтезирует крахмал
пз глюкозо-1-фосфата только при наличии в реакционной смеси66
следов крахмала, в качестве «затравки». Концентрация водо¬
родных ионов оказывает влияние на равновесие реакции. В ак¬
тивную группу этого фермента входит адеииловая кислота. Мо¬
лекулярный вес фосфорилазы равен 340—400 тыс. Этот фермент
широко распространен в растениях; высокая его активность от¬
мечена в клубнях картофеля, в семенах бобовых и др.Определение гидролитической активности фосфорилазы.
Принцип метода основан на определении изменений в содержа¬
нки неорганического фосфора или крахмала в реакционной
смеси под действием фосфорилазы.Реактивы и аппаратура: 1) реактив а (60 смл 0.1 М Фосфатного бу-ti"pa. pH 7.2 ■+• 160 см1 0,9%-ного раствора NaCI + ! см3 0.8%-иого раствора
l(jSO«); 2) 3%-ный раствор крахмала; 3) 0.1 М раствор фтористого натрия;4)	10%-ный раствор трихлоруксуснон кислоты (ТХУ); 5) фотоэлектроколо-
римстр.Ход анализа. Навеску 2,5 г семян или 5 г клубней карто
феля тщательно растирают в фарфоровой ступке со стеклян¬
ным песком, переносят в мерную колбу на 25 смъ и настаивают
с дистиллированной водой в течение двух часов. Объем взвеси
в колбе доводят до метки, перемешивают н фильтруют или цен¬
трифугируют. Экстракт используют как препарат фермента.В опытную пробирку наливают 1 с.ч3 3%-ного раствора крах¬
мала, 2 см* реактива а, 1 см\ 0,1 М раствора фтористого натрия
и 1 см 3 препарата фермента, перемешивают и выдерживают в
течение двух часов при температуре 37°. Затем в пробирку при¬
ливают 5 см5 10%-його раствора ТХУ, перемешивают, доводят
содержимое пробирки водой до объема 10 см3 и небольшой оса¬
док отделяют центрифугированием. Берут 2 см* центрифугата в
мерную колбочку на 10 см3, нейтрализуют, прибавляют I см*
молибдата аммония, 0,4 см3 эйконогена и определяют фосфор
по Фиске—Суббароу. Параллельно проводят холостое опреде¬
ление, добавляя реактив и фтористый натрий к прокипяченному
ферменту или после предварительного прекращения действия
фермента 10%-ным раствором ТХУ (1 см* фермента 4- 5 см*
10%-ного раствора ТХУ). Активность фосфорилазы выражают
ь миллиграммах связанного фосфора под действием фермента
из I г ткани. Количество связанного фосфора определяют по
разности между содержанием фосфора в контрольной и опыт-
гой пробе.Определение синтезирующей активности фосфорилазы. В дан¬
ном случае активность фермента выражают в миллиграммах не¬
органического фосфора на 1 г исследуемой растительной ткани
или на 100 мг ее белка, для чего предварительно определяют
содержание белкового азота.Реактивы: I) 0.1 М раствор глюкозо-1-фосфата (готовят в небольших
количествах и .хранят в холодильнике); 2) 0.1 п. нитратный буфер, pH 6;
3) 2.5%-ный раствор крахмала; 4) 10%-ный раствор ТХУ.3*67
Ход анализа. Навеску семян 2,5 г тщательно растирают с
кварцевым песком в ступке, затем переносят в мерную колбу
на 25 см3. Вытяжку настаивают 2 часа, периодически встряхи¬
вая. Берут 2 см3 вытяжки (болтушки) м добавляют 0,5 см3
цитратного буфера, 0,5 см3 2,5%-ного раствора крахмала и
I см3 0,1 М раствора глюкозо-1-фосфата. Для инактивации фос-
фатаз вносят 20 мг фтористого натрия. Эту смесь 60 минут
выдерживают в термостате или водяной бане при 37°. По окон¬
чании инкубации приливают 2 см3 10%-ной ТХУ. В контроль¬
ные пробы сразу приливают 2 см3 10%-ной ТХУ. Фильтруют и
в мерные колбочки на 10 см3 вносят по 2 см3 фильтрата. После
нейтрализации и прибавления соответствующих реактивов
определяют фосфор по Фиске—Суббароу (стр. 409).Определение активности
альдолазыАльдолаза (Н.Ф.4.1.2.7) играет большую роль в процессе
превращения сахаров в растениях. Она катализирует обрати¬
мую реакцию расщепления фруктозо-1,6-дифосфата на 2 фос-
фотриозы: 3-фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиаце*
тон (см. реакцию). Направление реакции зависит от темпера¬
туры. При повышении температуры реакция смещается в
сторону образования фосфотриоз, а при низких температурах
положение равновесия сдвигается в сторону синтеза. Альдолаза
принимает участие в синтезе как гексоз, так и пентоз. Наиболь¬
шая активность фермента обнаружена в активно растущих ча¬
стях растений.Метод основан на расщеплении ферментом фруктозод и фос¬
фата на фосфотриозы. Последние в отличие от других фосфор¬
ных эфиров гидролизируются в 1 и. щелочи при комнатной тем¬
пературе с отщеплением неорганического фосфора, прирост ко¬
торого после щелочной обработки соответствует количеству
фосфотриоз.68
Реактивы. 1) I к. растпор NaOH; 2) I п. раствор HCI; 3; 10%-ный
раствор ТХУ; 4) раствор натрксвоЛ соли фруктозо- 1.6-днфосфата (готовят
разведением I см* исходного 10%-лого раствора — аптечный препарат в ам¬
пулах— дистиллированной воаоА до объема 10 ел’; исходный раствор фрук-
тоэоднфосфата можно хранить в холодильнике около года, он не должен
иметь желтого оттенка; рабочий раствор лучше готовить и день опреде*
лення).Ход анализа. Навеску растительного материала (2 г) поме*
тают в фарфоровую ступку и тщательно растирают с дистилли-
ров а пішії водой. Содержимое переносят в мерную колбу объе¬
мом 50 см3 и доводят водой до метки. Колбу с экстрактом вы¬
держивают при комнатной температуре в течение 20 минут,
после чего перемешивают. В мерную колбочку или в градуиро¬
ванную пробирку объемом 10 см3 вносят 2 см3 ферментной
вьпяжки и прибавляют I см3 фруктозо-1,6-днфосфата. Содер¬
жимое пробирок перемешивают и' инкубируют в течение часа
в термостате при 37°.Одновременно ставят контрольные пробы. Для этого в про¬
бирки наливают 5 см3 10%-ного раствора ТХУ, затем 2 см3 фер¬
ментной вытяжки и 1 см3 фруктозо-1,6-днфосфата.Через час в опытные пробирки приливают 5 см3 10%-ного
раствора ТХУ. Содержимое пробирок (опытной и контрольной)
доводят дистиллированной водой до метки и фильтруют через
обеззолеиный фильтр. Затем берут 1 см3 опытного фильтрата в
мерную колбочку на 10 см3 или градуированную пробирку та¬
кого же объема, прибавляют к нему I см3 1 н. раствора едкого
натра и оставляют на 20 минут для гидролиза при темпера¬
туре 20°.Параллельно в мерные колбы объемом 10 см3 вносят 1 см3
контрольного фильтрата, к которому сразу прибавляют 1 см1
I н. раствора NaOH и I см* 1 ii. раствора HCI.Во все колбочки (или пробирки) приливают реактивы, необ¬
ходимые для определения неорганического фосфора (см.
стр. 409). Находят содержание неорганического фосфора в ис¬
ходном объеме вытяжки (50 елі3) с учетом разведения. Вычис¬
ление ведут по формуле:Л’У'У*
х н-Vx’Vi •где: а — количество фосфора, найденное по калибровочной
кривой (разность между опытом и контролем);
н — навеска;V	— объем исходной вытяжки;t*i — объем вытяжки, взятой на инкубацию;—	объем после инактивации фермента;
гл —объем, взятый для щелочного гидролиза фосфотриоз
и определения фосфора.69
Определение активности
кислой и щелочной фосфатазФосфатазы — ферменты, под действием которых происходит
гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты. Эти ферменты
связаны с обменом углеводов, нуклеотидов и фосфолипидов. По
химической природе гидролизируемых ими субстратов среди
фосфатаз различают фосфомоноэстеразы, фосфоднэстеразы,
фосфоамндазы, фитазу и др. Фосфомоноэстеразы различаются
со оптимумам pH, необходимым для -их действия. В растениях
имеются весьма активные кислые фосфатазы, у которых опти¬
мум pH находится около 4—5, и щелочные фосфатазы, опти¬
мум pH у которых 8,5—9.Принципы метода определения фосфатаз основаны на гид¬
ролизе какого-либо фосфата (глицерофосфата, амида фосфор¬
ной кислоты, лецитина, фнтниа и т. л.) раствором фосфатазы
в присутствии соответствующего буфера при определенной тем¬
пературе и за установленный отрезок времени.Реактивы и аппаратура: I) 0,29%-ный раствор NaCI; 2) 1%-ный раствор
глниерфосфата натрия (при определении кислой фосфата іьі I г р-гльцерофос-
фата растворяют о ацетатном буфере pH 5.2 и доводят буфером до объема
100 смл. в случае определения щелочной фосфатазы используют борлтный бу¬
фер. pH 8.9); 3) 20%-пая трихлорукс\спая кислота (ТХУ): 4) фарфоропая
ст\пка; 5) мерная посуда; 6) воронки 2.5 см\ 7) фотоэлектроклюрнметр.Ход анализа. Навеску измельченного растительного мате¬
риала 1 — 2 + 0,001 г помещают в фарфоровую ступку и тща¬
тельно растирают в присутствии 0,29%-ного раствора NaCI. Со¬
держимое ступки переносят в мерную колбу и доводят
0,29%-ным раствором хлористого натрия до объема 25 или
50 см3. В пробирку вносят 2 см3 полученного ферментного пре¬
парата (вытяжки) и 1 см3 глицерофосфата натрия. Содержи¬
мое пробирки перемешивают встряхиванием, закрывают проб¬
кой и ставят в термостат на 1 час при температуре 36°. После
этого периода к смеси прибавляют 2 см3 20%-ного раствора
ТХУ, перемешивают и фильтруют через обеззоленный фильтр.
В случае необходимости анализ на этом можно прервать до
следующего дня.'Одновременно готовят контрольные пробы. Для этого в пр
бирки наливают 2 см3 20%-ной ТХУ, затем 2 смя вытяжки1	см3 1%-ного раствора p-глицерофосфата натрия.В прозрачном фильтрате (опытном и контрольном) опреде¬
ляют неорганический фосфор по Фиске—Суббароу (см. стр. 409).
На определение фосфора берут 1 см3 вытяжки, которую вносят
в мерную колбочку объемом 10 см9, и далее поступают так же,
как при определении фосфора.Активность фосфатаз выражают в миллиграммах отщеплен¬
ного неорганического фосфора под действием фермента из 1 г
ткани или на 100 мг белка.70
Определение активности
А тФ-азыМетод основан на отщеплении ферментом от аденозинтри
фосфата (АТФ) неорганического фосфора, количество которого
определяют колориметрически *.Реактивы и аппаратура: I) 0,01 М раствор динатрневой соли АТФ;2)	СэратпыГ) буфер. pH 6.8; 3) 0.05 М растпор МпСЬ; 4) 10%-ный раствор
(ТХУ); Г») 0.5 М раствор КСІ; 6) ФЭК-М; 7) центрифуга.Ход анализа. Навеску листьев или проростков 0,10—0,15 +0,001 г растирают в течение 5 минут в охлажденных ступках
с песком и 2 см* 0,5 М КСІ. При работе с экстрактом взвесь
центрифугируют в течение 5 минут при 5 тыс. ooJmuh. В зара¬
нее приготовленные пробирки приливают 0,3 см* боратного бу¬
фера, 0,1 см3 M11CI2, 0,3 см3 экстракта и 0,3 см3 АТФ. Пробирки
ставят в водяную баню или термостат при температуре 45°. По
окончании инкубации к опытной смеси приливают равный объем
(1 см') 10%-ной ТХУ. В контрольные пробирки приливают
сразу раствор ТХУ, а затем все компоненты. Если экстракты
окрашены в желтый цвет, то окраску можно удалить двойным
объемом н-бутилового спирта.Определение фосфора ведут по Фиске—Суббароу или по ме¬
тоду Лоури и Лопеса в модификации Скулачева (стр. 412).
Активность фермента выражают в миллиграммах Р, отщеплен¬
ного от АТФ за 15 минут. Результаты выражают на 100 мг
белка.Определение активности
риоонуклеазыПринцип метода М. Куница в модификации О. П. Чепииога,Э.	Б. Сквирской, А. П. Рук и ной, Т. П. Силич (1964) основан на
определении фосфора низкомолекулярных продуктов, которые
отщепляются от рибонуклеиновой кислоты (РНК) иод влиянием
рибонуклеаэы и не осаждаются (в отличие от рнбонуклеазы)
кислыми растворами ураннлацетата.Реактивы и аппаратура: I) 0.1 М ацетатный буфер. pH 5; 2) 0,«1%-ииГі
водный раствор натриевой соли РНК; 3) 0.25%-ный раствор уксуснокислого
уранила [UOj(CjH.iC>2)r2HjO]. прнготоалениого на 5%-ной ТХУ; 4) фото.
*лектроколорнмстр нлн СФ-4А.Ход анализа. Берут навеску проростков 1—2 + 0,001 г, тща¬
тельно растнрают в ступке в присутствии дистиллированной•	М. П. Любимова. Ф. С. Файн, Н. С. Д с м я н о в с к а я. Биохи¬
мия. т. 31. вып. 4, 1966.71
воды и содержимое переносят в мерную колбочку или цилиндр
на 10 или 20 см3 (соотношение между навеской и водой 1:10).
После настаивания в течение часа водный экстракт центрифуги¬
руют и надосадочную жидкость используют для определения
активности рнбонуклеазы (определение можно вести и в гомо¬
генате). В опытные пробирки приливают 0,5 см3 водного эк¬
стракта и 1 см3 раствора натриевой соли РНК (субстрат).
Смесь инкубируют при 37° в течение часа, после чего в про¬
бирки приливают равный объем осадителя — уксуснокислого
ураннла и через 30 минут фильтруют. В фильтрате определяют
фосфор на ФЭК-М по методу Фиске—Суббароу после предвари¬
тельной минерализации или на СФ-4А.В контрольные пробирки сразу прибавляют 2 см3 уксусно¬
кислого уранила, затем 0.5 см* экстракта, 0,5 см* ацетатного
буфера и 1 см3 раствора натриевой соли РНК. По разности
между содержанием фосфора в опытной и контрольной пробах
судят о количестве фосфора, отщепившегося от РНК под дей¬
ствием фермента. Активность рнбонуклеазы выражают в милли¬
граммах Р на 100 мг белка ферментного экстракта.Определение активности
пектинметилэстеразы (ПЭ)Принцип метода. Сущность метода заключается в получении
гомогената и в гидролизе раствора пектина с последующим
определением в нем метилового спирта.Две параллельные навески растительного материала по 10 ±
yz 0,01 г растирают с 50 с.«3 0,2 М фосфатного буфера (pH 6—
6,5). Гомогенат настаивают в течение часа при комнатной тем-
пературе. Затем фильтруют через плотную ткань, тщательно
отжимают, промывают небольшой порцией буферного раствора.
После этого фильтрат и промывные воды переносят в мерную
колбу на 100 см3 и добавляют 10 см3 0,5%-ного раствора пек¬
тина. Одна навеска служит опытной пробой, другая — контроль¬
ной. В контрольную колбу приливают 2 см* 2 н. раствора сер¬
ной кислоты для инактивации фермента. Контрольную и опыт¬
ную пробы оставляют в одинаковых условиях на 2 часа при
температуре 20°.После инкубации в опытную колбу добавляют также 2 см32	и. раствора серной кислоты. Смесь отфильтровывают в мер¬
ные колбы, остаток на фильтре промывают водой и содержи¬
мое обеих колб доводят до метки.После доведения содержимого мерных колб до метки али¬
квотные количества (20—50 см3) полученного фильтрата отго¬
няют в аппарате Парнас—Вагнера и собирают по 20—40 с.«3
дистиллята, в котором определяют содержание метилового
спирта (см. определение метилового спирта —стр. 73). За еди-72
ницу активности ПЭ принимается количество фермента в 1 г
изучаемого растительного материала, способное выделить из
пектина при pH 6,5 и +20° в течение часа 0,032 мг метилового
спирта.Колориметрическое определение метилового спирта. Метод
основан на окислении метилового спирта марганцовокислым ка¬
лием в кислой среде до формальдегида. Последний при взаимо¬
действии с хромотропово» кислотой в силыюкислой среде обра¬
зует окрашенный продукт реакции, который определяют коло¬
риметрически.Реактивы и аппаратура: 1) 2%-ный раствор марганцовокислого калии;2)	раствор серной кислоты (1:3); 3) хромотроповая кислота: 4) насыщен¬
ный раствор сернист окислого натрия; 5) метиловый спирт (обезвоженный и
езежеперегнанный); 6) этиловый спирт; 7) колбы мерные на 100 н 200 с.и*:
8) пипетка, градуированная на 1 см\ и другая химическая посуда; 9) ФЭК-М;
10) шкаф вакуум-сушильный.Приготоаленис реактивов. Очистка хромотропової'!
кислоты (нафтолдисульфокислоты). Хромотроповую кислоту
в количестве 10 г растворяют в 100 си/3 воды, фильтруют, упа¬
ривают раствор до 8—10 см3 и приливают 250 см3 этилового
спирта. Выпавший осадок хромотроповой кислоты отфильтровы¬
вают и сушат в вакуум-сушилыюм шкафу при 40°. Приготов¬
ляют 10%-ный раствор хромотроповой кислоты (годен не более
1—2 дней).Приготовление стандартного раствора мети¬
лового спирта. Обезвоженный и свежеперегнанный мети¬
ловый спирт в количестве 0.1 г растворяют в воде в мерной
колбе на 200 с.и3, тщательно перемешивают раствор. Отмери¬
вают 2 си/3 этого раствора в мерную колбу на 100 си/3 и доводят
водой до метки. Приготовленный стандартный раствор содержит
0,01 мг метилового спирта в 1 си/3.В чистые сухие пробирки вносят пипеткой от 0,1 до 1 СП/3
стандартного раствора метилового спирта с интервалами в 0,1 си/3
и содержанием метилового спирта от 0,001 до 0,01 мг, добав¬
ляют дистиллированную воду до объема 2,5 си/3. Одновременно
ставят 2 контрольные пробы с 2,5 си/3 воды (всего используют
12 пробирок). Затем в каждую пробирку, содержащую стан¬
дартный раствор и контрольную пробу, вносят пипеткой 1 си/3
раствора I-bSO«. 0.5 си/1 раствора КМп04, встряхивают каждую
пробирку одинаковое число раз и оставляют раствор на 10 ми¬
нут для окисления метилового спирта до формальдегида. Затем
в пробирки с контрольными пробами прибавляют по каплям на¬
сыщенный раствор №гСОз до обесцвечивания раствора и
столько же капель раствора №а3СОз прибавляют в каждую про¬
бирку стандартных проб. К обесцвеченным растворам прибав¬
ляют по 0.5 см* раствора хромотроповой кислоты, перемеши¬
вают и приливают осторожно по стенкам пробирок по 5 си/3
концентрированной H«SOi. Пробирки помещают в термостат73
на 30 минут при 100°. После этого их охлаждают до комнатной
температуры и измеряют оптическую плотность окрашенных ра¬
створов на ФЭК*М с зеленым светофильтром, в кювете с тол¬
щиной слоя 30 мм. Строят градуированный график, откладывая
по оси абсцисс концентрации метилового спирта (в мг). а по
оси ординат— оптические плотности, соответствующие этим кон¬
центрациям.Ход анализа. В чистые сухие пробирки вносят от 1 до 2 см'
анализируемого раствора (в зависимости от ожидаемого содер¬
жания метилового спирта), добавляют 2,5 смЛ дистиллирован¬
ной воды и интенсивно перемешивают раствор в течение 5 ми¬
нут. Дальнейшие определения проводят так, как при построении
градуировочного графика.Измерив оптическую плотность полученных растворов по
градуировочному графику, находят содержание метилового
спирта (в мг).Содержание метилового спирта (jc) вычисляется ло формуле
в объемных процентах:«• 100
х ~ б. I0C0*где: а — количество метилового спирта в анализируемом ра¬
створе, найденное по графику (в ліг);
б — количество взятой вытяжки (в ел3).Продолжительность определения 2,5 часа. Относительная
ошибка 6,5%. Метод позволяет определять от 0,001 до 0,01 мг
метилового спирта в колорнметрируемом объеме.Потенциометрический метод
определения пектинэстеразы (ПЭ)Пектинэстеразу (Н.Ф.3.1.1.11) по этому методу лучше опре¬
делять в ацетоновых препаратах, которые не содержат феноль¬
ных соединений и части органических кислот. Нейтрализация
их в обычных гомогенатах требует применения больших объе*
мов растворов щелочи, что приводит к спонтанному расщепле¬
нию эфирных связей и затрудняет учет количества щелочи, не¬
обходимой для титрования освобождающихся карбоксильных
групп в пектине в результате ферментативного гидролиза.Ацетоновый препарат в количестве 200 или 250 мг помещают
в колбочку с растворами: 15 см3 трис-буфера 0,05 М с pH 6,5
(или фосфатного той же молярности), 1 см3 10%-ного NaCI,5	см3 0,5%-ного яблочного или цитрусового пектина, доведен¬
ного до pH 6,5 раствором 0,05 н. NaOH. Смесь инкубируют
прн 30° в течение часа в термостатированной ячейке (можно в
термостате). Проточный электрод прибора ЛПУ-01 лучше заме¬
нить капиллярным, заполненным гелем агар-агара. По мере74
приближения стрелки гальванометра к pH 6 смесь оттитровы-
вают новыми порциями 0,05 и. NaOH. Одновременно отмечают
время, за которое стрелка гальванометра передвигается с поло¬
жения соответствующего pH 6,5 до pH 6. Титрование всей смеси
должно занимать не .менее часа. Реакционную смесь постоянно
перемешивают магнитной мешалкой или азотом, пропускаемым
через погруженный в смесь капилляр. Скорость протока газа
регулируют редуктором. Если смесь инкубируют в термостате,
то ее титруют одни раз— через час от начала опыта. Актив¬
ность фермента выражают суммарным количеством NaOH, по¬
шедшей на титрование карбоксильных групп, освобожденных
нектииэстеразой.Активность фермента (дг) вычисляют по формуле:Та л ох - н 2.3.где: Т — титр щелочи;а — количество щелочи, пошедшей на титрование;
н — навеска препарата;2.3 —постоянная величина (1 смл 0,05 н. NaOH соответ¬
ствует 2.3 мг — СООН групп).Определение активности
пояигалактуроназы (ПГ)Полнгалактуроиаза (Н.Ф.3.2.1.15) катализирует разрушение1,4	tt-глюкозндной связи между двумя остатками D-галактуро-
новой кислоты в молекуле деметокснлироваиного пектина (пек¬
тиновой кислоты). Активность ПГ определяется но количеству
разрушенного пектина за время ферментного гидролиза.Реактивы и аппаратура: I) ацетатный буфер. pH 4.7: 2) субстрат:
0.4%-ныА буферный раствор пектина (pH 4,7); 3) термостат.Приготовление субстратов. В лень анализа берут навеску0.4 г пектина сахарной свеклы или яблочного пектина и раство¬
ряют в 100 см3 ацетатного буфера. Для лучшего растворения
содержимое нагревают на плитке до 50—60°, а затем взбалты¬
вают на механической качалке около часа. После растворения
пектина раствор профильтровывают через ватку в сухую колбу,
откуда берут на анализ пипеткой по 25 см3.Ход анализа. Две навески по 25 г измельченного на мясо¬
рубке или растертого в ступке исследуемого материала, перено¬
сят с возможно меньшим количеством воды в колбы на 250 см3,
сюда же приливают по 25 см3 0,4%-ного буферного раствора
пектина.Содержимое одной колбы кипятят на плитке в течение при¬
близительно трех минут для инактивации фермента (контроль).
После охлаждения в контрольную пробу, а также и в опытную,75
которая не нагревалась, добавляют по 0,5 см3 толуола (анти¬
септик). закрывают корковыми пробками и ставят в термостат
при температуре 30° (колебание температуры допускается +1®)
на 3 часа (можно оставить на ночь). За время автолиза в опыт¬
ной пробе ПГ разрушает часть внесенного пектина. После авто¬
лиза (через 24 часа) опытную пробу кипятят так же, как ранее
контрольную. Затем содержимое обеих колб отфильтровывают
в мерные колбы на 200 см3 *. Фильтровать надо осторожно, ста¬
раясь не переносить навеску на фильтр (флльтр-ватка быстро
забивается).Навески в колбах хорошо промываются декантацией дистил¬
лированной водой, промывные воды пропускают через тот же
фильтр в те же мерные колбы и объем доводится до метки.
Б полученных фильтратах определяют содержание пектина
одним из описанных выше методов (объемным или карбазоль-
ным), причем в данном случае определяют только воднораство¬
римую фракцию.Пример вычисления. На титрование контрольной пробы пошло
a CJK3 гипосульфита (при определении пектина объемным методом). На тит¬
рование опытной пробы пошло б см1 гипосульфита. Разность между о и б
соответствует разрушенному пектину jr. Сіедовательио.х = (в — б)-К•0,0006357*6,5 мг Са-пектата,
где: 0,0006357 — титр гипосульфита по меди;6.5— коэффициент пересчета Си на Са-пектат.Учитывают разбавление л вычисляют активность фермента за 24 часа
опыта ня навеску 25 г (можно на меньшую или*ббльшую).Если определяют активность полигалактуроназы с исполь¬
зованием карбазолыюго метода для выяснения остатка нераз¬
рушенного пектина, то можно сделать это одним из следующих
двух способов.1.	По прописи, предложенной Е. В. Сапожниковой, Л. Г. Се-
мочкиной, Г. С. Барнашовой **, активность фермента определяют
в навеске 0.5—1 г растительного материала и соответственно
вносят меньше субстрата (пектина), примерно 2,5—5 см3
0,5%-ного раствора пектина. Действие фермента в контрольной
пробе сразу, в опытной — через 20 часов прекращают прнлпва-
ние.м в каждую колбу 20 с.и3 горячего 96%-ного этилового
спирта с одновременным помещением колб с обратными холо¬
дильниками в горяччю водяную баню на 5 минут (спирт должен
кипеть).*	Если в изучаемом растительном материале ПЭ обладает высокой ак¬
тивностью. то образуется гель, который прн фильтровании проб остается на
фильтре, и поэтому пектина в фильтрате будет мало. Создается впечатле¬
ние, будто ПГ также очень активна н разрушила весь пектин.В таком случае необходимо внести о инкубационную смесь раствор ща¬
велевокислого аммония, например 2%, в таком количестве, чтобы конечная
концентрация его оказалась примерно Г%. Тогда гель пектина не образуется
и результаты определения активности ПГ будут более достоверными.** *П. В. С а її о ж н ii к о в a. JI. Г. Семочки на. Г. С. Варна ш о в а.
Прикладная биохимия и микробиология, т. 3, вып. І, 1967.76
Количественное определение пектина в обеих пробах можно
произвести сразу по прекращении действия фермента или отло¬
жить на несколько дней. В день проведения анализа на содер¬
жание пектина в обе пробы добавляют еще по 15 см3 96%-ного
илового спирта (для получения его концентрации в смеси, рав¬
ной 82%) и кипятят на водяной бане 30 минут для удаления
сахаров, которые также реагируют с карбазолом. Остаток от¬
фильтровывают или центрифугируют и после 2—3-кратного про¬
мывания его горячим спиртом и удаления спирта извлекают во¬
дой растворимый пектин и учитывают его карбазольным мето¬
дом. Из разности между количеством пектина в контрольной и
опытной пробах вычисляют количество пектина, распавшегося
под действием фермента.Преимущества этого метода заключаются в малом расходе
растительного материала и пектина (субстрат), что ускоряет
фильтрование, н в возможности завершения аналитической
работы через некоторый промежуток времени. Недостатком яв¬
ляется большой расход спирта.2. По способу, рекомендованному Жослином *, пектин осаж¬
дают в виде Са-пектата, соблюдая при этом условия осаждения,
которые описаны выше, при определении пектина по Са-пектат-
ному методу. Берут из мерной колбы (фильтрат после инкуба¬
ции) аликвотную порцию, омыляют пектин равным объемом
0,4% -ного раствора едкого натра и оставляют на ночь (нли
на 4 часа) при комнатной температуре. Затем подкисляют
таким же объемом I н. раствора уксусной кислоты и осаждают
также равным объемом 11,1%-ного раствора СаС12. Центрифу¬
гируют, промывают осадок горячей водой, растворяют
в 0,5%-ном растворе версена (ЭДТА — этилендиаминтетрауксус-
ная кислота) при pH 6, доводят до определенного объема ** и в
аликвотной порции определяют пектин карбазольным методом.Определение активности
&-фруктофуранозидазыЭтот фермент (Н.Ф.3.2.1.26) известен был прежде как саха-
раза, инвертаза; он гидролизует только p-фруктознды (саха¬
розу, раффинозу, стахиозу и др.).Сахароза, или тростниковый сахар, как указывалось выше,
без гидролиза кислотой или ферментом не может быть опреде¬
лена обычным способом по Бертрану, р-фруктофуранозидаза
расщепляет ее на составные части — глюкозу и фруктозу. Актив-*	М. Joslyn, Chen Tung-Shan. Jour. Agr. and Food Chcm.,
v. 15. No 3. 1967.•• Учитывая, что карбазольным методом можно определить только милые
концентрации галактуронової! кислоты, следует соответственно разбавить
раствор.77
кость этого фермента различается у разных родов и видов ра¬
стений, у одного и того же растения она неодинакова в различных
органах (корнях, листьях, плодах), в различное юремя суток за¬
висит от возраста растения.Активность фермента определяют в вытяжке, в болтушке
(суспензии), приготовленных на буферном растворе, pH 5,5, или
в ацетоновом препарате (см. стр. 85). Для приготовления вы¬
тяжки или ацетонового препарата берут по 3 навески свежих
растительных материалов от 10—25 + 0,01 г (в зависимости от
активности фермента) и тщательно растирают с толченым стек¬
лом в фарфоровой ступке в присутствии ацетатной буферной
смеси. Затем переносят количественно в колбы на 100—250 см*
и добавляют буферной смеси до 25 см?. Одну колбочку с суспен¬
зией кипятят 2—3 минуты для инактивации фермента (кон¬
трольная проба). После этого во все 3 колбы приливают
по 5 см? 10%-ного раствора сахарозы (можно раствора обыч¬
ного продажного сахарного песка), т. е. в каждую колбу вно¬
сится 0,5 г сахарозы; pH смеси должен быть 5—5,5. В обе колбы
приливают по 4—5 капель толуола, закрывают плотно кор¬
ковой пробкой и ставят в термостат на 16—18 часов при
28—30°.По истечении этого срока колбы вынимают из термостата,
переносят из каждой содержимое в соответствующие мерные
колбы на 250 или 500 глі3, доводят до метки дистиллированной
водой, перемешивают и отфильтровывают часть жидкости. Бе¬
рут из фильтрата пробы по 10 (если объем доводился
до 250 см?) или по 20 см* (если объем был доведен до 500)
в конические колбы и определяют сахар по Бертрану или ферро-
цнанидным методом. В контрольной пробе, прокипяченной в на¬
чале опыта, редуцирующего сахара будет очень мало. Неболь¬
шое количество осадка закиси меди, которое образуется в кон¬
трольной пробе, получается за счет редуцирующих сахаров,
находящихся в навеске изучаемого образца, и отчасти за счет
примеси моносахаров, имеющихся в сахарном песке. По раз¬
ности между опытными и контрольной пробами судят об актив¬
ности фермента. Активность фермента выражают в миллиграм¬
мах полученного редуцирующего сахара на 100 мг белка или
на 1 г свежей навески.Пример п ы ч и с л с ii и я. Навески свеклы по 10 г доведены после
инкубации до 200 см* каждая, отсюда взято для определения сахара по
Бертрану по 20 см5 вытяжки, пошло на титрование контрольной пробы
4.6 елі3 перманганата с титром fio меди, равным 10 мг, на титрование опыт¬
ной —16,8 см* того же раствора.Разность между ними получена за счет работы фермента, разложив¬
шего часть сахарозы 16,8 —4.6 *= 12.2 см3, что отвечает 122 мг меди или
65.63 мг сахара. Если активность фермента выразить на 1 г навески, то
в нашем примере 20 см3 соответствуют навеске в I г. Этой навеске соот¬
ветствует 65.65 мг сахара. Следовательно. 10 г свеклы мог\г разложить
656 мг сахарозы.78
Определение
суммарной активности
протеолитических ферментовПротеолитичёские ферменты осуществляют разрыв пептид¬
ных связей (пептидазы) с фиксацией одной молекулы воды:
R — СО — NH — R,+HOH = R — COOH + R, — NH*. По спе¬
цифике действия на белки протеазы делятся на 2 группы: п р о-
теиназы. расщепляющие крупные белковые молекулы, и
пептидазы, катализирующие гидролиз продуктов распада
белков (полипептиды, дипептиды) до аминокислот. Обычно
определяют суммарную активность протеаз, используя в каче¬
стве субстрата белок исследуемого растительного объекта или
препарат стандартного белка — пептон.Основой метода является определение аминного азота в
фильтрате после расщепления белка протеолитнческими фер¬
ментами за определенный промежуток времени.Протеолитические ферменты, как правило, в растениях пред¬
ставлены различными молекулярными формами, называемыми
изофермента ми, которые, несмотря на свои химические и
физические особенности, катализируют одну и ту же реакцию.
Ввиду этого для выявления спектра деятельности суммарных
протеаз изучение активности в автолнтическнх смесях рекомен¬
дуется проводить во времени, а также при различных значениях
pH и температурах.Реактивы: I) фосфатная буферная смесь, pH 5.5: 2) рпкгнвы для опре¬
делении аминного азота но одному из методой, указанных на стр. 285 и 2&7;
3) 10%-нын раствор пептона: I) намельченное химическое стекло.Ход анализа. При определении активности в автолнтнческой
смеси отвешивают 5—10 г хорошо размолотой муки (пшеницы,
ячменя и др.) в конические колбы на 100 см\ приливают 40 см'
перегнанной воды, 20 смл фосфатного буфера, pH 5,5, 0,5 см3
толуола и ставят на 48 часов в термостат с температурой
35 4:1°. Параллельно ставят контрольный опыт, для чего взя¬
тую навеску муки с прибавленной водой кипятят на сетке 3—5	минут для инактивации фермента. В охлажденную колбу при¬
бавляют толуол и вместе с опытной колбой ставят в термостат.
Для каждого образца берут по 2 параллельные навески для
опытных и контрольных проб.При изучении изменений активности ферментов во времени
колбы с автолитическимн смесями выдерживают в термостате
различное время (3; 6: 12; 14; 24; 48 и 72 часа) и получают ха¬
рактеристику активности ферментов во времени. Для изучения
реакции ферментов на различное pH среды добавляют фосфат¬
ный буфер до получения различных значении pH субстрата (4.5;
5; 5,6; 6,2; 7,0; 8,0; 9,2). В зависимости от предполагаемой актив¬
ности ферментов ставят в термостат на 24—48 часов. По окон-79
чашш опыта колбы вынимают из термостата, содержимое
фильтруют в мерные колбы на 100 см% и берут 10—20 см3 филь¬
трата для определения амннного азота по одному из указанных
методов (стр. 285).Определение в суспензии (болтушке). Метод позволяет опре¬
делить активность ферментов, находящихся в растворе и в ад¬
сорбированном состоянии на поверхности твердых частиц
тканей.Муку в количестве 10 г растирают в ступке с битым стеклом
в присутствии небольшого количества воды до состояния ка¬
шицы, которую переносят в мерную колбу на 200 см3 (исполь¬
зуя около 150 см3 воды), прибавляют 0,5 см3 толуола и 2 часа
настаивают при комнатной температуре, периодически взбал¬
тывая содержимое. Через 2 часа жидкость в колбе доводят до
метки, хорошо перемешивают и берут 4 пробы по 10 елі3 в колбы
на 100 см3, добавляют 20 см3 воды, 10 см8 фосфатной буферной
смеси с pH 5,5, 2 см3 толуола и 10 см3 10%-ного пептона.
Колбу закрывают пробкой и помещают в термостат при 37°
на 48 часов. Содержимое двух контрольных колб до прибавле¬
ния буферной смеси и пептона предварительно кипятят (на
сетке) 3 минуты для инактивации фермента.Через 48 часов колбы вынимают из термостата и кипятят
на сетке 3 минуты для инактивации фермента. После этого со¬
держимое колб переносят в мерные колбы на 100 смг, доводят
промывными водами до метки, перемешивают, отфильтровывают
и в фильтрате определяют аминный азот.При вычислении результатов активность протеолитическнх
ферментов выражают в миллиграммах амннного азота, образо¬
вавшегося за 1 час, в пересчете на 1 г белка автолитнческой
смеси. Для этого нужно знать количество белка в исследуемом
материале. Активность ферментов можно выражать в милли¬
граммах амннного азота, образовавшегося за 1 час. в пересчете
на 1 г растительного материала.Определение изоферментовВ экстрактах из растительных тканей присутствуют и раз¬
личные изоферменты. В процессе электрофоретического разде¬
ления экстрактов и белков на гелях сохраняется активность
ферментов. Проявление электрофореграмм на гелях специфиче¬
скими реагентами позволяет выявить отдельные ферменты, не
затеняемые другими белковыми компонентами изучаемого
объекта. При этом удается провести четкое разделение фермен¬
тов с одинаковой специфичностью к субстрату, но различаю¬
щихся молекулярными особенностями и получивших название
изоферментов, или изозимов. После проведения электрофореза
белков на щелочном или нейтральном гелях (техника электро¬
фореза изложена на стр. 308) для выявления нзоферментов гели80
помещают в соответствующие инкубационные среды. Ниже при¬
водятся способы, обнаружения некоторых изоферментов, прове¬
ренные на различных растительных объектах *.Эстеразы. Для составления инкубационных сред готовят
следующие растворы: I) 0,2 М фосфатный буфер» pH 8;
2) 15%-ный раствор о-нафтилацетата в 50%*ном ацетоне.Инкубационная среда состоит из 10 см3 фосфатного буфера,
pH 8, 0,5 см3 а* нафтил ацетата и 20—50 мг диазониевой соли
(прочный синий РР), которую добавляют непосредственно перед
обработкой геля. Смесь тщательно перемешивают, отфильтро¬
вывают и разливают в пробирки, в которые помещены столбики
гелей после электрофореза. Проявление длится 10—30 минут
при 20°. Зоны белка, обладающего эстеразной активностью,
окрашиваются в черный цвет (продукт гидролиза а-нафтол
образует нерастворимый краситель с диазониевой солью). Элек-
трофореграммы отмывают перегнанной водой и при необходи¬
мости хранят в 20%-ном этаноле.Перокскдаза. Инкубационная среда состоит из 9 см3 запас¬
ного раствора. 1 см3 0,1%-ной HsOj, 10—20 мг нитропруссида
натрия. Запасной раствор готовят следующим образом:
н 100 см3 7%-ной уксусной кислоты растворяют 16 г уксусно¬
кислого натрия п насыщают этот раствор версеном (ЭДТА),
раствор фильтруют, фильтрат насыщают бензидином (основа¬
нием), фильтруют и хранят в холодильнике.Пробирки с гелем в инкубационной среде погружают в воду
со льдом, встряхивают до растворения кристалликов ннтро-
пруссида. Через 10 минут в зонах локализации нзофсрментов
появляется голубая окраска. После проявления раствор сли¬
вают и заливают водой. При хранении окраска может изме¬
ниться до слабо-голубой и коричневой.ц-амилаза. Для выявления изоферментов а-амнлазы необ¬
ходимы следующие растворы: 1) 0,1 М ацетатный буфер, pH 5,6;2)	индикаторный раствор (0,3%-ный раствор иода в 3%-ном
водном КІ. который перед употреблением разбавляют перегнан¬
ной водой в 6 раз).Для выявления белковых зон, обладающих амнлазной актив¬
ностью. в нижний гель заранее вводят крахмал. Рабочий ра¬
створ для приготовления нижнего (щелочного) геля состоит из
одной части раствора ЛГ? 1 (стр. 308), двух частей раствора № 2,
одной части воды и четырех частей раствора Лге 3, приготовлен¬
ного на 1%-ном растворе крахмала.После электрофореза гель помещрют в пробирку на 30—60	минут в ацетатный буфер, pH 5.5 (при 3г). Затем буфер
сливают, гель промывают перегнанной водой и погружают в
раствор иода на 5—10 минут (время подбирают для объекта нс-*	В. It. Сафонов. М. П. Сафонова. Биохимические методы в фи¬
зиологии растений. «Наука». 1971. стр. 127—II).81
следований). После этого раствор иода слипают и промывают
водой. О локализации изознмов а-амилазы судят по неокрашен¬
ным зонам.Лактатдегидрогеназа. Для приготовления инкубационной
среды используют следующие растворы: І) 0,5 М трис-HCl бу¬
фер, pH 7,4 {к 24,2 г трііс-(оксііметнл-амішометана) приливают
170 см3 1 її. НС1 и доводят объем до І дм*}; 2) І М раствор
лактата натрия (1,13 г в 10 см3 0,2 М трис-НСІ буфера).Свежеприготовленная инкубационная среда состоит из 5 см'I	М лактата натрия в трис-НСІ буфере и 1 мг феназнимето-
сульфата. Объем доводят до 50 см3 трис-НСІ буфером. Стол
бики гелей помещают в пробирки и заливают инкубационной
средой. Проявление электрофореграмм проводят в темноте
при 37° в течение часа. В местах локализации фермента появ¬
ляются фиолетовые зоны. Электрофореграммы хранят в смеси:
этанол — вода — уксусная кислота (10:30:1) -Алкогольдегмдрогеназа. Инкубационная среда состоит из
0,1 см3 96%-ного спирта, 20 мг НАД, 4 мг иитросинего тетро-
золия в 0,5 см* гликоля н 1 мг феназинметосульфата в 50 см'0,1 М трис-буфера. Для приготовления 0,1 М трис-буфера,
pH 8,5 берут 24,2 г триса и 50 см3 1 и. НС1 и доводят до 1 ом3
водой.Гель помешают в пробирки с инкубационной средой и про¬
являют в течение часа при 37°. Изоферменты алкогольдегидро-
геназы проявляются в виде фиолетовых зон. Гель хранят в ра¬
створе этанол — вода — уксусная кислота (10:30:1).Малатдегидрогеназа. Для приготовления инкубационной
среды используют следующие растворы: 1) 2 М раствор яблоч¬
нокислого натрия; 2) 0,1 М трнс-HCI буфер, pH 8,5; 3) ледяная
уксусная кислота.Инкубационная среда состоит из 1,5 смг 2 М раствора яблоч¬
нокислого натрия, 18 мг НАД, 0,6 мг феназинметсульфата.
10 мг нитросинего тетразолия. Объем доводят до 25 or
трис-НСІ буфером, pH 8,5.Гелн помешают в пробирки с инкубационной средой при 20—
24° на период от 30 минут до двух часов (выявляют оптималь¬
ное время для объекта исследования). Затем столбики геля пе¬
реносят в смесь для промывания: этанол—вода —уксусная кис¬
лота (10:30:1). Электрофореграммы хранят в последнем ра¬
створе в пробирках с закрытыми пробками.Метод вакуум-инфильтрацаиПри биохимическом изучении превращения веществ, актив¬
ности ферментов, а также действия различных минеральных
и органических соединений на биохимические процессы в
растительных тканях применяют метод вакуум-инфильтра¬
ции.82
Преимущество метода состоит в том, что не нарушается
целостность не только значительных участков тканей, по и от¬
дельных клеток, что приближает исследования к нормальным
условиям обмена веществ.Аппаратура: 1) вакуум-эксикатор; 2) шкаф или приспособление для
с)шки в токе теплого воздуха; 3) торсионные весы н вакуумный насос.Условия инфильтрации. Метод вакуум-инфильтрации требует
учета и соблюдения однородности и сопоставимости: 1) отдель¬
ных проб, изучаемых объектов (высечки листьев, диски корне¬
плодов, плодов и других органов); 2) фаз роста и других осо¬
бенностей исследуемых объектов; 3) концентрации и pH вводи¬
мых растворов для инфильтрации; 4) количества введенного
вещества на единицу веса тканей; 5) продолжительности ва-
куум-инфильтрации и инкубационного периода.При использовании данного метода однородность сред¬
них проб растительных объектов для анализа необходима по¬
тому, что пробы, инфильтрированные опытными растворами ве¬
ществ, сравниваются с соответствующими контрольными про¬
бами (без инфильтрации); высечки и диски должны быть взяты
в таком количестве и так, чтобы в каждую пробу попало одина¬
ковое количество одних и тех же или разных растений (по весу,
но числу дисков и проч.). В пробе могут быть листья только
одних и тех же ярусов.Концентрация и pH растворов одного или нескольких
веществ подбираются так, чтобы их общая концентрация не вы¬
зывала обезвоживания (плазмолиза) растительных тканей. Для
разных культур и различных органов концентрации должны
несколько отличаться. Во всех случаях следует приготовлять ра¬
створы, концентрация которых определяется числом молекул,
а не количеством весовых единиц. Концентрация водородных
ионов (pH) раствора должна быть близкой к изучаемым
объектам.Общее количество введенного вещества зависит от ана¬
томических особенностей объектов, величины межклетников,
продолжительности инкубации, концентрации и pH раствора,
а также особенностей культур. Надо стремиться, чтобы сопо¬
ставляемые пробы были по возможности одинаковы по количе¬
ству введенного pactBopa. Об этом судят по весу проб до и
после инфильтрации. Кроме того, концентрация раствора после
инфильтрации может быть измерена рефрактометром или более
точно — интерферометром.Продолжительность инфильтрации и инкубации не
может быть одной и той же для различных органов и культур.
Остаточное давление при инфильтрации также должно прини¬
маться во внимание.Ход анализа. Пробы высечек могут быть получены в двух
вариантах: а) срезанные с растений листья помещают череш-83
нами в воду на 1 час для выравнивания содержания воды в них.
а затем делают высечки; б) срезанные листья сразу же идут
для получения высечек, что имеет значение при изучении
различных сортов растений, выросших в неодинаковых усло¬
виях.Диски корнеплодов н плодов нарезают одинаковой толщины
и во избежание окисления сразу помещают в стаканчики с со¬
ответствующими растворами (стаканчики с растворами заранее
взвешивают). Затем из подготовленных проб листьев берут
одинаковые навески на автоматических весах с точностью
до 0,01 г (типа ВТК 200 + 0,01). Каждый вариант опыта с ин¬
фильтрацией какого-либо раствора лучше проводить в двух по¬
вторениях. Например, когда хотят инфильтрировать растворфосфата, то отвешивают 4 одинаковые
навески (2 для опытного н 2 для конт¬
рольного определения).Затем каждую навеску помещают в
сетчатый мешочек и погружают в стакан
по нескольку проб. Для того чтобы на¬
вески не всплывали на поверхность, их
покрывают крупнопористыми пластин¬
ками с грузом, заливают растворителем
и ставят в вакуум-эксикатор для разре¬
жения, разредив вакуум-эксикатор до
30—40 мм остаточного давления. Воздух
из межклетников выделяется, вспенивая
раствор. Давление поддерживают на оп¬
ределенном уровне, пока не прекратится
выделение пузырьков, затем, разъединив
соединение с насосом, медленно впускают
воздух в течение двух минут. В это вре¬
мя раствор проникает в ткани, диски
листьев становятся темно-зелеными. Пос¬
ле того как давление в эксикаторе урав¬
няется, пробы оставляют в растворах в
течение 5 минут. Наконец, пробы вынимают из растворов, про¬
мывают в дистиллированной воде и просушивают на фильтро¬
вальной бумаге. Для учета количество проникшего раствора
взвешивают и затем доводят до первоначального веса по воз¬
можности быстрее, на рассеянном свете, создавая ток теплого
воздуха. Для этой цели можно использовать шкаф с вентилято¬
ром внутри или сбоку (рис. 12).Время от времени навески взвешивают. Одним из показате¬
лей удаления влаги из межклетников листьев является приобре¬
тение нормальной окраски. После того как навески достигли
первоначального веса, отмечают время начала экспозиции. По
разнице между начальным и конечным количеством изучаемых
веществ судят о ферментативных процессах.Рис. 12. Шкаф для сушки
в токе воздуха (схема)./ — отверстие для входа воз¬
духа. 2 — рабочее простран¬
ство. 3 — спираль для на¬
грева. 4 — вентилятор; раз¬
мер шкафа 80 X 50 X 40 см.
нагрев спирали до 300*.84
Приготовление ацетоновых
препаратов ферментовАцетоновые препараты ферментов приготовляют двумя спо¬
собами.1.	Навеску материала замораживают в ступке, перемешивая
с сухим льдом (примерно по объему 1:1), в течение 1 минуты
измельчают в пластмассовой кофейной мельнице и полученный
порошок переносят на фильтр в воронку Бюхнера. Добавляют
ацетон, предварительно охлажденный до —10°. Осадок на во¬
ронке промывают сухим ацетоном 3—4 раза, до образования
рыхлого остатка. Полученный порошок высушивают над H2SO4
и хранят в эксикаторе над СаСІг в холодильнике. На 100 г ра¬
стительного материала расходуют примерно 500 см* ацетона.В полученном препарате определяют белок по Лоури для
учета активности фермента.Ацетон, применяемый для получения ферментных препара¬
тов, необходимо очистить, так как обычно он содержит уксус¬
ную кислоту и другие примеси. Для очистки 1 Ли3 ацетона к нему
добавляют 4 г перманганата калия н 6 г бикарбоната натрия,
дают отстояться и перегоняют. Отгоняют ацетон в колбу, снаб¬
женную хлоркальциевой трубкой. Система холодильников и
колб для этих операций должна быть собрана на шлифах и
обеспечивать охлаждение (применять змеевик, а не шариковый
холодильник). Для высушивания ацетона к нему добавляют
плавленый хлористый кальций из расчета 120 г на 1 дм* ацетона.Порошки могут храниться при низкой температуре различ¬
ное время (от нескольких дней до 1—2 месяцев) в зависимости
от того, препарат какого фермента приготовляется, каков уро¬
вень его активности в исследуемом растительном материале.
В каждом отдельном случае необходимо проверить, как долго
сохраняется активность фермента.Для определения активности фермента ацетоновый порошок
(весь или определенную навеску) экстрагируют буферным ра¬
створом и определяют активность. При вычислении ее учиты¬
вают величину навески порошка и вес растительного материала,
>!3 которого он был получен.Если необходимо не только определить ферментную актив¬
ность экстракта, но и выделить фермент, чтобы изучить его
свойства, применяют высаливание его с помощью сернокислого
аммония; применяют также препаративный электрофорез, ад¬
сорбцию на колонках и другие приемы *.2.	Растительный материал помещают в сухой лед. растирают
со льдом в ступке, промывают ацетоном при температуре не*	П. В. Г о р я ч с н к о в а. Основные принципы препаративного выделе¬
ния и очистки ферментов. В кн. «Основы молекулярной биохимии. Ферменты».
«На\ка». 1964.85
выше —15° н затем промывают ацетоном на вброике Бюхнера.
После этого материал вторично растирают с ацетоном в охлаж¬
денной ступке. Этот прием применяют до тех пор. пока порошок
не обесцветится. Бесцветный порошок высушивают на воздухе
или под вакуумом и хранят в вакуум-эксикаторе над H2SO4
и холодильнике.Перед определением активности ферментов в ацетоновом
препарате последний растирают в охлажденной ступке с 10 см
фосфатного буфера (pH 8,5) или трис-буфера (pH 8) в течение
20 минут. Затем смесь настаивают при комнатной температуре
30 минут и центрифугируют при охлаждении в течение 20 минут
при 20 тыс. об/лшн. Такой ацетоновый препарат содержит на¬
бор ферментов, но ряд естественных кофакторов удаляется в
процессе получения этого препарата. Поэтому в работе с этими
препаратами надо добавлять все необходимые кофакторы.
Определение витаминов
и других
биологически активных
ГЛАВА V веществ*Значение витаминов
и особенности их накопления
в растенияхВитамины относятся к различным классам низкомолекуляр¬
ных органических соединений, среди которых имеются углеводо¬
роды, спирты, кислоты. Витамины являются жизненно необхо¬
димыми веществами для человека и животных. Их отсутствие
в пище и кормах вызывает ряд специфических заболеваний.
В растениях витамины широко распространены и выполняют в
кич роль биокатализаторов, активно участвуя в различных про¬
цессах обмена веществ. Количественное содержание их в ра¬
стениях. как правило, очень невелико, что обусловливает спе¬
цифику н необходимость особо точных методов определения
витаминов. Некоторые растения или их отдельные органы яв¬
ляются естественными концентратами одного нли нескольких
витаминов одновременно. Так, например, овощные и плодовые
растения накапливают повышенные количества аскорбиновой кис¬
лоты. фолиевой кислоты, каротина. Количество аневрина, ниа-
цина и рибофлавина выше в зерне зерновых культур (особенно
злаковых и бобовых) по сравнению с другими сельскохозяй¬
ственными растениями. Витамин Ki накапливается в основном
к зеленых листьях.Витамины принадлежат к очень лабильным веществам, и их
количественное накопление в тех или иных растениях опреде¬
ляется генетическими особенностями и условиями выращивания
этих растений. Значительная роль в изменчивости содержания
витаминов принадлежит климатическим факторам и биологи¬
ческим особенностям изучаемых культур. Так. количество
аскорбиновой кислоты повышается у ряда культур (моркови,
огурцов, яблок) при их выращивании в северных районах
страны, в то время как у ряда других сельскохозяйственных ра¬
стений. таких, как томаты, перцы и некоторые другие, количе¬
ство аскорбиновой кислоты выше при их выращивании на юге.
Прн выращивании проса, риса и гречихи количество тиамина и
рибофлавина увеличивается прн повышении температуры воз¬
духа и ограниченном количестве осадков в период налива зерна.67
Большое значение имеют также дозы макро- и микроудобрений
и опособы внесения их в почву. Бор, цинк и марганец, напри¬
мер, усиливают накопление тиамина и рибофлавина в различ¬
ных зерновых культурах. Для получения высоковитаминной
продукции сельского хозяйства при выращивании растений
должны проводиться мероприятия, способствующие накоплению
в урожаях различных групп витаминов.Отмечены значительные различия в содержании витаминов
по отдельным органам и тканям растений. Так, содержание
аскорбиновой кислоты, как правило, выше в зеленых листьях
растений, чем в корнеплодах или клубнеплодах. Аневрин скон¬
центрирован в основном под оболочкой зерна и в зародыше.
Количество каротина выше в зеленых листьях; исключение со¬
ставляют клубни батата, корнеплоды моркови и плоды некото¬
рых видов тыквы. Установлена значительная индивидуальная
изменчивость по содержанию витаминов по отдельным расте¬
ниям. плодам и семенам. Эти различия связаны с величиной,
возрастом, условиями созревания. Так, плоды томатов, созрев¬
шие на растении, содержат больше аскорбиновой кислоты и
каротина, чем дозаренные. При этом условия дозаривания
также определяют величину накопления различных витаминов.
Индивидуальная изменчивость витаминов определяет необходи¬
мость правильного отбора средней пробы.Большое значение п изменчивости витаминов имеют и спо¬
собы выращивания растений, например различные виды культи¬
вационных сооружений. Для выяснения процессов накопления
витаминов является обязательным изучение их изменчивости в
онтогенезе растений, так как в отдельные периоды развития ход
накопления витаминов бывает различным. Интенсивность того
или иного процесса накопления определяется особенностями пе¬
риода вегетации, количеством осадков, температурой, степенью
освещенности. Многообразие внешних факторов,' влияющих на
количественное содержание витаминов, необходимо учитывать
при оценке витаминных качеств получаемой сельскохозяйствен¬
ной продукции.Определение аскорбиновой
кислотыВитамин С — аскорбиновая кислота (антицинготный фак¬
тор) растворим в воде. В особенно больших количествах он со¬
держится в свежих ягодах, плодах (актинидии, черной сморо¬
дины, апельсина, лимона) и овощах (стручковых перцах,
цветной капусте, брокколи, брюссельской капусте, кресс-
салате, укропе, листьях петрушки и др.). В растворах ви¬
тамин С очень чувствителен к кислороду воздуха и нагре¬
ванию.88
Аскорбиновая кислота обладает сильными восстановитель¬
ными свойствами. Продуктом ее первого окисления является
дегидроаскорбиновая кислота. В молекуле аскорбиновой кис¬
лоты имеются 2 энольные группы, которыми обусловлены ее
кислотные свойства.I—0	1СО - СОН = СОН — НС— НОСН — СН;ОН
L-аскорбиновая кислотаI	0	1СО — СО - СО - НС - НОСИ - СН,ОН
дегидроаскорбиновая кислотаМетод определения аскорбиновой кислоты основан на ее ре¬
дуцирующих свойствах. Раствор 2,6-дихлорфенолнндофснола
синей окраски восстанавливается в бесцветное соединение экс¬
трактами растений» содержащими аскорбиновую кислоту (реак¬
ция Тильманса).Реактивы и аппаратура: 1) I %-ная соляная кислота; 2) 1%-ныЛ водныйГгвор щавелевой кислоты, которым заменяют метафосфорную кислоту;2%-ная серная кислота; 4) аскорбиновая кислота кристаллическая;5)	KI; 6) 1 %-мый раствор крахмала; 7) 10%-ный раствор сернокислой меди;
8) 0,001 н. раствор KIOj (навеску 03568 г иодата после ааух часов высу¬
шивания при 102° растворяют о воде в мерной колбе на I дм*; из этого
0,1 и. раствора берут 100 см* н доводят водой до 1 дм*; раствор удобно
хранить а склянке с установленной микробюреткой, наполняющейся раство¬
ром снизу при помощи «груши»); 9) 0.001 н. раствор 2,6-днхлорфенолнн-
дофенолакраска (растворяют 60 мг сухой краски в мерной колбе на 200 см*,
прибавляют 100—150 с*3 теплой дистнллнроплниой воды н 4—5 капель 0,01 н.
щелочи; после сильного Ю-мннутного взбалтывания доливают колбу водой
до метки и, перемешав, фильтруют через плотный фильтр в сухую колбу);10)	2 мнкробюреткн с градуировкой на 0.01 см3, емкостью I и 5 см3;
ІИ бюретка с делениями на 0,05 г-м3; 12) ступка диаметром *15 см; 13) нож
из нержавеющей или хромированной стали; 14) кюветы эмалированные, лучше
вииипластовые, размером 20 X 40 см.Установка титра краски по аскорбиновой кислоте по
С. М. Прокошеву. Несколько кристаллов (около 1—1,5 мг) ас¬
корбиновой кислоты растворяют в 50 см3 2%-ной серной кис¬
лоты. Затем 5 см3 этого раствора титруют раствором краски из
мнкробюреткн. Сразу после этого другую пробу с 5 см* ра¬
створа аскорбиновой кислоты титруют из другой мнкробюреткн
точно 0,001 н. раствором иодата, причем в колбочку перед тит¬
рованием прибавляют несколько кристалликов (около 5—10 мг)
йодистого калия и 5 капель 1%-ного раствора крахмала (более
высокие количества йодистого калия сильно тормозят окисле¬
ние аскорбиновой кислоты иодом). Расчет титра краски произ¬
водится по следующей формуле:0.068 ах =	g	= мг аскорбиновой кислоты,89
где; а—число куб. сантиметров точно 0,001 н. раствора иодата;б	— число куб. сантиметров раствора краски;0.088 мг аскорбиновой кислоты соответствуют 1 см3 0,001 н.
раствора иодата.Пример вычисления титра 2,6-а н х л о р ф е и о л и и д о ф с-
иола. Пошло на титрование 1,32 см1 краски и 1,68 см1 иодата. Следова¬
тельно. 1 см* раствора краски эквивалентен (0,088-1,68) : 1,32 = 0,112 мг
аскорбиновой кислоты.Среднюю пробу (плодов, кочанов, корнеплодов, клубней,
листовых овощей) предварительно грубо измельчают ножом из
нержавеющей или хромированной стали на плексигласовой пла¬
стинке или в ростильне (следы железа и особенно меди катали¬
зируют разрушение аскорбиновой кислоты). Весь процесс из¬
мельчения необходимо выполнить возможно быстрее. Средняя
проба составляется не менее чем из 10—20 экземпляров, по¬
этому пробу для анализа берут так, чтобы входили в соответ¬
ствующей пропорции все ткани каждого экземпляра.Обычно отрезают сегмент толщиной 0,5—1 см после того,
как объект разрезан на 2 половины по главной оси. Полученные
таким образом сегменты ткани быстро измельчают ножом на
винипластовой или эмалированной кювете на мелкие кусочки и
перемешивают.Крупные сочные плоды (томатов и т. п.) режут по верти¬
кальной оси на 4 части, берут одну часть от каждого плода,
измельчают в винипластовой плоской чашке ножом или же
грубо растирают в большой фарфоровой ступке и перемеши¬
вают. Среднюю пробу мелких плодов и ягод (сливы, сморо¬
дины) измельчают в ступке целиком. Из плодов косточковых
предварительно вынимают косточки. Среднюю пробу листовых
овощей (укропа, сельдерея, петрушки, пера лука и пр.) измель¬
чают целиком или же берут ТОЛЬКО 1І2 листовой пластинки (по
оси) каждого листа, входящего в среднюю пробу (шпината,
салата, листовой капусты, щавеля и пр.).Из измельченного и хорошо перемешанного материала бе¬
рут в химические стаканчики на 50 см3 или на часовые стекла2	параллельные навески на технохимических весах для опреде¬
ления аскорбиновой кислоты. Прн одновременном анализе не¬
скольких образцов следует стремиться все навески для опреде¬
ления аскорбиновой кислоты сразу залить раствором соляной
кислоты и потом уже растирать до образования гомогенной
массы в ступке.При анализе навеску исследуемого материала в 5—20 г или
больше (в зависимости от содержания аскорбиновой кислоты)
заливают в ступке 20 см3 1%-ной соляной кислоты и растирают
до образования гомогенной массы. Процесс растирания не дол¬
жен длиться больше 10 минут. При анализе грубых тканей ра¬
стирают их в присутствии 2—3 г (в зависимости от павески)
хорошо промытого стеклянного песка, который берут по объему.90
Полученную массу сливают из ступки (через Стеклянную па¬
лочку н воронку) в мерную колбу на 100 смл. Ступку споласки¬
вают несколько раз 10%-ной щавелевой кислотой, которую вы¬
ливают в ту же мерную колбу. Содержимое колбы доводят до
метки 1%-ной щавелевой кислотой и закрывают ее пробкой,
сильно встряхивают и оставляют стоять около 5 минут. Затем
содержимое колбы выливают на сухой фильтр и отфильтровы¬
вают часть экстракта (около 50 см3) в сухой стакан или колбу.Соляная кислота извлекает из растительной ткани как сво¬
бодную, так и связанную аскорбиновую кислоту. Щавелевая
же кислота улучшает стойкость аскорбиновой кислоты в экс¬
трактах.Для титрования вытяжек из полученного фильтрата берут
пипеткой 2 параллельные порции по 10—20 см*, наливают в ста¬
канчик объемом 50 смъ и титруют из микробюретки 0,001 н. ра¬
створом (2,6-дихлорфенол индофенол а) краски до появления
ясно розового окрашивания, не исчезающего в течение 0,5—
1 минуты.Вытяжки из богатых аскорбиновой кислотой объектов можно
с успехом титровать из бюретки с делениями на 0,05 см\ и
объемы вытяжек, употребляемых для титрования, могут быть
увеличены до 20 см3.Ввиду стойкости аскорбиновой кислоты в присутствии ща¬
велевой кислоты титрование готовых вытяжек при необходи¬
мости можно отложить до следующего дня. При вычислении ре¬
зультатов вводят поправку и на реактивы.При необходимости производить особенно точные анализы
следует принять в расчет и другие вещества, которые могут
реагировать с 2,6-дихлорфенол индофенолом. Для этого к дру¬
гим двум порциям по 10 см? исследуемой вытяжки прибавляют
0,1 см* 10%-ного раствора сернокислой меди и нагревают 10 ми¬
нут при 110° (на бане или в термостате) и после охлаждения
титруют краской. В присутствии меди и при нагревании аскор¬
биновая кислота разрушается нацело. Полученную поправку
вычитают из данных титрования опытных растворов.Определение аскорбиновой кислоты в окрашенных вытяжках.
Многие плоды и ягоды и некоторые овощи дают окрашенные
экстракты, что затрудняет определение аскорбиновой кислоты
вышеописанным способом. Аскорбиновую кислоту окрашенных
вытяжек титруют раствором 2,6-дихлорфенолнндофенола
.(краски) в присутствии хлороформа, дихлорэтана или толуола.Навеску. (10 г) экстрагируют как обычно и доводят объем
экстракта до 100—200 см3 раствором щавелевой кислоты. После
фильтрования берут пипеткой 5 см? окрашенного экстракта в
пробирки (диаметр 20—25 мм. длина 150 мм) и туда же при¬
бавляют мерным цилиндром по 5 см* химически чистого хлоро¬
форма. Затем вытяжку титруют раствором краски при осторож¬
ном перемешивании, наклоняя пробирку, прикрытую пробкой.91
Прн появлении первого розового окрашивания в слое хлоро¬
форма титрование считается законченным. Одновременно про¬
водят такое же титрование контрольных проб с тон разницей,
что вместо экстракта в пробирки прибавляют смесь растворов
кислот соляной и щавелевой в соотношении объемов 1 :5.Количество аскорбиновой кислоты (д') в образце вычисляют
по формуле:I	(Ч'-а-Т'об
х = об^н *где: а —число куб. сантиметров краски (с вычетом поправки
на титрование чистого растворителя), которая пошла
на титрование экстракта;Т —титр краски по аскорбиновой кислоте;об	—общий объем вытяжки;об\ — число куб. сантиметров экстракта, взятого для тит¬
рования;
н —навеска материала.Пример вычисления аскорбиновой кислоты (в ягодах
черной смородины). Берут 10±0,01 г размельченных ягод и экстракт доводят
до 100 саР. Берут о см* экстракта, на титрование которого пошло 5.85 см
краски с титром 0.22 мг аскорбиновой кислоты. Подставив полученные ве¬
личины в приведенную выше формулу, получают содержание аскорбиновой
кислоты (в мг на 100 г свежих ягод):100-5,85 0.22‘100
.V =		= 2о/,4 мг аскорбиновой кислотыОпределение аскорбиновой
и оегидроаскорбиновой кислот(по Божику) *Реактивы и аппаратура: I) и. раствор H;SO«; 2) 1 М раствор Na2SO»
или Na?S; 3) 1 М раствор хлорной ртути—сулемы (27,15 г сулемы раство¬
ряют в 100 см3 96%-ного спирта); 4) 0.001 и. раствор 2.6-дихлорфенолиндо-
фенола (титр устанавливают, как указано на стр. 89); 5) I М раствор
уксуснокислого свинца; 6) конические колбочки на 50 см3; 7) химические
стаканчики на 30—50 ел3; воронки диаметром 5—6 см\ 8) пипетки мерные —
на 2, 5 и 10 см\ 9) штатив для серийного фильтрования; 10) мнкробюреткн
на 2 см1.Определение общего содержания аскорбиновой и дегидро*
аскорбиновой кислот. Отбирают пипеткой 5 или 10 см3 вытяжки,
в которой определена аскорбиновая кислота (по вышеописан¬
ному способу), в коническую колбу па 50 см3, туда же добав¬
ляют 3,5 см3 1 н. раствора серной кислоты и после перемешива¬
ния— 1,75 см3 1 М раствора NasSO<.*	J. Boczek. Rocz. psntswowego zaktadu higieny, 14. 1, 1963.92
После нового перемешивания закрывают колбочку резиновой
пробкой и оставляют на 10 минут. Через 10 минут* добавляют
в ту же колбу 2,5 слО 1 М раствора хлорной ртути и 5,75 с.н3
воды (11,5 см3 в случае, если взято 5 см3 вытяжки). После пе¬
ремешивания образовавшийся осадок отфильтровывают. Филь¬
трат является бесцветным, а если вытяжка была окрашена, она
частично обесцвечивается. Затем к 5 или 10 см3 фильтрата при¬
бавляют соответственно 10 или 20 см3 воды и титруют раство¬
ром 2,6-дихлорфенолнндофенола. Вычисляют содержание аскор¬
биновой кислоты, как указано ниже. Полученные результаты
представляют общее содержание аскорбиновой и дегидроаскор-
биновой кислот. По разности между этим количеством и содер¬
жанием аскорбиновой кислоты узнают содержание дегидро-
аскорбииовой кислоты в пробе.Для определения аскорбиновой кислоты в колбы на 50 см3
берут по 5—10 см3 вытяжки, приготовленной для определения
аскорбиновой кислоты, и последовательно прибавляют следую¬
щие реактивы: 3,5 сж3 1 н. раствора серной кислоты, 2,5 см3 ра¬
створа уксуснокислого свинца и 5 см* воды (или 10 см3, если
взято 5 см* вытяжки). После добавления каждого раствора со¬
держимое колбы перемешивают вращением. Под конец выпа¬
дает осадок (он сероватый, тянущийся, что обусловлено при¬
сутствием высокомолекулярных веществ). Содержимое колбы
интенсивно перемешивают вращением в течение 10 секунд, а за¬
тем добавляют 2.5 см3 95%-ного этилового спирта. Реакцион¬
ную смесь опять перемешивают, фильтруют через бумажный
фильтр, отбирают 5 или 10 см3 фильтрата н титруют 2,6 дихлор-
фенол и н дофенолом.Для вычисления аскорбиновой кислоты с учетом разведений
применяется следующая формула:О' Т'Об\'Об\' 100
* =	и-об,-об,	100 '•где: а —количество куб. сантиметров краски, которое пошло
на титрование пробы (об*);Т —титр краски;об| — первоначальный объем вытяжки, полученной из на¬
вески;обг —часть вытяжки, взятой для дальнейшего определения;063	—объем, полученный в результате обработки частипервоначальной вытяжки;064	— объем вытяжки, взятой на титрование краской;н — навеска.Пример вычисления аскорбиновой и дсгидроаскор-
би ново ft кислот (8 листьях петрушки). Навеска 10 г (н) разведена
на 100 см5 (об,), на определение суммы аскорбиновой и дегндроаскорбнно-
вой кислот взято 10 см* (об*); в результате обработки объем доведен да
23,5 гм1 (оба). Отсюда после фильтрования на конечное определение взято
10 см1 (о5|).93
На титрование пошло 6 см3 краски с титром 0.096 (мг аскорбиновой
кислоты).Подставив в фор.ч>л> значения, получают:6-0.C9J-I00-23.5-100 ,,, , 1ЛЛ
Х~	lU-lo-U»	— ' мг 11 г'Содержание аскорбиновой кислоты в данном случае составляло 126 и<»
на 100 г. Отсюда содержание дегндроаскорбнновой кислоты: 135,*1— 120 —
9.4 мг на 100 г.Определение витамина С в окрашенных объектах по Бекеру.Принцип метода: 2,5-дннитрофенн л гидразин с дегидроаскорби-
новой кислотой дает соединение, образующее с серной кислотой
осадок красного цвета, интенсивность которого измеряют фото-
метрически.Реактивы и аппаратура: I) 2%-ная щавелевая кислота (С2О4Н2); 2) аце¬
татный буферный раствор, pH 5,4 (стр. 441). который смешивают с 2%-ной
щавелевой кислотой в отношении 2:1 и разбавляют водой 1:1; 3) 2,6-ди-
хлорфенолиндофенол — ДИФ (0.2 г растворяют в 1000 см3 воды, сосуд хо¬
рошо закрывают н хранят в холодильном шкафу); 4) уксусноймиловый эфир
или хлороформ; 5) 10%-ный раствор тиомочевины в водном спирге I : 1
(раствор неустойчив); 6) 2,4-диннтрофешілгндразнн— ДФГ (3 г растворяют
в 100 см1 9 н. серной кислоты и фильтруют: устойчив около 4 недель):7)	85%-пзя серная кислота; 8) L-аскорбиновая* кислота — АК (приготов¬
ляют стандартный раствор для построения кривой растворением 0.60 г аскор¬
биновой кислоты в 200 см5 2%-ного раствора щавелевой кислоты); 9) центри¬
фуга, объем лробирок 50 н 100 см\ 10) баня со льдом; II) гомогенизаторХод анализа. Растительный материал измельчают под угле¬
кислым газом. Затем берут определенную навеску, в которой
должно содержаться около 5 мг аскорбиновой кислоты, смеши¬
вают со 120 см3 2%-ной щавелевой кислоты, гомогенизирую i
(2 минуты при 4 тыс. об!мин) и после тщательной промывка
стакана и ножа 2%-ной щавелевой кислотой доводят до объема.
Экстракт взбалтывают и после центрифугирования берут пипет¬
кой 5 см* прозрачного раствора в другую центрифужную про¬
бирку. в которую уже заранее налито 12 см3 ДИФ, и спустя
полминуты—10 смл хлороформа и взбалтывают до тех пор,
пока лишняя краска не перейдет в органический растворитель,
который после центрифугирования удаляют. Из водной фазы
пипеткой берут в 2 стаканчика по 4 ел3 жидкости, туда же до¬
бавляют 1 см* ДФГ и каплю раствора тиомочевины и пробу
ставят для реакции в термостат на 75 минут при 50°. Второй
химический стакан обрабатывают точно так же, но без добав¬
ления ДФГ. После охлаждения в ледяной бане добавляют еще
5 см* 85%-ной серной кислоты и спустя час измеряют экстинк-
цию при 540 нм. Незадолго до того во второй стакан добавляют
1 см3 ДФГ.Для построения калибровочной кривой из стандартного ра¬
створа, содержащего 30 мкг АК в 1 см3, берут 5 проб. В первую
добавляют 1 см* раствора аскорбиновой кислоты+ 4 см*М
2%-ной щавелевой кислоты, что составляет 30 мкг на 5 см*, за¬
тем в последующие приливают 2 см\ 3 см\ 4 сл3 и 5 см3 аскор¬
биновой кислоты и щавелевой кислоты так, чтобы общий объем
раствора составлял 5 см3. Затем пробы просматривают на фото-
электроколориметре и строят калибровочный график.Определение фолиевой кислоты
в плодах и овощахФолиевая, или птероилглютаминовая, кислота широко рас¬
пространена в растительных и животных тканях. Впервые кри¬
сталлическая фолиевая кислота была выделена из листьев
шпината, откуда получила свое название. Ее синонимы —фо¬
лат, фолацин, фолиат, витамин Вс. Фолиевая кислота включает
птеридиый скелет—р-амииобензойную и глютаминовую кис¬
лоты:Птероилглютаминовая (фолиевая) кислота (молекулярный
вес 441.42) кристаллизуется в виде желтоватых пластинок. Она
трудно растворима в воде, значительно лучше — в теплых ра¬
створах серной кислоты и гидрохлорной кислоты. Нерастворима
ь спирте, этиловом эфире и бензине. Фолиевая кислота наибо¬
лее устойчива в щелочных растворах. В ультрафиолете имеет
спектр при 257, 282 н 265 нм в 0.1 н. NaOH и соответствующиеEi*!-* величины 586, 570 и 206.Фолиевая кислота участвует в синтезе пуринов, пирпмиди-
нов, пантотеновой кислоты и различных аминокислот.Определение фолиевой кислоты по методу Г. М. Лущевской
(1968) основано на окислении водного экстракта раствором
КМпО< при pH 4 до интенсивно флуоресцирующего соедине¬
ния — 2-амино-4-гидроксиптеридин-6-карбоновой кислоты, кото¬
рое адсорбируют на активированном диатомите. Содержание
фолиевой кислоты определяется по интенсивности флуоресцен¬
ции элюата.Реактивы и аппаратура: I) фолиевая кислота (0.5—5 лмгг/сл3); 2) 0.25 М
и 2.5 М раствор ацетатного буфера, pH 4; 3) 4%-нын раствор перманга¬
ната калия; 4) 3%-иыА раствор лерекиси водорода; 5) 4%-ныЛ раствор
б)ры; 6) 2 н. раствор соляиоЛ кислоты; 7) 40%-ный раствор NaOH;8)	раствор сернокислого хиннна (0.5 мкг/см3 в 0.1 и. серной клслоте); 9) ад¬
сорбент-днатомят; 10) флуорометр ЭФ-ЗМ (см. рис. 14).95
Приготовление адсорбента-диатомита. Растертый диатомит
в количестве 50 г дважды суспензируют в 200 см3 4%-ного рас*
твора буры, кипятят 30 минут, декантируют. Промывают ли¬
сі нллнрован ной водой и суспензируют в 200 см* 0,25 М ацетат¬
ного буфера, pH 4. После 30 минут кипячения отфильтровывают
на воронке Бюхнера и промывают 1 дм2 0,25 М ацетатного бу¬
фера. Адсорбент высушивают прн комнатной температуре тон¬
ким слоем и хранят в банке с притертой пробкой.Ход анализа. Навеску 50—100 г тщательно растирают, затем
переносят в мерную колбу на 100—250 см3 н добавляют воды
до 3/« ее объема. Затем нагревают колбу 30 мннут на кипящей
водяной бане, охлаждают и доводят до метки водой. Содер¬
жимое колбы после взбалтывания фильтруют и берут для даль¬
нейшего анализа, объект экстракта, в котором должен быть 50—
100 мкг витамина. Взятый объем переносят в стакан, доводят
pH вытяжки до 4 2,5 М раствором ацетатного буфера. Затем
добавляют 4%-ный раствор перманганата калия до устойчивой
розовой окраски. Раствор перемешивают, оставляют на 5 ми¬
нут, избыток перманганата калня разрушают добавлением
3%-ной перекиси водорода, взбалтывают, реакцию среды до¬
водят снова до pH 4. Далее раствор очищают на колонке, при¬
готовленной заранее.Для приготовления адсорбционной колонки трубку размером
1,2X20 см наполняют активированным диатомитом при раз¬
режении с уплотнением. После этого колонку промывают 3 см
0.25 М раствора ацетатного буфера, затем пропускают опытный
раствор. Адсорбент должен быть постоянно покрыт раствором.Фолиевая кислота адсорбируется в верхней части колонки,
и ее элюируют дважды 10 смя ацетатного буфера и дважды
10 смл кипящего водного 4%-ного раствора буры. В мерную
колбу на 25 см3 переносят элюат, охлаждают его. реакцию
среды соляной кислотой доводят до pH 4 и добавляют воды до
метки. Затем интенсивность флуоресценции измеряют флуоро¬
метром со светофильтрами ФК-1 и ФК-2. Для определения со¬
держания посторонних флуоресцирующих примесей производят
гашение флуоресценции, например птеридин-б-карбоновой кис¬
лоты, добавляя в кюветы флуорометра 3—4 см3 40%-ного
NaOH и вновь измеряют интенсивность флуоресценции.Содержание фолиевой кислоты определяют по разности ин¬
тенсивности флуоресценций до и после гашения. Учитывают
снижение флуоресценции посторонних примесей на 15%, проис¬
ходящее за счет разбавления раствора щелочью.Для определения фолиевой кислоты составляют калибровоч¬
ный график. Его строят путем разбавления стандартного рас¬
твора фолиевой кислоты 0,5—5 mkzJcm* ее окислением и хрома*
тографической очисткой. Флуорометр настраивают по раствору
сернокислого хинина. Стрелка гальванометра при его исполь¬
зовании устанавливается на 30-м делении шкалы.96
Определение
никотиновой кислотыНикотиновая, или 0-пиридинкарбоновая кислота (C6H502N)
и ее амид (CeHeONs) широко распространены в растениях и
особенно в семенах.Никотиновая кислота растворима в воде, этаноле, серном
эфире и глицерине и не растворима в петролейном эфире. Она
устойчива к действию света, температуры и окислителей. Ме¬
тоды определения никотиновой кислоты основаны на образо¬
вании окрашенных соединений с бромцнаном, бромистым рода-
ном в присутствии различных аминов. Более стойкую окраску
дают соединения с бромистым роданом.Метод основан на измерении интенсивности окраски, обра¬
зующейся при взаимодействии никотиновой кислоты с броми¬
стым роданом и метолом. Ниже приведено описание метода
в модификации Є. М. Степановой.Реактивы и аппаратура: 1) 2 ii. серная кислоте; 2) 0,1 н. серная кис¬
лота; 3) 10 и 4 и. растворы NaOH; 5) 8и%-ный раствор сернокислого цинка;6)	0,5 и 4 я. растворы HCI; 7) 1%-иый н 10%-ный растворы роданистого
калия или аммония; 8) роданбромидный растоор (готовят перед употреб¬
лением; к охлажденной бромной воде «прибавляют по каплям 10%-ныЛ
раствор роданистого калия или аммония до окрашивания сначала в светло-
желтый цвет, а затем до обесцвечивания прибавляют 1%-иый раствор этих
реактивов, затем добавляют 20—50 мг углекислого кальция до образования
осадка: раствор фильтруют и храият на холоде п темноте); 9) 8%-ныА
раствор метола в 0,5 н. соляной кислоты; 10) основной раствор никотиновой
кислоты (приготовляют из расчета 1 мг никотиновой кислоты в 1 ел910	н. серной кислоты); II) рабочий раствор (готовят ежедневно из основ*
ного из расчета 5 мкг в I см* раствора); 12) ФЭК-М; 13) пробирки широ¬
кие с притертыми пробками или колбы с притертыми пробками на 50 см*.Перекристаллизация метола. Метол в количестве 100 г. сме¬
шанный с 0,7 г бисульфита натрия, добавляют к 300 см3 0,1 н.
серной кислоты, нагретой до кипения, и вновь подогревают до
кипения. При появлении окраски раствора добавляют активи¬
рованный уголь и раствор фильтруют. К фильтрату добавляют
0,3 г бисульфита натрия, 700 см3 спирта и помещают в ледя¬
ную баню на несколько часов, в темноте. Выпавшие кристаллы
отфильтровывают, промывают спиртом и высушивают на воз¬
духе в темноте.Ход анализа. Навеску 3 — 5 і 0,01 г, содержащую около
100 мкг никотиновой кислоты, тщательно растирают с неболь-4 Заказ Л* -10»	97
шон порцией 2 н. серной кислоты. Затем количественно пере¬
носят в мерную колбу на 50 см* , которую ставят на кипящую
водяную баню на 90 минут, помешивая содержимое.Растительные материалы, содержащие большое количество
жира, предварительно обезжиривают.После окончания гидролиза колбу охлаждают, доводят во¬
дой до метки и фильтруют, отбрасывая первые порции. Затем
берут 25 см* фильтрата и, прибавив несколько капель раствора
фенолфталеина, по каплям добавляют Юн. раствор едкого натра
до порозовеиня. Избыток щелочи нейтрализуют 5 н. серной кис¬
лотой. В полученный раствор после охлаждения вносят 2 см*
сернокислого цинка и несколько капель спирта. Сюда же по
каплям вносят 4 н. NaOH до появления осадка и бледно-ро¬
зовой окраски. Оставляют на 10 минут, при перемешивании,
объем доводят до 50 см3, затем фильтруют.Для проведения цветной реакции берут 8 пробирок с при¬
тертыми пробками и приливают в них следующие растворы.
В 3 пробирки (1—3) набирают по 5 см3 рабочего раствора
никотиновой кислоты, в 4 (4—7) — по 5 см3 исследуемого рас¬
твора и в одну (8) пробирку — 5 см3 воды (используется впо¬
следствии для внесения поправки на реактивы). Пробирки
нагревают на бане при 50° в течение 5 минут. В 1; 2; 3; 4; 5 и
8-ю пробирки прибавляют по 2 см3 роданбромидного реактива.
Пробирки 6 и 7 используют для поправки на амннореагирую-
щие вещества. Содержимое пробирок перемешивают и вторично
пробирки ставят в баню на 10 минут при 50°. После охлажде¬
ния и отстаивания в темном месте в течение 10 минут в первые
5 и 8-ю пробирки добавляют по 3 см3 метола, а в 6-ю и 7-ю —
но 2 см3 воды. Содержимое пробирок перемешивают и остав¬
ляют на час в темноте. Интенсивность окраски определяют на
ФЭК-М при 420 нм. Вычисление результатов производят по
формуле:Mt — Ai)'Oif| 'Об$‘Я' 100
* = Мэ —Л«) о*3 о** « ИКЮ •где: А\—оптическая плотность испытуемого раствора (2 оп¬
ределения);—	то же для поправки на аминореагирующне веще¬
ства (2 определения);А3 — то же для стандартного раствора;^4 — то же для поправки на реактивы;
об\ — объем гидролизата;обі	и 063 — количество гидролизата, взятого для очистки серно¬
кислым цинком и после нее;064—объем раствора, взятого для цветной реакции;о	— содержание никотиновой кислоты в 5 см* стан¬
дартного раствора;
н — навеска.9S
Определение тиаминаТиамин (витамин В\) представляет собой соединение, по¬
строенное из пиримидинового и тиазолового колец:СН3N=CNH3HBr <! = С-СНэ-СНаОНСН3-С i-CHa-N^ III	II	1^1N —СН	Вг СН-£Тиамин хорошо растворим в воде, в разбавленных этаноле
и метаноле. Нерастворим в этиловом и петролейном эфирах,
хлороформе, ацетоне, бензоле и изобутнловом спирте. Он очень
стоек в сильнокислой среде и менее стоек в нейтральной и
щелочной среде при нагревании. Тнамнн весьма чувствителен
к окислителям и восстановителям. Прн его окислении обра¬
зуется тиохром — вещество, обладающее сильной голубой флуо¬
ресценцией в ультрафиолетовом свете.Тиамин играет важную роль в обмене веществ. Кофермент-
ное производное тиамина — кокарбоксилаза, или тиаминппро-
фосфат, участвует в ферментативном декарбокснлировании
а-кетокислот.Метод определения основан на окислении тиамина железо*
синеродистым калием в щелочной среде. При этом образуется
тиохром, который флуоресцирует голубым светом прн ультра¬
фиолетовом освещении.Ниже приводим описание флуорометрического метода в раз¬
работке В. Н. Букина, К. Л. Поволоцкой, А. А. Кондрашевой,
Е. П. Скоробогатовой *.Реактивы и аппаратура: I) 0.1 н. раствор H2SO4. 2) 10%-пая соляная
кислота; 3) 15%-ный раствор чистого едкого натра: 4) 2.5 М раствор уксус¬
нокислого натрия; 5) 1%-ный раствор красной кровяной соли — Kjrc(CN)#
(готовят в день употребления; для окисления вытяжки используют 0,04%-ный
раствор KjFe(CN)e а 15%-ио» растворе NaOH; для этого к 4 см1 исходного
раствора приливают 96 см1 15%-ного NaOH; щелочной раствор красной кро¬
вяной соли очень нестоек и годен к употреблению только в течение 4 часов);6)	ацетатный буфер, pH 3.8—4; 7) 3%-ная уксусная кислота; 8) 25%-ный
KCI в 0,1 и. растворе HCI; 9) иэобутиловый спирт, который не должен
флуоресцировать (продажный н отработанный спирт можно очистить акти¬
вированным углем — 30 г угля на 1 дм*, с последующей перегонкой в при¬
боре со шлифами; прн испытании очищенного спирта на флуорометре стрелка
гальванометра не должна отклоняться более чем на 5 делений); 10) адсор¬
бент— катионит СДВ-3, или декальсо — см. стр. 436 (регенерацию и активи¬
рование адсорбента производят кипячением декальсо в течение 15 мннут
с 10-кратным количеством 3%-ной уксусной кислоты или нагреванием катио¬
нита СДВ-3 при температуре не выше 60—'70® ввиду его термолабильности);11)	ферментный препарат, содержащий фосфатазу (мицелий гриба Penicillum*	В. Н. Букин, К. Л. Поволоцкая, А. А. Кондратов а, Е. П.
Скоробогатова. Витаминные ресурсы и их использование. Сб. 3, 1955.
notatum млн chrystogenum отжимают на прессе, высушивают при 45*. расти*
рают и хранят а сухом месте; препарат применяют из расчета ЗО мг на I г
сухого вещества навески); 12) стандартный раствор тнамнна (10 мг тиаынн-
бромяда растворяют в 100 см3 0.01 н. раствора НС1; приготовленный раствор
тнаминбромкла стоек при дранении в холодильнике; Мэ основного раствора
в день определения готовят рабочий раствор; для этого 1 см1 стандартного
растэора доводят дистиллированной водой до 100 см*; в 1 см* последнего
раствора содержится 1 лгтиаминбромнда); 13) воронки делительные цилинд¬
рические объемом 40—50 см* (их краны и пробки смазывают глицерином);Ход анализа. Извлечение тиамина.
Навеску 5—10 ±0,01 г измельченного расти*
тельного материала помещают в ступку, при¬
ливают небольшое количество 0,1 н. раствора
H2SO« и тщательно растирают. Растертую
массу переносят в коническую колбу так,
чтобы общий объем составлял 50—75 см*. Со¬
держимое колбы нагревают в течение 45 ми¬
нут на кипящей водяной бане. После охла¬
ждения в колбу прибавляют 2,5 М ацетата
натрия до pH 4,5—5 (около 5 см*) и фермент¬
ный препарат фосфатазы, (мицелий; его надо
предварительно растереть с ацетатом натрия).
Колбы ставят в термостат при 37°, на ночь.
Затем содержимое колбы переводят в мерную
колбу на 100 см*, доводят объем до метки
дистиллированной водой и фильтруют через
бумажный фильтр. Для адсорбции берут
10 сл& вытяжки.Адсорбция тнамнна. Для проведения
адсорбции тиамина используют специальные
трубки (рис. 13). На дно трубки помещаюткусочек ваты и насыпают столбик адсорбента
(6—8 см). Через адсорбент пропускают 10 см3
3%-ной уксусной кислоты и вводят 10 см* вы¬
тяжки. Затем столбик адсорбента трижды
промывают 10 см3 дистиллированной воды
(30 см*).Элюирование тиамина ведут горячим
25%-ным раствором КС1 в 0,1 н. НС1. Элюат
собирают в мерный цилиндр до объема 25 см*. При использо¬
вании катионита СДВ-3 в качестве адсорбента элюирование
рекомендуется проводить 30 см* 25%-ного раствора KCI в 0,1 и.
НС1, небольшими порциями, по 5—6 см*.Примечание. Определение витамина В| в ряде объектов допустимо
анализировать упрощенно, без использования адсорбента. Для этого часть
вытяжки (20—25 см*), полученной после фильтрования первоначального
экстракта, встряхивают 2 раза с равным объемом изобугплового спирта
« течение 1—2 минут. Верхний спиртовой слой, содержащий нежелатель-10014) флуорометр.Рис. 13. Трубка
для адсорбции
тиамина.
ные флуоресцирующие примеси, отбрасывают. Нижний раствор лосле отслаи¬
вания я фильтрования используют для окисления, возможность исключения
стадии адсорбции тиамина для разных объектов определяется эксперимен¬
тальным путем.Окисление опытных н стандартных раство¬
ров (получение тнохрома). В маленькие делительные воронки
(на 40—50 см3) наливают по 5 смъ полученного элюата (или
вытяжки). В одну из воронок прибавляют 3 см3 0,04%-ного
раствора железосинеродистого калия в 15%-ном NaOH, пере¬
мешивают в течение 30 секунд и прибавляют 12 см3 изобути-
лового спирта. В другую воронку (контрольную) прибавляют3	см3 15%-ного раствора NaOH (без железосннеродистого ка¬
лия), перемешивают и приливают 12 см3 изобутилового спирта.
Делительные воронки закрывают пробками и сильно встряхи¬
вают в течение одной минуты. После отслаивания нижний слой
сливают. В изобутиловый спирт добавляют 1,5—2 г безводного
Na2S04 встряхивают, дают постоять и сливают в пробирку для
флуорометрии. Если раствор мутный, то следует добавить сер¬
нокислого натрия. Для флуорометрии используют только со¬
вершенно прозрачные растворы.Одновременно производят окисление стандартного раствора.
Для этого в 2 делительные воронки вводят по 1 см3 рабочего
раствора и прибавляют 4 см3 воды. В одну из воронок прили¬
вают щелочной раствор с железосинеродистым калием, а в дру¬
гую—только щелочной раствор. В дальнейшем поступают так,
как описано выше, и после сушки растворов сернокислым нат¬
рием приступают к флуорометрии.Флуорометри я. Для определения тиамина используют
флуорометр (рис. 14). Электронный флуорометр ЭФ-ЗМ (СССР)
предназначен для количественного измерения величины флуо¬
ресценции веществ в растворах. Он имеет набор светофильтров,
позволяющих производить количественное определение витами¬
нов В|, Вг, фолиевой кислоты. Принцип действия прибора за¬
ключается в том, что свет от кварцевой лампы типа СДВ-120,
проходя через отверстие диафрагмы, первичный фильтр и квар¬
цевую лампу, попадает на пробирку с испытуемым раствором.
Испытуемый раствор, облученный коротковолновой частью
спектра (для витамина В| длиной волны 320—390 нм, а для
витамина Вг —350—480 «д»), сам начинает светиться. Свет
флуоресценции испытуемого раствора попадает в кварцевую
оптику, расположенную с двух сторон пробирки. Сфокусиро¬
ванный пучок света проходит через вторичные светофильтры и
попадает на фотоэлементы. Фотоэлемент, преобразовывая све¬
товую энергию в электрическую, подает ее на вход электри¬
ческого усилителя, к которому подключен микроамперметр.В ходе работы с прибором включают стабилизатор прибора
в сеть переменного тока 220 в. В гнезда ниши вставляют один
первичный и два вторичных светофильтра с соответствующим101
обозначением (например, для витамнна Bj первичный свето¬
фильтр будет с надписью Bj — I, а вторичный В| — 2). В цен¬
тральное гнездо, между светофильтрами вставляют пробиркуРис. Н. Флуорометр ЭФ-ЗМ.а — общий вид (объяснение о тексте). 6 — схема прибора: /— квар¬
цевая лампа. 2 — светофильтр, J — пробирка с раствором, который
флуоресцирует под влиянием ультрафиолетовых лучей кварцевой
лампы, 4 — фотоэлемент, на которые попадает отфильтрованный
свет флуоресценции. Сигнал от фотоэлементов поступает на элек¬
тронный усилитель.(кювету) со стандартным раствором и нишу закрывают крыш¬
кой. Включают прибор, повернув ручку реостата 4 по часовой
стрелке до отказа, и дают прогреться в течение 10 минут. На¬
жимают кнопку 8, держат ее в нажатом состоянии и с помощью
ручки реостата 2 устанавливают стрелку гальванометра на
нуль. Отпускают кнопку и с помощью ручки реостата 5 при¬
водят стрелку гальванометра к нулю. Снова нажимают кнопку
>1 подводят ручкой реостата 2 стрелку к нулю, а затем это же
делают с помощью ручки 5. Эту операцию с реостатами 2 и 5
повторяют до тех пор, пока стрелка не будет сохранять нулевое
положение как при нажатой, так и при отпущенной кнопке.
Далее нажимают клавишу заслонки 7 и с помощью ручки 6
устанавливают диафрагму так, чтобы стрелка гальванометра
стала на желаемое деление, например 80. После этого пробирку
со стандартным раствором вынимают и в гнездо вставляют
испытуемый раствор. Нажимают клавишу заслонки и снимают
ноказания гальванометра.Расчет концентрации чистых растворов производят следую¬
щим образом. Предположим, стандартный раствор рибофлавина
с концентрацией 0,4 мкг показал 80 делений, тогда одно деле¬
ние будет равно 0,005 мкг; если испытуемый раствор показал
50 делений, то его концентрация будет 50*0,005 = 0,25 мкг. Если
растворитель флуоресцирует, то из показаний стандартного и
испытуемого раствора вычитают показания флуоресценции рас¬
творителя. Подготовка рабочих испытуемых растворов произ¬
водится согласно разработанным методикам определения вита¬
минов и других веществ.После определения интенсивности флуоресценции результаты
вычисляют по формуле:(Л - В)-1 *v,*v3
а- = ті	о \ \Г7Г ТЩ' мг тиамина в 1 г вещества,[Ах —	1%где: А — показание флуорометра для исследуемого раствора:
В — показание флуорометра для исследуемого раствора
без окислителя;В\ — показание флуорометра для стандартного раствора
без окислителя;А\ — показание флуорометра для стандартного раствора;
1 — 1 мг тиамина в 12 см3 изобутилового спирта;
vi — общий объем вытяжки после ферментативного гид¬
ролиза (обычно 100 см3);
иг — объем вытяжки (в см3) для определения (в данном
случае для адсорбции);
н — навеска;из —объем элюата (25 сл3);и* —объем вытяжки (5 см3) для окисления.Если определение проводилось без применения адсорбента
(очистка первоначальной вытяжки изобутиловым спиртом и по¬
следующее окнсление ее), то расчет следует производить по
формуле:(Л — В)' I • V|
х~ (Л, — Bt)-v3'H *103
Определение
суммарного рибофлавинаРибофлавин (витамин В»)—кристаллическое вещество с
точкой плавления 292°. Молекула его состоит из трехцикличе¬
ского изоаллаксазинового ядра и углеводной боковой цепи (ри¬
боза):Чистый рибофлавин растворим в воде (12 мг на 100 см3
при 27,5°), в этиловом, метиловом, амиловом, бутиловом спир¬
тах. Хорошо растворяется в щелочах. Нерастворим в ацетоне,
эфире, бензоле и хлороформе. Водные растворы рибофлавина
дают зелено-желтую флуоресценцию в ультрафиолетовом свете.
Он имеет характерный спектр поглощения с тремя максиму¬
мами при 270; 370 и 450 нм.В растворах рибофлавин довольно стоек; на скорость раз*
рушения его в сильной степени влияет свет и pH раствора.
В щелочной среде рибофлавин разрушается, в кислой среде
устойчив при нагревании.В природных объектах обнаружены 4 формы рибофлавина;
свободный рибофлавин, фл а вин-мононуклеотид, флавинаденнн-
динуклеотид и форма, прочно связанная с белком, открытая
К. Л. Поволоцкой.Рибофлавин входит в состав ряда окислительно-восстанови¬
тельных ферментов, играющих важную роль в обмене веществ.Метод определения рибофлавина основан на способности его»
флуоресцировать в ультрафиолетовом свете. При определении
суммарного рибофлавина для освобождения его из дннуклеотнда
применяют кислотный гидролиз и обработку ферментными пре¬
паратами, обладающими фосфатазным действием. Для осво¬
бождения прочно связанного с белком рибофлавина применяют
гидролиз в слабощелочных растворах и обработку протеолити-
ческимн ферментами. Ниже приводится описание флуорометри-
ческого метода по К. Л. Поволоцкой, Н. И. Зайцевой, Е. П. Ско-
робогатовой *.*	К. Л. Поволоцкая, Н. И. Зайцева, Е. П. Скоробогатова.
Витаминные ресурсы и их использование. Сб. 3, 1935.104
Реактивы и аппаратура: 1) стандартный раствор рибофлавина; 2) раствор
хлористого олова (основной раствор готовят растворением 10 «* SnClz в 25 см*
концентрированной НС1 и хранят в темной склянке с притертой пробкой при
комнатной температуре; рабочий раствор готовят каждый раз в день опре¬
деления, разбавляя дистиллированной водой 042 см* исходного раствора до
100 or5); 3) раствор гидросульфита натрия (0,25 г NajSjOi-5HjO раство¬
ряют в 10 смР 2%-ного раствора NaaCOj; раствор готовят в день употреб¬
ления); 4) 3%*ный раствор HjOj; 5) 4%-ный раствор КМпО« (раствор прн*
готовляют через каждые 2 недели); 6) 4 М раствор фосфата калия (69,6 г
К3НРО4 растворяют в 100 слР воды; если лри стоянии раствора выпадают
кристаллы, то его перед использованием нагревают; 7) 2.5 М раствор ук¬
суснокислого натрия; 8) фосфатный буфер, pH 7,8—8; 9) ферментные писпа*
раты: трипсин, панкреатин или ферментный препарат нэ мицелия Penicillum:
мицелий отжимают от лишней влаги «под прессом и сушат при 45°; все ука¬
занные препараты можно использовать как лротеолитическне, <8 качестве же
фосфатазных следует использовать только последний; ферментный препа¬
рат вносят из расчета 30 мг на J г сухого вещества навески); 10) флуоро¬
метр (см. рис. 14).Приготовление растворов рибофлавина. Навеску рибофла*
вина 10мг растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе
объемом 250 о*3. В 1 см3 такого раствора содержится 40 миг
рибофлавина. Раствор стоек в течение месяца при хранении в
темноте и на холоде. Рабочий раствор готовят в день опреде¬
ления, для этого в мерную колбу на 100 см3 вносят 1 см3 ис¬
ходного стандартного раствора и доводят дистиллированной во¬
дой до метки.При определении рибофлавина с использованием трихлор-
уксусной кислоты (ТХУ) рабочий стандартный раствор для со¬
ответствия с опытным должен быть приготовлен следующим об¬
разом. В мерную колбу емкостью 100 см3 вносят 37,5 см3 20%-
ного раствора ТХУ, добавляют 24 см3 4 М раствора КгНРО«,1	см3 исходного стандартного раствора рибофлавина и объем
доводят дистиллированной водой до метки. В 1 с.и3 рабочего
раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.Ход анализа. Извлечение рибофлавина. Навеску
исследуемого материала (3 — 5 + 0,01 г семян) тщательно рас¬
тирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством фос¬
фатного буфера (pH 7,8—8). Растертую массу переносят в ко¬
ническую колбу с помощью буфера с таким расчетом, чтобы
общее разведение было 1:20. Смесь выдерживают в кипящей
водяной бане в течение 45 минут, охлаждают до 30°, проверяют
pH (оно должно быть 7,8—8) и прибавляют ферментный пре¬
парат (трипсин или панкреатин; последний более доступен).
Смесь выдерживают в термостате при 37° в течение 12—16 ча¬
сов. В этих условиях отщепляется прочно связанная с белком
форма рибофлавина. После ферментативного гидролиза вы¬
тяжку переносят в мерную колбу на 100 см3 и доводят дистил¬
лированной водой до метки. После фильтрования через склад¬
чатый фильтр берут 5 см3 в коническую колбу со шлифом и
добавляют 5 см* 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты.
Колбы закрывают обратным холодильником и выдерживают на105
кипящей водяной бане в течение 10 минут. Обработка трихлор-
уксусной кислотой освобождает рибофлавин из его нуклеотид¬
ных форм *. Вытяжку охлаждают и добавляют ‘/в объема 4 М
раствора КзНР04 с целью доведения pH до 6.Окисление перманганатом. При окислении к вы¬
тяжке по каплям прибавляют 4%*ный раствор КМпО< до тех
пор, пока красноватая окраска не перестанет исчезать. Через10	минут для разрушения избытка перманганата по каплям
прибавляют, медленно и взбалтывая, 3%-ный раствор Н*Ог.
К обесцвеченному раствору прибавляют 0,2 см3 рабочего рас¬
твора SnCIa и 0,1 ел3 раствора гидросульфита натрия. Смесь
интенсивно встряхивают 20 минут на приборе для встряхива¬
ния. После проведения окисления и восстановления объем вы¬
тяжки измеряют и доводят до 15 см3 дистиллированной водой;
если вытяжка мутная, ее фильтруют.Измерение интенсивности флуоресценции.
Опытный и стандартный рабочий раствор наливают в пробирки
или кюветы из нефлуоресцирующего стекла и измеряют интен¬
сивность их флуоресценции на флуорометре.После этого в каждую нз пробирок прибавляют примерно
по 0,1 г NaHC03 и 0,1 г Na2S204-2Ha0 (гидросульфит натрия)
для тушения флуоресценции рибофлавина и снова измеряют
флуоресценцию (примесей). Иногда возникает необходимость
прибавлять гидросульфит натрия 2—3 раза (до тех пор, пока
показания гальванометра будут постоянными).Вычисление результатов. Содержание рибофлавина
(в мкг на 1 г исследуемого материала) находят по формуле:_ (Л — В)-0.4»р-у3
х~ (Ax—Bt)'V^M *где: А — показание флуорометра для опытного раствора;В — показание флуорометра для опытного раствора по¬
сле тушения флуоресценции;0,4 — мкг рибофлавина в 1 смъ рабочего стандартного
раствора;А\ — показание флуорометра для стандартного раствора;В\ — показание флуорометра для стандартного раствора
после тушения флуоресценции (обычно около нуля);о	— общий объем вытяжки (100 CJK3);v\ — объем экстракта перед измерением флуоресценции
(15 ся3);Vi — объем вытяжки, взятой для анализа при кислотном
гидролизе (5 см3);
н — навеска растительного материала.*	Освобождение рибофлавина из его нуклеотидных форм можно вест»
ферментативным путем. Для этого pH вытяжки после обработки протеолнти-
ческнмн ферментами доводят до 4,5 (прибавляя 0.1 н. HjSO«) и вносят фосфа*
таэныЛ препарат. Инкубируют 12—16 часов при 37°. Этот способ удлиняет ход
определения суммарного рибофлавина еще ва сутки.106
Определение каротиноидовКаротиноидные пигменты, которые содержатся в растениях
наряду с хлорофиллом, являются полиэнами, принадлежащими
к 4 группам: 1) каротин, каротиноидные углеводороды
(С<оНбс), включающие а-, р-, у-каротин и ликопин; 2) ксанто¬
филлы, окси- и гидроокиси-производные каротинов, которые
включают криптоксантин C«H3sOH н лютенн С4оН54(ОН)2;3)	эфиры ксантофиллов с жирными кислотами; 4) каротиноид¬
ные кислоты и карбонильные производные каротинов.Каротиноидные пигменты характеризуются системой конъ¬
югированных двойных связей, определяющей окраску этих со¬
единений от ярко-красного до желтого. Концевые группы али¬
фатической цепи адсорбируются по-разному и имеют различную
растворимость, что и позволяет отделить их один от другого.
Наибольшей биологической активностью обладает р-каротин,
самый распространенный из желтых пигментов. Биологическая
активность по отношению к 0-каротину составляет: криптоксан¬
тине 57%, а-каротина 53%, нео-р-каротина 38%, у-каротнна
28%'.Метод определения каротина (по И. К. Мурри). Метод осно¬
ван на экстракции ацетоном с последующим хроматографиро¬
ванием.Реактивы и аппаратура: 1) ацетон или этанол, или смесь этанола с
ацетоном (1:3); 2) охнсь алюминия 4%-ной влажности (влажность опреде¬
ляют высушиванием при 105°, затем прибавляют рассчитанное по весу
количество воды и хранят лосле этого в закрытой банке); 3) летролейный
эфир; 4) стандартные растворы каротина, азобензола или двухромовокис¬
лого калия (растворяют 0,145 г перекристаллнэованного из спирта и высу¬
шенного азобензола в 100 см» этанола и разводят его а 10 раз; I см? этого
раствора соответствует 0.00233 мг каротина; основной стандартный раствор
двухромовокнелого калия — КзСгаО; содержит в 1 дмЛ 720 мг КаСгаОг;
1 ся* этого раствора соответствует 0,00416 мг каротина; стандартный раствор
каротина; 50 мг смеси каротина, состоящего из 90% 0- и 10% а-каротина,
доводят летролейным эфиром до 500 см3; приготовляют различные разведе¬
ния н строят график; растворы азобензола и двухромовокислого калия мо¬
гут долго храниться в темноте; 5) стеклянный песок; 6) прибор для хро¬
матографии (рис. 15); 7) колориметр, Дотоэлектрокол ори метр или спектро¬
фотометр; 8) микронэмельчитель тканей (см. рис. 2).Ход анализа. Навеску 5—10 г (в зависимости от содержа¬
ния каротина) измельчают ножом из нержавеющей стали, по¬
мещают в стеклянный бюкс и заливают ацетоном. Для нейтра¬
лизации органических кислот добавляют немного углекислого
натрия, так как каротин неустойчив в кислой среде. Если нет
возможности сразу же провести экстракцию, то бюкс со смесью
убирают в темное прохладное место. Навеску размельчают в
микронзмельчнтеле или растирают в ступке. Растертую навеску
переносят на воронку Бюхнера и фильтруют с отсасыванием.
Растирание с растворителем и отсасывание повторяют несколько
раз, пока стекающий фильтрат не станет бесцветным (экстрак¬
цию и хроматографирование желательно проводить в токе угле-107
кислого газа или азота). Экстракт или часть его переливают
в делительную воронку и переводят пигменты в петролейний
эфир. Для более быстрого извлечения добавляют соленую воду.
Извлечение каротиноидов петролейним эфиром производят не¬
большими порциями до их обесцвечивания. Затем петролейную
вытяжку осторожно промывают водой до удаления запаха аце¬
тона в промывной воде. Вытяжке дают отстояться от эмульсииРяс. 15. Приборы для хроматографиив собранном виде.а — прибор на и. т.: / — колонка. 2 — де¬
лительная воронка с иасадкоЛ, J — колба
с тубусом для отсасывания; 6 — приборы
с резиновыми пробками: / — обычная хро
матографияеская колонка. 2 — простая во¬
ровка, J — колба или цилиндр с тубусом.воды и пропускают ее через адсорбционную трубку с безводным
сернокислым натрием и окисью алюминия.Для зарядки хроматографической колонки в узкую часть
трубки закладывают небольшой ватный тампон, после чего не¬
большими порциями насыпают окись алюминия, слегка уплот¬
няя ее стеклянной палочкой. Высота столбика окиси алюминия
в хроматографической трубке 10 см. Сверху окиси алюминия
кладут слой ваты, а поверх нее насыпают слой в 0,5 см без¬
водного сернокислого натрия. Опытный раствор медленно про-
пускают через трубку, затем промывают колонку петролейным
эфиром до тех пор, пока вся желтая полоска каротина не пе¬
рейдет в приемник. Остальные пигменты остаются в верхней
части адсорбента. При разделении пигментов необходимо сле¬
дить, чтобы верхний конец столбика адсорбента всегда был по¬
крыт слоем петролейного эфира, так как в противном случае
каротин может окисляться. Измеряют объем полученного рас¬
твора каротина и колориметрируют на колориметре, фотоэлек*
троколорнметре или спектрофотометре при длине волны 436 нм.Анализ может быть прерван до следующего дня на стадии
получения ацетоновой вытяжки, при переводе пигментов из аце¬
тоновой вытяжки в петролейную или на стадии после адсорбции
пигментов на колонке.При колориметрировании в левый стаканчик колориметра
наливают стандартный раствор, а в правый — раствор каротина.
Показание колориметра стандартного раствора устанавливают
на отметке 10, а изменением толщины опытного раствора соз¬
дают одинаковую окраску полей. Затем делают 8—10 отсчетов
и берут среднее.Вычисление результатов производят по следующей формуле:O,OO235,otfi,003*fl* 100	4ЛЛ* =	іГїбГві	=^на 100 *•где: В — показание колориметра стандартного раствора
(обычно 10);В\ — показание колориметра для исследуемого раствора;
об\ — объем полученной ацетоновой вытяжки;
оба — объем ацетоновой вытяжки, взятой для определе¬
ния каротина;оба. — объем готового петролейного раствора каротина;
н — навеска материала (в г).Пример вычисления. Для анализа взята навеска 5 е листьев
укропа (и). подучено 120 см? (об|) ацетоновой вытяжки, откуда для даль¬
нейшей работы озято 30 см* (об*). Окончательный объем полученного
раствора петролейного эфира равен 40 см? (оба). При колориметрировании
этого раствора шкала для стандартного раствора установлена на 10 (В),
средняя высота слоя опытного раствора о,62 (Ві). Содержание каротина
равно:0.00235*120-40-10#	=	5.30.6 eft	100= 8,7 мг на 100 г каротина.Количественное определение каротнвоидных пигментов и
хлорофилла овощных и плодовых растений. Метод основан на
разделении каротиноидов на хроматографической бумаге, выде¬
лении полоски бумаги с каротином, растворении его и колори-
метрироваиии.Реактивы и аппаратура: 1) летролейный эфир і(т. кип. 60—60*); 2) аце¬
тон (чистый) или спирт этиловый; 3) сода (NajCO*); 4) хроматографическая109
бумага (ленинградская, сбыстрая», вес 1 дм1 — 0,85 е; для каждой пробы
нарезают полоскн шириной 15, высотой 25 см и хранят в сосуде, предохра¬
няя от различных паров); 5) стандартный раствор—145 мг азобензола а
100 см* этилового спирта (такой раствор по окраске соответствует 0,0078 мг
ликолина в 1 при разбавлении первого раствора в 10 раз получают
второй раствор, который-содержит 14.5 мг азобензола в 100 см* спирта;
I см3 второго раствора соответствует 0,00235 мг каротина, 0,00252 мг ксанто¬
филла, 0,00256 .«гг лютеина и 0,00260 мг виолаксантина); 6) колориметр
(КОЛ-1) со светофильтрами или мнкроколориметр — нефелометр, завода
с Красногвардеец». 7) цилиндрические сосуды высотой 25—30 см. диаметром
I3-—'15 см, с притертыми крышками или пробками (можно использовать ба¬
тарейные стаканы, к которым притирают стекла для их иакрывання; стенки
сосуда обклеивают снаружи темной бумагой); 8) мерные цилиндры на
100 см* с притертыми пробками.Ход анализа. Отвешивают 5±0,01 г размельченных корне¬
плодов (листьев или других частей растений) в чашки, затем
растирают в ступке с ацетоном (или спиртом) в присутствии
5 г стеклянного песка и щепотки соды (анализ рекомендуется
проводить в токе СОд или азота). Растертую с ацетоном массу
перемещают в цилиндр на 100 см\ смывают ступку порциями
ацетона и доводят объем до 50 или 100 см*. Затем 1 см3 .или
другое количество этого экстракта наносят в виде полоскн на
нижний конец хроматографической бумаги на высоте 4 см от
края.Нанесенный на бумагу раствор подсушивают в токе теплого
воздуха (феном), избегая света, к после этого бумагу сворачи¬
вают в однослойную трубку, а верхний конец скрепляют скреп¬
кой из пластмассы и ставят на дно цилиндрического сосуда,
в котором находится слой петролейного эфира в 2—3 см.Через 20—30 минут хроматограмму вынимают и вырезают
полоску бумаги, окрашенную в желтый цвет (каротин идет
следом за фронтом подъема растворителя). Полоску бумаги с
каротином мелко нарезают в бюкс и извлекают пигмент не¬
большими порциями (1 сл3) петролейного эфира со следами
спирта или ацетона. Для более полного извлечения нарезанные
полоски бумаги несколько раз промывают растворителем до
полного обесцвечивания. Затем этот раствор доводят до опре¬
деленного объема и колориметрируют; количество каротина вы¬
числяют как обычно (стр. 109).В объектах, содержащих ликопин, определение лнкопнна
проводят по Г. А. Луковниковой, получение вытяжек и хрома¬
тографирование выполняют так, как указано выше.Широкая, окрашенная в розовый цвет полоса ликопина сле¬
дует на хроматограмме за желтой полоской каротина. Полоску
бумаги с каротином отрезают и поступают так, как было ска¬
зано выше. Размытая полоса ликопина не позволяет получить
концентрированный раствор ликопина, что затрудняет колори-
метрированне. Поэтому от оставшейся части хроматограммы
удаляют стартовое пятно и помещают нижний конец в хрома¬
тографический сосуд, на дно которого налит небольшой слой110
ацетона. При этом лнкопин концентрируется в узкой полоске
бумаги.В дальнейшем поступают так, как описано при определении
каротина. При этом в качестве стандартного раствора при ко-
лориметрнровании используют первый раствор, 1 смг которого
по окраске соответствует 0,078 мг ликолина.Определение ксантофиллов. После отделения поло¬
ски с каротином от исходной хроматограммы оставшуюся часть
хроматограммы помещают нижним концом в смесь бензола с
летролейным эфиром (в соотношении 3:1 или 4:1) и основные
ксантофиллы зеленых листьев (лютеин и виолаксантин) разделя¬
ют в этой смеси. Через 40—50 минут хроматограмму снимают и
проводят определение ксантофиллов так, как описано для опре¬
деления каротина. На бумажной хроматограмме среди разде¬
лившихся ксантофиллов верхняя полоса принадлежит лютен ну,
нижняя — виолаксантнну. Ниже их расположены полосы хло¬
рофиллов са» и «б». На месте нанесения вытяжки остается
пятно, принадлежащее в основном хлорофиллидам и другим
окисленным продуктам.В объектах, содержащих ксантофилл-капсантин (стручковый
перец), определение каротина проводят как обычно. Капсантин
отделяют от других ксантофиллов прн повторном хроматогра¬
фировании в смеси бензола и петролейного эфира (в соотно¬
шении 3:1 или 4:1). Верхняя полоса на хроматограмме при¬
надлежит капсантииу.При определении хлорофилла используют стандарт, приго¬
товленный из чистого хлорофилла.Пример вычисления содержания каротина (в корне¬
плодах моркови). Навеска (5 г) лроэкстрагирована ацетоном н доведена до
объема 80 CJ& (об,), нэ этого объема взят 1 ел** (об») и нанесен на хромато»
графическую бумагу. После разделения пигментов в петролейном эфире
объем раствора каротина составил 5 см* (оба). Этот раствор служит для ко-
лориметрированвя. Стандартный раствор (в|) установлен на высоте 10 см.
при этом опытный раствор (ва) установился на высоте 20,1. Подставив эти
значения в формулу. Вычисляют содержание каротина:0,00235 80 5.10-100 л „ 1ЛЛ
х =	51.20,1	= 9 3 мг на 100 гРазделение хлорофилла, каротина и ксантофиллов методом
ТСХ. Разделение жирорастворимых пигментов хроматографией
в тонких слоях маннита и сахарозы, предложенное Л. Шми¬
том с сотрудниками *, имеет ряд преимуществ по сравнению с
колоночным методом, так как оно просто в приготовлении и
использовании. Количественное определение полос пигмента так¬
же дает хорошие результаты.*L. W. Schmith. R. W. Breidenbach, О. Rubenstein. Sci¬ence, 148, N. 3669. 1965.Ill
Реактивы и аппаратура: I) манниг; 2) порошкообразный сахар;3)	30%-яый раствор крахмала (суспензию — 5 г крахмала и 10 см? воды —
кипятят одну минуту и выдерживают 3—5 дней); 4) растворители: 0,5%-ный
(по объему) н-пропанол в петролейиом эфире '(т. кип. 30—60°); 2%-ный (по
объему) метанол в петролейиом эфире (т. кип. 30—60°); 5%-ный (по объему)
ацетон л тяжелом бензине (т. кип. 60—70°); 5) стеклянные пластины разме¬
ром 15X20 см: 6) спектрометр СФ-4А (см. рис. 9).Приготовление тонкого слоя. Суспензию для покрытия пла¬
стинок приготовляют смешиванием 65 г маннита и 100 см3 аце¬
тона в течение одной минуты в смесителе. Затем к полученной
кашице добавляют 1 см3 30%-ного водного раствора картофель¬
ного крахмала и выдерживают несколько дней. Добавление
картофельного крахмала в маннит-суслензню дает лучшее сли¬
пание частиц и не влияет на разделение пигментов.Слой готовят и используют быстро, так как очень быстро
испаряется растворитель. Пластинки готовы к использованию
в течение 20—30 минут, но без высушивания. Пластинки хранят
в эксикаторе. Сахарозные пластинки готовят из суспензии по¬
рошкообразного сахара (75 г) в 100 см3 ацетона с 1 см3 50%-
ного водного раствора сахарозы.Ход анализа. Ацетоно-водные (8:2) экстракты из листьев
экстрагируют петролейним эфиром. Петролейные эфирные вы¬
тяжки высушивают безводным NaaSO* и определенный объем
вытяжки наносят на приготовленные пластинки. Для разгонки
на пластинках используют смеси растворителей (см. Реактивы).Число разделенных желтых пигментов всегда больше на
манннтной пластинке, чем на пластинке с порошкообразной са¬
харозой. Скорость передвижения фронта растворителя также
выше на маннитной пластинке и при 12-сантиметровой разгонке
в смеси пропанола и петролейного эфира составляет 20 минут.
Магнитные пластинки могут быть использованы для разделения
хлорофилльных пигментов (хлорофилл «а» и хлорофилл «б»).Для количественного определения пигментов полученные на
хроматограмме полосы соскабливают с пластинки и элюируют
различными растворителями. При элюировании в летролейный
эфир оптическую плотность раствора определяют на спектро¬
фотометре СФ-4А при длине волны 452 нм.Спектры поглощения для каротинондных пигментов в види¬
мой области (при определении в хлороформе): каротин — 465:
496, лютенн — 430; 455; 485, виолаксантин — 452; 481, неоксан¬
тин— 448; 478, флавоксантин — 430; 455; криптоксантин — 435;
465; 495 нм.Определение токоферолов
(витамина Е)Витамин Е (антистерильный витамин) широко распространен
в растениях. В наибольших концентрациях он содержится в
зародышах семян и в листьях. Под витамином Е понимают112
группу токоферолов. В настоящее время изучены 7 токоферо¬
лов— а, р, V* б 11 т* Д* Из них наиболее физиологически ак¬
тивным является а-токоферол (C^HsoOj). Его молекула имеет
следующее строение:Все токоферолы являются производными одноатомного
спирта токола и отличаются один от другого по количеству и
положению метильных групп. Для разделения и определения
отдельных токоферолов применяют тонкослойную и газожид¬
костную хромаюграфии *.Метод определения витамина Е в семенах. Метод основан на
образовании хннонов при окислении молекул токоферола хлор¬
ным железом. При этом хлорное железо восстанавливается до
хлористого, количество которого определяется по интенсивно¬
сти окраски при добавлении а, а'-дипиридила или ортофенан-
тралина.Реактивы и аппаратура: I) 10%-ный и 50%-иuft спиртовые растворы
КОН; 2) 0,5%-ный раствор а, а’-дипиридила (0.5 г «, а'-дипиридила раство¬
ряют в абсолютном этиловом спирте в мерной колбе на 100 см*; раствор
годен в течение месяца при .хранении в темной склянке); 3) 0,5%-ный спир¬
товой раствор ортофенантралина; 4) 0,2%-ный спиртовой раствор хлорного
железа (FeClj-GHjO); 5) адсорбенты—диатомит или силикагель марки
КСК; 6) аппарат Сокслета; 7) фотоэлсктроколорнметр.Ход анализа. В основе использована пропись метода Б. А.
Девятнина н И. А. Солуннной. Навеску тонко измельченных
семян 2—4 ±0,001 г помещают в пакет или патрон из филь¬
тровальной бумаги и экстрагируют серным эфиром в аппа¬
рате Сокслета. Растворитель удаляют, а к жировому остатку
приливают 15 см3 10%-ного спиртового раствора КОН и омы-
ляют на водяной бане в течение 45—60 минут в присутствии
небольшого количества пирогаллола (50 мг). Содержимое колбы
переносят количественно в делительную воронку двойным объ¬
емом воды (30—35 ел3) и неомыляемую фракцию экстрагируют
свободным от перекисей этиловым эфиром порциями по 40; 35;
30 см3. Эфирные экстракты объединяют и промывают в дели¬
тельной воронке водой до отрицательной реакции на лакмус.*	С. С. М х и т р я н, А. П. Нечаев и др. Прикладная биохимия и
микробиология, т. 5, вып. 4,1969.ИЗ
Затем сушат, пропуская через адсорбционную колонку с без¬
водным сернокислым натрием. Высушенный эфирный экстракт
переносят в сухую колбу и отгоняют растворитель в токе азота
досуха. Остаток растворяют в бензоле и переносят в мерную
колбу на 25 см3, доводя объем до метки.Адсорбция и колориметрирование. Из полученного бензоль¬
ного раствора берут 5—10 см3 и вносят на колонку с диато¬
митом или силикагелем, пропуская раствор при слабом разре¬
жении. При анализе семян или листьев, богатых пигментами,,
применяют диатомит (высота слоя адсорбента 3,5 см, диаметр1.5	см). Токоферолы с адсорбента смывают 12—18 см3 бензола.
Элюаты количественно собирают в мерной колбе на 25 см1 и
доводят объем до метки бензолом.Для проведения красочной реакции берут 1—2 см3 получен¬
ного раствора и вносят в мерную колбу на 25 см3, приливают
10—15 см3 бензола и 1 см3 0,5%-ного раствора а, а’-дипнри-
дила или 0,5%-ного раствора ортофенантралина, затем по кап¬
лям при помешивании приливают 1 см3 хлорного железа; объем
доводят до метки бензолом, перемешивают и оставляют в тем¬
ном месте на 10 минут. Одновременно ставят контроль на ре¬
активы, приливая те же количества в мерную колбу на 25 см3.
Растворы колориметрируют на фотоэлектроколориметре при
длине волны 490 нм, устанавливая нулевую точку прибора по
бензолу. В работе используют кювету с расстояниями между
рабочими гранями 5 мм. Из показания испытуемого раствора
вычитают показания контроля.Определение витамина Е в вегетативных частях растений»
Ход анализа. Навеску 1—2 + 0,001 г растительного материала
растирают в ступке с кварцевым песком в присутствии спирта.
Растертую массу промывают на стеклянном фильтре М* 3 не¬
большими порциями спирта (20—30 см3) до бесцветного филь¬
трата. Затем промывают эфиром объемом около половины объ¬
ема взятого спирта. Общий объем эфирно-спиртовой смеси 30—
50 см3. Хлорофилл удаляют омылением 10%-ным спиртовым
раствором КОН. Для этого к эфирно-спиртовой смеси прибав¬
ляют 50%-ный раствор КОН в количестве до конечной концен¬
трации 10% (на 30—50 см3 смеси примерно 6—10 см3 50%-ной
КОН). Омыляют на кипящей водяной бане в течение часа в.
присутствии небольшого количества пирогаллола. После омы¬
ления смесь количественно переносят в делительную воронку,
разбавляют равным объемом воды и осторожно перемешивают.
В нижний, водный слой переходит соль хлорофилла, а в верх¬
ний, эфирный —токоферолы н каротиноиды. Эфирный слой со¬
бирают, а водно-спиртовой слой несколько раз промывают эфи¬
ром и отбрасывают. Эфирные экстракты объединяют, сушат
сернокислым натрием. Затем переносят в круглодонную колбу
и растворитель отгоняют. Остаток растворяют в бензоле и коли¬
чественно переносят в мерную колбу на 25 с.и3. Далее посту-114
vtdiOT так, как при определении в семенах, начиная с адсорбции
к колориметрирования. Для проведення красочной реакции с
•а, а'-дипиридилом и FeCl3 берут по 5—10 см3 раствора.Составление калибровочного графика и вычисление резуль¬
татов. Готовят стандартный раствор токоферола, для этого
•отвешивают на аналитических весах 50 мг а-токоферола, рас¬
творяют его в бензоле в мерной колбе на 250 см3. Из получен*
лого стандартного раствора в мерные колбы на 25 см3 вносят
по 0,25; 0,50; 0,75; 1; 1,25; 1,50; 1,75; 2 см\ добавляют а, о'-
дипнридила или ортофенантралина, FeClj и объем доводят до
метки. По истечении 10 минут колориметрнруют. При составле¬
нии калибровочного графика на оси абсцисс откладывают кон¬
центрацию раствора (в мг или в мкг), а на оси ординат — экс-
тинкцию растворов. Вычисление ведут по формуле:_ аруа-100
х~ H-Vt-V3 ’где: х — содержание токоферола (в мг на 100 г);а — содержание токоферолов, найденное по калибровоч¬
ному графику;V	— объем первоначального экстракта (обычно 25 сдэ);Pi — количество раствора для адсорбции на колонку;Vi — объем элюата после пропускания через колонку с диа¬
томитом или силикагелем (обычно 25 см3);
из — количество раствора, взятое на проведение красочной
реакции;
н — навеска.Количественное определение а-токоферола (витамина Е) в
листьях растений методом тонкослойной хроматографии*. Оп¬
ределение содержания витамина Е основано на окислительно¬
восстановительных свойствах токоферолов, которые под дейст¬
вием иода окисляются в свой хинон.Реактивы и аппаратура: I) а, а'-днпнрндил; 2) дважды перегнанный хло¬
роформ; 3) 95%-ный этанол (перед употреблением очищают, прибавляя 2 г
КОН и 1 г КМпО« на 1 дм3 спирта и через 30 минут отгоняют при 78е);4)	стандартный а-токоферол (приготовлен посредством тонкослойной хро¬
матографии из d. I-а-токоферола; 5) спектрометр; 6) центрифуга; 7) тонко¬
слойные пластинки 20 X 20 си.Ход анализа. Навеску 0,3 — 0,5 г измельченных листьев рас¬
тирают и экстрагируют в ступке в 5 см* ацетона и 10 см3 петро¬
лейного эфира (т. кип. 60—80°). Жидкость фильтруют через
стеклянную вату. Эту операцию повторяют до полного обесцве¬
чивания навески. Затем растворитель отгоняют в колбе Вюрца
и к маслянистому остатку добавляют 5 см3 смеси этанол-бензол
(90:10) и вновь отгоняют жидкость из колбы Вюрца до полного
удаления воды. Затем сухой липидный остаток растворяют в пет-
ролейном эфире и раствор переносят в маленькую пробирку.*	Raughan. Analyt. Biochem., 19, 3, 1967.115
После этого пётролейный эфир удаляют пропусканием азота, а
оставшийся остаток растворяют в 0,2 см3 хлороформа. Заготов¬
ленные заранее для анализа тонкослойные пластинки с силикаге¬
лем (слой 250 нм, размер пластинок 20X20 см) перед самым
использованием активируют, нагревая 30 минут в термостате при
120°. Затем приступают к хроматографированию. На пластинку
наносят (полосой) растворенный в хлороформе липидный остаток.
С двух сторон наносят пятна а-токоферола. Пластинки ставят
в хроматографическую камеру (подвижная жидкость — бензол)
на 30 минут. После этого пластинки вынимают и сушат на воз¬
духе в течение 5 минут. Разделенные полоски, относящиеся к
различным изомерам токоферолов, проявляют, помещая пла¬
стинку в пары иода. Для этого на дно чистого сосуда кладут
несколько кристаллов иода. Полоска, соответствующая а-то-
коферолу, появляется обычно первой, ее тщательно обводят
иглой и иол удаляют выпариванием. Затем полоску адсорбента,
обведенную иглой, помещают в небольшую стеклянную воронку
со стеклянной ватой. Элюирование а-токофернлхинона с адсор¬
бента, образовавшегося в результате окисления а-токоферола
ларами иода, проводится диэтнловым эфиром 4 раза по 2 сиг3.
После этого элюат собирают в центрифужную пробирку, эфир
удаляют током азота, а остаток а-токоферилхинона растворяют
в 3 см* 95%-ного этанола. Если в спиртовой раствор попали
следы адсорбента, то необходимо их отцентрифугировать и
удалить.Максимум светопоглощения определяется на спектрофото¬
метре при 262 нм до и после добавления нескольких кристаллов
(0,05 мг) боргидрида натрия. Для подсчета концентрации а-то¬
коферола (в мг) нужно умножить разность экстинкцни А на
72,5.Определение филлохинона
(витамина Кх)Витамин К, был впервые выделен из листьев люцерны, он
регулирует свертываемость крови, недостаток его приводит к
обеднению организма протромбином. Филлохинон (2-метил-
3-фитил-1,4*нафтохиион) очень свеючувствителен и неустойчив.
Главной задачей при определении витамина К] является отде¬
ление его от веществ, мешающих определению.По прописи Л. И. Внгорова (с соавторами) навески по 5 г
свежих размельченных плодов или овощей обезвоживают, рас¬
тирая со стеклянным порошком с добавлением 5 с.ч3 метанола
(этиловый спирт занижает результаты). Затем спирт отделяют
на центрифуге или отсасывают. Обезвоживание является очень
важной процедурой, и ее повторяют 2—3 раза (обычное высу¬
шивание в термостате не допускается). После этого обезвожен¬
ный остаток извлекают 5 см3 петролейного эфира при настаи-116
ванни и перемешивании в течение 5 минут. Желтоватый раствор
отделяют и извлечение повторяют до тех пор, пока вытяжки не
станут бесцветными (это служит показателем на полноту из¬
влечения филлохинона). Общий объем петролейного экстракта
доводят до 25 см3. Затем петролейную вытяжку отмывают от
метанола. Для этого экстракт переливают в делительную во¬
ронку на 100 см3 и, осторожно покачивая с двойными порциями
воды, отмывают спирт. Водный слой сливают и операцию от¬
мывки повторяют 5 раз н более. Если нельзя хорошо отделить
водный слой из-за эмульсии, то добавляют насыщенный рас¬
твор NaC!.Петролейний раствор, высушенный над безводным NajSO^,
пропускают через адсорбционную колонку (см. рис. 15), с 8-саи-
тиметровым слоем окиси алюминия, который предварительно
смачивают петролейным эфиром. Окись алюминия, прокаленная
в течение двух часов прн 600°, не адсорбирует филлохинон.
Сухой петролейный экстракт следует пропускать через колонку
со скоростью 12—15 капель в минуту. Затем колонку промы¬
вают чистым растворителем порциями, до тех пор, пока зона
каротиноидов не пройдет 3/4 высоты слоя адсорбента.Элюат, свободный от каротиноидов, испаряют в фарфоровой
чашке в токе воздуха от настольного вентилятора. Остаток в
чашке смывают в пробирку 3 см3 96%-ного этанола в 3 приема
(по 1 см3). Затем к охлажденному до 0° этому раствору до¬
бавляют охлажденные растворы: 0,5 см3 спиртовой 1%-ный рас¬
твор диэтилдитиокарбамат натрия и спустя 5 минут 0,75 см3
2%-ный раствор алкоголята натрия (100 мг Na в5 см3 этанола).
Пробирки ставят в холодильник ровно на 4 минуты и затем рас¬
творы сливают через маленький плотный фильтр (синяя полоса)
и через одну минуту измеряют окраску на ФЭК-М (см. рис. 27)
при светофильтре' 2 (кювета 10 мм). Контролем служат эти же
растворы, прибавленные к 3 см3 этанола.Вычисление результатов проводят по графику, составленному
по чистому филлохннону с теми же реактивами. Так, при со¬
держании в 3 см3 спирте 0,05 мг витамина Ki светопоглощение
составит окаю 13%, a при 0,10 мг — около 25%.Все работы необходимо проводить при затемнении, так как
филлохинон очень чувствителен к свету.Определение
флавоноидных соединенийХарактеристика флавоноидных соединений. Флавононды, ан-
тоцнаны, флавоны, халконы, ауроиы и другие соединения нахо¬
дятся в тканях цветков, плодов и листьев в основном в форме
гликозидов. Флавононды определяют окраску цветков, плодов,
стеблей, корней, а также листьев у некоторых видов и сортов117
растений; они обычно находятся в клеточном соке, а также
обнаружены в аморфном н кристаллическом состоянии. Общее
содержание антоцнанов колеблется от 0,4 до 24% (на сухое
вещество).При кислотном и ферментативном гидролизе они расщеп¬
ляются на сахар и аглюкон. Установлено, что гликозиды более
характерны для тканей с активным обменом веществ, а аглн*
коны, по-видимому, накапливаются в качестве конечных про¬
дуктов обмена.Известны 4 основных типа этих соединений, их представите¬
лями являются пеларгонндин, цианидин, дельфинидин, а также
реже встречающийся алигенин.Отдельные группы флавоиоидов различаются по положению
н числу гидроксильных групп. Флавонондные пигменты осо¬
бенно широко распространены в растительном мире. Они пред¬
ставляют собой группу родственных воднорастворнмых веществ,
имеющих в своей основе углеродный скелет флавона (С|$).
Кроме антоцнанов, сюда относятся флавоны и менее распростра¬
ненные халконы, ауроны, а также флавэноны н изофлавоны. Эти
пигменты содержатся в различных органах растений в виде тли-
козидов. Так, в листьях и цветках многих культурных растений
широко распространен рутин. В лепестках цветкоз некоторых
растений флавоноиды составляют значительную часть их сухого
вещества.Некоторые флавоноиды имеют большое значение в создании
вкуса и аромата лнщи. Так, флавононд кожуры плодов цитру¬
совых — нарннгин имеет горький вкус, другие безвкусны (ру¬
тин) или очень сладки (халконы).Качественное определение флавоноядных веществ. Качест¬
венное определение флавоноидов (по Гейсману) основано на
различной их подвижности в разделительных смесях при хро¬
матографировании на бумаге.Реактивы и аппаратура: I) этанол, этилацетат; 2) растворитель: н-буга-
нол—вода—уксусная кислота (40 : 50:10); 3) этиловый и уксусно-этиловый
эфиры; 4) сосуд для хроматографирования (см. рис. 24).Ход анализа. Навеску (2—10 г) свежего материала извле¬
кают вначале водой или водным этиловым спиртом. Вытяжку,
в которой содержатся такие углеводы, затем сгущают и извле¬
кают этил ацетатом или бута иолом. Полученный экстракт филь¬
труют, сгущают в вакууме и промывают серным эфиром, под¬
кисляют НСІ и опять извлекают уксусно-этиловым эфиром.
Уксусно-этиловый экстракт промывают разбавленной соляной
кислотой и водой, высушивают безводным сернокислым натрием
и сгущают в вакууме до образования сиропа. Отсюда берут для
хроматограмм определенный объем, наносят его сплошной по¬
лосой на хроматографическую бумагу размером 24 X 30 см (бу¬
мага ленинградская, «медленная»). Время хроматографирова¬
ния —18 часов.118
После этого бумагу сушат и при двухмерной хроматографии
снова пропускают через нее растворитель в направлении пер¬
пендикулярном первому (Rf мирицитина 0,43, Rf дельфинидина0,11). Менее гидроксилироваиные или менее гликозидированные
вещества продвигаются быстрее (Rf изо-кверцнтрина 0,68, а аг-
ликонов таких, как кверцетин Rf 0,74, лютеолин Rf 0,88 и апи-
геии Rf 0,92). После рассмотрения бумаги в видимом свете
ее просматривают в ультрафиолете. Можно также обрабаты¬
вать бумагу парами аммиака или летучих кислот и снова про¬
сматривать при обоих освещениях. Флавонолы обладают ярко-
зеленовато-желтой флуоресценцией в ультрафиолете. Флавоны,
не содержащие окснгрупп в положении 3, проявляются в виде
коричневых пятен. Флавононы и катехины на хроматограм¬
мах вообще не проявляются и видимы только на хромато¬
граммах, обработанных аммиаком. Более детальный анализ
качественного состава флавонондов рекомендует В. А. Бандю-
кова *.Определение флавоиоидов методом тонкослойной хромато¬
графии (ТСХ) no Е. Г. Сальковой и Р. И. Бекбулатовой **. Ме¬
тод основан на хроматографии в смеси бутанол — муравьиная
кислота — вода.Реактивы и аппаратура: 1) и-бутанол; 2) 15%-ное хлорное железо;3)	1%-ный KjFc(CN)e; 4) 1%-ныП ваннлнн в концентрированной соляной
кислоте; 5) тонкослойные пластинки.Приготовление тонкослойных пластинок. Тщательно смеши¬
вают 6 г тонко измельченного силикагеля марки КСК с 0,3 г
гипса и 17,5 см3 воды до получения однородной массы. Приго¬
товленную массу наносят тонким слоем на стеклянные пластинки
размером 13X18 см, которые раскладывают на строго гори¬
зонтальной поверхности для получения одинакового слоя сили¬
кагеля. Высушенные на воздухе пластинки досушивают 2—3	часа в термостате при температуре 105—110° и хранят в
эксикаторе.Хроматография. Разделительная смесь бутанол — муравьи¬
ная кислота — вода (95:20:10 или 140:10:5). В первом случае
хроматографическая разгонка длится 3 часа, а во втором —1,5	часа.После разделения хроматограммы высушивают на воздухе
и просматривают в ультрафиолетовом свете. Флуоресцирующие
или поглощающие ультрафиолетовые лучи пятна очерчивают
иглой.Затем пластинки опрыскивают смесью 15%*ного раствора
FeCb и 1%-ного раствора Кз (Fe(CN)«] (1:1) или 1%-ным ва¬
нилином в концентрированной HCI. В первом случае получаются*	В. А. Бандюкова. Растительные ресурсы, I, 4. 1965.•• Е. Г. Салькова, Р. И. Бекбулатова. Прикладная биохимия it
микробиология, I, 4, «Наука», 1965. стр. 466—468.119
синие пятна фенольных веществ, во втором — красные пятна
катехинов.При хранении непроявленных хроматограмм на воздухе на
них появляются пятна фенольных соединений — от светло-зеле¬
ных (у хлор ore новой кислоты) до темно-синих — в результате
взаимодействия фенольных веществ с железом, загрязняющем
силикагель.При количественном определении проводят очистку силика¬
геля.Количественное определение флавоноидов. В приводимой
прописи Свейна и Хиллиса* для определения разных групп
флавоноидных соединений применяются различные окислитель¬
ные реагенты. Полученные после окисления продукты опреде¬
ляют фото- и спектрометрически.Реактивы: 1) реактив Фолина—Дениса (10 г Na2WO<, 2\е фосфорномо*
либденовой кислоты, 5 г 85%-ной фосфорной кислоты и 75 см* воды кипя¬
тят в течение двух часов, отфильтровывают к водой доводят до 100 ем*);
2) лейко-антоцнановый реактив (25 см* 36%-ной соляной кислоты разбавляют
н-бутанолом до 500 г*3): 3) 1%-ный раствор ванилина в концентрированной
серной кислоте (готовят каждые 3 дня); 4) реактив на антоцианы (свеже¬
приготовленный раствор I см3 30%-ной перекиси водорода в 9 см* 3 н.
раствора соляной кислоты в метаноле); 5) насыщенный раствор углекислого
натрия.Определение общего содержания фенолов. Навеску 5 г пло¬
дов с окрашенной мякотью фиксируют горячим этанолом или
метанолом, а затем экстрагируют холодным спиртом до обес¬
цвечивания и доводят до объема 50 см3. Берут 0,5 см3 экстра¬
кта, разбавляют водой до 7 см3 в пробирке на 10 см3. Содер¬
жимое перемешивают и прибавляют 0,5 см3 реактива Фолина —
Дениса, после чего снова тщательно перемешивают. Через 3 ми¬
нуты прибавляют 1 см3 насыщенного раствора №аСОз н до¬
водят объем до 10 см3 при перемешивании. Через час опреде¬
ляют величину поглощения на спектрометре (в кювете на 1 см)
при 725 нм. В «холостом» опыте используют воду с реактивами.
В случае мутных растворов или осадка их отфильтровывают
или центрифугируют.Лейко-антоцианины. В каждую из двух пробирок с притер¬
тыми пробками наливают по 1 см3 экстракта (разбавленного
до 50° концентрации спирта) и прибавляют 10 см3 лейко-анто-
цианового реактива. Пробирки встряхивают и одну из них по¬
мещают на 3 минуты (без пробки) в водяную баню с терморегу¬
лятором при 97° ± 1°. Затем, закрыв пробирку пробкой, нагре¬
вают еще 40 мннут. Открытую пробирку охлаждают под краном
в течение 5 минут. После этого измеряют интенсивность погло¬
щения раствора в кюветах при толщине слоя 1 см при 550 нм. а
•если присутствует хлорофилл — 650 нм. В качестве «холостого»
раствора служит жидкость второй, ненагретой пробирки.*	Т. Swain, W. Є. Hillis. Jour, of the Science of Food and Agric.,
10, 1, 1959.І20
Флавонолы. Берут 3 колбы на 25 см3 и в 2 приливают не
более 0,1 см3 спиртового экстракта (этилового) и разбавляют
водой до 2 см3. После этого в колбу I прибавляют из бюретки
в течение 10—15 секунд 4 см3 ванилинового реактива, а во*II	— 4 см3 70%-ной (1:1) серной кислоты. При этом пробирку
встряхивают в холодной водяной бане, чтобы температура не
поднялась выше 35°. В колбу III приливают и используют в ка¬
честве контроля (К) на реактивы 4 см* ванилинового реактива
и 2 см3 воды. После этого колбы оставляют на 15 минут прн
18° и затем определяют интенсивность поглощения, просматри¬
вают в кюветах с расстоянием 1 см при 500 нм против рас¬
твора серной кислоты в колбе II (4 см3 70%-ной серной кис¬
лоты и 2 см3 воды).Показание контрольной пробы (К) на реактивы и пробы
второй колбы (II) вычитают из показания, полученного для
первой пробы в колбе (I).Антоцианины. Экстракт в количестве 1 см3 разбавляют до *
10 сл3 0,5 н. HCI в 80—85%-ном метаноле. Затем из этого
объема берут по 3 см3 в 2 пробирки. В первую пробирку до¬
бавляют 1 см3 3 и. соляной кислоты в метаноле (5:1), а во
• вторую пробирку — 1 см3 реактива на антоцианы. Обе пробирки
оставляют на 15 минут в темноте, после чего измеряют интен¬
сивность поглощения раствора во второй пробирке в кюветахI	см прн 525 нм; содержимое первой пробирки используют а
качестве «холостого» опыта. Расчет производят по калибровоч¬
ным кривым, полученным для каждого соединения. При опре¬
делении флавонолов для построения калибровочной кривой
применяют хлорогеновую кислоту.Определение флавоноидов методом колоночной хроматогра¬
фии по М. Т. Головкиной и Н. В. Новотельнову. Метод основан
на экстрагировании сухого материала смесью хлороформа со
спиртом.Реактивы: 1) смола-катионит Дауэкс 50W X 2; 2) I н.. 2 н . 3 н. растворы
соляной кислоты; 3) 1%-ный раствор ванилина в концентрированной соляной
кислоте; 4) растворы 30%-ного и 70%-ного метанола; 5) лейко-антоциановый
реактив Ру (3%-ный спиртовой раствор толуолсульфокнслоты); 6) 1%-ный
л 3%-ный растворы K*[Fe(CN)e]; 7) реактив Соейна н Хнллиса (25 смг кон¬
центрированной соляной кислоты в 500 см3 и-бутанола); в) железотартратный
реактив (25 е безводного FeSO* н 1,25 г сегиетовой соли в 230 см1 ди¬
стиллированной воды и фосфатном буфере при pH 6,24 н 8.1).Приготовление колонки. Стеклянную трубку длиной 65 см
с диаметром 1,6 см наполняют 40 г катионита, хорошо разме¬
шенного в воде. Затем для зарядки смолы через колонку про¬
пускают 1 н. раствор НС1, после чего катионит промывают ди¬
стиллированной водой до нейтральной реакции.Ход анализа. Навеску 1 + 0,01 г сухого измельченного рас-
т и тельного материала сперва экстрагируют смесью хлоро¬
форма со спиртом 97,5:2,5 для удаления липидов, смол и дру¬
гих веществ, а затем навеску подсушивают до полного удале-121
«ия растворителя и извлекают спиртом до обесцвечивания. Для
определения содержания катехинов и лейко-антоцианов берут1	см3 из определенного объема экстракта, смешивают с 5 см3
1%-ного раствора ванилина. Интенсивность окраски просматри¬
вают на фотоэлектроколориметре с сине-зеленым светофиль¬
тром. Калибровочную кривую строят по флороглюцину.Определенную часть экстракта (в зависимости от содержа¬
ния исследуемых веществ в пробе) наносят на колонку с катио¬
нитом и затем флавоноидные вещества последовательно элюи¬
руют водой. 30%-ным и 70%-ным водным метанолом. Элюат
собирают в пробирки, по 10 см3 в каждую. Ход элюции и ее
•окончание контролируют по ванилиновой реакции. Фракции,
дающие положительную реакцию, затем сгущают в вакууме, в
токе СО2 и лиофилизируют. Затем колонку подготавливают для
следующего анализа. Для этой цели ее промывают смесью 2 н.
НС1 с метанолом (1:1), водой, І н. НС1 и опять водой до ней¬
тральной реакции. После этого колонку используют снова.Идентификация флавоноидов. Лейко-антоцианы идентифи¬
цируют следующими методами.1.	Хроматографией на бумаге в разных системах раствори¬
телей: н-бутанол — уксусная кислота — вода (40:12:28); н-бу-
танол — 27%-ная уксусная кислота (1:1); 95%-ная муравьиная
кислота—3 и. НС1 (1:1); вода — уксусная кислота — концен¬
трированная НС1 (10:30:3); 2%-ная уксусная кислота. Для
проявления хроматограмм используют следующие реактивы:
•смесь водных растворов —3 ел3 3%-ного FeCl3 + 3 см3 3%-ного
KaFe(CN)e в 100 см3 перегнанной воды, 1%-ный раствор вани¬
лина; лейко-антоциановый реактив Ру (после опрыскивания хро¬
матограммы нагревают 5 минут при 103°).2.	Спектральной характеристикой отдельных лейко-антоциа-
нов в ультрафиолетовом свете.3.	Превращением лейко-антоцианов в антоциаиидины с ре¬
активом Свейна и Хиллиса (стр. 121) с последующей иденти¬
фикацией по Харборну (см..ниже).4.	Определением сахарных остатков в гидролизатах лейко-
антоцианов путем хроматографии на бумаге.Катехииы идентифицируют следующими методами.1.	Хроматографией на бумаге в присутствии ссвидетелей»
(чайных катехинов) в системах растворителей: н-бутанол —
■уксусная кислота —вода (40:12:28); н-бутанол — 27%-ная ук¬
сусная кислота (1:1); лейко-антоциановый реактив Ру; смесь
1%-ных водных растворов FeCfo и KsFe (CN)e (1:1); 2%-ная
уксусная кислота, с последующим просмотром просушенных
-хроматограмм в ультрафиолетовом свете или визуально с про¬
явителями (1%-ный раствор ванилина в концентрированной
НС1).2.	Качественной реакцией элюатов с железотартратным
раствором.122
3.	Хроматографией на бумаге кислотного гилролнзата элю-
ата в системах: н-бутанол — 85%-ная муравьиная кислота —
вода (95:10:20) или изоамиловый спирт — 85%-ная муравьи¬
ная кислота — вода (100:23:77) в присутствии «свидетеля» —
галловой кислоты и с последующим просмотром просушенных
хроматограмм в ультрафиолетовом свете или проявлением
смесью равных объемов 1%-ных водных растворов FeClj и
K3Fe(CN)e.4.	Спектральной характеристикой отдельных соединений.Качественное определение
антоциановых пигментовКачественное определение антоцианов, предложенное Дж.
Харборном*, учитывает их способность продвигаться с различ¬
ной скоростью в определенных системах растворителей.Реактивы и аппаратура: I) 1%-ныЛ раствор НС1; 2) 10%-ныЛ и 2 к.
растворы соляной кислоты; 3) н-бутанол; метанол и >ксусная кислота;4)	спектрометр; 5) ФЭК-М.Ход анализа. Навеску 5—10 + 0,01 г свежих ягод, плодов
или овощей экстрагируют на холоде спиртовым 1%-иым рас¬
твором соляной кислоты и доводят до определенного объема.
В полученной вытяжке определяют и общее содержание анто-
цнанов при соответствующей длине волны, на спектрофотометре
или на ФЭК. Для построения калибровочных кривых лучше
использовать антоцианы, выделенные из исследуемого растения.
Для качественного определения антоцианов берут часть полу¬
ченной вытяжки, гидролизуют ее 10%-НОЙ СОЛЯНОЙ КИСЛОТОЙ:
5—10 минут и затем 1 см3 гидролизата наносят на хромато¬
графическую бумагу сплошной полосой. Размер хроматографи¬
ческой бумаги 24X^6 см (ленинградская, «быстрая»). Хрома¬
тографирование длится 8—10 часов с разделительной смесью —
бутанол—2 и. НС1 (1:1 по объему). После этого ее высушивают
и сравнивают с положением метчиков, нанесенных тут же. При
неудовлетворительном разделении полосы антоцианинов элюи¬
руют смесью вода — метанол — уксусная кислота (25:70:5) и
повторно хроматографируют в разделительной смеси бутанол —
уксусная кислота — вода (4:1:5).Разделительные смеси при определении антоцианов могут
быть различными, так же как и условия хроматографирования.
Так, например. Г. Б. Самородова (1962) для качественного
определения антоцианов хроматографией на бумаге рекомендует
смесь 75%-ной уксусной кислоты с концентрированной НС1
(40:3 по объему) и смесь 90%-ной муравьиной кислоты с 3 н.
НС1— 1:1 по объему (смесь Форесталя).J. В. Harbor ne. Biochcm. J., 70, К 1958.123.
Суммарное определение
бетанинаБетанин, или бетаиидин, является специфическим пигментом
семейства маревых и относится к азотистым антоцианидинам
или бетацианинам. Его молекула содержит кольца индола и
пиридина; близок к группе желтых пигментов (бетаксантииов).
В человеческом организме обладает гипотензивными свой¬
ствами.Суммарное содержание бетанина определяется колометри-
ческим способом при определенной длине волны.Реактивы: 1) этанол; 2) спиртовой 20%-ный раствор HCI; 3) 9%-ный
водный раствор гидрата окиси лития; 4) 30%-ный раствор уксуснокислого
свинца; 5) янтарно-боратный буфер pH 5,2 (стр. 438).Ход анализа. Навеску сырого корнеплода свеклы в 1 г экст¬
рагируют этанолом, подкисленным HCI (на 100 см3 этанола2,5	см3 концентрированной HCI). Доводят ее до 50 см3, фильт¬
руют и затем просматривают на ступенчатом фотометре Пульф-
рнха при фильтре с длиной волны 533 или 496 нм (S 53 или
5 50) или на ФЭК с фильтром, имеющим длину волны 530 нм
(№ 2).Вычисление производят по заранее построенной калибровоч¬
ной кривой, по чистому бетанину.Выделение бетанина (по Пухеру и др.*) основано на оса¬
ждении пигмента бетанина из спиртовой солянокислой вытяжки
гидратом окиси лития.Навеску 300 г тонко измельченной массы корнеплодов сто¬
ловой свеклы экстрагируют горячим этанолом для удаления
сопутствующих веществ. Оставшийся осадок вновь измельчают
и экстрагируют спиртовым 20%-ным раствором НС1. Получен¬
ный таким образом раствор нейтрализуют 9%-ным водным рас¬
твором гидрата окиси лития. Выпавший осадок растворяют в
воде и, чтобы освободить его от сопутствующих пигментов, до¬
бавляют 30%-ный раствор уксуснокислого свинца. После этого
осадок центрифугируют, промывают и суспензируют в ацетоне.
Затем осадок промывают последовательно подкисленным мети¬
ловым спиртом, этиловым эфиром и, наконец, высушивают его
над серной кислотой.Для построения калибровочной кривой полученный сухой
препарат в количестве 10 мг тщательно переносят в колбочку
с 10—15 см3 янтарно-боратного буфера, pH 5,2 и объем доводят
до 100 см3 дистиллированной водой. После часового выдержи¬
вания в темноте разбавляют от 1:10 до 1:50 с помощью того
буфера, который наиболее удобен для спектрофотометрнрова-
иия.•	G. W. Р и с h е г, L. С. Curtis, Н. В. V і с h е г у. Jour. Biolog.
Chemistry. Baltimore. 123. No I, 1938.J24
Определение рутинаРутин является глнкозидом, который широко распространен
в листьях и цветках культурных растений. В состав рутина
входит флавонол (кверцетин) и сахар рутиноза (6, p-L-рамно-
зндо-О-глюкоза). У различных видов гречихи наибольшее коли¬
чество рутина сосредоточено в листьях и цветках, меньшее —
в стеблях и плодах. В цветках софоры японской содержание
рутина достигает 25% на сухое вещество.Принцип метода, который был предложен И. К. Муррн для
определения, основан на цветной реакции рутина с солями алю¬
миния в присутствии избытка уксуснокислого калия. Интенсив¬
ность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре.Реактивы и аппаратура: I) 2%-ный раствор хлористого алюминия;2)	8%-ный раствор уксуснокислого калия или натрия; 3) 80%-ный ло оСъему
этиловый спирт; 4) серны А эфир; 5) колбы Бунзена н вюрца; 6) мерные
цилиндры на 25 см* с лритсртоА пробкой; 7) фотоэлектроколорнмстр.Ход анализа. Извлечение рутина из вегетатив¬
ных органов. Берут 2 навески по 2—5 + 0,01 г листьев
(или цветков) в фарфоровые ступки и тонко растирают с квар¬
цевым песком в присутствии спирта. Растертую навеску пере¬
носят на воронку Бюхнера и экстрагируют спиртом до полного
обесцвечивания остатка и стекающего экстракта. Доводят
фильтрат спиртом до 100 или 150 см3 и из этого объема берут
для определения 25 или 50 см3 в колбу Вюрца. Спирт отгоняют
под вакуумом почти досуха и остаток в колбе обрабатывают ма¬
лыми порциями этилового эфира до получения неокрашенного
экстракта (для удаления кверцетнна. хлорофилла, каротиноидов
н других эфирорастворимых веществ). Эфирные извлечения сли¬
вают через фильтр на маленькой воронке Бюхнера и отбрасы¬
вают. Рутин растворяют в спирте при легком нагревании колбы
Вюрца на водяной бане и фильтруют через тот же фильтр на
воронке Бюхнера в чистый приемник. Спиртовой раствор руїнна
доводят 80%-ным спиртом до 15; 25 или 50 см3 (в зависимости
от содержания рутина). Затем приступают к проведению цвет¬
ной реакции и колориметрированню.Извлечение рутина из семян. Берут навески по
10 + 0,1 г тонко измельченной ядрицы гречихи обыкновенной
или 2 + 0,001 г гречихи татарской, извлекают спиртом в экст¬
ракторах, работающих по принципу аппарата Сокслета. Для
этого навеску муки заделывают в пакет (патрон) из фильтро¬
вальной бумаги и извлекают спиртом в экстракторе до полного
обесцвечивания жидкости. В дальнейшем экстракт доводят до
100 слэ. Затем из всего экстракта (семян обыкновенной гре¬
чихи) или его части (богатых рутином семян) отгоняют раство¬
ритель в колбе Вюрца. Далее поступают так, как указано
выше. При отсутствии экстракторов извлечение рутина из семян125
ведут растиранием навески в ступке с отсасыванием на воронке
Бюхнера.Колориметрироваиие. В мерный цилиндр с притерто»
пробкой приливают последовательно 5 см3 спиртовой вытяжки»
5 см3 2%-ного раствора хлористого алюминия и 15 см3 8%-нога
уксуснокислого калия (или натрия). Содержимое цилиндра пе¬
ремешивают и оставляют стоять 2 часа для развития желтой
окраски. При присутствии большого количества сопутствующих
рутину окрашенных веществ готовят контрольный раствор, ко¬
торый приготовляют таким же образом, как и опытный раствор»
только вместо 5 см3 раствора хлористого алюминия прибав¬
ляют 5 см3 воды.Наливают отфильтрованный через бумажный фильтр рас¬
твор в кювету (10 мм) и измеряют интенсивность его окраски
на фотоэлектроколориметре при синем светофильтре. Нулевую
точку устанавливают либо по дистиллированной воде, либо па
контрольному раствору. Содержание рутина вычисляют по ка¬
либровочной кривой.Составление калибровочной кривой. Стандарт¬
ный раствор готовят растворением 20 мг чистого рутина в
100 см3 80%-ного спирта. Для лучшего растворения рутина
раствор можно слегка подогреть. В мерные цилиндры на 25 см*
вводят следующие количества стандартного раствора: 1; 1,5; 2;
2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5 см3 и каждый доводят до 5 см3 80%-ным
спиртом. В полученном объеме соответственно содержится 0,2;0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; I мг рутина. Затем в каждый цилиндр
добавляют 5 см3 2%-ного раствора АІСІз и 15 см3 8%-ного рас¬
твора уксуснокислого калия, перемешивают и оставляют стоять
в темном месте 2 часа. Для построения калнбоовочного гра¬
фика откладывают на оси абсцисс миллиграммы рутина, а на
оси ординат — оптическую плотность окрашенных растворов.Пример вычисления. Навеска листьев 5 г. Общий объем экст¬
ракта 100 см*. Для работы взято 25 см* экстракта. Объем спиртового
экстракта рутина (после эфирной обработки) —50 см1. На проведение цвет¬
ной реакции взято 5 ел*. По калибровочной кривой найдено 0,4 мг рутина
в 5 cju* спиртового раствора. Содержание рутииа (х), в мг на 100 г сирых
листьев, будет:0,4.100 50-100 _
х~ 5-25-5 — 320-Определение холина и бетаинаХолин распространен в растениях и образуется при гидро¬
литическом расщеплении лецитинов. Он является источником
метнльных групп при реакции ферментативного метилирования»
относится к липотропным факторам и предупреждает ожире-
че печени. Сравнительное изучение растений показало, что
максимальный количества холина накапливаются в семенах сои,
зеленом горошке, соцветиях цветной капусты и других расте¬
ниях.Солянокислая соль холина (холнн-хлорнд) находит приме¬
нение как составная часть кормов для птиц, а также для
молодняка различных животных.С Н20 НС H3N(C Нэ)зОН CH3OHCH3N(CH3bCtЮДИН	ХОЛИИ-ХДОрНДБетаин, или метилированный гликокол, так же как и холи и,
относятся к метилсоединениям. В обмене веществ связан с не¬
заменимой аминокислотой — метионином, лецитином и холином.
Глицинбетаин представляет собой пример бетаинов, найденных
в растениях. Данные последних лет показывают, что макси¬
мальные количества бетанина содержатся в столовой свекле и
особенно в ее листьях, а также в краснокочанной капусте.Определение холина. Принцип метода определения холина
в модификации Г. А. Луков ни новой и А. И. Есюниной основан
на образовании окрашенного соединения холина с солью Рей-
неке.Реактивы и аппаратура: /) 20%-ный раствор HNOj; 2) 33%-ный раствор
'NaOH; 3) раствор cam Рей неке в 2%-ном этиловом спирте; 4) мерные ци¬
линдры с притертой пробкой или мерные колбочки на >10 см*\ 5) ФЭК-М.Ход анализа. Навеску 2 + 0,001 г измельченного образца
заливают 15 см* 20%-ной HN03 в 100 см3 конической колбочке
и нагревают на кипящей водной бане с обратным холодиль¬
ником 2 часа. Затем горячий экстракт фильтруют и осадок на
фильтре промывают дистиллированной водой с HN03. Фильтрат
нейтрализуют 33%-ным раствором щелочи до pH 10. К этому
раствору (после его охлаждения) добавляют 10 см* 2%-ного
раствора соли Рейнеке и оставляют в холодильнике на 18 ча¬
сов.Выпавший осадок соединения холина отфильтровывают че¬
рез стеклянный фильтр № 4 и промывают н-пропаиолом при О5.
Затем осадок растворяют в ацетоне, промывая фильтр, и до¬
водят до 10 см3. Раствор сразу же колориметрируют на ФЭК-М.
За контрольный раствор принимают ацетон.Для построения калибровочной кривой берут 100 г хими¬
чески чистого холин-хлорида и разводят дистиллированной во¬
дой до 100 см*. Из этого раствора пипеткой отмеривают 2; 4;
6; 8; 10 и т. д. см»3 в колбочки на 100 см3. Затем с содержимым
колбочек проводят те же операции, что и с опытными образ¬
цами, начиная от момента гидролиза. Полученные растворы
колориметрируют. При составлении графика иа оси абсцисс
откладывают концентрацию холина, а на оси ординат — соот¬
ветствующие им показания прибора.Пример вычисления. Навеска сухого материала кормовой свеклы
составляла 3 г («). Показание на ФЭК—0,07 (£). Коэффициент, еысян-127
тамхыА по калибровочной кривой, равен 40,1 (/С). Тогда количество холл на
в 100 г сухого .вещества будет:/(•£•100н40,1-0,07-100
3= 93,57 мг.Сухое вещество анализируемого материала 11,63%. Следовательно, коли¬
чество холина в 100 г сырого вещества корнеплода равно <10,8 мг.Определение бетаина. Метод в модификации Г. А. Луковни-
ковой и А. И. Есюниной основан на измерении оранжеватой
окраски комплексного соединения бетаина с солью Рейнеке
в 70%-ном ацетоне.Реактивы и аппаратура: I) NH4Cr(NHs)* (SCN)<] • HjO — водный рас¬
твор соли Рейнеке; 2) 70%-ный ацетон; 3) безводный эфир (без следов
спирта, для чего его промывают водой); 4) 2 и. раствор НО; 5) стеклянные
фильтры № 3 или № 4; 6) мерные цилиндры с притертой пробкой или мер¬
ные колбочки на 10 см1.Приготовление водного раствора соли Рейнеке. К 1,5 г соли
добавляют 100 см3 дистиллированной воды и полученный ра¬
створ доводят до pH 1 с помощью 2 н. НС1 (pH проверяют по
лакмусовой бумажке). Для лучшего растворения соли раствор
взбалтывают в течение 45 минут при 18—20°, а затем фильт¬
руют. Прозрачный раствор используют для приготовления бе¬
таина.Ход анализа. Растворяют 3 г сухого материала (с оптималь¬
ным количеством бетаина 1—3 мг\см3 вытяжки) в 50 см3 воды,
добавив 2М раствор НС1 — до pH 1 и около 0,25 г активи¬
рованного угля. Полученную смесь нагревают на электрической
плитке почти до кипения (время от времени ее взбалтывают).
Затем горячий раствор фильтруют через складчатый фильтр н
осадок на фильтре промывают несколько раз горячей водой,
присоединяя промывные воды к основному фильтрату. После
охлаждения к нему добавляют по каплям 2 н. НСІ до pH 1 и объем
доводят до 50 см3. Затем из общего объема опытного раствора
берут 2 параллельные пробы по 5 см3 и помещают их в кол¬
бочки на 50 см3 и колбочки с испытуемым раствором ставят на
15 минут на лед. Температура раствора в колбочках по исте¬
чении этого времени должна быть не выше +2°, после чего
в них прибавляют по 5 см3 водного раствора соли Рейнеке
(каплями при постоянном помешивании). Калибровочную кри¬
вую строят по бетаину.
Определение
глава vi сахаров*Особенности сахаров
и методов их определенияРастворимые сахара в том или ином количестве нахо¬
дятся в любом органе растения.Содержание сахаров в растениях и качественный состав их
весьма разнообразны. Широко распространены в основном 3 са¬
хара — глюкоза, фруктоза и сахароза, редко —другие сахара
(например, сорбоза в ягодах рябины). При одном и том же
количественном содержании сахаров у различных видов и сор¬
тов растении качественный их состав неодинаков. В сахарной
свекле, например, содержится в среднем около 19% сахаров,
представленных главным образом сахарозой. Ягоды винограда
содержат 15—25% сахара, состоящего почти исключительно
из глюкозы и фруктозы (примерно в равных количествах).
В большинстве же плодов и овощей имеются все 3 вида са¬
хара с преобладанием того или иного из них.Весьма значительны сортовые отличия в химическом составе
плодов. Это широко использовано селекционерами при выве¬
дении сортов различного направления использования (напри¬
мер, столовых и винных сортов винограда). Плоды и овощи
содержат большие количества воды— 70—97%; наибольшую
часть их сухого вещества составляют сахара. В связи с этим
колебания в содержании воды сильно отражаются на процент¬
ном содержании сахаров (обратная зависимость). Как правило,
дожди и избыточные поливы снижают процент сахара в ово¬
щах и плодах. Наоборот, засуха или недостаток влаги увели¬
чивают процентное содержание сахаров. На содержание са¬
харов в растениях влияют и сопровождающие факторы — тем¬
пература почвы и воздуха, удобрение. Применение удобрений
отражается на общем химическом составе плодов и овощей,
в том числе на их сахаристости. Наибольшее значение для са-
харонакопления среди других элементов минерального питания
имеет фосфор.Одним из важных факторов накопления сахаров в плодах,
овощах является температура: плоды на юге значительно ела-5 Заказ М 401129
ше, чем на севере; в одном н том же районе в годы с жарким
солнечным летом плоды более сахаристы, чем в годы с преоб¬
ладанием пасмурной* прохладной летней погоды.Отличия в химическом составе растений, происходящие под
влиянием условий выращивания, зачастую превышают сорто¬
вые отличия. Орошение и удобрение являются действенными
факторами, которыми удается регулировать сахаристость пло¬
дов и овощей. Вкусовые свойства плодов многих культур и
сортов, особенно их сладость, обусловлены отличиями не только
в содержании сахара, но и других веществ, в первую очередь
органических кислот (томаты, сливы, виноград, яблоки), а так¬
же эфирных масел (репчатый лук), капсаицина (в перце)
и т. д. Эти вещества маскируют истинную сахаристость пло¬
дов, и для правильной оценки качества их приходится наряду
с сахаристостью определять и эти вещества (острые сорта реп¬
чатого лука содержат больше сахара и особенно сахарозы, чем
сладкие).Длина вегетационного периода оказывает влияние на саха¬
ристость и соотношение сахаров и плодах: ранние сорта, как
правило, менее сахаристы, чем поздние и средние, и сахарозы
у них меньше.Наконец, чрезвычайно изменяется сахаристость плодов в
процессе их созревания — изменяется и общее количество са¬
харов и их соотношение. В связи с большими отличиями в са¬
харистости незрелых и зрелых (или перезревших) плодов и
овощей и с отсутствием достаточно объективных показателей
зрелости — при взятии средней пробы самое пристальное внима¬
ние должно быть уделено правильному отбору плодов.Не остается постоянной сахаристость плодов и в период
зимнего хранения: в начале хранения идет дозревание плодов
некоторых культур (так называемых зимних сортов), и в этот
период сахаристость может увеличиваться за счет гидролиза
полисахаридов. В дальнейшем же (а для других сортов —сразу
после закладки на хранение), как правило, содержание сахаров
снижается вследствие расходования их в процессе дыхания.При сравнительной оценке сортов необходимо не упускать
из вида всю указанную выше изменчивость, чтобы сопостав¬
лять только сравнимые между собой объекты.Ббльшая часть растворимых сахаров находится в клеточ¬
ном соке, и одним из приемов для оценки образцов является
анализ сока, выжатого из растения. Для количественного опре¬
деления сахаров служат самые разнообразные методы, осно¬
ванные на физических или химических свойствах сахаров.
Определяют содержание сахара рефрактометром (по показа¬
телю преломления) или ареометром (по плотности сока).
Часто используют поляриметрический метод (например, для
анализа сахарной свеклы), основанный на присущей всем са¬
харам оптической активности и характерном для каждого из130
них удельном вращении. Широко применяют хроматографию —
на бумаге и «тонкослойную».Наиболее общий — классический химический метод количе*
ственного определения сахаров, обладающих свободной альде¬
гидной или кетонной группой, основан на их способности вос¬
станавливать в щелочной среде сернокислую медь в закись
меди и учете последней.Дисахариди определяют тем же методом, но лишь после их.
гидролиза.Не все растения и не все ткани пх одинаково легко от*
дают сок. В таких случаях концентрация сахара в выжатом
соке и оставшегося в тканях различна; тем самым вносится
погрешность в определение сахара. Для ряда объектов этот
прием все же удобен, и меньшая точность вполне компенси¬
руется быстротой определения при получении сравнимых резуль¬
татов (так в производстве сахара определяют сахаристость са¬
харной свеклы, в виноделии — сахар в виноградном сусле).Сахара легко растворяются в воде, и на этом свойстве
основано выделение их из растений в водную вытяжку. Для
отделения сахаров от полисахаридов используют их свойство
растворяться в 80—82-градусном спирте (полисахариды не¬
растворимы). Для разделения моносахаридов используют ме¬
тоды, основанные на способности фруктозы давать окрашива¬
ние с резорцином.Глюкозу определяют по разности между общим содержа¬
нием моносахаридов и количеством фруктозы или количествен¬
ным окислением ее D-глюкооксидазой.Для разделения и идентификации более сложных смесей
сахаров, а также веществ, входящих в другие классы органи¬
ческих соединений, широко используют методы хроматографии,
с помощью которых можно разделить смесь сахаров на от¬
дельные компоненты н количественно определить каждый из
них.Пользуясь методом хроматографии, кроме широко рас¬
пространенных фруктозы, глюкозы, сахарозы, во многих расте¬
ниях обнаружили присутствие рафинозы, стахиозы, некоторых
пентоз и других сахаров. Этот метод требует сравнительно
много времени.Значительно более быстрыми являются методы ТОНКОСЛОЙ¬
НОЙ хроматографии, например на силикагеле.Для предварительной идентификации сахаров можно по¬
лучать их производные в виде фенилозазонов. Из нескольких
разных сахаров образуется один и тот же фенилозазон, по¬
этому для более точной идентификации из фенилозазонов по¬
лучают фенилизотриазолы и изучают их свойства *.*	Методы химии углеводов. Перси, с англ. под ред. Н. К- Кочеткова,
«Мир», 1967.5*131
ілг>л(іЦА4	Содержание сахара в съедобной частаглавнейших культур(в процентах на сырое вещество)Обшії сахаристостьСахарозаКультурачашечащеПреобладающий сахарамплитудавстречаетсяамплитудавстречаетсяСахарная свекла16-2316-1916-2316-191 СахарозаМорковь ....6-8—2-6—Репчатый лук . .4.5-10,56-80,4-8,44-6Капуста 	1,6-42,5-30-0,30,3-0,4Томаты	1,6-5.52,5—3,50.2-0,80,2-0,4\j МоносахаридыОгурцы 	1,2-2,1—0-0,3—JАрбуз	6-116-81,2-3,2Около 2ФруктозаДыня	6-188-111.3—113,7СахарозаТыква	Яблоки 	2,7—8,3
6-183-610-110,6-6
0,3-9,61-32-3j МоносахаридыГруши 	4-218-120-7,84—7ФруктозаСливы 	4,7-178-100,9—8,32-4Сахароза илиПерсики	5-22моносахаридыІ10-116-157-101Абрикосы ....5-238—103,7-17,35-711 СахарозаАпельсины . . .4,3-11,57-86-104JВиноград ....12-2512-230-50-0,3Черешня ....9,7-17,810-120,15-2,20,2-0,5Земляника ....4,6-105-70-4,60,6—1.4Малина	3.9-10.86-80-2.74Смородиначерная . . .5.1-11.680-2,7Моносахаридыкрасная . . .4,1-8,96-70-0,4—Крыжовник . . .5,3-129-100,3—0,9—Хурма 	9-20	0—5—Инжир	5-238—120-82Извлечение сахаровИзвлечение сахаров водой. Из сырого, измельченного тем
или иным способом материала приготовляют водную вытяжку.
В производственных условиях для ориентировочных целей часто
ограничиваются отжиманием сока, который и подвергают
анализу.Для приготовления вытяжки применяют следующие способы.1.	Из предварительно измельченной средней пробы берут
навеску, которую дополнительно измельчают или в размель-
чителе тканей (гомогенизатор), или в фарфоровой ступке.
В первом случае навеску помещают в стакан гомогенизаторау
заливают нагретой предварительно до 80° водой и экстрагируют
в течение 10 минут. Затем новыми порциями воды количест¬
венно переносят содержимое стакана в мерную колбу и по
остывании доводят до метки.132
Если требуется извлечь сахар спиртом, то поступают точно
так же, заменив воду при экстракции 82%-ным этиловым
спиртом.2. При отсутствии гомогенизатора в фарфоровой чашке (из¬
вестного веса) отвешивают навеску 25 + 0,01 г из тщательно
перемешанной непосредственно перед взвешиванием средней
пробы. Навеску количественно переносят в фарфоровую ступку,
смывая туда же из чашки остатки навески дистиллированной
водой, и тщательно растирают с 2—3 г толченого стекла до од¬
нородной кашицеобразной массы (небольшие кусочки тканей,
например, кожицы плодов томатов, слив и т. д., должны быть
растерты). Растертую массу количественно переносят в кони¬
ческую колбу на 250 см3, заливают 150—200 см3 горячей ди¬
стиллированной воды ii нагревают в течение часа на водяной
бане при 75—80°. Через час колбу снимают с бани, переносят
содержимое ее в мерную колбу на 500 см3 (удобно переносить
при помощи воронки со срезанным концом), ополаскивая не¬
сколько раз колбу, в которой производилось извлечение саха¬
ров на бане. После охлаждения вытяжки объем ее доводят до
метки и, перемешав тщательно содержимое, фильтруют вы¬
тяжку в любую другую колбу. Как только наберется требуе¬
мое количество жидкости, приступают к анализу; нет надоб-
ностн отфильтровывать всю вытяжку, так как объем ее уже
определен и взбалтыванием достигнуто равномерное распреде¬
ление сахаров во всем объеме.Указанными способами сахара извлекаются одинаково легко
не из всех объектов. Для большинства объектов (ягоды, вино¬
град, овощи — брюква, репа и др.) более полное извлечение
сахара достигается 2—3-кратной обработкой новыми порциями
воды. Первый раз извлечение проводится на бане в течение
30 минут. Жидкость сливают через фильтр в мерную колбу,
заливают 100 см3 горячей дистиллированной воды, помещают
опять в баню на 15 минут. Эту процедуру повторяют еще раз.
При работе с малоизвестным материалом проверяют полноту
извлечения.При анализе воздушно-сухого материала необходим ряд по¬
следовательных экстракций с предварительным растиранием
навески в ступке с первой порцией воды и настаиванием в те¬
чение нескольких часов (с добавлением антисептиков — тимола,
толуола) и с обязательной проверкой полноты извлечения.Некоторые объекты (томаты, яблоки, виноград, лимоны)
обладают значительным содержанием кислот, которые могут
во время извлечения сахаров при нагревании частично или
полностью гидролизовать сахарозу. Поэтому, если предпола¬
гают определять не только общий сахар, но и отдельно саха¬
розу, необходимо в колбу перед нагреванием на бане добавить
мел для нейтрализации кислот. При анализе моркови, брюквы,
баклажанов, бахчевых, капусты и других объектов, характе-133
ризуюшихся низкой кислотностью, добавлять мел нет надоб¬
ности.В вытяжке некоторых объектов кроме сахаров присутствуют
также н другие редуцирующие вещества, которые искажают ре¬
зультаты анализа или затрудняют фильтрование (белки и пр.).
В таких случаях требуется очистить вытяжку (осадителями
белков и других веществ).Обязательно производят осветление вытяжек (осаждением
примесей) при анализе винограда, репчатого лука, листовых
овощей, кормовых трав, сахарной свеклы. При анализе любого
неизвестного объекта рекомендуется іцювернть сравнительным
анализом необходимость осаждения. Более же целесообразно
эту операцию проводить во всех случаях.В качестве осадителей можно использовать: 1) смесь 30%-
ного раствора сернокислого цинка и 15%*иого раствора желе-
зистосинеродистого калия, которые приливают в равных объ¬
емах (по 0,5—1,5 см3); 2) 4%*ный раствор фосфорновольфра¬
мовой кислоты; 3) 10%-ный раствор уксуснокислого свинца»
избыток которого удаляют фосфорнокислым натрием.Раствор свинца добавляют по каплям в теплую, не дове¬
денную до окончательного объема, вытяжку до прекращения
образования осадка. Рекомендуется, прибавив некоторое коли¬
чество раствора, дать постоять вытяжке и затем внести еще 1—2	капли. Если в отстоявшейся жидкости сохраняется образо¬
вание значительного осадка, то необходимо продолжать при¬
бавление раствора свинца. Для примера укажем, что чаще его
приходится добавлять около 1—2 см3, в некоторых случаях
(при анализе трав, листовых овощей)—до 5 см3 на вытяжку,
полученную из навески 25 г. Избытка соли свинца следует из¬
бегать, так как впоследствии он проходит через фильтр и ме¬
шает ходу анализа.Извлечение сахаров спиртом. При определении сахаров в
водных вытяжках объектов, содержащих в значительных ко¬
личествах крахмал или инулин (картофель, батат, топинамбур,
цикорий), могут быть получены искаженные результаты, так как
эти вещества частично или полностью переходят в водную вы¬
тяжку (декстрины, инулин). Кроме того, такие вытяжки обычно
трудно фильтруются. В таких случаях вместо водной вытяжки
готовят спиртовую. Навеску свежего измельченного материала
заливают в колбе горячим 96°/о-ным этиловым спиртом и на¬
гревают в бане с обратным холодильником. Количество при¬
бавляемого спирта рассчитывают так, чтобы в результате раз¬
бавления спирта водой, содержащейся в навеске, концентрация
его оказалась равной 75—80%. Спиртовые экстракции произ
водят так же, как водные, т. е. первую — 30 минут, две после¬
дующие по 10—15 минут на водяной бане при кипонии
спирта. Полученные экстракты смешивают, отгоняют спирт на
водяной бане (лучше под вакуумом), остаток (содержащий и101
некоторое количество воды) переносят водой в мерную колбу,
доводят до черты, фильтруют через бумажный фильтр; освет¬
лять раствором солей свинца обычно не требуется, так как
полисахариды в него не переходят, а белки если и переходят,
то в небольшом количестве (при работе с плодами и овощами).
Отогнанный спирт собирают и повторно используют для извле¬
чения сахаров из других образцов (проверяют концентрацию
его; обычно опа около 80%).Анализ водной вытяжки
на содержание
различных сахаровИз профильтрованной вытяжки (приготовленной по одному
из указанных способов и доведенной в мерной колбе до метки)
берут пипеткой пробы для определения: 1) редуцирующих са¬
харов и 2) сахарозы.1.	Две пробы по 10—20 см3 (в зависимости от ожидаемого
количества сахара) берут в конические колбы на 150—200 см3,
добавляют соответствующие реактивы и необходимое количе¬
ство воды и определяют сахар по Бертрану. При этом опреде¬
ляется сумма моносахаров — глюкозы и фруктозы. Если ре¬
зультаты титрования параллельных проб сильно расходятся
(например, на титрование идет 6 см3, а расхождение между
пробами 0,25 сл3), то количество проб увеличивают.2.	Пипеткой берут 50 см3 вытяжки в коническую колбу на
100 см3, добавляют 5 см3 5%-ного раствора соляной кислоты
(чем достигается 0,5%-ная концентрация кислоты в данной
пробе), помещают в кипящую водяную баню на 30 минут для
гидролиза сахарозы. Через 30 минут колбу охлаждают (или
дают остыть), жидкость нейтрализуют щелочью или лучше на¬
сыщенным раствором углекислого натрия по лакмусу до слабо-
кислой реакции, переносят в мерную колбу на 100 см3, доводят
до метки, перемешивают и, если жидкость мутная или обра¬
зуется осадок, фильтруют, берут пипеткой 2 пробы по 10—
20 см3 и определяют сахар по Бертрану.В этой пробе определяют редуцирующие сахара (найденные
ранее в отдельной пробе), а также сахарозу. Разность между
2-м и 1-м определениями, умноженная на коэффициент 0,95,
составляет сахарозу.Приготовленную вытяжку, если неудобно анализировать в
тот же день, можно оставить до следующего дня в прохладном
месте (лучше в холодильнике), прилив 2—3 капли толуола.Прокипяченную с растворами Фелинга пробу для опреде¬
ления сахара нельзя оставлять на продолжительное время, на¬
пример, на час и дольше. Ни в коем случае нельзя прерывать
определения. Начатое определение надо сразу же довести до135
конца, иначе осадок закиси меди может частично окислиться н
тем понизить результат анализа; кроме того, реактивы при
длительном нахождении в смеси и соприкосновении с возду¬
хом могут образовать некоторое количество закиси меди, что
также исказит результаты анализа.Если вытяжку готовили, применяя осаждение раствором
уксуснокислого свинца, то нет надобности прибавлять толуол»
так как свинец предохраняет вытяжку от заражения микро¬
организмами.Вместо метода Бертрана можно определять сахар по полу*
микрометоду, особенно в случае ожидаемого низкого содержа¬
ния сахара, или по микрометоду (эбулностатический метод).Если требуется знать не только сумму моносахаридов, но
и отдельно содержание каждого из них (глюкозы и фруктозы),
то в аликвотной порции первоначальной вытяжки (негидроли¬
зованной) определяют фруктозу резорциновым методом. Раз¬
ность между суммой моносахаридов, определенной по Бертрану
(или одним из микрометодов), и содержанием фруктозы пред¬
ставляет содержание глюкозы.Определение сахаров
по БертрануМетод основан на способности редуцирующих сахаров, об¬
ладающих свободной карбонильной группой, восстанавливать
в щелочном растворе окисную медь в закисную. Реакция про¬
текает количественно. Сахароза и другие олигосахара, у кото¬
рых связаны обе карбонильные группы (сахароза) или одна
(мальтоза), требуют предварительного гидролиза кислотой или
ферментом. Задача заключается в том, чтобы определить коли¬
чество образовавшегося осадка закиси меди, которое строго
соответствует количеству сахара, находящемуся в растворе.
Для этой целн осадок закиси меди растворяют сернокислым
(окисным) железом в присутствии серной кислоты; при этом
закись меди количественно окисляется окисным железом, вос¬
станавливая его в закнсное, а последнее в свою очередь также
количественно окисляется марганцовокислым калием. Прн этом
протекают следующие реакции:CuSO< + 2NaOH = Cu(OH}3 + Na.SO,;
yOH НО — СН — COONa	>OCHCOONa,4- I	—* Cu^	+ 2H30xOH HO-CH —COOK	NOCHCOOK>OCHCOONa	О	COONa COOK2Cu4	+ Rc^f = CujO + 2CHOH - CHOH -f RCOOHX)CHCOOK ^Hсахар осадок
закиси
меди135
Реактивы и аппаратура: 1) титрованный расгвор перманганата КМпО«
5 г в I дя3 воды; 2) раствор. рО г сернокислого железа (окисного) или 100 г
жслезоаммначных квасцов в воде + 200 см3 HjSOi, плоти. 1,84; 3) рас¬
твор CuSOi-5HjO (40 г псрскристаллнзованного медного купороса раство¬
ряют в I дм3 дистиллированной воды); 4) раствор щелочи (250 г едкого
иатра растворяют в воде, сюда же добавляют 50 см* чистого глицерина и до¬
водят до I Ли5); 5) фильтр стеклянный (трубка для фильтрования —
рис. 16), приготовленный так, как описано ниже, из стеклянной ваты;6)	колба Бунзена на 250 см3 (толстостенная колба с тубусом); 7 )водоструй¬
ный насос или насос Комовского; 8) электрическая ллитка или любой дру¬
гой нагревательный прибор; 9) песочные часы на 3 минуты; 10) липетхн
на 50, 20, 10 и 5 см3.Приготовление раствора перманганата калия. Отвешивают
5 4; 0,01 г перманганата из расчета на 1 дл3 (лучше готовить
сразу несколько куб. дециметров) в колбу (не мерную) и при¬
лив около 1 дм* дистиллированной воды, кипятят 30—40 минут.
Затем колбу закрывают пробкой со вставленной в нее трубкой,
наполненной сухой натронной известью, и дают остыть. Осталь¬
ное количество воды, необходимое для титрованного раствора
(5—6 А«3), также кипятят и остужают.После этого раствор фильтруют через обычный бумажный
фильтр прямо в предназначенную для хранения раствора
склянку из темного стекла (или покрытую черной краской),
в которой уже находится остальная вода, закрывают пробкой
и оставляют на несколько дней.Через 4—5 дней определяют титр раствора перманганата,
который обычно не изменяется в течение 3—4 месяцев. Через3	месяца титр проверяют (если раствор хранится дольше).
Удобно определять титр по щавелевокислому натрию или по
щавелевой кислоте *.Титр перманганата по кислороду необходимо выразить по
меди, так как в таблицах Бертрана представлены весовые зна¬
чения меди и соответствующие им весовые эквиваленты сахара.
Для перевода титра пользуются уравнениями:Cu50 + Fe« (SO,)., j- H3SO, = 2CuS04 f 2FeSO« + H30;
lOFeSO* -f 2KMn04 J- 7H,SO< = 5Fc., (SO,)3 + 2MnSO* + 8H30.Следовательно, на два Си идет один О. Таким образом,
если титр по кислороду равен 1,157, то 126:16=х* 1,157, откуда126 - 1,157
.* =	да — - =9,11 мг Си.Приготовление фильтра. Для отфильтровывання осадка за¬
киси меди, промывания и его растворения удобно иметь не¬
сколько фильтров, приготовленных из стеклянной ваты и стек¬
лянного порошка. Фильтр приготовляют следующим образом.
Берут цилиндрические трубки диаметром 30—40 и длиной•В. М. Суслонникова, Е. К. Киселева. Руководство по при¬
готовлению титрованных растворов. «Химия», 1965.137
100 мм, к которым с одного конца припаяна более узкая
трубка, диаметром 6—8 мм (рис. 16). В суженную часть трубки
помещают стеклянную или фарфоровую бусинку, а затемкрест-накрест несколько слоев крупно
нарезанной стеклянной ваты и распреде¬
ляют ее палочкой таким образом, чтобы
она закрывала всю суженную часть. За¬
тем кладут более мелко нарезанную
стеклянную вату, толщина слоя которой
должна быть 10 мм, и после этого запол¬
няют стеклянным леском сечением 1—
2 мм (для этой цели толченое химическое
стекло просеивают вначале через сито
диаметром 1 мм, а затем оставшуюся на
сите часть просеивают через следующее
сито диаметром 2 мм). После этого для
получения нового слоя в трубку прибав¬
ляют стеклянный порошок, пропущенный
через сито с отверстиями 1 мм. Толщина
каждого слоя должна быть около 15—
20 мм и самый верхний слой фильтра
должен состоять из частиц песка, прохо¬
дящего через отверстие 0,5 мм *. Когда
стеклянная трубка заполнена, ее много¬
кратно промывают водой, чтобы отмыть
остатки кислоты и мельчайшие частицы.
Фильтр должен легко пропускать теплую
воду. Приготовленные таким образом
фильтры устанавливают в специальный
штатив для одновременного фильтрова¬
ния 6—8 проб.Ход анализа. Берут пипеткой 5—20 см3
исследуемого раствора (в зависимости от
ожидаемого содержания сахара) в колбу
на 200 см3. Количество сахара в пробе
должно быть не менее 10 и не более
100 мг (предпочтительно 40—60 мг).
Определение требует сохранения опреде¬
ленных объемов реагирующих веществ,
поэтому, если предполагают большое со¬
держание сахара в исследуемой вытяжке,
берут 5—10 см3 раствора и добавляют
соответственно 15—10 см3 дистиллированной воды. В кониче¬
скую колбу на 200—250 см3 приливают (мерным цилиндром)
по 20 см3 растворов сернокислой меди и щелочного раствора,
содержащего сегнетовую соль или глицерин, осторожно смеши-* Стеклянный порошок перед употреблением обрабатыоают нагреванием
е хромовой смесью, а затем отмывают водой до нейтральной реакции.Рис. 16. Схематический
разрез трубки для филь¬
трования осадка закиси
меди (без отсасывания)./ — стеклянный шарик. 2 —
стеклянная мта. 3 — стек¬
лянный песок. крупны»!.
4 - то же. средний. 5 — то
же, мелкий.138
Номограмма для определения глюкозы по меди (по Бертрану).
вают их, слегка вращая колбу, и кипятят точно 3 минуты с мо¬
мента закипания. Полученному красному осадку закиси меди
дают отстояться 1—2 минуты.Если в анализируемом растворе сахара очень мало, осадка
закиси меди в нем не образуется и, наоборот, при наличии
в растворе слишком большого количества сахара (за преде¬
лами его учета)—вся медь полностью восстанавливается в за¬
кисную, что характеризуется исчезновением синей окраски и
большим количеством выпавшего осадка. В обоих случаях
(мало или много сахара) анализ следует переделать, взяв дру¬
гое количество исследуемого раствора. Если осадка закисиРис. 17. Штатна для фильтровальных трубок (для
отфильтровывання и промывания осадков закисе
меди); вид спереди.меди не образуется или он так мал, что на титрование идет
всего 1—2 см3 раствора марганцовокислого калия, то надо
приготовить другую вытяжку — взять ббльшую навеску (50 г),
разбавив вытяжку до того же объема, или такую же навеску
(25 г) довести до меньшего объема. Тем самым концентрация
сахара в растворе повысится. Если израсходована не вся серно¬
кислая медь на окисление сахара во взятой пробе, то умень¬
шают объем пробы или дополнительно разбавляют раствор в
5—10 раз.Жидкость фильтруют через фильтр из стеклянной ваты без
отсасывания, пользуясь штативом (рис. 17), который устанав¬
ливают на раковине. Осадок по возможности не переносят на
фильтр и отмывают его от щелочи в колбе декантацией, а за¬
тем на фильтре — горячей дистиллированной водой. Затем под
фильтр с осадком подставляют чистую колбу, как показано
на рис. 17. Промытый осадок закиси меди растворяют в реак¬
ционной колбе 10—15 см3 раствора железоаммиачных квасцов
или окисного сернокислого железа и переливают на фильтр.140
Осадок на фильтре размешивают палочкой и дают ему пол¬
ностью раствориться; обычно он при этом фильтруется без при¬
менения отсасывания. Затем промывают колбу теплой дистил¬
лированной водой 2 раза и сливают все через фильтр.Фильтрат сразу же титруют 0,1 н. раствором перманганата
до появления розового окрашивания (от последней капли).
Титрование двух параллельных проб не должно расходиться
более чем на 0,05 см2, если на пробу идет 6—8 см3 раствора
марганцовокислого калия. Если идет 10—12 см3, то допускается
расхождение на 0,1 см3.При вычислении процента сахара объем 0,1 н. перманга¬
ната, пошедший на титрование, умножают на титр по меди и
по таблицам или графику находят, какому количеству сахара
он соответствует. Процент сахара (х) вычисляют по формуле:а ’ у • 100А = V| • Nгде: а —количество сахара во взятом объеме (»0, найденное
по таблице Бертрана;V — объем вытяжки, полученный из навески;
їм — проба вытяжки (в см3), взятая для определения;
н — навеска материала.Полумикрометод
определения сахаровДля определения сахара в пробе 0,1—9 мг может быть ис¬
пользован микрометод, отличающийся от метода Бертрана тем,
что работа ведется с меньшими объемами растворов сахаров и
для титрования применяется более разбавленный раствор мар¬
ганцовокислого калия. Метод может быть применен для массо¬
вых анализов.Реактивы и аппаратура: 1) раствор сернокислой меди (40 г перекри-
сталлнзованного медного купороса растворяют 1 дм* дистиллированной
воды); 2) раствор щелочи (150 г едкого натра растворяют в 500 г*1 воды,
добавляют 50 см* чистого глицерина я доводят до 1 дм1); 3) раствор серно*
кислого железа (растворяют 50 г окисного сернокислого железа или 100 г
железоаммиачных квасцов в воде, добавляют 200 см* H2SO4. плоти. 1,84 и
доводят до 1 дм*); 4) 0,01574 н. раствор марганцовокислого калия (на¬
веску 0.5 г растворяют в 1 дмі* воды; I с-м3 раствора соответствует I мг
меди); 5) стеклянные пробирки на 10 см*; 6) колбы Бунзена на 200 см1;
7) цилиндрическая трубка со стеклянным или асбестовым фильтром; 8) баня
и штатив к ней с отверстиями для пробирок или другое приспособление.Ход анализа. Для работы используют вытяжку, содержащую
примерно 0,1% сахара. Такой раствор в количестве 3 см3 по¬
мещают в пробирку, приливают по 3 см2 растворов медного ку¬
пороса и щелочи с глицерином. Пробирку после взбалтывания
погружают в кипящую баню на 6 минут, затем — в сосуд с хо¬141
лодной водой и фильтруют содержимое через стеклянный
фильтр. Осадок закиси меди дважды промывают горячей водой,
d или вают промывные воды из колбы Бунзена, тщательно моют
и ополаскивают ее (или заменяют другой, чистой).Определение ведут в параллельных пробах и вычисляют со¬
держание сахара по приведенной табл. 5.таблица 5	Определение сахаровпо меда (в мг)ГлюкозаМельГлюкоздМельГлюкозаМедь0,100,551,303,003,507.100,200.801,403,204,006.000,301,001.503.404,509,000,401.151.603,605.009,950,501.351.703.805,5010.800,601,601.804,006,0011,900,701,801.904,156,5012.800,802,002,004,307.0013,900,902,202,254,807,5014,901,002,402,505,308,0015,901,102,602,755,758,5016,901.202,803,006,209,0017,80Определение глюкозыОдин из специфических методов определения D-глюкозы в
присутствии других сахаридов основан на количественном окис¬
лении ее D-глюкооксндазой в присутствии молекулярного кис¬
лорода до глюконо-6-лактона. D-глюконовую кислоту титруют
стандартным раствором щелочи.Для определения глюкозы этим методом необходимо распо¬
лагать специфической D-глюкооксндазой. Д. Белл (1960) реко¬
мендует для этой цели растирать продажный порошкообразный
препарат фермента в течение 5 минут с 10 частями дистил¬
лированной воды с последующим центрифугированием. К над-
осадочной жидкости при 4° добавляют этиловый спирт до кон¬
центрации 54% и оставляют при 4° на 15 минут. Центрифуги¬
руют, охлаждают надосадочную жидкость до 4° и добавляют
этанол до концентрации 61%. Осадок собирают центрифугиро¬
ванием и вновь растворяют в дистиллированной воде — в объ¬
еме, вдвое превышающем объем исходного экстракта. Раствор
диализуют в течение 15 часов при 4° против 0,5%-ного раствора
ацетата кальция. Центрифугированием удаляют нерастворимые
частицы.При определении глюкозы 1 см3 фермента смешивают с
5 см1 раствора, содержащего около 20 см3 D-глюкозы, и про¬
пускают через раствор при 30° медленный ток кислорода. Г1е-142
рио'дически титруя 0,01 н. раствором NaOH (свободным от кар-
боната), поддерживают pH около 5,6. Учитывают израсходован¬
ное количество NaOH.Реакция должна закончиться через 2 часа. После этого за¬
вершают титрование при 50—60° (для ускорения гидролиза лак-
тона) в присутствии фенолфталеина.Определение фруктозы
и других кетосахаровВ методе Мак-Рери и Слаттери (1960) используется спо¬
собность кетосахаров давать окраску с резорцином в кислой
среде.Реактивы: I) спиртовой раствор резорцина (I г резорцина растворяют
в 1 дм* 95%-ного спирта); 2) раствор 80%-ной соляной кислоты (не дол¬
жен давать окраски с резорцином; к 5 объемам концентрированной HCI —
плотн. 1.19 приливают 1 объем дистиллированной воды); 3) стандартный
раствор фруктозы (приготовляют исходный раствор, растворяя 100 мг фрук¬
тозы в 100 сл3 насыщенного водного раствора бензойной кислоты; этот
раствор хранят в холодильнике и готовят нз него рабочий раствор — 4 см\
разводят до 100 см3 водой: инулин для приготовления стандарта не исполь¬
зуется. так как окраска, даваемая им. зависит от источника и метода его
выделения).Ход анализа. В пробирку вносят пипеткой 5 см3 экстракта,
содержащего от 1 до 8 мг фруктозы в 100 см3, 5 см3 спиртового
раствора резорцина и 15 см3 30%-нога раствора НС1. В другую
пробирку вместо экстракта вливают 5 см3 воды, остальные ре¬
активы—как в опытной пробе (слепой опыт). Перемешивают
и помещают пробирки на 20 минут в водяную баню, где под¬
держивают температуру 80°. Охлаждают до комнатной темпе¬
ратуры н измеряют интенсивность окраски на ФЭК с зеленым
светофильтром (540 нм).Слепую пробу используют в качестве эталона для сравне¬
ния. Содержание фруктозы в фруктозанах вычисляют по гра¬
дуированному графику.Антроновый метод определения
сахаров и крахмалаАнтроновый реактив образует синевато-зеленое окрашива¬
ние со всеми растворимыми углеводами, которые в одинаковой
концентрации лают окрашенные растворы практически одной
и той же оптической плотности. Это позволяет при определении
углеводов использовать калибровочную кривую, составленную
по глюкозе, для определения других сахаров.143
Метод дает возможность определять крахмал и сахара в
небольших концентрациях (до 0,2 мг в пробе) л пригоден для
анализа вегетативных органов.Реактивы и аппаратура: 1) антроновыА реактив (0,2%-ный раствор ант*
рона ь концентрированной серной кислоте (200 мг в 100 см* HjSCM;
2) 0,5%-ный раствор HjS04 (2,8 см* серной кислоты—плотя. 1.84 раство¬
ряют в 1 дм* дистиллированной воды; 3) 30%-ный раствор сернокислого
цинка; 4) 15%-ный раствор желтой кровяной соли — K4Fe(CN»)J-3H*0:
5) водяная баия; 6) ФЭК-М.Ход анализа. Отвешивают по 1 ± 0,002 г измельченного све¬
жего материала (листьев, корнеплодов, плодов и др.) в 2 мер¬
ные колбы на 100 см3. В одну колбу для суммарного опреде¬
ления сахаров и крахмала прибавляют 50 см* раствора
0,5%-ной H2SO4 и гидролизуют на кипящей водяной бане в
течение 15 минут. При этом происходит гидролиз крахмала.
Затем добавляют по 2 см* растворов 30%-його сернокислого
цинка и 15%-ной желтой кровяной соли для осветления раство¬
ра, доводят дистиллированной водой до метки и фильтруют.
В экстракте должно быть не более 0;2 мг углеводов в 1 см*.В другой колбе с навеской, предназначенной для определе¬
ния растворимых сахаров, проводят извлечение в течение часа
с 80 см3 воды при периодическом взбалтывании на встряхи¬
вающем аппарате. После этого экстракт осветляют, прибавляя
по 1 см* растворов сернокислого цинка и желтой кровяной
соли. Затем объем доводят до метки и раствор фильтруют.Берут по 2 пробирки для каждого экстракта, а также для
контрольного опыта и приливают по 3 см* антронового реак¬
тива, а затем по 1 см3 опытной вытяжки из первой колбы
(сумма сахаров, полученных после гидролиза) и из второй
колбы (растворимые сахара). Для контроля служат пробирки
с 3 см3 антронового реактива, в которые прибавляют по 1 см*
воды. Все пробирки быстро взбалтывают и помещают в кипящую
водяную баню на 7 минут. После кипячения пробирки с раст¬
ворами охлаждают до 20° и затем определяют плотность сине-
зеленой окраски на ФЭК, применяя красный светофильтр
(610 нм) против контрольной пробы. По калибровочной кривой
рассчитывают содержание сахаров.Вычисление производят по формуле:а ' V • 100
* =	н	•где: а — количество сахаров, найденное по калибровочной кри¬
вой;v — объем экстракта (в ел*);
н — навеска.По экстракту в первой колбе узнают суммарное содержание
сахаров и крахмала, а по экстракту второй колбы определяют
содержание свободных сахаров. Для вычисления крахмала раз-144
ность между процентами суммарного содержания сахаров после
гидролиза и сахаров до гидролиза умножают на 0,9.Необходимо отметить, что с антроновым реактивом реаги¬
руют не только сахара, но и их производные (фосфорные эфи¬
ры, гликозиды и др.), поэтому реактивы Бертрама являются
более специфичными. При отсутствии антрона его можно легко
получить нз антрахинона *.Микрометод определения
сахаровСущность метода А. С. Швецова и Э. X. Лукьяненко (1968)
заключается в восстановлении феррнцнанида калия редуцирую¬
щими сахарами в щелочной среде до ферроцианида. Последний
в присутствии желатина образует с сернокислым окисным же¬
лезом устойчивую синюю окраску.3K«Fc (CN)e -f 2Fe3 (SO.fe - Fe, (Fe (CN)e]3 + 6K,SO«.Интенсивность синей окраски измеряют на ФЭК-М. Данный
метод является модификацией метода Н. И. Ястрембовича и
Ф. Л. Калинина, но он более пригоден для массовых анализов.
Концентрацию сахара в растворах от 0,01 до 0,1 мг в 1 см'
можно определять с хорошими результатам».Реактивы и аппаратура: 1) 5%-вые растворы HCI н NaOH; 2) раствор
красной кровяной соли (навсску 1.65 г последней и 10 ±0.1 г Na^COj
растворяют в I дм* воды; раствор хорошо сохраняется в темной склянке).
3) раствор сернокислого окисного железа (состоят из раствора I ± 0,01 г
Fcj(SO«)j в 10 см1 крепкой серной кислоты, который в колбе на 1 дм* до¬
водят водой до метки, и 10%-ного раствора желатина; в день употребления
готовят рабочий раствор, смешивая объемы обоих растворов в соотношении
20:1); 4) фотоэлектроколориметр; 5) баня с мешалкой.Ход анализа. Приготовляют вытяжки сахаров (стр. 132) и
осаждают белки и другие коллоиды гидратом окиси цинка или
фосфорновольфрамовой кислотой. Затем в пробирки, имеющие
метки на 20 см3, приливают 2 см* вытяжки и по 2 см3 щелоч-
ного раствора феррицианида и воды. После этого встряхивают
и нагревают 15 минут в кипящей водяной бане. Для равно¬
мерного нагревания серии пробирок водяная баня снабжается
мешалкой. После нагревания пробирки охлаждают и приливают
в каждую по 4 см3 раствора сернокислого железа, перемеши¬
вают и доводят объем до 20 см3 — до метки. Наконец, после
хорошего перемешивания измеряют оптическую плотность на
ФЭК-М с красным светофильтром. Интенсивность окраски со¬
храняется без изменения более 12 часов.При суммарном определении сахаров после гидролиза в
пробирки с 2 см3 экстракта приливают 1 см3 5%-ной соляной*	Синтезы органических препаратов. Сб. I. Иэд-во иностранной литера¬
туры, 1945.145
кислоты и нагревают в течение 5 минут при 70°. Затем пробирки
охлаждают и нейтрализуют 5%-ной щелочью по лакмусовой бу¬
мажке. Далее поступают так, как выше описано.Вычисление результатов содержания сахаров по оптической
плотности производят по калибровочной кривой.Метод дает завышенные результаты при исследовании объ¬
ектов с повышенным содержанием воднорастворимых азоти¬
стых веществ.Количественное
определение сахаров методом
хроматографии на бумагеПринцип метода. В растениях в свободном состоянии при¬
сутствуют различные сахара — моносахариды и олигосахариды
(глюкоза, фруктоза, сахароза, раффиноза, стахмоза, свободные
пентозы, олигофруктозиды и др.). Все классические методы
анализа их основаны на учете редуцирующей активности не¬
посредственно в вытяжке (моносахариды) или после гидролиза
(олигосахариды), но при этом они учитываются суммарно.
Если более или менее удовлетворительно удается определить
сумму альдоз и сумму кетоз, то определение индивидуаль
альдоэ при использовании классических методов длитель
сложно, а порой и невозможно. Использование специфических
реакций в неразделенной смеси также не достигает цели иден¬
тификации, как и получение производных сахаров, например,
фенилозазонов (которые недостаточно специфичны).Эти трудности в анализе сахаров, как и многих других при¬
родных соединении (органических кислот, аминокислот и др.),
были радикально преодолены благодаря введению в лаборатор¬
ную практику метода распределительной хроматографии на бу¬
маге. С его помощью удается легко и сравнительно быстро раз¬
делить сложную смесь сахаров на индивидуальные сахара и
идентифицировать их. Хроматографический метод используется
как для качественного, так и для количественного анализа.Разделение и идентификация сахаров. Разделение веществ
этим методом основано на различном распределении их межл>
двумя несмешивающимися жидкостями, одной из которых слу
жит вода, другой — тот или иной органический растворите:)
(чаще других н-бутанол, пиридин или фенол). Различное ра<
пределение вещества в двух несмешивающихся жидкостях обу
ловлено неодинаковой растворимостью его в них и выражает
коэффициентом распределения (/С).Например, для глюкозы, при использовании в качестве орга
нического растворителя м-бутанола, этот коэффициент выра¬
жается соотношением:	концентрация глюкозы в воде~ концентрация глюкозы в и-бутаноле *146
Водная фаза неподвижна, так как вода прочно удер/
вается фильтровальной бумагой, а фаза органического расти
рителя — подвижна. Суть метода заключается в том, что чері
полоску фильтровальной бумаги, на которую нанесен водным
раствор разделяемой смеси сахаров, пропускают органический
растворитель. При этом сахара распределяются между водой
и растворителем в соответствии с величиной их коэффициентов
распределения. Коэффициенты распределения у различных са¬
харов неодинаковы, поэтому достигается разделение смеси са¬
харов.При непрерывном движении растворителя и вещество не¬
прерывно перераспределяется между двумя фазами — наблю¬
дается движение исходного пятна по потоку растворителя н
разделение его на отдельные пятна.Для идентификации сахаров рядом с испытуемой смесью
в тех же условиях пропускают искусственно составленную смесь
чистых сахаров — «свидетелей», или «метчиков». Скорость дви¬
жения вещества на бумаге зависит от коэффициента распреде¬
ления. Каждое вещество, способное растворяться в двух не-
смешивающихся жидкостях, характеризуется постоянным отно¬
шением расстояния, пройденного веществом, к расстоянию,
пройденному растворителем. Оно обозначается Rf и может так¬
же служить для идентификации веществ. Величина Rf зависит
от ряда факторов, поэтому одного этого показателя для этой
цели недостаточно. Ниже приводятся значения Rf для ряда
сахаров.Хроматограмму высушивают и опрыскивают специфическими
растворителями-индикаторами. Сопоставление готовых хрома¬
тограмм (с изучаемой смесью и со смесью «свидетелей») по¬
зволяет точно установить, какие сахара присутствуют в изучае¬
мой смеси.Пятна вырезают из хроматограмм, элюируют и количествен¬
но определяют сахара эбуллностатическим методом.Значение Rf для некоторых сахаров: рафиноза — 0,05; лак¬
тоза — 0,08; мальтоза — 0,11; сахароза — 0,14; галактоза — 0,16;
глюкоза — 0,18; манноза — 0,20; арабнноза — 0,22; фруктоза —
0,23; ксилоза — 0,25; рибоза — 0,31.Хроматографирование. Хроматографический анализ сахаров
состоит из нескольких этапов: 1) подготовка растительного ма¬
териала к анализу, экстракция сахаров и очистка экстрактов;
2) нанесение экстракта на бумагу и хроматографическое раз¬
деление сахаров; 3) проявление хроматограммы, элюцня са¬
харов и количественное определение сахаров в элюате.Весьма важным является составление градуировочных кри¬
вых, отдельно для каждого сахара.Обязательным условием получения точных результатов яв¬
ляется четкое распределение сахаров на хроматограммах. Это
в значительной мере зависит от сорта бумаги и от системы раст¬147
ворителей, применяемых для хроматографирования. Большое
значение имеет длительность хроматографирования (пропуска¬
ния растворителя) и температура помещения. Рекомендуется
избегать температуры выше 20°, а если и при 20° не достигается
хорошее разделение сахаров, то следует повторить его при бо¬
лее низкой температуре. Таким образом, следует регулировать
эти два фактора — продолжительность пропускання раствори¬
теля и температуру.Поскольку вытяжка сахаров должна содержать возможно
меньше примесей, особенно минеральных солей, обычно ее по¬
лучают этанолом, а не водой. Если анализируют свежий мате¬
риал, то навеску заливают горячим 96%-ным этанолом в таком
количестве, чтобы концентрация его в экстракте была 82%, и
кипятят на бане с обратным холодильником 30 минут. Экстрак¬
цию повторяют 3 раза. Охлажденные экстракты центрифуги¬
руют, объединяют и сгущают в вакууме до небольшого объема,
который необходимо точно учесть (мерная колбочка на 5 или
10 см3, градуированная пробирка). Если анализируются листья
или семена (содержащие значительное количество спиртораст¬
воримых белков), то необходимо осадить примеси 10%-ным
раствором уксуснокислого свинца, а затем удалить избыток
его насыщенным раствором сернокислого натрия. При анализе
плодов можно очистку свинцом не проводить.Для хроматографии используют бумагу Ленинградской бу¬
мажной фабрики — плотную, «быструю» или «медленную». Ёе
нарезают полосками 6 см ширины и 50—55 см длины (зависит
от размеров сосуда, в котором проводится разделение сахаров).
Удобно помещать в камеру одновременно 4 полоскн, по 2 с
каждой стороны ванночки в верхней части сосуда, в которую
помещен растворитель. Для сахаров предпочтительно пользо¬
ваться нисходящей хроматографией. Известно много систем
растворителей, пригодных для разделения смесей сахаров (мо¬
носахаридов и олигосахаридов): н-бутанол — уксусная кисло¬
та—вода (4:1:5)—универсальный растворитель, применяе¬
мый для разделения различных веществ. Хорошее разделение
сахаров достигается с системой этнлацетат —уксусная кисло¬
та-вода (9:2:2). Растворитель в указанном соотношении
объемов смешивается заранее в деліггельной воронке. Если
пользуются растворителем, образующим 2 слоя в делительной
воронке, его оставляют на ночь. Он должен быть совершенно
прозрачным; используют верхний слой.Все сахара разделяются хорошо, за исключением трех пар:
глюкоза — галактоза, фруктоза — арабиноза и фруктоза — кси¬
лоза (в свободном состоянии галактоза в растениях не встре¬
чается).При наличии их в изучаемой смеси приходится более дли-
іельно разделять сахара или подбирать другие системы раство¬
рителей.148
Каждую полоску бумаги карандашом разделяют вдоль по¬
полам. На левую половину наносят изучаемую смесь, правая
в трех полосках остается в качестве контроля, на четвертую
(рядом с образцом) наносят смесь «свидетелей».Если навеска исходного материала (например, из плодов)
составляла 20 г и спиртовой экстракт после упаривания и очи¬
стки доведен до 25 с*3, то дальше разбавление подбирают
эмпирически, чтобы концентрация сахара, наносимая в пятно,
не превышала 500 мкг. Если требуется, проводят дополнитель¬
ные разведения, взяв 5 см* из 25 см* и доведя их до 50 и т. д.Раствор смеси сахаров-«свндетелей» готовят 2%-ный. Если
смесь составляют из 5 сахаров, то в 25 см2 растворяют по
100 мг каждого сахара. Сахара наносят на хроматограмму в
определенном объеме, например по 0,01—0,03 см3 в одно пятно,
мнкропипеткамн (удобно автоматическими, можно медицин¬
скими). Смесь «свидетелей» наносят по 0,004 см3 2%<-ного
раствора.После разделения сахаров через 24; 36; 48 часов (в зависи¬
мости от полноты разделения) хроматограммы высушивают под
тягой до полного удаления растворителя и определяют поло¬
жение сахаров на хроматограмме. Для этой цели хроматограм¬
мы опрыскивают специальными «проявителями» — анилинфта-
латом для альдоз (1,66 г фталевой кислоты растворяют в
95 см3 н-бутанол а, добавляют 0,93 г перегнанного анилина и
доводят до 100 см*) и мочевиной — для кетоз (5 г мочевины
растворяют в 100 см3 96%-лого спирта и добавляют 20 см* раст¬
вора—2 н. НС1). Каждым из проявителей опрыскивают отдель¬
ные хроматограммы. Затем их нагревают 5—10 минут при 100—
120э и по полученным пятнам выявляют отдельные сахара.Из хроматограммы, проявленной ашшшфталатным прояви¬
телем, элюируют пятна 5 см3 ледяной уксусной кислоты, на¬
гревают 10 минут в кипящей водяной бане и колориметрируют
против контроля (с правой стороны хроматограммы вырезают
соответствующий пятну участок, элюируют и колориметрируют)
на ФЭК-М с синим светофильтром.Проявление сахаров анилиндифениламинофосфатным реак¬
тивом. Смешивают 4%-ные растворы анилина и дифениламина
в этиловом спирте с концентрированной фосфорной кислотой
в соотношении 5:5:1. Ежедневно готовят свежий раствор.После равномерного смачивания в этом проявителе хрома¬
тограмму нагревают при 80° в течение 10 минут. При этом об¬
разуются синие, фиолетово-синие и зелено-синие пятна сахаров.
После проявления хроматограмм сопоставляют пятна сахаров-
«свидетелей» с пятнами сахаров опытных образцов.С хроматограммой, проявленной мочевиной, поступают ина¬
че: прикладывая проявленную хроматограмму к непроявленной,
определяют положение пятен .на последней. Вырезают соответст¬
вующие пятнам участки непроявленной хроматограммы, поме¬149
щают их в пробирки, элюируют (заливают спиртом, нагревают
на бане) и определят по Кульку.Для вычисления содержания сахаров пользуются специально
составленными градуировочными кривыми. Для этой цели на
такие же хроматограммы (3 для каждого сахара) наносят
строго количественно раствор сахара. Из исходного раствора
его разбавлением готовят несколько концентраций и на каждую
хроматограмму наносят только одну из них. Пропускают раст¬
воритель, подсушивают и проявляют хроматограммы, элюи¬
руют сахара (как выше) и количественно определяют тем же
методом.Для построения графиков требуется не менее 6—8 повтор¬
ностей для каждой концентрации. Это работа длительная и кро¬
потливая, но ее проводят один раз и этими графиками поль¬
зуются долго.Определение сахаров
методом тонкослойной
хроматографии на силикагелеВ данной прописи этот метод проверен только на гидролн-
затах, содержащих сахара (но не на свободных сахарах).Ход анализа. Гидролизат нейтрализуют до pH 7—7,4 с по¬
мощью анионита, фильтруют, анионит дважды промывают во¬
дой по 100 см* и фильтрат упаривают (лучше в вакууме при
35—40°). Конечная концентрация сахаров не должна превы¬
шать 1%. иначе на хроматограмме получаются вытянутые
пятна.Смесь сахаров наносят с помощью мнкропипетки на пла¬
стинки, покрытые слоем силикагеля, на расстоянии 2 см от ниж¬
него конца пластинки. После высушивания пятен пластинки
помещают в сосуд (хроматография восходящая).Хроматографирование. Приготовление растворите¬
ля. Для получения воспроизводимых результатов необходимо
создать в сосуде атмосферу насыщения минимум за 30 минут
перед пропусканием растворителя. Для этого стенки сосуда об¬
кладывают плотной фильтровальной бумагой, смоченной раство¬
рителем, пропуская его одни раз при температуре 22°.Система растворителя: н-бутанол — ацетон —вода в соотно¬
шении 4:5:1 хорошо зарекомендовала себя, так же как и си¬
стема: этилацетат—уксусная кислота—вода (6:3:2vlv). В пер¬
вой системе растворителя можно добиться хорошего разделения
глюкозы и галактозы, но плохо разделяются манноза и араби-
ноза; во второй системе хуже—первая пара сахаров и лучше —
вторая.После пропускания растворителя пластинки высушивают на
воздухе и опрыскивают анилинфосфатным проявителем. Окра¬
ска развивается в течение 10 минут при 100°.150
Для количественного определения пятна после нагрева со-
скабливают с пластмиок, переносят в центрифужные пробирки
и растворяют в 1 см* 1%-ного раствора НСІ, содержащего 0,1%
аскорбиновой кислоты в метаноле*. Силикагель отделяют цент¬
рифугированием при 2000 оборотов в течение 15 минут. Н а до¬
садой ную жидкость переносят о кюветы (1,5 см) и замеряют на
спектрофотометре. Если количество вещества превышает 20 мкг
на 1 см\ можно увеличить объем экстрагирующего реагента.Приготовление пластинок. Силикагель КС К в ко¬
личестве 35 г, специально очищенный (см. ниже), смешивают
с 2,5 г гипса и 100 см* 0,ЗМ раствора одноэамещенного фосфата
натрия, смесь гомогенизируют 3—4 минуты; полученную суспен¬
зию наносят на стеклянные пластинки (18X20 см); толщина
слоя 0,25 мм. Пластинки оставляют <на сутки при комнатной
температуре, затем их активируют в течение часа нагреванием
при 100°. Пластинки хранят в эксикаторе — над H2S(XПр и готов л е ни е силикагеля. Один объем (по весу)
силикагеля кипятят в течение часа с 5—10 объемами 1%-иого
раствора NaOH, декантируют, силикагель промывают дистилли¬
рованной водой до нейтральной реакции. Затем силикагель за¬
ливают 3—6 объемами «царской водки» и кипятят в течение2—3 часов; смесь сливают, заливают 2 объемами концентриро¬
ванной НС1, кипятят около часа. Очищенный продукт промы¬
вают дистиллированной водой до отсутствия ионов хлора.Высушенный на воздухе силикагель измельчают на шаровой
мельнице, просеивают через сито с отверстиями 0,1 (не более
0,2) мм. Затем 2 кг силикагеля помещают в сосуд 10 &и\ зали¬
вают дистиллированной водой, интенсивно перемешивают, че¬
рез минуту сливают 7э смеси во второй сосуд (10 дл3). В пер¬
вый сосуд доливают воду до первоначального объема, опять
взмучивают и переносят во второй сосуд. Операцию повторяют
до тех пор, пока не наполнится второй сосуд. Аналогичным
образом смесь переносят в 3; 4; 5; 6-й сосуды. Затем вновь воз¬
вращаются к первому сосуду и цикл повторяют снова, до на¬
ступления полной прозрачности раствора при взмучивании.Воду из сосудов после полного отстаивания декантируют.
Силикагель сушат на воздухе; фракции 1; 2; 3 и 4-го сосудов
измельчают, а из 5 и 6-го сосудов — используют для тонкослой¬
ной хроматографии. Фракцию из этих сосудов сушат в тече¬
ние часа при 105°, затем час при 115° и хранят в склянкахПриготовление анилинфосфатного прояви¬
теля. Анилинфосфат (свежеперегнанный) в количестве 4 см*>4	г дифениламина, 20 см3 80%-ной ортофосфорной кислоты раст¬
воряют в 200 см* ацетона, в эту смесь добавляют 0,66 г бензи-
днна, растворенного в 110 см* ледяной уксусной кислоты. Бен¬
зидин увеличивает стабильность и чувствительность реакции.* Можно применить прямое денснтометрнрованис без элюирооання.151
Определение
полисахаридов
глава vii и лигнина*Особенности полисахаридов
и методов их определенияВысокомолекулярные углеводы и их производные чрезвы¬
чайно широко распространены в растениях. Одни входят, в ос¬
новном, в состав клеточных оболочек, другие откладываются
з качестве запасных веществ. Наиболее широко распространена
клетчатка, являющаяся главным компонентом стенок раститель¬
ных клеток. Ей сопутствуют обычно гемицеллюлозы, а в старе¬
ющих, одревесневших тканях — и лигнин. Пектиновые вещества
также имеют значение опорных ткане Л растений, входя в состав
клеточных стенок, заполняя промежутки между соседними клет¬
ками. склеивая их между собой. Кроме того, пектины участвуют в
механизме роста молодых тканей. Крахмал и инулин—запасные
вещества. Некоторые гемицеллюлозы (типа гексозанов) также
отчасти имеют значение запасных веществ. С содержанием пен-
тозанов связаны такие физиологические свойства растений, как
устойчивость к морозу и к засухе.Полисахариды, входящие в состав клеточных стенок, выпол¬
няют функцию структурных компонентов растительной ткани (в
отличие от животных тканей, где эту функцию выполняют белки).
Особенно возрастает эта их роль в плодах, содержащих боль¬
шое количество воды и очень мало белка. Они способствуют под¬
держанию тургора тканей, что имеет особенно большое значе¬
ние при длительном хранении плодов. Под лежкостью плодов
понимается не только сохранение их пищевых и вкусовых досто¬
инств, но и сохранение структуры мякоти плода (следовательно,
и тургора) и других свойств, от которых зависит их вкус и то¬
варный вид. Наиболее пластичные полисахариды испытывают
при хранении плодов различные превращения под действием фер¬
ментов, за счет которых повышается сахаристость зимних сор¬
тов различных культур; продукты их распада вовлекаются
в процессы общего обмена.У некоторых родов и видов растений полисахариды накапли¬
ваются в особенно больших количествах. Содержание того или
иного из полисахаридов изменяется в зависимости от условий152
произрастания, в связи с возрастом растения и т. д. Крахмал
накапливается в запасных органах растений по мере созревания;
содержание пектиновых веществ у одних культур увеличивается,
у других снижается; процент лигнина возрастает в стареющих
тканях и т. д.Выделение чистой целлюлозы из растительного материала
основано на стойкости ее к воздействию слабых кислот и ще¬
лочей, спирта, эфира и др. Сырье обрабатывают различным»
растворителями, удаляя все сопутствующие вещества. Пектин в
производственных условиях выделяют гидролизом сырья (ки¬
пячением с подкисленной водой) и последующим осаждением
раствором СаСЬ или этанолом.Необходимо учитывать, что наряду с количественным изме¬
нением все углеводы подвержены и качественным изменениям в
зависимости от происхождения растительного материала, под
влиянием условий выращивания, а также в течение вегетацион¬
ного периода. Так, для крахмала характерны различное соотно¬
шение составляющих его компонентов (амилозы и амилопектина),
вязкость, скорость осахаривания, способность клейстеризоваться,
температура клейстеризации, содержание золы и т. д. Крахмалы,
выделяемые из различных растений, различаются именно
этими показателями. Крахмал, например, морщинистого го*
роха в отличие от крахмала круглого гороха совсем не
образует клейстера. При созревании семян или клубней»
содержащих крахмал, изменяется его вязкость и другие
свойства.Для различных родов и видов растений характерны также
различные количественные соотношения растворимого и нераст¬
воримого в воде пектина (протопектина). При созревании пло¬
дов и овощей соотношение этих фракций пектиновых веществ
изменяется: как правило, уменьшается количество протопектина
и возрастает количество воднорастворимого, т. е. протопектин
переходит в растворимую форму, хотя в ряде случаев содержание
воднорастворимого пектина может уменьшаться. Например, в
корнеплодах сахарной свеклы ко времени уборки урожая нара¬
стает процентное содержание протопектина за счет снижения ко*
личества воднорастворимых пектинов, образующих нераствори¬
мые соединения с другими веществами.Уже отмечалось, что большие количественные и качественные
изменения претерпевают углеводы при хранении урожая, осо¬
бенно плодов и ово.щей. При этом, с одной стороны, происходит
усиленное дыхание плодов в основном за счет сахаров, вследствие
чего их содержание снижается. С другой стороны, имеет место
частичный гидролиз полисахаридов (особенно при хранении зим¬
них сортов, дозревающих после снятия урожая) и возрастание
за их счет количества растворимых сахаров. В хранящемся при
низких температурах картофеле накапливаются растворимые са¬
хара за счет гидролиза крахмала.153:
Все эти и многие другие факты изменчивости углеводов ука¬
зывают на необходимость учитывать ее как при сравнительной
оценке сортов, так и при изучении изменчивости их состава при
постановке опытов по изучению влияния условий выращивания
и пр.При изучении можно сравнивать только такие образцы, кото¬
рые находятся в одной фазе зрелости или одновременно убраны
и хранятся одинаковый период в одинаковых условиях. Большая
изменчивость углеводного состава плодов и овощей, состоящих
на 80—85% (на сухое вещество) из углеводов, заставляет осо¬
бенно внимательно относиться к отбору материала для иссле¬
дования, исключать все, что может исказить результаты ана¬
лиза, тщательно составлять среднюю пробу и не ограничиваться
оценкой материалов по единичным анализам данного образца.Для качественного обнаружения различных углеводов исполь¬
зуют некоторые характерные для них реакции. К ним принад¬
лежит очень чувствительная реакция крахмала с подом (синее
окрашивание), применяемая, например, в качестве контроля на
полноту гидролиза при качественном определении крахмала.
Для обнаружения целлюлозы применяют раствор иода в рас¬
творах хлористого цинка и йодистого калия (синее окрашива¬
ние), для пектина—окраску с рутением красным или после
гидролиза —окраску галактуронової! кислоты карбазолом.Количественное определение большинства высокомолекуляр¬
ных углеводов основано на свойстве их гидролизоваться при
кипячении с разбавленными (крахмал, гемицеллюлозы) или
концентрированными (целлюлоза) минеральными кислотам» до
конечного продукта — простых сахаров, и на учете последних.
Большинство углеводов обладает оптической активностью, и это
свойство также используется для количественного их определе¬
ния (крахмал).Количественное определение пектиновых веществ основано
а их свойстве осаждаться хлористым кальцием и ионами меди.Отделение всех полисахаридов от простых сахаров произво¬
дят, используя их свойство осаждаться 75—80-градусным этило¬
вым спиртом, в котором простые сахара растворяются. Некото¬
рые гемицеллюлозные полисахариды отчасти растворяются в
воде, иногда в значительном количестве. Высокой раствори¬
мостью в воде рбладают пектиновые вещества.Наиболее изучены в химическом отношении только углеводы,
имеющие крупное промышленное значение — крахмал и целлю¬
лоза. Пектиновые же вещества, особенно гемицеллюлозы, изу¬
чены меньше. Известно, что каждая из этих групп объединяет
целый ряд близких по свойствам веществ, которые в растениях
никогда не встречаются в чистом виде, а находятся в смеси с
другими представителями из той же группы. Количественное
определение каждой из групп полисахаридов затрудняется именно
тем, что сходны такие их свойства, как растворимость. Поэтому154
существует много схем последовательного определения полиса*
харидов, но ни одну из них нельзя рассматривать как достаточно
точную. В большинстве схем предварительным кипячением с во¬
дой спиртонерастворимого остатка извлекают пектиновые ве¬
щества, затем, применяя растворы щелочи различной концент¬
рации, извлекают гемицеллюлозы, затем серной кислотой (также
различной концентрации) определяют целлюлозу. В некоторых
схемах вместо щелочи для определения гемицеллюлоз применяют
обработку разбавленной (2—3%) кислотой. Следует помнить,
что в плодах много воднорастворимых гемицеллюлоз, которые из¬
влекаются вместе с пектином при кипячении с водой. Одна из
схем анализа полисахаридов приводится ниже.Следует отметить, что в отдельных случаях требуется полу¬
чить и некоторую другую характеристику' полисахаридов, напри¬
мер количество гидроксильных, метоксильных групп, другие осо¬
бенности их строения. Для этих целей полисахариды выделяют
тем или иным способом из растений, по возможности с сохране¬
нием их нативных свойств, и изучают их особенности. При уста¬
новлении строения углеводов широко применяется получение ме¬
тиловых эфиров сахаров. В аналитических и препаративных це¬
лях применяется периодатогое окисление для определения числа
свободных гидроксильных групп, для выделения целевых про¬
дуктов окисления, а также для установления структуры полиса*
харидов, строения гликозидов *.Выделение крахмалаОбщие свойства крахмала. Крахмал — полимер глюкозы, со*
стоит из двух полисахаридов, отличающихся по строению и свой¬
ствам—линейного полисахарида амилозы н «ветвистого» амнло-
пектина. Молекулярный вес амилозы —от 10000 до 100000, мо¬
лекулярный вес амилопектина — от 50000 до 1000000. Амилоза
более легко растворима и обладает меньшей вязкостью, чем
амилопектин. У разных растений в крахмале содержится 10—
30% амилозы и 70—90% амилопектнна. У восковидных сортов
ячменя, кукурузы, риса крахмал состоит исключительно из амн-
лопектнна, но встречается крахмал и с высоким содержанием
амилозы, например у гибридов кукурузы и в мозговом горохе (до
50—80%). Недавно установлено, что амилоза и амилопектин
также гетерогенны и могут быть оазделены хроматографиче¬
скими методами каждый на ряд субфракций.При нагревании под действием кислот крахмал распадается
на полисахариды меньшего молекулярного веса — декстрины.
Они гидролизуются дальше до дисахарида мальтозы, а послед¬
няя— до глюкозы.*	хнмт| углеводов. Перев. с англ. под ред. Н. К. Кочеткова.сМнр», 1967.155.
Более интенсивно крахмал распадается под действием фер¬
ментов—а- и р-амилаз л ряда других, а-амилаза глубже рас¬
щепляет крахмал с образованием не только декстринов различ¬
ной степени поллмеризации, мальтозы, но и глюкозы. Под дей¬
ствием р-амилазы образуются мальтоза и высокомолекулярный
декстрин.Самой характерной реакцией крахмала, используемой для
его качественного обнаружения, является сине-фиолетовое окра¬
шивание раствором иода в иодистом калин: амилоза дает с
иодом они ее окрашивание, амнлолектин — красно-фиолетовое.В растениях крахмал отлагается в виде зерен, круглых или
эллиптических, имеющих слоистое строение, а также различных
по размеру. Форма зерен разнообразна и для некоторых расте-
ли А настолько характерна, что этот показатель используется
для распознавания принадлежности крахмала к тому или иному
виду растений.Установлено, что различие между крахмалами разных расте¬
ний обусловлено в основном различиями в амилопектине, тогда
как амилозы, выделенные из различных крахмалов, более сход¬
ны. Картофельный амилопектин — прозрачный, бесцветный, же¬
латинообразный, слизистый; пшеничный — непрозрачный, молоч¬
но-белый, пастообразный, неслизистый.Для качественной характеристики крахмала определяют тем¬
пературу его клейстеризации, скорость осахарнвания, вязкость.
Для этих определений (кроме последнего) используют или не¬
посредственно муку (семян), или растертые клубни (картофеля),
или выделенный препарат крахмала. В целях большей точности
определений последнее предпочтительнее.Выделение крахмала из клубней картофеля. Клубни карто¬
феля превращают в мезгу, заливают в фарфоровой (или стек¬
лянной) чашке водой и отжимают через марлю. Одну и ту же
порцию мезги обрабатывают 3 раза, каждый раз новой порцией
воды, н объединяют получившуюся болтушку, в которой нахо¬
дится и крахмал. Мезгу выбрасывают, а болтушке дают от¬
стояться, после чего осторожно сливают воду с крахмала. Для
удаления белков крахмал заливают 10%-ным раствором хлори¬
стого натрия и дают отстояться в течение двух часов. Жидкость
сливают, а крахмал отмывают от хлористого натрия сначала
прокипяченной водопроводной водой (холодной), а затем дистил¬
лированной— путем взмучивания и последующего отстаивания
осадка крахмала до отрицательной реакции на нон хлора в про¬
мывных водах.Выделение крахмала из семян гороха. Целые семена нама¬
чивают в 4%-ном растворе хлористого натрия в течение 18—24
часов при 10—12° до полного набухания семян. С набухших се¬
мян снимают оболочку, семядоли промывают и растирают на
шаровой мельнице или очень тщательно в фарфоровой ступке.
В последнем случае выход крахмала получается меньше.356
Определение крахмалаПрименявшийся ранее Анастатический метод опре¬
деления крахмала заключается в осахарнвании диастазом пред¬
варительно окленстеризованного крахмала, последующем гидро¬
лизе кислотой и учете сахара, полученного з результате гидролиза.
Для этой цели использовался солодовый диастаз, или фермент»
содержащийся в слюне. Детально этог метод онисан в предыду¬
щем издании настоящего руководсгва (1952 г.). Впоследствии
было установлено, что в семенах различных растений находятся
антиамилазы, которые затрудняют ферментативный гидролиз.Для определения крахмала в настоящее время широко при¬
меняются поляриметрические методы с использова¬
нием поляриметров различной конструкции. Поэтому ниже при¬
водим краткие сведения о поляриметрин.Понятие о поляриметрин. Свет с волновыми колебаниями в
одной плоскости называется поляризованным. Плоскость
волновых колебаний поляризованного света называется пло¬
скостью поляризации. Многие вещества обладают спо¬
собностью вращать на некоторый угол плоскость поляризации.
Такие вещества называются оптически активными. Угол
вращения плоскости поляризации может быть правым (если под¬
ходит от нулевого положения к искомой точке против часовой
стрелки) и левым (по часовой стрелке). Кристалл исландского
шпата поляризует свет в двух взаимно перпендикулярных пло¬
скостях.Оптическая активность веществ определяется в приборе (по¬
ляриметре), основными частями которого являются 2 призмы из
исландского шпата, специальным образом обработанного. Одна
из плоскостей поляризации призм называется главным сече¬
нием.Одна из призм является поляризатором, вторая — анализа¬
тором. Анализатор может вращаться относительно поляризатора.
Если главные сечения поляризатора и анализатора совпадают,
то поле зрения прибора освещается поляризованным светом.Если же между поляризатором и анализатором поставить
слой оптически активного вещества (твердого или в растворе),
то оно повернет плоскость лоляризации и поле зрения прибора
станет темным. Чтобы восстановить освещенность поля зрения,
необходимо анализатор повернуть в противоположную сторону
на тот же угол, на который плоскость была повернута исследу¬
емым веществом. Угол поворота анализатора отсчитывается по
шкале. Он и будет углом вращения плоскости поляризации ис¬
следуемого вещества.У™ вращения, вызываемый слоем активного вещества вп** °®03начаютбуквой а.Плотность вещества оказывает влияние на угол вращения,
поэтому вращательную способность выражают в виде отноше-157
«ия угла вращения а к плотности (концентрации). Это отноше¬
ние называют удельным вращением и обозначают знаком [а].
При определенных условиях опыта удельное вращение есть
>вполне постоянная и характерная величина для каждого опти¬
чески активного вещества.Оптическая активность различных веществ обусловливается
свойством и расположением их отщелыных атомов и наблю¬
дается у большого числа твердых и жидких тел, имеющих
асимметрическое строение молекул.Рис. 18. Поляриметр СМ (круговой).а — общий анд: / — поляризатор. 2 — анализатор, 3 — линза освети¬
тельная. 4 — лимб в градусах, 5 — нон ну си. 6 — светофильтры, 7 —
трубка для жидкостей; б —оптическая схема устройства поляриметра
с круглой шкалой (объяснение ■ тексте).Оптическая активность имеется, когда атом углерода связан
с четырьмя различными радикалами, не лежащими в одно»
плоскости.Угол вращения плоскости поляризации зависит от длины
волны поляризованного света, поэтому определение угла враще¬
ния производят в монохроматическом свете, обычно при желтой
линии (длина волны 589,3 нм).Поляриметр (рис. 18а). Оптическая схема прибора (рис. 186).
Поляриметр состоит из двух главных оптических узлов: поляриза¬
тора и анализатора. Поляризатор состоит из двух призм Нико-158
ля З її 4 нли одной с осветительной линзой 2 и диафрагмами /
и 5. Анализатор состоит из призмы Николя 7, диафрагмы 6 и зри¬
тельной трубы 9. Поляризатор и анализатор разделены проме¬
жутком для помещения трубки с раствором изучаемого веще¬
ства.Отсчет угла вращения производят по шкале, соединенной с
анализатором, который вращают вокруг оси прибора. Угол по¬
ворота анализатора выражен в градусах дуги или в делениях
dia прямой.Для точного определения нулевого положения анализатора
(нулевое положение соответствует полной силе освещения поля
зрения) поляриметру придается особое устройство, при котором
нулевое положение легко узнается по состоянию поля зрения.
Призма 4 меньше призмы 3, она покрывает лишь половину поля
зрения. Призмы 3 и 4 собраны в обшей оправе так, что плоскости
поляризации проходящих через них лучей образуют между собой
лолутеневой угол ф, вследствие чего поле делится на 2 половины.Если поставить анализатор 7 так, что главное сечение его бу¬
дет перпендикулярно главному сечению призмы 3, то лучи, про¬
шедшие через последнюю, не пройдут через анализатор и левая
сторона будет темной. Правая же половина будет освещена, по¬
тому что главные сечения анализатора и призмы 4 не перпен¬
дикулярны. Если главное сечение анализатора будет перпенди¬
кулярно призме 4, то правая половина поля зрения будет тем¬
ной, а левая освещенной. Если плоскость поляризации анализа¬
тора будет поставлена под углом <р к плоскости поляризации
призмы 3, то лучи от призм 3 и 4 будут проходить одинаково
через анализатор и обе половины поля зрения будут одинаково
освещены, но слабо. Это положение и является нулевой точкой
поляриметра.Проверка прибора. Перед определеним угла вращения надо
проверить нулевую точку прибора. Для этого производят наблю¬
дения с поляриметрической трубкой, наполненной дистиллиро¬
ванной водой, положив ее в ложе прибора. В качестве источника
света служит электрическая лампочка, свет от которой .проходит
-через оранжевый фильтр. Окуляр (см. рис. 20) устанавливают
на резкость по глазу. Затем вращают винт, приводящий анали¬
затор в движение вправо или влево, добиваясь равномерности
освещения и однородности поля зрения (рис. 196). При таком
положении делают отсчеты делений на шкале (сахариметра)
или градусов на круге, пользуясь окуляром с лупой.Отсчеты производят до долей градуса, пользуясь неподвиж¬
ным нониусом. Нулевые деления круга и ноіїн ус а (рис. 19а)
должны совпадать. Если нулевое деление круга не совпадает с
нулевым делением нониуса, то сделав несколько отсчетов и уста¬
новив среднее, вносят поправки, прибавляя или вычитая в за¬
висимости от знака поправки (-j-) или (—), «ли же, установив
нулевое деление круга против нулевого деления нониуса, доби¬159
ваются равномерного освещения поля зрения, осторожно двигая
винтами, меняющими положение поляризатора. При этом пере-
мешаются призмы. Эту юстировку должен выполнять специа¬
лист, знакомый с конструкцией данного поляриметра.Техника работы. Поляриметрическую трубку наполняют ис¬
пытуемым р а створ м до краев так, чтобы образовался выпук¬
лый мениск, затем прикрывают круглым стеклышком, «адвигая
его с края трубки до необходимого положения и следя за тем.
чтобы под стеклышком не осталось пузырьков воздуха. После
этого навинчивают шайбу с резиновой прокладкой. В трубке не
должно быть пузырьков, мешающих определению. При наличиитрубок с расширением на од¬
ном конце пузырьки воздуха
можно загнать в расширение
и они не будут мешать опре¬
делению, как в прямой трубке.
Хорошие трубки не должны
изменять соотношение силы ос¬
вещения обеих сторон поля
зрения при их повороте, что
бывает от непараллельности
концов трубок.Прочистка трубок произво¬
дится после отвинчивания шайб
деревянной палочкой, на кото¬
рую навернута чистая тря¬
почка.Отсчет показаний. Шкала
на лимбе поляриметра (с кру¬
говой шкалой, модель СМ) разделена на градусы от 0 до 360°
с помощью нониусов, которые имеют по 25 делений; цена одного
деления равна 0,05° (рис. 19 а). При измерении следует пользо¬
ваться двумя нониусами для учета эксцентриситета круга при
больших углах вращения.Исследуемые растворы должны быть прозрачными (бесц¬
ветны или слабо окрашены).Определение крахмала поляриметрическим методом. Прин¬
цип метода состоит в гидролизе крахмала и определения в гид-
ролизате угла вращения. Удельное вращение [а]0 шдролизатов
крахмала, полученного из семян различных культур при концент¬
рации крахмала в растворе около 2% (как показали исследо¬
вания Н. А. Бондаренко и В. А. Смирнова) *, имеют близкие
значения [а]л, равные 181.Реактивы и аппаратура: I) 1%-ныЛ и 5%-ный растворы НСІ; 2) 5%-ный
раствор фосфорновольфрановоА кислоты или рлствор желеэпстосинерод исгоп»*	II. А. Бондаренко и В. А. Смирнов. Прикладная млкро
биология и биохимия. 2. Д4 6. 1966Рис. 19. Нониус поляриметра с кру¬
говой шкалой (в); виды полей зре¬
ния у поляриметров различных кон¬
струкций (б).160
цинка (последний готовят из 30%-ного раствора сернокислого цинка и
15%-ного раствора желтой кровяной соли; при осаждении белков н других
коллоидов вначале приливают 1—2 см3 раствора сернокислого пипка, а за¬
тем, после встряхивания, прибавляют столько же раствора желтой кровя¬
ной соли); 3) мерные колбы иа 50 или 100 с*3; 4) поляриметр (сахариметр)
СУ-2 (рис. 20); о) торсионные весы на 5 г; 6) штатив или приспособление
.зля встряхивания мериых колб (рис. 21).Рис* 20. Универсальны А поляриметр СУ-2 (общи А вид)./ — поляризатор. ? — осветительная лампа, 3 — светофильтр. * — зри¬
тельная трубка. 5 — анализатор. 6 — винт для вращении анализатора.7 —окуляр для отсчета по шкале. 5 —ложе для трубки с раствором.Ход определения крахмала в семенах. В основе анализа ле¬
жит метод Эверса. Отвешивают навески по 3x0,001 г тонко из¬
мельченных семян и пересыпают
в мерные колбы на 100 см3, при¬
ливают по 12,5 см3 1%-ной соля¬
ной кислоты. Хорошо размешав,
приливают еще 12,5 см3 этого же
раствора и колбы нагревают в
бурно кипящей водяной бане в
течение 15 минут. Во время ки¬
пячения содержимое следует си¬
стематически перемешивать, для
чего при проведении серии
анализов удобно пользоваться
установкой для экстракции и гид¬
ролиза (рис. 21). Сначала содер¬
жимое колбы загустевает за счет
клейстеризации крахмала, а
затем разжижается. По истечении времени гидролиза приливают
30 см3 воды и колбам дают остыть. Затем приливают 5 смгРис. 21. Установка для экстракции
н гидролиза при нагревании н
взбалтывании (схема общего*
вида)./ — прибор для встряхивания. 2 — че~
тырехугольмая баня. 3 — устроПстао для
взбалтывания 24 колб по 50 см*,
4 — на гоеаа тельный элемент.6 Заказ Л <01161
растоора 5%-ной фосфорновольфрамовой кислоты и после
взбалтывания доводят объем водой до метки. На этом этапе
анализ можно прервать на несколько часов или оставить в хо¬
лодильнике до утра.Экстракт перед определением вращения фильтруют в сухую
колбу. Прозрачный бесцветный фильтрат наливают в поляриза¬
ционную трубку (обращать внимание на ее длину) и опреде¬
ляют угол (вращения їв поляриметре (стр. 157 и 160). Условия
гидролиза крахмала (навески, разбавление, кипение бани,
взбалтывание) должны быть одинаковыми для всех проб.Содержание крахмала в процентах (*) вычисляют по формуле:100 -е- 100 -0.3465
х~ 181/-«где: а— угол вращения, найденный прн отсчете в поляриметре
(если поляриметр с прямой шкалой, то полученные
данные переводят в градусы круговой шкалы);181 — фактор для крахмала, соответствующий [а]©;/ — длина трубки (в дм);
н — навеска;100 — объем экстракта.Пример вычисления. Навеска муки риса была 3.0 ± 0,001 г. угол
вращения (о) по сахариметру СУ-2«*35.8°. / трубки—2. После подставле¬
ния значений в формулу получают содержание крахмала в процентах (68%).Определение крахмала в картофеле, батате и других
крахмалонакопителях. Наряду с крахмалом в клубнях карто¬
феля содержится до 1% сахаров (в клубнях батата —более 3%),
поэтому при точных анализах сахар следует извлечь концентри¬
рованным спиртом, а остаток употребить для определения крах¬
мала. Сахар определяют одним из соответствующих методов.
Для сравнительной оценки сортов в зрелых клубнях картофеля
крахмал определяют часто вместе с сахаром.Из отобранной и размельченной на размельчителе тканей
средней пробы клубней отвешивают 2 навески по 15 + 0,01 г и
растирают дополнительно в ступке с 5 смг 5%-ной соляной кис¬
лоты до однородной массы, затем переносят в мориую колбу на
100 см* и добавляют 25 см3 1%-ной соляной кислоты, одновре¬
менно ополаскивая ступку. После этого колбы укрепляют в шта¬
тиве и погружают в кипящую водяную баню на 15 минут.
В дальнейшем поступают так, как указано в прописи определе¬
ния крахмала в муке семян.Приближенное определение крахмала в мякоти плодов и в
корнеплодах. После размельчения проб в мясорубке или кухон¬
ном комбайне отвешивают навески по 10 ±0,01 г мякоти тыквы
(для петрушки, сельдерея, брюквы навески следует увеличить),
помещают в сосуд размельчнтеля, приливают туда же 9 смг воды
и размельчают в течение 5 минут с перерывами. Полученную
суспензию переливают в колбу на 200 см3 для клейстеризации162
крахмала, кипятят 5 минут с обратным холодильником. После
охлаждения набирают 5 см3 «болтушки» в пробирку и прибав¬
ляют туда 3 капли 0,3%-ного раствора иода. Интенсивность по¬
явившейся окраски зависит от содержания и состава крахмала,
а также от количества раствора иода и взвешенных частиц мя¬
коти. Ввиду этого необходимо сохранять единообразие в приемах
анализа. Образцы, содержащие в свежей мякоти около 1%
крахмала, дают светло-голубую окраску, 2%—светло-синюю,
2,5%—синее окрашивание, 3,5% —темно-синее окрашивание.
Окраска образцов, содержащих более 4,5% крахмала, трудно
различима на глаз. Для приближенного количественного опре¬
деления следует составить шкалу, пользуясь навеской (10 г)
корнеплодов, не содержащих крахмала (морковь, свекла сахар¬
ная), к которой добавляют препарат крахмала из такого расче¬
та. чтобы иметь шкалу, соответствующую содержанию крахмала
на сырой вес от 1 до 7%, с интервалом в 0,5%. Этот метод
может быть использован для отбора корнеплодов на повышение
крахмалистости.Определение крахмала (по Пьючеру) *. Метод основан на
извлечении крахмала хлорной .кислотой и его осаждЬнии в виде
йодного комплекса для освобождения от сопутствующих углево¬
дов. Затем иодистый комплекс крахмала разлагают и после
гидролиза до глюкозы определяют редуцирующие сахара. Этот
метод пригоден для определения крахмала в листьях, стеблях,
корнях (относительная точность метода±2%).Реактивы и аппаратура: I) 72%-ная хлорная кислота; 2) 3%-ный раствор
иола в 3%-ном водном растворе К1; 3) 0,25 н. спиртовой раствор едкого
натра; 4) 0.7 н. раствор соляной кислоты; 5) 0.005 н. гипосульфит (1.365 г
аз I дм*), концентрацию которого проверяют по раствору Сомоги; 6) реак¬
тив Сомоги на фосфосахариды; 7) индикатор — раствор крахмала (к суспен¬
зии I г картофельного крахмала в воде приливают 200 см1 кипящей воды,
содержащей 0.2% салициловой кислоты; после 5 минут кипячения дают от¬
стояться и затем прозрачную жидкость сливают); 8) баня со вставкой для
пробирок; 9) центрифуга.Приготовление реактива Сомоги. Растворяют в 1 дм3 воды
56 г безводного \*агНРО« и 80 г сегнетовой соли и пиливают
200 см3 1 и. раствора едкого награ. Затем при помешивании по¬
степенно приливают 160 см3 10%-ного раствора медного купо¬
роса и добавляют 360 г безводного сульфата натрия. Когда по¬
следний растворится, смесь переливают в мерную колбу на 2 &и3
и добавляют 200 см3 0,1 и. раствора иодата калия (растворив
точно 3,5760 г в 1 Аи3). Наконец, колбу доводят до метки и через
несколько дней фильтруют через сухой фильтр, отбросив первые
50 см3 фильтрата. Концентрация иодата будет равна 0,01 н., а
5 см3 этого реактива соответствуют 10 см3 0,005 н. гипосуль¬
фита.•G. Pucher, С. Leavenworth, Н. Vickery. Analvt. Chem.. 20.
850. 1948.6*Г63
Ход анализа. Приготовление вытяжки. В зависи¬
мости от содержания крахмала отвешивают 100—250 мг сухого
размельченного материала в пробирки из жаростойкого стекла»
грнбавляют 4 см3 воды и 0,2—0,3 г стеклянного песка. Затем
пробирки нагревают в течение 15 минут иа водяной бане для
клейстеризации крахмала и после охлаждения до 25° добавляют3	см' хлорной кислоты при помешивании. После этого дополни¬
тельно растирают стеклянной палочкой частицы ткани и вновь
помещают в баню. Стеклянную палочку споласкивают, прибав¬
ляя 20 см3 воды. После перемешивания раствор центрифугируют
н сливают в колбочку на 50 см\ а осадок повторно обрабаты¬
вают 3 см3 хлорной кислоты и 4 см3 воды. Объединенные экст¬
ракты с промывными водами доводят до 50 см3 (на этом этапе
можно сделать перерыв, сохраняя колбочки в холодильном
шкафу).Осаждение крахмала. Берут 5—10 см3 экстракта в
калиброванные пробирки и доводят до 10 см3, прибавляют 5 с*3
20%-ного раствора NaCI и 2 см3 раствора иода в KI. После пе¬
ремешивания и 20-минутного стояния центрифугируют и жид¬
кость сливают, сохраняя от потерь осадок. Осадок промывают
5 см3 спиртовым раствором NaCI и жидкость сливают после цент¬
рифугирования. Затем разлагают крахмал-иодный комплекс, при¬
ливая к сосуду 2 см3 спиртового раствора NaOH н встряхивают
до исчезновения синей окраски. Выделившийся крахмал отделяют
ка центрифуге и промывают 3 см3 спиртового раствора NaCI.Гидролиз крахмала. К осадку промытого крахмала
приливают 2 см3 0,7 н. соляной кислоты и пробирку нагревают
на кипящей бане 2,5 часа. После гидролиза и охлаждения раст¬
вор нейтрализуют 0,5 н. едким натром в присутствии нескольких
капель индикатора — фенол красного. Нейтральный раствор раз¬
бавляют в зависимости от содержания крахмала до 10—20 см*.Определение сахара. Гидролизат в количестве 5 см3
помещают в пробирку, добавляют точно 5 см3 реактива Сомоги
и пробирки одновременно со «слепыми» пробами нагревают на
кипящей бане в течение 15 минут. После охлаждения, не пере¬
мешивая содержимого, по стенке приливают 1 см3 2,5%-ного
раствора KI, а затем при взбалтывании добавляют 3 см3 1,5 и.
серыой кислоты. После того как осадок закиси імедн растворится,
раствор титруют гипосульфитом (0,005 н.), добавляя крахмаль¬
ный индикатор в конце титрования. Таким же способом титруют
«слепые» пробы.Процент крахмала (х) в исследуемом материале вычисляют
по формуле:500-а 0.9x=—jn—•где: а — количество глюкозы (в мг) в объеме гндролнзата крах¬
мала;164
о —объем хлорнокислой вытяжки, взятый для осаждения
крахмала;0,9 —коэффициент для пересчета глюкозы на крахмал;
н — навеска (в мг).Объемный метод определения крахмала (по X. Починку).
)бъемный метод основан на получении комплексного соединения
чрахмала с иодом, последующем окислении крахмала биохрома-
гом и нодометрическом учете избытка последнего.Реактивы: 1)>0.25 н. раствор КзСггО? і(навеску 12,3 г KjCfjO? растворяют
в 250 см} НаО в двухлитровой колбе и постепенно, при охлаждении, прибав*
ляют 800 смі* концентрированной HsSO«: после перемешивания и охлажде¬
ния переливают в склянку с притертой пробкой); 2) 80%-ный раствор
Ca(NOj)j (навеску 200 г Ca(N0jh-4H*0 растворяют в 70 см> воаы в мер¬
ном цилиндре и постепенно доводят водой до 250 см3; нз этого раствора по
мере надобности готовят 20%-ный или 5%-ный растворы); 3) 0,5%-ный
раствор иода (10 г KI и 5 г U) растирают а ступке сначала в сухом виде,
затем с 10 ем* воды количественно переносят в мерную колбу и доводят
до I Ли*); 4) 0.1 и. раствор гипосульфита.Ход анализа. Навеску исследуемого материала, содержащую
от 20 до 200 мг крахмала (3 г листьев, 0,25 г зерна, I г клубней
картофеля) растирают в ступке с 5 см3 80%-ного раствора азот¬
нокислого кальция, переносят в коническую колбу на 200 смг,
смывают 25 см3 80%-ного раствора Са(МОз)г* колбу накрывают
стеклянной воронкой, ставят на плитку и кипятят (не сильно)3	минуты. При этом крахмал переходит в раствор. После охлаж¬
дения воронку смывают водой. Содержимое колбы переносят в
мерную колбу на 100 см3 и доводят водой до метки, перемеши¬
вают и фильтруют через складчатый фильтр. Набирают пипеткой
5 см3 фильтрата (при анализе листьев—10 сл3) в центрифуж¬
ную пробирку, прибавляют 2 см3 раствора иода (5 г 12 и 10 гК1
в 1 дм3 воды), перемешивают стеклянной палочкой, ополаски¬
вают ее несколькими каплями воды и оставляют на 30 минут.
При этом осаждается соединение крахмала с иодом, содержащее
14—16% иода. Через 30 минут центрифугируют, прозрачный ра¬
створ сливают возможно полнее, осадок промывают 5%-ным
распвором Ca(N03)j несколько раз, каждый раз прибавляя 5 см3,
и перемешивают осадок с раствором стеклянной палочкой, кото¬
рую затем промывают тем же раствором. Промывание повто¬
ряют 3—6 раз в зависимости от количества примесей (обычно
листья необходимо промывать большее число раз). Промытый
осадок крахмала с иодом сливают в коническую колбу емкостью
200 ел5 небольшими порциями воды —по 0,2—0,3 с.м3, хорошо
перемешивая стеклянной палочкой. Общее количество воды не
должно превышать 3 см3. В колбу прибавляют 10 см3 0,25 н.
раствора К3СГ2О7, приготовленною на 85%-ной H2SOi, переме¬
шивают и сейчас же помещают на 15 минут в кипящую водяную165
баню. При этом крахмал окисляется бихроматом до углекислоты
и воды:4КзСг3От + (СвН10О5)я + 16H,SO« = (6С03)„ + 4K,S04 +-h 4Cr (S04)3 + (21НаО)я.Затем колбу снимают» дают остыть» прибавляют 5 см3 20%-
ного раствора йодистого калия» который» реагируя с избытком
бихромата» выделяет иод. Иод оттнтровывают 0,1 и. раствором
гипосульфита, под конец добавляя в качестве индикатора 1 см*
0,5%-ного раствора крахмала; 1 см? 0,1 н. раствора гипосуль¬
фита соответствует 0,675 мг крахмала (иод, адсорбированный
крахмалом, практически не сказывается на результатах опреде¬
ления).Отдельно титруют 10 см3 0,25 и. раствора КзСг^ после раз¬
бавления его 120 см3 воды и прибавления 5 см3 20%-ного раст¬
вора йодистого калия. Из полученных данных вычисляется со¬
держание крахмала в процентах (х) по следующей формуле:0.675 • в • Т(а — а,)*=	«Г7*	•где: а —количество куб. сантиметров раствора пшосульфг
затраченного при контрольном титровании бихро?
калия;а i — количество куб. сантиметров раствора гипосульфии
затраченного при определении крахмала;в—объем исследуемого раствора (в ел3)» в котором раст¬
ворена навеска исследуемого вещества;ві — объем (в см3) исследуемого раствора, взятого для
осаждения крахмала;Т — раствор гипосульфита;- навеска растительного материала (в г).Определение амилозы в растительном крахмале. Содержа¬
ние амилозы в препаратах крахмала, выделенного из различных
видов и сортов растений, существенно различается. Метод
М. Ульмана и С. Аугустата (в модификации М. И. Смирновой-
Иконниковой, Т. М. Петровой и В. О. Мохнач *) позволяет опре¬
делять амилозу в препаратах крахмала и производить сравни¬
тельную оценку образцов. Относительная ошибка определения
при содержании амилозы в крахмале 10% и более составляет
14—20% (от содержания амилозы). Метод основан на образова¬
нии комплексов крахмала с иодом. Интенсивность окраски опре¬
деляют на фотоэлектроколориметрах.Реактивы и аппаратура: 1) I н. раствор NaOH; 2) 1 я. раствора
3) 0.5%-ный раствор иода в 1%-ном растворе йодистого калня; 4) •;
метр Пульфриха или ФЭК-М (см. рис. 2/).• М. И. Смнрнова-Ихоняякова, Т. М. Петрова, В. О. Мох-
и а ч. ДАН СССР, т. 140, № 2, 1961, стр. 485-487.166
Ход анализа. Навеску 100 мг сухого крахмала заливают6,6	см* 1 н. NaOH и, взболтав, оставляют на ночь при комнатной
температуре. Утром раствор крахмала тщательно перемешивают
и доводят дистиллированной водой до 100 ак8. Затем берут
10 см'*- в мерную колбу на 200 см*, на которой предварительно
сделана отметка 150 см*. Доводят объем до 150 см*, нейтрали*
зуют раствор 1 н. НС1 до pH 5, прибавляют 2 см* раствора иода
в йодистом калии. Содержимое колбы доводят до метки, хорошо
перемешивают, из окрашенного раствора берут 25 см\ разбав¬
ляют до 150 см3 и просматривают в фотометре со светофильт¬
ром в кювете с толщиной слоя жидкости 5 см (для фотометра
Пульфриха используют светофильтр 66).Для построения кривой нужны чистые препараты амилозы и
амилопектина. Амилозу выделяют по Е. Гузеыану и Н. Бартлю
(1965), которую лнофнльно высушивают. Амилопектин выде¬
ляют по М. И. Княгиничеву (1952) или используют крахмал об¬
разцов, не содержащих амилозы.Содержание амилозы вычисляют по калибровочной кривой,
составленной по чистым препаратам амилозы и амилопектина.
Для построения кривой в 6 мерных колб на 100 cjh3 отвешивают
возрастающее количество амилозы и убывающее — амилопек-
тнна. Так, в первую колбу —0, а в последующие — 20; 40; 60;
в0 и 100 мг амилозы и 100; 80; 60; 40; 20 и 0 мг — амилопектина,
чтобы общее количество амилозы и амилопектина в каждой колбе
составляло 100 мг.Во всех колбах определяют амилозу так, как указано выше
для опытных проб. На основании полученных величин экстинк-
цнн известных концентраций амилозы и амилопектина вычерчи¬
вают кривую.Хроматографическое разделение полисахаридов крахмала.Способ, предложенный Н. А. Смыковои и Б. Н. Степаненко41,
позволяет выделить из крахмала амилозу для различных харак¬
теристик. В качестве сорбента используют фосфат кальция.При определении сначала выделяют препараты крахмала.
Крахмал из клубней картофеля выделяют, отмывая 0,01 М раст¬
вором сулемы, которая подавляет энзиматическую активность.
Затем крахмал очищают многократной седиментацией в 0,1 М
NaCI и хранят в растворе соли под слоем толуола прн 2—4°. Для
выделения амилозы на колонку наносят 15 мг крахмала в виде
0,3% -ного водного раствора, который готовят следующим обра¬
зом. Соответствующую навеску смешивают с раствором КОН
при 0° и через 10 минут нейтрализуют. Затем диспергируют в
воде кипячением в течение часа в атмосфере азота. После на¬
несения на колонку последнюю промывают водой, при этом про¬
мывные воды не должны окрашиваться с иодом. Затем элюируют*	Н. А. Смыкова и Б. Н. Степаненко. Химия и биохимия угле¬
водов. «Наука», 1909, стр. 309—311.167
фосфатным буфером, pH 5,7. При этом с колонки вымывается
фракция, дающая ярко-синее окрашивание (амилоза), а на ко¬
лонке остается амилопектин, дающий с иодом фиолетово-красное
окрашивание.Определение клетчаткиОпределение клетчатки по Кюршнеру и Ганеку. Приводимая
модификация может быть рекомендована в качестве универсаль¬
ного метода. Последний основан на окислении, разрушении и
растворении различных химических соединений, входящих в со¬
став растений, смесью уксусной и азотной кислот. При этом
клетчатка практически не растворяется, отфильтровывается и
взвешивается.Реактивы и аппаратура: I) смесь по объему (1:10) азотной кислоты
(плоти. 1,4) и 80%-ной уксусной кислоты; 2) этиловый эфир и спирт;3)	колбы на 100—120 см* с притертыми холодильными трубками; 4) тигли
Гуча или стеклянные тигли с пористым дном № 2 (рис. 22.2); 5) песчаная
баня.Ход анализа. Отвешивают на¬
вески около 1 4; 0,0002 г крупно
измельченных семян в колбы на
120 см\ приливают 40 смг смеси
кислот и, закрыв колбу обратным
холодильником, нагревают на пес¬
чаной бане в течение часа. Затем
отфильтровывают белый, слегка
кремовый осадок через стеклянный
тигель № 2 или тигель Гуча с ас¬
бестовым фильтром. Если осадок
после отсасывания экстракта кре¬
мового цвета, то его промывают
1—2 раза горячей 0,2 М спирто¬
вой щелочью. После этого несколь¬
ко раз промывают небольшими
поршнями дистиллированной воды
л под конец—10 см3 спирта с
эфиром.При этом следят, чтобы ра-
спворители хорошо отмыли стен-
пси тиглей (при анализе маслич¬
ных семян на них может остаться «маслянистая жидкость).
Тигли с чисто белым осадком высушивают до постоянного веса
при 105°.При анализе кормовых и овощных растений навески сухого
материала увеличивают до 1,5 г и заливают 50 см3 смеси кислот
и также нагревают в течение часа.Рис. 22. Приспособление для
фильтрования с отсасыванием.; — колба Бунэева. 2 — стеклямный
стаканчик с пористой пластинкой или
тигель Гуча с фильтром, S — резино¬
вая манжета для плотного соединения.168
Процентное содержание клетчатки (х) вычисляют по формуле:(«,-«)• 100х = ■■■■ ■ 	*	нгде: в —вес сухого (без осадка) тигля;в\ — вес тигля с сухим осадком;н — навеска.Если для определения клетчатки использован воздушно-сухой
материал, то делают пересчет на сухое вещество. Этим методом
при серийных анализах один лаборант выполняет 12 определений.
Д. В. Петербургский (1968) описывает модификацию метода
Кюршнера и Ганека, по которой навеску 1 г кормовых растений
нагревают на водяной бане от 1 до 2 часов с 30 смг смеси кислот
(5 объемов азотной и 100 объемов 80%-ной ус кус ной). Далее
фильтруют, лрозшвают водой, спиртом а эфиром. Следует от¬
метить, что здесь экономически нецелесообразно увеличивать
расход уксусной кислоты.Примечание. При использовании асбеста для приготовления фильт¬
ров его кипятят в смеси азотной н уксусной кислот (1:10) н затем промы¬
вают водой. После этого его употребляют для приготовления фильтров.Определение клетчатки по модифицированному методу Кюр¬
шнера н Хафера. Выбор метода для анализа зависит во многом
от доступности реактивов, необходимых для анализа, производи¬
тельности труда и воспроизводимости результатов. Улучшенный
А. И. Ермаковым вариант метода Кюршнера и Хафера удовлет¬
воряет этим требованиям.Метод основан на окислительном разрушении и растворении
различных веществ (в том числе сопутствующих клетчатке) раст¬
ворами азотной кислоты в спирте и спиртовой щелочи. Особенно
ценен метод для определения клетчатки в различных вегетатив¬
ных органах, богатых гемицеллюлозами и лигнином.Реактивы и аппаратура: 1) этиловый или метиловый спирт; 2) смесь
этилового спирта (4 объема) с I объемом азотной кислоты (плоти. 1,4);
3) 0.3 М спиртовой раствор щелочи; 4) эфир этиловый; 5) баня с обрат¬
ными холодильниками для экстракции н гидролиза (рис. 23); 6) колбы
конические на 200 см*: 7) тигли Гуча или стеклянные с пористой пластин¬
кой >& 2.Ход анализа. Отвешивают по 1 —3 + 0,001 г из средней пробы
крупно размельченных сухих вегетативных частей растений в
колбы на 200— 250 см3 (величина навесок зависит от содержа¬
ния клетчатки в анализируемом материале).В колбы с навесками приливают по 30 или 50 см3 смеси
спирта н азотной кислоты. Смесь готовят для серии образцов,
приливая к спирту азотную кислоту при размешивании. Колбы
с обратным холодильником ставят на кипящую водяную баню на
один час. Колбы в воду не погружают, и кипение должно быть169
Рис. 23. Баня с регулируемым нагревом с обратными хо¬
лодильниками для экстракции и гидролиза.
равномерным. Через час коричнево*желтый раствор сливают н
отсасывают через стаканчик с пористым дном. Для того чтобы
обеспечить быстроту фильтрования, на поверхность стаканчика
помещают слон мелкого толченого стекла (перед употреблением
стаканчики со слоем песка высушивают и взвешивают). При
фильтровании следят за тем, чтобы на фильтре был слой жид¬
кости. Если анализируемый материал богат белковыми вещест¬
вами или содержит много сопутствующих клетчатке веществ,
то целесообразно, не перенося осадка из колбы, добавить еще
реагирующей смеси и повторить нагревание в течение 30 минут
с обратным холодильником на той же бане. Жидкость приобре¬
тает лимонно-желтый или слабо-коричневый цвет (в зависимости
от оставшихся примесей). Когда жидкость вторично слита( через
тот же стаканчик), остаток в колбе промывают небольшими пор¬
циями крепкого спирта.К промытому осадку в колбе прибавляют 50 см3 0,3 М спир¬
тового раствора щелочи и нагревают вновь в течение часа на
водяной бане при хорошем кипении или на песочной бане. Прн
отсасывании щелочного раствора белый осадок клетчатки пере¬
носят на фильтр того же тигля, промывают 2 раза порциями по
10 or3 горячей воды, а затем 1—2 раза спиртом (спиртовые раст¬
воры собирают и отгоняют для следующих анализов). Затем
стеклянные тигли или тигли Гуча сушат до постоянного веса
при 105° и после охлаждения взвешивают.В некоторых случаях тигли необходимо промыть после спирта
эфиром. При необходимости экономии спирта можно пспользо-
вать водный раствор щелочи, но отфильтровывание водных раст¬
воров иногда очень осложняется.Вычисление результатов производят ло формуле, приведен¬
ной на стр. 169.Определение фруктозанов
и олигофруктозидовОпределение фруктозанов и олигофруктозидов по Бертрану.Фруктозаны, включая и наиболее высокомолекулярный среди
них инулин, принадлежат к легкорастаорнмьим, резервным поли¬
сахаридам. Они содержатся в мясистых запасных органах слож¬
ноцветных (в клубнях топинамбура, георгин, в корневищах ци¬
кория, кок-сагыза и ар.), a также в стеблях этих растений и а
некоторых злаковых растениях (рожь, ячмень). Фруктозаны со¬
стоят из остатков D-фруктозы в фуранозной форме соединенных
между собой 1—2 связями (инулші ai родственные фруктозаны)
или 2—6 связями (фруктозаны типа флеаиа в злаковых расте¬
ниях). Большинство фруктозанов, в том числе и инулин, содер¬
жит в небольшом количестве н глюкозу. Фруктозаны не обла¬
дают редуцирующей способностью, но после мягкого кислотного171
гидролиза могут быть определены по редуцирующей активності!
продуктов гидролиза (фруктозы н глюкозы) с помощью реактива,
реагирующего как с альдозами, так и с кетозами по методу
Бертрана и др. При этом определяют общее количество связан¬
ного сахара. Если применять специфичный для кетозы резорци¬
новый реактив, то учитывается только количество связанной фру¬
ктозы (поэтому цифры будут несколько занижены).При определении навеску свежего растительного материала
(клубни топинамбура, цикория и др.) заливают горячей водой и
экстрагируют їв гомогенизаторе 30 минут (см. стр. 132) или же
на кипящей бане в течение 40 минут. Гидролизуют экстракт со¬
ляной кислотой 30 минут при конечной концентрации ее в экст¬
ракте 0,5% (соляную кислоту можно заменить 0,1 и. щавелевой
кислотой, гидролизуют также 30 минут). После нейтрализации
экстракта 0,5 н. раствором NaOH (или другим слабым раство¬
ром щелочи), если имеют дело с окрашенным раствором, то
проводят осветление, чтобы ликвидировать ломехи со стороны
белкою и других веществ, присутствующих IB растворе. Осветле¬
ние проводят 30%-ным раствором ацетата свинца или раство¬
ром фосфорновольфрамовой кислоты (стр. 134).Осадок отфильтровывают без отсасывания и к раствору при¬
бавляют 5 см3 3%-ного раствора оксалата натрия для удаления
избытка свинца. Раствор отфильтровывают и в нем определяют
содержание фруктозы по методу Бертрана. Для вычисления
содержания фруктозанов пользуются табл. 6 (поскольку в раст¬
воре количественно преобладает фруктоза).таблица 6	Определение фруктозыпо меда (в мг)МедьФруктом 1МедьФруктозаМедьIФруктоза IМедьФруктоза20,210 і73,140123,870 1172,210038,120 N90.350140,280 I186,511055,730 И107,260155,390 IОпределение фруктозанов и олигофруктозидов по Мак-Рери
и Слаттери. При этом методе экстракт не гидролизуют, а в слу¬
чае необходимости осветляют и берут аликвотную часть для
определения фруктозы колориметрическим методом с резорци¬
новым реактивом, в состав которого входит соляная кислота
(определение кетосахаров). При этом учитывается общее коли¬
чество фруктозанов различной степени полимеризации. Если тре¬
буется определить содержание высокополнмернзованных и низко¬
молекулярных фруктозанов отдельно, то навеску свежего расти¬
тельного материала обрабатывают кипящим этиловым спиртом
(стр. 134). При этом низкомолекулярные олигофруктозиды ра¬
створяются в спирте, а фруктозаны остаются в спиртонераствори-172
мом остатке. При определении содержания последних их извле¬
кают горячей водой (см. выше). Содержание кетосахаров в
обоих экстрактах (спиртовом и водном), полученных из сухого
остатка, определяют резорционовым методом.Если требуется определить раздельно спирторастворимые оли-
юфруктозиды различной степени полимеризации, их разделяют
методом хроматографии на (бумаге, в системе растворителей:
н-бутонал — ледяная уксусная кислота — вода в соотношении
4:1:5 (верхний слой) н н-бутонол — придин — вода в соотноше¬
нии 1:1:1. Пользуются методом нисходящей хромотографии
(бумага ленинградская, «быстрая»). Хроматограмму делят на 3
равные части, .проявляют только одну из них (стр. 149).Для проявления кетоз пользуются реактивом Форета—1%-
ный раствор резорцина в этаноле и 0,2 и. раствор HCI в соотно¬
шении 1:1 или реактивом Дедонде — 5 г мочевины и 20 см3
н. НС1 доводят до 100 см3 этанолом.Из непроявленной хроматограммы вырезают участки, содер¬
жащие кетосахара (контролем служат соответствующие им уча¬
стки на хроматограмме, не содержащие сахаров). Участки не¬
обходимо строго выравнять по площади. Элюирование кетасаха-
ров проводят 60%-ным этиловым спиртом. Для этой цели из¬
мельченный участок бумаги заливают в пробирке 6 см3 60%-ного
спирта и нагревают 30 минут на водяной бане при 80°. Затем
бумажки отжимают и элюат доводят до 6 смг спиртом.Определение кетосахаров. Кетосахара в элюате удобно оп¬
ределять методом Кулька, очень чувствительным. Это —
одна нз модификаций резорцинового метода.Реактивы: 0,1 г резорцина в 200 см3 96% -ного этилового спирта;
2) 0,043 г железоаммиачных квасцов в 200 см3 крепкой соляной кислоты.Ход ансмиза. В пробирку берут 2 см3 элюата и приливают по3	см3 растворов резорцина и железоаммиачных квасцов. Содер¬
жимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой, затем на¬
гревают в течение 40 минут с воздушным холодильником на во¬
дяной бане прн 80°. Рядом с опытными растворами нагревают
2 см3 элюата контроля (из «чистой» полоски хроматограммы) с
добавлением тех же реактивов. Сразу по окончании нагревания
все пробирки охлаждают в проточной воде. Интенсивность
окраски измеряют на ФЭК-М с синим светофильтром. Количест¬
венное содержание кетосахаров определяют по градуировочному
графику, составленному по чисгой фруктозе. Предварительно ее
необходимо довести до постоянного веса при 104°. Все реактивы
должны быть химически чистыми и не давать окраски прн сме¬
шивании в отсутствии кетоз.Этот метод количественной хроматографии применяют и при
анализе гидролизатов полисахаридов (фруктозанов).Если, кроме фруктозанов, в навеске материала присутст¬
вуют и сахара, которые нужно определить, то всегда перед этим173
навеску экстрагируют кипящим этанолом, чтобы определить
спирторастворимые сахара. Этот метод применяют для тех объ¬
ектов, которые не содержат низкомолекулярных фруктозаиов,
так как последние тоже растворяются и извлекаются спиртом.
Высокомолекулярные фруктозаиы извлекают горячей водой; они
не растворяются в спирте и не будут нм извлекаться.Для раздельного же определения фруктозы, глюкозы, саха¬
розы и низкомолекулярных фруктозанов, присутствующих в эк¬
страктах из топинамбура, используют метод хромотографии на
бумаге—Бэкона и Эдельмана.Определение
пектиновых веществОбщие свойства пектиновых веществ. Пектиновые вещества
содержатся в растениях в форме воднорастворимого пектина,
Ca-Mg соли пектиновой кислоты и протопектина. В раститель¬
ных тканях пектиновые вещества откладываются и во внешней
стороне клеточной стенки и между клетками, входя в состав
срединной пластинки. Это придает определенную пластичность
растительной ткани, особенно в период роста. Воднорастворнмый
пектин находится в клеточном соке. Химическая природа пектн-
новых веществ еще не полностью изучена. Основой их является
цепь из остатков D-галактуроновой кислоты, соединенных свя¬
зями а-1,4, т. е. пол нг а л акту ромовая (пектовая) кислота. Высо¬
комолекулярные полигалактуроновые кислоты, небольшая часть
карбоксильных групп которых этерифицнрована метиловым
спиртом, называются пектиновыми кислотами, а их соли — пекти-
патами (нормальными или кислыми). Пектиновые кислоты, часть
карбоксильных групп которых в различной степени этерифици-
рована и нейтрализована, называются пектинами.Пектины различных растений содержат то или иное количе¬
ство ацетильных групп, особенно пектин сахарной свеклы. Про¬
топектин — нерастворимое в воде производное пектиновых ве¬
ществ; при осторожном гидролизе дает воднорастворнмый пек¬
тин. Химическая природа его до сих пор не изучена, так как вы¬
делить его в неизменном виде из растений не удается. Однако
считают, что в протопектине молекула пектина находится в хи¬
мическом соединении с другими компонентами клеточной стен¬
ки—с целлюлозой, гемицеллюлозами, по-видимому, и с азоти¬
стыми веществами. Нерастворимость протопектина объясняют
и механическим переплетением пектиновых молекул с другими
высокомолекулярными компонентами клеточной стенки и нали¬
чием многовалентных ионных мостнковых связей через кальций
и магний между свободными карбоксильными группами пекти¬
новых молекул; предполагают и другие причины плохой раство¬
римости протопектина.174
Присутствие в молекуле пектина какого-то количества сво¬
бодных карбоксильных групп обусловливает его кислый харак¬
тер.Непременными спутниками полигалактуроновой кислоты яв¬
ляются обычно также высокомолекулярные арабаны н галак¬
тани. Исследованиями последних лег, на примере яблочного
пектина, установлено, что он состоит из кислого компонента —
пектиновой кислоты и нейтрального — арабано-галактанового
комплекса, примерно равного числа остатков. Пектиновая кис¬
лота, кроме галактуроновой кислоты, содержат арабннозу, га¬
лактозу, рамнозу, ксилозу н следы других сахаров.Пектиновые вещества представляют неоднородную смесь мак¬
ромолекул различных размеров. Средний вес молекул данного
образца зависит от способа выделения пектина и колеблется для
пектинов разного происхождения от нескольких тысяч до 200—
300 тысяч.Все пектиновые вещества 'в той или «ной степени растворимы
в воде: воднорастворимый пектин — полностью, протопектин не¬
которых растений прн кипячении с водой может быть растворен
на 80%, другого происхождения — менее растворим.В растительных тканях пектиновые вещества расщепляются
пек то.тити чес ким и ферментами (стр. 72) —«протопектин пере¬
ходит в воднорастворимыи пектин (при созревании сочных пло¬
дов), все формы пектина распадаются на низкомолекулярные
фракции, вплоть до свободной галактуроновой кислоты и глуб¬
же. Когда разрушаются срединные пластинки, клетки ткани
отделяются одна от другой (нацример, при перезреванші
плодов).Характерное свойство пектиновых веществ — их студнеобра¬
зующая способность—широко используется в пищевой промыш¬
ленности. В определенных соотношениях с органической кислотой
и сахаром пектины образуют желе, хотя и не все пектины в оди¬
наковой степени обладают такой способностью.В нашей стране пектин получают из отходов свеклосахарного
производства (жом); налаживается получение его нз яблочных
отходов.Определение пектиновых веществ по пектату кальция. Этот
метод основан на переведении различных пектиновых веществ в
раствор, превращении их в пектиновую кислоту, осаждении по¬
следней в виде кальциевой соли и учете ее весовым способом.В зависимости от цели исследования можно определять от¬
дельно растворимый пектин н протопектин или учитывать сумму
пектиновых веществ. Ход анализа остается одним и тем же, с
тем лишь отличием, что в первом случае осаждают и учитывают
пектиновую кислоту отдельно в двух экстрактах, а во втором —
экстракты соединяют и определяют сумму пектиновых веществ.Реактивы и аппаратура: I) 0,3 н. раствор соляной кислогы; ?) 1%-ныА*
раствор лимоннокислого аммония; 3) 0,4%-ныЙ раствор едкого натра;175
4)	6%-ный раствор уксусной кислоты; 5) 0,5%-ный и 11,1%-вый расгаоры
хлорветого кальция; в) мерные колбы н конические колбы на 250 см\7)	сушнльиый шкаф; 8) центрифуга; 9) механическая качалка.Ход анализа. Раздельное определение пектино¬
вых (веществ. Навеску 25 г свежего материала тщательно
растирают со стеклом в ступке до совершенно однородной массы
и трижды извлекают сахара спиртом *. Остаток заливают в ко¬
нической колбе 100 см3 воды, нагретой до 45°, выдерживая при
этой температуре 30 минут (на водяной бане). Лучше остаток
после извлечения поместить в центрифужную пробирку на
100 см\ прилить воды, нагретой до 40—45° и, закрыв резиновой
пробкой, энергично взбалтывать пробирку на электрической ка¬
чалке или руками 15—20 минут. Через 20 минут пробирки урав¬
новешивают и центрифугируют, жидкость сливают через бу¬
мажный складчатый фильтр в мерную колбу на 250 см3. Остаток
в центрифужной пробирке еще дважды извлекают водой (75 и
60 см3) и все экстракты, соединенные в мерной колбе, доводят
до метки (если’раствор мутный, его еще раз центрифугируют
и фильтруют). Таким образом получают вытяжку JV* 1 воднора¬
створимых пектинов.Затем весь остаток из центрифужных пробирок с 50 см3
0,3 н. раствора соляной кислоты переносят в коническую колбу.
Закрывают колбу пробкой с вертикально поставленным обрат¬
ным холодильником и нагревают 30 минут на кипящей водяной
бане. После этого жидкость фильтруют через складчатый фильтр
в мерную колбу на 500 см\ остаток несколько раз промывают
на фильтре горячей водой, сливая в ту же колбу. Затем фильтр
вместе с остатком переносят палочкой в экстракционную колбу,
заливают 50—70 см3 1%-ного раствора лимоннокислого аммо¬
ния и также нагревают в кипящей бане 30 минут. Экстрат филь¬
труют в ту же мерную колбу, промывают горячей водой и после
охлаждения доводят до метки. Полученная вытяжка № 2 со¬
держит нерастворимый в воде протопектин и пектиновую кис¬
лоту.В дальнейшем весь ход анализа в обеих вытяжках совер¬
шенно одинаков.Омыление пектиновых веществ. К 50 или 100 см3
вытяжки № 1 в зависимости от разбавления и от ожидаемого
количества пектина прибавляют 50 или 100 см3 0,4%-ного едкого
натра и оставляют на ночь при комнатной температуре. Утром
раствор подкисляют тем же объемом (50 или 100 гм3) нормаль¬
ной уксусной кислоты и осаждают пектиновую кислоту 50 (или
100) см3 11,1%-ного раствора хлористого кальция. Полученный*	В навесках свежего материала без предварительной обработки спиртом
ii отделения слиртонерастворимого остатка можно определять пектин только
при массовых анализах. Во всех остальных случаях обязательно полное из¬
влечение сахаров (3-кратное: 1 раз 95%-ным и дважды—80%-ным спиртом),
затем промывание ацетоном и подсушивание на воздухе.176
осадок лектата кальция отфильтровывают через заранее высу¬
шенный до постоянного веса фильтр. Затем осадок на фильтре
промывают 0,5%-ным раствором хлористого кальция, после
этого многократно промывают холодной дистиллированной во¬
дой для удаления хлористого кальция (проверяют на хлор с
азотнокислым серебром). Под конец промывают несколько раз
горячей водой для удаления солей. Фильтр с осадком переносят
(пинцетом) в бюкс и сушат до постоянного веса при 100—105°.
Вес осадка, полученный из разности между весом стакана с
фильтром и осадком пектина после сушки и весом их же без
пектина (до фильтрования осадка), умножают на 0,9235 и тем
самым переводят на пектиновую кислоту. Вес осадка пектата
не должен превышать 0,03 г. Если осадка больше, то его не
удается высушить н результаты получаются чрезмерно повы¬
шенными. Учитывают разбавление и вычисляют процентное со¬
держание пектина.С вытяжкой Л? 2 протопектина поступают совершенно так
же, но ее нейтрализуют едким натром до прибавления щелочи,
потребной для омыления.Определение пектинов длительно, хотя и несложно. Целесо¬
образно проводить одновременно анализ трех образцов, если
растворимый лектин учитывают отдельно, или 6 образцов, если
определяют только общее количество пектиновых веществ. За
день до анализа подготовляют складчатые фильтры из плотной
фильтровальной бумаги, на краях фильтров надписывают про¬
стым карандашом тот же номер, который имеет и бюкс. Фильт¬
ры должны быть предварительно высушены до постоянного веса
при 105е (6—8 часов сушки). Фильтры с осадком лектата каль¬
ция также высушивают до постоянного веса при 105°. Если вес
осадка пектата' превышает 0,03 г, анализ надо повторить, взяв,
например, .вместо 100 смг вытяжки 50 см3.Пример вычисления. Навеска сыроА моркови 25 г, водная вы¬
тяжка доведена до 250 смР. Для определения взяты пробы но 50 см1. вес
осадков пектата кальция в них 0,030 г и 0,026 г, в среднем 0,028 в. В на¬
веске 25 г содержится 0,1405 г пектата кальция, пли 0,562% на сырой вес
и 4,95% на сухоА вес (при содержании сухого вещества 11,8%). Эту ве¬
личину умножают на 0,9235 для перевода пектата кальция на лектиноаую
кислоту: 4,59-0.9235—4.24%. Аналогично вычисляют протопектин.Определение пектиновых веществ объемным методом (поС. Я. Раик). Измельченную навеску 10—15 г свежего мате¬
риала заливают горячим этиловым спиртом (из расчета полу¬
чения конечной концентрации спирта 80—82%) и нагревают
на кипящей водяной бане (с воздушным холодильником) 20—
30 минут для извлечения сахаров, затем фильтруют через бу¬
мажный фильтр в мерную колбу. Извлечение спиртом повторяют-3—4 раза для полного удаления сахаров. Фильтр вместе с ос¬
татком подсушивают при 50° до удаления спирта (по запаху).
Затем остаток вместе с фильтром заливают в колбе 50 см* воды.177
нагретой до 45°, и (при этой температуре экстрагируют <водно-
растворимый пектин на водяной бане в течение часа. Отфильт¬
ровывают в мерную колбу на 200 см3, промывают водой и, ох¬
ладив, доводят объем до метки. Для извлечения нерастворимых
фракций пектина остаток переносят в экстракционную колбу»
заливают 50 см3 0,3 н. HCI л нагревают іполчаса в киля щей
водяной бане с обратным воздушным холодильником. Фильт¬
руют в мерную колбу на 200—250 см3 и промывают 2—3 раза
горячей водой. Фильтр вместе с осадком возвращают в ту же
колбу, перенося количественно посредством 50 см3 1%-ного ра¬
створа лимоннокислого аммония, и ставят в кипящую водянук>
баню на полчаса. Фильтруют в ту же мерную колбу, где нахо-
лнтся фильтрат от соляно-кислой вытяжки, промывают горячей
водой, по охлаждении доводят до метки. Из обоих экстрактов
берут по 2 пробы по 50 см3 в конические колбы иа 250 см3. За¬
тем для омыления воднорастворимого пектина приливают в
каждую колбу по 50 см3 0,1 н. раствора NaOH, а в экстракт не¬
растворимого пектина — еще дополнительно столько щелочи»
сколько требуется для нейтрализации соляной кислоты (устано¬
вить отдельно). Последние остатки эфирных связей омыляются
с трудом. Это омыление необходимо проводить не менее 3—4	часов. Раствор удобно оставлять на ночь, потому что все по¬
следующие операции, включая растворение осадка, следует за¬
кончить в один день. После омыления во все пробы добавляют
по 50 смг 1 н. раствора уксусной кислоты и через несколько
минут —по 50 см3 5%-ного раствора медного купороса. Раствор
с осадком фильтруют спустя 30—40 минут через беззольиый
фильтр (белая или красная лента). Осадок тщательно промы¬
вают горячей водой до исчезновения в промывной воде реакции
иа медь.Затем осадок вместе с фильтром помещают в колбу для ти¬
трования, заливают 30—40 см3 горячей воды и для растворения
добавляют несколько капель аммиака. Раствор приобретает си¬
неватый оттенок из-за окраски комплексного аммиаката меди.
Затем приливают 8—10 см3 2 и. раствора H2SO.», добавляют5	г KI и титруют из микробюретки раствором 0,01 и. гипосуль¬
фита в присутствии свежеприготовленного крахмала. Восстанов¬
ление необходимо проводить в слабокислой среде, так как вы¬
сокая кислотность приводит к заметному окислению ионов иода
кислородом воздуха. Однако при слишком малой кислотности
реакция 2Cu'Н-4Г = 2Си1-|-Ь сильно замедляется и конечная
точка титрования становится неясной — иодкраммальная ок¬
раска после окончания титрования очень быстро появляется
вновь, что указывает на возобновление выделения иода.Вычисления проводят по формуле:
где: о —число куб. сантиметров Na2S*03, пошедшее на тигро-
ванне;К — поправочный коэффициент к титру гипосульфита;Г —титр NjSjCb (по меди равен 0,06357-К);н —навеска в титруемом объеме (учетное разведение).При К — 0,01, Т а 0,0006357. Пектат-Са (%) = (% Си X 6,5).Определение пектиновых веществ на основе реакции галак-
туроновой кислоты с карбазолом. Этот метод основан на полу¬
чении специфического фиолетово-розового окрашивания уроно-
вых кислот с карбазолом в сернокислой среде. При этом обра¬
зуется 5-карбокснфурфурол. При определении пектиновых
веществ этим методом для получения воспроизводимых резуль¬
татов в опытном растворе не должно быть сахара. Окраска/по¬
лучаемая после добавления карбазола, нестабильна и чувстви¬
тельна к перегреву <и окислителям. Кроме того, иа результаты
анализа влияет степень метоксилировання пектина.Необходимо чтобы концентрация пектиновых веществ в экст¬
рактах соответствовала содержанию галактуроновой кислоты от4	до 50 мкг в 0,5 см* раствора. (Поэтому делают .необходимое
разведение экстрактов. Предварительно перед определением
пектиновых веществ по реакции с карбазолом проводят демет-
оксилирование их, так как неодинаковая степень метоксилиро*
вания снижает величину оптической плотности, но не строго
пропорционально. Деметоксилированне пектина проводят при
комнатной температуре добавлением 0,05 и. раствора NaOH, за¬
тем через полчаса добавляют 0,05 и. раствор НС1 до нейтраль¬
ной или слабокислой реакции.Реактивы и аппаратура. I) раствор 250 мг NajBtOr • IOHjO (хим. ч.) в
100 см3 концентрированной H2SO<, плоти. 1,84 (химически чистую серную
кислоту прогревают до начала выделения сернистого ангидрида, затем до*
бавляют 0,15 г химически чистой мочевины); 2) 0.2%-иый раствор карбазола
и абсолютном этаноле (продажный препарат карбазола нужно перехристал*
лнэооать из бензола и очистить возгонкой; раствор карбазола хранят в
темноте при 4°; а этих условиях раствор устойчив до 12 недель); 3) галах*
гуроновая кислота; 4) ФЭК-М.Ход анализа. Из обессахаренной отшртом навески плодов
20 г извлекают воднорастворнмый пектин и доводят экстракт
до 200 см*. Такое же разведение применяют и для протопектина.
Для анализа берут 0,5 см* из каждого экстракта. Если оптиче¬
ская плотность окажется выше 0,45, то необходимо провести до¬
полнительное разведение и повторно измерить плотность. В каж¬
дые 3 пробирки, помещенные в сосуды со льдом и содержащие
по 0,5 см* исследуемого раствора, осторожно (по стенке) при¬
ливают по 3 см* раствора концентрированной серной кислоты
с боратом, охлажденной до температуры, не превышающей 4°.
Необходимо не допускать перегрева получаемой смеси, что до¬
стигается применением сухого льда и тщательным встряхива¬
нием пробирок в охлаждаемой смеси; в противном случае на179
поверхности соприкосновения раствора и кислоты температура
сильно повышается, что отрицательно отражается на воспроиз-
водії мости результатов. Затем пробирки нагревают б минут
на кипящей водяной бане (удобно помещать их в баню непо-
средственно в штативе). Увеличение длительности нагрева в од¬
них и тех же условиях понижает оптическую плотность раствора
пектина.После кипячения штатив с пробирками охлаждают в сосуде
с водой и льдом. В каждые 2 пробирки (из трех) с экстрактом
пектина добавляют по 0,1 см3 0,2%-ного раствора карбазола и
вновь помещают в кипящую водяную баню на 10 минут. После
охлаждения пробирок измеряют оптическую плотность при длине
волны 535 нм в кювете с рабочей длиной 5,06 мм. Отсчет пока¬
заний на ФЭК-М производят по левому барабану по шкале оп¬
тической плотности. С левой стороны для установления нулевого
положения помещают кювету с одной из трех проб (без кар¬
базола), с правой — кювету, содержащую смесь серной кислоты
с боратом и дистиллированной водой в соотношении 3:0,5. Рас¬
чет производят по калибровочной кривой, построенной по га-
лактуроновой кислоте (табл. 7).таблица 7	Величины оптическойплотности, соответ¬
ствующие содержанию
галактуроновой кис¬
лотыГалактуронова»
кислота (мкг)ОптическаяПЛОТНОСТЬГалактуроновая
кислота (мкг)Оптическаяплотность40.055250.23660,073300.28280.С91350.325100.102400.366І50.152450.410200.195500.454Для получения точных результатов замеры оптической плот¬
ности необходимо проводить в экстрактах или растворах галак-
туроновой кислоты, содержащих ее от 4 до 50 мкг в 0,5 см3
воды. В этих пределах интенсивность окраски растворов
прямо пропорциональна концентрации галактуроновой кис¬
лоты.Установлено, что при содержании глюкозы 60 мкг в 1 см3
развивается окраска, эквивалентная 8 мкг галактуроновой кис¬
лоты, и присутствие пентоз отражается в меньшей степени. При
отсутствии бората в серной кислоте чувствительность реакции
с карбазолом в отношении гексоз и пентоз значительно увели¬
чивается.180
Определение общего
количества гемицеллюлозГемицеллюлозы листьев И стеблей обычно определяют В ВОЗ'
душно-сухом материале, так как в этом состоянии листья и
стебли могут длительно храниться без изменения содержания
гемицеллюлоз.При определении гемицеллюлоз навеску 5 + 0,01 г подсу¬
шенного при 50° и измельченного материала помещают в колбу*
для определения гемицеллюлоз (при работе с сырым материа¬
лом навеску необходимо увеличить до 25 г) и одновременно
2 навески по 2—5 ±0,001 г — в бюксы для определения про¬
центного содержания воды.В колбу с навеской приливают 20-кратное количество дис¬
тиллированной воды и нагревают в кипящей водяной бане в
течение часа. Затем вытяжку сливают в мерную колбу через
фнльтр декантацией, остаток в колбе заливают новой порцией
горячей воды и извлекают еще в течение 30 минут на кипящей
бане. Присоединяют фильтрат к первому и, если требуется,
учитывают содержание сахара в нем. Остаток с фильтра тща¬
тельно переносят обратно в колбу, смывая 2%-4іой соляной кис¬
лотой. Учитывают количество использованной кислоты и еще
приливают ее в колбу с таким расчетом, чтобы общее количе¬
ство составило 225 см%. После этого колбы с обратным холо¬
дильником нагревают в течение 5 часов в бурно кипящей во¬
дяной бане. Фильтруют и по остывании переливают в мерную-
колбу на 250 см3, нейтрализуют до слабокислой реакции (по
лакмусу) раствором щелочи и осаждают основным уксуснокис¬
лым свинцом. В таком виде вытяжку можно оставить до сле¬
дующего дня.После этого вытяжку в колбе доводят до метки, отфильтро¬
вывают жидкость и берут параллельные пробы для определе¬
ния сахара по Бертрану.При определении гемицеллюлоз в большинстве случаев по¬
лучают хорошее схождение результатов (при анализе парал¬
лельно взятых навесок), поэтому можно на всю группу образ¬
цов, экстрагируемых одновременно на бане, делать параллельно
извлечение только в одном образце (на серию), что экономит
время.Нели параллельные пробы этого образца дают большое
расхождение (например, 17 и 14% гемицеллюлоз), необходимо
переделать анализы и других образцов.Процент сахара вычисляют как обычно, учитывая разбавле¬
ние и навеску, и найденную величину для перевода на гемицел¬
люлозы умножают на 0,9.181
нтозановМетод основан на гидролизе пентозанов кислотой до пентоз,
от которых отщепляется вода и образуется фурфурол. Фурфу¬
рол отгоняют и определяют. Наиболее простым по выполнению
является бромный метод определения фурфурола. Он основан
на взаимодействии 4 атомов брома с одной молекулой фурфу¬
рола в присутствии соляной кислоты. Метод требует для вы*
лолнения 4—5 часов.Реактивы: I) 0,1 н. раствор натрий-бромид-бромата (2,515 г NaBrOj
и 11,577 г NaBrHjO на 1 дм3 воды); 2) 12%-ная соляная кислота.Ход анализа. Г идролиз и отгонка фур фу рол а. На¬
веску 5 ±0,01 г воздушно-сухого материала помещают в колбу
Вюрца на 250—500 см3. Колбу закрывают каучуковой пробкой
со вставленной капельной воронкой; отводную трубку соединяют
с холодильником. В качестве приемника к холодильнику под¬
ставляют мерный цилиндр или стакан, градуированный на 30 см3.
В колбу Вюрца через воронку вливают 100 см3 12%-ной соля¬
ной кислоты, «после чего «нагревают при 160° на лесчаной бане
(знмнее авиамасло) или на бане со сплавом Вуда или Розе.
В прием пик следует вставить воронку с небольшим фильт¬
ром.После отгонки из колбы каждых 30 см3 дистиллята в нее че¬
рез капельную воронку добавляют свежую порцию 30 см3
12%-ной соляной кислоты; 30 см3 жидкости отгоняют в течение
не более 10 минут. Общий объем дистиллята должен составить
360 см\ его доводят до 500 см3 тем же раствором соляной кис¬
лоты. Полноту отгонки проверяют бумажкой, смоченной уксус¬
нокислым анилином (смесь равных объемов анилина и ледяной
уксусной кислоты); красное окрашивание бумажки указывает
на присутствие фурфурола. Для получения правильных резуль¬
татов необходимо всегда соблюдать одинаковые условия от*
гонки.Определение фурфурола. В 4 колбы с пришлифован¬
ными пробками помещают по 25 см3 0,1 н. раствора натрий-бро-
мид-бромата. В 2 колбы прибавляют ло 200 см3 дистиллята фур¬
фурола, а 2 другие служат для определения титра бромнд*бро*
мата, в них приливают по 200 см3 12%-ной соляной кислоты.
Колбы в закрытом виде выдерживают в темноте в течение часа.
За это время бром присоединяется к фурфуролу по реакции:
CjHtOj “f* Вг2 — С5Н4О2ВГ2.Затем в колбы приливают по 10 см3 10%-ного раствора КІ
и избыток иода оттитровывают 0,1 н. раствором гипосульфита.
Ло разности между результатом титрования контрольных и
опытных колб узнают, какой объем раствора гипосульфита по¬
шел на реакцию с фурфуролом. Умножив эту разницу на 0,0024,
узнают вес фурфурола в 200 см3. Для пересчета фурфурола на162
пентозани результат умножают на 1,08. Процент пентозаном
(х) вычисляют ^ формуле:2.5а • 1.08* 100
х~	мгде: а—количество фурфурола во взятом объеме;
н — навеска материала.Этот метод при повторных анализах дает лишь незначитель¬
ные отклонения.Определение лигнинаЛигнин — сложное высокомолекулярное соединение, ВХОДЯ'
щее наряду с целлюлозой и гемицеллюлозами в состав древе¬
сины. Лигнин содержит ряд функциональных групп (гидроксиль¬
ные, фенольные, метоксильные и др.). Это — инкрустирующее
ароматическое вещество, построенное в основном из фенилпро-
лановых структурных звеньев. Его не рассматривают как инди¬
видуальное соединение, считая термин «лигнин» собирательным,
названием для ряда больших молекул, близких по структуре.
Он не гидролизируется кислотами, растворяется в горячей ще¬
лочи и бисульфите.Качественно лигнин можно обнаружить пріґ помощи харак¬
терных для него цветных реакций, получаемых с фенолами
или с ароматическими аминами в присутствии соляной кислоты.
Но многие из этих реакций не являются, по-видимому, специ¬
фичными для самого лигнина. Количественно лигнин определяют
большей частью путем удаления целлюлозы и геми целлюлоз
гидролизом концентрированными кислотами и учетом по весу
остатка, представляющего «сырой» лигнин (остаток содержит
и минеральные вещества).Определение лигнина по модифицированному методу Кла-
сона. Этот метод предназначен для хорошо одревесневших ма¬
териалов и является одним из лучших.Для определения лигнина отвешивают навески 0,5—0,6 г
воздушно-сухого материала в пакетики из фильтровальной бу¬
маги .и экстрагируют смолы л доски їв аппарате Сокслета (ем.
главу IX) ацетоном, содержащем 10% воды (с учетом количе¬
ства воды в пакетах с материалом).Ацетон извлекает также растворимый лигнин.Затем пакетики просушивают в токе воздуха п навеску по¬
мещают в колбочки на 100 см\ сметая туда кисточкой частицы
навески с бумажного пакетика. После этого приливают 25 см9
раствора 72% -ной серной кислоты, закрывают колбу пробкой и
оставляют на 48 часов при 20е для гидролиза. По истечении
этого срока в колбу с темным осадком добавляют до 100 см?
воды и осадок отфильтровывают в стаканчике со среднепори¬
стой пластинкой (или в тигле Гуча с асбестом). Осадок промы¬18$
вают горячей водой, пока промывные воды не станут бесцвет¬
ными. После этого стеклянный фильтр с осадком высушивают
при 105° до постоянного веса и, вычитая первоначальный вес
стеклянного фильтра, узнают вес лигнина.Перечисляют его в проценты к навеске и вносят поправку
на растворимый в ацетоне лигнин, прибавляя 0,5%.Определение лигнина в травянистых объектах. Навеску
0,5—0,6 г измельченного материала (кожура семян, кочерыжки
кукурузы, листьев и др.) тщательно смешивают с 6 см* 37%-ного
фіормалина в стакане на 100 см\ прибавляют 6 см3 72%-ной
серной кислоты (и/р)» затем S см3 концентрированной кислоты
и оставляют на 24 часа при периодическом помешивании. После
этого к раствору добавляют 35 см3 смеси ледяной уксусной кис*
лоты и хлороформа (6:1) и после взбалтывания содержимое
стакана медленно переливают в стакан на 600 см3, в котором
находится 400—450 см3 воды. Хлороформ удаляют, нагревая
на водяной бане 15—20 минут, и дают отстояться осадку в те¬
чение 24 часов. Лигнин собирают во взвешенный стеклянный
фильтр № 2 (набитый стеклянной ватой). Далее, после про¬
мывки лигнина 5%-ной НС1 и водой, поступают так, как указа¬
но в предыдущем методе (поправки на растворимый лигнин не
делают).Примечание. При определении лигнина а растительных материал,
содержащих дубильные вещества, а также в травянистых объектах, богатых
белками и растворимыми углеводами, необходимо иметь 8 виду, что крепкие
кислоты могут способствовать образованию нерастворимых продуктов и за¬
вышать результаты. В таких случаях нааесхн после обработки ацетоном
сначала экстрагируют водой <при температуре 80*, в затем кипятят 3 часа
с 1 %-ной соляной кислотой.В некоторых случаях бывает достаточно отфильтрованный лигнин смыть
0,5%-ной НСІ в колбу и прокипятить несколько часов, а затем отфильтро¬
вать, промыть и после высушивания завершить анализ, как сказано выше.Последовательный анализ плодов
на содержание полисахаридов *Особенности анализа полисахаридов. Полисахариды, входя¬
щие в основном в состав клеточных стенок, обычно определяют
последовательным извлечением их из одной навески соответст¬
вующими экстрагентами. Широко распространены схемы ана¬
лиза, в которых после удаления этиловым спиртом свободных
сахаров остаток обрабатывается водой для извлечения всех
воднорастворнмых полисахаридов, затем растворами щелочи
разной концентрации для дифференцированного извлечения ге**	В. В. Араснмович, С. В. Б а л т а г а, Н. П. Пономарева. Ме¬
тоды анализа пектиновых веществ, гемн целлюлоз и пектолитнческих фермен¬
тов в плодах. Изд. АН Молдавской ССР, Кишинев, 1970.184
мицеллюлоз и, наконец, кислотой — для определения целлюлозы.
После кислотного гидролиза полученных экстратов определяют
редуцирующую активность каждого и вычисляют содержание
соответствующей группы полисахаридов.В излагаемой схеме, применяемой для анализа плодов,
предусматривается и определение содержания пектиновых ве¬
ществ. При извлечении «пектинов ibo все экстракты переходит и
некоторое количество гемицеллюлоз, которым в данном ходе ана¬
лиза пренебрегают. Поэгому остаток навески после извлечения
свободных сахаров спиртом обрабатывают обычными экстра¬
гентами для извлечения пектиновых веществ. Далее, как и в
других схемах, щелочными растворами извлекаются гемицеллю¬
лозы и кислотой — а-целлюлоза.При анализе на определение полисахаридов необходимо все
экстракции и гидролизы проводить в колбах, снабженных воз¬
душными холодильниками. Из оборудования надо иметь центри¬
фугу на 6 тыс. обімин с пробирками емкостью 50 см*.Подготовка материала к определению полисахаридов. Хо¬
рошо измельченную навеску (20 г сырого материала) помещают
в колбу с воздушным холодильником и обессахаривают в 3—4	приема кипящим 82-градусным спиртом на водяной бане по
15 минут (аналогично обрабатывают навески, фиксированные
спиртом и хранившиеся до анализа). Отфильтровывают через
бумажный фильтр (не складчатый) и остаток количественно
переносят на фильтр. Фильтрат служит для определения сво¬
бодных сахаров.Остаток на фильтре сушат ацетоном, промывая его 3—4 раза
новыми порциями, и оставляют на ночь на фильтре при ком¬
натной температуре. Остаток после высушивания должен быть
рыхлым. В нем определяют последовательно пектиновые веще¬
ства, гемицеллюлозы А, Б и а-целлюлозу. Если хотят учесть
и другие воднорастворимые полисахариды (гемицеллюлозы), то
остаток обрабатывают кипячением с водой (12 часов) и в этом
экстракте, после кислотного гидролиза и специальной подго¬
товки, определяют сумму пектиновых веществ и гемицеллюлоз
методом количественной хроматографии. При этом не получают
данных о раздельном содержании этих групп полисахаридов.
После извлечения волнорастворимых полисахаридов так же об¬
рабатывают остаток 5%-ным раствором щелочи (см. «Извлече¬
ние гемицеллюлоз группы А —стр. 186).Извлечение пектиновых веществ. Воздушно-сухой остаток
(после обработки ацетоном) переносят з колбу, заливают 50—
60 см* дистиллированной воды и экстрагируют прн 45° в те¬
чение часа (баня или термостат). Остаток полносгью отмывают
теплой водой на фильтре, в воронке Бюхнера. Экстракт доводят
водой до черты в мерной колбе на 100 или 200 см\ В этом экст¬
ракте находятся воднорастворимый пектин и другие раствори¬
мые в воде вещества.185
Остаток переносят опять в колбу и экстрагируют 30 мнн\
50 см3 0,05 н. НС1 на водяной бане при 80°. Экстракт I отфнльт
ровывают, а остаток в той же колбе заливают 30—50 см3 1%-
ного раствора Лимоннокислого аммония и экстр а пір уют в тече¬
ние часа на кипящей бане. Отфильтровывают экстракт II, объ¬
единяют оба экстракта и после доведения до определенного объ¬
ема определяют протопектин, как и воднорастворимый пектин,
карбазольным или объемным методом.Остаток после извлечения пектинов так же обрабатывают
.ацетоном и высушивают, как указывалось выше, после чего в
нем определяют гемицеллюлозы.Извлечение гемицеллюлоз группы А. Остаток экстрагируют
в колбе 35 см3 5%-ного раствора КОН 2 часа при комнатной
температуре и постоянном помешивании. После этого центри¬
фугируют или отфильтровывают в стеклянных стаканчиках с
пористым дном (J& 1 или 2), промывают водой и собирают
фильтрат с промывными водами в мерную колбу на 50 см3,
доводят до метки.В зависимости от ожидаемого содержания гемицеллюлоз по¬
ловину или весь щелочной экстракт нейтрализуют концентриро¬
ванной уксусной кислотой, доведя до pH 4,7 (около 5 см3 уксус¬
ной кислоты). Из общего объема нейтрализованного экстракта
25 см3 осаждают в стакане 4—5-кратным количеством 9о-гра-
дусного спирта. В осадке — гемицеллюлозы А.Извлечение гемицеллюлоз группы Б. Остаток после извле¬
чения гемицеллюлоз группы А экстрагируют 35 см3 25%-ного
раствора КОН при комнатной температуре также в течение
двух часов и постоянно помешивают. Экстракт нейтрализуют
(примерно 15 см3 концентрированной уксусной кислоты) до pH4,7	и доводят до 100 см3 в мерной колбе.Отбирают 50 см3 (из 100) и осаждают спиртом так же, как
лри извлечении гемицеллюлоз группы А.Количественное определение гемицеллюлоз. Осадки фракції
гемицеллюлоз А и Б (отдельно) отделяют от надосадочнои
жидкости центрифугированием, количественно переносят 10—
12 см3 2%-ного раствора НС1 или 3%-ного раствора HNOa в
колбы на 25 см’ с воздушными холодильниками и гидролизуют
на водяной бане 5—6 часов. Если гидролизуют азотной кис¬
лотой, то добавляют несколько крупинок нитрата мочевины
для предотвращения образования труднорастворимого осадка.
Окончание гидролиза определяют визуально.Полученный гидролнзат переносят в градуированную про¬
бирку или мерный цилиндр на 20 см* и доводят до определен¬
ного объема. Фильтруют через бумажный фильтр и определяют
в фильтрате содержание сахаров. При вычислении содержания
гемицеллюлоз каждой группы учитывают величину навески и
разведение.1S6
Пример вычисления. Навеска — 20 г. фракция гсмнцеліюлоз
группы А доведена до 60 дн* к осаждение спиртом проведено во воем
объеме. Объем гндролизата доведен до 12 с*3, нэ которых для определения
редуцирующих сахаров взято 3 см*. Найдено 0,85 мг глюкозы. Учитывают
величину навескн и разведение; для пересчета на гемицеллюлозы применяют
коэффициент 0.9. Количество гемицеллюлозы <а процентах на сырой вес вы*
чнеляют по формуле:0,85 - 12 - 100 0.9 л Л1„о А#
х — 3-20-100 О.ОІоЗ /о-Следует отметить, что применение растворов шелочи высо¬
кой концентрации для извлечения гемицеллюлозных полисаха¬
ридов перенесено из практики лабораторий по анализу древе¬
сины многолетних деревьев, где требуются жесткие условия
гидролиза. При анализе сочных растительных тканей (однолет¬
ние побеги, листья, проростки семян, плоды) следует, где воз¬
можно, избегать высоких концентраций щелочи. Поэтому ре¬
комендуется при работе с новым объектом испытать различные
более низкие концентрации щелочи, например 1%-ный раствор
для более растворимых гемицеллюлоз группы А и 5%' (жела¬
тельно до 10%, не выше) для труднорастворимых гемицеллю¬
лоз. При этом достичь более полного извлечения гемицеллюлоз
можно увеличением продолжительности экстракции, но не по¬
вышением температуры. Обработку раствором щелочи следует
вести, как указывалось выше, при комнатной температуре.Кроме того, при необходимости большего фракционирова¬
ния гемицеллюлоз из первоначальных экстрактов двух фракций
(А и Б) можно осадить дополнительные фракции нейтрализа¬
цией экстрактов, доводя pH до 4,2—4,5 (и обозначая их услов¬
но: например, гемицеллюлозы А» и Б|).И только после их осаж¬
дения и отцентрифугирования в остальном экстракте осаждают
гемицеллюлозы А и Б спиртом, как указано выше (при соотно¬
шении экстракта и спирта 1:5).Во всей работе, связанной с анализом гемицеллюлоз, следует
избегать контакта с воздухом, хотя бы просто изолируя щелоч¬
ные экстракты от него. Более правильно вести выделение геми¬
целлюлоз в атмосфере азота.Определение содержания а-целлюлозы. Остаток после извле¬
чения гемицеллюлоз, обработанный, как ранее, ацетоном, пере¬
носят в маленькую чашечку или стаканчик, заливают І0 см*
72%-ной серной кислоты и оставляют на 2 часа при комнатной
температуре. Затем содержимое стаканчика количественно пере¬
носят в колбу, используя для этой цели 150 см3 дистиллирован¬
ной воды (при этом достигается требуемая концентрация кис¬
лоты—около 5%), и «гидролизуют 6 часов на кипящей бане.Гидролнзат фильтруют и доводят до метки в мерной колбе
на 250 см9. Из экстракта, нейтрализованного 20%-ной щелочью,
берут 3 см* для определения редуцирующих сахаров. При вы¬
числении содержания а-целлюлоэы учитывают величину перво¬
начальной навески и примененное разведение.18Г
Определение
органических
глава vin кислот*Особенности
органических кислот
и методов их определенияОрганические кислоты растений разнообразны по своему
строению, н некоторые из них широко распространены в раз*
личных органах. Ряд кислот под влиянием ферментов находится
во взаимных превращениях (цикл трикарбоновых кислот; вза¬
имное превращение щавелевой, глиоксиловой и гликолевой кис¬
лот).Органические кислоты являются продуктами превращения
углеводов; при синтезе белков они образуют углеродные скелеты
аминокислот. Количественное содержание органических кислот
в растениях подвергается суточным и сезонным изменениям.
Установлено, что различные виды и сорта растений имеют раз¬
личие и ло содержанию в них отдельных органических кислот.Яблочная, лимонная, винная, щавелевая н другие кислоты
находятся в растениях не только в свободном состоянии, но и
в виде солей, главным образом калия, натрия и кальция. При
титровании (усреднении) нейтральные соли почти не учитывают,
а титруют почти исключительно свободные кислоты и кислые
соли. О содержании в растениях солей кислот можно судить по
щелочности золы, полученной при сжигании растительных ма¬
териалов: соли органических кислот при сжигании плодов обра¬
зуют карбонаты калия и кальция, обладающие в растворе
щелочной реакцией.Растворы солей органических кислот в смеси со свободными
кислотами являются буферами. Свободные кислоты, кислые и
нейтральные соли их находятся в подвижном равновесии, опре¬
деляемом концентрацией водородных ионов в растворе. В пло¬
дах и ягодах преобладают свободные кислоты, а в листьях они
содержатся главным образом в форме солей. В различных орга¬
нах растений органические кислоты распределены неравномер¬
но. В зависимости от условий выращивания культурных расте¬
ний кислотность плодов и овощей заметно изменяется. Кислот¬
ность плодов является не только сортовым, но и видовым при¬
знаком. Так, титруемая кислотность, выраженная в яблочной188
кислоте в процентах на свежие плоды, колеблется для груши
от 0,1 до 0,6%. сливы —от 0,4 до 3,5%, лимона—от 3,8 до 8%,
граната —от 0,2 до 9%.Почвенно-климатические условия, в которых выращиваются
культурные растения, а также удобрення и поливы влияют <на
накопление свободных кислот сообразно биологическим особен¬
ностям отдельных культурных растений. В процессе созревания
и хранения плодов и овощей происходят не только шменешия
общего количества свободных (титруемых) органических кис¬
лот, но существенно изменяется и их состав. Например, в не¬
которых незрелых плодах и в молодых листьях содержится ян¬
тарная кислота, тогда как в зрелых плодах и стареющих листь¬
ях накапливаются главным образом яблочная н лимонная.
В старых листьях щавеля, шпината, ревеня преобладает ща¬
велевая кислота, а в молодых — яблочная, лимонная и другие
кислоты. Некоторые виды растений характеризуются высокой
концентрацией тех или других кислот.Органическими кислотами, представляющими большой прак-
шческий интерес, являются лимонная, яблочная, винная, щаве¬
левая, янтарная и др. Извлечение этих кислот из растений
основано на хорошей растворимости их в воде, спирте и эфире.
Наиболее удобным способом для выделения органических кис¬
лот с целью последовательного количественного и качествен¬
ного их изучения является экстракция этиловым эфиром расти¬
тельных веществ, подкисленных минеральными кислотами. Ка¬
чественное и количественное определение органических кислот
основано не только на рациональном использовании различных
их химических свойств, но и на неодинаковой подвижности их
при хроматографировании на колонках, бумаге и в тонких слоях.Качественное определение
органических кислот
хроматографированием на бумагеСпецифические качественные реакции имеются для многих
органических кислот, однако методы их определения, как пра¬
вило, трудоемки (см. А. И. Ермаков и др., 1952). Более быст¬
рыми являются хроматографические методы на бумаге и в тон¬
ких слоях. Для разделения оргашгческнх мис л от существуют
кислые и основные системы реактивов.Кислыми системами реактивов являются следующие:1)	н-бутанол — 90% -ная муравьиная кислота — вода (4:1:5);2)	н-бутанол — уксусная кислота — вода (4:1:5); 3) эфир —
уксусная кислота —вода (9:4,5:2,5 или 13:3:1); 4) ксилол —
фенол 85 дг-ная муравьиная кислота (5:5:2); основными —
1) н-бутанол — насыщенный раствор 1,5 н. аммиака (смесь для189
разделения летучих кислот); 2) 30%-ный этанол — аммиак -
вода в соотношении 8:0,4:1,6 (смесь для разделения днкарбо
новых кислот, ароматических и фенолов); 3) 95%-ный этанол —
30%-ный аммиак (10:1).Кислоты обнаруживают опрыскиванием высушенных хрома¬
тограмм индикаторами с определенным pH. Для этого приме¬
няют: 1) раствор бромфенолового синего в спирте, pH 6,7 (ам¬
монийные соли образуют темно-синие пятна иа светло-синем
фоне); 2) раствор бромкрезолового зеленого в спирте (после
высыхания хроматограмм остаются темно-синие пятна на местах
нахождения кислот); 3) бромтимоловый синий — 50 мг на
100 см3 спирта, pH доводят до 10 (аммонийные соли кислот
образуют желтые пятна на зеленом фоне).Хроматограммы опрыскивают смесью растворов из 2 г глю¬
козы, 2 см* анилина в 20 см3 воды с 20 см3 спирта и 60 см3
бутанола. После высушивания в течение 10 минут при 115°
на месте кислот образуются темно-коричневые пятна (яа бе¬
лом фоне). Эти хроматограммы длительно сохраняются.Ниже приведен метод качественного определения органи¬
ческих кислот, основанный на сравнении высоты подъема иа
бумаге кислот в опытных пробах с подъемом органических кис-
лот-«свидетелей».Реактивы и аппаратура: 1) подвижная жидкость для хроматографиро¬
вания; 2) 0.1 н. раствор едкого натра; 3) 20%-кый раствор серной кислоты;4)	инднкатор бром фенол синий (40 мг растворяют в 50 см* 95%-ного спирт»
и добавляют по каплям 0,1 н. NaOH до появления сине-фиолетового окра¬
шивания. после чего доводят спиртом до 100 см}); 5) набор органических
кислот, из которых приготовляют 5%-ные растворы в 50%-ном спирте; фу¬
маровую и винную кислоты готовят 2%-ноА концентрации, а аконитовую —
0,5%-ноА; для использования приготовляют смесь, сливая вместе по 0.2 см*»
<1 из омеса берут каплю для нанесення на бумагу в качестве «свидетелей»;
6) адсорбционная трубка длиной 15 см. диаметром 15—20 мм или трубка
Аллнва; 7) хамера или сосуд для хроматографии или стеклянный колокол
высотой 45—50 см, диаметром 22 мм (рис. 24); 8) хроматографическая бу¬
мага (ленинградская, «медленная», вес 1 дм* — 1,20 г); 9) пульверизатор:
10) мнкропнпетка (рис. 25).Приготовление подвижной жидкости для хроматографирова¬
ния. Готовят смесь 250 см3 н-бутанола, 25 cjt3 муравьиной кис¬
лоты и 297 см3 дистиллированной воды*. Эту смесь взбалты¬
вают на аппарате для встряхивания (см. рис. 43) в склянке
с притертой пробкой в течение 4 часов, затем переливают в-
делительную воронку и дают отстояться в течение суток. По ис¬
течении этого срока происходит разделение на 2 слоя: а) верх¬
ний является н-бутаиолом, насыщенным муравьиной кислотой;
б) нижний — раствор муравьиной кислоты, насыщенный бута-
нолом. Таким образом, получают 2 раствора.*	С. В. Солдатонков рекомендует соотношение этих компонентов
18:2:9.190
Определение качественного состава кислот. В начале ана¬
лиза из сухого растительного объекта (плоды, ягоды) извле¬
кают свободные кислоты смесью серного эфира и ацетона
(2,5:7,5). Для этого хорошо измельченную навеску (1—3 г)
помещают в коническую колбу на 50 см* и, прилив 10—15 см3
смеси эфира и ацетона, закрывают колбу пробкой и взбалты¬
вают в течение 30 минут на любом аппарате для встряхивания(см. рис. 43). При определении
состава свободных и связанных
органических кислот к навеске
растительного материала прибав¬
ляют 2—3 капли 20%-ной серной
кислоты на 10 см3 экстрагирую¬
щей смеси эфира и ацетона. При
этом органические кислоты ос во¬Рис. 24. Стеклянная ка¬
мера для восходящей и
нисходящей хроматогра¬
фии на оумагс./ — стенке камеры. 1 — под¬
ставка (стекло или пластик).
J — кюкта. укрепленная на
бортах подстаакн. 4 — чаш¬
ка с растворителем. 5 —бу¬
мага. в — затвор Бунзена
в крышке.Рис. 25. Микропипеткн.I — медицинская, t — капил¬
лярная на стеклянной труб¬
ки, 3 н 4 — самоэаполияю*
щвеся на определенный
объем.бождаются из своих солей и извлекаются растворителем.При свежем анализируемом материале навеску (10 г) расти¬
рают с 4 г безводного сернокислого натрия и затем выдержи¬
вают в термостате при 40° до образования кристаллической
массы, из которой извлекают органические кислоты. После
30 минут встряхивания суспензию фильтруют через слой без¬
водного сернокислого натрия, для этой цели используют трубку
для хроматографирования, в суженную часть которой помещают
комочек ваты, а затем насыпают 3—4 сл^агБО*.191
Слой сернокислого натрия после фильтрования промывают
небольшой порцией смеси растворителей, применяя отсасыва¬
ние водоструйным насосом. Затем все вливают в фарфоровую
чашечку и выпаривают растворитель на водяной бане досуха.
Сухой остаток в чашке растворяют в 1 см* дистиллированной
воды.Хроматографирование. На заранее нарезанные полоски хро¬
матографической бумаги (40 см длиной и 3 см шириной) микро¬
пипеткой наносят на расстоянии 5 см от одного конца и 1 см3
от края* полоски одну каплю водного опытного раствора и про¬
сушивают. На эту же бумагу рядом, отступив на 1 см от стар*
тового пятна, наносят каплю растворов смеси органических
кислот («свидетелей»). Затем полоску хроматографической бу¬
маги другим концом подвешивают (пропуская стеклянную
трубку или палочку через 2 разреза, которые делают на по¬
лоске бумаги). Нижний конец со стартовым пятном погружают
в кристаллизатор с н-бутанолом, насыщенным муравьиной кис¬
лотой. Одновременно подвешивают полоску (35 X 35 см) филь¬
тровальной бумаги, смоченной муравьиной кислотой, насыщен¬
ной н-бутанолом для наполнения камеры его парами. После
этого хроматограммы накрывают стеклянным колоколом, края
которого должны находиться на прослойке, не пропускающей
лары.Проявление хроматограмм. Разделение органических кис¬
лот проводят в течение 18 часов (с вечера до утра) при 15°.
Утром хроматограммы снимают (линия жидкости на бумаге
не должна достигать самого верха полоски —ее отмечают ка¬
рандашом), просушивают на воздухе и проявляют раствором
индикатора (бромфенол синим), распыляя его при помощи
пульверизатора. Органические кислоты окрашиваются в ярко-
желтый цвет на голубовато-синем фоне. Совпадения пятен «сви¬
детелей» с пятнами опытного образца указывают на наличие
одних и тех же органических кислот.Расположение и идентификация органических кислот про¬
изводятся по величине Rf (отношению высоты поднятия пятна
органической кислоты к высоте поднятия растворителя). Вели¬
чина Rf зависит от системы жидкостей и температуры. При хро¬
матографировании по вышеприведенной прописи величина Rf
для кислот: щавелевой — 0,09; винной — 0,41; лимонной — 0,54;
яблочной — 0,64; маленновой — 0,78; молочной — 0,83; пирови-
ноградной — 0,84; янтарной — 0,89; фумаровой — 0,92.Определение титруемых
кислот (общей кислотности)Это определение основано на титровании определенных объ¬
емов экстракта раствором 0,1 и. щелочи в присутствии инди¬
катора. Результаты титрования выражают 8 процентах одной192
из наиболее распространенных или главных органических кис¬
лот, входящих в состав объекта.Реактивы: 1) 0,10 ii. раствор щелочи известного титра; 2) индикатор —
раствор 1 г фенолфталеина или р-метмлумбелнферона в 100 см1 этилового
спирта.Ход анализа. Две пробы по 20—50 см3 (из вытяжки, при¬
готовленной без добавления мела и уксуснокислого свинца)
вносят в конические колбы на 200 см* и добавляют в качестве
индикатора несколько капель (4—5) фенолфталеина при не¬
окрашенных или слабо окрашенных экстрактах и титруют раст¬
вором щелочи.Окрашенные вытяжки удобно титровать с 15 каплями флуо¬
ресцирующего индикатора (1%-ный спиртовой раствор р-ме-
тилумбелиферона). Если этого индикатора нет, то можно титро¬
вать в присутствии тнмолфталениа. Титровать следует 0,1 н.
раствором щелочи до розового окрашивания, а для повышения
точности применять точные бюретки или мнкробюреткн на 5 см3.Улавливание переходов окраски у слабо окрашенных жид¬
костей очень облегчается, если одновременно сравнивать с ря¬
дом стоящей колбой с таким же количеством вытяжки, с до¬
бавлением тех же 4—5 капель фенолфталеина (титрование со
«свидетелем»).Титрование с флуоресцирующим индикатором необходимо
проводить на темном фоне (подложив под колбу черную бу¬
магу), при дневном освещении, до появления заметной флуо¬
ресценции раствора.Для вычисления кислотности количество щелочи (в CMZ),
которое пошло на титрование пробы, переводят в куб. санти¬
метры только 01 н. раствора. Кислотность может быть выра¬
жена в процентах одной из наиболее широко распространен¬
ных кислот (яблочной, лимонной, винной).Общую кислотность вычисляют по формуле:а • 61 • 100где: а — количество куб. сантиметров 0,1 и. щелочи;бі — общий объем вытяжки;бі — объем вытяжки, взятый для титрования;
н — навеска материала.Если результат хотят выразить в какой-либо из основных
органических кислот, то умножают на коэффициент. Один
куб. сантиметр 0,1 н. раствора щелочи соответствует 7,5 мг вин¬
ной, 6,4 мг лимонной, 6,7 мг яблочной и 4,5 мг щавелевой кис¬
лоты. Нередко кислотность выражают в мнллиэквивалентах
(мэкв). Один куб. сантиметр раствора 0,1 и. щелочи соответст¬
вует 0,1 мэкв. Миллиэквивалент щелочи равен миллиэквиваленту
любой кислоты, поэтому легко миллиэквивалент щелочи пере-193
считать в проценты органической кислоты. Для этого доста¬
точно умножить число миллиэквивалентов на вес (в г) 1 мэке
кислоты.Определение лимонной кислотыЛимонная кислотаСООН СООН<!:на—с (он)-сн, соонявляется одним из компонентов цикла трикарбоновых кислот.
Она накапливается в значительных количествах в плодах и
листьях. В плодах цитрусовых, клюкве и других культурах она
составляет более 90% всех кислот. О качественных реакциях
на лимонную кислоту см. в первом издании данной книги
(А. И. Ермаков, В. В. Арасимович и др., 1952).Определение лимонной кислоты в плодах или листьях осно¬
вано на окислении лимонной кислоты перманганатом до аце*
тонднкарбоновой кислоты и броммровании этого продукта до
образования пентабромацетона. Последний определяют весо-
вым или объемным методом.Реактивы: 1) 20%-пая серная кислота; 2) 20%-ный раствор бромистого
калия; 3) 5%-ный раствор перманганата; 4) насыщенный раствор сернокис¬
лого железа (40 г в 100 ся* воды, подкисленной серной кислотой); 5) 0,1 и.
раствор едкого натра или едкого кали; в) 5%-пый раствор фосфорновольфра¬
мовой кислоты.Ход анализа. Извлечение лимонной кислоты из
сухих плодов и листьев. Отвешивают от 5 до 10 + 0,01 г
(в зависимости от количества лимонной кислоты в них), тща¬
тельно растирают в ступке с добавлением толченого стекла,
переносят в мерный цилиндр на 250 см' и водой доводят до
100 см*. Затем прибавляют 15 см3 20%-ной серной кислоты
(1:8). Оставляют па 15—30 минут и прибавляют воды до
200 см3. Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 2 часа; во
время' настаивания неоднократно взбалтывают, после этого
прибавляют 5—10 см3 5%-ной фосфорновольфрамовой или мета¬
фосфор ной кислоты, хорошо перемешивают я центрифугируют
или фильтруют через сухой фильтр в сухую посуду.Хорошим растворителем лимонной кислоты является аце¬
тон (в 100 частях растворителя 4 части кислоты). Извлечение
органических кислот ацетоном из сухого материала проводят
в аппаратах Сокслета (см. рис. 29). Ацетоновые вытяжки упро¬
щают дальнейшие процедуры.Окисление фильтрата. Берут 50 см3 прозрачного
фильтрата в колбу на 200 см3 и добавляют 5 см3 30%-ного раст¬
вора бромистого калия, 10 см* разведенной серной кислоты
(1:1) и после перемешивания быстро добавляют 20 см* 5%-ного194
раствора перманганата. Смесь оставляют на 10 минут под тя¬
гой, периодически взбалтывая без подогревания, затем охлаж¬
дают колбу до температуры 10°. Если появившийся вначале
бурый осадок двуокиси марганца исчезает, то определение надо
повторить с прибавлением большего количества раствора пер-
мангалата.Избыток окислителя удаляют прибавлением 20 см* насы¬
щенного раствора закисного сернокислого железа до полного
обесцвечивания. Смесь с образовавшимся в этих условиях пен¬
табромацетоном ставят в воду со льдом или в холодильник.
На этом этапе определение можно прервать до утра. За эта
время мутный раствор постепенно осветляется, а осадок уплот¬
няется на дне колбы.Затем сливают жидкость с осадка декантацией через стек¬
лянный тигель с пористым дном № 2. Фильтр с осадком тща¬
тельно промывают до нейтральной реакции ло метилоранжу.
Осадок пентабромацетона должен быть чисто белым или слабо
окрашенным.Тигель с осадком высушивают в эксикаторе над серной кис¬
лотой, взвешивают и, зная вес сухого тигля, по разности узнают
вес осадка пентабромацетона (СНВг*—СО—СВг3), I мг ко-
юрого соответствует 0,483 мг лимонной кислоты.Количество пентабромацетона можно определить н объем¬
ным методом. В этом случае промытый осадок с фильтра пере¬
носят в колбу на 200 см3, растворяя в 20 см* спирта, затем
добавляют 50 см3 о,1 и. раствора щелочи. Колбу ставят в воз¬
душную баню и нагревают 30 минут при температуре не выше
90° для полного растворения осадка. Затем раствор охлаждают
и избыток щелочи оттитровывают 0,1 н. серной кислотой в при¬
сутствии мегнлрота до ясно-розового цвета.Количество лимонной кислоты в процентах (х) вычисляют
по формуле:а • 0.483 - /С - 100
'v =	н	где: й — количество куб. сантиметров 0,1 н. щелочи, свя¬
занной в реакции с пентабромацетоном;0,483 — количество миллиграммов лимонной кислоты, соот¬
ветствующее 1 см3 0,1 н. щелочи;К—коэффициент разбавления (отношение объема эк¬
стракта к объему, взятому для окисления);
я — навеска материала.Определение яблочной кислотыЯблочная кислота (СООН—СНОН—СН2СООН) также яв¬
ляется компонентом цикла Крепса. Она широко распростране¬
на в растениях (главным образом ее левый стереоизомер) н на¬
капливается в них в больших количествах.7*195
Определение яблочной кислоты методом Ньючера и Викери.Хорошие результаты определения яблочной кислоты дает при-
менение метода Ньючера н Викери. Этот метод основан на по¬
лучении бромопроизводного яблочной кислоты, которое пере¬
гоняют с водяным паром в раствор парадинитрофеннл гидразина.
В результате реакции с 2,4-днннтрофен ил гидразином выпадает
нерастворимый в воде оранжево-желтый осадок — озазона. По¬
следний растворяют в пиридине и, прибавляя раствор щелочи,
получают синее окрашивание. Интенсивность последнего опре¬
деляют на спектрофотометре или колориметре сравнением ин¬
тенсивности окраски опытных растворов со стандартным раст¬
вором яблочной кислоты.Реактивы и аппаратура: 1) стандартный раствор яблочной кислоты;
2) растворы серной кислоты 1:4 и 1:1; 3) 1 н. раствор бромистого калня
(11,9 г на 1 дм* дистиллированной воды); 4) 1,5 н. раствор перманганата
(47,4 е на I д«э); 5) 3%-ная перекись водорода; 6) активированный уголь;
7) летролейный эфир с температурой кипения 35—60®; 8) 5 н. раствор ед¬кого натра (20 г на 1 дмг дистиллированной воды); 9) 2,4-дннитрофениЛгиД*
раэин; 10) лирндин с температурой кипения 116і; 11) этиловый (серный)
эфир — очищенный и свежеперегнанный (стр. 430); 12) фотоэлектроколорн-
метр ФЭК-М (рис. 27) или микроколорнметр; 13) аппарат Сокслета (см.
рис. 29); 14) установка для перегонки продуктов окислення яблочной кис¬
лоты с водяным паром (рис. 26), лучше на шлифах; 15) пробирки с отвод¬
ной трубкой; 16) мерные колбы на 250, *100 и 50 см*.Ход анализа. Извлечение кислот. Навеску в 5±0,01 г
сухого, тщательно измельченного материала растирают в ступке
с 4 см* раствора серной кислоты (1:4) и оставляют стоять
на ночь (для перевода органических кнслот в свободную фор¬
му). На следующий день добавляют для обезвоживания 5 г
безводного сернокислого натрия и, тщательно растерев, остав*196Рис. 26. Установка для перегонки с водяным
паром (на н. ш.).
ляют стоять на ночь. После этого Сухой порошок анализируе¬
мого материала количественно переносят в бумажный патрон
и извлекают кислоты 20-кратным объемом эфира, настаивая
в широкогорлой колбе в течение суток. Затем патрон с мате¬
риалом помещают в экстрактор аппарата Сокслета, сливая эфир¬
ный настой туда же, и продолжают извлечение в течение 20—24	часов. После этого эфирный экстракт переливают целиком
в делительную воронку на 250 см* и взбалтывают с 100 см3
дистиллированной воды (20—30 минут) до полного извлечения
органичеоких кислот. Эфир при этом обесцвечивается, а водная
вытяжка окрашивается, так как в воду, кроме органических
кислот, переходят пигменты и некоторые смолы. Водный слой
из делительной воронки сливают в мерную колбу на 250 см3
и доводят водой до метки. Из этого исходного раствора берут
в случае необходимости отдельно пробу для определения ли¬
монной кислоты *.Для определения яблочной кислоты берут 50 см3 этой вод¬
ной вытяжки, осторожно нейтрализуют 5 и. раствором едкого
натра с фенолфталеином и количественно переносят в мерную
колбу на 100 см\ куда добавляют 0,2 г активированного жи¬
вотного или древесного угля и доводят водой до метки. Сильно
встряхивают 2 минуты и затем фильтруют в сухую коническую
колбочку.Окисление яблочной и лимонной кислот.
В 2 конические колбы «а 100 см? берут по 25 см" фильтрата
и прибавляют по 3 см3 серной кислоты (1:1). 2 см3 нормаль¬
ного раствора бромистого калия, а затем колбу ставят на во¬
дяную баню при температуре не выше 20—22а на 10 минут.
После этого приливают 5 см* 1,5 н. раствора перманганата при
частом взбалтывании (реакцию следует проводить в вытяжном
шкафу, так как при этом выделяются пары брома). После
окончания реакции колбу охлаждают до 5—10° и добавляют
по каплям охлажденной 3%-ной перекиси водорода до полного
обесцвечивания раствора. Избыток перекиси водорода разру¬
шают, приливая по каплям слабый раствор перманганата до
появления бледно-розовой окраски.Удаление пентабромацетона. При наличии в ана¬
лизируемом материале лимонной кислоты она выпадает в виде
пентабромацетона (мелкий белый осадок). Для удаления по¬
следнего смесь обрабатывают петролейным эфиром. Для этого
окисленную смесь вместе с осадком пентабромацетона пере¬
носят в делительную воронку на 100—200 смг*. Остатки в колбе
смывают петролейным эфиром и также переносят в делитель¬
ную воронку. Смесь взбалтывают в делительной воронке 5—
6 раз, добавляя при этом каждый раз по 5—10 см3 петролей**	Винная кислота определяется в отдельно взятой навеске сырого или су¬
хого материала, так как для ее определения навески должны быть значитель¬
но больше, чем для определения яблочной кислоты.197
ного эфира. Промывание петролейным эфиром заканчивают,
когда осадок пентабромацетона полностью будет удален из раст¬
вора. Всего для промывания должно быть использовано 30—
60 см* петролейного эфира (в зависимости от величины осадка).Перегонка с водяным паром. Промытый водный раст¬
вор, освобожденный от пентабромацетона, переливают в колбу
Кьельдаля* и соединяют все части установки для перегонки.
Остатки петролейного эфира удаляют продуванием «грушей».
Трубку холодильника погружают в раствор 2,4-динитрофенил-
гидразина (см. приготовление раствора, стр. 199), 25—30 см3
которого наливают в коническую колбу на 100 смг. Отгонку
ведут при сильном нагреве до тех пор, пока в колбе останется5	смК Воду через холодильних пропускают только первые 5—
10 минут, затем приток воды прекращают и перегонку продол¬
жают. В приемнике образуется оранжево-желтый осадок оза-
зона — продукт реакции динитрофенилгидразина с окисленной
яблочной КИСЛОТОЙ.После отгонки с паром приемник с оранжевым осадком
отставляют от холодильника, предварительно обмыв трубку
струей воды от приставших частиц осадка. Колбу с осадком
охлаждают до комнатной температуры и осадок тщательно от¬
фильтровывают через стеклянный тигель с пористым дном
(№ 4). Затем несколько раз промывают водой, каждый раз
ополаскивая приемник для полного переноса оранжево-желтого
осадка в тигель. Тигель с осадком сушат в течение 2—3 часов
при 100—110°.Растворение оранжево-желтого осадка. Сухой
осадок в тигле растворяют горячим пиридином, отсасывая в
пробирку с отводной трубкой (всю дальнейшую работу, свя¬
занную с пиридином, лучше производить в вытяжном шкафу
с хорошей тягой). Пиридин нагревают до кипения, накрыв
колбу часовым стеклом. В тигель с осадком приливают 5—6 см3
горячего пиридина и отсасывают, повторяя эту процедуру
3 раза. Затем пиридиновый раствор из пробирки переносят в
мерную колбу на 25 см3 и туда же смывают остатки пириди¬
нового раствора в пробирке несколькими куб. сантиметрами
горячего пиридина. Раствор в мерной колбе охлаждают, дово¬
дят до метки пиридином и перемешивают. Из этого объема
берут 2—5 см? раствора озазона в мерную колбу на 100 см3,
приливают 50 см3 воды и 10 см3 5 н. раствора едкого натра.
Сразу же появляется голубая или синяя окраска в зависимости
от концентрации, которая не исчезает в течение двух часов.
Колбу доводят до метки и перемешивают.Колориметрирование. Раствор с голубой или синей
окраской фотометрируют, применяя светофильтр, пропускаю-*	Колбу Кьельдаля во время перегонки тщательно отепляют нля слегка
подогревают во избежание конденсации водяного пара.198
щнй свет с длиной волны 570 нм. Результаты определений на¬
ходят по составленной калибровочной кривой или при исполь¬
зовании колориметра, сравнивая со стандартным раствором яб¬
лочной кислоты.При измерении колориметром концентрацию яблочной кис¬
лоты в процентах (*) вычисляют по формуле:К • в • о • 100
х ~ в,. н *где: К—концентрация яблочной кислоты в стандартном раст¬
воре;в—толщина слоя стандартного раствора в колориметре
при равной интенсивности окраски;
ві— толщина слоя исследуемого раствора в колориметре;
а —разбавление;« — навеска.При определении яблочной кислоты в свежем раститель¬
ном материале необходимо к мезге или отжатому соку при¬
бавить столько 4 н. серной кислоты, чтобы pH стал около 0,6—
0,9, и затем обезводить сернокислым натрием. Навеска и раз¬
бавление должны быть рассчитаны на содержание яблочной
кислоты в пробе от 0,2 до 2,5 мг.Пример вычисления. 5± 0,005 г сухих ягод черной смородины
обработаны этиловым эфиром. Из этого экстракта кислоты переведены
в водную вытяжку и объем доведен до 250 см*. Отсюда взято 50 ел9
для окисления. Из этого объема яблочная кислота переведена в произ¬
водное с динитрофеиилгидразином. Желтый осадок — оэазона растворен в
25 cjk3 пиридина, из этого объема взято 5 см\ разбавлено до 100 см? и
окрашенный раствор сравнен в колориметре со стандартным раствором яб¬
лочной кислоты, в котором содержится 2 мг яблочной кислоты, толщина
слоя стандартного раствора (еі) — 30 мм, толщина исследуемого раствора
(о) — 32,5 мм, следовательно:0,002 • 30 • 25 • 100 • 250 л лп,* =	3-2.І ■ & ■ Sb ■ &— = 0,92Приготовление раствора 2,4-дн нитрофеннл-
гидразина. Берут в фарфоровую чашку 5 г этого реактива,
растворяют постепенно небольшими порциями (50 см3) соляной
кислоты (200 см3 обычной кислоты на 800 см3 дистиллирован¬
ной воды); затем смесь кипятят в чашке 1—2 минуты, хорошо
помешивая; после охлаждения раствор разбавляют водой до
1 дм* и фильтруют через плотный фильтр (фильтрование возоб¬
новляют перед употреблением).Приготовление стандартного раствора яблоч¬
ной кислоты. Яблочную кислоту дважды перекристаллизо-
вывают из воды и высушивают до постоянного веса в вакуум-
эксикаторе над серной кислотой. Навеску 200 мг яблочной кис¬
лоты растворяют в мерной колбе на 100' см* нормальным раст¬
вором серной кислоты и его доводят до метки. В растворе кис¬
лоты реактив сохраняется долгое время.199
Из этого раствора берут 5 см3, что соответствует 10 мг яб¬
лочной кислоты; в колбу на 100 см3 приливают 2 см* н. раст¬
вора бромистого калия, охлаждают ло 20° и добавляют 5 см31,5	н. раствора перманганата. После охлаждения реакционной
смеси до 10° обесцвечивают 3%-ным раствором перекиси водо¬
рода. Затем окисленную смесь перегоняют в колбу, содержа¬
щую 25 cjm3 2,4-динитр’офенилгіідразина, полученный осадок оза-
зона отфильтровывают, промывают и растворяют в горячем пи¬
ридине, доведя объем в мерной колбе до 25 см*. Отсюда берут5	см3, или 2 мг.Определение яблочной кислоты с а-нафтолом. Получение
экстракта описано на стр. 196. Из водного экстракта удаляют
в виде битартрата возможно присутствующую там винную кис¬
лоту.Объем фильтрата, содержащего до 200 мг яблочной кислоты,
упаривают на водяной бане до 50 см3. В теплый раствор при¬
ливают 2 см3 10%-ного раствора сернокислого цинка и каплю
фенолфталеина. Затем по каплям добавляют горячий насыщен¬
ный раствор Ва(ОН>2. После появления неисчезающей красной
окраски добавляют еще 1 см3 Ва(ОН)2. Смесь охлаждают,
водой доводят до 100 см3 н фильтруют через складчатый фильтр.
Затем в центрифужный стакан со смесью из 4 см3 96%-ного
спирта и 4 капель 10%-ного раствора хлористого бария прили¬
вают I см3 фильтрата. Содержимое стакана перемешивают стек¬
лянной палочкой и отстаивают в течение 10 минут. После этого
центрифугируют и надосадочную жидкость сливают. Центри¬
фужный стакан с осадком на несколько минут ставят вверх
дном на фильтровальную бумагу. Затем осадок дважды про¬
мывают 5 см3 60%-ного спирта, насыщенного бариевой солью
яблочной кислоты, и каждый раз центрифугируют. Осадок
растворяют в 5 см3 кипящей воды и переносят в фарфоровую
чашечку, дважды смывая теплой водой порциями по 2 см3.
Раствор в чашке почти досуха выпаривают на водяной бане и
охлаждают. Осадок увлажняют 2 см3 2,5%-ного раствора на¬
фтола в концентрированной серной кислоте и после нагрева¬
ния в течение 15 минут на кипящей водяной бане охлаждают.
В центрифужный стакан на 100 см3 наливают 25 см3 воды и
затем содержимое чашечки. В охлажденную смесь добавляют
10 см3 изооктнлового спирта. Анализ проводят в темной ком¬
нате, так как красящее вещество чувствительно к свету. Осто¬
рожно перемешивают н центрифугируют. Затем 5 см* окрашен¬
ного в желтый цвет раствора изооктнлового спирта смешивают
в центрифужном стакане с 25 см3 5%-ного водного раствора
NaHCOj. Смесь перемешивают и центрифугируют в течение
15 минут. Красную, совершенно прозрачную (в противном слу¬
чае следует повторить центрифугирование) водную фазу сохра¬
няют в темноте. Интенсивность окраски определяют фотомет¬
ром, используя зеленый фильтр (табл. 8). По калибровочной2С0
кривой, построенной в аналогичных условиях для растворов,
содержащих 10—200 мг яблочной кислоты в 100 находят
содержание яблочной кислоты.Для составления калибровочной кривой (см. стр. 202) берут
по 5 см3 раствора яблочной кислоты разной концентрации. Для
приготовления основного раствора 200 мг чистой, дважды пере»
кристаллизованной из воды н высушенной до постоянного веса1,	d-яблочной кислоты растворяют в 100 см3 1 и. раствора H2SO4.Фотоэлектроколориметр ФЭК-М (рис. 27). Назначение при¬
бора. Прибор, изготовляемый в СССР, предназначен для опре*
деления концентраций окрашенных веществ в растворах по ве¬
личине поглощения ими света в определенных частях спектра.
Мерой поглощения света служит величина, называемая экстинк*
циен (Е). Экстннкцня — £=/(. С. /. (закон Ламберта — Бера),Рнс. 27. ОбщнЛ вид фотоэлоктроколорнмстра (ФЭК-М)./ — держатели кювета. 2 — рукоятка для иасгройки. 3 — рукоятка для пе¬
реключения гальванометра. 4 — барабан для отсчета. 5 — гальванометр,6 — рукоятка светофильтров.где: К — коэффициент, зависящий ог свойства вещества и дли¬
ны волны поглощаемого света; С — концентрация изучаемого
вещества (в молях); I — толщина слоя (в см). Экстинкция раст¬
вора, пересчитанная на толщину слоя в 1 см, называется коэф¬
фициентом экстинкции. На фотометре при измерениях отсчи¬
тывают поглощение света в единицах экстинкции или в про¬
центах пропускания. Черные цифры на отсчетиом барабане
обозначают проценты непоглощенного света, прошедшего через
раствор, а красные цифры показывают экстинкцию.ФЭК-М и другие современные фотометры являются объек¬
тивными приборами. Равенство световых потоков, проходящих20!
через опытный и стандартный образцы, устанавливается двумя
фотоэлементами, включенными на нулевой гальванометр по
дифференциальной схеме. Прибор снабжен электрическим пн*
тающим устройством от сети и набором кювет с расстояниями
между рабочими гранями от 1 до 50 мм.Работа с фотоэлектроколориметром. Перед началом опреде¬
ления устанавливают лампу осветителя. Патрон лампы снабжен
регулирующими винтами, которыми лампа устанавливается так,,
что нить ее изображается на линзах. Проверка равномерности
освещения — нулевой точки производится следующим спо¬
собом. На пути правого и левого потоков света помещают кю¬
веты с чистым растворителем (спиртом, водой н др.). Шкалу
правого барабана устанавливают на 100% пропускания света.
Затем, вращая круговые фотометрические клинья, изменяют
освещенность на одном фотоэлементе так, чтобы уравнять токи
обоих фотоэлементов. При этом стрелка гальванометра должна
занять нулевое положение.Чтобы избежать ошибок, связанных с возможной неодинако¬
востью характеристик фотоэлементов прибора, рекомендуют кю¬
вету с исследуемым раствором помещать справа. Способ из¬
мерения зависит от диапазона измеряемых величин.Способ измерения оптической плотности.
В правый и левый потоки света ставят кюветы с растворителем.
Правый барабан устанавливают на нулевом делении шкалы
оптической плотности. Щелевая диафрагма имеет при этом
максимальную ширшу. Вращением круговых фотометрических
клиньев устанавливают стрелку гальванометра на нуль. Затем
на пути правого потока света ставят кювету с исследуемым
раствором. Вращением измерительных барабанов увеличивают
ширину щелевой диафрагмы и устанавливают стрелку, откло¬
ненную от нулевого положения, снова на нуль. Величину опти¬
ческой плотности раствора, или экстннкцню, отсчитывают по
правому барабану. Этот способ измерения является более точ¬
ным, так как одно деление шкалы составляет 0,5% шкалы.Перед определением концентрации опытного раствора при¬
бор градуируют по нескольким растворам с известными концент¬
рациями. Концентрацию опытного раствора определяют по ка¬
либровочной кривой, по измеренной оптической плотности при
подобранном светофильтре (табл. 8).Составление калибровочной кривой. В одну кю¬
вету фотометра наливают растворитель, а в другую — стандарт¬
ные растворы известной концентрации. Обычно бывает доста¬
точно 4—6 растворов различной концентрации, чтобы (после
определения их экстинкции или процента пропускания света)
навести на миллиметровую бумагу по оси абсцисс концентра¬
цию вещества, а по оси ординат — показания фотометра. Соеди¬
нив точки, получают кривую, которой пользуются для нахожде¬
ния любой концентрации вещества при данной толщине слоя.202
ТАБЛИЦА 8Окраска растворов при рамочной
длине волнКалибровку производят по красной шкале (экстинкция) или по
черной (процент пропускания).Выбор кювет проводят так, чтобы свет поглощался иссле¬
дуемым <в них раствором в пределах £«0,15 до 1,3 (по красной
шкале).Янтарная кислота (СООН—CHs—СН2—СООН) в некоторых
проростках и незрелых плодах содержится в значительных ко¬
личествах.Метод основан на извлечении органических кислот и пере¬
воде их в бариевые соли. Янтарную кислоту после окисления
перманганатом отделяют от других органических кислот (ли¬
монной, яблочной) и титруют.Реактивы и аппаратура: 1) раствор серной кислоты (1:4); 2) безводный
сернокислый натрий; 3) едкий барий; 4) 10%-ныА раствор хлористого барня;5)	5%-ныА раствор перманганата; 6) 20%-ный раствор сульфита; 7) 0,1 н.
раствор щелочи; 8) этиловый эфир и спирт; 9) аппарат Сокслета; 10) мерные
колбы на 200 еле3; 11) делительная воронка.Ход анализа. Извлечение кислот. Извлечение кислот
из сухого или свежего растительного материала проводят так
же, как при определении лимонной и яблочной кислот. Навески
около 10 г растирают с 4 см* раствора серной кислоты (1:4),
затем обезвоживают 5 г безводного NajS04 и органические кис¬
лоты извлекают сухим серным эфиром в аппарате Сокслета
(можно заменить это извлечение встряхиванием с эфиром, так
как янтарная кислота отличается хорошей растворимостью в
эфире).Из эфирного экстракта органические кислоты переводят в
водную среду (как указано в методе определения яблочной
кислоты). Остатки эфира удаляют выпариванием. Объем жид¬
кости доводят водой до 100 или 200 см3.Определение янтарной кислоты203Длипа
волн (юс)Пропущенный свет
< окрдсха раствора)ПогдошскныА свет
(дополнительная окраска)400-435ФиолетовыйЖелто-зеленый435-480СмннйЖелтый480—490Зелено-голубойОранжевый490-500Сине-зеленыйКрасный500-560ЗеленыйПурпуровый560-580Желто-зеленыйФиолетовый580—595ЖелтыйСиний595-610ОранжевыйЗелено-голубой610-750КрасныйСине-зеленый
Получение бариевых солей органических кис¬
лот. Берут 50 или 100 см3 охлажденной вытяжки в круглодон¬
ную колбу на 200 см\ нейтрализуют 1 н. раствором едкого ба¬
рия и добавляют 1 cju3 10%-ного раствора хлористого бария.
Затем колбу нагревают 10 минут на кипящей водяной бане
с обратным холодильником. Содержимое колбы переносят в
фарфоровую чашку и (выпаривают на водяной бане до сиропооб¬
разного состояния. Остаток после выпаривания растворяют в
20 смг воды, добавляют 80 см3 95% • ного спирта и дают постоять1—2 часа после перемешивания.Отделение органических кислот. По истечении
указанного времени осадок отсасывают н промывают спиртом.
После этого осадок смывают с фильтра струей воды в колбу и„
прибавив в общей сложности около 70 смй воды, колбу нагре*
вают для удаления спирта. Затем, нагревая колбу, постепенно
прибавляют 5%-ного раствора перманганата дэ сохранения
устойчивого красного цвета. Избыток перманганата и осадок
перекиси марганца удаляют прибавлением 3%-ной перекис»
водорода или прибавлением сульфита после подкисления реак¬
тивной смеси серной кислотой.Янтарную кислоту извлекают этиловым эфиром в аппарате
Сокслета в течение 8 часов из сухого порошка, полученного
после выпаривания водного раствора до 10—15 см\ с последую¬
щим смешиванием с 5 г безводного сернокислого натрия. После
извлечения эфир отгоняют, приливают 20 см3 воды и титруют
янтарную кислоту 0,1 н. щелочью (1 см3 0,1 н. щелочи соот¬
ветствует 5,9 мг янтарной кислоты).Щавелевая, янтарная, яблочная и лимонная кислоты могут
быть определены из одной и той же вытяжки.Определение винной кислотыВинная .кислота [СООН—СН(ОН)— СН(ОН)— СООН] в не¬
значительных количествах широко распространена в растениях,
а в больших количествах она находится в растениях семейств
виноградных, гераниевых и бобовых. Из четырех стереозо*
меров винной кислоты в растениях обычно встречается право¬
вращающая форма. Хороший метод определения винной кисло¬
ты основан на осаждении винной кислоты в присутствии уксус¬
ной кислоты в виде труднорастворимой кислой винно-калиевой
соли, которую оттитровывают щелочью:1)	С4Н0Ов + 2КОН + СНзСООН -* С,Н5ОвК + СНзСООК + 2НА
2) CtH5OeK + NaOH - C^O^KNe - Н.О.Этот метод позволяет определить количественно винную
кислоту в присутствии других органических кислот.204
Реактивы и аппаратура: 1) ii. раствор сермоП кислоты; 2) н. раствор ед¬
кого калия; 3) 5%-ный раствор фосфорковольфрамовоЛ кислоты (приготов¬
ление см. на стр. 434); 4) этанол; 5) 30%-ная уксусная кислота; 6) 0.1 н.
раствор едкого натра, титр которого точво установлен; 7) насос для отса¬
сывания; 8) колба для отсасывания (Бунзена); 9) тигли Гуча.Ход анализа. Извлечение винной кислоты. Экстракт
из высушенных или свежих плодов или других растительных
объектов готовят и очищают, как указано выше (стр. 203).
Обычно винная кислота, кроме листьев и ягод винограда, встре¬
чается в небольших количествах, поэтому в вытяжке (водной)
предварительно определяют примерное содержание органиче¬
ских жислот титрованием 0,1 н. раствором щелочи и выражают
в количествах винной кислоты (1 см3 0,1 и. щелочи соответст¬
вует 7,5 мг винной кислоты).Пробу фильтрата после осаждения 5%-ным раствором фос-
форно-вольфрамовой кислоты (см. определение лимонной кис¬
лоты) составляют такого объема, чтобы в нем содержалось не
меньше 100 мг винной кислоты, и выпаривают до 20 см* в хими¬
ческом стакане на 150 см*.Осаждение винной кислоты. К охлажденной вытяжке
приливают (до нейтрализации по фенолфталеину) 1 н. раствор
едкого калия и еще избыток в 3 капли. Затем добавляют 4 см
80%-ной уксусной кислоты и в течение двух минут приливают
80 см* 95-градусного спирта при постоянном помешивании.
Раствор энергично перемешивают стеклянной палочкой для
ускорения выпадения осадка. При замедленном осаждении трут
палочкой о стенку стакана. Стакан с выпавшим осадком белых
кристаллов кислой винно-калиевой соли помещают на ночь »
холод. Наутро спирт сливают декантацией, а осадок постепенно
переносят в тигель Гуча или стаканчик с пористым дном 80%-
ным охлажденным спиртом, применяя отсасывание. Осадок про¬
мывают до исчезновения кислой реакции в промывном спирте
(по фенолфталеину).Трехкратного промывания по 15 см* обычно бывает доста¬
точно. Необходимо полностью отмыть осадок от следов кис¬
лоты. Затем промытый осадок из тигля вместе с асбестом пере¬
носят обратно в тот же стакан на 150 см3 при помощи 100 см*
горячей воды. Для лучшего растворения осадка содержимое
тщательно взбалтывают, затем стакан с раствором нагревают
почти до кипения и полностью растворившийся кислый винно¬
кислый калий оттитровывают 0,1 н. щелочью с фенолфталеином
(1 см* 0,1 н. раствора едкого натра, пошедшего на титрование
этой соли, соответствует 15 мг винной кислоты).Содержание винной кислоты в процентах (х) вычисляется
по следующей формуле0.015 а -о*'100х -	Н • Обх205
где: 0,015 г винной кислоты, соответствующие 1 см3 0,1 н. раст¬
вора едкого натра*;а — количество куб. сантиметров 0,1 н. раствора едкого нат¬
ра, пошедшего на титрование кислого виннокислого кадия;об	— объем вытяжки;об| — объем пробы, взятой для анализа для осаждения вин¬
ной кислоты;н — навеска материала.Пример вычисления. Навеска свежих ягод винограда 100 г до*
ведена до 500 с*3, откуда взято 100 см* для осаждения винной кислоты.
На титрование осадка кислого виннокислого калия пошло 22,7 см? 0,1 н.
NaOH. Следовательно, процент свободной и связанной винной кислоты (х)
вычисляется по формуле:,= ™	- 1.70 °/»Определение
щавелевой кислотыВ форме слаборастворимой соли кальция, а также других
растворимых солей щавелевая кислота (СООН—СООН) ши¬
роко распространена в растениях. В свободном виде она на¬
капливается в значительных количествах в стареющих листьях
щавеля, шпината, свеклы, черешках листьев ревеня и других
растений.Метод количественного определения основан на осаждении
щавелевой кислоты в виде щавелевокислого кальция, почти не¬
растворимого в холодной воде.Реактивы и аппаратура: I) реактив для осаждення щавелевой кислоты
(к раствору 25 г хлористого кальция а небольшом количестве воды, поме¬
щенному в мерную колбу на 600 см3, доливают до метки 50%-ную уксус¬
ную кислоту н раствор 330 г кристаллического уксуснокислого натрия в
300 см* воды; оба раствора хорошо перемешивают, реактив выдерживают
48 часов при температуре 5—7° и фильтруют); 2) борная кислота; 3) 0,1 я.
раствор перманганата; 4) 1%-ный раствор AgNOy, 5) гомогенизатор (рис 2).Ход анализа. Для определения свободной и связанной в виде
кальциевой соли щавелёвой кислоты используют экстракт, по¬
лученный из свежего материала (см. стр. 191). Если определяют
в сухом материале, то 5 + 0,01 г сухих листьев растирают со
стеклянным песком, с 5 см* 10%-ной серной кислоты и неболь¬
шим количеством спирта. Затем все переносят в мерный ци¬
линдр или колбу и доливают водой до 250—500 см9, встряхивают
и оставляют на несколько часов или на ночь. Свободную ща¬
велевую кислоту определяют в водных вытяжках, полученных
без подкнелення (стр. 132)." При титровании кислого виннокислого калия 1 ея* того же раствора
соответствует 15 мг винной кислоты, так как прибавляемая щелочь вытес¬
няет из титруемой соли только один атом водорода.206
Для осаждения щавелевой кислоты в колбы на 200 см* бе¬
рут по 50 см3 вытяжки, приготовленной как указано выше, при¬
бавляют до щелочной реакции аммиак н 1—2 г борной кислоты
(последнюю прибавляют для затруднения осаждения солей вин¬
ной кислоты и ее оптических изомеров). Затем прибавляют
10 см3 реактива для осаждения щавелевой кислоты и остав¬
ляют на 48 часов при температуре не выше 7°. Выделившийся
осадок щавелевокислого кальция отфильтровывают и промы¬
вают горячей водой до отрицательной реакции на хлор (отсутст¬
вие осадка от прибавления нескольких капель 1%-ного раст¬
вора азотнокислого серебра). В дальнейшем щавелевую кислоту
определяют по одному из следующих спбсобов.1.	Осадок щавелевокислого кальция смывают с фильтра во¬
дой из промывалки в колбу и сразу же приливают горячую
10%-ную серную кислоту через тот же фильтр, чтобы раство¬
рить следы оксалата. Осадок в колбе при помешивании пере¬
ходит в раствор; при медленном растворении осадка колбу с
жидкостью нагревают. Фильтр промывают горячей водой и раст¬
вор титруют 0,1 и. раствором перманганата до появления розо¬
вой окраски. Зная, сколько см3 перманганата идет на титро¬
вание взятой пробы и зная титр перманганата по щавелевой
кислоте, узнают количество кислоты (в г).Процент щавелевой кислоты (х) находят по формуле:й •б • 100
* = в, • н ’где: в — общий объем вытяжки;а — щавелевая кислота в пробе вытяжки;в\ — объем пробы;н — навесха опытного образца.2.	Осадок щавелевокислого кальция вместе с фильтром пере¬
носят в колбу, растворяют в точном объеме титрованного раст¬
вора H2SO4 и избыток кислоты оттнтровывают 0,1 и. раствором
щелочи (1 см* 0,1 н. H2SO4 равен 4,5 мг щавелевой кислоты).3.	При больших осадках щавелевокислого кальция щавеле¬
вая кислота может быть определена весовым путем по окиси
кальция после озоления (I мг окиси кальция соответствует1,605 мг безводной щавелевой кислоты).Примечание. Лимоииая и винная кислоты могут осаждаться сов¬
местно со щавелевой кислотой; в этом случае получают завышенные ре¬
зультаты при титровании раствором перманганата, особенно лри небольших
концентрациях. Для определения щавелевой кислоты в небольших концент¬
рациях имеется ряд методов, в частности, микрометод, основанный на ре¬
акции с 2,7-диоксннафгалином. Метод позволяет определять от 3 до 200 мкг
щавелевой кислоты в пробе *.Микрометод Халливела ** рассчитан на определение 0,4—4 мг в пробе.*	R. Pereira. Mikrochemie und Mikrochem. A?ta, 36/37, 398, 1951.•* К. Пейх, М. Тракей. Биохимические методы анализа растений. Пе-
рев. с нем. под ред. М. Н. Запрометова. Изд-во ИЛ, 1960, стр. 346.207
Определение
пировиноградной кислотыПнровиноградная кислота (СНз—СО—СООН) в кислой сре¬
де реагирует с кислыми сернистокислыми солями (KHSOs или
NaHSOa), давая бисульфитиое соединение:СНз - СО СООН + NaHSOj - СН3С (ОН) - (OSOjNa) - СООН.Избыток прибавленного бисульфита связывают иодом:
NaHSOj -f I3 + Н30 - NaHSO, + 2 HI.Соединение пировиноградной кислоты с бисульфитом раз*
лагают н бисульфит оттитровывают иодом.Реактивы и аппаратура: 1) 1%-иый раствор бисульфита натрия (или ка*
лия; хранят 2—3 дня); 2) 0,1 н. и 0.01 н. растворы иода (готовят, как было
указано выше); 3) двууглекислый натрий; 4) 1%-ный раствор крах,
мала; 5) 5—10%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты; 6) мнкро*
бюретка (или бюретка) с делениями 0.025 см3', 7) мерные колбы на 200 и
300 сд1; 8) пнпеткн на 5, 10, 20 ex’; 9) ковичесхне колбы на 100 см3.Ход анализа. В коническую колбу наливают 20—25 см9 вы¬
тяжки и осаждают белки прибавлением нескольких капель раст¬
вора фосфорновольфрамовой кислоты (см. стр. 134). К 5—
10 см* вытяжки, из которой осажден белок фосфорновольфра*
мовой кислотой, добавляют 3 см3 1%-ного раствора бисульфита
натрия; содержимое колбы хорошо перемешивают и оставляют
на 30 минут. Затем избыток бисульфита удаляют сначала 0,1 н.
раствором, а затем 0,01 и. раствором иода.Соединение пировиноградной кислоты с бисульфитом разру¬
шают добавлением 1 г сухого бикарбоната натрия и выделив¬
шийся бисульфит оттитровывают 0,01 и. раствором иода (1 смг
0,01 н. раствора иода соответствует 0,44 мг пировиноградной
кислоты).В присутствии больших количеств аминокислот метод не
дает верных результатов. В таких случаях необходимо экстракт
молочной кислоты до окисления пропустить через колонку с ионо¬
обменной смолой.Определение кетокислотМетод* основан на том, что кетокнслоты образуют с фенил-
гидразинами гидразоны, плохорастворимые в воде. Они легко
экстрагируются из водной реакционной среды этилацетатом.
Гидрозоны кетокислот отделяют от образовавшихся гидразо-*	И. Вольф. Биохимические методы анализа растений. Перев. с нем.
под ред. М. П. Запромстова. Изд-во иностранной литературы, 1960, стр. 377.208
нов нейтральных карбонильных соединений н нспрореагноовав-
шего фенил гидразина экстракцией их водным раствором угле¬
кислой соды и фотометрнруют 2,4-дшштрофенилгидразоны. Кс-
токислоты дают в щелочном растворе интенсивное оранжевое
или красное окрашивание.Применяя избирательные растворители и фотометрируя при
определенной для гндразона каждой кетокислоты длине волны,
можно определить некоторые пн кетокислот отдельно. Основы¬
ваясь на этом принципе, кроме общего количества кетокислот,
определяют также пировнноградную и кетогл юта рову ю кислоты
отдельно*.Реактивы и аппаратура: 1) 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;2)	1.5 М раствор NaOH; 3) 0.1%-ныЛ раствор 2,4-диннтрофенил гидразин а
в 2 н. растворе соляной кислоты; 4) етилацетат; 5) центрифуга на 6 тыс. обо¬
ротов; 6) електрометр СФ-4Л (см. рис. 9).Ход анализа **. Навеску 1 ± 0,01 г растительной ткани расти¬
рают в ступке с 3 г стеклянного порошка и 2 см* воды. Добав¬
ляют еще 3 см3 воды, гомогенат переносят в центрифужную
пробирку на 15 см\ Затем 5 см3 10%-ного раствора трихлор-
уксусной кислоты порциями смывают остаток гомогената со
стенок ступки в центрифужную пробирку и центрифугируют
10—15 минут при 5 тыс. об/мин. К 2 см* прозрачного центри¬
фугата в трех пробирках добавляют по 0,7 см5 0,1%-ного
2,4-дннитрофенилгидразинового реактива и помещают иа водя¬
ную баню при 25° на 10 минут. Затем в первую пробирку, слу¬
жащую для определения общего количества кетокислот, вли¬
вают 5 см3 этилацетата, во вторую, в которой определяют пиро-
виноградную кислоту,— 5 см3 бензола, в третью — для опреде¬
ления кетоглютаровой кислоты — 5 гм3 н-бутанола. Пробирки
встряхивают в течение двух минут и после отстаивания водный
слой отсасывают пипеткой с вытянутым в капилляр носиком.
Затем во все пробирки добавляют по 4 см* 10%-ного раствора
карбоната натрия. После перемешивания верхний слой отбра¬
сывают, а из нижнего переносят по 2 см3 в кюветы и, добавив
по 2 см* 1,5 М раствора NaOH, колориметрируют на СФ-4А.
Общее количество кетокислот определяют при длине волны
420 нм; пнровиноградную кислоту при —372 нм, кетоглютаро-
вую — при 380 нм. Количество кетоглютаровой и пировиноград-
ной кислот определяют по калибровочным кривым (принцип
составления см. на стр. 202).*	Применительно к растительной ткани В. Л. Кретовнч рекомендует ко*
личественное определение содержания аминокислот проводить посредство»
восстановления гидразонов кетокислот до соответствующих аминокислот, а
последние учитывать методом количественной хроматографии.••И. В. Вумбу. Физиолого-биохимичесхие исследования в системе па*ЕІЗМТ—хозяин при некоторых фито гельминтоз ах. Автореферат диссертации,
[ишннев, 1968.209
Хроматографический метод
определения органических кислот(по С. В. Солдатенкову и Т. А. Мазуровой)Метод количественного и качественного определения осно¬
ван на экстракции органических кислот, очистке их на катио¬
ните КУ*1, превращении в бариевые соли, разделения барие¬
вых солей в растворах спирта и хроматографировании на бу¬
маге органических кислот.Реактивы и аппаратура: 1) 0,1 н. раствор Ва(ОНЬ; 2) этнловыА спирт
н эфир; 3) 7%-ный раствор HCI; 4) смеси растворов I и II для аолвижвых
фаз; 5) хроматографическая бумага (ленинградская № 4, «медленная» или
№ 2, «быстрая»); 6) ионообменная колонка для разделения органических
кислот.Приготовление смеси растворов I и II для
подвижных фаз. I. В течение 30 минут взбал¬
тывают смесь н-бутанола, муравьиной кисло¬
ты и воды (18:2:9) и используют ее верх¬
ний слой, если не надо разделять и количест¬
венно определять лимонную и яблочную
кислоты, или в том случае, когда одна из них
отсутствует. Эта смесь мало летуча, окружаю¬
щая температура не оказывает существенного
влияния на разделение смеси винной, лимон¬
ной (или яблочной), малоновой, аконитовой,
янтарной и фумаровой кислот.II.	Серный эфир, вода и муравьиная кис¬
лота в объемах 18:9:5. Верхний слой этой
смеси хорошо разделяет яблочную и лимон¬
ную кислоты при их одновременном присут¬
ствии.Ионообменная колонка и работа с ней.
Для аналитических работ с органическими
кислотами растений удобна специальная ко¬
лонка (рис. 28), которую наполняют ионооб¬
менной смолой КУ-1. Оптимальными размера¬
ми частиц смолы считают 0,3—0,1 мм. Более
мелкие частицы затрудняют продвижение раст¬
воров через колонку. Около 15—20 г ионооб¬
менной смолы растирают в ступке и просеи¬
вают через сито до необходимых размеров
частиц, насыпают в коническую колбу на 250—300 сл\
приливают 200 смг дистиллированной воды и ставят для набу¬
хания на 3 часа, часто взбалтывая. Набухший катионит много¬
кратно промывают дистиллированной водой до полной прозрач¬
ности. Затем на дно колонки кладут немного стеклянной ваты,
катионит переносят порциями вместе с водой, трамбуя каждую
порцию стеклянной палочкой с резиновым наконечником, иРис. 28. Кологіха
для разделения
органических кис¬
лот.210
сверху катионита помещают слой стеклянной ваты. После этого
через колонку пропускают 7%-ный раствор НС1 со скоростью
истечения 1,5—2,5 см3 в минуту до тех пор, пока не уравняются
концентрации кислоты в фильтрате н в исходном растворе. Обыч¬
но для заполнения колонки, содержащей 15 г катионита» доста¬
точно 120—150 смъ кислоты. После заполнения колонки катио¬
нит промывают водой до полного исчезновения HCI в фильтра¬
те. Если кагионит отмыт от избытка НС1, то 75—100 см3 про-
мывной воды должны окрашиваться от 1—2 капель раствора0,1 н. щелочи с фенолфталеином — промытая колонка готова
для работы.По использовании 3Л обменной емкости колонки смолу в пен
надо заменять.Ход анализа. Подготовка материала. Навеску 3—5	+ 0,01 г сухого измельченного растительного материала зали¬
вают дистиллированной водой (1:30; 1:50) в колбе на 250 см3.
Затем колбу ставят в термостат при 60° на один час и время
от времени содержимое колбы перемешивают. Через час экст¬
ракт отфильтровывают на воронке Бюхнера в колбу Бунзена.
После этого осадок экстрагируют таким же образом еще 2 раза.
Объединенный экстракт ставят в холодильник, если хотят про¬
должить анализ на следующий день Объединенный экстракт
фильтруют в случае надобности непосредственно в колонку,
заполненную смолой КУ-1, установив над ней маленькую во¬
ронку с фильтром. Оптимальная скорость пропускания экстрак¬
та через колонку 1,5—2,5 см* в минуту. После того как через
колонку пропущен весь экстракт, ее трижды промывают водой
порциями по 75 см3. Затем экстракт и промывные воды объеди¬
няют и нейтрализуют 0,1 н. Ba(OH)i в присутствии фенолфта¬
леина до розового окрашивания. Рассчитывают общее содержа¬
ние кислот в материале. Измеряют объем нейтрализованного
экстракта.Выделение кислот. Титрование раствора кислот бари¬
том позволяет: 1) определить общее содержание кислот; 2) раз¬
делить кислоты на группы, используя различную растворимость
их бариевых солей в растворах спирта, так как бариевые соли
ди- и трикарбоновых кислот осаждаются 60%-ным спиртом на
90-95%.При титровании водного раствора кислот баритом может
выпасть осадок бариевых солей — щавелевой, фосфорной и сер¬
ной кислот, если они были в растворе. Для полного выпадения
этих солей экстракт нагревают почти до кипения, отстаивают
до следующего дня и осадок фильтруют или центрифугируют.
Из прозрачного фильтрата, объем которого известен, берут
50—100 см3, снова пропускают через колонку с катионитом и
затем отмывают водой. Полученный раствор вместе с промыв¬
ными водами нейтрализуют 0,1 н. Ва(ОН)2 и определяют содер-2U
жанме фракции органических кислот, пересчитывая на весь
объем.По разности между количеством барита, использованного
при определении общей кислотности, и фракции органических
кислот высчитывают содержание кислот, бариевые соли которых
выпадают в осадок при нейтрализации экстракта. Остаточную
часть фильтрата (раствор бариевых солей органических кислот)
сгущают в вакууме на кипящей водяной бане в фарфоровой
чашке до общего объема 25—30 см3. Затем сгущенную жидкость-
переносят о мерный цилиндр с притертой пробкой, доводят
до 37 см3 водой, а затем доливают до 100 см3 96%-ным
спиртом.Если на титроваїше экстракта пошло более 100 см3 0,1 н.
раствора барита, что указывает на высокую концентрацию кис¬
лот в экстракте, то этот раствор солен сгущают до 74 см* и
доводят спиртом до 200 см3. В цилиндре создается 60%-ный
спиртовой раствор органических кислот, в котором выпадает
осадок бариевых солей ди- и трикарбоновых кислот. Его от¬
фильтровывают на другой день через небольшую воронку Бюх¬
нера, но лучше отцентрифугировать. Прозрачный центрнфугат
сливают, осадок заливают 20—25 см3 60%-ного спирта, расти¬
рают палочкой и снова отцентрифугируют. Операцию повторяют2—3 раза, каждый раз сливая промытый спирт. Наконец, оса¬
док в центрифужной пробирке заливают горячей водой, взму¬
чивают и количественно переносят в коническую колбу. Нагре¬
вают раствор и добавляют воды до полного растворения осадка.
Если в растворе остается незначительная муть, то его фильт¬
руют, пропускают через катионит и отмывают водой. Затем
определяют объединенный объем полученного фильтрата. Часть
раствора нейтрализуют 0,02 и. щелочью по фенолфталеину для
определения общего количества дн- и грикарбоновых кислот.
Оставшийся раствор сгущают в вакууме или на кипящей водя¬
ной бане до 5%-ной концентрации по яблочной кислоте. Сгу¬
щенный раствор используют для хроматографии.Качественная хроматография нелетучих кис¬
лот. Хроматографическую бумагу № 4 режут на полоски. За¬
тем, отступив 2,5 см от узкой стороны полоски, проводят ка¬
рандашом линию и на ней ставят точки на расстоянии 1,5 см
от длинных сторон листа и 3 см одна от другой. В местах то¬
чек наносят тонким капилляром или микропнпеткой (рис. 25)
5—6 «апель одного из растворов кислот-«свидетелей», подсуши¬
вая феном или комнатным вентилятором места после занесе¬
ния каждой капли.«Свидетелей» (яблочная, лимонная и другие кислоты) при¬
готовляют заранее в концентрации 3—4% в 50%-ном этиловом
спирте. Затем на одну из свободных точек наносят таким же об¬
разом раствор изучаемых кислот, полученный из осадка барие¬
вых солей.212
После нанесения проб полоску бумаги подвешивают в ка-
мере (рис. 24), затем наливают смесь растворителей I через
стеклянную трубку, доходящую до дна камеры,—(подвижная
фаза) так, чтобы ее уровень был на 1 гм ниже стартовой линии
на хроматограмме с нанесенными кислотами. Спустя 24 часа
хроматограмму вынимают из камеры и подсушивают в вытяж¬
ном шкафу фіеном в течение 15—20 минут. Затем оставляют
хроматограмму на ночь при комнатной температуре и на сле¬
дующий день (около двух часов) сушат при 70°, чтобы удалить
следы муравьиной кислоты, мешающей проявлению. Затем про¬
являют водным (или спиртовым) 0,05%-ным раствором бром-
фенол синего.Для выяснения качественного состава кислот опреде¬
ляют R1 кислот; для этого измеряют расстояние между линией
нанесения кислот — «стартом» и границей подъема раствори*
теля, а также расстояние между линией старта н верхней гра¬
ницей пятна кислоты, а затем делят вторую величину на
первую.Определив Rf для каждой кислоты, сопоставляют его с
Rf кислоты-«свидетеля». Совпадение величины Rf «свидетеля»
и определяемой кислоты растения в значительной мере может
служить одним из показателей их идентичности.Для количественного определения нелетучих органиче¬
ских кислот наносят исследуемые растворы так, чтобы общее
количество кислот на старте всех точек составило 15—20 мг.
Таким путем изготовляют 2 хроматограммы, которые помещают
затем в камеру (см. рис. 24), и осторожно наливают одну из
смесей для разделения. При разделении смеси кислот смесью
растворителей II окружающая температура воздуха должна
быть 12—14° (но не выше 18°). Через 24 часа после начала раз¬
деления бумагу вынимают из камеры (камеру сразу же прикры¬
вают во избежание испарения эфира), подвешивают в вытяжном
шкафу на штативе, подсушивают феном 15—20 минут и снова
помещают в камеру еще на 24—26 часов. Затем ее подсушивают
в тяге феном и оставляют на воздухе до следующего дня.
Для удаления следов муравьиной кислоты сушат еще 2 часа
при 60—80°. Для выявления мест расположения органических
кислот на хроматограмме ее кладут «а чистое стекло, затем
тонким капилляром или микропипеткой набирают проявитель
(бромфенол синий) и мелкими каплями наносят его редким
пунктиром по длине хроматограммы. Начиная от места рас¬
положения кислот пунктир становится желтым, а в промежут¬
ках между ними остается голубым. Если муравьиная кислота
полностью не удалена, то пунктир на всем протяжении будет
желтым, и в этом случае сушку следует продолжить.Для точного установления каждой зоны точки проявителя
наносят чаще и место расположения кислот очерчивают каран¬
дашом, чтобы затем их вырезать для элюирования. Если между213
двумя зонами расстояние оказалось малым (5—30 мм), то ли¬
нию раздела проводят посередине участка голубого пунктира.
Так получается несколько отграниченных зон, соответствующих
набору кислот в изучаемом растворе.Элюирование органических кислот. Зоны распо¬
ложения на бумаге отдельных кислот разрезают иа узкие корот¬
кие ленточки. Соответствующие зоны с одновременно получен¬
ных хроматограмм объединяют и экстрагируют 3 раза во¬
дой (по 15 см3), медленно нагревая до кипения. Элюат каждый
раз сливают в мерную колбочку на 50 см3, охлаждают, доли¬
вают до метки водой и перемешивают. Затем берут 25 см• раст¬
вора кислоты и титруют 0,02 и. раствором щелочи из микробю¬
ретки (рис. 36) в присутствии трех капель раствора фенолфта¬
леина, защищая раствор от углекислоты воздуха.Пример вычисления содержания ди- н трикарбоно-
пых кислот. Навеска 3±0,01 г сухой цветной капусты. На титрование
экстракта, пропущенного через катионит, пошло 47 см3 0,1 н. раствора ед¬
кого барита (I ай* 0,1 и. раствора едкого барита соответствует 6,7 мг яб¬
лочной кислоты). Общее содержание кислот в нашей навеске равно 314,74 мг
(в пересчете на яблочиую кислоту).При вычислении общего содержания кислот общий объем
раствора был 550 см*, а на титрование 50 см* раствора ди- и трнкарбоновых
кислот (после пропускания через колонку) пошло 4.76 см? 0,02 н. едкого
натра; следовательно, на весь объем раствора пошло 52.36 см*; 1 см* 0,02 и.
едкого натра соответствует 1,34 мг яблочной кислоты, следовательно во всем
растворе содержится 70,1 мг ди- и трнкарбоновых кислот в пересчете на
яблочную кислоту.При вычислении содержания отдельных кислот для титро¬
вания элюатов (после выделения винной, лимонной и яблочной кислот)
пошло 0,02 н. едкого натра: соответственно — 1 с**; 5,88 см1; 1,28 см3.
Таким образом, всего на титрование пошло 8,16 см* 0,02 н. едкого натра.
Приняв указанную величину за 100. узнаем, что объем щелочи, пошедшей
на штроваиие винной (хі). лимонной (х?) и яблочной (хі) кислот состав¬
ляет: Х\ ■= 12,25%; х* *» 72,06%; х3 — 15,69%.Затем вычисляют, какой объем 0,02 а. едкого натра приходятся иа
долю каждой кислоты, если на титрование всего количества ди- и трнкар¬
боновых кислот пошло 52,36 см*. Так. количество щелочи (х), пошедшей
на титрование винной кислоты, равно:52,36 • 12.25
х~ 100 ~ ,41 ем •Коэффициент пересчета для винной кислоты —1,5; тогда 6,41X1.5-
—9,61 мг винной кислоты в 3 г навески, а в 100 г соответственно будеї320,5	мг, нлн 0,32% винной кислоты. Таким же образом делают расчет для
лимонной и яблочной кислот. Коэффициенты пересчета на кислоты: яблоч¬
ную 1,34; лимонную 1428; янтарную 1,18. В нашем случае определено 1,61%
лимонной и 0,37% яблочной кислот.Зарядка (регенерация) ионообменной колонки.
Установлено, что ионообменная емкость смолы КУ-l соответст¬
вует 1,5 мг-экв поглощенного катиона.В случае пропускания солей органических кислот 1 г катио¬
нита КУ*1 связывает 1,5 мг-экв бария. Атомный вес бария—*214
137,4; валентность бария — 2, следовательно, 1,5 мг-экв бария
составляет:137,4. 1,5— 2 = 103 мг,т. е. 1 г КУ*1 соответствует 103 мг бария, а 15 г КУ-1 — 1,545 г
бария. В нашем случае 15 г КУ-1 (одной колонки) соответст¬
вует 1,55 г бария.Пример вычисления. На титрование раствора свободных кислот
пошло 37 ел* раствора едкого барита с фактором, вавным 1,23. Титр раствора
составлял 10,7 мгісм*. Таким образом, получаем 37-10.7 — 395,9 мг бария —
0,40 г, т. е. в вашем случае 0,40 г связалось с катионитом. Учитывая, что
зарядку колонки с иовитом рекомендуется производить после использования
75% ее обменной емкости, получим 1,55-0.75=» 1.17 г бария. Непоглощен¬
ного бария осталось в нашем случае 1,17 —0,40 «0,77 г бария. После по¬
глощения еще 0,8 г бария необходимо произвести регенерацию колонки.
Определение
жирных масел
глава їх и других липидов*Особенности жирных масел
и методов их определенияМасла широко распространены в растительном мире. Они
находятся в значительных количествах не только в семенах, но
и в .мякоти плодов, в корневищах, в зародышах зерна злаков,
в коре деревьев и в листьях.Главным же сырьем для получения растительных масел яв¬
ляются семена и мякоть плодов маслин и пальм. Масличные
культуры, представляя большое разнообразие сортов, отли¬
чаются одна от другой не только количеством масла в семенах,
но и его качеством. Особенностью масличных семян является
более низкое содержание воды по сравнению с немасличными
семенами в одних и тех же условиях хранения. Изменчивость
содержания масла в семенах зависит от условий выращивания,
сортового разнообразия и степени зрелости семян (табл. 9).
Содержание масла в семенах различных форм одного и того
же вида подвержено большим колебаниям, иногда достигая
разницы в 1,5—2 раза; однако устойчивые сортовые различия
на 10% (например, от 20 до 22 или от 40 до 44%) надо счи¬
тать уже значительными.Соотношение основных запасных веществ в семенах яв¬
ляется типичным для различных видов растений. Видимо, эти
определенные соотношения особенно важны для обеспечения
обмена веществ н развития проростка. Можно наблюдать
также, что величина семян и соотношение между ядром и обо¬
лочкой в различных условиях выращивания изменяются в боль¬
шей степени, чем изменяются количественные соотношения
упомянутых главнейших веществ. Однако происходящие изме¬
нения количества масла в семенах у одних и тех же сортов
под влиянием различных условий выращивания представляют
большое практическое значение. Эти изменения должны быть
правильно установлены и оценены.При сравнительной оценке сортов в селекционной практике
важно выделить и установить различия в количестве и качестве
масла, связанные с наследственной природой сорта. Для этого216
таблица 9	Внутривидовые колебания мае-личности семян и незаменимых
жирных кислот в масле у раз¬
личных культур (колебания
средних величин за 2 года)(в процентах)МЛСЛИ’4-
ность
ссмян 'Кислоты маслаКультуралннолеваадсно-
дспои вЛен прядильный, масличный . .33-519-1436-66Конопля среднерусская 	31—3744-5819—27Горчица сизая	35-4610—«243-1234—4215-2020-33Рапс озимый	40-5212—163-Ю15-2344—653-12Подсолнечник (ядро-зародыш)
Хлопчатник мексиканский (ядро-40-6640-720-2зародыш) • •*•••••••♦36—4345-580Арахис (ядро-зародыш)	44-6020-43052—6540-480Кукуруза (зародыш)	40-5260-70020-4030-600-4необходимо принять такой метод выращивания и такой подход
в составлении проб для анализа, которые позволят правильно
сравнивать результаты (см. стр. 6).Накопление масел в семенах полевых культур зависит от
питания растений и обеспечения их водой. Для увеличения на¬
копления масла большое значение имеет нормальное увлажне¬
ние почвы в процессе вегетации и особенно в период от цвете¬
ния до созревания семян, а также и обеспеченность растении
в почве более высокими количествами фосфорной кислоты по
сравнению с азотом. Минеральные удобрения и орошение поз¬
воляют управлять накоплением масла в семенах. Сроки посевов
также являются мощными факторами не только в повышении
общей урожайности семян, но и в изменении количества и ка¬
чества масла в семенах.Количественное определение масел основано на их физиче¬
ских и химических свойствах. Наиболее широко распростра¬
нены методы, основанные на экстракции масла из определенных
навесок и последующем взвешивании полученного масла или
высушенного обезжиренного остатка после удаления раствори¬
теля. В ряде случаев для количественного определения масла
пользуются различием в светопреломляющей способности ма¬
сел и их растворителей или же различием в плотности масел и
растворителей, а также используют явления ядерно-магннтного
резонанса. Для некоторых случаев, когда при извлечении масла
вместе с ним извлекается много других веществ, разработаны
методы, в которых используется свойство масел расщепляться.217
Для идентификации отдельных масел в Оольшинстве случаев
бывает достаточно определения физических и некоторых хими¬
ческих показателей.В отдельных случаях приходится прибегать к сложным хи¬
мическим анализам. Качественные реакции на отдельные масла
в значительной мере являются реакциями на сопутствующие им
вещества. Эти вещества при получении масел переходят в них из
семян.Все разнообразие растительных масел зависит не только
от разнообразия жирных .кислот, входящих в состав глицери¬
дов, но также от сочетания жирных кислот в глицеридах. На¬
пример, 3 гидроксильные группы в глицерине могут быть заме¬
щены тремя молекулами одной и той же жирной кислоты или
тремя молекулами разных кислот. Все жирные кислоты, входя¬
щие в состав различных масел, делятся на 2 группы — насы¬
щенные и ненасыщенные. Содержание этих кислот не по¬
стоянно. Растения полевых культур, выращиваемых в нашей
стране, содержат в маслах от 70 до 93% ненасыщенных кислот.
В настоящее время методы газожидкостной и тонкослойной хро¬
матографии позволяют точно определить состав и соотношение
жирных кислот. Определением йодных чисел производится оцен¬
ка масла по степени ненасыщенности. Содержание насыщенных
и ненасыщенных кислот, а также жирных кислот, отличающихся
степенью ненасыщенности, является существенным качественным
показателем масел. Определение количества высокомолекуляр¬
ных насыщенных жирных кислот основано на их стойкости к
окислителям.Качество масел культурных растений и их сортов можно
рассматривать со стороны их пищевых достоинств и со сто¬
роны использования их для технических целей.Первое представление о качестве масла может быть полу¬
чено при определении некоторых физических показателей. Боль¬
шая часть жирны* кислот масел основных наших культур со¬
стоит из цепочки в 18 углеродных атомов, а небольшая часть
(4—10%) жирных кислот масел имеет 16 углеродных ато¬
мов. Лишь немногие масличные растения (из семейства кресто¬
цветных) содержат большой процент жирных кислот в маслах
с 20—22 углеродными атомами. Следует также отметить масло
семян хлопчатника, в котором содержится до 25% пальмити¬
новой кислоты (с 16 углеродными атомами) и масло семян ара¬
хиса, содержащее до 7—8% арахиновой кислоты (См).Большое практическое значение имеет повышение в маслах
хлопчатника содержания насыщенных жирных кислот.Средний молекулярный вес жирных кислот масла может
быть вычислен на основании определения числа омыления.
Большой экспериментальный материал, полученный в последнее
время, показывает, что средний молекулярный вес суммы жир-218
ных кислот масла .у одних и тех же сортов той или иной куль¬
туры мало отклоняется от крайних величин. Это указывает на
то, что размер углеродной цепочки «жирных кислот —очень КОН’
сер-вативный признак. Напротив, степень непредельности н ко¬
личество отдельных жирных кислот изменяются в значитель¬
ных пределах. Однако в лределах видов масличных культур
выявлены формы, стойко различающиеся одна от другой в раз¬
личных условиях.Методы определения качественных показателей масла в зна¬
чительной части являются очень трудоемкими. Тем не менее сре¬
ди них могут быть выделены методы для широкого применения в
целях изучения производственных сортов и методы, пригодные
для массовых селекционных работ.Кроме физических и химических показателей масел, для
определения их качества как продуктов биологического проис¬
хождения имеет значение определение отдельных жирных кис¬
лот. Каждый вид культурных растений характеризуется свойст¬
венным ему соотношением жирных кислот и присутствием зна¬
чительных количеств некоторых из них или наличием специфи¬
ческих жирных кислот. Например, такими являются эруковая
кислота в семенах крестоцветных, рициновая в клещевине, пет-
розелиновая в семенах зонтичных.Из всего сказанного можно сделать некоторые выводы от¬
носительно показателей, необходимых для оценки сортов мас¬
личных растений. Одним из главных показателей масличных
семян является процентное содержание в них масла. Не¬
сомненно, важным показателем культур и сортов является
большее или меньшее количество вредных веществ в семенах
(госсипол в хлопчатнике, эфирно-горчичные масла в горчицах»
алкалоиды и прочие вещества), переходящих в масло при его
получении н понижающих его качество, а также качество
жмыха и шрота. Одним из быстро определяемых показателей
масла является коэффициент преломления, который от¬
ражает изменения, происходящие в маслах, и характеризует от¬
дельные культуры.К существенным качественным показателям масел видов н
сортов культурных растений надо отнести их общую непредель-
ность — величину йодных и гексабромндных чисел, указывающих
на содержание линоленовой кислоты. Большее или меньшее со¬
держание линоленовой кислоты в масле можно оценігвать по-
разному.В пищевых маслах, употребляемых в свежем виде, большее
содержание линоленовой кислоты придает неприятный вкус и
запах олифы.Важными показателями зрелости семян являются окраска
масел и кислотное число, которое обычно составляет неболь¬
шую величину.219
Качественные реакции
на жирные маслаДля качественного определения жирных масел существуюі
следующие характерные реакции.1.	Проба на акролеин. Две-три капли испытуемого вещества
(масло, экстракт после отгонки растворителя) нагревают в
пробирке на голом огне с 1,5—2 частями безводного сернокис¬
лого натрия. Появление после вспенивания тяжелых белых па¬
ров и резкий запах акролеина (чада), вызывающего слезоте¬
чение, указывают на наличие масла. Акролеин — непредельный
альдегид—(СНг = СНСНО) образуется из глицерина при от¬
нятии двух молекул воды. Если пары отвести в пробирку с фук-
снносернистой кислотой, то последняя приобретает красную
окраску.2.	Проба на омыление. Нагревают 2—3 капли испытуемого
вещества в пробирке с 5 смг раствора спиртовой щелочи; от¬
гоняют спирт. Оставшийся продукт растворяют в воде (мыло
в воде растворимо). Прибавление кислоты до кислой реакции
вызывает образование всплывающих на поверхность водного
раствора жирных кислот.3.	Проба с галошами. Эта реакция является характерной
для масел, содержащих непредельные жирные кислоты. В про¬
бирку с раствором масла в эфире прибавляют 1—2 капли бром¬
ной воды н встряхивают. Быстрое исчезновение желтой окраски
бромной воды указывает на присутствие ненасыщенных кис¬
лот.Кроме этих сбщнх качественных реакций, имеются цветные
реакции на отдельные масла, которыми обнаруживают сопутст¬
вующие маслу вещества, образующиеся в семенах некоторых
растений.Определение общего
содержания липидов (масел)Методы количественного определения масла в семенах ос¬
нованы на способности его растворяться в некоторых органи¬
ческих растворителях. В семенах и других растительных объ¬
ектах содержится в больших или меньших количествах ряд
веществ, которые полностью или частично переходят в раствор
вместе с маслом. Эфирно-этиловый, нли петролейний, экстракт
семян после удаления растворителя называют «сырым жиром».
Процент масла в размельченных семенах может быть опреде¬
лен ло массе (весу) «сырого жира», извлеченного из опреде¬
ленной навески, или по массе (весу) обезжиренной сухой на¬
вески. Бблыиая часть «сырого жира» — липидов семян является
триглицеридами с «примесью сопутствующих веществ. Большой220
интерес представляют методы, основанные на определения по¬
казателей преломления масел и их растворителей; разрабаты-
ваются также методы, основанные на ядерно-магнитном резо¬
нансе.Определение сырого жира в семенах по массе (весу) извле¬
ченного масла. При анализе семян с небольшим процентом
масла, а также травянистых материалов этот метод дает более
достоверные результаты, чем метод обезжиренных остатков.Реактивы и аппаратура: 1) эфир этиловый (серный)
млн петролейний (точка кипения 40—6(f); 2) аппарат Соке-
лета на 100—200 см3 (объем рабочей части экстрактора);3) бюксы для материала; 4) эксикаторы — большой для
колб и средний для исследуемого материала; 5) фильтро¬
вальная бумага (плотная).Аппарат Сокслета и работа с ним. Этот ап¬
парат (рис. 29) используют для извлечения раз¬
личных веществ эфиром или другими раствори¬
телями. Ои состоит из шарикового или спи¬
рального обратного холодильника 3, экстрак¬
тора 2 и колбы 1. Колба сообщается с экстрак¬
том трубками. Все 3 части соединяются между
собой шлифами. В настоящее время изготов¬
ляют аппараты с взаимозаменяемыми частями
(на нормальных шлифах). Объемы экстрактора
и колб находятся в соответствии один другому
(100; 200; 400 см3). Эти аппараты монтируют
батареями по 4—6 шт. в ряд или по кругу
(баня на 6 гнезд). Растворитель нагревают воз¬
душными или водяными банями (см. рис. 23
и 30).Пары растворителя, образующиеся в колбе
в результате кипения, поднимаются по тру¬
бочке экстрактора 2 в холодильник 3 и, сгу¬
стившись в жидкость, стекают в экстрактор.В экстрактор помещают материал, из которого
производится извлечение. Нагрев регулируют
яо скорости наполнения экстрактора растворн-
-телем. Если нагрев недостаточен для того,
гчтобы пары поднялись в холодильник при вы-
сококипящих жидкостях, прибегают к отепле¬
нию асбестовым шнуром паропроводных трубок
экстрактора, начиная от шлифа, и опускают колбу внутрь на¬
гревательного прибора (рис. 30).Как только уровень растворителя в экстракторе поднимется
несколько выше верхнего колена сифонной трубки, раствор с
извлеченным маслом стечет в колбу. После этого весь процесс
повторяют снова. Иногда после (первого стекання растворительРис. 29. Ап¬
парат Сокс¬
лета./ — колбе, 2 —
экстрактор.J— холодиль¬
ник.221
наполняет экстрактор (не доходит до верхнего конца си¬
фона) н непрерывно стекает. Это объясняется дефектом си¬
фона: узким диаметром трубки с перехватом, вследствие чего
из сифона жидкость не вытекает полностью. Растворитель неРис. 30. Установка для 4 аппаратов Сокслста
с электроламповым нагревом (вид спереди)./ — расположение колбы аппарата е высококкпящей жид¬
костью. 2 — расположенно колбы с ннэкохнпящеА жидкостью.должен сильно кипеть,, в противном случае он не успевает*
охладиться в холодильнике и улетучивается. В результате этого*
правильное действие сифона также нарушается.Ток воды, проходящий через холодильники, должен быть-
отрегулирован так, чтобы не было отпотевания холодильников
и стекания воды на шлифы. Если этого нельзя избежать, то
попадание воды в шлифы надо устрашіть, сделав .перетяжку
из бечевки на трубке холодильника так, чтобы концы бечевкіп
свисали по наружной стенке экстрактора.222
Необходимо, чтобы все шлифы были чистыми, иначе их во
время работы «заест».Прн работе с огнеопасными жидкостями не следует остав¬
лять аппараты Сокслета без присмотра.Ход анализа. 1. Берут 2 навески из каждого измельченного
материала от 3 до 12+0,005 г в зависимости от содержания
в нем масла. Так, лри масличносги материала до 10% употреб¬
ляют 10—12 г, а при масличности 50—60% достаточно взять
1—2 г.При единичных анализах для извлечения масла применяют
воэдушно-сухой материал, в котором одновременно определяют
содержание воды. При массовых анализах удобнее производить
определения в сухом материале. Для этой цели сушат цельные,
неизмельченные семена и после измельчения онова подсуши¬
вают. Навески заделывают в пакетики или патроны из плотной
фильтровальной бумаги.2.	Каждый пакетик (помещают в экстрактор аппарата Сокс¬
лета. Во взвешенные колбочки этого аппарата наливают 2/з—3Л
объема сухого, чистого, без перекисей этилового эфира *. Затем
колбу соединяют со своим экстрактором через притертый шлифи,	установив колбу в гнездо нагревательного прибора, соединяют
экстрактор с обратным холодильником. Нагревание и кипение
эфира регулируют так, чтобы за час происходило 3—4 слива¬
ния.Для полной экстракции достаточно 12 часов. Полнота из¬
влечения масла зависит от тонкости помола материала **. Если
в процессе сушки материала был допущен перегрев, то это ве¬
дет к окислению части масла (особенно масел льна, ляллеман-
цим, конопли). Окисленная часть масла трудно растворяется,
вследствие чего результаты определения будут занижены.Конец экстракции устанавливается практическим путем — по
времени работы аппарата при определенном числе сливаний
экстракта, с учетом величины навески материала и ее измель¬
чения.3.	После окончания экстракции аппарат разбирают, сливают
остаток раствора из экстрактора в колбу. Из колбы с раство¬
ром масла отгоняют растворитель на установке для перегонки
или другим способом. Затем эту колбу с маслом продувают ре¬
зиновой грушей для удаления паров эфира и сушат около часа
в термостате при 100—105° до постоянного веса. По разности
между массой (весом) колбы с маслом и без масла узнают
массу (вес) масла, которое было извлечено из навески.*	Для разрушения перекисей эфир промывают 5%-ным раствором же¬
лезного купороса, затем сушат и перегоняют с несколькими кристаллами
железного купороса.*• Иногда необходимо навески растирать в ступке со стеклянным по¬
рошком. после чего все количественно переносят в патрон, а ступку проти¬
рают ватой, смоченной эфиром, и тоже помещают в патрон.223
Содержание масла в процентах (х) вычисляют по формуле:(а — в|)-100			,где а — масса (вес) колбы с маслом;
ai — то же без масла;
н — навеска.Достоверность н совпадаемость результатов зависят от
степени размельчения материала, на что обращают особое вни¬
мание.Нередко при размельчении в ступке нескольких грам¬
мов мелких семян (мака, горчицы, кунжута и др.) часть их
остается цельными или плохо раздробленными. Это является
главной причиной заниженных результатов.Положительные свойства этилового (серного) эфира заклю¬
чаются в низкой температуре кипения. К недостаткам серного
эфира как растворителя прн определениях масла относится его
способность не только растворять воду (до 8%), но и ряд ве¬
ществ.Петролейный эфир обладает более высокими точками
кипения, но не извлекает воды и хуже извлекает различные со¬
путствующие маслу вещества.Определение масла по массе (весу) сухого обезжиренного
остатка. На опытных станциях нашей страны наиболее часто
применяется вариант этого метода в модификации С. В. Руш-
ковского, рассчитанный на массовые анализы семян для оценки
селекционного материала.Реактивы и аппаратура (дополнительно к перечисленным на стр. 221):1)	петролейный эфир с точкой кипения 70° или авиабензин; 2) банки с
притертыми пробками на 1—1,5 дм1 для настаивания, желательно широко-
горлыс; 3) стакан с притертой пробкой диаметром 4,5 см, высотой 7.5 см
для взвешивания пакетов.Ход анализа. Две навески по 1 г размельченных, высушен¬
ных или воздушно-сухих семян (в последнем случае одновре¬
менно в отдельных навесках определяют колігчество воды) пе¬
ресыпают в бумажные пакеты, предварительно высушенные и
пронумерованные*. Пакеты с навесками по 10—12 шт. поме¬
щают в марлевые мешочки, опускают в банку с притертой
пробкой и настаивают с авиабензином или с петролейным эфи¬
ром в течение двух суток (сменяя бензин 2—3 раза). После та¬
кого -настаивания мешочек с частично обезжиренными пакетами
помещают в патрон аппарата Сокслета и извлекают в течение2—4 часов остатки масла этиловым эфиром, причем эфир и
экстракторе должен сливаться 4 раза в час.*	Навески можно помещать н в предварительно высушенные пакеты, за¬
тем подсушить в сушильном шкафу в течение 1,5—2 часов прн 100—105° и
после охлаждения взвесить.224
После экстракции пакеты извлекают из банки, помещают в
широкий кристаллизатор и дают под тягоГі испариться раство*
рителю, затем их помещают в стаканчики с притертыми крыш¬
ками и сушат в течение 2—3 часов при 100—105° в сушильном
шкафу. После охлаждения в эксикаторе их взвешивают*.
Взвешивание выполняют быстро, на торсионных весах или в
специальном стакане для пакетов —на аналитических весах.
Разница в весе пакета с навеской до экстракции и после экст¬
ракции должна показывать вес (содержание) масла. Поэтому
плохо высушенные перед экстракцией пакет и навеска дают
преувеличенные значения 8 содержании масла, что является по¬
стоянным источником ошибок в этом анализе. Преимущество
этого метода состоит в более экономном расходе растворителя
на каждое определение и в большей производительности.Приведенный метод дает вполне удовлетворительные ре¬
зультаты при анализе различных растительных объектов, если
учитывать извлечение воды в процессе анализа. При массовых
анализах высокомасличных семян (40—70%) расхождение в
содержании масла между парными определениями допустимо
до1%.Повышение производительности методов зависит от воз¬
можности механизации и распределения каждой операции ме¬
тода между отдельными работниками. Бьісірота взвешивания
на торсионных весах избавляет от взвешивания в стаканах
с притертыми пробками и уменьшает ошибки, происходящие за
счет гигроскопичности.Пример вычисления. Навеска сухих размельченных семян гор¬
чицы вместе с пакетиком равна 1,588 г, масса сухого пакетика — 0,474 г,
масса пакетика после обезжиривания —1,118 е. Следовательно, масса семян
была 1,114 г, а масла —0,470 & Таким образом, процент масла (х) а сухнх
семенах равен:0,470.100
Х~ 1,114 -4А20-Определение масла в семенах при помощи рефрактометра(По А. И. Ермакову). Метод основан на использовании боль¬
ших различий в коэффициентах переломлення масла исследуе*
мых семян н а-монобром нафталина, который хорошо растворяет
масла на холоду и не обладает большой летучестью благодаря
высокой температуре кипения (280°), что является очень важ¬
ным. При растворении масла показатель преломления пони¬
жается на величину, пропорциональную количеству растворен¬
ного масла. Если брать одинаковые навески семян и объемы
растворителя, то показатель преломления смеси (раствора) бу¬•	Желтые или коричневые пятна на пакетах после их сушки, пронсхо*
дяшне в результате окислеиия масла, указывают на его неполиое извлече¬
ние.8 Заказ М 401225
дет тем .меньше, чем больше масла в семенах. Этот метод
можно сочетать с определением йодного числа по показателям
преломления масла семян ряда растений.Реактивы и аппаратура: I) а-монобромиафталнн, по*0 1.6584; 2) пстро*
леАныА или диэтиловыА эфир для промывания пипеток и призм рефракто¬
метра; 3) универсальный рефрактометр (см. рнс. 4): 4) мнкробюретка иа
2 см* с делениями на 0,01 сміш, 5) фарфоровые ступки диаметром 6—7 см;6)	резиновые «груши» М 1 или меньших размеров; 7) стеклянная пипетка
для набирания и Фильтрования прозрачных растворов масла из кашеобраз¬
ных смесей (рис. Зі), экстрактов, соков, масел и других веществ для опти¬
ческих нсслелованнА н микроопродслениА.Изготовление пипеток. Пипетки изготовляют из трубок с на¬
ружным диаметром 5 мм и внутри 3—3,5 мм. Шарик пипетки
должен иметь 10—14 мм в диаметре. Длина трубки с одной
стороны шарика 80—100 мм, с другой —18—20 мм. КороткийРнс. 31. Пипетка с ватным фильтром для набирания и фильтрованияжидкостей.конец (носик) пипетки следует слегка оттянуть в средней части
и изогнуть под углом 60—70°. Внутренний диаметр носика пи¬
петки должен быть равен диаметру трубки (3 мм) или немного
сужен. Изгиб носика пипетки делает ее удобной для набира¬
ния, фильтрования и, если необходимо, взвешивания жидкостей
(для этой цели к ней приделывают подвеску из нихромовой
проволоки).В носик пипетки перед употреблением вставляют ватную
пробку (фильтр): кусочек гигроскопической ваты, расправив
по длине волокон, сгибают пополам и затем, сдавливая вату
пальцами в месте сгиба, вставляют в носик пипетки так, чтобы
концы волокон были направлены наружу. Вату обрезают нож¬
ницами на расстоянии 4—5 мм от носика и расправляют паль¬
цами так, чтобы носик был покрыт шапкой ватных волокон.
Ватная пробка должна быть всіавлена плотно и не выскаки¬326
вать при подрезании концов. Фильтрование и набирание жид*
костей производятся под некоторым вакуумом, который соз¬
дается резиновой грушей № I.Ход анализа. Предварительно высушенные в течение 2—3 ча¬
сов при 100° или воздушно-сухие семена, очищенные от приме¬
сей (или оболочек) размельчают на лабораторной зерновой
мельнице типа «Пируэт», употребляя небольшие порции (по3—3,5 г) и включая мотор на короткие промежутки времени,
или в фарфоровой большой ступке размельчают дроблением
(отдельными ударами пестика), а не растиранием, чтобы из¬
бежать образования мазеобразной массы. Размельченные се¬
мена подсушивают в течение часа при 100—105° в термостате.
Из средней пробы размельченных семян на торсионных весах
взвешивают одинаковые навески (с точностью до 1 мг) и вы¬
сыпают их на дно фарфоровых ступок диаметром 6—7 см. На¬
вески отвешивают на совочке из алюминиевой фольги.Ступки с навесками размещают в больших кюветах, поме¬
щая этикетки с номером анализа под ступки. Затем приливают
из микробюретки точный объем а-монобромнафталина. Соот¬
ношение между навеской и объемом растворителя сохраняют
всегда одно и то же (3:4). Так, на навеску 0,300 г берут
0,400 см* жидкости, на 0,600; 0,900; 1,200 г соответственно —
0,80; 1,20; 1.60 см3 а-монобромнафталина.Навеску тщательно растирают пестиком до однородной ка¬
шицы, не размазывая по стенкам ступки. Затем дают постоять3—5 минут и повторно растирают. После этого пипеткой для
фильтрования (рис. 31) отбирают несколько капель раствора.Для этого резиновую грушу № 1 сжимают и, не разжимая
пальцев, надевают на пипетку перед тем, как опустить другой
конец с ватной пробкой в растертую кашицу (мезгу и т. п.),
стараясь, чтобы ватный фильтр был полностью смочен каши¬
цей или раствором. Когда вата хорошо пропитается жид¬
костью, грушу устанавливают на подставку. В пипетку мед¬
ленно насасывается прозрачная жидкость. Вязкие жидкости
набираются медленно, нерастворимые частицы материала за¬
бивают ватную шапку и создают хорошую фильтрующую по¬
верхность. Когда набрано нужное количество жидкости, сни¬
мают грушу и лишь затем вынимают ватный фильтр.Эти пипетки с набранными образцами жидкости удобно
держать в деревянных подставках. Подставки на 24 пипетки
представляют собой плоский ящик 35X10 см, глубиной 1,5—
2 см, стенки толщиной 0,5 см. Ящик разделен перегородкой на
2 части. На стенках, параллельных этой перегородке, н на са¬
мой перегородке делают квадратные вырезы по диаметру труб¬
ки пипеток. Эти вырезы служат гнездами для концов пипеток,
которые укладывают горизонтально, шариками внутрь. На дне
подставки укладывают слой ваты, на которую помещают эти¬
кетки с номерами исследуемых образцов,#•227
Полученный раствор масла служит для определения пока¬
зателя преломления при температурах, близких к 20°. На каж¬
дый градус температуры выше и ниже 20° вносят поправку 0,0004.
Показатель преломления определяют, как указано на стр. 235.Процент масла (х) в семенах вычисляют по формуле (по
таблицам или по вычерченной номограмме):Н Пс — Пягде а —объем а-монобромнафталина;
d — плотность масла;
н — навеска масла;
пл — показатель преломления а-монобромнафталина;
пе — показатель преломления определяемой смеси;
пл — показатель преломления масла.Плотность н показатель преломления масла семян различ¬
ных сортов изменяются, но если пользоваться оредними дан¬
ными для изучаемых культур, то на процент масла эти изме¬
нения существенно не влияют. Для более точных вычислений
можно определить показатель преломления масел изучаемых
образцов (стр. 235).Првмер вычисления. Взята навеска 1,20 * измельченных семян
подсолнечника, а-монобромнафталина 1,600 cju3, d масла—0,921, л©30 масла —
1,4750, а по30 а-монобромнафталина —1,6585. Найденный показатель прелом¬
ления для экстракта, полученного после растирання навески с а-монобромнаф-
талнном, равен 1,6087; подставив все эти величины в формулу, получаем:1,600 - 0,921 1,6585— 1,6087 • 100 	—Ш	0557 —1.4750 ”Этот метод с успехом мож¬
но применять в селекционной
практике для характеристики
масличности отдельных расте¬
ний, причем определение ко¬
личества масла можно совме¬
стить с рефрактометрическим
определением йодных чисел.
Такая задача может возник¬
нуть при селекции подсолнеч¬
ника, льна, рыжика, конопли
и др.Практические указа¬
ния. Если нужной микробю¬
ретки нет, ее заменяют ми-
кропнпеткой. Объемы а-моно-
бромнафталина можно отби¬
рать по массе. Навески а-мо-
нобромнафаталина берут по разности, применяя пробирки с
простым приспособлением для взвешивания (рис. 32).228Рис. 32. Пробирки с приспособлением
для взвешивания масла.в - обшив мл. О — положение стеклянной
палочки при отливаиии масла.
Краны микробюретки должны быть хорошо притерты наж¬
даком или крокусом. В качестве смазки служит вода, которая
с а-монобромнафталином дает поверхность раздела. Смазы-
вают только края кранов, свободные от а*монобромнафталина.Показатель преломления определяют при температурах,
близких к тем, при которых составлены таблицы (отклонения
должны быть не более +2°), так как 1,5—2 минуты может ока¬
заться недостаточным для нагревания или охлаждения слоя
раствора между призмами рефрактометра до той темпера¬
туры, прн которой производят определения. Нарушение этого
условия приводит к большим ошибкам. Температуру отмечают
с точностью до 0,25°, поправка на температуру смеси прини¬
мается в среднем 0,0004 на 1°, для масла 0,00036, а для а-моно-
бром нафталина 0,00045. Температуру удобно поддерживать в
заданных пределах при помощи универсальных термостатов
типа Вобсера или Хеплера (см. рис. 5).Для полного количественного извлечения масла необхо¬
димо, чтобы все ткани были разрушены и клетки вскрыты. Для
этой цели навески иногда растирают со стеклянным песком.
При определении липидов в коре, деревянистых и других
трудно измельчаемых материалов полезно 5 г вещества про¬
греть 2 минуты со смесью 10 см3 95%-ного спирта и 5 см3
12—15%-ного раствора аммиака. Затем после охлаждения
массу размельчают и используют для извлечения масла.Метод отбора семян с повышенной масличность» (по
А. И. Ермакову и О. М. Мегорской). Этот метод пригоден для
массового отбора на масличность. Определение основано на
погружении семян в смеси жидкостей с различными плотно¬
стями. Для каждого вида семян составляют шкалу, по которой
узнают масличность воздушно-сухих семян в зависимости от
того, при какой плотности жидкости они погружаются или
всплывают.Реактивы и приборы: 1) парафиновое (вазелиновое) масло, бесцветное,
точка кипения 200*. плотя. 0,86--0,90: 2) четыреххлористый углерод, плоте.
1,60, точка каления 77е; 3) петролейный эфир, точка кипения до 70*; 4) на¬
боры ареометров для определения плотности от 0.9 до 1.3 с точностью до
0,001 (удобно использовать денсиметры, включающие 19 шт. ареометров
для определения плотности в интервале от 0.700 до 1,840 прн 20а); 5) уни¬
версальный термостат типа Хеплера (см. рис. 5); 6) цилиндры диаметром
35-—10 мм и высотой 180—200 мм с резиновыми или корковыми пробками;7)	мелкосетчатая капроновая ткань для изготовления фильтров.Приготовление шкалы жидкостей различной плотности.
Смеси жидкостей должны иметь невысокую вязкость и не сни¬
жать всхожесть семян. Опыты показали, что прн определен¬
ных режимах испытания можно значительно снизить влияние
растворов на всхожесть семян. Погружение семян в опытные
жидкости на несколько минут, вынимание их и промывка пет¬
ролейным эфиром, проветривание иа воздухе показали, что че¬229
рез 15 дней после такой обработки семена не теряли всхо¬
жести, однако в полевых засушливых условиях всхожесть се¬
мян снижалась.Для приготовления шкалы используют вазелиновое масло и
четыреххлористый углерод в следующих соотношениях (табл.
10).таблица to	Приблизительная плотность сме¬си жидкостей при смешивании ва¬
зелинового масла с четыреххло¬
ристым углеродомсо,<«*•)Ьпято*
мс ми»
(ем*)до*СС1«(см*)Висдямо-
■ое масло
<**•>рКГ10900,96932,567,51,12512,587,50,98635651,14315851,00437,562,51.16517,582,51,02140601,17820801,03942.557,51,19522,577,51,05645551,21325751,07447,552,51,23027,572,51,09150501,24730701.10852,547,51,264Пользуясь таблицей, приготовляют по 350—400 см* жид¬
костей в необходимых интервалах плотностей м хранят в закры¬
тых склянках. Перед употреблением приготовленные смеси
проверяют точным ареометром (до 0,001) при 20°. Для этого со¬
суды, в которых проводят испытание, выдерживают в универ¬
сальном термостате и жидкости доводят до необходимой плот¬
ности, прибавляя одну из жидкостей, составляющих смесь. Этот
способ применяют для разделения (отбора) нормально выпол:
ненных семян с плотно прилегающей оболочкой (семян льнаі
видов горчицы, рапса, сурепицы). У семян с неплотно приле¬
гающей оболочкой необходимо ее отделять, однако после по¬
гружения их в жидкости для разделения всхожесть иногда сни¬
жается.В табл. 11 показана зависимость плотности жидкостей и
масличности семян льна, сизой горчицы, сурепицы, рапса. На¬
правление стрелок указывает, при какой плотоости жидкости
идет погружение семян или их всплывание. На стыках стрелок,
направленных в противоположные стороны, указана прибли¬
женная масличность воздушно-сухих семян (при содержании
воды 5—7%).Определение более масличной фракции семян в общей пробе
образца. Для выделения яз пробы более масличной части се¬
мян их предварительно просушивают при 30—40°, а затем бе¬
рут около 5 г (по объему) и помещают в цилиндрический со¬
суд со смесью жидкостей, в кс юрой семена с масличностью230
t л плица и	Определение масличности семянпо плотности опытной жидкости(Ж
опытной
жидкое тпІіодожсиїїсССМЯІІПроцентMflCIIp20*
on УТКОЙ
ЖИДКОСТИПоложениесемамnpoumMICII1,2251> 331,1351*491,215i t> 341,125i t1,205I T* Wli as1.115i tъ M1,1951 fЙ 3fi1,1051 Ti 4*i1,185i i9 ov
Ш 371.C05i t1,175l T 111 1361.085i tъ 471,165i ti 391.0751 Ti 4ft1,1551 Tt 401.0651 t1.1451 t! 411.055i T1.1351,0451выше заданной должны всплывать, а с маслнчностью ниже за¬
данной — погружаться. После тщательного перемешивания се¬
мян стеклянной палочкой в жидкости сосуд закрывают пробкой
и на 10—15 минут помещают в термостат при 20°, чтобы се¬
мена разделились н уравновесились. Очень важно, чтобы се¬
мена в цилиндре могли свободно погружаться или подниматься.
Если надо отобрать семена льна с масличностью выше 42%
на сырое вещество, то плотность жидкости в сосуде должна
быть 1,125. Если семена содержат 43% и более масла, то они
поднимаются и сосредоточиваются в верхнем слое жидкости. Се¬
мена, содержащие менее 43% масла, оседают иа дно или рас¬
пределяются ниже поверхностного слоя. Более масличные се¬
мена, сосредоточенные в поверхностном слое, собирают при
помощи петли из проволоки, обтянутой капроновой сеткой.
Затем их помещают в воронку с фильтром из капроновой сетки
или в воронки с пористым дном для стекания жидкости. Через
несколько минут промывают небольшой порцией авиационного
бензина, просушивают в кюветах на воздухе и ссыпают в па¬
кетики, сохраняя для посева.При необходимости всплывающие семена проверяют на мас¬
личность более точным методом. Быстрое определение маслич¬
ности с точностью до 1% (от веса семян) может быть вполне
Достаточным, если принять во внимание сохранение этих же
семян для посева.Температура рабочих жидкостей непрерывно поддержи¬
вается на одном и гом же уровне (20°), а их плотность в про¬
цессе проведения опытов контролируется.231
Определение масла в одной семянке подсолнечника. В ос¬
нове этого метода лежит принцип метода А. Шмука, заключаю*
щейся во взвешивании 2 г подсолнечных ядер на воздухе и в
масле. Ст. Пеичев уточнил формулу для расчета и примени¬
тельно к определению масла в одном семени *.Для этой цели используют торсионные весы, к которым под¬
вешивается маленькая чашечка с чистым маслом. Высушенную
на воздухе семянку взвешивают, затем освобождают от лузги и
снова взвешивают. Из полученных результатов вычисляют про¬
цент лузги в одной семянке. Затем ядро взвешивают в чашечке
с маслом. Содержание масла в воздушно-сухом ядре вычис¬
ляют по формуле:280 • 9,где: в — вес ядра в воздухе; в\ — вес ядра в масле.Бели между семядолями ядра имеется воздушная полость
(что определяется пропусканием тонкой проволочки между се¬
мядолями), то воздух вытесняется путем вакуум-инфильтрации
в масле.Определение физических
и химических показателей
масел и других липидовФизико-химические показатели изменяются в зависимости
от условий выращивания н сортового разнообразия культур.
Эти показатели могут быть относительно постоянны для одно¬
образных по биологическим
свойствам сортов, выращивае¬
мых в относительно одинако¬
вых условиях. На физико-хн-
мические показатели масел
влияют способы их получения.
Лучшим способом получения
масла является холодное прес¬
сование семян. В лаборатор¬
ных условиях этот способ осу¬
ществляется с помощью мас¬
ляного пресса (рис. 33). Для
облегчения получения масла
из ограниченных количеств се¬
мян применяют предваритель¬
ное настаивание с низкокнпя-
щим растворителем в сочета¬
нии с прессованием.Получение масла из семян и мякоти плодов. Навеску 100—
200 г свежеизмельченных семян помещают в толстостеннуюРве. 33. Лабораторный масляный
пресс.*	Сг. П е й ч е в. Доклады Болгарской Академик наук, т. 10, в. 5, 1957.332
колбу или банку с широким горлом и с покатыми стейками
у горла и приливают от І до 2 объемов днэтилового или пет¬
ролейного эфира (т. кип. 45°). Днэтиловый (серный) эфир дол*
жен быть совершенно свободен от примесей. Перемешивают ра¬
створитель с навеской материала и через полчаса отжимают на
гидравлическом (масляном) прессе раствор масла. В стальной
стакан предварительно помещают плотный фильтр-мешочек.
Если раствор масла мутный, то его фильтруют и затем отго¬
няют растворитель при 25—30°(при слабом вакууме). Тщатель¬
но удаляют остатки эфира в ва-
куум-экснкаторе над HsSO*. Об¬
разцы масла лучше хранить в
темноте в вакуум-эксикаторе, на¬
полненном СОа. Физические и хи¬
мические показатели определяют
в с веже по л ученных маслах. При
помощи пресс-стакана (рис. 35)
можно быстро получить неболь¬
шое количество нативного масла
из небольших навесок семян, ис¬
пользуя лабораторный или учеб¬
ный гидравлический пресс.В целом ряде случаев лабо¬
раторный масляный пресс может
быть заменен учебным масля¬
ным прессом. Если к этому
прессу изготовить некоторые до¬
полнительные части (зеер, под¬
ставку для стока жидкости)» его
можно использовать для лабора¬
торных целей.Определение плотности (удель¬
ного веса) масел. Под плот¬
ностью понимается отношение веса масла при 20° к весу воды
в том же объеме при 4° «или при той же температуре и обозна¬
чается р2?*.Аппаратура: 1) пикнометры на 5—23 ел* (рис. 34); 2) универсальный
термостат Хеплера или 3) стеклянный сосуд, применяемый в качестве водя¬
ной бани, диаметром 13—15 см и высотой 15—20 см.Плотность жидких масел определяют весовым способом. Не
менее точно плотность можно определить ареометром, но для
этого необходимо достаточное количество масла (100 см3 и
больше).Плотность твердых жиров и восков определяют объемным
методом или при высокой температуре.Рис. 34. Пикнометры на 5 и 25 сд*
для определения плотности жидко¬
стей.гзз
В качестве пикнометров могут быть использованы мерные
колбы с узкими горлышками, объемом на 25 и 30 см3.Весовое определение. Сухие и взвешенные «капиллярные»
пикнометры на 2—5 см3 наполняют маслом при помощи пи¬
петки с укороченным и оттянутым носиком; масло должно
быть сухим и свободным от растворителей. Температуру масла
предварительно доводят до температуры, при которой произ¬
водят определение. Затем пикнометр закрывают пробкой, в ко¬
торой имеется капилляр с меткой, и помещают в сосуд уни¬
версального термостата или в водяную баню при температуре
20^ на 15 минут. Если температура масла выше 20°, то при
охлаждении до 20° масло засасывается в капилляр, поэтому
•необходимо, чтобы на пробке над капилляром была капля
масла (надо следить, чтобы в капилляре или в масле не оста¬
лось пузырьков воздуха). По истечении 15 минуї тонким капил¬
ляром и фильтровальной бумагой снимают избыток масла, со¬
бравшегося между пробкой и горлышком. Затем тщательно
обтирают пикнометр от воды, стараясь не нагревать его, и
взвешивают на аналитических весах. Взвешивание пикнометра
с дистиллированной водой производят после доведения ее до
метки при 4° и при 20°. Вес пикнометров с водой может быть
установлен заранее —до серии определений.П ример вычисления. Вес пикнометра с водой при 20° равен
8,7855/ г, с маслом—8,6582 г. Вес чистого и сухого пикнометра 4,8282 г.
Следовательно, вес данного объема масла 3,8300 г, а вес воды 3,9575 г.Плотность будет 3,8300 : 3,9575 = 0,968. При букве р ставят два числа —
Рзд или р4°; верхнее число — температура масла, нижнее — температура
воды, при которой производилось определение.Объемное определение. В легкий цилиндр с притертой проб¬
кой и точно градуированный наливают 40—50 см3 60—70% -ного
спирта. После этого цилиндр со спиртом взвешивают и изме¬
ряют точно объем спирта в цилиндре при 20°. Затем опускают
в цилиндр 2—3 г воска, (изрезанного на кусочки, отмечают
новый объем спирта и снова взвешивают. Разность между
двумя взвешиваниями и дает вес взятого для испытания воска,
а разность в объеме спирта с воском и без воска дает объем
воска. Вычисление производят по формуле:где: V\ и v2 — объемы спирта в цилиндре до и после прибав¬
ления к нему воска;м и л<і — масса (вес) цилиндра со спиртом до и после
прибавления воска (или жира).Этот метод дает вполне удовлетворительные результаты.Пример вычисления. Вес цилиндра со спиртом 87,513 г (л);
объем спирта 50 см3; вес цилиндра после добавлення кусочка воска (жира)
89,975 г (*■), а объем 52,55 см*; плотность будет:(89,975 — 87,513): (52,55 - 50,00) = 0,965.234
Плотность твердых лішндов можно также определить, уз¬
нав ллотшость раствора этого жира в растворителе или в жид¬
ком масле с известной плотностью.Плотность (удельный вес) масел зависит от содержания
глицеридов оксикислот и ненасыщенных кислот (повышается
при окислении масел).Определение показателя преломления масла. Показателем
преломления (называют отношение скорости света в воздухе к
скорости света в некотором веществе (масле, воде и др.) и
обозначают его латинской буквой п. Показатель преломления
определяют рефрактометрами обычно при 20° для желтой ли¬
нии D и тогда обозначают /г#20 (внизу справа длина волны D.
а вверху температура в С°).Универсальный рефрактометр. Универсальные рефракто¬
метры Аббе иди выпускаемые в СССР ИРФ-22 (см. рис. 4) и
другие* позволяют определять показатели преломления при
различных температурах с точностью до 0,0001, в пределах от
1,30 до 1,70. Рефрактометры типа Аббе меньше других требо¬
вательны к монохроматическому свету. Определение показате¬
лей преломления производят при температуре, близкой к 20°,
которую удобно поддерживать на заданном уровне при помощи
универсального термостата (см. рис. 5). На каждый градус
температуры выше или ниже 20° вносят поправку для масла
+0,00035, для а-монобром нафталина +0,00046, для воды
+0,00007.Проверка рефрактометра производится при помощи пласти¬
нок с известным по. Пластинку полированной стороной при¬
крепляют каплей а-монобромнафталина к неподвижной верх¬
ней призме рефрактометра Аббе и при опущенной нижней
призме определяют показатель преломления. Для проверки при¬
бора Аббе при помощи пластинки необходимо открыть отвер¬
стие у неподвижной призмы прибора. При проверке рефракто»
метра ИРФ-22 открывают верхнюю призму и, добавив каплю
а-монобромнафталина, накладывают пластинку полированной
стороной на нижшою призму. Пластинку слегка прижи¬
мают, чтобы избежать интерференционных полос. При сов¬
падении показателя преломления, указанного на пластинке, с
данными отсчета считается, что прибор установлен правильно.
Если же получают другую величину, чем указано на пластинке,
то устанавливают прибор точно на деление, указанное на пла¬
стинке, и ключом (приложенным к рефрактометру) вращают
винт (у прибора Аббе на передней части трубы, у ИРФ-22 —
четырехгранный винт, расположенный на фланце за зритель¬
ной трубкой) и доводят границу раздела поля до точки пере¬
сечения нитей. После этого прибор считают пригодным к ра¬*	Б. Иоффе. Рефрактометрические методы химии. Госхимиэдат, I960.335
боте. В дальнейшем работу прибора контролируют смионобром-
иафталином.Ход анализа. Подняв призму рефрактометра ИРФ-22 (или
опустив ее—у прибора Аббе), наносят несколько капель масла
при помощи стеклянной (обязательно оплавленной) трубки или
палочки на полированную поверхность. Без нанесенной на
призму жидкости в приборе нет разделения. Затем, закрыв
призму, устанавливают окуляр трубы так, чтобы нити были
резко очерчены, находят оптимальное освещение и начинают
двигать маховичок слева у прибора И РФ-22 или винт около
дуги с нанесенными показателями у прибора Аббе. Алидаду пе¬
ремещают от положения п0=1,3 (снизу) в направлении возра¬
стающих значений nD до тех пор, пока поле не разделится на2	части — темную и светлую (см. рис. 6). Неясная граница
между светлой и темной частями поля иногда зависит от не¬
достатка жидкости, которая не покрывает собой поверхности
призм. Размытую радужную границу делают четкой, для чего
поворачивают маховичек компенсатора справа (или в нижней
части трубы прибора Аббе, где находятся призмы для уничто¬
жения аберрации света). Границы между светлой и темной
частями поля зрения совмещают с точкой пересечения нитей оку¬
ляра. Целые, десятые, сотые и тысячные доли значений показа¬
теля преломления находят по шкале, а десятитысячные — опре¬
деляют на глаз. Измерение и отсчеты проводят 3—4 раза,
передвигая после каждого раза линию раздела. Показатели пре¬
ломления жирных масел редко достигают 1,52 (тунговое), по¬
этому они с успехом могут быть определены рефрактометрами-
сахариметрами, позволяющими работать в диапазоне от 1,33
до 1,54.Определение вращения плоскости поляризации. Некоторые
масла и жирные кислоты оптически активны. К ним относятся
масла растений семейства флакурциевых, так называемые
чаульмугровые. Большинство масел культурных масличных ра¬
стений оптически мало активны. Примеси, входящие в состав
неомыляемых веществ, а также витамина А обладают большим
удельным вращением. Например, сезамин в растворе хлоро¬
форма имеет вращение [а]22 = -f68°36'. Оптически активны и
фосфатиди (лецитины и кафалины). По степени вращения пло¬
скости поляризации, которая определяется поляриметрами,
можно обнаружить примеси. Мерой для сравнения является
удельное вращение, обозначаемое [а]. Так обозначают угол от¬
клонения, который образуется при прохождении поляризован¬
ного света через столб жидкости в 1 дм. содержащей 1 г опти¬
чески деятельного вещества в 1 см3 раствора. Угол вращения
зависит от длины вращающего слоя, его плотности, природных
качеств вещества и длины волны света. Обычно принято опре¬
делять вращение при 20° для желтого луча D (589 нм). Таким
образом, удельное вращение при 20е надо обозначать [а]о236
(описание определения см. на стр. 160). По удельному враще¬
нию касторового масла до и после ацетилировання можно
быстро определить содержание рицннолевой кислоты.Определение в липидах чисел — кислотного, омыления и
эфирного. Кислотное число показывает, сколько милли¬
граммов едкого кали необходимо для нейтрализации свободных
жирных кислот в 1 г масла. Число омыления показывает
количество миллиграммов едкого кали, необходимое для омыле¬
ния связанных и нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г
масла. Эфирное число показывает количество миллиграм¬
мов едкого кали, необходимое для омыления сложных эфиров
1 г вещества; его находят по разности между числами омыле¬
ния и кислотности.Реактивы и аппаратура: I) 0,2 н. и 0,5 в. спиртовые растворы едкого
кали, титры которых устанавливают каждый раз перед определением;2)	1%-ный раствор фенолфталеина; 3) баня с установленными обратными
холодильниками; 4) микробюретки на 2—5 см*.Приготовление спиртового раствора едкого кали. Для при¬
готовления 0,5 и. раствора на каждый куб. дециметр спирта от¬
вешивают 30 г щелочи, смывают с ее поверхности углекислые
соли опусканием на несколько секунд в дистиллированную
воду. Навеску щелочи стараются растворить в минимальном
объеме воды (30 г растворяют в 20 см3 воды). После того как
навеска растворена, прибавляют несколько куб. сантиметров
крепкого раствора хлористого бария для осаждения оставшихся
углекислых солей, а затем доводят чистым спиртом до нужного
объема. Спирт очищают от карбонильных соединений добавле¬
нием к каждому 1 дм3 спирта 10 г едкого кали и 5 г цинковой
пыли, после кипятят с обратным холодильником в течение
двух часов и спирт перегоняют.Определение кислотного числа. В сухие колбы на 200—
250 см3 отвешивают по 2 навески масла от 2,5 до 5 ±0,01 г.
Для взвешиваний используют пробирки, закрываемые корко¬
вой пробкой, в центре которой вставлена тонкая заплавленная
стеклянная трубка или палочка (см. рис. 32). По этой палочке
отливают масло из пробирок. Вес навески узнают по разности
весов пробирки с маслом перед отлнванием и после отливания
в колбы.В колбы с навесками приливают мерным цилиндром по
50 с.и3 смеси 95-градусного спирта с этиловым эфиром (1:1) ii
добавляют 5 капель 1%-ного раствора фенолфталеина (для
светлых масел) или 1 см3 1%-ного раствора тимолфталеина
или же алькали синий 6 (для темно окрашенных масел). После
растворения масла жидкость титруют 0,1 н. спиртовой ще¬
лочью точной бюреткой до ясного изменения окраски, устойчи¬
вой в течение 30 секунд. Одновременно с титрованием опытных
проб титруют контрольные пробы, в которых находится только237
растворитель в таких же объеыах. Средние результаты из
двух титрований контрольных проб вычитают из опытных н
вычисляют кислотное число (к. ч.) по формуле:где: Г—титр щелочи (в мг КОН);а —объем (в см3) раствора 0,1 и. щелочи, пошедшей на
титрование опытной пробы;б	— то же контрольной пробы;
н— навеска масла (в г).Свободные кислоты масла можно титровать 0,5 и. водным
раствором щелочи, пользуясь микробюреткой. Если применяют
водный раствор щелочи, то объем спирта, взятый для растворе*
ния, должен превышать в 5—6 раз объем раствора щелочи,
пошедшей «а титрование. Для массовых определений кислот¬
ных чисел смесь спирта с эфиром приготавливают сразу на
большое число проб и заранее нейтрализуют. Темно окрашен¬
ные растворы масла удобно титровать в присутствии флуорес¬
цирующих индикаторов на темном фоне при дневном освеще¬
нии до появления заметной флуоресценции. Таким индикато¬
ром служит р-метил-умбелиферон.Кислотное число, определенное указанным способом, не¬
сколько завышено за счет нейтрализации фосфатндов, содер¬
жание которых в масле составляет около 1%.Определение числа омыления. В колбы на 200—250 зд3 от¬
вешивают 1—3 г масла с точностью до +0,001 г, пользуясь
пробиркой, н приливают точный объем 0,5 н. спиртового
раствора щелочи. Для навесок масла 1—1,5 г надо точно взять
25 см3, для 2,5—3 г — 50 см3.Колбы с растворами соединяют с обратными холодильни¬
ками и кипятят на водяной бане в течение часа, за этот период2—3 раза раствор взбалтывают. Параллельно кипятят контроль¬
ные колбы с точно такими же объемами щелочи, но без наве¬
сок масла.При полном омылении не должно быть блестящих капелек
масла на дне раствора после охлаждения опытных колб. После
омыления оставшуюся несвязанной щелочь титруют 0,5 н. ра¬
створом серной или соляной кислоты при добавлении раствора
индикатора.Для удобства вычислений титр кислоты, употребляемой для
титрования, выражают в миллиграммах едкого кали. Тогда из
объемов кислоты, пошедших на нейтрализацию щелочи в конт¬
рольной пробе, вычисляют объемы кислоты, израсходованной
на нейтрализацию опытных колб, и разность умножают на
титр в миллиграммах КОН. Вычисление числа омыления (ч. о.)
производят по такой же формуле, как для вычисления кис¬238
лотного числа, где а и б соответствуют объемам кислоты с тит¬
ром, выраженным в миллиграммах КОН.При омылении восков их навески предварительно раство¬
ряют в бензине (точка кипения до 100°), в дальнейшем посту¬
пают так, как с маслами, но продолжительность кипячения
увеличивают до двух часов. Омыление удобнее проводить в
колбах с притертыми к холодильнику горлышками.Числа омыления или нейтрализации смеси или отдельных
жирных кислот представляют функцию молекулярного веса и
могут служить для нахождения среднего молекулярного веса.
Так, молекулярный вес миристиновой кислоты (Си) равен
256,4, а число нейтрализации (ч. н)—218,8; М стеариновой
юислоты (Cie) соответствует 284,4, а ч. н равно— 197,2; М эру-
ковой кислоты (С») соответствует 338,5, а ч. н равно 165,7.Повышенным числам омыления масел соответствует более
низкий средний молекулярный вес жирных кислот, а понижен¬
ным числам омыления, наоборот, — более высокий средний мо¬
лекулярный вес. Так, у хлопкового масла среднее число омы¬
ления 198—200, у рапсового 172—174, а средний молекулярный
вес жирных кислот соответственно 282 и 313.Полумакрометоды определения чисел — кислотного, омыле¬
ния и эфирного. Определение кислотного числа. Отвешивают
навески масла 0,2—0,3 г. Масло получают отжиманием
(стр. 232) и собирают при помощи специальных пипеток (см.
рис. 31). Пипетки с маслом взвешивают с точностью до
+0,2 мг до и после отливания определенного числа капель
масла в колбы на 100 см3. В колбы с маслом приливают по
15 см3 96-градусного спирта, прибавляют по 2—3 капли
раствора фенолфталеина и титруют из микробюретки 0,2 н.
спиртовым раствором щелочи (если масло полностью не раст¬
ворится, то это не мешает определению). Титрование более
слабыми растворами едкого кали не дает четких изменений
окраски и затрудняет определение конца титрования. Конт¬
рольные пробы титруют точно так же.В дальнейшем для определения эфирного числа про¬
водят омыление оттитрованных проб или берут новые навески
для определения числа омыления.Определение числа омыления. Отвешивают в конические
колбы на 100 см3 по 0,15—0,2 + 0,001 г масла (как указано
выше), приливают по 15 см3 0,2 н. спиртовой щелочи из точ¬
ной бюретки и нагревают на водяной бане 30 минут с обратным
холодильником (лучше со шлифом). После охлаждения не
должно быть мельчайших блестящих капелек масла, в против¬
ном случае омыление надо продолжить. После омыления и
охлаждения колб оттитровывают избыток щелочи 0,5 н. раство¬
ром серной кислоты, пользуясь микробюреткой. Одновременно
кипятят контрольные колбы с таким же количеством раствора
щелочи. Результаты вычисляют так же, как при макроопреде-239
леиии. Совпадение результатов двух определений зависит от
точности измерения объемов щелочи и титрования. Обычно
числа омыления двух параллельных определений различаются
не более чем на 2 единицы.Для вышеуказанных определений имеет значение концент¬
рация спирта. При (Недостатке спирта происходит гидролиз
мыла, искажающий результаты титрования. Гидролиз мыла
(соли жирных кислот) не происходит, если в конце титрования
содержание воды в среде будет не более 20%. Поэтому при
употреблении водных титрованных растворов щелочи и кис*
лоты необходимо следить, чтобы было достаточно спирта в ре¬
акционной смеси.Определение ацетильного и гидроксильного чисел. Ацетиль¬
ное число показывает, сколько миллиграммов едкого кали тре¬
буется для нейтрализации уксусной кислоты, которая обра¬
зуется при омылении 1 г ацетилированного масла. Величина
ацетильного числа указывает на содержание свободных гидрок¬
сильных групп в продукте. Гидроксильное число можно вычис¬
лить, зная ацетильное число, и наоборот. Определение ацетиль¬
ного числа основано на способности веществ, содержащих сво¬
бодные гидроксильные группы, образовывать при нагревании
с уксусным анпидридом сложные эфиры уксусной кислоты.В сочетании с другими показателями гидроксильное число
служит для определения состава сложных смесей (моно-три-
глицериды, глицерин н жирные оксикислоти).Реактивы: I) уксусный ангидрид; 2) 0,5 ii. спиртовой раствор едкого
кали; 3) 0,5 н раствор соляной кислоты; 4) колбы для ацетилнрования.Определение ацетильного числа по Норману. Отвешивают
навески масла по 2—2,5 + 0,0) г в колбы на 200 см? для ацети-
лирования, прибавляют 4—6 см* уксусного ангидрида и кипя¬
тят на песочной бане или на электроплитке в течение
1—1,5 часов с обратным воздушным притертым холодильни¬
ком. Затем приливают немного серного эфира, переливают со¬
держимое в фарфоровую чашку и выпаривают на водяной бане
до потери запаха уксусного ангидрида. После удаления уксус¬
ного ангидрида добавляют 5 см3 эфира и переносят в колбу
на 250 см3 (сполоснув чашку эфиром), добавляют 5 см3 воды,
перемешивают и нейтрализуют 0,5 н. раствором щелочи. Затем
приливают по 50 см3 0,5 и. спиртового раствора едкого кали
и омыляют в течение часа, соединив колбу с обратным холо¬
дильником. Одновременно такие же навески масла омыляют
в тех же условиях для определения числа омыления, а так же
кипятят контрольные пробы с 50 смг 0,5 н. раствора спиртовой
щелочи.После омыления избыток щелочи титруют 0,5 н. раствором
серной кислоты в присутствии фенолфталеина.240
Для вычисления ацетильных чисел (в. н.) необходимо из
числа омыления после ацетилировання вычесть числа омыления
масла:Ч.О. — ч.о.м
«•«.- (1 — 0,00075). ч.о.я ’где: ч. о.— число омыления ацетилироваиного масла;ч.	о.м — число омыления масла;0,00075 — коэффициент, представляющий отношение массы
остатка уксусной кислоты (С2Н30) к массе (весу)
молекулы едкого кали (в мг)—43,02:56110.Определение ацетильных чисел в предварительно получен¬
ных ацетилированных продуктах.' 1. Для ацетилировання берут5—10+0,01 г чистого масла в колбы на 100 см8 для ацети-
лирования и прибавляют двойной объем уксусного ангидрида.
Колбы с содержимым соединяют с обратным холодильником и
кипятят 2 часа на песочіной бане или над колбонагревателем,
добиваясь равномерного кипения. Затем охлажденную смесь
переливают в литровую коническую колбу или стакан, в кото¬
рый приливают 500 см3 горячей воды. Эту смесь кипятят пол¬
часа для превращения оставшегося уксусного ангидрида в ук¬
сусную кислоту и ее удаления. Затем смесь переливают в дели¬
тельную воронку, отделяют от кислотного водного слоя и
промывают несколько раз, взбалтывая с горячей водой, до нейт¬
ральной реакции. Иногда бывает целесообразно после первого
кипячения отделить воду сифоном и, добавив новую порцию
горячей воды (500 см3), повторить кипячение. Окончание про¬
мывки определяют по лакмусовой бумаге или другим спосо¬
бом. Промытое ацетил ированное масло сливают в пробирку,
прнбавляюі для сушки 1—1,5 г безводного сернокислого нат¬
рия и выдерживают не менее 18 часов или сушат путем фильт¬
рования через адсорбционную колонку со слоем в 3—4 см без¬
водного сернокислого натрия.2.	В колбы на 200—250 см3 отвешивают 2—2,5 ± 0,005 г
ацетилированйого масла, приливают до 25 см3 0,5 н. раствора
спиртовой щелочи и омыляют на «водяной бане в течение часа,
в дальнейшем поступают так, как при определении числа омы¬
ления (стр. 238). Вычисление ацетильного числа производят
по формуле, приведенной выше. По ацетильному числу можно
вычислить гидроксильное число (г. ч.) по формуле:ЛЧ.*•*•-( 1—0,00075)•<*.*.*Определение йодного числа (по Ганусу). Вещества с непре¬
дельными связями легко присоединяют галогены. Хлористый и
бромистый иод в определенных условиях количественно насы¬
щают этиленовые связи, не замещая водорода на галоген.241
Йодное число показывает» сколько граммов иода» эквивалент¬
ных галогену, присоединяется к 100 г липидов. Величина йод¬
ного числа зависит от числа этиленовых связей в липидах. Ме¬
тод Гануса основан на использовании в качестве реагента бро¬
мистого иода» который образуется при смешении брома с иодом
в ледяной уксусной кислоте» например:СН, <CHah СН = СН (СН,Ь соон + Brt
СН, (СНа)т - СНВгСН! (СН,)7 соон.Реактивы и посуда: 1) хлороформ чистый (не должен окрашиваться
при взбалтывании с нодисты.ч калием); 2) раствор бромистого иода в ле¬
дяной уксусной кислоте (раствор Гануса); 3) 20%-ный раствор йодистого
калия; 4) 0.1 к. раствор гипосульфита; 5) 1%-ный раствор крахмала; 6) про¬
бирки для взвешивания масла; 7)' колбы с хорошо притертыми пробками.Приготовление раствора бромистого иода. В 100 сл3 без¬
водной уксусной кислоты растворяют 13 г иода» а затем при¬
бавляют 8,2 г брома (2,6 см'). Избыток брома не допускается,
так как он вызывает замещение водорода. После прибавления
брома объем раствора доводят до 1 дм8 ледяной уксусной кис¬
лотой и хранят в темной склянке.Ход анализа. В чистые и сухие колбы на 200—300 см* с
притертыми пробками отвешивают по 2 навески каждого об¬
разца масла. Величины навесок в зависимости от величины
йодного числа масла приведены в табл. 12.таблица із	Оптимальные величины навесок ивремя настаивания с реактивом
в зависимости от йодного числаЙодноечислоНавеска U)Время
настаива¬
ния (часов)ЙодноечнедоНавеска («)1 *
25_"3S1*0шДо 30Окаю I0,5100—1300.2-0,30130-600,5-0,60.5130-1600,15-0,20160—1000,3-0,40.5160-2000,10—0,151Навески в указанных границах удобно брать, используя
для отвешивания масла пробирки, снабженные пробкой, через
которую проходит стеклянная палочка. С помощью этой па¬
лочки отсчитывают одинаковое число близких по размеру ка¬
пель. Зная примерный вес капли масла, можно навески для
определения йодного числа подбирать так, что они не будут
различаться более чем на 0,02 г (капли масла не должны по¬
падать на стенки колбы). Затем в колбы с навесками прили¬
вают по 10 см3 чистого хлороформа и добавляют точно по25	см* раствора Гануса. Раствор наливают из бюретки, каждый
раз от одного и того же деления, или автоматической пипет¬242
кой, снабженной поглотителем. Время настаивания с реакти¬
вом считают от момента наливания, поэтому при титровании
избытка реактива в колбах должна соблюдаться такая же по¬
следовательность.Колбы с реакционной смесью перемешивают, закрывают
пробками, смоченными в растворе нодистого калия, и остав¬
ляют на один час в темном месте при температуре 20—30°.
При пониженной температуре (12—15°) продолжительность
стояния надо увеличить до двух часов для образцов с высо¬
ким йодным числом.Одновременно с опытными пробами в таких же условиях
ставят контрольный опыт (без масла).По окончании срока стояния в колбы приливают по 10 см*
20%-ного раствора йодистого калия, затем по 50 см3 дистилли¬
рованной воды и титруют избыток иода 0,1 и. раствором гипо¬
сульфита до желтой окраски, затем прибавляют по 1 см*
1%-ного раствора крахмала и титруют до исчезновения голу¬
бой окраски. Обратно должно оттитровываться 60% иода по
сравнению с контрольной пробой. Раствор йодистого калия и
воду прибавляют перед началом титрования (нельзя приливать
эти растворы преждевременно). Йодное число (и. ч.) вычис¬
ляют по формуле:100 (а —С) Т
и* =	н	•где: Г —титр 0,1 н. раствора гипосульфита;а — объем 0,1 и. раствора гипосульфита, пошедшего на
контрольное определение;б	—то же на пробы с маслом;« — навеска масла (в г).Хлороформ должен быть чистым и не должен изменяться
в окраске при взбалтывании с йодистым калием. Колбы, в ко¬
торых происходит реакция присоединения, должны быть совер¬
шенно сухими.Полумакрометод определения йодного числа. В целях эко¬
номии реактивов в ряде случаев с большим успехом может при¬
меняться следующий метод, который мы рекомендуем для ла¬
бораторий опытных станций.Реактивы и посуда: те же самые, что и 8 предыдущем методе. Бюретки
н пиоеткн должны быть более точными (с делениями в 0,05 см'), колбы —
на 120—150 смг с яригертымн пробками.Ход определения. Таким же приемом, как указывалось
выше, берут навески в колбы на 120 см*. Из масла льна
берут навески от 0,05 до 0,07 г, что обычно составляет 2—2,5	капли.Для растворения масла приливают по 5 см* хлороформа и
по 13 см* раствора Гануса. Колбы закрывают пробками и243
ставят в темно^ Место. Реакция присоединения продолжается
от 1 до 1,5 часов в зависимости от температуры. По истечении
этого срока приливают по 5 см* раствора иодистого калия, при¬
чем тщательно смывают иод с пробки, добавляют 25 см* воды
и титруют гипосульфитом до желтой окраски при постоянном
взбалтывании (по кругу), затем добавляют 0,о смг 1%-ного
раствора крахмала и титруют до исчезновения голубой окраски.
Посинение растворов в колбах через некоторое время свиде¬
тельствует, что не было избытка гипосульфита прн титрова¬
нии. Иод должен легко оттитровываться сразу и нижний хло¬
роформный раствор должен быть бесцветным.Вычисление производят так,
как указано выше.Если хлороформ не чистый,
он постелено отдает иод, титро¬
вание длится долго, а резуль¬
таты определения будут не¬
верны.Рефрактометрический метод
определения нодного числа (по
А. И. Ермакову). Метод, изло¬
женный ниже, сочетает в себе
быстрый способ получения натив¬
ного масла с определением йод¬
ных чисел по показателям пре¬
ломления. Необходимым усло¬
вием для получения хорошего
совпадения результатов этого ме¬
тода с данными, полученными химическими методами, является
точное определение показателей преломления при 20° в маслах,
полученных холодным прессованием из свежеизмельченных се¬
мян.Быстрое определение йодных чисел в условиях контрольных
и селекционных лабораторий зависит также от возможности
быстро получить масло из небольших количеств семян.Аппаратура: I) рефрактометр ИРФ-22 (см. рис. 4) или другой универ¬
сальный рефрактометр; 2) стальной пресс-стакан высотой 4.5 см, шириной
7,5—8 ся —рис. 35 (в центре стакана расточено отверстие — рабочая часгь
диаметром 20—22 мм и глубиной 25—30 мм; для этого отверстия сделан
стальной или бронзовый, плотно входящий пестик, к которому приделана
металлическая ручка; на верхней гладкой поверхности стакана выточено не¬
много шире рабочего отверстия кольцеобразное углубление глубиной до
1 мм и шириной 2—3 мм; в это углубление собирается масло); 3) пипетка
для набирания масла (см. рис. 31); 4) лабораторный масляный прессХод анализа. Для получения масла в стальной преос-стакан
насыпают 2 г (или больше) грубо измельченных семян (мелкие
семена не измельчают), вставляют плотно входящий пестик-
поршень, подставляют под масляный пресс и давление доводят244Рис. 35. Стальной пресс-стакан./ — ПОЛОСТЬ СТАК1НЙ объемом 12—
15 ел’. 2 — осстк-поршсяъ с плоской
ручкой.
до 100 атм (для семян, содержащих от 15 до 25% масла, ис¬
пользуют пресс-стакан, содержащий 5—10 г семян, н приме¬
няют давление до 200 агл). Масло, выступившее вокруг поршня
на поверхность пресс-стакана, собирают пипеткой, на конце ко¬
торой вставлен ватный фильтр. Вату пропитывают маслом, ко¬
торое насасывается внутрь пипетки резиновой грушей (стр. 226
и рис. 31). Таким образом в течение нескольких часов полу¬
чают масло из 20—30 образцов.После этого определяют показатель преломления при опре¬
деленной температуре (20—25°). Для каждого образца полу¬
чают по 2 пробы масла, о которых определяют показатели
преломления, делая несколько отсчетов.Величину йодных чисел вычисляют по одной из формул, в
которые подставляют среднюю величину показателя преломле¬
ния, полученную для двух параллельных проб масла (взятых из
одного образца).«2-1,4595* 100= оЛ)Щ	ШНами на большом числе образцов различных масел (льна,
конопли, сои, подсолнечника, хлопчатника, горчицы) проверена
формула (1), по которой получают хорошие совпадения резуль¬
татов с определениями йодных чисел по методу Гануса.Точность определения йодных чисел этим методом зависит
от качества масла: наличие примесей в масле влияет на резуль¬
таты. Для быстрого вычисления йодных чисел по показателям
преломления следует составить таблицу.Так, по —1,4780; 1,4790; 1,4800; 1,4810; 1,4820. Им соот¬
ветствуют йодные числа, рассчитанные по формуле (1): 156,9;
165,2; 173,7; 182,2; 190,6 единиц.Для вычисления йодных чисел М. Фове и К. Понжан * при¬
водят для масел льна формулу (2), а для сои —формулу (3).ПЛ. «=[я£-1,4626 — 0,05 (л$- 1,4806)] . 10»при «*>1,4806,	(2)п.*. — [п$— 1,4618 - 0,25(п$- 1.4750)] • 10*при л™> 1.4750.	(3)Определение роданового числа масел. Родановое число по¬
казывает число іраммов иода, эквивалентное родану, пошед¬
шему на присоединение к 100 г взятого масла. Насыщение
двойных связей роданом в отличие от галогенов идет строго се¬
лективно. Так, у олеиновой кислоты родановые и йодные числа
совпадают, у лииолевой йодное число приблизительно в 2 раза♦	М. Фове, К. Повжан Иеиское обозрение, 5, 1964, стр. 230.245
меньше, у линоленовой родановое число составляет около */з от
йодного. К кислотам с тройными связями родан не присо¬
единяется.Реактивы и аппаратура: 1) роданистый свинец; 2) ледяная уксусная
кислота; 3) уксусный ангидрид; 4) 10%-ный раствор иодистого калия;5)	0,10 н. раствор гипосульфита; 6) колбы на 120—200 см* с притертыми
пробками; 7) бюретка с делением в Vio см\ 8) мнкробюретка на 2 см?(рис. 36, а).Приготовление роданового раствора. Стойкость родановых
растворов зависит от отсутствия в них воды, поэтому их гото¬
вят, тщательно оберегая от воды. К ледя¬
ной уксусной кислоте прибавляют 10% све-
жеперегнанного уксусного ангидрида. При
исследовании нерастворимых в этой смеси
жиров (растворимость твердых жиров, на¬
пример, в уксусной кислоте ограничена)
прибавляют еще 30% четыреххлористого
углерода. Полученный раствор разливают
по склянкам из темного стекла с пришлифо¬
ванными пробками. На каждые 200 см3 этого
раствора добавляют по 6 ±0,01 г совер¬
шенно сухого и чистого роданистого свин¬
ца. Эти склянки с раствором хранят в
темноте до того момента, когда потре¬
буется приготовить родановый раствор.
Тогда на каждые 6 г роданистого свинца
(в осадке) приливают из микробюретки по0,6 мл чистого и обезвоженного брома.
Смеси дают постоять 10—15 минут для
полного обезвоживания брома, а затем
энергично встряхивают до обесцвечивания.
Реакция идет следующим образом:Pb (SCN), + Вг, = РЬВг3 4- (SCN)j.Затем дают осесть осадку и раствор
отфильтровывают через просушенную при
100° воронку с двойным фильтром. Полу¬
ченный родановый раствор должен быть
светлым и прозрачным. Если содержание
(SCN)2 в свежеприготовленном растворе принять за 100%, то
на 3-й день будет 99,3%, на 14-й —95,8%.Приготовление роданистого свинца. Роданистый свинец го¬
товят из химически чистого уксуснокислого свинца и родани¬
стого аммония или роданистого калия. На 100 г уксуснокис¬
лого свинца берут 62—63 г роданистого калия и 150—200 см3
воды. Раствор уксуснокислого свинца подкисляют уксусной
кислотой и на холоде осаждают роданистый свинец прибавле¬Рис. 3G. Образцы мик-
робюреток.а — обычная, 6 — само*
заполняющаяся.246
ние.4 раствора роданистого калия в воде. Осадок отсасывают и
хорошо промывают водой, подкисленной уксусной кислотой» за¬
тем спиртом и потом эфиром. После этого роданистый свинец
высушивают при температуре не выше 60° в термостате, а затем
в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом (Pj05) в тем¬
ноте. Только после сушки не менее 16 часов роданистый свинец
становится годным к употреблению.Ход анализа. Навески масла отвешивают точно (+0,0001)
в таких же количествах, как для определения йодных чисел,
в колбы с притертыми пробками. Навески берут по разности
взвешивания пробирок с маслом до и после отливания его в
колбу. Затем в колбы из бюретки приливают по 20 см3 рода¬
нистого раствора, в котором хорошо растворяется большая
часть масел. Бюретку закрывают пробкой с CaClj. Одновре¬
менно ставят контрольные колбы без масла. Кроме того, конт¬
ролируют скорость разложения роданового раствора, сравни¬
вая результаты титрования свеженалитого раствора с контроль¬
ными пробами. После 18—20 часов стояния разница не должна
превышать 0,2 см\Для масел, содержащих лнноленовую кислоту, применяют
по 40 см* роданового раствора. Одновременно точно такое же
количество роданового раствора приливают в контрольные
колбы. Все колбы после перемешивания оставляют стоять в тем¬
ноте в течение 18 часов (например, раствор родана приливают
во второй половине дня, а оттнтровывают в первой половине
следующего дня). По истечении этого срока приливают
15—20 см3 10%-його раствора иодистого калия и, сильно встря¬
хивая, добавляют равное количество воды. Выделившийся иод
оттнтровывают гипосульфитом [(SCN)* + 2КІ «= 2KSCN + IJ.
Йодистый калий и воду прибавляют перед титрованием каждой
колбы в отдельности.Реакция иода с гипосульфитом идет быстрей реакции гид¬
ролиза родана, что позволяет применять водные растворы йоди¬
стого калия.При вычислении результатов анализа титр роданового
раствора определяют так же, как раствора бромнода (стр. 243).
По титрованию гипосульфитом выделившегося иода в контроль¬
ных пробах определяют титр роданового раствора, который вы¬
ражают в миллиграммах иода.Родановое число равно:100Г(а — б):н,где: Т — титр роданового раствора;о—число куб. сантиметров 0,1 н. раствора гипосульфита,
пошедшего на титрование контрольных проб;6-го же опытных проб (с маслом);
п — навеска масла (в г).247
Определение состава
жирных кислот
по физико-химическим
показателям маслаМетоды определения жирных кислот. Состав жирных кислот,
следует определять хроматографическими или спектральными
методами. Широкое значение приобретают газовые хромато¬
графы, изготовляемые в нашей стране, однако эти приборы
не везде доступны. Не утратил своего значения тиометрический
метод для определения состава жирных кислот в маслах семян.
Этот метод дает приближенные результаты, однако вполне до*
статочные для ряда целей. Определив йодные числа (по Га¬
нусу) н родановые числа, а также содержанке насыщенных
кислот по изложенным выше методам, вычисляют состав жир¬
ных кислот по различным формулам *. Формулы для вычисле¬
ний, приведенные ниже, дают наиболее сопоставимые резуль¬
таты с хроматографическими методами.В маслах, содержащих ненасыщенные кислоты, олеиновую
и линолевую, проценты этих кислот вычисляют по формулам:Л = 1,1481 (а.*. — р.ч.)О = 2,3115/7.«. — 1,1992 и.ч.Н = 100—(Л+ О + Ht0M + Га).В маслах, содержащих, кроме указанных кислот, еще и
ли ноленовую кислоту, проценты этих кислот вычисляют по
формулам:Ле = 1,5375р.ч. — 0,0675 и.ч. + 1,3215 (Н + Неоя + Гл) — 132,15
Л = 1,2337и.ч. — З.С986р.ч. — 1,6765 {Н + Неом -j- Гл) + 167.65
О = 1,5611 р.ч. -1,1662 и.ч. - 0,645 (Н + Нвоя + Гл) + 64,5Здесь: Ле —линоленовая кислота;Л —линолевая кислота;О — олеиновая кислота;Н — насыщенные кислоты;Неом — неомыляемые вещества;Г л — глицерин.Определение соотношения жирных кислот в масле семян
льна. Содержание линоленовой, лмнолевой, олеиновой и суммы
насыщенных жирных кислот можно рассчитать по эмпириче¬
ским формулам, выведенным М. Фове и К. Понжаном (1964).
Для этого достаточно определить йодное число масла.На основании многочисленных спектрофотометрическнх и
родаиометрических анализов были выведены следующие формулы•	Н. И. По гон кин а, В. П. Ржсхин и др. Гр. ВНИИЖ. вып. 25, 1965,
стр. 251.248
для вычисления линоленовой (х). лииолевой (f/), олеиновой (г)
«i насыщенных («) жирных кислот в процентах глицеридов:х{Ле) = 0,5-е. 38,6	(1)у (Л) = 5,54 — 0,1538'jr	(2)*(0) = 78,36—1,03 х	(3)« = 16.09 — 0,124-jr	(4)Пример вычисления. Показатель преломления масла пра 20? в
среднем из двух проб был 1,4820. Тогда поднос число по формуле:и. ч. = [ng - 1,4626 - 0,05 (л£ - 1,4806) ] • 104составит 193.3 едииины. Содержание жирных кислот, вычисленное по фор¬
мулам (1), (2), (3), (4). будет соответствию 58%: 14.5%: 18.6%; 8,9%.Определение соотношения жирных кислот в масле семян
подсолнечника по А. И. Ермакову и Э. В. Поповой. В масле се¬
мян подсолнечника главными являются линолевая, олеиновая
и насыщенные —пальмитиновая, стеариновая — жирные кис*
лоты. Сумма их составляет 97—99% от всех жирных кислот.
Содержание их можно вычислить по формулам, выведенным
на основании изучения изменчивости показателей преломления
у различных образцов масла семян подсолнечника и определе¬
ния соотношений в нем жирных кислот методом газожидкост¬
ной хроматографии.Для вычисления содержания жирных кислот необходимо
точно определить показатель преломления при 20° в натив¬
ном масле (получение масла см. на стр. 232).Содержание лииолевой кислоты (х) в процентах можно вы¬
числить по следующей формуле или по таблице, составленной
на ее основе:х = 9257,85.я£ -13589,74.	(1)Между олеиновой и лииолевой жирными кислотами в масле
подсолнечника была установлена высокая отрицательная зави¬
симость:г = — 0,98 + 0,02.Содержание олеиновой кислоты (у) в процентах опреде¬
ляют по формуле:у — 83,434—0,918* дг.	(2)Процент насыщенных жирных кислот («) вычисляют по
формуле:н « 100—(дг + у).	(3)Првмер вычислена я. Показатель преломления нативного масла
семян подсолнечника (среднее из двух проб) составил 1,4739.х - 9257,85-1,4739 - 13589,74 - 55.40 ± 0.65%.у - 83,434 — 0.918 X 55,4 - 32.58%н - 100 - (55,4 + 32,28) - 12,02%248
Определение
неомыляемых веществК числу неомыляемых относятся инертные к действию
растворов щелочей вещества, нерастворимые в воде. В эту
группу веществ, сопутствующих маслу, входят углеводороды,
стерины, спирты высокого молекулярного веса, токоферолы и
др. Содержание этих веществ в масле обычно составляет1—1,3%, однако встречаются масла дикорастущих растений, у
которых количество неомыляемых веществ значительно больше.Принцип определения неомыляемых веществ основан на
омылении масла и отделения солей жирных кислот и глице¬
рина отмыванием водой лз раствора петролейного эфира, в ко¬
тором находятся неомыляемые вещества. Эфир отгоняют, оста¬
ток высушивают и взвешивают.Реактивы: 1) этиловый спирт (95%-иый); 2) петролейиый эфир с точкой
кипения 45—6<Р; 3) 50%-ный раствор едкого калия.Ход анализа. В конической колбе на 250 см3 нагревают до
кипения 5±0,01 г испытуемого масла с 15 см3 95%-ного
спирта; в другой колбе нагревают 15 см3 того же спирта и3	см3 50%-ного раствора едкого калия в воде. Затем раствор
из второй колбы переливают в колбу с маслом, смешивают и
кипятят 10 минут, охлаждают, прибавляют 50 см3 петролейного
эфира и переливают в делительную воронку. Колбу промывают
эфиром, который присоединяют к главной части. Затем мед¬
ленно приливают 150 см* воды в воронку и осторожно пере*
мешивают все содержимое, избегая образования эмульсии.
После отстаивания, когда водный и эфирный слои разделяются,
мыльный водный раствор сливают.Соединенные петролейно-эфирные вытяжки промывают
50%-ным спиртом с добавлением нескольких капель раствора
едкого калия, а затем промыват водой 2 раза по 100 см*. По¬
следняя порция промывной воды не должна давать красного
окрашивания с фенолфталеином.При образовании стойкой эмульсии ее отделяют вместе с пет-
ролейно-эфирной вытяжкой, разрушают прибавлением неболь¬
шого количества крепкого спирта и вновь разделяют. Затем из
петролейного экстракта удаляют растворитель, а полученный
остаток сушат при 100° и определяют процентное содержание
неомыляемых веществ в масле.Определение восковВоска широко распространены среди растений, особенно на
поверхностях листьев, стеблей, плодов, а также в тканях ра¬
стений. Они выполняют защитную роль, обладая большой
устойчивостью против механических и химических воздействий.250
Воска представляют разнообразные смеси жирных кислот,
спиртов, углеводородов, сложных эфиров жирных кислот и вы¬
сокомолекулярных спиртов; последние вещества составляют
главную часть восков.Масла и воска имеют в своем составе общие жирные кис*
лоты.Реактивы и аппаратура: 1) петролейный эфир с точкой кипения 60—70°;
2) этиловый пли метиловый спирт; 3) водяная баня с установленными об¬
ратными холодильниками; 4) конические колбы на 250 см'; 5) мерный ци¬
линдр; 6) воронка Бюхнера или с пористой пластинкой.Ход анализа. Для определения восков в волокне хлопчат¬
ника навески измельченного волокна по 10—15 г помещают в
конические колбы на 200 см\ приливают 100 см* петролейного
эфира и нагревают на водяной бане с обратным холодильни¬
ком 40 минут. Полученный экстракт сливают в заранее взве¬
шенную' колбу. В колбу с навеской прибавляют новую порцию
петролейного эфира и еще раз нагревают 30 минут. Экстракт
отсасывают через фильтр иа воронке Бюхнера. Затем эфирные
вытяжки объединяют и растворитель отгоняют, колбу проду¬
вают грушей и сушат.Навеску после эфирной экстракции дополнительно дважды
экстрагируют этиловым спиртом. Для этого в колбу с исследуе¬
мым материалом приливают 100 см* 96%-ного спирта и нагре¬
вают на водяной бане с обратным холодильником в течение
часа, экстракт сливают через фильтр и проводят следующее
извлечение с 75 cjk3 спирта. Для этого извлечения нагревают
30 минут. Растворитель после каждой экстракции сливают в
ту же чистую колбу, из которой его отгоняют на водяной бане.
В остатке, кроме восков, содержатся и другие экстрактивные
вещества, которые удаляют промыванием теплой водой, после
чего остаток сушат в термостате при 100—105° в течение часа.После этого отдельно подсчитывают количество веществ, пе¬
реходящих в спиртовую вытяжку и в петролейный эфир. Соот¬
ношение между веществами этих вытяжек указывает на их
качественный состав. В спирт переходят вещества, содержащие
гидроксильные группы и богатые кислородом соединения.Определение насыщенных
высокомолекулярных кислот(по Бертраму)Метод основан на окислении ненасыщенных кислот раство¬
ром перманганата. Прн этом происходит распад кислот по
месту двойных связей с образованием низкомолекулярных
жирных кислот нли окисление их с образованием оксикислот»
нерастворимых в пеіролейном эфире. Высокомолекулярные на¬251
сыщенные жирные кислоты отделяют от оксикислот, используя
их свойства не растворяться в петролейно» эфире. Магниевые
соли низкомолекулярных жирных кислот, образовавшиеся в ре¬
зультате окисления растворимы в воде, а соли высокомолеку¬
лярных насыщенных кислот не растворимы.Реактивы и посуда: I) 0,5 н. спиртовой раствор едкого кали; 2) 4,5%-ный
раствор перманганата; 3) 10%-ный раствор сернистокислого натрия;4)	10%-ный раствор хлористого аммония (NH«C1); 5) 15%-ный раствор
хлористого ел* сернокислого магния; 6) серная кислота; 7) 25%-ный ам¬
миак; 8) оетролейный эфир; 9) спирт; 10) плоскодонные колбы на 1,5 дм\
II) колбы ва 250 и 100 до; 12) делительная воронка иа 500 смл.Ход анализа. Омылеяие масла и удаление не¬
омыляемых веществ*. Навеску масла (около б г) омы-
ляют в колбе на 250 см3 кипячением с 75 см3 0,5 и. спиртового
раствора едкого кали. Раствор переливают в делительную во¬
ронку, добавляют равный объем воды и неомыляемые вещества
извлекают 3 раза петролейным эфиром по 50 см3. Соединенные
растворы неомыляемых веществ в петролейиом эфире промы¬
вают 50%-ным спиртом для удаления следов мыла.Окисление жирных кислот. Промывные воды при¬
соединяют к основному мыльному раствору. Спирт отгоняют
иа водяной бане. Мыло, растворенное в воде, количественно пе¬
реносят в колбу иа 1,5 дм3, объем раствора доводят до 200 см3,
прибавляют к нему 5 см? 50%-ного раствора едкого калия, а
затем при постоянном перемешивании по каплям прибавляют
раствор перманганата (30 г на 650 см3 воды) до тех пор, пока
раствор в колбе не приобретет устойчиво розовый цвет. Темпе¬
ратура жидкости при окислении не должна «превышать 20°.
При повышении температуры колбу нужно охлаждать под во¬
допроводным краном. Колбу с жидкостью оставляют на ночь.
На следующий день, если окисление закончено, реактивную
смесь подкисляют серной кислотой и 10%-ным обесцвечиваю¬
щим раствором сульфита. Раствор бисульфита и кислоты при¬
ливают попеременно небольшими порциями. Под действием
серной кислоты освобождаются жирные кислоты, которые
после нагревания всплывают и собираются на поверхности вод¬
ного раствораИзвлечение насыщенных жирных кислот. Вы¬
делившиеся кислоты 2—3 раза извлекают петролейным эфиром
в делительной воронке. Затем вытяжки отфильтровывают, про¬
мывают остаток на фильтре петролейным эфиром и отгоняют
эфир. К остатку, состоящему из жирных кислот, прибавляют
200 см3 воды, 25%-ного раствора аммиака с избытком и 30 см3
10%-ного раствора хлористого аммония. Смесь нагревают для*	Определение насыщенных кислот по этому методу можно совместить
с последовательным определением чисел кислотности, омыления и количества
неомыляемых всщсста в одной и той же навсске.252
перевода свободных жирных кислот в аммонийные мыла и
осаждают 20 см3 15%-ного раствора сернокислого или хлори¬
стого магния. Выпавший после нагревания осадок отфильтро¬
вывают, промывают на фильтре водой и количественно перено¬
сят в делительную воронку или стакан, где прибавлением сер¬
ной кислоты выделяют жирные кислоты. После охлаждения
жирные кислоты извлекают петролейным эфиром, эфир отго¬
няют н полученные жирные кислоты подвергают вторичной
очистке через магниевые соли, как описано выше. После пов¬
торной очистки жирные кислоты выделяют из магниевых солей
подкислением кислотой и затем извлекают петролейным эфи¬
ром. Эфирный раствор промывают водой (встряхивая в дели¬
тельной воронке) до нейтральной реакции промывных вод по
метилоранжу. Затем эфир отгоняют, жирные кислоты высуши¬
вают в сушильном шкафу при 80°, взвешивают и вычисляют
как обычно.Определение состава
жирных кислот липидовРазделение сложных смесей гидрофобных веществ (лнпндов
и др.) основывается «а принципе «обращенных фаз». Для этого
хроматографическую бумагу пропитывают малолетучнм гидро¬
фобным органическим раствором (высококипящие углеводо¬
роды, вазелин, парафин) — неподвижная фаза; подвижной фа¬
зой служат гидрофильные жидкости (уксусная кислота, мета¬
нол, ацетон и др.).Условия разделения жирных кислот. Высокомолекулярные
жирные кислоты образуют так называемые критические пары,
которые имеют очень близкие значения Rf, что затрудняет их
разделение. Наиболее часто встречаются следующие критиче¬
ские- пары жирных кислот: олеиновая (Cie)—пальмитиновая
(Cie); лннолевая (Сю)—мнристиновая (См); линолеиовая
(Си) —лауриновая (С«); эйкозеновая (Сад)—стеариновая
(Cie); эруковая (С*г)—арахиновая (См). Таким образом, не¬
насыщенная кислота с одной двойной связью и п атомами угле¬
рода идет в паре с насыщенной кислотой с п — 2 атомами угле¬
рода, а кислота с двумя связями — в паре с насыщенной кисло¬
той с п — 4 атомами углерода и т. д.Для хроматографии жирных кислот можно использовать
восходящий, нисходящий и другие способы. Значение Rf насы¬
щенных жирных кислот в восходящей хроматограмме в системе
уадекан — 90%-ная уксусная кислота следующие: каприновая
(Сю) — 0,58, лауриновая (Cia)—0,46; мирисгиновая (Сц)—0,37; пальмитиновая (Cie)— 0,22; стеариновая (Ci8)—0,15.Хорошее разделение жирных кислот зависит от способа про¬
питывания бумаги гидрофобным растворителем. Бумага, содер-253
жашая большое количество растворителя (как и сильно отжа¬
тая), не дает хорошего разделения. Жирные кислоты после раз¬
деления остаются незаметными, и их необходимо перевести в
соли тяжелых металлов (меди, ртути, свинца, серебра и др.).
Затем соли жирных кислот проявляют ферроцианидом калия
или сульфидами и получают окрашенные пятна. Идентнфика*
цию осуществляют с помощью кислот-«свидетелей», сравнивая
величины Rf. «Свидетелей» наносят на ту же полоску бумаги,
что и исследуемую пробу, и по расположению пятен тех и дру¬
гих идентифицируют.Выделение жирных кислот из глицеридов. Способы выделе¬
ния жирных кислот. Выделение кислот можно осуществить не¬
сколькими способами.1.	В стакане на 50 см3 из термостойкого стекла растворяют
при нагревании 0,8 г КОН в 5 см3 чистого глицерина. После
того как прекратится выделение паров воды из глицерина, в
стакан приливают 2,1 см3 нагретого масла. Смесь размешивают
при нагревании в течение 4 минут до состояния прозрачного
раствора. Затем, после охлаждения, приливают по каплям3	см3 25%-ного раствора серной кислоты и выделившиеся жир¬
ные кислоты извлекают в делительной воронке петролейным
эфиром, отмывают от серной кислоты, сушат сернокислым нат¬
рием и фильтруют. Затем растворитель отгоняют.2.	Выделение жирных кислот можно производить и спирто¬
вым I и. раствором КОН. Затем омыленный раствор в дели¬
тельной воронке разбавляют водой, извлекают неомыляемые ве¬
щества, встряхивая с петролейным эфиром, выпаривают спирт
ка водяной бане. Мыло разлагают 10%-ной серной кислотой и
с выделившимися жирными кислотами поступают так, как ука¬
зано выше.3.	В ряде случаев удобно проводить холодное омыление
глицеридов. Для этого 2 г масла растворяют в 25 см3 петро¬
лейного эфира, добавляют 25 см3 1 и. спиртового расгвора ще¬
лочи и после тщательного перемешивания оставляют в темноте
на мочь (на 20 часов) для омыления. После этого прибавляют
25—50 см3 воды и тщательно переносят в делительную воронку.
Мыло разлагают прибавлением раствора кислоты н далее по¬
ступают так, как указано выше.Хроматографирование. Подготовка фаз. Для пропиты¬
вания бумаги марки Б («быстрая») используют фракцию керо¬
сина с температурой кипения 190—220° (неподвижная фаза).
Отогнанную фракцию очищают встряхиванием с концентриро¬
ванной H2SO4 на механическом встряхивателе в течение 40—
45 минут и затем отстаивают в делительной воронке (на
500 см3 фракции керосина берут 100 см3 серной кислоты). Об¬
работку керосина кислотой ведут до тех пор, пока слой кислоты
после встряхивания не будет светло-желтого цвета. Очищен¬
ный керосин промывают один раз 25 см3 1%-ного раствора254
щелочи, затем — водой до нейтральной реакции и сушат без¬
водным Na2S04 (пропуская керосин через колонку). В ка*
честве подвижной фазы приготовляют раствор 90%-ной уксус¬
ной кислоты. Приготовленные растворители взаимно насыщают.
При подготовке растворителя для неподвижной фазы к 500 см3
очищенного и сухого керосина прибавляют 25 см3 90%-ной
уксусной кислоты н в течение 30 минут встряхивают при тем¬
пературе около 20°, а затем отстаивают. Если после отстаива¬
ния насыщенный раствор керосина будет мутным, то добав¬
ляют к последнему 10—12 смл керосина, чтобы снизить насы¬
щение. Такой раствор (№ 1) может сохраняться долгое время в
закрытой склянке.Для подвижной фазы таким же образом насыщают 90%-ную
уксусную кислоту, прибавляя к 500 см3 90%-ной уксусной кис¬
лоты 25 см* керосина (раствор № 2), и поступают так, как опи¬
сано в пункте 1.Подготовка бумаги и нанесение жирных кис¬
лот. Нарезают бумагу марки Б вдоль на полосы длиной 35 сл
и шириной по размеру камеры для хроматографирования, по¬
мещают в камеру, промывают 70%-ной уксусной кислотой до
полного обесцвечивания жидкости, стекающей с концов бумаги.
Бумагу выветривают под тягой и затем высушивают при 100°
до удаления запаха уксусной кислоты.Перед употреблением бумаги для хроматографирования по¬
лоски насыщают неподвижной фазой. Для этого взвешенную на
технических весах полоску бумаги свертывают в рулон н по¬
гружают на 10 секунд в стакан с керосином, насыщенным ук¬
сусной кислотой, затем бумагу подвешивают строго верти¬
кально и дают стечь избытку керосина, после этого укладывают
на стекле между двумя листами фильтровальной бумаги, при¬
жимая сверху вторым стеклом (с равномерно распределенным
грузом в 4 кг), и отжимают полоску в течение 25—30 минут, ме¬
няя бумагу до получения степени насыщения полоски несколько
больше, чем необходимо (0,23—0,25 г керосина к 1 г бумаги).
Отжатую полоску взвешивают на весах н сразу же пускают в
работу.Жирные кислоты, выделенные после омыления липидов,
растворяют, приготовляя 2—2,5%-ный раствор в смеси мета¬
нола с бензолом (3:7 объемных частей). При взятии навесок
жирных кислот н их растворении надо иметь в виду, что опти¬
мальное количество каждой жирной кислоты не должно пре¬
вышать 20—40 мкг. На линии старта слегка отмечают карай*
дашом точки с интервалом 2—4 см н при помощи мнкропипетки
наносят на каждую точку по 0,005 см3 раствора кислот, при
этом пипетку держат вертикально. Размер пятна должен быть
не больше 3—4 мм, что достигается в том случае, если одно¬
временно наносят не более 0,001 см3 и дают растворителю уле¬
тучиваться.256
После быстрого нанесения всех проб полоски бумаги опять
взвешивают (для вычисления степени насыщения керосином) и
помещают в камеру.Разделение кислот и идентификация. На дно камеры уста¬
навливают кристаллизаторы или чашки с жидкостью № I для
насыщения пространства камеры парами керосина. Затем поме¬
щают полоски бумаги с нанесенными пробами в камеру,
плотно ее закрывают и оставляют при температуре 20—22° на
2 часа для насыщения.После этого наливают в лоток через капельную воронку,
вставленную в крышку камеры, раствор № 2. Полоски бумаги
впитывают жидкость, которая медленно продвигается вниз.
Через 18—20 часов линия фронта растворителя продвинется на
25—30 см; тогда бумагу вынимают и отмечают карандашом
линию фронта. В вытяжном шкафу выветривают полоски от
уксусной кислоты и затем сушат в течение 1,5—2 часов при тем¬
пературе 90° до полного испарения растворителя.Для окрашивания пятен жирных кислот опытные полоски по¬
гружают на 30 минут в кювету с раствором уксуснокислой
меди—10 см3 насыщенного раствора (СН»СОО)яСи на 240 см3
воды. Для удаления избытка меди бумагу 2 раза промывают
в 2%-ном растворе NaCI, покачивая жидкость в кювете и ме¬
няя раствор через каждые 30 минут. Затем ополаскивают водой
и полооки бумаги опускают на 10 минут в раствор 0,05%-ной
рубеановодородной кислоты. На месте разделившихся жирных
кислот появляются темно-зеленые пятна. Бумагу отмывают от
индикатора водой, высушивают и отмечают карандашом прояв¬
ленные пятна жирных кислот *.Определение состава
липидов газожидкостной
хроматографией (ГЖХ)Метод основан на неодинаковой скорости прохождения че¬
рез колонку (наполненную порошкообразным носителем, про¬
питанным нелетучей жидкостью) паров метиловых эфиров жир¬
ных кислот с инертным газом. Парообразные эфиры проходят
тем быстрее, чем ниже их растворимость в жидкой фазе**.
Хроматографы устанавливают в соответствии с инструкциями,
приложенными к приборам (Цвет-3, СССР и др.). Получение
чистых масел показано на стр. 232. Метилирование проводят
по одной из следующих прописей.*	Руководство по методам исследования, техиохнынческому контролю и
учету производства в масложировой промышленности, т. I. кн. 2. 1967.•• Г. Берчфилд и Э. Сторрс. Газовая хроматография в биохимии.
Перев, с англ, под ред. К, В. Чмутова. «Мир», 1964,256
Реактивы и аппаратура: I) 5%-ный раствор мстнлага натрия в мети¬
ловом спирте; 2) 5%-ный pacruop H1SO4 в метаноле (в двухгорлую колбу
на I дм\ сиабжснпую холодильником, лучше со шлифом, наливают
300 см* метанола, а затем из капельной воронки, укрепленной в другом
горлышке колбы, приливают по каплям при постоянном размешивании на
магнитной мешалке 25 см} концентрированной серной кислоты); 3) 2%-ный
раствор ацетнлхлорида в метаноле; 4) очищенные* н высушенные раствори¬
тели — метиловый спирт, летролейный эфир, Гекели, хлороформ; 5) аппа¬
рат для метилирования (рис. 37); 6) песчаная блин.1.	Метилирование с метил атом натрия. В круг¬
лолонную колбу иа 50 с.к3 аппарата для выполне¬
ния метилирования и других работ вносят пипет¬
кой около 0,6 см3 жирного масла, прибавляют
10 см3 абсолютного метанола (стр. 430) и 0,05 см3
5%-ного раствора метилата натрия. Затем уста¬
навливают обратный холодильник со шлифом и
нагревают колбу на песчаной бане в течение
1,5 часов при 75—80°. После этого отгоняют поло¬
вину метанола (5 с-»!3), а остаток из колбы пере¬
носят полностью в делительную воронку и. доба¬
вив 20 см3 дистиллированной воды, извлекают ме-
тилопые эфиры жирных кислот порциями 110 10 см3
этилового эфира. Объединенный эфирный экстракт
промывают небольшими порциями воды до нейт¬
ральной реакции. Затем экстракт суша г, фильтруя
через колонку с безводным Na»S04. Наконец, эфир
отгоняют при 20—23°, применяя вакуум (получен¬
ные метиловые эфиры используют для ГЖХ).2.	Получение метиловых эфиров с помощью
ацетилхлориде *. К капле масла (0.01 см3) прили¬
вают I0c.«j2%-Horo раствора ацетнлхлорида в мета¬
ноле н кипятят с обратным холодильником на во¬
дяной бане в течение часа. Затем отгоняют избы¬
ток метанола, а метиловые эфиры извлекают іек-
саном 3 раза по 1 см\ сушат и нейтрализуют
смесью сульфида н бикарбоната натрия. Гексан
удаляют под вакуумом без нагревания.Пробу метиловых эфиров в количестве 7—10 мм3 вводят в газовый хроматограф. При хране¬
нии проб метиловые эфиры оставляют в среде
гексана.3.	Метилирование в метаноловом растворе сер¬
ной кислоты. В колбе на 25 см3 прибора (с нор¬
мальны мн шлифами 14,5, рис. 37) нагревают около0,1 г масла с 10 см3 5%-ного раствора серной кис¬
лоты в метаноле в течение 1,5 часов с обратным хо¬
лодильником на песчаной бане. Затем охлажденную жидкостьРис. 37.
Аппарат для
метилирова¬
ния и от¬
гонки рас¬
творителя./ — ХОЛОДИЛЬ¬
НИК. 2 — ftxer*
pjitTop с хра¬
пом, 3 — колба.*	Л. Н. Харченко. Известии оысших учсОиы.ч заведений, 6, 1968У Jattu М ил257
из колбы переливают в делительную воронку на 100 см5 и
встряхивают с 20 см3 гексана. Геке а новую вытяжку промывают
полунасыщенным раствором NaCI (10; 10; 5 см3) и сушат,
фильтруя через колонку с безводным NaxSO* в круглодонную
колбу на 50 см3. Гексан отгоняют под вакуумом при 40° до
2 см3. Остаток тщательно переносят в маленькие пробирки и
сохраняют для ГЖХ.Методы ГЖХ позволяют точно определить состав жирных
кислот в липидах. Результаты определения жирных кислот
позволяют вычислить групповой состав триглицеридов. Для
определения их группового состава существует ряд методов;
наибольший интерес представляют методы Карта и Гильдича*.Разделение и определение
фосфолипидов в тонком слоеХроматография фосфолипидов в тонком слое позволяет бы¬
стро разделить их на отдельные группы: фосфатидилсерины,
фосфатиднлхолины, фосфатидилэтаноламины, инозитфосфатиды
и др.Метод основан на различной подвижности фосфолипидов в
тонком слое силикагеля в системе растворителей.Реактивы и аппаратура: I) силикагель марки КСК (150—180 меш),
приготовленный для целей хроматографии (см. главу XV. стр. 437); 2) ам¬
миак; 3) хлороформ, метиловый спирт; 4) реактив Драгендорфа; 5) дифе¬
ниламин (20 смР 10%-ного дифениламина в 96%-ном этиловом спирте 4-
+ 100 см* концентрированной соляной кислоты + 80 см3 ледяной уксусной
кислоты); 6) 0,1 н. AgNO» в смеси с 5 и. аммиаком и 2 и. NaOH (1:1:2);
7) 0,5%-ный раствор нннгидрниа в ацетоне; 8) 0,15%-ный раствор сернокис¬
лого гидразина; 9) 2,5%-ный раствор молибденовокислого аммония в 10 н.
серной кислоте; 10) камера для тонкослойной хроматографии; 11) спектрофо¬
тометр (СФ-4А); 12) стеклянные пластннки.Приготовление реактива Драгендорфа. Реактив готовят пу¬
тем смешивания двух растворов: а) 1,7 г нитрата висмута рас¬
творяют в 100 см3 20%-ной уксусной кислоты; б) 40 г К1 раство¬
ряют в 100 см3 НгО. Сливают 20 см* раствора «а» и 5 см3
раствора «б» и добавляют 70 см3 воды.Ход анализа. Нанесение сорбента на пластинку.
В работе можно использовать пластинку с незакрепленным и за¬
крепленным слоем. Для нанесения закрепленного слоя готовят
смесь из расчета на пластинку 12X18 см2: силикагеля 6 г,
гипса 0,3 г и воды 15 см*. При нанесении незакрепленного слоя
предварительно готовят суспензию из воды и силикагеля (3: 1),
быстро растирая силикагель с водой в фарфоровой ступке. По¬
лученную суспензию тотчас выливают на поверхность чистой*	Руководство по истодам исследования (ВНИИЖ) под ред. В. П. Рже-
хииа и А. Г. Сергеева, т. I, ки. 1, стр. 270; т. I. кн. 2, стр 947, 1967.258
пластинки и ровно распределяют при помощи аппликатора или
стеклянной палочки. Однородность толщины слоя сорбента яв-
ляется важным условием для получения хорошего разделения.
На пластинку размером 9X18 см3 наносят 4 г силикагеля, на
12Х18сж2 — 5,2 г, на 24X18— 10,7 г. Пластинки с нанесенным
слоем силикагеля осторожно помещают на ровную, гладкую
поверхность и оставляют на воздухе для высушивания и закре¬
пления слоев. Перед использованием пластинок слои активи¬
руют, нагревая в термостате при 100—110° в течение часа.Извлечение фосфолипидов по модифициро¬
ванной методике Фолча и др. * К 50—100 г размолотых
семян приливают 250—500 см3 смеси хлороформа с метанолом
(2:1) и экстрагируют липиды в течение 30 минут. Осадок от¬
фильтровывают через воронку Бюхнера, тщательно промывают
растворителем. К экстракту добавляют 0,29%-ный раствор
NaCI из расчета 0,2 части от объема экстракта. Смесь переме¬
шивают с помощью электромешалки в течение часа и оставляют
на ночь в темном месте. После расслоения смеси нижнюю ли¬
пидную фракцию сливают, растворитель отгоняют в вакууме в
токе азота до объема 3—5 см3. К этому объему прибавляют
30—50 см2 ацетона и смесь оставляют до выпадения фосфоли¬
пидов. Выпавшие фосфолипиды отделяют центрифугированием,
высушивают в вакууме. Для нанесения на пластинки готовят
раствор из расчета 0,025 г в I см3 хлороформа.Хроматографирование. Раствор на пластинки можно
наносить пятнами (по 0,04 см3) илн полоской. Линия старта
должна быть на высоте 1—2,5 см3 от нижнего края пластинки.
Растворитель наливают слоем высотой 5—7 мм. Пластинки с
незакрепленным слоем ставят под углом 15-20° в камеру для
хроматографирования, предварительно насыщенную растворите¬
лем. Для разделения фосфолипидов можно принять следующие
системы растворителей: хлороформ—метанол—уксусная кисло¬
та—вода (25:15:4:2) и хлороформ—метанол—25%-ный ам¬
миак (65:35:5). Хроматографирование заканчивается, когда
фронт растворителя не дойдет до верхнего края пластинки на1,5—2 см2.Идентификация пятен. Пластинки высушивают до ис¬
чезновения следов растворителя, после чего окрашивают пятна
парами иода. Для этого в камеру (эксикатор), насыщенную па¬
рами иода, помещают пластинку с разделенными фракциями и
выдерживают в течение 30 секунд. Затем вынимают и быстро
обводят пятна иглой.Для идентификации разных фосфолипидов ставят несколько
пластинок. При использовании одной пластинки идентификацию•	J. F о 1 с h. М. Lees, Y. Н. SI о а п е • S t е n I у. J. Biol. Shcm,
226, 497, 1957; Г. Н. Новожилова и др. Прнкл. биох. и ыикробиол., 5, I,
1959.259
можно вести частями, осторожно опрыскивая из пульвириэаторавыделенные секторы.Фосфатидилхолины (лецитины) идентифицируют реакти¬
вом Драгендорфа; при этом пятна окрашиваются в оранже¬
вый цвет. Глнколипнды определяют с помощью дифенилами¬
на, который дает светло-голубое окрашивание. Инозитфос-
фатиды окрашиваются смесью 0,1 и. AgNO$, 5 н. NH3 и
2 н. NaOH в черный цвет. Фосфотидилсерины окрашиваются
в красный цвет при взаимодействии с 0,5%-ным раствором
нингидрииа.При хорошем разделении различных компонентов фосфоли¬
пидов последние осторожно соскабливают с пластинок и элюи¬
руют системой: хлороформ—метанол—уксусная кислота—во¬
да (50:3:8:4) 3 раза по о cjk3. Элюат переносят в колбу Кьель¬
даля, минерализуют и проводят количественное определение
фосфолипидов по фосфору.Для этого к содержимому колбы Кьельдаля добавляют 1 см*
крепкой серной кислоты и 3 капли перекиси водорода. Нагре¬
вание ведут при температуре 210—230° до обесцвечивания рас¬
твора. К минерализованному содержимому в колбу Кьельдаля
прибавляют 5 слс3 0,15%-ного раствора гидразинсульфата и
15 cjk3 2,5%-ного раствора молибденовокнслого аммония, пере¬
носят в мерную колбу на 50 cjk9 и объем доводят до метки
дистиллированной водой. Колбы нагревают в кипящей бане 25
минут. Определение фосфора проводят на спектрофотометре
(СФ-4А) при 820 нм. Количество фосфора определяют по калиб¬
ровочному графику, построенному на основании измерения ра¬
створов с известной концентрацией фосфора.Метод определения группового
состава глицеридов маселПринцип метода. В настоящее время Гильдичем, а также
Картом разработаны методы определения группового состава
глицеридов масел. Метод Гильдича основывается на четырех
правилах: 1) если какая-нибудь жирная кислота А составляет
33 М% и более от суммы всех кислот масла, то она входит не
менее одного раза во все молекулы масла, образуя триглице¬
риды типа АХ*; 2) если жирная кислота составляет от 33 до66	М% от суммы жирных кислот масла, то она может входить
дважды в молекулу глицерида, образуя триглицериды типа
А*Х; 3) если кислота составляет 67 и более М%, то в масле
будут главным образом триглицериды типа А*Х, а также типа
А3; 4) жирные кислоты, входящие в состав триглицеридов ме¬
нее чем на 33 М%, входят не более одного раза и не в каждую
молекулу триглицерида*280
Бели в составе масла 2 вида радикалов насыщенной S я не*
насыщенной U кислот соответственно 10 и 90 М%, то количе¬
ство U глицеридов типа SU2 составляет 33 М%, а остальные67	М% будут составлять триглицериды типа Ua.В тех случаях, когда S = Уз, a U «2/з всех жирнокислотных
остатков, то все масло должно быть из триглицеридов гипа
SUj. В тех случаях, когда количество остатков насыщенных
кислот (S) колеблется между 7з и Vs (от суммы жирных ки¬
слот), то масло может иметь в своем составе смесь глицеридов
типа S*U и SUj. Если S равно 38 М%, a U равно 62 М%, тогда
для определения количества этих глицеридов надо решить2	уравнения:‘/э(ЗД) + а/з(ЗД = 38
9/з (5£/а) + */з (StU) =s 68.Решив эти уравнения, находят, что содержание (S2U) соста¬
вит 14 М%, a (SU2) —86 М%.Таким образом, по методу Гильдича можно рассчитать со¬
держание основных групп глицеридов в маслах. Метод вычи¬
сления построен на количественных определениях тринасыщен-
ных глицеридов и общего содержания насыщенных жирных
кислот.Количество трииасыщенных глицеридов (S3) определяют в
маслах путем окисления двойных связей ненасыщенных жир¬
ных кислот раствором перманганата в ацетоне. В такой среде
тринасыщенные глицериды могут быть выделены количествен¬
но без изменения. Общее количество насыщенных жирных кис¬
лот в изучаемом масле определяют по Бертраму (стр. 251).Ход определения. Растворяют 12 + 0,01 г масла в 150 сл3
сухого ацегона при нагревании на водяной бане в 2 дм3 колбе с
воздушным холодильником. В течение 1,5—2 часов добавляют
небольшими порциями порошок перманганата в 6-кратном ко¬
личестве от веса масла, при размешивании. Затем смесь на¬
гревают 2 часа на бане, ацетон отгоняют и к остатку прили¬
вают 300 см3 дистиллированной воды.Двуокись марганца (МпОа) разрушают сульфитом натрия
(двойным количеством от взятого КМпО<) при нагревании и
взбалтывании в присутствии 50%-ной серной кислоты. Прозрач¬
ный раствор кипятят на бане 2 часа до потери запаха SO?. По¬
сле этого смесь в делительной воронке дважды извлекают дн-
этиловым эфиром. Эфирный слой после отделения промывают
водой до нейтральной реакции. Затем эфирную вытяжку в той
же воронке обрабатывают 10%-ным раствором аммиака для
отделения продуктов окисления от тринасыщенных глицеридов.
После разделения слоев нижний слой сливают, а эфирный слой
дважды промывают водой и 2 раза 6%-ным раствором аммиа¬
ка, затем сиоиа 3 раза промывают водой и сушат сульфатом
нагрия.261
После отгонки эфира сушат до постоянного веса при 105°
(продукт а). Все промывные воды объединяют после обработки
эфиром. Из эфирной вытяжки после промывания и сушки суль*
фатом натрия отгоняют эфир и так же высушивают остаток
(продукт б).Процентное содержание тринасыщенных глицеридов (х) вы¬
числяют по формуле:(л + <Г)100
х =	н	•где: fl-f-б—вес нейтральных продуктов;
к— навеска масла.Содержание насыщенных кислот в масле определяют по
Бертраму, хроматографией на бумаге или газожидкостной.
Определение
белковых и других
глава х азотистых веществ*Особенности белковых
и других азотистых веществ
и методов их определенияБелок является незаменимой основой живого вещества гете¬
рогенной природы. В состав его входят группы родственных сое¬
динений. Характерные различия их заключаются в неодинако¬
вых аминокислотном составе, растворимости и извлекаемое™ их
различными растворителями.Биосинтез белка является сложным, многоступенчатым про¬
цессом, требующим участия многих ферментов, источника
энергии и отдельных структур клетки. В функциональном отно¬
шении различают белки конститутивные и запасные. Проблема
полноценного пищевого и кормового белка решается в основ¬
ном за счет сбалансированного по содержанию незаменимых
аминокислот (лизина, триптофана, метионина, треонина, валнна,
фенилаланина, лейцина, изолейцина) белка, сосредоточенного в
урожае семян.Различные таксоны культурных растений различаются по
содержанию белка, которое, по данным биохимической лабора¬
тории ВИР, изменяется в следующих пределах (табл. 13).Специфической составной частью белка является азот, вхо¬
дящий в определенном количестве в белки различных групп
культурных растений.Определив содержание азота и умножив его на коэффициен¬
ты 5,7 для злаковых и 6,25 для зерновых бобовых и большин¬
ства других культур, вычисляют количество общего белка
(стр. 267).Наблюдаемая изменчивость белка у культур обусловливает*
ся генотипическими особенностями видов, сортов, а также усло¬
виями выращивания. Наибольшие различия по содержанию
белка отмечаются у культур с сильно выраженной видовой н
эколого-географической дифференциацией. У пшеницы макси¬
мальная концентрация белка установлена в зерне диких видов:
однозернянок, содержащих 18—30%, и двузернянок—20—28%
белка. Последние содержат свыше 50% клейковины высокого
качества (против 25—35% у культурных видов). СодержаниеЖ
ілБЛиид із	Содержание белка e' семенах и в вегетатив¬ной массе различных культур
(в процентах на сухое вещество)КультураСодержание
бедка ii се¬
менахКультямСодержание
белка * iere*
тативпой массеПшеница	10,4-30,2Клевер красный (веге*13,7-19,4Рожь	8,1-18,3татнвная масса) . . .Ячмень ........10-19.4Люцерна	10,2-18,3Овес	8-20Лядвснец	15,1-18,6Рис (ядро)	7-14,5Вика .........17,8—24,8Гречиха (ядро) ....11-18.2Эспарцет 	14,6-20,9Просо (ядро)	12-19,3Тимофеевка луговая . .6,3-9,1Кукуруза 	9-25.1Житняк	9,7-12,9Горох 	18,5-35.7Костер безостый . . .4,3-10,7Фасоль	15-32,1Райграс пастбищный . .17,5-18,3Соя28,4-50,4Овсяница луговая . . .5.2-11.6Чечевица 	22.7-34,7Мятлик луговой ....10,2-14,2Бобы	24-35Ежа сборная	5,2-12,7Вика	17,8-24,8Лисохвост	12-19Нут	14,6-30,8Картофель (клубни) на0,7-2,7Чнна	22,2—32,3сырое вещество*. . .Люпин	26,7—19,5Капуста белокочанная
(кочаны) 	1,2-2.5белка у эколого-географнческих групп зависит от условий их
происхождения, изменяясь, например, у гороха от 20 до 27,
у проса от 12,8 до 15, у ячменя от 14,2 до 18,8%.Под влиянием гибридизации и мутагенеза возникают формы
с различным количеством и качеством белка. Получены сорта
гороха гибридного происхождения и мутантные формы сои а
кукурузы, содержащие на 2—4% больше белка по сравнению
с исходными формами. Мутанты кукурузы Опак 2 синтезирует
белок с пониженным содержанием спирторастворимого белка
зеина—15% и повышенной концентрацией лизина —до 6%, а
Флоури 2 с повышенным содержанием лизина, метионина и три¬
птофана.Содержание белка, как правило, отрицательно коррелирует
с продуктивностью растений.Исследования показали, что имеется общая закономерность
изменчивости в содержании и свойствах белка в растениях в за¬
висимости от климатических условий выращивания. В юго-вос¬
точных зонах страны в растениях увеличивается содержание
белка, в котором у зерновых культур повышается уровень спир¬
торастворимой фракции и клейковины повышенного качества,
у зерновых бобовых, масличных и сочноплодных — белка с по*
вышенным содержанием солерастворимой фракции. В северо-
западных районах содержание белка снижается, а в белке по¬
вышается количество воднорастворимых белков. Под влиянием264
определенных доз и сочетаний азотного, калийного и фосфор*
ного удобрений повышается содержание белка: у пшеницы на0,6—3,7%, у гороха на I—6%; при внесении микроэлементов,
особено молибдена, белок у гороха увеличивается на 2,7 —
3,1%. Аминокислотный состав белка под влиянием удобрений
не меняется. Повышенные дозы азота и калия увеличивают в
белке содержание воднорастворнмых, а фосфора — соле- и спир-
торастворимых фракций белка. Степень наблюдаемых измене¬
ний обусловливается биологическими особенностями сортов.На условия орошаемого земледелия в сочетании с удобре¬
ниями растения реагируют увеличением белка в семенах и уро¬
жая (пшеница, рожь, соя, картофель и др.). У зерновых и
зерновых бобовых повышается содержание воднорастворимой
фракции белка. Различные сорта на данные условия реагируют
по-разному.Наряду с белками в растениях присутствуют небелковые азо¬
тистые вещества — свободные аминокислоты, пептиды, аммиак,
амиды и др. В семенах зерновых и зерновых бобовых растений
они составляют до 10%, в клубнях картофеля —до 40% от об¬
щего азота. Одни из этих соединений имеют питательную цен¬
ность (аминокислоты), другие важны для характеристики от¬
дельных звеньев белкового обмена.Белковая молекула содержит ряд активных группировок,
обусловливающих ее реакционную способность. Некоторые уча¬
ствуют в спнралнзации пептидных цепей и «упаковке» их в бел¬
ковой молекуле, определяя этим ту или иную степень ее струк¬
турной сложности. Важная роль в этом принадлежит S — S н
SH — SH группам. Определение их является важным показате¬
лем качества клейковины.Изучение состава белковых фракций суммарного белка се¬
мян и вегетативных органов у различных культур показало, что
главнейшие таксоны культурных растений характеризуются спе¬
цифическим соотношением главнейших белковых фракций
(А. И. Ермаков, М. И. Смирнова-Иконникова, Г. А. Луковнико-
ва, Н. П. Ярош, 1969).Исследование белковых фракций современными методами
хроматографии, гельфильтрацин и электрофореза показало,
что они являются гетерогенными и состоят из компонентов —
основных, нейтральных и кислых белков. Белковые фракции ви¬
дов и сортов растений различаются по количеству компонентов
и их концентрации. У альбуминов и легкорастворимых глобули¬
нов они обладают различными каталитическими активностями,
для многих установлены изоферментные спектры. Для данного
рода исследований особое значение имеет метод электрофореза
в полиакриламидном геле (стр. 308).Биологическая ценность белка зависит от соотношения в
нем незаменимых аминокислот, определяемых хроматографией
на колонках или химическим методом (стр. 298 и 313). Суммар»265
ные белки и особенно белковые фракции у различных культур,
видов и сортов различаются по содержанию некоторых амино¬
кислот (лизина, триптофана). Количество лизина, в зависимости
от видовых особенностей, может изменяться в 1.5—2 раза. Кон-
центрация триптофана в семенах видов н сортов тоже сущест¬
венно изменяется, например (в процентах к белку): пшеницы
0,94—1,53, овса 1,2—1,7, проса 1,39—1,93, риса 1,15—1,44, яро¬
вого ячменя 0,89—1,25, гороха 0,89—1,14, подсолнечника 1,26—
1,61.Содержание метионина в белках семян также колеблется в
связи с изменениями состава фракции.Повышение белка в урожае зерновых культур приводит к
увеличению спирторастворимой фракции в белке, снижая био¬
логическую ценность суммарного белка. В настоящее время
ведутся интенсивные работы по селекции высоколнзинных сор¬
тов кукурузы, пшеницы, ячменя. В этой связи для определения
лизина могут быть использованы портативные колонки с ионо¬
обменной смолой (стр.- 303). Для определения триптофана удо¬
бен метод, основанный на получении красочной реакции.Качественные реакции
на белкиДля качественного определения белков применяют следую¬
щие характерные реакции.1.	Бпуретовая реакция на белки (реакция Пиотровского на
пептидную связь). В разные пробирки наливают no 1—2 см3
раствора белка с равным объемом 4%-ного раствора щелочи и
постепенно, по стенке пробирки добавляют 1—2 капля 0,5%-но¬
го раствора медного купороса. Жидкость окрашивается в фио¬
летово-синий или фиолетово-красный цвет (биуретовая реак¬
ция) благодаря присутствию в молекуле белка пептидной связи
(—СО — NH—). Реакцию дают все белки, а также продукты
их гидролиза — пептоны и полипептиды, начиная с тетрапёпти-
дов.2.	Нинпидриновая реакция на а-аминокнелогы. В пробирки
наливают по 1 смг раствора белка с равным объемом 0,1%-ного
свежеприготовленного раствора нингидрина, осторожно нагре¬
вают, все время вращая пробирку в пламени. При охлаждении
развивается синее окрашивание. Эта реакция на присутствие з
белке NHs-rpynn в a-положении свободных и связанных ами¬
нокислот и является крайне чувствительной.3.	Реакция с азотнортутным реактивом (реактив Миллона).
Этой реакцией определяется наличие фенольных и гетероцикли¬
ческих группировок, например тирозина и триптофана. Если к
раствору белка прибавить примерно Vs объема реактива Мил¬
лона и оставить стоять на 20—30 мл нут или слегка нагреть на266
горелке, то образующийся осадок белка окрашивается в крас¬
ный цвет. Присутствие хлористых солей затрудняет реакцию.Реактив Миллона приготовляют растворением ртути при
осторожном нагревании с двойным по весу количеством крепкой
азотной кислоты. Раствор разбавляют двумя объемами воды.4.	Реакция на содержание в белке серы. Белки содержат
серу в виде аминокислот— цистина н метионина. Серу можно
обнаружить, пользуясь свойством ее давать с солями свинца
черный осадок сернистого свинца. Если белок нагреть со ще¬
лочью и с уксуснокислым свинцом, то происходит отщепление
от аминокислот сероводорода, который дает со свинцом черный
осадок.Определение азота(по Кьельдалю — модификация)Метод основан на минерализации навесок при нагревании с
крепкой серной кислотой в присутствии катализаторов. Аммиак
отгоняют в раствор борной кислоты и оттитровывают его 0,1 и.
раствором серной кислоты. Объем кислоты, пошедшей на титро¬
вание, умножают на титр по азоту и узнают содержание азота
в пробе.Реактивы и аппаратура: 1) 0,1 н. раствор серной кислоты; 2) 2%-ный
раствор борной кислоты (растворяют 20 г HjBOj при нагревании в 500 слО
дистиллированной воды и после охлаждения доводят до I дм}; на каж¬
дые 3 дм* раствора прибавляют 35 см? смешанного индикатора); 3) сме¬
шанный индикатор (50 см} раствора метилен синего — 1 г метилен синего
в 800 см* 95%-ного спирта — смешивают со 100 см* раствора метил крас¬
ного-1 г метил красного в 750 см} 95%-ного спирта; в кислом растворе
индикатор дает красмо-фнолетовое окрашивание, а в щелочном — зеленое;
в переходной стадии, при pH 5,5, индикатор бесцветен); 4) селеновый ка¬
тализатор (готовят растиранием и смешиванием 100 г сернокислого калия,
10 г сернокислой меди и 2 г селена); 5) 40%-ный раствор технической
щелочи; 6) колбы Кьельдаля на 100—250 см1 (для сжигания) и на 250
(для отгонки); 7) конические колбы на 250 слс*; 8) установка для отгонки
аммиака (рис: 38).Ход анализа. Навеску 0,3—0,5 + 0,001 г тонко размолотого
вещества (помол должен проходить через сито с отверстиями
0,1 мм) завертывают в кусочек папиросной бумаги (4X5 см) и
опускают в колбу Кьельдаля на 250 см\ После прибавления
5—7 см3 концентрированной H2SO< и 1 г селенового катализа¬
тора ставят колбу на нагревательный прибор в вытяжном
шкафу. Величина навески для сжигания зависит от содержания
белка в материале и тонкости помола.Колбу Кьельдаля постепенно нагревают и содержимое дово¬
дят до кипения. При образовании пены в первый период окис¬
ления рекомендуется снять колбу с нагревательного прибора и
дать пене осесть, а потом снова нагревать, не допуская попада¬267
ния пены в горло колбы. Минерализация обычно длится около
часа. После полного обесцвечивания и охлаждения содержи*
мое колбы на */з разбавляют водой, вливая ее по стенке тонкой
струен. Затем в колбу приливают 3 капли индикатора и, утеплив
асбестово-глиняной «рубашкой» (каркасом), присоединяют ее к
перегонному аппарату. Приемную колбу с раствором 20 см3
2%-ной борной кислоты подставляют так, чтобы конец
холодильной трубки был погружен в жидкость. Через воронку
отгоночного аппарата сливают 15 см5 40%-ной едкой щелочи иначинают отгонку аммиака,
пропуская пар из парообразо¬
вателя. Парообразователь
(колба на 2 дм3) должен быть
снабжен предохранителем в ви¬
де стеклянной трубки длиной
около 1 м, диаметром 5—6 мм,
не доходящей до дна парооб¬
разователя на 3—5 см. Для ре¬
гулирования кипения между
парообразователем и воронкой
для щелочи вставляют стеклян¬
ную отводную трубку, снаб¬
женную резиновой трубкой с
винтовым зажимом. Конец
трубки опускают в стеклянную
колбу ил її склянку, где соби¬
рается образующаяся из пара
вода. Для ускорения отгонки
колбу Кьельдаля на 250 см3
отепляют смесью асбеста с
глиной (5:1). Кипение не
должно быть бурным, чтобы
частицы щелочи не могли по¬
падать в каплеуловитель. Че¬
рез 20—30 минут отгонка окан¬
чивается.При нормальном кипении
через 15—20 минут, когда отго-
нится приблизительно 70—90% всего аммиака, приемную
колбу с раствором борной кислоты опускают так, чтобы
трубка холодильника была выше уровня раствора кислоты
в приемной колбе. После отгонки конец трубки холо¬
дильника обмывают дистиллированной водой в приемную
колбу.Пр-i отгоне окраска жидкости в приемной колбе изменяется
от малиновой до зеленой. По окончании отгонки дистиллят ти¬
труют 0,1 и. раствором серной кислоты до изменения окраски от
зеленой до малиновой.Рис. 38. Установка для отгонкн
аммиака.268
Вычисление результатов. Титр серной кислоты выра¬
жают в миллиграммах 4зота. Точную нормальность приготов¬
ленного 0,1 и. раствора серной кислоты удобно установить по
перекристаллизованной буре (NaaB^/'lOHjO).Для определения гитра серной кислоты в колбы помещают
навески буры 0,18—0,20 ± 0,0001 г, приливают 50 см* горячей
дистиллированной воды и несколько капель смешанного инди¬
катора и титруют приготовленным приблизительно 0,1 и. раство¬
ром серной кислоты до появления малиновой окраски.Пример вычисления. Взята навеска буры 0.1886 г, на титрование
которой пошло 9.65 см* приготовленного раствора серной кислоты. Истинная
нормальность приготовленного раствора серной кислоты (ж) будет:0,1886-1000 	х° 190,61-9.65 “°'1025-1 см* точно 0,1 а. раствора серной кислоты соответствует 1,4 мг азота,
а I см* приготовленного для работы раствора будет равен: 0,1:0.1025 ~—	1.4 где х«= 1,43.Для определения азота взята навеска муки ячменя 0,50 г. На титрова¬
ние раствора в приемной колбе пошло 9 см3. Содержание азота в навеске
составит 1,43-9«12.87 мг, а процент азота будет равен 0,01287: * —
«0,50: 100; х = 2,60.Определение азота
по полумикрометодуМетод основан на сжигании навески или определенного
объема жидкости концентрированной H^SO*. Аммиак отгоняют
в раствор чистой борной кислоты и титруют серной кислотой из
микробюретки.Химическая реакция аммиака с борной кислотой идет с об¬
разованием метаборной кислоты из ортобориой (НзВ03->
—^НВОа + НгО). Сама борная кислота очень слаба и не ока¬
зывает влияния на концентрацию ионов водорода. Реакция идет
следующим образом: NHj-f-HBO* * NH4++ ВО**\ Получен¬
ный в результате анион ВО*- оттнтровывают раствором кисло¬
ты; при этом происходит восстановление протона в борат анион
(основание) Н+ + ВО*~ - НВ02. Анион ВО* является сильным
основанием и, следовательно, его можно титровать сильной ки¬
слотой.Метод можно применить для изучения содержания белка в
отдельных семенах или в растворах, содержащих белок.Реактивы и аппаратура: 1) приготовление растворов см. на стр. 267;
2) прибор для отгонки аммиака.Описание прибора. Для микроотгонки аммиака используют
прибор модификации Парнаса — Вагнера (рис. 39а). Прибор
состоит из сосуда / с двумя стенками. Через сосуд проходит269
впаянная и согнутая в конце сосуда Трубка (на другом конце
этой трубки припаяна небольшая вороика). К верхней части со¬
суда I припаян каплеуловитель; холодильник 2 с тугоплавкой,
неразъедаемой трубкой соединяют верхним изогнутым концом с
каплеуловителем. Под нижний конец холодильной трубки под¬
ставляют коническую колбу 3 на 50 cjm3; сосуд и холодильник
соединены с другим цилиндрическим сосудом 4, имеющим оття¬
нутый конец для надевания резиновой трубки н припаянную
трубку (тубус) в верхней части для соединения с парообразо¬
вателем. Этот сосуд служит для создания вакуума и для регу-Рис. 39. Аппараты для отгонки небольших количеств аммиака.
о — аппарат Парнаса—Вагнера (объяснение в тексте), 6— аппарат Рота.лирования давления пара и тем самым позволяет промывать
и отсасывать отработанные и промывные жидкости. Перед нача¬
лом определения прибор в собранном виде пропаривают 15—
20 минут.Ход анализа. Навески вещества сжигают в колбе Кьельдаля,
раствор количественно переносят в мерную колбу на 100—
200 см3 н берут для отгонки такой объем жидкости, чтобы в
нем было 0,1—2 мг азота. Этим приемом устраняется необходи¬
мость взвешивания навески (для сжигания вещества) на микро¬
весах. В коническую колбу отмеривают цилиндром 10 см3 рас¬
твора 1%-ной борной кислоты и подставляют ее под холодиль¬
ник так, чтобы конец трубки его находился в кислоте. Пробу
после сжигания и разбавления (или только часть сожженной
пробы) количественно переносят через воронку в сосуд с двой-270
ними стенками, ополаскивают их несколько раз порциями 3—
5 см3 дистиллированной воды, при этом используют зажим у со¬
суда 4, создавая вакуум, выпуская воду. Вместе с водой вво*
дят каплю индикатора, после чего через ту же воронку вливают
5—6 см3 30%-ного раствора едкого натра. Изменение окраски
индикатора указывает на щелочную среду. Затем пропускают
пар, отвинчивая винтовой зажим на пути к сосуду 4, и закры¬
вают свободный выход пара. Жидкость в сосуде / быстро пере¬
ходит в кипение, и отгонка аммиака заканчивается через 10—
15 минут. За 5—10 минут до окончания отгонки приемную
колбу с борной кислотой опускают так, чтобы конец трубки хо¬
лодильника не касался раствора. После смывания трубки дис¬
тиллят титруют 0,05 н. раствором серной кислоты из микробю-
ретки. При вычислении результатов принимают во внимание, чтоI	см3 точно 0,1 н. раствора кислоты соответствует 1,4 мг азота.Закончив отгонку аммиака, открывают зажим, сообщающий
сосуд с наружной средой, и закрывают на несколько секунд
зажим, соединяющий прибор с парообразователем. Благодаря
более быстрому охлаждению сосуда 4 образуется вакуум и вся
жидкость из сосуда / перетекает в сосуд 4. После промывания
прибор готов к новому определению.Биуретовый метод определения
белка в семенах(Н. П. Я potu)Количественное определение основано на измерении интен¬
сивности окраски, получаемой в результате реакции сернокис¬
лой меди в щелочной среде с пептидными связями белка
(СО —NH—). Интенсивность окраски коррелирует с содер¬
жанием белка в растворе.Реактивы и аппаратура: 1) 3,1%-ный раствор сернокислой меди (5 г
CuS0i-5H30 о 95 см1 воды); 2) 4%-ный раствор едкого натра (4 г NaOH
в 96 г воды или в 20%-ном растворе спирта); 3) толстостенные стеклянные
банки на 200 цилиндрической формы, с ровным дном и несколько за¬
уженным горлом; 4) песочные часы на I и 3 минуты; 5) фильтры tk 3 с
пористой пластинкой; 6) мнкроиэмельчнтель тканей РТ-2 (Одесса); 7) тор¬
сионные весы на 500—1000 мг (рнс. 41); 8) ФЭК-М или колориметр (КОЛ-1).Микроизмельчитель РТ-2 (рнс. 40 а). Рабочая часть прибора
включает контейнер /. полую пробку 2 для закрывания банки,
банку 3, прокладку 4 из пористой резины, приспособление для
размельчения. Это приспособление (рис. 40 6) позволяет из¬
мельчать навеску, извлекать белок и проводить биуретовую
реакцию. К имеющемуся в приспособлении стержню вместо двух
ножей закрепляют пластинку 5 из нержавеющей стали, толщи¬
ной 1,5—2 мм. Пластинка должна иметь форму параллело¬
грамма, короткие стороны которого срезаны иод острым уг-271
лом 6. Наибольшая детина пластинки 51—55 діл, ширина 12—
13 мм. Острые концы пластинки иэолиуты а одну сторону на2—3 мм. Перед закреплением пластинки концами вниз на стер¬
жень надевают полую пробку 2—приспособление, предохра¬
няющее от потери жидкости в сосуде. Такую пробку изготов¬
ляют из резинового баллончика («груши»), >потребляемого в
лабораториях для нагнетания или распыления жидкостей. Для
этого концы резиновой груши с одной стороны обрезают наРис. 40, Мнкроразмельпигель РТ-2. приспособленный дли опреде¬
ления белка и соменя х {объяснение я гсксге).IJ Щ|Д \*Л 1М«* И.ЧГПСДИ II рабочем ОКТО’МГИН» б — КфИСНОСОблПШ* К jFil'Ч«.1И117МЮ.■/< длины, a с другой — ня 1 см так, чтобы стержень свободно
вращался с закрепленной на нем пластннкон. Длина получен¬
ной полой конусообразной пробки 50—52 мм. Концы и среднюю
часть пробки обтачивают на пильником н надевают на стер нам к»
конусом ЙНИЗ.К мнкроизмельчителю удобно подключить реле времени, ко¬
торое автоматически отключает прибор.Ход анализа. Подготовка к анализу. В семенах,
имеющих окрашенную оболочку, пигменты которой переходят
в щелочную водо-сшгртовую среду, белок нельзя определять без
предварительного удаления оболочки. Семена овса, риса, проса.
сорго, подсолнечника также предварительно отделяют от оболо¬
чек (см. стр. 10).Из средних проб семян, размельченных до крупного помола,
после перемешивания отбирают 3 или о г и тонко измельчают
на лабораторной мельнице типа «Пируэт». Однородность по*
мола образцов одной и той же культуры обеспечивается величи*
ной навески и продолжительностью* измельчения. Так, 3 г из¬
мельчают в течение минуты, получая достаточно тонкий помол,
при котором 2 параллельные навески по 200 яг лают совпадаю¬
щие результаты. После высушивания до постоянно сухого со¬
стояния и охлаждения образцов отвешивают по 200 яг х 0.001Рис. 41. Схема четигохпрсдольныт торсионных вссоо ntna«ВТ* (ПНР).f — Уіюееиь ялн уешмовки, 2— чашка несом онугри корпуса. S— мшг
лля установки продола измерений >1<М JOtti мг и >. і.|, 4 — нниг
< слспа 1. ирашак*шиП в* роба и со шкалоП, по которой отсчитывают ре*
іулмати, S— рмча» ада устаЖФкн армьи ка п>л>, б - ш-лпмжнаи
шкдев І» И|і«і*чЛ части pMcyuh* пок»м«а • уае.)ич«милм м«де).из торсионных весах (рис. 41) н ссыпают в банки на 200 см1
(подобранные к стержню размельчи геля). Режим сушки нмеег
большое значение, гак как продолжительное действие высокой
температуры в процессе сушки снижает интенсивность окраски
при проведении бііуретсвой реакции. Обычно суша г материал
при #0" около 6—7 часов и затем при 105s не более трех часов.На банках 3 (рис. 40и) ставят лабораторный номер образца
и из бюретки или автоматической ншгетки приливают в нее5	см* 3,Г)о-иого раствора сернокислой мели, равномерно смачи¬
вая нм навеску. Затем приливают 35 смл 44*-ного раствора
шелочн (NaOH), растворенной в 20%-ном спирте. Таким обра*
зом, обший обілм раствора составит 40 см\эта
Затем, наклонив слегка банку, в нее вставляют стержень
прибора, после чего банку помешают в пластмассовый контей*
нер / прибора или зажимное приспособление (рис. 406). На
дно этого приспособления опускают прокладку 4 (рнс. 40а) из
пористой резины толщиной б мм, а вокруг внутренних стенок
укладывают полоску шириной 5 мм и толщиной 3,5 мм. Вра¬
щающаяся металлическая пластинка не должна касаться сте¬
нок банки, а нижний конец стержня должен находиться на рас¬
стоянии 2—3 мм от дна банки. Затем банку закрывают рези¬
новой паюй пробкой и на 3 минуты включают мотор (на пер¬
вое деление — 3000 оборотов). В течение этих трех минут, кроме
извлечения белков, происходит дополнительное измельчение
муки и образование биуретового комплекса. Через 3 минуты
мотор прибора выключают и контейнер снимают. Банка удер¬
живается перемешивающей пластинкой стержня. Банку сни¬
мают, слегка наклонив, удаляют приставшие частицы навески
с ее стенок и горлышка стеклянной палочкой с резиновым на¬
конечником. Содержимое банки перемешивают и оставляют на1,5—2 часа. Перед установкой очередной банкн с навеской стер¬
жень пластинки (нож) и резиновую пробку размельчителя про¬
тирают марлей. Для ускорения работы и более рационального
использования времени следует иметь 2 микроизмельчителя с ,
приспособлением и автоматические бюретки для растворов.Осветление растворов. Белковый комплекс семян, со¬
держащий спирторастворимые белки, в указанных концентра¬
циях щелочи в условиях извлечения полностью переходит в
раствор. Окрашенные щелочные растворы фильтруют через
стеклянные фильтры М* 3. Фильтрование растворов биуретовых
комплексов через бумажные фильтры не допускается, так как
бумага поглощает их из раствора.Спирт не только способствует растворению спиртораствори¬
мых белков, но и разрушает соединения липидов с различными
веществами, что способствует осветлению и осаждению взве¬
шенных частиц. Окрашенные растворы переливают в пробирки
и оставляют для осаждения на ночь. Фильтрование проводят
перед колориметрированнем.Колориметр и рован и е. Интенсивность окраски про¬
зрачных растворов биуретовых комплексов определяют на ап¬
парате ФЭК-М и по калибровочной кривой узнают содержание
белка или сравнивают в колориметре со специально приготов¬
ленным стандартным раствором, полученным из образца, в ко¬
тором точно определен «сырой» белок (по Кьельдалю). В ка¬
честве такого образца служит проба семян (250—500 г), состав¬
ленная нз различных сортов. Ее грубо измельчают и хранят
в банках с крышками, из которых отбирают по 5 г для приго¬
товления растворов, используемых для сравнения.Способ приготовления стандартного раствора такой же, как
и раствора из исследуемых образцов, но при этом для вычисле-274
яия средних показаний отвешивают большее число навесок (4—
6) по 200 мг.Измерение окраски проводят фотоэлектроколориметром
ФЭК-М. При этом следует иметь стандартные калибровочные
графики для каждой культуры отдельно. Так, например, при со¬
ставлении такого графика для ячменя нами были подобраны
сорта с содержанием сырого белка от 10 до 20%. Биуретовые
комплексы семян этих сортов просматривали на фотоэлектро-
колориметре (кювета 10 мм, зеленый светофильтр). На основа¬
нии показаний оптической плотности и содержания сырого бел¬
ка, определенного по Кьельдалю, строят калибровочный график.
Для удобства составляют таблицу, по которой на основании экс-
тіінцин раствора узнают содержание белка в зерне. Так, в на¬
шем случае для ячменя экстинцня раствора, равная 0,160, соот¬
ветствует 10,5% белка в зерне, а экстинцня раствора, равная
0,300, соответствует 19,4% белка.Пр н м с ч а н и е. Если график был построен на основания определе¬
ния общего азота по Кьельдалю. то по нему рассчитывают «сырой» белок,
так как данные, полученные по биуретовому методу, относят к «сырому
белку». Окраска же бнуретового комплекса зависит от содержания белка, н
доля небелкового азота в образцах зерна учитывается как белок. Если при
построении графика учишпают чистый белок (азот), то данные, получен¬
ные биуретовым методом, будут отображать содержание чистого белка.Калориметрический метод
определения белка(по Лоури)Метод основан на реакции белков с реактивом Фолина, даю¬
щей синее окрашивание. Метод применяют для определения
белка в растворах с концентрацией от 10 до 100 мкг.Реактивы и аппаратура: I) 2%-ный раствор Na2CO, в 0.1 в. NaOH;
2) раствор 0.5%-ного CubO»-5HjO в 1%-ном растворе дву за мешенного винно¬
кислого натрия нлн калия; 3) опытный раствор готовят, смешивая 1-А и 2-й
растворы (SO: 1 по объему); реактив годен в течение одного дня; 4) реактив
Фолина; 5) ФЭК-М (ом. рис. 27).Приготовление реактива Фолина. Для приготовления стан*
дартного раствора растворяют 100 г вольфрамат а натрия
(NajWO* *2^0) н 25 г молибдата натрия (NajMo04'2H20) в
700 см* дистиллированной воды. К смеси добавляют 50 см*
85%-ного раствора фосфорной и 100 см3 соляной кислот (d =
= 1,19). Затем кипятят (не слишком сильно) 10 часов с обрат¬
ным холодильником в вытяжном шкафу. После этого в колбу
добавляют 150 г сернокислого лития, 50 см3 дистиллированной
воды и 5 капель бромной воды. Смесь кипятят в течение 15 ми*
•нут в вытяжном шкафу для удаления избытка брома, после
охлаждения доводят до 1 дм3. Затем фильтруют и хранят в
темной склянке с притертой пробкой. Раствор должен быть яр*275
ко-ж ел roro цвета. Для определения концентрации .кислоты в
реактиве Фолина 1—2 см* реактива разводят в 10 раз и тит¬
руют 0,1 н. раствором щелочи с фенолфталеином.Если при титровании этого реактива оказалось, что концен¬
трация кислоты выше 1 г-эка, то для приготовления рабочего
раствора необходимо взять больше воды. Обычно перед употреб¬
лением реактив Фолина разбавляют в 2 раза. Раствор можно
хранить длительное время.Ход анализа. К 0,4 см3 раствора белка добавляюг 2 см*
раствора 3. Смесь перемешивают и через 10 минут приливают
к ней 0,2 см3 рабочего раствора Фолнна. Интенсивность окраски
определяют на ФЭК-in с красным светофильтром (или иа
спектрофотометре прн 750 нм) через 30 мннут. Количество бел¬
ка в растворе находят по калибровочной кривой.Для построения калибровочной кривой 100 мг чи¬
стого белка (сывороточного у-глобулина, кристаллического аль¬
бумина и др.) растворяют в 100 сл3ч0,1 н. NaOH (1 см3 содер¬
жит 1 мг белка). В 9 мерных колб на 10 см3 приливают раст¬
вор белка в возрастающих количествах: от 0,5 см3, а затем от 1
до 8 см3. Раствор в колбах доводят водой до метки, перемеши¬
вают и из каждой колбы берут по 0,4 см* для определения
белка по указанной пропиои. По полученным данным вычерчи¬
вают калибровочную кривую.Биуретовый микрометод
определения белкаДанный метод требует для выполнения доступные реактивы
и используется для определения белков в растворах, в том чи¬
сле предназначенных для электрофореза. Приведенный ниже ме¬
тод (по К. Е. Мерку) позволяет определить белок в растворах
с концентрацией от 0,04 до 1,6 мг в 1 см3.Реактивы и аппаратура: 1) биуретовый реактив (готовят 1 дм? 0.2 ii.
раствора едкого натра, свободного от карбоната; к 400 см? этого раствора
в мерной колбе на 1 дм* добавляют 9 г калня-ватрия виннокислого; после
растворения добавляют 3 г сернокислой меди — порошке, затем к раствору
прибавляют о г йодистого калия и объем доводят до метки 0.2 н. раство¬
ром едкого натра); 2) раствор мочевины (к 300 г мочевины прибавляют
кусочех тимола величиной с горошину, приливают 700 см? дистиллированной
воды и смесь нагревают, затем прибавляют 3 г активированного угля, все
тщательно перемешивают и фильтруют а мерную колбу на t дм1; объем
доводят до метки дистиллированной водой); 3) ФЭК-М; 4) термостат или во¬
дяная баля.Ход анализа. В пробирки наливают 2,4 см3 раствора моче¬
вины, 0,1 ел3 раствора белка и 2,5 см3 биуретового реактива.
Смесь хорошо перемешивают и пробирки помещают в водяную
баню (или в термостат) при 40° на 10 мннут. Через 30 минут
после добавления биуретового реактива раствор колориметри-
руют на ФЭК-М при 545 нм. Количество белка высчитывают на276
основании предварительно составленной калибровочной кри¬
вой по яичному альбумину или по чистому воднорастворимому
препарату растительного белка. Для этого готовят исходные
водные растворы с содержанием 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45 и т. д.
мг белка в 10 см3. Для составления шкалы из полученных раст¬
воров отбирают в пробирки по 0,1 см\ добавляют 2,4 см* рас¬
твора мочевины и 2,5 см3 биуретового реактива. Далее посту¬
пают так, как указано выше.Примечание. Определение белка данным методом, а также и мето*
дом по Лоури и растительных объектах, содержащих флавоноады я фе¬
нолы, приводит к завышению результатов, так как они образуют аналогич¬
ную окраску с реактивами. По данным лаборатории биохимии ВИР (Г. Б.Са-
моролова) присутствие в пробе (0,5 см1) 50 мкг рутина или катехнна по ин¬
тенсивности окраски соответствует 150 мкг белка, а присутствие такого же
количества хлорогенової или кофейной кислот равноценно содержанию 80
и 400 мкг белка (соответственно). Перед определением белка, для удаления
фенольных соединений, необходима обработка ацетоном, охлажденным
до -10*.Определение сырого белка
в клубнях картофеляМетод основан на гидролизе белков щелочью до аммиака,
который накапливается в закрытых колбах и проникает в труб¬
ки с поглотителем аммиака. Степень проникновения аммиака
в заполненную трубку зависит
от количества сырого белка в
образце. Приводимый ниже
приближенно количественный
метод предложен А. И. Ерма¬
ковым и Г. А. Луковннковой в
1954 г. для селекции картофеля
и капусты на повышенное со¬
держание белка. Широкая про¬
верка показала, что результа¬
ты, как правило, совпадают с
методом Кьельдаля ± 0,2%.Это вполне достаточно не толь¬
ко для отбора, но и для пред¬
варительной оценки сортов.Реактиоы и аппаратура: I) 37,5%-
ный раствор NaOH; 2) агар-агар;3) 0,5%-ный раствор конго крас*
ного; 4) С%-ный раствор HjSO»;5) приборы, состоящие нз колб (на
7э0 см*), трубки 80—84 мм длиной н 4,5—5 мм диаметром, наполненные по¬
глотителем аммиака (>тн трубки подвешивают к пробке и опускают в колбу,
рис. 42); 6) стеклянный песок.Подготовка прибора. Наполнитель для трубок готовят в
день «загрузки» колб приборов. На каждые 10 трубок берут277Рнс. 42. Колба с индикаторной труб¬
кой во время вынимання трубки из
колбы при помощи крючка.Справа — индикаторная трубка в '/» мату-
ральмоЛ величины; е обоих краев видны
изменения в окраске слоя.
12 г стеклянного песка и смешивают с 0,12 е мелко истолчен¬
ного агар-агара. Затем приливают микробюреткой 1,3 см3 6%-
ной серной кислоты. После хорошего перемешивания добав*
ляют 0,70 см9 раствора конго красного и тщательно перемеши¬
вают до равномерной голубовато-синей окраски. Этой смесью
заполняют трубки до краев. Важно однообразно и с одинако¬
вой плотностью заполнить каждую трубку.Ход анализа. Среднюю пробу клубней картофеля размель¬
чают на мясорубке до однородного состояния. После тщатель¬
ного перемешивания отвешиваюг по 5 + 0,01 г на часовых стек¬
лах или в стаканчиках, а затем переносят в колбы прибора так,
чтобы материал не попадал на стенки или горлышко колб (смы¬
вая остатки материала 5 см3 воды). После этого в колбу опус¬
кают индикаторную трубку (рис. 42). В каждую колбу прили¬
вают мерным цилиндром по 25 см3 раствора щелочи. Слабым
покачиванием равномерно распределяют материал по дну колбы
так, чтобы раствор щелочи покрывал навеску. Пробку плотно
закрывают. Индикаторные трубки при закрытом горлышке кол¬
бы во всех колбах должны находиться на одном уровне от дна
(4—4,5 см). Колбы оставляют на 16—17 часов при температуре
18°. На следующий день измеряют длину розово-красного слоя
в индикаторных трубках и записывают средний результат из ве¬
личин правого и левого края. Длину слоя измеряют, помещая
трубки на миллиметровую линейку. Длина покрасневшего слоя
пропорциональна количеству белка в клубнях. Скорость по¬
краснения индикаторной трубки зависит от температуры воз¬
духа и продолжительности действия щелочи.Определение сырого белка производят по шкале на основа¬
нии измерений длины покрасневшего слоя:278Индикаторная трубка окрашивается полностью, если содер¬
жание белка в клубнях составляет 4,5—5% на сырое вещество.
Повышение или понижение температуры в помещении на 4° не
должно изменять длину покрасневшего слоя з трубке в среднем
на + 2 мм. Этим методом вдвоем можно ежедневно пропускать
100 образцов.Определение клейковины
зерна злаковых растенийБелки семян некоторых злаковых культур при замешивании
муки с водой набухают и образуют вязкую, упругую массу, ино¬
гда коротко рвущуюся или в виде мелких сгустков. Такуи)Длинакрвснэго
слоя (мм)7-12 13-16 17-19 20-22 23-25 26-28 29 и болееПроцентбелкаVNX6.25)1,5—1,9 2—2,3 2,4—2«7 2,8—3,2 3,3—3,6 3,7—4 4 и более
массу, отделенную от небелковых частиц, называют клейкови¬
ной.Методы определения клейковины основаны на свойстве бел¬
ков образовывать вязкие массы или сгустки.Содержание клейковины в муке и ее физико-химические
свойства определяют характер использования и качество полу¬
чаемых из муки изделий. Содержание клейковины находится в
положительной зависимости от общего количества белка и из¬
меняется, как и ее свойства, от условий выращивания растений
и их видовых и сортовых особенностей *.Аппаратура: I) фарфоровая чашка или стеклянный кристаллизатор
15X20 см; 2) эксикатор; 3) бюретка на 50 см}: 4) сито капроновое или нэ
плотной ткани: 5) алюминиевые пластинки 5X5 cjk или маленькие кристал¬
лизаторы 4X2 см; 6) аппарат для отмывхи клейковины (глютеникс Ьлюср.ч
или Тэби).Определение клейковины в муке пшеницы. Берут по 10 или
25 + 0,01 г тонко размолотого воздушно-сухого зерна (величина
частиц 0,25—0,5 мм) в фарфоровые чашки и приливают из бю¬
ретки 6 или 15 см* воды в зависимости от величины навески,
замешивают в тесто при помощи шпателя, собирая всю навеску
в единый комок. Затем приливают воды с температурой 20'’
столько, чтобы комок теста был ею покрыт, и оставляют на 20
минут (для отлежкн). После этого комочек теста помещают для
отмывамия клейковины на капроновое с.ито аппарата Тэби и
поступают в соответствии с инструкцией. Если механического
аппарата нет, то отмывание крахмала и других веществ из те¬
ста ведут под слабой струей водопроводной воды над густым
ситом (из капрона, шелка). Промывные воды процеживают так,
чтобы не растерять мелкие кусочки клейковины. Упавшие ку¬
сочки клейковины присоединяют к общей массе. Отмытую клей¬
ковину с силой отжимают руками от избытка воды, которая
должна быть без мути. Полноту отмывки удобно контролиро¬
вать реакцией на крахмал раствором иода. Затем клейковину
закатывают ладонями в шарик, который взвешивают на заранее
взвешенной пластинке из алюминия с загнутыми краями или в
маленьком кристаллизаторе. После взвешивания производят
в течение двух минут дополнительное отмывание, отжимают
воду руками и опять взвешивают. Если разница между первым
и вторым весом будет не более 0,1 г, то отмывку считают закон¬
ченной.Содержание сырой клейковины в процентах узнают, умно¬
жая ее вес на 10 (навеска 10 г) или на 4 (навеска 25 г).Далее часть клейковины может быть использована для опре¬
деления некоторых ее свойств, а другая — для определения со¬
держания сухой клейковины.•	А. Б. В а ка р. КяеЛковииа пшеницы. Изд. АН СССР, 1961.279
Определение клейковины в муке ржи и ячменя (по П. Н. Ши¬
баеву). Быстро набухающая и прочно собранная в единую массу
клейковина характерна для пшеницы. Нередко встречаются
клейковины» которые обладают меньшей связностью, чем пше¬
ничная, например клейковина ржи и ячменя.Отмывать и собирать крошащуюся или чрезмерно слабую,
растекающуюся клейковину следует несколько иначе, чем клей¬
ковину пшеницы.В этом случае поступают следующим образом. Отвешивают
по 10—25 4; 0,1 г тонко измельченной муки, помещают в чашку
или кристаллизатор и заливают 12—13 см3 воды, нагретой до
50°. После отлежки теста в течение двух часов в термостате от¬
мывают водой, нагретой до 45—50°, на тонком сите для уланли-
вания слабо агрегирующих частиц клейковины и для тщатель¬
ной отмывки полужидкой массы на поверхности сита. В осталь¬
ном поступают так, как с клейковиной пшеницы.Определение физических свойств клейковины. Физические
свойства клейковины имеют важное значение в оценке ее каче¬
ства и качества зерна. Из физических свойств наиболее сущест¬
венными являются степень гидратации, раствори¬
мость (шарика клейковины) в растворах молочной кислоты,
растяжимость (способность растягиваться, не разрываясь),
эластичность (способность возвращаться к исходному со¬
стоянию после растяжения) и др.Определение степени гидратации, или способность клейко¬
вины набухать и удерживать воду, легко вычисляют из резуль¬
татов содержания сырой и сухой клейковины и выражают в
процентах.Так, в муке пшеницы было определено 41% сырой и 15%
сухой клейковины. Степень гидратации клейковины составит:
(41—15) • 100:15 = 173%.Для определения других физико-химических свойств суще¬
ствуют различные автоматические объективные приборы,' по¬
зволяющие проводить всестороннюю оценку муки, теста, клей¬
ковины и изделий.Методы и приборы, служащие для этих целей, являются
предметом специальных руководств *.Необходимо отметить, что принцип оценки качества клей¬
ковины по растворимости в молочной кислоте использован для
приближенной оценки степени «силы» муки по величине набу-
хаемости навески муки в растворе слабой уксусной кислоты **.В настоящее время разработаны микрометоды для опреде¬
ления количества клейковины (Н. П. Козьмина, 1967).*	Н. П. Козьм ип а. Биохимические основы улучшения качества зерна.
М., 1959.** А. Я. Пумпянский. Хлебопекарные качества пшеницы н муки. Л.,
1961.380
Определение
сульфгидрильных групп
амперометрическим
титрованием (АМТ)Для белков характерно наличие сульфгидрильных (SH) и
дисульфидных (— S — S —) группировок. Третичная структура
молекул белка поддерживается также при помощи —S—S и
S11 групп. По соотношению содержания последних судят о каче¬
стве белка семян, в частности клейковины пшеницы.Определение основано на титровании сульфгидрильных групп
белков раствором азотнокислого серебра. Конец титрования ус*
танавливают по возникновению диффузного тока в овязи с по¬
явлением в растворе свободных ионов серебра. Содержание SH
групп эквивалентно количеству серебра, затраченному на титро¬
вание.Реактивы и аппаратура: I) 0,001 н. раствора AgNOj (ежедневно гото¬
вят из 0,1 и. раствора); 2) раствор I М трнс-буфера (стр. 441); 3) раствор
1 М HNOs (6.3 г на 100 ел3); 4) раствор I М KCI (5.8 г на 100 смл)\5)	этиленднамннтетраацетат (ЭДТА. 100 мг на 100 см*); 6) 12%-ный
раствор салицнлата натрия; 7) насыщенный раствор сульфита натрия
(все растворы готовят на дважды перегнанной воде); 8) установка
для амперометрического титрования, состоящая из следующих частей:а)	платинового электрода (0 0,5 мм), вращаемого моторчиком на
20 вт н на 600 обімин; б) электрода сравнения с потенциалом 0,10 в по
отношению к каломельному электроду*; в) миллиампервольтметра чувст¬
вительностью 10~10 в, КМ а, соединенного с электродами, которые погру¬
жают в широкий низкий толстостенный стаканчик; г) мнкробюреткн для
титрования раствором 0,001 н. AgNO».Электрод сравнения соединен с трехходовым краном, один конец трубки
которого (с пробкой из фильтровальной бумаги) погружают в стакан с
опытной смесью. Трубка заполнена насыщенным раствором KCI.Ход анализа. Определение SH групп. 1,5 + 0,01 г сы¬
рой клейковины (в которой определяют белок по Кьельдалю)
встряхивают в течение часа на качалке с 25 см3 12%-ного рас¬
твора салицнлата натрия и оставляют на ночь при 2°, затем еще
раз встряхивают в течение часа на качалке и центрифугируют
в течение 10 минут при 6—8 тыс. обімин.Для определения SH групп берут 5 см3 центрифугата в низ¬
кий стаканчик на 50 см3 и приливают последовательно раство¬
ры: 2,7 см3 1 М трнс-буфера, 2,3 см3 I М HNO3, 0,2 см* 1 М
КС1, 0,2 см3 ЭДТА, 1,89 г кристаллического салицнлата натрия,
доводя общий объем до 20 см3 дважды перегнанной водой.Для определения SH и —S—S— групп в стакан на 50 см3
приливают последовательно растворы: 1 см3 центрифугата,
0,2 см3 насыщенного раствора сульфита натрия, 2,7 см3 1 М*	Дж. Бейли. Методы химии белков. «Мир», 1965.2*1
грис-буфера. 2,3 ел*3 1 M HN03, 0,2 см3 1 М КС!, 0,2 см* ЭДТА,
2,39 г кристаллического салицилата натрия н объем доводят до
20 см*.Титрование. В низкий широкий стакан со смесью погру¬
жают платиновый электрод, который через шкив вращают мо¬
тором. При этом стабилизация тока устанавливается при вра¬
щении электрода в течение двух минут. Образование пены
устраняют добавлением двух капель изоамилового спирта. За*
тем титруют 0,001 г раствором AgNCb из бюретки со скоростью
грех капель в минуту, отмечая показания микроамперметра.
Конец титрования определяют графически, огкладывая куб. сан¬
тиметры AgN03 и показания микроамперметра. Проекция точ¬
ки пересечения двух прямых показывает количество куб. сан¬
тиметров AgNOs, затраченного на тритрование SH групп. Пред¬
варительно проводят тнтрование 0,001 н. раствором AgNOs
стандартного раствора глютатиона или цистина, содержащего
5 мк-экв SH группы в 1 см*; для сравнения титруют и буфер¬
ный раствор без добавления цистина или глютатиона.Пример вычисления. При определении SH групп на 5 см* дис¬
персии клейковины пошло на титрование 0.8 cjk1 0.001 и. раствора AgNCV,
следовательно, на весь объем в 25 см1 идет 4 cjk1. что соответствует
4 мк-экв; в 25 см? было определено по Кьельдалю 319 мг белка, откуда
SH-4:0,319 мк-экв на 1 г белка.При определении SH и —S—S—групп в I ел1 дисперсии клейковины
на титрование пошло 0.5 см* 0.001 я. раствора AgNOj; следовательно, на
25 см* идет 12,5 см*, что соответствует 12.5 мк-экв, откуда SH -)—S—S— ■■
■>12,5:0,319 мК'ЗКв на 1 г белка.По разности между величиной, вычисленной для SH-J—S—S— н для
SH групп узнают количество —S—S—групп.Определение белкового азотаДля определения азота белковых веществ наиболее широко
используют метод Барнштейна, хотя он и не лишен некоторых
недостатков.Метод основан на осаждении белков в водных растворах
гидратом окиси меди. Полученный осадок сжигают и опреде¬
ляют азот по Кьельдалю.Реактиви: 1) 6%-ный раствор медного купороса (CuS0<-5H]0):
2) 1.25%-вый раствор едкого натра; 3) 5%-ный раствор хлористого бария.Ход анализа. 1—2 + 0,0002 г мелко размолотого вещества
(0,5 мм) помещают в химический стакан на 100—150 см*, раз¬
мешивают в 50 см* горячей дистиллированной воды и нагре¬
вают до кипения. Если материал содержит много крахмала, то
нагревают 10 минут на водяной бане при 40—50°. Затем при*
ливают 25 см* 6%-ного раствора медного купороса и после раз¬
мешивания добавляют 25 cjk3 1,25%-кого раствора едкого натра.282
Раствору дают постоять 30—60 минут для полного осаждения
осадка или оставляют на ночь. Раствор над осадком сливают
декантацией на фильтр. Осадок многократно (10—12 раз) про¬
мывают кипящей дистиллированной водой, сливая каждый раз
промывную воду на фильтр, н палочкой перемешивают осадох.
Дают осадку снова отстояться и жидкость опять сливают, и так
до прекращения появления мути в промывных водах от прибав¬
ления 10 капель 5%-ного раствора хлористого бария (проба на
серную кислоту). В ряде случаев для осаждения белковых
веществ можно применять раствор основного уксуонокислого
свинца *.Промытый осадок подсушивают вместе с фильтром на во¬
ронке в термостате, завертывают в сухую фильтровальную бу¬
магу и сжигают в колбе, определяя азот по методу Кьельдаля.Количество белкового азота вычисляется так же, как при
определении общего азота по Кьельдалю. Зная содержание в
материале общего азота (например, 2,32%) и белкового азота
(2,20%), можно вычислить небелковый азот по разности
(2,32% —2,20% = 0,12%).Определить белковый азот можно и иным путем. Осажден¬
ный белок не отфильтровывают, а переносят вместе с жидко¬
стью в мензурку на 100 см\ доводят содержимое до 80—100 сл\
дают отстояться или центрифугируют. После этого из прозрач¬
ной жидкости, не захватывая осадка, берут пипеткой 20—
25 см3 н определяют небелковый азот. Пробу жидкости берут
такую, чтобы по предварительному расчету в ней содержалось
не менее 3—5 мг азота.Зная количество общего азота в исследуемом материале и
количество небелкового азота, можно по разности вычислить
количество белкового азота.Этот способ значительно ускоряет анализ, так как не требует
длительного промывания осадка.Наилучшим осадителем белка, применяемым в современных
работах по изучению белков, является трихлоруксусная кисло*
та, используемая обычно в виде 5—10%-ного раствора, но этот
реактив реже бывает в продаже.Определение небелкового азота
(аммиака, аминов и аминокислот)Определение проводят в отдельных навесках, но в тех слу¬
чаях, когда требуется провести исследования нескольких веществ
сразу, удобнее взять навеску от 5 до 10 г и приготовить•	А. И. Ермаков, В. В. Арасимович, М. И. Смярнова-Икон*
нпиова, И. К. М у р р и. Методы биохимического исследования растений.
Сельхоэгаа, 1952.283
одну вытяжку для всех определений. К навеске в колбу на
200—250 см3 приливают 10-кратное количество дистиллирован¬
ной воды, плотно закрывают резиновой пробкой и экстрагируют
на механической качалке 30 мшит. Осадок отделяют на центри¬
фуге и повторяют экстракцию. Последний раз извлекают таким
же количеством горячей воды. Если вещество содержит крах¬
мал, то употребляют теплую воду. Экстракты сливают в мер¬
ный цилиндр и измеряют объем.Количественное определение аммиака. Используют фильтрат
после осаждения белка (см. стр. 282) или непосредственно вы¬
тяжку. Определение основано на вытеснении аммиака из его
соединений (обычно солей органических кислот) слабыми ще¬
лочами—окисью магния или окисью кальция, отгонке и улав¬
ливании его кислотой.Реактивы и аппаратура: I) окись магвия (MgO) или кальция (СаО);
2) растворы для определения аммиака (те же. что и для определения по
методу Кьельдаля); 3) колбы Вюрца.Ход анализа. 50—100 см3 первоначальной вытяжки, из ко¬
торой удален белок, помещают в колбу Вюрца. Через воронку
с длинной трубкой прибавляют хорошо прокипяченное и охла¬
жденное известковое или магнезиальное молоко до ясно щелоч¬
ной реакции, о которой судят по брошенной в колбу лакмусовой
бумажке. Обычно идет от 2 до 10 г окиси магния. Жидкость
перед прибавлением окиси магния или кальция должна быть
нейтрализована. Затем колбу плотно закрывают резиновой проб¬
кой, в которую вставлены длинные трубки с воронкой и капил¬
ляр с зажимом. Отводную трубку этой колбы соединяют с при¬
емной колбой, в которую приливают 20 см3 2%-тнои борной ки¬
слоты. Отводную трубку приемной колбы Вюрца соединяют
резиновой трубкой с водоструйным (или ручным масляным) на¬
сосом. Перед насосом присоединяют предохранительную склян¬
ку. После этого включают насос и колбу Вюрца с реактивной
смесью и начинают нагревать (не выше 38—40°) в водяной
бане. Выделяющийся аммиак будет поглощаться кислотой в
приемной колбе; эту колбу охлаждают непрерывной струей хо¬
лодной воды, которая затем стекает в раковину через воронку,
поставленную под колбу. При хорошем вакууме отгонку 80—
100 см3 можно произвести за 30—40 минут. По окончании от¬
гонки зажимают резиновую трубку приемной колбы зажимом,
постепенно открывают кран капельной воронки и, выровняв дав¬
ление, вынимают пробки сначала из отгоночной, а затем из при¬
емной колбы. Тщательно промывают трубку отгоночпой колбы,
бывшую в растворе кислоты, присослиняя эти промывные
воды к кислоте, находящейся в приемной колбе. Прибав¬
ляют в кислоту индикатор и титруют дистиллят 0,1 н. раст¬
вором H*SO«.Вычисление азота производят так, как указано на стр. 269.284
Определение аминокислот по числу карбоксильных групп »
водно-спиртовых растворах. В водных растворах аминокислоты
и полипептиды нейтральны, а в водно-спиртовых у них увеличи¬
ваются константы диссоциации, они ведут себя как кислоты и
могут быть оттитрованы. Определение основано на титровании
в водно-спиртовых растворах карбоксильных групп аминокислот
и полипептидов титрованным раствором щелочи. Данным мето-
дом можно определить до 99% аминокислот от их общего коли¬
чества.Реактивы: I) этанол; 2) 0.1 и. раствор едкого кми; 3) раствор тимол-
фталеина (0,1 s в 125 сjm* этанола).Ход анализа. Берут 5 см3 водного раствора гидролиэата
белка, прибавляют 50 см3 96%-ного этанола, 4—5 капель ти*
молфталеина и титруют 0,1 н. раствором едкого кали до появ¬
ления синего окрашивания. Параллельно ведут титрование кон*
трольной пробы (вода, спирт, тимолфталеин) до появления та*
кого же оттенка, как в опытной пробе. Разность в объемах
раствора едкого кали, пошедших на опыт и на контроль, умно¬
жают на титр щелочи по азоту и узнают количество азота в
пробе.Если хотят раздельно определить в продуктах распада бел¬
ка азот аминокислот н пептидов, то пептиды титруют по фе¬
нолфталеину в 50%-ном спирте, а аминокислоты — в 90%-ном
растворе спирта. Поскольку аминокислоты в 50%-ном спирте
можно оттитровать приблизительно на 28%, а пептиды полно¬
стью, то рекомендуют определять в смесях эти соединения по
следующему расчету. Допустим, на титрование опытного образца
в растворе 50%-ного спирта пошло 8,9 см\ а в 90%-ном рас¬
творе спирта — 15,7 см3 едкой щелочи. Обозначив объем ще¬
лочи, требуемой для титрования присутствующих в растворах
аминокислот, через х, а полипептидов — через у, составляют2	уравнения.Титрование в 50%-ном спирте: 8,9**у + (28: !00)х. Титро¬
вание в 90%-ном спирте: 15,7 ** х+0* Отсюда 8,9 =={15,7 —
— х) +0,28.(15,7-8,9). 100 . „ _
х =	^	=9,44 слАИспользуя приведенные выше уравнения, находят количество
щелочи: для аминокислот 0,46 ел3, для полипептидов — 0,80 см3.Фотометрический микрометод определения аминного азота.
Метод определения аминного азота по Н. И. Ястрембовнчу и
ф. А. Калинину* позволяет определять 0,1 мкг в 1 см3 рас¬
твора. Анализ основан на переводе аминокислот в растворимые•	Н. И. Я с т р е м б о в и ч. Ф. А. Калинин. Научные труды Украин¬ского НИИ физиологии растений, вып. 3, 1962, стр. 23.285
медные соли по методу Попе и Стивенса и последующем фото*
метрическом определении меди. Содержание меди определяют
в виде ферроцианида меди CuFe(CN)e, дающей розовую
окраску при малых концентрациях.Реактивы и аппаратура: ]) 0,16 М раствор двухлористоА меди (27,3 г
до 1 дд1); 2) раствор фосфорнокислого натрия (NajPO*) (готовят, раство¬
ряя 64,5 г №гНРОг12НаО в 500 смг воды без углекислоты, н после до*
бавлення 7,2 г едкого натра доливают водоА до 1 Ли3); 3) бораткыА буфер
(pH 8,9); 4) взвесь фосфорнокислой медн (готовят перед употреблением из
упомянутых выше трех растворов: сначала смешивают растворы I и 2 в со*
отношении 1:2, а затем добавляют 2 объема буфера); 5) фсрроцианндимЛ
реактив [готовят перед употреблением; смешивают в равных объемах
1%*ный раствор азотнокислого аммония и Г%-ныА раствор K*Fe(CN)»);6)	стандартный раствор медноА соли для изготовления калибровочной кри*
вой (растворяют 0.6092 г CuCIj-HjO в 100 см3 воды); I см1 этого раствора
содержит 6,092 мг медной соли или 2,27 мг меди, которые соответствуют
1 мг аминного азота; 7) ФЭК-М.Ход анализа. Навески 0,200 г хорошо измельченной воздуш-
но-сухой вегетативной массы или І—-2 г сырой растирают в
фарфоровой ступке с 3—*5 см9 воды и помещают в мерную
колбу на 25 см9. Затем приливают еще 10 см3 воды (так же
готовят контрольный образец). При анализе семян навески уве-
личивают до 1—2 г. Колбы нагревают в водяной бане при
45—50° 30 минут; в период экстракции содержимое колб пере¬
мешивают 2—3 раза. В экстракте осаждают белки 2 см9 5%-
ного раствора inSO* После перемешивания к экстракту по
каплям приливают 0,5 см3 5%*ного раствора NaOH и вновь пе-
ремешивают. При достижении нейтральной реакции (ИЭТ)
верхний слой жидкости становится прозрачным. Реакцию раст¬
вора устанавливают по лакмусовой бумажке, а полноту осажде-
«ия цинка проверяют прибавлением одной капли 1%*ного рас¬
твора NaOH (от одной капли не должна появляться муть). По¬
сле осаждения белковых веществ в опытных и контрольных
пробах содержимое доводят водой до метки, перемешивают и
фильтруют через тигель № 3.Берут 5 см3 фильтрата испытуемого образца в коническую
колбу на 50 см3, прибавляют 5 см9 медной фосфорнокислой
взвеси (реактив 4) и взбалтывают в течение 10 минут. Одновре¬
менно таким же образом готовят контрольный образец, прили¬
вая вместо фильтрата 5 см9 воды. Содержимое колбы филь¬
труют через небольшие воронки и берут 5 см9 фильтрата
в обычную пробирку, калиброванную на 10 см9, подкисляют
0,1 см9 10%-ной НС1 (реактив 2), прибавляют 1 см9 ферроциа¬
нида (реактив 5) и после энергичного взбалтывания доводят
водой до метки и перемешивают. Интенсивность окрашенного
раствора измеряют фотоколориметром; для сравнения служит
контрольный растаор.Концентрацию меди в исследуемом растворе находят по
калибровочной кривой, полученной из последовательно воз-286
растающнх концентраций стандартных растворов медной
соли.Определению меди мешает присутствие в растворе иона
трехвалентного железа (Fe'")* Для связывания этого иона к
раствору прибавляют сегнетовую соль.Для изготовления калибровочной кривой исходный стандарт¬
ный раствор медной соли (реактив 6) разбавляют водой в
10 раз. Из полученного рабочего раствора готовят серию стан¬
дартных образцов. Для этого нумеруют И пробирок, кали¬
брованных на 10 см3 (от 0 до 10), прибавляют рабочий раствор
медной соли от 0,1 до 1 см* с интервалом в 0,1 см3 и каждую
пробирку дополняют водой до 1 см*. В дальнейшем поступают
так же, как с испытуемыми образцами. В одну пробирку при¬
ливают только воду.Оптические плотности стандартных растворов соответствуют
возрастающим концентрациям 0,001; 0,002 и так до 0,01 мг
амннного азота.Оптические плотности и соответствующие им концентрации
аминного азога наносят на график и получают калибровочную
кривую; по графику составляют таблицу данных последователь¬
но возрастающих оптических плотностей и соответствующие
им концентрации аминного азота.Вычисление производят по формуле:100*e*v
*-	н	•где: * —содержание (в мг на 100 г) аминного азота в иссле¬
дуемом материале;
о —количество аминного азота в исследуемом растворе,
найденное по калибровочной кривой (в мг на 1 &мэ);
t> — объем (в смг) исследуемого раствора, соответствую¬
щий навеске материала;
н — навеска материала (в г).Микрометод определения аминного азота медным способом.Для определения малых количеств аминного азота представ¬
ляет интерес метод Войвуда в модификации Т. А. Глаголевой *.Принцип метода заключается в следующем. Аминокислоты,
реагируя с солями меди, образуют растворимый медный ком¬
плекс. Избыток меди удаляют из раствора и медь в растворе
определяют либо иодометрически, либо с помощью диэтнлдн-
тиокарбамата натрия, который количественно разлагает мед¬
ные соединения с аминокислотами, давая при этом желтое окра¬
шивание.Оптическую плотность желтого раствора определяют на фо¬
тоэлектроколориметре. Линейная зависимость между количе-•Т. А. Глаголева Методика количественной бумажной хроматогра¬
фии сахаров, органических кислот и аминокислот у растений. АН СССР, 1962.287
ством аминокислоты и оптической плотностью сохраняется в пре¬
делах от 1 до 30 мкг аминного азота.Реактивы и аппаратура- I) 2.8%-ныЛ раствор CuClj; 2) 2,56%-ныА
раствор Na»PO* (25.6 г безводной cam Na*HPO« растворяют в 500 см* ди¬
стиллированной веды, добавляют 180 км} I н. NaOH и объем доводят до
1 Ли1); 3) 2.56%-ный раствор NajHPO, (25.6 г безводной Na»HPO« раство¬
ри ют в дистиллированной иоде н доводят до I дм*); 4) суспензия фосфорно*
кислой меди (к I объему раствора NajHPO» добавляют I объем раствора CuCI*
и смесь хорошо перемешивают); 5) смесь (к суспензии добавляют 4 объема
раствора NasHPO* и смесь нагревают с обратным холодильником в течение
часа; сметь следует готовить не менее чем за 24 часа до употребления; пригод¬
ность суспензии к использованию сохраняется в течение 1—2 месяцев);6)	2%-ный водный раствор днэтилднтнокарбамлга натрия (по мере стояния
из раствора выпадает осадок, поэтому перед употреблением раствор необхо¬
димо фильтровать); 7) пробирки, градуированные на 10 см\ 8) центрифуга;
9) ФЭК-М.Ход анализа. К 1 см3 испытуемого раствора, содержащего
10—60 мкг аминного азога, добавляют 2,5сл3 раствора NajHP04
и 2,5 с.«3 суспензии фосфорнокислой меди. Смесь в пробирке
хорошо встряхивают и через 30 минут стояния удаляют избы¬
ток меди. Для этого жидкость фильтруют через плотный фильгр
в сухую пробирку или центрифугируют при 10 тыс. обімин, что
обеспечивает полное удаление из раствора следов осадка фос¬
форнокислой меди, которая может исказить результаты.Половину фильтрата или центрифугата (3 см3) помещают в
градуированную пробирку и, долив водой до 8 гл<3, прибавляют
0,1 см3 2%-ного профильтрованного раствора диэтилдитиокар-
бамата натрия, доводят водой до 10 см3 и хорошо перемеши¬
вают.После 10-минутного стояния раствор в пробирке принимает
желтую окраску. Соединение, имеющее желтый цвет, экстра¬
гируют 10 см3 бутилового спирта, затем экстракт бутилового
спирта центрифугируют и определяют его оптическую плотность
на фотоэлектроколорнметре с синим светофильтром. Парал¬
лельно определяют оптическую плотность контрольной пробы,
к которой вместо испытуемого раствора была прилита вода.При вычислении результатов содержание аминного азота
определяют по найденной величине оптической плотности, ис¬
пользуя калибровочную кривую, которую строят по чистым ами¬
нокислотам.При вычислениях величину оптической плотности контроль¬
ного раствора вычитают из величины оптической плотности опыт¬
ного раствора.При использовании для анализа окрашенных растворов сле¬
дует предварительно определить их оптическую плотность (при
этом необходимо исходный раствор разбавить в том же соот¬
ношении, что и при определении аминного азота в пробе) и вы¬
честь ее величину из показания оптической плотности, получен¬
ной в опыте.288
Определение изоэлектрической
точки белкаРеакция среды водного раствора белка может быть ней*
тральной (белок содержит равное количество групп NHa и
СООН). щелочной (в белке преобладают диаминокарбоновые
аминокислоты) и кислой.Большинство белков имеет в водном растворе кислую или
слабокислую реакцию. При добавлении к раствору белка сла¬
бой кислоты белок выпадает в осадок, так как диссоциация его,
как кислоты, понижается, белковая молекула теряет отрица¬
тельный заряд и становится электронейтральной. Реакция
среды, при которой устанавливается равенство положительных
н отрицательных зарядов, получила название изоэлектрической
точки (ИЭТ) и характеризуется величиной концентрации ионов
водорода среды —pH раствора. Изоэлектрическая точка яв¬
ляется характерной величиной белков. Определение ИЭТ необ¬
ходимо для суждения о состоянии белка и имеет большое зна¬
чение для жизненных процессов в организме.Реактивы и аппаратура: I) градуированные пипетки; 2) колбы мерные
емкостью 25 см*', 3) препараты белков; 4) 0,1 н. и 0.5 и. растворы
CHjCOOH.Ход анализа. 0,2 г белка (альбуминов, глобулинов) раство¬
ряют в 5 см* 0.5 н. СНзСООН в колбе на 25 см* при осторож¬
ном нагревании на водяной бане и доводят водой до метки.
В 8 пронумерованных пробирок вносят по 1 см3 раствора бел¬
ка и в каждую добавляют воду и 0,01 и. или 0,1 н. растворы
уксусной кислоты в количествах, указанных в табл. 14.таблица и	Соотношение объемовводы, растворов уксус¬
ной кислоты и величи¬
ны pH смесимпробиркиКоличество распора, прилитого а
каждую пробирку (гл*)pHсмеси■ода0.01 п.сн.соон0.1 и.
CHiCOOH18.409,605.927.751.25_5.638.750,255.348,50_0.505,058_14.767_24.475—44.181Ь3,810 Зама М 401289
Содержимое пробирок осторожно перемешивают. При зна¬
чении pH, равном или очень близком к ИЭТ белка, последний
выпадает в осадок, что можно установить по появлении мутн
в соответствующей пробирке.Выделение белков из семян
и вегетативных органовОпределение аминокислотного состава, характеризующего
биологическую ценность белка в растительном материале, про¬
изводят в суммарном белке.Выделение суммарного белка из семян зерновых бобовых и
масличных культур. Семена размалывают до тонкого помола
(удаляют кожуру; маелччные растирают в ступке), обезжири¬
вают настаиванием с петролейным эфиром и высушивают в
вакуум-эксикаторе (или под тягой) при комнатной температуре.Отвешнваюі 10—20 г муки в коническую колбу и экстраги¬
руют белок 10-кратным количеством баратиого буфера (pH
10,0), в который добавляют 0,2%-ного бисульфита натрия. Кол¬
бу взбалтывают на механической качалке в течение часа, а за¬
тем выдерживают 15—18 часов в холодильнике при 0°. Болтуш¬
ку центрифугируют 10 минут при 3—4 тыс. o6Jmuh, раствор сли¬
вают в мерную колбу на 500 см3. Далее процедуру повторяют4—5 раз, употребляя порции по 100 см3 растворителя и, не
охлаждая центрифугат, сливают в ту же мерную колбу и объем
доводят до метки.Осаждение белка из раствора проводят так, как указано
ниже (стр. 292).Выделение белка из семян зерновых культур. Извлечение
белков. Извлекают белки баратным буфером (см. выше). Из
остатка извлекают спирторастворимый белок, обрабатывая не¬
сколько раз 80%-ным спиртом, каждый раз в течение часа цент¬
рифугируют и сливают в мерную колбу. Раствор белка концент¬
рируют (под вакуумом, при 35°), добавляют небольшое количе¬
ство воды и оставляют в холодильнике на ночь. Для полного
осаждения белков раствор насыщают ацетоном до 90%; реакцию
раствора доводят до слабощелочной, добавляя несколько ка¬
пель 1 и. NaOH. Дальше поступают так, как указано выше. По¬
лученные препараты содержат 15—17% азота.Очистка белков. К влажному осадку белка в центри¬
фужной пробирке прибавляют теплый раствор 0,2 и. NaOH,
переносят в стакан, подогревают на водяной бане при 50° до
полного растворения и центрифугируют. Белок осаждают, до¬
бавляя 50%-ную грнхлоруксусную кислоту, до конечной кон¬
центрация 5%, осадок отбивают на центрифуге и промывают в
пробирках ацетоном, теплым спиртом, эфиром и высушивают.
Иногда производят более детальную очистку белков — диалн-293
зом, многократным высаливанием, фракционированием на сефа-
дексе и др.*Диализ. Диализ проводят в специальных приборах—диа¬
лизаторах или батарейных стаканах. Для малых объемов ис¬
пользуют целлофановые мешочки. Диализ ведут против дистил¬
лированной воды на холоде, при периодической смене воды, в те¬
чение 24—36 часов. Большие объемы растворов диализируют
против водопроводной воды в течение суток, а затем против ди¬
стиллированной в течение 10—12 часов.Высаливание. Из растворов альбумины и глобулины
выделяют сульфатом аммония: 2 М (50%-ное насыщение) глобу-
лины н 4 М (100%-ное насыщение) — альбумины.Молекулярная фильтрация. Скорость разделения
основана на различиях в весе и размерах молекул веществ.
Для очистки белков (в том числе от солей) используют обычно
сефадексы G-25.Выделение зеина из эндосперма кукурузы **. Эндосперм от¬
деляют от зародыша, размалывают, муку просеивают через сито
с отверстиями 0,25 мм, обезжиривают, настаивая с петролейным
эфиром в течение часа, фильтруют и муку высушивают на воз¬
духе. Затем белок выделяют 3-кратной экстракцией 70%-ным
спиртом. Первую и вторую экстракцию проводят при 20° в те¬
чение часа с пятью объемами спирта, третью при 60° в течение
часа с тремя объемами. Экстракты центрифугируют 15 минут
при 3000 g, объединяют,охлаждают до 4°.Белок осаждают тремя объемами 0,1 М NaCI на холоде.
Осадок отстаивают в течение часа, отделяют центрифугирова¬
нием при 3000 g 15 минут, промывают дистиллированной водой3—4 раза до полного удаления ионов хлора и сушат в вакуум-
эксикаторе над щелочью. Рыхлый порошок белка хорошо раст¬
ворим в 70-градусном этаноле, 8 М мочевине и служит для раз¬
личных исследований, в том числе для анализа методом элек¬
трофореза в полиакриламидном геле.Выделение белка из вегетативных органов растений. Отве¬
шивают 50—100 г или меньше свежего материала, проморажи¬
вают в холодильнике и размельчают в гомогенизаторе с 4-крат-
иым (по весу) количеством боратного буфера (pH 10), добавляя0,2%-ный бисульфит натрия и несколько капель октилового
спирта. Гомогенат промораживают в холодильнике, оттаивают,
встряхивают на качалке в течение 1—2 часов и центрифугируют
5—10 минут при 3 тыс. обімин. Центрифугат сливают в мерную
колбу, остаток вновь гомогенизируют 5-*-6 раз, употребляя
меньший объем буферного раствора и встряхивая в течение•	Ф. Гауровитц. Химия я биология белков, 1950. Аналитические ме¬
тоды белковоА химии. 1963.♦* В Г. К о и а р е о. Ю В П е р у а и с к и А, А. Ю. P у б ч с и я. Доклады
ВАСХНИЛ, Лі 9, 1969, стр. 28-31,	1	«оклады10*	29»
20—30 минут. Объем доводят до метки буферным раствором.
Количество навлеченного азота должно составлять не менее
90—95%.Для осаждения белков экстракт наливают в 2 стакана ем¬
костью 700—800 см\ доводят pH раствора до 4,4—4,5, добав¬
ляя 10%-ную уксусную кислоту, нагревают на водяной бане дэ
70° и осажденные белки отделяют центрифугированием. В про¬
бирку добавляют 1%-ную уксусную кислоту, перемешивают,
центрифугируют и жидкость над осадком сливают. Проводят
очистку белка (см. выше). Полученные препараты белков серо¬
ватого цвета, содержат около 14% азота (на сухое вещество).Количественное определение
белковых фракций(по А. И. Ермакову)Физико-химические свойства белковых фракций. В семенах
и вегетативных органах растений образуются и накапливаются
разнообразные группы белковых веществ. Различные белки
часто образуют сложные комплексы с углеводами, липидами
и другими соединениями. Каждый белок характеризуется не
только последовательностью отдельных аминокислот в моле¬
куле белка и количественным соотношением их в белках, но и
структурными особенностями более высоких порядков (сте¬
пенью скрученности, полимерности). Физико-химическое со*
стояние белков в тканях семян и в вегетативных органах за¬
висит также от степени подвижности н характера связи белков
друг с другом, с водой и с другими веществами клеток. Эти
связи определяют собой такое биологическое качество, которое
не может быть объяснено составом и свойствами выделенных
и очищенных препаратов белка. Необходимо подчеркнуть, что
качество, обусловливаемое взаимодействием белков с другими
веществами, имеет большое биологическое и практическое зна¬
чение.Белковый комплекс у растений представлен разнообразными
белками или группами близких белков, наличие которых обу¬
словлено составом аминокислот, структурой и состоянием связи
с другими веществами. Между различающимися белками
имеются такие, которые обладают некоторыми важными об¬
щими свойствами. Так, одним из главных свойств альбуминов
семян является способность растворяться в воде н выпадать
в осадок в изоэлектрической точке, глобулины же растворяются
в нейтральных растворах солей (5—10%) и выпадают в осадок
при диализе. В последние годы выделена группа белков, кото¬
рые растворяются в очень слабых растворах солей, переходит
в воднорастворимую фракции вместе с альбуминами и выпа¬293
дают в осадок прн диализе против дистиллированной воды*.
Это легкорастворимые глобулины, которые также выпадают в
осадок при нагреве вместе с альбуминами. Легкорастворимые
глобулины в суммарном белковом комплексе семян бобовых
и масличных культур составляют большой процент. Прежде
нами было показано, что в семенах злаковых растений среди
белков, растворимых в 70—80%-ном спирте, имеются 2 группы
белков. Одна группа растворяется не только в спирте, но и в
слабых растворах щелочи (проламины пшеницы, ячменя и др.),
а другая — не может быть выделена растворами слабой щелочи
(проламины проса, сорго, частично кукурузы и др.). Поэтому
вторую группу белков следует отличать от проламинов **.Важнейшим свойством белков является их неодинаковая
растворимость в различных растворах. Эта способность свя¬
зана с общим строением белкового комплекса его физико-хи-
мическими связями с другими веществами в растительных клет¬
ках, а также с составом аминокислот. Определение белковых
фракций надо считать существенным показателем качества
белков растений и особенно показателем их биологической при¬
роды.Можно наблюдать определенную зависимость в количе¬
ственных изменениях и закономерную последовательность об¬
разования одних или других белковых фракций. Это указывает
не только на то, что синтез белков в растениях протекает со¬
гласно общему механизму, но и на наличие в белковых ком¬
плексах общих белковых субструктурных единиц. Количествен*
ные соотношения белковых фракций не являются случайными.
Они изменяются от условий произрастания и исторически свя¬
заны с происхождением сортов и культур.Разделение и количественное определение белковых фрак*
ций. Физико-химическое состояние белков неодинаково в ор¬
ганах растений, богатых и бедных водой. Методы разделения и
определения белковых фракций должны быть строго обуслов¬
лены и однообразны, так как нарушение их приводит к невер¬
ным результатам.Принцип метода определения белковых фракций заключает¬
ся в извлечении белков различными растворами, применяемыми
в двух неодинаковых последовательностях: 1) солевыми, ще¬
лочными и спиртовыми и 2) солевыми и спиртовыми. При такой
последовательности можно определить 2 различные группы
спирторастворнмых белков. С солевыми растворами поступают
двояко: большую часть подвергают диализу; в небольшой части
растворов определяют суммарный азот, а также азот после
осаждения белков.*	W- И. Смирнова-Иконникова, Е. П. Веселова. ДАН СССР,
т. 120. V» 4. 1958. стр 849-852.•• Эту группу спнрторастворимых белков в отличие от глиадика в ему
подобных мы ранее назвали неглмадииэм, что было неудачно.293
Величина навески и объем вытяжки, получаемой при извле¬
чении отдельных белков, зависят от предполагаемых количеств
отдельных фракций. Определение фракционного состава белков
производят в воздушно-сухих семенах и в свежих вегетативных
органах с целью оценки качества белков сортов отдельных
культур.Поллота извлечения белков зависит от степени измельче¬
ния материала, от полноты разрушения клеток, объема раство¬
рителей и числа обработок. Чтобы обеспечить полноту извле¬
чения белков, необходимо муку, а тем более другой материал
тщательно растереть в ступке со стеклянным песком (чтобыРис. 43. Аппарат для механического встряхивания LE-I03. (ВНР).полнее разрушить ткани). Сумма извлеченного азота в виде
белковых и небелковых фракций должна быть не меньше 85—
90% от общего количества азота. Проверить результаты сле¬
дует по количеству азота в остатке после извлечения раствори¬
телями.Реактивы и аппаратура: 1) 1 М расгвор КС1; 2) 70%-ныД раствор спир¬
та; 3) раствор для осаждения белков; 4) реактивы для определения азота
по полумикрометоду (Кьельдаля); 5) центрифуга (с пробирками 50—
100 еле3); 6) диализатор и целлофановые мешочки для диализа; 7) прибор
для механического встряхивания (рис. 43); 8) мерные колбы на 100; 200;
250 см*; 0) стеклянный песок (бигую химическую посуду размельчают на
шаровой мельнице или в ступке, отсевают фракцию сначала через сито с
отверстиями 1,76 мм, а затем отсеянную часть отделяют от мелких частиц,
просевая через сито с отверстиями 0,5 мм).Ход анализа. Извлечение белков раствором со¬
ли из богатых водой растительных частей. От¬
вешивают навески измельченных овощей столько, чтобы в них со¬
держалось около 5 г сухих веществ (для корнеплодов около
50 г, клубней картофеля и листьев около 25 г). Навески расти¬
рают в фарфоровой ступке с 5 г стеклянного песка в присут¬
ствии 1 М раствора хлористого калия. Последнего берут на5—10 смг меньше объема навески (объем навески условно мо-
ж но принять за величины, взятые по весу).Извлечение белков из семян раствором соли.
Навески по 2,5 или 5 + 0,01 г (в зависимости от объема центри¬
фужных пробирок) хорошо размельченных семян помещают
в ступку диаметром 11 см. прибавляют 2 г толченого стекла
и материал тщательно растирают, после этого приливают 3—
5 смл раствора 1 М хлористого калия и далее растирают до
тонкой кашицы, затем добавляют еще немного того же раст¬
вора и дополнительно растирают. Общий объем растворителя —
80 см3 отмеривают мерным цилиндром и из него приливают
частями.Полученную суспензию переносят в центрифужную пробирку
на 50 или 100 см3 и добавляют раствор хлористого калия до
16-кратного количества по отношению к навеске (до 50 или
100 ел*3). Пробирки закрывают резиновыми пробками и встря¬
хивают 15 минут в аппарате для встряхивания (рис. 43) или
вручную. Через 15 минут осадок отделяют на центрифуге при4	тыс. оборотах в течение 10 минут.Экстракт сливают в мерную колбу или мерный цилиндр
иа 250 см3 через воронку с ватным фильтром, который поме¬
щают в горлышко воронки. Извлечение 1 М раствором хлори¬
стого калия повторяют еще 3 раза, но с 8—10-кратным коли¬
чеством растворителя *. После прибавления новой порции раст¬
ворителя осадок в пробирке хорошо перемешивают палочкой.
Экстракцию солевым раствором заканчивают промыванием
остатка 20—25 см3 воды, которую после перемешивания и цент¬
рифугирования сливают в мерную колбу с солевыми вытяж¬
ками, и доводят объем до метки. В солевую вытяжку перехо¬
дят азотсодержащие небелковые вещества, альбумины и все
глобулины. Для установления их количества определяют общий
азот солевой вытяжки, а затем определяют азот после осажде¬
ния всех белков, проводят диализ, если хотят определить аль¬
бумины и глобулины.Для определения общего азота отбирают 20—25 см3 солевой
вытяжки, затем из фильтрата берут пробы по 50 см3 для диа¬
лиза и разделения белков.Во всех случаях азот определяют в фильтратах. Это быст¬
рее и удобнее, но необходимо учитывать низкие концентрации
азотсодержащих веществ, оставшихся в растворе.*	Во всех случаях солевая вытяжка содержит азота не менее 30% от его
суммы, а часто гораздо больше; следовательно, эта экстракция должна быть
проведена очень тщательно.295
После солевой экстракции извлечение можно прервать до
следующего дня, если в этом есть необходимость. К остатку
материала прибавляют тимол или I см3 толуола, перемети*
вают и, закрыв пробкой, оставляют до следующего утра в хо¬
лодильнике.Для определения азота небелковых и белковых веществ со*
левой вытяжки берут в колбы Кьельдаля на 100 см3 по 25 см3
экстракта, сжигают и определяют азот по Кьельдалю.Диализ солевой вытяжки. В целлофановый мешочек
наливают 50 cjk3 солевого экстракта и в качестве антисептика
прибавляют тимол, затем помещают в диализатор, наполнен*
ный водой и кусками льда, и в течение рабочего дня про¬
пускают медленный ток водопроводной воды. На ночь диали¬
затор ставят в холодильник с дистиллированной водой. На сле¬
дующий день диализ продолжают (реакция с AgN03). К концу
диализа в мешочке солерастворимые белки выпадут, а в раст¬
воре будут находиться только водкорастворимые белки. Не¬
белковые вещества (свободные аминокислоты и другие) уда¬
ляются.Альбумин от осадка глобулинов отделяют центрифугиро¬
ванием в течение 10 минут при 4 тыс. об/мин. Жидкость над
осадком и промывные воды (после промывания осадка и цент¬
рифугирования) сливают в мерную колбу, доводят до метки
н берут пробы для сжигания и определения азота. Осадок гло¬
булинов тщательно переносят в другую мерную колбу на
200 cjm3 путем растворения в 1 M КС1 и многократного смывания.
Затем колбу доводят до метки этим же раствором. Берут пробы
раствора, в котором находятся легко- и труднорастворимые гло¬
булины, для сжигания и определения их азота.Суммарное содержание белков в солевой вытяжке можно
определить, не применяя диализа; в этом случае определяют
азот после осаждения белков. Это упрощает работу, но не дает
информации о конкретном содержании альбуминов и глобу¬
линов. После осаждения белков раствор отфильтровывают или
центрифугируют. Затем пробы по 20 или 50 cjk3 фильтрата
сжигают и определяют небелковый азот, отгоняя аммиак в ап¬
парате для микроопределения (см. стр. 268).Примечавне. При необходимости определения группы легкораство¬
римых глобулинов извлечение белков из семяи начинают водой. Для вы¬
деления глобулинов проводят дналнз водной вытяжки. После водного извле¬
чения приступают к экстракции белков I и. KCI, как указано выше.Извлечение белков 0,2%-ным раствором ще¬
лочи. После солевого извлечения экстрагируют раствором
щелочи, чтобы извлечь все оставшиеся белки (растворимые
в этом растворителе). Извлечение ведут 0,2%-ным раствором
щелочи последовательно, порциями—сначала 80. а затем по
40 cjk3. Для этого в пробирку к остатку муки приливают296
80 см3* 0,2%-ного раствора едкого натра н после перемеши¬
вания стеклянной палочкоА пробирку закрывают пробкой н
чстряхивают в течение 15 минут, я затем центрифугируют.
Жидкость сливают в мерную посуду на 250 см3. Извлечение
раствором щелочи производят не менее 3—4 раз. Промывают
осадок водой так же, как после солевой экстракции. Объем
доводят раствором щелочи до метки и берут пробы до 50 см?
для определения азота.Извлечение белков раствором 70%-ного спир¬
та. Спирторастворнмые белки извлекают в двух или трех сле¬
дующих вариантах.1.	После извлечения белков раствором КС1 к остатку в цент¬
рифужных пробирках приливают 70%-ный спирт, нагретый до
60° (10-кратное количество для первой экстракции и 5-кратное
для каждой ил последующих). Пробирки закрывают пробками,
которые укрепляют так, чтобы они не открывались при взбал¬
тывании на механическом аппарате в течение 30—60 минут.
Затем вытяжку в пробирках центрифугируют 2 минуты и экст¬
ракт белка сливают в колбу на 100—200 см3 (семена пшеницы,
ячменя, овса, ржи, кукурузы экстрагируют последовательно3	раза). После этого в мерную колбу приливают 1—2 капли
щелочи, чтобы белки не выпадали в осадок. Объем раство¬
римых в спирте белков доводят до метки, взбалтывают и бе¬
рут пробы для определения азота, используя полумакро- или
нолумикрометоды.2.	После извлечения белков растворами хлористого калия
и затем щелочи поступают так же, как сказано в первом ва«
рианте. При этом имеют в виду, что семена проса, сорго и дру¬
гих просовидных содержат таких белков более 50% от общей
суммы белков в семенах; много их также в семенах отдельных
сортогрупп кукурузы. В связи с этим семена этих культур об¬
рабатывают спиртом не менее 3—4 раз и объем вытяжек этой
фракции доводят до 200 см3. В остальных случаях (семена
пшеницы, ячменя, овса и др.) достаточно 1-2 экстракций спир¬
том, где эта фракция составляет обычно не более 5%.3.	Спирторастворнмые белки извлекают сразу, без предва
рительной экстракции другими растворителями. В этом случае
в экстракте находятся и свободные аминокислоты.Из проб, взятых для определения азота, отгоняют ббльшук*
часть спирта в присутствии 1 см3 крепкой HjSO<.Вычисление состава азотистого комплекса.
Определения азота в семенах проса (без оболочек) показали,
что в 5 г семян находится 112,5 мг азота. Содержание азота
в отдельных вытяжках, полученных из 5 г семян, было следую¬
щее: в солевой 20 мг, в щелочной (после солевой) —28 мг, в
спиртовых вытяжках: 1) после предварительного извлечения*	Если навеска в 2 раза меньше, наливают 40 слР.297
раствором КСІ — 75 мг: 2) после извлечения растворам» КСІ
и щелочи—62,5 мг; 3) после извлечения спиртом без предва¬
рительной экстракции водой или растворами солен — 77 мг азо¬
та. В солевой вытяжке из 5 г семян, после осаждения белков,
содержалось 5 мг небелкового азота.Полученные результаты позволяют вычислить в процентах
от общего количества азота в семенах: азот небелковых ве¬
ществ, сумму солерастворнмых белков (альбуминов и глобу¬
линов), сумму спирторастворимых белков (с выделением двух
групп проламинов) и щелочерастворимых белков.Если провести диализ солевого экстракта, то можно от¬
дельно вычислить содержание альбуминов и глобулинов. Па¬
раллельное извлечение из разных навесок, проводимое этим
способом, дает хорошо совпадающие результаты.Определение аминокислот
путем хроматографии
на колонкахМетод* основан ка различии скоростей перемещения отдель¬
ных аминокислот, движущихся в потоке растворителя (подвиж¬
ная фаза) через слой ионообменного сорбента (неподвижная
фаза). При этом в определенных зонах сорбента концентри¬
руются отдельные определенные аминокислоты. Скорость и оче¬
редность вымывания каждой аминокислоты зависят от ее
свойств.Реактивы и аппаратура: 1) смола амберлит JR-I20 (или дауэкс
50 X В или эеокарб 225). ацетатный буфер с pH 5,51 ±0.03 (не должен" со¬
держать аммиака); 2) цитратно-натриевые буферы, pH 3,25 ± 0,01,
pH 4.25 ± 0.02, pH 5,25 ± 0,02, а также pH 5 для лейциновой кривой (см.
стр. 439); 3) 0,35 н. раствор NaOH; 4) над муравьиная кислота (к 9 см1
88%-ной муравьиной кислоты приливают»! см* 30%-ной перекиси водорода
и оставляют на один час при температуре 20°. затем охлаждают до 0°);5)	раствор 6 и. соляной кислоты (соляную кислоту перегоняют в стеклян¬
ной колбе); 6) бн-дистнллнрованная вода, полученная в помещении, не за¬
грязненном аммиаком и аминами: 7) набор стандартных чистых аминокис¬
лот; 8) ниигидрии (чистый, для анализа); 9) гндриидангии (4 г нннгндрина
растворяют в 100 см* воды, нагретой до 90°; после растворения добавляют
при помешивании 4 г аскорбиновой кислоты, растворенной в 20 ел3 подо¬
гретой до 40е воды; через 30 минут раствор охлаждают водой, выпавшие
кристаллы гндриндантина отфильтровывают, промывают водой, высушивают
в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом к храняі защищенным от
света); 10) метил- или этилцеллозольв. нлн дноксан (их очищают от пере¬
кисей настаиванием с твердой щелочью при периодическом встряхивании,
а затем отгоняют в присутствии 10 г сернокислого железа и собирают
фракцию, кипящую при По—125°—для метилцеллозольва и 132—136® для
этмлцеллозольаа: эти фракции хранят в темных склянках, в темноте; перед
использованием проверяют на отсутствие перекисей 10% -ным раствором К1;
II) нивгидрнновый реактив (20 і нингидрииа растворяют а 750 см1 мешл-•	По прописи Н. Ф. Кошелева и Н. К- Головиной298
или эгилцеллозольва. затем добавляют 3 г гндрнндантныа; если раствор
помутнеет, его фильтруют через стеклянный фильтр I; после этого до*
бавляют 250 см1 ацетатного буфера. pH 5,5; покрасневший раствор немед¬
ленно переносят в темный резервуар с автоматической пипеткой, заполнен¬
ной перед этим азотом; буферные растворы готовят очень тщательно; ли¬
монная кислота используется только химически чнетая; величины pH раство¬
ров устанавливают очень точно на высокочувствительном потенциометре; во
избежание развития микроорганизмов в буферные растворы добавляют фе¬
нол из расчета 1 г на 1 дм* буфера; растворы хранят в полиэтиленовых нлн
стеклянных бутылях при 0е); 12) автоматический собиратель белковых
фракций (рис. 44): >3) ионообменные колонки (0,9X15 н 0,9X150 cjk);
14) ФЭК-Al (см. рис. 27).Рнс. 44. Автоматический собиратель фракций СФ-22./ — •pjUUKHUHftCfl коллектор. 2 — передвижное плечо їді ваподвенмш пробирок*
J — мнкромасос. 4 — шкаф для управленні.Подготовка к анализу. Приготовление стандартной
смеси аминокислот. Работу на вновь приготовленной ко¬
лонке начинают с анализа стандартной смеси аминокислот.
Для этого отвешивают по 0,1 мм М каждой аминокислоты и
хлористого аммония; смесь растворяют в 100 см3 0,2 н. цитрат-
ного буферного раствора pH 2,2 и наносят по 1 см3 на 150-сан-
ти метровую колонку и по 0,5 смл на 15-сантиметровую.Подготовка смолы. Продажную смолу измельчают до
г-ели чины зерен 35—40 мкм и 47—65 мкм. Чем однороднее зер¬
на, тем больше разрешающая способность колонки. Измельче¬
ние проводят на мельнице тонкого помола или в ступке. Перед
измельчением смачивают водой. Из частиц смолы разной ве»209
личины отбирают фракции указанной выше величины при по*
мощи гидродинамической установки типа П. Гамильтона*.Нужную фракцию смолы промывают 4 н. соляной кислотой
до получения бесцветного фильтрата иа стеклянном фильтре.
Затем промывают 2—3 раза дистиллированной водой и после
этого 2 н. раствора NaOH до сильнощелочной реакции стекаю¬
щего раствора. Наконец, смолу нагревают в колбе в кипящей
бане с двойным объемом 1 н. раствора NaOH (6 раз по3	часа). После каждого трехчасового нагревания, спустя 45 ми¬
нут, раствор сливают и заменяют новым. Конец такой обра¬
ботки определяют по бесцветной окраске щелочи. Затем смолу
промывают дистиллированной водой на стеклянном фильтре
до удаления свободной щелочи.Заполнение большой колонки смолой. Влажную
смолу с величиной частиц 56 + 9 мкм взбалтывают в 0,2 и.
цитратном буферном растворе (pH 4425 ±0,02). Затем суспен¬
зию промывают на стеклянном фильтре медленным током
того же буферного раствора до pH 4. После этого суспензию
в стакане заливают двойным количеством того же буфера и,
размешав, вливают в колонку (через воронку с изогнутым
концом) 5—6 порциями равного объема так, чтобы суспензия
стекала по стенке; выходное отверстие колонки закрывают и
дают равномерно сформироваться слою смолы. Когда смола
полностью осядет, выходное отверстие открывают и, не ожидая,
когда пройдет весь буферный раствор, вливают новую порцию
суспензии. К верхнему концу колонки подают давление вели¬
чиной 15—30 см ртутного столба при помощи «груши», и даль-
нейшее«оседание смолы происходит под давлением. Эта про¬
цедура повторяется до заполнения всей колонки. Для внесения
последнего слоя к колонке наращивают стеклянную грубку та¬
кого же диаметра, которую затем удаляют. Прн правильном
заполнении смола в колонке располагается столбиками высотой
15—20 см с четкими, горизонтальными линиями раздела. Ника¬
ких, даже маленьких пузырьков, трещин и разрывов не должно
быть. После заполнения колонки через нее пропускают 0,2 и.
раствор NaOH до тех пор, пока фронт не пройдет больше поло¬
вины длины колонки. Вслед за щелочью через колонку про¬
пускают цитратно-натриевый буфер с pH 3,25 + 0,01. Колонка
считается готовой к работе, если скорость протекания буфер¬
ного раствора будет находиться в пределах 10—12 см3 в час
при давлении 25—30 см ртутного столба.Заполнение малой колонки смолой. Для разделе¬
ния основных аминокислот колонку заполняют смолой с вели¬
чиной частиц 35—40 мкм. Смолу промывают н суспензируют
в 0,35 М цнтратно натриевом буфере (pH 5,28). Колонку за¬
полняют смолой так, как указано выше, но только в2—3 приема. Затем через нее пропускают 15— 20с.иэ0,35 и. раст-•	Р. В. Н а ш I И о п. Anal. Chein.. ЗО, 914, 1958.эро
вора NaOH и вслед за ним — около 60 см3 предварительно про-
кипяченого буферного раствора (pH 5,28). Колонка готова к
работе, если скорость протекания буферного раствора при 50°
и давлении 15 см ртутного столба составляет 25—30 см} в час.
Подробности об аппаратуре, приготовлении смолы и заполнении
колонок см. в работе Кравченко и Клеолиной *.Ход анализа. Гидролиз белка. Ответа венной опера*
цией является гидролиз белка. Для этого отвешивают 50 +
±0,1 мг чистого белка в стеклянную ампулу, прибавляют10	см* 6 н. HCI, заполняют ампулу азотом, заплавляют и нагре-
оают 24 часа при 110°. Для растительных объектов отношение
навески к кислоте должно быть не менее 1:2000, до 1:10000
и даже больше. В процессе гидролиза 2—3 раза содержимое
ампул осторожно перемешивают круговым движением. После
гидролиза охлажденную ампулу вскрывают и раствор перелн-
вают в фарфоровую чашку (ампулу промывают перегнанной
водой). Раствор выпаривают под вакуумом до сиропа и, прили¬
вая 10 см* воды, выпаривают досуха, повторяя это 2—3 раза,
до потери запаха соляной кислоты. При необходимости гидро-
лизат сохраняют в ампуле в замороженном виде. Для опреде¬
ления метионина и цистина берут другую навеску белка, окис¬
ляют в фарфоровой чашке 20 см3 надмуравьиной кислоты и
оставляют на 4 часа при 0° для окисления цистина в цистеино-
рую кислоту, а метионина —в метионин-сульфон (если белок
растворяется плохо, то время увеличивают до 12—15 часов).
Раствор выпаривают в вакуум-эксикаторе при 50° над щелочью
до сиропа и используют 10 см3 6 н. HCI для растворения и пере¬
носа раствора белка в ампулу. Гидролиз проводят так, как
указано выше.Разделение аминокислот на большой колонке.
За 1—1,5 часа до внесення опытного субстрата включают обо¬
грев колонки и пускают цитратный раствор pH 3,25 при 50° под
давлением 20—24 см ртутного столба, со скоростью прохожде¬
ния 10—12 см* в час. Гидролизат растворяют в таком объеме
воды, чтобы в 1 см? содержалось 0,35—0,4 мг азота. Беру г1	см3 гидролизата н вносят на колонку. После того как гидроли¬
зат впитается в смолу, стенки колонки обмывают буферным раст¬
вором pH 2,2 три раза по 0,3 см*, давая каждый раз ему впи¬
таться в смолу. Затем к колонке присоединяют делительную во¬
ронку с буферным раствором pH 3,25, который наливают по
стенке до верха колонки. На поверхность буфера наливают
0,5-сантнметровый слой парафинового масла. Наконец, воронку
присоединяют к системе, создающей воздушное давление, и
элюат, вытекающий из колонки, собирают по 1—2 см3 в про¬
бирки, помещенные в коллектор (рис. 45). Первые 90—100 см*•	Н. А. Кравченко. Г. В. Клеопнка. Руководство по хроматогра¬
фическому анализу аминокислот на колонках. «Наука*, 1964.901
802Рис. 45. Ионообменная колонкав рабочем состоянии.I — колонка с обогревом от универсального
термостата, і —воронка, соединенная с си¬
стемой. создающей воздушное давление;
з — пробирка в коллекторе для собирания
элюата, вытекающего на колония.элюата, вытекающего из колонки, аминокислот не содержат.
Затем выходит аспарагиновая кислота; далее следуют треонин,
серии, глютаминовая кислота, пролин, глнцнн, аланин, валин,
метионин, нзолейцни, лейцин, тирозин, фенилаланин. В окислен¬
ном гидролизате перед аспараги¬
новой кислотой, начиная от 20 до
25-й фракции, каждая по 2 см3,
из колонки выходит цистеиновая
кислота, а вслед за ней может
поя виться метиони н-сульфоксид;
остальной метионин в виде ме-
тионин-сульфома выходит после
аспарагиновой кислоты перед
треонином. Для сокращения вре¬
мени разделения аминокислот
между выходом глицина и алани¬
на меняют буферный раствор на
менее кислый (pH 4,25). Момент
смены буферного раствора уста¬
навливают по объему элюата, со¬
бранного до появления аспара¬
гиновой кислоты (примерно
116 с*3), умножают на эмпири¬
ческий коэффициент 2,15 и узна¬
ют количество элюата, после вы¬
хода которого, начиная от появ¬
ления аспарагиновой кислоты,
следует сменить буфер.Закончив разделение, смолу в
колонке регенерируют, пропуская
0,2 и. NaOH. После выхода
фронта щелочи из колонки про¬
пускают охоло 120 см3 буфер¬
ного раствора pH 3.25. Затем
на нижний конец колонки наде¬
вают резиновую трубку с зажи¬
мом, а сверху на смолу нали¬
вают слой буфера и верх колон¬
ки плотно закрывают.Разделение основных
аминокислот на малой ко¬
лонке. На колонку наносят
0,5—1 см3 гидролизата, содержа¬
щего 0,35—0,40 мг азота, и элюи¬
руют буферным раствором (pH
5,28) при температуре 50°, под давлением 10— І5 см ртутного
столба, со скоростью вытекания буфера 2 см3 за 5 мину г. Пер¬
вым выходит лизин, затем гистидин, аммиак и аргинин.
Определение лизина на малой колонке (по
М. И. Смирновой-Икон ни новой и Т. И. Пене вон). На малой ко*
лонке в тех же условиях определяют количественно одни лизин.
Для этого с колонки собирают элюаты только данной амино¬
кислоты. За час до внесения гидролизата на колонку включают
обогрев и пропускают буфер (pH 5,28). Скорость вытекания
буфера из колонки (должна быть 2 см? за 5 минут) регулируют,
изменяя давление в пределах 10—15 см ртутного столба. На
колонку наносят 1 смг гидролизата, содержащего 0,35—0,40 мг
азота. Когда раствор впитается в смолу, стенки колонки обмы¬
вают буферным раствором (pH 2,2) трижды по 0,3 см3, давая
каждый раз впитаться ему в смолу. Затем к колонке присоеди-
!,яют делительную воронку с буфером (pH 5,28), которым осто¬
рожно, по стенке заполняют колонку доверху. На поверхность
буфера наливают слой в 0,5 см парафинового масла, создают
давление и проводят разделение и элюирование аминокислот.
Собирают фракции объемом 2 см* В первые (примерно 10 фрак¬
ций) входят все аминокислоты, содержащиеся в гидролизате,
кроме лизина, гистидина и аргинина. Их собирают, но не ана¬
лизируют. Последующие (примерно 10 фракций) анализируют
для проверки устойчивости нулевой линии. Затем производят
сбор 7—8 фракций, в которых уже содержится лизин. После
его выхода коллектор отключают и остальные фракции амино¬
кислот собирают и из анализа удаляют. Для проведения боль¬
шего числа анализов работу на одном коллекторе проводят од¬
новременно на 2—3 колонках. Для сбора элюатов лизина, гисти¬
дина и аргинина требуется приблизительно 5 часов, а для вы¬
деления только лизина— 2—-2,5 часа. После выхода аргинина
малую колонку можно использоваїь повторно без регенерации.
Если смолу необходимо очистить, то через колонку пропускают
25—50 см3 0,35 н. NaOH, а затем ее вновь уравновешивают с
рабочим буферным раствором.Определение количества лизина на малой колонке и на ами-
ноанализаторе дает аналогичные результаты.Определение а мни окисло т. Для приготовления ннн-
гпдрннового реактива на аминокислоты надо употреблять реак¬
тивы высокой чистоты и строго соблюдать условия нагревания,
pH среды и защиты от кислорода воздуха, который снижает
интенсивность окраски. Пробирки с элюатами аминокислот по¬
мещают в штатив и в каждую вносят по 0,5 см3 нингидринового
реактива на 1 см3 элюата; пробирки закрывают колпачками из
фольги, встряхивают вместе со штативом, помещают в кипящую
водяную баню на 15 минут. Затем в охлажденные до 20° про¬
бирки приливают по 5 см3 60%-ного этанола, хорошо встряхи¬
вают до полного перемешивания жидкости и после этого фото-
метрируют при 570 нм против контроля.Фракции элюата, собранные на большой колонке в области
пролина, фотометрнруют при 570 и 440 нм. Первые данные ис*303
пользуют для расчета глутаминовой кислоты, вторые —для
пролина. В качестве контроля при фотометрировании исполь¬
зуют порцию элюата, предшествовавшую выходу данной группы
аминокислот. Реакцию производят так же, как и основных
фракций. При фотометрировании против воды она не должна
иметь оптическую плотность выше 0,05 ±0,1. Более высокие
показатели указывают о поглощении пробами большого коли¬
чества аммиака.Вычисление результатов. По результатам фотомет-
рирования, которое заканчивают не позже чем через 1,5 часа
после добавления в элюаты нингидринового реактива, состав¬
ляют график. На оси абцисс откладывают порядковые номера
фракций, а на оси ординат —их оптическую плотность. После
соединения всех точек получают ряд кривых в виде пиков, соот¬
ветствующих по величине и форме характеру выделения амино¬
кислот из колонки. Количество каждой аминокислоты в процен¬
тах (лг) вычисляют по формуле:ж = (С‘Ф-а-V-100) i V|),где: С —сумма концентраций аминокислоты, найденных по
стандартной лейциновой кривой а отдельных фракциях,
образующих пик этой кнслоты (в jkM);Ф —фактор объема элюата;а—вес I мМ рассчитываемой аминокислоты (в мг);
и — общий объем (в см3) гидролизата;
и»—объем пробы (в см3), нанесенной на колонку;
к—коэффициент цветности рассчитываемой аминокислоты
(табл. 15);
н — навеска чистого сухого белка (в мг).Фактор Ф рассчитывают по формуле:ф (V| + V* + У>)-»«(V« + +»»)•»» •где: Vi — объем элюата в одной фракции;va —объем добавляемого нингидринового реагента;
иг — объем добавляемого спирта;»4 — объем пробы, использованный при построении калиб¬
ровочной кривой.Сумму концентраций аминокислоты (С) определяют при сло¬
жении величин концентраций, найденных в отдельных фрак¬
циях элюата, образующих пик этой аминокислоты.Построение лейциновой кривой. Лейцин в количе¬
стве 32,8 мг растворяют в 50 см3 нитратного буфера, pH 5.
Из этого объема берут 20 см3 и доводят до 100 см3 тем же
буфером. Полученный раствор содержит 12,13 мг лейцина, что
соответствует 1 *М в 1 см3 раствора. Отбирают объемы раст¬
вора лейцина 0,05; 0,1; 0,15; 0,20; 0,25 см3 в пробирки и объем304
таблица is	Местность" ко методу с. Мураи В. Штейна(за tfiO примят лейцин)АминокислотаКоїффиш-
cirf .икт*ЙОСТИ*АнпоикмпКо»ффи-отит.акпюстн*Аспарагиновая кис¬•Тирозин, фенилала¬1,00лота, треонин, три¬
птофан 	0.94нин 	Метионин	1,02Серии, аспарагин . .0,93Лизин	1.10Алании, валин, ам¬0.97Аргинин	1,01миак 	г-аминоаднпшюоаяГлутамин 	0,99кислота 	0,95Цнстнн	Пролин (440 нм) . .0,550,220-аланин	0,50каждой пробирки доводят буфером pH 5 до 2 см* Затем добав¬
ляют по І см3 нингилршювого реактива и в дальнейшем посту¬
пают так же, как при обработке проб (см. выше). В связи
с тем, что интенсивность окраски проб может резко колебаться,
готовят 2 лейциновые стандартные кривые: одну с добавлением5	см3 спирта после нагревания и охлаждения, другую —с до¬
бавлением 15 см\ Фотоыетрируют против контроля. В конт¬
роль вместо воды также приливают буфер, pH 5.Пример вычисления содержания лизина в зерне
кукурузы. Навеска муки —200 мг; влажность муки —7%; содержание
белка а навеске муки—12%: количество белка в 200 мг муки с учетом
влаги — 22,2 мг.Средний объем I эл юг та—1.95 ел1; количество миллиграммов лизина,
соответствующее фоновой вкстипцни, — 0,064; количество фракций, в кото¬
рые выходит лнэин — 7; фактор объема элюата (Ф):1.95 + 1 +5 7.95
ф~ 2+1+5 ~ 8сумма концентраций данной аминокислоты, найденной ло лейцниовой кривой
в отдельных фракциях, образующих ник этой кислоты, с ■» 0,738 ——	<0.064*7) »0.290 мг; общий объем гидролизата —10 см*; объем пробы,
нанесенной на колонку. — 1 см>; количество лизина в I см? гидролизата —
0,14615 мг. коэффициент цветности —1,1. Таким образом, содержание лнзииа
в пересчете на белок равно:0,290*0,14615-0,994* 10* 100 	* =	Г.ТФЗП	=',72*-В пересчете на муку:0,293*0,14615*0,994*10*100 л*•	І7ГШТ	°-т-305
Хроматографическое
разделение белков на ДЭАЭЦ(по Петерсону и Соберу) *Днэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭЦ) является слабощелоч¬
ным анионитом и широко используется для очистки и фракцио¬
нирования белков с нзоэлектрической точкой в нейтральной и
кислой средах. Целлюлозоиониты обладают высокой разделяю¬
щей способностью; у них отсутствует поверхностная денатурация
белков, и поэтому выход разделенных белков достигает часто
100%. Они слабо сорбируют низкомолекулярные вещества.Реактивы: 1) ДЭАЭ-целлюлоза; 2) фосфатный буфер. pH 7; 3) 0,1 н.
раствор НС1 в I М раствора NaCt; 4) 1 М NaHCOj; 5) 1 М NajCOj;6)	0.1 я. раствор NaOH; 7) 1%-ный раствор NaOH; 8) растворы хлористого
натрия от 0.1 до 0,5 М.Подготовка колонки. Продажную ДЭАЭЦ предварительно
последовательно обрабатывают на воронке Бюхнера раство¬
рами 0,1 н. HCI в 1 М NaCI раствора, затем 1 М NaHC03,1	М №гСОз, 0.1 н. NaOH и этиловым спиртом. После отфильт-
ровывания каждого раствора целлюлозу промывают дистилли¬
рованной водой до нейтральной реакции. Затем высушивают
ДЭАЭЦ в вакуум-эксикаторе. Перед заполнением колонки
ДЭАЭЦ переводят в гидроксильную форму настаиванием в те¬
чение двух часов с 0,1 н. раствором NaOH, затем декантацией
отделяют неосевшие мелкие частицы, после чего суспензию
вносят в хроматографическую колонку.Обычно используют колонки с соотношением длины к диа¬
метру 10:1—20:1. В основание колонки помещают кусочек
стеклянной ваты и диск фильтровальной бумаги. При закры¬
том кране воронки вливают часть суспензированного в 0,1 и.
NaOH целлюлозоионита, затем кран приоткрывают, создавая
постоянный равномерный сток раствора щелочи из колонки.
При этом в колонку все время вливают суспензию, перемеши¬
вая ее стеклянной палочкой. Нужно сделать, чтобы ДЭАЭЦ по¬
стоянно была покрыта слоем щелочи высотой 0,5—1 см, чтобы
не допустить проникновения в колонку воздуха. Необходимо
добиться равномерного распределения целлюлозы в колонке.Верхнюю часть колонки соединяют с цилиндрической дели¬
тельной воронкой иа 100 см3 и начинают промывать ДЭАЭЦ
сначала водой до нейтральной реакции, а перед нанесением
белка—стартовым буфером.Колонку соединяют с автоматическим коллектором фракций
(см. рис. 44), который регулируют по времени или по объему
(чаще по времени). Сменяя в коллекторе пробирки через ка欕	Е. A. Peterson, Н. A Sober. Современные методы в биохимии.
Под ред. В. Н. Орсхопнча, т. I. «Медицина», I9C4, стр. 37.306
дые 10 мннут и установив в колонке скорость тока жидкости
30 см3 в час, получают фракции объемом 5 см\ Можно при-
менять более высокие скорости протекания растворов —до
50 см* в час на 1 см2 поперечного сечения колонки. Хромато¬
графию белков обычно проводят при 0—4°. При работе в комнат*
ных условиях воду в холодильник колонки пропускают через
змеевик, помешенный в лед, что обеспечивает достаточное
охлаждение колонки.Ход анализа. В колонку вносят раствор, содержащий 20—
40 Ate белка. Используют фосфатный, ацетатный или боратный
буферы с низкой ионной силой *, так как сорбируемость белка
на целлюлозоношпах наибольшая в бессолевой среде и в раз¬
бавленных буферных растворах.Неалсорбирусмый белок вымывают исходным буфером, за¬
тем элюируют адсорбированный на ДЭАЭЦ белок одним из
двух способов: изменением pH раствора или растворами нейт*
ральных солей возрастающей концентрации. Изменение кон¬
центрации солей может быть либо ступенчатым, либо плавным.
Использование приема ступенчатого элюирования на достаточ¬
но высоких колонках дает хорошее разделение белков.Прочно адсорбированный белок вымывают щелочными раст¬
ворами. Таким образом, элюирование белков с колонки можно
проводить в следующем порядке: I/I5 М фосфатный буфер,
pH 7; затем растворы хлористого натрия, приготовленные в
1/15 М фосфатном буфере, pH 7: 2/0,1 М; 3/0,2 М; 4/0,3 М;
5/0,4 М; 6/0,5 и 7/1 % NaOH.При увеличении концентрации соли белковые компоненты,
как правило, выходят из колонки в порядке уменьшения их
изоэлектрнческих точек.Каждый элюат пропускают через колонку до тех пор, пока
в собираемых с колонки фракциях будет отсутствовать белок.
Определение белка во фракциях проводят по методу Лоури
(стр. 275).Результаты хроматографического разделения белков на ком¬
поненты выражают графически.Содержание белка в каждом компоненте выражают также
в процентах к исходному белку. Для этого растворы из про¬
бирок соответствующих компонентов объединяют, измеряют
объем, определяют концентрацию белка по Лоури и вычисляют*	Ионная сила ц равна половине суммы произведений концентраций С
каждого присутствующего в растворе иоиа на квадрат его валентности (за¬
ряда ) Z:Пj» = -у {CtzJ + C?z\ + + ... + — 2 CjZ%,огде: индекс i —порядковый номер, присвоенный иону в данном растворе, со¬
держащем всего п ионов.307
количественное содержание каждого компонента в исходном
белке. Например, объем фракции VII компонента равен 13 ел3,
концентрация белка —140 мкг на 1 см\ содержание белка —
0,140 мгХ 13= 1,82 мг. Сумма белка во всех компонентах —
24,50 мг; следовательно, VII компонент составляет 1,82:24,50 X
X 100*7,4%.Разделение белков
на полиакриламидном гелеРазделение белкой путем вертикального электрофореза в мо*
дифнкации В. И. Сафонова и М. ГІ. Сафоновой* является эф*
фективным аналитическим мнкрометодом для выявления гете¬
рогенности природных смесей н выделенных препаратов белков
из растений.В буферном растворе белкп находятся в ионизированном
состоянии. В электрическом поле молекулы белка передвигают¬
ся к аноду или катоду в зависимости от знака их суммарного
заряда. Скорость перемещения зависит от размеров белковых
молекул и величины заряда.Реактивы и аппаратура: I) запасные растворы для приготовления ще*
лочного и кислого гелеП (см. приготовление);. 2) буферные растворы для
заполнения сосудов при электрофорезе (табл. 16); 3) камера для электро¬
фореза: 4) универсальный источник питання (УИГЫ).Приготовление запасных растворов. Раствор № 1 (pH 8,9):
берут 48 см3 1 и. І1СІ, 36,6 г трис-окснметиламинометана и
0,46 см3 тетраметнлэтилендиамнна и доводят водой до 100 см\
Раствор Лг 2: отвешивают 30 г акриламида. 0,8 г N, М'-мети-
лен'бис-акриламида и доводят водой до 100 см'. Раствор № 3
(свежеприготовленный): аммоний надсернокислый 0,14 г, вода
до 100 см3. Раствор № 4 (pH 6,85—6,95): 1 М НэР04
(плотн. 1,05) 25,6 см\ трнс*оксиметила минометам 5,7 г. тетра-
метилэтилендиамин 0,05 см3, вода до 100 см3. Раствор № 5:
растворяют 10 г акриламида и 2,5 г N, N'-метилен-бис-акрнла-
мида в воде и доводят до 100 см9. Раствор № 6: рибофлавин4	мг, вода до 100 сиі3. Раствор № 7 (pH 2,9): I н. КОН 12 см\
ледяная уксусная кислота 53 см*, тетраметилэтнлендиамин
1,2 см\ вода до 100 см3. Раствор № 8 (свежеприготовленный):
аммоний надсернокислый 0,56 г, вода до 100 см*. Раствор № 9
(pH 5,9) :1 н. КОН 48 см3, ледяная уксусная кислота 2,9 см3,
тетраметилэтнлендиамин 0,05 см3, вола до 100 см3. Необходимо
каждый раз проверять pH растворов (стр. 37).Для экономии реактивов рабочие растворы № 1; 4; 5 и 6
приготовляют в меньших объемах (25—50 см3).*	В. И. Сафонов, М. П. Сафонова. Физиология растениА. 16, 2,
1969, стр. 350-356.808
Рабочие растворы для приготовлении гелей
и буферовГели дм рааделепиа
белков а шелочно*Раствори,
вс шее гмОбъемы.частя.Гели д«а разделения
бСЛКОВ » кМСЛОАРастворы.вешестваОбъемы.част».сред*вессрtitвесСмесь для мел*м 11Смесь лля мел-№ 22копорнстого22KOnOpttCTOrO№ 74(нижнего) геля,М 34(нижнего) геля,М 82рН8.9Вода1pH 2.9смесь для круп»№ 41Смесь для 11№ 52нопористого№ 52крупнопорис¬№ 61(верхнего)геля,
pH 6,5; 6,6№ 6
Вола14того (верхнего) \
геля, phi 5,9 \№ 9
Вода14Буфер дляТрис-ок-0.6Буфер лляГликокол2.8 гэлектродныхенметнл-электродныхУксуснаякислота(ледяная)Водасосудов, pH 6,3амино-
метан
Г ЛИКОКО.1Вода2.9 г
До 1 дм3сосудов, pH 40.3 ем1
До 1 дм3Гель для электрофореза приготовляют непосредственно в
электрофоретических трубках смешением нескольких растворов
(табл. 16), содержащих необходимые реактивы н сохраняю¬
щихся в течение нескольких недель в холодильнике. Состав
растворов можно изменять в зависимости от свойства разде¬
ляемых белков, но он всегда включает в себя гелеобразующие
компоненты (вкриламид и метилен-бис-акрнламид).Камера для электрофореза. Прибор (рис. 46) состоит из
двух сосудов для буферного раствора: нижнего / — стеклян¬
ного, например цилиндрического «батарейного» или химиче¬
ского стакана на 700—800 см*, и верхнего 2—пластмассового,
например полиэтиленовой «хозяйственной» банки с крышкой.
Верхний сосуд служит не только емкостью для буфера, но и
опорой для других частей камеры. Он снабжен крышкой 3 с
направляющим отверстием в центре, диаметром 7 мм и имеет
в дне центральное отверстие диаметром 18 мм для резиновой
муфты 4. В муфте плотно укреплена стеклянная электродная
трубка 5, несущая ннжний и верхний платиновые электроды 6
и 7. Оба электрода припаяны к концам тонких проводов с по*
лихлорвиниловой изоляцией, а места спая тщательно изолиро¬
ваны стирилакрилом или раствором оргстекла 8 дихлорэтане.
Боковое отверстие 8 в электродной трубке, через которую вы¬
ходит наружу верхний электрод, тщательно залито водостой¬
ким клеем.Стеклянные электрофоретические трубки 9 с внутренним
диаметром 5—6 мм, длиной 75 мм, со слегка отшлифованными
краями укрепляют в 12 отверстиях в дне верхнего сосуда при
помощи отрезков резиновой трубки. Трубки тщательно подби*800
башке, образующейся между стенками стеклянных сосудов.
В качестве наружного сосуда удобно пользоваться цилиндриче¬
ским «батарейным» стаканом емкостью 3 Aw1.В собранном виде верхний сосуд не должен пропускать бу-
ферный раствор. Электрический ток в этом случае будет про¬
ходить только через трубки с гелем, что необходимо для нор¬
мального протекания процесса электрофореза.Рис. 46. Схема электрофоретиче¬
ской камеры для вертикального
мнкроэлектрофореэа с охлажде¬
нием геля (объяснение в тексте).Рис. 47. Магнитная мешалка с на*
гревательным прибором УР-63
(ГДР).рают по размерам, хорошо промывают хромовой смесью или
содой и тщательно высушивают. В верхний и нижний электрод¬
ные сосуды наливают разбавленный буферный раствор, кото¬
рый перемешивают магнитной мешалкой //. Магнит 10 поме¬
шают в нижнем буферном сосуде, который находится на маг¬
нитной мешалке (рис. 47), что
обеспечивает равномерное пе¬
ремешивание буфера и охлаж¬
дение электрофоретических
трубок. Охлаждающая смесь
(лед с водой) находится в ру-
В качестве выпрямителя тока для электрофоретической ка*
меры служит УИГЫ (универсальный источник питания) или вы¬
прямитель к прибору ЭГА-1 для поддержания заданной силы
тока.Приготовление гелей. Готовая к работе электрофоретиче¬
ская трубка содержит 2 слоя геля. В верхнем (крупнопори¬
стом) геле происходит предварительное концентрирование бел¬
ковой зоны, а в нижнем (мелкопорнстоы)—разделение белков
в зависимости от заряда и величины их молекул.Приготовленную для полимеризации мелкопористого геля
смесь быстро разливают в заранее подготовленные сухие элект¬
рофоретические трубки слоем высотой 45 мм. Трубки должны
быть предварительно размечены и закрыты снизу водонепро¬
ницаемыми донышками (например, кружками из лейкопласты¬
ря с последующей пропиткой расплавленным парафином) п
помещены вертикально в штатив. Поверх раствора в трубки
необходимо осторожно налить слой волы 7—10 мм при помощи
пипетки с капиллярным кончиком. По окончании полимериза¬
ции (она длится около часа) воду из трубок осторожно отса¬
сывают пипеткой и трубки сразу же заливают смесью для
верхнего крупнопористого геля слоем 5—7 мм. Поверх этого
слоя в свою очередь таким же образом наливают слой волы
и трубки выставляют на солнечный или люминесцентный свет
для фотополнмеризацни. Через 5—15 минут образуется «за¬
метно опалесцирующий верхний гель. Воду из трубок уда¬
ляют.Ход анализа. В готовые трубки вносят не более 0,2—0,25 ел3
исследуемого раствора с общим содержанием белка около
0,1 мг. Для лучшего разделения белков образец заключают в
антиконвекционную среду, для чего прибавляют 6%-ный раст¬
вор линейного поликриламида * или 40%-ный раствор сахарозы
и индикаторной краски (5—10 микрограммов) для наблюдения
за процессом разделения. В качестве индикаторов используют
краски, обычно не присоединяющиеся к изучаемым белкам.
При разделении белков в щелочном геле используют в качестве
индикатора бромфенол синий или «закатно-желтую» (Sunset
yellou-FCF Supre, Англия, из группы пищевых красителей), в
кислом геле индикаторм служит метиленовая синь.Образец тщательно перемешивают. Трубки осторожно за¬
полняют доверху буферным раствором для электродных сосу¬
дов и присоединяют к верхнему сосуду камеры через отрезки
резиновой трубки, вводя последние в верхний сосуд на 1 см.
Затем приклеенные снизу к трубкам донца удаляют. В сосуды
камеры наливают буферный раствор так, чтобы трубки и элект¬
роды были полностью погружены в него. После полной сборки*	6 г акриламндл. 0.5 мг рибофлавина, 0.05 c.wJ ТЭМЭД (тетраметнлэти-
леиднамин) к доводят водой до 100 см3.311
камеры включают магнитную мешалку, а охлаждающую ру-
башку заполняют смесью холодной воды и льда и подключают
прибор к выпрямителю.Разделение белков можно проводить в щелочном или кис*
лом геле, но в любом случае белки должны двигаться в труб¬
ках сверху вниз. В щелочном геле большинство компонентов
направляется обычно к аноду, поэтому нижний электрод ка¬
меры должен быть присоединен к положительному полюсу вы¬
прямителя. В кислом геле часть белков обычно мигрирует к
катоду, н поэтому полюса электродов необходимо переменить
на противоположные. Электрофорез проводят примерно 45—
60 мннут при температуре около 5°, силе тока 48 ма и напря¬
жении от 400 до 600 в. Когда зона индикаторной краски до¬
стигает 4—5 мм от нижнего конца колонки геля, процесс оста¬
навливают.При разделении щелочных белков на кислых гелях необхо¬
димо особенно внимательно следить за охлаждением буферной
системы, не допуская разогрева буфера в верхнем сосуде.
В противном случае гели трудно извлекаются из трубок.Для лучшего извлечения геля рекомендуется трубки перед
заполнением смочить 6—10%-ным раствором диметилхлорси-
лана, поместив их затем в сушильный шкаф на 1,5—2 часа.
Наслаивать гель в такие трубки следует осторожно, с помощью
топкой трубки.По окончании электрофореза камеру разбирают, трубки вы*
ни мают и столбики геля отделяют от внутренних стенок трубки
с помощью тонкой стальной проволочки. Положение зоны краски-
индикатора отмечают проколом извлеченного геля тонкой иглой
из темного стекла. Столбики геля фиксируют 30 мннут в
5%-ной трихлоруксусной кислоте, отмывают трижды но 10 ми¬
нут в дистиллированной воде, погружают на 1—2 часа в 0,2%-
нын раствор красителя Кумасси (ярко-голубой G-250) в смеси
метанол — вода — уксусная кислота (10:30:1). Избыток краски
отмывают этой же смесью растворителей, оставляя ее на
ночь.Применяют также краситель Амидо-Шварц 10*В в 0,5%-ной
концентрации: навеску растворяют в метаноле с добавлением
волы и ледяной уксусной кислоты (1:1:0,1). Окрашивание
проводят в течение нескольких минут. Гель отмывают в тече¬
ние 4—5 часов до прозрачного раствора.Отмытые электрофореграммы фотографируют в проходящем
свете под слоем растворителя или же зарисовывают, просмат¬
ривая гель (под слоем растворителя в пробирке) через мато¬
вое стекло, помещенное поверх 9лекірической лампочки. Ин¬
тенсивность окраски различных зон измеряют денситометром
или краситель извлекают и измеряют при помощи аппарата
ФЭК-М. Извлекаемые трис-глициновым буфером (pH 8,3) белки
используют для выделения изоферментов (стр. 80).312
Определение триптофана
в семенахМодификация метода количественного определения трипто¬
фана основана на получении цветной реакции триптофана с
п-днметиламинобензальдегидом. В сильнокислой среде в при¬
сутствии нитрата образуется голубая окраска, интенсивность
которой измеряется на фотоэлектроколориметре. Триптофан
определяют в крахмалистых, белковых и масличных семенах
без выделения препарата белка (А. И. Ермаков, Н. П. Ярош) *.Реактивы и аппаратура: I) 2,5%-ныЛ раствор п-днметиламинобензальде*
гида в 10%-ноА HCI (раствор хранят в холодильнике в течение двух не¬
дель); 2) 1%-ный раствор нитрата нагрия — NaNO»; 3) 4%-ный раствор
пищевой желатины в 25%-ном КОН (сначала готовят 25%-ный раствор
КОН —плоти. 1,23 при 15е); 4) соляная кислота (плотн. 1,19); 5) фото¬
электроколориметр ФЭК-МХод анализа. Подготовка к анализу. Среднюю пробу
семян размельчают до крупного помола. После перемешивания
отбирают Зги измельчают до тонкого помола в мельнице типа
«Пируэт». На торсионных весах берут навеску 200 мг муки
крахмалисто-белковых семян или 100 мг маслично-белковых се¬
мян (подсолнечника, сон, арахиса, кунжута и т. д.). Предва¬
рительно высушивать пробы в термостате не рекомендуется.
Определение следует вести в свежеразмолотом материале. Прн
анализе семян с пигментированной оболочкой последнюю сле¬
дует удалить, так как дополнительная окраска мешает опреде¬
лению. В ряде случаев приходится удалять не только плодо¬
вую, но и семенную оболочки (у гречихи). Вместо голубой в ре¬
акционной смеси иногда получается зеленая окраска за счет
наличня в зерне желтых пигментов, которые можно удалить,
промывая муку н-бутанолом или петролейным эфиром. Навеску
пересыпают в коническую колбу на 100 см3 и равномерно сма¬
чивают 2 см3 дистиллированной воды, после чего прибавляют
по 1 см3 25%-ного раствора КОН с желатиной. В случае об¬
разования комочков смесь размешивают стеклянной палочкой
(палочку с приставшими к ее концу частицами протирают ку¬
сочками папиросной бумаги, которую опускают в колбу). За¬
тем колбы закрывают резиновыми пробками и ставят в термо¬
стат для гидролиза на 18—20 часов (на ночь) при 40°.Проведение цветной реакции. Утром в каждую кол¬
бочку прибавляют 0,5 см3 2,5%-ного п-днметиламинобензаль-
дегида в 10%-ной НС1, 0,5 см3 1°/о-иого раствора NaNOa и
28 см3 концентрированной HCI (плотн. 1,19), перемешивают
содержимое путем вращения, закрывают пробками и ставят в
термостат при 25° на 1,5 часа для крахмалисто-белковых семян•	А. И. Ермаков. Н. П. Ярош. Бюллетень Всесоюзного ин-та расте¬
ниеводства, вып. 14, 1969, стр. 31—35.313
її на 3 часа — для маслично-белковых семян. После экспозиции
реакционную смесь сине-голубого цвета доводят дистиллиро¬
ванной водой до объема 100 см3 (прибавляют 68 см3 воды)
или до 50 см3 (прибавляют 18 см3 воды) при низком содер-
жании триптофана в объекте исследования. В разбавленной
реакционной смеси развитие окраски прекращается.Колориметрирование. Раствор фильтруют через обез-
золенный бумажный фильтр «среднепористый», используя во¬
ронку диаметром 5 см. Первые порции фильтрата удаляют.
Прозрачный фильтрат используют для определения оптической
плотности окрашенного раствора. Определение ведут на фото-
электрокол ори метре при красном светофильтре, используя кю¬
веты с длиной оптического пути 10 мм. Эталоном для сравне¬
ния при колориметровании служит раствор чистого трипто¬
фана. Для определения концентрации триптофана удобнее со¬
ставить калибровочные кривые для кювет с различной длиной
оптического пути (10 и 20 мм).Составление калибровочной кривой. На анали¬
тических весах берут навеску 25 мг химически чистого трипто¬
фана в мерную колбу на 25 см3 и после растворения в 20 см3
воды, к которой прибавляют 1 см3 0,1 и. КОН или NaOH, до¬
водят спиртом до метки. Затем в ряд конических колб на
100 см3 прибавляют по 2 см* дистиллированной воды, 1 см3
25%-ного КОН с желатиной и другие реактивы в такой после¬
довательности: 1) 0,5 см3 2,5%-ного раствора п-диметиламиио-
бензальдегида; 2) 0,5 см3 1%-ного раствора NaNOa; 3) 28 см3
концентрированной HCI. После этого прибавляют растворы
триптофана по 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 см3, в которых содержится
соответственно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 мг триптофана. Для разви¬
тия голубого окрашивания оставляют на 60 мннут при 25°.
Затем объем доводят водой до 100 см3 (используя бюретку),
раствор фильтруют и определяют оптическую плотность на
ФЭК-М при красном светофильтре. Для построения калибро¬
вочного графика на оси абсцисс откладывают количество трип¬
тофана (в мг на 1 елі3), а на оси ординат — оптическую плот¬
ность растворов.Пример вычисления. По калибровочной кривой найдена кон¬
центрация триптофана (в мг на I сж*) 0.0042. Общий объем 100 см\ На¬
веска муки из обрушенного зерна проса 0.2 г. Количество триптофана (дс)
вычисляют по формуле:0,0042-100*100х =		= 210 мг ка 100 г воздушно-сухого вещества.Зная влажность последнего, пересчитывают на постоянно сухое вещество.Содержание триптофана можно также выразить в процентах азота
триптофана от общего азота зерна (муки) ила в процентах от сырого
белка Так. содержание сырого белка в нашем образце —14%, следова¬
тельно концентрация триптофана в сыром белке (ж) будет:— (0,210*100). 14 = 1,5%.814
Определение триптофана
в вегетативных частях
растенийМодификация метода определения триптофана Лоренцо-
Андрю и Франдзена* основана на образовании окрашенных
в желтый цвет продуктов реакции іриптофана с азотной кисло¬
той в присутствии серной кислоты. Интенсивность окраски из¬
меряется на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре.
Метод пригоден для массовой оценки кормовых растений.Реактивы и аппаратура: I) сульфонитратная смесь [895 см1 дистиллиро¬
ванной воды+ 292,5 см* HNOa (плоти. 1,4) + 812,5 с я* HjSO« (її лоти. 1,84)];2)	стандартный раствор триптофана (берут навеску 50 мг и растворяют
в 50 см* воды; концентрация І яг в I см* воды); 3) широкогорлые колбы на
100 см*.Ход анализа. Отвешивают в конические колбы на 100 см9
по 1 г хорошо измельченного растительного материала. Затем
приливают 10 см3 дистиллированной воды и 40 см3 сульфонит-
ратной смеси. После равномерного смачивания навески колбы
нагревают на хорошо кипящей водяной бане в течение часа.
В первые 2—3 минуты колбы интенсивно встряхивают, а за¬
тем это делают время от времени в течение часа. Затем колбы
вынимают и оставляют стоять в течение ночи в холодном месте
(при 10—15° или ниже). Содержимое колбы фильтруют через
плотный обеззоленный фильтр. Фильтрат собирают в мерные
колбы на 50 см\ Осадок промывают контрольным (холо¬
стым) раствором, который готовят, смешивая воду и сульфо-
нитратную смесь в соотношении 1:4 и нагревая в течение часа
на кипящей водяной бане одновременно с опытными пробами
(примерно 200 смг раствора на 12 колб с опытными образ¬
цами).Жидкость в мерных колбах на 50 см3 доводят до метки
этим раствором и после перемешивания определяют интенсив¬
ность желтой окраски на СФ-4А при длине волны 440 нм или
на ФЭК-М (синий светофильтр), в кювете 10 мм, сравнивая с
контрольным раствором.При составлении калибровочной кривой в конические колбы
на 50 см3 приливают стандартный раствор триптофана (в ко¬
личествах 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 гм3). К взятым объемам раст¬
вора триптофана прибавляют столько дистиллированной воды,
чтобы обшнй объем в колбах составлял 10 см3. Затем в каж¬
дую колбу приливают 40 см3 сульфонитратной смеси. Таким об¬
разом, концентрация триптофана в колбах (в мг на 1 см9) со¬
ставит: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12.*	A. Locenio Andrcv, К. F г л n s с n. Acta agriculture Scandina*
Vice, X, 2—З, I960, pp. 135-152.315
Интенсивность окрашенных растворов на СФ*4 или ФЭК-М
просматривают через 1—2 часа после приливання реактив (без
нагревания). На основе полученных данных строят калибровоч¬
ный график.Пример вычисления. Взята навеска листьев ячменя I ±0.001 г.
Общий объем гкдролизата — 50 см\ Показания ФЭК-М — 0,121. Это соот¬
ветствует концентрации триптофана 0,0825 мг на I см\ Содержание трипто¬
фана (х) в мг на 100 г будет:0,0825-50*100
х =	j		 412.Результаты выражают в процентах азота триптофана от общего азота
листьев или в процентах от сырого белка.Определение лизина в семенахПринцип метода основан на реакции свободных 2-NHs
групп лизина белков с нингидриновым реактивом. В качестве
раствора для сравнения (стандарта) используют раствор лей¬
цина, который содержит одну аминогруппу и соответствует ли*
зину, имеющему свободные 2-NHj группы в белке. Ниже при¬
ведена пропись метода А. С. Мусийко и А. Ф. Сысоева* с не¬
которыми изменениями.Реактивы и аппаратура: 1) буферный раствор (30 г муравьино¬
кислого натрия растворяют в 60 ел1 воды, добавляют 10 см* 86—88%-ной
муравьиной кислоты н доводят до 100 с*1); 2) нингидрниовый реактив (в
темную склянку с притертой пробкой отвешивают 1 г химически чистого ник-
гндрина + I г хлористого кадмия — CdCb-2,5H»0, добавляют 25 см3 буфера
и 75 см3 этиленглнколя; реактив перед употреблением выдерживают в тече¬
ние суток при комнаткой температуре): 3) 4- и 2%-ные растворы безводного
NasCOs; 4) стандартные растворы леГшина 100, 200 и 300 мкг в 1 см3
(отвешивают в мерные колбы на 100 см1 точные навески 10; 20 и 30 мг
сухого чистого лейцина и растворяют в 20%-ном спирте); 5) ФЭК-М;
6) баня водяная большой теплоемкости с крышкой и автоматической регу¬
лировкой температуры (если такой бани нет, то используют большую алю¬
миниевую кастрюлю 10—12 дм3, отепляют ее стенки и крышку асбесто¬
глиняной смесью и налаживают коитактный термометр для регулировки
температуры; объем воды должен быть на уровне жидкости в пробирках);
8) штативы для пробирок, алюминиевые.'Ход анализа. В пробирки прибавляют около 200—250 мг
измельченного химического стекла, затем в каждую отвеши¬
вают по 30 мг тонко измельченной муки пшеницы, ячменя и др.
Для каждого образца берут по 2 навески, которые в пробирки
пересыпают через маленькую воронку с длинной трубкой. Да¬
лее приливают 1 смг 2 % -ного раствора Na*COa и после пере¬
мешивания со стеклянным порошком ставят в штатив для про¬
бирок и нагревают в течение 10 минут на водяной бане при
80° (предварительно нагретой), в которой температура автомକ	А. С. Мусийко, А. Ф. Сысоев. Доклады ВЛСХНИЛ. 6, 1970, стр.
10-12.316
тически регулируется. Затем содержимое очень тщательно пе¬
ремешивают стеклянной палочкой до гомогенного состояния.
После этого к содержимому пробирки добавляют 2 см3 нингид-
рннового реактива, соблюдая последовательность, и после пере¬
мешивания нагревают в той же водяной бане в течение 30 мн¬
нут. Затем пробирки охлаждают, погружая их вместе со шта¬
тивом в сосуд с водой. В охлажденные пробирки добавляют5	см3 95%-ного спирта, взбалтывают, фильтруют через бумаж¬
ный фильтр через стеклянные воронки с диаметром 4—4,5 см.Экстинцию измеряют на ФЭК-М при зеленом светофильтре,
используя кювету 3 мм. Последовательность измерений образ¬
цов сохраняют такой же, как и при выполнении красочной ре¬
акции. При появлении сильной интенсивной окраски раствор
разбавляют спиртом и это учитывают при вычислении резуль¬
татов.Количество лизина в опытном образце рассчитывают по ка¬
либровочной кривой, которую строят ежедневно по трем стан¬
дартным растворам, содержащим 100; 200 и 300 мкг на 1 см3
лейцина. Для каждого стандарта берут по 3 пробирки и в каж¬
дую приливают 0,5 см3 стандартного раствора, 0,5 см3 4%-ного
раствора Ыа»СОз, 2 см3 нингидрннового реактива и после пере¬
мешивания нагревают на водяной бане с опытными пробир¬
ками. Далее поступают точно также, как описано выше для
опытных растворов. Результаты определения экстинцни откла¬
дывают по оси ординат, а содержание лейцина, соответствую¬
щее экстинции,— по оси абсцисс.Если же проводят анализы образцов, относящихся к одной
и той же культуре, то содержание лизина можно вычислить,
не составляя кривой, а рассчитать по одному из трех стандар¬
тов, причем стандартный раствор подбирают так, чтобы он не
отличался резко от опытного раствора. Тогда вычисление про¬
водят так, как указано ниже.Пример вычисления. Для сравнения взят стандартный раствор,
содержащий 0.20 мг в I см* лейцина, а в 0,5 cjk3 — 0,10 мг. Средняя экстин-
цня для стандартного раствора была равна 0,285, а для опытного 0.314. Так
как все процедуры с опытными и стандартными пробами проводили а оди¬
наковых условиях, то содержание аминокислоты (лейцина) в навеске уз¬
нают из уравнения:х - 0,10 х 0,314:0,22$ - 0.110.а в 1 г навески (0,110 X 1000) : 30 «3,66 мг. В 100 г навески —366 мг
(ка воздушно сухое вещество). Эту цифру надо увеличить на 11% для
пересчета на лизин и пересчитать на сухое вещество (после того как будет
определено содержание воды).Кроме того, вносят поправку на содержание аминного азота в зерне,
который определяют одним из точных методов (стр. 285) и делают пересчет
на лизин. Полученную величину вычитают иэ результатов определения ли¬
зина в зерне (муке).Обычно вызревшие семена пшеницы и некоторых других культур, кото¬
рые прошли послеуборочное дозревание, содержат 10 мг аминного азота317
на 100 г м) кн. Однлко некоторые обра.шч содержат 30 мг и большее количество
амннного азота. Например, в зерне ячменя найдено N свободных аминокислот
0,01% (или 10 мг на 100 г). При пересчете на лизин это будет составлять
52 мг. Следовательно, если лнзнна найдено в муке без учета амннного азота
405 мг. то содержание лизина в составе белков будет равно 353 мг на
100 с- (405—52).Результаты определения лнзнна выражают на сухую массу (вес) семян
в миллиграммах и в процентах на сырой белок семян.Для систематической проверки воспроизводимости резуль¬
татов определения лизина проводят в одном и том же образце
семян, которые служат своеобразным контролем. Навески муки
этого образца берут ежедневно на серию в 10—12 образцов.
Нормой является 24 определения в день.Следует отметить, что для получения воспроизводимых ре¬
зультатов семена должны быть размолоты до гомогенного со-
стояния, а взвешивание надо проводить на чувствительных (тор¬
сионных) весах.Применение стеклянного порошка и растирание перед при¬
бавлением реактива иа аминокислоты является обязательным,
так как способствует лучшему воспроизведению результатов.
Точность определения и совпадение результатов по параллель¬
ным пробам зависят также от условий нагрева и pH буферного
раствора, при котором развивается максимальная интенсив¬
ность окраски. Метол применим для массовых определений в
процессе отбора и при оценке сортов. В последнем случае не¬
обходим выборочный контроль методом колоночной хроматогра¬
фии с соблюдением оптимальных условий при гидролизе наве¬
сок *.*	В. Ф. Гол ей ко о. В. М. Гильэин. Труды ВНИИЗ, 71, 4.1, 1971.
В. Н. Кои а рев, Ю. В. Перуанский. Ссльскохоз. биология, VI, 4, 1971.
Определение веществ,
содержащих фосфорГЛАВА XI	UAU Серу*Особенности соединений,
содержащих фосфор или серу,
и методов их определенияФосфорсодержащие соединения растений широко распрост¬
ранены и весьма разнообразны. Их особенность состоит в том,
что фосфор содержится в них исключительно в наиболее окис¬
ленном состоянии и главным образом в форме фосфорнокислых
эфиров. Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, фосфо¬
липидов и других веществ. В форме фитина он откладывается
в качестве резервного вещества.’ Особая роль в различных
звеньях обмена веществ принадлежит накопителям энергии —
аденозин-три и ди-фосфатам (АТФ и АДФ), которые являются
так называемыми макроэргическими соединениями. Образова¬
ние последних осуществляется в процессе окислительного фос-
форилирования. Фосфорная кислота является постоянным ком¬
понентом ряда окислительных ферментов. В форме минераль¬
ных солеи, как правило, фосфор находится в небольших кон¬
центрациях. Однако в вегетативных органах п незрелых семенах
они обычно составляют значительную долю от общего фосфора.
В зрелых семенах растений около 90% фосфора находится в
виде органических соединений, причем ббльшая часть в запас¬
ной форме (инозитфосфаты). Содержание фосфора положи¬
тельно коррелирует с концентрацией сырого белка в растениях.
Установлено, что повышенное соотношение фосфора к азоту в
питательной среде способствует увеличению содержанию бел¬
ков и доли белков от суммы азотистых соединений.Серусолержащие вещества растений также весьма разно¬
образны. Наиболее высокое накопление серусодержащих соеди¬
нении происходит в зрелых семенах и, как правило, в отличие
от фосфора — в восстановленной форме. Сера и фосфор обла¬
дают особыми преимуществами, которые позволяют им в орга¬
низмах выполнять функции переноса групп и энергии. Сера,
так же как и фосфор, образует богатые энергией соединения.
Сера образует 3 типа макроэргическнх комплексов: ацнло-
вые эфиры тиолов (ацетйл-КоА); смешанные ангидриды фос¬
форной и серной кислот (аденозннфосфорилсульфат) в реак¬319
циях сульфирования; S-аденознл метионин в реакциях метили*
рования.Сера и фосфор способны к образованию различных типов
связей, для которых характерна меньшая прочность и неста¬
бильность, облегчающая обмен.Методы анализа фосфор* или серусодержащих соединений
основаны на их выделении и разделении с последующим опре*
делением этих элементов или на специальных свойствах отдель¬
ных их соединений.Последовательный
ход определения
фосфорсодержащих соединенийПринцип метода основан на последовательном выделении
с помощью различных растворителей фосфорсодержащих вс*
ществ, гидролизе отдельных групп фосфорных соединений и
определении содержания фосфора по одному из колориметри¬
ческих методов.Ниже приведена пропись для выделения и определения раз¬
личных форм фосфора: кнслоторастворимого, фосфолипидов и
нуклеиновых кислот. Ход определения различных фракций кис¬
лоторастворимого фосфора и фосфолипидов приводится в раз*
работке В. П. Ниловой* с некоторыми изменениями, приня¬
тыми в биохимической лаборатории ВИР. Для определения ну¬
клеиновых кислот по фосфору приводится модификация метода
Шмидта и Тангаузера (В. Г. Конарев. С. Л. Тюте рев, 1970).Реактивы и аппаратура: 1) 1%-ныА, 5%-мыА и 7%-ный растворы три*
хлоруксусной кислоты (ТХУ); 2) 0,5 и., 2 н. и 6 я. растворы соляной кис¬
лоты; 3) 5%-нач хлорная кислота; 4) 0.5 н. раствор КОН (или NaOH);5)	магнезиальная смссь (растворяют 55 г хлористого магния и 100 г хло¬
ристого аммония в 500 см* воды, добавляют 100 сл*1 25%-ного аммиака и до¬
водят объем до 1 дм1-, полученный раствор взбалтывают и фильтруют);6)	реактивы, необходимые для определения фосфора по методу Фиске и
Суббароу или его модификации (стр. 409); 7) центрифуга с охлаждением;8)	фотоэлехтроколоримстр ФЭК-М.Определение кислоторастворимых фосфорных соединений.Ход анализа. Берут 4 параллельные навески тонко измельчен¬
ного в ступке растительного материала (1 г крахмалисто-бел-
ковыхсемян или0,5 г масличных семян) и помещают в центри¬
фужные пробирки на 50 см3, прибавляют 15 см3 охлажденной
7%-ной ТХУ, закрывают плотно пробками и помещают в ме¬
таллическую баню или пластмассовый сосуд со льдом. Содер¬
жимое пробирок взбалтывают на качалке в течение 20 минут.*	В. П. Нилова. Тр. ВНИИ защиты растений, выи. 24, № 2, 1964,
стр. 71-80.320
Чатем центрифугируют при 4000 об!мин на центрифуге с охлаж¬
дением о течение 10 минут. Центрнфугат сливают в мерную
оібу на 50 см3 через обеззоленный фильтр. К остатку вновь
приливают 15 см* охлажденной 7%-ной ТХУ и ход извлечения
повторяют, как указано выше. Остаток вначале промывают
охлажденной 1%-ной ТХУ, а затем дистиллированной водой
н переносят без потерь на фильтр. Общий объем кислотного
экстракта составляет 50 см3. После извлечения кислотораство¬
римого фосфора остаток на фильтре промывают этиловым спир¬
том» а фильтрат собирают и в дальнейшем присоединяют к ли-
ииднон фракции. Фильтры с остатком можно оставить для под¬
сушивания при комнатной темпьратуре до утра.В состав кислоторастворимой фракции входят неорганиче¬
ские фосфаты, легко гидролизирующиеся фосфорсодержащие
органические соединения (карбокснлфосфаты, лабильные пиро-
фосфаты, аминофосфаты, глюкозо-1-фосфат) и устойчивые эфи¬
ры фосфорной кислоты (инознтгексафосфаты, гексозо-2-фосфат,
гсксозо-6-фосфат, триозофосфаты и др.).Определение суммарного кислоторастворимого фосфора.
В колбу Кьельдаля на 50 смР вносят 10 cjk3 кислотного экстрак¬
та и сжигают с 3 см3 HsSO< и 2 см3 НС104 (или со смесью
H2SO4 и HgOs). По окончании сжигания содержимое переносят
в мерную колбочку на 25 см3 и доводят дистиллированной во¬
дой до метки. Для определения фосфора берут 2 см3 получен¬
ного раствора в мерную колбочку на 10 см3, нейтрализуют по
фенол фта леи ну, добавляют 1,6 cjk3 2,5% -ного раствора молнб*
деновокислого аммония, 0,4 cjk3 0,2%-ного раствора эйконо-
гена и объем доводят до метки. Через 30 минут раствор коло-
риметрируют на ФЭК*М при красном светофильтре, используя
кювету 5 мм. Количество фосфора в пробе находят по калибро¬
вочной кривой, составленной так, как указано на стр. 411.Пример вычисления. Навеске муки I г; общий объем экстракта
50 ск*. Для ежкгаиия взято 10 см1 экстракта. После сжигания объем дове¬
дем до 25 см3. На определение фосфора нз указанного объема было взято
2 см*. По калибровочвой кривой во взятом объеме (2 cjk1) найдено 0,062 до
фосфора. Содержание общего кислоторастворимого фосфора будет:0,062-50.25 100 	дг =	17ПГ5	“387,5 мг на 100 г.Для пересчета результатов на сухое вещество в двух параллельных
пробах анализируемого образца определяют содержание влаги.Определение неорганического фосфора. Из исходного кис¬
лотного экстракта берут 5 см3 в мерную колбочку иа 10 см3,
добавляют необходимые для определения фосфора реактивы,
как указано выше, и через 30 минут растворы колориметри-
руют. Необходимо отметить, что прн определении минерального
фэсфора в экстракте из масличных семян после прибавления
к пробе молибденовокислого аммония и эйкоиогена, помимо ro¬
ll Зімі м 401	321
лубой окраски, образуется легкая, трудно оседающая муть.
В этом случае необходимо ставить контроль (вытяжка + реак¬
тивы без добавления эйконогена или амидола) либо перевести
синюю окраску восстановленного фосфорно-молибденового
комплекса в н-бутиловый спирт (10 см*) и в этом растворителе
по интенсивности окраски определить фосфор.Пример вычисления. Навеска растительного материала 1 г. Об¬
щий объем полученного экстракта 50 из которого взято 5 см* для
определения Фосфора. По калибровочной кривой найдено в пробе (5 с«*)
0,044 мг фосфора. Содержание неорганического фосфора (х) будет:0,044-50 100	1ЛЛх =	17^	= 44 мг на 100 г.Определение фосфора легкогидролизируемых соединений.
Берут 5 см3 исходного кислотного экстракта в коническую кол*
бочку на 50 ся\ добавляют 5 см3 2 н. раствора НС1, закры¬
вают пробками с обратным воздушным холодильником и по¬
мещают в хорошо кипящую водяную баню на 7 минут. По исте¬
чении указанного времени колбы быстро охлаждают в ледяной
воде. Отбирают 5 см3 из полученного гидролизата в мерные
колбочки на 10 сж3, прибавляют реактивы, как указано яа
стр. 411, и определяют фосфор. Количество фосфора в пробе
(5 см3) гидролизата находят по калибровочной кривой.Пример вычисления Навеска муки 1 г. Общий объем экстракта
50 см}. На гидролиз взято 5 см!*, к этому объему прибавлено 5 см* 2 и. HCL
Таким образом, обший объем гидролнзата 10 см*. На определение фосфора
взято 5 см* гидролнзата. По калибровочной кривой в этом объеме найдено
0.030 мг фосфора. Содержание фосфора 7-мннутиого гидролиза (х) равно:0,027 50 10.100 _
х =	ї^-j	= 54 мг на 100 г.Разность между фосфором 7-минутного гидролиза и неорга¬
ническим фосфором будет соответствовать фосфору легкогид¬
ролизируемых соединений (лабильному фосфору), в состав кото¬
рого входят ди- и трифосфаты, кокарбоксилаза, глюкозо-1-фос¬
фат. Эти формы фосфора в зрелых семенах по сравнению с
незрелыми находятся в очень малых количествах. Количество
лабильных форм фосфорных соединений возрастает при про¬
растании семян. Разность между общим кислоторастворимым
фосфором и фосфором 7-минутного гидролиза соответствует
фосфору устойчивых эфиров. В зрелых семенах это будет глав¬
ным образом фитин. Разность между общим кислотораствори¬
мым фосфором и неорганическим фосфором соответствует орга¬
ническому фосфору, растворимому в кислотах.Определение фосфора липидов. Остаток после кислотной
экстракции и промывания спиртом* помещают вместе с филь-•	Во избежание потерь РНК в спирт добавляют ацетат натрия или калия
(до насыщения).322
«ом в специальную металлическую сеточку или пористую уко-
очен ну к> пробирку, подвешенную в коническую колбу на
Р00 сМз с широким горлом. В колбу наливают 20 см* смеси
пирта с эфиром (1:1) и экстрагируют в течение трех часов
на кипящей водяной бане с обратным холодильником. После
этого спиртово-эфирный экстракт переливают в колбу Кьель¬
даля на 50 см\ куда присоединяют и спиртовой фильтрат после
промывки остатка от кислотной экстракции. Растворитель
(спирт + эфир) удаляют. После спиртово-эфирного извлечения
в коническую колбу приливают 20 см3 хлороформа и экстрак¬
цию продолжают еще в течение трех часов на кипящей водяной
бане. Хлороформенный экстракт переносят в ту же колбу
Кьельдаля и растворитель отгоняют. Суммарный липидный ос¬
таток после отгона растворителей осторожно сжигают в 6 см3
смеси серной и хлорной кислот (4 и 2 см*), так как вначале
содержимое колбы сильно пенится. После сжигания бесцветное
содержимое переносят в мерную колбу на 25 см3 и доводят
объем до метки. Из полученного раствора берут 5 см* в мер*
ную колбу на 10 см* и после проведения красочной реакции
с молибденовокислыми аммонием и эйконогеном колориметри-
руют (стр. 411). Количество фосфора в пробе находят по ка¬
либровочной кривой.Извлечение фосфолипидов можно вести другим путем. После
удаления кислоторастворимого фосфора остаток навески в цен¬
трифужной пробирке заливают 5 см* этанола, тщательно рас¬
тирают, добавляют 15 см3 эфирно-спиртовой смеси (1:1) и ки¬
пятят на водяной бане 10 минут с обратным холодильником.
Затем охлаждают, центрифугируют в течение 5—10 минут при3	тыс. обімин. Центрифугат переносят в колбу Кьельдаля на
50 сл3. В центрифужную пробирку вновь приливают 5 см3 эти¬
лового спирта, растирают, затем добавляют 15 смг хлороформа
и кипятят на водяной бане в течение 30 минут. Вновь центри¬
фугируют 15 минут. Центрифугат переносят в ту же колбу
Кьельдаля и растворитель удаляют. Остаток осторожно мине¬
рализуют в смеси серной и хлорной кислот. После сжигания
содержимое переносят в мерную колбу на 25 см3 и объем до¬
водят до метки. В дальнейшем поступают так, как указано
выше.Пример вычисления. Навеска семян 1 г. Общий объем после
сжигания липидного остатка 25 см*. Из этого объема взято 5 см* для опре¬
деления фосфора. По калибровочной кривой найдено 0,039 мг фосфора.
Количество фосфора (х) будет:0.039-25 100
х —	ртг	= 19,5 мі на 100 $.Определение нуклеиновых кислот по фосфору. Определение
суммы нуклеиновых кислот. Остатки двух параллельных наве¬
сок после последовательного извлечения кислоторастворимого11*823
и липидного фосфора заливают в центрифужных пробирках
10 см* 0,5 и. хлорной кислоты, растирают стеклянной палочкой
и экстрагируют в течение 20 минут при 70° на водяной баке.
Затем центрифугируют и надосадочную жидкость сливают ft
мерную колбу на 25 см*. Экстракцию повторяют 2 раза, прц.
ливая ло 7 сл/э 0,5 н. раствора хлорной кислоты. Объем полу*
ченного экстракта (центрифугата) доводят до метки и беру*
10 см3 экстракта для минерализации. После сжигания бесцвет¬
ный экстракт переносят в мерную колбу на 25 см3 и доводят
до метки. Отсюда берут 5 см3 раствора в мерную колбочку:
на 10 см3 и после прибавления соответствующих реактивов ко*
лориметрируют на ФЭК-М. Количество фосфора в пробе, взя*
той для колориметрирования (5 см3), находят по калибровоч¬
ной кривой. Затем высчитывают общее количество фосфора в
объеме 25 см3 (Р0).В полученном экстракте, помимо фосфора нуклеиновых
кислот (Я**) содержится минеральный (остаточный) фосфор
(Рман). Обычно он содержится в малых количествах, а иногда
совсем отсутствует.Остаточный минеральный фосфор определяют осаждениек
магнезиальной смесью. Для этого к 10 аи3 экстракта (центри*
фугата), полученного при обработке навески хлорной кислотой»
прибавляют 10 см* магнезиальной смеси, перемешивают и ней*
трализуют 10%-ным раствором аммиака в присутствии фенол¬
фталеина. Смесь оставляют на 20 мннут, затем центрифугируют
при 4 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок
промывают дважды 2 см3 воды с 2—3 каплями магнезиальной
смеси. Затем осадок магниевых солей растворяют в 1 см5 0,1 н,
раствора НСІ и переносят 4 см3 дистиллированной воды в мер*
ную колбочку иа 10 см3. После добавления необходимых реак¬
тивов объем доводят до метки, определяют фосфор на ФЭК-М
и содержание минерального (остаточного) фосфора рассчиты¬
вают на весь объем экстракта (25 см3). Количество фосфора
нуклеиновых кислот (Рнк) определяют по разности между фос¬
фором экстракта {Р0) и минеральным остаточным фосфоромЛ»).Пример вычисления. Навеска семян 1 г. Общий объем экстракта,
полученного после обработки остатка хлорной кислотой, —25 см?. На сжи¬
гание взято 10 см* экстракта; после сжигания содержимое было перенесено
в мерную колбу на 25 см* н объем доведен до метки. Отсюда взято 5 см}
раствора, в котором по калибровочной кривой найдено 0.046 яг’фосфора.
При условии, что в экстракте не найдено остаточного минерального фос¬
фора,—количество фосфора нуклеиновых кислот (х) будет:25.25-0,048.100 _ я
х =	ГГПГЗ	= • мг на *•Определение фосфора ДНК. Остатки двух других парал¬
лельных навесок после извлечения кислоторастворимого и ли-т
яного фосфора заливают 20—30 см* 0,8 я. NaOH (или КОН),
Стельно перемешивают и выдерживают в термостате 16—
Tg цасов при 37°. Затем центрифугируют при 4 тыс. обімин
течение 15 минут. Вся дальнейшая работа (осаждение и цен-
J„„фугирование) проводится на холоде. Берут 10—15 см3 цен¬
трифуга™ в центрифужные пробирки и охлаждают. В охлаж¬
денный центрифугат по каплям прибавляют 6 и. НС1 до pH
g 6—6,8 при постоянном помешивании. После нейтрализации
приливают равный объем 6% -ной ТХУ для осаждения
белков и ДНК. Пробирки с содержимым выдерживают на
холоде в течение 20 минут и затем центрифугируют при 4 тыс.
обімин в течение 20 минут до просветления жидкости. Осадок
в пробирке промывают 10 см3 смеси, состоящей из 5%^ной ТХУ
и 0,5 н. НСІ (1:1), а затем вторично такой же смесью, но в
5-кратном разбавлении водой. Отмытый осадок дважды по
10 см3 экстрагируют 5%-ной ТХУ в течение 20 минут при 90е.
После каждой экстракции пробирки центрифугируют 10 минут,
надосадочную жидкость объединяют и сжигают в колбе Кьель¬
даля, как обычно. После этого содержимое колбы Кьельдаля
переносят в мерную колбочку на 25 см* и доводят водой до
метки. Из этого объема берут 5 см* для колориметрического
определения фосфора.Пример вычисления. Навеска 1 г. Общий объем экстоакта 25см\
Для колориметрического определения фосфора взят объем 5 см\ в котором
найдеио 0,041 мг фосфора. Содержание фосфора ДНК (х) будет:0,041 25-100 _ „
jf =		= 20,5 мг на 100 г.Количество фосфора рибонуклеиновых кислот рассчитывают по разности
между фосфором суммы нуклеиновых кислот и фосфором дезоксирибону¬
клеиновых кислот.Спектрофотометрическое
определение РНК и ДНКМетод определения нуклеиновых кислот по Волгину и Пар-
тье дает возможность определить РНК и ДНК в одной навеске.
Преимуществом этой модификации является сокращение вре¬
мени щелочкой экстракции по сравнению с методом Шмидта и
Тангаузера и другими его модификациями, что значительно
ускоряет проведение анализа в целом. Определение фосфора
РНК и ДНК ведется на спектрофотометре при длине волны
270 и 290 нм в свежем или фиксированном материале. Фикса¬
цию материала можно проводить лиофилизацией или горячим
96%-ным этанолом,г£?активы и аппаратура: 1) 0.5 и. растаор КОН или NaOH; 2) 5%-ная
и 97%-иая хлорная кислота; 3) спектрофотометр СФ-4 (см. рис. 9).на
Ход анализа. Предварительное удаление пигментов» кисло,
торастворимого и липидного фосфора является непременным
условием. В том случае, когда необходимо определить только
фосфор РНК и ДНК, навеску семян или зеленого фиксирован*
ного материала, тщательно растертого, можно обработать рас*
творителями в следующей последовательности (по Е. П. Не¬
чаевой*): 96%-ный спирт и 85%-ный ацетон (1:1), серный
эфир, 85%-ный ацетон, настаивание на холоде с холодной 5%.
ной хлорной кислотой в течение 20 минут, отмывание от кис»
лоты спиртом. Затем обработка смесью спирта с эфиром (1:1)(
серным эфиром, 96%-ным этиловым спиртом. Предварительную
обработку свежего материала можно проводить по описанию
О. Н. Кулаевой и Э. А. Поповой **.Остаток после извлечения кнслоторастворимого и липидного
фосфора заливают 0,5 н. раствором КОН (или NaOH) из рас*
чета 10 см3 щелочи на 100 мг остатка и выдерживают при 37*
в течение часа. Затем охлаждают и центрифугируют 15 минут
при 4 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливают и осадок
после промывания 5 см3 холодного 0,5 н. раствора КОИ отбра*
сывают. Прозрачные центрифугаты объединяют и нейтрализуют
на ледяной бане холодной 57%-ной хлорной кислотой по фе¬
нолфталеину. Затем, концентрацию раствора этой кислотой до*
водят до 5%-ного ее содержания. На холоде выпадает в осадок
ДНК, а в растворе остается РНК. Через 20 минут осадок .от*
леляют центрифугированием и 2 раза (по 5 гм3) промывают
охлажденной 5%-ной хлорной кислотой. Центрифугаты, содер¬
жащие рнбонуклеотиды, объединяют в конической колбочке на
50 гм3, закрывают обратным воздушным холодильником и гид*
ролизуют на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Затем
охлаждают и фильтруют через стеклянный фильтр № 4 или че¬
рез обеззоленный фильтр «мелкопористый». Объем прозрачного
фильтрата измеряют и используют для определения фосфора
РНК спектрофотометрически. В случае необходимости при ра¬
боте на спектрофотометре исходные растворы можно разбавить.Осадок ДНК в центрифужных пробирках заливают 5%-ной
НСЮ« и гидролизуют 30 минут на кипящей водяной бане.
После охлаждения и центрифугирования (или фильтрации)
жидкость сливают в мерную колбочку, осадок промывают не¬
большим количеством 5%-ной НСЮ«, центрифугируют и над*
осадочную жидкость присоединяют к первому центрифугату,
объем доводят до метки (или просто измеряют). Прозрачный
раствор спектрофотометрируют. В качестве контроля, против
которого измеряют оптическую плотность опытного раствора,
берут 5%-ный раствор хлорной кислоты. Оптическую плотность*	Е. П. Нечаева. Физиология растений, т. 13, 3, 1966, стр. 919—923.•• О. Н. Кул аева, Э. А. Попова. Физиология растеннА, т. 12, 3. 1965,
стр. 558-564.326
полученных опытных РастВ0Р0В измеряют при 270 нм и при^Вычисление концентрации фосфора нуклеиновых кислот (х)
производят но формуле:=мг Я, 1 ем>,Е — оптическая плотность растворов прн соответствующейГде* ^длине волны.Деление па 190 дает количество миллиграммов нуклеино¬
вого фосфора в 1 см3 опытного раствора. Для пересчета ну¬
клеинового фосфора на нуклеиновые кислоты пользуются пе-
несчетными коэффициентами. Такими коэффициентами будут:
для ДНК—10,1, для РНК—10,5, для суммы НК—10,3. Фор¬
мула для вычисления концентрации суммы нуклеиновых кислот
в исходном растворе будет:£дто — g^-10,3*** ~ Ї55 *Пример вычисления. Прн спектрофотометрированни раствора
РНК найдено £гто “ 0,964, а £змв 0,700. Объем раствора РНК составлял
50 см\ Перед определением оптической плотности он был разбавлен в 4 раза.
Навеска растительного материала 0,5 г. Количество фосфора РНК (*) будет:(0,934 - 0,700) 50.4.100 ' 4ЛЛх =	UIFT55	= 47,1 мг «• 100 «•Определение изотиоцианатов
(горчичных масел)Изотиоцианаты широко распространены среди культурных
растений семейства крестоцветных. Они содержатся в различ¬
ных органах растений, в особенности в семенах. Наличие их
в тканях придает особый резкий запах и вкус. Изотиоцианаты
известны как горчичный масла. Они являются эфирами изотио-
циановой кислоты и непредельных спиртов (аллилового, бути¬
лового и др.), а также ароматических (фенилэтилового, п-окси-
бензилового и др.). В растениях эти эфиры находятся в форме
гликозндов, которые под действием специальных ферментов
высвобождаются. Методы определения горчичных масел осно¬
ваны на выделении их в свободном виде с последующей пере¬
гонкой с водяным паром или определении в субстрате, минуя
перегонку, так как некоторые не летучи с водяным паром. Ниже
приводятся 2 модификации определения горчичных масел.Определение горчичных масел с использованием азотнокис¬
лого серебра. Метод основан на отгонке продуктов распада
в раствор 1МИ3 и AgN03 и титровании избытка последнего.Реактивы и аппаратура: 1) 0,1 и. растворы азотнокислого серебра, рода-
2!,С1по? амм0||ИЯ и хлористого натрия; 2) фтористый натрий; 3) аммиак;10%-ныД раствор азотной кислоты; 5) 10%-ный раствор желеэоаммиач-337
nux квасцов; 6) ацетатный буфер. pH 4; 7) установка для перегонки изо*
тпоцканатов (рнс. 48); 8) установка с обратным холодильником; 9) круглой
донные колбы иа 500 с*3; 10) мерные колбы и цилиндры иа 250 см\Ход анализа. Навеску 2 — 5 Jr 0,01 г свежих и мелко измель¬
ченных семян помещают в круглодонную колбу на 500 см3, вла-
вают 300 см3 водопроводной воды и добавляют 0,3 г фтористого
натрия. После хорошего перемешивания колбу закрывают проб*
кой и оставляют на час при 35° в водяной бане или термостате-
для ф<м>ментативного гидролиза. При более низкой температуре
(15—18°) ферментативный гидролиз протекает медленнее. При
серийных определениях закрытые колбы удобно оставлять на.ночь. Утром приливают 15 см3 спирта-
(чтобы не допустить вспенивания) и на¬
чинают отгон. При определении изотио-
цианатов в семенах раоса и сурепицы
рекомендуется ферментативный гидролиз
проводить в буферной среде (pH 4). Для
этого навеску растирают с ацетатным
буфером и переносят в круглодонную
колбу (объем 70 см3). Колбу оставляют
на ночь, после чего добавляют 70—80 см%
дистиллированной воды, 15 см* 96%-но*
го спирта и сразу начинают отгон.Для отгонки изотиоцианатов
колбу соединяют с прямым холодильни¬
ком резиновыми пробками или на шлифе
и отгоняют 100 гм3 дистиллята в прием¬
ную колбу на 200 см3, в которой нахо¬
дится 15 см3 раствора аммиака и 5—10	см3 0,1 и. раствора AgNO*. Конец хо¬
лодильника должен быть погружен в
раствор аммиака. После того как ото-г
гнано 50 см3, приемную колбу опускаю**'
так, чтобы конец холодильника находил¬
ся свободно над жидкостью. Отгонку
производят в течение 45—60 минут. Для
полноты реакции дистиллят с осадкой
нагревают на бане при 80—85° в тече*
ние часа. После охлаждения объем в.
мерной колбе доводят точно до 200 см*,.
хорошо взбалтывают и фильтруют. Горчичное масло улав¬
ливается аммиаком, соединяясь с ним по реакции:CaHjNCS + NH3 NHa — CSNH(CaH6).Это соединение при нагревании с азотнокислым серебром
образует сернистое серебро. К 50 см3 отгона добавляют 5 см*
10%-ной HNOj и 5 см3 раствора квасцов. Избыток AgNO* оттит*тРис. 48. Установка для
перегонки изотиоциана¬
тов.
ывают 0,1 ii. раствором NH4CNS до появления красногоїкрашивания.Вычисление содержания горчичного масла в процентах (*)
производят по формуле:(а-дг4)-0,004958.100
х ~~	н	•где: а — количество куб. сантиметров ОД н. раствора AgNO*
взятое в приемную колбу для сбора всего отгона;—	количество куб. сантиметров ОД н. раствора рода ни*
стого аммония» пошедшее на оттитровывание избытка азотнокис-
лого серебра, соответствующее его ОД н. раствору;4 — коэффициент пересчета на весь отгон;н — навеска семян.Титр раствора AgN09 определяют по раствору хлористого
натрия.Молекула аллилового масла (C3H5NCS) осаждает молекулу
сернистого серебра, поэтому 215,4 г серебра соответствуют
99,15 г аллилового масла; 1 см* ОД н. раствора азотнокислого
серебра содержит 0,01077 г серебра и соответствует 4,958 мг
аллилового масла. При определении изотиоцианатов в семенах
рапса и сурепицы следует учесть, что 1 см3 ОД и. AgN03 соот¬
ветствует 5,659 мг 3-бутенилизотиоцианата, который является
продуктом ферментативного гидролиза тиогликозидов этих
культур.Пример вычисления. Навеска семян сизой горчицы 2 г. В при¬
емную колбу взято 10 см3 0,1 н. AgNQf На титрование 50 см3 фильтрата
(из 200 см3) пошло 1,62 с** 0.1 и. раствора роданистого аммония. Следо¬
вательно, на всю навеску пошло 1,62*4 = 6,48 см* роданистого аммония.
Процент аллилового масла (х) в образце будет:(10 — 6,48)*0,004958*100 л „X —	2	" 0,87.Примечание. При определении изотиоцианатов в семенах, бедных
этими веществами, в приемную колбу можно брать 5 слР 0,1 н. AgNO«, а
для оттитровывання избытка пользоваться 0,01 н. раствором роданистого
аммония, который готовят в день определения. При расчете учитывают
разведение.Определение горчичных масел с использованием перманга¬
ната калия. Принцип метода, разработанного П. С. Половым
(1968) *, основан на окислении перманганатом калня в кислой
среде производных тиомочевины соответствующих горчичных
масел. При этом на 5 молекул изотиоцианата расходуется 4 мо¬
лекулы КМ1Ю4 или 1 см? ОД и. КМпО« соответствует 0,002 479 г
аллилизотиоцнаната (аллнлгорчичного масла).*	П. С. Попов. Бюллетень «Изобретения. Промышленные образцы. То¬варные знаки», М 33, 1968, стр. 112.829
Навеску семян 2 г пометают в колбу на 500 см\ приливают
200 см3 воды, 10 см3 этилового спирта и нагревают на водяной
бане прн 35° 30 минут для ферментного гидролиза гликозидов.
Отгон горчичных масел ведут в колбу на 200 с,и3, в которую
приливают 20 см3 15%-ного раствора аммиака. После отгона
объем приемной колбы доводят дистиллированной водой до
метки, перемешивают и отсюда берут в коническую колбу 50
для титрования. К испытуемому раствору приливают 2,5 см9
концентрированной серной кислоты (плотн. 1,84) для создания
кислой реакции среды и титруют 0,1 и. раствором КМп04 из
точной бюретки до розовой окраски, не исчезающей в течение
3—5 секунд.Количество горчичных масел в процентах (х) в пересчете
на аллилгорчичное масло вычисляют по формуле:0,002479 лім00
х~	«v«	’где: а — количество куб. сантиметров 0,1 и. раствора КМпО*
израсходованного на титрование;V	— исходный объем в куб. сантиметрах испытуемого рас*
твора (200 смг);v\ — количество испытуемого раствора (50 сл3), использо¬
ванного для титрования;« — навеска (в г).Определение
роданистых соединений
в вегетативных органахТиоцианаты (R-S-CeN), или роданиды, содержатся
в вегетативных частях растений семейства крестоцветных. Пред¬
полагают, что тиоцианаты могут быть продуктами фермента¬
тивного расщепления серусодержащих глюкозидов в растениях.
Роданиды накапливаются в листовых пластинках, черешках и
стеблях, причем у рапса этих соединений больше в стеблях,
чем в листьях. В молодых листьях кормовой капусты содер-
жится от 46 до 164 мг% на сухое вещество, у рапса 10—
50 мг%. Максимальные концентрации роданистых соединений
в растениях обнаружены в период активного роста. Скармли¬
вание растений, богатых родаиидами, вызывает угнетение роста
и снижение плодовитости животных. Снижение концентрации
роданистых соединений в растениях путем селекции является
актуальной задачей.Принцип метода (ло Джонстону и Джонсу*) заключается
в получении окрашенных продуктов при взаимодействии ноиа*	Johnston, Johns Science Food and Agruc., v. 17, N 2, 1966,
pp. 70—71.9Э0
<CN~ c азотнокислый железом я последующим колориметри*рованием мх.Рсаитивы и аппаратура: 1) 0,4 М раствор азетнокислого железа
Р /ч]0,))-9Н]0 в I н. азотной кислоте; 2) 5%-ный раствор сулемы (HcClj);3)	0.1 11 • раствор роданистого аммония; 4) фотоэлектроколориметр; б) во*
дяяая баня.Ход анализа. Навеску зеленой массы растений 5 + 0,01 г
тщательно растирают в ступке и переносят с помощью 25 см3
дистиллированной воды в конические колбы, после чего нагре¬
вают на кипящей водяной бане в течение 15 минут; содержи¬
мое охлаждают и переносят в мерную колбу на 250 см3, до¬
водят до метки дистиллированной водой и фильтруют через
плотный фильтр. К 5 см3 фильтрата приливают 5 см3 0,4 М
раствора азотнокислого железа, встряхивают и интенсивность
окраски определяют на фотоэлектроколориметре при синем све¬
тофильтре, в кювете 20 мм. При добавлении азотнокислого же¬
леза, помимо основной розовой окраски, зависящей от присут¬
ствия тиоцианатных ионов, развивается желтовато*зеленоватая
окраска, мешающая прямому определению SCN”, поэтому в ка¬
честве контроля берут 5 см3 фильтрата 4-5 см3 азотнокислого
железа +1 каплю 5%-ного раствора сулемы. Последнее веще*
ство разрушает окрашенный комплекс. Нулевую точку уста¬
навливают по раствору: 5 см3 HiO + 5 см* азотнокислого же¬
леза.Содержание SCN” (в виде NH<SCN) в пробе находят по
калибровочной кривой.Для составления калибровочной кривой готовят ра¬
бочий образцовый раствор роданистого аммония. Для этого
берут 36,2 см3 исходного 0,1 н. раствора NH<SCN в мерную
колбу на 1 дм* и доводят до метки дистиллированной водой.
Из полученного раствора вновь берут 36,2 см3 в мерную колбу
на 1 дм* и доводят объем дистиллированной водой до метки.
В 1 см* полученного раствора содержится 0,01 мг NH4SCN.
Готовят серию пробирок, в которые приливают 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5;
3; 3,5; 4; 4,5; 5 см3 раствора роданистого аммония с содержа¬
нием 0,005; 0,01; 0,015; 0,020; 0,025 и т. д. до 0,05 мг NH<SCN.
Затем в пробирки приливают дистиллированную воду с тем,
чтобы общий объем составлял 5 см* В каждую пробирку до*
бавляют 5 см9 раствора азотнокислого железа и сразу интен*
енэность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре против
раствора; 5 см3 НаО+5 см3 азотнокислого железа. На оси ор¬
динат откладывают величины оптической плотности растворов,
а на оси абсцисс — содержание NH«SCN (в 10 см3). Вычисляют
процентное содержание NH«SCN в зеленой массе. Для пере¬
счета на ион SCN** найденную величину (%) умножают иа
коэффициент 0,76.331
Количественное определение
эфирного масла в лукеОстрый вкус репчатого лука вызывается наличием эфирного
масла, состоящего из аллилпропилдисульфида (С3Н7—S——	С*Нб) . Количество масла в луке не превышает сотых долей
процента, но так влияет на вкусовые качества, что маскирует
высокую сахаристость острых сортов лука.Эфирное масло в луке находится в форме гликозида. Me-
тоды определения эфирного масла основаны на гидролизе глн~
кознда кислотой, отгонке различных сульфидов в бромную воду,
где сульфиды окисляются в сульфаты, которые затем осаждают
баритом и серу определяют весовым методом.Реактивы и аппаратура: I) бром; 2) соляная кислота (плоти. 1,19);
9} 10%-ный раствор углекислой соды; 4) 50%-ный раствор едкого натра*
5) хлористый натрий; 6) 10%-пый раствор хлористого бария; 7) установка
для перегонки летучих масел (рис. 49); 8) песчаная баня; 9) различная XV*
мическая посуда.Ход анализа. Отвешивают 250 Hz 0,01 г измельченного тон*
кнми ломтиками лука и помещают в короткогорлую колбу, при*
ливают туда же 50 см*соляной кислоты и 125 см3 воды. Колбу /
погружают в песчаную баню до уровня находящейся в ней
смеси и соединяют с холодильником. Баню предварительно на¬
гревают до 125° и поддерживают температуру 122—124° 3 часа
(с момента погружения колбы). К холодильнику присоединяют
трубку, доходящую до дна приемной колбы или цилиндра с
тубусом, содержащих 5 см8 брома и 5 см3 воды. Приемник 2
соединяют последовательно со склянками Дрекселя 3 и 4 или
с узкогорлыми банками, содержащими разбавленный раствор
соды для поглощения паров брома, прошедших через склянку а.Рис. 49. Установка для перегонки летучих масел лука
(объяснение в тексте).
После этого колбу / соединяют с парообразователем, причем11	°бка, соединенная с парообразователем, в колбе 1 не должна
доходить до уровня жидкости. Вся работа ведется в вытяжном^В^ течение трех часов в колбе 2 собирается около 100—
150 с.«3 дистиллята. Колбу / снимают с бани, охлаждают, при¬
бавляют 250 см3 води к 150 г хлористого натрия (для более
ровного кипения смесн при дальнейшем нагревании при более
высокой температуре). Нейтрализуют* смесь 50 см3 40%-ного
раствора едкого натра, соединяют опять прибор и поддержи¬
вают в течение часа температуру 135°. Через час поднимают
температуру до 145° (но не выше) и поддерживают ее до тех
мор, пока в колбе 2 наберется 400—500 см3.Холодильник ii соединительную трубку промывают н при¬
соединяют промывные воды к содержимому колбы 2; колбу
закрывают, и на этом можно прервать определение до следую¬
щего дня. На другой день в колбу кладут стеклянные бусы
или различные обрезки оплавленных стеклянных трубок и слегка
нагревают колбу под тягой, до удаления брома. Переводят рас¬
твор в литровый стакан н выпаривают на бане до тех пор,
пока раствор станет прозрачным. Отфильтровывают, промы¬
вают фильтр водой и приливают к фильтрату 10 см3 бромной
волы.Нагревают на бане до удаления избытка брома и выпари¬
вают опять до 200—250 см3. В горячий раствор прибавляют
по капле (при перемешивании) 10 см3 10%-ного раствора хло¬
ристого бария, подогревают 10 минут, затем охлаждают и ос¬
тавляют на ночь. Утром фильтруют через беззольный фильтр,
отмывают осадок от хлоридов до отрицательной реакции с 1%-
ным раствором азотнокислого серебра, сжигают, прокаливают
и остаток (сульфат бария) взвешивают. Определение ведут в
двух параллельных навесках лука.Если требуется прервать определения, то это можно сделать
после гидролиза гликозида и нейтрализации смесн. Для этого
соединяют прибор и оставляют до следующего дня. На сле¬
дующий день продолжают анализ так, как описано выше.Содержание эфирного масла у различных сортов лука ко¬
леблется от 0,010 до 0,050%.Пример вычисления. Навеска лука 250 г. Вес полученного осадка
сернокислого бария —0.2140 г. Вес серы в осадке вычисляют из уравнения:
233.36 : 32 = 0.2140: *, откуда0.2140-32
х = ~25з'зб ’ — 0,0293 г серы,где: 233,36 — молекулярный вес сернокислого бария;	32 — атомный вес ссры.*	Необходимо избегать щелочной реакции, так как она дает повышен¬
ные результаты. НгГпрлльнаи и слабокнслая реакции дают практически оди¬
наковые результаты.333
По найденной сере вычисляют количество вллялпропнлднсульфкщв
(С»Нт —S —S—CjHs); 148:64«-Х|:0,0293, где 146—молекулярный вес
алдиллролнлднсульфнда, 64 — вес двух частиц серы в его молекуле, отсюда14810,0293ж, =	щ	= 0.С68 г аллилпропилдисульфида.Процентное содержание эфирного масла (ха) вычисляют по формуле:
260:0,068 100: xit откуда х% ■■ 0,027%.Определение серосодержащих
гликозидовМетод, разработанный С. Марковым * в модификации
В. П. Гавриловой, применим для быстрого определения серусо-
держащих гликозидов в малом количестве расти гельного ма¬
териала.Метод основан на реакции получения комплексного соеди¬
нения натрийнитропруссида с двухвалентной серой, окрашен¬
ного в щелочной среде от желтого до красновато-коричневого
цвета (проба Легаля на двухвалентный ион S). Этот цвет ана¬
логичен цвету раствора иода от 0,1 до 0,01-нормального к
сохраняется в течение 1—2 минут. Поэтому к окрашенному рас¬
твору быстро приливают 1%-ный раствор натрийнитропруссида»
просматривая интенсивность.окраски на ФЭК-М.Реактивы и аппаратурах 1) 30%-ныЙ раствор спирта; 2) 1%-ный раствор
ннтропрусснда натрия; 4) 0,1 я. раствор нода; о) песчаная баня; 6) центри¬
фуга; 7) ФЭК-М.Ход анализа. Из 2 ±0,01 г измельченного растительного
материала экстрагируют гликозид, растирая в ступке с 10 см*
30%-ного раствора спирта. Раствор сливают в центрифужную
пробирку, осадок экстрагируют повторно. Суммарный экстракт
центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 минут. Затем4	см0 центрнфугата помещают в фарфоровый тигель с 1,3 см3
4% -ного раствора NaOH и на песчаной бане выпаривают досуха
(без кипения). После охлаждения осадок растворяют в 4 см*
воды. Из этого объема берут 2 см* в пробирку с 2 см3 1 %-ного
раствора нитропруссида натрия и тщательно перемешивают.
Раствор окрашивается от желтого до коричневого цвета в за¬
висимости от концентрации гликозида в растворе. Интенсив¬
ность окраски опытного раствора просматривают на фотоэлек¬
троколориметре против 0,1 и. раствора иода. Количество серу-
содержащих гликозидов определяют из расчета, что 1,48 мг
иода соответствует 0,008 мг серы.Построение калибровочной кривой. Для вычис¬
ления строят калибровочную кривую по 0,1 и. раствору иода.•	С. М а р к о в. Фармация, 14, № 3» 1964.834
vT 20 пробирок; в 19 из них наливают от 9,5 до 0,5 зд3 раст-
®е'а иода с интервалом 0,5 см3. Во все 20 пробирок в том же
В°оядке приливают дистиллированную воду от 0,5 до 10 см3
інтервалом 0,5 см3. Просматривают на ФЭК-М с белым свето¬
фильтром, в кювете толщиной 3 см.На основании полученных данных строят калибровочный
афик. для этого на оси абсцисс откладывают мг иода, а на
оси ординат оптическую плотность растворов (красная шкала
(Ьотоэлсктроколориметра). Находят точки пересечения для каж¬
дой пробирки с известным содержанием. Точки пересечения
объединяют и полученную кривую используют для вычисления.
Для составления стандартной шкалы проводят несколько парал¬
лельных определений.Пример вычислен и я. Навеску лука 3 е экстрагировали 10 сд3
30%-пого спирта. Показания на ФЭК-М — 0,159; по калибровочной кривой
это соответствует 78,6 мг J. Так как I мг иода соответствует 0,006 мг S,
то 78,6 X 0.006 = 0.472 мг в 3 г сырого материала. В I г сырого вещества —
0,472:3 — 0,158 мг, в 100 г — 15,8 мг.
Определение
алкалоидов
глава ха и гликозидов*Особенности
алкалоидов и гликозидов
и методов их определенияВсе алкалоиды и многие гликозиды являются физиологи¬
чески активными веществами. Алкалоиды — это гетероцик¬
лические основания, как правило, содержащие азот ь
составе циклов. По азотсодержащим циклам алкалоиды клас¬
сифицируют на группы, различающиеся между собой по
химическим и биологическим свойствам: производные пири¬
дина, пирролидина, хинолина и изохинолина, индола, пурина
и др.Биосинтез алкалоидов в растениях непосредственно связан
с азотным обменом. Они могут рассматриваться как промежу¬
точные соединения, через которые в растениях происходит пре¬
вращение азотистых веществ и, возможно, обезвреживаются и
сохраняются метаболиты азотного обмена. В синтезе алкалои¬
дов важную роль играет корневая система.С некоторыми реактивами алкалоиды образуют цветные ре¬
акции или нерастворимые осадки (стр. 338). Эти свойства ал¬
калоидов легли в основу методов их определения. В растениях
алкалоиды содержатся в виде солей яблочной, лимонной и дру¬
гих органических кислот и накапливаются в коре корней, стеб¬
лей, в листьях и семенах. Наиболее интенсивный синтез алка¬
лоидов происходит в молодых органах. Содержание и характер
алкалоидов в различных органах растений изменяются в тече¬
ние вегетационного периода.Гликозиды очень разнообразны по своей природе и находят
широкое применение не только в медицине, но и в промышлен¬
ности. Обшей чертой гликозидов является присутствие в их мо¬
лекуле какого-либо сахара. По характеру сахара определяют
иногда отдельные гликозиды. Многие гликозиды обладают горь¬
ким вкусом или специфическим запахом. В гликозидах одна
или несколько гидроксильных групп простого сахара соеди¬
нены с другими веществами (спиртами, альдегидами, кетонами,
фенолами, стеринами и др.), которые называются аглюконами.азб
Строение и свойства аглюкона определяет собой особенность
пнкозндов. В природе встречаются главным образом р-глнко-
з'идЫ __ производные р-глюкозы.Накопление некоторых гликозидов связано с азотистым об¬
меном растений. Например, цианогенные гликозиды образуют
при гидролизе синильную кислоту. Они распространены среди
видов бобовых, злаковых, розоцветных и других семейств. Осо¬
бую группу составляют глнкоалкалоиды, например соланин
картофеля, томатин томатов и др. Они характеризуются свой¬
ствами гликозидов и алкалоидов, иногда придавая нм горький
вкус. К числу широко распространенных гликозидов относятся
кумарииы и фурокумарини. Наконец, в форме гликозидов и
растениях находятся дубильные вещества.Количество алкалоидов и гликозидов в .растенцях и их ка¬
чественный состав изменяются в зависимости от генотипиче¬
ских особенностей и условий выращивания, что необходимо
учитывать прн анализе. Так, азотистые удобрения, повышая
содержание белка, одновременно увеличивают в растениях кон¬
центрацию алкалоидов и цианогенных гликозидов. Большая из¬
менчивость в содержании алкалоидов и гликозидов по отдель¬
ным растениям была выявлена с помощью микрометодов ко¬
личественного и качественного их определения. Результаты
отбора показали перспективность использования таких методов
в селекции растений.Качественные реакции
на алкалоидыАлкалоиды имеют и некоторые общие свойства, например
растворимость в одних и тех же растворителях. Их извлекают
в виде солей путем обработки материала, например водой,
спиртом с прибавлением 1— 2%-ной соляной, серной и других
кислот или в виде свободных оснований. В последнем случае
алкалоиды, находящиеся в растениях в виде органических кис¬
лот, выделяют сначала при обработке их щелочью (аммиаком,
содой, едким натром), а затем уже извлекают одннм из орга¬
нических растворителей (эфиром, бензолом, хлороформом, ди¬
хлорэтаном и др.). Летучие алкалоиды выделяются перегонкой
с водяным паром.Характерными реакциями на алкалоиды являются реакции
их осаждения нлн реакции окрашивания их растворов.Реактивы для осаждения алкалоидов. I. Раствор иода в ра¬
створе йодистого калия (реактив Бухарда) образует с алкалои¬
дами красновато-коричневый осадок. Готовят растворением 5 г
иода в небольшом количестве (10—15 ел3) воды, в которойсодержится 10 г нодистого калия; затем объем доводят до
100 см*.837
таблица 17	Изменчивость содержания алка¬лоидов у различных культур
(в процентах на сухое вещество)РастениеОрганрастениаГлавнейший алкалоидСодержание
алкалоида (X)ЧайЛистьяКофеин0,65-4,1Табак•Никотин0-9Махорка•91,59-1!Белладонна•Атропин0,14-1.3Скополия светло-Гиосцнамнн1,08-4желтаяЛюпинКорниСеменаЛюлинии и люланин0-3,5АнабазисТраваАнабазин1-7,7КартофельКлубниСоланин0,02-0,1ТоматыПлодыТоматнн0,03-0,07Баклажаныm0,01-0,12МакКоробочкиМорфин0,2-1,12.	Фосфорновольфрамовая кислота — реактив Шейблера
(Н3РО<* 12W03-2H20) или H7[P(W20?)e]. Водный раствор кис¬
лоты с алкалоидами образует белые аморфные осадки. Приме¬
няют в виде 10—20%-ного водного раствора.3.	Фосфорномолибденовая кислота (НзР04* 12Мо03*2Н,0)
с алкалоидами образует аморфные желтоватые или бурные
осадки, через некоторое время приобретающие синюю или зеле¬
новатую окраску.4.	Кремневольфрамовая кислота — реактив Бодфруа пли
Бертрана Hs[Si(W207)e] или (12W0s*Si02*4H20). В подкислен¬
ных алкалоидных растворах кислота образует нерастворимые
в воде белые аморфные осадки алкалоидов состава 12WOa*
•Si02-4H20. Кремневольфрамовая кислота, как и фосфорномо¬
либденовая,—один из наиболее чувствительных реактивов на
люпиновые алкалоиды. Применяют 10— 12%-ный водный
раствор кислоты.5.	Раствор йодной ртути или нодида калия — реактив Майе¬
ра (Hgh’2Kl или K2HgI<). В слабокислых или нейтральных
растворах алкалоиды образуют белые или слабо-желтые осад¬
ки. Готовят растворением 1,35 г Hgl2 и 49,6 г KI в 1 дм3 воды.Реактивы для окрашивания. Растворы солей алкалоидов при
взаимодействии с раствором иодистого висмута в подпетом ка¬
лин (реактив Драгендорфа — KBiI4) окрашиваются в оран¬
жево* или коричнево-красный цвет. Это очень чувствительная
реакция на алкалоиды. Приготовление реактива: 1) 0,85 г ос¬
новного нитрата висмута растворяют в 40 см3 дистиллирован¬
ной воды и 10 см3 ледяной уксусной кислоты; 2) 8 г иодистого
калия растворяют в 20 см3 дистиллированной воды. Смешивают5	см3 первого и 5 см3 второго растворов, 20 см3 ледяной уксус¬
ной кислоты и 100 см3 воды и хранят в склянке из темного338
.текла. Чувствительной является также реакция с реактивом
ВухйРД3 (см> вышеЬ Дающего с раствором алкалоидов буро-
!ли красно-коричневый цвет. С помощью данного реактива об¬
наруживаются алкалоиды при концентрации их в растворе
0,005%.Качественное определение
алкалоидов в люпине(по Н. Н. Иванову, М. И. Смирновой)Метол разработан для отбора безалкалоидных семян. Для
этой цели применяется реактив Бухарда (стр. 337). По интен¬
сивности окрашивания судят о степени алкалоидности семян.
Метод может быть применен непосредственно в полевых усло¬
виях и в лаборатории. Отобранные семена после анализа хо¬
рошо сохраняются и не теряют всхожести.Реактивы и аппаратура: 1) кодио-нодистокалиевыА реактив (20 г подп¬
етого калия растворяют в 30 cjm3 воды, затем в раствор вносят 13 г кри¬
сталлического иода; когда иод растворится, прибавляют дистиллированной
воды до 1 дм*', такоА раствор условно называют «концентратом»; для ана¬
лиза алкалоидов берут раэбавленныА раствор — 1 cjm3 «концентрата», доводят
до 20 см* водой — раствор Xt 1; растворы хранят в бутылях темного цвета
с притертыми пробками); 2) кювета с белым дном или доски, покрытые
белой бумагой; 3) стеклянные палочки; 4) часовые стекла диаметром
3—4 см или предметные; 5) капельницы из темного стекла с притертыми
пробками.Ход анализа. Из семени, со стороны, противоположной руб¬
чику, кончиком скальпеля высверливают небольшую часть семя¬
доли (но так, чтобы не повредить росток) и помещают ее иа
предметное стекло в каплю дистиллированной воды. Стекла
помещают на кюветы с белым дном, чтобы на этом фоке от¬
четливее была видна окраска образующегося осадка от взаи¬
модействия алкалоида с реактивом.Исследуемое семя кладут около стекла и сохраняют до по¬
лучения результатов анализа. После взятия каждой пробы
скальпель промывают водой. Затем из капельницы в воду с
мучкой вносят 1—2 капли реактивов (раствор № 1). При на¬
личии в семени не менее 0,1% алкалоидов после прибавления
к пробе реактива сразу же выпадает характерный осадок крас-
но-бурого цвета. Если алкалоидов в исследуемом материале
меньше 0,1%, окраски от прибавления реактива данной кон¬
центрации не обнаруживают. Для проверки выделенных зерен
с пониженным содержанием алкалоидов, т. е. таких, которые
не дают окраски с применяемым реактивом, составляют более
концентрированный реактив. Для этого к 1 см3 «концентрата»
прибавляют 9 см3 дистиллированной воды (раствор М 2). Ре¬
активом такой концентрации обнаруживают меньше, чем 0,1%-,339
содержание алкалоидов в зерне. Такие семена относятся к
типу малоалкалондных. Семена с содержанием алкалоидов
меньше 0,025% окраски не дают и считаются практически
«безалкалоидными». Прн анализе для сравнения необходимо
иметь семена сладкого люпина или сои и типично горькие
семена люпина.Качественное и приближенное
количественное определение
алкалоидов(по А. И. Банъкавскому и др.)Метод позволяет проводить работу с серией образцов и
быстро оценить в условиях лаборатории воздушно-сухой расти-
тельный материал.Реактивы и аппаратура: I) дихлорэтан; 2) 1%-ныА раствор кремне-
вольфрамовой кислоты; 3) раствор иода в растворе иодистого калия (С,5 г
иода растворяют в растворе 10 г йодистого калия в 25 с*3 воды и доводят
раствор до 500 cjk1); 4) 10%-ная соляная илн серная кислота; 5) 10%-ный
раствор аммиака; 6) стеклянные банки на 250 см1, воронки, пробирки.Ход анализа. Навеску 10 ±0,01 г воздушно-сухого расти¬
тельного материала, размолотого в мелкий порошок, помешают
в склянку на 250 гл3 и заливают 10 см3 10%-ного раствора ам¬
миака. Содержимое колбы хорошо перемешивают и через 20—
30 минут заливают дихлорэтаном в отношении 1:10 к навеске,
хорошо встряхивают и настаивают в течение суток. Через сутки
дихлорэтан отфильтровывают с 10 см3 10%-ной серной кислоты.
После этого в 3 пробирки берут по 1 см3 кислотной вытяжки
для реакции с 1%-ным раствором кремневольфрамовой кис¬
лоты, фосфорномолибденовой кислоты и раствором иода в раст¬
воре иодистого калия (в соотношении 1:2).При оценке степени алкалоидиости условно могут быть при¬
няты следующие обозначения: 0 — отсутствие алкалоидов (кис¬
лотная вытяжка остается прозрачной после прибавления реак¬
тива); следы алкалоидов (появляется небольшая муть); И—
наличие алкалоидов до 0,1% (небольшй осадок, появляющийся
от первой капли и при дальнейшем прибавлении реактива не
увеличивающийся); 4Н—наличие алкалоидов от 0,1 до 0,5%
(осадок продолжает увеличиваться от последующих 2—3 ка¬
пель реактива); ++4—наличие алкалоидов от 0,5% и выше
(образуется обильный творожистый осадок). Для полного
осаждения алкалоидов требуется от 10 до 30 капель реак¬
тива.Для оценки алкалоидиости растений непосредственно в по¬
левых условиях Д. Крафтом в 1953 г. был предложен капель¬
ный метод с индикаторной бумагой, пропитанной раствором340
,трата висмута в уксусной кислоте и КІ. Проверка этого
метода, проведенная Т. К. Никоновым и А. И. Баньковским *,
показала, что он отличается высокой чувствительностью и из¬
бирательностью.Определение общего
содержания алкалоидов
весовым методом(по Маху и Лед ер лею)Принцип метода основан на способности алкалоидов коли¬
чественно осаждаться расі вором кремневольфрамовой кислоты
с образованием при этом комплексных солей. При сжигании
осадка алкалоид сгорает, остается кремневольфрамовая кис¬
лота. На этом основании представляется возможным учесть ко¬
личества чистого алкалоида.Реактивы и аппаратура: 1) этиловый эфир; 2) дихлорэтан; 3) 15% -ный
раствор едкого натра; 4) 1%-ная соляная кислота; 5) 20%-ная кремне-
вольфрамовая кислота; 6) тигли Гуча с дырчатым дном (стр. 168) ;7) ко¬
нические колбы на 250 и 500 см* с притертыми пробками; 8) колбы с тубу¬
сом (Бунзена); 9) цилиндрические делительные воронки на 250 см\ 10) во¬
ронка Бюхнера; II) электрический муфель; 12) водяная электрическая баня.Ход анализа. Экстракция. Берут 10+0,005 г воздушно-
сухого вещеста в коническую колбу на 500 cjk3 и приливают
100 cjm3 эфира, 50 см3 дихлорэтана, 10 сяР 15%-ного раствора
аммиака, смесь хорошо встряхивают и оставляют на ночь для
извлечения алкалоидов. Если отстоявшаяся жидкость над осад¬
ком будет недостаточно прозрачна, прибавляют несколько ка¬
пель воды и встряхивают, благодаря чему наступает быстрое
осветление. Затем жидкость фильтруют через воронку Бюх¬
нера, осадок промывают эфиром, фильтрат помещают в ци¬
линдрическую делительную воронку И последовательно 3-““4	раза встряхивают с 25 cjk3 1%-ноА соляной кислотой, каждый
раз возможно полнее отделяя водный раствор кислоты. Алка¬
лоиды переходят в раствор кислоты, образуя солянокислую
соль. В эфирном слое производят пробу на полноту извлечения
алкалоида, для чего часть эфнрно-дихлорэтановой жидкости
выпаривают, остаток растворяют в воде и раствор испытывают
на осаждение кремневольфрамовой кислоты.Осаждение Солянокислый экстракт, содержащий соли
алкалоидов, переносят в фарфоровую чашку, нагревая на во¬
дяной бане до полного удаления следов эфира и дихлорэтана,
охлаждают, переводят в коническую колбу на 250 см3 и осаж¬
дают 20%-ным раствором кремневольфрамовой кислоты, при-*	Т. К. Никонов. А. И. Баньковский. Тр. Всесоюзного ин-та ле¬
карственных и ароматических растений, XI, 1959.841
бавляя последний по каплям. Полученный осадок перемеши¬
вают, проверяют на полноту осаждения, прибавляя осторожно»
по стенке 2—3 капли раствора кремневольфрамовой кислоты,
и оставляют стоять в течение ночи (на 18—20 часов). Затем
осадок фильтруют через асбест в тигле. Осадок кремневольф-
рамовой кислоты с алкалоидами промывают в тигле возможно
малым количеством 1%-ной соляной кислоты, сушат при 100°
до постоянного веса и сжигают в муфельной печи. Алкалоид
сгорает, и остается то количество кремневольфрамовой кислоты
(SiOa* I2WO3), которое связывало алкалоид.Вычисление результатов. Разность между весом
осадка до и после прокаливания соответствует сухому весу ал¬
калоида. Эту разность перечисляют на навеску и выражают
в процентах на сухое вещество. Одновременно определяют про¬
цент влаги в материале.Процентное содержание алкалоидов в материале вычисляют
по формуле:а» 100где: а —найденное количество алкалоидов в исследуемой на¬
веске (после прокаливания тиглей);
н — навеска взятого для анализа материала.Определение алкалоидов
в растениях семейства
пасленовыхМетод в модификации Н. И. Либизова основан на выделе¬
нии и очистке алкалоидов путем повторного перевода в кис¬
лую среду и извлечения хлороформом. После отгонки хлоро¬
форма алкалоиды определяют весовым или объемным путем.
В растениях, содержащих гиосциамин, атропин или скопола-
мин, результаты определения алкалоидов можно рассчитать по
количеству троповой кислоты, основой которой является тро-
пин с молекулярным весом 141,1.Реактивы и аппаратура: 1) дихлорэтан; 2) хлороформ; 3)‘ аммиак
25%-ныА; 4) 0.7 н раствор ссриой кислоты и шел очи; 5) аппарат для встря¬
хивания (см. рис. 43).Ход анализа. Извлечение алкалоидов. К 20 + 0,01 г
измельченного (до 1 jmjm) растительного материала приливают
200 см3 дихлорэтана в колбе на 250 см3 и после этого добав¬
ляют 5 см% 25%-його раствора аммиака, взбалтывают колбу
15 мннут и оставляют стоять до следующего дня. На другой
день содержимое колбы энерпично встряхивают 15 минут,’ за¬
тем центрифугируют «или отфильтровывают, точно огмеряюі 50342
niti 100 см3 (что соответствует 5 или 10 г навески образца)
и переносят в делительную воронку на 200 см3.Извлечение из дихлорэтано во го экстракта.
Алкалоиды извлекают 5%-ным раствором серной кислоты в де¬
ятельной воронке, порциями 15; 15; 15; 10; 10 см3 до полного
истошения раствора (отрицательная реакция с раствором
кремневольфрамовой кислоты). Затем из объединенных кислых
растворов (после подщелачивания 10%-ным раствором аммиа¬
ка до слабого покраснения фенолфталеиновой бумажки) из¬
влекают алкалоиды хлороформом порциями, как указано выше.
Последние хлороформные извлечения проверяют раствором
кремневольфрамовой кислоты. Хлороформные растворы пере¬
ливают в делительную воронку на 250 см3 и алкалоиды вновь
извлекают 5%-ным раствором серной кислоты, как и в пер¬
вый раз.Затем сернокислые растворы алкалоидов подщелачивают
10%-ным аммиаком и алкалоиды повторно извлекают хлоро¬
формом, как описано выше. Наконец, хлороформные растворы
алкалоидов фильтруют через небольшую адсорбционную ко¬
лонку с 3—4 г безводного сульфата натрия в тарированную
круглодонную колбу на 100 см*.Колбу и остатки раствора на сернокислом натрии на
фильтре промывают чистым хлороформом, который присоеди¬
няют к первоначальному фильтрату. Из круглодонной колбы
с раствором алкалоидов хлороформ отгоняют на водяной бане
почти досуха (лучше под вакуумом в 50—60 мм ртутного стол¬
ба). Остаток хлороформа удаляют продуванием воздуха при
нагревании на водяной бане. Колбу с алкалоидами выдержи¬
вают 2 часа в термостате при 50—60°, затем в эксикаторе над
серной кислотой, после чего взвешивают.Вычисление результатов. Содержание алкалоидов
вычисляют в процентах на сухой вес анализируемого образца.
После взвешивания алкалоиды в круглодонной колбе можно
растворить в 0,1 н. серной кислоте и избыток кислоты оттитро¬
вать из микробюреткн 0,1 и. раствором едкого натра при инди¬
каторе метил красном. 1 см3 0,1 н. серной кислоты, связанной
алкалоидами, соответствует 28,92 мг алкалоидов, рассчитан¬
ных на гиосцнамин, и 16,2 мг — на никотин. При этом нельзя
ожидать совпадающих результатов весового метода с данными
ацидометрического метода, так как сумма алкалоидов боль¬
шинства растений семейства пасленовых представлена значи¬
тельным количеством алкалоидов, отличных по молекулярному
весу и основности. Кроме того, соотношение между алкалои¬
дами непостоянно и зависит от роста и развития растений. Ме¬
тод может быть выполнен в микроварианте.Процент алкалоидов (дс) по гиосциамнну находят по фор-
УГ * = (а • 0,02892 • 100) :н, где: а —число ел30,1н. кислоты,
язанной алкалоидами; н — навеска.343
Определение состава
и содержания алкалоидов
в люпине
методом хроматографииНа основе существующих методов А. В. Мироненко с соав¬
торами* разработали вариант доступного метода определения
качественного состава и количественного содержания отдель¬
ных алкалоидов в люпине.Принцип метода основан на разделении солянокислого раст¬
вора алкалоидов на составные компоненты с помощью хрома¬
тографии; пятна алкалоидов проявляют реактивом Драген¬
дорфа (см. стр. 338), а концентрацию алкалоидов определяют
в элюате.Реактивы и аппаратура: I) эфир этиловый; 2) 15%-ный раствор NaOH;3)	кристаллизаторы или чашки Петри диаметром 13—14 см; 4) стеклянные
цилиндры с притертой пробкой; 5) стаканчики высотой 1.5—2 см и диамет¬
ром 2 см; 6) элс-ктровснтилятор или электрофен; 7) ФЭК-М (см. рис 27).Ход анализа. Извлечение алкалоидов. Навеску 2—3	г воздушно-сухой мелко размолотой муки из семян, листьев
и других органов растений люпина, предварительно просеянной
через сито с отверстиями 0,5 мм, помещают в колбу с притер¬
той пробкой на 100 см\ Если анализируется свежий материал,
то его предварительно высушивают при 70—80° и извлечение
алкалоидов проводят так же, как указано на стр. 341.Разделение алкалоидов. Далее полученную соляно¬
кислую вытяжку алкалоидов наносят микропипеткой или капил¬
ляром на язычок на 1,5—2 см от центра кружка хроматографи¬
ческой бумаги. Кружки бумаги вырезают из листов хромато¬
графической бумаги (ленинградская, «быстрая»); диаметр
кружков должен быть немного больше диаметра кристаллиза¬
тора, на края которого их помещают. Вдоль волокон в кружке
вырезают «язычок» шириной 5 мм. Длина «язычка» должна
быть такой, чтобы он погружался на 0,5 см в стаканчик с жид¬
костью. Маленький стаканчик с разделительной смесью, состоя¬
щей из водонасыщенного изобутилового спирта и концентриро¬
ванной соляной кислоты (100:2), ставят на дно кристаллиза¬
тора. Кружок бумаги с нанесенной вытяжкой кладут на края
кристаллизатора и «язычок» опускают в растворитель. Сверху
бумагу покрывают чашками Пегри или стеклом, помещают в
эксикатор или стеклянный цилиндр и оставляют на 18—20 ча¬
сов при комнатной температуре. У желтого люпина, содержа¬
щего 2—3 алкалоида, четкое разделение наступает через &—10	часов. У узколистного белого и многолетнего люпина, содер-*	А. В. Мироненко в др. Доклады АН Белорусской ССР, т. % № 2.
Минск. 1950.344
жаших 5—7 алкалоидов, разделение иногда требует более про¬
должительного времени. У последних для лучшего разделения
смеси алкалоидов следует эту же хроматограмму высушить в
вытяжном шкафу и снова поставить иа 15—20 часов для луч¬
шего разделения.Для определения качественного состава алкалоидов по¬
лученные хроматограммы высушивают и проявляют реактивом
Драгендорфа (стр. 338), погружая на 3—5 секунд или же
опрыскивая хроматограммы раствором этого реактива. Ал¬
калоиды иа бумаге окрашиваются в ярко-оранжевый цвет.Количественное определение. После 20—40 часов
экспозиции высушенные при комнатной температуре хромато¬
граммы обрабатывают парами иода. Для этого на дно эксика¬
тора ставят кристаллизатор с кристаллическим иодом, слегка
увлажненную водяным паром хроматограмму помешают над
парами иода, закрывают крышку эксикатора и эксикатор по¬
мещают на водяную баню на 3—5 минут. Под влиянием паров
иода пятна алкалоидов на хроматограмме окрашиваются в бу¬
рый цвет. Пятна алкалоидов вырезают, разрезают на мелкие
полоски шириной 1—2 мм н помещают в маленькую стеклян¬
ную банку. Алкалоиды извлекают из бумаги при комнатной
температуре 4 смг 0,6 н. MCI в течение часа, элюат фильтруют
через тонкий слой ваты, предварительно смоченной 0,6 н.
IICI. Отбирают 2,5 см3 вытяжки в кювету, куда добавляют
реактив йодистого калия в бромной воде, и сразу же произ¬
водят измерение на фотоэлектронефелометре с применением
красного светофильтра. Параллельно для поправки на реактив
(контроль) обрабатывают аналогичным образом кусочек хро¬
матографической бумага без алкалоидов. Далее производят
расчёты по калибровочным графикам, построенным по чистым
препаратам алкалоидов.В качестве стандартного раствора пользуются 0,005 М вод¬
ным раствори сернокислого слартеина (CieHgeNjHjSO* • 5Нг0),
если состав и соотношение алкалоидов в испытуемом образце
неизвестны, или берут смесь 0,005 М раствора алкалоидов в
предполагаемой пропорции, если их состав и соотношение из¬
вестны.Стандартный раствор. На микроаналитических весах
отвешивают 21,128 мг сульфат спартенна и растворяют в 10 г
дистиллированной воды. В 1 cjm3 такого раствора содержится
1,1718 мг чистого спартенна (CibHmNs). Стандартный раствор
(метчик) хранят в холодильнике.Чувствительность определения по спартеину составляет
0,001 мг в пробе. Это значит, что при навеске испытуемого
материала в 1000 мг чувствительность метода составляет 0,1 мг.
При соблюдении указанных условий реакции ошибка изме¬
рения не превышает 1,5% измеряемой величины оптической
плотности,345
Определение морфинаМорфин (Сі?НівОз) является главным алкалоидом опия, ко
торый представляет собой высохший на воздухе млечный сок
незрелых коробочек опийного нлн масличного мака. С хими¬
ческой точки зрения морфин является производным изохино
лина. Морфин (монопират) имеет вид бесцветных кристаллов,
точка плавления его 2о4°. Он растворяется в воде — 0,019 г
в 100 г (20°), в 90%-ном этиловом спирте —0,37 г в 100 г
(10,6°), в метаноле—1,67 г в 100 г (10,8°). Морфин содержит
одну вторичную спиртовую группу и один фенольный гидрок¬
сил, который обусловливает его растворимость в щелочах. Ал¬
калоид морфин обладает сильным физиологическим действием
и широко применяется в практике медицины в качестве боле¬
утоляющего средства. Ниже приводятся 2 метода определения
морфина. Из них второй пригоден для серийных определений
при оценке селекционного материала.Определение морфина по стандартному методу (ВТУ-МЗ
№ 37-58). Метод основан иа осаждении морфина и последую¬
щем получении его нигрозопронзвоаных. Оптическая плотность
окрашенных в буровато-оранжевый цвет растворов измеряется
на фотоэлектроколориметре. Изложенный ниже метод в прописи
ВИЛАР предложен Харьковским НИХФИ.Реактивы и аппаратура: 1) морфив солянокислый, содержащий 3 моле¬
кулы кристаллизационной воды; 2) реактив Майера (1,358 г чистой дли
анализа сулемы растворяют в 60 <ur дистиллированной воды, приливаю i
раствор иодистого калия —5 г в 10 см* дистиллированной воды —и разбав¬
ляют до 100 см* дистиллированной водой); 3) баритовая воде (5 г гидрата
окнен бария энергично взбалтывают со 100 см3 дистиллированной воды в
течение t0 минут и дают отстояться; для работы берут отстоявшийся
раствор); 4) 4%-ный раствор соляной кислоты (19.2 см} соляной кислоты-
плотн. 1,19—добавляют к 80,8 см* дистиллированной воды); 5) 10%-ный
раствор сульфата натрия; 6) 10%-ный раствор нитрита натрия; 7) 10%-ный
раствор аммиака (44 cjk* 25%-ного водного аммиака прибавляют к 56 см1
дистиллированной воды); 8) 0,5 и. раствор уксусной кислоты (28 см1 ледя¬
ной уксусной кислоты разбавляют дистиллированной водой до 1 д*>);9)	I н. раствор ацетата натрия (136.09 г кристаллического ацетата натрия
СI IjCOONa ■ ЗНаО растворяют в дистиллированной воде и объем раствора
доводят водой до 1 ДО); 10) спирт этиловый 96-градусный; II) хлороформ;
12) мерная посуда (колбы, цилиндры, пипетки); 13) делительные воронки
емкостью 200—250 глг»; 4) воронки Бюхнера диаметром 4—6 и 8—9 см\
15) водяная баня (см. рис. 23); 16) фотоэлектроколорнметр (см. рис. 27).Ход анализа. Извлечение морфина. Навеску 16 г вэз-
душно-сухих измельченных (величина частиц 1 - 2 мм) коробо¬
чек н верхних частей стеблей масличного мака помещают в
плоскодонную колбу емкостью 250 см*, прибавляют 160 см3
смесн, состоящей из 8 см* 25%-ного аммиака и 152 см* 96-гра¬
дусного спирта с хлороформом (смесь 1:2). Колбу с содержи¬
мым взвешивают н нагревают на водяной бане при темпера¬
туре 55е прн частом встряхивании в течение часа. Затем колбу346
лаждают и доводят ее вес с содержимым до первоначаль¬
но веса такой же смесью спирта с хлороформом. Содержимое11	бы фильтруют через воронку Бюхнера диаметром 8—9 см
поп слабом вакууме. Для анализа берут 100 см9 фильтрата
/соответствует 10 г исходного сырья) в коническую колбу на
250 см* и отгоняют растворитель досуха. К остатку прибавляют5	см3 0,5 н. уксусной кислоты, 5 см* дистиллированной воды
„ 1—2 см3 хлороформа. Смесь нагревают на водяной бане,
встряхивают до удаления хлороформа.Жидкость после охлаждения фильтруют через ватный
фильтр в мерную колбу на 50 см3. Колбу с остатком промывают
дистиллированной водой несколько раз по 5 см3, сливая через
вату в ту же мерную колбу, приливают 10 см3 1 и. раствора
ацетата натрия и объем доводят перегнанной водой до метки.
Затем из полученного экстракта дважды извлекают побочные
алкалоиды путем встряхивания в сухой делительной воронке
с 50 см3 хлороформа в течение 10 минут. Хлороформные извле¬
чения отбрасывают, а водный слой фильтруют через складча¬
тый фильтр.Осаждение морфина. В фарфоровой чашке на 50 см3
выпаривают 20 см? фильтрата (соответствует 4 г коробочек)
до объема 2 см3. После охлаждения добавляют 4 см3 реактива
Майера, перемешивают стеклянной палочкой и спустя 10 мн¬
нут фильтруют через воронку Бюхнера диаметром 5 см при ела*
бом вакууме. Чашку после осаждения промывают перегнанной
водой 3 раза по 2 см3 и сливают промывные воды через тот
же фильтр. Затем фильтр с осадком переносят в ту фарфоро¬
вую чашку, в которой проводилось осаждение, и приливают
(трижды по 5 см3) баритовой воды, каждый раз растирая оса¬
док н сливая раствор в мерную колбочку объемом 25 см3. За¬
тем фарфоровую чашку и стеклянную палочку обмывают пере¬
гнанной водой и объем доводят до метки. Содержимое переме¬
шивают и фильтруют через бумажный фильтр в коническую
колбочку на 50—100 см3. Берут 15 см3 фильтрата в мерную
колбу на 50 см\ прибавляют 5 см3 10%-ного раствора сульфата
натрия и объем доводят водой до метки. После перемешивания
и отстаивания (30—40 минут) фильтруют через тройной бу¬
мажный фильтр. Фильтрат должен быть совершенно прозрач¬
ным (раствор А).Колориметрирование. В коническую колбу на 50—
100 елі* вносят 25 см3 раствора А и прибавляют к нему 1 см3
8,4%-ного раствора соляной кислоты, 2 см3 10%-ного раствора
нитрита натрия. Через 5 мннут приливают 4 см3 10%-ного раст¬
вора аммиака и перемешивают (раствор Б). Через 30 минут
интенсивность буровато-оранжевой окраски измеряют на фо«
тоэлектроколориметре с зеленым светофильтром, в кюветах
толщиной 10 мм. Нулевую точку устанавливают по раствору А,
затем в правую кювету наливают раствор Б и измеряют опти¬347
ческую плотность испытуемого раствора. Количество морфина
в растворе находят по калибровочному графику.Построение калибровочного графика. Готовят
стандартный раствор морфина. Навеску 0,6585 г кристалличе¬
ского гидрохлорида-морфина растворяют в дистиллированной
воде в мерной колбе на 50 см* и объем раствора доводят водой
до метки. В 1 смг приготовленного стандартного раствора содер¬
жится 0,010 г безводного морфина-основания. Для построения
калибровочной кривой в фарфоровые чашечки объемом 50 см3
приливают из микробюретки следующие количества стандарт¬
ного раствора: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2 см3 и до¬
бавляют в каждую чашечку дистиллированной воды до общего
объема 2 см3. Это соответствует 0,002; 0,004; 0,006; 0,008; 0,010;
0,012; 0,014; 0,016; 0,018; 0,020 г морфина-основания в 2 см3 по¬
лученного раствора. Затем к полученным растворам приливают
по 4 см* реактива Майера и далее поступают так, как описано
выше (см. «Осаждение морфина»). После определения оптиче¬
ской плотности каждого стандартного раствора строят калибро¬
вочный график, откладывая на оси абсцисс количество морфи-
на-основания, взятого для осаждения реактивом Майера, а на
оси ординат — оптическую плотность.Вычисление результатов. По калибровочному гра¬
фику количество морфина в процентах (х) находят по формуле:а-100-100«.(Гбо—«У •где: а —содержание морфина (в г), найденное по калибровоч¬
ному графику;к — воздушно-сухая навеска (в г), соответствующая объ¬
ему раствора, взятого для осаждения реактивом
Майера;
в — влажность навески (в %).Определение морфина полумикрометодом. Метод основан на
весьма чувствительной реакции морфина с ванадатом аммония.О	содержании морфина судят по относительному помутнению
раствора, которое измеряется на фотоэлектроколорнметре.Реокіияn* и аппаратура: 1) насыщенный раствор аанадата аммония
(навеску 4,5 ± 0.001 ь ванадате аммония растворяют при умеренном нагре¬
вании на водяной бане в I дм* бидистиллированной воды); 2) 10%-ный
раствор молнбдековокнслого аммония; 3) морфкв-хлоргидрат фармокопейпый;4)	10%-ный растрор азотной кислоты; 5) 55%-ный раствор ускусвокислого
свинца; 6) 4%-ныЛ раствор сульфата натрия; 7) мерная посуда; 8) фото¬
электроколориметр ФЭК-М (см. рис. 27).Ход анализа. Навеску 1 г тонко измельченных коробочек
помещают в мерную колбу объемом 250 &м3, добавляют 160 см3
бидистиллированной воды, 0,8 см9 10%-ной азотной кислоты и*	Всс реактивы готовят на бидистиллированной воде.848
тавляют на ночь для извлечения морфина. Утром добавляют
,а1ымл порциями 6 см* 25%-ного раствора уксуснокислого
свинца, периодически взбалтывая. Для проверки полноты осаж¬
дения раствору дают отстояться и прибавляют еще несколько ка¬
пель уксуснокислого свинца. Затем приливают 4 см3 10%-ного
сульфата натрия. Общий объем доводят до метки и фильтруют
через тройной фильтр. Фильтры готовят из среднепористой
фильтровальной бумаги (широкопористые фильтры непригодны
для использования). Из полученного исходного раствора берут
50 см*, помещают в мерную колбу на 100 см* и доводят до
метки бндистиллнрованной водой (испытуемый раствор). При
низком содержании морфина эту операцию можно опустить.
Затем берут 35 см* исходного (или испытуемого) раствора в
коническую колбу на 100 см\ прибавляют 5 см* 10%-ного раст¬
вора азотной кислоты и 2 см9 20%'-ного раствора молибденово¬
кислого аммония.По истечении 30 минут раствор фильтруют через маленький
фильтр, к фильтрату добавляют 8 см* насыщенного раствора
ванадата аммония и строго через час определяют относитель¬
ное помутнение на ФЭК-М при желтом светофильтре, исполь¬
зуя кювету с расстояниями между рабочими гранями 5 мм.
Нулевую точку прибора устанавливают по контрольному раст¬
вору: 35 см3 бидистиллированной воды + 5 см* 10%-ного раст¬
вора азотной кислоты + 2 елі310%-ного раствора молибденово-
кислого аммония+ 8 см* насыщенного раствора ванадата ам¬
мония.Концентрацию раствора (в мкг на 1 см* испытуемого
раствора) вычисляют по калибровочному графику. При состав¬
лении калибровочной кривой* навеску 0,066 + 0,0001 г мор¬
фина растворяют в 1 см3 10%-ного раствора азотной кислоты
и разбавляют раствор до 1 дм3 дистиллированной водой. В 1 см*
полученного раствора содержится 50 мкг морфина. Из этого
раствора берут 1; 2; 4; 6 и т. д. до 34 см* в конические колбы
на 50 см*. В каждую колбу прибавляют бидистиллированной
воды до объема 35 см\ затем 5 см3 10%'ного раствора азот¬
ной кислоты, 2 см* 10%-ного раствора молибдата аммония и
6 см* насыщенного раствора ванадата аммония. Прнливание
ванадата аммония к каждой последующей пробе следует вести
через определенный промежуток времени (достаточный для
проведения одного определения иа ФЭК-М). Колориметрируют
растворы через час с учетом последовательности приливаний
ванадата. Процентное содержание морфина (х) находят по
формуле:_ a-tMytylOO
_	Х~ «• tyVj •лястся^оиовоИГОТОВЛСИИЯ иовых РаствоРов калибровочный график состав*349
где: а — концентрация морфина (в мкг в 1 смг), найденная
по калибровочной кривой;V	— объем исходного раствора;V\ —- объем, взятый для приготовления испытуемого раст-
вора;v2 — объем испытуемого раствора;Рз — объем, взятый для проведения реакции с ванадатом;—	объем раствора перед колориметрированием.Пример вычисления. Навеска 1 г. Общий объем исходного
раствора 250 см? (о). Иа этого объема взято 50 см? (pi) для приготовления
испытуемого раствора (100 см? о*). Для реакции с ванадатом взято 35 см}
раствора (fj). После прибавления реактивов объем для колориметрнрования
составлял 50 см* (р«). По калибровочной кривой найдено 15 мкг в 1 см* (а)
раствора. Подставив полученные значения в формулу, находят содержанке
морфина (лг) <— 0,52%.Определение гликоалкалоидовГликоалкалоиды относятся к стероидам, в основе их аглн*
кона лежит циклопентанпергидрофенантрен. Гликоалкалоиды
характерны для некоторых видов рода паслена (Solanum), а
также рода чемерицы (Veratrum). Они содержатся во всех ор¬
ганах растений, причем проростки и молодые листья более бо¬
гаты, чем старые листья и стебли, но особенно много глико-
алкалоидов содержится в цветках и незрелых плодах. Зрелые
плоды томатов гликоалкалоидов не содержат. Ниже приведены2	модификации определения гликоалкалоидов, основанные:
1) на появлении малинового окрашивания на холоде в присут¬
ствии серной кислоты и формалина (реакция Альберти на двой¬
ную связь в положении 5,6 в кольце); 2) на реакции с треххло¬
ристой сурьмой.Метод определения гликоалкалоидов (по модификации
Л. Р. Гусевой и В. А. Пасешниченко). Данный метод является
модификацией метода С. М. Прокошева, опубликованного в
первом издании данного руководства (А. И. Ермаков, В. В. Ара-
симович и др., 1952).Реактивы и аппаратура: I) 1 н. раствор серной кислоты; 2) смеси эта¬
нола, уксусной кислоты н воды (4:1:4) и (50 : 2:48); 3) 1%-ный раствор
формалина; 4) 2%-ный раствор уксусной кислоты; 5) 25%-ный раствор ам¬
миака; 6) фотоэлектроколориметр ФЭК-М (см. рис. 27); 7) прибор для
взбалтывания (см. рнс. 43).Ход анализа. Навеску 1 ± 0,01 г сухих измельченных ли¬
стьев или 5 + 0,01 г клубней картофеля заливают в колбе
15 смг смеси этанола, уксусной кислоты и воды (50:2:48) и
оставляют на 2—3 часа, периодически взбалтывая. Затем раст¬
вор отфильтровывают, остаток промывают 3 раза по 5 см*
смеси. Фильтраты объединяют и упаривают в фарфоровой350
чашке до половины объема. При этом выпадает осадок, и раст¬
вор гликоалкалоидов фильтруют, а фильтр промывают 3—4	раза по 3 см3 2% -ной уксусной кислотой. После объединения
уксуснокислых фильтратов проводят осаждение гликоалкалои¬
дов, подщелачивая 25%-ным раствором аммиака по фенолфта¬
леину. Затем смесь нагревают до 70° и оставляют на ночь.
Выпавший осадок гликоалкалоидов центрифугируют или от¬
фильтровывают, промывают на фильтре 0,1%'ным аммиаком,
пока промывные воды не станут бесцветными. Промытый по¬
светлевший осадок растворяют в 10 см3 смеси этанола, уксус¬
ной кислоты и воды (4:1:4). На фильтре остаются примеси,
ке содержащие алкалоидов. Раствор гликоалкалоидов пере¬
носят в мерную колбу на 100 — 200 см3 и доводят смесью до
метки.Для проведения цветной реакции 1 см3 раствора гли¬
коалкалоидов наливают в пробирку, охлаждают льдом и по
каплям добавляют 2 см3 H2S04 (плоти. 1,84) в течение двух
минут. После 10-минутного выдерживания смеси на льду добав¬
ляют по каплям 1 см3 1%-ного раствора формалина в течение
одной минуты. При этом наступает малиновое окрашивание,
которое измеряют через 30—40 минут на ФЭК-М с зеленым
светофильтром.Калибровочную кривую строят по раствору чистого сола¬
нина или других глнкоалкалоидов, которые получают разде¬
лением смеси на колонке с А1203 *.Качественное определение гликоалкалоида может быть вы¬
полнено при помощи бумажной или лучше тонкослойной хро¬
матографии на пластинках с силикагелем. Силикагель марки
КСК размалывают на шаровой мельнице и просеивают через
шелковое сито (100 меш). На пластинку 13X18 см наносят
взвесь (6 г силикагеля, 0,3 г гипса в 18 см* воды). Слой раз¬
равнивают и сушат 2—3 часа на воздухе, на ровной поверх¬
ности. Затем наносят в одно пятно от 50 до 1000 мкг смеси
гликоалкалоидов. Через 2 часа фронт растворителя (этилаце-
тат, пиридин и вода —20:5:2) должен подняться на 15 см.
После высушивания пластинки проявляются насыщенным раст¬
вором иода в гексане и пятна отмечают иглой. После возгонки
иода пятна с алкалоидами соскабливают в пробирку и исполь¬
зуют для количественных определений.Для качественного определения гликоалкалоидов сравни¬
вают хроматограмму с положением «свидетелей», которыми яв¬
ляются известные гликоалкалоиды.Ввиду того, что реакция на гликоалкалоиды (формалин с
концентрированной серной* кислотой) требует охлаждения
ьдом, что не всегда удобно, Р. Шварц** опубликовал моди-«тр. 585 ^ а с с ш *•и 4 е и к о и Л. Р. Гусева. Биолимня, 21, 1968,
R. S с h w а г г с. Der Zuchter, 32. Z, 1962, p. I5&.851
фикацию метода для количественного определения соланина
без применения охлаждения, заменив серную кислоту на кон*
центрированную ортофосфорную кислоту, а формалин на пара*
формальдегид.Определение гликоалкалоидов для селекционных целей(по Р. Шварцу). Для обнаружения бедных и богатых гликоал-
калоидами клонов картофеля опубликован метод, основанный
на реакции гликоалкалоидов с 38%-ным раствором SbCfo в хло¬
роформе. Для этого на полоски фильтровальной бумаги на*
носят несколько капель вытяжкн из листьев или клубней н
после высушивания погружают на несколько минут в упомя¬
нутый выше реактив. При большом содержании гликоалкалон*
дов образуется ярко-красное пятно, а при бедном —слабое
окрашивание.Быстрое определение гликоалкалоидов в клубнях картофеля.Метод основан на растирании и смешивании навески клубней
(в г) с аликвотным объемом (в см*) 5%-ной трнхлоруксусной
кислоты (ТХУ) в 50%-ном метаноле. После растирания от*
фнльтровывают часть экстракта, берут его аликвотную часть
и после прибавления БЬСЬ-реактява измеряют окраску прн
550 нм ♦.Реактивы и аппаратура: 1) 5%-ный раствор ТХУ в водном растворе
метанола (1:1); 2) раствор треххлористой сурьмы (готовят перед употреб¬
лением; 3 г SbClj растворяют в 2 см* концентрированной соляной кислоты:
кроме того, на каждый грамм SbCI» прибавляют 3 мг аскорбиновой кислоты
при растворении): 3) фотоэлектроколориметр ФЭК-М; 4) пробирки (18X
X ISO мм): 5) мпкроразмельчнтель (см. рис 40).Ход анализа. Из размельченной средней пробы клубней от¬
вешивают навески в сосуд для размельчения. На каждый 1 г
приливают I см* 5%-ного раствора ТХУ в 50%-ном метаноле.
После 4 минут обработки отфильтровывают на складчатом бу¬
мажном фильтре 20—30 сл3 экстракта. Затем берут 2 ел*3 филь¬
трата (что соответствует 1 г пробы клубней) в пробирку и
приливают 8 см3 раствора реактива треххлорнстой сурьмы. Од¬
новременно выполняют слепой опыт. После тщательного смеши¬
вания на встряхивающем аппарате и развития максимальной
окраски (обычно через 15 минут) проводят измерение ее интен¬
сивности. Количественное содержание гликоалкалоидов в пробе
определяют по стандартной кривой. Для составления кривой
берут 5; 10; 15 и 20 мг соланина в 100 см3 5%-ного раствора
ТХУ в 50%-ном метиловом спирте. Кривая имеет прямолиней¬
ный вид и проходит через нулевую точку.Содержание соланина (х) выражают в мг иа 100 г свежих
клубней. Растворы треххлористой сурьмы собирают и регене¬
рируют перегонкой при 225°.*	V. W. Bretzlaff, Am, Potato. Journ. 5, 1971, pp. 158-192.35?
Примечание Техника работы с трех хлористой сурьмой имеет за*
іруднения. Ввиду ядовитости этого реактива необходимо анализы проводить
в вытяжном шкафу, в резиновых перчатках, резиновом переднике к в маске.Определение
стероидных гликозидов
сердечного действияСтероидные гликоэиды содержатся в различных видах рас*
тений нескольких семейств. Эти гликознды являются лечеб¬
ным средством сердечного действия. Они содержатся во всех
органах растений, но, как правило, их больше в верхушечных
листьях н в цветках и особенно в семенах, где концентрация
их достигает 5% и более. Качественный состав стероидных гли¬
козидов в разных органах, так же как и в различные периоды
вегетации, неодинаков.Ниже приводится метод по прописи А. И. Ермакова с изме¬
нениями П. М. Лошкарева.Принцип метода основан на реакции активного водородного
атома пятичленного лактонового кольца (Де— Р и Др—у) с пи-
кратом натрия (реакция Балье). Сердечные гликоэиды, встре¬
чающиеся в растениях, представляют собой соединения агли-
кона с одним или ббльшим числом молекул специфических са¬
харов. Молекулы агликона (генина), состоящие из 23 и реже
из 24 атомов углерода, в основе имеют циклопентапергидрофе-
нантрсн, к которому у семнадцатого углеродного атома присое¬
диняется ненасыщенное пятичленное лактоновое кольцо (аглн-
кон типа строфантидина и дигитоксигенина) или шестичленное
ненасыщенное кольцо (агликоны типа сциллерена). Большин¬
ство гликозидов имеют в аглюконе пятичленное лактоновое
кольцо.Метод слагается из следующих приемов: 1) удаления из
растительного материала веществ гидрофобного характере (ли¬
пидов, пигментов, смол, каучука); 2) извлечения гликозидов из
остатка растительного материала; 3) перевода гликозидов в
раствор водного спирта и очистки экстракта; 4) фото- или коло-
рнметрирования раствора после взаимодействия с пикратом на¬
трия.Реактивы а аппаратура: I) 20%-ный раствор NajSO<; 2) 1%-ный
раствор пикриновой кислоты в 0.5%-ном растворе едкого натра; 3) 10%-ный
раствор NaOH (химически чистого); 4) стандартный раствор гликозидов
(20 мг в 100 сх1 25%-ного спирта), служащий для построения кривой;5)	безводный Na?SO«; 6) 30%-ный раствор основного уксуснокислого свинца;7)	фото эл сктрокол ори метр ФЭК-М или концентрационный колориметр;8)	аппарат Сокслета или его заменяющий.Ход анализа. Приготовление экстракта. Отвешивают
2—10 ±0,01 г воздушно-сухого растительного материала (од¬
нородно измельченного и пропущенного через сито с отверстия-12 Зама М 401а»
ми 0,5 мм) о пакетики из фильтровальной бумаги (9Х 17,5 см).
Одновременно определяют количество воды в материале. Паке¬
тики с навесками помещают в банку на 1 дм3 с притертой проб¬
кой, заливают петролейным эфиром (60—70°) и настаивают з
течение ночи. Утром пакетики после испарения растворителя по¬
мещают в экстрактор аппарата Сокслета по одному и экстра¬
гируют смесью спирта с хлороформом (1:9) в течение 12 часов
или более при двух сливаниях в час.Паропроводящие трубки экстрактора должны быть отеплены
(лучше всего — асбестовым шнуром) для обеспечения необходи¬
мого числа сливов.Получение бесцветной вытяжки. Спирто-хлорофор-
мойный экстракт из колб аппарата Сокслета переносят в мер¬
ные колбы на 200 или 250 см3 и доводят до метки. Отсюда бе¬
рут 25 или 50 см* в колбы на 100 см3 и отгоняют растворитель
на водяной бане.Остатки растворителя удаляют продуванием «грушей». За¬
тем в колбу приливают 10—15 см3 спирта для растворения
сухого остатка при подогревании и добавляют воды до 20—
25%-иой концентрации спирта. При этом гликозиды остаются в
растворе, а примеси выпадают. Мутные растворы переливают
в мерную колбу на 100 см\ промывают несколько раз неболь¬
шими объемами 20—25%-ного спирта и асе собирают в ту же
мерную колбу. После этого прибавляют туда же 5—10 капель
30%-«ого раствора уксуснокислого свинца для осаждения ос¬
тавшихся различных примесей, а затем избыток свинца уда¬
ляют прибавлением 0,5—1 см3 20%-ного раствора сернокислого
натрия. Колбу доводят до метки 25%-ным спиртом, дают осадку
отстояться и фильтруют одновременно избыточный свинец и
осажденные примеси. Получают прозрачные бесцветные рас¬
творы, пригодные для реакции с пикратом и колориметриро-
вания.Реакция с пикратом иатрия. В пробирки наливают
по 5 или 10 см* прозрачного раствора и добавляют столько же
пикрата натрия. Одновременно берут определенные объемы
стандартного раствора из такого расчета, чтобы в 5 см3 содер¬
жалось 0,2; 0,6; 1 мг гликознда, и также приливают 5 см3 пи¬
крата натрия. По истечении 18—20 минут (при 18^) приступают
к колориметрированию. Сравнение опытных растворов со стан¬
дартными производят в близких концентрациях. В этих случаях
получаются наиболее хорошо сравнимые окраски частей поля
колориметра. Если концентрации растворов различаются, то
для сравнения используют другой стандарт или разбавляют
опытный раствор и вновь производят реакцию с пикра¬
том.Стандартные растворы могут быть приготовлены с исполь¬
зованием одного из сердечных глнкозидов, который можно все*
гда приготовить.354
Построение калибровочного графика. Из стан¬
дартного раствора гликозида в 25%*ном спирте, содержащем в1	смг 0,2 мг сердечных гликозидов, отмеривают в пробирки 0,5;
I; 1,5; 2 и до 5 см*, затем объем в каждой пробирке доводят
до 5 см* 25%-ным спиртом и приливают равный объем щелоч¬
ного раствора пикрата. Нулевым раствором служит раствор пи-
крата, разбавленный в 2 раза. Необходимо, чтобы время от на¬
чала реакции раствора гликозида с пикратом натрия до мо¬
мента измерения окраски растоора на ФЭК-М было одинаковым
(около 20 минут). Измерения производят с зеленым свето¬
фильтром и на основании полученных результатов строят
кривую.Если построить на одном н том же графике ряд кривых раз¬
личных гликозидов, то они различаются лишь по высоте рас¬
положения. Для измерения следует избирать кривую для того
гликозида, содержание которого преобладает.Вычисление результатов. Общий вес гликозидов в
навеске равняется количеству гликозидов в I см3 (находят по
кривой), помноженному на общий объем экстракта в мерной
колбе. Далее вычисляют процентное содержание в образце и
пересчитывают на сухое вещество.Вычисление общего процентного содержания гликозидов (JC)
при измерении на колориметре КОЛ-1 производят по формуле;х = (<*•«• 100) гн'6,где: а—-объем спнрто-хлороформенного экстракта;б	—объем, взятый из спирто-хлороформенной вытяжки (а);
в»количество гликозида в объеме (б);
н—навеска сухого материала.Пример вычисления. Навеска воздушно-сухой травы желтушника
б г. Объем спирто-хлороформного экстракта 250 см*. Из этого объема 50 с*9
взято для определения суммы гликозидов. После выпаривания объем глико¬
зидов доведен до 100 (раствор № I).В качестве стандарта взят раствор, содержащий I мг гликозида в 5 см*.
Стандартный раствор установлен в колориметре на высоте 10 мм; среднее
показание из отсчетов для высоты опытных растворов M 1 м М2 равнялось
9.8 мм. Концентрацию гликозидов находят нэ соотношенияК: Кі—Лі :h,где: К — определяемая концентрация гликозида;Ki — концентрация гликозида в стандартном растворе;Л — высота слоя опытного раствора;
h\ — высота стандартного раствора;
Определение
цианогенных глюкозидов
и синильной кислотыГлюкоз иды синильной кислоты распространены среди мно-
гнх культурных растений. Их концентрация коррелирует с со¬
держанием белковых веществ.Определение данной группы глюкозидов в различном све¬
жем растительном материале основано на выделении синильной
кислоты в результате гидролиза глюкозидов соответствующими
ферментами (эмульсин) в определенных условиях яли кисло¬
тами. Определив синильную кислоту, вычисляют глюкозид,
пользуясь соответствующими коэффициентами, или выражают
их в процентах синильной кислоты.Сбор проб для оценки содержания синильной кислогы в
листьях следует проводить в одно н то же время суток, так как
концентрация HCN повышается в жаркие дневные часы и сни¬
жается к ночи. Подвяливание листьев также вызывает сниже¬
ние ее содержания.Меркурометрический метод определения синильной кислоты.
Этот метод определения синильной кислоты в растительном ма¬
териале дает хорошо воспроизводимые результаты, тах как
более четкий конец титрования получается при меркурометриче-
ском связывании синильной, кислоты (по ора&нению с осажде¬
нием азотнокислым серебром). В этом случае осадок не обра¬
зуется, чем устраняются неудобства при титровании, которые
имеются при аргентометрии.Меркурометрический метод основан на улавливании синиль¬
ной кислоты при перегонке титрованным раствором азотнокис¬
лой ртути. Образующееся цианистое соединение ртути
(Hg(CN)s) представляет собой единственное цианистое соеди¬
нение тяжелых металлов, растворимое в воде.Реактивы и аппаратура: I) 0,1 и. раствор азотнокислой ртутн
(Hg(NOi)jl (10,03 г чистой ртутн нагревают в колбе Кьельдаля с 50 ел*
50%-ной азотной кислоты, удаляют окислы азота кипячением, так как по¬
следние разлагают нон родаиа, охлаждают н разбавляют водой в колбе до
1 ДО; из этого 0,1 н. раствора по мере потребления приготовляют 0.01 н.
раствор); 2) 0,01 н. раствор роданистого аммония (NH«CNS) (0.761 г рода¬
нистого аммония растворяют в 1 дм1 воды); 3) индикатор — насыщенный
раствор железоаммонийных квасцов (квасцы растворяют прн нагреваннн до
насыщения—примерно 40%, дают охладиться, отстояться, затем фильтруют;
раствор имеет желтовато-бурый цвет; обесцвечивают его прибавлением креп¬
кой азотной кнелоты, присутствие которой обусловливает более точные реэуль*
та ты; кислоту прибавляют осторожно, до тех пор. пока цвет раствора не пере¬
станет изменяться от дальнейшего прибавления кислоты); 4) 8 н. раствор
азотной кислоты; 6) установка для отгонки с водяным паром (см. рис. 26);6)	колбы иа 500 см\ подобранные к установке для отгонки.Ход анализа. От го« к а синильной к и с л о т ы. Навескуб	і 0,01 г семян (вики, льна, миндаля, персика), или 10 г се¬856
мечковых плодов, или 10 г свежих вегетативных органов (сорго»
клевера и т. д.) растирают с 5 см3 воды, переносят в колбу на
500 см3 и добавляют воды (всего используется 100 см* воды).
В эту же колбу добавляют несколько капель тимола и 3 см*
серного эфира, закрывают пробкой и оставляют на 24 часа для
гидролиза. После этого срока колбу быстро устанавливают для
отгонки с водяным паром и синильную кислоту отгоняют, со¬
бирая дистиллят в колбу на 250 см*, в которую прилито перед
началом отгонки 20 сж3 0,01 н. раствора азотнокислой ртути и
Ю см3 8 я. азотной кислоты. В зависимости от ожидаемого ко¬
личества синильной кислоты в материале количество азотнокис¬
лой ртути должно быть увеличено или уменьшено. Когда будет
перегнано 150 cjk3 жидкости, отгонку заканчивают, обмывают
капилляр 5 см* воды, охлаждают дистиллят, если это требуется,
и приступают к титрованию.Титрование, титрование при меркурометрическом опре¬
делении синильной кислоты заключается в оттитровывании из¬
лишка азотнокислой ртути роданистым аммонием в азотнокис¬
лой среде в присутствии индикатора — железоаммонийных квас¬
цов. количество индикатора, азотной кислоты, а также объем
титруемой жидкости во всех по возможности опытах нужно
брать одинаковыми, исходя из того, что на каждые 100 cjk3
титруемой жидкости следует прибавлять 10 см3 8 и. азотной
кислоты для создания кислой среды и 1—2 см3 индикатора.К объему жидкости в приемнике (180—190 см*) прибав¬
ляют 2 см* индикатора н титруют непосредственно в колбе ро¬
данистым аммонием, постоянно помешивая до неисчезаюшего
розового окрашивания. Перед титрованием устанавливают соот¬
ношение между основным реактивом (азотнокислой ртутью) и
роданистым аммонием при тех же объемах жидкости.Вычисление результатов. Реакция азотнокислой
ртути с синильной кислотой в азотнокислой среде происходит
по следующему уравнению:Hg(NO*h + 2НС1 - Hg(CN), + 2HN03.Из этого уравнения324,626г Hg(NOsh реагируют с 27,0158 г
HCN, или 1 см* 0,01 н. раствора Hg(NOa)s соответствует
0,0002701 г HCN.Процентное содержание HCN (х) вычисляют по формуле:I00'd‘** = —;—.где: а — 0,2701 — количество миллиграммов синильной кислоты,
соответствующее 1 см* 0,01 н. раствора llg(NOab;
б —количество куб. сантиметров 0,01 н. раствора Hg(N03)j,
соединившегося с HCN дистиллята:« — навеска исследуемого вещества (в г).Щ
Пример вычисления. Взято 10 г сырых листьев, соответствующих
2,5 г сухого вещества. На обратное титрование азотнокислой ртути пошло
15.94 сім1 роданистого аммония. На титрование 20 см* 0,01 и. раствора азот*
нокнелой ртути пошло 20 см3 0,01 и. раствора роданистого аммония. Следова¬
тельно, на связывание сииилыюй кислоты пошло 4.06 см* (20—15,94) азотнокис¬
лой ртути. Содержание синильной кислоты (х) в исследуемом веществе равно:0.2701 4.06 100 	х =		= 43,8 мг на 100 «.Этим методом можно определить с большой точностью сотые
н даже тысячные доли процента синильной кислоты в иссле¬
дуемом веществе. По количеству образующейся синильной ки¬
слоты судят о наличии глюкозидов в растениях.Ммкрометод определения синильной кислоты (по А. Ф. Сы¬
соеву) *. Этот метод применим для массовых анализов растений,
не содержащих тиоцианатов (сорго, вика и др.). Метод осно¬
ва» на специфической чувствительности реакции HCN с пири¬
дином и бензидином и поэтому не требует отделения HCN от
других веществ.Реактивы и аппаратура: I) пиркдин-бензидиновый реактив (растворяют
0.8 * сернокислого или 0,73 хлористоводородного бензидина в 100 см1
10%-ного водного раствора пнриднна и добавляют 10 см* концентрированной
НС1; раствор хранят в темной склянке не более недели); 2) бромный раствор
(приливают 5%-ный раствор КОН до слабо-желтой окраски к насыщенному
раствору брома в воде или 0,8% КВг); 3) 2%-ный раствор мышьяковисто-
кислого натрия NbiAsOi (можно технический); 4) 10%-ныЙ раствор три-
хлоруксусной кислоты; 5) бюретки для отмеривания ядовитых растворов;6)	стандартная шкала; 7) торсионные весы (см. рис 41).Приготовление стандартной шкалы. В мерной колбе на
100 см3 растворяют 10 мг парафуксина (основного) в воде и до¬
бавляют 0,5 см3 0,6% -ного раствора метилвиолета, после чего
доводят водой до метки (раствор № 1). Из части раствора
№ 1 готовят раствор № 2 разбавлением в 10 раз. Затем в рав¬
ные по диаметру 9 пробирок (от 2-й до 11-й) наливают рас¬
твор № 2 н в 7 пробирок (от ll-й до 17-й) раствор № 1 в сле¬
дующих объемах (табл. 18).Содержимое пробирок доводят до 2 см* и прибавляют 2 см*
вытяжки из листьев анализируемого объекта. Вытяжку готовят
из 0,2 г высечек из листьев при нагревании с 20 с*3 1 н. NaOH
на кипящей бане (10 минут). После фильтрования вытяжки к
фильтрату прибавляют20 с*310%-ной трихлоруксусной кислоты
(ССЬСООН) и кипятят на водяной бане 20 минут для удаления
HCN. К охлажденному раствору добавляют 2 см3 бромного рас¬
твора и, спустя 2 минуты, 20 см* раствора мышьяковистокислого
натрня, перемешивают и приливают 20 см* пиридин-бензидино-
вого реактива. После выдерживания в холодильнике в течение
суток раствор центрифугируют или фильтруют и фильтрат до-•	А. Ф. Сысоев. Вестник сельскохозяйственной науки, Л) 10, 1962,
стр. 110—111;358
таблица te	Распределена* pacmso-рое фуксина по пробар-
нам стандартной
шкалыМ пробиркиРктмр М 2
(г**)М пробиркиРктвор М 1
<**')10И0,2020,1120.2530,2130.304о.з140,3550,4150,4060,5160.4570.6170,5080,7_—91	_101,5——бавляют в пробирки со шкалой. Пробирки плотно закрывают
пробками или запаивают и устанавливают в одноярусном шта¬
тиве, оставляя свободные места для помещения в них проби¬
рок с опытными пробами (шкалу можно хранить в темноте 2—3	месяца).Калибровку шкалы производят при помощи растворов циа¬
нистого или роданистого калия, содержащих* в 1 см3 определен¬
ное известное количество этих солей (например, 1,5—2 мг).
Для этого берут в 3 сухие пробирки 0,1; 0,2; 0,4 см3 раствора
цианистого или роданистого калия и добавляют воды до 0,5 см*.
После этого прибавляют реактивы (как указано в разделе «Ход
анализа»), начиная с прибавления раствора CCUtOOH. Через
15 минут добавляют 2 см* этилового спирта и появившуюся
окраску немедленно сравнивают с окраской пробирок шкалы.
Отсюда рассчитывают, какому количеству HCN соответствует
окраска пробирок шкалы.Ход анализа. Сбор листьев для анализа производят с одного
и того же яруса, в одно и то же время дня и не допускают под-
вяливания. На одном листе делают 3—4 высечки пластинок
пробочным сверлом (4 мм) и взвешивают на торсионных весах.
Помещают их в пробирки, в которые приливают 0,5 см* 0,05 н.
NaOH, затем нагревают в кипящей бане 15 минут (высечки все
время должны находиться в жидкости). После охлаждения в
холодной воде приливают 0,5 см3 10%-ной трихлоруксусной ки¬
слоты и 2 капли бромного реактива. Затем взбалтывают и по
истечении трех минут (песочные часы) удаляют избыток брома
прибавлением 0,5 см* 2% його Na$As04. Пробирки взбалтываюти.	наклоняя их, смывают стенки от непрореагировавшего брома.
Наконец в пробирки прибавляют 0,5 см* пиридин-бензидннового
раствора, и при наличии цианмлоп раствор постепенно приобре¬
тает красную окраску. Через 15 минут к раствору приливают
2 см? этанола и зафнчснр^ваглую окраску сравнивают со стан*339
дартной фукснновоА шкалой. Окраска раствора сохраняется ц
течение часа, а затем исчезает. Содержание HCN выражают в
миллиграммах или в процентах на 100 г сырого вещества.Приближенно-количественное определение синильной кис¬
лоты в листьях. Принцип метода, модифицированного
М. И. Иконниковой и Т. А. Ката некой, основан на применения
бумажек, пропитанных пикриновой кислотой. Пары синильной
кислоты изменяют золотистый цвет бумажки на оранжево-крас-
ныи. Интенсивность покраснения бумажки зависит от количе*
ства синильной кислоты. Чувствительность реакции — 0,005 мг
синильной кислоты в I дм* воздуха.Приготовление пикратных бумажек. Фильтровальную бу¬
магу пропитывают 1%-ным раствором пикриновой кислоты н
высушивают в темноте при комнатной температуре, затем сма¬
чивают 10%-ным раствором углекислой соды н снова высуши¬
вают в темноте. Высушенную бумагу нарезают полосками
5X50 мм и хранят в стеклянных банках. В термостатах су¬
шить нельзя, так как вызываемое нагревом неравномерное
подсыхание делает бумажку пятнистой и негодной к употребле¬
нию. Бумажки заготовляют не более чем на 6 дней, так как
в течение более длительного срока они меняют свой цвет. Для
проведения анализов употребляют плоскодонные колбы на
100 см3 одинаковой высоты. К каждой колбе подбирают каучу¬
ковые пробки. К нижнему концу пробки наклеивают парафи¬
ном полоску пикратной бумажки. Перед этим концы каждой
полоски сгибают под углом на расстоянии 5 мм от края и оба
конца смачивают расплавленным парафином.Ход анализа. Для анализа берут молодые листья с 3—4
верхних ярусов растений, в одни и те же часы дня —с 12 до
17 часов. Из крупных листьев пробочным сверлом делают вы¬
сечки {не затрагивая жилки) и составляют среднюю пробу. На¬
вески 1—5 г растирают в фарфоровой ступке со стеклом и не¬
сколькими каплями толуола. После этого полученную массу
дистиллированной водой переносят количественно в мерную
колбу на 100 см3, доводят водой до метки, закрывают плотно
пробкой и оставляют на 12 часов при комнатной температуре.
В это время происходит ферментативное расщепление глюко-
знда с освобождением синильной кислоты. Затем содержимое
колбы хорошо перемешивают и из полученной взвеси берут ПО5	см* в 2 опытные колбы. Колбы плотно закрывают пробкой с
реактивной бумажкой и оставляют на 48 часов в темном месте
при комнатной температуре (в помещении не должно быть рез¬
кого перепада температуры). Через 24—48 часов сравнивают
окраску бумажек опытных колб. Тот образец, который не из¬
менил окраски совсем или дал только слабое порозовение,
можно считать мало или практически бесцианистым. В таких
образцах определяют содержание синильной кислоты количест¬
венным меркурометрнческнм методом (из ббльших навесок).ЗЗД
Определение танниновОбщая характеристика таннинов, Таннины широко распро¬
странены в различных органах растений. В качестве промыш¬
ленных источников дубильных веществ используются листья,
плоды, кора, корневища, ядровая древесина. Таннины делят на
2 класса в зависимости от характера их фенольных ядер и спо¬
соба их соединения. В основе структуры таннинов первого клас¬
са находится сахар (ди- или трисахарид), у которого гидро¬
ксильные группы тарифицированы частично или полностью гал¬
ловой кислотой или близкими ей веществами. Они растворимы
в воде, а также легко гидролизуются кислотами, щелочами и
ферментами, ацилгидралазами (таназами) и получили название
гидролизуемых таннинов.Таннины второго класса содержат только фенольные ядра,
которые образуются путем соединения двух или более молекул
катехина, лейкоцианидина или образования смешанного поли¬
мера. Они не гидролизируются на иизкомолекулярные соедине¬
ния и получили название конденсированных таннинов.
Установлено, что лейкоантоцианы в особенности распространены
у растений, накапливающих конденсированные таннины.Наиболее распространенной качественной реакцией на тан-
нин является реакция осаждения или помутнения в присутствии
1%-ного раствора желатина (в 10%-ном NaCI). Таннины дают
осадки с растворами алкалоидов, а также реакции с солями же¬
леза и других тяжелых металлов, которые неслецифичны.Принятые в настоящее время методы для количественного
определения таннинов основаны на их способности соединяться
с белком. Кожаный (гольевый) порошок теперь заменяют по¬
рошкообразным нейлоном, а количество таннина определяют ко¬
лориметрически. Опубликованы методы, основанные на осажде¬
нии алкалоидами.таблица is	Характер и содержанке дубильных веществв различных частях растений, используемых
в промышленности
(в процентах на сухое вещество)Koiueucii’1 Иіролюу*РастениеЧасть растениярораінше
агАилышс
et шел ыРастениеЧасіь pi с ten мисыые іу-
бпдышсWIIICC1MД»» {Кора	8—12СуммахЛистья . . .18—30Древесина . .
Шишки . . .5—6Скумпияв • • •20Ольха24Толокнянка• щ 9 •Корневища15-30ИваКора	7-15Батан20-30Ель7-16КермекКорин ....12-17Лиственница10-15Чухра14—16Сосна7-11Таран13-25Акация• •••••20-35КаштавКора ....13861
В наибольших количествах конденсированные дубильные ве¬
щества накапливаются в коре древесных пород, меньше —8 ли¬
стьях и плодах. В зависимости от анализируемых частей рас¬
тений выбирают и метод для определения таннинов.Определение дубильных веществ осаждением желатином.
Этот метод определения таннина (по П. А. Якимову н Г. В.
Куршаковой, 1961) рекомендуется использовать для сравнитель¬
ной оценки однородных дубильных материалов, при изучении
динамики таннина в процессе роста вегетативных органов» соз¬
ревания плодов и других целей. Испытания, проведенные авто¬
рами метода, показали, что с растворами чистого таннина этот
и стандартный метод дают одинаковые результаты. Однако ре¬
зультаты анализа растительных объектов, получаемые по жела¬
тиновому методу, несколько ниже результатов стандартного ме¬
тода, так как гольевый порошок поглощает часть недубильных
веществ.Метод основан на реакциях таннинов образовывать осадки
с растворами желатина. Сущность метода состоит в титровании
экстрактов таннинов растворами желатина определенной кон¬
центрации. Точность метода зависит от установления момента
полного осаждения.Реактивы и аппаратура: I) 0.4%-ный раствор таннина; 2) 0.5%-ный
раствор желатина; 3) мерные колбы на 250, 1000 сл1; 4) воронки диаметром
5—6 ем. пробирки (20—30 шт.); 5) водяная баня.Приготовление раствора таннина. Растворяют 1 ± 0,001 г
фармацевтического таннина в теплой дистиллированной воде
в мерной колбе на 250 см3 и после охлаждения доводят до
метки и хорошо смешивают. Таннин должен легко и полностью
растворяться в теплой воде. Раствор пригоден для однократного
установления титра раствора желатина.Приготовление раствора желатина. Отвешивают 2,5 ±0,01 г
крупно размельченного пищевого желатина, помещают в ста¬
кан на 100 см3 и настаивают с 50 см3 холодной воды в течение
30 минут для удаления примесей и набухания желатина. Воду
осторожно сливают, а набухший желатин растворяют 8 нагре¬
той до 50* дистиллированной воде, сливая раствор желатина
в мерную колбу на 500 см3, в которую внесено 50 г чистого
хлористого натрия. После этого колбу взбалтывают и раствор
фильтруют через складчатый фильтр. Охлажденный до $0° рас¬
твор доводят до метки. Прозрачный раствор желатина хранят
в закрытой склянке при 5° в холодильнике. Перед началом ра¬
бот раствор желатина каждый раз подогревают до 40° и опре¬
деляют титр. Срок пользования !0 дней.Определение титра раствора желатина по таннину. Берут
при помощи бюретки в 5 сухих пробирок по 5 см3 раствора ган-
нина и затем приливают в пробирки раствор желатина 8 воз*
растающем объеме от 1 до 5 см3 (с интервалом в 1 см3). Про-362
бирки закрывают резиновыми пробками я встряхивают 3 мину¬
ты. Выпавшие осадки желатин-таннатов отфильтровывают в но¬
вые сухие и чистые пробирки через маленькие бумажные филь¬
тры и просматривают в проходящем свете*. Если растворы в
пробирках прозрачны, значит есть избыток свободного такннна,
а если мутны — имеется избыток желатина. В пробирки с про¬
зрачным фильтратом прибавляют из бюретки по 2 капли рас¬
твора желатина, находят предел, при котором фильтрат от при¬
бавления желатина остается прозрачным (полнота осаждения).
Так, если в 1-й пробирке были хлопья, во 2-й —муть, в 3-й —то
же, в 4-й —слабая муть, а в 5-й —раствор остался прозрач¬
ным, то объем раствора желатина, необходимый для полноты
осаждения, находится между 4 и 5 слА Тогда берут 4 пробир¬
ки, отмеривают в каждую по 5 см* испытуемого раствора и при¬
бавляют из бюретки раствор желатина: в 6-ю пробирку —
4,2 см\ в 7-ю — 4,4, в 8-ю — 4,6 и в 9-ю — 4,8 см*. После встря¬
хивания и фильтрования каждой пробирки к фильтратам опять
прибавляют пс 2 капли раствора желатина и наблюдают реак¬
цию. Например, в 6-й пробирке образовалась слабая муть, в
7-й -только слабая опалесценция, а в 8-й и 9-й растворы оста¬
лись прозрачными. Следовательно, необходимый объем рас¬
твора желатина лежит между 4,4 и 4,6 г.н\ или 4,5 см3. Для
проверки берут еще 5 см3 опытного раствора, прибавляют к
нему 4,5 см* раствора желатина, встряхивают, фильтруют и к
фильтрату добавляют 2 капли раствора желатина. Ёсли при
?том раствор останется прозрачным, удостоверяются в правиль¬
ности анализа, если же появится слабая опалесценция — за
искомую величину принимают 4,6 гл3. Титр раствора желатина
вьфажают в граммах таннина. Если прн определении сухого
остатка в 5 см3 раствора таннина найдено 0,0019 г и стандарт¬
ным методом определено 95% таннина, следовательно в 5 cjk3
будет 0,0181 г таннина. Титр же раствора желатина равен
(181:4,6) — 3,98 мг.Ход анализа. Приготовление раствора (экстрак¬
та) дубильных веществ. Отвешивают навески из расчета
чтобы в 1 дм3 содержалось от 3 до 4 г таннинов. Например, бе¬
рут 2 + 0,001 г размельченного материала сухой коры в хими¬
ческий стакан на 100 см3, приливают 40 см* дистиллированной
воды и оставляют на ночь. Утром настой сливают в мерную
колбу на 250 см* через воронку с фильтром из двух слоев
марли, стараясь не переносить частиц материала, а попавшие
частицы переносят обратно в стакан. Затем приливают 30 см*
воды, нагретой до 50°, и настаивают 20 мннут при такой же тем¬
пературе в водяной бане. Сливают второй слив и все операции
повторяют еще 3 раза с той разницей, что третья и четвертая*	Источником соста служит настольная лампе с абажуром, а котором
сделана горизонтальная щель шириной 1 см.363
вытяжки проводятся при 70°, а все последующие — на кипящей
водяной бане. Перед последним сливом проверяют полноту из¬
влечения таннинов. Для этого в пробирку берут 5 см* вытяж¬
ки и прибавляют 1—2 капли раствора желатина. Полнота из-
влечения определяется отсутствием мути.В объектах, содержащих мало дубильных веществ, бывает
достаточно настаивания навесок с водой в течение ночи и 1—2	извлечений. Можно применить извлечение дубильных веществ
холодной и теплой водой, используя для этого макроизмельчи»
телн (см. рис. 40). Однако во всех исследуемых образцах не-
обходимо соблюдать однообразие в получении вытяжек.Вычисление результатов. После охлаждения вытяжке
берут 5 пробирок и в каждую отмеривают по 5 см3 исследуе¬
мого раствора. Затем в каждую пробирку прибавляют титро¬
ванный раствор желатина в последовательно возрастающем
количестве. Анализ выполняют так, как при определении титра
желатина. Устанавливают с точностью до 0,І см3 раствора
желатина, необходимого для перевода в остаток дубильных ве¬
ществ, и умножают на титр.Вычисление содержания таннинов (дубильных веществ) в
коре, листьях, плодах или других органах производят на сухое
вещество.Пример вычисления таннинов в плодах. Навеска сухих
плодов дикоА груши 5 г доведена до объема 200 см*. Из этого объема
взято для аиялмэа 10 см1 вытяжки, на которые пошло 0,5 см* раствора
желатина. Титр желатина соответствует 3,08 мг таннина. Процентное содер*
жание таннинов вычисляют по формуле:0.5*0.00398-200-100 л ^Хяя	Ш	=ж0‘79*При анализе различных объектов этим методом можно по¬
лучить несколько состояний растворов после отфнльтровывания
осадков желатин-таннатов: 1) растворы прозрачны; 2) слабо
опалесцируют; 3) мутные. Первый случай не вызывает никаких
сомнений. Во втором выбирают за конец осаждения самую
прозрачную (переход от слабой опалесценции к очень слабой).
Третий случай наблюдается, если материал содержит очень
мало дубильных веществ и 1 смг раствора желатина является
избытком. Тогда в пробирки с опытным раствором приливают из
мнкробюреткн 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 см3 желатина и определяют с
точностью до 0,1 см3 количество раствора желатина, необходи¬
мое для осаждения дубильных веществ.Стандартный метод анализа дубильных веществ. Этот метод
применяется для оценки растительных и других дубильных ма¬
териалов в практике заготовок и в кожевенном производстве.
Метод дает достаточно точные результаты. К недостаткам его
нужно отнести значительную сложность и длительность ана¬
лиза.864
Принцип метода заключается в поглощении дубильных ве¬
ществ из водных растіоров кожаным порошком, который обра¬
ботан особым способом. При этом таннины (дубильные вещест¬
ва) вступают в реакцию с кожаным порошком, нетажшны ос*
та юте я в растворе. Обычно в изучаемых образцах определяют
общую сумму растворившихся в воде веществ, содержание ду¬
бильных и недубнльных веществ (нетаннннов).Реактивы и аппаратура: I) кожаный порошок; 2) толченое стекло, от¬
мытое от примесей железа; 3) крепкая НС1; 4) 3%-ный раствор хромовых
квасцов KjSO^Crj (SO«)i<24HaO; 8) 1'%-ныЙ раствор желатина в растворе
10%-ного NaCI; 6) 1%-ный раствор AgNO}; 7) экстракторы Проктерв. со¬
стоящие из химического стакана ва 600—800 см\ стеклянного сифона. к од¬
ному концу которого припаяна шарообразная воронка с перетяжкой у краев,
а на другой конец надета резиновая трубка с зажимом, н мерной колбы;S)	воронки, бюксы, пипетки и т. п.Подготовка экстрактора. На дно химического стакана на
500—700 см3 насыпают стеклянный порошок слоем 2—3 см.
Круглое расширение сифона затягивают марлей. На другой ко¬
нец сифона надевают резиновую трубку с оттянутой стеклянной
трубкой, (которая во время экстракции должна быть опущена в
горлышко мерной колбы на 5—7 см. Приготовленный таким об¬
разом сифон расширенной частью погружают в песок до дна
стакана и укрепляют держателем.Приготовление экстракта. Навеску анализируемых дубиль¬
ных материалов берут такой величины (15 — 25 — 50±0,1 г),
чтобы в полученной вытяжке было 3,5—4,5 г таннинов в І дм*
(одновременно берут навеску для определения влажности) н по*
мещают на поверхность песка экстрактора, приливают 125—
150 см2 дистиллированной воды и оставляют на ночь. Материал
должен быть хорошо смочен и покрыт водой.Утром настой сливают (первый слив) через сифон в мерную
колбу на 1 дм* и материал вновь заливают 100 см3 воды, нагре¬
той до 50°. Затем экстрактор с материалом настаивают в тече¬
ние 30 минут прн температуре 50° в бане и второй настой сли¬
вают в ту же мерную колбу. Так настаивают и сливают настой4	раза. Количество слитой жидкости не должно превышать
500 см\ а общая продолжительность настаивания —2 часа. По¬
сле 4-го слива (при 50°) температуру бани повышают до кипе¬
ния и в экстрактор наливают 125 см3 горячей воды*. Каждое
настаивание прн температуре кипения баки продолжается по
30 минут, причем вновь делают 4 слива за 2 часа. Таким обра¬
зом, экстракция длится 4 часа; за это время делают 9 сливов,
не считая ночного настоя. Перед последним сливом нужно про¬
верить материал на полноту извлечения дубильных веществ
(реакция 5 см3 последнего экстрактора с 1—2 каплями раство¬
ра желатина). При появлении осадков надо удлинить время по**	Когда материал очень богат крахмалом, температуру бани поднимают
только до 80е. иначе в дальнейшем затрудняется фнльтроваике я з-эн клей-
стернзацин крахмала.865
следіїего настаивания до одного часа і- опалесценция дону-
стнма.Ход определения общего количества i растворимых веществ.
На следующий день после экстракции, охлажденный раствор
доводят в мерной колбе до метки, хорошо перемешивают и
фильтруют через складчатый фильтр в сухую плоскодонную
колбу на 250 см3. Первые 50 см3 фильтрата удаляют, так как
фильтровальная бумага адсорбирует некоторое количество ду¬
бильных веществ. Из фильтрата бэрут пипеткой 2 пробы по
25 см3 в заранее взвешенные бюксы диаметром 5—6 см*. Бюксы
ставят на кипящую водяную баню и выпаривают досуха.Определение количества недубильных веществ. Для дневной
нормы отвешивают 97,5 ;£ 0,1 г кожаного порошка (по 7,5 г на
пробу). Навеску кожаного порошка осторожно переносят в банку
на 2 дм3 и заливают 10-кратным количеством воды (975 см9),
к которой предварительно прибавлено 86,5 cjk3 3%-ного раство¬
ра хромовых квасцов. Иногда обычный (продажный) кожаный
порошок уже заранее хромирован и не нуждается в такой об¬
работке. Хромируют кождный порошок для уменьшения набу-
хасмости.После прибавления хромирующей омеси банку плотно за¬
крывают резиновой пробкой, обернутой куском пергаментной
бумаги, и всю смесь встряхивают в течение часа на механиче¬
ской качалке. Затем порошок 4—5 раз промывают дистиллиро¬
ванной водой в большом кристаллизаторе. После каждой про¬
мывки отжимают от порошка избыток воды через капроновое
сито (чулок). Промытый и плотно отжатый порошок сразу раз¬
вешивают в материальные банки на 250 см3 следующим обра¬
зом: скачала взвешивают всю массу порошка, затем его закры¬
вают полотном и делают вычисление количества влажного по¬
рошка, приходящегося на одно определение. Например, вся
масса весила 308,1 г, что рассчитано на 13 проб. Следователь¬
но, на каждую пробу приходится 308,1:13 = 23,7 + 0,01 г влаж¬
ного кожаного порошка. В каждую банку с кожаным порошком
прибавляют дистиллированной воды, чтобы общее содержание
ее в навеске составляло 36,5 г (36,5 — 23,7 « 12,8 сл3).После этого в каждую банку прибавляют по 100 cjk3 вы¬
тяжки. В одну из банок вместо вытяжки наливают 100 cjk3 ди¬
стиллированной воды (контроль на растворимость кожаного
порошка в воде). Затем банки закрывают пробками и встря¬
хивают 40 минут на механической качалке для соединения
(дубления) порошка с находящимися в вытяжке таннннами.
После встряхивания обездубленные вытяжки фильтруют через
бумажный фильтр в плоскодонные колбы на 250 cjk3. Первые
порции фильтрата часто бывают мутные, и их вновь возвращают
на тот же фильтр, пока фильтрат не станет прозрачным. Затем
из каждой колбы отмеривают пипеткой по 50 cjk3 фильтрата в
заранее высушенные и взвешенные бюксы (диаметром 5—6 cjk),366
выпаривают досуха на водяной бане н высушивают при 100—
105°.Вычисление результатов анализа. Все расчеты яри опреде¬
лении дубильных веществ производят условно на материал 13%-
иой влажности. Вычисляя содержание растворимых ве¬
ществ (Р), учитывают, что для выпаривания взято 25 г*3
экстракта, в котором найдено 0,175 г сухого остатка; следова¬
тельно, в 1 дмг было 7,00 г. При расчете на 13%-ную влаж¬
ность навески получено 43,75%. При вычислении количества
недубильных веществ (НТН) учитывают, что для выпа¬
ривания взято 50 см3 раствора, в котором найдено 0,139 г су¬
хого остатка; поправка на растворимость кожаного порошка
0,005. Следовательно, НТН составляли 0,133 г (0,139 — 0,006).
Затем делают поправку на влажность кожаного порошка, кото¬
рый содержал 30 см? воды, и поэтому поправка на разбавления
будет 2,6. Следовательно, в 1 дм? было 3,20 г (10*0,123*2,6)
НТН. В расчете на навеску с 13%-ной влажностью получено
20%.Содержание таннинов находят по разности между общим
количеством растворимых веществ (Р) и нетаннинами (НТН):43,75 — 20 * 23,75 %.Определение дубильных веществ в семенах. Метод основан
на применении мочевины и железоаммиачных квасцов (В. Май-
баум, С. Кудревич) *.Для суммарного определения дубильных веществ перед упо¬
треблением готовят реактивную смесь, состоящую из 50%-ного
раствора мочевины в 0,1 М ацетатном буфере (pH 4,7),1%-ного
раствора гуммиарабика и 5%-ного раствора NH*re(S04h* 12Н*0
в соотношении 90:10:1.Для анализа берут навеску измельченных, необезжиренных
семян, извлекают водой н 50%-ным раствором мочевины в те¬
чение часа при комнатной температуре. Раствор мочевины из¬
влекает дубильные вещества семян полностью. К 1 см3 опыт¬
ного экстракта прибавляют 4 см? указанной смеси реактивов
и после перемешивания определяют интенсивность окраски при
680 нм на фотометре. Окраска устойчива в течение двух часов
и ее интенсивность пропорциональна концентрации дубильных
веществ в интервале 40—400 мкг в 5 см*.Для вычисления результатов строят калибровочный график
по водным растворам пирокатехина, галловой кислоты или очи¬
щенного галлотаннина. Производные галловой кислоты обра¬
зуют фиолетовую окраску, а пирогаллола и пирокатехина — зеле¬
ную. Резорцин, флюроглюцин, ванилин, фенилаланин этим ре¬
активом не проявляются.•	В. Maybaum. С. Kudrewitcb. Acta biocbim. polon., 13, N 1,
1966.367
Определение капсаицина*Пряные CBoftcTea стручкового перца обусловлены капсанци*
ном, или ванилиламид-7-метилоктен-б-карбоновой кислотой. Со*
держание последней колеблется от 0,01 до 1% на сухое веще*
ство перцев. По данным В. Л. Газенбуша, капсаицин сосредо¬
точен только в тканях плаценты. Это вещество имеет форму
тонких белых кристаллов, не растворимых в холодной воде н
растворимых в метиловом и этиловом спиртах, эфире, хлоро¬
форме и бензоле. Капсаицин сильно раздражает слизистые
оболочки и кожу, ускоряет кровообращение, стимулируя обмен
веществ, и имеет большое фармакологическое и косметическое
значение.Принцип метода основан на извлечении капсанцина, отделе¬
нии его от примесей и определении спектрометрическим или
одним из двух рекомендуемых колориметрических методов с ис¬
пользованием реакции с диазобензосульфокнслотой или с 2,6-
дихлорбензхиион'4-хлоримииом (реактив Гиббса). С последним
реактивом получают более воспроизводимые результаты.Способы извлечения капсанцина. Для извлечения н после*
дующего определения капсанцина существует несколько спо¬
собов.Реактивы и аппаратура: I) метанол абсолютный (приготовление см. на
стр. 340); 2) окясь алюминия 1 — по Брокману; 3) активированный уголь;4)	хроматографическая колонка 20 см длиной н 18 мм диаметром (см.
рис. 15).Хроматографическое извлечение капсаицина. Работу начи¬
нают с наполнения колонки. На пористую пластинку колонки
вносят 12 г А1*Оз в смеси с метанолом. Поверх окиси алюминия
добавляют смесь из 0,9 г активированного угля и 0,5 г силика*
геля также в виде суспензии с метанолом. Сверху наполнители
покрывают слоем ваты. Колонку промывают примерно 100 см*
метанола и над ватой оставляют слой метанола в 5 см.Ход анализа. Осторожно отвешивают около 5—10 + 0,01 г
тонко измельченного (в среднем до 0,5 лш) стручкового перца
и экстрагируют метанолом в аппарате Сокслета не менее 6 ча¬
сов. Полученный экстракт переливают в мерную колбу на 100
или 200 см9 и доводят метанолом до метки прн 20°.Пробу экстракта (100 см*) пропускают через наполненную ко¬
лонку, сохраняя всегда слой метанола под ватной пробкой, и
элюируют абсолютным метанолом. В течение 4—5 часов соби¬
рают 450 см* элюата и выпаривают его на водяной бане до
50 см*. Затем переливают остаток в мерную колбу на 100 см\
доводят до метки метанолом и хорошо смешивают.Далее проводят определение капсаицина в этом растворе
по одному из методов, приведенных ниже (стр. 369). Если ис¬•	Analyst, 89, 196«, р. 382,аы»
пользуют спектрофотометрическое определение, го метанол дол¬
жен быть очищен (стр. 430).Эфирно-щелочное извлечение капсаицина. Me-
гаполовый экстракт (100 cjk3) капсанцнна переливают в дели*
тельную воронку на І5Ф-200 см3 и, прибавив 2 г NaCI и 5 см3
0,1 н. раствора едкого натра, хорошо встряхивают. После этого
капсаицин 3 раза извлекают петролейным эфиром (точка ки¬
пения 80—100°) порциями по 10 см3. Затем объединенные пе-
троленные вытяжки промывают 2 раза по 5 cjk9 60%-ным мета¬
нолом. Слитые вместе водно-метаноловые вытяжки фильтруют
через ватную пробку и промывают ее 10 с.и3 60%-ного мета¬
нола. После этого метанол выпаривают на водяной бане до объ¬
ема 5 см3 и разбавляют дистиллированной водой до 50 см\ под¬
держивая рп в пределах 7—7,5 при помощи 0,1 н. соляной ки¬
слоты (концентрацию водородных ионов контролируют рН-мет-
ром или фенол красным индикатором). Наконец из водного
раствора капсаицин извлекают диэтнловым эфиром 6 раз
по 20 елі3. Объединенные эфирные вытяжки промывают 10 см3
дистиллированной воды. К промытой объединенной эфирной вы¬
тяжке в делительной воронке добавляют 20 см3 абсолютного
метанола, а затем раствор упаривают до 1 см9. После этого
к остатку приливают метанол и переносят все в мерную колбу
на 100 cjk3.Колбу доводят метанолом до метки, добавляют 0,05 г акти¬
вированного угля и после хорошего встряхивания фильтруют
или центрифугируют.Далее производят определение капсаицина одним из следую¬
щих методов.Диазо-колориметрический метод определения. Метод основан
на реакции метанолового раствора с диазобензосульфоновой
кислотой.Реактивы: I) 0.4%-ный раствор диаэобенэолсульфокислоты — C#HjN п
н NSOi в приблизительно 0.25 и. соляной кислоте (готовят этот раствор све¬
жим и сохраняют на льду); 2) 0,33%-ныЙ водный раствор Nal; 3) стандарт¬
ный раствор капсанцнна (растворяют чистый капсаицин в абсолютном мета*
ноле в концентрации 0,13 мг в I см3).Приготовленім диазобензосульфокислоты. Растворяют 2 +
+ 0,01 г сульфониловой кислоты (NHjCe^SOa • НгО) в 15
8%-ного едкого натра и 4 см3 20%-ного водного раствора
NaNOi в колбе, погруженной в баню со льдом, и добавляют
при взбалтывании 4 см3 соляной кислоты (плотн. 1,18), охлаж¬
денной на льду. Осадок полученной дназобензосульфоноаоЙ ки¬
слоты промывают на предварительно охлажденном стеклянном
тнгле № 3 последовательно 100 см9 ледяной дистиллированной
воды, 25 см3 метанола н 25 cjk3 диэтилового эфира.Ход анализа. Для выполнения реакции с капсаицином берут
пипеткой порции раствора капсаицина в метаноле (содержа¬
щего or 0,35 до 0,70 мг капсаицина, это необходимая концен¬309
трация раствора) в мерные колбы на 20 ем*, погруженные в ле¬
дяную баню, н, если необходимо, объем доводят до 10 см* ме
танолом, затем прибавляют 2 см3 раствора едкого натра н че¬
рез 10 минут приливают 2 см* раствора/дназобензосульфоновой
кислоты. Смесь хорошо встряхивают и через 15 минут стояния
при комнатной температуре приливают 2 см* 0,33%-ного рас-
твора NaJ, а затем 2 см3 разбавленного раствора соляной кис¬
лоты. Колбу хорошо встряхивают и нагревают, погружая колбу
на 15 минут в водяную баню, нагретую до 60—70°. Охладив со¬
держимое колбы, доводят ее до метки раствором едкого натра
(если во время охлаждения раствор мутнеет, то прибавляют не
более двух капель днэтнлового эфира перед доведением до
метки).В случае необходимости раствор фильтруют через фильтро¬
вальную бумагу (ватман № 542), отбрасывая первые 5 см3
фильтрата. Оптическую плотность полученного раствора изме¬
ряют в 1 см кювете при 480 нм по сравнению с кюветой с дис¬
тиллированной водой.Одновременно разбавляют метанолом порции стандартного
раствора капсаішнна 3; 4; 5 см* до 10 см3 и выполняют такие
же определения с каждым раствором, как было описано для
опытного раствора.Составляют график, в котором оптическая плотность соответ¬
ствует количеству микрограммов капсаицина, и по нему узнают
содержание капсаицина в опытном растворе.Колориметрический метод Гиббса. Метод основан на реак¬
ции раствора капсаицина с реактивом Гиббса.Реактивы: П метанол (абсолютный); 2) буферный раствор, pH 9,4 (раст¬
воряют 3,1 ± 0.01 г чистой для анализа борной кнелоты и 3,7 г чистого для
анализа хлористого калия в 750 см* дистиллированной воды и доводят pH
до 9,4 раствором едкого натра около 32 сяР н. раствора NaOH, после чего
раствор разбавляют водой до I ДО); 3) реактив Гиббса (растворяют около
I г 2,6-дпхлор-р*бензохннон*4-хлорнмина в 50 см1 ацетона, фильтруют раствор
и осаждают реактив, прибавляя небольшое количество воды при постоян¬
ном размешивании, употребив всего 200 см? воды; кристаллы собирают иа
воронке Бюхнера, быстро сушат при отсасывании и затем высушивают в
сушилке; реактив хранят в запечатанной банке, в холодильнике; перед упот*Їеблснием готовят раствор 0.1%-ного перекристаллиэованного реактива
иббса в абсолютном метаноле).Ход анализа. Берут 5 см3 раствора капсаицина в метаноле,
приготовленного так, как указано выше, в мерную колбу на
50 см*, приливают 40 см* буферного раствора и хорошо встря¬
хивают, выдерживают 15 минут в водяной бане при 20° и до¬
бавляют 1 см* реактива Гиббса, после чего колбу ставят в тем¬
ное место на 25 минут. Затем содержимое колбы перемеши¬
вают и доводят до метки буферным раствором. Оптическую
плотность определяют при 595 нм в кювете шириной 2 см
в сравнении с дистиллированной водой.479
Вместо раствора капсаицина приготовляют холостой раствор
с 5 см3 метанола и производят те же операции, что и с опыт*
нЫм раствором; показання оптической плотности сравнивают с
дистиллированной водой. При 595 нм (миллимикрон) Е\*ем со¬
ответствует величине, равной 470.Определение госсиполаОпределение госсипола анилиновым методом. Госсипол-кра-
сящее ядовитое вещество хлопкового семени, встречается во
всех частях хлопкового растения. В семенах госоипол находит¬
ся в свободном и связанном, измененном состоянии. Госснпол
является 2,2-д и-1,6, 7-тригидроокси-3-метил-5-нзопропил-8-альде-
гидо-нафтолом. В сыром масле хлопчатника находится госсипол,
который окрашивает его в темно-красный цвет.Метод определения госсипола основан на реакции взаимо¬
действия госсипола с анилином и образовании нерастворимого
в некоторых органических растворителях осадка — дианилин-
госсипола.Реактивы и аппаратура: 1) серный эфир, свободный от перекиснім со¬
единений; 2) петролейный эфир с точкой кипения 60—80°; 3) анилин све-
жеперегиакный над цинковой пылью; он должен быть слабо-желтого цвета;4)	пиридин; 5) аппарат Сокслета емкостью 100 см3; 6) стаканчики и воронкм
с пористой пластинкой № 3; 7) пробирки с отростками на 50 см*; 8) колбы
Бунзена ii Вюрца.Ход определения свободного госсипола. Извлечение гос¬
сипола. Навеску воздушно-сухих ядер хлопковых семян 8—
10 г, предварительно хорошо измельченных (в мельнице типа
«Пируэт» и дополнительно в ступке), заделывают в бумажный
патрон, прикрывают сверху небольшим слоем ваты и помещают
в экстрактор аппарата Сокслета (см. рис. 29). Экстракцию про¬
водят 20—24 часа, до потери окраски. Затем эфир отгоняют в
аппарате Сокслета до объема экстракта 30—40 см3. Оставший¬
ся эфирный экстракт профильтровывают через стеклянный
фильтр № 3. Фильтрат помещают в коническую колбу на
100 см\ добавляют 2 см8 анилина и отгоняют эфир на водяной
бане при температуре 40—50®.Осаждение госсипола. Костатку добавляют 6 с.мэпи¬
ридина, взбалтывают и оставляют в теплом месте (50—60°) на
час. Выпадает осадок дианилнн-госсипола, но для полноты оса¬
ждения раствор оставляют на 2 суток. Осадок отфильтровы¬
вают через стаканчик с пористой пластинкой № 3, отсасывая
водоструйным или масляным насосом. Полученный осадок дна-
нилин-госсипола и колбу промывают 50—60 сл*3 (малыми
порциями) смеси 96-градусного спирта и петролейного эфира
(1:2). Необходимо, чтобы масло было смыто с краев стакан¬
чика. Стаканчики с осадком высушивают в течение часа при271
100—105° до постоянного веса, охлаждают и взвешивают на
аналитических весах.Ход определения связанного госсипола. Извлечение го с*
с и п о л а. Для количественного определения связанного госси¬
пола навеску после извлечения свободного госсипола помешают
в коническую колбу на 100 см3 н в нее приливают двойной
объем анилина (от взятой навески), после этого нагревают на
песочной бане при 110° в течение 5 минут. Затем анилиновый
экстракт отфильтровывают через воронку с пористой пластин¬
кой Лв 3 в колбу Вюрца на 250 см3. Остаток в конической колбе
промывают серным эфиром (до слабо-желтой окраски).Отгонка растворителей н осаждение. Эфир от¬
гоняют на водяной бане, после этого отгоняют анилин до объ¬
ема 5—6 см3 под вакуумом. Остаток содержит дианилин-госси-
іюл, который переводят из колбы Вюрца в коническую колбу,
смывая 6—9 см3 пиридина. Колбу Вюрца промывают петролей¬
ним эфиром с точкой кипения 60—80° (75 см3) и после встря¬
хивания в течение 15—20 минут оставляют на 2 суток для пол¬
ного осаждения. В дальнейшем поступают так, как описано
выше. Полученный вес осадка уменьшают на 0,775 (коэффи¬
циент, характеризующий соотношение между госсиполом и дна-
ннлин-госсиполом) и вычисляют вес госсипола в навеске.Пример вычисления. Для определения госсипола была взята на¬
веска размельченных ядер семян мексиканского хлопчатника — 6.0 г, найден¬
ный вес сухого осадка днанмлнн-госсипола составлял 0,0815 е.Содержание госсипола (х) в воздушно сухих семенах будет:0.0815.0,775-100 . 	*	=	О	=я1'03%Определение госсипола п-анизиднновым методом. Опреде¬
ление госсипола основано на реакции госоипола с параанизи-
дином. В результате образуются параанизидниовые производ¬
ные, имеющие характерную полосу поглощения при длине вол¬
ны 447 нм. Ниже приводится описание метода в модификации
ВНИИЖ.Реактивы и аппаратура: 1) 1%-ный раствор парааннзиднна (навеску
0,25 г предварительно перекристаллизоваиного парааннзиднна — кристаллы
белого цвета — растворяют в 80%-ном изопропиловом спирте в мерной
колбе на 25 см*, добавляют 0,5 см1 ледяной уксусной кислоты н доводят
до метки 80%-ным изопропиловым спиртом; раствор готовят ежедневно
свежий); 2) 2%'ИЫЙ раствор уксусной кислоты в 80%-ном изопропиловом
спирте (I см* ледяной уксусной кислоты разбавляют до объема 50 сл1
80%-ным нзопропанолом); 3) изопропиловый спирт (разбавляют дистилли¬
рованной водой до 80°/о*ной концентрации по объему); 4) водный раствор
ацетона (70 см1 ацетона и 30 еж* воды); 5) спектрофотометр или фото-
»лектроколорнметр (см. рис. 27).Ход анализа. Извлечение госсмпола. Навеску тонко
измельченного ядра хлопчатника 200—300 мг помещают в кони*
ческую колбу и приливают 50 см3 водного раствора ацетона.
Колбу закрывают пробкой, содержимое колбы несколько раз
перемешивают н оставляют стоять 5 минут. После этого вновь872
перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Сразу же
берут по 2 см* фильтрата в мерные колбы на 25 см\ В одну из
колб прибавляют 3 ел* раствора уксусной кислоты и доводят
80%-<ньш изопропиловым спиртом до метки. В другую колбу при*
бавляют 3 см* параанизидина. Одновременно готовят контроль¬
ные пробы. Для этого в мерные колбы на 25 cjk3 вносят 2 см*
водного раствора ацетона. В одну из них (№ 1) добавляют3	см* раствора уксусной кислоты и доводят 80%-ным изопропи¬
ловым спиртом до 25 cjk3.В другую контрольную пробу (№ 2) прибавляют 3 см* пара¬
анизидина. Обе колбы с парааннзидином (опыт и контроль) на¬
гревают 30 минут на водяной бане при 60°. Затем охлаждают
и доводят объем до метки 80%'ным изопропанолом.Фотометрирование. Определение растворов проводят
на спектрофотометре СФ-4 при длине волны 447 нм и толщине
слоя 1 см или же <на фотоэлектроколориметре с использованием
светофильтра с максимум поглощения 447—468 нм.Вначале определяют пропускание раствора с параанизиди-
ном (Т\) по отношению к контрольной пробе X* 2, а затем про¬
пускание раствора с уксусной кислотой' (Га) по отношению к
контрольной пробе № I. Затем находят логарифм отношений.
Вычисление производят по градуировочному графику или же
по формуле:	тalg-jr
х — н *где: х—процент госсипола;а — пересчегный коэффициент (при работе на приборе
СФ-4 равен 0,828);
я—навеска.Составление калибровочного графика. Для со»
ставлення градуировочного графика готовят стандартный рас*
твор госсипола. Навеску 25 мг госсипола помещают в мерную
колбу на 200 слР и доливают до метки водным раствором аце¬
тона (1 cjk3* 0,125 мг госсипола). Затем в мерные колбы на
25 cjk3 вносят следующие количества стандартного раствора: 3;
6; 9; 12; 15; 18; 21 cjk3 и доводят до метки водным раствором
ацетона. В 2 cjk9 разбавленных растворов соответственно со¬
держится: 0,03; 0,06; 0,09; 0,12; 0,15; 0,18; 0,21 мг госсипола.
В дальнейшем берут из каждой колбы по 2 cjk3 раствора, прово¬
дят процедуру по описанной выше методике и находят коэффи¬
циенты пропускания (Г*— с парааннзидином и Т%—с уксуснойкислотой). Вычисляют для каждого раствора и строят
градуировочный график, откладывая на оси абсцисс количество
госсипола, а на оси ординат—величины lg-y2-. Находят коли¬
чество госсипола в пробе и выражают полученные данные в
процентах.873
Определение кумарннов
и фурокумариновКачественное определение кумарннов и фурокумаринов ме
тодом хроматографии на бумаге. Многие кумарины и фу року м а
рины флуоресцируют при УФ-облучении спиртовых и водных
щелочных растворов. $то свойство было положено в основу ме¬
тодов определения кумаринових соединений.Реактивы и аппаратура: 1) 20%-ный растпор этиленгликоля; 2) 2 н.
водный раствор КОН; 3) днаэотированный п-нптроанилин (5 си1 0.5%-ного
раствора гыштроанилина в 8%-ном растворе НСІ. перед употреблением
смешивают с 0,5 см* 5%-ного раствора NaNO»); 4) хроматографическая
бумага (ленинградская, марки «Б»; полоски бумаги шириной 4 см помещай*i
в сосуд с 20%-ным раствором дтиленглнколя на 10 мннут. затем подвеши¬
вают для стенания растворителя на 10—15 минут, после чего сушат в тече¬
ние 25 мннут при 50°; подсушенные полоски бумаги содержат 35—40*4
З.ГИЛЄНГЛИКОЛЯ — иа ощупь чуть влажные); 5) УФ-лампа.Ход анализа. Помещают 0,5 —2 і 0,01 г в зависимости от
содержания веществ воздушно-сухого материала в пробирку,
добавляют 15 см% 96%-його этилового спирта и настаивают
24 часа при комнатной температуре. Затем пробирку погружают
в баню, нагретую до 60°, и через час спиртовой экстракт отфиль¬
тровывают. Осадок на фильтре промывают 2 см3 этанола. Филь¬
трат упаривают в пробирке на кипящей водяной бане до уда¬
ления растворителя, остаток растворяют в 0,5 см3 смеси спирта
с ацетоном (1:1); 0,04 слэ экстракта наносят на полоску хро¬
матографической бумаги на расстоянии 7 см от края, к кото¬
рому стекал растворитель. После высушивания нанесенных ка¬
пель полоску (концом с нанесенной каплей) подвешивают в хро¬
матографической камере, в верхней части которой помещают
сосуд с петролейным эфиром (60—70°); хроматография нисхо¬
дящая. Хроматографирование длится 1,5—2 часа прн 20°
(фронт прохождения растворителя 30—35 см3). Полоски выни¬
мают, высушивают на воздухе под тягой и просматривают
свечение пятен под УФ-лампой. Флуоресцирующие пятна кумарн¬
нов и фурокумаринов очерчивают. Затем хроматограмму опрыс¬
кивают *2 н.* раствором КОН, высушивают при 80° и снова
просматривают в УФ-свете. Отмечают цвет и интенсивность флу¬
оресценции до и после обработки щелочью. Для кумарннов
наиболее характерно фиолетовое, сиреневое, голубое, синее све¬
чение, для фурокумаринов — желтое и зеленое. Наконец,
хроматограмму опрыскивают раствором дназотированногэ
п-нитроаннлина, с которым кумариновые производные дают
цветную реакцию. При наличии «свидетелей» можно определять
относительную концентрацию компонентов вытяжки.В случае наложения пятен проводят хроматографирование в
разных условиях с различными системами растворителей для374
разделения веществ с близкими значениями Rf. Используют
также цветные реакции *.Для аналитических и препаративных целей применяют так¬
же метод тонкослойной хроматографии. Хорошее разделение ку-
маринов и фурокумарннов получают, используя системы раство¬
рителей: изобутилацетат — бензол (1:2), этил ацетат — бензол
(1:2), хлороформ— летролейный эфир (1:2). Проявление ку-
маринов и фурокумарннов на хроматограммах производят по
флуоресценции при УФ-освещении.Для качественного и приближенно количественного опреде¬
ления кумарина в работах по селекции бескумаринного донни¬
ка применяют метод М. И. Смирновой-Иконниковой и Р. Б.
Гельчинской (А. И. Ермаков и др., 1952, стр. 418).Количественное определение кумаринових соединений (по
Г. К. Никонову с соавторами) **. Кумариновые соединения ши¬
роко распространены в растительном мире. Они обнаружены в
вегетативных органах и плодах таких культур, как пастернак,
петрушка и др.Для определения отвешивают 25 г мелко измельченного ма¬
териала (корнеплодов, корней) экстрагируют 250 см3 хлорофор¬
ма настаиванием в течение 24 часов. Навеска, а соответственно
и количество растворителя могут быть уменьшены. Раствор
отфильтровывают и 200 смъ его отгоняют в колбе досуха. К ос¬
татку прибавляют 20 см3 10%-ного раствора NaOH, нагревают5	минут на водяной бане, жидкость переносят в делительную
воронку и кумарины четырехкратно извлекают хлороформом пор¬
циями по 25 см3. Оставшийся щелочной раствор подкисляют
20%-ным раствором серной кислоты и извлекают порциями хло¬
роформа по 25 см* 3—6 раз (проба на сухой остаток). Хлоро¬
формные экстракты объединяют, взбалтывают в делительной во¬
ронке с 20 смъ 5%-ного раствора Na2C03, затем с 20 см* воды
и высушивают безводным сульфатом натрия. Отфильтрованный
раствсю отгоняют во взвешенной колбе, остаток высушивают
при 7(г до постоянного веса и вычисляют процентное содержа¬
ние кумариновых соединений.Быстрый флуорометрический метод определения кумарина
(всех соединений). Метод позволяет производить быстрый отбор
растений с низким содержанием кумарина и близких ему соеди¬
нений.Принцип метода основан на свойстве кумарина в присутст¬
вии водного раствора NaOH давать зеленую флуоресценцию в
УФ-свете, интенсивность которой указывает на концентрацию
кумариновых соединений в растительном материале. Хлорофилл
реагирует слабее, вызывая слабо-красную флуоресценцию.*	Г. А. Кузнецова. Природные кумарины я фурокумарини «Наука»,
1967. стр 22—23.•• Г- К- Н и к о н о а н др «Аптечное дело», 4, 1963.375
На каждом исследуемом растении обрывают 10 или больше
листьев одного и того же яруса; листья высушивают при ком¬
натной температуре в течение 3—4 дней. Отвешивают 100 мг
сухих размельченных листьев и кипятят в течение двух часов
с 2,5 см5 и. раствора NaOH. При этом кумарин переходит в
ортокумариновую кислоту, которая оильно флуоресцирует. Про¬
бирки с пометкой до 15 см* доводят водой до метки, встряхи¬
вают и дают отстояться. Затем отбирают в фарфоровую ча¬
шечку (лишенную пятен) немного жидкости и просматривают
в ультрафиолетовом свете.Бескумаринные образцы будут флуоресцировать слабо-буро*
красным цветом, образцы с низким содержанием кумарина’бу¬
дут иметь красно-зеленую флуоресценцию, тогда как высоко-
кумаринные — блестящую зеленую флуоресценцию*.*	J. М. SI a tenek, Е. К. Washburn. J. Amer. Sos. Agricn 36, b, ІіЖ.
Определение
изопреноидов
(эфирных масел
глава хи/ и каучука)*Особенности
эфирных масел и каучука
и методов их определенияЭфирные масла обнаружены в различных органах расте-
ннй —листьях, стеблях, корнях, почках, цветках, плодах, семе¬
нах. Среди эфирных масел установлено свыше 500 различных
химических веществ — терпены, сесквитерпены, дитерпены, выс¬
шие терпены и их многообразные производные, а также нетер-
леновые соединения — нзотиоционаты (крестоцветных), органи¬
ческие сульфиды, индол и эфиры аитраниловой кислоты (по¬
следние определяют запах цветков жасмина и плодов апель¬
сина) и нормальные углеводороды. Однако в эфирных маслах
преобладают терпены (С10Н5), сесквитерпены (С|$Н>4) и их раз¬
личные производные. В разных органах одного и того же расте¬
ния содержание эфирных масел неодинаково; обычно они зна-
чительно преобладают только в каком-либо одном органе. Для
выделения связанных пахучих веществ требуется предваритель¬
ное расщепление их ферментами. Терпены, составляющие пре-
обладающую часть пахучих веществ, являются очень лабиль¬
ными веществами, склонными к различным превращениям. Для
биологии представляет большой интерес наблюдаемое химиче¬
ское родство терпенов со стеринами, каучуком и каротинои-
дами.В основе их строения лежит изопрен (CsHe), все атомы изо-
преновых остатков происходят от ацетата, что доказано в опы¬
тах с меченым С,4-ацетатом.Пахучие вещества накапливаются в растениях в небольших
количествах (до 1%), однако в некоторых растениях количе¬
ство эфирного масла достигает 10% и больше (в семенах аж-
гона, анизета и др.).Количество эфирного масла в пределах одного вида (или
культуры) отличается большой изменчивостью, достигающей
10— 100-крагных величин.Количество и качество эфирного масла изменяются в про¬
цессе индивидуального развития растений. В различных орга¬
нах эти изменения у разных растений носят неодинаковый ха¬
рактер. Например, в семенах кориандра максимальное холиче-377
ічво эфирного масла накапливается к периоду молочной спе¬
лости плодов, а к созреванию плодов количество масла резко
снижается. В других растениях максимальное количество масла
приходится на период полного созревания плодов.Изменения качества эфирного масла происходят в каждом
органе сообразно с изменениями условий произрастания. Изу¬
чение влияния условий произрастания, а также влияние гибри*
дизации на образование н накопление пахучих веществ а
растениях требуют соответствующих биохимических мето¬
дов.Как правило, количественное определение эфирного масла
основано на его свойстве перегоняться с водяным паром при
нормальном или уменьшенном давлении. По отдельным физиче¬
ским и химическим показателям можно судить о качественных
различиях и изменениях. Прн биохимической оценке культур и
сортов необходимо учитывать влияние на содержание и состав
эфирных масел не только условий выращивания и индивидуаль¬
ного развития растений, но и условий подготовки материала к
анализу. Эфирные масла s вегетативных органах необходимо
определять в свежеубранном (сыром) материале, так как суш¬
ка приводит к различным изменениям. Время сбора проб для
анализов (утренние или дневные часы) также имеет существен¬
ное значение при сравнительной оценке.В изучении эфирных масел большая роль принадлежит га¬
зожидкостной хроматографии, позволяющей в короткое время
определить состав смеси компонентов, не разделяемых другими
методами (хроматографией на колонках или фракционной пе¬
регонкой). Однако прежние методы разделения и изучения не
потеряли своего значения. Так, наиболее действенным методом
отделения углеводородов от кислородосодержащих компонентов
является пропускание эфирного масла через колонку с окисью
алюминия. Фенолы могут быть выделены из эфирного масла из¬
влечением растворами щелочей.К изопреноидам относятся также такие природные соеди¬
нения, как каучук и гутта.Каучук является сложным полимером. В каучуке полиизо-
преновая цепь имеет двойные связи, расположенные в цис-по-
ложении, а в гуттаперче — <в транс-положении. Более 500 видов
высших растений являются каучуконосами. Образование кау¬
чука особенно характерно для растений семейств сложноцвет¬
ных, молочаевых, кутровых, ластовневых (ваточник), тутовых.
Однако только у немногих представителей нашей флоры кау¬
чук накапливается в количествах, выгодных для его получения.
К ним относятся корневые каучуконосы.Содержание каучука колеблется в отдельных частях расте¬
ний. Так, у кок-сагыза в двухлетних корнях содержится от 12
до 15%, в листьях 1—3%; у гваюлы в коре стеблей около 8,5%,
в коре корней 13%, в листьях 0,2%.т
Каучук растений различных видов существенно отличается.
В связи со своей непредельностью каучук легко вступает в ре*
акции присоединения» окисления и полимеризации. Количествен¬
ные определения каучука основаны на его физических и хими¬
ческих свойствах. Он хорошо растворяется в хлороформе, бен¬
зине, бензоле и не растворяется в спирте, ацетоне и воде.Определение эфирных маселМетод получения и определения количества эфирных масел.Основным методом для получения эфирных масел с целью изу¬
чения их состава н определения их количества является пере¬
гонка с водяным паром.Рис. 50. Прибор для перегонки эфирных масел.а — общий ид (обыюмм* i tener*), б — приеиияк для эфирного масла.Прибор для перегонки эфирных масел. На рис. 50а пока¬
зана установка для получения и количественного определения
эфирного масла. В вей имеется запарник / — цилиндрический
металлический сосуд объемом 12—15 дм\ с хорошей асбесто¬
вой изоляцией снаружи. Запарник сверху закрывают крышкой,
имеющей в центре отводную трубку, изогнутую под углом.
Крышкой запарник закрывают герметически, с помощью гид*
равлического затвора (или на хорошей прокладке крышку гер*
метически привинчивают винтами-сбарашками»). Сосуд эапар»
инка имет конусообразное дно с трубкой в центре для спуска
конденсатора. Другими частями этой установки являются паро-37»
о*т>азаватель 7, прямой холодильник 2, приемник 3 для сбора
и измерения масла (он же в более увеличенном виде показан
на рис. 506), нагревательный прибор 6, плоскодонные колбы 4
н 5 объемом 1—2 дм*.Ход анализа. Навески 1—2 кг свежих вегетативных частей
эфирномасличных растений или 0,5—1 кг воздушно-сухих семян
помещают на сетку внутри запарника. При количественном
определения отгооку ведут из двух проб параллельно. Листья
и соцветия анализируют без измельчения, стебли и корни грубо
измельчают одним из способов, семена грубо измельчают пе¬
ред отгонкой эфирных масел. Сосуд-запарник герметически за¬
крывают крышкой и в желоб гидравлического затвора иали-
вают горячую воду, подливая ее по мере испарения. Отводную
трубку крышки соединяют с холодильником и начинают пере¬
гонку сильной струей водяного пара. Скорость перегонки не
должна превышать 5 дм* в час. Перегонку заканчивают, когда
прекратится прибавление масла в бюретке приемника, объем
которого периодически измеряют после каждых 30—60 минут
перегонки. Для перегонки масла из семян и твердых плодов
требуется затратить 5—6 часов, из свежей травы —1—2 часа
Ииопда перегонка длится до 12—18 часов.После отгонки прекращают поступление воды в холодильник
и быстро нагревают его, чтобы смыть паром капельки масла в
холодильной трубке. При этом следят, чтобы не разогреть
масло в приемнике; через 30 минут отстаивания объем масла
измеряют. Содержание эфирного масла вычисляют в объемных
или весовых процентах на воздушно-сухое или абсолютно су¬
хое вещество (х), по формуле:а-100
*	~•где: а — объем эфирного масла в навеске;
к — навеска материала.Если плотность эфирного масла известна, то ее умножают
на полученную величину объема.Эфирное мало из приемника сливают в пробирки, парал¬
лельные пробы объединяют и высушивают над прокаленным
сернокислым натрием; далее их используют для определения
показателей их физических и химических свойств.Для пересчета количества эфирного масла на сухое ве¬
щество а отдельных навесках определяют содержание воды
(стр. 23). При 'определении количества эфирного масла с
плотностью около единицы в качестве приемника употребляют
склянку, в которой подача дистиллята происходит на дно со¬
суда. При отгонке масел, сильно растворимых в воде, объем
первых перегнанных вод собирают и дважды взбалтывают в де¬
лительной воронке с серным эфиром из расчета 100 см* эфира
на 1 дм3 перегонных вод. Эфир отделяют после сушки вытяжки,380
пропуская ее через адсорбционную трубку с безводным серно¬
кислым натрием. После удаления эфира и проветривания на
открытом воздухе остаток взвешивают. Вес полученного масла
присоединяют к его основному количеству.Расхождения в количестве полученного масла между двумя
одинаковыми навесками могут быть из-за «парения» перегон¬
ной установки, что происходит при отсутствии герметичности
соединения се частей.Определение эфирных масел в небольших навесках. Этот ме¬
тод удобен для определения количества эфирного масла в про-Рис. 51. Прибор
для перегонки
эфирных массл
(н. ш.)./ — холодильник. 3 —
приемник. 3 — от го¬
ночная колба.Рис. 52. Прибор для микроопределсниАэфирных массл./ — колб* для материала, 3— паропроводная
трубке, 3 — холодильник, 4 — приемник е деле¬
нием* (размеры детелей показаны » мм).
бах до 500 г свежего материала и отличается от предыдущего
метода тем, что масло перегоняют с одним и тем же объемом
воды в перегонной колбе. Перегонха с водяным парам проста
по выполнению и дает хорошо воспроизводимые результаты.Для выполнения анализа используют прибор (рис.* 51, со¬
стоящий из колбы объемом около 1 дм\ холодильника и гра¬
дуированного приемника дія эфирного масла. Все части при¬
бора соединяют на шлифах и установку укрепляют на штативе.В колбу помещают испытуемый материал (300* -400 г корне¬
плодов сельдерея, петрушки или 10—20 г семян) и заливают
200—250 см9 воды. Для борьбы с пенообразованием в колбу
добавляют 3—5 см3 спирта и 100 см9 насыщенного раствора
хлористого натрия, после этого устанавливают приемник и об¬
ратный холодильник. Колбу нагревают на колбонагревателе
или на горелке, причем нижнюю половину колбы необходимо
обмазать смесью асбеста с глиной или наложить ровным слоем
хорошо увлажненную асбестовую массу и затем ее на колбе
подсушить. Пары эфирного масла и воды конденсируются в
холодильнике, и жидкость стекает вместе с маслом обратно че¬
рез приемник, в котором эфирное масло собирается в градуиро¬
ванной трубке, а вода из приемника стекает обратно в колбу.
Отгонка масла заканчивается примерно через 0,5—1 час. Эфир¬
ное масло, собравшееся в градуированном приемнике, изме¬
ряют и вычисляют его процентное содержание. В некоторых
случаях*необходимо учесть содержание эфирного масла, пере¬
шедшего в воду. Для этого из охлажденной отгоночной колбы
отделяют водный слой и встряхивают в делительной воронке
с эфиром. Слой эфира отделяют, эфир выпаривают, масло соби¬
рают и измеряют.Определение эфирных масел (модификация ВИЛАР). Метод
основан на использовании специального прибора (рис. 52), ко¬
торый перед каждым анализом очищают пропусканием пара в
течение 15—20 минут. После 6—8 определений прибор промы¬
вают последовательно ацетоном и водой.Прибор для макроопределений эфирных масел. Прибор со¬
стоит из следующих четырех частей.1.	Дистилляционная круглодонная колба / емкостью 1 дм9.
Горло ее имеет н. ш. 29.2.	Трубка 2 с внутренним диаметром 13—15 мм. Длина от¬
резка а—б 340—350 мм.3.	Холодильник с прямой внутренней трубкой 3 диаметром
13—15 мм и внутренним диаметром рубашки около 40 мм.
Продолжением прямой трубки является трубка а% с внутренним
диаметром 10—12 мм. Свободный кі/нец этой трубки имеет
скос, в результате которого отверстие трубки открыто в про¬
тивоположную сторону от входа трубки б\.4.	Градуированная трубка 4 с внутренним диаметром
7—8 мм. Длина градуированной части трубки около 160 мм,382
цена деления 0,020 см3. Верхняя часть градуированной трубки
переходит в трубку с внутренним диаметром 18—20 мм. Верх*
ний конец этой трубки спаян с трубкой а i холодильника.
К средней расширенной части градуированной трубки припаяна
трубка б\ (под углом 30—40°).Вторая и четвертая части прибора соединены трубкой дна*
метром 5 мм.код анализа. Вариант 1. Навеску измельченного мате¬
риала помещают в колбу и приливают 300 см3 воды, затем
колбу соединяют через шлиф с паропроводящей трубхой и за¬
полняют водой градуированную трубку через кран при помощи
резиновой трубки с воронкой. Колбу нагревают до бурного ки¬
пения и кипятят с интенсивностью, прн которой скорость сте-
кання дистиллята должна быть 60—65 капель в минуту
(200 см3 в час). В конце установленного для каждого объекта
времени нагревание прекращают и через 5 минут замеряют
объем эфирного масла в градуированной части приемника. Для
этого открывают кран и спускают часть дистиллята до уровня
делений градуированной трубки.Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах
ло отношению к воздушно-сухому материалу вычисляют так,
как указано выше.Вариант 2. Если материал содержит эфирные масла, ко¬
торые образуют стойкие эмульсии, загустевают или имеют плот¬
ность, близкую к воде, то после того, как внесена навеска в
колбу и заполнена водой градуированная трубка, в свободное
отверстие боковой трубки б% приливают пипеткой в приемник
0,5 см3 декалина (ВТУ № РУ 1018-53). Затем в градуирован¬
ной трубке точно замеряют количество прибавленного дека¬
лина, а далее поступают так, как описано выше.Объем декалина вычитают из объема раствора масла в
декалине и вычисляют содержание эфирного масла в объемно¬
весовых процентах (х) по отношению к воздушно-сухому об¬
разцу по формуле:(t» — V,)-100х~	нгде: и — объем раствора масла в декалине (в cjk3);и,	— объем декалина (в ел3);
н — навеска (в г).Определение физических
и химических показателей
эфирных маселНеодинаковое содержание в эфирном масле одних и тех же
или различных компонентов обусловливает разнообразие их
физических и химических свойств. Некоторые физические и хи-383
мические показатели достаточно хорошо определяют качествен¬
ный состав эфирного масла. К ним относятся плотность—р
(в г/см*), коэффициент преломления — nDt вращение плоскости
поляризации — [а]©, растворимость в этиловом спирте, темпера¬
тура застывания, кислотное число, эфирное число, эфирное число
после ацетилирования, метильные и карбонильные числа.Определение плотности. Большинство эфирных масел имеет
плотность меньше воды, но есть эфирные масла, плотность ко¬
торых выше плотности воды (например, масло семян петрушки
рк*» 1.101, гвоздики = 1,068).Взвешенный чистый сухой пикнометр (см. рис. 34) напол¬
няют дистиллированной водой так, чтобы уровень воды был
несколько выше метки в горлышке пикнометра. Пикнометр
погружают в водяную баию со строго определенной температу¬
рой (например, 4; 15; 20°) на 10—15 минут, чтобы содержимое
пикнометра успело принять температуру воды ванны. По исте¬
чении этого времени заранее заготовленными тонкими капилля¬
рами и узкими полосками фильтровальной бумаги снимают из¬
быток воды в шейке пикнометра. Если конструкция ванны поз¬
воляет, то эту операцию производят, не вынимая пикнометра из
ванны. В противном случае, быстро вынув пикнометр и доведя
содержимое до метки, его еще раз на 2—3 минуты погружают
в ванну и проверяют точность установления мениска на метке.
Затем пикнометр вынимают, тщательно протирают горлышко
толстыми жгутиками из фильтровальной бумаги, насухо выти¬
рают снаружи, закрывают пробкой, ставят на некоторое время
к весам, чтобы он принял температуру окружающей среды, и
взвешивают. После взвешивания воду из пикнометра выливают,
а пикнометр сушат спиртом и эфиром. Сушить пикнометр, по¬
догревая его или продувая горячим воздухом, — нельзя, так как
при этом пикнометр деформируется, что влечет за собой су¬
щественные ошибки в определениях.Высушенный пикнометр наполняют исследуемым эфирным
маслом, помещают опять в водяную баню, доводят до метки
и взвешивают с точностью +0,0002 г, повторяя эти операции
так же, как и при наполнении его водой. Расхождение между
двумя параллельными определениями не должны превышать0,4 мг. Величину плотности вычисляют по формуле:м» «i-мР<° *= «J-H •Пример вычисления. Сухой чистый пикнометр весит 4,8991 г (м),
с дистиллированной водой — 5,8878 г (нз), с эфирным маслом — 5,7857 г
(кі). Следовательно, вес данного объема масла 0,8866 г, а вес этого же
объема воды 0,9887 г, откуда плотность масла будет 0.8866:0,9887 — 0,8765.Определение коэффициента рефракции (преломления). Длямногих веществ величина преломления является очень харак¬
терным показателем, имеющим большое значение, например,
для определения концентрации, для распознавания новых хи¬
мических веществ и т. д.Удобным прибором для определения (показателей преломле¬
ния является универсальный рефрактометр (см. рис. 4). Для
работ со многими эфирными маслами пригодны рефрактометры,
позволяющие определять показатели преломления о пределах
1,33—1,51.Коэффициент рефракции, или показатель преломления
(nD)♦ обычно измеряют при определенной температуре, так как
с повышением температуры рефракция падает, а с понижением,,
наоборот, возрастает. В среднем для эфирных масел изменение
температуры иа 1°С (вызывает изменение коэффициента ре¬
фракции на 0,00035.Высокий коэффициент рефракции, так же как и высокая
плотность, обычно указывает иа обогащение эфирного масла
кислородными соединениями. При длительном хранении эфир¬
ного масла наблюдается его окисление, оомоление и накопление
в нем продуктов полимеризации. Это сопровождается повыше¬
нием рефракции и плотности эфирного масла. Но иногда проис¬
ходит обратный процесс. Так, при длительном хранении масел,
содержащих значительные количества анетола, наблюдают
уменьшение коэффициента рефракции. Измерение показателя
преломления описано на стр. 235.Определение вращения плоскости поляризации. По силе
вращения плоскости поляризации различные вещества можно
качественно идентифицировать. Вещества, входящие в состав
эфирных масел, в подавляющем большинстве обладают опти¬
ческой активностью. По величине вращения плоскости поляри¬
зации можно судить об относительном богатстве масла тем
или иным компонентом.Аппаратура: поляриметр (прибор снабжается набором трубок разной
длины — от 5 до 20 см; схема устройства поляриметра и методика работы
с ним описаны на стр. 158).Ход определения. Поляриметрическую трубку наполняют ис¬
следуемым эфирным маслом так, чтобы при закрытии ее не
было внутри пузырька воздуха. Наполненную трубку помещают
їв ложе поляриметра между узлами поляризатора и анализа¬
тора. Моментом нулевого положения является однородное осве¬
щение обеих половин поля. Затем вращением анализатора
находят такое положение, чтобы при самом незначительном по¬
вороте резкая тень сразу заменялась хорошо освещенным полу¬
кругом, и наоборот. Между этими двумя положениями устанав¬
ливают среднее положение «полутени», когда ївсе поле зерении
освещено ровно, ио довольно слабо (см. рис. 21). При таком
положении отсчитывают угол вращения. Если к искомой точке
приходят поворотом анализатора против движения часовой
стрелки нулевого положения, то вращение — правое и его обо¬Vj 13 Заказ NV 401385
значают знаком (~Ь). если анализатор поворачивали по часовой
стрелке, то вращение —^левое (—). Большинство приборов ка¬
либровано только <на 180°, поэтому иногда можно сомневаться
в направлении вращения масла. Для решения вопроса о вели¬
чине и знаке вращения поступают следующим образом. В ложе
поляриметра помещают вдвое меньшую или вдвое большую
трубку, чем та, в которой в первый раз определялось вращение.
При этом вторичном отсчете при вдвое меньшей трубке угол
(вращения будет равно вдвое меньший, a при вдвое большей
трубке угол вращения будет соответственно вдвое больший.Установив, что угол вращения увеличился ровно вдвое при
повороте анализатора по часовой стрелке, заключают, что пра¬
вильный отсчет для (Первоначально взятой трубки был со зна¬
ком (НК)» Бели бы было левое вращение, то не произошло бы
удвоения. Для большинства эфирных масел (кроме лимонного
н померанцевого) температура очень мало влияет на величину
вращения плоскости поляризации, поэтому при отсчетах темпе¬
ратуру не указывают.Вращение плоскости поляризации в эфирных маслах обычно
определяют в трубках длиной 10 см. Только при сильно окра¬
шенных маслах применяют более короткие трубки (2—5 см).
Если вращение очень мало, то применяют трубки длиной 20 см.
Для небольших количеств вещества существуют трубки с внут¬
ренним диаметрам 1 мм. Для нейтральных жидкостей можно из¬
готовить трубки из дюралюминия, просверлив отверстие в 2 мм
по всей длине.Вращение сильно окрашенных или твердых веществ опреде¬
ляют в растворах, применяя оптически деактивные раствори¬
тели (хлороформ, бензол, спирт и др.). Вычисление производят
или на концентрацию вещества (С—число граммов деятель¬
ного вещества в 100 см3 раствора), или выражают в процентах
(Сі—число граммов деятельного вещества в 100 г раствора).
В последнем случае определяют и плотность (р) раствора.При определении вращения плоскости поляризации в раство¬
рах и в жидкостях обычно определяют и удельное вращение
вещества. Удельное вращение определяют по формуле:Но = •где: [а]о—удельное вращение;
а — отсчитанный угол;I — длина трубки (в дм);
р—плотность исследуемого вещества.Для определения удельного вращения растворов твердых
или сильно окрашенных веществ пользуются следующей форму¬
лой:100*, 100аИо - 1C - /?С, •386
где: С —концентрация (навеска вещества в 100 см3 раствора);С i — навеска вещества (в г) в 100 г раствора.Удельное сращение—(величина непостоянная; она зависит
от растворителя, концентрации и температуры. Для растворов
размой концентрации угол 'вращения прямо 'Пропорционален
концентрации.Определение растворимости эфирных масел. Все эфирные
масла хорошо растворяются в чистом этиловом спирте. В раз-
•веденном спирте опособны растворяться лишь масла, содержа¬
щие в своем составе большое количество кислородных соеди¬
нений. Растворимость эфирных масел является (весьма сущест¬
венным показателем, дающим представление о ого составе. В
качестве растворителя применяется 90%-лыА или 70%-ный эти¬
ловый спирт.Растворимость эфирного масла определяют следующим спо¬
собом. В градуированный цилиндр наливают 1 см* эфирного
масла и, приливая из бюретки небольшими порциями (при
•постояwhom (взбалтывании) спирт определенной крепости, опре¬
деляют, при каком объеме прилитого спирта образуется совер¬
шенно однородный, «без эмульсии, раствор. Этим опособом часто
пользуются для обнаруживания фальсифицирующих примесей
в масле, а также для первых ориентировочных исследований
состава и качества масла.Известно, что -большинство углеводородов плохо раство¬
ряется в разведенном 70%-ном и даже крепком спирте. По¬
этому по степени растворимости можно примерно судить об от¬
носительном богатстве масла углеводородами. Различной раст¬
воримостью отдельных компонентов, входящих в состав эфир¬
ных масел, пользуются иногда для отделения более ценных
компонентов масла от менее ценных.Раогворимость эфирного масла выражают в объемах спирта
(90-, 80- или 70-іного по объему), необходимого для растворе¬
ния 1 см* эфирного масла при 20°.Определение температуры застывания. Одной из наиболее
важных физических «констант» эфирного масла является тем¬
пература застывания. Это свойство характеризует качество
масла. Высокая температура застывания некоторых масел
(фенхелевого, анисового и др.) указывает на богатство масла
анетолом.Определение температуры застывания производят в специ¬
альном аппарате. Сосуд наполняют водой, водой со льдом или
другой охладительной смесью в зависимости от того, какая
температура необходима для определения. В пробирку нали¬
вают некоторое количество эфирного масла и помещают ее в
сосуд для охлаждения, а затем наблюдают н отмечают по тер*
мометру, при какой температуре произошло застывание масла.
При этом часто происходит переохлаждение жидкости, и при
начале застывания температура быстро поднимается за счет387
освобождения скрытой теплоты. Высшую точку, до которой
быстро поднимается температура, считают температурой за¬
стывания данного масла. Во избежание переохлаждения реко¬
мендуют во все время определения перемешивать жидкость
■мешалкой. После оттаивания масла, определение повторяют еще
2—3 раза.Определение кислотного н эфирного чисел и числа омыления.Кислотное число эфирного масла дает представление о коли¬
честве содержащихся в нем овободных жирных кислот. В числе
компонентов, входящих в состав эфирных масел, свободные кис¬
лоты присутствуют почти всегда, но количество их обычно очень
незначительно. Это объясняется тем, что в растениях широко
распространена реакция этерификации, при которой свободная
кислота связывается со спиртом.Эфирное число означает количество миллиграммов КОН, не¬
обходимое для омыления сложных эфиров, содержащихся в1	г эфирного масла. При длительном хранении эфирного масла
•происходят процессы окисления, и содержание овободных кис¬
лот при этом обычно увеличивается за счет омыления эфиров,
в связи с чем изменяется и эфирное число.Число омыления является суммой чисел кислотного и эфир¬
ного и означает общее количество миллиграммов КОН, необхо¬
димое для нейтрализации овободных кислот м омыления слож¬
ных эфиров, содержащихся в 1 г эфирного «масла.Реактивы и посуда, необходимые для определения, указаны
на стр. 237.Для анализа берут по 2 навески в пределах 1—2 + 0,0002 г.
Навески эфирного масла берут так же, как навески жирного
масла, взвешивая масло в пробирке до и после отливания в
колбы. В колбы с навесками приливают 5 см? нейтрализован¬
ного спирта и 3—4 «капли 1 %-лого спиртового раствора фенол¬
фталеина. После этого титруют 0,5 и. спиртовой щелочью из
микробюретки до появления окрашивания. Иногда окраска
раствора быстро исчезает, что указывает на начало омыления
сложных эфиров. Поэтому титрование «ужно производить
быстро и концом его считать момент появления первой окраски,
задерживающейся на 2—3 секунды. Кислотное число вычис¬
ляют, используя результаты титрования (по формуле, приведен¬
ной на стр. 238). Затем в колбу прибавляют точно 10 или 15 см%0,5 н. спиртовой щелочи (в зависимости от величины навески
и содержания в данном масле эфиров), бросают туда же ку¬
сочек пемзы или несколько стеклянных капилляров, соединяют
колбу с обратным холодильником и нагревают на водяной бане
в течение ровно одного часа от начала «кипения. Одновре¬
менно в другой колбе нагревают такое же количество щелочи и
спирта, только без эфирного масла (контрольная проба). По
окончании нагревания колбы охлаждают, <в них приливают по
50 см? воды и по 2—3 капли фенолфталеина, а затем оттитро-388
вьівают оставшуюся свободную щелочь 0,5 н. раствором серной
кнслоты.Числа кислотное, эфирное и число омыления вычисляют де*
лением на навеску масла (в г) произведения количества куб.
сантиметров 0,5 и. раствора щелочи на его титр.По величине эфирного числа можно вычислить процентное
содержание в эфирном масле спирта (дс) и эфира (Jti), если
известна молярность спирта и кислоты, образующих сложный
эфир изучаемого масла:Af, Э	М Эх~ 501 : **“ oGltf'где: М — молекулярный вес эфира;Mi — молекулярный вес спирта;
б — основность кислоты;561 — грамм-эквивалент щелочи;Э	— эфирное число.Определение спиртов
в эфирных маслахВ состав эфирных масел входят различные спирты (лииолоол,
гераниол, цитроиеллол и т. д.). Для количественного определе¬
ния спиртов в масле производят ацетилирование и затем опре*
деляют эфирное число. Зная эфирное число масла до и после
ацетилнрования, узнают содержание спиртов в данном масле.Реакцию ацетилнрования обычно проводят в специальной
колбе емкостью 75—100 см3, с обратным холодильником на нор¬
мальных шлифах (рис. 536).В тщательно высушенную колбу берут 10 см3 эфирного масла
(высушенного над безводным сульфатом натрия), 10 см3 уксус¬
ного ангидрида и точно 2 г плавленого уксуснокислого натрия.
К колбе присоединяют обратный холодильник и кипятят в те¬
чение часа на песчаной бане. Кипение должно идти равномерно
и не слишком бурно. Затем колбу охлаждают, приливают 30 см3
перегнанной воды и 15 минут нагревают на кипящей водяной
бане, часто взбалтывая, для того, чтобы остаток уксусного ан¬
гидрида превратить в уксуоную кислоту. После этого содержи*
мое колбы переливают в делительную воронку, а колбу смывают
водой порциями по 10 см3. Затем отделяют нижний водяной слой
и отбрасывают. Масляный слой 3—5 раз промывают насыщен¬
ным раствором NaCI до нейтральной реакции промывных вод (с
проверкой индикатором). Ацетилнрованное масло сливают
в пробирку и сушат безводным сульфатом натрия.Для омыления отвешивают в колбы навески 1,5 — 2 і 0,001 г
прозрачного и сухого ацетилированного масла и растворяют их
в 3—4 см3 спирта, прибавляют 2—3 капли фенолфталеина, тща¬
тельно нейтрализуют свободные кислоты, после чего проводят13 іакя» М 401№
омыление (стр. 238). Если предполагают высокое содержание
спиртов, то для омыления берут 20—30 см8 0,5 и. раствора едко¬
го кали. Эфирное число вычисляют по формуле (стр. 238).Полученное эфирное число является суммой эфирных чисел
исходного масла и образовавшихся эфиров при ацетилированин
свободных спиртов масла.Если в масле мало омыляемых веществ,
то содержание свободных спиртов (х) в ис¬
ходном масле вычисляют по формуле:МТах~ 2J(« —0,021л) •где: М — молекулярный вес данного спирта;
Т — титр щелочи;а — количество куб. сантиметров 0,5 н.
раствора едкой щелочи, пошедшего
на омыление ацетилцрованного мас¬
ла;н — навеска этого масла (в г).Один см3 0,5 и. раствора КОН соответст¬
вует 0,021 г ацетильной группы или 0,0085 г
гидроксильной.Если в исходном масле много эфиров (на
что указывает эфирное число), то количество
свободных спиртов в процентах (х) обычно
вычисляют по следующей формуле:* Oi-3)-Af
*- 561-0.43(3,-3) •где: Э — эфирное число исходного масла;Э\—эфирное число ацетилироваюного
масла;М — молекулярный вес спирта;561—эквивалентное число миллиграммов
КОН, соответствующее присоеди¬
няющемуся остатку уксусной кис¬
лоты (С2Н30), молекулярный вес которого 43.Сумма свободного и связанного в форме эфиров спирта в
процентах (х) вычисляют по формуле:/ Т-а-М \ ( 43,04-tf \*- \20(« — 0,21)М 100ф+ 43,02)/'где б— содержание эфиров (в %).Метод ацетилнрования пригоден для определения первичных
и вторичных спиртов в присутствии третичных спиртов и альде¬
гидов.390Рис. 53. Колба с
обратным холо¬
дильником (II. ш.).в — для оиылепия.
б — для ацетклирова-
ния.
Определение альдегидов
и кетонов эфирных маселВ оценке качества эфирных масел различных видов и сортов
растений существенным показателем является содержание аль¬
дегидов и кетонов. Многие из них обладают приятным запахом
н очень важны в практическом отношении.Качественные реакции на альдегиды и кетоны. Присутствие
в эфирном масле альдегидов можно определить по чувстви¬
тельной качественной реакции с фуксиносернистой кислотой.
Фуксиносернистая кислота является очень слабым водным раст¬
вором основного фуксина, обесцвеченного пропусканием через
него сернистого газа. В присутствии альдегида фуксиносерни¬
стая кислота окрашивается в розовый «или красный цвет. Кроме
этой реакции, характерна другая реакция: при «наличии альдеги¬
дов и аммиачного раствора окиси серебра на стенках пробирки
выделяется металлическое серебро.Качественной реакцией на кетоны является образование
окраски в присутствии салицилового альдегида и серной кис¬
лоты. Цвет и интенсивность окраски изменяются при возраста¬
нии углеродной цепи в кетонах (от оранжево-красной до темно¬
малиновой).К 50 см3 исследуемого вещества прибавляют 4 см3 10%-ного
раствора салицилового альдегида в воде и 2 см3 серной кислоты
(плотн. 1,84). После встряхивания слой салицилового альдегида
принимает характерную окраску.Метод количественного определения альдегидов и кетонов
с применением бисульфита. Количественное определение альде¬
гидов и кетонов основано на реакциях карбонильных групп с
кислым сернистокислым натрием (бисульфитом натрия, NaHS03),
семикарОазидом, гидроксиламином и некоторыми другими сое¬
динениями. Если на вещества, содержащие карбонильные груп¬
пы, подействовать, например, бисульфитом натрия, то обра¬
зуются так называемые бисульфитные соединения;На этой реакции основан количественный метод определения
альдегидов и некоторых кетонов в эфирных маслах.При действии бисульфита на альдегиды и некоторые кетоны
образуются устойчивые к окислителям оксисульфокислоты в
противоположность бисульфиту, который неустойчив.Для количественного определения альдегидов и кетонов раз¬
работаны также методы с реактивом Несслера, амперметрвіче-
ского титрования с 2,4-ди нитрофенил гидразином, полярографи¬
ческого определения в растворах» содержащих семнкарбазид, и
хроматографии на бумаге.391
Реактивы: 1) 0.4 н. раствор бисульфита; 2) 0,1 ■. раствор иода;
3) 0,1 н. раствор тиосульфата.Ход анализа. В 2 мерные колбы объемом 50 см3 наливают
по 25 смг 0,4 н. раствора бисульфита натрия и по 10 cjk3 спирта.
К содержимому одной колбы (опытной) прибавляют 0,3—05 г
эфирного масла, затем объемы в обеих колбах доводят водой до
метки и после перемешивания оставляют на один час при ком*
наїшой температуре. Для определения избытка бисульфита в ко¬
ническую колбу приливают 50 см3 0,1 и. раствора иода и 10 смг
жидкости из мерной (опытной) колбы и тиртуют 0,1 и. раствором
тиосульфата натрия. Так же поступают с контрольной пробой.Процентное содержание карбонильного соединения (х) вычис¬
ляют по формуле:5аЛМ00
* ~ к-2бООб *где: а — разность (в cjm3) 0,1 н. раствора иода, пошедшего на
титрование контрольной и опытной пробы;М — молекулярный вес карбонильного соединения;
н — навеска.Бисульфидные соединения ароматических и высших алифати¬
ческих соединений, содержащих альдегиды и кетоны, охлаждают
льдом до прибавления иода и во время реакции.NOHRCOR, + NH,OH - Н.О + RC^Реактивы: 1) бромфеиоловыА синий (0,1%-ный раствор в 20%-ном эта-Ге); 2) раствор гидроксиламнна (4.5 г гидроксила и ина-HCl растворяют в
слс3 воды и прибавляют 400 cjk3 95%-ного спирта; этот раствор смеши¬
вают с раствором 1,8 г КОН в 300 cjk9 этанола и, добавив 5 слс* раствора
бромфенолового синего, фильтруют через складчатый фильтр; раствор годен
14 суток); 3) раствор 0,05 н. НС1.Определение кетонов и альдегидов с гидроксиламином (по-
лумикрометод). Метод основан на определении гидроксилами*
нового числа, которое представляет количество миллиграммов
едкого кали, эквивалентное гидроксиламину, пошедшему на окси-
мирование 1 г карбонильных соединений. Карбоксильные группы
с гидроксиламином образуют окснмы по реакции:Ход анализа. В колбу (со шлифом) на 250 см3 помещают
точно отвешенную навеску и приливают 50 cjk3 раствора гидро-
ксиламина, кипятят в течение часа, присоединив к колбе обрат¬
ный холодильник. Навеска должна быть такой, чтобы на титро¬
вание шло от 10 до 15 см3 0,5 н. раствора HCI. Параллельно про¬
водят контрольный опыт (без навески). После охлаждения раст¬
воров их тиртуют 0,05 и. раствором НС1.m
Гидроксиламиновое число (г ам) вычисляют по формуле:Гмм = (а • Т): н,где: а — количество куб. сантиметров 0,05 и. НС1 (разница между
объемами, пошедшими на титрование контрольной и
опытной проб);Г —титр раствора соляной кислоты, выраженный в милли¬
граммах едкого кали;н — навеска.Теоретическое гидроксиламиновое число вычисляют по фор¬
муле:(56100-я) :М,где: п — число карбонильных групп в молекуле;М — молекулярный вес вещества.Хроматографическое определение альдегидов и кетонов. Дляразделения и идентификации альдегидов и кетонов используют
растворы эфирного масла в смесях метанола и уксусной кисло*
ты, метанола и ацетона и др. Кроме того, употребляют растворы
известных карбонильных соединений.Реактивы и аппаратура: I) реактивы для обнаружения альдегидов: а) ре¬
актив Шнффа с 0.15%-ной серной кислотой: б) реактив Хоррокса —0.5%-ныА
раствор бензидина в смеси с этанолом н уксусной кислотой (4:1); в) реак¬
тив Нссслера; 2) камера (или сосуд) для хроматографии.Ход анализа. Раствор эфирного масла в метаноле в коли*
честве 1 см* наносят на полоску фильтровальной бумаги и, по¬
местив в сосуд для хроматографии, разделяют восходящим током
смесн метанол — уксусная кислота (9,25:0,75) при 20°. Фронт
растворителя поднимается на 28 см. После подсушивания хрома¬
тограмм в течение нескольких минут их проявляют. Применение
«свидетелей» позволяет идентифицировать альдегиды и кетоны.Определение каучука
каучуконосных растенийВ млечной системе каучуконосных растений (кок-сагыза, тау-
сагыза, гваюлы и др.) содержится каучук в виде мельчайших
частиц. В млечном соке таких растений присутствуют необходи¬
мые ферменты, синтезирующие полизопреноидные молекулы (ка-
учук). Млечный сок (латекс) при высушивании растительных
объектов анализа коагулирует, образуя нити.Определение каучука корневых каучуконосов. Принцип ме¬
тода состоит в обработке горячей щелочью кусочков корней, в
механическом отделении нитей каучука от остальных частиц и
во взвешивании после высушивания выделенного каучука.393
этот метод отличается простотой и позволяет оыстро опре¬
делять каучук в свежих и высушенных корнях, однако он не дает
возможности улавливать пизкопол и мерные частицы каучука.Реактивы и аппаратура: I) 3%-ный раствор едкого натра; 2) 95-градус¬
ный спирт; 3) химические стаканы на 100 см\ бюксы 3XS см; 4) фарфоро¬
вая ступка диаметром 15—20 см; 5) торсионные весы на 500 мг (каждый
раз перед взвешиванием уравновешивают по горизонтали); 6) электрическая
плитка; 7) электрическая баня для варки корней (устанавливают обяза¬
тельно под тягой).Ход анализа. Высушенную до воздушно-сухого состояния
среднюю пробу корней нарезают на кусочки 0,5 см, причем го¬
ловки корней с остатками листьев в анализ не включают. Корни
удобно нарезать специальным ножом, приспособленным для
резки фотобумаги. После тщательного перемешивания корней
отвешивают навески по 5±0,01 г в химические стаканы на
100 см* заливают 50 см3 3%-ного раствора едкого натра и кипя¬
тят на электрической плитке, которую покрывают куском листо¬
вого асбеста, не допуская бурного кипения.Продолжительность разрушения тканей щелочью зависит от
характера материала: молодые корни кипятят меньше (час),
старые, многолетние — до 2,5 часов.После заметного разваривания корней щелочь сливают через
металлическую сетку в колбу и разварившиеся корни растирают
в фарфоровой ступке без добавления воды, до тех пор, пока не
получится однообразная масса с пленкой каучука в ступке. Не
следует допускать, чтобы каучук скатывался в комочки, так как
внутри их могут остаться древесные частицы корня.Для отделения каучука к растертой массе прибавляют горя¬
чую воду, всю смесь размешивают и целиком переносят на сито,
отцеживая жидкость над раковиной. На сите остается пленка
каучука и мелкие агломерированные его частицы, которые про¬
мывают на сите под струей холодной воды. Затем пленку каучука
переносят пинцетом обратно в фарфоровую ступку. Мелкие ча¬
стицы собирают с сита пинцетом, прикладывают к пленке и при¬
давливают к ней пестиком. Пленку каучука 2—3 раза промывают
горячей водой до полного обесцвечивания промывной воды в
ступке, при этом каждый раз хорошо растирают и воду сливают
через сито. Хорошо промытая пленка каучука должна быть
светло-серого цвета и не иметь древесных остатков (такая плен¬
ка содержит 85% чистого каучука). Промытую пленку отжимают
от избытка воды в кусочке полотна и опускают в бюкс с 10 см3
95-градусного спирта.Обезвоженную спиртом пленку отжимают в другом кусочке
полотна и, поместив в бюксы, сушат в течение двух часов при
60°, затем быстро взвешивают на торсионных весах. Расхождение
в весе двух параллельных проб каучука допустимо на 0,05 г.Ход анализа сырых корней. При массовых анализа.* удобнее
вести работу с сырыми корнями и результаты выражать на сырое394
вещество. Средние пробы, составленные из 50—100 сырых кор¬
ней взвешивают после сбора с точностью +0,01 г и, не размель¬
чая, разваривают в 5%-ном растворе едкого натра в течение5	часов. Отмывание от разварившихся частей древесины корня
проводят в ступке или в специальных приспособлениях. Полу¬
ченные пленки высушивают и взвешивают, как указано выше.Примечание. Все операции (варку корней, растирание и промывку
пленок, сушку и взвешивание) производят в один рабочий день. Норма —
20 определений (10 образцов).Надо учитывать, что отдельные отрезки корней неоднородны по содер¬
жанию каучука. Поэтому для получения правильных результатов нужно
следить, чтобы корни были нарезаны на равные кусочки.' Толстые корни
сначала разрезают поперек, а затем каждую часть режут вдоль на отрезки
ие длиннее 0.5 см.При определении каучука в небольших навесках корней на¬
вески разваривают в растворе щелочи, из которого каучук вы¬
деляют, промывают, сушат и взвешивают. Такой способ опреде¬
ления каучука в корнях пригоден и для оценки каучуконосности
отдельных растений (А. И. Ермаков, В. В. Арасимович и др.,
1952).Определение каучука в листьях и стеблях каучуконосных
растений. Принцип количественного определения заключается в
одновременном извелечении каучука и смол холодным хлорофор¬
мом с последующим удалением смол ацетоном или спиртом, в ко¬
торых каучук не растворяется. До сих пор этот принцип является
наиболее надежным и точным для всех растений, накапливающих
каучук в тканях листьев и стеблей в виде мессекретных капель.Иеакгивы и аппаратура: 1) хлороформ; 2) спирт или ацетон: 3) уста*
новка для отгонки растворителей; 4) аппарат Сокслета (см. рис. 29) или
установка для извлечения с обратными шариковыми холодильниками (рис.
53); 5) нагревательные приборы и бани; 6) аппарат для встряхивания (см.Sue. 43); 7) колбы * на 250 и на 500 см>\ 8) мерные цилиндры на 100 cjk1;
) бюксы диаметром 3 см.Ход анализа. Извлечение каучука и смол. Отве¬
шенные по 3 — 5 + 0,001 г навески тонко измельченного воздуш¬
но-сухого материала, заделанные в пакеты (подготовку см. на
стр. 19), заливают 75 см3 хлороформа в материальных банках
на 250 см3. Работу проводят в вытяжном шкафу. Банки плотно
закрывают поливиниловыми или корковыми пробками, оберну¬
тыми кусками пергаментной бумаги, и оставляют на ночь (для
набухания и лучшего извлечения каучука). На следующее утро
банки с залитыми хлороформом навесками ставят на 3 часа на
аппарат для встряхивания. После этого раствор смол и каучука
отфильтровывают через складчатый фильтр в заранее высушен¬*	Колбы должны иметь несмываемые метки, для чего в верхней части
горлышка колбы точильным камнем делают матовую поверхность и на ней
ставит метки простым мягким карандашом.395
ные ii взвешенные плоскодонные колбы на 250 cjw3. Пробку и
банку, в которой производилось извлечение смол и каучука, ело-
ласкивакл порциями хлороформа по 10 см3, который также сли¬
вают на фильтр Остаток материала на фильтре дважды промы-
вают хлороформом порциями в 20 см3. После фильтрования хло*
роформ отгоняют из раствора смол и каучука почти досуха; оста*
ток его удаляют из колбы продуванием «грушей» на кипящей
водяной бане. Во время продувания колбу необходимо все время
вращать, чтобы остаток смол и каучука равномерно распреде¬
лялся по дну ii стенкам колбы.Удаление смол и каучука. После продувания колбы
смолу и каучук заливают 50 см3 ацетона или спирта и кипятят
15 минут с обратным холодильником. Раствор смолы тщательно
сливают в другую, высушенную и взвешенную плоскодонную кол¬
бу на 250 см3. Остаток каучука заливают 3—5 см3 хлороформа
и колбу вновь продувают на кипящей бане до полного удаления
следов хлороформа. Эту процедуру повторяют 3 раза (раствор
смолы каждый раз сливают в одну и ту же колбу). Закончи»
промывку колбы с пленками каучука, ее подсушивают в течение
часа, при 60° и взвешивают, затем после 30-минутного дополни¬
тельного подсушивания еще раз взвешивают. Ввиду летучести
продуктов термического разложения каучука его сушат до по¬
стоянного веса, в строго определенное время. Это же относится
и к высушиванию смол. Ацетон или спирт из колбы с раствором
смол отгоняют досуха на кипящей водяной бане. Затем посту¬
пают так же, как с колбами с каучуком, но сушат при 100°.Вычисляют содержание каучука и смол в процентах на сухое
вещество.Содержание гутты в листьях эвкоммии, коре бересклета и
других растений-каучуконосов определяют по этой же методике,
с той разницей, что для нзвелечения гутты применяют горячую
экстракцию хлороформом в колбах с обратным холодильником
в течение трех часов.
Определение золы
и некоторых
глава XIV зольных элементов*Определение золы
в различных органах растенийОбщие сведения. Остаток, получаемый после сжигания и
прокаливания органических веществ, называют золой. При сжи¬
гании уїлерод, водород, азот и частично кислород улетучиваются
и остаются лишь нелетучие окислы.Содержание и состав зольных элементов растений зависит
от видовой принадлежности, роста н развития растений и осо¬
бенно от почвенно-климатических и агротехнических условий их
выращивания. Концентрация зольных элементов существенно
отличается в разных тканях и органах культурных растений. Так,
листья обычно содержат больше золы, чем другие органы.По относительному количеству, необходимому для нормаль¬
ного роста растений, все зольные элементы произвольно делят
на макроэлементы (К, Са, Mg, N, Р, S) и микроэлементы (Fe.
Mil, Си, Zn, В, Cl, Мо и др.). Некоторые микроэлементы обнару¬
жены в растениях в ничтожно малых количествах (I, Со, Ni, Сг,
Ag, Pb, Hg и др.).Содержание отдельных зольных элементов существенно раз¬
личается в разных растительных органах. Некоторые виды расте¬
ний являются накопителями отдельных элементов.Зольные элементы входят в состав биологически активных
соединений и играют важную роль в обмене веществ растений.
Получены убедительные данные о том, что ряд металлов (Мп,
Со, Ni и др.) входят в состав нуклеиновых кислот, образуя с
иимн соединения типа хелатов, стабилизируя вторичную струк¬
туру *.Наряду с объемными и колориметрическими методами опре¬
деления химических элементов важное значение имеют методы
пламенной фотометрии, спектрометрии и полярографии.Определение золы в семенах. Определение золы основано на
сжигании растительного материала и последующем количествен¬
ном определении остатка.* «Природа», jW 12. 1968.397
Реактивы и аппаратура: Ц раствор 1.61 г уксуснокислого магния в
tOO см* 95-градусного этанола с несколькими кристаллами иода (I см* этом»
раствора после прокаливания образует 3 мг окиси магния); 2) пергидроль
(30%-ная Н(Ог); 3) азотная кислота (плотн. 1,40); 4) электрический муфелі,
(рис. 54); 5) прямостенные широкодонные фарфоровые тиг;ш-чашсчкн
(лучше кварцевые).Ход определения. В прокаленные и взвешенные широколон¬
ные тпгли-чашечки (диаметром 3,5—4,5 и высотой 2,5 см) отве¬
шивают от 2 до 5 + 0,001 г семян, размельченных до среднего
помола (величина навесок зависит от содержания золы). Затем
каждую навеску смачивают 1—2 смл спирта, чашечки сгаияіРис. 5-і. Электрическая муфельная печь МІ1-2У.I — муфель. 2 — нагревательная спираль. 3 — асбестовая и зо¬
ли ції я. 4 — керамический затвор. 5 — переключатель.на электроплитку в вытяжном шкафу и спичкой зажигают смо¬
ченные спиртом навески. После того как спирт выгорит, плитки
включают в сеть и сжигают материал. Когда тигли перестанут
дымить и навески обуглятся (через 30 минут) поступают по од¬
ному из следующих способов.I.	В каждый тигель прибавляют 5—8 капель концентрирован¬
ной азотной кислоты или столько же капель 3%-ного пергидроля
(перекиси водорода) или столько же капель 10%-ного раствора
азотнокислою аммоння. Тигли ставят в слабо нагретый муфель
(100°) для выпаривания окислителей. Затем нагревание муфеля
постепенно усиливают до красного каления, что соответствует99»
600°; при этой температуре тигли должны простоять 25—30
минут.2.	В каждый тигель прибавляют по 2 или 3 см* раствора ук¬
суснокислого магния* в спирте, перемешивают ii дают пропи¬
таться, затем помешают в слабо нагретый муфель и усиливают
нагревание. Для озолення достаточно однократного прибавления
катализатора и нагревания в течение 45—60 мннут. Полученная
зола в зависимости от анализируемого материала может иметь
самые разнообразные цвета н оттенки.После этого тигли вынимают из муфеля и ставят в эксикатор,
по охлаждении (около 30 минут) тнглн взвешивают с точностью
до 0,5 мг.Для вычисления процента золы из общего веса золы вычи¬
тают внесенное количество магния или кальция в пересчете на
их окиси. Титр этих растворов устанавливают весовым методом.
Для этого в заранее прокаленный и взвешенный тигель наливают
из бюретки 5 см* приготовленного раствора, выпаривают, про¬
каливают и подсчитывают, какое количество окиси магния или
кальция содержится в 1 см* приготовленного раствора.Процентное содержание золы пересчитывают на сухое ве¬
щество, если материал не был предварительно доведен до су¬
хого состояния.Определение золы в листьях и стеблях. Содержание золы в
листьях и травянистых органах растений значительно выше,
чем в семенах. В листьях золы больше, чем в стеблях, поэтому
навески измельченных листьев берут в пределах 1,5—2 г.Для определения золы в травянистых материалах, которые
при помоле дают неоднородные по величине частицы, навески
следует брать в пределах 3—5 г. В дальнейшем озоляют по
одному из приведенных выше способов (см. стр. 398).Для ускорения озоления и предотвращения сплавления
залы можно рекомендовать один из следующих приемов, кото¬
рые обеспечивают разрыхление навески в тигле и быстрое озо-
лен не.1.	Навеску в тигле заливают 5 см* этилового спирта, кото¬
рый поджигают спичкой. Когда пламя погаснет, тигель ставят
в муфель и сжигают навеску, как было указано выше.2.	Навеску в тигле смешивают тонкой стеклянной палочкой
(диаметр 2—2,5 мм) с титрованным раствором уксуснокислого
магния или кальция, содержащего приблизительно 3 мг окиси
магния или кальция в 1 см* раствора. После этого тигель с на¬
веской ставят на выпаривание, при котором иногда наблю¬
дается сильное вспучивание. После образования корки на по¬
верхности сжигаемой навески тигель ставят в печь, в которой
производят сжигание навески, как указывалось выше. Навески’• Укусуснокислый магний можно приготовить растворением окиси маг¬
ния в растворе уксусной кислоты с последующей кристаллизацией получен¬
ной соли.39»
мелкосемянных культур, 6 частности семян горчицы» рыжика,
мака, льна» проса и других культур, можно брать для озоле-
ния без предварительного измельчения.Определение щелочности эолы. Зола имеет щелочную реак¬
цию благодаря большому содержанию углекислых солей
калия и натрия. Определение щелочности можно производить,
используя золу после определения общей зольности.Тигли с золой помещают в стаканы из жароустойчивого
стекла, приливают точно отмеренное количество титрованной
0,1 н. серной кислоты и нагревают 5 минут для разложения
углекислых солей. Содержимое стакана и тигля осторожно раз¬
мешивают и избыток кислоты оттнтровывают в присутствии уни¬
версального индикатора. Иногда щелочность выражают в куб.
сантиметрах нормальной кислоты на 100 г взятой навески.Озоление и определение
главнейших
минеральных элементовСухое озоление. Некоторые минеральные элементы удобно
определять в золе, так как их концентрация увеличивается
при озолении во много раз. Однако озоление следует прово¬
дить в условиях, исключающих потерю зольных веществ. Для
получения золы для ее анализа берут около 25 г измельчен-
його материала и озоляют в небольших кварцевых или фарфо¬
ровых плоскодонных чашках. Сначала иа небольшом нагреве
обугливают» прикрыв крышкой» а затем нагрев лечи или пламя
горелки усиливают. Однако температуру не поднимают выше
550°. О температуре приблизительно можно судить по цветам
каления: темно-красный — 550—600°» вишневый — 800—900°,
темно-оранжевый—1100°.Для ускорения сжигания применяют окисление несгоревших
частиц. Для этого чашку охлаждают и остаток смачивают 5 см3
пергидроля или азотной кислоты и прокаливают в муфеле 15—
20 минут после выпаривания (при необходимости обработку де¬
лают 2 раза). Затем чашки с золой охлаждают в эксикаторе,
золу, свободную от темных частиц, пересыпают в стеклянные
бюксы.Для озоления и количественного определения золы при конт¬
ролируемой температуре удобна муфельная печь (рис. 54).Мокрое озоление. При озолении в муфеле температура в ряде
случаев контролируется только по окраске каления. При темпе¬
ратурах выше 530° могут быть потери калия и особенно фосфора.
Мокрое же озоление протекает при температуре около 330°. Для
мокрого озоления можно использовать сухой и сырой маїериал.Для мокрого озоления навеску измельченных растительных
веществ 1—3 + 0,001 г помещают в колбу Кьельдаля в зависи-400
мости от навески на 250 или 500 см3 и приливают 8 см3 крепкой
азотной кислоты, а затем частями, при помешивании, приливают
8 см3 серной кислоты. При бурной реакции и сильном вспенива¬
нии колбу охлаждают, опуская в воду. Далее сжигание ведут
при слабом нагревании на песчаной бане или колбонагрсвателс.
После прекращения выделения бурых паров окислов азота катбу
снимают с подогрева и приливают 5 см3 азотной кислоты из ка¬
пельной воронки с изогнутым для удобства концом. Эгу опера¬
цию иногда повторяют 2—3 раза. Озолеине веду г до полного
обесцвечивания. Благодаря периодическому прибавлению азот¬
ной кислоты температура озоления не поднимается выше 330°.
При сильном кипении может не хватить серной кнслоты. Тогда,
сняв с нагрева колбу, добавляют 1—3 см3 серной кислоты. В кол¬
бе должно остаться около 5 см3 жидкости. Для ускорения мокро¬
го озоления добавляют 1—2 см3 пергидроля. На дне колбы
иногда находится осадок CaSO< и Si62. Наконец, в колбу
Кьельдаля по стенкам из промывалки добавляют около 50 с-м-
волы и раствор переливают в мерную колбу (смывая колбу
Кьельдаля нескаїько раз водой); содержимое мерной колбы
после охлаждения доводят до метки для удаления избытка азот¬
ной кислоты н Si О*.Небольшие навески до 1 г могут быть озолены серной кисло¬
той (5 см3) с периодическим добавлением пергидроля в течение1—2 часов. Определение азота может быть совмещено с опре¬
делением ряда зольных элементов из одной навески. При этом
в качестве окислителей используют серную кислоту н пергидроль
или серную и хлорную кислоты, но не рекомендуются пер¬
хлораты.Растворы навесок золы или растворы после мокрого озоле-
ння используют для определения различных веществ (определе¬
ние фосфорной кислоты см. стр. 409).Определение кремнекислоти. Для определения кремнекнс*
лоты (SiO?) отвешивают часть охлажденной белой (или слегка
окрашенной в зеленоватый или розовый цвет) золы в фарфоро¬
вую чашку, куда приливают 50 см3 концентрированных соляной
и азотной кислот (1:1). Содержимое тщательно перемешивают
и нагревают на водяной бане в вытяжном шкафу около часа.
Жидкость выпаривают досуха и остаток сушат при температуре
не выше 120° (для сохранения кремнекислоти в нерастворимом
состоянии). После этого остаток растворяют в 50 см3 горячей
воды, подкисленной соляной кислотой, и отфильтровывают через
плотный фильтр в мерную колбу на 250 см3 или больше (в зави¬
симости от навески золы). Осадок кремнекислоти (иногда за¬
грязнен углем) промывают до отрицательной реакции на железо
в промывных водах (проба с роданистым аммонием). Фильтр
с осадком сжигают и прокаливают в тигле до постоянного веса.
После охлаждения и взсшнвання узнают вес осадка н вычисляют
количество кремнекислоти.401
Колбу доливают до метки и из этого раствора берут пробы
по 100 см9 для определения полуторных окислов, а также каль¬
ция и магния.Определение полуторных окислов железа и алюминия. Полу¬
торные ОКИСЛЫ (Fe203 + А12Оз) вместе с фосфорной кислотой
осаждают в форме основных уксуснокислых солей железа и алю¬
миния и фосфорнокислой соли железа.Из мерной колбы берут 100 см3 раствора золы в стакан на
250 см3 и, прибавив одну каплю метилового красного, нейтрали¬
зуют 10%-ным раствором аммиака из бюретки до слабощелоч
ной реакции (при постоянном помешивании). Затем жидкость
подкисляют уксусной кислотой до кислой реакции, добавляют
10—15 см3 10%-ного уксуснокислого натрия или аммония и жид¬
кость кипятят 2—3 минуты. Выпавший осадок быстро отфильтро¬
вывают, поддерживая жидкость в горячем состоянии. С этой
целью стаканы все время держат на кипящей водяной бане. Оса¬
док па фильтре промывают горячей водой, содержащей немного
уксуснокислого натрия или аммония, до отсутствия кальция в
промывных водах (проба на кальций).Определение кальция. Кальций входит в основную группу
органогенных элементов. Он необходим для поддержания струк¬
туры и функции мембран растительных клеток. От присутствия
кальция зависит поглощение калия из растворов в кислой среде,
а также баланс между калием и натрием. Кальций отклады¬
вается в клетках многих растений в форме оксалата. Как прави¬
ло, концентрация кальция повышается по мере старения клеток.
Принцип определения кальция основан на осаждении его щаве¬
левокислым аммонием в присутствии уксусной кислоты:CaClj + (NHJaCaO* —> CaCjO* + 2NH«CI.Реактивы и посуда: 1) 1%-ная серная кислота; 2) 5%-ный раствор окса¬
лата аммония; 3) 10%-ный раствор уксусной кислоты; 4) 0,1 и. раствор
КМпО«; 5) стеклянные тигли Jw 4 с колбой Бунзена.Ход анализй. После осаждения полуторных окислов из мер¬
ной колбы берут 50 см3 жидкости в химический стакан на
200 см3 и подкисляют 10%-ной уксусной кислотой (так как иначе
осаждение будет неполным), нагревают до кипения и прибав¬
ляют по каплям 10—20 см3 горячего раствора 5%-ного щавелево¬
кислого аммония, применяя помешивание палочкой. Для полного
осаждения стакан с осадком ставят в термостат или водяную
баню, делают пробу на полноту осаждения, прибавляя осадитель,
и оставляют на 4 часа. Затем осадок отфильтровывают и промы¬
вают через стеклянный тигель № 4. Тщательно перенесенный
осадок промывают горячей водой с несколькими кристаллами
оксалата аммония до отрицательной реакции на хлор (с AgN03).
Промывные воды время от времени сливают отдельно, убедив¬
шись, что в них нет осадка. Через 5—6 минут промывка заканчи¬
вается. Далее определяют кальций весовым или объемным мето¬402
дом. Объемное определение кальция является более точным и
быстрым. Осадок оксалата кальция на фильтре растворяют по¬
догретым раствором 1%-ной серной кислоты небольшими порци¬
ями, применяя слабое отсасывание в колбу Бунзена; затем до¬
бавляют в раствор 50—100 cjk9 горячей 1 %-ной серной кислоты и
титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до порозовения,
сохраняющегося в течение одной минуты; 1 смг 0,1 и. перманга¬
ната соответствует 2 мг Са или 2,8 мг СаО.Содержание кальция в процентах (дг) вычисляют по формуле:х = (0,0028 • а * б • 100) :где: а — количество куб. сантиметров 0,1 н. раствора перманга¬
ната;б	— величина разбавления;
н— навеска (в г).Определение магния. Магний входит не только в состав хло¬
рофилла, но н имеет большое значение в процессах обмена ве¬
ществ в клетке. Он откладывается в значительных количествах
в семенах в виде фитина. Накопление большего или меньшего
количества важнеших химических соединений в семенах зависит
от поступления магния. Он активирует ряд важнейших фермен¬
тативных реакций, связанных с переносом остатков фосфорной
кислоты на молекулы различных соединений.Реактивы: I) соляная кислота (1:5); 2) 10%-ный раствор NajHPO*;3)	10%-пый раствор аммиака; 4) 0.1 н. растворы HCI и щелочи.Ход анализа. После осаждения кальция фильтрат вместе с
промывными водами доводят до объема 100—150 до3 н берут
в стакан часть объема, содержащего 10—25 мг магния. При
необходимости взятый объем раствора сгущают выпариванием,
затем подкисляют соляной кислотой до покраснения лакмусовой
бумажки. После этого для осаждения магния к отмеренной жид¬
кости приливают 15 см3 10%-ного раствора Na2HPO*. Затем жид¬
кость нагревают до 90° и к горячему раствору приливают 10%-
ный раствор аммиака до Уз общего объема. После перемешива¬
ния раствора оседают кристаллы Mg NH4 РОц-бНгО. Если оса¬
док выпадает аморфным, то его отфильтровывают на стеклянном
тигле, растворяют в небольшом количестве НС1 (1:5) и вновь
осаждают.Осадок отфильтровывают по истечении стояния в течение
6—10 часов (удобно оставить иа ночь). Далее магний можно
определить весовым или объемным способом.При объемном определении полученный осадок от¬
фильтровывают через тигель с пористой пластинкоїі j\b 4 (или
через бумажный фильтр) и промывают 25%-ным раствором ам¬
миака. Сначала стараются осадок не переносить. Отмывают ло
отрицательной реакции с раствором AgNOe. Наконец, осадок
промывают 25%-ным спиртом для удаления аммиака и затем
чистым спиртом. Осадок подсушивают для удаления спирта. За¬403
тем осадок MgNH^PO* растворяют в избытке 0,1 м. HCI и пере-
водят в колбу. Избыток кислоты оттитровывают 0,1 н. раствором
щелочи и вычисляют количество куб. сантиметров соляной кис¬
лоты, пошедшей на разложение соли:MgNH«P04 + 2НС1 -* MgClj + NH*H3PO«.Один куб. сантиметр 0,1 и. НС1 соответствует 2 мг MgO.Определение магния и кальция с помощью комплексона-3.Матий и кальций в щелочной среде образуют с комплексоном-3
соединения, которые можно оттитровать с соответствующими ин¬
дикаторами. Комплексон-3, трилон Б (версеиат), имеет сле¬
дующую формулу:NaOOC — CHjv	XHj — COONayN — СНЭ — CHa -»	2H30HOOC — СН/	\CH3 — COOHРеактивы и посуда: 1) 5%-ный раатвор хлорного железа; 2) 5%-ный
раствор солянокислого гидрокенламина; 3) 10%-ный раствор гсксаметилсн-
тстрааынна (уротропина); 4) днэтилдмтнокарбамат натрия; 5) хлорндкоаммк-
ачный буфер; 6) мурехгид; 7) эрнохроы черный Т (CwHisOjNajS).Ход анализа. Берут 25 см9 раствора золы в коническую колбу
на 100 см*. Раствор нагревают и добавляют 3 см* 5%-ного раст¬
вора железа. Затем для осаждения ионов алюминия и фосфатов
приливают 25 см3 10%-ного раствора уротропина (pH раствора
должен быть 4,2—5,5, на что надо обращать особое внимание).
После нагревания каабы с раствором до 80° ее охлаждают и
жидкость переливают в мерную колбу на 100 см3, доводят до
метки и фильтруют после перемешивания.Для определения кальция в коническую колбу на 250 см3
отбирают 25 см3 фильтрата, содержащего 2—10 мг СаО, добав¬
ляют воды до 75 см3, приливают туда же 1 см3 или больше 5%-
ного солянокислого гидрокенламина и доводят pH жидкости до
12 10%-ным раствором NaOH (для устранения действия мар¬
ганца). Обычно для паїучения необходимого pH требуется от
5 до 10 см3 щелочи.Вредное влияние меди устраняют добавлением 50 мг днэтил-
дитиокарбамата натрия перед самым титрованием.При определении кальция в колбу прибавляют сухой мурек-
енд, растертый с NaCI (0,1:9,9), в таком количестве, чтобы жид¬
кость окрасилась в розовый цвет, и титруют 0,02 и. раствором
трилона Б до фиолетовой окраски.Для определения суммарного содержания кальция н магния
поступают до подщелачивания так же, как сказано выше. Под-
щелачиванис жидкости раствором щелочи делают до pH 9—9,5,
на что расходуют от 1 до 7 см3 щелочи. Во всех случаях pH конт¬
ролируют индикаторными бумажками (стр. 36. глава III).
После этого приливают 10 см3 хлоридноаммначного буфера для
получения pH 10 и 50 мг диэтилдитнокарбомата натрия. В ка¬404
честве индикатора прибавляют сухую смесь хромогена черного
(или эриохрома черного Т) с NaCI (0,1:9,9) до явно винно-
красной окраски жидкости и титруют 0,02 н. раствором трилона
Б до перехода окраски в сине-голубую.Каждый куб. сантиметр 0,02 н. раствора трилона Б соответ¬
ствует 0,02 мг-экв кальция или магния; 0,02 мг-экв равны 0,40 мг
кальция и 0,24 мг магния. Содержание магния (в мг-экв) узнают
по разности между результатами второго и первого титрования.Содержание выражают в процентах от золы или сухого ве¬
щества растительных материалов.А. Петербургский (1968) указывает, что марганец, даже вое-
становленный, титруется в присутствии хромогена черного, что
завышает содержание магния. Однако надо отметить, что кон¬
центрация марганца на 1—2 порядка меньше, чем магния.Определение калия. Калий играет важную физиологическую
роль в растениях. В более высоких концентрациях он находится
в молодых органах. В золе листьев и семян калий по концентра¬
ции занимает или второе или первое место. Калий регулирует со¬
отношение свободной и связанной воды в тканях растений, повы¬
шает гидрофильность протоплазмы. Он способствует не только
передвижению продуктов ассимиляции, но и активирует ряд фер¬
ментативных процессов, повышая накопление белков, полимери¬
зацию углеводов. Изучение роли калия представляет большой
интерес.Для определения калия существует много весовых и объем¬
ных методов. Лучше всего зарекомендовал себя весовой метод
И. В. Тананаева. Сущность этого метода состоит в осаждении ка¬
лия в виде кобальт-нитритного комплекса, включающего серебро.
Пропись этого метода приведена ниже.Реактивы и аппаратура: I) 0.01 н. соляная кислота; 2) 0,5 и. азотная
кислота; 3) 0,05 ii. раствор AgNCb; 4) реактив Тананаева для осаждения
калия; 5) этиловый спирт и этиловый эфир; 6) колбы Бунзена; 7) стеклян¬
ные тигли Л) 4 и обычная химическая посуда.Приготовление реактива Тананаева. В мерную колбу на
250 слi3 наливают 50—70 см3 воды, в которой растворяют 18 г
акотнокнелого кобальта — Co(N03)2*6H20 — и 6 г азотнокис¬
лого серебра — AgNOa. После растворения солей всыпают в эту
же колбу 60 г нитрита натрия и хорошо встряхивают, прибавляя
50 см3 воды до полного растворения нитрита. Затем прибавляют
по каплям 2,5 см3 раствора азотной кислоты (253 г безводной
кислоты в 1 дм3 воды) при взбалтывании колбы. Через 2—3 часа
раствор фильтруют в мерный цилиндр и доводят дистиллирован¬
ной водой до 195 см3. Этот реактив хранят в темной склянке.Ход анализа. Мокрое озолеине. Для определения ка¬
лия используют золу, полученную так, как сказано на стр. 400.
Калий можно определять в растворах, полученных непосредст¬
венным извлечением сухих навесок растительных объектов раст¬405
вором 0,01 к. соляной кислоты. Хлор мешает определению калия
методом И. В. Танаиаева и его следует удалять. Определение
содержания калия удобнее совместить с определением фосфора
в растворах, полученных при мокром озолении с азотной кисло¬
той и пергидролем (стр. 400).Навеску 2 + 0,001 г сухого измельченного вещества экстраги¬
руют с 100 см8 0,01 н. НС1 в течение 20—30 мйнут на кипящей
водяной бане. Затем экстракт фильтруют через беззольиый
фильтр в мерную колбу на 200 см3 и доводят до метки. Фильтро¬
вание можно ускорить, применяя стеклянные тигли и отсасыва¬
ние. Затем берут 25 слР раствора и, прибавив 1 см3 крепкой
HNOs в чашке под тягой, на водяной бане содержимое выпари¬
вают досуха (так же поступают, если используют солянокислый
раствор золы).Осаждение калия. Сухой остаток в чашке растворяют
в 25 о*3 дистиллированной воды, тщательно обмывают стенки
чашки, протирая их палочкой с резиновым наконечником, и, при¬
бавив 2 капли метилоранжа, нейтрализуют 0,01 н. раствором ед¬
кого натра до розовой окраски.После этого чашку нагревают на водяной бане и для осажде¬
ния осталка хлора прибавляют несколько капель 0,05 и. раствора
AgNOa. Затем раствор фильтруют в мерную колбу на 50 см3,
промывают фильтр и, добавив 2—3 капли 0,05%-ной азотной
кислоты, доводят водой до метки. Наконец, в стакан на 50 слэ
приливают 5 см3 реактива Тананаева и туда же приливают 2$ см3
исследуемого раствора, в котором должно быть от 3,5 до 4 мг
калия. Жидкость в стакане перемешивают стеклянной палочкой
2 минуты и оставляют стоять на 1—2 часа. За это время вы¬
падает осадок комплексной соли:3KNOa + NaAg2Co(N02)6 + Na2AgCo(N02)6 =
=3NaN03 + KAg2Co(N02)e + K2AgCo(N02)e.Осадок фильтруют через предварительно взвешенный стеклян¬
ный пористый тигель 4, применяя отсасывание. Осадок на
фильтре промывают 0,5%-ной уксусной кислотой, пока фильтрат
не станет совершенно бесцветным. Затем осадок промывают
спиртом, эфиром (по 3—5 cjk3) и, наконец, сушат в термостатетаблица зо	Коэффициент для пе¬ресчета соли калия на
налийВес осадка <*)Коэффн- І
пнект 1i Вес осадка (.’>Ко»ффн-имеит0,2800-0.33250.2270-0.28000,1725-0,22700.1300-0,17250,11950,11860.11670.11550.0875-0,1300
0,0660-0,С875
0,0446-0,0660
0,0022-0,04460,11450,11380,11280,1124406
при 105° в течение 20 минут и после охлаждения взве-
шнвают.Вычисление результатов. Вес стеклянного тигля с
осадком за вычетом веса чистого тигля соответствует осадку
комплексной соли калия. Для вычисления калия величину осадка
умножают на коэффициент, который находят в табл. 20.Пример вычисления. По ходу определения было взято 0.5 объема
жидкости после экстракции калия из навески и 0.5 объема для осаждения.
Таким образом, вес осадка соответствует 0.25 веса взяїой навескн. Следо¬
вательно. процентное содержание калия (х) будет:4100а
ДГ =	-	.где: а — вес осадка после умножения на коэффициент;н — навеска материала.Колориметрический микрометод определения железа. Метод
пригоден для определения железа непосредственно в соляно¬
кислом растворе золы, полученной из навесок 0,5—5 г.Реактивы: 1) 0.1%-ный раствор а,а-дипиридила (сохранять в холоде);
2) 2.5%-ный раствор гидрохинона в 0.17% -ной соляной кислоте (готовят
перед употреблением); 3) ацетатный буфер pH 4.6; 4) соляная кислота
(плоти. 1.19). не содержащая железа; 5) стандартный раствор железу
(0,1404 г кристаллической соли Мора« 5 см} крепкой серной кислоты доводят
перегнанной водой до І дм\ I см* этого раствора содержит 0.02 мг же¬
леза; можно приготовить стандарт растворением чистого железа в 0.3 и.
соляной кислоте — 2 мг в 100 сл*1).Ход анализа. Навеску от 0,5 до 5 г (для листьев от 0,5 до 1,
для семян от 2 до 5 г) озоляют, как указано выше (стр. 400).
Для этого анализа может быть использована зола после опреде¬
ления общего содержания золы в растениях и после определения
ее щелочности. Раствор золы фильтруют в мерную колбу на
100 смг, тщательно смывая тигель дистиллированной водой, и
доводят до метки. Переливают 10 см3 этого раствора в колбу
на 100 cju3 и добавляют туда же (при помешивании) 2 см3 раст¬
вора гидрохинона, 5 см3 буфера и 2 cjk3 раствора а,а-днпири-
дила. Интенсивность окраски раствора измеряют на фотоэлектро¬
колориметре или фотометре (стр. 201). Одновременно точно так
же проводят контрольное определение на реактивы.Определение хлора. Растительные материалы или другие ор¬
ганические вещества, содержащие хлор, по методу, модифициро¬
ванному В. П. Ниловой, разрушаются марганцовокислым калием
в кислом растворе в присутствии избытка азотнокислого геребра.
Часть азотнокислого серебра при этом связывается хлором (не¬
органическим и находившимся прежде в органических соедине¬
ниях). Остаток азотнокислого серебра оттитровывается обратно
роданистым аммонием в присутствии железоаммиачных квасцов
в качестве индикатора. Конец реакции характеризуется появле¬
нием розовой окраски.407
Реактивы и аппаратура: 1) 0,01 в. раствор азотнокислого серебра;
2) 0,01 н. раствор роданистого аммония или роданистого калия;) 3) растаор
азотной кислоты (1:1); 4) насыщенный раствор железоаммиачных квасцоп
[(NHi)jSO* Fej(SO«)jl; 5) насыщенный раствор перманганата; 6) щавелевая
кислота, не дающая реакции на ион хлора; 7) вода, дважды перегнанная
в стеклянном аппарате; 8) микробюретка (см. рнс. 36).Ход анализа. Навеску 2 — 5 і 0,001 г растительного матери¬
ала помещают в колбу Кьельдаля. Из микробюреткн или из
точной пипетки в колбу приливают такое количество 0,01 н. раст¬
вора AgNCb, которое должно соответствовать возможному коли¬
честву хлора в исследуемой навеске, чтобы после реакции оста¬
вался некоторый его избыток. Так, для определения хлора в
листьях пшеницы надо прибавить 2 см3 0,1 н. раствора AgN03.
В колбу вносят 20—25 см3 раствора азотной кислоты (1:1) и
ставят на песчаную баню. Когда содержимое колбы прогрето,
вносят по каплям насыщенный раствор перманганата и продол¬
жают вести минерализацию, нагревая колбу на бане. По мерс
исчезновения окраски раствора в процессе деления пробы под¬
ливают раствор перманагаиата, пока окраска не станет медлен¬
но исчезать. Небольшой избыток перманганата не вредит; его
удаляют прибавлением в раствор небольшого количества щаве¬
левой кислоты.Охлажденный бесцветный раствор разбавляют дважды пере¬
гнанной водой примерно в 10 раз, к нему приливают 1 с.н3 насы¬
щенного раствора квасцов и оттнтровывают из бюретки или
микробюреткн (смотря по содержанию хлора) избыток азотно¬
кислого серебра 0,01 н. раствором роданистого аммония; I см3
0,01 и. раствора AgN03 или NH^CNS соответствует 0,355 мг
хлора. Чувствительность метода — не меньше 0,035 мг хлора.Определение нитратного азота no X. Починку—Гриссу. Ме¬
тод основан на восстановлении нитратов до нитритов цинком в
слабокислой (уксуснокислой) среде:NaNO, + Zn + 2СН3СООН —» NaNO, + Zn(CH,COO), + H,0Нитриты определяют по интенсивности розово-красной окрас¬
ки, полученной с а-нафтиламином и сульфанилоэой кислотой
(азокраска):NaNO, + Cl0HjNHj + NHAH1SO3H + СНаСООН -*—* NH9C,0He — N = N — CeH*S03H + CH3COONa + 2НгОРеактивы и аппаратура: 1) реактив на нитриты (0,10 г а-нафтнламина
растворяют в 60 см9 воды при нагреве; если проявляются жирные фиолсти-
пые капельки, их удаляют фильтровальной бумагой, затем добавляют 0.25 г
сульфиннловой кислоты н после полного растворения при перемешивании
переливают в мерную колбу на 100 см3; добавляют 40 cjk3 ледяной уксусной
кислоты и доводят водой до метки; хранят раствор в темной склянке);2)	0,4 М раствор ацетата натрия; 3) цинковая пыль (20 г пыли настаивают
в течение 30 минут с 100 см1 горячей 2%-ной уксусной кислоты, после
чего отфильтровывают, промывают и высушивают иа воздухе); 4) стандарт¬
ный раствор нитрата калия (180,6 мг растворяют в ЗД0 cjk3; из этого408
раствора готовят рабочий раствор, в 1 см* которого содержится ІІ мкг NOj—
2.5 мкг азота; в мерную колбу на 100 см3 приливают 5 сму образцового
раствора, 0,5 cjk* ледяной уксусной кислоты и доводят водой до метки).Ход анализа. Отвешивают из средней пробы 500 мг воздуш¬
но-сухого вещества и тщательно растирают с 0,5%-ной уксусной
кислотой. Затем переливают суспензию в мерную колбу на
50 см3, смывают ступку и доводят до метки. Экстракт фильтруют
через беззольный фильтр (белая лента) и отмеривают 4 см3 в
сухую пробирку (диамегр 16 лик), добавляют туда же 4 см3
0,4 М ацетата натрия и 10 мг цинковой пыли. Смесь перемеши¬
вают и периодически встряхивают в течение 10 минут (можно
использовать механический прибор).Для колориметрирования хорошо перемешанную смесь цен¬
трифугируют 3 минуты при 2 тыс. обімин или фильтруют. Всу¬
хую пробирку отбирают 4 см3 и добавляют в нее 1 см3 реактива
на нитриты. После перемешивания через 10 минут окрашенный
раствор сравнивают в колориметре с образцовым или фотомет*
рируют (ФЭК-М) при светофильтре 540 нм в кювете шириной
10 мм.Для фотометрирования берут 2 см3 исследуемого раствора
и разбавляют его до 5 см3.Вычисление производят по калибровочной кривой, которую
готовят, используя раствор, содержащий в 1 см3 2,5 мкг азота,
и поступают как описано выше.Результаты вычисляют по формуле (в мг на 100 г раститель¬
ного материала):0,1-у-а
VfVj-K ’где: 0,1 — коэффициент для перерасчета вещества (в мг на 100г);
а — микрограммы нитритного азота, найденного по калиб¬
ровочной кривой;V	— исходный объем вытяжки;їм— объем, взятый для восстановления;Vi — объем, взятый для фотометрирования с учетом разве¬
дения;
н — навеска.Колориметрический микрометод определения фосфора. Фос¬
фор в растениях находится в виде различных соединений фос¬
форной кислоїы и играет большую физиологическую роль. Наи¬
большее количество фосфорной кислоты сосредоточено в семенах.Колориметрический метод определения фосфора по Фиске —
Суббароу основан на том, что фосфорная кислота в присутствии
молибденовокислого аммония в кислой среде образует фосфо-
молибденовокнслый аммоний. Это соединение при взаимодейст¬
вии с восстановителем (эйконогеном) дает синее окрашивание.
Интенсивность окраски пропорциональна количеству фосфорной
кислоты, содержащейся в растворе. Модификации этого метода409
связаны главным образом с применением различных восстанови¬
телей (амидола, хлористого олова, аскорбиновой кислоты и т. д.)
при соответствующей кислотности среды. От восстановителя за¬
висит скорость превращения фосфорномолибденового комплекса
в «синь», а также чувствительность метода *.Реактивы и аппаратура: 1) стандартный раствор однозаметенного фос¬
фата калия (готовят растворением 0.439 г КпгРО« в I дм* дистиллирован¬
ной воды; в 1 см* приготовленного раствора содержится 0.1 мг фосфора;
фосфат калия предварительно сушат в течение двух часов при 100е); 2) 10 и
раствор серной кислоты (279 г*3 концентрированной кислоты — плот. 1.84—
разбавляют водой до I дм*), 3) 2.5%-ный раствор молнбдсновокислого ам>
моння в 5 ii. серной кислоты (25 г чистого молнбдсновокислого аммония
растворяют примерно в 300 см* воды в мерной колбе на I ОмК затем при¬
ливают 500 см* 10 и. раствора серной кислоты, доводят объем до меткм
дистиллированной водой и раствор фильтруют); 4) 0.2%-ный раствор эйко-
ногена (нлн амидола — прн модификации метода); 5) 1 н. раствор HtSCb;
6) 10%-ный и 20%-ный раствор NaOH; 7) фенолфталеин — 0.5°/о-ный
спиртовой раствор; 8) 30%-ная хлорная кислота или 30%-ный пергидроль
(последний очищают от следов фосфора, для чего на 200 см' Н/)» при¬
бавляют 20 см* 2%-ного хлорного железа — FeClj, перемешивают и добав¬
ляют 10 г CaCOj. взбалтывают и фильтруют через фильтр с пористым дном
Л* 3; к фильтрату приливают I см* концентрированной HCI; раствор хранят
в темной склянке); 9) фотоэлектроколорнметр.Приготовление растворов-восстановителей. Раствор эико-
ногена. Навеску 200 мг эйконогена (1, 2, 4-аминонафтолсуль-
фоновой кислоты), 12 г бисульфита натрия (Na2S20s) и 2,4 г
сульфита натрия (Na2SOa) растворяют в мерной колбе на 100 см'
в небольшом количестве воды, встряхивают и объем доводят до
метки дистиллированной водой. Раствор фильтруют через бу¬
мажный фильтр и хранят в холодильнике в течение двух недель.Р&створ амидола. Раствор готовят на 10%-ном мета-
бисульфите калия. Берут 5 г метабисульфита калия в мерную
колбу объемом 50 см* и растворяют примерно в 25 см3 дистил¬
лированной воды, затем добавляют 100 мг амидола, встряхивают
и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор хра¬
нят в темной склянке не более 10 дней.Ход анализа. Навеску семян (или сухих листьев) 200 мг по¬
мещают в колбу Кьельдаля (на 50—100 елі3) или в коническую
колбу с удлиненным горлышком (на 100 с*3), приливают 3--4	см* крепкой серной кислоты, 2 см3 30%-ной хлорной кислоты и
сжигают до полного обесцвечивания. Если раствор долго оста¬
ется желтым, то колбу охлаждают и прибавляют еще несколько
капель хлорной кислоты. Сжигание ведут при слабом нагреве.
Сильный нагрев вначале и в стадии выделения белых паров мо¬
жет вызвать потерю фосфора. При отсутствии хлорной кислоты
используют пергидроль; последний приливают в колбу не сразу,
а предварительно доводят содержимое до начала побурения.•	Г. Н. Никулина. Обзор методов колориметрического определении
фосфора но образованию «молибденовой сини». «Наука». 1965.410
После обесцвечивания содержимого горлышко колбы обмывают
дистиллированной водой и дожигают до полного обесцвечивания
раствора. Затем колбу охлаждают, содержимое переводят, смы¬
вая дистиллированной водой, в мерную колбу на 50 или на
100 cjk3 (для масличных семян), доводят до метки и перемеши¬
вают. Для определения фосфора из полученного объема берут
2 см3 и вносят в мерную колбочку на 10 cjk3. Нейтрализуют по
фенолфталеину едким натром, для чего прибавляют 2 капли фе¬
нолфталеина и затем осторожно, по каплям 10%-ный или
20%-ный раствор NaOH до розового цвета. Избыток щелочи
устраняют прибавлением по каплям 1 н. раствора HjSO* до
обесцвечивания от одной капли.Края колбочки обмывают дистиллированной водой и вносят1	см3 молибденовокислого аммония. Затем прибавляют 0,4 смь
раствора эйкоиогена, доводят дистиллированной водой до метки,
перемешивают и через 30 минут стояния при комнатной темпе¬
ратуре (или через 3 минуты при 37°) фогометрируют. Работа
на ФЭК-М ведется с красным светофильтром. Содержание фос¬
фора вычисляют по заранее составленной калибровочной кривой.Примечание. В случае применения о качестве восстановителя ами¬
дола (модификация метода Аллена) в мерные колбочки на 10 см3 наливают2	см1 раствора фосфата. После нейтрализации вносят 1,6 мг 2.5% -його мо-
либденовокислого аммония. 5 см3 дистиллированной воды, затем 0.5 смл ами¬
дола. Объем доводят до метки дистиллированной водой и колориметрируют
через 30 минут, как указано выше.Для построения калибровочного графика исходный стандарт¬
ный раствор разбавляют в 4 раза (25 см3 в мерной колбе
на 100 см3 доводят перегнанной водой до метки). В I см3 приго¬
товленного рабочего раствора содержится 0,025 мг фосфора. В
мерные колбочки на 10 cjk3 вносят следующие количества рабо¬
чего раствора: 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2; 2,4 см1 и т. д. Эго соответствует:
0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06 мг и т. д. внесенного фосфора, а
концентрация фосфора (мг в 1 cjk3) будет: 0,001; 0,002; 0,003;
0,004 и т. д. Содержимое колбочек нейтрализуют по фенолфта¬
леину едким натром, прибавляют все необходимые реактивы, как
указано выше, и после 30-минутной экспозиции приступают к
измерению оптической плотности на фотоэлектроколориметре. В
работе обычно используют кювету с длиной оптического пути
5 мм. При построении калибровочного графика на оси абсцисс
откладывают содержание фосфора, а на оси ординат — экстинк¬
ции растворов.Пример расчета. Навеска семян 0.2 г. Объем пробы 50 еді На
определение взято 2 см3. Концентрации фосфора (мг в 1 см1), найденнчя
по калибровочной кривой. 0.0036. Содержание фосфора (в мг на 100 г воз¬
душно-сухих семян) будет:0,0036-10-50.100
х - 2.0,2 _ 45°*
Определение фосфора с применением аскорбиновой кислоты.Принцип метода по Лоури и Лопесу в модификации Скулачева *
состоит в превращении фосфорномолибденового комплекса в
«синь» под действием аскорбиновой кислоты. Ускорение реакции
и повышение чувствительности метода достигается присутствием
ионов меди в инкубационной среде. Этот метод особенно приме-
ним в тех случаях, когда в анализируемой вытяжке, кроме неор¬
ганического фосфора, присутствуют лабильные органические
фосфорсодержащие соединения. Образование и восстановление
фосфорномолибденового комплекса проводится при более низ¬
кой кислотности среды (pH 4), чем в методе Фиске—Суббароу
(pH 0,65). В таких условиях лабильные фосфорные соединения
более устойчивы.Реактивы •• и аппаратура: I) 0,1 М ацетатный буфер, pH 4; 2) 1%-ный
раствор молибденовокнелого аммония, приготовленный на 0,05 н. растворе
серной кислоты; 3) 1%-ный раствор аскорбиновой кислоты, приготооленный
на 0,001 М растворе сернокислой меди — CuSOvSHgO (реактив нестоек,
поэтому готовят небольшие порции в день определения — на 25 ел»3 берут
0,06 г сернокислой меди, растворяют в 10—12 ди* воды, добавляют 0,25 г
аскорбиновой кислоты и объем доводят до метки); 4) фотоэлсктроколорп-
метр.Ход анализа. Из полученного экстракта для определения не¬
органического фосфора берут 0,1 см3 вытяжки, 5 см3 ацетатного
буфера, 0,5 см3 1%-ного молибдата аммония и 0,5 cjw3 раствора
аскорбиновой кислоты. Общий объем 6,1 см3. Через 10 минут
раствор колориметрируют на ФЭК-М при красном светофильтре,
используя кюветы 10 мм.Для построения калибровочной кривой берут объемы фосфата
от 0,05 до 0,5 см3. Объем ацетатного буфера изменяют от 5,45 ло
5 см3 в зависимости от взятого объема фосфата. Общий объем
смеси (фосфат 4* реактивы) равен 6,5 см3.Метод характеризуется более высокой чувствительностью, чем
другие колориметрические методы, и позволяет определять от
0,3 до 6 мкг Р в 1 см9 колориметрнруемого раствора.Определение бора. Бор необходим для нормального развития
и плодоношения ряда культурных растений из семейств маре¬
вых, крестоцветных, сложноцветных, цитрусовых и др. В от¬
сутствие бора затруднено поступление кальция в расте¬
ния. В литературе (Б. А. Рубин, 1962) приводится ряд фак¬
тов о физиологической зависимости между бором и каль¬
цием у растений.Сущность метода определения бора по П. Ннкншкиной (см.
А. В. Петербургский, 1968) основана на образовании фиолетово-
синей окраски с раствором кармина в крепкой серной кислоте.*	В. П. С к у л а ч с р. Соотношение окисления и фосфолнрнровапии в ды¬
хательной цепи. Изд. АН СССР. 1962. стр. 153.•• Все растворы готовят на бмдистилляте.412
Реактивы и аппаратура: 1) раствор 50 мг кармина в I дмл серкой кис¬
лоты (плотн. 1,84); 2) пергидроль; 3) 0.5 н. раствор серной кислоты:4)	10%-ный раствор гнпофосфита кални нлн натрия в 2%-ной соляной кис¬
лоте; 5) ФЭК*57; 6) кварцевая или платиновая чашечка.Приготовление стандартных растворов. Растворы для срав¬
нения готовят с концентрацией бора от 0,5 до 10 мкг в 1 см3 жид¬
кости. Отвешивают 2,858 г перекристаллизованной борной кисло¬
ты, растворяют в 1 дм3 0,5 и. серной кислоты и доводят до метки.
В 1 см3 этого раствора содержится 0,5 мг бора (раствор № 1).
Берут 20 см3 раствора № 1 и доводят 0,5 и. раствором серной
кислоты до 1 дм3 (раствор Л% 2). В 1 см3 раствора Хя 2 (рабо¬
чего) содержится 10 мкг бора.таблица зі	Шкала стандартныхрастворов (в см*) для
определения бора
(в мкг/см3)Бор0.S п.
Н*50,Н,ВО,Бор04 N.H.SO,н,во.0,50,950,05б0,400.6010.9J0,1080,200.6020,800,20100,001,0040,600,40Для приготовления шкалы берут микробюреткой в 7 кварце¬
вых пробирок с притертыми пробками указанные в таблице ко¬
личества раствора борной кислоты и 0,5 и. раствора H2SO4.
Затем в каждую пробирку с I см3 смеси добавляют 0,5 см3 ги-
пофосфнта калия и 19 см3 0,005%-ного раствора кармина, про¬
бирки закрывают пробками и взбалтывают. После установления
максимальной окраски (1,5—2 часа) проводят фотометрирова-
мне.Ход анализа. Навеску 0,5—1 і 0,001 г сухого растительного
материала смачивают, озоляют в кварцевой чашечке 1%-пым
раствором КОН и после выпаривания на плитке озоляют в му¬
феле при температуре до 550°. Бледно-серую золу растворяют в5	или 10 см3 0.5 и. серной кислоты (в зависимости от количества
бора) при подогревании, фильтруют через беззольный фильтр и
берут 1 см3 для определения бора. К этому объему в кварцевой
пробирке с пробкой добавляют 0,5 см3 гипофосфита калия и
19 см3 раствора кармина, закрывают пробкой и перемешивают;
через 1,5—2 часа измеряют интенсивность окраски на ФЭК-57
при светофильтре 7 или 11 и сравнивают с образцовыми раст¬
ворами. Измерение можно проводить и на ФЭК-М, тогда в ка¬
честве светофильтра используют раствор кармина.Определение калия, натрия я кальция методом пламенной
фотометрии. Метод основан на определении интенсивности от¬413
дельных линий спектра, характерных для каждого элемента,
электроны которого находятся в возбужденном состоянии в пла¬
мени с высокой температурой. По силе возникшего при этом
тока судят о концентрации элемента в опытном растворе.Реактивы и аппаратура: I) раствор KCI (1,9069 г сухой соли раство¬
ряют в I дм 2%-ной I1CI); 2) раствор NaCI (2.5420 г сухой соли раство¬
ряют в I дм} 2%-ной НС1); 3) раствор CaCOj (2,4973 г высушенного
в течение часа при 100° нейтрализуют 10 см* концентрированной соляной
кислоты и доводят до I дм3 2%-ной HCI; растворы для построения ка¬
либровочных кривых готовят из псрскристаллнзованных солей); 4) баллон
с ацетиленом; 5) баллон с воздухом или мембранный компрессор; 6) пла¬
менный фотометр (рис. 55)Рис. 55. Общий вид пламенного фотометра ФПФ-58./—водяной нанометр, 9 — регулятор давления воздуха, 3 — манометр. 4 я
4 — регуляторы потенциометров, 6 — регулятор давлення ацетилена. 7 — шту¬
цер для подключения подачи воздухе, в — узел распыления, 9 — ручка ком¬
бинированной заслонки. 10 — патрубок горелки. II — микроамперметры.Работа с пламенным фотометром. Включение и подготовку
прибора к измерениям проводят в соответствии с инструкцией
к приборам (см. также А. В. Петербургский, 1968, стр. 59).Для подачи пропан-бутаиовой смеси или ацетилена в прибор
открывают вентили, установленные на баллоне и редукторе, и по¬
степенно увеличивают подачу газа до тех пор, пока с помощью
искрового разрядника не зажжется газ над горелкой при давле¬
нии ацетилена 120—200 мм (регистрируют водяным маномет¬
ром). Конус пламени над горелкой должен иметь голубой цвет,
быть четко очерченным и не сильно вытянутым. При установив¬
шемся стабильном режиме горения фиксируют по показаниям414
манометров давление воздуха и ацетилена, так как это необхо¬
димо при калибровке и измерениях опытных растворов.Сжатый воздух из баллона или компрессора поступает в
распылитель и на манометр. В распылителе сжатый воздух, про¬
ходя через сопло, создает на выходе разрежение, благодаря чему
происходит засасывание и распыление изучаемого раствора
(аэрозоль). Трубка от распылителя обязательно опускается в со¬
суд с водой. Образовавшийся аэрозоль проходит через каплеот-
делитель и поступает в смеситель горелки, где перемешивается
с ацетиленом, поднимается к головке горелки и сжигается над
ней.Для построения калибровочных кривых готовят
эталонные растворы: 5—50 мг натрия или калия и 10—150 мг
кальция в 1 дм3. Для приготовления эталонных растворов натрия
и калия из чистых растворов готовят промежуточные 0,01%-ные
растворы. Работу с прибором начинают с распыления перегнан¬
ной воды и установки указателя микроамперметра на нуль. При
этом компенсационное плечо перекрывают, а в основном плече
устанавливают светофильтр, соответствующий элементу, по ко¬
торому производят калибровку.Эталонные растворы этого элемента с равномерно возрастаю¬
щей концентрацией поочередно вводят через распылитель в
пламя фотометра и делают отсчет по микроамперметру. Распы¬
литель промывают после каждого определения перегнанной во¬
дой до тех пор, пока зайчик микроамперметра не вернется в ну¬
левое положение. На графике по оси ординат записывают пока¬
зания микроамперметра, а на оси абсцисс — соответствующие нм
концентрации катиона (мг в I дм*). Кроме того, на графике ука¬
зывают условия работы на приборе: раскрытие диафрагмы, по¬
ложение рукоятки чувствительности прибора, давление воздуха
и ацетилена и другие необходимые сведения.Пример построения калибровочной кривой для каль¬
ция В 8 мерных колб на 100 см? наливают поочередно: 1; 2; 4; 5: 6: 8;
10 н 15 смі* чистого 0,1%'Horo раствора СаСОэ н доводят 2%-ным раствором
НС1 до метки. При таком разведении в растворе содержится 10; 20; 40; 50;
60; 80; 100 н 150 мг кальция в 1 дм*.Показания приборов для растворов в колбах от І до VIII были: 1 — 6;
11-12; III — 23; IV-29; V-35; VI-45; VII —56; VIII-87.Условия снятия калибровочной кривой: давление воздуха—0.4 атм, дав¬
ление ацетилена — 160 jhjh водяного столба, диафрагма — 44, светофильтр —
№ 2. чувствительность прибора — 1.Во время работы прибора надо 2—3 раза производить проверку калиб¬
ровочного графика.Анализ опытной пробы. Растворяют навеску золы 100—200 мг
в 4,6 см3 концентрированной НС1 в мерной колбе на 100 см3 и
доводят до метки перегнанной водой, а затем фильтруют через
беззолышй фильтр.Солянокислые растворы солей золы (опытные растворы) по¬
очередно подносят к распылителю. При определении концентра»415
ции калия устанавливают светофильтр №4 и диафрагму основ¬
ного плеча иа деление 48,5. Концентрацию элемента определяют
ло калибровочной кривой.При определении концентрации натрия и кальция применяют
компенсационный метод измерения. Так, прн определении натрия
сначала грубо (без компенсации) определяют концентрацию
кальция (установив в основном плече светофильтр и диафрагму
для кальция). Затем в основное плечо включают светофильтр
для натрия, а в компенсационное — светофильтр для кальция.
В пламя горелки вводят стандартный раствор кальция с кон¬
центрацией, соответствующей концентрации кальция в опытном
растворе. Диафрагма основного плеча должна быть такой же,
как при построении калибровочной кривой для натрия (60). Из¬
менением диафрагмы компенсационного плеча устанавливают
указатель микроамперметра на нуль. В этом случае фототок бу¬
дет скомпенсирован по кальцию. Затем опытный раствор вводят
в пламя горелки и по величине отсчета микроамперметра и по
калибровочной кривой для натрия определяют его концентрацию.Подобным же образом определяют кальций, произведя ком¬
пенсацию фототока по натрию.таблица 22	Характеристика светофильтровпламенного фотометра модели
ФПФ-58Раскрытиедиафрагмыосновногоплечамсвето¬фильтр*Длюм водны(МЛ) UI ПОЛ¬
НОГО пропус¬
канияДля какого
элементаМесто уста коми
светофильтра60,0159Э+ЮNa1 В ОСНОВНОМ и44,02620**®Са! компенсационномJ плечах48,54768+10КВ основном плечеПо окончании работы необходимо: 1) отключить подачу аце¬
тилена, закрыв вентиль на баллоне; 2) когда стрелка манометра
на редукторе баллона спадает на нуль, закрыть вентиль редук¬
тора; 3) отключить компрессор и выключить прибор.Вычисление результатов производят по формуле:Е'К'Об’Обі* 100х~—«-orf.-iiXx)—-■*»“ 100 *•где: Е — показание прибора;/( — коэффициент, полученный прн калибровке прибора:
об— первоначальный объем раствора зольных элементов;
об\ — количество куб. сантиметров, взятых для дополнитель¬
ного разведения;
оба — объем дополнительного разведения^
н — навеска.416
Пример вычислении. Зола белокочанной капусты в количестве
100 мг растворена в 100 см* (об) 2%*ной НС1. Отсюда взнлн 5 см* (об»)
н дополнительно развели 50 см? (об3). Показание прибора прн определе¬
нии калия — 59. Коэффициент на калибровочной кривой для калия — 0,05.
Подставив в формулу эти значення, получим:0.65 • 59 • 100 . 50 . 100	о;І .'5 • І000	= 38,35% калия в золе.В лабораториях нашей страны используют пламенный фото¬
метр Ланге (модель С). Последний прибор позволяет определять
до 10 элементов. Пользование указанными приборами изложено
в специальных инструкциях к ним и в отдельных руководствах по
пламенной фотометрии.Определение железа, марганца, цинка и меди методом поля¬
рографии. Принцип метода. Полярограф позволяет записать
вольтамперную кривую, называемую полярограммой, если прово*
дить электролиз растворов солей капельным ртутным методом в
условиях возрастающего напряжения (от 0 до 2 о). Эта кривая
показывает ход изменения силы тока, проходящего через раст¬
вор, в связи с изменением напряжения и позволяет определять
не только качественно, но и количественно катионы, присутст¬
вующие в опытном растворе.Кривая показывает, что пока приложенное напряжение не
достигло определенной величины, сила тока остается постоянной,
близкой к нулю (остаточный ток). Если только напряжение пре¬
высит эту величину, то сила тока быстро увеличится (с ростом
напряжения) и кривая круто поднимется кверху, а затем увели¬
чение силы тока снова прекратится и кривая перейдет в прямую,
параллельную оси абсцисс (предельный или диффузионный ток).Величина потенциала, при котором начинается крутой подъем
кривой, зависит от концентрации восстанавливаемого иона и от
способов измерения. Для удобства измерения берут среднюю
точку наклонной кривой и. опустив из нее перпендикуляр на ось
абсцисс, отсчитывают соответствующее ей напряжение. Получен¬
ная величина, называемая потенциалом полуволны, не зависит
от концентрации ионов в растворе и способов его измерения и
характеризует природу восстанавливаемых на катоде ионов, т. е.
на этом основано качественное их определение.Количественное определение основано на измерении высоты
полярографической волны, т. е. силы предельного тока. По мере
повышения напряжения скорость восстановления ионов опреде¬
ляемого металла на катоде возрастает, а непосредственно при¬
легающий к катоду слой раствора обедняется этими иоиамн
до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие ионов, разря¬
жающихся в единицу времени на катоде и подходящих к нему
в результате диффузии из более отдаленных частей раствора.
Скорость диффузии пропорциональна разности концентраций
ионов в растворе й в прилегающем к катоду слое (при предель¬
ном токе концентрация ионов у катода практически равна нулю).417
Следовательно, высота полярографической волны прямо пропор¬
циональна концентрации определяемых ионов, которые восста¬
навливаются на катоде.Если в опытном растворе присутствуют сразу несколько
ионов, то при повышении напряжения после достижения предель¬
ного тока для одного иона в конце концов будет достигнут по¬
тенциал, при котором начинают восстанавливаться катионы дру-Рис. 56. Полярограф ЛР-60 (ЧССР).гою металла, т. с. вольтампериая кривая после горизонтального
участка начнет снова круто подниматься вверх и возникнут дру¬
гие полярографические волны.Реактивы и аппаратура: I) I н. раствор щавелевой кислоты; 2) 0.5 ii.
расгвор щавелевокислого аммония или 0.5 М триэтаноламин или комплск*
сон-1 (нитрнлотриуксусная кислота); 3) 5%-ныЙ раствор (Nf-hh'FefCtOth*
•ЗНаО или FcCU; 4) 5 М едкий натрий; 5) 25%-ный раствор аммиака;
6) 0,5%-ный раствор желатина; 7) растворы 0.01 М сернокислого марганца
н сернокислого цинка; 8) полярограф ЛР-60 (рис. 56) или полярограф П-8-5
(СССР), которые уста на ил ива ют в соответствии с инструкциями, приложен¬
ными к приборам); 9) баллон с азотом.
Ход анализа. Около 1 г золы отвешивают в фарфоровую чаш¬
ку н растворяют в I см* соляной кисюты (1:3) в присутствии
нескольких капель 3%-ной перекиси подо родя. Затем раствор вы¬
паривают досуха на песчаной бане и кремнекислоту (содержа¬
щуюся и золе) переводят в нерастворимую форму, выдерживая
около часа в сушильном шкафу прн 110°. После этого остаток
растворяют при кипении в 10 см3 1 н. соляной кислоты. Раствор
фильтруют для отделения кремнекислоти через фильтр (диамет¬
ром 3 см) в мерную колбочку на 25 см'Л. Фильтр промывают пор¬
циями по 5 смЛ горячей 1 и. соляной кислоты до тех пор, пока
объем фильтрата не достигнет метки.Определение железа. Для анализа берут различные объемы
солянокислого фильтрата в зависимости or содержания в нем
железа. Сначала в полярографическую ячейку Калауска с насы¬
щенным каломелевым электродом (или ртутным электродом) на¬
ливают раствор-фон (смесь 1 едг1 щавелевой кислоты и 1) см' ща¬
велевокислого аммония pH 4), затем удаляют из раствора воздух,
пропуская азот в течение трех минут, и после этого записывают
полярограмму раствора-фона, чтобы проверить его чистоту.Затем в ячейку добавляют 0,5 см3 (или меньше) опытного
раствора. Для перевода железа в трехвалеитную форму раствор
продувают кислородом, полученным из щелочного раствора пн-
рагаллола. Под конец для стабилизации раствора добавляют не¬
сколько капель желатина и, пропуская азот, удаляют оставшийся
кислород. После этого снимают полярограмму при анодно-катод¬
ной поляризации ( + 1 — 1 в) или при катодной поляризации с
применением двухвалентного аккумулятора (0—2 в). Потенциал
полуволны железа»1,1 в. Чтобы уловить всю волну, запись на¬
чинают проводить при напряжении от 0,6 в Нулевую точку галь*
ванометра устанавливают на Ь мм и запись начинают с 0 оси
абсцисс. Чувствительность гальванометра не менее '/го. далее
чувствительность гальванометра увеличивают до */ю—'/б-После снятия полярограммы раствора в ту же ячейку с раст-
вором добавляют 0,2—0,5 см3 оксалатжелезоаммиачного раст¬
вора (NM.t)3Fe(C20.»)3-3Ha0 или FeClj, употребляемого в каче¬
стве стандартной добавки. Вновь продувают азотом и заново сни¬
мают полярограмму. Затем по разности в высоте полярографиче¬
ских волн, полученных от внесения стандартной добавки и опыт¬
ного раствора, определяют содержание железа в растворе.Определение марганца и железа. Подготовка раствора солей
проводится тем же способом, который указан выше. Раст-
вор-фон приготовляют из равных объемов 5 M NaOH и 0,5 М
триэтаноламина. Для этого 10 см3 растиора фона наливают в
полярографическую ячейку. Сначала на приборе записывают по*
лярограмму раствора-фона. Диапазон поляризации — 0,2 в. Чув¬
ствительность прибора 7го. Условия записи полярограммы тс же,
что и в предыдущем метоле. Затем в полярографическую ячейку
с раствором фоном добавляют 0,5 см* опытного раствора. Потен-419
циал полуволны марганца 0,4 в, чувствительность прибора Чг
или XU. Перед началом определения растворы каждый раз про¬
дувают кислородом, а затем азотом. После записи полярограм-
мы опытного раствора добавляют сюда же 0,2 см3 раствора
сернокислого марганца в качестве стандартной добавки.В этом растворе может быть определено и железо — при тех
же условиях записи полярограммы, которые приводились в пре¬
дыдущем методе. Запись начинают с напряжения в 0,1 в. Чувст¬
вительность прибора Vis и меньше. Волна железа в этом раст¬
воре более отрицательная; запись начинают с 1 в.Определение цинка, меди и железа. Раствор золы приготов*
ляют так, как указано выше (стр. 419). Приготовление раствора-
фона проводится путем растворения 0,4 г комплексона-1 (нитри-
лотриуксусная кислота) в 5 см* 25%-ного раствора аммиака.
Раствор-фон н опытный раствор смешивают в соотношении 1:1
и на определение берут половину раствора.Работа полярографа при диапазоне п о л я р и -з	а ц и и 0—2 в. В данном случае используют ячейку Калауска
с насыщенным каломелевым электродом. Перед полярографиче¬
ской ячейкой ставят склянку Дрекселя с 12%-ным раствором
аммиака, чтобы при продувании азотом не удалять аммиак из
раствора-фона. Потенциал полуволны меди лежит при 0,5 и при
1,4 в. Для определения меди и цинка ввиду их различного содер¬
жания в растениях необходимо пользоваться различными чув¬
ствительностями гальванометра. Например, для определения
содержания цинка в золе овощных растений используется чув¬
ствительность гальванометра '/iso и '/200; при определении меди
максимальная чувствительность гальванометра должна быть не
более '/г- Измерение прн таких чувствительностях во избежание
возникновения побочных явлений и осцилляции необходимо прово¬
дить с компенсацией емкостного тока. Затем в опытный раствор
в качестве стандартных добавок вносят 0,1—0,2 см3 сернокислого
цинка и меди. Определение железа проводят при условиях, ука¬
занных в предыдущих методах. При совместном определении
только железа и цинка в растворе используют более близкие
чувствительности. При определении одного цинка запись начи¬
нают с напряжения 1,1 в для того, чтобы зафиксированная к
этому времени волна железа уже не мешала определению.Ход раб от ы с прибором. Перед тем как приступить
к работе с прибором, нужно проверить исправность его электри¬
ческой части. С этой целью на приборе «снимают» закон Ома.
При записи прямых используется зависимость между увеличе¬
нием напряжения и увеличением силы тока по формуле:—7— = /?, £ = /•/?,где: Е — напряжение;/ — сила тока;R — сопротивление.420
Графически закон Ома выражается прямой, берущей начало
из точки пересечения координат:у=а-х (уравнение прямой)Прибор включается как обычно, только на месте подключения
электролизера ставят сопротивление в 100 ком. Условия поля*
ризации 0—4 в. Затем записывают прямые при чувствительности
прибора ’/iso* Vioo, '/so (самая большая чувствительность).Записи полярограм м. Источником тока служит ак¬
кумулятор на 2—4 в. В начале опыта напряжение тока, проходя¬
щего через раствор, близко к нулю, потому что в цепь включено
намотанное на барабан сопротивление, которое можно посте¬
пенно выключать, вращая барабан. Каждому полному обороту
соответствует повышение напряжения на 0,1 (или 0,2) в.Прежде чем приступить к измерению, на приборе устанавли¬
вают нужную чувствительность гальванометра, затем подклю¬
чают к прибору аккумулятор, включают сам прибор, регулятор
диапазона поляризации ставят на нужный диапазон, переста¬
навливают запоминающее устройство на 2 (или 4) в, включают
на нужную скорость коробку скоростей, включают мотор на при¬
боре и самописец.При выключении прибора выключают подзарядку аккумуля¬
тора, аккумулятор и сам прибор. Мотор выключается автомати¬
чески.При работе с прибором необходимы следующие условия:1)	анализируемый раствор не должен реагировать с ртутью;2)	электролиз должен протекать без перемешивания раствора,
чтобы не разрушить диффузионные слои, окружающие электрод;3)	капилляр должен быть погружен в раствор; скорость выте¬
кания ртути из него около 30 капель в минуту (регулируется из¬
менением высоты резервуара); эта скорость должна быть оди¬
наковой при полярографировании опытного и стандартного раст¬
воров.Определение микроэлементовОсобенности методов определения микроэлементов. Неболь¬
шие количества микроэлементов в растениях (Си, Zn, Мп, Со,
Мо и В) могут быть быстро н точно определены с помощью ви¬
зуального колориметрирования с использованием цветных шкал.
Модификации методов, разрабоганные Г. Я. Ринышсом *, имеют
некоторые преимущества при массовых анализах и позволяют
избежать ряда операций, необходимых при пользовании высоко¬
чувствительными приборами.*	Г. Я. Рквьхис. Методы ускоренного колориметрического определения
микроэлементов в биологических объектах. Ияд. АН Латвийской ССР. Рига,
1963.421
При определении микроэлементов следует обращать внимание
на качество дистиллированной воды, реактивов и характер по¬
суды. Склянки для воды, растворов и реактивов должны быть
из полиэтилена. Колбы и стаканы считаются лучшими из кварца,
однако вполне можно пользоваться посудой из термостойкого
стекла и полиэтилена (воронки, стаканы). Дистиллированную
воду и растворы реактивов можно держать в стеклянной посуде,
в которой длительное время хранились крепкие кислоты.Озоленне навесок (2—5 г) растительных материалов для оп¬
ределения микроэлементов целесообразно проводить, обрабаты¬
вая их парами азотной кислоты.Ускоренное озоленне парами азотной кислоты. Этот метод
озоления применяют при определении микроэлементов. Навески
растительного материала 3—5 г равномерно распределяют в
кварцевой или фарфоровой чашке и нагревают на электроплитке
в вытяжном шкафу. При появлении дыма поджигают спичкой
(при этом сгорают газы и частицы дыма). Обугливание должно
быть полным. После этого чашку с навеской покрывают фарфо¬
ровой воронкой или другой чашкой с отверстием в дне. Покры¬
вают так, чтобы края опирались на шамот электроплитки. Далее
укрепляют отводную трубку, один конец которой должеи нахо¬
диться на высоте 1 см от обугленной навески, а другой соединен
на шлифе с колбой, содержащей 20 см3 крепкой серной и 15 см3
крепкой азотной кислот. Для получения паров HNO3 смесь в
колбе слегка подогревают. Через 30 секунд после пропускания
паров сжигаемый материал осматривают и при неполном озоле-
нии продолжают пропускать пары. После полного озоления чаш¬
ку с золой нагревают еще несколько мннут.Определение меди* Метод основан на реакции меди с дифе-
нилтиокарбазоном CeHsNH — NH — CS — N = N — СвН5, (дити-
зоном), который образует окрашенные днтизонаты с многими
металлами. В кислых средах и в присутствии ионов родана
днтизонаты образуют только медь, золото и палладий. В присут¬
ствии железа и ряда окислов азота днтизон окисляется до дифе-
нилтиокарбодиазона (желто-бурого цвета), который с металла¬
ми не дает соединений. В биологических объектах находится
незначительное количество ионов, мешающих определению меди.
Колорнметрированне лучше производить по смешанной окраске,
которая удобна для визуального сравнения со шкалой, так как
обеспечивает хорошо заметные переходы окрасок.Реактивы и аппаратура: I) раствор днтвзона; 2) комплексный буфер¬
ный раствор; 3) раствор цитрата натрия; 4) стандартный раствор.Приготовление реактивов. Раствор дитизона. Раст¬
воряют около 0,01 г дитизона в 50 см3 ССЬ и фильтруют. Затем
к этому фильтрату приливают 50 см3 раствора аммиака (1:20)
и взбалтывают в делительной воронке на 200 cjk3 (желтый вод¬
ный слой указывает на щелочную реакцию). Нижний CCU слой422
отделяют, а водный раствор промывают 3 раза чистым СС14,
взбалтывают и сливают СС1<. После этого прибавляют 50 см3
ССІ4» 5 см3 5%-ного раствора аскорбиновой кислоты и подкис¬
ляют 1 и. НСІ до зеленой окраски. При взбалтывании дитизон
переходит в слой ССІ4. Рабочую концентрацию дитизона полу¬
чают, добавляя к чистому СС14 по каплям очищенный раствор
до совпадения окраски с нулевой пробиркой шкалы минераль¬
ных солей. Очищенный раствор дитизона сохраняют под слоем
5%-ного раствора аскорбиновой кислоты.Комплексный буферный раствор. Растворяют
15 г уксуснокислого натрия, 7,5 г Na2HP04 н 2,5 г КС! в 40 см3
дистиллированной воды, затем подкисляют крепкой HCI до pH2	и доводят до 100 см3.Раствор цитрата натрия. Растворяют 25 г цитрата
в дистиллированной воде, доводя объем до 100 см3.Стандартный раствор. Растворяют 3,9330 г перекрн-
сталлизованной соли (CuS04*5H20) в 1 дм3. При разбавлении
10 см3 этого раствора до і дм3 дистиллированной водой полу¬
чают стандартный раствор, содержащий в 1 см3 0,01 мг меди.
Последний раствор разбавляют в 10 раз и получают рабочий ра¬
створ, содержащий 1 мкг меди в 1 см3.Приготовление цветной шкалы* В 7 калиброванных пробирок
с притертыми пробками приливают стандартный (рабочий) раст¬
вор в следующих количествах:№ пробирки			I 2 3 4567Объем стандартного раствора (см3)	0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Количество меди в пробирке (мкг)	0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Далее пробирки доливают перегнанной водой до 5 см3 и при¬
бавляют 5 см3 раствора дитизона в СС1< и 2 см3 комплексного
буферного раствора. Смесь в пробирках сильно встряхивают до
образования неизменяющейся окраски. Окраска в пробирках
шкалы соответствует содержанию меди в 1 см3 дитизона: 0; 0,1;
0,2... 0,6 мкг.Можно приготовить постоянную шкалу растворов минераль¬
ных солей и проверить ее по шкале образцовых растворов (см.
Г. Ринькис, 1963).Ход анализа. В калиброванную пробирку с притертой пробкой
наливают 2 см3 солянокислого раствора опытного образца золы
(см. раздел «Озоление»), добавляют 1—2 см3 раствора цитрата
натрия и доводят pH до 2, добавляя по каплям раствор соляной
кислоты (1:1). Проверяют pH индикаторной бумажкой (для pH
от 1 до 3), прикасаясь ею только к мокрой пробке. Затем добав¬
ляют 1 см3 раствора дитизона и после 0,5-минутного сильного
встряхивания сравнивают окраску слоя четыреххлористого угле¬
рода с окраской шкалы из пробирок. Прн присутствии в растворе
•окислов азота дитизон окисляется и раствор желтеет. Тогда про¬
цедуру повторяют и перед прибавлением раствора дитизона423
взбалтывают с 1—2 каплями 1%-иой перекиси водорода. Если
цвет экстракта краснее последней пробирки шкалы, то добав¬
ляют еще 1 cjk3 раствора дитизона. Если при добавлении 6—
8 cjk3 дитизона окраска экстракта краснее шкалы, то берут мень¬
шее количество раствора, если окраска зеленее, то объем увели¬
чивают.Результаты вычисляют по формуле:Л'б'У
Х~ *
где: х—медь (в мг на 1 кг материала);
а—медь (в мкг в 1 см3 по шкале);б—объем раствора дитизона, взятый для экстракции (в cjk3);
и — объем исходного раствора (в см3);
н—навеска (в г);v\ — объем пробы, взятый для реакции (в cjk3).Определение цинка. Метод основан на образовании красного
днтизоната цинка при взбалтывании опытной пробы с раствором
дитизона в CCU. Определение цинка проводят с добавлением
комплексообразователей (гипосульфит натрия), который обра¬
зует более прочные соединения с мешающими определению ме¬
таллами, чем с дитизоном; кроме того, гипосульфит предохра¬
няет его окисление.Реактивы: 1) раствор дитизона (готовят при определении меди); 2) 1 н.
раствор КС1 (доводят pH до 5 и очищают от следов цинка раствором дити¬
зона); 3) комплексный буферный раствор; 4) стандартный раствор.Приготовление реактивов. Комплексный буферный
раствор. Растворяют 50 г ацетата натрия в дистиллирован¬
ной воде, доводят pH до 5,5—6 раствором 1 н. HCI, туда же
добавляют 40 г гипосульфита натрия и объем доводят до 200 cjk3.
Дистиллированную воду и растворы солей очищают, взбалтывая
в делительной воронке с раствором дитизона. Нижний слой НС1
сливают и обрабатывают до получения стабильной зеленой
окраски.Стандартный раствор. Растворяют 0,1 г чистого ме¬
таллического цинка в 50 cjk3 очищенной от цинка дистиллирован¬
ной, подкисленной 1 см3 крепкой серной кислотой воды и доводят
до 1 дм3. Из этого раствора берут 5 cjk3 и очищенной дистилли¬
рованной водой доводят до 1 дм3. В 1 cjk3 этого раствора содер¬
жится 0,5 мкг цинка.Приготовление цветной шкалы. Для приготовления шкалы
берут 7 пробирок с притертыми пробками и приливают в каждую
из 6 пробирок возрастающее количество стандартного раствора—
от 0,5 до 3 см3 с интервалом в 0,5 cjk3; в седьмую пробирку раст¬
вор не приливают. Далее все пробирки доливают дистиллирован¬
ной водой до 5 см3, затем добавляют в них по 2 cjk3 комплекс-424
кого буферного раствора н 5 см3 дитизона, после чего пробирки
встряхивают в течение 30 секунд.Окраска слоя дитизона соответствует содержанию в 1 см3
от 0,05 до 0,3 мкг цинка.Смешиванием различных объемов трех растворов — серно¬
кислой меди, сернокислого кобальта и бихромота калия — можно
приготовить постоянную шкалу, так же как и для определения
меди (см. Г. Рннькнс, 1963).Ход анализа. В калиброванную пробирку с притертой пробкой
наливают 0,5 см3 опытного раствора, добавляют 2—3 см3 комп¬
лексного буферного раствора и сразу взбалтывают, чтобы нахо¬
дящийся в нем гипосульфит не разложился в кислой среде.
Раствор должен иметь pH в пределах 5—5,5 (проверяют инди¬
каторной бумажкой). Затем прибавляют в пробирку \ см3 раст¬
вора дитизона и через 0,5-минутного взбалтывания сравнивают
окраску слоя четыреххлористого углерода с окраской шкалы
(пробирок). Если цвет раствора в опытной пробирке краснее
последней пробирки шкалы, то добавляют еще 1. см3 раствора
дитизона, встряхивают и сравнивают со шкалой. Если при добав¬
лении 8 см3 дитизона окраска краснее последней пробирки шка¬
лы, то для анализа берут меньшее количество раствора зольных
элементов. Если же окраска опытной пробы при добавлении I см*
дитизона будет более зеленой, чем содержимое первой пробирки
шкалы, то объем раствора увеличивают.Вычисление результатов производят по формуле:Х = M’V I •где: х — Zn в мг на 1 кг образца;а — Zn в мкг в 1 см3, найденный по, шкале;V	— общий объем (в см3) исходного раствора;
н — навеска (вг)-,vi — объем пробы, взятый для реакции (в см3);V2 — объем раствора (ел3) дитизона, израсходованный для
экстракции.Определение кобальта. В растениях кобальт содержится в
очень малых количествах, поэтому навески для определения
берут от 5 до 10 г. Определение кобальта основано на получении
красного комплекса с 1-нитрозо-2-нафтол-3,6-дисульфонатом нат¬
рия или нитрозо-И-солью. Эта соль желтого цвета, хорошо раст¬
ворима в воде.Реактивы: І) растоор I н. HNOj: 2) 0,05%-ный раствор ннтрозо-Я-соліг,3)	смссь 5 частей 85% -ной HjPO« и I части крепкой HNOa*. 4) раствор ди-
тнэона (в 100 см3 растворяют 0,1—0.2 СС1«); 5) раствор 12,5%-ного аммиака
(дитизоны несколько минут встряхивают н затем фильтруют); 6) стандарт¬
ный раствор.Приготовление стандартного раствора. Берут 0,263 г перекри-
сталлизованного и прокаленного в муфеле при 550° сернокислого»11 Заказ Я» 401425
кобальта и растворяют в 0,4%-ном растворе серной кислоты (в
мерной колбе иа 1 дм3). В 1 см? этого раствора содержится
0,1 мг кобальта. Из этого раствора готовят рабочий стандартный
раствор, содержащий 0,01 мг кобальта в 1 см3.Приготовление цветной шкалы. Для приготовления шкалы бе¬
рут 8 колб на 100 см3 и приливают в каждую возрастающее ко¬
личество стандартного раствора — от 2 до 9 см3, с интервалом
в 1 см3. После этого в каждую колбу приливают около 50 см3
перегнанной воды, в которой растворяют 2 г цитрата нат¬
рия и 2 г ацетата натрия, приливают туда же 0,2 см3 0,05%-його
раствора ннтрозо-Р-соли и нагревают до кипения. Далее охлаж¬
дают, переливают в мерные колбы на 100 см3, споласкивают,
приливают по 5 см3 смеси фосфорной и азотной кислот (5:1) и
доводят водой до метки. В 1 см3 этих растворов содержится от0,2 до 0,9 мкг кобальта. Из каждой колбы наливают часть раст¬
вора в пробирки, получая цветную шкалу. (Пробирки должны
быть тщательно нодобраны по размерам). Сразу же после при¬
ливання растворов пробирки закрывают поливиниловыми проб¬
ками и устанавливают в деревянном или металлическом шта¬
тиве в один ряд.Таким образом получают шкалу, соответствующую по ок¬
раске следующему количеству кобальта в 1 см3 в микрограм¬
мах: 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9.Раствор золы, соответствующий 5—10 г сухого материала
растений, наливают в делительную воронку на 100 см3 н, добавив5—10 см3 раствора цитрата натрия, нейтрализуют раствором ам¬
миака (1:1) до слабо-розовой окраски в присутствии одной кап¬
ли фенолфталеина. Затем добавляют 10 см3 насыщенного раст¬
вора дитизона и после взбалтывания отделяют слой ССЦ в колбу
на 50 см* из жаростойкого стекла. Извлечение повторяют до
тех пор, пока очередная порция дитизона не станет чистого зеле¬
ного цвета. Под конец добавляют 5—10 см3 очищенного СС1«.
Это позволяет установить полноту извлечения.В колбу с экстрактом приливают 1 см3 крепкой HNOa, 0,5 см3
концентрированной серной кислоты, 1 см3 пергидроля и выпа¬
ривают досуха сперва при слабом, а под конец при сильном на¬
греве. Если остаток не достиг белого цвета, то добавляют 1—2	раза по 1 см3 пергидроля. Сухой белый остаток растворяют в2	см3 дистиллированной воде с одной каплей 1 н. раствора азот¬
ной кислоты. После этого в раствор насыпают около 0,3 г аце¬
тата натрия, доводят до кипения и, прилив 0,2 см3 0,05%-ного
раствора нитрозо-Й-соли, вновь доводят до кипения.Если раствор будет окрашен в красный цвет, то добавляют
дополнительно по 0,2 см3 раствора нитрозо-Р-соли, пока раствор
не станет красно-желтого цвета. Растворы, к которым было до¬
бавлено только 0,2 см3 нитрозо-Р-соли, выпаривают до 1 смл, с
осторожностью, чтобы на дне колбочки не было сухих мест.
После этого к охлажденному остатку приливают 0,5 смг смеси426
азотной и фосфорной кислот и переливают в калиброванную
пробирку. Колбочку споласкивают 2—3 раза небольшими объ¬
емами воды и присоединяют эту воду к раствору в пробирке.
Наконец, объем в пробирке доводят дистиллированной водой до2—6 (или более) см3 (так, чтобы в 1 см* общего объема находи¬
лось 0,1 см3 добавленного раствора нитрозо-И-соли) и окраску
раствора сравнивают со шкалой.Содержание кобальта (х) вычисляют по формуле:a-v-6
jt= цм мг на ! кг.Я* V|где: а — кобальт (в мкг!см?) по совпадающей шкале;V	— объем исходного раствора;б—	объем колориметрируемого раствора;Vi — объем исходного раствора, взятый для определения ко¬
бальта;
н — навеска (в г).14*
Способы регенерации
и приготовления
некоторых
глава XV реактивов*Регенерация реактивовОбезвоживание и очистка этилового спирта. Этанол нельзя
сушить СаСІг вследствие образования растворимого соединения
СаСІг • 2СгНвОН. Высушивать этиловый спирт следует негаше¬
ной известью, прибавляемой в количестве, завис и тем от содер¬
жания в спирте воды.Молекула негашеной извести присоединяет одну молекулу
воды: СаО +НгО = Са(ОИ)г, т. е. 56 г извести поглотят 18 г
воды. Следовательно, чтобы обезводить 1 <9лі3 80%-ного спирта
(200 г воды), требуется 622 г. СаО; практически СаО требуется
в 1,5—2 раза больше, т. е. 900—1200 г.Обезвоживание спирта. Колбу на 1,5—2 см3 наполовину за¬
ливают отмеренным количеством спирта известной концентра¬
ции, ранее очищенною и несколько обезвожеиного перегонкой,
и осторожно добавляют куски доброкачественной извести (по
расчету). Затем колбу с обратным холодильником напревают на
«водяной бане 1,5—2 часа. Иагреіваиие происходит и от реакции
воды с известью, поэтому смесь нагревают только до слабого
кипения. Охладив колбу, в которой известь рассыпалась в поро¬
шок, и установив холодильник в наклонное положение для от¬
гонки, присоединяют к колбе дефлегматор с 2—3 шариками,
заполненными стеклянной ватой (во избежание переброса в кон¬
це отгонки известковой пыли в холодильник и приемник), и
перегоняют до тех пор, пока не отгонится весь спирт; прм этом
собирают фракции спирта, .кипящие прн 76—80%, — это и будет
очищенный спирт с небольшой примесью воды. Фракции спир¬
та, кипящие ниже л выше 76—80°, собирают отдельно и пускаю г
в дальнейшую очистку.Другим веществом, применяемым для обезвоживания спир¬
та, «является безводный медный купорос. Кристаллический мед¬
ный купорос—синего ц-вета, содержит 5 молекул кристаллиза¬
ционной воды (CuSO* • 5Н20), на сухом воздухе выветривается,
переходя в светло* гол убой гидрат (CuS04 * ЗНгО), а при силь¬
ном нагревании (200—300°) переходите безводную сернокислую428
соль (CuS04), которая и применяется для обезвоживания спир¬
та и других растворителей. Обезвоживание медным купоросом
производится так же, как и негашеной известью. Теоретически
молекулы безводного купороса присоединяют 5 молекул воды,
или 161 г безводной соли присоединяют 90 г воды. Практически
медного купороса следует брать в 2 раза больше, учитывая его
меньшую по сравнению с известью водоотнимающую способ¬
ность и гигроскопичность самого спирта при высоких концен¬
трациях.Обезвоживать растворители медным купоросом менее вы¬
годно, чем' известью, вследствие меньшей поглощающей воду
способности этого реактива и большей его стоимости.Получив безводный абсолютный сшгрт .при помощи нега шей¬
ной извести и медного купороса нельзя вследствие того, что он
с водой дает постоянно кипящую при 78,15° смесь, содержащую
около 4,5% воды. После многократного обезвоживания свеже-
прокаленной известью можно получить 99,5%нный спирт.Получение абсолютного спирта. Абсолютный спирт получают
следующими способами. 1) На каждый дм3 99,5%-ного спирта до¬
бавляют 27,5 г диэтилфталата и 7 г металлического натрия.
Металлический натрий, реагируя со спиртом, образует этилат
натрия, который с диэтилфталатом в присутствии воды реаги¬
рует с образованием спирта:QH,(COOQ.H5)2 -f 2C3H6ONa + 2Н30 —► C«H*(COONa)3 + 4C3HsOH.2)	Из обезвоженного спирта (этилового, метилового н-пропи-
лового), содержащего 0,5—0,8% воды, абсолютный спирт полу¬
чают следующим образом. В колбу на 1,5 дм3 с обратным холо¬
дильником помещают 5 г стружек магния, 70 см3 99%-його
спирта, 0,5 г иода и нагревают до исчезновения последнего.
При этом весь магний переходит в этилат ii выделяется водо-,
род. К этому раствору приливают 850 см3 предварительно обез¬
воженного опнрта и кипятят с обратным холодильником в тече¬
ние 30 минут. После этого отгоняют абсолютный спирт на уста¬
новке со шлифами.От альдегидов и кетонов опирт очищают добавлением хо¬
лодного насыщенного раствора кислого сернистокнслого натрия
или калия. При этом вьтаїдает белое кристаллическое бисуль-
фитное соединение альдегидов и кетонов [СН3СНО + NaHS03 =
= CH3CH(0H)S03Na]. Спирт сливают, прибавляют 20—
30%-ную щелочь до явно щелочной реакции с фенолфталеином,
перегоняют с дефлегматором и собирают фракции, кипящие при
77—79°.Для получения насыщенного раствора бисульфита натрия
к кристаллической соде прибавляют воду в таком количестве,
чтобы жидкость только покрывала кристаллы, и пропускают
в смесь сернистый газ до тех пор, пока асащок .не растворится и
раствор не приобретет бледно-зеленой окраски. При отстаива-429
нші из раствора выделяется осадок бисульфита натрия. Жел¬
тый «раствор, получающийся при насыщении раствора соды сер-
'Нистым газом, содержит свободную сернистую кислоту, кото¬
рая распворяет бисульфитное соединение алвдепида.Очистка метилового спирта. Метиловый спирт — СН3ОН, мо¬
лекулярный вес 32,03 температура кипения 64,5°, плотность0,790. лорошр растворяется в воде, сам растворяет многие ор¬
ганические вещества, ядовит. В биохимии широко используется.От примесей метиловый спирт может быть очищен теми же
способами, что и этиловый спирт.С (ВОДОЙ метиловый опцрт не образует постоянно кипящей
омеси, вследствие чего значительно лучше, чем этиловый спирт,
может быть отделен от воды фракционированной отгонкой. Для
спектрометрических методов абсолютный метанол (этанол) очи¬
щают следующим способом. В 3 дм3 абсолютного метанола рас¬
творяют 5 г чистого гранулированного NaOH и добавляют 5 г
чистого AgN03. Эту смесь кипятят 3 часа с обратным холодиль¬
никам и после охлаждения перегоняют, отбрасывая первые
200 смг отгона. Оптическую плотность проверяют «а спектро¬
метре или фотометре, при длине волны 280 нм в 4-сантиметро-
.вой кювете против дистиллированной (воды. Оптическая плот¬
ность не должна (быть выше 0,010. Очищенный метанол хранят
в желтой склянке.Очистка других спиртов. Изобутиловый спирт —
(СН з) 2СНСН2ОН, температура кипения 107°, плотность 0,810,
нормальный бутиловый спирт (СН3СН2СН2—СН*ОН). темпе¬
ратура кипения 117°, плотность 0,810, амиловый спирт—
СН3(СН2)зСНгОН, температура кипения 137°, плотность 0,815,
кзоаімилошьій спмрт— (£Нз)*СН€Н/ЯДОН, температура кипе¬
ния 131°, плотность 0,810 и другие спирты, применяемые для
определения витамина Вь могут быть очищены и обезвожены
опособа<ми, указанными для этилового и метилового спиртов.
Обычно перегонку проводят с водяіньіім паром в присутствии ак¬
тивированного угля, чтобы получить (достаточной «чистоты спир¬
ты для работы с витаминами.Очистка диэтилового (серного) эфира. Серный эфир —
(С2Н5 — О — С2Н5), молекулярный вес 74,08, температура кипе¬
ния 35°, плотность 0,714. Эфир (чрезвычайно летуч и легко вос¬
пламеняется. Распространяясь <в воздухе, пары его дают опас¬
ные, взрывчатые, гремучие смеси, поэтому он является вещест¬
вом чрезвычайно огнеопасным.Использованный серный эфир бывает загрязнен главным об¬
разом органическими веществами н содержит воду (100 г сер¬
ного эфира могут поглотить 7,5 г воды). При длительном стоя¬
нии продажный эфир содержит перекиси, которые опасны при
перегонке. Для очистки эфир перегоняют с дефлегматором. Пе¬
ред перегонкой его обязательно промывают 5%-ным раствором
железного купороса. Промывание с целью удаления спирта, аце¬430
тона и 'разрушения нюрекионш соединений в &фире проводят
(0,2 объема раствора от объема эфира) >2—3 раза, подкисляя
серный кислотой до слабокислой реакции -и добавляя железный
купорос, чтобы разрушить перекиси, которые могут образо¬
ваться в неочищенном эфире и при перегонках смогут вызвать
взрыв. Эфир, содержащий .перекиси, обладает резким запахом.
На каждый куб. дециметр этилового эфира берут 10 г кристал¬
лического железного купороса. Затем отгоняют, собирая
фракции, кипящие при 33—37°; остальные фракции соби¬
рают отдельно и употребляют для дальнейшего фрактиониро-
вания.Фракции эфира, кипящие при 33—37°, обезвоживают гра¬
нулированным свежепросушенным прн 100—105° или прокален¬
ным при 725° плавленым хлористым кальцием, для чего в
склянку на 5—7 дм3 лаливают 3—4 дм3 перегнанного эфира и
добавляют хлористый кальций. Гранулированный хлористый
кальций берут їв количестве Vs объема от (взятого для лросушкн
эфира, а плавленый — в меньшем количестве.Склянку с эфиром и хлористым кальцием остаівляют на ночь
после чего производят отгонку с дефлегматором. Собирают
фракции эфира, кипящие при 34—36°, приемник плотно соеди¬
няют с аллонжем холодильника и снабжают трубкой, наполнен¬
ной іхлорлстькм кальцием, для устранения поглощения эфиром
«воды из воздуха.Примесь спирта, содержащегося в эфире, может быть уда¬
лена одним лз следующих двух способов.1.	Эфир многократно промывают небольшими порциями
воды. Этот способ довольно легко и быстро приводит к цели, но
недостатком его является значительная потеря эфира вследст¬
вие его заметной растворимости в іводе.2.	Спирт в эфире окисляют до уксусного альдегида или ук¬
сусной кислоты, которые затем удаляют в шнде альдегидной
смолы или уксуснокислого лаприя. В склянку с эфиром прибав¬
ляют небольшое количество тщательно растертого в порошок
марганцовокислого калия и 1—2 куска (10 г) едкого натра. Че¬
рез несколько часов поверхность кусков едкого иатра покры¬
вается бурым осадком альдегидной смолы. Операцию эту повто¬
ряют до тех пор, пока через 12 часов больше не будет наблю¬
даться выделение окрашенной смолы на едком -натре. Эфир
сливают в чистую сухую колбу, сушат над хлористым кальцием
в течение 24 часов и перегоняют с дефлегматором.Для получения абсолютного эфира обезвоженный эфир сушат
несколько дней лад овежеплавленным хлористым кальцием, ко¬
торого берут 15—20% от веса жидкости, после чего быстро от¬
фильтровывают через складчатый фильтр в сухую склянку, куда
кладут затем натрий s виде проволоки или небольших кусочков,
очищенных от окиси. (Пока продолжается выделение водорода,
склянку закрывают пробкой со «вставленной в нее хлоркальцие-131
вон трубкой, на (которую для уменьшения испарения надевают
короткую, (вытмнутую в ікаїпилляр стеклянную трубку.Очистка хлороформа. Хлороформ — СНС13, молекулярный
лес 119,39, температура кипеню 61°, ллотность 1,488. В 100 г
хлороформа растворяется 0,82 г воды; спирт и эфир в нем рас*
творяются хорошо. (При действии авета хлороформ окисляется
кислородом (Воздуха, образуя хлор, соляяую кислоту, угольный
ангидрид л фосген (COCIa); последний сильно ядовит. При дей¬
ствии слабой .водной щелочи (получаются «о л и (муравьиной ки¬
слоты. С крепкой щелочью образуется окись углеірода. Вследст¬
вие хорошей способности растворять органические вещества и
невысокой температуры кипения хлороформ широко приме¬
няется в биохимической практике. Подобно другим органиче¬
ским растворителям (спирту, эфиру) хлороформ загрязняется
всякого рода органическими веществами, от которых может
быть очищен: 1) (перегонкой с дефлегматорам (при этом соби¬
рают фракции, кипящие при 59—62°); 2) удалением спирта,
ацетона л эфира (хлороформ промывают «водой в делительной
воронке 3—4 раза, затем сушат хлористым кальцием и перего¬
няют, собирая фракции, кипящие при 60—61°).Обезвоживание и очистка ацетона. Ацетон — СН3ОСН3, мо¬
лекулярный «вес 58,05, температура кипения 56°, плотность 0,792.
Смешивается с водой, спиртом, эфиром во асах отношениях.При добавлении к водному ацетону раствора солей
(поваренной соли, поташа и др.) происходит «высали¬
вание» ацетона, причем жидкость разделяется на 2 слоя;
таким путем можно освободить его от значительного ко¬
личества воды.Использованный ацетон обезвоживают следующими прие¬
мами: 1) перегонкой водного ацетона с дефлегматором (соби¬
рают фракции, кипящие при 54—58°) л осле дополнительного
обезвоживания хлористым кальцием или медным купоросом и
повторной перегонкой (собирают фракции, кипящие при 55—
57°); 2) высаливанием его из водных раствором, отделением на
делительной воронке, отгонкой с дефлегматором, обезвожива¬
нием 'И (повторной перегонкой.От спирта, эфира и хлороформа ацетон очищают бнеуль-
фнтным соединением (см. этиловый спирт), отделением спирта
и эфира (слить), разрушением бнеульфитного соединения при¬
бавлением раствора соды и последующей фракционированной
перегонкой.Обезвоживание и очистка бензола. Бензол — СвН6, молеку¬
лярный вес 78,05, температура кипения 80°, плотность 0,879.
В воде нерастворим, с эфиром и спиртом смешивается во всех
отношениях. При +6° бензол переходит в твердое кристалличе¬
ское состояние, чем пользуются для отдаления его от приме¬
сей; для этого бензол охлаждают до 0° и после того как он пе¬
рейдет в кристаллическое состояние, примеси сливают.432
От примесей бензол можно освободить также следующими
способами: 1) от «воды—обезвоживанием хлористым кальцием
и <перегонкой с дефлегматорам; 2) от спирта, эфира н ацетона
— промыванием водой, отделением на делительной воронке, обез¬
воживанием и перегонкой; 3) от хлороформа — а) (выморажи¬
ванием или б) обработкой 5—10%-лым раствором щелочи; прн
этом образуется соль муравьиной кислоты (CHCb + 4NaOH =
=HCOONa -j-3NaCl -f-2H20), водный раствор которой отде¬
ляют на делительной воронке, бензол фракционируют и соби¬
рают фракции, кипящие дри 79—81°.Очистка уксусной кислоты. Уксусная кислота — СН3СООН,
•молекулярный вес 60, температура кипения 118°, температура
плавления 16,5°, плотность 1,052. Чрезвычайно стойка ло отно¬
шению к окислителям, даже таким сильным, как хромовая ки¬
слота и марганцовокислый калий. Ледяная уксусная кислота
является прекрасным растворителем для многих органических
•веществ и находит широкое применение «в лабораторной прак¬
тике. От примесей уксусную кислоту очищают: 1) дробной лере-
гонкои с дефлегматором; 2) перегонкой сухой уксусно-натриевой
соли с серной кислотой; 3) 'вымораживанием из водных концен¬
трированных растворов при температуре от 0 до —10°.Очистка петролейного эфира. Петролейный эфир, бензин —
это легко кипящие фракции нефти (обыкновенно не выше 150°).По плотности и температуре кипения бензины делятся на
легкие, средние и тяжелые. Легкие бензины (р = 0,64 — 0,66,
температура кипения главной части — от 40 до 80°) обыкно¬
венно называют петролейным эфиром, или та золи ном. Исполь¬
зованный петролейный эфир можно очистить: 1) от примесей
спирта, ацетона, серного эфира — промыванием водой в дели¬
тельной •воронке, отделением от промывных 'вод, обезвожива¬
нием хлористым кальцием и последующей перегонкой; 2) от
примесей хлороформа — обработкой слабым раствором щелочи,
промыванием водой, отделением промывных вод, обезвожива¬
нием хлористым кальцием, фракционированием.Обезвоживание минеральных веществ. Хлористый кальций.
Хлористый кальций — СаСЬ, молекулярный вес 110,92. Образует
белую, чрезвычайно гигроскопическую массу, плавящуюся около
800° и улетучивающуюся при температуре белого каления.
Плотность переплавленного хлористого кальция 2,2. Безводный
хлористый кальций получают из содержащего воду хлорида
кальция нагреванием выше 260°. Обезвоживать следует осто¬
рожно, так как при слишком быстром нагревании происходит
частичный гидролиз и выделение соляной кислоты.Для получения пористого препарата гранулированного хло¬
ристого кальция (СаС1г»2НгО) раствор безводного хлористого
кальция (полученный так, как указано выше) выпаривают до
появления на поверхности раствора пленки сухой соли, после
чего уменьшают нагревание, прибавляют немного концентриро-433
ванной соляной кислоты, «перемешивают до образования гранул
и оставляю г на 4—6 часов, тюка хлористый кальций не сделает¬
ся совершенно сухим. Массу еще 8 горячем состоянии разби¬
вают на куши л складывают в хорошо закрывающуюся банку.Окись кальция. Окись кальция, или негашеная известь,—
СаО, молекулярный івес <56,07. В лабораторных условиях чистую
негашеную известь получают прокаливанием мрамора или мела
в муфельной лечи при 800°.Совершенно чистая окись кальция плавится чрезвычайно
трудно, поэтому получаемая при прокаливании совершенно чис¬
того углекислого кальция (мрамора) окись, даже если .нагре¬
вание производилось до очень высокой температуры, представ¬
ляет собой рыхлый, аморфный порошок, легко реагирующий с
водой. Реакция обожженной извести с водой известна под на¬
званием гашения извести. Она сопровождается выделением зна¬
чительного количества тепла: СаО + Н*0 = Са (ОН) г + 15,2 кал.Сернокислая медь. Сернокислая медь, или медный купорос,—
CuS04>5Hs0, (Молекулярный вес 249,7. Безводная соль (CuS04)
белого цвета, аїри поглощении воды оииеет и переходит в ги¬
др атные формы. Из водных растворов сульфат меди кристал¬
лизуется с 5 молекулами воды, образуя лазурно-голубые кри¬
сталлы, которые на воздухе с поверхности выветриваются и пе¬
реходят в светло-голубой гидрат (CuS04 • ЗНгО). Способностью
безводного сульфата меди хорошо поглощать воду и синеть от
ее присоединения пользуются для обезвоживания и обнаруже¬
ния воды в органических растворителях.Кристаллический сульфат меди атри назревании теряет воду;
сначала он переходит в тригидрат (CuSO< • ЗНгО), затем в мо¬
ногидрат (CUOSO4 • Н*0) и лишь при 258 происходит полное его
обезвоживание. Нагревать выше 258° не следует во избежание
разложения его на CuO, S02 и О. Серый цвет сульфата меди
указывает на перегрев.В 100 см3 воды сульфат імеди растворяется при 0° — 14,8 гг
при 15°—19,3, при 25°—23,05, при 50® — 33,5, при 100® — 73,6 г.Регенерация «медного купороса, использованного для обез¬
воживания, состоит: 1) в удалении органического растворителя,
подвергавшегося обезвоживанию (проветривание); 2) в обезво¬
живании нагреванием (твердой соли) при 200—258°; 3) если
медный купорос в виде растворителя—в фильтровании, выпа¬
ривании, обезвоживании нагреванием. Использованный медный
купорос можно очистить перекристаллизацией.Приготовление некоторых
реактивовПриготовление фосфорновольфрамовой кислоты. Вольфра-
мовоюислый натрий растворяют в кипящей воде и в этот рас¬
твор прибавляют половинное по весу количество фосфорной ки¬434
слоты (плотность 1,13). При вымаривании раствора получают
кубические кристаллы фосфорновольфрамовой кислоты —
Нт[Р<>У,07)бЗп*Н20.К растворенному в кипящей воде вольфрамовокислому на¬
трию прибавляют (до кислой реакции) фосфорную кислоту;
после охлаждения жидкость сильно подкисляют уксусной или
соляной кислотой и после суточного стояния фильтруют *.В случае отсутствия фосфорной кислоты к раствору 200 г
вольфрамовокислого натрия в 600 см3 воды прибавляют раствор
120 г фосфорнокислого «атрля (NajHPO^ 12НгО) в 500 см* во¬
ды, затем прибавляют 100 <см* серной кислоты (плотность 1,84).Приготовление кремневольфрамовой кислоты. Раствор
вольфрамовокислого натрия кипятят со свежеосажденной крем¬
невой кислотой (кремнекислоту готовят смешением водных рас¬
творов кремиенатриевой соли и серной кислоты в количествах,
определяемых лз уравнения: nJaaSiOa + frhSC^-^FbSiOa-t*
4~NaSO<; полученный студенистый осадок промывают лодой).Из полученного раствора осаждают кремневольфрамовую
кислоту прибавлением азотнокислой закиси ртути. Осадок ртут¬
ной соли переносят на фильтр, промывают и разлагают соляной
кислотой. Отфильтрованный раствор выпаривают для удаления
соляной кислоты. При отстаивании из концентрированного
раствора выпадают кристаллы (в форме больших октаэдров)
кремневольфрамовой кислоты. В качестве реактива употребляют
10—12%-ный раствор кремневольфрамовой кислоты.Приготовление растворимого крахмала. Картофельный крах¬
мал в количестве 250—500 г помещают в колбу at заливают
12%-ной соляной кислотой так, чтобы уровень кислоты был вы¬
ше уровня крахмала на 1,5—2 см, и настаивают в течение 6—7	суток, ежедневно сливая кислоту и наливая новую ее порцию.
Под действием кислоты оболочки крахмальных зерен растрески¬
ваются; отделившиеся оболочки сливаются вместе с кислотой.
Уже на вторые сутки в пробе такого настоя можно наблюдать
(под міикроскопом) отшелушивание оболочек крахмальных зе¬
рен. После 6—7-дневного настаивания крахмал отмывают от ки¬
слоты водой (на воронке Бюхнера или многократном промыва¬
нии путем декантации) и высушивают на воздухе «ли в сушиль¬
ном шкафу при невысокой температуре. Таким способом полу¬
чают образцы (хорошо растворимого крахмала.Получение хлорофилла. Навеску в 1 кг свежих листьев вы¬
сушивают в токе воздуха при температуре 30—35° до 400—500 г.
затем листья измельчают на «мясорубке и добавляют 200 г по¬
рошка негашеной извести. Из полученной сухой массы листьев
и извести извлекают желтые пигменты петролейным эфиром
(т. кип. 70°). Извлечение лучше производить в шаровой мель¬
нице. Для этого в сосуд шаровой мельницы насылают исследу嬕	Ю. В. Корякни. Чистые химические реактивы. Научно-техническое
нзд-во химической литературы. 1947, стр. 291.435
мый материал н приливают туда 1 дм3 петролейного эфира.
Более полное извлечение желтых пигментов достигается в ап¬
паратах Сокслета.Из обработанной петролейным эфиром смеои листьев и изве¬
сти извлекают хлорофилл, настаивая в банке на 1,5 дм3 с
0,05 дм3 чистого серного эфира. После этого «раствор хлорофил¬
ла сливают и приливают новую порцию эфира (300 ел3), снова
встряхивают, настаивают л сливают. Наконец, порциями эфира
массу -переносят на фарфоровую воронку и вымывают из нес
хлорофилл порциями эфира, применяя отсасывание. Затем эфир
отгоняют из раствора под вакуумом. Хлорофилл в колбе рас*
творяют в небольшом количестве петролейного эфира (т. кип.
50°) <и переносят <в (маленькую фарфоровую чашку. Раствори¬
тель выпаривают в вакуум-эксикаторе, и хлорофилл выпадает в
ввде тонких блестящих пластинок.Приготовление адсорбента типа декальсо. Этот реактив при¬
меняют для определения тиамина л готовят следующими спо¬
собами.1.	Берут 69 см3 раствора кремнекислого натрия (плотность
1,188 при 20°), добавляют 46 см3 воды и при помешивании
приливают 48,6 смг 25%-ного раствора азотнокислого алюми¬
ния. К образовавшемуся студенистому осадку прибавляют
75 см3 воды и после тщательного перемешивания оставляют на
48 часов. После этого белый осадок отделяют и промывают во¬
дой от нитратов. (Полученный продукт высушивают при 80° и
измельчают (способ Международной комиссии по химии зерна).2.	Растворяют в 120 см3 дистиллированной 'воды 20,5 г сер¬
нокислого алюминия и затем при постоянном взбалтывании до¬
бавляют 30 см3 60%-ного (раствора едкого натра. При этом вы¬
падает осадок, который растворяется по «мере прибавления ще¬
лочи. В полученную смесь приливают 36 г 60%-ного раствора
кремнекислого натрия. Колбу тщательно взбалтывают и остав¬
ляют с образовавшимся гелем на 24 часа. Затем полученную
массу отмывают на воронке Бюхнера от щелочи до нейтраль¬
ной реакции (проба с фенолфталеином). Осадок (высушивают
при температуре до 70°, и когда вес его будет около 30 г. рас¬
творяют в 200 см8 80%-ной НС1 в стеклянном стакане. Через
48 часов образовавшийся гель переносят в фарфоровую чашку
и сушат при 100—110°, отмывая периодически соляную кислоту
из чашки водой до исчезновения желтой окраски. Далее осадок,
уменьшившийся в объеме, сушат при 130° в течение двух масов,
промывают 2 раза водой и вновь сушат в течение 1—2 часов
при температуре 100°. Наконец, образовавшиеся блестящие
желтоватые частицы измельчают в ступке так, чтобы 60% их
просеивалось через сито с отверстиями 0,25 мм, а остальные
40% проходили через сцто с отверстиями 0,5 мм. Полученный
продукт (выход 8—10 г) дважды обрабатывают 3%-ной уксус¬
ной кислотой при нагревании в течение 15 минут и при соотно-436
шенин адсорбента и кислоты 1 : КО. Затем адсорбент обрабаты¬
вают четырьмя объемами 25%-ного хлористого калия, промы¬
вают водой до отрицательной реакции на хлор, фильтруют, вы¬
сушивают и хранят в закрытой склянке *.Приготовление адсорбента диатомита. Реактив применяют
для определения токоферолов; его шриготовляют следующим
способом.Днатомит настаивают в течение суток с соляной кислотой
(плотность 1,19). Затем кислоту сливают и диатомит кипятят
с 2 н. (раствором соляной кислоты в течение часа в колбе с об¬
ратным холодильником. После этого кислоту сливают и диато¬
мит промывают на воронке Бюхнера дистиллированной водой
до нейтральной іреакции промывных вод. Далее, после отса¬
сывания, промывают спиртом, бензолом и сушат лрн темпера¬
туре 50° или на воздухе. Полученный продукт годен к употреб¬
лению до 6 месяцев (без повторной активации).Приготовление силикагеля для колоночной и тонкослойной
хроматографии. Силикагель марки КСК, размолотый на ша¬
ровой мельнице, заливают концентрированной соляной кислотой.
Через сутки кислоту слшвают, осадок многократно промывают
дистиллированной водой до отрицательной реакции на ион С1~
(проба с AgNOj). Затем осадок промывают несколько раз аце¬
тоном и метанолом на воронке Бюхнера. Отфильтровывают и
высушивают при 120° в течение 4 часов. Для хроматографии ис¬
пользуют фракцию, проходящую через сито 150—200 меш.
(табл. 14).Заполнение колонки сефадексом. Для разделения белков,
декстранов н очистки ферментов применяют сефадексы типа G.
Основным условием хорошего разделения является правильное
заполнение колонки. Колонку укрепляют строго вертикально,
в основание ее помещают диск из плексигласа с отверстиями и
сверху — кружок фильтровальной бумаги. Порошок сефадекса
предварительно намачивают в воде или рабочем буфере, прили¬
вая в количествах, рассчитанных на основании свойств сефа¬
декса (например, для набухания 1 г сефадекса G— 100 тре¬
буется 10 см3 воды, стр. 445). Величина навески определяется
объемом колонки. В стакан наливают воду или буфер с неболь¬
шим избытком и при помешивании всыпают навеску сефадекса
и 20 да/100 см3 смеси — азида натрия (антисептик). Через 5 дней
из смеси, а также из буферного раствора удаляют пузырьки воз¬
духа. После этого колонку с закрытым краном заполняют на */<
буферным раствором и, перемешивая переносят взвесь сефа¬
декса тонкой струей. После того, как в колонке осядет слой се¬
фадекса высотой 5 см, открывают внизу кран так, чтобы жид¬
кость вытекала медленно и продолжают наполнять колонку.Слон сефадекса в колонке должен быть горизонтальным н
подсыхание его не допускается.•	О. С. Ш е р м а и. Сборник трудов ВНИВИ, т. IV, 1963.437
Приложениятаблица i	Международные атомные массы (веса) не-которых распространенных элементов*ЭлементНомерш-ментаСимволAtom*ИЫЙнесЭлементНомерэле¬мент*СимволАтом»•1ЫЙвесАзот . . .7N14,007Мышьяк . . .33As74,921Алюминий13АІ26,981Натрий ....ИNa22,989Аргон . .18Аг39,948Никель ....28NI53,71Парий . .56Ва137,34Олово ....50Sn118,69Бор . . .5В10,S11Осмий ....76О*190,2Бром . . .35Вг79,916Палладий . . .46Pd106,4Ванадий .23V50,912Платина . . .78Pi195,09Висмут . .63Ві208,98Радий ....88Ка226,05Водород .1Н1,008Ртуть ....80Hg200,59Вольфрам74W183,85Рубидий . . .37Rb85.47Гелий . .2Не4,003Рутений . . .44Ru101,07Германий .32Ое72,59Свинец ....82Pb207,19Железо26Fe55,847Селен ....34Se78,96Золото . .79Au196,967Сера	16S32,064Иод . . .531126,904Серебро . . .47Ag107,87Иридий . .77Іг192,2Стронций . . .38Sr87,62Кадмий . .48Cd112,40Сурьма ....51Sb121,75Калий . .19К39,102Теллур ....52Те127,60Кальций .20Ca40,08Торий ....90Th232,038Кислород.8О15,999Углерод . . .6С12,011Кобальт .27Со58,933Уран	92u238,03Кремний .14St28,086Фосфор . . .15p30,973Литий . .3LI6,939Фтор	9F18,998Магний. .12Mg24,31Хлор . . . . •17ClЗо,45ЬМарганец .25Mn54,938Хром	24Cr51,99Медь. . .29Cu63,54Цезий ....55Cs132,905Молибден42Mo95,94Цинк	30Zn65,37* Атомные массы элементов основаны на углеродной шкале, в основу
которой положен изотоп углерода с числом массы 12 (по данным на 1963 г.*)Буферные смеси
Для приготовления растворов используют чистые реактивы,
перекристаллизованные и просушенные. Вода должна быть ос¬
вобождена от СО]. Раствор со щелочными значениями pH пре¬
дохраняют от поглощения С09.таблица и	Бо ратна я буфернаясмесь(рН 3,0—5А)Готовят путем смешивания объемов в указанном
процентном соотношении 005 н. растворов буры и
янтарной кислоты.pH0,05 и. растворы [j pH0.05 н. растворыбуры jІ ынтарноА I
1 кислоты 1буры■пиарнойкислоты3,01,498,64,630,070,03,23,596,54.833,566,53,46,094,05,036,863,23,69,590,55,239,560,5438
0.05 н. растворы 10.05 н. растворыpHбурыянтарной 1
кислоты ВPHбурыянтарнойхмсяоти3,84,04,24.413.717.8
22,2
26,286,3 182.2 I77.8	I73.8	15.45,65.842.244.3
46,057,855,754,0таблица ні	Воротная буфернаясмесь (pH 7,62—9,17)
Готовят путем смешивания 0/)5 н. растворов
буры и соляной кислоты.pH0.05 п. раствора (см*) Iр”0.05 . раствора (смш)бурыHCIбурыHCI7,6252,547.58,8075257,9455458,9180208,1457,542,59,0185158,2960409,0990108.5165359,179558,687030-——таблица IV	Нитратный буфер Серенсена //(pH /,/ - 6 fi)Готовят путем смешивания растворов: 0,1 н. лимоннокислого
натрия (2Г/Ю8 г лимонной кислоты, моногидрата и 200 см? / н.
NaOH в / дм?), 0,1 н. НС1, 0,! н. NaOH. Для получения соответ¬
ствующих значений pH берут следующие соотношения объемов
растворов:рн0.1 раствора IpH0.1 в. растворалимонно¬кислогонаїриясоляной 1КИСЛОТЫ 1ЛИМОННО¬КИСЛОГОнатрияСОННОЙкяслотыедкогонатршг1.14,895,24,056,044,01,315,984,14,261,138,9—1.522,277,84.467,932,1—1.726,573,54,676,923,1—1,929,570,54,888,012,0—2,030,669,45,096,4	3.62,232,667,45,285,1—14,62,434,565,55,380,7	19,32,636,463,65,476,3	23,72,838,361,75,669,6—31,03,040,359,75,863,9_36,43,242,757,46,059,6	40,43,445,454,66,256,6	43,43,648,451.66,454,6	45,43,851,948,16,653,0	47,0439
таблица v	Фосфатная смесь Се¬рея с єна (pH 4,94—9,18)Для приготовления смеси растворяют в / дм3
дистиллированной воды 1/JB76 г кислого Na2HPOt ■
12HiO и в / Ли3 воды — 9078 г KHjPO*. Для полу-
нения приведенных значений pH растворы смеши¬
вают в указанных соотношениях (при расчете на
10 частей).pHNa,HPO,КН,РО«pHNa,HPO.КН,РО,4,940.109,90 I6,986,004,005.290.259,757.177,003,005.590.509,507,388,002,005.911,009,001 7,739,001,006.242,008,001 8>049,500,506,473,007,00В 8,349,750.256,644,006,001 8,679,900,106,815.005,001 9.1810,000,00таблица vi	Универсальная буфернаясмесь (pH 1A1—1U&)Для приготовления буфера к смеси равных
объемов О/И М растворов фосфорной, уксусной и
борной кислот прибавляют 02 н. раствор NaOH. Для
получения необходимых значений pH к 100 см* смеси
указанных кислот добавляют следующие количества
щелочи (в см3):pHNaOH 11 рнNaOH 11 рнNaOH1,810.04,5630,008,6965,001,985.05,0235,009.1570,002,095.55,7240,009,6275,002,2110,006,3745,0010,9880,002,5615,006,8050,0011,2085,003,2920,007,2455,0011,5890,004,1025,007,9660,0011,8295,00Для получения промежуточных значений pH добав,
ляют соответственное промежуточное количествощелочи.таблица VII	Фосфатно-цатратная буфернаясмесь Мак-Ильвейна (pH 23—8,0)
Приготовление: 02 М раствор NasHPOt ■ 12НіО и OJ А/
раствор лимонной кислоты смешивают в указанных соотношениях
(при расчете на 20 частей).рнРастворы ВРастворыNa.HPO,мімошіаакислота1 рпNa,HPO,лимоннаякислота2,22.40.401.2419.6Э
18,765,2
1 5.410,7211.159,288.85440
Расі «ори ІРастворыpHNa.HPO,лимоішая І
кислота 1pHNa,HPO«ЛИМОННА И
кисло га2.62,1817.825.611.608.402,83,1716,835.812,097.913,04.1115,896,012,637.373,24,9415,066.213,226,783,45,7014,306,413,856.153,66.4413,566,614,555,453.87.1012,906,815,454,554.07,7112,297,016,473,534,28,2811,727.217.392,614,48,8211,187.418,171.834,69,3510,657,618,731.274,89,8610.147.819.150.855,010,309,708.019.450.55таблица viit	Ацетатная буфернаясмесь (pH 3j6Sj8)Для получения растворов с указанными значе¬
ниями pH при 18* смешивают 02 М растворы уксус-
нокислого натрия (CHtCOONa*3HtO) и •уксусной
кислоты в следующих соотношениях (при расчете на
tO частей).рн0.2 М растворырн0f2 М растворыуксусно¬кислогонатрияуксуснойкислотыуксусно¬кислоговлтрняуксуснойкислоты3.60.759.254,85,904,103,81,208,805,07*003,004.01,808,205.27.902,104,22,657,335.48,601,404.43,706.305.69,100.904,64,905.10 11 5.89.400.60таблица IX	Трис-буфер (pH 72—9,1)(буферная смесь 0,05' М: шрис-оксиметиламчнометан — НС!).
Готовят 02 М раствор трис-оксиметиламинометана (2423 г в t дм2 воды)
и ОJ н. AfC/. Для получения соответствующего pH смешивают растворы
в нижеприведенных соотношениях и доводят водой до 100 см3.рн0.2 М ірис0.1 и. НСІрн0.2 М томе0.1 и.при 23° 1при 37°<**»>(ел»)при 23°при 37°W#» Swm 9 ftr|9%(м»)неї(см*)9,108,95255,08.148,СО2525,08,928,78257.58,057,902527,58,748,602510.07,967.822530,08,628,482512.57,877,732532,58,508.372515.07.777,632535,08,408,272517,57,667,522537,08,328.182520,07.547,4025f I W40,08,238,102522,57,367,222542,511 7.207,052545,0441
таблица х	Плотность (?) растворов различнойконцентрациисильных кислот и щелочей при 15®•	При 20е.** При 20Р и концентрации раствора 65%.•** При 20° и концентрации раствора 69,57%.Концентра¬
ция кH,SO«нко,HCIконNaOHNH,н,РО.21,0131.0111,0091,0161.0230,9921,01041,0271.0221,0191,0331,0460.9831,02261,0401.0331.0291,0481,0690,9731,03381,0551.0441.0391,0651.С920,9671,045101.0691.0551,0491,0821,1150.961,056121.0831.0681.0591.1001.1370.9531,067141.0981.0801.0691.1181,1590,9461,079161.1121.0981,0791,1371,1810,9391,091181,1271,1061,0891.1561,2030.9321,103201.1431.1191,1001.1761,2250,9261,119221.1581.1321,1101.1961.2470,9191,129241.1741.1451.1211.2171,2680,9131,143261.19Э1.1581,1321.2401.2890,9381.156281,2051,1711,1421.2631.3100,9031,170301.2241.1841,1521.2861,3320,8981,188321.2381.1981,1631,3101.3520,8931,204341.2551,2111,1731,3341,3740,8891,219361.2731.2251,1831.3581.3950,8841,233381.2901.2381,1941.3841,416—1,249401.3071.251—1,4111,437—1,265421.3241,204—1,4371.458—1,281441.3421,277—1,4601.478—1,297461.3611.290—1,4851.499—1.314481.3801,303—1,5111,519—1,381501.3991,316—1.5381,540—1,348561.4601,351—1,6161.601—1,402601.5031,373——1,643—1,439661.5711,403————1,475**681.5941.405*————1,528***701.6171.413*————1,526*801,7331.452*————1,633*901.8191.483*————1,746*921.8301.485*————1,770*941.8371.491*————1,794*961.8401,495*————1,819*981.8411,501*————1,844*1001.8381.513*————1,870*
таблица xi	Охлаждающие смесисолей со льдом или
снегом и другие
охлаждающие смесиВеществоigg о xS*Iз w
e ® 4*28S
• ущ ОС* 91О о5 SjuВеществоА*С.ХО Оа 2«NH«C120-15,5Тнерлая COj—78,8nh«no316-14Твердая CO, сОт —72этаноломдо —115NH,N0331-26NaCI21-21Твердая С03 с—80ацетономСаСІ32Н,055-40Жидкий азот--І96Спирт50—24Жидкий азот сЛо -150ацетономРаствори солей для получения температур выше 100?Насыщенные растворы солей NaCI NaNOa К-С03 CaCI 2пС13
Температура (°С)	 108 120 135 180 350Сплавы солей, приготовленные нз 45%-ного NaNOj и 55%-ного KN03
расплавляются при 218°; сухая соль KN03 плавится при 337°.таблица XII	Вес / дм? газов при 0° и 760 ммдавленияГаэИ«с <о|i ^аЭВсе (г)Воздух	1,2930Хлористый водород . .1,6392Азот	1,2505Окись азота	1,3402Кислород 	1,4289Аммиак	0,7708Углекислый газ ... .1,9767Ацетилен	1,1791Водород 	0,0899Сероводород . . . . •1,5392Аргон	1.78091Сернистый газ ....1,4289Гелий 	0.17841 Пропан	2,01%Хлор	3,214(]|1 Бутан	2,6726таблица хні	Плотность (?) некоторыхорганических жидкостей
при комнатных температурахЖидкостьТемпература IгТемпература16*2024эЖидкость16’ж34°Этанол . .0,7970,7910,788Бензол . .0.8820,8790,876Метанол . .0,7990,7950,792Хлороформ1,4841,4761,468Ацетон . .0,7960,7920,787УксуснаяЭтиловый0,7180,7130,709кислота1,0621,0581.05-1эфир . .Муравьи*ная кис¬лота . .1,2251.2211,217443
таблица xiv	Соответствие размеров частицразнымединицам измеренияметмммкм jj мешММмкм20-5050—1100,84—0,2970,297—0,149840—29л
297—149100—200
200—4000,149-0,0740,074-0,038149-7474-38таблица XV	Индикаторы, применяемые в аналитическойхимиии для колориметрического определения pHОкраска раствораpH интер¬Концентра¬
ции инди¬
катора <%)Индикаторв кислой
средев щелочной
средевала пере¬
хода
окраскиРастворительКристалл фиоле¬
товыйЗеленаяФиолетовая0-2—ВодаТропеолин 00КраснаяЖелтая . .1,3-31,0 и 0,1ВодаМетиловый жел¬
тый (диметил-
амидоазобснзол)КраснаяЖелтая . .2,9—40,1 и 0.01Спирт 93“Метиловый оран¬
жевыйКраснаяОранжево¬желтая3,1—4,40,1ВодаМетиловый крас¬
ныйКраснаяЖелтая . .4,4-6,20,1 и 0,2Спирт 60°БромтимоловыйСІІІІИЙЖелтаяСиняя . . .6-7,50,05Спирт 20°*НейтральныйкрасныйКраснаяЯнтарно¬желтая6,8-80,1Спирт 60°Крезоловый крас¬
ный (2-й пере¬
ход)Янтарно¬желтаяПурпурно¬красная7,2—8,80.1Спирт 20°**ФенолфталеинБесцвет¬наяПурпурная8,2-100,1 и 1Спирт 60°ТимолфталеинБесцвет¬наяСиняя . . ,0,1Спирт 90°АлизариновыйжелтыйЖелтаяЛиловая10,1-12,10,1ВодаТропеолин 0ЖелтаяОранжево-
коричне¬
вая . . .11—130,1Вода*	Добавляют 3,2 cjk* 0,06 н. NaOH на 100 мг индикатора.*• Добавляют 5,3 ел* 0,06 и. NaOH на 100 мг индикатора.444
таблица xvt	Некоторые свойствасефадексов типа ОСефадекс типа 0я§е*1!»*1 л
*-8~И--ІЗЧИ £*wwS
“ Sя ** 5It*les§ о §mПределы фракционирования
(іммекумршй вес в тыс.)пептидов и
глобулярных
протеиновдекстраиов1040-1201.02-3Не более 0,7Не более 0,71540—1201,52.5-3,5Не более 1,5Не более 1,525 — грубый100-3002,54—61-50,1-525 — средннй50—1502,54-61-50,1-525 — тонкий20-802,54—61-50,1-525 —очень тонкий10-402.54—61-50,1-550— грубый100—3005.09-111.5-300,5-Ю50 — средннй50—1505.09-111.5-300,5—1050 — тонкий20—805,09-111,5—300,5-1050 — очень тонкий10-405.09-111,5-300,5—107540-1207,512-153-801-5075 — очень тонкий10-407,512—153—701-5010040—120Ю.О15-204-1501-100100 —очень тонкий10-4010,015-204—1001—10015040—12015,020—305—3C01—150150—очень тонкий10—4015,018-225-1501-15020040—12020,030-405-6001-200200 — очень тонкий10—4020,020-255-2501-200
ЛитератураАх рем А. А.. А. И. Кузнецов а. Тонкослойная хроматография.
«Наука», 1964.Аналитические методы белковой химии. Изд-во ИЛ, 1963.Баславская С. С., О. М. Трубецкова. Практикум по физиологии
растений. Изд. Московского ун-та, 1964.Белки, том II. Под ред. Г. Нейрата и К. Бэйли. Перев. с англ. под ред.
А. Г. Пасьшского. Изд-во иностранной литературы, 1956.Берчфнльд Г., Э. Сторрс. Газовая хроматография в биохимии. Пе¬
рса. с англ. под ред. К. В. Чмутова. «Мир», 1964.Биохимические методы анализа растений. Перев. с нем. под ред. М. Н. За-
лрометова. Изд-во иностранной литературы, 1960.Биохимические методы в физиологии растений. Под ред. О. А. Паилм-
новой. «Наука», 1971.Горяев М., И. П л и в а. Методы исследования эфирных масел. Алма-
Ата. 1962.Г рода н иски б Н. М., Д. М. ГродзннскиА. Краткий справочник
по физиологии растений. «Наукова думка», Киев, 1964.Д е в я т н и и В. А. Методы химического анализа о производстве вита¬
минов. «Медицина», 1964.ДжорджескуЛ., Б. Пэунеску. Биохимические методы диагноза и
исследования. Бухарест. 1963.Ермаков А. И., В. В. Арасимович, М. И. Смирнова-Икон¬
никова, И. К. М у р р и. Методы биохимического исследования растений.
Ссльхозгнз, 1962.Ермаков А. И., М. И. Смирнова-Иконникова. Г. A. tfl у к о в •
н и к о в а. Н. П. Я р о ш. Ресурсы советской селекции для улучшения химиче¬
ского состава культурных растений. Тр. по прикл. бот., геи. и сел., т. 39, в. 2,
1969.Иоффе Б. Рефрактометрические методы химии. Госхимнздат. 1960.Кон а рев В. Г., С. Л. Тюте ре в. Методы биохимии н цитохимии ну¬
клеиновых кислот растений. «Колос», 1970.К р е т о в и ч В. Д. Введение в энзнмологню. «Наука», 1967.Кретовнч В. Л. Основы биохимии растений. «Высшая школа», 1971.Лабораторная техника органической химии. Под ред. Б. Кейла. «Мир»,
19G6.Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в по¬
лиакриламидном геле. «Мир», 1971.Нестерова Е. А. Методы определения витаминов в кормах. М.. 1967.Петербургский А. В. Практикум по агрономической химии. «Колос»,
1968.Плешков Б. П. Практикум по биохимии растений. М., 1968.Р у б и и Б. А. Физиология растений. М., 1970.Руководство по методам исследования, технохимическому контролю и
учету производства в масложировой промышленности. Под ред. В. П. Рже-
хина н А. Т. Сергеева, т. I, кн. 1 и 2, Л., 1967; т. II, Л., 1965.Современные методы в биохимии. Под. ред. В. Н. Ореховича, т. I, М.,
1964; т. II, М., 1968.Физико-химические методы изучения анализа и фракционирования био¬
полимеров. Перев. с англ. под ред. Г. В. Самсонова. «Наука», 1966.Хроматография на бумаге. Под ред. И. М. Хейса и К. Мацека. Перев.
с чешек, под ред. М. Н. Запрометова. Изд-во иностранной литературы. 1962.Хроматография в тонких слоях. Под ред. Э. Шталя. «Мир». 1965.Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. Пе-
рев. с англ. под ред. М. Н. Мейселя и Я. М. Варшавского. «Мир». 1965.Methods in Enzymology. Edit by S. P. Cotowick, N. O. Kaplan. Academic
Press. N. Y., vol. 1—2, 1955; vol. 5, 1962.446
Автоматический собиратель фрак*
щій 299Лд<шозині|>нфосфорі!ая	кислотаАдсорбент типа «декальсо» 437
Азот, определение аминного 285, 287	аммиачного 284	белкового 282	нитратного 408	«о Кьельдалю 267, 269Акролеин 220Активная кислотность плодов и ово¬
щей 34Алкалоиды, качественные реакции
337—	определение весовым методом 341
	в семенах люпина 344	в семенах пасленовых 342Альдегиды, качественные реакции 391—	определение в эфирных маслах
391Альдолаза 68Аминокислоты, определение колоноч¬
ной хроматографией 298	лизина (колориметрическое) 316	триптофана 313, 315Амигдалин (цианогенный гликоэид)
356
Амилоза 166
Амилопектин 166Амперметрическое титрование 281
Аневрин 99Аиилннфосфат (проявитель сахаров)
161Антоцианы 123
Антрон 144
Аппарат Варбурга 55—	для метилирования 257—	для механического встряхивания
294—	для определения катал азы 44—	для определения эфирных ма¬
сел 381—	для перегонки эфирных масел 379—	Ларнаса-Вагиера 2/0
Арабиноза 147, 175
Аскорбиновая кислота 88
Ацетилцрованне 241, 369
Ацетилцеллюлоза 50
Ацетильное число 240
Ацетон (очистка) 432
Ацетоновый препарат ферментов 85Баня для экстракции н гидролиза J70
Бариевые соли ди- и трикарбоно¬
вих кислот 241Предметный
указательБелки, определение 263	биуретовым маїфометодом 271	микрометодом 276	методом Лоури 275	сырого белка в картофеле 277—	пиролиз 301—	качественные реакции 266—	клейковины муки злаков 278—	выделение из семян 290
	 зеина 291Белки, разделение по растворимости
296, 296	ка Д ЭАЭ-целлюлозе 306	на полиакрнламвдном геле 306—	извлекаемые солевыми раствора*
ми 295	спиртовыми растворами 297	щелочными растворами 296—	реактивы для осаждения 283, 290—	содержание в растениях 264
Бетаин 128Бетанин (бетаноднн) 124
Бор 412Бромистый иод, приготовление раство¬
ра 242
Бромнафталин 226
Бумажки индикаторные 36
н-бутанол, очистка 433
Буферные растворы (смеси) 438—
441Вамуум-нифильтрация 82
Версен, трилон Б (этилеидиамннтет-
іраужсусная кислота) 77, 404
Весы торсионные 273
Витамины, определение 87	аскорбиновой кислоты 88. 91	аневрина (В|) тиамина 99	днгидро аскорбиновой кислоты92	никотиновой кислоты 97	(рибофлавина 104	 рутина 125	токоферола (Е) 112, 114, 115Витамины, определение фолиевой кис*
лоты 95	филлохинона (Кі) 116Вода, определение общего количест¬
ва 22	свободной, связанной 29Воски 250Вращение плоскости поляризации,
определение в жирных и эфирных
маслах 236, 385447
Галактоза 175Галактуроновая кислота 174, 180
Гсксоэофосфаты 68
Гель полиакриламидный, приготов*
леїтс 31 і
Гемішеллюлсзьі 181, 186
Гидроксила мнн 392
Гидроксильное число 240
Гидролиз белка 301—	сахаров 135—	крахмала 144, 161
Гликоалкалоиды 350, 352
Гликозиды 336—	кумариновые 374—	сердечные 353—	серусодержащие 328—	цианогенные 356, 358
Глицериды, определение 260
Глюкоза 142Горчичные масла (изотиоцианаты)Госсипол 371
Гутта, гуттаперча 378Делители семян 8
Диализ 291, 296
Диаэобенэсульфокнслота 369
Диатомит (адсорбент) 96, 437
Днкарбоновые кислоты 214
Дисульфвдиая связь 281
Дитизон (дифошлтиокарбазон) 422.
424. 426Дихлорфенолицдофенол, определение
титра 89Днэтнловый эфир (серный), очист¬
ка 430Дубильные вещества 362
	содержание в растениях 361Жидкость Броди, приготовление 55
Жирные кислоты в маслах 217
	определение >в масле подсол¬
нечника 349	а масле льна 348	юыиелспис 253. 254—	масла, качественные реакции 220Заполнение колонок ионитами 121,
300, 306	окисью алюминия 108	сефадексамш 437Зеин, получение 291
Зола 399Зола, щелочность 400
Зольиые элементы 397	определение бора 412	железа 407, 415, 419	калия 405, 41	кальция 404, 415	кремнекислоты 401448Зольные элементы, определение маг¬
ния 403, 404	меди 420, 422	марганца 419	 серы 332	фосфора 409	 хлора 407Измельчение материала 9
Изопреноиды, изопрен 377
Изоферменты 80Изоэлгастрическая точка белков 289
Индикаторы 444
Инулин 171Иодат калия 0,001 н. 89
Йодное число, определение по Га*
нусу 241	рефрактометрически 244Ионная сила 307Ионообменные колонки 210. 302—	смолы 210, 298Камеры для хроматографии 191
Капсаицин 368
Карбаэол 179Карбоксильные группы 285
Каротинонды. определение кароти¬
нов 107	ксантофиллов 111	лмкопина ПОКаучук, определение в корнях 393	в листьях и стеблях 395Кетоны. определение в эфирных мае*
лах 391. 393
Кетосахара 173
Кислотное число 237. 388
Кислотность общая 192
Кислоты, хроматография на бумаге
213—	разделение на колонке 210—	органические 188—	определение качественное 188	(количественное 191	винной 204	кетокислот 208	лимонной 194	гаирошшоградной 208	щавелевой 206	яблочной 195, 200	янтарной 203Клейковина пшеницы 279—	ячменя и др. 280
Клетчатка 168
Кобальт 425Колба для ацетилцрования 390
Колонка для -разделения органичс*
скнх кислот 210
Колонки для хроматографии 108
Колориметр ФЭК-М 201
Консервирование 18
Концентрация водородных ионов 96
Коэнзнм-А (КоА) 319
Крахмал, выделение 155—	полярометрическое определение
160—	определение объемное 165—	получение 435Кремневольфрамовая кислота, полу¬
чение 435. 338
Кумарины 376Латекс 393
ЛеАмоаятоцнаны 120
Лецитин 236, 260
Лиганн 183
Лизин 303« 316
Лмкопнн 107Линолевая кислота 248. 253	содержание в семенах 217Липиды 216
Л ипохсидаза 55Магнитная мешалка 310
Масло, качественные реакции 220—	определение по обезжиренному
остатау 224	по Сокслету 223Масло, определение в семянке под¬
солнечника 232—	получение из семян, плодов 232
Масляный пресс лабораторный 232
Мельница лабораторная 9
Метиловый спирт, определение 73
	очистка 430Метиловые эфиры кислот 257
Метилумбелнферон-В 193
Метол, очистка 97
Меш, соизмерение с другими 444
Микробюреткн 246
Микропипеткн 191Микроэлементы, определение кобаль¬
та 425	меди 422	цинка 420, 424Морфин 346, 348
Мочевина 276Муфельная печь электрическая 398Насыщенные жирные кислоты 251
Ненасыщенные жирные кислоты 248
Неомыляемые вещества 250
Никотиновая кислота 97
Номограмма для нахождения глю*
козы по меди 139
Нуклеиновые кислоты 323, 325Оболочка семян, отделение 9, 10	определение 11Озоление сухое 400—	мокрое 400
—азотной кислотой 422Олеиновая кислота 249, 253
Омыление 338, 340, 350, 388
Оптическая активность 236, 385
Органические .растворители 443
Отбор проб для анализа 5	на масличность 229Охлаждающие смеси 443Пальмитиновая кислота 253, 249
Пектиновые вещества 174	определение Са пектатиым ме^годом 175	объемным 177	— карбаэоловым 179	пектиновой кислоты, прото¬
пектина 175
Пентабромацетон 194, 197
Пентозаны 182Перекись водорода, определение тит-.
ра 46Перманганат калия, титрованный.раствор 137
Летролейный эфир, счистка 433
Пикнометры, заполнение 234
Пнпеїка для набирания н фильтро¬
вания 226
Пирокатехин, раствор 48
Пламенный фотометр 414
Пластинки для тонкослойной хрома-.тот рафии 151
Пленчатость, определение 11
Плоды, подготовка к анализу 15
Плотность жирных масел 233—	органических растворителей 443—	эфирных масел 384—	(растворов щелочей и кислот 442—	смесей вазелинового масла и
CCU 230Показатель преломления 28, 236,
384Полисахариды 152, 184
Поляриметрія, понятие основ 157
Поляриметры (сахариметры) 161—	оптическая схема, техника работ
158Полярограф ЛП-60 418
Полярографическое определение же-.леза 419
-- — марганца 419	меди 420	цинка 420Потенциометр ЛПУ-01 38
Пресс масляный лабораторный 232-
Преос-стакан для получения масла
244Приборы для определения белка 277—	фильтрования с отсасыванием 168—	определения воды и гидрофобных
веществ 23—	хроматографии 108449.
Приготовление вытяжек из плодов и
овощей 132
Приготовление титрованного раство¬
ра КМпО« 137Пробирки для отвешивания вязких
жидкостей 228
Протопектин 174Разделение хроматографическое 344	алкалоидов 298. 351	аминокислот 298	белков 306. 308	жирных кислот 254	каротиноидов 109	органических кислот 189. 210	 сахаров 146	флавонондов 121Размельчитель тканей 10. 272
Растворимость терпенов 387
Растворы буферные, приготовление
438Реактив антроновый 144—	Бухарда 337, 339—	Гануса 242—	Гиббса 368—	Грисса 61, 408—	драгендорфа 258. 338—	Дадокде 173—	Майора 338. 346
Реактив Мнллона 267—	«а антоциан 120—	на лейкоаитоциан 121—	Несслера 393—	шшпидрииовый 298—	орцнноаый 316—	(резорциновый 172, 176—	Свейиа—Хиллиса 120, 121—	Сомоги 163—	Тананаева 405—	Фелннга 135—	Фолина—Дениса 120, 275—	Хорроиса 393—	Шпффа 393Реакции на алкалоиды 339. 340—	аминокислоты 298, 303—	белки 266—	глнкоалкалоиды 350—	дубильные вещества 361, 367—	жирные масла 220—	крахмал 156—	сахара 149—	биуретовая (Пиотровского) 266,
271, 276—	ксаитопротеиновая 315—	нингндрниовая 266—	пнрвиин'бенэцдшювая (яа си¬
нильную кислоту) 358—	триптофан 313
Рейиеке соль 128
Рефрактометрия 28, 235, 384450Рефрактометр, проверка 235—	ИРФ-22 ЗОРибонуклеиновая кислота (РНК) 325
Рнбофл&шш, определение 104
Рнцинолевая кислота, определение
237Роданистые соединения, определение
330Родановое число 245
Родановый раствор 246
Рутин 125Сахар, содержание в плодах и ово¬
щах 132
Сахара, определение 129	антроновым методом 143	микрометодом 149	по Бертрану 136	по полумшсрометоду 141	тонкослойной на силикагеле 150	хроматографическое на бумаге146—	хроматографическое разделение
148.298Свииец роданистый, приготовление
246Семена, подготовка к анализу 9
Сера 333, 334
Сефадексы 445Силикагель, приготовление 151
Синклькая кислота, определение 356,
358Смесь Форесталя 123
Смолы ионообменные экстракция
396Содержание воды в плодах и ово¬
щах 21—	доела в семенах 217—	сахаров 132
Соланин, определение 351
Составление средних проб 6. 12, 16.
Сооуды Варбурга 56
електрограф СФ-4А, выполнение из¬
мерений 52Спирты, получение оптически чистых
(для анализа) 430, 431—	определение в эфирном масле 389
Средние пробы 5. 12, 13. 16. 19, 90
Стеариновая «нслот* 253. 249
Стеклянная камера для хроматопра-фии 191
Стерты 250Стероидные глнкозиды 353
Сульфопшрнльные группы 281
Сурьма треххлористая, приготовле¬
ние раствора 352
Сухое вещество, определение 20	высушиванием 22, 24	методом перегонки 23	рефрактометрическое 26
Сушильный шкаф с вентиляцией 84
Схема хроматографической камеры
191Танмниы 361Темлераггура застывания 387
Терпены 377
Тиохром 99
Тиоцианаты 330
Токоферол ИЗТонкослойные пластинки 258
Тригляцершы. определение 260
Трилаа Б (версенат) 404
триптофан 313
Трис-буфер 441г^тр^мтетразодай хлористыйТроповые алкалоиды 342Трубка для адсорбции тиамина 100—	для отфильтроаывання осадка за*
кисн меди 137Трубка Тунберга 62Углеводороды, отделение 260
Углекислота 443
Удельное вращение 158
Уксусная кислота, очистка 433
Уроновая кислота 179
Установки для перегонки аммиака
268—	— (веществ с водяным паром 328,
379. 381Установки для перегонки изотиоцна*
патов 328
	летучих масел лука 332Фенолы, определение 120
Ферменты 41—	определение альдолазы 68
	амилаз 66, 81	АТФ-азы 71	глнкозидазы 63	аскорбичатоксндазы 49	дегидрогеназ 57	изоферментав 80	 каталазы 44	липоокендаэы 55	липазы 62	нитратредуктазы 61	пектинметилэстераэы 72	пектолитечеоких ферментов 72	перонсодазы 47, 81	«галифенолоксцдазы 48	протеолетическнх ферментов 79	рнбонуклеазы 71	фосфатаэы 70	(Ьосфорнлазы 66	фруктофуранаэидаэы 77	интохромоксидазы 51Филлохшюн 116Флавоноиды, флавонолы 117, 121Флуоресценция 104, 106
Флуорометр 101
Фотоэлектронол орнметр 201
Фотоэлсктраколараметрия 47, 202
Фосфорные соединения определение
320Фосфор 409, 412Фосфатиды, фосфолипиды 258, 322
Фосфорновольфрамовая кислота 338	получение 434Фракционирование* аминокислот 298—	белков 294—	кислот 210, 213—• углевоаосв 184, 167
Фруктоза 143
Фрухгозаны 171
Фруктозо-1,6-до-фосфат 68
Фувоинсернистая квел ота 391Хлор 407Хлорогепиовая кислота 121
Хлорофилл, получение 435—	определение 1!1
Холан 111Х|ки<атог|>афия на бумаге 146, 189,—	на колонках 210, 298, 306, 368,
107—	газожидкостная 256—	тонкослойная 258, 351, 119, 115
Хроматографическое разделение бел¬
ков 306	жирных кислот 254	 капсаицина 368	органических кислот 210	 сахаров 146	фосфолипидов 258—	— флавонондов 119, 121	эфирных масел 393Хроматографические колонки, запол¬
нение 300, 306, 220Хромотроповая кислота, очистка 73Целлюлоза 187
Цианогенные гликозиды 63
Цннк. определение 420, 424
Цитохром С 52Эйконоген, приготовление раствора
410Электрофорез ЗІ I
Электрофоретические трубки 309
Эриохром черный Т 404
Этанол, оптически чистый 429
Эфирные масла (терпены) 377	получение 379	определение 380, 382Эфир петролейный, очистка 433
Эфирное число 239, 388Яблочная кислота 199
Янтарная кислота 203451
ОглавлениеПредисловие	Зглава і Средние пробы культурных растенийи подготовка их к анализу (А. И. Ермаков) ьСпособы отбора среди ах проб	5Средние пробы семян зерновых, масличных « бобовыхкультур 			6Подготовка семян к анализу	9Средине пробы овощей	12Средние пробы плодов и ягод	13Подготовка проб овощеЛ « плодов к анализу	15Средние пробы кормовых растений	16Подготовка проб кормовых растений к анализу ....	18
Средние пробы каучуконосных н дубильных растений иподготовка их к анализу	19глава и Определение содержания водыв растительных объектах (А. И. Ермаков) 20Значение «одержании воды при биохимической оценке	20Определение содержания воды в семенах 		22Определение воды в плодах, овощах и картофеле ....	24Определение воды в вегетативных частях растений ...	26Рефрактометрический метод определения сухого вещества	26Определение связанной воды	29глава /// Определение активной кислотности(А. М. Ермаков)	33Биологическое значение активной кислотности	33Определение концентрации водородных ионов (pH) ... 36глава IV Определение активности ферментов(М. П. Ярош, А. И. Ермаков, В. В. Арасимович) 41Особенности ферментов и методов их определения ... 41Определение активности каталазы	44Определение активности перокаидаэы	47Определение активности полифенолокондазы	48Определение активности аскорбинатоксндазы	49СпектрофотометрическнА метод определения активностицнтохромоксидазы 	51Определение активности лнпокенгенаэы	55Определение активності дегидрогеназ 	57Определение активности нитратредуктазы	61Определение активности лнназы 	 62Определение активности фермента Р-глюкозндязы .... 63Определение активности амилазы	65Определение активности фосфо;шлазы	66Определение активности альдолази 	68Определение активности кислой и щелочной фосфатаз . . 70Определение активности АТФ-<азы	71Определение активности рибонуклеази	71Определение активности пектинмстилэстсразы (ПЭ) ... 72
ПотенциомешическнА метод определения пектинэсте-
разы (ПЭ) 	74452
Определение активности полигалактуроназы (ПГ) ....	75
Определение активности Р*фруктофураиозидаэы .....	77
Определение суммарной активности протёолчгтнческнх фер¬
ментов (М. И. Иконникова) 	79Определение изоферментов	80Метод вакуум-инфильтрации	82Приготовление ацетоновых препаратов ферментов ....	85глава V Определение витаминови других биологически активных
веществ (Г, А. Луковникова а Н. П. Ярош) . . 87Значение витаминов и особенности их накопления в ра¬
стениях 		87Определение аскорбиновой кислоты	88Определение аскорбиновой н дегндроаонорбішовой кислотпо Божику 	92Определение фолиевой кислоты в плодах <и овощах ... 95Определение никотиновой кислоты		97Определение тиамина	...99Определение суммарного рибофлавина	104Определение каротиноидов	107Определение витамина Е	112Определение филлохиноиа (витамина КО (А. И. Ермаков) 116Определение флдооноидных соединений	117Качественное определение антоциановых пигментов .... 123Суммарное определение бетанина	124Определение рутина	125Определение холина и бетаина 	 126ГЛАВА VI Определение сахаров (В. В. Арасимович) . .129Особенности сахаров и методов их определения .... 129Извлечение сахаров	132Анализ водной вытяжки на содержание различных са¬
харов	13эОпределение сахаров по Бертрану	136Полумнхрометод определения сахаров	141Определение глюкозы 		142Определение фруктозы и других кетосахаров	143Антршовый метод определения сахаров и крахмала . . . 143
Микрометод определения сахаров (А. И, Ермаков) ... 145
Количественное определение сахаров методом хромато¬
графии на бумаге 			146Определение сахаров методом тонкослойной хроматогра¬
фии на силикагеле	150глава vn Определение полисахаридови лигнина (В. В. Арасимович, А. И. Ермаков) 152Особенности полисахаридов и методов их определения . . 152Выделение крахмала		155Определение крахмала	157Определение клетчатки	168Определение фріуктозанов и олигофруктозвдов	171Определение пектиновых ІВЄЩЄСТВ	174Определение общего количества гемнцеллюлоз	181Определение пептоэднов	182Определение лигнина	183Последовательный анализ плодов иа содержание поли¬
сахаридов 		.184453
ГЛАВА VIII Определениеорганических кислот (А. И. Ермаков) . . . шОсобенности органических кислот и методов их опре¬
деления 	188Качественное определение органических кислот хромато¬
графированием на бумаге	189Определение титруемых кислот (обшей кислотности) . . 192Определение лимонной кислоты 		194Определение яблочной кислоты	195Определение янтарной кислоты 		 . 203Определение винной кислоты		 . 204Определение щавелевой кислоты	206Определение пировинограднон кислоты	208Определение кетокислот (В. В. Арасимович)	208Хроматографический метод определения органических
кислот (по С. В. Солдатенкову и Т. А. Мазуровой)(Г. А. Луковникова)	210глава їх Определение жирных масели других липидов (А. И. Ермаков)	216-Оообенностн жирных масел и методов ох определения . . 216Качественные реакции на жирные масла	220Определение общего содержания липидов (масел) . . . . 220
Определение физических и химических показателей масел« других липидов 	232Определение состава жирных кислот по физико-химиче¬
ским показателю! масла			248Определение неомыляемых веществ	250Определение восков . ,		250Определение насыщенных высокомолекулярных кислот (поБертраму)	251Определение состава жирных кислот липидов	253Определение состава липидов газожидкостной хромато¬
графией (ГЖХ)	256Разделение и определение фосфолипидов в тонком слое 258
Метод определения группового состава глицеридов масел 260глава х Определение белковых и других
азотистых веществ(М. И. Иконникова, А. И. Ермаков)	263Особенности белковых н других азотистых веществ и ме¬
тодов их определения 	263Качественные реакции на белки	266Определение азота (по Кьельдалю — модификация) . . . 267Определение азота по полумикрометоду	269Биуретовый метод определения белка в семенах(Н. П. Ярош) 			271Колориметрический метод определения белка (по Лоури) 275
Биуретовый микрометод определения белка (И. П. Ярош) 276
Определение сырого белка л клубнях картофеля . . . .277
Определение клейковины зерна злаковых растений . . . 278
Определение сульфгндрнльных групп амперомотрнческнмтитрованием (АМТ) 	281Определение белкового азота 	282Определение небелкового азота (аммиака, аминов и ами¬
нокислот) 	283Определение изоэлектрической точки белка	289454
Выделение белков из семян н вегетативных органов . . . 290
Количественное определение белковых фракций (поА. И. Ермакову) 	292Определение аминокислот путем хроматографии «а ко*лотках 			 				298Хроматографическое разделенно белков на ДЭАЭЦ (поПетерсону н Соберу) 	306Разделение белков на ноли акрил амидном геле	308Определение триптофана в семенах (Н. П. Яроіи) . . .313
Определение триптофана в вегетативных частях расте-ни fi (Н. П. Ярош)	315Определение лизіша в семенах	316глава X/ Определение веществ, содержащихфосфор или серу (Н. П. Ярош)	319Особенности соединений, содержащих фосфор или серу, нметодов их определения	319Последовательный ход определения фосфорсодержащих со¬
единений 	320Слектрофотометричоское определение РНК и ДНК . . 325Определение изотиоцианатов (горчичных масел)	327Определение роданистых соединений в вегетативных ор¬
ганах 	330Количественное определение эфирного масла в луке(А. И. Ермаков)	332Определение серусодержаишх гликозидов (М. И. Икон¬
никова ) 	334глава хи Определение алкалоидов и гликозидов(М. А/. Иконникова, А. И. Ермаков, Н. П. Ярош) 336Особенности алкалоидов и гликозидов и методов их опре¬
деления 	336Качественные реакции lia алкалоиды		337Качественное определение алкалоидов в люпине (поН. Н. Иванову, М. И. Смирновой)	339Качественное и приближенное количественное определе¬
ние алкалоидов (по А. И. Баньковскому и др) .... 340
Определение общего содержания алкалоидов весовым ме¬
тодом (по Маху и Ледерлею)	341Определение алкалоидов в растениях семейства пасле¬
новых ...»	342Определение состава и содержания алкалоидов в люпинеметодом хроматографии	344Определение морфина 		346Определение глнкоалкалонлов 	350Определение стероидных глимозндов сердечного действия 353
Определение цианогенных глюкозидов и синильной кислоты 356Определение таннинов 	361Определение капсаицина	368Определение госсипола 	371Определение, кумаринов и фурокумарннов	374глава хні Определение изопреноидов
(эфирных масел и каучука)(А. И. Ермаков)	377Особенности эфирных масел и каучука « методов ихопределения 	 377Определение эфцрных масел	379155
Определение физических и химических показателей эфир¬
ных массл	383Определение спиртов и эфирных маслах	389Определение альдегидов и кстоноа эфирных массл .... 391
Определение каучука каучуконосных растений	393глава XIV Определение золы и некоторых
зольных элементов(А. И. Ермаков, Г. А. Луковникова, Н. П. Ярош)Определение золы в различных органах растений . . . .397
Озолснис и определение главнейших минеральных эле¬
ментов 	400Определение микроэлементов	421глава XV Способы регенерациии приготовления некоторыхреактивов (А. И. Ермаков, И. П. Ярош) . . . 42ьРегенерация реактивов 	 428Приготовление некоторых реактивов 	 434Приложения 	438Литература	4*16Предметный указатель	-	447Ермаков Александр Иванович
Арасимович Валентина Вячеславовна
Смирнова-Иконникова Мария Ивановна
Ярош Нина Петровна
Луковникова Галина АлексеевнаМетоды
биохимического
исследования
растенийИзд. 2 с. переработанное я дополненноеПод редакцией д-ра биолог, наук Д. И. ЕрмаковаЛ., отделение издательств* *Колос». 1972
450 с. с мл.Редактор С. Д. ВихренОформление художника Б. II. Осенчакопа
Художественный редактор О. П. Андреев
Технические редактори Л. Л. Фридман
н Л. В. Резникова. Корректоры Л. В. Вешнякова
и В. II. Ражен.Сдано в набор 7/1V 1972 г. Подписано к печати I/IX 1972 г. М-54961.Формат СО X 901/)». Бумага тип. «Уг 2. 11еч. л 28,5. Уч.-изд. л. 30.90.Тираж 5900 »кз. Цепа 2 р. 10 к. Заказ М 401.Отделение ордена Трудового Красного Знамени издательства «Колос*191150. Ленинград. Невский пр., 28.Типографии им. Котлякова издательства «Финансы» Государственного
комитета Совета Министров СССР по делам издательств,
полиграфии и книжной торговли. Ленинград, Садовая. 21.