/
Автор: Воробьева Л.И.
Теги: прикладная микробиология общетехнические дисциплины биология селекция микроорганизмы издательство московского университета культивирование учебное пособие для студентов
ISBN: 5—211—00417—5
Год: 1989
Текст
Л. И. Воробьева
Промышленная
МИКРО-
БИОЛОГИЯ^
Допущено Государственным комитетом СССР
по народному образованию
в качестве учебного пособия
Для студентов биологических и технологических специальностей
высших учебных заведений
ИЗДАТЕЛЬСТВО
МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
1989
ББК 30.16
В75
УДК 579.66
Рецензенты:
кафедра биотехнологии микробного синтеза
Московского технологического института
пищевой промышленности (зав. кафедрой
проф. В. М. Кантере), доктор биологиче-
ских наук, профессор И. Л. Работнова
Воробьева Л. И.
В75 Промышленная микробиология: Учеб, пособие. — Mr
Изд-во МГУ, 1989. — 294 с.: ил.
ISBN 5—211—00417—5.
В учебном пособии рассматриваются метаболизм микроорганизмов^
его регуляция, представлены принципы масштабирования, оптимизации и
компьютеризации микробиологических процессов. Особое внимание уде-
лено особенностям ведения ферментационных процессов в промышленное-
ти, начиная от подготовки инокулята до выделения различных продуктов»
Описан механизм получения продуктов энергетического обмена микро-
организмов, веществ, образующихся в результате бактериального броже-
ния и окисления,- а именно: этанола, ацетона и бутанола, глицерина, про-
пионовой, молочной, лимонной, уксусной кислот и др. Главное внимание^
уделено тем продуктам, которые уже получает промышленность в Совет-
ском Союзе й" за рубежом.
Для студентов биологических специальностей вузов.
1905000000(4309000000)— 158 ц mJ 1
14 1-- 89
077(02)—89
ББК 30. IS
ISBN 5—211—00417—5
© Воробьева Л. И., 1980
ПРЕДИСЛОВИЕ
В 1987 г. вышла в свет книга «Техническая микробиология». В ней
было подробно разобрано получение и применение препаратов, из-
готовляемых из микробной биомассы, а также получение амино-
кислот, ферментов, антибиотиков — целевых продуктов наиболее
крупных действующих микробиологических производств. Рассказы-
валось там и о главных объектах промышленной микробиологии —
микроорганизмах и современных способах их усовершенствования.
В настоящей книге, которая является продолжением первой, изло-
жено применение микроорганизмов для получения продуктов мета-
болизма, выделяемых в среду: этанола, ацетона, бутанола, глице-
рина и других нейтральных продуктов, органических кислот, вне-
клеточных полисахаридов, ароматизаторов, ПАВов.
В учебное пособие включена также глава «Витамины», так как
появились новые интересные и важные сведения по теории и прак-
тическому использованию витаминов.
Новые разработки в биотехнологии и промышленной микробиоло-
гии появляются с такой скоростью и в таких количествах, что
.книги невольно от них отстают и потому часто имеют короткую
жизнь. Чтобы продлить жизнь настоящей книги, мы использовали
много экспериментальных фактов (факты не стареют!), доложен-
ных на последних международных конгрессах по промышленной
микробиологии и биотехнологии. Многие из научных разработок,
описанных в книге, в будущем лягут в основу важных промышлен-
ных процессов.
На 4-м Конгрессе по биотехнологии в Амстердаме в 1987 г. отме-
чалось, что «физиология микроорганизмов есть краеугольный ка-
мень биотехнологии». С этим нельзя не согласиться, и потому пер-
вая часть настоящей книги посвящена общим вопросам микробной
физиологии: метаболизму микроорганизмов, регуляции метаболизма
(в основном в физиологическом аспекте), а также современным
приемам управления микробиологическими процессами путем ис-
пользования физиологического контроля (без математических мо-
делей) и создания динамических математических моделей, помо-
гающих осуществлять динамическую оптимизацию микробиологиче-
ских процессов. Достижения в области компьютерной техники и
ферментной технологии активно проникают в промышленную ми-
кробиологию. В последние годы происходит слияние биотехноло-
гии и электроники. Компьютерное управление и контроль позволя-
ют увеличить выход продукта и/или продуктивность ферментации
и создать ее автоматический контроль. Поэтому мы рассматриваем
некоторые вопросы компьютеризации и масштабирования.
Считаем своим приятным долгом искренне поблагодарить коллектив
преподавателей кафедры биотехнологии микробного синтеза МТИПП
во главе с профессором В. М. Кантере и профессора И. Л. Работ-
нову за сделанные ими ценные критические замечания, большая
•часть которых была автором учтена при подготовке рукописи.
Всегда практика должна быть возд-
вигнута на хорошей теории, вождь и?
врата которой — перспектива.
Леонардо да Винчи
ВВЕДЕНИЕ
НОВЫЕ СТРАТЕГИИ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ
ПРОМЫШЛЕННО ЦЕННЫХ ШТАММОВ
Промышленная микробиология — наука о получении некото-
рых ценных продуктов с помощью микроорганизмов.
Промышленность имеет своей главной целью — увеличить ко-
личество получаемого продукта. Существенное требование к про-
изводству — утилизация дешевого (лучше возобновляемого)
сырья.
Высокий выход продукта, низкая стоимость и доступность
сырья определяют рентабельность промышленного производства^,
целесообразность его функционирования.
ОСНОВНЫЕ ПУТИ ПОЛУЧЕНИЯ
НОВЫХ ПРОДУКТОВ И ШТАММОВ
Скрининг новых продуктов. Одна из важнейших задач совре-
менной промышленной микробиологии состоит в разработке ме-
тодов получения новых продуктов. При скрининге новых продук-
тов в культуральной жидкости в качестве кандидатов может вы-
ступать более 100 тыс. веществ. В результате первоначального
скрининга оставалось ~ 10 тыс., а после вторичного — тыс.
веществ; химическая характеристика давалась ~ 100 веществам^
а биологической полезностью обладали ~10 продуктов. Эта кро-
потливая работа могла приводить к потерям потенциально цен-
ных продуктов, поскольку специфическая биологическая актив-
ность обычно определялась после первого длительного скрининга.
Идеальный микробный скрининг должен быть специфичным —
открывать только желаемые эффекты, точным — давать опреде-
ленный ответ: да или нет, чувствительным — открывать до
25 мкг/мл вещества или меньше, надежным — проявлять ста-
бильность в условиях сложной микробной культуральной жидко-
сти, автоматическим — позволять осуществлять скрининг до
100 тыс. микробных культур. Такие условия возможны в новых
программах, построенных на методах, учитывающих механизмы»
биохимических реакций (иммунологические определения, исполь-
4
5
ч
CO
<D
tn
L—'
<D
tn
cj
<T)
N
cu
co
<D
co
CU
зование ингибиторов ферментов, связывание с меченым лигандом
и др.). Цель исследования состоит в идентификации новых ма-
леньких молекул, которые оказывают специфическое влияние на
соответствующие биохимические системы. Такие вещества отно-
сят к новому поколению микробных продуктов.
Селективное выделение важных промышленных штаммов. Се-
лективные факторы, которые обычно учитывают и используют
для выделения специфических типов микроорганизмов, суммиро-
ваны в табл. 1. Используя селективные приемы выделения за
10 лет (с 1974 по 1984 г.), количество антибиотиков, образуемых
только одной группой актиномицетов Actinoplanes, выросло с 6
до 95. В начале главное внимание было сосредоточено на роде
Streptomyces, из которого были получены главные антибиотики
в лаборатории С. Ваксмана: актиномицин, неомицин, стрептоми-
цин, стрептотрицин. Стрептомицеты обладают непревзойденной
способностью синтезировать антибиотики, возможно, за счет на-
личия у них очень длинной DNA, высокой степени обмена гене-
тическим материалом и присутствием плазмид. Но теперь изве-
стно, что важным источником антибиотиков служат еще и иные
актиномицеты (кроме стрептомицетов). Например, в родах Dac-
tilos rangium, Pseudonocardia и Actinomadura в 1974 г. не было
известно ни одного антибиотика, в 1980 г. открыто 4, 3 и 16, а в
1984 г. — 19, 8 и 51 антибиотик соответственно.
Актиномицеты служат также богатым источником ферментов,
ингибиторов ферментов. Их используют для трансформации аро-
матических веществ, стеролов и стероидных соединений и для
деградации трудно разлагаемых соединений.
Новые биоактивные соединения можно получить из новых
редких и забытых бактерий, иных, чем актиномицеты.
Аэробные эндоспоровые бактерии применяют в промышлен-
ности в качестве продуцентов ферментов, антибиотиков и инсек-
тицидов.
Для этих, пожалуй, наиболее важных промышленных групп
микроорганизмов разработана новая селективная техника выде-
ления (пригодная и для других бактерий). Цель такой селектив-
ной изоляции — ограничить рост грибов, отделить легко выде-
ляющиеся бактериальные штаммы с тем, чтобы открыть редкие
и новые виды. С этой целью предложены такие способы предоб-
работки субстрата, которые позволяют снизить число нежела-
тельных микроорганизмов.
Возникновение новых штаммов при культивировании смешан-
ных культур. Получение новых штаммов возможно путем нового
и интересного применения смешанных культур. В среде, содер-
жащей гербицид Далапон, культивировали смесь культур, один
из компонентов которой Ps. putida вначале не мог расти с Дала-
поном (22DCRA), но через 2900 ч хемостатного культивирования
возник мутант этого штамма, обозначенный РЗ, который был спо-
собен утилизировать Далапон как единственный субстрат. У му-
танта оказалась измененная, очень активная дегалогеназа, необ-
7
ходимая для использования 22DCRA. Полагают, что другие штам-
мы были «бутафорией», поддерживающей рост исходного штам-
ма, пока не возник и не отселектировался соответствующий му-
тант.
Ряд факторов может участвовать в создании нового штамма:
селективное давление, поддержка роста «слабыми» штаммами,
дающими возможность появиться «сильному» штамму, перенос
генетического материала при помощи плазмид и фагов. Эти фак-
ты позволяют переоценить возможности смешанных культур и
рассматривать их культивирование как альтернативу генетической
инженерии, что позволяет комбинировать генетические свойства
разных организмов. Технология (rDNA) помогает обходить барье-
ры, стоящие на пути промышленного применения штаммов: их
слабый рост, незначительное образование метаболита, иногда па-
тогенность, и расширяет потенциальные возможности разнообра-
зия микроорганизмов.
ЛИТЕРАТУРА
Захаров И. А., Кожина Т. Н. Генетическая инженерия у дрожжей//Мо-
лекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л., 1986. С. 117—138.
Инге-Веч томов С. Г. Дрожжи: этап в развитии биотехнологии//Биоло-
гические науки. 1985. № 12. С. 31—36.
Hynes М. L. Transformation of filamentous fun gi//Exp eriment al mycology.
1986. P. 1—8.
Porter R. D. Transformation in Cyanobacteria//CRC Crit Rev. Microbiol. 1986.
Vol. 13, N 2. P. 111—132.
Sanders G., J u i t e M. F., Hott G. Fungal cloning vectors//Trends in Bio-
technol. 1986. Vol. 4. P. 93—98.
Stellweg E. L., Brenchley L. E. Genetic engineering of microorganisms
for biotechnology//Microbial. Ecol. 1986. N 12. P. 3—13.
ГЛАВА I
МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ
Метаболизм клетки или организма определяется суммой об-
щих реакций, катализируемых ферментами клетки или данного
организма. Метаболизм любого организма направлен прежде все-
го на обеспечение роста и размножения и общий метаболический
процесс может быть суммирован следующим образом:
питательные вещества-^клеточный материал +;
+ продукты отходов + тепло.
Для промышленной микробиологии используют клеточный ма-
териал как источник белковых веществ, липидов, каротиноидов,
витаминов и продукты отходов — этанол, ацетон, бутанол, гли-
церин и другие вещества. Познание путей метаболизма и его
регуляции позволяет изменять не только общий выход и соотно-
шение продуктов, но также их состав. Например, известно, что*
ацетоно-бутиловые клостридии при нейтральном значении pH об-
разуют уксусную и масляную кислоты, а в кислой среде — аце-
тон и бутанол. В аэробных условиях пекарские дрожжи накап-
ливают много биомассы и мало этанола, а в анаэробных — на-
оборот. В целом метаболизм складывается из катаболических и
анаболических реакций. Катаболические (энергетические) реак-
ции обеспечивают клетки энергией, а во многих случаях также
строительными блоками и источником углерода. И тогда такие
реакции называют амфиболическими. В результате анаболических
реакций осуществляется биосинтез клеточного материала из про-
стых органических или неорганических соединений. Эти общие
положения о метаболизме относятся ко всем живым существам —
от прокариот до животных.
Но круг объектов промышленной микробиологии ограничен
бактериями, нитчатыми грибами, дрожжами, одноклеточными во-
дорослями, которые в силу малых размеров имеют ряд метабо-
лических особенностей.
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА
МИКРООРГАНИЗМОВ
Микроорганизмы используют большое разнообразие веществ
как источников энергии и углерода. Первое место в этом отно-
шении занимают бактерии, далее нитчатые грибы и дрожжи.
Только бактерии-литотрофы способны к извлечению энергии из
восстановленных неорганических веществ: Fe, S°, H2S, Н2, NH3,
Nev, CO и др.
9
Бактерии могут использовать все существующие на земле ор-
ганические вещества — от Ci до полимеров, особенно если по-
следние имеют природное происхождение. Только бактерии могут
утилизировать метан.
Энергия в виде радиации или извлеченная из разных веществ
преобразуется организмами в доступную для них форму: АТР
(при субстратном фосфорилировании), Дцн+ (при окислитель-
ном и фотофосфорилировании) и у некоторых бактерий еще в
Др +• Все три формы: АТР«-»Др h <->Др +— обратимы и взаи-
мозаменяемы*
Автотрофия, т. е. способность использовать СО2 как единст-
венный источник углерода для процессов биосинтеза, не есть при-
вилегия бактерий. Высшие растения тоже обладают такой спо-
собностью. Но в мире бактерий существует не один, а по крайней
мере, три различных механизма фиксации СО2: у большинства
автотрофов цикл Кальвина (как и у растений), цикл Арнона у
зеленых фототрофных бактерий и своеобразный способ фиксации
СО2 у метаногенов (см. дальше). Этот и многие другие примеры
уже не позволяют говорить о единстве биохимии во всем живом
мире. Бактерии опровергают этот принцип как в отношении био-
химической активности, так и в отношении молекулярной орга-
низации. Некоторые бактерии и мицелиальные грибы гидролизу-
ют и используют такие трудноутилизируемые, но легко возобнов-
ляемые вещества, как лигнин, гемицеллюлозу, целлюлозу.
Углеводы — самая распространенная группа биологических
соединений на Земле, и из них больше всего целлюлозы (поли-
мера глюкозы). Другой широко распространенный и трудно раз-
лагаемый углевод — хитин (полимер ацетилглюкозамина) — это
главное органическое соединение экзоскелетов артропод (насе-
комых, крабов, раков). Миллионы тонн хитина ежегодно образует
один только вид краба. Способностью разлагать хитин, а также
кератин (основной компонент роговых частиц) и даже латекс
(каучук) обладают некоторые актиномицеты.
Хемиоосмотический механизм преобразования энергии свойст-
венен всем бактериальным клеткам. В состав цитоплазматической
мембраны всех бактерий, в том числе и анаэробных, входит АТР-
синтетаза. У анаэробов ATP-синтетаза гидролизует часть обра-
зованной АТР и на цитоплазматической мембране создается про-
тондвижущая сила. У всех других бактерий протондвижущую
силу, приводящую в действие ATP-синтетазу, синтезирующую у
них АТР, создает цепь переноса электронов.
Градиент протонов участвует в транспорте веществ через мем-
брану против градиентов их концентраций, в выделении ионов
Na+ наружу, в движении бактериальных жгутиков. Ионы Na+
выносятся из бактерий по механизму Na+—Н^-антипорта, заме-
няющего Na+—К+-АТРазу эукариотических клеток (рис. 1). По-
глощение питательных веществ происходит у бактерий по меха-
10
низму Н+-симпорта. Нужные клетке метаболиты поступают вме-
сте с одним или несколькими протонами при участии специаль-
ных белков-переносчиков: так транспортируется большинство са-
харов и аминокислот.
Метаболизм микроорганизмов характеризуется высокой интен-
сивностью. В силу маленьких размеров микробных клеток созда-
ется высокое отношение поверхности к объему (S/V), вследствие
чего происходит активное поступление веществ в клетку. Поэто-
му неудивительно, что в природе сферическая форма клеток яв-
ляется доминирующей в мире бактерий; замечено, что ухудшение
дыхание
подвижность
энергизованная
мембрана
.. 2+ ~ 2 +
Мд , Са
АТРаза
брожение
~ АТР -
образование
биомассы
трансгидрогенирование транспорт
Рис, 1, Схематическое изображение генерации и утилизации АТР (по Stoutha-
тег, 1984)
снабжения питательными веществами бактерий Arthrobacter sp.
вызывает у нее увеличение S/V за счет превращения палочковид-
ных клеток в кокки. Поскольку пептидогликановая клеточная
стенка бактерий способна противодействовать огромному осмо-
тическому давлению, субстраты и питательные вещества акку-
мулируются в бактериях в высоких количествах. Это обусловли-
вает высокие скорости метаболических реакций, что выражается
в активном дыхании или брожении, высокой скорости деления
клеток, чему способствует также наличие одной хромосомы и ко-
ротких циклов деления.
В метаболизме микроорганизмов различают первичные и вто-
ричные метаболиты. Микробным метаболитом называют (Tem-
pest, 1979)' молекулу, которая участвует в метаболизме, и это
может относиться к СО2, Н2, N2, с одной стороны, или к DNA,
белкам, белкам-ферментам — с другой.
Первичные метаболиты необходимы для роста и размножения
клеток и сходны у всех микроорганизмов.
Вторичные метаболиты возникают после остановки роста ми-
кроба (иногда и раньше) и могут различаться у разных организ-
мов. Образование вторичных метаболитов зависит от состава сре-
ды и условий роста, а регуляция их биосинтеза отличается от ре-
гуляции синтеза первичных метаболитов. У вторичных метаболи-
тов обычно более сложная молекулярная организация, чем у пер-
вичных.
11
Первичные продукты анаболизма, имеющие промышленную
важность, — это липиды, витамины, биомасса, полисахариды и
интермедиаты клеточного биосинтеза: нуклеотиды и аминокисло-
ты. Из вторичных продуктов анаболического обмена наиболее
важны антибиотики, алкалоиды, токсины.
Первичные продукты катаболического обмена — это этанол,
уксусная кислота, СО2, АТР. Вторичные продукты катаболизма —
например, ацетон и бутанол.
Главные внутриклеточные функции у бактерий контролируют-
ся ферментами. Генетические системы часто непосредственно свя-
заны со всеми бактериальными функциями без подключения дру-
гих регуляторных механизмов. Они позволяют изменять уровень
образования продуктов путем воздействия на активность и синтез
ферментов. В последние годы появилось достаточно данных, по-
казывающих, что некоторые бактерии синтезируют феромоны по-
добно высшим организмам. Бактериальные феромоны называют
индукторами, ауторегуляторами, факторами d и А. Феромоны
синтезируются в ничтожных количествах и участвуют в диффе-
ренциации клеток и циклах деления бактерий. Обнаружены у
псевдомонад, бацилл, миксобактерий, стрептококков, люминесци-
рующих бактерий, стрептомицетов, цианобактерий. У миксобак-
терий, например, феромоны индуцируют процесс агрегации кле-
ток и спорогенез, у стрептомицетов с участием фактора А связан
синтез стрептомицина, устойчивость к нему клеток и споруляция,
У животных координация и регуляция метаболизма осущест-
вляются главным образом путем посттранскрипционной модифи-
кации iRNA, и управлять метаболизмом животных гораздо труд-
нее, чем метаболизмом прокариот.
В силу маленьких размеров обмен веществ многих микроор-
ганизмов вывернут «наизнанку». Они выделяют в окружающую
среду не только конечные продукты обмена, но и некоторые про-
межуточные метаболиты, например аминокислоты; гидролитиче-
ские ферменты вновь могут вовлекаться в метаболизм. Они имеют
практическую ценность.
КАТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ. РОЛЬ О2
В МЕТАБОЛИЗМЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Охарактеризуем главные функции молекулярного кислорода,
который стал фактором, разделившим живые существа на две
неравные части: анаэробы (их немного) и аэробы (огромное ко-
личество).
По современным представлениям, функции молекулярного кис-
лорода далеко не ограничены его ролью терминального акцептора
электронов. Для аэробов О2 служит еще субстратом для боль-
шого класса ферментов, известных как оксигеназы. Эти ферменты
включают молекулярный кислород в различные органические мо-
12
лекулы с образованием продуктов, которые затем легко вовле-
каются в центральные метаболические процессы. Например, после
включения О2 в такие субстраты, как алканы, циклоалканы, аро-
матические углеводороды и многочисленные родственные соеди-
нения, начинается их микробная деградация. Оксигеназные реак-
ции аэробов анаэробы замещают реакциями гидроксилирования:
комбинация дегидрогенирования и гидратации; так, например,
происходит синтез малата из сукцината в ЦТК (цикле трикарбо-
новых кислот).
Вообще, почти все катаболические и анаболические реакции
в организмах происходят главным образом в анаэробных услови-
ях, и прямое вовлечение молекулярного кислорода в метаболи-
ческий процесс — исключение. Ниже показаны три такие исклю-
чительные О2-зависимые ступени, которые осуществляют только
аэробные формы:
ацетил-СоА
сквален каротиноиды олеиновая кислота} анаэробы
аэробы <
2
стеролы эпоксиксанто-
филы
арахидоновая
кислота
В анаболических реакциях О2 не может быть заменен другим
соединением. Поэтому анаэробы не синтезируют стеролы, эпокси-
ксантофилы, а их жирные кислоты содержат не более одной двой-
ной связи. Известно, что процессы восстановления О2, которые
протекают в живых клетках, приводят к образованию трех раз-
личных продуктов: Н2О (больше всего), Н2О2 и О2~, из которых
два последних токсичны, а в реакциях, приведенных ниже, дают
еще более токсичные, чем они сами, вещества: синглетный кис-
лород (О’) и гидроксильный радикал (ОН*):
О? + Н2О2 ОН’ + О2 + Н2О О?—супероксидный радикал
ОН' + О2 “>О’ + ОН ОН’—гидроксильный радикал
О—синглетный кислород
Синглетный кислород1 (0‘) вызывает разрушение клеточных
мембран и даже гибель клеток. Недавно показано, что О2~ и Н2О2
образуются при функционировании дыхательной цепи Brevibac-
terium flavum, при этом уменьшается Дцн+ и фосфорилирую-
щая активность мембран. Для удаления О2“ и Н2О2 у аэробных и
1 Обычный кислород (триплетный) — бирадикал. Молекула О2 содержит два
неспаренных электрона, тогда как в синглетном кислороде, более богатом
энергией, спины этих двух электронов антипараллельны (спарены).
13
аэротолерантных анаэробных форм выработаны такие ферменты,
как супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза, под действием ко-
торых происходят реакции, избавляющие клетки от вредных ве-
ществ:
ог+ОГ+2Н+ н,о2+О2,
Н2О3 н2О + 1 /2О2.
Каталаза может быть заменена пероксидазой:
ХН2 + Н2О2 х + 2На0
Оксигеназы аэробов, включающие О2 в органические молеку-
лы, позволяют избежать опасности образования свободных реак-
тивных форм О2. Облигатные анаэробы очень богаты рибофла-
вином, который реагирует с молекулярным О2 с образованием
Н2О2 и О2~, и если при этом отсутствует СОД или ее содержание
в клетках недостаточно, то это может служить причиной высокой
чувствительности анаэробов к молекулярному кислороду. В на-
стоящее время считают, что в небольшом количестве кислород,
требуется всем или почти всем организмам.
Категории организмов в связи
с отношением к кислороду
1. Анаэробы — не могут использовать О2
облигатные — не могут расти в присутствии О2,
оксидуриковые — не убиваются кислородом,
оксилабильные — убиваются кислородом,
аэротолерантные — могут расти в присутствии О2,
но не используют его.
2. Аэробы — могут использовать О2 как источник энергии в-
метаболизме
облигатные — не могут расти без О2,
эриоксиковые (факультативные) — могут расти без О2,
микроаэрофилы — лучше растут при концентрации О2 бо-
лее низкой, чем атмосферная.
Некоторые облигатные анаэробы могут расти при низком давле-
нии О2 в окружающей среде, поглощая О2. Более того, с одним
из не самых строгих анаэробов, живущих в желудке жвачных,,
Selenomonas ruminantium было показано, что постоянная под-
кормка кислородом в пределах давлений 0—35 мм ртутного стол-
ба способствовала росту и брожению, но при давлении 36,7 мм
ртутного столба клетки вымывались, как полагают, за счет того,
что О2 уводил электроны из биосинтетических путей. Даже среди
оксилабильных метаногенных бактерий, которые убиваются кис-
лородом, был обнаружен аэротолерантный штамм.
14
КАТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
ГЛАВНЫЕ ТИПЫ
МИКРОБНОГО МЕТАБОЛИЗМА
У бактерий главных типов метаболизма 4 или 5: бродильный,
дыхательный (аэробное и анаэробное дыхание), метаногенный и
фотометаболизм (при наличии света).
Тип метаболизма определяется главным образом энергетикой
микроба, поэтому условно эти типы можно различать в связи с
их катаболическими особенностями. Для нас такой способ раз-
деления удобен тем, что в дальнейшем будут рассмотрены в ос-
новном способы получения продуктов энергетического метабо-
лизма.
Таблица 2
Основные типы метаболизма у микроорганизмов
Тип
метаболизма
Источник энергии
Источник углерода
Питательный тип
Бродильный
.Дыхательный
.Метаногенный
Фототроф ный
органическое вещество
органическое вещество
неорганическое вещест-
во
органическое вещество
неорганическое вещест-
во Н2
радиация
органическое вещество
органическое вещество
СО2
органическое вещество
СО2
органическое вещество
СО2
органотрофы
органотрофы
автотрофы
органотрофы
автотрофы
фотоорганотрофы
фотоавтотрофы
В случае бродильного типа источником энергии и углерода
служат частично окисленные органические вещества, следователь-
но «бродильщики»-хемоорганотрофы (табл. 2). В случае трех
других названных типов метаболизма бактерии могут использо-
вать как органические, так и неорганические вещества в качестве
источников энергии и углерода. Поэтому среди них имеются ор-
ганотрофы, литотрофы и фототрофы (см. табл. 2). У эукариотных
микроорганизмов известны брожение, аэробное дыхание и фото-
синтез. Бактерии располагают не только большим, чем эукариоты,
числом типов метаболизма, но в каждом из своих метаболических
типов они имеют еще несколько (или много) вариаций. Специ-
альная подготовка субстрата с последующим извлечением части
или всей содержащейся в нем энергии производится в процессе
гликолиза (или др. путем). Ферменты гликолиза есть в клетках
всех живых организмов, он относится к одному из самых древних
метаболических путей, но у бактерий наряду с гликолитическим
расщеплением углеводов может происходить их расщепление по
пути Энтнера-Дудорова (КДФК-пути, рис. 2) или по одному из
двух фосфокетолазных путей (рис. 3, 4).
15
глюкоза
L—АТФ
N-АДФ
глюк озо* 6-фосфат
НАДФ
НАДФН+Н
D- глю коно-6 - лак тон-6- фосфат
I
н9о
Jg2+
Н Н ОН Н
соон
он он н он
6-фосфо- D- гл юконат
6-фосфо-0-глюконат-гидро-лиаза Fe2+
фосфо гл юконат-де гидратаза < u
2
Н Н
С—с—с—-с—соон
он он н он
Н Н
о * *
(ф)ОСН„—с—С—СНО—со—соон
ОН он
3-дезокси-2-кето-6-фосфо-О-глюконовая кислота
сн3сосоон
пировиноградная
кислота
сщсосоон
о
пировиноградная
кислота
Суммарная реакция:
С6Н^2О6+АДФ4-Ф^ + 2НАД(Ф)~~^-2СН3СОСООН+АТФ + 2НАД (Ф) -Н + 2Н++Н2О
глюкоза пировиноградная кислота
Рис, 2. Сбраживание глюкозы по пути Энтнера-Дудорова
этанол
ацетальдегид
*-NAD
7
4---NADH-
ацетил-СоА
СоА----' 6
СН,—СО—ОРО,Н,
f---NAD
2
<~^NADH9
6-(P)* глюконат
Н3Р04 ->
---NAD
3
^NADH9
1'
рибулозо-5-( P
|4
CH OH
1 fcfc
c=o
HO—c—H
H—C—OH
I
сн9—о—(p)
ксилулозо-5-f P )
гл и цера л ьдеги д -3-
Гис. 3. Пентозный фосфокетолазный путь (гетероферментативное молочнокис-
лое брожение). В результате действия фосфокетолазы ксилулозо-5-фосфат рас-
щепляется на двух- и трехуглеродное соединение с последующим образованием
из них соответственно ацетата (или этанола) и лактата
2 глюкоза
эритрозо-4-
глицеральдегид-3-f р
ADP
ATP
ацетат
ксилулозо-5-( Р
2P.
2 NAD
2 лактат
рибулозо-5-( P
|б
2 глицеральдегид-3-( р
2 NADH
ксилулозо-5-{ Р
Рис, 4, Гексозный фосфокетолазный путь (комбинация обоих вариантов пен*
тозного и пентозофосфокетолазного путей; предполагается у Acetobacter xyli-
пит и Bifidobacterium.
1 гексокиназа и глюкозо-6-фосфат-изомераза, 2 — фруктозо-6-фосфат-фос-
фокетолаза, 3 — трансальдолаза, 4 — транскетолаза, 5 — рибозо-5-фосфат-
изомераза, 6 рибулозо-5-фосфат-З-эпимераза, 7 — ксилулозо-5-фосфат-фос-
фокетолаза, 8 ацетаткиназа, 9 — ферменты гомоферментативного молочно-
кислого брожения
У бактерий насчитывается более 30 различных брожений (глав-
ные приведены в табл. 3). Наряду с аэробным имеется несколько
способов анаэробного дыхания.
Таблица 3
Главные классы брожений углеводов
(по Stanier et al., 1966)
Класс брожений
- -
Спиртовое
Молочнокислое (гомо-
ферментат ивное)
Г етероферментативное
молочнокислое бро-
жение
Смешанное брожение
Бутиленгл иколевое
Маслянокислое
Б у та но л- ацетоновое
Пропионовокислое
Главные продукты из гексоз-
ных сахаров
этанол (СН3—СН2ОН), СО2
молочная кислота
(СНз—СНОН—СООН)
молочная кислота, этанол,
со2
молочная к ислота, этанол,
уксусная кислота, Н2 и СО2
или муравьиная [кислота
(НСООН)
сходно со смешанным броже-
нием, но включает учце 2,3-
бут иленгликоль
(СНз—СНОН—СНОН-СН3)
масляная к ислота,
(СН3—СНа— СНо^СООН)
уксусная кислота
На, со2, бутанол,
(СН3-СН2- СН2- СН2ОН)
этанол, ацетон (СН3СОСЙ3),
изопропиловый спирт
(СН3—СНОН—СН3)
пропионовая кислота,
(СН3-СН2-СООН) уксус-
ная кислота, СО2
Возбудитель брожения
дрожжи Sacch. cerevisiae
молочнокислые бактерии, не-
которые простейшие и грибы,,
ткани млекопитающих
некоторые молочнокислые
бактерии, например род Leu-
conostoc
группа кол и-дезентер ийной-
тифозной палочки (Е. coll)
некоторые Pseudomonas
род Aerobacter и родственные
формы
некоторые псевдомонады
некоторые анаэробные бакте-
рии (например Clostridium),
Вас. macerans, некоторые
анаэробные простейшие
клостридил
Propionibacterium и родствен-
ные анаэробные бактерии
У цианобактерий и прохлорофита работает оксигенный фото-
синтез, у зеленых и пурпурных бактерий — аноксигенный фото-
синтез, а у галобактерий — фотохимическое превращение света
с участием бактериородопсина (а не бактериохлорофилла). Ме-
таболизм галобактерий относится к дыхательному типу. Фото-
химическое превращение света происходит в условиях недостатка
кислорода.
Только у бактерий существует своеобразный метаболический
тип, называемый метаногенезом.
Почти все эукариоты — аэробы, осуществляющие дыхание или
оксигенный (с выделением Ог) фотосинтез. Лишь некоторые про-
стейшие и дрожжи могут получать энергию, осуществляя спир-
товое брожение. Однако считают, что главным способом жизни
19
дрожжей является аэробное дыхание, а брожение — это лишь
способ перенесения неблагоприятных условий (отсутствие Ог).
В анаэробных условиях дрожжи не способны синтезировать не-
насыщенные жирные кислоты и стеролы, образуются дегенера-
тивные митохондрии — промитохондрии, в которых нет крист,
электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) и отсутствует окислитель-
ное фосфорилирование. При появлении кислорода структурная
и функциональная целостность митохондрий восстанавливается и
эти наблюдения поддерживают точку зрения о том, что нормаль-
ный метаболический тип дрожжей связан с аэробным дыханием.
органические
вещества
интермедиаты
брожение
органические
кислоты и
родственные
соединения
анаэробное дыхание
аэробное дыхание
т
ацетат,
формиат,
СО2'Н2
метаногенез
СН4
Рмс. 5. Центральные реакции микробного метаболизма (по Gibson, 1980). X —
акцептор электронов
Схематическое изображение общих принципов микробного ме-
таболизма дано на рис. 5. Видно, что главная роль в метаболизме
принадлежит окислительно-восстановительным реакциям. Типы
реакций зависят от окружающих условий. Так в анаэробных ус-
ловиях происходят брожения, метаногенез и анаэробное дыхание.
На свету возможен фотометаболизм. В аэробных условиях имеет
место аэробное дыхание. В природе все типы метаболизма тесно
связаны. Полное разложение органического вещества в строго
анаэробных условиях может завершиться метаногенезом или (при
наличии SO4 или МОз“) образованием восстановленных соедине-
ний серы или азота.
20
В аэробных условиях роль конечного акцептора электронов
выполняет молекулярный кислород, который восстанавливается
до воды. Большая часть микроорганизмов, включая бактерии,
осуществляет аэробное дыхание.
БРОДИЛЬНЫЙ тип метаболизма
Характеристика брожения. Брожениями называют биологиче-
ские процессы, которые происходят в темноте и в которые не во-
влекаются дыхательные цепи с кислородом или другими внеш-
ними акцепторами электронов. Так считали 10 лет тому назад.
Теперь требуется сделать некоторую поправку к такому опреде-
лению, потому что короткие дыхательные цепи и внешние акцеп-
торы электронов иногда могут вовлекаться в брожения. Но в це-
лом брожение зависит от способности органических соединений
служить акцепторами электронов, поэтому восстановленные ак-
цепторы выступают конечными продуктами процесса:
АвосСТ 4~ Бокисл Аокисл Т" Бвосст»
ADP АТР
Pi
где Авосст — донор; Бокисл акцептор.
Это наиболее древний способ существования у бактерий.
Для брожений типично: участие не связанных с мембранными
структурами ферментов, неполное окисление исходного субстрата,
образование недоокисленных конечных продуктов, многие из ко-
торых имеют коммерческую ценность. Использование большего
количества субстрата для получения того же количества АТР, что
и в других процессах.
АТР в брожении у большей части облигатных анаэробов об-
разуется в процессе субстратного фосфорилирования, который
состоит в присоединении фосфора к веществу, окисляемому в эн-
зиматической реакции с последующим образованием энергетиче-
ски богатой фосфатной связи в окисленном продукте.
Чтобы быть сброженным, вещество должно образовывать окис-
ленные и восстановленные интермедиаты, т. е. оно должно быть
не очень окисленным и не слишком восстановленным. Этому тре-
бованию прекрасно соответствуют углеводы, хотя некоторые бак-
терии сбраживают различные органические кислоты, аминокис-
лоты, пурины, пиримидины. Углеводы хорошо утилизируются, мо-
гут обеспечить скелеты для синтеза аминокислот, удобны для
сохранения энергии: образуемые из них нерастворимые полиме-
ры — крахмал и гликоген — могут аккумулироваться, не оказы-
вая влияние на осмотическое давление клетки.
21
Подготовительный этап — гликолиз,. Большей части брожений^
предшествует расщепление гексоз по фруктозодифосфатному (гли- ’
колитическому) пути, или пути Эмбдена-Мейергоффа-Парнаса '
(Э-М-П). Он может происходить как в аэробных, так и в ана-
эробных условиях. Меньшее распространение, и только среди
бактерий имеют путь Энтнера-Дудорова и фосфокетолазные пути
с их незначительными вариациями у различных видов.
В общих чертах гликолиз можно изобразить так:
глюкоза
<-2АДР
1,6-фруктозодифосфат
-+4АТР
,4 [Н]
2 пирувата
собственно
гликолиз
Гликолиз слагается из девяти последовательных ферментатив-
ных реакций (рис. 6), в результате которых глюкоза оказывается,
расщепленной на две молекулы пировиноградной кислоты.
В общем виде реакция выглядит следующим образом:
глюкоза + 2ADP + 2NAD + 2Н3РО4->-
~+2 пирувата + 2NADH + 2АТР + 2Н+
Как видно из уравнения, при гликолизе образуется 2М АТР^
которых хватает для синтеза 10,5 мг сухих клеток. Лишь гомо-
ферментативные молочнокислые бактерии черпают всю энергию
только в процессе гликолиза. Для других организмов гликолиз —
это подготовительный этап к дыханию (для аэробов) или к бро-
жению (для анаэробов-бродильщиков), дающих большой (в слу-
чае дыхания) дополнительный выход энергии и нужных клетке
строительных блоков, поэтому гликолиз, как и ЦТК, относят к
амфиболическим путям.
Собственно брожение. Возвращаясь к вышеприведенному урав-
нению гликолиза, мы видим, что водород, отнятый при дегидро-
генизации глицеральдегид-3-фосфата, переносится на дегидроге-
назы, коферментом которых служит NAD \ Поскольку в клетках
существует ограниченное количество молекул NAD, то должна
постоянно происходить его регенерация из NADH : NAD^>NADH.
У аэробных микроорганизмов (как и у большинства клеток
животных), осуществляющих аэробное дыхание, NADH через пе-
реносчики дыхательной цепи передает водород (точнее, электрон
и протон) на молекулярный кислород с образованием воды, так
1 Нз не выделяется в свободном виде в атмосферу, в частности потому, что
его концентрация в атмосфере относительно низка, в 40 тыс. раз ниже, чем
концентрация Ог. Поэтому улавливание Н2 было бы очень затруднительным.
В противоположность Нг свободный Ог выделяется в атмосферу, а потом
снова возвращается в биосферу в процессе дыхания.
22
ATP
ATP
2х
глюкоза
гпюкозо-6-фосфат
фруктоза-6-фосфат
фруктозо-1,6-бис фосфат I
гл и це р а л ьде гид- 3-фосфат
*-2 NADH
2х
1,3-бисфосфоглицерат
^2 АТР
2х
3-фосфо глицерат
2х
2-фосфоглицерат
яашмнпкмйамюжшмяяМхмвмйамвиткп
2 АТР
(D
и 1»тл1'^1тжч||
фосфоенолпируват
Рис, 6. Промежуточные продукты гликолиза. Каждая из пронумерованных ре-
акций катализируется особым ферментом. На этапе 4 шест и углеродный сахар
расщепляется, давая два трехуглеродных сахара, так что после этой реакции
число молекул на каждом этапе удваивается. Реакции 5 и 6 .ответственны за
суммарный синтез АТР и NADH
что проблемы с регенерацией (реокислением) NADH у них нет.
У фототрофных бактерий водород, фиксированный в NADH2, в
дальнейшем используется для восстановления СО2 (и иногда Ns)
до уровня углеводов (СН2О)Л.
Проблема есть у анаэробов, которые должны синтезировать
молекулы — акцепторы водорода для регенерации
NAD. Поэтому в разных брожениях, которые продолжают гли-
глюкоза-----........2пирувата
2NAD* 2NADH
Рис. 8.
Объяснения в тексте
субстрат
интермедиат (+Н )
!
продукт
2пирувата
4Fd
окисл
2NADH
2ацетиЛ'СоА
4Fd• +4Н
восст
2NAD
4Fd
восст
2ацетил-СоА+2СО
бутират
4Fd^w +2Н,
окисл z
Рис. 7.
Объяснения в тексте
колиз, только 1—2 реакции служат для получения энергии, а все
остальное нагромождение реакций связано с наработкой акцеп-
торов водорода, и энергетические реакции утопают в реакциях,
непосредственно не относящихся к образованию АТР.
Типы брожений. 1. Во многих случаях акцепторы электронов
образуются из субстрата в неразветвленных путях. К таким ти-
гомоферментативное молоч-
пам брожений относится спиртовое,
нокислое, в которых (рис. 7) реакции дегидрогенирования и гид-
рогенирования сопряжены с NAD/NADH-циклом. 2. Особый тип
этих реакций представляет маслянокислое брожение, которое осу-
ществляют сахаролитические клостридии (рис. 8). У них окисле-
ние пирувата до ацетил-СоА и СО2; сопряжено с восстановлением
ферредоксина, который далее восстанавливает протоны до молеку-
лярного водорода. 3. У пептолитических клостридий известен дру-
гой вариант реакций — реакции Стикланда, в которых исполь-
зуется внешний акцептор электронов. Например, аланин окисля-
ется через пируват до ацетата, СО2 и аммония, а вторая амино-
кислота — глицин — восстанавливается, давая ацетат и амоний
(рис. 9). 4. Известно брожение, в котором имеет место комбина-
ция этих реакций: электроны могут частично переноситься между
внутриклеточными метаболитами, а частично к электронному ак-
цептору, который может использовать данная клетка. Например^
Cl. Kluyverii сбраживает этанол и ацетат с образованием бути-
24
субстрат i субстрат 2
(донорУ1 (акцептор)
Рис. 10. Объяснения в тексте
рата, капроата и Н2. Один этанол не используется этим организ-
мом, а отношения между кислотами варьируют (рис. 10). 5. Воз-
можным вариантом электронного потока рассматривают их пе-
ренос на протоны; при этом образуется Н2. Это имеет место, на-
пример, у Desulfobrio (рис. 11) при низких концентрациях суль-
фата. Очень немногие субстраты имеют достаточно отрицательный
электрохимический потенциал, чтобы переносить электроны на
протоны, поэтому выделение Н2 во многих случаях происходит
очень слабо. Но образованию Н2 может благоприятствовать очень
низкое парциальное давление Н2 в культуре. Снижение давления
Н2 до 10-3 бар эквивалентно из-
менению свободной энергии в
17 кДж на 1 моль образованно- ।
го Н2 (рис. 12). Если организм j
выделяет Н2, то для него очень j
выгоден симбиоз с другим орга- ]
низмом, который активно потре-
бляет Н2 в экзоорганической ре-
акции, как показано на рис. 12.
Известно множество таких меж-
видовых переносов водорода. На-
пример, Ruminococcus albus сбра-
живает глюкозу в этанол, ацетат
и Н2 вместе с Vibrio succinoge*
Рис. 12. Изменение свободной энергии
в зависимости от парциального давле-
ния водорода,
ties, который подхватывает Н2 и восстанавливает им фумарат до
сукцината. 6. Но не все клостридии могут выделять Н2, потому
что у них нет гидрогеназы. Так, у CL therrnoaceticum и Cl. for mi*
coaceticum гексозы окисляются в ацетат и СО2, а электроны ис-
пользуются для восстановления СО2 до ацетата. В результате
образуются 3 моля ацетата/1 моль глюкозы (см. ниже). Восста-
новление СО2 — обязательная ступень для этих клостридий, так
как они не способны к образованию лактата или этанола или
бутирата из ацетил-СоА.
1. С6Н12О6 + 2Н2;О~^2СН3СОО-+2НСО3 + 4Н2 AG0-—206 кДж.
2. 2НСО3 +4Н2:+Нф^СН3СОО +4Н2О Аб7°=1О5 кДж.
гексоза—>-3 ацетата
Это ацетатное брожение Cl, therrnoaceticum. 7. Образование фор-
миата бактериями в энергетическом отношении сравнимо с об-
разованием Н2. Редокс-потенциал формиат/СО2 — 432 мВ, а ре-
докс-потенциал Н2:--420 мВ, т. е. очень близки.
Виды, принадлежащие к родам Schigella и Erwinia, образуют
значительные количества формиата, Е. coli и Enterobacter aeroge*
26
nes имеют формиатгидрогенлиазу и в анаэробных условиях рас-
щепляют формиат на СО2 и Н2, а продукция Н2 или формиата
увеличивает снабжение организма энергией, так как образуются
менее восстановленные конечные продукты и больше энергии ока-
зывается доступной для организма.
Брожения, сопряженные с электронным транспортным фосфо-
рилированием. Некоторые факультативные и облигатные анаэро-
бы в качестве акцепторов электронов используют неорганические
соединения (NO3” ) или фумарат. Фермент фумаратредуктаза свя-
зан с мембраной у ряда организмов и ассоциирован с редокс-пе-
реносчиками, такими как цитохромы типа в, и менахинонами.
Пара фумарат/сукцинат имеет стандартный редокс-потенциал
+ 33 мВ, и по крайней мере на 200 мВ больше, чем у большин-
ства других редокс-пар в метаболизме. Поэтому фумарат служит
удобным акцептором Н2 в анаэробном метаболизме, а образую-
щейся энергии оказывается достаточно, чтобы генерировать 1 моль
ATP/моль восстановленного фумарата. Это восстановление осо-
бенно важно для тех случаев, где фосфорилирование на уровне
субстрата невозможно, как в случае гидрогенирования СО2 до
СН4 или уксусной кислоты. Даже в тех случаях, когда перенос
электронов к фумарату или нитрату или другим акцепторам не
сопряжен с образованием АТР, эти реакции могут давать орга-
низму энергетическое преимущество. Например, диссимиляцион-
ная нитратредуктаза Cl, perfringens не связана с окислительным
фосфорилированием. Но нитраты увеличивают рост этого орга-
низма, так как среди конечных продуктов происходит сдвиг в
пользу ацетата, менее восстановленного, чем бутират. Ацетил-СоА,
вместо того чтобы конденсироваться с образованием бутирата,
становится доступным для образования дополнительного АТР че-
рез образование ацетил-Р.
Двухфазность брожений. Теорию брожений изучал академик
В. Н. Шапошников, и ему принадлежит открытие двухфазности
бактериальных брожений. Сущность ее состоит в том, что в пер-
вую фазу активно протекающие биосинтетические процессы тре-
буют в больших количествах восстановительных потенциалов. Сле-
довательно, первая фаза характеризуется интенсивным размно-
жением клеток и образованием окисленных продуктов брожения.
По мере затухания биосинтетических процессов акцепторами
водорода начинают выступать недоокисленные продукты броже-
ния, которые при этом восстанавливаются.
Значит, вторая фаза брожений — это торможение анаболиче-
ских процессов и образование восстановленных продуктов. Откры-
тие было сделано на ацетоно-бутиловом брожении, в первой фазе
которого образуется уксусная, масляная кислота, СО2, а во вто-
рой — ацетон и бутанол (см. рис. 45).
Бактерии, вызывающие брожение. Это прежде всего бактерии
рода Clostridium, Bacteroides ruminicola и другие, живущие в ки-
шечном тракте жвачных животных, ацетогенные бактерии; все
они не способны к использованию О2 как терминального акцеп-
тора электронов.
Брожение вызывают факультативные анаэробы: пропионово-
кислые, молочнокислые бактерии, бифидобактерии, а также мно-
гие факультативные аэробы и даже настоящие аэробы (например,,
нитрат или нитритредуцирующие бактерии), хотя для них бро-
жение не есть главный способ жизни и они полностью экипиро-
ваны для аэробного метаболизма.
Для облигатных анаэробов характерны некоторые биохимиче-
ские реакции. К ним, в частности, относится:
1. Своеобразный способ фиксации СО2 при участии восстанов-
ленного ферредоксина:
а 1 восстановленный _______ < а
ацетил-СоА 4~ СО2-----------------*—пируват 4“ СоА,
ферредоксин
/лл 1 Г'гл восстановленный л „ _ „ < <
сукцинил-СоА 4- СО2-------------------->• а-кетоглутарат 4- СоА.
ферредоксин
(Те же реакции осуществляют анаэробные зеленые фототрофные
бактерии.)
2. Другая характерная реакция облигатных анаэробов — вос-
становление СО2 до формиата. При этом донором электронов мо-
жет выступать восстановленный ферредоксин (С/, pasteriannum),
NADPH (С/. thermoaceticum) или вещество неизвестной структу-
ры (Cl. formicoaceticum).
3. Полного цикла ЦТК облигатные анаэробы не имеют, но
есть отдельные реакции, направленные на синтез глутамата, на-
пример в мембранах некоторых облигатных анаэробов содержит-
ся короткая ЭТЦ:
Н2
2е~ у ЦИТОХрОМ Ь MX
лактат
NADH
фумарат редуктаза
х—неизвестный переносчик.
Перенос электронов по ЭТЦ сопровождается окислительным
фосфорилированием, т. е. дополнительным выходом АТР по отно-
шению к субстратному фосфорилированию. Например, окисли-
тельное фосфорилирование осуществляют типичные бродильщики
Cl. aceticum, Acetobacter woodii, катализируя реакцию:
4Н24~2СО2—>СН3—СООН-у2Н2О, а также Vibrio succinogenes
и Wolinella succinogenes в реакции:
СООН—СН=СН—СООН + Н, ^-ма-рат- СООН—СН,—СН2—
редуктаза з
—СООН (сукцинат).
Поэтому те организмы, которые сбраживают углеводы в янтар-
ную, пропионовую, уксусную кислоты и СО2, дают необычайно
большую биомассу по сравнению, например, с молочнокислыми
бактериями. Так, Propionibacterium freudenreichii образует до
65 г сухой биомассы на 1 моль глюкозы, Selenomonas ruminan-
28
Hum — 62, Bacteroides fradtlis — 50, а молочнокислые бактерии
только 15—30 г/моль глюкозы.
Распространение в природе. Облигатные и аэротолерантные*
анаэробы, осуществляющие брожение, живут в кишечном тракте
животных, в грязях, компостах и в воздушной пыли в виде спор.
В естественных условиях облигатные анаэробы могут долгое
время существовать, а в чистой культуре очень чувствительны к
кислороду. Это объясняется тем, что в природе анаэробы живут
в микробных комплексах, которые включают в себя утилизирую-
щие О2 формы.
В силу неполного извлечения энергии из субстрата бродиль-
щики должны перерабатывать огромные количества субстратов,
поэтому в природе чаще встречаются бродильные процессы, ко-
торые сопровождаются большой мощностью, т. е. выделением
максимально высокого количества АТР, — это пропионовокислое,,
маслянокислое и ацетогенное брожение (см. выше). Спиртовое и
молочнокислое брожение дают мало энергии (2 моля АТР). По-
этому в природе среди природных метаболитов чаще других об-
наруживаются пропионовая и уксусная кислоты.
У аэробных организмов нет субстратной проблемы. Они извле-
кают 38 молей ATP/моль гексозы и их существование в большей
мере ограничивают питательные вещества, чем энергетические
субстраты. Еще в меньшей степени селекция максимальной мощ-
ности процесса относится к фототрофам, поскольку они имеют
энергию в достаточном количестве.
Практическое применение
Бродильный тип метаболизма осуществляют облигатные ана-
эробы — клостридии и аэротолерантные анаэробы. Этот тип ме-
таболизма характеризуется малым выходом энергии и биомассы:
(есть исключения, см. выше), большим образованием недоокис-
ленных продуктов и сбраживанием больших количеств субстрата.
Брожение — это такой тип метаболизма, при котором орга-
низм получает больше шансов на выживание не за счет накоп-
ления максимального урожая клеток, но за счет образования жиз-
неспособных клеток (количество биомассы меньше, чем при дру-
гих типах метаболизма). Для сохранения жизнеспособности и ро-
ста клеток важно создание условий, допускающих экскрецию ме-
таболитов. Такие условия одновременно позволяют получать на
практике стабильные и воспроизводимые выходы продуктов и не
ведут к дегенерации штамма. Целый ряд брожений используют
в промышленности для получения соответствующих целевых про-
дуктов.
Путем ферментации в промышленности получают сырье: эти-
ловый спирт, ацетон, бутанол, имеются промышленные разработ-
ки для производства глицерина, 2,3-бутандиола и др. Среди выде-
ляемых продуктов чаще всего встречаются органические кислоты
и наиболее важные продукты бактериальных брожений — молоч-
ная, муравьиная, уксусная, пропионовая, масляная и янтарная..
29
Анаэробные процессы имеют преимущество перед аэробными 1
для промышленных производств, поскольку не требуют дорого- |
стоящей стадии аэрации, при них выделяется меньше тепла и, I
следовательно, идет меньше затрат на отвод тепла. Анаэробные 1
микроорганизмы используют для обработки сточных вод. В по- |
следнее время открыты новые анаэробные реакции, которые могут
быть использованы на практике. Известна анаэробная деграда- '
ция галогенированных алканов ароматических веществ. Приме- j
чательно, что вещества, которые противостоят аэробному разло- j
жению, подвержены дегалогенирированию в восстановительной
реакции в отсутствие О2. Это важно для анаэробного разложения ;
гексахлорциклогексана, дихлоробензоата, тетрахлорэтилена и об-
разования монохлорбензола из трихлорбензола.
Анаэробные процессы давно применяют для получения многих
пищевых продуктов: сыра, йогурта, вина, пива.
Их используют также для изготовления и консервации кормов
(в силосовании используют молочнокислые бактерии).
ДЫХАТЕЛЬНЫЙ тип метаболизма
Дыхательный тип метаболизма — наиболее распространенный
способ жизни микробов. Это относится к микроорганизмам с
аэробным дыханием и не относится к десульфатирующим бакте-
риям, которые составляют небольшую эволюционно древнюю
группу. Аэробные бактерии — эволюционно наиболее молодая
группа.
Схематично дыхательный метаболизм можно изобразить сле-
дующим образом:
СО2
глюкоза пируват
Н2О, О2—терминальный акцептор (аэробное
НАДН Дыхательная цепь. j дыхание)
иной, чем О3 акцептор (анаэробное дыхание) j
Характеристика дыхания. Дыхание органотрофов начинается
с цикла лимонной кислоты (цикла трикарбоновых кислот — ЦТК,
цикла Кребса), в котором происходит полное окисление ацетата
(в виде ацетил-СоА), образованного из конечного продукта гли-
колиза — пировиноградной кислоты. Завершается дыхание окис-
лительным фосфорилированием] в дыхательной цепи.
Окислительное (и фотосинтетическое) фосфорилирование —
мембранно-связанный процесс, который включает серию последо-
вательных окислительно-восстановительных реакций, связанных с
рядом пространственно организованных редокс-переносчиков (ды-
хательная цепь, фотосинтетическая цепь переноса электронов).
Ковалентных, богатых энергией интермедиатов в обоих про-
30
цессах не образуется и перенос энергии между редокс-системами
и энзимным комплексом, ответственным за синтез АТР, происхо-
дит через энергизованные
ский градиент Н+(Др +):
протоны, образующие электрохимиче-
Рис. 13а.
Перенос электронов (ё) сопровождается выбросом Н+ наружу
через заряжающие протонные помпы рис. 13 а (1, 2, 3). При} этом
используется энергия электронов, переходящих на более низкие
энергетические уровни.
Поскольку мембрана плохо проницаема для Н+, образуется
трансмембранный электрохимический градиент протонов. Этот
градиент обусловливает перемещение Н+ в обратном направлении
через протонные помпы, разряжающие мембрану. Разряжающая
протонная помпа представлена ферментным комплексом, катали-
зирующим образование АТР из ADP и Р^.
За счет осуществляются и другие мембранные энерго-
зависимые реакции, например обратный транспорт электронов,
движение клеток и некоторые виды транспорта веществ. Поэтому
аэробы должны быть обеспечены нужным уровнем кислорода.
В дыхании имеет место высокий выход свободной энергии, и
при окислении 1 моля глюкозы образуется до 38 молей АТР.
Дыхательный тип свойствен большей части хемогетеротрофов,
всем хемолитотрофам и некоторым факультативным фототрофам.
Цикл трикарбоновых кислот. Различают две фазы дыхания:
I — ЦТК и II — дыхательная цепь:
пируват -> СО3
NAD -> NADH,
&
i, цтк
NADHj-^-NAD | ц, дыхательная цепь
ЦТК (рис. 13) называют камерой сгорания, в которой могут
сгорать не всякие вещества, а только те, которые служат или мо-
гут превратиться в интермедиаты ЦТК. В результате одного обо-
рота ЦТК суммарная реакция выглядит как: ацетат + оксалаце-
тат —> 2СО2 4- оксалацетат или еще более упрощенно: ацетат->
Ь->2СО2. Оксалацетат, играя как бы каталитическую роль, подво-
дит «под нож» ацетил-СоА, а после того как ацетатный компо-
нент окислен, он принимает на себя новую молекулу ацетил-СоА.
NAD
пируват
зс
NADH +
NAD
l NADH + К-*
малат
*
фумарат
FAD
.-ADH9
4С
4С
ацетил-СоА
4С
оксалоацетат
2С
цитрат
со2
6С
изоцитрат
6С
NAD
*-NADH + Н+
сукцинат
GTP
GDP
сукцинил-СоА
2-оксоглуТарат
СО
NAP
NADH + Н
5С
.Рис. 13. Цикл трикарбоновых кислот. Ацетогруппы, образованное из пирувата,
подвергаются дальнейшему окислению. Атом углерода ацетильной группы пре-
вращается в СО2, водородные же атомы переносятся к молекулам-переносчикам
NAD+ и FAD. Дополнительные атомы кислорода и водорода включаются в
цикл в виде молекул, воды на стадиях, отмеченных звездочками (•&)
Химическое окисление ацетильной группы осуществляется с
трудом, и, видимо, поэтому природа изобрела элегантный катали-
тический цикл — цикл лимонной кислоты.
ЦТК служит не только механизмом окисления жиров, амино-
кислот и углеводов; он обеспечивает предшественниками процес-
сы биосинтеза: а-кетоглутаровая кислота аминируется с образо-
ванием глутаминовой, янтарная кислота служит предшественни-
ком тетрапирролов, из щавелевоуксусной образуется аспарагино-
вая кислота. Поэтому ЦТК относят к амфиболическим путям.
Анаплеротические пути ЦТК. В связи с возможной утечкой
интермедиатов существуют пути их восполнения, или анаплеро-
32
тические пути. У бактерий и грибов имеются ферменты изоцит-
ратлиаза и малатсинтаза, не обнаруженные у животных. Эти фер-
менты участвуют в глиоксилатном цикле (и шунте), который слу-
жит для образования янтарной и яблочной кислот.
ИЗО лимонная изоцитрат
кислота лиаза
глиоксиловая кислота
янтарная кислота
уксусная f глиоксиловая малат яблочная
кислота кислота синтаза кислота
Глиоксилатный шунт пересекает ЦТК на уровне изоцитрата
и яблочной кислоты. Глиоксилатный цикл работает у микроор-
ганизмов, растущих за счет уксусной кислоты:
сукцинат
t
цитрат —изоцитрат —5------> глиоксилат
ацетил-СоА -> -> СоА СоА <- ацетил-СоА
оксалацетат ч----------------------— малат
2[Н]
Другой способ восполнения ЦТК состоит в фиксации СО2 в
С3 соединениях: С3 + С1~>С4, что может происходить в реакции
Вуда-Веркмана, открытой на пропионовых бактериях:
СН3СОСООН + СО2 + АТР
пируват—$
карбоксилаза
НООС—СН3—СО—СООН + ADP + Р£
или чаще при фиксации Сх в РЕР:
РЕР + СО, + Н,0 -^^->НООС-СН„-СО-СООН т Р,
ЦТК — не единственный путь полного окисления органиче-
ских веществ. Альтернативным по отношению к ЦТК служит окис-
лительный 1 пентозофосфатный цикл.
ЦТК, как мы видели, описывает только судьбу углеродного
скелета уксусной кислоты, но не участвует в сохранении энергии.
Вместе с тем в цикле имеют место 4 ступени дегидрогенированця,
которые приводят к образованию 2 молей NADH2;, по 1 молю
NADPH2 и FPH2. Эти 4 молекулы передают свои электроны дру-
гой серии ферментов, составляющих дыхательную цепь.
Особенности дыхательной цепи бактерий
В отличие от митохондрий состав переносчиков дыхательной
цепи бактерий и их содержание в клетке непостоянны и зависят
1 В окислительном пентозофосфатном цикле образующиеся молекулы NADPH2
поступают в дыхательную цепь, а фруктозо-бР и фосфоглицериновый альде-
гид не сбраживаются по пути Э-М-П (как в анаэробном пентозофосфатном
.цикле), а снова вовлекаются в цикл.
2 Л. И. Воробьева
33
от состава среды, температуры, pH, возраста культуры, концен-
трации СО2. Необходимо, чтобы комбинация цитохромов облада-
ла разностью потенциалов, достаточной для того, чтобы служить
источником энергии для синтеза АТР. Главное значение развет-
вленности дыхательной цепи бактерий в ее начале и в конце со-
стоит в гибкости жесткого потока электронов, что позволяет клет-
кам переключаться с одного акцептора электронов на другой при
изменении условий.
Окислительное фосфорилирование у бактерий меньше 3 и обыч-
но около 1—1,5. Это связано с иным составом дыхательной цепи
и со свойственным бактериям так называемым свободным окис-
лением, т. е. окислением, не связанным с синтезом АТР.
Регуляция скорости дыхания у бактерий осуществляется в ос-
новном путем изменения состава дыхательной цепи и переключе-
ния с одного терминального акцептора на другой. Общая схема
окисления субстратов у микроорганизмов может быть изображена
следующим образом:
—цитохром фотооксида за—ОН
h
—цитохромпероксидаза----Н2О?
J
—*- редуктазы —
неорганических
соединений
субстрат
Р
а 1
субстрат----2[Н]
неорганические
соединения
(SO^ . NO3 , N0? >
к
---*- 0^
г
i d е
цитохромы *- цитохромоксидазы-----------02.
! (а + а3)
фумарат -
редуктаза
*- фумарат
Путь а—f схематично отображает брожение, путь а—b—g — фла-
виновое дыхание.
Основной путь (a, b, с, d, е) может заканчиваться кислородом^
но роль терминального акцептора электронов у микроорганизмов
берет на себя и целый ряд других соединений, способных восста-
навливаться; в этом случае говорят об анаэробном дыхании.
При анаэробном дыхании оксидазы замещаются на редуктазы
и электроны передаются на соответствующие редуктазы с цито-
хромов b или с.
Облигатные аэробы
Нет брожения. Транспорт электронов по пути а—b—с—d—е.
Факультативные анаэробы
34
1. Цитохромнезависимые (например, молочнокислые), аэробный
транспорт по пути: а—b—g, анаэробный: а—f (брожение).
2. Цитохромзависимые (энтеробактерии):
аэробный транспорт: a, b, с, d, е; a, b, g.
анаэробный транспорт: a, f\ а, &, с; / (нитратредукция),
а—Ь—1 (нитратредукция).
Облигатные анаэробы
1. Цитохромнезависимые (Clostridium):
анаэробный транспорт: а—f.
аэробный: а—b~g (в физиологических условиях не реализуется).
2. Цитохромзависимые (десульфатирующие):
а, Ь, с, j восстанавливают SO42~
АЭРОБНОЕ ДЫХАНИЕ
Дыхательная цепь хемоорганотрофов
Восстановительные эквиваленты у хемогетеротрофов и факуль-
тативных фототрофов могут поступать в дыхательную цепь не
только с пиридиновых и флавиновых нуклеотидов, но и с таких
восстановителей, как сукцинат, лактат и метанол:
сукцинат
Fp. FeS
NADH
хиноны
цитохромы
1/2 О2
хиноны
метанол
Различие в редокс-потенциалах: Е0^АО+/МАВН+= —320 мВ,
1/2 О2/Н2О=-- +820 мВ, значит, +1140 мВ. Высокий выход
свободной энергии обусловливает высокий выход АТР. Фактиче-
ски реакция переноса Н2 на кислород равноценна сгоранию во-
дорода в воздухе с образованием воды. Дыхательная цепь содер-
жит различные переносчики Fp. (флавопротеиды), FeS-белки,
хиноны, цитохромы (a, b, с, d) и цитохромоксидазы (Fe-содержа-
щие гемопротеиды). Значит, имеются как органические, редокс-
центры (флавопротеины, хиноны), так и металлсодержащие pe-
at .) кс-центры: цитохромы, FeS-белки, молибдобелки, Си-белки,
Ми-белки. Органические переносчики, имеющие относительно фик-
сированный редокс-потенциал, переносят атомы Н2 (Н2 легко
диссоциирует на электрон и протон где-то на уровне хинонов),
а металлические переносчики могут иметь различный потенциал
и переносят электроны и атом кислорода. Значит, эти два типа
переносчиков связаны с окислением-восстановлением органиче-
ских и неорганических субстратов соответственно.
35
Как мы уже знаем, почти все реакции в живых организмах !
происходят в анаэробных условиях. И среди них есть такие, ко- I
торые полностью ингибируются (и/или репрессируются) в присут- |
ствии молекулярного кислорода, например синтез и активность I
нитрогеназы, катализирующей фиксацию N2, или синтез корри- 1
ноидов. Такие синтезы относятся к «трудным» синтезам аэробов,. I
требующих от них специальных ухищрений и защиты ферментов I
от кислорода. Например, Azotobacter полностью прекращает син- 1
тез нитрогеназы в присутствии О2, а синтезированную ранее под- |
вергает полимеризации — временной и обратимой инактивации. I
Практическое значение. Хемоорганотрофы с кислородным ды- |
ханием накапливают большую биомассу за короткое время. По- I
этому такие организмы используют для получения белковых пре- 1
паратов, а также биоинсектицидов (специальные штаммы) и как |
источники разных частей клеток и их отдельных компонентов. 1
Например, если требуются нуклеотиды, то их источники следует I
искать среди аэробных дышащих форм с интенсивным метаболиз- I
мом, активным биосинтезом белков и, следовательно, высоким 1
содержанием рибосом, которые служат главным источником нук- i
леотидов. (В настоящее время их можно получать автоматическим |
путем.) Конечные продукты метаболизма — СО2 и Н2О (не име- |
ют практической ценности), но У некоторых аэробов наружу вы- 1
деляются интермедиаты аэробного метаболизма, например глу- 1
таминовая кислота. Практическое значение имеют некоторые ин- 1
термедиаты ЦТК. Известны штаммы грибов, выделяющие в среду I
в больших количествах лимонную кислоту. Их используют в про- I
мышленности (см. дальше). Из цисаконитовой кислоты путем ее |
микробного декарбоксилирования получают итаконовую кислоту. |
Ее применяют в производстве бумаги, обоев. Почти все важные ]
продуценты антибиотиков также располагаются в группе аэробов.
Дыхательная цепь хемолитотрофов
Хемолитотрофы окисляют неорганические доноры (табл. 4),
используя О2, но иногда нитрат как конечный акцептор. Донора-
ми электронов могут служить Н2, различные восстановленные сое-
динения серы и азота, Fe2+ и СО.
рвЦ2
хиноны цитохромы 1/20
NADH
Мо
t
NO..
Кроме тех случаев, когда используется Н2 и возможно СО, выход
АТР очень низкий.
Таблица 4
Окисление неорганических веществ бактериями
(по Jones, 1982)
Семейство
Nilrobacteriaceae
I liiobacillaceae
Si il folobaceae
Tliiobacillaceae
I ^riidomonodaceae
Донор электронов
Thiobacillus
Sulfolobus
Thiobacillus
Alcali genes (Hydrogeпото-
пав)
NH3 NO2
NO2 NO3
Fe2 + Fe3+
H2
Pseudomonas и некоторые
другие роды, включая
сульфатвосстанавливаю-
щие и метаногенные бак-
терии
Поэтому для генерации необходимой энергии такие бактерии
перерабатывают огромные количества субстратов и очень активно
эксплуатируют терминальный участок цепи (потребляют в 10—
100 раз больше О2 в единицу времени, чем хемоорганотрофы).
Электроны доноров (кроме Н2) вступают в середине цепи или
даже в ее конце. Поэтому другая трудность при таком типе мета-
болизма связана с необходимостью затраты дополнительной энер-
гии (за счет обратного транспорта электронов) для генерации
восстановленных NAD. Источником углерода хемолитотрофам
служит СО2. Указанные особенности хемолитотрофного метабо-
лизма объясняют обычно низкие выхода биомассы таких бакте-
рий (кроме водородных) и большие метаболические изменения,
которые они совершают в окружающей среде, например при вы-
щелачивании металлов с участием Thiobacillus ferrooxidans в био-
металлургии.
Практическое применение
Хемолитотрофы используют не только в биогеотехнологии. Во-
дородные бактерии окисляют Н2 кислородом, усваивают СО2, на-
капливают за короткое время большую биомассу, которая может
служить источником белка, поли-р-оксимасляной кислоты* 1 (мо-
жет заменить полиэстерное волокно в полимерной химии), ами-
нокислот и некоторых ферментов.
1 Недавно показано, что источником поли-р-оксибутирата могут служить гало-
фнльные архебактерии Halobacterium volcani. При выращивании в среде, со-
держащей 1% глюкозы, менее 20% NaCl и дрожжевой экстракт, их клетки
на 45% состоят из поли-р-оксибутирата.
37
Источник энергии A [i + I
У некоторых бактерий, способных жить в щелочных условиях,!
окисление субстрата в дыхательной цепи сопровождается выбро-|
сом из клетки не протонов, а ионов натрия. Создается Ац^Л
Аналогично обратному переносу Н+ через мембрану перенос Na+ I
приводит к синтезу в клетке АТР. I
АНАЭРОБНОЕ ДЫХАНИЕ |
Многие факультативные анаэробы и облигатные анаэробные !
хемогетеротрофы вместо О2 используют иные акцепторы электро-1
нов. Такими акцепторами могут служить различные окислы N и I
S, Fe+3, СО2 и органические соединения, как фумарат, триметил-1
амин-Ы-оксид. Анаэробное дыхание встречается только у бакте- 1
рий (табл. 5). Выход АТФ при анаэробном дыхании меньше, чем 1
при аэробном, но больше, чем при брожении. Больше всего энер- |
гии образуется, как известно, при использовании О2 как терми- 1
нального акцептора. Нитраты дают довольно много энергии I
(табл. 6) и меньше всего сульфаты и гидрогенирование СО2 до |
СН4. Вместе с тем восстановление фумарата до сукцината, как 1
энергодающая система довольно выгодна и часто используется I
факультативными и облигатными анаэробами. Готшалк, напри- |
мер, считает, что образование СН4 у метаногенов можно понять, |
если принять, что фумарат-сукцинатный цикл действует в ком- I
бинации с транспортом электронов. Дыхательная цепь анаэробов |
содержит те же переносчики, что и аэробные системы, но цито- 1
хромоксидазы заменены на соответствующие редуктазы.
Денитрификация 1
Микроорганизмы. Денитрификацию, т. е. анаэробное дыхание
за счет NO3(NO2, N2O, NO), осуществляют гетеротрофные грам- ]
отрицательные бактерии родов: Acinetobacter, Alcaligenes, Achro- 1
mobacter, Agrobacterium, Chromobacterium, Flavobacterium, Kin-
gella, Moraxella, Pseudomonas, Rhizobium и несколько грамполо-
жительных палочек из рр. Bacillus, Corynebacterium, Propioni- I
bacterium. Денитрификаторы встречаются у Hyphomicrobitim и '
видимо у р. Arthrobacter, Cytophaga, Thermothrix, среди хемоли-
тотрофов — у Thiobacillus и Thiomicrospira, а среди фотооргано-
трофов у штаммов Rhodopseudomonas. Денитрификация репрес-
сируется кислородом, хотя есть данные, что при невысоком содер-
жании О2 она тоже происходит. Например, известно, что Thio-
sphaera pantotropha одновременно дышит кислородом и нитрита-
ми. Но вообще микроорганизмы обычно выбирают энергетически
более выгодный тип дыхания. В соответствии с величиной редокс-
потенциалов выбор акцепторов электронов микробами должен
был бы быть следующим: нитраты, окислы металлов, SO42”, СО2.
38
Для типичных денитрификаторов характерно, что в отсутст-
вие О2 клетки прекращают синтез цитохрома с, а + яз, но обра-
зуют пиридиннуклеотиды, флавины, хиноны и цитохром Ь. Денит-
рификаторы реагируют на присутствие нитратов или других окис-
лов азота, которые индуцируют синтез: 1) молибдопротеина (нит-
Таблица 5
Анаэробное дыхание
Семейство
Электронный
акцептор
Примечание
IjiLerobacteriaceae
Bacillaceae
1 ’seudomonadaceae
Streptomycetaceae
Vibrionaceae
Bnterobacteriaceae
Bacteroidaceae
Bacillaceae
I ’ropionibacter iaceae
Bacillaceae
Methanobacteriaceae
Bacillaceae
1 Vcudomonadaceae
B.iiterobacteriaceae
I ’’-oiidomonadaceae
Vibrionaceae
Escherichia
Klebsiella и все
другие роды
Bacillus
Pseudomonas
Streptomyces
Vibrio
NO^ NOif
NOy* NH3
NO“^-NO2
NO7 (—n2o, n2)
NO2" (-* NO?)
фумарат-*сукцинат
Bacillus
Desulfovibrio
Desulf otomaculum
Desulforomonas
Methanobacterium
и 2 других рода
Bacillus
Pseudomonas
Escherichia, Proteus
и другие
S° S2-)
SO4“ -> APS -*
SO|“ S2“
CO2 -> CH4
Fe3+ ->• Fe2+
I
TMAO TMA
ТМАО-триметил-N -
оксид
факультативные анаэ-
робы
денитрифицирующие
бактерии
облигатные анаэробы,
или факультативные
анаэробы. Не все виды
могут
су л ь фатв о с стана вл и -
вающие
39
ратредуктазы), 2) с—а-цитохрома или (у некоторых видов) Си-
протеина (нитритредуктазы), 3) цитохрома С554 (возможно редук-
тазы NO) и 4) возможно цитохрома с—NsO-редуктазы.
Поток электронов у различных типов денитрифицирующих бак-
терий представлен на рис. 14. Как видно из рис. среди ДеНИТрИ-
Та б л и ц а 6
Восстановительные процессы, сопряженные с окислительным фосфорилированием
(по Dellweg, 1980)
Реакция AG0 ккал/реакция Выход энергии (кДж) при переносе двух электронов от водо- рода
О2 + 2Н2 2Н2О —113,4 —237,2
2NO ® + 2Н® + 5Н2 N, + Н2О —207,0 —224,1
NO ® + Н2 NO® + Н2О —39,0 — 103,2
Фумарат + Н2 сукцинат —20,0 —86,2
SO^® + Н® + 4Н2 -» HS® + Н2О —30,3 —38,0
НСО® + Н® + 4Н2 СН4 + ЗН2О —32,4 —33,0
n2
о
ф
о
углеводы
хемогетеротрофы
спирты и
органические
кислоты
NADP
тиосульфат——флавины
хемоавтотрофы \
ХИНОНЫ
цитохром с-дтипа
или Си-белок
азурин или CRR1
V V I
цитохром С
г типа
цитохром С
типа
конечные
продукты
n2o
NO
NO“
Ю
цитохром В
ГО
2
фототрофы
сульфид----(х)п
[NaR Mo (V) ~Fe3+—S2 “ ]
*-NOT
О
сульфит----*Ну)п
малат, сукцинат-----
свет
Рис, 14, Сравнение потоков электронов при денитрификации у различных ти-
пов бактерий (по Payne, Grant, 1981)
40
фикаторов имеются хемогетеротрофы (большинство), хемоавто-
трофы и фотогетеротрофы. Эффективность нитратного дыхания
составляет 67—77% по сравнению с аэробным дыханием.
Практическое значение. Денитрификация — мощный и широко
распространенный в природе процесс. Многие виды, способные к
денитрификации, могут использовать все простые и многие слож-
ные углеводы, органические кислоты, белки и пептиды, липиды,
спирты, некоторые виды Moraxella и Pseudomonas осуществляют
денитрификацию за счет ароматических соединений, которые при
этом разлагаются не под действием оксигеназ, но путем восста-
новления двойных связей с последующим гидролитическим рас-
щеплением и образованием органических кислот, служащих бак-
териям источником энергии и углерода. В процессе денитрифика-
ции Alcaligenes faecalis var. denitrificans деградирует ди-, три-,
тстраэтиленгликоли и ряд этоксиолигомеров, этиленгликоль, пер-
вичные и вторичные алкилэфиры олигомеров эфира гликоля. Та-
ким образом, при обеспечении нитратами бактерии в анаэробных
условиях деградируют ряд веществ, загрязняющих биосферу. Био-
логические методы очистки сточных вод от нитратов разработаны
и используются для очистки бытовых сточных вод. Рассматрива-
ют возможность использования процесса нитрификации и денит-
рификации для очистки рудничных и промышленных сточных вод.
В связи с использованием химических удобрений возросло содер-
жание нитратов в подземных водах. Для снижения концентрации
нитратов и детоксификации вод предлагают использовать денит-
рифицирующие микроорганизмы, в частности Paracoccus denit г i-
ficans. Скорость денитрификации, осуществляемая бактериями,
иммобилизованными в гранулы альгината Са, составляла 0,65 кг
питратов/м3 в сутки. Иммобилизованные клеточные агрегаты спо-
собны работать в экстремальных условиях: в пределах^ темпера-
туры от 5 до 50° С, pH 4,0—9,0 и от нулевого до максимального
насыщения воды кислородом. Непрерывную полупромышленную
денитрификацию подземной воды с концентрацией нитратов 44,0—
92,0 мг-л-1 проводили в колонне, заполненной 2 кг влажной мас-
сы биокатализатора при количестве перекачиваемой сырой воды
от 16,0 до 26,0 л-ч-1. За три месяца непрерывной эксплуатации
биокатализатора его активность сохранялась на максимальном
уровне. Денитрификация и подбор штаммов, способных к актив-
ной денитрификации, необходимы для проведения силосования
кормов. Виды Bacillus при обеспечении нитратами могут в ана-
эробных условиях деградировать лигноцеллюлозу — наиболее
поильное возобновляемое вещество на земле и в отходах, которое
с трудом подвергается биологическому разложению. Следователь-
но, денитрификаторы играют важную роль в круговороте угле-
рода, входящего в состав полимерных волокон растений.
За счет денитрификации на больших глубинах в водоемах
(100 500 м) могут нарушаться привычные пищевые отношения
и снижаться продуктивность рыбоводства. Средние потери свя-
занного азота при денитрификации составляют от 2—77% (NO2
41
и N2). Так что уникальный двугемовый (с—d) -цитохром (нитрит-
редуктазу) называют «несчастьем» сельского хозяйства. Си-белок
приносит не меньше потерь. Продукт денитрификации — N2O —
оказывает влияние на эффект зеленого дома, N2O через NOX вы-
зывает уменьшение озона в стратосфере. Озоновый слой не про-
пускает на землю короткие ультрафиолетовые лучи, губительно
действующие на живые существа, поэтому его сохранение очень
важно для жизни.
Таблица 7
Новые виды сульфатвосстанавливающих бактерий
(по Hamilton, 1985)
Вид Морфология Питание Акцептор электронов
1. Desulfovibrio1 sapovo- rans изогнутые палочки жирные кислоты (С18) -> ацетат, про- пионат so2~ -*s2
2. Desulfobulbus propioni- cus лимоновидные пропионат ацетат S02~^S2~ NO74 -> NO^
3. Desulfotomaculum2 ace- toxi dans спорообразующие палочки ацетат -+ СО3 SO2~->-S2’
4. Desulforomonas acetoxi- dans палочки ацетат СО2 S°->S2~
5. Desulfobacter postgatei палочки до эллип- тической формы ацетат СО2 so4->s2-
6. Desulfosarcina variabi- Us неправильной фор- мы в пакетах органические ве- щества СО2 СО2 клетки SO2~->S2-
7. Desulfonema magnum нити (7 мкм в диа- метре) органические ве- щества ->• СО2 so4->s2~
1 Ранее было описано 7 видов. 4 Ранее было описано 5 видов.
Активная денитрификация рассматривается как защитный ме-
ханизм, обеспечивающий сохранение очень низкого уровня окис-
лов азота, не оказывающих влияния на стратосферный озоновый
слой.
Сульфатное дыхание
Бактерии. Акцепторы электронов. Десульфатирующие бакте- 1
рии — облигатные анаэробы — используют сульфат как конеч-
ный акцептор электронов и восстанавливают его до сульфидов. I
Описано 9 родов бактерий (табл. 7). Некоторые и немногие виды, j
например Desulforomonas acetooxidanst не используют сульфат, |
а вместо него восстанавливает S0 до сульфида. Некоторые виды i
могут использовать тиосульфат, нитрат или фумарат как акцеп-
42
торы электронов, другие способны к брожению, например пиру-
вата.
Сульфат уникален как акцептор электронов по той причине,
что в начале должен быть активирован в реакции с АТР с обра-
зованием аденилилсульфата (APS). APS восстанавливается далее
до сульфита в 2-электронном переносе (Ео= —60 мВ) и сульфит
восстанавливается до сульфида (£о= —116 мВ). Пока точно не
установлено, происходит ли при этом 6-электронный перенос или
три 2-электронных переноса через такие интермедиаты, как три-
тионат (S3O62~) и тиосульфат (S2O32-).
Вследствие относительно низких значений редокс-потенциалов
двух последних соединений (для О2; и NO3 как терминальных ак-
цепторов эти значения соответственно равны +820 и +433) име-
ется ограниченный выход энергии при окислении субстратов.
Доноры электронов и источники углерода. Рост возможен за
счет СО2, ряда органических соединений, включая бензоат, жир-
ные кислоты (от ацетата до стеарата).
Для Desulfovibrio postgatei ацетат — единственный источник
углерода для роста. На сахарах и углеводах не растет. Путь ас-
симиляции и окисления ацетата (изучал Тауэр с сотр.) показан
па рис. 15. Описан новый вид Desulfobacterium phenolicum sp.
nov., использующий фенол, фенилацетат, 2-гидроксибензоат, 4-гид-
роксибензоат, 4-гидроксифенилацетат, п-крезол, индол, антрани-
ловую кислоту, фенилаланин, а также различные жирные кисло-
ты, спирты и дикарбоновые кислоты.
Другой новый вид — Desulfobactericum indolicum — дополни-
тельно к описанным источникам углерода утилизирует хинолин,
формиат. Акцептором электронов вместо сульфата может служить
тиосульфат. Многие виды, включая Desulfovibrio vulgaris и D. de-
sulfur leans, окисляют молекулярный водород как источник энер-
гии. Углерод обычно ассимилируют из ацетата .и СО2 в отношении
70:30%, но некоторые виды растут автотрофно. В некоторых ус-
43
ловиях бактерии могут выделять молекулярный водород, то же
относится к ацетату. Десульфатирующие бактерии живут в осад-1
ках морей, ответственны за 50% минерализации органического]
фумарат
ацетат
сукцинил
сукцинил-СоА
ацетил-СоА
2
а-кетоглутарат-----биосинтез
2
изоцитрат
'l
цитрат
малат
оксалацетат--
биосинтез
СО
-нсо,.
ацетат
ацетил - СоА
пируват -
ФЕЛ
(анаплеротический путь)
Рис 15. Путь метаболизма ацетата у Desulfobacter post gat ei (no Hamilton
1986)
вещества за счет утилизации следующих главных субстратов в
осадках морей: Н2 (10%), ацетата (50%), пропионата (10%), бу-
тирата (10%). Как и метаногенные бактерии, десульфатирующие
бактерии осуществляют полную минерализацию органических ве-
ществ в составе трех больших групп: гетеротрофов, способных
хотя бы к частичному разложению первичных продуктов и созда-
ющих условия анаэробиоза, Н2-образующих ацетогенных бакте-
рий и сульфатвосстанавливающих. В таких консорциях они ути-
лизируют Н2 и ацетат как источник энергии и углерода.
Практическое значение. Коррозия металлов. Десульфатирую-
щие бактерии вызывают коррозию металлов, которая происходит
при нейтральных значениях pH, в анаэробных условиях. Продукты
коррозии включают сульфиды металлов. Водородная пленка, об-
разующаяся на железе при его поляризации (анодная поляриза-
ция), в воде служит защитным слоем для металлов: 4Fe + 8H+->
->4Fe+2+4H2. Медленное окисление пленки молекулярным кис-
лородом происходит в аэробных условиях. В анаэробных условиях
в присутствии SO42- сульфатредуцирующие бактерии могут ак-
тивно поглощать Н2 и вызывать катодную деполяризацию: 4Н2+
+ SO42~->H2S + 2H2O + 2OH. H2S может соединяться с Fe и вызы-
вать порчу металлических труб и других металлических конструк-
44
ций, включая нефтяные буры и склады; 4Fe+2 + H2S + 2OH +
I 4H2O-^FeS + Fe(OH)2+6H+. H2S ингибирует рост риса, губит
рыбу, является источником образования и выделения в атмосферу
сульфата, что очень вредно.
Десульфатирующие бактерии имеют важное значение для очи-
стки сточных вод в метантенках (в илах, где они живут и окис-
ляют ароматические (индольные, фенольные) и другие трудно
разлагаемые соединения). Считают, что весь H2S происходит в
результате жизнедеятельности сульфатредуцирующих бактерий.
МЕТАНОГЕНЕЗ
Этот своеобразный тип метаболизма осуществляют предста-
вители архебактерий — метаногенные бактерии, единственные,
выделяющие метан как главный продукт метаболизма. Метан об-
разуется при восстановлении СО2.
Микроорганизмы. Описано 14 родов метаногенных бактерий.
Места обитания. Хотя метаногенные бактерии используют ма-
ло субстратов, но они широко распространены: живут в осадках
водоемов, в желудке жвачных, в пресных и соленых водах, тер-
мальных горячих источниках, стволах деревьев, в солеварнях, гео-
термальных источниках, в трещинах на больших морских глуби-
пах.
Субстраты. Большинство метаногенов может использовать смесь
водорода и углекислоты (и/или формиата) — 1-я группа; соли
уксусной кислоты — 2-я группа (недавно выделены нитчатые ме-
таногенные бактерии, которые ис-
пользуют только ацетат и не ра-
стут за счет Н2/СО2) и одноугле-
родные соединения тиламины •—
3-я группа.
Биоценоз. Эти вещества пред-
ставляют собой конечные продук-
ты жизнедеятельности других бак-
терий, с которыми метаногенные
живут в тесном сообществе (рис.
16). Различают 3 фазы процес-
са: гидролиз полимеров, кислотоге-
исз и собственно метаногенез.
На 1-й фазе в результате деятель-
ности литических микроорганизмов
образуются моно- и олигосахариды,
пептиды, аминокислоты, азотистые
основания, жирные кислоты,
спирты, метанол. Они подвер-
'и с. 16. Схема анаэробного разложения
органических веществ (по Bryant, 1979)
полимеры
(целлюлоза, белкиУ
группа 1
(гидролитические и
сн4 + со2
45
гаются действию микрофлоры, которая объединяется под об-
щим названием «прстонвосстанавливающие или Н2-образую-
щие» бактерии. К ним относятся бактерии-бродильщики (не-
облигатные протонвосстанавливающие бактерии) и облигатные
синтрофные бактерии, использующие продукты брожения с обра-
зованием Н2 и ацетата. На 3-й фазе процесса функционируют
метаногенные бактерии. Метаногены превращают ацетат, СО2 и
Н2 в СН4.
Таким образом, в природе метаногенные бактерии завершают
анаэробное разложение мертвых растений и животных. Его могут
завершать и десульфатирующие бактерии, но их жизнедеятель-
ность бывает ограничена недостатком сульфатов. В отличие от
десульфатирующих метаногены никогда не ограничены своим ак-
цептором, так как СО2 присутствует в больших количествах в
бескислородных местах, где разлагается органическое вещество.
В целом процесс выглядит как превращение 1 моля глюкозы в
2,8 М СН4, 2,6 М СО2, 0,06 г биомассы и сопровождается выде-
лением 632 кДж.
Биохимия метаногенеза. Для превращения маленьких молекул
в метан природа изобрела особые коферменты (на сегодня опи-
сано 7). Центральная роль принадлежит коферменту М (СоМ)
(называется так потому, что переносит метильные группы). Он
обнаружен у всех метаногенных, и только у них; у других архе-
бактерий отсутствует. Ферменты метаногенов перечислены ниже:
Со-М — меркаптоэтансульфоновая кислота — HS—СН2—
—СН2—SO3H;
СНз-СоМ — Н3С—S—СН2—СН2— SO3H;
Fe42o — 8-гидрокси-5-деазаизоаллоксазин;
Fe342 — метаноптерин, дигидрометаноптерин и карбоксиди-
гидрометаноптерин (вещество флуоресцирует желтым светом);
F43o — никельтетрапиррол, придает желтый цвет метил-
СоМ-редуктазе.
Бактерии содержат по крайней мере 4 никельсодержащих фер-
мента, имеются только у метаногенов. Метил-СоМ-редуктаза, мо-
лекулярная масса 300 тыс., состоит из трех субъединиц.
Мембранно-связанная гидрогеназа;
Fill — 5-гидроксибензимидазолкобамид.
В мембранной и растворимой фракции клеток метаногенных бак-
терий обнаружены корриноиды (витамин В12), которые, как пола-
гают, участвуют в восстановлении метил-СоМ до метана. Многие
кофакторы и компоненты ферментов чувствительны к кислороду
и другим акцепторам электронов, чем, видимо, обусловлен экстре-
мальный анаэробиоз метаногенных бактерий.
Предполагаемый химизм метаногенеза изображен на рис. 17.
Согласно модели, предложенной Ромессером Дж. А (1978) и мо-
дифицированной Р. С. Вульфом, СО2 вначале связывается с не-
известным фактором и образуется производное с карбоксильной
группой (ХСООН). После этой ступени следует 4 последователь-
46
IIых восстановления (реакции II, III, IV и V), в которых Н2 слу-
жит восстановителем. CDR-фактор нужен лишь на первых сту-
пенях восстановления до формиата. Рз42 — переносит Сггруппу
па уровне формила, метилена и метила (его аналог — тетрагид-
рофолат). Коэнзим F420 — переносчик электронов на конечных
YH,
Рис. 17. Связь между ранними и
СОг и Нг
гидрогеназа
III
хними стадиями образования метана из
Н ungate, 1983)
AG° 38 —26,3 кДж/моль
Н2
С09
**
ADP + Pj
Рис. 18. Участие фума-
рат-сукцинатного цикла
в образовании метана у
метаногенных бактерий
(по Gottschalk, 1979)
47
ступенях метаногенеза. F420 может принимать электроны от гид- |
рогеназы и формиатдегидрогеназы. Таким образом, при изучении !
метаногенных бактерий оказалось, что кроме NAD(P) и FAD в I
природе есть и другие коэнзимы, вовлекаемые в реакции элек- |
тронного транспорта. У метаногенов обнаружены менахиноны и |
новые, ранее неизвестные хиноны, у Methanosar ста нашли цито- I
хромы. Согласно модели Готшалка, электроны от донора с отри-
цательным потенциалом не непосредственно используются на вое- |
становительных этапах образования СН4. Вместо этого они вна- j
чале восстанавливают фумарат до сукцината, продуцируя при
этом энергию. Сукцинат далее может функционировать при вы-
полнении последней ступени метаногенеза — восстановления ме-
танола в метан с одновременной регенерацией фумарата. Реак-
ция энергетически выполнима и имеет стандартное значение AG° =
=—26 кДж (рис. 18). Из Mb. thermoautotrophicum выделена
растворимая Ог-чувствительная фумаратредуктаза; она не содер-
жит флавинов, но содержит новый кофактор, напоминающий тет-
рагидрометаноптерин. При использовании ацетата и метанола их
метильные группы переносятся на СоМ и далее, как описано вы-
ше. СНз-М, видимо, служит центральным метаболитом в образо-
вании метана из формиата, метанола, метиламинов и ацетата.
фактор
СНОСГCCV-> СН3 —S—СоМ—е30^сн4
СН3ОН-----------11 "
СН3—NH,---------
сн3—сосг-----------
В 1988 г. открыли, что последняя стадия метаногенеза связана
с синтезом АТР и работой протонтранслоцирующей АТР-синте-
тазы. Кроме того, показано, что образуется еще и трансмембран-
ный градиент ионов Na+, дающий возможность осуществления ‘
некоторых термодинамически невыгодных реакций. Эти и другие 1
факты указывали на то, что вероятный механизм получения энер- 1
гии у метаногенов связан с электронным транспортным фосфо- I
рилированием и сходен с механизмом получения энергии у дру- J
гих организмов. У Mb. barkeri в процессе метаногенеза на мета- 1
ноле создается трансмембранный градиент Na+.Выход из клеток I
Na^ ингибируют протонофоры и амилорид, что позволяет пред- 1
положить, что генерация трансмембранного градиента Na+ обес- |
печивается трансмембранным градиентом Н+ за счет функцио- |
нирования Ыа+/Н+-антипорта. j
Синтез клеточного материала. Жизнь метаногенных бактерий 1
характеризуется не только своеобразным способом получения
энергии, но и необычным конструктивным метаболизмом Хотя
многие из них автотрофы, т. е. живут за счет СО2, они не фик-
сируют ее в цикле Кальвина, характерного дЛя большинства фо-
45
р '
ТО- и хемотрофных организмов. Нет у них также ферментов се-
ринового и гексулозо-фосфатного циклов, работающих у метило--
трофов. Вместо этого функционирует модифицированный обрати-
мый и разорванный цикл трикарбоновых кислот. Первоначальное
образование ацетил-СоА происходит из двух молекул СО2 по мало
изученному пути конденсации Ci + Ci соединений, причем одно
(ф — это СНз—СоМ, а другое — СО2. Это путь «активированной
уксусной кислоты». Процесс образования ацетил-СоА не является
циклическим и происходит при участии уникальных коферментов:
метаноптерина, корриноида, фактора восстановления СО2 и СО-
дегидрогеназы. В пути имеет место уникальное восстановление СО
и уникальное карбонилирование СНз—X. В результате восста-
новительного карбоксилирования ацетил-СоА образуется пируват
и далее оксалацетат, которые служат предшественниками амино-
кислот и сахаров.
Таким образом, у метаногенных бактерий проявляется унифи-
кация в образовании метана и клеточного углерода с использо-
ванием единого интермедиата СНз—-СоМ.
СО2-------[СН] энергия+СН4
клеточный углерод
СО2 ч- [СН] энергия+ СН4
Ацетат----1---СН3ОН
Практическое использование. В атмосфере около 5 млрд, т ме-
тана. Главный источник метана — жвачные животные, которые
отрыгивают СН4, образованный живущими в них бактериями.
Другие источники СН4 — осадки, богатые органическими веще-
ствами, рисовые поля. СН4, как и СО2, увеличивает эффект зеле-
ного дома, так как поглощает инфракрасные тепловые лучи. Кро-
ме того, в некоторых частях океанов, озер и прудов СН4 может
быть причиной удаления кислорода. С другой стороны, контро-
лируемый метаногенез используется для обеспечения горючим при-
родным газом населения деревень и городов, животноводческих
ферм и теплиц и удаления отходов. Анаэробное разложение ор-
ганических веществ, завершаемое метаногенами, происходит в
водоочистительных сооружениях населенных пунктов.
В Китае работает более 7 млн. биогазовых заводов, в Индии —
75 тыс. гобар-заводов, перерабатывающих навоз. Брожению под-
вергают органические отходы при одновременной очистке окру-
жающей среды от них и кроме топлива получают еще калийные,
фосфорные и азотные удобрения для растений. В Японии сель-
скохозяйственные, промышленные и бытовые отходы составляют
49
2-Ю8 т/год. В процессе использования этих отходов при проведе*
нии мезофильного метанового брожения получают до 45-108 м!
СН4. В процессе микробного метаногенеза на землю возвращает'
ся около 80% энергии, заключающейся в окисленном субстрате,
Метаногенные
бактерии удалось адаптировать
к фенольным
сое
Таблица 8
Влияние анаэробных микробных процессов на окружающую среду
(по Zehner A., Swensen В. Н., 1986)
Процесс Вовлекаемое соединение Характер действия
эффект «зеленого дома», снижение озо-j
на в стратосфере, потери азота для)
сельскохозяйственных культур
,Денитр ификация
Восстановление же-
леза и марганца
Брожения
1Ред у к ц ия су л ьфа -
,тов
.Метаногенез
N2O, N2O через NO2,
n2o, n2
Fe2+
Mn2+
органические кислоты,
ксенобиотики
органическая сера, азот
H2S
СН4
мобилизация железа и марганца в грун-
товых водах]
ингибирование роста зерновых и кор-
ней рассады, усиленная деградация!
алифатических замещенных и сниже-
ние деградации ароматических соеди-
нений ;
проблемы вкуса и запаха
коррозия, гибель рыбы зимой,
ингиби-^
рование роста рисовых проростков, по-
явление сульфата в атмосфере
увеличение эффекта «зеленого дома»,
голодание по кислороду в водных участ-
ках
динениям, что позволяет шире использовать анаэробное разло-
жение промышленных сточных вод. Термофильные метаногенные
бактерии собираются применять для полного обеззараживания
жидких отходов на бойнях. И в заключение в табл. 8 мы сум-;
.мир уем влияние анаэробных микробных процессов: денитрифи-
кации, десульфатации, метаногенеза и брожений — на окружаю-
щую среду.
ФОТОМЕТАБОЛИЗМ
♦ к
Масштабы фотосинтеза. Типы метаболизма, которые мы рас-
сматривали до сих пор (за исключением хемолитотрофного), ба-
зировались на продуктах фотосинтеза как источниках энергии,
углерода и кислорода. Это было то общее, что их объединяло.
В отличие от них, фототрофный тип жизни основан на непосред-
ственном улавливании солнечной энергии специальными пигмен-
50
тами и построении органических веществ из СО2 и Н2О. Суммар-
ное уравнение фотосинтеза записывают так:
СО2 + Н2О->СН2О+О2.
Земля представляет собой планету, купающуюся в солнечном све-
те. Поэтому неудивительно, что многие живые существа, которые
возникли на земле, выработали у себя способность улавливать
световую энергию.
Из всех способов взаимодействия жизни со светом наиболее
фундаментальным является фотосинтез — биологическое превра-
щение световой энергии в химическую.
Большая часть живущих на земле существ осуществляет фо-
тосинтез, и все остальные Существа зависят от фотосинтеза, ко-
торый служит источником всех видов пищи и даже О2 в земной
атмосфере. Когда Н2О заменила Н2 как донор электронов для
фотосинтеза (после появления цианобактерий), углеводы стали
такими же дешевыми, как свет, воздух и вода и могли синтези-
роваться в огромных количествах при небольших затратах для
клетки.
Солнечную энергию нельзя непосредственно внедрить в био-
логические процессы в связи с мимолетностью жизни кванта.
Квант жив, пока светит солнце, но поскольку жизнь продолжа-
ется и после захода солнца, энергию кванта нужно было стаби-
лизировать. Энергия кванта улавливается специальными пигмен-
тами: хлорофиллами (хл) или бактериохлорофиллами (бхл) — и
первоначально сохраняется в нестабильном продукте АТР (и
NADP при наличии фотосистемы II), который затем передает
свою энергию глюкозе, отличающейся высокой стабильностью.
Механизм фотосинтеза
Адсорбция кванта света вызывает разделение положительного
и отрицательного заряда в реакционном центре (РЦ), который
содержит пигменты в особом состоянии. РЦ остается с положи-
тельным зарядом, а свободный электрон, получив много энергии
от поглощения фотона, способен к вос-
становлению акцептора.
Способность поддерживать разделе-
ние зарядов является одной из главных
особенностей фотосинтетической систе-
мы. Разделение зарядов поддерживается
за счет того, что вблизи РЦ располага-
ются молекулы, составляющие электрон-
но-транспортную цепь (ЭТЦ) (рис. 19).
Рпс. 19. Схематическое изображение функции 3
компонентов фотосинтетического аппарата (по
Startler et al., 1982)
hr hr hr
51
За счет энергии возбужденного электрона, которую он посте-]
пенно теряет, происходит выброс Н+ через мембрану (рис. 20) .1
Образование трансмембранного электрохимического потенциала!
протонов (Аин+) используется клеткой для синтеза АТР из ADP j
и Рг*. *
н+ н+
NADP+ NADPH
Рис. 20. Схематическое изображение генерации I
при фотосинтезе цианобактерий I
Светозависимый синтез АТР называется фотофосфорилирова- |
яием. И описанный процесс — это циклическое фотофосфорили-
рование. Принцип циклического фотофосфорилирования очень на- |
поминает окислительное фосфорилирование. Основное различие
между ними состоит в том, что при окислительном фосфорили-
ровании электроны уходят из системы на внешний акцептор (О2),
а при циклическом фотофосфорилировании внешний акцептор ;
отсутствует (рис. 21). !
хлорофилл
ADP + Р.
/
/
I
\
\
АТР
субстрат
ADP +Р
Z
/
1
\
АТР
свет
А
Рис. 21. Циклическое фосфорилирование при фотосинтезе (Д) и окислительное
фосфорилирование (5) (по Stonier et al., 1966)
52
550—660 нм >660 нм
3 hv hp
фикобилипротеины | хлорофилл а
ADP АТР
циклический поток электронов у пурпурных несерных бактерий
хлоропласты растений и цианобактерии
Рис. 22. Диаграмма фотосинтетического аппарата цианобактерий (а). Показан
нециклический поток электронов (по Startler et al., 1982); б — поток электро-
нов у цианобактерий (и в хлоропластах растений) и у пурпурных несерных
бактерий
Для синтеза органического вещества из СО2 и Н2О в процессе!
фотосинтеза необходим не только АТР, но и NADPH+ и Н+ По-!
следний образуется в процессе нециклического фосфорилирова-j
ния (рис. 22), он называется так потому, что перенос электронов!
от внешнего донора на хлорофилл также сопровождается обра-;
зованием АТР.
Оксигенный и аноксигенный фотосинтез
Оксигенный фотосинтез происходит с выделением кислорода. I
Его осуществляют высшие зеленые растения, а из прокариот >—1
цианобактерии и группа Prochlorophyta. Участвуют две фотоси- j
стемы: ФС1 и ФС11. Источником О2 служит Н2О, окисляемая I
ФСП.
В аноксигенный фотосинтез Н2О не вовлекается; О2 не выде-
ляется и принимает участие ФС1. Этот тип фотосинтеза известен
только у прокариот. ]
Особенности аноксигенного
фотосинтеза. Свет в качестве пер-
вичного источника энергии используют следующие группы бакте-
рий: зеленые и пурпурные серные (Chlorobiaceae и Chromatiaceae)
и пурпурные несерные (Rhodospirillaceae) (аноксигенный фото-
синтез), цианобактерии и небольшая группа Prochlorophyta (ок-
сигенный фотосинтез), зеленые несерные.
Н2О не используется, О2 не выделяется.
Фиксация и метаболизм СО2 происходят не только в цикле
Кальвина — Бенсона, но и иным путем (см. дальше). Существует
(тесная связь между фотосинтетическим аппаратом и ЭТЦ и цито-
плазматической мембраной, которая у пурпурных бактерий сильно
развита. У зеленых бактерий мембранная система не развита, но
есть хлоросомы (мембранные образования), присоединенные к
цитоплазматической мембране. В хлоросомах находятся фотосин-
тетические пигменты.
В аноксигенном фотосинтезе участвуют особые пигменты. Глав-
ный фотосинтетический пигмент — бактериохлорофилл (бхл), и в
большинстве случаев это бхл а, а в некоторых случаях (Rhodo-
pseudomonas sphaeroides) — бхл в; каротиноиды у бактерий тоже
особые: ациклические метокси- и арилкаротиноиды, например спи-
риллоксантин.
Фотосинтетический аппарат может быть экспериментально
разделен на три компонента, которые тесно связаны между собой
в структурном и функциональном отношении: антенна, РЦ и ЭТЦ.
Антенна состоит из светособирающих пигментов: бхл и каро-
тиноидов в соотношении 1:1.
РЦ получает энергию возбуждения с антенны. Бактериохло-
рофилл РЦ поглощает свет при 870—875 нм (аналогично хлоро-
филлу аг — Р-700 высших растений) у Rhodopseudomonas и при
890 нм у Chromatium. РЦ содержит 3 полипептида, ассоциирован-
ных с 4 молями бхл, 2 моля бактериофеофитина, 1 моль убихи-
54
пока и негемовое Fe. Присутствует также небольшое количество
каротиноидов. Перенос энергии происходит с бхл с через бхл а
на бхл с РЦ.
ЭТЦ. Химическая природа донора и акцептора электронов
ЭТЦ у разных бактерий сильно различается в деталях. У всех
изученных бактерий участвует несколько цитохромов. Пластохи-
нона нет, но его функцию могут выполнять убихиноны. У бакте-
рий имеет место циклический путь переноса электронов (рис. 23),
t-г н
свет — бактериохлорофилл
ADP АТР
Рис. 23. Генерация Н+ у пурпурных бактерий (Акименко, 1985)
сопряженный с генерацией АТР, но способ образования восста-
новителей не совсем ясен. Существуют данные, что у бактерий
(зеленых) тоже функционирует нециклическое фосфорилирование,
при этом донором водорода служат серосоединения H2S, Na2S2;O3,
молекулярный водород.
Поскольку все экзогенные — восстановительные — пары кро-
ме 2Н+/Н2 имеют более высокий редокс-потенциал, чем NADP/
/NADPH+, то восстановление NADP требует энергии и реакция
идет либо за счет солнечной энергии (возможно у зеленых бак-
терий и цианобактерий) или за счет протонного градиента, обра-
зованного при циклическом переносе электронов (пурпурные бак-
терии). Современные зеленые серные бактерии используют лучи-
стую энергию для переноса атома водорода от H2S к NADP+
Электроны, отнятые от H2S, обладают очень высоким отрицатель-
ным редокс-потенциалом (—230 мВ) и способны к восстановле-
нию NAD до NADH при поглощении одного кванта света единст-
венной фотосистемой, имеющейся у этих бактерий.
Оксигенный фотосинтез цианобактерий. Подобно высшим рас-
тениям цианобактерии выделяют О2, но тилакоидные мембраны
у них находятся не в хлоропластах, как у растений, а распреде-
лены по всей цитоплазме клетки, преимущественно на периферии.
У цианобактерий тоже две ФС и ЭТЦ Z-типа 1 как у растений.
: Зигзагообразная система потока электронов при фотосинтезе.
Г
55
Фотосинтетические пигменты отличаются от растительных. Они!
содержат единственный хлорофилл айв качестве вспомогатель-
ного пигмента фикобилины (фикоэритрин и фикоцианин), лока-
лизованные в фикобилисомах. Последние связаны с ФСП. ФС1 |
не использует энергии света, уловленной фикобилинами. В ее ан- 1
тенне присутствует хлорофилл а. С ФС1 ассоциирован (3-каротин
и возможно эхиненон, а с ФСП — различные ксантофиллы. ФС1
(хлорофилл a-содержащая система) при освещении окисляет ци-
тохром и восстанавливает NADP+. Функционирование ФСП
приводит к образованию О2 и восстановлению цитохромов.
В реакциях фотосинтеза у цианобактерий участвуют ферредок-
сины, NADP-ферредоксин оксидоредуктаза, пластоцианин, связан-
ный с мембраной цитохромом С554 и цитохром f, растворимый ци-
тохромом С549 с низким потенциалом и £550- Имеются данные, что
ФС1 и ФСП связывают цитохром f и fesss, а с550 служит первичным
электронным акцептором для ФС1. Р-700 служит первичным элек-
тронным донором для ФС1. Электроны с ИЦП переносятся на си-
стему переносчиков и ФС1. Дополнительные пигменты (фикоциа-
нин или хлорофилл Ь) содержат систему, участвующую в свето-
зависимом окислении Н2О, освобождении О2 и генерации е~. ко-
торые восстанавливают промежуточные переносчики и цитохромы.
Prochloron только один род в Prochlorophyta. Это экстрацеллю-
лярные симбионты морских беспозвоночных (асцидий). У них нет
фикобилисом, но есть Р-700 хлорофилл — а-белок и хлорофилл
а/й-белок, сходный с таковыми зеленых растений, и два хлоро-
филла: а и Ь.
Ассимиляция СО2 бактериями
Пурпурные серные бактерии фиксируют СО2 в цикле Кальви-
на-Бенсона. Пурпурные могут, кроме того, использовать глиокси-
латный цикл для синтеза Отсоединений. У зеленых бактерий не
обнаружено ключевых ферментов цикла Кальвина — фосфорибу-
локиназы и рибулозобифосфаткарбоксилазы. Пурпурные несерные
и зеленые бактерии (Chlorobium) осуществляют карбоксилиро-
вание ацетил-СоА и сукцинил-СоА с образованием пирувата и
а-кетоглутарата. Обе реакции происходят при участии восстанов-
ленного ферредоксина.
Установлено, что зеленые бактерии р. Chlorobium содержат
большую часть ферментов ЦТК и что у них функционирует осо-
бый циклический путь ассимиляции СО2, который называют вос-
становительным циклом карбоновых кислот или циклом Арнона
(рис. 24). Цикл может действовать в двух вариантах: удлиненный
вариант. Имеют место 4 карбоксилирования 4С1^-)->С4 (ща-
велевоуксусная); укороченный вариант. Имеют место два карбо-
ксилирования: 2Ci—>C2 (ацетат). В удлиненном цикле синтезиру-
ется оксалацетат, так как регенерированный ацетат вновь вклю-
чается в цикл, а при укороченном цикле синтезируется ацетат,
56
нооссосн.соон
4^*
ща ве лево у к сус ная • к ислота
к
2
фосфоенол пировиноградная кислота
свет
СН3СОСООН
пировиноградная /
кислота /
2е
CH3COSKoA
ацетиЛ'КоА
HSKoA д
| АДФ+ФН
АТФ
пируватсинтетаза
сн2соон
лимонная кислота
€Н9С00Н
ж»
С(ОН)СООН
нооссосн2соон
щавелевоуксусная кислота
НАДН+Н
НООССНОНСН2СО(
яблочная кислота
СН.СООН
¥
г
сн2соон I
изолимонная кислота
НАД
2
свет
2 кетоглутарат
синтетаза
НАД-Н+Н
2СО?
НООССН2СН2СОСООН
2-кетоглутаровая кислота
HSKoA
2
HOOCCH9CH9COSKoA
сукцинил-КоА
НООССН—--СН.СООН
фумаровая кислота
I
к-ФДДН2
ФАД
НООС.СН2СН9СООН
янтарная кислота
4СО, + 4й + 4Н+ + 2НАД-Н + 2Н+ + ФДДН2+ 2АТФ НООССОСН_,СООН + 2НАД++
+ 2АДФ + 2ФН +Н2О.
+ ФАД
Рис. 24. Фотосинтетическая система восстановительного карбоксилирования с
помощью фотохимически восстановленного ферредоксина у Chlorobium thiosul-
fat ophilum
а оксалацетат снова входит в цикл. У зеленой фототрофной бак-
терии Chloroflexus auranticus OK 70 восстановительный ЦТК не
используется и ассимиляция СО2 происходит, по-видимому, в ре-
зультате следующих реакций:
ацетил-СоА >• пируват >. оксалацетат цитрат
Однако, как образуется ацетил-СоА, пока не установлено. Циано-
бактерии и Prochlorophyta включают СО2 через восстановитель-
ный пентозофосфатный цикл.
Влияние внешних факторов
на реакции фотосинтеза
Фотосинтез пурпурных и зеленых фототрофных бактерий про-
исходит в анаэробных условиях, а в аэробных условиях в темноте
многие из них могут дышать. Бактерии способны выбирать наи-
более энергетически выгодный тип метаболизма, реагируя при
этом на парциальное давление кислорода и интенсивность осве-
щения. В темноте увеличивается синтез компонентов ЭТЦ. Вме-
сте с тем освещение в бескислородных условиях индуцирует син-
тез фотосинтетических мембран и пигментов. Главным фактором
при этом выступает кислород. Если его содержание выше опре-
деленного уровня, то синтез фотосинтетических мембран и пиг-
ментов не происходит.
Состав пигментов определяется интенсивностью освещения
(сравните с цианобактериями). Например, при низкой интенсив-
ности света у Rhodopseudomonas spp. синтезируются бхл и каро-
тиноиды. При высокой интенсивности содержание этих пигментов
снижается. Свет полностью ингибирует дыхание у Rho do spirillum
rubrum и частично у других представителей этого рода. В при-
сутствии ингибиторов переноса электронов в реакциях фотосин-
теза (атразина и некоторых разобщителей) ингибирования дыха-
ния не происходит. Полагают, что регенерация энергии в клетке
поддерживается на постоянном уровне в результате совместной
регуляции процессов дыхания и фотосинтеза.
Цианобактерии отличаются высокими адаптивными свойства-
ми. Синтез билипротеидов, фикоэритрина и фикоцианина у циано-
бактерий регулируется длиной волны освещаемого света. Синтез
фикоцианина усиливается при освещении красным светом, а фи-
коэритрина — зеленым (показано у Оsdilatoria). Поэтому циано-
бактерии могут приспосабливаться к определенной интенсивности
освещения. Селективное снижение в содержании фикоцианина
сопровождается азотным хлорозом — возникает дефицит по азоту.
Если в культуру Anacystis nidulans внести нитраты, то пигмен-
тация восстанавливается. Содержание фикоцианина снижается
при снижении содержания СО2. Предполагают, что СО2 участвует
в контроле синтеза фикоцианина. Приспособленность цианобакте-
рий выражается еще в том, что они могут переключаться на ано-
ксигенный фотосинтез, и в этом случае в качестве электронного
58
донора используют Н2 из H2S в гидрогеназной реакции. Анокси-
генный фотосинтез индуцируется анаэробиозом. Окисление H2S
при работе ФС1 сопровождается стехиометрической ассимиляцией
СО2, а элементарная сера откладывается вне клетки (например,
у Oscilatoria limnetica). Интенсивная фотоассимиляция при вы-
сокой концентрации H2S ингибирует СФН; непосредственная роль
H2S заключается в селективном ингибировании ФСП и превра-
щении оксигенного фотосинтеза в аноксигенный. В анаэробных
условиях цианобактерии не содержат гетероцист, при этом может
выражаться их генетическая способность фиксировать N2. Поэто-
му факультативный аноксигенный фотосинтез может иметь зна-
чение в фиксации N2 в условиях, которые относятся к промежу-
точным между аэробными и анаэробными.
Практическое применение
Цианобактерии составляют около 20% микробного планктона.
Они приспосабливаются к различным окружающим условиям: мо-
гут жить в очень соленых водоемах, в пустынях, в порах камней,
скалах, — это вообще наиболее распространенные фототрофные
прокариоты, имеющие самое важное практическое значение.
Их используют как азотные удобрения на рисовых полях (хо-
рошо фиксируют N2). Некоторые виды (Spirullina) используют
с. пищу людям как белковый про-
дукт с хорошими питательными и
вкусовыми качествами.
Культивирование цианобакте-
рий в закрытом фотобиологиче-
ском реакторе (рис. 25) позволя-
ет решать задачу контролируе-
мого запасания энергии, пищи и
углеродного сырья за счет сол-
нечной энергии и СО2.
Биореактор состоит из 50-мет-
ровой стеклянной трубки с диа-
метром 1 см. Культура подвер-
гается рециклированию под дей-
ствием насоса. Консорция пред-
освещение
нее 25. Фотореактор для получения
биомассы микроорганизмов
ставлена одной водорослью и
тремя, бактериями; она стабиль-
па и устойчива к заражению.
Среда включает NH4OH, минеральные соли, СО2. Выделяется
чистый О2. В биомассе содержится 50% белка, жир, крахмал,
глицерин. Преимущества использования биореактора перед тра-
диционными сельскохозяйственными приемами показаны в табл. 9.
В Южной Америке такой биореактор, занимающий 318 км и
поглощающий 14% падающей солнечной энергии, дает за год
2 млрд т в угольных эквивалентов, что равноценно общей потреб-
ности США в нефти (рис. 26). В США изучается возможность
получения масел, предшественников бензина и дизельного топ-
59
лива путем выращивания микроводорослей. Собираются получать
до 5 7 баррелей продукта в неделю с одного акра специальных
прудов с микроводорослями. Для таких прудов выбирают пустын-
ные районы с жарким климатом, большим количеством солнеч-
ных дней в году и с водоемами с соленой водой. В 1989 г. пла-
Рис. 26. Площадь (заштрихована), необходимая для получения за
один год биомассы, соответствующей 2 млрд угольных эквивален-
тов
нируют открыть первое такое производство. Бентические циано-
бактерии образуют флокулянты и эмульсификаторы. Биофлоку-
лянты используют для получения «эмульсана» — полисахаридо-
белкового комплекса, под действием которого гидрофобные клетки
приобретают гидрофильные свойства. Эмульсаы образует устой-
чивые эмульсии из углеводородов и воды при минимальной кон-
центрации солей. Его можно применять в пищевой и фармацев-
тической промышленности. Другие фототрофные бактерии исполь-
зуются пока главным образом в теоретических исследованиях. Но
в последние годы фотосинтетические бактерии (Rhodopseudomonas
и Rhodobacter) привлекают интерес как продуценты молекуляр-
ного водорода. В анаэробных условиях, используя в качестве суб-
60
Таблица 9
Сравнение фотореактора и традиционных приемов сельского хозяйства
для получения биомассы фототрофных организмов
(по Pirt. 1981)
Фактор Традиционное сельское хозяйство Фотореактор для культуры водорослей
Орошаемая земля требуется не требуется
Дожди зависит не зависит (рециклирова- ние воды)
Эффективность утилизации добавленных питательных веществ 50% 100%
со2 из воздуха; может быть лимитирован снабжение СО2 необходи- мо, нет лимитации
Продолжительность продук- ции прерывистое непрерывное
Фотосинтетическая эффектив- ность (максимум на прак- тике) 1% 18%
Отходы биомассы значительные незначительные
Таблица 10
Примерный химический состав типичной бактерии*
и типичной клетки млекопитающего
(по Альберте и др., 1986)
Доля от общей массы клетки, %
К®миенен
бактерии
клетка млекопи-
тающего
Н2О
Неорганические ионы (Na\ К+,
Mg2+, Са2+, С1“ и т. п.)
Разнообразные низкомолекулярные
метаболиты
Белки
РНК
ДНК
Фосфолипиды
Другие липиды
Полисахариды
70
1
3
15
6
1
2
2
70
18
1Д
0,25
Общий объем клетки
2-10-12 см3
4 • 10 9 см3
* Приведенный состав очень приблизителен, так как резко меняется при измене-
нии условий культивирования.
страта бутират, ацетат или лактат, они образуют с высокой ско-
ростью Ня. Например, при освещенности 10 килолюкс из лактата*
61
с помощью иммобилизованных клеток бактерии получают
348 мкл-ч~7см2 молекулярного водорода. Со штаммом Rhodo-
pseudomonas в Японии из лактата получают молекулярный водо-
род с эффективностью 55—60%. Штамм образует водород при
повышенной температуре, вплоть до 40° С. Процесс водородообра-
зования осуществляют как в лаборатории, так и в природных
условиях.
АНАБОЛИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
С деталями биосинтетических процессов можно познакомиться
® одном из руководств по биохимии.
Большую часть веса сухой биомассы бактерий составляют
полимерные молекулы белков, полинуклеотидов, полисахаридов
(табл. 10).
Для биосинтеза клеточных полимеров необходимы: получение
субъединиц макромолекул из доступных источников, генерация
АТР, активирование субъединиц за счет энергии связи АТР, об-
разование специфических макромолекул путем полимеризации
(дегидратации) активированных субъединиц. Для построения мак-
ромолекул необходимы субъединицы, содержащие от (Д до С6
атомов углерода. Источником Ci служит СО2; С2 в виде молекул
ацетил-СоА (активированного ацетата) образуется в реакциях
гликолиза, который, как и пентозофосфатный цикл, поставляет
также Сз-мономеры. С.гсубъединицы возникают в процессе гете-
ротрофной фиксации СО2 (см. выше), в ЦТК, а также в пентоз-
Рис. 27, Схематическое изображение метаболизма микробов в виде 3 частей:
1 — окислительных реакций, 2 — биосинтетических реакций, 3 — реакций вос-
становления кофакторов (NADH, FADH2) в брожениях и дыхании, где про-
исходит их регенерация (по Zehnder, Swensson, 1986)
62
iii,ix путях, где образуется эритрозо-4-фосфат. Поставщиком С5-мо-
номеров служат реакции пентозофосфатных циклов в ЦТК. С6-са-
хара — обычные, широко распространенные субстраты в виде*
моно-, ди-, три- и олигосахаров, которые большая часть микро-
организмов легко утилизирует. Связь катаболических и анаболи-
ческих реакций схематически представлена на рис. 27. Клеточ-
ный метаболизм условно может быть поделен на 3 части: 1) окис-
лительные реакции, направленные на субстрат и ведущие к обра-
зованию интермедиатов, например ацетил-СоА, пирувата, а-ке-
тоглутаровой кислоты и др., восстановленных кофакторов и АТФ;
2) реакции, в которых кофакторы (NADH2, FADH2) реокисляются
и таким образом регенерируют (это происходит в брожении и
дыхании); 3) биосинтетические реакции, в которых синтезируют-
ся макромолекулы и обычно за счет АТР. Первые 2 части мета-
болизма относятся к катаболизму, а 3-я — к анаболизму.
Большинство реакций биосинтеза требуют энергию; они могут
протекать при сопряжении с другими реакциями, сопровождаю-
щимися выделением большого количества свободной энергии (AG).
Гакова реакция гидролиза АТР, которая характеризуется боль-
шой отрицательной величиной AG. Поэтому АТР служит наибо-
лее важным агентом, активирующим биосинтетические субъеди-
ницы, из которых состоят макромолекулы клеток — белки, поли-
нуклеотиды (DNA, RNA), полисахариды.
За счет энергии гидролиза АТР субъединица переводится в»
высокоэнергетическое промежуточное соединение, способное лег-
ко вступать в реакцию с другим соединением.
Одна из функций метаболизма состоит в регенерации АТР из
продуктов его разложения (nADP и Р$ или АМР + Р—Р). Суще-
ственная функция фотосинтеза, дыхания, гликолиза и брожения —
это обеспечение энер-
гией связей для регене-
рации АТР. Фосфори-
лированные (активи-
рованные) мономеры
собираются в полимер-
ные молекулы путем
многократного повто-
рения реакций дегид-
ратации. Активацию
м о л еку л, уч а ствующих
T а б л и ц а 11
Некоторые коферменты, принимающие участие
в реакциях переноса химических групп
(по Альберте и др., 1986)
Кофермент
Переносимая группа
АТР
в биосинтетических ре-
акциях, может осуще-
ствлять не только АТР,
по и другие специфи-
Кофермент А
Биотин
S-аденозилметионин
IDP-глюкоза
фосфатная
водород + электрон (гид
р ид- ион)
ацетильная
карбоксильная
метильная
глюкоза
ческие молекулы-пере-
носчики (табл. 11).
Подобно .АТР они образуют с другой молекулой высокореак-
ционное промежуточное соединение с лабильной связью. Новая
связь легко расщепляется с выделением свободной энергии, по-
63
этому активированная молекула легко присоединяется к другим
молекулам. Так, при синтезе липидов ацетил-кофермент А (аце-
тил-СоА) переносит ацетильную группу на молекулу растущей
цепи жирной кислоты. Для некоторых биосинтезов необходимы
восстановительные эквиваленты NADH и NADPH, в которых гид-
;рид-ион присоединен высокоэнергетической связью. При разрыве
связи он может быть перенесен на другую молекулу; NADH и
NADPH в таких биосинтетических реакциях служат, по существу,
эквивалентами АТР, например при синтезе глутаминовой кислоты:
а-кетоглутаровая кислота + NH3 4-NADPH—>
—^глутаминовая 4- NADP.
NADH чаще работает с ферментами, катализирующими катабо-
лические реакции, a NADPH — с ферментами биосинтеза. Зна-
чит, путем изменения уровня NADH и NADPH можно независимо
регулировать катаболические и биосинтетические реакции.
Главным поставщиком NADPH служит пентозофосф атный
путь, он образуется также в ЦТК, в пути Энтнера-Дудорова, пен-
тозном фосфокетолазном пути и при фотосинтетическом транс-
порте электронов (см. выше). NADH образуется в ЦТК, в глико-
лизе и других процессах. Подготовка мономеров, например син-
тез аминокислот, компонентов белков, или мононуклеотидов, из
которых состоят RNA и DNA, у бактерий и у эукариотных орга-
низмов мало различается.
ЛИТЕРАТУРА
'Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. М., 1986.
Воробьева Л. И. Техническая микробиология. М., 1986.
Иванов В. Н„ С т а б н и к о в а Е. В. Стехиометрия и энергетика микробио-
логических процессов. Киев, 1987. С. 3—137.
.Allen М. М. Oxygenic photosynthesis in prokaryotes//Bact. in Nature. 1985.
Vol. 1. P. 133—153.
Deha ye L. Methan fermentation Ducellier isman process//Bioenergy 84. Proc.
Int. Conf. Goteborg. London. 1985. Vol. 3. P. 440—441.
D о e 11 e H. W. Bacterial metabolism. N. Y.; London, 1969.
Gibson D. T. Microbial metabolism//React. a. Progress. 1980. P. 161—192.
Gottschalk G. The anaerobic way of life of prokaryotes//Prokaryotes. Berlin,
1981. Vol. 2, Ch. 115. P. 1415—1424.
'Hamilton W. A. Sulfate—reducing bacteria and anaerobic corrosion//Ann.
Rev. Microb. 1985. Vol. 39. P. 195—217.
‘Haslam E. Secondary metabolism — facts and fiction//Natur. Prod. Rept. 1986.
Vol. 3. P. 217—249.
Mak K. A., Smith M. K. The methanogenic bacteria//The Prokaryotes. 1981.
Ch. 76. P. 948—977.
Payne W. L., G г о n f M. A. Overview of denitrification//Gen. eng. of Symb.
Nitrogen fixation a. concentration of fixet nitrogen. 1981. P. 411—426.
P f e n n i c N. Stages in the recognition of bacteria using light as a souree of
energy//Bact in Nature. 1985. Vol. 1. P. 113—131.
Pirt S. Fermentation — a question of life//Adv. in Biotechnol. 1981. Vol. 3.
P. 241—246.
Stanier R. Y. e. a. Introduction to the phototrophic Prokaryotes//The Prokaryo-
tes. 1981. Vol. 1, Ch.7. P. 197—211.
Zehnder L. B., Svensson В. H. Life without oxygen: what can and what
cannot?//Experientia. 1986. N 4. P. 1197—1204.
ГЛАВА II
РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Одна из главных задач промышленной микробиологии — уве-
личение выхода целевого продукта (клеточной массы, внутрикле-
точных или внеклеточных продуктов), точнее, увеличение выхода
продукта по отношению к потребленному субстрату (субстратам).
Выход продукта по отношению к использованному субстрату на-
зывают экономическим коэффициентом У (У — от английского
слова yeald — выход, урожай). Чем выше У, тем выше продук-
тивность биотехнологического процесса. При низкой продуктив-
ности производство оказывается нерентабельным и неконкуренто-
способным.
Экономический коэффициент рассчитывают по источнику угле-
рода, энергии, фосфора, азота, но наиболее важный стехиомет-
рический показатель для большинства микробиологических про-
изводств — это экономический показатель по источнику углерода.
Гены бактерий репрессированы на 90—95%, значит, только
путем снятия естественной репрессии можно заставить микроб
выражать себя более полно, например синтезировать новые веще-
ства, усваивать ранее не утилизируемые субстраты или значи-
тельно увеличить выход практически ценного продукта, т. е. ва-
жен сверхсинтез.
Под сверхсинтезом поним ают такое производство продукта,
которое не требуется для роста самого продуцента. Следователь-
но, эти продукты возникают при замедлении роста. Некоторые
их относят ко вторичным метаболитам. При неполной лимита-
ции роста питательными продуктами рост невозможен, а синтез
продукта возможен.
Ослабление или полное нарушение регуляции синтеза (дегра-
дации) определенного продукта у промышленных штаммов мож-
но вызвать искусственно, изменяя или нарушая работу регуляци-
онной системы.
Изменение регуляции метаболизма возможно двумя путями:
генетическим и физиологическим (не затрагивающим генетики ор-
ганизма). Изменение генетики штамма производят путем мута-
генеза с последующей селекцией и отбором мутанта и использо-
вания современных рекомбинационных методов генетической и
клеточной инженерии. Мутационные методы отличаются большой
трудоемкостью, а получаемые мутанты подвержены реверсии. Ген-
но-инженерные штаммы еще более нестабильны, так как клетка
3 Л. И. Воробьева
65
старается освободиться от лишнего, введенного в нее генетиче-
ского материала, если отсутствуют селективные преимущества.
Дело в том, что синтез белка связан с затратой большого коли-
чества энергии (большего, чем синтез других полимеров). Поэтому
если чужеродный белок составляет, например, 10% от общих бел-
ков клетки, то и скорость роста соответственно снижается на 10%
по сравнению с исходным
штаммом.
Показателен такой
пример
в кишечную палочку ввели гены соматостатина, присоединив их
к р-галактозидазным генам (чтобы гены высших эукариот могли
транскрибироваться и транслироваться в бактерии). Но посколь-
ку образование кишечной палочкой сложного белка р-галактози-
до-соматостатина не имело для нее физиологического значения, она
вообще перестала синтезировать полную р-галактозидазную мо-
лекулу. Правда есть такие задачи биотехнологии, которые можно
решить только с помощью генно-инженерных штаммов. Тогда эти
трудности приходится преодолевать. Например, человеческие бел-
ки получают с помощью рекомбинантных штаммов бактерий и
дрожжей, поскольку источники таких белков дороги или мало-
доступны, а получение их в культуре тканевых клеток млекопи-
тающих пока еще не разработано достаточно хорошо. Что каса-
ется продуктов микробного происхождения, то увеличить их вы-
ход при сохранении стабильности можно физиологическим подхо-
дом. Для этого нужно знать физиологическое значение соответст-
вующего процесса для продуцента, путь синтеза метаболита и
оптимальные условия его синтеза. Эти условия обычно изучают
при хемостатном культивировании, когда варьируют только один
изучаемый фактор, сохраняя другие на постоянном уровне. На-
ряду с большим разнообразием ответных реакций микроорганиз-
мов на изменения в окружающей среде (/, pH, рО2 и др.) уста-
новлены некоторые общие закономерности, основанные на наблю-
дениях за поведением микробов в природе и подтвержденные по-
том в лабораторных исследованиях.
Скорость роста популяции
и синтез продукта
Если синтез продуктов связан с ростом микроба, то основной
путь увеличения продуктивности должен быть направлен на до-
стижение высокой удельной скорости роста. Поэтому важно знать*
какие факторы увеличивают скорость роста микроорганизмов.
В природных условиях микроорганизмы обычно ограничены пи-
тательными факторами: С, N, Р, и эволюционно возникли-, формы*
которые при таких ограниченных возможностях растут с макси-
мальной скоростью. Это достигается за счет очень высокого срод-
ства системы поглощения к
поглощаемому дефицитному веществу
1 Значения для различных источников С примерно 1 —10 мг/л. Значит, клет-
ка может расти с максимальной скоростью (цМакс), если концентрация ис-
точника С находится в избытке и составляет 10 Ks, или 10—100 мг/л.
66
а также за счет синтеза большего количества соответствующих
ферментов или увеличения цмакс и, наконец, благодаря интенсив-
ному начальному метаболизму вещества, проникшего в клетки
при условии низкой концентрации этого вещества в клетке. Такая
закономерность наблюдалась и в проточной культуре. С увеличе-
нием скорости роста Zymomonas mobilis в углеродлимитированной
среде выход этанола увеличивается.
Если синтез продуктов не связан непосредственно с ростом
культуры, то для получения высокого выхода продукта придер-
живаются другой тактики. Чтобы большая часть субстрата пре-
вращалась в целевой продукт, культуру длительное время под-
держивают в состоянии разобщенного роста. Например, выращи-
вая культуру пропионовокислых бактерий при высокой кислот-
ности или щелочности или при высоком содержании лактата (суб-
страта), получают высокий выход летучих кислот — пропионовой
н уксусной.
Внутриклеточная регуляция при разобщенном росте направ-
лена на поддержание высокой скорости катаболических реакций,
поскольку, как было установлено, эффективность образования
энергии (показано на аэробах) уменьшается, происходит рассеи-
вание энергии в реакциях, не связанных с биосинтезом; могут
происходить выброс не полностью окисленных интермедиатов и
гспловыделение.
Другие общие принципы
физиологической регуляции метабо-
лизма с целью достижения сверхсинтеза. К ним относятся: отсут-
ствие строгой регуляции поглощения источника углерода; нали-
чие высокой проницаемости цитоплазматической мембраны по
отношению к метаболиту, поскольку это будет определять степень
экскреции вещества; подбор специального организма, так как
регуляция метаболизма и проницаемость мембраны варьируют
у разных организмов.
Сверхсинтез специфического продукта зависит от природы ро-
Эта зависимость обусловлена тем,
столимитирующего
актора.
что лимитирующий фактор определяет узкое место в метаболиз-
ме, обход которого приводит к особому типу сверхсинтеза. При-
ведем примеры. Когда Klebsiella aerogenes 418 выращивали в
среде с маннитом, глицерином и лактатом в сульфатлимитирован-
пой среде, то пируват не образовывался, а при выращивании в
среде с глюкозой — образовывался. Почему? Потому что при де-
фиците серы не синтезируются серосодержащие кофакторы пиру-
ва гдегидрогеназной системы: тиаминпирофосфат, линолевая кис-
лота и кофермент А. Дефицит по тиаминпирофосфату приводит к
экскреции пирувата микроорганизмами. Глюкоза может оказы-
вать катаболитное действие на синтез пируватдегидрогеназы. Ман-
нит, глицерин и лактат используются с меньшей скоростью, чем
глюкоза, поэтому сульфатлимитированные культуры, выросшие
па таких источниках углерода, не образуют пируват.
Роль природы ростолимитирующего фактора была показана
в регуляции метаболизма Streptococcus faecalis, который культи-
67
вировали в хемостате анаэробно в синтетической среде с глюко-
зой или триптофаном как ростолимитирующими факторами. Если, я
рост лимитировался глюкозой, то скорость поглощения глюкозы I
была ниже, чем в том случае, если рост лимитировался трипто-
фаном. При лимитировании роста триптофаном поглощение глю- I
козы оставалось постоянным при всех скоростях роста, а обра- Я
зование лактата увеличилось при увеличении скорости роста. Зна- Я
чит, степень глюкозного катаболизма не контролируется скоростью Я
роста и в условиях роста, не лимитированного источником угле- Я
рода, должны существовать энергетические spilling реакции. Я
С помощью определенного лимитирующего фактора можно полу- Я
чить определенный метаболит. При лимитации роста К/, aeroge- Я
nes фосфором 40% глюкозы превращается в а-кетоглутарат. Я
Природа ростолимитирующего фактора оказывает влияние и I
на химический состав клеток путем перераспределения потоков I
метаболитов. Например, лимитация среды по азоту приводит к а
значительной аккумуляции внутриклеточных запасных веществ, а
Следствием лимита по фосфору является замена тейхоевых кис- а
лот на тейхуроновые в клеточных стенках грамположительных а
бактерий, а фосфолипиды замещаются на орнитинсодержащие ли- а
пиды и кислые гликолипиды у морских Pseudomonas fluorescent 1
Синтез метаболитов увеличивается за счет снижения непродуктив- 1
ных затрат субстрата и энергии. а
Ю. Э. Швинка подытожил следующим образом непродуктив- 1
ные затраты энергии у микроорганизмов. Она расходуется на син- I
тез побочных продуктов при быстром размножении, на поддержа- I
ние клеточной целостности и жизнеспособности и на поддержание I
высокой скорости катаболизма при разобщенном росте. У быстро- 1
растущих организмов возможно образование и резервных побоч- I
ных продуктов (нуклеиновых кислот, поли->р-оксобутирата, напри- I
мер водородных бактерий, гликогена у дрожжей). I
Непродуктивные затраты увеличиваются в экстремальных ус- I
ловиях и могут быть снижены путем оптимизации условий куль- I
тивирования. Разобщенность анаболических и катаболических I
процессов вызывается дефицитом по элементам питания при не- ]
благоприятном pH. При этом (см. выше, наличие токсических ве- 1
ществ) катаболизм продолжается с той же или более высокой ]
скоростью, а анаболические процессы замедляются. В отличие от 1
субстратного фосфорилирования, в котором количество образован- |
ного АТР постоянно независимо от условий выращивания микро-
организмов, окислительное фосфорилирование очень сильно зави- j
сит от природы субстрата — источника энергии, вида микроба и j
условий его культивирования. Часть электронов переносится на
кислород, минуя те места в ЭТЦ, где происходит синтез АТР,—• ,
это цианидрезистентное дыхание. Оно получило такое название в
связи с тем, что не ингибируется цианидом в отличие от основного
пути транспорта электронов. У бактерий цианидрезистентные пути
могут быть сильно развиты: они позволяют регенерировать NAD и
уменьшают выход АТР. Активирование цианидрезистентного ды-
68
хания увеличивает непродуктивные расходы и экономический ко-
эффициент снижается. Путем ингибирования цианидрезистентного
дыхания салицилгидроксаматом у культуры Brevibacterium flavum
удалось увеличить выход лизина. Столь же важно удаление кис-
лорода из среды при брожении Zymomonas mobilis, иначе часть
энергии и субстрата бактерии расходуют на создание защиты от
кислорода: синтез NADH- и NADPH-оксидаз, супероксиддисмута-
зы, пероксидазы, каталазы, поэтому в аэробных условиях выход
этанола сильно снижен.
Экономия органического субстрата за счет миксотрофии. На-
блюдения показывают, что если микроорганизмы располагают бо-
лее чем одним типом субстрата, то они обычно метаболизируют
тот из них, который поддерживает наиболее высокую скорость рос-
та, так как другие ферменты репрессированы. Такое свойство не
полезно для жизни в естественных условиях, где питательных ве-
ществ, как правило, мало, поэтому в природе должны отбираться
формы, которые могут одновременно утилизировать несколько
субстратов. Действительно, известны многие организмы, одновре-
менно утилизирующие два субстрата, если их концентрации не-
высокие. В этих условиях катаболическая репрессия многих ката-
болических ферментов снижена. Используя смесь сахарозы и аце-
тата (подпитка) в соотношении 3,6 : 1 (по массе), был получен вы-
ход лизина у Br. flavum на 19% более высокий, чем при исполь-
зовании только сахарозы. Экономии органического субстрата до-
стигли на основе миксотрофии. Клетки синтезировали лизин, ути-
лизируя органический источник углерода и водород.
Микроорганизмы могут использовать одновременно смесь ак-
цепторов электронов. Hyphomicrobium X. растет в минеральной
среде, содержащей диметиламин, аэробно и анаэробно с нитрата-
ми. Денитрификация имела место и в аэробных условиях, если
скорость роста сохранялась низкой. Поэтому в аэробных почвах
обнаруживают активные нитратредуктазы.
В метаболической регуляции принимают участие мембранно-
связанные процессы. Непродуктивные затраты увеличиваются при
повышении проницаемости мембран для Н+ Недиссоциированные
кислоты проникают в мембрану и действуют подобно протонофо-
рам, т. е. уменьшают трансмембранный потенциал ионов водоро-
да, что может привести к полной остановке метаболизма. Протон-
движущая сила необходима для осуществления ряда жизненно
важных процессов (см. ниже), в том числе она требуется для
эпергизованного поглощения ряда аминокислот (у Str. cremoris)
п возможно для поддержания внутриклеточного пула этих соеди-
нений. Репрессию синтеза аминокислот и экзоферментов связыва-
ют с энергетическим статусом клетки. Показано, что репрессию
синтеза экзоферментов можно преодолеть в железо- или кисло-
родлимитированной среде. У Ps. aeruginosae отмечалась отрица-
тельная корреляция между величиной протондвижущей силы и
количеством экзопротеазы. Снижение протондвижущей силы при-
водило к увеличению образования экзопротеазы. Такой механизм
69
создает соответствие между уровнем утилизируемого субстрата, ;
количеством образуемого фермента и скоростью роста. Необходи-
мо дальнейшее изучение роли мембранно-связанных процессов в
регуляции метаболизма у микробов. Это особенно важно в связи
с тем, что цитоплазматическая мембрана является главным барь-
ером между содержанием клетки и ее окружением. Многие изме-
нения в окружающей среде вначале влияют на электрохимичес-
кий градиент протонов поперек мембраны, и возможно, что изме-
нение этого градиента служит первопричиной
енотипического от-
вета микробных клеток.
Нарушение сопряженности окисления и фосфорилирования. Со-
пряжение нарушается, например, под действием недиссоциирован-
ных кислот, проникающих в клетку. Поэтому внеклеточная кон-
центрация недиссоциированной уксусной кислоты имеет критичес-
кое значение для клетки. Культура Candida utilis при росте в ам-
монийлимитированной среде вымывается при pH 4,8, так как рКа
уксусной кислоты 4,76. Уксусная кислота действует как динитро-
фенол, нарушающий сопряжение окисления и фосфорилирования.
Так же ведут себя и другие слабые кислоты, если у них имеется
достаточная растворимость в биологических мембранах, а рКа ле-
жит в той же области, что и уксусной кислоты. Поэтому говорят,
что организмы, образующие уксусную кислоту, сами себя убива-
ют. Токсическое действие кислоты можно избежать в диализируе-
мой культуре. Так, в диализируемой культуре Е. со И получал к
140—150 г/л сухих клеток, а без диализа — только 30—50 г/л. По
этому диализ относят к одному из полезных, усовершенствованных
способов культивирования микробов, хотя он и не получил пока
применения в промышленности.
Мы рассмотрели лишь некоторые факторы, но существует мно-
го параметров окружающей среды, которые оказывают влияние на
сверхсинтез продуктов у разных штаммов в зависимости от содер-
жания и свойств ферментов, проницаемости мембран, питательных
потребностей и типа энергетического метаболизма микроба (фото-
синтез, брожение или дыхание). Но все-таки можно указать на
некоторое единство в типе поведения микробов, растущих в усло-
виях лимитирования питательными веществами.
Физико-химические
акторы
и
и синтез метаболитов
Микроорганизмы осуществляют сверхпродукцию метаболитов
в том случае, когда создаются особые окружающие условия и
сверхпродукция для микроорганизмов есть способ решения своих
физиологических проблем. Значение pH. Микроорганизмы в целом
растут в широких пределах pH 1—11, хотя вида, который мог бы
расти в столь широком пределе pH, не существует. Оптимум pH
для большей части бактерий 6,5—7,5. Ниже значения pH 5,0 и
выше 8,5 бактерии растут плохо. Исключение составляют уксус-
нокислые и серуокисляющие бактерии. Дрожжи предпочитают
значение pH 4—5,0 и растут в области pH 2,5—8,5. Предпочтение
70
дрожжами низких значений pH обусловливает их преимущества
перед бактериями, так как предохраняет их от бактериального за-
ражения в промышленности. У плесневых грибов оптимум pH
обычно 5,0—7,0, но, как и дрожжи, они могут выдерживать широ-
кие пределы pH 3,0—8,5. Между величиной pH и температурой
имеется взаимосвязь. Если температуру при росте увеличивают,
то предел переносимых значений pH сужается.
У ацидофилов внутри клетки pH 6,0—7,0, у алкалофилов —
9,0—10,0 и у нейтрафилов — 7,5. Известен ряд механизмов, под-
держивающих внутриклеточное значение pH: 1) первичные про-
гонные насосы, способствующие увеличению внутриклеточного
pH; 2) Na+/H+ — антипортовая система, которая выкачивает Na+
и возвращает Н+ в клетку; 3) К+/Н+ — антипортовая система, ко-
торая выкачивает К+ в обмен на Н+. Вклад каждого из механиз-
мов в создание благоприятного внутриклеточного pH неясен. Но
хорошо известно, что значение pH среды оказывает сильное влия-
Значения.рН культуры
ние на микробный рост и мета-
болизм. При низком значении pH'
энтеробактерии образуют боль-
ше нейтральных продуктов, а в
20 25 30 35 40
Температура (°C)
Рис. 29. Влияние температуры на из-
быточный метаболизм Klebsiella aero-
genes, лимитированной по аммонию
(D==0,17 ч"1, pH 6,8); 1 — глюкоза,
2 — кетоглутарат, 3 •— пируват, 4 —
ацетат, 5 — полисахарид (в глюкоз-
ных эквивалентах) (по Dense М. е. а.,
1979)
Гис. 28. Влияние значения pH на
избыточный метаболизм Klebsiel-
la aerogenes, лимитированной по
аммонию (D“--0,l ч"1, 35°С): 1 —
глюкоза, 2 — 2-кетоглютарат,
3 — пируват, 4 — ацетат (по
Dense et al., 1979)
щелочных условиях — больше кислых. Известно, что активность
формиатдегидрогеназы выше при низком значении pH у тех же
бактерий, поэтому в щелочной среде формиат не расщепляется на
71
С02 и Н2, что способствует созданию более благоприятного для
клеток pH. Подобных примеров много. Влияние значений pH на
синтез метаболитов культурой Л7. aerogenes, лимитированной по
аммонию, показано на рис. 28. Удельная скорость синтеза ацета-
та у К/, aerogenes увеличивается с увеличением pH, а продукция
а-кетоглутарата и пирувата не имела такой явной тенденции. Об-
щая удельная скорость образования кислот увеличивается с уве-
личением pH: при pH 5,0 образовано 1,9 ммоля• г"1 -ч"1 кислот, а
при pH 7,7 -4 ммоля• г"1-ч-1.
Контроль за поддержанием pH важен не только для создания
оптимальных условий для образования продукта, он также важен
для оценки средств контроля pH. Например, известно, что изме-
нение pH происходит в ответ на утилизацию микробом NH4+, при
этом выделяется Н+. Последний утилизируется при метаболизме
NO3" с использованием аминокислот как источников углерода.
Значит, путем управляемого контролирования pH можно иметь
качественное и количественное представление о ферментации.
Поддержание нужного pH титрованием также существенно в
отношении изменения окружающих условий. Если для нейтрали-
зации кислот используют аммоний, то может развиться аммоний-
ная токсичность. Если для той же цели используют NaOH или
Са(ОН)2, необходима предосторожность в связи с тем, что эти
титранты оказывают влияние на ионную силу, а также на раст-
воримость продукта. Поэтому поддержание и контролирование
величины pH в промышленности имеет важное критическое зна-
чение. Необходимо также учитывать, что оптимум pH для роста
и образования продукта необязательно одинаков.
Обнаружено, что при частой смене pH (с интервалом в не-
сколько минут) от оптимального значения к ингибирующему за-
ставляет дрожжи рода Candida больше субстрата превращать в
биомассу, чем при росте при постоянном оптимальном pH.
Температура. Каждый организм растет в определенных темпе-
ратурных пределах. Температурный фактор оказывает влияние на
максимальную скорость роста, макромолекулярный состав и уров-
ни внутри- и внеклеточных метаболитов. Сверхпродукция метабо-
литов также определяется температурой. Скорость роста медлен-
но увеличивается с увеличением температуры по достижению мак-
симальной скорости роста. При t, превышающей максимальную,
скорость роста быстро снижается при дальнейшем увеличении t.
Температура оказывает влияние на эффективность конверсии суб-
страта в клеточную массу. Максимальная степень конверсии имеет
место при t, которая обычно ниже Z, обеспечивающей максималь-
ную скорость роста. Это важно знать при оптимизации процесса,
когда нужно максимизировать скорость роста, но не выход био-
массы. Важность установления оптимальной для данного процес-
са температуры обусловлена еще и тем, что в любом промышлен-
ном процессе ферментеры разогреваются в результате микробно-
го метаболизма, а охлаждение требует больших экономических
затрат.
72
Температурный режим оказывает влияние на выбор организ-
мом того или иного метаболического пути. Например, психотроп-
ный штамм Bacillus cereus может сбраживать глюкозу по двум
путям: гликолитическому и пентозофосфатному. Когда темпера-
туру снижали с 32° до 7° С, то глюкоза метаболизировалась глав-
ным образом по пентозофосфатному пути, а сдвиг температуры в
более высокую область ( — 32°) включал в работу ферменты гли-
колитического пути. Или клетки поздней логарифмической фазы,
выращенные при 20° и 7° С, могут окислять ацетат до СО2, а вы-
ращенные при 32° — не могут.
При избытке глюкозы Вас. cereus при 32° образует ацетат, лак-
тат, пируват и немного этанола, при снижении температуры до
20° и далее до 7° выход продуктов снижался соответственно до
20 и 75%, но доля этанола увеличивалась при снижении темпера-
туры, доля пирувата сохранялась, а лактата и особенно ацета-
та— сильно снижалась. Эти эксперименты проводились с перио-
дической культурой, поэтому на соотношение и выход продуктов
могла оказывать также влияние и величина pH. Влияние темпе-
ратуры на выход продуктов изучалось в проточной культуре 1(1.
pneumoniae (рис. 29).
При увеличении температуры с 20 до 40° выход ацетата и
2-кетоглутарата снижался, а выход экзополисахаридов подчинял-
ся другой зависимости: при снижении t с 40 до 35° он уменьшал-
ся, но при t ниже 35° снова увеличивался. В общем, считают,
что низкие температуры снижают транспорт и диффузию солей
через биологические мембраны и еще чаще снижают энзиматиче-
скую активность. Более высокие температуры стимулируют про-
дукцию метаболитов.
Температура оказывает влияние и на внутриклеточный состав.
Ps. sp — облигатный морской психрофил. При оптимальной t=
~14°С в хемостате в лактатлимитированной среде при различных
скоростях разведения наблюдали линейную зависимость между
содержанием в клетках RNA и скоростью разведения. Если t сни-
жалась, то сильно увеличивались содержание RNA и дыхатель-
ная способность клеток. Влияние t на содержание RNA отражает
ее влияние на скорость синтеза белка и необходимость поддержа-
ния данной скорости синтеза белка, что позволяет поддерживать
данную скорость роста. При оптимизации процесса важно пом-
нить, что t может оказывать различное влияние на скорость рос-
та и синтез продукта. Поэтому эти два объективных фактора дол-
жны оптимизироваться независимо.
Ионная сила. Сильное увеличение концентрации NaCl равно-
сильно удалению воды из цитоплазмы \ но и оно продолжается до
1 Увеличение концентрации глюкозы вызывает частичную дегидратацию клеток
и понижает скорость роста; причем бактерии, более чувствительны к осмоти-
ческому давлению, чем дрожжи и плесневые грибы. . ... .. .....
73
тех пор, пока осмотическое давление внутри и вне клетки не срав-
няется.
Метаболическая реакция организма на осмотическое давление
может быть одной из двух: либо организм переносит соли (осо-
бенно катионы) из среды через цитоплазматическую мембрану в
цитоплазму — это снимает первоначальную разницу в осмолярно-
сти, либо синтезирует в клетке органические вещества, которые
проявляют тот же эффект.
Осморегуляторные механизмы могут вовлекать одно или не-
сколько из 5 главных групп веществ, а именно неорганические
ионы, аминокислоты, дисахариды, полиолы и бетаины. Неоргани-
ческие ионы, особенно ионы К+, служат важными осморегулято-
рами у морских и галофильных бактерий, а для пресноводных
микроорганизмов главное значение имеют К! и органические ве-
щества. В ответ на увеличение концентрации NaCl в среде (от 0—
4% вес/объем) у Д7. aerogenes в клетках в 3 раза увеличилось
содержание К+ и заметно выросло количество глутамата. След-
ствием добавления NaCl к среде служит выход Н+ Это вызыва-
ет активацию глутаматдегидрогеназы — фермента, который имеет
оптимум pH 8,0, поэтому синтез глутаминовой кислоты усиливает
ся. У прокариотных фототрофов органические вещества служат
главными осморегуляторами. У Ectothiorhodospira halochloris ак-
кумулируется бетаин, а у морских цианобактерий — глюкопира-
нозил глицерин.
Эукариотические микроводоросли тоже регулируют осмотичес-
кое давление путем аккумуляции органических соединений. Среди
таких соединений могут быть сахара (например, сахароза) и по-
лиолы — глицерин, маннит и гликозилглицерин. Эта группа ве-
ществ имеет значение в регуляции осмотического давления и у
дрожжей. Органические осмотики кроме роли в осморегуляции
обладают полезным свойством совместимости в клетке. У них ма-
ленький ингибиторный эффект при высокой концентрации, они за-
щищают ферменты от ингибиторного действия высоких концентра-
ций неорганических ионов, которые могут временно аккумулиро-
ваться в цитоплазме.
Существует много других факторов, вызывающих изменение
метаболизма: добавления к бродящей культуре соответствующего
акцептора для восстановленных эквивалентов может изменить ход
брожения, добавление некоторых специфических ингибиторов не-
которых ферментов может вызывать побочные реакции у микро-
организма, изменяя ход метаболизма. Такой же эффект наблю-
дался даже при простом прикреплении клеток к поверхности.
Приведенные примеры, составляющие малую долю тех физио-
логических возможностей, которыми потенциально обладают мик-
роорганизмы, показывают, что сильное увлечение генно-инженер-
ными работами, не должно предавать забвению физиологические
методы управления микробным метаболизмом.
В основе физиологических изменений метаболизма лежат из-
менения активности и уровня синтеза ферментов.
74
Регуляция активности ферментов
Этот тип контроля позволяет организму быстро отреагировать
па изменившиеся условия. Известны 3 главных механизма: моду-
ляция фермента (ретроингибирование), ковалентная модифика-
ция, селективная инактивация.
Модуляция. Большая часть ферментов подчиняется модуляци-
онному типу контроля — это аллостерические ферменты и их ак-
тивность изменяется в ответ на присутствие низкомолекулярных
эффекторных молекул. Это обычный контрольный механизм био-
синтетических путей, например, в синтезе аминокислот, когда ко-
нечный продукт ингибирует первый фермент неконкурентно. Так
происходит контроль в неразветвленных путях. В разветвленных
путях ретроингибирование первого общего фермента одним из ко-
нечных продуктов будет оказывать влияние на выход более чем
одного продукта. В разветвленных путях обнаружены различные
типы ингибирования.
1. Конечный продукт ингибирует первый фермент в каждом
случае после точки разветвления.
2. Первая ступень общего синтетического пути катализируется
несколькими изоэнзимами, каждый из которых может регулиро-
ваться независимо.
3. Первый общий фермент в разветвленном биосинтетическом
пути ингибируется при условии накопления избытка всех конеч-
ных продуктов (мультивалентное ингибирование).
4. Каждый конечный продукт действует как ингибитор, прояв-
ляется коммулятивное ингибирование.
Ковалентная модификация и селективная инактивация реже
встречаются у прокариот, чем у эукариот. При ковалентной моди-
фикации происходит взаимопревращение двух форм ферментов пу-
тем ковалентного присоединения или удаления ацетила, адениль-
ной или фосфорильной группы и др. Например, активность глута-
минсинтетазы у многих бактерий регулируется через обратимое
энзиматическое аденилирование и деаденилирование, что зависит
от азотного статуса клетки. Если в клетке мало азота, то уровень
фермента увеличивается и он находится главным образом в своей
активной деаденилированной форме. Если клетки растут с из-
бытком аммония, фермент находится в аденилированной форме,
которая не может катализировать образование глутамина. Обе
формы фермента также различаются по чувствительности к мо-
дуляции различными эффекторами.
Селективная инактивация ферментов часто наблюдается, ког-
да организм адаптируется к изменению в составе питательных ве-
ществ, например появляется новый источник углерода или азота.
В таких случаях каталитическая активность ферментов быстро и
необратимо теряется при модификации ферментов или просто при
(‘го разложении. Например, когда Saccharomyces cerevisiae пере-
носят из ацетатной среды в глюкозную, то происходит инактива-
ция фермента — это катаболитная регуляция. Или другой хоро-
75
шо известный пример с дрожжами. Когда дрожжи переходят в
стационарную фазу роста, триптофансинтетаза разрушается с по-
мощью специфической протеазы.
Регуляция посредством запаса энергии это ретроингибитор-
ная регуляция ферментов катаболических (и анаболических) пу-
тей, в которых АТР является главным продуктом. Электрический
заряд (ЭЗ) рассчитывают так:
эз (АТР)+ 0,5(АРР)
(АМР) + (ADP) + (АТР) ’
ЭЗ находится в пределах от 0 до 1,0. Если ЭЗ высокий, то ак-
тивность ферментов, вовлеченных в синтез АТР, ингибируется, на-
пример, изоцитратдегидрогеназа ингибируется, когда ЭЗ>0,8.
Напротив, активность анаболических ферментов, например ас-
партокиназы, работа которой связана с утилизацией АТР, стиму-
лируется высоким энергетическим зарядом.
Таким образом, изменение интенсивности катаболизма может
вызывать увеличение или снижение активности многих ферментов,
поскольку катаболические процессы определяют выход АТР, и
следовательно ЭЗ.
Регуляция синтеза ферментов
Механизм индукции. В присутствии утилизируемого углерод-
ного или азотного субстрата скорость синтеза ферментов, вовлека-
емых в их метаболизм, увеличивается. Механизм индукции — уни-
версальный контрольный механизм для катаболических путей.
Он состоит в том, что сигнальный метаболит (индуктор) связыва-
ется с белком-репрессором, который в свою очередь может бло-
кировать инициацию транскрипции соответствующих генов. Иног-
да индуктором служит не субстрат первого фермента, но один из
ранних продуктов метаболизма или побочных продукт.
Механизм репрессии выражается в том, что в присутствии ко-
нечных продуктов синтез ферментов, вовлекаемых в биосинтез
клеточных мономеров или их предшественников, снижается неза-
висимо от того, находится ли конечный продукт в клетке или в
среде. Репрессия вызывает снижение частоты инициации транс-
крипции. Избыток конечного продукта, репрессирующего синтез
ферментов, действует как корепрессор.
Синтез различных конститутивных ферментов прямо связан с
концентрацией циклических нуклеотидов.
Аттенюация. Кроме этих основных механизмов может иметь
значение аутогенная регуляция, когда фермент контролирует свой
собственный синтез и аттенюацию. В последнем случае начатая
транскрипция может быть прекращена раньше, чем будут полно-
стью транскрибированы регуляторные гены. Согласно модели ат-
тенюатора скорость транскрипции оперона регулируется вторич-
ной структурой лидерной последовательности во вновь синтезиро-
ванной mRNA. Она (структура) определяет, будет ли продолже-
76
на транскрипция оперона RNA-полимеразой или прекращена. Этот
механизм может работать в дополнение к механизму репрессии.
В регуляции и экспрессии многих генов важная роль принад-
лежит гуанозинтетрафосфату (ppGpp-гуанозин б'-дифосфат-З' ди-
фосфат). Особенно важен сигнал о голодании по незаменимым
аминокислотам, который получает клетка в виде аккумуляции
ppGpp. В таком случае нарушается транскрипция генов, кодиру-
ющих RNA, рибосомные белки и, возможно, другие белки белок-
синтезирующей системы, поэтому говорят, что ppGpp служит не-
гативным эффектором рибосомного синтеза. Первичной мишенью
в регуляции транскрипции, видимо, является RNA-полимераза.
In vitro в контроль промоторов селективности RNA-полимеразы
вовлекаются 3 системы: аденин-нуклеотидная пара (АТР, АМР),
гуанин-нуклеотидная пара (ppGpp, GTP) и система макромоле-
кулярных эффекторов (EF—Tu, EF—Ts, EF—G, IF—2, [met—
LRNA).
Регуляция синтеза ферментов в присутствии двух субстратов.
В первую очередь утилизируется тот субстрат, который обуслов-
ливает более высокую скорость роста и в его присутствии синтез
ферментов других субстратов репрессирован. Значит, это прояв-
ляется в последовательности утилизации субстратов (бывает не
всегда, см. ниже) и так называемой диауксии роста организма.
Для Е. coll предпочтительным субстратом служит глюкоза, а для
некоторых других бактерий, в том числе некоторых псевдомо-
над, — органические кислоты. Последовательность утилизации
субстрата связана с его транспортом. В первую очередь транс-
портируется предпочтительный субстрат, что также мешает индук-
ции специфических катаболических ферментов второго субстрата.
Это явление называется исключением индуктора.
Кроме механизма «исключение индуктора» у Е. colt и S. ty-
phi работают еще другие механизмы, обеспечивающие блокиро-
вание других ферментов в присутствии глюкозы. У них есть осо-
бый белок — САР (катаболический активаторный белок), кото-
рый связывается с сАМР и только тогда связывается с промото-
ром, допуская инициацию транскрипции. Легко утилизируемый
источник углерода, как глюкоза, индуцирует синтез фермента,
разлагающего сАМР, и тогда САР превращается в неактивную
форму. Таким образом, глюкоза ингибирует синтез mRNA всех
ферментов, требующих САР для биосинтеза. Это называется ка-
таболитной репрессией1. Роль САР для вторичного метаболизма
точно не показана. Чтобы понизить катаболитную репрессию, в
промышленности используют иные, чем глюкоза, источники угле-
рода, а если вносят глюкозу, то порциями, постепенно.
' Существуют и другие типы регуляции метаболизма, связанные с уровнем
глюкозы. Примером служит эффект Крэбтри, проявляемый у дрожжей: если
дрожжи выращивать с высокой концентрацией глюкозы (более 0,15 г/л), то
даже в аэробных условиях они осуществляют анаэробный метаболизм и из
глюкозы образуют этанол.
77
СВЕРХСИНТЕЗ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
Первичные метаболиты. Исходя из вышесказанного сверхсин-
тез может быть достигнут в том случае, когда отсутствует репрес-
сия конечным продуктом. Для этого конечный продукт следует
удалять из среды или работать с мутантами. Для этой цели мо-
гут быть полезны ауксотрофные мутанты, которые утеряли в про-
цессе мутации способность синтезировать конечный продукт. Ко- 1
нечный продукт добавляют в среду в минимальном количестве^
но не вызывающим ингибирования
первого
допускающим
фермента:
рост,
Рис. 30. Сверхпродукция первичных
метаболитов ауксотрофными мутанта-
ми (по Crueger a. Crueger, 1984): 1 —
реакционная ступень, блокированная
благодаря ауксотрофной мутации; 2 —
ретройнгибирование. А — минимальное
добавление Е; Б — минимальное до-
бавление Е и G; В — минимальное до-
бавление J
ступень блокирования при мутации
Ауксотрофные мутанты могут
быть использованы и в раз-
ветвленных биосинтетических
путях (рис. 30).
Другой тип мутантов, с ко-
торыми также можно произ-
водить избыточное количество*
продукта, — это мутанты,,
устойчивые к антиметаболи-
там. У таких мутантов могут
быть мутации в гене-регулято-
ре (7?“-мутанты), в операторе
(Ос-мутанты) или такое изме-
нение в структуре фермента^
что он не способен связать
конечный продукт — во всех
случаях возникают конститу-
тивные мутанты, и следова-
тельно, сверхсинтез.
Третий тип мутантов —
супрессорные мутанты или ре-
вертанты. У них восстановле-
на каталитическая активность
фермента, но отсутствует спо-
собность аллостерически свя-
зывать корепрессор, следова-
тельно, такой штамм тоже не-
чувствителен к конечному про-
дукту.
Вторичные метаболиты. В
синтезе вторичных метаболи-
тов участвуют гены пяти различных классов: 1) структурные гены;
2) регуляторные гены; 3) гены устойчивости продуцента к собст-
78
венным метаболитам; 4) гены проницаемости, они контролируют
поглощение и экскрецию веществ; 5) регуляторные гены, контро-
лирующие первичный метаболизм и таким образом опосредован-
но регулирующие вторичный метаболизм. Поскольку во вторич-
ный метаболизм вовлекается несколько сот генов (в синтез нео-
мицина — 2000 генов) и часто имеется недостаточно данных о пу-
тях биосинтеза, регуляция вторичного метаболизма сильно услож-
няется. Однако известно, что антибиотики ингибируют свой собст-
венный синтез. Поэтому штаммы, устойчивые к пенициллину,
хлорамфениколу, виргинемицину, ристомицину, циклогексимиду,
нуромицину, фунгицидину, стрептомицину, должны обладать по-
вышенной антибиотической продуктивностью.
Биосинтез различных вторичных метаболитов подчиняется так-
же углерод-катаболитной репрессии. Быстро утилизируемые ис-
точники углерода, особенно глюкоза (табл. 12), вызывают инги-
бирование синтеза, усиливая рост биомассы.
Азотная регуляция. Определенный источник азота тоже может
быть предпочтительным перед другими и таковым обычно служит
сульфат аммония. При выра-
щивании KI. aerogenes в сре-
де, содержащей глюкозу,
(NH4)2SO4 и гистидин, послед-
ний подвергается катаболит-
ной репрессии глюкозой. Но
использование органических
азотистых соединений зависит
не только от энергетического
статуса клетки, но также от
азотного (азотная метаболит-
ная репрессия). Установлено,
что продукты генов, близко
связанных со структурным ге-
ном глутаминсинтетазы, вовле-
каются в регуляцию различ-
ных азотконтролирующих ге-
нов Е. coli и S. typhi.
Регуляция фосфором. Фос-
фор (Р,) требуется для роста
в количестве 0,3—300 ммолей.
Для вторичного метаболизма
самая высокая концентрация
— 1 ммоль, а полное инги-
бирование наступает при
10 ммолях Pt. Как Pi контро-
лирует метаболические пути,
Таблица 12
Катаболитная регуляция биосинтеза
антибиотиков
(по Martin, 1978)
Источник углерода
Антибиотик
Пенициллин
Цефамицин
Цефалоспорин С
Актиномицин
Стрептомицин
Индол миц ин
Бацитрацин
Хлорамфеникол
Митомицин
Неомицин
Канамицин
Пуромицин
Новобиоцин
Кандицидин
Кандигексин
ингибирует не ингибирует
глюкоза
глицерин
глюкоза
глюкоза
глюкоза
глюкоза
глюкоза
глюкоза
глюкоза
глюкоза
глюкоза
глюкоза
цитрат
глюкоза
глюкоза
лактоза
подкормка
глюкозой
аспарагин
сахароза
галактоза
маннан и D-
рамноза
фруктоза
цитрат
глицерин
подкормка
глюкозой
мальтоза
галактоза
глицерин
глюкоза
подкормка
глюкозой
то же
точно неясно; в ряде случаев полное потребление из среды Р/
есть условие перехода из трофофазы в идиофазу. Если Pi доба-
вить в конце трофофазы, то можно идиофазу отдалить. Если Р/
внести в идиофазу, то рост микроба продолжится, а синтез анти-
79
I
биотика остановится. Итак, уровень Рг определяет переход про-
дуцента из трофофазы в продуцирующую идиофазу.
Второй механизм фосфорного контроля может быть связан с
ингибированием или репрессией фосфором фосфатаз — фермен-
тов, которые вовлекаются в биосинтез вторичных метаболитов.
Третий механизм работает как переключатель метаболизма: при
избытке Р/ вместо пентозофосфатного или гексозомонофосфатногО
цикла включается гликолиз. NADPH2 становится лимитирующим
фактором в синтезе антибиотиков.
По четвертому механизму Р/ ограничивает индукцию образо-
вания вторичных метаболитов. Некоторые данные показывают,
что фосфорная регуляция происходит опосредованно, через конт-
рольную систему, действующую на уровне транскрипции. Концент-
рация репрессора (Р/) снижается в конце трофофазы, так что
транскрипция генов, кодирующих синтез антибиотика, становится
возможной. Пока неясно, действует ли Pi сам как корепрессор
или он регулирует содержание внутриклеточных эффекторов
(сАМР, АТР, ppGpp или pppGpp).
Промышленное производство вторичных метаболитов, регули-
руемых при участии Pf, осуществляют в условиях лимита Р/, но
стандартная среда, которую обычно применяют в промышленности
при ведении периодического процесса, содержит относительно
много Р/ ( — 2,5 ммолей). Поэтому получают Pi-дерегулированные
мутанты. Например, такие мутанты, полученные из продуцента
кандицидина, образуют более чем на 70% больше антибиотика,
чем дикий тип в исходной среде. Используют также постоянную
подпитку фосфатом.
а
t
ч
г
ЛИТЕРАТУРА
Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности, М., 1986.
Работнова И. Л. Тактика оптимизации микробиологических процессов//
//Антибиотики. 1986. № 7. С. 508—513.
Координация микробного метаболизма//Ферментация и технология ферментов..;;
М„ 19813. С. 9—14. 1
Швинка Ю. А. Физиологические и биотехнологические аспекты регуляции!
выхода продуктов//Изв. АН ЛатвССР. 1984. № 10(447). С. 56—71. •
Demain A., Kennel Y., Aharonowitz Y. Carbon catabolite regulation of \
secondary metabolism//Microbial technology: Current state, future prospects/,4
/Ed. Bull et al. London, 1979. P. 163—185. i
Harder W.} Dijkhuizen L., Veldkamp H. Environmental regulation of.-j
microbial metabolism//37 Symp. of Soc. for General microbiol. 1984. P. 51—**
61. Cambridge.
Mecke rvon Michael. Neue erkenntnisse fiber die regulation der genexpres- ;
sion in Bakterien — Eine Ubersicht//Biol. Zbl. 1987. Vol. 106, N 4. S. 377— :
399.
Neijssel M., Qense M., Tempest D. W. The physiology of metabolite
overproduction//Microbial technology: Current state, future prospects. Lon-
don; N. Y.; Melboune. 1979. P. 53—82,
ГЛАВА III
ОПТИМИЗАЦИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ
ПРОЦЕССОВ
Установление путей и способов регуляции микробного метабо-
лизма необходимо микробиологам для практической работы —
оптимизации процесса с целью получения такого выхода продук-
тов, который обусловливал бы рентабельность производства. Пред-
посылкой для оптимизации процесса служит большое различие
между величиной теоретически возможного и экспериментального
выхода целевого продукта.
Подсчет ведут по элементарному составу субстрата и продук-
та и составляют уравнение элементарного баланса (Иванов, Стаб-
пикова, 1987). Рассчитывают теоретически возможное превраще-
ние субстрата в целевой продукт — Утеор. Далее сравнивают тео-
ретические величины Ух/s или Yp/S (где х— биомасса, а р — про-
дукт) с экспериментальными и оценивают потенциальную про-
дуктивную возможность микроорганизма.
Теоретические расчеты показывают, что получаемые в настоя-
щее время выходы продуктов можно было бы увеличить по край-
ней мере в 2—3 раза. Но известны факты, когда выход антибио-
тика монензина у актиномицетов был увеличен в 30 раз (ЧССР),
а выход миксовиресцина у миксококков (США) — в 50 раз пу-
тем оптимизации условий культивирования.
Чтобы биотехнологическое производство было рентабельным,
важно осуществлять оптимизацию в таком направлении, которое
должно привести к получению максимально высокой объемной
продуктивности (г-л-ч-1), максимально высокой концентрации
продукта (г/л), высокой полноте конверсии субстрата в целевой
продукт, хорошей воспроизводимости процесса.
Почему важны эти показатели?
Поддержание высокой объемной продуктивности позволяет макси-
мально оправдать (вернуть) капиталовложения, что особенно важ-
но при внедрении новых процессов. Необходимость достижения и
поддержания высокой продуктивной концентрации отражает важ-
ность возмещения себестоимости продукта. Высокая полнота пре-
вращения необходима для того, чтобы снизить затраты на сырье,
а также на потребность в кислороде и удалении тепла. И наконец,
высокая воспроизводимость процесса важна потому, что позволя-
ет максимально снизить капитальные и оперативные затраты.
Решение этих задач требует различной стратегии в каждом
конкретном случае, хотя есть и общие принципы.
Общие принципы. Как уже было сказано, микробиологическим
путем получают продукты трех типов: 1) клеточную массу; 2) пер-
37
вичные продукты; 3) вторичные продукты. Поэтому в первую оче®
редь необходимо изучить динамику роста культуры, биосинтезе
продуктов и потребления субстрата. Это позволяет установить®
связь синтеза продукта с ростом культуры, определить параметры®
роста и дать количественную характеристику процессу. Далее не*®
обходимо определить ростолимитирующий фактор, который, как®
мы видели, оказывает решающее влияние на выход целевого про-®
дукта (это может быть С, О2, N, S, Р и др.). Третий этап опти-®
мизации связан с подбором синтетической среды, обеспечивающей®
хороший рост продуцента и не содержащей компонентов, репрес-Я
сирующих синтез целевого продукта. На практике обычно исполь-Я
зуют по возможности недорогую среду, главные компоненты ко*®
торой доступны, а сверхсинтез продукта экономичен. 10—60% I
стоимости продуктов ферментации связаны со стоимостью компо-Я
нентов среды и прежде всего со стоимостью источника углерода;®
В микробиологическом производстве чаще всего используют зла*®
ковый крахмал, мелассы, декстрозу, растительное масло, метанол,®
н-парафины, целлюлозу, лактозу. Если стоимость очистки фермен-Я
тационного продукта велика, то выгоднее использовать более до-1
рогие, но более чистые субстраты: метанол, этанол или уксусную V
кислоту. Ферментацию может сильно удорожить источник азота.,1
Считают, что комплексные азотистые вещества выгоднее исполь-1
зовать, чем аммоний или его соли. Следующий, четвертый, этап |
оптимизации микробиологического процесса — это подбор спосо-1
ба культивирования, наиболее благоприятного для синтеза дан- |
ного продукта. Например, было установлено, что удельная актив- 1
ность мальтазы дрожжей Saccharomyces italicus выше при пе- |
риодическом культивировании, чем при проточном. Причем, за- I
менив сложную среду на синтетическую, удалось не только пони- I
зить стоимость среды, но и оградить фермент мальтазу от даль- 1
нейшей деградации. На пятом этапе важно определить непроиз- 1
водительные затраты (н. п.) субстрата и энергии, которые рас- I
ходуются на иные процессы, чем синтез клеточной массы и целе-
вого продукта: <7н.п=<7эксп—(qxqP), где q — количество любого !
компонента (N, О2, СО2 и др.), х — биомасса, р — продукт. Ведут J
оптимизацию по принципу минимизации непродуктивных затрат i
(Швинка, 1984). Примером оптимизации по принципу минимиза- j
ции непродуктивных затрат может быть значительное увеличение ;
выхода лизина культурой Br. flavum путем максимального сни- *
жения активности цианидрезистентного дыхания, которое сопро-
вождается значительным поглощением кислорода. Направленное
лимитирование и ингибирование метаболизма относятся к опти-
мизации условий для получения вторичных метаболитов, и об
этом говорилось выше. Мощным репрессором синтеза вторичных
метаболитов выступают фосфор и глюкоза, поэтому важно сле-
дить за их концентрацией или вести процесс с другим источником
углерода.
Оптимизация процесса с использованием смешанных культур.
Большую часть промышленных процессов проводят с чистыми мо-
82
1
шжультурами. В ряде случаев смешанное культивирование при-
водит к оптимизации микробиологического процесса по причинам,
приведенным ниже. Например, если применяют смешанное, цел-
люлозосодержащее сырье, то лучше использовать смешанные
культуры. Одни из них утилизируют целлюлозу, другие гемицел-
люлозу, третьи — лигнин; в результате происходит более полное
потребление сырья.
Целлюлоза редко встречается в чистом виде. Это разве что
экстрацеллюлярная капсула Acetobacter xylinum и обезжиренные
волокна хлопка. Причем целлюлоза ингибируется ди- и моноса-
харами. Поэтому в смеси культур, одна из которых гидролизует
целлюлозу с образованием моно- и дисахаров, а другая их удаля-
ет, получают биомассу и этанол с максимальной скоростью, не
достигаемой с монокультурой.
Смешанные культуры используют при очистке отходов, при
анаэробном переваривании отходов для получения СН4. Сущест-
венно то, что с помощью смешанных культур удается более полно
использовать субстрат (или смесь субстратов) и в ряде случаев
иметь более высокие производственные показатели, чем с моно-
культурой. Для получения SCP на среде с метаном использовали
смешанную культуру, состоящую из метилотрофа Methylococcus
и четырех гетеротрофных форм: трех представителей Pseudomonas
sрр. и Mycobacterium sp., не способных утилизировать СН4. В чис-
той культуре Methylococcus при проточном культивировании да-
вал больше пены, был менее стабилен, чем в смеси. Продукты
лизиса клеток: белки, RNA, DNA, липиды и пептиды—утилизиро-
вались сопутствующими бактериями, стабилизирующими культу-
ру. Метилотроф соответствующих гидролитических ферментов не
вмел. Не меньше преимуществ было у ассоциации, растущей на
метаноле (EN — облигатный метилотроф, Curtobacter sp. 1102,
Pseudomonas sp. 11019 и Ps. sp. 11022) перед монокультурой об-
лигатного метилотрофа:
1) проявлялся синергический эффект и увеличивался выход
биомассы. В монокультуре —10% метанола остается неис-
пользованным, в смешанной культуре весь субстрат пре-
вращается в биомассу;
2) ассоциация имела более высокую скорость роста, чем мо-
нокультура;
3) монокультура не обладала стабильностью, а ассоциация
была стабильна;
4) со смешанной культурой было возможно осуществлять ре-
циркуляцию воды, что важно при масштабировании процес-
са получения SCP. С монокультурой рециркуляция невоз-
можна, так как в супернатанте содержатся метаболиты, ко-
торые аккумулируются при рециркуляции. Гетеротрофы по-
требляют все метаболиты, циркулирует чистая вода;
5) монокультура в стационарном состоянии образует много
пены, так что требуется добавление антивспенивателей, ас-
социация пенится слабо или вообще не образует пены, что,
83
видимо, обусловлено различием в содержании органически!
веществ в супернатанте;
6) ассоциация более устойчива к заражению, чем монокульту
ра, и стабильно растет в течение нескольких тысяч часо!
в проточной культуре без стерилизации добавляемой средь!
Еще один пример преимущества ассоциаций. В природном га-
зе присутствуют наряду с СН4 другие газы, которые могут инги
бировать рост метилотрофов. Сопутствующие бактерии удаляю'
вредные газы и увеличивают выход SCP.
Использование смешанных культур позволяет удешевить сре
ду. При использовании чистых субстратов (метанола или крахма
ла) некоторые микроорганизмы требуют ростовых факторов. Мно
гие штаммы Methylomonas methylovora требуют высоких концен
траций тиамина, а дрожжам обычно нужен биотин и тиамин. Пр1
масштабировании эти потребности сильно удорожают производ-
ство. В смешанной культуре продуценты ростовых факторов обес*
печивают нуждающийся в них организм. Известны случаи проч^
ных и производственно ценных ассоциаций, основанных на обеФ
печении главного организма азотом; эти случаи описаны для при1
родных условий. Показано, например, что выщелачивание меди >
никеля с участием Thiobacillus ferrooxidans происходит более эф^
фективно в союзе с ^фиксатором Beijerinkia lacticogenes. Сме*
шанные культуры незаменимы для многоступенчатых трансфор-
маций.
Так, лактоза сыворотки молока превращается лактобациллами
в лактат, который утилизируют Propionibacterium shermanii, син^
тезирующие витамин Bi2, но лактозу самостоятельно не сбражи-
вающие.
Рассмотрим теперь более конкретные приемы, применяемые'
при оптимизации условий для получения клеточной массы, про-?
дуктов первичной и вторичной фаз роста. !
Получение биомассы. Хлебопекарные дрожжи. Оптимизация]
условий для получения биомассы связана с хемостатным культи-
вированием, с большими скоростями протока, но не достигающи-
ми максимальных, чтобы не оставался недоиспользованным суб-
страт. Лимитирующий фактор — углерод. Рост ограничен массой
передачей кислорода. Для получения клеточной массы дрожжей/
обладающих активными хлебопекарными свойствами, т. е. способ-
ностью образовывать СО2 в условиях хлебопечения, стратегия ос-;
нована на подаче источника углерода в соответствии с потребно-
стью организма. Чтобы максимально увеличить превращение суб-
страта в биомассу, работают в узком пределе удельных скоростей
роста (ц): между 0,075 и 0,25 ч™1. ц должна быть больше, чем
0,075 ч-1, чтобы предотвратить затраты на поддержание, но ниже,
чем 0,25 ч4, чтобы избежать образования этанола, который обра-
зуется в ответ на эффект Крэбтри.
Кроме того, важна подача достаточного количества кислоро-
да (воздуха), чтобы не происходило анаэробного образования эта-
нола.
84
Предложен компьютерный контроль для этого процесса. Конт-
ролируют скорость подачи воздуха, поглощение О2, выделение
СО2 в комбинации с уравнениями материального баланса. Рас-
считывают концентрацию клеток, скорость роста и применяют
стратегию модифицированной подкормки с целью такого увели-
чения (снижения) скорости добавления мелассы, которая бы не
допускала превышения критической величины удельной скорости
роста дрожжей и обеспечивала бы максимальную продуктив-
ность. Результаты типичной ферментации с компьютерным конт-
ролем показывают, что ключом успешной ферментации служит
контролируемая и правильная подача источника углерода.
SCP (белок одноклеточных). При традиционном проточном
культивировании максимальная продуктивность достигается при
максимальной скорости протока (цМакС). Концентрация субстрата
S’o постоянна. Но реально все определяется скоростью переноса
()2 или в случае очень больших ферментеров — скоростью отвода
тепла. Поэтому стратегия оптимизации условий для получения
SCP следующая. Выбирают скорость протока, которая позволяет
держать на минимуме остаточную концентрацию лимитирующего
питательного вещества за счет наиболее высокой утилизации суб-
страта и одновременно максимально сократить объемы работ и
затрат на обработку отходов. При этом достигается наиболее пол-
ное превращение субстрата (S) в клеточную массу (Yx/S), увели-
чивается до максимума концентрация клеток и максимально сни-
жаются расходы на выделение продукта. Концентрация S непо-
стоянна. Эта стратегия также основана на эффективном управ-
лении подачей источника углерода (С), так как концентрация
S непостоянна.
Получение ферментов. Экономику продукции ферментов обыч-
но определяет стоимость их выделения. Поэтому главным предме-
том оптимизации является максимальное увеличение удельной ак-
тивности (Е/г-ч™1) и объемной продуктивности (Е/л-ч"1) фермен-
та. Максимальное увеличение удельной активности обеспечивает
аффективное превращение сырья в продукт и облегчает выделе-
ние фермента.
Максимальное увеличение общей объемной продуктивности
способствует снижению расходов на выделение и сильно поддер-
живает экономику производства (оправдываются капиталовложе-
ния). Чтобы иметь высокую удельную активность фермента и вы-
сокую плотность клеток, используют генетические манипуляции и
ведут управляемое культивирование. Подбирают правильный со-
став среды, обращая особое внимание на количество источника
углерода, учитывают индуктор синтеза фермента и другие фак-
торы (см. выше), регулирующие их синтез. При производстве
ферментов хорошие результаты могут быть получены при усовер-
шенствовании штамма традиционными генетическими методами
или генно-инженерными манипуляциями. При этом можно изме-
нить регуляцию синтеза и особенности утилизации источника уг-
лерода, можно нарушить катаболитную, репрессию, элиминиро-
85
вать побочные реакции, приводящие к образованию нежелателъ]
ного продукта, избавить штамм от потребности в индукторе. Уве]
личение дозы гена позволяет увеличить удельную активность ц0|
левого фермента, «узкого места» метаболизма. 1
Получение продуктов второй фазы. При производстве микроб]
ных метаболитов (нейтральных продуктов, органических кислот]
антибиотиков и др.) главная задача заключается в максимальном
увеличении их концентрации, что ведет к снижению затрат на им
выделение. Высокая концентрация продукта должна быть следст!
вием возможно более полного превращения дорогого сырья в про!
дукт в условиях высокой объемной продуктивности. Это снижаем
капитальные расходы. Обычный общий подход состоит в получе!
нии большой концентрации клеток за короткое время в условиях!
способствующих максимальной скорости превращения сырья в же|
лаемый продукт. 1
Если речь идет о продукте второй фазы, то эти условия пре!
дусматривают исчерпание веществ, поддерживающих рост (когда
он завершен), но наличие или поступление веществ, необходимых
для синтеза метаболита. С этой целью культуру чаще всего куль!
тивируют с подпиткой, внося, например, источник углерода. Сре]
да не должна содержать репрессоров синтеза вторичных продук|
тов или лишних веществ. Точный подбор веществ в среде, не от*
влекающих биосинтез на другие продукты, — главное условие дл’Л
высокого выхода целевых вторичных метаболитов. Поэтому важ-1
но использование датчиков на важнейшие компоненты среды. I
Продукт может находиться в клетках (липиды, токсины, спо4
ры) или выделяться наружу. Для получения внутриклеточный
продуктов следует иметь большую биомассу, состоящую из немо-1
лодых клеток, прошедших стадию сверхсинтеза. Для этого клетки]
культивируют в батарее ферментеров. В первом наращивают био*1
массу, а в следующем создают условия, оптимальные для созреч
вания клеток и биосинтеза вторичных продуктов. I
Для получения внеклеточных продуктов следует также нако|
пить большую биомассу и далее создать условия, направляющий
ее синтетические способности в сторону желаемого продукта. 1
Приведем пример оптимизации условий для получения пени-1
циллина грибом Penicillium chrysogenum. Стратегия предусматч
ривает периодическое культивирование с подпиткой, что ограни-1
чивает поступление источника углерода и катаболитную репрес*]
сию. 1
Для продукции пенициллина важен контроль скорости роста!
в трофофазе. Клетки, растущие более медленно в начальной рос-1
товой фазе, имеют более высокую удельную скорость синтеза пе-1
нициллина, чем клетки, выращенные с высокой скоростью роста.|
Для повышения удельной скорости продукции пенициллина важ*^
но управляемое поступление источника углерода как в ростовой*/
так и в продуктивной фазе. Компьютерный контроль поступления !
источника углерода в культуру служит лучшим средством повы-,
шения пенициллиновой продукции. (
86
ЛИТЕРАТУРА
Цирюков В. В., Кантере В. М. Оптимизация периодических процессов
микробиологического синтеза. М., 1985.
Воробьева Л. И. Техническая микробиология. М., 1987.
Дорошенко М. И., Гапонов К. П. Моделирование и масштабирование
процессов микробного синтеза. М., 1984.
Кестнер А. И. Оптимизация и контроль технологических биокаталитических
процессов. Фундаментальные аспекты и практическое применение в меди-
цине и сельском хозяйстве достижений биотехнологии//Мат-лы республ.
конф. Тарту, 1986. С. 208—217.
Работнова И. Л. Тактика оптимизации микробиологических процессов//Анти-
биотики и медицинская биотехнология. 1986. № 7. С. 508—'513.
Ill в и н к а Ю. Э. Физиологические и биотехнологические аспекты регуляции
выхода продуктов, синтезируемых микроорганизмами//1У Всесоюзная кон-
ференция «Управляемое культивирование микроорганизмов» (21—-23 октяб-
ря 1986 г. Пущино). Тез. докл. Пущино, 1986.
Ill т а н и с к и с И. Оптимальный контроль биотехнологических процессов. Виль-
нюс. 1984.
ГЛ A BA IV
ФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ
В ПРОМЫШЛЕННОСТИ
В промышленной микробиологии полный процесс получен
целевого продукта подразделяется на две главные фазы: ферме
тацию и выделение продукта. Ферментация — энергодающий пу
метаболизма, в котором органические соединения выступают к
доноры и акцепторы электронов (в этом смысле ферментац:
аналогична брожению). Термин используется в промышленное’
для обозначения любого процесса выращивания микроорганизм
независимо от аэробности и анаэробности. В ферментационщ
процессе главное внимание обращают на микроорганизмы, и при
мы инженерной технологии помогают развитию и осуществлена
управляемого культивирования микроорганизмов. Чем лучг
известен и расшифрован путь метаболизма, тем меньше эмпири
ма и больше возможностей для рационального ведения метаб
лического процесса.
Г
I
L
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РОСТА
И ПРОДУКТИВНОСТИ
удельной ск
биомасса, отн
Скорость роста. Чаще всего она характеризуется
ростью роста ц: ц = (1/Х) • (dXfdt) (1), где X
шение dXjdt выражает скорость роста популяции. Штаммы ми:
роорганизмов характеризуются максимально возможной скор!
СТЬЮ роста В данных условиях Цтах- Величина Цтах зависит (
специфики организма и от условий ферментации, pmax определ!
ют из кривой роста гомогенно растущей периодической культур!
/л 1п2 __ 0,693
Время удвоения биомассы (W): =------------</)• Экон<
АХ
мический коэффициент У. У , где XX — увеличение бис
AS
массы, соответствующее потреблению субстрата в количестве Д4
При этом У есть выход биомассы (Уз). Но в настоящее врем
экономический коэффициент используется шире — для характв
ристики ферментационного процесса, например как отношени
веса клеток к количеству модифицированного субстрата или
количеству потребленной энергии. Экономические коэффициент!
непостоянны и зависят от таких биологических параметров, как X
ц, или химических параметров (рО2, С/N, содержание продукте
в среде и др.). Различают 3 класса экономических коэффициен
88
той: 1-я группа — Ks, Уо2, У ккал дают информацию о техническом
процессе, и следовательно, о стоимости и эффективности процесса;
2 я группа — Ус, Ур, У и описывают катаболизм, амфиболизм и
Анаболизм. 3-я группа включает Уатр, описывает энергетические
отношения в клетке.
Метаболический коэффициент (q) выражается отношением: 7==|т/У.
Влияние концентрации субстрата ( S ) на скорость роста. Эта за-
писимость отражает уравнение (отношение Моно): ц — Цт * S/(S +
I Ks) (3), где Ks — константа насыщения, эквивалентная кон-
станте Михаэлиса-Ментен. Концентрацию субстрата S в биореак-
торе проточного действия определяют как5~----И), где D —
Ртах
объемная скорость протока через объем ферментера. Уравнение
показывает зависимость S от скорости протока.
Продуктивность и специ
пость (р) определяют к
ЙЙ
ическая скорость продукции. Продуктив-
концентрация продукта (л)
время ферментации (ч)
В проточной ферментации максимальная продуктивность равна
общей продуктивности, поскольку время, необходимое для очистки
п стерилизации ферментера и прохождения лагфазы можно не
учитывать (рис. 31).
Рис. 31. Общая и максимальная продуктивность
Специфическую скорость продукции (qp) определяют из уравне-
пня: ——=Цр • А (5), где pi — концентрация продукта.
dt
Специфическая скорость продукции эквивалентна удельной ско-
рости роста ц. Но во II и III типе ферментаций (см. ниже) пря-
мая корреляция между ц и др отсутствует.
89
КИНЕТИКА РОСТА
МИКРООРГАНИЗМОВ
Кинетика исследуется по-разному в традиционных период:
ческих и проточных процессах.
В периодическом процессе в инокулированную среду в течен!
всего периода ферментации кроме О2 (в виде воздуха), антивсп
нивателей и кислоты или основания (для контроля pH) больи
ничего не вносится — все компоненты вносятся в начале ферме
тации, поэтому периодический процесс относится к закрытым с
стемам.
Состав среды, концентрация биомассы и метаболитов все вр
мя изменяются как результат метаболизма клеток.
В процессе культивирования наблюдают четыре главные фаз
роста: лаг-фазу, лог-фазу, стационарную фазу и фазу отмиранш
Лаг-фазы может и не быть, если инокулят находится в лог
фазе.
Во время лог-фазы, когда культура растет с постоянной ]
максимальной скоростью, рост клеточной массы можно описат:
количественно, как время удвоения числа клеток в единицу вре
мени (для дрожжей и бактерий) или как удвоение биомассы
единицу времени (для нитчатых форм), например стрептомице
тов и грибов. Скорость увеличения биомассы пропорциональн
ее количеству и времени.
В стационарной
азе количество биомассы постепенно увели
чивается или не изменяется вовсе, хотя состав клеток может ме
пяться. В этой фазе часто образуются продукты, обладающи!
биотехнологической ценностью.
Фаза отмирания характеризуется тем, что какие-либо компо
ненты среды и прежде всего энергетические запасы клеток исчер
пываются. В промышленности ферментацию обычно заканчиваю!
в конце лог-фазы или перед началом фазы отмирания.
Периодический процесс с подпиткой используется довольно ча
сто в тех случаях, когда нужно избежать катаболитной репрессии
и в частности в производстве пенициллина. При ферментации (
подпиткой критический элемент вносят в маленьких дозах в на
чале ферментации и во время продуктивной фазы при получешл
вторичных продуктов (Воробьева, 1987).
Периодическая ферментация связана со следующими проблемами
1) большие затраты времени в связи с необходимостью загруз
ки и разгрузки биореактора;
2) большие капиталовложения из-за низкой продуктивности
Низкая продуктивность периодических ферментаций связа
на с низкой концентрацией биокатализатора (микробный
клеток), ингибированием конечным продуктом и исчерпа
нием субстрата;
3) вариации в качестве продукции от ферментации к фермен
тации;
90
1) необходимость отделения микробных клеток в конце фер-
ментации;
5) длительность ферментации, иногда измеряемая днями.
Проточный процесс. В настоящее время требуются высокопро-
изводительные процессы наращивания биомассы, которые реали-
зуются при проведении проточных процессов. Проточный процесс
должен работать с высокой скоростью протока, с поддержанием
высокой плотности клеток на протяжении всей ферментации, ин-
гибирующие конечные продукты должны постоянно удаляться из
системы. Проведение проточной ферментации вместо периодиче-
ской понижает капиталовложения, позволяет лучше осуществлять
контроль процесса и часто приводит к увеличению продуктивно-
сти. Например, в случае производства этанола проточным спосо-
бом продуктивность в 3 раза выше, чем при периодическом куль-
тивировании дрожжей. Различают два главных типа проточной
ферментации, относимых к открытым системам:
1) биореакторы с гомогенным перемешиванием жидкости. Они
могут работать как хемостат или как турбидостат;
2) реактор полного вытеснения. При этом раствор протекает
по тубулярному реактору без перемешивания и состав пи-
тательных веществ, число клеток, содержание О2 и продук-
тивность различаются в разных местах. У входа в реактор
вместе с питательной средой постоянно подаются клетки.
При проточной ферментации удаление клеток вместе с уходящим
из системы раствором должно быть сбалансировано с ростом ор-
ганизма.
Концентрация субстрата на входе обозначается So. При мед-
ленном протоке субстрат (S) почти полностью используется клет-
ками (S->0) и концентрация клеток х = 50/У. Если D увеличива-
ется, то х медленно снижается в начале, а затем, когда Р = Цтах,
резко падает до 0. Величина S медленно увеличивается в начале
по мере увеличения D и становится равной So при Р = цтах. Когда
v = 0 в уравнении (6), то достигается точка вымывания Ртах:
^max^o /с\ л
шах = —г~о“ (Ь), отсюда
Ac j - о0
= 1 (7), поэтому Dmax = fimax
Если Ртах превышают ртах, то стационарное состояние ста-
новится невозможным. Если скорость протока лишь немного н;и-
же Ртах, то система очень чувствительна к внешним воздействиям.
На рис. 32,1 показана зависимость от скорости протока D кон-
центрации субстрата (S), клеток (%) и скорости образования кле-
ток (Р-х), а также времени удвоения клеток (td).
Модель Моно не всегда применима для проточного культиви-
рования, например при очень низких или очень высоких скоростях
роста: если источник углерода — лимитирующий фактор, то при
низких скоростях протока добавленные углеводы используются
в первую очередь для поддержания клеток, но не для роста. При
высоких скоростях протока часть субстрата не полностью исполь-
зуется и продуктивность понижается.
91
Если азот (N) лимитирующий фактор, то при низких скор|
стих протока образуется резервный материал, например полис
хариды, при этом размеры клеток и биомасса увеличивают,
Скорость разведения, 1/час
Рис. 32. Влияние скорости пр(
тока на концентрацию субстрг
та (S), концентрацию клетс
(X), время удвоения td и ск(
рость образования клеток (DX
(I) (по Crueger a. Cruege.
1984); II — типы ферментаций
классифицированные Gage:
(1959): 1 — удельная скорост
роста; 2 — удельное потреблен^
углеводов; 3 — удельная скс
рость образования продукта
i
тип !
i
*
тип !’
1
и
тип НЕ
Время, часы
-------2
Продукция метаболитов тоже не описывается достаточно точн
моделью Моно при очень высоких или очень низких скоростях про
тока. Известно, что при минимальной скорости роста продукции
пенициллина прекращается и начинают образовываться конидие
споры. ;
Скорость образования продуктов зависит от скорости протока
Это относится к экскреции первичных и вторичных метаболитов
синтезу отдельных ферментов.
Промышленные процессы, использующие проточное культиви
рование,
включают получение биомассы дрожжей,
очистку сточ-
ных вод, производство пива, получение глюкозоизомеразы,, эта
нола.
Хотя многие микробиологические процессы в лабораторны
условиях ведут как проточные, в промышленности они не нашлЦ)
применения по ряду причин: для промышленного производства
надо, чтобы система стабильно работала по крайней мере 500—1
92
1000 ч, а для этого требуются глубокие знания физиологии,»
элвисимости процесса от внешних условий.
В промышленном масштабе особенно трудно поддерживать
стерильность.
Состав компонентов промышленных питательных сред не яв-
ляется оптимальным для каждой стадии процессов. Состав ма-
териалов нестабилен (например, состав пептона, крахмала, ку-
курузного экстракта), поэтому максимальных выходов продуктов
достигать не удается.
Снижение продуктивности может еще происходить за счет то-
го, что высокопродуктивные штаммы подвержены реверсии и воз-
никающие обратные мутанты могут перерасти и вытеснить в про-
|окс продуктивные штаммы.
ТИПЫ ФЕРМЕНТАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ
Различный характер зависимости образования продукта от
энергетического метаболизма позволяет разделить ферментацион-
ные процессы на три главных типа.
I тип. Продукт возникает в результате первичного метаболиз-
ма, направленного на получение энергии. Рост, катаболизм угле-
водов и образование продукта происходят почти параллельно
(рис. 32,11). Трофофаза и идиофаза не отделены друг от друга.
К такой категории ферментации относится производство белка
одноклеточных (SCP), этанола, глюконовой кислоты. Схематично
реакция выглядит как Sпродукт или S В С продукт.
Сюда же относят проточные ферментации без каскадной системы,
т. е. производимые в одном ферментере.
II тип. Продукт тоже образуется из субстрата, используемого
в первичном метаболизме, но во 2-й фазе, которая отделена от
1 и во времени:
субстрат S -> В С ->• D —первичный метаболит.
E-+F -> продукт
В периодической ферментации этого типа (рис. 32, II) наблюда-
ется 2 максимума. Вначале имеет место хороший рост, а затем
рост замедляется и начинается образование продукта, которое
сопровождается интенсивным потреблением субстрата. Значит, в
ном типе трофофаза и идиофаза разделены во времени. Так об-
разуется лимонная, итаконовая кислоты, некоторые аминокислоты,,
и амилаза у Вас. subtills.
Ill тип. Первичный метаболизм полностью отделен от образо-
н-шия продукта (рис. 32,11). Продукт образуется по амфиболи-
ческому пути. Первичный метаболизм сопровождается потребле-
нием субстрата и ростом, а целевой продукт образуется позднее,,
93
в реакциях промежуточного метаболизма. По III типу образую*
ся многие антибиотики, витамины, растворители.
Не всегда удается строго подразделить все ферментации 1
три типа, возможны промежуточные варианты. Например, обр
зование молочной кислоты нужно поместить между I и II типо:
В трех указанных типах невозможно уложить производство ант
биотиков стрептомицетами.
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ
г
ЕРМЕНТАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ
ОБРАЗОВАНИЕ ТЕПЛА
Чтобы получить оптимальный выход продукта, ферментаци
надо вести при постоянном температурном режиме. Поэтому тен
ло, которое образуется при перемешивании и метаболической ак
тивности микроорганизмов, необходимо удалять с помощью охла^
дительных систем.
Количество тепла, выделяемого микроорганизмами, определи
ют как
Таблица 13
Экономические коэффициенты Кккал
с различными субстратами
(по Crueger, Craeger, 1984)
где Уцкал — выражается в г кле<
ток/ккал выделенной энергии
Ys — г клеток/г потребленного суб-
страта; Hs и Нс — тепло, выде-
Субстрат
Чжал
(г клеток/ккал)
ляемое соответственно при сгора
нии субстрата и клеток (определи
ется экспериментально), ккал/г
Представление о выделении тепл
.Малат
Ацетат
Глюкоза
Метанол
Этанол
Изопропанол
н-Парафин
Метан
0,30
0,21
0,42
0,12
0,18
0,074
0,16
0,061
бактериями при росте на разньп
субстратах дают данные табл. 13
из которых следует, что чем боле<
окислено вещество (глюкоза илц
ацетат), тем меньше тепла выде*
ляется на единицу биомассы; чел|
больше величина р, тем больш|
Уккал* Скорость выделения тепла й
единицу времени рассчитывают, ис*
ходя из скорости роста, объема реактора (V) и коэффициент
Уккал- Скорость роста:
dx
dt
скорость выделения тепла в единицу времени:
(9)
(Ю)
ккал
Qto — V рх
94
СОДЕРЖАНИЕ 02 В ЖИДКОСТИ
Критическим фактором ферментаций служит массоперенос га-
зов: кислорода и углекислоты.
О2 часто выступает лимитирующим фактором. Он плохо ра-
створяется: в 1 л воды при 20° С в растворенном состоянии нахо-
дится только 0,3 ммоля О2, а в питательной среде его содержание
еще ниже. Растворимость газов подчиняется закону Генри в об-
ласти давления газов, которые имеют место в ферментерах.
Закон Генри описывает растворимость О2 в питательном ра-
створе по отношению к парциальному давлению О2 в газовой
фазе:
= (11)
Н 9
где С* — концентрация О2, насыщающего питательный раствор;
— парциальное давление газа в газовой фазе; Н — константа
Генри, специфичная для газа и жидкой фазы. Если концентра-
ция О2 увеличивается в газовой фазе при постоянном Р, то со-
держание О2 в питательном растворе тоже увеличивается. При
повышении Г растворимость О2 снижается. Парциальное давле-
ние газа равно произведению мольной доли газа на общее дав-
ление смеси (закон Дальтона): где у — мольная доля
газа, Р — общее давление.
Перенос О2. Для ферментаций, осуществляемых одноклеточны-
ми организмами (бактериями, дрожжами), наиболее важный фак-
тор, контролирующий скорость переноса О2, связан с устойчиво-
стью фазовой границы пузырьков газа и жидкости. Микробные
клетки, находящиеся рядом с газовыми пузырьками, могут непо-
средственно поглощать газ через фазовые границы, и перенос
газов к таким клеткам увеличен. Перенос же О2 сквозь агломе-
раты, или комочки клеток, затруднен и становится лимитирующим
фактором. Перенос О2 через жидкости характеризуется следую-
щим уравнением:
Na = —= CJ = OTR, (12)
dt
где Na — массоперенос, зависимый от объема (ммоль О2/л-ч),
показывает скорость сорбции растворенного О2, т. е. количество
переходящее из газовой фазы в жидкую в единицу объема за
единицу времени; Кь — коэффициент переноса на границе фаз;
а — специфическая поверхность обмена; — объемный коэф-
фициент переноса О2 (ч"1); Сх — равновесная концентрация ра-
створенного О2; в жидкости, т. е. та концентрация, которая уста-
навливается при равенстве скоростей процессов абсорбции и де-
сорбции и зависит от природы и физико-химических параметров
жидкости и газа; CL -— концентрация растворенного газа (ммоль
(Мл) (текущая концентрация растворенного О2 в жидкости);,
OTR — скорость переноса О2 (ммоль О2/л-ч).
95
Объемный коэффициент переноса KLa рассматривают как крц.
функционирования биореактора. Величин!
тический параметр для
KLa зависит от диаметра, вместимости, мощности, аэрационно^
системы и скорости аэрации в биореакторе, а также плотности^
вязкости и состава питательной жидкости, структуры микрооргф
низмов, применяемого антивспенивателя и f. i
Зависимость коэффициента Кьа от ферментационных услови:
описывают уравнением
KLa = K(P8/V) °'4(VS)°’5(<'5,
где К — константа; V — объем реактора, м3; К — скорость вы?
хода газа, см/мин; Pg — мощность, необходимая для аэрируемого
биореактора, л. с. — кг-м-с-1; N — скорость вращения мешалки
с-1. В многоуровневых системах вместо употребляют велд
чину Kd:
Kd = (2,0 + 2,8^) (PgN)0,56 V°'7 • 103,
где Ni — число мешалок.
О2 как субстрат. Рост микробной культуры с лимитирующим суй
стратом рассчитывают по уравнению:
ц — Р —— (15
г г max S V
Если О2 выполняет роль субстрата, то
Qo2 = Q
где К®— константа Михаэлиса-Ментен для О2; Qo2—удельная ско
рость поглощения О2, отнесенная к весу сухих клеток, ммол]
О2/г клеток -ч; Qmax — максимальная скорость поглощения 0<j
Среди микроорганизмов существуют значительные различия в по
требности в О2 (табл. 14).
Растворенный О
Рис. 33. Определение коэффици-
ента масс-переноса с использо-
ванием динамического метода
Таблицам
Максимальная скорость поглощения О2
у некоторых организмов
(по Brown, 1970)
Организм
Q (моль О2/г клетокЧ
I • V
Aspergillus niger
Sir. griseus
Pen. chryzogenum
Klebsiella aerogenes
Sacch. cereoisiae
E. coll
3,0
3,0
3,9
4,0
8,0
10,8
96
Критическая концентрация Ог показывает величину удельной
скорости поглощения О2, которая допускает беспрепятственное ды-
хание. Есть 4 приемлемых метода определения скорости поглоще-
ния О2: 1) динамический; 2) сульфитный; 3) прямое измерение
скорости переноса О2 и 4) теоретический расчет, учитывающий
рост биомассы.
Динамический метод. В периодической ферментации истинную
концентрацию О2—CL можно определять, измеряя скорость сни-
жения CL после прекращения аэрации. Если снижение в концент-
рации О2 в питательной среде нанести в зависимости от времени
(после прекращения аэрации), то получается прямая линия с на-
dCT
клоном Qo2* (cig угла р). ctg(3 =—— (рис. 33). Наклон кривой
dt
(угол р) определяет обратную величину коэффициента переноса
1 1
' “ KLa *
Иногда величина CL(CL определяют поформуле:
Q = ( —J-- + Qo2x\m + C*, (17)
\ dt /
где т — среднее значение в биореакторе) так мала, что ее точное
измерение в ферментационной жидкости невозможно.
Сульфитный метод применяют часто. Принцип его заключает-
ся в том, что в присутствии 10”3 молей Со2+илиСп1 2 * 4+ сульфитнат-
рия окисляет растворенный кислород соответственно уравнению
Na2SO3 + 1/2О2 Сц2.3±и22Т^ Na2SO4.
Сульфит определяют, добавляя раствор йода, а остаточный йод
гитруют Na-тиосульфатом:
Na.2SO3 + X + Н2О 2NaJ + H2SO4,
J2 4- 2Na2S2O3 2NaJ + Na3S4O6,
(18)
(19)
1 ммоль Na2S3Oy = 0,25 ммоля O2.
Недостаток метода в том, что он не дает представления о динами-
ке обеспечения кислородом и, кроме того, для больших биореак-
торов стоимость реактивов удорожает процесс. Но он характери-
зует условия аэрации в ферментере или в колбе.
Прямое определение скорости переноса О2 дает наиболее точ-
ные данные, но требует много времени и точных аналитических
приборов.
1 Данные, полученные динамическим методом, более надежны, чем получен-
ные другими методами, так как на их величину скорость диффузии О2 в
комочки клеток оказывает меньшее влияние, чем при использовании других
методов.
4 Л. И. Воробьева
97
Определение скорости переноса О2 по измерению микробног
роста. В аэробных условиях потребление О2—С рассчитывают н
1 г сухой биомассы, пользуясь уравнением
А .
&
где С — потребление О2 (на сухую биомассу), ммоль О2/г сухи
клеток; А—О2, необходимое клеткам для окисления 1 г субстрат^
до СО2, Н2О и NH3; В—О2, необходимое для окисления 1 г сухо“"
биомассы в СО2, Н2О и NH3; Уз — биомасса, г/субстрат, г; А -
получают в результате теоретических расчетов окисления субстра^
та; В — требует анализа биомассы (для дрожжей В = 934 мл О2/1^
сухой биомассы). Данные табл. 15 дают представление о потреб*
Таблица 15
Потребность в кислороде для некоторых микроорганизмов
при росте на разных субстратах
(по Brown, 1966)
Микроорганизм
Субстрат
Потребность в О2
(мл О2/г сухих клеток)
Aerobacter aerogenes
Е. coli
Penicillium chryzogenum
Sacch. cerevisiae
Sac ch, cerevisiae
Sacch. cerevisiae
Rhodotorula glut inis
Candida utilis
Candida utilis
Candida utilis
глюкоза NH3
»
»
меласса
глюкозо-пептон
»
глюкозо-мочевина
глицерин-пептон
515
400
410
430—590
430—550
510
510
550
460
480
ности в О2 для некоторых микроорганизмов. Чтобы определить об*
щее количество О2, которое требуется культуре за 1 ч, нужно знать
удельную скорость роста р (ч"1), биомассу X (г/л) и Ус (г кле*
ток/г О2) (г/г):
хл=Рх-А (21)
Г о
где Na — общее количество О2, необходимое культуре за 1 ч; К —
„ , ммоле й (X у т 1/
корректирующий фактор , ------- . Чтобы определить То
г О2
(г клеток/г О2), используют следующее уравнение:
где С, Н, О — число атомов углерода, водорода и кислорода в
субстрате; С', Н', О', iN' — % углерода, водорода, кислорода и азо-
та в биомассе; М — молекулярный вес субстрата.
98
РОЛЬ со2
В ФЕРМЕНТАЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ
С02 — наиболее важный метаболический продукт, но о его ро-
ли известно гораздо меньше, чем о роли О2.
«Перенос О2» может служить лучшим способом для масштаби-
рования и оптимизации погруженной культуры. Углекислоту тоже
следует учитывать как фактор, который оказывает непосредствен-
ное влияние на ферментационный процесс. Если кислород (для
аэробных организмов) ограничивает обычно ферментационную ки-
нетику, то СО2 действует как кислота в культуральной жидкости:
он влияет на величину pH и на кислотно-основное равновесие в
среде с электролитами, т. е. характер его действия совершенно
иной, чем у О2.
На биологические клетки СО2 может иметь двойственное дей-
ствие: низкие его концентрации необходимы для роста, а высо-
кие — оказывают ингибирующее действие на него.
Полное отсутствие самого СО2 обычно имеет отрицательное
действие на рост большинства бактерий, если не всех микробов
вообще. СО2гЛ имитирующие условия создаются в начале роста
(что приводит к удлинению лаг-фазы) или при мощной аэрации.
Последнее связано с тем, что в растворе бикарбонатные ионы на-
ходятся в равновесии с растворенным СО2 и с СО2 газовой фазы.
То же явление можно наблюдать с анаэробными культурами'
которые продувают молекулярным азотом, чтобы удалить О2, а
при этом удаляется также углекислота. Эти трудности можно пре-
одолеть если ионы бикарбоната вносить в среду или среду проду-
вать газом, содержащим СО2.
Вместе с тем в определенных количествах, выходящих за пре-
делы парциального давления 0,5—-1,0 атм (25—100 кПа), СО2
задерживает рост большинства организмов, хотя устойчивость к
СО2 сильно отличается у разных организмов.
К организмам, чувствительным к СО2, относятся бактерии ро-
да Pseudomonas, а к СО2-устойчивым — гомоферментативные мо-
лочнокислые. Бактерии родов Enterobacter, Staphylococcus, Ba-
cillus и Clostridium обладают промежуточной устойчивостью меж-
ду экстремальными Pseudomonas fragi и гомоферментативными
молочнокислыми бактериями.
На ростоингибирующий эффект СО2 на Ps. fragi влияют раз-
ные факторы: например температура (чем ниже, тем больше), ис-
точник углерода (на глюкозе — незначительное ингибирование, в
средах с аспарагином, цитратом или лактатом — сильное), лими-
тирование по О2 усиливает ростоингибирующее действие СО2, как
и низкие значения pH. В области pH 5,7—6,7 СО2 не оказывает ин-
гибирующего действия на Ps. fragi. Характер действия СО2 на ме-
таболизм микроорганизмов усиленно изучается в настоящее время,
но уже из приведенных данных ясно, что уровень его концентра-
ции может существенно влиять на ферментационные процессы.
1*
99
БИОРЕАКТОРЫ
ДЛЯ АЭРОБНОЙ
ЕРМЕНТАЦИИ
Существуют три главных типа конструкций биореакторов: со-
суды без внутренних частей, сосуды с перемешиванием (мешал-
кой) и барботажные колонны (buble column). Кроме этого рабо-
тают колоночные реакторы с твердой укладкой, биореакторы со
взвешенным слоем, петлевые реакторы (с замкнутым контуром),
круговые кюветы (разновидность горизонтального петлевого (lo-
op), реактора) и вращающиеся диски. Ферментеры для лаборато-
рии (объемом до 20 л) изготавливают из стекла. Большие фер-
ментеры конструируют из нержавеющей стали. Ферментеры вплоть
до 3000 л могут быть стандартизованы. Если объем и характер
процесса меняются, то геометрию ферментера изменяют. Отноше-
ние высоты к ширине ферментера варьирует от 2:1 до 6:1, а ме-
шалка может находиться в верхней или в нижней части биореак-
тора. Аналогом биореактора можно рассматривать мышь или да-
же корову или их интегративную часть для продукции монокло-
нальных антител.
Функции биореактора. Чтобы выполнять работу, биореактор
должен иметь определенные эксплуатационные качества (парамет-
ры, характеристики). Эти показатели связаны со следующими
функциями биореактора. Контролем за перемещением на грани-
це с внешней средой: 1) не должно быть выхода клеток из реакто-
ра, так как необходимо поддерживать высокую концентрацию био-
массы и не допускать инфицирования внешней среды (например,
при обработке патогенных сточных вод); 2) не должно быть про-
никновения посторонних микробов в биореактор.
Возможностью введения субстрата и кислорода.
Возможностью выведения продуктов (СО2 среди прочих).
Возможностью осуществления дисперсии газов и жидкостей (в
случае нерастворимых жидких субстратов).
Возможностью суспендирования твердых частиц (твердых субстра-
тов и самих микроорганизмов).
Удалением тепла.
Движение на границе (стерильность) определяется типом кон-
струкции биореактора. Для осуществления других функций био-
реактора используют перемешивание, аэрацию, охлаждение.
В соответствии с функцией биореакторов данные процессы мож^
но классифицировать, как показано в табл. 16. Данные таблицы
показывают, что различные процессы требуют совершенно разных
функций от биореактора. Поэтому существуют самые разные кон-
струкции. Вместе с тем любопытно, что совершенно разные про-
цессы могут иметь общие аспекты в отношении требований к био-
реакторам. Например, эффекты гидродинамического фрагментиро-
вания (shear — эффекты) важны для получения культуры клеток
растений, продукции вакцин и обработки сточных вод.
Типы биореакторов. Биореакторы для промышленного произ-
водства принадлежат в основном к одному из 3 классов: 1) без не-
100
ремешивания, неаэрируемые сосуды — составляют 86%, 2) без-
перемешивания, аэрируемые — 1%, 3) с перемешиванием и аэра-
цией — 13%. Первые используют для анаэробных периодических
процессов, находящихся под кинетическим контролем. Поэтому
Таблица 16
Функциональные аспекты существующих биореакторов
(по Kossen, 1984)
Аэробная продукция
Анаэробная продукция
рДНК культуры
Культура клеток растений
Продукция вакцин
Аэробная обработка сточных вод
Анаэробная обработка сточных вод
< )бработка твердых отходов
II римечание. —[- — жизненный аспект, + — важный аспект, (+) — важен для аэробных
погруженных условий, -]— — неважен, но полностью не может быть отрицаем, —неважен,
—- — не относится к делу {нужно избегать).
/1/++ предполагаемая или реальная опасность (риск); А2-\—[- проблемы инфекции из-за низкой
скорости роста; C++ иногда очень высокая потребность в кислороде; Е-]—р часто периодический
процесс с подпиткой приводит к низкой концентрации и быстрому истощению (повреждению);
Г— то же самое, G-j—[- часто низкая скорость движения жидкости, осаждение, ?++ организ-
мы или (желаемые) агломераты, очень чувствительные к гидродинамическому фрагментированию
Jicar — эффекту).
транспортные явления играют в них незначительную роль и усо-
вершенствование конструкции имеет ограниченные возможности. В
аэрируемых без перемешивания реакторах скорость поглощения
()2 культурой может быть очень высокой, часто выше, чем допус-
кают возможности биореактора. Такие реакторы в основном рабо-
тают в периодическом режиме с подпиткой и иногда как проточ-
ные. К ним относятся барботажные колонные (buble column) фер-
ментеры. Биореакторы с перемешиванием и аэрацией в связи со
способом распределения газа делят на следующие типы (рис. 34).
Распределение газа путем перемешивания с различным размеще-
нием мешалок и подачей воздуха. Биореакторы этого типа исполь-
зуют в производстве уксуса и при обработке сточных вод, а так-
же при производстве биомассы. Газ подается с помощью насоса
(рис. 34, 1—3). В 4-м варианте раствор накачивается насосом и
подающийся независимо от жидкости воздух активно перемешива-
ется с движущимся потоком жидкости. В 5-м и 6-м вариантах эжек-
пня воздуха производится за счет засасывания мотором жидкости,
г. е. происходит прямое перемешивание жидкости и газа.
Распределение газа за счет избыточного давления сжатого воз-
духа (варианты 7—И). В большей части таких систем отсутству-
ют движущиеся части в стерильной области ферментера. Рецик-
101
13
Рис. 34. Биореакторы для аэробной ферментации.
А — распределение газа путем смешения. 1 — установка с вращающимися
мешалками; 2 — вращающийся сосуд с глубинной трубкой; 3 — смеситель с
вращающейся мешалкой и засасывающей воздушной трубкой.
Б — распределение газа с помощью насосов: 4 — сплавленный диск с рецик-
лированием; 5 — распределение газа по принципу эжекции; 6 — водоструйный
аэратор.
В — распределение газа за счет избыточного давления газа. 7 — сплавленная
дисковая система; 8 — система Эйрлифта; 9 — реактор, работающий под дав-
лением и с рециклированием; 10 — гигантский трубчатый реактор; И — си-
стема каскадных сетевых тарелок.
Г — непрерывная газовая фаза. 12 — струйный пленочный реактор; 13 —-
поверхностный пленочный реактор; 14 — колесно-лопастный реактор
лирующий под давлением ферментер (9) (из этой категории) был
первой моделью, примененной в биотехнологии для получения в
промышленности белка одноклеточных. В 11-м варианте обогаще-
ние воздухом усиливается за счет увеличения поверхности сопри-
косновения жидкости и газа и за счет продавливания среды через
поры сита.
Непрерывная газовая фаза. В струйном 1 реакторе воздух цир-
кулирует над пленкой микроорганизмов. Организм (12) растет на
твердом, инертном материале. Питательный раствор и воздух мо-
торами накачиваются и разбрызгиваются (распределяются) по
пленке. В поверхностном реакторе (13) организм находится на
поверхности или в толще питательного раствора или растет на по-
лутвердой или плотной среде. В колесно-лопастном реакторе (14)
организм растет на перемещающихся лопастях или барабанах и
попеременно погружается в питательный раствор,, налитый в ниж-
ней части реактора и в газовую фазу при повороте колеса. Такие
биореакторы используют при очистке сточных вод, выщелачива-
нии руд, в производстве уксуса или лимонной кислоты.
Мембранные реакторы. Кроме традиционных с перемешиваю-
щими устройствами в промышленности находят применение и име-
ют некоторые преимущества мембранные реакторы. Использова-
ние мембранных биореакторов позволит перейти с периодического
на непрерывный процесс ферментации в условиях высокой концент-
рации биомассы, непрерывного отвода из системы конечного про-
дукта, ингибирующего процесс биосинтеза, и повышенного коэф-
фициента разбавления. На основе мембранных процессов, активи-
рованных давлением, как при ультрафильтрации и микрофильтра-
ции существуют рециклирующие биореакторы, работающие в про-
точном режиме при полном смешении, и биореакторы с полыми
волокнами, действующие главным образом как реакторы полного
вытеснения. Мембранный рециклирующий реактор изображен на
Рис. 35. Схематическое изображение
мембранного рециклирующего реактора:
1 — питательный раствор, 2 — биока-
тализатор, 3 — продукт
рис. 35. Главный реакционный сосуд, в котором проводят фермен-
тацию, связан с полузакрытым ответвлением — мембранным мо-
дулем. Через мембранный модуль происходят сепарация микроб-
* В струйных биореакторах интенсификация массообмена происходит за счет
струй, падающих из секции в секцию при циркуляции жидкости.
103
ных клеток от продукта и рециклирование клеток обратно в фер-
ментационный сосуд. Содержимое сосуда выкачивается насосом
через мембранный модуль. Вначале реакционный сосуд заполняет-
ся культурой с определенной концентрацией клеток и накачивает-
ся питательная среда с определенной скоростью. Молекулы про-
дукта и непревращенные молекулы субстрата, которые имеют ма-
ленькие размеры и могут пройти через поры мембран, удаляются с
той же скоростью, с какой поступает свежая среда, поэтому сохра-
няется постоянный объем. Учитывая различия в размере микроб-
ных клеток и большинства продуктов ферментации, используют
микрофильтры или ультрафильтры с большими порами и опреде-
ленной модульной конфигурацией. Рециклирование клеток с по-
мощью центрифужного сепаратора для сепарирования и рецикли-
рования приводит к заметному увеличению продуктивности. Хотя
современные центрифуги достаточно эффективно отделяют клетки,
их приобретение, функционирование и поддержание обходится до-
рого. Очевидный выбор для замены центрифуг и механических оса-
дителей — это мембранные сепарирующие устройства. Можно
обойти ступень сепарации при работе немембранных ферментеров
проточного действия, используя иммобилизованные биокатализа-
торы. Но иммобилизация создает собственные проблемы, такие как
диффузионные ограничения и стерические препятствия,
потеря
клетками активности в процессе иммобилизации, возможность за-
ражения культуры во время иммобилизации и высокая стоимость
самого процесса иммобилизации.
Итак, преимущества мембранного рециклирующего биореакто-
ра следующие:
1) создается более
высокая эффективность проточного про-
2)
3)
4)
5)
6)
цесса;
можно получать высокую плотность клеток вплоть до
100 г/л (по весу сухой биомассы);
можно использовать высокую скорость разведения как
следствие высокой концентрации клеток;
облегчается контроль внешних условий;
в мембранном биореакторе можно использовать как раст-
воримые, так и нерастворимые субстраты, чего нельзя осу-
ществить в реакторах с полыми волокнами и в большинст-
ве биореакторов, работающих с иммобилизованными клет-
ками;
поток продуктов, выходящих из мембранных биореакторов,
свободен от клеток и других специфических материалов,
что приводит к снижению стоимости очистки.
Эти реакторы легче всего вводить в существующие заводы. В
настоящее время их применяют при очистке сточных вод. Перс-
пективно их использование для производства
ния D-сорбита в L-сорбозу уксуснокислыми
ции молочной кислоты L. delbruckii, а также
этанола, превраще-
бактериями, продук-
ацетона и бутанола
ацетоно-бутиловыми бактериями. Но применение рециклирующего
мембранного биореактора имеет и свои трудности, вызванные п^
104
реносом тепла и массопередачей, — это лимитирующие факторы.
Например, в мембранном реакторе для продукции этанола обра-
зуется в 50 раз больше тепла и газа на объем биореактора, чем в
традиционных ферментерах, что требует серьезной перестройки.
Есть и другие трудности в эксплуатации мембранных биореакто-
ров. Возможность химического взаимодействия клеток и состав-
ных частей питательной среды с мембранами. Известны мембра-
ны, которые полностью инактивируют некоторые ферменты. Дру-
гая трудность связана со стерилизацией мембран. Мембраны, име-
ющие хорошие функциональные свойства, часто обладают высо-
кой чувствительностью к повышенным температурам. Поэтому
считают, что необходима работа и исследования по созданию но-
вого поколения биосовместимых мембран для их специфического
применения в микробиологической промышленности.
Биореакторы с полыми волокнами (рис. 36) используются
меньше, чем мембранные рециклирующие реакторы. Продуктив-
ность их ниже, а потребление субстрата микроорганизмами более
слабое, чем в последних. Ограничивающий ступенью таких реакто-
Рис. 36. Схематическое изображение биореактора с полыми волокнами: 1 —
питательный раствор, 2 — биокатализатор, 3 •— продукт
ров служит диффузия питательных веществ к клеткам и продук-
тов от клеток (см. рис. 36), отделенных от питательного раствора
мембраной. Такие биореакторы рекомендуют использовать для ре-
акций, осуществляемых нерастущими клетками.
Биореакторы для получения очень вязких материалов. При
производстве вязких материалов сильно снижается OTR, если вяз-
кость увеличивается до величины 0,1 мНс-м“2. Это явление име-
ет место в продукции полисахарида ксантана. В таких случаях ре-
комендуют использовать двухфазную систему. Конверсия субстра-
та происходит в водной фазе, которая диспергируется в непрерыв-
ную фазу с органической жидкостью с низкой вязкостью, но хоро-
шей растворимостью в ней кислорода. Даже при очень высокой вяз-
кости водной фазы общая вязкость системы остается низкой.
Жидкая фаза имеет много функций: перенос О2, транспорт микро-
организмов, представляет собой среду для проведения конвер-
сии — все это открывает совершенно новые возможности для
реализации биореакторной системы.
105
Твердофазная ферментация используется в процессе компости- 1
рования, ферментации пищевого сырья, как зерна какао, кофе.
Разработана новая система для получения этанола из твердых ма- 1
териалов (как злаков сладкого картофеля и кассавы). Влажный j
воздух циркулирует через биореактор, заполненный субстратом, j
Этанол выделяют из газовой смеси, охлажденной до —5—10° С.
Это более медленный процесс, чем традиционное получение этано-
ла, но имеет два преимущества: образуется меньше жидких отхо- |
дов, а оставшиеся твердые отходы могут быть сразу же превраще- .1
ны в корма. Удаление этанола снижает его ингибиторное дейст- ]
вие на дрожжи.
Условия работы биореакторов, способствующие увеличению j
продуктивности и снижению стоимости существующих процессов.
Низкая продуктивность может быть результатом ряда факторов, >
некоторые из которых следующие: 1) ограниченная скорость пере- i
носа О2 (OTR), 2) ограниченная скорость удаления тепла (HTR), j
3) субстратное ингибирование, 4) ингибирование продуктом. Ско- '
рость переноса О2 была увеличена на предприятии ICI (выпус- j
кает белковый кормовой препарат прутин) за счет разбивания пу-
зырьков воздуха и придания им по возможности одинакового оп-
тимального размера, обусловливающего высокое значение OTR. |
Чтобы избежать высоких градиентов источника азота, аммоний .
вводили с газовым потоком.
Недостаточно сильное перемешивание приводило к локальным
высоким концентрациям метанола и снижению выхода биомассы.
Проблема была решена путем многократного внесения субстрата
по частям. (Это дешевле, чем увеличение скорости аэрации в bub-
ble column). Другое решение в отношении увеличения OTR было
реализовано в процессе Linde, производящем SCP. На этом пред-
приятии вместо воздуха использовали чистый кислород; величина
OTR достигала 7,2-10~3 кг/м3/с, а для пекарских дрожжей доста-
точна 4,17-10“3 кг/см3/с. Далее, поскольку чистый О2 токсичен для
большинства микроорганизмов, стерилизации газа не требовалось.
Это обстоятельство и высокое значение величины OTR компенси- 1
ровали высокие цены на чистый О2 по сравнению с воздухом.
Дрожжи культивировали при pH 2—3,5 и асептических условий
не требовалось, так что была снижена общая цена на фермента-
цию.
Удаление тепла. Возможно прямое охлаждение (в мало мас-
штабном органическом синтезе используют тепло для испарения
летучих жидкостей). Летучие жидкости можно добавлять к фер-
ментационному бульону, чтобы создать двухфазную систему. Они
постоянно выпариваются в биореакторе и таким образом удаляет-
ся значительная часть тепла. Это тепло реализуется вне биореак-
тора в конденсоре. Поскольку растворимость О2 в ряде органиче-
ских жидкостей значительно выше, чем в воде, они могут использо-
ваться также для увеличения массопереноса О2. Возможные кан-
дидаты для этой работы — фторуглеродистые соединения. Раство-
римость О2 можно увеличить в их присутствии в 10 раз по сравне-
106
нию с его растворимостью в воде. Ряд фторуглеродов нетоксичен,
хотя довольно дорог, поэтому пока используется в процессах не-
большого масштаба, например в производстве вакцин.
Усовершенствование биореакторов в будущем. Эта работа про-
водится с целью: увеличения продуктивности существующего про-
цесса (интенсификация процесса); снижения стоимости существу-
ющего процесса (путем снижения потребления энергии и увеличе-
ния выхода продукта), эффективного использования плохо раст-
воримых субстратов (газов, несмешивающихся жидкостей, твер-
дых веществ); получения очень вязких материалов; культивирова-
ния в больших масштабах культур клеток растений; культивиро-
вания в больших масштабах рекомбинантных штаммов микроор-
ганизмов, культивирования в больших масштабах клеток тканей
животных для производства вакцин, моноклональных антител
и др.; проведения твердофазных ферментаций для обработки твер-
дых отходов, выщелачивания бедных руд in situ и богатых руд
на заводах и для очистки почвы.
МАСШТАБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТАЦИЙ
Масштабирование — это перенесение процедуры в промыш-
ленность. Известно, что процесс, работающий в лаборатории, мо-
жет плохо работать или вовсе не работать в условиях крупного
производства. Народному хозяйству необходимы крупномасштаб-
ные биотехнологические производства. Если в лаборатории для
микробиолога прежде всего важен высокий выход продукта на вес
биомассы в единицах/мл культуральной жидкости или в макси-
мальном выходе за единицу времени, то при переходе от лабора-
торных условий к промышленным масштабам главное — это мак-
симальный выход продукта при минимальных энергетических и
(других) затратах и времени. Большая часть исследований, посвя-
щенных масштабированию, касается аэробных ферментаций, пос-
кольку именно с этими процессами связаны сложные проблемы, ка-
сающиеся перемешивания и массопереноса. Главные параметры,
влияющие на масштабирование: число генераций микроорганизма,
способы прекультивирования, стерилизация среды и воздуха, пе-
ремешивание и аэрация, перенос тепла.
ГЛАВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ,
ВЛИЯЮЩИЕ НА МАСШТАБИРОВАНИЕ
Число генераций. Число генераций, необходимое для достиже-
ния нужной конечной концентрации биомассы, есть функция объе-
ма ферментера. Если для простоты принять, что культура находит-
ся постоянно в экспоненциальной фазе роста, то
X=XQe^ или Vx/XQ=e^>
где V — объем ферментера; х — концентрация биомассы; X —
107
общая биомасса (Vx); ц — специфическая скорость роста; е —
основание натурального логарифма. Учитывая известные взаимо-
отношения между ц, временем удвоения (td) и числом генераций
pVg), предыдущее уравнение можно записать как
Vx/X0=e^ln2 (23)
или
Ng— l,44(ln V+lnx—1пХ0) • (24)
Уравнение показывает прямое отношение между числом генераций
и логарифмом объема ферментера (верно для принятых условий о
равном размере инокулума Хо), идентичности ростовой среды, ко-
торая в свою очередь поддерживает одну и ту же конечную кон-
центрацию биомассы — х. Если популяция клеток неоднородна,
но вариант имеет ту же скорость роста, что и родительский штамм,
фракция вариантов через Ng генерацией будет
(25)
где Хп — биомасса родительского штамма; Хт — биомасса вари-
анта; Хп* и Хто — биомасса в момент инокулирования; % —
скорость появления вариантов, выраженная как число вариантов,
образованных на геном/генерацию. В более общем случае, когда
родительский штамм и вариант имеют различные скорости роста,
имеем
CZ Хг 1
Хт + Хп (а_ j) __X22V£(a+k~1)
(26)
где а — отношение специфической скорости роста варианта к та-
ковой родительского штамма. На практике может возникать не-
сколько вариантов. Из уравнений (25), (26) и (27) следует, что с
увеличением масштабов ферментации частота возникновения не-
желательных вариантов возрастает.
Стерилизация. Стерилизуют среды, входящий и выходящий
воздух, соответствующее оборудование биореактора с целью пред-
отвращения заражения культуры во время ферментации. Для
сред чаще всего используют тепловую стерилизацию. На полноту
тепловой стерилизации оказывают влияние тип микроорганизма,
состав среды, значение pH, размер суспендированных частиц. В ла-
боратории полная стерилизация легко достигается путем автокла-
вирования в течение короткого периода времени. Большие объемы
сред (от 10 до 50 тыс. л) в производственных масштабах требуют
большего времени стерилизации, что неизбежно приводит к ухуд-
шению свойств среды. В настоящее время применяют непрерывную
тепловую стерилизацию, при которой среду нагревают до очень вы-
сокой температуры (150 °C) за несколько минут, причем вновь по-
ступающую среду можно нагревать за счет стерильной среды. При
увеличении размеров емкости ферментера площадь ее поверхности
108
резко снижается относительно объема, что затрудняет передачу
тепла, а также контроль температуры во время выращивания мик-
роорганизмов. В воздухе содержится в среднем 5—2000 микроор-
ганизмов/м3, из них 50% — это споры грибов и 40% — грамотри-
цательные бактерии. Ферментеры обычно работают со скоростью
аэрации 0,5—1,0 объемов воздуха/объем жидкости/мин. Для сте-
рилизации воздуха используют стерильные фильтры. В настоящее
время применяют систему мембранных фильтров или фильтров из
стекловолокна (раньше часто использовали фильтры из стеклян-
ных волокон, которые плохо выдерживали тепловую стерилиза-
цию). Мембранные фильтры изготавливают из эфиров целлюлозы,
нолисульфона, нейлона. Их можно легко заменить свежим фильт-
ром. Фильтров, предотвращающих заражение бактериофагом, по-
ка нет.
Перемешивание и аэрация. Для максимального выхода про-
дуктов важно иметь оптимальную температуру, концентрацию раст-
воренного О2, pH в разных частях реактора, что зависит от хоро-
шего перемешивания. При масштабировании периферическую ско-
рость мешалки (м-с1) увеличивают как куб корня масштаба при
условии, что специфическая утилизация мощности сохраняется по-
стоянной. Аэрация имеет две функции: обеспечение кислородом и
удаление СО2 и других летучих метаболитов из культуральной жид-
кости. О роли этих факторов говорилось выше. Сохранение посто-
янства /(ад служит одним из главных принципов масштабирова-
ния.
Перенос тепла. Ферментация осуществляется при определен-
ной температуре и это требует поддержания теплового баланса в
ферментере, который в общем виде выглядит как:
С^метабД" Qперемет—Сиспар фтеплообмен —0.
(27)
Для удовлетворения этого уравнения необходимо удаление тепла
из системы со скоростью теплообмена ((^теплообмен). Отвод тепла
обычно осуществляют с помощью охладителей, содержащих воду.
11оверхность обмена, доступная для удаления тепла из единицы
объема жидкости, снижается при увеличении размеров масштаби-
рования, что и определяет лимит размеров биореактора. Это до-
стигается, когда скорость образования тепла равна максималь-
ной скорости удаления тепла:
QTennoo6M — А с 1пъ
(28)
где Ас — площадь теплообмена/ед. объема, м2, U — коэффициент
общего переноса тепла, ккал°C"1; ATim — логарифм зна-
чения разницы температур между культуральной жидкостью и ох-
ладителем. Масштабы ферментации оказывают влияние на урав-
нение различными путями, но главное влияние осуществляется че-
рез Ас, так как Ас —, где Dt — диаметр мешалки; Д7\т обыч-
но не зависит от масштабирования, если используют один и тот
109
же охладитель, но на (^теплообмена влияет на скорость аэрации^
Снижается величина U при масштабировании, так как приходится
увеличивать толщину стен для больших ферментеров. В целом не*
ренос тепла снижается при масштабировании, что может обусловь
ливать верхний лимит в отношении размеров ферментера. j
Стабильность культуры. Известен ряд механизмов генетической^
нестабильности, например диссоциация гетерокарионов, митотичес-
кое несоответствие у грибов, но общих методов контроля таких яв*!
лений нет. Возможный подход может состоять в том, чтобы отыс-
кать вещества, селективно ингибирующие непродуктивные вариан-
ты. В случае «инженерных штаммов», несущих плазмиды, имеет
место сходная ситуация. Нестабильность может вызывать боль-
шая склонность плазмид к мутациям или утрата плазмид.
Много сложных проблем возникает при масштабировании про-
цессов с нитчатыми организмами, которые часто создают высокую*
вязкость и «неньютоновскую» ферментацию. Это приводит к об-
разованию негомогенности культуры, высокорежущих зон вокруг
лопастей мешалок и низкую вязкость и слаборежущих зон и вы-
сокую вязкость в отдалении от лопастей мешалок, а это отража-
ется на массопереносе. Другой фактор, связанный с вязкостью, —
это удаление тепла (пропорционально градиенту температуры меж-
ду культурой и теплообменником). Возможность проведения фер-
ментаций при более высокой температуре обеспечивает лучший
теплообмен, что в свою очередь облегчает проблемы, вызванные
вязкостью и размером сосуда (например, отношением поверхности
к объему). В связи с изложенным очень важна селекция термото.-
лерантных штаммов.
ПРИНЦИПЫ МАСШТАБИРОВАНИЯ
Наиболее важные параметры, которые используют в качестве
критериев при масштабировании, следующие: постоянство потреб-
ления энергии на единицу питательной среды; сохранение (по срав-
нению с лабораторными условиями) той же объемной скорости пе-
реноса кислорода. Дополнительным критерием может быть ско-
рость мешалки, которая лежит в области 5—7 м/с для многих про-
дукционных ферментеров. Время перемешивания зависит от объе-
ма ферментера. В сохранении одного и того же геометрического
типа ферментера на пилотной установке и на заводе необходимо-
сти нет, если выполняются другие вышеуказанные параметры.
Масштабирование при обеспечении постоянства
потребления энергии (на ед. объема)
Для обеспечения указанного требования необходимо учитывать
зависимость между потреблением энергии (Pg) и параметрами
ферментера. В частности, В. Крюгер предложил следующую зави-
симость:
Pg=Kt(PiWDz3/Q°>56)0)45? (29>
110
>где JV — скорость мешалки, об/мин.; Рё — требуемая энергия для
аэробного биореактора, л. с.; Di — диаметр мешалки, см; К —
константа (функция геометрии ферментера); Pi — энергия, пот-
ребляемая неаэрируемым ферментером, л. с.; Q — скорость аэра-
ции (vvm: объем воздуха/объем жидкости в минуту). Было уста-
новлено, что указанная выше зависимость верна для разных фер-
ментеров от 20 л до 30 тыс. л.
На примере получения новобиоцина показано, что максималь-
ный выход антибиотика имеет место, если мощность более
1,5 л. с./м3 культуральной жидкости; при мощности менее 1 л. с./м3
выход антибиотика заметно снижается. На выход продукта оказы-
вает влияние диаметр мешалки при одинаковом потреблении энер-
гии.
Масштабирование при условии сохранения постоянной
(по сравнению с лабораторными условиями)
скорости переноса О2
Чаще всего масштабирование проводят на основе данных, ко-
торые рассчитывают по сульфитному числу. Но эти расчеты не да-
ют информации о переносе О2 в сильновязких, в неньютоновских
ферментерах (которые работают во многих антибиотических про-
изводствах) или в условиях очень высоких скоростей перемеши-
вания. Если соблюдается постоянство K.L&, то ни тип ферментера,
ни объем его не оказывают влияние на рост дрожжей или на био-
синтез пенициллина, стрептомицина и других антибиотиков. То
же относится к первичным метаболитам. Вместо KLa можно ис-
пользовать как постоянный параметр Kd (см. выше).
Масштабирование при использовании штаммов,
полученных методами генетической инженерии
В ближайшие годы ожидается широкое внедрение «генно-ин-
женерных» штаммов, а практическая ценность штаммов выявляет-
ся после их культивирования в промышленном масштабе. Пробле-
ма масштабирования при использовании «генно-инженерных»
штаммов вообще не отличается от применения диких штаммов. Но
нестабильность плазмид для первых является их специфическим
свойством.
Плазмидные штаммы растут более медленно, при этом сниже-
ние скорости роста пропорционально величине плазмид. Кроме то-
го, образование высоких уровней продуктов клонированных генов
тоже может привести к медленному и ненормальному росту. По-
этому в промышленности, где клетки проходят большое число гене-
раций, возможно вытеснение плазмидных клеток дикими штамма-
ми (сегрегационная нестабильность) или части плазмид (структур-
ная нестабильность). В настоящее время известен ряд приемов
(Воробьева, 1987), которые позволяют обойти эти трудности. К
ним относится сокращение ферментации (при этом нестабильность
плазмид не предотвращается); путем расчета кинетической моде-
77/
ли определяют момент, продолжение ферментации после которого^
экономически невыгодно. г)
Универсальным приемом служит создание селекционных мето-d
дов. Для промышленных масштабов приемлемо включение в плаз-й
миду генов прототрофности, по которым дикие штаммы ауксо<!
трофны. Правда, для реализации этого приема надо, чтобы пита-ч
тельная среда была дефицитна по одному или нескольким компо-
нентам.
Используют метод рекомбинации дефицитных диких штаммов
и метод интеграции клонированных генов в хромосому. Последний’
путь подходит для того случая, когда достаточно небольшого чис-?
ла копий генов.
Наконец, можно контролировать число копий генов. На прак-
тике чаще всего пользуются комбинацией методов, поскольку ни.
один из них не дает 100%-й гарантии сохранения плазмиды. Не-
давно для стабилизации плазмид в промышленности предложили
использовать в качестве векторов плазмиды бактериоцина, убива-
ющие бесплазмидные штаммы того же типа по мере их появления,
в культуре. Клетки, образующие бактериоцин, имеют к нему им-
мунитет.
Масштабирование при получении вакцин
и моноклональных антител '
Вакцины. Только бактериальные вакцины получают при куль-
тивировании бактерий в биореакторах на несколько сот литров по-
груженным методом. Другие вакцины получают из вирусов, вы-
ращенных на эмбрионах куриных яиц (например, вакцина энфлю-
энцы) или на культуре клеток млекопитающих.
Недавно в США для получения вакцин стали использовать ли-
нию ВЯА-21 (помогает при раке рук и ног), которую можно куль-
тивировать в погруженной культуре. (До сих пор вирусы выращи-
вались в монослое диплоидных клеток, которые не размножаются
в погруженной культуре.) Не так давно во Франции для получе-
ния вакцины против полиомиелита начали использовать гетеропло-
идные клетки Verocell, которые также удается культивировать по-
груженным методом, выращивая их на микрошариках из синтети-
ческих материалов, заполняющих биореактор на несколько куби-
ческих метров.
Моноклональные антитела. В США предложен метод промыш-
ленного получения моноклональных антител. Гибридомы инкапсу-
лируют в капсулы углеводной природы, которые сохраняют гиб-
ридомы при циркулировании к ним питательных веществ и удале-
нии отходов метаболизма. Через несколько дней капсулы собирав
ют, отмывают и вскрывают. Получают до 40—50% антител на вес
сухой массы клеток. Хотя гибридомы обычно культивируют в жи-
вых мышах, теперь возможно их выращивание in vitro в 100-лит-
ровых ферментерах эйрлифтного типа. Можно выращивать гибри-
домные клетки в биореакторах, соединенных с коровой. Лимфа ко-
ровы выводится, оксигенируется и вводится в биореактор, где ис-
112
пользуется как субстрат. Жидкость из биореактора рециркулиру-
ет к корове. Можно получать до 5 г моноклональных антител при
использовании одной коровы в день. Это снижает цену на моно-
клональные антитела с 1200—1500 до 100—200 долларов за один
грамм. Изобретение основано на регенерации субстрата.
Масштабированное культивирование
пищевых микроводорослей
Наиболее подходящими для этой цели оказались африканская
цианобактерия Spirulina platensis и мексиканская Spirulina ma-
xima, достигающие длины от 200—500 мкм до нескольких мм.
Системы для культивирования микроводорослей представляют
гобой искусственные водоемы с пластиковыми или цементными
берегами и дном, оснащенные устройствами для автоматическое
го контроля pH, температуры, солености воды, концентрации СО2
и др. Масштабированное культивирование спирулины имеется, на-
пример, в Таиланде.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СТАДИЙ
ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФЕРМЕНТАЦИЙ
Общая схема ферментационных процессов для производства
первичных и вторичных метаболитов показана ниже.
Стадия
I
II
III
IV
Ход ферментации
сохранение инокулята
подготовка инокулята
а) 1—2 качалочные колбы
б) получение спор на твердой среде
предварительная ферментация культуры
1—3 предварительных ферментации
продукционный ферментер
а) периодическая ферментация
б) проточная ферментация
I стадия. Сохранение инокулята в течение длительного пери-
ода — главное условие для практической ферментации. Важно
не просто сохранить клетки жизнеспособными, но и сохранить их
способность к образованию продукта. Цель сохранения — под-
держание штамма без его деления как можно дольше (чтобы
избежать спонтанных мутаций).
Рабочие штаммы получают из маточных культур, которые не
должны пересеваться чаще одного раза в два года.
Для каждого штамма выбирают наиболее подходящий способ
(охранения: при низких температурах (2—6° С), замораживании
при —18° С или при —809 в рефрижераторах или при —196° под
ИЗ
жидким азотом. Замораживание производят постепенна
(1° С/мин), но если используются защитные средства, предотвра]
щающие образование кристаллов, можно проводить и быстро!
замораживание. Число выживших клеток критично, так как до 95°^
микроорганизмов может погибнуть во время замораживания 1
to
после оттаивания клеток. j
Лиофилизация — лучший способ сохранения штаммов. Добавь
ление защитных веществ (обезжиренного молока или сахарозы|
понижает летальность во время лиофилизации. Лиофилизирован^
ные культуры можно сохранять неограниченно долгое время, по^
этому этот способ сохранения культур считают наиболее удов»)
летворительным. (
II стадия. Рост инокулята. Стандартное время для роста ино^
кулята следующее.
Лиофилизированные культуры — 4—10
дней
Замороженные при низких температурах
бактерии
актиномицеты
грибы
.Хранение при низких температурах
бактерии
актиномицеты
грибы
—4—48 ч
—1—5 дней
—1—7 дней
—4—24 ч
— 1—3 дня
— 1—5 дней
Для некоторых ферментаций используют споровый материал.
Для этого хранившийся материал культивируют на твердой ере-.
де 8—24 дня. В качестве субстрата чаще всего используют отру-ч
би, горох, рис, ячмень. Для аэрирования материал постоянно;
перемешивают. Споры вместе с культуральной жидкостью смеши-;
вают с ПАВами (например, с твином~80) и переносят в фермент
тер. Для хорошей ферментации важны возраст инокулята, число;
клеток и спор, среда, которая используется для инокулирования^
Стадия III. Предварительную ферментацию проводят, чтобы
получить достаточное количество инокулята для большого (про-
дукционного) ферментера. Оптимальная концентрация опреде-г
ляется числом стадий предварительной ферментации. Обычно;
для инокулирования требуются следующие концентрации клеток:
бактерии
актиномицеты
грибы
споровые суспензии
-0,1-3,0%,
-5-10%,
-5-10%,
1—5-105/л р аствор а.
На последней стадии используют продукционную среду,
индуцировать образование целевого продукта.
чтобы
Стадия IV. Продукционная ферментация
Ферментеры. Используют ферментеры различных размеров в
зависимости от природы получаемого целевого продукта
(табл. 17).
114
Таблица 17
Размеры ферментеров для различных процессов
Размер фермен-
тера, м3
Продукт
1—20
40—80
—450
ферменты для диагностики, вещества для молекулярной биологии
некоторые ферменты, антибиотики, протеазы, амилазы, трансфор-
мации стероидов, аминокислоты
аминокислоты (глутаминовая кислота)
СРЕДЫ И СЫРЬЕ
для МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ промышленности
Подбор синтетической среды
О преимуществах использования синтетических сред в микробио-
логической промышленности говорилось выше. При подборе син-
тетической среды исходят из потребностей микроба в элементах
питания, которые в свою очередь зависят от элементарного соста-
ва его клеток.
Многие аэробные и факультативно-аэробные организмы растут
па простой химически определенной (синтетической) среде, не
содержащей ростовых факторов или других сложных ингредиен-
тов. Поскольку элементарный состав большей части микроорга-
низмов очень сходен, можно составить среду, основываясь на
атом анализе. Состав клеток зависит от типа клеток у бактерий,
дрожжей или плесеней; обычно содержание углерода находится
в пределах 45—55%, азота — 6—14, К — 0,5—2, Р — 1—3, Mg—•
0,1—1, S — 0,02—1, Са — следы — 1%. Микроэлементы присут-
ствуют в количествах (на 100 г сухой биомассы): Си — 0,1—1 мг,.
Г'е—1—10, Zn—1, Мп — 0—5 мг. Из указанных элементов со-
ставляют среду, которая позволяет получить желаемую концен-
трацию клеток. Для этого требуется выбрать лимитирующий фак-
тор, которым чаще всего служит источник углерода, поскольку
при его исчерпании рост останавливается, в то время как при ли-
митах по другим элементам, например по азоту, может происхо-
дить аномальный рост, сопровождающийся большим накопле-
нием липидов. Если принять, что желаемая концентрация кле-
ток-— 10 мг/л, а источник С — глюкоза, то в аэробных условиях
выход клеток составляет ~45—50% (по весу сухой биомассы).
В табл. 18 представлен состав среды, подобранной на основе
элементарного состава клеток. В группе А — все необходимые
компоненты, кроме N, в группе В — источники N в виде аммо-
нийного азота, который предпочитается большинством микро-
организмов, и ионы Р, обеспечивающие буферную емкость. Функ-
пня группы С — хелатора — сохранение металлических ионов в
растворе, а также предотвращение их токсических эффектов, осо-
бенно при использовании маленьких инокулятов. Буферные свой-
115
ства группы D необходимы для поддержания значения pH, блщ
кого к нейтральному (оптимального для большинства бактерий]
Снижение pH есть результат поглощения аммонийного иона и
Таблица 18
Пример химически определенной (синтетической) среды
(по Miller е. а., 1986)
Ингредиенты
Цель
Концентрация, г/л
Группа А
Глюкоза
КаНРО4
MgSO4 • 7НаО
СаС12
Fe2 (SO4)3
ZnSO4 7H2O
MnSO4 H2O
Группа В
(NH4)3HPO4
(NH4) hspo4
Группа C
CeH6Na3O7 • 2HaO
Группа D
Na2HPO4
KH2PO4
С, энергия
Ca
Fe
Zn
Mn
20,0
1,0
0,4
0,03
12-1(Г4
4С0“4
4-Ю”4
хелатирующее вещество
20
10
N
N
4
3
4
ж
раствора. Если хотят получить более высокий урожай клеток, то.
содержание компонентов среды пропорционально увеличивают,
но при этом pH поддерживают уже не с помощью буферной сме-
си, а путем добавления оснований, например NH4OH. Высокая]
концентрация буферов, необходимая для получения высокой^
плотности клеток, может быть токсичной для них. Величину pHj
поддерживают в соответствии с типом организма: 4,5—7,0 для
плесневых грибов, 4,5—6,0 для дрожжей или 6,0—7,5 для бакте-
рий. Если клетки выращивают в колбах, то О2 является наиболее.!
важным питательным веществом и подается путем качания колб/1
содержащих 100 мл среды в 500 мл, на круговой качалке. Можно!
достичь скорость поглощения О2 от 0,3 до 9,5 ммолей/л/мин вт
зависимости от типа применяемой колбы: гладкой или с разбрыз-
гивателем. В ферментерах с аэрацией, перемешиванием и разбрыз- ]
гиванием скорость поглощения О2— 0,1—10 ммолей/л/мин. '
СЫРЬЕ
ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ промышленности
Источник углерода. 10—60% стоимости продуктов фермента-
ции приходится на стоимость компонентов среды и прежде всего
116
I1
ил стоимость источника углерода. Для снижения затрат в микро-
fino,логическом производстве обычно применяют дешевые среды,
При готовленные на основе сырья растительного происхождения.
Как источник углерода чаще всего используют злаковый крах-
мал, мелассы, кроме того, декстрозу, растительное масло, мета-
1юл, этанол, н-парафины, целлюлозу, лактозу, реже этанол и ук-
сусную кислоту.
Таблица 19
Наиболее обычные источники азота,
используемые в ферментационных процессах
(по Cooney, 1985)
Кукурузный экстракт Мочевина
Ьн-ная мука Дрожжевой экстракт
Рыбная мука Гидролизат белка
Остаток после отгонки спирта Сернокислый аммоний
Аммонийный газ
Источники азота. Наиболее обычные источники азота, исполь-
зуемые в промышленности, приведены в табл. 19. Источник азота
Может сильно удорожать ферментацию. Считают, что комплекс-
ные азотистые вещества (как и углеродные) выгоднее использо-
н.тгь, чем аммоний или его соли, поскольку они обеспечивают вы-
сокую скорость ферментации и конверсии, так как содержат до-
полнительные питательные вещества. Но в комплексных источни-
ках могут присутствовать неутилизируемые компоненты, которые
и у жно отделять от конечного продукта и ликвидировать. Кроме
loro, с простым источником азота легче осуществлять контроль
и регуляцию процесса. Использование недорогих питательных ве-
ществ известного состава как источников азота более целесооб-
разно для таких процессов, высокую стоимость которых в боль-
шей степени определяет собственно ферментация, а не выделение
продукта.
При приготовлении сред в промышленных масштабах учиты-
шиот состав ингредиентов, качество сырья, вариабельность со-
<чава сырья от партии к партии, отношение C/N, содержание при-
месей. Для приготовления сред существует определенный поря-
док растворения или суспендирования ингредиентов, учитывают
шачение pH до и после стерилизации.
Повышение температуры (при стерилизации) и аэрации изме-
няют качество питательной среды, поэтому эти изменения прове-
ряют перед инокулированием. Состав сред может быть оптимизи-
рован с использованием статистических методов при создании
программ, основанных на применении компьютеров.
В настоящее время ферментационную промышленность рас-
сматривают как интеграционное производство, включающее под-
готовку сырья, приготовление сред, проведение собственно фер-
117
ментации, выделение и очистку продукта и обработку (удалена
отходов. Причем обработке или утилизации отходов в последи
время придают особо важное значение. Например, известно, Ч
сейчас при пуске нового завода 10—15% капиталовложений |
глощает обработка отходов. Поэтому выгоднее использовать ]
сырье, которое дает меньше отходов. К важным условиям (пас
метрам) проведения микробиологического процесса относят^
температура, аэрация (если процесс аэробный), давление, перей
шивание и некоторые другие.
г.
УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ
Температура. Иногда вначале повышают температуру, что®
получить за более короткое время биомассу, после чего темпер!
туру снижают при наступлении идиофазы. С помощью темпе$|
турной манипуляции можно очень сильно изменить выход пр|
дукта. Например, если повысить температуру только на 1% вьпЗ
оптимума, то выход продукта в пенициллин ацилазной реакци
снижается на 20%. 1
Аэрация. Скорость аэрации устанавливается в соответстви
с потребностью организма в О2. т
Давление. Ферментацию осуществляют при избыточном да|
лении 0,2—0,5 бар, чтобы избежать инфицирования. В большй)
ферментерах учитывают гидростатическое давление, так как эТ
оказывает влияние на растворимость О2 и СО2. 1
Перемешивание. Если применяют дисковые мешалки, то ИС
пользуют следующие скорости перемешивания.
Размер ферментера, м3
0,02
1—20
40—150
450
Скорость перемешивания,,
число оборотов в 1 мин
250—450
250—350
120—180
120—150
60—120
КОНТРОЛЬ 1
ЗА ХОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ |
Для анализа используют специальные датчики (сенсоры), Koi
торые должны быть стерильными, если они помещаются в сте^
рильные области ферментера. Измеряют следующие параметру
(см. табл. 19): физические — /0, давление, потребляемую моцц
ность, вязкость, скорости потоков газов и жидкости, мутность,
вес ферментера; химические — pH, растворенный О2, О2 и СО2 I
выходящих газах, редокс-потенциал, концентрацию субстратов
концентрацию продуктов; биологические — содержание RNA
DNA, NADH2 и АТР, белка. Биологические параметры измеряю!
118
I отобранных пробах вне ферментера, за исключением NADH2,
который можно измерять на биотехнологической линии (on line)
флюорометрическим методом.
Недавно разработаны биосенсорные датчики, основанные на
Мптализных и аффинных свойствах биологических молекул.
О2 определяют по парамагнитным свойствам, СО2 — по по-
глощению в инфракрасной области. Широко применяют масс-
спектрометр для измерения О2, СО2, N2, NH3, метанола и этанола
одновременно. Измерения производятся непосредственно на линии
(он line), непрерывно, с большой надежностью и точностью,
И настоящее время существует постоянно действующая и связан-
ная с реактором система пиролиза, которая позволяет анализи-
ровать всю ферментационную жидкость, включая растворенные
Или суспендированные в жидкости нелетучие продукты, в том
числе биомассу, белки и др. Можно определять растворенные в
жидкости газы, используя мембраны, пропускающие газы.
Для измерения pH используют электроды, которые выдержи-^
на ют стерилизацию при высокой температуре, давление, механи-
ческие стрессы. Для определения О2 в промышленности исполь-!
дуют кислородные электроды амперометрического типа. При изме-
нении концентрации О2 изменяется сила тока. При полярографи-
ческом измерении О2 восстанавливается на катоде (Pt), а сереб-
ро окисляется на аноде.
Ток, образующийся в этой реакции, пропорционален пар-
циальному давлению О2. В промышленности кислородные элект-
роды широко применяются, но служат они не долго. Концентра-
цию растворенного СО2 (рСО2) определяют в инфракрасном ана-
лизаторе.
КОМПЬЮТЕРИЗАЦИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
Оптимизация микробиологических процессов
с помощью ЭВМ
ЭВМ используют для учета масштабного эффекта при оценки
ферментационных параметров и поддержания их в оптимальном
режиме, а также для проведения анализа при установлении влия-
ния отдельных параметров на метаболическое поведение культур
микроорганизмов. Процесс оптимизации требует варьируемого
параметра, который надо оптимизировать. Удобными параметра-
ми для вариаций служат: общая продукция при ферментации в
периодических условиях, образование продукта/ферментер-ч, кон-
центрация продукта в выходящем потоке, стоимость тонны про-
дукта, выходящего из ферментера, стоимость тонны экстрагиро-
наиного продукта.
Каждый контрольный контур содержит: объект регулирования,
намеряющий элемент (например, термометр), преобразователь
гнгпала (например, компьютер), конечный исполнительный эле-
119
мент (контрольный клапан или насос). После получения сигнал
ошибки компьютер вырабатывает и посылает к конечному ncnoj
нительному элементу нужный сигнал для корректировки процв
са. Имеется общая тенденция заменить все аналоговые датчик
на цифровой компьютерный контроль. ;
Контроль процесса с помощью компьютера
Компьютерный контроль очень важен для дозируемого доба!
ления сырья и общего потребления энергии. Это особенно важн
для ферментаций, в которых субстрат и сырье составляют гла|
ную стоимость. Другая причина полезности компьютерного кош
роля — это возможность оптимизации процесса, которая вклм
чает максимизацию объемной продуктивности, концентрации npi
дукта и увеличения степени конверсии субстрата в продукт. Пр^
имущество компьютерного контроля — это также быстрое и эй
фективное управление параметрами процесса, хранение и во<Й
произведение нужных данных, большая гибкость работы заво|
в соответствии со спросом на продукцию, наиболее надежны]
контроль загрязненности и безопасности на заводе. Многие
этих задач пока еще не реализованы, так как нет надежных чу$
ствительных инструментов для измерения важных биологическй
Таблица 20
Физические и химические параметры,
измеряемые в ферментационном процессе
(по Wang, 1986)
Параметры
Частоты ис-
пользования
в процессах
в промышлен-
ных фермен-
терах (обычно
>50 тыс. л)
Параметры
Частоты И(
пользовали
в процесс#
в промышл(
ных ферме|
терах (обыч
>50 тыс. I
Физические
Температура
Давление
Использование мощности
Скорость перемешивания
Вязкость
Скорость потока газа
Скорость потока жидкости
Мутность
Объем и вес танка
Пенообразование
Химические
PH
Растворенный кислород
Концентрация выходящего
СО2
Концентрация выходящего
О2
Редокс-потенциал
Концентрация субстрата
Концентрация продукта
Биологические
Концентрация клеток
Активность ферментов
ДНК И РНК
НАДН
АТФ
4-4’4' широко используется, 44“ менее часто используется, 4 редко используется.
120
it физико-химических параметров. Сложность микробных систем
делает их трудными для адекватного моделирования в целях
контроля, но даже при этих трудностях некоторые ферментации
проводятся с компьютерным контролем: это производство глута-
миновой кислоты, пекарских дрожжей, циклогексимида, лизина,
пенициллина и других антибиотиков. Параметры, измеряемые в
(ферментационных процессах, представлены в табл. 20. Широко
применяют сенсоры для определения физических величин, менее
широко — для определения химического состава и весьма редко
применяют биологические сенсоры, позволяющие определять кон-
центрацию клеток, активность ферментов, содержание DNA и
RNA, NADH, АТР. Для осуществления биологических измерений
on line (на линии ферментера) имеются большие помехи: присут-
ствие нерастворимых субстратов или окрашенных веществ, малая
специфичность сенсора или необходимость поддерживать стериль-
ность. Датчики, применяемые в биологических процессах, не вы-
держивают стерилизации паром. Эти помехи стараются обойти,
используя мембранные закрытые электроды или сенсоры.
Для решения экономико-финансового вопроса применения
ЭВМ требуются дополнительные чисто экономические данные,
которыми мы еще не всегда располагаем в должном объеме. Од-
нако компьютеры уже сегодня применяются по крайней мере
для трех целей: 1) для сбора первичной информации; 2) для ана-
лиза процесса; 3) при разработке математических ферментацион-
ных моделей с целью управления процессом регулирования его
хода.
Сбор первичной информации
Его можно осуществлять с помощью ряда сенсоров, опреде-
ляя такие параметры, как pH, рО2, давление, вязкость, ско-
рость аэрации, содержание О2 и СО2 в растворе и газовом пото-
ке4. Другие данные можно получить путем лабораторных измере-
нии в отобранных пробах и ввести их непосредственно в компью-
тер вне биотехнологической линии. Это — содержание биомассы,
питательных веществ, образование метаболитов.
Первичная информация, полученная от системы различных
датчиков, с помощью компьютеров превращается в любую удоб-
ную стандартную систему единиц.
Определяя весь необходимый набор параметров, характери-
зующих данный процесс, можно с помощью ЭВМ находить опти-
мальные их соотношения, т. е. оптимизировать процесс. Для по-
ручения четкой модели, описывающей динамику процесса, важно
:нать события, происходящие внутри клеток, например протеи-
назная активность и аккумуляция продукта определяют конечный
выход продукта ферментации. Это особенно важно для новых
процессов, основанных на rDNA-технологии и слиянии клеток.
Компьютерный контроль делят на два типа: прямой цифровой
контроль и аппаратурный контроль. В первом случае компьютер
121
И4
получает данные с сенсоров и использует эту информацию Д|
образования сигнала, который посылается обратно в систе!
управления для эффективного регулирования. В случае аппад
турного контроля компьютер только устанавливает показан!
существующих аналоговых датчиков. I
Анализ процесса. Можно определять с помощью ЭВМ см
рость образования СО2, потребления О2, коэффициент дыханш
удельную скорость потребления субстрата, экономический коэ!
фициент, тепловой баланс, потребление энергии на единия
объема жидкости, число Рейнольдса и другие. В частности, есл
количество биомассы непосредственно не определяется, то I
можно рассчитать по потреблению О2. Принимают при этом, 41
константа выхода биомассы и количество О2, необходимое д4
поддержания метаболизма, известны. j
В настоящее время установлено, что кривая роста микроорг!
низмов, получаемая по расчетным данным, хорошо совпадает^
кривой роста, которую можно построить по экспериментальна
данным. Как пример дальнейшего использования данных анал|
за, на рис. 37 проиллюстрирована оптимизация биосинтеза
• 'У
эр|
Рис. 37. Кривые изопродукции и изовремени для процесса продукции эритрс
мицина в зависимости от температуры и величины pH. Проценты основаны н
самых низких полученных выходах (Cherry a. Durant, 1979)
тромицина. Вначале были проведены ферментации при различные
условиях pH и t и далее произведены расчеты, целью которые
было построение кривых, определяющих параметры (/, величин1
pH и др.), обусловливающие выход постоянной продукции (изо
продукции) или постоянное время для протекания процесса
(изовременные кривые).
122
РАЗРАБОТКА МАТЕМАТИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ
ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ
Контроль и оптимизация биотехнологических процессов стано-
вятся все более важными задачами. Но, как мы уже знаем, пока
иг! надежных сенсоров для определения биомассы и ряда мета-
болитов. Как уже упоминалось, измерение этих продуктов вне
линии производят с опозданием и эти данные трудно ввести в
контрольную систему. Это одна из причин, объясняющая все
большее использование математических моделей для предсказа-
ния поведения культуры.
Проблема состоит в том, чтобы разработать модель, которая
не потребляла бы слишком много компьютерного времени и
объема памяти, а позволяла бы проанализировать поведение
реального объекта в различных условиях, значит, в модели долж-
ны быть учтены все наиболее существенные факторы, имеющие
влияние на процесс. Пока оптимизация и контроль биотехноло-
гических процессов с использованием компьютеров и математи-
ческих моделей проводятся главным образом для периодических
пилотных установок. На рис. 38 показана схема пилотной уста-
Тш\ 38. Контрольная система пилотной установки по получению ферментов у
Bacillus sp. (no Geoffroy в. a., 1987)
попки, производящей бактериальные ферменты. Из биореактора
через сенсоры данные поступают на преобразователь (преобра-
|\»'Т электрические сигналы в цифровую информацию) и далее
мы водятся на микропроцессор, где они используются для вычис-
ления выходных данных. Кроме того, в системе имеется еще ос-
новной (host) компьютер, в котором заложена математическая
модель процесса, есть ввод и вывод информации. Эта математи-
123
ческая модель совместно с текущей информацией, поступающ
от микропроцессора и от газового анализатора, вырабатыв
окончательные выходные данные, поступающие обратно на микр
процессор. Выходные данные из микропроцессора, пройдя чер
дополнительные преобразователи, служат управляющими сиг
лами. Существует множество математических моделей для пр
точных и периодических ферментаций, но они применимы толь]'
для определенного специфического процесса. Использование мат
матической модели позволяет лучше понимать ферментационнЬ
процесс, рассчитать влияние отклонений от стандартных парами
ров на результаты ферментации и оптимизировать процесс быс
рее и с меньшими затратами, чем с помощью традиционных прц
мов.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТА
Целевой продукт (если это не клетки) в промышленнц
микробиологических производствах обычно находится в очень н
большом количестве огромного объема жидкости. При этом част
требуется хорошая очистка продукта.
Целевым продуктом могут быть клетки микроорганизмов ил
их метаболиты, которые сохраняются в клетках, — внутрикле;
точные метаболиты или выделяются наружу — внеклеточные ме
таболиты.
На первой ступени очистки сепарируют клеточный материа
и нерастворимые в культуральной жидкости вещества от фильт*
рата. Сепарацию осуществляют путем фильтрации или седимен!
тации. В промышленности используют барабанные фильтры, ко;
торые представляют собой вращающиеся барабаны, а фильтрую!
щим материалом служит ткань или тонкая сеть.
В промышленности седиментацию производят в больших спе
циальных центрифугах, в которых твердая фаза приобретае
консистенцию крема или пасты. Для выделения внутриклеточны
веществ клетки разрушают одним из известных методов. Исполь*
зование ультразвука хотя и эффективно, но дорого и в промыщ
ленном масштабе обычно не применимо. Существует серия физи-
ческих, химических и биологических методов для разрушеии
клеток (рис. 39).
Поскольку продукты ферментации обычно находятся в очень*
низких концентрациях в фильтратах, требуется их концентриро-
вание. Его осуществляют различными методами (рис. 40). ‘
Экстракция. Липофильные вещества экстрагируют смешиваю-]
щимся растворителем, например пропанолом или бутилацетатом».
На второй ступени экстрагированный материал снова переводят]
в водную фазу. Метод может легко и быстро выполняться прй4
крупномасштабной ферментации, и поэтому особенно важен для,|
нестабильных веществ. Но традиционные экстрактивные системы,,^
использующие спирты, кетоны или эфиры, малоактивны для вы-,
124
Разрушение клеточных стенок
Рис. 39. Методы разрушения клеток для выделения внутриклеточных метаболитов
деления некоторых веществ, например органических кислот. В Hi
чале развития микробиологической промышленности выделен!
органических кислот вели путем их осаждения в виде кальций
вых солей с последующим выделением свободной органически
Принцип сепарации
размер
диффузия
заряд
разгонка
упариванием
растворимость
вес
поверхностное
натяжение
размеры частиц 10 4
101
10“3 ю
10“1 10°
ю2 ю3
мкм
Рис. 40. Процессы концентрирования, в которых используют различные хими-
ческие и физические свойства частиц и молекул
г
кислоты при внесении H2SO4, очисткой, упариванием для получе-
ния кристаллов. Эти старые способы малоэффективны. Кислоты;
кристаллизуются с большим трудом и маленьким выходом. Kalt
126
пльтернатива к классическому методу осаждения для промыш-
ленных масштабов предложена экстракция с использованием но-
вых мощных экстрактантов, таких как фосфорорганические ве-
щества и алифатические амины, экстрагирующие кислоты из;
большого числа водных растворов, включая ферментационный;
бульон, сточные воды и др*
Хроматографические методы.
Существует ряд методов хрома-
тографии, которые применяют при очистке различных продуктов:
адсорбционная хроматография, ионообменная (основана на раз-
личных константах диссоциации катионов или анионов), гель-
хроматография. В последнем случае используют гели с известны-
ми порами. Вещества, имеющие размеры, большие, чем поры ге-
ля, проходят через него. Таким образом, разделяют молекулы
разных веществ по молекулярному весу.
Аффинная хроматография основана на селективном связыва-
нии носителя с определенным продуктом, который затем элюи-
руют.
При распределительной хроматографии молекулы распреде-
ляются между двумя фазами в зависимости от своего родства к
растворителям.
Мембранные процессы. Для концентрирования вещества и его
очистки используют ультрафильтрацию, обратный осмос и диализ..
С помощью диализа отделяют маленькие молекулы. При об-
ратном осмосе низкомолекулярные вещества (молекулярная мас-
са <500, например глюкоза или соли) фильтруют через мембра-
ну под давлением 50—100 бар (1 бар=105 Па). При ультрафиль-
трации от маленьких молекул отделяют молекулы с большой мо-
лекулярной массой, например белки, бактерии, дрожжи. Отделе-
ние производят под давлением 0,5—10 бар. Кроме целлюлозно-
ацетатных мембран для этой цели предложено использовать но-
вые тонкие пленки: полиакриламид/полисульфоновые мембраны.
Считают, что удаление воды (обратный осмос) до проведения
традиционной дистилляции (например, спиртов) целесообразно и:
этот способ в ближайшем будущем можно реализовать в промыш-
ленности. Для концентрирования вещества используют молеку-
лярные сита. Это поровые твердые материалы, которые пред-
почтительно используют для поглощения спирта или воды из их
смеси. Используют цеолитовые молекулярные сита. Неорганиче-
ские соли эти сита не аккумулируют. Для выделения спиртов
разработаны полимерные адсорбенты. Это синтетические поли-
мерные смолы серии ХАД.
Кристаллизация и осаждение. На последних стадиях очистки
и концентрирования метаболитов применяют низкотемператур-
ную кристаллизацию. Для осаждения к веществу добавляют хи-
мические агенты.
Высушивание. Применяют конвективную (в сухом воздухе)
сушку, контактную (с адсорбентом) сушку и высушивание из
замороженного состояния (последнее для небольших объемов ю
в небольшом масштабе).
127
а о л и ц a
Потери выходов в типичных ферментационных процессах
(по Crueger, Crueger, 1984)
Продукт ферментации
Потери выхода, %
Белок одноклеточных
Антибиотики
Внеклеточные ферменты
Внутриклеточные ферменты
---tin
Таблица 22
Сравнение трех технологий
(по Harry et al., 1984)
Параметр
Классическая
ферментация
Энзимная
технология
ч
Органический ।
синтез ?
Катализатор
живые клетки
-Специфичность реакции
Условия реакции
Стерильность
Концентрация продукта
(г/л)
Выход, в %
Специфические условия
(трудности)
Особые проблемы
иногда
умеренные
Да
10—200
10—95
охлаждение
регуляция мета-
болизма
Продукт
мертвые клетки
ферменты
часто
умеренные
Да
50—500
70—99
стоимость катали-
затора
стабильность фер-
мента
металлы
часто умеренные <
экстремальные
нет
50—500
\1
70—99
стоимость
затора
токсичность для О1Й
ружающей среды
катал
Таблица 23
Вещества^ выпускаемые в больших количествах
с использованием методов биотехнологии, (в млн долларов!год в 1980)
(по Harry et al., 1984)
млн, долларов в год ферментация Энзимная ' технология 'i
Этанол
L-глутаминовая кислота
L-лизин
L-молочная кислота
.Витамин С
Метан (биогаз)
Глюкоза
.Изоглюкоза
Ксантан
..Лимонная кислота
Белок одноклеточных
Уксусная кислота
Глюконовая кислота
Итаконовая кислота
-4— вещества производят.
128
Выход продукта. Он зависит от числа стадий очистки и чувст-
вительности вещества к операциям очистки. Сравнительные поте-
ри разных веществ в процессе очистки показаны в табл. 21. Стои-
мость очистки не должна превышать 20%, но в случае некоторых
внутриклеточных метаболитов она достигает 90% продукционных
затрат (ферментация-[-очистка).
Сравнение трех технологий классической ферментации, энзим-
ной технологии и органического синтеза — дано в табл. 22.
В табл. 23 показаны продукты, выпускаемые в больших количе-
ствах с использованием биотехнологических методов. Практиче-
ское применение этих продуктов, характеристика продуцентов,
процессы биосинтеза, реализованные способы получения и новые
перспективные разработки для производства указанных веществ
рассматриваются в следующей части книги.
ЛИТЕРАТУРА
Внес тур У. Э., Шмите Л. А., Жил ев и ч А. В. Биотехнология: Биологи*
ческие агенты, технология, аппаратура. Рига, 1987.
Юсуп беков И. Р., Бабаянц А. В., Мунгиев А. А., Якубов Э. М.
Управление процессами ферментации с применением микро-ЭВМ, Ташкент,
1987.
Adder J. Bioreactors//Proc. 4th Eur. Congress on biotechnology. Amsterdam,
1987. June 14—19. P. 9.
Bailey J. E., О 11 i s D. J. Biochemical engineering fundamentals. N.Y., 1977.
Bartholomew J. Scale-up of submerged fermentation//Adv. Appl. Mier. 1960.
Vol. 2. P. 289—300.
C hery an M., M e h a i a M. A. Bioreactors for high—performance fermentations.
1985. P. 231—245//Osmosis a. Ultrafiltr. Symp. Philadelfia. Washington,
1984.
Cooney Ch. L. Growth of microorganisms//Biotechnology. 1983. Vol. 1, Ch. 2. P. 97.
ox R. I. Computers and Microprocessors. Industrial Fermentation.//Topics in
Enzyme and Fermented Biotechnology. 1984. Vol. 8. P. 125—127.
Goto Y. Computer control of fermentation Processes.//Biotechnol. Aminoacid
Prod. Tokio, Amsterdam. 1986. S. 90—98.
1 s h i z a k i A. Behavior of carbon dioxide and its function affected to the fer-
mentation in submerged culture//Proc. 4th Eur. Congress on Biotechnol.
Amsterdam. 1987. Vol. 3. P. 48.
J a r a i M. Oxygen transfer in the fermentation of primary and secondary meta-
bolites//Ferment. technology today. 1972. P. 97—103.
Kertest A. S., King C. L. Extraction chemistry of fermentation product car-
boxylic acids//Biotechnology a. Bioengineering, 1986. Vol. 28, N 2. P. 269—282.
Nyeste L., Pecs M. Fermentacios rendszeren iranyitasa es* ellenozese//Bio-
technol. Szimp. aug. Budapest, 1985.
О 1 d s h u e L. J., Coyle С. K. et al. Scale up problems in aerated stirred ves-
sels//Dechema Monographion. 1977. Vol. 81. P. 115—135.
Paar H. et al. New tubular reactor for anaerobic bioprocessing. A contribution
to biotechnical methodology//Proc. 4th Eur. Congress on Biotechnol. Amster-
dam, 1987. P. 234.
Sisak C., Ormos Z. A new tipe multilayer fluidized bed bioreactor and its
application to glucose isomerization//Proc. 4th Eur. Congress on Biotechnol.
Amsterdam, 1987. P. 273—276.
Tsao G. T., Mukerjee A., Lee Y. Y. Gas—liquid cell oxygen transfer in
fermentation//Fermentation technology today. 1972. P. 65—71.
Vol esky B. Bioprocess modelling and optimization//Proc. 4th Eur. Congress
on Biotechnol. Amsterdam, 1987. P. 193.
Wang D. L. C. et al. Fermentation and enzyme technology. N. Y., 1979.
i Л. И. Воробьева
ГЛАВА V
НЕЙТРАЛЬНЫЕ продукты
ЭТАНОЛ |
,J J
Практическое применение. Большую часть этилового спирта
получают в мире химическим способом путем гидратации продук-
та переработки нефти — ацетилена: 1
СН9 - СН2 + Н2О каталиэато±. СН3СН2ОН (30) 5
J 3 2 высокая f> 3 2 1
Таким путем производят —440 млн. л этанола в год. Другой
традиционный способ получения этанола — микробиологический и .
заключается в проведении спиртового брожения
С6Н12О6->-2С2Н5ОН + 2СО2 AG°=234,5 кДж.
При этом из 180 гексозных ед. (главным образом глюкозы) по-
лучают теоретически 92 ед. по весу этанола и общий выход со-
ставляет 51,1 %, а на практике менее 47%. Биологическим путем,
получают около 185 тыс. тонн л этанола в год. Его используют
как растворитель, экстрактант, антифриз. Но в последние десяти-
летия его рассматривают как биотопливо, которое в какой-то сте-
пени и в некоторых странах может компенсировать недостаток ис-
копаемого топлива. Биоэтанол рассматривают прежде всего как
автомобильное топливо, особенно важное для стран, импортирую-
щих в больших количествах нефть и вместе с тем располагающих
большими сельскохозяйственными площадями (как Бразилия и
Южная Африка). Для Бразилии, например, 2/3 внешнего рынка
еще недавно составляла нефть. Но уже в 1985 г. 50% автомоби-
лей в этой стране было переведено на 20% газгойль (бензин с
20% спирта). В 1981 г. в Бразилии было выпущено 450 тыс. ав-
томобилей с моторами, сконструированными в соответствии со*
сжиганием гидратированного (96%) этанола. Микробиологичес-
кое производство биоэтанола как автомобильного топлива орга-
низовано в США, во Франции, ФРГ, Швеции, Японии, Австралии^ .
Новой Зеландии, ЮАР. Биоэтанол как топливо имеет ряд’преиму-
ществ перед освинцованным бензином: меньше загрязняет атмо-
сферу, легче подвергается биодеградации, автомобили с газгойлем
лучше стартуют при низких температурах, что важно для стран
с холодным климатом, этанол имеет более высокое октановое чис-
ло, чем газолин, и потому лучше сжимается и проявляет более
высокий энергетический эффект, чем последний, для производства
этанола микробиологическим путем можно использовать возобнов-
ляемое сырье.
Но этанол — не только топливо, по еще и сырье для химиче-
ской промышленности. Из него можно получать этилен, глицерин,
линейные алифатические спирты и алкены. Считают, что на ос-
нове биоэтанола будет создана алкохимия как альтернатива (или
на смену) существующей сегодня петрохимии (нефтехимии). Сто-
имость 1 л этанола — 25—60 центов, газолина -— 27 центов, а
нефти — 33 доллара/баррель (1 баррель —159 л нефти). Сто-
имость биоэтанола на 55—70% определяется стоимостью класси-
ческого микробиологического сырья. Наименее дорога целлюлоза
и отходы, но они требуют предобработки, что также удорожает
производство.
Продуценты. Дрожжи. Большая часть исследований, а также
работа пилотных установок и промышленная продукция осущест-
вляются главным образом с помощью дрожжей Saccharomyces ce-
revisiae, а также Sacch, uvartim (ранее Sacch, car Isb er gensis). Тра-
диционные продуценты этанола — пекарские дрожжи — сбражи-
Таблица 24
Сельскохозяйственные ресурсы
(по Wohner et al., 1984)
Ресурсы
Количество сухого
вещества, т
Продукция глобальной биомассы
Мировая продукция крахмала
Утилизируемая продукция древесины
Мировая продукция сахара
Мировое потребление нефти
Лактозные отходы в сыворотке
1,2-10й
1,1-10»
1,3-1010
1,2-Ю8
3-109
1-10®
вают главным образом моносахара и некоторые дисахара. Для
роста дрожжей в питательную среду вносят такие источники азо-
та, как аммоний или его соли, мочевину или аминокислоты. Как
источник фосфора обычно вносят ортофосфаты, а также в неболь-
ших количествах соли К, Mg, Са и следовые элементы. Sacch. ce-
revisiae нуждается в биотине. Лучшим источником азота, макро-
и микроэлементов и витаминов служит дрожжевой экстракт. Для
промышленности особый интерес представляют дрожжи, способ-
ные использовать непищевое возобновляемое сырье. В связи с
этим в табл. 24 приведены данные, показывающие огромные ре-
сурсы таких субстратов: это продукты древесины, крахмал, сыво-
ротка молока, которые можно и нужно превращать в этанол, ес-
ли обратить внимание на то, что, несмотря на истощающиеся за-
пасы ископаемого топлива, нефть продолжает потребляться в ми-
ре очень интенсивно. Известны дрожжи рода Candida, способные
сбраживать пентозы сульфитных щелоков. Для сбраживания лак-
тозы молочной и сырной сыворотки применяют (в США широко)
«молочные дрожжи» Kluyveromyces fragilis, К- lactis, К. marxia-
nus, при выращивании в сырной сыворотке Kluyveromyces fragi-
131
Its в проточной культуре с рециклированием клеток максимальная
продуктивность — 7 г/л-ч. Причем превышение уровня лактозы
120 г/л ингибирует процесс. При использовании реактора с полы-
ми волокнами и KL fragilis объемная продуктивность достигает
30—60 г/л-ч при содержании лактозы 50 г/л и 100—135 г/л-ч при
содержании лактозы 150 г/л.
Недавно обнаружены амилолитические дрожжи Candida fen-
nica, способные образовывать этанол; с такими дрожжами воз-
можно получение этанола из крахмального сырья в одну или две
стадии.
Амилолитические ферменты (а-амилаза и две амилоглюкози-
дазы) образуют и выделяют в среду дрожжи Schwanniomyces
castellii. Ферменты гидролизуют крахмал. Выход этанола из крах-
мала составляет 72% от теоретического в аэробных условиях. Из-
вестны дрожжи, образующие этанол из Д-ксилозы в аэробных ус-
ловиях. Описано несколько видов дрожжей, являющихся хороши-
ми продуцентами этанола из Д-ксилозы. К ним относятся: С. tro-
picalis, Kluyveromyces marxianus, Pachysolen tannophilus (обра-
зует 0,20—0,35 г этанола/г ксилозы), бесполая стадия С. sheha-
ta — Pichia stipitis (0,45 г этанола/г ксилозы), С. shehata. Дрож-
жи Р. stipitis и С. shehata рекомендуют для промышленного по-
лучения спирта из гидролизатов гемицеллюлоз. К возобновляемо-
му сырью относятся лигноцеллюлолитические материалы. Для
промышленности интерес представляет способ гидролиза целлю-
лозных материалов целлюлазой Т. reesei с последующим сбражи-
ванием сахаров дрожжами Sacch. uvarum, обладающей относи-
тельной термо- и этанолоустойчивостью. Метод рекомендован для
конверсии в этанол волокон бумаги, отходов бумажной фабрики.
Способы культивирования дрожжей. Периодическое культиви-
рование. Используют как периодическое с подкормкой, так и про-
точное культивирование. Стерилизация среды не требуется, по-
скольку дрожжи растут быстро при низких значениях pH ( — 4,5)
и быстро накапливают этанол. В начале создают аэробные усло-
вия, чтобы накопить большую биомассу, после чего аэрацию пре-
кращают. Время ферментации 48—72 ч. Из 25,5 кг зерна получа-
ют 8,7—9,8 л спирта и 7,7 кг сухих остатков. Обычно Sacch. cere-
visiae образует 10—13% этанола при начальной концентрации са-
хара 20—25%. При подкормке можно получить до 16—18% спир-
та, но уже после достижения 5—7%-й концентрации спирта про-
дукция по этанолу сильно падает. При увеличении концентрации
спирта усиливается вход Н+ в клетку, поэтому требуется больше
АТР, чтобы откачать Н+ через АТФазу, а это приводит к сниже-
нию экономического коэффициента при росте в глюкозной среде
и как следствие к снижению удельной скорости роста.
Проточное культивирование позволяет получать более высокие
выходы спирта за счет рециклирования клеток и удаления этано-
ла в процессе ферментации. Оптимальный рост и продукция эта-
нола происходят при лимитации по сахару ( — 21 г/л), в микро-
аэрофильных условиях (0,2—5,0 мг Оз/г сухих веществ• ч), при
132
скорости разведения 0,17 ч-1. При использовании мелассы (12%
сахарозы) получают 6% объем/объем этанола за 36 ч; при ис-
пользовании гидролизатов древесины (15% сбраживаемых саха-
ров) — 8—9% этанола. Из 180 кг зерна злаков можно получить
100 кг крахмала, который далее конвертируют с выходом 91% по
материальному балансу и получают 51,7 кг этанола.
Рециклирование клеток позволяет поддерживать их высокую
концентрацию. Если дрожжи просто отделять центрифугировани-
ем и возвращать в ферментер, то сильно понижается жизнеспособ-
ность клеток. Рециклирование клеток при одновременном увели-
чении аэрации и снижении исходной концентрации сахара с 16 до
13% сильно повышает продуктивность клеток. Чтобы понизить ин-
гибирующее действие этанола на клетки, рекомендуют его уда-
лять под вакуумом. При температуре 35° С и давлении 50 мм рт. ст.
или при t 30° С и давлении 32 мм рт. ст. продуктивность по эта-
нолу увеличивается в 3—4 раза по сравнению с обычными усло-
виями культивирования. Правда, испарение под вакуумом имеет
свои недостатки: при этом отводятся большие объемы СОг в ат-
мосферу и требуются специальные вакуумные ферментеры.
Для промышленных целей приемлем метод селективной ад-
сорбции этанола микропористыми гидрофобными полимерными
сорбентами на основе полистирольных смол, сшитых дивинилбен-
золом. Этанол десорбируется с адсорбента сухим азотом при
60—80° С.
Когда к проточной культуре дрожжей добавили в качестве
протекторного агента фосфолипидный протеиновый комплекс, то
продуктивность по этанолу увеличивалась в 3 раза, а конечная
Таблица 25
Основные типы ферментаций, используемые для получения этанола
(по Бекер и др., 1984)
Тип ферментации
Продуктивность сис-
темы, г этанола/(л-ч)
11ериодическое глубинное культивирование
I (епрерывное культивирование
Многостадийное непрерывное культивирование
1 фотонная система с иммобилизованными клетками
11роточная система с рециркуляцией клеток
Вакуумная ферментация
Флеш-ферментация. (Для удаления этанола суспензию периоди-
чески впрыскивают в специальную камеру, где ее нагревают
и под вакуумом удаляют часть этанола. Клетки с культураль-
ной жидкостью возвращают в основной ферментер)
1,8—2,5
6,0
20
(в 2-стадийном
процессе)
25—30
30—40
80
80
концентрация этанола — на 25%. Но содержание этанола свыше
70 г/л ингибирует процесс даже в присутствии протекторного фак-
тора. Используя проточный неаэрируемый башенный ферментер,
133
при содержании глюкозы 100—180 г/л получают объемную проя
дуктивность 50 г/л-ч и максимальную концентрацию этанол^
75 г/л. Основные типы ферментаций, используемых для получений
этанола, приведены в табл. 25.
Для получения этанола используют также метод твердофаз-
ной ферментации. При нем ферментации подвергают кусочки са*
харной свеклы, сахарного тростника, сладкого сорго. Добавления
воды не требуется, так как ее концентрация в сырье достаточна
для прохождения ферментации. При этом получают высокую кон-
центрацию спирта (более 12% по объему). Ингибирование суб-
стратом и продуктом сильно понижено, что можно сравнить с вре-
менно иммобилизованной системой. Сахар диффундирует к клет-
кам дрожжей, а этанол адсорбируется обедненными сахаром
твердыми частицами. Стерилизация не требуется, так как глав-
ное заражение лактобациллами можно контролировать путем об-
работки дрожжей кислотой. Кинетические расчеты показали, что
твердофазная ферментация происходит быстрее, чем жидкая. Са-
хар утилизируется более чем на 90% при конверсии в этанол за
10—20 ч ферментации при 30° С. Разработан оригинальный непре-
рывный процесс получения этанола с помощью дрожжей Sacch.
cerevisiae. Реактор представлял собой трубку (диаметр 1,6 см,
длина 110 см), заполненную смесью дрожжей и кусочков древе-
сины, через которую пропускали раствор субстрата. Вдоль оси
трубчатого реактора располагались гидрофобные микропористые
волокна; через них пропускали органический растворитель (дибу-
тил фтал ат) для экстракции образуемого спирта. Вследствие бо-
лее низкого давления внутри полых волокон СО2 переходил в ор-
ганическую фазу.
Получение этанола в промышленности
Для получения этанола в промышленности используют сырье
трех типов: сахаросодержащее, которое можно непосредственно
сбраживать; крахмалистое, которое предварительно подвергают
кислотному или ферментативному гидролизу, и целлюлозосодер-
жащее сырье, которое гидролизовать трудно.
К первому типу сырья принадлежит меласса — это лучшее
сырье для ферментации. Можно также использовать сок сахар-
ной свеклы и сахарного тростника.
Главное сырье второго типа — ячменное сусло, злаковое сус-
ло, кукурузный сироп, рис. Поскольку дрожжи не содержат ами-
лаз, для гидролиза используют бактериальные и грибные амила-
зы. Третий тип сырья — целлюлозосодержащее — наиболее обиль-
ное, ибо это отходы бумажной промышленности, картофельная
мезга, злаковая солома, початки кукурузы. Особенно перспектив-
ны отходы бумажной промышленности, так как они частично де-
лигнифицированы. Для растительных отходов требуется обработ-
ка кислотой, щелочью или механическое разрушение с последую-
щей обработкой целлюлазой Asp. niger или Trichoderma reesel
(последнее лучше) 1 — пилотная установка такого типа работает
в США.
Древесное сырье в промышленности используется ограниченно
в виде кислотных гидролизатов древесины на 14 заводах в СССР
и на нескольких заводах в Японии. Микробные целлюлазы в про-
мышленности еще не применяют. При производстве спирта суще-
ствуют три ступени: подготовка сырья, ферментация и отгонка
спирта (дистилляция). Кроме того, требуется обработка или по-
вторное использование побочных продуктов и остатков фермента-
ции. Три ступени при использовании крахмалистого сырья пока-
заны ниже:
а-амилаза
Н2О
1
разжижение (60- 8(ГС)
клеточный материал
1 Из различных предобработок целлюлозных субстратов наиболее эффектив-
ной оказалась щелочная (80—120°С, 1 ч). Под ее влиянием снижается со-
держание лигнина, гемицеллюлозы и увеличивается чувствительность расти-
тельных материалов к действию целлюлаз.
135
11
Промышленные ферментации. Традиционная периодическая
ферментация. Этот процесс до сих пор применим в промышлен-
ном производстве ликеров, пива и вина и осуществляется в откры-
тых или закрытых ферментерах. Каждая новая ферментация тре«.
бует внесения новых чистых дрожжей, которые размножают в;
специальном растильном цехе. Ферментация длится несколько’
дней со скоростью продукции -2 мл спирта/л-ч. Выходы близки,
к теоретическим.
Периодическая ферментация с подкормкой. Этот процесс внед-
рен на большей части заводов, где этанол производят для промыш-
ленных целей. По сравнению с классическим процессом требует-
ся: pH-контроль, контроль температуры, контроль за количест-
вом подпитки и за пенообразованием. Стартовые дрожжи для
этого процесса тоже готовятся отдельно для каждой фермента-
ции. Скорость продуктивности колеблется между 2 и 5 мл спир-
та/л-ч. В Бразилии большая часть заводов использует модифи-
цированный метод и работает с более высокой скоростью продук-
тивности. Дрожжи механически сепарируют, подкисляют, промы-
вают и снова используют. Работают ферментеры открытого типа,
поэтому много этанола теряется при испарении и в случае инфек-'
ции. Чтобы понизить инфекцию, процесс ведут при очень низких
значениях pH, что замедляет ферментацию и увеличивает утили-
зацию кислот. 75% биоэтанола в промышленности получают пе-
риодическим путем с подпиткой или без нее.
Проточная ферментация в соответствии с процессом Мель-
Бойнота (Melle-Boinot). Все или почти все промышленные про-
точные ферментационные процессы, известные на сегодня, пред-
ставляют собой модификацию процесса Мель-Бойнота, который
известен уже 40 лет. Ферментеры устанавливают в виде каскада,
На первой стадии среда аэрируется, а на последней происходит
полная деградация сахара. Дрожжи выделяют, сепарируют, под-
кисляют, промывают и возвращают в первый ферментер. Хотя при
этом процессе не затрачивается время на опорожнение
индивидуальных ферментеров, продуктивность процесса
значительно выше, чем в предыдущем случае.
Вакуумный процесс. Это одностадийный проточный процесс.
Жидкость проходит через сепаратор, где дрожжи отделяются и
возвращаются в ферментер (рециклируют). Прозрачная жидкость
перекачивается в танк, из которого этанол, СО2 и Н2О удаляются
путем испарения под вакуумом и переправляются в дистилляци-
онное отделение. Остаток после выпаривания возвращается в фер-
ментер. Продукционная скорость 20 мл этанола/л-ч. Процесс осу-
ществим с концентрированными растворами субстрата.
Процесс Хохста/Унде (Hoechst/Unde). Проточная фермента-
ция, использующая новые биотехнологические принципы Хохст/Ун-
де-процесса, проводится в ферментере петлевой конструкции (loop
vessel). Ферментер аэрируется с помощью разбрызгивателя, ус-
тановленного на дне ферментера. Используются хорошо флокули-
рующие штаммы дрожжей, адаптированные к высокой концентра-
и чистку
лишь не-
I
ч
р
136
ции клеток в ферментере, которые рециклируют. Получают около
20 мл спирта/л-ч. Свободные утилизируемые сахара в системе по-
требляются полностью.
Проточные системы с биологическим контролем и в закрытых
сосудах лишь недавно начали работать. При этом производятся
стерилизация сырья, рециклирование дрожжей и частичный от-
вод спирта во время ферментации для того, чтобы обойти ретро-
ингибирование. В некоторых процессах поддерживается контроли-
руемая аэрация с целью стабилизации дрожжевой культуры.
В этих процессах клетки флоккулирующего штамма рециклируют
в ферментер путем седиментации. Классические периодические
ферментации работают на небольших европейских заводах. В Бра-
зилии и США имеется крупно-масштабное производство в откры-
тых или закрытых чанах вращательного типа, что позволяет не-
прерывно направлять отбродившие материалы на дистилляцию.
Периодические ферментации не требуют больших капитальных за-
трат, поэтому их технология долгое время мало подвергалась из-
менениям или усовершенствованию, но с операционной точки зре-
ния управление большим числом периодических ферментаций име-
ет ряд недостатков.
Отдельные ферментации отличаются между собой по выходам,
концентрации этанола, времени ферментации и образованию по-
бочных продуктов. Масштабирование существующих объемов фер-
ментеров (5 тыс. м3) невозможно (ограничения при отводе тепла,
перемешивающие свойства). Поэтому разрабатываются новые про-
екты для проточных установок, использующих большие фермен-
теры. При непрерывном процессе легче производить непрерывную
дистилляцию, осуществлять ферментационный контроль и стан-
дартизировать качество продукта. Ряд пилотных установок и не-
больших заводов уже работает.
Концентрация спирта при одностадийном проточном культиви-
ровании ниже, чем при периодическом (10—12 объемных процен-
тов — об. %), поскольку этанол оказывает ингибирующее дейст-
вие в концентрации 8,5 об.%. Но этот недостаток можно обойти
путем постоянного упаривания спирта под вакуумом, использова-
ния полупроницаемых мембран или с помощью жидкостной экс-
тракции. В многостадийном проточном процессе (без использова-
ния этих новшеств) можно достигать более высоких концентра-
ций этанола, но за счет снижения общей продуктивности фермен-
тера. Другая возможность — работать при концентрации 8,5 об. %
и подключать дистилляционный процесс. По сравнению с перио-
дической ферментацией проточный процесс позволяет сократить
время ферментации на 25—40% (в зависимости от используемо-
го сырья).
Дистилляция. Этот процесс разделяют на собственно дистил-
ляцию — отделение летучих компонентов от жидкости и твердых
частиц и концентрирование этанола в дистилляте до 30—96% по
весу и ректификацию, при которой этанол отделяется от других
летучих веществ. Поскольку этанол имеет более низкую t кипе-
737
ния, чем вода, в парах концентрации этанола выше, чем воды.]
Например, если в водном растворе содержится 10% этанола, то]
в парах его концентрация составляет 50% по весу, т. е. дистиллят]
сильно обогащается этанолом. |
Вода и этанол образуют азеотропную смесь. Это смесь летучих!
веществ, которая при данной концентрации имеет идентичный!
жидкий и воздушный состав. Для спирта и воды такая концепт*!
рация — 96% по весу, a t кипения азеотропной смеси — 78,2°. 1
Следовательно, этанол может быть сконцентрирован при дистил-1
ляции до 96% по весу, но не выше. |
Полное удаление воды возможно из тройной азеотропной сме-
си: 74% бензола, 18,5 этанола и 7,5% воды. Температура кипения]
такой смеси 68°. Поскольку в тройной азеотропной смеси содер-|
жится больше воды, чем в двойной, она может быть отогнана]
раньше и остается безводный спирт. Безводный этанол предпочи-1
тается для получения газгойля. Стадия дистилляции требует мак-1
симальной траты энергии: 10—13 мегаДж/л или при оптимиза-1
ции •— 5—7 мегаДж/л. При подсчете энергии, содержащейся в;
полученном этаноле, и энергии, затраченной на его получение,]
пришли к полному энергетическому балансу. Воду можно удалить]
адсорбентами, например целлюлозой или другими растительными
материалами, разломанными зернами злаков, тканными волокна-]
ми, но потом воду нужно удалять из адсорбентов (кроме зерен)
при нагревании. J
В целях экономии энергии можно использовать растворители,]
не смешивающиеся с водой. К ним относятся, например, дибутил-1
фталат (см. выше его применение) и СО2 (в водной фазе). С целью j
получения эффективной и простой системы отделение этанола от]
воды в составе водно-этанольных смесей предлагают использо-
вать обратный осмос. Рекомендуют применять мембраны, прони-j
цаемые для этанола и непроницаемые для воды. Для отделения]
спирта от воды можно использовать цеолиты как молекулярные]
сита. Наконец, предполагают, что при экстракции спирта бензо-
лом из азеотропной смеси вода—спирт экстрактант можно заме-]
нить газолином, и тогда если спирт используется как моторное]
топливо, органический растворитель не требует удаления. I
Утилизация побочных продуктов. В качестве побочных продук-]
тов при ферментации служат СО2 и сухие дрожжи. СО2 компрес-1
сируют или сжижают, если на него существует спрос. Дрожжи
используют в качестве кормовой добавки. Сточные воды (в зави-
симости от их источника) возвращают в почву как источник ор-
ганического азота. Если используют мелассу или злаки, то филь-1
трат концентрируют и применяют как добавку в корма сельско-
хозяйственным животным.
Имеется ряд интересных схем, описывающих механизацию ор-1
ганических остатков. Биотехнологическое производство этанола
по традиции базируется на маломощных заводах. Для топливно-
го этанола завод считают большим, если его мощность составляет
более 200 тыс. л в сутки. Большие заводы существуют только в
138
Бразилии и США. В настоящее время возможна конструкция за-
водов с продукцией не более чем 1 млн л этанола в сутки с еди-
ной продукционной линией, что должно сильно повысить экономи-
ку производства. Ограничивающим фактором служат не размеры
завода, а обеспеченность его сырьем. Например, для завода, вы-
пускающего 1 млн л в день, на 200 дней работы в году требуются
плантации сахарного тростника в 40 тыс. га. Считают, что при
высоких урожаях сельскохозяйственных культур, служащих источ-
ником сырья для производства, внедрения современной техноло-
гии (компьютеризации, проточного процесса, высокопродуктивных
штаммов, возможности легкой утилизации побочных продуктов),
ферментационный этанол станет вполне конкурентоспособным с
синтетическим в отношении качества, энергетических затрат, обес-
печенности необходимыми материалами и цены.
Мезофильные бактерии Zymomonas mobilis. Мезофильные бак-
от дрожжей очень ин-
тенсивным метаболиз-
мом. Это грамотрица-
тельные палочки (1,7|Х!
Х0,7-—1,0 мкм), среди
терии, синтезирующие этанол как главный продукт ферментации,
перечислены в табл. 26.
Среди мезофильных бактерий наибольший интерес представ-
ляет Zymomonas mobilis (опт. t 30—35° С), которая отличается
Т а б лица 26
Мезофильные бактерии, образующие этанол,
как главный продукт ферментации
(по Bernard, Hall, 1983)
которых встречаются
подвижные (имеют 1—
4 полярных жгутика)
и неподвижные формы.
Эндоспор не образуют,
пэротолерантные, ра-
стут в области pH 3,5—
7,5, отличаются высо-
кой устойчивостью к
этанолу. Z. mobilis
встречается в пиве, со-
ке груш, сахарного тро-
стника, яблок, агавы.
Организм
СЛ. sporogenes ®
CZ. indolicus (патоген)
Cl. sphenoides
Zymomonas mobilis
Erwinia amilovora
Spirochaeta aurantia
Leuconostoc mesenteroides
Streptococcus tact is
Spirochaeta lit or ales
Spirochaeta stenostrepta
Этанол
ммоли/ммоль глюкозы
4,15
1,96
1,8
1,9
1,2
1,5
1,1
1,1
1,1 (1,4)
0,84
Выделена из пальмово-
ю вина.
Из бродящего сока сахарного тростника выделен флокулирую-
щий штамм Zymomonas sp. При концентрации сахарозы 200 г/л
нот штамм способен образовывать в 3 раза большее количество
гганола, чем штамм Z. mobilis АТСС 10988. Способность к хлопье-
образованию открывает возможность использования нового штам-
ма для производства этанола из сока сахарного тростника и ме-
лассы. Флокуляция контролируется 6 генами, 3 из которых до-
минантны. Скорость флокуляции клеток штамма Z. mobilis АТСС
12526 увеличивается в присутствии ионов Са2+ и Mg2+, в то время
как ионы Ва2+ и Мп2+ сильно снижают скорость флокуляции, а
139
ЭДТА ингибирует этот процесс. У нефлокулирующих штаммов ни'
один из указанных ионов не вызывает флокуляцию. В отличие от
ионов Mg2+ ионы Са2+ резко ингибируют образование этанола у
исследованных штаммов.
Утилизируемые субстраты. Дикий штамм Z. mobilis утилизи-
рует только три источника углерода: глюкозу, фруктозу и саха-
розу. Среда обычно содержит 5—10 г/л дрожжевого экстракта'
как источника пантотената Са, необходимого бактериям. Целлю-
лозу вначале предобрабатывают, гидролизуя ферментами, или пу-
тем сольволизиса, после чего конвертируют в этанол смешанной
культурой Z. mobilis и Sacch, cerevisiae или Cl. saccharolyticum
(использующим ксилозы). Уксусная, муравьиная, пропионовая
кислоты, фурфурол, фенол, содержащиеся в гидролизатах древе-
сины в концентрации от 2 до 20 г/л, ингибируют рост Z. mobilis.
Утилизация сахарозы (обычно в составе меласс) вызывает ряд
трудностей, главная из которых — образование побочных продук-
тов, как леван и сорбит. Ограничить образование левана можно
при условии ведения ферментации при 35°, а сорбита — поддер-
живая pH на уровне 6,4. В последнем случае в большом количест-
ве образуется фруктоза. Другая трудность — высокое содержа-
ние в мелассах солей, ингибирующих рост Z. mobilis. Селектиро-
ван устойчивый мутант, который имеет более высокую скорость
роста в среде с мелассой, чем дикий штамм. Промышленный
процесс на мелассах еще не разработан. При использовании глю-
козы бактерии наряду с этанолом образуют глицерин, сукцинат,'
ацетат, лактат, ацетоин и бутандиол. Правда, количеств этих
продуктов гораздо меньше, чем у некоторых дрожжей (Sacch.
bayanus, например). Z. mobilis — один из немногих факультатив-
ных анаэробов, разлагающих глюкозу по пути Энтнера-Дудорова,
обычно функционирующего у строго аэробных организмов. Бак-
терии содержат две алкогольдегидрогеназы с различной молеку-'
лярной массой и энзиматическими свойствами: первая активиру-
ется ионами Fe+3 и может содержать Fe+3 вместо Zn+2 в активном
сайте. Второй фермент может находиться в плазмиде.
Состав мембран и действие этанола. Клеточные мембраны
Z. mobilis имеют необычный липидный состав. Главные липиды
представлены пентациклическими тритерпенами (гопаноидами) —’
прокариотическим эквивалентом стеролов эукариот. Фосфолипид-
ный состав необычен в том отношении, что включает в себя фосч
фотидилхолин (у Е. coli его нет); 70% жирных кислот приходит-
ся на цисвакценовую, остальное — миристиновая и пальмитине^
вая. Этанол и глюкоза приводят к снижению содержания фосфор
этаноламина, фосфотидилглицерина и увеличивают содержаний
фосфотидилхолина; под действием этанола снижается отношений
липиды/белки и увеличивается содержание цисвакценовой кисло*
ты и гопаноидов. Липидный состав Z. mobilis может отражать^
адаптацию бактерий к высокой концентрации этанола. Этанол^
увеличивает проницаемость мембраны, следовательно, может про*
исходить вытекание из клеток существенных кофакторов, кофер-J
140
ментов и интермедиатов, в результате чего скорость превращения
сахара в этанол понижается. Под действием этанола снижается
активность фосфоглицерокиназы и пируваткарбоксилазы. Недавно
показано, что этанол и температурный стресс вызывают синтез
специальных белков (белков теплового шока), которые могут во-
влекаться в механизм устойчивости к этанолу. Получен мутант,
устойчивый к высокой концентрации этанола, который используют
для продукции спирта. Имеются также термотолерантные му-
танты.
На практике защиту от этанольного ингибирования достигают
при добавлении к среде соевой муки. У бактерий обнаружено ан-
тибактериальное вещество, напоминающее бактериоцин.
Ферментация. В двустадийном реакторе получают до 100 г/л
этанола с выходом 94% от теоретического и продуктивностью
18 г/л-ч. Рециклирование клеток при использовании ультрафиль-
трации приводит к снижению скорости потока среды.
Очень высокую продуктивность по этанолу получили с флок-
кулирующим штаммом. При скорости протока — 1,0 ч'1 вымывания
не происходит, а продуктивность составляет 50—100 г/л-ч. Высо-
кую продуктивность получают в башенном реакторе, но поскольку
О2 и СО2 ингибируют рост, ни воздух, ни газ из ферментации не
могут использоваться для культивирования клеток, во взвешен-
ном слое. Поэтому считают, что для промышленных целей более
подходящий CSTR-реактор с насадкой (проточного действия с
перемешиванием). Концентрация сахарозы более 150 г/л ингиби-
рует выход этанола. Возможно как периодическое культивирова-
ние с непрерывной экстракцией этанола растворителем, так и про-
точное. Zymomonas считают одним из наиболее перспективных
продуцентов этанола, поскольку бактерии имеют следующие важ-
ные преимущества перед традиционными продуцентами — дрож-
жами: обладают высокой удельной скоростью конверсии глюко-
зы в этанол, образуют небольшую биомассу, толерантны к спир-
ту (выдерживают 70—80 г/л в проточной и 130 г/л в периодичес-
кой культуре), у них нет катаболитной репрессии. В Германии ра-
ботает один завод, использующий для получения биоэтанола Zy-
momonas mobilis периодическим способом. Преимущества бакте-
рий перед дрожжами, связанные с более высоким выходом этано-
ла и меньшим образованием биомассы, перекрываются потребно-
стью в более высоких значениях pH, вызывающих необходимость
в стерилизации. Далее, Z. mobilis образует небольшие количест-
ва уксусной и молочной кислоты и в значительных количествах
сорбит как побочные продукты. (Сорбит образуется только из
фруктозы и при условии, что фруктоза и глюкоза присутствуют
в более высоких количествах, чем 7 г/л.) Так, в среде, содержащей
250 г/л сахарозы, образуется до 43 г/г сорбита.
Экономический анализ показывает, что снижение цен на эта-
нол при работе с Z. mobilis можно получить, используя иммоби-
лизованные клетки и двустадийный или мультистадийный реактор.
Выход этанола в этих условиях 70—80 г/л.
141
Термофильные бактерии. Среди этанолсинтезирующих бакте<
рий имеется ряд термофилов, перечисленных в табл. 27. Они име-
ют несомненный практический интерес, особенно те, которые не-
посредственно превращают целлюлозу в спирт. К таковым отно-
сится Cl. thermocellum, обитает в горячих источниках, в навозе^,
компостах и обычно служит составной частью бактериальных со-
обществ.
Таблица 27
Бактерии-термофилы, синтезирующие этанол, как главный продукт
(по Bernard, Hall,'1983)
Организм
^макс
Этанол
ммоли/ммоли глюкозы
Thermoanaerobacter ethanolicus
Cl. thermohydrosulfuricum
Вас. stearotermophiles
Thermoanarobicum brocki
Cl. ihermosaccharolyticum
Cl. thermocellum
(анаэробный процесс
после 55°)
Из всех микробов, способных разлагать целлюлозу, Cl. thermo-
cellum самый быстрорастущий. Время его генерации при росте на
целлюлозе в два раза короче, чем у Trichoderma reesei, и состав-
ляет — 6—7 ч, причем примечательно, что целлюлаза этих клост-
ридий в отличие от грибной не ингибируется глюкозой и целло-
биозой. Недостаток Cl. thermocellum — относительно невысокий
выход этанола и узкий спектр утилизируемых углеводов. Но если
Cl. thermocellum выращивать в смешанной культуре, то выход
спирта увеличивается: в ассоциации с Th. ethanolicus образуется
в два раза больше этанола, чем в монокультуре, — 1,46 моля/моль
эквивалента глюкозы, а в стабильной ассоциации с Cl. thermohyd-
rosulfuricum— 4,5, при этом активно используются пентозы и гек-
созы соломы. Cl. thermohydrosulfuricum обладает высокой продук-
тивностью по этанолу (1,6 моля/моль утилизированной глюкозы.
Эти бактерии, а также Thermoanaerobacter ethanolicus превраща-
ют глюкозу в этанол с выходом 95%, что близко к максимально-
му выходу у дрожжей и у бактерий Zymomonas.
Анаэробная термофильная бактерия Cl. thermohydrosulfuricum
способна сбраживать крахмал, глюкозу, целлобиозу, ксилозу с об-
разованием этанола и лактата в качестве основных конечных про-
дуктов. Установлено, что выход этанола можно увеличить, если
бактерии культивировать в условиях, снижающих уровень фрук-
тозо-1,6-дифосфата в клетках (рост на крахмале, синтрофное
культивирование на целлюлозе или гемицеллюлозе, непрерывное
142
культивирование с низкой скоростью разбавления и лимитирую-
щей концентрацией углеродных субстратов).
Для ферментационной промышленности особый интерес пред-
ставляет способность штамма непосредственно утилизировать
крахмал. У Cl. thermohydrosulfuricum имеется пуллуланаза и ами-
логлюкозидаза.
Под действием нитрозогуанидина получен мутант Cl. thermo-
saccharolyticum, блокированный по образованию ацетата. Этот
мутант образовывал — в 2 раза больше этанола (50 ммолей/л),
чем исходный штамм, и рекомендован в США для биоконверсии
отходов биомассы в этанол. Амилолитическими способностями об-
ладает и целый ряд других анаэробных термофильных бактерий,
а именно Thermoanaerobacter ethanolicus, Th. brockii, Thermobac-
teroides acetoethylicus и неизвестный термофил Cl. sp. Thermoana-
erobacter ethanolicus, кроме крахмала и большого числа моно-,
дисахаридов и мальтозы используют также пентозы и целлобиозу.
Из 1 моля глюкозы можно получить 1,9 моля этанола — это зна-
чительно более высокий выход, чем у других изученных термо-
фильных бактерий. Устойчивость к этанолу у дрожжей связана
с их устойчивостью к температуре. Ингибиторный эффект этано-
ла сильно увеличивается после превышения 25° С. Поэтому полу-
чение этанола при повышенной температуре лучше осуществлять
с природными термофильными бактериями. У термофилов более
высокая скорость роста и стабильность ферментной системы, обыч-
но относительно низкий выход клеток, так что большая часть суб-
страта превращается не в биомассу, а в этанол. Высокая темпера-
тура снижает микробную инфекцию и обеспечивает удаление эта-
нола.
Мицеллиальные грибы. Из почвы выделен новый штамм Раесу-
lomyces 71, который рос только в аэробных условиях и образовы-
вал этанол из глюкозы, галактозы, фруктозы, маннозы, мальтозы,
растворимого крахмала, ксилозы, арабинозы, рибозы и целлобио-
зы. Выход этанола не изменялся в пределах pH от 2,2 до 7,0 и в
пределах температуры от 30 до 37° С, а также при повышении
концентрации ксилозы от 15 до 200 г/л. В последнем случае вы-
ход этанола составил 75% от теоретического и достигал 73 г/л —
это самая высокая из известных концентраций этанола при фер-
ментации ксилозы. Кроме этанола гриб образовывал немного кси-
лита, ацетата и н-бутирата. Из 150 г целлюлозы, гидролизованной
ферментами Т. reesei и Asp. niger, при ферментации образовыва-
лось до 60 г/л этанола.
Paecylomyces 71 может использовать все сахара, полученные в
результате кислотного гидролиза соломы. Считают, что гриб яв-
ляется перспективным продуцентом этанола и может быть реко-
мендован для его промышленного получения из растительной био-
массы.
Пути биосинтеза. Известны три пути превращения глюкозы в
этанол: кетокластический у молочнокислых бактерий; фосфоро-
кластический — у ряда бактериальных родов: Clostridium, Ther-
143
I
I
I
i
t
I
£
moanaerobium, Sarcina, Ruminococcus и декарбоксикластический —
у дрожжей, Zymomonas sp., Sarcina ventricula. Химизм указанных
путей представлен на следующей схеме.
глюкоза
q 0 ——— 2 N A D Р
•<^2NADPH2
т
ксилулозо-5-Р
ацетил-Р ------
I
ацетил-СоА
---- NADPH
NADP
ацетальдегид
/---NADPH
З-Р-глицерат
V
11
пируват
/---NAD
NAD
этанол
кетокластический путь
NADH
лактат
глюкоза
^_2NAD
2NADH
пируват -*•
пируват
ацетил-СоА
\х---NADH
\—NAD
ч
ацетальдегид
z---NADH
ч'—nad
глюкоза |
,---2NAD 5
k-^2NADH 4
пируват я
со2 I
ацетальдегид J
---NADH I
j4—*- NAD I
этанол I I
декарбоксикпастичес кий'
ПуТЬ
фосфоре кластический путь
Усовершенствование штаммов и новые разработки. Продуцент
ты этанола в промышленности — дрожжи — изменяют, исполь*
144
зуя методы классической гибридизации, мутагенез, слияние про-
топластов и трансформацию с применением методов рекомбинант-
ных DNA. Часто указанные методы применяют в сочетании.
Путем слияния протопластов в Японии получен новый штамм
дрожжей Sacch. cerevisiae AM 12, который обладает повышенной
устойчивостью к высоким концентрациям этанола и температуре.
Себестоимость продукта при использовании нового штамма ниже,
чем при использовании других штаммов.
В США получены два мутанта дрожжей Р. tannophilus, спо-
собных эффективно превращать D-ксилозу в этиловый спирт. Про-
изводительность обоих мутантов при росте в среде с 40% D-кси-
лозы была на 30% выше, чем у клеток исходного штамма. D-кси-
лозу можно превращать в этанол и с помощью пекарских дрож-
жей в присутствии ксилозоизомеразы, причем добавление NaNO$
увеличивает образование этанола и снижает накопление побоч-
ных продуктов (глицерин, уксусная кислота и ксилит). Внесение
ксилозоизомеразы необходимо в связи с тем, что Sacch. cerevisiae
способен к брожению ксилулозы (а не ксилозы), а ксилозоизоме-
разы не содержит. Поскольку ксиланы служат главной составной
частью гемицеллюлоз, последние могут быть превращены в эта-
нол при участии пекарских дрожжей следующим образом:
Гемицеллюлоза -^”^±абой H*so‘--> ксилоза
100°, 50 мин
ксилулоза брожение~» этанол
Гены фермента ксилозоизомеразы собираются включить в клетки
Sacch. cerevisiae. Древесные отходы — легко обновляемое сырье,
представляет особый интерес для получения этанола. Можно
сконструировать штаммы дрожжей или бактерий Zymomonas со
встроенными в них генами целлюлазы. Такие штаммы дрожжей
уже есть. Процесс превращения клетчатки в спирт пекарскими
дрожжами реализован на пилотной установке в США. Клетки
Sacch. cerevisiae (S. uvarum или S. brassicae) и C. utilis иммо-
билизовали на керамических дисках, покрытых желатиной и по-
перечно сшитых с помощью глутарового альдегида. Целлюлозо-
содержащий материал гидролизовали в 2 этапа:
1) гемицеллюлоза раэведенная пентозы
7 H2SO4
2) оставшаяся целлюлоза ФерУ—глюкоза
T.reesel
С. utilis использовала пентозы, a Sacch. cerevisiae — глюкозу.
Спирт получали в проточном режиме работы биореактора при
40° С. Увеличение выхода спирта достигают путем иммобилиза-
ции клеток, приучения штамма к повышенным концентрациям
спирта, увеличения термотолерантности штамма и сокращения вы-
хода побочных продуктов.
145
Иммобилизация. В табл. 28 показан выход спирта иммобил|
зованными клетками дрожжей Sacch cerevisiae и бактерий Zym$
monas. Иммобилизация клеток — альтернативный путь полуЧ|
ния высокой концентрации клеток и хорошей производительност
Таблица 28
Образование этанола с иммобилизованными клеткама микроорганизмов
Биокатализатор
Концентрация
глюкозы
% утилизиро-
ванной глю-
козы
Максимально
выход спирт
г/л
Sacch, cerevisiae (в карагена не)
Sach. cerevisiae (в Са-альгинате)
Zymomonas mobilis (в Са-альгинате)
Zymomonas mobilis (флоккулирующий
штамм)
Zymomonas mobilis (в карагенане)
100 г/л
100 г/л
лактоза
43
53,8
102
120
сыворотки
50 г/л
реакторов. При сравнении иммобилизованных в Са-альгинат ил1
х-карагенан клеток Z. mobilis и дрожжей более высокие показа
тели получены с бактериями, но длительная работа биокатализа
торов была невозможна в связи с их инактивацией. Трудност
обошли, используя иммобилизованные растущие клетки в альги
ватном или карагенановом геле. Клетки Z. mobilis. иммобили
зованные в х-карагенане в течение нескольких недель работы 1
биореакторе проточного действия (по принципу полного вытесне
ния), продуцировали 90—92 г/л этанола. Коиммобилизация кле
ток Z. mobilis с (З-глюкозидазой позволяет превращать целлобио
зу в этанол. Большое число исследований проведено с иммобили
зованными клетками дрожжей. Пожалуй, наиболее продвинута!
работа выполнена японскими исследователями, поскольку иммо
билизованные ими в Са-альгинат клетки Sacch. cerevisiae рабо
тают в колонном биореакторе и в большом масштабе длительно!
время. Биокаталитические гранулы (шарики) формировали прям(
в реакторе, причем дрожжи коиммобилизовали со стиролом и не
насыщенными жирными кислотами, что способствовало увеличе
нию выхода спирта. На основе этих исследований в Японии по
строен завод. В Са-альгинат заключили клетки дрожжей Deba
ryomyces polymorphic. В периодическом процессе с рециклирова
нием клеток за 8 ч из 100 г/л сахарозы получили 47 г/л этанола
т. е. 96% от теоретически возможного. Иммобилизованные клетк!
этих дрожжей отличались высокой стабильностью при проведе
нии по крайней мере 11 повторных циклов. При проведении фер
ментации с экстракцией этанола с целью снижения токсической
действия этанола предложили использовать «барьер» молекулал
растворителя, локализуя его ниже уровня расположения биока
тализатора. Наиболее эффективным «барьером» оказалось веще
146
сгво Рога рсК Q. Даже при насыщении среды этим растворителем
снижение выхода этанола не наблюдали после 8 ферментаций.
Термофилия. При работе с термофильными штаммами снижа-
ется возможность заражения, ускоряется процесс, меньше энер-
гии расходуется для отвода тепла и легче вести удаление этанола
под вакуумом. Уже получены термофильные дрожжи, лишенные
цитохромоксидазы.
Устойчивость к повышенным концентрациям спирта. Для по-
вышения эффективности процесса очень важно повысить устойчи-
вость организма к высоким концентрациям этанола. Разрабаты-
вают метод селекции микроорганизмов, устойчивых к этанолу, ос-
пованный на определении состава клеточной мембраны. Получен
штамм Zymomonas ZM-4, который выдерживает 15% этанола. От-
сслектирован также флоккулирующий штамм Z. mobilis, который
легко отделять от среды и сепарировать. Эти исследования про-
ведены в нашей стране и за рубежом.
У термофильного анаэроба Cl. thermocellum удалось сохранить
50% исходной активности при содержании 6% этанола в среде,
('.читают, что применение термофильных, целлюлозоиспользующих
бактерий будет рентабельно, если удастся поддерживать высокую
продуктивность клеток при концентрации этанола более 4,5%.
Сокращение выхода побочных продуктов. Хорошим примером
целенаправленного снижения выхода побочного продукта у про-
дуцента этанола служат результаты исследований с гомоталличе-
скими дрожжами Pachysolen tannophilus, Они осуществляют кон-
версию ксилозы в этанол с одновременным образованием побоч-
ного продукта ксилита. Оказалось, что если в среду вносить ак-
цептор водорода, например, ацетон, то количество этанола увели-
чивается и это увеличение точно коррелирует со снижением выхо-
да ксилита. Молекулярная основа процесса состояла в том, что
восстановление клетками дрожжей ацетона в 2-пропанол связано
г образованием НАВ+-кофактора ксилитдегидрогеназы, ответ-
ственной за превращение ксилита в ксилулозу. Последняя сбра-
живалась с образованием этанола.
Получение этанола из цельных зерен злаков. Самое большое
количество этанола получают из крахмала или размолотых цель-
ных зерен после термомеханической экструзии и желатиниза-
ции — разжижения без добавления а-амилазы при условии одно-
временной сахарификации и брожения субстрата дрожжами, вне-
((шпыми в то время, когда значение ДЕ —58. При такой предобра-
иогке субстрата он легко может использоваться дрожжами при
(одержании сухих веществ 25% и даже выше. Например, более
PS кг этанола можно получить из 100 кг целых зерен ячменя
0 влажностью 10%), что составляет 83% от теоретического.
Экономия энергетических затрат при выделении этанола.
*’лычная отгонка связана с затратой большого количества энер-
titn, которое превышает энергию, содержащуюся в полученном
о аноле. Поэтому разработаны альтернативные методы выделения
ишрта; этанол можно непрерывно удалять током СО2. Далее эта-
147
198
fi
нол с небольшим количеством воды сорбируют на активированно
угле. После десорбции воду удаляют, добавляя порошок целлй
лозы. Таким способом можно выделить более 92% этанола и
пара. Важно иметь высокую концентрацию спирта, так как от этй
го зависит расход пара при отгонке (2,25 кг на 1 л 96%-го спирт^
при концентрации 10% и более 4 кг — при концентрации 5%)
Поэтому использование дрожжей, выдерживающих повышенны^
концентрации спирта, уменьшает энергозатраты.
С целью экономии энергии предложен каталитический процесс
превращения этанола в углеводороды, при этом интегрируют энер$
гию, затраченную на дистилляцию, с энергией, выделяемой
цессе реакции. Таким путем достигают сильного снижения
затраты энергии.
В про-
обще
ЛИТЕРА ТУРА
Бекер М. Е. и др. Трансформация продуктов фотосинтеза. Рига,
С. 27—48.
Варфоломеев С. Д. Биотехнология получения и трансформации топлив
//Итоги науки и техники. Биотехнология. Т. 1. М., 1983. С. 6.
Barnard G. W., Hall D. О. Energy from renewable resources//Biotechnology
1983. Vol. 3. P. 597.
Chris L. Biological fuels. Inst, of Biology’s studies in Biology. N.—J., 1983.
Panchai С. I. et al. Fermentation ethanol production — application of th!
new genetics to an ancient art: Energy Technol//Appl. and Econ. proc. 11*1
Energy Technol. Conf. Washington, 1984. P. 1270—1273. j
P h a f f H. I. My life with yeasts//Ann. Rev. Microbiol. 1986. Vol. 40. P. 1—2Й
Reed G. Production of Fermentation alcohol as a fuel source//Prescott. a. Dunn’s
Industrial Microbiology. 4 ed. 1981. Ch. 19. P. 835—859.
АЦЕТОН И БУТАНОЛ
Ацетон и бутанол — единственные важные химические вещё
ства, которые в больших количествах получают путем бактери
ального брожения. !
Еще в XIX в. Пастер впервые обнаружил образование бакт^
риями бутанола. Ацетоно-бутиловое брожение было первым 6pd
жением, на котором академик В. Н. Шапошников, а позднее амв
риканец Буллок открыли двухфазность процесса. До начала
60-х гг. ацетоно-бутиловые заводы работали во многих страна^
в том числе в США, Канаде, но затем в силу экономических pad
четов ферментационные методы уступили почти полностью сво|
места нефтехимическому синтезу, сырьем которого для получений
бутанола служит пропилен (или этилен). В связи с быстрым и„
тощением запасов нефти и ее подорожанием возобновился интеИ
рес к изучению ферментационных процессов с целью удовлетво
рения всей или части нашей будущей потребности в бутаноле
ацетоне ферментационным путем.
Практическое применение. В начале XIX в. бутанол, получай
мый ферментативным путем, использовали для производства бу
тадиена — сырья для синтетической резины. Ацетоно-бутиловы!
148
бактерии образуют наряду с бутанолом также ацетон и этанол.
Во время первой мировой войны требовался главным образом аце-
тон для производства взрывчатого вещества тринитротолуена. Но
после войны бутанол снова потребовался для изготовления бутил-
ацетата — хорошей системы для нитроцеллюлозных лаков, ис-
пользуемых для автомобильной промышленности. В 50-е гг. неф-
техимические синтезы заменили собой биологические и большая
чисть заводов, где работали небольшие ферментеры (менее чем
па 200 м3), были закрыты. Но некоторые ацетоно-бутиловые за-
воды функционируют до сих пор: это заводы в Тайване, Южной
Африке и в Советском Союзе. В 1976 г. 5% ацетона и 10% бута-
нола получали путем ферментации, другую часть — петрохими-
ческим путем. Бутанол и теперь применяют в производстве лаков
для автомобилей, самолетов, мебели, игрушек, а также для про-
изводства синтетического каучука и искусственной кожи. Ацетон
необходим для получения искусственного шелка и искусственной
кожи, фотопленок, аэролаков, искусственных цементов.
Изучение продукции ацетона и бутанола при брожении Clos-
tridium acetobutylicum стало очень популярно в последнее время
благодаря возможности утилизировать возобновляемую биомассу
как источник энергии и химических веществ.
Ацетоно-бутиловое брожение вызывают бактерии рода Clostri-
dium, а именно Cl. acetobutylicum и другие виды. Бутанол-изопро-
паноловое брожение вызывает CL butylicum (см. ниже), а мас-
ляноуксуснокислое брожение — Cl. butyricum.
Продуценты. Почти все виды рода Clostridium осуществляют
ацетон-бутанол-этанольную ферментацию. Классификация этих
бактерий окончательно не изучена, но два вида этого рода ис-
пользуют для получения растворителей — это CL acetobutylicum
McCoy et. al. и Cl, beijerinckii Donker. Недавно обнаружены новые
виды, полезные для получения ацетона и бутанола: Cl. aurantibu-
lyricum и Cl. tetanomorphum (группа Накамуры, Япония). На ос-
новании строения клеточных стенок и гомологии DNA установили,
что CL butylicum на самом деле — Cl. beijerinckii, поэтому пер-
вый вид больше не признают. Штамм Cl. tetanomorphum образует
бутанол как главный продукт брожения при небольшом количест-
ве этанола, уксусной и масляной кислоты, но не ацетона.
Споры клостридий широко распространены в почве. Большое
число штаммов (240) выделено из жидкости рубца. Бактерии фер-
ментируют глюкозу, целлобиозу, крахмал. Известны три штамма
с целлюлазной активностью.
Cl. acetobutylicum — спорообразующий, облигатный анаэроб,
имеет форму сигары, размеры клеток 0,6—0,9X2,4—4,7 мкм. Грам-
положительные клетки, подвижные за счет перетрихиального жгу-
тикования, делятся поперечной перегородкой, образуют цепочки.
Хотя споры не образуют растворители, наиболее сильные споро-
образователи синтезируют наибольшее количество растворителей.
Cl. acetobutylicum при высеве на плотную среду образует коло-
нии 4 типов: I — с темным центром и светлым краем, после не-
149
скольких пассажей на богатой среде появляются колонии типЯ
II —с коричневым центром и узкой зоной периферического рост»
типа III — с коричневым центром без светлого края и типа IV-Я
светлокоричневые без периферического роста. Способность к обЯ
разованию растворителей снижается в ряду: 1>П>Ш. Колонии
IV типа практически не образуют растворителей. Из колоний типЯ
II и III реверсий к типу I не обнаруживается. Я
Оптимальная температура для роста 37° С, pH 6,5 Eh от —25(Я
до —400 мВ. CL acetobutylicum сбраживает крахмал, гексозы илЯ
пентозы с превращением их примерно на 30% в смесь раствориЯ
телей, а остальное составляют газы Н2 и СО2 в соотношении
— 40:60. Смесь растворителей состоит из н-бутанола (60%), ацеЯ
тона (30%) и около 5—10% приходится на этанол. Cl, beijerinckim
сбраживает глюкозу и крахмал с образованием главным образолЯ
н-бутанола и в меньших количествах изопропанола и этанола. НеЯ
обычный вариант Cl. saccharo-butyl-acetonicum-liquefaciens плохой
сбраживает мелассы, но дает прекрасный выход продуктов в крахЯ
мальной среде и высокое образование бутанола; соотношение ацеЯ
тон : бутанол : этанол равно 19 : 78 : 3. У Cl. toanum при росте вл
сахарозной среде с добавлением обезжиренных рисовых отрубей!
выход растворителей составляет —30%, а их соотношение как!
52,9 (бутанол) : 42,5 (изопропанол) : 3,2 (этанол) : 1,4 (ацетон) Л
Для производства бутанола и ацетона в промышленности исполь-1
зуют Cl. acetobutylicum. При росте, в фазе образования кислот!
и бутанола, одновременно из глюкозы и реассимилированного бу-1
тирата Cl. acetobutylicum образует внеклеточный полимер, кото-1
рый может реутилизироваться культурой как резервный источник]
углерода. Предположительно полимер представлен ацетилирован* ]
ным полисахаридом. |
Обнаружено, что промышленный штамм в конце экспоненци-1
альной фазы роста выделяет вещество аутобактериомицин, обла-1
дающий антибиотическим действием по отношению к продуценту^!
а также к четырем штаммам сем. Bacillaceae. Бактериолитический!
эффект аутобактериомицина возрастает с возрастом клеток и кон-1
центрацией бутанола. Это аутолизин. Аутобактериомицин оказы-1
вает влияние на концентрацию биомассы и образование раство-1
рителей. Причем установлено, что если аутолизин прикреплен к]
клеточной стенке, то он играет положительную роль для роста. !
Если он освобождается и выделяется в среду в конце экспонен-1
циальной фазы, то он вызывает лизис клеток. Освобождение ауто-1
лизина происходит в связи с отсутствием дивалентных катионов!
в среде. Если в среду добавить Mg2+, то увеличивается устойчи-1
вость культуры к бутанолу. Тот же результат получают с помощью I
ультрафильтрации, которая позволяет термально денатурировать!
аутолизин в течение всей ферментации. 1
Ингибирование синтеза бутанола аутолизином служит перво- ]
степенным ограничением типичной ацетоно-бутиловой фермента-
ции. Поэтому ведутся исследования по получению Ьу^-штаммов. *
и один такой «безаутолизиновый» штамм получен. 5
150
Усовершенствование штамма. Методом химического мутагене-
за нитрозогуанидином в присутствии бутанола получен мутант
С/. acetobutylicum штамм 77. У мутанта более высокая удельная
скорость роста: 0,27 ч”1, в 2 раза большее накопление биомас-
сы (5,9 г/л) по сравнению с исходным типом. Мутант начинает
синтезировать растворители раньше и с большей скоростью, чем
исходный штамм. В процессе ферментации дикий штамм потреб-
ляет 65 г глюкозы, образуя при этом 20 г-л-1 растворителей в
течение 53 ч. Мутант потребляет 75 г глюкозы, образует 24 г-л"1
растворителей за 44 ч. Рост мутантного штамма менее подвержен
ингибирующему действию бутанола.
Для селекции мутантов Cl. acetobutylicum предложен метод от-
бора штаммов, устойчивых к ампициллину (1 мкг/мл), эритроми-
цину (10 мкг/мл) и к бутанолу (15 г/л). Более высокая эффектив-
ность мутагенеза (доля мутантов на число выживших клеток), чем
с нитрозогуанидином, получена при использовании другого мута-
гена — метансульфоновой кислоты (1% мутагена, 35°, 15 мин).
Недавно среди ацетоно-бутиловых клостридий обнаружены и изу-
чены штаммы, способные утилизировать ксилозу — главный са-
харный компонент гемицеллюлозных фракций. Максимальный вы-
ход растворителей при использовании ксилозы Cl. acetobutylicum
DSM 1731 составлял 9,2 г/л за 120 ч периодической ферментации.
Иммобилизованные клетки работали в двустадийной проточной
системе с высокой продуктивностью: 1,4 г/л-ч, причем выход раст-
ворителей составлял 30% при конверсии сахара на 51%. Счита-
ют, что продукция бутанола иммобилизованными клетками клост-
ридий достижима в больших масштабах.
Поддержание культуры. Культура Cl. acetobutylicum может
храниться в виде спор в стерильном песке или почве и сохранять
жизнеспособность вплоть до 30 лет. Способ поддержания культу-
ры оказывает влияние на образование продуктов. При периодиче-
ских пересевах на МПБ культура теряет способность образовы-
вать бутанол после девяти месяцев хранения. Культура сохраняет
хорошую жизнеспособность и способность к образованию раство-
рителей в течение девяти месяцев при хранении спор в дистил-
лированной воде или фосфатном буфере, pH 6,5 при 4° или при
-20°, в лиофилизированном состоянии, в МПБ при 4°.
Кинетика образования продуктов. При снижении pH в течение
первых 18 ч — до 4,3 ацетоно-бутиловые клостридии переключа-
ются на образование нейтрального продукта — ацетона. Ацетон
образуется при декарбоксилировании ацетоацетата и циклический
механизм образования масляной кислоты прерывается. Одновре-
менно происходит исчезновение двух ступеней окисления NADH2,
что требует создания новых окислителей, в результате чего начи-
нает восстанавливаться масляная кислота с образованием бута-
нола как конечного продукта. Образование нейтральных продук-
тов имеет важное приспособительное значение для бактерий, так
как при этом количество кислот снижается, повышается pH и соз-
даются более благоприятные условия для жизнедеятельности.
151
4
В том же аспекте можно рассматривать конденсацию двух ацетм
лов (с двумя карбоксильными группами) в один бутират. В слД
дующие 18 ч значение pH повышается до 5,8 и накапливаютсД
ацетон и н-бутанол. После 36 ч рост и образование растворителвД
заканчиваются, pH (5,8) остается неизменным и продукты можД
выделять. Д
Таким образом, для ацетоно-бутиловых бактерий хорошо раД
личимы две стадии процесса (рис. 41): образование кислот, котД
рое сопровождается быстрым ростом (бактерии имеют вид длшД
ных вегетативных клеток), и о
разование нейтральных проду
тов: бутанола, ацетона, этано</Д
(бактерии имеют вид утолще^
ных клостридиальных клеток, рй
утилизирующих масляную и ум
сусную кислоты). Клетки С1. асъ
tobutylicum на ранних стадий
движутся прямолинейно в теч|
ние нескольких секунд, затем ха
рактер движения изменяется Н|
«кувыркание». Изменение харак
тера движения совпадает с на
ф
6,0-
5,5-
5,0-
CD
ф
9 18 27 36
Время ферментации (часы)
Рис. 41. Кинетика ацетоно-бутиловог»
брожения (по Spirey, 1978): 1 — расД
ворители, 2 — титруемые кислотьД
3 — продукция газа, 4 — значение рНД
чалом стадии образования растворителей, которые служат репелД
лентами. Глюкоза, галактоза и лактоза являются аттрактантами»
Движение клеток обусловлено хемотаксисом.
Факторы, определяющие переход из первой фазы во вторукД
Ключевые вопросы ацетоно-бутилового брожения состоят в томД
что заставляет бактерии переключаться с образования кислот нД
образование растворителей и какие условия необходимы для под»
держания второй фазы в течение длительного времени. На первыД
вопрос исчерпывающего ответа пока дать нельзя. Обычно принятД
считать, что главная роль в переключении принадлежит фактор»
изменения pH среды. Действительно, у Cl. acetobutylicum АТСЯ
824 и DSM. растворители редко образуются при pH выше 6,0, нД
хорошо образуются при pH 4,3—5,5. Это можно понять, еслД
учесть, что ацетоацетатдекарбоксилаза имеет оптимум pH 5,(Д
Кроме того, величина pH оказывает влияние на образование дисД
социированных и недиссоциированных форм уксусной и масляноД
кислот. Только недиссоциированные кислоты могут проникать чеЯ
рез мембрану. Например, при pH 6,0 только 6% общего количеЯ
ства масляной кислоты находится в недиссоциированной форме, Д
при pH 4,5 — 66%. К началу образования бутанола количество не»
диссоциированной масляной кислоты 1,5 г/л, независимо от р]Д
(4,2—5,5) или общего количества масляной кислоты. При pH 6,Д
F
152
концентрация недиссоциированной масляной кислоты не достига-
ет 0,9 г/л и образование бутанола почти не происходит — это пер-
вая фаза брожения. Растворители образуются при достижении
критической концентрации недиссоциированной масляной кисло-
ты — 2—9,5 г/л. Значит, в случае Cl. acetobutylicum центральная
роль в регуляции процесса накопления растворителей принадле-
жит недиссоциированной масляной кислоте. Вначале (при кон-
центрации 0,25 г/л) она ингибирует рост клеток и свое образова-
ние, далее (при концентрации 1,5 г/л) наступает индукция синте-
за бутанола и бутанол сам начинает ингибировать рост и свою
собственную продукцию по достижении критической концентрации
8 г/л. Однако следует заметить, что это заключение не относится
ко всем клостридиям, продуцирующим растворители, в случае ко-
горых могут действовать другие факторы.
Cl. beijerinckii 13436 образует бутанол при pH 6,8 и регулиро-
вание с помощью величины pH или количества недиссоциирован-
ной масляной кислоты не обнаружено, но выход растворителей
снижается по мере их образования. У CL acetobutylicum NCIB
8052 (АТСС 824) растворители образуются при pH 7,0, при до-
оавлении к среде больших количеств ацетата и бутирата (по
100 ммолей каждой). У египетских штаммов Cl. acetobutylicum
при величине pH 7,0 активно образуются растворители и их кон-
центрация достигает 20 г/л. Ответ на второй вопрос, поставленный
в начале этой части, дают экспериментальные данные. На выход
нейтральных продуктов оказывает существенное влияние концент-
рация источника углерода и скорость разбавления (в случае про-
точных культур). При культивировании бактерий в периодичес-
ком режиме с подкормкой со скоростью подачи субстрата 4 г/л
в день или в проточных и периодических условиях при очень низ-
кой концентрации глюкозы (менее 7 г/л) образуются только кис-
лоты. В периодических условиях культивирования культура не
переходит при этом во вторую фазу, но в проточных условиях
высокая скорость разбавления позволяет культуре перейти во
вторую фазу, если концентрация глюкозы составляет по крайней
мере 5 г/л. Удельная скорость образования кислот увеличивается
с возрастанием D, то же в отношении образования растворите-
лей, но до определенного предела величины D : 0,1—0,2 ч’1, пос-
ле чего наблюдается сильное снижение их выхода. Выход раст-
ворителей только частично связан с ростом культуры, поэтому в
суспензии нерастущих клеток также возможно получение раст-
ворителей. Величина D играет очень важную роль в регуляции
выходов растворителей. При низких D (0,03—0,1 ч"1) в хемостат-
JIых культурах получают самый высокий выход и концентрацию
растворителей, на промежуточных D все продукты образуются од-
новременно, а при высоких D накапливаются только кислоты.
Физиология управляемого культивирования
Индукцию образования растворителей вызывают не только ук-
сусная и масляная кислоты, но также ацетоуксусная, пропионовая,
153
муравьиная; молочная, изомасляная и кислоты с длинной цепыи
(валериановая, капроновая, энантовая) не индуцируют образова!
ние растворителей. При искусственном добавлении к среде уксус!
ной кислоты количество ацетона сильно увеличивается, а бутано|
ла становится меньше. Это показывает, что уксусная кислота бла|
гоприятствует только образованию ацетона и что образований
двух метаболитов происходит независимо. Выход ацетона не ог|
раничен работой ферментов: СоА-трансферазы и ацетоацетатде!
карбоксилазы, но ограничен продукцией ацетата, и если в реактор»
искусственно ввести ацетат, то количество образованного ацето*^
на может стать в 2,5 раза выше, чем без введения уксусной кис-
лоты. Если в реактор добавить масляную кислоту и поддерживать
ее нетоксическую концентрацию, то наблюдается увеличение ско-
рости образования и ацетона и бутанола. Полезно вести процесс
под давлением — это сохраняет Н2. Напротив, сильное перемеши-j
вание ведет к утере Н2 и отрицательно сказывается на выходе бу-
танола. Если ферментацию вести в атмосфере Н2 (добавлять’
Н2), то выход бутанола и этанола увеличивается, а ацетона сни-
жается.
Соотношение растворителей можно изменить с помощью угар-
ного газа (ингибитора гидрогеназы) в сочетании с добавлением!
уксусной или. масляной кислоты. В присутствии растворенного СО;
(парциальное давление 0,1—0,2 атм) поглощение клетками орга-
нических кислот увеличивается, выход ацетона уменьшается
бутанола повышается на 10—15%. Добавление краски нейтраль-;
ной красной (6 ммолей) к культуре Cl, acetobutylicum, растущей
в среде с ксилозой или глюкозой, увеличивает долю бутанола за '
счет ацетона, и выход первого повышается на 10—15%. Показано J
также, что если снизить температуру культивирования с 30 до
24,5° С сразу после инокулирования и сохранять ее в течение
16 ч, то выход бутанола увеличивается на 3—5%.
При добавлении активированного угля и синтетических поли-
мерных смол XAD=2 и XAD = 4 в культуру Cl. beijeritickii бро-
жение сдвигается в сторону образования кислот. При добавлении4
смолы XAD-8 образуется больше бутанола, чем в культуре без j
адсорбента. Перемешивание в процессе ферментации губительно
в отношении синтеза растворителей, видимо, из-за удаления Н2. (
В целом влияние СО, повышенного давления, введения Н2, пере-,'
мешивания сходно в том смысле, что они оказывают влияние на
уровень восстановителей, необходимых для образования бутано-;
ла. Следует заметить, что бутанол представляет в настоящее вре-.
мя больший интерес для практики, чем ацетон, но известны так-
же факторы, способствующие сдвигу соотношения растворителей;
в сторону ацетона. Синтез ацетона прямо зависит от активности
ацетоацетатдекарбоксилазы, а ее синтез индуцирует формиат, аце- •
тат, пропионат, бутират и ацетоацетат. Добавление нитратов
вместо аммония к мелассной среде увеличивает количество аце-
тона за счет количества бутанола.
глюкоза
3-гидроксибути рил-СоА
кротрнил-СоА
nadh2
NAD
nadh2
NAD
бутиральдегид
nadh2
NAD
бутанол
битурил-СоА
ADP АТР
—бути о ат
Рис. 42. Химизм ацетоно-бутилового брожения (на примере Cl. acetobutylicum'}.
1 — ферменты пути Эмбдена.—Мейергоффа—Парнаса, 2 • пируват-ферредокси-
иоксидоредуктаза, 3 — NAD и NADPH-ферредоксин оксидоредуктаз а, 4 гид-
рогеназа, 5 — ацетальдегид-дегидрогеназа, 6 — этанолдегидрогеназа, 7 - - фос-
фоацетилтрансфераза, 8 — ацетаткиназа, 9 — тиолаза, 10 — ацетоацетил-СоА,
ацетат (бутират) СоА-трансфераза, 11 — ацетоацетатдекарбоксилаза, 12
3-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназа, 13 — кротон аза, 14 — бутирил-СоА-
дсгидрогеназа. 15 — фосфобутирилтрансфераза, 16 — бутираткиназа, 17
бутиральдегиддегидрогеназа, 18 — бутанолдегидрогеназа
154
7
Химизм процесса. Химизм процесса отражен на рис. 42. Аце
тил-СоА, образованный при фосфорокластическом расщеплена
пирувата, превращается в ацетат (АТР-продукция), в этанол (трй
буется 2NADH3) и ацетоацетил-СоА). Последний превращается
ацетон или восстанавливается (требуется 2NADH2) в бути
рил-СоА.
По последним данным, главный путь проходит через бутирил
фосфат с образованием АТР. Поэтому реассимиляция кислот мО
жет быть способом получения энергии для организма — энергии
необходимой для поддержания жизнедеятельности во время стрес
совой ситуации, связанной с накоплением растворителей. Декар
боксилирование ацетоацетил-СоА с образованием ацетона — дви
жущая сила для трансферазной реакции, опосредованной через
ацетоацетатдекарбоксилазу, которая индуцируется только при об
разовании растворителей. Образование восстановленных продук,
тов полностью зависит от количества доступных восстановителей
Во время кислотообразования часть их теряется в виде Н2. Ко
личество выделяемого Н2 у Cl. acetobutylicum варьирует в связ!
с пулом NADH2 и NADPH-ферредоксиноксидоредуктазы. У С1. асе
tobutylicum функция NADPH-ферредоксиноксидоредуктазы —
обеспечение клеток NADPH2 для анаэробных процессов, I
NADH-ферредоксиноксидоредуктаза или участвует в восстановлен
нии ферредоксина с помощью NADH2, или окисляет его с па
мощью NAD как акцептора электронов. В последнем случае об-
разуется меньше Н2, но больше NADH2. Эти активности регулщ
руются с помощью NADH2 (действует как конкурентный ингиби-
тор ферредоксин-ХАВ-редуктазиой активности) и ацетил-СоА (об-
лигатного активатора ХАЁ)Н2-ферредоксиоксидоредуктазы).
Чтобы увеличить количество бутанола, необходимо увеличит!
концентрацию NADH2 (образованную в последних реакциях гли-
колиза). Этого можно достичь с помощью ингибиторов гидроге
назы или работая с проточной культурой. Максимальный теоре
тический выход бутанола — 1 моль/моль глюкозы, или 0,41 г/г
ацетона — 1 моль/моль глюкозы или 0,32 г/г и этанола —
2 моль/моль глюкозы или 0,5 г/г глюкозы.
Токсичность продуктов ферментации. Бутанол наиболее токси
чен из растворителей. Полное ингибирование роста происходит пр>
содержании бутанола в количестве 14—16 г/л, ацетона — 70 I
этанола — 70 г/л. Механизм токсического действия бутанола дол
гое время связывали с его гидрофобностью. Мишенью его дейст-
вия служат мембраны с липидной основой. Недавно показано, чт(
бутанол (0,5—1,5% об/об), добавленный к липидам, экстрагиро-
ванным из клеток штамма 824 в средней экспоненциальной фаз(
роста, сильно увеличивает ротационную подвижность спин-мече
ных углеводородов в липидных дисперсиях. Результаты интерпре-
тируют в связи с сильным жидкостно-текучим эффектом бутано
ла на основную массу липидов мембран Cl. acetobutylicum. По^
действием бутанола изменяется состав липидных ацильных цепе{
в сторону большего количества насыщенных цепей (58,1% насы-
156
(ценности в экспоненциальной фазе и до 76,8% в стационарной).
Увеличение доли насыщенных жирных кислот рассматривают как
ответ организма, стремящегося сбалансировать жидкостно-теку-
чий фактор бутанола. Полагают, что увеличение устойчивости к
бутанолу может быть достигнуто, если будут получены мутанты
г измененным свойством клеточных мембран в отношении синтеза
липидов. Токсическое действие бутанола сказывается также на ас-
социативной функции мембран. Поглощение глюкозы ингибиру-
ется на 50% при добавлении 0,1 моля бутанола. Считают, что
пжсическое действие бутанола связано с нарушением механизма
энергозависимого транспорта веществ через мембрану. Чувстви-
тельность к бутанолу также связана с автолитической активно-
стью штамма Р622. Мутант (Lyt-1) который образует меньше
лутолизина, более устойчив к бутанолу, чем исходный штамм.
Добавление 7—16 г/л бутанола усиливает дегенерацию клостри-
диальных форм у Р262 и не влияет на Lyt-1 мутант.
Cl. acetobutylicum чувствителен не только к бутанолу, но и
к масляной кислоте. Ингибирующий эффект кислот коррелирует
с внутриклеточной концентрацией недиссоциированных кислот и
различается в связи с величиной внешнего pH. 50%-е ингибиро-
вание скорости роста наблюдается при общем уровне 8—15 г/л
уксусной кислоты и 6—13 г/л масляной. В 1983 г. удалось вы-
делить Cl. acetobutylicum, устойчивый к бутанолу, он мог расти
н присутствии 15 г/л бутанола.
Способы культивирования. Периодическое выращивание. При
периодическом выращивании следят за уровнем источника угле-
рода и pH. Определенный исходный уровень источника углеро-
да обусловлен токсичностью образуемых из него продуктов. Раст-
ворители, и в первую очередь бутанол, ингибируют процесс, по-
этому при периодическом выращивании редко образуется более
20 кг растворителей в 1 м3 Типичные выходы для этого режи-
ма: 0,2—0,6 кг/м3-ч в зависимости от субстрата и условий куль-
тивирования. Для удаления конечных продуктов ферментации в
качестве экстрактантов в ферментер добавляют несмешивающие-
ся органические растворители. Наилучшие результаты получены
при добавлении олеилового спирта и смеси олеилового спирта
(50%) в бензилбензоате. В обычной ферментации в периодичес-
ких условиях поглощение глюкозы —80 кг/м3. В экстракционной
ферментации получают более 100 кг/м3. Удаление бутанола в
процессе экстракции увеличило скорость его образования, и мак-
симальная объемная производительность по бутанолу увеличи-
лись более чем на 60% по сравнению с обычной периодической
ферментацией.
Проточное культивирование. Чтобы увеличить продуктивность
и снизить цены на продукты ферментации, предложено проточ-
ине культивирование.
При одностадийном проточном культивировании с низкими
скоростями протока можно одновременно достигать роста клеток
и максимального превращения сахаров в растворители. Но при
/57
низких скоростях разведения, благоприятных для синтеза ра<
ворителей, возникает нестабильность процесса и достичь стацк
парного состояния бывает очень трудно. Для промышленно
применения такой проточный процесс не подходит, так как I
должен быть стабильным в течение нескольких недель или лучи
нескольких месяцев. Стабильность — один из важнейших кр
териев непрерывного процесса.
Причину нестабильности усматривают в токсичности бутан
ла на клетки при его высокой концентрации и во флоккулящ
бактерий. Для устранения флоккуляции клеток, которая вози;
кает в условиях высокой концентрации растворителей, рекоме
довано добавление к синтетической среде солей хлора (NaC
КС1, СаС12). Действие хлористых солей может быть связано
эффектом заряда. Хлор, будучи самым маленьким анионом
растворе, легко диффундирует в клеточные агрегаты и создав
дестабилизацию многоклеточных структур. Предотвращена
флоккуляции клеток способствовало стабилизации проточный
культур. (Флоккуляция имеет место и в периодических культ]!
рах.) При рециклировании с помощью ультрафильтрации можн*
получить более высокую концентрацию клеток (до 40 г/л), п<
-вышенную продуктивность (более 10 г/л-ч) и высокую стабил)
.ность при промежуточных концентрациях бутанола.
При высокой концентрации растворителей стабильность фе]
.ментации можно улучшить в двустадийной проточной культура
рост клеток оптимизируют в первой стадии, а продукцию раств<
рителей — во второй. В оптимальных условиях такая кон фигур!
ция приводит к длительной стабильности на более чем один м*
сяц, даже при высокой концентрации растворителя (21 г/л). Пр
одностадийном проточном культивировании (D = 0,025 ч™1) 20cfl
глюкозы не используется клетками и остается в среде. В двуста
дийном процессе 87,5% глюкозы превращается в растворителе
Комбинируя две техники: двустадийный проточный реактор I
рециклирование клеток во втором ферментере, достигают как увй
личенную продуктивность, так и хорошую стабильность с высб
кой концентрацией растворителей (17 г/л).
Проточный процесс ведут при лимитизации по фосфатам (ил|
по сульфатам, но не по азоту или субстрату) в синтетической
среде. В двустадийном процессе: на первой стадии D=0,125 ч^
и 37°, а на второй — D = 0,04 ч1 и 33°. Растворители образуют
ся в пределах pH 4,3—4,7. Первая стадия — это индукция к сиН
тезу растворителей, вторая — непосредственно образование pacTj
ворителей. Поскольку фосфор почти полностью исчерпан ко вре
мени второй фазы, рост клеток останавливается. При низкой ком
центрации протока выход растворителей в непрерывной культур!
такой же, как в периодической: 0,29 г/г глюкозы. ;
При культивировании Cl. acetobutylicum в хемостате на син<
тетической среде с витаминами — биотином (0,01 мг/л) и р-амм
нобензойной кислотой (1 мг/л) — установили, что рост и обра-
зование растворителей лимитируются витаминами. Продуктив*
158
Нисть увеличивается в 4 раза при увеличении концентрации вита-
минов в среде. В строго анаэробных условиях выход раствори-
телей в 1,5 раза выше, чем при доступе воздуха. В оптимальных
условиях продуктивность растворителей равна ~2,0 г/л-ч.
Получение растворителей в промышленности
Для приготовления инокулята есть разные способы. Например,,
проводят тепловой шок, а затем последовательные пересевы для
уничтожения вегетативных клеток, слабых спор, а также для ин-
дукции прорастания спор. Нагревание осуществляют по-разному:
|()()° С — 50 с, 100° — 2 мин, 95° — 30 мин, 80° — 45 мин,
Ж Г — 5 мин, 75° — 2 мин и 70° — 90 с. Считают, что увеличение
времени теплового шока при каждом субкультивировании способ-
(чвует отбору самых «сильных» спор и, возможно, самых актив-
ных бродильщиков. На производстве культура бактерий хранится
в виде спор. Инокулят вносится в ничтожном количестве 1 :3000,
iiD его специальная подготовка имеет решающее значение для
процесса. Замечено, что лучшими продуцентами нейтральных про-
дуктов служат культуры, споры которых выдерживают наиболее,
высокую температуру. Считают, что клетки инокулята должны
быть подвижными. С сильно подвижными клетками получают
больше растворителей. Важно также последовательные манипу-
ляции делать во время максимальной подвижности клеток и ми-
нимального значения pH. Если в качестве посевного материала
используют клетки в стадии максимальной подвижности, то вы-
ход бутанола увеличивается в 2,5—3 раза. Первую, вторую и
(ретью генерации проводят в лаборатории. Для CL acetobutylicum
первая генерация проводится в среде, приготовленной на 5% су-
хих злаков и без питательных добавок, при t 37° в течение 24 ч.
Содержимое пробирки вносят в 300 мл мелассной или крахмаль-
ной среды с питательными добавками, налитой в колбу на 500 мл
и инкубируют в течение 24 ч. Далее содержимое колбы вносят
и <1-литровую колбу, содержащую 2900 мл той же среды. Одна из
1аких колб с культурой служит инокулятом для первого сосуда
па заводе. Через колбы интенсивно продувают инертный газ и
pH снижается до 3,9—4,5. Когда посевной материал переносят
и ( колбы, количество углеводов должно быть наполовину по-
। реблено.
Среды. Ферментация. Используют 3 типа сырья как источни-
ки} углерода и энергии: зерно (крахмал), паточную (неочищен-
ную мелассу) и очищенную мелассу. В качестве субстратов бу-
дущего рассматривают различные отходы, гидролизованную дре-
ш‘сину, гидролизаты кукурузных початков, гидролизаты отбро-
сов, сыворотку, сульфитные жидкости: гидрол — побочный про-
чу кт производства глюкозы из зерна. Данные о выходе раство-
рителей на средах, приготовленных из этого сырья, представле-
ны в табл. 29. Среды из зернового крахмала готовят следующим
образом. Мука вносится в количестве 60% к воде, туда же до-
бавляют сброженный остаток ферментации после отгонки раст-
159
ворителей. Конечная концентрация должна соответствовать 8,5*}
исходного зерна.
При использовании мелассы концентрация сахара должн
быть 5,5—7,5%. К среде добавляют суперфосфат и аммоний. Пс
следний вносят постепенно в случае очищенных меласс для пох
Таблица 29
Выход растворителей^при использовании возобновляемых субстратов
(по Haggstrom, 1985)
Культура Субстрат Время, ч Выход, % Соотношение растворител!
Б А э
Clostridium acetobutylicum гидролизат кукурузных кочерыжек, 7 % гидролизат опилок, 7 % 26,2 22,2
Бутиловая культура одна часть гидролизата кукурузных стеблей, три части мелассы 50- -55 31,4
Бутиловая культура гидролизат древесины и растений, 8 % 35,5 62 32 6
Cl. acetobutyli- cum 314 гидролизат кукурузных початков, 40 60 % и меласса, 60—40 % (3,7 % общ. сах) 48- -72 40 67,5
Бутиловая культура пентозы, 13,5% 25,4 67 33
П ри мечание. Б --бутанол, А—ацетон, Э—этанол.
держания pH на уровне 5,6—6,0 в количестве 2,2—1,3% NH3 w
отношению к концентрации сахара или сразу в случае паточны
меласс, которые сильно забуферены. В среду вносят 25—50% го;
рячего остатка после отгонки растворителей. Это увеличиваем
выход растворителей, снижает количество добавляемых питатель
ных веществ, сокращает затраты на нагревание и дает большую
экономию пара, необходимого для выпаривания остатка. Фер.
ментер и среду стерилизуют. Брожение протекает под избыточ
ным давлением газов для создания анаэробных условий. НачалЬ
ный pH 6,0, который снижается до —5,4 через 24 ч.
Концентрация растворителей (при использовании крахмально!
среды) через 50—56 ч ферментации 22,5 г/л, а соотношение ацв'
тона, бутанола и этанола 30:60:10. Ферментация в мелассны;
средах завершается за 40—45 ч, а в крахмальных (с питательна
ми добавками) — за 50—60 ч, в крахмальных без питательны
добавок — за 70—80 ч. Проточное выращивание бактерий ведет
ся в СССР, где работает серия из пяти ферментеров. За 18 дне
получают продуктивность в 3 раза выше, чем при периодическо1
160
культивировании, но выходы растворителей низкие в связи с вы-
соким образованием кислот в начальной фазе. В СССР также
излажен каскад из 11 пилотных ферментеров, где за 90 ч удает-
ся па 20% повысить продуктивность процесса по сравнению с пе-
риодическим режимом.
Побочные продукты ферментации. Количество газов в 1,5 ра-
за превышает количество растворителей; СО2, образующийся в
брожении, выделяют и сжижают либо превращают в твердый су-
хой лед. Ацетон, бутанол и этанол выделяют при постоянной от-
гонке и фракционировании, Н2 может быть использован для по-
лучения аммиака, который синтезируют каталитическим путем из
N? и Н2. Н2 используют для гидрогенирования жидких масел при
получении маргарина. В ацетоно-бутиловом брожении образует-
ся много рибофлавина (витамина В2), и его тем больше, чем
больше образовалось ацетона. После отгонки растворителей по-
лучают ацетоно-бутиловую барду — рибофлавиновый препарат
для животных. Для этого барду упаривают в 10 раз в многосту-
пенчатых вакуум-аппаратах и высушивают в распылительных су-
шилках. В сухом препарате содержится 60—100 мкг/г В2. У нас в
г1ране разработан метод получения ценного витаминного концен-
грата из ацетоно-бутиловой барды путем дополнительного сбра-
живания ее метанообразующими бактериями. В таком кормовом
препарате кроме витамина В2 содержится витамин Bi2.
Бактериофагия. Важная проблема связана с высокой чувстви?
1сльностыо бактерий к бактериофагам. Ферментация останавли-
вается, хотя через 24—48 ч она может снова начаться, но проис-
ходит более медленно и заканчивается с низким выходом продук-
тов. Чтобы покрыть расходы на ферментацию, зараженную фа-
гом, в некоторых случаях вносят Candida utilis, которые полно-
стью потребляют углеводы среды, образуя большую биомассу
для кормовых целей. Фаг можно отделить от бактериальных кле-
юк, пропуская жидкость через фильтр Беркефельда или стеклян-
ный фильтр. При этом фаг проходит, а бактерии нет. Можно по-
лучить фагоустойчивую культуру путем последовательных пере-
севов в присутствии фагового фильтрата. Но это не есть полное
решение проблемы. Фагоустойчивая культура содержит частицы
<|юга, но если эти частицы отделяются, то они могут заразить
культуру новой ферментации. Вирулентность фага увеличивается
и ферментация снова срывается. Физические и химические методы
инактивации фага редко бывают успешными, так как фаг прояв-
ляет к ним устойчивость, а бактерии оказываются чувствительны-
ми. Еще в 1957 г. Вальтоном предложен оригинальный способ
борьбы с фагом с использованием антифаговой сыворотки. Анти-
ф.ньвая сыворотка инактивировала фаг. Для ее получения про-
нш.нли инъекцию кроликов фаговым фильтратом в количестве
! э мл ежедневно в течение 20—30 дней. Активной считали та-
кую антифаговую сыворотку, которая в количестве 1 мл инакти-
инршзала все фаговые частицы в 10 мл фильтрата. Бутиловые
культуры могут заражаться более чем одним фагом; будучи ус-
Cj ./!. 11. Воробьева
161
тойчива к одному фагу, культура оказывается чувствительной
другому. В таком случае повторяют процедуру с новым фагом
Одни фаги специфичны, другие могут атаковать более чем оди;
штамм. В производственных условиях рекомендуют добавлять
2,5 мл антифаговой сыворотки к фагоустойчивой культуре сраЗ;
после теплового шока. Для ацетоно-бутилового брожения опас
ность представляют также молочнокислые бактерии Lactobacte
rium leichmanii и Str. lactis. При наличии бактериального зара
жения вторая фаза не наступает.
Выделение продуктов. Дистилляция — традиционный способ
выделения этанола, ацетона, бутанола из разведенных водны
растворов. При дистилляции продуктов ацетоно-бутилового бра
жения можно использовать тепло, выделяющееся при охлаждении
стерилизованного нагреванием ферментера. Дистилляция — ДС|
статочно гибкий процесс, при котором возможно фракционировав
ние и выделение каждого продукта. При традиционном фракцис
нировании растворителей из котла производят первую отгонку
собирают фракцию ацетона. Далее t повышают на 5° и отгоняю
этанол. Когда дистиллят начинает разделяться на два слоя, т
верхний бутиловый слой переносят в бутиловые танки, а нижни
слой возвращают в котел. Если верхний слой полностью удален
то пропускание пара прекращают и жидкость из котла удаляю
Далее осуществляют очистку неочищенных фракций от следов з;
грязняющих растворителей. Бутанол высушивают. Но более с<
временные способы выделения,
опробированные в
производен
этанола, проверялись и для процесса ацетоно-бутилового броз
ния. Испытывались мембранные процессы, например ультрафи
трация и обратный осмос. Выделение продуктов проводили
162
принципу первапорации; это мембранный процесс, в котором дви-
жущей силой служит большой вакуум с одной стороны мембра-
ны, свойства которой определяют эффективность разделения. Под
действием вакуума вещества, проникшие через мембрану, пере-
водятся в газовую фазу. Можно использовать N2 или воздух для
удаления паров веществ, которые затем конденсируют у холод-
ной стены, а жидкость удаляют. Испытывали обратный осмос,
диализ, используя полупроницаемую мембрану, жидкостную эк-
стракцию. В последнем случае используют жидкость, плохо сме-
шивающуюся с водой, но хорошо с растворителем. При выделе-
нии из экстракта продукта его отгоняют, а экстрагирующая жид-
кость рециркулирует. Многие сильные экстрагирующие жидко<
сти отличаются высокой токсичностью. Но если использовать
микрофильтр, убирающий клетки, то такие экстрактанты можно
использовать. В качестве экстрактантов рекомендуют применять
полиоксиалкилены и высокомолекулярные эфиры (бутилбутират,
и юбутилпальмитат). Например, у Kesso-792, — полиоксипропиле-
иовой смеси — малая токсичность, легкая сепарация от раство-
рителя без образования эмульсии. Растворители можно удалять
с помощью адсорбентов (молекулярных сит, полимерных гидро-
фобных смол серии XAD).
Хорошие результаты получают при селективной адсорбции
растворителями на силикалите (цеолите). Этот процесс можно ин-
нтрировать с ферментацией и работать с более концентрирован-
ными растворами. Комбинирование ферментации и выделения
продуктов возможно только при проточном культивировании. Воз-
можно применение химического выделения. Это новый метод, ос-
нованный на обратимой химической реакции. Например, этанол
вначале этерифицируют с некоторыми лактонами в присутствии
катализатора. Получается водонерастворимый нелетучий гидрок-
гнзфир, который хорошо отделяется от воды. При нагревании
(115°) этанол выделяется в безводной среде, а лактон восстанав-
ливается и поступает в цикл. По этому принципу можно подоб-
рать схему для бутанола.
Хотя многие из перечисленных методов применяют в лабора-
|ирняхина пилотных установках, в большой промышленности они
нг внедрены в силу недостаточности данных или высокой стои-
мосги. Считают, что в ближайшем будущем наиболее реально
внедрение в промышленность способа предварительного удаления
ни I.ы (обратный осмос) с последующей традиционной дистилля-
цией.
Новые разработки. Недавно во Франции создана математичес-
ки модель физиологии роста и метаболизма Cl. acetobutylicum.
Он.! была использована для оптимизации и компьютерного конт-
рили ферментационного процесса. По соответствующей сумме па-
ри метров эта физиологическая модель может предсказывать ход
ферментации в широких операционных условиях: в периодичес-
ком и проточном режимах культивирования, в одно- или двуста-
/|||IIной ферментации с или без рециклизации клеток. Более того,
II*
163
модель правильно отражает важное влияние pH на селективность)
ферментации. :
Другая оригинальная математическая модель (Канада) пред-
сказывала нестабильность биореактора при работе с избытком^
субстрата. При внесении увеличенного количества субстрат®
культура оказалась подверженной осцилляции и прогрессивному^
ингибированию увеличивающимся количеством бутанола. Пр^
удалении бутанола клетки вновь приобретали активность. Это по-ч
ведение клеток подтверждало постулат о ритмичности физиоло-]
гических функций клетки. Экспериментальные данные и модель
указывали на очень высокую чувствительность Cl. acetobutylicum
к проницаемости клеточной мембраны, которая в свою очередь
благодаря жидкостнокристаллической природе чутко отвечала на
силу внешних полей. Предполагаемую физико-механическую ван
риабельность мембраны заложили в новую модель физиологичен
ского состояния культуры. Новая модель копировала осцилляЛ
торное поведение культуры под действием магнитного поля. |
Другие новые разработки касаются использования иммобили]
зованных клеток, удаления растворителей в процессе фермента]
ции и рециркуляции клеток. Много внимания уделяется усовер]
шенствованию и внедрению непрерывного метода культивирова!
ния в промышленность. |
Иммобилизованные нерастущие клетки могут работать в ней
растущем состоянии. При этом снижены проблемы с удалением
биомассы, а среда может быть проще и не содержать вещества
необходимых для роста. Другое преимущество такого биокатали*
затора состоит в том, что нет вымывания клеток, которые могу1
работать месяцами. В будущем особенно важно использоватв
гидролизаты целлюлозы. Но нерастущие клетки со временем те!
ряют активность. Поэтому применяют дозированную питательную
технику, производя пульсирующую добавку питательных веществ
в реактор (вносят источник азота и ростовые факторы). На клет
ках, иммобилизованных путем адсорбции к березовым стружкам!
получают более высокий выход растворителей, чем при иммоби
лизации клеток в альгинат кальция. При оптимальном D — 0,2 чЧ
общий выход растворителей 6,3 г/л или 0,32 г/г глюкозы, a npd
дуктивность реактора — 1,2 г/л-ч. |
Растущие иммобилизованные клетки. В альгинат Са иммоби!
лизовали подвижные и растущие клетки Cl, acetobutylicum 27.q
Среда содержала глюкозу и дрожжевой экстракт. Лучшие pd
зультаты получены при Z) = 0,3 ч-1. Общий выход растворите
лей — 9—10 г/л, а продуктивность 1,5 г/л-ч. Споры CL acetobm
tylicum иммобилизовывали в 20%-м геле альгината Са, иниця
провали их прорастание тепловой обработкой и инкубировали Я
ростовой среде. Иммобилизованные клетки помещали в стекляй
ную колонку, соединенную с ферментером. Среда пропускалась
через колонку и поступала в ферментер. Фаза образования рас!
ворителей достигалась через 24—48, ч. Продуктивность систем!
по бутанолу составляла 67 г/л-сутки и в 8 раз превышала npd
164 1
дуктивность, достигнутую при периодическом культивировании.
Клетки сохраняли исходную активность более 1000 ч работы.
Работа проведена в Швеции, а также в других лабораториях,,
подтвердивших преимущества иммобилизованных клеток перед
свободными. Активирование клеток удалось также достичь иным
путем — путем пропускания суспензии клеток через узкие ка-
пилляры. В результате такой активации продавливанием увели-
чивались скорость утилизации глюкозы и выход растворителей.
11роточное культивирование активированных клеток можно про-
водить при £>>*0,4 ч"1, а неактивированные клетки в этих усло-
виях вымываются. Активированные клетки можно также исполь-
зовать и при периодическом культивировании.
Экстрактивная ферментация. Устранение ингибирующего дей-
ствия бутанола достигали в экстрактивной ферментной системе
с использованием таких растворителей, как г$ис-9-октадецен-1-ола
п гербетового спирта с разветвленной цепью из 20 углеродных
атомов. При использовании первого экстрактанта клетки сохра-
няли жизнеспособность в течение 146 ч, а концентрации бутанола
и ацетона в водной фазе составляли 4,8 и 6,4 кг/м3 и в фазе рас-
ширителя — 20,3 и 2,1 кг/м3 соответственно. Как уже отмечалось,
ранее, хорошим экстрактантом бутанола служат олеиловый спирт
пли его смесь с бензилбензоатом. Бутанол можно постоянно уда-
лять из среды, если ее пропускать через адсорбирующий мате-
риал, например активированный уголь. Адсорбированный бута-
нол удаляется далее десорбцией. Если в среду вносили 6% акти-
вированного угля, то выход бутанола увеличивался в 2 раза, до-
стигая 28,5 г/л (напомним, что в обычных условиях 13 г/л бута-
нола угнетает культуру). Предложено удаление метаболитов пу-
тем использования комбинированной технологии и твердого ад-
сорбента, интегрированных с ферментационным процессом. Через
мембрану проходит раствор с метаболитами, которые поступают
далее в адсорбционную колонку. Очищенный от метаболитов;
фильтрат возвращается в реактор.
Рециркуляция клеток. Разработан процесс непрерывного полу-
чения ацетона и бутанола с рециркуляцией клеток. В условиях
рециркуляции производительность по бутанолу возрастает с 0,36
'io 1,41 г/л-ч, а концентрация бутанола и ацетона повышается с
з1,5 до 190 и с 33 до 116 ммолей соответственно. Эффективность
реактора с рециркуляцией зависит от свойств мембраны. Опти-
мальные результаты получены в случае мембраны из триацетата
целлюлозы с максимальной проницаемостью 20 000.
Разработана еще более мощная система непрерывного куль-
|пвирования Cl. acetobutylicum с рециркуляцией клеток и части
фильтрата для увеличения продуктивности и концентрации про-
। у ктов брожения. Для ультрацентрифугирования использовали
мембраны «Carbosep М1». В такой системе концентрация био-
массы достигает 125 г/л, а концентрация растворителей — 20 г/л.
Средняя продуктивность 4,3 г/л-ч.
165
ЛИТЕРАТУРА
Ennis В. М., Gutierrez N. A., Maddox I. S. The acetone-butanol-ethai
nol fermentation: a current assessment//Process. Biochem. 1986. Vol. 21|
N 5. P. 131—147.
Haggstrom L. Acetone-butanol fermentation and its variants//Biotechnol
Adv. 1985. Vol. 3, N 1. P. 13—28. j
Haggstrom L. Clostridium acetobutylicum for butanol production.//Adv. BiO'
technol. Proc. 6th Int. Ferm. Symp. London (Canada), 1980. Vol. 2. P. 79—8$
Hastings L. H. Acetone-butanol Alcohol fermentation//Economic microbiology
1978. Vol. 2. P. 31—45.
ИЗОПРОПАНОЛ I
Изопропиловый спирт — хороший экстрактант (используют!
например, при выделении витамина Bi2). Его, как и другие С—Я
и С—4 спирты, можно вводить в неосвинцованный бензин как до!
бавку. Из изопропанола получают биомассу, ацетон, L-глутамаЯ
с помощью микроорганизмов. Среди низкомолекулярных спиртов
его рассматривают как важное сырье, следующее по своей значИИ
мости после метанола. Биологическим путем изопропанол в про!
мышленности не получают, но исследования в этом направления
проводят, поскольку известен организм Cl. beijerinckii, образую!
щий изопропиловый спирт наряду с н-бутанолом, и этот орга!
низм может использовать ксилозу и все моносахара гидролизата
древесины (т. е. возобновляемое сырье). Изопропанол образует!
ся в реакции восстановления ацетона с помощью NADH2: |
1 1
СН3СОСН3 NADHg NAD -»СН3СНОНСН3 (изопропанол)
На концентрированном гидролизате древесины ферментация
сильно ингибируется сахарами (25 г/л), ацетатом, н-бутанолом Я
солями. Поэтому использовали разведенный гидролизат, на КО|
тором выход н-бутанола и изопропанола составлял —0,20 Я
0,9 г соответственно на 1 г утилизированного сахара (примерна
такой же выход на чистой ксилозе), однако выход изопропа-ноля
пока невелик и требуются дальнейшие исследования, чтобы егя
поднять. I
Существенное влияние на характер брожения оказывает спо!
собность культуры образовывать агрегаты клеток. Бактерии куля
тивировали в проточном режиме хемостата при лимитации Пя
глюкозе (исследования проведены в университете Амстердама
1987 г.), в минеральной среде, pH 5,8, Z)~0,l ч л, Cl. beijerinckm
выделял уксусную и масляную кислоты как единственные пром
дукты брожения. Но из хемостата выделили аспорогенный вари
ант, который образовывал агрегаты, если концентрация глюкозе
была 3% или выше. Агрегатная форма варианта, кроме кислом
образовывала еще изопропанол и н-бутанол. Но если концентрй
ция глюкозы была ниже, чем 2%, то агрегаты исчезали и орг||
низм рос в нормальной суспендированной форме. Если этим иНСя
166 1
кулятом заражали среду с 4% глюкозы, pH 5,2, £>=0,1 ч-1,
30° С и выращивание вели в эйрлифтовом реакторе, брожение
снова переключалось на второй вариант, образовывались биослои
на стенках реактора и одновременно значительное количество
глюкозы (50%) превращалось в н-бутанол и изопропанол. В те-
чение одной недели устанавливалось стационарное состояние, а
стабильность культуры сохранялась по крайней мере два меся-
ца. Связь между условиями культивирования и образованием аг-
регатов и биослоев находится в центре внимания исследователей,
поскольку это отражается на характере брожения.
Cl. beijerinckii включили в Са-альгинат и осуществили про-
гонное культивирование биокатализатора. Продуктивность реак-
тора была в 6—16 раз выше, чем при периодическом культиви-
ровании свободных клеток. И одновременно увеличился выход
растворителей. Выход изопропанола-бутанола можно увеличить
путем их одновременного выделения выпариванием с использо-
ванием силиконовых трубочек в качестве мембран.
2,3-БУТАНДИОЛ
Практическое применение. По сравнению с брожениями, веду-
щими к образованию этанола, ацетона и бутанола, молочной и
уксусной кислот, превращение сахара в 2,3-бутандиол привлека-
ло к себе меньше интереса последние годы, хотя раньше получе-
ние 2,3-бутандиола как потенциального возобновляемого источ-
ника энергии обсуждалось довольно часто. В настоящее время
он больше рассматривается как важное вещество для химической
промышленности. Его можно легко превратить в 1,3-бутадиен,
мстилэтилкетон и другие химикалии. Бутадиен обычно получают
из этанола, но его продукция из 2,3-бутандиола обходится де-
шевле. 1,3-бутадиен в свою очередь необходим для изготовления
полибутадиеновых и стиролбутадиеновых смол. Бутадиен дорог
и его не хватает. 2,3-бутандиол -можно использовать как топлив-
ную жидкость в связи с содержанием в нем большой энергии
(27,2 мегаДж/кг). Он может быть использован в производстве
пластиков и красок, а также служить сырьем для полиуретано-
вых и полиэфирных смол.
Продуценты. D- (—)—2,3-бутандиол образуют многие и раз-
ные организмы, но лишь немногие виды можно использовать для
промышленных целей. Типичными продуцентами 2,3-бутандиола
служат Aeromonas hydrophila, Trichoderma harzianum, Serratia
marcescens, Erwinia caratovorum, Klebsiella pneumoniae, Aero-
bacter (Enterobacter) aerogenes и Bacillus polymyxa. A. hydrophila
непосредственно образует 2,3-бутандиол из растворимого крах-
мала.
Большая часть исследований проведена с последними двумя
организмами, которые дают самые большие выходы 2,3-бутандио-
л;к В. polymyxa используется для промышленного получения
167
2,3-бутандиола. В. polymyxa имеет два преимущества перед
Л/, pneumonia', она может ферментировать полимерные углевод
ды, что открывает большое поле субстратов из сельскохозяйсТ!
венных отходов; она образует чистый D— (—)—2,3-бутандиол, d
помощью которого возможно получение химикалиев со специальз
ными оптическими свойствами. В. polymyxa выращивают на ряд!
различных субстратов: глюкозе, злаковом крахмале, отходах цит|
русовых, сульфитных жидкостях, сахарной мелассе и сырной сь$
воротке. Изучена возможность использования такого экзотичен
кого растения, как иеруссалимский артишок (Helianthus tubero*
sus). Интерес к этому растению вызван тем, что у него хороша^
продуктивность (50 т клубней/ra) и высокая устойчивость к низ^
ким температурам. Очень высокое содержание (до 85%) сбражи^
ваемых углеводов (инулина и сахарозы) делает артишок отлич^
ным источником сахаров. Сок, экстрагируемый из клубней, утй
лизируется Р. polymyxa без какого бы то ни было предварителы
ного гидролиза. |
Химизм процесса. Путь синтеза 2,3-бутандиола (бутиленглико^
ля) на примере Aerobacter aerogenes выглядит следующим o6pa*j
зом:
он
глюкоза--СН-СОСООН------- СН-—С—С—СЬЦ
соон
а-ацетомолочная
кислота
со
сн3—CO—CHOH—сн3 + СО
ацетил метил карбинол
(ацетоин)
NAD
NADH,-
Снз—СНОН—снон—сн3
2,3-бутандиол
(бутилен гликоль)
NAD
NADH,
СН„—СО—СО—СН„
ди ацетил
Часть пирувата превращается в лактат, этанол, ацетат, фор-
миат, Н2, СО2, но основное количество конденсируется с образо*
ванием а-ацетолактата, который при декарбоксилировании дае1
ацетоин — предшественник
диола зависит от величины
6,3, то образуются уксусная
2,3-бутандиола. Образование бутан*
pH. Если значения pH среды выш<
и муравьиная кислоты, а образовав
168
пне ацетоина, 2,3-бутандиола, СО2 и прекращается. Если зна-
чение pH ниже 6,3, снова включается бутандиоловая система.
Получение 2,3-бутандиола
с помощью Вас. polymyxa
Кинетика процесса представлена на рис. 43. 2,3-Бутандиол на-
чинает синтезироваться с самого начала и с постоянной скоростью
и течение основной части процесса. Этанол образуется с меньшей
Время, часы
Рис. 43. Кинетика 2,3-бутандиолового- брожения (Вас. polymyxa'): 1 — био-
масса, 2 — 2,3-бутандиол, 3 — этанол, 4 — ацетон
скоростью и в небольшой степени в конце брожения утилизиру-
ется. Ацетоин поддерживается в низкой концентрации (несколько
г/л), пока уровень 2,3-бутандиола не достигнет максимума. Пос-
ле чего его уровень несколько повышается. В периодических ус-
копиях главным параметром, контролирующим процесс, выступа-
ет скорость снабжения клеток кислородом.
Кислород .необходим для дыхания и роста культуры и в мень-
шем количестве для синтеза бутандиола. Поэтому для производ-
ства последнего полезно запрограммированное изменение К^а.
Это было реализовано путем создания 3 аэрируемых уровней;
1) начальный аэробный метаболизм. Он поддерживает хоро-
ший уровень клеток и общую продуктивность процесса;
Кга=41 ч-1, длительность стадии 19 ч;
2) далее индуцирует бутандиоловый и ацетоиновый путь с
целью окисления субстрата до уровня конечного продукта
(бутандиола); Льа=21 ч-1, длительность стадии 23 ч;
3) контролируют все время синтез этанола и избегают пре-
169
F
вращения бутандиола в ацетоин в конце брожения.
снижено еще больше и поддерживается на уровне 8 ч~1,
длительность стадии — 55 ч. Эта последняя ступень бла-|
гоприятствует продолжению образования бутандиола при!
низких скоростях и задержке его конверсии в ацетоин. Бо-,
лее 94% сахара утилизируется в таком процессе. Макси-
мальная концентрация бутандиола 44,0 г/л при продуктов-!
ности 0,79 г/л-ч-1. Условия получения 2,3-бутандиола cl
помощью культуры В. polymyxa АТСС 12321 отображены в |
табл. 30. ’
Таблица 30
2,3 бутандиолозое брожение, осуществляемое Ваз. polymyxa при
оптимизации величины Къа
(по Pages et al. 1986)
Параметры
Концентрация
• Г
Начальная концентрация сахара
Время ферментации, ч
Максимальная концентрация 2,3-бутандиола, г/л
Ацетоин, г/л
Этанол, г/л
Продуктивность по 2,3-бутандиолу, г/л-ч
Выход 2,3-бутандиола, %
Потребление сахара, %
160
55
44,0
2,9
8,0
0,79
29,2
94,3
Усовершенствования в области биосинтеза бутандиола могут
проводиться на двух уровнях: генетическое усовершенствование
штамма с целью лучшей адаптации к субстрату и снижения ин-,
гибиторного действия продукта; оптимизация процесса на основе
непрерывного запрограммированного изменения Kia.
Bacillus subtilis как продуцент бутандиола и ацетоина. Вас. sub-
tills К (AJ 1992), как показано в 1987 г. в отделе химической ин-
женерии в Цюрихе, в зависимости от снабжения кислородом об-
разует ацетоин (ароматообразующее вещество) и бутандиол В’
широких пределах соотношений и в больших количествах. В ка?,
чалочных колбах в среде со 150 г/л сахарозы получают 60 г/л^
главным образом 2,3-бутандиола. В отсутствие сахара перед
споруляцией Вас. subtilis превращает бутандиол в ацетоин. Про-j
точное культивирование с целью получения бутандиола рекомен-1
дуют проводить при высокой концентрации субстрата, поддержи-'
вая клетки в состоянии, близком к споруляции. . j
Получение 2,3-бутандиола с помощью Klebsiella pneumonia^
NRCC. С использованием другого мощного продуцента 2,3-бутан-
диола Cl. pneumonia NRCC 3006 получили 82 г/л нейтральных
продуктов (2,3-бутандиола главным образом и ацетоина) при!
продуктивности 3,1 г/л-ч, т. е. в несколько раз выше, чем в преды-
дущем случае, видимо, за счет применения проточного метода.
1
170
культивирования в двустадийном хемостате с лимитом по О2.
брожение проводили в кислой среде (pH — 4,5—6,0). Если зна-
чение pH поднимали выше 6,0, то брожение превращалось в лак-
татно-ацетатное. Для максимального образования бутандиола,
требовалось чтобы скорость поглощения кислорода клетками
(Qo2 — моль О2/л-ч) находилась в отношении к скорости потреб-
ления глюкозы (моли глюкозы/л-ч) как 0,5—0,8. Условия обра-
зования бутандиола были оптимизированы так, что на первой
стадии они способствовали росту и образованию продукта (£>=
0,1 л/ч, pH 5,5, Кг^=400 л/ч или Qo =62 ммоля О2/л-ч)
Из первого ферментера культуру перекачивали во второй, в
котором создавали условия, оптимальные для продукции бутан-
диола: £> = 0,038 л/ч, pH 5,5, Лга=50 л/ч или Qo3 = Ю ммолей
(L/л-ч. Выходы продуктов в оптимизированных условиях пока-
заны выше. Cl. oxytoca может сбраживать гексозы и многие пен-
тозы.
Используя KI. pneumonia и кислотный гидролизат осины, по-
лучают 20 г/л 2,3-бутандиола, приближаясь к максимально воз-
можной эффективности биоконверсии — 0,5 г диола на 1 г ути-
лизированного сахара.
Получение 2,3-бутандиола с помощью иммобилизованных кле-
ток Enterobacter sp. Наряду с Klebsiella pneumonia Enterobac-
h'r sp. оказалась одна из лучших продуцентов. Бактерии были
выделены из вод целлюлозобумажного завода в Финляндии.
Максимальный выход 2,3-бутандиола на среде с ксилозой со’
свободными клетками в периодических условиях составлял 64%
от теоретического. Клетки, иммобилизованные в Са-альгинат, при
концентрации ксилозы 5% давали 12 г/дм3 2,3-бутандиола с вы-
ходом 48%. При проточном культивировании клетки, иммобили-
зованные в нейлоновые сетки, продуцировали тоже 12 г/дм3 2,3-бу-
гапдиола в течение 35 дней при внесении в среду СаСОз. Биока-
।.члизатор был стабильным. Возможность получать достаточно
высокие выходы 2,3-бутандиола при невысоких концентрациях
ксилозы (2—5%) позволяет считать этот метод пригодным для
промышленных целей.
Получение 2,3-бутандиола из целлюлозосодержащих материа-
лов. Получение 2,3-бутандиола из целлюлозы и гемицеллюлозы
древесины и сельскохозяйственных отходов имеет особый практи-
ческий интерес, поскольку речь идет об использовании возобнов-
ляемого сырья при одновременной очистке окружающей среды.
Исходный целлюлозосодержащий материал подвергали гидроли-
зу целлюлолитическими ферментами гриба Trichoderma harzianum
1 JxS, присутствующими в фильтрате культуральной жидкости. Но
якгивность целлобиазы и ксилобиазы гриба были очень низкими
вследствие ингибиторного действия на них моносахаров. Поэтому
Ьыл использован комбинированный энзиматический гидролиз и
ферментация, при которой моносахара утилизировались другим
организмом. Наиболее подходящим был такой, который мог бы
V । нлизировать целлобиозу и ксилобиозу непосредственно. Иде-
77/
альным организмом для этой цели оказалась Д7. pneumonia, КО’
торая может утилизировать глюкозу, целлобиозу, ксилозу, ксилоз
биозу, а также другие главные сахара гидролизата (арабинозу
галактозу, маннозу), ацетат и уроновые кислоты (глюкуроновук
и галактуроновую). KI. pneumonia, выращенная на ферментатив*
ном гидролизате древесины (исходная концентрация 5%), обра-
зовывала 11,1 —18,3 г бутандиола и этанола из 100 г негидроли-
зованного материала. Если использовать меньшую исходную кою
центрацию субстрата (2%), то можно увеличить выход продук-
тов до 23 г/100 г необработанной древесины. Таким образом, про-
веденные в 1986 г. исследования в Канадском отделе биотехно-
логии показали реальную возможность конверсии лигноцеллю
лозного материала в бутандиол и этанол.
Использование дрожжей для получения оптически чистого изо
мера 2,3-бутандиола. Дрожжи рода Candida растут на смеси трез
стереоизомеров 2,3-бутандиола и до 25% его превращают в аце
тонн. Поскольку в клетках дрожжей обнаружилась активная изо
цитратлиаза, считают, что бутандиол вначале превращался в аце
тонн, потом в Сг-фрагменты, которые ассимилировались в глиок
силатном цикле. Некоторые дрожжи, утилизирующие бутанди
ол, можно использовать для разделения стереоизомеров. Напри
мер, С. salmanticensis утилизирует только два из трех изомеро!
и один чистый изомер остается в среде.
В настоящее время считают биотехнологическое
получение
2,3-бутандиола в промышленности экономически возможным.
ГЛИЦЕРИН
Применение. Глицерин имеет многочисленные области приме-
нения. Он служит смазкой в пастах, клеях, целлофане, некоторых
сортах бумаги, конфетах, включается как ингредиент во многие
лекарства и косметические средства. Может служить экстраге-
ном. Его эфиры использовали в производстве взрывчатых веществ
во время первой мировой войны. И в период обеих войн глице-
рин производили микробиологическим путем. После войны глице-
рин делают путем сапонификации масел,
а
также синтезируют
из.
пропилена и пропана. Но ферментация глицерина имеет не толь-
ко практический, но и теоретический интерес, поскольку демон-
стрирует, как путем изменения условий культивирования можно,
изменить состав продуктов брожения. В настоящее время извест-
ны такие продуценты глицерина в природе, что его промышлен-;
ное получение биологическим путем может оказаться недалекой
реальностью. '
Продуценты. В качестве лучших продуцентов глицерина назы-
вают осмотолерантные дрожжи и такие штаммы, как Saccharo*
myces rouxii, Torulopsis magnolia и Pichia farinosa. Перспективен,
процесс с использованием водорослей Dunaliella salina.
Химизм процесса. Глицерин образуется в процессе спиртового^
172
брожения (рис. 44). В норме его количество ничтожно, но если
изменить ферментационный баланс, то выход глицерина можно
сильно увеличить. Так, если к спиртовому брожению, осуществ-
ляемому пекарскими дрожжами, добавить бисульфит
глюкоза
NAD'-*
Н-—с—он
2 1
н—с—он
I
Н2—с—он
nadh2
NaHSO^
О
н2—с—он
н—с—он
н2—с—он
глицерин
н2с—ОН
СН
Рис. 44. Биосинтез глицерина
Na(NaHSO3), то он образует комплекс с интермедиатом броже-
ния — ацетальдегидом и NADH2, образованный в начале глико-
лиза, восстанавливает уже не ацетальдегид, а другое вещество —
дигидроксиацетонфосфат до глицеринфосфата, который дефосфо-
рилируется с образованием глицерина. Выход глицерина при этом
не превышает 20—30% от сброженного сахара.
Известны две системы для получения глицерина путем ис-
пользования микробной ферментации: 1) в присутствии щелочи.
Штамм, который давал самый высокий выход глицерина в лак-
тозной среде при оптимальном значении pH 7,0 — Kluyveromyces
fragilis NRRL Y—665; 2) в присутствии сульфита рост штаммов
заметно снижается, но лактоза (глюкоза) превращается в глице-
рин при периодическом культивировании дрожжей. В случае при-
менения техники выпаривания выход глицерина можно увели-
173
чить. Получение глицерина микробиологическим, а не химическим
путем из производных нефти может быть оправдано в том случае,,
если используется дешевый возобновляемый субстрат. Такой суб-
страт представляет собой фильтрат сыворотки, полученный при
ультрафильтрации цельной сыворотки. Глицерин может быть по- *
лучен с помощью микроорганизмов четырьмя методами: 1) по
третьему типу ферментации, предложенному Нойбергом, при
котором в присутствии щелочи спиртовое брожение частично пе-
реключается на образование глицерина и уксусной кислоты;
2) по второму типу ферментации согласно Нойбергу, когда в сре-
ду вносится сульфит для образования комплекса с ацетальдеги-
дом— интермедиатом брожения, в результате образуется глице-
рин; 3) использование осмофильных дрожжей; 4) использование
галофильных водорослей.
Щелочной метод, В лактозной среде, содержащей 2,5 моля "
Na2COg, четыре штамма дрожжей С. pseudotropicalis IP 513 Д7ц-
yveromyces fragilis NRRL—Y665, К. fragilis NRRL Y—2415 и
К. fragilis CBS—397, .образовывали более 9% глицерина (среда
содержала 49 г/л лактозы). Снижение агР при добавлении NaCl
понижало выход глицерина и рост. Но если aw снижали путем
добавления сорбита, то выход глицерина возрастал у К. fragilis
NRRL Y—665. На глюкозе таким способом можно получить 26%
глицерина.
Сульфитный метод. Поскольку сульфит токсичен для дрожжей,,
в больших количествах его нельзя вносить в среду в начале бро-
жения. Поэтому сульфит вносят постепенно и так, чтобы в среде
постоянно присутствовала его свободная форма в количестве 4—
5 г/л. pH поддерживают на уровне 7,0 и t 30° С. Температура
поддерживается немного ниже оптимума для К. fragilis, посколь-
ку токсический эффект сульфита усиливается с повышением тем-
пературы. Чтобы накопить большую биомассу, клетки можно на-
растить еще до добавления сульфита (до начала брожения).
Чтобы снизить количество вносимого сульфита, через сре-
ду пропускают N2 для упаривания части образованного ацеталь-
дегида (выход глицерина 12,9%) или брожение ведут вообще под
вакуумом (выход—14%). В периодическом процессе с подкорм-
кой (обновлялось 80% среды) получают более 16% глицерина.
Выход глицерина на среде с глюкозой может достигать 21,1%.
Полное ингибирование роста Sacch. cerevisiae имеет место при
более высокой концентрации сульфита (40 г/л), чем у К. fragilis
(только 10—12 г/л).
Использование осмофильных дрожжей. Другой современный
способ предусматривает применение осмофильных дрожжей Pi-
chia farinosa (АТСС 20210), которые выращивают в щелочных ус-
ловиях, создаваемых добавлением карбоната натрия. Осмофиль-
1 Активность воды; aw определяют как отношение Р/Ро, где Р — давление па-
ра раствора, а Ро — давление пара дистиллированной воды.
ные дрожжи имеют то преимущество, что могут выдерживать
очень высокие концентрации глюкозы (30%) и, следовательно, да-
вать высокие концентрации продукта, что важно также для его
выделения. При начальном pH 8,2 и концентрации глюкозы 30%
эти дрожжи образуют 48% глицерина от утилизированной глюко-
зы. Ферментация завершается за 120 ч. Этанол образуется в сле-
довых количествах. Критическим фактором служит аэрация. Для
максимального выхода глицерина оптимально 40%-е насыщение
растворенным кислородом (эти исследования проводятся в Ин-
дии) .
Получение глицерина с помощью галофильных водорослей. По-
жалуй, один из наиболее интересных и перспективных способов
биологического получения глицерина связан с использованием
галофильной водоросли Dunaliella salina. Процесс был разрабо-
тан в последние годы в Израиле. Эта водоросль обитает обычно
в очень соленых озерах, лагунах, в соленых полях и синтезирует
глицерин как внутриклеточное вещество, балансирующее осмоти-
ческое давление, вызываемое высокой концентрацией соли снару-
жи. Чем выше концентрация соли, тем больше внутриклеточная
концентрация глицерина. (Достигает 40% от веса сухих водорос-
лей.) Но если неожиданно концентрация соли снаружи понизит-
ся, излишек глицерина выливается из водоросли.
При промышленном получении глицерина водоросли вначале
культивируют на свету в среде, содержащей высокую концентра-
цию соли, а когда рост завершен, клетки концентрируют. Липиды
и белки плазматической мембраны этих водорослей сильно ассо-
циированы при высокой концентрации солей, и это создает час-
тичную гидрофобность и ригидность внешнего слоя, что способ-
ствует высаливанию и концентрированию водорослей из разве-
денных растворов. Сконцентрированные водоросли помещают в
пресную воду. За короткий период глицерин вытекает, создается
('го достаточно высокая концентрация. Далее глицерин подвер-
гают очистке.
Эти водоросли содержат не только много глицерина, но и
[)-каротин.
Новые разработки по получению глицерина с.помощью иммо-
билизованных клеток. Клетки пекарских дрожжей, иммобилизо-
ванные в полиакриламидный гель и помещенные в колонный ре-
актор, давали стабильный выход глицерина в количестве 32 г/л
в присутствии высоких (7,5%) концентраций NasSOs1. Процесс
заканчивался за 24 ч. Исследователи из Мюнстеровского универ-
ситета ФРГ отмечают следующие преимущества иммобилизован-
ных клеток перед свободными: полиакриламидные шарики с клет-
ками дрожжей сохраняли стабильность в условиях высоких ион-
ных концентраций; титр клеток, вырастающих из геля, был по-
Иммобилизованные в ПАА Г клетки проявляли высокую стабильность в при-
сутствии MgSOs. Но чистый MgSO3 довольно дорог-
175
нижен; время ферментации снижено по сравнению со свободны-
ми клетками; имелась возможность повторного использования
клеток, заключенных в геле полиакриламида, что необходимо для
создания проточной системы.
ДИГИДРОКСИАЦЁТОН
В промышленности увеличивается получение дигидроксиацето.-
на путем микробной трансформации глицерина. Дигидроксиацетой;
используют в дублении кож, косметике.
Некоторые штаммы Acetobacter превращают 10%-й раствор,
глицерина в дигидроксиацетон при 25° С в среде, содержащей;)
0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% КН2РО4, 2% СаС12, за 72~
96 ч. Промышленный процесс с Ac. suboxydans происходит при!
контролируемом pH — 6,0, чтобы предотвратить дальнейшее мик*<
робиологическое превращение продукта. Другой штамм — Glu-
conobacter melanogenes IFO 3293 — превращает 10%-й раствор,
глицерина в дигидроксиацетон за 33 ч в условиях хорошей аэра-
ции, Выход продукта составляет 35,8 г/г клеток (без аэрации —
12,2 г/г клеток). Осуществлен проточный процесс указанной
трансформации в колонном реакторе с пропусканием пузырьков
воздуха с помощью иммобилизованных в ПААГ клеток GL оху-
dans subsp. suboxydans. Оптимальные условия процесса: концент-
рация глицерина — 6%, pH 6,0, 30° С. При разработке проточно-
го процесса с использованием свободных клеток (Ac. suboxydans)
рекомендовано их отделение путем электроудерживания на силип
кагеле при температуре 28—30°С, напряжении 90—200 В с по-’
следующим смывом клеток свежей питательной средой и возвра-
том образующейся суспензии в реакционный аппарат.
ЛИТЕРАТУРА
Bisping В., Rehm Н. J. Production of glycerol by immobilized yeast cells//
//Proc. 3d Eur. Congr. on Biotechnol. Munchen, 1984. Vol. П. P. 125.
R a p i n J. D. e. a. A. study of possibilities to produce glycerol from whey//
//Proc. 4th Eur. Congr. on Biotechnol. Amsterdam, 1987. Vol, И. P. 136."
Vijaikishore P. a. Karanth N. G. Glycerol production by fermentation
with Pichia farinosa//Proc. 3d Eur. Congr. on Biotechnol, Mimchen. 1984.
Vol. II. P. 95.
ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ЭПОКСИДЫ
И ГИДРОКСИЛИРОВАННЫЕ АРОМАТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ
ЭПОКСИДЫ
О микробном эпоксидировании впервые было сообщено в
1963 г., а в 1973 г. обнаружили, что процесс эпоксидирования про-
текает стереоспецифично. Особый интерес привлекало тогда эпо-
ксидирование пропилена, поскольку химическая промышленность-
сильно нуждалась в пропиленоксиде. В настоящее время микроб-
ное эпоксидирование изучают на большом числе соединений, и
прежде всего таких, эпоксидирование которых трудно осущест-
вить традиционными методами органической химии. Эпоксид —
это циклический простой эфир.
Применение. Оптически активные эпоксиды — эфиры арил-
глицйдила — важные интермедиаты в органическом синтезе. Для
фармацевтических и агрохимических целей требуются теперь оп-
тически активные эпоксиды. Абсолютная конфигурация большей
части арилглицидиловых эфиров, образуемых Nocardia cor alii-
/ш, — это фармакологически активная S-конфигурация.
В продаже имеются 12 видов 1,2-эпоксиалканов (С/—С1б), по-
лучаемых с помощью N. corallina. Эти эпоксиды используют как
хиральную часть ферроэлектрических жидких кристаллов, кото-
рые настоящее время находятся в стадии разработок. Хираль-
ную часть жидких кристаллов получают из природных веществ.
Производство хиральных частей, получаемых из аминокислот,
ограничено источником получения. Вместе с тем асимметричное
эпоксидирование, осуществляемое микроорганизмами, обеспечива-
ет промышленность различными типами хиральных интермедиа-
тов.4’
Трансформаторы. Микроорганизмы, образующие эпоксиды из
олефинов, представлены в табл. 31. Микроорганизмы с № 1 по
№ 5 растут на средах с н-парафинами со средней длиной цепи
(С6—С17) и/или а-олефинами. А4икроорганизмы с № 6—11 утили-
зируют газообразные парафины (пропан, бутан). Все пропанас-
гимилирующие организмы обладают эпоксидирующей активно-
стью. Микроорганизмы с № 12—14 — ассимилируют метан и все
осуществляют эпоксидирование. Nocardia corallina В-276 и Nit-
rosomonas еигораеа ассимилируют газообразные олефины. Из них:
N. corallina В-276 используется в промышленности для производ-
ства оптически активных эпоксидов.
Все микроорганизмы, перечисленные в табл. 31 (кроме N. еи-
гораеа), ассимилируют углеводороды и содержат монооксигеназы
177
углеводородов, которые катализируют эпоксидирование послед-
них.
Биоконверсия. У Ps. olevorans содержится <о-гидроксилаза жир-
ных кислот (монооксигеназы), катализирующая эпоксидирование.
У метанотрофов Methylococcus capsulatus (Bath.), Methylosinus
Irichosporium (ОВЗЬ) и Methylobacterium organophilum CRL-26
Таблица 31
Продуценты эпоксидов
(no luruhashi, 1986)
№ Микроорганизм
Субстраты
№ Микроорганизм
Субстраты
1. Pseudomonas aery-
10. Nocardia neopaca
ginosa
2. Ps. oleovorans
Ce—C12, аллii-
бензолы
11. Ps. fluorescens
12. Methylococcus cap-
sulatus (Bath.)
.3. Corynebacterium
sp. 7E 1C
4. C. equi
5. Candida lipolytica
6. Arthrobacter sim-
plex
,7. Brevibacterium fus-
cum
S. Alcaligenes eutrop-
hus
9. Mycobacterium al-
bum
13. Methylosinus tric-
hosporium (OB3b)
14. Methylobacterium
organophilum
CRL—26
15. Mycobacterium
E20
16. Nocardia corallina
B—276
17. Nitrosomonas euro-
paea
C2—C4, стирен
C2-C4
в эпоксидировании принимает участие монооксигеназа метана/
У уникальной бактерии N, еигораеа в реакции эпоксидирования
участвует монооксигеназа аммония. Важно, что эпоксиды, обра-^
зованные бактериями, ассимилирующими метан или пропан, не:
подвергаются дальнейшей деградации. Для микроорганизмов, <
утилизирующих газообразные олефины, эпоксиды служат ключе-
выми промежуточными веществами в метаболизме олефинов. По-1
этому эти микроорганизмы разлагают эпоксиды в условиях pocv
та и требуются специальные условия для аккумуляции послед->
них. Особенности оксигеназ состоят в их способности с высокой
эффективностью и специфичностью включать О2 прямо в орга-(
нический субстрат; проведение прямого окисления неактивирован->
ного органического субстрата недоступно для химика-синтетика.
Поскольку оксигеназы нестабильны, процессы окисления осуще-
ствляют с помощью целостных организмов. ,
Кофакторами монооксигеназ, эпоксидирующих олефины, слу-
жит восстановленная форма NADH или NADPH. Конечно, требу-,
ется кислород. Необходима регенерация кофакторов, которая про-
исходит при деградации части субстрата (длинноцепочечных;
178
u-олефинов или газообразных олефинов) до СОг и Н2О. Пример»
реакции эпоксидирования приведен ниже:
Pseudomonas
oleovorans
1,7-октадиен
i
ч'г
7,8-эпокси-1-октен
Для метанотрофных бактерий, неиспользующих олефины, в среду
вносят косубстраты (метанол, формальдегид или муравьиную-
кислоту). Даже в предыдущем случае добавление к среде иного
источника углерода, кроме олефинов, увеличивает эффективность,
процесса. Микроорганизмам свойственна довольно строгая суб-
стратная специфичность. Исключение составляет N. corrallinar
способная проводить эпоксидирование широкого круга веществ.
Эти бактерии при росте на алкенах образуют соответствующие
1,2-эпоксиалканы и в оптимальных условиях накапливаются до
ВО г/л 1,2-эпокситетрадекана. Оптическая чистота эпоксидов варь-
ирует в зависимости от применяемого микроба и олефинового
субстрата, используемого в реакции. Единственный пример
100%-й оптической чистоты эпоксида представляет R= 1,2-эпо-
ксигексадекан, образуемый С. equi. В остальных случаях степень
оптической чистоты варьирует (табл. 32). Поэтому стоит задача
повышения оптической чистоты эпоксидов, а также увеличения
Таблица 32
Оптически активные эпоксиды, образуемые микроорганизмами
[(по Juruhashi, 1986)
Микроорганизм Эпоксиды Абсолют- ная конфи- гурация Оптичес- кая чис- тота, %
/ ^letulomonas 7,8-эпокси-1 -октан R 84
ulcouorans 1,2-эпокси-октан R 70
1.2-эпокси-декан R 60
I'ori'piebacterium iplli. 1,2-эпокси-гексадекан R 100
Ill гамм E 1,2-эпоксипропан R 86
1,2-эпоксибутан R 70
эпихлоргидрин R 92
крута субстратов для эпоксидирования. Использование микроор-
ганизмов для проведения асимметричного эпоксидирования име-
ет большие перспективы.
Новые разработки и усовершенствования. Биологическое эпо-
ксидирование может иметь преимущества перед химическими
процессами при производстве хиральных эпоксидов, а также в.
связи с тем, что образование эпоксида биокаталитической систе-
мой возможно в течение длительного периода времени.
179
У
Бактерии, утилизирующие углеводороды, часто содержат мо-
шооксигеназы с широкой субстратной специфичностью, и нераз- 1
множающиеся клетки могут эпоксидировать алкены, непригодные I
для роста. I
Главная проблема при создании приемлемого для промыш* I
..ленности процесса синтеза хиральных эпоксиалканов — быстрое I
снижение эпоксидирующей активности покоящейся суспензии кле- 1
ток, выращенных в среде с углеводородами. Эта проблема свя- I
/зана с потреблением NAD(P)H в монооксигеназной реакции и с я
нестабильностью фермента. I
Для регенерации кофактора предлагают использовать мета» I
Фолизируемые субстраты. При этом образование эпоксидов отмы- I
той суспензией клеток увеличивается. I
Стабильность фермента достигали при кометаболизме алкенов I
иммобилизованными клетками, растущими на селективных спир- I
тах. С помощью Nocardia, 1РЬ растущей на 2-пропаноле, в хе- I
мостате получали хиральный 1,2-эпоксипропан из пропена. Таким I
«образом возможно получение эпоксиалканов в непрерывном ре* .1
жиме. Только алкенутилизирующие бактерии пригодны для полу- I
^чения хиральных эпоксиалканов. я
ГИДРОКСИЛИРОВАННЫЕ
АРОМАТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ
Многие гидроксилированные ароматические соединения пред».,
вставляют большой интерес для фармацевтической и нефтехимии
ческой промышленности, но химических реакций для непосредст*
венного гидроксилирования ароматических соединений в большом!
масштабе нет. Прямой химический синтез очень труден, а непряч
мой синтез дорог и связан с трудоемкой серией реакций. Поэтов
му биосинтез указанных соединений представляет большой интеч
рес. Свободные и иммобилизованные клетки Klebsiella oxytoca ц
присутствии 2,2-дипиридила (ингибитора диоксигеназ) осущестч
вляют гидроксилирование 4-гидроксифенилуксусной кислота
(4НРА) с образованием 3,4-дигидрокси-фенилуксусной кислоты]
Два организма Xanthobacter 124Х и Flavobacterium sp. превра!
щает 4НРА (тоже в присутствии ингибитора диоксигеназ) з|
2,5-дигидроксифенилацетат (гомогентизат). D-энантиомер 4-гид|
роксифенилглицина служит интермедиатом в производстве полу»
синтетических пенициллинов и цефалоспоринов в промышленно»
сти. С помощью бактериальных ферментов (не клеток) разрабо!
тан метод прямого регио- и стереоспецифического гидроксилира!
вания фенилглицина в D-4-гидроксифенилглицин.
Недавно в Голландии разработан микробиологический способ
получения гидроксибензонатов из галобензоатов при участии миК^
робных гидролитических дегалогеназ. Ферменты обнаружены 1
Alcaligenes deniirificans и у Arthrobacter sp.
ft
180
Дегалогеназа Alcaligenes sp. работает при контролируемой
и низкой (3 мкмоля) концентрации растворенного О2. Выход про-
дукта 70%. В анаэробных условиях функционирование фермента
возможно только в присутствии нитратов. Полагают, что О2 и
нитраты нужны как конечные акцепторы электронов при дыхании
клеток для получения энергии, ибо для работы самой дегалогена-
зы кислород не требуется.
С помощью микроскопических грибов Beauveria basslana, Cur-
vularia lunata и C. geniculata осуществлено гидроксилирование
моно- и диметил пиридинов в соответствующие гидроксиметил пи-
ридины. Положение метильной группы не оказывало влияния на
активность фермента. Реакцию осуществляют как целые клетки
грибов, так и их бесклеточные экстракты. Окисление катализиру-
ют конституитивные оксидоредуктазы с широкой субстратной
специфичностью.
В случае диметил пиридина гидроксилированию подвергалась
только одна СН3-группа с 80—90%-м выходом конечного продук-
та. После модификации гидроксиметильной группы гидроксилиро-
ванию подвергается и вторая СН3-группа, в результате чего полу-
чают дигидроксиметилпроизводные пиридинов — предшественни-
ков в синтезе лекарственных препаратов.
Применение микробиологического способа получения 2fi-6uc-
(оксиметил)пиридина дает такой же выход продукта, что и хи-
мический синтез. Соединение используют в синтезе краунэфиров.
Оно служит ключевым полупродуктом в синтезе лекарственного
препарата «Пармидин» (антисклеротического средства). Получен-
ный при одностадийном микробиологическом способе З-метил-5-
оксиметилпиридин применяется в качестве лекарственного препа-
рата «Роникол», регулирующего липидный обмен в организме че-
ловека. Некоторые гидроксилированные производные фенилуксус-
ной кислоты используют как строительные блоки в синтезе полу-
синтетических антибиотиков, болеутоляющих средств и ингибито-
ров воспаления.
ЛИТЕРАТУРА
Кост А. Н., Воробьева Л. И. и др. Микробиологическая трансформация
2,6-диметилпиридина//Прикл. биох. микр., 1977. XIII, вып. 5. С. 696—703.
Biotechnology. Vol. 6А. 1984/ed. К. Kieslich. Verlag—Chemie.
Dovgilevich E. V., Vor ob j eva L. I. Hydroxilation of some pyridine ba-
ses by microscopic fungi//Proceed. 4th Eur. Congress on bioth. 1987. Vol. 2
P. 285.
Oroenewegen P. E. J., van den Tweel. Bioformation of 4-hydroxyben-
zoate from 4-halobenzoates by Alcaligenes denitrificans NTB—IJ/Proceed.
4th Eur. Congress on bioth. 1987. Vol. 3. P. 464.
Van den Twell W. I. I., Smith J. P. Biosyntesis of hydroxylated aromatic
compounds//Proceed. 4th Eur. Congress on bioth. 1987. Vol. 2. P. 172.
ГЛАВА VII
ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА
Поверхностно-активные вещества (ПАВы) — это амфипати-
ческие молекулы с полярными и гидрофобными участками. Такие
молекулы имеют тенденцию связываться друг с другом (образо-
вывать мицеллы) или с поверхностями фаз, имеющими различ-
ную полярность (например, воздух/вода,' нефть/вода или во-
да/твердая поверхность). Роль ПАВов в таких взаимодействиях
сводится к снижению поверхностного натяжения. Так, например,
поверхностное натяжение на границе фаз воздух/вода (для ди-
стиллированной воды) —72 мНм-1 (или динььсм^1), а межфаз-
ное натяжение вода/гексадекан —40 мНм”1. Синтетические, или
микробные, ПАВы снижают эти величины соответственно до 30—•
40 и 1 мНм4.
Эмульсификация и деэмульсификация. Эмульсификация полу-
чается при диспергировании одной жидкой фазы в виде микро-
скопических капелек в другой непрерывной фазе: например, во-
да в масле или масло в воде. Добавление эмульгаторов стабили-
зирует эмульсии и их активность определяют по времени рассло-
ения фаз. Деэмульсификационные свойства оценивают по влия-
нию микробных препаратов на стандартную эмульсию, приготов-
ленную с синтетическим ПАВом (тоже оценивают время рассло-
ения).
Применение. Микробные биоПАВы могут быть использованы
в качестве эмульгаторов и деэмульгаторов. Главное применение
биоПАВов микробного происхождения связано с нефтедобычей.
Они снижают межповерхностное натяжение, вязкость, увеличива-
ют подвижность нефти и облегчают ее добычу. Использование
биоПАВов позволяет добывать нефть из скважин, которые отне-
сены к исчерпанным, при условии выделения нефти традиционны-
ми методами. За счет применения чистых культур микроорганиз-
мов натяжение уменьшается только от 50 до 10 мНмг1, а для ус-
пешной добычи нефти необходимо по меньшей мере 102 мНм“1.
Необходимую величину межповерхностного натяжения можно до-
стичь с помощью подобранной смеси биоПАВов в присутствии
электролитов. ПАВы используют в различных отраслях промыш-
ленности, научных исследованиях, в домашней работе. В связи
с выделением микробных ПАВов с различными и специфически-
ми свойствами их применение может быть расширено. В настоя-
щее время ни один из микробных ПАВов не получают в про-
мышленности, но некоторые (главным образом для добычи неф-
ти) производят в пилотных установках. Невысокие выходы и от-
носительно высокая стоимость продукции по сравнению с ПАВа-
182
ми, получаемыми из производных нефти, задерживают масшта-
бирование. По мере более детального изучения уникальных
свойств микробных ПАВов положение может измениться, поэто-
му условия образования и специфические свойства микробных
ПАВов продолжают интенсивно изучаться.
Преимущества микробных ПАВов перед синтетическими. Эти
преимущества связаны с лучшей деградабельностью (что исклю-
чает загрязнение окружающей среды), иногда меньшей чувстви-
тельностью к экстремальным температурам, pH или солености.
Таблица 33
Главные типы хорошо охарактеризованных поверхностно-активных
веществ микроорганизмов
(по Parkinson, 1985)
Гликолипид
Структура
Организм-
продуцент
Трегалозо-димиколаты
(,, корд-фактор “)
Трегалозо-дикорино-
миколаты
Рамяолипиды
Софорозные липиды
Другие
Эмульсан
Сурфактин
трегалоза ацилирована в положении
С—6,6х, связана с 1-алкил-2-ОН-кис-
лотами
как у предыдущего, но с более корот-
кими алкильными цепями (С28—Сз8)
рамноза или дирамноза, как гликозид с
p-гидроксидекановой кислотой или
димер
софороза, связанная с 17-гидрокси-С18-
киелотой
большой полимер с белком, полисахари-
дами и жирными эфирами
циклические липопептиды с липофиль-
ными и гидрофильными компонента-
ми
Mycobacterium
Nocardia
Rhodococcus
Gorynebacteria
Pseudomonas
sp.
Т oral op sis
Acinetobacter
calcoaceticus
Bacillus
subtilis
Если микробные эмульсификаторы (или деэмульсификаторы) по-
лучают, используя возобновляемые субстраты, а не нефтехимиче-
ское сырье, то появляется еще и экономическое преимущество.
Типы микробных ПАВов. Поверхностно-активные соединения
служат основными компонентами клеточных мембран и потому
широко распространены в природе. Существует мнение, что сама
клеточная поверхность микроорганизмов обладает свойствами
ПАВов. Наиболее распространенные у микробов вещества с по-
верхностно-активными свойствами — это гликолипиды. Но спектр
химических типов ПАВов очень широк (табл. 33) и включает пеп-
тиды, жирные кислоты и фосфолипиды. Из гликолипидов лучше
всего изучены факторы микобактерий. Они представлены липи-
дами, содержащими трегалозу, связанную с цепью «-разветвлен-
ных (p-гидроксикарбоновых) кислот, известных как миколовые:
= СНОН = CHRZ—СО2Н. Трегалозодимиколаты обладают не
183
только свойствами ПАВов, но и иммуностимуляторов. Они могут
иметь значение и для патогенности различных микобактерий.
Миколовые кислоты обнаружены у некоторых актиномицетов
у микобактерий, в роде Nocardia, Corynebacterium (Rhodococcus),
Arthrobacter и Brevibacterium. Число атомов углерода в цепи и
степень ненасыщенности специфична для различных групп бак-
терий. Трегалозодикориномиколаты связаны с клетками. Напро-
тив, трегалозные липиды, образуемые Rh. erythropolis в условиях
лимитированного роста, на 70% представлены внеклеточными ве-
ществами. Эти экскретируемые липиды представляют собой кис-
лые тетраэфиры трегалозы, главный компонент которых этери-
фицирован в положении 2, 3, 4 и 2' одним сукциноилом, одним?
октаноилом и двумя деканоильными остатками.
Другой тип гликолипидов — рамнолипиды — выделены из не-
скольких штаммов Ps. aeruginosas. В рамнолипиде 1 или 2 мо-
лекулы рамнозы связаны с одной или двумя молекулами fl-гид-
роксидекановой кислоты. Виды дрожжей Torulopsis образуют
гликолипиды, в которых дисахарид софороза связана с Cie—С19
жирными кислотами. Ustilago maydis образует внеклеточные цел-
лобиозо-липиды.
Пептиды и полимеры. Acinetobacter t образует внеклеточный
биоэмульгатор — эмульсан — это гетерополисахарид и состоит из*
D-галактозамина и неидентифицированной аминоуроновой кис-
лоты с небольшим количеством D-глюкозы и неидентифицирован-
ным эфиром жирной кислоты. Образование и экскреция био-
эмульгатора клетками Acinetobacter calcoaceticu's Е 13114, рас-
тущими на среде с ацетатом, повышаются при добавлении глю-
козы, которая не утилизируется клетками, но активирует их.
Дрожжи Candida petrophillium, утилизирующие углеводороды,
выделяют пептидный полимер со свойствами эмульгатора. Cory-
nebacterium hydrocarboclastus и С. lipolytica образует внеклеточ-
ный полимер с поверхностно-активными свойствами. Препараты
представлены сложной смесью, содержащей липид, белок и уг-
левод.
Сурфактин. Это вещество, образуемое Вас. subtilis, обладает
самыми высокими поверхностно-активными свойствами и, кроме-
того, проявляет еще литическое действие на биологические систе-
мы. Сурфактин представлен липопептидом. Ничтожное содержа-
ние сурфактина (0,005%) снижает поверхностное натяжение
0,1 молярного раствора NaHCO3 в гораздо большей степени, чем
синтетический ПАВ-лаурилсульфат в той же концентрации.
Жирные кислоты. Nocardia erithropolis, выращенная на среде
с н-алканами, образует моноглицерид, представляющий собой
эфир спирта и трех жирных кислот. Corynebacterium lepus обра-
зует свободные кориномиколовые кислоты, определяющие поверх-
ностно-активные свойства этих бактерий. Отличными поверхност-
но-активными свойствами обладают разветвленные кориномико-
ловые кислоты, намного превосходящие в этом отношении более
простые карбоновые кислоты с тем же числом атомов С. Высо-
184
кую активность кориномиколовых кислот связывают с функциями
их р-гидроксильных групп. БиоПАВы (эмульгаторы) можно полу-
чать ферментативным путем. Недавно из Pen, ciclopium выдели-
ли фермент, который катализирует синтез моноглицеридов из
глицерина и ненасыщенных жирных кислот. Фермент действует
как обратимая глицеридгидролаза.
Получение микробных ПАВов и их роль
в жизнедеятельности микроорганизмов
Роль углеводородов. Большая часть микроорганизмов образует
ПАВы в ответ на присутствие углеводородов в среде. Например,
среда с углеводородами, на которой выращивали Cor. lepus, про-
являет поверхностное и межповерхностное натяжение 30—
32 мНм"1 и 1—3 мНм-\ а если культуру выращивали в среде с
глюкозой, то эти величины гораздо выше: 55 мНм-1 и 10 мНм”1
соответственно. Но при выращивании в глюкозной среде ПАВ на-
ходился в клетках и выделялся из них при добавлении углеводо-
рода и клеточной суспензии в дистиллированной воде. Биоповерх-
ностные вещества, по-видимому, участвуют в транспорте углево-
дородов в клетку. Для некоторых культур они служат ростовыми
стимуляторами и добавление ПАВов к среде может привести к
заметному увеличению скорости роста (наблюдается у клеток,
растущих с углеводородами).
У Candida lipolyticci добавление ПАВов вызывало увеличение
скорости дыхания дрожжей, которое зависит от концентрации уг-
леводорода в среде. Биоэмульгаторы могут иметь значение в ад-
гезии клеток к углеводороду. Мутанты Acinetobacter calcoaceticus,
утерявшие способность прикрепляться к каплям углеводорода,
не были способны к росту в углеводородной среде и приобретали
эту способность при внесении «сверхколичеств» биоэмульгаторов.
Как ранее отмечалось, некоторые биоПАВы входят в состав
мембран клеток, они играют важную структурную роль, нахо-
дясь в составе клеточных стенок актиномицетов, и при росте в
углеводородной среде отмечают нарушение структурной целост-
ности. Вероятно, в процессе роста биоПАВы экстрагируются из
клеток углеводородами среды, что стимулирует микроорганизмы
к дальнейшей продукции биоПАВов в ответ на утерю важных
клеточных компонентов. Но следует заметить, что не для всех
микроорганизмов присутствие углеводородов обязательно для об-
разования биоПАВов. Более того, у Bacillus sp., например, до-
бавление. углеводородов к среде ингибирует продукцию .биоПА-
Вов, для синтеза которых требуется другой индуктор.
Тип углеводорода оказывает влияние на образование био-
ПАВов. Например, Cor. hydrocarboclastus предпочитает линейные
углеводороды — Ci2—Си, а для продукции биоПАВов Rhodococ-
cus erythropolis лучше использовать углеводороды с длиной цепи
С]2—Cis- У Acinetobacter наибольшее количество эмульгаторов
185
получают на среде с углеводородами, содержащими циклические
и алифатические компоненты.
Влияние других источников углерода. Если Arthrobacter, Nocar-
dia, Corynebacterium и другие организмы, образующие трегалозо-
липиды, выращивать в сахарозной среде, то трегалоза замещает-
ся сахарозным компонентом. Напротив, у Torulopsis bombicola
сахарное и липидное ядро сохраняет постоянный состав незави-
симо от природы источника углерода в среде. Дисахариды, свя-
занные с одной жирной кислотой, более эффективны, чем диса-
хариды, связанные с двумя жирными кислотами, или моносаха-
риды с одной жирной кислотой. Для Arhrobacter природа источ-
ника углерода в среде определяет, будет ли биоПАВ выделяться
из клеток или он останется внутриклеточным. При росте на среде-
с этанолом или ацетатом 75% биоПАВов — внеклеточные, на уг-
леводородной среде — все биоПАВы внеклеточные.
Источник азота. Ps. aeruginosa предпочитает азот в виде нит-
рата. Наибольший выход биоПАВа имеет место при отношении
С : N— 18. Высокое отношение С : N благоприятствует синтезу
гликолипидов бактериями Ps. sp. и Rhodococcus erythropolis. Вы-
ход гликолипида последней культурой увеличивается при ограни-
чении количества всех поливалентных ионов металлов, например
при добавлении ЕДТА к среде.
Другие условия. У некоторых микроорганизмов образование
биоПАВов связано с ростом клеток, и возраст культур может
иметь существенное значение. Увеличение выхода биоПАВов у
Вас. subtilis и Ps. sp. происходит при непрерывном удалении про-
дукта. Клетки Ps. sp. иммобилизовали в альгинате Са и культи-
вировали при непрерывном удалении биоПАВа путем рециркуля-
ции среды через адсорбционную колонну.
Итак, микробные поверхностно-активные вещества относятся
к специфическим биологическим продуктам, биотехнологическое
получение которых в будущем будет расширено и поэтому необ-
ходимы дальнейшие исследования по оптимизации условий куль-
тивирования и усовершенствование штаммов продуцентов.
Новые разработки.
Скрининг продуцентов
В ФРГ проводили скрининг бактерий с гидрофобной поверх-
ностью. С гидрофобных поверхностей листьев и иголок листвен-
ницы были выделены 126 штаммов. Из 60 испытанных бактерий
80% были гидрофобными. Из 126 испытанных супернатантов
50% содержали эмульгаторы. Эмульгаторы относились к одной
из двух химических групп: липопептидам или полимерным соеди-
нениям. Липопептиды, итурин и сурфактин, синтезировали бацил-
лы, а вискозин — псевдомонады. Полимеры были представлены
гомо- и гетерополисахаридами. Считают, что такого рода скрининг
служит лучшей стратегией для выделения биоПАВов.
186
Использование иммобилизованных клеток
Pseudomonas sp. DSM 2874, как и другие псевдомонады, об-
разует внеклеточный рамнолипид (рл) с хорошими эмульсифи-
пирующими свойствами и в большом количестве в условиях ли-
митированного роста. Наиболее высокую продуктивность (20 мг
рл/г сухих клеток) имеют клетки стационарной фазы, лимити-
рованные по азоту. Для продукционной фазы наиболее благопри-
ятными субстратами служат н-алканы и глицерин. При исполь-
зовании иммобилизованных покоящихся клеток подходит только
глицерин, если применяют гидрофильный альгинатный матрикс.
Скорость образования рамнолипида таким биокатализатором
можно увеличить в 10 раз, если клетки выращивать в среде с
глицерином и сконцентрировать их у поверхности альгинатных
шариков, что облегчает процессы диффузии.
Концентрирование клеток у поверхности альгинатных гранул
достигали путем проведения ростовой фазы клеток, заключен-
ных в гранулы. Продуктивность таких клеток составляет 80% от
свободных. Ее можно еще больше увеличить, если периодически
осуществлять реинкубацию биокатализатора в питательной сре-
де, лимитированной по азоту.
ЛИТЕРАТУРА
The role of microbiology in enhanced oil recovery «BMR 82»: Tearb. Bur. Miner.
Resour. Ged. and Geophys Canberra. Canberra, 1983. P. 42—45.
Asselineau C., Asselineau J. Trehalose — containing glycolipids//Progr.
Chem. Fats a. other lipids. 1978. Vol. 16. P. 59—99.
Cairns W. L., Cooper D. G., Kosaric N. Bacteria-induced deemulsifica-
tion in microbial enhanced oil recovery//Penn. Well, books. 1983. P. 106-
113.
Cooper D., Pad dock D. Surface active compounds from microorganisms//
//Adv. Appl. Microbiol. 1980. Vol. 26. P. 229—253.
Emulsifiants par voie enzymatique//Biofutur. 1986. N 43. P. 12.
Muller R. et al. Verfahren zur Produktion von bioemulgatoren. Пат. ГДР
240389 Al. 1986.
ГЛАВА VIII
ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ
Органические кислоты используют в пищевой промышленно-
сти, в технике, иногда в медицине и как химическое сырье.
Все кислоты ЦТК можно получать микробиологическим путем1
в высоких количествах. Одни кислоты прямо возникают из цик-
ла, например лимонная, другие получают косвенным путем, на-
пример итаконовую. Известны кислоты, которые непосредствен-
но получают из глюкозы, например глюконовую, или как конеч-
ные продукты метаболизма глюкозы из пирувата или этанола^
например молочную и уксусную.
Лимонную кислоту в промышленности целиком получают пу-
тем ферментации, что касается других органических кислот, то
обычно существует жесткая конкуренция между микробиологи-
ческими и химическими процессами. Например, для получения
молочной и уксусной кислот одновременно работают два метода,
Таблица34
Получение органических кислот в производственных условиях
(по Crueger, Crueger, 1984)
Кислота Продуцент Промыш- ленное производ- ство ’ I Субстрат Процесс Выход, % Использование
Фумаровая Rhizopus sp. есть глюкоза 3 ДНЯ, 33° 65 изготовле- ние смол
Пропионовая пропионово- кислые бак- терии » лактоза, глюкоза, крахмал 8—12 дней, 30° 60 добавка в духи, фун- гицид
Яблочная Leuconostoc brevis нет фумаровая кислота, н-алканы 24 ч 99 пища
сс-кетсглута- ровая Candida Aerob act er н-алканы, глутаминовая кислота 40 ч 46
5-кетоглю- коновая Acetobacter есть глюкоза 5—6 дней 85° L -винна я кислота
2-кетоглюко - новая Serratia mar ce sc ens » » 16 дней 95-100° и зо-аскорби- новая кис- Хяота .Jj
лмащАШшажняянш'. - wraaL'a а t.
для других кислот — а-кетоглутаровой, яблочной — разработаны
ферментативные процессы, которых в промышленном масштабе
еще нет по той причине, что нет достаточного числа потребите-
лей на эти кислоты либо метод в экономическом отношении еще
188
слаб. В табл. 34 представлены главные органические кислоты иг
способы их производства (если есть) в мире. В настоящее время
и промышленном масштабе и на пилотных установках с помощью'
микроорганизмов производят 18 видов органических кислот с.
максимальным выходом от 35% (изолимонная) до 100% (гал-
ловая).
ЛИМОННАЯ КИСЛОТА
Лимонная кислота (СН2СООНСОНСООНСН2СООН) впервые
была выделена из сока лимона и перекристаллизована Шееле.
В лимонах содержится 7—9% этой кислоты; в Италии и Испании
до сих пор ее получают из лимонов, но на 99% ее продукция ос-
нована на микробиологическом синтезе. Вемер (1893) впервые
указал на лимонную кислоту как метаболический продукт плес-
невых грибов родов Penicillium и Мисог. В настоящее время
большую часть лимонной кислоты получают при ферментации
грибов. Из всех органических кислот по объему производства ли-
монная кислота занимает первое место в мире — 350 тыс. т/год.
Применение. Большая часть лимонной кислоты ( — 70%) ис-
пользуется в пищевой промышленности и в производстве напит-
ков, около 12% в фармацевтической промышленности и около
18%—для технических целей: как антивспениватель, при обра-
ботке текстиля, в производстве чистых металлов, детергентов
(где она может заменить полифосфаты, поскольку в ряде мест
их использование запрещено), для поглощения SO2 в дымовом
газе заводов. Использование лимонной кислоты в пищевой про-
мышленности и в производстве напитков как подкислителя обус-
ловлено ее хорошей растворимостью, чрезвычайно низкой ток-
сичностью и приятным кислым вкусом.
Растущая потребность в лимонной кислоте требует значитель-
ного увеличения ее производства, поиска активных штаммов и
разработок новых более эффективных способов. В СССР выпус-
кают около 25 тыс. т/год, а потребность — 38 тыс. т/год, в том
числе для пищевой промышленности — 29 тыс. т/год. Самым
крупным производителем лимонной кислоты являются США.
(в 1977 г. — 200 тыс. т).
Применение находят и побочные продукты ферментации: ми-
целий грибов и культуральная жидкость. Мицелий высушивают и
используют как сырье или добавляют к удобрениям. Недавно
предложено использование мицелия как источника хитина, кото-
рый служит биосорбентом. Хитозан — глюкановый комплекс, по-
лученный из мицелия, обладает лучшими хелатирующими свой-
ствами, чем хитозан животных. В культуральной жидкости обна-
ружены гидролитические ферменты пектиназа, протеаза, целлю-
лаза, р-глюкозидаза.
Продуценты. Среди грибов — это штаммы Asp. niger, Asp.
awamori, Asp. fonsecalus, Asp. luchensis, Asp. wenti, Asp. saitoi,.
189
Asp. usani, Asp. jumaricus, Asp. phoenicus, Asp. lanosus, Asp. fla»
vus, Penic. jantinellum, Penic. restriction, Trichoderma viride, Mu*
cor piriformis, Ustilina vulgaris и штаммы видов Botrytis, Asco-
chyta, Absidia, Taralomyces, Saccharomycopsis lipolyiica, S. oleo*
phila, Sacch. sp., Acremonium и Eupenicillium. Среди бактерий
лимонную кислоту образуют Arthrobacter paraffineus, Corynebac*
terium sp. и другие формы. В промышленности используют толь-
ко мутанты Asp. niger и A. wenti и некоторые штаммы дрожжей.
Аспергиллы образуют больше лимонной кислоты, чем пенициллы
в единицу времени, кроме того, образование побочных продуктов
(щавелевой, изолимонной, глюконовой кислот) у этих мутантов
может быть сильно подавлено.
Выбор активных продуцентов. Для выбора наиболее активных
штаммов используют два главных метода: «технику одной споры»
и «метод пассажей». По первому методу приготавливают разве-
дение спор и получают культуру из отдельных спор. Учитывая ге-
терогенность популяции, отбирают наиболее активные продуцен-
ты, используя индикаторный тест на лимонную кислоту, а именно
специальное вещество — парадиметиламинобензальдегид, образу-
ющее окрашенное соединение с цитратом. Конидии грибов про-
растают на фильтрах, разложенных на поверхности плотной сре-
ды. Фильтры высушивают и обрабатывают индикаторным веще-
ством.
«Метод пассажей» состоит в том, что популяцию клеток по-
мещают на чашки, содержащие варьирующие концентрации со-
единений, ингибирующих рост или прорастание спор. Отбирают
фракции из популяции, выдерживающие наиболее высокие кон-
центрации селектирующего агента.
В случае дрожжей главным образом рода Saccharomycopsis,
образующих лимонную кислоту при росте в среде с н-алканами,
отбирают мутанты, которые не растут на лимонной кислоте.
Дрожжи как побочный продукт образуют изолимонную кислоту,
и образование последней связано с аконитазной активностью.
Поэтому для отбора мутантов со слабой аконитазной активно-
стью используют ингибиторы аконитазы — фторацетат и фтор-
цитрат и выделяют колонии, наиболее чувствительные к этим ин-
гибиторам, поскольку мутантные штаммы с низкой аконитазной
активностью обладают более низкой устойчивосью к ингибито-
рам, поскольку мутантные штаммы с низкой аконитазной актив-
ностью обладают более низкой устойчивостью к ингибиторам.
Биосинтез и его регуляция. Нитчатые грибы. У грибов разли-
чают трофофазу, которая характеризуется ростом мицелия и ак-
тивным дыханием с выделением СО2, и идиофазу (продукцион-
ную фазу), когда рост завершен, дыхание подавлено, а оставшая-
ся глюкоза перерабатывается во вторичные метаболиты; в дан-
ном случае в лимонную или другие кислоты.
Образование лимонной кислоты может быть условно разде-
лено на три процесса: 1 — разложение гексоз до пирувата и аце-
тил-СоА при гликолизе, 2—анаплеротическое образование оксал-
190
ацетата из пирувата и С02 и 3 — аккумуляция цитрата в ЦТК-
Asp. niger разлагает глюкозу по гексозодифосфатному (80%) к
глюкоза
пируват
щавелево-
уксусная
кислота
ацетил-СоА
цитрат
3
гексозомонофосфатному пути. При работе первого пути СО2, об-
разованная в результате декарбоксилирования пирувата, фикси-
руется при анаплеротическом образовании оксалацетата. (При
работе гексозомонофосфатного пути СО2 не фиксируется.) В про-
цессе разложения глюкозы образуются промежуточные соедине-
ния: маннит, арабит, эритрит, глицерин.
Образование лимонной кислоты тесно связано со скоростью-
фиксации СО2. Фиксацию СО2 у Asp niger осуществляет консти-
тутивный фермент пируваткарбоксилаза. Существует почти сте-
хиометрическое отношение между фиксацией СО2 и продукцией
цитрата.
Фермент аконитаза, участвующий в расщеплении цитрата в
ЦТК, снижает его продукцию. Считали, что при дефиците Fe или
при добавлении Си происходит ингибирование аконитазы и соот-
ветственно увеличение выхода цитрата. Однако аконитаза ката-
лизирует реакцию, сильно сдвинутую в сторону образования цит-
рата, и необходимости в ее ингибировании нет. Другой фер-
мент — NADPH-зависимая изоцитратдегидрогеназа, которая тео-
ретически должна способствовать снижению аккумуляции лимон-
ной кислоты, ингибируется цитратом (при концентрации 4—
9 ммолей). Правда, у Asp. niger имеется еще один аллостеричес-
ки NAD-связанный фермент — изоцитратдегидрогеназа, которая
активируется цитратом.
Выход лимонной кислоты зависит от активности а-кетоглута-
а-кетоглутаратдегидрогеиаза
)атдегидрогеназы. Реакцию а-кетоглутарат-----------------------------------
сукцинил-СоА называют узким местом ЦТК. Фермент ингибиру-
ется физиологической концентрацией щавелевоуксусной кислоты
и NADH. Увеличение клеточного оксалацетата снижает катабо-
лизм цитрата на уровне а-кетоглутарата и одновременно усили-
вает скорость его синтеза при участии цитратсинтазы. Аккумуля-
ция а-кетоглутарата и NADH снижает активность NAD(NADP)-
изоцитратдегидрогеназы, что способствует увеличению накопления:
191
цитрата до уровня, при котором он сам ингибирует вышеуказан^
ный фермент. 1
Цитрат сильно ингибирует транспорт глюкозы в клетки путем
подавления активности фосфофруктокиназы. Последнему проти-
водействует увеличение концентрации NH4+, а накоплению NH4+
способствует дефицит Мп в среде. Полагают, что при дефиците
...Мп усиливается разложение белков и внутриклеточное содержа-
ние NH4+ возрастает.
Фактором, стимулирующим аккумуляцию лимонной кислоты,
служит аэрация: глюкоза+ 3/2 О2~>лимонная кислота+ 2Н2О.
О2 необходим и для реокисления гликолитического NADH в про-
цессе лимоннокислой ферментации.
Условия ферментации Asp. niger в среде с углеводами. Для
производства лимонной кислоты требуется высокая концентрация
сахара (140—240 г/л). При более низких концентрациях накапли-
вается больше щавелевой и меньше лимонной кислоты. Asp. niger
не использует сахарозу, но часть ее разлагается во время стери-
лизации. Кроме того, грибы содержат внеклеточную, связанную
с мицелием инвертазу, активную в кислых условиях ферментации
и катализирующую быстрый гидролиз сахарозы.
Чаще всего, в качестве источника углерода и энергии приме-
няют сахарную или тростниковую мелассу или сахарозу, ис-
пользуют картофельный крахмал, гидролизаты крахмала, глюкоз-
ный сироп. Если используют крахмал, его подвергают гидролизу
собственные амилазы гриба или добавляемые извне. В мелассе
содержится около 48—50% сахарозы, но также большое количе-
ство зольных элементов. Мелассу разбавляют слабой серной кис-
лотой до концентрации 15—20% сахара, pH устанавливают 5,5—
6,5. Перед стерилизацией мелассы обрабатывают гексацианофер-
ратом Са или катионными обменниками для удаления металлов.
В качестве источника азота используют соли аммония (2—
2,5 г/л), предпочтительно (NH4)2SO4; его утилизация сопровож-
дается снижением pH среды ниже 2,0, что необходимо для про-
дукции лимонной кислоты.
Фосфор
важное питательное вещество, имеющее значение в
регуляции синтеза лимонной кислоты. Если поддерживается ли-
.мит металлических ионов, то эффект Р мало выражен и, наобо-
рот, при заражении следовыми элементами лимит по фосфору да-
ет хороший эффект. При высокой концентрации фосфора акку-
мулируется много сахарных кислот вместо лимонной.
Микроэлементы. Если содержание следовых элементов откор-
ректировано, то другие факторы (концентрация сахара, Р и др.)
проявляют незначительные эффекты. Asp. niger требует для рос-
та все микроэлементы, но лимит по некоторым следовым элемен-
там, особенно для глубинной ферментации, имеет критическое
значение. Определенное влияние оказывают ионы Zn, Fe и Мп.
Последний в концентрации 3 мг/л сильно снижает выход лимон-
ной кислоты. Ионы Си служат противовесом не Fe-ионам, как
ранее полагали, а Mn-ионам. Си служит ингибитором поглоще-
192
ппя, который считается критическим металлом и действует на
уровне синтеза белка. Для максимальной продукции цитрата до-
статочно 0,05—0,2 ppm Fe. Zn+2 оказывает регулирующее влияние
на процесс ферментации (1 ppm=10~12 М). В концентрации 1—
2 мкмоля он способствует прохождению ростовой фазы, но при
концентрации менее 1 мкмоля ограничивает рост. Добавление
Zn+2 в избытке к культуре, продуцирующей цитрат, обращает
ферментацию в первую фазу. Считают, что дефицит Zn2+ служит
сигналом для культуры о переходе из ростовой фазы в продук-
ционную. Предполагают также, что Zn2+ имеет косвенное значе-
ние для функционирования циклического АМР (сАМР). Если до-
бавление сАМР во время продукционной фазы усиливает обра-
зование цитрата, то внесение Zn2+ задерживает синтез кислоты.
Волыпая часть лимонной кислоты образуется нерастущими клет-
ками.
Значение pH. В период идиофазы значение pH нужно под-
держивать ниже 2,0, чтобы подавить образование щавелевой и
глюконовой кислот. Последняя образуется под действием глюко-
зооксидазы, активность которой увеличивается при повышении
рН>4,0, но при рН<2,0 фермент инактивируется. Во время тро-
фофазы начальный pH — 5,0.
Аэрация. Аэрация имеет критическое значение для глубинной
ферментации. Пропускание чистого О2 увеличивает образование
лимонной кислоты, но это дорого; газовая фаза может рецирку-
лировать, если при этом поглощается СО2. Прерывание аэрации
па короткое время может иметь губительное действие на продук-
цию лимонной кислоты, но если при этом повысить pH с 3,0 до
4,0, то ферментация может начаться снова.
Влияние других
акторов.
Гексацианоферат (HCF) поддер-
живают в небольшом избытке в растворе. При этом он не только
связывает металлические ионы, но и несколько ограничивает рост
гриба. Обычно вносят 10—200 мг HCF на один литр в зависи-
мости от качества и сорта сырья и проводят обработку горячего
раствора. Погруженная культура Asp. niger менее устойчива к
HCF, чем поверхностная.
Низшие спирты. Наряду с Сп+2 и HCF низшие спирты — мета-
нол, этанол, н-пропанол, изопропанол и метилацетат в концент-
рации от 1 до 5%—относят к важным добавкам сред, приго-
товленных из природного сырья.
Жиры. Природные масла, особенно содержащие много ненасы-
щенных жирных кислот, способствуют увеличению выхода цитра-
та. Жиры часто используют как антивспениватели. Во время
ферментации рекомендуют поддерживать 0,05—0,3% жирных кис-
лот.
Н2О2. Перекись водорода стимулирует образование лимонной
кислоты, по-видимому, за счет увеличения О2 в среде при своем
разложении. Помимо указанных соединений стимулирующее дей-
ствие на выход лимонной кислоты грибами оказывают 4-метил-
/1 /,, Л, И. Воробьева
193
1
I
засев среды про-
споры, полученные из глубин*
продуценты цитрата, чем спо^
культуры. Исходная концент-
или 100—150 мг конидий на
используют: 1 — поверхностное
беллиферон, FeCN, четвертичные аммонийные основания, амино*
ксимы, крахмал, ЕДТА, ПАВы, вермикулит.
Типичный состав основной среды для продукции цитрата Aspt
niger следующий: общее количество редуцирующих сахаров (ме-
лассы, сахароза) — 14—15%; источник N-—0,25%; КН2РО4 —
0,10—0,15%; MgSO4-7H2O — 0,02—0,25%; pH: мелассные сре-
ды — 5,0—6,0, сахарозные среды — 2,0—3,0.
Получение лимонной кислоты
в промышленности
Приготовление инокулята. В качестве инокулята используют
суспензию спор Asp. niger. Их получают в стеклянных бутылях
на твердой среде при 25° С при инкубировании в течение 10—*
14 дней. Для активации прорастания спор проводят предвари-
тельную ферментацию в питательном растворе, содержащем 15%
сахара, а для того, чтобы мицелий вырастал в виде крупинок, в
среду вносят цианид. Эти крупинки используют как инокулят для
продукционных ферментеров при выращивании глубинной куль-
туры.
В случае поверхностного культивирования
изводится спорами. Замечено, что
ной культуры, дают более слабые
ры, полученные из поверхностной
рация конидий 1,5—2,2-109/1 м2,
1
1 М .
При промышленном получении
культивирование грибов, 2 — погруженное культивирование, 3 —
твердофазную ферментацию, 4 — процесс Koji.
1. Поверхностный способ предусматривает использование сте-
рильной питательной среды, содержащей сахарозу. Среда раз-
ливается в алюминиевые кюветы на глубину 0,1-—0,25 м; кюве-
ты размещаются в стерильных комнатах. Контролируется темпе-
ратура, влажность и циркуляция чистого воздуха. Инокулятом
служат споры Asp. niger; температура поддерживается около
28—30° С и относительная влажность между 40 и 60% в течение
8—12 дней. Если количество СО2 в воздухе увеличивается более
чем на 10%, то выход цитрата снижается. Споры прорастают че-
рез 24 ч. Начальный pH 5,0—6,0 после прорастания спор быстро
снижается до 1,5—2,0, так как ионы NH3 удаляются из раство-
ра. Если значение pH увеличивается до —3,5 после первоначаль-
ного изменения или доводится до 3,5 или >, то образуется неко-
торое количество щавелевой кислоты. Присутствие Fe- или
Na-солей тоже благоприятствует аккумуляции оксалата и обра-
зованию желтого или желто-зеленого пигмента (асперенона) в
мицелии, который может экстрагироваться. При выделении и
очистке лимонной кислоты его трудно отделить. В конце фермен-
тации питательную жидкость можно заменить, строго контроли-
руя сохранение мицелия на поверхности. Если мицелий утопает/
то происходит его полная инактивация. По окончании фермента-1
*
194
ции жидкость выливается из кювет для выделения из нее цит
рата. Это наиболее старый способ, но 20% цитрата в мире полу-
чают таким образом. На рис. 45 изображена кинетика образова-
ния лимонной кислоты, а на рис. 46 — схема ее получения при
культивировании гриба в жидкой
Гюм. Идиофаза начинается че-
рез 60 ч. Ферментация закан-
чивается через 8—14 дней.
Выход лимонной кислоты в вп-
еред е
поверхностным спосо-
дс моногидрата на жидкой пи-
тательной среде — 1,2—
1,5 кг/м* 2 в день или 0,2—
0,4 кг/м3 • ч. Ферментационные
выхода находятся обычно в
пределах 70—75% по отноше-
нию к содержанию начального
сахара.
Поверхностное культивиро-
Рис. 45. Кинетика образования ли-
монной кислоты (по Siebert а.
Schulz, 1979): 1 — сахароза, 2 —
глюкоза, 3 — фруктоза, 4 — мице-
лий, 5 — лимонная кислота, 6 —
глюконовая кислота
Время ферментации (ч)
Мицелий (г/л)
вание проводят и на твердом субстрате, чаще всего на пшеничных
отрубях или на пульпе картофеля, разложенных толщиной в 3—
5 см. pH отрубей устанавливают до 4,0—5,0 перед стерилизацией.
Рост можно интенсифицировать добавлением а-амилаз. Процесс
занимает 5—8 дней.
2. Глубинный способ. На современных заводах принято погру-
женное культивирование гриба, характеризующееся более высо-
кой продуктивностью, чем первый процесс. При этом инокулиро-
ванная среда наливается в хорошо аэрированные ферментеры с
перемешиванием и контролем аэрации. О2 должен находиться как
минимум в концентрации 20—25% от насыщения. Другое важное
условие — использование для стен биореакторов устойчивых ма-
териалов, так как лимонная кислота очень коррозивна и может
переводить в раствор металлические ионы из стенок сосуда, что
кроме вреда стенам наносит дополнительный вред в связи с уве-
личением концентрации металлов в среде. Поэтому для внутрен-
них стен ферментеров используют различные покрытия. Засев
производят суспензией конидий с добавлением ПАВов или пре-
культивированным мицелием. В начале дают слабую аэрацию
0,1—0,4 vvm (объем воздуха/объем жидкости в мин), после про-
растания спор и появления мицелия аэрация усиливается до 0,5—
195
о
и
о
й
1 vvm. Первые 2—3 дня роста играют решающую роль для все-
го процесса ферментации. Структура мицелия, образованная во
время трофофазы, имеет определяющее значение. Если мицелий
слабый и нитчатый, с ограниченным ветвлением и без хламидо-
спор, то в идиофазе образуется мало лимонной кислоты. Структу-
ру мицелия определяет отношение Fe+3 к Си+2 в среде. Предпоч-
тителен рост в виде маленьких крупинок (комочков). Фермента-
ция, по существу, протекает под контролем одного главного пара-
метра: загрязненности используемого сырья металлическими ио-
нами. Поэтому в начальной фазе ферментации поддерживаются
постоянные концентрации HCF, Си+2, спиртов и др. веществ. При
температуре 25—30° С ферментация заканчивается за 5—8 дней.
Иногда грибные комочки используют повторно, как и в предыду-
щем методе. Разработан также двустадийный процесс, который
включает «ростовую фазу» и «продукционную фазу». В этом спо-
собе ростовая среда вначале инокулируется спорами, через 3—
4 дня мицелий отделяют от раствора и вносят в ферментационную
среду. Ферментация продолжается еще 3—4 дня при 25—30° С
при интенсивном пропускании воздуха через среду. 80% цитрата
в мире получают погруженным путем. Большая часть ферменте-
ров имеет объем 120—220 м3. Используют эйрлифтовые фермен-
теры и ферментеры с мешалкой. В качестве пеногасителя при-
меняют масла и механические средства.
Интерес представляют башенные ферментеры: они дешевле,
чем другие, дают возможность высокого масштабирования, в них
отсутствуют вращающиеся детали, поэтому меньше риска помех
и создаются лучшие условия для работы с вязкими растворами,
как концентрированная культуральная жидкость с грибами.
3. Твердофазная
ерментация предусматривает использование
импрегнированного средой пористого твердого материала, как
багасса, картофель, пульпа сахарной свеклы и др. в определен-
ных пропорциях. Материал стерилизуют и инокулируют суспензи-
ей спор. Инкубируют, в лотках при 25—30° С в течение 6—7 дней.
После инкубирования содержимое экстрагируют водой, концент-
рируют, цитрат осаждают и очищают.
4. В Японии в процессе Koji получают пятую часть выпускае-
мой в стране лимонной кислоты. Это твердофазное культивиро-
вание специальных штаммов Asp. niger на пшеничных отрубях.
Перед стерилизацией значение pH отрубей доводят до 5,5, ув-
лажняют отруби горячим паром так, чтобы их влажность состав-
ляла 70—80%. Далее субстрат охлаждают до 30—36° С и иноку-
лируют спорами штамма, малочувствительного к присутствию
Fe3* Температура не должна быть выше 28° С. Крахмал отрубей
осахаривается ферментами гриба, но добавление готовых сс-ами-
лаз к субстрату увеличивает выход продукта. Инокулированные
отруби размещают в лотках на глубину 3—5 см. Через 5—8 дней
Koji собирают и переносят в инокулятор для экстракции лимон-
ной кислоты водой. Загрязнение субстрата следовыми металла-
ми является проблемой в процессе Koji, так как их труднее уда-
/ Л. И. Воробьева
197
цитрат
кальция
вода
(32>
лимонная
кислота
гипс
(33) ’
4
лять, чем в других вариантах процесса. Поэтому проводят селек-
цию и используют штаммы, устойчивые к следовым металлам.
К субстрату также добавляют HCF или Си+2.
Выделение лимонной кислоты. После отделения мицелия его
прессуют, чтобы выделить из него максимум ферментационной
жидкости. Рекомендуют разрушение мицелия, промывание его
водой и фильтрование. Поскольку мицелий используют в корм
скоту, из него нужно удалить щавелевую кислоту (до выделения
лимонной), которая токсична. Это делают путем осаждения Са-
солей при pH ниже 3,0. Фильтрат нагревают до 80—90° С и вно-
сят в него немного С а (ОН) 2, чтобы осадить щавелевую кислоту,
ее отделяют, а лимонную кислоту далее выделяют в виде цитрата
Са при точном добавлении 1 части гидратированной извести на
2 части жидкости, pH 7,2±0,2 и повышении t до 95°. Цитрат
Са сепарируют и высушивают. Если нужна более чистая лимон-
ная кислота, то ее освобождают из Са-соли путем добавления
H2SO4; CaSO4 осаждается:
2С6Н8О7 + ЗСа(ОН)2-э-
лимонная известковое
кислота молоко
Са3(С5Н6О7)а + 3H2SO4
цитрат серная
кальция кислота
Последующие ступени очистки включают обработку раствора ак-
тивированным углем, катионами и анионами, упаривание и кри-
сталлизацию лимонной кислоты в виде ее моногидрата.
В последние годы разработаны другие методы выделения ли-
монной кислоты. В частности, осуществляют экстракцию цитрата
растворителями. Существует ряд экстракционных методов. При-
ведем два новых способа. Лимонную кислоту экстрагируют из
среды азотом (N), N-дизамещенными производными алкилацета-
мида. Из амидной фазы лимонную кислоту вновь реэкстрагируют
в водную фазу. Процесс экстракции экзотермичен, поэтому его
проводят при 10—20°, в реэкстракцию при 60—70°.
В ФРГ предложено лимонную кислоту экстрагировать смесью
30%-го Hastareex А324, 30% изодеканола и 40% алканов Shel-
losol. На второй стадии происходит реэкстракция лимонной кис-
лоты при добавлении уксусной кислоты к экстракту в смеси ор-
ганических веществ. Очистку и регенерацию органических раст-
ворителей, с одной стороны, и выделение лимонной кислоты из-
смеси с уксусной кислотой — с другой, осуществляли с помощыа
дистилляции. Эта схема реализована в заводских масштабах.
Преимуществом технологии выделения является возможность по-
лучения пищевой лимонной кислоты по безотходной схеме.
Образование лимонной кислоты из н-алканов дрожжами.
Дрожжи предпочитают фракции н-алканов Сю—Csoi наиболее вы-
сокий выход цитрата получают, используя С14Н30 и С]5Нз2. Кон-
198
центрация н-алканов в среде от 3 до 10% (WV). Величину pH
поддерживают >5,5, иначе аккумулируются полиспирты: эритрит
и маннит за счет цитрата. Для поддержания pH к среде добав-
ляют СаСОз, NH4OH, ионообменные смолы или проводят диализ,
а также полупроточное рециклирование клеток. В определенной
концентрации лимонная кислота сама ингибирует свое образова-
ние.
Особенность ферментации н-алканов дрожжами — потреб-
ность в тиамине.'Если его нет, то аккумулируются а-кетокислоты,
что, по-видимому, объясняется тем, что тиаминпирофосфат слу-
жит коэнзимом при окислительном декарбоксилировании в про-
цессе деградации н-алканов. Р требуется в ограниченном коли-
честве и необходимо высокое отношение С/Р.
Различные физиологические аспекты аккумуляции лимонной
кислоты нитчатыми грибами и дрожжами, представленные в
табл. 35, служат указанием на различия в регуляции аккумуля-
ции лимонной кислоты. С интактными митохондриями Candida
lipolytica показано, что в регуляции накопления цитрата участ-
Таблица 35
Сравнение физиологических аспектов аккумуляции лимонной кислоты
Asp. niger и дрожжами
(по Kubicek, Rohr, 1986)
Aspergillus niger
Требуется дефицит Мп
pH ниже 2,0
Аккумуляция цитрата стимулируется лимитом
ио Р
Лимит по N не влияет на аккумуляцию
Тиамин не требуется
Дрожжи
дефицит Мп не влияет
pH 4,5—6,5
то же
лимит по N провоцирует
аккумуляцию кислоты
тиамин требуется
вуют адениловые нуклеотиды, особенно АМР, действующие через
аллостерическую NAD-зависимую изоцитратдегидрогеназу. Ли-
моннокислое брожение дрожжей длится 3—5 дней, и выход про-
дукта составляет 140% по отношению к парафинам при конечной
концентрации цитрата более 20%; высокий выход облегчает его
выделение. Обычный состав среды для образования лимонной
кислоты дрожжами из н-алканов следующий: н-парафины — 30—
100 г/л, неорганический Р (КН2РО4) — 0,2—1 г/л, (NH4)2SO4 —
1 -4 г/л, Mg, К, Na — 0,1—0,5 г/л, СаСОз (буфер) — 10 г/л,
следовые элементы — 0,1—1 ppm, тиамин — НС1 — 0,3 ppm,
pH 4,5—6,5, t 28° С. Недостатком ферментации служит образова-
ние высоких количеств изоцитрата как побочного продукта. Для
снижения выхода изоцитрата имеется ряд приемов. Не вводить
попы Fe (составную часть молекулы аконитазы). Поскольку в
сложных средах содержится избыток Fe+2, в Японии был получен
199
-Мутантный штамм, чувствительный к фтору со слабой аконитаз-
ной активностью. Он давал высокие выхода цитрата в среде с
н-алканами. Добавлять монофторацетат, который превращается в
монофторцитрат — ингибитор аконитазы в клетке в присутствии
агента, нарушающего сопряжение (например, 2,4-динитрофено-
ла). Добавлять некоторые спирты: метанол, этанол, лауриловый,
стеариловый, олеиловый спирт. Использовать мутанты с низкой
аконитазной активностью. Такие мутанты отселектированы, они
растут на н-алканах, но не на цитратах. Добавлять малые
(0,1 мг/л) количества Na2B4O7-ЮН2О. Более высокие концентра-
ции (1 мг/л) вызывают снижение выхода лимонной кислоты,
не оказывая влияния на рост. В качестве продуцента предпочи-
тают штаммы рода Saccharomycopsis.
Дрожжи имеют то преимущество перед аспергиллами, что с
ними можно легко наладить проточный процесс. Candida catena*
lata CBS 1904 образует трео-£>5-изоцитрат из н-алканов при вы-
ращивании в среде, содержащей соевое масло, олеиновую кис-
лоту, тридекан, тетрадекан и ПАВ («Эмульган 903»), Макси-
мальный выход из 5-литрового ферментера через 80 ч культиви-
рования с перемешиванием — 55 мг/мл.
Продукция лимонной кислоты бактериями. Некоторые бак-
терии — Bacillus licheniformis, Вас. subtilis, Brevibacterium fla*
vum, Arthrobacter paraffineus — способны к образованию лимон-
ной кислоты при росте в среде с глюкозой, изоцитратом или уг-
леводородами (додеканом или смесью Ci2—Си парафинов). Бак-
терии еще мало изучены в этом плане, но представляют собой
несомненный практический интерес как продуценты лимонной
кислоты, так как растут быстрее, чем грибы, и используют боль-
ше разнообразных субстратов при образовании цитрата.
Новые тенденции в производстве лимонной кислоты. Компью-
терный контроль
ерментации.
включая такие группы значений,
17 ферментационных данных,
как поглощение энергии, физи-
ческий статус биореактора, аэрация, анализ выходящих газов,
трансформировали в типичные ферментационные параметры, как
скорости, выходы продукта, баланс по углероду. Для этих целей
использовали маленькие компьютеры, позволяющие разработать
физиологические модели и создать эффективно управляемую и
контролирующую систему. Успех этой операции в крупномасштаб*
ном производстве лимонной кислоты демонстрирует большую цен-
ность процессов, сопряженных с компьютерным контролем.
Проточное культивирование. Его в промышленности еще нет.
Лабораторные исследования показали, что непрерывная культура’
Asp. niger 2270, лимитированная по азоту, при оптимальном зна«:
чении pH 1,7 имеет продуктивность 0,48 кг/кг клеток-ч и общий’
выход 26,5 кг/м3. При переходе к низким скоростям разбавления’
(29 = 0,1—0,25 ч-1) продуктивность увеличивается. При
= 0,075 ч”1 она достигала 1,99 кг/кг клеток -ч. В то же время
максимальная удельная продуктивность при периодическом куль-j
тивировании — 0,16 кг/кг клеток-ч при общем выходе 85 кг/м®!
200
через 140 ч ферментации. Очевидный недостаток: низкая концент-
рация лимонной кислоты в выходящем протоке — 26,5 г/л, что
приводит к большим объемам при выделении и большим потерям
остаточной глюкозы. Учитывая двухфазность и сложность про-
цесса ферментации, можно полагать, что многостадийная систе-
ма, состоящая из ряда ферментеров, собранных в серию, окажет-
ся более плодотворной.
Усовершенствование штаммов. Получение мутантов. Получен
мутант Asp. niger, который образует в 4 раза больше лимонной
кислоты, чем исходный штамм, описаны и другие мутанты с вы-
сокой продуктивностью.
Дрожжи, способные утилизировать широкий круг различных
веществ, представляют несомненный интерес для практики. Полу-
чены мутанты с низкой активностью аконитазы или фторчувст-
вительные мутанты (у них тоже низкая активность этого фер-
мента). Описан мутант С. lipolytica, аккумулирующий 140 г/л
лимонной кислоты и превращающий 70% субстрата в целевой
продукт.
Иммобилизация клеток. Целые клетки Asp. niger АТСС 9142
включили в Са-альгинатный гель и культивировали их в коло-
ночном реакторе с целью непрерывного получения лимонной кис-
лоты. На оптимизированной среде максимальную объемную про-
дуктивность (0,3—0,5 г/дм3-ч) получали при pH 2,2—2,3. Произ-
водительность реактора заметно возрастала, если вместо воздуха
применяли чистый кислород. Еще более интересные результаты
получены с иммобилизованными в С а-альгин ат спорами грибов.
Споры прокультивировали в среде с различным содержанием
NH4NO3 и выбрали оптимальную концентрацию — 100—200 мг/л.
('поры проросли в альгинатных шариках, и продуктивность, по-
лученная с такими клетками, была в 1,5 раза выше, чем со сво-
бодными. Выход составлял 20 г/л цитрата. При культивировании
клеток в эйрлифтовом ферментере продуктивность увеличили в
2 раза по сравнению с культурой, выращенной в ферментере с
мешалкой (за счет интенсификации аэрации). Считают, что иде-
альным биокатализатором будет нерастущий мицелий, поскольку
продукционная фаза длится долго и не связана с ростом. Исполь-
зуя технику обменной фильтрации, с помощью Asp. niger в тече-
ние 30 дней получали 0,41 г/л-ч. Как альтернатива к этому спо-
собу рекомендовано культивирование гриба во вращающемся
щековом ферментере, где мицелий развивается на вращающих-
ся полипропиленовых дисках, которые только наполовину погру-
жены в питательную среду. Такой способ облегчает удаление ми-
целия и снабжение его свежей средой. Продукционная скорость
при этом культивировании — 0,57 г/л-ч^1 в течение 27 дней.
ЛИТЕРАТУРА
Мюллер Г., Литц П., Мюнх Г. Д. Получение лимонной кислоты//Микро-
биология пищевых продуктов растительного происхождения. М., 1977.
С. 272—279.
201
Miall L. M. Citric acid//Economic. Mier. 1978. Vol. 2. P. 49—76.
Kapoor К. K-, Chaudhary K., Tauro P. Citric acid//Prescott a. Dunn’s
Industrial microbiology. 4 ed. 1982. P. 709—747.
Kubicek С. P., Rohr M. Citric acid fermentation.//Crit. Rev. Biotechnol. 1986.
Vol. 3. Is. 4. P. 331—373.
УКСУСНАЯ КИСЛОТА
Производство уксусной кислоты из спиртовых жидкостей бы-
ло известно более 10 тыс. лет тому назад. Греки и римляне ис-
пользовали уксус как освежающий напиток для рабов и получа-
ли его, оставляя вино открытым. Для местного употребления ук-:
сус производили до середины средних веков. В промышленных j
масштабах вначале получали уксус в плоских открытых бочках.;
Пленка бактерий плавала на поверхности вина. В XIX в. поверх-
ностные ферментации превращались в более быстрые процессы/
например процесс в струйном генераторе работает до сих пор.
В начале 1942 г. стали разрабатываться глубинные процессы, ко*(
торые в усовершенствованном виде (генератор Фрингса) функ-i
ционируют и в настоящее время. ;
Некоторые определения. В США и в большинстве других стран1
уксусом называют продукт, полученный в результате уксуснокис^
лой ферментации спиртовых растворов. Он должен содержать 4 Г;
уксусной кислоты в 100 мл (при 20° С) и не более 0,5 объемных
% этанола. Поскольку в промышленности уксусную кислоту по-
лучают в более высокой концентрации, ее можно разбавить во-
дой до стандартной концентрации, правда, в США разбавленная
уксусная кислота не называется уксусом, хотя и может исполь-;
зоваться для тех же целей в пище. pH уксуса 2,0—3,5. В Совет-
ском Союзе столовый уксус содержит 6—9% уксусной кислоты*
Уксус получают при окислительной ферментации, при которой)
разведенные спиртовые растворы при участии уксуснокислых бак*
терий рода Acetobacter кислородом воздуха окисляются до уксуса
ной кислоты и воды: '
С2Н5ОН + О2 СНзСООН + Н2О ;
(34)
ДО = —493 кДж ;
Окисляемая смесь — это сусло, содержащее кроме спирта еще 1
уксусную кислоту для предотвращения развития нежелательны;
бактерий. Ее количества выражают в г/100 мл, а количеств!
спирта — в объемных %, сумма того и другого называется «об
щая концентрация».
Применение. Уксусную кислоту (уксус) используют как в пи
щевой промышленности, так и для растворения органических кра1
сителей, при получении медикаментов, пластмасс, синтетически
волокон. :
Продуценты. Уксусную кислоту образуют многие бактерии, н
промышленное производство основано на уксуснокислых бакте
202
риях, метаболические особенности которых являются отражени-
ем их экологии. Бактерии были открыты Кютцингом в 1838 г. и
подробно изучались датским ученым Хансеном. В СССР иссле-
дования уксуснокислых бактерий проводились под руководством
М. С. Лойцянской, В. Н. Шапошникова, А. Я. Мантейфель.
Бактерии приспособлены к сахаристым и спиртовым субстра-
там. Они живут на поверхности растений, особенно на цветах и
фруктах в растительных соках, в пиве, вине, чайном грибе, пче-
лином улье, в пальмовом вине, т. е. в субстратах, содержащих
спирт, углеводы, органические формы азота, витамины. Бактерии
развиваются как вторичная микрофлора в аэробных условиях,
следуя за спиртовым брожением дрожжей. Уксуснокислые бак-
терии отличают 4 особенности.
1. Высокая ацидофильность, они растут при значении pH 4,0,
а оптимум pH — 5,0—6,0.
2. Бактерии — строгие аэробы и растут только на поверхности
сред, образуя пленки. Пленка может быть тонкой или очень тол-
стой как у Acetobacter xylinum. Пленка A. xylinum представля-
ет собой оболочку, содержащую целлюлозу и воздушные полости,
благодаря которым вся пленка всплывает. При 12%-й общей кон-
центрации этанола и уксусной кислоты прерывание аэрации на
10—20 с приводит к гибели клеток. Удивительную чувствитель-
ность этих бактерий к недостатку О2 связывают с высокой ак-
тивностью фермента апиразы. Под действием этого фермента
АТР быстро гидролизуется и становится недоступной для мета-
болической активности клеток. Когда прерывается аэрация, то
очень быстро исчезает пул АТР. Полагают, что пул АТР необхо-
дим для предотвращения вхождения этанола или уксусной кис-
лоты в клетку.
3. Бактерии отличает сильно выраженная способность окис-
лять различные органические вещества в частично окисленные
продукты.
4. Способность окислять этиловый спирт в уксусную кисло-
ту — наиболее характерное свойство этой группы. Но они окис-
ляют и другие одноатомные и многоатомные спирты в соответст-
вующие кислоты.
Уксуснокислые бактерии не метаболизируют белки, не растут
на поверхности МПА, не образуют пигментов, не растут в моло-
ке, на картофеле, не патогенны, грамотрицательны. Их относят
к сем. Pseudomonodaceae. Различают 2 рода, 4 вида и 13 подви-
дов.
Род Acetobacter — перитрихи (или клетки неподвижны), окис-
ляют уксусную кислоту до СО2 и Н2О. Этанол и лактат предпо-
читают глюкозе.
Род Gluconobacter — монотрихи, не окисляют уксусную и мо-
лочную кислоты. На среде с мелом дают зоны просветления. Для
промышленного получения уксуса используют штаммы A. aceti,
A. pasterianus или A. peroxidans, а также G. oxydans и несколь-
ко подвидов этого вида. Роль уксуснокислых бактерий не' огра-
203
ничивается их участием в производстве уксуса и уксусной кис-
лоты. Важное значение имеет окисление ими D-сорбита в А-сор-
бозу — предшественник витамина С при его промышленном по-
лучении, а также окисление глюкозы в 2- и 5-кетоглюконовую
кислоту. С помощью уксуснокислых бактерий получают дигидро-
ксиацетон, эритрулозу и ряд других веществ, используемых в
препаративной химии. Образование этих веществ происходит при
окислении бактериями вторичных спиртов в кетоны (свойство так
называемых кетогенных бактерий). Уксуснокислые бактерии от-
личает высокая чувствительность к строению вещества, что очень
важно при стереоселективных окислениях. В частности, в поли-
спиртах окислению подвергается лишь вторичная спиртовая груп-
па, находящаяся в цисположении, которая расположена рядом с
другой первичной или вторичной спиртовой группой.
Другие бактерии — продуценты уксусной кислоты. Для полу-
чения уксусной кислоты в промышленности интерес представля-
ют анаэробные бактерии, способные к образованию ацетата из
СО2 при брожении сахаров, в автотрофных условиях роста — из
СО2 + Н2, при использовании СО, формиата и метанола. К чис-
лу таких микроорганизмов относятся: Cl. thermoaceticum, CL for-
micoaceticum, CL magnum, CL aceticum, CL thermoautotrophicum,
Acetoanaerobacter woodii, A. noteral, A. carbinolicum, A. wierin-
gae, Acetogenium Kivui, Sporomusa acidovorans, S. ovata, S, sphe-
roides. Уксусную кислоту из CO2 могут синтезировать сульфат-
редуцирующие бактерии — Desulfotomaculum orientis, Desulfo-
vibrio baarsii, а также Eubacterium limosum, Peptostreptococcus
productus, Butiribacterium methylotrophicum, ряд метанообразую-
щих бактерий при росте в автотрофных условиях.
Биосинтез уксусной кислоты уксуснокислыми бактериями.
Образование уксусной кислоты относится к процессу неполного
окисления субстрата. На первом этапе этанол окисляется до аце-
тальдегида при участии NAD- или NADP-зависимой алкогольде-
гидрогеназы, далее происходят гидратация ацетальдегида и вто-
рое окисление последнего вещества при участии ацетальдегидде-
гидрогеназы до уксусной кислоты:
2хЗАТФ + Н2О
дыхание
NADP NAD(P)H2
NAD(P) NAD(P)H2
CHqCHo0H
сносно
о
СН3СН (ОН)2
сщсоон
этанол
ацетальдегид
ацеталь-
дегидгидрат
уксуснал
кислота
Из одного моля этанола образуется один моль уксусной кислоты.
Из 1 л раствора с 12 объемными % спирта (мл спирта/100 мл
204
раствора) получается 12,4 весовых % (г уксусной кислоты/100 мл
раствора) уксусной кислоты. На 1 моль уксусной кислоты обра-
зуется 6 молей АТР. Снабжение клеток этанолом обязательно, и
если его концентрация оказывается ниже 0,2 объемных % в ра-
створе, то скорость наступления гибели клеток увеличивается. Но
максимальная концентрация этанола не должна превышать 5%
в традиционном процессе. В настоящее время продуктивные
штаммы синтезируют до 13—14% уксусной кислоты. Окисление
этанола в уксусную кислоту не находится в полной зависимости
от размножения клеток. Даже после остановки роста, например
вследствие высокого накопления ацетата, клетки еще способны
некоторое время окислять этиловый спирт.
Переокисление. Переокислением называют превращение уксус-
ной кислоты, образованной из спирта, в СО2 и Н2О. Переокисле-
ние обычно коррелирует с бактериальным ростом и происходит
при низких концентрациях ацетата и спирта; показано, что пере-
окисление наступает в том случае, когда концентрация уксусной
кислоты ниже 6%, и оно совершенно не происходит при наличии
этанола. Правда, непосредственно в производстве эта закономер-
ность может не соблюдаться. Например, если в ферментере (ча-
ще всего в струйном ферментере) образуется скопление бактерий
благодаря выделению слизи, то клетки'плохо снабжаются этано-
лом. В этих местах начинается переокисление, которое может ох-
ватить весь ферментер. Поэтому, если оно где-то началось, то
ферментацию надо прекратить. A. suboxydans не окисляет уксус-
ную кислоту. Для инициации роста A. suboxydarts и A. melanoge-
tium требуют добавления к среде сахара, после чего этанол мо-
жет окисляться до ацетата.
Метаболизм сахаров. При росте на глюкозе бактерии A. subo-
х у dans могут окислять ее непосредственно или после фосфори-
лирования. Метаболизм фосфорилированной глюкозы протекает
по трем путям: гликолитическому пути Эмбдена-Мейергофа-Пар-
наса, пентозному циклу или по пути Энтнера-Дудорова. Главное
значение .имеет пентозный цикл; путь Энтнера-Дудорова и
ЦТК имеют меньшее значение.
В отличие от A. suboxydans другие штаммы Acetobacter пред-
почитают различные пути глюкозного метаболизма. У A. pasleri-
а пит активно работает ЦТК. Видимо, его ферменты присутст-
вуют во всех клетках Acetobacter, но их репрессия может быть
вызвана условиями среды (например, высокой концентрацией
кислот).
Условия образования. Сырье. Большую часть уксуса получают
из разведенного спирта. Из него получают «белый уксус». Сид-
ровый уксус готовят из сброженного яблочного сока (сидра).
Сусловый уксус получают из ячменного сусла. Известен сыворо-
точный уксус, получаемый из сброженной сыворотки, сахарный
(из сброженных сахарных растворов), глюкозный (из сброжен-
ных глюкозных растворов). Рисовый уксус готовят из сахарифи-
цированного рисового крахмала с последующей спиртовой и ук-
205
суснокислой ферментацией. Когда готовят уксус из продуктов пи*
щевой промышленности (вина, сыворотки, сусла, сидра), то не*
обходимости в питательных добавках нет. Но если в качестве
сырья используют технический спирт, картофельный или зерно-
вой крахмал, то приходится вносить фосфат аммония, MgSO^
Са-цитрат и Са-пантотенат, сусло, причем при погруженном
культивировании концентрации питательных веществ должны
быть в 5 раз выше, чем при поверхностном культивировании, по-<
скольку в первом случае вырастает гораздо больше биомассы,;
Установлено, что применение питательной
пулом аминокислот при культивировании
среды с оптимальным?
A. aceti приводит к
увеличению продуктивности технологического процесса, увеличен
нию выхода уксусной кислоты, а также к снижению расхода эти*!
лового спирта.
Вредителями уксуснокислого производства являются бактерш
A. xylinum вследствие высокой склонности к переокислению и об
разованию слизи, которая нарушает аэрацию, уксуснокислые уг
рицы, пожирающие бактерий-продуцентов и, как было впервьп
обнаружено в 1987 г. учеными ФРГ, — бактериофаг. Индуциро
ванный фагом лизис уксуснокислых бактерий может полностьк
прервать уксуснокислую ферментацию.
Уксуснокислая угрица Anguillula aceti длиной —2 мм отно
сится к живородящим нематодам; для человека безвредна. Mb
можно уничтожить, нагревая раствор до 54° С или обрабатываз
его SO2.
Подготовка инокулята. Acetobacter очень вариабелен, он мо-
жет даже потерять свойство образовывать уксусную кислоту
Кроме того, бактерии должны выдерживать высокую концентра5
цию уксусной кислоты, не быть требовательными к высоким кои
центрациям питательных веществ и не осуществлять переокисле
ние уксуса. Все эти свойства у продуцента изменчивы. Для страз
Европы имеется централизованное снабжение инокулятом и
Бонна, где инокулят готовится специально и проточным путем
Чтобы избежать мутаций, инокулят поддерживается в среде
высокой общей концентрацией спирта и уксусной кислоты и низ
кой концентрацией питательных веществ.
Получение в промышленности
Производство уксуса ведется как поверхностным, так и глу
бинным путем.
Поверхностное культивирование осуществляют в настояще
время в струйных генераторах объемом —60 м3, наполненных де
ревянной стружкой. Исходный питательный раствор с бактерия
ми распыляют по поверхности стружек, после протекания rii
стружкам он собирается в нижней части реактора и вновь нака
чивается в верхнюю часть. Итак несколько раз. В результате 88-
90% спирта превращается в уксусную кислоту. 12%-ю уксусну!
кислоту получают через 3 дня. Эта довольно старая технологи
206
(150 лет) применяется на ряде заводов для производства домаш-
него уксуса.
Недостаток способа: в неравномерности распределения кисло-
рода, спирта и /, что удалось избежать в генераторах Фрингса.
Последние могут иметь объем 20, 40 и 60 м3. В них автоматически
поддерживается t, происходит интенсивная подача воздуха сни-
зу. Когда остается 0,3% этанола, то содержимое удаляют и вно-
сят в 2—3 стадии новое сусло. Время ферментации от 4 до
10 дней. В генераторах Фрингса получают 400 млн л уксусной
кислоты. Если генератор заполнен березовыми стружками, то вы-
ход уксусной кислоты 5 л с 1 м3 стружек в день. Более прогрес-
сивным методом считается погруженная ферментация, которую
па Западе проводят в ацетаторах Фрингса; в них возможно осу-
ществление хорошей контролируемой аэрации.
Глубинное культивирование. Аэрационный аппарат (рис. 47)
состоит из засасывающего ротора, воздух поступает через труб-
ку с верхней части ферментера. Теплообменники контролируют
температуру, а механические антивспениватели удаляют пену.
В аппарате поддерживаются следующие условия: t 30° С, ско-
рость аэрации — 34 объема воздуха/ объем жидкости-ч, скорость
вращения ротора 1500 об/мин, давление— 0. Исходная смесь
включает 7,5% уксусной кислоты и 5,5% этанола. В результате
ферментации получают 12—13% уксуса. Если начальный уро-
вень уксусной кислоты поднимают до 8—10 г/100 мл, а концент-
рацию этанола оставляют прежней (5,5 об %), то получают до
15 г/100 мл уксусной кислоты. Осуществляют полупроточный про-
цесс. Каждые 35 ч 50—60% питательного раствора заменяется на
свежее сусло.
При глубинном культивировании скорость продукции на 1 м3
в 10 раз выше, чем при поверхностной ферментации и — на 5%
выше, чем в струйном генераторе. В 1980 г. работало 428 ацета-
торов и, давали 715 млн л 10%-й уксусной кислоты в год.
Двустадийный глубинный полупроточный процесс. В первом
ферментере происходит размножение бактерий. Часть содержи-
мого из первого ферментера перекачивается во второй, где завер-
шается ферментация. В первый ферментер добавляют свежее сус-
ло, а содержимое второго полностью выливается. Поэтому первый
ферментер работает как полупроточный, а второй — как перио-
дический. Выход уксусной кислоты 18,5%.
Проточное культивирование. В Советском Союзе имеется ус-
тановка для непрерывного глубинного культивирования, состоя-
щая из пяти соединенных аппаратов. В первый непрерывно пода-
ется среда с общей концентрацией спирта и уксуса 6,4—6,7%.
В этом аппарате размножается культура и передается последо-
вательно в другие аппараты батареи. Культуральная жидкость
из аппарата в аппарат передается воздухом. В каждом аппара-
те поддерживаются свой постоянный температурный режим и ус-
ловия аэрации. Температура и аэрация от ферментера к фермен-
теру снижаются. Для поддержания во втором, третьем и четвер-
207
том аппаратах нужной концентрации спирта в них подают среду
с 40%-м этанолом. В такой системе получают 75—90 кг уксус-
ной кислоты из 100 л безводного спирта.
Для получения столового уксуса (в СССР это 5—9%-й раст-
вор уксусной кислоты) продукт из ферментера осветляют бенто-
нитом и лимонной кислотой. Смесь перемешивается воздухом,
фильтруется на фильтр-прессе и далее поступает на расфасовку.
Обработка сырого уксуса. При стоянии качества уксуса улуч-
шаются (это не относится к «белому» уксусу). Улучшение каче-
ства может быть обусловлено образованием эфиров с этанолом,
который остается после ферментации. При стоянии преципитиру-
ющий материал осаждается, что облегчает последующие опера-
ции.
Очистка. В уксусе могут содержаться уксуснокислые бакте-
рии (или угрица), создающие мутность раствора. Они осажда-
ются при добавлении бентонита. Фильтрацию осуществляют че-
рез фильтры с диатомовой землей. Можно применять ультра-
фильтрацию, которая удобна для проточного культивирования.
Для обесцвечивания уксуса используют [K4(FeCN)6].
Пастеризация. Непосредственно перед розливом уксус часто
пастеризуют, это особенно важно для фруктовых уксусов. В не-
которых странах уксус сульфитируют, пропуская SO2 в количе-
стве до 50 мг/л. Тогда пастеризация не требуется.
Концентрирование уксусной кислоты. В столовом уксусе со-
держится 5—9% кислоты (в СССР) или 4% (США), получаемой
из 10—13%-го уксуса. Уксус , с концентрацией 20—30% кислоты
получают путем вымораживания исходного раствора. Лед, кото-
рый образуется в этом процессе, отбрасывается. Процесс концент-
рирования довольно дорог. Путем перегонки получают 70—80%-ю
уксусную кислоту, называемую уксусной эссенцией. Ледяная ук-
сусная кислота содержит 98—99,8% кислоты.
Компоненты уксуса. В спиртовом уксусе обнаружены 8 ами-
нокислот (0,016—0,4 мг/л), витамины группы В (В2, В5, В3), об-
разованные в процессе ферментации, присутствует много летучих
веществ. Всего обнаружено до 27 компонентов; в винном — до
17 летучих компонентов (помимо аминокислот и витаминов), в
сидровом — до 31 летучего компонента, в сусловом — до 48.
Большое количество компонентов (в общем количестве от 2
до 380 мг/л) присутствует в сывороточном уксусе: это и молоч-
ная кислота и лактоза, металлические ионы, ацетоин и 15 ами-
нокислот.
Рис. 47. Ферментер для производства уксусной кислоты погруженным спосо-
бом:
I • - механический сепаратор пены, 2 — отверстие для спуска газов, 3 —
отверстие для инокулирования, 4 — трубка для засасывания воздуха, 5 —
реакционный сосуд, 6 — центральная засасывающая пробирка, 7 — турбина,
8 — электромотор, 9 — конус сепаратора, 10 — линия подачи среды, 11 —
тарелки теплообменника, 12 —держатель, 13 — кран для выхода продукта
209
у
Образование уксусной кислоты гомоацетогенными бактерия- j
ми. Эти бактерии не используют биополимеры, но могут исполь- j
зовать многие гексозы, пентозы и молочную кислоту. Гомоацето- |
генная (как и гомомолочная) ферментация уникальна в том j
смысле, что отношение С, Н и О2 в единственном конечном про-
дукте то же, что и в углеводе. Acetoanaerobium woodii может рас-
ти на среде с муравьиной кислотой, а также утилизировать Н2 + i
+ СО2 и образовывать уксусную кислоту по уравнению: j
2НСОз”+2Н++4Н2^СН3СОО-+Н++4Н2О ' )
AGZ=—104,6 кДж
Такую же реакцию осуществляют и другие бактерии, включая
Cl. aceticum, Cl. thermoautotrophicum, Eubacterium limosum.
Уксусная кислота, по-видимому, является наиболее частым орга-
ническим продуктом в природных ферментациях. На 1 моль глю-
козы A. woodii образует 3 моля уксусной кислоты. Cl. thermoace- i
ticum из гексозы тоже образует 3 молекулы ацетата и очень не- 1
значительное количество других продуктов.
Cl. formicoaceticum образует уксусную кислоту как единствен- |
ный продукт, в течение логарифмической фазы роста, но в ста-
ционарной фазе при низком значении pH накапливает также му-
равьиную кислоту. Химизм процесса, осуществляемого A. woodii,.
представлен ниже (см. с. 211). 1
В этом брожении пируват расщепляется с образованием аце-
тил-СоА, СО2 и 2Н. Превращение ацетил-СоА в ацетат через фос-
фотрансацетилазную реакцию приводит к образованию АТР. На
2 молей пирувата получается 2 моля АТР и 2 моля ацетата.
3-я молекула ацетата образуется при участии переносчиков С-1- ]
соединений: тетрагидрофолята (THF) и кофермента Bi2. На уров-
не кофермента Bi2 исходная СО2 восстанавливается до СН3—- j
Bi2, в которой фиксируется 2-я молекула СО2, a THF и кофермент |
Bi2 освобождаются в реакции. По этому же пути происходит об- I
разование ацетата из гексозы у Cl. therrnoaceticum и у Eubacte- 1
rium limosum {Butyribacterium rettgeri). Обнаружено, что подоб- I
ный тип ферментации осуществляют микроорганизмы, населяю- 1
щие желудок термитов, питающихся древесиной. Получение ук- 1
сусной кислоты с этой бактерией изучалось как в периодических, 1
так и в непрерывных термофильных условиях. Автоматически ]
поддерживали pH на уровне 7,2—7,4 и температуру 60° С. В пе- ]
риодическом режиме выход уксусной кислоты составил 67 весо- I
вых % (г/ЮО мл). Биосинтез уксусной кислоты при непрерывном I
культивировании продолжался более 65 сут. Выход продукта до-1
стигал 77 весовых % при значении цмаКс более 0,2 ч-1. I
Бактерии Cl. therrnoaceticum, образующие уксусную кислоту I
почти в том же количестве, что и уксуснокислые бактерии, име-1
ют перед ними те преимущества, что не требуют аэрации, рас-1
тут при высокой температуре и удобны для налаживания про-1
точного процесса с иммобилизованными клетками, так как аэра-|
ция не будет ограничивать процесс образования продукта. I
210 1
Новые разработки. Предложена математическая модель на-
копления биомассы и образования уксусной кислоты, адекватная
реальному процессу. Модель позволяет прогнозировать техноло-
глюкоза
пируват пируват
со2
ацетат ацета!
F d-ферредоксин
РдН2 ферредоксин восстановленный
THF-тетра гидрофолат, В12 — кофермент
।ический процесс накопления уксусной кислоты при различном
содержании в исходном сусле спирта и ацетата. Показано, что
и вменение соотношения уксусной кислоты и спирта в исходной
среде служит одним из главных факторов интенсификации уксус-
нокислой ферментации.
Ряд исследований посвящен налаживанию процессов с иммо-
билизованными клетками Acetobacter и Cl. therrnoaceticum. Био-
катализатор с уксуснокислыми бактериями работает при исполь-
зовании твердых носителей и связывании с ними по принципу
адсорбции. Несмотря на длительное образование уксусной кис-
211
лоты с высокой скоростью и высокую стабильность иммобилизо
ванных клеток, они сильно лимитируются кислородом и накапли
вают лишь 30—75 г/л кислоты (вместо 143 г/л у свободных кле
ток). В принципе считают, что биокатализаторы на.основе А. асе
ti, иммобилизованные на К-карагенане, керамике, полых поли-
пропиленовых волокнах, гидроокиси титана, могут быть рекомен
дованы для промышленного получения уксусной кислоты после
решения проблемы эффективной аэрации реактора. Предложено
например, использование воздуха, обогащенного кислородом, а
также применение системы с рециклизацией воздуха.
Вместе с тем при иммобилизации на поверхности различных
твердых носителей клеток анаэробного Cl. thermoaceticum проб*
лемы с аэрацией нет и в подобранных оптимальных условиях: рр
6,7—7,4, /=60° С, D — 0,04—3 ч-1, биокатализатор работает с вы
сокой производительностью — более 5 г/л-ч. Более того, недав-
но показано, что иммобилизованные клетки Cl. thermoaceticun
имеют в 4—7 раз более высокую объемную продуктивность п<
сравнению с неиммобилизованной культурой, выращиваемой I
проточном режиме в реакторе с перемешиванием без рециклиза
ции. При иммобилизации на комочках кукурузной кочерыжкр
клетки образуют внеклеточные фибрилы (которых не было у свО'
бодных клеток). Реактор с твердой упаковкой иммобилизованные
клеток работал в строго анаэробных условиях при 60° боле(
30 дней без потери жизнеспособности, заражения или уплотнения
укладки. Получение уксусной кислоты новым способом с помощьк
иммобилизованных клеток CL themoaceticum рекомендуют для
промышленного производства. Клетки Cl, thermoaceticum, заклю-
ченные в К-карагенан, образуют уксусную кислоту с максималы
ной продуктивностью 6,9 г/л-ч и с конечной концентрацией ук-
сусной кислоты 19 г/л (в среде 40 г/л глюкозы).
Выделены мутанты Pachisolen tannophilus, которые способны
образовывать значительные количества уксусной кислоты из
многих сахаров.
ЛИТЕРАТУРА
Мюллер Г., Л и т ц П., Мюнх Г. Д. Получение уксусной кислоты. Микро-
1977.
биология пищевых продуктов растительного происхождения. М.,
С. 261—268.
Ebner Н. V i n е g a r//Prescott a. Dunn’a Industrial Microbiology. 4 ed.
P. 802—834.
Биотехнология. Принципы и применение/Ред. И. Хиггенс и др. М.,
С. 141 — 147.
1982.
1988.
МОЛОЧНАЯ КИСЛОТА
В 1847 г. С. Блондо впервые показал, что молочная кислота
(СНзСНОНСООН) получается в результате брожения, а Л. Пас-
тер установил, что брожение вызывают бактерии. С помощью мо*
212
лочнокислых бактерий молочная кислота производится уже с
1881 г. Она была одним из первых продуктов, который стали по-
лучать микробиологическим путем. Теперь химический метод ее
получения сильно конкурирует с биологическим, но стоимость
продукта, получаемого одним и другим способом, одна и та же.
Применение. Молочную кислоту используют в пищевой про-
мышленности, при этом она должна иметь высокую степень очи-
стки. Она нужна при изготовлении лимонадов, сиропов, марме-
лада и фруктовых напитков, в кормах для жвачных. Молочная
кислота обладает антимикробным действием и применяется для
консервирования некоторых пищевых продуктов (рыбы, маслин).
Некоторые эфиры молочной кислоты служат хорошими эмуль-
сификаторами; лактат-Са применяется в фармацевтике как ис-
точник Са. Молочная кислота, получаемая биотехнологическим
путем из возобновляемых субстратов или отходов, служит потен-
циальным сырьем для химических синтезов, осуществляемых че-
рез лактонитрилы; ее используют также для получения лактид-
ных полимеров, акриловой кислоты.
Поскольку гомоферментативные молочнокислые бактерии не
образуют СО2 из сахаров, углеводный субстрат более эффектив-
но утилизируется в молочной кислоте в процессе молочнокисло-
го брожения, чем в этаноле, образуемом в процессе спиртового
брожения.
Продуценты. Для промышленного получения молочной кисло-
ты используют только гомоферментативные молочнокислые бак-
терии. Бактерии представлены кокковидными и палочковидными
формами, обычно неподвижны, каталазоотрицательны, неспоро-
образующие (исключение — бактерии вида Sporolactobacillus).
К характерным особенностям бактерий относят: 1) образова-
ние молочной кислоты при брожении (выдерживают до 1,5% мо-
лочной кислоты, некоторые еще больше), 2) высокую кислотоус-
тойчивость; сохраняют жизнеспособность при pH 3,5 и ниже,
3) спиртоустойчивость (выдерживают до 16% этанола). К другим
особенностям бактерий относятся: отсутствие гема, широкое ис-
пользование флавинов в окислительно-восстановительных фер-
ментах, отсутствие ЦТК и окислительного фосфорилирования, по-
требность в коферменте Bi2 для работы рибонуклеотидредуктазы.
Многие лактобациллы (а также педиококки и лейконостоки)
содержат большое количество двухвалентного Мп и не содержат
пли почти не содержат Fe. Например, типовой штамм Lactobacil-
lus plantarum АТСС 14917 является единственным из организмов
с абсолютным отсутствием потребности в Fe. Предполагается, что
роль Мп связана с аэротолерантностью и удалением О2 и воз-
можно ОН, образующихся в процессе метаболизма этих бакте-
рии.
Молочнокислые бактерии включают в два семейства: Lacto-
bncillaceae и Streptococcaceae, в каждом из которых имеются как
гомо-, так и гетероферментативные бактерии (табл. 36). В про-
мышленности для получения молочной кислоты применяют тер-
213
мофильные палочковидные штаммы видов Lactobacillus delbrii~\
eckii, Lb. bulgaricus и Lb. leichmanii, которые быстро растут и j
образуют много молочной кислоты за короткое время. Бактерии ’
культивируют при t 50° С. Если используют пентозы как субстрат ’
Таблица 36
Виды молочнокислых бактерий,'
имеющие наиболее важное значение для промышленности
Lactobacilaceae
р. Lactobacillus
р. Lactobacillus
Streptococcaceae
р. Streptococcus
р. Pediococcus
р. Leuconostoc
Семейства и роды
Главные виды
гомоферментативные
Термофилы
Lb. helveticus
Lb. bulgaricus
Lb. lactis
Lb. acidophilus
Мезофилы
Lb. casei
гетероферментативные
Lb. f erment i
Lb. brevis
Lb. reuteri
гомоферментативные
Мезофилы
S. lactis
S. cremoris
Термофилы
S. thermophilus
Мезофилы
P. pentosaceum
Термофилы
P. acidi lactici
Мезофилы
L. cremoris
Главные продукты брожения
D( — )L(+) и DL-
молочная кислота
I
I,
DL-молочная кислота i
CO2, уксусная кислота„ \
этанол
L( Д-)-молочная кислота J
L( -ф )-лактат
DL-лактат
D( —)-молочная кислота,
CO2, этанол, уксусная
кислота
(например, сульфитная жидкость), то применяют соответствую-
щие штаммы — Lb. pentosus. Для сбраживания молочной сыво-
ротки нужны Lb. bulgaricus, Streptococcus lactis и Lb. casei. Для
получения лактата из малеиновой кислоты используют Lb. casei.
214
Молочную кислоту можно получать из биодеградабельных лак-
тидных полимеров, и это вызывает растущий интерес к биотехно-
логическому получению молочной кислоты. Известны продуценты
молочной кислоты и среди грибов (например, Rhizopus oryzae),
но промышленных процессов с использованием грибов нет.
Молочнокислые стрептококки (S. thermophilus, S. lactis, Leuc.
cremoris) образуют исключительно L ( + ) -молочную кислоту.
Lb. lactis и Lb. bulgaricus ~90% Щ—)- и Lb. helveticus —
1/3 D(—) и 2/3 L ( + )-молочную кислоту. Лейконостоки образуют
преимущественно D(—)-молочную кислоту. Получение А ( + )-мо-
лочной кислоты зависит от выбора штамма, условий биосинтеза
и его хранения. Одно время полагали, что для пищевых целей
пригодна только L (+) -молочная кислота, что давало большое
преимущество ферментационному способу получения перед хими-
ческим. Но в настоящее время так не считают, хотя для некото-
рых целей требуется определенный стереоизомер.
Биосинтез. У гомоферментативных молочнокислых бактерий
только 3% субстрата превращается в клеточный материал; ос-
тальная часть его конвертируется в молочную кислоту. Ее накап-
ливается до 1,5%, а pH снижается при этом до 3,5, но в случае
Lb. acidophilus может образоваться более 2% молочной кисло-
ты. Побочные продукты накапливаются в ничтожном количест-
ве. Гетероферментативные бактерии образуют много различных
продуктов и неудобны для промышленных целей. У гомофермен-
тативных молочнокислых бактерий глюкоза расщепляется по
гликолитическому пути и образованный при окислении ЗР-глице-
ринового альдегида NADH2 далее переносится через NAD-зави-
симую лактатдегидрогеназу на пируват, который стереоспецифи-
чески восстанавливается в £( + )“ или D(—)-молочную кислоту:
ЗР-глицериновый
NAD ------
альдегид
----лактат
i
лактат
дегидрогеназа
nadh2
1,3-дифо сфо глицерат
пируват
Теоретически из 1 моля глюкозы образуются 2 моля лактата,
на практике выход составляет — 90%, т. е. образуется более
1,8 моля молочной кислоты из 1 моля глюкозы. Если из 1 моля
глюкозы образуется менее 1,8 моля лактата, то такие бактерии
относят к гетероферментативным, поскольку наряду с молочной
кислотой они образуют еще уксусную и муравьиную кислоты,
этанол и СО2. Следует, однако, заметить, что такое подразделе-
215
ние весьма условно, так как известны условия, при которых го^
моферментативное брожение превращается в гетероферментатив-^
ное. К таким условиям относится кислотность среды. При pH 5,0—
6,8 пируват, образованный при гликолизе, восстанавливается до
лактата. В нейтральной или слабощелочной среде пируват час-
тично превращается в муравьиную, уксусную кислоты и этанол
в отношении 2:1:1. Далее, при низких концентрациях глюкозы
в среде гомоферментативное брожение также превращается в ге-
тероферментативное. Такое же явление имеет место при исполь-
зовании бактериями галактозы в качестве источника углерода.
Любопытно, что при росте на лактозной среде (в состав лактозы
входит галактоза) брожение имеет характер гомоферментатив-
Н0ГО.
При периодическом культивировании S. lactis 651 в среде с
глюкозой или лактозой наблюдали гомолактоферментацию, а при
непрерывном культивировании на среде с глюкозой характерна
гетеролактоферментация. На среде с мальтозой в непрерывных и
периодических условиях также происходила гетеролактофермен-
тация. Если скорость, разведения в хемостате снижалась так, что
глюкоза или лактоза оказывались лимитирующими факторами»
то конечными продуктами брожения 3. lactis становились муравь-
иная, уксусная кислоты и этанол (что указывало на энергетиче-
ское обеспечение клеток по механизму формиатлиазной реак-
ции).
На ход брожения может оказывать воздействие аэрация. Из-
вестно, что бактерии не содержат цитохромов и ферментов ЦТК
и в анаэробных условиях осуществляют брожение. Но показано»
что они могут индуцировать НАДН-оксидазу и поглощать кисло-
род с образованием Н2О2. Аэробный метаболизм может приво-
дить к ингибированию роста и превращению пирувата не в лак-
тат, а в другие продукты, поэтому молоко надо защищать от
насыщения кислородом. Вместе с тем на нерастущих клетках ге-
тероферментативных бактерий показано, что при избытке глю-
козы они осуществляют типичное гомоферментативное брожение.
Регуляция процесса брожения происходит на уровне регуляции
активности фермента (ферментов). Путь образования продуктов
молочнокислого гомоферментативного брожения представлен на
схеме.
Поглощение лактозы бактериями связано с РЕР-зависимой
фосфотрансферазной системой, и, как полагают, в процессе тран-
спорта происходит фосфорилирование лактозы. Система тран-
спорта лактозы может быть закодирована в плазмидах. В регу-
ляции молочнокислого брожения, осуществляемого молочнокис-
лыми стрептококками, важное значение придают пируваткина-
зе — аллостерическому ферменту, который сильно активируется
восемью интермедиатами лактозного метаболизма от гексозо-Р до
триозо-Р. При малом содержании глюкозы в среде внутриклеточ-
ная концентрация активаторов пируваткиназы сильно снижает-
ся, в результате чего имеющийся в клетках РЕР может быть из-
216
расходован на активацию молекулы сахара и транспорт его в
клетки.
лактоза
фосфотрансферазная система
цитоплазм, мембрана
лактозо-РР (интермедиат!
галактозо-бР
ГПЮКОЗО-6Р
гагатозо-бР
фруктозо-6Р
гагатозо-1.6РР
фруктозо-! ,6РР
глицериновый альдегид-Р -*
диоксиацетон-Р
РЕР
пируват
формиат
пактат
ацетат
этанол
* - активатор пируваткиназы
- активатор лактатдегидрогеназы
Соотношение продуктов брожения зависит от активности дру-
гого аллостерического фермента — лактатдегидрогеназы. Этот
фермент регулируется аллостерическим эффектором — фрукто-
зо-1,6 РР. Если имеется высокая концентрация субстрата и уве-
личивается сродство аллостерического эффектора к ферменту
(например, при высоком содержании протонов — низкие значе-
ния pH), то происходит активация лактатдегидрогеназы и обра-
зуется главным образом лактат.
В условиях низких концентраций субстрата лактатдегидроге-
наза неактивна, а бактерии превращают пируват другим путем
в формиат, ацетат и этанол, получая при этом дополнительную
-шергию. Таким образом, деление бактерий на гомо- и гетерофер-
ментативные на основании продуктов брожения весьма условно.
Однако из сказанного ясно, что для наиболее полного превраще-
ния субстрата в лактат необходимо работать с высокими концент-
рациями углеводов, поддерживать значение pH ниже 7,0 (лучше
5,0—6,8) и не допускать аэрации или значительного содержания
кислорода в ферментационной жидкости.
3 Л. И. Воробьева
217
Более четкое разграничение на гомо- и гетероферментативныеЯ
бактерии можно получить на основании энзиматических опреде-Я
лений. Я
Гомоферментативные. Имеют фруктозодифосфатальдолазу и. Я
не имеют бР-глюконатдегидрогеназы и глюкозо-бР-дегидрогеназы..Я
Гетероферментативные (образуют СО2, требуют тиамин). Со-Я
держат указанные выше дегидрогеназы, но не имеют фруктозоди- Я
фосфатальдолазы. Факультативные. Содержат все ферменты и. Я
могут использовать любой из путей (гликолитический, фосфоке-
толазный, пентозомонофосфатный). Нельзя не упомянуть о том,. Я
что гомоферментативные бактерии отличаются от гетерофермен-Я
тативных высокой потребностью в питательных субстратах, т. е..Я
менее развитыми синтетическими способностями. Их потребно-Я
сти в ростовых факторах даже могут превышать таковые у выс-И
ших животных, что в значительной мере объясняется отсутстви-Я
ем у гомоферментативных бактерий пентозного пути, поставляю-Я
щего пентозы и эритрозы для синтеза азотистых оснований и аро-Я
магических аминокислот: тирозина и фенилаланина. Я
Сырье для получения молочной кислоты. Используют мелассугЯ
осахаренный картофельный затор, к которым добавляют источ-Я
ники витаминов — солодовый и кукурузный экстракт, минераль-Я
ные соли, источники азота и фосфора. При сравнении различных Д
углеводов лучшие результаты (выход молочной кислоты 86%) по-Я
лучили при использовании Д-глюкозы. Глюкозу удалось заменитьЯ
гидролизатами древесины и лучшим биокатализатором оказалисьЯ
иммобилизованные в альгинат-Са клетки Lb. plantarum ЕТНЯ
В-4258. Я
Для оптимизации условий культивирования хорошие резуль-Я
таты получены при использовании математического метода по-Я
верхности отклика. За 56 ч работы биокатализатора (10 г кле-Я
ток) при добавлении к гидролизату древесины (2—7% восста-Я
навливающих сахаров) 1%-го дрожжевого экстракта получилиЯ
38 г/л молочной кислоты. Использовали метод непрерывной ре-Я
циркуляции субстрата. Я
В качестве субстратов в Финляндии предложено использоватьЯ
ультрафильтраты молока и сыворотки с добавлением к ним дрож^Я
жевого экстракта, гидролизата белков (казеина или белка сыво-Я
ротки)? кукурузного экстракта. Максимальная продукция молоч-Я
ной кислоты без добавок и с вышеуказанными добавками к уль«Я
трафильтрату молока и сыворотке при использовании Lb. helve^K
ticus составляла соответственно 0,60, 1,74 и 1,51 г/л-ч. ВыходЯ
молочной кислоты за 30 ч ферментации — соответственно 36, 7ёЯ
и 82% от теоретического, а утилизация лактозы на 43, 94 нН
98%. Установлено, что более 70% молочной кислоты, образования
ной в периодическом процессе, выделяют нерастущие клетки, осо^Я
бенно если к среде не внесены добавки. Скорость продукции моЯ
лочной кислоты можно увеличить при использовании ультрафиль^И
трата без добавок, если молочная кислота образуется нерастущиЯ
ми клетками инокулята, выращенного и пассированного в снятомЯ
218
t
молоке. Способ обладает практической ценностью, так как уль-
трафильтраты молока — это побочные продукты молочной про-
мышленности. Л( + )-молоч-ную кислоту можно получать из отхо-
дов производства фруктового сока путем ферментации Lactoba-
cillus sp. при pH 3,7. Выход продукта составляет до 5 г/л. До-
бавление к мелассной среде технической инвертазы при брожении
Lb. delbruckii позволяет более чем на 80% поднять выход молоч-
ной кислоты. (Видимо, за счет обогащения субстрата глюкозой.)
Потенциальным сырьем для получения лактата служит суль-
фитная жидкость. Из жидкости удаляют SO2 и лигнин, вносят не-
обходимые добавки (в том числе солодовые ростки как источник
азота), t 30° С. Пентозы составляют значительную часть суль-
фитной жидкости и могут сбраживаться Lb. pentosus, правда бо-
лее медленно, чем глюкоза. Этот организм используют для про-
изводства молочной кислоты. Через 40—48 ч максимальный вы-
ход составляет 2,1%.
В качестве сырья уже давно применяют сыворотку молока и
Lb. bulgaricus как продуцент, использующий лактозу (t° 43° С).
Выращивание бактерий осуществляется на пилотных установках
в проточной культуре. Таким образом, наряду с периодическим
культивированием возможно и непрерывное культивирование бак-
терий. Для ускорения последнего процесса предложена смешан-
ная культура, максимальная продуктивность с которой составила
3,7 г/л-ч. Процесс работал 64 дня. В промышленных масштабах
проточное культивирование ведется очень ограниченно, например
п|)и использовании сыворотки молока.
Получение в промышленности
Ферментация. Ежегодно микробиологическим путем получают
более 20 тыс. т L ( + ) -молочной кислоты. Хотя молочнокислое
брожение протекает в анаэробных условиях, организмы относят
к факультативным анаэробам и воздух из ферментеров полно-
чью не удаляют, поскольку бактерии малочувствительны к кис-
лороду.
В качестве сырья чаще всего используют мелассу из свеклы
и сахарного тростника, а также гидролизованный крахмал. В сре-
зу вносят (NH4)2SO4 и NH4HPO4, а также вещества, служащие
факторами роста, например солод и кукурузный экстракт. Кон-
центрация сахара в среде не должна быть более 12%. Иначе лак-
ни Са может кристаллизоваться в ферментере, затрудняя пере-
мешивание содержимого.
При подготовке инокулята бактерии пассируют несколько раз
н среде с небольшим избытком мела, выдерживая при t 45—
33'’ С. Каждая стадия длится 16—18 ч. В ферментер вносят 5%
инокулята. Начальное значение pH 5,5—6,0. Во время фермен-
|лции периодически вносят Са(ОН)2, СаСОз или MgCO3 для ней-
। рализации образующейся кислоты, высокое накопление которой
угнетает рост бактерий. Периодически включается мешалка для
перемешивания мела.
219
Брожение обычно ведут при 49—50° С, при слабокислом зна*
чении pH, что облегчает сохранение относительной стерильности
Среда не стерилизуется. По этим причинам брожение несложнС
в техническом отношении (по сравнению с ацетоно-бутиловым
например).
Продуцентами служат различные штаммы вида Lactobacillus
чаще всего Lb, delbriieckii. В промышленности осуществляете!
ферментеры
главным образом периодическая ферментация;
име*
ют объемы на 25 тыс. л или 113 500 л. На рис. 48 приведена тех
нологическая схема получения молочной кислоты с помощь
Lb. delbriieckii.
*
Рис. 48. Технологическая схема производства молочной кислоты из мелассы ,
помощью Lb. delbruckii: 1 — меласса, 2 — дозировочное устройство, 3 — та!
для перемешивания и стерилизации, 4, 5 — питательные соли, 6 — CaCQ
7 —• ферментер, 8 — фильтр, 9 — танк с мешалкой, 10 — H2SO4, 11—вакуум
ный барабанный фильтр, 12—15 — ступени очистки, 16 — вакуум-выпарнс
аппарат, 17 — лагерный танк, 18 — розлив
В связи с выделением тепла при метаболизме бактерий еГ
отводят путем охлаждения ферментера. Время ферментации £
двух до семи дней в зависимости от концентрации ‘углевод^
Важно, чтобы остаточного сахара было не более —0,1% ид
220
меньше, так как он затрудняет выделение молочной кислоты. За-
ражения могут вызывать термофильные клостридии, и тогда на-
ряду с лактатом образуются бутанол и масляная кислота. Такой
продукт может быть использован только в кожевенной промыш-
ленности для декальцинирования кож.
Выделение молочной кислоты. Главные проблемы возникают
не при ферментации, а при выделении молочной кислоты, которая
плохо кристаллизуется с низким выходом и в самом чистом виде
представляет собой бесцветный сироп, который легко поглощает
воду. В продаже это обычно 65%-е растворы молочной кислоты.
По окончании ферментации культуральная жидкость нейтра-
лизуется и фильтруется для отделения бактериальных клеток.
Фильтрат (содержит 12—13% молочной кислоты) подвергают
многоступенчатой очистке (12—15) после того, как лактат Са
обрабатывают серной кислотой для выделения молочной кисло-
ты. (Легче очищать Zn-соли лактата и осуществлять очистку пу-
тем экстракции ее растворителем или путем отгонки его метило-
вого эфира.) Фильтрат сгущают до нужной концентрации в ва-
куум-выпарном аппарате (16) до желаемой концентрации. Пи-
щевая молочная кислота слабо-желтого цвета, содержит —50%
общих кислот. Ее получают путем сбраживания чистых сахарных
растворов с минимальным содержанием белков. Молочная кис-
лота1 «USP» — бесцветная жидкость; концентрация целевого^
продукта 76—78%, летучих кислот 2—35% и золы 0,5—1,0%.
30% молочной кислоты находится в виде полимеров: лактида,
линейного полимера или их смеси. Не исключено, что получение
/,( + )-молочной кислоты с помощью Rhizopus будет предпочти-
тельнее перед бактериальной ферментацией, так как в первом
случае время ферментации короче (48 ч), а очистка продукта
легче, чем во втором, ибо грибы растут на средах простого соста-
ва. Выход молочной кислоты одинаков, но кристаллы продукта
ферментации Rhizopus бесцветные и негигроскопичные, но при
потере воды они имеют тенденцию к разжижению.
При химическом способе сырьем служит лактонитрил — по-
бочный продукт производства акрилонитрила:
CH3CHOHCN СН3СНОНСООН
(лактонитрил) (молочная кислота)
Поскольку первоисточником лактонитрила служат углеводоро-
ды нефти, запасы которой ограничены, а сам лактонитрил до-
вольно дорог, производство лактата путем ферментации снова
станет конкурентоспособным. На фирме Rhone—Poulenc молочную
и щавелевую кислоты получают при непосредственном окислении
1 Продажная молочная кислота — это L(4-)-> D(—)-изомер, или рацемическая
« мель. Буквы обозначают название кислот, знаки направление вращения
плоскости поляризованного света.
221
г
получения^
субстрата^
составлял-
субстрата-!
О ___ _ _ .. ?
пропилена с помощью NO2 и О2 с образованием у-нитратопропи-
новой кислоты, которая гидролизуется водой при 100°.
Новые разработки. j
Использование иммобилизованных клеток
Лактобациллы хорошо выдерживают иммобилизацию в альги-1
нате Са и долго сохраняют способность к образованию молочной^
кислоты, что позволило разработать проточный процесс
молочной кислоты с использованием рециклирования
через колонный биореактор. Выход молочной кислоты
4,8% за 5 ч работы реактора при 90 -95% конверсии
в продукт. В традиционной ферментации получают такой уровень!
конверсии за 4—6 дней, т. е. иммобилизованные клетки фермен-1
тируют глюкозу с относительно высокой скоростью. ]
В альгинате Са и в периодическом режиме культивирования
хорошо работали клетки Lb. pentosus, сбраживая углеводы суль-J
фитной жидкости. За 70 ч было получено 40 г/л молочной кисло-1
ты. Lb. bulgaricus, иммобилизованный в том же геле, в рецикл
лирующем периодическом процессе при ферментации лактозы!
(5—9%), превращает ее на 55—60% в молочную кислоту. Пря
проточном культивировании получают 37—44% молочной кисло!
ты из 5—10%-го раствора лактозы за 12,5 ч. 1
Если используют сыворотку молока, то с иммобилизованной!
Lb. bulgaricus уровень конверсии в молочную кислоту составляв
ет 70%, а из деминерализованной сыворотки — 80% за 90 ч. Ре-?
актор с твердой упаковкой работает стабильно. С иммобилизо4
ванными клетками получали 1,4—2,1% молочной кислоты. В це4
лом иммобилизованные клетки лактобацилл можно применять каю
биокатализатор для превращения в молочную кислоту различный
субстратов в реакторах периодического и проточного действия»!
Показано, что такой биокатализатор годен для получения молоч-*
ной кислоты из разбавленных сточных вод, содержащих гексозьп
и пентозы, из гидролизатов древесины и побочных продуктов мо-
лочной промышленности, а также для предферментации (пони-1
жение значения pH) молока. j
Непрерывное культивирование свободных клеток. Масштаби-j
рованное получение молочной кислоты налаживают в ЧССР с
использованием Lb. delbrtleckii при непрерывном культивирова-j
нии бактерий. Ферментацию проводят при 48°, /7 = 0,163 ч1, на-1
чальной концентрации глюкозы 40 г/л. При использовании сед-|
ловидной насадки получают 25 г/л молочной кислоты, а при ис-|
пользовании биореактора с насадкой из стеклянных шариков прш
начальной концентрации глюкозы 70 г/л получают 80 г/л молоч4
ной кислоты за 120 ч. I
Математические модели. Датскими учеными разработана ма4
тематическая модель, удовлетворительно описывающая процесс!
стационарного режима в хемостате, а также динамику переход*!
ных процессов. Модель позволяет осуществлять компьютерный
контроль и оптимизацию процесса получения молочной кислоты]
222
Другая математическая модель (/иггу-моделирование) 1 пред-
ложена финскими исследователями. В нее удалось включить всю
доступную информацию о процессе. Использование модели по-
зволило успешно предвидеть и оптимизировать процесс образо-
вания лактата, что явилось подтверждением правильности и по-
лезности техники fuzzy-моделирования.
ЛИТЕРАТУРА
(васников Е. И., Нестеренко О. А. Молочнокислые бактерии и пути
их использования. М., 1975.
I стер со н Г. Э. Промышленное использование микроорганизмов — некото-
рые современные открытия в области молочного дела//Тр. 21-го межд. мо-
лочного конгресса. 1982. Т. 2. С. 230—241.
Bottazzi V. Other fermented dairy products//Biotechnology. 1983. Vol. 5,
Ch. 5. P. 315—365.
,awrence R. C., Thomas T. D. The fermentation of milk by lactic acid bac-
teria//Microbial technology. Current state, Future prospect. 1979. P. 186—
219.
J nko P., S t e n г о о d s S. L., L i n k Y. Y. Appl. of Immob. lactic acid Bacteria//
//Ann. N. Y. Acad. Sci. 1986. Vol. 25, N 1. P. 406—417.
. ockwood L. B. Production of organic acids by fermentation//Microbial tech-
nology, Microbial process. 1979. Vol. 1. P. 356—387.
(obinson K. H.//Dairy Ind Int. 1981. Vol. 46, N 6. P. 15.
I. de Roissart. Les bacteries lactiques.//Rev. des Enil. 1981. Vol. 66. P. 29—33.
ГЛЮКОНОВАЯ КИСЛОТА. ГЛЮКОНАТЫ,
ОКСИГЛЮКОНАТЫ
Применение. Свободная глюконовая кислота применяется при
обработке металлов, кожи, в производстве красок, а также в мо-
лочной промышленности для целей очистки оборудования, в пи-
щевой промышленности для улучшения вкуса. Ее соли (Fe-глю-
конат и Fe-фосфоглюконат) используют в железотерапии. Са-глкь
конат служит источником Са в медицинской и ветеринарной прак-
тике.
Глюконат Na применяют как очищающий агент во многих де-
тергентах. Он обладает металлокомплексующими свойствами и
является главным продажным (из соединений глюконовой кисло-
ты) продуктом на рынке. б-Глюконолактон используют главным
образом в пищевой промышленности, например, он входит в со-
слав пекарских порошков, в Японии служит коагулянтом соево-
го белка (для получения сгустка соевых бобов).
Ежегодная продукция глюконовой кислоты и ее солей —
15 тыс. т. Практическое применение имеет и фермент глюкозоок-
1 При составлении fuzz (/-модели предполагают некоторые зависимости записы-
вать произвольно (предположительно) и далее производить сравнительную
проверку результатов, полученных на базе этого предположения и экспе-
риментальных данных. В случае несовпадения принимают другие зависимо-
сти и так до тех пор, пока не получится хорошее соответствие.
223
сидоредуктаза (GOD), ответственный за образование глюконовой
кислоты.
Технические препараты GOD с различной каталазной актив-
ностью широко используют в приготовлении пищи в тех случаях,
когда требуется удалить глюкозу или предотвратить окислитель-
ные изменения в пиве, соках, майонезе, молочном порошке.
Высокоочищенные препараты GOD используют в медицине
для количественного определения глюкозы в жидкостях тела.
GOD применяют в глюкозных электродах Кларка и в других био-
сенсорах.
Продуценты. Многие микроорганизмы могут осуществлять де-
гидрогенирование глюкозы. Это Asp. niger, Регк chryzogenum,
Pen. luteum-purpurogem и другие штаммы Penicillium, Acetobac-
ter spp. (особенно Gluconobacter oxydans), различные виды Pse-
udomonas, Vibrio, Pullularia pullulans, виды Moraxella, Endomy-
copsis, Scopulariopsis, Gonatobotrys. Многие бактериальные штам-
мы производят дальнейшее окисление глюконата до кетоглюко-
новых кислот. В промышленности используют главным образом
Asp. niger и в некоторых случаях также A. suboxydans.
Биосинтез. Получение глюконата Са. В настоящее время в
промышленности применяют только погруженный процесс и пе-
риодическое культивирование вышеуказанных штаммов. При мик-
робиологическом получении важно использование такого организ-
ма и условий культивирования, при которых конверсия глюкозы
в глюконовую кислоту происходит быстро и полно и останавлива-
ется на стадии образования глюконата. Глюконовая кислота и
ее б-лактоны образуются при дегидрировании D-глюкозы.
5-D- глюконолактон
0-глюкоза
О
С"-----
Н—С—ОН
I О
НО—С—Н
Н—С—ОН
н—С-----
СН90Н
СООН
н—с—он
но—С—н
Н—с—он
I
I
н—с—он
I
СНо0Н
глюкановая
кислота
Рис. 49. Получение глюконовой кислоты из глюкозы
У Penicillium notatum и других плесневых грибов 1-ю сту-j
пень — превращение глюкозы в б-глюконолактон (рис. 49) — ка-1
тализирует глюкозооксидоредуктаза (p-D-глюкоза: О2-оксиредук-^
224
таза, GOD ЕС 1.1.3.4). Вначале она была описана как антибио-
тик (пенициллин В, нотатин) в связи с ингибирующим действи-
ем на рост бактерий. Причина ингибирования заключалась в об-
разовании Н2О2.
Глюкозооксидоредуктаза обладает высокой специфичностью к
fVD-глюкозе. В реакции образуется Н2О2 при переносе Н2 от
EADH.2 на кислород. При участии каталазы Н2О2 разлагается на
воду и кислород, а d-лактон спонтанно гидролизуется в глюко-
повую кислоту.
Грибной продуцент глюконовой кислоты выращивают в среде,
включающей в себя глюкозу, NH4NO3, (NH^HPCU КН2РО4,
MgSO4-7H2O, пептон, СаСО3. Оптимальную конверсию получают
при содержании глюкозы 150—200 г/л и pH 5,0. При добавлении
к среде солей бора концентрацию глюкозы можно увеличить до
350 г/л. При этом образуется Са-В-глюконат — хорошо раство-
римое соединение (в отличие от Са-глюконата), что не мешает
дальнейшей конверсии субстрата.
Хорошие результаты получают при первоначальном внесении
лишь части глюкозы, а после нейтрализации кислот мелом —
дополнительного и постепенного внесения остальной части глю-
козы. В этом процессе возможно количественное превращение
глюкозы и получение более 600 г/л глюконата.
Таким образом, микробиологическое превращение глюкозы в
глюконат — высокоэффективный процесс, и наиболее узкое мес-
то в нем — выделение глюконатов, поскольку большая часть их
имеет очень высокую растворимость и с трудом кристаллизуют-
ся из смешанных растворов.
Получение Na-глюконата. Главное различие в проведении
ферментации для получения Са- и Na-глюконата состоит в исход-
ной концентрации глюкозы, конечной концентрации глюконата и
контроля pH. В первом случае поддержание pH производят за
счет внесения водной суспензии мела во время ферментации; во
втором производится автоматическое поддержание pH на уровне
6,5 путем добавления раствора NaOH. Значение pH не должно
быть ниже 6,5 после инокулирования. Требуются аэрация (1,0—
1,5 об. воздуха/об. жидкости) и перемешивание. Среда содержит
250—300 г/л глюкозы, кукурузный экстракт и питательные соли.
Если инокулят представляет собой прорастающие споры гриба,
то 300 г глюкозы превращаются в глюконат за 36 ч ферментации.
Почти все используемые штаммы Aspergillus образуют смесь кис-
лот: глюконовой, лимонной и щавелевой. От лимонной кислоты
избавляются с помощью Мп2+, присутствующего в кукурузном
жстракте, но присутствие Na благоприятствует образованию ща-
велевой кислоты многими штаммами. Известен один штамм —
NRRL3, который образует только лактон и глюконовую кислоту.
П зоне оксоглюконатов Gluconobacter oxydans содержит
два фермента: хинопротеиновую глюкозодегидрогеназу (ЕС
1.1.99.17) и растворимую NADP-связанную глюкозодегидрогеназу
(ЕС 1 71.47). Gl. oxydans АТСС 621-Н-культивировали в перио-
225
дическом режиме. Глюкоза окисляется до глюконата и далее до
кетоглюконата. Причем обнаружено, что первый из упомянутых
ферментов обладает большей активностью, чем растворимая глю-
козодегидрогеназа, откуда делают вывод, что окисление глюко-
зы в глюконат происходит внеклеточно и главным образом за
счет работы мембранно-связанного фермента. Окисление глюко-
зы и глюконата происходит одновременно, поэтому полагают, что
последний процесс как-то регулируется скоростью окисления
глюкозы. Бактерии могут образовывать как 2 оксо-, так и 5 оксо-
но—с—н
I
н—с—он
I 0
но—с—н
н—с—он
н—с--------
СН2ОН
ДО-глюкопираноза
О
С-------------------------
Н—С—ОН О
ДО-глюкоза:
---------------------------------------------- |_j-Г-:-1
кислородоксидоредуктаза---------------|
Н—С — ОН
Н-------------------------С:—ОН
СН2ОН
D-глюко но-5-лактон
О
с—ОН
н—с—ОН
- но—с—Н
н—с—он
н—с—он
сн2он
D-глюконовая кислота
''
О
с—он
н—с—ОН
но—с—н
н—с—он
с=о
I
сн2он
5-о к си глюконовая
кислота
Pseudomonas
——....
О
С—ОН
С=О
НО—С—Н
н—с—ОН
н—с—он
сн2он
2-оксиглюконовая кислота
।
i
I
♦
О
С—ОН
с=о
но—с—н
I
н—с -эн
сн2он
2,5-д ио к си глюконовая
кислота
226
глюконат, что зависит от природы штамма и условий его культи-
вирования. Gl. oxydans превращает D-глюкозу в смесь 2-оксо- и
5-оксоглюконат. Обычно превалирует 5-оксоглюконат, а 2-оксо-
глюконат образуется в следовых количествах.
Для получения 2,5-диоксоглюконата из глюкозы можно ис-
пользовать Gl. melanogenum: D-глюконо-б-лактон служит интер-
медиантом в образовании D-глюконатов этими организмами. Со-
ли D-глюконата — хороший субстрат для роста штаммов Pseudo-
monas и конверсии субстрата в 2-оксоглюконат (см. выше). Мно-
гие виды Pseudomonas аккумулируют 2-оксоглюконат в растворах
глюкозы с выходом до 90%. 2-оксоглюконат — единственный из
оксоглюконатов, который производится в промышленном масшта-
бе. Условия ферментации те же, что при получении глюконата
Са грибами.
Выделение глюконата Са. При выделении глюконата Са вна-
чале отделяют мицелий и другие твердые частицы, к фильтрату
добавляют активированный уголь, далее его отфильтровывают и
раствор упаривают до концентрации 15—20% глюконата Са. При
охлаждении до 0° С кристаллизуется большая часть глюконата.
Кристаллы центрифугируют и промывают холодной водой.
Глюконат Na. Фильтрат концентрируют до 42—45%, pH до-
водят до 7,5 с помощью NaOH и высушивают. Более очищенная
продукция получается при обработке перед выпариванием горя-
чего раствора активированным углем или в результате перекрис-
таллизации неочищенного высушенного продукта после обработ-
ки активированным углем.
Глюконолактоны и глюконовая кислота. Водные растворы глю-
коновой кислоты находятся в равновесии: свободная тлюконовая
кислота, глюконо-б-лактон и глюконо-у-лактон. Кристаллы, от-
деленные из пересыщенного раствора при t ниже 30° С (лучше
0°С), — это главным образом свободная глюконовая кислота, при
30—70° С — в основном глюконо-б-лактон, а выше 70° — у-лак-
тон. Точное 'соблюдение температурного режима позволяет полу-
чить чистый продукт.
Свободная глюконовая кислота. Стандартный 50 % -й раствор
глюконовой кислоты можно приготовить, если обработать раствор
глюконата Са серной кислотой и нагревать ее до осаждения
CaSO4 с последующим фильтрованием и концентрированием
фильтрата до 50%-й концентрации. Если в растворе имеются ос-
таточный сахар или грибные полисахариды, то необходима его
обработка активированным углем. Глюконовая кисдота обычно
продается в виде 50%-го технически чистого водного раствора.
Хранение при />18° С предотвращает от кристаллизации кисло-
ты или ее лактона.
Оксоглюконаты. 2-оксоглюконовая кислота обычно выделяет-
ся и продается в виде свободной кислоты после центрифугирова-
ния или фильтрования для удаления клеток. Са удаляют путем
осаждения с H2SO4. Кислоту можно переправлять как сироп или
как кристаллический материал, полученный после упаривания под
227
вакуумом при t не выше 50° С. Можно перекристаллизовать эфи-
ры кислоты, поскольку этерификация необходима для конверсии
в эриторбовую кислоту. J
Продукция эриторбовой кислоты, ее эфиров и солей — глав- ]
ные области применения 2-оксоглюконовой кислоты. Ее исполь- ')
зуют как водо- или жирорастворимые антиоксиданты, восставав-,)
ливающие окраску, запах и питательную ценность консервирован- )
ных фруктов, овощей, мяса и мясных продуктов. 5-оксоглюконат j
в промышленности не производится, но представляет интерес как j
потенциальный источник £( + )-винной кислоты. Для получения, i
глюконовой кислоты химическим путем осуществляют электроли- j
тическое окисление глюкозы в присутствии брома или в других !
окислительных реакциях, катализируемых палладием. Эти спосо- -j
бы довольно дороги. •;
Новые разработки. J
fl
Использование новых бактериальных штаммов
в качестве продуцентов
В 1987 г. при проточном режиме культивирования испытаны
как потенциальные продуценты глюконата и 2-оксоглюконата ;
бактерии родов Klebsiella, Pseudomonas и Е. coli, Бактерии пер- i
вых двух родов окисляют глюкозу в глюконат с помощью пир-
ролхинолинового хинона (PQQ), связанного с глюкозодегидроге- ’
назой: j
глюкоза --Л1О--(|30Д—k-APjr£I,a3J->. глюконолактон -> глюконат j
PQQ PQQH3 j
Далее глюконат может окисляться бактериями при участии фла- 1
вопротеиновой глюконатдегидрогеназы. Е. coli не синтезирует
глюконат, так как не содержит первый фермент (PQQ), но име- j
ет апоэнзим глюкозодегидрогеназы. Е. coli также не окисляет j
глюконат в 2-оксоглюконат. Если в среду, в которой инкубируют
Е. coli, добавить PQQ, то окисление глюкозы в глюконат имеет
место. Накопление продуктов у четырех изученных штаммов на- |
ходится в большой зависимости от природы лимитирующего
фактора (табл. 37). При определенных условиях более 60% глю-
козы можно превратить в глюконат и оксоглюконат всеми бакте- |
риями, если лимитирующим фактором служит не глюкоза. Про- j
точный процесс имеет большие перспективы.
Использование иммобилизованных клеток. Клетки Asp. niger
NRRL3, иммобилизованные в Са-альгинатный гель, 44% глюко- ч
зы (15%-й раствор) за 24 ч превращают в глюконат. Важна хо-
рошая аэрация. Если использовать чистый кислород, то степень 1
превращения может достичь 93%. Иммобилизованные в различ-
228
пые альгинатные гели клетки Gluconobacter oxydans, subsp. su-
boxydans (АТСС 621H) также образуют глюконовую кислоту в
проточном процессе. Узким местом при проточном культивиро-
вании иммобилизованных клеток служит трудность поддержания
достаточного количества растворимого Ог и скорость его пере-
носа. С целью преодоления этой трудности предложено использо-
вать коиммобилизованную систему: Gl. oxydans и микроводо-
росли, снабжающие первых кислородом. Специфическая продук-
тивность по глюконовой кислоте коиммобилизованных в Са-аль-
Таблица 37
Образование глюконата и кетоглюконата (%) при проточном культивировании
бактерий и лимитации различными факторами среды
(по Hardy et al., 1987)
Лимитация KI. aerogenes Утил. гл.1 ГК2 Pseudomonas fluorescens Е. coli (в прис. PQQ) Утил. гл. ГК К ГК, % Ps. pufida Утил, ГЛ. ГК кгк, %
К ГК3, о/ /□ Утил. гл. ГК К ГК, %
Глюкоза 4 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0
К 31 12 11 75 10 2 4 65 6 1 0 18 34 17 12 85
Фосфат 18 4 9 74 10 6 0 53 30 9 19 93
Аммоний 9 2 1 29 8 1 3 56 4 0,3 0 8 8 1 3 53
Сульфат . 10 0,5 2 20 8 2 2 51 7 5 0 64 7 0,1 1 21
1 Утил. гл,—утилизация глюкозы, 2 гк~глюконат, 3 как -кетоглюконат.
Оптимальные условия культивирования:
KI. aerogenes: рн 6,0, £>—0,3 ч"1
Е. coli: pH 5.5, £>-0,15 ч"1
Ps. spp,: pH 7,0, £>—0,2 ч 1
гинат Gl. oxydans и Chlorella sorokiniana при проточном куль-
тивировании составляла 3, 5 г/г-сухих клеток-ч, что в 10 раз
превышало продуктивность (0,35 г/г-ч) иммобилизованных кле-
ток GL oxydans и сравнимо с выходом глюконовой кислоты в
классической ферментации. Правда, через 100 ч работы актив-
ность биокатализатора необратимо снизилась вследствие измене-
ния фотосинтетической активности хлореллы (возможно, связан-
ной с экскрецией ею гликолата).
Использование иммобилизованных ферментов. Промышленно-
стью производится GOD (глюкозооксидаза), иммобилизованная
на различных органических и неорганических носителях, а также
на молекулярных ситах. Кинетические свойства иммобилизован-
ного фермента близки к таковым свободного (Kzm—2,0 • 10-2 мо-
лей для иммобилизованного и К'т—1,93-10-2 — для свободно-
го). Поскольку иммобилизованная GOD недостаточно стабильна,
а неиммобилизованная GOD (и каталаза) дорога, предложен ряд
способов увеличения стабильности указанных ферментов. Один из
них состоит в том, что иммобилизуют весь мицелий гриба и ко-
пммобилизуют его с дополнительными ферментами с помощью
229
глютарового альдегида. Для пермеабилизации мицелия Asp. ni-
ger его промывали изопропанолом и высушивали под вакуумом.
В таком состоянии GOD и каталаза оставались прочно связанны-
ми внутри мицелия, который следовательно, можно было исполь-
зовать для проведения реакции и получения глюконовой кис-
лоты:
глюкоза + О2 + Н2О ——глюконовая кислота 4- Н2О2
_ каталаза л _
Н2О2----------—> Н2О -J- 1 /2О2
глюкоза -4 1 /2 О.-»---------> глюконовая кислота
каталаза
Для увеличения стабильности системы (защиты внутриклеточной
глюкозооксидазы от ингибиторного действия Н2О2) биокатализа-
тор обогащали дополнительно каталазой, которую иммобилизо-
вывали на мицелии. Каталазная оболочка, коиммобилизованная
с мицелием, расщепляла добавляемый Н2О2 с образованием Н2О
и 02. Наличие 02 в микроокружении фермента сильно увеличи-
вало скорость реакции. Без коиммобилизации с каталазой наблю-
дали быструю инактивацию фермента: остаточная активность
после использования некоиммобилизованной GOD — 57,4, а ка-
талазы—21,4, с коиммобилизацией — 91,3 и 79,2 соответственно.
В условиях окисления глюкозы (pH 5,5, t —5°, 20 мг О2/л,,
100 г/л глюкозы, 5 г/л биокатализатора) каталаза скорее инак-
тивируется, чем GOD, поэтому рекомендуют повторную коиммо-
билизацию биокатализаторов с новой каталазой.
Применение мультиферментных систем. Такие системы нуж-
ны в случаях использования более сложных, чем глюкоза, суб-
стратов, например гидролизованного крахмала. В качестве моде-
ли изучено превращение мальтозы в глюконовую кислоту с ис-
пользованием глюкозоамилазы Rhizopus delemar в комбинации
с глюкозооксидазой и глюконолактоназой Asp. niger.
Для превращения сахарозы во фруктозу и глюконат исполь-
зовали мультиферментный комплекс, состоящий из инвертазы и
каталазы дрожжей Sacch. cerevisiae, на клеточных стенках ко-
торых с помощью конкавалина А фиксировали глюкозооксидазу.
Клетки погружали в полиакриламидный гель и инкубировали в
проточном режиме. Биокатализатор работал более 20 дней, осу-
ществляя полное превращение глюкозы с образованием двух по-
лезных продуктов (глюконовой кислоты и фруктозы), которые
легко отделяли из смеси.
В будущем получение глюконовой кислоты будет произво-
диться в проточном процессе с иммобилизованными клетками или
ферментами. Возможно получение глюконовой кислоты в проточ-
ных условиях в реакторе с твердой укладкой иммобилизованных
в нейлоновых губках клеток Gl. oxydans. Контроль pH не требу-
ется. Однако при низких значениях pH образуются кетоглюко-
наты.
230
ИТАКОНОВАЯ КИСЛОТА
Образование итаконовой кислоты плесневыми грибами в
1931 г. было открыто Киношитой. Он назвал гриб-продуцент
Asp. itaconicus. Итаконовая кислота — важный интермедиат в
процессе сополимеризации для получения полимеров, и интерес
к биотехнологическому получению этой кислоты недавно вырос.
Ее получают в США, Японии, СССР (Риге), на нескольких за-
водах в Западной Европе. Максимальный выход в пилотных ус-
тановках на 300—600 галлонов (1 галлон = 4 л) — 64,2% из
6,15 % -го глюкозного раствора. Раньше итаконовую кислоту по-
лучали путем пирролиза лимонной кислоты, но метод промыш-
ленного внедрения не получил.
Аконитовая кислота — предшественник итаконовой, содер-
жится в соке сахарного тростника и, как полагают, оказывает
влияние на кристаллизацию сахара. Удаление Са-аконитата при
очистке сахара и его превращение в итаконовую кислоту при на-
гревании растворов рассматривают как главный источник полу-
чения последней, пока не будут оптимизированы и масштабиро-
ваны ферментационные процессы.
Применение. Главное применение в производстве пластиков.
Итаконовая кислота образует сополимеры с эфирами и другими
мономерами; пластики используют в бумажной промышленности
(в производстве обоев и других бумажных продуктов) и для по-
лучения адгезивных средств. Сополимер итаконовой кислоты и
акрилонитрила легче прокрашивается, чем другие полимеры.
Продуценты. Кроме Asp. itaconicus итаконовую кислоту обра-
зует Л. terreus при росте на плотной среде Чапека. Любопытно,
что другие 5 штаммов вида Asp. itaconicus не образовывали ита-
коновую кислоту, а штамм Киношиты после 14 лет синтезировал
лишь ее следы.
Asp, itaconicus и Asp. terreus — родственные грибы. 1-й —
гак называемая зеленая плесень из группы A. glaucus, который
растет только в среде, обеспечивающей высокое осмотическое
давление. 2-й гриб — хорошо известная коричневая плесень, ши-
роко распространенная в разных почвах. Описаны и другие гри-
ны рода Aspergillus с желтыми и оранжевыми конидиями (не-
идентифицированы), способные к образованию итаконовой кис-
лоты при росте в среде, содержащей 20—25% сахарозы, в зави-
симости от температуры. При более высоких t они образуют ита-
коновую "кислоту с выходом —20%, при понижении t — коевую.
В небольших количествах итаконовую кислоту образуют грибы
I : 4iIago zeae. Среди большого числа штаммов A. terreus был
обнаружен только один, а именно NRRL 265, синтезирующий ита-
коновую кислоту в больших количествах. Вместе с тем из 308
штаммов, выделенных из почвы, 11 штаммов образовывали кис-
лоту с выходом более 45% от теоретического, или 72% по весу
продукта. Один из таких штаммов, обозначенный как Asp. terre-
us NRRL 1960, был отобран для промышленных целей.
231
г
Биосинтез. Итаконовая (метил-янтарная) кислота образуется
при декарбоксилировании аконитовой кислоты в следующей по-
следовательности реакций ЦТК:
НО—СН —СООН
СН —СООН
СН3—СООН
Н.О-1-----
i
СН —СООН
С —СООН
СН,—СООН
&
со2-«-----
СН,—СООН
£
С —СООН
D-изолимонная кислота
гидролаза аконитовой кислоты
цисаконитовая кислота
декарбоксилаза аконитовой кислоты
итаконовая кислота
СН2—СООН
итатартаровая
кислота
итаконовой кислоты, поэтом’
Из итаконовой кислоты могут образоваться нежелательные!
побочные продукты: янтарная и итатартаровая кислоты: ]
СН2 СН2ОН ’
С—СООН окс^аз--^НО—С—СООН j
I итаконовой
| кислоты
СН,—СООН
А
итаконовая
кислота
Ионы Си ингибируют оксидазу
добавление Си+2 увеличивает выход целевого продукта. Есть И
другой путь биосинтеза итаконовой кислоты: из пирувата чере^
1-окси-1-метилянтарную, метилмалеиновую и итатартаровую кис^
лоты. |
Получение. В промышленности в качестве продуцента исполН
зуют Asp. terreus и периодический процесс. Asp. terreus имеет пре^
имущество перед A. itaconicus — он не разлагает итаконовую
кислоту. При использовании среды, содержащей 15% сахара, по^
лучают итаконовую кислоту с выходом 78% от теоретического]
Для промышленного получения итаконовой кислоты используют
в качестве сырья тростниковую мелассу в таком количестве, чтоа
бы исходная концентрация сахара была 15%. j
В конце ферментации содержание итаконовой кислоты
8,5% и выход 85% от теоретического. Культуру Asp. terreus под]
232
дсрживают на агаризованной среде Чапека в виде спор. Для хра-
пения споры соскребают со скошенного агара в стерильную садо-
вую почву. Для приготовления инокулята споры проращивают в
жидкой или плотной среде, содержащей мелассу свеклосахарную
с конечной концентрацией сахара 15%, ZnSO4 — 1,5 г, MgSO4X
X 7Н2О — 5,0 г, CuSO4 • 5Н2О — 0,02 г, соевое масло — 0,25 мл,
вода до 1 л. Инкубирование проводят с аэрацией (1/4 объема
воздуха/объем жидкости) и сильным перемешиванием. В этих ус-
ловиях споры прорастают, образуется мицелий и pH изменяет-
ся с 7,5 до 4,0. Инокулирование производят большим количеством
посевного материала, составляющего 1/5 часть общего объема
жидкости. Необходимость в большом инокуляте вызвана высо-
кой температурой ферментации (39—42°) и желанием эффектив-
ного использования больших количеств мелассы. Ферментацион-
ную среду готовят предпочтительно на тростниковой мелассе с
конечным содержанием сахара 150 г. В состав среды входят:
ZnSO4 — 1 г, MgSO4-7H2O — 3,0 г, CuSO4-5H2O — 0,01 г и во-
да до 1 л. Через раствор пропускают воздух и ферментацию про-
водят с сильным перемешиванием. Через 24 ч значение pH сни-
жается с 5,1 до 3,1. Для подведения pH до 3,8 используют
Са(ОН)2 или аммоний. Через следующие 48 ч ферментацию за-
канчивают. Конечная концентрация итаконовой кислоты 85 г/л.
В другом процессе рост гриба прекращают путем добавления
< -uSO4 • 5Н2О к деминерализованному сиропу. В этом процессе
можно использовать 30%-е растворы сахарозы, а конечная кон-
центрация итаконовой кислоты достигает 180 г/л. 10—15% кисло-
ты приходится на янтарную и винную кислоты. Но если к смеси
добавить щелочноземельные металлы, то эти кислоты почти не
образуются, а выход итаконовой кислоты возрастает.
Выделение продукта. Мицелий и другие твердые частицы уда-
ляют, раствор подкисляют минеральной кислотой, очищают акти-
вированным углем, фильтруют, упаривают, далее охлаждают и
кристаллизуют. После удаления кристаллов маточный раствор
можно обработать активированным углем и экстрагировать из не-
го оставшуюся кислоту с помощью органического растворителя,
например n-амилового спирта. Есть и другой прием. Маточную
жидкость пропускают через анионит, а итаконовую кислоту элю-
ируют далее с анионита минеральной кислотой. Неочищенную
и га коновую кислоту можно использовать для этерификации или
осадить из ферментационного фильтрата негашеной известью, а
<’л затем осадить в виде CaSO4 при добавлении H2SO4. При
концентрировании итаконовая кислота кристаллизуется. В Япо-
нии предложен полупроточный процесс, при котором грибы вы-
ращивают в среде, содержащей углеводы, кукурузный экстракт и
минеральные соли; к среде добавляют 35—50 г/л итаконовой
кислоты. Последняя ограничивает рост грибов. Через определен-
iii.iii период мицелий отделяют фильтрованием, часть образован-
ной итаконовой кислоты удаляют (охлаждают раствор, кристал-
лизуют кислоту и фильтруют кристаллы), а маточный раствор и
V Л И. Воробьева
233
мицелий возвращают в ферментер, добавляя дополнительно са-
хар и соли. Ферментация происходит при pH 2,1—2,5. Такой про-<
цесс может действовать целый месяц с высокой продуктивностью^
Глюкозу удалось заменить гидролизатом древесины. В описан-
ном полупроточном процессе продуктивность была в 4 раза вы-
ше, чем при периодическом культивировании гриба. Возможн
получение итаконовой кислоты и при проточном культивировали
Asp. terreus с использованием серии из двух сосудов. /
Использование иммобилизованных клеток. Клетки Asp. terreu
G-0,26, иммобилизованные в полиакриламидный гель, при инку.1
бации в проточном реакторе имели максимальную продуктив
ность — 83,4 мг/ч. Объемную продуктивность удалось повысит]
в 4 раза и получить 1—2 г/л-ч в реакторе с целитом R-626 i
Asp. terreus NRRC 1966 по сравнению с традиционной фермента
цией.
Непрерывное получение итаконовой кислоты с высокой про
дуктивностыо достигают при выращивании мицелия Asp. terretL
в ферментере на дисках, укрепленных на вращающемся стержн(
на расстоянии 2 см друг от друга. Диски сделаны из нержавею
щей стальной сетки. На дисках вырастает иммобилизованная та
ким способом пленка, достигающая через 30 дней толщины 0,6 см
Наивысшую концентрацию итаконовой кислоты (18,2 г/л), объем
ную продуктивность (0,73 г/л-ч) получают при температур,
36° С, рНЗ,0, скорости подачи среды 60 мл/ч и скорости вращений
дисков 8 об/мин.
Эмпирическое моделирование. Использовали свободный и им
мобилизованный мицелий Asp. terreus для оптимизации выход]
итаконовой кислоты. Наиболее высокую концентрацию целевог
продукта получали с Asp. terreus G-0,26, иммобилизованного
ПААГ в трехстадийном биореакторе колонной системы со взве
шенным слоем. Важными условиями для получения высокого вы
хода были низкие значения pH (2,3—3,7) и высокая концентра
ция глюкозы (4,8—13%). Максимальная продуктивность состав-
ляла 200 мг/л-ч на 100 г иммобилизованных клеток. Если полн^
мерные кубики с грибами уменьшали в размере с 4 до 2 мм, т
получали увеличение выхода итаконовой кислоты в 1,6 раза
том же трехстадийном биореакторе.
КОЕВАЯКИСЛОТА
Применение. Коевая кислота — это 5-гидрокси-2-гидроксим(
тил-4-пирон (см. рис. 54). В связи с большим числом реактивны
групп в молекуле коевая кислота имеет целый ряд реальных
потенциальных применений. Она находит применение как сыр:
в промышленности пластиков, используется как хелатирующ1
вещество для производства инсектицидов, для аналитическо:
определения Fe, так как коевая кислота дает красное окраш
вание в присутствии ничтожных количеств ионов Fe — 0,1 ppi
234
Из коевой кислоты через комениковую, 5-окси-у-пирон-2-карбоно-
вую, и 6-метилкомениковую можно получить ароматобразующее
вещество мальтол.
Продуценты. Микроскопические грибы Asp. flavus и Asp. огу-
/,ас образуют коевую кислоту путем биоконверсии ряда субстра-
тов.
Биосинтез. Получение. Образование коевой кислоты при био-
конверсии глюкозы показано на рис. 50. Коевую кислоту можно
получать из пирувата, глицерина, ацетата, этанола, арабинозы.
Долгое время ее получали в промышленности микробиологичес-
ким путем из глюкозы. Выходы составляют 70—90% при исполь-
зовании. вышеуказанных грибов.
D-глюконо-
пираноза
Aspergillus
oryzae
коевая кислота
Рис. 50.
Биосинтез коевой кислоты
Если ферментацию проводят в среде с глюкозой, то условия
сходны с теми, которые соблюдают при получении лимонной или
итаконовой кислоты (см. выше). При изменении условий фермен-
тации (аэрации, скорости перемешивания) некоторые штаммы
Лар. flavus oryzae, образующие лимонную или итаконовую кисло-
ту, переключаются на синтез коевой. Главная проблема в произ-
водстве коевой кислоты — не ферментация, а выделение про-
дукта.
ПРОПИОНОВАЯ КИСЛОТА
В промышленности большую часть пропионовой кислоты полу-
чают нефтехимическим путем и лишь малую долю — биосинте-
тнчсски с помощью пропионовокислых бактерий, хотя на послед-
нюю возможность как рациональное средство получения пропио-
натов указывал еще Ван Ниль в 1928 г.
Применение. Пропионовую кислоту, получаемую путем фер-
ментации, используют для пищевых и кормовых целей и для со-
хранения зерна. Кроме того, ее можно использовать как источник
но.; . нения пропилена, так как выход продукта при этом выше,
чем при использовании для той же цели этилена, получаемого из
ферментационного • этанола. Пропионовая кислота служит хоро-
шим фунгицидом и в концентрации 0,5—1% задерживает рост
। рш'юв. В качестве фунгицида ее применяют в США, Англии,
ФРГ. Зерно, опрыснутое слабым раствором пропионовой кислоты,
иг плесневеет, находясь под легким навесом даже в дождливую
w* 235
погоду. Для предотвращения плесневения ее (точнее, бактерий»'
ее образующих) вносят в тесто.
Для получения аромата кислого хлеба и защиты его от плес-
невения, предложено культивировать Р. acidi-propionici вместе су
молочнокислыми бактериями Lb, brevis, создавая таким образом j
стартовую (заквасочную) культуру для теста. Через 3 дня при*’
культивировании бактерий в среде, приготовленной из пшеничной,
муки, обработанной ct-амилазой, при t 37° образовалось: 0,55 %J
уксусной, 1,1% молочной и 0,53% пропионовой кислоты. 1
При внесении в тесто такой закваски хлеб содержит 0,1 % ук-
сусной, 0,2% молочной и 0,1% пропионовой кислоты (по отноше-.]
нию к весу муки). Такого количества пропионовой кислоты до-|
статочно для проявления фунгицидного действия. Эти работы
проведены недавно советскими и финскими учеными. Образова-
ние пропионовой наряду с уксусной кислотой в твердых сычуж-
ных сырах обусловливает их вкус и аромат. ?
Продуценты. Это пропионовокислые бактерии, и прежде всего*
штаммы видов Propionibacterium shermanii и A technician, син-
тезирующие высокие количества пропионовой и уксусной кислот, i
Биосинтез. Получение. Образование пропионовой кислоты про-
пионовокислыми бактериями происходит в результате осуществ-1
ления брожения, химизм которого подробно описан нами ранее.,;
В качестве субстрата бактерии могут использовать глюкозу, лак-;
тозу и другие углеводы (в зависимости от видовой принадлеж-j
ности штамма), а также глицерин, лактаты, а бактерии видов
Technicum и Coccoides также полисахариды: декстрины и крах-]
мал. Пропионовая кислота может быть получена как отход проч
изводства витамина В12, получаемого в промышленности из био-]
массы пропионовокислых бактерий.
Интерес представляет использование ксилозы в качестве суб-]
страта, поскольку это древесный сахар, составляющий большую1!
часть гемицеллюлозных гидролизатов. Ксилозу в смеси с глюко-]
зой утилизируют бактерии вида Р. acidi-propionici. Пропионовая]
кислота является сильным ингибитором для самих продуцентов,]
поэтому в периодической культуре можно получить максимум!
15 г/л пропионовой и 3 г/л уксусной кислоты. При проточнош
культивировании выход кислот может быть увеличен. Для про-1
изводства пропионовой кислоты в проточных условиях рекомен4
дованы реакторы двух систем, обеспечивающие высокую концентр
рацию биокатализатора: ультрафильтрационный реактор (UFR)I
и реактор системы ICR (колонный реактор для иммобилизован^
ных клеток). В первом реакторе при поддержании постоянного!
pH на уровне 6,0 и скорости разбавления 0,12 ч-1 из раствора!
ксилозы и глюкозы с общей концентрацией 50 г/л получают со4
ответственно пропионовую и уксусную кислоты с объемной проч
дуктивностью 2,2 и 2,7 г/л-ч и конечной концентрацией 18,0 Я
4,0 г/л. Молярное отношение кислот составляет 3,5 и их общий
выход (по отношению к утилизированным сахарам) — 58%. По!
скольку стоимость пропионовой кислоты выше, чем уксусной!
236
сдвиг отношения в сторону первой очень желателен (обычно от-
ношение пропионовой кислоты к уксусной —2). Если фермента-
цию проводить при одновременном экстракционном удалении про-
дукта и/или контролировании pH, то выход летучих кислот может
быть увеличен.
Новые разработки. Использование иммобилизованных клеток.
Иммобилизованные в ПААГ клетки Р. shermanii при периодиче-
ском и проточном инкубировании образуют из глюкозы пропио-
новую и уксусную кислоты. Периодическая реактивация живых
иммобилизованных клеток путем погружения их в полноценную
питательную среду продлевает время функционирования биока-
тализатора в 5—6 раз с сохранением 100%-й активности клеток в
течение 40 сут. В качестве субстрата вместо глюкозы и лактата
можно использовать отход сыроделия — подсырную сыворотку,
что важно при масштабировании процесса.
Совместное культивирование. Р. shermanii не растут на под-
сырной сыворотке, стерилизованной автоклавированием, если со-
держание сухих веществ в сыворотке превышает 2%. Если сыво-
ротку стерилизуют при ультравысоких температурах, то клетки
образуют 1,6—2,2% пропионовой кислоты при концентрации су-
хих веществ в сыворотке — 12%, но при этом 50% лактозы, со-
держащейся в сыворотке, не используется. Если клетки Р. sher-
manii культивировать совместно с Lb. casei, то вся лактоза ути-
лизируется за 52 ч и образуется 3% пропионовой кислоты.
При отъемно-доливном культивировании выход пропионовой
кислоты равен 45%, а если концентрацию сухих веществ сыво-
ротки увеличить до 18%, то выход кислоты повышается до 6,5%.
Совместное культивирование указанных выше культур (связан-
ных, по-видимому, симбиотическими взаимоотношениями) и ис-
пользование подсырной сыворотки являются перспективным спо-
собом получения пропионовой кислоты для применения ее в пи-
щевой промышленности. С помощью смешанной культуры Lacto-
bacillus amilophilus, способной утилизировать крахмал, и Prop,
shermanii показана возможность получать пропионовую кисло-
ту из крахмалсодержащего сырья в одну стадию без предвари-
тельного гидролиза крахмала. Концентрация пропионовой кисло-
ты через 170 ч ферментации в среде, содержащей муку (5%), ку-
курузный экстракт (2,5%) и мел (2%), достигает 20 г/л.
Использование возобновляемых субстратов. Пропионовую (и
уксусную) кислоту можно получать, подвергая сбраживанию гид-
ролизаты ягодных трав (листьев) культурой Р. acidi-propionici;
в проточных условиях конверсии подвергается глюкоза и ксило-
за и более 80% обоих субстратов превращаются в кислоты. Стои-
мость смеси уксусной и пропионовой кислот, получаемых из гид-
ролизатов биомассы сельскохозяйственных культур, очень низ-
кая, ниже 1/4 современной стоимости кислот на международном
рынке. Поэтому этот способ считают очень перспективным для
промышленного получения химических веществ из биомассы.
237
КСИЛОНОВАЯ КИСЛОТА
Ксилоновая кислота — это продукт окисления ксилозы. Ее!
можно производить биотехнологическим методом из чистой ксит|
лозы с выходом более 80%. Высокий выход позволяет считать,]
что ксилоновая кислота является одним из наиболее перспектив-]
ных потенциальных продуктов, который можно получать из кси*1
лановых фракций путем конверсии биомассы. I
Применение. Возможное применение ксилоновой кислоты мо-1
жет быть основано на ее физических свойствах, напоминающих!
свойства глюконовой кислоты. Основное применение ксилоновоЙя
кислоты в промышленности связано с ее комплексообразующими]
способностями (особенно для Fe+2 и Са+2). 1
Продуценты. Ксилоновую кислоту образуют Ps. fragi ATCCl
4973 и Gluconobacter oxydans subsp. suboxydans ATCC 621 в ко-
личестве 15 и 10% соответственно. j
Получение. Образование ксилоновой кислоты Ps. fragi не свя- i
зано с ростом и максимальная продуктивность равна 2,8 г/л-ч.1
Gl. oxydans плохо растет на ксилозе, если к среде не добавляют
0,5% глюкозы. Условия, необходимые для максимальной продук-?
ции ксилоновой кислоты двумя штаммами, показаны в табл. 38.
Таблица 38
Получение ксилоновой кислоты
бактериями Ps. fragi и Gl. oxydans
(по Buchert et al., 1987)
Состав среды и условия
Ps. fragi
Gl. oxydans
Ксилоза, г/л
Глюкоза, г/л
Рабочий объем, л
t ферментации, °C
Аэрация (объем воздуха/объем жидкости-мин)
Перемешивание, об/мин
Начальное pH
Минимальное pH
Выход от теоретического, %
Общая продуктивность, г/л-ч
5
30
1,0
650
8,0
6,5
96
100
5
3
25
0,5
400
6,5
6,5
91
2,1
Установлено, что некоторые вещества гидролизата биомассы, наИ
пример фурфурол (0,5 г/л) и уксусная кислота (1—2%), ингиби-!
руют утилизацию ксилозы культурой Ps. fragi, но не GL oxydans\
(даже при концентрации фурфурола 2,5 г/л). Поэтому Gl. oxydanfi
считают наиболее перспективным организмом для получения кси*1
лоновой кислоты при использовании гемицеллюлозных гидролин
затов. Приоритет в этих исследованиях принадлежит финский!
ученым. I
238
ЛИТЕРАТУРА
Воробьева Л. И. Пропионовокислые бактерии и образование витамина Bi2,
М„ 1976.
Crueger A., Crueger W. New approaches to produce Base materiales by
means of Biotechnology. 1984. Vol. 6a, Ch. Y. P. 439; Ch. Yl, P. 441.
Ilartmever W. et al. Gluconic acid from coimmobilized biocatalysis. Munchen,
1984. Vol. Ill, 3ECB, P. 507.
Hendricks B. et a. Propionic acid production by bacterial fermentation//
//Biotechnol. a. Bioenerg. Symp. 1985. N 15. P. 241—245.
Levering P. R. et al. Regulation of ketogluconate formation by Gluconobac-
ter species. Vol. 3. Amsterdam, P. 447.
M i a 11 L. M. Organic acids//Economic microbiology ed. A. H. Rose. Vol. 2e
1978. P. 48—119. London; N. Y.
M i 1 s о n P. E., Meers Y. L. Comprehensive Biotechnology/ed M. Meo-Young.
1985. Vol. 3. P. 681—700.
Spicher G. Food and feed production with microorganisms//Biotechnology/
/Eds H—S Rehm, G. Reed. 1983. Vol. 5. P. 1—80.
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ
Применение. Практическая ценность полисахаридов связана с
их способностью изменять реологические свойства водных раство-
ров.
Полисахариды производят в промышленности для получения
гелей, уплотняющих и стабилизирующих пищу, для медицинских
и технических целей. В частности, их используют для облегчения
добычи нефти.
В США половина добычи нефти ведется с использованием
микробного ксантана, который требуется в количестве ~100т/день.
Промышленность в большом масштабе выпускает крахмал, аль-
гинат (из морских водорослей), агар, а с 1960 г. начала также
производить микробные полисахариды, наиболее важные из кото-
рых представлены в табл. 39.
Таблица 39
Микробные полисахариды, имеющие промышленную ценность
(по Crueger, Crueger, 1984)
Полисахарид
Организм
Ксантан
Альгинат
Курдлан
Склероглюкан
Пул л улан
Декстран
Xanthomonas campestris
Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter vinelandii
Alcali genes
Sclerotium glucanicum, S. del phi nil, S. rolfsli
Pullularia pullulans
Acetobacter sp.
Lenconostoc mesenteroides
Leuconostoc dextranicum
Streptococcus mutans
В 1987 г. продукция микробных полисахаридов оценивалась в
300 млн долл. В самых больших количествах производится ксан-'
тан. Микробные, полисахариды обладают рядом важных для их
практического использования свойств: у них высокие вязкостный
или гелеобразующие свойства, сочетаемость с рядом солей в ши-
роких пределах pH и температуры, хорошая растворимость в во-}
де и синергизм с некоторыми полисахаридами. J
Биосинтез. Существуют гомо- и гетерополисахариды. Большая!
часть микробных экзополисахаридов представлена гетерополимеч
рами, состоящими из нейтральных сахаров и обычно уроновых|
240
кислот. Многие гетерополисахариды содержат ацетильные или
другие ацильные группы (формиат, сукцинат).
Выпускаемые в промышленности полисахариды (см. табл. 39)
имеют следующие общие свойства: нетоксичны, накапливаются в
среде в периодических условиях культивирования погруженной
культуры невирулентных штаммов с эффективностью конверсии
субстрата ~ 50 %. Микробные экзополисахариды синтезируются
по 3 различным механизмам. Такие как декстраны и леваны об-
разуются только внеклеточно из специафического субстрата — са-
харозы. Продукты представлены высокомолекулярными развет-
вленными полимерами. Другие микробные полисахариды образу-
ются внутри клетки при последовательном присоединении моно-
сахаров и ацильных групп к липидным интермедиатам. В этом
случае получаются повторяющиеся единицы, которые затем по-
лимеризуются и экскретируются из микробной клетки. По этому
механизму образуются как гомополисахариды, так и гетерополи-
сахариды, и их синтез не зависит от природы субстрата. В вари-
анте этого способа полимер модифицируется после экскреции из
микроорганизма и полисахарид утрачивает регулярность повто-
ряющихся единиц. Так синтезируются альгинаты. Биосинтез го-
мополисахаридов, например декстрана, происходит вне клетки в
реакции, катализируемой декстрансахаразой.
Ксантан
Имеет поли-р (1->4) -£>-глюкопиранозную структуру, напоми-
пающую целлюлозу (рис. 51), но содержит три боковые цепи са-
харов. Некоторые цепи содержат заряженные группы пирувата и
ацетата. Молекулярная масса варьирует от 2 до 12-106 в зависи-
мости от образца и способа приготовления препарата. Ксантан
обладает уникальными свойствами: образует очень вязкие раст-
воры при низких концентрациях, причем вязкость заметно сни-
жается с увеличением дробления (псевдопластичность); растворы
Ксантана нечувствительны к концентрации соли, pH и температу-
ре в широких пределах. Водные растворы ксантана имеют тен-
денцию образовывать упорядоченную структуру, так как полиса-
харид имеет гребнеподобную молекулу, напоминающую модель
двойной спирали. Ксантан применяют при приготовлении пищи,
lyoiibix паст, гелевых дезодорантов, при окраске (печатании)
ковров, при суспендировании сельскохозяйственных химикалиев,
для повышения добычи нефти. В связи с уникальными реологиче-
скими свойствами ксантан и в будущем остается главным мик-
робным полимером, выпускаемым в промышленности.
Условия получения. Для получения ксантана в производстве
не пользуют бактерии Xanthomonas campestris. Важная пробле-
ма, связанная с продукцией ксантана — тенденция производст-
венного штамма к реверсии к дикому типу. Ксантаны получают в
Периодических условиях культивирования. Культура проходит две
фа «ы в своем развитии: ростовую и продуктивную (синтез ксан-
В сложной среде с глюкозой X. campestris NRRL-B1159
241
образует ксантан главным образом после остановки роста. В син^
тетической среде добавление цитрата и глутамата приводит я
увеличению продуктивности.
Лимонная кислота приводит также к улучшению качеству
ксантана за счет увеличения в его составе остатков пирувата
носн9 носн9 носн9 носн9 носн9
I 1
Рис. 51. Повторяющиеся единицы ксантана
Существует положительная корреляция между выходом ксантаЛ
и отношением С/N в среде. Высокая концентрация фосфата л|
митирует образование продукта. Эти данные относятся к 1987-
До последнего времени в производстве использовалась среда, ci
держащая 2—4% углевода, 0,05—0,1% азота, минеральные сол|
pH поддерживают на уровне нейтрального. Продолжительном
ферментации двое суток; выход ксантана 20—30 г/л. Ксант!
осаждают при добавлении изопропанола или метанола, культуя
(обладает патогенностью) при этом погибает. Осадок сушат!
измельчают. 1
242
Возможно получение ксантана в двустадийном процессе. Вто-
рая ступень (синтез ксантана) осуществляется в среде, лимити-
рованной по азоту (с высоким соотношением С/N) без л аг-фазы.
При проточном культивировании ксантан образуется со скоро-
стью 0,6 г/кг культурального фильтрата-ч-1. Культура сохраняет
стабильность в отношении вязкости и продукции ксантана более
чем 6 нед проточного культивирования.
Новые продуценты. Под действием ультрафиолета, у-облуче-
ний и нитрозогуанидина получены стабильные мутанты — сверх-
продуценты ксантана, отобранные в чашках с агаром, содержа-
щим градиент карбенициллина (0—50 мкг). Клоны с толстой
капсулой ксантана были физически защищены от действия кар-
бенициллина, и самые устойчивые обладали наибольшей продук-
тивностью в отношении ксантана.
Альгинат
Продуцентами альгината являются Azotobacter vinelandii и
Ps. aeruginosa. Промышленного производства еще нет. Альгинат
состоит из 2 уроновых кислот — маннуровой и глюкуроновой, со-
отношение которых Может быть от 4:1 до 20 : 1. Выход альгина-
та повышается при лимитации среды по азоту и углероду. Так.
в первом случае Ps. aeruginosa образует 8,9 г/л, а во втором —
5,8 г/л альгината.
Важное свойство альгинатов — способность образовывать ге-
ли в реакциях с солями Са. Скорость образования геля, его ка-
чество и консистенция контролируются добавлением Са. В мире
производят более 22 тыс. т альгината в год. Это самый большой
сектор в промышленности водорослей, поскольку большую часть
альгинатов получают из морских коричневых водорослей. Бакте-
риальные альгинаты могли бы иметь широкое применение (в при-
готовлении мороженого, желе, пива, также в печатании текстиля),,
но рынок бактериальных альгинатов находится в острой конку-
ренции с водорослевыми альгинатами, что задерживает внедрение
первых в промышленность.
Курдлан
Alcaligenes faecalis var. myxogenes и Agrobacterium radiobac-
ter образуют 2 полимера: курдлан и сукционоглюкан (3-1,3-
глюканы.
Курдлан — это полимер глюкозы, а сукциноглюкан кроме
глюкозы содержит еще янтарную кислоту и галактозу. Промыш-
.'н.'ипо важное свойство курдлана: образование термически не-
норатимых гелей. При нагревании курдлан набухает в воде и
но разует эластичный гель. Гелеобразование необратимо. Приме-
няется как уплотнитель в диетических блюдах, особенно в тех,
ю ।;'рые при приготовлении нагреваются. Поскольку курдлан
|ю разлагается животными, он служит ингредиентом малокало-
|и|ипой пищи, например желе. Ацетильные производные курдлана
в Японии используют в качестве основы ультрафильтрационных
243
t
полупроницаемых мембран для фракционирования веществ с мо-
лекулярной массой 200—2000. Селективность таких мембран по
фуранозе 96%, по витамину B!2 — 97%. i
Курдлан используют в медицине: он имеет противоопухоле-
вую активность и служит источником редких сахаров: гентибио-*1
зы и ламинарибиозы. Поэтому проводятся интенсивные исследо-'1;
вания по улучшению продукции курдлана бактериями. За 80 ч
ферментации в среде определенного состава, содержащей 8%
глюкозы, получают —40 г/л курдлана. Курдлан нерастворим в-
холодной воде, и вязкость среды не увеличивается с течением
ферментации в отличие от сукциноглюкана. Поэтому при полу-!
чении последнего среда содержит только 4% глюкозы. ’
Склероглюкан
Многие виды грибов рода Sclerotium образуют полисахарид как
^-связанный глюкан (имеет промышленное название политран).
Склероглюкан образует в воде гели в концентрации 1,5%, обла-
дающие псевдопластичностью в широком пределе t. По степени
вязкости склероглюкан подобен ксантану. Его применяют как до-
бавку в чернила, краски, латекс, используют как покрытие для
семян, керамической глазури, его считают идеальным средством
для приготовления сельскохозяйственных гербицидов и пестици-
дов. Склероглюкан конкурирует с ксантаном в области нефтедо-
бычи.
Продуцент склероглюкана — Scl. rolfsii и Scl. glucanicum.
Максимальное количество продукта образуется в ранней лог-фазе
роста клеток (спустя 48 ч). При росте на среде с глюкозой вы-
ход склероглюкана достигает 50%. Полимер получают в пилот-;
ной установке при непрерывном культивировании в течение дли-
тельного времени. Микробиологическое получение склероглюкан
на — экономически выгодный процесс, и после оптимизации ус*
ловий получения его собираются внедрить в промышленность.
Пуллулан
Это глюкан с а-1,4 и небольшим числом а-156-гликозидным]
связями. Продуцент пуллулана — Aerobasidium pullulans ~
дрожжеподобный гриб. Пуллулан рекомендован как биодеграда
тивный материал для покрытия и упаковки пищи; обладает ан
тиокислительными свойствами. Это хороший компонент для низ
кокалорийных продуктов вместо крахмала.
У некоторых бактерий имеется фермент пуллуланаза, расщеп
ляющая пуллулан. Кинетика процесса образования пуллулан!
изображена на рис. 52. 50%-е растворы глюкозы за 5 дней пре
вращаются в полисахарид с эффективностью 70%. Сильное влия
ние на вязкость раствора оказывает величина pH. Самая низказ
вязкость при pH ниже 4,0. Причем при низкой вязкости молеку
лярная масса пуллулана 220 тыс., а при высокой — 450 тыс
В Японии пуллулан выпускают в количестве одна тонна в ме
сяц.
244
Декстран
Это бактериальные гомоглюканы, состоящие из а-/)-глюко-
лиранозильных остатков, связанных главным образом а (1->6)-
евязями, хотя а (1-^2), а (1->3) и а (1->4) связи тоже обнару-
жены в декстране. Этот полигликан образуют многие виды грам-
52. Образование пуллулана культурой Pullularia pullulans в среде, со-
держащей глюкозу и сульфат аммония (по Catley, 1973): 1 — сухие клетки
(мг/мл), 2 -— внеклеточная глюкоза (мкМ/мл), 3 — пуллулан (мкМ безводной
глюкозы/мл), 4 — скорость аккумуляции i4C как мера ассимиляции глюкозы
(мкМ/мг клеток-ч), 5 — скорость образования пуллулана (мкМ безводной глю-
козы/мг клеток*ч)
положительных и грамотрицательных бактерий: Klebsiella spp.,
Aerobacter spp., Steptococcus bovis, Str. viridans, Leuconostoc dex-
Iranicum и Leuc. mesenteroides. Декстран — первый микробный
полисахарид, который был получен в промышленности. Для про-
дукции декстрана используют Leuc. mesenteroides NRRL В-512 (F)
или близкородственные штаммы. Они образуют в больших коли-
чествах декстрансахаразу, которая индуцируется своим субстра-
том. Нативный декстран образуется либо клетками Leuc. mesen-
leroides, либо in vitro в энзиматическом процессе и имеет одну
и ту же структуру, состоящую на 95% из линейных а (1-^6)-свя-
зей и только 5% а (1->3)-связей, что придает декстрану необыч-
но гибкую основу.
245
Декстраны представлены сложной группой полимеров с моле-
кулярной массой от 15 до 500 тыс. В результате кислотного гид-
ролиза высокомолекулярные декстраны расщепляются и дают-
продукт с молекулярной массой 40—60 тыс., который применяют?
в фармацевтической промышленности и в производстве тонких
химических реактивов. Самое важное применение декстрана свя--
зано с его использованием как заменителя плазмы крови, где он?
выполняет функцию переносчика Fe. Декстраны применяют в фо-
тографии для получения эмульсий и как основу в хроматогра-
фии.
Декстран образуется внеклеточно, так как субстрат не про-
никает в клетки. Молекулярная масса определяется концентра-
цией сахарозы и Г реакции. При высокой концентрации (70% по
весу) образуются низкомолекулярные декстраны. При использо-
вании низкомолекулярной затравки и небольшой концентрации;
глюкозы (10%, pH 5,0, 15° С) значительная часть продукта име-
ет молекулярную массу 50—100 тыс., при этом не требуется,
дальнейшего фракционирования для применения в медицине.
Декстраны производят на заводах медицинской промышлен-
ности в СССР и во многих других странах. Бактерии культиви-
руют в среде, содержащей неорганический фосфат, органический
источник азота и высокую концентрацию сахарозы ( — 20%). Об-
разование декстрана происходит с высокой скоростью, аэрации
не требуется. По окончании ферментации декстран осаждают
спиртом и подвергают кислотному гидролизу. Продукты гидроли-
за снова осаждают спиртом и высушивают. В мире производят
1 тыс. т декстрана в год. Для контролирования молекулярного
веса декстрана разработаны новые энзиматические методы. По-
лучен очищенный фермент, с помощью которого получают все’
фракции декстрана: от дисахарида до полимеров в 100 тыс. даль-
тон. Этот процесс дает более высокую степень конверсии сахаро-
зы, облегчает выделение продукта и позволяет лучше охаракте-
ризовать структурные и реологические свойства полимера.
Из различных видов рода Alcaligenes открыты новые полиме-
ры. Полимер S-130 неизвестной структуры, имеет большую вяз-'
кость при высокой ( — 149° С) температуре, неустойчив к сдвиго-
вым напряжениям. Полимеры S-194 и S-198 обладают сходными)
свойствами, но устойчивы к сдвиговым напряжениям и служат'
прекрасными суспендирующими агентами. ;
В будущем будут разработаны способы для получения конт-
ролируемого синтеза биополимеров с определенной композицией
и свойствами. Появится новое искусство конструкции полисахарид
дов (как это произошло с белками), что позволит улучшить свой-
ства существующих полисахаридов и создать новые полимеры.
I
1
ЛИТЕРАТУРА
Блинов Н. П. Некоторые микробные полисахариды и их практическое при-*'
менение//Усп. микробиол. 1982. Т. 17. С. 158—177.
246
Baird J. К., Sandford P. A., Cottrell I. W. Industrial application of so-
me new microbial polysaccharides//Biotechnol. 1983. Vol. 1. P. 778—783.
Berkeley R. C. W., С о о d w a у G. W., E 11 w о о d D. C. Microbial polysac-
charides and polysaccharases. N.-J., 1979.
Compere A. L., Griffith W. L. Scleroglucan biopolimer production, pro-
perties and economics//Adv. Biotechnol. Proc. 6th Int. Ferm. Symp. London
(Canada). July, 1980. Vol. 3. Toronto, 1981. P. 441—446.
John K. F., В r a d s h a n I. Production and application of xanthan.//Mod. AppL
Trad. Biotechnol. 1984. P. 319—371.
Pace G. W., Pighelate R. C. Production of extracellular microbial poly-
saccharides//Adv. Biochem. Eng. 1980. Vol. 15. P. 41—70.
Sandford P. A., Cottrell I. W., Pet ti tt D. J. Microbial polysaccharides:
new products and their commercial applications//Pure and Appl. Chem. 1984,
Vol. 56. P. 879—895.
Paul F., Morin A., Monsan P. Microbial polysaccharides with actual po-
tential industrial application//Biotech. Adv. 1986. Vol. 4. P. 245—259.
Sutherland J. W. Biosynthesis of microbial polysaccharides//Adv. Microb.
Physiol. 1982. Vol. 23. P. 79—150.
ЦИКЯОДЕКСТРИНЫ
Циклодекстрины (ЦД; другое название: циклоамилозы, цик-
лополиглюканы, декстрины Шардингера) известны почти 100лет,,
но наиболее важные результаты при их изучении получены в по-
следние 10—12 лет — они обусловили широкое практическое при-
менение ЦД.
ЦД называют гомологичный ряд полимеров с общей форму-
лой СбН1о05. В узком смысле в эту группу включают три соеди-
нения: сс-, р- и у-гомологи 1,4-глюкозидного макрокольца, содер-
жащие соответственно 6,7 и 8 молекул глюкозы. Самым стабиль-
ным является р-ЦД (из-за образования вторичных водородных
связей). Структурной единицей ЦД служит /)-глюкоза в пира-
нозной форме. Известно большое число производных ЦД. Если в
молекуле присутствуют гликозидные заместители, то такие ЦД
называют разветвленными. Известны также метил-ЦД, ацетил-ЦД,.
фосфорил-ЦД — химически модифицированные формы ЦД. Ре-
акционная способность ЦД определяется наличием в каждой мо-
лекуле глюкозы одной первичной (С6) и двух вторичных (С2 в
С3) гидроксильных групп, служащих акцепторами в реакциях
присоединения с образованием полимерных, разветвленных и хи-
мически модифицированных ЦД. Гликозидные связи в ЦД более*
стабильны, чем в линейных декстринах, в частности в отношении
действия большинства ос-амилаз; под действием кислот гидролиз
ЦД происходит в 4—5 раз медленнее, чем в случае линейных
декстринов. Наиболее характерное свойство ЦД — комплексооб-
разование, которое лежит в основе молекулярного инкапсулиро-
вания. Комплексы включения образуются с неорганическими и
гидрофобными органическими соединениями, причем включение
органических молекул в ЦД малоспецифично. ЦД и их химичес-
ки модифицированные производные часто обладают каталитиче-
ским действием и могут быть рассмотрены как модели ферментов.
Энзимоподобные катализаторы на основе ЦД получены путем
присоединения таких групп, как например имидазол (он имити-
рует активный центр ферментов).
Применение. Наиболее важное практическое значение имеет
стабилизация многих веществ в результате комплексообразова-
ния с ЦД. Инклузивные комплексы можно нагревать до темпера-
туры разложения ЦД (260° С), при этом включенное соединение
не разлагается и не улетучивается. Нестойкие вещества, хранение
которых возможно только в морозильной камере, могут в составе
комплекса храниться при комнатной температуре в течение дли-
тельного времени. ЦД безвредны для человека, поэтому их ши-
248
роко применяют в медицинской, пищевой промышленности и в
I косметике.
I ЦД используют для улучшения свойств лекарственных форм,
что может проявляться в увеличении растворимости (стероидные
гормоны, простагландины, барбитураты), стабилизации против
гидролиза, окисления, фоторазложения (витамины), дегидратации
(простагландины), улучшении биологической доступности (барби-
тураты) , предотвращении испарения (йодид, ментол, камфора),
снижении неприятного запаха и вкуса, защите слизистой желудка
от повреждения (например, аспирином), ингибировании гемолиза
(в случае антибиотиков, в частности). ЦД применяют при кон-
версии стероидов, которые плохо растворяются в воде. При до-
бавлении в систему р-ЦД стероиды растворяются и происходит
их эффективная конверсия.
I В пищевой промышленности ЦД используют для стабилизации
I аромата веществ, при введении в продукты витаминов, антиокси-
дантов, красителей. Комплекс р-ЦД с этиловым спиртом рекомеп-
I дуют использовать для подавления роста плесени в упаковке пи-
I щевых продуктов. Адсорбция фенилаланина на полимере р-ЦД
I позволяет получать белковые гидролизаты для питания людей,
I страдающих фенилкетонурией.
I ЦД добавляют в шампуни, дезодоранты и в зубные пасты. Их
I применяют также для технических целей: при получении полимер-
ных материалов, внесении антиоксидантов, изготовлении мембран
I для диализа, ароматических волокон и пластмасс. Раствор ЦД
можно использовать для очистки воздуха от примесей бензола,
дихлорэтана и гексана. Их применяют для экстракции нефтепро-
дуктов из песка, для затвердения жидкого топлива, для защиты
материалов от ржавчины. Большие перспективы имеет применение
ЦД для получения ферментоподобных катализаторов.
Получение ЦД. ЦД получают только ферментативным путем
нз крахмала в результате переноса гликозидной связи в его мо-
лекуле: Gx^n + цикло-Оп, где п=6,7 или 8. Реакцию катали-
зирует 1,4-а-£-глюкан-4-а (1,4-а-глюкано) трансфераза. Цикло-
глюкантрасферазы (ЦГТазы) катализируют два типа реакций:
циклизации и диспропорционирования (перенос олигосахаридов
от одной глюкопиранозной цепи на другую). Обе реакции обра-
тимы и связаны с переносом части 1,4-смО-глюкопиранозной цепи
к акцептору, которым чаще всего выступает Сггидроксильная
группа в конце глюкановой цепи (могут быть и другие акцепто-
ры). С целью регулирования направления реакции часто в реак-
ционную смесь добавляют соответствующий комплексообразова
н*.'|ь, например толуол в производстве р-ЦД. Выход продуктов
увеличивается, если наряду с ЦГТазой вносят изоамилазу. Для
устранения декстринов используют а-амилазу. р-ЦД выделяют в
нице кристаллов из упаренного раствора, у-ЦД путем адсорб
ипи на колонке с адсорбентом (Тойопеарл в Японии). Для био
конверсии рекомендуют также иммобилизованные препараты
1 ЦГТазы. В настоящее время для выделения и разделения ЦД
249
применяют различные синтетические смолы, хроматографические^
методы, в том числе афинную хроматографию. В качестве неочи^
щенного препарата ЦГТаз применяют культуральную жидкость,^
ее концентрат или частично очищенный препарат. i
а-ЦД, ЦГТаза KI. pneumonia М5 al оказалась очень селек-j
тивной для образования а-ЦД. Этот фермент применили при раз-j
работке процесса получения а-ЦД с высоким выходом при высо-,.
кой концентрации крахмала и использовании деканола как ком-1
плексующего агента. Поскольку добавление деканола может ме-
шать использованию а-ЦД в пищевой промышленности, был раз-;
работай другой процесс: периодическое культивирование с раст-
воримой ЦГТазой и ультрафильтрацией для очистки реакционной;
смеси с последующей концентрацией и гель-хроматографией. Что-i
•бы получать выход а-ЦД порядка 40—60%, ферментацию про-;
водят с низкими концентрациями крахмала: оптимальная исход-
ная концентрация — 20 г/л. Ультрафильтрацию осуществляют,
повышая температуру до 70° С, чтобы понизить вязкость среды.,
При использовании мембран, пропускающих вещества с массой,
10000 г/моль, а-ЦД получали с чистотой —60—65%, остальные
продукты — декстрины. Для получения а-ЦД с высокой чистотой
фильтрат концентрируют и а-ЦД отделяют от декстринов с по-
мощью гель-хроматографии.
р-цд. Из определенного штамма Вас. circulans выделены
ферменты, катализирующие образование главным образом (67%)
₽-цд. Возможно образование ЦД из частично деградированно-
го крахмала, но сильно деградированный крахмал (степень поли
меризации менее 14) не может непосредственно использоватьсз
как субстрат для реакций циклизации. Но благодаря реакци]
диспропорционирования возможно образование ЦД из олигоса
харидов со степенью полимеризации 5—14, если концентрации
олигосахаридов с длиной цепи короче С5, низкая. Выход р-Щ
&
сильно снижается с увеличением концентрации крахмала, чп
связано с ингибированием фермента главным образом р-ЦД
Удаление р-ЦД из смеси при ультрафильтрации или путем обра
зования инклузивного комплекса (например, с бензоатом) увели
чивает выход при высоких концентрациях крахмала.
Для сохранения чистой окружающей среды важно знать д<
градабельность нового вещества. Известно, что ЦД устойчив
к гидролизу под действием многих амилолитических фермента
Вместе с тем под действием ферментов штаммов рода Bactero
des они расщепляются до глюкозы. В кишечнике крысы под де!
ствием амилолитических ферментов микрофлоры ЦД превращ;
ются в олигосахариды. р-ЦД, получаемые описанным выше cni
собом, могут применяться в пищевой промышленности.
Продуценты циклоглюкантрансфераз. Это главным образом б
циллы; Вас. macerans, Вас. stearother mophilus, Вас. circulan
Вас. megaterium, Вас. sp., Вас. polymyxa, а также KlebsieL
pneumoniae. Описаны алкалофильные штаммы бактерий Вас. sj
и Alcalibacterium cyclodextrinogenes, синтезирующие главны
250
образом р-ЦД, наиболее важные для практического использова-
ния. Новым продуцентом ЦГТазы является Вас. ohbensis, обра-
зующая главным образом р-ЦД; Вас. macerans образует в основ-
ном р-ЦД. Вас. stearothermophilus образует ЦГТазы при 50° и
даже при 80° С. ЦД образуют бактерии рода Micrococcus (Л4. 1и-
teas'). Для всех продуцентов ЦД необходимо содержание в сре-
де крахмала или продуктов его гидролиза, либо сами ЦД, поэто-
му ЦГТазы могут быть отнесены к индуцибельным ферментам.
Все микроорганизмы, как правило, синтезируют внеклеточные
ферменты. Сравнительная характеристика ЦГТаз, синтезируемых
микроорганизмами, представлена в табл. 40. Соотношение а-, 0-
и у-ЦД в продукте зависит от природы источника фермента. Со-
Таблица 40
Сравнительная характеристика циклоглюкантрансфераз,
синтезируемых микроорганизмами
Продуцент Оптимум pH pH—ста- бильность Выход, % Основ- ной продукт Способ культивирования
Вас. macerans 5,0 -5,7 8,0—10,0 50 a периодическое и не- прерывное двуста.- дийное
Вас. megaterium 5,0—5,7 7,0—10,0 62 p периодическое
Вас. stearother тор- hi lus 5,9—5,5 5,5—8,8 50 a периодическое
Вас. ohbensis 5,5 6,5—9,5 * p периодическое-
KI- pneumoniae 5,2 1 , * " ™ cc непрерывное
Вас. sp. No 17—1 9,0—9,5 5,0—10,5 65 P периодическое-
Вас. sp. No 38—2 4,5—9,0 6,0—10,0 75—85 P пер иод ическое
Вас. sp. No 13 9,0—9,5 6,5—10,0 60 P периодическое
★—данные отсутствуют.
отношение гомологов можно изменять, подбирая источники фер-
ментов и добавляя определенный комплексообразователь. На-
пример, если нужно получить а-ЦД, то применяют ЦГТазу из
Klebsiella pneumoniae и н-деканол как комплексообразователь.
Получение ЦД в промышленности. В настоящее время про-
мышленное производство ЦД налажено на ряде фирм: в Японии,
Англии, на фармацевтическом предприятии «Хиноин» в Венгрии.
В нашей стране выпускают опытные партии ЦД. В основе произ-
водства ЦД лежит производство трансглюкозидазного фермента,
катализирующего превращение крахмала на 40—50% в ЦД. Наи-
более подходящим сырьем служит кукурузный крахмал, который
пг'сдварительно гидролизуют а-амилазой, далее к смеси добавяя-
мл ЦГТазу и.после выдерживания определенное время из смеси
выделяют ЦД. Разработан способ получения разветвленных гли-
251
козил- и мальтозил-ЦД из ЦД и крахмала под действием пуллу-
ланазы и а-амилазы. Разветвленные ЦД обладают большей раст-
воримостью, чем неразветвленные. Первые получают в Японии и
используют в пищевой промышленности, медицине и парфюме-
рии. Химически модифицированные ЦД в виде коммерческих ре-
активов и промышленных препаратов еще малодоступны. Пола-
гают, что к 1990 г. рынок ЦД превысит 10 тыс. т год.
ЛИТЕРАТУРА
Циклодекстрины (продуценты, свойства, строение)//Итоги науки и техники.
Т. 20. Сер. микробиология. 1988.
Микробный синтез циклодекстринов, выделение и их применение//Итоги науки
и техники. Т. 21. Сер. Микробиология. 1988.
Proceed. Second Intern. Symp. on cyclodextrins ed. Atwood L. and Davies J. E.
Netherlands, 1984.
Bender H. Production, characterization and application of cyclodextrins//Adv.
Biotechnol. Process. Vol. 6. N. Y., 1986. P. 31—71.
ГЛАВА XI
АРОМАТИЗАТОРЫ
ФЛАВОРИЗАТОРЫ
К ароматизаторам под названием «flavours» (прямого пере-
вода на русский язык нет) относят вещества, придающие не толь-
ко аромат, но и вкус пище, а иногда вызывающие специфические
вкусовые ощущения, например холод или жжение во рту, ед-
кость и др. Эти вещества для краткости называют флаворизато-
рами.
Мировой рынок флаворизаторов составляет 2—3 млрд долл,
ежегодно. 10—15% всех используемых в мире пищевых добавок
приходится на флаворизаторы, и их долю собираются увеличить
до 25%. Многие флаворизаторы экстрагировали из растений, но
использование этого источника связано с рядом недостатков, сре-
ди которых низкие концентрации нужных флаворизаторов, высо-
кая стоимость экстракции, доступность источника, ограниченная
временем года или погодой, и, наконец, постепенное вымирание
ряда ботанических видов.
Некоторые природные вещества можно было бы превращать
во флаворизаторы химическим путем (так как известна их хими-
ческая природа), например путем их трансформации. Но химиче-
ские методы могут не обладать субстратной специфичностью, и в
таком случае вещества получают с низкой чистотой и выходом, а
часто образуется рацемическая смесь, из которой выделение же-
лаемого изомера может быть дорогим и непрактичным процес-
сом.
На сегодняшний день только биотехнологические способы ли-
шены указанных недостатков, что делает их очень привлекатель-
ными и перспективными.
Продуценты и получение. Флаворизаторы, получаемые биотех-
нологическим путем, делят на 2 группы: 1) комплексы — смесь
индивидуальных ароматизаторов, 2) индивидуальные очищенные
ароматизаторы.
Комплексы. Эту сложную смесь ароматических веществ невоз-
можно создать, смешивая известные химические вещества. На-
пример, в различных алкогольных напитках идентифицировано
более 400 различных веществ; из них 118 эфиров, 80 алифатиче-
ских и ароматических кислот, 41 карбонильное соединение и 38
алифатических и ароматических спиртов. Состав и соотношение
ароматизаторов зависят от природы штамма и субстрата. Или
253
другой пример — сыры, в которых идентифицируют до 50 соеди-
нений. Наиболее важные из них метилкетоны и вторичные спир-
ты с 4—11 атомами углерода. Используя Pen. roquefortii в про-
изводстве сыра Рокфор, можно получить сложную смесь флаво-
ризаторов. Для этого смесь молока, молочного жира и соли в те-
чение 3 дней подвергают ферментации при 24—26° С. За это вре-
мя грибные липазы превращают молочный жир в метилкетоны и
вторичные спирты:
липазы п
жиры------>жирные кислоты-^р-кетокислоты->метилкетоны->вторичные спирт».
В ферментированном продукте содержится в 6—20 раз больше
сырного аромата, чем в самом сыре.
Некоторые пищевые продукты (особенно приготовленные и&
фруктов и овощей) при нагревании теряют аромат вследствие
денатурации соответствующих ферментов. Поскольку такие про-
дукты могут содержать предшественники флаворизаторов, им.
(продуктам) можно вернуть аромат, если внести утерянный фер-
мент, правда, на практике этот способ еще не применяется.
Индивидуальные вещества. Это эфиры, лактоны, терпены, пи-
разины, альдегиды, аминокислоты и нуклеотиды — все они мо-
гут быть получены микробиологическим путем. Например, Ps. fra-
gi образует эфир этилбутират с запахом ананаса.
Лактоны дают запахи, начиная от фруктового и кокосового*
ореха до запаха масел и конфет. Лактоны из кетокислот обра-
зуют дрожжи рода Candida, грибы рода Penicillium, бактерии
рода Sarcina. Химический синтез лактонов из кетокислот — мно-
гоступенчатый процесс. Например, Trichoderma reesei образует*
сильный запах кокоса — следствие образования 6-пентил-а-пир-
рона. Его химический синтез протекает в 7 стадий.
Терпеновые соединения — это основные компоненты незаме-
нимых жиров. Kluyveromyces lactis образует цитронелол и лино-
лол, обладающие легким ароматом, который они могут придать
охладительным цитрусовым напиткам. Секвитерпен валенцен.
содержится в маслах апельсина, но обладает низкой коммерчес-
кой ценностью. Ее можно повысить путем бактериальной транс-
формации в секвитерпен нуткатон (запах грейпфрута).
а-Ментол придает запах мяты и охлаждающее ощущение, при-
меняется в кондитерских изделиях и в медицинских препаратах.
Предшественник а-ментола — а-ментан образуется в перечной
мяте в определенную пору цветения и лишь частично превраща-
ется в желаемый продукт. сс-Ментан предлагают получать из рас-
тения и далее трансформировать его полностью в а-ментол с по-
мощью Ps. putida, обладающий соответствующей дегидрогеназ-
ной активностью.
Пиразины — большая группа флаворизаторов, содержащихся
в жареных кукурузных зернах, орехах, кофе, шоколаде. Следо-
вательно, добавление пиразинов полезно к «микроволновой» пи-
254
ще, которая не подвергается обычным реакциям поджаривания
и поэтому лишена запаха жареного продукта. Получены мутан-
ты Corynebacterium и Вас. spp., образующие «сверх»-количе-
ства этих флаворизаторов.
Некоторые флаворизаторы, такие как ацетальдегид, — силь-
но летучие вещества. Ацетальдегид кипит при 21° С, имеет запах
фруктов или орехов, придает свежесть конечному продукту. Если
добавить природный ацетальдегид к соку, то возникает ощуще-
ние свежевыжатого фрукта. Ацетальдегид образуют дрожжи
С. utilis из этанола, который может быть также превращен ими
в этилацетат. Образование продуктов зависит от концентрации
этанола.
Ароматизаторы образуют молочнокислые бактерии, выделяя
ацетальдегид, метионал, летучие жирные кислоты. Это важные
компоненты твердых сыров. В аромате сыров участвуют также
амины — продукты декарбоксилирования аминокислот, серово-
дород, образующиеся при распаде серосодержащих аминокислот,
молочная кислота, лактоны, эфиры и другие химические соеди-
нения.
Ацетальдегид — главное ароматическое вещество йогурта, об-
разуемое S. thermophilus, Lb. bulgaricus, Leuc. cremoris\ и неко-
торые лактобациллы используют цитраты и образуют диацетил
и ацетальдегид. Для получения этиловых и других эфиров жир-
ных кислот, обладающих ароматизирующим действием, рекомен-
дуют применять липазы и эстеразы из разных источников. Эфи-
ры жирных кислот могут использоваться в кремах, маргарине и
других продуктах.
Но есть уникальные запахи, например ароматы некоторых рас-
тений, которые с помощью микроорганизмов еще не воспроизве-
дены. Такие флаворизаторы в больших масштабах получают ли-
бо в культуре клеток растений с последующей экстракцией, ли-
бо из бактерий со встроенными в них генами растительных фла-
воризаторов.
Особенности технологии получения. Многие предшественники
флаворизаторов обладают ограниченной растворимостью в вод-
ных растворах, поэтому их трансформацию осуществляют с по-
мощью ферментов в органических растворителях. Эти условия
способствуют стабилизации фермента. Многие флаворизаторы
токсичны для клеток-продуцентов, и тогда ферментацию сопро-
вождают одновременной экстракцией этих веществ. Если соеди-
нения неполярной природы, то применяют непрерывную экстрак-
цию органическим растворителем, который далее удаляют (оста-
точная концентрация растворителя не должна быть выше 0,5—
50 ppm). Для экстракции используют также неполярные или ионо-
обменные смолы. Летучие флаворизаторы (ацетальдегид) токсич-
ны для микробной клетки и их можно непрерывно удалять с по-
мощью пропускаемых газов либо проводить ферментацию под
вакуумом.
255
ВЕЩЕСТВА,
УСИЛИВАЮЩИЕ ЗАПАХИ
Таким свойством обладает глутамат натрия, а также некото
рые нуклеозиды и нуклеотиды.
ГЛУТАМАТ НАТРИЯ
Глутамат Na в промышленности получают при ферментации4
с помощью Cor. glutamicutn. Другие промышленно важные штам-
мы принадлежат к родам Brevibacterium, Microbacterium или
Arthrobacter. Выход глутаминовой кислоты в ферментации
— 30 г/л. Штаммы Е. coli, сконструированные методом генетиче-
ской инженерии, образуют —10 г/л глутаминовой кислоты. Био-
синтез и получение глутамата подробно описаны ранее (Воробь-
ева, 1987). Ежегодно промышленность выпускает 320 тыс. т глу-
тамата Na.
РИБОНУКЛЕОТИДЫ
Запах пищи усиливают 6-оксипуриновые рибонуклеозиды 5-мо-
нофосфатов, гуаниловая кислота (5'-GMP), инозиновая кислота
(5Z-IMP) и ксантозиновая кислота (5Z-XMP), и это свойство убы-
вает в той последовательности, в которой написаны соединения.
5'-АМР, 2Z- и З'-изомеры, б'-дезоксирибонуклеотиды, нуклеозиды и
пиримидиновые нуклеотиды указанным эффектом не обладают.
Пуриновые рибонуклеотиды 5-монофосфатов получают, проводя
энзиматический гидролиз дрожжевой RNA. После 1961 г. разра-
ботана прямая ферментация с использованием мутантов бакте-
рий, а также Salvage синтез, при котором происходит достройка
предшественника (например, азотистого основания) до б'-рибо-
нуклеотида при участии микробных клеток или ферментов. В уси-
лении природных запахов существует синергизм у глутамата Na
и 5ММР и 5Z-GMP. Их часто используют в комбинации для уси-
ления запахов супов и соусов. При этом требуется ничтожное
количество добавок: достаточно 0,005—0,01% 5/-рибонуклеотидов.
Добавки помогают также избавиться от нежелательных свойств
пищи, например от металлического вкуса консервов. Ежегодное
производство рибонуклеотидов составляет 3 тыс. т.
Получение
В промышленности (в Японии главным образом) рибонуклео-
тиды 5Z-GMP и 5Z-IMP получают тремя способами: проводят гид-
ролиз дрожжевой RNA с помощью микробных ферментов; хи-
мический гидролиз дрожжевой RNA; путем прямой феРментаВДи.
Гидролиз дрожжевой RNA. Используют чаще всего дрожжи
С. utilis или Sacch. cerevisiae в ранней логарифмической фазе
256
роста. В таких клетках RNA может составлять до 20% общего
веса, причем 75—80% RNA приходится на рибосомальную. RNA
экстрагируют из биомассы раствором 5—20% NaCl при 100° С в
течение 8 ч. Далее биомассу отделяют, a RNA осаждают, добав-
ляя к фильтрату НС1 или этанол. Осадок отделяют, высушивают
и подвергают энзиматическому гидролизу, в результате которого
получают смесь, содержащую 5Z-GMP, 5Z-AMP, 5Z-HMP и 5Z-CMP.
Пиримидиновые нуклеотиды являются побочными продуктами;
5Z-AMP под действием деаминазы превращают в 5Z-IMP. Источ-
никами ферментов в промышленности служат Pen. citrinum или
Str. aureus. Важно, чтобы штамм-мутант обладал слабой фосфа-
тазной активностью. Рибонуклеотиды очищают с помощью акти-
вированного угля, ионообменной хроматографии и подвергают
фракционированному осаждению метанолом. Под действием
57-фосфодиэстеразы происходит гидролиз не только RNA, но и
DNA (которая тоже присутствует в исходном материале), поэто-
му 5Лдезоксинуклеотиды образуются как побочные продукты, от-
делять которые от 5/-рибонуклеотидов очень трудно. Недавно им-
мобилизованную 57-фосфодиэстеразу модифицировали таким об-
разом, что она селективно осуществляет гидролиз только RNA,
и ее предварительная очистка от DNA теперь не требуется. Им-
мобилизованный модифицированный фермент работал в широ-
ких пределах pH (от 4,5 до 6,0), воздействовал на субстрат с мо-
лекулярной массой только меньше, чем 200 тыс. Для работы фер-
мента необходим Zn2+ В условиях проточного режима иммобили-
зованная 5/-фосфодиэстераза стабильна после 360 дней работы.
Химический гидролиз RNA проводят при 130° С в растворе
Са(ОН)2 в течение 3—4 ч. При этом образуются нуклеозиды, ко-
торые подвергают химическому фосфорилированию после деами-
дирования аденозина в инозин.
Прямая
ерментация
Путь синтеза нуклеотидов одинаков у всех изученных живых
существ и отображен ниже. Регуляция синтеза изучалась у Вас.
subtilis. Установлено, что АМР вызывает репрессию и ретроинги-
бирование ключевого фермента синтеза нуклеотидов — PRPP-
аминотрансферазы и ингибирование ферментов собственного син-
теза аденилсукцинатлиазы и аденилсукцинатсинтетазы. GMP вы-
зывает менее сильное, чем АМР, ингибирование PRPP-амино-
трансферазы. ХМР и особенно GMP оказывают сильное репрес-
сирующее и ингибирующее действие на IMP-дегидрогеназу. При
производстве рибонуклеотидов методом прямой ферментации вна-
чале получают нуклеозиды, применяя для этого мутанты с бло-
ком в синтезе нуклеотидов и с нарушенной регуляцией синтеза
с участием конечного продукта. Полученные нуклеозиды далее
подвергают химическому фосфорилированию — это один способ.
По другому способу проводят прямую ферментацию, в которой
сразу получают б'-рибонуклеотиды также с помощью мутантов
с блоком в регуляции образования продуктов.
257
Получение инозина. Мембрана клеток не пропускает нуклео-
тиды, но пропускает нефосфорилированные производные — нук-
леозиды. АМР и ADP оказывают сильное ингибирующее действие-
5-фосфо рибозил-
пирофосфат (PRPP)
PRPP-амидотрансфераза
фосфо рибозиле мин
SAICARP 1- (5-фссфорибозил) -4- (N-сукцино-
карбоксамид) -5- (аминоимидазол)
AICARP [5-амино-1 - (5-фосфорибозил) - I
имида зол карбоксамид]
IMP
। М Р дс гид ро гена за
( /
v GMP
GMP-синтетаза
аденил сук цинатсинтетаза
сукцино-АМР
на амидотрансферазу раннего предшественника синтеза PRPP
(фосфорибозилпирофосфат). Поэтому используют мутанты с бло-
ком в синтезе АМР, а также с пониженной нуклеозидазной ак-
тивностью, не содержащие IMP-дегидрогеназы и/или с увеличен-
ной активностью б'-нуклеотидазы. Продуценты инозина обнару-
жены среди адениновых ауксотрофов разных штаммов: Bacillus,
Brevibacterium, Corynebacterium, Streptomyces и Saccharomyces.
В промышленности используют ауксотрофные мутанты: Вас. sub-
tilis (максимальный выход инозина 18,0 г/л), Brevibacterium ат-
moniagenes и Microbacterium с максимальным выходом 30 и
35 г/л инозина соответственно. Инозин подвергают химическому
фосфорилированию с образованием 5ММР.
Получение 5Z-IMP. Мутанты, используемые для получения
5Z-IMP, не должны содержать SAMP-синтетазу, чтобы избежать
отрицательную регуляцию со стороны АМР на амидотрансферазу
PRPP, должны иметь низкую активность ферментов, разлагаю-
щих 5Z-IMP и повышенную проницаемость мембраны для экскре-
ции 5Z-IMP. Регуляция биосинтеза пуриновых нуклеотидов пока-
зана выше.
Для получения 5Z-IMP используют мутанты Brevibacterium
ammoniagenes. Максимальный выход 5Z-IMP (19 г/л) получают у
штамма КУ13105, ауксотрофа по аденину, нечувствительного к
258
Mn2+1. Концентрация фосфата и MgSCU должна поддерживаться
на уровне 1 и 2% соответственно. Для ферментации используют
сложную синтетическую среду.
Получение 5Z-GMP. 5Z-GMP можно получить: из 5-амино-4-
имидазолкарбоксамидрибозида (AICAR), который химическим
путем превращают в 5Z-GMP, и из гуанозина, образованного
микробиологическим путем, который затем подвергают химиче-
скому фосфорилированию, из ксантина или 5Z-XMP с последую-
щим превращением в 5Z-GMP и путем прямой ферментации. По-
лучение 5Z-GMP путем прямой ферментации встречает ряд труд-
ностей. Во-первых GMP — это конечный продукт синтеза (в от-
личие от IMP и ХМР), и трудно заблокировать его дальнейший
метаболизм без летальных мутаций. Во-вторых, GMP (как и
АМР) контролирует многие ступени биосинтеза (см. выше), по-
этому его аккумуляция может перекрыть дальнейший синтез нук-
леотидов. В промышленности используют только первые два спо-
соба получения GMP из AICAR и гуанозина.
Получение AICAR. AICAR в больших количествах образуют
пуриновые ауксотрофы. Для промышленных целей используют
мутанты В. megaterium. Максимальный выход AICAR в фермен-
тации — 16 г/л. Мутант культивируют в среде с гидролизатом
крахмала. В качестве источника пурина служат сухие дрожжи
или дрожжевая RNA. Источник азота — гидролизат соевого бел-
ка и NH4C1. Газообразный аммоний используют для поддержа-
ния pH и как источник азота. Споруляция сильно снижает выход
AICAR, поэтому в среду вносят ингибитор спорообразования —
масляную кислоту или с той же целью снижают количество О2.
AICAR экскретируется в среду, его выделяют, очищают, вначале
превращают в гуанозин через ряд химических ступеней, а затем
фосфорилируют.
Получение гуанозина. Штаммы, образующие в больших коли-
чествах гуанозин при ферментации, не должны содержать
SAMP-синтетазу, GMP-редуктазу, должны иметь пониженную
нуклеозидазную активность и дерегулированные ферменты син-
теза GMP, особенно PRPP-аминотрансферазу, 1МР-дегидрогеназу
и GMP-синтетазу. Гуанозин выделяют в среду штаммы Вас. sub-
tilis, Вас. pumilis, Cor. petrophilum, Streptomyces griseus. В про-
мышленности используют главным образом мутанты Вас. subtilis
(они же продуценты инозина). Мутант Вас. subtilis является аук-
сотрофом по аденину, не содержит GMP-редуктазу, не проявляет
регуляции по типу ретроингибирования при участии GMP, имеет
увеличенную активность IMP-дегидрогеназы и GMP-синтетазы.
Бактерии культивируют в среде, содержащей глюкозу, аденин,
гидролизат соевого белка, NH4C1, фосфаты, минеральные соли,
мел, при 30°. Выход гуанозина — 4,3 г/л, а инозина — 3,1 г/л.
1 У диких штаммов ионы Мп2+ в среде снижают проницаемость цитоплазма-
тической мембраны в отношении экскреции рибонуклеотидов.
259
Возможно получение гуанозина, инозина и ксантозина, а также-
их нуклеотидов из соответствующих оснований с помощью мутан-
тов Вас. subtilis. Методом salvage («спасительного» синтеза) по-
лучают 5'-АМР, АТР из аденина:
аденин —---------> аденозин---------—АТР.
subtilis
Мутант Вас. subtilis имеет блок на уровне аденозиндеаминазы,..
GMP-редуктазы и IMP-дегидрогеназы и образует до 16 г/л аде-
нозина. Высушенные клетки пекарских дрожжей служат источни-
ком аденозинфосфокиназы: 1 г аденозина они превращают в 1,6 г
натриевой соли АТР в присутствии глюкозы и фосфата.
Перспективы роста
промышленности ароматизаторов
Считают, что спрос на глутамат Na, инозинат, гуанилат и на?
дрожжевой гидролизат будет все время увеличиваться. Это вы-
звано тем, что большое распространение получает маложирная^
диета и всевозрастающее использование имеет растительная пи-
ща, которую нужно разнообразить. В будущем будут произво-
диться уникальные растительные флаворизаторы либо в культу-
ре клеток растений, либо путем экспрессии генов растений в
микроорганизмах. Летучие ароматические соединения, как иононы
и цитраль, оказывают положительное действие на настроение лю-
дей и вообще на их самочувствие. Эти и многие другие арома-
тизаторы с терапевтическим эффектом будут производиться глав-
ным образом биотехнологическим путем.
Для удаления неприятных запахов природных, искусственных;
и синтетических волокон, бумаги, кожи, смол, пленок и других
материалов предлагают использовать искусственные иммобилизо-
ванные ферменты — оксидоредуктазы на основе Fe-содержащих
фталоцианиновых комплексов. В качестве дезодорирующих аген-
тов собираются использовать растущие микроорганизмы. Str. gri-
seus, Str. antibioticus, Micrococcus sp., Flavobacterium sp., Cory-
nebacterium sp. и другие бактерии за 10 ч осуществляют дезодо-
рирование таких дурнопахнущих отходов, как фекалии сельско-
хозяйственных животных и птиц, активного ила сточных вод. За
несколько дней бактерии вызывают компостирование этих отхо-
дов, после чего их можно использовать как отличное удобрение
для полей.
ЛИТЕРАТУРА
Безбородов А. М. Синтез нуклеотидов, их производных и флавинов//Био*
химические основы микробиологического синтеза. М., 1984. С. 266—277.
Родопуло А. К., Егоров И. А. Влияние различных видов дрожжей на
образование ароматообразующих веществ//Прикладная биох. и микр. 1987_
Т. 23. № 6. С. 833—836.
260
Armstrong D. W. Biogeneration of aroma Compounds//Amer. Chem. Soc.
1986. P. 254—265.
D em a i n A. L. Production of nucleotides by microorganisms, in: ed. Rose A. H.//
//Primary products of metabolism. 1978. Vol. 2. London, 1978. P. 187—208.
К i 11 a r a A., M u t i 1 a n g i W. A. M. The role of enzyme and microbial biotech-
nology in flavor development of foods//World Biotechnol. Rept. Proc. Conf.,
San Francisco; N. Y., 1986. P. 51—62.
Kinin aka A.//Flavour Reaserch 1981. P. 305—353.
Sharpell F. H.//Comprehensive Biotechnology. 1985. Vol. 3, P. 965—981. Per-
gamon Press.
ГЛАВА XII
ВИТАМИНЫ И ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ
С использованием микроорганизмов описаны процессы полу-
чения витаминов Вь В2, фолиевой и пантотеновой кислот, пири-
доксаля и витамина В12. Кроме того, в синтезе некоторых вита-
минов, например витамина С, микроорганизмы могут осущест-
влять некоторые ступени. Изучается микробный синтез биотина,
но его промышленного производства еще нет. Промышленная
ферментация экономична только для получения витаминов В2 и
В12. Получение (3-каротина (провитамина А) микробиологическим
путем менее выгодно, чем его химический синтез, но в связи с
ростом цен на сырье ферментация может стать более экономич-
ным процессом. В промышленном масштабе микробиологическим
путем получают витамины Bi2, В2, D2 (облученные дрожжи).
В полупроизводственных условиях выпускают [3-каротин. В мире
работают 40 крупных фирм — производителей витаминов: 18 в
США, 8 в Японии, 14 в Западной Европе. Ведущее место зани-
мает швейцарская фирма Hoffman La Roche, выпускающая 50—
70% всех витаминов. В мире ежегодно выпускают витамины С и
РР в количестве —40 тыс. т; биотин, фолиевая кислота и Bi2
представлены малотоннажным производством — 10 т. Другие ви-
тамины производят в количестве от 1 до 10 тыс. т в год.
ВИТАМИН В12
Витамин В12, или цианкобаламин, — важное биологическое
соединение, активный гематопоэтический фактор млекопитающих
и ростовой фактор для многих видов микроорганизмов и живот-
ных.
В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в
печени быка — 1 мг/кг), чтобы использовать этот источник для
промышленных целей. Активированный ил сточных вод содержит
4—10 мкг/кг витамина, но при этом требуется разделение боль-
шого числа различных форм (аналогов). Химический синтез
очень сложен. Больше 10 лет потребовалось сотрудникам двух
больших лабораторий — Вудворта и Эшенмозера — для осуще-
ствления химического синтеза витамина Bi2, включающего 70 сту-
пеней. Поэтому это соединение в промышленности получают био-
синтетическим путем. Из Ют ежегодно выпускаемого в мире
витамина В12 3,5 т приходится на цианкобаламин (собственно ви-
тамин Bi2), 2 т на гидроксокобаламин, 1 т — на коэнзим В12 и
небольшое количество на метилкобаламин; эти формы в указан-
262
ных количествах используют в медицине. Остальное количество
витамина используется для животноводства.
Применение. Витамин Bi2 применяют при лечении злокачест-
венной анемии, цирроза печени, при нервных и психических рас-
стройствах. Он широко используется в кормопроизводстве. В на-
стоящее время большинство комбикормов для свиней и птиц обо-
гащают витамином В12, особенно благоприятное действие на жи-
вотных оказывает сочетание витамина Bi2 с малыми дозами ан-
тибиотиков, в частности биомицина. Витамин В12 воздействует на
кроветворную функцию и на обмен белков, принимает участие в
регуляции оптимального содержания в организме животного ме-
тионина, валина, треонина, лейцина, изолейцина.
У птиц снижение содержания В12 в желтке яиц приводит к
резкому падению выводимости потомства. При добавлении Bi2 в
корма (10—15 мг/т) прирост поросят увеличивается на 10—15%,.
цыплят — до 20%, яйценоскость кур — со 180 до 208 яиц в год.
При добавлении В12 к кормам можно заменить животный белок
растительным. Микробиологическая промышленность в Советском
Союзе выпускает витамин В12 двух марок: А— 100—500 мг/кг,
В — не менее 500 мг/кг препарата.
Люди получают витамин с пищей и не могут усваивать ви-
тамин, выделяемый бактериями кишок. Животные получают ви-
тамин с кормом и утилизируют витамин, образуемый кишечной
микрофлорой.
Молекулярная структура. Витамин Bi2 — первое органометал-
лическое соединение, выделенное из биологической системы. Из
неполимерных органических соединений имеет наиболее сложное
строение, изображенное на рис. 53. Молекула состоит из двух поч-
ти планарных циклических структур и линейного участка. Металл
Со+з связан с макроциклом, сильно напоминающим порфирино-
вое ядро гема. Это тетрапиррольная структура, но имеющая ту
особенность, что вместо метеновых мостиков, связывающих 4 пир-
рольных кольца, кольца А и D непосредственно связаны. Вторая
кольцевая структура — азотистое основание — 5,6-диметилбен-
зимидазол (5,6 ДМБ). 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой си-
стемой гетерогенной боковой цепью, состоящей из £М-амино-2-
пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мо-
нонуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ Ыа-гликозидной:
связью. Эта структура не только очень сложная, но содержит не-
которые необычные части: 1) корриновая структура ранее не бы-
ла известна в органической химии (до открытия витамина Bi2 в
1948 г. независимо Риксом и Смитом); 2) Na-гликозидная связь
встречается в природе очень редко и обнаружена лишь в несколь-
ких соединениях, содержащих рибозо-3-фосфат; 3) 5,6 ДМБ тоже
принадлежит к уникальным соединениям и встречается в природе
только в составе кобаламинов.
Атом Со имеет 6 координационных связей; 4 из них заняты
пиррольными кольцами. Одна — N-3—5,6 ДМБ и последняя —-
верхним лигандом (У), природа которого может варьировать..
263
В коммерческом витамине Bi2 (цианкобаламине) лиганд —
CN-rpynna (артефакт процесса выделения). In vivo чаще всего
встречаются дезоксиаденозильная группа (С0-В12—I)» метильная
группа (метилкобаламин, СН3—В12~СоВ12—П) или оксогруппа
2
ос
КОБАЛАМИНЫ
X - CN : цианкобаламин
X = сн~
о
метилкобаламин
аденозил кобаламин
или коэнзим В12
Рис. 53. Структура кобаламинов
(оксокобаламин). Кроме этих соединений, известных как коба-
ламины, есть другие корриноидные соединения с иным нуклеотид-
ным основанием.
264
Нижний лиганд (х) — 5,6 ДМБ может быть заменен на аде-
нин (псевдовитамин В12), на гуанин (фактор С), 2-метиладенин
(фактор А) и др. Они могут проявлять активность для некото-
рых микроорганизмов, но неактивны для людей. Из всех вита-
мин В12-подобных соединений только Co-Bi2—I и Со-В12—II
(СНз—В12) действительно активны на клеточном уровне и как
кофакторы вовлекаются в катализ двух типов реакций. Аденозил
Bi2 используется в реакциях, в которых имеет место перестройка
углерод-углеродных связей. Метил В12 вовлекается в реакциях
переноса метильных групп, например в синтезе метионина из го-
а минолевулиновая
кислота
порфобилиноген
гидрокси метилбилан
уроген III
мо но метил ко рри фи ри н
кобириновая кислота
X- кобина мид- GDP
гем
Х-кобаламин-5'р
Х-кобаламин
или витамин В19
I 4*
Рис. 54. Биосинтез кобаламинов. 1 — ретролнгибирование
моцистеина (Воробьева, 1982). Недавно открыты новые аналоги
витамина Bi2: три из них получены при частичном синтезе (фтор-
метилфосфито-Р-кобаламин, диметил фосфито-Р-коб ал амин, Fe-ко-
баламин) и один фактор VA выделен из активного ила.
По сравнению с CN-кобаламином у них были модифицирова-
ны либо верхний лиганд, либо центральный атом корринового
|() Л. И. Воробьева
265
кольца. Два фосфито-корриноида, содержащие Со-Р-связь, про-
являют активность для Ochromonas malhamensis (реакция как
у высших животных) для Е. coli 215 и животных. В отличие от
них Fe-кобаламин и фактор VA проявляли очень низкую актив-
ность. Первые два аналога связывались с внутренним фактором
(ВФ) животных (белок, участвующий в транспорте витамина
Bi2), другие два — нет. Значит, биологическая активность корре-
лирует со способностью связываться с ВФ.
Биосинтез. Путь биосинтеза представлен на рис. 54 и вклю-
чает ступени образования: 1) порфиринового ядра, 2) коррино-
вого ядра, 3) кобаламинов. Путь до уропорфирина III хорошо
изучен в отличие от последующих ступеней от УПГ III к кобири-
новой кислоте. В последние годы открыт ряд пигментированных
интермедиатов — метилкорриноидов. Источником СН3-групп слу-
жит S-аденозилметионин. Диметилкоррифирин идентичен сирогид-
рохлорину (сирогему микробной сульфитредуктазы), следователь-
но, этот интермедиат и возможно другие коррифирины имеют ви-
таминнезависимую биологическую функцию.
Образование кобаламина включает: амидирование семи кар-
боксильных групп корринового кольца, включение остатка изо-
пропиламина (происходит из треонина), активацию кобинамида
с участием GTP и с образованием GMP, включение нуклеотидно-
го основания. Включение атома Со происходит вскоре после об-
разования кобириновой кислоты. У Prop, shermanii все извест-
ные корриноиды, амидированные больше, чем кобириновая кис-
лота, находятся в б'-аденозильной форме. Аэробные и аэротоле-
рантные формы синтезируют 5,6 ДМБ из рибофлавина через
FMN. Для синтеза требуется О2.
Анаэробы образуют 5,6 ДМБ другим путем, включающим гли-
цин и метионин. б-Аминолевул ивовая кислота (б-АЛК) у аэро-
бов образуется из глицина и сукцинил-СоА, а у анаэробов — из
глутамата (как у растений).
Биосинтез витамина В12 у бактерий происходит двумя неза-
висимыми путями, но оба приводят к образованию 5'-дезоксиаде-
нозилкобинамидгуанозиндифосфата и а-рибазол-б'-фосфата, яв-
ляющихся субстратами для конечной стадии синтеза. Из клеток
мутанта Е. coli выделили 70 S рибосомы, способные синтезировать
витамин В12 в реакционной системе. Основным катализатором
синтеза является белок 18L. Белки 5S RNA также катализирова-
ли синтез витамина. Витамин В12, синтезированный при участии
изолированных рибосом, был биологически активным. Гем ока-
зывает ингибирующее действие на общие начальные пути синте-
за корриноидов и порфиринов. Синтез витамина Bi2 регулирует-
ся на уровне монометилкоррифирина. Регуляция осуществляется
с участием кобаламинов и аналогов, в которых 5,6 ДМБ заме-
щен на аденин или метиладенин. Фактор В регулирующей актив-
ностью не обладает. На биосинтез витамина пропионовыми бак-
териями стимулирующее действие оказывает ион NH4+; в его от-
сутствии клетки витамин
не синтезируют.
Глутамин и
аспарагин
266
могут заменить ион NHyh Стимулятором синтеза Bi2 у Ps. de-
nitrificans выступает бетаин (триметилглицин).
Продуценты. Витамин синтезируют многие бактерии. Дрожжи
и мицелиальные грибы не образуют корриноиды. В табл. 41 пе-
речислены микроорганизмы, которые в силу высокого уровня
биосинтеза кобаламинов в разное время рассматривались как его
Таблица 41
Образование витамина В12 разлитыми штаммами
(по Florent, Ninet, 1979)
j
Штамм Источник углерода
Выход,
мг/л
.Micromonos рог a sp.
Nocardia rugosa
Propionibacterium freudenreichii
Propionibacterium shermanii
Propionibacterium vannielii
Pseudomonas denitrificans
Streptomyces olivaceus
Смешанная культура метаногенных
бактерий
Bacterium FM-O2T
Methanobacillus omelianskii
Protaminobacter ruber
Corу neb act er ium и
Rhodopseudomonas
Nocardia gardnerii
глюкоза
глюкоза4-тростниковая меласса
глюкоза
глюкоза
глюкоза
свеклосахарная меласса
глюкоза-лактоза
метанол
метанол
метанол
метанол
н-па рафины
гексаденан
11,5
14
25
23—40
59
35
2,6
8,8
2,5
2,3
4,5
потенциальные продуценты в промышленности. В настоящее вре-
мя в промышленности используют в основном три штамма бак-
терий: Pseudomonas denitrificans, представителей рода Propioni-
bacterium и метаногенные бактерии (смешанную культуру). Во
всех случаях независимо от используемого штамма и условий
культивирования в среду вводят ионы кобальта и часто 5,6 ДМБ.
Добавление таких предшественников корриноидов, как глицин,
треонин, 6-АЛК и аминопропанол, может оказывать стимулиру-
ющее действие на витаминообразование.
ПОЛУЧЕНИЕ
Получение витамина В12
с помощью пропионовокислых бактерий
Для производства используют Prop, freudenreichii АТСС 6207,
Prop, shermanii АТСС 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их ва-
рианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы,
способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку син-
тез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществля-
ют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий
выход продукта. На 1-й стадии культуру выращивают в анаэроб-
ных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии вклю-
10*
267
чают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМ&
и превращения этиокобаламина в дезоксикобаламин. Обе ста-
дии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Ана-
эробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирова-
ния и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно,
в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят
только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезиру-
ют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются
полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для
ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную*
мелассу (10—100 г/л), небольшие количества солей Fe, Мп ю
Mg, а также Со (10—100 мг/л), источники азота [(NH^SC^].-
В среду добавляют кукурузный экстракт (30—70 г/л), содержа-
щий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бак-
терий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез ви-
тамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии
культивируют при 30°, поддерживая pH на уровне 6,5—7,0 путем;
введения (NH4)OH. Ферментацию производят в ферментерах на
500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевно-
го материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим дав-
лением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следую-
щие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возмож-
ны некоторые вариации в культивировании. Витамин Bi2 сохра- j
няется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:. '
1) выделение витамина из клеток и превращение его в цианкоба-
ламин, 2) выделение неочищенного продукта (80% чистоты), ко- j
торый можно использовать в животноводстве, 3) дальнейшую’ ;
очистку до уровня 91—98% (для медицинских целей).
Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при-
80°—120° в течение 10—30 мин при pH 6,1—8,5. Превращение в j
CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или кле- ]
точную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутст- 1
вии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различ- |
ных носителях: амберлите IRC-50, А120з, активированном угле ж 1
элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Ив I
водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или кре- ]
золом или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеро-1
дистым тетрахлоридом или хлороформом. 1
При упаривании различных растворителей получают осадок 1
или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем’I
растворителе до нужной концентрации. I
Выход витамина Bi2 при использовании пропионовокислых!
бактерий — 25—40 мг/л. Но есть патентное сообщение (Фран-!
ция) о достижении невероятно высокого выхода — 216 мг/л. Л
Получение витамина В12 I
с помощью Pseudomonas denitrificans ,а
Ряд штаммов рода Pseudomonas образует в значительных ко*Я
личествах Bi2, но чаще всего используют мутант Ps. denitriftiB
268
cans, у которого в результате мутагенеза уровень витамина В12
удалось поднять с 0,6 мг/л (дикий штамм) до 60 мг/л. Бактерии
культивируют с аэрацией и перемешиванием в периодических (или
проточных) условиях в среде (а) следующего состава: свеклоса-
харная меласса — 100 г, дрожжевой экстракт — 2 г, (NH4)2
НРО4 — 5 г, MgSO4 — 3 г, M11SO4 — 200 мг, СоЫОз — 188 мг,
5,6 ДМБ — 25 мг, ZnSO4 — 20 мг, Ма2МоОз — 5 мг, вода водо-
проводная — до 1л, pH 7,4. Меласса богата бетаином и глута-
миновой кислотой, оказывающими положительный эффект на
выход витамина. Бетаин стимулирует синтез б-АЛК и, возможно,
также изменяет проницаемость мембраны.
Культуру сохраняют в лиофилизированном состоянии, поддер-
живают в вышеприведенной среде. Пересев осуществляют в про-
бирку с плотной средой (б). Состав среды (б): свеклосахарная
меласса — 60 г, пивные дрожжи — 1 г, N—Z-амин — 1г,
(NH4)2HPO4 — 2 г, MgSO4 — 1 г, MnSO4 — 200 мг, ZnSO4 —
20 мг, MoSO4 — 5 мг, агар — 25 г, вода водопроводная — до 1 л,
pH 7,4. Инкубируют 4 дня при 28°. Далее клетки переносят в
150 мл жидкой среды того же состава (но без агара), налитую в
литровую колбу Эрленмейера. Инкубируют 3 дня при 28° на ка-
чалке. Содержимое колбы вносят в ферментер на 5 л, содержа-
щий 3,3 л среды (см. выше), стерилизованный 75 мин при 120°.
Инкубируют 90 ч при 29° с перемешиванием (420 об/мин) и аэра-
цией (0,2 м3/ч). Чистый витамин Bi2 получают в результате про-
ведения следующих последовательных операций:
Культуральная нагревание 30 мин при 120° С, охлаждение, доведение
жидкость с клетками pH до 8,5, добавление KCN, перемешивание 16 ч при
Ps. denitrificans (3,3 л) 25°, добавление ZnCl3 (200 г), доведение pH до 8,0, пе-
ремешивание, фильтрация
У
Фильтрат
трехкратная экстракция 350 мл смесей крезола и угле-
родистого тетрахлорида (1 : 2 — соотношение)
Органический экстракт I
добавление 500 мл н-бутанола, трехкратная экстракция
100 мл воды
Водный экстракт
трехкратная экстракция 30 мл смеси крезола и угле-
родистого тетрахлорида (1:2 соотношение)
Органический экстракт II
добавление 200 мл ацетона и 120 мл эфира
4
Неочищенный витамин В12
растворение в 10 мл метанола, хроматография на ак-
тивированном алюминии (4 г), элюция 2%-й уксусной
4- кислотой в метаноле, осаждение эфиром
Чистый витамин Bi2
В результате процесса экстракции получают цианкобаламин с
269
98%-й чистотой и выходом 75%. Конечный выход — 59—60 мг/л,
CN-кобаламин — стабильная форма витамина.
Получение витамина Bi2
с помощью метаногенных бактерий
В клетках метанобразующих бактерий присутствует от 4,1 нмо*
ля/мг сухих клеток у Methanosarcina barkeri до 0,65 наномо
лей/мг сухих клеток у Metanobacterium fortnicutn. Биосинтез ко-
баламинов архебактериями (изучали на М. barkei) сходен с био-
синтезом корриноидов у анаэробных эубактерий. У Mtb. thermo-
autotrophicum большая часть клеточного кобамида локализована
во фракции мембран и связана с мембранным белком. Предпо-
лагают, что содержащий кобамид интегральный мембранный
белковый комплекс играет существенную роль в метаболизме этих
бактерий при утилизации Н2+СО2, которая, видимо, сводится к
переносу электронов и генерации Ар +. Корриноиды1 * у метан-
образующих бактерий участвуют также в катаболизме ацетата и
метанола. Превращение метанола в метан у Mts. barkeri проис-
ходит через образование СН3-С0М, в метилировании которого за
счет метанола участвуют две метилтрансферазы, зависимые от
кобамида. Корриноид, видимо, служит простетической группой
фермента.
В Венгрии из ила сточных вод выделили мезофильные мета-
ногенные бактерии и инкубировали их в ассоциации с другими
бактериями в полупроточном режиме в среде, содержащей мета- !
нол (3—12 г/л), мелассу, кукурузный экстракт, NH4, Со, орто-
ксилидин и 5,6 ДМБ. Ферментацию ведут при 35° в ферментере I
на 1000 м3 с ежесуточной заменой 10% бродящего субстрата све-
жей средой. Биомассу отделяют на сепараторах и высушивают
на распылительной сушилке. Высушенный концентрат усредняют |
мелом до стандартной активности 1000 мкг/г препарата, который I
используют в таком виде как добавку к кормам. Сухой концент-1
рат до усреднения содержит —3000 мкг/г витамина В12, что со-1
ставляет 45—50% суммы корриноидов, фактор III — 10—15% и]
другие неполные корриноиды — 40—50%. Термофильные штаммы!
родов Methanobacillus и Methanobacterium образуют 2 мг/л ко-|
баламина при содержании в среде 8 г/л метанола. 1
В Советском Союзе производство кормового препарата вита-]
мина В12 на двух заводах основано на переработке барды (от-|
хода ацетоно-бутилового или спиртового производства) биоцено-1
зом бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожеЛ
ние сточных вод. Используют сложный консорциум анаэробный
1 Получены экспериментальные данные (Stupperich, 1987), показывающие, чтс
метаногены нуждаются скорее в высоком содержании кобамидов, чем в на<
линии специфических кобамидов, накопление которых лишь отражает ocoi
бенности биосинтетических путей у метаногенов. j
270
микроорганизмов, включающих углеводсбраживающие, аммони-
фицирующие, сульфатвосстанавливающие и метанобразующие
бактерии. К барде добавляют метанол — до 2%, СоС12-6Н2О —
10 г/м3, мочевину — 300 г/м3 и сухие кормовые дрожжи —
230 г/м3. Дозировку обогатителей производят автоматически.
Барду подают в нижнюю часть метантенка (на 4—5 тыс. м3),
в котором автоматически регулируют параметры процесса, обес-
печивая контроль температуры (55—57° С), pH (7,5—8,0) и дли-
тельности брожения. Брожение ведут непрерывно, ежесуточно за-
меняя 20—25% бродящей жидкости на свежую барду. В каче-
стве пеногасителя используют рыбий жир.
Для получения кормового препарата бражку выпаривают и
сушат. Поскольку витамин Bj2 неустойчив при тепловой обра-
ботке, особенно в щелочной среде, его стабилизируют. Для этого
получаемую в процессе брожения жидкость перед выпариванием
подкисляют до pH 5,0—5,3 и добавляют к ней сульфит натрия
(0,1—0,25%). Содержание витамина В12 в исходной сброженной
жидкости — 4,4 г/м3. Сгущение сброженной барды осуществля-
ют на выпарных аппаратах (до 14—17% содержания сухих ве-
ществ), а сушку в распылительной сушилке. Концентрация ви-
тамина В12 в высушенном препарате — 500—600 мг/кг. Истинный
витамин составляет 20—25% от суммы корриноидов, фактор
III — 35—40%, фактор В и другие — 40—45%. Получаемый пре-
парат называют КМБ-12. Мезофильные и термофильные метано-
генные бактерии, в том числе Metanobacterium thernioautotrophi-
сит, Mb. thermoformicum, Mb. bryantii, Metanosarcina barkeri,
Ms. vacuolata, Ms. tnazei, Methanococcus halopilus, синтезируют
исключительно фактор III. Истинный витамин В12 образуют не-
спорообразующие метилотрофы: Eubacterium limosum, близкий к
нему Butyribacterium methylotrophicum и Acetobacter woodi. Пу-
тем создания искусственных биоценозов и подбора условий фер-
ментации возможно целенаправленное регулирование процесса
биосинтеза витамина Bj2.
Новые разработки. Для удешевления производства витамина
В12 и утилизации дешевого возобновляемого сырья изучалось об-
разование корриноидов бактериями Prop, acidi-propionici АТСС
25562 при росте на ксилозе как главной составной части гидро-
лизатов гемицеллюлоз. Используя ксилозу, бактерии аккумули-
ровали 0,35 мг корриноидов в одном литре среды без внесения
солей Со. Для продукции корриноидов из ксилозы больше всего
подходит UFR-реактор, работающий с ультрафильтрационной ре-
циркуляцией клеток.
Иммобилизованные клетки. В Японии сравнивали стабиль-
ность и продуктивность биокатализатора при включении клеток
Propionibacterium sp. в гели каппа-каррагенана, Na-альгината,
тира и форполимерные уретановые смолы. Оптимальной под-
ложкой служит форполимер PU-9, полимерная матрица которой
Ис снижала активности включенных в нее клеток. В оптимальных
условиях ферментации 5 г иммобилизованных клеток вновь син-
271
тезировали.и экскретировали 900 мкг витамина за 18 дней повтор-
ной периодической ферментации, продемонстрировав возмож-
ность проведения многоступенчатого сложного синтеза (подобных
примеров известно немного).
Усовершенствование штаммов. В последние годы усовершенст-
вование штаммов было достигнуто путем мутаций и селекции.
Этим методом в 50 раз увеличена продуктивность по витамину у
Ps. denitrificans. Для грамположительных бактерий Propionibac-
terium, Bacillus, Streptomyces применимо слияние протопластов,
для грамотрицательных бактерий, например Pseudomonas, до-
ступны конъюгативные плазмиды, как Inc PI. Пока весомых
практических результатов этими новыми и мощными методами
не получено, но начало таким работам положено. Клонировали
И генов, кодирующих ферменты биосинтеза витамина В!2 у Вас.
megaterium. Полагают, что в геноме содержится всего 20—30 та-
ких генов. Поэтому DNA Вас. megaterium подвергли фрагменти-
рованию и крупные фрагменты встраивали в плазмиды, которы-
ми далее трансформировали мутанты-ауксотрофы по Bi2. Такие
мутанты приобрели способность синтезировать витамин В]2. Ме-
тод может быть использован для получения штаммов-продуцен-
тов в производственных масштабах.
В Е. coli клонированы гены Prop, technicum, ответственные за
синтез витамина Bi2. Prop, technicum не содержит плазмид, по-
этому из этого штамма выделили, очистили и частично разруши-
ли ДНК, получив фрагменты 15—20 килобаз. Эти фрагменты
включили в расщепленную плазмиду pBR 322 и полученной гиб-
ридной плазмидой трансформировали Е. coli. Новые трансфор-
манты отличались от контрольного штамма в отношении морфо-
логических и физиологических признаков.
ЛИТЕРАТУРА
Быховский В. Я. Микробиологический синтез витамина Bi2. Сер. V. М.,
1984.
Быховский В. Я., Панцхава Е. С. Промышленное получение витамина
В12 методом метанового брожения. Пущино, 1983.
Воробьева Л. И. Микробиологический синтез витаминов. М., 1982.
Письменный В. В., Зыбин Н. С. и др. Автоматизация процессов про-
изводства кормового концентрата витамина Bi2 ВНИИСЭНТИ. 1985.
Сер. IX.
П оморцева Н. В. Перспективы получения витаминов и коферментов с по-
мощью микроорганизмов//Химико-фарманевтический журнал. 1986. № 8. 1
С. 965—976.
Jeter R., Escalante-Semerena J. С. et al. Synthesis and use of vitamin i
Bi2//Escherichia coli and Salmonella typhimurium. 1987. Vol. 1. P. 551—556.
Kamikubo T. et al. Biological activities of new corrinoids//Agr. Biol. Chenh и
1982. Vol. 46(6). P. 1673—1677. 4
Lago B. D.? Kai an L. Vitamin fermentations: B2 and Bi2. Adv. Biotechnol//1
//Proc. 6 Int. Ferm. Symp. London, 1980. Vol. 3. P. 241—246. 1
Yongsmith B., Son о mot о К. et al. Production of vitamin Bi2 by immo- J
bilized cells of Propionic acid bacteria//Eur. J. Appl. Mier. Biotechnol. 1982.1
Vol. 16. P. 70—74. 1
272
РИБОФЛАВИН
Рибофлавин (витамин В2, лактофлавин) уникален в том отно-
шении, что образуется de novo в очень больших количествах и
за короткое время некоторыми микроорганизмами. Эти организ-
мы, включаемые в группу аскомицетов (Eremotheciiun ashbyii и
Ashby a gossypii), синтезируют более 3 и 7 г/л рибофлавина (РФ)
соответственно. В связи с открытием Гильермоном в 1935 г. та-
кой биосинтетической способности у микроорганизмов в микро-
биологии появился термин сверхсинтез. Но несмотря на столь
высокие выходы рибофлавина, существует жесткая конкуренция
между микробиологическим процессом и химическим синтезом.
Микроорганизмы служат источником коферментной формы РФ —
FAD, имеющей очень важное применение в качестве фармацев-
тического препарата.
Применение. РФ применяют при лечении дерматитов, заболе-
ваний глаз (например, сверхчувствительности глаз к свету, со-
судистых нарушений в роговице), а также при мышечных судо-
рогах, мигренях, при обычных состояниях питательного дефицита
и вообще как средства, улучшающего здоровье. Кормовые пре-
параты РФ (включают мицелий Е. ashbyii и сухие вещества сре-
ды) используют в животноводстве. Такой препарат содержит не
менее 15 мг РФ/г, до 20% белка, а также витамины Вь В3, В6,
В12; и никотиновую кислоту. Использование препарата в живот-
новодстве увеличивает прирост сельскохозяйственных животных
рибофлавин-Ь'-фосфат или FMN
АМР
Рис. 55. Структура рибофлавина. Флавиновые коферменты ФАД и рибофлавин-
I/фосфат (ФМН). Пунктиром обозначен участок, структура которого изменя-
ется при восстановлении
273
н
и птицы до 15%, ~ на 30% снижает смертность, на 3%' увеличи- j
вает яйценоскость кур и на 6% выводимость цыплят. >
Структура. РФ — производное аллоксазина — 7,8-диметил-10-
(l-D-рибитил-изоаллоксазин (рис. 55). Он содержит птериди-
новое кольцо, конденсированное с бензольным кольцом. Боковая I
цепь — это производное рибита (Cs-спирта). Изоаллоксазиновая 1
система функционирует как обратимая редокс-система и участвует 1
во многих окислительно-восстановительных реакциях в составе 1
FMN и FAD. 1
Продуценты* РФ синтезируют большая часть высших растений 1
и многие микроорганизмы, включая бактерии, дрожжи и грибы. 1
Высшие животные не способны к самостоятельному синтезу РФ, I
и их потребность в нем удовлетворяется микрофлорой желудоч- I
но-кишечного тракта и с пищей. I
В соответствии с классификацией А. Демайна микроорганиз- I
мы-продуценты подразделяют на 3 подгруппы: слабые, умерен- I
ные и сильные сверхпродуценты. К слабым относят виды Clostri- I
dium. CL acetobutylicum был первым организмом, о котором в I
1933 г. появилось сообщение как о хорошем продуценте РФ. Син- Я
тез РФ клостридиями чувствителен к ионам Fe. При контроля- Я
ровании этого факта получали ~100 мг/л РФ. Я
К умеренным продуцентам относят дрожжи, особенно вида Я
Candida и Pichia — Р. guilliermondii и С. flareri, но их чувстви-1
тельность к иону Fe в сотни раз выше, чем у клостридий; посколь-Я
ку для их культивирования применяют сложные среды, требуется!
тщательная очистка их от ионов Fe, что затрудняет применение!
дрожжей в промышленности. В лабораторных условиях с помо-1
щью С. flareri за 7 дней получают ~600 мг/л РФ. !
Таблица 42
Микроорганизмы-продуценты рибофлавина и оптимальные
концентрации железа для его биосинтеза
(по Ваггеге, 1983)
Микроорганизмы
Рф, мг/л
Оптимальное содер-
жание железа, мг/л
Clostridium acetobutylicum 97 1 Q X M
Mycobacterium smegmatis 58 не влияет
Mycobacterium riboflavina 200 не влияет
Candida flaveri 567 0,04—0,06
Eremoihecium ashbyii 2480 не влияет
Ashby a gossypii 6420 не влияет
К сильным сверхпродуцентам принадлежат дрожжеподобнй
грибы Е. ashbyii и A. gossypii. Оба представляют собой патоген
растений и обычно инфицируют хлопчатник. Первый гриб отн!
274
сится к гетероталлическому виду, а второй • гомоталлический.
Оба гриба образуют игольчатые аскоспоры. Ионы Fe не оказы-
вают влияния на синтез РФ, что служит важным преимуществом
для использования этих продуцентов в промышленности. Микро-
организмы, представляющие практический интерес в отношении
синтеза РФ и влияние ионов Fe на этот биосинтез, перечислены
в табл. 42.
Полагают, что Fe-флавопротеин у чувствительных к Fe3+ ор-
ганизмов может действовать как репрессор синтеза РФ; Е. ash-
byii и A. gossypii, видимо, содержат конституитивные РФ-син-
тезирующие ферменты. Другое предположение состоит в том, что
условия, стимулирующие синтез РФ, ингибируют у грибов обра-
зование репрессора.
Биосинтез. Путь биосинтеза показан на рис. 56 и постулиро-
ван на основании проведения экспериментов с дрожжами, A. gos-
sypii. РФ образуется из гуанинового производного. Пуриновое
кольцо гуанинового соединения (GTP) (1) (кроме атома С—8)
включается в изоаллоксазиновое кольцо РФ. С—8 выделяется в
|виде свободной муравьиной кислоты, а предшественник I превра-
щается 2,5-диамино-6-окси-4 (5'-фосфорибозиламино) пиримидин
или PRP (2). PRP деаминируется в положении С—2 кольца, а
его рибозиламиногруппа восстанавливается с образованием 5-ами-
но-2,6-диокси-4(5'-фосфорибитиламино) пиримидина или ADRAP-P
(4). Следующий интермедиат пути 6,7-диметил-8-рибитиллЮмазин
(DMRL) (5) возникает в результате присоединения С—4-единицы
к предшественнику ADRAP—Р'. Источником С—4-единицы в
случае грибов и дрожжей служит рибитильная часть ADRAP—Р7;
после дефосфорилирования две молекулы ADRAP взаимодейст-
вуют; одна как донор С—4-группы, другая — как ее акцептор.
При взаимодействии выделяется формальдегид и диаминоурацил
(6) и образуется DMRL — 6,7-диметил-8-рибитилюмазин. При
реагировании молекул DMRL образуется молекула рибофлави-
на (7):
2 DMRL рибофлавин 4- ADRAP.
Недавно РФ-синтазы из видов Bacillus и Clostridium разделили
на две активные фракции: тяжелую РФ-синтазу (мол. масса М
Da), содержащую 2 или 3 а-субъединицы и 60 р-субъединиц, и
легкую РФ-синтазу, которая содержала 3 а-субъединицы. Имеют-
ся указания, что р-субъединицы тяжелого фермента вовлекаются
it превращение пиримидина (ADRAP) в DMRL, а а-субъединицы
катализируют дисмутацию DMRL в РФ. Итак, пиримидин
(ADRAP) происходит из GTP, так что кольцо «С» РФ, атомы
азота и рибитильное ядро кольца «В» образуются из GTP, а во-
< ( мь атомов С о-ксиленового (А) кольца РФ (и это доказатель-
< ню относят к важнейшим достижениям за последние годы) про-
исходят из пентоз в результате внутримолекулярной перестройки
гььПекуЛ и УтРаты С—4. У сильных сверхсинтетиков образование
регулируется .самим витамином или флавиновыми кофермен-
>.|мп. У С. guiltiermondii синтез GTP циклогидролазы (первого
275
Рис. 56. Предполагаемый путь синтеза рибофлавина
фермента пути) регулируется при участии Fe, а ее активность
подчиняется ретроингибированию под действием FAD. У Вас. sub-
Ulis FAD, FMN и РФ служат эффекторами оперонов, имеющих
по крайней мере два оператора. В регуляции участвует белок,
кодированный геном rib С, не связанным со структурными РФ-
ггенами.
Получение РФ в промышленности
Промышленное производство РФ осуществляется тремя спо-
собами: полным химическим синтезом, полным микробиологиче-
ским синтезом, смешанным синтезом, включающим микробный
синтез рибозы с последующей химической трансформацией ее в РФ.
В настоящее время больше 70% промышленной продукции про-
изводят путем химического синтеза из рибозы. Поскольку в хи-
мии нет простого и экономического синтеза рибозы, этот сахар
получают в основном путем микробной ферментации. С этой целью
в Японии используют высокопродуктивные штаммы — мутанты
Вас. subtilis и другие бациллы, образующие ~70 г/л рибозы.
30% мировой РФ продукции относится к микробному синтезу
Ashbya gossypii. Для получения медицинских препаратов РФ с
помощью микробного синтеза промышленность использует в ос-
новном грибы A. gossypii NRRL Y-1056. A. gossypii требует для
роста биотин, инозит и тиамин. Для прорастания спор требуется
лейцин и фенилаланин. Высокий выход РФ (7 г/л) получают в
результате усовершенствования штамма, оптимизации состава
среды и условий культивирования и использования небольшого
йнокулята. В настоящее время основная среда для получения РФ
включает кукурузный экстракт — 2,25%, пептон — 3,5%, соевое
масло — 4,5%. Стимуляцию синтеза РФ получают при добавле-
нии различных пептонов, глицина, остатка после отгонки спиртов
или дрожжевого экстракта. Критическое значение имеют режим
стерилизации среды, использование маленького инокулята (0,75—
.2%) молодой (24—48-часовой) культуры и эффективная аэрация.
Максимальный выход РФ получают при стерилизации среды в
течении 15—30 мин, скорости аэрации 0,3 объем воздуха/объем
жидкости • мин, температуре 28° С. Ферментация продолжается
7 дней.
В качестве антивспенивателя вносят силикон или (что лучше)
соевое масло, которое используется грибом. В сложной среде
сверхпродукция начинается после остановки роста. Во время ро-
ста pH снижается с 7,0 до 4,0—5,0 в связи с выделением кислот.
В конце ферментации кислоты утилизируются грибом и значение
pH повышается, после чего начинается образование РФ. Кристал-
лы РФ появляются в гифах и вне мицелия. В синтетической сре-
де pH сохраняется на постоянном уровне и сверхсинтез начина-
ется до завершения роста.
Если гриб культивируют в углеводсодержащих средах, то об-
разование РФ не начинается раньше, чем остаточная концентра-
277
ция сахара не снизится до 20 г/л. Присутствие в больших коли-
чествах остаточного масла (если среда содержала масло как
источник углерода и энергии) не мешает синтезу РФ. Существует
взаимосвязь между споруляцией и синтезом РФ. Споруляция про-
исходит во время продукционной фазы. Условия, неблагоприятные
для синтеза РФ, ингибируют споруляцию. Непродуцирующие му-
танты аспорогенны, а сверхпродуценты хорошо спорулируют. Свя-
занный в мицелии РФ освобождают при тепловой обработке (1 ч5,
120° С). Мицелий отделяют, а РФ подвергают очистке. Применяе-
мый в промышленности гриб подвергался многоступенчатому хи-
мическому мутагенезу и селекции, в результате чего выход РФ!
увеличили в 11 раз по сравнению с родительским штаммом.
Eremothecium ashbyii. В некоторых странах (в том числе в>
СССР) препараты РФ получают с помощью другого сверхпроду-
цента — Е. ashbyii. Для получения кормового препарата в нашей
стране оптимизирована среда, включающая следующие компо-
ненты: масло, соевую муку, кукурузный экстракт, мел и свекло-
вичный или яблочный порошок. В Англии оптимизированы усло-
вия, обеспечивающие наиболее высокую скорость роста Е. ashbyii
(0,24 4“!) и РФ-продуктивность (2,19-10~3 г/г клеток). Среда со-
держала глюкозу (5 г/л), подсолнечное масло (15 г/л); pH 6,5—
7,0, температура 30° С, скорость перемешивания 750 об/мин, ско-
рость аэрации 220 см3/мин, конечная концентрация РФ — 10,9%.
Bacillus subtilis. Методами генетической инженерии в Совет-
ском Союзе создан штамм В. subtilis — продуцент РФ, для ко-
торого оптимизирована питательная среда. Штамм используют
как продуцент РФ в промышленности. Он образует 4 г/л РФ за
35 ч ферментации.
Получение FAD. FAD может быть получен микробиологиче-
ским путем из внесенных в среду предшественников (FMN и аде-
нина) или в результате синтеза de novo. К активным продуцен-
там FAD относят Е. ashbyii, Sarcina lutea, Brevibacterium ammo*
niagenes. В Японии для получения FAD рекомендован Е. ashbyii»
культивируемый в сложной среде с 20% глюкозы, к которой пос-
ле 48 ч ферментации добавляют 150 г/л мальтозы. В культуре
накапливается до 626 мг/л FAD. Еще более высокий выход FAD
получают с пуринзависимым мутантом Sarcina lutea. В среду
вносят FMN, и аденин; образованный клетками FMN, экскрети-
руется наружу, а максимальное содержание продукта составляет
1 г/л. Синтез и экскреция FAD клетками S. lutea активно проис-
ходят при введении в среду РФ и D-циклосерина, увеличиваю-
щего проницаемость клеточной стенки. Выход FAD (700 мг/л) до-
стигается за 5 дней ферментации.
Новые разработки. Дрожжи до сих пор не использовались в
промышленности в силу более низкой продукции РФ, чем у A. gos-
sypii, и высокой чувствительности к ионам Fe. В последние годы
в лаборатории Г. М. Шавловского выполнены работы с культурой
Р. guiltier mondii, имеющие важное значение для биотехнологиче-
ского использования этих дрожжей как продуцентов РФ. Путем
278
г
слияния протопластов разных штаммов получены гибриды — ге-
терокарионы или диплоиды. Выделены мутанты, способные к ак-
тивному поглощению РФ из среды и аккумуляции в клетках боль-
ших количеств РФ благодаря функционированию специфической
РФ-пермеазы, обладающей высоким сродством к субстрату. По-
лучены мутанты с блокированной РФ-экскретазой. На основе
этих мутантов созданы штаммы, способные накапливать в клет-
ках до 6 мг РФ на 1 г сухой биомассы при росте в среде с саха-
розой или этанолом. Продуктивность сконструированного штамма
в несколько сот раз превышает обычное содержание флавинов
в дрожжах.
ЛИТЕРАТУРА
Воробьева Л. И. Рибофлавин//Микробиологический синтез витаминов. М.,
1982. С. 32—66.
Ш а в л о в с к и й Г. М., Логвиненко Е. М. Биогенез флавинов у дрожжей//
//Украинский биохимический журнал. 1985. Т. 57. № 4. С. 98—112.
Brooke A. G., Dijkhuizen L. Regulation of flavin biosynthesis and meta-
nol metabolism in the yeast Hansenulla polymorpha//Proc. 4th Eur. Congress
on Biotechn. Amsterdam, 1987. P. 458.
Perlman D. Microbial process for riboflavin production//Microbial technology
2 ed. 1979. Vol. 1, Ch. 16. P. 521—527.
Shavlovsky G. M., Sibirny A. A. Riboflavin transport in yeasts and its
regulation//Env. regul. of microb. metabolism/ed. Kulaev e. a. N. J., 1985.
P. 385—392.
Young D. W. The biosyntesis of the vitamins thiamin, riboflavin and folic
acid//Nutr. Prod. Reports. 1986. Vol. 3, N 4. P. 395—419.
АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА
{ВИТАМИН С)
L-Аскорбиновая кислота впервые была выделена из лимонов.
В 1933 г. группы Рейхштейна и Гавордта независимо друг от дру-
га сообщили о химическом синтезе £-аскорбиновой кислоты. По
методу Рейхштейна витамин С получают в промышленности по
настоящее время. Одну реакцию многоступенчатого синтеза, а
именно высокоселективное дегидрогенирование D-сорбита в £-сор-
бозу в соответствии с этим методом осуществляют с помощью
уксуснокислых бактерий. Ежегодно производят более 35 тыс. т
Е-аскорбиновой кислоты.
Применение. Аскорбиновую кислоту используют как витамин-
ный препарат и как антиоксидант при изготовлении пищи. В не-
которых странах витамин С вносят в корма. К недостатку вита-
мина особенно чувствительны поросята. В ФРГ в качестве гаран-
тийных добавок витамина С поросятам-сосунам дают по 50 мг/кг
корма, курам-несушкам — 30—50 мг/кг, а в корм-заменитель мо-
лока для телят — 150—200 мг/кг.
Синтез Рейхштейна. D-глюкозу каталитически гидрогенируют
t образованием D-сорбита. В современных процессах вместо глю-
279
козы используют гидролизованный крахмал. На следующей сту-
пени осуществляют региоспецифическое микробное дегидрогени-
рование D-сорбита в L-сорбозу. Далее, через две ступени получают
2~кето-£-гулоновую кислоту, которая химическим путем через
3 ступени превращается в витамин С (рис. 57). Процесс эконо-
мичен: из 2 кг глюкозы получают 1 кг аскорбиновой кислоты.
каталитическое
гидрогенирование (Ni)
сн2он
НО—С—Н
НО—С—Н
Н—С—ОН
НО—С—Н
СНО
D-глюкоза
СН2ОН
НО—С—Н
НО—С—Н
н—с—он
но—с—н
сн2он
D-сорбит
сорбитде гидрогена за
Acetobacter suboxydans, A. xylinum
СН2ОН‘
с=о
О~ С--------1
С—ОН
II 0
с—он
н—с---------
но—с—н
СН2ОН
L-аскорбиновая
чмслота
но—С—Н
Н—с—он
но—С—н
сщон
du
2-кето-Ь~гулоновая
кислота
Рис. 57. Дегидрогенирование D-сорбита в L-сорбозу при производстве L-аскор1-
биновой кислоты
Микроорганизмы, используемые для превращения D-сорбита
в L-сорбозу. Чаще всего используют для этой цели Acetobacter
xylinum и Ac. suboxydans. Для последнего штамма необходимо
присутствие в среде пантотеновой, р-аминобензойной и никотино-
вой кислот. Недостатком Ac. xylinum является его чувствитель-
ность к никелю. Поэтому никель, связанный с сорбитом (образу-
ется в реакции с никелевым катализатором), приходится удалять,
280
используя ионообменные смолы, а содержание никеля в кукуруз-
ном экстракте понижают при тепловой обработке. Можно также
адаптировать культуру к высоким концентрациям Ni; Acetobacter
melanogenum выдерживает до 10 мг Ni в 1 л среды. В современ-
ных промышленных процессах, использующих Ac. suboxydans,
превращению подвергают 20 %-й раствор сорбита, содержащий
24 мг/л никеля.
Процесс превращения D-сорбита в £-сорбозу. Процесс осу-
ществляют в аэрируемых ферментерах с перемешиванием. Среда
содержит сорбит, источник азота и мел. Увеличение выхода до-
стигают при начальном внесении в среду 10—20% сорбита и даль-
нейшем его добавлении до конечной концентрации 28—35%. В ка-
честве источника азота чаще всего используют кукурузный эк-
стракт (0,1—0,3%). pH доводят до 5,0—6,0.
Инокулят. Бактерии инкубируют в среде с 20% сорбита при-
мерно 20 ч и вносят в среду в количестве 3—10%.
Ферментация. Культивирование проводят при 30—35° в перио-
дических условиях с интенсивной аэрацией. Если воздух заме-
щают кислородом при повышенном давлении, то время фермен-
тации сокращается. Такой прием подходит для Ac. xylinum и
Ac. suboxydans, но не для Ac. melanogenum. Рост последнего
ингибируется при повышенном содержании Ог. Ферментация за-
канчивается через 24 ч. После фильтрования или центрифугиро-
вания клеток прозрачную жидкость деионизируют, концентрируют
и получают кристаллы L-аскорбиновой кислоты. Выход L-сорбо-
зы ~87%. Показано, что конверсию могут осуществлять покоя-
щиеся клетки Gl. oxydans, которые пригодны для многократного
использования без снижения скорости окисления.
НОВЫЕ ПУТИ БИОКОНСЕРВАЦИИ
ПРИ СИНТЕЗЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
Путь через образование £-сорбозона. По этому пути (рис. 58, А)
£-сорбоза окисляется через L-сорбозон в кетогулоновую кислоту
(КГК). Первую ступень осуществляют покоящиеся или иммоби-
лизованные клетки Gl. melanogenum IFO 3293. Этап от £-сорбо-
зона в КГК выполняют дикие или мутантные штаммы Ps. putida,
Gl. melanogenum, Вас. subtilis, Candida albicans или Penicillium
digitatum. Наиболее высокий выход продукта (5 г/л) получают
с клетками или бесклеточным экстрактом Ps. putida АТСС 21812.
Выход КГК составляет 80%.
Путь через 5-кето-В-глюконат. По этому пути (рис. 58, Б)
Ac. suboxydans в двухступенчатой реакции из глюкозы образует
5-кетО'Р-глюконат. 10%-й раствор глюкозы превращается при
аэрации в 5-кето-/)-глюконат за 33 ч с 90%-м выходом. 5-кетэ-£~
глюконат Са каталитически гидрогенируется с образованием сме-
кш D-глюконата и £-гулоната в отношении 1:1. Превращение по-
281
fl
I
0—0
<n
I
CO
OS
1Л
со
(Л
со
co
04
F ш
о
0—0
X
сл
СС
Ф
о
сл
04
г
«В
(*)
OI со
о
го
Ги-^щ*-
ф
58. Сидтоя 2-кето-Ь-гулоновой кислоты через: А — L-сорбозон, Б — 5-кето-О-глюкоиат Са
E
»
о
|Ц
ф
аз
н
о
«I
о
ф
о
L-
|ф
Q
СО
о
Q
С
ф
г
С)
и
ф
(Л
Q
£Л
Ш
,г*Ч
i
OS
C5
о
I.N
с
о
следнего в КГК осуществляют многие микроорганизмы; выход
продукта при использовании Xanthomonas translucens достигает
>90%. D-глюконат под действием Ac. suboxydans может быть
снова возвращен в цикл через образование 5-кето-Р-глюконата с
выходом 70%.
Путь через 2,5-дикето-В-глюконат. Это вещество образуется
из глюкозы через D-глюконат и 2-кето-£>-глюконат при участии
Ps. albosesamae АТСС 21998, Gluconobacter rubiginosus IFO 3244
или Acetobacter melanogenum АТСС 9937. 2,5-дикето-£)-глюконат
превращается в КГК с помощью Brevibacterium ketosoreductum
АТСС 21914 и некоторыми штаммами Brevibacterium sp. или
Corynebacterium sp. Используя смешанные культуры бактерий»,
осуществляют непосредственное превращение глюкозы прямо в
КГК.
Другие новые разработки. Разработан новый способ получения
витамина С, включающий следующую последовательность реак-
ций: £)-глюкоза->2,5-дикетоглюконовая кислота->2-кето-£-гулоно-
вая кислота->аскорбиновая кислота. Две первые реакции
осуществляют клетки Erwinia, последнюю — путем химического
синтеза. В клетках Erwinia herbicola клонировали ген Coryne-
bacterium sp., контролирующий синтез редуктазы 2,5-дикетоглю-
коновой кислоты. Модифицированная таким способом Е. herbi-
cola позволяет получать прямо из глюкозы 2-кето-£-гулоновую
кислоту, из которой легко получить L-аскорбиновую путем обыч-
ной реакции циклизации, катализируемой кислотами или осно-
ваниями. В настоящее время разрабатывается технология для
внедрения этого нового способа получения витамина С. Обнару-
жен новый микроорганизм, осуществляющий ферментные реакции,
заменяющие первые 5 стадий химического синтеза витамина С.
Метод Крафта. Этот метод рекомендован для получения вита-
мина С из сыворотки (или из других лактозосодержащих субстра-
тов). Процесс Крафта включает гидролиз лактозы сыворотки с
помощью лактазы и анаэробную ферментацию с образованием
этанола и D-галактозы, которая окисляется до D-галактоновой
кислоты. Из раствора, содержащего этанол и галактоновую кис-
лоту, с помощью измененного штамма Candida norvengensis по-
лучают витамин С в количестве >1 г/л.
ЛИТЕРАТУРА
Поморцев а Н. В. Перспективы получения витаминов и коферментов с но-
мощью микроорганизмов//Химико-фармацевтический журнал. 1986. С. 965—
Воробьева Л. И. Аскорбиновая кислота (витамин С)//Микробиологический
синтез витаминов. М., 1982. С. 114—122.
р-КАРОТИН
Каротиноиды обнаружены во многих животных и раститель-
ных тканях. Ежегодно в природе образуется около 100 млн. т
283
каротиноидов, и большая часть их содержится во фруктах, ово-
щах, молочных и морских подуктах, чем объясняется их разно-
образная окраска от ярко-красного до ярко-желтого.
Получают каротиноиды исключительно из растений или мик-
роорганизмов. Микробиологическое получение p-каротина имеется
:в СССР, во Франции, США, Польше и в других странах, р-каро-
тин — провитамин А, превращается в витамин А в мукозных мем-
бранах тонких кишок человека и хранится в печени в виде эфира
пальмитата. Потребность человека в витамине А •— 1,5—2 мг/день;
при его дефиците развивается ночная слепота, появляются изме-
нения в коже и мукозных мембранах.
Применение. В конце 70-х гг. потребность в p-каротине со-
ставляла 27 т в год. Он используется главным образом как пище-
вой краситель. Для окрашивания продуктов (маргарина, сыра,
кремов, десертов) с целью придания им привлекательного вида
используют и другие каротиноиды, не обладающие активностью
витамина А, например ликопин или ксантофиллы.
Другая важная область применения р-каротина — кормопро-
изводство; его используют как кормовую добавку в индустриаль-
ном птицеводстве и животноводстве. Добавление от 15 до
55 мг/день p-каротина обеспечивает ежедневный прирост (0,5—
1кг) животных, положительно сказывается на здоровье телят,
у крупного рогатого скота улучшаются репродуктивные способ-
ности, у кур-несушек при скармливании кормовых препаратов
микробиологического каротина (КПМК) увеличивается на 7—
26% яйценоскость, у бройлеров — на 30% живая масса. Добав-
ление к кормам каротиноидов улучшает окраску цыплят и яич-
ного желтка. Каротиноиды — кантаксантины применяют в кос-
метической промышленности как дубильное средство. Они ока-
зывают профилактический эффект в случаях ряда форм злокаче-
ственных новообразований. Их действие связывают с влиянием
на уровень свободных радикалов, а не с превращением в вита-
мин А.
В промышленном масштабе каротиноиды получают в основ-
ном химическим синтезом, а также из красного пальмового масла,
муки люцерны или моркови. Ксантофилы тоже могут быть полу-
чены путем экстракции из растительного материала.
Каротиноиды образуют многие микроорганизмы, но пока мик-
робный биосинтез не может конкурировать с дешевым химиче-
ским синтезом. Микробиологические способы разрабатываются;
препарат p-каротина, получаемый из микроорганизмов, по био-
логической активности не уступает каротину, полученному из мор-
кови, и в несколько раз дешевле последнего.
Структура. Каротиноиды — высоко ненасыщенные производ-
ные изопрена, встречаются в природе — тетратерпеноиды, состоя-
щие из 4 изопреновых остатков и имеющие скелет из 40 атомов
углерода. На сегодня известно более 400 природных каротинои-
дов; биологически активны лишь 10. На рис. 59 показана струк-
тура каротиноидов, образуемых при микробной ферментации. На
обоих концах p-каротиновой молекулы имеются р-ионовые коль-
цевые структуры, обусловливающие провитаминную активность
p-каротина. Из последнего можно получить две молекулы вита-
мина А (С—20), из у- и а-каротина — только одну, так как они
содержат только по одному р-ионовому кольцу.
ликопин
ОН
зеаксантин
Рис. 59. Структура некоторых каротиноидов, которые можно получать фермен-
тационным путем
Каротиноиды делят на каротиноидные углеводороды — а-, р-,
у-каротины, ликопин, гидроксисодержащие растительные каро-
тиноиды — ксантофиллы, каротиноиды, содержащие карбониль-
ные группировки, и каротиноиды — производные карбоновых кис-
лот. Есть и такие, строение которых еще не установлено.
Продуценты, p-каротин и родственные каротиноиды образуют
главным образом микроскопические грибы и водоросли, а ксан-
тофиллы — бактерии и грибы. К продуцентам каротиноидов от-
носят фототрофные бактерии семейств Rhodospirillaceae, Chroma-
tiaceae, Chlorobiaceae, Chloroflexus. В этой группе обнаружено
около 85 различных каротиноидов. Среди гетеротрофных микро-
285
организмов активные продуценты каротиноидов это Neurosporcfc
cfcissci, Phycomyses blakcslccctaas, Blahcslca trispora, дрожжепо-
добные грибы рода Rhodotorula, особенно Rh. glutinis, ряд акти-
номицетов (желтая, оранжевая и оранжево-красная группы). Str.
chestomyceticus, Str, mediolani, Act. sabf lavas. Галобактерии, кро-
ме каротиноидного пигмента бактериоруберина, образуют вита-
мин А — ретиналь (в составе бактериородопсина) и в этом отно-
шении представляют собой исключение, среди прокариот, как пра-
вило, витамин А не синтезирующих. Миксоксантофиллы харак-
терны для цианобактерий, бициклические ксантофиллы обнару-
жены у всех водорослей. Самые активные продуценты каротинои-
дов среди водорослей встречаются в родах Dunaliella, Chlorella,
Scenedesmus.
Главное значение каротиноидов связывают с защитой клеток
от фотодинамического действия света. У фототрофных бактерий
каротиноиды участвуют в адсорбции света при фотосинтезе и в
передаче поглощенной энергии на бактериохлорофилл (хлорофилл
«а» у цианобактерий). Бактериородопсин галобактерий — про-
тонная помпа — участвует в фотохимическом превращении све-
та1. У мукоровых грибов, водорослей и растений каротиноиды
участвуют в половом процессе.
Биосинтез. В биосинтезе каротиноидов различают 4 этапа:
1 — образование С40-углеводорода (УГВ); 2 — последовательное
дегидрирование с образованием ненасыщенных ациклических ка-
ротиноидов; 3 — образование ациклических и ароматических ка-
ротиноидов; 4 — окисление каротиноидов (иногда сопровождае-
мое модификацией углеродного скелета) с образованием ксанто-
филлов.
Первые два этапа относят к ранним ступеням биосинтеза, они
общие для различных каротиноидов и достаточно хорошо изуче-
ны, другие два этапа — «поздние реакции» до конца не расшиф-
рованы.
Основная субъединица каротиноидов — пренильный (изопре-
ноидный) (С5) остаток. Образование С40-угв происходит в резуль-
тате димеризации соединений с более короткой углеродной цепью
и в следующей последовательности:
С5+с5—>сю + С5—>С)5 + Сб—>-С2:о+ С20—>С40
С5 — субъединица — представлена пренильным остатком, кото-
рый образуется из ацетата.
Три молекулы ацетата в виде ацетил-СоА конденсируются с
образованием З-окси-З-метилглутарил-СоА (ОМГ-СоА).
ОМГ-СоА может синтезироваться и иным путем, а именно из
лейцина.
При восстановлении ОМГ-СоА образуется мевалоновая кисло-
та (МВК) — обязательный предшественник каротиноидов и дру-
1 Комплекс белка с ретиналем — родопсин — является пигментом сетчатки
глаза и участвует в сумеречном зрении у позвоночных.
286
тих терпеноидов. МВК далее фосфорилируется с образованием
монофосфо-МВК и пирофосфо-МВК. Из последнего соединения
при его декарбоксилировании и отщеплении молекулы воды по-
лучается изопентенилпирофосфат (ИППФгСб). ИППФ изомери-
зуется в диметилаллилпирофосфат (ДМАПФ), и при их конден-
сации образуется геранилпирофосфат (ГПФ:Сю). Последующее
присоединение ИППФ приводит к образованию фарнезилпиро-
фосфата (ФПФ : С15) и затем герани л герани л пирофосфата
;(ГГПФ : С20).
С40-каротиноиды образуются при димеризации ГГПФ с обра-
зованием фитоина — предшественника окрашенных каротинои-
дов.
Фитоин подвергается далее серии дидегидрирований, каждое
из которых образует новую двойную связь. Соединения образу-
ются в следующей последовательности: фитоин-^фитофлуин-хр-
каротин->нейроспорин->ликопин.
Превращение ликопина в 0-каротин и другие циклические ка-
ротиноиды связано с циклизацией предшественника.
Таким путем образуются каротиноиды у растений и грибов,
в том числе у активных продуцентов 0-каротина. Тем не менее
они не являются универсальными. Пути синтеза каротиноидов
могут различаться в зависимости от физиолого-биохимических
особенностей микроорганизма и условий его культивирования.
Роль фитоина как интермедиата в синтезе каротиноидов оконча-
тельно еще не доказана.
При введении в каротиноиды кислородсодержащих групп: окси,
кето, альдегидо, метокси и других — образуются ксантофиллы.
Установлено, что оксигруппа включается после циклизации и
происходит из молекулярного кислорода, а не из воды.
В зависимости от места включения кислорода возникают раз-
ные каротиноиды, например эхиненон (кислород в С—4), лютеин
и зеаксантин (ОН-группа в С—3 положении).
В случае некоторых бактерий и грибов для превращения ка-
ротинов в ксантофиллы необходимо освещение.
Получение
Самый высокий выход p-каротина получают с грибом Blakes-
lea trispora. Это гетероталличный гриб, образующий (+) и (—)
мицелий. 0-каротин образует (—)-штамм, но в гораздо меньшем
количестве, чем при смешивании (—) и ( + ) -штаммов. Образо-
вание 0-каротина индуцируют триспоровые кислоты, которые дей-
ствуют, видимо, как половые гормоны, но не как предшественники
0-каротина. Они образуются из 0-каротина. При добавлении три-
споровых кислот к (—)-штамму выход 0-каротина сильно увели-
чивается.
Другой активатор биосинтеза — изониазид — особенно в ком-
бинации с 0-иононом. Только один 0-ионон токсичен для грибов,
но в присутствии растительных масел он действует как стимуля-
тор каротиногенеза. Сам 0-ионон не включается в молекулу 0-ка-
287
ротина и может быть заменен рядом веществ, как терпены, цик-
логексанон с его триметильными производными. Выход р-каро»
тина в два раза увеличивается при добавлении к среде очищен-
ного керосина, положительное действие которого может быть свя-
зано с индукцией некоторых ферментов или с изменением (увели-
чением) проницаемости клеточной мембраны, что предотвращает
ингибирование синтеза конечным продуктом. Поскольку р-каро-
тин малостабилен вне клеток, к мицелию добавляют антиоксидан-
ты: ц-нафтол, аскорбиновую кислоту, лецитин.
P-каротин получают в погруженной культуре ( + )- и (—) -штам-
мов гриба. Поскольку p-каротин образует (—)-штамм, его коли-
чество должно превалировать над ( + )-штаммом. Двустадийный
процесс разработан на фирме Farmaceutici (Италия). 1-я стадия —
накопление биомассы, 2-я — образование каротина. В период
роста культура должна быть полностью обеспечена необходимым
количеством азота, а в период накопления каротина количества
азота в среде снижают. Углерод должен присутствовать в избыт-
ке и в Пй, и во 2-й стадиях. На 1-й стадии проводят совместное
культивирование (Ч-) и (—)-штаммов Bl. trispora в среде, содер-
жащей растворимый крахмал, хлопковое масло и керосин. При
этом образуется 3,5 г/л триспоровых кислот, которые экстраги-
руют из биомассы и добавляют к культуре (—)~Bl. trispora, вы-
ращиваемой в среде того же состава, но дополнительно содержа-
щей 0,5 г/л р-ионона. При таком культивировании получают до
1,2 г/л p-каротина. Более высокий выход p-каротина можно по-
лучить при использовании способа, представленного на следую-
щей схеме (по Ninet, Renaut, 1979):
По окончании ферментации грибной мицелий отделяют, высуши-
вают и стабилизируют. Он может быть непосредственно исполь-
зован как добавка в корм животным. Для извлечения каротинои-
дов из высушенного под вакуумом и размельченного мицелия
используют гидрокарбоновые или хлоргидрокарбоновые раствори-
тели. Затем проводят переосаждение и кристаллизацию в раст-
ворителях (этанол, смесь бензина и этанола 1 : 1—4). 75—92%
каротиноидов приходится на p-каротин. Иногда экстракцию ка-
ротиноидов проводят очищенными растительными маслами и по-
лучают масляные растворы.
В СССР КПМК получают микробиологическим путем и с ис-
пользованием Bl. trispora. Ферментацию проводят глубинным спо-
собом в течение 120 ч в среде, включающей гидрол, кукуруз-
ный экстракт и подсолнечное масло. Выход продукта не менее
50 мг/100 мл культуральной жидкости. По ходу процесса в среду
вводят р-ионон и антиоксидант сантохин (0,2—0,6%). Мицелий
отделяют, высушивают под вакуумом, дробят. В готовом препа-
рате содержится не менее 5 г/кг каротина. Препарат может хра-
ниться 4 мес.
Параметры периодического процесса биосинтеза р-каротина
исследовали с помощью статистического анализа и математиче-
ского моделирования; установили, что Bl. trispora в процессе
288
ферментации использует —90% углеводов и только 60% амино-
кислот питательной среды. При оптимизации среды за 108 ч фер-
ментации получают 1243 мг/л |3-каротина, 38,2 г/л биомассы. При
подборе оптимального соотношения ( + ) и (—)-штаммов выход
0-каротина увеличили до 1430 мг/л.
Bl. trispora
NRRL 2456 (+)
в пробирках
Bl. trispora
NRRL 2457 (—)
в пробирках
Споры, смешанные со стериль-
ным песком
Культура в пробир-
ках на скошенных
агаровых косяках
Инкубация 7 дней, 27° С
Посевная колба с
вегетативным ми-
целием
Посевная колба с
вегетативным мице-
лием
Двухлитровая колба эрленмей-
ера с 0,4 л среды (а)- Инкуба-
ция 48 ч, 26 °C на качалке
Посевная колба со
смесью вегетативного
мицелия
I Ферментация в фер-
ментере объемом 170 л
I
Ферментация в главном
ферментере
170 л стальной ферментер со 120 л среды
(а), инокулированной 0,4 л каждого из ино-
кулята; инкубация 40 ч, 26° С, с переме-
шиванием (170 об/мин) и аэрацией (8 м3/ч)
800 л ферментер из нержавеющей стали
320 л среды (в), стерилизованной 35 мин при
122° С, инокулированной 32 л смешанной
культуры. Инкубация 185 ч, 26° С, с пере-
мешиванием (210 об/мин) и аэрацией
(25 м3/ч)
Среда (а): кукурузный экстракт, кукурузный крахмал, К2НРО4 тиамин, вода водо-
проводная.
Среда (в): остаток после отгона спиртов, кукурузный крахмал, соевое масло, се-
мена хлопка, этоксихин, MnSO<, тиамин, изониазид, керосин, вода во-
допроводная, pH 6,3. Через 48 ч роста добавляют 1 г/л Р-ионона
5 Мл/л керосина, далее непрерывно вплоть до конца ферментации вно-
сят раствор глюкозы (общее количество 42 г /л).
Для обогащения хлебобулочных изделий каротином в СССР
изготовлен препарат на основе дрожжей Rhodosporidium diobo-
vatum.
Для повышения рентабельности микробиологического способа
необходимо усовершенствование способа и продуцента с целью
289
увеличения выхода (3-каротина, а также удешевление фермента-
ционных сред.
ЛИТЕРАТУРА
Васильченко С. А., Орехов В. С., Кунщикова И. С. Статистический
анализ и оптимизация микробного синтеза |3-каротина//Биотехнология. 1987.
Т. 3, № 3. С. 391—393.
Воробьева Л. И, Каротиноиды//Микробиологический синтез витаминов. М.^,
1982. С. 122—139.
Кольцова Э. В., Минина В. С. Каротиноидные препараты микробиоло-
гического синтеза и их применение. Сер. VI. М., 1984.
Leuenberger Н. G. W. Microbiologically catalized reaction steps in the field
of vitamin and carotenoid synthesis//Biocatal. Organ. Synth. Proc. Intern.
Symp., Noordwijkerhout. 1985. P. 99—118.
Ninet L., Renant J. Carotenoids//Microbial technology. 1979. Vol. 1. P. 529—
543.
Olson J. A. Carotenoids, vitamin A and cancer//J. Nutr. 1986. Vol. 116, N
P. 1127—1130.
ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ
Витамины группы В служат коферментами многих фермен-
тов, катализирующих биохимические реакции. Ряд заболеваний.,
как мы видели, вызывается отсутствием или дефицитом в орга-
низме того или иного витамина, который в этом случае прихо-
дится искусственно вводить в диету людям или в корма живот-
ным. В последние годы разрабатываются новые методы лечения
заболеваний, не вызываемых инфекцией (вирусной или бактери-
альной), но связанных с нарушением обмена веществ, причиной
которого может служить неправильная работа ферментов. В ча-
стности, возможно использование ингибиторов ферментов, уча-
ствующих в возникновении и развитии соответствующего заболе-
вания.
К настоящему времени открыто уже большое количество ин-
гибиторов ферментов микробного происхождения и некоторые из
них нашли применение в медицине.
Ингибиторы протеаз. Их известно много. Бестатин образует
Str, olivoretuculi\ ингибитор аминопептидазы В и лейцинамино-
пептидазы, которые относятся к поверхностным белкам лимфо-
цитов и могут включаться в иммунный ответ организма, а соеди-
нение, которое связывается с такими ферментами, может высту-
пать как иммуномодулятор. Бестатин увеличивает гиперчувстви-
тельность in vivo, усиливает активность антираковых препаратов
у животных, увеличивает число клеток, образующих антитела и
задерживает рост медленнорастущей твердой опухоли (лимфо-
саркомы Гарднера и IMC-карциномы). В клинических исследо-
ваниях бестатин увеличивает иммунитет у пациентов, имеющих
опухоли. Для лечения эмфиземы легких рекомендован микробный
ингибитор протеаз — а-антитрипсин. Наследственное отсутствие
ux-антитрипсина приводит в раннем возрасте к тяжелой форме за-
болевания, так как отсутствие ингибитора эластазы вызывает ло-
кальный распад коллагена в тканях легких. Ген человеческого
290
п-аптритрипсина ввели в Е. coll, которая вырабатывала его в ко-
личестве 15% от всех клеточных белков (10 мг/л), ингибитор
проявлял антиэластазную активность. Препарат называется
эглин.
Ингибиторы кишечных гликозидаз. Акарбозу — ингибитор р-
глюкозидазы — образует Actinoplanes sp.; ингибитор амилазы
выделен из Str. tendae. Он блокирует гидролиз крахмала и сни-
жает содержание сахара в крови. Акарбоза успешно прошла кли-
ническое испытание на больных диабетом.
Ингибиторы орнитиндекарбоксилазы. Полиамины — путресцин,
спермин и спермидин — играют неясную, но важную роль для
роста, размножения и дифференциации клеток. Орнитиндекарбо-
ксилаза контролирует скорость синтеза полиамина в клетках мле-
копитающих. Из Str. neygawaensis выделили два вещества дигид-
роксисаркомицин и саркомицин (старый противоопухолевый ан-
тибиотик), ингибиторы орнитиндекарбоксилазы, которая является
хорошей мишенью при таких заболеваниях, как псориаз, хрони-
ческие простатиты и рак.
Ингибитор пролил-4-гидроксилазы. Аккумулирование фиброти-
ческого коллагена вызывает фибротические заболевания соеди-
нительной ткани. Фиброз легких и печени у животных предотвран
щается пролиновыми аналогами. Нетоксичного ингибитора син-
теза коллагена не было известно, поэтому большой интерес
представляет ингибитор Р-1894В, выделенный из Str. sp. и ока-
завшийся идентичным противоопухолевому антибиотику винкоми*
цину А. При оральном введении вещество нетоксично. Мишенью
действия ингибитора считают пролил-4-гидроксилазу, поскольку
для секреции коллагена и его термальной стабильности требуется
гидроксипролин.
Ингибиторы ферментной системы,
изменяющей давление крови
Кровяное давление обычно регулируется реннинангиотензион-
ной системой. Ангиотензиноген (плазматический белок) расщеп-
ляется под действием трипсина и реннина с образованием инерт-
ного пептида ангиотензина I (AI). Под действием AI-изменяю-
щего фермента (Zn-экзопептидазы) из AI образуется ангиотен-
зин II (АП). Сверхпродукция АП — главная причина возникно-
вения высокого кровяного давления. Синтезированы лекарства
каптоприл и более новые вещества, действующие как ингибиторы
вышеуказанного фермента. Каптоприл — производное небольшого
пептида, выделено из культуральной жидкости Str. sp.
ЛИТЕРАТУРА
Безбородов А. М. Микробные метаболиты — ингибиторы ферментов. М.,
Demain A. L. New applications of microbial products/ZScience 1983. Vol 219.
P. 709—714.
Grab ley S. Niedermolekulare Naturstoffe aus Microorganismen//Jahrb. Bio-
fechnol. 1986—1987. Munchen; Wien, 1986. S. 417—418.
Последнее слово будет за бактериями.
Луи Пастер
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Промышленная микробиология включает эксплуатацию мик-
роорганизмов в промышленности для получения коммерчески цен-
ных продуктов и лекарств. К продуктам промышленной важности
в настоящем и будущем относится сырье для химических синте-
зов (пока химическая промышленность развивается в основном
как нефтехимия).
Обнаружены штаммы Pseudomonas, продуцирующие этилен со
скоростью 4—500 млн. д. в сутки. Работы по клонированию соот-
ветствующих генов позволяют считать эти исследования перспек-
тивными для создания нового направления в нефтехимии. К важ-
ным продуктам микробного синтеза относят специальные веще-
ства, используемые для фармацевтических целей: антибиотики,
ферменты, ингибиторы ферментов, витамины, ароматизаторы и
другие добавки для пищевой промышленности, циклодекстрины,,
полисахариды, выпуск которых должен расширяться.
В задачу промышленной микробиологии входят изучение и
реализация биодеградации и/или детоксификации отходов с целью
поддержания или улучшения состояния окружающей среды. Мик-
робную физиологию называют краеугольным камнем в развитии
промышленной микробиологии и биотехнологии. Физиология —*
это наука о том, как надо обращаться с микроорганизмами, как
заставить их образовывать максимально высокие количества це-
левого продукта. Эмпирический поиск оптимальных условий уста-
рел. Теперь задача — зная физиологию, создавать оптимальные
условия, управляемо культивировать и делать это, добиваясь авто-
матизации, когда сам микроб должен давать команду, а ЭВМ эти
условия создавать.
Рентабельность микробиологического производства и, следова-
тельно, целесообразность его организации в значительной мере
определяются выходом продукта ферментации и стоимостью сы-
рья. Поэтому усовершенствование промышленного штамма и по-
иски дешевого возобновляемого сырья относятся к важным про-
блемам микробиологии. Параллельно с этим ведутся поиски но-
вых штаммов и новых практически ценных продуктов, образуемых
микроорганизмами. Необходим научно обоснованный скрининг, с
использованием новейших методов и приемов, а отнюдь не слу-
чайный, как было до сих пор. Важнейшее значение для развития
промышленной микробиологии будущего придают биоэлектрони-
ке — слиянию биологических систем с электронными приборами.
Это позволит широко использовать компьютеры для контроля и
управления процессами ферментации. Для компьютеризации фер-
ментационных процессов требуются дальнейшее развитие и раз-
работка биосенсоров.
ОГЛАВЛЕНИЕ
II ! .................... II II —....................... — - ! ........ й,. । *.Д !»....................... .^г.-
Предисловие....................................................... 3
Введение.......................................................... 4
Новые стратегии для выделения промышленноценных штам-
мов .................................................... 4
Глава I. МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ............................ 9
Особенности метаболизма микроорганизмов ................ 9
Катаболические процессы................................12'
Анаболические процессы..................................62
Глава II. РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА...................................65
Физиологические аспекты.................................65
Сверхсинтез продуктов метаболизма с использованием гене-
тических методов........................................78
Глава III. ОПТИМИЗАЦИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ 81
Глава IV. ФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПРОМЫШЛЕННО-
СТИ ............................................................88
Количественные характеристики роста и продуктивности . 88
Кинетика роста микроорганизмов..........................90
Типы ферментационных процессов..........................93
Количественные показатели ферментационных процессов . 94
Биореакторы для аэробной ферментации...................100
Масштабирование ферментаций............................107
Последовательность стадий при проведении ферментаций . 113
Среды и сырье для микробиологической промышленности . 115
Контроль за ходом ферментаций..........................118
Компьютеризация микробиологических процессов ... 119
Выделение продукта........................... . . 124
Глава У. НЕЙТРАЛЬНЫЕ ПРОДУКТЫ................................130
Этанол.............................................130
Ацетон и бутанол.......................................148
Изопропанол........................................166
2,3-бутандиол......................................167
Глицерин...........................................172
Дигидроксиацетон...................................17б
Глава VI. ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ЭПОКСИДЫ И ГИДРОКСИЛИ-
РОВАННЫЕ АРОМАТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ . . 177
Глава VII. ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА .... 182
Глава VIII. ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ.................................188
Лимонная кислота......................................189'
Уксусная кислота .................................. 202
Молочная кислота . . . ..................212
Глюконовая кислота, глюконаты, оксиглюконаты . . . 223
Итаконовая кислота ................................ 231
Коевая кислота ....................................... 234
Пропионовая кислота .................................. 235
Ксилоновая кислота .................................. 238-
293
Глава IX, ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ........................240
Глава X. ЦИКЛОДЕКСТРИНЫ....................................248
Глава XI. АРОМАТИЗАТОРЫ....................................253
Флаворизаторы....................................253
Вещества, усиливающие запахи.....................256
Глава XII. ВИТАМИНЫ И ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ . ... 262
Витамин В12.................................... 262
Рибофлавин..................................... 273
Аскорбиновая кислота (витамин С).................279
0-каротин........................................283
Ингибиторы ферментов.............................290
Заключение................................................ 292
Учебное издание
ВОРОБЬЕВА ЛЕНА ИВАНОВНА
ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Зав. редакцией Н. М. Глазкова
Редактор Н. М. Горелик
Художник И. Н, Аникушин
Художественный редактор Л1. Ф. Евстафиева
Технический редактор В. В. Макарова
Корректоры В. ГЕ Кададинская, Т. С. Милякова
ИБ № 3354
Сдано в набор 17.02.89. Подписано в печать 01.11.89.
Л-14324. Формат 60X90/16. Бумага кн.-журп.
Гарнитура литературная. Высокая печать.
Усл. печ. л. 18,5. Уч.-изд. л. 20,43.
Тираж 7000 экз. Заказ 35.
Изд. № 319. Цена 1 руб.
Ордена «Знак Почета» издательство
Московского университета.
103009, Москва, ул. Герцена, 5/7.
Типография ордена «Знак Почета»
изд-ва МГУ.
119899, Москва, Ленинские горы
ВНИМАНИЮ ЧИТАТЕЛЕЙ!
В 1990 году
Издательство
Московского университета
выпустит книгу:
ОРЛОВА Н. Н.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. —
1990. — 20 л. — 1 р.
В учебном пособии рассматриваются основные задачи и
методы генетического анализа объектов различных
уровней организации: организменного, клеточного, мо-
лекулярного. Описываются особенности и возможности
применения гибридологического метода к растениям и
животным, разобраны причины отклонений в расщепле-
нии. Представлен анализ совместного наследования
двух и более признаков при независимом и сцепленном
наследовании. Большой раздел посвящен исследованию
локализации гена. Пособие включает также разделы,
посвященные методам анализа мутаций и особенностям
генетического анализа у полиплоидов.
Для студентов биологических специальностей вузов:
может быть полезно аспирантам, научным работникам,
селекционерам.
'.Темплан 1990, № 149.
I