/
Автор: Градова Н.Б.
Теги: биология клетки и субклеточных частиц цитология микробиология лабораторный практикум
ISBN: 5-94343-009-1
Год: 2001
Текст
Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева Н.Б. Градова, Е.С. Бабусенко, И.Б. Горнова, Н.А. Гусарова Лабораторный практикум по общей микробиологии Москва ДеЛи принт 2001
УДК 576(076.5) ББК 28.4 Г753 СОДЕРЖАНИЕ Градова Н.Б. и др. Г753 Лабораторный практикум по общей микробиологии. - М.: ДеЛи принт, 2001. - 131 с. ISBN 5-94343-009-1 В лабораторный практикум включены задания, цель которых привить студентам навыки работы в лаборатории с микроорганизмами, изучить их морфологию и физиологические свойства а также освоить методы микро- биологцческО|-о исследования объектов окружающей среды, техногенных потоков и продуктов. Основное внимание уделено освоению студентами методов посева и пересева микроорганизмов, способов подготовки препаратов для светополь- ной микроскопии, культивирования микроорганизмов, определения их роста и биосинтетической активности, обнаружения в объектах окружающей сре- ды. а также получения накопительных и чистых культур микроорагнизмов разных физиологических групп. В качестве объектов исследования при выполнении работ используют- ся культуры микроорганизмов, широко распространенных в природных сре- дах. участвующих в биогеохимических циклах превращения веществ в био- сфере, используемых в биотехнологических процессах. Лабораторный практикум содержит основные требования, предъяв- ляемые к выполнению и оформлению самостоятельной работы, которая за- вершает цикл [фактических задач по микробиологии. Лабораторный практикум по общей микробиологам предназначен дня студентов IV курса специальности 25.09 «Биотехно.тогая» и 11.00.11 - «Ох- рана окружающей среды и рациональное использование природных ресур- сов», а также может быть полезен всем, кто использует в своей работе мик- робиологические методы. Рецензенты: канд. биолог. наук Л. М. Захарчук (МГУ им. М.В. Ломоносова)! канд. биоло., наук И.Б. Котова (МГУ им. МВ. Ломоносова); канд, хим. наук Т.В. Гусева (ВХТУ им. Д.И. Менделеева). УДК 576(076.5) ББК 28.4 Тема 1. Правила работы в микробиологической лаборатории. Методы изучения морфологии микроорганизмов и строения клеток....................................6 1.1. Правила работы в микробиологической лаборатории......6 1.2. Методы изучения морфологии микроорганизмов...........7 Работа !. Устройство микроскопа. Методы микроскопии.....8 1.3. Методы микроскопии..................................13 Работа 2. Микроскопия в светлом поле. Приготовление фиксированных препаратов и препаратов живых клеток............................................. 17 Тема 2. Морфология микроорганизмов........................23 Работа 3. Морфология бактерий ................ ...,.24 Работа 4. Морфология грибов.................... .....32 Работа 5. Морфология микро во до рослей...-...........39 Работа 6. Морфология простейших.................... 40 Тема 3. Ст роение клеток микроорганизмов..................42 Работа 7. Определение размеров клеток.............. „43 Работа 8. Окраска клеток по Граму................... 46 Работа 9. Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов (по Крегенсену)........-..............48 Работа 10. Окраска спор...............................49 Работа 11. Окраска капсул.......................... 50 Работа 12. Окраска внутриплазматических включений.....51 Работа 13. Выявление живых и мертвых клеток грибов......52 Тема 4. Питательные среды. Техника посевов микроорганизмов. Выделение чистых культур...................53 Работа 14. Питательные среды. Стерилизация питательных сред и посуды...........................—............. 53 Работа 15. Подготовка посуды и сред к стерилизации.......59 Работа 16. Техника посева и пересева культур микроорганизмов.,.................................. 60 Работа 17. Выделение чистых культур микроорганизмов........64 ISBN 5-94343-009-1 С'РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2(101 ф ООО "ДеЛн принт", 2001
5 4 Тема 5. Методы количественного учета микроорганизмов........... $ Работа 18. Методы количественного учета микроорганизмов на твердых средах........................................... Работа: 19. Количественный учет микроорганизмов с помощью счетных камер..................................... Работа 20. Количественный учет микроорганизмов на фиксированных препаратах........................... 7 Тема 6. Физиология н генетика микроорганизмов............. у. Работа 21, Рост микроорганизмов в периодической (статической) культуре. Влияние условий культивирования на показатели роста микроорганизмов...................................... 7: Работа 22. Метод накопительных культур для выделения микроорганизмов разных физиологических групп...........8: Работа 23. Изучение чувствительности микроорганизмов к * антибиотикам. Определение спектра антимикробного действия антибиотиков................ 8( Работа 24. Исследование бактериофагии. Фаготипирование бактерий (метод Фюрта)................................81 Работа 25. Летальное н мутагенное действие ультрафиолетовых лучей на клетки микроорганизмов........................8е, Работа 26. Изучение фенотипической изменчивости Proteus vulgaris пол действием фенола...........................93 Тема 7. Микробиологические методы исследования объектов окружающей! среды, техногенных потоков и продуктов.........................................93 Работа 27. Микробиологические методы исследования почвы.94 Рабощ 28. Микробиологические методы исследования воды.....97 Работа 29. Микробиологические методы исследования воздуха_99 Работа 30. Микробиологические методы исследования пищевых продуктов и других твердых продуктов...........102 Тема 8. Участие микроорганизмов в превращении веществ и энергии в биосфере (биогеохимические циклы превращения веществ)................................ЮЗ Работа 3 |. Получение накопительных культур микроорга- низмов, разрушающих целлюлозу (клетчатку)..............|0б Работа 32. Получение накопительной культуры денитрифицирующих бактефий............. Работа 33. Получение накопительной кульзуры микроорганизмов аммонификаторов. Работа 34. Обнаружение свободноживущих азотфикс|1рующих микроорганизмов Работа 35. Получение накопительной культуры сульфатредуцйруюших бактерий........... 108 ПО И2 ИЗ Методические указания к выполнению самостоятельной работы по микробиологии. Требования к содержанию и оформлению .................................... Приложение....................................... Рекомендуемая литература.........................
б Тема 1. Правила работы в микробиологической лаборатории. Методы изучения морфологии микроорганизмов и строения клеток 1.1. Правила работы в микробиологической лаборатории Работа в микробиологической лаборатории требует строгого со- блюдения специальных правил, что определяется двумя основными по- ложениями. Первое - в микробиологической практике используют, главным образом, чистые культуры микроорганизмов, т. е. популяции микроор- ганизмов одного вида, часто являющихся потомством одной клетки. Поскольку в воздухе, на поверхности окружающих нас предметов, на. одежде, руках, волосах всегда имеется большое количество разнооб- разной микрофлоры, то для обеспечения стерильности исследований и избежания загрязнения культур работа должна проводиться с соблюде- нием правил асептики. Второе - при исследованиях с неидентнфицированцыми микроор- ганизмами. при их выделении из объектов окружающей среды и техно- генных потоков, могут быть выделены патогенные и условно патоген- ные микроорганизмы. Кроме того, клетки как сапрофитных, так и патогенных микроор- ганизмов могут являться аллергенами для определенных индивидуумов. Таким образом, для получения достоверных результатов исследований, для обеспечения личной безопасности и безопасности окружающих не- обходимо соблюдение определенных правил. Подготовка помещения для проведения микробиологических работ включает мокрую уборку и тщательную вентиляцию с последующим облучением ультрафиолетовыми лучами бактерицидных ламп. Поверх- ность стола, где непосредственно проводится работа с культурами мик- роорганизмов, следует дезинфицировать путем протирания 3% раство- ром хлорамина или 70% раствором изопропилового или этилового спиртов. Подготовку лаборатории к занятиям проводит лаборант; студенты, выполняя задания, должны соблюдать следующие правила. I. Каждый студент в микробиологической лаборатории работает на постоянном месте, выполняя задания индивидуально. I. 2. На рабочем месте не должно быть посторонних предметов (в т ом числе портфелей и сумок). 3. Студент должен работать только в чистых халатах, волосы должны быть подобраны, не падать на плечи. 4, При работе с культурами микроорганизмов необходимо соблю- дать все правила микробиологической техники. На пробирках, колбах, чашках Петри, матрацах должна быть сделана надпись, содержащая родовые и видовые названия культуры, дату засева, '.уттглию стулента и номер группы. 5. Все предметы, использованные при работе с живыми культура- ми, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки (петли, иглы), либо погружены в дезинфицирующий раствор (предмет- ные и покровные стекла, пипетки, шпатели). 6. Все засеянные пробирки, чашки помещаются в термостат пли сдаются лаборанту. Отработанный материал (пробирки, чашки Петри) также помешается в определенные емкости по указанию лаборанта для их дальнейшего обеззараживания. 7. В лаборатории запрещается курение, прием пиши, лишнее хож- дение по лаборатории. 8. В конце занятия студент должен привести в порядок рабочее ме- сто, вымыть руки. Необходимо иметь индивидуальное полотенце, сал- фетки для вытирания рук. Каждый студент ведет журнал лабораторных работ, являющийся документом, позволяющим контролировать правильность полученных данных. Записи проводятся в определенной последовательности и должны содержать следующее: I. Номер работы. Ее название. Дата постановки и окончания опыта. 2. Объект исследования. 3. Условия проведения опыта, включая методы анализов, 4. Полученные результаты и выводы из них. При изучении морфологии культур делаются их зарисовки при оп- ределенных увеличениях микроскопа, что указывается в тетради; циф- ровые данные обобщают в таблицах, графиках, диаграммах. 1.2. Методы изучения морфологии микроорганизмов При изучении морфологии микробных- клеток используются раз- личные виды микроскопии, поскольку глаз человека устроен так. что не может отчетливо разглядеть мелкие предметы.
9 8 Невооруженным глазом рассматриваются предметы чаше всего с расстояния так называемого лучшего видения ~ 250 мм. При нормальной остроте зрения глаз может на этом расстоянии различать детали размером не менее 0,15 мм. Размеры микробных клеток могут быть менее 0,1 мм. Для наблюдения более мелких деталей необходимо использование спе- циальных средств. Такими средствами являются лупа и микроскоп. Работа 1. Устройство микроскопа. Методы микроскопии Лупой называется положительная линза или простая оптическая система, которая помещается перед глазом, а предмет располагается в ее передней плоскости или несколько ближе. Система образует прямое увеличенное п мнимое изображение, расстояние от которого до глаза зависит от расстояния между предметом и передним фокусом системы. Микроскоп предназначен для наблюдения мельчайших предметов (в микроскопии их* называют препаратами или объектами) с увеличением значительно большим, чем дает лупа и, соответственно; с большей раз- решающей способностью. Микроскоп имеет оптическую систему с двумя ступенями увеличе- ния (рис. I): первая осуществляется объективом 2, вторая - окуляром 3. Рис. 1. Принципиальная схема микроскопа (оптическая) Объектив 2 и окуляр 3 здесь условно показаны в виде одиночных линз, тогда как на самом деле они представляют собой более или менее сложные системы. Препарат ! находится перед объективом на расстоя- нии несколько большем фокусного расстояния объектива. Объектив об- разует действительное увеличенное и перевернутое изображение /' пре- парата в плоскости, лежащей вблизи переднего фокуса окуляра 3 на рас- стоянии немного меньше фокусного расстояния. Окуляр работает по- добно лупе (промежуточное изображение !' является для него предме- том) и образует вторично увеличенное мнимое и прямое изображение !’ которое, как условно принято считать, расположено от глаза наблю- дателя 4 на расстоянии наилучшего видения D = 250 мм (или больше в зависимости от особенностей глаза и его аккомодации), В результате микроскоп дает возможность рассматривать изображение препарата под большим углом, чем в случае невооруженного глаза, но это изображение - перевернутое относительно препарата. Подавляющая часть объектов исследований не обладает самосвече- нием, поэтому ИХ необходимо освещать посторонним источником света (рис. 2). При микроскопировании прозрачных объектов применяется про- ходящий свет, для непрозрачных объектов - отраженный. В микроскопи- ческих исследованиях используют освещение по методу светлого и тем- ного поля. При освещении объекта по методу светлого ноля лучи из осветитель- ной системы, пройдя через прозрачный предмет (проходящий свет) или отразившись от поверхности непрозрачного предмета (отраженный свет), поступают в объектив и создают изображение менее прозрачных участков объекта в виде темных участков на светлом фоне. Принципиальная схема оптической и осветительной систем микроскопа представлена на рис. 2, Оптическая часть включает объективы, окуляры и осветительный аппарат. Объективы - самая важная и наиболее ценная часть микроскопа. Они представляют собой систему линз, закрепленных в металлическую оправу, число которых доходит до десяти. Передняя (фронтальная) линза - самая малая, она производит основное увеличение. Остальные линзы (коррекционные) исправляют недостатки оптического изображения. Как известно, любое увеличенное изображение предмета при по- мощи линз со сферическими поверхностями имеет два крупных недос- татка: I) каждая точка объекта имеет вид кружочка, а не точки и 2) изо- бражение имеет окраску, которой не имеет объект. Первый дефект из- вестен под названием сферической аберрации, а второй - хроматиче- ской аберрации. Причина сферической аберрации связана со свойством линз неравномерно преломлять краевые и центральные лучи. Первые? обычно преломляются больше, чем вторые. Поэтому они пересекаются олиже к линзе, чем центральные лучи. В результате изображение точки, рассматриваемой через такую оптическую систему, распределяется в пространслве между местами пересечения краевых и центральных лучей и приобретает вид расплывчатого кружка значительных линейных pai3- меров, определяемых продольной сферической аберрацией (расстояние между крайними точками пересечения лучей) и поперечной сфернче-
]0 и ской аберрацией (радиус кружка, образованного сечением краевых и центральных лучей). Рис. 2. Принципиальная схема опти- ческой системы микроскопа и осветительной системы; / - источник света: 2 — коллектор; 3 - полевая диафрагма осветителя; 4 - зерка- ло: 5 - апертурная диафрагма конденсо- ра; 6 - конденсор; 7 - препарат; 7', 7'‘ - изображение объекта; 8 - объектив; 9 - выходной зрачок объектива; !0 - полевая диафрагма окуляра; ! i - окуляр; 12 - глаз Причина хроматической аберрации связана с тем, что при прохож- дении через линзу пучка лучей с различной длиной волны отдельные лучи, преломляясь в разной степени, пересекаются не в одной точке Наиболее сильно стекло преломляет с пне-фиолетовые лучи, меньше все- го преломляются красные лучи, имеющие большую длину волны. В ре- зультате хроматической аберрации получается несколько точек, также располагающихся в пространстве, ограниченном продольной и попереч- ной хроматической аберрацией. Для устранения обоих вышеуказанных недостатков объективы готовятся из ряда линз, имеющих различную кривизну и изготовленных из разных сортов стекла, обладающих строго пропорциональными спектрами. При использовании линз с разными оп- тическими свойствами и различной кривизной поверхности удается уст- ранить сферическую аберрацию, но большие трудности встречаются при устранении хроматической аберрации. Поэтому довольно долго коррек- ция хроматической аберрации ограничивалась только двумя цветами спектра, и объективы, имевшие такую коррекцию, получили название ахроматов. Они дают изображение предмета, лишенное окраски. После получения особых составов стекла удалось сконструировать более со- вершенные объективы, в которых устранено не только окрашивание объекта, но и изображение от луча разного цвета получается одинаково резким. Такие объективы получили название апохроматов. Все объективы по способу применения делят на сухие и иммерсион- ные (погруженные в масло или воду). У сухих между фронтальной лин- зой и рассматриваемым препаратом находится воздух, у иммерсионных — пространство между фронтальной линзой и препаратом заполнено мас- ломДкеДровым, касторовым, гвоздичным и др.) или водой. Стекло, на котором изготовлен препарат, стекло объективов и масло (кедровое) имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,52 и 1 515). Лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, свет не рассеивается, рассматриваемые объекты не искажаются и при этом бы- вают хорошо видны. Показатель преломления света, близкий к стеклу, имеют и другие вещества: касторовое масло (1,48-1,49), гвоздичное мас- ло (1,53), смесь касторового и гвоздичного масел (1,515). Воздух и стекло имеют разный показатель преломления света (1,0 и 1,52), в результате чего лучи света при переходе из одной среды в другую преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение рассматриваемых объек- тов (рис. 3). Рис. 3. Влияние иммерсионного масла на ход лучей в микроскопе: 1 — объектив, 2 — предметное стекло, 3 — объект, 4 — иммерсионное масло, 5. — лучи света, 6 - фронтальная линза объектива
12 13 Окуляры состоят из двух плосковыпуклых линз, обращенных вы пуклыми сторонами к объекту и заключенных в металлическую опраВ; Верхняя линза, обращенная к глазу, называется глазной, нижняя - coei рателыюй. Как и па окулярах, на оправе объективов есть цифры, not- зываютие их собственное увеличение в 10 и 16 раз. Общее увеличение .микроскопа равно произведению увеличени объектива на увеличение окуляра. Эта величина, однако, не характери зует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение може быть как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображу нН я определяется разрешающей способностью микроскопа. Под не следней понимают минимальное расстояние между двумя точками, ко гда они еще не сливаются в одну. т.е. чем больше разрешающая способ ность, тем меньший объект можно увидеть. Величина разрешающей способности L микроскопа зависит о длины волны используемого света и суммы числовых апертур объект ва и конденсора: 1 X — = о. --------, L Al + Aj где о - минимальное расстояние между двумя точками: At - числова: апертура объектива, Ат- числовая апертура конденсора, X - длина воз ны используемого света. Числовая апертура А определяется произведением синуса полови НЫ отвесного угла U на показатель преломления >г среды, граничащей i линзой (рис. 4): А = wsint/. Иными словами, числовая апертура - это «охват» линзы, она ха- рактеризуется количеством лучей, попадающих в линзу. Используя объективы с большой апертурой и освещая препора; светом с более короткой длиной волны, можно увидеть более мелк1;( Объекты или различить в клетке более тонкие структуры. Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом, не может быть больше I, так как показатель преломления воздуха равен 1, а угол U не может быть больше 90й (т. е. sinU < 1). Практически повысить раз- решающую способность можно двумя путями: либо освешая объект ешг более короткими лучами света, например, ультрафиолетовыми. ли<х увеличивая показатель преломления среды, граничащей с линзой, с те'*1 чтобы приблизить его к показателю преломления стекла, на которой находится объект. Последнее и осуществляется при работе с иммер- сионной системой. Рис. 4. Схема хода лучей при разной величине угла U; Ь" - объект, О - объектив, а — отвесу ныйуго.ч, (У - половина отвесного угла 1.3. Методы микроскопии Фазово-контрастная микроскопия. Глаз человека выявляет толь- ко различия в длине (цвете) и амплитуде (интенсивности, контрастности) световой волны, но не улавливает различий в фазе. Препараты живых клеток микроорганизмов по окраске и прозрачности мало отличаются от окружающей среды, так как световые лучи, проходя через живую клетку, не меняют своей амплитуды. хотя и изменяются по фазе. Метод фазово- контрастной микроскопий позволяет преобразовать невидимые фазовые изменения, претерпеваемые световой волной при прохождении через микробную клеткус в видимые амплитудные и тем самым повысить кон- трастность изображения. Оптическая система, используемая для получе- ния фазового контраста, состоит из фазовой пластинки и кольцевой диа- фрагмы (рцс. 5). Фазовая пластина - это круг напыления из солей редких металлов на одну из линз объектива, она обеспечивает изменение фазы проходя- щей волны на 1/4, что приводит к превращению фазовых различий в амплитудные. Кольцевая диафрагма - это непроницаемая для света пла- стина, имеющая прозрачную щель в виде кольца, через которую посту- пает свет в конденсор. Фазовый эффект получается лишь при точном совмещении фазового кольца с проекцией кольцевой диафрагмы. Фазо- во-контрастное устройство состоит из набора фазовых объективов, имеющих на металлической оправе кроме указанна увеличения еще и пометку «ф», револьверного конденсора с набором кольцевых диа- фрагм, каждая из которых соответствует фазовой пластинке определен- ного объектива, и вспомогательного микроскопа, назначение которого —
15 14 центрирование кольцевой диафрагмы по отношению к фазовой пла тов в темном поле позволяет различить только их контуры, но не дает стинке объектива. возможности рассмотреть внутреннее строение. Рис. 5. Схема хода лучей при использовании фазово- контрастного устройства: 1 - кольцевая диафрагма, 2 - конден- сор, 3 - объект, 4 - объектив, 5 - фа- зовая пластина Микроскопия в темном поле. Микроскопия в темном поле осно- вана на освещении объекта косыми лучами света. Эти лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Если препарат со- держит клетки микроорганизмов, то косые лучи, проходя через такой препарат, в значительной степени отражаются от поверхности клеток и настолько уклоняются от своего первоначального направления, что по- падают в объектив. Тогда наблюдатель видит на черном фоне интенсив- но светящиеся объекты, даже если их диаметр в 10 раз меньше, чем пре- дел разрешения объектива. Такое освещение препарата достигается при- менением специального конденсора. Темнопольный конденсор имеет затемненную среднюю часть, поэтому центральные лучи света, идущие от зеркала, задерживаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лучи, отраженные от зеркальных поверхностей, расположенных внутри конденсора (рис. 6). При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, т. е. лежит за пределами видимости обычного микроскопа. Однако наблюдение объек- Рис. 6. Схема хода лучей в конденсоре темного поля: 1 — линза конденсора, 2 — черная пла- стинка, 3 - объектив Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия. Люминес- центная микроскопия основана на способности ряда веществ биологиче- ского происхождения (хлорофилл, витамин В2, некоторые алкалоиды и антибиотики и т. д.) и некоторых красителей светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесцен- ции, поглощают энергию, переходя на более высокий энергетический уровень. Однако в таком состоянии они находятся непродолжительное время и вновь возвращаются к исходному энергетическому уровню. Этот переход сопровождается отдачей избытка энергии в виде света - люми- несценцией, причем освещаемый объект испускает лучи энергетически менее богатые, т. е. с большей длиной волны, чем лучи возбуждающего света. Поэтому вызывать люминесценцию следует либо коротковолно- вой частью видимого спектра (с и не-фиолетовые лучи, X = 460 нм) или ультрафиолетовыми лучами (X = 360-380 нм). В обоих случаях возни- кает люминесценция в цветовой гамме видимого спектра, т. е. получает- ся цветное изображение объекта. Большинство микробных клеток обла- дают весьма слабой собственной или первичной люминесценцией, по- этому их обрабатывают водными растворами специальных красителей - флуорохромов, к числу которых относятся акридин оранжевый, приму- лин, берберин и другие. Они могут окрашивать не только всю микроб- ную клетку, но и избирательно концентрироваться на определенных кле- точных структурах, вызывая их свечение. Так, например, акридин оран-
16 17 жевый окрашивает в зеленый цвет протоплазму, в розовый - вакуоли, в ярко-красный - метахроматиновые зерна и в светло-зеленый цвет-ядро. Малая токсичность применяемых растворов красителей позволяет изу- чать живую неповрежденную клетку. Такая наведенная или вторичная люминесценция имеет большое значение при проведении цитологиче- ских исследований. Электронная микроскопия. Электронные микроскопы применяют для изучения объектов в структур, находящихся за пределами видимости обычных микроскопов. Разрешающая способность электронных микро- скопов 1-40 А, увеличение в среднем 10' раз. Устройство электронного микроскопа в принципе аналогично светооптическому микроскопу, от- дельные узлы электронного микроскопа сходны с узлами обычного све- тового микроскопа, перевернутого окуляром вниз, но роль световых лу- чей в электронном микроскопе играет пучок электронов, излучаемых специальным источником - электронной пушкой (рис. 7). Электроны попадают в магнитную конденсорную линзу. Использовать стеклянные линзы или зеркала для фокусировки электронов нельзя, так как стекло непроницаемо для электронов. В электронном микроскопе роль динз выполняет круговое магнитное поле, под действием которого электроны могут отклоняться или центрироваться. Функция конденсорной линзы электронного микроскопа аналогична выполняемой конденсором обыч- ного микроскопа - сведение пучка электронов в одной точке на объекте. Пройдя через объект, электроны попадают в объектную линзу, которая вновь фокусирует расходящийся пучок и дает первое промежуточное изображение объекта. Магнитный проектор (проекционная линза, анало- гичная по функции линзе окуляра) дает окончательное увеличение изо- бражения объекта на флуоресцирующем экране - металлической пла- стинке, покрытой тонким слоем сернистого цинка или минерала вилле- мита. При попадании на экран электронных лучей каждая частица этого слоя начинает светиться; заметая экран фотографической пластинкой, изображение объекта можно сфотографировать. Препараты для электронно-микроскопических исследований по- мещают на специальные сетки, на которые нанесена тончайшая целлю- лозная или пластмассовая пленка (подложка); общая толщина препарата и подложки не должна превышать 2500 А. Для увеличения контрастно- сти объекта проводят его напыление тяжелыми металлами (хромом, золотом, палладием) в виде паров или проводят обработку контрасти- рующими веществами (фосфорно-вольфрамовая кислота, уранилаце- тат). При исследовании морфологических особенностей клеток микро- организмов под электронным микроскопом изучают целые клетки: ультраструктуру клеток изучают на их срезах, толщина которых не пре- вышает 800-900 А. При помощи электронного микроскопа нельзя на- блюдать живые клетки микроорганизмов, так как они гибнут при про- хождении пучка электронов через препарат. Электронные микроскопы имеют довольно сложную конструкцию и поэтому пока еще мало дос- тупны для учебных лабораторий. Рис. 7. Схема действия электронного микроскопа: 1 — -электронная пушка, 2 конден- сорная линза, 3 - объект, 4 — объект- ная линза, 5 - промежуточное изо- бражение. 6 - проекционная линза, 7 — изображение объекта на экране Работа 2. Микроскопия в светлом поле. Приготовление фиксированных препаратов и препаратов живых клеток Микроскопия в светлом поле осуществляется в проходящем свете. При выполнении заданий настоящего практикума каждый студент рабо- тает с микроскопом «Labova!-2» (рис. 8).
19 18 )В микроскопе различают механическую, оптическую и освети, тельную части. Рис. 8. Микроскоп «Laboval-2» Механическая часть включает штатив, предметный столик, тубус it систему винтов для передвижения элементов микроскопа. Штатив I состоит из основания и неподвижно привинченного тубус о держателя. Е верхней части штатива расположены тубус 2. куда вставляется окуляр Л и револьверное устройство 4, состоящее из двух пластин. Нижняя плй- стина вращается и имеет гнезда для объективов 5, верхняя закреплена неподвижно. Предметный столик 6 передвигается в вертикальном направлении а помощью макро- микровинта 7, Следует отметить, что пользоваться винтом надо очень осторожно, поскольку в микроскопе «Laboval-2» о- и микрофокусировки совмещены. Диапазон перемещения грубой МЯК дки составляет 20 мм, что соответствует 4,5 оборота макро- микро- Механизм точной наводки можно привести в действие в любом ВИНТ**' 1V1 положении грубой наводки с помощью изменения направления враще- ния того же винта. На предметном столике имеется объектоводитель для предметного стекла 8- С помощью висящих коаксиальных кнопок, расположенных слева под предметным столиком, осуществляется перемещение объек- товодителя в продольном и поперечном направлениях. Рядом с макро- микровннтом расположен винт конденсора 9, обеспечивающий его рас- положение на нужной высоте. В микроскопе «Laboval-2» имеются объективы, дающие увеличе- ние в 3,2, 10 и 40 раз, предназначенные для работы с сухими системами, и объектив с черной полосой для иммерсионнойI системы,- дающей увеличение в 100 pa3.j При работе с иммерсионным объективом, после установки света, при малом увеличении выбирают участок на препарате, на выбранное место наносят каплю кедрового масла и осторожно погружают в нее фронтальную линзу объектива 10Ох. По окончании работы остатки мас- ла с этой линзы удаляют, тщательно протирая ее мягкой тканью. Осветительный аппарат находится под предметным столиком и включает (см. рис. 8): - источник света в виде миньона. Данная лампочка вмонтирована внутри подставки, ее яркость можно регулировать при помощи реостата /(7, расположенного на задней панели, там же расположен тумблер включения микроскопа в сеть; - конденсор Аббе /У; апертуру конденсора можно регулировать, от- крывая и закрывая диафрагму конденсора при помощи рычажка 12. Конденсор Аббе состоит из двух линз, заключенных в металличе- скую оправу и предназначенных для собирания лучей света, иду- щих от зеркала; - отражающее зеркало, которое можно увидеть в окощко 13. Коли- чество лучей, попадающее на зеркало, можно регулировать при помощи диафрагмы светового поля. Рычажок диафрагмы обозна- чен позицией 14. Установка света по Келеру. Наилучшие результаты при работе с микроскопом могут быть получены лишь при условии правильного о с-
20 21 вещения объекта. Лучший способ освещения основан на системе Келе, ра. Последняя включает следующие основные приемы: а) получение резкого изображения источника света (спирали лампы на диафрагме конденсора; б) получение резкого изображения ирисовой диафрагмы осветителя в плоскости препарата. Порядок установки света по Келеру: 1. Включить в сеть. 2, Включить тумблер лампы. 3. Поднять конденсор вверх до упора винтом конденсора 9. 4. Отвести лампу широких полей и нейтральный светофильтр. 5. Увеличить яркость лампы реостатом 10. 6. 3акрытьапертурнуюдиафрагмуконденсора 12. 7. Открыть диафрагму светового поля до упора (установочный ры- чаг 14). 8. Проверить симметричность изображения светового пятна на ниж- ней стороне апертурной диафрагмы конденсора (при правильной ориентации лампового патрона изображение светящегося пятна на нижней стороне апертурной диафрагмы в виде спирали и зеркаль- ное изображение расположены параллельно друг другу, если такое условие не выполняется, нужно поднять микроскоп и поворотом кольца поправить ориентацию). 9. Поставить объектив 10х. 10. Уменьшить яркость лампы реостатом 10. II. Установить препарат. 12. Открыть апертурную диафрагму конденсора на 2/3 (рычажок 12). 13. Сфокусировать микрообъект с помощью механизма наводки (макро- микровинт 7). Для этого расположить объектив на расстоянии 1 см от препарата и, глядя в окуляр, медленно опустить препаратный сто- лик, находя изображение, 14. Закрыть полевую и апертурную диафрагму. В поле зрения видно нерезкое изображение краев диафрагмы светового поля. 15. Сфокусировать изображение светового поля с помощью конденсора. 16, Отцентрировать световое пятно с помощью центровочных винтов. 17. Открыть диафрагму светового поля, чтобы края светлого пятна чуть заходили на поле зрения (на 2/3 диаметра). Приготовление фиксированных препаратов. Микроорганизмы в лабораторных условиях выращивают обычно в пробирках, колбах, чаш- ках Петри в жидких и на плотных питательных средах. При пересевах ьтур или при извлечении части клеток для приготовления препарата ^обходимо строго соблюдать условия, которые позволили бы !тредо- нить культуру от загрязнения другими микроорганизмами, В про- Хессе приготовления фиксированного препарата можно выделить три этапа’ 1) приготовление мазка, 2) фиксация, 3) окраска препарата. Приготовление мазка. Пробирку с чистой культурой берут в ле- вую руку таким образом, чтобы была хорошо видна поверхность пита- тельной среды с выросшей на ней культурой. В правую руку берут бак- териологическую петлю так, как держат карандаш, и прокаливают ее в пламени горелки. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают ватную пробку к ладони и держат так во время последующих манипуляций. Края открытой пробирки обжи- вают в пламени горелки, вводят в нее петлю н берут небольшое количе- ство микробной массы. Горлышко пробирки снова обжигают, слегка обжигают пробку и закрывают ею пробирку, а микробную массу пере- носят в каплю воды на обезжиренном предметном стекле. Не следует вносить много культуры, капля должна стать слегка мутной. Остаток микробной массы на петле сразу же сжигают в пламени горелки. Из капли с внесенной культурой готовят мазок, равномерно размазывая ее петлей или краем покровного стекла на площади 2-4 см2. Мазок просу- шивают на воздухе или слегка нагревая в струе теплового воздуха вы- соко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Нельзя пере- гревать мазок: клетки микроорганизмов могут деформироваться! Хоро- ший мазок после сушки должен давать на предметном стекле еле замет- ный налет. Фиксация препарата. После высушивания приступают к фикса- ции препарата. Фиксация имеет целью: 1) убить микроорганизмы, 2) обеспечить их лучшее прилипание к стеклу и, тем самым, предохранить препарат от смывания, 3) сделать мазок более восприимчивым к окра- ске, так как мертвые клетки лучше красятся, чем живые. Для фиксации чаще всего используется высокая температура. С этой Целью захватываю! предметное стекло мазком вверх пинцетом и 3 раза проводят через пламя горелки. Перед окраской препарат охлаждают (!). Для исследования тонкого строения клетки применяют фиксацию различными химическими веществами- Фиксирующую жидкость нано- сят на мазок, или препарат погружают в фиксатор. При фиксации этило- вым спиртом время фиксации 15-20 мин, метиловым спиртом - 3-5 мин, ацетоном - 5 мин. По окончании фиксации препарат осторожно промы- вают водопроводной водой.
22 Окраска препарата. Существует позитивный и негативный спо- собы окраски. При позитивном способе окраски окрашиваются клетки микроорганизмов. При негативном контрастировании краситель запол- няет пространство, окружающее клетки, в результате чего микроорга- низмы, в которые краситель не проникает, выглядят как с-етль|е части- цы на равномерно окрашенном поле. Для простого позитивного окра- шивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются анилиновыми красителями: фуксином, генциан-виолетом, метиленовым синим. Фик- сированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие на стенках кюветы, и наносят на стекло из пипетки раствор выбранного красителя. Сроки окрашивания указанными красителями колеблются от 1 до 3 мин. В этот период краситель должен покрывать весь мазок. Затем его смывают легкой струёй воды. При этом со стекла смоется только лишний краситель, не адсорбированный микроорганиз- мами. Потом препарат высушивают, осторожно промокая его фильтро- вальной бумагой. Для негативного окрашивания чаще всего пользуются жидкой ту- шью или конго красным. Окрашивание негативными красителями мож- но вести двумя путями: либо раствор наносят на сухой мазок, дают ему высохнуть и сухой препарат рассматривают с иммерсией, либо каплю исследуемой суспензии бактерий смешивают с красителем непосредст- венно на предметном стекле, покрывают ее покровным стеклом и изу- чают с сухой системой. Приготовление препаратов живых клеток. В зависимости от объекта и цели исследования живые клетки микроорганизмов наблю- дают на препаратах «раздавленная капля» или «висячая капля». Препарат «раздавленная капля» готовится на обезжиренном пред- метном стекле, па которое наносят маленькую кашпо водопроводной воды, С соблюдением правил асептики, как описано ранее, бактериоло- гической петлей в воду вносят небольшое количество культуры микро- организмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Не следует вносить много культуры, препарат будет густым и мало пригодным для наблюдения; нельзя допускать образования пузырьков воздуха под по- кровным стеклом, при избытке жидкости, выступающей из-под покров- ного стекла, ее удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопирование проводят с сухой системой. ^Этот вид препарата позволяет установить форму клеток, их размер, спбсоб спорообразования, наличие или отсут- ствие подвижности. _ ' Для приготовления препарата «висячая капля» на покровное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов, переворачивают
23 ej-o каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углуб- лением (лункой) а центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь jqjaes и дна лунки. Если предстоят многодневные наблюдения, то края лунки смазывают вазелином и капля оказывается герметически заклю- ченной во влажной камере. Препарат «висячая капля» используют для выявления подвижности у микроорганизмов, изучения способов раз- множения, наблюдения за прорастанием спор. Задание 1. Ознакомиться с устройством микроскопа «Laboval-2». Установить свет по Келеру. 2. Приготовить фиксированный препарат дрожжей Saccharomyces cerevisiae позитивно окрашенный, промикроскопировать с объек- тивом 1 ООх, зарисовать. 3. Приготовить фиксированный препарат позитивно окрашенный бактериальных клеток. Промикроскопировать с объективом 100х, зарисовать. 4. Приготовить фиксированный негативно окрашенный препарат бак- терий р. Azotobacter. Промикроскопировать с объективом 100х, за- рисовать. 5. Приготовить препарат «висячая капля» культуры бактерий. Про- микроскопировать. 6. Приготовить препараты «раздавленная капля» дрожжей и бакте- рий. Промикроскопировать соответственно с объективом 40х и 100х. зарисовать. Приготовить препарат «висячая капля». Промик- роскопировать с объективом 40х, зарисовать. Познакомиться с фазово-контрастной микроскопией. Тема 2. Морфология микроорганизмов Мир микроорганизмов включает огромное разнообразие форм, общим свойством которых является их малый размер - от десятых до- лей микрометра (мкм) до десятков, иногда сотен микрометров. Боль- шинство микроорганизмов - одноклеточные, встречаются неноцитные, многоклеточные, однако дифференциация клеток на органы ц ткани у них отсутствует. На основании современных представлений о микромолекулярной организации клеток высшие таксоны живой природы относят к трем надцарствам и шести царствам (табл. 1).
24 В системе живых организмов микроорганизмы занимают особое положение, В отличие от растений и животных, которые относятся ц одному надцарству эукариоты, микроорганизмы относятся к трем над- царствам. При этом к надцарстам акариотов и прокариотов относятся только микроорганизмы, К царству растений относятся микроорганизмы - микроскопии?, ские водоросли, к царству животных - простейшие. Таблица I. Система высших таксонов жияой природы Надцарства Царства Акариоты (безъядерные) Прокариоты (доадерные) Эукариоты (ядерные) ♦ Вирусы Архебактерии Цианобактерии Эубактерии Растения Животные Грибы г Естественными средами обитания микроорганизмов является поч- ва, Вода, организм человека, животных, растений. Воздух не является благоприятной средой для развития микроорганизмов, так как не со- держит капельно-жидкой воды, однако многие микроорганизмы могут временно сохранять жизнеспособность в воздухе. Почва является местом .обитания разнообразных видов бактерий, во- дорослей. грибов, простейших.’ Численность и видовой состав микроорга- низмов, населяющих почву, определяется наличием влаги, питательных веществ, реакцией среды, температурой, степенью азрации. Численность н видовое разнообразие микроорганизмов водных объектов определяется прежде всего степенью загрязненности воды, наличием в ней органических соединений и биогенных элементов, азота, фосфора и др. В природных во- доемах могут развиваться водоросли, бактерии, простейшие и грибы. Работа 3. Морфология бактерий Бактерии представлены в основном одноклеточными формами с прокариотическим типом строения клетки,(Размножение бактерий осу- ществляется путем поперечного деления клетки на две равные части. Клетки после деления могут разъединяться, однако у некоторых видов
25 остаются вместе, образуя различные сочетания. Эти скопления не экви- валентны многоклеточным формам, так как каждая входящая в них клетка является самостоятельным организмом, сохраняющим жизнеспо- собность и после отделения от других клеток/Що форме клеток бакте- рии подразделяют на четыре основные группы: палочковидные, кокко- видные, извитые и нитевидные (рис. 9\ Рис. 9. Бактерии: 1 - палочковидные, 2 - кокковидные. 3 - извитые, 4 - нитевидные Палочковидные бактерии имеют форму палочек. Различаются разнообразием величины, форм и расположением клеток. Размеры варьируют от 2-5 мкм до 10-12 мкм. Палочки различаются отношением длины клетки к ширине, формой окончания (полюса) клетки. Концы их Могут быть ровными, как бы обрезанными, закругленными, утолщен- нымидли заостренными. (Взаимное расположение различно: бес порядочное,/характерное для большинства бактерий, клетки которых после деления расходятся;, па- рами - диплоформы, сохраняют после деления две клетки; в виде длйн- Hbix цепочек.^Среди палочковидных форм есть подвижные и неподвиж- яые^Цвижениё^бактерий зависит как от видовой принадлежности, так й от возраста культуры и условий выращивания^ Для выявления подвиж- ности препараты готовят из односуточных культур. ^Подвижные палоч- ковидные бактерии перемещаются при помощи жгутиков, которые осу- ществляют вращательное движение и по-разному располагаются на микробной клетке (рис. Ю), По способности образовывать спорь(тйлочковшшые бактерии под- разделяют на три большие группы - бактерииДлат. Bacterium), необра- зующие спор, бациллы (лат. Bacillius), образующие эндоспоры без изме- нения формы клетки, и клостридии (лат, Clostridium), у которых в про- цессе спорообразования наблюдается изменение формы клетки и из па-
26 почковидной она превращается в веретеновидную или утолщенную с одного конца, напоминающую барабанную палочку. В каждой клетке образуется только одна спора; когда спора сформируется, оболочка и содержимое клетки лизируются. Споры бактерий хорошо переносят вы- сушивание, нагревание, воздействие ряда химических веществ. Попадая в благоприятные условия, спора прорастает в вегетативную клетку. Па- лочковидные бактерии могут располагаться по одной без определенной системы, быть попарно связанными по длине или образовывать цепочки. Рис. (О, Схематическое изображение типа жгутикования у бактерий:: 1 - монотрих, 2 —амфитрих, 3 лофотрих, 4 ~ перитрих Кокковидные формы (лат. coccus — шарик) характеризуются от- сутствием подвижности и способности к спорообразованию^) Могут быть шаровидной формы, слегка вытянутой или несколько вогнутой с одной из сторон, диаметром 0,5-1 мкм, фЗ зависимости от расположения клеток и характера их деления кокки подразделяют на несколько морфологических групп. Микрококки характеризуются одиночным беспорядочным расположением клеток, диплококки (лат. diplos - двойной) характеризуются расположением клеток попарно, стрептококки (греч. streptos - цепь) имеют вид цепочки, состоящей из отдельных шарообразных клеток. Такие расположения клеток возможны при делении их в одной плоскости. У тетрадйккрв (греч. tetra — четыре) деление клетки возможно в двух взаимно-перпен- дикулярных плоскостях, в результате чего клетки располагаются по че- тыре. У сарцин (лат, sarcio —связывать) образуются скопления по 8, 16 и более клеток в результате деления клетки в трех взаимно перпендику- лярных плоскостях. -Стафилококки (греч. staphylos ~ гроздья), - скопле- ния неправильной формы, напоминающие виноградные гроздья; обра- зуются в результате деления клетки в различных плоскостях. Многие бактерии образуют капсулу снаружи клеточной стенки, представляющую скопление слизистого вещества (полисахариды, поли-
27 пептиды). В зависимости от размера различают микрокапсулу и макро- дапсулу. При микроскопировании капсулированных бактерий капсулы имеют вид бесцветного ореола, окружающего клетки, так как вещестао капсул плохо воспринимает красители. ^"Извитые формы бактерий, К этой группе бактерий относятся вибрионы, спириллы и спирохеты}} Вибрионы (лат. vibrio — изгибающийся): слегка изогнутые клетки, в виде запятой, изгиб их составляет 1/4 завитка спирали, подвижность осуществляется за счет жгутика. Спириллы (лат. spira - изгиб) отличаются спиральным строением клетки с одним или несколькими оборотами спирали, способные к дви- жению с помощью биполярно расположенных жгутиков. Различаются по количеству и характеру изгибов, общей длине и толщине клетки. Характерную в морфологическом отношении группу составляют спирохеты. Строением клеток и способом передвижения они отличают- ся от всех других бактерий. Клетка спиралевидная, но не ригидная, как у спирилл, а чрезвычайно гибкая. В сравнении с длиной (5—500 мкм) толщина ее необычно мала (0,1—0,6 мкм). Большинство спирохет под- вижны, они могут извиваться, перемещаться в жидкой среде путем вра- щательных и легких волнообразных движений. Движение спирохетобу- словлено сокращением фибрилл, плотно обвивающих цилиндрическую клетку и расположенных под клеточной стенкой. Каждая фибрилла прикреплена одним концом вблизи одного из полюсов клетки, другой ее конец свободен. У различных представителей этой -.руппы число фиб- рилл варьирует и более или менее пропорционально величине клетки — у мелких форм к каждому полюсу прикреплено no 1-2 фибриллы, у крупных - до нескольких сотен. Спирохеты размножаются поперечным делением, при этом каждая клетка получает один из двух наборов фиб- рилл; новый набор фибрилл формируется на вновь образованном полю- се каждой из дочерних клеток. Эндоспоры у извитых форм не обнаружены. Бактерии нитевидной формы представляют собой нити из ци- линдрических или дисковидных клеток, часто окруженных общим чех- лом. Длина нитей может достигать 500 мкм, они могут быть как прямы- ми, так и скрученными в спирали, у некоторых форм нити плоские, по- хожи на ленты. Нитевидные бактерии могут быть разветвленной фор- мы. Боковые выросты представляют собой ложное ветвление, так как они образуются за счет вытеснения клеток из основной нити при деле-
28 :йии. Это многоклеточные колониальные организмы, не имеющие функ- ционального разделения между клетками. Нитевидные бактерии - вод- ные организмы, где они могут свободно плавать или прикрепляться к твердым субстратам^д последнем случае на конце нити образуется сли- зистая подушечка?,размножаются нитевидные бактерии путем фрагмен- тации, с образованием отдельных коротких цепочек^путем отщепления отдельных скользящих клеток от апикального конца нити, а также го- нидиями, представляющими собой клетки овальной формы, образую- щиеся внутри материнской клетки. Гонидии некоторых нитевидных бактерий имеют жгутики, при помощи которых передвигаются. Ните- видные бактерии встречаются среди представителей различных физио- логических групп - есть нитевидные формы среди серобактерий, желе- зобактерий, цианобактерий. Микроскопические исследования бактерий проводят на фиксиро- ванных препаратах с иммерсионной системой. Спириллы и спирохеты плохо воспринимают красители, поэтому после фиксации мазка в пла- мени горелки проводят его обработку в течение 3-5 мин 0,5% раство- ром соляной кислоты. Протравливание клеток кислотой повышает их восприимчивость к красителю. Мазок окрашивают в течение 1-2 мин фуксином Циля. Нитевидные бактерии - достаточно крупные формы; для их микро- скопирования можно приготовить препарат «висячая капля» и исполь- зовать сухую систему. Задание Познакомиться с формой клеток конкретных штаммов кокковид- ных бактерий, приготовив фиксированные препараты, промикроскопи- ровать (1 ООх, МИ), зарисовать. Познакомиться с формой клеток палоч- ковидных бактерий (фиксированные препараты, 1 ООх, МИ), зарисовать. Познакомиться с формой клеток извитых бактерий на примере культу- ры Rhodospirillum rubrum и спирохет, выявляемых в фиксированном окрашенном препарате из зубного налета (100х, МИ). Познакомиться с формой клеток нитевидных цианобактерий (препарат «висячая капля», 40х), зарисовать. Конкретные культуры для приготовления препаратов предлагаются на замятии. Морфология цианобактерий цианобактерии (прежнее название сние-зеленые водоросли) — про- кариотические организмы — относятся к бактериям, но, подобно расте-
29 ниям и водорослям, осуществляют фотосинтез с выделением кислорода, т, е. они относятся к аэробным оке и генным фотолитоавтотрофам. Циа- нобактерии распространены в водоемах, в почве, на рисовых полях. В эвтрофных озерах часто наблюдается массовое размножение цианобак- терий - «цветение» воды. Благодаря способности фиксировать молеку- лярный азот и выдерживать экстремальные условия (температура, pH) цианобактерий первыми заселяют места, бедные питательными вещест- вами (пустыни, скалы и т. п.) и участвуют в первичном почвообразова- тельном процессе. Цианобактерии - морфологически разнообразная группа и включает как одноклеточные, так и многоклеточные формы. Одноклеточные фор- мы - это палочки, кокки, которые часто существуют в виде объединен- ных капсулами и слизью клеток в агрегаты (колонии). Размножаются бесполым путем а результате бинарного, множест- венного деления или почкования (рис, 11). Рис. 11. Схематическое изображение цианобактерий Многоклеточные формы - это нитчатые бактерии, представлены цепочками клеток, называемых трихомами, часто погруженных в слизи- стые чехлы. Размножаются путем деления клеток внутри трихома. В некоторых нитчатых цианобактериях, растущих в отсутствии связанно- го азота н фиксирующих молекулярный азот, наблюдается дифферен- циация клеток (рис. 11), Образуются гетероцисты - клетки с толстой клеточной стенкой, слабо пигментированные. Они являются местом
30 фиксации молекулярного азота. Образуются также покоящиеся клетки с утолщенной стенкой - акинеты. Задание Ознакомиться с морфологией цианобактерий. Приготовить препа- рат «раздавленная капля» из культуры Spirulina, Nostoc. Зарисовать, объектив 40х. Актпномнцеты (греч. actis - луч, rnycOs - гриб) - лучистые грибки - группа микроорганизмов, относящаяся к прокариотам, но имеющая некоторое сходство с грибами. Как и бактерии, все актиномицеть) со- держат в составе клеточной стенки иептидоглюкан, не имеют дифферен- цированного ядра, ширина клеток (0,5-1,5 мкм) сходна с бактериальны- ми. Сходство с грибами проявляется в способности клеток ветвиться в виде мицелия и образовывать на концах гиф споры, являющиеся для ря- да родов актнномицетов основным способом размножения. Низшие формы актиноминетов - проактиномицеты и коринс- формные бактерии - включают такие роды как Mycobacterium, Nocar- dia, Artlirobacter, Corynebacteruim и др. Это одноклеточные формы, у которых наблюдается тенденция к образованию мицелия или клеток с изменчивой иеправилыюй формой в молодых культурах. С возрастом клетки большинства видов распадаются на кокковидные или овальные формы. Плеоморфизм (морфологическое многообразие) характерен для всех видов, размножение происходит путем деления клеток, фрагмента- ции минелия или образования спор. Так, у некоторых видов микобакте- рий споры формируются из отдельных фрагментов цитоплазмы, покры- ваются собственной оболочкой; по мере их созревания оболочка мате- ринской клетки разрушается, и споры освобождаются. В клетках таких микобактерий всегда образуются несколько спор, поэтому для предста- вителей этого рода спорообразование можно рассматривать как способ размножения. Практическое применение из этой группы микроорганиз- мов нашли многие виды рода Corynebacteruim, являющиеся продуцен- тами аминокислот. Кроме плеоморфизма, для коринобактерий харак- терно «защелкивание» клеток при их делении. Оно происходит из-за того, что соединяющая дочерние клетки перегородка расслаивается на разных сторонах с разной скоростью, так что клетки оказываются под углом друг к другу. Наряду с этим наблюдается и множественное деле- ние клеток, при котором из одной длинной палочки получается не- сколько коротких (рис. 12).
3] Рис. 12. Актиномицеты: 1 -коринебактерии: 2 -микобактерии: 3 -стрентомицеты Истиннее актиномицеты или эуактиномицеты объединяются в несколько родов . Один из них - род Streptomyces. Эти микроорга- низмы образуют сильно разветвленный мицелий, не имеющий попе- речных перегородок, он частично врастает в питательную среду, об- разуя плотный субстратный мицелий, который трудно отделяется бактериологической петлей. Над поверхностью субстрата образуется воздушный мицелий. Имеются особые воздушные гифы (спорофоры), от которых отшнуровываются споры, служащие для распространения вида. Строение этих спорофор (прямые, волнистые, спиральные, соб- ранные в пучки, мутовчатые и т- Д-) служит одним из систематиче- ских признаков стрептомицетов. Споры стрептомицетов неустойчивы к нагреванию, однако в сухом состоянии могут длительное время со- хранять жизнеспособность. Мицелий у истинных актиномицетов со- храняется в течение всего жизненного цикла, расчленения с возрас- том на кокки и палочки не наблюдается. Многие стрептомниеты об- разуют пигменты, окрашивающие колонии в самые разные цвета, час- ш то пигменты выделяются в среду. Большинство стрептомицетов про- 7 дуцируют биологически активные вещества с антибиотическими свойствами, некоторые из которых нашли применение в медицине J (стрептомицин, тетрациклины и т. д.). ' Культуры стрептомицетов, выращенные на питательной среде в чашках Петри, изучают непосредственно на чашке при малом увеличении (объектив 1 Ох), помещая открытую чашку' на предметный столик микро- скопа. При этом можно видеть, что гифы мицелия частично внедряются в субстрат, частично стелются по поверх! юсти и приподнимаются над ней. Просматриваются спорофоры со спорами. Из этих же культур готовят
32. препараты для микроскопического изучения: на предметное стекло нано- сят каплю 10% раствора щелочи (КОН или NaOH) или 70-90% раствора уксусной кислоты или 60% этанола, в которой расщепляют с помощью двух препаровальных игл мицелий, взятый с небольшим кусочком под- лежащей питательной среды. Препарат плотно накрывают покровным стеклом и микроскопируют с объективом 40х. На твком препарате хоро- шо видна разница в толщине субстратных и воздушных гиф, форма спо- роносцев. Для изучения типа спорообразования, формы и размера спор готовят препарат «отпечаток». Для приготовления такого препарата по- кровное стекло плотно прижимают к поверхности колонии, а затем по- кровное стекло помещают на предметное стекло в каплю воды Отпечат- ком вниз; микроскопируют с объективом 40х. Задание 1. Приготовить фиксированный препарат культуры Corynebacterium glutamicuni. Промикроскопировать с объективом ЮОх. Отметить плеоморфизм культуры и «защелкивание» разделившихся клеток. 2, Промикроскопировать при малом увеличении колонии на чашках Петри культур стрептом инетов. Зарисовать форму края колоний, субстратный и воздушный мицелий, форму спороносцев. 3. Приготовить из этих же культур препараты «раздавленная капля» и «отпечаток». Промикроскопировать с объективом 40х и зарисовать. Работа 4. Морфология грибов Грибы — это эукариотические организмы, составляют пэрство Му- сой.^^еди грибов встречаются одноклеточные, нитчатые и мицелиаль- ные формы.;) Одноклеточные грибы, утратившие способность к мицелиальному росту, называются дрцжжами и относятся к различным систематиче- ским группам. ~— Большинство грибов - цероцитные организмы с вегетативной структурой, называемой мицелием. Мицелий состоит из многоядерной массы цитоплазмы, наполняющей сильно разветвленную систему жёст- ких трубочек примерно одинаковой толщины (-5 мкм). Обычно мице- лий образуется путем прорастания н разрастания одиночной репродук- тивной клетки-споры. Грибная спора дает длинную нить или гифу, ко- торая удлиняясь, многократно ветвится и образует целую систему ни- тей, т. е. мицелий. Рост грибов осуществляется за счет кончиков гиф и может продолжаться до тех пор, пока хватает питательных веществ; у некоторых грибов мицелий может занимать участок почвы до 15 м в
33 диаметре. Мицелий грибов может быть одноклеточным (несептирован- ным) и многоклеточным (септированным). Грибы могут размножаться вегетативным, бесполым и половым путем. Грибы распространены в природе повсеместно. Споры грибов обнаруживаются в любых экоси- стемах, техногенных потоках и продуктах. Наибольшее количество гри- бов встречается в почве. Они принимают активное участие в биогеохи- мическом цикле превращений углерода в природе и относятся как к зи- могенной, так и автохтонной микрофлоре. Среди большого разнообразия грибов, приспособившихся к жизни в почве, имеется небольшая группа водных грибов, а также довольно обширная группа паразитических грибов, вызывающих заболевания человека, животных и растений (микозы). Грибы способны выделять во внешнюю сред? ферменты и абсорб- ционным путем поглощают питательные вещества, продукты фермента- тивного гидролиза природных биополимеров и других растворимых веществ. Такой тип питания определяет положение почвенных грибов как самую крупную экологическую группу, участвующую в минерали- зации органических веществ в экосистемах. К царству Mycota (или Fungi) относятся миксомнцеты (истинные слизевики) и эумицеты (истинные грибы) (рис. 13). Царства и подцарства Классы Половые структуры Мицелий Одноклеточные формы Рис. 13. Структура царства грибов
34 Среди эумицетов различают низшие грибы фикомицеты (или зиго- минеты) и высшие грибы, которые распределены по классам: аскомице- ты, базпдиомицеты и несовершенные грибь!. Зигомицеты - низшие грибы, имеют хорошо развитый несептиро- ванный мицелий. Отсутствие перегородок в мицелии определяет его мно- гоядерность (ценоцитный мицелий). Типичный представитель фикомице- тов Мксог pusillus развивается в виде войлоковидного налета серого цве- та. Его мицелий образует структуры двух типов - разветвленные гифы (ризоиды), проникающие в субстрат, и поднимающиеся вверх над пучка- ми ризоидов особые воздушные гифы - спорангиеносцы, расширяющиеся на верхушке, образуя округлый спорангий. Спорангий отделяется перего- родкой от остальной части спорангиеносца. Внутри спорангия развивает- ся большое количество сферических эндоспор, служащих для размноже- ния. Это бесполый способ размножения (рис. 14). Рис. 14. Грибы: I -р. Мисог; 2 -р, Aspergillus; 3 -р. Penicilliuin; 4 -р. Fusarium; 5 - р. Oidium; б-р. Saccharomyees; 7 - р. Schizosaccharomyces; 8 — р. Saccharoraycpides; 9 - р. Candida
35 У зигомицетов существует и половой способ размножения, сопро- вождающийся образованием зигоспор. У го металлических форм зигос- поры образуются в результате слияния половых клеток, образующихся на одном и том же мицелии: у гетероталлических форм различают два вида мицелия, не отличающихся морфологически и обозначаемых как (+) и (-). Зигоспоры образуются только при контакте гиф (+) с гифами (-). При прорастании зигоспоры происходит мейоз и появляется гифа, обра- зующая спорангий (рис. |5). Аскомпцеты - высшие грибы, имеющие многоклеточный ветвя- щийся мицелий. Клеточные перегородки имеют поры, что обусловливает ценоцитную природу цитоплазмы. У аскомицетов различают два способа размножения: половой и бесполый. При половом способе слияние двух ядер приводит к образованию зиготы, которая превращается в аск (сум- ку), внутри него в результате деления диплоидного ядра образуются гап- лоидные аскоспоры, их может быть от четырех до 1000 и более. При бесполом способе размножения на концах плодоносящих гиф - кони- диеносцах - образуются экзоспоры - конидии (рис. |4). К аскомицетам относятся многие виды плесневых грибов и дрож- жей. Виды рода PenicilJum используются при получении антибиотиков. Пенициллы размножаются в основном бесполым путем, конидии обра- зуются на концах мутовчаторазветвленных конидиеносцев, напоми- нающих кисть руки (отсюда и название пенициллов -кистевики). Представители рода Aspergillus. Конидиеносцы у асперптлов обыч- но одноклеточные, шаровидной, булавовидной или грушевидной формы. На них располагаются параллельно друг другу' короткие кеглеобразные стеригмы, каждая из которых отшнуроаывает цепочки конидий. Вся го- ловка конидиеносца напоминает наконечник лейки со струйками воды, поэтому гриб называют леечным. Представители рода Aspergillus исполь- зуются как продуценты лимонной кислоты и ферментов. Особую группу среди аскомицетов составляют дрожжи. Клетки дрожжей могут быть округлой, овальной, палочковидной, грушевидной, лимоновидной формы. При половом способе размножения две клетки сливаются, образуется зигота, которая превращается в аск, В аске фор- мируются 2-12 и более спор. Количество спор и их форма (округлые, серповидные, овальные и т. д.) рассматриваются как систематические признаки, определяющие видовую принадлежность. При прорастании из каждой споры образуется вегетативная клетка дрожжей. Вегетативный способ размножения у дрожжей может осуществ- ляться по способу почкования, деления и смешанным типом - почкую- щимся делением. Для сахаромицетов (род Saccharornyces) характерно размножение почкованием, когда на материнской клетке возникает вы-
пуклость - почка - или дочерняя клетка, которая постепенно увеличива- ется в размерах и отделяется. Дрожжи широко используются человеком в хлебопечении, при получении вина, спирта, пива. a j 2 3 Рис. 15: а - половые структуры грибов: I - зигоспора, 2 - сумки, J - базидии; б - струк- тура мицелия и септовых пор б: i - несептированный мицелий зигомццетов, 2 - :епты с простыми порами аскомицетов, 3 — пряжковый мицелий и септы с до- tuwpcutii базидиомнцетов, 4 - почкующиеся клетки и псевдомицелий дрожжей
37 Шизо сахаромицеты (род Sthizosaccharoniyces) размножаются деле- нием. При вегетативном способе размножения почки образуются только полярно, по концам клетки, причем отделение почки сопровождается образованием перегородки между нею и материнской клеткой. Исполь- зуют при производстве некоторых сортов пива. Базидиомицеты - наиболее высокоразвитая группа грибов, объе- диняющая все шляпочные грибы. Органы спородошения - базидии - клетки на концах гиф, содержат, как правило, четыре гаплоидных бази- диоспоры, отделяющиеся от базидии путем отпигуровывания. Мицелий базидиомицетов многоклеточный, многоядерный, отличить его от ми- целия аскомицетов можно по наличию пряжек - особых мицелиальных отростков крючкообразной формы, располагающихся над клеточными перегородками. Возникновение пряжек у базидиомицетов сопровождает процесс деления ядер и клеток (рис. 15). Несовершенные грибы (дейтеромицеты) - большая группа грибов, включающая как одноклеточные (дрожжи), так и многоклеточные мице- лиальные формы. Общим для всех грибов этого класса является отсутст- вие половой стадии при размножении. Из одноклеточных дейтеромице- тов дрожжи рода Candida широко применяются в микробиологической промышленности. Они используются при получении белково- витамимного препарата, органических кислот, многоатомных спиртов; представители этого рода принимают участие в очистке сточных вод, являясь компонентами активного ила, участвуют в очистке почвы и мор- ской воды от нефтяных загрязнений. Дрожжи р. Candida размножаются многосторонним почкованием, большинство видов образуют псевдоми- целий. Псевдоминелий часто бывает дифференцирован на псевдогифы и бластоспоры. Бластоспорами у дрожжей называют вегетативные споры, образующиеся путем почкования на псевдомицелии. Они обычно круг- лой или овальной формы и располагаются по отношению к псевдомнце- лиальным клеткам в определенном порядке, образуя или цепочки, или мутовки, К несовершенным грибам относятся также широко распространен- ные в природе виды дрожжей р. Rliodotorula. отличающиеся желтой или красной окраской за счет содержания каротиноидов. Их применяют для обогашения полученной биомассы провитамином А. К многоклеточным дейтером ицетам относятся виды р. Fusarium, р. Oidium и др. Большинство представителей этих грибов являются фи- то патогенными.
да Род Fusarium отличается серповидно изогнутыми многоклеточны- ми конидиями, которые развиваются на коротких разветвленных кони- диеноснах. Род Oidium характеризуется наличием сильно разветвленного ми- целия, гифы которого легко распадаются на оидни — отдельные клетки, служащие для размножения. Один из видов этого рода — Oidium lacrjs или молочная плесень часто встречается в виде бархатистой пленки на поверхности кисломолочных продуктов, вызывая их порчу. Изучение морфологических особенностей представителей мице- лиальных грибов проводят вначале при мелом увеличении (Юх) непо- средственно на чашках Петри, Затем с помощью препаровальной иглы вырезают кусочек мицелия (- 0,5 мм") и осторожно помещают его в каплю воды на предметное стекло, Сверху на мицелий кладут покров- ное стекло. Если вода не целиком окружает исследуемый мицелий, следует из капельницы добавить ее под покровное стекло до полного погружения мицелия. Избыток воды можно удалить фильтровальной бумагой. При малом увеличении находят конидиеиосцы, хорошо види- мые на краях препарата. Их детальное строение изучают с объективом 40х. У фпкоминетов спорангии обычно разрушаются при просмотре таким способом и видны лишь скопления спор. Для выявления нераз- рушенных спорангиев следует осторожно взять препаровальной иглой небольшое количество мицелия и другой иглой снять его на сухое предметное стекло. Просматривая препарат без покровного стекла при малом увеличении, можно видеть спорангиеносцы и круглые темные шарики на их концах — спорангии. Задание 1. Познакомиться с ростом грибов р. Мпсог, Aspergillus niger, Penicil- lium на чашках Петри при малом увеличении. Приготовить препа- раты на предметных стеклах по описанным выше способам, зари- совать гифы воздушного и субстратного мицелия, спорангии с эн- доспорами, конидиеносны и конидии. Объективы 10х и 40х. 2. Приготовить препараты дрожжей р. Saccharomyces, Schizosac- charomyces; выявить делящиеся клетки, описать способы деления; зарисовать. Объектив 40х. 3, Приготовить препараты аспорогенных дрожжей р. Candida, Rliodotorula; зарисовать почкующиеся клетки, псевдомицелий и бластоспоры, объектив 40х. 4, Приготовить препараты мицелиальных дейтеромицетов Fusarium sp., Oidium lactis; зарисовать мицелий, конидии и оидии. Объектив 40х,
39 Работа 5. Морфология микроводорослей Микроводоросли подобно высшим растениям являются фотосинте- зирующими организмами, осуществляют фотосинтез с выделением ки- слорода. Основным местом обитания водорослей являются водоемы, но мно- гие обитают в наземных экосистемах: в почве, на коре деревьев и др. У Многие водоросли — одноклеточные микроорганизмы, другие — нитчахы^, колониальные или неноцитные формы, третьи - многокле- точны^ц£ дифференцировкой клеток и тканей, аналогичной высшим растениям. В основу классификации водорослей положены в основном разли- чия в свойствах клеток, а не организма: в частности различия в природе фотосинтезирующих пигментов, запасных питательных веществ, хими- ческого состава клеточной стенки, наличия подвижной стадии при их развитии, в количестве, строении, расположении жгутиков у подвижной формы. Поэтому к одним и тем же таксономическим группам водорос- лей могут относиться как одноклеточные формы, так и многоклеточные растениеподобные, например, в группе зеленых и красных водорослей- Объектами исследования микробиологов являются в основном од- ноклеточные формы - представители подвижных форм, жгутиковые, и неподвижных, диатомовые и десмидиевые. И те и другие формы со- ставляют основную ,массу планктона, принимают участие в процессах самоочищения природных водоемов, очистки сточных вод в очистных сооружениях (биологические пруды, поля фильтрации, поля орошения), способствуют освобождению стоков от соединений азота и фосфора, обогащают воду кислородом, в природных условиях массовое развитие микроводорослей приводит к так называемому «цветению» водоемов. Культивирование микроводорослей методами биотехнологии осуществ- ляется с целью получения биомассы и биологически активных веществ в структуре системы жизнеобеспечения в космических кораблях. Эвглена (Euglena gracillus) (рис. 16) - типичный представитель подвижных форм обладает выраженной полярностью: у нее вытянутая листовидная форма клетки, на переднем конце которой имеются два жгутика. Вблизи основания жгутиков имеется специализированная ор- ганелла - глазок — окрашенный особыми каротиноидами в красный цвет. Это фоторецептор, определяющий направление движения клетки к свету. Форма клетки изменчива, так как вместо жесткой клеточной стенки имеется эластичная пленка пелликула. Размножение осуществ- ляется путем продольного деления,
40 Рис. 16, Микроводорослй: I - Eugtena gracillus; 1 - Chlorella vulgaris Хлорелла (Chlorella vulgaris) (рис. 16) - зеленая водоросль, вегета- тивное тело которой окружено клеточной стенкой из целлюлозы и имеет округлую форму. Клетки одиночные, либо образуют бесформенные ско- пления. Размножение осуществляется с помощью автоспор, образую- щихся внутри клетки и высвобождающихся при разрыве оболочки. Задание 1. Приготовить препараты «висячая капля» из «зацветшей» воды ак- вариума. Выявить подвижные и неподвижные формы микроводо- рослей, зарисовать. 2. Приготовить препарат «раздавленная капля» из культуры Chlorella vulgaris и Dunaliella. Зарисовать, объектив 40х, Работа 6. Морфология простейших ‘"(Йрбстейшие (Protozoa) - это микроскопические одноклеточные животные, эукариоты. Обитают в воде, почве, многие паразитируют в организме позвоночных и беспозвоночных животных, ' У большинства простейших клетка дифференцирована на перед- нюю и заднюю части, имеется ротовое отверстие, одно или два ядра, принимающих участие в делении. Размножаются простейшие беспалым (делением клетки) или поло- вым путем (в результате конъюгации клеток). Классификация простейших основана на способах движения: в класс саркодовые.-(амебовидные) (Rhtzopoda) объединены виды, пере- двигающиеся с помощью псевдоподий; у ^жгутиковых (Mastigophora) подвижность обусловлена одним или несколькими жгутиками, движе- ние инфузорий (ресничные - Ciliata) осуществляется за счет координи-
41 рованной системы ресничек; неподвижные формы простейших объеди- нены в класс споровиков (Sporozoa). Для активной ~Жизни простейших в почве важнейшее значение имеет наличие воды в почвенных порах. Периоды иссушения пережи- вают в виде цист. Численность простейших в почве может быть очень высокой - до нескольких сотен тысяч клеток в 1 г почвы. Существен- ным фактором, регулирующим жизнь простейших в почвах,, является количество бактерий, которыми они питаются. Представители саркодовых (или корненожки) не имеют постоян- ной формы клетки из-за образования в различных ее участках псевдо- подий, временных цитоплазматических выростов, либо в виде широких лопастей, либо узких, заостренных. Псевдоподии служат как для дви- жения, так и для захвата пищи. Сталкиваясь с бактериальной или дрожжевой клеткой, амеба обте- кает ее и включает внутрь цитоплазмы (фагоцитоз). Размножаются амебы путем деления клетки в любом направлении. Инфузории (ресничные, Ciliata) - одна нз наиболее многочислен- ных и морфологически разнообразных групп простейших. Для этой Группы характерна дифференциация тела, это вершина дифференциа- ции на одноклеточном уровне. Инфузории в основном обитают в во- доемах. Большое морфологическое разнообразие характерно для ин- фузорий. Многие представители имеют форму эллипса, поверхность которого покрыта тонкими ресничками. Типичным представителем этой группы является инфузория-туфелька (Paramecium caudatum и Tethrapymena pyriFonnis). Простейшие входят в состав почвенных биоценозов, активных илов, используемых в процессах биологической очистки сточных вод. Питаясь бактериями и взвешенными веществами, они способствуют ос- ветлению воды. Простейшие выполняют функцию индикаторов: по раз- витию тех или других форм можно судить о качестве очистки стоков. Так преобладание амеб и отсутствие в составе активного ила инфу- зорий свидетельствует о плохой работе очистных сооружений, а отсут- ствие амеб и преобладание инфузорий -- о хорошей работе очистных сооружений. Инфузория Tethrahymena pyriformis широко используется в качестве тест-объекта для первичной оценки токсичности и биологиче- ской ценности разното рода продуктов. Форма других представителей этого класса напоминает бутоны растений. Реснички спиралеобразно окружают ротовое отверстие, движение осуществляется за счет сокра- щения как самой клетки, так и стебельков, с помощью которых они мо-
гут прикрепляться к субстрату;, есть одиночные и колониальные формы (рис, 17), Рис, 17. Простейшие: I - амеба; 2 - инфузория; 3 - сувойки Задание Ознакомиться с морфологией простейших. Приготовить препарат из активного ила. При приготовлении препарата «висячая капля» взять пипеткой осадок, содержащий активный ил. Найти и зарисовать пред- ставителей простейших: амеб, инфузорий различных подклассов Para- mecium caudatum (инфузория-туфелька), Vorticella convallaria (оувойка). Зарисовать зооглей бактерий. Объектив 1 Ох. Тема 3. Строение клеток микроорганизмов Важнейшими методами изучения общей организации и тонкой структуры клетки являются микроскопия, особенно электронная в соче- тании со сложной предварительной обработкой биологического мате- риала, а также биохимические исследования выделенных отдельных органелл и фракций клеток методом дифференциального центрифуги- рования. Изучение строения микробных клеток на уровне светового микро- скопа возможно при использовании пито- и гистохимических методов окраски. Используют, как правило, анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Наибольшее применение имеют основные кра- гитедп (красящая группировка - хромофор - катион): красные (сафра- яин, фуксин основной, гематоксилин); фиолетовые (генциан фнолето-
43 вый, кристаллический фиолетовый и т. д.); синие (метиленовый синий, виктория); коричневые (кризоилин, незурин); зеленые (янус зеленый) и черные (индулин). Реже применяют нейтральнее красители (нейтральный красный) и кислые красители (эозин). К кислым красителям относятся красные (фуксин кислый, эритро- зин), желтые (конго, пикриновая кислота), черные (нигрозин). Из на- званных красителей готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные рас5- творы- Различают следующие виды гистохимической окраски: - простое окрашивание - диффузная окраска каким-либо раствором красителя всей клетки; — сложное окрашивание - дифференциальная окраска отдельных структур, органоидов, включений клетки под воздействием двух красящих веществ, из которых одно - основное, а другое дополни- тельное - контраст. - позитивное окрашивание - непосредственная окраска клетки или отдельных структур, органоидов, включений; - негативное окрашивание - окраска пространства вокруг клетки, в результате чего клетка выглядит силуэтом на фоне красителя; - прижизненное окрашивание (витальное) - окраска живых клеток микроорганизмов; - окрашивание фиксированных клеток - окраска убитых клеток мик- роорганизмов. Живые микроорганизмы прокрашиваются значительно труднее, чем те же микроорганизмы, фиксированные различными способами. Окрашивание происходит лишь только после того, как нарушается про- ницаемость стенки и цитоплазматической мембраны. Работа 7. Определение размеров клеток Размеры микробных клеток варьируют в широких пределах: от со- тых долей микрометров (мкм) у некоторых бактерий до нескольких де- сятков и сотен микрометров у микроскопических простейших и водо- рослей. Определение размеров клеток микроорганизмов под микроскопом включает три этапа: определение размеров клеток в делениях окулярной линейки, определение цены деления окулярной линейки в мкм и расчет размеров клеток в мкм.
1. Определение размеров клеток fe делениях окулярной линейки осуществляют с помощью окулярной линейки (окуляр-микрометра) которую помещают на диафрагму окуляра, для чего вывинчивают глаз- ную линзу окуляра, устанавливают окуляр-микрометр и вновь завинчи- вают линзу (рис. 18). На столик микроскопа помещают препарат «раздавленная капля», препарат парафинируют для предохранения от высыхания нанесением расплавленного парафина на края покровного стекла. Фиксированные Препараты для определения размеров клеток нежелательны, так как фиксация и окраска может изменить размеры клеток. Если клетки под- вижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспен- зии добавляют 0,1 % водный раствор агар-агара. После установки препарата на столн- Рис. 18, Окулярный микрометр ке микроскопа, проводят фокусировку объекта. Путем передвижения предметно- го столика в двух плоскостях располагают клетки на шкале окуляр-микрометра и определяют, скольким делениям линейки соответствует длина и ширина к-летки при данном увеличении микроскопа. Чтобы результаты были достоверными, измеряют обычно не менее 10-20 клеток. У кокков измеряют диаметр, у других форм - длину' и ширину. 2. Определение цены деления оку- лярной линейки в мкм проводят с помо- щью Объективной линейки (объект-микрометра) для данного увеличе- на микроскопа. Объективный микрометр представляет собой металлическую пла- тинку с отверстием в центре, в которое вставлено стекло. На стекло занесена линейка длиной 1 мм, которая разделена на 100 частей, так что дно деление ее соответствует 0.01 мм или 10 мкм (рис. 19). Для определения цены деления окулярной линейки на столик мик- эскопа вместо препарата помещают объективный микрометр и при ма- зи увеличении фокусируют изображение линейки. Затем перемещают шейку объект-микрометра в центр поля зрения и меняют объектив на л, при котором измеряли размер клеток. Перемещая столик микроско- ; и поворачивая окуляр, устанавливают микрометры так, чтобы их салы были параллельны и одна перекрывала другую (рис. 20). Совме-
45 щают одно из делений шкалы окулярного и объективного микрометров и находят следующее их совмещение. Устанавливают, какую часть деле- ния объективного микрометра составляет одно деление окулярной ли- нейки и умножают полученное число на 10. Таким образом получают цену деления окулярного микрометра в микрометрах для данного увели- чения микроскопа: и Юмкм а --------— «! где а — цена деления окуляр-микрометра, мкм; п - число делений объект- микрометра; п, — число делений окуляр-микрометра; 10 мкм — цена одно- го деления объект-микрометра Ряс. 19, Объективный микрометр Рис. 20. Определение цены деления Определение цены деления окуляр-микрометра проводят в трех- кратной повторности, каждый раз сбивая совмещения и устанавливая новые, результаты определений записывают в таблицу: Результаты определений Объектив; окуляр Цена деления (каждого iB трех определении), мкм Цена деления (среднее значение), мкм Юх; 7х 3[ &СР 40х: Юх й[ aa а3 аср 90х:!5к 3[ 2*3 Ау
6 3. Расчет размеров клеток в мкм. Зная, скольким делениям окудяр- гой линейки соответствует длина и ширина изучаемого объекта, ум ко- кают цену деления окуляр-микрометра на эти числа; У = №\~а, де N - длина или ширина клетки, мкм; /V( - число делений окуляр- ликрометра; а - цена деления окуляр-микрометра. Размеры клеток микроорганизмов в конечном счете записывают по форме: Hi) мкм, где /V и /Vt - минимальное и максимальное значения длины клетки, и и *?[ - минимальное и максимальное значение ширины клетки, мкм - еди- ница измерения размеров клеток, например; (2-3)(0,1-1.0). Результаты определения размеров клеток микроорганизмов вносят в твблицу: Результаты определения размеров клеток Культура микроор- ганизма 3 Число изме- ряемых клеток Длина ^Лирина Размер кле- ток, записан- ный по форме (М-ЦНп-п,) в делениях окулярной линейки в мкм в делениях окулярной линейки в мкм Задание 1. Определить размеры клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae или гриба Endomyces magnusii. препарат «раздавленной капли» (запа- рафиненный). Объектив 40х, либо ЮОх, МИ (масляная иммерсия). 2. Определить размеры бактерий Azotobacter chroococcum. Препарат фиксированных клеток. Объектив ЮОх, МИ. Работа 8. Окраска клеток по Граму Для дифференциации микробных клеток, различающихся химиче- ским составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод окраски - окраска по Граму (по имени датского ученого). ( При окраске по Граму все бактерии делятся на две группы: грампо- ложительные и грамотрицательные, • У грамположительных бактерий (Г+) толщина клеточной стенки составляет 15-80 нм, состоит из пептидогликана (от 60-90%), рас пол жендых в несколько слоев белка (около 1%) и липидов (около 1%). Об- наружена! полимеры особого типа - тейхоевые кислоты, ковалентно
47 связанные с пептидогликаном. Большое содержание пептидогликана обеспечивает при окраске по Граму образование комплекса с генциано- вым фиолетовым и йодом, устойчивого к спирту; вследствие чего они окрашены в сиие-фиолеговый цвет. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий 10—J5 нм, но структура ее значительно сложнее, чем у грамположительных бак- терий " Основу ее составляют ориентированные внутренние липиды (J0-20%), которые с поверхностно расположенными полисахаридами образуют липополисахаридный слой. На поверхности клеточной стенки мозаично расположены белки и полисахариды. Пептидогликан пред- ставлен одним сдоем толщиной всего 2-3 нм (около 5-10%), лежит под липополисахаридным слоем и плотно покрывает протопласт. Из-за большого содержания липидов клеточная стенка грамотрицательных бактерий при окраске по Граму образует с генциановым фиолетовым и йодом комплекс, разрушаемый при обработке спиртом, вследствие чего клетки обесцвечиваются. Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму связано с различиями в структуре и химическом составе клеточной стенки бактерий. ‘^ДГграмположительным микроорганизмам относятся кокки, бацил- лы (спорообразующне палочки), актиномицеты, микобактерии, клост- ридиальные бактерии, дрожжи. К грамотрицательным микроорганизмам относятся: бактерии (не- спорообразующие палочки! спириллы, сальмонеллы, E.coli, псевдомо- нады, азотбактер, вибрионы^ Имеются грамвариабельные микроорганизмы, отношение которых к окраске по Граму меняется на определенных этапах их жизненного цикла. Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста, для окраски по Граму используют клетки молодой культу- ры, чаще всего односуточной. Для сравнения одновременно с опреде- ляемым объектом целесообразно окрашивать клетки микроорганизмов, отношение которых к окраске по Граму известно (контронь). Окраску по Граму осуществляют следующим образом: 1- Готовят ца предметном стекле три мазка культуры микроорга- низмов. в центре — мазок исследуемой культуры, слева и справа - мазки контрольных микроорганизмов (рис. 21). Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки равномерно были рас- пределены по поверхности стерла и не образовывали скоплений, так как от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания.
48 Рис. 21. Расположение мазков на предметном стекле при окраске по Граму Высушивают мазки на воздухе, фиксируют нал пламенем горелки. 2. Окрашивают мазки карболовым генциа новым фиолетовым. На мазки наносят достаточное количество красителя, выдерживают 1-2 мин, краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором Люголя до почернения (приблизительно 1-2 мин). 3. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0,5-1 Мин I (строго!) 96% этиловым спиртом или путем погружения в стаканчик Со спиртом, или путем нанесения спирта на мазки (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания; при недостаточ- ной обработке все бактерии сохраняют окрашивание, при чрезмерной — Обесцвечиваются). 4. Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1 -2 мин водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, вы- । сушивают фильтровальной бумагой. 5. Микроскоп нруют препарат с иммерсионной системой. Грампо- । ложительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, гра- , мотрицательные - в красный или розовый цвет фуксина (цвет дополни- тельного красителя). Задание Провести окраску по Граму бактерий Bacillus subtil is, Pseudornonas aeruginosa, Micrococcus lactis, Proteus vulgaris (по указанию преподава- теля), используя в качестве контроля грамотри нательные бактерии Es- cherichia coli и гр а м положительные бактерии Sarcina flava. Работа 9. Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов (по Крегенсену) Метод основан на разрушении клеток грам отрицательных бакте- рий в щелочной среде н определения свободной ДНК. На предметное стекло наносят каплю 3 %-ного раствора КОН, в которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии (24-часо- вая культура со скошенного агара) и хорошо перемешивают петлей,
49 Чепез 5-10 с при передвижении петли по стеклу при пояожитель- ‘ ной реакции в результате тестирования грамотрицательных бактерий образуется слизистый след длиной 1-2 см. Если слизь ре образуется, то реакция отрицательная, тогда тестируется грам положительная культура. Работа Ю. Окраска спор При неблагоприятных условиях для роста, при лимитировании роста питательными веществами некоторые бактерии образуют покоя- щиеся клетки особого рода - споры (эндоспоры). К образованию эндоспор способна только небольшая группа бак- терий, это в основном палочковидные грамположительные бактерии (р. Bacillus, р. Clostridium, р. Desulfotomacnlum). Споры не являются обязательной стадией жизненного цикла этих бактерий. Спорообразова- ние (споруляция) - один из сложнейших процессов дифференцировки бактериальной клетки и сопровождается сложными мяртблическими процессами. При автолизе материнской клетки спррьГ'ЪС’вобождаютСЯ. Зрелые споры не проявляют никакой метаболической активности, но в "Течение многих лет сохраняют потенциальную способное г к к прораста- нию и развитию в вегетативные клетки, Они чрезвычайно устойчивы к воздействию высокой температуры, что обусловлено низким содержа- нием воды (около 15%), а также к разного рода излучений и химических веществ, что, с одной стороны, определяет их повсеместное распро- странение в различных природных средах, а с другой стороны, затруд- няет борьбу со спорообразующими патогенными бактериями. При микроскопическом исследовании споры видим благодаря сво- ему высокому показателю преломления, характерному для обезвожен- ного белка, поэтому их легко отличить от вегетативных клеток при про- смотре в микроскоп. Споры различных бактерий отличаются по форме, размеру и расположению в клетке. При светлопольной микроскопии споры выявляются в виде темных включений. При наблюдении с фазо- во-контрастным устройством споры имеют вид светлых включений на фоне темных клеток. Более надежный способ обнаружения спор заключается в диффе- ренциальной окраске клеток и спор, основанной на их различной спо- собности окрашиваться красителем и удерживать его при обработке водой или кислотой. Окраска спор по методу Циля: I. Подготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, обрабатывают 5 %-ным рас- твором хромовой кислоты в течение 5-1Й мин и промывают водой.
50 2. Окрашивают карболовым фуксином Циля при одновременном осторожном нагревании в течение 2-3 мин. Для этого предметное стек- ло с одного конца берут пинцетом и нагревают над пламенем горелки до появления паров (но не до кипения). По мере испарения красителя необходимо доливать его по каплям, не допуская подсыхания. Промы- вают препарат водой. Микробные клетки остаются окрашенными в красный цвет. 3. Обесцвечивают препарат 1 %-ным раствором серной кислоты в течение 10—15 с, немедленно промывают препарат водой (споры остают- ся окрашенными в красный цвет, а микробные клетки обесцвечиваются). 4. Дополнительно окрашивают препарат метиленовым синим около 20 мин. Промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании микробные клетки должны быть синими, споры красными, фон —бесцветный. Задание Провести окраску спор бактерий Bacillus subtiiis, В. subtilis van mesentericus, Bacillus mycoides (по выбору); аскоспор дрожжей Sac- charomyces cerevisiae по методу Циля. Промикроскопировать, объектив ) 0.0х, МИ, зарисовать. Работа 11. Окраска капсул На клеточных стенках многих бактерий наслаиваются снаружи раз- ной толщины слои материала в большинстве случаев из полисахаридов с: высоким содержанием воды - это капсулы и слизь. Капсулы имеют упо- рядоченное фибриллярное строение с расположением фибрилл вдоль клеточной стенки или перпендикулярно к ней. В зависимости от толщины и строения различают микро-, макро- капсулы и слизистые чехлы. Капсулы й слизи не имеют жизненно важ- ного значения для бактерии, но присутствие капсул часто обеспечивает более высокую степень их выживания при неблагоприятных условиях, большую резистентность к некоторым патогенным бактериям и фагоци- тозу, повышает их вирулентность. Наличие капсул у микроорганизмов является непостоянным при- знаком. Образование капсул зависит от условий внешней среды, состава питательной среды, возраста культуры и др. Капсулы имеют консистенцию геля и плохо видны при микро- скопировании. Для выявления капсул применяют негативные методы Окраски.
51 Окраска капсул по методу Омелянского Наносят каплю карболового фуксина Циля и каплю воды на пред- метное стекло. Помешают в каплю красителя исследуемую культуру бактерий и выдерживают 2-3 мин. Добавляют каплю жидкой черной туШ1< или Ю %-ного водного раствора нигрозина и тщательно переме- шивают. Накрывают покровным стеклом и просматривают с объекти- вом 40х либо размазывают суспензию по стеклу, высушивают на возду- хе и микроскопируют с иммерсией. Красители не проникают в капсулу, поэтому бесцветная капсула хорошо видна на обшем темном фоне препарата и окрашенных в крас- ный цвет клеток бактерий- Задание Провести окраску капсул Azotobacter chroococcum. Промикроско- пмроаать. Объектив 40х и ЮОх, МИ. Зарисовать. Работа 12. Окраска инутриплаэматических включений В процессе жизнедеятельности микроорганизмов в цитоплазме кле- ток могут формироваться морфологические образования^ представляю- щие либо продукты обмена клетки, либо запасные питательные вещест- ва. Включения различны по своей химической природе. Это могут быть жироподобные вещества, полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза), серополифосфаты (волютин), кристаллы щавелевой кислоты и др. Они не являются постоянными компонентами клетки, они образуются в зави- симости от условий культивирования, возраста культуры и могут ис- пользоваться в метаболизме клетки. Клеточные включения могут выявляться цитохимическими мето- дами. Окраска полисахаридов (гликогена и гранулезы) I На предметное стекло наносят небольшую кашпо микробной суспензии, добавляют каплю концентрированного раствора Люголя и выдерживают Ю-15 мин при комнатной температуре. 2. Накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости и микроскопируют с сухой системой либо с иммерсией. Гранулы крахмалоподобных веществ (гранулеза) окрашены в си- ним, а гранулы гликогеноподобных веществ (крахмал) - в красновато- коричневый цвет. Окрашивание гликогена происходит в кислой среде, поэтому перед выявлением в клетках гликогена среду, в которой выращивали микроорга-
52 низмы, подкисляют либо на предметное стекло вместо воды наносят кап- лю 0,5 %-ного раствора НС! и в ней эмульгируют исследуемую культуру. Окраска жироподобных веществ 1. Наносят каплю густой микробной взвеси на предметное стекло. Добавляют каплю формалина (40 %-ного), либо 5 %-ного раствора НС] и выдерживают 5 мин (формалин убивает клетку и разрыхляет ее оболочку). 2. Добавляют каплю метиленового Синего (1:10 либо 1:40) и вы- держивают 10 мин. 3. Добавляют каплю концентрированного раствора Судана (111) в 90 %-ном этаноле и выдерживают 5 мин. Накрывают покровным стек- лом. Микро с ко пируют с сухой или иммерсионной системой. Клетки окрашены в синий, включения жира - в розово-оранжевый цвет. Окраска полифосфатов по Омслянскому 1. Готовят мазок на предметном стекле, высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Заливают препарат карболовым фук- сином Циля на 0,5-1,0 мин. 2. Сливают краситель, промывают препарат водой и обесцвечивают 20-30 с 1 %-ном раствором серной кислоты. Сливают кислоту, промы- вают препарат водой и дополнительно окрашивают метиленовым синим (1:40) в течение 20-30 с. Промывают препарат водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с иммерсионной системой. Волютин окрашен в красный, а цитоплазма - в синий цвет. Задание 1. Провести окраску включений гликогена в клетках дрожжей Saccha- romyces cerevisiae и др ож же и сдобного гриба Endomyces rnagnusii (по выбору) и гранулезы в клетках Bacillus mycoides. Промикро- скопировать. Объектив ЮОх, МИ. Зарисовать, 2. Провести окраску липидных веществ в клетках дрожжей. Промик- роскоп ировать. Объектив ЮОх. Зарисовать. 3. Провести окраску волютина в клетках дрожжей. Промикроскопи- рбвать. Объектив ЮОх, МИ. Зарисовать. Работа 13. Выявление живых и мертвых клеток грибов Метод выявления живых и мертвых клеток дрожжей и грибов ос- нован на различной проницаемости красителя в клетки, характеризую- щейся различным физиологическим составом. Выявление живых и мертвых клеток грибов проводят на витальных (прижизненных) препа-
53 патах с помощью метиленового синего. Для этого на предметное стекло в каплю микробной суспензии вносят кайлю красителя метиленового синего выдерживают не более одной минуты, накрывают покровным стеклом оттягивают избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют в проходящем свете. Живые клетки, не пр о пускающие краситель, не окрашены, мертвые клетки синего цвета. Задание Провести выявление живых и мертвых клеток пятисуточной куль- туры дрожжей с помощью метиленового синего. Про микроскоп кровать. Объектив 40х. Зарисовать. _ Тема 4. Питательные среды. Техника посевов К микроорганизмов. Выделение чистых К культур В любой биологической системе рост может быть определен как согласованное увеличение количества всех химических компонентов, как увеличение количества живого вещества. V многоклеточных орга- низмов в процессе роста увеличиваются размеры тела, у одноклеточных - растет число клеток. Рост микроорганизмов возможен, если в окру- жающей среде присутствуют все необходимые питательные вещества для осуществления конструктивных и энергетических процессов клетки, источники углерода, азота, зольных элементов и микроэлементов. Большое разнообразие метаболических процессов в клетках мик- роорганизмов определяет различия в их потребностях в элементах пи- тания. Культивированием микроорганизмов называют их выращивание да искусственных питательных средах, Работа 14. Питательные среды. Стерилизация питательных, сред и посуды В микробиологической практике для выращивания микроорганиз- мов используют разнообразные питательные среды, которые по составу подразделяют на естественные или натуральные полусинтетические и синтетические среды. Натуральные среды состоят из продуктов животного и расти- тельного происхождения - мяса, молока, картофеля, моркови ит. д. ри.мерамп натуральных сред являются:
54 - мясо-пептонный бульон, состоящий из экстракта мяса (500 г мяса на I л воды), 0,5% NaCf и 1% пептона (продуктов неполного раз- ложения белка); - неохмеленное пивное сусло, приготовляемое на основе солода (про- росших зерен ячменя), гидролизованного до сахаров; - дрожжевая среда, состоящая из экстракта дрожжей (7-Ю г сухих дрожжей па 1 я воды), к которому добавляют углеводы (1-2%), ми- неральные соли К2НРО4 (0,1%) и NaCl (0,5%); - картофельная среда, которая готовится путем отвара картофеля (200 г картофеля на 1 л воды) и др. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорга- низмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста. Полусннтетические среды в своем составе наряду с соединения- ми известной химической природы содержат вещества неопределенного состава. К полусинтетическим средам относят мясо-пептонный бульон с глюкозой и фосфорнокислым калием, картофельную среду с глюкозой и пептоном, а также средь: известного состава с добавкой различных фак- торов роста (гидролизата казеина, дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта и т. д.). Синтетические среды - это среды, в состав которых входят из- вестные химические соединения в определенных концентрациях. Например, состав среды Чапека для культивирования грибов сле- дующий: глюкоза - 30 г; азотнокислый натрий - 2 г; фосфорнокислый (однозамещепный) калий - 1 г; сернокислый магний - 0,5 г; хлористый калий 0,5 г; сернокислое железо - 0,01 г; вода - 1000 мл, По назначению различают элективные и дифференциально-диагно- стические (индикаторные) среды. Элективные среды обеспечияают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов и менее пригодны (или со- всем непригодны) для развития других. Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды по- зволяют достаточно быстро отличить одни виды микроорганизмов оз других. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы он позво- лил четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида. По физическому состоянию различают жидкие, плотные и сыпу- чие среды. Жидкие среды применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов
55 " а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, ^^о°развиваютихся на плотных средах. Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии, К . Л,и^тгя например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, НИМ г пропитанные питательным раствором, Плотные среды используют для выделения чистых культур (полу- чение изолированных колоний), диагностических целей (установление морфологии колоний, особенностей роста на скошенном агаре и др.), для хранения культур, количественного учета микроорганизмов, опре- деления их антагонистических свойств и в ряде других случаев. Уплотнение сред осуществляют с помощью агар-агара, желатины и кремнекислого геля (силикагеля). Наиболее часто в микробиологической практике для уплотнения сред используется агар-агар. Это сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. В воде агар-агар образует гели, плавящиеся при 100° С. затверде- вающие при температуре около 40° С. Чаше всего агар-агар добавляют к средам в количестве 1,5-2%. Среду с внесенным в нее агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного расплавления агара. Менее широко используется желатина - белок, получаемый при вываривании костей и хрящей животных. Желатину добавляют к жид- ким средам в количестве 10-15%. Образуемый желатиновый гель пла- вится при 23-26° С. При специальных исследованиях используется кремнекислый гель (силикагель) - вещество неорганической природы и его используют как твердую основу для синтетических сред. Стерилизация - один из важных и необходимых приемов в мик- робиологической технике. Слово «стерилизация» в переводе с латин- ского (sterihs) означает обеспложивание. В микробиологии под стерили- зацией понимают гибель всех живых микроорганизмов. В микробиоло- гической практике стерилизуют питательные среды, посуду, инстру- менты и другие необходимые материалы, чтобы не допустить развития посторонней микрофлоры. Стерилизация питательных сред и посуды - обязательный момент в ра оте при выполнении всех задач практ икума. HHt -ществуют различные методы стерилизации: физический, меха- 1еский и химический. Целесообразность применения каждого из них ЖщнДеЛЯеТСЯ ос°бепностямй материала, подлежащего стерилизации, его ческими свойствами, химическим составом, целью исследования
56 1. физический метод стерилизации (стерилизация нагреванием) наиболее часто применяется в микробиологической практике. Стерилизация прокаливанием на пламени горелки. Этим способом стерилизуют мелкие лабораторные инструменты, препаровальные иглы бактериологические петли, стеклянные палочки, пинцеты и т. д. (После прокаливания охлажденные предметы нельзя класть на стол; их следует держать так, чтобы они не касались других предметов). Можно стерилизацию мелких инструментов (иглы; шприцы и т. д.) проводить кипячением в стерилизаторах в течение 30 мин. Стерилизация сухим жаром производится в эле ктросущ ильном шкафу. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду - пипетки, чаш- ки Петри, пробирки, шпатели и т. д., завернутые в бумажные салфетки. Стерилизация в сушильных шкафах осуществляется при 165-180сС в течение 2 ч. Выше 180° С температуру поднимать не следует, так как ватные пробки и бумага начинают обугливаться. При указанной темпе- ратуре погибают все вегетативные клетки микроорганизмов и споры. Простерилизованную посуду вынимают из шкафа после того, кан- она остынет до 50—70“ С, так как при резком охлаждении может трес- нуть стекло и нарушиться стерильность материала. Стерилизация автоклавированием применяется, главным образом, для стерилизации питательных сред. Этот способ основан на прогрева- нии насыщенным паром при давлении выше атмосферного, т. е. при температуре выше 100° С и осуществляется в специальных аппаратах - автоклавах. Таблица 2. Температура насыщенного пара при различных давлениях Давление, кПа Температура, QC нормальное добавочное 100 — 100 J00 50 112 100 100 |21 100 150 128 100 200 134 Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает надежность стерилизации - гибель вегетативных клеток и спор микро- организмов. Автоклавирование проводят при различных режимах, при дополнительном давлении 50, 100, 200 кПа (табл. 2).
57 бывают различной конструкции, но основанные на од- Автоклавы металличеекий двустенный котел, способный вы- нем прИНЦд^окое давление. Внутренняя часть котла - стерилизацион- держивать КОТОрую помешают стерилизуемый материал, окружена ная камеРу„ камерой, имеющей кран для выхода воздуха ц пара. При водопар & вОПОГ1аровую камеру наливают воду (лучше днстилли- s я0 необходимого уровня. Внутрь стерилизационной камеры ^специальную подставку помещают стерилизуемый материал. Пред- меты следует размещать не слишком плотно, так как пар должен сво- бодно проходить между ними. Крышка автоклава герметически закры- вается (рис. 22). Рис. 22. Схема автоклава: ? - стерилизационная камера; 2 - кран для выхода воздуха; 3 - манометр; 4 - чрейохрпнптелниш клапан; 5 - вадопаровая камера; 6 — воронка для заполнения автоклава водой; 7 — отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру; 8 - крышка автоклава; 9 — подставка для размещения стерилизуем<ях материалов Автоклав включается в электрическую сеть. Когда весь воздух бу- дет вытеснен парами воды, пар выпускают еще 15-20 мин. За давлением следят по манометру, Большинство питательных сред (мясо-пептОнный бульон, мясо- пептонный агар), а также водопровод чую воду стерилизуют в автоклаве 150 ддвлении 100 кПа в течение 20-30 мин; картофельную среду при Хав течение 30 мин; среды, содержащие сахара и витамины (сус-
58 59 ло, соки и т. д.), при 50 кПа в течение 20—30 мин; молоко, дрожжевой автолизат и среды с желатиной при 50 кПа в течение 15 мин. Стерилизация текучим паром применяется для сред, содержащих вещества, изменяющиеся под действием температуры выше 100° с. Ее осуществляют в автоклаве с пезавинченной крышкой при открытом кране для выпуска пара или специальном аппарате. Текучим паром производят дробную стерилизацию, которая про- водится при 100° С в течение 3-х дней подряд по 30-40 мин ежедневно. В промежутках между стерилизацией питательные среды оставляют при 18—20° С или выдерживают в термостате для того, чтобы споры, остав- шиеся после кипячения, могли прорасти в вегетативные клетки, которые уничтожают при следующем нагревании. Текучим паром проводят также пастеризацию и тиндализацию. Пастеризация — неполная стерилизация производится нагреванием до 50-60° С 15-30 мин или до 70-80° С 5—10 мин с последующим охла- ждением до 10-] 1° С. Применяется для инактивации вегетативных кле- ток микроорганизмов, бактерий в жидкостях, невыдерживающих высо- кой температуры: (молоко, пиво, соки и т. п.). Так как при пастеризации споровые формы выживают, то для того чтобы споры не проросли, пас- теризованные продукты хранятся ца холоду. Тгшдапизация — дробная пастеризация, которая осуществляется не- сколько раз (6—7 дней) с промежутками в 24 ч, когда стерилизуемый материал выдерживают при 18—20° С для прорастания спор в вегетатив- ные клетки, которые уничтожаются при последующей пастеризации. Стерилизация лучистой энергией. Действие ультрафиолетовых лу- чей находит широкое использование для стерилизации воздуха а лабо- раторных помещениях, в цехах промышленных предприятий. Для обез- зараживания воздуха используют бактерицидные лампы. Ввиду воз- можного неблагоприятного действия ультрафиолетовых лучей на орга- низм человека бактерицидные лампы включают только при отсутствии людей в помещении. 2. Химический метод стерилизации применяется при дезинфек- ции. Дезинфекция - это способ уничтожения микроорганизмов при по- мощи сильнодействующих химических веществ или так называемых антисептиков. Гибель микроорганизмов при дезинфекции происходит в основном в результвте гидролиза компонентов клетки, коагуляции бел- ков, инактивации клеточных ферментов. К группе антисептиков относятся неорганические и органические вещества. Из неорганических антисептиков широко используются неор- Г" ганические кислоты, щелочи и соли (0.1-6 2’/Й ш™,,, и> 10-20%. ю «Р- левый спирты, альдегиды, органические кисао^, « ~ » пути- р^пюр ф«о». о.2-о,5% р£иор (з-5% на). В лабораторной практике методы дезинфекции Z. фоРмал1{- обезвреживания рабочего стола, рук, камер для посевов Р Ют дая 3. Механический метод стерилизации применяется в тех слу- чаях, когда субстраты не выдерживают нагревания и воздействия хи- мических вешеств (белки, сыворотки, антибиотики, витамины, лету- чие вещества и др.). Стерилизация фильтрованием с помощью мембранных фильтров. Мембранные фильтры готовят из коллодия, ацетата целлюлозы и др. материалов. Они представляют собой диски толщиной около 0,1 мм диаметром 35 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются №№ 1,2, 3,4 и 5: | № фильтра Средний диаметр пор, мкм I 0,35 2 0,5 3 0.7 4 0,9 5 I.2 Для стерилизации следует использовать фильтр № 1. Стерилизация фильтрованием с помощью фильтра Зейтца. Фильтры Зейтца представляют плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. Фильтр закрепляется в специальном держателе, который вставля- ется с помощью резиновой пробки в приемник фильтрата - колбу Бун- зена. Фильтр Зейтца автоклавируют в собранном виде. Перед стерили- зацией фильтр с держателем, резиновой пробкой и колбой-приемником заворачивают в бумагу. В отводную трубку, которая будет присоедине- на к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон. j Работа 15. Подготовка посуды и сред к стерилизации Посуду черед стерилизацией тщательно моют, сушат и завертывают 8 бумагу для сохранения стерильности после прогревания. Каждую пипетку заворачивают отдельно в длинные полоски бума- пи, шириной 4-5 см. В концы пипеток, которые берут в рот, предвари-
60 тельно вставляют ватные тампоны. Обмотку начинают с противопо- ложного компа постепенным движением бумаги по спирали и оканчи- вают у конца с тампоном. Бумага должна плотно охватывать пипетку Завернутые пипетки для предохранения бумаги от загрязнения и разры- вов заворачивают по несколько штук вместе или помещают в специаль- ные металлические или картонные пеналы. Шпатели обертывают по отдельности аналогично пипеткам, ис- пользуя для обмотки полоски бумаги большей ширины. Чашки Петри завертывают вместе по 2—4 штуки. Колбы, пробирки и др. сосуды закрывают ватными пробками, а сверху бумажными салфетками. Задание I. Познакомиться с устройствами, используемыми для стерилизации посуды, сред, воздуха и т- Д. (автоклав, сушильный шкаф, фильтры, бактерицидные лампы). 2. Подготовить для стерилизации чашки Петри, пипетки, шпатели. 3. Подготовить для стерилизации эрленмейеровские колбочки (емк. 100 мл) с жидкой питательной средой; закрыть ватной пробкой, бумажной салфеткой и завязать. 4. Подготовить к стерилизации качалочные колбы со средой для культивирования углеводородокисляюших дрожжей: закрыть кол- бы ватно-марлевой салфеткой, накрыть бумажной салфеткой и за- вязать. 5. Подготовить для стерилизации пробирки с водопроводной во- дой (9 мл). Работа 16. Техника посева и пересева культур микроорганизмов В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на твер- дых и жидких средах в пробирках, колбах или в чашках Петри. -.J Посевом в микробиологии называют внесение клеток микроорга- низмов (посевного материала - инокулята) в стерильные среды. 7 Персеев - это перенос выращенной культуры микроорганизмов на питательной среде на другую свежую питательную среду. Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении оп- ределенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, что- бы прел охранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду' исследуемыми культурами микроорганизмов.
61 I Пересев микроорганизмов, выращенных ни твердой среде в пробирках, в другие пробирки со средой. На пробирке со свежей питательной средой разборчиво подписы- вают название микроорганизма и дату посева. Надписи делают чернилами по стеклу или стеклографом. __ за?кигают горелку. Посевы проводят над пламенем горелки, чтобы теплый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из ок- ружающего воздуха и отчасти их уничтожал. - Берут в правую руку бактериологическую петлю, с помощью кото- рой осуществляют посев (петлю держат как карандаш). - Стерилизуют бактериологическую петлю в пламени горелки, про- каливая проволоку докрасна, а одновременно обжигают примы- кающую к петле часть держателя, который будет вводиться в про- бирку с культурой микроорганизмов. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была раскалена. — Берут в левую руку две пробирки - одну со стерильной средой (дальше от себя), другую - с культурой микроорганизмов (ближе к себе). - Не выпуская бактериологической петли в правой руке, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружные концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть пробки на стол нельзя. - Слегка обжигают в пламени горелки края открытых пробирок. - Вводят в пробирку с культурой микроорганизмов петлю. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количество микробной массы. Вынимают петлю и вводят ее в пробирку со стерильной питатель- ной средой, избегая прикосновения со стенкам и пробирки. Проводят петлей от дна вверх зигзагообразную или прямую черту- штрих, слегка касаясь поверхности агара. Обжигают ватные пробки и края пробирок одновременно в пламе- ни и закрывают обе пробирки. Обжигают петлю в пламени.
62 2. Пересев культур микроорганизмов, выращенных в жидкой среде - Из стерильной бумаги зыннмают градуированную стерильную пи- петку за верхний конец, берут пипетку средним и большим паль- цами правой руки, не касаясь поверхности той части пипетки, ко- торая будет вводиться в сосуд с жидкой средой. - Берут в левую руку пробирку (или колбу) с культурой микроорга- низмов, выращенной в жидкой среде, и держат ее в вертикальном положении, чтобы не замочить пробку, - Открывают пробку, соблюдая все правила стерильности, описан- ные выше, и вводят пипетку в пробирку. - Набирают а пипетку суспензию микроорганизмов, закрывают пробкой пробирку (или колбу), вносят определенное количество суспензии в свежую стерильную питательную среду, соблюдая уже описанные правила предосторожности, - Пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором (0,5-3% водным раствором хлорамина или 3-5% водным раствором фенола), не касаясь ею окружающих предметов. Задание I. Подготовить скошенный агар (косяки) с МПА и сусло-агаром для культивирования микроорганизмов. 2. Провести посев культур микроорганизмов (бактерий, дрожжей и грибов) из пробирки в пробирку с помощью бактериологической петли. 3. Провести пересев культур бактерий и дрожжей, выращенных на жидких питательных средах, в стерильные питательные среды. 3. Посев на плотные среды в чашки Петри Посев в чашки Петри проводится несколькими способами. Поверхностный способ посева: • — Готовят в чашках Петри твердые пластинки из питательной средь;. Стерильную твердую питательную среду расплавляют на водяной бане в пробирке или колбе и охлаждают до 50° С, - Вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизова- лись, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность. - Берут пробирку или колбу с охлажденной до 50° С питательной средой, вынимают ватную пробку, обжигают на пламени горелки края пробирки и держат ее в наклонном положении. - Приоткрывают крыщку чашки Петри левой рукой, а правой рукой наливают среду на дно чашки Петря, заполняя всю ее поверхность.
63 ^Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды, за- ** тем ставят в термостат на 15-20 мин для подсушивания. На твердую среду наносят петлей или пипеткой каплю посевного материала и затем равномерно распределяют его по поверхности, пользуясь стерильным шпателем (изогнутая стеклянная палочка). Шпатель вынимают из бумаги и берут в правую руку. _ Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой и вносят в нее шпатель. _ размазывают каплю посевного материала шпателем вращатель- ными движениями по поверхности агаровой пластинки (надавли- вать шпателем на твердую среду не следует, так как можно ее по- вредить). Переносят шпатель в сосуд с дезинфицирующим раствором. В Глубинный сП&ёаблосева; - Приоткрывают стерильную чашку Петри и помешают петлей ил Я пипеткой каплю посевного материала на дно чашки. - Расплавляют агаризованную питательную среду в пробирке или колбе и охлаждают ее до 45-48° С. - Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки и выливают среду в чашку Петри с внесенным посевным материалом, соблюдая правила стерильной работы. - Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола. Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды. - Делают на чашке Петри надпись (число, название микроорганиз- ма). Все посевы, выполненные описанными способами, помещают в термостат для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста. Задание % Подготовить по 3 чашки Петри с МПА и сусло-агаром. Провести посев культуры микроорганизмов (дрожжей и грибов) поверхностным способом в чашки Петри с сусло-араром. Ровести посев бактериальных культур в чашки Петри с МПА глубинным способом.
64 Работа 17. Выделение чистых культур микроорганизмов В микробиологической практике широко используются как чистые культуры микроорганизмов, так и консорциумы. Консорциумы - смешанные или ассоциативные культуры, состоя- щие из 2-х и более микроорганизмов, между которыми существуют раз- личные формы взаимоотношений. Чистой культурой называют культуру, состоящую из Микроорга- низмов одного вида. Чистая культура микроорганизмов, которая являет- ся потомством одной единственной клетки, называется клоном. Загрязненная или инфицирован нал культура - чистая культура, в которую случайно попали посторонние микроорганизмы. Чистые культуры микроорганизмов, как правило, выделяют на по- верхности или внутри твердой питательной среды- С у шествует несколько методов получения чистых культур. Все они основаны па выделении из популяции одной клетки. Метод разбавлении Пастера. Из суспензии, содержащей смесь микроорганизмов, делается ряд последовательных разведении в стериль- ной жидкой питательной среде. С каждым разведением количество мик- роорганизмов. попадающих в пробирку, будет уменьшаться и можно Таким образом получить такие разведения, когда в объеме среды в про- бирке будет находиться только одна клетка, из: которой и разовьется чис- тая культура. Однако зтот метод не всегда дает возможность получить чистую культуру и в настоящее время практически мало используется. Выделение чистой культуры из одной клетки капельным мето- дом. Предварительно подготавливается разведение культуры микроор- ганизма в питательной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле этой среды могли быть единичные клетки. Затем на поверхность сте- рильного стекла с помощью простерилизованногг иглы и стеклянной па- лочки наносят ряды мелких капель среды, содержащей микроорганизмы. Стекло перевертывают и помещают над лункой предметного стек- ла. Края лунки предварительно обмазывают вазелином. Затем все капли просматривают под микроскопом и отмечают те из них, в которых на- ходится только одна клетка. Стекло помешают в чашку Петри, на дне которой находится ув- лажненная фильтровальная бумага, и ставят в термостат; клетка раз- множается, образуя микроскопическую колонию. Полученную колонию снимают стерильной фильтровальной бума- гой, которую держат цростсрилизованным на пламени пинцетом, н пе" реносят в пробирку с питательной средой.
65 Выделение чистой культуры капельным методом используется при те с крупными микроорганизмами (дрожжи, плесени). Ра выделение чистой культуры с помощью микроманипулятора. гт выделения под контролем микроскопа одиночных микробных кле- и ИД посева применяют специально оборудованные микроскопы - т^поманипуляторы. Отдельные микробные клетки в них вылавливают- из висячей микрокапли микропипеткой и микропетлей, перемещае- мыми в поле зрения микроскопа с микронной точностью с помощью системы винтов и рычагов. Наиболее распространен в микробиологической практике метод вЬ(даления чистой культуры с помощью твердых сред (метод Коха). Метод заключается в получении чистой культуры из отдельной ко- лонии, выросшей на твердой питательной среде в результате размноже- ния одной клетки. Метод основан на том, что при нанесении микроорганизмов из по- севного материала на твердую среду отдельные клетки будут закреп- ляться (иммобилизироваться) в определенной точке твердой среды и, размножаясь, давать потомство (клон), представляющее чистую культу- ру микроорганизма. Для получения изолированных колоний на твердой среде иссле- дуемый материал высевают на поверхность твердой питательной среды, наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала. Рассев проводят либо методом истощающего мазка, либо методом истощаю- щего штриха. В первом случае шпателем равномерно распределяют на- несенную каплю по поверхности твердой среды. Тем же шпателем де- лают посев на поверхности второй пластинки и затем третьей, т. е. пе- ренося последовательно на твердую среду клетки микроорганизмов, которые остались на Шпателе. Таким образом, количество микроорга- низмов, вносимых последовательно на пластинки, будет уменьшаться: на вторую - меньше, чем на первую; на третью - еще меньше, чем на вторую И Т. Д. При использовании метода истощающего штриха исследуемый ма- териал наносят петлей в верхнюю часть твердой среды в чашке Петри и аккуратно, зигзагообразно петлей по поверхности чашки (рис. 23). За- тем посев проводят аналогично на второй и третьей чашке. После посева чашки необходимо перевернуть вверх дном и поста- вить в термостат при температуре, благоприятной для данного микроор- ганизма. Инкубируют посевы обычно в термостате в течение 2-3 дней. В ультате на поверхности среды вырастают колонии микроорганизмов.
67 66 Рис. 23. Метод посева зигзагообраз- ной петлей Г Выросшие колонии сначала рассматривают невооруженным ГЛа_ зом, а затем при помощи лупы или при малом увеличении микроскопа. При описании колоний микроорганиз- мов отмечают следующий морфологические и культуральные признаки: Размер колоний - их диаметр в мм (ес- ли колонии не превышают 1 мм, их назы- вают точечными). Форма колоний - округлая, неправиль- ная, мицелевидная, ризоидная, амебовидная складчатая, концентрическая, сложная и др. . Цвет качаний - белый, желтый, розо- вый и т. д. и способность выделять пигмент в среду. Поверхность колоний - гладкая, складчатая, с радиальной или концентриче- ской исчерченностью. шероховатая, бугри- стая и др. Оптические свойства - прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, блестящая, матовая, флуоресцирующая и т. д. Профиль колоний - плоский, слабовыпуклый, сильновыпуклый, во- гнутый, кратерообразный и др. Kpatt колоний - ровный, извилистый, зубчатый, лопастной, волни- стый, неправильный, реснитчатый, нитчатый, ворсинчатый, ветвистый. Консистенция колонии - маслянистая, тестообразная, вязкая, плёнчатая. Для описания колоний из имеющихся чашек Петри берут ту, на ко- торой колонии достаточно изолированы друг от друга. В отобранной чашке выбирают хорошо изолированные и различающиеся внешним видом колонии, которые описывают, указав все характерные признаки их роста. Из отобранных колоний приготавливают препараты, микроскопн- руют для проверки морфологической однородности клеток. При прнго товлении препаратов необходимо соблюдать все правила стерильност (не открывать широко крышку чашки, хорошо просте рил из о ват ь nerJ1^ Далее пересевают культуру из колонии в пробирку со скоШен плотной питательной средой (косяк). Посев проводят следующим образом. 1 . Зажимают пробирку средним пальцем левой руки (скошенная верхность агара должна быть обращена вверх). 2 обжигают петлю. 3 Приоткрывают крышку чашки Петри, берут петлей материал из ь ' колонии и закрывают крышку, 4 Быстро делают посев штрихом по поверхности косого агара, 5 Делают на пробирке надпись, число, номер колонии и др., и ставят посев в термостат, Для выделения чистых культур многих бактерий используют МПА. для дрожжей - сусло-агар. Недостатком этого метода является то, что иногда получаются не чистые, а смешанные культуры. Это является результатом того, что ко- лонии могут образоваться не из одной, а из двух или нескольких клеток попавших в одну точку. Поэтому этот метод выделения чистых культур требует двух- или трехкратного повторения выделения культур из од- ной колонии. Для этого готовят суспензии культур микроорганизмов (йодированных колоний в стерильной водопроводной воде. Из каждой /суспензии стерильной пипеткой делают разведение в стерильной водо- проводной воде (1 капля суспензии на 8-10 мл воды) и взвесь микроор- ганизмов рассевают на поверхность плотной питательной среды в чаш- ки Петри, которые помещают на 3-4 суток в термостат, Через 3—4 суток просматривают выросшие колонии и сверяют их признаки с отмеченными признаками при выделении культуры. Однородность колоний и совпадение признаков с описанными ра- нее свидетельствуют о чистоте культуры. Изолированные колонии рассевают в две пробирки на поверхность скошенной питательной агаризованной среды и помещают в термостат при определенной температуре, благоприятной для данного микроорга- иизма^ на 2—3 суток. Задание Выделить чистые культуры бактерий по методу Коха на среде МПА или сусло-агар из предоставленной суспензии культур микроорганизмов. Тема 5. Методы количественного учета микроорганизмов Работа 18. Методы количественного учета микроорганизмов на твердых средах УЧета^ми^ ” наи®олее распространенный способ количественного кроорганизмов. Сущность метода заключается в высеве опре-
деленного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на TBennw, среду в чашки Петри и последующем подсчете числа выросших кол^ ний. При этом принимают, что каждая колония образуется при размно- жении одной клетки. Этот метод позволяет вести учет только жизнеспособных клеток микроорганизмов. При анализе берут стерильно 1 мл суспензии и по- мещают в 9 мл стерильной водопроводной воды или физиологического раствора (рис. 24), затем последовательно новой пипеткой (!) переносят no I мл в ряд пробирок с 9 мл стерильной водопроводной воды. О® О Рис. 24. Схема приготовления разведенной суспензии микроорганизмов и посева Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате. Из полученньгх разведений, предварительно тщательно перемешан ных, производят высев на поверхность агаровой пластинки в чашки Пе® ри. Посев производят пипеткой обычно по 0,05; 0,1 или 0,2 мл, начиная наибольшего разведения, при этом может применяться для посева стерильная пипетка. Объем внесенной суспензии распределяют по
69 х{10СТи среды стерильным шпателем. Если высев проводят, начиная с ВеГ> тих разведении, то используют новую стерильную пипетку и новый Патель для каждого разведения. Чашки Петри с засеянными средами помещают в термостат при определенной температуре, благоприятной для развития учитываемых микроорганизмов. Подсчет выросших колоний проводят через определенное время росле посева (3-5 суток). Колонии, как правило, считают, не открывая чашки Петри, повернув их кверху дном. Для счета берут те чашки Пет- ой на которых колонии хорошо отделены одна от другой. Каждую от- считанную колонию помечают точкой с йижней стороны чашки Петри чернилами или стеклографом. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Следует иметь в виду, что роли ость метода зависит от числа под- считанных колоний: лучшим разведением считают то, при высеве из которого на плотной питательной среде вырастает от 50 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасы- вают и для расчета количества клеток в исходном субстрате не исполь- зуют. Желательно, чтобы об шее количество подсчитанных колоний при высеве из данного разведения было не менее 300. Зная количество выросших колоний и степень разбавления, легко определить количество микроорганизмов в 1 мл исследуемой суспен- зии, пользуясь формулой: д, _(п±2^Х И где W - количество микроорганизмов в 1 мл суспензии; К - разведение, из которого проведен высев; а - среднее количество колоний на чашке Петри при разведении К: V - объем суспензии, взятый для посева, мл; 2 - критерий при 9% уровне значимости; - среднее квадратичное Jy'a отклонение, равное ±----, п - число повторностей. п Например, если при разведении I: | О5 выросло 85 колоний, количе- бактерий в 1 л исследуемого вещества при объеме суспензии, взя- Для посева, равном 0,1 мл, будет равно 85-105 А- = 85 IО6 =8,5. |О7 + 2о>.
70 71 Причинами ошибок определения могут быть: негомогенное рас- пределение клеток микроорганизмов в объеме жидкости за счет недос- таточной продолжительности взбалтывания пробы, сорбирование мик- роорганизмов на стенке сосудов, ошибки пересчета и др. Наиболее надежные результаты получаются при соблюдении сле- дующих условий: - В разведениях для счета число колоний должно быть от 50 до 150. При большем количестве колоний подсчет становится затрудни- тельным и неточным. — Количество параллельно засеваемых чашек должно быть не менее 2. Задание Провести количественный учет дрожжей по методу Коха, содер- жащихся в суспензии, предоставленной для анализа, Результаты работы оформляют в виде следующей таблицы. Количественный учет дрожжей по методу Коха Разве- дение, К Количество колоний, выросших на чашке Петри Среднее значение - Z> а - - ti Значение „ № И Количество мик- роорганизмов в 1 мл исследуемой суспензии // _("±2<7<тХ Г Повторность л, «2 10м 10~5 . 106 н т. д. - Работа 19. Количественный учет микроорганизмов с помощью счетных камер Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных каме- рах успешно применяют для определения общего количества микроор- ганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях). Известны счетные камеры разных конструкций, принцип устройст- ва которых одинаков (Горяева, Фукс-Розенталя, Петрова-Хауссера, То- ма-Цейса и др.). Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счет- ных камер имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счет- ных камерах проводится учет всех клеток микроорганизмов без их дифференциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные ка- меры могут быть использованы лишь для подсчета относительно круп- ных объектов - клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопи- руемых при объективе 8-40х. Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные плоские площадки (рис. 25. а). Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка (рИс. 25, а). Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней (рис. 25, б).Эти площадки служат для притирания покровного стекла. Рис, 25. Счетная камера Горяева: а - вид сверху, 6 - вид сбоку, h — высота камеры: в - вид при ма- лом увеличении микроскопа Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, по-разному сгруппированных (рис. 25, в). Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат (ABCD, рцс. 25, в), сторона которого равна 1/20 мм, плошадь его - (/400 ммг, а объем при высоте камеры )/|0 мм — 1/4000 мм или Н4000000 мл. Так называемый большой квадрат ABCD, состоит из |6 маяых квадратиков.
41 72 73 Камера Горяева имеет площадь 9 мм2, объем камеры - 9 мм3 и раз- бита на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом ряду) (рис. 25, в). Каплю взвеси наносят иа сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна равно- мерно без пузырьков распределиться по всей сетке, не выступая в жело- бок между стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно при- тирают к боковым площадкам камеры до появления ньютоновских колец. Камеру с исследуемым материалом помещают на предметный столик микроскопа и микроскопируют с объективом 10-40х (в поле зрения долж- ны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов). Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, разме- шенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей ча- стью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на 2-х из 4-х границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают. Находят среднее количество клеток в одном квадратике. Допустим, в 5 больших квадратах (80 малых) -240 клеток, тогда в I малом квадра- тике среднее количество клеток 240:80 = 3. Пересчет на 1 мл суспензии с учетом разведения производят по формуле: hS где У - число клеток в I мл суспензии; а - среднее число клеток в ма- лом квадрате; h — глубина камеры, мм; S — площадь малого квадрата. мм2; К-разведение исходной суспензии; 1000- коэффициент пересчета мм3 в мл (1 мл = 1000 мм3). Для проверки правильности проводимых подсчетов и статистиче- ской обработки полученных данных по методу Стьюденса готовят трех- четырехкратные разведения взвеси или суспензии и из них делают трех- или пятикратные повторности счета клеток. При 95% уровне значимости Р = 0,95, формула (2) приобретает вид: (п±2сг?)1000 hS J > a где 2 - критерий; <т- = +-- , где п - число квадратов сетки; а - об- п щее число киеток в малых квадратах. Задание Провести количественный учет клеток дрожжей, содержа пт их с я в предоставленной суспензии. Подсчет клеток дрожжей проводить в исходной (неразбавленной) суспензии и суспензии, разбавленной в 2, 5 и 10 раз в трехкратной по- вторности. Подсчет клеток дрожжей в счетной камере Горяева проводить при объективе 20х или 40х. L Результаты работы оформляют в виде следующей таблицы. Количественный учет микроорганизмов в камере Горяева Раз- веде- ние По- втор- ность Количество клеток микро- организмов в большом квадрате счетной камеры Общее число клеток в ма- лых квадр. Сред- нее число кле- ток Количест- во клеток в исходном образце 1 2 3 4 5 и др. 0 1 2 Зи др. 1 1 2 3 и др, Работа 20. Количественный учет микроорганизмов на фиксированных препаратах Сущность метода заключается в том, что в определенном объеме исследуемой суспензии подсчитывают количество клеток микроорга- низмов непосредственно под микроскопом. Использование фиксиро- ванных мазков дает возможность сохранять препараты длительный срок и проводить подсчет не по ходу опыта, а в другое, удобное для исследо- вателя время. Для проведения количественного учета микроорганизмов готовят фиксированный препарат. Для этого определенный объем исследуемой суспензии (обычно 0,02-0,05 мл) наносят микропипеткой на хорошо обезжиренное сухое предметное стекло, помещенное на миллиметровую умагу с очерченной площадью в 4 или 6 см2. К капле суспензии добав-
75 .74 ляют каплю стерильного 0,03 %-ного водного раствора агар-агара, быст- ро перемешивают стерильной бактериологической петлей и равномерно распределяют на площади, отмеченной на бумаге. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют 20—30 мин 96% спиртом и окрашивают фуксином основным либо метиленовой синью в течение 2 мин. Затем препарат ос- торожно промывают в кристаллизаторе с водой. Воду меняют до тех пор, пока после очередного погружения в нее препарата она останется бес- цветной. Готовый препарат высушивают на воздухе. Подсчет клеток микроорганизмов проводят с иммерсионным объ- ективом 90-!00х в квадратах окулярной сетки, которую вставляют в окуляр. Просчитывают 50-100 квадратов сетки (не менее 10 полей зре- ния), передвигая препарат по диагонали, При отсутствии окулярной сетки можно подсчитывать клетки микроорганизмов на всей площади поля зрения микроскопа. Максимальная, с точки зрения практической целесообразности, точность достигается, когда общее число подсчитан- ных клеток составляет 600-1000 единиц. На основании данных рассчитывают среднее количество клеток в квадрате сетки (ноле зрения): гл /7 где а - среднее количество клеток в квадрате сетки; - общее число Подсчитанных клеток; п - число просчитанных квадратов сетки (полей зрения). Для определения наиболее вероятного количества клеток в 1 мл (1 г вещества) изучаемого субстрата необходимо учесть разведение, объем суспензии, площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) и площадь мазка. Площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) определяют с помощью объективного микрометра, который помещают на столик микроскопа, при котором проводили подсчет клеток, и измеряют сторо- ну квадрата сетки (или диаметр поля зрения). Зная сторону квадрата сетки, определяют ее площадь 5. Площадь поля зрения вычисляют по формуле 5 = лг2. Пересчет ко- личества клеток в квадрате сетки на 1 мл суспензии (I г вещества) про- водят по формуле: 5 0,05 где jV - число клеток в 1 мл суспензии (I г вещества); а - среднее количе- ство клеток в квадрате сетки; б) - площадь мазка (6-10® или 410® мкм2), К - разведение суспензии; S - площадь квадрата сетки (поля зрения); 0,05 - объем взятой суспензии, мл. Задание I. Провести количественный учет дрожжей, содержащихся в пред- ставленной суспензии. 2. Подсчет клеток дрожжей проводить в исходной (неразбавленной) суспензии и суспензии, разбавленной в 2, 5 и 10 раз, приготовив препарат фиксированных клеток. 3. Подсчет клеток дрожжей на фиксированных окрашенных мазках проводить при объективе 90- ЮОх, МИ, Результаты работы оформляют в виде следующей таблицы. Количественный учет микроорганизмов на окрашенных мазках Разве- дение Количество клеток в квадрате сетки (поле зрения) Общее число клеток Средн, число клеток Количество клеток в исходном образце I 2 3 4 5 0 с Тема 6, Физиология и генетика микроорганизмов Работа 21, Рост микроорганизмов в периодической (статической) культуре. Влияние условий культивирования на показатели роста микроорганизмов К настоящему времени разработано несколько способов культиви- рования микроорганизмов: периодическое, непрерывное культивирова- ние и культивирование иммобилизованных клеток. Наиболее распространен способ периодического культивирова- ния. При данном способе инокулят вносится в питательную среду, ко- торая содержит заданное количество всех необходимых питательных
76 веществ. При этом ни один из существе иных компонентов питательной среды не поступает в систему в процессе культивирования, т. е. это за- крытая система. Периодическое культивирование возможно как поверх- ностных культур (на поверхности твердой питательной среды), так и глубинных культур (в жидкой питательной среде). При внесении мик- роорганизмов в питательную среду их рост прекращается тогда, когда содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды дости- гает минимума или в среде накапливаются продукты метаболизма, ин- гибирующие рост микроорганизмов. Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Типичная кривая роста (рис. 26) имеет S-образную форму и характеризуется различными фазами, свя- занными с изменением состава питательной среды, составом биомассы и физиолого-биохимическими свойствами микроорганизмов. Рис. 26. Кривая роста периодической культуры микроорганизмов: 1—лаг-фаза; П — фаза ускоренного роста; 111 — фаза логарифмического роста; IV — фаза замедленного роста из-за недостатка источников питания или из-за накопления ингибирующих продуктов; V - стационарная фаза; VI — фаза отми- рания клеток Второй способ культивирования микроорганизмов - рост в непре- рывной культуре. Все компоненты питательной среды постоянно по- ступают в систему и выводятся из нее. Это открытая система осуществляется только в глубинной культуре, чаще всего аэрируемой. Третий - культивирование иммобилизованных клеток, Клетки микроорганизмов прикрепляются (иммобилизуются) на каких-либо
77 инертных носителях. Питательная среда постоянно поступает в систему и выводится из нее, т. е. это тоже открытая система. Для культивирования микроорганизмов необходимо наличие жиз- неспособной засевной культуры (инокулята), питательной среды, со- держащей все необходимые элементы питания (источник энергии, угле- рода, макро- и микроэлементов и, в случае потребности, факторы рос- та), отсутствие в среде разного рода ингибиторов роста. Необходимо также поддержание оптимальных для роста микроорганизмов физико- химических условий окружающей среды (температура, pH, давление, условия аэрации, источники света и др.). Основные параметры роста микроорганизмов: X- концентрация биомассы, г/л; Л - число клеток в единице объема (титр культуры, плотность популя- ции), количество клеток в 1 мл; р - удельная скорость роста - прирост биомассы или числа клеток в единицу времени, отнесенный к концентрации биомассы или коли- „ честву клеток, ч“!: [ dx 1 dN 1 *=лх' 7(/ - время генерации, время удвоения биомассы или числа клеток, ч: _ In 2 _ 0,693 ld------------; и м У- экономический коэффициент (или выход биомассы от потребленно- го субстрата), %: где АЛ" - увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстра- та в количестве AS. Для определения роста микроорганизмов используется ряд мето- дов, которые подразделяются на прямые и косвенные методы определе- ния. К прямым методам относятся: к - определение биомассы весовым или турбидиметрическим методом; | — определение количества клеток микроорганизмов при использова- I нии счетных камер или при высеве на твердые среды. При использовании косвенных методов проводят определение мас- №ы отдельных компонентов клетки (белок, клеточный азот, нуклеиновые
78 кислоты, аденозинтрифосфорная кислота и др.), массы потребленного субстрата (источника углерода, азота, кислорода и др.), массы образуе- мых продуктов метаболизма или др. Работа заключается в экспериментальном проведении процесса пе- риодического культивирования дрожжей и бактерий и определении па- раметров их роста в зависимости от условий культивирования. Техника периодического культивирования микроорганизмов вклю- чает следующие операции; I. Подготовка питательной среды Состав основной питательной среды (I) лля выращивания дрожжей (г/л): глюкоза - 100; (NH4)2SO4 - 3.5; NH[H,PO4 - 0,8; K.CI - 0,5; MgSO4-7H,O - 0,25; FeSO4 - 0,15; ZnSO4 -0,015; MnSO4 - 0,015; дрож- жевой автолизат - 1 мл. Состав основной питательной среды (И) для выращивания бакте- рий (r/л): глюкоза - 10,0; NH4H2PO4 - 10,0; MgSO4-7H3O - 0,7; Na2HPO4-12H2O - 7,0; КН2РО4 - 6,8; дрожжевой автолизат - 1 мл. В зависимости от варианта опыта помимо основной питательной среды (I) готовят питательную среду без добавления дрожжевого авто- лизата, а также среду, содержащую 50% глюкозы, и среду, в которой присутствует только 10% источника фосфора и 10% источника азота от их концентрации в среде 1. Помимо питательной среды (11) готовят питательную среду, не со- держащую дрожжевого автолизата, среду, содержащую 50% глюкозы, а также среду, содержащую 10% источника азота от их концентрации в среде [I. Подготовленная питательная среда разливается по 100 мл в кони- ческие качалочные колбы и стерилизуется при 0,5 атм 20 мин, 2. Подготовка инокулята (засевного материала) Чистые культуры дрожжей и бактерий выращиваются соответст- венно на твердой питательной среде (косяки), сусло-агаре и МПА (мясо- пептонный агар) в течение 48 ч при температуре соответственно 32-34 и 37-38° С. Выросшие культуры засевают в жидкие питательные среды I и II и выращивают на качалке в течение 24 ч. Выросшие культуры исполь- зуются в качестве посевного материала. 3. Засев подготовленной питательной среды Измеряют на фотоэлектроколориметре величину светорассеяния суспензии выросших культур, используемых в качестве инокулята. Питательная среда для микроорганизмов, в которой предполагается определять биомассу по светорассеянию, должна быть оптически про-
79 Гзрачной. Если помутнение среды связано с выпадением в осадок солей, , чаше всего фосфатов, то перед измерением светорассеяния среду под- 1 кисляют несколькими каплями концентрированной соляной кислоты. Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечи- вающий максимум пропускания света данной суспензии. Светорассея- ние суспензии дрожжей и бактерий в бесцветных средах измеряют с зеленым или сине-зеленым фильтром против воды и выражают в еди- ницах оптической плотности. fc. При высоких концентрациях клеток в культуральной среде рассея- ние света усиливается, что приводит к получению заниженных резуль- ^Втов. Поэтому суспензии с высокой плотностью клеток перед измере- нием светорассеяния следует разводить средой или водой. i Для исследуемых культур по имеющимся трафикам зависимости | показаний фо тоэлектр о колориметра от числа клеток и биомассы, опре- I дел я ют содержание клеток или сухой биомассы в единице объема сре- Гды. Засевают подготовленную к опыту питательную среду таким объе- |мом засевной суспензии, чтобы обеспечить в опытной колбе количество [засевного материала 0,5% и 1% (в зависимости от варианта опыта). | Инокулят вносят при использовании техники, обеспечивающей [стерильность операции. 1 4. Культура инкубируется в термостатированных качалках, или в термостатных комнатах на качалке при определенной температуре, в зависимости от варианта опыта. 5, В динамике определяются параметры роста культуры. Для это- ' го каждые 2 ч при соблюдении стерильности операции отбирается I мл суспензии культуры. Определяется оптическая плотность суспензии, при выращивании дрожжей подсчитывается количество клеток в камере Го- ряева, культуры микроскопируются. При микроскопировании дрожжей готовится препарат «раздавленная капля», окрашенный метиленовым си- ним, и ми крое копируется с объективом 40х; при микроскопировании бак- терий готовится фиксированный окрашенный препарат и просматривается с иммерсионным объективом ЮОх. Опыт заканчивается при снижении прироста биомассы. 6. По мере получения данных строится график - кривая роста, определяется продолжительность лат-фазы, рассчитывается величина удельной скорости роста в логарифмической стадии и выход биомассы от заданного субстрата при завершении эксперимента (табл. 3).
80 Таблица 3. Общая схема опыта Состав питательной среды Дрожжи Бактерии t, °C условия аэрации t, °C условия аэрации 1. Среда 1 32-34 инкубируют на качалке - - 2. Среда I 32-34 стационарные условия - - 3. Среда I 37-38 инкубируют на качалке - - 4. Среда I без добавления автол из ата 32-34 инкубируют на качалке - - 5. Среда 1 с добавлением 50% глюкозы 32—34 инкубируют на качалке - - 6. Среда 1 с содержанием 10% источника азота 32-34 инкубируют на качалке 7. Среда 1 с содержанием 10% источника фосфора 32-34 инкубируют на качалке 8. Среда ]] - - 37-38 инкубируют на качалке 9. Среда П - - 37-38 стационар- ные условия 10. Среда ]1 - - 32-34 инкубируют на качалке ] L Среда 11 без добавле- ния автол из ата - - 37-38 инкубируют на качалке 12. Среда II с добавлени- ем 50% глюкозы - - 37-38 стационар- ные условия 13. Среда II с содержани- ем 10% источника азота - — 37-38 инкубируют на качалке Задание 1. Провести экспериментально периодическое культивирование мик- роорганизмов. Варианты эксперимента определяются преподавате- лем. Построить графически кривую роств и описать морфологию культуры.
81 2. Определить параметры роста культуры (продолжительность лат- фазы, ц, У) и записать в виде таблицы. Условия культиви- рования Параметры роста Морфологическое состояние клеток продол ж ител ьн ость лаг-фазы Y 1. 2. 3. и т. д. 3. Обобщить результаты опытов, полученные другими студентами по другим вариантам схемы. Составить общую таблицу. Сформулиро- вать выводы о влиянии условий культивировании на рост изучен- ных культур микроорганизмов. Работа 22. Метод накопительных культур для выделения микроорганизмов разных физиологических групп Для выделения микроорганизмов определенных физиологических групп Виноградским и Бейеринком предложена техника так называе- мых «накопительных кулыур». Техника накопительных культур осно- вана на использовании элективных методов культивирования, т е. соз- дания таких условий при культивировании (наличие определенного ис- точника углерода и энергии, азота, pH, t°, азрации, освещенности, кон- центрации элементов питания и др.), которые будут благоприятны для развития микроорганизмов определенной физиологической группы, а другие организмы в этих условиях не могут размножаться или их рост будет весьма незначителен. Так, подбирая определенный состав питательной среды и парамет- ры культивирования и инокулируя среду какими-либо природными суб- стратами (почва, ил, вода) или техногенными (активный ия, сточные воды и т. п.), содержащими разнообразные микроорганизмы, можно получить накопительную культуру микроорганизмов, характеризую- щихся определенными физиолого-биохимическими свойствами, напри- мер, способных окислять определенные органические субстраты, разви- ваться при определенном pH и температуре, способных фиксировать те :от атмосферы и окислять неорганические соединения и др. в результа- преимущественного развития микроорганизмов, приспособленных к данным условиям. Последовательные частые пересевы на такую же
82 элективную жидкую среду предотвращают рост сопутствующих микро- организмов, которые могли бы использовать продукты метаболизма или даже автолиза первичной культуры и, таким образом, позволяют полу- чить обогащенную накопительную культуру. При получении накопительных культур лучшим материалом для инокуляции служат субстраты, в которых происходит естественное «обо- гащение». Так, например, для выделения микроорганизмов, окисляющих нефтепродукты, — это почвы, загрязненные нефтью; для выделения мик- роорганизмов. способных использовать органические соединения, загряз- няющие сточные воды химических производств, - пробы сточных вод., этих же производств или почвы, загрязненные этими стоками и т. п. f О получении накопительной культуры судят визуально, по прояв- лению признаков роста микроорганизма; помутнению среды, появлению пленки, осадка, пигментов, выделению газообразных веществ и т. д. Из накопительных культур выделяют чистую культуру микроорга- НЬЕЗМОВ. Получение накопительной культуры Bacillus subtil is var. ruesen tericus (картофельной палочки) Картофельная палочка широко распространена в природе, особен-- по на картофеле, куда она попадает из почвы. Картофельная палочка образует очень стойкие центральные споры, которые выдерживают на- гревание при 100° С в течение 6 ч. Накопительную культуру картофельной палочки получают сле- дующим образом: очишенный картофель нарезают ломтиками, поме- щают в чашки Петри и прогревают 10 мин при 100° С в стерилизаторе (инактивируются все вегетативные клетки микроорганизмов), цосле чего помещают в термостат на 2-3 дня при 25-30° С. На картофеле про- растают споры и образуется крепкая морщинистая пленка, при микро-! скопированип которой видны подвижные палочки длиной до 4—5 мкм,1 часто соединенные в цепочки. I Получение накопительной культуры молочнокислых бактерий | Общим признаком молочнокислых бактерий является способность , осуществлять сбраживание углеводов (моно- и дисахаров) с образова-! нием молочной кислоты (молочнокислое брожение). 1 Инокулятом для получения накопительных культур молочнокис- 1 лых бактерий могут служить кисломолочные продукты. В качестве питательной среды используют стерильное молоко, В | Пробирку со стерильным молоком вносят i мл кислого молока или друго- го молочнокислого продукта. Пробирку с посевом и контрольную (со
83 Серильным МОЛОКОМ) с-гавят в термостат при 30-.2 С. Через 24 ч отме- чают свертывание молока, характер роста микроорганизмов образование с ка 5плотного рыхлого, слизистого), газообразование. Далее прово- дят микроскопирование препарата фиксированных клеток, приготовлен- ного из культуральной жидкости. Отмечают морфологические особенно- сти бактериальных клеток: форму, спорообразование, подвижность и Т. д. Учитывая особенность субстрата (молока), препарат фиксирован- ных клеток готовят следующим образом: на предметное стекло из про- бно и наносят каплю культуральной жидкости, которую равномерно пазмазынают покровным стеклом. Мазок высушивают на воздухе, фик- сируют и одновременно обезжиривают смесью спирта и зфира (Г.1) в течение 10 мин, которую наносят непосредственно на мазок. После ис- парения смесь наливают повторно. Высушенный мазок окрашивают синькой Лефлера- Получение накопительной культуры у глеводородоки сияющих микроорганизмов Углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии могут использоваться широким кругом микроорганизмов среди бактерий и дрожжей, относящихся к разным систематическим группам. Наиболее активно усваивают углеводороды бактерии - представители .родов Pseudomonas, Acinetobacter. Arthrobacter, Mycobacterium, а среди фрибоз —дрожжи рода Candida, Rhodotorula и др. Углеводороде к и сияющие микроорганизмы широко распростране- лгы а природе. Их распространение не связано строго с присутствием нефти и нефтепродуктов в местах их обитания. Однако при наличии Нефти и нефтепродуктов в природных субстратах наблюдается естест- венное обогащение их микроорганизмами, активно использующими углеводороды для роста. Из углеводородов наиболее доступны для микроорганизмов н-ал- каны с числом атомов углерода С10-С18. Для окисления углеводородов микроорганизмам необходима хо- рошая аэрация питательной среды. Для получения накопительной культуры углеводородокисляющих микроорганизмов в качалочную колбу на 750 мл вносят 100 мд синтети- ческой минеральной среды следующего состава (г/л): аммоний фосфорнокислый однозамешенный 10 калий фосфорнокислый двузамещенный 10 магний сернокислый-7Н2О 0,7
84 железо сернокнслое-7Н20 0,013 цинк сернокислый-7Н2О 0,012 марганец сернокислый'7Н2О 0,012 Для получения накопительной культуры углеводородокисляющих бактерий устанавливают pH 6,8-7,0, углеводородокисляющих дрожжей - 4,5-5,0. В колбу вносят 2 мл жидкого н-парафи на и инокулируют небольшим количеством почвы, загрязненной нефтепродуктами. Колбу помещают на качалку (200-300 об/мин) в термостат при 30-32° С на 3-5 суток. Наличие смеси углеводородов (н-нарафина) в среде в качестве един- ственного источника углерода и хорошая аэрация способствуют развитию углеводородокисляющих микроорганизмов, а различное значение pH среды определяет преимущественное развитие либо бактерий, либо дрожжей. После инкубации через 3—5 суток отмечают и записывают из- менения, которые произошли со средой, и микроскопируют. При получении бактерий готовят фиксированный препарат и мик- роскопируют с объективом 100х, а при получении дрожжей — препарат «раздавленная капля», окрашенный метиленовой синью, и микроскопи- руют с объектияом 40х. Получение накопительной культуры маслянокислых бактерий Маслянокислые бактерии сбраживают углеводы (глюкозу, сахаро- зу, крахмал) с образованием масляной кислоты. Кроме масляной кисло- ты образуется некоторое количество уксусной кислоты, водорода и уг- лекислоты. Маслянокислые бактерии строгие анаэробы, поэтому при их куль- тивировании необходимо создавать условия, которые обеспечивают отсутствие кислорода. Для получения накопительной культуры маслянокислых бактерий в большую пробирку (емкостью 50 мл) помещают несколько кусочков неочищенного картофеля, четверть чайной ложки мела, заливают водо- проводной водой (расстояние до пробки 2—3 см), закрывают ватной пробкой и пастеризуют при 80° С в течение 10 мин в водяной бане, по- сле чего помещают в термостат при 37° С- Через 1-2 сут в жидкости на дне пробирки при микроскопировании обнаруживается большое количество подвижных палочек. Отличитель- ной особенностью маслянокислых бактерий является их способность накапливать в клетках запасное вещество - гранулезу, а также образо- вывать споры. При спорообразовании клетки утолщаются либо в сере- дине (клостридиальный тип), либо на конце клетки (плектридиальный тип). После созревания спор гранулеза в клетках исчезает.
85 После 5-6 дней культивирования анализируют накопительную культуру Для приготовления микроскопического препарата культу- ра ьную жидкость с микроорганизмами берут пипеткой со дна пробир- ки вблизи ломтиков картофеля. Для обнаружения в культуральной жидкости масляной кислоты проводят две качественные реакции: 1 В сухую чистую пробирку вносят 3—5 мл культуральной жидко- сти взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добав- ляют 1-2 мл 5 %-ного раствора хлорного железа. Слегка подогревают. Наблюдают появление кирпично-бурого окрашивания из-за образова- ния маслянокислого железа. 2 . В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидко- сти взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добав- ляют 1-2 мл 96 %-ного этилового спирта, 1 мл концентрированной сер- ной кислоты. После охлаждения пробирки обнаруживают ананасный запах обра- зовавшегося масля ноэтилово го эфира. Для обнаружения гранулезы в клетках маслянокислых бактерий на каплю культуральной жидкости с бактериями наносят на 5—10 мин кап- лю концентрированного раствора Люголя, после чего накрывают по- кровным стеклом (витальный препарат) и микроскопируют. Гранулеза окрашивается в темно-коричневый цвет. Задание I. Получить накопительную культуру картофельной палочки. Опи- сать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток и промикроскопировать. Объектив 100х. Зарисовать. 2; Получить накопительную культуру молочнокислых бактерий из кислого молока, ацидофилина либо кефира. Описать характер рос- та. Приготовить препарат фиксированных клеток. Промикроскопи- ровать. Объектив 100х. Зарисовать. 3. Получить накопительные культуры углеводородокисляющих мик- роорганизмов бактерий и дрожжей. Описать характер роста. При- готовить препараты разбавленной капли (дрожжей) и фиксирован- ных клеток (бактерий). Промикроскопировать. Объектив 100х и 40х. Зарисовать. 4. Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий. Опи- сать характер роста. Приготовить иг про ми крое ко пировать препарат фиксированных клеток. Объектив 100х. Провести окраску клеток на наличие гранулезы с помощью раство- ра Люголя (витальный препарат)- Промикроскопировать. Объектив ЮОх.
86 Провести качественную реакцию на образование масляной кислоты с хлорным железом и этиловым спиртом. Записать уравнение реакции. Работа 23. Изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Определение спектра антимикробного действия антибиотиков Антибиотики - это специфические продукты жизнедеятельности микроорганизмов и их модификации, обладающие высокой физиологи- ческой активностью по отношению к определенным группам микроор- ганизмов, избирательно задерживая или полностью подавляя их рост. Антибиотические вещества разнообразны по химическому составу И механизму действия. Характерной особенностью антибиотиков являет- ся избирательность их действия: каждый антибиотик проявляет биологи- ческое воздействие (эффективен) лишь по отношению к определенным организмам или группам организмов, не оказывая воздействия на другие. Образование антибиотиков — это наследственно закрепленная осо- бенность метаболизма организмов, это специфическая особенность вида или даже штамма микроорганизмов, возникшая в результате эволюцион- ного развития как одна из приспособительных особенностей, обусловли- вающая проявление широко распространенных в мире микроорганизмов антагонистических отношений. К синтезу антибиотиков, главным образом, способны грибы из р. Penicilliinn, актиномицеты и некоторые группы бактерий. Процесс образования антибиотиков тесно связан с развитием организмов- продуцентов и осуществляется, как правило, в фазу замедления роста. Для определения спектра антимикробного действия антибиотика или чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используются мето- ды, основанные на способности антибиотика диффундировать в толщу агара. Для определения чувствительности микроорганизма к анти- биотикам на чашки Петри с подсушенной средой МПА засевают ис- следуемую культуру сплошным газоном. Посев производят стерильным ватным тампоном, смоченным суспензией исследуемой культуры. Сте- рильным пинцетом на агар плотно накладывают индикаторные бумаж- ные диски (4-5 штук), пропитанные раствором определенного антибио- тика на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии около 2,5 см от центра чашки. Диски номеруют на обратной стороне дна чашки. Засеянные чашки с нанесенными дисками термостатируют (вверх дном) при 37° С в тече- ние 16-18 ч.
87 Антибиотики, диффундирующие в толщу агара, предотвращают или задерживают рост чувствительных к ним культур микроорганизмов, что проявляется в образовании вокруг соответствующих дисков зоны угнетения роста, четко выделяющейся на фоне сплошного газона роста тестируемой культуры. Величина зоны угнетения определяет степень чувствительности микроорганизмов к данному антибиотику: Диаметр зоны задержки Степень чувствительности к роста, мм антибиотику: более 25 высокочувствительные 15-25 чувствительные 10-14 малочувствительные менее 10 и полное отсутствие устойчивые Для определения спектра антимикробного действия продуцен- та антибиотиков на наружной поверхности дна чашки Петри с агари- зованной пеитоно-глюкоз ной средой по диаметру чашки на расстоянии 1 см друг от друга проводят две параллельные линии. Петлей проводят посев спор культуры актиномииета вдоль отмеченных полос. При посе- ве чашки держат агаровой пластинкой вниз (чтобы споры не разлете- лись). Через 6-7 дней перпендикулярно штриху выросшего актцноми- цета проводят посев штрихов тест-организмов. Посев делают петлей из густых суспензий тест-организмов в стерильной водопроводной воде. Чашки инкубируют при 30° С в течение 1-2 суток. Воздействие антибиотика, продуцируемого актиномицетом, на тес- тируемые микроорганизмы определяют по величине расстояния между краем штриха актиномицета и началом роста тест-организм а. Задание 1- Провести тестирование чувствительности к 4-5 антибиотикам культуры микроорганизма (рекомендованной преподавателем) ме- тодом бумажных дисков. Определить степень чувствительности по величине зоны задержки роста. 2. Определить спектр антимикробного действия культуры актиноми- цета по методу перпендикулярных штрихов и степень чувстви- тельности тест-организмов к продуценту по величине зоны подав- ления роста. 3. Обосновать степень чувствительности тестируемых культур к изу- ченным антибиотикам, исходя из их химического строения и меха- низма действия.
88 Работа 24. Исследование бактериофагии, фаготипиро- вание бактерий (метод Фюрта) Вирусы микроорганизмов называются фагами, вирусы бактерий - бактериофагами, грибов - микофагами, актиномицетов - актинофагами. Фаги могут быть вирулентными и умеренными. Вирулентные фаги проникают в микробную клетку, репродуцируются и вызывают ее ли- зис. Умеренные фаги, проникнув в клетку, включаются в хромосому бактерий и реплицируются вместе с ней. Бактерии, несущие умеренный фаг, получили название лизогенных, а фаг, присутствующий в них, — профагом. Явление лизиса бактерий под действием бактериофагов на- зывается бактериофагией. Фаги характеризуются высокой степенью специфичности. Фаг мо- жет лизировать только бактерии одного вида или даже типа. Это свойство фагов используется при фаготипировании, для идентификации бактерий. С помощью фага можно определить видовую принадлежность или фаготип исследуемой культуры (фаготипирование). Ход выполнения работы: к 20 мл расплавленного и остуженного до 45-46° С МПА добавляют 1 мл суспензии колибактериофага. Смесь выливают в стерильную чашку Петри. После застывания агаровой сре- ды дно чашки делится на четыре сектора. На каждый сектор засевается петлей штрихом бульонная культура кишечной палочки. Чашки инку- бируются 18-24 ч при 37° С. Обнаружение бактериофага (метод Отто) Агаризованная среда МПА в чашке Петри засевается густым газо- ном 16-18-часовой бульонной культурой, гомологичной искомому фагу. Спустя 5—10 мин после посева, на подсушенную поверхность среды на- носят каплями исследуемый фильтрат (фаг). Чашку делят на сектора и в каждый сектор вносят по капле фильтрата. После того, как жидкость (суспензия фага) впитается в среду, чашки перевертывают вверх дном и инкубируют 18-24 ч при 37° С. Бактериофаг будет лизировать клетки типоспецифической культу- ры. На некоторых секторах чашек будет отсутствовать рост колоний тех штаммов бактерий, которые будут чувствительными по отношению к взятому фагу и лизированы им. Полное отсутствие роста бактериальной культуры в месте нанесе- ния капли фильтрата свидетельствует о присутствии активного бакте- риофага. Наличие мелких стерильных пятен — колоний бактериофага свиде- тельствует о присутствии бактериофага слабой активности.
Задание . Пповести фаготипирование четырех культур бактерий (представ- ' ляются преподавателем) по отношению к колибактериофагу. Опи- сать результата исследования. Исследовать наличие кол и бактерио фага в четырех фильтратах 2 (представляются преподавателем на занятии). Описать характер зон лизиса. Работа 25. Летальное и мутагенное действие ультрафиолетовых лучей на клетки микроорганизмов Ультрафиолетовый свет оказывает на микроорганизмы как леталь- ное, так и мутагенное воздействие. Наибольший эффект ультрафиолето- вых лучей (УФЛ) наблюдается при длине волны 260 нм, так как это сов- падает с максимумом поглощения УФЛ ДНК. Основным результатом облучения бактериальных клеток в этих условиях является образование в ДНК тиминовых димеров. Зависимость детального эффекта (выживае- мости клеток) от дозы УФЛ имеет экспоненциальный характер. При изучении зависимости выживаемости бактериальных клеток От дозы УФЛ необходимо учитывать следующие факторы: 1. Большое значение имеет плотность облучаемой суспензии. УФЛ интенсивно поглощаются клетками, поэтому при большой плотно- сти суспензии клетки экранируют друг друга. Это обстоятельство не играет существенной роли при концентрациях суспензии, не. превышающих 108 кл/мл. При использовании более густой суспен- зии ее следует непрерывно перемешивать во время облучения. 2; Выживаемость клеток зависит и от состава среды, в которой их суспендируют. Лучше проводить облучение в буферных растворах. Питательный бульон поглотает УФЛ интенсивнее, чем буферные растворы, поэтому получаемая клетками доза УФ уменьшается. Кроме того, после облучения в бульоне могут образовываться ток- сичные органические пероксиды, увеличивающие летальный эф- фект Уфд. 3. Действие УфД зависит также от физиологического состояния кле- т°к, прежде всего от возраста. Обычно клетки культур в стадии экспоненциального роста более чувствительны к УФЛ, чем в ста- ЦИонарной фазе. па_п Кроме летального эффекта облучение клеток УФЛ вызывает в них Различные мутации.
90 Мутации ауксотрофности, измененные потребности в определен- ных факторах роста являются удобными генетическими маркерами и широко используются в генетических исследованиях. Ауксотрофные мутанты находят применение и в биохимических исследованиях ддЯ выяснения путей биосинтеза в клетке тех или иных соединений, а также в селекции микроорганизме в-продуцентов таких биологически актив- ных веществ, как аминокислоты, витамины и т. д. Биохимические мутанты характеризуются тем, что в силу наруше- ния мутацией синтеза какого-либо компонента внутриклеточного обме- на они не могут расти на среде, не содержащей этого компонента. В отличие от них клетки дикого типа — прототрофы - размножаются без дополнительных факторов роста. Спонтанно ауксотрофные мутанты у дрожжей возникают довольно редко (I на 106-107 клеток), но это коли- чество можно значительно увеличить, обрабатывая культуры мутагена- ми (Уф-лучи, ионизирующие излучения, химические мутагены). Выделяют ауксотрофные мутанты из популяции прототрофных клеток различными методами. Для характеристики мутагенного действия УФЛ часто используют обратные мутации. Несмотря на некоторые недостатки (часть реверсий обусловлена супрессорными мутациями), этот тест удобен, так как он позволяет благодаря использованию селективных сред значительно уве- личить размер анализируемой популяции. Количество обратных мутан- тов по одному гену, наблюдаемых в эксперименте, обычно мало. По- этому концентрацию и частоту обратных мутаций принято выражать не в процентах, а в виде числа мутантов на определенное количество жиз- неспособных клеток, например 1 на 10й, 107 или 10s в зависимости от уровня мутабильностн. Ход выполнения работы: В работе используют штаммы E.coli АВ 1157 thr', leu", arg Е", pro A', tlii”, нуждающиеся соответственно в трео- нине, лейцине, аргинине, пролние и тиамине (BJ. В качестве полной среды используют МПА. В качестве минимальной используют среду следующего состава (г/л): NH4C1 - 5,0; ЫН4ЫО3 - 1,0; Na2SO4 -2,0; К2НРО4 - 3,0; КН2РО4 - 1,0: MgSO4-7H20- 0,1. Среду стери- лизуют при 0,5 атм. После стерилизации вносят 0,2% стерильной глюкозы. Значение pH среды 7,0. Для получения селективных сред в минимальную среду добавляют лейцин, аргинин, пролин и тиамин (LAPBt) или треонин, аргинин, про- лин и тиамин (TAPBt). Аминокислоты и витамины готовят отдельно, стерилизуют при 0,5 а™ и вносят в среду в количестве 100 мг/л и 10 мыл
91 Селективные среды служат для выявления обратных соответственно. и 1ец мутаций по л* вь(раЦ1ЙБают в колбах, содержащих 50 мл бульона Хотгин- kaKTeP^[Ke при 37° С в течение 18 ч. Выросшую культуру центрифу- гера. на 017ЛЬ!вают от среды К-фосфатмым буфером (50 мМ, гируют. ,пендируют в том же объеме буфера. Полученная суспензия Рщ1жна содержать примерно 2 - 10е кл/мл. Каждому студенту выдают 15 мл суспензии клеток. У Облучение клеток. Суспензию клеток E.coli облучают различными озами УФЛ. Часть суспензии оставляют иеоблученной (контроль). Из обработанной и контрольной суспензий высевают пробы на чашки с МПА и с селективными средами (ТАРВ, и LAPB,). По числу колоний, выросших на чашках с МПА, определяют количество жизнеспособных клеток в I мл облученных и контрольной суспензий. О летальном дей- ствии УФЛ судят по соотношению числа жизнеспособных клеток в кон- троле и облученных пробах. По числу колоний, выросших на селектив- ных средах, определяют концентрацию обратных мутаций по двум ло- 1 кусам (the, leu). Мутагенное действие УФЛ оценивают по разнице кон- центраций мутапий в контрольной и облученных пробах. Суспензию бактерий облучают с помощью лампы БУФ-15. Ис- пользуемые дозы облучения около 1, 2, 3 и 4 тыс. эрг/мм1. Этим дозам соответствуют экспозиции в 8, 16, 24 и 32 с на расстоянии 5 см от лам- пы. Облучение бактерий проводят в открытых чашках Петри диаметром 100-110 мм. Для каждой дозы попользуют отдельную чашку, содержа- шую 3 мл суспензии. Во время облучения суспензию тщательно пере- мешивают покачиванием чашки. Для определения количества жизнеспособных клеток берут по 0,5 мл каждой из облученных суспензий и делают ряд 10-кратных разведении: Вариант опыта Экспозиция, с Конечное разведение К 0 Iff7 1 8 Iff6 2 16 ю5 3 24 ю” 4 32 10’5 Из двух последних разведении каждого варианта отбирают по 0, мл суспензии и вносят на поверхность двух чашек Петри с МПА. Для опре- деления концентрации обратных мутантов по 0,1 мл суспензии каждого варианта высевают без разведения на чашки с селективной средой. Все засеянные на занятии чашки инкубируют при 37° С: с МПА — 24 ч, с се- лективными средами — 48 ч.
92 Определение эффекта действия УФЛ на E.coii. Подсчитывают число колоний на чашках. По результатам подсчета на МПА находят количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии каждого варианта определяют выживаемость облученных УФЛ клеток в процентах от контроля и данные вносят в таблицу. Вычерчивают кривые выживаемо- сти в арифметической и логарифмической шкале. Подсчет колоний на чашках с селективными средами (титр жизне- способных клеток в этих вариантах уже известен) позволяет определить концентрацию обратных мутаций по локусам thr и leu в разных пробах Данные вносят в таблицу. Строят кривые зависимости частоты мутаций от дозы облучения для обоих локусов в арифметическом масштабе. Летальное действие УФЛ на клетки E.coii АВ 1157 Вариант опыта Разведение Количество колоний на чашках Число жизнеспособ- ных клеток в 1 мл суспензии Выживае- мость к Ю’7 1 10“® 2 10’5 3 КГ4 4 ]0'3 Мутагенное действие УФЛ на клетки E.coii АВ 1157 Вариант опыта Количество жиз- неспособных клеток в 1 мл суспензии Ч ис л о жиз не с п особ- ных клеток в 1 мл суспензий на средах Концентрация обрат- ных мутантов на 10s клеток по локусам LAPB[ ТАРЕ, thr leu К 1 2 3 После обработки каждым студентом результатов проведенных им опытов определяют среднюю по всей группе микроорганизмов выжи- ваемость клеток и их мутабильность по двум локусам для каждой дозы УФЛ: высчитывают среднюю арифметическую и ошибку средней (ре'
93 ельных студентов принимаются за повторности ’ Та6"™- Изучение фенотипической изменчивости Работа 2 ’eus vu|garis под действием фенола ения фенотипической изменчивости Proteus vulgaris куль- дпя ”3^*^с^шеаной Среде МПА и МПА с фенолом. Для приготов- тивируют < с фенолом в пробирку с 3 мл МПА, предварительно ЛеНплавленпого на водяной бане, добавляют 0,3 мл 1% раствора фенола, готовят скошенный агар. После затвердения агара культуру Протея засевают петлей в каплю сконденсированной воды у основания скошенного агара на две пита- тельные среды. Культуру инкубируют 24 ч при 37° С. На чашке с мясо-пептонным агаром без фенола протей дает ползу- чий рост, затягивая всю поверхность агара. На второй чашке, где к мя- со-пептонному агару добавлен фенол, наблюдается рост отдельных очерченных колоний. Протей в присутствии фенола не образует жгути- ков, утрачивает подвижность. Это пример фенотипической изменчиво- 'сти. При пересеве на среду без фенола протей снова дает ползучий рост. Задание 1. Провести посев культуры Proteus vulgaris на среду МПА и МПА с фенолом. Описать характер роста протея на этих средах. Приготовить фиксированный препарат. Ми крое копировать при объективе ]00х. 2. Описать морфологию клеток. Зарисовать, Тема 7. Микробиологические методы исследования объектов окружающей среды, техногенных потоков и продуктов Микроорганизмы широко распространены в природе и обнаружи- ваются во всех природных средах (почве, воде, воздухе), на растениях и в организме животных и человека. ч Согл^но концепции С.Н. Виноградского микроорганизмы, встре- и алл еСЯ К ЭК0Системе, Можно подразделить на две группы: автохтонные тонные (или зимогенные). Автохтонные микроорганизмы - это
94 типичные обитатели данной экосистемы и присутствуют там постоянно что обусловлено присутствием питательных веществ, характерных данной экосистемы. Аллохтонные (или зимогенные) микроорганизмы обнаруживаются в данной экосистеме в связи со случайным повышением концентрации питательных веществ или привнесением каких-то веществ, не свойст- венных данной экосистеме. Количество и качественное разнообразие микроорганизмов в окружающей среде зависят не только от наличия питательных веществ, но и температурных условий, влажности, аэрации действия солнечных лучей и др. абиотических и биотических факторов окружающей среды. Качественный состав, количество и соотношение между различными группами микроорганизмов изменяются в зависимо- рти от типа почвы, способов ее обработки, климатических условий н др. С выделениями больных животных и человека в почву попадают и патогенные микроорганизмы, многие из которых, особенно споровые, могут сохраняться в почве длительное время, иногда десятками лет. Поэтому почву рассматривают как возможный путь передачи возбуди- телей ряда инфекционных заболеваний (ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы и др,). При санитарно-микробиологических исследованиях почвы исследуют возможность ее фекального загрязне- ния ц помимо показателя «микробное число» (количество микроорга- низмов в I г почвы) определяют и коли-индекс, т. е. содержание кишеч- ных палочек в 1 г почвы. Обнаружение и количественный учет микроорганизмов в объектах окружающей среды (природных и техногенных средах) необходимы при санитарно-гигиенических и экологических исследованиях для модели- рования природных систем и разработке основ управления природными процессами. Работа 27. Микробиологические методы исследования почвы Населяющие почву многочисленные популяции и группы популя- ций разнообразных организмов, различающиеся по экологическим функ- циям и таксономическому положению, объединяются общим понятием «почвенная биота». Почва является средой обитания большого числа разнообразных микроорганизмов. В 1 г почвы содержится от I до 10 млрд, клеток мик- роорганизмов. В почве активно протекают процессы разложения органических природных веществ при участии широкого разнообразия сапрофитных микроорганизмов. *
95 явления, изучения и учета численности почвенных микро- ДлЯ ВЬ'исгтользуют прямые методы микроскопирования и методы организмоВ едении почвенной суспензии на плотные и жидкие среды, посева из Р яМ0Г0 микроскопического изучения почвы применяется ме- ДЛЯ ^адского з различных модификациях. Суть его заключается в тод ^ин0^ЧБеН11у1о суспензию, нанесенную на предметное стекло, фик- тоМ’ и окрашивают карболовым эритрозином. Окрашенные клетки „посчитывают под микроскопом. к Несмотря на то, что прямые микроскопические методы позволяют выявить и учесть значительно большее количество микроорганизмов /число бактерий, учитываемых прямыми методами, в 1000 раз превы- шает то. которое учитывается методом посева), цетол посева остается одним из распространенных в практике исследования почвенных мик- роорганизмов. вследствие того, что позволяет не только учитывать ко- личество. но и групповой (а часто и видовой) состав микрофлоры, а также позволяет из изолированных колоний, выросших на чашках, вы- делять микроорганизмы в чистые культуры для дальнейшего исследо- вания и идентификации. Отбор и подготовка почвенного образца для микробиологического анализа При отборе образцов почвы учитывают чрезвычайную макро-, ме- зо- и микро гетер о ген и ость как микробиологических показателей почвы, Так и других ее свойств. С пробной площадки отбирают 3-10 образцов и анализируют их отдельно. Это позволяет получить статистически дос- товерные результаты о среднем количестве микроорганизмов, а также дают возможность судить о разнообразии и степени разброса получен- ных данных. Образцы почв для проведения микробиологических исследований Отбирают в стерильные пергаментные пакеты, полиэтиленовые пакеты или стеклянную посуду с ватными пробками и др. При отсутствии возможности анализировать образцы непосредст- венно после сбора, их в течение нескольких часов высушивают на воз- дУхе. предохраняя от прямых солнечных лучей. При подготовке почв к микробиологическому анализу необходимо роватС™ СлеД'та1Ц11е операции: разрушить почвенные агрегаты; десорби- нео микроорганизмы с поверхности почвенных частиц и из органоми- ного геля и дезагрегировать микроколонии микроорганизмов, тод У111 Разрушения почвенных агрегатов чаще всего используют ме- ирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в те-
96 чение 5 мин в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке. Используется также метод обработки почвенной суспензии на элек- трической мешалке или на ультразвуковой установке. Перед посевом влажную или сухую почву высыпают на часовое стекло, протертое спиртом, и освобождают от посторонних включений Техника посева Навеску подготовленной почвы в 1 г переносят в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды. Готовят разведения почвенной сус- пензии, для чего I мл суспензии из колбы последовательно переносят в ряд пробирок с 10 мл стерильной водопроводной воды. ) Посев на плотные среды производится из разных разведении. Раз- ведение для высева подбирают таким образом, чтобы на чашке развива- лось 50-200 колоний. Из каждого образца берут не менее 3-х повторных навесок и каждую высевают не менее чем на 3 чашках. - На поверхность застывшей и подсушенной среды наносят каплю почвенной суспензии определенного разведения и с помощью стеклян- ного шпателя распределяют ее по всему агару, Засеянные чашки пере- ворачивают вверх дном и помещают в термостат. Сроки учета микроор- ганизмов зависят от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов. На МПА обычно на 2—3 сутки инкубации учитывают споровые я неспоровые формы бактерий. На среде Чапека на 5-7-е сутки учитывают колонии актиноми цетов, на сусло-агаре на 5—7-е сутки — колонии грибов и дрожжей. Подсчет количества колоний на чашке Проводят обычно со дна чашки в проходящем свете. На месте подсчитанной колонии чернилами по стеклу или маркером ставится точка. Подсчитав количество колоний на всех параллельных чашках, вы- числяют их среднее число на одной чашке и затем делают пересчет для определения содержания микроорганизмов в 1 г почвы по формуле: а =б-в-г, где a - количество клеток в 1 Г почвы, б - среднее количество колонии на чащке, в — разведение, из которого сделан посев, г - количество ка- пель в ! мл суспензии. Результаты обрабатывают статистически, рассчитывают ошиоку среднего арифметического, среднее квадратичное отклонение, коэфф11 циент вариации (Дмитриев, 1972).
1. 2. Задание читать общее количество бактерий, количество споровых и П°4СЧ овых форм в почве методом посева на МПА. Описать мик- ое разнообразие на основания изучения морфологии вырос- р0 колоний. Приготовить фиксированный препарат доминирую- щей группы бактерий. Микроскопировать с объективом ЮОх. За- рисовать. Подсчитать количество актиномицетов в почве методом поверхно- стного посева на среду Чапека. Приготовить фиксированный препа- рат из доминирующего типа колоний. Микроскопировать с объек- тивом 40х и зарисовать. Подсчитать количество грибов и дрожжей в почве методом по- верхностного посева на сусло-агар. Приготовить препараты «раз- давленная капля» из доминирующего типа колоний грибов и дрожжей- Микроскопировать с объективом 40х. Зарисовать. Работа 28. Микробиологические методы исследования воды Водные экосистемы являются средой обитания микроорганизмов. Первичными продуцентами служат одноклеточные водоросли. В пище- вую непь входят бактерии и простейшие. Микрофлора воды чаще всего отражает микробный пейзаж почвы около водоема, постоянно меняется и обновляется, что связано с попаданием различных бактерий с ливне- выми, сточными, талыми водами, с пылью, из организма живущих в водоеме рыб, гниющих растений. Микрофлора в пресных и соленых водоемах различна. В пресных водоемах (озерах, реках) обнаруживаются кокки (Micro- coccus roseus и др.) и палочковидные бактерии (Pseudomonas fluorescens). Анаэробов в воде мало; в основном они размножаются в Ийе на дне водоемов, участвуя в биохимических процессах очищения. Сапрофитные микроорганизмы выполняют роль мусорщиков, расщеп- ляя органические отходы, делая их пригодными для метаболических процессов других живых существ. Микрофлора морей и океанов не так богата и представлена гало- филъными (солелюбивыми) микроорганизмами. что артезианских скважин почти не содержит микроорганизмов, Объясняется фильтрующей способностью почвы. мик 'Г1[1ваевЬ!ми, талыми и сточными водами в реки и озера попадают Рганизмы - представители нормальной флоры кишечника чело-
98 века и животных, например, кишечная палочка, энтерококки, раздень клостридии. Вместе с ними могут попасть и патогенные микроорганиГ мы (брюшнотифозные, дизентерийные бактерии, холерные вибрионы" вирусы полиомиелита, гепатита), которые сохраняются от нескольких дней до недель. Именно поэтому водный путь передачи является одним из возможных факторов распространения кишечных инфекций. Отбор проб воды В зависимости от задачи исследования определяют место и время отбора пробы. Для исследования воды открытых водоемов, а также колодцев от, бирают пробы воды на глубине 10—15 см от поверхности в стерильные флаконы. Для отбора проб водопроводной воды используют стерильные скляцки вместимостью 500 мл с ватно-марлевыми пробками. Бактерио- логическое исследование отобранных проб должно производиться не позднее 2 ч с момента отбора или нё позднее 6 ч при хранении пробы при 1—5° С. Методы определения микробного числа B.I мл исследуемой воды определяют содержание мезофильных аэробов и факультативных анаэробов, способных при 37° С в течение суток на МПА образовывать колонии, видимые невооруженным глазом или при увеличении в 2-5 раз. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы число выросших колоний на чашке колебалось от 30 до 300. При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек вносят по 1—0,1 мл чистых вод и по 0,01 и 0,001 мл более загрязненных. При определении микробного числа сильно загрязненных вод и сточных Жидкостей исследуют по 0,0001 и 0,00001 мл. Для посева 0,1 мл и меньших объемов исследуемую воду разводят стерильной дистиллированной водой. Готовят последовательно 10-кратные разведения. По 1 мл каждого разведения вносят в 2 чашки Петри и заливают тонким слоем предварительно растопленного и остуженного до 45° С питательного агара (10-12 мл агара). После интенсивного перемешивания среде дают застыть на строго горизонтальной поверхности. Посевы вы- ращивают в течение суток при 37° С. С лупой при увеличении в 2-5 раз подсчитывают все выросшие колонии. Учитывают результаты только на тех чашках, где число колоний колеблется в пределах от 30 до 300, в ПР° изводят перерасчет содержания бактерий в I мл исследуемой воды.
99 нял-im показателем санитар но-микро б иол огического ис- Обшепр^^ двлдется показатель коли-индекс, т. е. количество бак- следованпя кишечных палочек в 1 л воды или коли-титр - наимень- терин ГРУ| и найбольшее разведение воды, в котором еще обна- Задание еделить количество микроорганизмов (микробное число) в во- допровод воДе » загрязненных водах. Работа 29. Микробиологические методы исследования воздуха Воздух не является средой обитания микроорганизмов, а является транзитной средой. Микрофлору воздуха можно условно разделить на постоянную, часто встречающуюся, и переменную, представители которой, попадая в воздух из свойственных им мест обитания, недолго сохраняют жизне- способность. Постоянно в воздухе обнаруживаются пигментообразую- шие кокки, палочки, дрожжи, грибы, актиномицеты, спороносные ба- циллы и клостридии н др., т-е. микроорганизмы, устойчивые к свету, высыханию. В воздухе крупных городов количество микроорганизмов больше, чем в сельской местности. Над лесами, морями воздух содер- жит мало микробов (в 1 mj - единицы микробных клеток). Дождь и снег способствуют очищению воздуха от микробов. В воздухе закрытых помещений микробов значительно больше, чем в открытых воздушных бассейнах, особенно зимой, при недоста- точном проветривании. Состав микрофлоры и количество микроорга- низмов. обнаруживаемых в I м' воздуха (микробное число воздуха), зависят от санитарно-гигиенического режима, числа находящихся в по- мещении людей, состояния их здоровья и других условий. В воздух могут попадать и патогенные микроорганизмы от живот- ных, людей (больных и носителей). Ддя микробиологического исследования воздуха пользуются мето- Пв Н'В 0СВДЕУ кот°рь1х положены оседание (седиментация) и аспирация. с п°мощи седиментационных методов можно получить общее пред- мето ° ВСтРеча1°Щнхся в воздухе микроорганизмах. Аспирационные личес ' да!От в03мощность определить не только качественное, но и ко- ленное содержание бактерий в определенном объеме воздуха. давани^”10^ осе^ания- Простейший метод бактериологического иссле- л В03дУха - метод оседания, который основан на оседании бакте-
ido риальных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхцос агара открытой чашки Петри. Чашки с МПА экспонируют 5-10—15 мц в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения. Мет оседания не дает количественного представления о содержании микр^ флоры в воздухе, так как на открытых чашках плохо улавливаются тон кодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц, а за держиваются главным образом крупные пылевые частицы, которые оседают или прибиваются токами воздуха к поверхности среды. Поэто- му перерасчет по Омелянскому (на поверхность 100 см- агара оседает за 5 мин такое количество бактерий, которое содержится в 10 л воздуха) малопригоден для количественного изучения микрофлоры воздуха по- мещенин и абсолютно не пригоден для атмосферного воздуха, где имеют место большие колебания в скорости его движения. Тем не менее метод оседания может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют бо- лее совершенные приборы и методы или когда нет источника электро- энергин. Для расчета микробного числа воздуха используют следую- щую формулу; а -1001000 - 5 в-10-f где X - количество микробов в 1 м’ воздуха; а - количество колоний в чашке; в - площадь чашки (см. таблицу); / - время экспозиции; 5 - вре- мя экспозиции; 10 - объем воздуха из которого происходит оседание микробов за 5 мин., л; 100 - плошадь, на которую происходит оседание, см2; ЮОО - объем воздуха, л. Площадь чашки в зависимости от диаметра: Диаметр чашки, см Площадь чашки, см2 1 8 50 1 9 63 lb 78,5 Простейшие аспирационные методы основаны на улавливании бактерий жидкостью. Через сосуд с определенным объемом изотонического раствора NaCI или водопроводной воды просасывают (с помощью воздуходувка пылесоса, насоса и др.) определенный объем воздуха. Затем проводят высев на МПА по 0,1-0,2 мл улавливающей ЖИД' КОСТИ. В случае большего объема полученной суспензии всю н часТЬ улавливающей жидкости профильтровывают через мембранные фильт' ры №2 или №3 с последующим посевом фильтров на поверхность пл°т ных питательных сред.
ioi и приборов для исследования воздуха помещений самым рас- ^^енньгм является прибор Кротова, Механизм улавливания мик- простра fOgwBaeTM на ударно-прибивном действии струи воздуха, рофлоры ^р0Х0ДИТ через узкую клиновидную щель и с большой скоро- которыи тся о влажнуЮ поверхность питательной среды. В результате стьюу дящиеся в воздухе аэрозоли, в том числе содержащие бакте- У^пылевые частицы и капли, прибиваются к поверхности МПА или ^"ктивиЫХ сред. Во время отбора пробы воздуха чашка Петри вращает- э' вместе со столиком, благодаря чему достигается равномерное обсеме- нение поверхности агара м икрофлорой воздуха. Для отбора проб следует подбирать чашки Петри с плоским дном, а количество питательной сре- ды в чашке не должно превышать 15 мл. Прибор Кротова характеризуется эффективностью улавливания микрофлоры в пылевой фазе аэрозоля, дает четкие сопоставимые ре- зультаты, прост в работе, позволяет за короткое время произвести отбор проб воздуха непосредственно на чашки Петри с МПА или элективны- ми средами. Производительность прибора от 20 до 40 л/мин. Основной недостаток прибора состоит в том, что он нуждается для работы в элек- троэнергии, это ограничивает возможности его. применения для иссле- дования атмосферного воздуха. Для исследования атмосферного воздуха используется ряд прибо- ров, в которых аэрозоль улавливается в жидкую среду. Принцип уст- ройства этих приборов прост. Они представляют собой стеклянные ем- кости, в которых через отверстия в пробке пропущены две трубки. Одна трубка кончается чуть ниже пробки и соединена с аспиратором, другая - опущена на дно цилиндра, куда поступает исследуемый воздух. В ци- линдр наливают стерильный изотонический раствор хлорида натрия или водопроводную воду (жидкости, необразующие пену) и через нее про- сасывают определенный объем воздуха. В качестве аспиратора могут быть использованы воздуходувки, пылесосы, насос. Посев жидкости производят на питательный агар или дифференциальные среды. На А засевают по 0Д-0.2 мл улавливающей жидкости, а на элективные сРеДЫ- ло о,3-0,5 мл. Для исследования атмосферного воздуха используются также при- 10актсРиоУловители’ т- е- трубки с размещенными s них плотными От^ TPaMil (хлопчатобумажная или стеклянная вата). После окончания в скл 3 возаУха в количестве 100—300 л ватный тампон помещают иы ° и30Т0[[И1[еским раствором хлорида натрия и тщательно от- ют встрлх ива кием со стеклянными бусами. Полученную суспен-
102 зию подвергают бактериологическому анализу посевом на поверхцост^ плотных питательных сред. Мембранные фильтры. Для бактериологического исследования воздуха могут быть использованы стерилизованные и высушенные мем- бранные фильтры №4. При помощи воздуходувки через фильтр проса- сывают воздух. Мембранные фильтры должны быть хорошо просушены так как мокрые и даже влажные фильтры практически воздухонепрони- цаемы. Преимуществом метода мембранных фильтров является их цор. тативность и возможность концентрировать на них микроорганизмы из относительно больших объемов воздуха. Мембранные фильтры могут быть использованы при исследованиях атмосферного воздуха в зимних условиях. Для обнаружения вирусов в воздухе наиболее целесообразно ис- пользовать приборы, в которых улавливание вирусного аэрозоля осуще- ствляется в жидкой улавливающей среде. В зависимости от поставленной задачи Исследования микрофлоры воздуха и условий отбора проб могут проводиться определения обшей бактериальной обсемеиенности воздуха, содержания санитарно- показательных микроорганизмов и наличия патогенных или условпо- патогенных микроорганизмов. Пробы воздуха следует отбирать на уровне дыхания сидящего или стоящего человека. Задание Определить содержание микроорганизмов в воздухе лабораторных помещений методом седиментации и с помощью аппарата Кротова. Работа 30. Микробиологические методы исследования пищевых продуктов и других твердых продуктов Порядок взятия проб, методы их исследования и нормативы каче- ства регламентируются серией ГОСТ или другой нормативно- технической документацией. Исходным материалом для посевов продуктов плотнойко нс истен- цпи обычно является 10 %-ная взвесь продукта. Для ее приготовления стерильно взятую из разных мест пробы навеску (обычно 15 г) измель- чают в гомогенизаторе (или растирают в стерильной ступке), прибавляют 135 мл стерильной водопроводной воды или изотонического раствор3 хлорида натрия. Жидкие и полужидкие продукты тщательно персмеШ»'
1 103 учае резко кислой реакции подщелачивают 10% стерильным ва>от и ” с бикарбоната натрия до pH 7,2-7,4. Жидкий продукт или да- раствор°-м ^звесь плодного продукта используют для приготовления лучей!'^тиКрат1.|Ь1х разведений в зависимости от характера продукта и РЙгоедполагаемого обсеменения. 07 "общую обсемененность или общее количество бактерий в I г/мл -та учитывают по росту колоний мезофильных микроорганизмов иПОДУК*4 ' мясо-пептонном агаре. Тема 8. Участие микроорганизмов в превращении веществ и энергии в биосфере (биогеохимические циклы превращения веществ) Микроорганизма принимают активное участие в биогеохимиче- ских циклах превращения веществ в биосфере. Глобальное значение имеет деятельность микроорганизмов в циклах углерода, азота и серы. Процесс круговорота углерода состщгг из синтеза и минерализации ор- ганических веществ. Ежегодно накапливаемое органическое вещество в процессе фотосинтезирующей деятельности, главным образом, расте- ний и водорослей перерабатывается на разных уровнях жизни консу- ментами и деструкторами. К первым принадлежат, в основном, живот- ные, ко вторым - грибы и бактерии. Последовательность этих событий выражается в трофических цепях или цепях питания. Конечное, дест- руктивное, звено этой цепи - минерализация органических веществ с возвратом СОг в атмосферу - осуществляется гетеротрофными микро- организмами. Первыми деструкторами природных биополимеров (белки, нук- леиновые кислоты, гемицеллюлоза, пектин, крахмал, целлюлоза, лигнин и др.) могут выступать лишь те микроорганизмы, которые синтезируют гидролитические ферменты. В аэробной зоне к таким микроорганизмам относятся грибы, некоторые, главным образом, грамположительные ктерии в том Ч|[Сле и актиномицеты. В анаэробной зоне - это только д1)т1еРИ11‘ в осповном из группы клостридий, В аэробной зоне процехо- В оракт цчески полное превращение полимеров с освобождением СО>. ских аЭР°®нь1>: Условиях в процессе первичного разложения орган и че- -----------1 в качестве продуктов распада образуются жирные кисло- спирты и молекулярный водород, которые частично используются СК11* веществ ты.
104 вторичными анаэробами, например, сульфатредуцирующими и ден рифииирующими бактериями в качестве источника углерода при во ' становлении неорганических акцепторов электрона или метанобрЕ13 " щими бактериями в процессе карбонатного дыхания. Азот один из главных биогенных элементов входит в состав ос новных полимеров любой жияой клетки - структурных белков, белкОа" ферментов, нуклеиновых и аденозинфосфорных кислот. Большие запа сы азота на планете представлены его восстановленными и окисленны- ми газообразными формами (N2, NH3, N2O, NO, NO2), которые входят в состав атмосферы Земли. Молекулярный азот составляет 7S,09% (по объему) атмосферных газов. Главными агентами круговорота азота в природе выступают мик- роорганизмы (рис, 27), Рис. 27. Круговорот азота в природе Азот в этом цикле участвует в газообразной форме, в виде мине- ральных и органических соединений. При фиксации азота микроорганизмами происходит его восста- новление; при разложении органических азотсодержащих соединений (аммонификация) азот освобождается в форме аммиака, который далее Окисляется последовательно до нитритов и нитратов (нитрификаций). Окисленный азот вновь восстанавливается до N: в процессе денитри- фикации. Аммонийные и нитратные формы азота ассимилируются Рас" тениями в виде органических веществ. Сера, биогенный элемент, содержится в белках в форме амин°кИС лот, входит в состав молекул витаминов, коферментов. В природе с р претерпевает разнообразные химические и биологические превратен переходя из неорганических соединений в органические и обратно.
105 пазяожеяйи остатков животных, растений, микроорганизмов ^Ри ются серосодержащие аминокислоты, тиоспирты, тиофенолы, асЭрбоЖ гетер011иклические соединения, в которых сера находится а "ЙЙвленном состоянии. В° ' В иикле превращения серы участвуют разнообразные группы мик- иизмов, бактерий и архебактерий, аэробных, анаэробных, хемо- и Ос' 28)' I 61 L. J Органические соединения серы i И ill Рис. 28. Цикл превращения среды: / -восстановительные. процессы: I! - без перемены валентности серы; iff - окислительные процессы. Возбудители процессов: I - бесцветные серобокте- рии. тионовые (в аэробных условиях) и фотосинтезирующие серные бактерии (в анаэробных условиях): 2.3 - тионовые бактерии, архебактерий; 4 - все микроор- ганизмы и растения (ассгрпыяция); 5 - су-чьфатредуцирующие бактерии; 6 — тфмоацидофильные анаэробные бактерии; 7 — облигатно анаэробные термо- фильные клостридии В аэробных условиях окислительные процессы серы и ее восста- новленных неорганических и органических соединений осуществляют хемоавтотрофные прокариоты (серные, тионовые бактерии), а также некоторые типичные гетеротрофные бактерии родов BacrJlus, Pseudo- monas И др. В анаэробных процессах участвуют фототрофные серные пурпур- ные и зеленые бактерии, осуществляющие бескислородный фотосинтез, Яри ассимиляции сульфатов, как источника серы, происходит вос- циа еИИе сеРЬ| Б nPoueccax конструктивного метаболизма - ассимиля- сулыЬ СУЛ ьф атрецу кция, Биологическое закрепление растворимых фатов в микробных клетках называется также иммобилизацией серы.
106 В анаэробных условиях сульфаты восстанавливаются до сероводо- рода узкоспециализированной группой облигатных анаэробов сульфат- редуцирующих бактерий в процессе анаэробного дыхания. Восстановление SO.,'- и S2O3*- до S0 осуществляют облигатно ана- эробные термофильные бактерии р. Clostridium. В восстановлении молекулярной серы до H2S участвуют многие термоацидофильные строго анаэробные архебактерии. При разложении белковых веществ (обычно этот процесс называется гниением) выделяется сероводород и ряд других ле ту ч их дурнопахнущих продуктов. Гнилостные микроорганизмы - это аэробные и анаэробные микроорганизмы родов Bacillus и Clostridium. Процессы восстановитель- ных звеньев цикла серы тесно сопряжены с окислительными, и часто сульфатредуцирующне бактерии развиваются в общих местообитаниях с серными, которые используются для окисления сероводорода, посту- пающего из анаэробной зоны. Работа 31. Получение накопительных культур микроорганизмов, разрушающих целлюлозу (клетчатку) Наиболее распространенным углеродным соединением в природе является целлюлоза. Целлюлоза составляет от 15 до 60% массы расте- ний, в хлопке и льне содержание целлюлозы достигает 80-95%. Разложение целлюлозы микроорганизмами является самым боль- шим по масштабам естественным цестру кино иным процессом, звеном круговорота углерода, обеспечивающего возврат фиксированного в процессе фотосинтеза углерода в атмосферу в виде СО?. Глобальная роль микроорганизмов в этом процессе определяется тем, что ни животные, ни растения, как правило, не способны разлагать целлюлозу. Трансформация целлюлозосодержащих соединений в при- роде происходит в разных условиях аэрации, температуры, pH среды. В природе разложение целлюлозы - это сложный, комплексный процесс, происходящий при участии сообщества микроорганизмов, в состав которого входят микроорганизмы, разлагающие целлюлозу, и микроорганизмы-спутники, использующие продукты распада. В анаэробных условиях разложение целлюлозы осуществляется анаэробными бактериями рода Clostridium. При этом образуется много органических кислот (уксусная, янтарная, молочная, масляная, муравьи- ная) этиловый спирт, углекислый газ и водород. В отличие от процесса анаэробного разложения целлюлозы, кото- рый осуществляется только бактериями, в аэробных условиях клетчатку
107 пэзлагакп многие микроорганизмы разных систематических групп: бак- терии. миксобактерии, актиномипеты, грибы. В кислых лесных почвах главная роль в превращении целлюлозы принадлежит грибам (р. Triciioderma, р. Aspergillus, PeniciJlium и др., базидиальные грибы). В почвах под травянистой растительностью, в степных и луговых ландшафтах в разложении целлюлозы помимо грибов участвуют миксо- бактернн, актиномицеты, вибрионы р. Cellvibrio. Разложение целлюлозы до глюкозы микробными ферментами про- текает в несколько стадий и требует участие сложного ферментного комплекса, включающего не менее четырех ферментов (см. схему). В анаэробных условиях глюкоза сбраживается в основном по типу маслянокислого брожения. В аэробных условиях глюкоза окисляется микроорганизмами до оксикислот, а затем до конечных продуктов — углекислого газа н воды. Для получения целлюлозе разрушающих аэробных бактерий ис- ЙОЛьзуют среду Гетгинсона (г/л); К.Н?РО4 - 0,1; НаС1 - 0,1; СаСЬ - 0,1; ТеС13 -0,1; MgSO4-7H2O - 0,3; NaNO3 - 2,5; агар-агар - 2%. Среду разливают в чашки Петри и на поверхность накладывают фильтровальную бумагу, вырезанную по размеру чашки Петри и пред- варительно тоже простерилизованную. Стеклянной палочкой с оттянутым концом на поверхность фильтра раскладывают параллельными рядами комочки почвы на расстоянии I см (по трафарету). Засеянные чашки Петри помещают в эксикатор над водой и ставят в термостат при 25-30° С. Через 10-14 суток вокруг комочков почвы развиваются колоний Целлюлозоразлагаюшнх микроорганизмов в виде желтых, зеленых, оранжевых и коричневых пятен. В местах образования колоний фильт- ровальная бумага разлагается, ослизняется, становится прозрачной. Пр Морфологии можно дифференцировать колонии плесневых грибов, ак-
108 типомкцетов и бактерий. Принимая общее число высеянных комочков почвы за 100%, можно подсчитать в процентах число комочков почвы, давших колонии целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Из зон разрушения клетчатки готовят препарат «раздавленная капля» и описы- вают выделенные различные целлюлозоразрушающие микроорганизмы. Для накопительной культуры анаэробных целлюдозоразрушающих бактерий используют среду, предложенную Имшенецким: мясо- пептонный бульон - 500 мл, CaCOj - 2 г, фильтровальная бумага - 15 г, водопроводная вода - 0,5 л. Среду разливают высоким слоем в высокую пробирку. На дно опускают нарезанную полосками фильтровальную бумагу. Пробирки закрывают ватными пробками, затем пробирки стерилизуют и засевают комочком почвы или навоза. Инкубируют в течение 10-14 суток в тер- мостате при 30-35° С для обнаружения мезофильных бактерий и при 60° С - для поиска термофильных бактерий. Через 3-4 суток при 60° С в пробирках начинается процесс разру- шения клетчатки, жидкость пенится, выделяется газ. Полоски фильтро- вальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в аморфную массу и оседают на дно. При 30-35° С разрушение клетчатки происходит медленнее, Разрушенные массы клетчатки подвергаются микроскопическому анализу. Готовят фиксированный препарат. Задание I. Получить накопительную культуру цел дю дозор излагающих аэроб- ных микроорганизмов. Подсчитать относительное количество цел- люлоз о разрушающих бактерий в почве. Описать морфологию их колоний- Описать морфологическое разнообразие клеток вырос- ших микроорганизмов. Приготовить препараты «раздавленная кап- ля». Микроскопнровать с объективом 40х. 2. Получить накопительную культуру анаэробных це л л юл оз ор аз ла- гающих микроорганизмов. Описать характер протекающих процес- сов. Приготовить фиксированный препарат, окрашенный фуксином, микроскопнровать при объективе 20х. Описать и зарисовать мор- фологию анаэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Работа 32. Получение накопительной культуры денитрифицирующих бактерий Термином «денитрификация» обычно обозначают сумму процессов, которые ведут к образованию газообразных форм азота в результате вос- становления нитратов и нитритов и к потере запасов азота в почве.
109 В отличии от ассимиляционной нитратрецукпин, восстановления нитратов в анаболических процессах, которые приводят к синтезу азот- содержащих клеточных компонентов, процессы денитрификации назы- ваются диссимиляционной нитратредукцией. Процессы денитрифика- ции протекают в анаэробных условиях и представляют собой анаэроб- ное нитратное дыхание. Конечные продукты денитрификации выделяются из клетки в га- зообразной форме в виде NO, N2O или N2 в зависимости от вида микро- организма и условий среды. Число родов бактерий, представители которых способны к нитрат- ному дыханию, велико. Они распространены во влажных слабоаэрируе- мых почвах с высоким содержанием органических веществ. Это факуль- тативно-анаэробные хсмоорганогетеротрофы родов Pseudomonas н Bacil- lus, Процесс денитрификации могут осуществлять представители хемо- литотрофных бактерий, например, Thiobacillus denitrificans, нитраты для которых выступают в качестве окислителей неорганических веществ. АН2 донор аэробные условия Н2° '—анаэробные условия- > NO3----► NO2 NHa акцептор N7O N2 Для получения накопительной культуры денитрифицирующих бактерий используют синтетическую среду Гильтая следующего соста- ве bit (г): I раствор (I г/250 мл воды): КМО3 -2.]; аспарагин - ] ,0 I! раствор (1 г/50 мл воды): КН2РО - 2,0; MgSO.] - 2,0; СаС12 - 0>2; ТеС]3 — следы; лимоннокислый натрий - 5,0. Растворы [ и И сливают и доводят объем до 1000 мл дистиллиро- ванной водой. pH 7.0. Среду разливают высоким слоем в пробирки и Стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 20 мин. Пробирки заражают комочком почвы, плотно закрывают пробками й термостатируют при 30-35° С. Для создания анаэробных условий по- аерхность жидкости в пробирках покрывают тонким слоем вазелиново- го масла. Через 7-| 0 суток при анализе среды отмечают ее помутнение, обра- зование пены в результате развития микроорганизмов и выделения газов СО2 и N2. Нередко при развитии бактерий Ps. aeruginosa, образующих зеленовато-синий пигмент, наблюдается позеленение жидкости.
111 но Ход процесса денитрификации контролируется также по исчезно- вению нитратов и нитритов из среды по качественной реакции с дифе- ниламином и реактивом цинк-йод-крахмал и по появлению аммиака в среде с реактивом Несслера, Для этого в фарфоровую чашечку к 3 кап- лям реактива цинк-иод-крахмал добавляют 1 каплю 20% H2SO4 и 1 кап- лю исследуемой жидкости. В присутствии азотистой кислоты жидкость окрашивается в темно-синий цвет. — Оценка присутствия азотной кислоты в среде проводится по реак- ции с дифениламином. В фарфоровую чашечку к 3-4 каплям концен- трированной H?SO4 добавляют кристаллик дифениламина и после его растворения 1 каплю исследуемой жидкости. При наличии азотной ки- слоты жидкость окрашивается в темно-синий цвет. Для определения накопления аммиака в среде на фарфоровую пла- стинку к нескольким каплям среды добавляют каплю реактива Несслера. В присутствии следов аммиака жидкость окрашивается в желтый цвет, при большей концентрации аммиака образуется коричневый осадок. Задание I. Получить накопительную культуру денитрифицирующих бакте- рии. Описать характер ее роста (помутнение, вспенивание, пигмен- тация). 2. Приготовить фиксированный препарат со дна пробирки. Микро- скопировать при объективе ЮОх. Описать морфологию денитри- фицирующих бактерий. Зарисовать. 3. Провести качественные реакции на содержание в среде азотной, азотистой кислоты и аммиака. Записать результаты. Работа 33, Получение накопительной культуры микроорганизмов аммонификаторов Процесс аммонификации, разложения (минерализации) органиче- ских азотсодержащих веществ (белки, пептиды, аминокислоты, нуклеи- новые кислоты, мочевина, хитин, гумусовые вещества) с выделением аммиака осуществляется широкой группой микроорганизмов (бактерий, актипомкиетов, грибов) в широком диапазоне температурных условий и аэрации (см. схему). Аммонификаиия белков (гниение) является наиболее динамичным звеном в цикле азота. Для выявления аммонификаторов анаэробов получают их накопи- тельную культуру на мясном бульоне с добавлением 2% пептона. Среду наливают высоким слоем в большие пробирки, плотно закрывают ват- ными пробками и Стерилизуют- NH3. жирные и ароматические кислоты, спирты, дурнопахнащие (индол, скатол, метилмеркаптаны), ядовитые амины (кадоверин, путресцин) NH3. СО, и оксиды серы Среду заражают комочком почвы. Для обнаружения выделяю- згося аммиака под пробку пробирки подвешивают полоску красной жмусовой бумаги, а для обнаружения сероводорода - полоску 1 фильтровальной бумаги, смоченную 10% раствором уксуснокислого свинца. Для герметичности пробирку плотно закрывают целлофано- вым колпачком. Пробирки инкубируют при 25-28° С. Через 3-5 суток определяют присутствие в среде продуктов аммонификации белков. Выделение ам- миака - по посинению лакмусовой бумаги, выделение сероводорода - по почернению бумаги, смоченной уксуснокислым свинцом. к Задание . Получить накопительную культуру анаэробных микроорганизмов, аммонифицирующих белок. Описать качественную реакцию на присутствие продуктов аммо- нификации: аммония и сероводорода. Приготовить фиксированный препарат из нижних слоев жидкости. Мцкроскопировать с объективом ЮОх. Описать морфологию вы- деленных в накопительной культуре микроорганизмов - аммони- фикаторов.
113 112 Работа 34. Обнаружение свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов Свободноживущие азотфиксцрующие организмы распространены повсеместно и встречаются среди бактерий самых разных таксономиче- ских групп, относящихся как к хемотрофам, так и фототрофам к аэро- бам и анаэробам. Наиболее хорошо изученным средн свободноживущих аэробных азотфиксирующих бактерий является азотобактер. Azotobacter chroococcum - это соединенные а пары одиночные кок- ковидные клетки размером 3-7 мкм, в старой культуре клетки обычно окружены слизистой капсулой, а колонии темнеют до темно-серого и темно-коричневого цвета. Активность азотфиксации до 20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества. Наиболее изученными анаэробными свободноживущими азотфик- сирующими организмами являются маслянокислые бактерии Clostri- dium pasteuriamim, активность азотфиксации которых достигает до 12 мг азота на ) г потребленного органического вещества. Для обнаружения азотфиксирующих организмов в природных сре- дах используют метод получения накопительных культур на синтетиче- ских средах, в которых отсутствуют источники азота. В частности ис- пользуется среда Эшби, г/л; маннит (или глюкоза, или сахароза) - 20; К2НРО4-0,2; MgSOj -0,2;NaCi -0,2; K2SO4-0.1; СаССЬ, - 5,0; pH сре- ды 6,0-6,5 Питательную среду по 30 мл, не стерилизуя, разливают в колбы объемом 100-150 мл и вносят комочек почвы (1/2 чайной ложки), за- крывают ватными пробками и термостатируют при 28-30° С. На 5-6 сутки на поверхности жидкости образуется бурая плевка, при микроскопировании которой обнаруживаются клетки азотобактера з виде кокков и диплококков. Некоторые клетки докрыты слизистой капсулой. Элективными условиями для азотобактера, способного фиксиро- вать азот атмосферы, являются аэрация, отсутствие в питательной среде азота и присутствие в среде фосфора и кальция, к которым требователен азотобактер. В некоторых случаях наблюдается вспенивание жидкости в колбе и появление запаха масляной кислоты, что указывает на развитие в среде на дне колбы в анаэробных условиях бактерий Clostridium pasteuriamim. Для изучения морфологии микроорганизмов готовят два препара- та: один из пленки с поверхности среды для выделения азотобактера (фиксированный препарат, негативно окрашенный тушью. Микроско- пируют с объективом 100х); второй препарат готовят из нижних слоев жидкости для выявления клостридий. Готовят препарат «раздавленная капля» с добавлением раствора Люголя (реактив, окрашивающий гра- нулезу). Микроскоп ируют с объективом 40х. Образование масляной кислоты в среде обнаруживают по реакции с хлорным железом. 5 мл жидкой среды из накопительной культуры переносят в пробирку, добавляют 2 мл 2% раствора хлорнокислого же- леза и нагревают до кипения. Пары образующегося раствора масляно- кислого железа в проходящем свете имеют кроваво-красный цвет. Задание 1. Получить накопительную культуру свободноживущих азотфикси- рующих микроорганизмов. Описать характер роста. 2, Приготовить фиксированный препарат из образовавшейся пленки, негативно окрашенный тушыо. Микроскопировать с объективом ЮОх. Зарисовать. 3. Приготовить со дна накопительной культуры препарат «раздавлен- ная капля», окрашенный раствором Люголя. Микроскопировать с объективом 40х. Зарисовать. 4. Провести качественную реакцию с хлорным железом на присутст- вие масляной кислоты. Описать результат реакции. Работа 35. Получение накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий Восстановление сульфатов микроорганизмами может иметь разное Начение. Большое число видов способны использовать сульфаты как очник серы. Это требует восстановления SO42- до S2', необходимой дя биосинтеза серосодержащих органических веществ клеток. Такой ОЦесс носит название ассимиляционной сульфатредукции. Известен также ряд бактерий, которые используют сульфат в каче- е конечного акцептора электронов при анаэробном дыхании. Этот ронесс, ведущий к накоплению в среде сероводорода, называют дис- симиляционной сульфатредукцией или сульфатным дыханием, а бакте- рии, его осуществляющие, -сульфатредуцирующими. К числу сульфа треду цирующих бактерий относится значительное число анаэробных бактерий с разной морфологией. Среди них есть ге- теротрофные и автотрофные виды. Некоторые из них способны не толь- ко к сульфатному дыханию, но и брожению.
Для получения накопительной культуры сульфатреду пирующих бактерий применяют среду Постгейта следующего состава: Раствор 1 (г): К2НРО4 - 1,NH4C1 - 1. СаС12-Н2О - 0,1, MgSO4-7H3O - 2, лактат Na (70% раствор) - 3,5, дрожжевой экстракт - 1, pH 7,4, дис- тиллирован/гая вола - 980 мд. Раствор 2 (г): FeSO4*7H3O - 0,5; дистиллированная вода - 10 мл. Раствор 3 (г): аскорбиновая кислота - 0,1; Na-тиогликолят - 0,1, pH 7,4, дистиллированная вода - 10 мл. Растворы стерилизуют отдельно, затем их сливают и разливают по .стерильным пробиркам до самого верха. Инокулируют почвой (лучше болотной). Пробирки закрывают резиновыми или притертыми пробками и заливают парафином. Инкубируют в течение 20-25 дней при 30" С. Развитие сульфатреду пирующих бактерий регистрируют по почер- нению осадка в пробирках вследствие образования сернистого железа. Задание Получить накопительную культуру сульфатреду пирующих бакте- рий. Описать характер роста. Приготовить фиксированный препарат. Микроскопировать с объективом 90х. Зарисовать. Методические указания к выполнению самостоятельной работы по микробиологии Требования к содержанию и оформлению /. Цель и задачи выполнения самосгпоятелыюй работы Основной целью выполнения самостоятельной работы является развитие навыков экспериментальных микробиологических исследова- ний, правильного использования освоенных на практических занятиях методов пр» выполнении исследований и решении практических задач,- а также ознакомление с требованиями к оформлению результатов науч- ных исследований. В задачу самостоятельной работы, как правило, входят два основ- ных этапа: 1. Выделение чистой культуры микроорганизмов (из объектов ок- ружающей среды, техногенных потоков, лабораторных изолятов, за- грязненных культур и Др.); 2. Характеристика чистой культуры. Второй этап работы включает: — описание культуральных признаков, морфологии колоний, штриха;
[ (5 - морфология клеток, размер клеток, тип окраски по Граму и др.; - физиологические свойства культуры: кривая роста, отношение к температуре культивирования, pH среды, к аэрации среды, отно- шение к антибиотикам, способность к антибиотикообразованию; - определение метаболита чес к ой активности (активность роста при использовании различных источников углерода и азота, образова- ние определенных метаболитов, способность деградации ксено- биотиков, других загрязняющих веществ и др.). 2. Порядок выполнения работы 2.1. Студент получает от преподавателя индивидуальное задание. Работа выполняется в лаборатории кафедры биотехнологии, либо в дру- гих организациях, если студент участвует в проведении научных иссле- дований. В последнем случае тема самостоятельного задания обязатель- но должна быть согласована с преподавателем. 2.2.1. Выполнение работы начинается с определения цели ее и за- дач, что должно быть отражено и в названии работы. 2.2.2. Проведению исследований должно предшествовать состав- ление плана работы, а также подбор методов исследований. При выполнении экспериментальной работы должно быть преду- смотрено использование максимально возможного количества методов, из освоенных при выполнении лабораторных занятий. 3. Методические рекомендации по выполнению работы 3.1. Выделение чистой культуры Основные понятия о чистых и смешанных культурах Чистой культурой микроорганизмов называется культура, в кото- рой присутствуют клетки лишь одного вида (или штамма) микроорга- низмов. Культура, в которую случайно попали посторонние микроорганиз- мы, называется зараженной. Совокупность или ассоциация двух или более организмов в куль- туре называется консорциумом микроорганизмов. Различают три основных типа консорциумов микроорганизмов: I - искусственно созданные смеси микроорганизмов, которые на- зывают смешанными культурами. 2 - консорциумы, выделенные непосредственно из природных ис- точников, как функционально неделимое целое. Такие консорциумы на- зываются ассоциативные культуры, или ассоциации микроорганизмов.
Форма колонии круглая круглая круглая ризоидные с фестончатым краем с валиком по краю амебовидная складчатая с ризоидным краем неправильная нитевидная концентрическая сложная Профиль колонии изогнутый к р атеро об раз и ы й врастающий в субстрат плоский выпуклый Край колонии зубчатый волнистый бугристый каплевидный лопастной конусовидный неправильный гладки» реснитчатый нитчатый ворсинчатый ветвистый Структура колонии однородная струйчатая волокнистая мелкозернистая крупнозернистая
us 3 - консорциумы, образовавшиеся в результате практической дея- тельности человека при приготовлении пищевых продуктов, это разного рода «закваск-и». При выделении чистой культуры из объектов окружающей среды, техногенных потоков, при расчистке загрязненных культур следует учитывать, что однократный пересев микроорганизмов из выросшей колонии на другую среду не всегда гарантирует чистоту культуры. На- пример, колонии слизеобразующих бактерий могут содержать в виде примеси другие микроорганизмы, захваченные со слизью - контами- нантьь Трудности возникают также и при выделении культур на селек- тивной среде. В этом случае контаминанты могут существовать в ла- тентном состоянии и вызывать загрязнение при отборе и пересеве коло- ний. Наилучшая очистка достигается на полной питательной среде, на- пример, МПА. Но даже в этом случае пересевать следует нз оформив- шихся колоний, так как возможно присутствие медленно растущих коп- там инантов. 3,2, Рост на плотных питательных средах На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посе- ва микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где растет микроорганизм клетки (на поверхности плотной пи- тательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхност- ные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием н являются наиболее суще- ственной особенностью роста многих микроорганизмов на плотном субстрате. При itx описании учитывают следующие признаки: форма, профиль, край, структура, размер, поверхность, цвет колонии. Край и структуру колонии определяют с помошью лупы или при малом увеличении микроскопа. Для этого чашку Петри помешают на столик микроскопа крышкой вниз. Размер (диаметр) колонии измеряют в миллиметрах; если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называютточечными. Поверхность колонии - гладкая, шероховатая, бороздчатая, склад- чатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально ис- черченная. Блеск и прозрачность - колония блестящая, матовая, тусклая, муч- нистая, прозрачная.
Цвет колонии - бесцветная (грязно-белые колонии относят к бес- цветным) или пигментированная - белая, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная. Особо отмечают выделение пигмента в суб- страт. При описании колоний актиноминетов отмечают пигментацию воз- душного и субстратного мицелия, а также выделение пигментов в сред)'. Консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой i-ши врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, пленчатой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей). При изучении морфологии клеток в световом микроскопе (бакте- рии - на фиксированных препаратах, объективы с масляной иммерсией; грибы. дрожжи, водоросли, простейшие - на препарате раздавленная капля) определяется не только форма клеток, но их взаимное располо- жение. например, в виде цепочек, неравномерных скоплений и т- п. ’’ Отмечаются также специфические морфологические признаки, ес- ли они имеются, например, наличие эндоспор, экзоспор, капсул, цист, плодовых тел. пли такие свойства, как скользящая подвижность, истин- ное ветвление и способность к размножению почкованием. Необходимо использовать окраску по Граму, как обязательный ме- тод для первичного изучения выделенных штаммов бактерий. 3,3, Характеристика чистой культуры 3.3.1. Обычно колонии из клеток чистой культуры, высеянной на плотную среду, похожи одна на другую, что и служит доказательством чистоты культуры (но есть и исключения, например, в случае диссоциа- ции колоний на гладкие (S) и складчатые (R). Глубинные колонии довольно однообразны. Чаще всего они по ви- цу похожи на более или менее сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными копнами. Лишь у немногих бактерий глубинные колонии напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний час- то сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы вы- деляют углекислоту илидрупге газы. Донные колонии разных микроорганизмов имеют обычно вид тон- ких прозрачных пленок, стелющихся по дну. Размеры и другие особенности колонии могут изменяться с возрас- том и зависят от состава среды. Поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования. 3,3.2. При описании роста микроорганизмов по штриху отмечают следующие особенности: скудный, умеренный или обильный, сплошной
120 с ровным или волнистым краем, четковидный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ри- зоидный. Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверх- ность и консистенцию. Для описания колоний и роста по штриху многие микроорганизмы часто выращивают на мясо-пептонном агаре. 3.3.3. Другой критерий чистоты культуры - это морфология кле- ток. Для чистой культуры обычно характерна высокая степень морфо- логического сходства клеток в окрашенных и влажных препаратах. Од- нако бывают исключения, в зависимости от возраста культуры, исполь- зуемой среды или других условий роста. Возможно образование кокко- видных форм, цист и спор, а также проявление плеоморфизм. 3.4. Изучение физиологии микроорганизмов На первых этапах выделения чистой культуры устанавливается, является ли организм фототрофным, хемоавтотрофным или хемогетеро- трофным. 3.4,1. Определение способности микроорганизмов использовать углеводы и сахаро-спирты. Микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического обмена. Для идентификации большинства гетеротроф- ных микроорганизмов необходимо определить, какие углеродсодержа- щие вещества обеспечивают рост данного организма и какими измене- ниями среды сопровождается его рост. Как правило, используют следующие углеводы: арабинозу, ксило- зу, глюкозу, фруктозу, галактозу, сахарозу, лактозу, мальтозу и спирты - глицерин и маннит. Готовят среду основного состава на водопроводной воде (г/л): пеп- тон - 5,0: К2НРОМ -1.0. Среду разливают в пробирки по 9 мл в каждую и стерилизуют при I атм. Углеводы и спирты рекомендуется стерилизовать отдельно в виде !0 %-ных водных растворов и добавлять после стерилизации к стериль- ной среде в количестве 1%. Растворы дисахаридов лучше стерилизовать фильтрованием, чтобы избежать их гидролиза при высокой температуре. Среды углеводами и спиртами засевают одновременно 0, 1-0,2 мл суспензии клеток изучаемого микроорганизма и ставят в термостат. Ес- ли организм развивается быстро, то результаты можно регистрировать через 48—96 часов, а если медленно — через 7—10 суток. Визуально по помутнению среды, образованию пленки, осадка от- мечают рост или его отсутствие на всех использованных средах. Рост на
J2J средах с этими соединениями может приводить к накоплению органи- ческих кислот, нейтральных продуктов и газов. Образование кислот отмечают по изменению pH среды; образование газов - по появлению на поверхности среды пены. Чтобы обнаружить изменение pH, к среде добавляют индикатор - бромтимолбяау, из расчета 2 мл 4,6 %-ного спиртового раствора на 1 д среды. При pH 6,0 индикатор желтого, а при pH 7,6 синего цвета. Результаты сравнивают с контрольной средой, не содержащей ни углеводов, ни спиртов. На основании полученных результатов делают заключение о том, какие углеводы н спирты использует изучаемый организм., Чтобы исключить необходимость инокулцровать большое количе- ство разлитых по пробиркам сред, в настоящее время разработаны и имеются в продаже разнообразные наборы для удобного и быстрого проведения данных тестов. Подобные системы идентификации приве- дены в работе (5). 3.4.2. По отношению к кислороду микроорганизмы делят на четыре большие группы: I, облигатные аэробы; 2. микроаэрофилы; 3. факультативные анаэробы (аэробы); 4, облигатные анаэробы. Для описания микроорганизмов и дальнейшей идентификации на- блюдают рост изучаемого организма после посева уколом в агаризован- ную среду или после посева в расплавленную агаризованную среду, Строгие аэробы растут на поверхности среды и в самом верхнем ее слое, микроаэрофилы - на некотором расстоянии от поверхности среды, факультативные анаэробы - по всей толще среды, облигатные анаэробы — только в глубине среды. Благоприятную для роста микроорганизма среду (например, МПА) разливают в четыре пробирки на 1/2 ее высоты и стерилизуют при ) атм, В две пробирки с МПА посев проводят уколом. МПА в двух других про- бирках расплавляют в кипящей водяной бане, охлаждают до 45-50° С, а затем в среду добавляют водную суспензию клеток исследуемого орга- низма, тщательно перемешивают и дают агару застыть. Отмечают рост и его интенсивность по уколу и в толще среды и. соответственно, характеризуют отношение организма к кислороду.
I — аэробы: 2 ^микроаэрофилы: 3 - факультативные анаэробы. 4 — анаэробы 3.4.3. Определение ферментативной активности 3.4.3.1. Оксидазную активность можно определить двумя способами. Первый: На отрезок фильтровальной бумаги наносят несколько ка- пель 1' %-ного раствора дигидрохлорида тетраметил-п-фенилендиамипа, приготовленного в тот же день. Выросшую культуру снимают в поверх- ности агаровой среды и наносят ее !!а увлажненную бумагу'. Положитель- ная реакция: развитие фиолетовой или пурпурной окраски в течение !0с. Второй: Этот метод менее чувствителен, чем первый, но он более удобен. Несколько капель смеси (В 1, по об.) I %-ного а-нафтола, раство- ренного в 95 %-ном этаноле, и свежеприготовленного 1 %-ного водного раствора оксалата диметил-п-фениленлиамина наносят на колонии в чаш- ках с агаром. В другом варианте к жидкой культуре добавляют 0,2 мл а-нафтол а и 0,3 мл диметил -п-феннлендиамина ц энергично перемеши- вают. Положительная реакция: окрашивание колоний или бульонной культуры в фиолетово-синий цвет в течение 10-30 с (б). 3.4.3.2. Каталазная активность свойственная большинству аэроб- ных микроорганизмов. Каталаза разлагает перекись водорода с образо- ванием кислорода в соответствии с реакцией: каталаза HjO; -------^Н2О+О> Каталазную активность выявляют следующим образом. Посев произ- водят в пробирках на скошенный питательный агар. После инкубации аливают по капле вниз по косяку 1 мл 3 %-ной перекиси водорода. Сразу же и через 5 минут наблюдают за образованием пузырьков, которое озна-
123 чает положительную реакцию. Можно добавить несколько капель 3 %-ной перекиси водорода к колониям на чашке. В случае бульонной культуры к 1 мл культуры добавляют 1 мл 3 %-ной перекиси водорода и наблюдают та постоянным образованием пузырьков. Чтобы устранить проблему впи- тывания, которая может возникать при добавлении перекиси водорода в колонии, выросшую культуру снимают с поверхности агара неметалличе- ским инструментом и суспендируют в капле 3 %-ной перекиси водорода на предметном стекле. Немедленно и через 5 минут наблюдают за образо- ванием пузырьков визуально или в микроскоп с малым увеличением. Однако следует помнить, что тесты на каталазу и оксидазу не дают хорошей воспроизводимости результатов. 3.4.4. Если известны особые физиологические свойства, присущие микроорганизму, то это облегчает его идентификацию. Например: 1. способность к азотфиксапии; 2. ферментативная активность; 3. образование аммиака; 4. образование сероводорода; 5. восстановление нитратов; 6. способность микроорганизма образовывать пигмент, красящие ве- щества, что свойственно многим бактериям, особенно обитателям почвы и воды и грибам. Колонии пигментообразующих микробов окрашиваются э разнообразные цвета; белый, желтый, красный, розовый, черный, зеленый и др. Если пигмент растворим в воде, то питательная среда, в которой растут пигментообразующие бакте- рии. также окрашивается в соответствующий цвет. Но у некоторых бактерий пигмент остается связанным с клетками. Наиболее актив- но пигментообразование происходит при комнатной температуре, хорошем доступе кислорода и света; 7. чувствительность культуры к антибиотикам и способность проду- цировать антибиотики (таблица 4). 3.5. Исследование динамики роста (построение кривой роста) микроорганизма на глюкозе или другом углеродном субстрате в зави- симости от физиологических особенностей культуры. 3.6. Таксономия н классификация микроорганизмов Таксономией называется наука о классификации микроорганизмов. Группу организмов, обладающих заданной степенью однородности, называют таксоном. Отношение между группами организмов (таксонами) изучает сис- тематика.
124 В соответствии с действующим кодексом номенклатуры бактерий приняты следующие классификационные категории царства прокариотов: отдел - класс — порядок - семейство - род - вид. Вид является основной таксономической единицей. Таблица 4. Наиболее широко применяемые антибиотики Анти- биотик Основной продуцент Объект воздействия Механизм действия Пеницил- лин Penicill iuni chrysogenum Г рам положительные бактерии Подавляет образование клеточной стенки Це ф ало сп Орин Ccplialospo- rium sp. Грамположительные и г рам отрицательные бактерии То же Стрепто- мицин Slreptomy- ces griseus Грамположительные и грамотрицательные бактерии Подавляет функции рибосомальных 50S субъединиц Эритро- мицин S.erythrens Грамположительные бактерии То же Тетра- циклин S.aureofa- ciens Г рам положи тельные и грам отрицательные бактерии Ингибирует связыва- ние аминоацил-тРНК с рибосомой Полимик- Сйн Bacillus po- lymyxa Г рамот р и цате л ь н ы е бактерии Разрушает цито- плазматическую мем- брану Бацитра- цин B.subtilis Грамположительные бактерии Подавляет синтез ком- понента клеточной стенки пент идо глик ина Амфоте- рицин В Streptoniy- ces nodesus Микроскопические грибы Действует на компо- ненты мембрац Хлорам- феникол S.venezuelae Грамположительные и грамотрицательные бактерии; риккетсии Подавляет процесс трансляции в рибосо- мах Для микроорганизмов, так же как и дяя животных и растений, при- нята бинарная система номенклатуры, т. е. указывается родовое и видо- вое название. Например: Bacillus (род) subtil is (вид). В микробиологии используются также такие понятия как штамм И клон, не относящиеся к таксономическим категориям.
125 Штамм - это культура, выделенная из определенного местообитания. Клоц - совокупность особей микроорганизмов, происходящих из одной клетки. Одной из задач таксономии является полное описание и идентифи- кация основных таксономических единиц, видов, т. е, определение к ка- ким таксонам относится организм. Таксономические категории микроорганизмов описываются с по- мощью таких признаков; - морфологические; - цитологические (основные органеллы, строение клетки); - культуральные (характер роста на определенных средах); - физиолого-биохимические; - иммунологические. Для идентификации бактерий помимо этих признаков изучается и ряд других молекулярно-биологических; определение нуклеотидного состава, последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК, последова- тельность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функ- циями и др. Используется также метод гибридизации ДНК, что позволяет оп- ределить степень гомологичцости ДНК организмов (6). Новейший способ идентификации бактерий - это применение ге- нетических зондов. Метод основан на определении специфического участка молекулы ДНК данного организма. Зонд представляет собой небольшой отрезок ДНК, нуклеотидная последовательность которого уникальна для данного вида или рода бактерий. В целях идентификации исследуют реакцию меченного флуоресцентным красителем, радиоизо- топом или биотином зонда с денатурированной молекулой ДНК иссле- дуемого организма. Если ДНК организма содержит комплиментарную зонду последовательность, произойдет ее связывание с ДНК зонда за счет спаривания комплиментарных оснований. К настоящему времени имеются флуоресцентные зонда к генам рибосомных РНК, позволяющие проводить определение живых микро- организмов под микроскопом. Однако, пока не создана систематика микроорганизмов, которая учитывала бы их физиологические особенности, данные их генетиче- ского анализа и филогенетики, г. е. родственных отношений между прокариотами и историю их эволюционного развития. Микроорганизмы в настоящее время не столько систематизирова- ны, сколько каталогизированы. Основная цель составления каталога практическая - осуществить быструю идентификацию микроорганизмов.
126 В соответствии с определителем бактерий признаки, по которым осуществляется разделение бактерий на группы, легко определяемы и вынесены в название группы. Например, группа 7 - «Грамотрицатель- ные палочки и кокки аэробные» (7). Идентификация полученной чистой культуры не является основ- ной задачей самостоятельной работы, поскольку это требует продолжи- тельного времени для выполнения и разнообразных материалов, кото- рыми в полной мере кафедра не располагает. Однако при выполнении самостоятельной работы студент может исследовать ряд важных для идентификации культуры свойств, что мо- жет быть использовано для первичной оценки принадлежности микроор- ганизмов к определенной группе, семейству или роду. В частности, мор- фологические свойства, определение размеров клеток, тип окраски по Граму, способность к аэробному или анаэробному катаболизму сахаров, температурные границы роста, чувствительность к антибиотикам, В лабораторных условиях студентами может быть исследован ряд других простых биохимических и физиологических тестов, которые необходимы для идентификации организмов (раздел 3.4). 4. Представление результатов выполненной работы Результаты выполненной работы оформляются в виде отчета й представляются по форме, соответствующей принятой для научных от- четов, публикации результатов исследований в научных журналах. От- чет включает следующие разделы: I. Введение, в котором обосновывается актуальность темы выпол- ненных исследований, формулируются основная цель работы и ее задачи. 2. Объекты к методы. Описывается основной объект исследова- ния. Перечисляются использованные в работе методы, включенные в методические рекомендации к лабораторным работам по микробиоло- гии. Подробно описываются другие использованные методы, приводит- ся ссылка на источник. 3. Результаты исследований и их обсуждение. Приводятся полу- ченные результаты в виде таблиц, рисунков и графиков, которые обсу- ждаются по мере их представления. Наиболее простым способом представления данных является со- ставление таблт/. Таблица - первый этап регистрации научной инфор- мации. Графически данные могут быть представлены в виде линейного графика. Экспериментально полученные точки соединяются линиями: прямыми, плавной кривой или кривой регрессии. На каждой координат-
127 ной оси необходимо отмечать название и размерность переменной. Шкапы должны быть разбить! на интервалы с равным количеством еди- ниц, которые обозначаются цифрами рядом со шкалой. Если требуется крупный масштаб в области, начинающейся не от нуля, то после нуля на оси делается отметка о разрыве (-//-). Метод оценки значений путем измерения координат любой точки, лежащей на линии, соединяющей экспериментально полученные точки, называется интерполяцией. Метод определения координат крайних точек путем продолжения линии графика дальше значения последней экспериментальной точки, называется экстраполяцией. Крутизну кривой можно оценить с помощью градиента - величи- ны, характеризующей скорость изменения переменной в каждой точке графика. Кроме линейного графика данные могут быть представлены: - диаграммой в виде вертикальных столбцов; - диаграммой в виде горизонтальных столбцов; - гистограммой; - кант-диаграммой (8), Полученные в научных экспериментах данные должны быть стати- стически обработаны. Оценка среднего значения может быть проведена на основании арифметического среднего, медианы и моды. Оценка разброса величии или мера рассеяния включает дисперсию и стандартное отклонение. Статистическая обработка проводится для того, чтобы определить достоверна ли разница между двумя группами данных (8, 9). Все рисунки, таблицы и графики должны быть подписаны. На изо- бражениях, полученных с помощью микрофотосъемки, необходимо указать увеличение. 5. Выводы. 6. Список использованной литературы. Помимо отчета преподавателю представляется чистая культура мик- роорганизма, высеянная на скошенной твердой среде, а также рассеянная на чашке Петри, или другой микробиологический материал. соответст- вующий задачам исследований. Завершенная работа по усмотрению преподавателя может защи- щаться в виде доклада на занятиях группы. Работа оценивается по балльной системе.
128 Приложение Питательные среды для культивирования микроорганизмов Мясная вода. Мясо освобождают от костей, жира, пленок и сухо- жилий. пропускают через мясорубку, заливают двух- или четырехкрат- ным количеством водопроводной воды (по весу) и кипятят в течение часа. Жидкость фильтруют через вату или полотно, затем через фильт- ровальную бумагу; фильтрат измеряют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой. Разливают по 3-5-литровым бутылям и стерилизуют при 120° С в течение 30—40 минут. Мясо-пептонныЙ бульон (МПБ). К мясной воде добавляют 1 % пеп- тона, 0.5% химически чистой поваренной соли и Ю% воды (на выкипа- ние). Кипятят до растворения пептона, затем в еще горячем бульоне уста- навливают (насыщенным раствором едкого натра) pH 7,3-7,5. После до- бавления шелочи бульон еше раз кипятят в течение 15-20 минут и фильт- руют через бумажный фильтр. Бульон разливают по пробиркам (колбам) и стерилизуют при 120° С в течение 15-20 минут (после стерилизации pH, как правило, дает сдвиг на 0,2-0,3 в сторону кислой реакции, Мясо-пептонный агар (МПА). На 1 л мясной воды берут 10 г пеп- тона и 5 г поваренной соли, варят в течение 30 минут, устанавливают pH, фильтруют, добавляют 30 г лучших сортов архангельского агара (одес- ского нужно брать 60 г), нагревают до полного растворения и проверяют реакцию. Фильтруют через вату или марлю (в теплом автоклаве), а затем Прозрачную среду разливают по колбам и стерилизуют при 120° С в те- чение 15-20 минут. Дрожжевой автолпзат используют для приготовления основного питательною субстрата в плотных агаровых средах. Хлебные и пивные дрожжи содержат 40-60% азотистых веществ, а также ряд ферментов, способствующих их самоперевариванию. Дрожжевые среды обеспечи- вают пышный рост, несмотря ца низкое содержание общего азота и сла- бую степень его расщепления. Прессованные пекарские дрожжи нарезают небольшими кусками и закладывают в бутыли с таким расчетом, чтобы автолизат занимал око- ло 1/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей на 20-литровую бутыль). Бу- тыль с дрожжами ставят на 2 суток в термостат при температуре около 60° С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равно- мерного прогревания содержимого (1-2 раза в сутки). Конец автолиза
129 iM пасжижением дрожжей. Автолизат должен характеризуется п^нок „ приятный запах. иметь к°РичнеВ^вт0ЛИзата ухудшается, если процесс протекает при Качество окончании автолиза в бутыль добавляют температуре “родной массе дрожжей) количество теплой водопро- тройное (по не „рожжей 16 л воды). Разведенный автолизат ПОЛНОЙ ВОДЫ 1 * zi'ift водвил авт0КЛав ДЛЯ стерилизации при 1-1,3 атм (120-123° С) на 3(Гмин вставляют на несколько дней (не меньше 5-7 дней) для от- стаивания. „ Твердая среда Сабуро (для дрожжей и грибов). Основой этой среды является дрожжевая вода. На 1 л водопроводной воды берут 80 г прессованных пекарских дрожжей (или 20 г сухих Дрожжей), кипятят 15 мин фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара, нагревают до растворения агара, за- тем добавляют 4% глюкозы (или мальтозы), фильтруют, разливают в- пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Среду можно готовить и не на дрожжах, а на I %-ной пептонной воде. После стерилизации среду в пробирках скашивают. Жидкая среда Сабуро отличается от описанной выше тем, что не содержит агара. Среду разливают в колбы по 150-200 мл, стерилизуют также, как описано выше, Эта среда употребляется главным образом для получения гемокультуры. Пивное сусло-агар (для дрожжей и грибов). Неохмеленное пив- ное сусло разводят водопроводной водой до содержания сахара 7-8% по Каллингу (измеряют сахарометром) и стерилизуют при 110° С 10 мин. В таком виде сусло может сохранятся длительное время. Перед употреб- лением надое а до иную жидкость осторожно сливают с осадка. В I л сте- рильного сусла добавляют 18 г агара, нагревают до растворения агара и разливают по колбам. Стерилизуют при 110° С 10 мин. Жидкое сусло после сливания отстоявшейся жидкости с осадка разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при режиме, указанном для сусло-агара. Среда Чапека (для грибов) (г/л): NaNO3 - 2; КС1 - 0.5; КН2РО4 - 1; Fe^SO^HjO - 0,01; MgSO47H2O - ’ > pH 5,2. Стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 20 мин. После сте- рилизации в колбы над пламенем горелки добавляют источник углерода. Среда для культивирования простейших (г/100 мл): Tpajr!F'Jri0K03a ~ Пептон - 0,2; Морская соль - 0,1; Дрожжевой экс-
130 Среда для культивирования актиномицетов: Агар на отваре из овсяной муки: (00 г муки в i л воды кипятят на водяной бане в течение часа при 60° С, фильтруют, добавляют 3% агара, стерилизуют при 1 атм. Среда Заркуа (для культивирования цианобактерий) (г/л): NaHCO3 - 8,0; MgSO„-7H>O - 0,2; К2НРО1( - 0,5; СаС12 - 0,04; NaNO3 - 6,0; FeSO4 - 0,01, K2SO4 - 1,0; ЭДТА - 0,08. Рекомендуемая литература 1, Шлегель Г. Общая микробиология, М.: Мир, 1987, С. 10-175. 2. Руководство к практическим занятиям по микробиологии./Под ред. Н.С.Егорова. М.: Изд-во МГУ им.М.В-Ломоносова, 1995. 3. Методы почвенной микробиологии и биохимии. /Под ред. Д.Г.Звягинцева. М.:Изд-во МГУ им.М.В.Ломоносова, 1991. С. 61- 110,229-254. 4. Бабаева И.П., Зенова Г.М. Биология почв, М.: Изд. МГУ нм. М.В. Ломоносова, 1989. С. 154-195. 5. L. Amato et al. Substrate profile systems for the identification of bacteria and yeasts by rapid and automated approaches. In: Manual of Clinical Microbiology: Baiows, Hausler, Herrmann, Isenberg and Shadomy (Eds.), 5 th Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1991. 6. Методы общей бактериологии в 3-х томах. /Под ред. Ф. Герхард а и др., М.: Мир, 1984. 7. Определитель бактерий Берджи в 2-х томах. 9-е изд. М,: Мир, 1997. 8. Грин И., СтаутУ., ТейлорД. Биология в 3-х томах, М.: Мир, 1996. 9. Голикова Т.И., Никитина Е.П., Терехин А. Т. Математическая ста- тистика. М.: Изд-во МГУ им. М.В. Ломоносова, 1981-
Учебное издание Градова Нина Борисовна Бабусеико Елена Сергеевна Горнова Ирина Борисовна Гусарова Наталья Александровна Лабораторный практикум по общей микробиологии Редактор О. В. Саламаха 1, . Художественный редактор В.Н Смирнов I - й" « г. ’ I Изд. лип ИД №02300 ст 32.07 00. Подписано в печать 24.05 01 Формат 60Х 84 1/16 Бумага офсет Л 2. Гарнитура ’'Таймс”. Усл печ. л. 7,6. Уч.-изд. л 6,4. Тирах W00 зкч Заказ № Издательство «ДеЛи прим r>> 123181. г Москва, а/я 42. гел. (095) 264-9947 Типография МИФИ. 115409. г. Москва. Каширское iu._ 3 [