Текст
АКАДЕМИЯ НАУК СССР
А. И.ЗОТИИ ^Физиология ВОДНОГО ОБМЕНА У ЗАРОДЫШЕЙ РЫБ И КРУГЛОРОТЫХ
ИЗДАТЕЛЬСТВО АКАДЕМИИ НАУК СССР
АКАДЕМИЯ НАУК СССР
ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЖИВОТНЫХ им. л. Н. СЕВЕРЦОВА
А. И. 3 ОТ ИН
ФИЗИОЛОГИЯ ВОДНОГО ОБМЕНА У ЗАРОДЫШЕЙ РЫБ И КРУГЛОРОТЫХ
ИЗДАТЕЛЬСТВО АКАДЕМИИ НАУК СССР
МОСКВА 1961
Ответственный редактор доктор биологических наук
Т. А. Д Е Т Л А Ф
ПРЕДИСЛОВИЕ
В течение эмбрионального развития рыб только два вещества поступают из окружающей среды в зародыши: кислород и вода. Естественен поэтому интерес к роли этих веществ в развитии рыб. Однако, если значение кислорода и дыхания в зародышевом развитии изучены достаточно хорошо, то о роли воды в развитии мало что известно. Обычно отмечают значение воды как среды для различных химических реакций, протекающих в зародышах. Это общее положение не исчерпывает, конечно, всего значения воды в биохимии развития зародышей, но конкретных данных о путях и механизме вовлечения воды в биохимические реакции у зародышей рыб пока не получено.
Исходя из этого, очевидно, что проблема водного обмена зародышей рыб в настоящее время может быть изложена только как физиологическая проблема. Конечно, в книге, посвященной водному обмену, невозможно полностью обойтись без попыток понять способы и механизм вовлечения воды в биохимические реакции, особенно в процессе обновления воды у зародышей, однако при современном уровне знаний еще преждевременно делать какие-либо обобщения или проста обзоры вопросов, связанных с биохимией водного обмена зародышей рыб. Одной из целей этой книги является стремление в какой-то мере подготовить физиологическую базу для постановки исследований по биохимии водного обмена у зародышей рыб.
Физиология водного обмена зародышей рыб имеет и свои собственные проблемы и цели, последовательно изложенные в книге, которые сводятся к изучению физиологических механизмов процессов: 1) поступления, перераспределения и выведения воды из зародышей, 2) изменения зародышей в осмотически необычных условиях среды (изучение осмотических свойств яиц и зародышей) и 3) обновления воды в зародышах. Каждый из этих разделов имеет свои большие и малые вопросы, иногда тесно связанные с более общими проблемами морфо
3
генеза, физиологии и биохимии развития (с теориями активации, проницаемости, клеточной секреции и др.).
Распределение материалов по главам и, так сказать, весомость каждой отдельной главы определялись, к сожалению, не значимостью того или иного вопроса для физиологии водного обмена зародышей рыб, а степенью изученности и обилием литературы по данному вопросу. Это особенно относится к первым главам, где излагаются обширные экспериментальные материалы по механизму поступления в яйца воды, идущей на образование перивителлиновой жидкости и набухание оболочек. Такое положение дел является вполне естественным, так как более простые явления, такие как образование перивителлинового пространства или набухание оболочек, значительно проще исследовать и понять. Вместе с тем, эти исследования, проведенные усилиями многих ученых с необычайной полнотой, дают нам яркий пример того, с какими трудностями происходит познание самых элементарных биологических явлений и насколько тесно оказываются связанными эти явления со многими другими значительно более сложными биологическими процессами.
В настоящее время невозможно рассматривать физиологические или биохимические процессы, происходящие в зародышах рыб, не учитывая экологических особенностей развития зародышей. Это в полной мере относится и к физиологии водного обмена зародышей рыб, что нашло свое отражение во многих главах книги. Глава V целиком посвящена этим вопросам.
Изучение водного обмена зародышей рыб, по-видимому, будет иметь большое значение для некоторых вопросов искусственного разведения рыб. В частности, оказалось, что скорость поступления воды в зародыши рыб зависит от условий развития зародышей и поэтому, наряду с дыханием, может служить физиологическим критерием хороших условий инкубации икры. Некоторые другие возможные применения данных, полученных при изучении водного обмена зародышей рыб, в практике указаны в заключении.
Изложение материалов в книге ограничено данными, полученными при работе с яйцами костистых рыб, осетровых и миног. Материалы о водном обмене зародышей акуловых рыб не были включены в книгу, так как по характеру физиологии развития и строению яиц они резко отличаются от зародышей других рыб. Рассмотрение этих данных могло бы увести в сторону от основных проблем, рассматриваемых в книге, и значительно увеличить ее объем, так как понимание физиологии водного обмена зародышей акуловых рыб невозможно без привлечения многочисленных материалов, полученных при 4 .
изучении зародышей рептилий и птиц. Наоборот, изложение физиологии водного обмена зародышей рыб и миног оказалось невозможным без привлечения данных, полученных на зародышах амфибий и иглокожих. Хотя я старался как можно меньше пользоваться этими материалами, все же в большинстве глав они занимают достаточно большое место.
Наконец, хотелось бы отметить еще одну особенность книги, которая связана, с одной стороны, с желанием облегчить чтение книги для тех, кто далек от проблем, разбираемых в ней, с другой стороны,— с желанием несколько оживить изложение. Эта особенность книги сводится к тому, что обсуждение почти каждой проблемы заканчивается обобщением механизма процесса в виде схем, степень обоснованности которых и достоверность различны. Если эти схемы вызовут интерес у читателей, я буду считать, что книга достигла своей цели. Хотелось бы также, чтобы справочные материалы, помещенные в книге, были полезны для читателей, интересующихся физиологией, биохимией и экологией развития рыб.
Написание книги, затрагивающей различные проблемы зародышевого развития рыб, связано с большими трудностями собирания и обобщения обширной литературы. Надеюсь, что литература до 1960 г. использована с достаточной полнотой. При работе по сбору литературы я пользовался многими библиографическими изданиями, такими, как «Реферативный журнал биология», «Реферативный журнал биохимия», «Летопись журнальных статей», «Biological Abstracts», «Zoological Record», библиографическими обзорами В. А. Невского в журнале «Рыбное хозяйство», В. В. Алпатова в журнале «Успехи современной биологии», книгами и статьями Н. *С. Романова (1955, 1959), И. И. Николаева (1955) и С. Н. Шехонина (1959). Не все работы, которые известны мне по этим библиографическим изданиям и по обычным источникам сбора литературы, удалось найти и использовать, однако многие труднодоступные работы, особенно японских авторов, все же были получены. В этом мне большую помощь оказал доктор Т. С. Ямамото (Yamamoto, Т. S.), который не только прислал оттиски своих работ, но и помог мне установить контакт и получить оттиски работ других японских авторов, так много сделавших для понимания механизма активации и образования перивителлинового пространства у яиц рыб и миног. Приношу глубокую благодарность доктору Т. С. Ямамото и всем другим авторам, приславшим мне оттиски своих работ.
Я должен также отметить большое значение советов, замечаний и помощи моих друзей и товарищей по работе Т. А. Детлаф, А. С. Гинзбург, Г. М. Игнатьевой, А. В. Попова,
а
С. Э. Голосовской, Р. В. Пагнаевой, Л. А. Филатовой и Л. В. Шкапской, которым я выражаю свою искреннюю благодарность и признательность. При подготовке рукописи к печати особенно большую помошь оказала Р. В. Пагнаева.
Я благодарен члену-корр. АН СССР Б. Л. Астаурову, доктору биологических наук Г. В. Лопашову и проф. В. А. Дорфману за те ценные замечания и поправки, которые они сделали при обсуждении данной работы и чтении рукописи, а также А. Ф. Маркову, А. В. Попову, П. А. Самсоненко и И. П. Гречановскому за предоставление рабочего места и материалов при многолетней работе с зародышами лососевых и осетровых рыб на Свирском рыбоводном заводе и на Рогожкинском осетровом рыбоводном заводе.
Глава I
НАБУХАНИЕ ЯЙЦЕВЫХ ОБОЛОЧЕК И ОБРАЗОВАНИЕ ПЕРИВИТЕЛЛИНОВОГО
ПРОСТРАНСТВА
При оплодотворении или активации яиц рыб яйцевые оболочки, до этого плотно прилегающие к поверхности яйца, отделяются от нее и образуется перивителлиновое пространство, наполненное жидкостью. Сами оболочки при этом претерпевают целый ряд изменений: появляется клейкость, происходит их набухание, изменяется структура, резко увеличивается прочность. У разных видов рыб эти процессы идут различно в зависимости от строения яиц и яйцевых оболочек и экологии развития зародышей.
Уже простые морфологические наблюдения над образованием перивителлинового пространства и набуханием оболочек наталкивали на мысль, что эти процессы играют существенную роль в потреблении воды яйцами рыб из окружающей среды сразу после оплодотворения или активации. Однако только довольно многочисленные экспериментальные исследования точно показали, что то и другое происходит за счет поступления воды, главным образом из окружающей среды.
Следовательно, размеры перивителлинового пространства и студенистой оболочки определяют объем поступающей в яйцо воды, а скорость их образования определяет скорость потребления воды яйцами в первое время после оплодотворения. У яиц разных видов рыб скорость образования перивителлинового пространства и изменение оболочек, так же как и их 'размеры, сильно варьируют и этим, очевидно определяются специфические особенности характера потребления воды яйцами на самых первых стадиях развития.
Осетровые. Как показали многочисленные исследования овоцитов (Ольшванг, 1936; Молчанова, 1941; Вотинов, 1947; Детлаф и Гинзбург, 1950, 1954; Иванова, 1953; Гинзбург и Детлаф, 1955; Иванов, 1956; Садов, 1956, 1958) и зре
7
лых неоплодотворенных яиц (Заленский, 1878; Пельцами, 1883; Ершов, 1936; Астауров, 1951; Детлаф и Гинзбург, 1951а, 1954; Зарянова, 1954, 1956) осетровых рыб, система яйцевых оболочек у них представлена внутренней и внешней желточными и наружной студенистой оболочками (соответственно zona radiata interna, z. r. externa и сотовый или студенистый слой овоцитов). После оплодотворения внутренняя желточная оболочка отходит от поверхности яйца и образуется периви-теллиновое пространство. Внешняя желточная и тесно с ней связанная студенистая оболочки (капсульная оболочка) отделяются от внутренней желточной оболочки. Происходит значительное разбухание студенистой оболочки и общее увеличение объема яйца (Ершов, 1936; Астауров, 1951; Детлаф и Гинзбург, 19516, 1954; Гинзбург и Детлаф,1955; Зотин, 1953д, 1955а; Зарянова, 1954, 1956).
Оболочки неоплодотворенных яиц донской севрюги (Aci-penser stellatus Pallas) имеют толщину 70 у, донского осетра (A. gflldenstadti colchicus V. Marti) — НО—150 у. (Детлаф и Гинзбург, 1954). Толщина оболочек не одинакова в разных частях яйца: в области анимального полюса оболочки тоньше. В первые 6—8 мин. после оплодотворения толщина оболочек не изменяется заметным образом, а затем она начинает быстро увеличиваться (рис. 1). Через 15 мин. после осеменения при 16,8° толщина оболочек удваивается, а к началу первого деления — утраивается. У севрюги она в это время достигает 180—200, у осетра — 360—400 у. (Детлаф и Гинзбург, 1954). На основании этих данных можно оценить величину набухания оболочек севрюги и осетра после оплодотворения. Принимая, что объем зрелых неоплодотворенных яиц севрюги в среднем равен 10,2 и объем яиц осетра 17,6 мм3 (расчет из данных Детлаф и Гинзбург, 1954), мы можем видеть, что объем оболочек увеличивается после оплодотворения у яиц севрюги на 2,7—3,3 и у яиц осетра на 7,9—12,3 мм3.
Неоплодотворенные яйца волжского осетра имеют размеры в среднем 3,05x3,35 мм и севрюги 2,57X2,87 мм (Зарянова, 1954). Через 3 часа после оплодотворения размеры яиц осетра достигают в среднем 3,42X3,70 мм, а размеры яиц севрюги (через 50 мин) 2,94X3,25 мм. Рассчитывая из этих данных (по формуле объема эллипсоида вращения) увеличение объема яиц волжского осетра и севрюги после оплодотворения, мы получим, что объем оболочек яиц волжского осетра увеличивается приблизительно на 6,4 и яиц севрюги на 4,7 мм3. Эти цифры близки данным, полученным из материалов Т. А. Детлаф и А. С. Гинзбург.
Для доказательства того, что набухание оболочек яиц осетровых рыб связано с поступлением воды из окружающей'
8
Рис. 1. Набухание оболочек и образование периви-теллинового пространства у яиц осетра при 16,8°С.
Фотография яиц, вид сбоку:
а — 5 мин после оплодотворения; 6—10 мин-, в — 15 мин-, г — 30 мин, появилось узкое перивителлииовое пространство; д — 2 часа; в — 22 часа. Стрелкой указан аиимальный полюс (Детлаф и Гинзбург, 1954)
среды, мною были поставлены специальные опыты. Поступление воды в яйца изучалось методом, в основу которого положено измерение плотности яиц (Зотин, 1953а, д, 1955а, б).
Метод основан на измерении плотности яиц по скорости их падения. Подобный же метод был применен Ягль (Yagle, 1930) для изучения проницаемости оболочек яиц Fundulus heteroclitus. Однако автор не обратила достаточного внимания на разработку математической стороны метода, поэтому полученные ею результаты подверглись справедливой критике (Brooks a. Brooks, 1941), а метод не получил распространения, несмотря на удобство и простоту. Трудности определения плотности яиц по скорости падения сводятся к трудностям математического описания падения яиц, так как формула Стокса, которую применяла Ягль (1930), в этом случае не применима. Исходя из некоторых эмпирических зависимостей, известных из гидродинамики, между коэффициентом сопротивления движущемуся шару и числом Рейнольдса, были получены формулы, при помощи которых можно пересчитывать изменение скорости падения яйца на объем поступившей в него воды. В окончательном виде основная формула имеет следующий вид (вывод см. Зотин, 1953а):
TJ1.37 = 52,8 [Уо (о — р) — ДУ (р-1)] ..
р0,37 тд0,88 (г3 + О,238ДУ)0,45 ’ ' ’
rjifi U — скорость падения яйца (см-сек-1);
Vo—начальный объем яйца (радиуса го) (см3);
ДУ — объем поступившей или вышедшей из яйца воды (ел3);
а — плотность яйца с радиусом Го (г • см-3);
р — плотность среды (г • см~3);
т; —вязкость среды (г• см-1 • сек-1).
В формулу (1) входят две неизвестные величины: скорость падения яйца (определяется из опыта) и количество поступившей в яйцо воды, р и 1) находятся по таблицам или экспериментально; чтобы найти Го, достаточно измерить диаметр яйца на одной из стадий развития; а определяется из формулы (см. Зотин, 1953, а)
<5 = р + 0,0732
„0,37 0,83 j1,37tt1,37
Р / ио о
Vo
(2)
где d и Uo— соответственно диаметр и скорость падения яиц с начальным объемом Vo и радиусом г0.
Непосредственно из формулы (1) ДУ вычислить нельзя, так как ДУ входит в знаменатель в составе многочлена, поэтому для нахождения ДУ необходимо сначала составить график зависимости ДУ от U и затем находить ДУ графически.
Можно преобразовать формулу (1) так, чтобы вычислять ДУ, не прибегая к графическому способу (Зотин, 19556). Однако опыт показывает, что удобнее пользоваться графическим способом нахождения ДУ, основываясь на формуле (1).
Для измерения скорости падения яиц применялся прибор, показанный на рис. 2. Определялось время падения яйца между двумя метками, нанесенными на расстоянии 20 или 60 см друг от друга (первое — для яиц осетровых рыб, вьюиа, судака и сига, второе — для яиц лосося и форели). Диаметр трубки должен не менее чем в три-четыре раза превышать диаметр яйца, иначе на скорость падения будут оказывать заметное влияние стенки трубки. В качестве жидкостей применялись дистиллированная вода; 0,18; 0,27 и 0,37 м растворы сахарозы. Измерительная трубка соединяется
с чашкой посредством двух зажимов, поочередное открывание которых позволяет переводить яйцо из измерительной трубки в чашку, не выливая раствора из трубки. Такое устройство прибора позволяет применять его для решения двух задач: 1) измеряя скорость падения яиц на разных ста--диях развития, можно по формуле (1) определить количество воды, поступающей в яйца, 2) измеряя через известные промежутки времени скорость падения яиц, по-Д мещенных в раствор сахарозы, можно изучать
кинетику выхода воды из яиц в гипертониче-
5 ской среде (см. гл. 6). В последнем случае яйца
переводятся из измерительной трубки в ча-i. шку, где оставляются до нового измерения
- скорости падения. Так как в трубке и в чашке
-- находится один и тот же раствор, то яйца ока-
У зываются под непрерывным действием гипер-
0 тонического раствора. При изучении выхода во-
ды из яиц в гипертонических растворах прп-; меняется формула (1).
На вис. 3 приведены данные о потреблении воды яйцами севрюги, полученные при помощи описанного метода. В течение первых 6—8 мин. после оплодотворения вода в яйца не поступает (рис. 3). Затем начинается быстрое поступление воды в яйца. К началу дробления содержание воды в яйцах достигает максимального значения для данного периода развития. В среднем за первые 2—3 часа после оплодотворения в яйцо севрюги поступает 2,5, а в яйцо осетра 9,5 .и.и3 воды.
Рис. 2. Прибор для опре- Эти цифры близки величинам увеличе-деления плотности яиц ния объема оболочек яиц севрюги и по скорости их падения осетра, вычисленных из данных Т. А. Детлаф и А. С. Гинзбург (1954) (соответственно 2,7—3,3 и 7,9—11,3 мм3).
Сходные данные были получены для яиц белуги (Husa husa L) (Зотин, 1955а) и осетра (Acipenser giildenstadti colchi-cus V. Marti). На рис. 4, Б показано изменение толщины обо-
лочек яиц осетра после оплодотворения при 19,0°. Сразу
после осеменения и помещения яиц осетра в воду различить трехслойное строение оболочки при наблюдении в отраженном свете не удается. Через 8—10 мин. впервые становятся заметными контуры внутренней желточной оболочки. Примерно с этого момента начинает увеличиваться толщина оболочек, в основном (р,ис. 4, Б) вследствие утолщения наружной студенистой оболочки. Для более точного учета увеличения толщины оболочек было проведено измерение
10
объема оболочек яиц из той же партии икры и в те же сроки. С этой целью путем зарисовок наружных и внутренних контуров яйцевых оболочек определялся объем яйца во всех оболочках и объем яйца без оболочек. Затем вычислялся объем оболочек: от объема яйца во всех оболочках отнимался объем яйца без оболочек. На рис. 4, А показано изменение
Рис. 3. Поступление воды во всех оболочках (/) ив
в яйца севрюги после оплодотворения яйца, лишенные капсульной оболочки (2)
при 20° С
объема оболочек яиц осетра, измеренных описанным способом. Для сопоставления на этом же рисунке приведена кривая поступления воды в яйца. Кривая увеличения объема оболочек совпадает с кривой поступления воды в яйца из окружающей среды. Объем оболочек у яиц осетра увеличивается на 9,8 мм3, за это же время в яйцо поступает около 9,4 мм3 воды. Таким образом, увеличение объема оболочек севрюги, осетра и белуги совпадает с объемом воды, поступившей в яйцо после оплодотворения, т. е. происходит благодаря оводнению оболочек.
Связь между поступлением воды в яйца осетровых рыб после оплодотворения с набуханием яйцевых оболочек можно показать и более прямым путем. На рис. 3 приводились кривые поступления воды в яйца севрюги во всех оболочках и в яйца, у которых удалены капсульные оболочки. Как видно из рис. 3, 2 яйца, лишенные капсульных оболочек, потребляют в несколько раз меньше воды, чем яйца, имеющие все оболочки. Это показывает, что вода, поступающая в яйца севрюги в первое время после оплодотворения, идет главным образом на увеличение объема студенистой оболочки.
У яиц разных видов осетровых рыб при набухании студенистых оболочек после оплодотворения в яйцо поступает разное количество воды из окружающей среды, но это не значит,
Рис. 4. А —количество воды, поступающей в яйца осетра (У), и изменение объема оболочек (2) после оплодотворения; Б — изменение толщины оболочек у этих же яиц
Расчет показывает, что на единицу объема оболочек неоплодотворенных яиц из окружающей среды поступает для набухания у яиц севрюги 1,83—2,24 единиц воды, у яиц осетра 1,75—3,32 и у яиц белуги — 1,32, т. е. оводнение оболочек у всех трех видов приблизительно одинаково.
До сих пор мы рассматривали поступление воды в яйца осетровых рыб как результат набухания и увеличения объема студенистых оболочек. Однако не вся вода, поступающая в яйца после оплодотворения, идет на набухание оболочек — часть ее проходит через оболочки и участвует в образовании перивителлинового пространства.
Наблюдения за живыми яйцами севрюги и осетра, помещенными в вертикальную камеру, позволяющую рассматри-12
вать яйцо сбоку, показали, что через некоторое время после оплодотворения в верхней части между анимальным полюсом яйца и оболочками образуется перивителлиновое пространство (Детлаф и Гинзбург, 1954). В самые первые минуты после оплодотворения его обнаружить не удается (рис. 1). Затем между анимальной областью яйца и оболочками становится заметной узкая щель. По мере ее расширения происходит уплощение анимальной области и возникает пространство, заполненное мутноватой, слабо опалесцирующей жидкостью, которая при фиксации икры формалином 'коагулирует и превращается в довольно плотный студень (Детлаф и Гинзбург, 1954; Гинзбург и Детлаф, 1955). Состав перивителлиновой жидкости оказался довольно сложным (Детлаф, 19576). Этот вопрос будет подробней рассмотрен в дальнейшем (|Стр. 55); в данный же момент нас интересует другое: в какой мере образование перивителлиновой жидкости связано с потреблением воды яйцами из окружающей среды? На рис. 3 видно, что яйца севрюги, лишенные капсульной оболочки, потребляют воду из окружающей среды, особенно интенсивно в период с 10 до 30 мин после оплодотворения. Как показывают наблюдения А. С. Гинзбург и Т. А. Детлаф (1955) и Детлаф (1958в), примерно в это же время образуется перивителлиновое пространство. На рис. 1 этого не видно, так как наблюдение начала образования перивителлинового пространства затруднительно при наличии всех оболочек. Если же фотографировать яйца, лишенные капсульной оболочки (фото рис. 1 сделано с яиц во всех оболочках), то можно заметить, что образование перивителлинового пространства начинается через 12—15 мин после оплодотворения и почти заканчивается через 30 —35 мин (рис. 5). Эти цифры сопоставимы с данными о потреблении воды яйцами, лишенными капсульной оболочки.
Как видно на рис. 3, без капсульной оболочки яйца севрюги потребляют после оплодотворения в первые 2—3 часа около 0,7 ммл воды. Согласно наблюдениям Е. Б. Зариновой (1954), размеры перивителлинового пространства у яиц севрюги составляют 1,19—4,30% диаметра яиц. Из этих данных можно примерно вычислить величину объема перивителлинового пространства у севрюги: оно равно 0,5—1,9 мм\ Следовательно, объем перивителлиновой жидкости приблизительно соответствует объему воды, поступившей в яйцо севрюги, без капсульной оболочки.
Были проведены и прямые опыты, показывающие, что для образования перивителлиновой жидкости необходимо поступление воды в яйцо из окружающей среды. У яиц осетра через 1,2, 5, 10, 15, 25 и 40 мин после осеменения и помещения в
13
воду снимали капсульную оболочку. Затем их обсушивали на фильтровальной бумаге и помещали в безводную среду (вазелиновое масло). Перивителлиновое пространство образова-тось только у яиц, пробывших в воде, до помещения в масло,.
Рис. 5. Фотографии образования перивителлинового пространства у яиц севрюги (вид сбоку), лишенных капсульной оболочки (t = 22,4°):
а — 10 мин после оплодотворения; 6—14 мин; в — 16 мин; г — 20 мин; д — 24 мин; е — 40 мин
не менее 15 мин, т. е. у таких яиц, в которые уже начала поступать вода из окружающей среды. У осемененных яиц, лишенных воды, сразу после оплодотворения перивителлинового-
14
пространства не образовывалось, хотя они нормально дробились и даже гастролировали, находясь в вазелиновом масле.
Миноги. Зрелые неоплодотворенные яйца миног имеют эллипсовидную форму со слабой вдавленностью на анималь-ном полюсе. Желточная оболочка, плотно прилегающая к поверхности яйца, состоит из двух слоев (Calberla, 1878; Нег-fort, 1893, 1901; Okkelberg, 1914; Schartau u.'Montalenti, 1941; T. Yamamoto, 1944c; T. S. Yamamoto, 1956; Hardisty, 1957). В анимальной области снаружи от оболочки расположена студенистая масса или «хлопья», а в вегетативной — слой, который становится клейким после добавления воды (Нег-fort, 1901; Okkelberg, 1914; Schartau u. Montalenti, 1941; T. S. Yamamoto, 1956). Клейкий слой и студенистая масса становятся особенно заметны при погружении яиц в разведенную тушь (Schartau u. Montalenti, 1941). По мнению этих авторов и Т. С. Ямамото (1956), в студенистую массу происходит внедрение сперматозоидов после осеменения, и она содержит вещества, ускоряющие и направляющие движения сперматозоидов.
Наблюдения, над образованием перивителлинового пространства и изменением оболочек после оплодотворения проведены на яйцах Lampetra planeri (Calberla, 1878; Т. Yamamoto, 1944с; Hardisty, 1957), L. wilderi (Okkelberg, 1914), L. fluviatilis (Schartau u. Mantalenti, 1941; Генина, 1957; Генина и Эрик, 1958), L. japonica (T. S. Yamamoto, 1956) и L. reissneri (Kpisa a. Ootake, 1959). Отделение оболочек у яиц миног начинается на анимальном полюсе в области микропиле, а затем волнообразно распространяется по поверхности яйца, заканчиваясь на вегетативном полюсе (рис. 6). По мере отделения оболочек между ними и кортикальным слоем яйца образуются нити, которые затем разрушаются (Calberla, 1878; Okkelberg, 1914, и др.). Возникает большое перивителлиновое пространство, которое у яиц L. planeri достигает 30% от объема яйца (Hardisty, 1957), а у яиц L. fluviatilis— 20—25% (Генина и Эрик, 1958). Одновременно с образованием перивителлинового пространства внешний слой желточной оболочки и клейкий слой начинают набухать, граница между ними становится малозаметной. Студенистая масса исчезает ко времени первого деления (Т. S. Yamamoto, 1956).
У неоплодотворенных яиц, активированных уколом, действием температуры, постоянным током или различными химическими веществами, изменение оболочек и образование перивителлинового пространства происходит таким же образом, как у оплодотворенных яиц (Т. Yamamoto, 1944с, 1945). У яиц, активированных уколом стеклянной иглы, отделение оболочек и образование перивителлинового пространства
15
начинается не на анимальном полюсе, а в месте укола (Т. Yamamoto, 1944с).
Согласно наблюдениям Оккельберга (1914), после оплодотворения яиц L. wilderi (Gage) одновременно с увеличением объема перивителлинового пространства происходит
Рис. 6. Последовательные стадии образования перивителлинового пространства и набухания оболочек у яиц миноги Lampetra reissneri (Kusa а.
Ootake, 1959)
довольно значительное сокращение объема собственно яйца: объем яйца уменьшается с 0,6017 до 0,5205 мм3, т. е. на 13,45%. Небольшое уменьшение объема яйца L. planeri после оплодотворения можно видеть и на кривых, приводимых в работе Хардисти (1957). Эти наблюдения показывают, что образование перивителлинового пространства у яиц миноги может происходить не только за счет поступления воды в яйца из окружающей среды, но и благодаря сокращению объема самого зародыша.
16
Костистые. В отличие от осетровых рыб и миног, строение яйцевых оболочек которых однотипно у разных видов, оболочки яиц костистых рыб имеют довольно разнообразное строение. Так еще Эйгенман (Eigenmann, 1890) на основании изучения овоцитов разных видов костистых рыб выдвинул следующую классификацию оболочек.
1. Яйца с одной оболочкой (zona radiata):
a) zona radiata — единичный слой однородной структуры (примеры: Notemigonus chrysoleucus, Carassius auratus);
6) zona radiata разделяется на внутренний и наружный слои (примеры: Morone americana, Esox reticulatus, Cycloga-ster lineatus, Amiurus catus).
2. Яйца c zona radiata и тонким гомогенным внешним слоем:
а) внешняя оболочка без отростков (пример: Clupea ver-nalis);
б) внешняя оболочка несет нитевидные отростки (пример: Fundulus heteroclitus, F. diaphanus);
в) внешняя оболочка с короткими отростками (пример: Pugosteus pungitius).
3. Яйца с zona radiata и толстым внешним слоем, образованным секрецией или превращением фолликулярного эпителия (пример: Perea americana).
Примеры, приводимыеЭйгенманом, можно было бы значительно расширить. Возможно также ввести и другие подразделения, отражающие строение оболочек яиц некоторых костистых рыб. Однако достаточно и этой схемы, чтобы увидеть, что у большинства видов костистых рыб система яйцевых оболочек зародышей представлена единичной желточной оболочкой и различным количеством клейких ворсинок, иногда сливающихся в тонкий студенистый слой. Так как набухание оболочек связано (как мы видели у осетровых рыб) с увеличением толщины студенистой или слизистой оболочки, то у большинства видов рыб потребление воды яйцами после оплодотворения зависит не от разбухания оболочек, а главным образом от образования перивителлинового пространства.
У яиц некоторых костистых рыб (3-я группа Эйгенмана) описано присутствие значительных по толщине студенистых или слизистых оболочек, а также различных слизистых общих для всей кладки икры оболочек, в которую включены отдельные икринки. Так, у яиц окуня над желточной оболочкой располагается толстый студенистый слой (Eigenmann, 1890; Мейен, 1927; Строганов, 1938; Персональная, 1946; Thomo-poulos, 1953а; Иванов, 1956, 1958а, б), который образуется У овоцитов, благодаря секреции фолликулярного эпителия (Иванов, 1958а, б). Зрелые икринки окуня соединены между
2 А. И. Зотин 47
собой, студенистыми оболочками, и кладка икры имеет вид Широкой длинной студенистой ленты (Крыжановский, Дислер, Смирнова, 1.953).
Мощный студенистый слой над тонкой желточной оболочкой описан у яиц сома Silurus glanis L. (Крыжановский, 1949; Иванов, 1956, 1958а, б). Он , об разуется у овоцитов за счет преобразования фолликулярного эпителия в студенистый слой (Иванов, 1958а, б). Толстый студенистый слой имеется также у яиц других сомовых рыб (Соин, 1947, Крыжановский, 1949, Крыжановский, Смирнов и Соин, 1951), у некоторых видов амурских пескарей (Крыжановский, Смирнов и Соин, 1951), японской камбалы (Перцева-Остроумова, 1953) и других рыб. Хотя исследования потребления воды яйцами этих видов костистых руб не проводились, все же можно думать, что у них набухание студенистого слоя оболочек, как и у яиц осетровых рыб, связано с поступлением воды из окружающей среды. Рассчитывая из данных С. Г. Соина (1947), С. Г. Кры-жановского (1949), С. Г. Крыж айовского, А. И. Смирнова и С. Г. Соина (1951), Н. С. Персональной (1946) объем студенистого слоя, можно принять, что в первое рремя после оплодотворения яйца Perea fluviatilis потребляют1 для набухания оболочек около 1,6—2,2 мм3, или 0,9—1,1 мг/мм3 воды, яйца Silurus glanjs —18,1 мм3, или. 4,3 мг/мм3, яйца амурского сома Parasilurus asotus (Цппё)—24,0—64,0 мм3, или 7,0 — 9,3 мг/мм3, яйца косатки-скрипуна Pseudobagrus fulvidraco (Richardson) —3,5 мм3, или 0,66 мг/мм3, яйца косатки Бражникова Liocassis brashnikovi Berg — 2,1 мм3, или 0,53 мг/мм3.
Значительно подробнее исследованы вопросы, связанные с образованием у яиц костистых рыб перивителлинового пространства. Перивителлиновое пространство у разных видов костистых рыб отличается по размерам, форме и времени образования. Для примера на рис. 7 показано образование и изменение размеров перивителлинового пространства после оплодотворения яиц верхогляда (Erythroculter erythropterus Basilewsky), бычка (Bathygobius soporator) и сига (Corego-nus lavaretus baeri n. swirensis Pravdin). Диаметр неоплодо-творенных яиц верхогляда равен 1,0—1,1 мм (Соин, 1959)» При 23—24° яйца начинают заметно увеличиваться в размерах через 10 мин после помещения их в воду. Процесс образования перивителлинового пространства заканчивается через 40—45 мин. К этому времени диаметр яйца достигает 3,5— 4,2 мм. Из данных С. Г. Соина (1959) легко рассчитать, что объем перивителлинового пространства яиц верхогляда достигает 22,0—38,0 мм3. Яйца бычка сильно отличаются по форме от яиц верхогляда и многих других рыб. Взятые из Ьамкй неоплодотворенные яйца имеют в среднем 0,8 мм в. Н
длину (Tavolga, 1950). Оболочка плотно прилежит к поверхности яйца. Через 2—5 мин после оплодотворения при 27— 29° в морской воде оболочка удлиняется и через 15—2Q мин достигает максимальной длины в 2,4 мм. Яйцо приобретает характерную форму, которая сохраняется до самых поздних
/5
£
Рис, 7. Последовательные стадии образования перивителлинового пространства у яиц:
Л — верхогляда (Соли, 1959); Б — бычка (Tavolga, 1950) и В — свирского сига. Цифры показывают время после оплодотворения в мин
стадий развития (Tavolga, 1950). У сига образование перивителлинового пространства происходит так же, как у верхогляда и многих других костистых рыб (рис. 7), и отличается только временем образования и размерами (Зотин, 1955а).
Кроме морфологической картины образования перивителлинового пространства, у разных видов костистых рыб описаны количественные изменения объема яиц и перивителлино-вого пространства после оплодотворения. На рис. 8 показаны кривые изменения объема перивителлинового пространства после оплодотворения яиц волжской сельди, сельди-чер-
2*
19
Рис. 8. Увеличение объема перивителлинового пространства после оплодотворения яиц: / — волжской сельди (Строганов, 1939, 6); 2 — сельди-черноспиики (Сомова, 1940); 3 — каспийского пузанка (Перцева, 1939); 4 — вьюна; 5 — судака (Алексеева, 1939); 6 — окуня (Строганов, 1938); 7 — беломорской сельди (Каринский, 1938)
практически не изменяется во время
носпинки, каспийского пузанка, беломорской сельди, окуня, судака и вьюна, вычисленные по данным разных авторов. Образование перивителлинового пространства у яиц костистых рыб, как видно на рис. 8, происходит в основном в первые 1 — 3 часа после оплодотворения. Конечный объем перивителлинового пространства сильно отличается у яиц разных видов рыб, что связано с различиями в экологии развития этих видов. Скорость образования перивителлинового пространства зависит от температуры, поэтому трудно по этому признаку сопоставлять наблюдения, полученные разными авторами. Например, у яиц Perea fluviatilis при 4—5° образование перивителлинового пространства заканчивается через I час 50 мин; при 16—17° — через 50 мин\ при 27° — через 37 мин (Thomopoulas, 1953а).
Р. С. Мухина (1948), работавшая с яйцами волжской сельди, показала, что сухой вес яиц развития, тогда как из
менение сырого веса яиц после оплодотворения совпадает с изменением объема перивителлинового пространства. Это свидетельствует о том, что образование перивителлинового пространства у яиц волжской сельди связано с поступлением воды в яйца из окружающей среды.
20
Особенно подробные и многочисленные данные о потреблении воды яйцами после оплодотворения при образовании перивителлинового пространства получены на яйцах лососевых рыб.
Рунстрём (Runnstrom, 1920) определял понижение точки замерзания оплодотворенных и неоплодотворенных яиц Sal-mo salvilinus и нашел, что она изменяется с Д= —0,645° у неоплодотворенных яиц до А=—0,599° черен 4 часа после оплодотворения. Сходные данные получены П. Г. Светловым (1928а, 1929), который нашел, что у неоплодотворенных яиц Salmo trutta morpha fario A= —0,497°, а у оплодотворенных — A= —0,468°. Это изменение депрессии точки замерзания содержимого яиц связано, по мнению авторов, с поступлением воды в яйцо и образованием перивителлиновой жидкости.
Кронфельд и Щеминский (Kronfeld u. Scheminsky, 1926), Богуцкий (Bogucki, 1930), Грей (Gray, 1932), Манери и Ирвинг (Manery a. Irving, 1935), Аоки (Aoki, 1939), Хайес и Армстронг (Hayes a. Armstrong, 1942), Хайес (Hayes, 1949), Кано (Konoh, 1951а), Т. И. Привольнее (1952, 1953), Прескот (Prescott, 1955) измеряли изменение сырого и сухого веса яиц лососевых рыб разных видов после оплодотворения. Ими получены сходные результаты, показывающие, что сразу после оплодотворения происходит увеличение сырого веса яиц за счет воды окружающей среды, так как сухой вес не изменяется. Количество поступившей воды достигает 12— 20% веса яйца. В табл. 1 для примера приведены данные, полученные Прескотом (19'55) на яйцах чавычи (Oncorhyn-chus tschawytscha).
Таблица 1
Изменение веса, объема и содержания воды у яиц чавычи после оплодотворения (Prescott, 1955)
Яйца Сырой вес, мг Сухой вес, мг Объем, мм* Содержание воды, % Плотность
Неактивированные . . 245 93 230 66 1,065
Активированные . . . 283 93 268 71 1,056
А. И. Смирнов (1954) измерял диаметр яиц кеты (Опсог-hynchus keta), Б. П. Лужин (1956) — Salmo ischchan issykoge-garkuni Lushin. Оба автора нашли, что диаметр яиц изменяется в первые часы после оплодотворения, когда происходит образование перивителлинового пространства.
21
Поступление воды в яйца лососевых рыб заканчивается через 50—60 мин после оплодотворения (Bogucki, 1930; Ма-nery a. Irving, 1935; Aoki, 1939; Hayes a. Armstrong, 1942; Привольнев, 1952; Зотин, 1955,а). Было показано также, что у неоплодотворенных яиц, помещенных в воду, увеличение сырого веса идет в том же темпе и размерах, как и у оплодотворенных яиц (Bogucki, 1930; Manery a. Irving, 1935; Привольнев, 1952; Зотин, 1955а), (см. рис. 8). Как известно (Runnstrom, 1920; Aoki, 1939; Kanoh, 1950, 1951; Kusa, 1950a,b, 1951, K- Yamamoto, 1951b; Соин, 1953; Зотин, 1953 б, д, 1955а; Дислер, 1957; Беляева, 1959), все неоплодотворенные яйца лососевых рыб в воде активируются, поэтому речь идет об активированных, а не просто неоплодотворенных яйцах.
Полученные мною данные по потреблению воды яйцами свирского лосося, форели и сига (при помощи метода определения плотности яиц по скорости падения в трубке с 0,18 и 0,37 М сахарозы) принципиально не отличаются от данных, полученных в отношении зародышей других лососевых рыб (Зотин, 1954а, 1955, а).
Как видно на рис. 9 при 4° поступление воды в яйца свирского лосося и сига начинается через 5—6 мин после осеменения. Затем идет интенсивное потребление воды из окружающей среды. Поступление воды в яйца лосося прекращается через 60—80 мин и в яйца сига через 120 мин после оплодотворения.
Скорость поступления воды в яйца после оплодотворения зависит от температуры воды. Так, Н. Ф. Старостина и К- Г. Осепян, работавшие одновременно со мной в 1959 г. на Свирском заводе, нашли, что поступление воды в яйца форели при 1,4° прекращается через 90 мин, при 8,3°—через 30 мин, при 20,7° — через 20 мин.
Яйца лосося захватывают намного больше воды, чем яйца сига. Это связано с большими размерами яиц лосося (объем яйца лосося в этих опытах (рис. 9) равен 115,2 мм3, а яйца сига—12,92 мм3). Однако, если вычислить из кривых, показанных на рис. 9, изменения объема яиц лосося и сига после оплодотворения в процентах от первоначального объема, то мы увидим обратное соотношение: относительный объем яиц сига увеличивается После оп'лодотворения гораздо больше, чем объем яиц лосося. По наблюдениям А. В. Подлесного (1947), яйца белорыбицы (оплодотворенные или неоплодотворенные) увеличивают свой диаметр с 2,2—2,4 до 2,7 мм через 2 часа и до 3,1 мм через сутки, т. е. увеличиваются в объеме на 8,4— 10,0 мм3, что близко к объему поступающей воды, определенному мною для яиц сига (рис. 9).
22
Вода, поступающая в яйца после оплодотворения, идет на образование перивителлиновой жидкости. Это видно из сравнения кривой поступления воды в яйца (рис. 9) и картины образования перивителлинового пространства у яиц сига
Рис. 9. Потребление воды оплодотворенными (/) и пеоплодо-твбренными (2) яйцами свирского лосося и оплодотворенными яйцами сига (3} при 4°
(рис. 7) и лосося (рис. 10). Фотографии образования перивителлинового пространства делали с яиц лосося, помещенных в специальную камеру из органического стекла, которая позволяет зарисовывать или фотографировать яйца сбоку (перивителлиновое пространство у яиц сига и лосося образуется в верхней части яйца). Образование перивителлинового пространства начинается (при 4°) через 9 мин после осеменения у яиц лосося и через 5 мин у яиц сига и закан
23
чивается примерно через 60 мин у лосося и через ПО мин у сига. Эти наблюдения сопоставимы с данными о потреблении воды яйцами сига и лосося (рис. 9). Исходя из данных рис. 7 и 10, можно высчитать объем перивителлинового пространства: у яиц лосося он равен 20,2 мм3, у яиц сига — 5,9 мм3. Как можно видеть, полученные цифры близки к данным о количестве воды, поступившей за время образования перивителлинового пространства в яйца (19,2 мм3 у яиц лосося и 7,3 мм3 у яиц сига), и к данным других исследователей об увеличении сырого веса яиц лососевых рыб после оплодотворения на 12—20%.
Образование перивителлиновой жидкости за счет поступления воды из окружающей среды было показано и прямыми методами при помощи тяжелой воды (D2O) Крогом и Юссин-гом (Krogh a. Ussing, 1937; Krogh, 1939). Для опытов они помещали по 12,48 г неоплодотворенной икры радужной форели (Salmo irideus) в 10 см3 2,98%-ного раствора D2O. К концу опыта (14,6 час.) масса яиц увеличилась до 14,20 г. Из этих яиц была отогнана вода и в ней определена концентрация тяжелой воды. Оказалось, что они содержат 1,527±0,003% D2O. Таким образом, увеличение веса яиц после оплодотворения произошло за счет поступления воды в яйца из окружающей среды. Прескот (Prescott, 1955) изучал поступление тяжелой воды (D2O) после оплодотворения или активации в яйца чавычи (Oncorhynchus tschawytscha). Для определения концентрации Г)2О применялся метод картезианского поплавка. Эти опыты так же показали, что образование перивителлиновой жидкости сопровождается проникновением через оболочку D2O из окружающей среды. При работе с яйцами свирского лосося (Salmo salar m. sebago Girard) и сига (Coregonus lavaretus baeri n. swirensis Pravdin) я пользовался 4,5 %-ной тяжелой водой, меченной дейтерием (D2O),h 1,5 %-ной тяжелой водой, меченной стабильным изотопом кислорода (Н2О18). Измерение концентрации Н2О18 и D2O проводилось при помощи метода падающих капель. В обоих случаях получены совпадающие результаты, показывающие, что образование перивителлиновой жидкости у яиц свирского лосося и сига идет за счет поступления воды из окружающей среды.
Можно привести еще более наглядные доказательства того, что перивителлиновая жидкость у яиц лососевых рыб образуется за счет поступления воды под оболочку из окружающей среды. Так, Дэвилер, Томопулос и Кола (Devillers, Thomopoulos et Colas, 1954) помещали яйца Salmo irideus на 15 мин в воду, затем вынимали их из воды и держали во влажной атмосфере: у таких яиц перивителлинового прост-
24
Рнс. 10. Последовательные стадии образования перивителлинового пространства у яиц свирской форели при 6,6° >
Фотографии яиц, вид сбоку: а — иеоплодотворенные яйца; б — 3 мин после оплодотворения; в —5 мин; г—1 мин; д — 10 мин*, е — 30 мин.
ранства не образовалось, хотя происходила активация яиц и образование зародышевого диска. Я помещал яйца свирско-го лосося после 5 мин. активации в воде и обсушивания на фильтровальной бумаге в вазелиновое или льняное масло. У таких яиц образования перивителлинового пространства не происходило, хотя они испытывали все другие изменения, характерные для активации: образование бластодиска, жировой зоны, увеличение прочности оболочки.' Следовательно, в безводной среде образования перивителлинового пространства у яиц лососевых рыб не происходит.
Подводя итоги всему изложенному, можно сказать, что характер и объем потребления воды яйцами рыб в первое время после оплодотворения или активации определяется в основном строением оболочек и размерами перивителлинового пространства, так как вода, поступающая в это время в яйцо из окружающей среды, идет главным образом на набухание оболочек или образование перивителлиновой жидкости. Основываясь на приведенных данных, нельзя, однако, утверждать, что вся вода, поступающая в яйцо рыб после оплодотворения или активации, полностью идет на набухание оболочек и образование перивителлиновой жидкости. Существуют данные, показывающие, что часть воды, поступающей в яйцо после оплодотворения, усваивается самим зародышем.
Следует также отметить, что в образовании перивителлинового пространства у яиц рыб принимает участие не только вода, поступающая из окружающей среды, но и вода и вещества, выделяемые из яйца. У яиц Carassius auratus L. после оплодотворения происходит уменьшение размеров собственно яйца (желтка) за первые 30—35 мин на V3 (Tchou-Su a. Chen-Chao Hsi, 1936). У яиц Oryzias latipes желток после оплодотворения сокращается на 7% (Т. Yamamoto, 1940). Так как объем яйца Oryzias latipes увеличивается после оплодотворения на 13%, то перивителлиновое пространство у этих яиц равно 20% первоначального объема яйца. Уменьшение объема желтка после оплодотворения отмечено также и у яиц лососевых рыб (Bogucki, 1930), сельдевых рыб (Каринский, 1938; Kanoh, 1953; Тоом, 1958) и, как уже отмечалось, у яиц миног (Okkelberg, 1914) *. У яиц беломорской сельди при солености воды 18—ЗО°/оо объем собственно яйца после оплодотворения уменьшается на 12% при увеличении объема яйца в оболочках за это же время на 31% (Каринский, 1938). У яиц бал-
* Уменьшение объема. янц после оплодотворения происходит также у яиц морского ежа на 5% и яиц морской звезды на 12—17% (Gilaser, 1914, 1924), у яиц крысы на 13—17% (Gilghrist a. Pincus, 1932), у яиц кролика (Красовская, 1935), хомяка (Venable, 1946) и некоторых других животных (см. обзор Ямамото, 1940, и Ротшильда, 1958, а).
25
тайской салаки при солености воды 5,4—6,О°/оо в первые 3 часа после оплодотворения диаметр яйца сокращается на 5—8%, при возрастании диаметра яиц в оболочке за это же время на 24,6—28,2% (Тоом, 1958).
Особенно интересные данные получены на яйцах Fundulus heteroclitus. Перивителлиновое пространство у яиц F. hete-roclitus образуется только в результате сокращения объема собственно яйца (Kagan, 1935). Это доказывается тем, что после оплодотворения не удается наблюдать увеличения сырого веса (Manery, Warbritton a. Irving, 1933) и объема яиц в оболочках, в то время как объем желтка сокращается (Kagan, 1935). По данным Чень-Юань Као и Р. Чемберса (Као Chien-Yuan a. R. Chambers, 1954), объем перивителлинового пространства у яиц Fundulus heteroclitus равен 40% объема яйца, а так как объем, ограниченный яйцевой оболочкой, не меняется после оплодотворения, то это значит, что при образовании перивителлинового пространства происходит уменьшение объема собственно зародыша на 40%.
Материалы, полученные на яйцах Fundulus, на первый взгляд резко выделяют их среди других костистых рыб в отношении способа образования перивителлиновой жидкости после оплодотворения или активации, так как у них, как мы видели, не происходит увеличения объема яйца в оболочках после оплодотворения и можно было бы думать, что в образовании перивителлиновой жидкости яиц Fundulus не принимает участие вода окружающей среды, а только вещества, выделяющиеся из зародыша. Однако тщательные исследования Чень-Юань Као, Р. Чемберса и Е. Чемберс (Chambers, RJ, Chambers, Е. а. Као С. Y, 1951; Као С. Y., 1951, 1956; Као С. Y., Chambers R. a. Chambers Е., 1951, 1954; Као С. Y. a. Chambers R., 1954) показали, что и у яиц F. heteroclitus образование перивителлинового пространства происходит при участии воды, поступающей под оболочку из окружающей среды. Авторы при помощи микропипетки (в комбинации с ртутным манометром) измеряли внутреннее гидростатическое давление в перивителлиновом пространстве, активированных уколом яиц Fundulus heteroclitus. Сразу после укола яйца было зарегистрировано отрицательное давление, в среднем равное 10 мм ртутного столба. Отрицательное давление постепенно выравнивается и к 4-ой мин делается равным нулю (равным атмосферному давлению). В течение последующих 10 мин происходит быстрое увеличение давления со скоростью 12 мм) мин и к концу 10 мин оно достигает значения в 70 мм Hg. Затем скорость увеличения давления постепенно уменьшается. К 50-ой мин давление достигает приблизительно 150 мм Hg и в дальнейшем остается константным. Сопо
26
ставляя изменение гидростатического давления, возникающего под оболочкой яиц, со скоростью образования перивителлинового пространства Чень-Юань Као и Чемберс (1954) показали, что эти процессы связаны друг с другом (табл. 2). Ими
Таблица 2
Изменение гидростатического давления в перивителлиновом пространстве и изменение объема яиц Fundulus heteroclitus после оплодотворения
(Као a. Chambers, 1954)
Время, мин Давление, мм Hg Объем яйца, мм9 Увеличение объема перивителлинового пространства, %
в оболочке без оболочки перивител-лнновое пространство
0 — 3,20 3,20 0,00 0,0
3 — 3,20 2,53 0,67 20,9
8 56 3,20 2,19 1,01 31,3
20 125 3,20 2,16 1,04 32,5
41 150 3,20 1,75 1,45 45,3
0 — 3,60 3,60 0,00 0,0
3 12 3,60 3,00 0,60 15,9
12 87 3,60 2,90 0,70 19,4
22 118 3,60 2,35 1,25 34,7
32 133 3,60 2,19 1,41 38,6
44 145 3,60 2,19 1,41 38,6
внутреннее гидростатическое давление
было доказано, что
возникает именно в перивителлиновой жидкости, так как, делая разрез в оболочке и измеряя гидростатическое давление в этих условиях, они нашли, что оно равно 2—4 мм Hg при 150 мм в контроле. Если яйца с полностью сформированным перивителлиновым пространством поместить в морскую воду, содержащую 1,9 М сахарозы и имеющую осмотическое давление в два раза выше, чем обычная морская вода, то в этих условиях перивителлиновое пространство яиц Fundulus почти полностью исчезает, а внутреннее гидростатическое давление делается равным нулю. Затем постепенно происходит восстановление гидростатического давления в перивителлиновом пространстве яиц (Као a. Chambers R., 1954; Као, С. Y., 1956). Результаты этих опытов можно объяснить только тем, что гидростатическое давление под оболочками яиц Fundulus после оплодотворения или активации возникает благодаря поступлению воды в перивителлиновое пространство из окружающей среды (фактически гидростатическое давление, измеренное авторами, является мерой осмотического давления,
27
возникающего под оболочками яиц после оплодотворения или активации). Следовательно, и у яиц Fundulus перивителлиновое пространство образуется после оплодотворения или активации в большой степени благодаря поступлению под оболочку воды из окружающей среды. У этих яиц наиболее ярко выявляется двойственность происхождения перивителлиновой жидкости, так как она образуется не только за счет поступления воды из окружающей среды, но и вследствие выделения жидкости из собственного яйца. Как мы видели, и для некоторых других рыб показано, что какая-то часть перивителлиновой жидкости образуется в результате выхода воды и других веществ из желтка. Однако не у всех яиц костистых рыб образование перивителлиновой жидкости сопровождается выделением воды из собственно яйца и сокращением его объема. Как будет показано в дальнейшем, участие воды, выделяемой из яйца, в образовании перивителлиновой жидкости зависит, по-видимому, от экологии развития зародышей, главным образом от осмотических свойств среды.
Чень-Юань Као и Чемберс показали, что сокращение объема желтка яиц Fundulus обусловлено, с одной стороны, высоким осмотическим давлением перивителлиновой жидкости, с другой,— нерастяжимостью яйцевой оболочки. Прочность и малая эластичность оболочек определяет, следовательно, в известной степени соотношение количества воды, поступающей в перивителлиновое пространство из яйца и окружающей среды. Переходя к обсуждению механизма поступления воды в перивителлиновое пространство после оплодотворения яиц рыб, мы должны поэтому рассмотреть не только механизм образования перивителлинового пространства, но и механизм ограничения размеров перивителлинового пространства, который связан с изменением прочности оболочек.
Глава П
МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ ПЕРИВИТЕЛЛИНОВОГО ПРОСТРАНСТВА
Как было показано выше, перивителлиновая жидкость образуется после оплодотворения или активации яиц рыб главным образом за счет поступления воды из окружающей среды. Поэтому любая гипотеза о механизме образования перивителлинового пространства должна прежде всего объяснить механизм поступления воды под оболочку при образовании перивителлиновой жидкости. Таких гипотез было предложено две.
Первая гипотеза высказана Богуцким (Bogucki, 1930) на материале яиц лососевых рыб и рассмотрена в свете более новых материалов Хайесом и Армстронгом (Hayes а. Armstrong, 1942; Hayes, 1949). Содержание ее сводится к следующему. При перенесении неоплодотворенных яиц лососевых рыб в воду или после оплодотворения их в воде из поверхностного слоя яиц выделяются белковые коллоиды, которые абсорбируют воду из окружающей среды. Поступление воды под оболочку приводит к отделению ее от поверхности яйца и образованию перивителлинового пространства к Белковые коллоиды абсорбируют воду из окружающей среды до тех пор, пока упругость желточной оболочки, которая претерпевает характерный процесс затвердевания, не уравновесит силы всасывания воды. Авторы на основании полученных Богуцким данных о влиянии солей и сахаров на скорость отделения оболочки и образования перивителлинового пространства у яиц лососевых рыб настаивали на том, что абсорб-
1 Сходные гипотезы о механизме образования перивителлинового пространства у яиц морских ежей предложены Ж. Лебом (Loeb, 1908, 1913, 1926) и другими авторами (Heilbrunn, 1915; Hiromoto, 1955; Parpant а. Laris, 1955; Heilbrunn a. Byers, 1959; Costello, 1959; см. также у Вильсона, 1936); для яиц амфибий подобная же гипотеза высказана Билашевичем (Bialaszewicz, 1912) и Пржилецким (Przylecki, 1917).
29
ция воды под оболочку происходит не осмотическим путем. Нидхем (Needham, 1931) пошел еще дальше, считая, что обычные законы диффузии и осмоса не применимы к процессу образования перивителлиновой жидкости.
Независимо от указанных авторов сходная гипотеза была подробно разработана и обоснована Токи-о Ямамото (Т. Yamamoto, 1939b, 1940, 1951, 1954b, 1956) на материале яиц костистой рыбки Oryzias latipes и миноги (Yamamoto, 1944 с. 1945). Однако в отличие от них, Т. Ямамото на основании своих данных пришел к выводу, что поступление воды под оболочку при образовании перивителлинового пространства у яиц Oryzias идет осмотическим путем. Автор связывает появление осмотически активных веществ под оболочкой с разрушением и исчезновением из поверхностного слоя яиц особых структур — кортикальных альвеол. Механизм образования перивителлинового пространства был впоследствии подробно исследован многими другими авторами, работавшими с разными видами костистых рыб (Kanoh, 1950, 1951, 1952а, Ь, 1953; Као С. Y., R. Chambers а. Е. Chambers 1951, 1954; Као С. Y. a. R. Chambers, 1954; Крыжановский, 1953, 1956: Kusa, 1953—1959; Devillers, Thomopoulos et Colas, 1954; Tho-mopoulos, 1953a, 1954; Зотин, 1953д, 1954a; Aketa, 1954; Nakano, 1954, 1956; T. S. Yamamoto, 1957b), осетровых рыб (Дет-лаф и Гинзбург, 1954; Детлаф, 19576, 1958в, 1961) и миног (Hardisty, 1957; Kusa, 1957b; см. также обзоры Smith, 1957; Rothschild, 1958b).
Вторая гипотеза относительно механизма отделения оболочек и образования перивителлинового пространства у яиц лососевых рыб предложена Манери и Ирвингом (Мапегу a. Irving, 1935) и в последнее время в некоторой части поддержана С. Г. Крыжановским (1956) на материале яиц сельдевых рыб. По мнению Манери и Ирвинга, при перенесении яиц в воду в желточной оболочке под действием воды происходит конденсация коллоидноподобных веществ. Этот процесс ведет к отделению оболочки от поверхности яйца. Отделение оболочки не связано с общим метаболизмом, протекающим в яйце после оплодотворения, но является пассивным следствием взаимодействия оболочки с водой. Так как оболочка проницаема для воды, то последняя свободно входит в перивителлиновое пространство и, воздействуя на поверхность желтка, вызывает образование цитоплазматического слоя, который непроницаем для воды и солей. С. Г. Крыжановский (1956) говорит об этих процессах более осторожно. Он считает, что отделение оболочки и образование перивителлинового пространства обусловливается свойствами самой оболочки и взаимодействием ее с яйцом и водой, и не являет-30
ся простым механическим следствием повышенного осмотического давления жидкости, выделяемой яйцом.
Легко показать, что гипотеза Манери и Ирвинга неверна. В основу своей гипотезы авторы положили известный факт, что оплодотворенные и неоплодотворенные яйца форели, будучи помещены в воду, потребляют для образования перивителлинового пространства одинаковое количество воды с одинаковой скоростью. По мнению Манери и Ирвинга, это доказывает, что отделение оболочек и образование перивителлинового пространства у яиц форели происходит без участия яйца. Однако, как указывалось выше, многие авторы показали, что неоплодотворенные яйца лососевых рыб, помещенные в воду, в 100% случаев активируются и все начальные изменения у них идут в том же темпе и объеме, что и у оплодотворенных яиц. С другой стороны, оболочка лососевых рыб не изменяется в воде без предварительного воздействия на нее со стороны яйца. Это доказывается тем, что прочность оболочек, снятых с неоплодотворенного яйца и помещенных в воду, не возрастает (Зотин, 19586, в, см. также стр. 112).
Представления С. Г. Крыжановского (1956) основаны на наблюдениях небольшого числа яиц салаки, у которых после помещения в воду все кортикальные альвеолы выделились из поверхностного слоя яйца, а перивителлинового пространства не образовалось. Однако такое явление, как отмечает С. Г. Крыжановский, наблюдается у яиц, выделивших альвеолы с большим опозданием (через несколько часов пребывания в воде), поэтому законно предположить, что с веществами альвеол могли произойти за это время такие изменения, в результате которых они потеряли свои осмотические свойства. Возможность потери способности яиц насасывать воду под оболочку можно показать экспериментальным путем. Так, Аоки (Aoki, 1942), а позднее Дэвилер, Томопулос и Кола (1954) показали, что А1С13 препятствует образованию перивителлинового пространства у яиц кеты и радужной форели. То же самое происходит у яиц свирского лосося и форели, если оплодотворенные яйца через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин после помещения их в воду переносить в 0,1 н. неза-буференные растворы А1С13 или FeCl3; образование перивителлинового пространства останавливается на той стадии, на которой яйца помещены в раствор (рис. И). А1С13 и FeCl3 фиксируют вещества, насасывающие воду под оболочку, в результате чего образование перивителлинового пространства прекращается.
Таким образом, гипотеза Манери и Ирвинга (даже в более осторожной модификации С. Г. Крыжановского) не верна. Это особенно становится очевидным, если подробнее
31
Рис. 11. Влияние 0,1 н. раствора А1С1з на образование перивителлинового пространства. Яйца форели помещаются в раствор
а — неоплодотворенными; б — через 7 мин. после оплодотворения; в — 12 ли«; г — 20 мин; д — 30 мин; е — контрольные яйца в воде. Фотографии сделаны через 2 часа после оплодотворения (t -» 5,7°)
рассмотреть доказательства, подтверждающие представления о механизме образования перивителлинового пространства, высказанные Богуцким и Т. Ямамото, и познакомиться с дальнейшим развитием этих представлений. Три момента должны быть особенно подробно разобраны при обсуждении гипотезы Богуцкого — Ямамото: 1) проницаемость оболочек для различных веществ; 2) наличие высокомолекулярных, осмотически активных веществ непосредственно в перивителлиновой жидкости; 3) доказательство того, что источником осмотически активных веществ является само яйцо и что они не предсуществуют под оболочкой неоплодотворенных яиц.
1. ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЯЙЦЕВЫХ ОБОЛОЧЕК ЗАРОДЫШЕЙ РЫБ
Для подтверждения представлений Богуцкого и Т. Ямамото о механизме образования перивителлинового пространства очень важно было доказать, что вода, соли и другие вещества легко проникают через оболочку, а высокомолекулярные вещества не проникают через нее. Только при наличии таких данных можно утверждать, что именно белки или другие коллоиды, а не соли, сахара или какие-либо другие вещества создают градиент сил, достаточный для поступления воды под оболочку. Доказательства этих положений получены для яиц лососевых рыб П. Г. Светловым (1928а, 1929) и Богуцким (1930), а позднее и многими другими авторами.
П. Г. Светлов (1928а, 1929), работая с яйцами форели (Salmo trutta m. fario), показал, что оболочка яиц проницаема для солей (NaCl, HgCh, К ON), сахарозы и таких высокодисперсных коллоидных красок, как нейтральрот и нильблау-сульфат. Низкодисперсные коллоиды (трипанблау) через оболочку не проходят. Богуцкий (1930) снимал желточную оболочку с яиц Salmo fontinalis, S. irideus и S. salar и насаживал ее на капилляр, используя такую систему как микродиализатор. Оказалось, что соли, моносахара и аминокислоты легко проникают через оболочку яиц лососевых рыб, в то время как белки, полисахариды и другие коллоиды через нее не проходят. Проницаемость оболочек для воды, солей и сахаров была установлена затем при работе с яйцами форели (Gray, 1932), кеты (Aoki, 1939, 1940, 1942; Kanoh, 1950), свир-ского лосося и сига (Зотин, 1953д, 1954а), радужной форели (Kalman, 1959).
У других костистых рыб: Oryzias latipes (Ikeda, 1934; Т. Yamamoto, 1936, 1939b), колюшка (Kusa, 1953b), хамса, морской язык, шпрот, барабулька, камбала-глосса (Зайцев,
3 А. И. Зотин
33
1956), вьюн (Беляев, 1957)—яйцевые оболочки также легко проницаемы для воды, солей, сахаров и непроницаемы для Коллоидов. В частности, найдено, что при помещении яиц Oryzias latipes в морскую воду и в растворы солей и сахаров происходит сокращение объема яиц с последующим возвращением к исходному размеру (Ikeda, 1934; Yamamoto, 1936, 1939b). Это показывает, что соли и сахара проходят через яйцевую оболочку, хотя и медленнее, чем вода. Наоборот, помещение яиц Oryzias latipes в белок куриного яйца и раствор гуммиарабика (Т. Yamamoto, 1939b; Nakano, 1956), яиц кеты в раствор гуммиарабика (Aoki, 1942; Kanoh, 1950, 1951), яиц колюшки в раствор гуммиарабика и крахмала (Kusa, 19536), яиц вьюна в раствор Рингера, содержащего 8,0—8,5%-ный раствор желатины (Беляев, 1957), приводит к тому, что объем яиц сокращается й не возвращается к норме, а у яиц, помещенных в растворы сразу после оплодотворения, перивителлиновое пространство образуется в сильно уменьшенном размере. Для примера в табл. 3 показано влияние 10%-ного раствора гуммиарабика и белка куриного яйца
Таблица 3
Уменьшение перивителлинового пространства у яиц форели при помещении их в белок куриного яйца и в 10%-ный раствор гуммиарабика
Номер форели 4 4' 7 8
Время после оплодотворения, мин 8 15 30 120
Объем перивителлин, пространства
в начале опыта, мм3 3,6 11,2 18,0 14,0
Объем перивителлино-1 белок ку-
вого пространства рииогояйца 2,4 3,9 3,3 1,0
через 6—8 час после помещения в рас- ’ ‘ твор 7 г 3,6 1,6 1,5 0,5
Объем перивителлинового простраи-
: ства в конце опыта (контроль) 19,7 18,9 18,6 14,5
на образование перивителлинового пространства яиц свирской форели. Как видно из данных табл. 3, объем перивителлинового пространства у яиц, помещенных в растворы, в несколько раз меньше, чем у яиц в воде. Если оболочку осторожно-।разрезать или проткнуть иглой, то объем яиц в растворе гуммиарабика и в белке куриного яйца восстанавливается до .нормы: 'Из этого можно' заключить, что уменьшение объема яиц в этих растворах зависит от того, что высокомолекуляр-, ные. вещества не проникают через оболочку.
34
Сходными методами показана проницаемость оболочек яиц миноги Lampetra planeri для воды и солей и непроницаемость ее для гуммиарабика (Т. Yamamoto, 1944с). В наших совместных с Т. А. Детлаф опытах, проведенных на яйцах осетра и севрюги, было найдено, что растворы 0,1 н. NaCl и КС1 не препятствуют образованию перивителлинового пространства (Детлаф, 1961, см. также стр. 108). Это показывает, что оболочки яиц осетровых рыб проницаемы для солей. Яйцевые оболочки зародышей осетровых рыб легко проницаемы и для воды, так как во время развития зародыши потребляют воду из окружающей среды (Остроумов, 1911; Зотин, 1953а, д, 1955а, 1957; Емельянов, 1957; Зотин и Кру-минь, 1959), а вода, меченная дейтерием, легко обменивается с водой зародышей (Зотин, 1958а). *
Всеми этими работами показано, что яйцевые оболочки зародышей рыб проницаемы для воды, солей (LiCl, К.С1, NaCl, I\CN, СаС12, MgCl2, ВаС12, SrCl2, HgCl2), сахароц (глюкоза, манноза, сахароза) и не проницаемы для таких высокомолекулярных веществ, как трипанблау, гуммиарабик, крахмал, желатина и белки.
Иные результаты получены для яиц морской рыбки Fundulus heteroclitus. Еще Леб (1903, 1912, 1913, 1926) показал, что яйца Fundulus могут развиваться нормально в дистиллированной воде и в воде с повышенной концентрацией солей, причем объем яиц вместе с оболочкой не изменяется. Помещая яйца Fundulus в 3 М раствор NaCl или в ’% М раствор СаС12, Леб (1912, 1926) нашел, что яйца сжимаются и опускаются на дно сосуда. Если яйца поместить в смесь 3 М NaCl + 10/8 М СаС12, то они плавают в растворе, не опускаясь на дно в течение 3 суток и больше. Зародыши, вылупившиеся из оболочек и помещенные в такой раствор, погибают почти мгновенно. По мнению автора, это указывает на то, что оболочки яиц Fundulus практически не проницаемы для воды и солей в физиологически сбалансированном растворе. Применяя метод измерения электропроводности раствора, О. Браун (Brown, 1905) не смог обнаружить потерю ионов яйцами F. heteroclitus в дистиллированной воде, а также уменьшения концентрации ионов в морской воде при помещении в нее яиц Fundulus. Последующими авторами, изучавшими проницаемость оболочек яиц Fundulus, были получены довольно противоречивые данные. Так, Ягль (Yagle, 1930) подтвердила наблюдения Леба, считая, что только в несбалансированных солевых растворах оболочка яиц Fundulus проницаема для Na, К, и Са. Брукс (Brooks, 1943), изучая проницаемость неоплодотворенных яиц F. heteroclitus при помощи фосфата натрия, меченного радиоактивным фосфором, нашел, что ионы
3* 35
фосфата абсорбируются оболочкой и проходят через нее очень медленно. С другой стороны, Армстронг (Armstrong, 1928), Бодин (Bodin, 1928), Торнер (Thorner, 1929) и Сумвольт (Sumwalt, 1928, 1929, 1933) разными методами показали, что оболочка яиц этих рыб довольно легко проницаема для ионов 1.
В настоящее время все эти разногласия потеряли интерес, так как работами Чень-Юань Као, Р. Чемберса и Е. Чемберс
Рис. 12. Прибор («микроосмометр») для определения проницаемости оболочек яиц лососевых рыб
(Chambers, Chambers а. Као С. Y., 1951; Као С. Y., Chambers a. Chambers, 1951, 1954; Као С. Y. a. Chambers R., 1954; Као С. Y., 1956) и Шанклина (Shanklin, 1959) точно доказано, что оболочки яиц Fundulus heteroclitus проницаемы для воды, солей и сахаров.
Следует отметить, что проницаемость оболочек яиц рыб изучалась до сих пор лишь с качественной стороны, так как количественные измерения связаны с трудностями математической обработки измерений. Эти трудности в некоторой степени преодолены исследователями, работавшими с яйцами морских ежей (Northrop, 1927; McCutcheon a. Lucke, 1932; Jacobs, 1935; Luc-
кё, 1940; Davson a. Danielly, 1943; Dick, 1959), однако полученные ими уравнения почти не используются при работе с яйцами рыб1 2. Поэтому мы сделали попытку разработать метод количест-
венного изучения проницаемости яйцевых оболочек рыб (Зо-тина и Зотин, 1961). Он состоит в изучении проницаемости изолированных оболочек яиц лосося, форели и сига при помощи «микроосмометра» (сходная методика без рассмотрения математической стороны дела была применена П. Г. Свет-
ловым (19286) при изучении проницаемости оболочек коконов дождевых червей).
1 Интересно, что в работе самого Леба (Loeb a. Wasteney, 1915) была явно доказана проницаемость оболочек яиц Fundulus для солей и воды в физиологически сбалансированном солевом растворе (морская вода). Однако Леб на основании предыдущих работ настолько был уверен в полной непроницаемости оболочек яиц Fundulus, что предпочел ввести специальное предположение об субмикроскопическом строении и особых свойствах поверхностного слоя яйцевой оболочки для объяснения полученных данных.
2 Исключением являются работы Прескота (Prescott, 1955), Хардисти (Hardisty, 1957) и Кальмана (Kalman, 1959).
36
Прибор состоит из капилляра (рис. 12), имеющего расширение на конце, и шкалы, по которой можно измерять изменение объема воды внутри капилляра. На расширенный конец капилляра надевается яйцевая оболочка и привязывается ниткой. Это проделывается следующим образом. В оболочке яйца остро отточенными пинцетами делается отверстие по величине несколько большее, чем расширенный конец капилляра. Содержимое яйца через это отверстие удаляется н в него вводится конец капилляра, затем внутрь капилляра набирается вода и на расширенном .конце закрепляется оболочка. Конец капилляра с оболочкой помещается в .стаканчик (рис. 12)
Рис. 13. Кривые выхода воды из микроосмометра через оболочку яиц лосося (/) и сига (2) на стадии дробления
с 2,22 М раствором сахарозы. Под действием осмотических сил количество воды в капилляре начинает уменьшаться, о чем можно судить по изменению уровня воды. Для измерения количества воды, выходящей из капилляра через единицу площади оболочки, необходимо знать внутренний диаметр капилляра, величину расстояния между двумя делениями на шкале и диаметр расширенной части капилляра. В данной работе применялся микроосмометр, у которого объем пространства между двумя делениями шкалы соответствовал объему 0,344 мм3 и площадь нижнего отверстия равнялась 4,25 лип2.
Для оболочек яиц сига применялся микроосмометр, у которого объем пространства между двумя делениями шкалы был равен 0,28 мм3, а площадь нижнего отверстия капилляра — 2,41 мм2.
На рис. 13 показаны кривые выхода воды из капилляра через оболочку яиц лосося и сига (стадия дробления). Из этих кривых легко видеть, что при помещении микроосмометра в раствор сахарозы идут два процесса: под действием осмотических сил вода выходит из капилляра, но одновременно, благодаря диффузии, сахароза входит внутпь капилляра. Действи
37
тельно, уравнение выхода воды из капилляра можно написать в следующем виде (см. Northrop, 1927; Lucke, Hartline a. McCutcheon, 1931; McCutcheon a. Lucke, 1932; Lucke a. McCutcheon, 1932; Jacobs, 1933, 1934, 1935; Lucke, 1940; Davson a. Danielly, 1943; Dick, 1959, и др.).
Се) , ’ (3)
где v—объем вышедшей воды, а0— начальный объем раствора в капилляре, q— количество сахарозы, проникшей в капилляр, с и се — концентрация сахарозы внутри И вне капилляра, к — константа, t— время, S—площадь и Л — толщина оболочки.
Если бы сахароза не проходила внутрь капилляра, то q — О и уравнение (3) имело бы решение
С = — к (4)
т. е. была бы прямая пропорциональность изменения объема воды в капилляре по времени. Как видно на рис. 13, этого нет. Следовательно, сахароза проходит через оболочку, что совпадает с данными П. Г. Светлова (1928а, 1929), Богуцкого (1930) и других авторов.
Таким образом, при изучении проницаемости оболочек при помощи микроосмометра речь идет о двух процессах: проникновение сахарозы через оболочку в капилляр и выход воды из капилляра в среду. Задача сводится к получению данных о константах проницаемости оболочек для воды и сахарозы по скорости уменьшения объема воды в капилляре. Способ вычисления констант проницаемости для случая проникновения вещества при одновременном выходе воды из яиц морских беспозвоночных разработан Джекобсом (Jacobs, 1933), а для случая проникновения воды и сахарозы через оболочку яиц лососевых рыб на микроосмометре нами (Зотина и Зотин, 1961). Этот способ сводится к решению системы двух уравнений вида
(5)
при помощи приближенного метода Рунге — Кутта (см. Коллатц, 1953) и нахождению констант щ (Зотина и Зотин, 1961).
На рис. 14 показаны кривые изменения константы проницаемости яйцевых оболочек лосося и форели после оплодотворения. Как видно из рис. 14, проницаемость оболочек для воды быстро увеличивается в первые 60—90 мин после оплодотворения, а затем достигает определенного уровня (при ( = 4° через 3—4 часа}. Изменение проницаемости оболочек по времени совпадает с образованием перивителлинового пространства.
38
Интересно было выяснить, связано ли изменение проницаемости оболочек после оплодотворения с воздействием на них веществ, выделяемых яйцом, или это изменение проницаемости происходит спонтанно при попадании яиц в воду. Чтобы ответить на этот вопрос, были поставлены следующие
Рис. 14. Изменение константы проницаемости оболочек яиц лосося для воды:
1 — оплодотворенных янц; 2 — оболочек, снятых с неоплодотворенных янц
опыты. Определялась проницаемость оболочек, снятых с не-осемененных яиц и с оплодотворенных яиц, в разные сроки после оплодотворения. Было установлено (рис. 14), что проницаемость оболочек, снятых с неосемененных яиц, увеличивается значительно медленнее, чем проницаемость оболочек оплодотворенных яиц. Следовательно, изменение проницаемости оболочек после оплодотворения связано с воздействием оплодотворенного яйца на оболочки. Время, необходимое для того, чтобы яйцо успело оказать воздействие на оболочки, устанавливалось путем определения изменения проницаемости оболочек, снятых с оплодотворенных яиц, пробывших в воде от 7 до 25 мин. Контролем служили оболочки неоплодотворенных и оплодотворенных яиц, находившихся в воде в течение всего опыта.
39
Как видно из данных табл. 4, время, необходимое для выделения из оплодотворенного яйца веществ, изменяющих проницаемость оболочки, при 4° равно 10—25 мин.
Таблица 4
Время, необходимое для выделения из оплодотворенных яиц форели веществ, изменяющих проницаемость оболочек
Время снятия оболочек после оплодотворения яиц, мин
0
7
10
25
Контроль
к, (\<У~‘-см* 2/сек)'
через 5 час
2,87
3,81
5,12
6,00
6,20
2, ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ПЕРИВИТЕЛЛИНОВОЙ ЖИДКОСТИ ЯИЦ РЫБ
Как было показано выше, помещение яиц рыб в растворы высокомолекулярных веществ приводит к сокращению объема яиц за счет уменьшения объема перивителлинового пространства. После перенесения таких яиц в воду объем яиц увеличивается до первоначального размера (Т. Yamamoto, 1939; Aoki, 1942; Kusa, 1949а; Kanoh, 1950). У яиц кеты сокращение объема перивителлинового пространства в 10%-ном растворе гуммиарабика и его восстановление (рис. 15), после перенесения яиц из раствора гуммиарабика в воду, происходит приблизительно с одинаковой скоростью (Aoki, 1942). В других опытах было показано, что можно механическим давлением, не нарушая целостности яиц Oryzias latipes, выжать часть воды из перивителлинового пространства (Т. Yamamoto, 1939b). Если после этого деформированное яйцо поместить в воду, то оно через некоторое время набухает, восстанавливая свою сферическую форму. Сходные опыты я проделал с яйцами лосося, форели и сига, сжимая их в приборе Грея (см. рис. 27). При нагрузке в 1—2 кг яйца сильно деформировались, но полностью восстанавливали свой объем после помещения их в воду.
У яиц миноги, перенесенных из 2%-ного раствора гуммиарабика в воду, так же как и у яиц костистых рыб, происходит восстановление первоначального объема яиц (Т. Yamamoto, 1944с). Хардисти (Hardisty, 1957), помещая яйца L. planeri после оплодотворения в дистиллированную воду, 40
нашел, что объем перивителлинового пространства увеличивается по сравнению с яйцами, лежащими в обычной воде, больше чем в два раза.
Все эти наблюдения указывают на присутствие в перивителлиновой жидкости высокомолекулярных веществ, способных отдавать и набирать воду. Прямое доказательство наличия таких веществ получено путем физико-химического анализа перивителлиновой жидкости и химической идентификации коллоидов этой жидкости.
Рис. 15. Выход воды из яиц кеты в 10%-ном растворе гуммиарабика и поступления воды в яйца после перенесения их из гуммиарабика в воду (Aoki, 1942)
Состав перивителлиновой жидкости довольно сложен и значительно изменяется во время развития. П. Г. Светлов (1929) и Богуцкий (1930), а позже Хайес и Армстронг (1942) нашли, что .в перивителлиновой жидкости яиц лососевых рыб содержится небольшое количество белков, дающих слабую ксантопротеиновую реакцию. В перивителлиновой жидкости яиц аксолотля обнаружено присутствие хлористого натрия и каких-то органических веществ (McClendon, 1914а). Автор также обнаружил очень слабую положительную реакцию Миллона на белки. Недавно в серии работ Арима (Arima, 1952, 1955, 1958) довольно подробно исследовал состав перивителлиновой жидкости яиц японской веслоногой лягушки (Rhacophorus schlegelii var. arborea) на трех стадиях развития: стадии гаструляции, стадии начала пульсации сердца и стадии вылупления. Им установлено, что пе-ривителлиновая жидкость веслоногой лягушки содержит ионы натрия, хлора и сульфата, S-содержащие аминокислоты, следы креатина, аммоний, мочевую кислоту, мочевину и белки. Арима (1952) не обнаружил в перивителлиновой жидкости
41
ионов калия, кальция, фосфата, нитрата, а также углеводов типа гликогена. Белки в перивителлиновой жидкости яиц веслоногой лягушки были обнаружены при помощи биуретовой, нингидриновой, ксантопротеиновой, миллоновой реакций и другими тестами на белки.
Исследования аминокислотного состава белков перивителлиновой жидкости при помощи бумажной хроматографии показали, что они содержат цистин, тирозин, лизин, глютаминовую кислоту, аргинин, аспарагиновую кислоту и лейцин или изолейцин (Anima, 1955).
В перивителлиновой жидкости обнаружены и некоторые другие вещества, играющие специфическую роль в развитии зародышей. Так, Г. А. Буз-никовым (1955, 1957, 1959) обнаружен в перивителлиновой жидкости яиц белорыбицы, тайменя, лосося, горбуши, кеты, рыбца и шемаи фермент гиалуронидаза, который секретируется железками вылупления (Бузников, 1955; Бабурина и Бузников, 1957) на довольно поздних стадиях развития зародышей. Предполагается (Бузников, 1955, 1959), что этот фермент увеличивает проницаемость оболочек и сосудов желточного мешка зародышей, улучшая тем самым условия дыхания. Такие же специализированные функции, по-видимому, несут фермент затвердевания оболочек, обнаруженный у яиц лососевых (Зотин, 19586, в), пероксидаза (см. стр. 112) и фермент вылупления, подробный обзор о распространении которого у разных видов рыб, амфибий, моллюсков и др. животных, химии и физиологии секреции из желез вылупления дан недавно Г. А. Бузниковым и Г. М. Игнатьевой (1958). .
Все эти работы имеют лишь косвенное отношение к обсуждаемому здесь вопросу. К сожалению, кроме уже указанных выше исследований Дримы, проведенных на зародышах амфибий, мне известна лишь одна работа последнего времени, в которой достаточно тщательно изучен состав перивителлиновой жидкости только что оплодотворенных яиц — это работа Отзуки (Ohtsuka, 1958), проведенная на яйцах Oryzias latipes. Исследование Отзуки показало, что перивителлино-вая жидкость представляет собой гидрофильный коллоид, содержащий полисахариды. После кислотного гидролиза и при помощи бумажной хроматографии автор установил, что полисахариды перивителлиновой жидкости состоят из галактозы, маннозы и сахара, предположительно типа метилпентозы.
Несмотря на малочисленность исследований химического состава перивителлиновой жидкости яиц рыб, они вместе с цитохимическими данными (см. стр. 53) позволяют идентифицировать эти вещества с мукополисахаридами. Приписывать значительную роль в образовании перивителлинового пространства белкам, как это делали Богуцкий (1930) и Хайес и Армстронг (1942), нельзя, так как содержание их в перивителлиновой жидкости слишком мало.
42
3. КОРТИКАЛЬНЫЕ АЛЬВЕОЛЫ У ЯИЦ РЫБ
Богуцкий (1930) предполагал, что коллоиды секретируются под оболочку при образовании перивителлинового пространства из поверхностного слоя яйца. Однако позднее Аоки (Aoki, 1942) высказал предположение, что коллоиды с самого начала, до соприкосновения яйца с водой, предсуществуют между поверхностью яйца и оболочкой. Гипотеза Аоки противоречила данным Т. Ямамото (1939а, Ь), полученным на яйцах Oryzias latipes, согласно которым появление коллоидов в перивителлиновом пространстве связано с разрушением и исчезновением из поверхности яйца особых структур — кортикальных альвеол. Это заставило Кано (Kanoh, 1950) тщательно проверить гипотезу Аоки. Автор на срезах неоплодотворенных яиц не смог обнаружить даже следов студня между оболочкой и поверхностью яйца. Кано (1950) также показал, что у неоплодотворенных яиц кеты, помещенных в 1О°/о-ный раствор гуммиарабика, разрушаются кортикальные альвеолы, хотя при этом не происходит отделения оболочек. Однако выделение альвеол из поверхности яиц оказалось достаточным для того, чтобы после перенесения яиц из гуммиарабика в воду образовалось нормальное перивителлиновое пространство. Таким образом, коллоиды не предсуществуют под оболочками яиц, но появляются там после оплодотворения — одновременно с разрушением и исчезновением из поверхностного слоя яиц кортикальных альвеол.
Строение альвеол
Костистые. Ридер (Ryder, 1884) описал в поверхностном слое зрелых неоплодотворенных яиц трески (Gadus mor-hua) особые включения в виде частичек или пузырьков, которые исчезают из яйца после оплодотворения. Эти структуры, названные позднее Чжу-Си и Чен-Чао Ши (Tchou-Su a. Chen-Chao Hsi, 1936) кортикальными альвеолами, были обнаружены у зрелых неоплодотворенных яиц щуки (Reichard, 1893) *, Fundulus heteroclitus (Kagan, 1935; Kao C. Y., R. Chambers a. E. Chambers, 1951, 1954; Huver, 1956; Kemp a. Allen, 1956), серебряного карася — Carassius auratus L. (Tchou-Su a. Chen-Chao Hsi, 1936; Hamano, 1951, 1957; T. Yamamoto, 1954a), Oryzias latipes (T. Yamamoto, 1939a, 1944a, b, 1954b, 1956; Aketa, 1954; T. S. Yamamoto, 1955a; Nakano, 1954, 1956; Ohtsuka, 1957a), карпа — Cyprinus carpio L. (Ozima, 1943), лососевых рыб — Oncorhynchus keta (Kanoh, 1950, 1952a; K- Yamamoto, 1951b, 1952a; Kusa, 1953a, 1954, 1956,
* Цит. по Оккельбергу (Okkelberg, 1914).
43
1958а; Т. S. Yamamoto, 1955b; Kanoh a. T. S. Yamamoto, 1957), Salmo irideus (Devillers, Thomopoulos et Colas, 1954; Kusa, 1956), O. nerka (Kusa, 1954, 1956), Salvelinus fontinalis (Kusa, 1956), камбал — Limanda schrenki (K. Yamamoto, 1951a, 1953), Liopsetta obscura (K- Yamamoto, 1956c), сельдевых — Clupea harengus pallasi Vai (Kanoh, 1952a, 1953; K. Yamamoto 1955a, 1956a; Крыжановский, 1956; T. S. Yamamoto, 1957a; Yanagimachi, 1957b), Caspialosa kessleri pontica Eichwald (Крыжановский, 1953, 1956), Clupea harengus membras L. (Крыжановский, 1956), угая — Tribolodon hakuensis (Ka-noh, 1952a; Kanoh a. Ito 4953), Plecoglossus altivelis (Kanoh, 1952b; Ito, 1954), ерша—Acerina cernua L. (Крыжановский, 1953), леща — Abramis brama L. (Крыжановский. 1953), синца — Abramis ballerus (Юровицкий, 1956), окуня — Perea fluviatilis L. (Thomopoulos, 1953a), колюшек — Pungitius pungitius L. (Kusa, 1953b, 1956), Pungitius tymensis (Kusa, 1956), Gasterosteus aculeatus L. (Thomopoulos, 1953b), минтая— Theragra chalcogramma (Kanoh, 1954), Zacco platypus (Ito, 1954), корюшек — Hypomesus olidus (T. Yamamoto 1954a), Hypomesus japonicus (K- Yamamoto, 1955b, 1956b), Ammody-tes tobianus (Thomopoulos, 1954) .гольца — Lefua echigonia (Osanai, 1956), сырти — Vimba vimba L. (Сакун, 1958, 1959), змееголова — Ophiocephalus punctatus (Chopra, 1958).
По описанию Токи-о Ямамото (1939а, 1944а), весь кортикальный слой зрелых неоплодотворенных яиц Oryzias latipes, кроме небольшого участка на анимальном полюсе против микропилярного отверстия, заполнен альвеолами диаметром 10—20 ц, отличающихся от жировых капель показателем преломления. При оплодотворении или активации кортикальные альвеолы разрушаются и исчезают из поверхности яйца (рис. 16). Процесс разрушения кортикальных альвеол начинается на анимальном полюсе и волнообразно распространяется по всей поверхности яйца, заканчиваясь на вегетативном полюсе через 3 мин при 23° и через 2 мин при 28° (Т. Yamamoto, 1944а). Вслед за исчезновением кортикальных альвеол происходит отделение яйцевой оболочки, образование перивителлинового пространства и другие изменения, связанные с началом развития. Разрушение кортикальных альвеол у неоплодотворенных яиц О. latipes и последующее отделение оболочек можно вызвать активирующими агентами (1%-ным таурохолатом и гликохолатом натрия, 0,1%-ным сапонином, 0,06%-ным дигитолином, олеатом натрия, а также нагреванием яиц до 45° и воздействием электрического тока). Разрушение кортикальных альвеол у искусственно активированных яиц начинается, как и у нормально оплодотворенных, на анимальном полюсе и распространяется к вегетативному. При 44
активации неоплодотворенных яиц уколом тонкой стеклянной иглы разрушение альвеол и отделение оболочек начинается в месте укола и заканчивается на противоположной стороне яйца (Т. Yamamoto, 1939а, 1944а). Сходным образом описан процесс разрушения кортикальных альвеол у яиц сельди, салаки, ерша, леща (Крыжановский, 1953, 1956), колюшки
Рис. 16. Разрушение и исчезновение кортикальных альвеол после оплодотворения яиц Oryzias latipes.
С. Л.—кортикальные альвеолы; О. Р.—жировые капли; А — аинмальный полюс; V — вегетативный полюс (Yamamoto, 1939, а)
(Kusa, 1953b, 1956, 1958b), Plecoglossus altivelis, Zacco platypus (Ito, 1954) и др. рыб. Фотография кортикальных альвеол зрелых неоплодотворенных яиц Clupea pallasi, взятая из работы Кано и Янагимачи (1956), приведена на рис. 22.
У лососевых рыб наличие кортикальных альвеол в поверхностном слое неоплодотворенных яиц и их выделение под оболочку после оплодотворения или активации описано несколькими авторами (Kanoh, 1950, 1952а; К. Yamamoto, 1951b, 1952а; Kusa, Г953а, 1954, 1956, 1958b; Devillers, Thomopoulos et Colas, 1954; Kanoh a. T. S. Yamamoto, 1957; Гинзбург, 1960). Яйцевая оболочка зародышей лососевых рыб малопрозрачна, поэтому первые исследователи изучали кортикальные альвеолы на фиксированном материале. Лишь после разработки особой методики удалось наблюдать кортикальные альвеолы на живом материале (Kusa, 1954, 1956). Для этой цели неоплодотворенные яйца Oncorhynchus. keta и О. легка помещали в изотоничный раствор Рингера1, в котором яйца не
1 Изотоничным для яиц Oncorhynchus keta является физиологический солевой раствор (1 М NaCl—100; 1 М КС1 — 2,8, 2/з М СаС12 —3,4; рН = 7,0 добавлением '/ю н. NaHCO3), разбавленный до >/8 (Aoki, 1939). Для яиц Oryzias latipes изотоничным физиологическим раствором является М/7,5 раствор Рингера: М/7,5 NaCl— 100; М/7,5 КС1 — 2, М/11 СаС12— 2,1; рН = 7,3 добавлением NaHCOs ( Т. Yamamoto, 1939а).
45
активируются. Затем в оболочке делался разрез скальпелем и после того, как из разреза вытекала часть желтка, осторожно удалялся небольшой кусочек оболочки. Микроскопическое изучение открытого участка поверхности неоплодотворенного яйца показало, что она плотно набита кортикальными альвеолами диаметром от 3 до 30 ц, отличающимися по светопреломлению от более мелких (1,0—1,5 ц) каплеобразных структур и от более крупных жировых капель. В фазовом контрасте альвеолы имеют вид темных включений. По данным К- Ямамото (1951b), кортикальные альвеолы неоплодотворенных яиц О. keta имеют размеры 12—24 ц в диаметре. У яиц Salmo irideus (Devillers, Thomopoulos et Colas, 1954) кортикальные альвеолы имеют размеры около 20 ц в диаметре.
Кортикальные альвеолы, описанные у разных видов рыб, имеют размеры от 1 до 40 ц в диаметре. У яиц окуня и трехиглой колюшки они равны 20, у девятииглой колюшки — 4— 25, у кеты — 3—30, у форели — 20, у Oryzias latipes—10—40, у сельди 1,0—37,5, у корюшки—16—40, у минтая — 5—10. у угая —4—17, у яиц Zacca platypus и Plecoglossus altive-lis — 5—35, у Ammodytes tobianus.— 13 ц. Скорость выделения кортикальных альвеол из поверхности яйца различна у разных видов рыб и зависит от температуры. Так, у яиц черноморской сельди выделение альвеол при температуре 16— 18° заканчивается через 1,5 мин после оплодотворения (Кры-жановский, 1956), а у яиц сахалинской сельди при 10° за 10 мин (Kanoh, 1953). У яиц окуня выделение кортикальных альвеол происходит за 3 мин при 16—17° (Thomopoulos, 1953а), у яиц Plecoglossus altivelis за 4 мин при 20°, у яиц Zacco platypus за 5 мин при 20° (Ito, 1954), у яиц Vimba vimba L. при 15—16° за 5 мин (Сакун, 1959).
Разрушение каждой отдельной альвеолы происходит значительно быстрее. По наблюдениям С. Г. Крыжановского (1953, 1956), выделение каждой отдельной альвеолы у яиц черноморской сельди происходит почти мгновенно за промежуток времени, измеряемый долями секунды. У яиц сахалинской сельди крупные альвеолы диаметром 35 ц исчезают за 3—10 сек (Kanoh, 1953), у яиц серебряного карася — за 13— 15 сек (Hamano, 1951, 1957).
Осетровые. В. В. Заленский (1878) рписал у только что оплодотворенных яиц стерляди выделение в анимальной области прозрачного однородного вещества. Он считал, что это вещество образуется вследствие разбухания поверхностного слоя яйца. Процесс секреции особых веществ в анимальной части яйца после оплодотворения или активации яиц осетровых рыб детально изучен Т. А. Детлаф и А. С. Гинзбург 46
(Детлаф и Гинзбург, 1951а, б, 1954; Детлаф, 19576, 1958в, 1961). Они обнаружили в цитоплазме неоплодотворенных яиц осетра и севрюги, фиксированных 4% и 1О°/о-ным формалином,
Рис. 17. Выделение секрета из яиц осетра.
Разрезы: .4 — неоплодотворенное яйцо; Б — через 1 час после оплодотворения (20°). Фиксация 10%-ным формалином, окраска азановым методом по Гейденгайну
ж. о. I — внешняя желточная оболочка, ж. о. II — внутренняя желточная оболочка;
•я — лакуны, заполненные секретом; м. к.— микропилярные канальцы; пв. п.— перивителлиновое пространство; с. о.— студенистая оболочка (Детлаф и Гинзбург, 1954)
значительное количество веществ, окрашивающихся азановым методом по Гейденгайну в голубой цвет и распределенных в виде множества мелких островков в анимальной области (рис. 17). После оплодотворения или активации эти вещества выделяются из яйца, заполняя все пространство между уплощенной анимальной областью и оболочками (рис. 17). Прижизненные наблюдения и изучение срезов показывают, что секреция описанных веществ начинается не сразу, а лишь
•47
через 30 мин после оплодотворения (Детлаф и Гинзбург, 1954; Детлаф, 19576). В более поздней работе Т. А. Детлаф (1958в) указывает, что секреция веществ и образование видимого перивителлинового пространства начинаются, через 20—25 мин после оплодотворения и заканичваются через 40— 60 мин (при t=l7,8—18,0°).
В последние годы Т. А. Детлаф (19576, 1958в, 1961) обнаружила и подробно исследовала в овоцитах IV стадии зрелости и зрелых яйцах севрюги, осетра и белуги особые кортикальные гранулы. Эти гранулы расположены в кортикальном слое цитоплазмы над гранулами пигмента и образуют ряд плотно прилегающих друг к другу овальных телец, наиболее крупные из которых имеют размеры 2,2 X 3,8 ц. Кортикальные гранулы выделяются из яйца при оплодотворении или искусственной активации, причем этот процесс, как и у зародышей костистых рыб, начинается на анимальном полюсе (через 5—10 сек после осеменения) и, волнообразно распространяясь по поверхности яйца, заканчивается через 2—3 мин при 18° в вегетативной области. В результате выделения кортикальных гранул на нижней поверхности внутренней желточной оболочки образуется тонкий, вакуолизированный слой — гранулярный слой (Детлаф, 19576).
Кортикальные гранулы у яиц осетровых рыб изучены также А. С. Гинзбург (1959, 1960). Ею показано, в частности, что выделение кортикальных гранул из поверхности яйца препятствует проникновению в яйцо сверхчисленных спермиев.
Таким образом, у яиц осетровых рыб, в отличие от яиц костистых рыб, обнаружено два типа веществ, секретируемых яйцами после оплодотворения и отличающихся друг от друга по времени выделения из яйца, морфологии секрета и химическому составу.
Кроме этих веществ, у овоцитов IV стадии зрелости осетра, севрюги и стерляди недавно описаны особые «белковые фрагменты», расположенные в поверхностном слое цитоплазмы анимального полюса (Садов, 1957). По мнению автора, эти фрагменты являются остатками белковых веществ, поступающих в цитоплазму овоцита из фолликулярного эпителия. И. А. Садов считает, что при попадании яиц в воду фрагменты фолликулярного происхождения и светлый слой яиц разжижаются и, отжимая оболочки, образуют перивителлиновое пространство. Фрагменты ядерного вещества не оводняются и не участвуют в образовании перивителлинового пространства. Наблюдения И. А. Садова (1957) недостаточно обоснованы, поэтому необходимо подтверждение их другими авторами, прежде чем учитывать эти наблюдения при обсуждении
48
механизма образования перивителлиновой жидкости у яиц осетровых рыб.
Миноги. Херфорт (Herfort, 1893, 1901) описал в поверхностном слое зрелых неоплодотворенных яиц миноги (Lam-petra fluviatilis) альвеолы размерами 12 ц. Они располагаются по всей поверхности яйца, кроме небольшого участка в центре анимального полюса и вокруг направительного тельца (рис. 18). Такие же структуры найдены у неоплодотворенных яиц Lampetra wilder! (Okkelberg, 1914), L. planeri (T. Yamamoto, 1944c), L. fluviatilis (Лебкова, 1956), L. reissneri и L. japonica (Kusa, 1957b).
После оплодотворения или искусственной активации, когда оболочки начинают отделяться от поверхности яйца, стенки альвеол кортикального слоя вытягиваются в длинные нити, которые вскоре разрушаются, и содержимое альвеол переходит в перивителлиновое пространство (Okkelberg, 1914). Исчезновение кортикальных альвеол начинается вблизи анимального полюса и, волнообразно распространяясь по поверхности яйца, заканчивается на вегетативном полюсе (Okkelberg, 1914; Т. Yamamoto, 1944с). Весь процесс заканчивается в.течение 5 мин.
Наблюдение за живыми яйцами миноги показало, что отделению оболочек всегда предшествует секреция коллоидов из поверхностного слоя яйца в виде прозрачной массы, которая постепенно становится невидимой. Т. Ямамото (1944а) считает, что появление коллоидной массы в перивителлино-вом пространстве яиц миноги после оплодотворения связано с разрушением и исчезновением кортикальных альвеол из поверхности яйца. Активация яиц миноги искусственно-партеногенетическими агентами ведет к сходным изменениям: выделяется коллоид и оболочка отделяется от поверхности яйца (Т. Yamamoto, 1944с, 1945).
В недавней работе Куза и Оотаке (Kusa a. Ootake, 1959) обнаружили новые структуры, которые выделяются из поверхностного слоя яиц L. reissneri после оплодотворения. Они нашли, что через 20 мин после оплодотворения в перивител-линовом пространстве яиц появляется большое количество маленьких частичек, структурно отличающихся от кортикальных альвеол (см. рис. 6). Частицы появляются на анималь-ном полюсе на ранних стадиях отделения оболочек и образуют плотный слой, который менее плотен в вегетативной области яйца. После образования этот слой отделяется от внутренней поверхности и постепенно становится невидимым. Если только что оплодотворенное яйцо поместить в среду, богатую ионами Са, то эти частицы активно мигрируют по направлению к яйцевой оболочке и образуют сплошной
4 А И. Зогич
49
Рис. 18. Кортикальные альвеолы в неоплодотворенном яйце' миноги Lampetra fluviatilis
А — разрез яйца при малом увеличении; Б — часть поверхности яйца-при большом увеличении (Herfort, 1901)
глобулярный слой под внутренней поверхностью оболочки. Роль этих структур в развитии яиц миног пока не ясна.
Другие животные. Выделение веществ из яиц после оплодотворения описано у многих видов животных, начиная от червей и кончая млекопитающими.
У яиц нематоды Diplogaster longicauda после оплодотворения происходит исчезновение из цитоплазмы яйца особых вакуолей с последующим образованием оболочки и перивителлинового пространства (Ziegler, 189'5). В тех случаях, когда спер,мий не проникал в яйцо, опорожнения вакуолей и образования оболочки не происходило. Секреция содержимого вакуолей и связанные с этим процессом образования оболочки и перивителлинового пространства описаны также у яиц нематод из рода Rhabditis (Пальчикова-Остроумова, 1926) и у яиц лошадиной аскариды Parascaris equorum (Макаров, 1953а, б, 1958).
Ф. Лилли (Lillie, 1911, 1912, 1926) обнаружил в кортикальном слое неоплодотворенных яиц полихеты Nereis гомогенные альвеолы, которые исчезают после оплодотворения яиц. Студенистая оболочка и перивителлиновое пространство, которые отсутствуют у неоплодотворенных яиц, образуются у оплодотворенных яиц, благодаря секреции альвеол. Сходные образования у яиц Nereis были описаны и подробно изучены и другими авторами (Dungay, 1913; Novikoff, 1939; Costello, 1949, 1957, 1958; Taoka, 1956c) Костелло (1949, 1957, 1958) четко показал, что гранулы (как он называет альвеолы Лилли) являются предшественниками студенистой оболочки, которая возникает после оплодотворения яйца: в результате центрифугирования гранулы скапливаются на центробежном конце яйца, благодаря чему в первое время после осеменения перивителлиновое пространство и оболочка образуются только в той части яйца, где расположились гранулы. Кортикальные гранулы и их отношение к образованию студенистой оболочки у яиц некоторых других полихет изучены несколькими японскими авторами (Katsura, Taoka, Sakai a. Ichihara, 1955; Takashima, Katsura, Taoka a. Sakai, 1955; Taoka, 1956a, b).
Кортикальные гранулы у неоплодотворенных яиц морских ежей и их исчезновение после оплодотворения или активации были подробно изучены Мозером 1 (Moser, 1939а, b; Moser а.
1 Ротшильд в своей книге (1968а) указывает, что кортикальные гранулы у яиц морских ежей описаны еще Гарвеем (Harvey, 1911) и Джастом (Just, 1919). Однако следует подчеркнуть, что в работах этих авторов кортикальные гранулы (или капельки) упоминаются лишь мельком, наряду с описанием других изменений яйца, происходящих при оплодотворении. Только в четких работах Мозера, специально посвященных изменению кортикальных гранул, было показано значение кортикальных гранул для процесса оплодотворения яиц морских ежей.
4*
51
Kitching, 1939) и Мотомурой (Motomura, 1941). В кортикальный слой неоплодотворенных яиц Arbacia включены гранулы диаметром 0,79 ц, которые через 10—20 сек после осеменения начинают разрушаться (Moser, 1939а, Ь). От места вхождения спермия волна разрушения гранул распространяется по поверхности яйца, заканчиваясь на противоположном полюсе яйца через 9,9 сек при 25,7° после начала разрушения. Вслед за исчезновением гранул происходит образование перивителлинового пространства и оболочки оплодотворения (Moser, 1939а). Впоследствии было опубликовано много работ, показавших значение кортикальных гранул для образования перивителлинового пространства, оболочки оплодотворения и развития яиц различных видов морских ежей (см. Endo, 1952; Runnstrom, 1955; Дорфман, 1955; Allen а. Griffin, 1958; Rothschild, 1958а; Allen, 1958). Электрономикроскопическое исследование кортикальных гранул яиц морских ежей (McCulloch, 1952; Cheney a. Lansing, 1955; Afze-lius, 1956; Rothschild, 1958c) показало, что они представляют собой довольно сложные образования, состоящие из двойной внешней мембраны толщиной 90 А и нескольких внутренних включений, образующих иногда спиральные или концентрические структуры.
Кортикальные гранулы и их выделение из яиц после оплодотворения описаны также у яиц Saccoglossus (Colwin а. Colwin, 1954), амфибий (Motomura, 1952; Kemp, 1956а) и млекопитающих (Austin, 1956; Austin a. Bischop, 1957а, b). У яиц лягушки кортикальные гранулы имеют размеры 1,75— 2,0, у яиц хомяка — 0,1—0,5 р.
Таким образом, у очень многих групп животных после оплодотворения или активации обнаружена секреция веществ яйцами, которая предшествует образованию оболочек и перивителлинового пространства.
Интересную попытку сравнить кортикальные гранулы яиц осетровых рыб с кортикальными гранулами яиц морских ежей и амфибий, а секрета, выделяемого яйцами осетровых рыб после оплодотворения,—с гиалиновым слоем яиц морских ежей сделала Т. А. Детлаф (1958в). Ею показано, что существует аналогия в поведении, размерах, химическом составе и значении этих образований у яиц осетровых рыб, амфибий и морских ежей.
Куза (1953b, 1954, 1956) попытался сопоставить кортикальные альвеолы яиц костистых рыб с кортикальными гранулами морских ежей и амфибий и альвеолами нематод и аннелид по их функции и химическому составу. Однако в на стоящее время трудно провести обоснованное сопоставление кортикальных альвеол яиц костистых 'рыб с подобными же
52
структурами яиц других животных: хотя существует много общего в происхождении и механизме выделения кортикальных альвеол яиц костистых рыб и кортикальных гранул осетровых рыб (а также морских ежей), но по своему значению в процессе образования перивителлинового пространства кортикальные альвеолы яиц костистых рыб имеют больше общего с азановым секретом яиц осетровых рыб.
Химический состав альвеол
Данных о химическом составе веществ перивителлиновой жидкости, которые ответственны за образование перивителлинового пространства, пока еще слишком мало. Это связано с трудностями получения перивителлиновой жидкости в количестве, достаточном для химического анализа. Поэтому в последнее время была проделана большая работа по цитохимическому исследованию состава кортикальных альвеол рыб, содержимое которых после оплодотворения переходит в пе-ривителлиновое пространство и, по-видимому, определяет химический состав перивителлиновой жидкости.
Костистые. Конопацкая (Konopacka, 1935), по-видимому, первая обнаружила, что кортикальные альвеолы неоплодотворенных яиц бычка и карпа содержат мукопротеины. Куза (Kusa, 1953а, Ь, 1954, 1956), исследуя при помощи цитохимических методов кортикальные альвеолы неоплодотворенных яиц колюшки, кеты и нерки, нашел, что в их состав входят в основном полисахаридосодержащие вещества. Присутствие полисахаридов в кортикальных альвеолах установлено при помощи реакции Хочкисса, а также методом Бауера (рис. 19). Эти реактивы окрашивают разные полисахариды: гликоген, гиалуроновую кислоту и др. Однако, как показал Куза, альвеолы не окрашиваются реактивом Бенсли на гликоген и красятся основными красками после обработки их гиалуронидазой, что указывает на отсутствие в них гиалуроновой кислоты. Кортикальные альвеолы дают четкую метахромазию с толуидиновым синим, нейтральным красным и тионином, а также окрашиваются старыми растворами пиро-нина В. То и другое свидетельствует о том, что в состав альвеол входят полисахариды, эстерифицированные серной кислотой. Наличие мукополисахаридов в кортикальных альвеолах отмечено при помощи цитохимических реакций у неоплодотворенных яиц Leiognathus argenteum (Ihmuma а. Tsukuda, 1952), окуня, колюшки и Ammodytes tobianus (Thomopoulos, 1953а, b, 1954), Oryzias latipes (Aketa, 1954, T. S. Yamamoto, 1955a), форели (Devillers, Thomopoulos et Colas, 1954), судака и сазана (Arndt, 1954 — 1955, 1956), минтая
5S
Рис. 19. Окрашивание кортикальных альвеол яиц кеты (а) и нерки (б) по методу Хочкисса (Kusa, 1'954)
(Kanoh, 1954), камбалы, сельди и корюшки (К- Yamamoto, 1955а, b, 1956b, 1958), сельди (Т. S. Yamamoto, 1957а), сырти (Сакун, 1958, 1959, 1960) и Ophiocephalus puncta-tus (Chopra, 1958). У некоторых рыб кортикальные альвеолы яиц содержат кислые мукополисахариды (Oryzias latipes, колюшка, кета, нерка, корюшка), у других — нейтральные мукополисахариды (сельдь, камбала, сырть).
Химическим путем установлено наличие полисахаридов в изолированных центрифугированием кортикальных альвеолах яиц Oryzias latipes (Nakano, 1956, Ohtsuka, 1958).
Помимо полисахаридов в кортикальных альвеолах неоплодотворенных яиц костистых рыб обнаружено цитохимическими тестами небольшое количество белков (Kusa, 1954, 1956, 1958; К- Yamamoto, 1956с, d, 1958; Т. S. Yamamoto, 1957а; Chopra, 1958; Сакун, 1959, 1960).
Большинство авторов (кроме Акеты, 1954), изучавших цитохимический состав кортикальных альвеол, не смогли обнаружить в них липидов (Kusa, 1953b, 1956, 1958; Т. S. Yamamoto, 1955а); К- Yamamoto, 1955а, b, 1956а, b, с; Chopra, 1958). Вкортикальных альвеолах не обнаружены также рибонуклеиновая и дезоксирибонуклеиновая кислоты (Kusa, 1954, 1956, 1958b).
Предполагается, что в состав кортикальных альвеол лососевых рыб входит небольшое количество аминосахаров (Kusa, 1954, 1956, 1958). При помощи реакции Шевремона и Фредерика в кортикальных альвеолах яиц сахалинской сельди отмечено наличие дисульфидных связей (Т. S. Yamamoto, 1957а). Кортикальные альвеолы неоплодотворенных яиц сига содержат также пероксидазу (см. стр. 113).
Осетровые. У яиц осетровых рыб подробное цитохи-
54
мическое исследование кортикальной реакции при оплодотворении яиц проведено Т. А. Детлаф (19576, 1958в, 1961). Как уже говорилось, -было обнаружено два типа секреции веществ яйцами осетровых рыб после оплодотворения или активации: выделение секрета, окрашиваемого в синий цвет азановым методом, и выделение кортикальных гранул. Цитохимические исследования показали, что в состав этих двух секретов входят разные вещества.
Кортикальные гранулы дают положительную реакцию на полисахариды по методу Хочкисса в модификации Шабада-ша, которая сохраняется при обработке препаратов растворами диастазы и гиалуронидазы (Детлаф, 19576, 1961). При окрашивании толуидиновым синим они обнаруживают у-ме-тахромазию. При окрашивании старым раствором пиронина они имеют красновато-розовый цвет, который сохраняется после обработки срезов раствором кристаллической рибонуклеазы. Все это свидетельствует о присутствии в кортикальных гранулах кислых полисахаридов (Детлаф, 1957, 1958). Наоборот, секрет, окрашиваемый азановым методом в голубой цвет, не содержит кислых полисахаридов, но включает гранулы гликогена, следы рибонуклеиновой кислоты и, возможно, аминосахара (Детлаф, 19576).
Миноги. Цитохимическое исследование состава кортикальных альвеол яиц миног (Lampetra reissneri и L. japoni-са) показало, что они дают положительную реакцию при обработке препаратов Шифф-йодной кислотой (реакция Хочкисса), Шифф-хромовой кислотой (реакция Бауэра) и Шифф-2,4-динитрофенилгидразином, т. е. содержат мукополисахариды (Kusa, 1957b). Альвеолы устойчивы к амилазе, не красятся йодом и не дают метахромазии с толуодиновым синим. Альвеолы миног не дали также заметной реакции на белки. Из этих наблюдений можно заключить, что в состав кортикальных альвеол миног входят в основном нейтральные мукополисахариды (Kusa, 1957b).
Другие животные. Наличие мукополисахаридов, эстерифицированных серной кислотой, обнаружено в кортикальных гранулах морских ежей (Моппё a. Slautterback, 1950; Моппё, 1950; Моппё a. Harde, 1951b). Иммерс (Immers, 1956) считает, что в состав кортикальных альвеол морских ежей входят мукополисахариды с незамещенными а-гликоло-выми группами. У яиц нематод (Макаров, 1953а, б, 1958) и полихет (Таока, 1956с) также найдены полисахариды в составе включений, секретируемых яйцами после оплодотворения.
В состав гранул яиц Tylorrhynchus heterochaetus входят кислые мукополисахариды (Taoka, 1956b). Келли (Kelly, 1954) показали, что у некоторых видов аннелид, моллюсков,
55
членистоногих и иглокожих поверхностный слой яиц дает метахромазию с толуидиновым синим.
Кортикальные гранулы яиц амфибий также, по-видимому, содержат кислые мукополисахариды. Как показал Вартенберг (Wartenberg, 1956), гранулы кортикального слоя яиц Xenopus laevis и Rana fusca дают положительную реакцию Хочкисса. Розенбаум (Rosenbaum, 1958) нашел, что поверхностная зона яиц Rana pipiens, лежащая под оболочками, дает метахромазию с толуидиновым синим, тионином, целестиновым синим В и пинационолом и положительную реакцию Хочкисса.
Таким образом, кортикальные альвеолы яиц костистых рыб и миног, кортикальные гранулы осетровых рыб и многих других животных содержат главным образом кислые или нейтральные мукополисахариды.
Происхождение альвеол
Выяснение химического состава кортикальных альвеол при помощи цитохимических реакций дало в руки исследователей хорошие методы специфического окрашивания кортикальных альвеол и их предшественников во время овогенеза. Акета (Aketa, 1954) один из первых проследил происхождение кортикальных альвеол в овоцитах Oryzias latipes. Он, а позднее и другие авторы (Arndt, 1954— 1955, 1956; Т. S. Yamamoto, 1955а; К. Yamamoto, 1955а, b, 1956а, Ь, 1958; Osanai, 1956; Са-кун, 1958, 1959, 1960; Chopra, 1958) показали, что кортикальные альвеолы зрелых овоцитов происходят из вакуолей, которые появляются вблизи ядра молодых овоцитов до начала образования желтка.
Следует сказать, что вакуоли в молодых овоцитах костистых рыб были описаны очень многими авторами, изучавшими овогенез у разных видов рыб (см., например, Мейен, 1927; Гербильский 1939; Казанский, 1949; Анисимова, 1952; Иванов М. и Додзина, 1957; Чепурнова, 1958, и др.). Однако только после работ Акеты, Т. С. Ямамото, Арндта, и особенно’ после работ К. Ямамото и О. Ф. Сакун, становится ясным роль и значения этих структур.
В овоцитах сельди (Clupea pallasi) вакуоли или желточные пузырьки появляются в виде маленьких гранул в цитоплазме молодых овоцитов еще до начала образования желтка (К. Yamamoto, 1955а). По мере роста овоцита они увеличиваются в размерах и числе и располагаются по периферии овоплазмы,. образуя кольцо. Сходным образом изменяются желточные пузырьки в овоцитах комбалы (рис. 20). Желточные пузырьки, в отличие от овоплазмы, дают положительную реакцию 56
Рис. 20. Возникновение и изменение кортикальных альвеол во время овогенеза у камбалы Liopsetta obscura
а — ранний период появления желточных пузырьков (презумптивных кортикальных альвеол); б — средний период; в — поздний период; г—первичная стадия образования желтка; д — вторичная стадия; е — ранний период третичной стадии; ж и з — поздние периоды третичной стадии; и — стадия созревания. Фиксация смесью Буэн-Аллена, окраска по методу Хочкисса (з— толуидиновым синим), с. а,— кортикальные альвеолы, у. v — желточные пузырьки (К. Yamamoto, 1956с)
Хочкисса и Бауэра на полисахариды. Желточные пузырки сельди (К- Yamamoto, 1955а) и корюшки (К. Yamamoto, 1955b) не дают заметной реакции на липиды и белки. При дальнейшем росте овоцитов сельди желточные пузырьки постепенно распространяются к центру, заполняя почти всю цитоплазму овоцита (К. Yamamoto, 1956а). Желточные зерна, появившиеся несколько позже желточных пузырьков на периферии овоплаз-мы, также начинают распространяться к центру и постепенно •оттесняют желточные пузырьки снова к периферии овоцита. На всех стадиях образования желтка размер и количество пузырьков остаются почти неизменными. На стадии созревания овоцита они располагаются вблизи оболочек и по размерам, форме, местоположению и реакции на полисахариды сопоставимы с кортикальными альвеолами (рис. 20). За время •образования желтка химическая природа содержимого желточных пузырьков овоцитов сельди и камбалы (К. Yamamoto, 1956а, с, d) не меняется, они содержат главным образом нейтральные мукополисахариды. Желточные пузырьки корюшки (Hypomesus japonicus) на ранних стадиях развития овоцитов содержат также нейтральные мукополисахариды (они не дают метахромазии с толуидиновым синим), однако на более поздних стадиях развития в желточных пузырьках появляются кислые мукополисахариды, которые сохраняются и в кортикальных альвеолах (К. Yamamoto, 1955b, 1956b, 1958). К. Ямамото (1956b) указывает также, что имеются и такие виды рыб, например, Oryzias latipes (см. Т. S. Yamamoto, 1955а), у которых желточные пузырьки с самых ранних стадий содержат кислые мукополисахариды.
В отличие от желточных зерен желточные пузырьки образуются не из митохондрий, а из особых аргентофильных телец, выявляемых по методу Да-Фано. В овоцитах сельди (К. Yamamoto, 1955а) эти тельца появляются раньше желточных пузырьков и располагаются в виде неправильного полулунного тела, вплотную прилегающего к ядру. Затем аргентофильное тело разбивается на гранулы, которые распространяются по всей овоплазме. Перед образованием желточных пузырьков аргентофильные гранулы образуют сеть по всей овоплазме, а затем скапливаются на периферии, где и обнаруживаются впоследствии (К. Yamamoto, 1955b). Желточные пузырьки в первое время после своего образования импрегни-руются серебром, затем это свойство исчезает.
Исследуя цитохимически природу аргентофильных телец молодых овоцитов камбалы (Liopsetta obscura), К. Ямамото (1957а) нашел, что после фиксации раствором кобальт-нитрит-формола и смесью Рего можно обнаружить мукополисахариды в наиболее крупных молодых овоцитах в тех же местах,
.58
где обнаруживаются аргентофильные тельца. По методу Око-мото обнаружены свободные сахара у маленьких по размеру овоцитов также в местах, где расположены аргентофильные тельца (К- Yamamoto, 1957а).
Осетровые. У яиц осетровых рыб происхождение кортикальных гранул прослежено недостаточно полно. В овоцитах до стадии растворения ядра они найдены в' кортикальном слое (Детлаф, 1961).
Рис. 21. Схема последовательных стадий перехода кариоплазмы .в цитоплазму при созревании овоцитов осетра
1 — зародышевый пузырек; 2 — кариоплазма (Казанский, 1954)
Происхождение секрета, окрашивающегося азановым методом по Гейденгайну в голубой цвет, изучено значительно полнее. Было показано, что появление этого секрета в цитоплазме зрелого неоплодотворенного яйца преемственно связано с растворением ядра овоцита: в фазе растворения ядер-ной оболочки в цитоплазме овоцита обнаруживаются ручейки, окрашивающиеся азановым методом в голубой цвет (Детлаф и Гинзбург, 1954). Наличие особой однородной массы веществ, рассеянной в виде островков в анимальной части яиц стерляди, отмечал еще В. В. Заленский (1878). Однако он не установил их связи с выделением яйцом прозрачных веществ под оболочку. Переход кариоплазмы ядра овоцита севрюги и осетра фазы растворения ядра в цитоплазму и распределение ее среди желтка анимальной области описано также Н.П.Вотиновым (1947) и Б. Н. Казанским (1954, 1957). Согласно данным Б. Н. Казанского (1954, 1957), крупное пузырчатое ядро овоцита при созревании овоцита уменьшается почти в 300 раз за счет выхода («выфильтровывания») большей части кариоплазмы через базальную часть ядра, при этом кариоплазма распределяется среди желтка анимальной области (рис. 21). Голубые (при окраске азановым методом) островки кариоплазмы в дальнейшем перемещаются к оболочке. Таким образом, появление веществ, секретируемых яйцом осетро
59
вых рыб после оплодотворения или активации, в цитоплазме анимальной части яйца связано с деятельностью ядра овоцита в фазе растворения ядерной оболочки.
Мы видим, что вещества, описанные у яиц осетровых рыб, по способу образования и характеру секреции резко отличаются от кортикальных альвеол яиц костистых рыб.
4. СВЯЗЬ ПРОЦЕССА РАЗРУШЕНИЯ
И ИСЧЕЗНОВЕНИЯ КОРТИКАЛЬНЫХ АЛЬВЕОЛ С ОБРАЗОВАНИЕМ ПЕРИВИТЕЛЛИНОВОГО ПРОСТРАНСТВА У ЯИЦ КОСТИСТЫХ РЫБ
Первые авторы, описавшие процесс исчезновения кортикальных альвеол из поверхности яиц рыб после оплодотворения или активации, считали, что исчезновение альвеол связано с формированием бластодиска (Kagan, 1935). Однако на основании тщательных исследований Т. Ямамото (1939а,Ь) пришел к выводу, что исчезновение кортикальных альвеол у яиц Oryzias latipes связано главным образом с отделением оболочек и образованием перивителлинового пространства. Т. Ямамото (1939а, Ь) все же считал, что, кроме образования перивителлинового пространства, исчезновение кортикальных альвеол необходимо для начала и других процессов, происходящих после оплодотворения, таких как образование бластодиска и жировой зоны (биполярная дифференцировка). В дальнейшем многими авторами было доказано, что разрушение кортикальных альвеол не является обязательным условием биполярной дифференцировки и развития оплодотворенного яйца. Так, нагревая неоплодотворенные яйца сельди (Clupea pallasi) до 30—35° в течение 1 мин, Кано (Kanoh, 1952а) показал, что у таких яиц после осеменения начинается образование бластодиска и последующее дробление, хотя разрушения кортикальных альвеол не происходило (см. также Kanoh a. Yanagimachi, 1956). Кортикальные альвеолы у яиц, обработанных высокой температурой, сохранялись в желтке до очень поздних стадий развития (рис. 22). Кортикальные альвеолы сохраняются также в развивающихся яйцах кеты, которые до оплодотворения были лишены яйцевых оболочек путем обработки их подкисленным раствором Рингера и панкреатином. В других опытах было найдено, что активация яйца кеты изотоничными растворами СаСЬ и MgCl? (Kanoh, 1952а; Kusa, 1953b, 1954, 1956, 1958) и изотоничным раствором Рингера, содержащим ионы цинка (Т. S. Yamamoto, 1957b), происходит без разрушения кортикальных альвеол. Трехвалентные ионы АТ", Се" и La"’ препятствуют разрушению кортикальных альвеол у яиц форели, не влияя на акти-
60
Рис. 22. Влияние нагревания неоплодотворенных яиц сельди Clupea pallasii (1 мин., 30—35°) на процесс разрушения кортикальных альвеол и развитие зародышей
'1 и б — яйца, обработанные температурой (стадия 4 и 8 бластомер); в и г — разрезы тех же яиц (видны кортикальные альвеолы в бластодиске); е — контрольное яйцо (стадия 2-х бластомер): д— разрез контрольного яйца (кортикальные альвеолы отсутствуют); ж — поверхность зрелого неоплодотворенного яйца (Kanoh a. Yanacimachi.
1956)
нацию яйца и биполярную дифференцировку зародыша (De-villers, Thomopoulos et Colas, 1954). Наконец, было установлено, что у яиц угая (Tribolodon hakuensis) образование бластодиска в 15—20%-ном растворе гуммиарабика начинается задолго до того, как заканчивается разрушение кортикальных альвеол (Kanoh, 1952а; Kanoh a. Ito, 1953).
Таким образом, этими опытами точно доказано, что разрушение и исчезновение кортикальных альвеол из поверхностного слоя яиц костистых рыб после оплодотворения или активации не является обязательным условием дальнейшего развития зародышей. С другой стороны, экспериментальные данные, полученные при изучении влияния солей и солевых сред на оплодотворенные яйца, показывают необходимость выделения кортикальных альвеол из яйца для образования перивителлинового пространства.
Еще Рунстрём (Runnstrom, 1920) показал, что яйца форели в растворе Рингера и морской воде не отделяют оболочку
61
и сохраняют способность к оплодотворению в течение 3 суток. Позднее Богуцкий (1930) нашел, что присутствие электролитов в воде задерживает образование перивителлинового пространства у яиц форели, в то время как даже концентрированные растворы неэлектролитов не влияют на этот процесс. Как уже говорилось, это заставило автора предположить, что поступление воды в перивителлиновое пространство происходит не под действием осмотических сил, а путем абсорбции воды коллоидами, выделяемыми яйцом под оболочку. Подробные исследования влияния солей на образование перивителлиново-го пространства у яиц лососевых рыб показали, однако, что из опытов Богуцкого не следует вывод о том, что электролиты и неэлектролиты по-разному действуют на процесс образования перивителлинового пространства. Если яйца свирского1 лосося и сига из полостной жидкости, после осеменения, перенести в раствор 0,1 н. NaCl, минуя воду, то у таких яиц,, как и следует из материалов Богуцкого, отделения оболочек и образования перивителлинового пространства не происходит (Зотин, 1954а). Яйца, помещенные из полостной жидкости а 0,1 н. раствор NaCl, имеют вид неоплодотворенных яиц: обо лочка у них не отделилась, объем не изменился, бластодиск и жировая зона не образовались (у сига жировая зона не стянута к центру анимальной части яйца). При помещении таких яиц в воду через 10 час пребывания в 0,1 н. растворе NaCl все эти процессы протекают нормально. В 0,1 М растворе-глюковы и в воде образование перивителлинового пространства и другие изменения яйца идут с обычной скоростью.
Действие раствора NaCl на образование перивителлинового пространства можно объяснить двояко: 1) 0,1 н. раствор NaCl блокирует вещества, выделенные яйцом под оболочку, препятствуя тем самым нормальному процессу всасывания воды или 2) 0,1 н. раствор NaCl действует на поверхность самого яйца препятствуя секреции веществ под оболочку. Проверка обоих предположений была проведена следующим образом. Одну часть яиц форели оплодотворяли в воде и через 10 мин помещали в 0,1 н. растворы, солей (рис. 23, Б). Другую часть яиц из полостной жидкости, куда была добавлена сперма, переносили в соответствующие растворы, минуя воду (рис. 23, А). На рис. 23 показаны сфотографированные сбоку яйца после 120 мин пребыванияи в 0,1 н. растворах различных солей (1 и 2 — LiCl; 3 и 4 — КС1; 5 и 6 — СаС12; 7 и 8 — Mg С12; 9 и 10 — FeCh; 11 и 12 — 0,09 н. NaCl). Как видно из рис. 23, у яиц, помещенных в 0,1 н. растворы NaCl, MgCl2, СаС12, FeCl3 прямо из полостной жидкости, процесс отделения оболочек оказался полностью остановленным, а у яиц, помещенных в 0,1 н. растворы LiCl и КС1,— сильно затормозился. Наоборот, у яиц, помещенных в растворы солей после того, как они побыли некоторое время в воде (10 мин), образовалось нормальное перивителлиновое пространство (кроме FeCl3). Торможение секреции осмотически активных веществ под оболочку не является специфичным для растворов NaCl, MgCl2 и СаС12, хотя их действие более эффективно, чем растворов LiCl п КС1, (рис. 23). Как показывают опыты, увеличение концентрации солей КС1 в растворе также приводит к полному подавлению образования перивителлинового пространства.
62
С другой стороны, уменьшая концентрацию NaCl в растворе, можно получить такие растворы NaCl, в которых отделение оболочек и образование-перивителлинового пространства будет итти нормально (рис. 23; 13 и 14--0,08 н. NaCl; 15 и 16-—0,07 н.; 17 и 18 — 0,06 н.; 19 и 20 — 0,05 н.). Раствор NaCl полностью подавляет образование перивителлинового пространства у яиц свирского лосося, форели и сига только в концентрации от 0,7 н. и выше.
Опыты показывают, что 0,1 н. растворы LiCl, КС1, NaCl, MgCl2 и СаС12 действуют не на процесс всасывания воды под оболочку, а подавляют процессы выделения яйцом веществ, вызывающих образование перивителлинового пространства. Если образование перивителлинового пространства уже началось, то растворы указанных солей, так же как и раствор глюкозы, не могут приостановить этого процесса. Это не относится к FeCl3 и А1С1з, которые, как уже говорилось, блокируют не только выделение активных веществ из яйца, но и сам процесс всасывания воды под оболочку. С другой стороны, эти опыты доказывают, что осмотически активные вещества секретируются из яйца после оплодотворения, а не предсуществуют между оболочками и поверхностью неоплодотворенного яйца.
Опытами Т. Ямамото (1939а) и других авторов установлено, что действие солевых растворов связано с предотвращением разрушения кортикальных альвеол у неоплодотворенных яиц Oryzias latipes. В М/7,5 растворе Рингера яйца не изменяются и сохраняют способность к оплодотворению в течение многих часов, в то время как в водопроводной воде они теряют эту способность за несколько минут. Кортикальные альвеолы у яиц, помещенных в раствор М/7,5 Рингера, не разрушаются. У неоплодотворенных яиц Salmo irideus, помещенных в двойной раствор Гольфретера, кортикальные альвеолы оказались неизменными даже через 36 час пребывания в этом растворе, тогда как в воде они исчезают из поверхности яйца через 30 мин (Devillers, Thomopoulos et Colas, 1954). Сохранение кортикальных альвеол при действии трехвалентных катионов сопровождалось подавлением образования перивителлинового пространства. Сходные данные получены для яиц окуня (Thomopoulos, 1953а), кеты и нерки (Kusa, 1953а, 1954).
Таким образом, солевая среда тормозит процесс разрушения кортикальных альвеол и тем самым препятствует образованию перивителлинового пространства'.
1 В работе Ито (Ito, 1960b) приведены наблюдения, показывающие что механизм действия ионок Na-, К' и Са- на яйца Plecoglossus altivelis различен: Na- блокирует изменения, предшествующие исчезновению кортикальных альвеол, а К' и Са- — сам процесс разрушения альвеол.
63
Следует отметить, что опыты с влиянием трехвалентных ионов на образование перивителлинового пространства (Devil-ler, Thomopoulos et Colas, 1954; Thomopoulos, 1953a) сами no себе не достаточны для доказательства того, что образование перивителлинового пространства связано с веществами, выделяющимися из яйца, так как трехвалентные ионы тормозят образование перивителлинового пространства на всех стадиях его возникновения (рис. 11, 23). Однако во всех'случаях, когда удавалось блокировать разрушение кортикальных альвеол (опыты Kanoih, 1952а; Kusa, 1953b, 1954, 1956; Kanoh a. Ito, 1953; Kanoh a. Yanagimachi, 1956; Kanoh a. T. S. Yamamoto, 1957; T. S. Yamamoto, 1957b), всегда одновременно подавлялось и образование перивителлинового пространства. Сопоставление всех этих наблюдений с данными о блокировании солевыми растворами осмотически активных веществ показывает, что появление осмотически активных веществ под оболочкой яиц после оплодотворения или активации связано с разрушением и исчезновением кортикальных альвеол из поверхности яиц.
Для яиц миног нет точных доказательств связи разрушения кортикальных альвеол с образованием перивителлинового пространства. Однако наблюдения Т. Ямамото (1944с) над исчезновением альвеол, отделением оболочек и образованием перивителлинового пространства у оплодотворенных и активированных яиц Lampetra planeri делают эту возможность весьма вероятной.
У осетровых рыб перивителлиновое пространство возникает одновременно с выделением из яйца секрета, окрашивающегося азановым методом в синий цвет (Детлаф и Гинзбург, 1954; Детлаф, 19576). Поэтому образование перивителлинового пространства у яиц осетровых рыб, в отличие от миног и костистых рыб, связано не с выделением кортикальных гранул, ас секрецией особых веществ из анимального полюса яйца. Кортикальные гранулы выделяются из яиц осетровых рыб значительно раньше начала образования перивителлинового пространства и служат, вероятно, для высвобождения яйца из прочной связи с внутренней желточной оболочкой, что является, конечно, и первой, необходимой ступенью образования перивителлинового пространства (Детлаф, 1958в, 1961).
5. МЕХАНИЗМ РАЗРУШЕНИЯ АЛЬВЕОЛ И КОРТИКАЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ У ЯИЦ РЫБ
Куза (1953b, 1956, 1958) детально изучил в фазовом контрасте процесс исчезновения отдельной альвеолы из поверхности яиц девятииглой колюшки. Исчезновение альвеолы
5 А. и. Зотин
65
осуществляется за несколько секунд. Первым признаком начала процесса разрушения альвеолы является потеря ею четких очертаний (рис. 24), после чего альвеола становится больше и ярче и принимает форму кувшина, открытый конец ко-торого обращен к оболочке. Затем альвеола начинает уменьшаться в размерах и исчезает (рис. 24). Сходные описания
Рис. 24. Схематическое изображение процесса разрушения одной кортикальной альвеолы. Объяснение в тексте (Kusa, 1956)
процесса исчезновения кортикальных альвеол у яиц Plecog-lossus altivelis и Zacco platypus приводит Ито (Ito, 1954). Он также отмечает, что перед исчезновением альевола становится крупнее и ярче. В месте контакта альвеолы с поверхностью яйца, по-видимому, образуется отверстие, через которое и происходит переход содержимого альвеолы под оболочку. Электронно-микроскопическое исследование неоплодотворенных и оплодотворенных яиц Fundulus heteroclitus (Kemp а. Allen, 1956) показало, что детали процесса исчезновения каждой отдельной альвеолы у яиц этих рыб сходны с тем, что прижизненно наблюдали Куза и Ито на яйцах других рыб. После оплодотворения альвеолы у F. heteroclitus подходят к поверхности яйца и их содержимое выбрасывается в перивителлиновое пространство, при этом у многих альвеол образуются кратероподобные углубления на поверхности с цитоплазматическим кольцом вокруг кратера альвеолы. Через этот кратер происходит выход содержимого альвеол под оболочку.
Импульс активации или «волна оплодотворения»
Как отмечалось выше, процесс разрушения всех кортикальных альвеол у яиц костистых рыб продолжается 3— 5 мин, исчезновение каждой отдельной альвеолы осуществляется за несколько секунд. Встает вопрос, зависит ли исчезновение каждой отдельной альвеолы от исчезновения соседних альвеол или оно определяется распространением по яйцу какого-то общего для всех альвеол фактора?
66
Т. Ямамото (1944а, b, 1951, 1954b, 1956) на основании своих наблюдений над яйцами Oryzias latipes пришел к заключению, что разрушение кортикальных альвеол связано с распространением в кортикальном слое яиц особого стимула — «волны оплодотворения», возникающего в результате оплодотворения или искусственной активации. Импульс активации может проходить по цитоплазме, свободной от кортикальных альвеол, и разрушение каждой отдельной альвеолы не связано с разрушением соседних альвеол. Действительно, у яиц О. latipes, как и у других рыб, в небольшой зоне анимальной области против микропилярного отверстия, т. е. в том месте, куда при оплодотворении проникает сперматозоид, кортикальные альвеолы отсутствуют и импульс, создаваемый спермием, проходит через участок, свободный от альвеол (Т. Yamamoto, 1944b). Независимость прохождения импульса активации от наличия кортикальных альвеол еще более убедительно показана в опытах с центрифугированием яиц Oryzias. В центрифугированных яйцах Oryzias (10 мин, 120 об!мин) альвеолы смещаются к вегетативной области яйца, и большие участки поверхностной цитоплазмы яйца в районе анимально-го полюса оказываются свободными от кортикальных .альвеол. Такие яйца можно оплодотворить, причем альвеолы, лежащие в кортикальной цитоплазме, разрушаются и исчезают, как и при оплодотворении нормальных яиц (Т. Yamamoto, 1944b), Активация центрифугированных яиц уколом микроиглы в без-альвеольную область вызывает разрушение альвеол, лежащих в противоположной части яйца. . .
Распространение «волны оплодотворения» осуществляется только по кортикальной цитоплазме1, так как разрушения альвеол, попавших в результате центрифугирования в желток, не происходит (Т. Yamamoto, 1944b, 1954b, 1956, см. также Rothschild, 1958b).
1 Следует сказать, что эти наблюдения Т. Ямамото не могут, конечно, служить достаточным доказательством того, что «волна оплодотворения» распространяется по поверхностной цитоплазме яйца, так как, исходя из наблюдений Куза (1953в) и Ито (1954), трудно себе представить возможность разрушения альвеолы, окруженной со всех сторон желтком. Ротшильд (1949, 1958а) на основании математических расчетов скорости диффузии гипотетических веществ, вызывающих кортикальные изменения и блок полиспермии у яиц морских ежей, пришел к выводу, что если в этих явлениях участвует диффузия, то вещество скорее диффундирует через цитоплазму яйца, чем через кортикальный слой. Рунстрём и Крисчат (Runnstrom a. Kriszat, 1952) на основании своих опытов (раскритикованных Ротшильдом, 1958а), Кашер (Kacser, 1955), Эллен и Хэг-стром (Allen a. Hagstrom, 1955) пришли к выводу, что кортикальные изменения связаны с импульсом или реакциями, протекающими в поверхностной Цитоплазме яйца
Т. Ямамото в доказательство теории «волны оплодотворения» приводит свои наблюдения за скоростью процесса разрушения кортикальных альвеол и чувствительностью к уколам анимальной и вегетативной областей яиц Oryzias latipes (Т. Yamamoto, 1944b) и Lampetra planeri (T. Yamamoto, 1944c, 1956). Он показал, что скорость распространения разрушения альвеол и чувствительность к уколу микроиглой больше в анимальной области яйца: разрушение альвеол при уколе •в аномальный полюс яиц Oryzias начинается через 18 сек, (21—23°), на экваторе — через 20 сек, на вегетативном полюсе— через 37 сек. У яиц миноги укол на анимальном полюсе вызывает разрушение альвеол через 38 сек (17—18°), а укол на вегетативном полюсе — через 89 сек. Таким образом, существует градиент возбудимости и проводимости кортикальной реакции в направлении от анимального полюса к вегетативному. Наличие этого градиента трудно объяснить, если считать, что разрушение каждой отдельной альвеолы зависит только от разрушения соседних альвеол. Возникновение волны оплодотворения в яйцах Plecoglossus altivelis по данным Ито (Ito, 1960b) стимулируется в кислой среде; в щелочной среде и в М/т растворе NaCl происходит торможение этого процесса.
Для понимания природы «волны оплодотворения» интересные данные получил Хори (Hori, 1958), изучавший изменение биоэлектрических потенциалов у неоплодотворенных и активированных яиц Oryzias latipes при помощи микроэлектродов. Оказалось (рис. 25), что изменение потенциала после активации проходит пять фаз: 1) пик снижения потенциала, предшествующий разрушению кортикальных альвеол, 2) постепенное уменьшение потенциала, 3) плато в течение небольшого времени, 4) постепенное увеличение потенциала и 5) новое плато. Пик снижения потенциала, предшествующий разрушению кортикальных альвеол, достигает значения в 15—20 mV. Если разрушение кортикальных альвеол начинается через 25—100 сек после активации, то пик снижения потенциала наблюдается через 3—18 сек после активации и продолжается '/so—'/25 сек (рис. 25), причем чем меньше время от активации до пика, тем меньше проходит время до начала разрушения альвеол. Если при попытке искусственной активации пик не наблюдается, то разрушения кортикальных альвеол не происходит. Как предполагает Хори (1958), пик Снижения потенциала связан с прохождением волны оплодотворения по поверхности яйца, хотя прямых доказательств Этой связи пока не получено Интересно, что и сам процесс
1 В работе Ито и. Маено (Ito а Маёпо, 1960) показано, что мембран
разрушения кортикальных альвеол сопровождается изменением электропотенциала: в течение процесса разрушения альвеол происходит постепенное снижение электропотенциала, а начало увеличения потенциала совпадает с окончанием процесса разрушения альвеол (рис. 25).
Рис. 25. Изменения электропотенциала, сопровождающие активацию яиц Oryzias latipes.
1 — пик, предшествующий разрушению кортикальных альвеол; 2 — начало разрушения альвеол; 3 — окончание разрушения почти всех альвеол (Hori, 1958).
Таким образом, в работе Хори впервые у яиц костистых рыб обнаружены явления, отличные от процесса разрушения кортикальных альвеол, которые, возможно, указывают на прохождение волны оплодотворения по яйцу.
Наличие импульса активации или «волны оплодотворения», предшествующих процессу исчезновения кортикальных гранул из поверхности яйца, обнаружены также в яйцах морских ежей (Horstadius a. Runnstrom, 1953; Allen, 1954а, b,
ный потенциал у неоплодотворенных яиц О. latipes равен —10 mV. Положительный потенциал, найденный Хори (рис. 25), зависит, по мнению авторов, от того, что в опытах Хори кончик микроэлектрода не прорывал поверхностный цитоплазматический слой яйца. Авторы, как и Хори, обнаружили «потенциал активации», возникающий при активации неоплодотворенных яиц Orizias, но характер его изменений, по их данным, значительно отличается от того, что описано Хори.
69
Sugiyarna, 1953a, b, 1956). Сугияма (1953a, b, 1956), в частности, показал, что если неоплодотворенные яйца Hemicen-trotus pulcherrimus, обработанные холеиновокислым натрием, перенести в воду в момент начала отделения оболочки оплодотворения, то разрушается только часть кортикальных гранул. Следовательно, разрушение кортикальных гранул в одном месте не обязательно влечет за собой разрушение соседних гранул. Если яйцо, сжатое между двумя стеклами, обрабатывать холеиновокислым натрием или осиным ядом, то кортикальные гранулы разрушаются только в зоне, находящейся в контакте с раствором. Наоборот, масляная кислота, мочевина и дистиллированная вода вызывают распространение процесса разрушения гранул по всей поверхности яйца (Sugiyama, 1953а, Ь, 1956). Это показывает, что одни факторы действуют непосредственно на кортикальные гранулы (осиный яд, холеиновокислый натрий, моноген, липон), другие же действуют косвенно, вызывая распространение «волны оплодотворения» в кортикальной цитоплазме (сперматозоид, мочевина, масляная кислота, дистиллированная вода). Сапонин способен к смешанному действию.
Значение ионов кальция для процесса разрушения кортикальных альвеол
Большое значение для процесса оплодотворения и активации яиц рыб и других животных имеют ионы кальция (см. обзоры Тайлера, 1951; Дорфмана, 1955; Детлаф, 1957а, 1959; Ротшильда, 1958а, и др.). Активации яйца и разрушения кортикальных альвеол не происходит в бескальциевых средах или при добавлении в среду веществ, связывающих ионы кальция (ацетат, цитрат или оксалат натрия, версен и др.), у яиц Oryzias latipes (Т. Yamamoto, 1939а, 1944а, 1954b, 1956), сельди (Yanagimachi a. Kanoh, 1953; Yanagimachi, 1957d), серебряного карася (Т. Yamamoto, 1954а) и девятииглой колюшки (Kusa, 1956). Кортикальные гранулы не выделяются в бескальциевых средах у яиц осетровых рыб (Детлаф, 1957а, 1958а, Ь) и у яиц морских ежей (Moser, 1939b; Endo, 1952; Kacser, 1955). Необходимость ионов кальция для активации и оплодотворения отмечена для яиц морских ежей (Loeb, 1914, 1915, 1926; Heilbrunn a. Young, 1930; Runnstrom a. Monne, 1945), аннелид (Loeb, 1914; Heilbrunn a. Wilbur, 1937) и моллюсков (Loeb, 1914). Активация яиц лососевых рыб не предотвращается помещением их в бескальциевую среду (Kusa, 1950, 1956; Детлаф, 1959). Однако обработка неоплодотворенных яиц кеты М/12 раствором оксалата натрия в течение 2 час (Kusa, 1949b) или М/15 раствором цитра-
то
та натрия в течение 10 мин (Hamano, 1957) приводит к тому, что они теряют способность к оплодотворению после перенесения в воду. Яйца кеты, перенесенные из раствора цитрата натрия в раствор СаС12, а затем в воду, восстанавливают способность к оплодотворению (Hamano, 1957). Т. А. Детлаф (1959) подробно исследовала роль ионов кальция в процессе оплодотворения и активации яиц свирского лосося и нашла, что яйца лососевых рыб отличаются от других рыб только тем, что у них кальций прочнее связан в кортикальной цитоплазме и для быстрого удаления его требуются вещества такие как версен, обладающие большим сродством к кальцию. В работах Т. А. Детлаф (1957а, 1958а, б, в, 1959) подробно обсуждаются все случаи, противоречащие представлению о необходимости ионов кальция для оплодотворения и активации яиц и доказывается обязательность участия кальция в этих процессах. Ионы кальция могут быть заменены в процессах оплодотворения яиц осетровых рыб ионами стронция (Детлаф и Турпаев, 1957, Детлаф, 1958b) и у яиц сельди ионами магния в концентрации, значительно большей, чем кальций (Yanagimachi a. Kanoh, 1953; Yanagimachi, 1957d). Кальций при оплодотворении яиц осетровых рыб не может быть заменен магнием, барием или марганцем (Детлаф и Турпаев, 1957).
Значение ионов кальция для процесса оплодотворения у яиц морских ежей установлено еще Лебом (1914, 1915, 1926), который считал, что ионы кальция необходимы для проникновения сперматозоида в яйцо. Т. Ямамото (1944а, 1954b) также пришел к выводу, что присутствие ионов кальция необходимо для взаимодействия гамет у Oryzias latipes. Как выясняется в последние годы, этот вопрос не так уж прост. Т. А. Детлаф (1958а), изучая цитологию процесса проникновения сперматозоидов в яйца осетровых 'рыб в растворах оксалата натрия, установила, что для соединения гамет присутствие ионов кальция не обязательно: контакт спермия с яйцом устанавливается несмотря на отсутствие ионов кальция. Однако в работах Янагимачи (Yanagimachi a. Kanoh, 1953; Yanagimachi, 1957d) показано, что у сахалинской сельди, сперматозоиды которой неподвижны в морской воде (Крыжа-новский, 1955, 1956; Yanagimachi a. Kanoh, 1953; Yanagimachi, 1956, 1957а, d) и активируются только вблизи микропиляр-ного отверстия яйца (Yanagimachi, 1955, 1957b, d), эта активация сперматозоидов происходит только при наличии ионов кальция в среде. Хотя у большинства других костистых рыб сперматозоиды активируются сразу же при попадании их в воду, все же и в этом случае (кета, О. latipes) обнаруживается некоторое ускорение движения сперматозоидов вблизи
71
микропилярного отверстия, которое не происходит в бескальциевых средах (Yanagimachi a. Kanoh, 1953). Следова- -тельно, хотя ионы кальция не играют особой роли при уста- < новлении контакта между спермием и поверхностью яйца (вероятно, сельдь является исключением из этого правила), они все же имеют некоторое значение для процесса осеменения.
Гораздо более значительную роль ионы кальция играют для самого процесса активации. Так, у яиц осетровых рыб соединение гамет может происходить в отсутствие ионов кальция, однако активации яиц и выделения кортикальных гранул в этих условиях не происходит (Детлаф, 1957а, 1958а, б, в). Т. Ямамото (1939а, 1954а, Ь, 1956) показал необходимость ионов кальция для процесса активации яиц Oryzias latipes и Carassius auratus (Т. Yamamoto, 1954а),— в бескальциевом изотоничном растворе Рингера или M/ц растворе оксалата натрия неоплодотворенные яйца не активируются уколом, олеатом натрия и сапонином. С другой стороны, перенесение наколотых в бескальциевой среде яиц О. latipes в обычный изотоничный раствор Рингера приводит к активации яиц без дополнительных воздействий. Сходные данные получены для яиц сахалинской сельди (Yanagimachi a. Kanoh, 1953; Yana-gimachi, 1957с) и девятииглой колюшки (Kusa, 1956). По мнению Т. Ямамото (1954b, 1956), процесс активации яиц складывается из двух фаз: фазы стимуляции и фазы распространения волны оплодотворения. Присутствие ионов кальция необходимо только для второй фазы. Следующие изменения происходят по его мнению при оплодотворении или активации яиц костистых рыб.
стимул —--1
стимуляция---1 Са”
волна оплодотворения --
разрушение кортикальных -
альвеол !
освобождение коллоидов-
из альвеол отделение оболочки
Эта схема в настоящее время принята большинством исследователей, хотя место приложения ионов кальция не совсем ясно. Т. А. Детлаф (1957а, 1958в, 1961) на основании тщательного изучения роли ионов кальция в процессе оплодотворения и активации яиц осетровых рыб пришла к выводу, что ионы кальция необходимы только в момент стимуляции, а не в период распространения кортикальных изменений по
72
поверхности яйца. Действительно, по ее данным, присутствие ионов кальция при оплодотворении яиц необходимо только^ в первые 2—4 сек после осеменения, в то время как выделение кортикальных гранул осуществляется в течение' 2—3 мин (Детлаф, 19586, в). Хотя эти опыты четко показывают, что ионы кальция необходимы в фазу 'Стимуляции яйца и не нужны для распространения процесса разрушения кортикальных гранул по поверхности у яиц осетровых рыб, они не достаточны для того, чтобы полностью отвергать необходимость ионов кальция для распространения волны оплодотворения, так как волну разрушения кортикальных гранул нельзя отождествлять с волной оплодотворения. Так, в опытах Сугияма (Ротшильд, 1958а) масляная кислота при обработке ею открытой части яиц морского ежа, втянутых в капилляр, вызывала распад кортикальных альвеол на противоположном конце яйца, тогда как в поверхностном слое яйца, находящемся в контакте с масляной кислотой, распада гранул не происходило. Это показывает, что распад кортикальных гранул и волна оплодотворения — явления разного порядка. Скорость распространения волны оплодотворения, вероятно, также значительно отличается от скорости разрушения кортикальных гранул. Ротшильд и Шванн (Rothschild a. Swann, 1952; Rothschild, 1954, 1958а) показали, в частности, что блок полиспермии у яиц морских ежей осуществляется в две фазы: частичное блокирование, проходящее по поверхности яйца за 1—2 сек, и более медленный процесс, сопоставимый по времени с распадом гранул (1,0—1,5 мин) '.
Данные Хори (1958), приведенные выше, показывают, что в яйцах рыб при активации в первые 3—18 сек происходят изменения электрического потенциала, предшествующие началу разрушения кортикальных альвеол. Следовательно, в первые же секунды после активации по поверхности яйца распространяются какие-то изменения, и у нас нет оснований отвергать возможности того, что эти изменения связаны с прохождением ролны оплодотворения.
С другой стороны, как показала Т. А. Детлаф (1957а, 19586), опыты Т. Ямамото и других авторов не могут служить убедительным доказательством того, что для распространения волны оплодотворения необходимы ионы кальция. Таким образом, если необходимость ионов кальция для фазы стимуляции доказана опытами Т. А. Детлаф, то вопрос о необходимости ионов кальция для распространения волны оплодотворения остается открытым.
1 Эти представления не общеприняты и оспариваются другими исследователями (Hagstrom a. Runnstrom, 1959; Гинзбург, 1959, 1960).
73
Разрушение и исчезновение альвеол
Т. Ямамото (1956), исследуя кортикальные альвеолы, изолированные из яиц (О. latipes) в изотоничном растворе Рингера, нашел, что они состоят из двух частей: тонкой оболочки :и внутреннего содержимого. Позднее Куза (1956, 1957а) разработал способ массового выделения кортикальных альвеол
Рис. 26. а — изолированные в растворе Рингера кортикальные альвеолы (увел. X 200) неоплодотворенных яиц колюшки (Kusa, 1956); б — коацерватные капли (увел. X 245), образующиеся из гуммиарабика и желатины (Евреинова, 1955)
из неоплодотворенных яиц колюшки и кеты путем разрушения яиц стеклянной иглой в изотоничном растворе Рингера и последующего центрифугирования. По данным Куза, изолированные альвеолы (рис. 26) состоят из оболочки и коллоидного содержимого (мукополисахариды). После разрушения -изолированной альвеолы при разбавлении раствора Рингера пустая оболочка альвеолы некоторое время сохраняется (Kusa, 1958а, b). В строении кортикальных альвеол яиц рыб, по-видимому, существуют видовые различия, так как мне не удалось обнаружить морфологически выраженной оболочки у изолированных кортикальных альвеол свирского сига (Соге-gonus lavaretus). Если неоплодотворенные яйца сига поместить на предметное стекло в каплю 0,15 н. раствора NaCl и разрушить остроконечными пинцетами, то альвеолы выходят
•74
из поверхности яйца и плавают в солевой среде. По внешнему виду кортикальные альвеолы сильно напоминают коацерватные капли. При соприкосновении друг с другом изолированные альвеолы свирского сига, подобно коацерватным каплям, сливаются, образуя большие капли, во много раз превосходящие размерами отдельные альвеолы. Это показывает, что у кортикальных альвеол сига отсутствует оболочка. Сравнению кортикальных альвеол с коацерватными каплями не противоречат данные Т. Ямамото и Куза о наличии у них морфологически выраженной оболочки, так как и коацерватные капли, особенно состоящие из липидов и белков, легко образуют на поверхности пленки и оболочки (Евреинова, 1954).
Цитохимическими методами показано присутствие липидов в кортикальных альвеолах яиц Oryzias latipes (Aketa, 1954) и Fundulus heteroclitus (Kao a. Chambers, 1954). Большинство других авторов, исследовавших овоциты и зрелые неоплодотворенные яйца рыб, не смогли цитохимически обнаружить заметных следов липидов в стенках кортикальных альвеол (Kusa, 1953b, 1956, 1958b — у яиц колюшки, Т. S. Yamamoto, 1955а — у яиц Oryzias latipes; К- Yamamoto, 1955а, b, 1956а, Ь, с — у яиц камбалы, корюшки и сельди; Kanoh, 1954-—у яиц минтая, Chopra, 1958 — у яиц Ophioce-phalus punctatus). Отзука (1957а) не нашел следов жирных кислот в альвеолах яиц О. latipes. Т. А. Детлаф (19576) сообщила, что по данным А. С. Гинзбург, кортикальные гранулы яиц осетровых рыб лишены липидов, хотя кортикальный слой цитоплазмы овоцитов и зрелых яиц содержит диффузно рассеянные липиды (окраска Суданом черным В).
Несмотря на отрицательные результаты с цитохимическими тестами, стенка кортикальных альвеол яиц рыб, вероятно, все же содержит некоторое количество липидов, так как было показано, что оболочки изолированных альвеол яиц Oryzias latipes растворяются липоидорастворителями (хлороформом, эфиром, бензином, толуидином и изоамиловым спиртом) и не растворяются ацетоном (Т. Yamamoto, 1956). Это указывает на то, что стенки кортикальных альвеол содержат липиды, но не нейтральные жиры. Куза (1957а, 1958а) подтвердил наблюдения Т. Ямамото, показав, что стенки изолированных альвеол яиц колюшки разрушаются в парах эфира или хлороформа и не разрушаются в ацетоне. Так как стенки альвеол проницаемы для воды, то они не могут состоять только из липидов, поэтому Куза (1957а) предположил, что оболочка кортикальных альвеол представляет собой гетерогенную белковую пленку с зонами липоидной природы. Было найдено также, что оболочки альвеол растворяется под действием змеиного и пчелиного яда, содержащих
75.
лецитиназу А, а также при помещении альвеол в среду из раздавленных яиц в присутствии следов Fe". При замене Fe" в среде из раздавленных яиц на Fe’" распад оболочек альвеол не происходит (Т. Yamamoto, 1956). Все это указывает на то, что растворение оболочек альвеол осуществляется энзима* тическим путем (яйца не содержат липоидорастворителей); Эстеразная система, находящаяся по мысли Т. Ямамото (1951, 1956) около альвеол, активируется при прохождении волны оплодотворения и растворяет стенки альвеол. Носителями эстеразной системы, по его предположению, у яиц О. latipes являются «кортикальные гранулы А», расположенные в кортикальной цитоплазме неоплодотворенных яиЦ вокруг альвеол и исчезающие из яиц после их оплодотворения или активации (Т. Yamamoto, 1951). Сходные структуры' обнаружены вокруг кортикальных альвеол у яиц девятииглой колюшки (Kusa, 1956).
Представления Т. Ямамото об участии энзиматической, эстеразной системы в разрушении кортикальных альвеол подтверждено работами Хамано (Натапо, 1951, 1957) и Кано, и Янагимачи (Kanoh a. Yanagimachi, 1956). Если яйца серебряного карася поместить до оплодотворения в 0,01%-ный раствор ацетата свинца (активатор эстераз), приготовленный на изотоническом растворе Рингера, а затем вернуть в чистый раствор изотонического Рингера, то происходит разрушение кортикальных альвеол и отделение яйцевой оболочки (Натапо, 1951). Наоборот, ингибитор эстераз (изотоничный раствор Рингера, содержащий 0,01% монойодацетата) задерживает разрушение альвеол при перенесении яиц после обработки в дистиллированную воду. Хамано (1951) удалось химическим путем выделить из неоплодотворенных яиц серебряного карася эстеразоактивные вещества. Кано и Янагимачи (1956) на основании своих опытов с влиянием нагревания неоплодотворенных яиц сельди до 30—35° С пришли , к выводу, что энзиматическая система (предположительно эстеразная), разрушающая альвеолы, инактивируется этой температурой, в то время как волна оплодотворения не тормозится: яйца оплодотворяются и развиваются, хотя кортикальные альвеолы не выделяются из яйца. Мною также проделаны опыты по влиянию кратковременного прогрева (10 мин) на образование перивителлинового пространства у неоплодотворенных и только что оплодотворенных яиц форели. Как видно из табл. 5, нагревание неактивированных яиц форели в течение 10 мин до температуры 3'0° приводит к тому, что объем перивителлинового пространства у таких яиц в воде оказывается значительно меньшим. Так как у активирован-
76
Таблица 5
Влияние кратковременного нагревания (10 мин) на образование перивителлинового пространства у яиц форели
Температура, °C Объем перивителлинового пространства (мм3) через 5 час
нсактивированные яйца яйца через 5 мин после активации
10 14,0 13,0
20 — 12,6
25 13,7 13,3
30 7,3 13,5
них яиц после выделения веществ, ответственных за образование перивителлинового пространства, нагревание до 30° не замедляет образования перивителлинового пространства (табл. 5), то ясно, что высокая температура действует не на сами вещества, а нарушает механизм их выделения из яйца. Следовательно, механизм секреции этих веществ термочувствителен, что может быть связано с его энзиматической природой.
В последние годы Куза (1957а, 1958а, Ь) подробно исследовал особенности разрушения изолированных кортикальных альвеол яиц колюшки и кеты в связи с их осмотическими свойствами. Он нашел, что в среде с высокой концентрацией солей альвеолы сморщиваются, а при разбавлении солевой среды дистиллированной водой — расплавляются и принимают снова первоначальную сферическую форму. Гипертонические растворы неэлектролитов (мочевина, сахароза, эти-лен-гликоль и глицерин) также вызывают сжатие альвеол и тем сильнее, чем больше концентрация неэлектролита в среде. Кроме воды, оболочка альвеолы проницаема для мочевины, этиленгкликоля и глицерина (в 2 М растворе мочевины или глицерина альвеолы возвращаются к первоначальной форме через 20 мин при 25°). Если альвеолы поместить в сильно разбавленный раствор Рингера или в дистиллированную воду, то они разрушаются (Kusa, 1957а, 1958b). Тщательные наблюдения показали, что разрушение альвеол в дистиллированной воде или в растворе Рингера, разбавленного в 80 раз, начинается с увеличения размеров и последующего сжатия, оболочка при этом разрывается и содержимое альвеолы выбрасывается наружу. По мнению Куза (1958а, Ь), стенка альвеолы способна к сокращению, возможно 'благодаря структурно-сократимым белкам оболочки аль
77
веол. Пока не ясно, происходит ли разрушение оболочки альвеолы энзиматическим путем или под действием осмотических сил (Kusa, 1958а).
Несмотря на привлекательность гипотезы Т. Ямамото об; энзиматическом механизме разрушения стенки альвеол, пока еще рано пренебрегать другими возможными объяснениями-этого явления и, в частности, предположением Куза об осмо-; тическом механизме разрушения стенки с последующим ее-сокращением. Можно, по-видимому, предложить и другие объяснения механизма разрушения альвеол, исходя из сравнения кортикальных альвеол с коацерватными каплями.; Однако следует отметить, что гипотеза Т. Ямамото больше других предположений увязывается с существующими теориями активации. Основываясь на гипотезе Ямамото, с учетом данных Т. А. Детлаф о влиянии ионов кальция на фазу стимуляции, можно следующей схемой изобразить процессы, происходящие при разрушении альвеол.
стимул-- ।--Са**
стимуляция -
V волна оплодотворения - -активация эстераз, расположенных около альвеол —- -растворение стенок корти- -кальиых альвеол L выделение мукополисахаридов из корти- -—. кальных альвеол ф
отделение оболочки
Как уже говорилось, образование перивителлинового пространства у яиц осетровых рыб происходит иначе, чем у яиц костистых рыб. У яиц осетровых рыб образование перивителлиновой жидкости связано главным образом с секрецией веществ, окрашиваемых азановым методом в голубой цвет. Секреция этих веществ отличается как от разрушения кортикальных альвеол у яиц костистых рыб, так и от выделения кортикальных гранул у яиц осетровых рыб.
6. ТЕОРИИ АКТИВАЦИИ ЯИЦ
Мы не можем закончить обсуждения механизма образования перивителлинового пространства у яиц рыб без рассмотрения, хотя бы краткого, различных теорий активации, так как без понимания природы стимуляции и волны оплодотворения понимание механизма разрушения кортикальных альвеол было бы неполным. Крбме того, рассмотрение теорий активации поможет нам ясно увидеть место явлений, со-;
78
провождающих образование перивителлинового пространства, в общей картине изменений, происходящих при оплодотворении или активации яиц.
Со времени открытия искусственного партеногенеза и получения точных данных по цитологии оплодотворения было* создано много различных теорий, пытающихся объяснить механизм оплодотворения и активации. Мы не будем подробно-останавливаться на всех этих теориях, так как существует много хороших обзоров, в которых подробно рассмотрена история и современное состояние проблемы активации (см. Леб, 1926; Лилли, 1926; Вильсон, 1936; Астауров, 1940; Дорфман, 1945, 1955; Тайлер, 1951; Runnstrom, 1949, 1955, 1956а; Rothschild, 1958а, b, Allen, 1958; Runnstrom, Hagstrom a. Perl-mann, 1959). Нас могут интересовать лишь те теории активации, которые прямо или косвенно связаны с рассмотрением: механизма стимуляции и прохождения волны оплодотворения. Больше того, мне кажется, что только теории, объясняющие механизм стимуляции и волны оплодотворения, можно считать истинными теориями активации, так как теории, описывающие последующие изменения, происходящие в яйце, объясняют или первые ступени развития зародышей или механизм образования перивителлинового пространства и изменения оболочек. Исходя из этого, остановимся лишь кратко-на теориях, не рассматривающих механизм стимуляции или волны оплодотворения.
Гейльбрун (Heilbrunn, 1937, 1957) попытался создать теорию, объединяющую такие далекие явления, как активация яиц, мышечное сокращение, возбуждение нерва и свертывание крови. Согласно этой теории, стимулирующий активацию агент вызывает разжижение кортикального слоя яйца и высвобождение кальция из кальций-протеинового комплекса. Мигрируя внутри цитоплазмы, кальций активирует протеолитический фермент, который вызывает обратимые изменения белков, подобные изменениям, происходящим при свертывании крови. Представления Гейльбруна были частично подтверждены теми наблюдениями, в которых показана необходимость ионов кальция для процесса оплодотворения и активации яиц, а также данными о высвобождении кальция при оплодотворении яиц морских ежей (Heilbrunn, Mazia а. Steinbach, 1934; Mazia, 1937; Orstrom a. Orstrom, 1942; Monroy-Oddo, 1946*; Heilbrunn a. Byers, 1959); яиц Oryzias latipes (T. Yamamoto, 1954b; Hamano, 1957) и кеты (Kanoh, 1956). Показано также (Hsiao a. Broughs, 1958), что радиоактивный
* Данные всех этих авторов были подвергнуты критике в последующих исследованиях (см. Rudenberg, 1953; Rothschild, 1958а).
Са45 среды легко обменивается с Са40 неоплодотворенных яиц морских ежей, лишенных студенистой оболочки (эти наблюдения не совпадают с данными Rudenberg, 1953). У яиц амфибий микросжигания показали, что кальций концентрируется в поверхностном слое яиц (Kohn, 1956). Наконец, Т. А. Детлаф и Т. М. Турпаев (1957) показали, что ионы кальция могут быть заменены ионами стронция в процессе оплодотворения, мышечного сокращения и свертывания крови, что согласуется с теорией Л. Гейльбруна.
Однако существует и ряд фактов, которые не позволяют принять, что волна оплодотворения сводится к выделению ионов кальция или взаимодействию белков кортикальной цитоплазмы с кальцием. У яиц амфибий после оплодотворения, по данным Кона (Kohn, 1956), происходит увеличение количества нерастворимого кальция, тогда как по теории Гейль-брунна должно происходить высвобождение кальция из связи с белками. У яиц осетровых рыб, по наблюдениям Т. А. Детлаф (19586, 1961), ионы кальция необходимы только в первые секунды после оплодотворения в фазу стимуляции яиц и не необходимы для процесса разрушения кортикальных гранул. В то же время, как показывают наблюдения Хамано (1957), изменения белков яйца в результате оплодотворения наступают после разрушения кортикальных альвеол.
К представлениям Гейльбруна близко примыкают теории активации, связывающие изменения в кортикальной цитоплазме яиц после оплодотворения или активации с обратимой коагуляцией или денатурацией белков (Mirsky, 1936; Астауров, 1940, 1943, 1956, 1958; Александров, 1947; Monroy, 1950, 1956, 1957а; Monroy a. Monroy-Oddo, 1951; Натапо а. Kubo, 1954; Натапо, 1957). Б. Л. Астауров (1940, 1943, 1956, 1958) нашел, что процесс термоактивации яиц тутового шелкопряда к партеногенетическому развитию по температурным зависимостям имеет много сходного с тепловой смертью и тепловым свертыванием белков, особенно в отношении очень большой энергии активации этого процесса (ц= 120 000— —130 000, при ц=10 000—17 000 для обычных химических и биохимических процессов). Б. Л. Астауров приходит к выводу, что в основе этих явлений лежит один и тот же процесс—'процесс тепловой денатурации белков, обратимой в случае термоактивации яиц. Мирский (Mirsky, 1936) обнаружил, что после оплодотворения около 12% белков яиц морских ежей становятся нерастворимыми в 1 М растворе КС1. Эти данные, как и данные Монрой (Monroy, 1950), были оспорены при повторных исследованиях (см. Rothschild, 19'58а). Однако недавние исследования Монрой и его сотрудников
(D’Amelio, 1955; Ceas, Impellizzeri a. Monroy, 1955; Giardina a. Monroy, 1955; Monroy, 1956, 1957a) на яйцах морских ежей и Хамано (Натапо a. Kubo, 1954; Натапо, 1957) на яйцах колюшки, форели и кеты томно показали наличие изменения белков при оплодотворении. Хамано (1957), в частности, нашел, что процесс оплодотворения или активации яиц сопровождается слабыми дейатуранионными’изменениями белков, что свидетельствует, по мнению автора, о реорганизации их структуры. Эти изменения происходят, по-види-мому, благодаря увеличению активности протеолитических ферментов в первые минуты После активации (Натапо, 1957). Д. Н. Насонов и В. Я. Александров (1940) и В. Я- Александров (1947) указывают, Что денатурационные изменения клеточных белков связаны с обменными процессами, так как нативное состояние белков Поддерживается благодаря притоку энергии за счет обменных процессов. Следовательно, изменения, происходящие с белками яиц после оплодотворения или активации, должны быть связаны с изменениями обмена веществ, происходящими в это время в яйцах.
В основу теории активации, разрабатываемой Рунстремом и его сотрудниками (Runnstrom, 1949, 1955, 1956а, Ь, 1958; Runnstrom a. Wicklund, 1950; Kriszat a. Runnstrom, 1952; Wicklund, 1954a; Runnstrom a. Immers, 1956; Immers, 1956), положено представление об активировании ферментных систем яйца благодаря высвобождению их из связи с ингибиторами. Такими ингибиторами энзиматических систем Руннстрем (1949а, Ь) считает вещества типа гепарина (мукополисахарид). Этот взгляд обоснован тем, что, как уже говорилось, в кортикальных гранулах, цитоплазме и студенистой оболочке яиц морских ежей содержатся кислые мукополисахариды (Моппё,, 1950; Моппё a. Slautterback, 1950; Monne a. HSrde, 1951а; Immers, 1956; Kelly, 1954; Runnstrom a. Immers, 1956, и др.). Установлено, что перйодат натрия, деполимеризующий мукополисахариды, активирует нёоплодотворенные яйца и увеличивает скорость оплодотворения (Runnstrom, 1955, 1958; Kriszat a. Runnstrom, 1952; Runnstrom a. Immers, 1956). Напротив, вещество студенистой оболочки, содержащее кислые мукополисахариды, а также гепарин, бактериальные полисахариды, фукоидин (вещество, извлекаемое из водоросли Fu-cus vesiculosus и содержащее кислые полисахариды) и другие вещества, сходные с веществами студенистой оболочки, тормозят процесс оплодотворения и образование оболочки оплодотворения у яиц морских ежей (Runnstrom a. Kriszat, 1950b; Runnstrom a. Wicklund, 1950; Harding, 1951; Harding a. Harding, 1952; Runnstrom, 1955, 1958; Kriszat a. Runnstrom, 1952; Wicklund, 1954; Runnstrom a. Immers, 1956; Esping, 1957 a,b).
6 А. Ц. Зотин 81
Тормозящее действие вещества студенистой оболочки и дру-тих мукополисахаридов снимается 5 • 10_5 н.раствором перйодата натрия (Runnstrom a. Kriszat, 1950а; Runnstrom, 1955, 11958; Kriszat a. Runnstrom, 1952; Runnstrom a. Immers, 1956) Рунстрём (1949) предполагает, что удаление ингибитора при оплодотворении приводит к высвобождению киназ, которые активируют энзимные системы яйца. Существует большое число данных, показывающих, что при оплодотворении яиц морских ежей и других животных происходит активация протеолитических ферментов (Lundblad, 1949, 1950, 1954; Monroy, 1956; Maggio, 1957; Hamano, 1957), альдолаз (Ishihara, 1957} и многих других ферментов (Rothschild, 1958а). Показано, также, что вещество, полученное из фукуса (фукоидин), ингибирующее оплодотворение яиц морских ежей, ингибирует также протеолитические ферменты, активация которых происходит’ при оплодотворении (Lundblad, 1954; Runnstrom а. Immers, 1956), а также гиалуронидазу, рибонуклеазу, уреазу и амилазу (Runnstrom a. Immers, 1956; Esping, 1957). Гипотеза об аквитировании энзимных систем в процессе оплодотворения лежит также в основе представлений М. Брукс (М. Brooks, 1946).
Все рассмотренные здесь теории достаточно обоснованы и объясняют целую группу экспериментальных фактов. Однако ни одна из них не объясняет механизма стимуляции и волны оплодотворения и, следовательно, имеет лишь косвенное отношение к механизму разрушения кортикальных альвеол и образованию перивителлинового пространства. В последние годы появилось несколько работ, в какой-то степени пытающихся расшифровать механизм стимуляции и волны оплодотворения на химическом уровне.
Кашер (Kacser, 1955), анализируя данные Ротшильда и Шванна (Rothschild a. Swann, 1949) по скорости изменения оптических свойств поверхности яиц морских ежей после оплодотворения (кортикальная реакция) и собственные наблюдения за скоростью отделения оболочки оплодотворения в разных точках поверхности яйца, пришел к выводу, что кортикальная реакция яиц морских ежей является автокаталитическим процессом, который осуществляется только при достаточной концентрации кальция. Для стимуляции этого процесса ионы кальция не нужны. Им предложены две схемы автокаталитического механизма распространения импульса актирации по поверхности яйца с учетом участия кальция в этом процессе
' 1 I , • . . катализ
Ca-f-M--------->• СаМ*
или
катализ | I '
Са4-М —> СаМ----> СаМ*,
где М — компонент поверхности яйца, испытывающий транс* формацию.
Гипотеза Катера об автокаталитическом механизме корг тикальной реакции не кажется вполне убедительной, хотя формально скорость кортикальной реакции, по-видимому, можно сопоставлять с кинетикой автокаталитического процесса. Предложенная им схема реакции с участием ионов кальция противоречит данным Т. А. Детлаф (1958а, в), показавшей, что ионы кальция не необходимы для распространения кортикальной реакции (речь идет о реакции, отмечаемой по распаду кортикальных гранул) по поверхности яйца. Следует, конечно, учитывать возможность видовых отличий в этом отношении, так как Т. А. Детлаф работала с яйцами осетровых рыб, а Катер— с яйцами морских ежей, но для таких общих для многих видов животных процессов, как кортикальные изменения яиц при оплодотворении, значительно вероятнее наличие сходного механизма реакций;
Рунстрём (1956а) высказал гипотезу, что волна оплодотворения или импульс активации представляет собой цепную реакцию. распада гипотетического комплекса: энзим-АТФ-магний-ингибитор с высвобождением ионов кальция за счет деполимеризации ингибитора и АТФ. Предполагается также, что высвобождающийся кальций активирует АТФ-азу. (В более поздней работе Рунстрём (1958) предполагает, что гипотетический комплекс, стабилизированный магнием, состоит из протеинов, липидов и полисахаридов). Хотя имеются работы, в которых показано увеличение активности АТФ-аз после оплодотворения в гомогенатах (Connors a. Scheer, 1947) и в изолированных митохондриях морских ежей (Monroy, 1957с),- однако опыты с воздействием АТФ на неоплодотво-ренные яйца, приводимые в работе Рунстрёма (1956а), не кажутся достаточно убедительными.
Следует также отметить, что в опытах Монрой (1957с) ионы кальция ингибировали активность АТФ-азы митохондрий яиц морских ежей.
Более обоснованным кажется предположение ^длена (Allen, 1954b) и Оказаки (Okaz-aki, 1956а, Ь) об участии богатых энергией фосфорных связей в процессе распространения волны оплодотворения.
Эллен (19546), изучая влияние различных факторов н^ скорость распространения и величину зоны распространения
6* 83
кортикальной реакции у яиц морских ежей, втянутых в капилляр, нашел, что АТФ усиливает то и другое. Более подробные исследования были осуществлены Оказаки (1956а,Ь). Он показал, что обработка яиц морских ежей перед оплодотворением 2,4-динитрофенолом, азидом натрия и нитратом уранила тормозит разрушение кортикальных гранул и отделение оболочки оплодотворения (кстати сказать, добавление АТФ к раствору динитрофенола не снимало его ингибирую-дцего действия на процесс оплодотворения). Так как эти вещества тормозят окислительное фосфорилирование, то Оказаки пришел к выводу, что перенос богатых энергией фосфатных групп при окислительном фосфорилировании играет важную роль в процессе распространения кортикальной реакции. Им точно доказано, что речь идет о распространении волны оплодотворения по поверхности яйца, так как яды окислительного фосфорилирования блокировали кортикальные изменения при оплодотворении и искусственной активации раствором масляной кислоты и не влияли на кортикальную реакцию при активации яиц холеиновокислым натрием. Как уже отмечалось (Sugiyama, 1953а, b, 1956), в первом случае (сперматозоид и масляная кислота) активация яиц происходит благодаря стимуляции волны оплодотворения, во-втором—’благодаря непосредственному действию холеино-вокислого натрия на кортикальные альвеолы.
Эллен (Allen, 1954b) на основании своих опытов с яйцами морских ежей высказал гипотезу, согласно которой кортикальная цитоплазма яиц содержит однородные единицы (молекулы или субмикроскопические гранулы), способные существовать в двух формах: неактивированной и активированной. Роль сперматозоида состоит в том, что он активирует некоторое количество единиц, каждая из которых в свою очередь активирует соседние единицы и таким образом им-.пульс активации, в виде 'Следующих друг за другом активаций, распространяется по поверхности яйца. Гипотезу Элле-на можно было бы изобразить в виде следующей схемы реакций
L I I. ; L । .
Э’ 7 » Э‘------------- Э2 ' ’ ЭП -
Са "--
d
.где Э —неактивированные единицы Эллена, находящиеся на равном расстоянии от места внедрения спермия в яйца;
184
Э* — те же единицы в активированном состоянии.
Подобного рода механизм распространения импульса активации кажется более вероятным по сравнению с автокаталитической схемой, предложенной Катером (см. стр. 82). Автокаталитический механизм распространения импульса, рассмотренный Катером, справедлив для реакции идущих в объеме, но вряд ли пригоден для процесса, протекающего в тонком поверхностном слое яйца.
В последнее время Монрой (Monroy, 1956, 1957b) разработал теорию активации, сходную с представлениями Т. Ямамото (1954а, б, 1956), Хамано (1957) и Эллена (19546), в которой попытался дать единую связанную картину процессов, происходящих при активации яиц.
Это первая попытка подобного рода, что является ее глав; ным достоинством.
Было показано, что сперматозоиды морских ежей содержат поверхностно лежащую систему эстераз (Monroy, 1953» 1956, 1957b; Maggio a. Monroy, 1955). Если сперму Arbaoia lixula инкубировать при комнатной температуре с желтком куриного яйца и измерять появление эфирорастворимых фосфолипидов, то в первые 10—45 мин количество свободных фосфолипидов в среде быстро увеличивается за счет отщепления их спермой от липопротеинов желтка. Параллельно высвобождению фосфолипидов в среде появляется гемолитиче*. ская активность. Это показывает, что фосфолипиды атакуются фосфолипазой А спермиев, в результате чего образуются свободные лизофосфатиды (гемолитический фактор). Затем' количество лизофосфотидов быстро уменьшается за счет расщепления их фосфолипазой В спермы (до глицерин-фосфо-рил-холина и жирной кислоты). Эти данные позволили Магио и Монрой (1955) высказать предположение, что сперматозоид ды морских ежей, несущие на поверхности фосфолипазы; вызывают в месте контакта с яйцом расщепление липопро^ теинового комплекса, высвобождение фосфолипидов и появ^ ление литического фактора, лизирующего поверхность яйца. Затем, по их представлениям, этот процесс распространяется по всей поверхности яйца. Позднее Монрой (1957b) предположил, что фосфолипаза спермы активирует близлежащие фосфолипазы кортикальной цитоплазмы яйца, которые в свою очередь активируют ближайшие фосфолипазы и таким образом по поверхности яйца проходит волна активации фосфолипаз.
По мнению автора (Monroy, 1956, 1957b), смысл этого процесса состоит в образовании лизофосфатидов, лизировании поверхности яйца и освобождении некоторого вещества «Х»,‘ способного вызвать обратимые изменения белков. Схематиче-
85
ски эту гипотезу Монрой (1956, 1957b) изображает следующим образом
фосфолипазы спермия -
активация фосфолипаз-.
яйца |
кортикальные фосфолипиды -.
V лизофосфатиды--:
V связанный «X» фактор-
свободный «X» фактор
Теория активации Монроя согласуется с данными Эмана (Ohman, 1945, 1947), показавшего, что пчелиным ядом, содержащим лецитиназу А, можно активировать яйца морского ежа (Psammechinus miliaris) в бескальциевой морской воде. Он обнаружил, что после оплодотворения происходит уменьшение эфирорастворимых фосфолипидов типа кефалина на 29% и переход их в эфиронерастворимую фракцию. Монрой (1947) нашел, что у оплодотворенных яиц морских ежей кортикальные липиды связаны с белками менее прочно, чем у неоплодотворенных яиц. Наличие липидов в кортикальном слое яйц на основании косвенных данных предполагается во многих других работах (Runnstrom, Моппё a. Broman, 1944; Runnstrom а. Моппё, 1945; Monroy, 1948).
Большое значение в своих взглядах на процесс активации Монрой придает изменению биохимической активности митохондрий, активации энзимных систем и обратимым изменениям белков яиц после оплодотворения (Monroy, 1952, 1958). Было показано, что после оплодотворения происходит увеличение АТФ-азной активности митохондрий (Monroy, 1957с, 1958), увеличение активности цитохром оксидазы митохондрий на 30% (Maggio, 1959), изменение проницаемости митохондрий (Monroy, 1957с, 1958) и активация обмена между митохондриями и небелковой фракцией яйца, изученного при помощи 535-метионина (Nakano a. Monroy, 1958; Nakano, Giu-dice a. Monroy, 1958; Monroy, 1958). Найдено также, что после оплодотворения происходит уменьшение протеазной активности митохондрий при одновременном увеличении протеазной активности цитоплазмы яйца (Maggio, 1957, Monroy, 1958).
Представления Монроя о кинетике распространения волны активации эстераз по поверхности яйца во многом напоминают взгляды Эллена о волне активирования особых единиц поверхности яйца и поэтому могут быть изображены той же схемой реакции (см. стр. 84). Так как согласно данным Т. Ямамото и Т. А. Детлаф стимуляция отличается по некоторым свойствам от волны оплодотворения, то и характер хи-86
мических реакций этих процессов должен отличаться. Следовательно, трудно себе представить, чтобы фосфолипаза спермин прямо активировала фосфолипазы яйца. Более вероятным кажется предположение, что активация фосфолипаз осуществляется продуктами распада субстрата фосфолипаз. Если принять эту гипотезу, то процесс распространения волны оплодотворения можно изобразить в следующем виде
где С — субстрат действия эстераз;
а — активные 1 „
Ь —пассивные/ ПР°ДУКТЫ расщепления субстрата;
Э—неактивные эстеразы 1
Э * - активные эстеразы /кортикальной цитоплазмы яйца.
Многое в теории Монроя в настоящее время недостаточно обосновано и требует дальнейшего уточнения. В частности, неясен механизм активации фосфолипаз яйца под действием фосфолипаз спермин. Так, согласно данным Т. Ямамото (1951, 1956), при малых экспозициях воздействия липоидорас-творителей на неоплодотворенные яйца Oryzias latipes происходит активация яиц, хотя удаление субстрата действия фосфолипаз казалось бы не должно вызывать активации по теории Монроя. Однако наиболее трудным для объяснения, с точки зрения теории активации Монроя, являются данные, полученные Кано (Kanoh, 1952а), Кано и Янагимачи (Kanoh a. Yanagimachi, 1956). В этих работах показано, что разрушение кортикальных альвеол предотвращается нагреванием яиц сельди до 30—35°, в то- время как волна оплодотворения и. биполярная дифференцировка зародышей этой температурой не тормозится. Если принять, что; в этих опытах происходит инактивация фосфолипаз, то окажется, что ни волна
оплодотворения, ни процессы развития не связаны с актива-.цией фосфолипаз. Если , же принять, что фосфолипазы не инактивируются этой температурой, то окажется, .что разрушение кортикальных альвеол не зависит от фосфолипаз и, следовательно, необходимо пересмотреть данные других авторов об участии эстераз в процессе разрушения альвеол.
\ Несмотря на эти оговорки, теория Монроя пока остается единственной теорией, объединяющей очень большое число Разнообразных фактов.
87
Сейчас еще не настало время подводить итоги многочисленным наблюдениям и теориям, касающимся оплодотворения и активации яиц. Однако для целей настоящей работы было бы полезным объединить описанные выше представления различных авторов о механизме активации с тем, чтобы яснее представить место процесса образования перивителлинового пространства и изменения оболочек у яиц костистых и осетровых рыб в общей системе явлений, происходящих при оплодотворении или искусственной активации. Эта схема строится на основании теории Т. Ямамото и Монроя в части, касающейся начальных процессов, происходящих при активации; из теории Монроя и Рунстрёма — в части, касающейся освобождения ингибитора и активации ферментов; из представлений Б. Л. Астаурова, Монроя и Хамано о денатурации белков при активации; из данных Б. Л. Астаурова, Рунстре-ма, Сугияма и Оказаки по активации яиц искусственно-партеногенетическими агентами; из данных Т. А. Детлаф, Т. Ямамото и Кано и др. по роли ионов кальция при активации яиц; из данных Оказаки по значению богатых энергией связей для активации; из многочисленных наблюдений за изменением обмена веществ (см. обзоры Needham, 1931, 1942; В. А. Дорфмана, 1933, 1936, 1945; Runnstrom, 1956b; Rothschild, 1958а; Ж. Браше, 1961, и др.), проницаемости (R. Lillie. 1916,1918а; Lucke a. McCutcheon, 1932; Hobson, 1932а; Lucke, 1940; Needham, 1931; Stewart a. Jacobs, 1936; Дорфман, 1945; Abel-son, 1947; Brooks a. Chambers, 1954; Ishikawa, 1954; Rothschild, 1958a), электрических свойств (Дорфман, 1934, 1935, 1945; Rothschild, 1958a; Tyler, Monroy, Kao a. Grundfest, 1956) *, вязкости (Heilbrunn a. Wilson, 1948) и эластичности кортикальной цитоплазмы (Mitchison a. Swann, 1955) у яиц после оплодотворения или активации. Нижняя часть схемы, описывающая последовательность процессов, приводящих к отделению оболочек и образованию перивителлинового пространства, построена на основе всех тех данных, которые приведены в этой главе, и относится к яйцам костистых рыб.
Приведенная схема отражает теории, построенные в основном на материале, полученном при работе с яйцами морских ежей, и поэтому, возможно, не во всех деталях применима к яйцам рыб. Однако не следует чрезмерно преувеличивать это обстоятельство, так как многое из этой схемы
* Как показали исследования Хори (1958, см. стр. 69), электрические изменения происходят не только после разрушения альвеол, но и на стадиях, предшествующих разрушению и в момент разрушения альвеол. Следовательно, время появления и происхождение электрических изменений в яйцах после активации значительно сложнее того, как это показано на схеме.
88
Схема, показывающая место изменений, происходящих при образрванци перивителлинового пространства у яиц. костистых рыб, в общей системе явлений, сопровождающих активацию и оплодотворение яиц.
1_
изменение проницаемости,. _______ изменение ________ изменение
электрических параметров, -----обмена -------------энергетики
белков
протеаз
- (киназы)
нагревание
перйодат натрия
искусственно-партеногенетические факторы сапонин
1
I _ связанный фактор „X
“| *" (киназы, блокированные
! мукополисахаридами)
масляная к-та, мочевина, вода
фосфолипаза А, х олеиновокислый
натр, моноген, липон
лизофосфатиды
фосфолипиды
АТФ стимуляция-----'—
----Са"
сперматозоид
(фосфолипазы спермия)
АДФ f волна оплодотворения 1 (активация кортикальных фосфолипаз яйца)
активация эстераз около' кортикальных альвеол
разрушение стенок кортик кальных альвеол (под действием эстераз)
выделение коллоидов
(мукополисахаридов из' альвеол)
отделение оболочки
Н2О-----------------{
образование перивителли
нового пространства
(осмотический захват воды му коп олисах а рядами)
Схема, показывающая место изменений, происходящих при образовании перивителлинового пространства у яиц осетровых рыб, в общей системе явлений, сопровождающих активацию и оплодотворение яиц.
пространства
подтверждено, а в некоторых случаях и впервые обосновано при изучении оплодотворения и активации яиц рыб.
У яиц осетровых рыб образование перивителлинового пространства протекает несколько сложнее и осуществляется в два этапа: сначала выделяются из поверхностного слоя яйца кортикальные гранулы и происходит высвобождение яйца из прочной связи с оболочками, а затем выделяется секрет, окрашиваемый азановым методом в голубой цвет, который и образует ясно выраженное перивителлиновое пространство (Детлаф и Гинзбург, 1954; Детлаф, 19576). Секрет второго рода начинает выделяться через 12—15 мин после оплодотворения, т. е. значительно позднее времени осуществления кортикальной реакции. Характер его выделения (рис. 17) напоминает клеточный секреторный процесс. Это позволяет предположить, что выделение секрета связано совершенно с другими явлениями, чем отторжение кортикальных гранул от поверхности яйца, и зависят от более поздних изменений,происходящих с яйцами после оплодотворения. В общей форме можно считать, что выделение секрета и образование перивителлинового пространства у яиц осетровых рыб связано с более поздними изменениями в яйцах, такими, как изменение обмена веществ и физического состояния яйца. Особенности яиц осетровых рыб можно отразить в схеме, аналогичной той, которая относится к яйцам костистых рыб.
Приведенные в схемах наблюдения, конечно, не исчерпывают всех имеющихся данных о процессах активации и оплодотворения. В частности, в ней совершенно не учитываются многочисленные работы о взаимодействии гамет при оплодотворении. Не отражены также работы Куза (1950а, Ь) и К. Ямамото (1951b), показавших, что у яиц лососевых рыб для процесса оплодотворения недостаточно проникновения сперматозоида в яйцо, но необходимо активирование яиц помещением их в воду. К- Ямамото (1951b) считает, что волна оплодотворения зависит от ионной (но не осмотической) концентрации в среде. (Как показала Т. А. Детлаф (1961), для яиц осетровых рыб это положение не верно, так как у них выделение кортикальных гранул не тормозится 0,1 и 0,2 М растворами NaCl). Не учтены также наблюдения Нуманои (Numanoi, 1955), который показал, что при оплодотворении яиц морских ежей в яйцах происходит синтез ацетилхолина, играющего, по мнению автора, некоторую роль в проведении импульса оплодотворения по поверхности яйца. Вероятно, не учтены и некоторые другие работы, имеющие отношение к проблеме активации. Не отражено также такое явление, как блокирование кортикальной реакции у яиц костистых рыб солевыми растворами. Как мы уже ни раз отмечали, вода
91
окружающей среды является фактором, вызывающим активацию пресноводных яиц костистых рыб, а соли блокируют этот процесс. Интересно, что у некоторых морских яиц костистых рыб, по-видимому, имеется обратное отношение. оТак, для яиц Fundulus heteroclitus (Kagan, 1935), беломорской наваги (Халдинова, 1936), сельди (Yanagimachi, 1953, 1957а) и минтая (Kanoh, 1954) найдено, что помещение неоплодотворенных яиц в морскую воду приводит к их активации, в то время как в разбавленной морокой или пресной воде активации яиц не происходит.
В заключение следует подвести некоторые итоги рассмотрения механизма образования перивителлинового пространства у яиц рыб и миног. В целом следует сказать, что гипотеза, высказанная Богуцким и Ямамото на материале яиц костистых рыб, подтверждена всеми последующими исследователями, хотя в нее внесено достаточно много поправок и дополнений. Можно кратко сформулировать эту теорию в настоящее время для яиц костистых рыб в виде следующих положений.
1. Образование перивителлиновой жидкости происходит благодаря появлению под оболочкой яиц осмотически активных веществ, типа мукополисахаридов, которые осмотическим1 путем набирают воду из окружающей среды.
2. Мукополисахариды входят в состав кортикальных альвеол неоплодотворенных яиц и переходят под оболочку при разрушении альвеол после оплодотворения или активации яиц.
3. Кортикальные альвеолы возникают в овоцитах на ранних стадиях овогенеза в начале периода большого роста около ядра, а затем по мере роста овоцитов перемещаются к поверхности.
4. Механизм разрушения кортикальных альвеол и секреция их содержимого под оболочку тесно связаны с прохождением импульса активации или «волны оплодотворения» по поверхности яйца и активацией энзимных систем (эстераз), расположенных вблизи альвеол. Активированные эстеразы разрушают стенку альвеол, в состав которых входят липиды, и содержимое альвеол переходит под оболочку. Возможно, что при секреции содержимого альвеол происходит активное сокращение стенки альвеол.
Яйца осетровых рыб по механизму образования периви-теллинового пространства значительно отличаются от яиц костистых рыб. Два типа веществ участвуют у них в образовании перивителлиновой жидкости: кортикальные гранулы и секрет, окрашивающийся азановым методом по Гайденгайну в синий цвет. Кортикальные гранулы близки по химическому 92
составу кортикальным альвеолам яиц костистых рыб. Выделение их из яйца связано, как и выделение альвеол, с прохождением импульса активации и осуществляется примерно в те же сроки. Однако кортикальные гранулы яиц осетровых рыб заметно меньше по размерам (2,2—3,8 и) альвеол (20—40 ц) и они несут другую -функцию, чем альвеолы, так как их участие в образовании перивителлинового пространства сводится к нарушению -прочной связи внутренней желточной оболочки с поверхностью яйца. Всасывание воды под оболочку при образовании перивителлинового пространства осуществляется азановым секретом, который выделяется из яйца значительно позднее кортикальных гранул. Этот секрет отличается от кортикальных альвеол рыб не только химическими свойствами, но и происхождением, так как он возникает на базе ядерного сока при растворении ядра овоцитов в период созревания, а также характером выделения из яйца. По описанию Т. А. Детлаф и А. С. Гинзбург (1954), выделение этих веществ из яйца имеет вид типичной клеточной секреции, т. е. процесса значительно более сложного, чем разрушение кортикальных альвеол в яйцах костистых рыб.
Следует отметить, что яйца костистых рыб отличаются от яиц осетровых рыб не только по характеру секретируемых яйцом веществ, но, возможно, и механизмом захвата воды из окружающей среды при образовании перивителлиновой жидкости. В то время как у яиц костистых рыб поступление воды под оболочку из окружающей среды происходит благодаря более высокому осмотическому давлению перивителлиновой жидкости, создаваемому мукополисахаридами, у яиц осетровых рыб большую роль, вероятно, играет желатинообразное набухание секрета, выделяющегося из яйца. На это, в частности, указывает значительная концентрация и обилие секрета. У яиц осетровых рыб, фиксированных 4%-ным формалином, секрет образует -сгусток, который можно даже снять с поверхности яйца пинцетом. У яиц костистых рыб периви-теллмновая жидкость содержит значительно меньшую концентрацию веществ и не образует при фиксации формалином Подобного сгустка.
Г л a&a III
МЕХАНИЗМ ОГРАНИЧЕНИЯ РАЗМЕРОВ ПЕРИВИТЕЛЛИНОВОГО ПРОСТРАНСТВА
Богуцкий (1930) считал, что объем перивителлинового пространства ограничивается напряжением, возникающим в оболочках во время их растягивания. По его мнению, существует подвижное равновесие между силой всасывания воды, растягивающей оболочку, и силой сопротивления, возникающей в оболочках при растяжении. Легко, однако, наблюдать, что после прокола или удаления небольшой части оболочки у яиц лососевых рыб не происходит сокращения объема, ограниченного оболочкой. Следовательно, не подвижное равновесие между осмотическими силами и силой, препятствующей растяжению оболочек, определяет размеры перивителлинового пространства. Хайес и Армстронг (1942) высказали предположение, что фактором, ограничивающим растяжение оболочек, является процесс увеличения прочности оболочек, протекающий примерно в одно время с образованием перивителлинового пространства. Этот вопрос был исследован позднее Куза (1949 а, Ь) и мною (Зотин, 1953д, 1954).
1. ИЗМЕНЕНИЕ ПРОЧНОСТИ ЯЙЦЕВЫХ ОБОЛОЧЕК ПОСЛЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ИЛИ АКТИВАЦИИ
Прочность .яйцевых оболочек значительно отличается у яиц разных видов рыб и зависит главным образом .от экологии развития данного вида рыб (Анисимова, 1952; Зотин» 1953д; Зайцев, 1956, 1959а, б; Соин, 1954; Никольский и Соин» 1954). У пелагических яиц, развивающихся в плавучем состоянии, оболочки очень слабые и непрочные, в то время как у донных яиц, особенно яиц, развивающихся, среди камней или в зоне приливов —отливов, оболочки обладают очень большой прочностью (табл. 6). Прочность оболочек зависит также от размеров яиц. Так у севрюги, осетра и белуги, развитие которых происходит в сходных экологических условиях» прочность 94
Таблица 6
Максимальная прочность оболочек оплодотворенных яиц разных видов рыб-
Вид Груз, который вызывает раздавливание яйца, s Условия развития Автор
Хамса ...... Шпрот Камбала-глосса . . Морской язык . . Морс 0,1 0,1 0,1 0,1 ка я и кра Черноморские пелагические икринки Зайцев, 1959 То же » »
Морская игла . . 10 Развитие в выводковой камере Зайцев, 1956
Морская собачка . 35—40 Пустые створки раковин моллюсков Зайцев, 1956
Сарган Тихоокеанская сельдь Охотская сельдь . Pterolebias longi-pinnis 1000 800—1200 3000 500 Донная икра, мелководье, фитофил Донная икра То же » Зайцев, 1956 Фридлянд, 1949 Галкина, 1957 Siegel, 1957—1958
Белорыбица . . . Свирский сиг . . Атлантический лосось Пресно! 500 1800—2200 3000 5одная икра Донная икра, развитие между камнями на речных перекатах Донная икра, развитие в каменисто-песчаных гнездах Подлесный, 1947 Зотин, 1958в Hayes, 1942
Озерный лосось . Озерная форель Кета < ; . . . 2500—3500 2500—3500 4000—5000 То же Зотин, 1958в То же Соин, 1954 Никольский и Соин, 1954
Горбуша Ручьевая форель , 8000—9000 4000—6000 , Соин, 1954 Никольский и Соин, 1954 Hein, 1907
Севрюга Осетр .. . . Белуга . . . . . 60—80 80—140 120—160 Донная икра, развитие на речных перекатах с галечным грунтом Зотин, 1953в То же »
95
яйцёвых оболочек значительно отличается, что совпадает с отличиями в размерах яиц (Зотин, 1953в).
Как видно из табл. 6, яйца лососевых рыб имеют чрезвычайно прочные оболочки, которые позволяют выдерживать нагрузку (при давлении груза на целое яйцо) в 3—8 кг*. Такая высокая прочность оболочек появляется не сразу после оплодотворения или искусственной активации яиц. У яиц Salmo salar L. прочность оболочек начинает быстро увеличиваться через 1—2 часа после оплодотворения и достигает максимального значения через 2 суток (Hayes a. Armstrong, 1942). Затвердевание оболочек у яиц пятнистой форели начинается через 2 часа после оплодотворения и заканчивается через 24 часа (Мапегу, Fisher a. Moore, 1947; см. также Hoar, 1957).
Мною было изучено изменение прочности оболочек после оплодотворения у яиц форели, лосося и сига (Зотин, 19536, 1954а, 1958в; Зотин и Попов, 1959).
Работа с зародышами озерного лосося, форели и свирского сига проведена мною в 1951, 1952, 1956 и 1957 гГ. на Свирском рыбозаводе (Зотин, 19536, 1958в). Для оценки прочности оболочек зародышей лосося и форели использовался прибор (рис. 27, А), описанный Дж. Греем (1932), при помощи которого определяется величина груза, вызывающего раздавливание яйца, и прибор (рис. 27. Б), при помощи которого можно определять прочность снятых с яйца оболочек на прорыв (Зотин, 19536). Измерение прочности оболочек яиц сига в начальный период, когда яйцо выдерживает нагрузку не более 250 г, проводилось при помощи прибора, показанного на рис. 27, В (Зотин, 1953в). На более поздних стадиях развития прочность оболочек яиц сига измерялась при помощи прибора Грея. В дальнейшем во всех случаях, когда для измерения прочности применялся прибор, показанный на рис. 27, Б, прочность оболочек выражается в г) см1, а когда применялись приборы, показанные на рис. 27, А и В, в граммах.
Типичные кривые изменения прочности оболочек яиц форели, лосося и сига в первое время после оплодотворения приведены на рис. 28, 36 и 38. Неоплодотворение яйца форели и лосося, взятые из полостной жидкости, способны выдерживать нагрузку в 160—280 г** (в среднем 220 г), а яйца сига — 40—50 г. После осеменения и помещения яиц в воду прочность оболочек сначала уменьшается. Яйца форели и лосося в это время выдерживают нагрузку 60—210 г (в сред
* Значительные различия в прочности оболочек, найденные разными авторами для разных видов Лососевых рыб (табл. 6), связаны, вероятно, с тем, что для определения прочности оболочек использовались разные методик».
** В моем предварительном сообщении (Зотин, 19536) все данные о прочности оболочек яиц лососевых рыб несколько занижены, так как ие были учтены константы приборов.
9В
нем 130 г), яйца сига — 20 г. Затем через 60—120 мин у яиц лосося и форели и через 120—180 мин у яиц сига прочность оболочек начинает быстро возрастать и достигает максимальной величины через 3—7 суток у яиц лосося и форели (нагрузка 2600—3500 а) и через 1—2 суток у яиц сига (1800—
Рис. 27. Приборы для определения прочности оболочек яиц лососевых (А, Б) и осетровых (В) рыб на раздавливание (Л, В) и на прорыв (В)
2200 г). Прочность оболочек на разрыв у неоплодотворенных яиц форели и лосося равна 1500—2000 г!см2, максимальная прочность оболочек оплодотворенных яиц равна 19000— 20000 г/сл2 (Зотин, 1958в). По данным Грея (pray, 1932), прочность оболочек яиц Salmo fario равна 7700 г/сл2. Изменение прочности оболочек у неоплодотворенных яиц ло-
7 А. И. Зотин 97
сосевых рыб, помещенных в воду, происходит с той же скоростью и в тех же размерах, как и у оплодотворенных яиц (Зотин, 19536, 1958в). Это связано с тем, что после помещения неоплодотворенных яиц в воду они в 100% случаев активируются и в первое время изменяются точно так же, как и оплодотворенные яйца.
Изучение прочности оболочек У яиц осетровых рыб проводилось мною весной 1951 —1956 гг. в низовье Дона (Зотин, 1953в). Яйца осетровых-рыб, как уже говорилось, имеют три яйцевых оболочки. Студенистая оболочка, благодаря ее консистенции, не играет существенной роли в общей устойчивости яиц при раздавливании. Небольшую роль в общей прочности яйца играет и прочность самого зародыша (Зотин, 19546). Поэтому при определении суммарной прочности яиц речь идет о прочности двух желточных оболочек, а если снять капсульную оболочку—о прочности внутренней желточной оболочки.
Измерение прочности яйцевых оболочек после оплодотворения было проведено на икре севрюги, осетра и белуги. Результаты, полученные на разных партиях икры одного вида, были однотипны: характер процесса увеличения прочности оболочек принципиально сходен у всех трех видов. Неопло-дотворенные яйца севрюги из полостной жидкости способны выдерживать нагрузку 15—20, яйца осетра — 30—40 и яйца белуги — 45—50 г. После осеменения и помещения в воду прочность оболочек несколько падает по сравнению с прочностью оболочек неоплодотворенных яиц, взятых из полостной жидкости. Затем начинается быстрое увеличение прочности оболочек: у севрюги через 6—8 мин, у осетра через 8—11 мин, у белуги через 11 —12 мин (при 19°), К стадии первого дробления достигается максимальная величина прочности оболочек. В это время яйца севрюги во всех оболочках выдерживают 60—80, яйца осетра 80—140, яйца белуги 120—160 г. На этой же стадии яйца севрюги во внутренней желтрчной оболочке выдерживают 25—40, яйца осетра 40—80, яйца белуги 60—100 г.
На рис. 29 и 30 показаны типичные кривые изменения прочности оболочек яиц севрюги и осетра.
В отличие от лососевых рыб при помещении неоплодотворенных яиц осетровых рыб в воду только небольшая часть яиц активируется, большинство же яиц остаются неактивированными (Астауров, 1951; Детлаф и Гинзбург, 1951а, б, 1954). Измерение прочности таких яиц показало (рис. 30), что у неактивированных яиц прочность оболочек не возрастает после помещения яиц в воду; у немногих же активированных яиц, развивающихся партеногенетически, прочность оболочек при-98
мерно такая же, как и у нормально развивающихся оплодотворенных яиц.
У других видов рыб также найдены значительные различия в прочности оболочек оплодотворенных и неоплодотворенных яиц. Неоплодотворенные яйца охотской сельди выдерживают нагрузку всего в 20—50 а; по мере развития яиц прочность оболочек возрастает почти в 100 раз, и яйца способны выдерживать давление до 3000 г (Галкина, 1957). У черноморских палегических икринок, по наблюдениям Ю. П. Зайцева (1959а, б), прочность оболочек возрастает с 30 мг на ранних стадиях развития до 100 мг на более поздних.
2. ЗАТВЕРДЕВАНИЕ ОБОЛОЧЕК
И ОБРАЗОВАНИЕ ПЕРИВИТЕЛЛИНОВОГО ПРОСТРАНСТВА
Из кривых изменений прочности оболочек яиц лососевых рыб (рис. 28, 36 и 38) видно, что увеличение прочности оболочек происходит одновременно с образованием перивителлинового пространства. На рис. 28 сопоставлены кривые увеличения прочности оболочек яиц лосося и сига и кривые скорости поступления воды в яйца при образовании перивителлинового пространства. Мы видим, что потребление воды, которая идет на образование перивителлиновой жидкости, прекращается с началом увеличения прочности оболочек. У лосося поступление воды в яйцо заканчивается через 80—90 мин, в это же время начинается затвердевание оболочки (рис. 28, Л). У сига поступление воды прекращается через 120—140 мин, соответственно в это время начинается затвердевание оболочек (рис. 28, Б). Следовательно, начавшееся затвердевание оболочек у яиц лососевых рыб останавливает дальнейшее увеличение размеров перивителлинового пространства. Эти данные подтверждают наблюдения Хайеса и Армстронга (1942). В качестве дополнения к их толкованию процесса можно добавить следующее. По-видимому, ослабление прочности оболочек в первое время после осеменения у яиц лососевых рыб необходимо для образования перивителлинового пространства. Это соображение основано на трех фактах: 1) образование перивителлинового пространства происходит в тот промежуток времени, когда оболочки имеют сниженную прочность, 2) поступление воды в яйцо прекращается, когда прочность оболочек достигает величины, близкой к исходной прочности оболочек неоплодотворенных яиц из полостной жидкости, 3) у яиц сига, у которых образование перивителлинового пространства продолжается дольше, продолжительней и период сниженной прочности оболочек.
7* 99
У яиц осетровых рыб изменение прочности яйцевых оболочек также совпадает по времени с потреблением воды яйцами из окружающей среды (Зотин, 1953в). Однако, в отличие от яиц лососевых рыб, у яиц осетровых рыб потребление
Рис. 28. Сопоставление скорости поступления воды (1,3) и затвердевания оболочек (2,4) у яиц лосося (А) и сига (Б)
Прочность оболочек
воды идет параллельно изменению прочности. На рис. 29 сопоставлены кривая скорости потребления воды яйцами севрюги, лишенных капсульной оболочки, и кривая увеличения Прочности внутренней желточной оболочки. Как видно из сопоставления этих кривых, потребление воды яйцами, идущей на образование перивителлиновой жидкости, резко замедляется с достижением внутренней желточной оболочкой прочности в 40 а (прочности всех оболочек в 70 г). Следовательно, у осетровых рыб, в отличие от лососевых, ограничи-
ло '
телем размеров перивителлинового пространства является не начало увеличения прочности оболочек, а конечные стадии этого процесса. Сейчас еще трудно сказать, являются ли эти отличия выражением особенностей морфологии и физиологии яиц или они связаны лишь с различиями в величине прочности оболочек. К сожалению, мне не удалось найти в литературе прямых данных об изменении прочности оболочек в
Рис. 29. Сопоставление скорости поступления воды (/) в пер.ивителлмновое пространство яиц севрюги и увеличения прочности внутренней желточной оболочки (2)
связи с образованием перивителлинового пространства у других видов рыб. Н. С. Строганов (1939а) и Р. И. Мухина (1948) изучали прочность икры волжской сельди (Caspialosa volgensis) на разных стадиях развития, сбрасывая икринки с высоты в 50 см в кристаллизатор и учитывая процент лопнувших при этом оболочек. Оказалось, что процент лопнувших оболочек в первые 2—3 часа после оплодотворения быстро возрастает от 5 до 96% (при 19°), а затем начинает вновь уменьшаться и достигает через 6—8 час, к стадии гаструляции, 10—20%. Исходя из этих данных. Н. С. Строганов (1939а) считает, что механическая прочность оболочек яиц сельди уменьшается в первые 2 часа после оплодотворения, а затем увеличивается и достигает максимума к стадии
101
гаструляции. Так как увеличение объема яиц волжской сельди и образование перивителлинового пространства происходит также в первые 2—3 часа после оплодотворения (Строганов, 19396; Мухина, 1948), то сопоставление этих наблюдений казалось бы показывает, что у яиц сельди, подобно яйцам лососевых рыб, увеличение перивителлинового пространства прекращается с началом затвердевания оболочек. Однако данные, полученные Н. С. Строгановым (1939а) и Р. С. Мухиной (1948) по изменению прочности оболочек, вызывают сомнения, так как в их опытах не учитывалось изменения объема и веса яиц в первые 2—3 часа, а следовательно, и возрастание-силы удара.
Все приведенные выше данные свидетельствуют лишь косвенно о роли затвердевания оболочек в образовании перивителлинового пространства у яиц рыб. Прямые данные впервые получены Куза (Kusa, 1949а, Ь). Автор помещал яйца кеты после оплодотворения в 6- и 10%-ный раствор гуммиарабика и парафиновое масло, а затем через несколько часов переносил их в воду. В растворе гуммиарабика образование перивителлинового пространства задерживалось благодаря тому, что снимался осмотический градиент между перивителлиновой жидкостью и водой среды, а в парафиновом масле прекращался доступ воды в перивителлиновое пространство. В обоих случаях затвердевание оболочек происходило при уменьшенных размерах перивителлинового пространства, в результате чего после перенесения яиц в воду их перивителлиновое пространство оказалось уменьшенным (табл. 7).
Таблица 7
Размеры перивителлинового пространства у яиц, перенесенных через разное время после оплодотворения в 6%-ный раствор гуммиарабика и возвращенных затем в воду (Kusa, 1949а)
Время помещения в гуммиарабик после оплодотворения, мин Увеличение веса яиц после перенесения их из гуммиарабика в воду, %
10 30 60 120 12,4±0,08 14,5+0,09 15,1±0,06 15,9±0,11
Я проделал сходные опыты с яйцами свирского лосося и форели. Яйца после осеменения помещали на 5 мин в воду, обсушивали на фильтровальной бумаге и переносили в вазе-
липовое масло. У таких яиц перивителлинового пространства не образовалось. Оболочки начали затвердевать через 10—20 мин после помещения в масло. При прочности оболочек в 200—400 г яйца были перенесены в воду и у них измерен процесс потребления воды для образования перивителлинового пространства. Оказалось, что такие яйца потребляют воды из окружающей среды меньше, чем контрольные яйца (табл. 8).
Таблица 8
Влияние вазелинового масла на затвердевание оболочек и объем перивителлинового пространства яиц лосося
Время после оплодотворения, час Прочность оболочек, г Момент перенесения яиц из масла в воду Объем перивителлинового пространства через 6 час
в воде в масле
0 109 109 0,0
1 67 236 + 12,7
2 159 476 + 12,4
3 186 1556 + 12,1
4 254 1704 + 10,6
6 491 2370 + 10,7
Контроль в воде 13,6
Еще раньше Аоки (Aoki, 1940), изучая влияние солей на потребление воды яйцами кеты после оплодотворения, нашел, что процент увеличения веса яиц в м/?5 растворах MgCh, СаС12 и ВаС12 меньше, чем в растворах NaCl, КС1 и LiCl. Эти данные также свидетельствуют о том, что ускорение процесса затвердевания (см. стр. 122) ведет к уменьшению размеров перивителлинового пространства. Кано (Kanoh, 1951) помещал яйца кеты на 1,5 мин в воду, а затем в м/4 гипертонический раствор Рингера и также нашел, что в солевой среде вес яиц увеличивается до меньшего значения, чем в воде. Наконец, Отзука (1957а, 1958) показал, что у яиц Oryzias latipes, обработанных до оплодотворения 0,1%-ным раствором CdCl2 в течение 10 мин, перивителлиновое пространство по размерам значительно больше, чем у контрольных яиц (хлористый кадмий, как показал Отзука, ингибирует процесс затвердевания оболочек, см. стр. 129).
Интересно, что в некоторых случаях, как уже отмечалось, прочность оболочек (или их малая эластичность) достигает такой степени, что после оплодотворения не происходит растяжения оболочек, и перивителлиновое пространство обра-
103
зуется в результате сжатия желтка. Такой уникальный случай описан (см. стр. 26) для яиц Fundulus heteroclitus. Очевидно, что в этом случае ограничение размеров перивителлинового пространства связано только с величиной сжатия желтка, которое достигается при данном осмотическом давлении.
Таким образом, всеми этими наблюдениями доказано, что процесс затвердевания оболочек является фактором, регулирующим поступление воды в яйца рыб при образовании перивителлинового пространства, а изучение механизма ограничения размеров перивителлинового пространства должно свестись к изучению скорости затвердевания оболочек. Прежде чем переходить к обсуждению механизма затвердевания оболочек, рассмотрим подробнее 1) взаимодействие яиц и оболочек в процессе затвердевания оболочек, 2) влияние различных факторов окружающей среды на процесс затвердевания и 3) период скрытого течения процесса затвердевания оболочек.
3. ВЫДЕЛЕНИЕ ЯЙЦОМ ВЕЩЕСТВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ПРОЦЕСС ЗАТВЕРДЕВАНИЯ ОБОЛОЧЕК
Фермент затвердевания. У осетровых рыб, как видно на рис. 30, затвердевание оболочек происходит только у оплодотворенных или активированных яиц, в то время как у неоплодотворенных, неактивированных яиц, помещенных в. роду, прочность оболочек не возрастает и даже уменьшается. Следовательно, для того, чтобы произошло затвердевание оболочек у яиц осетровых рыб, необходимо какое-то воздействие на оболочки со стороны оплодотворенного или активированного яйца. Выделение яйцами после оплодотворения или активации веществ, вызывающих затвердевание или уплотнение яйцевых оболочек, описано у нескольких видов морских ежей (Motomura, 1941, 1954; Runnstrom, 1948, 1955; Monroy a. Runnstrom, 1952; Wicklund, 1954), лососевых рыб (Зотин, 19536) и костистой рыбки Oryzias latipes (Nakano,. 1956; Ohtsuka, 1957a). T. С. Ямамото (1957в) предполагает, что химические изменения оболочек у яиц кеты также происходят под влиянием веществ, выделяемых яйцом после активации.
В большинстве случаев суждения о наличии таких веществ основывались на косвенных данных. В частности, у яиц лососевых рыб и Oryzias основанием для таких суждений послужили опыты, в которых показано, что оболочки, снятые с неоплодотворенных яиц, затвердевают значительно медленнее,, чем оболочки нормально развивающихся яиц. Позднее уда-104
лось показать, что в перивителлиновой жидкости только что оплодотворенных или активированных яиц лососевых рыб имеются вещества, вызывающие затвердевание оболочек неактивированных яиц (Зотин, 19586, в).
Рис. 30. Затвердевание оболочек яиц осетра в воде во всех оболочках (1) и без капсулы (2), неоплодотворенных (3) и партеногенетических яиц во всех оболочках (4), неоплодотворенных яиц в вазелиновом масле (5). и в полостной жидкости (6)
Опыты ставились следующим образом. В лунки, сделанные на дие парафиновой ванночки, помещали по 3 капли воды и перивителлиновую жидкость, взятую от 10 яиц форели через 30—60 мин после оплодотворения. Перивителлиновую жидкость получали через прокол в оболочке (не повреждая желтка). Затем в лунки помещали оболочки, снятые с неактивированных яиц в 0,1 н. растворе NaCl. Прочность этих оболочек была измерена' при помощи прибора (рис. 27, 5) через 10 час. Контролем служили: оболочки, снятые с неактивированных яиц, и оболочки, снятые с яиц черед 10 час после оплодотворения в момент определения прочности всех опытных оболочек. Кроме того, была измерена активность перивителлиновой жидкости через 27 час после ее получения из оплодотворенных яиц и активность перивителлиновой жидкости контрольных яиц через 27 час после оплодотворения.
105
Таблица 9
Действие перивителлиновой жидкости яиц форели на оболочки, снятые с неактивированных яиц
Оболочка яйца Среда, в которую помещается снятая оболочка Прочность оболочек черезЮчас в г/см2 Число измерений
Неактивированного Вода 3800 10
Через 10 час после оплодотворения Вода 9000 10
Неактивированного Перивителлиновая жидкость через 30—60 мин после оплодотворения 14 000 10
» Та же перивителлиновая жидкость через 27 час после ее получения 5000 3
» Перивителлиновая жидкость через 27 час после оплодотворения 5800 3
I
Как -видно из табл. 9, в перивителлиновой жидкости оплодотворенных яиц форели имеется вещество, вызывающее затвердевание оболочек. Это вещество через 27 час частично инактивируется как в воде, так и в перивителлиновой жидкости целых яиц. Повторные опыты показали, что найденное вещество (при t=5,7°) не инактивируется через 4 и 8 час и инактивируется через 30 час. Нагревание перивителлиновой жидкости в течение 5 мин до 30° инактивирует вещество, вызывающее затвердевание яйцевых оболочек. Установлено также, что это вещество не проходит через яйцевые оболочки.
Как уже говорилось (Светлов, 1928а, 1929; Bogucki, 1930; Gray, 1932, и др.), оболочки яиц лососевых рыб легко проницаемы для воды, солей и высокодисперсных коллоидов и непроницаемы для низкодисперсных коллоидов. Таким образом, вещество, выделяемое яйцом после оплодотворения и вызывающее затвердевание оболочек у зародышей лососевых рыб, является высокомолекулярным, нестойким соединением, быстро инактивируемым высокой температурой, что дает основание считать это вещество ферментом.
В связи с обнаружением в перивителлиновой жидкости фермента затвердевания представляет интерес вопрос: содержится ли фермент затвердевания в кортикальных альвеолах и /происходит ли его выделение вместе с секрецией содержимого кортикальных альвеол под оболочку. Накано (Nakano, 1956) нашел, что в коллоидных растворах (гуммиарабика, '106
альбумина, желатины) у неоплодотворенных яиц Oryzias latipes (происходит затвердевание оболочек, хотя кортикальные альвеолы при этом не выделяются. Однако растворы, состоящие из изолированных альвеол, лопнувших в воде, вызывают изменение оболочек. Накано (1956) считает, что вещество затвердевания содержится в альвеолах, а действие коллоидных растворов вызывает затвердевание оболочек независимо от этого вещества. Однако вероятнее, что фермент затвердевания не входит в состав кортикальных альвеол, а локализован в самом кортикальном слое цитоплазмы яйца.
/200
1 800 I W F | /200 800
§ 400
Рис. 31. Влияние концентрации NaCl на прочность оболочек и образование перивителлинового пространства у яиц лосося (Л) и сига (5)
Данные, свидетельствующие в пользу этого предположения, были получены на яйцах лососевых рыб (Зотин, 19586, в). Для этой цели было поставлено несколько серий опытов с влиянием разных концентраций раствора NaCl, блокирующих исчезновение кортикальных альвеол, на образование перивителлинового пространства и затвердевание оболочек у оплодотворенных яиц лосося, форели и сига, перенесенных из полостной жидкости непосредственно в раствор соли. Оказалось (рис. 31), что при определенной концентрации раствора NaCl образование перивителлинового пространства происходит, а прочность оболочек остается на уровне прочности оболочек неоплодотворенного яйца.
Иногда образование перивителлинового пространства без последующего затвердевания оболочек происходит также при активации яиц водой в течение 2—3 мин и перенесении их затем в 0,1 н. раствор NaCl. Обработка неоплодотворенных яиц 0,1 н. раствором LiCl подавляет затвердевания оболочек, хотя перивителлиновое пространство образуется нормально. Наконец, перивителлиновое пространство образуется у неоплодотворенных яиц, пролежавших около 27 суток в вазелиновом масле и затем помещенных в воду, тогда как затвердевания оболочек у таких яиц не происходит.
107
Было показано (табл. 10), что в опытах с применением раствора NaCl происходит блокирование хлористым натрием процесса секреции фермента из яйца, а не торможение ферментативного действия его на оболочки. Перивителлиновая жидкость, содержащая фермент затвердевания, в растворе с 0,1 н. содержанием NaCl действует на изолированные оболочки так же, как перивителлиновая жидкость, разбавленная водой. Следовательно, отсутствие затвердевания в оболочках в опытах, показанных на рис. 31, определяется отсутствием фермента затвердевания в перивителлиновой жидкости, а не-влиянием солевой среды на его активность.
Таким образом, выделение фермента затвердевания оболочек яиц лососевых рыб не связано с выделением веществ, участвующих в образовании перивителлиновой жидкости и об-разующихся в результате разрушения кортикальных альвеол. Эти наблюдения дают основания предположить, что фермент затвердевания не содержится в кортикальных альвеолах неактивированных яиц.
, , Т а б л и ц а 10
Влияние NaCl на активность фермента затвердевания перивителлиновой жидкости яиц лосося
Среда, в которую помещены оболочки, снятые с иеактивированных яиц Прочность оболочек, г/си2
через 19 час (опыт № 1) через 27 час (опыт № 2)
Смесь (1 : 1) перивителлиновой жидкости и 0,2 н. раствора NaCl .... 7500 13800
Смесь (1 : 1) перивителлиновой жидкости и воды 9400 12300
Вода 1900 3600
У зародышей осетровых рыб, как показали наши опыты совместно с Т. А. Детлаф, выделение фермента затвердевания также не связано с выделением веществ, участвующих в образовании перивителлинового пространства. Так, у яиц, помещенных через 1 мин после осеменения в 0,2 н. раствор NaCl, затвердевание оболочек не происходит, хотя у яиц образуется нормальное по размерам перивителлиновое пространство (рис. 32), что свидетельствует о выделении кортикальных гранул и веществ, окрашиваемых в синий цвет азановым методом. Последнее показано и прямым путем при цитологическом анализе процессов, происходящих с яйцами осетровых рыб в 0,1 и 0,2 н.растворе NaCl (Детлаф, 1961). После выделения фермента затвердевания у яиц осетровых
108
рыб 0,2 н.раствор NaCl, так же как у яиц лососевых рыб, не тормозит затвердевание оболочек (см. стр. 125).
Продолжительность действия фермента затвердевания на оболочки. При оплодотворении или активации яиц лососевых рыб происходит образование перивителлинового пространства, затвердевание оболочек, образование бластодиска и жировой зоны. Хотя все эти изменения происходят вскоре после оплодотворения или активации
Рис. 32. Образование перивителлинового пространства в 0,2 .н. растворе NaCl у яиц севрюги. Фотография сделала с яиц, лишенных капсульной оболочки, через 1,5 час. после помещения их в раствор
яиц, они в известной степени независимы друг от друга. В предыдущей главе описаны различные опыты, проведенные разными авторами, которые показали, что в некоторых условиях происходит нормальное образование бластодиска и жировой зоны (биполярная дифференцировка), но перивителлиновое пространство не образуется. Выше было показано, что таким же образом можно разделить процессы затвердевания оболочек и образования перивителлинового пространства. Уже отмечалось, что для выделения фермента затвердевания из яйца, так же как для образования перивителлинового пространства и для осуществления биполярной дифференцировки, необходимо непродолжительное действие воды окружающей среды на неоплодотворенное яйцо. Однако время действия воды не одинаково для процесса секреции фермента затвердевания и секреции веществ, вызывающих образование перивителлинового пространства. Для образования перивителлинового пространства достаточно, чтобы яйца пробыли в воде 30—60 сек, тогда как для того, чтобы у яиц произошло затвердевание оболочек, необходимо пребывание их в воде в течение 2—3 мин (табл. 11).
Для того чтобы определить не только время действия воды на яйцо, необходимое для секреции фермента' затвердевания, но и суммарное время, в течение которого присутствие яйца необходимо для затвердевания оболочек, с яиц через
109
разное время после оплодотворения снимали оболочки, а затем определяли их прочность. Как видно из табл. 12, прочность оболочек, снятых с яиц через 6—7 мин после помещения их в воду, не изменяется или изменяется значительно медленнее, чем у оболочек, находящихся на яйце. Так как для
Время пребывания яиц лосо для выделения фермента
Время пребывания в воде (мин) перед перенесением яиц в 0,1 н. NaCl или масло 0 0,5 1,0 1,5
Прочность оболочек (г) яиц в 0,1 и. 1 8 час- 200 — — —
растворе NaCl J 4 час. 90 100 120
Прочность оболочек (г) яиц через 14 час пре-
бывания в вазелиновом масле 280 — -- —
активации яиц и выделения фермента затвердевания требуется 2—3 мин (табл. 11), то ясно, что процесс действия фермента на оболочки при 4° продолжается 3—4 мин. В дальнейшем увеличение прочности оболочек продолжается и без наличия фермента затвердевания.
В связи с этим встает вопрос, является ли действие фермента затвердевания на оболочки обязательным условием для процесса затвердевания, или он только ускоряет медленно идущий в оболочках спонтанный процесс? Казалось бьц
Таблица 12
Время, необходимое для того, чтобы фермент затвердевания оказал действие на оболочки
Прочность оболочек, г/см2
Время снятия оболочек с яиц после оплодотворения, мин форели (через 9 час) лосося (через 10 час)
Неоплодотворенные яйца 3700 8700
6 — 10 500
7 3300 —
12 — 15 700
15 13 000 —
20 — 19 000
25 14 300 —
35 — 19 300
Контроль 10 100 14 800
110
что следует принять последнее предположение, так как затвердевание оболочек, снятых с неоплодотворенных яиц и помещенных в воду медленно, но происходит (см. табл. 12" и рис. 33,2). Однако следует учесть, что на оболочках, снятых с неоплодотворенных яиц в полостной жидкости,
Таблица 11
севых рыб в воде, необходимое затвердевания
2,0 3 5 8 10 12 15 20 Контроль
120 — 1000 — 1200 — 1400 — 990
— 360 340 — — — — — 360
— 180 — 1000 — 3400 — 2000 960
остается часть содержимого яйца. Удалить остатки яйца из таких оболочек в воде очень трудно, так как желток в воде коагулирует и прилипает к оболочке. С остатками яйца, возможно, попадает и фермент затвердевания. Если же снятые в полостной жидкости оболочки перенести не в воду, а в раствор 0,1 н. NaCl, то здесь легко и довольно быстро можно избавиться от всех остатков желтка. Оказалось, что прочность оболочек, полностью освобожденных от желтка, не изменяется ни в растворе 0,1 н. NaCl (рис. 33, 5), ни при перенесении их из раствора соли в воду (рис. 33,4). Таким образом, можно считать, что у лососевых рыб затвердевание яйцевых оболочек не может произойти без участия в этом процессе фермента затвердевания.
Таблица 13
Время пребывания осемененных яиц осетра в воде, необходимое для выделения фермента затвердевания (t=18.1°)
Время пребывания яиц в воде, сек
Прочность оболочек (г) яиц, помещенных в вазелиновое масло (через 2 часа) .............................
Контроль в воде
60
У осетровых рыб установить время взаимодействия фермента затвердевания с оболочками прямым путем не удается. Однако, учитывая, что после начала затвердевания оболочек присутствие его больше не является необходимым для этого процесса, можно принять, что фермент затвердевания яиц
11*
осетровых рыб действует на оболочки не более 6—10 мин <(у разных видов осетровых время начала увеличения прочности оболочек несколько различно), так как для выделения фермента затвердевания из яиц осетровых рыб требуется
Рис. 33. Изменение прочности оболочек нормально развивающихся яиц лосося (1), оболочек, снятых с неосе-мененных яиц и помещенных в воду (2) и в 0,1 н. раствор NaCl (3). Часть оболочек из 0,1 н. раствора NaCl перенесена в воду (4)
воздействие воды на яйцо после осеменения в течение 1 — 2 мин (табл. 13, см. также табл. 24).
Пероксидаза. Л. И. Радзинская (1960) установила, что оболочки яиц осетровых рыб дают отчетливую реакцию на пероксидазу.
Мной было проведено изучение наличия пероксидазной реакции в перивителлиновой жидкости и оболочках яиц форели при помощи реактива Слонимского — Лапинского (0,15 г бензидина, 12 мл 96%-ного спирта, 2 мл 4 %-ной перекиси водорода и 1 мл ледяной ускусной кислоты). Перивителлиновая жидкость и снятые оболочки яиц форели дают лишь слабую положительную реакцию на пероксидазу со
<12
свежим реактивом (Слонимского — Лапинского. Слабая положительная реакция на пероксидазу в перивителлиновой жидкости и оболочках обнаружена как у только что оплодотворенных яиц, так и через 2 суток после оплодотворения. Значительно более интенсивную реакцию на пероксидазу дают яйца свирского сига, у которых окраска перивителлиновой жидкости и оболочки сравнима по интенсивности с пероксидазной реакцией плазмы крови. Окраска появляется при 6— 7° через 1—2 мин после добавления реактива и достигает наибольшей интенсивности через 10—42 мин (в оболочках несколько позднее). Наиболее интересным оказалось то, что оболочки, снятые с неоплодотворенных яиц в 0,15 н.раствора NaCl, не дают пероксидазной реакции. Положительная реакция в оболочках появляется через 1 мин после активации (табл. 14) и на последующих стадиях развития бывает также
Таблица 14
Реакция Слонимского—Лапинского на пероксидазы в перивителлиновой жидкости и оболочках яиц сига
интенсивна, как и после первого появления. В перивителлиновой жидкости яиц -сига положительная пероксидазная реакция обнаруживается с того момента, когда можно получить перивителлиновую жидкость в достаточном количестве для исследования. Реакция перивителлиновой жидкости яиц сига через 5 суток после активации так же интенсивна, как и в начале образования перивителлинового пространства. Из этих наблюдений становится очевидным, что пероксидаза появляется в оболочках и перивителлиновой жидкости яиц сига только после активации. Исследование неоплодотворенных яиц показало, что пероксидазную реакцию дают кортикальные альвеолы. Неоплодотворенные яйца сига помещали на предметное стекло, делали надрез оболочки и добавляли 3 капли свежеприготовленного реактива на пероксидазу. Через 3—5 мин кортикальные альвеолы окрашиваются в ярко-
В А. И. Зотин
ИЗ
синий цвет, резко выделяясь на фоне светло-желтой цито-мы и оболочек. Таким образом, кортикальные альвеолы «е-оплодотворенных яиц сига содержат пероксидазу и появление-ее в перивителлиновой жидкости и оболочках после активации связано с разрушением альвеол и выделением их содержимого под оболочку.
(Синее окрашивание с бензидиновыми реактивами дают не только пероксидазы, но и некоторые другие вещества (Михлин, 1956). Поэтому было испробовано действие ингибиторов пероксидазы на интенсивность пероксидазной реакции в перивителлиновой жидкости яиц сига.
Как известно (см. Михлин, 1947, 1956; Самнер и Сомерс,, 1948), пероксидаза ингибируется синильной кислотой, азидом натрия, перекисью водорода, гидроксиламином, гидросульфитом натрия и тиомочевиной. Оказалось, что перивителлино-вая жидкость яиц, помещенных через ФО мин после активации на 60 мин в 0,005 раствор KCN, 0,05 раствор гидроксиламина, 0,01 раствор гидросульфита, 0,3 раствор тиомочевины и 0,6 М раствор перекиси водорода, не дает положительной пероксидазной реакции. Интересно, что перекись водорода действует только в большой концентрации: 0,006 М раствор Н2О2 не ослабил интенсивности реакции перивителлиновой жидкости. Сходные результаты были получены при обработке ингибиторами перивителлиновой жидкости, изолированной из яйца через 40—50 мин после активации (с последующим действием ингибиторами в течение 60 мин). Перивителлино-вая жидкость, содержащая тиомочевину, при прибавлении реактива Слонимского — Лапинского окрашивается через некоторое время в желто-оранжевый цвет, что также характерно для пероксидаз. Таким образом, проверка пероксидазной реакции с использованием ингибиторов пероксидаз подверди-ла наличие пероксидазы в перивителлиновом пространстве и оболочках яйца.
Эти наблюдения и другие соображения заставили предположить, что пероксидаза принимает участие в процессах затвердевания оболочек. Для проверки этой гипотезы я проделал осенью 1959 г. на Свирском рыбоводном заводе несколько опытов с действием ингибиторов пероксидазы на затвердевание оболочек яиц форели. Яйца форели через 10 мин после активации помещали в растворы с различной концентрацией ингибиторов пероксидазы (раствор гидросульфита нейтрализовался едким натром). Прочность оболочек была измерена через 15 час. Как видно на рис. 34, все изученные ингибиторы при определенной концентрации их в среде останавливают процесс затвердевания оболочек. Предельные концентрации ингибиторов пероксидазы, действующих
114
тормозяще на затвердевание оболочек, суммированы в табл. 15.
Наиболее чувствителен процесс затвердевания оболочек к присутствию в среде перекиси водорода, которая полностью
Таблица 15
Предельная концентрация ингибиторов пероксидазы, вызывающая торможение затвердевания оболочек яиц форели
Вещество Концентрация, M
Н2О2 Ю-4—Ю-5
nh2oh Ю-2—10-3
KCN 10-2—io-з
NaN3 10-1
NaHSO3 10-1
NH2CSNH2 3-10-1
подавляет затвердевание уже при концентрации, равной 10~4 М. Значительный эффект оказывает также цианистый калий и гидроксиламин. Тиомочевина тормозит процесс затвердевания оболочек только при концентрации 0,3 М,
Таблица 16
Влияние ингибиторов пероксидазы на затвердевание оболочек, снятых с яиц форели
Концентрация, М Прочность оболочек (103 г/см2) через 26 час
2-Ю-2 1-Ю-2 5-10-з ью-3 ыо—• 1-10-® 1- 10-8
nh2oh 1,3 1,3 — 18,6 16,0 —
KCN 2,0 — 8,2 16,4 15,1 —
Н2О2 — — — — 3,1 6,5 13,5
Контроль Неоплодотворенные яйца — 1,3 Оплодотворенные — 12,0
Можно легко показать, что ингибиторы пероксидазы действуют не на яйцо, а на процессы, протекающие в самой оболочке. Для доказательства этого оболочки снимали с яиц через 10 мин после активации и помещали в растворы с разной концентрацией гидроксиламина, HjOj и KCN. Как видно из данных табл. 16, затвердевание изолированных оболочек тормозится при той же концентрации ингибиторов, как и -при
8*
115
Таблица 17
Пероксидазная реакция перивителлиновой жидкости последействия высокой температуры в течение 10 мин
t, °C Реакция на пероксидазу
4,2 +
25—31 +
42—46 -р
90—95 +
действии их на целые яйца. Действие ингибиторов на оболочки до определенной концентрации, по-видимому, обратимо. Так, если яйца форели обработать 0,001 М раствором Н2О2 в течение 10 мин, а затем перенести в воду, то торможения затвердевания не происходит (0,6 М раствор Н2О2 при такой же обработке яиц действует необратимо).
Интересно, что все ингибиторы, тормозящие затвердевание оболочек, при уменьшении их концентрации в среде ниже некоторого предела вызывают ускорение процесса затвердевания оболочек (рис. 34). Особенно сильно в этом отношении действует гидросульфит натрия, затвердевание оболочек, в 0,01—0,001 М растворе которого идет в два-три раза быстрее, чем в воде. При дальнейшем уменьшении концентрации ингибиторов в растворе их активирующий эффект постепенно исчезает (рис. 34). Вопрос о механизме ускоряющего действия малых концентраций ингибиторов пероксидазы на затвердевание оболочек пока неясен.
Установленный факт влияния пероксидазы на за
твердевание яйцевых оболочек естественно поднимает вопрос, не является ли фермент затвердевания пероксидазой? То, что фермент затвердевания оболочек не идентичен пероксидазе, показывают следующие наблюдения.
1. Как было отмечено выше, фермент затвердевания, в отличие от пероксидазы, не входит в состав кортикальных альвеол неоплодотворенных яиц (в том числе и у яиц сига).
2. Фермент затвердевания оболочек термолабилен и инактивируется при нагревании до 30° (Зотин, 19586, в). В то же время, известно (Самнер и Сомерс, 1948), что пероксидазы устойчивы к действию высоких температур: даже после кипячения происходит частичное восстановление активности некоторых пероксидаз. Действительно, нагревание выделенной из яйц сига перивителлиновой жидкости даже до 90— 95° не привело к потере способности этой жидкости давать положительную бензидиновую реакцию на пероксидазу (табл. 17).
3. Наконец, как мы видели (табл. 14), перивителлиновая жидкость яиц сига способна давать яркую положительную реакцию на пероксидазу даже через 5 суток после активации,
116
Рис. 34. Влияние ингибиторов пероксидазы на затвердевание оболочек активированных яиц форели. Прочность оболочек через 15 час. На абсциссе отложены логарифмы концентрации ингибитора
1 — прочность оболочек контрольных оплодотворенных яиц;
2 — прочность оболочек неоплодотворенных янц
Прочности оболочек (10 Зг)
Рис. 35. Влияние 0,1; 0,5; 1,0 н. раствора гидросульфита на затвердевание оболочек яиц. форели, помещенных в раствор через разные сроки после оплодотворения. Прочность оболочек измерена через 26 час
в то время как фермент затвердевания исчезает из перивителлиновой жидкости яиц форели уже через 27—30 час после активации.
Трудным вопросом для исследования является вопрос о времени вступления в действие пероксидазы при затвердевании оболочек. Можно лишь предположительно указать это время, исходя из косвенных данных. Были поставлены опыты с влиянием ингибитора пероксидазы (гидросульфита) на разные стадии процесса затвердевания оболочек яиц форели. Для этого яйца помещали через 5, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 120 и 240 мин в 1,0, 0,5 и 0,1 М растворы гидросульфита, ней
118
трализованные NaOH, и измеряли прочность оболочек через 26 час. Как видно на рис. 35, 1 и 0,5 М растворы гидросульфита при помещении в них яиц в первые 1—2 часа после активации тормозят процесс затвердевания оболочек, а в последующее время — ускоряют затвердевание. Это говорит о том, что пероксидаза, диффундировавшая в оболочки, в первые 1—2 часа после активации изменяется так, что она перестает ингибироваться растворами гидросульфита данной концентрации. Можно предположить, что этот момент и является началом вступления пероксидазы в реакции, протекающие в оболочках при затвердевании.
Как уже отмечалось, Л. И. Радзинская (1960) обнаружила пероксидазу в оболочках яиц осетровых рыб. Поэтому возможно, что и у яиц осетровых рыб пероксидаза принимает участие в процессах затвердевания оболочек.
4. ФАКТОРЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ СКОРОСТЬ ЗАТВЕРДЕВАНИЯ ОБОЛОЧЕК
Вода окружающей среды является фактором, вызывающим активацию пресноводных яиц костистых рыб. В этом смысле вода является необходимым звеном в процессах, предшествующих затвердеванию оболочек яиц лососевых рыб, так как без 2—3-минутной обработки яйца водой не происходит выделение фермента затвердевания. Манери и Ирвинг (Manery a. Irving, 1935) высказали предположение, что затвердевание яйцевых оболочек зародышей лососевых рыб каким-то образом связано с поступлением воды в яйцо и в оболочки. Это предположение трудно проверить на яйцах лососевых рыб. Для зародышей осетровых рыб имеются некоторые косвенные данные, показывающие, что вода окружающей среды принимает участие в начальных стадиях процесса затвердевания оболочек (Зотин, 1953в, д). Во-первых, начало затвердевания оболочек яиц осетра совпадает по времени с началом поступления воды в оболочки. Во-вторых, затвердевание оболочек начинается с внешней желточной оболочки (табл. 18) и только спустя 2—3 мин начинается затвердевание внутренней желточной оболочки. Если бы для затвердевания оболочек было бы достаточно только' воздействия фермента затвердевания, выделяемого яйцом, то первой должна бы затвердевать внутренняя желточная оболочка, а потом внешняя.
Отзука (Ohtsuka, 1957а), изучавший процесс затвердевания оболочек яиц Oryzias latipes, также нашел, что затвердевание оболочки начинается в наружной части, а затем распространяется на внутреннюю (автор судил о прочности оболочки, рассматривая под микроскопом характер разрыва оболочки
119
Таблица 18
Время начала затвердевания оболочек у яиц осетровых рыб
Вид t,°c Начало затвердевания желточных оболочек, мин Момент отделения внешней желточной оболочки от внутренней, мин
внешней внутренней
Севрюга 17 8 11 8
» 15 8 13 12
» 17 8 9 —
» 20 6 7 7
Среднее . . 7,5 10,0 9,0
Осетр 19 11 16 12
» 19 10 15 10
» 22 9 И 9
» 19 9 13 —
» 19 8 10 9
Среднее . . 9,4 13,0 10,0
Белуга 18 12 12 —
» 19 И 13 —
» 16 И 13 —
Среднее . . 11,3 12,6 —
стеклянной иглой). Эта наблюдения, конечно, не доказы-вают того, что именно вода участвует в затвердевании оболочек, так как можно себе представить и другие влияния, идущие из окружающей среды, например, диффузию кислорода. Однако они указывают на возможность участия одного из. факторов среды в процессе затвердевания после воздействия фермента.
Вода окружающей среды на более поздних стадиях играет противоположную роль в процессах затвердевания оболочек, являясь фактором, регулирующим (тормозящим) скорость процесса затвердевания яйцевых оболочек. Если яйцо-лосося поместить после 5—10 мин пребывания в воде (для активации) в безводную среду (вазелиновое масло), то затвердевание оболочек в этих условиях идет быстрее, чем у контрольных яиц, лежащих в -воде (Зотин, 1958в). Как видно из данных табл. 19, стимулирующее действие масла на процесс затвердевания оболочек яиц лососевых рыб осуществляется только в том случае, если яйца помещать в масло в первые 20—25 мин после оплодотворения. Интересно, что в первые 20—30 мин после оплодотворения происходит наиболее интенсивное поступление воды в перивителлиновое пространство при его образовании (см. рис. 28). Поэтому можно*
120
Таблица 19
Влияние масла на процесс затвердевания оболочек яиц лосося
Время пребывания яиц в воде после оплодотворения до помещения в масло, мин 5 8 10 12 15 20 25 30 40 60
Прочность оболочек, г
через 9 час (вазелиновое масло) . . .'
через 5 час (льняное масло)
1800 — 1600
2000 1400 1300
1000— 700
900 556 300
Контроль
670
250
650
думать, что именно прохождение воды через оболочки при образовании перивителлинового пространства служит регулятором скорости затвердевания оболочек, замедляя развитие этого процесса. Ускорение процесса затвердевания можно получить не только помещением яиц в вазелиновое масло,, но и в любую другую среду, препятствующую образованию перивителлиновой жидкости и прохождению воды через оболочку. Так, мне удалось получить ускорение затвердевания оболочек яиц лосося, помещая их через 5 мин после активации в льняное масло, на воздух, в 12%-ный раствор гуммиарабика и белок куриного яйца. У яиц сига, помещенных после активации в подсолнечное масло, затвердевание оболочек также идет быстрее, чем в воде.
Предположение о том, что снижение прочности оболочек происходит благодаря прохождению воды через оболочку во время образования перивителлинового пространства, можно подтвердить следующими наблюдениями. Яйца лосося через 8 мин после оплодотворения быстро проводили через 96°-ный спирт, обсушивали на фильтровальной бумаге и помещали в вазелиновое масло. Контрольные яйца находились все время в воде. Как видно на рис. 36, при затвердевании оболочек в безводной среде снижения прочности в начале процесса не происходит. Можно думать, что прохождение воды через оболочки при образовании перивителлинового пространства у яиц лососевых рыб автоматически регулирует величину перивителлинового пространства, замедляя процесс затвердевания оболочек и снижая прочность оболочек. Этому предположению несколько противоречат данные, полученные при изучении прочности оболочек яиц осетровых рыб, так как и у них тоже происходит снижение прочности сразу после оплодотворения (см. рис. 29), но значительно раньше, чем начинается образование перивителлинового пространства. Все же
121
и у яиц осетровых рыб вода из окружающей среды, по-видимому, ответственна за снижение прочности оболочек после оплодотворения. На рис. 30 показаны кривые изменения прочности оболочек оплодотворенных яиц белуги в воде (/), неоплодотворенных яиц в воде (3), в полостной жидкости (6) и в вазелиновом масле (5). В воде снижение прочности оболочек неоплодотворенных яиц идет параллельно снижению
Рис. 36. Затвердевание оболочек яиц лосося в воде (2) и в вазелиновом масле (/)
лрочности оболочек оплодотворенных. У последних снижение прочности оболочек прекращается начавшимся затвердеванием оболочек. В полостной жидкости и в вазелиновом масле снижения прочности оболочек неоплодотворенных яиц не происходит. Таким образом, и у зародышей осетровых рыб снижение прочности оболочек яйца после оплодотворения, вероятно, связано с действием воды окружающей среды.
Соли. Как было показано выше (рис. 31), 0,1 н. раствор NaCl блокирует выделение неоплодотворенными яйцами фермента затвердевания, препятствуя тем самым возможности развития процесса затвердевания в оболочках. Многие другие соли обладают сходным действием на неоплодотворенные яйца лососевых рыб (табл. 20).
422
Таблица 20
Действие солей на прочность оболочек яиц лосося
0,1 н. растворы Н2О LiCl NaCl KC1 СаС12 MgCl, SrCl2 io-3 Al Cl, FeCl,
Прочность оболочек (г) через 6 час пос- Активированные (10 мин) 400 90 610 520 1920 990 2270 61 100
ле помещения яиц в растворы Неактивированные 400 90 130 НО 95 82 — 47 47
Действие 0,1 н. растворов NaCl, K'Cl, СаС12 и MgCl2 на не-оплодотворенные яйца сводится к блокированию процесса секреции фермента затвердевания: растворы этих солей не тормозят самого процесса затвердевания оболочек, если яйца поместить сначала на 10 мин в воду для активации и выделения фермента затвердевания, а затем перенести в растворы солей (табл. 20). Этого нельзя сказать о действии 0,1 н. растворов LiCl, А1С13 и FeCl3, так как они тормозят процесс затвердевания оболочек даже после активации яйца и выделения фермента под оболочку (Зотин, 1953д, 1958в, Зотин и Попов, 1959). Испытание действия LiCl, А1С13 и FeCl3 проводилось не в буферных смесях, поэтому трудно, сказать, влияют ли на процесс затвердевания оболочек ионы, или растворы этих солей действуют благодаря тому, что они изменяют кислотность среды1. Блокирование выделения фермента затвердевания из яиц лососевых рыб зависит от концентрации солей в среде. Как видно из данных табл. 21 (см. также рис. 31), торможение выделения фермента затвердевания у яиц лосося происходит при концентрации 0,06— 0,07 н. NaCl в среде, а у яиц сига уже при концентрации 0,04 н. Из этой же таблицы видно, что необратимое блокирование выделения фермента затвердевания у яиц лосося и сига происходит при действии более высоких концентраций NaCl в среде (у яиц лосося 0,08, у яиц сига 0,07 н.).
Сходные данные о влиянии солевой среды на затвердевание оболочек яиц Salmo salvilinus были получены ранее Рун-стремом (Runnstrom, 1920), который показал, что затвердевание оболочек не происходит в течение суток, если неопло-дотворенные яйца поместить в морскую воду с соленостью
1 Испытания действия растворов с малой концентрацией А1СЬ (0,0001 н.) показало, что хлористый алюминий столь же сильно ускоряет затвердевание оболочек, как СаС12 и SrCI2.
123
Таблица 21
Влияние концентрации NaCl в растворе на затвердевание оболочек яиц лосося и сига (t=4°)
8—10%. Интересную работу по влиянию солености морской воды на прочность оболочек яиц охотской сельди провела Л. А. Галкина (1957). Она показала (табл. 22), что у яиц
Таблица 22
Влияние солености морской воды на прочность оболочек яиц охотской сельди (Галкина, 1957)
Соленость, %о
Неоп-лодо-творен ные яйца
Прочность (г) оболочек на стадии 16 бластомер ... 20—50 50
Прочность (г) оболочек на стадии гаструля-ции ... 20—50 230
охотской сельди, нормально развивающихся в морской воде, торможение секреции веществ, вызывающих затвердевания оболочек, происходит в отличие от пресноводных яиц лососевых рыб при снижении концентрации солей в среде.
124
Большое значение солей для процесса выделения из яйца веществ, влияющих на затвердевание оболочек, было найдено также на яйцах осетровых рыб. В табл. 23 показаны концентрации различных солей, при которых происходит торможение процесса затвердевания оболочек яиц осетра.
Таблица 23
Концентрация солей (в н.), при которой происходит торможение процесса затвердевания оболочек яиц осетра
Соль LiCl КС1 NaCl ВаС12 СаС12 СоС12 MgCl2 FeCl3 А1С 12 Ma2SO4 NaCO3 Na 3Ce H6O7 Морская вода
Тор-мо-же-ние 0,02— 0,03 0,02— 0,03 0,09— 0,10 0,03— 0,05 0,10— 0,15 0,15 0,20— 0,25 0,005 0,005 0,20 0,05 0-,05 0,15
Полная остановка 0,03 0,05— 0,07 0,15-0,20 0,06— 0,08 0,20 0,15 0,3 0,005 0,005 . 0,20
Опыты были повторены три раза и проводились следующим образом: яйца осеменяли в воде и сразу после обсушки на фильтровальной бумаге помещали в растворы солей с разной концентрацией, прочность оболочек измеряли через 1, 3 и 15 час.
Как видно из данных табл. 23, наибольшее влияние на прочность оболочек яиц осетра оказывают FeCls, А1С13, LiCl, КС1 и ВаС12. Следует отметить, что раствор LiCl, который я применял, имел сильную щелочную реакцию, а растворы FeCl3 и А1С1з — кислую реакцию. При нейтрализации этих растворов до pH = 7 они не оказали при испытании на яйцах осетра тормозящего влияния на затвердевание оболочек даже в концентрации 0,1 н.
У яиц осетровых рыб, так же как у лососевых и сельдевых рыб, действие солей в первый момент после активации связано с блокированием выделения веществ (фермента затвердевания) из яйца. Помещение яиц осетра в воду на 2—3 мин перед перенесением их в растворы NaCl, КС1 и ВаС12 достаточно, чтобы торможения затвердевания оболочек не произошло, хотя увеличение прочности оболочек начинается
125
лишь через 8—11 мин (табл. 24). Процесс секреции фермента затвердевания полностью блокируется, если яйца перенесены в растворы солей не позже чем через 90—120 сек. после активации '. В тех случаях, когда яйца осетра содержались в воде свыше 90 сек, а затем были перенесены в 0,2 н. раствор NaCl или 0,1 н. раствор КС1, выделение фермента затвердевания блокировалось не полностью, так как в дальнейшем наблюдалось затвердевание оболочек.
Таблица 24
Время выделения фермента затвердевания у яиц осетра
Время пребывания яиц в воде дс помещения
в раствор, сек
Затвердевание оболочек (t = 18,5°)
Примечание. (— оболочки не затвердели, -|- затвердевание на половину меньше, чем в контроле, —|- оболочки затвердели)
Интересно, что стимулирование водой секреции фермента затвердевания из я»ц осетра является процессом кумулятивным, т. е. можно действовать водой на яйцо в разное время после осеменения, и это действие, несмотря на перерыв во времени, будет суммироваться. В табл. 25 приведены данные опытов, в которых одни яйца осетра помещались через 30, 60, 90, 120 и 180 сек после осеменения в 0,1 н. раствор KCI (контроль), другие — через 30 сек после осеменения в 0,1 н. раствор КС1 на 10 мин, а затем переносились вновь
1 Это еще раз доказывает, что выделение фермента затвердевания из яйца осетровых рыб, так же как у яиц лососевых рыб, не связано с выделением кортикальных гранул, которые, как известно из работ Т. А. Детлаф (19576, 1958s, 1961) и А. С. Гинзбург (19576, 1959, 1960), начинают выделяться уже через-5—10 сек после осеменения [Т. А. Детлаф (1961) показала, что помещение яиц осетровых рыб через 10 сек после осеменения в растворы 0,1 н. и 0,2 н. NaCl не препятствует выделению кортикальных гранул].
126
на 30, 60, 90, 120, 180 сек в воду и снова возвращались в раствор соли (опыт). Таким образом, в этих опытах действие воды на яйцо прерывалось через 30 сек после осеменения и вновь возобновлялось через 10 мин. Оказалось (табл. 25), что' при повторном помещении яиц в воду достаточно было их пребывания в ней ровно на 30 сек меньше,
Таблица 25
Действие 0,1 н. раствора КС1 на затвердевание оболочек яиц осетра
Время пребывания в воде до помещения в раствор, сек Затвердевание оболочек
через 1 час через 3 часа
контроль опыт контроль опыт
30 — — —
60 — —
90 — + + ~|—1“
120 + ++ -1—F ++
180 ++ ++ ++ ++
чем у контрольных яиц, т. е. время действия воды суммировалось: за первые 30 сек произошли какие-то необратимые изменения в яйце, ведущие к выделению фермента затвердевания, и дополнительное действие воды продлило эти изменения с того момента, на котором они остановились.
Все приведенные выше данные относятся к влиянию солей на процесс затвердевания оболочек у неактивированных или только что активированных яиц. В этом случае действие солей связано главным образом с влиянием на процесс секреции фермента затвердевания из яйца. Но соли оказывают большое влияние на затвердевание оболочек и после выделения фермента затвердевания, ускоряя или тормозя этот процесс. Как видно из табл. 20 и рис. 37, двухвалентные ионы Са", Sr", Mg", если их влияние осуществляется после активации яиц и выделения фермента затвердевания, резко ускоряют процесс увеличения прочности оболочек у яиц лососевых рыб. Одновалентные ионы К' и Na’ также несколько ускоряют процесс затвердевания, но значительно слабее двухвалентных ионов. Для ускорения или угнетения процесса затвердевания оболочек в первые часы после оплодотворения или активации нет необходимости в непрерывном действии солей на оболочки. Достаточно 10 мин (и даже меньше) пребывания яиц в 0,1 н. растворах солей, чтобы проявилось их влияние на процесс затвердевания оболочек. Так, чтобы 0,1 н. раствор СаСЬ оказал влияние на скорость затвердевания оболочек, достаточно продержать яйца лосося в растворе 20—30 сек, хотя
127
более длительное пребывание яиц в этом растворе (больше одной минуты) оказывает иногда большее влияние (Зотин и Попов, 1959).
В своем предварительном сообщении Варрен, Фишер и Манери (Warren, Fisher ia. Manery, 1947) сообщили, что максимальное затвердевание оболочек яиц пятнистой форели достигается в мАоооо (0,000012 н.) растворе СаС12. Однако в опытах на яйцах свирского лосося мы получили несколько иные цифры (Зотин и Попов, 1959). Минимальная концентрация СаС1г в среде, которая через 10 мин после активации яиц заметно влияет на скорость затвердевания оболочек, равна 0,0002 н., т. е. оказывается значительно больше максимальной концентрации, найденной в опытах с яйцами пятнистой форели. Повышение концентрации СаС12 усиливает эффект его действия на оболочки яиц свирского лосося (табл. 26).
Таблица 26
Максимальный эффект достигается при концентрации 0,006 н-Сходные данные по влиянию ионов Са" на процесс затвердевания оболочек для яиц Oryzias latipes получил Отзука (Oht-suka, 1957 а), который показал, что в определенных пределах скорость затвердевания увеличивается с увеличением концентрации ионов Са" в среде. Расчет, по данным Отзуки, максимальной концентрации СаСЬ, после увеличения которой дальнейшего ускорения процесса затвердевания оболочек яиц О. latipes не происходит, показывает, что она равна 0,004 М, что достаточно близко к цифре, найденной нами для яиц лосося (табл. 26).
У яиц сига, как показали наши совместные наблюдения с Л. Н. Танасийчук, затвердевание оболочек яиц свирского сига также ускоряется ионами кальция: яйца, помещенные на 5 мин в воду для активации и перенесенные в 0,02 н. раствор СаС12, через 5 час выдерживали нагрузку в 690 г против 330 г у контрольных яиц, содержавшихся в воде.
128
Ускоряющее действие солей на затвердевание оболочек связано в основном с влиянием на этот процесс катионов, однако анионы также имеют некоторое значение. Так, из четырех солей натрия (NaCl, Na2SO3, NiaHCO3 и оксалата натрия) в концентрации 0,01 н. NaCl и Na2SO3 оказали заметно большее влияние на затвердевание оболочек яиц форели, чем две другие. Особняком в этом отношении стоит гидросульфит натрия, который действует в одних случаях как ингибитор пероксидазы, в других случаях — как сильный активатор процесса затвердевания (|стр. 116).
Несмотря на то, что при изучении влияния солей на оболочки в растворы солей помещались целые яйца, все же во всех этих опытах речь идет о влиянии солей непосредственно на оболочки, а не косвенным путем через яйцо. Для доказательства этого оболочки, снятые с яиц лосося через 5 мин после активации, помещали в различные 0,1 н. растворы солей (табл. 27). Результаты получились одинаковые с действием солей на целые яйца: FeCl3, А1С13 и LiCl тормозят
Таблица 27
Влияние различных веществ на затвердевание оболочек, снятых с яиц форели через 10 мин после активации
Вещество Прочность оболочек через 20 час (103 г'См~2) Вещество Прочность оболочек через 20 час (103 г-см~2)
0,001 М CdCl2 4,5 Ацетилхолин, 10~4 г/мл 21,1
0,001 М AgNOs 4,1 0,1 М СаС12 22,8
0,001 М HgCl2 5,6 IO-8 М SrCl2 21,0
0,001 М Н2О2 5,7 0,1 М NaCl 18,8
0,05 М NH2OH 4,6 0,1 М LiCl 1,5
0,005 М KCN 7,3 0,1 М А1С13 1,5
Вода 19,1 0,1 М НС1 1,6
затвердевание, NaCl и КС1 несколько ускоряют, а СаС12, MgCl2 и SrCl2 резко ускоряют затвердевание изолированных оболочек.
Не все двухвалентные катионы действуют ускоряюще на процесс затвердевания оболочек — CdCl2 и HgCl2 вызывают торможение процесса затвердевания оболочек у яиц Oryzias latipes (Ohtsuka, 1957 а, 1960). У яиц лососевых рыб они также вызывают остановку процесса затвердевания (Зотин и Попов, 1959). Не только хлористый кадмий (рис. 38), но и другие яды сульфгидрильных групп, такие как HgCl2 и AgNO3, вызывают остановку процесса затвердевания оболочек.
9 А. И. Зотин
129
Хлористый кадмий инактивирует затвердевание оболочек, начиная с концентрации 0,005 н., но тормозящее его влияние сказывается в концентрации 0,0002—0,0005 н. У яиц осетровых рыб CdCh также блокирует затвердевание оболочек. Отзука (1957а) считает, что действие раствора CdCl2 связано с их влиянием на кортикальный слой яйца, а не на -сами оболочки. Однако, как видно из табл. 27, CdClj вызывает остановку процесса затвердевания не только при воздействии на целые яйца, но и в снятых с яиц оболочках, т. е. CdCh блокирует процессы, идущие в оболочках яиц.
Кальций. Мы уже отмечали, что 0,1 н. раствор СаСЬ, как и другие соли двухвалентных металлов, с одной стороны, препятствует. выделению фермента затвердевания из поверхности неоплодотворенных яиц и. тем -самым полностью блокирует процесс затвердевания оболочек, с другой стороны, резко ускоряет процесс затвердевания оболочек оплодотворенных или активированных яиц (табл. 20). Кроме этого,, ионы кальция играют и другую, более специфическую роль в процессах затвердевания оболочек: затвердевание оболочек яиц лососевых рыб не происходит в растворах цитрата и оксалата натрия, связывающих ионы кальция, а в дистиллированной -воде этот процесс идет медленнее, чем в- контроле (Manery, Fisher a. Moore, 1947; Warren, Fisher a. Manery, 1947; Kusa, 1949b). T. А. Детлаф (1959) показала, что различие в действии на процесс затвердевания оболочек бескальциевых сред (дистиллированной воды и растворов кальциесвязывающих веществ) связано с тем, что последние не только создают бескальциевую среду, но извлекают кальций из самих оболочек. Особенно- наглядно это выявилось в опытах с версеном, в которых было показано, что при непродолжительном действии этого кальциесвязывающего вещества оно обратимо, однако, чем больше продолжительность воздействия версена на -оболочки, тем большую концентрацию Са-СЬ надо создать в среде, чтобы компенсировать действие версена (Детлаф, 1959).
Необходимость ионов кальция для затвердевания яйцевых оболочек обнаружена также в опытах с яйцами костистой рыбки О. latipes (Nakano, 1956; Ohtsuka, 1957а) и различных видов морских ежей (Loeb, 1915 Hobson, 1932b; Мо-tomura, 1954; Hiramoto, 1955; Markman, 1958).
Как и в других случаях, на яйцах лососевых рыб легко проверить, необходимы ли ионы кальция для процессов, протекающих в самих оболочках, или бескальциевые растворы, действуют на затвердевание оболочек косвенно, через яйцо.. В табл. 28 приведены данные о влиянии 0,1 н. раствора версена на изолированные оболочки, снятые с неоплодотворен-
130
Таблйца 28
Значение ионов кальция для действия фермента затвердевания на оболочки яиц лосося, снятых с неактивированных яиц
Оболочки сняты с неактивированных яиц в 0,1 н. растворе Перенесены Прочность оболочек через ’0 час в г/сл2
NaCl На 10 мин в 0,1 н. раствор версена и после отмывки (5 мин) в воде помещены в раствор фермента 3500
Версена На 5 мин в воду и затем в раствор фермента 2100
Версена На 30 мин в 0,1 н. раствор СаС12 и после отмывки в воде в раствор фермента 6300
NaCl В раствор фермента 11400
Конт-1 NaCl В 0,1 н. раствор NaCl 1600
рэли|версен В 0,1 н. раствор версена 2200
ных яиц лосося. Как видно из этих опытов, обработка оболочек неактивированных яиц 0,1 н. раствором версена приводит к таким изменениям, что последующее действие фермента затвердевания не ведет к увеличению прочности оболочек. Это действие версена частично обратимо после помещения оболочек в 0,1 н. раствор СаС12 на 30 мин. Таким образом, ионы кальция необходимы для действия фермента затвердевания на оболочки. В наших совместных с Т. А. Детлаф опытах было также показано, что версен тормозит затвердевание оболочек только в том случае, если яйца обрабатываются раствором версена в первые 5 мин после оплодотворения или активации (рис. 37), т. е. в: то время, когда происходит воздействие фермента затвердевания на оболочки. На последующих стадиях (от 5 до 200—300 мин после активации) версен действует противоположным образом: ускоряя процесс затвердевания оболочек (рис. 37).
Наконец, следует отметить еще одно значение ионов кальция для затвердевания оболочек. Как подробно разбиралось выше, выделение фермента затвердевания связано с процессом активации яиц, а так как ионы кальция играют значительную роль в процессах активации яиц (стр. 70), то они тем самым оказываются необходимыми и для выделения фермента затвердевания из поверхности яйца.
Таким образом, ионы кальция влияют на затвердеваний оболочек тремя различными путями: 1) путем влияния на процессы секреции фермента затвердевания, 2) участием в процессе воздействия фермента затвердевания на оболочки и 3) путем изменения скорости самого процесса затвердевания.
9*
131
Прочность оболочек, i03e
ложено время после оплодотворения, когда яйца перенесены из воды в раствор
Кислоты и щелочи. Оболочки неоплодотворенных яиц лосося частично растворимы в 1%-ных растворах NaOH и НС1 при 100° (Young a. Inman, 1938), а при температуре 14—15° они сильно разбухают в растворах кислот и щелочей (Aoki, 1941 а). В щелочной среде (0,1—1,0 н. NaOH) происходит растворение внутренней части оболочки, наружная часть оболочки в этих растворах не растворяется (Aoki, 1941а). К кислотам оболочки более устойчивы, однако в 1 н.
132
растворе НС1 и H2SO4 происходит сильное разбухание оболочек. Внутренний слой оболочки разбухает сильнее и постепенно исчезает. По данным Аоки (1941 а, Ь), оболочка яиц .лососевых рыб состоит из трех слоев: внешнего гиалинового (студенистого) слоя, среднего и внутреннего, причем последние два можно различить только экспериментально: внутренний слой, в отличие от наружного, разбухает в щелочах и кислотах. В 0,01 н. растворе НС1, по данным Куза (Kusa, 1949а) и Хамано (Hamano, 1957), внутренний слой оболочки неоплодотворенных яиц кеты не только разбухает, но и растворяется. Панкреатин разрушает оболочки неактивированных яиц кеты только после предварительной обработки их раствором Рингера, подкисленного НС1 до рН=1,8 (Т. S. Yamamoto, 1957b, с). Таким образом, в кислой и щелочной среде происходит разбухание и частичное растворение оболочек яиц лососевых рыб, что, конечно, должно снижать их прочность. Действительно, как показали опыты, проведенные мною на яйцах свирской форели, затвердевания оболочек у неоплодотворенных или только что активированных яиц, помещенных в 0,1 н. растворы НС1 или NaOH, не происходит (см. рис. 37, табл. 27).
Кислоты и щелочи действуют на оболочки только неопло-дотворенных неактивированных яиц (Aoki, 1941а). Двойная обработка активированных яиц (сначала подкисленным раствором Рингера рН=1,8, затем панкреатином), в отличие от неактивированных, не приводит к растворению оболочек (Т. S. Yamamoto, 1957b, с). Проведенные мною опыты на яйцах свирской форели показали, что 0,1 н. растворы NaOH и НС1 не влияют на прочность оболочек через 2—3 часа после активации и позже (рис. 37).
Кислород. Диффузия кислорода через оболочки при дыхании яиц также, по-видимому, играет в какой-то степени роль регулятора скорости процесса затвердевания оболочек. Были проведены следующие опыты. Яйца лосося, после
Таблица 29
Значение кислорода для затвердевания оболочек яиц форели
Яйца помещены в
Прочность оболочек (г) этих янц через 4 часа
Обычную воду..................................
Кипяченую воду...........................- • •
IO'3 н. (оплодотворенные......................
раствор KCN (неоплодотворенные................
Неактивированные яйца..................... .
440
290
200
120
60
133
осеменения помещали в прокипяченную воду, залитую сверху слоем вазелинового масла. Такие яйца начали нормально развиваться, но прочность их оболочек возрастала медленнее, чем прочность оболочек у контрольных яиц (табл. 29). Не-оплодотворенные и оплодотворенные яйца лосося помещались также в 10~3 н. раствор KCN. У них образовывалось перивителлиновое пространство, но прочность оболочек увеличивалась медленнее, чем у контрольных яиц (табл. 29). В последнем случае, вероятно, действие KCN связано с влиянием этого яда на пероксидазу.
5. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЙ ПЕРИОД ЗАТВЕРДЕВАНИЯ ЯЙЦЕВЫХ ОБОЛОЧЕК
Затвердевание яйцевых оболочек у яиц лосося, форели и сига происходит не сразу, а лишь через 60—180 мин после оплодотворения (рис. 28, 36). Действие же фермента затвердевания необходимо только в самые первые минуты после оплодотворения или активации. Следовательно, имеется подготовительный период затвердевания оболочек, когда фермент уже оказал необходимое воздействие, и подготовительные процессы идут в оболочках, но прочность оболочек еще не увеличивается и даже несколько падает. Понимание процессов, происходящих в оболочках в этот период, очень важно для выяснения механизма затвердевания оболочек.
Отличие подготовительного периода от последующих периодов изменения прочности оболочек состоит не только в том, что в это время не происходит увеличения прочности оболочек, но и в особенности их химических свойств, выявляемых при воздействии солей, кислот, щелочей и других веществ. Установлено, что именно в этот период соли одного-, двух- и трехвалентных металлов оказывают сильное влияние на затвердевание оболочек (Зотин 1958в; Зотин и Попов, 1959). В частности, действие растворов NaOH и СаСЬ (угнетающее и стимулирующее) сказывается особенно сильно в начале подготовительного периода затвердевания, а затем постепенно уменьшается и к концу этого периода (рис. 37) практически исчезает.
Особенно наглядно выявляется периодизация в процессах затвердевания оболочек при применении растворов 0,1 н. версена, NaHSO3 и FeCl3. На рис. 37 видно, что на разных стадиях процесса затвердевания оболочек версен оказывает совершенно различное влияние. В первые 5 мин после оплодотворения версен полностью тормозит процесс затвердевания оболочек. Это тот период, когда происходит действие фермента затвердевания на оболочки, требующее наличия в сре
134
де ионов кальция. В подготовительный период версен резко ускоряет процесс затвердевания. С окончанием этого периода влияние версена на затвердевание оболочек постепенно прекращается. 0,1 н. раствор FeCl3 в течение подготовительного периода затвердевания оболочек тормозит этот процесс (как уже указывалось растворы 0,1 н. FeCl3 дают резко кислую реакцию, поэтому, это действие, вероятно, связано с кислой реакцией раствора FeCl3). После окончания подготовительного периода (начиная с 150 мин после оплодотворения) FeCl3, наоборот, ускоряет процесс затвердевания. Сходным образом действует гидросульфит (см. рис. 35).
Действие растворов версена, LiCl, СаС13 FeCl3 и других солей во время подготовительного периода затвердевания вызывает необратимые изменения в оболочках, так как для предотвращения или стимуляции затвердевания необходимо лишь кратковременное (в течение 1 мин) воздействие этих растворов на оболочки.
У зародышей осетровых рыб увеличение прочности оболочек, так же как и у лососевых рыб, начинается не сразу, а через 8—12 мин (при 18°) после оплодотворения. Следовательно, и у яиц этих рыб имеется период, сходный с подготовительным периодом затвердевания оболочек у яиц лососевых рыб.
Подготовительный период затвердевания оболочек соответствует так называемому переходному периоду, в течение которого оболочка достигает своего дефинитивного строения и свойств. Наличие такого переходного периода разными методами установлено на яйцах Oryzias (Nakano, 1956), на яйцах кеты (Т. S. Yamamoto, 1957с, Натапо, 1957) и у яиц морского ежа (Корас, 1940, 1941; Runnstrom, Моппё а. Вготап, 1944; Markman, 1958).
6. ХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ЗАТВЕРДЕВАНИЯ ОБОЛОЧЕК
Рунстрём, Монне и Броман (Runnstrom, Моппё а. Вготап, 1944) нашли, что 0,1%-ный нейтрализованный раствор цистеина и 0,5%-ный раствор тиогликолевой кислоты замедляют затвердевание оболочек яиц морских ежей. Эти вещества действуют обратимо, так как после отмывки оболочки затвердевают. На затвердевшие оболочки указанные вещества не действуют. Так как цистеин и тиогликолевая кислота вызывают разрушение дисульфидных связей, то авторы пришли к выводу, что затвердевание оболочек связано с образованием таких связей. Можно вызвать также разрушение затвердевших оболочек яиц морского ежа трипсином и хемотрипсином, если их предварительно обработать тиогликолевой
135
кислотой (Monroy, a. Runnstrom, 1948). Это также показывает, по мнению авторов, что устойчивость оболочек яиц морских ежей зависит от присутствия в оболочках дисульфидных связей. Исходя из этих наблюдений и из своих данных о влиянии окислительно-восстановительных индикаторов (порфириндин и порфироксид) на яйца морских ежей Рунстрём (Runnstrom, 1957) пришел к выводу, что затвердевание слоев яйцевой поверхности связано с окислением SH-групп и образованием дисульфидных связей. Наличие сульфгидрильных групп во внешнем слое неоплодотворенных яиц морских ежей было установлено цитохимическими тестами (Afzelius, 1956). На яйцах морских ежей было показано также, что окисляющие вещества ускоряют затвердевание оболочек, а восстанавлива ющие — тормозят (Motomura, 1954; Motomura a. Hiwatashi 1954; Runnstrom a. Kriszat, 1957).
Желточную оболочку яиц лягушки можно растворить папаином после обработки их тиогликолатом натрия (Spiegel, 1951).
Для яиц рыб были получены сходные данные: 0,1 М растворы цистеина и тиогликолевой кислоты вызывают разбухание оболочки яиц Oryzias latipes в переходный период изменения оболочек, что указывает на участие дисульфидных связей в процессе изменения оболочек (Nakano, 1956).
Как уже говорилось, яды сульфгидрильных групп (2,5 • 10 : HgCl и р-хлормеркурийбензоат) припятствуют затвердеванию оболочек яиц Oryzias latipes (Ohtsuka, 1960) и яиц лососевых рыб. Цитохимическими методами наличие сульфгидрильных групп и дисульфидных связей обнаружено в оболоч-кая яиц радужной форели (С. Brown, 1955), миноги и сельди (Т. S. Yamamoto, 1956, 1957а), Oryzias latipes (Ohtsuka, I960)..
Отзука (1957а, б), показавший, что КМпО4 вызывает затвердевание оболочек яиц Oryzias, также как Рунстрём (1957), предполагает, что затвердевание оболочек происходит в результате окисления сульфгидрильных групп и образования дисульфидных связей. В более поздней работе он показал, что< обработка неоплодотворенных яиц Oryzias latipes окислителями вызывает затвердевание оболочек, тогда как восстановители тормозят этот процесс (Ohtsuka, 1960).
Если затвердевание оболочек яиц лососевых рыб зависит от присутствия сульфгидрильных групп, то яды сульфгидрильных групп должны останавливать затвердевание оболочек на любой из стадии этого процесса. На рис. 38 видно, что раствор CdCl2 и AgNOs блокирует процесс увеличения прочности оболочек яиц форели при помещении яиц в ингибитор на любой стадии процесса затвердевания. Интересно, что-происходит полная остановка процесса увеличения прочности 136
оболочек, но не уменьшение прочности, т. е. сохраняется прочность, достигнутая благодаря превращению сульфгидрильных групп в дисульфидные мостики к моменту помещения яиц в раствор хлористого кадмия. Специальные опыты, проведенные на изолированных оболочках, показали (табл. 27), что сульфгидрильные яды действуют непосредственно на процессы, протекающие в оболочках, а не косвенным образом через яйцо.
Чтобы доказать, что хлористый кадмий действует при остановке затвердевания именно на сульфгидрильные группы, яйца форели, обработанные 0,05 н. раствором хлористого кадмия, переносились в растворы цистеина различной концентрации. Цистеин является носителем сульфгидрильных групп, активно связывающим CdCl2, и поэтому его действие должно было бы привести к освобождению блокированных сульфгидрильных групп и активированию процесса затвердевания оболочек. Опыт показывает, что обработка яиц, затвердевание оболочек которых блокировано CdCl2, 0,008—0,006 н. раство-
Таблица 30
Влияние цистеина на затвердевание оболочек яиц форели, блокированных 0,05 н. раствором CdCl2 в течение 20 мин (t=7°)
Время помещения яиц в раствор после активации, мин Изменение прочности оболочек в контроле (г) Концентрация цистеина, 10- -3 М
8 6 4 2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 о,1
5 24->440 320 400 150 150 130 150 70 80 50 50
40 90-»480 550 500 500 — 300 250 180 200 180 130 —
24 часа 740-И 300 1250 — — — 860 880 940 900 650 660
ром цистеина, приводит к возобновлению процесса увеличения прочности оболочек (табл. 30). Эти наблюдения позволили обнаружить экспериментальным путем уменьшение сульфгидрильных групп в оболочках во время процесса затвердевания. Действительно, если происходит уменьшение сульфгидрильных групп, то на более поздних стадиях процесса затвердевания оболочки должны связывать меньшее количество молекул CdCl2, а следовательно нужна меньшая концентрация цистеина для возобновления процесса затвердевания, блокированного хлористым кадмием.
Предварительные данные, полученные таким способом на яйцах форели, приведены в табл. 30. Яйца форели через 5,
137
40 мин и 24 час после активации помещались на 20 мин в 0,05 и. раствор CdCl2, а затем после ополаскивания водой переносились в растворы цистеина разной концентрации. Перед помещением яиц в растворы CdCU и цистеина яйца обсушивались на фильтровальной бумаге. Как видно из данных табл. 30, при обработке яиц CdCl2 через 5 мин после активации растворы цистеина частично снимают действие хлористого кадмия на оболочки, начиная с концентрации 0,001 М, в то время как при обработке яиц CdCl2 через 24 часа после активации действующая концентрация цистеина снижается до 0,0004 М. Хотя эти данные требуют повторения, они все же указывают на снижение концентрации сульфгидрильных групп в оболочках во время их затвердевания. Исходя из данных, приведенных в табл. 30, концентрация цистеина, полностью снимающая действие хлористого кадмия на оболочки, равна 0,006— 0,008 М. Следовательно, в оболочках яиц форели содержится около 0,006—0,008 М сульфгидрильных групп. Пересчет на одну оболочку дает (принимая объем яйца — 78,0 мм3, радиус = 2,65 мм и толщину оболочки = 40 ц) содержание сульфгидрильных групп, равное 2,4 • 10-8 — 3,2-10-8 г]см3. За время с 5 мин до 24 час при 7° содержание сульфгидрильных групп меняется на 0,0006 м или на 2,4-10-9 г]см3, т. е. исчезает примерно 7ю часть имеющихся SH-rpynn.
Механизм окисления SH-rpynn
Отзука (1957а) предположил, что окисление сульфгидрильных групп осуществляется фосфолипидами или ненасыщенными жирными кислотами, выделяющимися из яйца после активации. Он нашел, что кортикальный слой неоплодотворен-ного яйца О. latipes содержит фосфолипиды типа лецитина. Наличие лецитина в неоплодотворенных яйцах костистых рыб отмечено и другими авторами. Неоплодотворенные яйца сазана содержат 6,86% лецитина (от сырого веса), яйца леща — €,88% и яйца судака — 6,31% (Касинова, 1936). Неоплодотворенные яйца кеты и горбуши содержат около 2,6% лецитина (Никонова, 1951). Отзука (1957а) сообщил также, что, по его наблюдениям, лецитин и жирные кислоты вызывают затвердевание оболочек неоплодотворенных яиц Oryzias.
Так как вопрос о влиянии жирных кислот и лецитина на прочность оболочек имеет принципиальный интерес для понимания механизма затвердевания оболочек, я поставил специальные опыты для изучения влияния продажного лецитина, пальмитиновой и линолевой кислот на скорость процесса затвердевания оболочек яиц свирской форели. Эти вещества плохо растворимы в воде, поэтому были использованы не только вод-138
ные, но и спиртовые и эфирные их растворы. Яйца через 5 мин после активации в воде помещали в соответствующие растворы на 18—20 час, а затем определялась прочность их оболочек. В табл. 31 представлены суммированные данные трех опытов.
Таблица 31
Влияние ацетилхолина, холина, лецитина, пальмитиновой м линолевой кислот и др. веществ на затвердевание'оболочек активированных яиц форели
Вещество Прочность обо -лочек через 20 час, %
Ацетилхолин 10~4 г/мл 235
Ацетилхолин 4- холинэстераза 432
Холинэстераза 105
Лецитин вода 180
Лецитин 1 %-ный спирт 147
Лецитин 4-5 %-ный спирт 131
Лецитин 4-10 %-ный спирт 163
Лецитин 4-1 %-ный эфир 189
Лецитин 4- 5%-ный эфир 205
Лецитин 4-10%-ный эфир 180
Пальмитиновая к-та 87
Пальмитиновая к-та 4-1%-ный спирт 108
Пальмитиновая к-та 4-5 %-ный спирт 100
Линолевая к-та 93
Линолевая к-та 4-1%-ный спирт 82
Линолевая к-та 4- 5%-ный спирт 90
Глицерин 10~2 М 46
Глицерин 10-6 М 70
Уксусная к-та 10'3 М 11
Уксусная к-та 10-в М . ’ 65
Контроль
1%-ный спирт 105
5 %-ный спирт 84
10%-ный спирт 79
1%-ный эфир 101
5 %-ный эфир 95
10%-ный эфир 110
Примечание Поочность оболочки в воде принята за 100%.
Как видно из этих данных, в пальмитиновой и линолевой кислотах ускорения затвердевания оболочек яиц форели не происходит. Лецитин несколько увеличивает прочность оболочек
139
Рис. 38. Влияние ядов сульфгидрильных групп (AgNO3, CdCl2), ядов пероксидазы (NH2OH, Н2О2) и холина (ацетилхолин + холинэстераза) на затвердевание оболочек яиц форели, помещенных в растворы через разные сроки после оплодотворения. Контроль в воде
по сравнению с контролем. Однако в отношении лецитина пока трудно говорить об его ускоряющем действии на затвердевание оболочек, так как использовались не чистые, продажные препараты лецитина. После экстракции эфиром лецитина из таблеток, он оказывает заметно меньшее действие на процесс затвердевания оболочек. Следовательно, пока нельзя считать доказанным, во всяком случае по. отношению к яйцам лососевых рыб, участие лецитина или жирных кислот в окислении сульфгидрильных групп или других химических реакциях, происходящих в оболочках во время увеличения их прочности.
Более вероятным кажется предположение, что окисление сульфгидрильных групп в процессе затвердевания оболочек происходит при участии пероксидазы. Это предположение под
140
крепляется тем обстоятельством (кроме Самого факта присутствия пероксидазы в оболочках и в перивителлиновой жидкости), что яды пероксидазы останавливают увеличение прочности оболочек на любой стадии процесса затвердевания (рис. 38). Так же, как и в случае блокирования затвердевания сульфгидрильными ядами, яды пероксидазы останавливают увеличение прочности оболочек, но не снижают ее. По-видимому, ингибирование пероксидазы блокирует процесс затвердевания оболочек потому, что прекращается окисление сульфгидрильных групп и образование дисульфидных связей. Можно думать, что при затвердевании оболочек идет процесс окисления SH-групп высокомолекулярных веществ, катализируемое пероксидазой, и образование — SS — связей.
Недавно Отзука (1960) высказал предположение, что в процессе затвердевания оболочек яиц Oryzias окисляются не только SH-группы, но и а-гликоловые группы. Автор считает, что сначала происходит окисление а-гликоловых групп, образование альдегидов, комбинация альдегидов с SH-группами и окисление SH-групп до —S—S—. Такое усложнение введено для того, чтобы объяснить данные о влиянии альдегидов на процесс затвердевания оболочек и участие полисахаридов оболочек, содержащих а-гликоловые группы, в процессе затвердевания (Ohtsuka, 1960). Эти представления не противоречат наблюдениям других авторов, однако требуются дополнительные данные, чтобы их безоговорочно принять.
Наконец, следует напомнить, что затвердевание оболочек яиц лососевых рыб тормозится в анаэробных условиях (табл. 29), поэтому возможно, что окисление SH-групп происходит с участием кислорода среды.
Таким образом, механизм окисления SH-групп, ведущий к затвердеванию оболочек, пока не совсем ясен. С учетом гипотезы Отзуки (1960) и данных о пероксидазе, можно предположить следующую последовательность реакций, ведущих к окислению SH-групп и образованию дисульфидных связей (реакции окисления альдегидов (см. Михлин, 1947).
/ОН
RCHO+H2O —> RCH _±2!_» RCOOH+H2O2 \он
Н2О2 + 2RSH пеР°*сиДаза 2Н2О -Р R-S-S-R-
'Окисление альдегидов в аэробных условиях происходит при участии альдегидразы, поэтому для осуществления такой последовательности реакций требуется доказать участие этого ^фермента в процессах затвердевания оболочек.
141
Роль фермента затвердевания
В результате оплодотворения или активации из поверхности яиц выделяется фермент затвердевания оболочек, не идентичный пероксидазе, без которого процесс затвердевания оболочек начаться не может. Как уже говорилось, Отзука (1957а) предположил, что затвердевание оболочек вызывается фосфолипидами или жирными кислотами, выделяющимися из поверхности яиц после активации. При этом автор исходил из теории Монрой (см. стр. 85), согласно которой при активации яиц происходит активирование кортикальных фосфолипаз, расщепление липопротеинового комплекса и дальнейший распад фосфолипидов. Отзука (1957а) считает, что при активации яиц Oryzias также происходит активирование лицитиназы (или холинфосфатазы), энзиматическое расщепление кортикального слоя и выделение под оболочку лецитина или ненасыщенных жирных кислот, которые вызывают затвердевание оболочки. Проверка этих предположений представляет большой интерес,, так как в случае их подтверждения можно было бы идентифицировать фермент затвердевания оболочек с одной из фосфолипаз. Для этой цели было исследовано влияние на оболочки яиц форели большинства продуктов энзиматического расщепления лецитина. Яйца форели через 10 мин после активации помещались в растворы лецитина, пальмитиновой и линолевой кислот, ацетилхолина, холина (ацетилхолина, расщепленного холинэстеразой до холина), глицерина и уксусной кислоты. Как видно из данных табл. 31, глицерин, уксусная кислота и жирные кислоты не оказали заметного ускоряющего действия на процесс затвердевания оболочек. Лецитин усиливает этот процесс, но, как уже говорилось, очищенный лецитин действует заметно слабее продажного. Очень сильное влияние, сопоставимое с действием ионов кальция, оказывают на затвердевание оболочек ацетилхолин, особенно после расщепления его холинэстеразой до холина (сама холинэстераза на прочность оболочек не влияет). Таким образом, если фосфолипазы принимают участие в затвердевании оболочек, то, вероятнее всего, их действие связано с образованием холина, возникающего в результате энзиматического распада лецитина. Проверка времени действия холина на процесс затвердевания оболочек показала (рис.38),что его влияние сказывается только в подготовительный период затвердевания оболочек и особенно сильно в первые минуты после оплодотворения или активации. Это вполне соответствует предположению о том, что продуктом действия фермента затвердевания является образование холина. К сожалению, попытка идентифицировать фермент затвердевания с фосфолипазами мне не уда
142
лась. Перивителлиновая жидкость не гемолизирует кровяные тельца, она не вызвала появления заметных количеств веществ, ускоряющих затвердевание оболочек, при обработке ею лецитина, куриного желтка и желтка яиц форели. В свою очередь, как оказалось, холинэстераза не вызывает ускорения процесса затвердевания оболочек при действии на изолированные оболочки и оболочки + перивителлиновая жидкость, в ко^ торой фермент затвердевания был инактивирован высокой температурой. Требуются дальнейшие исследования для того, чтобы идентифицировать фермент затвердевания и понять химические реакции, идущие в оболочках в подготовительный период. Сейчас можно лишь строить различного рода гипотезы. В частности, раньше мною было высказано предположение (Зотин, 1958в), что процесс затвердевания оболочек у яиц лососевых рыб связан с образованием высокополимерных веществ в оболочке путем инициированной цепной полимеризации. Предполагалось, что появление инициаторов связано с действием фермента затвердевания, а увеличение их количества в оболочке является процессом автокаталитическим. Достигнув определенной концентрации, инициаторы вызывают реакцию цепной полимеризации, идущей по обычной схеме: начало роста цепей, рост цепей и обрыв цепей
В настоящее время эта схема действия и роли фермента затвердевания еще не устарела. Однако мы не можем пока установить, какие вещества (инициаторы) появляются в результате действия фермента затвердевания, так как сильное влияние холина на процесс затвердевания оболочек еще недостаточно для того, чтобы считать его инициатором цепной полимеризации веществ в оболочках, ведущих к увеличению прочности оболочек. Возможно, например, что фермент затвердевания вызывает появление перекисей (довольно обычных инициаторов при цепной полимеризации, см. Коршак, 1950), альдегидов (роль которых в затвердевании подчеркнута в работе Отзуки, 1960) или других веществ с ненасыщенными двойными связями.
Механизм затвердевания
Следует подвести итоги рассмотренным выше данным и гипотезам о механизме затвердевания оболочек. Мы видели, что доказанным являются следующие положения: 1) для начала процесса увеличения прочности оболочек необходимо
1 Мотомура и Хиваташи (Motomura a. Hiwatashi, 1954) также высказали предположение, что затвердевание оболочек у яиц морского ежа происходит благодаря полимеризации.
443
выделение из яйца фермента затвердевания, действие которого на оболочки осуществляется только в присутствии ионов кальция; 2) действие фермента затвердевания необходимо только первые 3—4 мин после активации, хотя увеличение прочности оболочек у яиц лососевых рыб начинается через 2—3 часа; 3) увеличение прочности оболочек происходит благодаря окислению SH-групп и образованию дисульфидных связей; 4) окисление SH-групп осуществляется с участием фермента пероксидазы, расположенного в оболочках; 5) наконец, следует принять, что увеличение прочности оболочек происходит благодаря полимеризации, возможно цепной окислительной полимеризации, веществ по SH-группам с образованием высокомолекулярных полимеров. Для того, чтобы представить эти положения в виде схемы, мы должны ввести еще одно предположение, которое уже упоминалось выше: фермент затвердевания оболочек вызывает появление в оболочках или в перивителлиновой жидкости веществ, которые после автокаталитического увеличения их количества, инициируют цепную окислительную полимеризацию по SH-группам. Это предположение в какой-то мере оправдывается тем фактом, что фермент затвердевания действует на оболочки всего 3—4 мин, а в дальнейшем в оболочках в течение 1—2 час скрыто протекают процессы, отличные от процесса увеличения прочности по химическим и физическим свойствам (подготовительный период затвердевания оболочек). Учитывая все это, механизм затвердевания оболочек можно изобразить следующей схемой последовательных реакций
Са”
активация --!----> фермент затвердевания
окисление SH — групп
НаО -е-------
образование — S—S-----связей
увеличение прочности оболочек
144
Если учитывать гипотезу Отзука (1960) и предположить, что инициаторами затвердевания являются альдегиды, то схему реакций можно написать в следующем виде
, Са” 4-Ог
—► фермент затвердевания----> а-гликоловая группа--►
+н2о +О2
—> альдегид----->- альдегидгидрат--► карбоновая к-та -р Н2О2
H2O2+2RSH - --p0KC1ga32Н2О+ -R-S-S-R-
Эти схемы более или менее удовлетворительно описывают экспериментальные данные, полученные при изучении действия воды, солей, альдегидов, ядов сульфгидрильных групп, окислителей, восстановителей, ядов пероксидазы на разные стадии процесса затвердевания оболочек, а также такие факты, как участие фермента затвердевания, пероксидазы и кислорода в затвердевании оболочек. Действие различных веществ на. оболочки яиц лососевых рыб суммировано в табл. 32.
Влияние различных веществ можно изобразить, исходя из данных табл. 32, следующим образом:
С а”
1 версен, оксалат е
активация
фермент затвердевания
Н2О ------------
И + Н
« KC1, NaCl, J {LiCl, FeCl3,i ! MgCl^CaCU ! 'AlCt3, HC1J । SrCl2, холин j ' NaOH 1
*....................... 1
I малые концентрации: j
} NHSOH, FeCl3, AlCl3,H2O2,j
• NaN3, KCN, NaHSO3
J
Са”
'FeCl3,AlCl3 j *
T~~'7 ---1-------------п ерокси да за
;h2o2,nh2oh, KCN, 3
'[NaNaLNaHSO3,CS(NH2)2jf I
-R-SH HS-R-
{a gN O3J CdICl2iH gC j
-R—S-S-R-
10 А. И. Зотин
145
Таблица 32
Влияние различных веществ на процесс затвердевания оболочек янц лососевых рыб
Вещество Характер действия на процесс затвердевания
ускорение торможение | не влияет
Н2О СФ (ПП) УП
LiCl — СФ, ПП УП
КС1 (ПП) СФ УП
NaCl (ПП) СФ УП
MgCl2 ПП СФ УП
СаС12 ПП СФ УП
SrCl2 ПП СФ УП
FeCl3 УП СФ, ПП —
AICI3 УП СФ, ПП —
HC1 — ПП УП
NaOH — ПП УП
Оксалат — СФ, ДФ УП
Версен ПП СФ, ДФ УП
Холин ПП — УП
h2o2 — ПП, УП —
NaN3 — ПП,УП —
KCN — ПП, УП —
NH3OH — ПП,УП —
NaHSO3 — ПП, УП —
Тиомэчевина — ПП, УП —
AgNOs — ПП, УП —
CdCl2 — ПП, УП —
HgCl2 — ПП, УП —
При малых
концентрациях
FeCl3 ПП
AlClg ПП
H2O2 ПП, УП
NaN3 ПП, УП
KCN ПП, УП
nh2oh ПП, УП
NaHSO3 ПП, УП
Тиомочевина ПП, УП
Примечание. ПП — подготовительный период; СФ — секреция фермента затвердевания; ДФ — действие фермента; УП— период увеличения прочности оболочки; скобки—слабое действие.
146
В приведенных схемах не отражены наблюдения, (Согласно которым изменения оболочек начинаются с внутреннего слоя (Nakano, 1956; Т. S. Yamamoto, 1956, 1957с? Натапо, 1957), а затвердевание оболочек — с внешнего слоя (Зотин, 1953в; Ohtsuka, 1957а),.
О том, какие высокомолекулярные вещества испытывают превращения при затвердевании оболочек, высказаны различные точки зрения, основанные на изучении химического состава оболочек. Янг и Инман (Young a. Inman, 1938) приводят собственные данные и данные других авторов о аминокислотном составе оболочек яиц атлантического лосося, сельди, акулы и скорлупы курицы. Соотношение гистидина к лизину и аргинину в белке оболочки яиц лососевых рыб 1:3:4 в противоположность 1:4:12 в кератине и 1:4:9 в фиброине молока. Авторы считают, что белки капсулы являются псевдокератинами. Однако эти белки настолько отличны от кератина, что Браун (Brown С., 1955) сближает их с белками кутикулы беспозвоночных. Хамано (Натапо, 1957), изучавший химический состав оболочек яиц Oryzias latipes, считает, что состав внутреннего слоя оболочки у неоплодотворенных яиц отличается от наружного. По его мнению, наружный слой содержит кератоэластин, в то время как внутренний слой, растворимый в 0,01 н. растворе НС1, состоит главным образом из гликопротеинов. Обнаружено также присутствие, заметного количества серы в этом слое. Так как по наблюдениям Накано (1956) внутренний гомогенный слой оболочек яиц О. latipes в первые 30 мин после оплодотворения настолько изменяется, что становится ни по свойствам, ни по внешнему, гетерогенному виду не отличим от наружного слоя, то, вероятно, в нем происходят процессы преобразования гликопротеидов в кератиноподобные белки. Значительное количество серы, различные аминокислоты и следы железа найдены при изучении химического состава белков оболочек яиц осетра и севрюги (Белинская, Карпов и Шапиро, 1937). Наличие белков и полисахаридов цитохимическими методами показано в желточных оболочках яиц миноги и сельди (Т. S. Yamamoto, 1956, 1957а) и в оболочках яиц осетровых рыб (Т. А. Детлаф, 19576, 1958в).
На материале изучения яиц морских ежей было высказано предположение, что процесе -затвердевания оболочек аналогичен явлениям, происходящим при свертывании крови (Heil-brunn, 1915; Runnstrom, Monne a. Broman, 1944; Monroy a. Runnstrom, 1948 Monne a. Harde. 1951d). Процесс затвердевания оболочек яиц морских ежей сравнивают также с кера-тинизацией путем развертывания некоторых глобулярных молекул белка и образования дисульфидных связей между
10*
147
белковыми единицами (Runnstrom, Моппё a. Broman, 1944; Monroy a. Runnstrom, 1948). Сходную гипотезу высказал Хайес (Hayes, 1949), который считает, что затвердевание оболочек яиц лососевых рыб связано с реорганизацией белковых молекул в кератиноподобную структуру. Недавно эти гипотезы раскритиковали на основании изучения дифракции рентгеновских лучей оболочками, снятыми с неактивированных и активированных яиц Salvilinus fontinalis (Kusa a. Wada, 1959). Оказалось, что картина дифракционных колец не выявляет наличия кератина в оболочках и не меняется при активации яиц. По мнению авторов, при активации не происходит молекулярной реорганизации в оболочках. Эти исследования не
Схема,
показывающая место процесса затвердевания оболочек в общей системе изменений, происходящих при оплодотворении
лизофосфатиды
сперматозоид
фосфолипиды
------ Са’*
стимуляция
волна оплодотворения
разрушение кортикальных альвеол
выделение фермента затвердевания
выделение пероксидазы
выделение мукополисахаридов
I инициация процесса
затвердевания в оболочке
внедрение пероксидазы в оболочку
4
отделение оболочки
Н2О
увеличение прочности оболочки
4 образование
перивителлинового пространства
148
противоречат данным об уменьшении количества SH-rpynn при затвердевании, так как при реакции — SH >— S — S — рентгенограммы меняться не должны. Отзука (Ohtsuka, 1960) считает, что в оболочках яиц Oryzias при затвердевании происходит образование комплекса белков, содержащих SH-группы, и полисахаридов, имеющих а-гликоловые группы.
У яиц осетровых рыб экспериментальное изучение процесса затвердевания привело к получению результатов, близких к данным, полученным для лососевых и других костистых рыб. Это позволяет идентифицировать химические процессы, происходящие при затвердевании оболочек тех и других рыб.
В заключение мы схематически, как это было сделано для процесса образования перивителлинового пространства, сопоставим изменения, происходящие при затвердевании с другими изменениями оплодотворенного яйца (см. стр. 148).
Глава IV
МЕХАНИЗМ НАБУХАНИЯ ОБОЛОЧЕК
В первой главе подробно разобрано несколько примеров набухания оболочек у яиц осетровых рыб, миног и некоторых видов костистых рыб. Было показано, что увеличение объема оболочек, главным образом студенистой оболочки, наряду с образованием перивителлинового пространства, определяет характер поступления воды в яйца из окружающей среды в первое время после оплодотворения или активации. Как мы видели, образование перивителлинового пространства, изменение проницаемости и прочности оболочек яиц рыб тесно связаны с выделением яйцами после оплодотворения или активации различных веществ, вызывающих эти процессы. Естественно поэтому поставить вопрос: связан ли процесс набухания оболочек с оплодотворением яйца или этот процесс происходит автоматически при попадании яиц в воду?
1. СВЯЗЬ НАБУХАНИЯ СТУДЕНИСТЫХ ОБОЛОЧЕК С ОПЛОДОТВОРЕНИЕМ ИЛИ АКТИВАЦИЕЙ ЯИЦ РЫБ
Ответить на этот вопрос, работая с яйцами костистых рыб, трудно, так как у большинства видов костистых рыб зрелые неоплодотворенные яйца, помещенные в воду, активируются и в них разыгрываются такие же процессы как и при оплодотворении.
В частности, я измерял потребление воды (методом падения яиц в трубки) яйцами сома (Silurus glanis L.), которое зависит главным образом от набухания студенистой оболочки. Как видно из табл. 33, после помещения неоплодотворенных яиц сома в воду происходит быстрое поступление воды в них в течение первых 40—60 мин. Захват воды происходит благодаря набуханию студенистой оболочки, так как перивителлиновое пространство у яиц сома, как показал С. Г. Крыжановский (1949), невелико. Хотя при помещении неоплодотворенных яиц сома в воду происходит набухание студенистой оболочки, этот факт не может служить доказательством того, что набухание оболочек не зависит от оплодотворения, так как у яиц сома, Г>0
как и у, других костистых рыб, неоплодотворенные яйца в воде активируются, и все начальные изменения их не отличимы от изменений, происходящих в оплодотворенных яйцах. Этот пример показывает, что яйца костистых рыб, у которых имеются студенистые оболочки, мало пригодны для исследования связи процесса набухания оболочек с действием на них оплодотворенного яйца.
Таблица 33
Потребление воды неоплодотворенными яйцами сома (набухание оболочек) после помещения их в воду (+17,4°)
Время лежания в воде» мин AV, мм* Время лежания в воде» ми н AV» мм3
0 0,0 24 8,2
2 0,7 27 9,2
5 0,3 30 10,5
7 4,4 35 11,7
10 5,0 40 12,2
12 5,8 80 15,6
14 4,9 130 19,4
18 6,4 190 19,5
21 8,3 240 19,2
В этом отношении значительно более удобны яйца осетровых рыб. Неоплодотворенные яйца осетровых рыб, помещенные в воду, ведут себя по-разному: одни из них активируются и приступают к партеногенетическому развитию (зачаточный партеногенез), другие остаются неактивированными и испытывают специфические изменения (Астауров, 1951; Детлаф и Гинзбург, 1950, 1951 а, б, 1954; Алявдина, 1952; Зарянова, 1954, 1956). В то время как активированные яйца изменяются сходно с оплодотворенными: оболочки становятся клейкими и набухают, образуется перивителлиновое пространство, неактивированные яйца долгое время по своему строению напоминают неоплодотворенные яйца. Оболочки у таких яиц не клеятся или клеятся слабо, набухают они очень медленно и лишь на вегетативном полюсе (рис. 39). Позднее на поверхности оболочек образуются складки — оболочки как бы гофрируются, трехслойное строение оболочек, типичное для оплодотворенных яиц, у таких яиц не проявляется (Детлаф и Гинзбург, 1954). Изучение потребления воды яйцами осетровых рыб во всех оболочках также показало, что оплодотворение яйца имеет существенное значение для процесса набухания студенистой оболочки. На рис. 40 изображены кривые поступления воды в оплодотворенные и неактивированные яйца белуги. Как было показано раньше, потребление воды у яиц осетро
151
вых рыб в первое время после оплодотворения связано главным образом с набуханием наружной студенистой оболочки, поэтому кривые, приводимые на рис. 40, передают характер
Рис. 39. Изменение оболочек неоплодотворенных, неактивирр-ванных (а) и оплодотворенных (б) яиц белуги в воде:
ая. л.— аиимальный полюс: м — область микропиле (Детлаф и Гинзбург, 1954)
набухания студенистой оболочки. У неактивированных яиц. белуги, хотя и происходит некоторое набухание оболочек, но оно идет значительно медленнее и не так, как у оплодотворенных
152
яиц. Следовательно типичное набухание студенистой оболочки у зародышей осетровых рыб происходит только в результате оплодотворения яиц (или активации, так как активированные яйца имеют такой же объем и строение студенистой оболочки, как и оплодотворенные яйца). По-видимому, как и в случае
затвердевания оболочек, оплодотворенное яйцо выделяет какие-то вещества, вызывающие процессы набухания студенистой оболочки. Что это за вещества и в каком отношении они стоят с полисахаридными гранулами, веществами, вызывающими образование перивителлинового пространства, и веще-ствами, вызывающими затвердевание оболочек, в настоящее время сказать трудно. Возможно, что это низкомолекулярные вещества, так как, согласно наблюдениям Т. А. Детлаф и А. С. Гинзбург (1954), они могут проходить через яйцевые оболочки: у неоплодотворенных яиц осетровых рыб, помещенных рядом с оплодотворенными яйцами, в месте контакта оболочек происходит увеличение толщины студенистой оболочки неоплодотворенных яиц.
И. А. Садов (1957, 1958) описал у неоплодотворенных яиц осетра, севрюги и стерляди на границе между внешней
15$
желточной и студенистой оболочками особые гранулы или капельки, которые после оплодотворения и помещения яиц в воду оводняются, и образующаяся жидкость пропитывает студенистую оболочку. По мнению автора, вещество этих ка^ пелек принимает участие в набухании студенистой оболочки и появлении клейкости. Если содержимое капелек, описанных Садовым, принимает участие в набухании студенистой оболочки яиц осетровых рыб, то можно предположить, что воздействие веществ, выделяемых яйцом после оплодотворения или активации на студенистую оболочку, связано с их действием на капельки. В этом случае процессы, приводящие к набуханию оболочек, можно, как это уже не раз практиковалось в данной книге, изобразить в виде схемы
активация ----
v выделение «веществ набухания» из яйца--г . — НгО
у V оводнение капелек---:
V
диффузия вещества
капелек в студенистую--: ——— Н2О
оболочку ф I
набухание студенистой оболочки
2. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СТУДЕНИСТЫХ ОБОЛОЧЕК
Для того, чтобы ясно понять, какие вещества, входящие в состав студенистой оболочки яиц рыб, ответственны за процесс набухания, следует хотя бы кратко остановиться на данных о химическом составе студенистых оболочек. К сожалению, химический состав оболочек яиц рыб и миног изучен недостаточно полно, поэтому мы будем вынуждены обращаться к данным, полученным при изучении яиц амфибий и морских ежей, хотя в некоторых случаях студенистые оболочки яиц, особенно ряда видов амфибий, трудно сравнивать со студенистой оболочкой яиц рыб, так как они имеют разное происхождение.
Т. С. Ямамото (Т. S. Yamamoto, 1956) изучал при помощи различных цитохимических реакций и действия ферментов химический состав оболочек неоплодотворенных яиц миноги Lampetra japonica. У неоплодотворенных яиц миноги имеются две желточные оболочки, студенистая масса на анимальном полюсе и клейкий слой. Автор показал, что студенистая масса, клейкий слой и желточные оболочки (хорион) полностью растворяются пепсином. Это показывает, что в состав оболочек входят протеины [таким же способом установлено наличие белков в оболочках яиц амфибий (Townes, 1953)]. На основа
154
нии описанного действия пепсина и трипсина на оболочки яиц миноги Т, С. Ямамото, так же как Таунес (Townes, 1953) для оболочек яиц амфибий, приходит к выводу, что в белках оболочек присутствуют пептидные связи, образованные тирозином или фенилаланином, и карбоксильные группы. Студенистая масса яиц миноги легко растворяется в кислотах и окрашивается витально нейтральротом, как и студенистая оболочка яиц морских ежей (Т. S. Yamamoto, 1956). Окрашивание студенистой .массы мукокармином и анилиновым синим показало, что она состоит из мукоидного вещества. Клейкий слой также содержит мукоиды, кроме того он дает метахромазию с сафранином. Наличие белков и мукополисахаридов в оболочках яиц миноги было, как видно из табл. 34, подтверждено также цитохимическими тестами на яйцах, фиксированных жидкостью Буэна (Т. S. Yamamoto, 1956).
Таблица 34
Цитохимическое обнаружение белков и полисахаридов в оболочках янц миноги Lampetra japonica
(Т. S. Yamamoto, 1956)
Реакция
На полисахариды Бауэра .....................
Лангаиса.....................
На белки
Миллона......................
Ксантопротеиновая ...........
Ромье........................
Биуретовая...................
Салцара .....................
Студенистая^ масса ‘
Желточные
Клей- оболочки КИЙ слой внут- внеш-ренняя няя
Цитохимическими методами обнаружено наличие полисахаридов и белков в клейком слое и желточных оболочках яиц сельди Clupea pallasii (Т. S. Yamamoto, 1957а).
155
У яиц осетровых рыб полисахариды найдены в студенистой и желточных оболочках (Детлаф, 19576). Оболочки яиц осетра дают положительную реакцию Хочкисса на полисахариды, которая сохраняется после обработки срезов гиалуронидазой и диастазой. Студенистая оболочка, как и желточная, не дает метахромазии с толуидиновым синим, следовательно, она содержит нейтральные мукополисахариды. Т. А. Детлаф (19576) приводит некоторые данные, показывающие, что полисахариды в оболочках яиц осетра прочно связаны с белками. Наличие белков в оболочках яиц осетровых рыб доказывается также тем, что, по наблюдениям Г. М. Игнатьевой, они растворяются под действием трипсина, (Детлаф, 19576).
Таким образом, студенистые оболочки рыб и миноги содержат полисахаридосодержащие вещества, по-видимому, типа мукопротеинов. Это вполне согласуется с более многочисленными данными, полученными при изучении химического состава студенистых оболочек яиц амфибий и иглокожих.
Довольно давно было установлено, что студенистая оболочка яиц амфибии состоит из муцина (см. обзоры Needhem, 1931; Сергеева, 1943). В последние годы появился ряд работ по химическому составу студенистых оболочек яиц разных видов амфибий (Folkes, Grant a. Jones, 1950; Minganti, 1954, 1955, 1958; Minganti a. D.’Anna, 1957). Было показано, что студенистая оболочка яиц амфибий содержит белки и мукополисахариды (Spiegel, 1951; Minganti, 1955, 1958). Так, в состав сухого вещества студенистой оболочки яиц жабы Bufo bufo входит 37,8% белков и 62,2% углеводов (Minganti, 1955); капсульная оболочка яиц тритона Triton cristatus содержит 52% белков и 40% углеводов (Minganti a. D.’Anna, 1957); студенистая оболочка яиц лягушки Runa temporaria содержит 42%’ углеводов, в состав которых входят 7,1 % d-фруктозы, 3,5% d-маннозы, 12,7% d-галактозы (возможно также d-глюкозы и ксилозы), 8,9% d-глюкозамин и 9,5% d-хондрозамин (Folkes, Grant a. Jones, 1950). Химический анализ студенистой оболочки яиц амфибий после гидролиза серной кислотой и разделения моносахаридов при помощи бумажной хроматографии показал, что в состав полисахаридов оболочек входят главным образом галактоза, манноза и фукоза. Это же характерно для студенистых оболочек яиц морских ежей (Minganti, 1955, 1958; Minganti a. Vasseur, 1959).
В полисахаридные молекулы студенистой оболочки яиц Ра-raoentrotus входят фукоза, глюкоза, манноза и ксилоза в молярном соотношении соответственно 35 : 5 : 4 : 1 (Minganti а. Vasseur, 1959). Мукополисахариды и белки обнаружены так-156
же в студенистых оболочках яиц моллюсков (Jura a. George, 1958).
Минганти и другими авторами показано, что в состав студенистых оболочек яиц амфибий и большинства других животных входят полисахариды, связанные с белками (Minganti, 1958). Исключением являются только яйца некоторых ан-нелид, оболочка которых содержит свободные полисахариды. Данные о химическом составе мукопротеинов студенистых оболочек яиц нескольких видов амфибий, полученные разными авторами, суммированы Минганти (1958) в табл. 35.
Таблица 35
Химический состав мукопротеинов оболочек яиц амфибии (Minganti, 1958)
в ид В % к сухому весу
глюкоза галактоза манноза фукоза ^ксилоза глюкозамин галактозамин общий азот
Rana temporaria . ? 12,7 3,5 7,1 ? 8,9 9,5 8,1
Rana esculenta . . + + 4- ? 9,33
Rana japonica . . 28 14 8,8
Rana clamitans . . ? ? ? + + *
Discoglossus pictus ** 1 ** 1,7 16,5* 10
Bufo bufo . . . . j _ sfc * * 10,4 20—40* 7,6
Bufo vulgaris for- 30 20 8,4
mosus
Аксолотль . . . . + + + + * 8,3
Triton cristatus . .. 12,2 1,3 6,2 20,3* 10
Примечание. + качественные определения * Глюкозамин -^галактозамин.
** Глюкоза 4- галактоза 4- манноза=8,7%.
* * * Галактоза + манноза = 11,4%.
Как уже отмечалось, по химическому составу студенистые оболочки яиц амфибий близки студенистым оболочкам яиц морских ежей. В состав студенистых оболочек яиц морских
157
ежей входит 20—25% белков и 75—80% полисахаридов и их эфиров с серной кислотой (Vasseur, 1948а, b; Nakano а. Ohashi, 1954; Runnstrom, 1955; Minganti a. Vasseur, 1959). Как и у яиц амфибий, в состав студенистой оболочки яиц морских ежей входят галактоза, фукоза и глюкоза, хотя их соотношение и количество у разных видов морских ежей различно. В отличие от оболочек яиц амфибий гексозамины в студенистых оболочках яиц морских ежей не обнаружен^ (Vasseur a. Immers, 1949), кроме яиц Paracentrotos lividus (Minganti a. Vasseur, 1959).
Вассер (см. Runnstrom, 1955; Runnstrom, Hagstrom a. Perlman, 1959) предложил следующую схему химического строения полисахаридов, входящих в состав студенистой оболочки яиц морских ежей.
Такашима, Мори и Кавано (Takashima, Mori a. Kawano, 1955) считают, что в состав студенистой оболочки яйц морских ежей входят полисахариды, содержащие гиалуроновую и хондроитинсерную кислоты.
3. МЕХАНИЗМ НАБУХАНИЯ
Учитывая данные, полученные для оболочек яиц амфибий и морских ежей, можно думать, что набухание оболочек яиц рыб связано с коллоидными свойствами веществ типа мукопротеинов и представляет собой процесс оводнения или сольватации мукопротеинов, входящих в состав оболочек. Действительно, кривые набухания студенистых оболочек (стр. 12, 158
153) напоминают кривые набухания желатины или других веществ подобного типа.
В табл. 36 приведены данные о влиянии концентрации-NaCl в растворе на толщину оболочек яиц осетра. В то время, как желточные оболочки почти не изменяются в растворах NaCl, студенистая оболочка уменьшается в объеме на 38—59% в зависимости от концентрации NaCl в среде. Так как набухание студенистой оболочки является обратимым процессом, то ясно, что оно связано с коллоидным захватом воды из окружающей среды, а не с химическим ее связыванием.
Механизм набухания студенистой оболочки не может быть осмотическим, так как никаких полупроницаемых пленок на поверхности студенистых оболочек нет.
Следует все же с некоторой осторожностью обобщать эти наблюдения на всех рыбах, так как возможно, что механизм набухания оболочек яиц разных видов рыб различен. Например, как показал Кано (Kanoh, 1951b ), у яиц камбалы Limanda schrenki степень набухания оболочек увеличивается с увеличением концентрации солей в среде, в то время как у яиц сельди Clupea pallasii С. et V. уменьшается. Впрочем эти различия, возможно, связаны со сложностью действия солей на набухания белков (см. Паули и Валько, 1936).
Таблица 36
Влияние концентрации раствора NaCl на отдачу воды оболочками яиц осетра
м Толщина оболочек через 3 часа, мм Объем воды, вышедшей из студенистой оболочки
всех двух желточных студенистой мм3 %
Вода 0,352 0,094 0,258 0,00 0,0
0,02 0,272 0,105 0,167 4,14 38,4
0,04 0,251 0,107 0,144 5,12 47,5
0,06 0,222 0,096 0,126 5,88 54,6
0,08 0,219 0,092 0,127 5,84 54,2
0,10 0,221 0,098 0,123 6,00 55,7
0,12 0,214 >0,098 0,116 6,25 58,0
0,14 0,207 0,114 0,093 7,22 67,1
0,16 0,211 0,096 0,115 6,33 58,8
0,18 0.210 0,098 0,112 6,45 59,9
0,20 0,227 0,107 0,120 6,13 56,9
15»'
В заключение покажем место явлений набухания студенистых оболочек в схеме изменений яиц после оплодотворения или активации
лизофосфатиды
сперматозоид
------ Са-
фосфолипиды
стимуляция
—
волна оплодотворения
разрушение кортикальных альвеол
выделение фермента
затвердевания
Са- -----
выделение пероксидазы
выделение мукополисахаридов в перивителлиновое прост-
ранство
выделение веществ
набухания
----- НаО
инициация процесса затвердевания в оболочке
внедрение пероксидазы в оболочку
оводнение
'' капелек и отделение проникновение оболочек их в студенис-
тую оболочку
---Н2О —
увеличение прочности оболочки
образование набуханйе
перивителлинового студенистой пространства оболочки
В этой схеме, как и в предыдущих, многое еще требует выяснения. Неясно, например, выделяются ли вещества набухания в составе содержимого кортикальных альвеол или независимо от них, участвуют ли пероксидаза или ионы кальция в процессах набухания, неясен механизм набухания «капелек», неизвестно, что собой представляют «вещества набухания» и т. д.
Глава V
СОДЕРЖАНИЕ ВОДЫ В ЯЙЦАХ РЫБ И ЭКОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
Содержание воды в оплодотворенных яйцах рыб зависит прежде всего от содержания воды в неоплодотворенных яйцах и, как мы видели, от количества воды, поступившей в яйца в результате образования перивителлинового пространства и набухания оболочек, т. е. от конечных размеров перивителлинового пространства и студенистой оболочки. Чем же определяется содержание воды в неоплодотворенных яйцах?
С. Г. Крыжановский (1948, 1949) на основании изучения особенностей размножения и места кладки икры рыб выделяет несколько основных экологических типов рыб: литофильные— икра откладывается на каменистых, травильных или песчаных грунтах на быстром течении; ф и то-фи льны е—икра откладывается на растительный субстрат; п с амоф ильные — икра откладывается на подмытых корнях растений на участках дна с песчаным грунтом; остра-кофильные — икра откладывается в жаберную полость двустворчатых моллюсков; пелагофильные— икра развивается у поверхности или в толще воды во взвешенном состоянии.
Кроме того, С. Г. Крыжановский (1948, 1949) выделяет для охраняющих икру видов рыб такие группы, как строящие гнезда, вынашивающие, живородящие, а также предложил более крупные подразделения для экологической классификации яиц рыб.
Было показано, что зародыши рыб, относящихся к разным экологическим группам, отличаются по многим морфологическим признакам и физиологическим особенностям развития, а также строением оболочек, размерами яиц, объемом перивителлинового пространства (Крыжановский, 1948, 1949, 1956; Крыжановский, Смирнов и Соин, 1951) и по содержанию
И А, И. Зотин 161
воды в зрелых неоплодотворенных яйцах (Крыжановский, 1949, 1956, 1960; Крыж аиовский, Дислер и Смирнова, 1953; Виноградская, 1954). Следовательно, содержание воды в яйцах рыб определяется, по данным этих авторов, в основном экологическими условиями развития зародышей.
Существует большое число исследований, в которых приводятся материалы о содержании воды в овоцитах и зрелых неоплодотворенных яйцах 'рыб (см. Needham, 1931, 1942; Виноградов, 1944, 1953; Клейменов, 1952, и др.). Различия в содержании воды у овоцитов разных видов рыб довольно значительны и колеблются от 50—60 у яиц осетровых рыб до 90—98%, у яиц некоторых видов тресковых, барабулек, камбал и др. (см. табл. 37). Уже первые авторы, занимавшиеся этими вопросами, понимали, что .различия в содержании воды в овоцитах и неоплодотворенных яйцах рыб определяются особенностями экологии развития зародышей и в основном тем, являются ли яйца донными или пелагическими (Milroy, 1898; Fulton, 1898а, b; Jacobsen a. Johansen, 1908). Особенно большую работу для доказательства этого положения проделал Милрой (1898), который исследовал содержание воды в овоцитах большой группы разных видов рыб и нашел, что содержание воды у пелагических яиц значительно выше по сравнению с донными (табл. 37). Впоследствии эти наблюдения были подтверждены многими другими авторами (Крыжановский, 1949, 1956, 1960; Виноградская, 1954; Крыжановский, Дислер и Смирнова, 1953; Сорокин, 1957; Шульман, 1958). Согласно наблюдениям С. С. Виноградской (1954), пелагические яйца барабульки содержат 94,69% воды, в то время как донные яйца черноморской ате-рины содержат 72,67 воды, бычка кругляка —62,45, саргана— 75,19% (табл. 37). Для того, чтобы яснее показать связь, существующую между ‘содержанием воды в неоплодотворенных яйцах рыб и экологией развития, в табл. 37 наблюдения разных авторов сопоставлены с принадлежностью рыб к той или иной экологической группе. В эту таблицу не включены данные, которые противоречат более правильным измерениям (сравните, например, наблюдения разных авторов, проведенные на морских пелагических яйцах тресковых рыб). Дело в том, что для исследования морских пелагических яиц нельзя брать незрелые овоциты, так как содержание в них воды резко отличается от зрелых овоцитов.
Существует значительное различие в содержании воды у неоплодотворенных морских пелагических и донных яиц (табл. 37). Содержание у пелагических яиц достигает 85—97 (в среднем 91,8%), в то время как у донных яиц оно равно 60—75 (в среднем 70,0%). Большее содержание воды 162
Таблица 37
Содержание воды в % к сырому весу в зрелых овоцитах рыб разных экологических групп
Вид Содержание воды, % Автор
1 2 3
Осетровые
Acipenser stellatus 49,94 Киселевич, 1927
» » 52,0 Осипов, 1931
» » 51,76 Лазаревский, 1931
» » 48,48—55,17 Друккер, 1932
» » 51,25 Миндер, 1934
» » 53,84 из Виноградова, 1944,1953
» » 51,3 Клейменов, 1952
A. guldenstadti 56,52 Киселевич, 1927
» » 55,0 Осипов, 1931
» » 55,79 Лазаревский, 1931
» » 54,27—56,32 Друккер, 1932
» » 56,5 Клейменов, 1952
A. nudiventris 54,13—57,44 Друккер, 1932
Американский осетр 56,97 Клярк и Клоф, 1927
A. acipenser 56,97 из Виноградова, 1944, 1953
» » 62,33 из Виноградова, 1944,1953
» » 52,20 из Виноградова, 1944,1953
Huso huso 57,0 Осипов, 1931
» » ’ . . . . 50,81 Друккер, 1932
» * * 58,9 Клейменов, 1952
Костные ганоиды
Lepidosteus platystomus 1 56,2 Миноги* Nelsort й. 'Greene, 1921
Lampetra planeri . . . | 57,0 Hardisty, 1957
Костистые рыбы
Живородящие
Heterandria formosa . . 34,6—35,0 Scrimshaw, 1944
Lebistes reticulatus . . . 50,6—53,1 Rosenthal, 1953
Пресноводные литофильные (строящие гнезда)
Salmo trutta 57,59 Лазаревский, 1931
» » 64,7 Клейменов, 1952
» » 65,83 Сканави-Григорьева, 1939
» » 67,7 Сканави-Григорьева, 1944
S. trutta caspius . . . . 74,5 Клейменов, 1952
S. trutta 58,5 из Виноградова, 1944,1953
И*
103:
Таблица 37 (продолжение)
Вид Содержание воды, % Автор
1 2 3
S. fario » » S. trutta S. salar S. gairdneri S. irideus Salmo sp » » Oncorhynchus keta 0. keta (охотская) Oncorhynchus tschawytscha .... » » .... » » .... 0. nerka » » 0. gorbusha 53,4 67,4 60,9 67,3 72,2 66,18 63,0 56,7 51,0 55,0 57,68 57,68 66,0 61,1 59,0 80,6—82,6 Gray, 1926 Kronfeld u.Scheminsky,1926 Milroy, 1898 Hayes, 1930 Manery, a. Irving, 1935 из Smith, 1957 из Виноградова, 1944,1953 Milroy, 1898 Клейменов, 1952 Клейменов, 1952 Клярк и Клоф, 1927 из Виноградова, 1944,1953 Prescott, 1955 Кизеветтер, 1948 Клейменов, 1952 Клейменов, 1952
Пресноводные литофильные (разбрасывающие икру)
Salvelinus fontinalis 63,85
» » 72,3
» 72,6
» » 67,17
Stenodus leucichthys 69,6—79,1
Hucho taimen 67,0—71,0
Coregonus albula 56,7-64,0
» autumnalis 63,0
» eperlanus 66,0
» lavaretus .... ... 62,3—76,4
» migratorius 60,06
» muksun 60,1
» nasus 62,0
» peled 63,0
peled 61,6-74,1
tugun 54,2—70,0
Lota lota • 81,0
Vimba vimba • .... 65,6
Barbus brachycephalus caspius 72,93
из Needham, 1931 Manery a.Irving, 1935
из Виноградова, 1944,1953 из Виноградова, 1944,1953 Клейменов, 1952
Клейменов, 1952 Клейменов, 1952
Клейменов, 1952
из Виноградова, 1944, 1953
Клейменов, 1952 Подлесный, 1947 Клейменов, 1952 Клейменов, 1952
Клейменов, 1952 Клейменов, 1952
Клейменов, 1952 Клейменов, 1952
Клейменов, 1952 Лазаревский, 1931
164
Таблица 37 (продолжение)
Вид Содержание воды, % Автор
1 2 3
Barbus brachycephalus 73,5 из Сканави-Григорьевой,
1944'
» . . . . Ъ . 75,3 Клейменов, 1952
Barbus 70,2 Клейменов, 1952
Leuciscus ides 67,0 Клейменов, 1952
L. idus (обский) 61,8—64,7 Клейменов, 1952
Osmerus eperlanus «, 62,0 Клейменов, 1952
Пресноводные фитофильные
Cyprinus carpio 73,96 Киселевич, 1927
» 67,75 Лазаревский, 1931
» » ’ 70,0 Осипов, 1931
» » ’ 65,0 Вещезеров, 1934
» 75,52 Nowak, 1935
» 63,2-5 Касинова, 1936
» » ’ 66,15' Needham,' 1931
» » 64,08 из Виноградова, 1944, 1953
» » * 66,3 из Виноградова, 1944, 1953
» » (волго-каспийский) 70,0 Клейменов, 1952
» » (азово-черноморский) 67,7 Клейменов, 1952
Abramis brama 64,9 Вещезеров, 1934
» » . 67,26 Касинова, 1936
» » (азово-черноморский) 64,9 Клейменов, 1952
» » (волго-каспийский) 68,0 Клейменов, 1952
Rutilus rutilus caspicus 72,17' Попов, 1882
» » » 71,15 Киселевич, 1927
R. rutilus caspicus 67,0 Осипов, 1931
» » » 64,0-67,0 Клейменов, 1952
Silurus glanis 61,0 - Вещезеров, 1934
» » (азово-черноморский) 61,0 Клейменов, 1952
» » (дальневосточный) 66,2—78,7 Клейменов, 1952
Esox lucius 69,20 Киселевич, ред. 1927
» » 67,0 Осипов, 1931
» » 68,5 из Виноградова, 1944, 1953
» » 63,53 из Needham, 1931
» » (волго-каспийская) . . 67,0 Клейменов, 1952
» » (обская) 64,1 Клейменов, 1952
Lucioperca lucioperca 71,0 Осипов, 1931
» » 69,07 Шульман, 1934 Касинова, 1936
» » .... . . 67,34
» » (волго-каспийский) 70,9 Клейменов, 1952
» » (азово-черноморский) 70,1 Клейменов, 1952
Perea fluviatilis 56,28 из Виноградова, 1944, 1953
165
Таблица 37 (окончание)
Вид Содержание воды, % Автор
1 2 3
Пресноводны Alosa sapidissima A. commun Caspialosa caspia » kessleri » volgensis Pelecus cultratus Erythroculter erythropterus .... Морские n e пелагически 71,15 71,10 ' 71,23 69,18 73,4 64,5 78,2—80,0 елагические е из Виноградова, 1944, 1953 из Виноградова, 1944, 1953 Клярк и Клоф, 1927 Виноградская, 1954 Клейменов, 1952 Клейменов, 1952 Клейменов, 1952
Cadus morhua 91,14 Milroy, 1898
» » 94,67 из Виноградова, 1944,1853
» » 66,03 из Виноградова, 1944, 1953
» » 72,0 Клейменов, 1952
» » 92,0 Сорокин, 1957
» aeglefinus • . . 95,86 Milroy, 1898
» merlangus 96,41 Milroy, 1898
Molva vulgaris 85,07 Milroy, 1898
Pleuronectes platessa 91,66 Milroy, 1898
» platessa 93,1 Dakin a. Dakin, 1925
» flesus 87,20 Milroy, 1898
Rhombus laevis 90,0 Milroy, 1898
Mullus barbatus ponticus 94,69 Виноградская, 1954
Scorpaena porcus 97,69 Виноградская, 1954
Engraulis encrasicholus maeoticus . 90,18 Шульман, 1958
Lophius piscatorius 68,70 Milroy, 1898
Морские донные (в основном фиг оф ильные)
Clupea harengus , 70,04 Milroy, 1898
» » 69,22 из Needham, 1931
» » 65,0 из Виноградова, 1944, 1953
» » 60,0 из Виноградова, 1944, 1953
» » 71,71 из Виноградова, 1944,1953
» » 72,0-78,1 Клейменов, 1952
» » 76,88 Клерк и Клоф, 1927
C. sapidissima 71,2 из Needham, 1931
Clupea pilchardus 70,3 из Виноградова, 1944, 1953
Atherina hepsetus 72,67 Виноградская, 1954
Neogobius melanostomus 62,45 Виноградская, 1954
Belone belone eruxini 75,19 Виноградская, 1954
Anarhichas lupus 71,30 Milroy, 1898
Cyclopterus lumpus 70,46 Milroy, 1898
166
у пелагических морских яиц по сравнению с донными является приспособлением к плаванию яиц в морской воде (Крыжановский, 1949, 1956, 1960), так как сильное оводнение желтка пелагических икринок резко снижает плотность яиц и их плотность становится меньше плотности морской воды. Плотность донных яиц рыб достигает 1,056—1,081 г) см3 (Milroy, 1898; Гакичко, 1932; Зотин, 1953а, 1955а; Prescott, 1955), тогда как плотность морских пелагических яиц имеет порядок 1,007—1,025 г!см3 (Milroy, 1898; Потеряев, 1936; Зайцев, 1954, 1955, 1956). Благодаря низкой плотности, морские пелагические яйца плавают в верхних слоях моря, а в опресненных районах моря они распределяются по глубине в толще воды в соответствии с их плотностью (Зайцев, 1954).
Яйца морского черта (Lophius piscatorius), пелагический образ жизни которых достигается тем, что они включены в студнеобразную массу (Fulton, 1891), имеют сравнительно низкое содержание воды (табл. 37). Однако общая плотность яиц вместе со студенистой массой очень мала и равна 1,005 г/см3 (Milroy, 1898).
Интересно, что у пелагических пресноводных яиц, например, у чехони, верхогляда и азовочерноморской сельди, содержание воды в неоплодотворенных яйцах значительно меньше, чем у морских пелагических яиц, и близко к содержанию воды у донных яиц (табл. 37). Это связано с тем, что у пресноводных пелагических яиц уменьшение плотности достигается образованием большого перивителлинового пространства или разбуханием студенистой оболочки (Крыжановский, 1949, 1956, 1960). Так, учитывая, что яйца чехони захватывают из окружающей среды на образование перивителлиновой жидкости 64—ПО мм3 воды при объеме желтка 1,14—1,72 мм3 и содержании воды в нем 64,5 %, легко подсчитать, что после образования перивителлинового пространства содержание воды в яйцах достигнет 99%. Яйца азово-черноморской сельди потребляют из окружающей среды после оплодотворения 9,0—15,2 мм3 воды при объеме желтка 0,62—0,76 мм3 и содержании воды в нем 69,18%. Отсюда содержание воды в оплодотворенных яйцах должно быть 97—98%. Таким образом, у пресноводных пелагических яиц, в отличие от морских, сильное оводнение яиц происходит уже после оплодотворения. В связи с этим следует рассмотреть вопрос: на каких стадиях овогенеза происходит оводнение овоцитов у морских пелагических яиц.
Впервые этот вопрос исследован еще Фултоном (Fulton, 1891, 1898а, Ь) и Милрой (Milroy, 1898), которые показали, что сильное оводнение пелагических морских яиц рыб про-
167
исходит на поздних стадиях овогенеза при созревании овоцитов. Овоциты рыб.с пелагической икрой при созревании увеличиваются в объеме в три-четыре раза от стадии овоцита перед растворением ядра до зрелого неоплодотворенного яйца (Fulton, 1898а). До созревания яйца камбалы (Pleuro-nectes platessa) имеют объем 0,9275 мм? и удельный вес 1,070, после созревания яйца имеют объем 2,479 жж3 и удельный вес 1,025. У яиц пикши (Gadus aeglefinus) при созревании увеличение объема овоцитов происходит с 0,5236 до 1,5962 жж3, у яиц трески (Gadus morhua) -—с 0,3817 до 1,3706 жж3, у яиц палтуса (Rhombus maximus)—с 0,1795 до 0,5556 жж3 и у яиц Hippoglossus vulgaris — с 8,18 до 28,732 жж3 (Fulton, 1898а) и т. д. В среднем из 24 видов морских пелагических яиц, изученных Фултоном (1898b), при созревании объем овоцитов увеличивается с 0,636 до 2,294 жж3, т. е. в 3,6 раза. У донных яиц рыб такого сильного увеличения объема овоцитов при созревании не происходит (Fulton, 1898а).
Милрой (Milroy, 1898) получил сходные данные, измеряя плотность и содержание воды в пелагических яйцах рыб до созревания и после созревания. Из табл. 38 видно,
Таблица 38
Изменение плотности пелагических морских яиц рыб и содержания воды в них при созревании (Milroy, 1898)
Вид Плотность яиц Содержание воды в яйце, %
незрелых зрелых незрелые зрелые
Gadus aeglefinus 1,080 1,020 55,00 95,86
» merlangus 1,068 1,024 70,71 96,41
» morhua 1,055 — 73,00 91,14
Pleuronectes platessa 1,084 1,024—1,025 57,50 91,66
что увеличение содержания воды в морских пелагических яйцах рыб и уменьшение их плотности происходит после созревания. Оводнение овоцитов при созревании происходит одновременно с появлением в полости яичника жидкости низкой плотности (порядка 1,0115—1,0116 а/сж3), которая секретируется гранулярным слоем фолликул и захватывается путем эндосмоса овоцитами (Fulton, 1898а, Ь).
Подробные исследования изменения содержания воды во время овогенеза морских рыб с пелагической икрой в последние годы проведены С. С. Виноградской (1954), В. П. Сорокиным (1957) и Г. Е. Шульманом (1958). В табл. 39 при-168
ведены данные С. С. Виноградской (1954) об изменении содержания воды в овоцитах двух видов черноморских рыб, имеющих пелагическую икру, и трех видов рыб, откладывающих донную икру.
Таблица 39
Содержание воды в овоцитах рыб на разных стадиях овогенеза (Виноградская, 1954)
С донной икрой
Atherina hepsetus
Neogobius melano-stomus.............
Bel one belone euxin'
71,32
71,06
62,74
75,19
72,67
62,45
76,83
Как видно из данных табл. 39, овоциты рыб, имеющих пелагическую икру, на всех стадиях овогенеза содержат больше воды, чем овоциты рыб, имеющих донную икру. Эти отличия еще больше усиливаются при созревании овоцитов. (переход с IV стадии на V), когда происходит быстрое оводнение овоцитов морского ерша и барабульки, в то время как у рыб с донной икрой, таких как атеринка и бычок-кругляк,, содержание воды в овоцитах на этих стадиях не меняется. Уменьшение плотности овоцитов во время созревания найдено у яиц минтая (Kanoh, 1954), а увеличение содержания воды — у яиц трески (Сорокин, 1957) и азовской хамсы (Шульман, 1958). Наоборот, многочисленные исследования овогенеза различных рыб, имеющих донную икру, показали, что объем овоцитов, достигнувших IV стадии зрелости, почти не меняется и близок объему зрелых неоплодотворенных яиц (Гербильский, 1939; Подлесный, 1947; Казанский, 1949; Алявдина, 1956, и др.).
Таким образом, сильное оводнение пелагических икринок происходит в конце овогенеза в фазу созревания овоцитов и сопровождается сильным увеличением объема овоцитов. Механизм такого резкого оводнения не ясен, хотя понимание его очень важно для многих вопросов экологии и физиологии развития морских пелагических зародышей.
169'
У пресноводных пелагических яиц, как уже отмечалось, в яйце (желтке) содержится значительно меньше воды, чем у пелагических морских икринок. Однако и у них содержание воды в желтке заметно больше, чем у донных пресноводных яиц. В табл. 40 приведены суммарные данные о содержании воды в неоплодотворенных яйцах и овоцитах рыб разных экологических групп рыб. Кроме уже указанной разницы
Таблица 40
Сравнение суммарных данных (из табл. 37) содержания воды в зрелых овоцитах костистых рыб разных экологических групп, осетровых рыб, костных ганоидов и миног
Содержание воды, %
Рыбы среднее колебания
Костистые (пресноводные) Литофильные гнездующие 63,7 51—82
Литофильные разбрасывающие 67,1 54—81
Фитофильные 67,4 56—78
Пелагофильные .... 72,3 64—80
Костистые (морские) Донные 70,0 60—75
Пелагофильные 92,2 85—97
Костистые (живородящие) (Lebistes reticulatus) 50,6—53,1
Осетровые 54,5 48-59
Костные ганоиДы (Lepidosteus platystomus) 56,2 —
Миноги (Lampetra planeri) 57,0 —
в содержании воды между пресноводными пелагическими и донными яйцами, существуют заметные различия в содержании воды между донными морскими яйцами и донными пресноводными яйцами рыб. Установить различия в содержании воды у зрелых овоцитов пресноводных донных яиц рыб разных экологических групп почти не удается. Пожалуй, небольшая разница в содержании воды существует между яйцами пресноводных литофильных рыб, строящих гнезда, и литофильных рыб, разбрасывающих икру (табл. 40). Но •может быть эти различия зависят только от особенностей физиологии яиц лососевых рыб (группа литофильных рыб,
-170
строящих гнезда, данные о содержании воды в овоцитах которых приведены в табл. 37 и 40, представлена только лососевыми рыбами).
Значительные отличия в содержании воды в зрелых овоцитах существуют между всеми костистыми рыбами (кроме живородящих) —с одной стороны, и осетровыми рыбами, костными ганоидами и миногами — с другой. • Эти отличия не зависят от экологии развития зародышей. Так, например, осетровые рыбы относятся к группе пресноводных литофильных рыб, однако яйца осетровых рыб содержат воды заметно меньше, чем яйца литофильных пресноводных костистых рыб. Подробнее причины указанных различий в содержании воды в овоцитах рыб будут обсуждены позднее, при рассмотрении особенностей водного обмена зародышей костистых рыб, осетровых рыб, миног и живородящих костистых рыб. Можно лишь кратко сказать, что в отличие от осетровых рыб, костных ганоидов и миног зародыши костистых рыб не потребляют воду из окружающей среды во время развития, поэтому они вынуждены запасать ее заранее в желтке и затем использовать по мере надобности. Живородящие же костистые рыбы получают воду, как и другие вещества, из организма матери, поэтому для них нет необходимости запасать воду .путем оводнения желтка.
Глава VI
ОСМОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЗАРОДЫШЕЙ РЫБ, ОБНОВЛЕНИЕ И ПОТРЕБЛЕНИЕ ИМИ ВОДЫ В ПЕРВОЕ ВРЕМЯ ПОСЛЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
Мы уже рассматривали вопрос о проницаемости яйцевых оболочек и ее изменении после оплодотворения или активации яиц рыб. Было показано, что оболочки яиц легко проницаемы для воды, кристаллоидов и других низко молекулярных веществ, а сама проблема проникновения веществ через оболочки сводится к проблеме диффузии или осмотического переноса. Значительно сложнее обстоит дело с проблемой проникновения воды в зародыш (собственно яйцо). Могут осуществляться три типа явлений: 1) проникновение или выход воды при помещении зародышей в осмотически необычные условия, когда выход или вход воды определяется осмотическими свойствами зародышей, 2) вхождение или выход воды при нормальных физиологических условиях путем одностороннего транспорта, когда эти процессы определяются физиологическими потребностями зародышей, 3) обновление воды при нормальных физиологических условиях, происходящее без изменения их количества в зародышах. Механизм проникновения воды в зародыши во всех трех случаях различен, хотя имеются, вероятно, и общие моменты. Мы начнем обсуждение вопросов, связанных с проникновением воды в зародыши в первое время после оплодотворения, с рассмотрения осмотических свойств оплодотворенных и неоплодотворенных яиц рыб.
1. ОСМОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОПЛОДОТВОРЕННЫХ И НЕОПЛОДОТВОРЕННЫХ ЯИЦ РЫБ
Аоки (Aoki, 1939) показал, что М/8 физиологический сбалансированный солевой раствор является изотоничным для неоплодотворенных яиц кеты, так как в М/4 солевом 172
растворе вес яиц уменьшается, а в М/12 солевом растворе — увеличивается (в последнем случае образовывается перивителлиновое пространство). Наблюдения Аоки, подтвержденные позднее Кано (Kanoh, 1951а, 1952с), показывают, что в гипертонических солевых растворах неоплодотворенные яйца кеты отдают воду. Из этих наблюдений нельзя сделать обратный вывод, что в гипотонической среде происходит проникновение воды в неоплодотворенные яйца кеты и их набухание, так как при разбавлении солевого раствора яйца активируются и последующие изменения характеризуют активированные, но не неоплодотворенные яйца. Наличие обратного явления—,набухания неоплодотворенных яиц в гипотонической среде — обнаружено на яйцах минтая Theragra chalco-gramma (Kanoh, 1954). В отличие от пресноводных яиц кеты, которые активируются в пресной воде и не активируются в солевой среде (при достаточной концентрации солей), морские яйца минтая активируются в морской воде и не активируются в пресной. Это свойство позволяет использовать яйца минтая для изучения влияния гипотонической среды на неоплодотворенные яйца. При помещении зрелых неоплодотворенных яиц минтая в разбавленную морскую воду (от ’А до '/м) плотность их уменьшается (Kanoh, 1954), так как при этом происходит эндосмос воды из среды (для неоплодотворенных яиц минтая изотоничным является М/4 раствор NaCl). Неоплодотворенные яйца Oryzias latipes сокращаются в размерах при помещении их в М/2 и М/4 растворы Рингера, 1 М раствор глюкозы и набухают в М/16 и М/32 растворе Рингера (Ito, 1960а). Изотоничным для неоплодотворенных яиц О. latipes является М/7, 5 раствор Рингера.
Крог (Krogh, 1938, 1939) нашел, что зрелые неоплодотворенные яйца Pleuronectes flesus и Crenilabrus exoletus сначала плавают в морской воде 25—34 % о, но через несколько минут они становятся тяжелее и тонут. Диаметр этих яиц сначала уменьшается, а затем возвращается к первоначальной величине. Авторы измеряли также концентрацию ионов хлора в яйцах, помещенных в морскую воду различной концентрации, и обнаружили, что в неоплодотворенные яйца камбалы и Crenilabrus проникает не только вода, но и соли. Таким образом, неоплодотворенные и неактивированные яйца некоторых костистых рыб в гипертонической среде отдают воду, а в гипотонической — набирают воду из окружающей среды.
Иначе обстоит дело с осмотическими свойствами оплодотворенных или активированных яиц костистых рыб. Вес оплодотворенных яиц Salmo fario, помещенных в растворы Рингера различной концентрации, не изменялся в течение 6 час., т. е. в этих средах не происходило проникновения воды или
173
ионов в яйца (Gray, 1920, 1932). Мертвые или поврежденные яйца отдавали воду в гипертонической среде. На яйцах форели было показано, что депрессия точки замерзания содержимого оплодотворенных яиц, помещенных в растворы различной концентрации (табл. 41), не изменяется в соответствии с
Таблица 41
Изменение депрессии точки замерзания (Д) содержимого оплодотворенных яиц форели при изменении концентрации
NaCl в среде (Светлов, 1928а)
Концентрация NaCl в среде, М Д растворов NaCl, °C Д яиц, °C Примечание
0,05 0,17 0,46
0,10 0,34 0,47
0,12 0,39 0,50 Зародыши живы
0,20 0,68 0,51
0,30 1,05 0,56
0,50 1,68 1,52 1
1,00 3,34 3,02 } Зародыши погибли
изменением А среды вплоть до концентрации NaCl в среде,, равной 0,3 М (Светлов, 1928а, 1929). При повышении концентрации NaCl выше 0,3 М зародыши погибают и одновременно' с этим резко возрастает А содержимого яйца (табл. 41). Некоторое увеличение депрессии точки замерзания у живых зародышей при повышении концентрации NaCl в среде объясняется тем, что хлористый натрий проникает через оболочки в перивителлиновое пространство (А определялось суммарно: зародыш+перивителлиновая жидкость).
У Fundulus heteroclitus диаметр яиц, вынутых из оболочек на стадии сформированного бластодиска, не изменяет :я при изменении концентрации морской воды, т. е. оплодотворенные яйца не проницаемы для воды и солей (Chambeis, Chambers а. Као, 1951).
Для яиц свирской форели, лосося и сига сходные данные получены мною (Зотин, 1955а). Оплодотворенные или активированные яйца помещали в 0,37 М (для лосося и форели) или 0,18 М (для яиц сига) растворы сахарозы. Выход воды из яиц измеряли при помощи метода падения яиц в трубке через 3, 6, 9, 15, 20, 30, 40, 60 и 90 мин после помещения в раствор. Как видно из рис. 41, живые яйца в оболочках отдают воду только в течение первых 20—30 мин после помещения их в растворы сахарозы, а затем отдача воды яйцами прекращается. Погибшие яйца отдают воду непрерывно и в
174
значительно больших количествах по сравнению с живыми яйцами (убитые или естественно погибшие яйца лососевых рыб захватывают воду из окружающей среды, что на рис. 41
Ряс. 41. Выход .воды из яиц лосося (А) в 0,37 М растворе сахарозы и яиц сига (Б) в 0,18 М растворе
1 _ живые яйца в оболочках; 2 — живые яйца, у которых через окошко в оболочке удалена небольшая часть цитоплазматического слоя; 3— живые яйца лосося, у которых через окошко в оболочке удален бласто-днск; 4 — яйца лосося, убитые высокой температурой, и сига встряхиванием
изображено отрицательными значениями объема вышедшей воды). Выход воды из живых яиц лосося и сига в первые 20—30 мин связан с выходом воды из перивителлинового пространства, которое у лосося и сига достигает довольно значительных размеров. У яиц лосося и сига, у которых в
175
оболочке было сделано окошко, выход воды в растворе сахарозы происходит значительно быстрее (первые 6—10 мин). Более прямым путем связь выхода воды из яиц в оболочке в растворах сахарозы с потерей воды из перивителлинового пространства была доказана на яйцах сига. У яиц сига на стадии дробления остроконечными пинцетами полностью удаляли яйцевые оболочки. Затем измеряли выход воды из «голых» яиц в 0,18 М растворе сахарозы. Каи видно на
Рис. 42. Выход воды из яиц сига в 0,18 И растворе сахарозы
1 —из яиц, имеющих оболочки; 2— из яиц, лишенных оболочек
рис. 42, яйца сига, лишенные оболочек, воды в 0,18'М растворе сахарозы не отдают, а яйца, имеющие оболочки, отдают только воду из перивителлинового пространства. Таким образом, оплодотворенные живые яйца, в отличие от погибших лососевых и сиговых рыб, не отдают воду в гипертонических растворах сахарозы.
Грей (1920, 1932), П. Г. Светлов (1928а, 1929), Р. Чемберс, Е. Чемберс и Чень-Юань Као (1951) и Чень-Юань Као (1956) считают, что особенности поведения яиц костистых рыб в гипертонической среде зависят от непроницаемости цитоплазматического слоя, окружающего желток. В частности, Чень-Юань Као (1956) предполагает, что у яиц Fundulus в цитоплазматическом слое («плазменная мембрана») имеются поры, которые при образовании перивителлиновой жидкости уменьшаются в диаметре благодаря уменьшению объема собственно яйца. Однако в моей работе (Зотин, 1955а) было показано, что особенности поведения яиц лососевых рыб в гипертонической среде не зависят от присутствия цитоплазматического слоя. Опыты проводили следующим образом. Через окошко в яйцевой оболочке остроконечными пин-
Ив
цетами удаляли часть поверхностного цитоплазматического слоя или целиком 'бластодиск. Немедленно после этого изучали отдачу воды яйцами в растворах сахарозы. Как видно на рис. 41, отдача воды такими яйцами ничем не отличается от отдачи воды яйцами с ненарушенным цитоплазматическим слоем. Изменение в характере отдачи воды наступает только в том случае, если нарушение цитоплазматического слоя влечет за собой гибель яйца. Следовательно, найденная у яиц лососевых рыб, как вероятно и у других костистых рыб, особенность отдачи воды в гипертонической среде связана не с особыми свойствами поверхностного цитоплазматического слоя, а с особенностями всей живой массы яйца. Эти данные согласуются с представлениями Д. Н. Насонова и В, Я. Александрова (1940, 1943), Д. Н. Насонова (1959), А. С. Трошина (1956) о проникновении воды и других веществ в клетки, когда авторы говорят об ответственности всей массы клетки, а не специализированных поверхностных структур за проникновение веществ. Однако трудно согласиться с Д. Н. Насоновым и В. Я. Александровым (1940), когда они, хотя и очень осторожно, предлагают объяснять проникновение веществ коллоидным захватом, и с представлениями А. С. Трошина (1953, 1956) о коацерватном механизме проникновения веществ,. В этой связи следует рассмотреть материалы, полученные при изучении влияния растворов сахарозы и глюкозы, на отдачу воды яйцами осетровых рыб и амфибий (Зотин, 1955а, б). На рис. 43 приведены кривые выхода воды в 0,27 М растворе сахарозы из яиц белуги (стадия оплодотворенного, но еще недробящегося яйца), осетра (стадия поздней гаструлы), севрюги (стадия 16 бластомер) и аксолотля (стадия 2 бластомер) без капсульной оболочки. Во всех случаях общий характер выхода воды из яиц сходен: сначала, в течение 10—15 мин, яйца легко отдают воду, затем выход воды из яиц прекращается. На рис. 43 показана также кривая выхода воды в 0,27 М сахарозе из яиц севрюги, убитых высокой температурой на стадии дробления. Мертвые яйца севрюги, так же как и мертвые яйца лососевых рыб, сильно оводняютоя по сравнению с живыми, захватывая воду из окружающей среды (на рис. 43 вода, захваченная яйцами после их гибели, показана отрицательными значениями AV). Характер выхода воды из убитых яиц в гипертонической среде резко отличается от характера выхода воды из живых яиц: выход воды из убитых яиц продолжается и после прекращения отдачи воды живыми яйцами. Следовательно, прекращение отдачи воды живыми яйцами связано не с тем, что у них исчерпываются резервы воды в яйце, а с особенностями кинетики отдачи воды в гипертонической
12 А. И. Зотии
среде. У яиц осетровых рыб на стадиях, показанных на рис. 43, внутренняя желточная оболочка плотно прилежит к поверхности яиц, поэтому начальный выход воды из яиц нельзя объяснить, как у яиц лососевых рыб, выходом воды
Рис. 43. Выход воды из живых яиц белуги (/), осетра (2), севрюги (3), аксолотля (4) и убитых нагреванием яиц севрюги
(5) в 0,27 М растворе сахарозы
из перивителлинового пространства. Как и в случае лососевых рыб, более доказательными в этом отношении являются опыты с изучением выхода воды из яиц осетровых рыб и амфибий, лишенных всех оболочек. На рис. 44 показаны кривые выхода воды из яиц осетра (Acipenser giildenstadti col-chicus V. Marti), лишенного всех оболочек на стадии 23 и яиц жерлянки (Bombina bombina Linne), лишенных оболочек на стадии нейрулы. Несмотря на отсутствие всех оболочек яйца осетра и жерлянки теряют воду в 0,27 М растворе сахарозы ; первые 6—12 мин, а затем выход воды приостанавливается.!
Высушивание яиц осетра на стадии поздней бластулы; (при комнатной температуре) показывает, что яйцо весом 0,0136 г теряет около 0,0068 г воды, в то время как живые! яйца той же стадии развития и той же партии икры теряют] в 0,27 М растворе сахарозы только 0,0006 г воды, или 8,8%! всей воды яйца. Сходные опыты с яйцами аксолотля показывают, что на стадии 2 бластомер живые яйца отдают в.
178
0,27 М растворе сахарозы около 10% всей воды яйца. В сильно гипертонических растворах сахарозы яйца отдают гораздо больше воды, но при этом погибают. Таким образом, в 0,27М растворе сахарозы живые яйца осетровых рыб и аксолотля могут отдать (оставаясь живыми) только 8—10% всей воды, имеющейся в яйце.
Для яиц миноги (Lampetra planeri) были получены аналогичные данные, показывающие, что в растворе Рингела объем неоплодотворенных яиц уменьшается за 4 часа на 0,088 ami3, а в последующие 11 час не изменяется (Hardisty, 1957).
Все эти наблюдения не противоречат взглядам Д. Н. Насонова и В. Я. Александрова (1940, 1943) и А. С. Трошина (1953, 1956) на механизм выхода воды из клеток. Однако данные, полученные мною при изучении влияния концентрации глюкозы и сахарозы на выход воды из яиц осетра и аксолотля, не могут быть объяснены с точки зрения коллоидных или коацерватных представлений о связывании воды в яйцах (Зотин, 19556). Было показано, что количество воды, отдаваемое живыми яйцами аксолотля на стадии крупноклеточной бластулы, не зависит от концентрации глюкозы (в пределах от 0,25 1,00 М) и сахарозы (0,18—0,75 М). Убитые высокой
температурой яйца аксолотля отдают воду в растворах с разной концентрацией сахарозы иначе: чем больше концентрация сахарозы в растворе, тем больше воды теряют яйца за 60 мин пребывания в растворе (рис. 45). Сходные наблюдения были мною проведены в 1954 г. на яйцах севрюги (Зотин, 1955а).
Таким образом, выход воды из живых яиц осетровых рыб и амфибий в гипертонических растворах сахаров резко отличается от кинетики отдачи воды коллоидно-химичеакими системами и убитыми яйцами: у яиц осетровых рыб и амфибий имеется вода, которая легко отдается яйцами, и вода, которая связана в яйце более прочно, причём количество легко отдаваемой воды не зависит от силы осмотического давления окружающего раствора до тех пор, пока яйцо остается живым.
Рис. 44. Выход воды из зародышей осетра (1) и бомбины (2) на стадии гаструлы (яйца лишены всех оболочек) '
12*
179
По-существу, подобные же данные получены при работе с яйцами морских ежей (McCutcheon, Lucke a. Hartline, 1931; Lucke a. McCutcheon, 1932; Lucke, Larrabee a. Hartline, 1935; Lucke, 1940; Shapiro 1941, 1948, и др.). Хотя авторы считают, что отдача воды яйцами морских ежей в гипертонической
среде, или поглощение воды в гипотонической среде, про-
Рис. 45. Количество воды, выходящей из яиц аксолотля (стадия 2 бластомер) после 60 мин пребывания в различных по концентрации растворах сахарозы
/ — живые яйца; 2 — убитые яйца (5 мин действия кипящей воды)
исходит чисто осмотическим путем, им приходится для ликвидации расхождения между опытными данными и теоретическими положениями вводить в уравнения кинетики поступления воды поправку на осмотически недеятельные вещества. Следовательно, и у яиц морских ежей одна часть воды отдается достаточно легко, другая •— связана более прочно, что отражается в понятии «осмотически недеятельные вещества». Осмотически неактивный объем нео-
плодотворенных яиц морских ежей Arbacia punctulata равен 7 — 11% (Lucke, 1940; Shapiro, 1948), оплодотворенных— 27,4%> (Sha-
piro, 1948), полихе-ты Chaetopterus pergamentaceus, моллюсков Cumingia tellinoi-des и Ostrea virginica — 30—50% (Lucke, 1940), морских ежей Paracentrotus lividus — 46% (Ephrussi a. Neukomm, 1927), Strongylocentrotus franciscanus — 28,4% (Leitch, 1934), S. pur-puratus — 24,5% (Leitch, 1934), Urchis caup — 48% (Leitch, 1934). Интересно, что в большинстве случаев количество сухого вещества в яйцах морских ежей не совпадает с осмотически недеятельным объемом (Leitch, 1934).
Как мы видим, у яиц осетровых рыб и аксолотля объем
«осмотически недеятельных веществ» или уровень воды, бо-
лее прочно связанной в яйце, достигает 90—92%, а у лососевых и других костистых рыб весь зародыш представляет
180.
собой «осмотически недеятельную систему»: у них отсутствует вода, легко отдаваемая яйцом. Недавно показано, что у зрелых овоцитов и оплодотворенных яиц Bufo marinus и Hyla labialis количество осмотически недеятельных веществ достигает 60—80 и даже 90% объема яиц (de Luque a. Hunter, 1959; Hunter a. de Luque, 1959). Из данных, приводимых этими авторами, видно, что овоциты и оплодотворенные яйца, лишенные студенистой оболочки, при помещении их в разные концентрации NaCl на 1—4 часа сохраняют почти одинаковый объем, т. е. отдача воды яйцами не зависит от концентрации NaCl в среде.
Неоплодотворенные яйца костистых рыб не представляют собой «осмотически недеятельную систему»: они отдают воду в гипертонической среде и потребляют в гипотонической. Вопрос о наличии двух категорий воды у неоплодотворенных яиц костистых рыб не ясен. Вероятно, подобно морским ежам (Shapiro, 1948), у яиц костистых рыб после оплодотворения происходит увеличение уровня более прочно связанной воды и полная потеря категории воды, легко отдаваемой яйцом.
В какой же момент после оплодотворения происходит изменение осмотических свойств яиц костистых рыб? Как показали наблюдения на яйцах Fundulus heteroclitus, «непроницаемость плазменной мембраны» появляется в процессе оплодотворения ими активации яиц, но не раньше времени полного образования перивителлинового пространства (Chambers, Chambers а. Као, 1951). Так, если яйца Fundulus, у которых перивителлиновое пространство только что достигло максимального объема, поместить в 1,9 М раствор сахарозы, то перивителлиновое пространство исчезает и яйцо заполняет оболочки. Напомню, что у яиц Fundulus объем яиц в оболочках в этих условиях остается неизменным, поэтому исчезновение перивителлиновой жидкости может быть связано только с поглощением жидкости собственно яйцом. Это свидетельствует о том, что поверхность яйца проницаема в это время для воды. Так как объем собственно яйца уменьшается при образовании перивителлинового пространства, то это показывает также, что яйцо может как воспринимать, так и отдавать воду в первое время после оплодотворения.
Для изучения времени изменения осмотических свойств зародышей лососевых рыб и сига после оплодотворения и для установления того момента, когда оплодотворенные яйца полностью теряют способность отдавать воду в гипертонической среде, были поставлены специальные опыты. Измерялось количество воды, легко отдаваемое яйцами, и уровень воды, более прочно связанной в яйце, через разное время после
181
оплодотворения методом падения в трубке с 0,37 и 0,18 М сахарозой. Как можно видеть на рис. 62, происходит постепенное уменьшение количества воды, которую яйцо отдает за 60 мин в растворе сахарозы, пока оно не достигнет кон-ртантной величины через 5—8 суток после оплодотворения. Таким образом, изменения осмотических свойств у яиц лососевых рыб и сига происходит (при 4°) в первые 5—8 суток после оплодотворения.
Интересные данные получены при изучении осмотических свойств яиц морских ежей (Ishikawa, 1954). Оказалось, что характерное изменение осмотических свойств яиц морских ежей после оплодотворения, установленное ранее (Hobson, 1932а), зависит от разрушения и выделения кортикальных гранул из поверхностного слоя яйца (Ishikawa, 1954). Соответствующих данных для яиц рыб пока не получено.
1 2. ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВОДЫ В ЗАРОДЫШАХ РЫБ
В ПЕРВОЕ ВРЕМЯ ПОСЛЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
ИЛИ АКТИВАЦИИ
Мы показали выше, что неоплодотворенные яйца рыб отдают воду в гипертонической среде и воспринимают ее в гипотонической, причем это свойство пропадает не сразу после оплодотворения или активации, а спустя некоторое время. Это значит, что у морских яиц костистых рыб после оплодотворения должен происходить выход воды из яиц и уменьшение содержания воды, а у пресноводных — поступление воды в яйца и увеличение содержания воды до тех пор, пока оплодотворенные яйца не теряют своих осмотических свойств, и способность к обмену воды с окружающей средой. Действительно, как отмечалось, у многих донных яиц морских костистых рыб происходит уменьшение объема собственно яйца в первое время после оплодотворения: у яиц Fundulus heteroclitus на 40% (Kagan, 1935; Као a. Chambers, 1954), у яиц беломорской сельди на 12—35% (Каринский, 1938), у яиц балтийской салаки на 5—8% (Тоом, 1958). Уменьшение объема яиц у беломорской сельди зависит от солености морской воды, в которой они оплодотворены: при солености ЗО,9%о объем яиц сокращается на 12, при солености 41,5%0— на 22, при солености 43,8%0 — на 35% (Каринский, 1938).
Существует мнение, что не только донные морские яйца уменьшаются в объеме после оплодотворения, но и пелагические морские яйца. Оно основано на наблюдениях разных авторов, показавших, что в разных районах моря, имеющих разную соленость, пелагические яйца одного вида рыб име-)от разные размеры и тем меньше, чем больше соленость 182
(ом. Водяницкий, 1930; Расс, 1947, 1953; Зайцев, 1952, 1954, 1955), и на опытах Ю. П. Зайцева (1956), который нашел, что при оплодотворении яиц камбалы-глоссы (Pleuronectes flesus luscus Pall) в воде с разной соленостью удельный вес яиц тем больше, чем больше соленость воды. Т.С. Расс (1947, 1953) и Зайцев (1956, 1959) считают, что различие в размерах яиц одного вида рыб в разных районах моря свидетельствует скорее о появлении новых подвидов, чем о влиянии солености на размеры яиц. Следует отметить, что взгляды Зайцева на вопрос о влиянии солей на размеры пелагических морских яиц довольно противоречивы. С одной стороны, он показал, что пелагические яйца рыб непроницаемы для различных веществ (Зайцев, 1956), с другой стороны,— он нашел, что удельный вес яиц камбалы-глоссы, оплодотворенной в морской воде различной солености, Тем больше, чем больше соленость воды.
Чтобы проверить влияние изменения разбавления морской воды на пелагические яйца морских рыб, я поставил несколько опытов на яйцах барабульки (Mullus barbatus L.).
Работа проводилась на Карадагской биологической станции Академии наук УССР в 1958 г. Неоплодотворенные яйца барабульки были получены от текучих самок и искусственно осеменялись в лаборатории или в море сразу после вылова рыбРазвитие яиц проходило в лаборатории при 20— 25° в кристаллизаторах с морской водой. Для опытов яйца барабульки после оплодотворения в морской воде помещали в морскую воду различного разбавления и в пресную воду. Измерение плотности яиц проводилось по скорости падения яиц в трубке с пресной водой на расстоянии 5 см. Плотность яиц рассчитывалась по формуле
. . 0,000403-</1’37-и1>37
которая является частным случаем формулы (2), пригодной для изучения скорости падения яиц в воде. Плотность яиц барабульки была измерена на четырех стадиях развития: стадии 4 бластомер, 64 бластомео оанней и поздней бластулы.
Как видно из данных табл. 42, несмотря на то, что яйца лежали в среде с различной концентрацией солей, плотность их была практически одинакова. Резкое уменьшение плотности яиц в разбавленной на 2/3 морской и в пресной воде, показанное в табл. 42, происходит после гибели яиц, которая сопровождается быстрым оводнением яиц в гипотонической среде. Количество воды, захватываемое яйцами барабульки при гибели в пресной воде, достигает 0,0106 л.и3/яйцо. Инте-
1 Большую помощь при получении икры барабульки и работе с ней оказала мне Л. С. Овен, за что мне хочется высказать здесь свою благодарность.
’ 183
Таблица 42
Влияние разбавления морской (черноморской) воды на плотность зародышей барабульки
Время после оплодотворения, мин Стадия развития Пресная вода Морская вода
разбавленная иа 2/з разбавленная на Vs неразбавленная
40 1,008 1,008 1,009 1,008
150 4 бластомера 1,010 1,009 1,010 1,010
310 32—64 бластомера 1,010 1,010 1,011 1,011
530 Ранняя бластула 1,009 1,010 1,010 1,010
770 Бластула 1,0016 (погибшие) 1,0047 (погибшие) 1,010 1,009
ресно, что в неразбавленной морской воды погибшие яйца, наоборот, теряют воду и тонут.
Данные, приводимые в табл. 42, показывают, что живые яйца барабульки не разбухают в гипотонической среде. Проверка изменения плотности яиц барабульки сразу же после оплодотворения (рис. 55) показала, что увеличения плотности яиц в это время не происходит. Следовательно, у пелагических яиц морских рыб, в отличие от донных, в первое время после оплодотворения не происходит уменьшения объема яиц и выхода воды из яиц. Этому положению противоречат наблюдения Ю. П. Зайцева (1956), проведенных на яйцах камбалы-глоссы, однако они не кажутся мне слишком убедительными. Дело в том, что, работая с яйцами барабульки, я испробовал метод определения плотности яиц, применяемый Ю. П. Зайцевым и многими другими авторами, который сводится к помещению яиц в морскую воду различной плотности и нахождению такого разбавления морской воды, в которых яйца не тонут и не всплывают. Оказалось, что при этом методе довольно трудно получить точные результаты, так как он очень чувствителен к колебаниям температуры в лаборатории и сильно зависит от способа внесения яиц в раствор морской воды (в обоих случаях создаются токи и завихрения жидкости, затрудняющие возможность определения, тонут ли яйца, всплывают или остаются на месте).
Такие же противоречивые данные получены разными авторами для пресноводных яиц костистых рыб. Так, описано уменьшение объема собственно яйца после оплодотворения у серебряного карася на V3 (Tchou-Su a. Chen-Chao Hsi, 1936), а у яиц пресноводной рыбки Oryzias latipes — на 7% (Т. Yamamoto, 1940). С другой стороны, на яйцах окуня (Строганов, 1938) показано, что в первое время после оплодотво-184
рения происходит увеличение объема желтка, а следовательно, и увеличение содержания воды в нем. Н. С. Строганов
Рис. 46. Увеличение объема яиц окуня после оплодотворения. ! — во всех оболочках; 2 — собственно яйца (Строганов, 1938)
и нашел, что объем яиц постепенно увеличивается, достигая' максимума через 2—3 часа (рис. 46). Согласно этим наблюдениям, объем яиц окуня увеличивается на 0,35—0,40 -ия3 или на 67—76% объема яиц.
185
Хотя необходимы дополнительные исследования, все же, исходя из данных об осмотических особенностях и проницаемости яиц, можно предполагать, что у пресноводных яиц костистых рыб после оплодотворения происходит кратковременное поступление воды в собственно яйцо и увеличение содержания воды в них, у донных морских яиц — отдача воды и уменьшение содержания воды, у пелагических морских яиц — ни то, ни другое. В этом случае следует допустить, что у морских пелагических яиц рыб установление полной непроницаемости яиц для воды и других веществ наступает значительно раньше, чем у данных яиц, по-видимому, на поздних стадиях созревания овоцитов. Наличие такого приспособления у пелагических морских яиц биологически оправдано тем, что в противном случае в гипертонических условиях морской среды они теряли бы воду и способность плавать (ввиду увеличения плотности).
У осетровых рыб и миног поступление воды в яйца происходит не только после оплодотворения, но и продолжается на последующих стадиях развития (Зотин, 1953а, 1955а; Hardisty, 1957). Соответствующие данные будут рассмотрены три обсуждении вопросов, связанных с потреблением воды зародышами осетровых рыб и миног во время развития.
3. ОБНОВЛЕНИЕ ВОДЫ У ЗАРОДЫШЕЙ РЫБ
Для изучения обновления воды в клетках, т. е. для изучения замены атомов воды клеток на атомы воды окружающей среды, пригоден лишь один метод: метод меченых молекул воды стабильными или радиоактивными изотопами водорода и кислорода Впервые этот метод для изучения проникновения воды, меченной стабильным изотопом водорода — дейтерием, в яйца лососевых рыб применили Крог и Юссинг (Krogh a. Ussing, 1937; Krogh, 1939). Они помещали неоплодотворенные яйца радужной форели в воду, содержащую 2,98% D2O, и измеряли уменьшение концентрации тяжелой воды в среде. Оказалось, что меченые молекулы воды проникают в неоплодотворенные яйца форели, обмениваясь с молекулами воды яйца. Обновление воды у неоплодотворенных яиц продолжается в течение первых 6 час после помещения яиц в D2O, а затем прекращается. Принимая, что содержание воды в яйцах форели равно 65—70% и применяя формулу (7), можно рассчитать из данных Крога и Юссинга (1937)
1 Показано, что проникновение Н2О и D2O в неоплодотворенные яйца морских ежей происходит с одинаковой скоростью, при небольших концентрациях D2O (Lucke a. Harvey, 1934), поэтому данные, получаемые при помощи меченой воды, не являются артефактами.
186
количество воды, которое обновляется у неоплодотворенных яиц форели. В течение 6 час после помещения неоплодотворенных яиц в воду обновляется около 53—56% всей воды, имеющейся в яйце, а затем обновление воды прекращается. Остановка обновления воды связана, по-видимому, с тем, что неоплодотворенные яйца активируются в воде, а как показали в той же работе Крог и Юссинг (1937) в оплодотворенные (а следовательно, и активированные) яйца форели меченая вода не проникает. Следовательно, только неоплодотворенные яйца лососевых рыб способны к обновлению воды.
Данные, полученные Крогом и Юссингом (1937) о проникновении D2O в яйца радужной форели, не могут характеризовать скорость и объем процесса обновления воды у неоплодотворенных яиц, так как опыты сопровождались активацией яиц. Поэтому Куза (Kusa, 1951) разработал специальный метод изучения скорости проникновения D2O в неоплодотворенные яйца радужной форели (Salmo irideus). Он помещал неоплодотворенные яйца в изотоничный раствор Рингера1, содержащий 1,82% тяжелой воды. В солевой среде яйца не активировались и можно было исследовать обновление воды у неактивированных яиц форели. Изменение концентрации D2O в среде измерялось пикнометрическим
Таблица 43
Уменьшение концентрации D2O:1—в воде (Krogh a. Llssing, 1937) и 2— в изотоничном растворе Рингера (Kusa, 1951) при помещении в них неоплодотворенных яиц радужной форели
Время, час Концентрация D2O в среде, %
(1) (2)
0 2,670 1,57
1,05 2,004 —
3,0 — 1,30
3,2 1,949 —
5,0 — 0,92
6,3 1,832 —
10,0 — 0,92
14,6 1,815 —
Примечание. 12,48 г яиц (1), и 10 г яиц (2) в 10 еж3 раствора.
1 Состав изотоничного раствора Рингера для янц лососевых рыб см. в сноске на стр. 45.
187
методам. Им показано, что обновление воды у не активированных яиц форели при 10° прекращается через 5 час после помещения яиц в изотоничный раствор Рингера, содержащего D2O (табл. 43).
Расчет из данных Kusa (1951) по формуле (7) показы
вает, что у неактивированных яиц радужной форели за 5 час происходит обновление воды, составляющей 70% объ-
Рис. 47. Проницаемость оболочек и поверхности яиц чавычи для D2O
А — активированное яйцо в воде; Б — активированное яйцо в 80%-иом растворе D2O (Prescott, 1955)
ема яиц, т. е. фактически обновляется вся вода, содержащаяся в неоплодотворенных яйцах (см. табл. 37).
Прескот (Prescott, 1955), изучавший скорость проникновения D2O в яйца чавычи (Oncorhynchus tscha-wytscha), применил более совершенный метод
определения концентрации D2O — метод картезианского поплавка. Для предотвращения активации неопло
дотворенных яиц автор, так же как и Куза (1951), помещал яйца в изотоничный раствор Рингера. Им показано, что у неоплодотворенных яиц чавычи, помещенных в изотоничный раствор Рингера с 15% D2O, происходит обмен Н2О яйца на D2O среды в течение 60 мин. У яиц, помещенных в водный раствор 15% D2O н» стадии дробления, проникновение D2O происходит только в перивителлиновое пространство, но не в само яйцо. У неоплодотворенных яиц, помещенных не в раствор Рингера, а в воду, обновление воды прекращается быстрее и происходит в меньшем объеме, чем у неактивированныах яиц. Непроницаемость поверхности активированных яиц чавычи для D2O показана и в опытах с концентрированным раствором D2O (Prescott, 1955). Он помещал активированные яйца (плотность 1,056) в 80%-ной D2O (плотность 1,080). Яйца не тонут в этом растворе. Так как облочка яиц легко проницаема для D2O, то в перивителлиновой жидкости создается такая же-концентрация D2O, как и в среде, и собственно яйцо всплывает внутри оболочек (рис. 47). Из яиц, помещенных в 80 % -ный раствор D2O на 24 часа, только мертвые яйца опустились на дно сосуда. Яйца чавычи, убитые нагреванием (33° в течение 1 мин), хорошо проницаемы для тяжелой воды.
188
В опытах, проведенных на яйцах Salmo gairdnerii и Salmo clarkii с применением Н23О, Н2О18, Na29Cl и NaJ131, показано что в активированных яйцах происходит обновление не только воды, но и солей (Kalman, 1959). Автор показал, что за 20— 40 мин при 10° обновляется 12,4—13,8% общего количества воды желтка активированных яиц и 9,5% NaCl. Если яйца убить нагреванием в течение 3 мин до 35°, то количество обновляющейся воды возрастает до 62%, a NaCl — до 68%.
Изучение скорости обновления воды у неактивированных, неоплодотворенных и оплодотворенных яиц свирского лосося и сига было проведено мною в 1952, 1957 и 1958 гг. на Свир-ском рыбоводном заводе. Проникновение воды в яйце сига и лосося изучали при помощи воды, меченной стабильным изотопом кислорода (Н2О18). Для изучения проникновения воды в яйце лосося применялась также вода, меченная дейтерием (D2O).
Яйца, полученные от самок, выдержанных в реке, осеменяли спермой от 2—3 самцов и инкубировали в кристаллизаторах при 4—5°. Перед опытом яйца обсушивали на фильтровальной бумаге (в случае неоплодотворенных яиц от полостной жидкости) и размещали по 30 штук в 2 см3 (яйца лосося) или по 100 штук в 3 см- (яйца сига) в чашки с меченой водой (1,4 и 1,5%-ные растворы Н2О18 или 4,5%-ный раствор D2O). Затем через известные интервалы времени яйца вынимали, а раствор запаивали в пробирку. О скорости проникновения меченой воды в зародыши можно было судить по изменению концентрации раствора меченой воды в каждой из чашечек. Определение концентрации D2O и Н2О18 было проведено в Москве в 1957, 1958 гг.
Проба раствора, запаянная в пробирку, разбивалась на 3—5 порций. Каждую порцию перед определением концентрации меченой воды подвергали трехкратной перегонке под вакуумом в приборе, описанном А. Кестон, Д. Риттенберг и Р. Шёнхаймер (Keston, Rittenberg a. Schoenheimer, 1937), для полной очистки воды от примесей солей и других веществ, которые могут попасть в пробу за время опыта. Концентрацию D2O и Н2О18 измеряли при помощи метода падающей капли. Для изучения капель стандартного размера применяли стеклянную микрокапельницу (рис. 48), отличающуюся от капельниц, описанных другими авторами (Fenger-Erikson, Krogh a. Ussing, 1936; Fetcher, 1944; Rosebury a. Van Heyningen, 1942; Hochberg a. La Mer, 1937; см. также Кооп, 1948; Киршенбаум, 1953; Шатенштейн и др., 1957). Принцип действия ее ясен из рис. 48, А: каплю набирают и выдавливают из вытянутого кончика благодаря поднятию или опусканию уровня ртути в капельнице при помощи поднятия или опускания резервуара ртути (при открытом кране капельницы). Измерение объема капель проводится при помощи шкалы, присоединенной к хвостовой части капельницы. При помощи микрокапельницы, показанной на рис. 48, А, можно получать капли разного размера. В работе применялись капли объемом в 16 мм2. Скорость падения капель измеряли в трубке диаметром 15 мм, наполненной о-толуидином, на расстоянии 25 см. Так как о-толуидин немного растворим в воде, то перед употреблением его в течение нескольких суток насыщали водой (прием, описанный для других органических веществ у Шатенштей-на, 1957). Трубку с о-толуидином помещали в U-образный стеклянный сосуд, наполненный дистиллированной водой (рис. 48). Между двойными стенками этого сосуда пропускали воду, термостатируемую при помощи
189
ультратермостата Вобсера, в охлаждающую систему которого был подключен второй ультратермостат. Вся система для большей термоизоляции от внешней среды была окружена двумя плексигласовыми чехлами. Эта установка для поддержания постоянства температуры отличается от установок, описанных другими авторами (Fenger-Erikson, Krogh a. Ussing, 1936; Fet-cher, 1944; Коон, 1948; Киршенбаум, 1953; Шатенштейн и др., 1957). Скорость падения капель измеряли в основном при 30° с точностью термоста-тирования 0,001°. Ошибка, связанная с определением концентрации D2O
Рис. 48. Установка для определения концентрации тяжелой воды методом’ «падающей капли»
(учитывая ошибки зависящие от очистки проб), равнялась 0,015% концентрации D2O в растворе. Метод падающей капли может применяться? не только для определения концентрации D2O, но и Н2О18, причем точность метода даже больше, чем при измерении концентрации D2O.
На рис. 49 показаны кривые уменьшения концентрации НгО18 в среде при помещении в раствор неоплодотворенных яиц сига и яиц через 29 час после оплодотворения. Неоплодотворенные яйца сига, как и других пресноводных костистых рыб, в воде активируются, поэтому кривая, относящаяся к неоплодотворенным яйцам, характеризует не только проникновение Н2О18 в неоплодотворенное яйцо, но и влияние на этот процесс активации. Все же на рис. 49 видно, что неоплодотворенные яйца резко отличаются по характеру проникновения НгО18 от оплодотворенных яиц. У оплодотворенных яиц обмен Н2О18 среды с Н2О яйца происходит в течение
190
первых 10 час, а затем устанавливается равновесие. Легко рассчитать из данных, приводимых на рис. 49, количество воды в оплодотворенных яйцах сига, которая обновляется за счет проникновения воды из среды по формуле (вывод см. Зотин, 1958а)
(7’
где v — объем воды яиц, способной к обновлению;
Vo — объем внешнего раствора в начале опыта;
с0 — концентрация D2O или Н2О18 во внешнем растворе в начале опыта;
ср— концентрация D2O или Н2О18 в растворе ко времени установления равновесия между концентрациями меченой воды в растворе и в яйце.
Рис. 49. Скорость разбавления 1,5%-ного раствора НгО18 при помещении в 2 см? 100 яиц сига
/ — неоплодотворенные яйца; 2 — яйца через 29 час после оплодотворения
Яйца сига по 100 штук помещали в 2 см3 раствора с начальной концентрацией 1,50%. У оплодотворенных яиц равновесие устанавливается при с = 1,204%. Следовательно, по формуле (7) у = 0,490 см3. Измерение объема оплодотворенных (0,01003 см3) и неоплодотворенных (0,00515 см3) яиц показало, что объем перивителлинового пространства у одного
191
оплодотворенного яйца равен 0,00488, а у 100 яиц 0,488 см . Таким образом, у яиц сига наблюдаемое в опытах разбавление раствора Н2О18 при помещении в него оплодотворенных яиц зависит от обмена меченой воды с водой перивителлинового пространства. Иначе обстоит дело с неоплодотворенными яйцами сига. Они не могут разбавлять раствора за счет обме-
на Н2О18 с водой перивителлинового пространства, так как его у них нет. Поэтому разбавление раствора тяжелокислородной воды при помещении в него неоплодотворенных яиц зависит от проникновения
Н2О18 в яйцо и выхода Н2О из яйца. Как видно на рис. 49, обновление воды у неоплодотворенных яиц сига к 10—12 час лежания их в растворе сильно замедляется и практически прекращается. Однако расчеты объема обновляющейся воды у неоплодотворенных яиц сига из данных рис. 49 показывают, что за это время вся вода, имеющаяся в яйце,
Рис. 50. Скорость разбавления 4,5%-ногоПОЛНОСТЬЮ обновляется,
раствора D2O (2 с.и3) при помещении 30 яиц^ТО ВИДНО ИЗ следующих лосося расчетов. Вычисляя объем
/—неоплодотворенные яйца в 0,12 М растворе обмбНИВаЮЩеЙСЯ ВОДЫ NaCl; 2 — яйца через 24 часа после оплодотво- (рис. 49) ПОЛуЧИМ V = рения =0,333—о’,387 с/и3, что со-
ставляет 64—73% от объема неоплодотворенного яйца. Эта цифра вполне сопоставима с данными о содержании воды в неоплодотворенных яйцах сиговых рыб — 60—66% (табл. 37).
Сходные данные были получены мною для яиц свирского лосося. Изучение процесса обновления воды в яйцах проводилось в 4,5 %-ном растворе D2O. При работе с неоплодотворенными яйцами был применен прием, разработанный Кузой: неоплодотворенные яйца после обсушивания на фильтровальной бумаге помещали в 0,12 н. раствор NaCl, содержащий 4,5% D2O. Скорость обмена D2O среды с Н2О яиц была изучена также у оплодотворенных яиц через 24 часа после оплодотворения. На рис. 50 приведены результаты опытов. Они немного отличаются от данных, полученных Крогом и Юссин-гом (1937) и Кузой (1951) на яйцах Salma irideus и Прескот-tqm (1955) на яйцах Oncorhynchus tschawytscha: проникно
192
вение D20 в неоплодотворенные яйца свирского лосося происходит медленнее, чем в яйца радужной форели, и значительно медленнее, чем в яйца чавычи. Возможно, что эти различия связаны с разными температурными условиями, при которых проводились опыты. Заметные отличия в характере проникновения D2O имеются и у активированных яиц. У оплодотворенных яиц свирского лосося, как видно на . рис. 50, даже
через 12 час. после помещения их в раствор D2O продолжается обмен воды яйца с D2O среды. К этому времени обменивается вся вода перивителлиновой жидкости, и дальнейшее уменьшение концентрации D2O в растворе свидетельствует о проникновении D2O в само яйцо. Яйца свирского лосося через 24 часа после оплодотворения еще способны к обновлению воды с окружающей средой. Для того, чтобы выяснить, через какое время после оплодотворения у яиц лососевых рыб прекращается обмен воды со средой, были поставлены специальные опыты. Яйца форели через разные сроки после оплодотворения помещали на 24 часа в 4,5%-ный раствор D2O в измеряли изменение концентрации меченой воды в растворе за это время. Неоплодотворенные яйца помещали на 24 часа в 0,1 н. раствор NaCl, меченный также на 4,5% дейтериевой тяжелой водой. Для большей наглядности изменение концентрации D2O в растворе было пересчитано на количество обновляющейся воды в собственно яйце в процентах от содержания воды в нем (принято, что содержание воды в яйце равно 65%, см. табл. 37). Как видно на рис. 54, в первые
13 А. И, Зотнн
193
сутки после оплодотворения происходит быстрое уменьшение-, количества воды, содержащейся в яйце, способной к обновлению. Но полное прекращение обмена воды яйца со средой,, судя по полученным данным, наступает только через 10 суток после оплодотворения (при 7°). Эти наблюдения отличаются от данных, полученных Прескоттом (1955) для чавычи (Onoorhynchus tschawytscha), который нашел, что поступление воды в яйца прекращается через 25 мин после оплодотворения. Требуются дополнительные исследования для решения вопроса, являются ли эти различия выражением видовых особенностей яиц форели и чавычи или дело в методических неточностях. Однако важно отметить, что всеми авторами, изучавшими проникновение меченой воды в яйца лососевых рыб, показано, что обновление воды происходит не только у неоплодотворенных яиц, но и в первое время после оплодотворения. Следовательно, в первое время после оплодотворения вода может проникать и выходить из яйца костистых рыб, что соответствует наблюдениям об осмотических свойствах яиц на этих стадиях развития яиц. Вместе с прекращением обмена воды со средой у яиц костистых рыб теряется и способность отдавать или воспринимать воду при помещении их в гипертоническую или гипотоническую среду.
Интересно, что у осетровых рыб, у которых способность-яиц реагировать отдачей воды при помещении их в гипертоническую среду сохраняется, в отличие от костистых рыб, на всех стадиях развития, сохраняется и способность к обновлению воды (Зотин, 1955 а, б, 1958а). Измерение скорости проникновения DsO в живые и убитые яйца осетра на стадии поздней гаструлы (стадия 17, по Детлаф и Гинзбург, 1954) было проведено тем же способом, что и на яйцах лососевых рыб. Перед опытом с яиц снималась капсульная оболочка (студенистая + внешняя желточная). Как видно на рис. 67,. после помещения живых яиц в 4,5%-ный раствор D2O происходит быстрое разбавление этого раствора, заканчивающееся через 50—60 мин при 15—16°. В отличие от лососевых рыб у зародыша осетровых рыб на стадии гаструляции практически отсутствует пеоивителлиновое пространство, поэтому разбавление раствора DgO яйцами осетра, показанное на рис. 67,. связано с проникновением D2O в зародыши и выхода из них НгО. Очевидно, что и у зародышей осетровых рыб степень-разбавления раствора D2O зависит от количества воды, содержащейся в яйцах и способной к обмену с окружающей средой. Применяя формулу (7), можно приблизительно рассчитать, какой процент воды в зародышах осетра обменивается с водой окружающей среды в первые 50—60 мин — к мо
194
менту установления равновесия между концентрацией D2O в среде и в зародышах. Согласно, данным рис; 67, это равновесие на стадии поздней гаструлы наступает при концентрации D2O в среде ср =2,90%. Отсюда объем обновляющейся воды е=1,10 см3, а так как в опыте участвовало по 100 яиц осетра, то для каждого зародыша у = 0,0110 см3. Вес одного яйца на этой стадии развития был равен 0,0194 г. Отсюда количество обменивающейся воды у каждого-зародыша составляет 56,6% от веса зародыша. Согласно данным многих авторов (см. табл. 37 и 40), в неоплодотворенных яйцах осетра содержится в среднем 54,5% воды. Определение содержания воды в зародышах донского осетра (без капсульной оболочки) от 12 самок на стадии 12 показало, что они содержат 56,0% воды. Таким образом, у зародышей осетра на стадии поздней гаструлы при 15—16° происходит полное обновление всей воды в течение 50—60 мин. То же самое можно сказать и о других стадиях развития осетра: стадии 8 бластомер и более поздней стадии, когда хвост зародыша достиг головы (Зотин, 1958а).
Как видно на рис. 67, проникновение D2O в яйца осетра, убитые нагреванием на стадии поздней гаструлы, идет быстрее и в большем количестве, чем в живые зародыши той же стадии развития. Увеличение количества воды, способной к обмену путем самодиффузии с окружающей средой, у мертвых зародышей связано с тем, что при гибели зародыши осетровых рыб сильно оводняются и содержат больше воды, чем живые зародыши этой же стадии развития. Так, в опытах, проведенных на других зародышах осетра, взятых на стадии средней гаструлы, было найдено (методом падения яиц в трубке), что убитые нагреванием 100 зародышей содержат на 0,36 си3 воды больше, чем 100 живых зародышей. Расчет из данных рис. 70 по формуле (7) показывает, что количество воды, способной к обмену со средой, у убитых зародышей осетра на стадии поздней гаструлы на 0,42 см3 больше, чем у живых зародышей. Учитывая, что наблюдения были сделаны на зародышах, полученных от разных самок, можно считать такое совпадение цифр вполне удовлетворительным. Интересным является тот факт, что скорость проникновения D2O в мертвые зародыши заметно больше, чем в живые зародыши: весь процесс заканчивается в течение 20—30 мин. Так как в этом случае обмен D2OziH2O может происходить только путем самодиффузии, то очевидно, что проникновение D2O в живые зародыши отличается от процесса диффузии в неживые физико-химические системы.
13*
195
4. МАТЕРИАЛЫ К ПОНИМАНИЮ МЕХАНИЗМА ОБНОВЛЕНИЯ ВОДЫ У ЗАРОДЫШЕЙ РЫБ
К сожалению, в настоящее время трудно даже схематически представить себе механизм обновления воды и механизм прекращения обновления воды у яиц костистых рыб в первые часы после оплодотворения, так как эти проблемы упираются в малоразработанные проблемы биохимии развития. Можно лишь предполагать, по какой линии следует искать решения некоторых вопросов механизма обновления воды и остановки этого процесса.
Принципиальным в этом отношении является вопрос: происходит ли проникновение воды в яйца путем простой диффузии или вовлечение воды в яйца связано с химическими процессами, протекающими в зародышах. На рис. 67 приведены данные о скорости проникновения D2O в живые зародыши осетра на стадии поздней гаструлы и в зародыши, убитые на той же стадии высокой температурой. Видно, что проникновение D2O в мертвые зародыши идет быстрее, чем в живые. Эти наблюдения показали, что проникновение D2O в живые зародыши отличается от диффузии меченой воды в погибшие яйца, и заставили предположить наличие каких-то химических механизмов проникновения воды в зародыши. Как известно (см., например, Ельцина, 1940), повышение температуры по-разному ускоряет химические процессы и диффузию веществ: в то время как химические реакции при повышении температуры на 10° ускоряются в 2—3 раза (коэффициент Qio = 2—3), диффузия ускоряется лишь в 1,1 —1,3 раза. Поэтому было изучено влияние температуры на скорость проникновения D2O в яйца осетра (Зотин, 1958а). Оказалось, что Qw для этого процесса равно 2,3—2,9. Хотя ьысокий температурный коэффициент не является достаточно точным критерием для отличия химических процессов от физических (Гарвей и Даниелли, 1939; Ельцина, 1940; Даниел-ли, 1955), все же эти наблюдения указывают на вероятность существования активного, химического механизма проникновения воды в зародыши осетровых рыб.
Еще более показательные данные были получены при изучении влияния ферментных ядов на скорость обновления воды у зародышей осетра. Яйца осетра на стадии поздней бластулы и гаструлы помещали в 4,5%-ный раствор DgO, к которому добавлены фторид натрия (в концентрации 1,5• 10 2 М), азид натрия (9-10"3 М), 2,4-динитрофенол (7 • 10-3 М) и CdCl2 (6 • ГО 3 М). Как видно из данных рис. 52, скорость проникновения D2O в зародыши резко снижается при помещении их в растворы 2,4-динитрофенола, NaF и
4Ь6
NaN3. Как известно (Болдуин, 1949), фторид натрия останавливает гликолиз, а 2,4-динитрофенол и азид натрия действуют на окислительное фосфорилирование. Можно поэтому
Рис. 52. Влияние NaNs(/), NaF(2), 2,4-динитрофенола (3) и CdCl2 (4) на скорость разбавления 4,5%-ного раствора D2O (2 см3) 100 яйцами осетра на стадии поздней бластулы (/, 2) и средней гаструлы (3, 4); контроль (5)—яйца осетра на стадии 8 бластомер
думать, что вовлечение воды и ее обновление в зародышах осетровых рыб связаны каким-то образом с гликолизом и окислительным фосфорилированием. Сходные данные были получены мною на зародышах лосося с применением тяжело
197
кислородной воды НгО18. Так как у лососевых рыб оплодотворенные яйца теряют способность обновления воды, то опыты ставились на неактивированных, неоплодотворенных яйцах
Рис. 53. Влияние NaF(/) и NaNg(2) на скорость разбавления 1,5%-,ного-раствора НгО18 при помещении в 2 см3 30 яиц форели:
А — оплодотворенные яйца через 24 часа после оплодотворения; Б — неоплодотворенные яйца в 0,12 н. растворе NaCl; 3— контроль
лосося, помещенных в 0,12 н. раствор NaCl, а данные, полученные на оплодотворенных яйцах, служили, частично, контролем. В качестве ферментных ядов применялись азид и фторид натрия в концентрации 10-3 М. Как видно на рис. 53, оба эти яда вызывают торможение скорости обновления ьоды у неактивированных яиц лосося, так же как у яиц осетра. У оплодотворенных яиц лосося (рис. 53) влияние азида и фторида натрия на проникновение Н2О18 в яйца значительно
198
слабее. Это объясняется тем, что у оплодотворенных яиц обмен Н2О18, в основном, осуществляется только с перивителлиновой жидкостью путем диффузии, на которую ферментные яды не оказывают влияния. Таким образом, обновление воды у яиц осетровых и лососевых рыб является процессом активным, связанным со сложными ферментативно регулируемыми биохимическими процессами.
Несколько слов о механизме прекращения обновления воды у зародышей лососевых рыб после оплодотворения. Понимание этого процесса имеет большое значение, так как прекращение обновления воды у яиц костистых рыб совпадает по времени с потерей яйцами их осмотических свойств и прекращением отдачи или потребления воды из окружающей среды. Как уже отмечалось, существует мнение (Светлов, 1928а, 1929; Gray, 1932; Prescott, 1955), что особенности осмотического поведения яиц лососевых рыб зависят от непроницаемости поверхностного цитоплазматического слоя яиц для воды и других веществ. Однако свойствами поверхностного слоя яиц нельзя объяснять все особенности водного обмена яиц лососевых рыб, так как они не отдают воду и при нарушении целостности этого слоя. Близкие к указанным авторам взгляды высказал на основании цитохимического изучения распределения липидов в яйцах форели после оплодотворения Кришна (Krishna, 1956), который показал, что у яиц форели через 33 часа после оплодотворения липиды, расположенные в желтке яиц, перемещаются к поверхности яиц. Кришна (1956) предполагает, что с внедрением липидов в поверхность яйца она становится непроницаемой для воды. В гипотезе Кришна поверхностному слою отводится главная роль в процессе проникновения воды и, следовательно, ей противоречат те же опыты с разрушением поверхностного слоя.
Мне кажется, что в настоящее время рано еще пытаться объяснять явления прекращения обновления воды у яиц лососевых рыб после оплодотворения. Но все же вероятней всего этот процесс зависит от отключения биохимических реакций, ответственных за вовлечение и обновление воды в яйцах. Следовательно, прежде чем выяснять причины «непроницаемости» оплодотворенных яиц костистых рыб для воды, необходимо расшифровать химический механизм обновления воды яиц с окружающей средой. 5 * * *
5. ТЕОРИИ ПРОНИКНОВЕНИЯ ВЕЩЕСТВ
Обсуждение проблем, связанных с теориями проникнове-
ния веществ в клетки (и в зародыши), не входило в план
настоящей работы. Все же следует хотя бы кратко остано-
199
виться на основных взглядах, существующих в этой области, и определить свое отношение к ним.
Даже беглое знакомство с литературой по проблеме проникновения веществ в клетки показывает, что к этой области относят довольно различные явления, такие как осмотические свойства клеток, проникновение, выход и обновление веществ в самых различных условиях. Поэтому полезно было бы разделить проблему на отдельные части и рассматривать их (по крайней мере на первом этапе) врозь. Прежде всего следует различать понятие транспорта вещества, когда проникновение или выход вещества происходит путем одностороннего потока и сопровождается изменением концентрации его в клетки, и понятие обновления вещества, когда процесс проникновения вещества происходит одновременно с выходом без изменения его концентрации в клетки. Транспорт вещества, так же как и обновление, может осуществляться по градиенту сил (от большего осмотического давления к меньшему, от большего химического потенциала к меньшему и т. д.), против градиента сил и в условиях равенства сил. Последние два случая удобно рассматривать вместе, так как оба они требуют термодинамического обоснования, что и сделано в последние годы (Rosenberg, 1948; Patlak, 1956; Scheer, 1958).
Односторонний транспорт по градиенту сил. Известно, что в нашей литературе последние 20—25 лет велась оживленная дискуссия по вопросу о механизме клеточной проницаемости (см. сб. «Проблемы проницаемости», 1939, «Гагрские беседы», 1949; Насонов и Александров, 1940; Лепешинская, 1946; Рубинштейн, 1947; Трошин, 1956; Насонов, 1959), которая частично продолжается и в настоящее время (Чайлахян, 1959; Трошин, 1960 а, б). Одни авторы считают, что проникновение веществ в клетки и распределение веществ между клеткой и средой определяются свойствами полупроницаемых оболочек клеток (мембранная теория). Вхождение или выход воды, в частности, объясняют действием осмотических сил, возникающих при помещении клеток в гипертоническую или гипотоническую среду, благодаря полупроницаемости оболочек (Рубинштейн, 1939, 1944, 1947, 1949; Лепешинская, 1946, Lucke, 1940; Brooks a. Brooks, 1941; Davson a. Donielly, 1943; Hober и др., 1946; Даниелли, 1955; Чайлахян, 1959; Dick, 1959). Другие (сорбционная теория) предполагают, что проникновение веществ в клетки связано' с сорбционными свойствами (абсорбция, адсорбция, химическое связывание) всей массы живого вещества клетки и не зависят от особых свойств ее поверхности (Насонов, 1938, 1939, 1949, 1959; Насонов и Айзенберг, 1937; Насонов и Александров, 1940, 1943, 1945; Браун и Иванов, 1938; Камнев, 1938;
200
Айзенберг, 1939; Трошин, 1953, 1956, 1958, 1960а, б; Курелла, 1960). Д. Н. Насонов и В. Я. Александров (1940, 1943) предположили, что протоплазма клеток обладает свойствами фазы по отношению к окружающей среде и переход веществ из среды в клетку происходит в соответствии с их растворимостью в этой фазе, а также зависят от адсорбции на мицеллах и связывания в результате химических реакций. А. С. Трошин (1953, 1956, 1958, 19606) вкладывает конкретный физико-химический смысл в понятие фазовости протоплазмы, считая, что протоплазма представляет собой коацерватную систему. Он формулирует сорбционную теорию в следующих положениях (Трошин, 1958, 19606): 1) протоплазма представляет собой комплексную коацерватную систему; 2) вся вода в ней связана, подобно тому, как она связана в коацерватах; 3) протоплазма по отношению к окружающей среде ведет себя как жидкая, несмешивающаяся с водой фаза; 4) многие вещества растворяются в воде протоплазмы хуже, чем в воде окружающей среды; 5) в протоплазме вещества могут быть в свободном, адсорбированном или химически связанном состоянии; 6) факторы сорбции (растворение, адсорбция, хемосорбция) находятся в зависимости от функционального состояния клетки и от обменных ферментативных реакций в цитоплазме.
Г. А. Курелла (1960) считает, что цитоплазма клеток представляет собой гетерогенную фазу сильно набухших комбинированных шолиэлектролитных гелей, а осмотические свойства клеток определяются свойствами полиэлектролитов.
Мембранная (осмотическая), так же как .и сорбционная, теории были созданы для объяснения многочисленных опытов по влиянию гипертонических и гипотонических условий среды на отдачу или захват воды клеткой, а впоследствии распространены и на другие виды транспорта веществ в клетку. Поэтому они в основном призваны объяснить осмотические свойства клеток, но не кинетику одностороннего транспорта или обновления воды. Однако даже в отношении этой ограниченной задачи нельзя сказать, что обе теории удовлетворительно объясняют данные, полученные на яйцах рыб.
Критика мембранной, осмотической теории проницаемости, с которой во многом нельзя не согласиться, дана в работах Д. Н. Насонова (1938, 1939, 1959), Д. Н. Насонова и В. Я. Александрова (1940, 1943, 1945), А. С. Трошина (1953, 1956, 19606). В основном она сводится к доказательству того, что в гипертонической (или гипотонической) среде клетки не ведут себя как идеальные осмометры, т. е. не подчиняются количественным закономерностям, установленным осмотической теорией. В частности, для зрелых овоцитов и оплодотво
201'.'
ренных яиц амфибий это показано недавно де Люком и Хантером (de Luque a. Hunter, 1959). Материалы, которые, получены мною на яйцах лососевых рыб, также не согласуются с мембранной теорией, утверждающей, что осмотические свой-ства клеток определяются свойствами их поверхности. Как •было показано выше, удаление части поверхностной цито7 плазмы у. яиц лососевых рыб не меняло их осмотических •свойств (рис. 41). Однако, как уже отмечалось, и сорбционная теория не может удовлетворительно объяснить данные по поведению яиц рыб в гипертонической среде. Следует сказать, что представления Д. Н. Насонова и В. Я. Александрова о механизме выхода воды из мышц в гипертонической среде довольно противоречивы. С одной стороны, они указывают на то, что при гибели или повреждении мышц происходит потеря фазовых свойств протоплазмы и выравнивание концентрации веществ, находящихся внутри и вне клетки (Насонов и Александров, 1940, 1943; Камнев, 1938; Браун и Иванов, 1938). С другой стороны, они утверждают, что выход воды из живых мышц в гипертонической среде является чисто коллоидным процессом, так как он происходит одинаково как у живых мышц, так и у убитых (Насонов, 1939, 1959; Насонов и Александров, 1940). Данные, полученные на яйцах осетровых и лососевых рыб (рис. 41 и 43), показывают, что при гибели зародышей происходит быстрое оводнение яиц. Характер кривых выхода воды из убитых яиц резко отличается от живых яиц, так как в результате гибели теряется свойство, характерное для живых яиц,— отдавать в гипертонической среде только часть воды, имеющейся в яйце. Наличие двух категорий воды: легко отдаваемой яйцом в гипертонической среде и более прочно связанной в яйце, необъяснимо ни с точки зрения коллоидной теории сорбции воды, ни с точки зрения коацерватной теории. Мне кажется, что основным недостатком сорбционных теорий является то, что авторы их преждевременно попытались создать физико-химическую модель механизма сорбционных свойств клеток и тем самым вступили на путь упрощений, который ничем не лучше упрощенных представлений сторонников осмотической мембранной теории. Теперь все больше становится очевидным правильность мнения Г. Г. Винберга (1936), который считал, что период гос-подства упрощенных физико-химических представлений о проникновении веществ в клетки должен смениться периодом конкретных исследований механизма проникновения отдельных веществ, прослеживания их дальнейшей судьбы в протоплазме и физиологического значения. А. И. Колотилова и В. А. Энгельгардт (1937) показали, в частности, что распределение сахара между эритроцитами и окружающей средой
202
определяется прежде всего скоростью превращения сахара в продукты гликолиза в клетках. Хотя высказывания Г. Г. Винберга (1936) относятся скорее к проблеме одностороннего транспорта против градиента сил, осмотическое поведение клеток так же нельзя в настоящее время объяснять без привлечения данных об участии биохимических реакций в этих процессах. Существуют, правда пока еще немногочисленные, работы, показывающие, что выход или вход воды в зародыши в гипертонической или гипотонической среде зависит от активности ферментных систем: температурный коэффициент набухания яиц морских ежей равен 2,7 (McCutcheon a. Lucke, 1926, 1932), в гипертонической среде потребление кислорода зародышами амфибий значительно возрастает (Duryee, 1932), в анаэробных условиях набухание яиц морских ежей замедляется (Kekwick a. Harvey, 1934), под действием азида и фторида нарушается нормальное поведение яиц Fundulus в гипертонической среде (Shanklin, 1954) и др.
Односторонний транспорт против градиента сил. Проблема проникновения веществ, согласно сорбционной теории, сводится к проблеме распределения веществ между клеткой и средой (Насонов, 1938, 1939; Насонов и Александров, 1940, 1943; Трошин, 1956, 1960 6; Курелла, 1960). Кинетика проникновения веществ, в частности воды, сводится при этом к кинетике коллоидного, коацерватного или полиэлектролитного связывания, ограниченного растворимостью вещества в протоплазме. В свою очередь осмотическая, мембранная теория сводит механизм проникновения веществ к диффузии, а кинетику проникновения воды связывают с величиной осмотического давления протоплазмы. В этой части обе теории, основанные на чисто физико-химическом понимании явления проникновения веществ в клетки, к настоящему времени в значительной степени устарели. Появляется все больше данных, показывающих, что проникновение любых веществ в клетку происходит не путем диффузии, с активным транспортом с участием биохимических и ферментных систем и затратой энергии (см. Колотилова и Энгельгардт, 1937; Rosenberg, 1948, 1954; Ussing, 1952, 1958 а, b; Rosenberg a. Wilbrandt, 1955 a, b; Robinson 1953, 1954; Da-nielly, 1954; Mitchell, 1954, 1957; Mitchell a. Moyle, 1958 a, b; Rothstein, 1958; Wilbrandt, 1959). Принимается, что закон диффузии Фика не во всех случаях применим к проникновению веществ в клетки, так как живые клетки тратят часть энергии, образующейся в процессе метаболизма, на регуляцию скорости и направления перемещения веществ (Rosenberg, 1954). Особенно это относится к тем случаям, когда транспорт вещества идет против градиента сил пли в условиях равенства сил.
203
В понятие активного транспорта разные авторы вкладывают несколько различный смысл. Одни авторы (Rosenberg, 1948, 1954; Spanner, 1954; Scheer, 1958) определяют активный, транспорт как движение веществ в направлении от равновесия или против градиента активности. Другие (Hober, 1946; Danielly, 1954; Robinson, 1954)—как проведение осмотической работы или перемещения вещества за счет энергии клеточного метаболизма. Юссинг (Ussing, 1958а) называет активным транспортом такой перенос вещества в клетку, который осуществляется не под действием физических сил (диффузии, давления, электрических сил и т. д.). Определение Юссинга кажется более удачным, так как оно охватывает как случаи транспорта против градиента активности, так и по градиенту.
Механизм активного транспорта изображен Розенбергом (1954) в виде схемы проникновения вещества As в клетку
(для наглядности я включил схему Розенберга в символическое изображение контуров клетки). Цепь реакций метаболизма состоит в превращении компонента Gu через известное число реакций в Gn. Боковые реакции метаболизма связаны с главной цепью сопряженными реакциями, механизм которых следует определять в каждом конкретном случае отдельно (изображен на схеме зубчатыми колесами). Транспорт As->-A6, согласно этой схеме, оказывается связанным с реакциями Gi-*Gn (например, с метаболизмом глюкозы). Реакция А3->А4 является поставщиком энергии для переноса А5-^А6> который может происходить без химического превращения А5 = А6 или с превращением As¥=A6. Конкретный механизм транспорта вещества As в клетку для схемы Розенберга не имеет значения: это может быть осмотический захват, коллоидное связывание.
204
термоосмотический транспорт (Spanner, 1954), механизм типа «движущийся челнок», «вращающийся молекулярный носитель», «расширяющаяся решетка» (Danielly, 1954), гидратация актиноподобных белков (см. Поглазов, 1961) и др. Однако общим условием для всех конкретных механизмов, описывающих активный транспорт по схеме Розенберга, является необходимость учета снабжения транспорта А&-*А6 энергией, высвобождающейся при сопряженном химическом процессе типа Gi->Gn
Большинство авторов стремится свести проблему активного транспорта к активному переносу веществ через клеточную оболочку или поверхность. Однако вопрос о роли поверхности клетки в явлениях проникновения веществ еще недостаточно ясен. Хотя многими авторами показано, что ферменты, участвующие в транспорте (особенно это относится к транспорту глюкозы), локализованы на поверхности клеток (Браун, 1955; Розенберг и Вильбрандт, 1955 а, б; Ротштейн, 1958), это еще не означает того, что химические реакции, ведущие к переходу вещества через поверхность клетки, принципиально отличаются от реакций, сопровождающих дальнейший транспорт этого вещества в толще протоплазмы клетки. Вопрос этот следует решать экспериментальным путем, так как теоретически возможно и то и другое.
Остается пока не ясным и вопрос о месте активного транспорта в реальной жизни клеток. Довольно широко распространено мнение, что перенос веществ путем активного транспорта характерен только для специализированных клеток и клеточных структур. Особенно активно такое мнение отстаивают те авторы, которые в прошлые годы разрабатывали различные схемы проникновения веществ в клетки, основанные на физико-химическом понимании процесса вхождения веществ. Так, один из.сторонников мембранной теории проникновения веществ Даниелли (Danielly, 1954) считает, что проникновение веществ в клетки может осуществляться тремя путями: диффузией, облегченной диффузией и активным транспортом. По его мнению, активный транспорт характерен только для таких специализированных клеток, как клетки кишечного эпителия, печени и мышц, а также для таких клеточных структур, как вакуоли и митохондрии. Однако появляется все больше работ, указывающих на широкое распространение процессов проникновения веществ в клетки, идущих по типу активного транспорта. Ближайшее будущее покажет, можно ли считать, что все вещества (включая случаи проникновения по градиенту сил) поступают в клетки только путем активного транспорта. Очевидно, что в этом случае сам термин активный транспорт потеряет смысл.
205
В последние годы предпринята попытка описать транспорт химических групп через клеточную оболочку в обычных химических терминах, не прибегая к гипотезам молекулярных носителей или комплексов, легко диффундирующих через оболочку (Mitchell, 1957; Mitchell a. Moyle, 1958а, b). По представлениям авторов, транспорт химических групп осуществляется при помощи такого же механизма, как и перенос групп в обычных биохимических реакциях. В качестве примера они рассматривают механизм переноса фосфатной группы с АТФ" на субстрат (S) при участии фосфокиназы (Э). Предполагается (Mitchell a. Moyle, 1958а, Ь), что перенос фосфатной группы осуществляется или на поверхности энзима по схеме
АДФ Ф S
или в самой молекуле энзима
Если молекулы фермента (в данном случае фосфокиназы) ориентированы в оболочке так, что некоторый компонент (АТФ) реагирует с активным центром фермента на одной стороне, а другой компонент (S) — с противоположной, то можно себе представить транспорт химической группы (Ф) сквозь мембрану путем энзимо-катализируемой реакции. В этом случае транспорт через мембрану является интегрированным энзимо-химическим процессом. Механизм такого переноса, по мнению Митчелла и Моула (1958а), можно предполагать для многих химических групп (включая водород и транспорт электрона). Это принципиально новый подход к явлениям проникновения веществ в клетки, отличный как от физико-химических теорий проникновения веществ, так и от большинства теорий активного транспорта, основанных на признании только косвенного участия биохимических реакций в процессе транспорта веществ. Важность и принципиальность нового подхода к проблемам проникновения веществ в клетки определяется и тем, что он подрывает основы старых количественных теорий диффузии веществ в клетки (см. Jacobs, 1935;. Brooks a. Brooks, 1941; Davson a. Danielly, 1943; Hober и др.
20в
1946), так как проникновение веществ в этом случае опреде--ляется не законами диффузии, а закономерностями кинетики-биохимических реакций. Существует немало попыток математического описания процесса диффузии веществ в клетки с учетом вовлечения этих веществ в различные химические реакции в клеточной оболочке и внутри клетки (Roughton, 1952; Rosenberg a. Wilbrandt, 1955b; Best, 1955a, b; Patlak, 1956;. Rashevsky, 1960). Однако в большинстве из них, по-видимому,. преувеличивается роль чистой диффузии в процессе поступления вещества в клетку.
Обновление веществ. Обновление веществ — явление более сложное, чем транспорт или перемещение веществ. Однако для нас интерес имеют не такие сложные процессы,как обновление белков, углеводов или других высокомолекулярных соединений, а обновление простых веществ, таких, как вода, соли и т. д., поступление и выход которых не отделены по времени от процесса их обновления и поэтому имеют непосредственное отношение к проблеме проникновения веществ в клетки. В то же время проблему обновления этих веществ нельзя свести только к проблеме одностороннего транспорта, так как оно может происходить и при отсутствии и при наличии транспорта этих веществ в клетки. Опыт показывает, что обновление простых химических веществ, так же как односторонний транспорт, является активным процессом, тесно связанным с клеточным метаболизмом. В частности, мы видели, что обновление воды у зародышей осетровых и лососевых рыб происходит при участии ферментных систем и его нельзя объяснить самодиффузией, осмотическим или коллоидным захватом. Вероятно, наиболее правильный путь поисков механизма обновления веществ, как и активного транспорта, должен свестись к поискам пути вовлечения этих веществ в биохимические реакции клеточного метаболизма.
В заключение следует отметить, что хотя механизм транспорта веществ по градиенту сил, против градиента сил и при обновлении веществ, вероятно, различен, сейчас намечается некоторый общий принцип, объединяющий все эти явления: во всех случаях поступление веществ в клетки осуществляется путем вовлечения их в биохимические реакции клеточного метаболизма. Явление диффузии в этих процессах играет, по-видимому, второстепенную роль.
Глава VII
ПОТРЕБЛЕНИЕ ВОДЫ
ЯЙЦАМИ РЫБ И КРУГЛОРОТЫХ ВО ВРЕМЯ РАЗВИТИЯ
Так же, как при начальных изменениях яиц после оплодотворения, потребление воды из окружающей среды во время зародышевого развития и изменение ее содержания в яйцах рыб связаны, с одной стороны, с изменениями, происходящими в яйцевых оболочках, с другой стороны,— с изменениями самого зародыша. Последнее имеет, конечно, более существенное значение для жизни зародышей и понимания особенностей развития зародышей, однако и изменения, происходящие с оболочками, имеют определенный биологический смысл, так как они влекут за собой изменение плотности яйца в целом, что во многих случаях может изменить экологические условия развития зародышей. Рассмотрим вначале изменение суммарной плотности или объема яиц рыб и связанное с этим поступление воды в яйца из окружающей среды, а затем перейдем к данным о поступлении воды в зародыши, перивителлиновое пространство и в оболочки.
1. ПОСТУПЛЕНИЕ ВОДЫ В ЯЙЦА ИЗ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ВО ВРЕМЯ РАЗВИТИЯ
После оплодотворения или активации, как мы неоднократно отмечали, у многих яиц рыб происходит быстрое увеличение объема перивителлинового пространства или оболочек за счет поступления в яйцо воды из окружающей среды. Эти изменения заканчиваются, как правило, к стадии первого деления. На последующих стадиях развития процесс поступления воды в целые яйца различен у костистых рыб, осетровых и миног.
Костистые. Изменение содержания воды в яйцах костистых рыб на разных стадиях развития исследовалось 208
в основном тремя методами: определением депрессии точки замерзания, измерением объема яиц в оболочках, измерением сырого и сухого веса яиц.
Было показано, что в течение развития яиц Salmo salve-linus и S. fario депрессия точки замерзания (А) для целого яйца практически не меняется, т. е. в целом яйце лососевых рыб во время развития не происходит изменения концентрации солей и понижения A (Runnstrom, 1920; Gray, 1920; см. также Needham, 1931). Позднее П. Г. Светлов (1929) тщательно поставленными опытами на яйцах ручьевой форели (Salmo trutta m. fario) подтвердил эти наблюдения, получив несколько другое значение величины депрессии точки замерзания яиц (Рунстрём — 0,599°, Грей — 0,48°, Светлов — 0,468°). Хотя данные о неизменяемости осмотического давления содержимого развивающихся яиц лососевых рыб не являются достаточным доказательством того, что во время развития не происходит поступления воды в яйца (можно себе представить наличие специальных механизмов регуляции постоянства осмотического давления), они подтвердились прямыми определениями содержания воды в яйцах рыб. Так, взвешивание яиц Salmo trutta fario и Salmo lacustris на разных стадиях развития показало, что сырой вес целых яиц после образования перивителлинового пространства не изменяется во время развития вплоть до стадии вылупления зародышей из оболочек (Kronfeld u. Scheminsky, 1926; Sche-minsky, 1929). Сходные данные были получены для яиц других лососевых рыб (Hayes, 1930, 1949; Irving а. Manery, 1934; Manery a. Irving, 1935; Hayes a. Armstrong, 1942). Манери и Ирвинг (1935), в частности, исследовали изменение сырого и сухого веса во время развития яиц Salvelinus fontinalis и Salmo gairdneri. Как видно из табл. 44, сырой вес у яиц S. fontinalis на разных стадиях развития колеблется в пределах 62—65 мг, сухой вес — в пределах 32,7—33,5 мг. У яиц S. gairdneri сырой вес колеблется в пределах 82—85 мг. Эти данные показывают, что сырой и сухой вес яиц практически не изменяется во время развития, т. е. яйца не потребляют и не отдают воду на изученных стадиях развития. Тщательные исследования, проведенные на фиксированных формалином яйцах атлантического лосося Salmo salar, так же показали, что во время развития яиц поступление воды в них из окружающей среды происходит только в первые часы после оплодотворения, когда образуется перивителлиновое пространство (Hayes a. Armstrong, 1942; Hayes, 1930, 1949). Лужин (1956), измерявший диаметр яиц в оболочках форели,— гегаркуни на разных стадиях инкубации, так же отмечает, что диаметр яиц, а следовательно, и объем, изменяется только
14 А. И. Зотин
209
Изменение сырого и сухого веса целых яиц форели во время развития (Manery a. Irving, 1935)
ю -1 99 1 1 1
со СО
— 0,
С-1 1 1 * А С >
00 04 -о
LO СО
63, 32, 1 1 1
00 05
1 1
"Г 1 1 00 S3
НО
01 62 |33: 1 1 1
63 | |зз,з 1 1 1
—- -а о
г* п
1 1 СО 00 о?
о 1 1 1
сс СО 1 1
s 1 1 1 1
’ 00 ьО
v п
о 1 1 оО 04
oq СО
СО lO
ОС о 1 ['-’ж
00 7’4 СО
-- '
СЗ 1 1 I
С м о 1 1 1
с
с СО
СЗ £ I I гг^ о\
ОЙ 00 04 СО
3 со о
СО .2 о? Е 1 1 1
t*C) сО -
> GO о- Г"*
' А GJ LQ СО оо об 04
с/) со со 04 со
О 65 1 1
00 1 1
04 63 ;з2, 1 1 1
ыО
о
1 । 04 со 04
00 04 со
СО Oq 1 1 1
СО СО
• СЗ сз
Г J
CD Г J
г— Я а
S О о
♦ о о
о .
м А а
g со ед '•D
2 s 5 о SS о
С f- О >> Й о? Я ^е> сО
ф у к а к S к а
г д f j
о д CD CD CD CD CD
а а а а а
К sS sS
ф о о о о о
Й" Он X 2"
и и о и и
в первые 8 час после оплодотворения, когда образуется перивителлиновое пространство, а на последующих стадиях развития вплоть до конца инкубационного периода он остается неизменным.
В отличие от всех указанных авторов Т. И. Привольнев (1953), изучавший изменение сырого веса яиц нарвского лосося Salmo salar, считает, что во время развития происходит увеличение сырого веса яиц и поступление в них воды из окружающей среды. Однако это заключение автора недостаточно обосновано.
Дело в том, что, согласно данным Т. И. Привольнева (1953), сырой вес яйца лосося максимально изменяется за все время развития от 137 до 144 мг, т. е. на 5,1%. Т. И. Привольнев приводит данные о варьировании сырого веса яиц, из которых можно вычислить предельную ошибку измерения среднего веса яиц (чего автор не сделал). Она равна ±4,9%. Следовательно, даже максимальные различия в весе яиц лосося, найденные Т. И. Привольневым, лишь незначительно превышают ошибку измерения.
Для яиц других костистых рыб получены данные об изменении содержания воды в целых яйцах во время развития, сходные с данными, найденными для яиц лососевых рыб. Новак (Nowak, 1935) показал, что содержание воды и сырой вес оплодотворенных яиц карпа (Cyprinus carpio) остается постоянным в течение всего периода инкубации. Сухой вес яиц карпа постепенно уменьшается за время развития, что связано, по мнению автора, с окислением жира и углеводов. Сырой вес яиц сельди (Caspialosa volgensis) повышается до стадии мелкоклеточной морулы (2—3 час после оплодотворения), и в дальнейшем остается постоянным вплоть до вылупления зародышей из оболочек (Мухина, 1948). Повышение сырого веса в начале развития яиц связано с образованием перивителлинового пространства: после вылупления зародышей сырой вес их приближается к весу только что оплодотворенных яиц, у которых отсутствует перивителлиновое пространство. Сухой вес яиц сельди почти не изменяется за время развития яиц (Мухина, 1948). Противоречивые данные получены при изучении яиц .Fundulus heteroclitus (Manery, Warbritton a. Irving, 1933). С одной стороны, авторы показали, что за время развития от оплодотворения до вылупления (15 дней) плотность яиц Fundulus, равная 1,053 г,/ши3, не изменяется, с другой,— они нашли, что сырой вес и содержание воды в яйцах увеличивается за это время соответственно с 3,40 до 3,75 мг и с 81 до 83%. С утверждением авторов об увеличении сырого веса яиц Fundulus во время развития вряд ли можно полностью согласиться, так как, судя по рисункам, приводимым в этой работе, разброс точек при измерении сырого веса яиц на каждой стадии развития доволь-
14*
211
но велик. Кроме того, легко подсчитать, что при поступлении воды в яйцо за время развития в количестве 0,35 жа, найденное в работе Манери, Варбритона и Ирвинга (1933), плотность яиц должна была бы уменьшиться с 1,053 до 1,048 г] см3. Авторы не нашли уменьшения плотности яиц Fundulus во время развития, хотя измеряли ее с точностью до 0,001 г]см3. ?;
Данные, полученные весовым методом, подтверждены наблюдениями за изменением объема целых яиц рыб во время развития. Диаметр яиц белорыбицы (Подлесный, 1947), налима (Европейцева, 1947), каспийских килек (Сомова, 1946) и минтая (Горбунова, 1954) практически не изменяется за время развития. Для примера в табл. 45 приведены данные, полученные С. Г. Сомовой (1946), об изменении диаметра яиц каспийских килек на четырех стадиях развития.
Таблица 45
Изменение диаметра (в мм) яиц каспийских килек во время развития (Сомова, 1946)
Стадии развития (по Рассу) I II ill IV
Clupeonella delicatula 0,83—1,07 0,84—0,94 0,73—0,94 0,81—1,02
С. engrauliformis . . 0,84—0,94 0,83—0,94 0,81—0,88 0,86
М. Ф. Вернидуб (1953) на яйцах донского леща получила данные, противоречащие этим наблюдениям. Она указывает, что по ходу- развития яиц, особенно с началом роста зародыша, объем икринки леща увеличивается в два раза по сравнению со стадией дробления. Эти наблюдения, по-видимому, ошибочны, так как С. Г. Крыжановским (1949) показано, что у яиц Abramis brama (L) процесс растяжения оболочек заканчивается в течение 30—40 мин после оплодотворения и на последующих стадиях развития объем яиц в оболочках не увеличивается. Возможно, М. Ф. Вернидуб (1953) имела дело с патологически развивающимися яйцами леща.
Таким образом, согласно наблюдениям многих авторов, яйца костистых рыб во время развития не потребляют воду из окружающей среды, кроме самых первых стадий развития после оплодотворения, когда образуется перивителлиновое пространство.
Я также проводил изучение потребления воды целыми яйцами нескольких видов костистых рыб из окружающей среды методом падения яиц в трубке с вязкой жидкостью. Были изучены яйца донского судака (Lucioperca lucioperca L.), вью
212
на (Misgurnus fossilis L.), сига (Coregonus lavaretus baeri n. swirensis Pravdin), озерной форели (Salmo trutta m. lacustris Linne) и лосося (S. salar m. sebago Girard).
Работа с зародышами судака проводилась в 1956 г. в низовьях Дона. Зрелая икра и сперма были получены от гипофиаированных рыб Е. А. Бабуриной, оплодотворена сухим способом и развивалась в кристаллизаторах в лаборатории при 20°. Изучение потребления воды яйцами вьюна проводилось в 1957 г. в Москве. Зрелые яйца и сперма были получены А. А. Ней-фахом от гипофизированных рыб. Искусственно оплодотворенная икра развивалась в кристаллизаторах при 20°. Наиболее подробные исследования были проведены на яйцах лососевых и сиговых рыб в 1950—1953 и 1956— 1957 гг. на Свирском рыбоводном заводе. Икру, полученную от выдержанных в садках самок, осеменяли спермой от 2—3 самцов и инкубировали на рамках в желобообразных аппаратах при колебании температуры воды в 0,2—6,0°. Например, в сезон 1952—1953 гг. температура воды в аппаратах за время инкубации икры колебалась по месяцам следующим образом: с 25 октября по 2 ноября 1952 г. от 2,8 до 0,2°; с 3 ноября 1952 г. по 15 апреля 1253 г от 0,2 до 0,3°; с 16 апреля по 9 мая 1253 г. от 0,3 до 6,0°. Для опытов икру брали в заводскую лабораторию, где температура воздуха поддерживалась на уровне 2—5°. Контроль за типичностью развития проводился на живых зародышах и на материале, фиксированном 4%-ным формалином.
На рис. 54 показаны кривые изменения объема яйца форели (в процентах к объему яиц на 7-е сутки после оплодотворения) лосося и сига. Как видно на рис. 54, яйца
Рис. 54. Потребление воды яйцами форели (7), лосося (2), сига (3) из окружающей среды во время развития
лосося, форели и сига во время развития не потребляют воды из окружающей среды (кроме первых стадий развития, когда происходит образование перивителлинового пространства). Хотя небольшое уменьшение содержания воды в яйцах сига и лосося на поздних стадиях развития лежит в пределах
213
ошибки измерения плотности яиц применяемым методом, возможно, что оно связано с уменьшением размеров перивителлинового пространства на этих стадиях.
Для зародышей донского судака и вьюна были получены сходные данные (рис. 55). Потребление воды яйцами происходит только в первые часы после оплодотворения, когда об-
Рис. 55. Потребление воды яйцами вьюна (У), судака (2) и барабульки (<?) во время развития (в пересчете на единицу объема яйца). На оси абсцисс отложено время, выраженное в процентах от общей продолжительности развития зародышей от оплодотворения до вылупления из оболочек
стадиях развития яйца в оболочках не потребляют воды из окружающей среды вплоть до стадии вылупления, когда происходит быстрое увеличение объема яиц, причины которого будут рассмотрены ниже.
Изучение влияния вазелинового масла на развитие яиг кумжи, щуки и плотвы показало, что яйца рыб, погружег ные в масло на стадии первых бластомер, развивались в этой безводной среде до момента вылупления зародышей (Domu-rat, 1956). Эти опыты показывают, что зародыши рыб во время развития обходятся внутренними источниками воды.
Мы рассмотрели несколько примеров изменения содержания воды, плотности или объема у яиц костистых рыб во время развития. Следует сказать, что не у всех видов костистых рыб имеется полное единообразие в отношении этих изменений, так как существуют известные различия (не только количественные) в строении яиц разных видов костистых рыб.
214
В частности, это относится к яйцам сомовых рыб и морским пелагическим яйцам костистых рыб. У яиц сомовых рыб имеется толстая студенистая оболочка, набухание которой и определяет в основном потребление воды яйцами в первое время после оплодотворения. На последующих стадиях развития студенистая оболочка также оказывает существенное влияние на размеры и плотность яиц сома в целом: толщина студенистой оболочки яиц сома постепенно уменьшается по мере развития зародышей, а следовательно, уменьшается и общая оводненность яиц (Крыжановский, 1949). Относительно изменения плотности морских пелагических яиц существуют противоречивые данные, поэтому следует рассмотреть их подробнее.
Морские пелагические яйца костистых рыб имеют своеобразное строение: у них отсутствует перивителлиновое пространство, а желток сильно оводнен (см. рис. 57). Способность к изменению плотности у пелагических морских яиц рыб во время развития давно привлекала внимание исследователей, так как плотность яиц является главным фактором приспособления яиц к плаванию и определяет их местоположение в толще воды. Многие авторы, изучавшие удельный вес морских пелагических яиц, пришли к выводу, что с ростом зародышей происходит увеличение удельного веса яиц и они опускаются в более глубокие слои воды (Raffaele, 1888; Jacobsen a. Johansen, 1908; Кузнецов, 1909; Потеряев, 1936; Зайцев, 1954, 1955, 1956, 1959а). Особенно подробные исследования провел в последние годы Ю. П. Зайцев (1955, 1956, 1959а), который нашел, что у многих черноморских рыб за время развития пелагических икринок происходит увеличение их удельного веса, т. е. происходит выход воды из яиц и уменьшение содержания воды в них (табл. 46). Как видно из этих данных, от стадии I, по Рассу (начало дробления — появление зародыша), до стадии IV (хвост охватывает весь зародыш — вылупление) у всех изученных видов происходит увеличение удельного веса яиц на 0,0020—0,0025 г)см\ Если принять, что увеличение удельного веса яиц происходит только за счет выхода из яиц воды, то, по данным Ю. П. Зайцева, можно рассчитать количество воды, теряемой яйцами за время развития от стадии I до IV. Оно равно
4v“v«-^7t-. (8)
где AV — объем воды, вышедшей из яйца;
Vo — начальный объем яйца;
Pi — удельный вес яиц на стадии I;
Р2 — удельный вес яиц на стадии IV.
215
В табл. 46 приведены значения AV для яиц, изученных Ю. П. Зайцевым. За время развития, как видно из этих расчетов, пелагические яйца черноморских рыб теряют 17— 27% воды, содержащейся в них.
Таблица 46
Изменение удельного веса черноморских пелагических яиц костистых рыб во время развития (Зайцев, 1956)
Вид Стадия развития (по Рассу) Объем яиц, мм2 XV
I | IV IV-I
плотность яиц
Engraulis . . 1,0070 1,0092 0,0022
Callionymus 1,0073 1,0100 0,0027 0,195 0,0526
Solea 1,0094 1,0114 0,0020 0,900 0,157
Mullus .... 1,0100 1,0122 0,0022 0,202 0,0363
Ctenolabrus . . 1,0113 1,0132 0,0019 0,332 0,0478
Gaidropsarus 1,0115 1,0135 0,0020 0,250 0,0370
Pleuronectes 1,0116 1,0138 0,0022 0,900 0,143
Spratt us . . . 1,0120 1,0145 0,0025 0,700 0,120
Trachinus . . . 1,0128 1,0148 0,0020 0,620 0,08
Хотя наблюдения Ю. П. Зайцева (1954, 1955, 1956, 1959а), проведенные на разных видах рыб, дали во всех случаях сходные результаты, которые не противоречат данным многих старых работ, мне не удалось, подтвердить их, работая с яйцами барабульки (Mullus barbatus ponticus Esipov).
Измерение плотности яиц барабульки на разных стадиях развития проводилось при помощи метода падения яиц в трубке с дистиллированной водой. Плотность яиц барабульки рассчитывалась по формуле (6). В среднем она равнялась 1,0085 г! см3. Количество воды, потребляемой яйцами во время развития, вычислялось по формуле
AV — 5,83-10“8-/3’м—3,21 • 10'4, (9>
где AV — количество поступившей воды,
t — время падения яиц в дистиллированной воде на расстоянии 5 см, которая является производной формулы (1).
Было измерено потребление воды яйцами от четырех самок барабулек.
На рис. 55 суммированы полученные данные. В первой половине развития яйца не потребляют воды из окружающей среды. Примерно со стадии появления глазных пузырей у зародышей (37—40 час после оплодотворения при 20—22°) начинается медленное потребление воды яйцами, а на стадиях, близких к вылуплению,— быстрое. Следовательно, в от-216
личие от других авторов, я не нашел увеличения плотности яиц барабульки во время развития и даже, наоборот, как ясно из рис. 55, в конце развития происходит уменьшение плотности яиц. В некоторых случаях мне приходилось наблюдать отмеченное многими авторами явление, когда часть яиц барабульки, плавающих на ранних стадиях развития у поверхности, постепенно опускалась на дно кристаллизатора. Измерение плотности таких яиц показало, что она заметно больше плотности плавающих яиц. Оказалось, что большинство потонувших яиц развивалось ненормально: среди них было много неоплодотворенных яиц, уродливо развивающихся зародышей и погибших яиц. Все эти яйца теряли плавучесть, ио-видимому, в результате нарушения нормальной жизнедеятельности и начала процессов, ведущих к гибели зародышей. Погибшие морские пелагические яйца всегда тонут в морской воде в результате выхода из них воды в гипертонической среде (Jacobsen a. Johansen, 1908; Зайцев, 1956).
Осетровые. У яиц осетровых рыб изменение общей плотности и содержание воды в яйцах имеет свои особенности по сравнению с яйцами костистых рыб. А. А. Остроумов еще в 1911 г. показал, что во время развития зародышей стерляди от оплодотворения до стадии вылупления происходит увеличение веса (от 0,0039 до 0,0061 г) и диаметра (от 0,195 до 0,227 мм) яиц. Автор указывает, что эти изменения связаны с поступлением воды в яйца стерляди во время развития.
Мною было изучено потребление воды целыми яйцами белуги, осетра и севрюги в оболочках на разных стадиях развития методом падения яиц в трубке. Полученные данные приведены на рис. 56. После первоначального быстрого поступления воды в яйца, когда образуется перивителлиновое-пространство и набухает студенистая оболочка, в дальнейшем происходит сначала медленное уменьшение, а затем увеличение объема яиц. Потребление воды яйцами, взятыми от разных самок, значительно отличается, но общий характер процесса сходен. Перед вылуплением зародышей из оболочек происходит резкое увеличение потребления воды (на рис. 56 не показано), что является, по-видимому, общим явлением для зародышей рыб, так. как происходит и у костистых рыб.
Данные, полученные мною на яйцах донских осетровых рыб, принципиально не отличаются от данных, приводимых С. В. Емельяновым (1957) для яиц куринского осетра, у которых также происходит увеличение объема яиц в оболочках.
Миноги. Объем и содержание воды в целых яйцах миноги во время развития увеличивается (Hardisty, 1957). Однако характер кривой значительно отличается от кривой потребления воды целыми яйцами осетровых рыб. Как видно
217
Рис. 56. Изменение объема яиц белуги (/), осетра (2) и севрюги (<?) во всех оболочках за время .развития. (Цифры показывают стадию развития по Детлаф и Гинзбург, 1954, на абсциссе — время для севрюги)
на рис. 60, у миноги после довольно быстрого увеличения объема яиц в оболочках в первые 5—6 суток после оплодотворения происходит постепенное уменьшение объема, а следовательно, и уменьшение содержания воды в целых яйцах.
2. ИЗМЕНЕНИЕ ОБЪЕМА СТУДЕНИСТЫХ ОБОЛОЧЕК И ПЕРИВИТЕЛЛИНОВОГО ПРОСТРАНСТВА
ВО ВРЕМЯ РАЗВИТИЯ ЯИЦ РЫБ
Для того, чтобы понять особенности потребления воды из окружающей среды целыми яйцами рыб, мы должны рассмотреть вопрос, в какой степени эти изменения зависят от изменения оболочек и размеров перивителлинового пространства и в какой — от потребления воды самими зародышами. Довольно просто в этом отношении решить вопрос об изменении перивителлинового пространства у яиц костистых рыб. У большинства видов костистых рыб, имеющих периви-218
теллиновое пространство нормального вида, ооъем его почти не изменяется во время развития, кроме самых последних стадий развития, когда происходит быстрое растяжение оболочек перед вылуплением зародышей. Так, у яиц лососевых рыб, согласно наблюдениям Хайеса и Армстронга (1942), вес содержимого перивителлинового пространства и оболочек не меняется во время развития, вплоть до стадии вылупления зародышей из оболочек (см. рис. 61). По моим наблюдениям, плотность яиц свирского сига и лосося несколько уменьшается во время развития, поэтому возможно, что объем перивителлинового пространства у них немного уменьшается. Сходные наблюдения проведены на яйцах других костистых рыб. У волжской сельди увеличение объема яиц после оплодотворения зависит от возникновения перивителлинового пространства, но на последующих стадиях объем яйца, как и перивителлинового пространства, не изменяется, пока не происходит вылупления зародышей из оболочек и ликвидации перивителлинового пространства (Мухина, 1948).
У многих морских пелагических яиц (рис. 55) после оплодотворения перивителлиновое пространство не возникает. Поэтому в первое время развития объем яиц и их плотность не изменяются. Увеличение объема и потребления воды из окружающей среды во второй половине развития яиц барабульки (рис. 55) связано с тем, что в это время у них появляется видимое перивителлиновое пространство, которое постепенно увеличивается в размерах. Перед вылуплением зародышей из оболочек происходит дополнительное растяжение оболочек, характерное и для других рыб. Сходные изменения объема яиц в оболочках и изменение потребления воды, связанное с увеличением объема яиц, происходят, вероятно, и у других морских пелагических зародышей костистых рыб. Так, у яиц морского ерша (Scorpaena porcus) перивителлиновое пространство появляется через 28 час после оплодотворения (t = 21—22°) на стадии трех сомитов, а затем постепенно увеличивается, вплоть до стадии вылупления (рис.57).
У яиц осетровых рыб картина изменения оболочек и размеров перивителлинового пространства во время развития еще сложнее. Яйца осетровых имеют, кроме двух желточных оболочек, толстую наружную студенистую оболочку. После оплодотворения в течение первых 1—2 час происходит поступление воды в яйца и сильное набухание этой оболочки (см. гл. I). На последующих стадиях развития толщина студенистой оболочки постепенно уменьшается. Объем перивителлинового пространства в первые 12—40 мин после оплодотворения увеличивается и достигает максимума через 2— 3 часа к стадии 1 и 2 деления. На последующих стадиях
219
Рис. 57. Изменение размеров перивителлинового пространства у зародышей морского ерша за время развития
а — 5,5 час после оплодотворения; 6 — 24,5 час; а — 28,5 час; г — 32 час; «3 — 45,5 час‘„ е — 74 час стадия перед вылуплением (t = 21—22°)
Рис. 58. Изменение размеров перивителлинового пространства во время развития зародышей у севрюги. Фотографии яиц без капсулы:
а — стадия 22; б — стадия 26; в — стадия 27; г — стадия 30; д — стадия 35 (стадии даны по Детлаф и Гинзбург, 1954)
развития объем перивителлинового пространства постепенно уменьшается (см. рис. 1) и к стадии 5 деления (стадия по Детлаф и Гинзбург, 1954) перивителлиновое пространство почти полностью исчезает. На стадиях средней и поздней бластулы, гаструляции и нейруляции внутренняя желточная оболочка плотно прилежит к поверхности зародыша. Новое увеличение размеров перивителлинового пространства начинается на стадии формирования тела зародыша, когда зародыш приподнимается над желтком и его правильная шарообразная форма теряется, в то время как оболочки продолжают сохранять шарообразную форму (рис. 58). По мере усложнения формы тела зародыша происходит постепенное увеличение размеров перивителлинового пространства. Особенно быстро объем перивителлинового пространства увеличивается, начиная со стадии, когда сердце имеет вид прямой трубочки (стадия 26—27, по Детлаф и Гинзбург, 1954). У яиц севрюги объем перивителлинового пространства достигает наибольшего значения к стадии 30. У яиц осетра и белуги увеличение размеров перивителлинового пространства продолжается вплоть до вылупления зародышей из оболочек.
221
Количественное изучение изменения объема перивителлинового пространства и оболочек во время развития яиц осет- . ровых рыб проведено на яйцах белуги. Измерялись объемы яиц во всех оболочках, объемы яиц без капсульной оболочки и вес фиксированных 4%-ным формалином зародышей без оболочек (так как фиксация зародышей изменяет их вес, то' для сравнения с живыми яйцами делалась соответствующая поправка). На основании этих данных вычислялось изменение объема студенистой оболочки и объема перивителлинового пространства. Для контроля было проведено также измерение объема студенистых оболочек на трех стадиях развития по. рисункам яиц. Полученные данные представлены на рис. 59. Мы видим, что объем студенистой оболочки непрерывно уменьшается во время развития, что и обусловливает первоначальное постепенное уменьшение общего объема яиц в оболочках (рис. 59, 1). Уменьшение общего объема яиц идет, однако, значительно медленнее, чем уменьшение объема оболочек, так как одновременно происходит увеличение размеров самого зародыша (рис. 59, 2, 3). С некоторого момента процесс увеличения объема зародышей начинает компенсировать уменьшение объема оболочек, так что уменьшение общего объема яйца сначала приостанавливается, а затем начинается обратный процесс — медленное увеличение общего объема яйца. Таким образом, у яиц осетровых потребление воды зародышами из окружающей среды, ведущее к уменьшению плотности яиц в целом, компенсируется потерей воды из яйца за счет уменьшения толщины студенистой оболочки.
Данные об изменении объема перивителлинового пространства (рис. 59), не противоречат качественной картине изменения его размеров (рис. 58): только со стадии 26—27 начинается новое увеличение объема перивителлинового пространства (после его исчезновения на стадиях дробления). Однако количественные измерения дают ответ на вопрос, откуда берется жидкость вновь возникающего перивителлинового пространства. Как видно на рис. 59, происхождение этой жидкости у яиц белуги и осетра — двойственное. С одной стороны, начиная со стадии 27 и кончая стадией 30, происходит быстрое уменьшение веса зародышей (рис. 59), и, следовательно, перивителлиновая жидкость может образовываться за счет жидкости, секретируемой зародышами, с другой стороны,— примерно со стадии 30 — происходит увеличение объема яиц, имеющих одну внутреннюю желточную оболочку (рис. 59), т. е. объем перивителлинового пространства увеличивается благодаря поступлению воды из окружающей среды (см. также рис. 64 и 65). Начиная со стадии 30 и до стадии вылупления, вес самих зародышей не меняется, и количество 222
перивителлиновой жидкости увеличивается только за счет воды окружающей среды. На стадиях, близких к вылуплению зародышей из оболочек, у них происходит дополнительное растяжение оболочек и увеличение объема перивителлинового пространства. Изменение объема перивителлинового пространства у яиц севрюги носит более простой характер. У яиц севрюги на стадию 27—30 образование, перивителлиновой жидкости также сопровождается сокращением объема зародыша однако на последующих стадиях развития (стадия 30—34) растяжение оболочек, характерное для яиц белуги и осетра, не происходит. Поэтому можно заключить, что перивителли-новая жидкость в яйцах севрюги на стадиях 21-—34 образуется только за счет секреции ее из зародыша.
Механизм процесса увеличения объема перивителлинового пространства у яиц осетра и белуги на стадиях 30—34 не ясен. Можно предполагать, что растяжение оболочек происходит в результате секреции осмотически активных веществ из зародышей во время сокращения их объема на стадиях 27— 30. Однако в этом случае трудно объяснить отсутствие растяжения оболочек на стадиях 30—34 у зародышей севрюги, так как у них также имеется сокращение объема зародышей на предшествующих стадиях развития. Поэтому приходится прибегнуть еще к одному допущению, которое вместе с первым позволяет объяснить отличия яиц севрюги от осетра и белуги. Есть основания считать, что, хотя абсолютная прочность оболочек яиц севрюги меньше, чем прочность яиц белуги и осетра, яйца севрюги имеют на поздних стадиях развития относительно более прочные оболочки. Можно думать, что относительная прочность оболочек яиц севрюги настолько высока, что осмотическое давление перивителлиновой жидкости недостаточно для растяжения оболочек. В табл. 47 приводятся
Таблица 47
Изменение прочности внутренней желточной оболочки янц белуги, осетра и севрюги во время развития (в пересчете на единчцу поверхности яйца)
Стадия развития Прочность оболочек, г/мм2
белуг а осетр севрюга
1-е дробление 2,35 1,91 1,47
Начало гаструл яиц 2,35 1,91 1,47
Замыкание бластопора 2.20 1,66 1,47
Сердце в виде прямой трубки . . 1,69 1,37 1,47
Хвост достиг головы 1,35 1,18 1,47
Перед вылуплением 0,70 0,47 1,00
224
данные об относительной прочности оболочек яиц севрюги, осетра и белуги на разных стадиях развития. Условно за относительную прочность оболочек принята величина, равная отношению абсолютной прочности внутренней желточной оболочки к площади ее поверхности.
Абсолютная прочность оболочек у яиц севрюги практически не меняется за время развития, в то время как у яиц осетра и белуги она, после достижения максимума на стадии бластулы, постепенно снижается к стадии вылупления (Зотин, 1953в). Относительная прочность оболочек яиц осетра и белуги на стадии бластулы больше, чем у яиц севрюги, однако примерно со стадии 27 она становится меньше. Интересно, что у яиц осетра относительная прочность оболочек меньше, чем у яиц белуги (табл. 47). Может быть, этим объясняется тот факт, что увеличение объема перивителлинового пространства у яиц осетра на стадиях 30—34 происходит сильнее, чем у яиц белуги.
Снижение прочности оболочек у яиц осетровых рыб приводит к увеличению размеров перивителлинового пространства, это можно показать экспериментальным путем. Я помещал яйца осетра на стадии 14 в раствор фермента вылупления, который снижает прочность оболочек. Оказалось, что объем таких яиц резко увеличивался за счет образования большого перивителлинового пространства (табл. 48). Таким образом, растяжение оболочек и увеличение объема перивителлинового пространства у яиц белуги и осетра на стадиях 30—34, а следовательно, и потребление воды яйцами на этих стадиях,
Таблица 48
Увеличение объема яиц осетра, лишенных капсульной оболочки, под действием фермента вылупления (t=18°)
Время после помещения яиц в раствор фермента, час Увеличение объема пери-вителлинового пространства по сравнению с контролем, мм9
0,5 0,23
1,0 0,55
4,0 0,78
12,0 2,58
20,0 6,46
23,0 7,75
по-видимому, зависит от снижения прочности оболочек, происходящего на этих и предшествующих стадиях развития. Механизм снижения прочности оболочек во время развития 15 а. и. зотин 225
яиц белуги и осетра не ясен. Во всяком случае, снижение прочности оболочек не связано с действием фермента вылупления, так как на этих стадиях развития зародышей осетровых рыб его нет в перивителлиновой жидкости (Зотин, 1953 г.).
Наоборот быстрое увеличение объема яиц, происходящее на стадии вылупления зародышей осетровых и костистых рыб, можно объяснить только действием фермента вылупления на оболочки.
Вопросу о механизме вылупления зародышей рыб из оболочек посвящено довольно большое число исследований. Мы не будем на них останавливаться, так как в нашей литературе недавно опубликован хороший обзор-проблемы вылупления зародышей животных из яйцевых оболочек (Бузни-ков и Игнатьева,. 1958). В этом обзоре ясно показано, что хотя для вылупления зародышей рыб из оболочек имеет известное значение механическое давление, которое зародыш оказывает на оболочки, все же механизм вылупления связан главным образом с выделением зародышами особого фермента, расслабляющего и растворяющего яйцевые оболочки. Появление фермента вылупления в перивителлиновой жидкости связано с деятельностью, желез вылупления, имеющих разное происхождение у зародышей костистых и осетровых рыб. Секреция фермента вылупления у зародышей рыб-является весьма сложным актом и происходит под контролем различных факторов среды.
Появляясь в перивителлиновом пространстве, фермент вылупления резко ослабляет прочность оболочек и вызывает их растяжение (сдвигая равновесие, существующее между осмотическим давлением перивителлиновой жидкости и прочностью оболочек). Зародыши легко разрывают ослабленные оболочки и освобождаются от них и от перивителлино-: вой жидкости, в которых до этого момента протекало их развитие.
Миноги. У яиц миног, так же как и у яиц осетровых рыб, имеется студенистая оболочка, набухающая после оплодотворения яиц. По наблюдениям Хардисти (1957), у яиц Lampetra planeri набухание оболочек происходит главным образом в первые 45 мин после оплодотворения, но максимальной своей величины толщина студенистой оболочки достигает на 3-и сутки развития. Затем толщина ее уменьшается и, в конце концов, практически студенистая оболочка исчезает. Перивителлиновое пространство также быстро увеличивается в первые 45 мин после оплодотворения (Hardisty, 1957). На последующих стадиях развития оно медленно увеличивается в течение 3 суток. Затем увеличение объема перивителлинового пространства прекращается (рис. 60). Начиная с 5 суток развития (стадия гаструлы) происходит новое увеличение перивителлинового пространства и к стадии вылупления оно достигает размеров в 0,41 при 0,34 лш3 на стадии гаструлы. Это новое увеличение объема перивителлинового простран-226
ства связано, как и у яиц осетровых рыб, с уменьшением объема собственно зародыша (рис. 60), а не с поступлением воды из окружающей среды. В дистиллированной роде ^ъем, перивителлинового пространства значительно больше, чец. в обычной (рис. 60).
/ г ч 6 в io -If 18 гв w Дни.
Рис. 60. Объем (7), вес (2) и содержание (3) воды в яйцах,' зароДышах и личинках миноги Lampetra planeri. Стандартные ошибки показ'аны вер-' тикальными линиями. Вертикальная пунктирная линия — вылупления (Hardisty, 1957). •
Таким образом, у яиц миног потребление воды из окружающей среды за счет поступления ее в перивителлиновое; пространство отличается от подобных явлений у яиц костистых и осетровых рыб. Характерным для яиц миног является-постепенное увеличение объема перивителлинового пространства в первые 3 суток после его образования.
3. ПОТРЕБЛЕНИЕ, ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ОБНОВЛЕНИЕ ВОДЬ| У ЗАРОДЫШЕЙ КОСТИСТЫХ РЫБ ВО ВРЕМЯ развития
Выше мы рассмотрели данные о потреблении воды целым» яйцами рыб из окружающей среды и показали роль оболочек и перивителлинового пространства в суммарном процессе изменения содержания воды в яйцах. Теперь следует остановиться на обмене воды у собственно зародышей костистых рыб.
15*
221
Пог¥р!е:бл ение воды. Большинство исследований, посвящённый изучений' потребления воды зародышами костистых рыб, проведено на целых яйцах, включая оболочки и перййи¥ёллйн6вую' жидкость.Поэтому они дают лишь косвенные материалы для суждения о потреблении воды самими зародышами. Для получения прямых данных нужно было исследовать отдельно потребление воды яйцами в целом ц зародышами, освобожденными от оболочек. Одной из первых работ подобного рода, в которой были исследованы отдельно депрессия точки замерзания перивителлиновой жидкости и желтка, была работа П. Г. Светлова (1928а, 1929), проведенная на зародышах Salmo trutta fario. В табл. 49 приведены полученные им данные.
Таблица 49
Изменение депрессии точки замерзания (А) перивителлиновой жидкости и желтка яиц форели во время развития (Светлов, 1928а)
Время после 1 оплодотворения, сутки Д° перивителлиновая жидкость Время развития после оплодотворения, сутки д° желтка
2 0,02 5 0,50
5 0,01 17 0,49
29 0,02 29 0,49
50 0,02 50 0,51
Перивителлиновая жидкость по депрессии точки замерзания не отличается от водопроводной воды и не изменяется за время развития. Депрессия точки замерзания желтка практически также не изменяется во время развития.
Хайес и Армстронг (Hayes a. Armstrong, 1942; Hayes, 1949), взвешивали отдельно целое яйцо, оболочку зародыша и желток атлантического лосося на разных стадиях развития после фиксации яиц 5%-ным формалином. Ими было проведено специальное исследование влияния фиксации формалином на вес отдельных частей яйца, что позволило внести соответствующие поправки в полученные данные. Как видно на рис. 61, вес зародыша вместе с желтком, так же как перивителлиновой жидкости, не изменяется за время развития зародышей, в оболочках. Вхождение воды из окружающей среды й зародыш начинается только после вылупления его из оболочек.
Как указывалось выше (стр. 175), яйца лососевых рыб не содержат воды, прочно связанной в яйце, и поэтому вода, легко отдаваемая яйцом в гипертонической среде, характеризует количество воды, находящейся в перивителлиновой 228
Рис. 61. Изменение веса отдельных частей яйца атлантического' лосося во время развития (Hayes a. Armstrong, 1942)
жидкости. Если бы вода входила в собственно яйцо во время развития, то уровень связанной воды в яйце должен был бы увеличиваться. Как видно на рис. 62, у яиц свирского лосося, форели и сига этого не происходит, и, следовательно; можно
Рис., 62. Изменение уровня более прочно связанной воды у яиц форели (/), лосося (2) и сига (3) во время развития
заключить, что зародыши за время развития в оболочках не потребляют воду из окружающей среды. У яиц других костистых рыб зародыши так же не потребляют воду во время
229
развития. По данным Р. И. Мухиной (1948), у яиц волжской сельди вес только что вылупившихся зародышей близок весу неоплодотворенных яиц, т. е. почти не изменяется за время развития. Я не обнаружил изменения плотности яиц барабульки во время развития, кроме последних стадий, когда возникает видимое ... перивителлиновое пространство (см. (ри<£^)у
В'це,которых работах недавнего времени приведены наблюдения, несо-впадаитцие со сложившимися представлениями о характере потребления воды зррйдышами костистых рыб. Н. С. Строганов (1938, 19396), М. Ф. Вернидуб й X-к. Лейзерович (1950), X. А. Лейзерович (1950), М. Ф. Верни-дуб (фЭбх)'-измеряя диаметр желтка и всего яйца в оболочках, нашли, что во время’развития яиц окуня, сельди, корюшки и сига-лудоги происходит периодическое, сжатие и увеличение объема яиц. Авторы приходят к выводу, что 'На'/ всех стадиях развития зародышей происходит периодическое вхождррие-. й' выход воды из яиц, «гидратация» и «дегидратация» желтка. Это ответственное заключение нельзя считать доказанным, так как авторы не приводят- данных о точности и ошибке измерений. По личному опыту я знаю, насколько, трудно судить о характере изменения объема желтка по изменению диаметра. Необходимы дополнительные подтверждения иными методами наблюдений Н. С. Строганова, М. Ф. Вернидуб и X. А. Лейзерович. У Яиц сига, как будет показано ниже, периодической «гидратации» и «дегидратации» желтка, найденной М. Ф. Вернидуб и X. А. Лейзерович (1950)t не происходит, так как они до стадии поздней гаструлы не прони-цаемы'для воды. Я. Ф. Макарская (1938) и М. Ф. Вернидуб (1947) считают, что не. только вода, ио и соли проникают в зародыши костистых рыб, так как в солевом растворе Рингера яйца окуня, ерша, форели и сига окрашиваются. нрйтральротом слабее, чем в воде. Однако эти наблюдения не могут служить доказательством проникновения солей в яйцо — с яиц не были удалены оболочки и поэтому взаимоотношение солей и нейтральрота могло в этих опытах происходить не в зародышах, а в оболочках, которые легко проницаемы, и для солей и для нейтральрота.
Таким образом, зародыши костистых рыб во время развития цр потребляют воду из окружающей среды. Единственным, достоверным исключением из этого правила являются зародыши живородящих костистых рыб.
Во время развития зародышей Xiphophorus helleri (сем. Poecilidae) происходит увеличение их сухого веса, количества органических веществ и воды, причем содержание воды, в зародышах в конце развития возрастает до 84% (Bailey, 1933). У зародышей Heterandria formosa и Aulophal-lus elongatud (также из семейства Poecilidae) существует тесная связь между зародышами, и матерью, осущестйляе-мые через так называемую псевдо-плаценту (Scrimshaw, 1944, 1945). За время развития этих зародышей происходит очень сильное увеличение их размеров, сухого и сырого веса. Содержание воды у зародышей Н. formosa возрастает с 35 до 83%.’Следовательно из организма матери в зародыши поступают не только питательные вещества, но и большое количество воды. Баланс веществ, поступающих в зародыши
230
H. formosa, можно записать в вцХе следующего равенства (Scrimshaw, 1944)
0,1 мг + 2,6 мг + 15,8 мг = 18,5 мг
(сырой вес яйца)
(сухой вес) (сырой вес) (сырой вес 1 1 ' Личинки)
из организма матери
У других живородящих рыб сем. Poecilidae сухой вес зародышей вовремя развития почти не меняется (Scrimshaw, 1945). Однако, как показал Розенталь (Rosenthal, 1953), у зародышей Lebistes reticulatus при сохранении или даже уменьшении их сухого веса за время развития происходит увеличение концентрации кальция и фосфора и значительное изменение содержания воды. Розенталь (1953) измерял сырой и сухой вес зародышей, извлеченных из убитых кипятком самок. У живородящих Poecilidae период между рождениями потомства длится 28—30 дней. Его можно разбить на две фазы (Turner, 1937; Hopper, 1943; Rosenthal, 1953). В первую фазу (5—7 дней) происходит созревание яиц, во вторую (23— 25 дней) — оплодотворение и развитие зародышей («беременность»), В первые семь дней сырой вес и содержание воды в зародышах L. reticulatus остаются почти неизменными (Rosenthal, 1953). После оплодотворения и до момента рождения наблюдается быстрое увеличение сырого веса. Увеличение сырого веса определяется поступлением воды в зародыши, так как сухой вес практически в это время не меняется (табл. 50).
Таблица 50
Изменение содержания воды, сухого и сырого веса у зародышей живородящей рыбки Lebistes reticulatus во время развития (Rosenthal, 1953)
Возраст, дни Средний вес, мг Содержание воды, %
сырой сухой
0 2,96±0,73 1,46+0,36 50,6
7 2,75+0,40 1,33+0,28 58,1
14 3,86+0,57 1,33+0,33 70,9
21 4,95+0,44 1,24+0,25 75,0
Рождение 5,64+0,69 1,22+0,20 78,4
Перераспределение воды. Хотя зародыши костистых рыб (кроме живородящих) до вылупления не потребляют воду из окружающей среды, это не означает, что вообще не происходит поступления воды в зародыш. Как показали Грей (1926), Кронфельд и Шеминский (1926), содержание
231
воды в зародыше форели увеличивается во время развития за счет перераспределения воды в системе зародыш —• желток. При этом происходит не только увеличение абсолютного количества воды» но и увеличение ее относительного содержания в зародыше. В желтке содержание воды уменьшается. Позднее Шеминский (Scheminsky, 1929) подтвердил эти данные, показав, что содержание воды в желточном мешке зародышей форели падает с 66 до 50%. У яиц атлантического лосося содержание воды в желтке падает от 63,5 в начале развития к 62,0 в середине развития до 59,0% во время вылупления (Hayes a. Armstrong, 1942). Таким образом, у лососевых рыб увеличение содержания воды в развивающихся зародышах происходит за счет желтка.
Обновление воды. Водный обмен у зародышей рыб характеризуется не только поступлением или выходом воды, но и скоростью ее обновления, которое не обязательно связано с увеличением содержания воды в яйцах. При помощи воды, меченной дейтерием или стабильным изотопом кислорода О18, многие авторы (стр. 186) показали, что обновление воды у яиц лососевых рыб происходит только в первое время после оплодотворения или активации, а затем прекращается: яйца становятся непроницаемыми для воды. Однако зародыши форели, начиная со стадии формирования глаз, вновь способны к обновлению воды с окружающей средой (Krogh а. Ussing, 1937). В табл. 51 приведены данные Крога и Юссинга
Таблица 51
Разбавление раствора D2O яйцами форели с двух стадий развития (Krogh a. Ussing, 1937)
Время, час Концентрация D2O в среде
оплодотворенные яйца (вес 8,9/6 г) зародыши с глазами (вес 8,468 г)
0,0 2,975 2,975
2,0 — 2,735
3,5 2,905 —
19,0 2,903 2,489
24,0 2,905 2,367
Концентрация D2O в яйцах 0,000 1,006
(1937), измеривших обновление воды у зародышей форели при помощи DjO на двух стадиях развития. Через несколько часов после оплодотворения обновления воды в зародышах
232
не наблюдалось, однако к стадии замыкания бластопора (за-
родыш с глазами) D2O заметно проникает в яйца (неболь-
шое начальное разбавление раствора РаО оплодотворенными яйцами зависит от обмена с водой перивителлиновой жидкости). В опытах, в которых яйца помещались в раствор D2O на стадии, когда у зародышей появляются глаза, разбавление раствора происходит значительно сильнее, что свидетельствует о проникновении меченой воды в яйца. Это подтверждается и определением содержания D2O в самих зародышах (табл. 51). Авторы считают, что проникновение D2O в зародыши форели на поздних стадиях развития связано с началом функционирования почек, когда предпочечные канальцы открываются наружу. Так как эти наблюдения имеют принципиальный интерес для изучения водного обмена у зародышей рыб, я поставил проверочные опыты на яйцах сига. Яйца по 100 штук помещались в 3 см3 1,4%-ного раствора Н2О18 и измерялась убыль концентрации меченой воды из среды. Для определения концентрации Н2О18 применялся «метод падающей капли».
На рис. 63 приводятся данные опытов, проведенные на 5 стадиях развития зародышей сига. В первые 15 суток после оплодотворения при помещении яиц в меченую воду •происходит быстрое уменьшение
Рис. 63. Скорость разбавления 1,4%-ного раствора Н2О18 яйцами сига на разных стадиях развития
I — 29 час после оплодотворения (стадия 4-х бластомер); 2—15 суток; 5 — 30 суток (стадия замыкания бластопора); 4 — 65 суток; 5 — 91, сутки
1,3
1,3
1,1
1,0
1,3
1,3
1,1
1,3
1,2
1,
1
V _ л
о
2
°\ о
О
3
ч
а
О\"
о”
L 5
I
?
0 10 20 30 10 30 Часы
233
концентрации НгО18 в среде, которое прекращается через 4—6 час. В это время разбавление раствора происходит благодаря обмену Н2О18 с НгО перивителлинового пространства: расчет по формуле (7) показывает, что количество обменивающейся воды у одного яйца v = 4,71—4,98 мм3, а объем перивителлинового пространства — 4,88 мм3. На стадии замыкания бластопора (30 суток после оплодотворения) концентрация раствора НгО18 в среде при помещении в него яиц падает значительно сильней, чем на предыдущих стадиях развития, и продолжается в течение всего опыта. Такой же характер кривых разбавления имеется и в опытах с яйцами всех более поздних стадий развития. Вычисляя количество воды, обновляющейся за 2 суток, мы получим v = 8,16 мм3 Вычитая объем перивителлинового пространства, найдем, что обновляется около 3,28 мм3 или- 63% объема зародыша. Так как в яйцах сига содержится 60—65% воды, то эти данные показывают, что за 48 час. в зародышах сига поздних стадий развития обменивается практически вся вода. Интересно, что скорость обновления воды у зародышей на разных стадиях развития примерно одинакова.
Таким образом, у сига вода не проникает в зародыши и в желток до стадии замыкания бластопора, но начиная с этой стадии и позднее происходит обновление воды приблизительно с одинаковой скоростью на разных стадиях. Возможно, что как и у зародышей лососевых рыб, обновление воды на поздних стадиях развития зародышей сига зависит от начала функционирования предпочек.
4. ПОТРЕБЛЕНИЕ ВОДЫ ИЗ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ЗАРОДЫШАМИ ОСЕТРОВЫХ РЫБ И МИНОГ
Как отметил недавно Н. Л. Гербильский (1958), по типу дробления, происхождению, структуре и судьбе желточной энтодермы, преемственной связи между желточным мешком и желудком, по происхождению и функции железы вылупления и некоторым другим признакам осетровые рыбы стоят ближе к амфибиям, чем к костистым. В отношении характера потребления воды зародышами из окружающей среды во время развития осетровые рыбы (и миноги) также имеют больше сходства с зародышами амфибий, чем с зародышами костистых рыб. Поэтому для лучшего понимания вопросов, связанных с водным обменом у зародышей осетровых рыб и миног, мы будем в дальнейшем часто сопоставлять их с зародышами амфибий.
Осетровые. Изучение потребления воды зародышами осетра, севрюги и белуги проводилось мною путем определе
234
ния их плотности методом падения яиц в трубке с 0,27 М сахарозой. Измерения проводились на икре, взятой непосредственно из инкубационных аппаратов, так как даже непродолжительное (4—8 час) пребывание икры в лаборатории резко сказывается на водном обмене зародышей, что связано с неблагоприятными условиями развития икры в лаборатории (высокая температура, дефицит кислорода и др.). Перед измерениями с яиц удаляли капсульную оболочку и оставляли внутреннюю желточную оболочку. Как уже говорилось, перивителлиновое пространство у яиц осетровых рыб на большинстве стадий развития незначительно, так как внутренняя желточная оболочка плотно прилежит к поверхности зародыша.
При помощи метода падения яиц в трубке было изучено потребление воды яйцами от 7 самок белуги, 10 самок осетра и 8 самок севрюги. Эти данные суммированы на рис. 64. Так как каждое измерение проводилось на 10 яйцах, то каждая точка является средним из измерения на 70 яйцах белуги, 100 осетра и 80 севрюги. Развитие яиц из разных партий икры проходило при разных температурах, поэтому сравнение велось по стадиям развития,а шкала времени,показанная на рис. 64, относится к развитию яиц белуги при 15°. Яйца белуги, осетра и севрюги имеют разный объем. Для сравнимости степени оводнения яиц на рис. 64 приводятся данные о поступлении воды на единицу исходного объема яиц. Как видно из рис. 64, степень и скорость оводнения яиц отличаются у разных видов осетровых рыб, но общий характер кривых потребления воды сходен у всех трех видов. Можно установить пять периодов в водном обмене яиц, характеризующихся сходной скоростью поступления воды из окружающей среды на протяжении всего периода и резким изменением скорости поступления воды при переходе в другой период (Зотин, 1953а, 1955а).
I период — от оплодотворения до стадии начала гаструля-ции. На этих стадиях развития у всех трех видов яйца интенсивно захватывают воду из окружающей среды. Оводнение яиц в расчете на единицу объема в этот период у зародышей севрюги происходит в большей степени и с большей скоростью, чем у яиц белуги, и у яиц белуги больше, чем у яиц осетра. Так как кривая поступления воды в яйца имеет вид прямой, легко вычислить скорость вхождения воды в яйца. Она равна количеству воды, проходящей через единицу поверхности за единицу времени. Расчеты показывают, что в I период скорость вхождения воды в яйца севрюги при 17° равна 1,07 -10-4, у яиц белуги 0,54 • 10-4 (t=ll°), у яиц осетра 0,94 • 10~4 мг • мм~2 • мин~' (t=15°).
235
Рис. 64. Потребление воды из окружающей среды развивающимися зародышами осетра (/), белуги (2) и севрюги (3). Время, показанное на оси абсцисс, относится к зародышам белуги.
В конце периода происходит резкое уменьшение скорости поступления воды в яйца. Этот момент варьирует у яиц, полученных от разных самок, от стадии 13 до 14+ (по Детлаф и Гинзбург, 1954). Причины различия во времени окончания I периода не совсем ясны. Возможно они зависят от варьирования размеров яиц.
II — период от стадии начала гаструляции до стадии перед замыканием бластопора. В начале II периода скорость поступления воды в яйца резко падает (у севрюги до 4,46-10’6, у осетра до 5,76 • 10-6, у белуги до 4,3-10’6). В дальнейшем яйца потребляют воду из окружающей среды в незначительном количестве по сравнению с предыдущим периодом. Степень оводненности у яиц севрюги в этот период больше, чем у яиц белуги, и у яиц белуги больше, чем у яиц осетра (рис. 64). Скорость поступления воды в яйца близка у
236
всех трех видов. Так же, как и в предыдущем периоде, начало перехода к следующему периоду варьирует у зародышей разных самок от стадии 17 до 18 (Детлаф и Гинзбург, 1954).
III период — от стадии замыкания бластопора до стадии закладки сердца (сердце в виде прямой трубки). В этот период у осетра и белуги происходит наиболее интенсивный захват воды из окружающей среды. У яиц осетра скорость поступления воды равна 1,6 -10~4, у яиц белуги— 1,15- 10"4, у яиц севрюги — 8,42 • 10~4 мг • мм-2 • мин-1. Количество воды, поступившей на единицу объема из окружающей среды, к этому времени достигает у зародышей осетра и белуги того же значения, что и у зародышей севрюги, а в конце периода становится наибольшей у зародышей осетра и наименьшей — у зародышей севрюги. Период оканчивается на стадии 27 по Детлаф и Гинзбург.
IV период — от стадии, когда сердце представлено прямой трубкой до стадии, следующей за началом пульсации сердца. У всех трех видов на стадии закладки сердца происходит резкий переход от максимальной скорости поступления воды к прекращению поступления воды в яйца. На протяжении всего периода поступление воды в яйца практически не происходит.
V период — от стадии пульсации сердца до вылупления зародышей из оболочек. После начала пульсации сердца яйца белуги и осетра снова начинают интенсивно захватывать воду из окружающей среды. Яйца севрюги воду из окружающей среды в этот период не потребляют. Эти различия легко объяснить следующим образом. Как было показано выше, у яиц белуги и осетра на этих стадиях развития происходит растягивание оболочек и увеличение объема перивителлинового пространства за счет поступления воды из окружающей среды, чего нет у яиц севрюги. Только в самом конце развития, перед вылуплением зародышей из оболочек у яиц севрюги, так же как у яиц белуги и осетра, происходит быстрое растяжение оболочек, связанное с ослаблением оболочек под действием фермента вылупления (на рис. 64 не показано).
Скорость поступления воды в яйца осетра на протяжении V периода равна 5,5 • 10“5, у яиц белуги 6,2 • 10~5 мг-мм-^мин-1.
\т и IV периоды отличаются от остальных периодов и другими особенностями в водном обмене. Для того, чтобы понять эти особенности, необходимо рассмотреть данные об изменении осмотических свойств зародышей осетровых рыб во время развития. Раньше мы подробно рассмотрели осмотические свойства неоплодотворенных и оплодотворенных яиц рыб. Было показано, что после помещения оплодотворенных
237
Рис. 65. Изменение уровня воды, легко отдаваемой яйцом в 0,27 М сахарозе, во время развития яиц осетра (1), белуги (2) и севрюги (3)
яиц осетровых рыб и амфибий в гипертоническую среду происходит выход около 8—10% воды из яйца (легко отдаваемая яйцом вода). Остальную воду живые зародыши осетровых рыб в гипертонической среде не отдают независимо от концентрации осмотически активных веществ в среде (более прочно связанная в яйце вода). Количество воды, легко отдаваемой яйцом, у белуги, осетра и севрюги измеряли на тех же стадиях, как и само потребление воды во время развития (рис. 64). Для этого яйца после первого определения скорости падения оставляли в 0,27 М растворе сахарозы до тех пор, пока не прекращался выход воды из яиц (скорость падения яиц в трубке измеряли через 10,30 и 60 мин).
На рис. 65 показаны кривые изменения уровня воды, легко отдаваемой яйцом у белуги, осетра и севрюги во время развития от стадии только что оплодотворенного яйца до стадии вылупления. У севрюги в первые три периода водного обмена количество воды, легко отдаваемой яйцом, почти не изменяется (к стадии замыкания бластопора оно даже несколько уменьшается). Следовательно, в это время осмотйче1 ские свойства зародышей практически не изменяются. На
238
стадии закладки сердца у зародышей севрюги уровень ъоды. . легко отдаваемой яйцом, начинает быстро увеличиваться (рис. 65). Это увеличение продолжается весь четвертый период и прекращается с переходом в пятый период. Сопоставление этих наблюдений с данными об изменении объема пери-вителлинового пространства во время развития показывает, что увеличение количества легко отдаваемой воды у яиц севрюги зависит от возникновения и увеличения на этих стадиях перивителлинового пространства. Осмотические свойства самих зародышей на этих стадиях остаются вероятно такими же, как и на предыдущих стадиях развития. Изменение уровня воды, легко отдаваемой яйцами белуги и осетра, сходно с соответствующими изменениями у зародышей севрюги (рис. 65). Отличия в пятом периоде связаны с тем, что в этот период у яиц белуги и осетра происходит растягивание оболочек, т. е. увеличение перивителлинового пространства за счет воды, поступающей из окружающей среды.
Хотя увеличение в яйцах осетровых рыб в IV периоде количества легко отдаваемой воды зависит от возникновения перивителлинового пространства, все же изменения, происходящие с самими зародышами, в это время имеют принципиальное значение для их водного обмена. Дело в том, что на этой стадии развития зародыши осетровых рыб не потребляют воды из окружающей среды (рис. 64), и, следовательно, перивителлиновая жидкость образуется за счет сокращения объема зародышей. Это было показано при изучении изменения веса фиксированных формалином зародышей (рис. 59) и ясно видно из данных по изменению уровня воды, более прочно связанной в яйце (рис. 66). У трех изученных видов осетровых рыб в IV период развития происходит быстрое уменьшение уровня более прочно связанной воды, что указывает на выход жидкости из зародышей и переход ее в перивителлиновое пространство. Эти наблюдения позволяют разделить весь период развития зародышей осетровых рыб в отношении их водного обмена на два этапа (рис. 65 и 66): до закладки сердца и после закладки сердца.
Приведенные данные показывают, что с качественной стороны потребление воды собственно зародышами лучше всего характеризуется кривыми изменения уровня воды, более прочно связанной в яйце. Из рис. 66 мы видим, что в то время как в IV период поступления воды из окружающей среды в яйцо (зародыш + внутренняя желточная оболочка) не происходит и скорость поступления воды близка нулю, сам зародыш теряет воду со скоростью примерно 5-1СН5 мг-мм~2-мин. В V период яйца осетра и белуги потребляют воду со скоростью 5—6 10~5 мг-мм~2-мин~1, но сам зародыш воды не
239
Рис. 66. Изменение уровня более прочно связанной воды у яиц осетра (1), белуги (2) и севрюги (3) во время развития
потребляет. В первые периоды скорость поступления воды в яйца с желточной оболочкой совпадает со скоростью поступления воды в зародыши осетра, белуги и севрюги.
Данные о потреблении воды яйцами осетра и белуги были подтверждены при изучении скорости обновления воды на разных стадиях развития при помощи D2O. На рис. 67 приведены кривые разбавления 4,5%-ного раствора D2O при помещении в 2 см3 100 яиц осетра, лишенных капсульной оболочки, на стадии 8 бластомер (стадия 6 — по Детлаф и Гинзбург, 1954), поздней гаструлы (стадия 17) и стадии, когда хвост достиг головы (стадия 32). На всех трех стадиях характер кривых сходен: сначала происходит быстрое уменьшение концентрации D2O, связанное с обменом меченых молекул воды с водой яиц, затем обмен D2O^H2O прекращается (через 50— 60 мин после помещения яиц в раствор). Однако степень разбавления раствора D2O на разных стадиях развития различна, так как разбавление зависит от количества воды, содержащейся в зародышах и способной к обмену с окружающей средой. Во время развития (рис. 64) происходит поступление воды в яйца осетра, поэтому понятно, что на поздних стадиях количество воды, способной к обмену с D2O, увеличивается.
Это доказывается следующими простыми расчетами. На стадии 6 равновесная концентрация D2O (ср) равна 3,05%, на стадии 17 — 2,90%, на стадии 32 — 2,30% (рис. 67). Рассчитывая по формуле (7) количество обнов-240
Рис. 67. Скорость разбавления 4,5%-ного раствора D2O яйцами осетра на разных стадиях развития
I — стадия 8-и бластомер; 2 — поздняя гаструла; 3 — стадия, когда хвост достиг головы; 4 — поздняя гаструла, яйца убиты высокой температурой
ляющейся воды в зародышах на этих стадиях, получим для стадии 6 — 0,0094 см5, для стадии 17 — 0,0110 слг3 и для стадии 32 — 0,0190 см3. Отсюда разница в количестве обновляющейся воды между стадией 6 и 17 равна 0,0016 см3, а между стадиями 17 и 32 — 0,0080 см3. Из данных,,приводимых ид рис. 64, можно вычислить разницу в количестве воды в яйцах на этих стадиях. Она равна соответственно 0,0010 и 0,0060 см3. Совпадение цифр вполне удовлетворительное.
Наконец, следует остановиться на опытах по влиянию гипертонических растворов на потребление воды яйцами осетровых рыб. Было проведено 6 опытов на яйцах севрюги, осетра и белуги, давших одинаковые результаты. Данные, полученные при изучении влияния 0,25 М раствора сахарозы на
16 А. И. Зотин 241
яйца белуги, лишенные капсульной оболочки, показаны на рис. 68. Оказалось, что при помещении яиц на любой стадии развития в раствор сахарозы происходит полная остановка потребления воды яйцами из окружающей среды. Это показывает, что сила, равная осмотическому давлению 0,25 М раствора сахарозы, предотвращает поступление воды в зародыши белуги на любой стадии развития.
Рис. 68. Влияние 0,25 М раствора сахарозы на потребление воды яйцами белуги (без капсульной оболочки). Стрелками указано время помещения яиц в раствор сахарозы; цифрами — стадия развития по Детлаф и Гинзбург, 1954
1 — потребление воды из окружающей среды; 2—изменение уровня воды, более прочно связанной в яйце
Миноги. Зародыши миног, так же как зародыши осетровых рыб, потребляют воду из окружающей среды во время развития. В табл. 52 приведены данные Хардисти (1957), измерявшего размеры (диаметр) собственно яйца Lampetra planeri до стадии поздней гаструлы, а затем, когда форма зародышей изменялась настолько, что диаметр не характеризовал их размеры, взвешивавшего зародыши.
Вес неоплодотворенных яиц миноги (табл. 51) относится не только к собственно яйцу, но и к яйцевым оболочкам. С поправкой на вес оболочек он должен быть равен 0,534 мг.
242
Таблица 52
Объем и сырой вес зародышей миноги на разных стадиях развития при температуре 11—12° (Hardisty, 1957)
Стадия Объем, мм3 Сырой вес, мг
Неоплодотворенные яйца 0,509+0,007 0,633+0,017
3 дня (бластула) 0,709+0,007 —
5 дней (гаструла) 0,816+0,008 —
11—13 дней — 0,612^+0,019
15—16 дней — 0,618+0,035
17 дней (вылупление) — 0,617+0,012
Автор показал, что за первые 5 дней развития объем зародыша увеличивается на 0,31 мм3, следовательно, сырой вес зародышей на стадии гаструлы должен быть не меньше 0,84 мг (сухой вес яиц за время развития до гаструлы уменьшается не больше чем на 0,02 мг). Таким образом, к 11-му дню развития происходит уменьшение сырого веса зародышей на 0,2 мг или на 24% по сравнению со стадией гаструлы. Это приводит к тому, что зародыши на стадии вылупления имеют сырой вес лишь немного больший, чем у зрелых неоплодотворенных яиц. С 11 дней и до стадии вылупления (17 дней) сырой вес зародышей не меняется.
Из наблюдений, проведенных Хардисти (1957), следует, что у зародышей миног можно выделить лишь три периода в водном обмене зародышей: I период (от оплодотворения до стадии гаструляции, 5 суток) — поступление воды в зародыши из окружающей среды со скоростью 0,009 ммг[мм2!мин-, II период (время которого не установлено)—выход жидкости из зародыша в перивителлиновое пространство, III период (по-видимому, со стадии несколько раньше 11 дней развития и до стадии вылупления) — содержание воды в зародышах не меняется.
Амфибии. Наконец, мы должны остановиться, хотя бы кратко, на потреблении воды зародышами амфибий, которые так же, как зародыши осетровых рыб и миноги, потребляют воду из окружающей среды во время развития (Morgan, 1906; Dempster, 1930, 1933; Atlas, 1938; Briggs, 1939; Brown, 1941, и др.).
Демпстер (Dempster, 1930, 1933) нашел, что объем и сырой вес зародышей Amblystoma punctatum непрерывно увеличивается во время развития, кроме стадии нейрулы, когда он уменьшается. Бригс (1939) и Браун (1941) измеряли плот
16*
243
ность зародышей Rana pipiens и Amblystoma maculatum во время развития в трубках с раствором гуммиарабика различной плотности. От оплодотворения до стадии ранней ней-рулы плотность уменьшается линейно от 1,1065 до 1,0501. Во время смыкания нервных валиков и удлинения зародышей плотность быстро возрастает до 1,085, затем постепенно опять снижается к стадии вылупления до 1,048. Снижение плотности в это время идет медленнее, чем до нейрулы. Тафт (Tuft, 1957) измерял объем зародышей Xenopus laevis, определяя плотность и редуцированный вес при помощи декартова поплавка, и нашел точно такие же особенности в потреблении воды, что и другие авторы (см. рис. 71).
Таким образом, у зародышей амфибии имеются также три периода в водном обмене: I период — от оплодотворения до нейрулы, когда в зародыши поступает вода из окружающей среды; II период — нейруляция, в это время зародыши секретируют жидкость в перивителлиновое пространство и уменьшаются в объеме; III период — от смыкания нервных валиков до вылупления, когда вновь происходит поступление воды в зародыши.
Поступление воды в зародыши R. pipiens предотвращается гипертоническими солевыми растворами (Holtfreter, 1943).
В заключение следут высказать некоторые соображения относительно различий в водном обмене зародышей костистых рыб, осетровых и миног. Чем определяются эти различия? Мы не можем свести эти различия к экологии развития зародышей, так как осетровые рыбы и миноги по экологии развития мало отличаются от многих костистых рыб. Следовательно, различия в характере потребления воды зародышами определяются физиологическими особенностями и строением яиц осетровых рыб и миног, которые в этом отношении ближе стоят к яйцам амфибий и костных ганоидов, чем к яйцам костистых рыб. Яйца (желток) костистых рыб содержат значительно больше воды, чем яйца осетровых рыб и миног: даже Донные, пресноводные неоплодотворенные яйца костистых рыб содержат 64—67% воды, в то время как неоплодотворенные яйца! осетровых рыб — 54, яйца миног — 57 (табл. 37), яйца амфибий 54—57% (см. Needham, 1931). Следовательно, зародыши костистых рыб с самых первых стадий развития в значительно большей степени обеспечены водой по сравнению с зародышами осетровых рыб, миног и амфибий. Нужда развивающихся зародышей костистых рыб полностью удовлетворяется этими запасами воды. 1пы уже отмечали, что этот вывод подтверждается и прямыми опытами, показавшими (Domurat, 1956), что зародыши кумжи, щуки и плотвы могут развиваться в безводной среде (вазелиновое масло). Наобо
244
рот, зародыши осетровых рыб, миног и амфибий вынуждены потреблять воду из окружающей среды. Кроме того, как будет показано в следующей главе, во время развития зародышей осетровых рыб, миног и амфибий, в отличие от зародышей костистых рыб, происходит возникновение обширных полостей, для образования жидкости которых необходимы дополнительные количества воды.
У зародышей живородящих рыб отличия в потреблении воды во время развития от других костистых рыб можно также объяснять тем, что в неоплодотворенных яйцах живородящих рыб содержится всего 35—53% воды в желтке. Поэтому потребности в воде зародышей живородящих рыб удовлетворяются за счет поступления воды из организма матери через псевдо-плаценту.
Несколько слов о роли изменения объема оболочек и перивителлинового пространства как регуляторов плотности зародышей осетровых рыб во время развития. Поступление воды из окружающей среды уменьшает плотность зародышей. В противоположность этому уменьшение толщины студенистой оболочки ведет к увеличению плотности яиц. Плотность яиц в целом, благодаря этим двум противоположно идущим процессам, изменяется незначительно. Отсюда биологический смысл процесса уменьшения толщины и увеличения плотности студенистой оболочки зародышей осетровых рыб состоит в том, что он нейтрализует быстрое уменьшение плотности самих зародышей и приблизительно сохраняет постоянство плотности яйца в целом. Необходимость сохранения неизменной плотности яиц связана с особенностями экологии развития осетровых рыб. Как известно, осетровые откладывают икру на речных каменистых перекатах в реках с быстрым течением (см. Крыжановский, 1949; Детлаф и Гинзбург, 1954). Икра приклеивается к камням и крупной гальке. Показано, что в естественных условиях икра развивается в приклеенном состоянии (Алявдина, 1951, 1952). Если бы происходило значительное уменьшение плотности приклеенных яиц осетровых рыб, то резко увеличилась бы возможность отрыва яиц от грунта и их перенесение током воды в плохие условия развития.
Глава VIII
ПОСТУПЛЕНИЕ ВОДЫ И ОБРАЗОВАНИЕ ПОЛОСТЕЙ У ЗАРОДЫШЕЙ ВО ВРЕМЯ РАЗВИТИЯ
Как уже отмечалось, образование наполненных жидкостью полостей является одной из главных причин потребления воды из окружающей среды зародышами осетровых рыб, миног и амфибий. Действительно, в отношении образования полостей зародыши осетровых, миног и амфибии резко отличаются от зародышей костистых рыб. На рис. 69 показано строение полости бластулы и гаструлы у зародышей атлантического лосося. У зародышей костистых рыб при дроблении почти не возникает полости дробления (Wilson, 1889; Берг, 1899; Sumner, 1903; Kopsch, 1911; Battle, 1944, и др.). Лишь у некоторых костистых рыб на поздних стадиях дробления возникает небольшая относительно всего яйца полость бластулы (см. Иванов, 1937; Шмидт, 1951, 1953). Гаструляция у костистых рыб также проходит без образования полости: инвагинирующий многослойный слой вдвигается в бластоцель между диском и перибластом, плотно прижимаясь к тому и другому (рис. 69). У зародышей осетровых рыб (рис. 73), миног и амфибий, наоборот, при дроблении образуется обширная полость, которая сохраняется и на стадии гаструлы в виде полости первичной кишки (Schultze, 1856; Goette, 1875; Заленский, 1878; Иванов, 1937; Шмидт, 1953; Nelson, 1953; Whitehouse a. Grove, 1957).
1. СВЯЗЬ ПОСТУПЛЕНИЯ ВОДЫ В ЯЙЦА
ИЗ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ С ОБРАЗОВАНИЕМ ПОЛОСТЕЙ
Для доказательства того, что вода, поступающая в зародыши осетровых рыб из окружающей среды, используется для образования жидкости полостей, было измерено изменение объема полостей во время развития зародышей. С этой целью производились зарисовки контуров зародышей и его полостей 246
Рис. 69. Строение зародышей атлантического лосося на стадиях до начала дробления (а), дробления (б, в) и гаструляции (г, д)
б. д,— бластодиск; б. м.— бластомеры; д. г.— дорзальная губа бластопора; ж.— желток; ж. г.— желточные гранулы; ж. к.— жировые капли; кл.— клеточный пласт; п.— полость; п. д.— полость дробления; пер.~ пернбласт; п. эк.— первичная эктодерма;
п. эн.—первичная энтодерма; ai — эпителиальный клеточный слой (Battle, 1944)
по полной серии срезов зародышей, фиксированных 4%-ным формалином, жидкостью Буэна или Санфеличе (Зотин, 1957). Рисунки вырезали и взвешивали на аптекарских весах; сначала все рисунки зародышей, включая полости, затем отдельно все рисунки полостей. Вес рисунков зародыша и его полостей
Рис. 70. Изменение объема полостей зародышей севрюги и потребление ими воды из окружающей среды
/ — потребление воды зародышами из среды; 2—общий объем полостей; 3— объем бластоцеля; 4— полость первичной кишки (позднее кишка); 5 — все остальные полости (включая перикард — 6)
пропорционален объему зародыша и его полостей, поэтому, выражая вес рисунков полостей в процентах от веса рисунков всего зародыша, можно получить объем полости зародыша, в процентах. На рис. 70 показано изменение общего объема полостей зародышей севрюги на разных стадиях развития от оплодотворения до вылупления зародышей из яйцевых оболочек. Для сравнения приведена кривая поступления воды в эти же зародыши во время развития (поступление воды изучалось у зародышей, находящихся во внутренней желточной оболочке). Как видно на рис. 70, потребление воды зародышами севрюги из окружающей среды тесно связано с изменениями объема полостей не только с количественной, но и с качествен
248
ной стороны: периодизация, установленная для потребления воды зародышами осетровых рыб из окружающей среды, совпадает с периодизацией в изменении объема полостей зародышей. В I период (стадия 2—13 — по Детлаф и Гинзбург) идет быстрое поступление воды в зародыши, в это же время происходит быстрое увеличение объема бластоцеля (рис. 70). Во II период (стадия 13—17) потребление воды зародышами прекращается, прекращается и увеличение объема полости бластоцеля. В конце II периода полость бластоцеля резка уменьшается и исчезает. В это же время возникает и быстро увеличивается новая полость — гастроцель (рис. 70). С этого момента начинается III период, в течение которого объем гастроцеля, а позднее (приблизительно со стадии 23) полости кишки, быстро увеличивается и к концу периода достигает максимальной величины. Вода поступает из окружающей среды в зародыши параллельно увеличению полости кишки. В IV период объем внутренних полостей зародыша резко уменьшается, в основном благодаря уменьшению объема полости кишки (рис. 70). Мы уже видели, что в этот же период происходит сокращение объема зародышей и выход из них жидкости в перивителлиновое пространство. Общий объем яйца во внутренней желточной оболочке в этот период не изменяется. Одновременно с уменьшением содержания воды в зародышах за счет резкого сокращения объема полости кишки в IV периоде возникают и увеличиваются в объеме новые полости. Часть из этих полостей возникает еще в середине III периода, но в IV периоде они начинают быстро увеличиваться в размерах. Со стадии 23 одновременно с образованием нервной трубки появляется и постепенно увеличивается в объеме полость нервной трубки. Увеличение полости нервной трубки происходит в основном за счет увеличения объема полостей головного мозга (Зотин, 1957). В начале IV периода появляется и быстро увеличивается полость перикарда (рис. 70). В это же время появляются, так называемые головные полости и полости слуховых пузырьков. В V периоде объем общих внутренних полостей зародышей несколько уменьшается, потребления воды зародышами в этот период не происходит.
Таким образом, периодизация в потреблении воды из окружающей среды, найденная у зародышей осетровых рыб, зависит от закономерного изменения (возникновение, увеличение и исчезновение) внутренних полостей зародыша. Если это так, то и у других видов животных (миног, амфибий, морских ежей), у которых зародыши потребляют воду из окружающей среды, периодические изменения этого процесса должны зависеть от изменения размеров полостей. И, действительно, у зародышей морских ежей, которые имеют большую полость
249
дробления и гаструлы (см. Иванов, 1937, 1945; Заварзин, 1939; .Шмидт, 1953; .и др..),, во время развития происходит уменьшение плотности зародышей и потребление воды из окружающей среды (Lyon, 1907; Salzen, 1956, 1957). У зародышей миноги также во время развития образуются обширная полость дробления и гастроцель (Schultze, 1856; Иванов, 1937; Чека-новская, 1941; Шмидт, 1953, и др.). Исчезновение полости первичной кишки у зародышей миноги происходит в конце гаструляции (Schultze, 1856; Чекановская, 1941). Данные о потреблении воды зародышами миноги легко поэтому объяснить изменением объема полостей. На стадии дробления и гастру-ляции, когда происходит непрерывное увеличение объема полостей, зародыши потребляют воду из окружающей среды. В конце гаструляции гастроцель резко сокращается в объеме, примерно в это же время происходит уменьшение объема и веса зародышей миноги (рис. 60, табл. 52).
Различия в периодизации водного объема у зародышей осетровых рыб и миног зависят от следующих причин.
1. У зародышей осетровых рыб увеличение полости бластулы прекращается к началу гаструляции, и на протяжении стадии гаструлы практически не происходит. В отличие от этого у зародышей миноги увеличение полости бластулы происходит не только на стадиях дробления, но и продолжается во время гаструляции. Поэтому у зародышей миноги потребление воды за время дробления и гаструляции я выделил в один период, тогда как у зародышей осетровых рыб в два периода.
2. В конце гаструляции у зародышей осетровых рыб возникает полость первичной кишки, которая начинает быстро увеличиваться в объеме, что влечет за собой новое поступление воды в зародыши из окружающей среды. У зародышей миноги в это время также происходит исчезновение полости бластулы, но новой полости у зародышей не образуется, поэтому они в этот период не воспринимают воду из окружающей среды, а, наоборот, отдают ее.
3. На стадиях формирования сердца у зародышей осетровых рыб происходит сходный процесс: исчезновение полости кишки. Таким образом, сильное уменьшение объема полостей происходит и у зародышей осетровых рыб и миног, но на различных стадиях развития.
То же самое можно сказать о зародышах амфибий. Бригс (Briggs, 1939) показал, что уменьшение плотности зародышей Rana pipiens на стадиях дробления и гаструляции связано с увеличением объема бластоцеля и гастроцеля на этих стадиях. Увеличение плотности зародышей на стадии нейрулы, характерное для зародышей амфибий, зависит от уменьшения об-.ема полости первичной кишки: объем полости первичной киш-.250
ки на стадии поздней нейрулы уменьшается на 24% по сравнению с раннней нейрулой, при этом жидкость полости первичной кишки переходит в перивителлиновое пространство (Briggs, 1939). Сходные данные получены для зародышей Amblystoma maculatum (Brown, 1941) и для зародышей Хе-nopus laevis (Tuft, 1957). На рис. 71 приводятся данные Тафта ,(1957) по увеличению объема зародышей X. laevis и объема
Рис. 71. Увеличение общего объема зародышей Xenopus laevis и объема их полостей во время развития (Tuft, 1957).
их полостей во время развития. Как видно из этих наблюдений, первоначальное увеличение объема зародышей зависит главным образом от увеличения объема бластоцеля и полости первичной кишки. Затем происходит резкое сокращение объема полости первичной кишки, сопровождающееся уменьшением объема зародышей. Таким образом, первые два периода в водном обмене зародышей амфибий, характеризующиеся потреблением воды (в первый период), а затем выходом воды (второй период), объясняются первоначальным увеличением объема полостей и последующим их сокращением.
Сложнее обстоит дело с пониманием оводнения зародышей амфибий в 1Г1 периоде (рис. 71) и небольшим оводнением зародышей осетровых рыб в V периоде, который аналогичен III периоду зародышей миног и амфибий. У зародышей осетро
251
вых рыб на поздних стадиях развития, несомненно, происходит оводнение тканей зародышей: несмотря на резкое уменьшение объема оводненных полостей у зародышей в IV и V периоды, уровень более прочно связанной воды у них все еще достаточно велик и даже выше, чем во время гаструляции (рис. 66). Как видно на рис. 66, на образование перивителлиновой жидкости идет только часть жидкости, содержащейся в полости кишки. Значительное количество воды сохраняется в зародышах: часть ее идет на образование жидкостей новых полостей (перикарда, полости нервной трубки, головных полостей и т. д.) и кровеносной системы, а часть, по-видимому, на оводнение тканей (на этих стадиях большое развитие получают соединительнотканные структуры).
У зародышей амфибий в III периоде, после резкого уменьшения объема полости первичной кишки, продолжается увеличение объема зародышей, которое так же трудно объяснить только возникновением новых полостей.
К сожалению, мы еще очень мало знаем о содержании воды и ее изменении в разных тканях и частях зародышей. Для зародышей Amblystoma maculatum, A. tigrinum, А. арасшп и Rana palustris доказано, что плотность презумтивной нервной ткани несколько уменьшается во время дробления, гаструляции и нейруляции (Brown, Hamburger a. Schmitt, 1941). Раппопорт (Rappaport, 1954) измерял изменения плотности эксплантатов кончика хвоста аксолотля .и лягушки, взятых со стадии хвостовой почки, и эксплантатов жаберной области зародышей аксолотля в зависимости от увеличения их размеров. Оказалось, что изменение плотности эксплантатов в зависимости от увеличения их размеров совпадает с теоретической кривой, основанной на предположении, что объем эксплантатов увеличивается только за счет поступления воды. Следовательно, увеличение размеров эксплантатов связано с поступлением в них воды. Конечно, в условиях целого организма увеличение размеров отдельных органов происходит не только за счет оводнения тканей, но все же эти опыты показывают вероятное участие воды в увеличении размеров органов зародыша.
Хотя плотность различных тканей зародышей, а следовательно и содержание воды в них, может изменяться во время развития, основным фактором, определяющим потребление-воды из окружающей среды, является образование больших, наполненных жидкостью полостей. Поэтому механизм образования и исчезновения этих полостей является важной и определяющей частью механизма потребления или вывода воды из-зародышей.
2. МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ БЛАСТОЦЕЛЯ
Процесс дробления яиц осетровых рыб и образования полости дробления, или бластоцеля, описан в работах В. В. Заленского (1878), В. Д. Лепешкина (1923), А. М. Завадского-(1926), О. Б. Лепешинской (1934), Т. А. Детлаф и А. С. Гинз
252
бург (1954), А. С. Гинзбург и Т. А. Детлаф (1955). Дробление яиц осетровых рыб является полным и неравномерным. Эта особенность обусловлена строением яйца осетровых рыб (Детлаф и Гинзбург, 1954). Дробление протекает неравномерно, так как основная масса желтка расположена в вегетативной части яйца. В соответствии с неравномерностью дробления бластоцель располагается не в центре зародыша, а ближе к анимальному полюсу (рис. 73).
Полость дробления появляется довольно рано на стадии пятого — шестого деления в виде отдельных щелевидных пространств между анимальными и вегетативными бластомерами. Количество и общий объем таких щелевидных пространств увеличивается по мере дробления. Затем на стадии 9—9+, по ДетДаф и Гинзубург, т. е. на стадии седьмого — восьмого деления, происходит объединение щелевидных полостей и образование небольшой шарообразной полости (рис. 73). Было бы целесообразно название полости дробления относить к стадиям развития, когда образуется щелевидная, медленно увеличивающаяся в объеме полость, а шарообразную полость обозначать, как полость бластулы или бластоцель. Бластоцель отличается от полости дробления не только строением, но и тем, что в отличие от медленного увеличения объема полости дробления полость бластоцеля увеличивается быстро (см. рис. 70). Увеличение объема бластоцеля продолжается до начала гаструляции, когда он достигает своего максимального объема. Во время гаструляции объем бластоцеля не изменяется. Можно, следовательно, выделить четыре стадий изменения объема и строения бластоцеля: стадия возникновения и медленного увеличения объема (полость дробления), стадия быстрого увеличения размеров, стадия, когда размеры бластоцеля не изменяются, и стадия исчезновения бластоцеля.
Увеличение объема бластоцеля, а следовательно и увеличение количества жидкости бластоцеля, происходит одновременно с поступлением воды в зародыши осетровых рыб (см. рис. 70). Можно прямыми опытами показать, что образование полости бластулы не происходит, если вода из окружающей среды не поступает в зародыш. Так, помещение дробящихся яиц в гипертоническую среду и прекращение поступления воды в яйца останавливает процесс увеличения объема бластоцеля (табл. 53). Практически вся вода, поступившая в яйцо от оплодотворения до гаструляции в зародыши осетра и севрюги, используется для увеличения объема бластоцеля (табл. 54).
О. Б. Лепешинская (1934) высказала предположение, что образование жидкости бластоцеля у зародышей севрюги происходит в результате попадания вегетативных бластомер
253
Таблица 53
Влияние 0,25 м раствора сахарозы на образование бластоцеля у зародышей осетра
Помещены в раствор сахарозы на стадии Размеры бластоцеля на стадии 14
Объем полости в % Микрофотографии срезов через зародыш
Таблица 54»
Влияние 0,25 М раствора сахарозы иа образование жидкости бластоцеля у зародышей осетра и севрюги
Стадия, на которой яйца помещены в раствор Объем воды, поступившей к данной стадии в яйца нз окружающей среды, % Объем бластоцеля у зародышей на стадии 14, %
осетр севрюга! осетр севрюга
2 5,45 — 4,63
5 — 1,90 — 1,32
6 7,87 2,10 8,10 1,87
8 — 2,60 — 2,87.
9 — 3,50 — 3,31.
10 — 5,91 .— 4,35-
И — 7,81 — 5,15
12 12,48 — 12,65 .—
14 15,51 9,51 14,55 9,40
в полость, их разрушения и разжижения желточных зерен. Этот взгляд не был подтвержден последующими исследованиями. Я также не смог найти подтверждения данным О. Б. Лепешинской. В некоторых случаях на препаратах можно видеть отдельные бластомеры в бластоцели, но, как правило, эти бластомеры оказываются связанными с клетками стенки или дна полости. Разрушения их в бласто-целе или наличия желточных зерен в ней мне наблюдать не приходилось. Вероятно, О. Б. Лепешинская, использовавшая препараты В. Д. Лепешкина (1923), имела- дело с патологическими явлениями.
Каков же механизм образования бластоцеля? Сейчас еще трудно совершенно точно ответить на этот вопрос, однако существуют все же некоторые подходы к этой проблеме.
Моине и Хард (Моппё a. Harde, 1951а) цитохимическими методами изучали образование бластоцеля и других полостей у зародышей морских ежей. Они нашли, что бластоцель наполнен не жидкостью, а желеобразным веществом. Студены ранней бластулы, по их наблюдениям, всегда значительно лучше сохраняется при фиксации, чем на более поздних стадиях: на ранней бластуле он имеет вид сжатой гомогенной массы, на стадии поздней бластулы — тонкой сети. Авторы считают, что-эти наблюдения указывают на разбухания студня бластоцеля по мере развития. Цитохимическое исследование показало, что студень бластоцеля дает положительную реакцию Хочкисса на полисахариды (Моппё a. Slautterback, 1950; Моппё а. Harde, 1951а). Он дает также положительную реакцию при окраске по методу Гомори и методу Хочкисса после обработки
255.
препаратов слюной и удаления рибонуклеиновой кислоты, а также метохромазию с толуидиновым синим. Это показывает, что студень бластоцеля содержит сульфатсодержащие кислые мукополисахариды. Монне и Слаутербак (1950) разработали способ торможения окрашивания полисахаридов желтка и в тоже время ускорение окрашивания полисахаридов цитоплазмы. Этим путем удалось обнаружить в цитоплазме, расположенной около бластоцеля, большое количество гранул, окрашивающихся фуксин-сульфитом (Моппё a. Harde, 1951а). По мнению авторов, мукоидное вещество накапливается в цитоплазме в виде гранул и на стадии ранней бластулы секретируется в бластоцель, образуя студень бластоцеля. Последующее увеличение студня бластоцеля обусловлено вхождением воды из окружающей среды. Иммерс (Immers, 1956) нашел, что в состав бластоцеля зародышей морских ежей входят два вида мукополисахаридов: эстерифицированные серной кислотой и не эстерифицированные. Перед исчезновением бластоцеля кислые мукополисахариды десульфируются.
В состав бластоцеля зародышей осетровых рыб входят вещества, которые на срезах зародышей, фиксированных 4°/о-ным формалином, хорошо заметны в виде плотного студня. Комочек студнеобразного вещества можно вынуть из фиксированных зародышей, разрезав их пополам или разрушив крышку бластулы. Так же как у зародышей морских ежей, вещество бластоцеля и полости первичной кишки зародышей осетровых рыб дает положительную реакцию на полисахариды (Зотин и Круминь, 1959). Более тщательные исследования показали, что содержимое бластоцеля (и полости первичной кишки) у зародышей, фиксированных 4°/о-ным формалином, состоит из большого количества гранул, окрашиваемых в красно-фиолетовый цвет по методу Хочкисса, и основного вещества. Недавно в предварительном сообщении Джаффи (Jaffee, 1959) сообщил о наличии мукополисахаридов и белков 1 в полости бластоцеля зародышей лягушки. Автор указывает, что в поверхностном слое цитоплазмы бластомеров, прилежащих к бластоцелю, им обнаружены белковые гранулы, которые секретируются в бластоцель.
1 В более ранней работе Грегг и Бэлентин (Gregg a. Ballentine, 1946) не смогли обнаружить наличия белков в жидкости бластоцеля и полости первичной кишки у зародышей Rana pipiens при помощи реакции Миллона. Они нашли, что жидкость бластоцеля содержит СО2, связанный в виде бикарбонатов, и имеют рН=8,0—8,4. Последнее совпадает с данными, полученными для зародышей тритона — рН = 8,4—8,6 (Buytendijk u. Woerde-man, 1927) и аксолотля — рН=8,3 (Stableford, 1949). У зародышей аксолотля pH бластоцеля изменяется за время гаструляции: у Amblystoma punctatum от 8,3 на стадии бластулы до 8,7 на стадии гаструлы; у А. jeffersonianum — от 8,3 до 9,4 (Stableford, 1949)
256
Несмотря на четкость всех этих наблюдений, процесс образования и увеличения студня бластоцеля у зародышей осетровых рыб остается во многом неясным. Т. А. Детлаф (1961) нашла, что студень бластоцеля осетровых рыб не окрашивается, по Хочкиссу, после обработки срезов слюной,что указывает на наличие в бластоцел-е гликогена, а не кислых мукополисахаридов. Т. А. Детлаф (1961) обнаружила также, что содержимое бластоцеля преемственно связано с веществом, секретируемым яйцами после оплодотворения и заполняющим перивителлиновое пространство. Во время дробления, по наблюдениям Т. А. Детлаф, вещество перивителлинового пространства спускается по бороздам дробления и образует жидкость бластоцеля. Для того, чтобы проверить эти наблюдения, мной были поставлены специальные опыты. Найдено, что у яиц осетровых рыб можно легко удалить яйцевые оболочки (включая внутреннюю желточную) сразу после оплодотворения, если яйца обработать ферментом вылупления (Зотин, 19546). Таким способом можно снять оболочки еще до начала первого деления и отмыть яйцо от перивителлиновой жидкости. Если жидкость бластоцеля образуется за счет перивителлиновой жидкости, то у таких яиц не должен образовываться бластоцель нормального объема. Оказалось, что у яиц осетра, с которыми проводились опыты, действительно не образовалось ясно выраженного бластоцеля. На рис. 72 показаны срезы с зародышей, фиксированных 4 %-ным формалином, на стадии поздней бластулы, после удаления у них перивителлиновой жидкости. Яйца осетровых, после удаления у них внутренней желточной оболочки, оседают под собственной тяжестью (Зотин, 19546), поэтому на срезах они имеют сплющенный вид (рис. 72). У таких яиц не удается обнаружить даже следов бластоцеля, хотя в контрольных яйцах образуется вполне сформированный бластоцель. Таким образом, эти данные показывают, что образование жидкости бластоцеля в большой степени зависит от проникновения в полость дробления веществ перивителлинового пространства. Результат этих опытов оказался несколько неожиданным, так как трудно себе представить, что жидкость бластоцеля целиком образуется за счет перивителлиновой жидкости. Даже после этих опытов мне кажется возможным предполагать, что кроме веществ перивителлинового пространства в образовании жидкости бластоцеля принимают участие вещества, накапливающиеся в бластомерах, окружающих полость, и секретируемые в бластоцель. Только в этом случае можно понять тот факт, что во время дробления яиц осетровых рыб поступление воды в яйца идет не по затухающей кривой, как должно было бы быть в случае постоянства количества связывающих воду веществ
17 А. И. Зотин
257
a
Рис. 72. Влияние удаления .перивителлиновой жидкости у яиц осетра на образование бластоцеля а — контроль; б — опыт
в яйце (см. рис. 70). Можно, конечно, представить себе, чтр, попадая в полость дробления, вещества перивителлиновой жидкости подвергаются изменениям, ведущим к резкому уве; личению осмотического давления жидкости бластоцеля. Но первое предположение лучше согласуется с наблюдениями Монне и Харде (1951а), проведенными на яйцах морских ежей, и Джаффи (1959), проведенными наяйцах лягушки, о наличии специальных гранул, секретируемых из бластомеров в . по-; лость дробления и участвующих в образовании вещества бла-; стоцеля. У зародышей осетровых рыб я также наблюдал полисахаридные гранулы как в полости бластоцеля, так и в клетках, окружающих бластоцель. Эти наблюдения сделаны на яйцах осетра, которые были помещены в вазелиновое масло до начала дробления. У таких яиц, естественно, образовался лишь незначительный по размерам бластоцель. Оказалось, что в центре клеток (в районе ядра), окружающих бластоцель, расположены гранулы, дающие положительную реакцию Хочкисса. У контрольных яйце нормально развитой полостью бластоцеля такие гранулы не были обнаружены. Эти опыты показывают, что 1) вещество бластоцеля образуется не только за счет перивителлиновой жидкости, но и, частично, за счет секреции из бластомеров, окружающих полость, 2) переход полисахаридных гранул из бластомеров в полость не происходит или задерживается, если в яйцо не поступает вода из окружающей среды.
Есть некоторые основания думать, что вода прежде накапт ливается в бластомерах, а затем уже переходит в бластоцель. Это следует из сопоставления кривых поступления воды в яйца и увеличения полости дробления и бластоцеля. Как видно из кривых, приведенных на рис. 70, поступление воды в яйца происходит еще до того, как начинается увеличение объема жидкости бластоцеля. Эти различия в кривых нельзя объяснять увеличением объема перивителлиновой жидкости, так как он после образования в первые 40—60 мин после оплодотворения на стадиях дробления начинает уменьшаться в размерах (Детлаф и Гинзбург, 1954). На последующих стадиях дробления яиц так же трудно объяснять поступление воды в яйца только увеличением объема жидкости бластоцеля.
Морган (Morgan, 1906) пришел к такому же выводу, работая на зародышах лягушки. Он переносил яйца, лишенные студенистой оболочки, на стадии 2—4 бластомер из воды на фильтровальную бумагу и оставлял их развиваться на воздухе без воды. Несмотря на отсутствие поступления воды в зародыши из окружающей среды у них к стадии поздней бластулы образовался бластоцель, хотя и уменьшенных размеров. Жид? кость бластоцеля образовалась за счет секреции из бласто-
17* 259
мер, вода в которые поступила в течение тех стадий развития, когда яйца находились в воде. Как уже отмечалось, я получил сходные данные на зародышах осетра, лишенных капсульной оболочки, помещая их на первых стадиях развития после оплодотворения в вазелиновое масло после обсушки на фильтровальной бумаге. У таких зародышей образовался небольшой но размерам бластоцель. На зародышах иглокожих показано, что после обработки яиц колхицином полость дробления не образуется, однако зародыши продолжают потреблять воду из окружающей среды, которая накапливается в бластомерах (Geilenkirchen a. Zeuthen, 1958).
Кроме этих наблюдений, можно привести и другие данные, говорящие в пользу того, что вода окружающей среды проходит сначала в бластомеры, а затем секретируется в бластоцель. В частности, оказалось, что стенка бластулы почти непроницаема для воды. Яйца осетра без капсульной оболочки на стадии поздней бластулы помещали в 0,27М!раствор сахарозы. За 30 мин они отдали около 1,2 мм3 воды. У таких яиц был сделан прокол в желток со стороны вегетативного полюса и прокол в бластоцель со стороны анимального полюса. В первом случае яйца отдали дополнительно 0,1 мм3 воды, во втором — 2,8 мм3, т. е. почти всю жидкость бластоцеля.
Остается не ясным вопрос, почему без перехода перивителлиновой жидкости в полость дробления совсем не происходит образования жидкости бластоцеля. Можно строить по этому поводу различные предположения. Можно думать, например, что без перехода веществ перивителлинового пространства в полость дробления не происходит секреции веществ (или гранул) и воды из бластомеров в полость дробления.
В заключение представим возможный механизм образования и увеличения размеров бластоцеля у зародышей осетровых рыб в виде схемы (стр. 261).
Ё этой схеме отражены не только влияния, оказываемые гипертонической средой и маслом на образование бластоцеля, нд и механизм ограничения объема бластоцеля. Предполагается, что этот механизм сводится к полному переходу активных веществ из бластомер, окружающих полость, в бластоцель.
3. МЕХАНИЗМ ИСЧЕЗНОВЕНИЯ БЛАСТОЦЕЛЯ И ОБРАЗОВАНИЕ ПОЛОСТИ ПЕРВИЧНОЙ КИШКИ
А. М. Завадский (1923, 1926), изучавший процесс гаструля-ции у зародышей стерляди (Acipenser ruthenus Linne), показал, что по мере образования полости первичной кишки стен* ка, отделяющая эту полость от бластоцеля, становится все
260
1 *
Схема механизма поступления воды в зародыши осетровых рыб при увеличении объема бластоцеля
активация яйца
образование перивителлиновой жидкости
поступление воды из среды в яйцо
увеличение содержания воды в бластомерах
Г----------------,
। гипертоническая г | среда, масло [
переход перивителлиновой жидкости в полость дробления
секреция воды и активных веществ из бластомер, окружающих полость, в бластоцель
увеличение содержания
воды в наружных бластомерах
поступление воды из среды в наружные бластом-еры
воды
секреция в бластоцель
уменьшение содержания воды во внутренних бластомерах
воды
переход
из наружных бластомер -во внутренние
уменьшение содержания воды в наружных бластомерах
увеличение содержания воды во внутренних бластомерах
увеличение объема бластоцеля
А
секреция активных веществ в бластоцель
увеличение количества активных веществ в бластоцеле
уменьшение количества
активных
веществ во внутренних бластомерах
более рыхлой, пока не происходит ее полное разрушение и полость первичной кишки оказывается связана широким проходом с бластоцелем. Бластоцель, войдя в состав полости первичной кишки, образует ее переднюю предголовную часть.
Сходные данные об образовании полости первичной кишки у зародышей лягушки были получены значительно раньше О. Шульцем (Schulze, 1888) и другими авторами (историю вопроса см. в работах Meek, 1923; Narayana Rao a. Romanna, 1925). Уже в прошлом веке сложилось две группы исследователей, которые по-разному отнеслись к наблюдениям О. Шульца. Одни авторы подтвердили на зародышах разных видов амфибий наблюдения о разрыве стенки, разделяющей бластоцель и полость первичной кишки, на поздних стадиях гаструляции и слиянии этих двух полостей в одну. Другие не под-тв!ердили этих наблюдений. По мнению последних, во время гаструляции образующаяся полость первичной кишки просто оттесняет бластоцель, который постепенно уменьшается в размерах и исчезает (Goette, 1875; Balfour, 1885).
В настоящее время среди эмбриологов также нет единого мнения о характере образования полости первичной кишки у зародышей амфибий. Одни эмбриологи поддерживают и подтверждают наблюдения О. Шульца (Иванов, 1937; Starck, 1955), другие описывают процесс образования полости первичной кишки и исчезновение бластоцеля, так, как это еще делали Гётте и Бальфур (Шмидт, 1951, 1953; Nelson, 1953; Whitehouse a. Grove, 1957). Таким образом, вопрос о разрушении стенки, разделяющей бластоцель и полость первичной кишки, при образовании полости первичной кишки остается до сих пор спорным.
Недавно высказано предположение, что жидкость полости первичной кишки у зародышей шпорцевой лягушки (Tuft, 1957) и осетровых рыб (Зотин, 1957; Зотин и Круминь, 1959) образуется за счет перехода жидкости бластоцеля в гастроцель. С этой точки зрения можно сгладить различия во взглядах разных авторов на процесс образования полости первичной кишки. Если образование полости первичной кишки происходит в результате просачивания в нее жидкости бластоцеля через стенку, разделяющую эти две полости, то легко себе представить, что при достаточно быстром переходе жидкости через стенку, состоящую из крупных, плохо скрепленных бластомеров, может произойти разрушение стенки и образование морфологически выраженного сообщения между полостями (Зотин и Круминь, 1959).
Таким образом, из этих работ становится очевидным, что механизм исчезновения бластоцеля является одновременно механизмом образования полости первичной кишки. Рассмот-
262
Рис. 73. Изменение полостей у зародышей стерляди на стадии средней бластулы (а), поздней бластулы (б), начала гаструляции (в) и последовательных стадиях гаструляции (г, д, е); бл — бластоцель; п. п. к.— полость первичной кишки
рим поэтому подробнее картину изменения формы и размеров бластоцеля и гастроцеля у зародышей осетровых рыб на стадиях исчезновения бластоцеля.
На рис. 73 показаны изменения полостей во время гаструляции у зародышей стерляди. К стадии начала гаструляции (стадия 13 по Детлаф и Гинзбург) полость бластулы достигает своей наибольшей величины. Она располагается эксцентрично, ближе к анимальной области яйца и имеет форму сплющенного шара (рис. 73). По мере гаструляции происходит сильное истончение крыши бластоцеля, форма полости несколько меняется — сначала удлиняясь, но потом постепенно снова возвращаясь к форме сильно сплющенного шара. Гаструляция у зародышей осетровых рыб, как это подробно описано Т. А. Детлаф и А. С. Гинзбург (1954), начинается с образования узкой щели в области пигментированных клеток краевой зоны. В этом месте происходит вворачивание и уход внутрь зародыша клеточного материала, который, постепенно продвигаясь вверх, подстилает наружный клеточный пласт. По наблюдениям Т. А. Детлаф и А. С. Гинзбург (1954), гастро-цель возникает с самого начала гаструляции в виде узкой щелевидной полости, которая лишь в конце гаструляции быстро увеличивается в размерах. Мы наблюдали такую же картину: вворачивающийся слой клеток продвигается вверх, плотно прижимаясь к вегетативным бластомерам вплоть до поздних стадий гаструляции, когда происходит быстрое возникновение обширной полости — полости первичной кишки (Зотин и Круминь, 1959). Возникновение и начальное увеличение объема полости первичной кишки происходит одновременно с уменьшением и исчезновением бластоцеля (рис. 73, д, е).
Образование полости первичной кишки и исчезновение бластоцеля у зародышей из разных партий икры может происходить в разное время, начиная со стадии 16 и кончая 17-й. Однако у зародышей из одной партии икры при хороших условиях развития этот процесс происходит достаточно быстро и оканчивается на той же стадии, на которой он начался. При плохих условиях развития, когда сильно варьируют стадии развития, можно наблюдать растянутость процесса исчезновения бластоцеля у разных зародышей из одной партии икры (рис. 74).
При образовании полости первичной кишки в некоторых случаях наблюдается прорыв стенки бластоцеля, обращенной в сторону вворачивающегося материала у зародышей стерляди (рис. 73, д), осетра, севрюги и белуги. Однако иногда образование полости первичной кишки у зародышей осетровых рыб не сопровождается разрывом стенки бластоцеля. Окрашивание срезов зародышей на стадиях гаструляции, по Хочкиссу,
263
показало, что содержимое бластоцеля, просачиваясь между бластомерами, переходит в образующуюся полость первичной кишки даже в том случае, когда стенка, разделяющая эти две полости, оказывается неразрушенной. В то же время даже у таких зародышей, у которых разрыва стенки не происходит, стенка, отделяющая бластоцель от полости первичной кишки, в конце процесса настолько разрыхляется, что, фактически, бывает трудно сказать, произошло ли разрушение стенки или
Часы
Рис. 74 Изменение объема бластоцеля (1), полости первичной кишки (2) и общего объема зародышей (3) осетра
нет (Зотин и Круминь, 1959). На основании этого можно считать, что разрыв стенки бластоцеля при образовании полости первичной кишки не является патологией, а зависит только ст интенсивности процесса просачивания жидкости через стенку и от прочности связи бластомеров друг с другом. Требуются дополнительные материалы для того, чтобы установить, зависит ли наличие разрыва стенки от условий развития зародышей или от качества икры.
Образование и начальное увеличение количества жидкости в полости первичной кишки у зародышей осетровых рыб происходит в результате перехода жидкости бластоцеляв гастроцель. Возникает вопрос, происходит ли увеличение объема полости первичной кишки в период ее образования только за счет перехода жидкости бластоцеля или это увеличение связано также с поступлением воды в зародыши из окружающей
2С4
среды? На эти вопросы можно было бы частично ответить,, исходя из данных, приведенных раньше о характере потребления воды яйцами осетровых рыб и изменения объема полостей зародышей севрюги во время развития (рис. 70), из которых видно, что в течение гаструляции у зародышей осетровых рыб потребление воды из окружающей среды не происходит. Однако для того, чтобы показать это точнее, нужно было проделать более дробные измерения на стадии перехода жидкости бластоцеля в полость первичной кишки. Поэтому были проведены дополнительные измерения объема полостей и потребления воды у зародышей осетра на первых стадиях развития и особенно дробно в конце процесса гаструляции (Зотин и Кру-минь, 1959).
Как видно на рис. 74, увеличение объема полости бластулы у зародышей осетра происходит параллельно с увеличением общего объема зародыша. Увеличение объема бластоцеля и поступление воды в яйца приостанавливается, с нача-1 лом гаструляции или несколько позже. С этого момента и до конца гаструляции поступление воды в зародыши осетра из окружающей среды не происходит. В конце гаструляции (рис. 74) содержимое бластоцеля переходит в гастроцель ш образуется полость первичной кишки. За этот довольно короткий промежуток времени происходит быстрое уменьшение объема бластоцеля и полное его исчезновение (рис. 74.). Воды из окружающей среды зародыши осетра в это время не потребляют. Таким образом, в первое время после возникновения полости первичной кишки объем ее увеличивается только за счет жидкости бластоцеля. Можно показать и экспериментальным путем, что образование полости первичной кишки в период гаструляции происходит за счет перехода в нее жидкости бластоцеля. На стадиях начала гаструляции прокладывали крышу бластулы, и содержимое бластоцеля выходило наружу. Во всех случаях такая операция приводила к тому, что полость первичной кишки до конца гаструляции не возникала (Зотин и Круминь, 1959). После полного перехода жидкости бластоцеля в гастроцель начинается новое быстрое увеличение объема полости первичной кишки за счет поступления в нее воды из окружающей среды (рис. 74).
Таким образом, жидкость полости первичной кишки образуется за счет перехода в полость первичной кишки содержимого бластоцеля, а так как образование последнего связано с попаданием в полость дробления веществ перивителлинового пространства, то оказывается, что у яиц осетровых рыб в образовании жидкости полости первичной кишки в какой-то мере принимает участие пеоивителлиновая жидкость. Интересно, что у зародышей морских ежей гиалиновый слой (гомо
265
логичный, по представлению Т. А. Детлаф (1958в), коллоиду перивителлинового пространства яиц осетровых рыб) также принимает участие в образовании жидкости полости первичной кишки (Immers, 1956). При этом, в отличие от содержимого бластоцеля, жидкость полости первичной кишки, так же как гиалиновый слой, содержит только кислые мукополисахариды (Immers, 1956). Следовательно, у яиц морских ежей содержимое перивителлинового пространства попадает в полость первичной кишки при инвагинации, а не через бластоцель, как у зародышей осетровых рыб.
Относительно механизма проталкивания жидкости бластоцеля в полость первичной кишки при ее образовании пока можно строить только более или менее правдоподобные гипотезы.
В. Д. Лепешкин (1923) считал, что на поздних стадиях дробления яиц севрюги происходит почкование бластомеров дна бластоцеля, так что они подстилают эктодерму и тем самым автоматически обращают полость дробления в архентерон, со всех сторон окруженный энтодермой. Эти наблюдения, по-видимому, основаны на каких-то ошибках или проведены на патологических зародышах, так как не подтверждены ни одним из последующих исследований. Все же представления В. Д. Лепешкина близки взглядам других авторов, которые считают, что бластоцель у зародышей стерляди (Завадский, 1923, 1926), лягушки (Meek, 1923) и узкоротых лягушек (Narayana Rao a. Ramanna, 1925) просто сливается с полостью первичной кишки, благодаря разрушению стенки между ними. Для этих авторов фактически не вставал вопрос о силах перехода жидкости из одной полости в другую, так как они считали, что происходит только разрушение стенки и объединение двух полостей. Как было показано выше, при образовании полости первичной кишки происходит перемещение жидкости в нее из бластоцеля иногда без разрушения стенки.
Интересную гипотезу о механизме образования жидкости полости первичной кишки высказал недавно Тафт (Tuft, 1957). Он измерял осмотическое давление жидкости бластоцеля и полости первичной кишки у зародышей Xenopus laevis и нашел, что в отношении величины осмотического давления между этими двумя полостями нет большой разницы. Тафт (1957) пришел к выводу, что переход жидкости бластоцеля в полость первичной кишки нельзя объяснять исходя из представления о наличии между ними осмотического градиента. Поэтому он предложил следующую гипотезу для объяснения механизма перехода жидкости бластоцеля в полость первичной кишки у зародыша африканской шпорцевой лягушки (Tuft, 1957). По^его представлениям, клетки поверхности зародышей поляризованы так, что они пропускают воду только в одном направлении, причем на стадии бластулы клетки анимальной области поляризованы в направлении снаружи внутрь, а клетки вегетативной области — изнутри наружу. Во время гаструляции, благодаря уходу энтодермы внутрьзаро-
266
дыша, стенка, разделяющая гастроцель и бластоцель, оказывается поляризованной в направлении от бластоцеля к гастроцелю и жидкость бластоцеля переходит в образующуюся полость первичной кишки.
Эта гипотеза не выдерживает критики (Зотин и Круминь, 1959), так как жидкость бластоцеля просачивается в полость первичной кишки не через клеточный пласт, разделяющий эти полости, а между клетками. Следовательно, переход жидкости бластоцеля в полость первичной кишки нельзя объяснять ни осмотическими силами, ни особой полярностью клеток стенки, разделяющей полости. Поэтому было высказано предположение, что переход жидкости бластоцеля в полость первичной кишки обусловливается разницей в гидростатическом давлении жидкости бластоцеля и гастроцеля (Зотин и Круминь, 1959). Можно думать, что во время гаструляции происходит увеличение гидростатического давления в жидкости бластоцеля в результате обрастания вегетативной половины яйца клеточными пластами анимальной области и резкому увеличению общей поверхности зародыша. Как показано на зародышах амфибий, поверхностный слой зародыша (coat) обладает эластическими свойствами (Holtfreter, 1943) и растяжение поверхности зародыша должно приводить к увеличению давления в полостях внутри зародыша. У зародышей осетровых рыб к стадии гаструляции происходит заметное увеличение эластических свойств поверхности по сравнению с предыдущими стадиями развития: только начиная со стадии гаструлы зародыш способен сохранять шарообразную форму после удаления внутренней желточной оболочки (Зотин, 19546).
Уоддингтон (Waddington, 1939, 1957) измерял магнитную силу, необходимую для остановки движения стального шарика диаметром 0,083 мм, помещенного между клетками инвагинирующего клеточного пласта гаструлы тритона (Tri-turus alpestris). Он нашел, «то максимальное давление на полусферу поверхности шара, которую развивают гаструли-рующие ткани, равно 0,34 мг/мм2, что соответствует силе в 3,6- 10~3 дины. Селман (Selman, 1955, 1958) применил сходную методику для определения силы, развиваемой нервными валиками при их сближении и смыкании в нервную трубку, вкладывая между нервными валиками стальные гантелеобразные палочки. Он нашел, что во время сближения нервные валики действуют на стальные гантельки с силой в 40— 45 • 10~3 дины у зародышей тритона (Т. alpestris) и 90— 110-Ю-3 дины у зародышей аксолотля (Amblystoma mexi-canum). Селман считает, что цифру, полученную Уоддингтоном для инвагинирующего клеточного пласта, следует увеличить в 10 раз и тогда она будет близка цифрам, получен
267
ным автором для процесса смыкания нервных валиков у зародышей тритона и аксолотля. Следует сказать, что измерение силы, необходимой для остановки гаструляционного процесса у зародышей иглокожих, проведенное совершенно другим методом, дало цифру в 2 тыс. раз большую, чем’ та, которую получил Уоддингтон (1939) для зародышей тритона. Согласно определению Мура (Moore, 1941, 1945), осмотическое давление жидкости бластоцеля должно соответствовать давлению в 3,88—7,75 г/мм2 для того, чтобы предотвратить гаструлянию. Все эти данные, хотя и требуют дополнительных уточнений, все же показывают, что во время гаструля-ции перемещающиеся клеточные пласты развивают известную силу, которая может вызывать повышение гидростатического, давления в жидкости бластоцеля. Расслабление связи между бластомерами, составляющими дно передней части, гастро-целя, при приближении подрастающего вверх клеточного! пласта должно приводить к тому, что находящаяся иод давлением жидкость бластоцеля прорывается в образующуюся полость первичной кишки.
В этой схеме процессов остается неясным один пункт, каким образом содержимое бластоцеля может полностью перейти в полость первичной кишки, так как по мере перехода жидкости разница в гидростатическом давлении должна исчезать. Поэтому следует учитывать возможность наличия совсем иных механизмов, обеспечивающих переход жидкости бластоцеля в полость первичной кишки. В частности, вероятно большое значение имеет движение клеточного пласта вверх, благодаря чему остатки жидкости бластоцеля вытесняются в полость первичной кишки.
4. УВЕЛИЧЕНИЕ ОБЪЕМА ПОЛОСТИ КИШКИ И МЕХАНИЗМ РЕЗКОГО СОКРАЩЕНИЯ ЕЕ РАЗМЕРОВ
После образования полости первичной кишки начинается быстрое увеличение ее объема вплоть до стадии формирования сердца (примерно с 23-й стадии полость первичной кишки превращается в полость кишки). Оно идет параллельно потреблению воды зародышами из окружающей среды (рис.70). Так же как на стадиях дробления помещение зародыше^, в гипертоническую среду приводит к остановке поступления воды в зародыши и увеличения объема полости кишки (рис. 58), т. е. увеличение объема полости кишки происходит за счет поступления воды из окружающей среды.
При образовании полости первичной кишки в нее переходит жидкость бластоцеля, которая на стадиях дробления способна связывать воду. Однако уже к стадии начала га-
268
струляции происходит настолько сильное оводнение бластоцеля, что полисахаридосодержащие и белковые вещества, входящие в состав жидкости бластоцеля, по-видимому, неспособны вызывать поступление новых порций воды в бластоцель на всех стадиях гаструляции, а следовательно, и после перехода их в полость первичной кишки. Поэтому новое сильное увеличение размеров полости первичной кишки, после ее образования, трудно объяснить осмотическими или коллоидными свойствами веществ жидкости бластоцеля. По-видимому, происходит дополнительное выделение активных веществ в полость первичной кишки из клеток, окружающих полость. Это доказывается следующими опытами. У яиц осетра на стадии начала гаструляции делали прокол в бластоцель. В результате жидкость бластоцеля выходит наружу и полость первичной кишки практически не образуется (Зотин и Круминь, 1959). Таким способом можно получить зародыши, у которых в полость первичной кишки не попадают вещества бластоцеля. Прослеживание дальнейшего развития таких зародышей показало, что у них полость кишки постепенно начинает увеличиваться, хотя она и меньше, чем полость первичной кишки у контрольных зародышей. Таким образом, в процессе увеличения объема полости кишки участвуют не только вещества, переходящие в полость первичной кишки из бластоцеля, но и какие-то новые вещества, появляющиеся в полости после ее образования. Окрашивание на полисахариды срезов зародышей, лишенных жидкости бластоцеля, на стадии 25 — по Детлаф и Гинзбург,— когда уже возникла новая жидкость в полости кишки, показало, что вновь секретируемые вещества, по-видимому, сходны по химическому составу с веществами жидкости бластоцеля, так как они дают положительную реакцию Хочкисса. Поступление воды в полость кишки происходит, по-видимому, таким же образом, как и в бластоцель: путем перехода воды и активных веществ в полость из клеток, окружающих ее, и последующим восстановлением содержания воды в этих клетках, благодаря поступлению воды из окружающей среды. Можно изобразить механизм поступления воды в полость кишки и увеличение ее размеров такой же схемой, что и механизм увеличения объема бластоцеля (стр. 270).
В этом случае инициатором процесса секреции воды и активных веществ из клеток, окружающих полость первичной кишки, является появление в ней активных веществ, входящих в состав жидкости бластоцеля. При обсуждении механизма образования жидкости бластоцеля мы предположили, что прекращение увеличения объема бластоцеля зависит от исчерпа-.ния резервов активных веществ, способных связывать воду,
269
Схема механизма поступления воды в зародыши осетровых рыб при уве личении объема полости кишки
в бластомерах окружающих бластоцель. Если принять, что при этом запасы активных веществ, находящиеся в наружных клеточных пластах зародышей, остаются неизрасходованными, то при перемещении этих клеточных пластов во время гаструляции внутри зародышей полость первичной кишки окажется окруженной клетками, способными отдавать в полость воду и активные вещества. Эти отношения можно, иллюстрировать следующими схематическими рисунками.
Переход в полость первичной кишки жидкости бластоцеля инициирует выброс воды и активных веществ из окружающих полость клеток. В клетках уменьшается содержание воды, происходит переход в них воды из наружных слоев, увеличение в них содержания воды и новый выброс активных веществ в полость кишки.
Ограничение объема полости кишки определяется иными процессами, чем ограничение объема бластоцеля. Хотя, как и в последнем случае, возможно, что происходит процесс уменьшения количества связывающих воду веществ в клетках, прилежащих к полости кишки, однако этим нельзя объяснить резкого уменьшения размеров полости кишки после достижения максимума на стадии формирования сердца (см. рис. 70). Было высказано предположение, что уменьшение и исчезновение жидкости полости кишки в IV периоде у зародышей-осетровых рыб и переход ее в перивителлиновое пространство зависят от начала функционирования предпочек (Зотин, 1957). Действительно, как показали Т. А. Детлафи А. С. Гинзбург (1954), на 27-й стадии, на которой начинается уменьшение полости кишки, предпочечные протоки достигают клоакального впячива-ния и открываются в него, получая сообщение с наружной средой. Поэтому можно было думать, что на этой стадии начинают функционировать предпочки зародышей.
К сожалению, мне не удалось получить достаточно четких данных по влиянию удаления предпочек у зародышей белуги и осетра на изменение объема полости кишки. В табл. 55 по-
271
Таблица 55
Влияние удаления предпочек у зародышей белуги и осетра (стадия 24) на объем полости кишки на стадии 28
Зародыш Объем полости кишки, %
контроль опыт
белуга .... 1,6 3,9
осетр 1,1 2,8
» 2,8 8,3
» ...... 2,5 4,4
казаны результаты нескольких опытов. Несмотря на малую убедительность этих данных, можно все же заметить, что у оперированных зародышей на стадии 28 объем полости кишки несколько больше, чем у контрольных зародышей на этих стадиях развития. Значительно более убедительные данные были получены при изучении изменения объема полости кишки у уродливых зародышей. Дело в том, что у зародышей осетровых рыб, особенно у белуги, в каждой партии икры бывает некоторый процент уродливых зародышей, причем среди них можно встретить зародышей с самыми различными дефектами: отсутствие передних отделов головы, всей головы, головы и осевых органов туловищного отдела (парные предпочки сливаются) и, наконец отсутствие всех передних отделов туловища (Детлаф и Гинзбург, 1954; Гинзбург и Детлаф, 1955). Среди зародышей одной партии белуги удалось отобрать все четыре указанные группы уродливых зародышей. Среди уродливых зародышей были зародыши с ненарушенными предпочками, уродливыми предпочками и зародыши вообще, лишенные предпочек (табл. 56). Как видно из табл. 56, у зародышей белуги, совершенно лишенных как передних осевых структур, так и предпочек, полость кишки не исчезает до самых поздних стадий развития. Зародыши, у которых уродства касаются только головных структур и не затрагивают предпочки, полость кишки исчезает в то же время, что и у контрольных нормальных зародышей. Эти морфологические наблюдения подтверждены изучением потребления воды уродливыми зародышами во время развития и особенно изучением уровня воды, более прочно связанной в зародышах. Переход воды из полости кишки в перивителлиновое пространство в IV периоде сопровождается быстрым уменьшением уровня воды, более прочно связанной в яйце. Оказалось, что у уродливых зародышей, не имеющих предпочек, уровень воды, более прочно связанной в яйце, не снижается в IV период в отличие от
272
jg А. И. Зотин
нормальных зародышей или зародышей, у которых предпочки были нормальны.
Таким образом, этими опытами доказывается, что уменьшение объема полости кишки и перекачка жидкости полости, кишки в перивителлиновое пространство осуществляется у зародышей осетровых рыб предпочками. Это, по-видимому, является первой основной функцией предпочек после начала их функционирования у зародышей осетровых рыб.
Иначе обстоит дело у зародышей амфибий и миног. Как показали многочисленные исследования, у амфибий резкое уменьшение полости первичной кишки происходит на стадии нейрулы, предпочки же начинают функционировать на значительно более поздних стадиях развития (Rappaport, 1955). У зародышей миног предпочки так же начинают функционировать только перед вылуплением, в то время как исчезновение полости первичной кишки у них происходит на стадии поздней гаструлы (Hardisty, 1957).
Браун (Brown, 1941) подробно исследовал механизм исчезновения полости первичной кишки у зародышей Rana pi-pens HAmblystoma maculatum. Он впрыскивал микропипеткой при помощи микроманипулятора раствор фенольного и нейтрального красного в полость первичной кишки на разных стадиях гаструляции и нейруляции и нашел, что у зародышей A. maculatum на стадии 12 + инъекцируемая жидкость не проходит через бластопор (хотя зародыш раздувается от инъекции), на стадии 13 и 13+ раствор начинает проходить и на стадии 14 свободно проходит через бластопор. У зародышей Amblystoma раствор не проходит через бластопор на стадии-15 и проходит на стадии 16—19, у зародышей Rana pipiens — не проходит на стадии 13+ (по Сумвей) и проходит на стадии 14—18. Разрезы зародышей A. maculatum показали, что на стадии щелевидного бластопора желточная пробка закрывает канал, соединяющий перивителлиновое пространство и архен-терон (Brown, 1941) На более поздних стадиях развития она не препятствует сообщению полости первичной кишкиспери-вителлиновым пространством. Браун (4941) считает, что при превращение нервной пластинки в нервную трубку развиваются силы натяжения, действующие на полость и достаточные для проталкивания жидкости полости первичной кишки в перивителлиновое пространство через незакрытую щель бластопора.
У зародышей миног, вероятно, существует сходный механизм выделения жидкости полости первичной кишки в перивителлиновое пространство.
274
5. ВЛИЯНИЕ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ УСЛОВИЙ РАЗВИТИЯ НА ПОТРЕБЛЕНИЕ ВОДЫ ЯЙЦАМИ
И ОБРАЗОВАНИЕ ПОЛОСТЕЙ
При неблагоприятных условиях развития зародышей (высокая температура, дефицит кислорода и др.) происходят нарушения водного обмена зародышей рыб, которые приводят к чрезмерному потреблению воды зародышами из окружающей среды и образованию водяночных зародышей. В табл. 57 приведены данные о потреблении воды зародышами белуги из одной партии икры, но развивающихся при разных условиях: в
Таблица 57
Потребление воды яйцами (без капсульной оболочки) белуги при плохих и хороших условиях развития
Стадия Объем воды, поступившей в яйцо, мм3
яйца из реки (t = 13—14°) яйца из лаборатории (1=19—20°)
12 1,47 1,88
15 — 3,03
16 2,39 —
17 2,30 2,98
23 3,63 4,41
26 5,97 7,20
28 6,40 8,35
35 —• 11,49
реке при обычных условиях развития и в лаборатории (плохие условия развития). Так как в лаборатории температура была значительно выше, чем в реке, то сравнение ведется по стадиям развития, а не по времени. Как видно из данных табл. 57, уже начиная со стадии 12, т. е. стадии поздней бластулы, зародыши в плохих условиях развития (лаборатория) потребляют значительно больше воды, чем зародыши, развивающиеся в реке. Избыточное потребление воды зародышами, развивающимися при плохих условиях развития в этом опыте, привело к тому, что у всех зародышей развилась водянка перикарда. Механизм чрезмерного оводнения перикарда у зародышей при неблагоприятных условиях развития еще не ясен. Можно только предполагать что оно зависит от чрезмерного увеличения объема полости кишки как результат поступления избыточного количества воды в зародыш и трудностями возникающими при выведении этой избыточной воды из полости кишки. В табл. 58 показаны результаты измерения объема полостей у зародышей севрюги развивающихся в плохих и
18*
275
; ' Л
Таблица 58
Объем полостей у зародышей севрюги, развивавшихся в плохих и хороших условиях
Стадия Объем полости, %
яйца из реки яйца из лаборатории
14 5,87 6,96
25 12,76 14,66
27 6,37 16,65
29 1,20 3,48
хороших условиях. Можно видеть, что при неблагоприятных условиях развития (лаборатория) объем полостей оказывается заметно больше, чем у нормальных зародышей. В результате этого исчезновение полости кишки происходит у опытных зародышей на более поздних стадиях развития. По-видимому, предпочки не справляются полностью с выведением жидкости из полости кишки в перивителлиновое пространство, и избыточная часть воды поступает в целом и, в частности, в перикардиальную сумку, вызывая водянку перикарда.
Механизм влияния неблагоприятных условий развития на потребление воды зародышами также не ясен. Бригс (1939), изучавший влияние температуры на изменение плотности зародышей лягушки во время развития, объясняет уменьшенную плотность зародышей при высокой и низкой температуре, по сравнению с контрольными зародышами, разной степенью ускорения развития и изменения плотности зародышей при разных температурах. Мне кажется, что проще объяснить влияние температур, как и других неблагоприятных факторов, их повреждающим действием на процесс потребления воды зародышами. Известно, что при гибели яиц рыб происходит их сильное оводнение (см. гл. VI). Можно думать, что при неблагоприятных условиях развития зародыши испытывают изменения, сходные с изменениями, происходящими при гибели, что приводит к поступлению избыточного количества воды в них. Однако в отличие от гибнущих зародышей эти изменения не заходят слишком далеко и в некоторой степени обратимы при перенесении зародышей в благоприятные условия развития.
6. СУБДЕРМАЛЬНЫЕ ПОЛОСТИ
У МОРСКИХ ПЕЛАГИЧЕСКИХ ЗАРОДЫШЕЙ КОСТИСТЫХ РЫБ
У зародышей костистых рыб во время развития образуются лишь незначительные по своим размерам полости. Исключением являются морские пелагические зародыши костистых
276
рыб, у которых на поздних стадиях развития возникает обширная полость в спинной непарной плавниковой складке, наполненная жидкостью (так называемая субдермальная полость). Эта полость образуется только у пелагических морских зародышей и не возникает у донных морских и пресноводных зародышей костистых рыб (Крыжановский, Дислер и Смирнова, 1953; Shelbourne, 1955, 1956а; Rasquin, 1958; Шкапская, 1959). Этими авторами дано ясное объяснение причины возникновения субдермального пространства у морских пелагических зародышей. Дело в том, что содержание воды в теле взрослых рыб колеблется от 60 до 85% (см. Ильин, 1911; Осипов, 1931; Виноградов, 1944, 1953; Клейменов, 1952), в то время как содержание воды в зрелых неоплодотворенных пелагических морских яйцах достигает 96—98% (см. табл. 37). В частности, в теле морского ерша, барабульки, трески и хамсы содержится соответственно 77, 98; 75; 79, 42% воды (Ильин, 1911; Виноградов, 1944, 1953; Клейменов, 1952), а в икре этих видов рыб содержится: 97, 95; 94, 69 и 90, 18% (Виноградская, 1954; Сорокин, 1957; Шульман, 1958). Следовательно, морские пелагические зародыши костистых рыб содержат значительно больше воды, чем взрослые рыбы. Эта избыточная вода, сохраняющаяся в желтке яиц на всем протяжении развития (что является приспособлением к пелагическому образу жизни) переходит с началом исчезновения желтка в непарную плавниковую складку и образует обширную полость, особенно сильно развитую в головной части (Крыжановский, Дислер и Смирнова, 1953; Смирнов, 1949, 1953; Shelbourne, 1955, 1956; Rasquin, 1958).
Развитие субдермальной полости описано у многих морских пелагических зародышей, но особенно подробно у зародышей барабульки (Смирнов, 1949, 1953; Крыжановский, Дислер и Смирнова, 1953; Шкапская, 1959).
Субдермальная полость возникает у зародышей барабульки после вылупления зародышей из оболочек. На рис. 75 показаны несколько стадий развития этой полости у зародышей барабульки при 20—22° (Шкапская, 1959). У только что вылупившихся зародышей субдермальной полости нет. Плавниковая складка начинается за головным отделом и идет вдоль спины. Видимая субдермальная полость появляется через 6 час после вылупления и имеет вид небольшого вздутия над продолговатым мозгом. На последующих стадиях развития происходит увеличение субдермальной полости и распространение ее в переднем и заднем направлении. Спустя 70 час после вылупления она распространяется вперед над всей головой (рис. 75). Максимального развития субдермальная полость достигает при 20—22° спустя 82 часа после
277
вылупления, затем она начинает постепенно уменьшаться и почти полностью исчезает к 103 часам после вылупления.
Л. В. Шкапская (1959) изучала изменение объема субдермальной полости у зародышей барабульки в сравнении с изменением размеров желтка. Данные по изменению объема полости совпадают с наблюдениями морфологического строения полости (рис. 75): субдермальная полость появляется
Рис. 75. Образование субдермальной полости у зародышей барабульки (i—20—22°)
а — 6 час после вылупления из оболочки; 6 — 13 час; в — 25 час; г — 70 час; д — 82 час; е — 96 час; ж— 103 часа; з — 109 час; сб. п.— субдермальная полость; ж. м.— желточный мешок (Шкапская, 1959)
через 6 час после вылупления, достигает максимального размера к 82 час и исчезает через 103 часа. Сравнение увеличения объема субдермальной полости с уменьшением объема желтка показало, что объем субдермальной полости увеличивается по мере исчезновения желтка, а так как общий объем зародыша в течение развития не изменялся, то увеличе
278
ние объема субдермальной полости происходит только за счет воды, поступающей из желтка (Шкапская, 1959).
С. Г. Крыжановский, Н. Н. Дислер и Е. Н. Смирнова (1953) предполагают, что субдермальная полость, кроме ее значения как гидростатического органа, выполняет роль характерного для морских пелагических яиц временного вместилища избыточной воды. По мере рассасывания желточного мешка вода, не нужная для обмена и нё могущая быть выделенной наружу из-за непроницаемости покровов зародышей для воды, перемещается в плавниковую складку, где она не мешает движениям организмов. Авторы предполагают, что исчезновение субдермальной полости связано с началом функционирования выделительной системы.
Шельборн (Shelbourne, 1955, 1956а) считает, что субдермальная полость, кроме других функций, выполняет функцию подвода вещества желтка к тканям. Во время развития синус желточного мешка соединяется с субдермальной полостью и питательные вещества желтка получают доступ к различным тканям и органам зародыша. В это время у пелагических зародышей отсутствует кровеносная система, транспортную функцию которой, по мнению Шельборна (1955), частично берет на себя субдермальная полость.
Наконец, Л. В. Шкапская (1959) отметила, что максимальное развитие субдермальной полости достигается к такой стадии, когда происходит поворот зародышей из положения желточным мешком вверх в нормальное положение—спиной вверх. Вероятно смещение центра тяжести при перемещении большого количества воды из желтка в спинную плавниковую -складку помогает зародышу принять нормальное положение в воде. В это же время происходит переход зародышей от питания за счет запасов желтка к активному планктонному питанию, чему способствует поворот зародышей.
Подводя итоги, следует отметить, что, по-видимому, -основной смысл наличия субдермального пространства у морских пелагических зародышей состоит в сохранении плавучести зародышей на таких стадиях развития, когда гидростатическая роль сильно оводненного желтка уже падает, а зародыши еще не способны к активному сохранению нужного положения в поверхностных слоях воды. С переходом на активное питание и движение зародыши, используя субдермальное пространство, поворачиваются вверх спиной, а затем с началом функционирования почек удаляют лишнюю воду из вздутой спинной плавниковой складки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Мы закончили рассмотрение вопросов, связанных с изучением поступления, выведения, перераспределения и обновления воды у яиц рыб и миног во время зародышевого развития, поэтому естественно было бы подвести некоторые итоги. Нет необходимости однако, останавливаться на всех вопросах, поднятых в книге, так как большинство из них обсуждены в соответствующих главах. Рассмотрим только наиболее общие вопросы физиологии водного обмена зародышей рыб и особенно те из них, которые в настоящее время решены или близки к разрешению.
Прежде всего следует отметить, что существуют глубокие отличия в водном обмене зародышей костистых рыб от зародышей осетровых рыб и миног (а также двоякодышащих рыб, амфибий и морских ежей). Эти различия зависят с одной стороны от особенностей строения развивающихся зародышей, с другой стороны — от степени обеспеченности зародышей внутренними запасами воды. Желток яиц костистых рыб содержит значительно больше воды, чем желток яиц осетровых рыб и миног. Это обстоятельство и то, что у зародышей костистых рыб не образуется значительных по размерам полостей, определяет главную особенность водного обмена зародышей костистых рыб: они потребляют воду из окружающей среды, только на самых первых стадиях развития, когда образуется перивителлиновое пространство или (у некоторых рыб) происходит набухание студенистой оболочки. Развивающиеся зародыши костистых рыб покрывают потребности в воде за счет воды, образующейся при резорбции желтка, и за счет перераспределения воды между желтком и зародышем. У большинства морских пелагических яиц костистых рыб содержание воды в желтке настолько велико, что зародыши этих рыб вынуждены вырабатывать специальные приспособления в виде субдермальной полости для отведения излишней воды с последующим выведением ее из
280
организма при начале функционирования предпочек. Эта особенность морских пелагических зародышей костистых рыб определяется экологией развития зародышей, так как большое содержание воды в желтке значительно уменьшает плотность яиц и определяет их местонахождение в толще воды. Экологические условия развития морских пелагических яиц костистых рыб определяют и другую особенность, отличающую их от пресноводных и донных морских яиц костистых рыб: большинство из них не образует перивителлинового пространства после оплодотворения и, следовательно, они не потребляют воды из окружающей среды на первых стадиях развития.
Экологическими причинами можно объяснять и особенность водного обмена зародышей живородящих костистых рыб, у которых в отличие от всех остальных зародышей костистых рыб во время развития происходит увеличение содержания воды в яйце, что связано с поступлением воды и питательных веществ в зародыши из организма матери.
Таким образом у подавляющего большинства яиц костистых рыб потребление воды из окружающей среды происходит только в первое время после оплодотворения, когда образуется перивителлиновое пространство. Возможно, что у пресноводных яиц костистых рыб в это время происходит непродолжительное поступление воды в зародыши, а у морских донных яиц — выход воды из зародышей. На последующих стадиях развития яйца костистых рыб не потребляют и не отдают воды до тех пор, пока не начинают функционировать предпочки. Но и в это время (до стадии вылупления зародышей из оболочек) увеличения содержания воды в яйцах,, то есть потребления воды из окружающей среды, не происходит.
В отличие от костистых рыб зародыши осетровых рыб и миног потребляют воду из окружающей среды почти на всем протяжении развития в оболочках. Это определяется, как уже отмечалось, двумя причинами: 1) сравнительно низким содержанием воды в желтке неоплодотворенного яйца, что не позволяет полностью обеспечить потребности зародыша в воде внутренними запасами, 2) и образованием различных крупных по размеру полостей (бластоцеля, полости первичной кишки, полости кишки и др.), для образования жидкости которых требуются большие количества воды. Вода, поступающая в зародыши осетровых рыб и миног из окружающей среды во время развития расходуется в основном на образование этих полостей. Картину поступления воды в зародыши осетровых рыб из окружающей среды можно изобразить в виде следующей схемы:
281
Н20
I
I оплодотворение ------1---> набухание оболочек
Н2О----------------
образование перивителлиновой жидкости
переход перивителлиновой жидкости в полость дробления
образование и увеличение объема бластоцеля
переход жидкости бластоцеля в гастроцель
Н2О ------------------
образование и увеличение объема полости первичной кишки
Н2О ——----------------
образование и увеличение объем а ПОЛОСТИ кишки
---------------------начало функционирования предпочек
уменьшение объема полости кишки
Н2О «-----------------1
i увеличение объема перивителлинового пространства I -----------------------------------фермент вылупления
ликвидация перивителлинового пространства
Н2О
Как показано на этой схеме, существует преемственность между жидкостями перивителлинового пространства, бластоцеля, полости первичной кишки и полости кишки. В свою очередь жидкость перивителлинового пространства у яиц осетровых рыб преемственно связана с кариоплазмой ядра ово-цита, которая после исчезновения зародышевого пузырька скапливается в анимальной области яйца, а после оплодотворения секретируется под оболочку (см. ’ гл. II). После •образования перивителлинового пространства и с началом дробления яйца эта жидкость просачивается в полость дробления и обусловливает образование жидкости бластоцеля и •связанное с этим поступление воды в зародыш. На поздних стадиях гаструляции жидкость бластоцеля переходит в полость первичной кишки, что также стимулирует быстрое увеличение объема этой полости, сопровождающееся поступлением воды в зародыш из окружающей среды. Наконец, на стадии образования сердца, когда начинают функционировать предпочки, эта жидкость вновь попадает в перивителлиновое пространство, а после растворения оболочек ферментов вылупления, выводится в окружающую среду. Физиологический механизм каждого из звеньев образования и исчезновения полостей подробно рассмотрены по главам, поэтому здесь мы на них останавливаться не будем. Отмечу только, что каждый из механизмов образования той или иной полости является •одновременно механизмом поступления воды в зародыш в этот период развития.
У зародышей миног особенности потребления воды из окружающей среды также связаны с образованием полостей: бластоцеля и полости первичной кишки. Однако, у них пока не найдена преемственная связь между жидкостями перивителлинового пространства, бластоцеля и полости первичной кишки.
В заключение хотелось бы остановиться еще на нескольких вопросах, связанных с возможностями использования данных по физиологии водного обмена зародышей рыб, в практике их искусственного разведения. Материалы, приводимые в книге о водном обмене нормально развивающихся зародышей рыб, могут быть использованы прежде всего при изучении различных нарушений водного обмена зародышей, связанных с неблагоприятными условиями инкубации икры, при акклиматизации рыб в новых водоемах, при гибридизации рыб и при разработке способов различных искусственных воздействий на зародышевое развитие рыб. Кроме того, данные, приводимые в книге, возможно, смогут помочь решению некоторых важных для рыборазведения вопросов, таких как вопрос о качестве икры, разработке критериев благопри
28:
ятных режимов инкубации икры, разработке методов борьбы с водянкой зародышей, разработке методов отбора погибших или гибнущих зародышей.
Следует подчеркнуть, что в каждом отдельном случае вопросы, указанные выше, потребуют еще специальных исследований, прежде чем выяснится их ценность для практики, искусственного разведения рыб.
ЛИТЕРАТУРА
Айзенберг Э.И. 1939. Влияние растворов неэлектролитов на содержание воды в яйцевых клетках.— Архив анат., гистол. и эмбриол., 13, № 1, 86—93.
Александров В. Я. 1947. Денатурационные изменения белков при физиологических процессах.— Успехи соврем, биол., 24, № 1, 45—60.
Алексеева С. П 1939. Материалы по развитию судака L. lucioperca L.— Зоол. ж., 18, № 2, 274—286.
Алявдина Л. А. 1951. Состояние и распределение нерестилищ осетра и севрюги на участке р. Волги Саратов — Камышин.— Тр. Саратовск. отд. Каспийск, фил. ВНИРО, 1, 14—32.
Алявдина Л.А. 1952. О партеногенетическом развитии икринок волжского осетра -в природе.— Докл. АН СССР, 85, № 2, 443—444.
Алявдина Л. А. 1956. Биологическая характеристика волжского осетра в период размножения.— Тр. Саратовск. отд. ВНИОРХ, №4, 253—432.
Анисимова И.М. 1952. Сравнительный анализ овогенеза некоторых видов костистых рыб.— Канд, дисс., М.
Астауров Б. Л. 1940. Искусственный партеногенез у тутового шелкопряда. Изд-во АН СССР, М.— Л.
Астауров Б. Л. 1943. Термоактивация как явление и как способ устранения эмбриональной диапаузы.— Ж- общ. биол., 4, № 6. 313—-344.
Астауров Б. Л. 1951. Зачаточный партеногенез у осетровых рыб (Aci-penser stellatus, Ac. giildenstadti, Huso huso).— Докл. АН СССР, 78, № 1, 173—176.
Астауров Б. Л. 1956. О биологических основах прижизненного обеззараживания растений и пойкилотермных животных с помощью сильных прогревов.— Успехи соврем, биол., 47, № 1, 62—86.
Астауров Б. Л. 1958. Пути управления развитием и жизнедеятельностью шелковичного червя посредством температурных воздействий.— Тр. Ин-та морфол. животных АН СССР, № 21, 5—38.
Бабурина Е. А. иБузников Г. А. 1957. Железы вылупления эмбрионов кубанского рыбца как источник гиалуронидазы и фермента вылупления.—Докл. АН СССР, 113, № 6, 1387—1390.
Белинская К. Г., Карпов П. П. и Шапиро О. И. 1937. Изучение химического состава белков икры осетровых.— Тр. ВНИРО, № 6, 55—70.
Беляев Э. В. 1957. Некоторые особенности физиологии спермы и яиц рыб.— Тр. Моск. техн, ин-та рыбн. пром, и хоз-ва, № 8, 271—277.
Беляева В. Н. 1959. Развитие неоплодотворенной икры белорыбицы.—• Рыбн. хоз-во, № 2, 13—15.
Берг Л. С. 1899. Дробление и образование парабласта у щуки (Esox luci-us).— Изв. импер. об-ва любит, естествозн., антроп. и этнографии, 86. Дневник зоол. отд. и зоол. музея, 11, № 9 и 10, 1—24.
Болдуин Э. 1949. Основы динамической биохимии. Изд. ИЛ, М.
Браше Ж- 1961. Биохимическая эмбриология. Изд. ИЛ, М.
285
Браун А.А. и Иванов М. Ф. 1938. К вопросу о проницаемости тканевых мембран.— Архив анат., гистол. и эмбриол., 19, № 1—2, 161 —174.
Бу з ников Г. А. 1955. Материалы по физиологии и биохимии развития икры костистых рыб.— Вопр. ихтиол., № 3, 104—125.
Бузников Г. А. 1957. К физиологии желез вылупления эмбрионов костистых рыб.— Ж. общ. биол., 18, № 5, 350—359.
Бузников Г. А. 1959. О функциональном значении гиалуронидазы в икре костистых рыб.— Докл. АН СССР, 125, № 6, 1382—1385.
Бузников Г. А. и Игнатьева Г. М. 1958. Ферменты вылупления,— Успехи соврем, биол., 64, № 3, 337—356.
Вернидуб М. Ф.— 1947. О специфичности действия солевых растворов, на развивающиеся яйца рыб.— Докл. АН СССР, 58, № 3, 493—496.
Вернидуб М. Ф. 1951. Основные причины отхода и понижения жизнеспособности яиц и личинок лососевых и сиговых на рыбоводных заводах и пути их устранения.— Уч. зап. ЛГУ, серия биол., № 29, 54—74.
Вернидуб М. Ф. 1953. Новый способ обесклеивания икры леща.— Рыбн. хоз-во, № 9, 31—33.
Вернидуб М. Ф. и ЛейзеровичХ. А. 1950. О водном обмене развивающихся яиц рыб.— Докл. АН СССР, 72, № 2, 417—419.
Вещезеров Б. И. 1934. Лещ, сазаи и сом Азовско-Донского района.— Тр. Всес. н.-и. ин-та рыбн. пром., № 3, 13—42.
Вильсон Э. 1936. Клетка, т. I. Биомедгиз, М.— Л.
Винберг Г. Г. 1936. «Проницаемость» и обмен.— Успехи соврем, биол., 5, № 2, 360—362.
Виноградов А. П. 1944. Химический элементарный состав организмов, моря, ч. III.— Тр. Биогеохим. лабор. АН СССР, № 6, 5—273.
В и н о г р а д о в А. П. (Vinogradov, А. Р.) 1953. The elementary chemical composition of marine organism. Sears Foundation for Marine Research, New Haven. ;
Виноградская С. C. 1954. Изменение химического состава икры некоторых рыб Черного моря в процессе ее созревания.— Зоол. ж., 33, № 1, 139—148.
ВодяиицкийВ.А. 1930. К вопросу о происхождении фауны рыб Черного моря.— Работы Новороссийск, биол. ст., 1, № 4, 3—34.
Вотинов Н.П. 1947. Яичник севрюги в период нерестовой миграции, нереста и поката.— Тр. Лабор. основ рыбовод., № 1, 139—154.
Г агрские беседы. 1949. Изд. АН Груз.ССР, Тбилиси.
Галкина Л. А. 1957. Влияние соленостей иа сперму, икру и личинок охотской сельди.— Изв. ТИНРО, № 45, 37—50.
Гакичко С. 1932. К характеристике величины зерна икры.— Тр. Центр-, научн. ин-та рыбн. хоз-ва, № 4, 18—20.
Гарвей Э. и Дан и ел л и Дж. 1939. Поверхность клетки и ее свойства.— Успехи соврем, биол., 10, № 3, 471—494.
Генина Н. В. 1957. О биотехнике искусственного разведения миноги.— Рыбн. хоз-во, № 9, 54—55.
Генин аН. и Эрм к В. 1958. Некоторые особенности биологии речной миноги и методика ее искусственного разведения.— Гидробиол. исследования, Тарту, № 1, 270—279.
Гербильский Н. Л. 1939. Возрастные и сезонные изменения в овоцитах зеркального карпа.— Архив анат., гистол. и эмбриол., 21, № 2, 241—2’54.
Г е р б и л ь с к и й И. Л. 1958. Анализ особенностей и взаимосвязей гистологических и анатомических структур в процессе эволюции видов и его значение для эволюционной гистологии. Тезисы докл. VI Всесоюзн. съезда анат., гистол. и эмбриол., стр. 309—310.
Гинзбург А. С. 1957а. Моноспермия у осетровых рыб при нормальном оплодотворении и последствия проникновения в яйцо сверхчисленных спермиев.— Докл. АН СССР, 114, № 2, 445—447.
286
Гинзбург А. С. 19576. Время установления контакта спермия с яйцом, при оплодотворении у осетровых рыб.— Докл. АН СССР, 115, № 4, 845—848.
Гинзбург А. С. 1958. Цитология оплодотворения у осетровых рыб. Тезисы докл. VI Всесоюзн. съезда анат., гистол. и эмбриол., стр. 512—513.
Гинзбург А. С. 1959. Оплодотворение у осетровых рыб. I. Соединение гамет. Цитология, 1, № 5, 510—526.
Гинзбург А.'С. 1960. Блокирование полиспермии при оплодотворении яиц осетровых и лососевых рыб и роль кортикальных гранул (альвеол) в этом процессе.— Ж. общ. биол.; 21, № 6, 419—429.
Гинзбург А. С. и Детлаф Т. А. 1955. Развитие зародышей осетровых рыб, Изд-во АН СССР. М.
Горбунова Н. Н. 1954. Размножение и развитие минтая Theragra chal-cogramma (Pallas).— Тр. Ин-та океанол. АН СССР, № 11, 132—195.
Детлаф Т. А. 1957а Значение ионов кальция в процессах оплодотворения и партеногенетической активации у осетровых рыб.— Ж. общ. биол., 18, № 1, 3—16.
Детлаф Т. А. 19576. Кортикальные гранулы и вещества, выделяющиеся из анимальной части яйца в период активации у осетровых рыб.— Докл. АН СССР, 116, № 2, 341—344.
Детлаф Т. А. 1958а. Соединение гамет в отсутствие ионов кальция у осетровых рыб.—-Докл. АН СССР, 120, № 5, 1165—1168.
Детлаф Т. А. 19586. Значение ионов кальция для стимуляции яиц и распространения кортикальной реакции у осетровых рыб.— Докл. АН СССР, 121, № 5, 944—947.
Детлаф Т. А. 1958в. Кортикальные изменения яйца в период оплодотворения и искусственной активации у осетровых рыб и роль ионов Са в этих процессах. Тезисы докл. VI Всесоюзн. съезда анат., гистол. и эмбриол., 457—458.
Детлаф Т. А. 1959. Значение ионов кальция для активации яиц лососевых рыб.— Ж- общ. биол., 20, № 3, 184—195.
Детлаф Т. А. 1961. Кортикальные изменения яйца осетровых рыб в процессе оплодотворения и искусственной активации. Ж. общ. биол., т. 22, № 5.
Детлаф Т. А. и Гинзбург А. С. 1950. Случай партеногенетического-дробления неовулировавших яйцеклеток в яичнике у севрюги.— Докл. АН СССР, 72, № 2, 429—432.
Детлаф Т. А. и Гинзбург А. С. 1951а. Ранняя партеногенетическая активация как причина неоплодотворяемости яиц севрюги.—Докл. АН СССР, 77, № 3, 537—540.
Детлаф Т. А. и Гинзбург А. С. 19516. Анализ источников отхода икры севрюги в период инкубации.— Тр. Ин-та морфол. животных АН СССР, № 5, 184—201.
Детлаф Т. А. и Гинзбург А. С. 1954. Зародышевое развитие осетровых рыб (севрюги, осетра и белуги) в связи с вопросами их разведения. Изд-во АН СССР. М.
Детлаф Т. А. и Тур паев Т. М. 1957. Специфичность действия кальция в процессах оплодотворения, активации и мышечного сокращения и его заменимость стронцием.— Изв. АН СССР, серия биол., № 5, 572—577.
Дислер Н. Н. 1957. Развитие осенней кеты р. Амура Oncorhynchus keta-(Walb.). Тр. Ин-та морфол. животных АН СССР, № 20, 3—70.
Дорфман В. А. 1933. Ритмы физико-химических изменений в развивающемся яйце.— Успехи соврем, биол., 2, № 1—2, 105—115.
Дорфман В. A. (Dorfman, W. А.) 1934. Electrical polarity of the amphibian egg and its reversal through fertilization.— Protoplasma, 21, № 2, 245—257.
287
Дорфман В. А. 1935. Электрополярность яйца лягушки и ее морфогенетическое значение.— Сб. исслед. по физико-химии клетки, 111 —142.
Дорфман В. А. 1936. Современное положение проблемы активации яйца.— Успехи соврем, биол., 5, № 5, 824—847.
Дорфман В. А. 1945. Химическая эмбриология. Изд-во АН СССР, М — Л.
Дорфман В. А. 1955. Проблемы стимуляции яйцевой клетки.— Успехи соврем. биол., 40, № 3, 331—348.
Друк кер Г. 1932. К весовому и химическому составу яичников и икры осетровых.— Тр. Центр, научн. ин-та рыбн. хоз-ва, № 4, 10—16.
Евреинова Т.Н. 1954. Коацерваты.— Успехи соврем, биол., 37, № 2, 177—202.
Европейцева Н. В. 1947. Личиночный период налима Lota lota L.— Тр. Ленингр. об-ва естествоисп., 69, № 4, 70—87.
Ельцина Н. В. 1940. Температурный коэффициент в биологии.— Успехи соврем, биол., 12, № 1, 52—64.
Емельянов С. В. 1957. Значение оценки качественной стороны результатов искусственного разведения рыб.— Тр. совещ. по рыбоводству, 54—64.
Ершов А. Ф. 1936. Некоторые наблюдения над икрой севрюги в связи с методикой ее искусственного оплодотворения.— Рыбн. хоз-во, № 2, 55—58.
Завадский А. М. 1923. Несколько соображений по поводу гаструляции у стерляди. — Тр. Первого Всесоюзи. съезда зоол., анат. и гистол. Пг., 121—122.
Завадский А. М. 1926. К учению о зародышевых листках. Развитие стерляди (Acipenser ruthenus L.). Изменения до гаструляции, возникновение зародышевых листков и связанные с их образованием процессы.— Уч. зап. Казанск. ун-та, 86, № 1, 85—117.
Заварзин А А. 1939. Руководство по эмбриологии человека. Медгиз. М.— Л.
Зайцев Ю. П. 1952. Наблюдения за развитием икры камбалы-глоссы (Р1е-uronectes flesus luscus Pallas) в Хаджибейском лимане.— Докл. АН СССР, 87, № 1, 151—154.
2 айцев Ю. П. 1954. Определение пловучести пелагической икры некоторых видов черноморских рыб.— Докл. АН СССР, 94, № 3, 577—579.
Зайцев Ю. П. 1955. Цловучесть пелагической икры некоторых черноморских рыб и ее значение для биологии нереста.— Тр. Одесск. ун-та, т. 145, серия биол., № 7, 223—233.
Зайцев Ю. П. 1956. Размножнение рыб с пелагической икрой в Одесском заливе. Канд, дисс., Одесса.
3 а й ц е в Ю. П. 1959а. 1хтюпланктон Одесько! затоки i сумтжных Д1лянок Чорного моря. Вид. Акад, наук Укра1н. РСР, Ки!в.
3 а й ц е в Ю. П. 19596. Механическая прочность икры хамсы и связанные с ней особенности размножения.— Вопр. ихтиол., № 12, 89—91.
3 а л е н с к и й. В. В. 1878. История развития стерляди (Acipenser ruthenus). ч. I. Эмбриональное развитие.— Тр. об-ва естествоисп. Казанск. ун-та, 7, № 3, 1—226.
Зар я нов а, Е. Б. 1954. Морфобиологическая характеристика осетра (Acipenser guldenstadti Brandt) и севрюги (Acipenser stellatus Pallas) на ранних стадиях развития.— Тр. Саратов, отд. Каспийск, фил. ВНИРО, № 3, 224—255.
ЗаряноваЕ. Б. 1956. Методы инкубации икры осетровых рыб и их влияние на развитие икры и выращивание молоди.— Тр. Саратовск. отд. Каспийск, фил. ВНИОРХ, №’ 4, 36—68.
Зотин А. И. 1953а. Потребление воды из внешней среды развивающимися яйцами осетровых рыб—Докл. АН СССР, 89, № 2, 377—380.
288
Зотин А. И. 19536. Начальные стадии процесса затвердевания оболочек яиц лососевых рыб.— Докл. АН СССР, 89, № 3, 573—576.
Зотин А. И. 1953в. Изменение прочности яйцевых оболочек зародышей осетровых рыб во время развития.— Докл. АН СССР, 92, № 2, 443—446.
Зотин А. И. 1953г. Фермент вылупления у зародышей осетровых рыб.— Докл. АН СССР. 92, № 3, 685—687,
Зотин А. И. 1953д. Строение, свойства и значение яйцевых оболочек зародышей осетровых и лососевых рыб.—Канд, дисс., М.
Зотин А. И. 1954а. Механизм образования перивителлинового пространства у яиц лососевых рыб.— Докл. АН СССР, 96, № 2,-421—424.
3 от ин А. И. 19546. Значение внутренней желточной оболочки, как механической опоры, для нормального развития осетровых рыб.— Докл. АН СССР, 96, № 3, 677—679.
Зотин А. И. 1955а. Потребление воды развивающимися яйцами лососевых и осетровых рыб из окружающей среды,—Вопр. ихтиол., № 4, 82—104.
3 о т и н А. И. 19556. Об особенностях отдачи воды яйцами осетровых рыб и амфибий в гипертонической среде.— Докл. АН СССР, 101, № 1, 189— 192.
Зотин А. И. 1957. Потребление воды из окружающей среды и образование полостей у зародышей севрюги.— Докл. АН СССР, 115, № 5, 1040—1043.
Зотин А. И. 1958а. Скорость обновления воды у зародышей осетра (Acipenser guldenstadti colchicus V. Marti).— Докл. АН СССР, 121, № 5. 948—951.
Зотин А. И. 19586. Фермент затвердевания оболочек у яиц лососевых рыб,—Докл. АН СССР, 121, № 6, 1105—1108.
Зотин, А. И. (Zotin, А. I.) 1958в. The mechanism of hardening of the salmonid egg membrane after fertilization or spontaneous activation.— J. Embryol. Exptl. Morphol., 6, № 4, 546—568.
Зотин А. И. и Круминь А. Я- 1959. Образование полости первичной кишки у зародышей осетровых рыб.— Ж. общ. биол., 20, № 4, 313—321.
3 о т и и А. И. и П о п о в, А. В. 1959. Ускорение процесса подготовки икры лососевых к инкубации при помощи солей двухвалентных металлов.— Рыбн. хоз-во, № 8, 9—15.
ЗотинаР. С. и Зотин А. И. 1961. Проницаемость оболочек яиц лососевых рыб для -воды, (в печати).
И в а н о в М. Ф. 1956. Яйцевые оболочки рыб, их сравнительная морфология и экологическое значение.— Вести. ЛГУ, № 21, серия биол., № 4, 79—90. Иванов М. Ф. 1958а. Развитие студенистой оболочки яйцевых клеток некоторых рыб.— Вести. ЛГУ, № 21, серия биол., № 4, 57—62.
И в а н о в М. Ф. 19586. Яйцевые оболочки рыб, их генезис и экологическое значение.— Тезисы докл. VI Всес. съезда анат. гистол. и эмбриол., стр. 464—465.
Иванов М. Ф. и Додзина Ф.И. 1957. Гистологический анализ половых желез волжских проходных сельдей в период миграций и нереста.— Уч. зап. ЛГУ, № 228, серия биол., № 44, 155—180.
И в а и о в П. П. 1937. Общая и сравнительная эмбриология. Биомедгиз, М,—Л.
ИвановП. П. 1945. Руководство по общей и сравнительной эмбриологии. Учпедгиз, Л.
Иванова С. А. 1953. Гистологическое исследование гонады, щитовидной железы и гипофиза стерляди Acipenser ruthenus при содержании ее в естественных — речных и прудовых условиях.— Докл. АН СССР, 91, № 3,- 651—654.
Ильин М. Д. 1911. Рыба как пищевой продукт (с краткими сведениями по биологии, технологии и продаже рыбы). СПб.
Казанский Б. Н. 1949. Особенности функции яичника и гипофиза у рыб с порционным икрометанием.— Тр. Лабор. основ рыбовод., № 2, 64—120.
19 А. и. Зотин 289
Казанский Б. Н. 1954. Ядерные изменения в овоцитах осетра при переходе организма в нерестное состояние после гипофизарной, инъекции.— Док л. АН СССР, 98, № 6, 1045—1048.
К а з а н с к и й Б. Н. 1957. Анализ явлений, происходящих в яйцеклетках осетровых при применении гипофизарной инъекции.— Тр. совещ. по ры-боводству, стр. 130—138.
Камнев И. Е. 1938. Проницаемость поперечнополосатых мышц лягушки для сахаров.— Архив анат., гистол. и эмбриол., 19, № 1—2, 145—160.
Каринский Ю. 1938. Некоторые особенности эмбрионального развития, беломорской сельди (Clupea harengus pallasi п. maris-albi Berg). Тр, - Моск. техн, ин-та рыбн. пром, и хоз-ва, № 1, 147—154.
КасиноваН. 1936. Содержание лецитина в рыбном и дельфиньем, сырье.— Рыбн. хоз-во, № 8, 45—47.
КизеветтерИ. В. 1948. Об изменениях химического состава тела красной (нерки).—Изв. ТИНРО, № 28, 29—42.
КиршенбаумИ. 1953. Тяжелая вода. Изд. ИЛ, М.
Киселевич К. А. (ред.) 1927. Пищевая и питательная ценность рыб к морских организмов. (Приложение!). Астрахань, стр. 70.
Клейменов И. Я. 1952. Химический и весовой состав основных промысловых рыб. Пищепромиздат, М.
КляркЕ. и КлофР. 1927. Химический состав рыб и моллюсков. Пищев: и т1итат. ценность рыб и морск. животных. Астрахань, стр. 5—39.
Ко л л ат ц Л. 1953. Численные методы решения дифференциальных уравнений. Изд. ИЛ.
Колотилова А. И. и Энгельгардт В. А. 1937. Проницаемость, гликолиз и распределение сахара в эритроцитах.— Биохимия, 2, № 2,. 387—401.
КоонМ. 1948. Определение дейтерия методом падающей капли.— Сб. «Получение и определение меченых атомов», стр. 65—75.
КоршакВ.В. 1950. Химия высокомолекулярных соединений. Изд-во АН СССР. М.
Красовская О. В. 1935. Оплодотворение яйца кролика вне организма 3. Изменение величины яйца кролика до и после оплодотворения.— Биол. ж., 4, № 2, 251—262.
Крыжановский С. Г. 1948. Экологические группы рыб и закономерности их развития.— Изв. ТИНРО, № 27, 3—114.
Кр ы ж а н о в с к и й С. Г. 1949. Эколого-морфологические закономерности развития карповых, вьюновых и сомовых рыб.— Тр. Ин-та морфол. животных АН СССР, № 1, 5—332.
Крыжановский С. Г. 1953. Особенности зрелых яиц. костистых рыб.— Вопр. ихтиол., № 1, 37—62.
Крыжановский С. Г. 1955. Особенности половых продуктов сахалинской сельди Clupea harengus pallasi Vai. Вопр. ихтиол., № 5, 34—38.
Крыжановский С. Г. 1956. Материалы по развитию сельдевых рыб.— Тр. Ин-та морфол. животных АН СССР, № 1.7, 3—254.
Крыжановский С. Г. 1960. О значении жировых включений в яйцах, рыб.— Зоол. ж., 39, № 1, 111—123.
Крыжановский С. Г., Дислер Н. Н. и Смирнова Е. Н. 1953. Эколого-морфологические закономерности развития окуневидных рыб (Percoidei).— Тр. Ин-та морфол. животных АН СССР, № 10, 3—138.
Крыжановский С. Г., СмирновА. И. иСоинС. Г. 1951. Материалы, по развитию рыб р. Амура —Тр. Амурск, ихтиол, экспед. 1945—1949 гг., № 2, 5—222.
Кузнецов И. И. 1909. Об изменении удельного веса пловучей рыбьей икры.— Вест, рыбопромышленности, 24, № 10—11, 543—548.
К у р е л л а Г. А. 1960. Сорбционная теория клеточной проницаемости и. предсуществование потенциала покоя.— Биофизика, 5, We- 3, 260—2691
290
Лазаревский A. A. 1931. Рыбы и рыбные товары Куринского района.— Тр. Центр, научн. Ин-та рыбн. хоз-ва, № 3, 49—92.
ЛебковаН. П. 1956. Стимуляция перехода в нерестное состояние самцов и самок речной миноги (Lampetra fluviatilis) в результате инъекции ги-пофиза сазана.— Докл. АН СССР, 109, № 2, 411—412.
Лейзерович X. А. I960. К вопросу о причинах специфического действия солевых гипертонических растворов на яйца некоторых рыб. Уч. зап, ЛГУ, серия биол., № 23, 102—106.
Лепешинская, О. Б,— 1934. Образование жидкости в бластоцеле из, желточных зерен (у Acipenser stellatus— севрюги).— Архив анат., гистол. и эмбриол., 13, № 1, 111—114.
Лепешинская О. Б. 1946. Оболочки животных клеток и их биологическое значение. Медгиз.
Лепешкин В. Д. 1923. Исследования по истории развития низших -позвоночных.— Биол. известия, № 1, 8—20.
Лужин Б. П. 1956. Иссык-кульская форель гегаркуни (Salmo ischchari issykogegarkuni Lushin). Изд. АН Киргизск. ССР, Фрунзе.
Макаров И. В. 1953а. Основы цитологии. Изд. «Советская наука», М.
М а к а р о в П. В. 19536. Цитология процесса оплодотворения у лошадиной аскариды (к морфологии оплодотворения в свете ассимиляционной тео-.. рии акад. Т. Д. Лысенко).— Изв. АН СССР, серия б-иол., № 1, 46—58.
Макаров П. В. 1958. Динамика полисахаридов в ходе гаметогенеза, оплодотворения и дробления яиц Parascaris equorum.—-Докл. AH' СССР, 120, № 2, 412—414.
МакарскаяЯ.Ф. 1938. К вопросу о проникновении солей в икру рыб.— Архив анат., гистол. и эмбриол., 19, № 1—-2, 175—183.
М е й е н В. А. 1927. Наблюдения над годичными изменениями яичника, окуня (Perea fluviatilis L.).— Русск. зоол. ж., 7, № 4, 75—ИЗ.
Мин дер Л. П. 1934. Промысел и обработка рыбы Азовского бассейна.-—. Тр. Всес. н.-и. ин-та рыбн. пром. № 3, 3—12.
М и х л и н Д. М. 1947. Пероксиды и -пероксидазы. Химизм медленного окис-ления. Изд-во АН СССР, М.— Л.
Михлин Д. М. 1956. Биологическое окисление. Изд-во АН СССР. ,, Молчанова И. Н. 1941. Гистологическое строение икры стерляди на рйй4 личных стадиях половой зрелости — Докл. АН СССР, 32, № 2, 162—164, Мухина Р. И. — 1948. Окислительные процессы на ранних стадиях развй-, тия рыб и чувствительность этих стадий к механическим факторам среды. Канд. дисс. М.
Насонов Д. Н. 1938. Влияние неэлектролитов на содержание воды в живых мышцах и набухшей желатине.— Архив анат., гистол. и эмбриол., 19, № 1—2, 116—144. .
Насонов Д. Н. 1939. Мембранная концепция в учении о проницаемости.— Проблемы проницаемости, стр. 18—46.
НасоновД. Н. 1949. О причинах возникновения местных и распространяющихся биоэлектрических потенциалов.— Гагрские беседы, № 1, 1—50.
НасоновД. Н.— 1959. Местная реакция протоплазмы и распространяю-* щееся возбуждение, Изд-во АН СССР, М.— Л. ' -
Насонов Д. Н. и Айзенберг Э. И. 1937. Влияние неэлектролитов на содержание воды в живых и убитых мышцах.— Биол. ж., 6, № 1, 165—183.
Насонов Д. Н. и Александров В. Я- 1940. Реакция живого вещества на внешние воздействия. Изд-во АН СССР.
Насонов Д. Н. и Александров В. Я. 1943. Принцип диффузии и распределения в проблеме клеточной проницаемости.— Усп. совр. биол., 16, № 6, 577—598.
НасоновД. Н. и Александров В. Я. 1944. О причинах возникновения биоэлектрических потенциалов.— Усп. совр. биол., 17, № 1—53.
19* 291
Нас о н ов Д. Н. и Александров В. Я. 1946. По (поводу статьи Д. Л. Рубинштейна «Клеточная проницаемость и теория биоэлектрических токов»,—-Усп. совр. биол., 20, № 1, 109—116.
Николаев И. И. 1955. Русская литература по биологии и рыбному промыслу Балтийского моря,— Балтийск, фил. ВНИРО, № 1, 125—133.
Никольский Г. В. и С о и н С. Г. 1954. О биологических основаниях лососевого хозяйства бассейна Амура.— Природа, № 4, 52—58.
Никонова Н. А. 1951. Определение качества соленой лососевой икры по химическим показателям.— Изв. ТИНРО, № 34, 195—205.
Ольшванг Н. А. 1936. Изменение гонад стерляди Acipenser ruthenus в связи с созреванием половых продуктов.— Изв. биол. н.-и. ин-та Пермск. гос. ун-та, 10, № 9—10, 363—384.
Осипов М.П. 1931. Химический состав и питательная ценность свежих рыб Волго-Каспийского района. Изв. Астрахан. научн. рыбохоз. ст., Астрахань.
Остроумов. А. А. 1911. Периодичность роста стерляди (аутокатализ),— Тр. об-ва естествоисп. Казан, ун-та, 43, № 6, 3—48.
Пальчикова-Остроумова М. В. 1926. Свободно живущие нематоды, как объект для наблюдения процессов оплодотворения и дробления,—Уч. зап. Казанск. ун-та, 86, № 1, 24—39.
Паули В. и ВалькоЭ. 1936. Коллоидная химия белковых веществ. ОНТИ, М.
ПельцамиЭ. 1883. Биологические наблюдения над осетровыми рыбами. Приложение к протоколам засед. об-ва естествоисп. имп. Казанск. унта, № '65, 1—47.
Персональная Н. С. 1946. Эмбриональное развитие окуневых рыб и их гибридов. Канд, дисс., Воронеж.
Перцева Т. А. 1939. Материалы по развитию каспийского пузанка — Cas-pialosa caspia Eichwald.— Тр. ВНИРО, № 8, 27—65.
Перцева-Остроумова, Т. А. 1953. Новые данные о развитии камбал (сем. Pleuronectidae).— Докл. АН СССР, 91, № 4, 973—976.
По г лазов Б. Ф. 1961. О механизмах элементарных движений живых существ.— Усп. совр. биол., 51, № 1, 62—73.
Подлесный. А. В. 1947. Белорыбица Stenodus leucichthys Giild. Биоэко-логический очерк,—Тр. Сибир. отд. ВНИОРХ, 7, № 1, 3—184.
ПоповА. В. 1959. Отчет Свирского рыбоводного завода за 1958 г.
Попов В. В. 1882. Определение количества питательных веществ в наиболее употребительных сортах рыбы. СПб.
Потерпев Е. А. 1936. Об искусственном оплодотворении и развитии икры камбалы Bothus maeoticus (Pallas). Тр. Новороссийск, биол. ст., 1, № 6, 8—13.
Привольнев Т.Н. 1952. Набухание икры лосося в начале развития,— Докл. АН СССР, 84, № 3, 641—643.
Привольнев Т. И. 1953. Изменение веса икры лосося при эмбриональном развитии. Изв. ВНИОРХ, № 33, 4—9.
Проблемы проницаемости. 1939. Тр. конф. Моск, об-ва физиол. М.
Радзинская Л. И. 1960. Пероксидазная реакция и образование гемо-, . .глобина в эмбриогенезе осетровых рыб.— Докл, АН СССР, 130, № 5 , 1173—1176.
Расс Т. С. 1947. О таксономическом значении размеров икринок костистых рыб (Teleostei).—Бюлл. МОИП, отд. биол., 52, № 6, 11—20.
Р асс Т. С. 1953. Значение строения икринок и личинок для систематики рыб.— Очерки по общ. вопр. ихтиол., стр. 183—198.
Романов Н. С. 1955. Указатель литературы по рыбному хозяйству южных бассейнов СССР за 1918—1953 гг. Изд-во АН СССР.
Р о манов Н. С. 1959. Указатель литературы по рыбному хозяйству Дальнего Востока за 1923—1956 гг. Изд-во АН СССР.
292
Рубинштейн Д. Л. 1939. Существует ли полупроницаемая клёточйай оболочка? Проблемы проницаемости. М., стр. 7—17.
Рубинштейн Д. Л. 1944. Клеточная проницаемость и теория биоэлектрических потенциалов.— Усп. совр. биол., 18, № 3, 376—392.
Рубинштейн Д. Л. 1947. Общая физиология. Медгиз, М.
Рубинштейн Д.Л. 1949. Кризис мембранной теории биоэлектрических потенциалов.— Гагрские беседы, № 1. 85 — 107.
СадовИ. А. 1956. Образование микропиле v овоцитов осетровых рыб.— Докл. АН СССР, 111, № 6, 1400—1402.
СадовИ. А. 1957. Образование перивителлинового пространства у овоцитов осетровых рыб.— Докл. АН СССР, 112, № 1, 174—176.
С а д о в И. А. 1958. О развитии оболочек овоцитов осетра, севрюги и стерляди,—Докл. АН СССР, 120, № 6, 1374—1376.
СакунО.Ф. 1958. Происхождение и развитие половых клеток в онтогенезе сырти.— Тезисы докл. VI Всесоюзн. съезда анат., гистол. и эмбриол., стр. 491—492.
С а кун О. Ф. 1959. Половые клетки и функция половых желез у сырти (Vimba vimba L.) в норме и при нарушении условий размножения,— Канд. дисс. Л.
С а кун О. Ф. 1960. Химическая природа и значение включений в овоцитах костистых рыб.— Архив анат., гистол. и эмбриол., 37, № 1, 38—42..
С а м н ер Дж. и Сомерс Г. 1948. Химия ферментов и методы их исследования. Изд. ИЛ.
Светлов П. Г. 1928а. К вопросу об осмотическом давлении и проницае-* мости яиц форели.— Докл. АН СССР, серия А. № 24, 504—508.
СветловП. Г. 19286. Исследование над развитием дождевых червей.— Тр Особой зоол. лабор. и Севастопольск. биол. ст., серия II, № 13, 95—329.
СветловП. Г. (Svetlov. Р.). 1929. Entwicklungsphysiologische Bepbach-tungen an Forelleneiern. Roux’s Arch. Entwicklungsmech. Organismen, 114, № 4—5, 771—785.
Сергеев A.M. 1943. Эволюция эмбриональных приспособлений рептилий. Изд. «Советская наука», М.
С к а н а в и - Г р и г о р ь е в а М. С. 1939. К вопросу о химическом элементарном составе рыб. I Анализ рыб семейства Cyprinidae-Cyprinus carpio (зеркальный карп) и Tinea tinea.— Тр. Биогеохим. лабор. АН СССР, № 5, 63—80.
Сканави-ГригорьеваМ. С. 1944. К вопросу о химическом элементарном составе рыб. II Состав икры озерной форели Salmo trutta morphd lacustris (свирская форель).— Там же, № 7, 116—121.
Смирнов А. И. 1949. Размножение и развитие черноморской султанки.— Докл. АН СССР, 68, № 6, 1131—1134.
Смирнов А. И. 1953. Биология размножения и развития черноморской султанки (Mullus barbatus ponticus Essipov).— Бюлл. МОИП, отд. биол., 58, № 4, 35—46.
Смирнов А. И.—'1954. Вопросы рационализации биотехники разведения лососей на Сахалине.— Тр. совещ. по вопр. лососев. хоз-ва Дальнего Востока стр. 94—НО.
Соин С. Г.— 1941. Некоторые данные о признаках партеногенетического развития Caspialosa volgensis.— Докл. АН СССР, 30, № 3, 262—264.
Соин С. Г. 1947. Об особенностях биологии размножения европейского и и амурского сомов.— Докл. АН СССР, 57, № 6, 629—632.
С о и н С. Г. 1953. О развитии неоплодотворенной икры лососевых рыб.— Рыбн. хоз-во, № 5, 55—58.
Соин С.Т.— 1954. Изучение дальневосточных лососевых рыб.— Вести. МГУ, серия физ.-мат. и естеств. наук, № 2, 143—145.
293
СоииС. Г. 1959. Эмбрионально-личиночный период развития верхогляда (Erythroculter erythropterus (Basilewsky).— Вопр. ихтиол., № 13, 112— 129.
С о м о в а С. Г. 1940. Развитие сельди черноспинки Caspialosa kessleri Gr.— Тр. ВНИРО, № 14. 149—170.
Сомова С. Г. 1946. Материалы по размножению и развитию каспийской обыкновенной кильки в Северном Каспии.— Канд. дисс. М.
Сорокин В. П. 1957. Овогенез и половой цикл у трески (Gadus morhua morhua L.).— Тр. ПИНРО, № 10, 125—144.
Строганов Н. С. 1938. Проницаемость клеток для воды. I. Периодическое изменение объема у икринок окуня (Perea fluviatilis L.) при нормальных условиях.— Биол. ж., 7, № 3, 515—526.
Строганов Н. С. 1939а. Резистентность икры волжской сельди (Caspialosa volgensis) к некоторым факторам внешней среды,—Уч. зап. МГУ, № 33, 185—200.
Строганов Н. С. 19396. Проницаемость яйцеклеток для воды II. Периодическая проницаемость икринок волжской сельди (Caspialosa volgensis) для воды при нормальных условиях. Там же, 220—W.
Тоом М. Н. 1958. Опыты по инкубации икры балтийской салаки.— Тр. ВНИРО, № 34, 19—29.
Трошин А. С. 1953. О регуляции содержания воды в протоплазме,-—Тр. Зоол. ин-та АН СССР, № 13, 420—433.
Трошин А. С. 1956. Проблема клеточной проницаемости. Изд-во АН СССР. М,—Л.
Трошин А. С. 1958. Современное состояние проблемы клеточной проницаемости.— Тезисы докл. VI Всесоюзн. съезда анат., гистол. и эмбриол., стр. 540—541.
ТрошинА. С. 1960а. По поводу статьи Л. М. Чайлахяна «Современные представления о природе потенциала покоя».— Биофизика, 5, № 1, 94— 98.
Трош нн А. С. 19606. Сорбционная теория распределения веществ между клеткой и средой.— Сб. Вопр. цитологии и протистол. Изд-во АН СССР, М.— Л., стр. 16—28.
Фридлянд И. Г. 1949. Размножение сельди у западного побережья Южного Сахалина.— Рыбн. хоз-во, № 11, 35—39.
ХалдиноваН. А. 1936. Материалы по размножению и развитию беломорской наваги [Eleginus navaga (Pall)].— Зоол. ж., 15, № 2, 321—339.
ЧайлахянЛ. М. 1959. Современные представления о природе потенциала покая.— Биофизика, 4, № 4, 385—400.
Чекановская О. В. 1941. Перемещение зачаткового материала в течение гаструляции и нейруляции у миноги.— Архив анат., гистол. и эмбриол., 26, № 1, 152—184.
Чепурнова Л. В. 1958. Половой цикл днестровского рыбца Vimba vimba vimba nation carinata (Pallas).— Уч. зап. Кишиневск. гос. ун-та, № 32 (ихтиол.), 175—183.
Шатенштейн А. И., Яковлева Е. А., Звягинцева Е. Н.. Варшавский Я.М, Израилевич Е. А. и Дыхно Н. М. 1957. Изо-, топный анализ воды. Изд-во АН СССР.
Ш е х о н и н С. Н. 1959. Библиографический указатель изданий Коми филиала Академии наук СССР (1941—1958 гг.). Коми книжи. изд. Сыктывкар.
Ц1 к а п с к а я Л. В. 1959. Развитие субдермальной полости у зародышей барабульки.— Дипломная работа МГУ.
ШмидтГ. А. 1951. Эмбриология животных, ч. I. Общая эмбриология. Изд. «Советская наука».
Шмидт Г. А.—1953. Эмбриология животных, ч. II. Частная эмбриология. Изд. «Совыская наука».
?94
ш у л ь м а и Г. Е. 1958. Изучение динамики химического состава азовской хамсы в связи с преднерестовым, нерестовым и предмиграционным пе» риодами годового цикла.— Канд, дисс., Керчь.
'Шульман Р. А. 1934. Химия и технология азовского судака.— Тр. Всес. н.-и. ии-та рыбн. пром., № 3, 43—54.
ЮровицкийЮ. Г. 1956. Биология синца Рыбинского водохранилища.— Канд. дисс. М.
Abel son Р. 1947. Permeability of eggs Arbacia punctulata to radioactive phosphorus.— Biol. Bull., 93, N 2, 203.
A f z e 1 i u s B. 1956. The ulitrastructure of the cortical granules and their products in the sea urchin eggs as studied with the electron microscope.— Exptl. Cell Res., 10, N 2. 257—285.
AketaK- 1954. The chemical nature and the origin of the cortical alveoli in the egg of the medaka, Oryzias latipes.—Embryologia, 2, N 3—13, 63—66.
Allen R. 1954a. Fertilization and activation of sea urchin eggs in glass capillaries. I. Membrane elevation and nuclear movements in totally and partially fertilized eggs.— Exptl. Cell Res., 6, N 2, 403—412.
A11 e и R. 1954b. Fertilization and activation of sea urchin eggs in glass capillaries. II. Cortical changes and the fertilization impulse.— Exptl. Cell Res., 6, N 2, 412—422.
Allen R. 1958. The initiation of development.— Sympos. Chem. Basis Development, Baltimore, p. 17—63.
Allen R. a. Hagstrom B. 1955. Some interrelationships among cortical reaction phenomena in the sea urchin egg.— Exptl. Cell Res., Suppl 3, 1—15.
Allen R. a. Griffin J. 1958. The time sequence of early events in the fertilization of sea urchin eggs. I. The latent period and the cortical reaction.— Exptl. Cell Res., 15, N 1, 163—173.
D’Amelio V. 1955. Trypsin sensitivity of some proteins of the sea urchin egg before and after fertilizationan electrophoretic analysis. — Experience, 11, N 11, 443.
Aoki K. 1939. Uber die Wasseraufnahme der Lachseier. I—J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 7, N 1, 27—38.
Aoki K. 1940. Uber die Wasseraufnahme der Lachseier. II. Der Einfl-° der lonen.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool, 7, N 2, 87—94.
Aoki K. 1941a. On the swelling of the membrane of dog salmon egg.— Kagaku 11, 517.
Aoki K- 1941b. On the hyalin layer of the membrane of dog salmon egg.— Kagaku, 11, 517.
Aoki K. 1942. Uber die Wasseraufnahme der Lachseier. HI. Die Wasser-aufnahme in dier KoMoidlosiung. — J. Fac. Sci, Hokkaido Univ., Ser. Zool., 8, N 2, 56—73.
Arima S. 1952. Studies on the end-products of metabolism in the early developmental stages of amphibia. IL Qualitative analysis of the composition of the peri-vitelline fluid of Rhacophorus schlegelii var. arborea.—Zool. Mag., 61, N 10, 300—302.
Arima S. 1955. Studies on the end-products of metabolism in the early developmental stages of amphibia. III. The organic constituents of the peri-vitelline fluid of Rhacophorus schlegelii var. arborea.— Zool. Mag., 64, N 4, 122—125.
Arima S. 1958. Studies on the end-products of metabolism in the early developmental stages of amphibia. IV. Ammonia-, Urea- and Iron-contents in the perivitelline fluid of Rhacophorus schlegelii var. arborea.— Annot. zool. japon., 31, N 3, 136—140.
Armstrong P. 1928. The antagonism between acetic acid and the chlorides of sodium, potassium and calcium as manifested in developing Fundulus embryos.— J. Gen. Physiol., 11, N 5, 515—523.
295
Arndt E. 1954—1955. Histologische und histochemische Untersuchungen fiber die Oogenese und bipolare Differenzierung bei Sfifiwasser-Teleo-steern.— Wiss. Z. Univ. Rostock, Math.-naturwiss. Reihe, 4, N 2, 191.
Arndt E. 1956. Histologische und histochemishe Untersuchungen fiber die Oogenese und bipolare Differenzierung von Sufiwasser-Teleosteern.— Protoplasma, 47, N 1—2, 1—36.
Atlas M. 1938. The rate of oxygen consumption of frogs during embryonic development and growth.— Physiol. Zool., 11, N 3, 278—291.
Austin C. 1956. Cortical granules in hamster eggs.— Exptl. Cell. Res., 19, N 2, 533—540.
Austin C. a. Bishop M. 1957a. Fertilization in mammals.— Biol. Rev., 32, N 3, 296—346.
Austin C. a. Bishop M. 1957b. Preliminaries of fertilization in mammals.— Beginn. Embryon. Development, 71—108.
Austin C. a. Braden A. 1956. Early reactions of the rodent egg to spermatozoon penetration.—J. Exptl. Biol., 33, N 2, 358—365.
Bailey R. 1933. The ovarian cycle in the viviparous teleost, Xiphophorus helleri.—Biol. Bull, 64, N 2,'206—225.
Balfour F. 1885. A treatise on comparative embryology. Macmillan and Co, London.
Battle H. 1944. The embryology of the atlantic salmon (Salmo salar L.).— Canad. J. Res, Sec. D, 22, N 5, 105—125.
Best J. 1955a. The inference of intracellular enzymatic properties from kinetic data obtained on living cells. I. Some kinetic considerations regarding an enzyme enclosed by a diffusion barrier —J. Cell. a. Com-par. Physiol, 46, N 1, 1—27.
Best J. 1955b. The inference of intracellular enzymatic properties from kinetic data, obtained on living cells. II. A study ,of hexokinase and invertase as cellular components of Baker’s yeast.— J. Cell. a. Compar. Physiol, 46, N 1, 28—52.
BialaszewiczK- 1912. Ueber das Verhalten des osmotischen Drucks wahrend der Entwicklung der Wirbertierembryonen.—• Roux’s Arch. Entwicklungsmech.— Organismen, 34, N 3, 489—540.
Bodine J. 1928. Action of salts on Fundulus egg. I. The action of Na, K. and Ca chlorides upon the egg of Fundulus.— Biol. Bull, 54, N 5,396— 404.
Bogucki M. 1930. Recherches sur la permeabilite des membranes et sur la pression osmotique des oeufs des Salomonides.— Protoplasma, 9, N 3, 345—369.
Briggs R. 1939. Changes m density of the frog embryo (Rana pipiensf during development.— J. Cell. Compar. Physiol, 13, N 1, 77—89.
Brooks M. 1946. The mechanism of fertilization of eggs.— Growth, 10, N.4, 391—410.
Brooks S. 1943. Intake and loss of ions by living cells. II. Early changes of phosphate content of Fundulus eggs.— Biol. Bull, 84, N 3, 226—239.
Brooks S. a. Brooks M. 1941. The permeability of living cells. Berlin.
Brooks S. a. Chambers E. 1954. The penetration of radioactive phosphate into marine eggs.— Biol. Bull, 106, N 3, 279—296.
BrownC. 1955. Egg-capsule proteins of selachians and trout.— Quart. J. Microscop. Sci, 96, N 4, 483—488.
В г о w n M. 1941. Collaps of the archenteron in embryos of Amblystoma and Rana.—J. Exptl. Zool, 88, N 1, 95—106.
Brown M, Hamburger V. a. Schmitt F, 1941. Density studies on amphibian embryos with special reference to the mechanism of organizer action.— J. Exptl. Zool., 88, N 3,. 353—372.
Brown O. 1905. The permeability of the membrane of the egg of Fundulus heteroclitus.— Amer. J. Physiol, 14, N 4, 354—358.
296
Brown R. (Браун P.) 1955. Ферменты поверхности протопласта и поглощение сахара.— Сб. «Совр проблемы цитологии», 213-—225, Изд. ИЛ, М.
Buytendijk F. u. Woerdeman М. 1927. Die physiko-chemischen Erscheinungen wahrend der Eintwicklung. I. Die Messung der Wasser-stoffionenkonzentration. Roux’s Arch. Entwicklungsmech. Organismen, 112,387—410.
C a Iberia E. 1878. Der Befruchtungsvorgang beim Ei von Petromyzort planeri.— Z. wiss. Zool., 30, N 3, 437—486.
Ceas M., Impellizzeri M. a. Mon-r oy. A. 1955. The action of urea on some proteins of the unfertilized and fertilized sea-urchin egg.—• ExptE Cell Res., 9, N 2, 366—369.
Chambers R., Chambers E. a. Kao C.Y. 1951. The internal hydro-' static pressure of the unfertilized activated Fundulus egg -exposed to various experimental conditions.— Biol. Bull., 101, N 2, 206—207.
Cheney®., a. L a n s i n g A. 1955. Caffeine ihibition of fertilization in Arba-cia.— Exptl. Cell Res., 8, N 1, 173—180.
Chopra H. 1958. A morphological and histochemical study of the oocytes of the fish, Ophiocephalus punctatus, with particular reference to lipids.— Quart. J. Microscop. Sci., 99, N 2, 149—157.
Col win L. a. Col win A. 1954. Fertilization changes in the membranes and cortical granular layer of the egg of Saccoglossus kowalevskii (En-teropneusta).— J. Morphol., 95, N 1, 1—46.
Connors W. a. Scheer B. 1947. Adenosinetriphosohatase in the sea urchin egg. I. Cell. a. Comp. Physiol., 39, N 3, 271—283.
Costello D. 1949. The relation of the plasma membrane, vitelline membrane, and jelly in the egg of Nereis limbata.— J. Gen. Physiol., 32, N 3, 351—366.
Costello D. 1957. The cortical response of the Nereis ovum to activation after centrifuging/—Biol. Bull., 113, N 2, 341—342.
Costello D. 1958. The cortical response of the ovum to activation after centrifuging.— Physiol. Zool., 31, N 3, 179—188.
Costello D. 1959. A general theory of membrane elevation in marine eggs.—Biol. Bull., 117, N 2, 410—411.
Dakin W. a. Dakin C. 1925. The oxygen requirements of certain aquatic animals and its bearing upon the source of food supply.—-Brit. J. ExptE Biol., 2, N 3, 293—322.
[Danielli, J.] (Даниелли Дж.).— 1955. Роль структурных факторов в клеточной проницаемости и секреции.— Сб. «Совр. проблемы цитологии», 166—182. Изд. ИЛ, М.
Danielli J. 1954. Morphological and molecular aspects of active transport— Sympos. Soc. Exptl. Biol. v. 8; p. 502—516. . ,
Da vs on H. 1954. Vertebrate physiology from the point of view of active transport. Sympos. Soc. Exptl. Biol., v. 8, p. 16—26. ,
Dav-son H. a. Dani ell у J. 1943. Permeability of natural membranes. Cambridge. ;
Dempster W. 1930. The growth of larvae of Amblystoma maculatum under natural conditions.— Biol. Bull., 58, N 2, 182—192. ,
Dempster W. 1933. Growth in Amblystoma punctatum during the embryonic and early larval period. J. Exptl. Zool. 64, 3, 495—511.
Devillers C., Thomopoulos A. et Colas J.—1954. Differentiation bi-polaire et formation de i’espace perivitellin dans 1’oeuf de Salmo irideus. Bull. Soc. zool. France, 78 N 5/6 : 462—470.
Dick, D.— 1'959. Osmotic properties of living cells. Intern. Rev. Cytology, 8:387—448.
D о m u r a t J.— 1956. Rozwoj embrionalny troci (Salmo trutta L.), szczupaka (Esox lucius L.) i ploci (Rutilus rutilus L.) w srodowisku bezwodnym. Polskie arch, hydrobiol., 3 : 167—173.
29?
Dungay N.—1913. A study of the effects of injury upon the fertilizing power of sperm. Biol. Bull., 25 N 4 : 213—260.
Duryee W.— 1932. The relationship between the water content and oxygen consumption of the organism. Science, 75 N 1950 : 520.
Eigenmann C.— 1890. On the egg membranes and micropile of some osseous fiches. Bull. Miseum Comp. Zool. Harvard Coll. USA, 19 N 2: 129— 154.
E n d о Y.— 1952. The role of the cortical granules in the formation of the fertilization membrane in the eggs from Japanese sea urchins. Exptl Cell Res., 3 N 2:406—418..
Ephrussi B. etNeukomm A.— 1927. L’oeuf d’Oursin, obeit-il a la loi de Boyle-Mariotte? Compt. rend. Soc. biol., 96 N 16 : 1291—1293.
Esping U.— 1957a. A factor inhibiting fertilization of sea urchin eggs from extracts of the alga Fucus vesiculosus. I. The preparation of the factor inhibitinig fertilization. Arkiv kemi, UN 12:107—115.
Esping U.— 19576. A factor inhibiting fertilization of sea urchin eggs from extracts of the alga Fucus vesiculosus. II. The effect of the factor inhibiting fertilization on some enzyme. Arkiv kemi, 11 N 13: 117—127.
Fenger-Eriksen K-, Krogh A. a Us sing H. 1936. A micro-method for accurate determination of D2O in water.— Biochem. J., 30, N 7, 1264— 1269.
Fetcher E. 1944. Modification of apparatus for deuterium oxide determination by the falling drop.— Industr. a. Engng. Chem. Analyt. Ed. 16, N 6. 412.
Folkes B., Grant R. a. Jones J. 1950. Frog-spawn mucin.— J. Chem. Soc., pt. Ill, N 440, 2136—2140.
Fulton T. 1891. The comparative fecundity of sea-fishes.— Ninth Ann. Rep. Fishery Scotland, Pt. Ill, 243—268.
Fulton T. 1898a. On the maturation of the pelagic eggs of teleostean fishes.— Zool. Anz. 21, N 556, 245—252.
Fulton T. 1898b. On the growth and maturation of the ovarian eggs of teleostean fisches.— Sixteenth Ann. Rep. Fishery, Scotland, Pt. Ill, 88— 124.
Felton T. 1898c. The ovaries and ovarian eggs of the angler of frog-fish (Lophius piscatorius), and of the John Dory (Zeus faber).— Sixteenth Ann. Rep. Fishery, Scotland, Pt. Ill, 125—134.
Geilenkirchen W. a. Zeuthen E. 1958. Changes in submerged (reduced) weight associated with cell division in echinoderm eggs. A study with the Cartesian diver balance.— C. r. trav. Lab. Carlsberg, Ser. chim., 31, N 2, 7—28.
Gilchrist F. a. Pincus G. 1932. Living rat eggs.— Anat. Rec., 54, N 2, 275—285.
Giardina G. a. Monroy A. 1955. Changes in the proteins of the sea-urchin egg at fertilization.— Exptl. Cell Res., 8, N 3, 466—473.
Glaser O. 1914. The change in volume of Arbacia and Asterias eggs at fertilization.— Biol. Bull., 26, N 2, 84—91.
Glaser O. 1924. Fertilization, cortex and volume.— Biol. Bull., 47, N 5. 274—283.
Goette A. 1875. Die Entwicklungsgeschichte der Unke (Bombinator igneus). Leipzig.
Goodrich K. 1925. The blastocoelic and enteric cavities in the amphibia.— Quart. J. Microscop. Sci., 69, N 4, 745—746.
Gray J. 1920. The relation of the animal cell to electrolytes. I. A physiological study of the egg of the trout.— J. Physiol., 53, N 5, 308—319.
Gray J. 1926. The growth of fish. I. The relationship between embryo and yolk in Salmo fario.— Brit. J. Exptl. Biol., 4, N 2, 215—225.
Gray J. 1932. The osmotic properties of the eggs of the trout (Salmo fario).—J. Exptl. Biol., 9, N 3, 277—299.
298
Gregg J. 0- Ballentine R. 1946. Nitrogen metabolism of Rana pipiens during embryonic development.— J. Exptl. Zool., 103, N 1, 143—168.
HagstronB. a. Runnstrom J. 1959. Refertilization of partially fertilized sea urchin eggs.— Exptl. Cell Res., 16, N 2, 309—314.
Hama no S. 1951. Preliminary note on the activation of the egg in the crucian carp (Carassius auratus).— Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ., 2, N 3, 172—175.
H a m a n о S. 1957. Physico-chemical studies on the activation and fertilization of fish eggs.— Mem. Fac. Fish. Hokkaido Univ.; 5, N 2, 91—143.
Hamano S. a. Ku bo S. 1954. On the electrophoretic difference between activated and fertilized eggs of the pond smelt, Hypomesus olidus Pallas.— Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ., 5, N 1, 9—14.
Harding D. 1951. Effect of bacterial polysaccharide on artificial activation in the frog egg.— Nature, 167, N 4244, 355.
Harding C. a. Harding D. 1952. The reversible inhibition of fertilization.— Arkiv zool, 3, N 4, 357—361.
H a r d i s t у M. 1957. Osmotic conditions during the embryonic and early larval life of the brook lamprey (Lampetra planeri).— J. Exptl. Biol., 34, N 2, 237—252.
Harris E. 1956. Transport and accumulation in biological systems. Acad. Press. New York, Butterworths Sci. Publ. London.
Harvey E. 1911. Studies on the permeability of cells.— J. Exptl. Zool., 10, N 4, 507—556.
Hayes F. 1930. The metabolism of developing salmon eggs. I. The significance of hatching and the role of water in development.— Biochem. J., 24, N 3, 723—727.
Hayes F. 1942. The hatching mechanism of salmon eggs.— J. Exptl. Zool., 89, N 3, 357—373.
Hayes F. 1949. The growth, general chemistry and temperature relation of salmonid eggs.— Quart. Rev. Biol., 24, N 3, 281—308.
Hayes F. a. Armstrong F. 11942. Physical changes in the constituent parts of developing salmon eggs.— Canad. J. Res., Sec. D., 20, N 5, 99—114.
Heilbrunn L. 1915. Studies in artificial parthenogenesis. II. Physical changes in the egg of Arbacia.— Biol. Bull., 29, N 3, 149—203.
Heilbrunn L. 1937. An outline of general physiology. W. B. Sanders Company, Philadelphia a. London.
[Heilbrunn L.] (Гейльбрун Л.) — 1967. Динамика живой протоплазмы. Изд. ИЛ, М.
Heilbrunn L. a. Byers Т. 1959. A study of membrane elevation in various marine eggs.— Biol. Bull., 117, N 2, 396—397.
Heilbrunn L., Mazia D. a. Steinbach H. 1934. Free and bound calcium in stimulation and injury.— Anat. Rec., 60, N 4, Suppl., 32.
Heilbrunn L. a. Wilbur K. 1937. Stimulation and nuclear break down in the Nereis egg.— Biol. Bull., 73, N 3, 557—564.
H e i 1 b r u n n L. a. Wilson W. 1948. Protoplasmic viscosity changes during mitosis in the egg of Chaetopterus.— Biol. Bull., 95, N 1, 57—68.
Hein W. 1907. Zur Biologie der Forcllenbrut. II. Ueber die absolute Druckfestigkeit der Bachforelleneier.— Allgem. Fischerei-Zg., 31, N 16 334—339.
Herfort K. 1893. Der Reifungsprocefs im Ei von Petromyzon fluviatilis.— Anat. Anz. 8, N 21—22, 721—728.
Herfort K. 1901. Die Reifung und Befruchtung des Eis von Petromyzon fluviatilis.— Arch. Mikroscop. Anat., 57, 54—95.
Hi r a mot о Y. 1955. Nature of the perivitelline space in sea urchin eggs. III. On the mechanism of membrane elevation.— Annot. zool. japon., 28, N 4, 183—193. (P. ж. биол., 1957, N 22, 93071).
H о a r W. 1957. The gonads and reproduction. In: «The physiology of fishes», v. 1, Ch. VII, p. 287—322.
299
Hob er R., Hitchcock D., Bateman J., Goddard’D. a. Fenn Wt 1946. Physical chemistry of cells and tissues. Blakiston Comp. Philadelphia — Toronto.
Hobson A. 1932a. The effect of fertilization on the permeability to water and on certain other properties of the surface of the egg of Psammechinus miliaris. J. Exptl. Biol., 9, N 1, 69—92.
Hobson A. 1932b. On the vitelline membrane of the egg of Psammechinus miliaris and of Teredo norvegica.— J. Exptl. Biol., 9, N 1, 93—106.
Hochberg S. a. La Мег. V. 1937. Microdetermination of density by the falling-drop method.— Industr. a. Engng. Chem., Analyt. et., 9, N 6, 261— 262.
Holtfreter J. 1943. Properties and functions of the surface coat in amphibian embryos.— J. Exptl. Zool., 93, N 2, 251—323.
Hopper A. 1943. The early embryology of Platypoecilus maculatus. Copeia, 3, 180—183.
Hori R. 1958. On the membrane potential of the unfertilized egg of the medaka, Oryzias latipes and changes accompanying activation.— Embryologia, 4, N 2, 79—91.
Horstadius S. a. Runnstrom J. 1953. Fertilization and membrane formation of sea urchin eggs aspirated in capillaries.— Exptl. Cell Res., 4, N 2, 468—476.
Hsiao S. a. Boroughs H. 1958. The uptake of radioactive calcium by sea urchin eggs. I. Entrance of Ca4S into unfertilized egg cytoplasm.— Biol. Bull., 114, N 2, 196—204.
Hunter F. a. de Luque O. 1959. Osmotic studies of amphibian eggs. II, Ovarian eggs.— Biol. Bull., 117, N 3, 468—481.
Hu ver C. 1956. The relation of the cortex to the formation of a perivitelline space in the eggs of Fundulus heteroclitus. Biol. Bull., Ill, N 2, 304.
Ihnuma M. a. Tsukuda T. 1952. Cytochemical studies on polysaccharide and protein of ovarian egg-cells of an osseous fish (Leiog-nathus argenteum).— Okajima’s Fol. Anat. Japan., 24, 49—53.
Ikeda Y. 1934. Permeability of the egg membrane of Oryzias latipes.— J. Fac. Sci. Imp. Univ. Tokyo. Sec. IV, 3, N 3, 499—504
Immers J. 1956. Changes in acid mucopolysaccharides attending the fertilization and development of the sea urchin.— Arkiv zool., 9, N 4, 367—375.
Irving L. a. Manery J. 1934. Changes in CO2 capacity and ionic changes during the development of trout eggs.— J. Cell. a. Compar. Physiol., 4, N 4, 483—503.
Ishihara K- 1957. Release and activation of aldolase at fertilization in sea urchin eggs.— J. Fac. Sci. Univ. Tokyo, Sec. IV, 8, N 1, 71—93.
Ishikawa M. 1954. Relation between the breakdown of the cortical granules and permeability to water in the sea urchin egg.— Embryologia., 2, N 3—12, 57—62.
11 о S. 1954. On breakdown of the cortical alveoli in the eggs of the fishes, Zacco platvpus and Plecoglossus altivelis.— Kumamoto J. Sci., Ser. B, 3, 30—35. '
11 о S. 1960a. The osmotic property of the unfertilized egg of fresh water fish, Orvzias latipes.—Kumamoto J. Sci., Ser. B. 5, In 1, 61—72.
11 о S. 1960b. Further studies on the effect of hydrogen ion concentrations and salts upon the cortical change of eggs of a fresh water fish Plecoglossus altivelis.— Kumamoto J. Sci., Ser. B, 5, N 1, 73—88.
Ito S. a. Ma eno T. 1960. Resting potential and activation potential of the Oryzias egg. I. Response to electrical stimulation.— Kumamoto J. Sci., Ser. B, 5, N I, 100—107.
Jacobs M. 1933. The simultaneous measurement oi cell permeability to-
300
water and to dissolved substances.— J. Cell. a. Compar. Physiol., 2, ’ N 4, 427—444.
Jacob.s M. 1934. The quantitative measurement of the permeability of the erythrocyte to water and to solutes by the hemolysis method.— J. Cell, a. Compar. Physiol., 4, N 2, 161—183.
Jacobs M. 1935. Diffusion processes.— Ergebn. Biol., 12, 1—160.
Jacobsen J. a. Johansen A. 1908. Remarks on the changes in specific gravity of pelagic fish eggs and the transportation of same in Danish water.— Medd. Kommus. Havundersog., Ser. Fiskeri, 3, N 2, 1—24.
Jaffee O. 1959. Osmotic forces and blastocoels formation.— Anat. Rec., 134, N 3, 585.
Jura C. a. G e о r g e J. 1958. Observations on the jelly mass of the eggs of three molluscs, Succinea putris, Limnaea stagnalis, and Planorbis corneus, with special reference to metachromasia.— Proc. Koninkl. Ne-derl. Acad. Wetensch, Ser. C, 61, N 5, 590—594.
Just E. 1919. The fertilization reaction in Echinarachnius parma. I. Cortical response of the egg to insemination.— Biol. Bull., 36, N 1, 1—10.
Kacser H. 1955. The cortical changes on fertilization of the sea-urchin egg.—J. Exptl. Biol., 32, N 3, 451—467.
Kagan B. 1935. The fertilizable period of the eggs of Fundulus heteroclitus and some associated phenomena.—-Biol. Bull., 69, N 1, 185— 201.
Kalman S. 1959. Sodium and water exchange in the trout egg. J. Cell. a. Comp. Physiol., 54, N 2, 155—162.
Kanoh Y. 1950. Uber die Wasseraufnahme und Aktivierung der Lachseier., I.—'Annot. zool. japon., 24, N 1, 13—21.
Kanoh Y. 1951a. Uber Wasseraufnahme und Aktivierung der Lachseier. II. Die Wirkung der hypertonischen Salzlosung. J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 10, N 3—4, 260—265.
KanohY. 1951b. Zweiamtige Adhasionstypen bei klebrigen Fischeiern.— Zool. Mag., 60, N 3, 65—67.
Kanoh Y. 1952a. Uber die Beziehung zwischen dem Zerfallen der Korti-kalalveoli und der Entwicklung bei Fischeiern.— Japan. J. Ichthyol., 2, N 3, 99—103.
Kanoh Y. 1952b. Uber das Ei und einige seiner Charakteristika bei einem japanischen Knockenfisch, Ayu (Plecoglossus altivelis).— Japan. J. Ichtyol., 2, N 4/5, 147—165.
Kanoh Y. 1952c. Uber Wasseraufnahme und Aktivierung der Lachseier. III. Die Permeabilitat der Eioberflacke.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. VI, 11, N 1, 95—100.
Kanoh Y. 1953. Uber den japanischen Hering (Clupea pallasii Cuvier et Valenc.). II. Veranderung im Ei bei der Befruchtung oder Aktivierung.— Cytologia, 18, N 1, 67—79.
Kanoh Y. 1954. On the buoyancy of the egg of Alaska pollack, Theragra chalcogramma.— Japan. J. Ichthyol., 3, N 6, 238—246.
Kanoh Y. 1956. Uber Wasseraufnahme und Aktivierung der Lachseier. IV. Vorlaufiges Experiment in Betreff des Calciumproblems.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ, Ser. VI, 12, N 3, 259—263.
KanohY. a. Ito S. 1953. The effect of the outer medium upon the cortical change, bipolar differentiation and karyokinesis at the time of activation in the egg of Japanese dace (Tribolodon hakuensis).— Bull. Japan. Soc. Scient. Fish, 18, N 10, 462—467.
Kanoh Y. a. Yamamoto, T. S. 1957. Removal of the membrane of the dog salmon egg by means of proteolytic enzymes.— Bull. Janan. Soc. Scient. Fish, 23, N 3, 166—172.
Kanoh Y. u. Yanagimachi R. 1956. Uber den japanischen Hering (Clupea pallasii C. et V.). III. Ьёг Beginn der Entwicklung ohne Zer-
301
fallen der KortikalalVeoli.— J. Fac. Sei. Hokkaido Univ., Ser. VI, 12, № 3, 264—272.
Kao C. Y. 1951. Micropuncture and the localization of the subsequently-forming blastodisc in the unfertilized Fundulus egg.— Biol. Bull., 101, N 2, 222—223.
Kao C. Y. 1956. Pressure-volume relationship of the Fundulus egg in sea water and sucrose.— J. Gen. Physiol., 40, N 1, 91—106.
Kao C. Y. a. Chambers R. 1954. Internal hydrostatic pressure of the Fundulus egg. I. The activated egg.— J. Exptl. Biol., 31, N 1, 139—149.
Kao C.Y., Chambers R. a. Chambers E. 1951. The internal hydrostatic pressure of the unfertilized Fundulus egg activated by puncture.— Biol. Bull., 101, N 2, 210—211.
Kao C. Y., Chambers R. a. Chambers E. 1954. Internal hydrostatic pressure of the Fundulus egg. II. Permeability of the chorion.— J. Cell, a. Compar. Physiol., 44, N 3, 447—461.
Katsura S., T aoka S., Sakai T. a. Ichihara M. 1955. On the mechanism of egg-activation under normal fertilization in Japanese Palolo.— Bull. Exptl. Biol., 5, N 4, 273—286. (P. Ж. биол., 1S67, N 15, 63720.
Kekwick R. a. Harvey E. 1934. The effect of anaerobic conditions on the permeability of the egg of Arbacia punctulata to water.— J. Cell, a, Compar. Physiol., 5, N 1, 43—51.
Kelly J. 1954. Metachromasy in the eggs of fifteen lower animals.— Protoplasma, 43, N 4, 329—346.
Ke st on A., Rittenberg D. a. Schoen heimer R. 1937. Determination of deuterium in organic compoud.—.J. Biol. Chem.. 122, N 1, 227— 238.
Kemp N. 1956a. Electron microscopy of growing oocytes of Rana pipiens— J. Biophys. a. Biochem. Cytol., 2, N 3, 281—291.
Kemp N. 1956b. Differentiation of the cortical cytoplasm and inclusions in oocytes of the frog.— J. Biophys. a. Biochem. Cytol., 2, N 4, 187—190.
Kemp N. a. Allen M., 1956. Electron microscopic observations on changes in the cortical cytoplasm after fertilization of Fundulus eggs.— Biol. Bull., Ill, N 2, 306.
Kohn R. 1956. Calcium in aging and fertilized frog eggs. Exptl. Cell Res., 10, N 3, 640—645.
Konopacka B. 1935. Recherches histochimique sur le developpement des Poissons. I. La vitellogenese chez le Goujon (Gobio fluviatilis) et la Carpe (Cyprinus carpio).— Bull. Acad. Polonaise sci. et lettres, ser. B, . 163—184.
Kopac M. 1940. The physical properties of the extraneous coats of living cells. Cold Spring Harbor Sympos. Quant. Biol. v. 8, p. 154—170.
К о p a с M. 1941. Disintegration of the fertilization membrane of Arbacia by the action of an «enzyme». J. Cell. a. Compar. Phvsiol., 18, N 2, 215— 220.
Kopsch F. 1911. Die Entstehung des Dottersackentoblast und die Furchung bei der Forelle (Salmo fario).— Arch. Mikroscop. Anat., 78, N 1, 618— 659.
Krishna D. 1956. Permeability of the vitelline membrane of the trout egg.— Current Sci., 25, N 1, 28—29.
Kriszat G. a. Runnstrom J. 1952. The activation of the egg of the sea urchin Psammechinus miliaris by periodate.— Exptl. Cell Res., 3, N 3, 597—604.
Krogh A. 1939. Osmotic regulation in aquatic animals. Cambridge.
Krogh A. with Krogh A. a. Wernstedt C. 1938. The salt concentration in the tissues of some marine animals — Scand. Arch. Physiol., 80, 214—222.
Krogh A. a. Ussing H. 1937. A note on the permeability of trout eggs to D2O and H2O.—J. Exptl. Biol., 14, N 1, 35—37.
302
Kronfeld P. u. Scheminsky F. 1926. Beitrage zur Physikalisch-chemischen Biologie der Forellenentwicklung. 2. Mitteilung: Wachstumr Dotterresorption und Wasserhaushalt. Roux’s Arch Entwicklungsmech. Organismen, 107, N 1, 129—153.
Kusa M. 1949a. Hardening of the chorion of salmon eggs.—Cytologia, 15, N 1—2, 131—137.
Kusa M. 194%. Further notes on the hardening of the chorion of salmon eggs.— Cytologia, 15, N 1—2, 145—148.
Kusa M. 1950a. A preliminary note on the fertilization in egg of Salmon (Oncorhynchus keta).— Zool. Mag., 59, 240—241.
Kusa M. 1950b. Physiological analysis of fertilization in the egg of the-salmon, Oncorhynchus keta. I. Why are the eggs not fertilized in isotonic Ringer solution?—Annot. zool. japon., 24, N 1, 22—28.
Kusa M. 1951. A brief note on the permeation of heavy water into the1 unactivated eggs of the rainbow trout.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 10, N 3—4, 271—273.
Kusa M. 1953a. Significance of the cortical change in the initiation of development of the salmon egg. (Physiological analysis of fertilization in the egg of the salmon, Oncorhynchus keta).—Annoit. zool. japon., 26,. N 2, 73—77.
Kusa M. 1953b. On some properties of the cortical alveoli in the egg of the stickleback.— Annot. zool. japon., 26, N 3, 138—144.
Kusa M. 1954. The cortical alveoli of salmon egg.— Annot. zool. japon., 27, N 1, 1—6.
Kusa M. 1956. Studies on cortical alveoli in some teleostean eggs.— Embryologia, 3, N 2, 105—129.
Kusa M. 1957a. Osmotic behavior of the isolated cortical alveoli of stickleback eggs. Annot. zool. japon., 30, N 2, 67—70.
Kusa M. 1957b. Occurrence of a neutral mucopolysaccharide in the cortical alveoli of lamprey eggs.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 13, N 1—4, 455—457.
Kusa M. 1958a. Explosion of isolated cortical alveoli of the stickleback egg.— Annot. zool. japon., 31, N 4, 212—215.
Kusa M. 1958b. Cortical alveoli in some teleostean eggs.— Sympos. Cell. Chem., v. 8, p. 101—118.
Kusa M. a. Ootake S. 1959. Notes on the particles occuring in the perivitelline space in the egg of the brook lamprey following insemination.— Bull. Yamagata Univ., Natur. Sci., 4, N 4, 459—468.
К u s,a M. a. W a d a T. 1959. X-ray diffraction patterns from the egg membrane of the egg of the brook trout.— Nature, 183, N 4658, 410—411.
Lefevre P. 1955. Active transport through animal cell membranes. Springer Verlag, Wien.
Leitch J. 1934. The water exchanges of living cell. II. Non-solvent volume determinations from swelling and analytical data.— J. Cell. a. Compar. Physiol., 4, N 4, 457—473.
L i 11 i e F. 1911. Studies of fertilization in Nereis. I. The cortical changes in the egg; II. Partial fertilization.— J. Morphol., 22, 361—366.
Lillie F. 1912. Studies of fertilization in Nereis. III. Morphology of the normal fertilization of Nereis.—J. Exptl. ZooL, 12, N 4, 413—427.
Lillie F. 1926. Проблемы оплодотворения. Госиздат, M.
Lillie R. 1916. Increase of permeability to. water following normal and artificial activation in sea-urchin eggs.— Amer. J. Physiol., 40, N 2, 249—266.
Lillie R. 1918a. Comparative permeability of fertilized and unfertilized eggs to water.— Science, 47, N 2, 147.
Lillie R. 1918b. The increase of permeability to water in fertilized sea-urchin eggs and the influence of cyanide and anaesthetics, upon this change.— Amer. J. Physiol., 45, N 4, 406—430.
303
Loeb,J. 1903. On the relative roxicity or distilled water, sugar, solutions, and solutions of the various constituents of the sea-water for marine animals. Univ. California Pubis. Physiol., 1, N 7, 55—69.
Loeb J. 1908. Uber die osmotischen Eigenschaften und die Entstehung der Befruchtungsmembran beim Seeigelei.— Roux’s Arch. Entwicklungs-
mech. Organismen, 26, 82—88.
Loeb J. 1912. Antagonistic action of electrolytes and permeability of the .cell membrane.— Science, 36, N 932, 637—639.
Loeb J. 1913. Artifical parthenogenesis and fertilization. Chicago.
Loeb J. 1914. On some non-specific factors for the entrance of the spermatozoon into the egg.— Science, 40, N 1026, 316—318.
Loeb J. 1915. Reversible activation and incomplete membrane formation of the unferilized eggs of the sea urchin.— Biol. Bull., 29, N 2, 103— 110.
Loeb J. (Лёб Ж-) — 1926. Организм как целое с физико-химической точки зрения. Госиздат. М.— Л.
LoebJ. a. WasteneyH. 1915. Note on the apparent change of the osmotic pressure of cell contents with the osmotic pressure of the surrounding solution.— J. Biol. Chem., 23, 157—162.
Lucke B. 1940. The living cell as an osmotic system and its permeability of water. Cold Spring Harbor Sympos. Quant. Biol., v. 8, p. 123—132.
Lucke B., Hartline H. a. McCutcheon M. 1931. Further studies on the kinetics of osmosis in living cells.— J. Gen. Physiol., 14, N 3, 405- 419.
Lucke B. a. Harvey N. 1934. Permeability of living cells to heavy water.— Anat. Rec., 60, N 4, Supol.. 32.
Lucke B., Larrabee, M. a. Hartline H. 1935. Studies on osmotic equilibrium and on the kinetics of osmosis in living cell by a diffraction method.— J. Gen. Physiol., 19, N 1, 1—18.
Lucke B. a. McCutcheon. M. 1932. The living cell as an osmotic system and its permeability to water.— Physiol. Revs., 12, N 1, 68— 139.
Lundblad G. 1949. Proteolytic activity in eggs and sperms from sea-urchin.— Nature, 163, N 4147, 643.
Lundblad G. 1950. Proteolytic activity in sea urchin gametes. I. Activity in untreated extracts.— Exptl. Cell Res., 1, N 2. 264—271.
Lundblad G. 1954. Proteolytic activity in sea urchin gametes. IV. Further investigation of the proteolytic enzymes of the egg.— Arkiv kemi, 7, N 2, 127—167.
Luque O. de a. Hunter F. 1959. Osmotic studies of amphibian eggs. I. Preliminary survey of volume changes.— Biol. Bull., 117, N 3, 458—467.
Lyon E. 1907. Results of centrifugalizing eggs. I. The specific gravity of eggs and the changes in specific gravity occurring during development.— Roux’s Arch. Entwicklungsmech. Organismen, 23, N 1, 151—157.
Maggio R. 1957. Mitochondrial and cytoplasmic protease activity in sea urchin eggs.— J. Cell. a. Compar. Physiol., 50, N 1, 135—143.
Maggio R. 1959. Cytochrome oxidase activity in the mitochondria of unfertilized and fertilized sea urchin eggs.— Exptl. Cell. Res. 16, N 2, 272—278.
Maggio R. a. Monroy A. 1955. Some experiments pertaining to the • chemical mechanisms of the cortical reaction in fertilization of sea urchin eggs —Exptl. Cell Res., 8, N 1, 240—244.
Manery J., Fisher К. a. M о о r e E. 1947. Water intake and membrane hardening of fish eggs.— Federal. Proc., 6, N 1, 163.
Manery J. a. Irving L. 1935. Water changes in trout eggs at the time . of laying.— J. Cell. a. Compar. Physiol., 5, N 4, 457—464.
304
Manery J., Warbritton V. a. Irving L. 1933. The development of an alkali reserve in Fundulus eggs.— J. Cell. a. Compar. Physiol., 3, N 3, 277—290.
Markman B. 1958. Studies on the formation of the fertilization membrane in sea urchin.— Acta zool., 39, N 1, 103—115.
M a z i a D. 1937. The release of calcium in Arbacia eggs on fertilization — J. Cell. a. Compar. Physiol., 10, N 3, 291—304. ,
McClendon J. 1914a. The increase in permeability of the frog’s egg at the beginning of development and the preservation of the life of the egg.— Science, 40, N 1019, 70—72.
McClendon J. 1914b. On the antagonistic action of salt and anesthetics in increasing permeability of fish eggs.— Science, 40, N 1023, 214— 215.
McCulloch D. 1952. Note on the origin of the cortical granules in Arbacia punctulata eggs.— Exptl. Cell Res., 3, N 3, 605—607.
McCutcheon M. a. Lucke B. 1926. The kinetics of osmotic swelling in living cells.— J. Gen. Physiol., 9, N 5, 697—708.
McCutcheon M. a. Lucke B. 1932. The effect of temperature on permeability to water of resting and of activated cell (unfertilized and fertilized eggs of Arbacia punctulata).— J. Cell, a. Compar. Physiol.. 2. N 1. 11—26.
McCutcheon M., Lucke B. a. Hartline H. 1931. The osmotic properties of living cells (eggs of Arbacia punctulata).— J. Gen. Physiol., 14, N 3, 393—403.
Meek A. 1923. The «segmentation cavity» of the egg of the frog.—Quart. J. Microscop. Sci., 67, N 1, 33—38.
MilroyT. 1898. The physical and chemical changes taking place in the ova of certain marine teleosteans during maturation.— Sixteenth. Ann. Rep. Fish. Board, Scotland, p. Ill, 135—152.
M i n g a n t i A. 1954. Sui glucidi della gelatina ovulare degli anfibi.— Ri-cerca scient., 24, N 8, 1658—1661.
Ming anti A. 1955. Chemical investigations on amphibian egg jellies.— Exptl. Cell Res., Suppl., N 3, 248—251.
Ming anti A. 1958. Sulla costituzione chimica degli involucri ovulari negli animali.— Boll, zool., 25, 57—89.
MingantiA. a. D’AnnaT. 1957. Ricerche sulla mucina ovulare di Triton cristatus.— Ricerca scient., 27, N 10, 3052—3054.
MingantiA. a. VasseurE. 1959. An analysis of the jelly substance of Paracentrotus lividus eggs.—-Acta embryol. Morphol exptl., 2, N 2, 195—203.
MirskyA. 1936. Protein coagulation as a result of fertilization.— Science, 84, N 2180, 333—334.
Mitchel IP. 1954. Transport of phosphate through an osmotic barrier.— Sympos. Soc. Exptl. Biol., v. 8, p. 254—261.
Mitch el IP. 1957. A general theory of membrane transport from studies of bacteria.—Nature, 180, N 4577, 134—136.
Miit ch ell P. a. Moyle J. 1958a. Group-translocation: a consequence of enzyme catalysed group-transfer.— Nature, 182, N 4632, 372—373.
M iit c h e 11 P. a. M о у 1 e J. 1958b. Enzume catalysis and group-transloca-tion.—Proc. Roy. Phys. Soc. Edinburgh, 27, 61—72.
MitchisonJ. a. SwannM. 1955. The mechanical properties of the cell surface. III. The sea-urchin egg from fertilization to cleavage.— J. Exptl. Biol., 32, N 4, 734—750.
MonneL. 1950. Structural changes of the cell resulting from clotting and liquefaction.—Arkiv. zool., 1, N 2, 101—130.
Monne L. a. HardeS. 1951a. On the formation of the blastocoel and similar embryonic cavities.— Arkiv zool., 1, N 4—5, 463—469.
20 А. И. Зотин
305
MonneL. a. HardeS. 1951b. On the cortical granules of the sea urchin egg.— Arkiv zool., 1, N 6, 487—498.
MonneL. a. SlautterbackD. 1950. Differential staining of various polysaccharides in sea urchin eggs.— Exptl. Cell Res., 1, N 3, 477— 491.
MonneL. a. SlautterbackD. 1952. On the staining of the cytoplasm with the Schiff reagent during the development of the eggs of Para-centrotus lividus.— Arkiv zool., 3, N 4, 349—356.
Monroy A. 1947. Further observation on the fine structure of the cortical layer of unfertilized and fertilized sea-urchin eggs.— J. Cell. a. Compar. Physiol., 30, N 1, 105—109.
MonroyA. 1948. Cortical changes accompanying maturation in sea-urchin egg.— Experientia, 4, N 9, 353—355.
MonroyA. 1950. A preliminary electrophoretic analysis of proteins and protein fractions in sea-urchin eggs and their changes on fertilization.— Exptl. Cell Res., 1, N 1, 92—104.
MonroyA. 1952. Biochemical and structural changes at fertilization.— Proc. Sympos. Biochem. Struct.— Basis Morphogen., p. 18—30.
MonroyA. 1953. A model for the cortical reaction of fertilization in the sea-urchin egg.— Experientia, 9, N 11, 424—425.
MonroyA. 1956. Some experiments concerning the chemical mechanisms of the activation of the sea urchin egg.— Exptl. Cell. Res., 10, N 2, 320—323.
MonroyA. 1957a. Studies of proteins of sea urchin egg and their changes following fertilization.— Begin. Embryonic. Developm. p. 169—174.
MonroyA. 1957b An analysis of the process of fertilization and activation of the egg.— Internat. Rev. Cytology, 6, 107—127.
Monroy A. 1957c. Adenosinetriphosphatase in the mitochondria of unfertilized and newly fertilized sea-urchin eggs.— J. Cell. a. Compar. Physiol., 50, N 1, 73—82.
MonroyA. 1957d. Swelling properties of the mitochondria of unfertilized and newly fertilized sea urchin eggs.— Experientia, 13, N 10, 398.
MonroyA. 1958. Il fenomeno della «attivatione dei mitocondri» alia fe-condazione nella uova di riccio di mare.— Ricerca scient., 28, N 1, 141—145.
MonroyA. a. Monroy-Oddo A. 1951. Solubility, changes of proteins in sea-urchin eggs upon fertilization.— J. Gen. Physiol., 35, N 2, 245.
MonroyA. a. RunnstromJ. 1948. Some experiments pertaining to the chemical changes occuring at the formation of the fertilization membrane of sea-urchin egg — Arkiv zool, 40A, N 4, 1—6.
MonroyA. a Runnstrom J. 1952. A cytoplasmic fraction acting on the surface layers of the Arbacia punctulata eggs.— Exptl. Cell Res., 3, N 1, 10—18.
Monroy-Oddo A. 1946. Variations in Ca and Mg contents in Arbacia eggs as a result of fertilization.— Experientia, 2, N 9, 371—372.
Mo ore A. 1941 On the mechanics of gastrulation in Dendraster excentri-cus.— J. Exptl. Zool. 87, N 1, 101—111.
Moo re A. 1945. The individual in simpler forms. Univ. Press, Oregon.
MorganT. 1906. Experiments with frog’s eggs.— Biol. Bull., 11, N 2, 71—92.
MoserF. 1939a. Studies on a cortical layer response to stimulating agents in the Arbacia egg. I. Response to insemination.— J. Exptl. Zool. 80, N З; 423—445.
MoserF. 1939b. Studies on a crotical layer response to stimulating agents in the Arbacia egg. II. Response to chemical and physical agents. J, Exptl. Zool., 80, N 3, 447—471.
MoserF. a. KitchingJ. 1939. Response of the Arbacia egg cortex to
306
chemical and physical agents in the absence of oxygen.— Biol. Bull., 77, N 2, 335—336.
Motomura I. 1941. Materials of the fertilization membrane in the eggs of echinoderms. Sci. Rep. Tohoku Imp. Univ., Ser. IV, 16, N 3, 345—364.
Motomura I. 1952. Cortical granules in the egg of the frog.— Annot. zool. japon. 25, N 1/2, 236—241. (Biol. Abstr. 28, N 1, 1954, 1161).
Motomura I. 1954. Inhibition and acceleration of the toughening of the fertilization membrane in the sea urchin eggs.— Sci. Rep. Tohoku Univ. Ser. IV, 20, N 2, 158—162. '
Motomura I. a. HiwatashiK. 1954. Further note on the inhibition and acceleration of the toughening of the fertilization membrane in the sea urchin’s egg.— Sci. Rep. Tohoku Univ., Ser. IV, 20, N 3, 2Г9—225.
N а к a n о E. 1954. Content of the cortical alveoli and the hardening of egg membrane of Oryzias latipes occuring at the time of fertilization.— Zool Mag, 63, Nil, 420.
Nakano E. 1956. Changes in the egg membrane of the fish egg during fertilization. Embryologia, 3, N 1, 89—103.
Nakano E, Giudice G. a. Monroy A. 1958. On the incorporation of S35-methionine in artificially activated sea urchin eggs.— Experientia, 14, N 1, 11.
Nakano E. a. Monroy A. 1958. Incorporation of S35-methionine in the cell fractions of sea urchin eggs and embryos.— Exptl. Cell. Res. 14, N 2, 236—244.
Nakano E. a. Ohashi S. 1954. On the carbohydrate component of the jelly coat and related substances of eggs from Japanese sea urchin.— Embryologia, 2, N 3—12, 81—85.
Narayana Rao C. a. Ram anna B. 1925. The formation of archenteric and segmentation cavities of the eggs of the Engystomatid frogs.— Quart. J. Microscop. Sci, 69, N 4, 731—744.
Needham J. 1931. Chemical embryology, v. I, III. Univ. Press, Cambridge.
Needham J. 1942. Biochemistry and morphogenesis. Univ. Press, Cambridge.
Nelsen O. 1953. Comparative embryology of the vertebrates. Blakiston Comp. N. Y. a. Toronto.
Nelson E. a. Greene C. 1921. The chemical composition of the ovaries of fresh water gar, Lepidoseus.—J. Biol. Chem, 49, N 1, 47—56.
Northrop J. 1927. Kinetics of the swelling of cells and tissues. J. Gen. Physiol, 9, N 1, 43—56.
Novikoff A. 1939. Changes at the surface of Nereis limbata eggs after insemination.— J. Exptl. Biol, 16, N 4, 403—408.
Nowak W. 1935. Zur biochemie des befruchteten Karpfeneies.— Z. Fisch, u. Hilfswissenschaften, 33, N 2, 319—330.
Numanoi H. 1955. Studies on the fertilization substance. VI. Formation of acetylcholine-like substance in echinoderm eggs during fertilization.— Scient. Papers Gen. Educ. Univ. Tokyo, 5, N 1, 43—54. (P. ж. биол, 1957, N 22, 93074).
Ohm an L. 1945. On the lipids of the sea-urchin egg.— Arkiv zool, 36A, N 2, 1—95.
Ohm an L. 1947. On changes in the properties of the protoplasm in the one-cell stage of the fertilized sea-urchin egg.— Arkiv. zool, 39A, N 4, 1—7.
Ohtsuka E. 1957a. On the hardening of the chorion in the fish egg after fertilization. I. Role of the cortical substance in chorion hardening of the egg of Oryzias latipes.— Sieboldia, 2, N 1, 19—29.
Ohtsuka E. 1957b. On the hardening of the chorion of the fish egg after fertilization. II. Fine structure in the hardening chorion of the egg of Oryzias latipes.— Sieboldia, 2, N 1, 31—34.
20*
307
Ohtsuka E. 1958. Carbohydrate component of the perivitelline fluid and its origin in the egg of Oryzias latipes.— Zool Mag., 67, N 3, 96—99.
Ohtsuka E. 1960. On the hardening of the chorion of the fish egg after fertilization. III. The mechanism of chorion hardening in Orvzias latipes.—Biol. Bull., 118, N 1, 120—128.
Okazaki R. 1956a. On the possible role of high energy phosphate in the cortical change of sea urchin egg. I. Effect of dinitrophenol and sodium azide.—Exptl. Cell Res, 10, N 2, 476—488.
Okazaki R. 1956b. On the possible role of high energy phosphate in the cortical change of sea urchin eggs. II. Effect on uranyl nitrate.— Exptl. Cell Res, 10, N 2, 489—504.
Orstrom A. u. Orstrom M. 1942. Uber die Bindung von Kalzium im Ei und Larve von Paracentrotus lividus.—• Protoplasma, 36, 475—490.
О s a n a i K. 1956. On the ovarian eggs of the loach, Lefua echigonia, with, special reference to the formation of the cortical alveoli.— Sci. Rep. To-hoku Univ, Ser. Biol, 22, N 4, 181—188.
Ozima Y. 1943. Cytological observation of fertilization in the carp. Cypri-nus carpio L.— Japan J. Genet, 19, 219—228.
Parpart A. a. Laris P. 1955. A theory for the lifting of the fertilization membrane of the egg Arbacia punculata. Biol. Bull, 109, N 3, 350— 351.
Patlak C. 1956. Contributions to the theory of active transport.— Bull. Math. Biophys, 18, 271—315.
Pearse A. 1925. The chemical composition of certain fresh-water fishes. Ecology, 6, N 1, 7—16.
Picken L. a. Rothschild Lord. 1948. Vapour pressure changes in the frog’s egg at fertilization.— J. Exptl. Biol, 25, N 3, 227—236.
Prescott D. 1955. Effect of fertilization on the water permeability of salmon eggs.— J. Cell. a. Compar. Physiol. 45, N 1, 1—12.
Przylecki S. 1917. Spadek cisnienia osmotycznego i rola periwitelinu w jajach plazow.— C. r. Soc. Sci. Varsovie, 10, 323—348.
Raff aele F. 1888. Le uova galleggianti a le larve dei Teleostei nel golfo di Napoli.— Mitt. Zool. Sta. Neapol, 8, N 1, 1—84.
Rappaport R. 1954. The uptake of water during development of Amphibian tissues.— J. Exptl. Zool, 127, N 1, 27—52.
Rappaport R. 1955. The initiation of pronephric function in Rana pipiens.— J. Exptl. Zooi, 128, N 3, 481—487.
R a s q u i n P. 1958. Ovarian morphology and early embryology of the pedi-culate fishes Antennarius and Historio.— Bull. Amer. Mus. Natur. History, 114, N 4, 333—371.
Rashevsky N. 1960. Mathematical biophysics, v. I. N. Y,
Robinson J. 1953. The active transport of water in living system.— Biol. Bull, 28, N 2, 158—194.
Robinson J. 1954. Secretion and transport of water.—Sympos. Soc. Exptl. Biol, v. 8, p. 42—62.
Rosebury F. a. van Heyningen W. 1942. A modified micropipet (for density determination in heavy water analysis).— Industr. Engng. Chem, Analyt. Ed, 14, N 4, 362—363.
Rosenbaum R. 1958. Histochemical observation on the cortical region of the oocytes of Rana pipiens.— Quart. J. Microscop. Sci, 99, N 2, 159—169.
Rosenberg T. 1948. On accumulation and active transport in biological systems. I. Thermodynamic consideration.—Acta chem. Scand, 2, N 1, 14—33.
Rosenberg T. 1954. The concept and definition of active transport.— Sympos. Soc. Exptl. Biol, v. 8, p. 27—41.
Rosenberg T. a. Wilbrandt W. (Розенберг T. и Вильбрандт В.) 19'55. Роль ферментных процессов в проницаемости клеточной мембраны.— Сб. «Совр. проблемы цитологии», 183—212. Изд. ИЛ, М.
308
Rosenberg T. a. Wilbrandt W. 1955. The kinetics of membrane transports involving chemical reactions.— Exptl. Cell. Res. 9, N 1, 49—67.
Rosenthal H. 1953. Embryonic development of the lordotic and normal guppy, Lebistes reticulatus (Peters).— Biol. Bull, 105, N 1, 160—165.
Rothschild Lord 1949. The fertilization reaction in the sea-urchin egg. A note on diffusion consideration.— J. Exptl. Biol., 26, N 2, 177—181 Rothschild Lord 1954. Polyspermy.— Quart. Rev. Biol., 29, N 4, 332— 342.
Rothschild Lord (Ротшильд). 1958a. Оплодотворение. Изд. ИЛ, M.
Rothschild Lord 1958b. Fertilization in fish and lampreys.— Biol. Rev. 33, N 3, 372—392.
Rothschild Lord 1958c. The surface of the sea-urchin egg.—Quart. J. Microscop. Sci., 99, N 1, 1—3.
Rothschild Lord a. Swann M. 1949. The fertilization reaction in the sea-urchin egg. A propagated response to sperm attachment.'—J. Exptl. Biol., 26, N 2, 164—176.
Rothschild Lord a. Swann M. 1952. The fertilization reaction in the sea-urchin. The block to polyspermy.— J. Exptl. Biol., 29, N 3, 469—483.
Rothstein А. (Ротштейн A.). 1958. Некоторые биохимические функции клеточной поверхности, исследованные при помощи изотопов.— Сб. «Мирное использование атомной энергии», т. 12, 481—485.
RudenbergF. 1953. The role of the jelly coat in the uptake of calcium by eggs of Arbacia punctulata before and after fertilization.— Exptl. Cell Res., 4, N 1, 116—126.
Roughton F. 1952. Diffusion and chemical reaction velocity in cylindrical and spherical systems of physiological interest.— Proc. Roy. Soc. London, Ser. B, 140, N 899, 203—229.
Runnstrom J. 1920. Uber osmotischen Druck und Eimembranfunktion bei den Lachsfischen.—-Acta zool., 1, N 2, 321—336.
Runnstrom J. 1948. Further studies on the formation of the fertilization membrane in sea-urchin egg.—Arkiv. zool., 40A, N 1, 1—19.
Runnstrom J. 1949. The mechanism of fertilization in metazoa.— Advances Enzymol., 9, 241—327.
Runnstrom J. (Руннстрём Дж. 1955). Роль поверхностного слоя яйцеклетки в процессе оплодотворения.— Сб. «Совр. проблемы цитологии», 253—310. Изд. ИЛ.
Runnstrom J. 1956а. Some aspects of the initiating processes in the fertilization of the sea urchin egg.— Zool. Anz., 156, N 5/6, 91—-101.
Runnstrom J. 1956b. Some consideration on metabolic changes occuring at fertilization and during early development of the sea urchin egg.— Pubbl. Sta. Zool. Napoli, 28, 315—340.
Runnstrom J. 1957. On the effect of porphyrexid and prophyrindin on the fertilization of the sea urchin egg.— Exptl. Cell. Res., 12, N 2, 374—394.
Runnstrom J. 1958. On analysis of the changes attending fertilization of the sea urchin egg.— Exptl. Cell Res., Suppl., 5, 527—546.
Runnstrom J., Hagstrom B. a. Perlmann P. 1959. Fertilization. The Cell. N. Y. a. London, p. 327—397.
Runnstrom J. a. Immers J. 1956. The role of mucopolysaccharides in the fertilization of the sea urchin egg.— Exptl. Cell. Res., 10, N 2 354— 363.
Runnstrom J. a. Kriszat G. 1950a. On the effect of adenosine triphosphoric acid and Ca on the cytoplasm of the egg of the sea urchin, Psammechinus miliaris.— Exptl. Cell Res., 1, N 2, 284.
RunnstrommJ. a. Kriszat G. 1950b. Action of periodate on the surface reactions attending the activation of the egg of the sea urchin, Psammechinus miliaris.— Exptl. Cell Res., 1, N 3, 355—370.
309
Runnstrom J. a. Kriszat G. 1950c. On the influence of ATP on the fertilization and segmentation of the sea urchin egg, Strongylocentrotus lividus.— Exptl. Cell Res., 1, N 4, 497—499.
Runnstrom J. a. Kriszat G. 1952. The cortical propagation of the activation impulse in the sea urchin egg.— Exptl. Cell Res., 3, N 2, 419—426.
Runnstrom J. a. Kriszat G. 1957. The solidifying effect of certain oxidation-reduction indicator on the surface of the unfertilized sea urchin egg.—Exptl. Cell Res., 12, N 3, 526—536.
Runnstrom J. a. Monne L. 1945. On some properties of the surface-layers of immature and mature sea urchin eggs, especially the changes accompanying nuclear and cytoplasmic maturation.— Arkiv zool., 36A, N 4, 1—26.
Runnstrom J., MonneL. a. Broman L. 1944. On same properties of the surface layers in the sea-urchin egg and their changes upon activation.— Arkiv zool., 35A, N 1, 1—32.
Runnstrom J. a. Wicklund E. 1950. Formation mechanism of the fertilization membrane in the sea urchin egg. Inhibitory effect of heparin and jelly substance on clotting of the vitelline membrane.— Arkiv zool., 1, N 2, 179—194.
Ryder J. 1884. A contribution to the embryography of osseous fishes, with special reference to the development of the cod (Gadus morrhua).— Ann. Rep. U. S. Comm. Fish a. Fisheries for 1882, p. 455—605.
Salzen E. 1956. The density of the eggs of Calanus finmarchicus.— J. Marine Biol. Assoc. U. K. 35, 549—554.
Sialzen E. 1957. The density of sea urchin eggs, embryos and larvae.— Exptl. Cell Res., 12, N 3, 615—625.
Schartau O. u. Mon tai ent i G. 1941. Untersuchungen fiber die Bef-ruchtung insbesondere fiber Gamone bie dem flufineunauge (Lampetra fluviatilis.) —Biol. ZbL, 61, N 9/10, 473—478.
Scheer B. 1958. Activ transport: definitions and criteria.— Bull. Math. Biophys, 20, N 3, 231—244.
Schemins к у F. 1929. Wassergehalt und Wachstum wahrend der Entwicklung der Forelle.— Ber. ges. Physiol., 50, 302—303.
Schultze M. 1856. Die Entwickelungsgeschichte von Petromyzon planeri. Hoarlem. Die erben Loosjes.
Schultze O. 1888. Die Entwicklung der Keimblatter und der Chorda dorsalis von Rana fusca.— Z. wiss. Zool., 47, N 3, 325—352.
Scrimshaw N. 1944. Embryonic growth in the viviparous poeciliid fish, Heterandria formosa.— Biol. Bull., 87, N 1, 37—51.
Scrimshaw N. 1945. Embryonic development in poeciliid fishes.— Biol. Bull., 88, N 3, 233—246.
Scrimshaw N. 1946. Egg size in poeciliid fishes.— Copeia, 1, 20—23.
Selman G. 1955. Studies on the forces producing neural closure in amphibia.— Proc. Roy. Phys. Soc. Edinburgh, 24, N 2, 24—27.
Selman G. 1958. The forces producing neural closure in amphibia.— J. Embryol. Exptl. Morphol., 6, N 3, 449—465.
Shanklin D. 1954. Evidence for active transport in Fundulus embryos. Biol. Bull., 107, N 2, 320.
Shanklin D. 1956. Factor influencing the transport of sea water cations across the ectoderm of Fundulus heteroclitus.— Nature, 177, N. 4505, 431—432.
Shanklin D. 1959. Studies on the Fundulus chorion.— J. Cell a. Compar. Physiol., 53, N 1, 1—11.
Shapiro H. 1941. Water permeability of the Chaetopterus egg before1 and after fertilization.— Z. Cell. a. Compar. Physiol., 18, N 2, 143—149.
Shapiro H. 1948. The change in osmotically inactive fraction produced by cell activation.— J. Gen. Physiol., 32, N 1, 43—51.
310
Shelbourne J. 1955. Significance of the subdermal space in pelagic fish embryos and larvae.— Nature, 176, N 4485, 743—744.
Shelbourne J. 1956a. The effect of water conservation on the structure of marine fish embryos and larvae.— J. Marine Biol. Assoc. U. K-, 3-5, N 1, 275—286.
Shelbourne J. 1956b. The abnormal development of plaice embryos and larvae in marine aquaria.— J. Marine Biol. Assoc. U. K-, 55, N 1, 177— 192.
Siegel G. 1957—1958. Zur Morphologie der Eihiillen- siidamerikanischer bodenlaichender Zahnkarpfen.— Wiss . Z. Friedrisch-Schiller-Univ., Jena, Math.-naturwiss. Reihe, 7, N 2—3, 229—231.
Smith S. 1957. Early development and hatching. In: «Physiology of Fishes», v. 1, ch. 8, p. 323—360.
Spanner D. 1954. The active transport of water under temperature gradients.— Sympos. Soc. Exptl. Biol., v. 8, p. 76—93.
Spiegel M. 1951. A method for the removal of the jelly and vitelline membrane of the egg of Rana pipiens.— Anat. Rec., Ill, N 3, 544.
Stableford L. 1949. The blastocoel fluid in amphibian gastrulation.— J. Exptl. Zool., 112, N 3. 529—546.
Starck D. 1955. Embryologie, Stuttgart.
Stewart D. a. Jacobs M. 1936. Further studies on the permeability of the egg of Arbacia punctulata to certain solutions and water.— J. Cell. a. Compar. Physiol, 7, N 3, 333—350.
Sugiyama M. 1953a. Physiological analysis of the cortical response of the sea urchin egg to stimulating reagents. I. Response to sodium cholei-nate and wasp-venom— Biol. Bull, 104, N 2, 210—215.
Sugiyama M. 1953b. Physiological analysis of the cortical response of the sea urchin egg to stimulating reagents. II. The propagating or non-propagating nature of the cortical changes induced by various reagents.— Biol. Bull, 104, N 2, 216—223.
Sugiyama M. 1956. Physiological analysis of the cortical response of the sea urchin egg.— Exptl. Cell Res, 10, N 2, 364—376.
Sumner F. 1903. A study of early fish development. Roux’s Arch. Entwick-lungsmech. Organismen, 17, N 1, 92—149.
Sumwait M. 1928. Potential differences across the chorion of the Fundulus egg.— Anat. Rec, 41, N 1, 31.
Sum wait M. 1929. Potential differences actoss the chorion of the Fundulus egg.— Biol. Bull, 56, N 3, 193—214.
S u m w a 11 M. 1933. Ion effects upon ion permeability of the Fundulus chorion.—Biol. Bull, 64, 1, 114—123.
Taoka S. 1956a. Cytological studies on the oogenesis in annelids. I. On the oogenesis of Japanese palolo.— Bull. Exptl. Biol, 6, N 2, 77—86.
Taoka S. 1956b. Cytological studies on the oogenesis in annelids. II. Cytochemical studies on the eggs of Japanese palolo.— Bull. Exptl. Biol, 6, N 3, 141—146.
Taoka S. 1956c. Cytological studies on the oogenesis in annelids. III. On the oogenesis of Nereis japonica.— Bull. Exptl. Biol, 6, N 3, 147—156.
Ta Volga W. 1950. Development of the gobiid fish, Bathyogobius sopora-tor.—J. Morphol, 87, N 3, 467—492.,
Takashima R, Mori S. a. Kawano M. 1955. The role of hyaluronidase in fertilization.— Bull. Exptl. Biol, 5, N 1, 75—81.
Takashima R, Katsura S, Taoka S. a. Sakai T. 1955. On the structure of mature unfertilized eggs of Japanese palolo.—Bull. Exptl. Biol, 5, N 4, 261—272.
Tchou S. a. Chen С. H. 1936. Fertilization in goldfish.— Contribs. Inst. Zool. Nat. Acad, Peiping, 3, N 2, 35—58.
Thomopoulos A. 1953a. Sur 1’oeuf de Perea fluviatilis L.— Bull. Soc. zool. France, 78, N 2—3, 106—114.
311
Thomopoulos A. 1953b. Sur 1'oeui de 1'epinoche (Gasterosteus aculea-tus L.).— Bull. Soc. zool. France, 78, N 2—3, 142—449.
Thomopoulos A. 1954. Sur Toeuf d’equille (Ammodytes tobianus L.).— Bull. Soc. zool. France, 79, N 1, 112—120.
Thorn er M. 1929. Recovery of the heart beat of Fundulus embryos after stoppage by potassium chloride.— Biol. Bull., 56, N 3, 157—163.
Townes P. 1953. Effects of proteolytic enzymes on the fertilization membrane and jelly layers of the amphibian embryo.— Exptl. Cell. Res., 4, N 1, 96—101. '
Tuft P. 1957. Changes in the osmotic activity of the blastocoel and archen-teron contents during the early development of Xenopus laevis.— Proc. Roy. Phys. Soc. Edinburgh, 26, 42—48.
Turner C. 1937. Reproductive cycles and superfetation in poeciliid fishes.— Biol.. Bull., 72, N 2, 145—164.
Tyler А. (Тайлер A.). 1951. Искусственный партеногенез.— Об. «Некоторые проблемы совр. эмбриофизиологии», стр. 3—52. Изд. ИЛ.
Tyler A., Monroy А., Као С. Y. a. Grundfest Н. 1956. Membrane potential and resistance of the starfish egg before and after fertilization.— Biol. Bull., Ill, N 1, 153—177.
Ussing H. 1952. Some aspects of the application of tracers in permeability studies.— Advances Enzymol., 13, 21—65.
Ussing H. (Уссинг X.). 1958. Изотопы при исследованиях проницаемости.— Сб. «Мирное использ. атом, энергии», 12, 299—305.
Ussing Н. 1958. Active and passive transport across epithelial membranes. Method Isot. Trac. Appl. Study Active Ion Transp., London — N. Y., Paris— Los Angeles, p. 139—154.
Vasseur E. 1948a. The sulphuric acid content of the egg coat of the sea-urchin Strongylocentrotus droebachiensis Mill.— Arkiv kemi, mineral., geol., 25B, N 7, 1—2.
Vasseur E. 1948b. Chemical studies on the jelly coat of the sea-urchin egg.— Acta chem. scand., 2, N 10, 900—913.
Vasseur E. a. Immers J. 1949. Genus specificity of the carbohydrate component in the sea-urchin egg jelly coat as revealed by paper chro-motography.— Arkiv kemi, 1, N 1, 39—41.
Venable J. 1946. Volume changes in the early development of the golden hamster.— Anat. Rec., 94, N 2, 129—138.
Waddington C. 1939. Order of magnitude of morphogenetic forces.— Nature, 144, N 3649, 637.
Waddington C. 1942. Observation on the forces of morphogenesis m the amphibian embryo.— J. Exptl. Biol., 19, N 3, 284—293.
Waddington C. 1957. Principles of embryology. George Allen a. Znwin LTD. London.
Warren A., Fisher K- a. Manery J. 1947. Calcium ions and the development of hardness in the eggs of speckled trout.— Federal. Proc., 6, N 1, 223.
W ar tenber g H. 1956. Topochemische Untersuchungen an den Ovarialeiern von Xenopus laevis und Rana fusca.— Acta Histochem., 3, N 1/2, 25—71.
Whitehouse R. a. Grove A. 1957. Manual of practical chordate embryology. Univ. Tutoriol Press, London.
Wicklund E. 1954a. The influence of some inhibiting substances on fertilization in the sea urchin egg.— Arkiv zool., 6, N 5, 485—502.
Wicklund E. 1954b. Formation of the fertilization membrane in centrifuged eggs of Arbacia lixula.— Arkiv zool., 7, N 2, 109—112.
Wilbrandt W. 1959. Permeability and transport systems in living cells.— J. Pharmacy a. Pharmacol., 11, N 2, 65—79.
Wilson H. 1889. The embryology of the sea bass (Serranus atrarius).— Bull. U. S. Fish. Commiss., 9, 209—231.
312
Yagle E. 1930. Permeability of egg membranes. Water exchange through the egg membrane of Fundulus.—Protoplasma, 9, N 2, 246—268.
Yamamoto K. 1951a. Studies on the fertilization of the egg of the flounder. I. Effects of salt concentration in the fertilization.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 10, N 3—4, 253—259.
Yamamoto K. 1951b. Activation of the egg of the dog salmon by water and associated phenomena.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 10, N 3—4, 303—318.
Yamamoto K. 1952a. Studies of fertilization in the dog-salmon, Oncorhynchus keta. I. The morphology of the normal fertilization. J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 11, N 1, 81—93.
Yamamoto K. 1952b. Studies on the fertilization of the egg of the flounder. II. The morphological structure of the micropyle and its behavior in response to sperm-entry.— Cytologia, 16, N 4, 302—306.
Yamamoto K. 1953. Studies on the fertilization of the egg of the flounder. III. On the formation of the micropyle-ball.— Annot. zool. japon., 26, N 3, 133—137.
Yamamoto K- 1955a. Studies on the formation of fish eggs. V. The chemical nature and the origin of the yolk vesicle in the oocytes of the herring, Clupea pallasii.— Annot. zool. japon., 28, N 3, 158—162.
Yamamoto K- 1955b. Studies on the formation of fish eggs. VI. The chemical nature and the origin of the yolk vesicle in the oocyte of the smelt, Hypomesus japonicus.— Annot. zool. japon., 28, N 4, 233—237.
Yamamoto K- 1956a. Studies on the formation of fish eggs. VII. The fate of the yolk vesicle in the oocytes of the herring, Clupea pallasii, during vitellogenesis.-—Annot. zool. japon., 29, N 2, 91—96.
Yamamoto K. 1956b. Studies on the formation of fish eggs. VIII. The fate of the yolk vesicle in the oocyte of the smelt, Hypomesus japonicus, during vitellogenesis.— Embryologia, 3, N 2, 131—138.
Yamamoto K. 1956c. Studies on the formation of fish eggs. IX. The fate of the yolk vesicle in the oocyte of the flounder, Liopsetta obscura, during vitellogenesis.— Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ.. 7, N 3. 208—
Yamamoto K. 1956d. Studies on the formation of fish eggs. III. Localization of polysaccharides in oocytes of Liopsetta obscura.—-J. Fac. Sci. ' Hokkaido Univ., Ser. Zool., 12, N 3, 391—399.
Yamamoto K. 1957a. Studies on the formation of fish eggs. X. Demonstration of carbohydrates related to Da-Fano positive bodies in the oocyte of the flounder, Liopsetta obscura.— Annot. zool. japon., 30, N 1, 33— 37.
Yamamoto K. 1957b. Studies on the formation of fish eggs. XL The formation of a continuous mass of yolk and the chemical nature of lipids contained in it in the oocyte of the flounder, Liopsetta obscura.—-J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 13, N 1—4, 344—351.
Yamamoto K. 1958. Vitellogenesis in fish eggs. Svmposia Cell. Chem., v. 8, p. 119—134.
Yamamoto T. S. 1955a. Morphological and cytochemical studies on the oogenesis of the fresh-water fish medaka (Oryzias latipes.)—-Japon. J. Ichtyol, 4, N 4—6, 170—181.
Yamamoto T. S. 1955b. Ovulation in the salmon, herring and lamprey. Japon. J. Ichthyol., 4, N 4—6, 182—192.
Yamamoto T. S. 1956. Digestion of egg envelopes and their chemical properties of the lamprey’s egg, Lampetra japonica.—J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 12, N 3, 273—281.
Yamamoto T. S. 1957a. Histochemical study on the development of the herring.— Zool. Mag., 66, N 7, 289—294.
313
Yamamoto T. S. 1957b. Some morphological and physiological aspects of the eggs of teleostean fishes.—J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 13, 1—4, 484—488.
Yamamoto T. S. 1957c. Some experiments on the chemical changes in the membrane of salmon eggs occurring at the time of activation.— Japon. J. Ichthyol, 6, N 3, 54—58.
Yamamoto T. 1936. Shrinkage and permeability of the chorion of Oryzias egg, with special reference to the reversal of selective permeability.— J. Fac. Sci. Tokyo Imp. Univ., Sec. IV, 4, N 2, 249—261.
Yamamoto T. 1939a. Changes of the cortical layer of the egg of Oryzias latipes at the time of fertilization.— Proc. Imp. Acad. Tokyo, 15, N 8, 269—271.
Yamamoto T. 1939b. Mechanism of membrane elevation in the egg of Oryzias latipes at the time of fertilization.— Proc. Imp. Acad. Tokyo, 15, N 8, 272—274.
Yamamoto T. 1940. The change in volume of the fish egg at fertilization.— Proc. Imp. Acad. Tokyo, 16, N 9, 482—485.
Yamamoto T. 1044a. Physiological studies on fertilization and activation of fish egg. I. Reponse of the cortical layer of the egg of Oryzias latipes to insemination and to artificial stimulation.— Annot. zool. japon., 22, N 2, 109—125.
Yamamoto T. 1944b. Physiological studies on fertilization and activation of fish egg. II. The conduction of the «fertilization-wave» in the egg of Oryzias latipes.— Annot. zool. japon. 22, N 2, 126—136.
Yamamoto T. 1944c. On the excitation-conduction gradient in the Lampet-ra planeri.—Proc. Imp. Acad. Tokyo, 20, N 1, 30—35.
Yamamoto T. 1945. Activation on the unfertilized eggs of the fish and the lamprey with synthetic washing agents.— Proc. Imp. Acad. Tokyo, 21, N 3, 197—207.
Yamamoto T. 1951. Action of lipoid solvents on the unfertilized eggs of the medaka (Oryzias latipes.)—Annot. zool. japon., 24, N 2, 74—82.
Yamamoto T. 1954a. Cortical changes in the eggs of the goldfish (Ca-rassius auratus) and the pond smelt (Hypomesus olidus) at the time of fertilization and activation.— Japon. J. Ichthyol., 3, N 3—5, 162—170.
Yamamoto T. 1954b. Physiological studies on fertilization and activation of fish eggs. V. The role of calcium ions in activation of Oryzias eggs.— Exptl. Cell Res., 6, N 1, 56—68.
Yamamoto T. 1956. The physiology of fertilization in the medaka (Oryzias latipes).— Exptl. Cell Res., 10, N 2, 387—393.
Yanagimachi R. 1953. Effect of environmental salt concentration on fertilizability of herring gametes.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 11, N 3, 481—486.
Yanagimachi R. 1955. Vital staining of the micropyle of the herring egg with toluidine blue and janus green (a preliminary report).—Zool. Mag., 64, N 11, 351—353.
Yanagimachi R. 1956. The effect of single salt solutions on the fertilizability of the herring egg.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 12, N 3, 317—324.
Yanagimachi R. 1957a bcudies of fertilization in Clupea. pallasii.
II. Structure and activity of spermatozoa.— Zool. Mag., 66, N 5, 222—225.
Yanagimachi R. 1957b. Studies of fertilization in Clupea pallasii.
III. Manner of sperm entrance into the egg.— Zool. Mag., 66, N 5, 226— 233.
Yanagimachi R. 1957c. Some properties of the sperm-activating factor in the micropyle area of the herring egg.— Annot. zool. japon., 20, N 3, 114—119.
314
Yanagimachi R. 1957d. Studies of fertilization in Clupea pallasii. IV. Some properties of the sperm-stimulating factor in the micropyle area of the mature egg.— Bull. Japan. Soc. Sci. Fish., 23, N 2, 81—85.
Yanagimachi R. 1957e. Studies of fertilization in Clupea pallassii. V. The role calcium ions in fertilization and development.— Bull. Japan. Soc. Sci. Fish., 23, N 6, 290—293.
Yanagimachi R. a. Kanoh Y. 1953. Manner of sperm entry in herring egg, with special reference to the role of calcium ions in fertilization.— J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. Zool., 11, N 3, 487—494.
Young E. a. Inman W. 1938. The protein of the casing of salmon eggs.— J. Biol. Chem., 124, N 1, 89—193.
Ziegler H. 1895. Untersuchungen fiber die ersten Entwicklungsvorgange der Nematoden.— Z. wiss. Zool., 60, N 3, 351—410.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие....................................................... 3
Глава I. Набухание яйцевых оболочек и образование перивителлинового пространства................................................ 7
Глава II. Механизм образования перивителлинового пространства . 29
1. Проницаемость яйцевых оболочек зародышей рыб ... 33
2. Химический состав перивителлиновой жидкости яиц рыб . 40
3. Кортикальные альвеолы у яиц рыб..........................43
4. Связь процесса разрушения и исчезновения кортикальных альвеол с образованием перивителлинового пространства у яиц костистых рыб.................................................60
5. Механизм разрушения альвеол н кортикальная реакция у яиц рыб...........................................................65
6. Теории активации яиц......................................78
Глава III. Механизм ограничения размеров перивителлинового пространства .......................................................94
1. Изменение прочности яйцевых оболочек после оплодотворения или активации.................................................94
2. Затвердевание оболочек и образование перивителлинового пространства............................................99"
3. Выделение яйцом веществ, влияющих на процесс затвердевания оболочек............................................104
4. Факторы, регулирующие скорость затвердевания оболочек . 119
5. Подготовительный период затвердевания яйцевых оболочек . 134
6. Химический механизм затвердевания оболочек .... 135
Глава IV. Механизм набухания оболочек......................150
1. Связь набухания студенистых оболочек с оплодотворением или активацией яиц рыб......................................150
2. Химический состав студенистых оболочек..............154
3. Механизм набухания..................................158
Глава V. Содержание воды в яйцах рыб и экология развития . . 161
Глава VI. Осмотические свойства зародышей рыб, обновление и потребление имн воды в первое время после оплодотворения . . 172
1. Осмотические свойства оплодотворенных и неоплодотворенных яиц рыб.................................................... 172
2. Изменение содержания воды в зародышах рыб в первое время после оплодотворения или активации ...................... 182
3. Обновление воды у зародышей рыб..........................186.
316
4. Материалы к пониманию механизма обновления воды у зародышей рыб.................................................196
5. Теории проникновения веществ.............................199
Глава VII. Потребление воды яйцами рыб и круглоротых во время развития ................................................... 208
1. Поступление воды в яйца из окружающей среды во время развития................................................... 208
2. Изменение объема студенистых оболочек и перивителлинового пространства во время развития яиц рыб......................218
3. Потребление, перераспределение и обновление воды у зародышей костистых рыб во время развития.........................227
4. Потребление воды из окружающей среды зародышами осетровых рыб и миног.............................................234
Г лава VIII. Поступление воды н образование полостей у зародышей во время развития................................................246
1. Связь поступления воды в яйца из окружающей среды с образованием полостей...........................................246
2. Механизм образования бластоцеля...........................252
3. Механизм исчезновения бластоцеля и образование полости первичной кишки.............................................260
4. Увеличение объема полости кишки и механизм резкого сокращения ее размеров...........................................268
5. Влияние неблагоприятных условий развития на потребление воды яйцами и образование .полостей.........................275
6. Субдермальные полости у морских пелагических зародышей костистых рыб.............................................276
Заключение.......................................................280
Литература.......................................................285
Александр Ильич Зотин
Физиология водного обмена у зародышей рыб и круглоротых
Утверждено к печати Институтом морфологии животных им. А. И. Северцова Академии наук СССР
Редактор издательства К). С. Бочаров Технический редактор Г. И. Романов
РИСО АН СССР № 84-55В. Сдано в набор 10/Ш 1961 г. Подписано к печати 17/VI 1961 г. Формат 60Х92’/1б печ л. 20 + 3 вкл. уч.-издат. л. 19,8 + 3 вкл.
(0,2 уч.-издат. л.) Тираж 1300 экз. Т-07057
Йзд. № 5065 Тип. зак. № 3741 Цена 1 руб. ц коп,
Издательство Академии наук СССР
Москва, Б-62, Подсосенский пер., 21 2-я типография Издательства АН СССР
Москва, Г-99, Шубинский пер., 10
ИЗДАТЕЛЬСТВО АКАДЕМИИ НАУК СССР
Контора «АКАДЕМКНИГА»
Атлас научных основ рыбопромысловой карты Онежского залива Белого моря. Ч. I. 1959. 55 стр. 65 коп.
П И С Л Е Р Н. Н. Органы чувств системы боковой линии и их значение в поведении рыб. 1960. 310 стр. 2 р. 13 к.
Жизнь пресных вод СССР. Т. 4. Ч. 2. 1959. 320 стр. 2 р. 02 к.
Жизнь пресных и солоноватых вод Советского Союза. Труды Всесоюзного гидробиологического общества Академии наук СССР. Т. 9. 1959. 396 стр. 2 р. 30 к.
ЛИНДБЕРГ Г. У., ЛЕГЕЗА М. И. Рыбы Японского моря и сопредельных частей Охотского и Желтого морей. Ч. I. Определители по фауне СССР. № 68. 1959. 208 стр. + 1 вкл. 1 р. 45 к.
И Т И Н А Н. А. Функциональные свойства нервномышечных приборов низших позвоночных. (Серия «Проблемы эволюции нервномышечной функции»), 1959. 195 стр. 96 коп.
Материалы по кормовой базе и питанию рыб. Труды Института морфологии животных Академии наук СССР. Вып. 13. 1960. 139 стр. 87 коп.
Некоторые особенности этапов развития леща, сазана, воблы, тарани и судака дельт Волги, Дона и Кубани. Труды Института морфологии животных имени А. Н. Северцова Академии наук СССР. Вып. 25. I960. 164 стр. 1 руб.
ПЕРЦЕВА-ОСТРОУМОВА Т. А. Размножение и развитие дальневосточных камбал (эколого-морфологический анализ). 1961. 484 стр. + 2 вкл. 3 руб.
Работы по изучению этапов развития туводных костистых рыб. (Труды Института морфологии животных Академии наук СССР. Вып. 28). 1960. 150 стр. 87 коп.
Руководство по изучению питания рыб в естественных условиях. 1961. 263 стр. 1 р. 21 к.
Труды совещания по биологическим основам океанического рыболовства. Труды совещаний. Вып. 10. 1960. 272 стр. 1 р. 50 к.
Труды совещания по болезням рыб. Вып. 9. 1959. 224 стр. 1 р. 35 к.
Фауна СССР. Рыбы. Т. 5. Вып. 5. В. В. БАРСУКОВ. Семейство зубаток. Новая серия. № 73. 1959. 175 стр. 1 р. 33 к.
ЧУГУНОВА Н. И. Руководство по изучению возраста и роста рыб. 1959. 164 стр. 69 коп.
319
Книги можно приобрести в магазинах книготоргов и «Академкнига».
Для получения книг почтой заказы направлять по адресу:
Москва, Центр, Б. Черкасский пер., 2/10
Отдел «Книга — почтой» конторы «Академкнига» или в ближайший магазин «Академкнига».
Адреса магазинов «Академкнига»:
Москва, ул. Горького, 6 (магазин № 1); Москва, 1-й Академический проезд, 55/5 (магазин № 2); Ленинград, Литейный проспект, 57; Свердловск, ул. Белинского, 71-в; Киев, ул. Ленина, 42; Харьков, Горяиновский пер., 4/6; Алма-Ата,, ул. Фурманова, 129; Ташкент, ул. Карла Маркса, 29;
Баку, ул. Джапаридзе, 13.
ОПЕЧАТКИ И ИСПРАВЛЕНИЯ
Страница Строка Напечатано Должав быта
22 8 св. 8 9
Вклейка между 24 и 25 1 сн. 1 7
137 Табл. 30, графы 3 и 6 В шапке должно быть 10 и 4
166 15 св. 1853 1953
206 12 сн. Моула Мойла
224 Табл. 47,5 си. г астру л яиц гаструляции
226 2 сн. 0,41 0,41 мм3
242 3 сн. 51 52
256 14 сн. бластоцеля бластулы
А. И. Зотин