/
Автор: Зефиров А.Л. Петров А.М.
Теги: физиология сравнительная физиология медицина биохимия практическая медицина физиология человека
ISBN: 978-5-74-97-0025-9
Год: 2010
Текст
Зефиров А. Л.
Петров А. М.
A ‘ Синаптическая
д везикула
���� т” и механизм
�o�� освобождения
медиатора
О
(экзо-эндоцитозный
__ везикулярный цикл)
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский
университет»
Кафедра нормальной физиологии
А.Л. Зефиров, А.М. Петров
СИНАПТИЧЕСКАЯ ВЕЗИКУЛА И
МЕХАНИЗМ ОСВОБОЖДЕНИЯ МЕДИАТОРА
(ЭКЗО-ЭНДОЦИТОЗНЫЙ ВЕЗИКУЛЯРНЫЙ
цикл)
Synaptic vesicle and mechanism ofneurotransmitter release
(exo-endocytosis vesicular cycle)
Казань - 2010г.
у;п<‹.12ш"< х; I;M< 3.x 707 ч
I'()\"BIl()<«I{u;1s:c1.:xii1<w).;.1p;:nc1.i!1.mMc,mI1Hnc|<HIiynlmcpcnaul Фсхгс-
pu,'H.H0HI .11 шашни [ш zngruum~.;w;mc».nmx:mun;m.nu-.1yp.1smsu12m>
/\n'Iup1.I:
£t-(bHp(m Au ЦШЙ flmmnu-! - '%:n:.\>+<cmz-.u"1 Ш" ж‘ п. пнукп РФ. =IxcH—1mpp. I’.-\\1H.
's;mc_'1y1m1n1ii *<;:.;>c,'1pmi морщи м: (fun II«1.!UH!II КГИУ. прнфсссор. 1.\: 2:.
Пепров Алексей Михайлович —\‘I.1p1!I;:i3 I:_;\-:Im,A.m:1Ic.1s. m:;w,:p.v.I l5up\1;1.'Ib1mii
фнзпкхчоппп KI'.'\.I.\".1<.('> п.
Жефпроп .»\..l.. "fl ров АН. ("шмннътчсгьиъл псппцлц п .\1L‘\:1Hm\1 оспи-
6u>x<;1cmmA1c.1n;ump;1(n<‘su m.Im1nxu':-m.m пс‹1:|\)„1яр)1}=|п ниш) К;наъ‹»:/\р1-к;п{‚;_
2010. - 3.24 c ll 52 c. unclnmcncI:u;1<n.
ISBN 978-5-71—*)7—U()Z5-‘)
B umonc (I>_\’HK|m(HH1p\)I5;llHl>{ m-pmmii cxucu-\n.| .nc;:<1:1 Ilpouccc K0.\1\I})l1Ilx.1!1l1|1
Mc>K,'Lyncp»:m.|\mK,1cn<;x\1n. K(>1«![7l.lHOC}1!1cL'll5.!Hc1<.'>lHCI[CHIl2l.'ll1'3l1p0H£UHH.I\‘»'I£!C-
лкнх - сппппсдц. В :m,u1u.'1>n<>|1|c\1 fm:H,:s1nncmc спшп:с‹_п: псрсцичп 1xu(bop\1:1;:'1:- про-
псходпн посрсдшншч ныдш шппя п з нсрэчпмк икшпчнппйё специальных ышпачсскътх
всшссчп - мснпагнров прп чкзолпп rmc C|HH1Hl11‘|cCK:!X nc3m<y.r1(I1y'u.1pm<m=) Зпрсд-
.x;11‘ucw)ii нкппсму нппмнпппз Kim: с п ззшжспы сш;р‹.".тснпь1с np<:11Cr;m.-lcmm и меха-
ппзмс сскрспълъ: чс минора: п хпгпшщ кон c:::::1':.'v. a:;*.u:1cccz1x 'JK'$0lUlH,‘5.. п нщошъ
lma cmmn I u-;ccs<n.\ заглянут; (испккудярпкн м 1:2: : н.) Поцпробно рцзбпракш-ч различ-
пыс H:1pn;1nH.I 11pcuxnu11in-lccmn п зкю- п )1l.'1U1lHl(‘5;l.ilILlK>KClIp()TCI{.xH‘:1ll!U}5XO)1L'
‘них npmmccm;(mum-6c.n<om,1c п Ос пшк- шпплпълс ншпчодсйстъзпя. Pm циугрспм
мсхпппхппц :sc';nm.mpnnm Ip;u1cI1upI;1 п yclimuiczzm псзпкулярпьп z:\.mv.. \1cTo;u.1
HCCJI\,‘,-KOI~‘.;1lIH>i ‘жт- н 'ш_‘1‹п1|!10'‹.\ м нсршшч окопчцънпх. Особое вппчдппс уцслепн
рсгуляцпп llpC(.'HH1lHlI1‘iC(1KO|U BL"5lIK}.'l)1pHUlt) япъклдь п осгюбождхснпя .\1c..;..1I0pz1B си—
папсс. Оснсшснь] мсхипъгщы псзпкуплярпо: п грнгсппртп. п также прочщ «ms ‘ax 50- п
')H,'10mnns;x B нервных ыспкцх пс ст; шипы: ь шкрсцпсё] чсдшгъпорац '};.-x1c.\'21nn';-
мы ‘вакдшйь гпоъкпчл п (_!mp\:Hpmau1mu H pc\n>:xc.IHpou:1m'n CHII'.1IH‘H‘{CCKl1\ мы" нсшв. и
'I;1K7!<L:IH\1cIIci1II>l.\‘»10.lcK}.1>ipH0iEMv\1HUm:i1Isl11;')c—HHm"ciHl;1IIHIHccKH\ \'c\:6p;m.
.'Ic;Km11s:.\ Н оспонс cxmunxwxccmix1:.»;1<;H1lumcx:1. }\'un..-. «.mc,=11mmu-1cn.1.: :я нссх,
I<xm1mcpcc_vc1c>a вопросами функшплнпршпьппя першит спысчьл п xmnu
TuG.1nI1» 4. рпсупкон- ‘)(~_ 6n6.zImIp;u[n1>a - КМ cum H<;1
I/I'n)umu' m'_\1m'um:wm) I1/III r/mlmmm,-.;1} !1и‹)‹)и/1.›пь‘г I’u<([z1nKU.‘u финт: к/цп-
()1!\l('I(III¢I'[Iv/ll-l\ um пчтныннп Ilr) принцип" .\7r А?! ll‘/—lI-/—I)_7()//‘r: › и)
рс: и Зофнрнн /\..'l.. Нырни .\..\1.
.~\[)I-Kulbt‘. 2010
l's‘B\ ‘)7S-5—"4—‘)7—(JU25-0
› 3
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ............. .......... `��� ...... @3��
ГЛАВА 1. ����
Электрические синапсы .............................................................. ..l1
Химические синапсы .................................................................. ..13
Глия ............................................................................. 0��� ..... ���� ..... ..18
Нервно-мышечный синапс ........................................................... „19
Квантово-везикулярная теория секреции медиатора в синапсе .... „23
Синаптические везикулы.... .... �I��
Общие сведения о пулах синаптических везикул ...... ..
Везикулярный цикл ...................................................................... ..29
Стимуляция экзо- и эндоцитоза синаптических везикул .............. ..30
Методы оценки квантовой секреции медиатора, экзоцитоза, эндо-
цитоза и рециклирования синаптических везикул ................ ���� ..... „32
ГЛАВА П. АКТИВНАЯ ЗОНА И ЭКЗОЦИТОЗ
СИНАПТИЧЕСКИХ �p��
Специализированные участки экзоцитоза синаптических везикул и
освобождения медиатора ........................................................... ..46
Активная зона двигательного нервного окончания ....................... ..48
Активные зоны в синапсах ЦНС .................................................. ..52
Активные зоны с выпуклыми проекциями .................... �3�� ............ ..53
Колокализация синаптических везикул, белков экзоцитоза и Са-ка-
налов в активной зоне . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..54
Основные белки активной зоны ................................................... ..55
Сборка активной зоны ................................................................. ..58
ГЛАВА Ill. ЭКЗОЦИТОЗ............................ .... ��� ...... ..6l
Сцепление и докирование синаптических везикул . . . . . . . . . . . . . . ..64
Прайминг синаптических везикул. ЗНАКЕ-белки .............. Pc�� ....... „66
Может быть не только ЗНАКЕ-белки управляют праймингом и сли-
янием мембран’? ............................................................................. ..73
Внутриклеточный кальций и экзоцитоз синаптических везикул.
Синаптотагмины ............................................................................ ..75
Шапероны и экзопитоз. Разборка SNARE комплекса .................... ..82
КаЬ3-1"1`Фазь1 в зкзоцнтозе ........................................................... ..85
Кальциевые каналы и зкзоцитоз .................................................. „89
Концепция кальциевых микроцометлов и макродоменов ................ „92
Модуляция входа ионов Ca (входящего Сак-тока) и зкзоцнтоз ........ „97
4 4
Кооперативность ИОНОВ Са В ЗЗПУСКС ')K30[IH'I'O33 И
секреции медиатора ................................................................... .._..98
Экзоцитоз синаптичсских везикул и
внутриклеточные кальциевые депо .............................................. ..99
Фосфорилирование и дефосфорилирование
в регуляции экзоцитоза синаптических везикул ........................... .. 101
Липиды мембран в экзоцитозс .................................................... „111
Нейротоксины и экзоцитоз везикул .............................................. „117
ГЛАВА IV. ЭНДОЦИТО3............. .... ���� ........ ����
Эндоцитоз синаптических везикул ............................................. „124
Скоростные характеристики эндоцитоза
в различных типах синапсов ....................................................... „127
Молекулярные механизмы клатрин-опосредованого эндоцитоза.... 136
Гены и структура молекулы клатрина ........................................ ..l38
Адаптерньте белки ...................................................................... ..142
Механизмы распознавания эндоцитируемых белков .......... .. ���� 145
Везикуло-специфичные сигналы эндоцитоза ................................ .. 146
Роль вспомогательных белков
в клатрин опосредованном эндоцитозе ........................................ ..149
Механизмы мембранных деформаций и
модель «Броуновской защелки» .................................................. „152
Значение динамина в отщеплении везикул ................................. ..156
Синаптоянин .............................................................................. ..160
Каркасные белки Eps I 5 и интерсектин в эндоцитозе ................... .. 161
Снятие клатринового покрытия ............................................... ..163
Механизм быстрого клатрин-опосредованного эндоцитоза .......... „165
Механизмы медленного (объемного) эндоцитоза ......................... .. 166
Место эндосомальной сортировочной стации
в рециклировании везикул. Классические эндосомьл .................. ..170
Факгоры регулирующие клатрин-опосрелованный эндоцитоз...... 173
Фосфоинозитидный цикл
в кругообороте синаптических везикул ....................................... „174
Роль холестерина мембран
в эндоцитозе синаптических везикул ............................................ ..179
Фосфорилирование белков в ходе эндоцитоза ............ .. ....l8l
Кальций-зависимость эпдоцитоза .............................................. „187
ППАВА V. МЕХАНИЗМЫ ТРАНСПОРТА ВЕЗИКУЛ.... ..... ......199
Транспорт синаптических везикул в нервном окончании .......... .. I 99
Актиновый цитоскелет ............................................................... „199
Синапсины и везикулярный цикл ................................................ „207
Белки-моторы в движении синаптических везикул ...................... „21 1
Везикулярные транспортные
механизмы на большие расстояния .............................................. „215
Септины. Новые элементы цитоскелета
и везикулярного транспорта ....................................................... ..218
ГЛАВА VI. ПУЛЫ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ, ИХ
СВОЙСТВА И ПУТИ РЕЦИКЛИРОВАНИЯ ............................ ..222
Везикулярные пулы в шести вилах химических синапсов .......... ..226
Устройство трех везикулярных пулов ......................................... ..229
Возможно пулов синаптических везикул в НО больше? ............. ..23О
Повторное использование синаптических везикул в секреции
медиатора. Скорость везикулярного Цикла ............................... .. 231
Время рециклирования синаптических везикул в типпокампе....231
Скорость прссинаптического везикулярного цикла при формирова-
нии синаптической пластичности в гиппокампе .......................... ..233
Двигательные нервные окончания .............................................. ..235
Заполнены ли рениклируютттие везикулы медиатором? ............ .. 239
Циклические нуклсотипы и скорость везикулярного цикла .......... ..240
Система нАМФ и процессы везикулярного цикла .................... ..240
Система ЦГМФ и везикулярный цикл ........................................ „241
B нервном окончании лягушки существует несколько циклов, обес-
печивающих повторное использование синаптических ве3икул...243
ГЛАВА VII ПРОЦЕССЫ ЭКЗОЦИТОЗА И ЭНДОЦИТОЗА В СИ-
ПАПСЕ, НЕ СВЯЗАННЫЕ С РЕЦИКЛИРОВАНИЕМ СИНАП-
ТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ И СЕКРЕЦИЕЙ МЕДИАТОРА...... .... ..245
Конститутивныс эндонитоз и экзоцитоз .... �X � ............................... ..245
Индуцированные эндоцитоз и экзоцитоз в постсинаптической клет-
ке ............................ 0[�� ................................................................ ..247
Процессы энло- и экзоцитоза в регуляции белкового синтеза и
ремоделировании синапсов ........................................................... ..249
Пре- и постсинаптические везикулярные циклы и
ттейролсгенеративные заболевания ............................................. ..251
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................... ..258
ЛИТЕРАТУРА ............................................................................ ..260
её
ЦВЕТНЫЕ РИСУНКИ
Если после цифры рисунка стоит буква «ц», то он представ-
лен на цветной вкладке. Номер после буквы «ц» указывает‘ номер
вкладки. '
список (ЗОКРАЪЦЕНИЙ
АЗ — активная зона,
АДФ — аденозиндифосфат,
АТФ — аденизинтрифосфат,
АХ — ацетилхолин,
ВПСП, ТПСП —- возбуждающий (тормозной) постсинатттичес-
кий потенциал,
ГАМК — гамма-аминомасляная кислота,
ГДФ — гуанозиндифосфат,
ГТФ — гуанозинтрифосфат,
ДАГ — диацилглицерол,
ИТФ —ч инозитолтрифосфат,
КЛЦМ — киназа легких цепей миозина,
МПКП, МТКП — миниатюрный потенциал (ток) концевой
пластинки,
МЦД — метил-бетта-ци клодекстрин,
НО — нервное окончание,
ПД — потенциал действия,
ПК — протеинкиназа,
ПКП, ТКП — потенциал (ток) концевой пластинки,
Ф — остаток фосфорной кислоты,
ФИ — фосфоиттозитиды,
ФИ-киназы — фосфоинозитол-киназы,
ФТИ — фосфатидттлттнозтттолы,
ФТИ-3‚4‚5-Ф3 — фосфтатидилинозитол-З‚4,5- трифосфат,
ФТИ-4,5-Ф2 — фосфатиднгтинозитогд -4,5-бифосфат‚
ФТИ-3(4 или 5)-Ф - фосфатидилино3итог1-3(4 или 5)-
монофосфат,
ЦНС — центральная нервная система,
цАМФ — циклический аденозинмоттофосфат,
цГМФ - циклический т‘уанозинмоноцйосфат,
ЭПС, ЭПР — энцоплатзматическая есть (ретикулум),
ААК1 — ассоциированная с адаптерами киназа 1,
AKAPS �� белки, заякориватолтттте протеинкиназу А,
Ь 7
АМРА и альфа-амино-З-гидрокси-5-метгхл-4-и3окса3ол
пропионовая кислота,
ARF — АДФ-рибозилируютлтий фактор,
Агр2/3 -— подобные актину протеины 2,
АР-1,-2,-3,—4 — адаптерный белковый комплекс 1, 2, 3, 4,
САМ — кальций/ кальмодулин‚
САМК11 — кальций / кальмодулин зависимая протеинкиназа 11,
СНС -— тяжелая цепь клатрина,
СК2 — казеин киназа 2,
СЬАР-домен — клатрин-АР2 связывающий домен,
СОР 1/11 -- протеины покрытия 1 /11,
ер515 — эпидермального фактора роста белковый субстрат 15,
GAK —~ СЪассоциированная протеинкиназа,
GDI — ингибитор диссоциации ГДФ,
GED —усиливающий ГТФаЗную активность домен,
GEF — фактор обмена гуаниловых нуклеотидов,
GFP — зеленый флуоресцирующий белок,
GPCR — сопряженные с О-белками рецепторы,
Н5с70 — протеин 70 кДа, родственный белкам теплового шока,
МАРК ›— митоген активируемая протеинкиназа,
NMDA— N—MeTm1-D-ac11apTaT,
NSF — К-этилмалеимид-чувствительный белок слияния,
pHluorir1 ��� pH-‘{yBC'I‘BPlTCJlbHa$I форма GFP,
Rab — Каз-подобные белки мозга,
RIM — Взаимодействующая с Rab3a молекула,
Sept — СеПТИНЫ,
ЗМ-белки -- secl/munc18—no11o6HL1e белки,
SNAP — растворимый NSF присоединяющий протеин,
SNAP~25 — ассоциированный с синаптосомами белок 25 кДа,
SNARE — рецептор для SNAP,
spH — синапто-рН-флуорин, белок синаптичсских везикул си-
наптобревин к люменальной части которого присоединен pH1u0rin,
SV2 — белок синаптичсских везикул 2,
sypHy -— синаптофизин, ко второй внутривезикулярной спира-
ли которого присоединен pHluorin,
TI-VAMP — устойчивая к действию тетанус токсина форма
\/АМР,
VAMP — синаптобревин или ассоциированный с мембраной
везикулой протеин,
WASP `��� протеин синдрома Вискотта-Олдрича.
8 {и
ВВЕДЕНИЕ
В современной биологической науке исследованиям молеку-
лярных механизмов синаптической передачи в химических синап-
сах отводится особое место, поскольку события, протекающие в сн-
напсе, служат отправной точкой основных и самых сложных фено-
менов нервной системы. Несмотря на наличие в нервной системе
синаптических контактов, использующих разные типы медиаторов
(нейромециаторов) и имеющих разную морфологию, сам механизм
освобождения нейромедиагора и факторы, обеспечивающие надеж-
ность и пластичность синапса, универсальны. В нервных оконча-
ниях (НО) различных синапсов содержится от нескольких сот до
нескольких сотен тысяч синаптических пузырьков (везикул), запол-
ненных медиатором, а секреция медиатора связана со слиянием этих
везикул с пресинаптической мембраной (экзоцитоз). В процессе си-
наптической активности трата везикул, чреватая остановкой «об-
щения» между нейронами, предотвращается с помощью механизма
эндоцитоза, который «конструирует» из поверхностной мембраны
новые везикулы. Они заполняются медиатором и могут участвовать
в новом раунде экзоцитоза. Отсюда в НО постоянно осуществляет-
ся везикулярный пикл. Естественно, скорость везикулярного цикла
определяет интенсивность секреции медиатора при высокочастот-
ной активности синанса и в конечном итоге силу синаптическото
контакта. В последнее время наметился серьезный научный нро-
гресс в этом направлении. Использование молекурно-биотюгичес-
ких, генетических, электронномикроскопических электрофизиоло-
гических, оптических и др. глодходов значительно продвинуло нас в
понимании значения и молекулярных механизмов экзо- энлонитоза
и транспорта везикул, что требует обобщения и осмысления огром-
ного количества разносторонних зксперттментальньлх данных. B на-
стоящее время обнаружено несколько вариантов экзо- и эндоцито-
за, а также показано, что популяция синаптических везикул неодно-
родна и может быть разделена, как минимум, на два или три пула.
Разная кинетика кругооборота синаптических везикул способна фор-
мировать сложные формы синаптической пластичности. В осуще—
ствление и регуляцию цикла синаптических везикул вовлечено гро-
мадное количество сигнальных молекул как нейротт-спецътфичтльтх,
так и распространенных в других тканях. Данные последних лет
свидетельствуют о том, что нарушения везикулярного цикла наблю-
Ь 9
даются при многих нейродегенеративных заболеваниях, а может быть
являются их причиной. В итоге, синаптическая везикула и везику-
лярный цикл обращают на себя пристальное внимание ученых все-
го мира, которые по кирпичикам собирают прочный фундамент со-
временной синаптологии и нейробиологии.
В настоящей книге обобщается большой пласт современных
данных о роли синаптических везикул в механизмах секреции ме-
диатора в химическом синапсе, подробно рассмотрены молекуляр-
ные машины экзо- и эндоцитоза, везикулярного транспорта, а так-
же регуляции этих механизмов.
Кроме этого представлены современные данные по исследова-
нию механизмов везикулярного транспорта, а также процессов экзо-
и эндоцитоза в нервных клетках, связанных с формированием и ре-
моделированием синаптических контактов, изменениями молекуляр-
ной композиции пре- и постсинаптических мембран, лежащих в ос-
нове синаптической пластичности. Широко представлены собствен-
ные данные авторов монографии и коллектива преподавателей и
ученых кафедры нормальной физиологии Казанского государствен-
но медицинского университета по исследованию везикулярного
цикла в двигательных НО, проведенных при поддержке РФФИ, гран-
тов Ведущей научной школы России и зарубежных фондов, Феде-
ральных целевых программ.
10
ГЛАВА 1. СИНАПСЬ]
Коммуникации между нервными клетками или между нейро-
ном и другой возбудимой клеткой происходят в специфичных реги-
онах, названных синапс-чми. Обычно в качестве синапса рассмат-
ривается участок тесного контакта между нейронами, где происхо-
дит синаптическая передача, то есть изменение мембранного по-
тенциала одной клетки (нервный импульс, потенциал действия)
вызывает соответствующие сдвиги мембранного потенциала мемб-
раны прилежащей клетки. Также термин синапс применяется к фун-
кционально схожим образованиям между рецепторными клетками
и нейронами, нейронами и мышечными волокнами, или клетками
желез. Фактически все стороны поведения животного и человека
зависят от межклеточных взаимодействий в нервной системе, по-
этому большая часть современной нейробиологии посвящена воп-
росам функционирования синапса (Магазанник, 2007).
Синапсы подразделяют на два класса — электрические и хи-
мические. Электрические синапсы являются простыми проводни-
ками пассивного ионного тока от одной клетки к другой. Такого
рода межнейрональньте соединения чаще встречаются у беспозво-
ночных, чем у позвоночных и нсмногочисленньт в организме млеко-
питающих. Подавляющее большинство синапсов (более 90 %) при-
надлежат к классу химических, поскольку их функционирование
связано с выделением химического посредника (нейротрансмитте-
ра, медиатора) из нервного окончания. В пресинаптической клетке
ПД вызывает освобождение медиатора в узкое межклеточное про-
странство (синаптическую Щель), затем молекулы нейротрансмит-
тера диффузией достигают поверхностной мембраны прилежащей
клетки (постсинаптической мембраны), густо усеянной специфич-
ными рецепторами. Связывание медиатора с постсинаптическими
рецепторами вызывает изменения проводимости мембраны для оп-
ределенных ионов и возникновение электрических постсипатттичес-
ких сигналов (Kandel, 2001).
Электрические СИНЗПСЫ
Под Электронным микроскопом электрические синапсы опре-
деляются в виде областей, где мембраны соседних клеток намного
ближе, чем в остальных (впесинаптгаческгтх) регионах, подходят друг
к другу. В районе электрического сипапса ‚дистанция между двумя
мембранами составляет около 2-3 нм, вместо 15-20 нм в соседних
участках. Исследование с помощью электронной микроскопии реп-
лик внутренних частей мембран, полученных методом заморажива-
ния-скальтвания, выявило нштичпе на обеих синаптических мембра-
нах гексагональнойрешетки из макромолекул. Биохимический ана-
лиз показал принадлежность этих макромолекул к отдельному клас-
су белков, известному как Коннексоны. Каждый коннексон, пред-
ставляющий собой трансмембранньтй канал, составлен из шести
субъединиц - коннексинов, каждая из которых 4 раза пересекает
плазматическухо мембрану. Конпексиньт — семейство короткоживу-
щих (несколько часов) белков, состоящее у человека из 21 члена.
Коинексипьт, образующие коннексопы смежных мембран, располо-
женные друг напротив друга, соединены между собой таким обра-
зом, что два коппексопа формируют сквозной канал между клетка-
A Цитоплазма одной цветки
Цитоплазма другой клетки
Рис. I . [Целевые (gap) K()}lI7‘l(lKI71bl.
A - КОННСКСОНЫ соседних гиембран расположены точно друг под
другом, образуя сквозной кангш между клетками. Стрелкой указано
положение межклеточного контакта (щель между мембранами 3 нм).
Б - трехмерная реконструкциях коннексонов,
12
ми (рис. 1). Через эту пору диаметром 1,5 нм происходит пассивное
ПрОПИКПОВСНИС ИОПОВ ИЗ ОДНОЙ КЛСТКИ В ПруГуЮ. ИЗМСНСНИС КОН-
формации коннексона при фосфорилировании отдельных субъеди-
ниц, изменении концентрации Caz’, pH цитоплазмы и натяжении
мембраны может приводить к закрытию канала. Скопление коннек-
сонов, которое обнаружьвается в не нервных клетках (таких как,
клетки глии, гепатоциты, кардиомиоциты, гладкомышечньте и эпи-
телиальные клетки), обозначается как щелевые (gap) контакты (рис.
1) и участвуют в транспорте ионов и малых молекул с молекуляр-
ной массой до 1,5 кДа (например, пептидов), что необходимо для
обеспечения функциональной Целостности ткани (Наточин, 2007).
Рис. 2. Электрический и ‚типический синапс (Galarrcta, Hcstrin,
2001).
Электрический синапс (а) между двумя дендритами ингибитор-
ных кортикальных интернсйронов (dl и d2) B 4 слое моторной зоны
коры полуцхарий взрослого примата. Химический синапс (б) между
аксоном А дендритом d2. Главной особенностью химического синап-
са является наличие большого количества синаптических везикул в
пресинаптической области.
Электрические спнапсы обнаружены в некоторых областях го-
ловного мозга по3во11очнь1х животных (рис. 2). Многие ингибирую-
щие (ГАМК-эргические) вставочные нейроны, имеющие схожее фун-
кциональное назначение, в коре головного мозга, стриатуме и моз-
жечке связаны между собой электрическими синапсами (Оа1аггета,
Hestrin, 2001). Вероятно, это вносит вклад в синхронизацию актив-
ности определенных популяций пнгибируютпих нейронов, позво-
ляя координировано предотвратить «ненужное» возбуждение. Кро-
ме того, некоторые аксоны нейронов мозга образуют между собой
щелевые контакты, в результате чего достигается быстрая сетевая
синхронизация. В нейронах гигтпокампа один из типов высокочас-
тотной осцилляции (100-200111), обозначаемый как «рябь», возни-
кает, вероятно, благодаря аксо-аксональньтм синаптическим элект-
рическим связям между ГАМК-эргическими аксонами (Dcbannc,
2004).
Способность нейронов образовывать электрические сипапсы
между собой возможно в скором времени будет использоваться для
создания микрочипов. Это следует из результатов экспериментов, в
которых удалось культивировать нейроны и заставить их образовы-
вать между собой электрические контакты на поверхностях стиму-
лятора и транзистора в силиконовом чипе (Zeck, Fromhcrz, 2001).
ХИМИЧЕСКИЕ СИНЭПСЬП
В химических синапсах ЦНС структурная специализация уни-
кальна для пре- и постсинаптической областей (рис. 2). Пресинап-
тический регион отвечает за накопление и выделение медиатора, а
постсинаптический — связан с рецепцией молекул медиатора. По
сравнению с электрическими, химические сипапсы проводят сиг-
нал в одном направлении и делают это медленнее, поскольку 0.1-
О.5 мс теряется на синаптическую задержку. Однако химические си-
напсы имеет важные преимущества. Они позволяют усиливать элек-
трический сигнал, легко превращают возбуждающие сигналы в тор-
мозные и имеют многочисленные контуры регуляции. Поэтому слож-
ность химической синаптической передачи является необходимой и
оправданной для обеспечения межклеточных коммуникаций в не-
рвной системе и формирования важнейших функций мозга (Нозд-
рачев, 2001).
14
Преситтатттическая специализация. Нейрон имеет три тлав-
ных части: тело, содержащее ядро, несколько дендритов и аксон,
Хотя обнаруживаются примеры синапсов между телами двух ней-
ронов, между двумя дсндритами, и между ттарой аксонов, наиболее
распространенный ‘тип межнейроттальньтх синапсов включает‘ аксон
в качестве преситтатттичсского компонента и тсло нейрона или ден-
дрит - в качестве ттостсинатггического. Нейрон обычно иннсрвиру-
ется многими аксонами. Каждый аксон за несколько микрометров
до иннервируемого нейрона образует древовидные ветвления на тер-
минальные веточки, простираюшиеся непосредственно тю поверх-
ности нейрона. Количество терминалей широко варьирует, дости-
гая в среднем нескольких десятков на микрометр поверхности ней-
рона-миптени. Во всех случаях нервные тсрминали способны к вы-
делению медиатора из нескольких сайтов, расположенных вдоль по-
верхности терминали, обращенной к постсинатттическому нейрону.
Каждая терминальная веточка усеяна многочисленными расшире-
ниями (варикозами, бутонами), непосредственно контактирующи-
ми с постсинаптической клеткой. Эти расширения часто называют-
ся нервными окончаниями (НО).
Композиция варикозов. Варикоз можно разделить на два ре-
гиона: аксональное основание и собственно варикоз (рис. 3 ul ). Ак-
сональное основание ч- это продолжение аксональньтх компонентов,
заполняющих родительский аксон, его претсрмиттальттьте веточки и
участки между варикозами. Его главными элементами являются Mll-
тохондрии, лнзосомьт, микротрубочки и филаменты, гладкий эпдоп-
лазматический ретикулум (ЭПР). Во втором регионе наиболее за-
метные компоненты - пузырьки (везикулы) и актиновые нити.
Везикулы, встречающиеся в варикозах, в соответствии с их
структурой и функциями можно разделить на несколько групп.
Первую наиболее многочисленную группу составляют‘ аграну-
лярныс везикулы, имеющие сферическую форму (35-50 нм в диа-
метре B зависимости от синапса) и содержащие молекулы класси-
ческих низкомолекулярных медиаторов (например, аминокислоты,
катехоловьте амины, серотонин, ацетилхолин) (Зефиров, 2005). Та-
кие везикулы называются синаптическими везикулами, часть из
них прикреплена к пресинатттической мембране, а часть - образует
скопления в толще варикоза. Когда нервный импульс достигает ва-
рикоза, некоторые синаттгиттеские везикулы сливаются с пресинап-
тпческой мембраной (экзоцитоз), освобождая содержимое. в том
числе молекулы медиатора, в синагггичсскую щель. Обычно только
один тип молекул медиатора заполняет синантнческие везикулы в
конкретном нейроне, но существуют примеры вьщсления различ-
ных медиаторов из одного и того же варикоза. Вскоре после слия-
ния синатттических везикул с нресинаптической мембраной, часть
мембраны захватывается варикозом, в результате чего появляются
новые везикулы, способные после заполнения к повторному экзо-
цитозу.
Вторая группа представлена гранулярттьтми везикулами 80-160
нм в диаметре с электронно-плотиым содержимым, видимыми при
использовании обычных методов электронной микроскопии. В ва-
рикозах таких везикул намного меньше, чем синаптических. Грану-
лярные везикулы заполнены крунномолекулярньтми медиаторами
пептидной природы, которые после выделения экзоцитозом в си-
наптическую щель связываются со специфичными иостсинаитичес-
кими рецепторами, модулируюшими действие классических медиа-
торов.
Покрытые везикулы, цистерны, эндоеомы и транспортные ве-
зикулы объединяют в третью категорию везикул. Покрытые вези-
кулы имеют размеры, как и у синаптических везикул, однако их
поверхность окутана сетью из белка клатрина. Цистерны —~ это сплю-
щенные (плоские) агранулярньте везикулы разной величины, эндо-
сомы — округлые агранулярньте везикулы больших размеров. По-
крытые везикулы, цистерны и эндосомы участвуют в рециклирова—
нии синаптических везикул (см. ниже). Транспортные везикулы,
содержат специфические компоненты пресинатттической мембраны
и участвуют в строительстве поверхности НО, в том числе сайтов
экзоцитоза.
Такой компонент варикозов как актиновьте (риламетттьт участву-
ют в транспорте синаптических везикул. Наибольшая плотность ак-
тиновых нитей обнаруживается в участках, окружающих скопления
синантических везикул. Реже актин встречается в пространстве сре-
ди везикул.
Отличительной чертой нресинатттических варикозов является
наличие на пресинатттттческой мембране снециалттзировгаттттых учас-
тков, называемых активными зонами, около которых группирутог-
ся синаптическъте везикулы и специфичные цитондшзматическис и
мембранные протеины. Именно здесь происходит зкзоцъттоз синап-
тических везикул.
16 Q
HOCTCI/lll2lll'lM‘lCCK2lSlCllCl[M1l.'lM‘l:!l1l/HI. В участке мембраны по-
СТСИННПТПЧССКОЙ КЛСТКН, pi1CIl()J!()'/KC‘!IHOFO СТрОГО HEIHPOTHB КЦЖДОЙ
A3 Bapnkma обнаруживается вьтсокая концентрация рецепторных
белков чувствтттезтьттьтх к меднатору’ (рис, 3 ц] ). В ряде синапсов
коттцеттграция рецепторов у: данном участке примерно в тысячу раз
больше. чем в каком-либо другом регионе постсинаптнческой клет-
ки. Густое скопление белков. в том числе фнламетттотз цитоскелета.
наблюдается в области ннтоттлазгньк нрнлетаютцетт к постсинапти-
ческой мембраны, содержатцей кластеры рецепторов. Этот цитоп-
лачматтнтескттй конгломерат белков обозначаются как постсинапти-
ческая плотность. Эти белки помогают «чаякоривать» реценторьт
в ттостсинантической мембране. Например, ионотроттттьте тлутамат-
ные рецепторы (АМРА, NMDA) свячываются с такими каркасными
белками как PSD—95 (белок ностсинаптической плотности 95 кДа),
$АР97 (синапс-ассоциированпый протеин 97 кДа), GRIP (взаимо-
действующий с тлутаматттьтми рецепторами протеин). Глициновьте
и ГАМКА-рецеттторы удерживаются в мембране белком гефирином,
которыи в свою очередь связывается с актнттовьнут цитоскедтетом и
микротрубочками. ГАМКорсцеттторьт, которые в большом количе-
стве присутствуют в биполярных клетках сетчатки, взаимодейству-
ют с белком MAP] B, ассоциированным c нитями Р-актитта (Мо55,
Smart, 2001).
В определенных синапсах в 1тостсинаптической плотности вы-
явлены и другие протеины (КО-синтаза, (Ёа/кальмодултттт-завттсттмая
протеинкиназа 2 (САМКП), нротеинкттттазат Сбета-П, SPAR — spine-
associated Rap GTPase-activating protein и др), которые регулируют
проводимость каналов ионотропттьтх рецепторов. Некоторые типы
рецепторов к медиатору располагаются за пределами постсинапти-
ческой плотности, например метаботронные глутаматные рецепто-
ры. Такие рецепторы активируются в случае обильного освобожде-
ния медиатора из варикозов, тогда медиатор «переливается» за пре-
делы области максимальной коттцетттргтттитт ионотронных рецепто-
ров (рис. 3 ц1).
Синантическан щель. Область внеклеточного пространства
шириной в 25 нм между прсситтаптттческотт мембраной варикоза н
богатым рецепторами участком постсинаптнческой мембраны обо-
значается как синаптическан щель. Эта шель существенно шире,
чем пространство, рачделяютцсе не синаптиттеские регионы нейро-
на от мембран других нейронов и тлпадтьттьтх клеток (около 15 HM).
митохондрия
\ \‘ а
\ .v.wf'-CR
AKCOH \_z
9 vmn :BoRab3a ё
о ъ Ё
8 Mmn д, ё �&7� ё
активная I 00 ш Са канал
зона AMPA-P NDMA-P
ПСП
О х
ё Ё Ё т; @
что‘ ` 43‘? а ` Home:
С: знач _ ‘ M—Fny-P
ДЕНДРИТНЫЙ
ШИПИК Ё
_- Cay ЭПР
шипиковый
аппарат
Р-актин
Рис. 3 ц1. Схематическое изображение зрелого глутаматэрги-
ческого синапса.
Пресинаптические терминали содержат большое количество си-
наптических везикул (СВ), заполненных нейромедиатором глутаматом и
несущих такие белки как синаптобревин (VAMP) И малую ГТФазу Rab3a.
Вход кальция в НО через Потенциал-завИсИмЬ1е Са- каналы Запускает
слияние везикул с плазматической мембраной, в итоге медиатор осво-
бождается в синаптическую щель. Слияние везикул происходит в актив-
ной зоне, которая характеризуется наличием особых белков (например,
RIM, Basson, Piccolo). Напротив активной зоны располагается постси-
наптическая область, обнаруживаемая на электронных микрофотогра-
фиях в виде электронно-плотного утолщения мембраны - постсинапти-
ческой плотности (ПСП). В ПСП имеется высокая концентрация ионот-
ропных глутамагных рецепторов (N MDA-P , AMPA-P) и связанных с ними
каркасных белков, а также сигнальных молекул. Метаботропные глута-
матные рецепторы (мГлу-Р) показаны лежащими за пределами ПСП.
Обозначены и другие белки CASK; GKAP, ИТФ-Р (инозитолтрифосфат-
нь1е рецепторы), Mintl, SER, Shank.
Ц1
Ц2
терминаль
интегрины 6 тенасцин -С
| в
. г д .
ЭКМ „д: д? Гпу-Р к ”‘_-‘W 3|(M
" и 1 ГПУ-Р д NDMA-P\ к
‘A3: I с:
am _
в ;
д - с]; 4—.—ш_
ник
“м” Ca"- an
а им:
отросток
дендрит ДЕГРВДЭЦИЯ ЭСТРОЦИТЭ
рецепторов
Рис. 4 142. Экстраклеточныйматрикс (ЭКМ) в синаптическом кон-
такте (Dityatev, Schachner, 2003).
иНТСГрИНЫ, нейрональные молекулы клеточной адгезии (N CAM) СВЯ-
зывают Молекулы ЭКМ И формируют в цитоплазме на краях пре- и постси-
наптических регионов сигнальные комплексы с рецепторными тирозинки-
назами (RTK). Молекулы ЭКМ служат мостами между пре- и постсинап-
тическими сигнальными комплексами, управляющими цитоскелегом и ве-
зикулярным транспортом, в том числе эндоцитозом И перемещением си-
наптических везикул (б), доставкой с помощью везикул рецепторов на по-
верхность клетки или, наоборот, направлением рецепторов на деградацию
(а). Потенциал зависимые Са-каналы напрямую взаимодействуют с бел-
КОМ ЭКМ —тенасЦином-С, что может модулировать их работу Молекулы
ЭКМ способны через NCAM ВЛИЯТЬ на аппарат экзоцитоза (в).
КВТОНИНЫ
это" т CASK ?
GRIP I синтенин
KERNPMH нейрексин SynCAM эфрин B
кадгерин иейролиги ЗУПСАМ EDhB |
пашут О с)
? GRIP
катениньп PSD-95
Puc.5 142. Основные взаимодействия бачков в синаптической щели.
Подробнее в тексте.
св - . _ .
‘ i ‘ 1 ‘t
М” „и ‘ ' * ‘ ‘ и в
ca" I _.
дат ` дог гнут‘
_ АТФ АТФ АТФ
_.
I
’. d""' �[�� пап-б. ‘Е; ел с П: ом
о о ‘о __ _
о \ I Г?‘ \
mo ma, Mn
I 3 .. д’ " I
l : а: S
“Ё \Са \0*‘ \са
. . T‘. ‘х?
Рис. 6 цЗ. Г лиальньяе клетки контролируют синаптическую
область (Hirrlinger е: а1.‚ 2004 с изменениями и дополнениями).
А — «тройственный синапс», где отростки астроцита окутывают
синаптическое соединение. Локальная сигнализация между нейроном
и астроцитом способна регулировать функцию синапса. ГАМК или
глутамат (1), освобождающиеся из НО могут действовать на рецепто-
ры астроцита, что вызывает увеличение уровня Сад (2). Ca“ Запускает
освобождение глутамата (3), модулирующего работу синапса. Б — при
высокочастотной активности наблюдается повышение Ca“ B астроци-
те, который может одновременно контролировать несколько синап-
сов, выделяя глутамат В - Механическая стимуляция глиальных клеток
сетчатки, заполненных Са-индикатором вызывает увеличение Ca”,
«распространяющееся» на соседние клетки. Показано перемещение
переднего фронта Са- волны. Г - Предполагаемый механизм активацгш
глиальных клеток и формирования Са- волн. Ионы Са высвобождают-
ся из внутриклеточных депо в ответ на повышение концентрации ино-
зитол- [,4,5-трифосфата (ИТФ). ИТФ может диффундировать к сосед-
ним клеткам через щелевые контакты. Сигнализация на длинные рас-
стояния осуществляется посредством освобождающегося АТФ, кото-
рый взаимодействуя с рецепторами активирует фосфолипазу С (ФЛ-
С), вызывает образование ИТФ и дальнейшее освобождение АТФ из
соседних астроцитов.
` ‚импелпи
Ядро шваиицвскоп
ткп
/ kill’
lllnanuostxlle
КЛЕТКИ
Нервные
терпшнилп
мышечное
ВОЛСРКИП
Активные юны
(‘пиаппяческая щель
rl0(“l‘l.‘IllI§lll'I‘II‘l€l‘liafl (КЛЕЦКИ
ОИНЗПТОТЯГМИИ
Cl - канал З
I
синатофизин
1
SV2» ..
\ ‚.
$САМР._
СИШОКФН "
‚ - ч“
I I
‘ ‘V _
Q‘; -
I ” § ��\�
ч з‘ ` P
друюй ‘ n
транспортер
везикулярный ` MUM 13
19000509799
myuuava на“
Пои:
в^‹'в‹?"'
г
‚ K
‘ ‘ VAMP4
CMHBTWMM
Puc. 7 ц4. Стро-
ение H€p8H0-]l/lblLLl€'-lH0-
го синапса лягушки.
Аксон двигатель-
ного нерва вблизи мы-
шечного волокна теря-
ет миелиновую обо-
лочку, при этом остает-
ся покрытым Шван-
новской клеткой. Ак-
сон ветвится, образуя
2-8 терминали на мЬ1—
шечном волокне (не-
рвное окончание). Де-
тали в тексте.
Рис. 8 ц4. Моле-
кулярная модель ти-
пичной синоптичес-
кой везикулы
' srwmzs (Takamori е: а1., 2006).
А — Трехмерная
реконструкция везику-
лы. Б — вид везикулы в
поперечном сечении.
В мембране содержит-
ся большое количество
холестерина (около 40-
50% всех липидов). В —
изображение везику-
лы, содержащей толь-
ко синаптобревин (бе-
лок‚ концентрация ко-
торого в везикуле мак-
симальна: на одной ве-
зикуле обнаруживает-
ся около 70 копий).
$17
НССМОТрЯ НЦ НСЗПЫЧНГСЛЬНОС КОЛИЧССГВО ВНСКЛСТОЧНОГО М1Г1`СрР1ЗЛ21
в ЦНС, в синаптиттескотт щели методами иммуногистохимии обна-
руживаегся большая плотность белковых агрегатов, соединяющих
прс- и поетситтаптпческтте мембраны (рис. 4 ц2). Эти белковые сети,
включающие внеклсточиые части рецепторов, каналов, транспор-
теров и специальных белков. поддерживают плотное сцепление меж-
ду протттволсжатцттмтт мембранами, но не препятствуют диффузитт
медиатора через синаиттическуто щель. В отличие от цетггрштьньтх си-
напсов в нервтто-мьттттечттьтх соединениях синаптичсскую Щель запол-
няет, так называемая, базальная мембрана в виде каркаса из гликопро-
теинов (ламинин, фибронекгитт, козтлагетт, энтактттн, перлекан и др.)
Другие важные мембранные белки - это молекулы межклеточной
адгезии. с номотцьто которых обеспечивается точное совмещение пре-
и постеиттаптичсскттх мембран (рис. 4 ц2). Непосредственно в пресн-
натттттческуто мембрану встроены такие молекулы межклеточной адге-
зии, как кадтериньт, протокадгсрттньт, нектины, нейрональная молеку-
ла межклеточной адгезии (NC/\M)_, фасциклттн 2, молекула межкле-
точной адгезтттт Аплизни, молекула адгезии синдрома Дауна, синдека-
Hm, нейротлиаттьт, ттнтетриттьт, нейрексттны. Все молекулы адгезии имеют
схожее строение: внетстеточттьтй домен, оцосредутотций связывание с
внететсточттьтхт матрикеом (молекулами экетракчегочнотт) матрикеа) шит
внеютегочттьтм регионом протеина постеинаптической мембраны, один
Траттсмембранттьтй домен (якорь), и часто внутриклеточный домен, ко-
торый взаимодсйетвует‘ с цитоскелсгом или каркаеными PDZ (PSD95,
Dlg/\, ZO—1)—.'.IO\1CII содержащими белками (CASK, GRIP, PSD-95), со-
бираютцнмн вокруг есбя большие белковые комплексы. Все из пере-
численных молекул, за исключением нейрекеина, который соединяет-
ся с постеинатттическим белком нейролигином, представлены как на
пре- так и на иостстнтаптиттеской мембране, и адгезия формируется за
счет гомофттльттьтх (одноименных) взаимодействий (рис. 5 ц2). Адге-
зивттыс гиолекугтьт и Экетраклеточный матрикс принимают участие в
меж- и внутриклеточной сигнализации, модулируют синаптическуто
передачу (рис. 4 ц2). В пресинаптической области сигналы, связанные
с эксграклеточттым матриксотхт и адгезией, могутконтролировать эндо-
цитоз и псреметцеттие синаптичсскттх везикул вглубь нервного оконча-
ння, а в постсттнатттттчеекотхт регионе воздействовать на доставку (с
помотцыо везикул) рсттеттторов на поверхность ютетки или, наоборот,
направлять рецепторы на ‚деградацию в лизосомьт. Потенциал (зависи-
мые С`а-катта:ть1 напрямую man N1(\11CfiC1‘I&y ют с белком зкстраклегочтто-
го матрикса ~ тсттасцттном-С. Следовагельтто, перестройка материата
сннаптической щели может мону;1иротъа'ть работу Сан-каналов, изменяя
концентрации) Сад‘ в [тостсинапгической области, B свою очередь, Cal’
активируя различные ферменты (в том числе, САМК II) регулирует
чувствительность и количество ностсинаптических рецепторов. Воз-
можно, молекулы внеклеточного магрикеа способны через присутству-
ющие на пресинатттической мембране белки адгезии (МСАМ) влиять
на аппарат экзоцитоза (рис. 4 ц2).
Глия
Глиальньте клетки могут формировать миелиповую оболочку
на исходном аксоне и претерминальных веточках. Нервные терми-
нали немиелттнизттроваттьт, но отростки глиальньтх клеток плотно
ассоциированы C 11111v111 (рис. 6 113). Причем глпальньте клетки пол-
ностью обертывают участки между варикозами, оставляя свободны-
ми только те места, в которых происходит освобождение и рецеп-
цпя медиатора. Глия осуществляет буферизацию из окружающей
среды ионов калия, захватывает освобожденный медиатор. Так, ас-
троцнты запасают нейротранемиттер и гликоген для последующего
снабжения нервных терминалей, синтезируют и освобождают ней-
роактивньте соединения (АТФ, глутамат, В-еерин, NO, простаглан-
дины), которые модулируют нейрональную активность. Многие си-
наптические медиаторы (глутамат, ГАМК, норадреналин, ацетилхо-
лин, аденозин, Дофамин, АТФ) активируют глиальньте клетки (рис.
6 ц3), которые могут передавать сигнал дальше соседним клеткам
глии с помощью «глиотрансмиттеров» (АТФ, NO, простагландинов)
или через щелевые соединения (при участии ионов Са, инозитол-
1,4,5-трифосфа'та (ИТФ)), которыми соединены клетки глии (Ве221,
Voltcrra, 2001 ; Vijayaraghavan, 2009). Действие такого глиотрансмит-
тера, как АТФ, связано е активацией пуринореттепторов, переводя-
щих Gq—6eI1o1< во включенное состояние. Впоследствии Gq—6c:1o1<
стимулирует фоефолипазу С, которая расщепляет фосфатидилино-
зитол-1‚4,5-трифосфат на диацидтглицерол и ИТФ. Гидрофпльные
молекулы ИТФ диффундируют в цитоплазму п связываются с ИТФ-
рецепторами, расположенными на мембране ЭПС. В результате от-
крывается канал ИТФ-репспторов и ионы Сад‘ устремляются из
ЭПС в цитоплазму (Haydon, 2001). В целом, активация глиальных
клеток заключается в повышении внутриклеточного уровня Ca" 11
появлении Caz‘ — волн (рис. 6 113).
19
Альтерании в глиальттом окружении вызывают‘ изменения мор-
фологии и фенотина сипанса. Фактически, коммуникации между
нейронами и глней являются двунаправленными (Haydon, 20()1).
Кроме того, некоторые глиальньте клетки, контролирующие различ-
mac синапсы, связаны между собой щелевыми контактами, что от‘-
крывает возможность взаимного влияния разных синантических кон-
тактов друг на друга.
Накопление данных, свидетельствующих о существенной роли
глин в сипаптической передаче, приводит‘ многих исследователей к
концепции «Тройственного синаттса» (рис. 6 ц3).
Нервно-мышечный синапс
Современные представления о синаптических функциях нер-
воначатьно были сформированы при изучении — нервно-мышечно-
го соединения скелетных мышц позвоночных. Этот синапс лежит
вне пределов мозга, однако, его доступность дает возможным ис-
следовать универсальные процессы сипаптической передачи и ме-
ханизмы их регуляции.
Скелетные мышцы иннервируются мотонейронахти, которые ло-
кализованы в спинном мозге или стволе мозга. Каэкдый из них но-
сылает аксон к отдельной мышце, где его веточки иннервнрутот мно-
жество мышечных волокон. Когда аксональная веточка достигает
мышечного волокна, она теряет мислиновую оболочку и разделяет-
ся на тонкие терминальные веточки или бутоны (нервное оконча-
ние - НО). Терминальная веточка находится в желобке на поверхно-
сти мышечной мембраны и прикрыта отростками [Пванновских кле-
ток (рис. 7 ц4). У млекопитающих большинство мышечных волокон
иннервируются через один синапс одним аксоном. Вследствие это-
го B нервно-мышечном соединении нет сипаптической интеграции;
каждый ПД нервной тсрминали вызывает один ПД в мышечном
волокне. Количество, форма и протяженность синантических кон-
тактов у различных животных в значительной мере варьирует. В
фазных мышцах холоднокровттьтх животных (лягушка) НО имеет вид
«конечного кустика», а в тонических - «виноградной кисти» (Birks
et а1., 1960; Блохина, Зефиров, 1984). Длина отдельной терминали
фазного мышечного волокна лягушки составляет 20 — 330 мкм, а
суммарная протяженность синаптътктеского контакта достигает 1-2
мм (рис. 17). У теплокровных животных, в отличие от амфибий,
20‹
фазные волокна имеют компактные НО с многочиецтеттгтьтми терми-
нальными утолщениями бутонами, и длина отдельнои терминалы
не превышает 20-40 мкм, при общей протяженности синапса около
100 мкм (рис. 17) (Добрецов и др. I983).
Электронные микрофютограсрии нервно-тиышечгтого соедине-
ния указывают на то, что и нервное и мышечное волокно высоко
специализированы в месте кон. ткта. Нервно-мышечный синапс,
также как и центральные сииапсь включает в себя три элемента:
пресинаптическую область НО, постситтаптическуто область (спе-
циализированную область мышечного волокна к которой прилегает
НО) — двигательную концевую пластинку (Eccls, 1963) и разделяю-
щую их синаптическую щель (Рис. 7 114).
Двигательные нервные терминали заполнены синаптически-
ми везикулами диаметром 50 нм, содержащими медиатор ацетилхо-
лин (АХ). Многие везикулы прикрепляются к плотным проекциям
на цитоплазматической стороне пресинаптической мембраны, дру-
гие разбросаны в цитоплазме НО. Эти проекции, названные актив-
ными зонами (АЗ), являются местом, где везикулы сливаются с пре-
синаптической мембраной и освобождают АХ в синаптическую щель
(рис. 7 114). Наблюдаются также несколько большие по размеру,
плотные везикулы, они, предположительно, содержат нейролепти-
ды, такие как кальцитонин ген-связанный пептид, вазоактивный
интестинальный пептид и др. В аксоплазме НО имеются различные
органеллы -- митохондрии, микротрубочки, микрофиламентьт, цис-
терны эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Митохондрии обес-
печивают клетку энергией. Также показано, что они могут контро-
лировать концентрацию внутриклеточных ионов Са. Цистерны ЭПР
специализированы для накопления в них ионов Са. Внутри цис-
терн находится Са-связыватотций белок (кштьретикулин). В мембра-
ну цистерн встроены Са-насосы (Са-АТФазы), закачиваютцие ионы
Са внутрь цистерн и Са-каналы, по которым ионы Са могут выхо-
дить в цитозоль по градиенту концентрации. На мембране ЭПР они-
саны по крайней мере два основных типа лиганд-зависимых Са-
каналов: рианодиновые и инозитолтрифосфатныс. В последние годы
быстро растет число свидетельств суптесттзованття и других разно-
видностей внутриклеточных (За-каналов, избирательно активируе—
мых внутриклеточными метаболитами — НАД‘, НАДФ‘, цикличес-
кой АДФ-рибозой, однако их свойства плохо изучены (Балезттгтат,
2002).
Постсинаптическая область представлена желобками (синап-
тическими ямками), в которые уложены нервные тсрминали (рис. 7
ц4). В желобке имеются различные по глубине инвагиттации шири-
ной 50-100 нм — постсинаптические складки. За счет таких складок
значительно увеличивается ширина синаптичсского контакта и уси-
ливается эффект выделения кванта медиатора (Robertson, 1983). B
нервно-мышечном синапсе лягушке напротив каждой АЗ имеется
обычно 2 складки, у человека — 7-8. Ha постсинаптической мембра-
не заякорены никотиновые холинорецепторньте ионные каналы, ко-
торые с наибольшей плотностью 10000 на мкм2 (молекулы располо-
жены практически «плечо к плечу») группируются в районе устья
складок (Ререг, McMahan, I972). Такая Кластеризация рецепторов в
значительной степени достигается с помощью белка рапсина. Пос-
ле взаимодействия с рецепторами АХ расщепляется ферментом аце-
тилхолинэстеразой или диффундирует из синаптической щетки
(Letinsky, De Cino, 1980).
Между пре- и постсинаптическими мембранами в синаптичес-
кой щели располагается так называемая базальная мембрана, кото-
рая заходит и в синаптические складки, Она является частью непре-
рывной оболочки, которая окружает мышечное волокно и сливает-
ся c базальной мембраной Шванновской клетки. Хотя синаптичес-
кая базальная мембрана морфологически не отличается от внеси-
наптической базальной мембраны, к которой прикрепляется, она
биохимически специализирована, т.к. содержит ацетилхолинэсте-
разу, инактивирующую трансмиттер, а также компоненты, отвеча-
ющие за адгезию нерва к мышце и факторы, которые отвечают за их
взаимодействие в процессе развития (агрин. коллагены, гепарин суль-
фат протеогликан, ламинин А, Б-ламинин, неурегулин, тенасцин,
фибронектин, энтактин, перлекап, ос-дистрогликатт). Такой компо-
нент базальной мембраны как (х-дистрогликан крепко связан C транс-
мембранным белком [3—дистрогликаном, который соединен е цитос-
келетным белком дистрофином, в свою очередь взаимодейству1о-
Щим с нитями Р-актина. Такая организация базальной мембраны
обеспечивает устойчивость и надежность механической связи пре-
и постеинаптических мембран при сокращении мышцы.
Сверху нервная терминаль покрыта Шванновской клеткой, паль-
цевидньте отростки которой делят терминаль на сегменты (Ros-
Canada et al., 1983; Haydon, 2001). Такое покрытие защищает не-
рвную терминаль от химических и механических повреждений. Од-
нако многие исследования позволяют предположить и другие роли
22
Шванновских клеток. Во-первых, они фатоштгируют нервную тер-
миналь после повреждения аксона п служат проводниками ДЛЯ про-
растания новых термипалей, участвуя в аксональном и терминаль-
ном ремоделировании. Во-вторых, они демонстрируют изменения
концентрации ионов Ca В ответ на прохождение ПД, следователь-
но, они чувствительны к электрическому сигналу. Шванновская клет-
ка несет на себе рецепторы к нейромедиаторам и модуляторам (аце-
тилхолину, АТФ, субстанции Р и др.). В ответ на аппликацию мус-
карина (атониста метаботропньтх холинорецеттторов) или АТФ в
Шванновской клетке регистрируется повышение уровня Сад’
(Gcorgiou ct а!.. 1999). Причем активация Шванновской клетки мо-
дулирует синаптическую депрессию при высокочастотной стимуля-
ции двигательного нерва. Так, секреция АХ в ходе высокочастотно-
го раздражения увеличивается после инъекции ингибитора О-бел-
ков (GDPBS) B Шванновскую клетку (Robitaille et а1.‚ 1998). Нако-
нец, они обнаруживают способность синтезировать и секретиро-
вать AX после денерваттии и, следовательно, способны передавать
сигналы к мышце. О тесной связи между НО и Шванновской клет-
кой свидетельствует наличие щелевых контактов (Rash ct а1.‚ 200 1 ).
Из представленных данных видно, что во многих отношениях
синапсы между нейронами сходны с нервно-мышечными соедине-
ниями. И в тех, и в других нервная терминаль содержит везикулы,
терминали покрыты глиальными отростками; пре- и ностсинапти-
ческие мембраны утолщены и специализированы на освобождение
нсйромедиатора и его рецспцию. Также в центральных и перифе-
рических синапсах есть одинаковые функциональные элементы, и
часто наблюдается гомологичность на белковом уровне (компонен-
тов машин экзо- и эндоцитоза, каналов, рецепторов, внутриклеточ-
ных регуляторных систем). Особенностями центральных синапсов
являются малые размеры терминали, значительно меньший запас
синаптиттеских везикул в НО, поэтому небольшое количество вези-
кул освобождают медиатор в ответ на пресинаптический ПД. Кро-
ме того, в межнейрональных синапсах отсутствует базальная мемб-
рана, а постсипаптическая мембрана не образует складок. Только
небольцтая часть мсжнейрональньтх синапсов использует АХ в ка-
честве пейромедиатора; соответственно, механизмы биосинтеза,
повторного захвата и инактивации медиатора, а также хеморецеп-
um, B них будут другими.
Структурная и молекулярная схожесть межнейронпьтх и нервно-
мытпечттьтх синапсов свидетельствует о том, что принципы работы
я 23
нерв{то-мыгггечного синапса могут быть приложимы и к работе меж-
нейроттальньтх синапсов (Cowan ct al. 2000), что и было подтвержде-
но в многочисленных исследованиях последних десятилетий (Sudhof,
2004; Зефиров, Петров, 2009; Dittman, Ryan, 2009).
Квантово-везикулярная теория
секреции медиатора в еинапее
В основе современных представлений о передаче возбуждения
в синапсе лежит квантово-везикулярная теория секреции медиа-
тора, согласно которой освобождение медиатора из нервных окон-
чаний (НО) происходит определенными порциями — квантами
(Castillo, Каш, 1955; Boyd, 1956). Основанием для формирования
этой теории послужил факт открытия миниатюрных потенциалов
концевой пластинки (МПКП) в нервно-мыгцечнътх синапсах лягуш-
ки (Fatt, Каш, 1950). В состоянии физиологического покоя наблюда-
ется спонтанная (асинхронная) секреция ацетилхолина из НО в виде
небольших порций, в результате чего на постсинаптической мемб-
ране регистрируются низкоамплитудные МПКП. Порция медиато-
ра, приводящая к генерации одного МПКП, и была названа квантом
медиатора. В ответ на электрический стимул также происходит ос-
вобождение медиатора в синаптическую щель, однако при этом ос-
вобождаетея множество квантов медиатора (синхронное освобож-
дение), и возникает потенциал концевой пластинки (ПКП), кото-
рый по амплитуде превосходит МПКП в десятки раз (Castillo, Каш,
1955; Katz, Miledi, 1965). Количество освобождаемых при раздраже-
нии квантов медиатора определяет величину постсинаптического
ответа и передачу возбуждения в синапсе. В межнейронагльных си-
напсах аналогами ПКП являются возбуждающие или тормозные по-
етсинаптические потенциалы (ВПСП и ТПСП), а аналогами МПКП
— миниатюрные ВПСП и миниатюрные ТПСП.
Обнаружение в цитоплазме НО синаптических везикул приве-
ло к возникновению представлений о том, что носителем кванта
медиатора является синаптическая везикула (Castillo, Кати, 1955).
Так родилась квантово-везикулярная теория секреции медиатора в
синапее, которая получила широкое признание во всем мире, и под-
тверждена многочисленными физиологическими и морфологичес-
кими исследованиями на всех видах химических синапсов.
24%
Как уже было сказано, в пресинаптических нервных оконча-
ния (НО) всех химических синапсов молекулы нейротрансмиттера
упакованы в мембранные пузырьки ~ еинаптичеекие везикулы, ко-
торые в изобилии представлены в этих регионах нервной клетки.
Предшественники синаптических везикул образуются в теле не-
рвной клетки из эндоплазматического ретикулума и цистерн аппа-
рата Гольджи. Затем они транспортируются быстрым аксональньтм
транспортом (моторными белками, кинезинами, по микротрубоч-
кам) к нервным терминалям (антероградный транспорт) (Folctti et
а1., 1999; Queralt, Goldstein, 2001).
Предшественники везикул имеют больший размер, отличаются
разнообразием формы и специфичной белковой композицией. Однако
после нескольких раундов экзо- и эндоцитоза непосредственно в НО
происходит настройка белкового интерфейса везикулы и формирова-
ние зрелого синаптичсского пузырька. Важную роль в этом играют
эндосомальные сортировочные станции, о которых будет сказано не-
сколько позднее (Mattcoli ct а1., 1992, 2004). В некоторых случаях «от-
работавшие» везикулы или везикулы, несущие нейротрофические сиг-
налы (или вирусы), а также поврежденные белки, могут направляться
по аксону обратно в тело нервной клетки (регроградный транспорт),
при этом в качестве перевозчика выступает белок - динеин (Qucralt,
Goldstcin, 2001).
Зрелые еинаптичеекие везикулы имеют однородные размеры (ди-
аметр 40-50нм) и содержат классические медиаторы (некоторые моно-
амины и аминокислоты), а также вспомогательные сигнальные моле-
кулы (ко-медиаторы), например АТФ (рис. 8 ц4). Каждая еинаптичее-
кая везикула составлена приблизительно из 10 000 молекул фосфоли-
пидов и 200 молекул белков, а по массе соотношение липиды - белки
составляет 50% на 50% (рис. 8 ц4) (Jahn, Sudhof, 1993). Белки везикул
можно разделить на два класса: белки-транспортеры, которые ведут
захват медиатора и других компонентов (ионов цинка, хлора, прото-
нов) B полость везикулы; и моторные транспортные белки, ответствен-
ные за перемещение везикулы внутри клетки. Синаптические везику-
лы содержат периферические мембранные белки (синапсины, рабфи-
лин), белки, которые прикреплены к мембране при помощи липидно-
го якоря (Rab3, CSP), И интегральные белки с одним (синаптотагмины,
синаптобревиттьт) или несколькими (синаптофизиньт 1 и 2, синаптоги-
СИНЗПТИЧССКИС везикулы
рины, $\/25, SVOP, SCAMPS) трансмембранными регионами (рис. 8
ц4). Почти все везикулярные белки или их подтипы также обнаруже-
ны и вне синапсов. Например, в не нейроналытьтх тканях синаптофи-
зин экспрессирустся в двух изоформах - пантофизин и митцутумин 29
(Takeshima et а1.‚ 1998). Однако для большинства из этих белков не
продемонстрирована не нейрональная функция. Многие протеины при-
сутствуют в двух или более изоформах в мембране везикул - синанто-
гирины, синаптотагмины, синаптобревины, $\/2, таЬЗ, синансины, и
SCAMP. Изоформы белков синаптических пузырьков (синатгтотагмины,
$\/2) дифферепциально экспрессируются в мозге с определенным пат-
терном, который не коррелирует не C ТИПОМ медиатора и не с извест-
ными функциями различных областей мозга. Так, семейство 5\/2 вклю-
чает три гликопротеина позвоночных животных (5\/2А, 5\/2В, $\/2С)
(Janz ct а1., 1998), имеющих 12 трансмембранных сегментов и распо-
лагатощихся исключительно на везикулах, которые подвергаются Са-
зависимому экзоцитозу. SV2A обнаруживаются повсеместно в моз-
те, $\/2В - преимущественно в ограниченных участках переднего
мозга, а 5\/2С концентрируются в каудальных регионах мозга. При-
чем SVZB форма сильнее экснрессируется в неонатальном мозге,
чем в ЦНС взрослого животного (Bajjaliech et а1.‚ 1994).
Эволюционное происхождение белков синаптической везикулы,
весьма, отлично. Так, показано, что некоторые везикулярные белки —
эволюционно высоко консервативны (синаптобревины, синаптотаг-
мины). Для других белков (синапсины, синаптофизины) только отда-
ленные гомологи найдены у беспозвоночных, а некоторые белки си-
наптических везикул (5\/2) вовсс отсутствуют у беспозвоночных.
Самый большой белок синаптических везикул (~1 млн Дальтон) ����
это протонный насос (помпа). Обычно на везикуле присутствует 1 -- 2
копии данного белка (рис. 9). Он составлен, по крайней мере, из 13
типов субъединиц и имеет размеры 14 х 14 х 24 нм_ занимая 10%
объема везиьуглы (Nishi, Forgac, 2002; Morel, 2003). Каталитический
цитоплазматический \/-1 домен (500кДа) помпы, включает 1 1 субъеди-
ниц (А-Н) из них шесть АТФ-связывающих субъединиц (ЗА + 3B) (рис.
9). Мембранный домен V0 (250 кДа) содержит 6 протеолипидньтх субъе-
диниц (5с + 10”) и по одной субъединице а и d (Nishi, Forgac, 2002).
Протсолипидътые частицы образуют гидрофобнос кольцо в мембране
везикулы, необходимое для транспорта протонов. Гидролиз АТФ про-
исходит в цитоплазме с помощью трех А-субъединиц V 1 , что вызывает
поворот протеолинидного кольца в мембране (также ротации подвер-
гаются D И Рсубьединицы \/1-домена) и транспорт протонов в вези-
Ё .
V 1 -домен
ЦИТОППЗЭМЭ
АТФ
АДФ
Н -пом па
УО-домен
Рис, 9. Ilpornoummi насос и (гезикд/лярньтй транспортер
ПЦЕГПЫЛЭСОЛЦН(1.
А — Н-помпа состоит из двух частей (Morel, 2003): мембранной -
\/О и 1тнтопггазма-гической - V! . V1 домен состоит из 8 разных субъеди-
ниц (от А до Н), АТФ-связьтватотцих субъединициц А и В содержится
по 3 копии. V0 — ДОМСН включает по одной а и d —субъединице и гекса-
мерное кольцо из протеолипидных с-субъеттиниц. АТФ гидролизуется
тремя А-субъедиттицами, это вызывает поворот кольца из с-субъеди-
ниц УО-домсна, а также D И F субъединиц V1 региона. Вращающиеся
субъединицы иногда обозначают ротором. Поворот ротора вызывает
транслокацию протонов, которые захватываются из цитоплазмы пери-
ферическим регионом гексамерного кольца. \/1-домен может диссо-
циировать от \/О. Б — Вторичная структура везикулярного транспорте-
ра ацетилхолина (ВТАХ), включающая 12 альфа-спиральных пронизы-
вающих мембрану доменов (Masson et а1., 1999). В — Схема «заправки»
везикул АХ. Сначала Н-помна накачивает протоны в полость везику-
лы, в итоге создается протонный градиент. Везикулярный транспортер
ацетилхолина обменивает два протона на одну молекулы АХ.
купу. Единственная копия насоса в течение миллисекунды устанавли-
вает электрохимический градиент ионов водорода на везикулярной мем-
бране (pH ВНуТрИ везикулы становиться 5.2-5.5), необходимый для зах-
вата медиатора (Fyksc, Fonnum, 1996). В холинергических синапсах
транспортер медиатора обменивает 2 иона H‘ на одну молекулу АХ
(рис. 9), в итоге в полости везикулы создается высокая концентрация
АХ (выше 5ООмМ в везикулах электрического органа Toredo). Причем
от количества молекул транспортера (обычно от 9 до 14 копий), прихо-
дящихся на везикулу, может зависеть содержание медиатора в везику-
ле (Sudhof, 2004), а экспрессия определенною транспортера- это глав—
ная детерминанта типа медиатора, который будет использоваться ней-
роном (Takamori ct а1., 2002, 2006).
Общие сведения о пулах
синаптических везикул
В НО различных химических синапсов содержится от ста до
нескольких сотен тысяч везикул. Небольшое количество везикул при-
креплено к пресинаптической мембране, а остальные разбросаны в
цитоплазме. Многочисленные электрофизиологические и флуорес-
центные исследования на различных синаптических образованиях
позволили выделить три пула синаптических везикул, различаю-
щихся по величине, локализации и физиологической роли (Cousin,
Robinson, 1999; Юной, Betz, 2005; Зефиров, 2007). Имеются различ-
ные обозначения этих пулов, однако наиболее часто применяют сле-
дующие названия: немедленно готовый к освобождению, мобили-
зационный и резервный (рис. 10).
Под готовым к освобождению пулом понимают везикулы,
которые немедленно используются при синаптической активности.
Они составляют лишь 1-2% от общего количества везикул, обычно
прикреплены к пресинаптической мембране и готовы к слиянию,
поэтому обладают слабой подвижностью в НО. Мобилизационный
пул составляет 5-20% всех везикул, которые обладают высокой мо-
бильностью и поэтому легко пополняют немедленно готовый к ос-
вобождению пул по мере его расходования. Резервный пул - это
совокупность везикул, которые освобождаются только при интен-
сивной и длительной стимуляции после истощения мобилизациош
ного пула (Richards ct 211., 2003). Пул составляет самую большую
В
О
Резервный пуп
О
Мобилизационный
пул
Немедленно готовый к
освобождению пуп
Рис. 10. Be3uKyJ1;1pHb1e пулы (Зефиров, 2007 с изменениями).
А- электрофизиологическое доказательство наличия трех различ-
ных везикулярных пулов. Динамика потенциалов концевой пластинки
(1 1КП) в нервно-мышечном синапсе лягушки при длительном высоко-
частотном, ритмическом раздражении (20 имп/с). Быстрый первона-
чальный спад амплитуды ПКП (1) отражает расходование небольшого
по величине пула везикул, стабилизация амплитуды (2) — мобилизацию
везикул из другого, несколько большего пула, а последующее медлен-
ное снижение (3)- расходование большою пула везикул. Б- схемати-
ческое изображение трех пулов, объясняющее электрофизиологичес-
кие данные на А. Стрелками показано восполнение пулов при актив-
ности синапса. В - современные представления о везикулярпых пулах в
НО. Везикулы различных пулов в значительной степени перемешаны.
часть везикул в НО (80-90%). Некоторые исследователи предпола-
гают, что в некоторых синапсах при физиологической активности
эти везикулы никогда не подвергаются экзоцитозу. Другие авторы
говорят о возможности совместного (параллельного) участия резер-
вного и мобилизационного пулов в секреции медиатора (Зефиров и
др, 2008; Реггоу е: а|‚, 2008). Подробная информация о свойствах
везикулярных пулов и путях их восполнения в различных синапти-
ческих образованиях представлена ниже.
Везикулярный цикл
Синаптические контакты работают в режиме проведения дос-
таточно длительных высокочастотных пачек импульсов, что долж-
но приводить к достаточно быстрому (особенно в малых по размеру
НО) уменьшению количества синаптических везикул и увеличению
поверхности НО за счет встраивания их мембран при экзоцитозе.
Однако в естественных условиях этого не происходит, поскольку
наряду с экзоцитозом в НО идут процессы эндоцитоза с образова-
нием новых везикул, их заполнения медиатором и транспортировки
в везикулярные пулы, где они впоследствии встают в очередь для
экзоцитоза (Murthy. De Camilli, 2003). Эти процессы получили на-
звание обратного хода синаптических везикул или рециклирова-
ния, а постоянный кругооборот везикул в НО называется везику-
лярным циклом (рис. 1 1). Рециклирование везикул включает мно-
жество ступеней, является одним из звеньев синаптической переда-
чи и ключом к пониманию основ синаптической пластичности.
Рис. 11. Пресинаптичес-
кий везикулярный цит (Зефи-
ров,20О7).
Везикулярный цикл вклю-
чает ЭКЗОШ/ГГОЗ (1 ), эндоцитоз (2),
иногда эндосомальную сорти-
ровку (3), внутриклеточный
транспорт везикул с включени-
ем в везикулярные пулы (4) и
последующую мобилизацию к
прееихтатттичсской мембране с
подготовкой к экзоцитозу (5).
Синаптические везикулы обра-
зуются в теле нервной клетки и
транспортируются в НО (а).
После определенного количе-
ства везикулярных нитов вези-
кула направляется в тело не-
рвной тетки для деградации (б).
30
При умеренной стимуляции (даже если она очень длительная)
освобождение медиатора обеспечивается в основном везикулами мо-
билизационного пула, без привлечения резервных везикул. Такая
способность связана с тем, что в ходе активности везикулы моби-
лизационного пула подвергаются постоянному рециклированию: пос-
ле экзоцитоза они быстро повторно образуются из поверхностной
мембраны и затем заново участвуют в секреции медиатора. На этом
основании мобилизационный пул (а иногда вместе с готовым к ос-
вобождением пулом) сейчас принято обозначать как рециклирую-
щий пул.
СТИМуЛЯЦИЯ ЭКЗО- И ЭНДОЦИТОЗЗ
СИНЗПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ
Для исследования процессов экзоцитоза синаптических вези-
кул необходимо его инициировать. В естественных условиях синх-
ронный экзоцитоз запускается деполяризацией НО и входом ионов
Са, поэтому в эксперименте наиболее часто применяется искусст-
венное раздражение нервных элементов, вызывающее появление
пресинаптических ПД. Для массивного синхронного экзоцитоза ве-
зикул необходимо применять высокочастотное, длительное раздра-
жение (рис. |0А, 12А). Для инициации спонтанного, асинхронно-
го экзоцитоза (рис. 12Б) можно применить искусственную деполя-
ризацию НО постоянным током или растворами с повышенной кон-
центрацией ионов К, при которой происходит открытие пресинап-
тических Са-каналов и вход ионов Са в цитоплазму. К увеличению
внутриклеточной концентрации ионов Са приводит и кофеин, ко-
торый освобождает кальций из внутриклеточных депо. Реже, для
стимуляции асинхронного экзоцитоза используют гипертонические
растворы (сахароза), некоторые токсины, ионы и др. воздействия
(Van dcr Kloot, Molgo, 1994).
Как мы уже говорили процессы экзо- и эндоцитоза тесно свя-
заны, эндоцитоз невозможен без предварительной стимуляции эк-
зоцитоза. Отсюда, все вышеперечисленные воздействия использу-
ются H для стимуляции эндоцитоза. При выяснении механизмов эн-
доцитоза и влияния на них определенных факторов или химичес-
ких агентов очень важно контролировать уровень зкзоцитоза. Де-
лать выводы об изменении эндоцитоза можно только в том случае,
А
г“ ГОО с:
В: ‚ N:
C 250-’ С
ш ‚ а:
т П?
.. ь
L3 L‘
С: С:
К) U
О .".
(E Ш
О О
F Ё
'2 “Z
2 @l7�
Б Норма
4’ vi.
UT
r “ .
p’;:fl‘:::';:§‘::»'A"; Постоянным ток (2 MA) Кофеин (2.5 MM) сахароза (mo MM)
. . _. р 1 .
Рт: I]. I//(771) 'lh')’()(»’(1IlIl(’ (u’Il_WI1[JllK.'IC’flI(I’IH().’(I ()I}l(>'L’()(’Illl}{ 0.151 ини-
."llI3(7 ')l\")’()lIlIN1()'](I ll }\'(?(1llNIO({(}l7 (,'(’K_[)C’I{llI( _\IC’()Il(‘lIH()‘1/‘(I Н НЁрН/НР.НЫЦ/(‘Ч-
lI0_1(('llli(II1(’(’(3C(1)Hp0BHjlp.2006. 2008 c ;10rI0.mcmm.\m).
А- ‚ннхамика квантового сос гнва ПКП (синхронная сскрсннъх мс-
днптора) в 1хсрпнго-чьннсчножт синнпсс кожгао-грулниной мъннны дя-
гушки (czrcna) и ‚'111а(])раг\1ь1 мыши (справа) нри нысокочастотълом gnu-
тельном p:1's;1p:1;Lcmm,'1rmr‘;1Tc:1bnoI'()ncpnu(2()nMn/c—3 .\1HH).”dBCT;lB-
ках свсрху нрсддсгиштсньл IIKI I, B разнос P.pC\I>1p11'i£lpLl}RCllSl$l.HOCKOJH.—
ку в окружающей cpc;1c:1:m блокирования I Ш и сокращений мьнннък
нахо‚‘нт:1сятубокурарин квинтовый состав рассчнгнн но ниснсрсни нм-
n:1my;u.1I'IKII. Б- TJIIKII (спонтанная, нсиъкхронння сскрснъжн мсдншго-
рн) и нервно-мыхнсчном синннсс Лягушки при нсйогпиъя гннсркалнс-
вого раствори. ‚гхсноцгярнзуюшсго ностоянгяого пока. кофеина. и c;1_\’;1—
розы. Видно рс ъкос унсднячстпис снонганной сскрснии при всех гвочдшй-
сгииях.
если чкчоккнтое нс изменен. Именно нштшту дня нрнжъгзнснного
исснсдшоъъания чндхонгггоза и всзикугпярнохо ннклн обычно одшонрс-
Mcnnoxmxo:n;:yc'1'cs:m:cr<o;n,x<o’>r<cI1cp1mcnm:u.m.1xno;1xo;10n(nanpn-
мср. '›:тск'гр‹›(1›изиоцн):‘нчсский ндш имнсромстрнчсскин для цнццнша
сскрснин мсдннггорн -~ 'n<'so1111'1m;1 и (рцлуорсснсъпгныи нцлн смкост-
ной дшя 21H:1.'IH's:1'>IlI1<)l1II'I‘0'%;1).
32
Методы оценки квантовой секреции
медиатора, экзоцитоза, эндоцитоза и
рециклирования синаптических везикул
Биохимические и радиоактивные методы. Во время экзоци-
тоза везикулы происходит выделение порции медиатора в синапти-
ческую щель, которая сообщается с окружающей средой. Для оцен-
ки количества нейромедиатора‚ выделенного группой клеток, ис-
следуемые клетки перфузируются физиологическими растворами,
содержащими стимулятор секреции. Омывающий препарат раствор
собирают и подвергают биохимическому анализу на хроматогра-
фических колонках, или если необходимо применяют электрохими-
ческие методики. Подобные технические подходы используют для
определения типа и количества освобожденного медиатора. В дру-
гих случаях инкубируют популяцию клеток с медиаторами или их
предшественниками, содержащими радиоактивную метку. Радио-
активные медиаторы захватываются клетками, после чего клетки
промываются в обычном физиологическом растворе и получается
радиоакгивно-ттомеченньхй препарат. Впоследствии можно стиму-
лировать выброс молекул радиоактивного медиатора, и, определяя
уровень радиоактивности в растворе и препарате, делать выводы
об освобождении медиатора. Такие методы имеют плохое времен-
ное разрешение и с их помощью невозможно различить источник
освобождения медиатора (из везикул или нет, из всех клеток равно-
мерно или нет) (Stevens, 2003).
Электрофизиологические методы. Для непрямого анализа эк-
зоцитоза в синаптических структурах часто используют разные ва-
рианты регистрации постсинаптических сигналов (потенциалов или
токов), возникающих в результате секреции квантов медиатора при
экзоцитозе везикул. Для этого используют электрофизиологичес-
кие методы внутриклеточного и внеклеточного отведения, метод
двухэлектродной фиксации мембранного потенциала, метод пэтч-
кламп в разных конфигурациях (3ефиров, Ситдикова, 2010).
Так, в нервно-мышечном синапсе при внутриклеточном мето-
де регистрации, очень тонкий (менее мкм) внутриклеточный мик-
роэлектрод (микропипетка), ввод-ится в мышечное волокно и регис-
трирует либо многоквантовые потенциалы в ответ на стимуляцию
двигательного нерва (ПКП), либо спонтанные, одноквантовые по-
стсинаптические потенциалы (МПКП). При этом регистрируется ак-
33
тивность всего синапса. Иногда применяют метод двухэттекгроттттогт
фиксации мембранного потенциала мышечного волокна, при кото-
ром регистрируются поегсинаптические токи (TKII и МТКП). Ин-
тенсивность вьтзваннои синхроннои секреции медиатора оценива-
ется путем расчета квантового состава ПКП (ТКП), который можно
определить либо путем деления амплитуды ПКП (ТКП) на сред-
нюю амплитуду М11К11 (МТКП), либо рассчитав дисперсию ампли-
туды ПКП (ТКП) в серии (Katz, Miledi, 1965, Зефиров и др. 2008)
(рис. 12А). Определив частоту МПКП (МТКП) можно оценить ин-
тенсивность спонтанной квантовой секреции медиатора во време-
ни (рис. 1213). При внеклеточном отведении микропипетка прижи-
мается к мышечному волокну в области нервной терминали, при
этом регистрируется активность небольшого участка синапса. Ана-
логичные методы используются для квантового анализа ностсинан-
тических сигналов в межнейрональньтх синапсах (ВПСП и ТПСП)
часто применяя метод внеклеточного отведения или пэтч-кламтт ре-
гистрации.
Амперометрия. Детекция событий экзоцитоза возможна C ис-
пользованием микрозлекгрода из углеродного волокна (рис. 13) -
альтернативная методика слежения за секрецией медиатора в от-
дельных клетках (Wightman et а1., 1991). B микроэлектроде устанав-
ливается потенциал около 700 мВ, который значительно выше, чем
требуется для окисления легко окисляемых нейромедиаторов, таких
как Дофамин, норадренашин, адреналин, серотонин и некоторых пеп-
тидов. Электрод располагается у поверхности секреторной клетки,
и в случаях экзоцитоза регистрирует электрохимические токи, ко-
торые возникают вследствие перемещения электронов в ходе окис-
ления секретируемого медиатора на поверхности электрода. Посколь-
ку экзоцитоз очень быстрый процесс, каждое событие экзоцитоза
приводит резкому Возрастанию тока, величина которого пропорци-
ональна количеству окисленного медиатора. Концентрация медиа-
тора в кванте может быть подсчитана исходя из общего заряда (Q,
интеграл тока по времени) перенесенного в течение экзоцитоза в
соответствие с законом Фарадея: Q/nF, где Рконстапта Фарадея, а п
- количество электронов необходимое для окисления 1 молекулы
медиатора (п=2 для катехоловых аминов) (Ciolkowski et а1., 1994).
Главное преимушеетво амперометрии — это высокое временное раз-
решеннеи чувствительность (15 х 10-21 моль). Например, освобож-
дение 9000 молекул дофамина (меньше чем размер кванта) Доста-
точно для детектирования е помощью этого метода. Однако следить
„С! = Q (КУПОН)
[медиатор]: Q /n.F
Рис. 13. Регистрация освобоэ/сдения катехоловььг ал/инов из
секреторных клеток с использовсижиел: карбонового микроэлектро-
да.
а - Окисление секретируемого медиатора происходит в ходе эк-
зоцитоза синаптических везикул. б —— Сверху представлена амперомет-
рическая запись при стимуляции выделение катехоловых аминов из
РС12 клеток раствором с высоким содержанием калия. Снизу — пик
тока, связанный с освобождением медиатора из одной везикулы. Ин-
теграл кривой тока указывает на заряд (Q), перенесенный в течение
события экзопитоза, с помощыо этой величины можно рассчитать
количество секретируемого медиатора.
за экзоцитозом посредством микроэлектрода из углеродного волок-
на можно только в некоторых клетках, расположив электрод в не-
посредственной близости OT сайтов освобождения медиатора. Кро-
мс того некоторые нейротрансмиггерьт (ацетилхолин, ГАМК, глута-
мат) таким путем не окисляются.
Измерение емкости мембран. Для исследования рециклиро-
вания синаптических везикул в крупных клеточных структурах и в
35
реальном времени может использоваться элеКтрофнзиологическая
методика, основывающаяся на измерении емкости мембраны с ис-
пользованием стеклянной мпкропипетки (конфигурация патч-кламтт
<<wholc—ccll>>) (Gersdorff, Mattcws, 1999; Jaroussc, Ке11у, 2001; Murthy,
De сатана, 2003; Rcnden, Gersdorff, 2007). Этот метод позволяет прямо
регистрировать процессы встраивания мембраны везикулы во вре-
мя экзоцитоза и восстановления мембраны клетки при зпдопитозе,
поскольку электрическая емкость поверхностной мембраны прямо
пропорциональна ее площади. Фосфолипидттьтй бислой клеточной
мембраны имеет емкость (См), которая определяется по формуле:
См = еА/о, е шдиэлектрическая кот-тстатгта, А- площадь мембраны, а
d — TOJII[1HHa. B ходе экзоцитоза везикулярпая мембрана встраивает-
ся в плазматическую, что ведет к увеличению площади мембраны и
возрастанию емкости. Затем происходит уменьшение поверхности
в следствие эндопитоза, что проявляется как уменьшение емкости
мембраны (рис. 14).
Рис. 14. Измерение мемб-
рамной емкости (Angclson, Betz,
1999; Augustine et а1.‚ 2006 с из-
менениями).
А — тучная клетка до (сле-
ва) п после (справа) стимуляции
массивного экзоцптоза. Видно
увеличение площади поверхно-
сти. Б —- Схематичпое изображе-
um: ua'ru—'):1e1<'1p0;1a.B — Измене-
ние емкости мембраны при элек-
трической стимуляции (20Гп — 15
с. начало раздражения отмечено
стрелкой) в нервном окончании
гигантского аксона кальмара.
Возрастание емкости отражает
ЦИНЦМНКУ ЭКЗОЦИТОЁЗЭ. а УМСНЬ-
[пение и возвращение к исходно-
му уровню - динамику эндоци-
тоза.
36‹
Хотя эта методика имеет высокое временное разрешение, она
не лишена значительных недостатков (Kushmeriek, Gcrsdorff, 2003).
B0-llCpBblX, при секреторной активности в клетке процессы экзо- и
эндоцитоза часто протекают практически одновременно, что дела-
ет невозможным их разделение (Gersdorff, Mattews, 1999). Во вто-
рых, многие не связанные c экзо- и эндоцитозом факторы могут
влиять на емкость мембраны, например, изменение пассивных элек-
трических свойств мембраны, Са-зависимые изменения емкости, во-
ротные токи трансмембранных протеинов. Более того, в клетках
сложной формы зависимость емкости от площади мембраны носит
нелинейный характер (Mennerick et а1., 1997). Поэтому этот метод
часто применяется совместно с другими методами, позволяющими
непосредственно следить за секрецией гормонов или медиаторов
(например, амперометрия). Наиболее часто метод измерения емкос-
ти мембран применяется, в таких объектах как тучные клетки (Toledo
eta1., -1993), хромаффинные клетки (Henkel et а1., 2000), биполярные
клетки золотой рыбки (llolt е’: а1., 2004), Calyx ofheld синапсах (Sun
et al., 2002; Wolfel, Schneggenburger, 2003).
Электронная микроскопия. Одним из методов позволяющих
наблюдать процессы рециклирования синаптических везикул явля-
ется электронная микроскопия. С использованием этого метода была
сформирована квантово-везикулярная теория освобождения медиа-
тора, произведена детальная реконструкция мест экзоцитоза и сек-
реции медиатора в НО (активных зон). Электронная микроскопия
позволила получить картины слияния и образования синаптичес-
ких везикул в НО (рис. 15) (Heuser, Reese, 1973).
Для идентификации вновь образованных посредством эндо-
цитоза везикул использовали специальные метки (трансферрин, кол-
лоидное золото, и др), которые захватывались везикулами и опре-
делялись в виде электронно-плотного материала (Farquhar, Palade,
1960; Cohn ct а1., 1966). Применялись энзимы (тирозиназа), присут-
ствие которых детектируется цитохимически (Steinman, Cohn, 1972),
а также флуоресцентные декстраньт (Walter et а1., 1980). Очень ин-
тенсивно применялась пероксидаза хрена, поскольку она определя-
лась как с помощью электронной микроскопии, так и биохимичес-
ки (Steinman et al., 1983). Впоследствии, клонирование белков си-
наптических везикул облегчило получение антител, направленных
против их наружных доменов, которые стали использоваться для
исследования процессов экзо- и эндоцитоза (Matteoliet а1., 1992).
Однако электронная микроскопия позволяет получать только стати-
Рис. 15. Процессы экзи- и эндицитоза синитпическилс везикул в
двнгательньдх нервных окончаниях лягушки (Heuser е: а1., 1979).
Электронные микрофогографии сколов пресинаптической мем-
браны (а) и поперечных срезов (б) нервно-мышечного синаиса. А-
покой. Видно строение участка отдельной активной зоны (АЗ), состоя-
щей из двух двойных рядов крупных внутримембранных частиц (а).
Синаптические везикулы, концентрирующиеся около A3 (6). Б- через
несколько мс после раздражения нерва. Наблюдаются многочислен-
ные углубления в области АЗ (а) и омега-подобные с'грук'1урьг(б)‚ от-
ражающие экзоцитоз. В - через несколько секунд после раздражения.
Видны многочисленные ямки (а) и 110крытые(клатрином) (б) везикулы
в стороне от АЗ, указывающие на зндоцитоз. При раздражении в окру-
жающий раствор добавлен 4- аминопиридин для резкого увеличения
квантовой секреции медиатора.
38 {
ческие картины везикулярных событий и не позволяет анализиро-
вать процессы рециклирования везикул в динамике на функциони-
рующих объектах.
Оптические методы с использованием флуоресцентных кра-
сителей и флуоресцентно- меченых белков.
В последнее время наметился серьезный прогресс в исследова-
ниях везикулярного цикла с использованием оптических методов.
Создание на базе классической флуоресцентной микроскопии, кон-
фокальной лазерной микроекопии, двух-фотонной микроскопии, и
совсем недавно эванеецентной волновой микроскопии дало нам сей-
час возможность проследить процессы экзо- эндоцитоза и транс-
порта даже отдельных везикул, локализовать и наблюдать в реаль-
ном времени за динамикой передвижения молекул, участвующих в
везикулярном Цикле.
Революцию в исследованиях эк3о— и эндоцитоза произвели сти-
риловые флуоресцентные красители (маркеры) способные метить
рециклирующие везикулы. Эти красители были применены в на-
ших исследованиях по изучению везикулярного цикла, которые пред-
ставлены в этой книге. Флуоресцентные красители, способны сво-
ими гидрофобными хвостами обратимо встраиваться в мембрану и
в ходе эндоцитоза оказываются внутри образующихся везикул (Betz
ct al., 1996).
Впервые флуоресцентный краситель был применен в исследо-
ваниях на нервно-мышечных препаратах 3Me1/1(Lichtman ct al., 1989),
однако он не захватывался другими НО. Позднее были синтезиро-
ваны стириловые флуоресцентные красители (рис. 16), хорошо «ра-
ботающие» во всех исследуемых объектах, лучшие из которых -
FM]-43, FM4-64 И FM2-10 (Betz, Bewick, 1992; Betz et al., 1996;
Richards ct al., 2000). Флуоресцентные FM красители — это амфи-
фильные молекулы, у которых линофильный электрон-донорный
хвост соединен е положительно заряженной электрон-акцепторной
группой пиридина через двойную связь или цепью двойных связей.
Для иследования процессов экзо-и эндоцитоза к красителям
нредъявляютя следующие свойствы. Краситель должен обратимо
связываться с мембраной, но не проникать через нее, краситель дол-
жен флуоресцировать только тогда, когда находится в мембране. Эти
свойства определяются строением молекулы красителя, которую
можно разделить на 3 части: гидрофобный хвост (растворяется в
мембране), головка (дикатионная) мешающая проникновению че-
рез мембрану, тело или ядро (включает ароматические кольца и двой-
А '“'\xBOCT „ гоповка
�'�� „ьх ядро д E/—
„с телик ——
B
Б 1 о 2 название ХВОСТ П
\“’\
FM1-84 Д“ ~ I
д ‚ ‚д, W и \ \ fl /,_-,
3 Ф 4 FM2-10 ���� -- 1
"’\
О FM4-64 д“ ‚М 3
Рис. 16. [’]C'I10.FIb3()(f(lllll(’ ([).'zy()pcc‘z¢cIznz/1ozx FM—Kpacumc.'1ez2
(Cousin, Robinson, 1999, Rizzoli 01:11., 2003, Rizzoli, Веки, 2004).
А — Структура FM 1-43. Б - типичный эксперимент с FM — красите-
лями. 1 - FM добавляется в раствор и попадает‘ в синаптическую щель.
2 — после экзопитоза при образовании новых везикул (эндопитоз) про-
исходит тахват‘ FM B везикулы (загрузка). 3 — FM убирается из окружа-
ющего раствора. 4 — при стимуляции экзоцитоза загруженные FM BC-
39
ЗИКУЛЫ СЛИВЗЛОГСЯ С МСМбрЗНОЙ И ВМЕСТЕ C MC;Z1H3.’I‘0pOM ОСВОбОЖДШОТ
FM (BblI‘py’5K'd), B - другие интересные РМ-краеители. Г ~— Слева изоб-
ражение в светлом поле культуры гранулярных клеток мозжечка. Тела
клеток покаталпы стрелками. Справа — тоже место после загрузки FM 1-
43. Флуоресценция F Ml-43 наблюдается в участках аксонов, me проте-
кают‘ процессы ‘зкчо-тт эндоцитозгъ. Д — Электронномикроскопическая
картина поперечного сечения цвигагельттотт нервной терминали ля-
гушки, загруженной FMI-43 (I0 сек - 30 1 п) и затем поцвергнугой про-
цедуре фотокопверситт. Содержащие FM 1-43 везикулы выглядят‘ чер-
ными. [Шкала - 500 нм.
40 ё”
ные связи, которые определяют спектральные свойства красителя)
(Betz ct а1., 1996).
Липофильный хвост обычно включает две алифатическтте уг-
леводородттые цепи. Были синтезированы и протестированы моле-
кулы с хвостами, содержащими от I до 18 углеродных атомов. Ока-
залось, что молекулы с короткими хвостами менее липофильны и
окрашивают мембраны менее ярко (РМ2-10, L=2), a C длинными
хвостами окрашивают поверхность мембраны ярко, но необратимо
(FM3—25, L=18), ОНИ полезны для изображения контуров нейронов.
Хвост FMl—43 включает 4 атома углерода, что обеспечивает яркий
сигнал и обратимое связывание с мембранами. Время диссоциации
FMl—43 OT мембраны от нескольких секунд 110 нескольких десятков
секунд.
Головка красителя важна в определении его проникающей спо-
собности через мембрану. Если, например, головка А- это малая ал-
кильная группа, то молекула красителя монокатиопная, и, соответ-
ственно, Плазматическая мембрана проницаема для красителя (это
используется для окрашивания митохондрий). Если «головная» груп-
па отрицательно заряжена, тогда молекула в целом нейтральна (та-
кие молекулы широко используются как сенсоры мембранного по-
тенциала). Дикатионные же молекулы, с дополнительными поло-
жительными зарядами — плохо проникают сквозь мембрану. Подоб-
ные молекулы также используются как сенсоры напряжения на мем-
бране, хотя флуоресцентный сигнал на изменение напряжения при
этом мал (для FMl—43: 3,3% на 100 мВ изменения мембранного по-
тенциала) (Smith, Betz, 1996). FM красители, в том числе и РМ1-43,
в воде флуоресцирует слабо. Однако яркость его флуоресценции
значительно увеличивается при растворении в мембране.
Спектр флуоресценции обусловлен «ядром», сформированным
двумя ароматическими кольцами, которые соединены одной или не-
сколькими двойными евязями. Краситель с большим числом 2-х свя-
зей («т») имеет более ‚цлинттьте 1 возбуждения и испускания. Ис-
пускание FM1—43 (m=l) наиболее яркое в желто-оранжевом спект-
ре, тогда как у FM4-64 (m=3) наиболее яркая флуоресценция в крас-
ном спектре. Красители с большим числом 2-х связей лучше ра-
створяются в липидах. Спектры дикатионных стириловых красите-
лей обнаруживают малую чувствительность к изменениям кислот-
ности в области от 5 до 9 (Bctz е: а1.. 1996). FM]--43 проявляет от-
личные спектральные свойства в мембранах разных типов клеток.
Например, в мышце лягушки: свечение красителя может быть зеле-
41
нь]м В МИСЛИНС, ЖСЛТО-ОРЗНЖСВЫМ В СИНЗПТИЧССКИХ ВСЗИКУЛНХ, И
оранжево-краеным в эндосомах1Цванновских клеток (Bclz, Bcwick,
1992). встраиваясь в мембрану, красители практически не изменя-
ют ее своиства.
Длительное облучение красителя светом, возбуждающим флу—
оресцеттттию, может приводить к фотовыцветаттию, хотя F.VI—1<pacn~
тели считаются фотостабильттьтмтт (Bctz, Вешек, 1992). Проблема
может быть решена путем уменьшения времени экспозиции на све-
ту, или применением «длинноволттового» красителя (FZ\/14-64).
Методика применения FM1—43 для исследования рециклиро—
вания синаптических везикул является простой в использовании и
не Дорогой (рис. 1613) (Ryan, 2001). FM1—43 обратимо связывается е
наружным листком плазматической мембраны. Затем производить-
ся стимуляция экзоцитоза, а при последующем эндоцитозе FM} -43
Попадает внутрь 110 (загружается в НО). Здесь FM 1-43 локштизу-
ется в эндоцитозпых структурах — везикулах, а также вакуолях и
цистернах, которые затем превращаются в синаптические везикулы
(Ryan ct а1., 1993; Henkel е: а1., 1996; Bctz, Bewick, 1992). Если FM1—
43 предварительно загружен в НО, то при стимуляции экзоцитоза
он высвобождается из еинаптическттх везикул (выгружается из НО)
(рис. 16). Умепыпение флуоресценции вследствие потери FMI-43
хорошо согласуется с освобождением медиатора (Betz, I-Icnkel, 1994;
Kuromi, Kidokoro, 1999).
Регионы нейронов, которые помечаются РМ-краситслями, стро—
го соответствуют иммунореактивньтм для везикулярных белков 06-
ластям (Betz ct а1., 1992; Ryan et а1., 1993). В пользу локализации
красителя внутри везикул свидетельствуют данные, полученные ме-
тодом фотоконвереии, комбинированного с электронной микроско-
пией (Hcnkel et а1., 1996). При этом РМ-краситель переводится в
электронпо-плотную форму, после чего препарат фиксируется и де-
лаются срезы, на которых видны везикулы, заполненные электрон-
ноплотным продуктом (рис. 16Д).
Для примера на рис. 17 гтредставлеттьт картины флуоресценции
двигательного НО ‚Чягушктт и мыши, загруженных FM1—43. Стиму-
ляпию экзопитоза и соответственно эндоцитоза везикул вызывали
гиперкалиевым раствором (ZOMM В течение 1 мин). Видны светя-
щиеся пятна, отражающие скопления везикул, захвативших краси—
тель в области АЗ. В исследовании Зефирова А.Л. и соавторов (2003)
были выделены различные варианты пятен от вытянутых. длинных
и птироких, до коротких. Узкие длинные пятна, по всей видимости,
42‹
представляют собой скопления везикул в области классической АЗ
двигательного НО лягушки, протяженностью 1-2 мкм, широкие
длинные пятна, являются перекрывающимися «облаками» синап-
тических везикул в области группы близко расположенных актив-
ных зон. Мелкие пятна могут представлять популяцию везикул в
30MlW 20 мкм
Рис. 1 7, Флуоресцентные инвертированные картины двигатель-
max нервных окончаний лягушки и мьиии, загруженных FM 1 -43 (36-
фиров и др. 2003 с изменениями).
А- НО кожно-грудинной мышцы. Видны 5 нервных терминалей,
сформированных одним моторным аксоном. Расположение после-
днего сегмента миелина дорисовано. Границы мышечного волокна
указаны пунктирными линиями. Б — НО диафрагмальной мыпщы
мьппи. Снизу представлены участки НО при большом увеличении.
Видны светящиеся пятна, образованные скоплениями еинаптичсскттх
везикул захвативших краситель.
области атипичных, коротких АЗ или фрагментированных АЗ, зани-
мающих только часть поперечного размера терминали и располо-
женных напротив одной постсинаптической складки. Такие актив-
ные зоны были показаны для интактного НО лягушки (Pawson et
al., 1998).
Наши исследования позволили обнаружить большую гетеро-
генность (неоднородность) процессов зкзо- и зндоцитоза в НО ля-
гушки. Были показаны выраженные колебания интенсивностей про-
цессов зкзо- и эпдопитоза (судя по яркости свечения и суммарной
площади светящихся пятен) на единицу длины терминали в различ-
›43
ных участках НО, а также проксимо-дистальньтй градиент ‘ЭТИХ па-
раметров тто ходу нервных терминалей. В проксимальных участках
нервных терминалей процессы экзо-и эндоцитоза протекают более
интенсивно, чем в дистальных (Зефиров и др. 2003).
Относительно недавно был разработан интересный генетичес-
Рис. 18. С инатпо-р11-(]я‚чуоритты — генетические сенсоры экзо-
эндоцитоза и освобождения нейролтедиатора (М iesenbock,
Kevrekjdis, 2005).
Справа - C иттапто-рН-флуорин - химсрный белок из рН-чувстви-
тельного СРР (рН-флуорина) пришитого к трансмсмбранному белку
VAMP-2/ C-HHaIlTO6pCBHHy. B покое белок локализуется внутри везикул
и при рН ~5.7 «выключен», поскольку его хромофорная группа «зату-
шена» протонами (не флуоресцируюшее состояние). При зкзоцитозе
внутренняя среда везикулы становится частью внеклеточной среды,
рН повышается до 7.4, и рН-флуорин «включается». После эндоцитоза
и закисления внутривезикулярной среды рН-флуорин снова «вьтклю-
чается» Слева - временной ход флуоресценции в нресинаптических
терминалях культуры нейронов гинпокамна в ответ на один ПД. Вид-
ны скачкообразные переходы верх (экзоцитоз) и вниз (эндоцитоз вези-
кулы). Экзоцитоз — увеличивает, а эндоцитоз снижает флуоресценцию.
Интересно, что после зкзоцитоза компоненты синаптических везику-
льт поглощаются эндоцитозом с задержкой, длительность которой ва-
вал ьирует.
кий подход для прижизненного исследования везикулярного цикла,
который базируется на применении синаптофлуорина (рис. 18)
производного GFP (Micscnbok ct al, 1998). GFP ЭТО зеленый флуо-
ресцирующий белок, который при облучение его синим или ближ-
ним ультрафиолетовым светом, излучает зеленый (Shimomura et a|.,
44 ���
1962). Этот белок состоит из 238 аминокислотных остатков
(Мг=281‹[)а)‚ и имеет высокий квантовый выход флуоресценции -
около 0,8 (Matz е: а1., 2002). Сегодня известно несколько десятков
белков, обладающих значительной степенью гомологии с GFP, их
объединяют в семейство ОРР-подобных белков (Wiedenmann ct 211.,
2000; Labas ct al., 2002). Удивительное свойство всех бРР-псэдобных
белков -- их очень высокая устойчивость к изменениям температу-
ры, кислотности среды, протеазам и разного po;1a;1e}1aTypupyro11mM
химическим агентам (Лабас и др. 2003).
Для исследования везикулярного цикла применяется модифи-
цированная форма GFP, которая на генетическом уровне присоеди-
няется к люменальной части везикулярного белка, такого как VAMP/
синаптобревина (vesic1c—associated membrane protein). Этот вариант
GFP обозначается как ecliptic pHluorin и отличается тем, что его
флуоресценция полностью тунлиться в протонированном состоянии,
рКа равна 7,1 (Sankaranarayanan ct 211., 2000). Поэтому, когда поме-
ченные синаптофлуоринами (5рН5) белки находятся в синаптнчес-
ких везикулах, внутри которых рН=5.5, флуоресценция не наблюда-
ется. После слияния везикулы с плазматической мембраной, синап-
тофлуорин подвергается воздействию более щелочного окружения
(протон отрывается от синаптофлуорина меньше чем за 1 милли-
сек), в итоге появляется связанный с экзоцитозом флуоресцентный
сигнал (рис. 18). При этом спад флуоресцентного сигнала в терми-
налях гинпокампа, экспрессируюших зрН, преимущественно отра-
жает динамику эндоцитоза везикул, поскольку этап повторного за-
кисления происходит намного быстрее. Этот метод, как и емкост-
ные измерения, не позволяет разделить кинетику экзоцитоза от эн-
доцитоза в течение периода стимуляции. Чтобы преодолеть это ог-
раничение, используется ингибитор протонной помпы бафиломи-
цин, который препятствует‘ повторному закислению содержимого
везикулы (Sankaranarayanan, Ryan, 2001). Таким образом, во время
вспышек ПД на фоне действия бафиломицина в образовавшихся
везикулах сохраняется «пойманная» щелочная среда, и флуоресцен-
тный сигнал будет отражать только количество подвергшихся экзо-
цитозу везикул независимо от скорости зндоцитоза. Затем проводят
количественное сравнение сигналов, вызванных ПД, в присутствии
и без бафиломицина.
В целом уникальная методика применения синатггофлуорина
имеет несколько недостатков, главные из которых: экспрессия си-
наптофлуорина на поверхности клетки, приводящая к высокому
45
ровню фоновой флуоресценции и сложности детектирования еди-
ничных событий экзо- и эндоцитоза; после экэоцитоза синаптофлу-
орин быстро диффундирует из синаптических бутонов в аксон, что
создает трудности анализа изменении интенсивности в заданной
области (Granscth et al., 2006). Для преодоления этих проблем был
создан новый «сенсор» экзо- и эпдоцитоза, получивший название
5урНу, который точнее локализовался в синаптических везикулах.
Он был сконструирован из того же pHluorin, по слитого со второй
внутривезикулярной спиралью синаптофизина (Zhu et al., 2004;
Granseth е: a1., 2006). Антитела к синаптофизипу являются лучши-
ми маркерами мембран синаптических везикул и почти не окраши-
вают поверхностные мембраны (Valtona et al., 2004).
46 ё
ГЛАВА П. АКТИВНАЯ ЗОНА И
ЭКЗОЦИТОЗ СИНАПТИЧЕСКИХ
ВЕЗИКУЛ
Специализированные участки экзоцитоза
синаптических везикул и освобождения
медиатора
После формирования квантово-везикулярной теории есте-
ственно возник вопрос о расположении мест экзоцитоза синап-
тических везикул. Детальные электронномикроскопические ис-
следования показали неравномерность распределения синапти-
ческих везикул в НО и их концентрирование в определенных
участках НО у пресинаптической мембраны (Drcycr, ct а1., 1973;
Jahromi ct а1., 1974). Такие скопления везикул показаны для си-
напсов различных отделов центральной и периферической не-
рвных систем почти для всех живых существ. На электронных
микрофотографиях видно, что синаптические везикулы концен-
трируются около электронноплотньтх образований пресинапти-
ческой мембраны, получивших название — «плотные проекции»,
«плотные тела» или «плотные полоски» состоящие из густо
переплетенных нитей, вмонтированных в мембрану НО, к кото-
рым прикрепляются синаптические везикулы (Jahromi, Atwood,
1974; Murhy, De Camilli, 2003). Было предположено, что плотные
тела, получившие название активных зон (АЗ), представляют
собой специализированные участки пресинаптической мембра-
нЫ, приспособленные для эффективного и многосторонне регу-
лируемого освобождения медиатора, посредством экзоцитоза си-
наптических везикул. Некоторые варианты структурной органи-
зации A3 в различных синапсах представлены на рис. 19. В за-
виеимости от размеров плотных тел АЗ можно разделить на две
группы: АЗ с проекциями, имеющими небольшую выпуклость в
сторону цитоплазмы (не более чем 100 нм) —- это нервно-мышеч-
ные синапсы позвоночных и синапсы ЦНС; A3 с вьшукльтми
плотными телами, включающие синапсы беспозвоночных с Т-
47
образной балкой и ‚тенточньте синапсы позвоночных. Несомнен-
но, что структурные особенности A3 обуславливанот‘ отличия в
кинетике и интенсивности выделения медиатора (Zhui, Bcllcn, 2004).
Ж
о
* RIBEYE
1;‘: CKBP1
'1 KlF3A
„о!
„ой о Piccolo
‘cg! o RIM1
до‘
т»;
‘д о Basson
\ о RIMZ
6 Munc13-1
т *1 о САЗТ1
���� 0'3 Са-канап
Рис. 19. Схе.иап2ическ‹)е предс/пандамне активных зон н различ-
ных синапсах (Zhai, Bcllcn, 2004; Dieck е: а1.‚ 2005 с изменениями).
А АЗ с плотной проекцией в "терминалы нервно-мьппечттого
еинаттеа речного рака. Б — сферическая плотная проекция в A3 сеп-
сорной волосковой клетки саккулуса лягушки. В -- A3 В моторном НО
ящерицы. Г A3 C T образной плотной проекцией (Т-балка) в двига-
тельном НО Drosophila. Д —— A3 ‘зона в впде длинной „ченто-под(›бной
проекции с ореолом синаптическттх везикул в электрорецетгторах exa-
Ta. E— A3 B возбуждающей термннали гнпттокатмтта человека. Ж -- Бел-
ки, составляющие A3 B ленточных синапсах фоторецепторов. На пре-
синатттпческой мембране белки RIM2, Munc13-l, CASY, Ca—KaHa;1hI об-
разуют дугообразный плотный комплекс, а в цитоплазме расположе-
на белковая «лента», которую формирует комплекс RIBIZYE-CtBP1—
KIF3/\ C прикрепленными к нему молекулами Piccolo И RIM 1. B роли
связутотцего звена между нугообразным комплексом и лентой вьтету-
пает Bassoon. Везикулы прикрепляются к синаптической ленте за счет
взаимодействия C Piccolo, RIM] , KIF3A, RIBEYE.
48€
Активная ЗОНЕ! ДВИГЦТСЗПЬНОГО
НСрВНОГО ОКОНЧЭНИЯ
Лягушка. Многие пионерские исследования АЗ проведены на
нервно-мышечном спнапсе лягушки. Сам термин активная зона «les
zones actives» был впервые предложен в 1970 Coulcaux И Ресош-
Dcchavassine для обозначения электрон}ю-плогных тлресигтатттичес-
ких полосок нервных терминалей амфибии. Ученые наблюдали по-
явление контуров открытых синаптических везикул в области при-
легающей к плотной полоске при фиксации нервно-мышечного пре-
парата лягушки в момент раздражения двигательного нерва (рис.
15). Такие омега - подобные проекции были интерпретированы как
свидетельства слияния везикул с пресинаптической мембраной (эк-
зоцитоза).
А Б перс-ямам
к чиагппнеектпг
вскипит
‚ ,_..
пресинагпичесхая
nnnocxa Мембрана 1-
синапгические\
везикулы
тцмпщь
ниц-гни
. �9�� игуймин ‚. „
\.‘
углублении
частицы
м‘ Наши-к:
[и капали
Рис. 20. Активные зоны двигательного нервного окончания
ляд/иски.
Слева - Трехмерная реконструкция участка пресинаптической
мембраны (метод замораживания - скалывания). Видно, что на цитоп-
лазматическом листке пресинаптической мембраны располагаются
плотные полоски, идущие поперек терминали, около них в два ряда
располагаются синаптические везикулы. Рядом с везикулами в мемб-
ране находятся крупные частицы — Са - каналы. В области АЗ наблюда-
ются углубления, отражающие процесс экзоцитоза синаптических ве-
зикул. Справа - молекулярная архитектура А? (электронномикроеко-
пическая томография) (Harlow ct а1.‚ 2001 с изменениями). Объяснения
СИНЗПТИЧЭСКЗЯ каркасные
спектри” О везикула белки АЗ R|BEyE
CIBP1
белки син псин BR рассеве
ЦИТОСКЭЛЭТЭ '\__j
актин /
нейро-
фипаменты
Рис. 26 145. Сцепление синаптической везикулы. Подробнее в тексте.
Б Rab3a
A ‚
везикула А \
ГТФ
§—-———-———--I ‘х Raboaa “дива
I
, 761533 B Unc18 / Munc18
LB Rab-3
х. а /' у \ K ‘к
ъ Ra
синтаксин 1a * ���� UnE18CMHTaKCMH Il\3/13\%'§sa'o-1
5;’: Г синаптотагмин
f._ MeM6paHa А \
CV|HanTOTarMV|H
cMHTaKcMHI: I
Puc. 27 ц5. Варианты докирования синаптической везикулы.
А. - Белки семейства п$ес 1/ Мипс18 могут Прочно связываться И «ка-
муфлировать» синтаксин 1а. Комплекс п$ес1-синтаксин1а служит сайтом
взаимодействия с прибывающей везикулой. Малая ГТФа3а Rab3a Ha повер-
хности везикулы связывается со своим эффекторньпи белком (КаЬ-Э), кото-
рый в свою очередь присоединяется к комплексу п$ес1-синтаксин 1а. Б -
КаЬЗа-ГТФаЗа способна напрямую присоединяться к комплексу ипс1 8 —
синтаксин. В - В докировании везикул могут участвовать белки Rab3a, Doc2
и MINT, последний соединяется одновременно с мембраной везикулы и
nSecl (Muncl8). Г - Докирование везикул может облегчаться за счет взаи-
модействия везикулярного белка синаптотагмина с протеином АЗ синтак-
сином.
шнаптобревин 115 А
а
NTS синтаксин 233 SNAP-25 206
H I Z I
TM
B 0‘ ° ‘
3‘ ° 2'.‘-.+
О I "I
I
‘ I . I
. Ч
О"О
Рис 28 цб. Роль SNARE—6e.7K0s в слиянии мембран (Ungerrnann,
Langosch, 2005).
А - Схематическое изображение доменов нейрональных SNARE-
белков. Количество остатков аминокислот показано сверху ТМ -транс-
мембранный домен, SNARE — SNARE МОТИВ. Б - Модель экзоцитоза
синаптических везикул. 1 - R- И Q-SNARE мотивы не соединены друг с
другом. R—SNARE ВХОДИТ в состав везикулярного белка синаптобреви-
на‚ а Q-SNARE мотивы присутствуют в белках АЗ синтаксине и SNAP-
25. П — происходит формирование ЗНАКЕ-комплекса за счет связь1ва-
ния R И Q SNARE МОТИВОВ. Ш - ЗНАКЕ-белки сильно перекручивают-
ся, сокращая расстояние между мембранами до минимума. В итоге
Цитоплазматические монослои соседних мембран сливаются, везику-
ла переходит в полу-слившееся нестабильное состояние (изображено
в квадратных скобках). Впоследствии происходит формирование поры
слияния (IV), которая может расширяться (V И VI). Возможно, везику-
лы ожидают своей судьбы, пребывая на стадии Ш или IV. B — Структур-
ная модель поры слияния. формируемой трансмембранными сегмен-
тами синтаксинов. Спиральные сегменты шести молекул синтаксинов
окружают пору слияния (Jackson, 2008). Для эффективного слияния
везикулы необходимо формирование как минимум шести SNARE-1<oM-
плексов, которые формируют «воротник» вокруг участка будущей
поры. В естественных условиях реакцию слияния могут вести более
десятка ЗНАКЕ-комплексов.
Munc18
N‘ 1 П I '- 3 '—' 2 —C
Munc13
N!-———5L-.'—--:-——c
cu ca юн nun с:
I U‘ Ь
L~‘D0|'||°N Крепом
ЧМППЕ СИМ
С
ЁЁЧЁЧЁШЁЦЁЁТЁПЁ
"DEX! ‘б
не С
в ник эта-знак:
oocz
N——-j-—'--c
‘до СЭА (Ж
Б
е" о
синаптобреви; 6‘ H‘:
9'; G ж
‘G Плюс“!
с кг н-‘еп гин "‘\
I J‘ ‘ J
cuuanroraruuu-1. _ . _ Митя 3
‘ 8МАР-25
. ‚ , \. ,.
ротового“
euutucm
Puc. 29 ц7. Основные компоненты прайминга синаптических вези-
куп.
А — Домены белков прйминга. Мипс 1 8 состоит из 4-х доменов, фор-
мирующих подковообразную структуру, связывающуюся с синтаксином 1.
Мипс13 включает два региона: R — взаимодействует с синтаксином, и L
(отличается между изоформами) - с RIM и кальмодулином. Комплексин
состоит из N И С-терминальнь1х последовательностей, дополнительной и
центральной альфа-спиралей. Томозин имеет С-концевой домен, содержа-
щий R—SNARE, М-терминальный регион с WD—4O повторами и гипервариа-
бельный (HVR) линкерный участок. DOC2: со стороны М-конца располага-
ется Мипс13-1взаимодействующий домен (MID), a Ha С-конце тандем из Са
связывающих доменов - С2В и С2А. Б - состояние прайминга. Мипс18 (ро-
зовый эллипс), Мипс 1 3 (эллипс вишневого цвета), комплексин (розовая спи-
раль), синаптотагмин 1 (синий эллипс). Нам-домен синтаксина показан со-
едниненным пунктирной кривой (связующая последовательность) со SNARE
спиралью синтаксина, обозначенной желтым цветом. SNAP-25 — зеленый,
синаптобревин - красный.
Ц8
А м
НаЬс-домвм
ч" Г синтаксина Митю - _ 27
. ‘ CMMTBKCMH
ъ J (aaxpumn)
СИМТНКСИМ (ОТКрЬПЫЙ)
r‘-1"
д 1.5’. .
I I в ` ���� " 1
SNAP-25
синатобравиъс
Б
‘К _
Ч к I
а 6 B
SN:E_25. Св - .
к мины 3 �ً� пинтвпто-
.` с“ RIM Г гагмин У `
I З «
K, „ „ („а
а ч *
Puc. 30 148. Роль Мипс18-1 в функционировании SNARE—K0Mm7eKca
(Rjzo, Rozenmund, 2008).
А - Слева - структуры SNARE комплекса и НаЬс-домена синтаксина
1, который соединен со ЗНАКЕ-мотивом с помощью связывающей после-
довательности. Справа - бинарный комплекс между Munc18—l и синтакси-
ном-1 в закрытой конформации. Б - Частично собранный SNARE-1<oMrI-
лекс (a) И его способность индуцировать слияние мембран при полной
сборке (б) или оставаться полностью собранньпи между двумя мембрана-
ми (в), в случае если связь между ЗНАКЕ-мотивами и трансмембранны-
ми регионами гибкая. В - Синтаксин-1 пребывает в закрытой конформа-
ции, которая стабилизируется Мипс 1 8-1 (а). Затем Munc18-1 вытесняется
белком Мипс13-1 (при участии RIM), B результате синаксин 1 переходит в
открытую конформацию и начинает вовлекаться в формирование SNARE-
комплекса. С частично собранным ЗНАКЕ-комплексом (б) повторно вза-
имодействует Munc18-1, способствуя переходу SNARE-1<oMHJ1e1<ca В пол-
ностью собранное состояние. При этом противолежащие мембраны стя-
гиваются, и в ответ на вход ионов Са и активацию синаптотагмина проис-
ходит слияние мембран (в).
$49
Позже при использовании метода замораживания-скалывания
в области плотной полоски были обнаружены скопления крупных
внутримембранных частиц, около которых наблюдаются углубления,
являющиеся «отголосками» экзонитоза (рис. 15 и 20) (Dreyer ct al.,
1973). Позднее эти частицы были идентифицированы как потенци-
ал-зависимые Са-каналы и Са-активируемые К-канальл (Pumplin
et а1.‚ 1981; Roberts ct а1.‚ 1990; Robitaille et а1.‚ 1993; Evans, Zamponi,
2006). Трехмерная реконструкция показала, что АЗ двигательного
НО лягушки состоит из плотной полоски (длинной 1-3 мкм и ши-
риной 0,1 мкм), идущей поперек нервной терминали, около кото-
рой в два двойных ряда расположены Са- и Са-активируемые К-
каналы канальт и в два одиночных ряда 40-50 везикул (рис. 20).
Расстояние между активными зонами составляет 1-2 мкм.
Применение воздействий, усиливающих экзоцитоз (яд паука
Черной Вдовы в начальной фазе действия, гиперкалиевые раство-
ры, длительная ритмическая стимуляция) приводили к резкому уве-
личению числа везикул слитых C мембраной в области АЗ. При этом
максимальное количество углублений обнаруживалось на расстоя-
нии 90 нм от Центра АЗ вдоль НО, в то время как между АЗ наблю-
дались только единичные углубления.
В блестящем электронномикроскопическом исследовании
Harlow И коллег (Harlow ct а1.‚ 2001) получено первое трехмерное
изображение A3 НСрВНО-МЫШСЧНОГО соединения лягушки (рис. 20).
Были показаны решетко-нодобные структуры из «перекладин»
(beams), проходящих вдоль [плотной полоски, и «ребер» (ribs), КОТО-
рь1е простираются от перекладин и соединяются с синаптическими
везикулами около поверхности раздела везикула -плазматическая
мембрана. Ребра с помощью 1-2 крючков (pegs) связывают внутри-
мембранные макромолекулы, напоминающие Са- каналы. Типич-
ная A3 соответствует сооружению из примерно 17 перекладин и
120 ребер (Zhai, Bcllcn, 2004). Предполагается, что белки SNARE-
комплекса (см. ниже) образуют ребра и перекладины.
То, что секреция квантов медиатора осуществляется именно в
области A3 было доказано нами Электрофизиологически, в экспери-
ментах на нервно-мышечных синапсах лягушки с использованием трех-
микрозлектродного метода впешеточной регистрации постсинапти-
ческих сигналов (Бениш и up, 1988; Zefirov е! а1.‚ 1995). Измеряя амп-
литуду одноквантового спонтанного или вызванного сигнала с исполь-
зованием этого метода, можно определить координаты места его воз-
никновения (точку освобождения кванта медиатора). Па основе ана-
50
лиза больнюго количества сигналов былн построены пространствен-
ные картины расположения точек освобождения в участке терминали.
Оказалось, что секреция медиатора происходит в определенных диск-
ретных участках НО, которые по своей конфигурации и размерам иден-
тичны A3 (рис. 21). Эти данные свидетельствуют о том, что экзоцитоз
синаптических везикул происходит по всей длине активной зоны Элек-
‘трофттзиолотически было показано, что величина запаса готового к
освобождению медиатора в АЗ составляет 40-60 квантов, мобилизаци-
онпото запаса - 200 квантов, что соответствует ультраструкгурттьтм дан-
ным по распределению пулов синаптических везикул в области АЗ
(3ефиров, I984).
0.5 мкм
Рис. 2/ . Топосрифия секреции ‚недиа/п0_1)и в днигсппель/1‹1й не-
рвной n1ep.11zma.m.m;32zu/<11 (Zcfirov ct 211., I995 с изменениями).
А- Три внеклеточных микроэлектрода pac1I0;1ara1oTCHna pacem-
янии несколько мкм друг от друга в виде треугольника около нервной
терминали и одновременно регистрируют МТКП или однокваптовьтс
ТКП от участка концевой пластинки. Специальный математический
аппарат по затуханию сигнала, одновременно регистрируемого тремя
электродами, позволяет онредегнтгь место освобождения кванта меди-
атора. Б - распределение точек освобождения медиатора в участке НО.
Видны две группы точек, соответствующие секреции медиатора в двух
A3.
B отдельной АЗ двигательного НО лягушки обычно находятся
несколько десятков готовых к экзоцитотзу везикул (Schikorski, Stevens,
1997). Можно было ожидать, что в ответ на нервный импульс в A3
будет освобождаться несколько квантов медиатора одновременно.
я 5 51
Однако в естественных условиях этого не происходит ��O� освобожде-
ние медиатора в A3 либо вообще не происходит, либо ограничива-
ется только одним квантом (Зефиров, 1982; Stevens, 2003). Это преж-
де всего определяется очень низкой вероятностью открытия Са- ка-
налов в ответ на пресинаптический ПД (по всей видимости на один
ПД открывается только один канал в АЗ) и как следствие очень
низкой вероятностью экзоцитоза везикул (Bennett, 1996). Кроме того,
ограничение освобождения медиатора в АЗ одним квантом может
быть связано с освобождением из везикулы вместе с медиатором
специальных веществ - ко-трансмиттеров, угнетающих экзоцитоз.
Возможно, что встраивание в пресинаптическую мембрану при эк-
зоцитозе фрагмента мембраны синаптической везикулы может от-
рицательно сказываться на функционировании соседних везикул.
Шванповская клетка также способна подтормаживать работу секре-
торного аппарата при активации НО. Такие уникальные характери-
стики синаптического экзоцитоза как его низкая вероятность и сек-
реция единственного кванта медиатора в АЗ — позволяют экономно
расходовать запас синаптических везикул и обеспечивают надеж-
ную синаптическую передачу на протяжении длительного времени.
Вероятность освобождения кванта медиатора в отдельной A3 MO-
жет многократно увеличиваться при определенных условиях и под
действием внутриклеточных сигнальных механизмов. Это создает
широкие возможности для регуляции силы синапса и развития раз-
личных форм пресинаптической пластичности (облегчение при пар-
ной и высокочастотной стимуляции, посттетаническая и долговре-
менная потенциация).
Мышь и крыса. Активные зоны в двигательных НО крыс и
мышей иные. Отчасти это связано с особенностями структуры не-
рвно-мышечното синапса теплокровных, который образован 3-4 не-
рвными терминалями, содержащими по 3-5 расширений овальной
формы (синаптических бутонов). В каждом бутоне (площадь — 5-10
мкм2) насчитывается от 10 до 20 A3 (в которых докированы 0.3%
всех везикул НО). Напротив каждой АЗ в мышечном волокне фор-
мируются 5-7 глубоких постсинаптических складок. Одна АЗ содер-
жит примерно 10 Са-каналов и только 1-2 прикрепленные везикулы
(рис. 22), что в 20- 30 раз меньше, чем в АЗ лягушки (Nagwaney, ct
a1., 2009). Столь существенное уменьшение везикул в АЗ стало воз-
можно благодаря увеличению складчатости постсинаптичес кой мем-
браны и входного сопротивления мембраны мышечного волокна, что
усиливает эффект кванта медиатора на генерацию постсинаптическо-
52
го сигнгша. В ответ на один ПД из одного синаптического бутона осво-
бождается 1-2 кванта, то есть только каждый десятый ПД будет вызы-
вать экзоцитоз везикулы в одной АЗ (Slater, 2008).
Рис. 22. Структура и рас/тредааенне А 3 в двигательном нервном
окончаниимьтши (Slater, 2008, Nagwaney, et a!., 2009, с изменениями).
А - двигательный аксон иннервируя мышечное волокно, развет-
вляется на несколько терминалей, по ходу которых имеются расшире-
ния (бутоны). Б - на территории одного бутона располагаются от 10 до
20 АЗ. В — в каждой АЗ докированы одна две везикулы. В ответ на один
ПД из отдельного бутона освобождается 1-2 кванта медиатора.
Активные зоны в синапсах ЦНС
Первые детальные данные об устройстве АЗ синапсов ЦНС
млекопитающих были получены Phillips и коллегами (2001). Им уда-
лось выделить пресинаптическую «упорядоченную сеть», состоя-
щую из частиц в форме пирамид (~50HM), соединенных между со-
бой фибриллами длинной от ~ 50 до 100 нм. При этом 50-100 нм
пазы сети формируют сайты для слияния синаптических везикул
(рис. 23). Проекции в форме пирамиды предположительно служат
для прикрепления везикул в районе АЗ, но они не требуются для
собственно процесса Са-регулируемого освобождения нейромедиа-
тора (Тоопеп ct а1.‚ 2006; Becherer, Кета, 2006). Вероятно, это необ-
ходимо для поддержания освобождения нейромедиатора при высо-
ком уровне синаптической активности (Семченко и др. 2008).
пирамиды
эбьгдчивнкые
Рис. 23. Активная зона в синапсш‘ центральной нервной систе-
мы .w.'1eK()I11ImaI0u;z1x (ЕРШ, Bcllcn, 2004).
Электронные микрофотографии пресипаптической части гипо-
кампального сипапса крысы, вид сбоку (А) и вид сверху (Б). В -- схема
устройства АЗ.
АКТИВНЫС ЗОНЬП С ВЫПуКЛЫМИ
ПрОСКЦИЯМИ
В некоторых синапсах АЗ имеют очень выпуклые в сторону
цитоплазмы электронно-плотные проекции. Они были впервые опи-
саны в синапсах позвоночных, вовлеченных в процессы зрения, слу-
ха, равновесия, где были названы синаптическими «лентами»
(Lagnado, 2003). Обычно такие ленте-подобные или сферические
структуры, простираются вглубь цитоплазмы на 0,5-1 мкм и имеют
ореол из привязанных к их поверхности синаптических везикул
(Lenzi, Gcrsdorff, 2001). Впоследствии схожие структуры были най-
дены в различных типах синапсов, не относящихся к сенсорной си-
стеме: в нервно-мышечных синапсах Drosophila (Т-образньте), рако-
образных (в виде Цилиндров), некоторых позвоночных животных
(ящериц) и т.д. (рис. 19).
В настоящее время предполагают, что от размера и формы про-
екции зависит количество везикул, способных прикрепиться к АЗ.
Например с сипаптической лентой в сенсорной волосковой клетке
мешочка лягушки, имеющей форму сферы ~O,5Mm B диаметре, в
среднем связаны 400 везикул. тогда как непосредственно к нреси-
наптической мембране прикреплены 124 везикулы. Причем везику-
лы, привязанные к ленте, могут освобождаться при сильной стиму-
ляции. Увеличение проекции приводит к возрастанию числа вези-
кул, способных быстро откликнуться на стимуляцию, без изтиене-
54
ния размера АЗ (количества сайтов слияния). Эта черта особенно
важна в сенсорных синапсах, поскольку поддержание освобожде-
ния медиатора при длительной активности требует огромного чис-
ла готовых к экзоцитозу везикул при ограниченном внутри терми-
нальном пространстве. Интересно, что внутри одной двигательной
нервной терминали Drosoplzila и ракообразных присутствуют АЗ с
выпуклыми Т-образными балками и без таковых. При этом в терми-
налях с высоким уровнем секреции медиатора имеется в три раза
больше Т-образных проекций, чем в терминалях с низким, хотя и те
и другие образованы одним и тем же аксоном мотопейрона (Govind
et а1., 2001).
Следовательно, наличие выпуклых проекций является следстви-
ем необходимости длительного и интенсивного функционирования.
В нервно-мышечных синапсах позвоночных и синапсах мозга, где
активность носит периодический характер, а нервные терминали
имеют относительно большие размеры, плотные тела располагают-
ся у пресинаптической мембраны, а прикрепленных к ним везикул
вполне достаточно для обеспечения необходимого уровня секреции
медиатора.
Колокализация синаптических
везикул, белков экзоцитоза и Са-
каналов в активной зоне
Пресинаптическая мембрана АЗ имеет двое «ворот» важных
для секреции медиатора: одни для входа ионов Са - потенциал-зави-
симые Са- каналы, а другие -- для выхода нейромедиатора — участок
слияния синаптической везикулы. Эти «ворота» располагаются по-
близости друг от друга, о чем свидетельствуют следующие факты
(Zhai, Bcllcn, 2004). B0-fl8pBbIX, задержка между входом ионов Са и
экзоцитозом только 0,2 мс (Stanley, 1997). Во- вторых, теоретичес-
кий анализ диффузии Caz’ И секреции кванта показал уменьшение
втрое вероятности секреции с удвоением дистанции между Са- ка-
налом и везикулой от 25 до 50 нм (Bennett et а1., 2000), причем в
большинстве синапсов это расстояние вероятно меньше 50 нм
(Ahmari ct а1., 2000). В- третьих, иммуногистохимические и элект-
ронномикроскопические исследования показали локализацию Са-
каналов около везикул A3 (Hcuscr ct а1., 1974; Haydon ct а1., 1994).
Одна из возможностей, объясняющих механизм такого тесного сцеп-
$55
ления сайтов слияния и Са каналов, заключается в наличие прямого
взаимодействия белков машины слияния (синтаксина и SNAP—25,
см. ниже), локализованных в пресинаптической мембране, с Са-ка-
налами (Jarvis et 31., 2002). Кроме того синтаксин, SNAP—25, и Са-
каналы могут входить в состав стабильных микродоменов мембра-
ны, обогащенных холестерином, так называемых липидных плоти-
ков (Lang е: а1., 2001). Подобного рода взаимодействия между белка-
ми и липидами способны концентрировать Са- каналы и белки эк-
зоцитоза в определенном участке мембраны в области АЗ. У
Drosop/11'/a специальный белок (fuselcss), 8 раз пронизывающий пре-
синаптическую мембрану, отвечает за локализацию Са- каналов в
АЗ, а его мутация приводит к угнетению вызванного кальцием эк-
зоцитоза (Long ct а1., 2008).
Тесная связь везикулы, Са-канала/каналов и белков машины
слияния позволила сформировать секретосомную гипотезу, соглас-
но которой этот конгломерат составляст минимально необходимый
модуль, обеспечивающий секрецию медиатора и функционирующий
как единое целое — секретосому. Секретосома —— это потенциальное
место экзоцитоза везикулы и освобождения кванта медиатора, а со-
вокупность секретосом образует активную зону (Bennett, 1996; 3e-
фиров, Черанов, 2000).
Основные белки активной зоны
Белки, идентифицированные в АЗ, по функциям разделяют на
три группы (Zhai, Bcllen, 2004; Schoch, Gundelfingcr, 2006). Первая,
представлена классическими белками цитоскелета (актин, тубу-
лин, миозин, ос- и В-спектрип, В-катенин), формирующими опор-
ные элементы и жесткий «сетке-подобный скелет» АЗ (Phillips ct а1.,
2001). Вторая группа, известна как каркасные белки (SAP90/PSD95/
Dlg, SAP97 и CASK/L1N—2). Они соединяют ионные каналы и ком-
поненты машины слияния в единый полипротеиновый комплекс,
гарантируя присущую A3 функцию. Например, CASK (CaZ"/
ca1modu1in—associated scrine/threonine kinase) взаимодействует с в-ней-
рексином, синдеканом 2, Са-каналами, цитозольным белком Vc1i/
LIN—7, И Мппс18/п-3ес1взаимодействующим белком Mintl (рис. 3
Ц1). Распределение этих белков не ограничено исключительно АЗ,
они участвуют и в кластеризации постсинаптических рецепторов, а
также в организации различных клеточных контактов. Третья груп-
56
па. включает специфичные белки АЗ: RIM 1, Munc 1 3/unc l 3, Bassoon
((bam'r), Piccolo (малая (b:1ei”i'ra)/Aczonin,CAST/ERCs,ot—Jmnpnu. Муль-
тидомснная структура ‘утих белков позволяет им связываться со мно-
гими синаттгическимгт белками (Rab3, cm1anToTaI‘MnH, SNAP—25, каль-
циевые каналы, синтаксин, DOC2, липрин, снектрин, нрофилин,
кальмодуллин) и участвовать в регуляции докирования, праймиро-
вання и слияния везикул, а также в инициации сборки АЗ. Эти бел-
ки связываются друг с другом, образуя макромолекулярньтй комп-
лекс. На роль строителя цнтоматрикса A3 претендует CAST
(cytomatix at active zone — associated structural protein), который может
одновременно связываться c Bassoon (или Piccolo) И комплексом
RIM1—Muncl3—1. МИКрОИНЪСКЦИИ пептидов, нарушающих взаимо-
действия RIM1 ИЛИ Bassoon с CAST, угнетают освобождение меди-
атора из НО культуры нейронов шейного ганглия крысы (Такао-
Rikitsu et al,, 2004). Другим образующим цитоматрикс A3 белком
является Munc l 3, его димеры способны соединяться с RIM, Bassoon,
CAST, Piccolo (Wang ct al., 2009). Немного известно об ос-липрине,
который взаимодействует с RIM-l И CAST, Mintl в АЗ. Установле-
но. что он необходим для поддержания нормальной структуры АЗ у
беспозвоночных. Мутации липрина плодовой мушки драматично
уменьшают размер и ветвистость нервно-мышечных синапсов
(Stryker, Johnson, 2007).
Активные зоны разных синапсов имеют отличный набор бел-
ков цитоматрикеа, кроме того в разных типах синаптических коп-
тактов отдельные специфические белки АЗ могут использоваться
для разных нужд. Так, уже упомянутый белок CAST (точнее, его
форма ЕЬК52ос) способствует уменьшению размера готового к ос-
вобождению пула везикул избирательно в тормозных синапсах мьппи,
тогда как гомогюгичный ему белок у Drosophila — BRP, наоборот,
способствует вовлечению синаптических везикул в секрецию меди-
атора в нервно-мышечных синапсах (Kaeser е: а1., 2009). В целом
же, вероятность освобождения медиатора из активной зоны в ответ на
потенциал действия положительно коррелирует с размером цитомат-
рикса A3.
B последнее время мы много узнали о белковой композиции
A3 с выпуклыми проекциями (рис. I9, Ж). Многочисленные иссле-
дования продемонстрировали участие выпуклых проекций в при-
креплении сииаптических везикул. В сенсорных синапсах позво-
ночных my функцию может выполнять компонент синацгических
лснт моторный белок KIF3A (Muresan е: al., 1999). B исследованиях,
агат”
Հ� „в 57
проведенных с нокаутами мышей и С. Eleguns no гспу, кодирующе-
My синтез белка RlMl (Schoch ct а1., 2002), который широко эксп-
рессируется в НО показано, что он необходим Для прикрепления
везикул к проекциям, но не требуется для собственно процесса Caz’
_ регулируемого освобождения нейромедхтатора. Другим предетави—
телем вьшуклых плотных проекций является белок BRP («bruchpilot»),
при его мутациях у Drosophila нарушаются процессы образования
Т-образных балок и наблюдается дефект кластеризации Са-каналов
(Fouquct ct а1., 2009). Специфическим компонентом АЗ лентовид-
ных синапсов сетчатки и сенсорных волосковых клеток позвоноч-
ных является белок RIBEYE, который составляет более половины
материала данных АЗ и полимеризуется в сферическую структуру,
способную взаимодействовать с белками A3 (Bassoon, Piccolo, RIM,
KIF3A, CIBPI ) И с многочисленными везикулами (Zanazzi, Matthews,
2009). Гомологом ШВЁУЕ зкспрессируютцимся синапсах повсеме-
стно служит протеин CtBPl/BARS.
B синаптических лентах сетчатки млекопитающих был обна-
ружен белок Bassoon с молекулярной массой 420 кДа (Brandstattcr ct
al., I999). Недостаток этого белка у мутантных мышей приводил к
уменьшению количества лент, а существующие ленты свободно пла-
вали в цитоплазме c прикрепленными синаптическими везикула-
ми. Причем нейропередача нарушалась только в случае стимуляции
фоторецепторов светом высокой интенсивности. Это свидетельству-
ет o способности везикул к экзоцитозу без участия лент. Возможно,
Bassoon служит филаментом, прикрепляющим полимер RIBEYE, B33-
имодействующий с синаптическими везикулами, к A3 (Dicck ct а1..
2005). Basson первым накапливается в будущих сайтах экзоцитоза,
при его дефиците в гиппокампе мышей происходит увеличение ко-
личества «спящих» (неактивных) синапсов, а в активных зона мши-
стых волокон нарушаются процессы посттетанической потенциа-
Linn. Схожую с bassoon структуру имеет белок piccolo, который уча-
ствует вместе c bassoon B формировании активной зоны и вовлечен
в прикрепление везикул к синаптическим лентам. Однако в возбуж-
дающих синапсах гиппокампа piccolo (B отличие от bassoon) ЯВЛЯСТ-
ся негативным регулятором освобождения медиатора, поскольку зат-
рудняет мобилизацию везикул резервного пула в активную зону.
При нарушении piccolo B НО гиппокампа наблюдается дисперсия
белка синапсина la, отвечающего за удерживание везикул в составе
резервного пула, и усиление доставки везикул в A3 (Lcal—Or1i7. ct al..
2008).
58
Детально, некоторые белки A3, I/IMCI()II.1I/IC наиболее важное зна-
чение в экзоцитозе синаптиттеских везикул и секреции медиатора
рассмотрены ниже.
Сборка активной зоны
Сборка A3 запускается после распознавания аксоном своей ми-
шени и контакта с ней (рис. 24). Специфичные для A3 белки в соме
нейрона упаковываются в транспортные везикулы и доставляются
в рождающийся участок синаптического контакта. При слиянии та-
ких везикул с плазматической мембраной белки АЗ приобретают
определенную локализацию. В культуре нейронов гиппокампа одна
A3 образуется из 2-3 транспортных везикул примерно за 30 мин
(Zhai е1а1., 2001). Поскольку в среднем каждая АЗ имеет 10-15 осво-
бождаюших участков (или «ячеек» для синаптических везикул), то
каждый транспортный пузырек должен нести строительный мате-
риат для 4-5 освобождаюших сайтов. Вероятно, in viva сборка A3
происходит в среднем в течение часа, что способствует быстрому
синаптогенезу во время развития и увеличению силы синапса в ходе
долговременной потенциации. Завершается формирование A3 по-
явлением функционирующих участков освобождения медиатора.
Инициировать сборку синапса способны некоторые молекулы меж-
клеточной адгезии и постситтаптической мембраны (рис. 4 ц2, рис.
5 ц2). Например, Х-кадгериньт могут стабилизировать акео-деттд-
ритньте контакты, давая возможность более специализированным
мембранным белкам активировать специфические впутриклеточньте
каскады, индуцируютцие пре- и постсинаптическуто дифференци-
ровку. Белки 1тостситтаптттческой плотности нейролигин I и 2, атакже
белок SynCA.\/I обладают‘ выраженной способностью индуцировать
группировку синаптических везикул в аксонах (Ziv, Camcr, 2004).
Генетический анштиз C. e/ega/Ls‘ Н Drosop/2//a идентифицировал
несколько генов, когорьте влияют на сборку АЗ. Мутанты С. e/egans, y
которых потеряна функция Syd-2, имеют уштиненньте, но менее элект-
ронно-плотные A3 B HCpBHO—MbI1IIClIHhlX синапсах (7..l1en, Jin. 1999). Бе-
лок 5ус1-2 локализован в АЗ и принадлежит к белковому семейству
липринов, которые взаимодействуют‘ с рецепторнымн протеин-тиро-
зин-фосфотазакти I,a1'—ceMciic'1Ba(RPTPS), группируюшихся в участках
фокальной адгезии (Serra-Pages ct а1., 1998). У мутантных плодовых
мушек [)ro.s'up/71'/a, с нарушенным геном б-цтиттрина, размер A3 B НС-
$59
примитивные
пресинаптические
сайты экзоцитсза
а „.,
кря ~
“Q” ' примитивные
... .. пресинаптические
в `}�� ‹—› Q.’ а ж д’, бутоны
` ` ` " M ` М” \... ’ ' ' '-' НЕСКОЛЬКО синаптических
везикуп,
- везикула-подобные
ё ё структуры
ю _ м" \ _
в "““""" созревающии
-* Q 0��� пресинаптическии
„в .„_..„...„„
E
Ё
т
-S
Ё
бутон- Ё
'5’ — активная зона, Ё
. ‚ _ �F�� - докированньае везикулы, Ё
о синаптическая - Ё . 1 - мапьнький резервный пуп S
везикула Ё
О ’pa"m°p'”"'e " зрелый 8
5e3"“‘Y“b‘ пресинаптический Ё
Т _. бутон: о.
' Q5e3”"y"°'"°“°6“"'° '. бепьшой резервный пуп 8
структуры 3
‚(д цитоскепет
образование “сиротских”
СЭЙТОБ axaouwroaa
V
Рис: 24. Модель сборки активной зоны (Ziv, Carner, 2004).
а) Аксоны нейронов содержат несколько типов транспортных «упа-
ковок» (синаптические везикулы, тубовезикулярные структуры, транспор-
тные везикулы с компонентами АЗ, такими как piccolo и bassoon), которые
используются в ходе сборки АЗ. б) Примитивные сайты экзоцитоза фор-
мируются спонтанно вдоль аксона. в) Контакг между аксоном и будущей
постсинаптической областью ведет к накоплению транспортных упаковок,
в результате формируются «примитивные» нресннантическне бутоны. B
этих участках запускается рецикзтирование синаптичееких везикул. г) Аль-
тернативно, установление аксо-дендритного контакта может вести к быст-
рому формированию АЗ посредством слияния транспортных везикул (с
компонентами АЗ) с пресинаптической мембраной и последующему при-
влечению синаптических везикул. д) С течением времени (дни), новые си-
наптнческне везикулы формируют большой резервный пул, п контакт прн-
обретает свойства зрелого. е) После формирования нресннантического
бутона. часть материала A3 И соответствующий ей кластер синаптических
везикул («сир0тские» сайты освобождения) могут «отночковываться» и
блуждать но аксону, давая начало новым сайтам.
60
рвно-мьццечном синапсе в ~2,5 раза больше, а морфология менее упо-
рядочена (Kaufmann ct :11, 2002). Потеря гена wit (wis/7/ill t/tin/cing) y
1)ro.s'0p/zila приводит к свободному плаванию Т-обратшых проекций в
цитоцлазтие НО и уменьшению количества синаптттттескттх бутонов,
однако увеличивается количество АЗ приходящихся на бутон.
АЗ достаточно нластичньте структуры и при смене режима ак-
тивности синанса часто наблюдаются соответствующие изменения
количества A3. При этом у Drosop/zi/a И Sarcophaga точно соблюда-
ется миттигиальттое расстояние между соседними A3 (Meinertzhagcn.
1998). В синапсах четверохолмия зрительной системы Пгозор/ц/а,
количество пресинаптических лент увеличивается при усилении све-
товой стимуляции (Brandstatter, Mainertzhagen, 1995). B ПСрВНО-МЫ-
шечных синапсах ракообразных вызванное высокочастотной сти-
муляцией долговременное облегчение связано с увеличением коли-
чества A3 И плотных проекций (W0jtowicz et а1.‚ 1994). Схожим об-
разом дело обстоит в гиппокампальньтх нейронах тилекопитаютцих,
где долговременная погенциация коррелирует с расширением и «де-
лением» АЗ (Weeks ct а1.‚ 2000).
Именно на территории АЗ начинается «трудовой» путь отдель-
ной везикулы: здесь проходят события, приводящие к слиянию ве-
зикулярной мембраны с пресинаптической (экзоцитоз) в ответ на
вход ионов Са через потенциал зависимые каналы (Schoch,
Gundelfinger, 2006; Evans, Zamponi, 2006).
ГЛАВА III. ЭКЗОЦИТОЗ
СИНАПТИЧЕСКИХ
ВЕЗИКУЛ
ВССМ ЭУКЗрИОТИЧССКИМ клеткам В ХОДС СВОСЙ ЖИЗНСДСЯТСЛЬНОС-
ТИ ПрИХОДИТСЯ ОбНОВЛЯТЬ, ИЗМСНЯТЬ СОСТЗВ ПЛЗЗМЗТИЧССКОЙ мембра-
НЫ. КрОМС ТОГО СуЩССТВуСТ ПОТрСбНОСТЬ В «ВЫДВОРСНИИ» за ПрСДС-
ЛЬ1КЛСТКИ<<ОТрабОТЗННОГО материала» И ВЫДСЛСНИИ В ОКрУЖЗЮЩУЪО
среду СИГНЗЛЬНЫХ МОЛСКуЛ В ЦСЛЯХ «СЗМОСТИМИЛИРОВЗНИЯ» И/НЛИ
МСЖКЛСТОЧНОЙ KOMMyHI/IKBIII/III. BO BCCX ПСрСЧИСЛСННЫХ ПрОЦСССЗХ
"стебелек"
мембрана везикулы
АИСТЕЪАЬНЬКЕ проксимаАьньте
МОНОСАОИ
поАусАияние "ОРЗ C“’1"““e
Рис. 25. Топология липидов при слиянии мембран (Jahn et а1.‚
2003).
Между двумя близко расположенными мембранами образуется
мембранный перешеек («стебелек» - stalk) за счет слияния «прокси-
мшпьных» монослоев мембран. Стебелек может расширяться, транс-
формируясь в иолуслившееся состояние (hemifusion) Затем происхо-
дит объединение «дистальных» монослов (полное слияние бислоев). в
результате чего появляется пора слияния. Причем пора слияния мо-
жет спонтанно менять свой диаметр («мерцание» - flicker). Тонкий ие-
решеек между мембранами может непосредственно трансформиро-
ваться в пору слияния, которая расширяется и происходит встраива-
ние мембраны везикулы в илазматическую мембрану.
62
КЦПОЧСВЗЯ РОЛЬ принадлежит‘ ‘ЭКЗОЦИТОЗУ ВСЗИКуЛЯрНЫХ СТруКГур, В
результате которого мембраны везикулы и клетки (Плазматическая
мембрана) сливаются в один непрерывный билиппдньтй слой. Вре-
мя, в течение которого происходит‘ экзоцитоз варьирует‘ от милли-
секунд (при экзопитозе сипапгических везикул) до десятков минут
(при слиянии вакуолей), также сильно (примерно в 104 раз) отлича-
ется размер задействованных в экзоцитозе мембранных органелл.
Несмотря на такое разнообразие, все реакции экзоцитоза воплоща-
ются с помощью универсального механизма, индуцирующего кон-
такт между мембранами, их объединение и образование водной порьт
слияния. Это механизм работает в нанометровых пространствен-
ных пределах, поэтому его детальное устройство до сих пор вьтзьт-
вает множество дискуссий.
Особое значение процесс экзоцитоза имеет в нервной системе,
поскольку с его помощью происходит освобождение нейромедиато-
ра в сипаптическуто щель (Угрюмов, 2004). В нервной системе эк-
зоцитотз отличается большой скоростью и сложностью регуляции со
стороны многочисленных сигпштьньтх каскадов и специфичных про-
теинов и липидов. Кроме того, экзоцитоз синаптических везикул
очень тесно связан с ионами Са и более четко локализован (на тер-
ритории A3), чем любой другой известный процесс слияния мемб-
ран.
В A3 осуществляются четыре основных процесса с участием
синаптических везикул, ведущих к экзоцитозу:
1. Транспорт‘ (мобилизация) везикул мобилизационного (рецик-
лируютпего) пула по направлению к АЗ, завершающийся сцеплением
(tethering) везикулы с цитоматриксом АЗ, то есть с белковыми «соору-
жениями», расположенными в цитоплазме непосредственно над мем-
браной A3.
2. Прочная стыковка (докирование) везикулы с местом осво-
бождения медиатора в АЗ. В этом состоянии везикула локализуется
точно напротив белков, составляющих машину слияния мембран.
3. Подготовка (прайминг, предслияние) везикулы к экзоцито-
зу, которая заключается в комплексной трансформации белкового
комплекса экзоцитоза. В результате прайминга еинаптическая вези-
кула становится полностью компетентной к экзоцитосзу и ожидает
лишь входа ионов Са. На этой стадии синаптические везикулы «пре-
дохрапеньт» специальными факторами от немедленного слияния
(стабилизированы) и в тоже время способны молниеносно ответить
на вход ионов Са, освобождением медиатора. Гипертонические ра-
63
створы и ос-латротоксин способны вызывать Са-нсзависимый amo-
циТ0З еинаптической везикулы в состоянии прайминга, а клостри-
диальныс токсины нарушают праймированис везикулы.
4. Экзоцитоз - слияние мембраны везикулы с плазматической
мембраной. Для осутцествления этого процесса необходимо откры-
тие потенциал-зависимых Садканалов и увеличение концентрации
ионов Са в области везикулы. Причем освобождение медиатора из
везикул начинаст в течение 0.2 мс после входа ионов Са, вызванно-
го вторжением потенциала действия в НО. Термин экзоцитоз упот-
ребляется в двух значениях. В широком, когда данное понятие обо-
значает все молекулярные реакции в АЗ (этапы сцепления, докиро-
вания, прайминг и слияния), приводящие к освобождению медиа-
тора; или в узком смысле — тогда, под экзоцитозом подразумевается
только непосредственно стадия слияния везикулы с мембраной НО.
Различают полный и неполный экзоцитоз. В первом случае
` происходит встраивание мембранного фрагмента еинаптической ве-
зикулы в пресинаптичеекую мембрану, а во втором - между полос-
тью везикулы и еинаптической щелью образуется короткоживущая
пора, через которую происходит выделение медиатора. Через неко-
торое время пора закрывается и везикула отходит от мембраны. Этот
механизм получил шутливое название «поцеловал и убежал» (от
англ. <<kiss—and—1'un») и часто рассматривается как сверх-быстрый
путь образования везикул, поэтому он будет подробнее обсуждаться
в главе, посвященной эндоцитозу.
Предполагается, что при приближении и слиянии мембран со-
здается нестабильный посредник. По поводу его устройства суще-
ствует несколько моделей (Jahn ct al, 2003; Ungermann, Langosch,
2005; Jahn, Scheller, 2006). Первая модель «полуслившегося» состо-
яния полагает объединение только цитоплазматических листков би-
липидных мембран. В соответствии со второй - сплав мембран за-
кончен, но расширение поры слияния заблокировано. Так или ина-
че, нестабильный посредник способен преобразовываться в «сквоз-
ную» пору слияния или регрессировать обратно в докированное со-
стояние (рис. 25) (Sudhof, 2004; Ungcrmann, Langosch, 2005; Schaub ct
al., 2006). '
64
Сцепление и докирование синаптических
везикул
Сцепление. На первом этапе синаптическис пузырьки прикреп-
ляются к белкам, которые образуют «возвышения» («плотные про-
екции») над АЗ (Dresbach ct а1., 2001; Lcnzi, Gcrsdorff, 2001). В ЦНС
млекопитающих возвышения в форме пирамид (~5()nM) были био-
химическим способом отчищены и проанализированы. Оказалось,
что в состав «пирамид» входят белки RIMI И синапсин 1 (Phillips ct
al., 2001). RIM I (Rab3 interacting molcculc l) можетвзаиьтодейство-
вать c синаптичсскими везикулами двумя способами. Первый, это
связывание RIM c везикулярным белком Rab3a (см. Rab} ГТФазы в
экзоцитозе), который прикрепляется к везикуле в ГТФ-загружен-
ном состоянии (Wang et al., I997, 2002). Кроме того, in vitro RIM
ассоциируется c везикулярным белком синаптотагмином 1 (Schoch
ct а1., 2002). Другой компонент «пирамид» АЗ, синапсин 1 взаимо-
действует с опорными белками цитоматрикса АЗ (актиновыми мик-
рофиламептами, спектрином, тубулином, и нейрофиламентами), а
его присутствие в A3 может возрастать после высокочастотной сти-
муляции (Tao—Cheng, 2006). Он относится к семейству белков - си-
напсинов, формирующих гомо- и гетеродимерьт, которые участвуют
не только в организации АЗ, но и доставке везикул в АЗ, а также
играют главную роль в удержании везикул в кластере неподалеку от
АЗ. Синапсиньт в нефосфорилированном состоянии связываются с
синаптическими везикулами через свой фосфолипид-связьтвающий
сайт и фиксируют их к белкам Цитоматрикса A3 (рис. 26 ц5)
(Jovanovic ct а1., 2001). В ингибиторных НО гиппокампа при нокау-
те гена синапсипа 1 наблюдается уменьшение размера готового к
освобождению пула (Baldelli et а1., 2007).
Предположительно, белковые возвышения служат для перво-
начального ориентирования везикул в области A3 (рис. 26 115), что
необходимо для бесперебойной доставки везикул в сайты экзоцито-
за при высокочастотной синаптической активности (Тоопеп ct а1.,
2006; Bechcrer, Негра, 2006). Большое значение «tethering» имеет в
лентовидных синапсах, работающих в режиме проведения высоко-
частотных пачек импульсов (рис. I9 Ж). B Данных синапсах в при-
крепление везикул вовлечены дополнительные белки цитоматрик-
са АЗ, такие как ШВЕУЕ, piccolo, KIF3A,CtBP1, BRP (рис. 26 115)
(Zana7,zi, Matthews, 2009). Однако этап прикрепления (сцепления) си-
65
напТИЧССКИХ I3C'3I1I\'yJI, CKUPCC BCCIU, НС ЯВЛЯСТСЯ ОбЯЗЁГГСПЬНЬПМ В ЭКЗО-
дитозе синаптических везикул (Koushika е1а1., 2001 ;.Zhai, Bc11cn, 2004;
Тоопеп е: а1.. 2006).
Докироваттие — это второй, самый слабо исследованный этап
дкзонитоза, представляет‘ собой обратимую, по прочную стыковку
везикул с мембраной АЗ непосредственно в месте протекания зкзо—
дитоза (рис. 27 115). Ранее предполагалось, что докирование вези-
кул управляется белками SNARE комплекса (см. ниже) (Sollncr ct
а1., 1993). Однако более поздние исследования, проведенные на НО
Drosophila, кальмара и мьппи, не подтвердили такую возможность
(Нит ct а1., 1994; Broadie ct а1., 1995; Deak et а1., 2004).
Докирование по всей видимости происходит с помощью ме-
ханизма (Весйетет, Rettig, 2006), который основывается на взаимо-
действиях везикулярньтх белков (синатгтотатмттна, Rab3a) с протеи-
нами пресинатгтиттеской мембраны (сиптаксином, SNAP—25) часто с
участием Цнтотплазматических белков п$ее1 (у дрожжей), Uncl8 (y
Dr0s0plu'la и C. elegans) И Мипе18 у млекопитающих (рис. 27 ц5). Эти
цитозольные протеины относят к семейству SM (nScc1/Munc18) бел-
ков. Предполагают существование нескольких «креплений» между мем-
браной АЗ и везикулой. Белок активной зоны синтаксин в комплексе
C Munc18 соединяется напрямую с везикулярным белком Rab3a или с
белком эффектором ГТФаЗЬт Rab3z-1 (КаЬ-эффектором), который свя-
зан с Rab3a (шепнет, Jorgenscn, 2003). Возможно прикрепление комп-
лекса синтаксин - Munc18 к везикуле с помощью белка MINT.
MINT (Munc18—intcrac1ing protein) может взаимодействовать с вези-
кулами через фосфотидилинозитол-4‚5-бифосфат (ФТИ-4,5-Ф2) свя-
зывающий домен и служить мостом между везикулой и Мцпс18,
образующим комплекс с сиптаксином преситтаптттческой мембра-
ны. В этом случае локальная продукция ФТИ-4,5-Ф2 в мембране
синаптических везикул должна приводить к докированию посред-
ством МПЧТ-завттсимото механизма (Okamoto, Sudhof, 1997). Дру-
той комплекс еитттакетпта с компонентами АЗ тцпс13 и RIM так-
же может прикрепляться к Rab3 молекулам везикулы, при этом RIM
выступает в качестве КаЬ-:›‹Ь‹1›ектора(МапеШ ct а1., 2000; Hammarlund
et a1., 2007). Кроме того синтаксин АЗ может взаимодействовать на-
прямую с белком синатгтотатзтиттозт на везикуле (Sudhof, 2004). С ве—
Зикулярпым еинатттотагмином способен также связываться белок A3
- SNAP-25 (Cllicregatti е! а1., 2002), который соединяется с Rab3a
везикулы через такой КаЬ—:›‹1›(1)ек'тор как рабфилин (Tsuboi ct а1.,
2007). Подробное описание указанных протеинов будет дано ниже.
В докировании злектротнюплотпьтх гранул нейронов С. E/cgzms уча-
ствует CAPS белок (Си-активируемый протеин секреции), тогда как
для стыковки стпнаптнческих везикул требуется ипс-13 (аналог мле-
копитающих обозначается munc 13). При зтом в ходе докирования
происходят взаимодействия CAPS - синтаксин и ипс-13 - синтак-
син (Hammarlund ct al., 2008).
Прайминг синаптических
везикул. ЗНАКЕ-белки
Что такое SNARE? Первоначально было обнаружено, что в
процессе экзоцитоза участвует белковый комплекс. который полу-
чил название 20 S частица, состоящий из везикулярного компонен-
та и компонента-мишени, расположенного на плазгиатичсской мем-
бране. Также был изолирован М-этилмалеимид-чувствительный бе-
лок слияния (NSF) необходимый для экзоцитоза. Прикрепление NSF К
мембране происходило при участии других белков, которые получили
наименование растворимые NSF присоединяюшие белки (ЗМАРз).
В свою очередь SNAP взаимодействовал с 20 S частицей, компонен-
там которой было дано название рецепторов растворимого NSF при-
соединяющего белка (soluble N-ethylmaleimide—sensitive factor (NSF)
— attachment protein receptor), то есть SNARE. B последствие SNARE
белки стали рассматриваться как главные элементы аппарата слияния,
тогда как NSF и SNAP была отведена роль в процессе разделения ком-
плекса из ЗНАКЕ-белков. SNARE протеины являются высококонсер-
вативными белками и имеют универсальное значение в процессе сли-
яния мембран у всех эукариотических организмов, начиная от дрож-
жей и заканчивая млекопитающими.
ЗНАКЕ-комплекс. Во внутриклеточном слиянии мембран уча-
ствуют SNARE белки, присутствующие на обеих сливающихся мем-
бранах и формирующие «плотный» основной (соге) комплекс (Chen,
Scheller 2001; Jahn е: 211., 2003). SNARF. белки характеризуются на-
личием в первичной структуре гомологичной последовательности
из 70 аминокислотных остатков, названной SNARE мотивом. Су-
ществуют 4 класса SNARE мотивов (К, Qa, Qb. Qc). Плотный ком-
плекс образуется, когда 4 SNARF, мотива (по одному мотиву каждо-
го класса) собираются в компактную 4-х спиральную связку («скру-
чиваются») (рис. 28 цб, рис. 29 ц7, рис. 30 118). Pe3yJu;mpyIou1asI
67
структура очень устойчива, поэтому разбирается только при темпе-
ратуре более 95°С. Формирующийся ЗНАКЕ-комплекс может стя-
гивать мембраны до их полного слияния, при этом скручивание
51чАКЕ-мотивов напоминает застегивание молнии на одежде (так
называемая модель «застежки - молнии» мембранного слияния). (Li,
Chin, 2003).
В экзопитозе синаптичсских везикул главная роль принадлежит
м SNARE белкам (рис. 28 цб): синтаксину 1 (содержащему Qa-
моТИВ) и ЗНАР—25 (с Qb— и Qc— мотивами) на пресинаптической плаз-
матической мембране и синаптобревину (VAMP, с К-моти вом) на мем—
бране везикулы (Sollner et а1., 1993). ЗНАКЕ-белка присутствующие
на мембране везикулы, часто обозначают v-SNARE (от слова vesicular).
ЗНАКЕ-белки пресинаптической мембраны, на взаимодействие е ко-
торыми нацелены у-ЗНАКЕ, называют t-SNARE (от слова target).
Прайминг - этап предслияпия, который составляют пропсс-
cu, обеспечивающие образование SNARE комплекса (Weimer,
Jorgcnsen, 2003; Chcng е‘: а1., 2006). Исследования in vitro предпола—
тают, что в ходе формирования SNARE комплекса самой медленной
(лимитирующей) реакцией является взаимодействие SNAP—25 с син-
таксипом (Nicholson et а1., 1998). Синтаксин помимо ЗНАКЕ-моги-
Ba Qa содержит трех-спиральную связку, обозначаемую НаЬс-до-
мен. Этот домен и ЗНАКЕ мотив соединены между собой подвиж-
ным линкерпым регионом и могут взаимодействовать внутри мо-
лекулы синтаксина («закрытазт конформация), в итоге ЗНАКЕ
мотив теряет способность форгпировать комплекс со ЗНАКЕ-мотив
вами других белков (рис. 29 ц7‚ рис. 30 Ц8). При сборке основного
комплекса требуется синтаксин в «открытом» состоянии (ЗНАКЕ—
Мотив и НаЬс не связаны) (Dulubova et а1., 1999).
Закрытая конформация синтаксина стабилизируется при свя-
зывании последнего с растворимьтъа (Цитозольным) белком ЗМ се—
Мейства (Мипс|8, пЗес| или Unc18) (рис. 29 ц7) (Нага е1 а1., 1993;
Fisher et а1., 2001). Комплекс синтаксин-Миле 1 8 исключает возмож—
ность взаимодействия ЗНАР-25 с синтаксипом (Misura et а1., 2000).
Поэтому перед формированием ЗНАКЕ комплекса Munc18 должен
отделиться от синтаксина (Dulubova et а1., 1999). B то же время по-
вторное связывание Мппс18 с «открытым» синтаксипом, который
уже «скручивается» со ЗНАР—25, стимулирует формирование пол-
ноценного ЗНАКЕ-комплекса и мембранное слияние (Dulubova et
а1., 2007; Rickman ct а1., 2007; Shcn ct а1., 2007). Таким образом,
Мцпс 18 с одной стороны препятствует начальному этапу сборки
68
БЫАКЕ-комнлекса, однако с другой — катализирует последутотпуто
стадию «построения» ЗНАКЕ-комплекса (рис. 29 ц7, рис. 30 118).
Причем последняя функция Мцпс18 является для него основной и
проявляется во всех событиях экзоцитоза у млекопитающих.
Гомологичные п$ес1 и Мцпс18 белки, составляющие ЗМ-семей-
ство, были идентифипированьт в каждом из изученных процессов
внутриклеточного слияния мембран, где они выполняют‘ аналогич-
ные функции (Jahn et а1.‚ 2003). На сегодняшний день имеются све-
дения о трех факторах, которые облегчают диссоциацию SM белка
от закрытого синтаксина. In шт было показано, что диапидтггхицс-
род-связывающий белок Celegans Unc-13 (аналог млекопитающих
- Vlunc-13) вытесняет Unc-18 ИЗ комплекса с синтаксином. Затем С-
конец Unc—l3 взаимодействует с синтаксином, стабилизируя его в
открытом состоянии (рис. 29 ц7) (Brosc et а1.‚ 2000; Richmond, Broadic,
2002). Согласуются с этой гипотезой данные об исчезновении выз-
ванной, синхронной секреции медиатора у нокаутированных по гену
Unc/Munc—l3—l мышей, C.e/egans И Drosop/11'/a (Richmond ct а1.‚ 1999;
Augustin et а1.‚ 1999; Brosc ct а1.‚ 2000). Причем, если у мышей по-
вреждались одновременно два гена, кодирующих Munc 13-1 И Мнпс
13-2, то исчезала и спонтанная секреция, как Са-зависимая, так и
индуцированная гипертоническим раствором сахарозы (Varoqueaux
ct а1.‚ 2002). Мыл-домен muncl3—1 может одновременно связываться
с синтаксином-1 и SN/\P—25, выступая в качестве матрицы для сборки
гетсродимерного комплекса «открытый синтаксин - SNAP—25>> (Guan
et а1.‚ 2008). Критическая роль Мипс13 в нраймироваттии синаити-
ческих везикул (рис. 29 ц7) связана с его С-концевым С2А-доменом
и МИМ-доменом, тогда как другие домены вовлечены в процессы
модуляции освобождения медиатора (Basu ct а1.‚ 2005). С1 домен
Мппс13, связывающийся с диацилглиперогтом, облегчает экзоцитоз
(Rhee e1 а1.‚ 2002), а взаимодействующий с кальмодулином регион
задействован в кратковременной синаптической пластичности (Jungc
е! а1.‚ 2004). С2В домен Munc 1 3, связывающий в присутствии ионов
Са фосфолипиды (в основном фосфоинозитидьт), обеспечивает уси-
ление освобождение медиатора в ответ на серию импульсов, кота ци-
тозольный базальный уровень ионов Са значительно повьпцен (Shin et
al., 2010).
Генетические исследования дрожжей и C.e[ega/Ls‘ предполага-
ют роль малых КаЬ-ГТФаз в отсоединении ЗМ белка от синтаксина
(рис. 30 L18) (Tall ct а1.‚ 1999; Koushika ct а1.‚ 2001). Привлекгггельттой
выглядит гипотеза, устанавливающая следующую последователь-
Ь 69
несть событий. Прибывающие в сайты зкзоцитоза везикулы несут
на своей поверхности КаЬЗа ГТФазу, которая соединяется с каркае-
ным белком RIM. B результате К1М активирует связанный с ним
белок Unc/Munc—13, переводящий синтаксин в открытую конформа-
“mo (Richmond, Broadic, 2002; Basu et a1., 2007). B дополнение к этому
белок Munc 18 может фосфорилироваться многими протеинкиназами
(in vivo — протеинкиназой С, циклин-зависитхтой киназой 5 (Cdk—5), Ca-
кальмодулин зависимой киназой Н; in что ~ протеинкиназой А, казе-
инкиназой 2), что существенно облегчает диссоциацию Мцпс 18 от
синтаксина (Fletcher et а1., 1999; Barclay ct a1., 2003; Craig ct a1., 2003).
В утублеттие между спиралями почти собранною SNARE КОМП-
лекса очень быстро мотут встраиваться мгшенькие (15—20 кДа) нейро-
нальньте белки комплексины (рис. 29 ц7), иногда их называют сина-
фины (Chen et а1., 2002; Bmngcr, 2005). У позвоночных идентифициро-
вано 4 формы комтшексинов (C PXS I—IV), которые дифференциально
распределены в нервной системе. Например, в сетчатки мыши C PX1
и II найдены в синапсах амакриновых клеток, а СРХШ и IV прева-
лируют BJ1CI1'1‘OBl/ILIHLIX синапсах фоторецепторов и биполярных кле-
ток. Центральная альфа-спираль комплексинов с помощью солевых
мостиков и водородных связей взаимодействует со ЗНАКЕ-комп-
лексом. Дополнительная альфа-спиршть может выступать в качестве
фактора ингибирующего слияние, поскольку конкурирует со SNARE
мотивом синаптобревина за связывание с синтаксином. Она встра-
ивается B SNARE комплекс между v— И t—SNARE белками, что пре-
пятствует их плотному скручиванию. Тогда как М-конттевой реги-
он комплексина предотвращает подобное действие дополнительной
альфа-спирали, стабилизирует ЗНАКЕ-комплекс и может связывать-
ся c фосфолипидами везикулярной мембраны, облегчая сближение
мембран. С-термиттальный участок комплекеина также способству-
ет более тесному стягиванию ЗНАКЕ-комплекса. В целом, комп-
лексины ускоряют «полноценную» сборку SNARE комплекса (мак-
симальное сближение мембран) и блокируют завершение реак-
ции слияния, «замораживая» везикулу в метастабильном состоя-
нии (Schaub е: а1., 2006; Tang ct a1., 2006). В хромаффинных клетках
комплексины способствуют праймироваттито везикул и делают их
готовыми к освобождению (Cai ct al., 2008). Нокаут генов комплек-
синов 1 и П значительно угнетает синаптическую передачу и снижа-
ет чувствительность экзопитоза к кальцию в глутамат- и ГАМК-
эргических НО мозга мыппт (Tadokoro ct 211., 2005; Хпе е! 211., 2008).
Сверхзкспрессия комплексинов 1 H Н в РС12 клетках также ослаб-
70
ляет освобождение аттетттлхолитта (Наката е: al., 1999). Исследова-
иия на нокаутных мышах указывают на важность комплсксинов 1 /II
исключительно для вызванного ионами Са быстрого, синхронного
освобождения медиатора в НО гиппокамтта (рис. 34 ul 1), а асинх-
ронное и спонтанное выделение медиатора (также зависящее от
SNARE комплекса) не требует участия данных белков (Reim е: а1.,
2001). Однако делеция генов комплексииов ведетк увеличению спон-
танного освобождения медиатора из двигательных НО I)/'0s0p/zi/a
(Huntwork, Littlcton, 2007). B синапсах сенсорных внутренних во-
лосковых клеток уха, где Са-сенсором является белок отоферлин.
комплексины не требуются для протекания экзоцитоза (Strenzkc е:
а1., 2009).
Сборку SNARE комплекса регулируют еще несколько синапти-
ческих белков. Два Цитозольных протеина томозин (Fujita et al., 1998)
и амизин (Scales е: aI., 2002) имеют на С-конце нефункциоттальттьте
R-SNARE МОТИВЫ, которые. заменяя К-мотив синаптобревина в
SNARE комплексе, ингибируют экзоцитоз (рис. 29 Ц7) (Hatsuzawa
et al., 2003). Томозин — располагается в цитоплазме HO, где перио-
дически соединяется с синаптическими везикулами и мембраной
АЗ, и рассматривается как главный антагонист Мипс13 в синапсе.
Томозин может «вынимать» синтаксин из комплекса синтаксин1-
Muncl8 и формировать конгломерат из 4-х белков: томозин-синтак-
син-ЗМАР-25-синаптотагмин («аеаб-епд/тупиковьтй» комплекс, раз-
бирается он также как и ЗНАКЕ-комплекс), в результате ключевые
участники экзоцитоза переводятся в неактивное состояние. В со-
став томозина входит WD—11oMen (составлен из повторов последова-
тельности из 40 аминокислот, названной WD40), формирующий
структуру типа бетта-проттеллера. ЧУБ-домен может взаимодейсто-
вать с миозинами П / V, не давая им участвовать в экзоцитозе (см.
Белки моторы в движении синаптических везикул), а также - со
SNAP—25 и синтаксином, что угнетает сборку ЗНАКЕ-комплекса (рис.
29 Ц7) (Ashexy е: а1., 2009). Способность томозина вмешиваться в
формирование ЗНАКЕ-комплекса уменьшается при его фосфори-
лировании протеинкиназой А и если синтаксин связан с Мппс13, а
увеличивается в случае фосфорилирования КОС-киназой (Rh0—ac—
социироваиная серин/треонин киназа, которая стимулируется лизо-
фосфатидной кислотой) (ВаЬа е: а1., 2005). Деления гена томолота
томозина у С. elcgans усиливает освобождение медиатора в нервно-
мыцтечном синапсе, увеличивая размер готового к освобождению
пула везикул. При этом также повьппается продолжительностт, асин-
71
хронной секреции (Grachcva ct а1.‚ 2006). Экспрессия амизина в РС 1 2
и хромаффинных клетках угнетает экзоцитоз и регулирует динами-
ку поры слияния, увеличивая время существования поры до ее рас-
ширения и полного встраивания мембраны везикулы в плазмати-
ческую мембрану (John ct а1.‚ 2005).
Везикулярные белки синаптофизины 1 /2, содержащие 4 транс-
мембранных сегмента, связываются напрямую с пронизывающим
мембрану доменом синаптобревина, в результате еинаптобревин те-
ряет способность участвовать в формировании SNARE комплекса
(Васей ct а1.‚ 2001). B синаптичеекой везикуле большинство молекул
синаптобревинов находится в комплексе с синаптофизинами. Ней-
ротокеин змеи тайпоксин (taipoxin), потенцирующий Са-зависимый
экзоцитоз, вызывает диссоциацию комплекса еинаптофизина 1 с
синаптобревином 2 в НО гиппокампа.
Белок спринг (spring), экснреееирующийея исключительно в
мозге и концентрирутощийся в синапсах (в АЗ), взаимодействует в
соотношении 1 к 1 со SNAP—25, удерживая его в неактивном состо-
янии, в итоге ингибируется Са-завиеимый экзоцитоз (Yankun et а1.‚
2001). Фосфорилирование спринг некоторыми протеинкиназами
ослабляет его связь со SNAP—25. После экзоцитоза, когда SNARE
белки объединены в один ансамбль, спринг может участвовать в
ссквеетрации (возвращении) SNAP—25 при разборке SI\'ARE—x<0Mn-
лекса шапероном NSF обратно в мембрану АЗ (см. Разборка SNARE
комплекса), что в перспективе способствует экзоцитозу (Klenchin,
Martin, 2000).
Таким образом, все три белка ЗЫАКЕ-комплекса, имеют своих
специфичных эндогенных белков-ингибиторов, которые предот-
вращают «нссанкционированньте» взаимодействия ЗНАКЕ-белков:
синтаксин - Munc18 И томозин; SNAP—25 — спринг и томозин; cw
наптобрсвин - еинаптофизин).
В праймингс синаптических везикул участвуют DOC2 (double
С2) белки (DOCZA, DOCZB, DOCZC), имеющие в своем составе
МипсЮ-связываютций домен (MID) и два С2 домена (рис. 29 Ц7).
DOCZA экспреееируется исключительно в ЦНС. Инъекция пепти-
дов, нарушающих взаимодействие MID домена DOCZA е Мипс13,
снижает секрецию медиатора в шейном ганглии крысы и чашеоб-
разных синапсах. DOCZB форма обнаружена только в определен-
ных регионах мозга и эндокринных клетках. ПОС2А и DOCZB реа-
гируют на повышение внутриклеточного уровня кальция во время
синаптичеекой активности, после чего перемсхцаются к плазмати-
72
ческой мембране И взаимодействутот‘ с помощью СЗА-домепов (Са-
зависимо) с фосфолипидами мембраны (Groffen ct а1., 2006). Свя-
занный е мембраной DOC2 белок ИЬГТТОЧЦСТСЯ», и начинает взаи-
модейетоватт, с белками экзопитоза (нащимер, С2В домен — с комп-
лексом SN/\P—25—cnHTaKcm1, MID IIOMCH — с Мипс 1 3), что облегчает
докирование, праймировцние везикул и расширение поры слияния
(Frcdrich et al., 2008). Кроме того, как и в случае с С2 доменами
синаптотагмипа I (см. ргшдел о сипаптотагмипе), С2А-С2В Дуплет
DOCZB может вызвать ‚Чефортматтито мембран, облегчая слияние
(Shahin е: а1.. 2008).
При повреждении SV2 белка синаптических везикул наруша-
ется сборка ЗТЧАКЕ-компдтекса в синапсах и уменьшается размер
готового к освобождению пула в хромаффиттньтх клетках, а делеция
$\/2 приводит к постнатальной летальности вследствие молниенос-
ных эпилептических припадков (Crowdcr ct а!., 1999; Custer е: а1.‚
2006). Предполагается участие $\/2 как усилителя экзоцитоза си-
паптических везикул на стадии после прайминта, но до действия
ионов Са. То есть SV2 «доводит» праймированттьте везикулы до оп-
тимальной чувствительности к ионам Са. Причем это свойство SV2
зависит от его трансмембраппьтх регионов и впутрпвезикулярного
гликозилированного участка, но не связано с его взаимодействием с
синаптотагмииом (Chang, Sudhof, 2009). Tp21HCMCM6paHHbIC сегмен-
ты могут образовывать переносчик, а гликозилированная область
SV2 может предотвращать «случайный» зкзоцитоз праймироватт-
ных синаптических везикул и буферизировать (связьтвать) молеку-
лы медиатора в полости везикулы (Reigada е: а1., 2003). Гипотети-
чески 5\/2 может требоваться для нормального заполнения медиа-
тором везикул.
Таким образом, в нервном окончании присутствуют специаль-
ные белки (комплсксинът, DOC2, SV2 И др), способствующие топ-
кой «настройке» («tuning») собранного ЗНАКЕ-комплекса, в резуль-
тате которой находится компромисс между «стабильностью» прай-
мироваипой везикулы и ее готовностью слиться в ответ па Са-сиг-
нал. Кроме того, как будет показано ниже активность ключевых бел-
ков машины зкзопитоза плотно регулируется многими сттгнальтты-
ми каскадами и молекулами.
73
Может быть не только SNARE-
белки управляют праймингом
и слиянием мембран?
На сегодняшний день рассматриваются две главные гипотезы
функции SNARE белков. В рамках первой гипотезы — SNARES пред-
ставляет минимальную машину сближения и слияния, которая еди-
нолично ведет «сплав» мембран. В рамках второй — SNARES явля-
ются только компонентами машины слияния, включающей допол-
нительные белки (Giraudo ct а1., 2006). Существуют «сильные» до-
воды, поддерживающие вторую гипотезу. Во-первь1х‚ удаление гена
синаптобревина (в синапсах нет другого R—SNARE мотива) значи-
тельно нарушает экзопитоз синаптических везикул, но 40% вези-
кул могут участвовать в экзоцитозе нормально (Schoch et al., 2001).
Причем вызванное, синхронное слияние повреждается тяжелее, чем
спонтанное (в том числе инициированное гипертоническим раство-
ром сахарозы). Подобные результаты были получены и в случае но-
каута гена SNAP—25 (Washb0umc ct а1., 2002). Таким образом, при-
сутствие SNARE комплекса в синапсе существенно для эффектив-
ного, регулируемого кальцием слияния везикул, а не для слияния
как такового. Кроме этого, делеция гена Мипс18-1 устраняет выде-
ление медиатора (экзоцптоз) полностью. Значит в синапсах Мнпс 1 8-
1 важнее для слияния, чем еинаптобревин или SNAP—25 (Rizo,
Sudhof, 2002; Sudhof, 2004).
Полученные к настоянтему времени данные предполагают, что
этап сведения мембран близко друг к другу частично может быть
замещен или дополнен другими клеточными механизмами (Вгнпэ,
Jahn 2002; Jahn е: а1.. 2003; Sudhof, 2004). Поэтому некоторые иссле-
дователи указывают на роль в экзоцитозе протонной помпы (Н-
помпы, насоса) синаптических везикул, фазовых переходов мемб-
ран, индуцирующихся ионами Са (Харакоз, 2001; Nishi & Forgac,
2002; Моге1, 2003; Wcimer & Jorgensen, 2003). Предполагается учас-
тие миозина П в экзоцитозе везикул: связанный C мембраной прай-
Мированной везикулы миозин может в ответ на вход кальция начать
Движение по актиновьтм нитями, расширяя пору слияния (Neco et
al., 2007).
Гипотеза о роли в слиянии мембран Н- помпы (рис. 31 119)
первоначально была сформулирована на основе исследований ис-
кусственных мембран (Morcl et а1., 20()1; Peters ct 211., 2001 ). BO'5M0)K—
74
но, что после стыковки везикулы с плазгчгггическотй мембранои на-
ружный \/1- CCI‘MCH'I’(11OMCH) помпы отделяется от V0- CCIMCIITR, BC'I‘pO-
енного в мембрану везикулы (рис. 9). Затем \/0-сегмен'г ЕЖ-ттомпы
везикулы соединяется с аналогичным сегментом, расположенным
на плазматической мембране. В итоге формируется сквозной канал,
который отрывается в ответ на повышение локального уровня каль-
ция. Затем сквозь отрытую нору молекулы медиатора покидают по-
лость везикулы (Morel. 2003). Подтверждением гипотезы является
тот факт, что из тела нейрона V1 И V0 домены Н- помпы траттспор-
тируются независимо и собираются только по прибытии в нервную
терминаль (Моге1 е: а1., 2003), причем Н-помпа присутствует как на
пресинаптической мембране, так и мембране сннаптических вези-
кул (Hicks, Parson, 1992). Субъединица а1-1 УО-домена необходима
для вызванного зкзоцитоза сннаптических везикул в НО Drosophila,
что не зависит от транслокации протонов, а определяется ее взаи-
модействием с синтаксином 1 и SNAP-25 (Hicsinger е: 211., 2005).
При этом а1—1 субъедииица избирательно экспрессируется в нейро-
нах, rue концентрируется в НО. Синтез al-I И al—IV субъединиц
усиливается в течение синаптогенеза и роста отростков нервных
клеток (Роеа-(Зпуоп е: а1., 2006). Возможно, aI—I субъединице: вхо-
дит в состав Н-помпьт сннаптических везикул, а а1-1\/ субъединица
— является частью протонного насоса пресинаптической мембраны
(Моте1 е: а1., 2003). а1-1 субъединица содержит кальмодулитт связы-
вающий сайт, нарушение которого приводит ошибочной локализа-
ции кальмодултттта и уменьшению его концентрации в синапсе, а
сверхэкспрессия вызывает гибель нейронов (Zhang е: а1., 2007). То
есть Н-помпа участвует в транспортировке молекул кальмодулитта в
пресинаптические НО. В вакуолях дрожжей УО-сетмен помпы крепко
связан с Са-каналом, активация которого запускает слияние вакуо-
лей. При этом ионы Са и комплекс Са - кальмодуттитт могут непос-
редственно связываться с УО-сегментом Н-насоса и вызывать кон-
формационные изменения, приводящие к открытию поры (Bayer е:
а1.‚ 2003). Роль Н-помпы установлена в экзоцитозе сннаптических
везикул плодовых мушек (Hiesinger et 211., 2005), ‘жзоцитозе морфо—
генов червей (Licgcois е: а1.‚ 2006, 2007), секреции инсулина панк-
реатическимтт клетками мышей (Sun—Wada е: 211.. 2006).
Согласно гипотезе фазовых переходов, индуцированное иона-
ми Са «отвердевание» липидной мембраны играет значительную
роль в механизме выброса нейромелиатора в химических синапсах
(Харакоз. 200! ). Главными фазовыми переходами считаются "транс-
›75
формации мембраны между жидким (жидкий кристалл) и твердым
(гель) состояттиями. При «отвердсвании» площадь поверхности мем-
браны сильтто сокращается за счет более плотной уттаковки длин-
max НСНОЛЯрНЫХ хвостов липидных молекул. Входящие ионы Са,
взаимодействуя с отриттательтто заряженными поверхностями (ани-
онными липидами) цитоплазматических листков везикулярной мем-
браньт и мембраны АЗ, переводят их из жидкого в твердое состоя-
ние. В итоге данньте моттослои «сжимаются», что может быть до-
полнительной движущей силой сближения и слияния мембран.
Экзоттитоз обычно представляется как слияние везикульт c
плазматической мембраной, хотя сейчас предполагается существо-
вание слияния между соседними везикулами в ленточных синапсах
(Matthews, Sterling, 2008). Провоцирование массивного экзоцитоза
(высокочастотной стимуляцией, раствором, с повышенной кон-
центрацией ионов К) может вызывать экзоттитоз везикул большею
размера (compound - везикулы), появившихся в результате быстрого
Са—зависимото объединения двух везикул. При этом слияние везикул
между собой также опосредуется ЗНАКЕ-белками (Не ct al., 2009).
Внутриклеточный кальций и экзоцитоз
синаптических везикул.
Ситтаптотагминьт
Кальттиевые сенсоры экзоцитоза. Считается, что поступле-
ние ионов C a через ттотенциал-активирусмьте Са—канальт и последу-
ющее увеличение внутриклеточной концентрации Caz’ является тте-
обходимым стимулом для инициации экзоттигоза синаптических вези-
кул и освобождения медиатора. В рамках современных представлений
в НО (на синаптических везикулах) имеется несколько различных Са-
сенсоров (сайтов) экзоцитоза, отличающихся по аффинноети к ионам
Са, ‘топотрафии и чувствительности к различным двухвалентным ка-
тионам. Вызванный нервным импульсом вход Cal‘ запускает два
компонента освобождения медиатора (Koh, Bellcn, 2003): быстрый
синхронный компонент (фазический) через ~ 50 мкс после Са- сит‘-
нала (Sabatini, Regehr 1996), и медленный асинхронный компонент;
продолжающийся ~ 1 сек (Barrett, Stevens 1972). В большинстве си-
напсов C а- сенсор быстрого зкзоцитоза активируется десятками и сот-
нями мкМ кальция. Так в чатнеобразньтх терминалях (Calyx of Held)
76
_ ���� _ ` ___'О‚25мв
0.5 сек
10
Частота мткп. c-‘I
(Я
mflm ��*�
Ca Sr Ba Mg Ca Sr Ba Mg
Гиперкалттевьтй
раствор
С
Контроль
Рис. 32. Чувствительнос/пь Са- сенсора спонтанного экзоци-
тоза к ионам двухвалентных металлов в нервно-лилтиечном синапсе
ляауъики (Зефиров, Григорьев, 2009).
А ���� Внеклеточно регистрируемые МТКП в контроле (а) и при
действии гиперкалиевого раствор (40 ММ) (б). Гинеркалиетзьтй раствор
вызывает деполяризацито преситтатттической мембраны, открытие Са-
каналов и резкое увеличение частоты МТКП. Внеклеточттая коттцеттт-
рация ионов Са- 1,8 мМ. Б — столбиковая диаграмма частоты МТКП в
растворах с различными пвухвалентными катионами. Концентрация
ионов Са, Sr, Ba или Mg составляет 1.8 мМ. Видно, что частота МТКП в
присутствии всех исследованных катионов примерно одинакова, что
свидетельствует о практически одинаковой чувствительности С а- сен-
сора спонтанного экзоцитоза к ионам Sr, Ba и Mg.
быстрый экзоцитоз запускается связыванистхт ~ 5 ионов С а с сенсором,
обладающим низкой аффинностыо (Koh, Bellen, 2003; Meinrcnkcn ct
al., 2003). Ахталогичттьтми свойствами обладает (За-сенсор синхрон-
ного экзонитоза в ‚чвигательттых НО лягушки (имеет низкую аф-
финностъ и активируется высокими коттнснтраниямтт кальция) (Зе-
фиров, Григоръев, 2009). Кроме чтого, в исследованиях кратковре-
меиной пластичности было обнаружено наличие самостоятельньтх
:§»:> 77
Са-сеттсоров, обеспечивающих облегчение секреции ктедиатора при
парном и высокочастотном раздражении (Зефиротз, Мухамедьяров,
2004). Эти сенсоры обладают более вьтсокой чувствительностьто к
Cal‘, no сравнению с сенсорами синхронного ‘экзоцитоза.
В большинстве нервных терминштей наблюдается также спон-
танное освобождение медиатора, которое вызывает‘ множество ност-
синатттнческих эффектов, нацеленных на стабилизацию и контроль
возбудимости ностситтантической мембраны. Например, спонтанная
секреция медиатора предотвращает деградацию дендритных тниников
контролирует локальный синтез белков в дендрнтах (Sutton е1а1., 2006).
Возможно, что медиатор, освобождающийся в ходе спонтанного ЭКЗО-
цитоза, действует на иные подтипы рецепторов и инициирует снеци—
фичньте сигнальные каскады (Fredj, Burrone, 2009). B работе Sutton
и коллег (2007) тгродемоттстрнровано, что именно спонтанное осво-
бождение специфически регулирует Постсинаптическую чувстви-
тельность к медиатору в синапсах гиннокампа. Глутамат, выделив-
шийся в результате спонтанного зкзоцитоза в покое, активирует
МВМА-рецепторьт несмотря на Mg“ — блок, вызывает локальное
повьннение уровня кальция и активирует еЕ1д2 (фактор 2 ЭЛОПГЗ-
ции эукариот), контролирующий белковый синтез, в том числе АМРА
и КОМА-рецепторов. Многие нсихоактивные соединения (каппа-
биноиды, кофеин, никотин) модулируют спонтанное освобождение.
Спонтанное освобождение медиаттора также инициируется ионами
Са, и связано с активацией высокоаффинттого Са-сенсора экзоцито-
за (Зефиров, Григорьев, 2008; Xu ct al., 2009). Этот сенсор значи-
тельно отличается от Са-сенсора вызванного экзоцитоза но чувстви-
тельности к ионамдвухвалентных металлов. Так, Са-связывающие
сайты спонтанного ткзоцитоза оказались чувствительными к ионам
5т, Ва и Mg (рис. 32). B тоже время замена внеклеточных ионов Са
на ионы Ва или Mg полностью блокирует вызванную сипхроннуто
секрецию медиатора, а в растворах с ионами Sr синхронная секре-
ция хоть и сохраняется, но примерно на порядок меньше, чем в ра-
створах с Caz‘. Это позволяет считать, что Са- связывающие сайты
вызванного синхронного экзоцитоза чувствительны только к ионам
$т (Зефиров, Григорьев, 2009).
Синаптотагминьт - главньте Са-сенсоры экзоцитоза, действу-
ют когда мембраны синатгтическотт везикулы и НО достаточно сбли-
жены между собой и дестабилизированы. Семейство синанготагми-
нов у нозвоночньтх состоит‘ из 15 генов (Sudhof, 2002). Два белка
синаптических везикул, названных синаптотагптиттьт 1 и 2 -— явля-
784
ются Са - сенсорами избирательно синхронного экзоцитоза (Оеррепт
ct al., I994; Gerber, званы; 2002; Sorcnsen ct 211., 2003). Сейчас к
сенсорам синхронного экзоцитоза также причисляют синаптотаг-
мин 1Х (также его называют синаптотагмин \/)‚ который локализу-
ется в НО нейронов лимбнческой системы и стриатума (Хи ct 31..
2007). Синантотагмины 1 и 2 в некоторых нейронах коэкспрессиру-
ются (мотонейроньт), в других преимущественно синтезируется си-
наптотагмин 1. Синантотагмином 2 «богаты» ствол мозга и спин-
ной мозц тогда как в переднем мозге он обнаруживается в суше-
ственно меньших количествах (Leitzell, 2009).
Синантотагмины 1 и 2 имеют значительную гомологию в пер-
вичной структуре и состоят из короткой М-концевой внутри-вези-
кулярной последовательности, единственного трансмембранного ре-
гиона, короткого соединительного участка и двух цнтоплазматичес-
ких C2 доменов (рис. 33 ц10) (Sudhof, 2002). С2А и С2В домены
связывают 3 И 2 иона Ca, соответственно (Makler ет а1., 2002; Stevens,
Sullivan, 2003). Для запуска экзоцитоза синаптических везикул нс-
обходимо связывание ионов Са с С2В доменом, тогда как прикреп-
ление ионов Са к С2А домену участвует в усилении освобождения
медиатора, облегчая связывание Caz‘ с С2В доменом. Средство к
кальцию С2 доменов очень низкое (О‚5-5мМ)‚ но может в тысячу
раз увеличиваться при взаимодействии с мембраной, поскольку от-
рицательный заряд головных групп фосфолипидов обеспечивает до-
полнительную «силу» связывания ионов Са (Fernandez-Chacon ет
а1.‚ 2001). С2 домены синаптотагминов способны взаимодейство-
вать со SNARE комплексом (B ‘{aCTI{0CTl/I, с синтаксином и SNAP-
25) Ca -зависимым и независимым способами (Shin ет а!., 2003: Chen
et al., 2005).
Перед входом ионов Са синаптотагмин может действовать как
молекулярный «замок», ингибирующий ведомое ЗЁЧАКЕ-бегтками
сближение (данный эффект веротяно опосредуется С2А доменом).
Так, при нокауте гена синаптотагмина 1 в культуре клеток гиппо-
кампа мыши и нервно-мышечных синапсах Dr0.vop/zila наблюдается
увеличение спонтанного освобождения медиатора (Chika ет а1., 2009).
При этом спонтанный экзоцитоз остается Са-зависимьтм, как и у
нормальных мышей, однако активируется более низкими концент-
рациями кальция. Мутации, нарушающие связывание ионов Са си-
наптотагмином 1, устраняют как вызванный, так и спонтанный эк-
зоцнтоз. Таким образом„ синаптотагмин 1 выполняет двоякую роль,
с одной стороны, он - сенсор быстрого, синхронного компонента
$79
вызванного экзопнтоза и спонтанного тэкзошггоза, а с другой — эн-
догенный блокатор более чувствительного к кальцию «запасного»
сенсора спонтанного экзоцитоза, напоминающего сенсор вызван-
ного асинхронного освобождения медиатора (рис. 34 ц11). Так, в
синапсах коры мыши более 95% спонтанного экзоцитоза, вызыва-
ется связванием кальция с синаптотагмином-1, а при делеции гена
синаптотагмина- 1 , его роль начинает выполнять более чувствитель-
ный к ионам Са протеин (Xu et а1., 2009).
Вероятно, резервным сенсором спонтанного экзоцитоза явля-
ется белок ПОС2 (рис. 29 Ц7), который связывается со SNARE ком-
плексом в том же регионе, что и синаптотагмин, но имеет суше-
ственно большую аффинность к Са3‘ (Groffcn et а1., 2010). Спон-
танный экзоцитоз избирательно подавляют комплексины, которые
усиливают синхронное освобождение медиатора (Maximov е’: а1.,
2009). Сенсор асинхронного экзопитоза до сих пор неизвестен, в
чашеобразных синапсах Хелда его аффипность составляет 44мкМ
(кооперативность - 2), тогда как аналогичный показатель для синх-
ронного экзоцитоза достигает 38 мМ (Sun ct а1., 2007).
Bo многих синапсах при удалении генов синаптотагминов 1/11
избирательно страдает синхронный экзоцитоз, а асинхронное осво-
бождение сохраняется или даже усиливается. Сипаптотагмин 7 имеет
большее сродство к Са, чем синаптотагмины 1/11, но связьтвангте им
Са происходит куда медленнее. Делеция гена синаптотагмина 7, не
затрагивая быстрого экзоцитоза, снижает асинхронную секрецию
(Maximov et а1., 2008). Синаптотагмин 7 концентрируется в мембра-
нах АЗ, то есть выступает как Са сенсор плазматической мембраны.
Другим кандидатом на роль Са-сенсора асинхронного освобожде-
ния медиатора является синаптотагмин 4. Существует предположе-
ние о том, при асинхронном экзоцитозе отсутсвует взаимодействие
SNARE белков с комплексинами(рис. 34111 1), поэтому процесс сбли-
жения мембран идет медленнее (Tang et а1., 2006).
Современная модель механизма функционирования синапто-
тагмина основывается на ЗЁЧАКЕ-концепции гэкзоцитоза (рис, 33 ц10)
(Schaub ct а1., 2006; Tang ct а1‚, 2006; Diao et а1., 2009). В отсутствии
ионов Са синаптотагмин 1 взаимодействует со SNARE комплексом
и принимает оптимальную ориентацию по отношению к Са- каналу
(Shin et а1., 2003). 11ри открытии канала ионы Са связываются C C2
доменами синаптотагмина, в результате чего происходит два собы-
тия. Во - первых, синаптотагмин «переключается» на другой учас-
ток SNARE комплекса, что приводит к вытеснению белков комн-
80<
лексинов из паза в связке SNARE мотивов и, как следствие, SNAR F.
комплекс трансформируется в метастабильное/ттеустойчитзое состо-
яние (рис. 33 1110, рис. 34 1111). Во-вторьтх, «схвативший» каль-
ний сипаптотагмин с помощью своего гидрофобного участка С2
домена взаимодействует с анионнымтт фосфолипидами (особенно
фосфагиттиятсериттом) пресинатттической мембраны, что вызывает no-
ПОЛНИТСЛЬНОС механическое напряжение мембраны («удар но мемб-
ране»), запускающее слияние (Fernandez—Chacon е: а1.‚ 2001; $нс11то1`.
2004; Tang е: а1.‚ 2006). Причем синаптотагтхтитт предпочитает взаи-
модействовать с деформированными участками мембраны, кото-
рые существуют в области перешейка между везикулой и A3.
B других исследованиях было высказано предположение о том,
что комплекс Са-си1татгготагмитт-фосфатидидтсертттт приводит к до-
волнительному «накручиванию» SN/\P—25 на еиптакеии, что ини-
циирует слияние (ВЬаНа е: а1.‚ 2006). Причем для «правильного»,
вызванного кальцием, проникновения С2 домена синаптотагмина в
билинидньтй слой мембраны АЗ необходимо предварительное Са-
независимое взаимодействие сипаптотагмина с синтаксином и
SNAP—25 (Chika е: а1., 2009).
В случае вызванного асинхронного зкзонитоза сипаптотагмин
1/11 не участвует, а SNARE комплекс не стабилизирован комплекси-
нами и готовящиеся к слиянию мембраны недостаточно «стянуты»
ЗНАКЕ-белками, то есть между ними имеется зазор, для сокраще-
ния которого требуется дополнительное время (Tang е: а1., 2006).
Кроме того Са-сенсор асинхронного экзоцитоза связывает Са мед-
ленно (хотя с большим сродством) и не может мгновенно дестаби-
лизировать везикулу в состоянии прайминга, что также удлиннняет
интервал между повышением уровня Са и освобождением медиато-
ра (рис, 34 ц11).
Некоторые из синаптотагминов функционируют как Са-сенсо-
ры медленного экзонитоза электронно-плотиых транул (Grise et а1.‚
2007; Melia, 2007). Кандидатами на роль таких Саюенсоров являют-
ся еинатттотагмины 3, 6. 7, которые чувствительны к более низким
(чем синаптотагмип 1 или 2) котшентраниям ионов Са. наблюдае-
мым после прекращения входящего Са - тока (Sugita е: а1., 2002).
Синаптотагмин 7 в избытке зкспреесируется в не нейрональпьтх
тканях и служит Са-сенсором в зкзонитозе лизосом фибробластов,
еекретипа альфажлетками поджелудоной железы, гранул остеобла-
стов (Martinez е: а1., 2000; Gustavsson е: а1., 2009). Также синатотаг-
мин 7 присутствует на мембранах нейроэндокриттиых РС12 клеток
‘]
медиатор АТФ АДФ .
Ж ` О ‘I
v н" (L
��V� <.> <.> ч
/
ч", , ‘д
медиа-
тор
< о > "'‹ I )"
I -
О ‘н. (г H1» у
‘транспортер ”'$g;"=" Д; . м°д"а'
О V0-ceIMeHT
‘“"§‘L'X§'é‘ ":5?
_ V-
H-noMna :.(;._),.: ��x� д: Q ‘W
Puc.3 I ц9. Гипотеза роли протонной помпы в экзоиитозе си-
ноптических везикуш и освобождении медиатора (Моге1, 2003).
(1) Синаптическая везикула докирована и праймирована в АЗ,
ЗНАКЕ-комплекс свел противолежащие мембраны близко друг другу.
УО-сегменты Н-помпы, расположенные на мембране синаптической
везикулы и мембране АЗ, формируют сквозную пору между поло с-
тью везикулы и внеклеточной средой, которая пока закрыта. (2) Ионы
Са запускают открытие поры и секрецию медиатора. Пора может рас-
Ширяться (3), при этом УО-сегменты ПОМПЫ разбираются на субъеди-
ницы, или закрываться (4). Вслед за закрытием поры происходит деп-
раймирование синаптиче ской везикулы (5), которая переходит в доки-
рованное состояние. УО-сегмент объединяется с V1-cerMeHToM, B итоге
собирается Н-помпа, закачиваюшая протоны в полость везикулы (6).
Везикулярный транспортер обменивает протоны на молекулы медиа-
тора, и везикула вновь заподшяется медиатором. После этого \/1-домен
отсоединяется от УО-сегмента (7).
3 синаптотагмин С” C:;,:r
к _;$\/‘ »~\ Со - i or‘-
из? ‘зад’ ° ° ' °
Б связывающий эмАве-хомплвкс 0 _ °"""'"°""‘""
регион комплексина 1 .
С N
ff ff
C ‚ . N c‘ . -‘ 5
s.-\ ' ' -0-A о ' N
синаптобревин синтпксин 5NAp_25
B
синаптобревин Kounmxcmm
Caz‘
.__.._....p +
G9
(эпитаксии SNAP-25 С2В домен синаптотагмина
Рис. 33 1110. С инаптотагмин. Взаимодействия с комплексиналпж и
SNARE-K0.mmeKc0,-1-1 (Chapman, 2002; Rizo, Rozenmund, 2008).
А - Доменная структура синаптотагмина 1, содержащего два кальций
связывающих домена (С2А и С2В). Справа - взаимодействие ионов С а (крас-
ные кружки) с С2 доменами. Б - Четырех спиральная связка ЗНАКЕ-моти-
вов и фрагмент комплексина 1, содержащий центральную альфа-спираль.
Справа - наложение ЗНАКЕ-комплекса, стабилизированного комплекси-
ном-1‚ и синаптотагмина. Кружком обведен регион между С2В-доменом
синаптотагмина и дополнительной альфа-спиралью комплексина-1. В —
Слева - связывание дополнительной альфа спирали комплексина с С-кон-
ЦОМ ЗНАКЕ-комплекса ингибирует слияние. М-конец комплексина пока-
зан эллипсом с Х- в центре. Справа - при входе ионов Са С2В домен синап-
тотагмина (показан синим) вытесняет дополнительную спираль комплек-
сина, в итоге ЗНАКЕ-комплекс может дополнительно «затянуться», облег-
чая слияние мембран.
Ё ‘uni
cuuamoramun-1 с
.
сииаптобровин �z�� ' ' М Rm
выдрав _£.
CZ!
cvmvaxcuu-1
ЧК.
.>> ‚
.
_ -_. _ ‚ _ . .
под”. mum” открытие поры слияния Стадия | праимиига
комплексии \
© синх, иное иьв- Вощение о
OYKPNTMG ПОРЫ СПИЙНИП комплексии Стадия || прайминга
Рис. 34 1411. Возможная роль cuI1anm0ma2.a4uHa и колтлексинов в Са-
вызванном экзоцитозе (Tang et al., 2006).
Сверху - Докированные везикулы содержат SNARE комплекс в разоб-
ранном виде. В процессе прайминга происходит Частичная сборка SNARE-
комплекса. катализируемая белками Muncl 8, Munc 1 3 и RIM (1). Затем вези-
кула может участвовать либо в асинхронном, либо в синхронном освобож-
дении медиатора. В первом случае, вход ионов Са запускает (при участии
не идентифицированного сенсора C a) супер-скручивание ЗНАКЕ-комплекса
(2), приводящее к полному слиянию мембран (3). Во втором - необходима
дополнительная стадия Прайминга. При этом комплексины активируют пе-
реход SNARE комплекса в суперскрученное состояние (4), а затем они «за-
мораживают» ЗНАКЕ-комплекс в метастабильном состоянии. Входящие
ионы Са, связываясь с синаптотагмином 1, индуцируют его взаимодействие
с фосфолипидами и SNARE комплексом, а комплексины вытесняются из
связи со ЗНАКЕ-коплексом. Происходит открытие поры слияния (5), кото-
рая может расширяться (6, полное слияние) или закрываться («kiss—and—
run» ')K'30l1HTO3), поскольку этапы 2 и 5 могут быть обратимыми. Этапы 1 и
4 тоже вероятно обратимы. Этапы 1, 2 и 5 C a- зависимы.
А D2
D1
Ч
ч _ __ 5 ‘ь Р:
»,_:'/”: Ч `�;�
‘ 7/ - .
ц
1
I Д‘
В
а-ЗНАР
NSFC A‘ v—SNARE (синаптобревин)
uuc-SNARE : ' О
’ \ э
Мипс18 nt-SNARE О г. .
TDaH(I3-SNARE
Puc. 35 ц! 2. NSF u разборка SNARE комплекса (Kuner et а1., 2008).
А- Схематическое изображение NSF (видны 3 субъединицы из 6). Мо-
номер НЗР состоит из Н-концевого региона (красный), D1 (желтый) и D2
доменов. Б - Г ексамер D2 доменов НЗР, молекулы АТФ Показаны Шарика-
ми (Richards et а1., 1998). В- Одна из моделей действия NSF (гигантские тер-
минали кальмара). Синаптические везикулы содержат цис-ЗНАКЕ комп-
лекс, с которым связываются ос-ЗНАР и NSF (1). ос-ЗНАР И SNARE стимули-
руют АТФазную активность NSF, B результате ЗНАКЕ-комплекс разбирает-
ся в течение 3-9 с (медленное действие NSF) (2). NSF может оставаться
связанным с мембраной везикулы после отсоединения SNAP. Освобож-
денные SNARE белки формируют транс-ЗНАКЕ Комплекс (синяя стрелка)
(3). Готовые к освобождению везикулы могут секретировать медиатор в
ходе Са-Зависимой реакции слияния (4), которая регулируется быстрой ак-
тивностью NSF (менее 0.5 с). Для ускорения сортировки эктоПиЧеские
SNARE белки (например, синтаксин и ЗНАР-25 на везикуле) могут связы-
ваться с акцепторными белками (красная стрелка). Munc18 (красный) со-
единяется с везикулярными t-SNARE белками (3). После слияния эктопи-
ческие SNARE сортируются в корректный компартмент (Показано стрел-
кой) (4). Образовавшийся SNARE комплекс попадает затем в синаптические
везикулы в Процессе эндоцитоза. NSF- желтый, альфа-ЗНАР- зеленый, V-
SNARE (синий), t-SNARE (оранжевый).
81
и вместе с синаптотагминами 1 и 9, и усиливает зкзоцитоз mem-
p0HHO-IIJIOTIIHX гранул (Wang е: а1., 2005). Синаптотагкиин 4 обна-
руживается в составе электронно-плотньтх везикул нервных терми-
налей гпппокампа и заднего гипофиза, где регулирует чувствитель-
ность экзоцитоза к кальцию (Zhang ct al., 2009). Кроме того, некото-
рые синаптотагмины могут Са-незавиеимо контролировать экзоци-
тоз. Так. регулируемый (росфорилировапием со стороны протеин-
киназы А синаптотагмин-12 (пе связывающий ионы Са) ускоряет
спонтанное освобождение медиатора из НО гиппокампа (Maximov
е’: а1., 2007).
Распространено явление, когда два варианта синаптотагмина
совместно контролирую экзоцитоз. Так обстоит дело с секрецией
инсулина бетта-клетками поджелудочной железы, адреналина хро-
маффинными клетками надпочечников, где в дуэте работают си-
наптотагмин 1 и 7 (Gustavsson ct а1., 2009). B ВОЛОСКОВЫХ клетках
слуховой системы в запуск синхронного экзоцитоза, наряду с Ch-
наптотагмином IV, вовлечен выеокоаффинный Са-еенсор - везику-
лярный белок отоферлин, содержащий шесть С2-Доменов и спо-
собный соединяться со ЗНАКЕ-белками и Са-каншюм. Чем больше
ионов Са связывают С2 домены отоферлина, тем сильнее он взаи-
модействует с белками синтаксин-1 и SNAP-25, входящими в со-
став ЗНАКЕ-комплекса, и больше вероятность экзопитоза. Это один
из факторов, обеспечивающих линейную зависимость между вхо-
дом ионов Са через 1ютенциал-зависимые каналы L-TI/ma(Cavl.3)14
количеством освобожденного глутамата (Dulon ct а1., 2009).
Предполагается, что дифференциальная экспрессия синапто-
тагминов определяет особенности Са-чувствительности процессов
экзоцитоза в НО различных нейронов, также от набора синаптотаг-
минов зависит соотпотпение синхронного, асинхронного и спонтан-
ного экзоцитоза в отдельных АЗ.
82
Шапероны и экзоцитоз.
Разборка SNARE комплекса
NSF. После слияния, но перед НОВЫМ раундом экзоцитоза (Galli,
Ilaucke, 2004) происходит разборка ЗНАКЕ комплекса (рис. 35 ц12)
при помощи щаперона NSF (Н-этилмалеимил-чувствительный бе-
лок слияния). Шапероны - это белки-«гувернантки», помогающие
вновь синтезирующемуся белку, а также белку, конформация кото-
рого искажена, приобрести правильную пространственную струк-
туру. Они распутьтвают‘ белковые «переплетения» и не допускают
«незаконные» белковые взаимодействия. Шаперон NSF В клетке пре-
бывает в виде гексамера, каждый мономер которого включает Н-
терминальный домен (NSF-N), два ААА (АТРазе associated with various
cellular activities) домена: каталитический NSF—Dl И струкчурттьтй NSF-
D2 (отвечает за объединение мономеров NSF B ГСКСаМСр). Вначале,
SNARE комплекс распознается белком альфа-ЗНАК’ (ко-шаперон,
soluble NSF attachment protein / растворимый NSF присоединяющий
белок), который одновременно встраивается в мембрану. После это-
го NSF связывается с помощью NSF-N и NSF-D1—;1oMeHoB со SNAP,
получая доступ к «скрученным» ЗНАКЕ-белкам, также возрастает
его АТФазная активность (NSF-D1). NSF «осторожно» распутывает
4-х спиральную связку SNARE мотивов (рис. 35 Ц12)‚ впоследствии
синаптобревин остается в везикулярном фрагменте мембраны, а
SNAP—25 и синтаксин направляются в плазматическуто мембрану
(Scales ct а1., 2001 ).
Не совсем ясно, на какой стадии работает NSF. Одна модель
предполагает действие NSF непосредственно после слияния мемб-
ран, в этом случае проще представить процесс сортировки у-(си-
наптобревин) и г-(синтаксин и ЗНАР-25) SNARE белков (Littleton ct
а1., 2001). Т-ЗНАКЕ остаются в пресинаптической мембране, а си-
наптобревин захватывается в везикулу в процессе эндоцитоза. В
птутаматэргических двигательных НО Drosophila собранный ЗНАКЕ-
комплекс «отплывает» в сайт эндоцитоза, где разбирается перед эн-
доцитозом NSF, 3ElTCM освободившиеся t—SNARF. перемещаются в
A3 (Kawasaki, Ordway, 2009).
B соответствие с другой моделью NSF разбирает ЗНАКЕ-комп-
лексы перед слиянием (Nichols et al., 1997). При этом синаптичес-
кая везикула и мембрана A3 содержат полный набор ЗНАКЕ-бел-
ков, собранных в ЗНАКЕ комплексы отдельно на каждой из поверх-
83
„остей (яте-положение ЗНАКЕ-белков). 1 Перед докированием с цис-
ЗНАКЕ-комплексами связываются альфа-ЗНАР н NSF. Альфа-ЗНАР
и ЗНАКЕ-белки усиливают АТФазттую активность NSF, B результа-
те ЗНАКЕ-комплекс разбирается: на мембранах везикулы и A3 no-
являются ЗНАКЕ-протеины, готовые к скручиванию в ЗНАКЕ-ком-
плекс. Освобожденный синаптобревин синаптической везикулы и
расположенные на мембране A3 сиптаксин и ЗНАР-25 формируют
новый ЗНАКЕ комплекс (транс-положение ЗНАКЕ белков). После
слияния везикулярной н преситтатттической мембран эктопические
(локализованные «не на своем месте») SNARE белки могут связы-
ваться с акцепторньтми белками, которые отсортировывают их в над-
лежащий регион. Например, белки АЗ Munc18 И spring соединяются
с везикулярными t—SNARE белками - синтаксинои и ЗНАР-25, в
итоге после зкзоцитоза эти белки остаются в АЗ, а не захватывают-
ся эндоцитозом в состав везикулы. В работе Kuner е: а]. (2008) зта
гипотеза бьтла подтверждена с использованием фотоактивируемого
ингибирующего NSF пептида (рис. 35 1112). Эти данные согласуют-
ся c тем, что «дуэт» SNAP—NSF намного эффективнее расплетает
цис-ЗНАКЕ-компдтексы (Winter е: а1., 2009). Пребывание ЗНАКЕ-
комплексов в нис-состоянии может служить механизмом, предотв-
ращающим неконтролируемые процессы экзоцитоза. Разборка цис-
ЗНАКЕ-комнлексов плазматических мембран в РС12 клетках про-
текает почти в 30 раз быстрее, если они пребывают на территории
обогащенных холестерином микродоменов мембраны, коими явля-
ются A3 (Bar-On е: а1., 2009).
Тандем SNAP И NSF способен разбирать комплекс томозина с
синтаксипом и ЗНАР-25, что может регулировать доступность син-
таксина или ЗНАР-25 для участия в образовании ЗНАКЕ комплекса
(I-Iatasuzawa е: а1., 2003). NSF может действовать на ЗНАКЕ комп-
лекс B ходе реакции слияния, способствуя правильному скручива-
нию ЗНАКЕ-белков и олигомеризации ЗНАКЕ-комплексов вокруг
места посадки везикулы на пресинаптическую мембрану (Tokumaru
е: а1., 2001). SNAP и NSF принимают участие в отделении белка
динамина от SNAP—25 и синтаксина (Ре:ег5 е: а1., 2004). Как будет
показано в следующей главе, белок динамин может образовывать
сжимающийся воротник в области перешейка между образующейся
везикулой и плазтиатической мембраной во время эндоцитоза. Взаи-
модействие динамина C t—SNARl~.I может обеспечивать закрытие поры
слияния, не допуская коллапса (полного встраивания) везикулы в
пресинаптическую мембрану. (Ёледовательно, раскручивая комплекс
динамитта и t-SNARE белков, NSF МОЖСТ управлять «судьбой» поры
слияния. Не исключено, что некоторые изоформы NSF действуют
на SNARE комплексы перед зкзоцитозом или сразу после образова-
ния поры слияния, в таком случае происходит депраймирование ве-
зикулы или закрытие поры слияния, соответственно (Мау е: а1., 2001 ;
Brungcr, 2005). B некоторых секреторных клетках освобождение ме-
диатора через «скоротечную» нору слияния контролируется фосфо-
рилированием NSF нротеинкиназой С (Cousin, Robinson, 2000;
Matveeva е: а1., 2001). Помимо связанной со ЗНАКЕ-комплексом
активностью NSF может воздействовать на GluR2 еубъединицу
АМРА-рецепторов, бегта-2-гхдретторецепторы, а также способен кон-
тролировать реакции нитрозилирования и фосфорилирования бел-
ков. АлЬфа-ЗКАР является не только помощником NSF, НО и имеет
собственную функцию в экзоцитозе: SNAP может связываться со
SNARE мотивом синтаксина, предотвращая его участие в сборке
SNARE комплекса (Barszczewski е: а1., 2008).
Другие шапероньт. Интересно, что до формирования SNARE
КОМПЛСКСЗ отдельные его компоненты могут правильно «сворачи-
ваться» (фолдинг) шапероном Hsc70 (70 кДа heat shock cognate
protein), который «наводится» на свои мишени ко-шапреоном CSP
(cysteine string protein) (Young et а1., 2003). СЗР включает М-конце-
вой З-домен (именно он придает белку свойства ко-шанерона) и
центральную нить (string) ИЗ остатков цистеина, к которому присое-
диняются нальмитиновьте (гидрофобные) группы. CSP ассоцииру-
ется с синантнчеекттмтт везикулами, хромафдрттттттьттхти, панкреати-
ческими зимогенньтми, инсулитт-содержащимн, муниновыми грану-
лами (Park е: а1., 2008). Мыши с делецией СЗР-альфа развиваются
нормально, но через 2-4 недели после рождения у них проявляется
массивная нейродегенерация (Fernandcz—Chacon е: а1., 2004). Внача-
ле было показано участие CSP B регуляции Са- зависимости экзо-
цитоза, поскольку при мутации CSP уменьшалась зависимость сек-
реции медиатора от величины входящего Са тока (Umbach е: а1.,
1994). B отсутствие СБР-альфа в двигательных НО мыщи к 18 сут-
кам постнатального развития происходило сильное угнетение синх-
ронного экзоцитоза, а с помощью высоких концентраций внекле-
точного Caz’ можно было восстановить «нормальную» вероятность
зкзоцитоза (Ruiz е: а1., 2008). Впоследствии стало понятно, что
CSP вовлечен в различные стадии секреторного процесса и стаби-
лизацию белков экзонитоза (Evans е: а1., 2003). CSP евязьтвается со
SNARE белками и через гетеротримерттьтй О-белок с Са-каналом N-
85
типа. Причем CSP способствует обмену ГДФ на ГТФ в альфа субъе-
динице (ЭБ-белка, то есть участвует в его активации (Natochin ct а1.,
2005).
В дополнение к постоянно экспрессирутощимся шаперонам в
нейронах в ответ на стресс начинают синтезироваться дополнитель-
ные цтапсроньт. В частности, после обработки гелдаътакптцитчом
(geldanamycin),Te11:10B0ML11o1<e в нейронах появляется белок Н5р40,
который взаимодействует с СЭР-альфа. Образовавшийся комплекс
локализуется на мембране ситтатттическттх везикул и плазматичес-
кой мембране, и способствует поддержанию секреции медиатора в
течение действия стрессового фактора, а также предотвращает пре-
синаптическую Hc1“1por1erc11epa11mo(Gibbs ct а1.‚ 2009). Субстратами
для комплекса С$Р/Н$с70 или СЗР/Н5С4О являются ЗНАКЕ-белки,
Са-каналы, белок гантингтин, РгРс, гитьфа-синуклеин, атаксин 1 и
3 (Daugaard et а1., 2007).
КаЬЗ-ГТФаЗЫ в экзоцитозе
Особое место в регуляции экзоцитоза и везикулярного цикла
занимают специальные ГТФазы‚ так называемые Rab — белки. Rab
— бСЛКИ представляют собой низкомолекулярные ГТФаЗЬт, регули-
рующие формирование A3, везикулярный транспорт, секрецию и
эндоцитоз. Rab семейство участвует в Движении везикул вдоль ци-
тоскелетных элементов, контролирует реакции прикрепления, до-
кирования, а также слияния везикул (рис. 36) (Zerial, McBride, 2001).
Эти белки могут пребывать в двух состояниях активном, в котором
Rab белок связан с ГТФ, и неактивном, когда Rab «загружен» ГДФ.
Активная КаЬ-ГТФаза может взаимодействовать C различными бел-
ками (так называемые эффекторные протеины), изменяя их функ-
циональное состояние (активируя или ингибируя). С течением вре-
мени ГТФ гидролизуется до ГДФ за счет собственной фермента-
тивной активности Rab, В результате Rab деактивируется. Подсе-
мейство Rab3 протеинов включает 4 изоформьт (а, Ь, с, d) с молеку-
лярной массой около 25кДа, которые экспрессируются в секретор-
ных клетках и специфично связываются с синаптическижти и други-
ми секреторными везикулами только в активном ГТФ-загруженном
состоянии (Schlutcr et 211., 2004). Rab3 молекулы могут прикреплять-
ся к мембране посредством расположенных на (Ё-конце двух С-20
изопрениловьтх липидных «якорей» (тераннл-гераттттл петлей), кото-
86
рьте присоединяются к двум остаткам циетеипа Rab3 BCKOpC ПОСЛС
его синтеза гератнш-герапндгграттсферазой. В неактивном ГДФ заг-
руженном состоянии Rab3, эти гидрофобные дополнения спрятаны
во «внутреннем кармане» белка, а при активации Rab3 (ГТФ-КаЬЗ)
они выставляются наружу и встраиваются в близлежащие мембра-
ньт, придавая Rab3 свойства мембранного протенна (Johnston е: а1.,
1991). Rab3a наиболее широко распространенная в мозге изофор—
ма, связываютцаяся с сннатттическитхти везикулами.
В ходе везикулярного цикла наблюдаются циклы присоедине-
ния -отсоединения Rab3 белка (рис. 36). Ассоциированная с мемб-
раной везикулы молекула ГТФ-КаЬЗ взаимодействует C некоторыми
белками (эффекторатии ГТФазьт), вовлеченными в секрецию (раб-
филин За, RIM). B ходе экзоцитоза следует гидролиз ГТФ, и Rab3
отсоединяется от эффекторных белков и везикулы (Star ct а1., 2005).
I‘L1CD-Rab3 форма удаляется с поверхности везикулярной мембраны
GI)! протеином (GDP dissociation inhibitor), который активируется
входом ионов Са. Возвратившийся в цитозоль Rab3 обменивает ГДФ
на ГТФ (чему способствует GEF белок, фактор обмена гуаниловых
нуклеотидов) и затем повторно связывается с везикулой.
Мутации всех 4 форм Rab3 J1C'l'a."II~»HBI, тогда как нарушение толь-
ко Rab3a белка характеризуется синатттическими дефектами (Nonet
et а1., 1997). При генетическом недостатке Rab3a y мышей нервные
термипали гиппокампа освобождшти болыне медиатора на Са- сиг-
нал (Geppert et а1., 1994), а в мшистьтх волокнах мозжечка феномены
долговременной потенциации и депрессии не индуцировались
(Castillo ct а1., 1997). Вероятно, слабый фенотип у мутантов Rab3a
не отражает полного диапазона функций Rab3a, поскольку Rab3b И
Rab3c белки могут выполнять схожие роли, выступать в качестве
«дублеров» Rab3/\.
Идентифицировано два основных типа Rab зффекторов, кото-
рьте имеют высокое сродство к ГТФ-КаЬЗ, но не к 1ДФ-КаЬ3, — раб-
филин и К1М1альфа/2альфа (Wang е: а1., 1997). Оба белка имеют па
ГЧ-конце цинк-Йпёет домен, взаимодействующий с Rab3, В центре
сайт фосфорилирования протеипкиназой А и два С2 домена на С-
конце.
Одна из функций Rab3 и его эффекторов, вероятно, заклю-
чаться в «цензуре» последней стадии экзоцитоза. Сверхзкспрессия
или микроинъекция Rab3A ингибирует экзоцигоз в РС 1 2 и хромаф-
финных клетках (Holz et а1., 1994; Schluter ct а1., 2002). Наоборот,
делеция гена Rab3A y мышей усиливает экзоцитоз в гиппокамналь-
87
ных синапсах (Осррегг е: а1., 1997). Кроме того, Rz1b3A (через эффек-
торы / или сам) способен контролировать формирование и стабиль-
ность SNAR15. КОМПЛЕКСЕ! (Coppola el а1., 2002). B отсутствие R21b3/\
в хромацлритптьтх клетка пора слияния стат-товится более узкой и су-
шествует необычно длительное время перед полным слиянием ве-
зикулы с плазматической мембраной (Wang, et 211., 2008).
Рабфилин — растворимый белок, который связывается с си-
наптическимп везикулами в присутствие ионов Са не напрямую, а
через посредничество ГТФ-КаЬЗ (Umbach е: а1.. 1998). Также С2В
домен рабфилина способен Са-независимо соединяться со SNARE
белком - SN/\P—25. Сначала комплекс 1"TCD—Rab3a/pa6(1J11;11111 может,
действуя на БЪЗАКЕ-комттттекс, итнибировгггь Са-вьтзванньтй экзо-
цитоз в АЗ (Deak ct 31., 2006). Вероятно, поэтому при нокауте раб-
филина наблюдается значительное увеличение скорости восстанов-
ления секреции медиатора после синаптической депрессии (Castillo
et a1., 2002). Однако в АЗ случается превращение ГТФ-КаЬЗ в ГДФ-
Rab3A, В результате рабфилин отделяется от КаЬ-белка и может воз-
действовать на SNARE комплекс самостоятельно, облегчая расши-
рение норы слияния (Lin е! а1., 2006). Таким образом, белок Rab3 (в
комплексе с рабфилином) способен ограничивать освобождение
медиатора, пребывая в ГГФ-загруженном состоянии, а переход Rab
в выключенное состояние, освобождает рабфилин от «пагубного»
влияния Rab 11 рабфилин стимулирует зкзоцитоз (рис. 36). То есть
эффекты рабфилина в комплексе с Rab и самостоятельные эффекты
рабфилина противоположные.
RIM — каркасный белок АЗ, способный одновременно взаимо-
действовать C Rab3 и 1Vlunc13,11p1/111eM его C2 домен не может соеди-
няться с ионами Са, а имеет сродство к синаптотагмину 1 и альфа-
липринам, Богатый пролином регион RIM связывается с ЗНЗ-доме-
ном ШМ-связываюлцего белка, который «цепляется» за потенциал-
зависимый Са- канал (Кавег, Sudhof. 2005). RIM способен напря—
мую соединяться с бета-субъединицей потекщиал-зависътмого Са-
канала АЗ. Взаимодействие Rab3a—RlM-Ca—1<a11a:1a участвует в удер-
жании сипаптнческкэй везикулы вблизи ворот для входа ионов Са и
ингибирует инактивацию Са-канала (Uriu е: а1.‚ 2010). Партнерами
RIM являются белки /\3(ELKS/CAST).SNAP-25,Cz1—1<a11a:11\1-T141111.
Ёрас 2, белок 14-3-3. Взаимодействие Rab3 и RIM]. предположи-
тельно, вовлечено в докирование, после чего ГТФ-КаЬЗ переходит
В l‘1I<D—Rab3(p1/1c.36).B11epB11o—M1,1111e11111,1x синапсах мьнни мутация
Rab3a снижает число докированньтх везикул (Coleman ct 111.. 2007).
88
При нокауте гена RIM 1, ИЛИ Rab3A B гиппокамне количество вези-
кул в АЗ не уменьшается (Gcppert et а|.‚ 1997; Schoch ct а1.‚ 2002),
однако после ритмической стимуляции количество докироваттньтх
везикул снижается и регистрируется более тлубокая синатгтическая
депрессия (Leendcrs е: al., 2001).
синаптическая ВЭЗИКУЛЭ
.________9_Ё_Р;_`____ _ `�&� Q rm:-Rabsa
.~‘~— -' ' О ГДФ-Нарзан
k - О . Rab3a~GD|
-рабфипин ЗА
RIM
‘Ca 2' C3 °
GAP
Рис. 3 б. Роль Rab3a б‘ экзоципюзе и освобождении meduamopa
(Lin 01:11., 2007 с изменениями).
Связавшая ГТФ форма Rab3a встраивается в мембрану вези культ
и соединяется с белком рабфилином За. B процесс докиротзаттия си-
наптттческой везикулы вовлечено взаимодействие ГТФ- Rab3a с бел-
ком АЗ RIM. При повышении цитотшазматического уровня кштьция
белок GAP (активирующий ГТФазу протеин) и рабфилитт За воздей-
ствуют на Rab3a. увеличивая ГТФаЗануЮ активность, Rab3a переходит
в ГДФ-загруженное состояние. ГДФ-КаЬЗа взаимодействует с белком
GDI (ингибитор диссоциации гуаниловьтх нулеогидов), который также
активируется кальцием, и комплекс II[<I>-Rab3a- GD] удаляется с но-
всрхности везикулы. При участии белка GEP (протеин обмена гуани-
ловьтх нуклеотидов) Rab3a избавляется от ГДФ и захватывает из цито-
золя молекулу ГТФ, переходя во «включенное» состояние. Впослед-
ствие, при содействии ОЕР, ГГФ-КаЬЗа высаживается на поверхность
везикулярной мембраны. Подробнее о роли Rab3a зависимой актива-
ции рабфилина и RIM объясняется в ‘тексте.
89
КаЬЗа непосредственно взаимодействует еще с одним синап-
тическим белком к синапсином, способным «склеивать» везикулы
между собой п с цитоскелетом (см. синапситты). Интересно, что с
одной стороны сииапсин стимулирует связывание ГТФ п «закреп-
ление» КаЬ-белка на везикуле, а с другой - ГТФазную активность
КаЬ-белтка, в результате которой Rab3a yJI'c1II5IC'I‘C${ C поверхности ве-
зикулы. В свою очередь Rab3a ингибирует активности синансигта,
направленную на кластеризацию везикул. Таким образом, КаЬЗа,
влияя на сипапситт, способствует выходу везикулы из состава резер-
вного пула и адресует везикулу в АЗ, где регулирует процессы до-
кировапия и экзопитоза. Это согласуется с угнетение транспорти-
ровки синаптических везикул в АЗ y мышей, липтепньтх гена Rab3a
(Leenders ct а1., 2001).
Таким образом, КаЬЗа белок принимает участие в большин-
стве, если пе во всех, стадиях везикулярного цикла. Rab3a белок в
активном состоянии способствует доставке везикул в АЗ, стыковке
везикул с сайтами экзонитоза, а также начальным этапам праймин-
га, однако охраничивает протекание финальных стадий зкзоцитоза.
Именно поэтому считают, что Rab3a белки участвуют в механизмах:
выбора везикулы для зкзонитоза и ограничивающих количество
освобождаемых квантов медиатора в АЗ (Fischer von Mollard ct al.,
1990). Переход Rab3 белка в неактивную форму дает «зеленьтй свет»
праймироваттттой везикуле на слияние. Очень заманчивой является
идея, представляющая КаЬЗа белок — «часами» экзоцитоза и вези-
кулярного цикла в НО (Giovedi ct а|., 2004).
Кальциевые каналы и
экзоцитоз
Са-каналы плазматической мембраны. Процесс зкзоцитоза
синаптических везикул в физиологических условиях запускается
входом ионов Са через потенциал-управляемые Са-каналы АЗ во
время ПД (Зефиров, Ситдикова, 2010). Через Са-канадты пресинап-
тической мембраны могут проходить также и некоторые другие двух-
Валентные катионы, такие как Sr“, Ва" и активировать зкзоцигоз
синаптических везикул. Другие двухвалентпые катионы, например
ионы Cd, блокируют (Га-каналы плазматической мембраны (Van der
Kloot.Mo1go, 1994).
90
мембрана синаптической °V‘“a’”°’3”"”"“
Be3|4K)"1b' синаптобревин
\
@ת� «а
„ладит
‘fix--.
(к
›. /
><' т» v~ ��� к `q��
‘z‘=»%222§§2?.?.-'f§§§- .>.§§</; г;
г? цв‘ *
.- га}.
SNAP—?.5 ' °
�g�� .35 :
тёк дъдхяххгк xxg é
СИНТЗКСИН
Са-канал /
Рис. 3 7. Связь C a--KaHa.7a активной зоны с белками SNARE-K0411-
n.r1eKca(Calterall, 2000 с изменениями).
Са-кахтал непосредственно взаимодействует со ЗНАКЕ-комплек-
сом, что с одной стороны - облегчает процесс докирования синапти-
ческой везикулы, а c другой — предотвращает случайное открытие Са --
капала. Са канал имеет сайты связывания с синаптотагмином, необ-
ходимые для правильной ориентации синаптотагмина (Са-сенсора) но
отношению к каналу. В more синаптотагмин занимает положение близ-
кое к устыо канала, те мгновенно после открытия канала будет наблю-
даться максимальная концентрация ионов Са.
Первоначально по порогу активации были выделены высоко-
пороговые, активируюшиеся при значительных сдвигах мембран-
ного потенциала, и низкопороговые Са-каналы, открывающиеся при
потенциалах близких к потенциалу покоя. Далее на основе чувстви-
тельности к дигидропиридинам (ДГП) высокопороговые каналы
были разделены на ДГП-чувствительные (L-Tun, long lasting) и ДГП-
нечувствительные (N-Tun, neither T nor L или neuronal). К блокато-
рам Ь-типа Са-канагяов относятся нимодипин, верапамил, тетрац-
дипин, дилтиазем, 0-600, этанол, ионы Cd, ТОКСИН морской змеи
Conus Geographus, называемый омега-конотоксином GVIA. Блока-
торами N—Tnna Ca—1<anan013 являются омега-конотоксигх GVIA, а так-
же ионы Cd, Ni. Со, La, Sn. Другой тип высоконороговьпх каналов.
91
обнаруженпый в клетках Пуркинье мозжечка и названный Р-тип
(Purkinjc) Са-каналов, блокируется ядом воропковых пауков, пеп-
тидным токсином FTX, OMCI‘a-aI‘a'I‘OKCI/IHOM [VA Н ионами Cd, Co,
La. При исследовании (Да-каналов, чувствительных к агатоксипу,
встроенных в ооциты, оказалось, что часть каналов имеет низкую
чувствительность к агатоксину (200 НМ), тогда как чувствитель-
ность Р-типа каналов намного выше (20 нМ). Было предположено,
что имеется другой тип вьтсокотторотовых каналов, который назва-
ли О-типом. Различия между Р- и О-типами Са-каналов незначи-
тельны, поэтому их часто объединяют и обозначают как Р/О-тип
Са-каналов. Низкопороговьте каналы были названы Т-типом капа-
лов (Т- transient). ПОКЗЗЗНО, что антигипертензивное вещество ми-
бефрадил селективно блокирует Т-тип Са-каналов (Ретеи-Кеуез.
1999). Поскольку L, N. P/Q, T-TIIHH Са-каналов являются потенци-
ал-зависимьтмтт и имеют инактивапионттьте ворота заблокировать
кальциевый вход можно длительной деполяризацией, переводящей
каналы в состояние инактивации. Также для этих целей можно вос-
пользоваться смесыо, содержащей блокаторы Са-каиштов - дитид-
ропиридин, омега-конотоксин GVIA и омега-агатоксин IVA B ВЫСО-
ких конпентраттиях. Однако после этого сохраняется остаточный Са-
ток еще через один тип каналов, которые получили название R-
каналы. Потенциал активации К-типа Са-каналов находится меж-
ду потенциалами активации высоко- и низкопороговьтх каналов. Ак-
тивность К-типа каналов блокируется ионами Ni В низкой концент-
рации (Meir ct а1 , 1999), Тип Са- каналов, обеспечивающих секре-
цию медттатора, различается в зависимости от объекта исследова-
ния. Если говорить, например, о крысе, то в нервно-мьппечттом си-
напсе секреция осуществляется за счет каналов N‘, B сетчатке - L-
TI/Ifla, а в центральных синапсах обычно участвует несколько типов
(в основном N И P/Q). Секреция медиатора в двигательных НО
Омара контролируется каналами Н-типа, лягушки ——N, МЫШИ — L, N
И P/Q, a человека - Р-типа.
Функция Са- каналов в процессе тэкзоцитоза синаптических ве-
зикул не ограничивается проведением ионов Са. Каналы P/Q И N
типа, обеспечивающие секрецию медиатора в подавляющем боль-
Шинстве синапсов, способны непосредственно взаимодействовать
со SNAP-25,CMIIT£iKCI1IIOM,CI/lUaIITO'1‘21I‘MHHOM и RIM (рис. 37) благо-
даря наличию специального специфического синпринт-сайта
(Synprint synaptic protein interaction) В бета-1 субъединице и во
внутриклеточной петле между доменами П и Ш альфа-1 субъедини-
92
цы (Shcng ct а|., 1994, Meir ct a|., 1999). Применение пептидов.
взаимодейсгвуютцих с этой питоплазматической петлей, пли ее фос-
форилированпе протеинкиназой С и САМКП ингибирует взаимо-
действие канала со SNARE белками. В результате изменяется зави-
симости экзоцитоза от ионов Са и угнетается синаптическая пере-
дача за счет нарушения процесса докирования синаптических вези-
кул. Однако взаимодействие ЗНАКЕ-белков е каналом может нс толь-
ко способствовать экзоцитозу, но и ограничивать его. Так, синтак-
син снижает функциональную активность N— И О-типов каналов за
счет стабилизации процессов инактивации в канале (Bezprozvanny
et 211., 1995). Таким образом, связь Са-канала с синтаксином и SNAP-
25 участвует в докировании синаптической везикулы и предотвра-
щает процессы случайного экзоцитоза докированных везикул.
Концепция кальциевых
микродоменов и макродоменов
Модельные исследования в 80-90 х прошлого века показали,
что внутриклеточная Са концентрация нарастает и спадает очень
быстро в непосредственной близости от Са- канала, когда он от-
крывается и закрывается (Chad, Eckcrt, 1984, Simon, Llinas, 1985).
Таким образом, быстрое увеличение, а затем снижение вероятнос-
ти секреции медиатора во время ПД может быть объяснено очень
близкой (десятки нм) колокализацией Са-канала и синаптической
везикулы. Методика освобождения связанното внутритерминального
кальция путем вспышечного фотолиза позволила установить, что
для инициации секреции необходимы микромолярные уровни ионов
Са — от 300-400 мкМ в гигантском синапсе кальмара и биполярных
клетках золотой рыбки, до 10 мкМ в чашевидных синапсах Хелда
(Schncggenburger, Nehcr , 2000, Thoreson et al., 2004). Если учесть,
что уровень Цитозольного Са в покое составляет около 50 нМ, то
максимально близкое расположение источника ионов Са и триггера
экзоцитоза является рациональным и энергетически выгоцньтм ре—
шением, поскольку Са токсичен, а его удаление из цитоплазмы ~~
достаточно энергоемкий процесс. Подобные построения согласуют-
ся сданными о том, что уровень Цитозольного Са в НО лягушки не
превышает 2-3 мкМ даже при высокочастотной активности (Suzuki
et al.. 2000).
e:1annorCa":<aHana
д д .
концентрация ионпв Ca, МКМ
ВРЕМЯ, МС
О 10 20 30
600
._.~.——-——'—"'
400
200
0 . I . н . .
10 20 30 40 50 60
расстояние от канала, нм
Рис. 38. Изменения конценпцлгцит: шшов Ca 80 тоннели и про-
cmpaucnme npu ()mI\'])hlI71llll Ca— канала сиателтппттшеское моделиро-
(mime) (Augustine ct 211., I991 : Ncher, 1998).
Сверху - схематическое расположение сииаптической везикулы
вдали (сотни нм) и вблизи (ДССЯТКИ нм) от Са- канала. Слева динами-
ка изменения концентрации ионов Са y BC'3VlKy.TIbI. Справа — зависи-
мость коттЦетгтраиии ионов Са от расстояния до Са- канала через 0.3 мс
после его открытия. Данные моделирования по методу Монте Карло.
72161 1. Динамика Ca” y сииантической везикулы, расположен-
ной на различном расстоянии от от крытого Са-катта:1а(Хе1тсг‚ I 998).
200 HM откопала
20 нм от канала
Концентрация ионов Cu около 5-! О хткМ
Коштетгграцня ионов Га около 100 мкИ
Концентрация ионов Ca тшрастиет и
ешщатет’ тат примерно т О мс
Коттненярдцтш ионов Ca xmpzxclucr и
C!l£i;I‘ciL‘l' ill МСНСС ЧСМ I НС
В равновесии с мобнльньтхттт fwydwcpzlxm
СИЛЬНО зависит от буферов: ЬОГА
Эффективен также как н ВАШ А
Внутриштетотттиы Konucmpumm попов Cu
OHpC,‘IL‘.l&lClC§{ ЦК! ИВПОСПЛО HL‘CKk).'ILRH.\
COCCJJIHX КШШЛОВ
Не в pzumouccmx с чобильньпти буферами
Меньше швисит от буферов; ВСЕ I А
прнкптчески не аффектннетт
Внутршететочная концентрация ионов Cu‘
L)]lpC,‘lC‘.Hl(.'l(.‘}{ B()CHUBH()\l()L1HH\1K2lH£1l\)\l
93
94
‚2[0К11'$З'1`еЛЬС'ГВг1 ПЗЛИЧНЯ ЛОКЦЛЬНЫХ КОРОТКОЖИВУЛЦНХ КЦЛЬЦИС-
aux облаков в прнмембрапттых слоях гигантских иреситтаттгическътх
терминалсй кальмара бьтлн получены в экспериментах с высокоско-
ростной регистрацией („За - сигналов с разрешением в доли мкм.
Нмиджинг низкоаффттттттого флуоресцентного Са иттдикатора акво-
рина показал наличие отдельных пятен диаметром менее 1мкм, при
этом длительность ‚гпомиттисцентного сигнала была не более 1 мс
(Llinas ct 211., 1995). Концентрация ионов Са в таком облаке, соглас-
но поттсчетазт, достигала сотен мкМ. Аналогичные данные были по-
лученьт в экспериментах на культуре нервно-мьтшечиьтх синапсов,
слуховых волосковьтх клетках, биполярных нейронах, хромаффин-
пых клетках и др. (Augustine, 2001).
Таким образом, была сформулирована концепция кальциевых
микродоменов (иногдгт их называют нанодомсттами), согласно ко-
торой секреция нейротранстютиггера осуществляется за счет кратков-
ременного (около 1 мс), строго локального (0.5—1 мкм) и значитель-
ного (до сотен мкМ) повыптеттття концентрации ионов Са в непос-
редственной близости от устья открытого Са- канала, расположен-
ного рядом с сттттаптической везикулой (рис. 38, 39 , табл. 1).
До сих пор ведутся споры, относительно того, сколько Са- ка-
налов обеспечивает экзоцнтоз одной везикулы. Существуют гипо-
тезы «одиночного домена» (один канал) и «перекрывающихся до-
менов» (несколько каналов). Во втором случае предполагается бо-
лее высокая коонерагивносгь ионов Са (Schneggenburger, Neher,
2005). Можно думать. что в реальных условиях существуют оба ме-
ханизма, а выраженность того или другого зависит от активности
синапса и особенностей объекта (пространственное распределение
Са- каналов, вероятность открытия канала при деполяризации, про-
водимость каналов, электрохимический градиент для входящего но-
тока ионов Са и др.).'1`ак в чашевидиом синапсе Хелда значитель-
ная часть Са- каналов открывается в ответ на одиночный TILL И
экзоцитоз везикулы ‘запускается благодаря работе многих каналов
(Schneggenburger, Neher, 2005). Предполагается, что Са- каналы в
этом объекте расположены кластерами, вокруг которых на различ-
ных расстояниях докированы везикулы. Сходная ситуация в буто-
нах мшистьтх волокон гинпокампа, где в ответ на ПД открывается
90% прссинатттических Са- каналов (Augustine, 2001). B то же вре-
мя, в гигантском синапсе кальмара, цилиарном ганглии цыпленка и
нерно-мытттечттом синапсе лягуптки только малая часть каналов от-
крьтваегся ири ПД, и секреция медиатора может ‘запускаться входом
95
Са -микродомен Са -макродомен
са-канапы `
EGTA
ВАРГА
Рис. 39 Эффекты мембранопроникатощих Са-буферов с различ-
ной скоростью связывания ионов Сана кальциевые микро- и макродо-
мены.
Слева - Са- микродомен в области отдельного Са-канала и влия-
нис на него ВАРТА и EGTA. Видно , что быстрый Са-буфер ВАРТА, в
отличии от EGTA резко уменьшает‘ Са- микродомен. Снрава- Са- мак-
родомен в области нескольких Са-каналов, который одинаково умень-
шается при действии как быстрого, так и медленного буфера. Исполь-
зуя такие построения нами было предположено, что в двигательном
НО микродомеп определяет вызванное, синхронное освобождение
медиатора, а макродомен — спонтанное (Зефиров, Григорьев, 2008).
ионов Са через один канал (Stanley, 1997).
Вход ионов Ca через большое количество близко расположен-
ных каналов образует область повышенной концентрации ионов Са
в определенном участке НО и формирует кальциевый макропо-
мен (рис. 39). По всей видимости, Са-макроттометт создается в обла-
сти Целой A3, a может включать и несколько соседних, близко рас-
положенных АЗ. Такие макродомены могут возникать при высоко-
частотной ритмической активности синанса и искусственной дли-
тельной деполяризации (гигтеркалиевьте растворы, гюстояттный ток).
Естественно, концентрация Са в подобном макродомене значитель-
но ниже в сравнении с микродоменом и составляет не более не-
скольких мкМ (Smith et al., 2000).
Исчезновение как микро- так и макродоменов связано с диф-
9 6 �� �sw�
фузией ионов Са в нтттозольномт прострапсттзе п работой внутри-
клеточных Са-связыватошпх систем. Обнаружено, что в регуляции
внутриклеточной концентрации ионов Ca принимают участие ми-
тохондрии, ЭПР, везикулы, мобильные буферные системы и др. (Ба-
лезпна и др., 2001). Показали), что Са-буферы действуют весьма
эффективно и оставляют только 0,1-2"о вошедших ионов Са сво-
бодными. Эти структуры способны не только быстро утилизиро-
вать ионы Са, но и некоторое время поддерживать высокую локаль-
ную внутриклеточную копцеттграцито ионов за счет их освобожде-
mm В цитоплазму. Отсюда Са-мьткродометт существует большее вре-
мя, чем длительность входящего Са-тока (Augustine et al. 2006).
ПрЗСИПЦПТИЧССКИС Са сигналы могут значительно изменяться
при введении в нервную термпналь экзогенных мобильных кальци-
евых буферов — ВАРТА (быстрый буфер) и EGTA (медленный бу-
фер). Подобные буферы можно напрямую инъсцировать при помо-
ши Снецигшьных микропипеток в большие нервные TCpMHl1£L‘II/I,Ha-
пример, гигантский сипанс кальмара и чашевидный синапс Хелда.
Для введения буферов в мелкие НО (многие центральные синапсы
н нервно-мышечные синапсы позвоночных), диаметр которых не
превышает I МКМ, часто используются эфирные формы буферов (АМ
формы). Эти формы за счет лттпянрильттосттт свободно проникают в
ПО, где под воздействием неспецпфических эстераз происходит от-
птепление эфирных группировок и освобождение Сад-связывающих
участков буферов. ВАРТА связывает ионы Са приблизительно в 100-
200 раз быстрее чем EGTA, поэтому способен эффективно влиять
на кратковреметтттьте Са- микродоххтетты (рис. 39). Медленная кине-
тика связывания ионов Са EGTA позволяет ему влиять в основном
на более длительные Са- макродомены и уровень цитозольното Са.
Присутствие данных буферов в ПО приводит к снижению синхрон-
ной секреции медиатора — более выраженное при Действии ВАРТА
и менее заметное при действии EGTA.
Эффекты буферов будут зависеть не ‘только от их собственных
свойств, но и от расстояния между Са- каналом, сипаптической ве-
зикулой и машиной экзоцитоза (табл.1). Введение кальциевых бу-
феров в нервные термипали нирамидных нейронов по-разпому влн-
яло на уровень секрепии медиатора в синапсах двухпучковых и мул ь-
типолярньтх клеток. Оказалось, что впутритермиттальттая концент-
рация как ВАРТА, ‘так и l:IGT/\, необходимая для снижения секре-
ции на 50 %. в синапсах на мультиполярпьтх нейронах в несколько
раз выше, чем в синапсах на двухпучковьтх клетках. Полученные
м&\ к
97
данные объясняются мепыпим расстоянием от Са-канала до синап-
тической везикулы в терминалях на мультиполярньтх клетках (Rozov
е: 211., 2001). B гигантском синапсе кальмара даже очень высокие
(80 MM) внутриклеточные концентрации EGTA не влияют на уро-
вень секреции медиатора, тогда как ВАРТА снижает секрецию в
концентрациях несколько мМ. В то же время в чашевидном синапсе
Хелда и некоторых других синапсах ЦНС EGTA снижает секрецию
медиатора до 50 % в концентрации 1-10 ММ, н но эффективности
практически не отличается от ВАРТА. Предполагается, что в не-
рвных терминалях с большим расстоянием между Са - каналом и
везикулой (например чащевидный синапс Хелда) секреция осуще-
ствляется в основном за счет перекрывающихся доменов от несколь-
ких Са-каналов, тогда как в терминалях, где Са-канал и везикула
колокализованьт очень тесно (гигантский синапс кальмара, нервно-
мышечный синапс лягушки), секреция медиатора может запускает-
ся одиночным Са- микродоменом (Schneggenburger, Nehcr, 2005). B
нервно-мышечном синапсе лягушки как ВАРТА, так и EGTA оди-
наково снижали спонтанную секрецию медиатора (частоту МПКП)
в гиперкалиевых растворах, но вызванная секреция медиатора (кван-
товый состав ПКП) угнеталась только при действии BAPTA (Зефи-
ров, Григорьев, 2008). Следовательно в двигательных IIO спонтан-
ный экзоцитоз везикул осуществляется в области Са- макроломена,
формируемого в области многих Са- каналов АЗ, в то время как
вызванный, синхронный — в области Са- микродомена от одного
Са-канала (рис. 39).
Модуляция входа ионов Са
(входящего Са-тока) и
экзоцитоз
Поток ионов Са через Са- каналы и соответственно процессы
экзоцитоза синантических везикул и секреции медиатора регули-
руются многочисленнытхпт факторами.
Входящий Са-ток (количество открытых Са-каналов), прежде
всего, зависит от величины и длительности деполяризации пресн-
Наптической мембраны во время ПД, которые определяются глав-
ным образом работой потенциал-зависимых калиевых и Са-акгиви-
руемых калиевых каналов, Токи через эти каналы укорачивают ПД
98
н уменыпанот Са-ток. Следовательно, модулируя работу тгих капа-
лов и соответственно амплнтудгго-временгтые характеристики ПД
нервной терминали можно регулировать интенсивность ‘экзоцито-
за. Многие химические агенты (экзогенный АХ, метаболиты кате-
холамипов, оксид азота. арахидоновая кислота, простагландин [~12 н
др.) изменяют секрецию медиатора в двигательных НО модифици-
руя работу калиевых каналов и тем самым изменяя входящий Са-
ток (Зефиров, Шакирьянова, 1992, Shakiryanova ct а1., 1994. Ситди-
кова н ‚цр., 1995, 1996, Архипова и др. 2005, Яковлева и др., 2006).
Модуляция работы Са-канаттов может осуществляться и дру-
гими способами. Во-нервых, показано, что ряд гормонов и медиато-
ров, действуя па пресинаптические рецепторы, изменяют секрецию
медиатора из НО за счет активации иттгнбиторттых СЗ-белков и мо-
дификации работы Са-капалов. бета-гамма субъединицы активиро-
ванного О-белка могут непосредственно подавлять активность Са-
каналов.
Во вторых, множество впе- и внутриклеточных сигналов, име-
ющих химическую или физическую природу, являются модулятора-
ми Са-каналов НО напрямую. К ним относятся изменения рН, де-
формация мембраны, лактат и др. Функция Са-каналов изменяется
при их фосфорилирование или дефосфоргтлировапие. В синантосо-
мах гиппокампа морской свинки показано, что протеинкиназа С уси-
ливает освобождение глутамата путем увеличения активности Са-
каналов (Terrian, 1995). В синантосомах коры головного мозга кры-
сы освобождение глутамата и Са-токи уменьшались при дефоыро-
рилировании под действием Ka:Im1nHeBp1ma(Sheng et а1., 1994),
Кооперативность ионов Са в
запуске экзоцитоза и секреции
медиатора
В 1967 году в своей пионерской работе Додж и Рахамимофнр на
нервно-мышечном сипапсе лягушки установили, что зависимость
секреции нейромедиатора от внеклеточного кальция описывается
степенной функцией с коэффициентом 4. Это послужило основа-
нием для предположения, что сайт, ответственный за освобожде-
ние кванта медиатора, активируется при связывании 4-х ионов Cu.
Позднее кооперативиость Ca B запуске секреции медиатора была
обнаружена почти во всех исследуемых синапсах, при этом коэф-
фициент степени варьировал от 3 до 5. Кооперетптвттость ионов Са
имеет важное физиологическое значение. Шнегеттбургер и Нейер
(2005) указывают на то, что именно благодаря кооттератпвноеттт воз-
можно столь значительное усиление секреции во время 11Д нервной
терминатпт. Действительно, ведь при увеличении уровня внутри-
клеточного кальция примерно B 4000 раз (с 50 нМ до 200 мкМ)
наблюдается увеличение секреции в 100000 раз (с 1 кванта в секун—
ду (приблизтттельньтй уровень сттотгтаттттой секреции) до 100 кван-
тов в миллисекунду (обычный квантовый состав ПКП). Второй
механизм, который может лежать в основе кооперативносттт это
перекрытие Ca микродоменов от соседних каналов в области вези-
культ.
Можно думать, что в синапсах с тесной локализацией Са- ка-
нала и синаптической везикулы, в которых Са-сенсор экзоцтттозат
обладает довольно низкой аажринноетьто (для активации требуется
уровень Са порядка сотен мкМ — это гигантский синапс кальмара,
биполярные нейроны золотой рыбки, нервно-мышечный синапс ля-
гушки) основой кооперативности служит первый механизм - нали-
чие нескольких мест связывания ионов Са. В то же время, в синап-
сах, где расстояние между Са- каналом и синаптической везикулотт
более значительно (например, чашевидный синапс Хеттда), а сенсор
экзоцитоза обладает достаточно высокой аффинностью (уровни Kans-
ция порядка 10-20 мкМ приводят к насыщению такого сайта), глав-
ным механизмом кооперативности является перекрытие Са-микро-
доменов от соседних Са- каналов (Schncggcnburger, Nehcr, 2005).
ЭКЗОЦИТОЗ СИНЗПТИЧССКИХ
ВЕЗИКУЛ И внутриклеточные
КЗЛЬЦИВВЬПЕ ДЕПО
Секреция медиатора управляется не только входом кальция из
внеклеточной среды, но и его освобождением из внутриклеточных
Са-депо посредством рианодиновых и ипозитолтрифосфатньтх
(ИТФ) рецепторов, являютцихся Са-канатлами большой проводимо-
сти (George ct 211., 2005). Идентифицировано три изоформы риано-
диновых рецепторов (их гены имеют 70% томологию), которые ло-
кализованы в мембранах органелл, содержащих высокие котптент-
100 {
рации ионов Са, таких как зндоплазматическая сеть, митохондрии
и секреторные везикулы. Рианодиновые рецепторы открываются в
ответ на небольшое повышение концентрации цитоплазматгтческо-
го кальция, в результате дополнительные порции Са тюступают в
цитоплазму и уровень кальция внутри клетки существенно возрас-
тает (кальций-вызванное освобождение кальция). Тип 1 экспресси-
руется в скелетных мышцах и в некоторых регионах мозга (особен-
но в клетках Пуркинье коры мозжечка). Тип 2 доминантная форма
для сердечной мышцы, а также широко распространена в мозге, тогда
как тип 3 обнаружен в низких концентрациях в отдельных тканях.
С помощью иммунохимичсских методов было показано присутствие
рианодиновых рецепторов в прссинаптических бутонах гиппокам-
па, гранулярных и корзинчатых клетках мозжечка, мшистых волок-
нах, гипоталамических нейронах, фоторецепторах (Zissimopoulos ct
а1., 2006). В нервных терминалях спонтанные выбросы ионов Са с
участие рианодиновых рецепторов из эндоплазматической сети (Са-
спарки, вспышки) были показаны во многих объектах. Более того, в
НО корзинчатых клеток амплитуда спонтанного Са -спарка была
сопоставима с повьнпением Са под действием одиночного ПД и при-
водила к спонтанному освобождению медиатора (Conti et а1., 2004).
деполяризация НО вызывает открытие потенциал-управляемых
каналов, а входящий Са-ток запускает опосредованное рианодино-
выми рецепторами освобождение ионов Са из депо, облегчающее
освобождение нейромедиатора. При этом доли кальция, поступаю-
щие из внеклеточной среды и внутриклеточных депо, соотносятся
друг с другом как 50 на 50 %. Активация рианодиновых рецепторов
может быть вызвана потоком ионов Са через пресинаптические ней-
рональные никотиновые ацегилхолиновьте рецепторы (Brain ст а1..
2001) или ИТФ-рецепторы эндоплазматической сети (Simkus, Stricker,
2002). Рианопиновыс рецепторы 2 типа могут фосфорилироваться
САМК Н, что приводит к увеличению вероятности их открытия
(Palfrcyman, Jorgcnscn, 2008).
B регулировании процесса экзоцитоза рианодиновыми рецен-
т‹›рами участвуют вспомогательные белки, например, снапин.
Снапин, маленький (I5 кДа) белок, локализованный на мембране
синаптических везикул и в цитоплазме. Снапин взаимодействует со
многими белками, в том числе SNAP—25 И собранным SNARE комн-
лексом, а также рианодиновыми рецепторами. Причем SNAP—25 и
рианодиновые рецепторы связываются с одним и тем же участком
снапина, то есть SNAP—25 И рианодиновые рецепторы конкурируют
101
за соединение со снапином. Снанин в комплексе с рианолиновьтми
рецепторами способствует увеличению их чувствителытосги к ионам
Са. Как результат, повышается вероятность спонтанного выброса
Са из депо и спонтанного экзошггоза. Взаимодеттствие снанина со
sNAP—25 облегчает работу SNARE комплекса, в том числе его взаи-
модействие с си1тантоттнтхтнноат на сгадъпт нраймиттга, усиливая син-
хронный экзонитоз в ответ на вход кальция через потенциал-управ-
ляемые каналы (Zissimopoulos et а1., 2006). При мутации гена snapin
в кортикальных синапсах мышей наблюдаются мультиниковьте
ВПСТ, увеличивается время нарастания и спада ВИСТ, что отража-
ет десипхронизанню вызванного зкзонитоза синантнчесих везикул
(Ран ct а1., 2009). Возможно, что переменцения снапина между
ЗНАКЕ-комплексом и рианодиновьтми рецепторами может контро-
лировать соотношение вызванного и спонтанного экзоцитоза.
Фосфорилирование и дефосфорилирование
белков в регуляции экзонитоза сипаптических
везикул
Фосфорилирование белков
Регуляция функций различных белков часто осуществляется с по-
мощью присоединения ковалентной связью к аминокислотным остат-
кам (тирозина, треопина или серина) фосфатной группы. Отрица-
тельный заряд фосфатной группы вызывает в фосфорилированных
белках конформаниопньте птзметтения, которые влияют на связывание
лигандов и активность белков (через аллостерический эффект). Кроме
того, (росфорттлирование может непосредственно создавать сайты свя-
зывания для других протеинов. События фосфорилирования контро-
лируют структуру и клеточную локализацию многих белков. В клети
ках млекопитающих в каждый момент‘ времени примерно 1/3 всех бел-
ков находится B (pocq)0pm1MpoBannoM состоянии (Albcrts ct а1., 2002).
Протеинкиназа А. В зукариотических клетках большинство
Эффектов вторичного посредника - ЦАМФ связано с (рерметггозт про-
Теинкиназой А (Tasken. Aandahl, 2004; Scino. Shibasaki, 2005). В не-
активном состоянии нрогеинкиназа А состоит‘ из 2-х каталитичес-
Ких субъединиц нековалептно связанных с 2-мя регуляторными
102
субъсдиниттами. При увеличении внутриКлеточной концентрации
цАМФ происходит разборка тетрамерного комплекса на димер ре-
гуляторных субъединиц (связавший 4 молекулы цАМФ) и две ак-
ти вные каталитические субъединицы, к0'горь1е фоефорилируют бел-
ки-мишени (Тау1ог ct a1., 2005).
лиганд
а ‘Р
" * ъ я ^ `
‘до: _ ,, о в Ѕ]�
. а as « г ’‚
‘я :.,:::v „г“ а "а о“ “а xagvwg
Q mdxhodouen °
ь ›
U , ь ЧАИ? °
c a Q .`
е
Фосфорилирование " с
машина A.
зкзоцитоза
9
Рис. 40. Регуляция экзоци/поза синатпических везикул цАМФ-
npomeLmK1ma3aA системой (Scino, Shibasaki, 2005).
В ответ на стимуляцию лигандом сопряженного с С-бслком ре-
цептора (Ев-белок активирует адснилатциклазу (АЦ). В результате фор-
мируется облако повышенной концентрацией цАМФ (микродомен
цАМФ). Распространению цАМФ по всему объему клетки препят-
ствуют фосфодиэстеразы (ФДЭ), гидролизуюшие цАМФ до 5’АМФ.
Маленькими кружочками показаны молекулы цАМФ. Протеинкина-
за А (ПКА), взаимодействуюшая с заякориваъошим белком (AKAP),
фосфорилирует белок, вовлеченный в экэоцигоз синантических вези-
кул VI усиливает Са-вызванную секрецию медиатора.
В клетках обнаружено 4 гена регуляторных (Юальфа, 1бета,
2а_льфа, 2бета) и 4 гена каталитических (Сальфа, Сбета, Сгамма.
РгКХ) субъединиц протеинкиназы А. Регуляторные субъединицы
1-го типа связывают цАМФ с большим сродством (константа акти-
вации — 50-100 HM IL/\I\/ICD), чем субъединицы 2—го типа (200-400
нМ). Предполагается, что в состав нротеинкиназы А входит комн-
103
лекс из двух одинаковых регуляторных субъединиц (гомодимер) и
двух любых каталитических субъединиц. Протеинкиназа А 1 ос (вклю-
чающая гомодимер R 1 ос субъединиц) в изобилии синтезируется во
многих клетках (особенно нейронах), и удаление гена R 1 ос летально
на ранних стадиях эмбрионального развития (Amieux ct а1., 1997).
Протеинкиназы А других типов экспрессирухотся в ограниченном
наборе клеток нервной системы, сердца, печени, жировой ткани, а
делеции генов их регуляторных субъединиц (RIB, 20¢, 2В) обычно
вызывают небольшие дефекты, например, некоторых форм синап-
тической пластичности (Huang ct а1., I995). B клетке протеинкина-
зЫ А расположены в определенном участке, благодаря семейству
АКАР5 («А-киназу заякоривающие протеины») из 50-60 белков.
Это типичные каркасные белки, которые связываются одновремен-
но с димером регуляторных субъединиц цротеинкиназы, белком—суб-
стратом фосфорилирования и специфичным внутриклеточным ком-
партментом (Tasken, Aandahl, 2004). Поэтому протеинкиназа А, по-
тенциально способная фосфорилировать множество белков, в каж-
дом конкретном случае «пришивает» фосфатную групну только к
белкам, которые удерживаются с помощью АКАР5 на «ударной»
дистанции для фосфорилирования (рис. 40). Таким образом, на тер-
ритории одной клетки повышение продукции цАМФ может вызы-
вать различные эффекты в зависимости от того, какис комплексы
АКАРЗ-А-киназа-субстрат оказались в зоне действия «облака» (мик-
рододомена) uAM(D(Vandccastee1e et а|., 2006). Кроме этого, АКАРЗ
могут привязывать к себе компоненты (фосфатазы и фосфодиэсте-
разы), отвечающие за прекращение сигнализации по цАМФ путь. В
этом случае на основе АКАР собирается полноценный цАМФ сиг-
нальный комплекс — «сигналосома» (Tasken, Aandahl, 2004; Del1’Acqua
et а1., 2006).
В синапсах беспозвоночных и позвоночных, включая млекопи-
тающих, цАМФ играет ключевую роль во многих феноменах синан-
тической пластичности и часто рассматривается как универсаль-
ный сигнал, регулирующий экзоцитоз (Nguyen, W00, 2003; Seino,
Shibaki, 2005; Cheung е: а1., 2006). Ниже приведено несколько вари-
антов участия цАМФ в контроле экзоцитоза везикул. В централь-
ных синапсах Aplysia, активация цАМФ каскада способствует зак-
рытию К-каналов, в результате мембрана деноляризуется и усили-
Вается вход ионов Са в НО при кратковременной высокочастотной
активности (Bmnalli et а1., 1976; Балабан, 2007). Помимо этого про-
Теинкиназа А может непосредственно модифицировать потенциал-
104 ‹ д.
зависимые Са-каналы, что увеличивает их проводимость и/или сме-
щает потенциал- зависимость их активации (Beaumont, Zucker, 2000).
Увеличение эффективности синаптической передачи при ак-
тивации цАМФ зависимой протеинкиназы может быть связана с
синхронизацией секреции квантов медиатора (Bukharaeva et а1.,
2002). В нервно-мышечных соединениях Drosophila протеинкиназа
А способствует «освобождению» везикул резервного пула из си-
напсинового «плена» (см. синапсины) и как следствие - при дли-
тельной высокочастотной активности везикулы резервного пула
«легче» перемещаются к местам экзоцитоза (Verstreken et al., 2005).
B гиппокампальных и мозжечковьтх синапсах под действием проте-
инкиназы А увеличивается вероятность экзоцитоза отдельных до-
кированных везикул не зависимо от входа ионов Са (Nguyen, Woo,
2003), а в хромаффинных клетках фоновая активность протеинки-
назы А необходима для поддержания докированных везикул в гото-
вом к освобождению медиатора состоянии (Nagy et al., 2004). Та-
ким образом, цАМФ-протеинкиназа А сигнальная система усилива-
ет экзоцитоз синаптических везикул, действуя непосредственно на
машину слияния, увеличивая вход ионов Са, облегчая транспорти-
ровку везикул резервного пула в A3. Однако цАМФ каскад может
участвовать и в формировании долговременной депрессии в гиппо-
кампе (Brandon et al., 1995; Nguyen, Woo, 2003).
Многие белки, вовлеченные в эк3оцитоз‚ фосфорилируются
протеинкиназой А (рис. 41 ц13). Однако физиологические послед-
ствия этого изучены недостаточно (Evans, Morgan, 2003; Seino,
Shibasaki, 2005; Snyder et al., 2006; Lee, 2006). При фосфорилирова-
нии А киназой белка CSP (cysteine string protein, компонента маши-
ны Са-зависимого экзоцитоза) ослабляется его взаимодействие c син-
таксином 1 и синаптотагмином 1, что может продлевать время су-
ществования поры слияния (Evans, Morgan, 2003). Другой белок си-
наптических везикул снапин после фосфорилирования протеинки-
назой А с большей силой начинает связывать SNAP-25, находящий-
ся в составе ЗНАКЕ-комплекса (Thakur et al., 2004). В итоге в хро-
маффинных клетках возрастает «сцепление» собранного SNARE
KOMl'IJ'IeKCa c синаптотагмином и увеличивается количество везикул,
готовых быстро слиться с плазматической мембраной в ответ на Са-
сигнал (Chheda et al., 2001). B том же направлении действует фос-
форилирование протеинкиназой А белка SNAP—25, после чего ско-
рость депраймирования снижается, и везикулы стабилизируются в
«активном» состоянии (Yang et al., 2007). Фосфорилированный про-
105
теинкиназой А синатотагмин XII, начинает более ирфективпо свя-
зываться с синатогаггииътом I и не дает последнему взаимодейство-
Ban. со SNARE комплексом, что увеличивает интенсивность спон-
танного экзоцитоза в центральных синапсах (Maximov е: а1.‚ 2007).
Белок синтафилин работает как молекулярный «фиксатор» («за-
мок»), связывая белки синтаксин 1 и динамин 1, переводя их в не-
активное состояние (Lao е: а1., 2000). Естественно, при этом проте-
кание зкзоцитоза затрудняется, поэтому сверхэксперссия синтафи-
лина в культуре нейронов гиппокампа и РС12 клетках значительно
угнетает освобождение медиатора. Фосфорилирование А-киназой
синтафилина уменьшает его сродство к синтаксину и динамину, что
ведет к освобождению белков от ингибиторной связи (Вос2ап е: а1.,
2004; Seino. Shibasaki, 2005). Зависимое от протеинкиназы А фос-
форилирование томозина, ослабляет его связь с синтаксином 1, в
итоге последний вовлекается в формирование ЗНАКЕ-комплекса
(ВаЬа е: а1., 2005). Протеинкиназа А способна фосфорилировать
каркасный белок АЗ ШМ10:, который участвует в нескольких эта-
пах экзоцитоза (Evans, Morgan, 2003; Schoch, Gundelfinger, 2006). B
параллельных волокнах мозжечка фосфорилировапнне RIIVIIOL за-
пускает перестройку АЗ, необходимую для индукции долговретиетъ
ной потенциации (Lonart е: а|.. 2003; Sudhof, 2004). In viva контакт
прорастаюшего аксона с постсинаптической областью ретроградно
вызывает увеличение внутриклеточного базального уровня ЦАМФ.
Таким образом, снимаются ограничители с механизмов экзоцитоза,
происходит перестройка A3 и функциональных характеристик си-
наптических пулов (Као е: aI., 2002). C возрастом в некоторых ней-
ронах (например, гиппокампа) появляется тенденция к уменьше-
нию количества К-субъединиц протеинкиназ А, что ослабляет пе-
редачу сигналов по цАМФ-пути и может лежать в основе возраст-
ных и неврологических заболеваний, связанных с угнетением экзо-
Цитоза (Karege е: а1.‚ 2001; Nguyen, Woo, 2003). Базальная актив-
Ность аденилагциклазы определяет статус синапсов в гиппокампе:
Повышенная продукция цАМФ наблюдается в активных синапсах, а
пониженная в «спящих».
Другие цАМФ связывающие белки, названные Ерас] и 2 («об-
менные белки, прямо активируемые цАМФ»), обнаружены недавно
(De Rooij е: а|., 2000; Qiao е: а1.‚ 2002). Ерас1 повсеместно экспрес-
Сируется, им богаты скелетные мышцы, мозп почки, а Ерас2 найден
В Некоторых регионах мозга и эндокринных клетках. Оба белка с
ПОМОЩЬЮ GEF («фактор обмена гуаниловьтх нуклеотидов») домена
106
могут активировать малые [Тфатзьт Rap! н Rap2, переводя их в GT1’-
загруженное состояние (Bos, 2003). В свою очередь ГТФаза Rap]
способна стимулировать зависимое от фосфолипазы С увеличение
уровня внутриклеточного Са. Пока существуют только предполо-
жения об участии цАМФ-Ерас нути в процессах пролиферации, меж-
клеточной адгезии. апопозе, секреции инсулина. Обсуждается зна-
чение Ерас в увеличении вероятности освобождения медиатора и
размера готового к освобождению пула в чашеобразных синапсах и
при долговременной синаптической потенциации ('1`а$1‹еп,Аапоа111,
2004; Seino, Shibasaki, 2005; Cheung е: а1., 2005). «Молекулярным»
основанием этого может быть взаимодействие Ерас с белками АЗ,
RIM и piccolo, также Ерас способствует переходу Rab3/\ во «вклю-
ченное» состояние (Shibasaki ct а1., 2006).
Протеинкиназа С. Протеинкиназа С также способна фосфо-
рилировать многие белки, задействованные в экзоцитозе (рис. 41
Ц13): Muncl 8, SNAP—25, синаптотагмип 1, синаптобревин, NSF, pa6—
филин ЗА, 0L—SNAP, Са-каналы A3 (Snyder ct а1., 2006). В большин-
стве случаев активация этой киназы ведет к усилению экзоцнтоза
синаптических везикул, однако ее мишени до сих пор не известны.
Форболовые эфиры, активирующие протеинкиназу С (а также бе-
лок Munc 13), стимулируют экзоцитоз (Finley е: а1., 2003). В зависи-
мости от того, какие Кофакторы необходимы для активации, проте-
инкиназы С разделяют на классические (альфа, бета, гамма — сти-
мулируются ионами Са и диацилглицеролом), новые (дельта, эпси-
лон, эта, тета — активируются диацилглицеролом) и атипичные (дзе-
та и йота/ламбда — ни кальция, ни диаштлглицерола для активации
не требуются) (Newton, 2001).
Следует упоминуть атипичную изоформу протеинкиназы С -—
киназу дзета — ключевой фермент поддержания поздней фазы дол-
говременной потенциации и стабильности синаптических контак-
тов, одной из главных мишеней которого является NSF. Эта киназа
постоянно активна, а ее синтез усиливается под влияние эпизодов
высокочастотной синаптической передачи.
Фосфорилирование SNAP-25 под влиянием протеинкиназы С
обнаруживается во многих типах клеток (нейроны гиппокамтта, сен-
сорные нейроны, РС12 клетки, панкреатические в-клетки, хромаф-
фит-иные клетки надпочечников) (Morgan ct а1., 2005). В хромаффитт-
ных клетках фосфорилирование по 187 остатку серина увеличивает
сродство SNAP—25 к синтаксину, но ослабляет (Га-независимое вза-
имодействие SNAP—25 с синаптотагмином (Yang ct al.. 2007). Фос-
Ь 107
форилироваттие SNAP—25 в 187 положении усиливается в течение
раннего эмбрионального развития крысы и нейрональной активно-
cm B гиппокампе, а снижается при обработке каиновой кислотой и
морфином. Возможно, поэтому при хронической обработке морфи-
ном снижается способность ЗНАКЕ-белков формировать комплекс
(Kataoka е: а1., 2006). В случае присоединения остатка фосфорной
кислоты к 138 остатку треонина взаимодействие SNAP—25 с други-
ми SNARE белками и синантотагмином не изменяется. В хромаф-
финных клетках модификация SNAP—25, вероятно, ускоряет вхож-
дение везикул в состав готового к освобождению пула после его
истощения (Nagy et а|., 2002).
Muncl 8 in vivo фосфорилируется протеинкиназой С по 313 ос-
татку серина. Это наблюдается во время активности хромаффин-
ных клеток, а также при деполяризации НО или стимуляции преси-
наптических метаботропных рецепторов глутамата кортикальных
нейронов (Yang ст а1., 2007). Фосфорилированный MUHC18-1 с мень-
шим сродством связывается с закрытой конформацией синтаксина
1, в результате в хромаффинньтх клетках усиливается освобождение
катехоловых аминов, но впоследствии происходит уменьшение раз-
мера кванта (Barclay ct а1., 2003).
Са/кальмодулин зависимая протеин киназа 11. Са/кальмоду-
лин зависимая протеин киназа 11 (САМК 11) представляет собой
холоэнзим из 12 составных частей. В нейронах САМК 11 присут-
ствует как в виде гомомерного комплекса только из альфа-форм,
так и гетеромерного ансамбля из альфа- и бета-форм (Со1Ьгап‚ Brown,
2004). Причем в период раннего развития организма в нейронах пре-
обладают гетеромерньте комплексы, в состав которых входит боль-
ше бета-форм, способных регулировать рост аксонов и формирова-
ние синапсов. В ходе постнатального периода в гетеромерных комп-
лексах значительно увеличивается содержание альфа-САМК и воз-
растает активность целого комплекса. Регуляция работы САМК 11
может осуществляться с помощью аутофосфорилирования, причем
аутофосфорилирование по 286 остатку треонина переводит фермент
в постоянно активное состояние. а по 305 или 306 треонину, наобо-
рот, выключает энзим. САМК 11 активируется главным образом вы-
сокочастотными осцилляциями внутриклеточного кальция, что со-
провождается аутофосфорилированием по 286 треонину и вызыва-
CT долговременную потеннианию (Ahmed, Frey, 2005).
Роль этой протеинкиназы в постсинаптической пластичности
Хорошо документирована, тогда как пресинаптические эффекты сла-
108 ё
бо исслсдоватты. B пресинаптической части ее мишенями выступа-
тот синаптобрсвин, SNAP-25, синаптотагмин I, рабфилитт ЗА, (1-
SNAP, NSF, синаптофттзитт, М-тин Са- каналов, Са-актттвттруемые
К-канальт, риаподиновые рецепторы (рис. 42 1113) (Snyder cl а1.‚ 2006).
Инъекция САМК Н в гигантский аксона кальмара увеличивает ос-
вобождение медиатора, что объясняется фосфорилированием синап-
сина 1 (рис. 42 н13) (Llinas ct al., 1991). Мутации б-формы САМК П
у мьтшей хотя и не приводят к изменениям базального уровня осво-
бождения медиатора в гиппокампс, однако экзоцитоз сииаптичес-
ких везикул в течение повторной стимуляции значительно усилива-
ется. Значит, в норме САМК П угнетает экзоцитоз везикул в тече-
ние ритмической акгивиости. Возможно механизм негативного дей-
ствия САМК П на экзоцитоз связан с фосфорилироваиием б-фор-
мой САМК Н эупргтпт-сайта М-типа Са-канала. В итоге затрудняют-
ся взаимодействия ЗКАКЕ-белков с каналом, необходимые для до-
кирования везикулы (Hinds ct а1.‚ 2003). После фосфорилирования
синаптотагмина САМК П наблюдается некоторое облегчение свя-
зывания синаптотагмина с синтаксином и SNAP—25, особенно в при-
сутствие ионов Са. Однако это заметно не сказывается на секреции
медиатора (Nagy ct а1.‚ 2006). Аутофосфорилированная форма САМК
ll способна Са—зависимо соединяться со ЗНАКЕ-мотивом си нтакси-
на и переводить синтаксин из закрытого в открытое состояние (при
этом ферментативная активность САМК II не требуется), что облег—
чает экзоцитоз (Ohyama е: а1.‚ 2002).
Ассоциированная с клеточной смертью протеинкиназа (ПАРК)
~— это Са/кальмодулин зависимая киназа, которая принимает учас-
тие в проведении различных индуцирующих тшсточттую смерть сиг-
налов (Cohen, катет, 2001). ПАРК присоединяет остаток фосфор-
ной кислоты к синтаксину 1, что значительно ослабляет его взаимо-
действие с Muncl 8 и может облегчать экзоцитоз при действии анон—
тозных сигналов на клетку (Seton ct а1.‚ 2003).
Другие, регулирующие экзоцитоз киназы. Синаптиттеские
белки могут фосфорилироваться многочисленными протеинкина-
зами, такими как казеин киназа 1 (синтаксин 1, синаптогагмитт 1) и
казеинкиттаза II (СИПТаКСИН 1, VAMP2, CHIIaII'I‘0T£1FMV[I~1), циклин-
зависимая киназа 5 (Мнпс 18), митогетт-активируемая протеин
киназа, некоторыми тирозип-кипазами (например, это-семейства)
(Burgone, Morgan, 2003). Казеин киназа П — это независимая от вто-
ричных посредников ссртттт/треоттттн протеинкиназа, в клетке ее ак-
тивность может модулироваться компонентами клатрттнового покры-
109
тия, о котором речь пойдет далее (Korolchuk, Banting, 2002). Фосфо-
рилирование синтаксина 1 казеин киназой 11 наблюдается только в
некоторых аксонах, в результате чего его способность взаимодей-
ствовать со SNAP—25 и синаптотагмином возрастает, однако in vivo
фосфо-синтаксин перемещается за пределы A3 (Foletti et а1.‚ 2000).
Казеин киназа II (как и нротеинкиназа С) фосфорилирует синапто-
тагмин I B соединительном регионе, расположенном между его С2 и
трансмембранттьтм доменами (Nakhost ct al., 2003). Белок, регулятор
экзонигоза, Munc18 из тканей выделяется в фосфорилированном
виде и вместе с циклин-зависимой киназой 5, поэтому весьма веро-
ятно, что Мцпс1 8 in vivo является ее субстратом (Fletcher ct а1.‚ 1999).
Модификация этой киназой Munc 1 8 способствует его диссоциации
от сиптакспна в «закрытой» конформации, после чего синтаксину
предоставляется возможность перейти в «активное» состояние.
GSK-3 (glycogen synthase kinase-3), которая в изобилии эксп-
рессируется в нейронах предотвращает долговременную потенциа-
цию, угнетая освобождение глутамата. GSK—3 фосфорилирует P/Q
ТИП Сшканалов, уменьшая вход Са, а также белки ЗНАКЕ-комплек-
са (синантобревитт, SNAP—25, синтаксин), в результате их взаимо-
действия друг с другом ослабляются. Кроме того под Действием GSK—
3 синантобревин прочнее взаимодействует с синантофизином 1 (Zhu
е’: а1.‚ 2010).
цГИФ зависимая-нротеинкиназа G1 кодируется одним но-
всеместно экснрессирущимся геном. В результате его альтернатив-
ного снлайсьтътга появляются два вариантах протеинкиназы G1 (аль-
фа и бета), формирующие в цитозоле гомодимеры. Альфа-изоформа
имеет 2 сайта, кооперативно связывающих цГМФ: один - с высо-
ким, другой - с низким сродством. Бета-форма содержит 2 участка,
нрисоединятотцие ЦГМФ с низкой ацхринттосттло (Hofmann ct al.,
2006). Несмотря на фосфорилирование нротеинкиназой G in vitro
MHO>KCC'l‘B'd белков, in vivo показано фосфолилироваттие лишь от-
дельных белков гладкомьтцтечньтх клеток, тромбоцитов, тучных кле—
ток, нейронов мозжечка и гиннокампа (schlosssmann, Hofmann, 2005).
На этом основании некоторые исследователи называют протеинки-
назу G -- «загадочной» киназой. -
Хотя документировано участие ЦГМФ-зависимой протеинки-
назы в феноменах синантической пластичности (Klcppisch ct al., 2003;
Stanton е1а1., 2003; Pctrov е: а1.‚ 2008) и переработке болевой инфор-
мации в спинном мозге (Тао ст а1, 2000), цикле сон-бодрствование,
in vivo белки синантиттеских везикул не идентифицированы как суб-
110 �q�
страты протеинкинат: G (Xuc ct 31., 2004; Lcc H—K., 2006). Поэтому
цГМФ зависимые изменения в работе цитоскелета, липид-моди‹ри-
пирующих ферментов, других сигнальных систем, вероятно, лежат
н основе действия цГМФ - протеинкиназа G — пути на экзоцитоз
синаптических везикул. Существуют данные о нарушении переме-
щения синаптических везикул из резервного пула в A3 при актива-
ции протеипкиназы G. B результате уменьшается вьтделеттие глута-
мата из корковых и гиппокамттальньтх синаптосом в процессе высо-
кочастотной активности (Stanton cl al, 2003). Кроме этого, регули-
руя экзоцитоз везикул в нейронах гиппокампа, протеинкиназа G
опосредует пресинатттпческий компонент как долговременной леп-
рессии (Feil ct al., 2003), так и потенциации (Klcppisch е1а1., 2003).
Дефосфорилирование белков в
процессах экзоцитоза
Фосфатазьт. Удаление фосфатных групп с поверхности белков
осуществляют фосфатазы, многие из которых в изобилии обнару-
живаются в клетках и контролируют процессы секреции (Sim ct а|.,
2003). В зависимости от субстратной специфичности фосфатазьт де-
лят на две группы: серин/треонин фосфатазьт и тирозин фосфатазы
(РТР5). В геноме человека закодирована информация примерно о
40 типах серин/треонин фосфатаз, их классифицируют на 7-8 групп,
основные из которых - РР|, РР2А, РР2В (кальциневрин) и РР2С.
В нейронах идентифицируется высокий уровень синтеза PP], РР2А
и РР2В. Субстратами РР2А являются белки ЗНАКЕ-комплекса, си-
папсиньт, Са-каналы М-типа (то есть участвующие в экзопиточе бел-
ки), тогда как РР2В в основном дефосфорилирует протеины, вов-
леченные в эндоцитоз.
Ингибирование фосфатаз с помощью окадаиковой кислоты или
каликулина А в синаптосомах и нейронгшьных культурах приводит
к угнетению выделения пейромедиаторов (Ogawa е1а1., 1994; Verhage
ct al., 1995). Выделение катехоловых аминов из хромаффинных кле-
ток увеличивалось при действии окадаиковой кислоты за счет уве-
личения концентрации медиатора в гранулах, при этом зкзоцито’;
бьтл ослаблен. Снижение активности РР2А фосфатазы, вызываемое
специфичным ингибитором фостриеципом, негативно сказывается
на экзоцитозе в синаптосомах (Baldwin ct а1., 2003). Кроме того,
ингибирование РР2А нарушает кластеризацию синаптических ве-
› 111
зикул, и они «расползаются» в боковых тшправлениях (Dai, Pong,
1996; Guatimosim ela1., 2002).
В нервных окончаниях обнаружено большое ргвнообразие раз-
личных протеинкиназ, которые могут, как усиливать, так и угне-
тать зкзоцитоз. В то же самое время дефосфорилируют практичес-
Kn все синаптические белки всего три фосфатазьх (РР1, РР2А и
PPZB), которые обычно служат элементами завершающими сигналь-
ный каскад. Несколько выделяется из общей картины Са/кальмоду-
лин активирусмая фосфатаза РР2В (кальциневрин), вовлеченная в
запуск процесса эндоцитоза синаптических везикул и индукцию дол-
говременной постсинаптической депрессии.
Липиды мембран в экзоцитозе
В мембранах АЗ, определяется высокая концентрация молекул
фосфатиднлинозитол-4,5-бифосфатов (ФТИ-4,5-Ф2)‚ которые син-
тезируются из ФИ-4-Ф фосфоинозитол-б-киназами, а также из дру—
гих фосфолипидов при помощи фосфолипазы D (катализирует от-
щепление от фосфолнпнда азотистого основания — холина, этано-
ламина, серина, в результате образуется фосфатидная кислота), ино—
зитогттрансфераз (синтезирующих фосфоинозитиды (ФИ) из фос-
фатдидной кислоты и инозитолов) и ФИ-4(5)—кина3 (Martin, 2001:
Ungermann, Langosch, 2005; Di Paolo, De Camilli, 2006). Обогащен-
ная ФИ-4,5-Ф2 мембрана АЗ «притягивает» к себе многие факторы,
необходимые для прикрепления и докирования синаптических ве-
зикул. В то же самое время ФТИ-4‚5—Ф2 везикулярной мембраны
облегчают связывание белков цитоматрикса АЗ с синаптической ве-
зикулой (Grishanin е: а1, 2004; Di Paolo ct al., 2004). ФТИ-4‚5-Ф2
электростатически взаимодействуют с обогащенным положитель-
ными зарядами околомембранным доменом синтаксипа, удерживая
его на территории АЗ. Также ФТИ-4‚5-Ф2 связываются с С2В и
С2А доменами сипаптотагмина VII, белком CAPS (caIcium—activated
protein for secretion) и рабфилипом. В ходе расщепления ФТИ-4,5-
Ф2 фосфолипазой С образуются молекулы диапнлглицерола, кото-
рые «привлекают» и активируют белки Unc/Munc—l3 (Rhee ct а1.,
2002), ускоряющие праймирование синаптических везикул
(Rosenmund е: а1., 2002). Применение ингибитора фосфолипазы С
(U73 122) сильно угнетает экзоцитоз сипаптических везикул во м11о-
112 d
ГИХ СИСТСМЦХ, даже на фОПС ПРИМСНСПИЯ ТЦКОГО МО111НОГ0 С'ГЪ1|\1уЛЯ'ГО-
ра секреции как (х-латротокситта (Davlctov е: а1., 1998).
Слияние мембран включает радикальное изменение геометрии
мембранных листков, поэтому локальная организация липидов имеет
большое значение (Jahn, Grubmullcr, 2002; Salaun ct а1., 2004; Di Paolo,
De Camilli, 2006). Липиды с болыпой полярной головкой (гликоли-
пиды, гликосфинголиттиды) и насыщенными остатками жирных кис-
лот или одним гидрофобным хвостом (лизолипиды) способствуют
искривлению внутреннего листка везикулярной и наружного лист-
ка плазматической мембран при образовании норы слияния. Липи-
ды с компактной головной группой и «размашистыми» гидрофоб-
ньтми хвостами (диацилглиттеродт, фосфататттдттая кислота, ФТИ-4,5-
Ф2) поддерживают деформации наружного монослоя мембраны ве-
зикулы и внутреннего монослоя плазматической мембраны в про-
цессе формирования полу-сливптегося посредника. При повышении
внутриклеточного уровня кальция молекулы <1)'1‘1/1—4,5—<1>2 могут пре-
образовываться в форму конуса, что способствует формированию
промежуточной фузогенттой структуры (5а1апп ет а1., 2004). Фосфо-
липазы С, D, А, и фосфатаза синаптоянин также непосредственно
влияют на слияние мембран, причем результат зависит от того, с
какой стороны плазматической мембраны фермент активен (Cohen,
Brown, 2001; Rohrbough, Broadie, 2005). Например, если фосфоли-
наза А, апплицируется внеклеточно, то она стимулирует экзоцитоз,
но если ее вводить внутрь клетки, то слияние ингибируется. Tax,
пейротропные яды змей, содержащие фосфолипазы А„ усиливают
освобождение медиатора, причем их действие нивелируется токси-
нами ботулизма, расщепляющими компоненты ЗНАКЕ-комплекса
(Rossctto ct а1., 2006).
Предполагается, что фосфолипаза 1)1 облегчает искривление
мембран при экзоцитозе синантических везикул, модифицируя ли-
пиды цитоплазматического слоя мембраны НО (рис. 43 ц14) (Badcr
е! а1., 2004). 1п viva активность фоефолипазьт D1 контролируется
малыми ГТФазами семейств ARF и Rho, обильно представленными
в НО, а также с помощью ее Са зависимого фосфорилирования
RS(rib0soma1 S6)—KmIu';0f12(1ixt()n, 2002; Iliroyama,13xton,2005). Бе-
лок КЬо-семейства Racl, связывающийся с синантическими везп-
кулами в ГТФ-загружеттттом состоянии (ГТФ-Кас! ), рассматривает-
ся как погеттциальттьтй активатор сросфолиттазьт 1)1 B нейронах
(Doussau et а1., 2000; Нптеап et а1., 2001, Bader ct а1., 2004). В нейро-
зндокринных клетках стимулировать (ростролттттазу может белок
стаптобгсгт протеинкиназаА
ТОМОЗИН
Са-канап
` синтафипин‘
ситаксип A ,’
ц I pe�� F SNAP- 5 CSP
2 I
SNAP-25 протеинкиназа C Синаптотагмин
5NAP‘25 Са-канап
Мипс18
синаптобревин
Рис. 41 Ц13. Главные эффекты протеинкиназы А и С в процессах
экзоцитоза синоптических везикул (по Leenders. Sheng, 2005).
Докирование синаптических везикул регулируется протеинкиназой
А и протеинкиназой С. Стадии прайминга преимущественно управляют-
ся с помощью протеинкиназы А.
Рис. 42 ц13. Механизмы пресинатпического действия Са/кальмоду-
лин зависимой протеин киназь: 11 (Wang, 2008).
САМК II ускоряет перемещение синаптических везикул из резервного
пула в готовый к освобождению пул, фосфорилируя синапсин 1 (SYN). Де-
фосфо-синапсин 1, фиксирует синаптические везикулы на актиновых нитях,
фосфо-синапсин 1 «освобождает» везикулы. САМК П может увеличивать
вход ионов Са, снижая скорость инактивации Са- каналов Р/О-типов. САМК
11 способна фосфорилировать рианодиновые рецепторы (РиР), усиливая ос-
вобождение кальция из ЭПС. Синаптотагмин И ЗНАКЕ-белки также фосфо-
рилируются САМК П in vitro, хотя физиологическое значение этого не ясно.
САМК П может угнетать выброс медиатора, фосфорилируя и стимулируя
Са-активируемые К-каналы большой проводимости (ВК). Открытие ВК ка-
налов укорачивает ПД, что уменьшает входящий Са- ток.
Ц14
микродомен
ФК
фосфатидилхолин фсюфатидная \
кислота (ФК) trroacccro ‘до
о ——›ш9 9 т в
ХОПИН
мембрана 5NA|2E-
ГДЕ везикулы КОМПЛСКС
- . гтг
син гакспн В "и тобревин » ARF6
Ш _____ SNAP-25 §n-n1
мембрана АЗ
I
- Г �<}�
$3’- fix‘: “ Чада“
Рис. 43 ц14. Модель роли продукции фосфатидной кислоты
фосфолипазой DI в мембранном слиянии (Bader et al., 2004 с измене-
ниями).
Фосфолипаза D1 (ФЛ-Д 1) способна гидролизовать мембранный
липид фосфатидилхолин с образованием конусообразной молекулы
фосфатидной кислоты (ФК) и холина. Присутствие фосфатидной кис-
лоты в мембранах значительно облегчает формирование мембран-
ных изгибов. На мембранах синаптических везикул локализуются ма-
лые Г ТФазь1 Arf6 И / или Rac, которые в ходе докирования переходят в
активную ГТФ-«загруженную» форму. При этом они способны ак-
гивировать фосфолипазу D1, заякоренную в АЗ. В результате на Ци-
гоплазматическом листе пресинаптической мембраны запускается
синтез фосфатидной кислоты. Локальное увеличение продукции фос-
фатидной кислоты ускоряет деформацию мембраны и формирова-
ние полу-слившегося посредника.
ц15
А
липидный плотик
тикопипиды
ъ б фосфолипиды
23’ "Ё ч“; p� � д/
- ` 17‘ I" на
- ., ,_ ружный
‚ ‚
���� ���� моноспой
._ I , и I 1 ‚‚ __,
. бы”! /W 1.5 Мы’ тж
ф ir,§;,b:_',1:j,__v;__¢ 3 рт! а ‚д; ,1’ д} :4 цитоппазматический
` K \.\.\~:‘u‘_” I р ~ \\ ДАНЬ \'-_‘L\\‘ . моноспой
'v“o“u“u"0‘3‘VV‘§‘b"o“o“o‘3‘V3 u“! о
\
Д:
‚к
и
2 мкм
5 мкм ..._........
Рис. 44 ц15. Холестерин и строение липидного плотика (Зефиров,
Петров‚ 2010).
A - Схематическое изображение липидного плотика в наружном монослое
плазматической мембраны. Б - Холестерин и липидные плотики в двигательных
НО. а, б конфокалъные изображения свечения флуоресцентного маркера фи-
липина Ш, связывающего холестерин в соотношении 1 к 1, в НО кожно-грудин-
ной мышцы лягушки и диафрагмы мыши, соответственно. в, г — окрашивание
образовавшихся в ходе эндоцитоза структур НО (синаптических везикул) с
помощью снабженной флуоресцентной меткой субъединицы В холерного ток-
сина, которая селективно соединяется с компонентом плотиков ганглиозидом
GM]. Д, е — типичное распределение свечения красителя FMI-43, загруженно-
го в НО (указывает на популяции синаптических везикул).
A состоим Б °?""""""‘ B
cunt слияния формирование ином...
- . . ь _ SNARE-awunnouca �l��
I Ч д стены-пиит-
Опции
:1. : �ܭ� " _
M взъ- \› sum: 0@��
"""""°° Е” -X-T “шиш
Рис. 45 ц16. Универсальный J'Ll€XaHu3M слияния мембран (Wickner.
Schekman, 2008 c I/IBMBHBHI/ISIMI/1)
А ~ Для сцепления мембран необходима заякоренная на одной из
мембран Rab ГТФаза (в активном состоянии) и так называемый Каб-эффек-
тор, закрепленный непосредственно / или через дополнительные белки на
противоположной мембране. Б — При формировании сайта слияния (доки-
рование) Rab (через свои белки-эффекторы) регулирует привлечение бел-
ков слияния и способствует организации липидного микродомена, включа-
ющего молекулы холестерина, фосфоинозитидов, диацилглицерола. В -Этап
прайминга (предслияния) заключается в сборке SNARE комплекса с участи-
ем регуляторных белков. Наружный монослой мембраны обогащается ли-
пидами с маленькой головной группой (красные Шарики). Г - Полусливше-
у еся состояние формируется за счет объединения наружных монослоев мем-
” бран. Стрелками показано направление движения липидов. Липиды, обла-
у дающие большой головной группой (синие шарики), накапливаются во внут-
V ренних монослоях мембран, облегчая формирование поры слияния. Слия-
ние мембран обычно запускается Ca“, при участии Са-связываюЩего бел-
ка. Д - Полное слияние, сопровождающееся перемешиванием липидов и
' мембранных белков. Белки SN ARE—KoM11ne1<ca, ранее локализованные на про-
тивоположных мембранах, оказываются расположенными в единой мемб-
l ране. Белок SNAP связывается со SNARE комплексом и подготавливает его
' для АТФ-зависимой разборки шапероном NSF. При этом SNAP вытесняет
fix! A DI: fipnxu.
Рис. 45 1416. Универсальный механизм»: слияния ‚нед/брал (Wickner,
Schckman, 2008 с изменениями)
А — Для сцепления мембран необходима заякоренная на одной из
мембран КаЬ ГТФаза (в активном состоянии) и так называемый КаЬ-эффек-
тор, закрепленный непосредственно / или через дополпительпьте белки па
противоположной мембране. Б — При формировании сайта слияния (доки-
ровапие) КаЬ (через свои белки-зффекгоры) регулирует привлечение бел-
ков слияния и способствует организации липидного микродомена, включа-
ющего молекулы холестерина, фосфоинозитидов, диацилглицерола. В -— Этап
прайминга (предслияния) заключается в сборке SNARE комплекса с участи-
ем регуляторных белков. Наружный монослой мембраны обогащается ли-
пилами с маленькой головной труппой (красные шарики). Г - Полусливтпе-
еся состояние формируется за счет объединения наружных монослоев мем-
бран. Стрелками показано направление движения липидов. Липиды, обла-
дающие большой головной труппой (синие шарики), накапливаются во внут-
ренних монослоях мембран, облегчая формирование поры слияния. Слия-
ние мембран обычно запускается Caz’, при участии Са-связьтватощего бел-
ка, Д - Полное слияние, сопровождающееся перемешиванием липидов и
мембранных белков. Белки ЗНАКЕ-комплекса, ранее локализованные на про-
тивоположных мембранах, оказываются расположенными в единой мемб-
ране. Белок SNAP связывается со SNARE комплексом и подготавливает его
для АТФ-зависимой разборки шапероном NSF. 11ри этом SNAP вытесняет
другие соелипеппьте со SNARE белки.
113
ARF6. Активная фосфолипиза D1 начинает конвертировать фос-
фатитцилхолин цитоплазматических монослоев везикулярной и пре-
синаптической мембран в фосфатидную кислоту (липид с очень
маленькой полярной головкой, имеющий форму конуса), что суще-
ственно облегчает искривление мембран при образовании перешей-
ка («стебелька») между ними. Такое изменение состава мембран,
вероятно, протекает на стадии нраймннга и способствует образова-
нию поры слияния (рис. 43 1114).
Полиненасьтндеттньте жирные кислоты. Одпн из важных ре-
гуляторов экзоцитоза липидной природы - это длитнто-ценочньте по-
линенасьттненттьте жирные кислоты (PUFAs: арахидоновая, омега-З
и -6 жирные кислоты), которые прямо могут воздействовать на
ЗНАКЕ белок синтаксин (СопнеН ct а1., 2007). Эти жирные кислоты
могут высвобождаться из фосфолипидов фосфолнттазой А2, кото-
рая участвует в прайминге везикул; или из диацилглицерола с по-
мощью ДАГ-липазы, ингибитор которой ослабляет рост нервов и
секрецию инсулина. Белок подобный ДАГ-линазе является необхо-
димым компонентом механизма освобождения пейромедиатора у
Drosophila (Huang et а1., 2006). Добавление арахидоновой кислоты
к синантичсским мембранам значительно облегчает формирование
SNARE КОМПЛЕКС?) (Darios, Davletov, 2006). Подвижные молекулы
арахидоновой кислоты проникают в гидрофобные впадины между
амфипатичными спиралями синтаксина и активируют его, даже в
том случае, если последний «зафиксирован» с помощью Мипс1 8. В
результате синтаксин начинает взаимодействовать со своими SNARE
партнерами, причем связь синтаксина с Munc18 сохраняется (Darios
et а|.‚ 2007).
Холестерин. Синаптические мембраны содержат достаточно
большое количество холестерина, который принимает существен-
ное учасгие в мембранных процессах (van Meer ct а1., 2008). Около
25% общего холестерина «проживает» в мозге млекопитающих (15-
20 мг на 1 г ткани мозга), хотя мозг составляет менее 10% массы
тела, высокая концентрация наблюдается в периферических нервах,
перехватах Ранвье (Zitman ct а1., 2010) и двигательных НО (Зефи-
ров, Петров, 2010). Присутствие холестерина в мембранах ускоряет
слияние мембран, как благодаря стабилизации им деформирован-
ных мембран в области поры слияния (точнее отрицательных изги-
бов), так и за счет индукции коттфоргиационпьтх изменений в транс-
мембрапных регионах SNARE белков, в особенности сипаптобре-
випа (Tong ct а1., 2009). Сцнптголнпттдьт с холестерином способны
114
самопроизвольно собираться в домены («нлотики»), прнсутсвие ко-
торых предполагается на обеих поверхностях плазматической мемб-
раны (van Blitterswijk et al., 2003; Петров и др. 2011) (рис. 44 Ц15).
Холестерин преимущественно смешивается со сфинголипидавти
вследствие того, что головные группы сфинголипидов ограждают
ненолярный холестерин, а молекулы холестерина заполняют лаку-
ны между гидрофобными хвостами липидов. В дополнение к этому
холестерин удерживается в мембране за счет водородных связей и
Вандер-ваальсовых взаимодействий с амидными группами сфинго-
липидов. Другая модель предполагает осуществление сборки липи-
nos в нлотики в результате взаимодействия насыщенных ацильных
цепей и холестерина. В состав плотиков часто входят ФТИ-4,5-Ф2
(Martin, 2001; Wenk, De Camilli, 2004). Линидные нлотики, с инкор-
норированными в них специфичными белками, плавают в более
жидкой липид-неутторядоченной фазе глицеролипидов. Болынинство
белков плотиков либо напрямую взаимодействуют с холестерином,
либо связываются с липидными плотикамьт с помощью гликозил-
фосфатидилиттозтттодтьного (GPI, glycosylphosphatidylinositol) — яко-
pa, двойного пальмнтилированття, миристилирования. В липидных
плотиках наблюдается высокая концентрация ганглиозидов (GM1,
CD111, CD1b, GTlb), ОНИ составляют до 15% всех липидов в не-
рвной системе позвоночных. Причем среди ганглиозидов домини-
рует ганглиозид GMI, который селективно связваетея субъедини-
цей B холерного токсина (Owen et al., 2007; Zitman ct а1., 2010),
Интегральные мембранные белки, участвующие во взаимодействи-
ях с нитоскелетом, могут быть компонентами нлотиков. Липидные
нлотики представляют собой маленькие (10-200HM), гетерогенные,
высоко динамичные структуры (могут изменяться в течение милли-
или даже микросекунд), которые комнартменталитзуют (распределя-
ют по регионам) клеточные процессы. Они могут собираться через
белок-белковые и липид-белковьте взаимодействия в болыпие «плат-
формы» (Pike, 2006).
Нами показано присутствие обогащенных холестерином и ган-
глиозидом GM] регионов (липидных плотиков) в мембранах двига-
тельных НО холоднокровных и теплокровных животных (рис. 44
15). Причем обнаруженные линидные микродометты располагались
в участках НО, где концентрировались синаптические везикулы, заг-
руженные FM1—43. то есть в областях экзо- и —'.)n;Lo1.1nTo3a(IIcTpoBH
др. 201 I ). Кроме того нам удалось идентифицировать линидные нло-
тики в мембранах синантиттесих везикул (Зсфиротз, Негров, 2010).
115
В сайтах зкзоцитоза и мембранах синаптических везикул плотики,
вероятно, выполняют функцию платтрорхт для локализации и акти-
вации белков ЗНАКЕ-комплекса (синтаксин, SN/\P—25, синаптоб-
ревин), (Ёа-кгтналов, а возможно и синантотагхтнна. Позтому удале-
ние холестерина из плазматических мембран, приводящее к разру-
шению липидных микродоменов, вызывает‘ «рассеивание» SNARE
белков и потеттциал-завттсимых Са- каналов по всей поверхности
НО (Lang е: а1., 2001, Chamberlain et al., 2001; Chamberlain, Gould,
2002; Taverna et al., 2004). Этим можно объяснить угнетение синх-
ронного экзоцитоза под действием метил-бета-цикиодекстритта, аген-
та вымьтваютцего холестерин из поверхностных мембран (Петров и
др. 2009).
Длительное воздействие (сутки) повышенного уровня глюко-
зы подавляет синтез холестрина в бета-клетках поджелудочной же-
лезы, в итоге его содержание в мембранах снижается, а сайты экзо-
цитоза теряют Синтаксин 1 А и секреция иттсулит-та резко ослабляет-
ся (Somanalh е: а1.‚ 2009). Способность коттцентрнроваться в липид—
пых плотиках зависит от изоформы SNARE белка. В детергент-ус-
тойчивых мембранах.(«аналоги» липидных плотиков, получаемые
при центрифугировании тканей) сосредоточено от 20 до 70% всех
SNARE протеинов, причем чем этот процент вьнпе, тем эффектив-
нее протекает зкзоцитоз (Salaun et al., 2004). Главным «пропуском»
в линидные нлотики является пальмитилироваттие (пришивание ос-
татка пальмитиновой жирной кислоты к белку). Так SNAP-25 со-
держит несколько трупп пальмитиновой кислоты, благодаря чему и
аккумулируется в плотиках. Пальмитилирование может регулиро-
вать насыщенность липидных микродоменов белками. Синтаксин
1А вовлекается в липидные плотики, непосредственно взаимодей-
ствуя с холестерином, CDTI/l—4,5—CD2, и через связывание с белками
плотиков (SN/\P—25).
Церамид. Это центральная молекула в пути метаболизма сфин-
голипидов, которая концентрируется в мембранах вместе со стеро-
лами и другими сфинголипидами. В плазматической мембране Це-
рамид образуется посредством гидролиза фосфатной головной грун-
пы сфингомиелина ферментами сфингомиелиназами или доставля-
ется в нее везикулами, транспортирутотцими ‚зипидьт. В случае му-
таций кислой шрингомиелазы возникает Ньюман Пик болезнь типа
А, харакгеризутотцаяся накоплением сфингомиелъттта в мембранах ли-
зосом и плазматических мембранах нейронов, дистротрттей аксонов
и гибелью нейронов, особенно клеток Пуркинье (Galvan et al,, 2008).
116
Продукция церамнда или его накопление в мембранах может потен-
цировать или ингибировать мембранное слияние.
Сфингозин. В естественных условиях распределение холесте-
рина н сфинголипидов контролируется церамидом и продуктом его
расщепления (церамидазой) - подвижным сигнальным липидом -
сфингозттттом (Pagano et 211., 2000). Церамидаза SLAB плодовой мушки
важна только для выполнения пресинаптической функции нейро-
нов. Причем мутации в гене SLAB, приводящие к изменению сфин-
голипидиого окружения в НО, не влияют на количество докирован-
иых везикул, но уменьшают на ~70% способность везикул к слия-
нию (Kidokoro, 2003; Rohrbough et а1., 2004). Кроме того, церамида-
зы могут функционировать как секретируемые ферменты, действуя
на наружный слой плазматической мембраны. Присутствие избыт-
ка сфингозитта в пресинатггической мембране способствует более
прочному связыванию Munc18 И синтаксина 1, изменяя конформа-
Цию синтаксина 1. В результате синтаксин 1 стабилизируется в зак-
рытой конформации и нраймироваттие синантических везикул зат-
рудняется (Camoletto ct а1., 2009). Однако сфингозин активирует ве-
зикулярный синантобревин, освобождая его от ингибиторных влия-
ний, в результате последний более «охотно» участвует в формиро-
вании ЗМАКЕ-комттлекса. В нервно-мышечном синапсе лягушки.
гиннокампальньтх нейронах, еинаптосомах, нейроэндокринных клет-
ках сфиигозитт усиливает экзоцитоз синаптическттх везикул (Darios
el al., 2009).
Таким образом, оттредеттеттттьтй липидный состав мембран ‘гре-
буется для докирования и праймирования синантических везикул,
формирования поры слияния. Липиды выполняют роль сайтов креп-
ления белков экзошттоза, могут регулировать их активность. Опре-
деленный липидный интерфейс облегчает формирование изогну-
тьтх мембранных структур(мембранногоперешейка между везику-
лой и АЗ), а также может стабилизировать полуслившееся состоя-
ние везикулы. В ходе всех стадий экзоцитоза происходят существен-
ные изменения активности ферментов, вовлеченных в метаболизм
фосфолипидов (особенно фосфадитилиттозтттолов)„ сфинголипттдов
и некоторых жирных кислот. Вероятно, координирующую роль в
направлении метаболизма липидов играют липидные плотики и
малые 1"1`Фа3ы.
Заключая главу об экзоцитозе синантических везикул и ме-
ханизмах слияния мембран, хочется сказать, что многое об инициа-
ции и регуляции цикла сборки-разборки SNARE КОМПЛСКСЗ остает-
117
cg пока неизвсстттьтм. Может сложиться впечатление, что молеку-
лярная машина зкзонитоза непомерно громоздкая и сложная, хотя
на самом ‚деле что не так, а предлагаемый в настоящее время меха-
низм сплавления мембран весьма прост (Bruns, Jahn 2002; Li, Chin,
2003; Sudhof. 2004; Bmnger. 2005; Giruudo ct а1., 2006; Takamori ct al..
2006; Shcn et aI., 2007). Набор нескольких траттсмембранньтх белков,
ведущих слияние, и 3-4 белка, регулирующих аспекты сборки-раз-
борки SNARE комплекса, Са-чувсгвительттьтй белок (сенсор Для за-
пуска экзоцитоза) функционируют схожим образом во всех эукари-
отических клетках. В то же время различные изоформьт SNARE,
Rab И SM (nScc / Munc 1 8) белков, локалнзуясь избирательно в опре-
деленных мембранных компартмептах, обеспечивают‘ специфику
процессов слияния. Предлагаемая в настоящее время универсаль-
ная схема белковых и липидных взаимодействий в слиянии мемб-
ран (Wickner, Schckman, 2008), которая полность применима для
описания механизмов экзоцитоза синантичееких везикул, представ-
лена па рис. 45.
Нейротоксины и экзоцитоз
везикул
Некоторые природные токсины избирательно действуют на мо-
лекулярную машину экзоцитоза синантичееких везикул, блокируя
или стимулируя слияние мембран и секрецию медиатора. Кроме су-
губо прикладного, медицинского аспекта, исследования молекуляр-
ных механизмов действия таких токсинов важны для изучения са-
мого процесса экзоцитоза. Ниже мы остановимся на трех наиболее
интересных токсинах, нарушающих процессы экзоцитоза синанти-
чееких везикул - столбнячном (тетанус-) токсине, токсине боту-
лизма, и альфа-латротоксине.
Мишени действия токсинов ботулизма и столбнячного ток-
сина. Эти токсины обладают зндопротеазттой активностью и проду-
цируются грамположительными бактериями из рода С`/‹).з'1‘1`г1'с11'ит (от
греч. «веретено›>). ГГоскольку токсины Действуют каталитически, в
рейтинге самых ядовитых веществ они занимают первые строчки, в
среднем летальная лоза составляет 1 пг на кг веса животного. Енип-
ствепная молекула токсина достаточна, чтобы «отравить» целую
нервную терминаль. Все клостридиальттьте токсины продутптрутотся
в форме белка около 150 кДа, формируемого однои полипептидной
цепью. Затем происходит протеолиз токсина, в результате образу-
ются тяжелая (100 кДа) и легкая (50 кДа) цепи, которые остаются
связанными одним дисульфидным мостиком и нековалентными вза-
имодействиями. Тяжелая цепь отвечает за связывание и захват ток-
сина в НО, а также проникновение легкой цепи в цитозоль, которая
является одной из самых специфичных (селективных по отноще-
нию к субстратам) из известных протеаз (Brunger, Rummel, 2009).
ТСТЗНуСТОКСИН (выделяется Clos/ridium feta/11' -— возбудителем стол-
бняка) действует преимущественно на синапсы ЦНС, блокируя ин-
гибиторные интернейроны, выделяющие глицин и ГАМК, в спин-
ном мозге. В результате наблюдается паралич, сопровождающийся
мощным сокращением мышц (Bleck, 1989). Ботулотоксины (типы
А, В, С, D, Е, F, G, вырабатываются С1о$гг1с11ип1 borulinum) самые
мощные из известных токсинов (с летальной дозой для мышей 0,5-
5 нг/кг), влияют на периферические холинэргические нейроны, в
итоге проявляется генерализованная мышечная слабость (Hathaway,
1995). Однако молекулярная мишень у названных токсинов одна -—
ЭТО белки экзоцитоза. Столбнячный токсин и ботулотоксины В, D,
F, G расщепляют внутренние пептидные связи в синаптобревине,
токсин ботулизма С «режет» синтаксин и SNAP-25, a токсины А и
G нацелены на SNAP-25. Токсины ботулизма используют в клини-
ке для снятия симптомов гиперфункции НО, выделяющих ацетил-
холин, таких как блефароспазм, спастичность, дистония (Rossetto et
а1., 2004). Хотя токсины ботулизма способны блокировать освобож-
дение и других медиаторов, включая глутамат, глицин, норадрена-
mm, Дофамин, серотонин, и нейропептиды (Schiavo et а1., 2000).
Клостридиальные нейротоксины вначале связываются со сво-
ими рецепторами на пресинаптической мембране и затем эндоци-
тозом поглощаются в цитоплазму НО. Поэтому проникновение ток-
синов происходит значительно быстрее на фоне синаптической ак-
тпвности, связанной с протеканием процессов экзо-эндоцитоза си-
наптических везикул. В качестве мест крепления (рецепторов) ток-
синов (точнее тяжелой цепи) на мембране выступают белки синап-
тических везикул синаптотагмины I/ll, белок 5\/2 (его A,B.C - изо-
формы). Причем кроме связывания с белком токсину для проникно-
вения требуется взаимодействие с мембранными липидами (поли-
сиалоганлиозидами. например, ганглиозиды GD1a. (ЗОН), GTIb)
(Verderio et а1., 2006). ОТНЕСПЛСНИС остатков сиаловых кислот от ган-
глиозидов с помощью фермента нейраминидазьт значительно ослаб-
119
ляет ‘эффекты клостридиальньлх токсинов. В кислой среде тяжелая
цепь ботулотоксина «нрободаег» везикулы, образуя в них канал,
через который легкая непь выходит в цитоплазму нервной термина-
ли, после чего действует как Хпдчзатзисимая эндонептидатза, разру-
шая машину экзоцитоза. Тетанустокснн в везикулах ретроградно
транспортируется (7.5 мм/час) по микротрубочкам в тела мотоней-
ронов спинного мозга, где аккумулируется в передних рогах. Вези-
кулы с тетанустоксином сливаются с мембранами дендритов мото-
нейронов, попадая в синаптическую щель, из которой токсины зах-
ватываются эндоцигозом аксонами тормозных интсрнейронов. В ин-
тернейронах тетанустоксин выходит из везикул и «приступает» к
протеолизу синаптобревнтта (Schiavo ct al., 2000). Специфичный мар-
шрут транспорта тетанус-токсина связан с его взаимодействием с
гликозилфосфатидили:тозитол-заякоренньтми гликопротеинами (на-
пример, Thy—I) и ганглиозидами CDlb / CT1b липидных нлотиков,
локализованных в мембране двигательных НО. В результате токсин
захватывается особым вариантом клатрин-опосредованного эндо-
цитоза, формирующим везикулы с нейтральным рН (то есть в них
не работает протонный насос). В норме эти везикулы при участии
малой ГТФазы Rab7 доставляют «нейротрофические» сигналы
(p75NTR, TrkB, BDNF) B сому мотонейронов (Deinhardt е: а|.‚ 2006;
Brunger, Rummel, 2009).
Са-зависимые и независимые механизмы действия альфа-
латротоксина. Альфа-латротоксин — высокомолекулярный белко-
вый компонент (130 кДа) яда паука черная вдова, запускающий
экзоцитоз синаптических везикул как готового к освобождению,
так и резервного пула во многих НО, находящихся в состоянии «но-
коя» (Longenecker ct а1.‚ 1970). В нервно-мышечных синапсах дей-
ствие этого яда начинается с некоторой задержкой и со всей силой
проявляется спустя 10 мин после аппликации. Особенно интерес-
но, что б-латротокеин усиливает квантовое освобождение медиато-
ра как в отсутствие, так и при нгитични внеклеточного Са (Clare е:
а1.‚ 1970). АлЬфа-латротоксин мощный стимулятор выброса гормо-
нов из электроплотътых гранул эндокринных клеток, включая хро-
маффинные клетки надпочечников (Hlubek е: а1., 2003). После мас-
сивного экзонитоза, вызванного альфа-латрогокситтом, наступает
фаза истощения запасов синаптических везикул — вероятно, являю-
щаяся следствием неспособности механизма эндоцитоза обеспечить
возросшие траты везикул (Silva е: a1., 2009).
Идентифицировано три типа эндогенных рецепторов ‚патроток-
120
сина, расположенных на пресинаптическои мембране — неирекси-
ны, латрофидтиттьт, тирозинфосфатаза сигма. Все три мишени дей-
ствия латротоксипа - это белки, вовлеченные в обеспечение меж-
клеточной адгезии пресинаптической мембраны с экстраклеточ-
ным матриксом и постсигтаптической мембраной.
Выявлено три основных механизма реализации эффектов аль-
фа-латротоксина на экзоцитоз. Во-первых, он обладает порообра-
зующей активностью. Этот Са-зависимый эффект латротоксина
ярко проявляется в эндокринных клетках и развивается медленно.
Латротоксин образует катион-селективный канал большой прово-
димости, через который ионы Са проникают в цитоплазму и запус-
кают зкзоцитоз. Одновременно через пору канала проходят ионы К
и Na, что в некоторых случаях вызывает стойкую деполяризацию
мембраны и открытие других потенциал-зависттмьтх каналов. Суще-
ствуют данные о выделении АХ и АТФ из НО через латротоксино-
вую пору (Ashton ct а1., 2000). Формирование поры протекает, по
крайней мере, в три этапа: объединение двух димеров латротоксина
в тетрамер, происходящее в присутствие двухвалентных катионов
(блокируется ионами La3+, Yb3+, Cd3+, Y3~, Al3+), взаимодействие
со специфичным мембранным рецептором (например, нейрексином
в присутствии Са или реже с у-тирозинфосфатазой без участия Са).
встраивание в мембрану (Ushkaryov et а1., 2008). Вследствие перфо-
рирования мембраны альфа-латротоксином нарушается мембранный
потенциал, баланс катионов и запускается «гибель» нервной тер-
минали (Sudhof, 2001).
Во-вторых, альфа-латротоксттн, связываясь с латрофилином (со-
пряженный с Gql 1-протеином рецептор) и активируя его, иниции-
рует высвобождение ионов Са через ИТФ-управляемые каналы из
внутриклеточных депо. Этот эффект латрофилина развивается бы-
стро. Кроме того, альфа-латрофилин может стимулировать откры-
тие потенциал-зависимых Са- каналов (Ushkaryov ct а1., 2008; Silva
et а1., 2009).
C а-зависимые эффекты альфа-латротокситта проявляется в виде
резко возникающих периодических вспышек интенсивного экзоци-
тоза, наблюдающихся на протяжении длительного времени (Lclianova
et а1., 2009). Увеличение освобождения медиатора под действием
альфа-латротоксхттта практически полностью ингибируется клост-
ридиальными токсинами, то есть требует участия SNARE бСЛКОВ.
Однако Са-зависпмьте эффекты альфа-латротоксина, хотя и с мень-
шей силой, продолжают проявляться в нейронах с гтоврежтхеттпьтмтт
› 121
синаптобревином 2, SNA P-25 и Munc13—1. Эта составляющая зави-
сит от перо-формирующей активности альфа-латротоксина и мо-
жет активироваться значительным входом ионов Са в НО (Deak et
al., 2009).
В-третьих, токсин способен Са-пезависимо стимулировать
машину экзоцитоза. Альфа-латротоксин стимулирует Са- незави-
симый экзоцитоз глутамата, ГАМК, ацетилхолина, но не катехоло-
вых аминов и пептидов (Khvotchev et а1.‚ 2000). Причем этот эф-
фект проявляется в присутствие ионов Mg, развивается медленно и
зависит от SNA RE-6em<o13. При этом рецептором латротоксина яв-
ляется также латрофилин, однако способность последнего активи-
ровать Gq белок в данном случае не требуется (Deak е: а1., 2009). В
дополнении, ос-латротоксттн вызывает диссоциацию комплекса си-
наптобревина 2 и синаптофизина 1, «освобождая» синаптобревин
для участия в работе SNARE—1<oMnneI<ca(Bonanomi et al., 2005).
122 ё
ГЛАВА IV. ЭНДОЦИТОЗ
Процесс эндоцитоза заключается в том, что участок поверх-
ностной мембраны, к которому с внешней стороны могут присое-
диниться различные субстанции, погружается в глубину клетки (ин-
тернализуется), а затем отщепляется, формируя мембранный пузы-
рек (везикулу), содержащий «кусочек» окружающей среды (рис. 46).
Эндоцитоз играет ключевую роль в развитии организма, иммунном
ответе, жировом обмене, сохранение размеров и передаче сигналов
внутрь клетки, поддержании гомеостаза целого организма. Понятие
ЭНДОЦИТОЗ
фагоцитов макропиноцитоз пиноцитоэ
мембрана
ЦИТОППЭЗМЭ ЗКТИНОВЫЭ
НИТИ
fl!
О
Рис. 46. Разновидности эндоциптоза (3ефиров‚ Петров, 2009).
Поверхностные рецепторы плазматической мембраны связыва-
ются с определенными участками на поглощаемой частице. Это при-
водит K полимеризации белка О-актина. Его длинные нити (Рактин)
способны толкать податливую мембрану, что приводит либо к форми-
рованию выступов (фагоцитов), либо к образованию складки (макро-
пиноцитоз). Пиноцтттоз, который используют многие клетки, состоит в
захвате небольших по массе веществ вместе с жидкостью.
123
«эидоиитоз» в общебиологическом смысле включает несколько ме-
ханизмов, которые принято делить на две обширные категории - A
фагоиитоз (захват очень крупных частиц) и пииоцитоз (захват жид-
костей, а также растворенных в них молекул). У млекопитающих
фагоцитоз осуществляется макрофагами, моиоцитамтт, нейтрофила-
ми и некоторыми глиальными клетками, которые задействованы в
очищении организма от больших иатогенов и крупных частиц. По-
глощение бактерий, грибов обычно сопровождается воспалитель-
ной реакцией со стороны макрофага с образованием токсичных сво-
бодных радикалов кислорода. тогда как при очистке организма от
собственных погибших клеток, например в участках повреждения
тканей или в течение развития, макрофаг ведет себя весьма «так-
тично» и не выделяет агрессивных, вызывающих воспаление, ве-
ществ. Некоторые клетки иммунной системы используют макро-
пиноцитозиук) активность для отбора и «проверки» на наличие
антигенов больших объемов внеклеточной среды. С помощью пи-
нопитоза, который имеет множество вариантов, клетки контроли-
руют состав (количество поверхностных рецепторов, ионных кана-
лов, в том числе водных каналов, аквапоринов, переносчиков, на-
сосов) и площадь мембраны. Пиноцитоз впервые появился при эво-
люционном переходе от про- к эукариотам. Чтобы выжить, ранние
клетки научились захватывать внеклеточную жидкость вместе с ра-
створенными макромолекулами (пиноцитоз) и вливать пищевари-
тельные ферменты непосредственно в эндошттознуто вакуоль.
Особое место эндопитоз занимает в нервной системе, посколь-
ку передача информации между нейронами, протекающая в специ-
ализированных структурах (синапсах), напрямую сопряжена с ин-
тенсивным использованием этого механизма. В настоящее время
многие ведущие лаборатории мира пытаются разобраться в слож-
ных молекулярных взаимодействиях, управляющих эндопитозом.
Этот в высокой степени координированный и сопряженный со всей
физиологией клетки пропесс позволяет предположить, что для его
появления было потрачено огромное эволюционное усилие (Соппег,
Schmid, 2003; Веселкин и др., 2004; Зефиров, Петров, 2009).
124
Эндонитоз синаптических
везикул
Как было сказано ранее, зкзоцитоз синантических везикул он—
ределяет освобождение медиатора. Однако длительное общение меж-
ду нервными клетками невозможно без «обратного» процесса, на-
правленного на восстановление численности сииантических вези-
кул и поддержание постоянства площади НО. Доставка новых вези-
кул из тела клетки является достаточно длительным процессом, по-
этому не может быть использована для восполнения численности
везикул. Поэтому, после встраивания везикулярной мембраны в пре-
сннаптическук) поблизости от АЗ запускается захват мембранного
материала внутрь НО — зндошггоз.
Виды пресинаптического эндоцитоза. В НО сосуществуют
несколько вариантов эндощттоза, для болынинства из которых тре-
буется белок клатрин. Рециклирование около 90% везикул в ней-
ронах обязательно включает этап клатрин-опосредоваттного эндо-
питоза (Girard ct al., 2005; Newton et al., 2006). Так, в гиппокамне
млекопитающих при истощении запасов клатрина при помощи ин-
терференционных РНК даже после короткой пачки из 4 ПД реани-
дификация рН-чувствительного синаптофлуорина не наблюдалась
(показатель эндоцитоза), следовательно, клатрин важен даже для
эндоцитоза везикул в ответ на кратковременную стимуляции)
(Granscth ct aL, 2006). Фотоинактивация легких цепей клатрина в
нервно-тхтьтцтечиом синапсе дрозофилы ведет к полному исчезнове-
нию синантических везикул в нервном окончании после продолжи-
тельной стимуляции (6000 стимулов 8 имп/с) (Heerssen ct al., 2008).
B настоящее время выделяют две основных разновидности клатч
ринового 311z1o11m03z1(pnc. 47) — быстрый (от нескольких секунд до
минутьт) и медленный (минута и более), обнаруженные как в цент-
ральных, так и в периферических синапсах (Royle, Lagnado, 2003;
Dittman, Ryan, 2009). Быстрый зндоцитоз осуществляется на плос-
кой поверхности плазматической мембраны, а медленный («объем-
ный» от англ. <<bulk») ')H,£10l_[HTO3 и на поверхности эндосомо-по-
добных структур, формирующихся после массивного экзоцитоза
синаптических везикул (Murlhy, De Camillli, 2003). [Причем инвати-
нации в мембране формируются очень быстро, и только во время
интенсивной стимуляции, а вот для образования из них везикул тре-
буется значительное количество времени (Clayton, Cousin, 2009).
125
__,_._.__..__._ ___
Рис. 4 7 . Варианты эндоцитоза сипап/пическиэс везикул в не-
рвном окончании (Зефиров, Петров‚ 2009).
А - после слияния синаптической везикулы с пресинаптической
мембраной и выделения медиатора (а) образуется новая везикула (б) C
участием белка клатрина (показан пунктиром). Б - после полного сли-
яния возникают крупные инвагинации (а), которые могут отщепляться
от мембраны с образованием замкнутых пистерн, вакуолей (эндосо-
моподобных структур) (б). с поверхности которых затем образуются
новыс везикулы. В - «kiss and run» ЭНДОЦИТОЗ осуществляется за счет
формирования временной поры, после закрытия которой везикула от-
ходит от мембраны.
Предполагается, что в таких мембранных «лагунах» в ходе процесса
эндоцитоза происходит сортировка «дефектных» и «здоровых» ней-
рональньтх белков. Испорченные протеины могут перемешаться в
составе особых эндонитозттых везикул по направлению к внутри-
клеточным сортировочным станциям (классическим эндосомам)
(Wucherpfennig et al.. 2003; Rizzoli, Веги, 2005), где происходит либо
их исправление либо белки переправляются дальше в лизосомы
для расшепдлеттия до аминокислот. Это необходимо для «безошибоч-
ной» длительной работы синаптического аппарата, поскольку при
Экзонитозс белки синаптических везикул вступают в многочислен-
ные взаимодействия и сильно деформируются. Стоит отметить, что
126
HCI\'OT0pbIC i1B'I‘()p}>I IIOHI/iMLlK)'l‘ ПОД МСДЛСНПЬПЁИ ')l{,"10lHi'R)'SOM ТОЛЬКО
процесс образования глубокой иттгвагинатннт и ее отшнуровки, тог-
да как образование из зндосомотттэдобных структур везикул, рас-
сматритзатот в рамках обычного клатрин-оттросредованного эндони-
тоза (С1ау:оп, Cousin, 2009). Подобная трактовка понятия, C нашей
точки зрения, только затрудняет изложение материала.
Предполагается, что в случае низкочастотной активности си-
напса часть везикул иногда может использовать сверх быстрый
клатрин-независимый путь эндошгтоза (от десятков миллисекунд
до 1 секупдты), называемый механизм «поцеловал и убежал» (kiss-
and-run механизм) (СессатеНй е: а1., 1973). При этом, как было ранее
сказано, полного слияния везикулы с пресинатгтической мембраной
не наблюдается, формируется короткоживущая пора, через которую
происходит выделение медиатора, а зндоцитоз заключается в зак-
рытии норы и отщепления везикулы от мембраны (рис, 47) (3ефи—
ров и др, 2004; Fescc е: а|., 1999; Gandhi, Stevens, 2003; Нагата е: 211..
2006). Гнпотетически закрытие норы слияния может осуществлять-
ся при быстрой разборке SNARE комплекса шапероном NSF, фер-
ментативном изменениии липидной композиции в области поры
или с помощью специального белка(например, динамина), образу-
ющего сжимающийся воротник между везикулой и АЗ. Сверх-быст-
рый эндоцитоз наблюдается во многих синаптических образовани-
ях (гиппокампе, чантеобразньтх НО ствола мозга) при определен-
ных, часто нефизиологических условиях. Хотя в работе Zhang е: а1.
(2009) c помощью подхода «quantum dots» получены свидетельства
многократного использования kiss-and-run механизма везикулами,
имеющими высокую вероятность освобождении, в начале стимуля-
ционного периода. В изолированных спинальных гапглиях крыс
(Zhang е: а1., 2004) был обнаружен Са- клатрин-литтавтин-ттетзавистт-
мый ультра быстрый тип эндоцггтоза (kiss—and—run механизм), кото-
рый стимулировался цАМФ зависимой протеипкихтазой и вызывал-
ся деполяризацией мембраны. Причем деполяризация непосредствен-
по усиливала производительность аденилатциклазы. Высказывают-
ся предположения, что дробное освобождение квантов глутамата из
НО гиннокамтта в ходе kiss-and-run регулирует чувствителыгость
A-.\/IPA рецепторов, в частности, переводит их в десенситгттзироват1-
ное состояние (Richards, 2009).
Как основной механизм зндоцитоза kiss—and—run путь функци-
онирует нри секреции модуляторов синаггтической передачи (ней-
ронетгтилов, нейротрофинов) из электронно-плот:тых гранул (Li е:
127
а1., 2005). Так например, в гиппокампальпых нейронах после сти-
муляции открытие поры слияния гранул гпропсходггг с шнггельньпи
латентным периодом (десятки секунд), а длительность существова-
ния поры слияния (О, 1 7 - 0,6 с) регулируется входом ионов Са через
L— ТИП Са- каналов (Xiz е: 211.. 2008).
Эндоцитоз происходит и за пределами НО. Ассоциирован-
ные с синаптическгтмтт везикулами белки после встраивания в мем-
брану вследствие латеральной диффузии (например, синаптобре-
вин) могут покидать синапс, попадая в аксон. Вероятно, поэтому
эндоцитоз может осуществляться как в сипаптическттх бутонах, так
и в аксоне. По крайней мере, Иммунохимия гиппокампгшьпьтх пей-
ронов указывает на наличие белков эндоцитоза (клатрипа, его адап-
теров, динамина) в аксоне, хотя и в меныпей концентрации, чем в
нресгтнантгтческой области (Yao ct al., 2003). Клатриновое покрытие
Эффективно «отслеживает и ловит» везикулярные белки, покидаю-
щие синапс. В пользу этого свидетельствует данные о том, что ко-
личество меченных (флуоресцегггпьни белком) молекул легких це-
пей клатрипа, покидающих синапс пропорционально количеству си-
наптических везикул, освобожденных стимуляцией. Причем движе-
ние меченного клатрина начинается почти сразу после экзоцитоза
везикул (Granseth et 211., 2007). Таким образом, аксональньтй эндо-
цитоз, по всей видимости, протекающий с образованием эндосом,
задействован в возвращении в состав синаптической везикулы «сбе-
жавших» при экзоцитозе (с помощью латеральной диффузии) бел-
ков (Dittman, Ryan, 2009).
Скоростные характеристики
эндоцитоза в различных типах
синапсов
Определение кинетики эндоцитоза стало возможным благода-
ря развитию электрофизиологических и оптических методик, опи-
санных выше. Однако применение разных экспериментальных под-
ходов дает существенно отличающиеся временные характеристики
эндоцитоза сннаптиттескгтх везикул (табл. 2) (Royle, Lagnado, 2003;
Dittman, Ryan, 2009). Регистрация электрической емкости, которая
служит показателем площади поверхностной мембраны и применя-
ется только на крупных синапсах (биполярные клетки сетчатки, сен-
сорные волосковые клетки, чанпеобразные синансы Хелда), указы-
128
вает на очень высокие скорости эндонитоза —- обычно порядка 1 н
10 с для быстрого и медленного типов эндоцитоза, соответственно
(Rcndcn, Gcrsdorff, 2007). Применение флуоресцентных FM краси-
телей в гиггпокамггалыгьгх и нервно-мышечных синапсах свидетель-
ствует о протекании быстрого эндошттоза в пределах нескольких
десятков секунд, а медленного - в течение минут (Ryan, 2001; Rizzoli,
Bctz, 2005; Зсфиров и др. 2008). С помощью генетических меток
синанто-рН-флуоринов константа быстрого эндонитоза в гипнокам-
пальных синапсах была оценена приблизительно в 15 с (Granseth ct
а1., 2006; Balaji, Ryan, 2007), причем задержка между экзонгттозоыт и
эндоцитозом случайно варьировала от секунды до десятка секунд
(Balaji, Ryan, 2007). Подробно рассмотрим скоростные характерис-
тики эндоцитоза в некоторых, наиболее изученных нервных окон-
чаниях.
Табл. 2. Скоросппжь/е xapaKmepucmzn<zz эндоцитоза в различ-
ных гиниптических образованиях.
Объект Эндонитоз ссылки
сверх быстрый быстрый медленный
сннансы _3 с Н, I 5 С Mlmym Granselh cl al.. 2006
x1mum<a,\um Вани. Ryan, 2007
ваш; е! ат, 2003
Zhu е! а|„ 200‘)
"ф""°'"ь""°"ш"° инициируется 20-60 с минуты (2-15 мин) Зефщюв и ‘Ф’ 2004
синансы ляцушкн ' Зсфнротх и Др 2008
mncpocmorn-uxumu юны; с; „д 3003
рас торами
нервно-мьпиечньке ‚З 204“) L, „шипы зефиром и др. 2008
синансы мыши Reid 0131.. 2003
( Н‘ -W") Tabnres cl а! ‚2007
бшнтирныв L2‘; 45¢ Jccnmcckvm Jockusch с! а! . 2005
ясейртлъл сетчатки ' Llobelct а! _ 2003
золотой рыбки Holt e1al,. 2004
сенсорные менее I с _ 6 с джип” „кущ Schncc cl а1., 2005
aouocmamc K.‘lC|‘I(H Pmllan cl al__ 2003
c.'n<I<y:Iyca:my1uxM
Чашеобразные Мысы с ` I5 с _ („до С Не el а]. 2006
синансьл Хелда wu, Wu, 2007
грызунов Renden. Gcrsdorfi
I007
Пресинаптические нервные окончания гипнокампа. Свиде-
тельства наличия kiss-and—run механизма нри физиологических ус-
ловиях в гипнокампе были получены нри слежении за поведением
отдельных везикул, заполненных флуоресцентным красителем F:Vl1—
. ‚ми
��?� › 129
43 (Aruvanis ct ai., 2003; Richards ct al., 2005; Наташа et al., 2006). Эти
исследования указывали на возможность освобождения медиатора
некоторыми везикулами через скоротечную пору слияния диамет-
ром менее 1 нм, хотя не исключалось и другое объяснение, что раз-
ные везикулы могут содержать разные порции красителя (Aravanis
е’: а1., 2003; Richards et al., 2005). Применение техники тушения флу-
opec11e11111111FM1-43 низкомолекулярным веществом, способным про-
никать через малые поры, предоставило новые доводы в пользу ги-
потезы об использовании kiss-and-run механизма некоторыми вези-
кулами при низкой частоте стимуляции (Нагата ct а1., 2006). Однако
многие авторы критически относятся к данным результатам, посколь-
ку FMI-43 метит везикулы, образующиеся и в постсинаптической
области, а также в глиальных клетках. Именно их тушение, скорее
всего, было принято за kiss-and—run механизм (Chen ct al., 2008;
Dittman, Ryan, 2009).
Другие работы по определению кинетики везикулярного цик-
ла в гиппокампе были проведены с использованием флуоресцент-
ного белка, синацгофгяуорина. Сигналы (вспышки флуоресценции)
от синаптофлуорина‚ вызванные длительными эпизодами стимуля-
ции, исчезают относительно медленно (показатель эндоцитоза), с
постоянными времени более 15 с. Однако ответы на единственный
ПД более вариабельны (Gandhi, Stevens, 2003, Granscth ct а1., 2006).
Часто наблюдалось быстрое падение свечения менее чем за 1 е, что
казалось бы подтверждало восстановление везикул посредством kiss-
and-run. Подобная интерпретация не согласуется со скоростью реа-
цидифи кации везикул, составляющей порядка 3-4 сек (Dittman, Ryan,
2009). Дальнейшие эксперименты доказали отсутствие связи между
быстрым спадом флуоресцентного сигнала синагтгосрлуорина и эн-
z1onmo3o.v1(Granscth ct а1.. 2006). В целом, на вопрос имеет ли место
«kiss-and-run» 13 естественных условиях в гиппокампе большинство
исследователей отвечают отрицательно (Jung, Hauke, 2007; Dittman,
Ryan, 2009).
Исследования гиппокампальных синапсов, выполненные с по-
мощью зурНу, выявили присутствие только клатрин-опосредован-
ного эндоцитоза, с временной константой около 15-20 сек (при ком-
натной температуре), сопровождающего экзоцитоз синаптических
везикул в ответ на одиночный стимул или короткий залп импульсов
(Granscth е: ai., 2006, 2007). Причем скорость эндоцитоза была оди-
накова в синапсах с высокой и низкой вероятностью освобождения,
а также постоят-гной в ингерваяге сгимулягпги до 40 ПД при частоте
130
20 имп/с (близко к параметрам физиологической активности). При
дальнейшем повьппении интенсивности экзоцитоза наблюдалось за-
медление эндоцитоза, а в НО появлялись эндосомоттодобныс струк-
туры, характерные для медленного типа эндоцитоза (Balaji ct al.,
2008). B других работах, рН чувствительный GFP генетически при-
вязывался к обращенной в полость везикулы петле везикулярного
транспортера глутамата (Voglmaiscr ct al.. 2006), который только в
незначительной степени (около 2%) присутствует на поверхност-
ной мембране. Оказалось, что после одиночного ПД среднее время
эндоцитоза составляет около 14 сек, причем после встраивания ве-
зикулярной мембраны в пресинаптическую эндоцитоз может запус-
каться сразу или с задержкой до нескольких десятков секунд (Balaji,
Ryan, 2007). B работе Zhu И коллег (2009) показано, что после еди-
ничного события экзоцитоза в гиппокампальных НО восстановле-
ние везикул происходит с помощью двух вариантов клатрин-зави-
симого эндоцитоза: «очень быстрого» в течение 3 с и «быстрого»,
продолжающегося около 10 с. Увеличение активности, сопровожда-
ющееся повышением уровня внутриклеточного кальция, избиратель-
но стимулирует «быструю» дорогу эндоцитоза, не влияя на «очень
быстрый» путь.
Двигательные нервные окончания лягушки и мыши. В на-
ших исследованиях произведена оценка кинетики эндоцитоза в дви-
гательных НО лягушки и мыши. Для этого мы применили одноми-
нутную аппликацию красителя FM I -43. Краситель добавляли на одну
минуту при одноминутном раздражении, на вторую минуту при двух-
минутном и на третью минуту при трехминутном раздражении с
частотой 20 имп/с (рис. 48). Такая схема позволяет уменьшить до
минимума выгрузку загруженного в НО красителя посредством эк-
зоцитоза при продолжающемся раздражении (повторные раунды эк-
зоцитоза) (Bctz, Bcwick, 1993). Для того чтобы определить динами-
ку эндоцитоза после прекращения стимуляции, краситель добавля-
ли на одну минуту в разные периоды после завершения трех минут-
ного раздражения (рис. 48А). Оказалось, что в НО лягушки при вы-
сокочастотной стимуляции зпдоцитоз нарастает медленно в про-
цессе раздражения и продолжает увеличиваться в течение 1-2 мин
после прекращения раздражения. После выключения раздражения
захват красителя продолжается более 10 минут. Иная ситуация в
НО мыши, где интенсивность эндоцгттоза очень быстро нарастает в
процессе раздражения и резко уменылается (на 50-60%) сразу после
его прекращения. Неболыпой захват красителя продолжается в тс—
А ЖЧПМШС G :lHI'yIHK'(\
Г ‘ .. ..
'aJ
C}
Ё
.-5
Т
U
З
'J
д
Ё
Ё
C-
э:
. 1 к '1' 1 1 '
о 1 2 3 4 5 в o1234557a910111z1:1
BPCMH, VIHH тент. “Н”
7
70 т с
~ ас .
sf 60 лягушка "”"””'
Ё. 50 5°
Z .
5 до ' ‘C
Cl
д . ..
с 30 30
Э 2о 2o
ж 1
1o 101
О ^-г^*^“—7’/^ т -. о
1 2 з з ~ 13 1 2 з з - 9
HPCNIH, YHHH время. МИН
Рис. 48. Эндоцитоз слн/аппхичаскид’ везикдт и с0()/пно1‚иение экзо- и
эндоцитозст в двигапгельнь/‚х‘ нервных‘ окг)нчиния.\' (Зщриров и др. 2008).
A— Динамика загрузки красителя }7Ml-43(31-1110111/1'1‘03a) в ПО. Слева-
протокол экспериментов: а, б. в ~— FI\/I1-43 апплинируется в последнюю ми-
нуту разлражения с частотой 20 ими/с, г — краситель добавляется на одну
минуту через определенный период времени после окончания раздраже—
ния 2011мн/е — 3 мин. Справа - (рлуоресненция НО кожнотрудинной мьнн-
цы лягушки (темные столбики) и диафрагмы мыши (светлые столбики). По
вертикали — яркость свечения (огносите:1ьнь1е единицы, о.е.), но горизонта-
ли — время (мин). Б — Соотношение эндоштгоза и экзонитоза в двит ательньтх
НО лягушки и мьнни. Светлые столбики — огносите:тьт1ый теми экзонтттоза
синаптических везикул, опрсделелтный но квантовому составу ПК! I при раз-
дражении 20 имп/с- 3 мин (лант-тьте представлены на рис. 12А) (кажльтй стол-
бик - % квантов медиатора, освобожценньхх за 1-10, 2-10, 3-10 МИН раздраже-
ния от общего количества освобожденных квантов, принятых за 100%). Тем-
ные столбики -— относительный теми знлонитоза (количество захваченного
красителя в 1,23, мин раздражения (столбики а, б, в на А) и после окончания
раздражения (сумма столбиков г и‘: А) в % от общего захвата красителя
(сумма всех столбиков на А). По вертикальной оси - ноля везикул (в %) от
общего количества везикул, погнзерпнихся зкзонитозу (принято за H)()%),11o
Горизонтальной время в минутах. 1 .2.3- время pa31'1p11>1<e11m1.3-13 и 3-9 вре-
мя после раздражения.
132 ё
чение нескольких мин после окончания стимуляции (рис. 48А).
Сопоставления данных электрофизиологических и оптических
экспериментов в НО лягушки показало значительное опережение
темпа экзопиго3а над эндоцитозом (рис. 485). Так, в 1-ю мин раз-
дражения соотношение эгтзо-эндопигоз составляет 6/1. Поэтому к
концу высокочастотного раздражения около 70% слившихся вези-
кул остаются встроенными в плазматическую мембрану. В НО мыши,
где процессы эндоцитоза более эффективны темп образования но-
вых везикул незначительно отличается от интенсивности экзоцито-
за. В 1-у минуту раздражения отношение экзо- эндоцитоз составля-
ет менее 2/1, а после окончания раздражения только 30% мембран-
ных фрагментов слившихся везикул не подвергались эндоцигозу (рис.
48Б).
Таким образом, в двигательных НО существует два вида эндо-
цитоза: быстрый эндоцитоз (время образования новых везикул не-
сколько десятков секунд), который осуществляется уже во время
высокочастотного раздражения и медленный эндоцитоз (время об-
разования везикул- 5-15 мин) активно работающий после прекра-
щения высокочастотной активности. Интересно, что в двигатель-
ных НО мыпти преобладает быстрый эпдоцитоз, а у лягушки — пред-
ставлены оба варианта эндоцитоза (3ефиров и др. 2008).
Нами было также показано, что кроме этих двух видов эндоци-
тоза в двигательном НО лягушки при некоторых воздействиях (на-
пример при увеличении осмотичности окружающей среды) суще-
ствует супербыстрый эндоцитоз по типу kiss—and—run механизма, свя-
занный со спонтанной секрецией медиатора (3ефиров и др. 2004).
Погружение нервно-мышечного препарата лягушки в гиперосмо-
тичный раствор (сахароза, ЗОММ) вызывает учащение событий спон-
танного экзоцитоза (судя по частоте МПКГЛ). Однако в данном слу-
чае зкзопитоз не сопровождался захватом красителя FM I -43, a пло-
щадь мембраны нервной терминали оставалась неизменной (рис.
49). Количественно одинаковая стимуляция экзоцитоза гиперкалис-
выми растворами (КС 1 - 4ОмМ) приводила к успешной загрузке кра-
сителя. Поэтому единственной возможностью восстановления чис-
ленности везикул при резком увеличении секреции медиатора в ги-
перосмотичньтх растворах является kiss—and—mn МСХЗНИЗМ. Допол-
нительным свидетельством kiss—zmd-run механизма является отсут-
ствие выгрузки FM l -43 из НО лягушки 11pnc'rnMym{I1I4n освобожде-
ния медиатора с помощью гиперосмотического раствора.
› 133
Гиперкалиеаый
раствор
‘из
ёж Ё
\ " Е
E20 Fmnepxanvlesbna 5 д; сахароза
S раствор S_
C--15 E15
>< ь-
E 1o E 1°
ю а ---------- -—
5 5 о 5
Ь-
›— о
0 cu
Ф о ' 3‘ °
3‘ д 10 20 30 до о zo до во so 1oo
Концентрация, MM Концентрация, мм
Рис. 49. К15_\'-а11а'-гип эндицитоз в Hepenu-Mbtme-mom cuuance
лягушки (Зефиров и др.‚ 2004).
А - свечение участка НО кожно-груцитхной мышцы лягушки (кра-
ситель FM 1 -43). Пятна, характеризуют скопления везикул пропледших
экзо-и эндоцитоз. Экзоцитоз вызывали гиперкалевым раствором (40
мМ — |мин) или гипсросмотичным раствором (сахароза, 30 мМ — 1
мин ). Б - Доза-зависимый эффект внеклеточного КС! и сахарозы на
частоту МПКП при внеклеточном отведении (МПКП - показатель эк-
зоцитоза 1 везикулы). По оси ординат частота МПКП, в сек. Стрелками
обозначены концентрации (КС 1 - 40мМ и сахароза — 30мМ)‚ использо-
ванные в А, вызывающие эквивалентное увеличение частоты МПКП
(экзоцитоза). Отсутствие загрузки красителя в гипертонических раство-
рах свидетельствует о хшличии kiss—and-run эндоцитоза.
Синапсы нейронов, участвующих в обработке сенсорной
информации. Синапсы, вовлеченные в проведение и переработку
сенсорной информации, приспособлены для поддержания эффек-
тивной синаптической передачи в течение длительного времени и
имеют способность очень быстро восстанавливать запасы медиато-
pa (Альтман и др. 2009; Островский, 201 О). Подобные свойства сен—
сорных нервных окончаний связаны с особенностями организации
АЗ (о которых мы уже говорили), большим размером пулов синан-
134 Q
ТИЧССКИХ везикул и высокими скоростями зндоцитоза.
В темноте фоторецепторы позвоночных постоянно освобож-
дают медиатор, за счет интенсивно протекающего зкзоцитоза сн-
наптических везикул. При этом эндоцитоз происходит только с ров-
ной поверхности мембраны и с очень короткой временной задерж-
кой после слияния везикулы в АЗ (Rieke, Schwartz, 1996). В этих
синапсах медленный (объемный) тип эилоцитоза, вероятно, вносит
незначительный вклад в восстановление популяции синаптических
везикул (Rea ct а1., 2004).
В биполярных клетках сетчатки действует клатрин-зависи-
мый эндоцитоз, имеющий постоянную времени около 15 сек, наря-
ду c более скоростным клатрин-независимым вариантом — восста-
навливающим везикулярную мембрану за 1-2 сек (Jockusch ct а1..
2005). Однако оба тина эндоцитоза протекают только после полно-
го встраивания везикулярной мембраны в плазматическую, а kiss-
and—run механизм не имеет существенного значения (Llobct ct а1.,
2003). Клатрин- опосредованный эндоцитоз наблюдается после силь-
ной стимуляции, а независимый от клатрина эндоцитоз, вызывает-
ся слабой и умеренной (физиологической) активностью.
В сенсорных волосковых клетках саккулуса лягушки клат-
рин-опосредованный эндоцитоз, позиционирующийся как основ-
ной механизм восстановления синаптических везикул, имеет посто-
янную времени около 6 сек (Schnee е: а1., 2005). Такую скорость
эндоцитоза может обеспечивать какой-то специфичный для волос-
ковых клеток белок, например, отоферлин. Этот белок, имеющий
связывающий ионы Са С2-домен, может быть сенсором кальция в
ходе рециклирования синаптических везикул волосковых клеток
(Коих е: а1., 2006). Также показано взаимодействие Са- каналов
(Cav1.3), расположенных в синаптической области, с белком клат-
рин-опосредованного эндоцитоза эндофилином, что может облег-
чать эндоцитоз (Chen ct al. 2003). После длительной стимуляции в
течение десятков секунд в синапсах как сенсорных волосковых кле-
ток, так и биполярных, проявляется объемный медленный эндоци—
тоз, блокирующийся ингибиторами фосфоинозитол-З-киназы (РаШап
ет а1., 2003; Holt et а1., 2004).
Calyx of Held синапсы формируются гигантскими нервными
терминалями (15 мкм в диаметре) слухового отдела ствола мозга.
окутывающими тела ностсинаптических нейронов наподобие чашек
(Sudhof, 2004). B чашеобразных НО грызунов динамику зндоцъттоза
можно исследовать с помощью емкостного метода и флуоресцент-
135
ной микроскопии (Rcndcn, (}crsdorff, 2007). Эндопитоз в данных
синапсах происходит с постоянной времени несколько секунд, а при
увеличении длительности или частоты стимуляции замедляется (Sun
et а1., 2002; Yamashita ct а1., 2005). Ультрабыстрытт эндоцитоз (kiss-
and-run механизм) возможно гтспользуст маленькая популяция вези-
кул (около 5%) и только в ответ‘ на одиночные стимулы (Не ct а1.
2006). Основная часть везикул образуется за счет эндоцитоза, ха-
рактеризующсгося временной константой порядка 15 сек. С помо-
щью объемного эндоцнтоза (постоянная времени около 60-70 с) даже
при сильной стимуляции восстанавливаются только около 10% ве-
зикул (Wu, Wu, 2007).
Большинство работ, посвященных кинетике процессов репик-
лировання синаптических везикул, выполнены при комнатной тем-
пературе. Однако скорость эндоцнтоза очень чувствительна к это-
My параметру, и увеличивается в два-три раза при физиологичес-
ких значениях температур (Michcva, Smith, 2005; Renden, Gcrsdorff,
2007). Поэтому, вероятно, кинетика эидоцитоза во многих синапсах
теплокровных недооценена. Так, константа эндоцитоза в синапсах
гиппокампа, оцененная в 15 с при комнатной температуре, при тем-
пературе 37С снижается до 6 с (Balaji, Ryan, 2007). Кроме этого
способность зндоцитоза протекать е высокой скоростью при высо-
кочаетотной активности разной длительности зависит от стадии раз-
вития животного. Так, например, у молодых мышей (7-10 день пос-
ле рождения) в синапсах Са1ух of Held при увеличении длительнос-
ти стимуляции эттдопитоз протекает медленнее, а у старших собра-
тьев (14-18 день постнатального периода) эндоцитоз имеет одина-
ково высокую скорость при действии как кратковременной, так и
длительной стимуляции. Показано, что в синапсах взрослых мышей
в десятки раз возрастает число сайтов эндоцитоза (Rcnden, Gersdorff,
2007). Это согласуется с гипотезой об увеличении емкости «маши-
ны» эндоцитоза, восстанавливающей численность синаптических
везикул, в ходе созревания синаптических контактов. Поскольку этап
эндоцитоза является самым длительным в везикулярном цикле, то
его скорость определяет силу синаптического контакта при ритми-
ческой активности. Следовательно, увеличение скорости эндоци-
тоза открывает «новые возможности» для объяснения феноменов
кратковременной и долговременной (Granscth, Lagnado, 2008).
136 P�[�
Молекулярные механизмы
клатрин-опосредованого
эндоцитоза
Клатрин-опосредованьхй эндоцитоз. На сегодняшний день
проведены большие исследования по вскрытию молекулярных ме-
ханизмов эндоцитоза, происходящего в синапсе. Основным меха-
низмом «затягивания» мембранного материала в клетку считается
клатрин-опосредованный эндоцитоз. Этот вид эндоцитоза функ-
ционирует как в ходе формирования синаптических везикул, так и
при конститутивном и вызванном лигандами захвате мембранных
рецепторов (рецептор-опосредованный эндоцитоз) (Murthy, Dc
Camilli, 2003; Jung, Hauckc, 2007; Dittman, Ryan, 2009).
клатрин-опосредованный эндоцитоз синаптических везикул мо-
жет быть разделен на морфологически различимые стадии, каждой
из которых присущи свои уникальные белок-белковые и белок-
липидные взаимодействия. Эти процессы лежат в основе зарожде-
ния клатринового покрытия (нуклеация) в месте прикрепления к
участку мембраны специфических адаптерных белков, созревания
покрытой клатрином глубокой ямки (формирование почки), отсое-
динения покрытой клатрином везикулы и разборки клатринового
покрытия (Jung, Haucke, 2007). Детальный анализ архитектуры клат-
рин-опосредованного эндоцитоза стал возможен благодаря приме-
нению новых методов молекулярной биологии. Одним из самых ус-
пешных подходов стало использование микроинъекций (в гигантс-
кие синапсы миноги или кальмара) интерферирующих-пептидов
(взаимодействуют с комплементарными участками белков, нарушая
их работу) или белковых доменов, связывающихся с белками эндо-
цитоза.
Сходные с клатрин-шхросредованньтм эндоцитозом синагггичес-
ких везикул процессы задействованы во всех событиях образования
везикул из внутриклеточных мембранных органелл: клатрин требу-
ется для образования везикул из транс-комплекса Гольджи (КГ) и
зНДосом, белки аналогичные клатрину - COPI И СОРН, ретромер
участвуют в везикулярном транспорте из КГ в "MIC И опосредует
почкование мембранных пузырьков от ЭПС. Все эти варианты ве-
зикулярного транспорта включают те же этапы, что и клатрин-опос-
редованный зндоцитоз (рис.50) (Масмапоп. Mills, 2004).
Некоторые протеины (так называемые каркасные белки) обла-
137
пятазмагическая Мембрана
клацшн везикула / ы
ь
е
КАРА кпш%и›ё"":кпа'оин Иди“
тпамс-КГ \ `д ��Q� ‘из .......... „у
о G? '
‹
к’
диски КГ
‚х
а
'_ „\ м
«-33?
рибосомы
Рис. 50. Протеины покрытия, udanmepbz II пути везикулярного
mpuucrmpnzu Н тетке (Robinson, 2004).
Изображены процессы образования везикул от плазматической
мембрагты и мембранных органелл, обозначены протеины покрытия
(клатрин, COP—I, СОР-П, рстромер), а также адаптерные протеины (АР 1 ,
AP2, AP3, AP4). пунктирными стрелками указаны пути, существова-
ние которых предполагается. ЭПС —- эндоплазматътческая сеть, КГ-ч- ком-
плекс Гольджи.
дают способностью организовывать белки зндоцитоза в мул ьти про-
теиновые эндоцитозные комплексы или модули. Один подобный
белковый ансамбль обозначается основным комплексом и образу-
ет каркас эндоцитозного покрытия. В него входят клатрин, АР-2,
AP-180, стонин 2. (menu, амфифизин. Белки (эндофилин. сииапто-
янин, динамин, синдапиът), входящие в состав комплекса вторич-
ных эффекторов„ вступают в тэндопитоз позднее и взаимодейству-
ют c протеинами основного комплекса. Два консервативных синап-
тических белка функционируют как организаторы белковых взаи-
модействий между различными белками эндонитоза. входящими в
разные комплексы - Ер515 и интерсектин (Montesinos е: al., 2005:
138
Dittman, Ryan, 2009). Эти два белка в течение активности переме-
щаются в сайты эндонитотза, где координируют белки эндонитоза
(рис. 55 1119).
Гены и структура молекулы
клатрина
Изучение клатрина началось более 40 лет назад, когда Roth Н
Porter (1964), ИССЛСДОВЭВШИС с помощью электронной микроско-
пии захват желточного белка ооцитами москитов, описали покры-
тьте «щетиной» ямки и везикулы. Десять лет спустя Реатзе (1975)
смог выделить само покрытие и окаймленные им везикулы из мозга
быка, а затем идентифицировать главный белковый компонент —
тяжелую цепь клатрина (190 кДа). Впоследствии были охарактери-
зованы легкие цепи клатрина двух классов 1„Са и LCb, каждая но
25 кДа (рис. 51 ц17)(Кн‘с1111аЦ$еп‚ Harrison, 1981; Ungewickell, Branton.
1981).
У людей существуют две изоформьт тяжелых пеней клатритта. с
85% совпадением аминокислотных последовательностей, обознача-
емые С1-1С(С1аг1нтп11еауу Chain)— CIVIC 1 7 И С1 1С22, которые кодиру-
ются двумя генами 0)�� CLTC и CLTD (R0yle_ 2006). СНС17 — повсе-
местно экснрессируются и состоит из 1675 аминокислотных остат-
ков. Эта форма участвует в мембранном транспорте (эндоцитозе) н
митозе, только с ней ассоциируются легкие пени клатрина. Вари-
ант СНС22 содержит 1640 остатков аминокислот и синтезируется в
скелетных мышцах, где играет роль в организации мембран, но не
связан с эндоцитозом. В геноме человека имеется два гена CLTA и
CLTB, отвечающих за синтез двух изоформ легких цепей клатрина
1_Са(и3 218 аминокислот) и LCb (ИЗ 21 1 аминокислот), идентичных
на 60%. В нейронах экспрессирутотся специфичные снлайсинговьте
варианты обоих изофбрм. B ЦЕЛОМ все цени клатрина невероятно
консервативны, а появление пары генов тяжелых и легких цепей
произошло в эволюции в результате дупликацитт независимых ге-
нов примерно 510 и 600 миллионов лет тому назад (Wakeham ct а1.‚
2005).
Изучения нокаутов генов клатрина, полученные у разных орта-
низмов, указывают на важность клатритта в эндоцтттозе, особенно у
высших организмов. Нарушение гена тяжелой цени клатритта у дрож-
жей н I)/cI_vo5te/ium discuia’cunz Bbl3blBaIO'I‘ только замедление роста
139
и ограничение эндоцитоза (Wessc1s е: a1., 200()). Это связано с тем,
что у низших организмов эндопитоз преимущественно зависит от
актина, а клатрин играет вспомогательную роль (Kaksoncn ct 211.,
2005). Повреждения генов клатрина плодовой мушки l)r0s0ph[la
melanogaster и удаление генов клатрина у мышей не совместимы с
жизнью и летальны на ранних стадиях развития эмбрионов. Вык-
лючения генов клатрина и вспомогательных белков в различных куль-
турах клеток млек‹›питающих значительно снижают интенсивность
эндоцитоза и приводят к множественным дефектам митозов
(Hinrichscn et 211., 2003; Duncan, Payne, 2005; Royle et 211., 2005). Это
связано с выполнением клатрином альтернативной функции на
протяжении процесса клеточного mITo3a(R0y1c, 2006).
Детальный анализ ультраструктуры клатрина стал возможен
благодаря развитию ренген-кристаллографического анализа (тег Нааг
et а1., 2000; Roy1e,2006).11o форме белок клатрин напоминает «ноту»
с изгибом по середине ���� «коленом», благодаря гибкости которого
молекула клатрина может «прилаживаться» к различным изгибам
(рис. 51 п17). Колено делит полинентид на дистальную и, взаимо-
действующую с легкой пенью, проксимальнуто части. Один из кон-
цов клатриновой ноги выступает по направлению к мембране на-
подобие «ступни» (содержит домен. называемый бета-пропеллер,
из семи лопастей) и обеспечивает распознавание ряда белков, уча-
ствующих в эндопитозе (AP—2, AP-180. амфифизин, эпсин, АР-1)
(Musacchio 61211., 1999; McPherson, Rittcr, 2005). Бета-пропеллер клат-
рина вовлечен во взаимодействия с «клатрин Ьох» и «W-box» МОТИ-
вами, имеющимися у эндоцитозных белков (Тег Нааг е: а|‚, 2000;
Miele ct al., 2004). Противоположный конец ноги содержит регион
(«штатив»), отвечающий за объединение молекул клатрина в «трех-
ногую» структуру — трискелию (Kirchhausen, 2000; Fotin et а1., 2004).
Отдельные трискелии способны соединяться в плоские или корзи-
но-подобные решетки из пента- и гексагонов. С использованием
крио-электронной микроскопии удалось создать объемные изобра-
жения клатриновых агрегатов. Плоские клатриновые решетки на
поверхности мембраны составлены в основном из гексагонов, а по-
крытые ямки с различной степенью кривизны - из пента- и гексаго-
нов. В последнем случае присутствие 12 нентагонов является необ-
ходимым для тесной корзино-нодобной структуры клатринового по—
крытия, тогда как число гексагонов пропорционально размеру по-
крытой ямки или везикулы. Покрытые клатрином везикулы, изоли-
рованные из синапсов, характеризуются очень стабильными разме-
140 Q 0=��
рами (примерно 70-75нм) п состоят из 12 пентагонов и около 24
гексагонов (Fotin et а1., 2004). Окаймленные клатрином везикулы
других регионов, а также не нервных клеток обычно имеют диаметр
более 90 нм. Толщина покрытия практически везде постоянна - око-
ло 22 нм (Реагэе с: а1., 2000). При, чюлагается, что клатриновые трис-
келии вначале формируют плоск) во гексагональную решетку, затем
некоторые гексагоны трансформируются в пентагоны, превращая
плоскую решетку в закрывающуюся сферу (Brodsky е: а1., 2001;
Santini, Ксеп, 2002; Nossal, 2005). Такая трансформация достигается
за счет отсоединения или присоединения трискелий при их поворо-
те вокруг своей оси (Musacchio е: а1., 1999). Свободный клатрин и
клатрин в составе решетки могут достаточно быстро (несколько се-
кунд) меняться местами (Wu е: а1., 2001; Locrkc е: а1., 2005).
B покоящихся клетках рядом c внутренней поверхностью плаз-
матической мембраны присутствуют регионы, me концентрируют-
ся молекулы клатрина -- клатриновые «заплатки». Впервые они были
обнаружены в виде больших плоских клатриновых решеток, по кра-
ям которых происходило почкование покрытых клатрином везикул
(I-Ieuser е: а1., 1987). Недавние исследования также показали, что
половина покрытых клатрином везикул образуется из больших ста-
ционарных клатриновых заплаток, а другая часть формируется с1е
novo (Merrifield et а1., 2005). В синаптосомах цилиарного ганглия
цыпленка Са-каналы У” АЗ примыкают к белковым скоплениям, в
состав которых входят тяжелые и легкие цепи клатрина (Khanna е:
а1., 2007). Однако некоторые авторы считают, что подобные струк-
туры не связанны с почкованием везикул и являются артефактами,
возникающими из-за контакта клетки с покровным стеклом (Ehrlich
et а1., 2004).
Несмотря на изобилие информации о тяжелых цепях клатрина,
очень мало известно о структуре и функции легких цепей, взаимо-
действующих с проксимальной частью ноги с высокой аффинное-
тью (Kd -10'°) (Chen ct а1., 2002). При этом легкие цепи, помеченные
флуоресцентными белками, оказались очень удобным инструмен-
том для прижизненного оптического исследования динамики клат-
ринового покрытия (Ehrlich е: а1., 2004; Merrifield е: а1., 2005). До-
менная структура легких цепей представлена на рис. 51 ц17 (Вгос151‹у
е: а1., 2001; Royle, 2006). Хотя in шт клатриповые решетки, в от-
сутствие легких цепей, могут нормально собираться и разбираться.
in viva предполагается участие легких цепей в регуляции сооруже-
ния клатринового покрытия. Так, нарушение LC21 облегчает фор-
мированттс ПОКРЫТЫХ клатрипом ЯМОК И ДСЛЦСТ НС!1р()11уК'ГЪН3НЬ1С B321-
имодействття (всдуютпие к искажении) и дестабилизации покрытия)
между молекулами клатрина более динамичными (нестойкими). Ус-
транение LCb укорачивает время жизни «ттродуктттвиьтх» клагрино-
вых покрытий и продляете существование абортивных связей в клат-
риновой решетке. То есть ЬСа цепь препятствуетсборке клатрино-
вой решетки нормальной конфигурации и способствует формиро-
ванию «дефектов» в покрытии (такое покрытие легче разбирается).
а LCb ЦСПЬ имеетпротивоположное значение. Исходя из этого пред-
полагается функция легких цепей как контролеров («checkpoint»)
взаимодействий между молекулами клатрина, если их работа бу-
дет нарушена, то это приведет к формированию аномальных клат-
риновых полимеров (Mettlen ct 211., 2009). <DoTom1aI<TnBaI1m1 легких
цепей метолом Fl/\sH—FALl после экзопитоза в нервно-мышечном
синапсе Drosop/7ila полностью предотвращает образование новых
синаптичееких ‚везикул, вместо этого в НО появляются большие мем-
бранные структуры, которые не имеют аналогов в синапсах дикого
типа (Hccrsscn ct al., 2008)
Возможно, что легкие цепи препятствуют быстрому объедине-
нию трискелий в решетки и служат своего рода «тормозом», кото-
рый не допускает неттродуктивных взаимодействий клатрина (Ybc
е’: а1., 1999). ”pI1BJICKa'I‘CJIbH()IL"I BL1r;1x;1n'r гипотеза, в соответствии с
которой диссоциация легких цепей от тяжелых происходит под дей-
ствием еттециальньтх адаптерных белков и ионов Ca (Greene ct а1..
2000). Это облегчило бы формирование клатриттового покрытия в
регионе, в котором сконцентрированы адаптеры и произошел выз-
ванный ионами Ca экзоцитоз. Так, партнером легкой Цепи является
распространенный в мозге везикулярный белок кальпион, один раз
принизыватотттттй мембрану. При его взаимодействии с легкой пе-
пыо ускоряется полимеризация клатрина (Хтао ct 211., 2006). Легкие
цепи клатрпна могут взаимодействовать с адаптерньтм белком HIPIR
(huntingtin—intcracting protein l—relatcd), который требуется для Эффек-
тивного взаимодействия покрытых клатрттттом везикул с актиноввтм
Цитоскелетом. В результате ускоряется сборка и клатриттового по-
крытия и актиновьтх филаметттов (Ропроп ст 211., 2008‘), B 0THOLlI€—
ние неттроналытьтх изоформ легких цепей выявлено их более эф-
фективное взаимодействие с кальмодтузтиттоэт. Также распростра-
нено мнение о том, что нейротт-сттеттифичттьтйт регион молекул лег-
ких цепей способствует быстрому клатрип-опосредовгтттттому ‘эндо-
Цитозу синаптичееких везикул (Jackson, Parhman, 1988).
142 а
АР-2 — главный партнер клатрина в еинапсе. Клатрин само-
стоятельно не прикрепляется к липидному биелою или интеграль-
ным белкам. Поэтому клатрин-опосредованный гзндоцитоз начина-
ется со связывания адатп ерных (адаптируют клатрин к поверхнос-
ти) белков е ограниченным участком плазматической мембраны, за-
тем к нему присоединяются клатриновые агрегаты, трискелии (Hirst,
Robinson, 1998). Главный синаптический алаптерньтй белок — это
АР-2 (рис. 50 ц17)‚ он состоит из 4-х субъединиц (адаптинов): ма-
лой (02), средней (п2) и двух больших (от, B2). Субъедиттицьт обра-
зуют структуру, похожую на «голову» е симметричными подвиж-
ньтми «ушами» (рис.52). Голова АР-2 прочно соединяется с фосфо-
липидами (точнее с ФТИ-4,5-Ф2) мембраны, а также взаимодей-
ствует c определенными аминокислотными последовательностями
(эндоцитозными мотивами, например, тирозин- или дилейцин- со-
держащие мотивы синаптотагмина, транспортеров медиаторов) п
целыми доменами некоторых белков синаптических везикул (доме-
ном SV2 белка и С2В-доменом синаптотагмина) (Grass е: а1., 2004).
Вероятно, что АР-2 ожидает везикулярные белки поблизости от сай-
тов экзоцитоза. Так, синпринт сайт Са-канала АЗ, связывающийся
с С2В-доменом синаптотагмина, напрямую может соединяться с п2
субъединицей АР-2. В покое при низкой концентрации ионов Са с
Са-каналом взаимодействует АР-2, а при увеличении ионов Са —
синаптотагмин. Следовательно, сразу после запуска экзоцитоза у
АР-2 появляется возможность связаться с синаптотагмином
(Watanabe et а1., 2010). При «посадке» на мембрану «уши» АР-2
комплекса ориентируются в сторону цитоплазмы, где они могут свя-
зываться с клатрином, а также «хватать» дополнительные эндоци-
тозные белки (McPherson, Ritter, 2005; Schmid et а1., 2006).
Процесс формирования покрытия происходит е положитель-
ной обратной связью: специфичные липидные и белковые компо-
ненты, встроенные в прееинаптическую мембрану еинаптических
везикул, «притягивают» к себе клатриновьте адаптеры, а собираю-
щееся покрьттие «рекрутирует» дополнительные везикулярпые про-
теины и липпдьт. Этот механизм позволяет покрытию функциони-
ровать как молекулярный сортировщик определенных белков, вхо-
дящих в состав мембран везикул. При повреждении синтеза АР-2 с
помощью s/1PHK B гиппокампе эпдоцитоз сннаптических везикул
существенно замедляется и нарушается белковая композиция вези-
Адаптерные белки
143
кул (Kim, Ryan, 2009). Генетические аномалии АР-2 ведут к эмбри-
ональной летальности как у беспозвоночных, так и у млекопитато-
ших (.\/Iitsunari ct а1., 2005).
Семейство АР белков. Наряду с АР-2, который главным обра-
зом работает в НО с синаптическими везикулами, идеттгифицттро-
вано несколько атталогично устроенных АР белков (API , AP3, AP4),
которые функционируют в различных путях образования везикул
(рис. 50). АР-1 играет‘ важную роль в упаковке и перемещении мем-
бранных белков из эндосом в транс-комплекс Гольджи (КГ) и обрат-
но, AP-3 вовлечен в транспорт белков из ранних и поздних эндо-
COM, a также из транс-КГ в лизосомы, АР-4 задействован: в клатри н-
независимой сортировке белков транс-КГ (Bonifacino, Schwartz, 2003;
Robinson, 2004).
Накапливаются сведения о вовлечении в процессе репиклиро-
вания синаптических везикул не только АР-2, но и АР-1 и АР-З.
При повреждении АР-2 в гиппокампальньтх синапсах его функцию,
хотя и менее «успешно», начинает выполнять АР-1 комплекс, кото-
рый чувствителен к брефилдину А. Вероятно, в норме АР-1 в НО
отвечает за эндоцитоз везикул, направляющихся в эпдосомы, из ко-
торых также АР-Х-зависимо образуется некоторая часть синапти-
ческих везикул. Альтернативная возможность заключается в учас-
тии АР-1 в эндоцитозе, протекающем на значительном расстоянии
от АЗ (Kim, Ryan. 2009). При дефиците только АР-1В в НО гиппо-
кампа наблюдаются некоторые нарушения рециклирования синап-
тических везикул, происходит накопление больших эндосомальных
структур. У таких мышей страдает координация движений и долго-
временная пространственная намять (Glyvuk et 211., 2010).
Если АР-2 участвует‘ в быстром и медленном клатрин-опосре-
Дованном эндоцитозе, то АР-3 (чувствительный к брефелдитчу А
адаптер) связан с клатриът зависимым почкованиетхт, формирующим
синаптические везикулы из классических ранних зндосомом, обра-
зовавтпихся благодаря слиянию эндоцитозньтх везикул друг с дру-
гом (рис. 50). Кроме этого АР-З участвует в образовании везикул в
теле нервной клетки из транс- КГ (рис. 53 ц18) (Voglmuier, Edwards,
2007; Dzmglot, Galli, 2007). Нейропалытая форма АР-ЗВ состоит из
четырех субъединиц: б. B38 (важна для связывания клатрина и эн-
Доцтггттруемого белка), _Ll3B (участвует в выборе белка) и G3
(Robinson, 2004).
Очень интересные данные о роли АР-ЗВ в формировании пор-
мальпой белковой коттпотзттттии белков синаптических везикул были
144 §
получены на мышах линии moc/Ia, дефицитных по б субъединице
АР-3. У ‘таких мышей имеется нормальное количество везикул н
сохранена синаптическая передача (Vogt с: а1.‚ 2000), но обнаружен
явный дефект в сортировке некоторых белков синаптических вези-
кул, и как следствие их отцибочная локализация или лаже исчезно-
вение из состава везикул ‘рис. 53 ц18) (Scheubcr е: а1.‚ 2006). Кроме
этого обнаружено, что в гранулы мутантных (mocha) клеток РС12
(линия нейроэндокринных клеток гипофиза) содержат меньше транс-
портеров глутамата и транспортера 3-го типа ионов Zn (Salazar с:
а1.‚ 2005).
В синаптических везикулах нормальных терминалей мшистых
волокон гиппокампа идентифицировано два секреторных белка: один
- VAMP2 (синаптобревин 2), а другой - TI—VAMP (тстанус токсин
устойчивая форма синаптобревина) (Muzcrellc е: а1.‚ 2003). Tl—VAMP,
задействован в слиянии везикул с поздними эндосомами, а также
принимает участие в экзоцитозе синаптических везикул (рис. 53
ц18) (Muzerellc et а1.‚ 2003; Galli е: а1.‚ 2006). При нарушении эксп-
рессии АР-3 происходит потеря TI—VAMP из терминалей у мышей
mocha (TI—VAMP скапливается в теле нейронов), что вызывает уг-
нетение асинхронного, но не синхронного компонента вызванного
освобождения глутамата (Scheuber е: а1.‚ 2006).
Таким образом, АР-З участвует в сортировке TI-VAMP, кото-
рая происходит сначала в теле нервной клетки при образовании пред-
шественников синаптических везикул (рис. 53), а затем АР-3 обслу-
живает рециклирование синаптических везикул, содержаших TI—
VAMP (Voglmaier, Edwards, 2007). Следовательно, АР-3-зависимьтй
путь оборота везикул обеспечивает асинхронный компонент выз-
ванного освобождения медиатора в мшистых волокнах гиппокампа,
а АР-2 опосредованное рециклирование — синхронный компонент
(Danglot, Саш, 2007).
Роль АР-3 в формирования синаптических везикул подтверж-
дается работами Nakatsu и коллег (2004), выполненными на ГАМК-
эргических НО. Было показано, что у мышей с нарушенной ЦЗВ-
субъединицей АР-3 снижалась плотность расположения везикул и
нарушилось освобождение ГАМК (вследствие уменьшения содер-
жания в везикулах транспортера для ГАМК). В итоге опосредуемое
ГАМК торможение ослаблялось, и у мышей регистрировались эпи-
лептические припадки.
Возможно, что разные АР-белки могут принимать участие в
формировании отдельных популяций везикул, обеспечивающих
Ц17
А 5 _
nnnuanopnoe а. "\
гюцрьггие ' fr д‘
28 трискелий ‘_’_
I 1
V? ' Q“
rexcamnanuvaa ‚д
бочка ц '_
38 триакетй д
_' n
ч. „Р“
"- ‚и _‘-—4, H-u...“
‘МИГ I‘ I‘ 'y ч)’
60 трискепий ‘
B ‚_ -
1 га 50 вэ ~00 ~52 192 243 '“°"'”"‘a""""‘_“"°"‘°"
[св I xouoepsamsuuupemou
д] п штатным Hsc10
_ Са-свяэывашъийсайт
Lcb I CHC-canaueanotunnpemou
I гоейронагьнэявставка
‘ 20 42 52 93 ‘55 ‘72 225 I fi сайт
Рис. 51 ц] 7. Молекулярное строение клатрина и клатринового по-
крытия (Royle, 2006).
А - Примеры клатриновых решеток различной геометрии. Б - Гексаго-
нальная бочка (показаны только СНС5 — тяжелые цегШ клатрина). Три трис-
келии выделены, чтобы показать, как трискелии взаимодействуют в решет-
ке. В - Схематическое изображение легких цепей клатрина LCa И LCb.
02
Puc. 52 ц] 7. Структура АР-2 (Hawryluk, 2000).
Глобулярные придатки крепятся к гетеротетрамерному ядру адапте-
ра, состоящего из ос, B2, ц2, 62 субъединиц. Придатки подвижны благодаря
неструктурированному шарнирному региону соединяющему их с ядром
белка. Вставка (справа) показывает субдомены а-придатка с сайтами, связы-
вающими различные аминокислотные последовательности (мотивы).
Ц18
_ диким тип "\ 1 нервное
W о д __ ’ окончание ‘
C 0% >- мшистого
. ‘д. у волокна
г $1.3
”¢ ‘Э '°a'.L’.'235§a"
‚Х
‚—-—/|
АР-З 653’ _ ‘
(‚лег‘) \ _
д/б/ 9-xa. -_
П-УАМР‘ у) ь‘?
ПИРЭМИДЭПЬНЭЯ _
КЛеТКа
Г I‘
TI-VAMP
транспортируется
в аксон два типа v-SNARE в синаптических
везикулах: \/АМР2 и ТН/АМР
мутация mocha Ж нервное
\ ` к?’ окончание
мшистого
г. волокна
В
TI-VAMP }
задерживается
в аксоне один тип v-SNARE в синаптических
везикулах - \/АмР-2
Рис. 53 1418. Роль AP—3 в сортировке белка синоптических везикул
Т1- VAMP на пршигрг мутации mocha (Danglot, Galli, 2007).
Дикий тип Мышей экспрессирует АР-З. При этом TI-VAMP (тета-
нус токсин устойчивая форма синаптобревина) концентрируется в си-
наптических везикулах НО гранулярных клеток зубчатой извилины, из
которых освобождается тлутамат. Эти везикулы содержат два типа v-
SNARE белков: синаптобревин 2 (VAMP-2) И TI-VAMP. У мышей mocha,
не экспрессирующих AP-3, TI-VAMP задерживается в гранулах сомы клет-
ки и отсутствует в составе синаптических везикул. Предположительно
АР-З необходим для экспорта T]-VAMP ИЗ сомы в синаптические везику-
лы терминалей аксона.
А С в в p�o� .
WHEN”. стонин 2
/
‘f’ . По ‘ъ " .
зндофилин ц, гл - @�5� д‘
.
г ` I "‘"‘ м.
Ljflég. |_.
везикупярные транспортеры везикулярный транспортер синапютагмин
МОНОЭМИНОВ. ЭЦЕТИПХОПИНЭ. rny'raMa'ra rnyTaMaTa 1 Типа
Рис. 54 1419. Сортировки некоторых везикулярных белков в ходе
клатрин-опосредованного эндоцитоза (Jung, Haucke, 2007).
А— Узнавание мотивов типа D/ExxL[LI], принадлежащих везикулярным
транспортерам медиаторов (моноаминов. ацетилхолина. глутамата -\/МАТ2,
VAChT, VGLUT 1) с помощью АР2. Б — узнавание транспортера глутамата
(VGLUT1) ЗаВИСИТ от взаимодействия богатого пролином пептида его ци-
топлазматического конца с SH3 доменом белка эндофилина. В - Са-сенсор
экзоцитоза синаптотагмин сортируется при помощи специального адапте-
ра стонина 2.
Ерз15
Ен EH EH cc ' орг
Интерсектин I
р...
EH EH cc SH3 SH3 SH3 SH3 SH3 Dbl PH Е;
N-WASP
Эпсин Ь: т
ENTH DPW NPF Синдапин
,.__.. «- __
‚ сс чРг SH3 а
Клатриновов эндофипин
покрытие та“ SH3
A I и
Амфифизин
‚Ъ Ар.2 BAR SH3
Кпатрин
.
.
АР-180 Синаптоянин
noflgghtfi Сборка КПШРИНЭ $ас1 Бдфосфатаза RD
домен
Ауксипин Динамин
Юмгдгзъдхгьт .....-" Ъ’ "52"" ниш
ДОМ Н
Рис.55 1419. Ключевые белки клатрин-опосредованного эндоцитоза
синоптических везикул (Slepnev, De Camilli, 2000).
Стрелками указаны взаимодействия между определенными домена-
ми белков, вовлеченных B ЭНДОЦИТОЗ. Некоторые белки связываются напря-
мую как с АР-2 (через его придаточные домены), так и тяжелой цепью
клатрина (через семи лопастной В-пропеллер на Ы-конце). Многие из изоб-
раженных взашиодействий регулируются фосфорилированием и ФТИ-4„5-
Ф2. Расшифровка доменов представлена в тексте.
Ц20
ВАКдимер
а-спираль 1
а-спираль О
/:/ФТИ-4,5-Ф2
ЗНЗ-домен
ДИНЗМИН
Рис. 56 Ц20. Модели опосредованной белками деформации мембраны
(Farsad, De Camilli, 2003; Gallop е: а1.‚ 2006).
А - Белки при полшиеризации образуют (а) агрегаты в виде сфер (адап-
терньге белки, клатрин) или (б) спиралей (динамин), что ведет к искривлению
мембраны. Б - Амфипатичная спираль некоторых белков (эпсина, эндофили-
на) проникает в зазоры между липидами и расталкиваег их, в результате уве-
личивается площадь одного монослоя мембраны относительно другого и
мембрана деформируется. В - сверху: М-ВАК-домены димера эндофилина,
связавшиеся с монослоем мембраны. Снизу: модель функционирования N-
BAR доменов эндофилина. N -BAR домен включает 3 части: Ы-концевая OL-
спираль 0 (а), ВАК-Мономер (б), С-концевая внутренняя ос-спираль 1 (в). Мо-
номеры эндофилина присоединяются к отрицательно-заряженной поверх-
ности мембраны. Встраивание обоих а-спиралей ускоряет искривление мем-
браны; одновременно происходит Димеризация ВАК-доменов, которая ста-
билизирует изгиб. Начавшаяся деформация мембраны облегчает прикреп-
ление следующих ВАК-доменов. ос-Спирали эндофилина могут связываться
с определенными мембранными белками, действуя в роли их «сортировщи-
ков».
145
спонтанное и вьтзванътое освобождение медиатора. Так, в некото-
рых синапсах, везикулы, участвующие в спонтанном и вьтзваттном
экзопитозе имеют различную белковую композицию, которая сохра-
няется после эндоцрттоза (Sara ст а1., 2005; Groomer, Книгам, 2007).
При поиске генов, похожих на гены субъединиц адаптерных
белков (АР1-4), было идентифицировано альтернативное семейство
клатриновых адаптеров GGA протеины (Golgi—localizcd у-еаг-
containing ARF—binding protein) (Hirst ct а1., 2000). Эти мопомерные
белки, аналогичные «ушному» домену у-субъединипы АР-1 комп-
лекса содержат регион, соединяющийся с определенной последова-
тельностью мембранного белка, длинный подвижный соединитель-
ный участок, клатрин-связываюцтие сайты, и обнаруживаются в
транс-КГ и эндосомах (Collins et а1., 2004).
Механизмы распознавания
эндоцитируемых белков
В мембране синаптических везикул содержится более сотни ве-
зикуло-специфичных белков, которые участвуют в процессах экзо-
цитоза, транспорта, заполнения медиатором и др. Поэтому в ходе
эндоцитоза требуется отсортировать определенные белки и укомп-
лектовать ими новую везикулу. Некоторые везикулярные протеины
специально депонируютея в поверхностной мембране, но большая
часть попадает туда при встраивании везикулярной мембраны при
экзоцитозс. I 1отлощаюшиеся в ходе эндоцитоза мембранные проте-
ины принято обозначать термином — грузы (или карго), а белки
машины эндоцитоза, которые распознают грузы называют адаптер-
ными белками (Owen et а1., 2004). Все они содержат уже описан-
ные компактные домены, ответственные за взаимодействия с мемб-
ранными белками или фосфолипидами, а также неструктурирован-
ный линкерпьтй участок, ассоциирующийся е концевым доменом
(В-гтропеллером) тяжелых цепей клатрина и/или с молекулой АР-2.
Адаптерные белки распознают мембранные грузы по коротким пеп-
тидным мотивам на питонплазматических хвостах. Возможно, одним
из наиболее распростратченных мотивов, узнаваемых эндоцитозны-
ми адаптерами, в том числе С-конпевым доменом р субъединицы
АР-2, является УххЭ-тип тирозин-содержащей последовательнос-
ти (где 9 обозначает большой гидрофобный остаток). Способность
адаптеров связываться с подобнымш мотивами белков часто зави-
146
СИ’! OT IlpC1IlIICCTB)/1011IC1‘O B3E:11r1MO[IC1"1CTBI/I5] С (1)()C(1JO.'I1/IITHJIZIMH И рСГу-
лируется фосфорилированием. Например, р-субьединица АР-2 эф-
фективно цепляется за УххО-мотив после коттформацттоттттьтх изме-
нений АР-2, вызванных связыванием С ФТИ—4,5-Ф2 (Honing ct a1.,
2005). Фосфорилирование 0L,B,p субъединиц АР-2 увеличивает аф-
финность адаптера к гптдоцитозттьтхт сигналам белков (в 2-4 раза) и
фосфолипидам (в 4 раза), а обработка фосфатазотт уменьшает срод-
ство АР-2 особенно к белкам (в 3-15 раз) (Fingcrhut ct 211., 2001).
Другой большой класс сигналов к поглощению представлен лилей-
цин мотивами (D/ExxxL(LI)), организованными в кластер. Такие
последовательности ассоциируются с участком АР—2, расположен-
ньтм на границе Ос и 62 субъединиц (Вогау ct £11., 2007). D/ExxxL(LI)—
тип ‘эндоцитозньтх сигналов идентифицирован в везикулярных
трапспортерах моноамиттов, ацетилхолина и r;1y'ra.viaTa(VogImaier е:
а1., 2006), cimanTo6pcBmic 2(11crring ct a1., 2003).
Везикуло-специфичньте сигналы
эндоцитоза
Синаптические везикулы включают набор разнообразных бел-
ков в строгом количественном соотношении, который необходимо
поддерживать на протяжении многочисленных раундов рециклиро—
вания (Ashby ct a1., 2006). Вероятно, это достигается с помощью
существования у везикулярных белков специфичных сигналов эн-
доцитоза (рис. 54 ц19). Для изучения захвата эндоцитозом белков
синаптических везикул успешно используется подход, основанный
на срашивапии генов интересующего белка (синаптобревипа 2, си-
наптофизина, синаптотагмттна, везикулярного транспортера глута—
мата 1) и флуоресцентного белка, чувствительного к концентрации
протонов (Ashby ct 211., 2006; Granscth et 31., 2006; Vog1mmaicr ct 31.,
2006; Wicnisch ct al., 2006). Этот метод позволил определить трафик
многих белков синаптических везикул и механизмы их ратспозътава-
ния адантерньтьттт белками. Альтернативный генетический подход,
обозначаемый как инактивация с помощью света флуоресцеттттитт
(Fluorcsccncc—assistcd light inactivation, F1As11—FA1-1) MO){<C'I'I‘1pC11OC'1‘:l—
вить информацию о том, как отразится мгновенное нарушение коп-
кретного везикулярного белка па эндоцитозе. Например, существен-
ная роль синаптотагмтттта 1 в репиклировании синаптнческттх вези-
кул у Drosophila была показана сленуютцттвт образом. К гену синап—
147
тотагмина 1 был присоединен участок, отвечающий за синтез пос-
ледовательности из четырех цистеинов. Такой вариант синатгтотаг-
мина своим тетрацистеиновьтм мотивом связывает мембранопро-
никающее гтроизводное флуоресцеина 4’,5 ’—bis( 1,3,2—dithioars01an—2-
yl)-fluoresccin (F1/1511'), а при флуоресценции последнего происхо-
дит интенсивное образование свободных радикалов, повреждающих
структуру синаптотагмитта. В итоге у плодовых мушек при повреж-
дении синаптотагмитта непосредственно после экзоцитоза наблю-
далось блокирование процессов эндоцитоза и кругооборота синап-
тических везикул (Poskanzer е: а!., 2003).
Узнавание мотивов, принадлежащих везикулярным транспор-
терам медиаторов (моноаминов, ацетилхолина, глутамата) осуще-
ствляется е помощью АР2. В случае везикулярного траттспортера
глутаматгч. 1 (VGLUTI) происходит взаимодействие обогащенной
пролином последовательности его цитоплазматического хвоста с
вспомогательным белком эндофилином (см. ниже), который напря-
мую связывается с АР-2 и динамином (рис. 54 1119). Интересно, что
такое специфичное взаимодействие участвует в поглощении транс-
портера глутамата только с помощью быстрого клатрин-опосредо-
ванного эндоцитоза, тогда как в ходе объемного эндоцитоза, проис-
ходящего с участием АР-3, оно не играет роли (Volgmaier е: а1., 2006).
В поглощении другого белка синаптических везикул синаптобреви-
Ha (особенно его варианта VAMP2) ведущую роль играет мономер-
ный адаптерньтй белок AP—180, о котором подробнее речь пойдет
ниже (Nonet ct а1., 1999). В последнем случае цитоплазматический
домен синаптобревина, вероятно, взаимодействует с АМТН-доме-
ном АР-18О (рис. 55 ц19). Сверхэкспресеия АР-18О уменьшает ко-
личество молекул синаптобревина 2 в плазматической мембране, за
счет его более интенсивного захватывания в синаптические везику-
лы. Наоборот, нарушение синтеза АР-18О ведет к накоплению си-
наптобревина 2 в поверхностной мембране (Наге1 е: а1., 2008). По
данным Новой е: а1. (2009) синаптобревин, наряду c СИНЗПТОТНГМИ-
пом и ионами Ca. вовлечен в сопряжение процессов экзо- и эндо-
Цитоза, При мутации АР-18О y Drosophi/a B регионах, расположен-
ных за пределами АЗ и сайтов эндоцитоза, появляется не только
синаптобревин, а также CSP Н синаптотагмгттт I (Вао е! а1., 2005).
Последовательпости, обладающие сродством к р-субъединнцс
АР-2, обнаружены в цитоплазматических С2 доменах сипаптотаг-
минов (Grass ct а1., 2004). Синаптотагмин - белок. запускаюший
экзоцитоз синаптических везикул, по всей видимости, является од-
�_��
148
ним из главных связывающих сайтов для тндоцигозттьтх адапте-
ров (.l0rgcnsc11 cl а1., 1995; Poskanzcr ct а1., 2003). Для обеспечения
постоянства белкового состава синаптическттх везикул важны не-
посредственные взгшмодтейст вия синантотагмина с р-субъединиттей
АР-2 и вспомогательным адаптером стонином 2 (sto11in—2) (рис. 54
1119). Стонин 2 служит’ мостом между синаптотагминотхт 1 (точнее
его кальций- связывающим С2В-доменом) и белками клатриновой
машины (АР-З и ер$15) (пат ct а1., 2006). У мутантных мушек
Юготр/п/и, экспресссируютцих измененный белок стонед (stoned —
аналог стонина млскопитаюцптх), при повышении температуры бе-
лок приобретает нефункциональнуто конформацию и мушки оказы-
ваются парализованными (G1‘ig11at1ictal., 1973). Подобные мутации
генов етонсл ведут к истощении) запасов синаптических везикул,
накоплению эндосомоподобттьтх структур, ошибочной локализации
синаптотагмина в НО (Phillips ct а1. 2000). Исследования, выполнен-
ные на Пгозорппа, процемонстрировали важность АР-2 связываю-
щего домена синаптотагмитта в регуляции размера везикул, а Са-
связьтвающего (С2В) домена в контроле скорости рециклироваттия
(Poskanzer ct а1., 2006). B НО гиппокампа поглощение синаптотаг-
мина зависит от тирозин-содержащего эндоцитозного мотива вези-
кулярного белка 5\/2, который распознается АР-2. Присутствие му-
тангиой формы SV2A—Y46A с нарушенным эндоцитозньтм мотивом
приводит к накоплению SV2 И синаптотагатина в пресинаптической
мембране, и уменьшению содержание указанных протеинов в си-
нантических везикулах (Y210 et а1., 2010).
Все ли белки синаптических везикул имеют свои собственные
эндоцитозньте и/или сортируюшие сигналы остается открытьтм воп-
росом (Jung, Haucke, 2007). Очень интересные данные были полу-
чены с использованием оптики высокого разрешения. Оказалось.
что компоненты синаптических везикул (еинаптофизитт, транспор-
тер глутамата) могут оставаться в кластере (быть сгруппированны-
ми в определенном участке мембраны) после экзоцитоза (Wil1ig ct
а1.. 2006; Voglmaicr, Edwards, 2007) или подвергаются быстрой рек-
ластсризации. Во втором случае, часть везикулярных белков (сина-
тотагмины, \/АМР2), принадлежащих одной везикуле, обменивают-
ся на аналогичные протеины, ранее входивтпие в состав другой ве-
зикулы, или на белки, заготовленные в пресинаптической мембра-
не (Fernande7,—/\lfonso et а1., 2006; Wicnisch, Klingauf, 2006). Следует
учитывать, что применяемые в данных исследованиях генетически
модифицирован}!ые везикулярные белки, слитые с GFP. менее
149
склонны к формированию кластеров, чем нативные протеины. Со-
гласно данным Ора2о ет а1. (2010) высокочастотная стимуляция, ос-
вобождающая полностью рениклирутощий пул, сопровождается диф-
фузий синаптотаггиина из синаптических бутонов, а при умеренном
раздражении — синаптотагмин после зкзоцитоза, избирательно по-
глощается эндоцитозом. При интенсивном экзоцитозе происходит
также потеря синаптобревина из состава везикулярного мембран-
ного фрагмента, что задерживает рециклирование синаптических
везикул, изменяет форму и размер везикул (Deak et а1.., 2004). Воз-
можно, что ограничивают диффузионную способность некоторых
везикулярных протеинов обогащенные холестерином микродомены
мембран, липидные плотики (Jia ct а1., 2006, Петров и др. 2009). В
соответствие с другой позицией диффузия везикулярных белков пре-
дотвращается адаптерными белками, которые сразу после экзоци—
тоза связывают протеины везикул. В целом, вопрос о том, как вези-
кулярные белки перснаправляются в ходе эндоцитоза в синаптичсс-
кис везикулы остается не разрешенным (Dittman, Ryan, 2009; Зефи-
ров, Петров, 2010; Ора2о et а1. 2010).
РОЛЬ ВСПОМОГЗТЕЛЬНЬПХ бЕЛКОВ В клатрин-
ОПОСРЕДОВЗННОМ ЭНДОЦИТОЗС
В настоящее время выявлено большое количество вспомога-
тельных белков, которые участвуют в формировании клатриновото
покрытия наряду с адаптерными белками (рис. 55 ц19). При этом
каждый из белков имеет свои особенности и участвует на опреде-
ленной стадии эндоцитоза (рис. 61 L122).
B частности, появляются доказательства участия в начальных
этапах сборки клатрина дополнительных, взаимодействующих с АР—
2, белков, таких как АР! 80 и эпсин. АР180 экспрессируется только
в нейронах, а подобный ему белок, называемый CALM (clathrin
assembly lymphoid mycloid protein), синтезируется повсеместно, в том
числе в нейронах (Itoh, Dc Camilli, 2006). АР- 1 80 локализуется пре-
имущественно в пресинаптических областях, а CALM присутсвует
в равной степени и в пре- и постсинаптических регионах, причем
им особенно богаты «молодые» развивающиеся нейроны. В мозге в
больших количествах зкснрессируется эпсин 1. АР-180 и эписин 1
Способны связываться с фосфолипидами мембраны и некоторыми
интегральными белками (синаптобревттттом), а также содержат уча-
стки для прикрепления к клатрину, то есть могут функционировать
как мосты, соединяющие фрагмент мембраны сипаптическттх вези-
кул C КЛЦТрИНОМ (рис. 55 ul9).
Комплекс АР-180 с АР-2 катализирует очень быструю сборку
клатрпна, какую не может обеспечить ни один из белков самостоя-
тельно. АР-180 необходим на всем протяжении эндоцитоза, его му-
тации у Drosophila и С. clcgans замедляют сборку клатрипового по-
крытия. Присоединение АР- I 80 к ФТИ-4,5-Ф2 мембраны происхо-
дит за счет ANTH (АР180 N—terminal homology) домена АР-180, ко-
торый включает 10 альфа спиралей, но не может искривлять мемб-
раны. Вероятно, АР-180 также участвует в определении размеров
эндоцитозньтх везикул, поскольку потеря этого белка ведет к обра-
зовапию везикул сильно отличающихся размерами, причем их сред-
ний диаметр увеличивается примерно на 30 % (_Nonct ct а1., 1999).
При нокауте АР-180 в гпппокампе наряду с ослаблением эндоцито-
за, наблюдается нарушение развития аксопов, тогда как сверхэксп-
рессия АР-180 ведет к формированию нескольких акеонов у нейро-
нов (Bushlin ct а1., 2008). Наряду C АР-180 способность АР-2 поли-
мерпзовать клатрин в мозге усиливается при помощи белка NECAPI
(adaptin car—binding Clathrin—z1ssoCiated protein 1), который связывается
с ушным доменом альфа субъединицы АР-2 (Murshid ct а1., 2006).
Взаимодействие эпсина с АР-2 требуется преимущественно
для первоначального «привлечения» АР-2 в определенный регион
плазматической мембраны. Эпеип перемещается за пределы покры-
тия до этапа отщепления везикулы и вызывает изгибание «обраста-
ющей» клатрипом мембраны. Деформация мембраны осуществля-
ется за счет ENTH (cpsin-N—terminal homology) домена эпсина, кото-
рый преимущественно взаимодействует с ФТИ-4,5-Ф2 (Ford et а1.‚
2002). Эпсин содержит несколько NPF (аспарагин-пролпн-феттила-
ланин) мотивов поблизости от С-конца, с помощью которых взаи-
модействует с ЕН (Eps l 5 homology) доменами таких белков, как Ер51 5
и интерсектин (рис. 55 ц19), о которых речь пойдет дальше. Эпсин
позиционируется как один из ключевых факторов, запускающих
образование и лимитирующих роет клатрипового покрытия на
мембране, и, следовательно, определяет размер вновь формирую-
щихся везикул (Jakobsson ст а1.‚ 2008). Удаление гена эпсипа даже у
дрожжей критично для эпдоцитоза и несовместимо с жизнью. Од-
нако при клатрин-оттосредоваттттом захвате тетатяус-токстттта в мото-
нейропьт, ЭПСИН не требуется (Dcinhardt ct а1., 2006).
Ё 151
Исследования роли зпсина и AP-I80 B формировании покры-
тых клатрином ямок послужили основой следующей гипотезы. Ог-
раниченное число зпсинов первыми присоединяются к плазмати-
ческой мембране, после чего привлекают к мембране молекулы АР-
2 и немного клатрина. АР-2 и АР-18О формируют комплекс, кото-
рый запускает быструю полимеризацию клатрина. При этом эпсин
активно вытесняется из связи с АР-белками в краевую область по-
крытой мембраны (рис. 61 1122). Концентрирование эпсина вокруг
клатринового покрытия вызывает начальный изгиб и формирова-
ние ямки. Последующее более значительное искривление мембра-
ны производиться другими белками, амфпфизином и эндофилином
(рис. 55 ц19)(1то1т, Dc Camilli, 2006; Andcrsson et al., 2008).
Семейство амфифизинов млекопитающих включает два похо-
жих белка, амфпфизин 1 и амфифизин 2, формирующих гомо- и
гетеродимеры (51ерпеу е’: а1., 2000). Концентрация амфифизитта 1 в
мозгу в 20-30 раз выше, чем в Других тканях, а сплайсинговые вари-
анты амфифизина 2 (Bin I, SH3P9) обширно экспрессируются во
многих тканях. Амфифизин содержит на М-конце регион, отвечаю-
щий за димеризацию и способный связываться с киназой cdk 5 и
фосфолнпазой D, a также ВАК-домен, способный чувствовать мем-
бранный изгиб и искривлять липидный бислой (рис. 55 Ц19). В Цен-
тре амфифизина располагается обогащенный пролином домен (PRD),
связывающий ‘эндофилин 1; за ним следует связывающий клатрип
и АР-2 домен (CLAP домен); далее С-терминальный Бгс-голомогич-
ный 3 (SH3) домен, соединяющийся с динамином 1 и синаптояни-
ном (рис. 55 1119) (Takei е: а1., 1999; Slepnev ct al., 2000). Амфифизин
1 с помощью SH3 и ВАК-доменов может соединяться с белком N-
WASP, запускаюптим полимеризацию актина, и стимулировать его.
Взаимодействия амфифпзина с АР-2. клатрином, зндофилпном 1,
липидами мембраны регулируются фосфорилированием (Циклин-
зависимая киназа 5, митоген-активируемая киназа, Dyrk I A/minibrain
киназа, казеинкиназа 2) (Craft et al., 2008). B условиях усиленной
синаптической активности амфифитзиът 1 расщепляется Са-завттси-
мой протеазой кальпаипом. Столь разнообразный спектр взаимо-
действий амфифизина служит основанием для обозначения этого
протеина как полифутткпионального адаптера, который выполняет‘
роль связующего звена между отдельными стадиями эндоцито-
за. У мышей с нокаутом гена амфифизпна 1 обнаруживается умень-
шенпе размеров рециклируюптего пула синаптпческих везикул и за-
медление эндоцитоза (Di Paolo ct al., 2002).
152
Эндофилин ~ семейство белков, продуктов трех похожих ге-
нов, которые обозначаются как БНЗР4, SH3P8, SH3P1 3, mm 3nz10~
филины 1, 2, 3. Эндофилин 1 в изобилие представлен в пресинан-
тических НО (Ringstad et a1., 1999). Первичная последовательность
эндофилина содержит постоянный М-концевой BAR домен (вклю-
чающий амфипатическую спираль), который соединен коротким ва-
риабельным регионом с С-терминальным ЗНЗ-доменом. М-конце-
вой регион имеет анилтрансферазную активность: катализирует объе-
динение арахидоновой кислоты с лизофосфатидной кислотой, что
ведет к образованию фосфатидной кислоты (Schmidt ct al., 2002).
ЗНЗ-домен эндофилина связывает динамин и синантоянин, с sm-
НЫМ предпочтением последнего (рис. 55 ц19). Микроинъекнии анти-
эндофилиновых антител специфичных по отношению к его SH3—
домену в ретикулоснинальный аксон миноги блокируют рецикли-
рование синантических везикул (Ringstad ct 211., 1999), на этапе по-
верхностных клатрин-нокрытых ямок, которые скапливаются в сай-
тах экзоцитоза. Те же последствия проявляются при нарушении (с
помошью антител) функционирования ВАК-домена эндофилина
(Andersson е: а1., 2010). Активность эндофилина 1 может усиливать-
ся продуктом гена OPHN1 (Oligophrenin— 1 ), потеря которого чревата
нарушениями в когнитивной сфере (Nakano—Kobayashi ct 31., 2009).
Механизмы мембранных деформаций и модель
«Броуновской защелки»
Способностью деформировать мембрану обладают протеины,
содержащие ENTH (cpsin-N—terminal homo1ogy)—Lx0MeH (эпсин) или
BAR (Bin, amphiphysin, Rvs)—1L0MeH. Существуют два вида BAR до-
менов: N—BAR присутствует в структуре амфифизина, эндофили-
на и необходим для образования значительных изгибов маленьких
участков мембран; F-BAR домен синдапина — функционирует при
формировании больших мембранных инвагинаций (подробнее см. в
разделе о механизмах тиедленного (объемного) зндоцитоза) (Gallop
ct а1., 2005; ltoh, De Сатин, 2006). В состав ENTH И ВАК-доменов
входит амфифильные (имеющих как гидрофнльххые, так и гидро-
фобные участки) альфа спирали «0». Встраивание гидрофобных
аминокислотных остатков спирали во внутренний листок мембра-
ны растьшкивает головки липидов. увеличивая поверхность внут-
’zfi\/
Ж ‘\«« ‘\=
Y ' . '
v }" ‘ Ap_2 АР-2
КЛЗТРИН и другие адаптеры И дРУГИе ЗДЗПТОРЬ‘
Ж \\ ‘ ‘N '
д
Y у «ъ as ‘
V т
‚а
v ‚и‘
Рис. 5 7. Модель «броуновской защелки» в формировании мемб-
ранной почки (Hcnrichsen ct а1.‚ 2006).
А- Эндоцитоз начинается с присоединения адаптеров (A P-2), до-
полнительных белков и клатрина к мембране. Мембрана изгибается за
счет случайных тепловых колебаний (Броуновское движение) и специ-
альных белков. Клатриновое покрытие способно приспосабливаться к
новой кривизне мембраны и изменять свой размер, поскольку как клат-
рин, так и адаптеры могут достаточно свободно переходить из раство-
ренного в ннтозоле состояния в составе полимера, и обратно. Клатрин
спонтанно полимеризуегся в стабильные закрытые корзины, посколь-
ку высокая кривизна клатриновой решетки энергетически более ста-
бильная конфигурация полимера. Благодаря этому, клатрнновое по-
крытие стабилизирует («зашелкивает») направленные внутрь клетки
выпячивания плазматической мембраны, деформация которой про-
должается до гиомента достижения оптимальной кривизны. Б- В клет-
ках‚ лишенных клатритта, молекулы АР-2 также высаживается на мемб-
рану и «ловят» термальные (рлуктуанилт мембраны, но нарушена на-
правленность процесса.
154
реннего монослоя. При этом уменьшается ‘итергия, требуемая для
искривления мембраны (рис. 56 ц20).
ЕХТН-домен эпсина составлен из 150 аминокислотных остат-
ков, образует компактную структуру из 8 альфа-спиралей, собран-
ных в 3 «шпильки». Когда ЕМТН-домен пребывает в цитоплазме
последовательность из 14 аминокислот на его ЪЕ-конце неструкту-
рировапна, однако при взаимодействии ЕМТН-домена с ФТИ-4,5-
Ф2 мембраны она формирует амфипатическую альфа спираль 0, ко-
торая внедряется в мембрану, вызывая небольшое искривление (Ford
е1а!., 2002). ЕЫТН-доменьт соседних молекул manna после внедре-
ния B um‘o1ma3MaTwxccx<m"1 монослой объединяются в комплекс, уси-
ливаюший мембранные деформации (Yoon cl а1., 2010).
Белки с ВАК-доменами формируют димеры в форме полуме-
сяца («баттатта»), которые связьтватотся за счет электростатических
сил с отрицательно заряженной поверхностью мембраны, форми-
руя или стабилизируя сильный изгиб (амфифпзин, эндофилин). In
vitro BAR домен преимущественно взаимодействует с липосомами
определенной формы, то есть BAR домен может «чувствовать» кри-
визну мембран (Gallop е1 а1., 2005). В деформировании мембраны
BAR доменами также участвует К-концевая амфипатическая спи-
раль 0. Наиболее изучена работа ВАК-домена эпдофилина (рис.
56 ц20), в состав которого входят ЁЧ-концевал амфииатическая спи-
раль (спираль О), центральный ВАК-Мономер и внутренняя амфи-
пагическая спираль 1 на С-конце (этой спирали нет у амфифизи-
на). ВАК-Мономер несет на своей «вогнутой» поверхности положи-
тельно заряженные труппы, которые притягиваются к имеющим от-
рипательный заряд фосфолипидам (особенно ФТИ-4,5-Ф2). В ре-
зультате такого взаимодействия липидный монослой стремится при-
нять форму ВАК-мономера. «Выстреливание» спиралей происхо-
дит сразу после связывания BAR домен эндофилина с мембраной, и
обе спирали внедряются в монослой липидов по краям центрально-
го региона BAR. Это облегчает деформацию мембраны. Одновре-
менно BAR домены эндофилинов димеризуются, приобретая фор-
му полумесяца/банана, что ведет к «втягиванию» мембраны в ди-
мер эндофилина (рис. 56 1120) (Gallop ct al., 2006; Jao ct а1‚, 2010).
Помимо этого, эндофилин имеет липид модифицирутощую (ацилт-
рансферазнуто) активность, которая теоретически может влиять па
кривизну бислоя, хотя экспериментальные данные Gallop И коллег
(2005) отвергают эту возможность.
Биохимическим способом отчищеттные молекулы клатрипа мо-
‹.
Ь 155
гут самопроизвольно собираться в закрытые корзины, то есть изгиб
клатриновой решетки это внутренняя характеристика покрытия
(МсМаспоп, Gallop, 2005). Электронно-микроскопические исследо-
вания смогли уловить изменения клатринового решетки на плазма-
тической мембране: промежуточные клатриновые структуры изме-
нялись от плоских до глубоко изогнутых (Hcuser, 1980). Некоторые
авторы не исключают, что полимеризация клатрина способствует
инвагинации мембраны (Wu е: а1., 2001). Однако большинство ис-
следований придерживаются другой точки зрения, по которой сборка
клатрина следует пассивно за изгибом мембраны, а клатриновое
«покрывало» необходимо для «фиксации и стабилизации» изгибов
мембраны. Другими словами клатриновое покрытие служит гибким
и полиморфным каркасом, на котором фиксируются факторы, де-
формирующие мембрану. Функция клатринового покрытия в поч-
ковании объясняется моделью «Броуновской защелки» (Peskin et
al., 1993; Hinrichsen ct al., 2006). В соответствие с этой гипотезой
(рис. 57), изначально плоская мембрана искривляется под действи-
ем случайных тепловых флуктуаций (Броуновского движения) и вспо-
могательньтх белков эндоцитоза. Клатриновое покрытие быстро при-
спосабливается к новой кривизне, поскольку и клатрнн и адаптеры
с готовностью совершают переходы между цитоплазматическим и
«мембранно-связаттттьтм» состояниями (Wu et al., 2001). Наиболее
энергетически стабильная конформация клатрина-полимера пред-
ставлена закрытой корзиной диаметром от 60 до 150 нм. Следова-
тельно, клатриновая решетка поддерживает обращенные внутрь де-
формации плазматической мембраны (их «защелкивает»), пока оп-
тимальная кривизна не будет достигнута (рис. 57). Изложенная выше
модель «защелки» не исключает потребность в искривляюших мем-
брану протеинах, которые направляют и ускоряют инвагинацию
мембраны (Hinrichsen е: а1., 2006).
Таким образом, деформация мембраны и образование глубо-
ких ямок, в ходе эндоцитоза определяется усилиями многих факто-
ров, в том числе снабженных специальными амфипатическими спи-
ралями, и каркасными белками (в первую очередь - клатрином), ста-
билизируютцими изогнутые мембраны (Jung, Haucke, 2007). Следу-
ет оговориться, что многие сведения об искривлении мембраны в
ходе клатрин-опосредованного эндоцитоза получены с помощью
TIRF (total internal reflection fluorescence)—MI/II<pocK0mm, которая по-
зволяет избирательно изображать часть клетки шириной 50-150 HM.
156 ё
ЗНЗЧВНИЕ динамина В ОТЩВПЛСНИИ везикул
Глубокие покрытые клатрином ямки, возникающие в процессе
эндоцитоза, характеризуются присутствием в области соединения с
плазматической мембраной структуры, внешне напоминающей
«шею». В этом месте происходит разделение мембран (отделение
образовавшейся везикулы), которое осуществляется главным обра-
зом с участием белка динамина (рис. 55 ц19). Динамин ~ это общее
имя трех малых ГТФаз: 1-я экспрессируется в мозгу (составляет 85%
от общего «мозгового» динамина), 2-ая повсеместно (в том числе, в
нейронах), 3-я преимущественно в яичках, хотя в небольших коли-
чествах обнаруживается и в нейронах. Динамины на одном конце
имеют ГТФазный домен (катализирующий превращение ГТФ в
ГДФ), а на другом - структуру, названную GED (эффекторный до-
мен ГТФаЗЫ), который участвует в объединение молекул динамина
в димер или тетрамер (in vivo структурные единицы динамина) (рис.
55 ц19). Динамин взаимодействует со многими БНЗ-домен содержа-
щими белками (эндофилин‚ амфифизин, синдапин) и с интерсекти-
ном через его обогащенный пролином домен (PRD). Этот домен
необходим для таргетинга динамина, то есть наведение на цель —
шейку покрьггой клатрином везикулы. Нарушение динамина 1 ве-
дет к блокированию эндоцитоза синаптических везикул на стадии
образования глубоких ямок, при этом ВАК-домен содержащие бел-
ки и актин скапливались у основания покрытой клатрином ямки.
Одной из наиболее удачных моделей изучения функции этого белка
является температуро-чувствительная мутация плодовой мушки, обо-
значаемая <<sl1ibire>> (рис. 58).
Поэтапно процесс разделения мембран при образовании си-
наптической везикулы представляется следующим образом (Зефи-
ров, Петров, 2009). Первоначально к покрытию и подлежащей мем-
бране крепится амфифизин, который привлекает из цитоплазмы
динамин (ди- или тетрамер) в ГДФ-загруженном состоянии. Необ-
ходимо отметить, что наряду с амфифизином концентрирование и
сборку динамина регулируют и другие ЗНЗ-домен содержащие фак-
торы — зндофилин, интерсектин и синдапин, участвующие к тому
же в деформации мембраны. Таким образом, достигается сопряже-
ние процессов искривления мембраны с реакцией отделением вези-
кулы. Затем динамин дополнительно связывается с фосфолипида-
ми мембраны. В результате этих взаимодействий запускается обмен
ГДФ на ГТФ, что ведет к диссоциации молекул динамина от покры-
Ё 157
19°С (пермиссивная) В мин при 29°С (непермиссивная)
плотное тело с
ПРИКрЭППОННЫМИ
веэикупами
‚г‘ ` ����
/~\ A ’
синаптически ‘
везикулы ‘ "м .':„ ‘
к эндоцитозные
ямки
2-3 мин при 19°C}
‚‚ цистерны
СИНЗПТИЧЕСКИЕ
10-20 мин при 19"C 1 _ везикулы
„в"""\/‘""'“`”ч д
O д 0
Puc. 58. Последствия нарушения функции ()zma.mm(I у .1I_\’l1I(lllmItbI.X‘
Drosap/zi/(I me/cmogaster (Pracfcke, McMahon, 2004).
Мутация в гене динамина 1, названная БЫЫге, приводит к наруше-
нию функции ‚тинамина при повышении температуры до 28°С (непер-
миссивная температура). Если же температура не достигает этого значе-
ния (пермиссивттая), то динамип «работает» в нормальном режиме. При
увеличении температуры в течение нескольких минут у мушек наблю-
дается паралич, а в пресинаптических НО истощаются запасы сииапти-
ческих везикул (даже плотное тело. A3. остается без везикул), происходит
увеличение площади поверхностной мембраны и накопления «профи-
лей» эндоцитозньтх структур. Это свидетельствует о блокировании про-
цессов эндоцитоза еинаитнческих везикул. При возвращении темпера-
туры к иермиссттвной в течение 2-3 минут в НО образуются эндосомо-
подобные структуры (цистерны) и как результат площадь иресинаиттт-
ческой мембраны возвращается к исходному значению. Спустя 10-20
минут из цистерн формируются синаптические везикулы. Интересно.
что в ‘электронный микроскоп не обнаруживается клатрттновое покры-
тие на ‘эндошггозных профилях при неиермктссттвной температуре. Воз-
можно, что разборка клатринового покрытия происходит независимо от
ведомой цитиаминохт реакции отщеиления везикулы.
158
тия. Затем динамин, содержавший ГТФ. быстро самопроизвольно со-
бирается на «шейке» ямки в кольца и спирали. Полимеризация ди-
намина увеличивает его ГТФазную активность в 50 раз, а при гид-
ролизе ГТФ конфигурация динаминового «воротника» изменяется.
Как следствия этого происходят — сначала отделение покрытой ве—
зикулы, а затем разборка содержащих ГДФ агрегатов динамина.
Динамины содержат PH (plcckstrin homology)—11owcH, который свя—
зывается с фосфоинозитидамтт с очень низкой аффинностью. У оли-
гомеров динамина этот домен обращен по направлению к мембране
и может притягивать (концентрировать) ФТИ-4,5-Ф2 в области шей-
ки везикулы, что существенно ускоряст разделение мембран
(Bethoney е1а|., 2009).
Предполагается два механизма функционирования полимеров
‚тинамина (рис. 59). Во-первых, динаминовое кольцо способно фи-
зически сдавливать шейку до тех пор. пока она не разрушится (ме-
ханизм «защемлениям. Во- вторых, вытягивание динаминовой спи-
рали (увеличение шага между двумя витками в два раза) при гидро—
лизе ГТФ может разделять мембраны (пружино-плодобтяьпй меха-
низм «выталкиваниящ. В обоих случаях динамин работает в роли
хемо-мехапяического энзима, трансформирутощего энергию ГТФ в
силу.
Недавно появился дополнительный фармакологический инст-
румент исследования эндоцитоза - высокоспецифичный и проника-
ющий сквозь мембраны ингибитор динамина, названный динасор
(dynasorc) (Macia ct al., 2006). Когда его апплицировали на синапсы
гиппокампа, он обратимо и полностью ингибировал восстановле-
ние после экзоцитоза синаптических везикул, подтвердив роль ди-
намина в этом процессе (Newton ct а1_, 2006). Предполагается перс-
пективным применение ингибиторов динамина для купирования
эпилептических припадков, которые связанны с постоянным рецик-
лированием большого количества везикул. Но при этом необходимо
учитывать более интенсивную спонтанную (тоническую) активность
тормозных нейронов по сравнению с возбуждающими. Так, в куль-
туре нейронов мышей мутация в гене динамина 1 приводила к на-
коплению глубоких ветвящихся гтнвагигтаций мембраны, увенчан-
ных покрытыми клатрином почками, тлреимутцсственио в иигиби—
торных синапсах (Hnyashi ct а1., 2008). После электрической стиму-
ляции (300 потенциалов действия, 10 ими/с) такой нейрональътойт
культуры и в возбуждающих ПО наблюдался глубокий дефект sum)-
цитоза и истощение запасов синаптичсских везикул (Ferguson et al.,
«Эшафшф ' ад '
ГГФаза РН GED PRD @_�� yaKr(.1re:14a
о?
é>°§"
а ‚и-
димер ` 4 о а д
динамика: °¢>¢% ewe‘ АН‘!
В „ ~.~. ‘
aesvmynafixf/G ‚ъ Н“ 3'1‘
г г н, г
‘\-K;/I ЁГЁ‘
опигомеризация
динамик
медленный - ЁЫСФЫЙ
гидролиз ГТФ удрали ПФ
\`/%%Ж €\‘/pacmennenne’)
Puc-.59. Модели олигомеризации и функции оиналтина (Praefcke,
McMahon, 2004 с изменениями).
А — Дииамин состоит из 4 доменов: ГТФа3нь1й (взаимодействующий с
ГТФ и M53‘),PI-I—roMoJ1orw1Hb1171 плекстрпну (связывающийся с CDT]/I—4,5—
Ф2). GED »~7¢)q)e1<1*opm,x171 домен ГТФазы (участвующий в объединении мо-
J'ICKyJlJ_1HHaMHl-I21 в димер (через «б» - регион) и тетрамер (через «а» регион))„
PRD — o6()I‘aLueuu}.u‘i пролином домен (соединяющийся с ЗНЗ-домен содер-
жащими белками). Динамии может собираться в стабильные димеры / 'тет—
рамеры. Строительный модуль динамина 1 BblI‘JI}L‘1H'I‘ как Т-образный брус
из 2-х молекул. Б — Дииамин в среде с низкой ионной силой или в присут-
ствии ГТФ собирается в кольца, которые могут укладываться в стеки (стоп-
ки) из колеи. Динамин способен образовывать спирали, которые оплетают
мембраны. Гидролиз ГТФ молекулами динамина ведет либо к уменьше-
нию диаметра спирали дииамина («защемление»), либо к увеличению шага
спирали. В - (вязьтвагтиединамина c искусственными липидными везикула-
ми, приводит к формированию спирали динамина на липидной трубке. В
случае медленной несинхронной ГТФазной активности молекул динамииа
шаг между витками спирали увеличивается, растягивая трубку, тогда как
быстрая и синхронная ГТфазиая активность ведет к быстрому растягива-
нию спирали и разделению трубки. В первом случае происходит‘ тубулиро-
вание везикулы. а во- втором -- ее разделение на две части.
160
2007). В работе Ferguson И коллег (2007) было показано, что при
удалении гена динамина 1 эндоцитоз нарушается не полностью, и
хотя замедленно, но протекает при умеренной синантической ак-
тивности. В течение двух недель такие мутантные мыши жизнеспо-
собны. В гигантских чашеобразных синапсах мутация динамингт 1
слабо воздейстовала на быстрый эндонитоз. Вероятно, в этом слу-
чае другие формы динамина (2 и 3) берут на себя «обязанности»
утраченного динамина 1 (Lou е: а1.‚ 2008).
Существуют предположения, что не только динамин контро-
лирует реакцию отделения везикул. В чашеобразных синапсах Хел-
да обнаружены популяции везикул, для которых динамин выполня-
ет роль только в запуске эндоцитоза (Ferguson ct а1.‚ 2007; Хн е: а1.
2008; Dittman, Ryan, 2009). Активированный ГТФ-содержатций ди-
намин, действуя как типичная «сигнальная» малая ГТФаза‚ спосо-
бен передавать сигнал эндофилину, сконцентрированному на мем-
бране между двумя кольцами динамина. После чего эндофилин на-
чинает объединять лизофосфатидную и жирную (точнее, арахидо-
ноил-коэнзим А) кислоту в фосфатиднуто, что само по себе доста-
точно для отделения везикулы. Кроме этого, in vivo дополнительное
усилие, облегчающее отрыв везикулы, может обеспечить вектор-
ная полимеризация актиновых филаментов. Запускаемая ГТФаз-
ным доменом динамина (Roux et а1.‚ 2006). Существуют предполо-
жения o существенной роли фосфатазы синатоянина в реакции
отшепления везикулы (Liu ct а1.‚ 2006).
Синаптоянин
Синаптоянин 1 содержит два инозитолфосфатазных Домена рас-
положенных друг за другом: М-концевой Бай-домен, отшенлятощий
остатки фосфорной кислоты преимущественно в 3 и 4 положениях
инозитольного кольца, центральный фосфатазньтй домен, действу-
ющий на фосфат в 5 положении ФТИ-4,5-Ф2 и ФТИ-3,4,5-Ф3
(Сгетопа, DcCamil1i,200l).C—x<0Hue130171 регион еинаптоянина 1 вов-
лечен в белок-белковые взаимодействия, необходимые для «наведе-
ния на цель» еинаптоянина: привлечения его к сайтам эндоцитоза.
Этот регион соединяется с ЗНЗ-доменами зндофилина (наиболее
важный партнер еинаптоянина), амфифизина, синдапина, интер-
секгина и т.п. (Gad е: а1.‚ 2000; ltoh et а1.‚ 2005). Возможно, для
эффективной посадки еинаптоянина на мембрану требуется при—
сутствие в липидном монослое нолиненасьттттенньтх жирных кислот
(Магии ct а1., 2008). 1'1CKU'I'0]‘)hIC авторы обсуждают‘ возможное не-
посредственное участие синатоянитта в реакции отшеплетттжя веш-
кулы. При атом 5’ (ростргтгазттьтй домен синаитояттъттта способен бы-
стро локально в области «тиейки» дефос‹1)орилироват ь (DT1~I-—1,5—(I)2.
в итоге сродство протеинов покрытия и ВАК-домен содсржаитих
протеинов к мембране будет снижаться, а также возникнет‘ гради-
ент ФТ11—4‚5—Ф2 между ямкой и ее «тиейкой». Все это будет‘ способ-
ствовать спонтанному сжатию перешейка (Lin ct 211., 2006; Dittman,
Ryan, 2009).
Известно два сплайсттнговых варианта сииатояттттна 1, с моле-
кулярным весом 145 и 170 кДа. У формы еиттатоянтттта 17ОкДа на C-
участке имеются связывающие сайты для клатрина, /\P—2 И Eps15,
благодаря которым синаттгояттитт прикрепляется к покрытьтм клат-
рином ямкам на ранних стадиях их образования (Haffncrc1a1., 2000).
Вероятно, на начальных стадиях эндоцитоза синаптттчееких везикул
d)oc(])a'1'a3u:;1$1 активность синаптоянттна-1 7ОкЦа играет роль в огра-
ничение роста клагрттттового покрытия и его ремоделирования
(Рсгега ct £11., 2006). Однако это может иметь место только в «разви-
вающихся» иейронах„ поскольку длинный вариант синаптоянина
практически отсутствует в зрелых синапсах. B прееиттаптттческттх
терминалях зрелых нейронов в очень больших концентрациях ири-
сутетвуег изоформа весом 145 кДа (McPl1crson 01:11., 1996). Совмео
тно с сит-тантояттттттом 1 в эндоцтттозе могут участвовать и Другие
фоетратазы, такие как сииатггояттитт 2, инозитол-З-(1›ос‹1›ата';а OCRL.
Причем фосфатаза OCRL по структуре похожа на длиипуто изофор-
му сииаитояттттна 1 (Lowe, 2005).
Каркасные белки Ер$15 и интереектин в
эндопитозе
Eps15 — это белок массой 110 кДа, который является важным
партнером эпсинат в сииаисе, а также увеличивает оттосредуемуто
АР-18О сборку 1<:1a'1‘pm121(M0rgun cta1., 2003).T\1-Koncx11ips15 содер-
жит три копии EH домена, свячыватотпихся с §\lI’I’ мотивами белков
(эпсин, AP180, етоиин, синаптктятттттт), а С-коиеп Ер515 может со-
единяться е АР-2 и клатриътозт (рис. 55 1119) (Kelly, Phi11ips. 2005). C
помощью центрального супер-скручениою региона lips! 5 способен
формировать ди- и ‘тетрамсрьт. а ‘также B3111IMO,’1C11C”I‘BOB€1Th с интер-
сект ином (Mousavi ct а1., 2004). Eps15 (как и ')нснн) содержит два
c4
162 ё �##� : ’
[Л-ЕИО1`ИН;1, КОТОРЫС ЦСПЛЯКУГ ПОМСЧСННЫС УбНКВЪПГГННОЁИ бСЛКОВЫС
«круты» (Roy, Штата, 2005). Недостаток Ёр515 у I)1'0s0phila ведет к
последутотцсму уменьшению концстгграций итттерсектттнтт, диттамтт-
на, стопина, синаптотагтхтитта 1, АР-2, эндофилитта в синапсе, а у С‘.
clcgans — к снижению количества синаптических везикул (Sulcini ct
al., 2001; Koh ct а1., 2007). Ёр515 концентрирует белки эндоиитоза
в опредсттсттттом регионе НО Drosophila, а в ответ на вьтсокочастот-
пую активность F.psl5 перемещается из центральных районов сп-
нахггического бутона на периферии) в примембраннуто область, где
активно протекает процесс эндоптттоза синаптических везикул (Кон
ct а|., 2007). In viva B клетках при участии тетрамерной формы Eps15.
взаимодейетвутотцей одновременно с четырьмя АР-2 комплексами,
происходит первоначальная группировка АР-2 на эндотнтгируемой
мембране. Таким образом, создается «многоточечный крепежный»
сайт («четыре АР-2 х Epsl 5») для привлечения и носледуютцейт сборки
Kna'rp1ma(Scl1mid ct а1., 2006).
Особый интерес вызывает интерсектин (или Dap 160) (рис. 55
ц19), функционирующий как каркасный протеин. Он соединяет
вместе белки эндоцитозиой машины (_АР—2, эпсины 1/2, Ерз15,
стонин 2, динамии, синаптоянин), и регулирует актиновый цитос-
келет (через N-WASP, Cdc42, Агр2/3, синапситтьт), МАР-киназньтй
каскад (через белок - msos), Секреторный аппарат (через SCAMP
протеины и SN/\P—25), a также имеет возможность взаимодейство-
вать с фосфолипидами. Мутации аналога интерсектина у Drosophila
(y беспозвоночных экспрессируется короткая форма — интерсектин
5), наруптаюпттте функции белка, летальны для мушки и сопровож-
даются тяжелыми нарушениями формирования нервно-штыкпечных
синапсов и рециклирования синаптических везикул (Koh ct а|., 2004).
В нейронах позвоночных тэкспрессируется длинная форма интер-
сектина IL, включающая два участка на N—x<0Hue(EH—,1o.\1cm.1), свя-
зывающих эпсины, супер-скрученный регион, взаимодействующий
с Ер515, и пять 5Н3 доменов, «притягивающих» молекулы динами-
нов, синаптоянинов и N—WASP, a также Dbl томологичный домен,
РН-домен и С2 домен. Последний (есть только у интерсектина 1)
способен действовать как фактор обмена гуаниловьтх нуклеотидов
для малой ГТФаЗЬт Сас42 (то есть активировать ее), регулирующей
цитоскелет‘ (Hussain е! а1., 2001). В ретикулосттингтлытом синапсе
мипоги одновременно с освобождением нейромедиатора интерсек-
тин перемещается из пространства, содержащего везикулярный пул.
в область окружающую A3. Таким образом, осутцеетвляет ся достав—
163
ка молекул динамина, связанных с интерссктипом, в сайты зндони-
тоза, где интерсектин содействует оргапизацтти машины эндоцито-
за и выступает как Каркасный белок (Evergren е: а1., 2007). Потеря
интерссктина у мух чревата снижением интенсивности зндоцигоза,
усилением синаптической депрессии в течение длительного раздра-
жения и снижением концентраций в зонах эндоцитоза, таких бел-
ков эндоцитоза как, АР-180, эндофилитта, синаптоянитта, динамина
(Koh et а1., 2004). Нарушение взаимодействия интерсектина 1 и АР-
2 в синапсах миноги ингибирует рецпклирование синаптических
везикул. Некоторые авторы называют интерсектин 1 — универсаль-
ным «актером» в везикулярном цикле, который «бродит» вслед за
везикулой, перемещая с собой регуляторные белки и протеины эн-
доцитоза (Pechstein ct 211., 2010). Хотя стоит оговориться, что в си-
напсах гиппокамттальной культуры крыс интерсектин 1 практически
отсутствует в пресинаптических НО, а колокализуется вместе с клат-
pl/IHOM,/\P-211 актином P дендритных шипиках (Thomas ct 91., 2009).
Снятие клатринового покрытия
После реакции разделения мембран, везикула быстро (в тече-
ние нескольких секунд) теряет клатриновое покрытие. Ключевая роль
в этом принадлежит тлаперонам. Основным из этой группы белков,
участвующий в эндоцигозе, является Н5е70 (heat shock cognate protein
70), который предотвращает ненродуктивные взаимодействия меж-
ду молекулами клатрина (рис. 60 I121). Когда клатрин и белки эндо-
цитоза неправильно свернутьт. гидрофобные аминокислоты, обыч-
но скрытые в глубине структуры белков, выставляются наружу и
могут нсспецифически взаимодействовать с пептидами, нуклеино-
выми кислотами и другими макромолекулами. Шаперон решает эту
проблему, связываясь с подобными участками вскоре после их «об-
нажения» и ограждает гидрофобные остатки аминокислот от незап-
ланированных взаимодействий (Bukan et а1., 2006). Шаперон Н5с70
может метить (привлекая систему убиквинтилирования) белки, вов-
леченные в зпдоцитоз, для направления их на деграцию как в про-
теосомьт, так и лизосомьт (Meimaridou et £11.. 2009).
Запуск процесса снятия клатринового покрытия происходит до
этапа отнтеплеттия везикулы. Разборка покрытия (рис. 60 ц21) начи-
нается с того, что вспомогательный нейрон-сттецифттчгтый белок (ко-
Шаперон) ауксилин связывается с клатриновьлм покрытием (с клат-
рином и АР-2) (рис. 55 1119). Судя но данным криоздпекгроттттоёё мик-
164 ���� �.� `_ �
рОСКОПИИ, В клгжтриттоноът IlOKpbITHH 3._VKCVlJIl/IH 'SE‘lHHMilCT ПОЛОЖСННС
между «штативом» (место соединения трех тяжелых целей клатри-
на) одной ‘триекелии и «голенью» ДРУГОЙ триекелии. что ослаГляет
взаимодействия между трискелиямтт и искажает геометрию покры-
тия (Fotin ct а1., 2004). Затем к ауксилииу притягивается из цитоп-
лазмы Н5с7О, содержащий АТФ. Молекула межклеточной адгезии
СНЫ удерживает Н5с7О поблизости от сайтов ъндоцитотза
(Lcshchyns’ka ct а1., 2006). В результате взаимодействий с ауксили-
ном возрастает АГФазттая активность Н5с7О, и он переходит в АДФ
загруженное состояние (Jiang ct al., 2007). АДФ-Н5с70 крепко связы-
вается с ОЬМЬТ-мотивом на С-конце тяжелой цепи клатрина, что
искажает ее коттформацито и ведет к разборке решетки на отдель-
ные триекелии (Rapoport ct 211., 2008). B соответствие с теоретичес-
кими расчетами даже маленький поворот триекелии по часовой
стрелке достаточен для расцепления с решеткой (Fotin ct a1., 2004).
B цитоплазме Н5с7О постоянно освобождает и заново связьтвает клат-
рин, стабилизируя его для последующей повторной сборки на плаз-
матической мембране. При нокауте гена ауксилина в нейронах его
функцию в эндоцитозе синаттгиттеских везикул (хотя и менее эф-
фекти вно) берет на себя повсеместно экспрессирутотттийся белок цик-
ли-С-зависимая киназа (GAK). Ауксилин и GAK высоко гомоло-
гичные протеины, отличие заключается в том, что у GAK есть N-
концевой киназньтй домен и GAK может взаимодействовать с АР-
1. Интересно, что мутации GAK ПрИВОДЯТ к существенным дефек-
там развития мозга, соттровождакттцимися уменьшением количества
нейронов в коре. При делеции ауксилина увеличивается содержа-
ние клатрина (за счет накопления его агрегатов, которые трудно
поддаются разрушению) и число покрьгтых клатрином везикул в НО,
замедляется эндоцитоз синаптических везикул (что вероятно явля-
ется причиной высокой летальности мутантных мышей) и усилива-
ется экспрессия GAK В нейронах (Yim ct al., 2010).
Поскольку <DTH—4,5—(D2 служат главными сайтами, к которым
крепятся адаптерньте белки, необходимым условием удаления этих
белков с поверхности везикулы является дефощрорттлттрование мем—
бранных липидов. Эту функцию выполняет фоефатаза синаптоя-
нин, которая оттцеиляет остатки фосфорной кислоты от иттозтттоль-
ного кольца головной гидрофильной группы фосфолипидов (рис.
55 1119). Многие из ЗНЗ-дометт содержащих белков, вступающих во
взаимодействия с синатттояттттттом, ‘также соединяются е дипамином
(ltoh ct a|., 2005). Поэтому реакция оттцепления везикулы. произво-
.- `\
165
димая динамином, может активировать гидролиз ‹1)'ГИ-4.5-<Г>2 с пос-
ледующей разборкой покрытия (Di Рао1о‚Г)е Сатин, 2006). Следует
заметить, что реакции дшросфорилирования полярных головок фос-
фолипидов происходят практически одновременно с деятельностью
шаперона Hsc70. B результате превращения синаптоянином ФТИ-
4,5-Ф2 в ФТИ-4-Ф в мембране везикулы создаются сайты для при-
крепления ауксилина через его ФТИ-4-Ф-стзязываюн1ий домен
(Massol ct а1.. 2006). Важность синаптоянина для отсоединения клат-
рина от везикулы подтверждают данные о накоплении покрытых
клатрином везикул, у мышей нокаутных по гену синаптоянина 1
(Kim ct а1.. 2002).
Интересно, что демонтаж клатринового покрытия строго зави-
сит от температуры и может представлять этап, на который в слу-
чае длительной стимуляции приходится более 50% времени всего
3H11o1mTma(Tcng, Wilkinson, 2000).
Механизм быстрого клатрип-
оттосредованттого эндоцитоза
Этот вид эндоцитоза (рис. 47) обеспечивает восстановление
численности синаптических везикул в условиях слабой и умерен-
ной синаптической активности, а блокирование данного тина ‘эндо-
цитоза очень быстро приводит к полной остановке освобождения
медиатора. Увеличение скорости этого варианта эндоцитоза сно-
собствует поддержанию освобождения медиатора на более высоком
уровне, а замедление, наоборот, способно потенцировать депрес-
сию секреции медиатора при высокочастотной активности (Zeflrov
et а1., 2006; Petrov ct а1., 2008). Поэтому динамика быстрого ЭНДОЦИ-
тоза может лежать в основе многих феноменов пресинаптической
пластичности. Становление машины быстрого эпдоцитоза проис-
ходит B процессе «взросления» сипаптического контакта и разви-
тия нервной системы в целом. Таким образом, механизм быстрого
клатритт-опосредованиого эндоцггтотза составляет один из ключевых
звеньев межнейроттальттой коммуникации.
Молекулярные компоненты и механизм быстрого клатртттт-оттос-
редованного зндонитоза на плоской поверхности плазматической
мембраны представлен на рис. 61 ц22. Видно, что в этом виде эндо-
цитоза принимают участие уже описанные белок-белковые и бе-
166
лок-липидпые взаимодействия. Однако, высокие скорости эндо-
цитоза в нресинантических областях связаны с синтезом ней-
рои-специфичных изоформ белков (вариантов, появляющихся в
результате альтернативного сплайсинга РНК): легких цепей клат-
рина, АР2ос, АР-180, эндофилина 1, амфифизина 1, интерсекти-
на 1-1, NECAP 1, динамнна 1, ауксилина 1 и др. (Ferguson е: а1.‚
2007; Dittman, Ryan, 2009) и строгой последовательностью их
участия в процессе формирования новой везикулы (рис. 61 ц22).
Кроме этого большая интенсивность зндоцитоза синаптических
везикул определяется тем, что значительная площадь пресинан-
тической мембраны отдана на откуп этому процессу (Fernandez-
Alfonso et а1.‚ 2006). Причем быстрый клатринюпосредованный
эндоцитоз протекает в сайтах, расположенных неподалеку от АЗ
(окружающих A3) (Heuser, Reese, 1973; Gundclfinger е: а1.„ 2003).
Механизмы медленного (объемного)
эндоцитоза
Клатритт-зависттмое медленное образование везикул из цистерн
(объемный («bulk») ЭНДОЦИТОЗ) протекает в терминалях ЦНС, ре-
тикуло-спинальных синапсах миноги, нервно-мышечных синапсах
лягушки и змеи, и отличается от вышеописанного быстрого клатри-
нового эндоцитоза везикул с плоской плазматической мембраной
(Clayton е: а1., 2007). Причем клатрин и АР-2 требуются для почко-
вания везикул с поверхности цистерн, образование которых проис-
ходит клатрин-тхезависимо (рис. 47) (Kasprowicz е: а1., 2008). Часто
нарушение быстрого клатрин-опосредованного зндоцитоза потен-
цирует протекание медленного эндоцитоза. Объемный эндоцитоз
обнаруживается практически во всех нервных терминалях, где уже
в течение 1-2 секунд высокочастотной стимуляции могут появлять-
ся большие участки инвагинироваътной пресинаптической мембра-
ны (Leenders et а1.‚ 2002; Tong et а1., 2007). Эти вакуолеобразньте
структуры могут оставаться прикрепленным к плазматической мем-
бране в течение некоторого времени п после окончания высокочас-
тотной стимуляции (Gad et а1.‚ 1998; Clayton et а1.‚ 2008). Причем
везикулярные белки остаются только частично сгруппированными
в таких структурах (Jia е: а1., 2006; Ора2о е: а1. 2010 ). Во время
очень интенсивной стимуляции зкзоцитоза (100 ими/с) в нспосред—
ственной близости от наиболее «горячих» A3 B двигательных 110
2.3
0n�� 0n�� 167
МЬНПИ МОГУТ ОбрЦЗОВЬПЗЭЁГЬСЯ 6()J11>Ll1l/1C ИНВНГИНЦЦИИ, 113 1£(7'[‘()p1>lX B
течение порядка десяти мин образуются новые везикулы ((}z1fT1c1d е:
а1., 2009). Под действием деполяризации мембраны е помощью ра—
створов.с повышеннымсодержанием ионов К (50—100MM), и высо-
кочастотной стимуляции в чашеобразных НО Хелда мьнпи и крысы
регисгрирукттся гигантские емкостные скачки, отражающие форми-
рование эндосохтоподобттьтх структур (Не е: а1., 2009).
Медленный тип эндонитоза быстро «включается» вслед за сти-
муляцией и контролируется Са/кальмодулитт-зависимой актива-
цией кальттиневрина и насыщением машины быстрого клатрин-
оттосрсноваттного эндоцито3а„ а не связан с накоплением мембран-
ных компонентов синаптических везикул в поверхностной мембра-
не (Clayton ct al.. 2007; Clayton. Cousin, 2009). Кальциневрин — это
фосфатаза, которая при связывании с комплексом Са-кальмодулин
производит‘ ятефосфорилттроваттие как минимум восьми белков, за-
действованных в эндонитозе синаптических везикул. Кальнинев-
рин локализуется в цитоплазме НО, поэтому для его активации тре-
буется интенсивная нейроналытая активность, ведущая к значитель-
ному повышению внутртггерминальното кальция (Evans, Cousin,
2007).
По всей видимости, объемный эндоцитоз связан с уровнем
лефосфорилирования динамина 1 и белком синдтанинозт 1
(Anggono е: а1., 2006; Clayton е: 211., 2009). Ингибитор динамина
dynasorc в равной степени блокирует как быстрый, так и объемный
эндоцитоз в культуре нейронов (Clayton е: а1., 2009). Установлено,
что слабая или умеренная синантическая активность ведет к час-
тичному дефосфорттлироваттттто динамина 1 ‚ в итоге он связывается
с ашрткризиттом, который вовлекает динамин в бьтетрьтй клатрин-
оттосредованньтй эндошгтоз. Высокая активность, сопровождающа-
яся массивным входом Cal’. вызывает полное дефосфорилирова-
ние ‚динамина, который затем связывается с белком синданином,
запускающим медленный 311;1o11m‘o3(Anggono е: а|.. 2006; Andcrsson
е: а1., 2008). Нарушение взаимодействия динамина 1 и синдаттина 1
селективно блокирует хтедленньттт зндоцтгтоз (Clayton е: а1.‚ 2009).
В гигантских чашеобразных синапсах мутация динамина 1 приво-
дила только к угнетению медленного клатритт-оттосредоваттттого эн-
доннтоза. Было высказано нреднтоложеттие что специфичная функ-
ция динамина 1 заключается в нристтособлсътънт уровня медленного
зндонтгтоза к возросшей интенсивности процессов ‘экзонитоза (Lou
е: a1., 2008). B связи с зтихт становится нонятттьтм, почему Экспрес-
168
сия динамина 1 постепенно увеличивается по мере созревания нс-
рвной системы (Chops ct al., 2007).
Синдапин (второе название паксип) суптесттзует в виде 3 изо-
форм: сппдаптттт 1 -- избирательно синтезируется в мозге, а 2 и 3
вариант — повсеместно. В состав синдаттнна входит F-BAR-;10MeH.
который способен преврсгпать мембрану в трубчатые структуры и
прикрепляется к небольшим изгибам, в отличие от N—BAR доменов
амфифизина и эндофилина, которые являются сенсорами сильных
деформаций, возникающих в ходе быстрого клатрттттового эндони-
тоза (рис. 56 1120). Также синдапин содержит несколько МРЁ-моттт-
вов (связыватошихся с ЕН-доменами белков), С-концевой SH3-110-
мен, взаимодействующий c;1m1a.\muoM и N-WASP (рис. 55 ц19). В
покое свободный ЗНЗ-домен синдаттина 1 связан с Р-ВАК-домсном
и ингибирует его, а при взаимодействии БНЗ-домсна с динамином
1 (наблюдается в ходе высокочастотной стимуляции) F-BAR домен
переходит в «активное» состояние (Rao ct а1., 2010). Синдапитт воз-
действует‘ на белок N-WASP (рис. 55 ц19), инитттитрутоттптй вектор-
ную полимеризацию актина (смнижс), которая обеспечивает силу
для инваптнации мембраны при медленном эндошттозе (Kcsscl,
Qualmann, 2002). Микропньекции в НО антител к синдаттину 1
уменьшают образование Р-актина в сайтах 3H11o11nT03a(Andcrss0n ct
al., 2008), a нарушение функции актина ингибирует объемный эн-
доцитоз в двигательном НО лягушки (Richards ct а1., 2004).
Вероятно, что для отделения эндосомоподобттьтх структур от
пресиътатттттческой мембраны и образования из них стптатттиттескттх
везикул также требуется дннамин. Однако не исключено, что EH Ds/
RME-I/pincher белки семейства, принадлежащего к суперсемей-
ству динаминов, могут выполнять роль динамина 1 в ‘этих процес-
сах (Вганп е: а1., 2005; Daumkc ct al., 2007). Кроме того, in мига F-
BAR ДОМСН синдаттина способен сжимать тубулярные мембранные
образования и стабилизировать узкий «перешеек», то есть гипоте-
тически еиндаттин может помотать вести реакцию отделения инва-
гинации от поверхностной мембраны (Wang ct а1, 2009). Так, в воз-
буждающих и тормозных синапсах мыши, лишенных динамина 1,
после длительного деполяризуютпего стимула (50 сек, 90MM KC!)
новые синаптические везикулы образовывались из объемных ваку-
олей. Такие эндосомо-поттобттьте структуры. линтенньте клатрттно-
вого покрытия, исчезали в течение 10 минут после окончания сти-
мула. а вместо них в НО появлялись везикулы (Huyashi ct a1., 2008).
Для протекания объемного ‘лтдотпттоза необхолитиа ‘также ак-
169
тивносгь некоторых литтид-модифицирулопшх ферментов, таких как
Цюсфолииаза С, ФИ-З-киттаза,диат1илглицерол-кипаза, синатггояннн
(Araki ct 211., 2006). RBO (rolling /2/ac-/mu!) липаза встроена в пресн-
напгичсскун) мембрану, где может взаимодействовать с синтакси-
ном 1 (Lagow ct al., 2007). Нарушение функции этого белка приво-
um K ОСТЦНОВКС формирования эндосом и блокаде медленного эн-
доцитоза. При этом клатрин-затзисмый быстрый эндоцитоз значи-
тельно усиливается (Vijayakrishnan ct а1.‚ 2009). При непермиссив-
ной температуре у мутантов RBO (те. при данной температуре RBO
перестает «работать») в мозге наблюдается накопление ФТИ-4‚5-
Ф2 и снижение уровня ‚чиапилпчииерола в синаптических мембра-
нах (Vijayakrishnan, Broadic, 2006). Предположительно, активность
RBO обеспечивает концентрирование определенных липидов, об-
легчатотттих образование глубоких мембранных иттвагинаттий. харак-
терных для объемного 3Hno111/1To3a(Vijayakrishnan ct 211.. 2009).
Для протекания медленного эндоцитоза особенно важен 5’-
фосфатазный домен синаптоянина (рис. 55 1119) и взаимодействие
синаптоянина с белком эндофилином. Нокаут гена синаптоянина
нарушает протекание как быстрого, так и медленного эндоцитоза,
однако при избирательном нарушении 5’ фосфатазттого домена си-
наптоянина повреждается только объемный эндоцитоз. Также при
мутации синаптоянина, приводящей к неспособности последнего
связываться с эидофилгтнотхт намного сильнее страдает медленный
эндоцитоз (Mani е! а1., 2007).
Интересный факт был обнаружен в исследовании Virmcmi И
коллег (2003), которые производили генетические манипуляции е
синаптотагмииом 7, который локализуется на плазматической мем-
бране. Сверхзкспресеия варианта синаптотагпиитаа 7А, содержащего
два С2 домена, направляет эндоцитозный процесс по медленному
пути. тогда как лишенная одного из С2 доменов 7B n3oq)opMa си-
наитотагмътна способствует протеканию бьтстрого клатрин-опосре-
дованного эндоцитоза.
Возможно объемный эпдоцитоз наряду с Процессами. проте-
кающими в классических зпдосомах. может участвовать в коррек-
Ции белковой композиции сипаптичсских везикул. Так, после мас-
сивного протекания объемного эидоцитоза в НО Drosuphila через
10 мин «отдыха» значительно возрастает размер кванта медиатора.
то есть белковые системы ведущие ЗаКваТ нейротрапсмитгера в ве-
зикулах. сформироваипьлх медленным зпдоцитозом изменились и
работают более ‘эффективно (/\kber;_;eno\=a. Bykhovskuia, 2009).
170
Место эндосомальной сортировочной стании в
рециклировании везикул. Классические эндосомы
Как уже было сказано, большинство синаптнческих везикул
рециклируются (быстро или медленно) без длительных «остановок»,
минуя стадию эндосомальното посредника. Поэтому эндосомы ред-
ко обнаруживаются c помощью электронной микроскопии в «нор-
мальных» НО (МппЬу, DcCamilli, 2003). Однако ряд исследований
доказывают непосредственное отношение эндосомальной дороги к
рециклированию везикул в определенных физиологических усло-
виях (рис. 62 ц23). B HCpBHO-MbI111C‘{HbIX синапсах Drosophila эндо-
comm ЯВЛЯЮТСЯ одним из обязательных этапов пути «меченых» флу-
оресцирующим белком синаптигтеских везикул (Wuchcrpfcnnig е1а1.,
2003).
B пресинаптических ПО локализуются так называемые ран-
ние эндосомы, которые образуются в результате слияния эндоци-
тозных везикул друг с другом или предсуществующими ранними
эндосомами. Это органеллы с кислым содержимым, которые функ-
ционируют как сортировочные станции для белков-грузов (везику-
лярных белков, различных рецепторов, транспортеров) и липидов.
После [пребывания в ранних эндосомах поглощенные эндонитозом
молекулы могут либо упаковываться в синаптические везикулы,
либо, попадая в транспортные везикулы, доставляются в рецикли-
рующне эндосомы (рис. 62 ц23). В репиклируюших эндоеомах, рае-
положенных преимущественно в околоядерной области поблизости
от транс-КГ, Протекает дополнительная проверка белков и лини-
дов‚ которые затем адресуются в НО. При обнаружении в процессе
эндосомальной сортировки неисправимых дефектов белков или по-
ступлении сигнала о ненужности некоторых протеинов, они транс-
портируются в поздние эндосомы и лизосомьт, где разрушаются
до аминокислот. Таким образом, входным элементом в зндосомаль-
ную систему являются ранние эндоеомы, на территории которых
определяется судьба поглощенных эндоцптозом компонентов. Су-
ществует несколько субпопуляггий ранних эндосом, специлизиро-
ванных на работе е отгределгенными грузами, кроме того, в каждой
ранней эпдосоме содержатся регионы, обслуживающие определен-
ные транспортные пути. Эпдосомшгытые пути транспорта особенно
сложны в поляризованных клетках (нейроны, эпителий), где плаз-
матичеекая мембрана гетеротенпа и имеет специфичные функции в
171
рЭЗНЫХ УЧЦСТКЦХ KJICTKI/I. I/IMCHHO yHl/IKZIJIBHOCTI) '_)H110COM И ИХ ЦССИ-
метричное расположение в нейронах определяет локализации) ак-
сонального и дендритных к(›мттар'гметтт‘‹›в (Schmidt, Haucke, 2007).
Специфика энлосом и их функция в значительной степени оп-
ределяется белками из Rab семейства малых ГТФаз‚ которое на-
считывает у человека 63 члена (Jordcns cl а1., 2005). B активном
связанном с ГТФ состоянии Rab белок, расположенный на мембра-
не везикулярной структуры, взаимодействует с КаЬ-эффекгорами.
В роли КаЬ-эффекторов выступают моторные белки (определяю-
щие специфику транспорта), факторы прикрепления и докирова-
Hm:(1IeTepMmmpyiou1ne специфику слияния), белки, ответственные
за почкование. Отдельные субпопуляции эндосом, более того, раз-
ньте регионы в пределах одной эндоеомьт характеризуются присут-
ствием специфичных Rab белков (рис. 62 ц23). Rab4 вовлечен в
образование везикул из ранних зндосом, их транспортировку и сли-
яние е рециклирутоптимн чндосомамтт. Rab} 1 регулирует мембран-
ный транспорт между рециклируютцими эндосомами и плазмати-
ческой мембраной. Rab7 и Rab9 обслуживают эндосомальньтй тра-
фик в системе поздних эндосом, причем Rab7 контролирует путь от
ранних к поздним зндосомам, затем в лизосомьт, тогда как Rab 9
отвечает за транспорт между поздними зндосомами и транс-КГ
(Schmidt, Haucke, 2007). Vhrrcpccno. что на мембранах всех везикул
содержится SNARE белок Vti—1aB (Antonin е: а1., 2000), участвующий
в слиянии мембран эндоеом с транс-комплексом Гольджи (Jahn,
Shellcr, 2006).
Для направления, образовавшихся в ходе клатрин-оттосредовач
ного зндопитоза везикул, в ранние эндосомы может требоваться
ГТФаза Rab5, которая является обязательным, хотя и «малочислен-
ньтм» компонентом синаптических везикул (рпс. 62 Ц23) (Fischer
Von Mollard ct а1., 1994). Мутации Rab5 угнетают освобождение ме-
диатора в течение повторной стимуляции н приводят к появлению
везикул больших размеров в фоторецепторах Drosophila. Некото-
рые авторы полагаю функнию Rub5 не в эндосомальном транспор-
те, а в прслотвращетттттт гомотиттттттеского слияния синаптическттх
везикул (Shimizu ct а1., 2003). В НО rm11ioi<aMI1aRab5 НС диссоции-
рует (как Rzib3) от мембраны сипаптических везикул даже после
зкзоцнтоза, а при сверхзксттрессии Rab5 наблюдается уменьшение
популяции везикул, участвующих в рецикдтттроватттттт (Star е! а1.,
2005). Наоборот‘ увеличение содержания Rub5 y Drosophilu усилива-
ет сннантпческук) передачу (Wucherpfennig е1а1. 2003). Эффектора-
172 ё
ми Rab5 являются более 20 белков. Это ФИ-З-кттттгтза, ситггезттруто-
тпая ФИ-ЗФ, EEA1 (антиген ранних зндосом 1), оттрсделятопгий при-
крепление везикул к зндосоме, KIF16B (кинезпп 168), моторный
белок. трапспортирутоптий эндотпттозттьте везикул в район тндосо-
мы и др. (НоерГттег ct 211., 2005). Мембраны. обогащенные ФТИ-З-Ф.
привлекают факторы, запускающие ‘эндопитоз везикул, которые
впоследствии адресуются в ранние эндосомы (см. ниже). Фармако-
логическое иттгибирование ФИ-З-киназы (в двигательном НО ля-
гушки) вызывает депрессию выделения медиатора и истотпетттте за-
пасов еинаптических везикул при повторных залпах высокочастот-
пой активности (Richards ct a1., 20()4).
По всей видимости, судьба синаптттческих везикул определя-
ется итттеттсттвттостыо их участия в нейропередаче. После многократ-
ньтх раундов репиклирования еинаптические везикулы «изнашива-
ются» и в какой-то момент направляются на «диагностику» и «ле-
чение» в ранние эпдосохтьт. Распознавание белков спнатттичсскпх
везикул, потерявших нагивную конформацию, происходит‘ уже при
клатрин-опосредоватгном эндошттозе и продолжается в эндосомах с
помощью белков-тпаперонов. Если тпапероньт не смогут исправить
«брак» в белковой молекуле, то включается система убиквинтилтт-
рования. Убиквинтин — это пептид из 76-аминокислотньтх остат-
ков, который присоединяется к пронизывающим мембрану (интег-
ральным) белкам ферментами убиквинтин-лигазами (Hickc, 1999).
B НО Ы-конпевой ubiquitin—11kc домен одной из таких лнгаз (парки-
на) связывается с ЗНЗ доменом зндоцитозттого белка зндофтттттттта,
причем данное взаимодействие усиливается при фосфорилирова-
нии (Тгетре ct а1., 2009). Обычно присоединение убиквинтина к
цитозольньтм белкам служит своеобразной «черной меткой», ука—
зываюшей на белки, которые необходимо направить на разрушение
(Thrower ct а1., 2000). Убиквинтилирование итттегральттых белков
плазматической мембраны (в том числе везикулярных) адресует их
(транзитом через эндосомьт) во внутриклеточные органеллы (лизо-
COMM). где пипгеварительньте энзимы в условиях повышенной кне-
лотноети разрушают отмеченные белки. В ходе клатриттового эндо-
питоза, помеченные убиквиптином белковые «грузы» (белки си-
наптичееких везикул. рецепторы, ионные канштьт) могут «цеплять»
такие адаптерньте протеины как эпсин и Ер515, которые содержат
убиквинтнн-связьтватотпие (UB) домены (Timsit ct 111., 2005). Кроме
того подвергаться моноубиквинтилированию могут и сами ‘тндопи-
тозньте адаптеры (эпсин н Ерз | 5). При этом присоединенный к адап-
173
теру убиквинтттн начинает взаимодеисттзовать с БЕЗ-доменом, в ре-
зультате белок переходит в «закрытую» конформацито. Почтому убик-
винтилироватттте эпсина и Epsl 5 ингибирует их связывание с убик-
винтилированттьтми мембранными белками и белками-партнерами
(АР-2, клатрином, интерсектиттом), что замедляет зндоцтттоз и, воз-
можно, дает время «задуматься» о судьбе везикулярных белков
(МаШо-Ваек, Wendland, 2006). B отсутствие одного из ферментов
системы убиквинтина UCI l—Ll (ubiquitin carboxyl—t<~:rminal hydrolase
Ll) B нервно-мьттттечньтх синапсах мыши уменьшалось количество
синантических везикул, в НО накапливались эндосомоподобньте
структуры, нарушались процессы зкзоцитоза и долговременной
пластичности (Chen 61:11., 2010). Фармакологическое жс блокирова—
ние убиквинтитт-завттсимого нротеолиза быстро приводило к усиле-
нито спонтанного экзоцитоза в возбуждающих синапсах гиппокам-
на (Rinclti, Schweizer, 2010), а также предотвращало снижение раз-
мера готового к освобождению пула, вызванное длительной депо-
ляризацией (Jiung ct 211., 2010).
Факторы регулирующие клатрин-
опосредованный эндоцитоз
Описано несколько универсальных синаптических механизмов,
обеспечивающих адаптацию клатрин-опосредоваттного эндоцитоза,
участвующего в рециклттроватттии синаптических везикул, к специ-
фическим потребностям быстрой синаитической передачи. Во-нер-
вых, это цикл биохимических превращений фосфатицилттттозито-
лов, встроенный в оборот синантических везикул; во-вторых, Са-
завттсимое дефосфорилировантте фосфатазой кальциневриттом ряда
(около восьми) белков зндоттитоза, названных «дефосфиттами»; в-
третьих, фосфорилирование ттротеитткттиазамтт белков механизма
эндоцтттоза (Di Paolo, Dc Camilli, 2006; Jung, Haucke, 2007).
174
Фосфоинозитидиьлй цикл в кругообороте
синаптических везикул
Фосфоинозитиды (ФИ) составляют около 10% среди всех ли-
пидов мембраны и отличаются специфичностью в различных кле-
точных структурах. Уникальность мембран, определяемая ФИ, тре-
буется для направленного транспорта везикул из одного компарт-
мента клетки в другой. Кроме этого, они играют роль регуляторных
молекул в клеточной сигнализации, мембранном транспорте, дина-
мике нитоскелста, развитии клетки. ФИ выполняют эти функции
«притягивая» различные эффекторные белки к специфическим уча-
сткам мембран, где клеточная «миссия» подлежит исполнению. Ме-
таболизм ФИ имеет важную роль в синаптической функции, про-
цессы их фосфорилирования и дефосфорилирования коррелируют
с синаптической активностью (Di Paolo е: а1., 2004; Di Paolo, Dc
Camilli, 2006).
B состав мембраны вновь образованной эндоцитозом везикулы
входят фосфатидилнпозитольп (ФТИ), а для включения везикулы
в определенный пул требуется присутствие ФТИ-4Ф в везику-
лярной мембране (рис. 63 ц 24). Образование ФТИ-4-Ф осуще-
ствляется с помощью ФИ-4—кипа3. ФИ-4 киназа II о: (вортман-
нин чпечувствительный тип) в высокой концентрации присут-
ствует в мозге, особенно в синапсах и в околоядсрпой области
нейрона. В НО ФИ-4 кипаза 11 а связана (посредством пальми-
тилирования) с синаптическимн везикулахш (то есть ФИ4-кана-
за постоянный компонент везикул) и отвечает за продукцию ФТИ-
4-Ф в мембранах везикул. В составе этой киназа есть дилейци-
новый эндоцитозный мотив, с которым могут взаимодействовать
адаптерные белки, в частотности АР-3. Работа данного фермен-
та начинается, после того как фосфатаза сипаптояпии переведет
ФТИ-4,5—Ф2 в ФТ11, поэтому синаптнческие везикулы. включа-
ютцисся в определенную популяцию, уже содержат мембраны,
обогащенные ФТИ-4-Ф (Guo е: а1., 2003)„ Мембраны, содержа-
щие ФТИ-4—Ф, не могут служить платформами для присоедине-
ния клатриттового покрытия, однако могут взаимодействовать с
белками синапсиълами, участвующими в кластеризации синап-
тичсскпх везикул. B (росфорилирование ипозитольного кольца
фосфоинозитгкдов вовлечена также ФИ-4 кинааа 111 В (вортман-
пип Атувствительный тип), которая регулируется кальцием и
I
p�H� 175
контролирует освобождение нсйромедиатора (рис. 63 1124) (Wcnk,
Dc Сатин, 2004).
В процессе активности синанса везикулы подвергаются экзо-
цитозу, в ходе которого также происходят‘ локальные изменения ФИ
мембран везикул и A3 (см. Липиды мембран в экзоцитозе). После
экзоцитоза мембрана везикулы, обогащенная ФТИ—4-Ф, встраива-
ется в плазматическуто мембрану 110. Для успешного протекания
энпоцтттоза требуется, чтобы ноглотцаезтая мембрана содержала в
изобилии ФТИ-4,5—Ф2‚ поэтому после экзоцитоза из ФТИ-4-Ф ве-
зикулярного фрагмента мембраны образуются (DTI/I—4,5-CD2. Ключе-
вым ферментом синтеза ФТИ-4,5-Ф2 из ФТИ-4-Ф является ФИ— 5
киназа 17 (рис. 63 1124), которая регулируется ГТФазой /\rf6 и
протеинфосфатазой кальниневриттовт. Причем кальниневритт сно-
собен дефосфорилировать Ат1`6‚ облегчая ее активацию. В сайтах
энлопитоза кортикальных нейронов ГТФаза ARF6 переводится во
«включенное» состояние (TTCD-/\rf6) В ответ на синантиттескую ак-
тттвпостт) (Са-кштьциневритт зависимо) и затем ГТФ-АтГ6 стимули-
рует ФИ-5-киттазу17 и ассоциируется с элементами клатриного но-
крытия, что играет ключевую роль в инициации сборки машины
эндоцтттоза (Сгетопа, СатНН, 2001; Di Paolo ct а1. 2004). Наоборот,
гидролиз ГТФ и переход Г'1`(1>азьт в «пезаряженное» состояние (ARF6-
ГДФ) способствует разборке клатрттттовото покрытия (Budcr ct а1.‚
2004). В 110 гиппокамна кальцинетзрттн контролирует взаимодей-
ствие ФИ-З киназы 7661(основная изоформа фермента в мозге) с
АР-2. В НО 112 11 [32 субъединицы АР-2 комплекса напрямую взаи-
модействуют с ФИ—5-киназой 7661, что ведет к ее активации. В по-
кое ФИ-З-кттназа 7661 фосфорилнруется протеинкиттазой Cdk5, В
результате комплекс АР-2 - ФИ-З-киттаза 7661 не формируется. Вход
ионов Са через ттотенциал-унравляемые Са-каналы стимулирует фос-
фатазу кальциневрттн, которая цефосфорттдттхрует‘ ФИ-З-кигтазу 7661.
Впоследствии; ФИ-З-кттттаза 7661 соединяется с знлоцитозттьтм адап-
тсром АР-2‚ раснознавцтттат везикулярный протеин, оказавшийся в
нресинатттттческой мембране в сайте эидопитоза. Затем происходит
активация Ф11-5-кттттазы 7661 , которая осуществляет „локальный син—
тез ФТИ-4.5-Ф2 только в сайтах эндоцнтоза, так называемых
«cndocytotic hot spots» (рис. 63 1124) (Nukato—Kob21yz1shi et а1., 2007).
Клатритт, взаимодействуютций с несколькими регионами [32-субъе-
диницы. в том числе и с оккунируемым CI>PI—5—1<1111:131)‘1’1. может при
политиерттзатнттт вытеснять ФП-З-ктнтазу на края покрытия, где ею
синтезируются ФТИ-4„5-(172, к которым крепятся новые АР-2 и ис-
176
кривлятоптис мембрану протеины (Тлтептап е1а|., 2009).
(DTI1—4,5—CIJ2 регулируют все этапы эидоцитоза и реииклттро-
вания синаптттческих везикул (рис. 63 1124), а удаление (росфотиди-
литто3тггол-4,З-бифосфатгов (Ф'ГИ—4‚5—Ф2) из поверхностной мемб—
раны полностью нарушает формирование покрьттьтх клатрином ямок
(Zoncu ct а1.‚ 2007). Прикрепление адаптерньтх белков (АР-2, АР-
180) и их ютатрттн-ттолимеризующая активность определяется ФТИ-
4,5-Ф2. Для инвагьтттаттии мембраны и отделения покрытой клатртт-
ном везикулы в ходе эндонитоза требуется взаимодействие с эпси-
на‚ эндофттлина, амфифизина синдапин, динамина с ФТИ—4,5-Ф2.
На заключительных стадиях эпдоцитоза происходит дефосфо-
рилирование ФТИ—4,5-Ф2 до ФТИ (рис. 63 Ц24). Возможно, быст-
рое превращение ФТИ-4,5-Ф2 в ФТИ случается уже в шейке эндо-
цитозной ямки и контролирует наряду с динамином реакцию отде-
ления везикулы (Liu ct а1., 2009). Разбора клатринового покрытия
связана с массивным дефосфорилироваттием ФТИ-4‚5-С1>2 фосфата-
зой синаптояттиттом до ФТИ. Мьтши с нокаутом гена синаптоянтттта
1 умирают вскоре после рождения, в результате серьезных невроло—
гических нарушений и увеличения уровня ФТИ-4,5-Ф2 в мозге.
Существует строгая зависимость между функционированием
синаптоянина и активностью Arf ГТФаз. Как было сказано ранее в
НО синтез ФТИ-4,5-Ф2 с помощью ФИ-4- и ФИ-З-киназ ттредпте-
ствует эндопитозу синаптиттеских везикул. ФТИ-4,5-Ф2 стимулиру-
ют рял GEF —белков (факторы обмена гуаниловьтх нуклеотидов),
которые облегчают переход малых ГТФаз (например, ARF —- АДФ
рибозилируемьтй фактор) во «включенное» состояние. ARF6 и ФТИ-
4,5-Ф2 сипергично активируют белок WASP, который запускает по-
лимеризацию актина, что может способствовать отрыву везикулы
от плазматической мембраны и ее транспорту вглубь НО (Wenk, Пе
Camilli, 2004). Кроме того малые ГТФазьт в активном состоянии свя-
зьтватотея с компонентами ттокрьттия (АР-2, клатрином) (Goldberg е:
211., 1999) и ферментами (фосфолипаза Д, ФИ-4-киназа, ФИ-З-китта-
за), усиливающими образование (DTI/I—4,5-(D2, что совместно етто-
собствует быстрой компоновке клатриттового покрытия на мембра-
не (рис. 64) (Wcnk, Пе Camilli, 2004). Таким образом. замыкается
положительная обратная связь между уровнем ФТИ-4,5-Ф2 и ак-
тивностью малых ГТФаз АКР-семейства. В качестве «размыкателя»
Данного контура выступает (рострататза синаптоянин. которая акти-
вируется ФТИ-4,5-Ф2 (возможно, и АКР-ГТФазотт) и переводит‘
ФТИ-4,5-Ф2 в <DTH (Сгетттопа, Пе СаппНт, 2001).
112
А KO-LLIEFIEDOHW Б
к мембрана
клиент
Надю д т Ё: * V
АТФ __ . ,-- _ ауксипин
. г“ . г " ‘“‘ J
АТФ И фдомвн
V Ф кпатрин / покрытая `
' ‘v. клатрином
д Am CBfi3b|BalOLLlVM Beam n ‘д
домен У а
by I
правильная „$75
конформация А “mp,”
_ауксилин 1
РИС. 60 Ц2 1. Шаперон Hsc 70 u его значение в эндоцитозе (Young et а1.‚
2003; Meimaridou et а1., 2009; Xing et а1., 2010 с изменениями).
А — Клатрин с искаженной структурой (клиент) связывается ко-шапе-
роном, который «представляет» его шаперону Н5с70. Шаперон соединяет-
ся с клиентом, а J -ДОМ6Н ко-Шаперона стимулирует АТФазную активность
(АТФ гидролизуется до АДФ и фосфата) Hsc70. B результате происходит
прочное взаимодействие клиента с Н$с70. Впоследствгш АДФ И клиент от-
деляются от Н5с70. Клиент может подвергаться нескольким циклам связы-
вания и освобождения перед достижением им правильной конформации. Б
— Разборка клатриновой решетки. Ауксилин присоединяется к клатрину в
составе покрытия. Затем К ауксилину крепится Н5с70, который с неболь-
шой силой взаимодействует и с клатриновой трискелией. J -ДОМ6Н ауксили-
на запускает гидролиз АТФ Шапероном, в результате Н5с70 наЧгШает креп-
ко соединяться с клагрином и последний диссоциирует от мембраны вези-
кулы (вместе с Hsc70). B цитоплазме Н5с70 отпускает клатриновую триске-
лию, которая может заново участвовать в эндоцитозе. В - Реконструкция
клатринового покрытия, связанного с молекулами ауксилина (красный) и
Н$с70 (зеленый), на основе данных электронной криомикроскопии. Слева -
вид снаружи, справа - вид в разрезе.
ц22
‘К’ КААТРИН с динамин
.‘. _ спираль
АР 2 динамина
. эпсии )
-0- H5670 r НИТИ актина
" зндофилин ._ ауксилин ё
у синаптоянин ‚д; ..- . в
,, .
= › =b=-
—-› Ъ_ д
›
I амфифизин 1- 9"’ п ‘ь г я O‘
I
Ё
Е}
1 2 3 4 5
КААТРНН _
АР-2 _
эпсии ,
амфифизин _
зндофилин
ь
динамин
ауксилин
Hsc70
синаптоянин
Рис. 61 1422. Этапы и протеины клатрин-опосредованного быст-
рого типа эндоцитоза синаптических везикул (Зефиров, Петров, 2009).
Сначала на пресинаптическую мембрану, обогащенную ФТИ-4,5-
Ф2 «высаживаются» Молекулы эпсина (1), которые облегчают последу-
ющее присоединение к згому участку адаптернь1х комплексов АР-2 (2). а
также белков АР-180‚ Eps15 (не показаны). Образовавшийся белковый
ансамбль привлекает трискелии клатрина (2) и стимулирует их полиме-
ризацию в решетку (3). Одновременно, под влиянием эпсина (3), а затем
эндофилина, амфифизина (4) везикулярная мембрана искривляется, что
ведет к формированию глубоких ямок с клатриновым покрытием (4).
При участии амфифизина белок динамин полимеризуется и образует
узкий спиральный воротник (5), сдавливающий перешеек между ямкой и
остальной мембраной. При затягивании воротника везикула отделяется
(6). После этого покрытие удаляется: клатриновая решетка (6) — шаперо-
ном Н5с70, а адаптерные белки (7) —— фосфатазой синаптоянином, кого-
рая привлекается к везикуле амфифизином. Направленная полимериза-
ция актина способствует перемещению везикулы (8). Представленная
модель существенно упрощена.
Ц23
покрытая
везикула
_. ______
покрытая
IV
СИНаПТИЧеСКаЯ
везикула
K Rab:
клатрин
/K
Rab5 ранняя /I‘ @Cj�
Я эндосома r‘
n ОЗДНЯЯ
эндоцитозная Raw эндосо
везикула
Rab9
рециклирующие \
R3174 ЗНДОСОМЫ Rab11
и
Ы
транс-Гопьджи Комплекс
Рис. 62 1423. Везикулярный и эндосомальныъ? транспорт и Rab
белки (Schmidt, Haulcke, 2007).
Белки синаптических везикул И ассоциированные с ними липиды
поглощаются клатрин-опосрсдованным эндоцитозом. После снятия по-
крытия, некоторые эндоцитозные везикулы сливаются друг с другом или
с существующими ранними эндосомами (органеллы с кислой средой,
служащие главными сортировочными станциями белков). Известно три
пути транспорта поглощенных прогеинов из ранних эндосом: 1) они мо-
гут быстро возвращаться в состав синаптических везикул, 2) перемещаться
в рециклирующие эндосомы, 3) направляться в поздние эндосомы и ли-
зосомь1 для деградации. Рсциклирующие эндосомы, переадресовывают
белки на поверхность клетки. Подробнее в тексте.
Ц24
— ФТИ
-— Фти-з-Ф
— ФТИА-Ф
— оти-4.5-Ф2
-— ФТИ-3.4.5-Ф3 _
поздняя
эндосома у
P��� xnampuuoeoe покрытие
_ ‘а Ф ����
ои-з-к ���� а
ФИ-З-К А " \
кпассическая г” @ �� О Б '-“"°‘ep“'°'
эндосома —-. 6 a
`____——
О ФИ-З-К Ф!
Фил-к A
CPM-_5;L( QC Q
I
ФИ -4-K
Фт в синаптические \"7
i
a
` ���� 1 _ _ ΠΠdeanxynbl a
n. ._ ���� O ���� .... .. о
еж довод „и --
активная ЗОНЗ
сома нейрона
'-....-г
Рис. 63 и24. Фосфоинозитидные циклы u рециклирование синап-
тических везикул (DeCamilli, Takei, 1996; Wenk, De Camilli, 2004;
Rohrbough, Broadie, 2005, Зефиров, Петров, 2010, с изменениями И до-
полнениями).
Варианты рециклирования синаптических везикул. Справа - си-
наптические везш<улы образуются посредством однократного клатрин-
зависимого почкования (а) либо с плоской поверхности мембраны -
быстрый эндоцитоз (А), либо из цистерн (энДосомо-подобые структу-
pm), частично или полностью потерявших связь с поверхностью клетки
- медленный (объемный) эндоцитоз (Б). Слева - рециклирование проис-
ходит с участием эндосомальной сортировочной станции (В). При этом
происходит двукратное клатрин- зависимое почкования везикулы (от
плазматической мембраны (а) и от классической эндосомьп (6)). При-
чем рециклирование может быть не завершено, если образовавшаяся
везикула направляется в сому нейрона. Ш - фосфатаза синаптоянин.
ФИ-киназы подчеркнуты. Подробнее в тексте.
177
Фостатиднтлттнозитол-(рошратьт, содержащие остаток фосфор-
ной кислоты в 3 положении инозитольного кольца, играют важную
роль в выборе «судьбы» образованной везикулы н связываются с
белками е PH, FYVE И РХ „доменами (рис. 63 п24). ФТИ-З-Ф обо-
гатцеиьт эндосоматтьные мембраны, z1(DTH—3,5—<I>2 вовлечены в био-
генез поздних эндоеом и втультивезтткуляриьтх телен. Последние мо-
гут ретрограцно транспортироваться в тело нейрона, где участвуют
в регуляции экспрессии генов. Не случайно, синтез ФТИ-З-Ф су-
синаптоянин 1
9
клатриновое покрытие ‘H
ARFGEF v цитоскелет
AEF › фосфолипиза D › Ёросфатидная А
. кислота
V -› 4 а
ФИ-4-киназа ФИ-5-киназа =
v
v v
ФТИ ' P ФТИ-4—Ф P ФТИ-4‚5-Ф2 -- >
Рис. 64. I7().703Ic11n1e,v7bmmnem'1,<z обратной c'8;13L1.wc.9/c()y ГТФп-
3017 /1RFu (D774-4,5—CD2 в эпдоциптозе (Стетопа, Dc Cami1li,200I с изме-
неттиямтт).
Некоторые из :)(1)<1>c1cr0poB/\RF являются ферментами, синтези-
руютпими (DTH-4,5-(D2 (в частности, ФИ-Б-киназа, (I>H-4-r<m1a3a,<1)0c-
фолттттаза Д). Появление значительных количеств ФТИ-4,5-<1>2 на мемб-
ране не только регулирует актиповый питоскелет, белки ‘эндонитоза,
но и привлекает из Цитонлазмьт сонержатпие РН-ломсн факторы обме-
на гуаниловьтх нуклеотидов - GEF. Эти факторы стимулируют переход
неактивной ARF ВО включенное состояние АКГ-ГТФ, которая направ-
ляет метаболизм фосфотитозитилов в сторону синтеза CDTI1-4,5~£I>2. (`и—
наптояптттт 1 . ,1c<1)0c(])0pu.'1upyr()umii (I)TI~I-4.5—(D2 действует как главный
вьтклточателт, представленной связи.
@��� ч‘ хг®
@��� ее „ямам завет-а
178
‘я:
тцестветито возрастает под действием стимулирующих выживание
нейронов трофических факторов, которые активируют ФИ-З-ктттта-
зы. Вьтделятот‘ 3 класса ЦЗИ-З-кттттаз млекопитающих. Ферменты I
класса в качестве главного субстрата используют (DTI/I—4,5-(D2 H ак-
тивируются реиепторнымтт тирозиикттттазттаттт (подкласс IA) или
сцепленными с (Дж-белками рецепторами (подкласс IB). (DI/I-3 кина-
зы II класса фосфорилттрутот ФТИ и также могут бьттъ активирова-
иы внеклеточными стимулами. Класс Ш представлен у людей од-
ним фертиетттоат hVps34. который имеет высокую активность даже в
покоящихся клетках и свячьтватегся с ГТфазкэй Rz1b5 B ранних эндо—
сомах, где cm1're';npye'rCDTI/I—3—<D. ФИ-З-кттттазьт взаимодействуют с
‘такими синаптическимтт белками как дииамин, синаитоятттттт 1, си-
напситты, а также могут связываться с клатриттотзым покрытием.
Предполагается. что образование ФТИ-3‚4,5-Ф3 и”: ФТИ-4,5-Ф2
посредством ФИЗ-кттназьт способствует протекаиито варианта эн-
доцтлттоза, наиравляютцего вновь сформированные везикулы в эн-
досомы (рис. 63 1.124) (МсСгеа, Dc Сатин, 2009). <DTI/I—3,4,5—CD3
синтезируются в течение нескольких секунд после активации
ФИ-З киназьт и взаимодействуют с адаптериьтми ттротеинамтт и с
белками, содержащими PII (pleckstrimhomilogy) домен, такими
как фактор обмена гуаниловьтх нуклеотидов для АтГГТФаж ФИ-
завиеимая протеинкиттаза 1 (PDKI) Н протеинкттттатзгт В.
Таким образом, протекание везикулярньтх циклов сопряжено с
циклами фосфорилттроваттття-дтесросфорттттттроваттия ФИ. Вновь сфор-
мированная эндоцтттозом везикула содержит ФТИ, которые фосфо-
рилируются до ФТИ-4-Ф‚ благодаря чему везикула может включиться
в везикулярный пул. подвергшаяся экзоиитозу везикула встраивгь
ется в иресинатттическук) мембрану, затем из <DTI’I—4—<D везикуляр-
ного мембранного фрагмента синтезируются ФТИ-4,5—Ф2. Это не-
обходимо для клатрии-оттосредованного эндошттоза, однако впос-
ледствие осуществляется дефострорттлттроваттие <I>TI/I~4,5—CD2 до (БТИ,
что требуется в ходе разборки клатрииового покрытия. Кроме того
иревратиеттъте ФТИ-4‚5-Ф2 в LDTI/I—3,4.5—<D2 во фрагменте везику-
лярной мембраиьт после экзоиитоза, по II€pC,’1‘)IIf10IlHT030M направ-
лет везикулярную мембрану в классическую зидосому, из которой в
процессе клатрттн-зависттмого почкования могут обратзктвьтваться ио-
вьте сииаитттческтте везикулы (рис, 63 I124).
ё 179
Роль холестерина мембран в зндоцитозе
синаптических везикул
Ранее мы уже указали на важную роль холестерина мембран в
процессах экзоцитоза синаптических везикул. В наших дальнейших
исследования была обнаруженная необходимость холестерина мем-
бран синаптических везикул для протекания эндоцитоза, в то вре—
мя как холестерин пресинаптической мембраны обслуживает про-
цесс экзоцитоза (Петров и др. 2009). Нами был использован метил-
Б-циклодекстрин (МЦД- 1 MM), ВЫМЫВЗЮЩИЙ холестерин из мемб-
ран (рис. 65); в использованной концентрации МЦД удаляет 20%
холестерина мембраны НО. В своем исследовании мы исходили из
следующих положений. Аннлицируя М1 [Д в покое (рис. 65А, МЦД1)
или при очень редком раздражении мы экстрагировали холестерин
нреимутцсстветтно из плазматической (нресииатттической) мембра-
ны НО. Присутствие МЦД при длительной высокочастотной ак-
тивности приводит к вымыванию холестерина и из мембран синапт-
тических везикул (рис. 65А, МЦД2)‚ Действительно, при массив-
ном экзоцитозе, мембранные фрагменты синаптических везикул
встраиваются в пресинантическую мембрану, достаточно долго кон-
тактируют с окружающей средой и могут быть подвергнуты дей-
ствию МЦД (Зсфнров и др. 2008; Pctrov ct aI., 2008).
Экстракция холестерина из нресинаптической мембраны при-
водила к примерно двукратному уменьшению захвата красителя (рис.
65). Однако эти данные нельзя рассматривать как следствие угнете-
ния зндоцитоза везикул. Уменьшение захвата красителя объясняет-
ся снижением примерно в двое экзоцитоза синаптических везикул
(количества освобожденных квантов медиатора) при высокочастот-
ной активности, которое было обнаружено нами в электрофизиоло-
гических экспериментах (Нетров и др. 2009). Другими словами, в
этих условиях эидоцитоз не нарушен, и полностью возвращает встро-
ившийся в ходе экзоцитоза мембранный материал везикул обратно
в НО, восстанавливая популяцию синаптических везикул до исход-
ного уровня. Экстракция везикулярного холестерина очень сильно
(в 12 раз) снижала загрузку красителя, что свидетельствует о блоки-
ровании зилоцитоза. Следствием блока энлоцитоза явилось накоп-
ление мембранного материала везикул в плазматической мембране,
повлекшее изменение морфологии светящихся пятен и расширение
нервных терминалей (рис. 65).
180 @I��
А
а ш I .25
контроль 23 идиш: v
6
МЦд 1 ;.';,m~..: I iv
""'.£s£'3E,'.Sl.I. "" "
МЦД 2 2-:1.m~,r @��� д,
.................... 0���
HO
120 1
80
I
АО
контропь мцд1 мцд2
Рис. 65. Значение .х’олесп1ерина в эндоци/позе синаптических вс-
3m<_v.r1 нервно-мышечниги синапси ‚тягучики (Петров и др. 2009 с изме-
нениями).
А — схемы экспериментов: контроль (а), МЦД 1(б) и МЦД 2 (в).
Черный прямоугольник раздражение 20 имп/с - 3 мин. Время аппли-
кации FM 1-43 (СПЛОПЛЮЯ линия) и МЦД (пунктирная линия). Подроб-
ное объяснение в тексте. Стрелкой показан момент регистрации флуо-
ресценции. Б — изображения участков НО. В - интенсивность флуо-
ресценции НО.
В мембранах синаптических везикул доля холестерина дости-
гает 3О-4О% от общего содержания липидов (Takamori et 211., 2006).
Роль везикулярного холестерина в ходе зндоцитоза может быть свя-
зана с функцией холестерина по поддержании) нормальной текучес-
ти (гибкости) мембран. Так, например, изменение жидко-кристал-
лического состояния мембраны вследствие удаления ионов Са из
внеклеточной среды нарушает процессы зпдопитоза (7.cfirov ct 211.,
2006). Устранение холестерина из мембран может препятствовать
искривлении) мембраны в покрытую клатрппохт почку (Subtil е: ul..
��S� 181
1999). Не исключено, что холестерин, взаимодействуя со сфинголтт-
гшдами, может органитовьтвать в мембранах сннаптических вези-
кул микротюменьт, подвижность компонентов внутри которых (на-
пример. ФИ или белков) сильно ограничена (в наших исследовани-
ях 20101; такая возможность была подтверждена). Это может пре-
дотвратить смешивания специфических белков синаптичеекой ве-
зикулы с протеинами плазматической мембраны. а значит, упрос-
тить сортировку и эндошттоз везикулярной мембраны. Участки мем-
браны, обогащенпьте холестерином и ФИ, способны связывать и ак-
тивировать многие белки, вовлеченные в эндопитоз и репиклиро-
вание сипаптических везикул (Ла ct aI., 2006). Уменьшение содер-
жания холестерина в мембранах наблюдается при некоторых нсйро—
дегенеративных заболеваниях (например, Ньюмап-Пик типа С бо-
лезнь), в этом случае сше до массивной гибели нейронов в ЦНС
наблюдается угнетение рециклирования синаптических везикул
(Hawcs ct al., 2010).
Фосфорилирование белков в ходе
эндоцитоза
Протеннкттттазьт могут контролировать все этапы эндотпттоза,
поскольку тиногие белки, входящие в состав машины эндопитоза
обратимо in vivo фосфорплируются (Korolchuk, Banting, 2003; Mousavi
ct 211., 2004). Причем в очищенных препаратах покрытых клатриноьт
везикул идентифицирована киназная активность, благодаря присут-
ствию, по крайней мере, 3-х протеинкиназ - казеинкиназьт 2, G-
ассопиированпой протеинкиназьт и ассоциированной с адаптерами
киназы 1. Все события фосфорилирования в ходе энлоцитоза мож-
но классифицировать на ингибирующие образование покрытых клат-
рипом везикул («негативное фосфорилирование») и на облегчаю-
шие сборку клатриттового покрытия («позитивное фосфорилиро-
ваиие»у
Большинство белков эндопитоза фосфорилируется одновремен-
но по нескольким аминокислотт-тьшт остаткам, поэтому степень фос-
форилирования белка различается в зависимости от условий. Пат-
терп фосфорилироваттия управляет функштонироваттием белков:
влияет на их активность, определяет выбор белками партера для
взаимодействия. В регуляции процессов эпдонигоза участвуют‘ спе-
цифичные наборы прогепт-ткпназ. отличные от задействованных в
„а .,,W.W_, . W
����
везикулярный
белок
д АР-2
н; кпатрин
‘ч’ QKZ.
K’. .G_Afl/___..
Q фосфат (+
а фосфат (-
покрытая
клатрином
везикула
K1
)
)
Рис. 66. Ат1одельрол1/ кпзеинкинигь/ 2 (CK2), циклин С-ассоции-
рока/иной п/ллпеинкинпвы 2 (CAK2) , u()m1m8/)—accomlu/)()(m/1/1017 ки-
‚чизы I (:1/lK—l)3K7ampmz-01z0cpe()(ma//H<).1I3H0u1;u1m)3e(rI()Korolchuk,
Banting, 2003 с изменениями).
Субъедттттина р2 АР-2 фосфорилируется G/\K (и/илн ААК) до
взаимодействия АР-2 с везикулярнымтт белками и остается в фосфо-
рилированножт состоянии до начала разборки клатринового покры-
тия. Отсоединснис кпатрина затхускает диссоциацию GAK Н AAK1 OT
'3un0un'ro3m.1x везикул, а также обеспечивает‘ доступ фосфатазы каль-
ципетзртттта к р2-субъспиттипе АР-2. В результате ‚тефосфортитироваттия
происходит‘писсопиапня AP-2 от нитонлазмагических доменов ве3и—
кулярттътх белков и ослаблению связи с CDTI/I-4,5~<D2 мембраны. Покры-
тые клатрином везикулы содержат‘ неактивную (ЁК2, при разборке но-
крытия торможение СК2 устраняется и СК2 начинает‘ фосфорпдтутро-
ватт, компоненты покрытия, переводя их в нсакт ивнос состояние. Ta-
KH.\1 образом. прецот вращается повторная сборка покрытия на мемб-
ране сформпрохзаттттотт тпдопптозттотт ве3ит<у:1ь1_ Посясдьутоптсе ‚тсфос-
форилътротзаттис этих компонентов покрытия в нпгозоле вотвратпает
им способность формироватт, клатрпновос покрытие.
экзоцнтозс. Это свидетельствует об относительной автономности
конгроглируютцих механизмов слияния и образования синаптичес—
ких везикул, что позволяет более точно настраивать временное со-
пряжение между экзо- и эндопитозом.
Негативное фосфорилироваиие характерно для динамина 1,
амфифизина 1 и 2, АР-18О, синаптоянина, зпсина, ер515. Эти белки
эндоцитоза носят коллективное имя - дефосфины, поскольку они
переходят в активное состояние после удаления остатка фосфорной
кислоты (дефосфорилировапия) (Cousin ct а1.‚ 2001). Так, фосфори-
лирование синаптоянипа 1 препятствует его связыванию с амфи-
физином. в свою очередь фосфорилированный амфифизин имеет
низкое сродство к клатрину и АР-2 (Slepnev ct а1., 2000). B 11OfI().TII1C-
IIHC K ЭТОМУ прикрепление остатка фосфорной кислоты к шарнир-
ному региону (х и B2 субъединиц АР-2 комплекса, уменьшает спо-
собность АР-2 взаимодействовать с клатрином. Относительно ди-
намина и его фосфорилирования этот вопрос разбирался при рас-
смотрении медленного (объемного) эндопитоза. Не исключено, что
фосфорилирование легких цепей клатрина (преимущественно LCb)
ингибирует полимеризацию клатрина (Cousin ct а1.‚ 2001). На роль
ферментов, осуществляющих негативное фосфорилирование, пре-
тендуют «minibrain» Kl/IHa3a (Dyrkl/\), казеин киназа 2, циклин-за-
висимая киназа 5.
DyrklA (Dual—specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase
IA) кодируется геном, расположенным в 21 хромосоме в регионе,
играющем ведущую роль в возникновении синдрома Дауна (при
данном заболевании синтез DyrklA явно увеличен). Dyrkl/\ может
связываться с эндофилином, тяжелыми цепями клатрина и присое-
динять остаток фосфорной кислоты к динамину 1, синаптоянину 1,
амфифизину 1. Фосфосфорилированньтй этой киназой амфифизин
1 слабее связывается C энлофилином. Если же Dyrk1A присоединя-
ет остаток фосфорной кислоты к динамину 1, или сразу несколько
фосфатных групп к синаптоянину 1(полифосфорилирование), то ука-
занные белки существенно менее «охотно» вступают в контакт с
амфифизином 1 (Murakami ct al., 2009). B итоге Действие данной
киназы приводит к ослаблению взаимодействий между белками ма-
шины эндоцитоза, следовательно, клатрин-огюсредованньхй эндо-
цитоз синаптических везикул замедляется.
Казеин кииаза 2 (СК2) - повсеместно экспрессирующаяся нс
зависящая от ионов Са и циклических нуклеотидов протеинкиназа,
которая в цитоплазме обычно постоянно активна. Особенно богат
СК2 мозг; причем работ‘осттособттость СК2 возрастает при стимуля-
Linn нейронов фактором роста нервов, ипдукции долговременной
потепциации в гиппокампс. СК2 обнаружена на синаптическьтх вс-
зикулах, mo особенно тесно связывается с сипаптотагминозт. СК2
действует на легкие цепи клатртттта, от и B2 субъединицы АР-З, ам-
фнфизитт, A1’~180, линамин, спнаптотагмттн (Нао ct 211., 1999;
Korolchuk, Banting, 2003). B целом активность СК2 угнетает форми-
рование покрьггьтх клатриттом везикул (Мотепо ct 211., 2009). В есте-
ственных условиях в интактных покрьгтьтх везикулах СК2 иттакти-
вирована за счет взаимодействия с ФТИ-4,5-Ф2 мембраны, однако
послс разборки покрытия ее работоспособность восстанавливается
п она начинает фосфорилироватт, белки эндотпгтоза (рис. 66)
(Кото1с1ш1< 61211., 2005).
Наряду с СК2 рс-фосфорилироваттие, тто крайней мере, четы-
рех дсфосфинов (динамина 1, амфнфттзгттта 1, ФИ-киттгтзьт 1y, синап-
тоянина 1) in viva может производить циклип-зависимая киназа 5
(cdk5) (рис. 66) (Tan ct a1., 2003, Lee ct £11., 2006). Субстратами для
cdk5 могут также выступать элементы цитоскелста, белки клеточ-
ной адгезии и вттугриклетоттпого везикулярного ‘транспорта, ттроте-
ины машин экзоцитоза (Sabin, Bibb, 2004). Деятельность cdk5 сти-
мулируется ее фосфорилированнем (сак-активирующей киназой
(САК), казеин-киназой 1, с-АЫ киназой, Гутт-киназой), хотя в не-
фосфорилированном состоянии активность cdk5 тоже высока. Это
связано с присутствием в цитоплазме специфических активирую-
щих cdk5 белков р35 и/или p39, которые после убиквитгтилирова-
ния быстро направляются в протеосомьт для разрушения до амино-
кислот. Причем фосфорилирование р35 со стороны cdk5 ЗНЭЧИТСЛЬ-
но облегчает протеолитическую деградацию р35, то есть существу-
ет отрицательная обратная связь, определяющая уровень активнос-
'rnc(1k5 (Suite et a1., 2003). Некоторые белки (в том числе СК2) могут
непосредственно связываться с cdk5 или р35 и иттгттбттровать актив-
ность cdk5 (Lim ct 211., 2004). Экспрессия cdk5 увеличивается в тече-
ние развития нервной системы, достигая максимума во взрослом
мозге. В период созревания нервной системы cdk5 локализуется в
телах нейронов, а у зрелого организма cdk5 преимущественно рас-
полагается в НО аксонов. При увеличении нейрональттой активнос-
ти возрастает количество cdk5 И р35 (Fischer cta1.. 2002).
После того как cdk5 фосфорилнрует дипамин его способность
взаимодействовать с белком сипдаттиттом снижается. а (росфорилтт-
рование синаптояпипа 1 0CJ1£l6.7I$1eT€1‘() З-тросфатазттуто актпвттость.
.. . . 5‘„
�u�� �u�� 185
оба фактора нега‘: ивно отражаются на гхрцюкгттвности восстановле-
ния синантических везикул с помощью объемного эндопитоза
(Anggono ct а1., 2006; Mani ct :1l., 2007). Действие cdk5 на синатггоя-
нин 1 приводит к ингибированию ет о взаимолеттетвия с зндофттли-
ном, при фосфорилированип динамипа сродство последнего к ФТИ-
4‚5-Ф2 уменьшается, в результате замедляется и быстрый вариант
клатрин-оттосредованного эндонтггоза (Lcc ct а!., 2004; Anggono ct
а1., 2006). После (фосфорилирования дтанной прогеинкттттазотт амфи—
физина, прикрепленного к мембране, связь амфифттзитта с мембра-
ной ослабляется (Liang ct 3]., 2007). Ингибирование cdk5 бЛОКИруСТ
повторные циклы эндопитоза, отражая необходимость деактттва-
пип белков эндоцитоза во время разборки клатринового покрытия
везикулы для их участия в новом раунде эндоцитоза (рис. 66) (Таи
ct а1._ 2003). В синапсах культуры гранулярттьтх нейронов мозжечка
рефосфорилироваттие белков с помощью этой киназы преимуще-
ственно контролирует медленную дорогу эндопитозгт, поскольку бло-
кирование c(lk5 избирательно прекращает захват флуоресцентного
маркера, вызываемый высокочастотной стимуляцией (Gareth et al.,
2007).
Массивный вход ионов Са в глутаматэргические НО гиппо-
кампа в течение эпизода высокочастотной синаптической передачи
стимулирует протеазу - кальнаин, которая быстро разрушает акти-
вируюшие cdk5 белки р35 и/или р39. Cdk5 частично инактивирует-
ca, И белки эндоцитоза освобождаются от ингибиторного влияния
cdk5. B итоге образование сипаптических везикул ускоряется и об-
легчается освобождение глутатиата в ответ на повторную интенсив-
ную стимуляцию. Это один из путей вовлечения кальпаина и cdk5 B
долговременную потенциацпто в тхтоэге (Goll et а1., 2003). С течени-
ем времени после первой серии высокочастотной стимуляции ак-
тивность кальпаина снижается, а cdk5 восстанавливается и она на-
чинает‘ рефосфорттлировать «отработавшие» андоцитозньте белки.
Позитивное фоефорплирование обнаружено в случаях тт2-
субъединицы АР-2, узлового домена тяжелых цепей клатрипа (этот
регион обеспечивает взаимодействие трех молекул клатрипа в трис-
келито), а также в оттределеттттьтх условиях для динамина. Так, LIGH-
ствтте па динамип протеинкиназьт С усиливает его ГТФазнуто ак-
тивность (Cousin, Robinson, 2001). Тяжелые цепи клатрипа фосфо-
рилирутотся гтротеитт киназамтт Згс-семейства в итоге полимериза-
ция клаттръттта на мембранах облегчается (Wilde ct а1.‚ 1999). В покое
связывающий везикулярные белки сайт р2-субъедитттттты АР-2 на-
186 §§ �$�� M
холится вдскттьттоги состоянии. а при фошрорилированъттт этой субъе-
пипицьп например, ацатттер-ассоттиттровашюй киназой 1 (AAKI,
представитель семейства Ark/Prk кииаз) или циклип С-ассопииро-
ваттной протеинкиттазой (GAK), оп открывается (Heldwcin е1 211..
2004). В результате увеличивается аффинность п2-АР-2 в 25 раз к
тирозин-соцсржатцттм знлопптозттьтм мотивам белков и в 4 раза к
<DTI/I—4,5—(D2 мембраны (Conner, Schmid, 2003). Позитивное фосфо—
рилиротзаттие протекает перец началом зпдоцитозгт синаптических
везикул и регулирует доступность адаптерных белков для участия в
новом раунде эндоцитоза (рис. 66).
ААК1 состоит из трех доменов: М-тсрмиттальттьтй серин/трео-
нип кипазттьттт домен, ЭРА-обогащенный участок и С-концевой, вза-
имодтсйствуюптитт с (х-гнтатттттттом регион, содержащий к тому же
ютатрин-связьтватотште мотивы (Conner, Schmid, 2002). Длинная форма
кипазьт AAKII. содержит на С-конпс дополнительпьтй клатртит—свя—
зыватотттий домен (СВП2), состоящий из множества мотивов„ взаи-
модействующих с клатрттттом с низким сродством. ААК1 и ААКН,
колокализутотся с покрытьтми клатрином ямками и взаимодейству-
ют с «ухом» (х-субъедптттицьт АР-2. При полимеризации клатрина
активность этих киназ увеличивается, в результате происходит фос-
форилированис р2 субъединицы АР-2, что способствует более силь-
ному связыванию АР-2 с везикулярными белками в местах сборки
клатрина (рис. 66) (Jackson е: a1., 2003; Conner, Schmid, 2003). В
целом деятельность AAK1 И AAKIL Kl/[H33 обеспечивает‘ более эф-
фективное поглощение везикулярных белков в хоце зндоцитоза, пре-
дотвращая их диффузию из сайтов зндопитоза (Motley et al., 2006).
ЦИКЛИН (Ё-ассоциированной протеипкиназа (САК) представ-
ляет из себя сложный белок, состоящий из М-коттцевого киназттого
домена, центрального томологичного тепзитху домена и С-терми-
нальпото J Домена, имеющего сходство с ко-тпапероттом ауксилином
и способного соединяться с птапсроном Н5с70 (поэтому GAK также
обозначают как ауксплин 2) (Greener et 211., 2000). GAK может не-
посредственно связьпзаться с клатрином и (х-адатттиттом АР-2 (рис.
66), участвовать в разборке клатриттового покрытия, выполняя роль
ауксилина (Umeda et 211., 2000).
Наряду с процессами фосфорилировапття в процессе эпдтоци-
тоза протекают‘ процессы цефосфорилирования белков, которые
опрепелятотся специфическими фос‹ратазамтт„ главной из которых
является кальцинетзритт. Этп процессы будут подробно освящены в
следующем разделе.
187
. ь
Кальций-зависимость эндоцитоза
Один из главных вопросов в механизмах регуляции эндоцигоза
— это роль ионов Са. Мы уже описали первостепенное значение
внутриклеточных ионов Са в процессе слияния везикулы при экзо-
цитозе. Что касается их роли в процессах эндоцитоза, то здесь не
все так просто. В некоторых исследованиях показана зависимость
эндоцитоза от уровня внутриклеточного кальция, в других - эта за-
висимость не была выявлена, а иногда обнаруживается блокирую-
щий эффект ионов Са на эндоцитоз (Зефиров, 2007).
Зависимость эндоцитоза от поступления ионов Са в двигатель-
ном НО лягутпки исследовалась с использованием яда наука черной
вдовы (black widow spider venum). Яд стимулировал экзоцитоз в от-
сутствие внеклеточного кальция. однако захват FM 1-43 (зндоцитоз)
наблюдался только при его наличии (СессагеШ, Hurlbut, I980). B сек-
реторных клетках с применением емкостного метода также проде-
монстрирована необходимость внеклеточного кальция для эндопи-
тоза. В тоже время процессы эндоцитоза могут продолжаться, если
внеклеточный кальций перестает действовать. В гиппокампальных
нейронах, захват FM 1 -43 не изменялся при удалении внеклеточного
кальция после начальной стимуляции в его присутствии (Ryan, 2001).
Используя мутанты shibirc, было показано, что процессы обратного
хода везикул после температурно-зависимого блока динамина не за-
висят от внеклеточного кальция. (Ramaswami ct а1., 1994). Анало-
гично, на нейронах миноги, кальций был необходим для запуска
процесса, но не для продолжения эндоцитоза после интенсивной
стимуляции (Gad at а1.‚ 1998). В исследованиях на ленточных си-
напсах было обнаружено, что увеличение внутриклеточного каль-
ция до микромолярных уровней с использованием ионофоров прн-
водит к блоку Эндоцитоза (Von Gersdoff, Matthews, 1994). В чашеоб-
разных синапсах Хелда повышение цитозольного кальция, наобо-
рот, приводило к ускорению эндоцитоза синантических везикул (Wu
et а1.‚ 2005). В работе Balaji И коллег (2009) продемонстрирована
прямая зависимость между уровнем внутритерминштьттого кальция
и эндоцитозом в гиппокампальных синапсах. Авторы предполагают
позитивное воздействие ионов Ca, входящих в НО при умеренной и
высокочастотной стимуляции, на количество функционирующих
сайтов зндоцитоза, то есть емкость эндоцитозного пути. Причем
увеличение концентрации внутриклеточного кальция не изменяет
скорость зндоцитоза отдельной везикулы. В НО грызунов Ca (точ-
188
пее его комплекс с кальмолулином) запускает все варианты эндопи-
'1‘0';a,a с увеличением входа ионов Са (при деполяризации) происхо-
дит постепенное переключение вариантов от клатрин-зависимого
эндоцитоза (с плоской [ховсрхности мембраны) к объемному до из—
бьггочного поглощения мембранного материала (эндоцитозньтй овер-
шут) (Wu ct а1., 2009).
Pm-. 67. Литография эпдоцтипоза в нервной тернии/спи кожно-
{ЪЦУдНННОЙ д1!1›!11«!ЦЬ1 .7/‘l?_}’lllKl/ flpll[)(13’.7ll‘lHbl)L'.3I(!l710dfl.X‘V8C’fIIIll(:'HIl/‘l 6’II}"I7I-
ptncvenmzmozi K()ll1{Cl{l1lp(1Z{llIl ионов Ca (Зефиротз и др, 2006).
Флуоресценция эндоцптозного красителя FM 1 -43 В одном и том
же участке НО при стимуляции экзоцхттоза кофеином (А) и гиперкали-
евым раствором (Б). Время экспозиции гипсркалиевого раствора - 40
мМ или кофеина-З мМ - 5 мин (такие концентрации вызывают одина-
ковое увеличение частоты МПК1 1- экзошгтоза. которое длится десятки
минут). Ниже представлен флуоресцентный профиль. По оси абсцисс
— расстояние, в мкм; по оси ординат - интенсивность свечения, в отн.
ел. Видно, что некоторые области НО (отмечены вертикальными пун-
ктирными линиями) не загружаются красителем под действием кофе-
ина, тогда как в гиперкалиевом растворе свечение появляется.
Источниками ионов Са для запуска энлоцитоза (также как и
экзоцигоза) могут служить внеклеточная среда, откуда кальций по-
ступает через 1потенциалзависимые Са-каналы, и энлоплазмати-
ческая сеть (ЭПС), содержащая Са-каналы рианодиновьтх рецепто-
ров, через которые ионы Са проникают в цитоплазму. Таким обра-
зом. чтобы значительно повысить концентрации) Ca B HO можно
189
ГР + БАРТА-АМ!
Б з
д; 0.3 1
С
Ё
Ё 0.2 1
Ф
Ш
U
Ё
8 0.1 1
ё 3 *
Ё
в
а
ё O0 Рингер гр гр+ ГР*
EGTA—AM BAPTA-AM
Рис. 68. Эффекты л1ш1бран011роника/0Ь1шх С`с1-буфер0вна эндо-
ципюз синаптическцт (газики (Зефиров, Григорьсв, 2008)
А - флуореснеплтия участка нервной термипали кожпо-груттитх-
ной мьппны лягушки после 5 минутной аппликации красителя FM 1 -43
B растворе Рингера. гиперкаггисвогхт растворе (ГР. 40 ММ), в ГР на
фоне действия EGTA-AM И BAPTA-AM (60 ,’vIV[H).KpL1(:I/ITC."II> захваты-
вался только при использовании гиперкалиевого раствора и гипсрка-
лисвого раствора на фоне пействия гиедлстпюго Ca — буфера — EGTA. Б
-~ средняя уштепспвътость свечения нервных термипалей.
либо дегхолярътзовать мембрану (например. с помощью гиперкаглие
вого раствора), либо активировать риаподиновгле рецепторы (на-
пример, кофепноги). С использованием красителя FM1—43 нами было
показано, что оба способа увеличения в1[утриклеточпотй когнхегттра-
цпи ионов Са стимулируют эпдоцитотз сипапгических везикул в дви-
гательном НО лягушки (рис. 67). В тоже время некоторые участки
НО загружгпотся красителем с испольковапгхем гиперкалиевого ра-
створа и не ‘загружаются кофеином. Это свидетсльсггвует о том, что
190
ЭПС не равномерно распределена но ходу терминали. Гипотетичес-
ки. в тех A3 около которых сильно развита зндоплазматическая есть,
она может служить дополнительным источником ионов Ca (рис.
67) (Зефиров и др, 2006).
B последнее время появились данные, характеризующие Са-
евязывающие сайты эндоцитоза синантических везикул в двига-
тельных НО. Оказалось, что топография и свойства Са-связывато-
щих сайтов эндоцитоза значительно отличаются от сайтов экзони-
тоза. Так, в работе Зефирова и Григорьева (2008) обнаружено, что
эндоцитоз везикул запускается ионами Са при активации низкоаф-
финного Са- связывающего сайта (рис. 68). Такой вывод был сде-
лан на основе анализа протекания эндоцитоза в условиях буфериза-
ции внутриклеточного кальция хелаторами, обладающими разной
скоростью связывания с ионами Ca, 110 одинаковой аффинностьто.
В условиях, когда НО было заполнено медленным Са буфером
(ЕСТА), эндоцитоз осуществлялся лишь немного слабее, чем в нор-
ме. Если же нервная терминаль содержала быстрый Са- буфер
(BAPTA), то признаки эндоцитоза синаптических везикул не были
выявлены, несмотря на сохраненную высокую интенсивность экзо-
цитоза (рис. 68).
Как уже было сказано быстрый Са- буфер (ВАРТА) резко умень-
шает Са-микродомен. Поэтому можно считать, что для инициации
эндоцитоза необходимы достаточно высокие концентрации каль-
ция, которые существуют поблизости от Са-канала. Следователь-
но Са- связывающий сайт эндоцигоза, также как и сайт синхронно-
го экзоцитоза в двигательном НО активируется Са-микродоменом
(Зефиров, Григорьев, 2008).
Не исключено, что эндоцитоз запускается особой разновидно-
етыо Са-каналов. Недавно, при изучении зависимости клатрин—опос-
редованного эндоцигоза синаптических везикул от уровня кальция
был идентифицирован белок «flower», мутации в гене которого из-
бирательно приводят‘ к нарушению эндоцитоза в нервно-тиытлеч-
ном синаисе плодовой мушки. При этом увеличение внеклеточного
кальция частично снимало функциональные дефекты у мутантов.
Поскольку структура Почиет-белка напоминает каншт, и у мутант-
ных мушек наблюдалась пониженная концентрация ионов Са в НО.
было сделано предположение, что этот белок является Са-каналом.
контролирующим (Зет-зависимый эндоцитоз (Уао ct а1., 2009). В ги-
гантских НО Хелда Бупргйпк-сайт Са- канала АЗ напрямую взаимо-
действует е АР-2, а вход ионов (Та. запуекаютцттйт ‘жзоцитоз, одно-
�N� _ W . \_ P3T� :: _ 19]
временно _\’IIpiiBil}1CI'CB>l'51.lB£1Hl1CM A1’—_’ с сннаптогатмтттттш, что об
легчает‘ ‘запуск '›тт,'1о11и'то'за сниаттгттчсских вешкул (Watun;1bc ct 111.,
2010).
Ф
ю
мс
Q .0
O „д
Интенсивность снсчстттгт. они. ел.
Рис. 69. Эндишнпоз сппиптичес/сих везикул в гиперки;111евь1.\^
pacm(:()pu.\'. a)()c'p.7I(‘uzmr.x‘ ионы Ca, Sr, Bu 113111 ��f�
А и Картины флуоресценции нервных терминалей кожно-гру-
динной мышцы лягушки при загрузке FM 1-43 B гиперкачиевом ра-
створе (40 MM-3 мин) содержащем ионы Ca, Sr, Ba или Mg B концентра-
циях 1,8 мМ. Такие концентрации вызывают одинаковое увеличение
спонтаиионого освобождения медиатора- частоты МПКП, экзоцито-
за. Заметно, что шрфектттвттьтй захват красителя происходит при ис-
пользовании только ионов Са, Ва или Sr. B - столбиковая Диаграмма
средней интенсивности свечения.
Свойства Са-сенсора эндоцитоза. были проанализированы в
слсдуютцехат исследовании (Зефиров, Григорьев, 2009). Оказалось
что Са-связьттзатотцитт сайт эндоцитоза активируется ионами Ва и
Sr, c наименьшей аффинностьто к последнему (рис. 69). Этим он
отличается от Са- связывающего сайта спонтанного экзоцитоза, чув—
сгвительного к ионам Sr, Ba и Mg (рис. 32) и синхронного экзоци-
тоза, чувствительного только к ионам Sr. Все это свидетельствует о
том, что в инициации экзо- и эндоцитоза участвуют разные Са-
связьтваъотцие белки . Elmo предположено. что Са- связывающими
сайтами экзоцитозгт (синхронного, асинхронного. спонтанного) мо-
1 92
тут быть разновттлттос т и cuHan'I'0'1‘aI'MIma, а ‘эндтоттитозгт кальмо-
дтулин. кальцинетзртттт, :›н‚1офн.'пттт (3ефпротз„ Гриторьстз, 2009; (ind
ct ;1l._ 1998; F,\'z1ns, (fousin, 2007).
B 11CH'l‘pilIIbliblX нейронах (`а-стимулттроваттттое Сам;кактьутолулитт-
зависимое ‚тефострорттлированис вероятнее всего ведет‘ т< активации
зилоцтттоза. Это бьтло выяснено при действии ппклосттортттта А. ко-
торьтй ингибирует Са/кадтт.молулин зависимую фосфатазу — каль-
циневрин. При этом не происходило захвата F.\/12- 1 О в нервной тер-
минали. хотя процессы экзоцтттоза не затрагивались (Marks.
Метанол, 1998). Как уже бьтло сказано, в НО было идентифициро-
вано несколько субстратов ‚тля кштьттиневртттта: динамин 1, амфи-
физин 1 и 2, синаптоятттттд menu и Eps 15 (дефосфиньт), каждый
из которых итраст роль в энлоцтттозе. При поступлении ионов Са в
НО происходит активация кальцинетзртттта, который быстро лефос-
форилирует ФИ-5-киттазу1у (при этом ее активность возрастает) и
белки эндтоптттознотт маппиньт, дефосфиттьт (Cousin ct а1.‚ 2001). что
ускоряет образование ‘эпдтоцтттозттьтх комплексов (Gundclfingcr ct 111..
2003, этапы е: 211., 2005). После окончания активности НО и сниже-
ния уровня кальция дефосфиттьт подвергаются рефосфоригтттрова-
нито соответствутоттттткти ттротеинкиттазамтт. Одновременно с запус-
ком эпдоцитоза кальцинсвртттт активирует белки, служащие сигна-
лом и о завершении эпцоцитоза. В частности стимуляция фосфа-
тазы синаптоянина способствует ускоренной разборке клатрииотзо-
то покрьттия и умсньщеттттто с тепени фосфорилирования фоефоино-
зитттдов мембраньт. Также кштьцииеврин способен активировать ка-
зеинкттназу 1, фосфорилируютттую Циклин зависимую киназу 5 (Lin
ct al., 2002), которая увезтичитзает‘ свою активность и начинает пере-
водить белки энлощттоза в «спящес» состояние после эндоцитоза.
Однако в некоторых условиях внутрттклетоътттьте ионы Ca мо-
гут не стимулттровать, а блокировать эндоцитоз. В работе Зефиро-
ва и соавторов (2006) с использованием эндоцитозттото красителя
ЁМ1—43 показано, что при коротком времени экспозиции (5 мин)
типеркадтттевого раствора -40 мМ или кофеина-З мМ (такие концен-
трации вьтзыватот‘ одинаковое увеличение частоты МПКП- экзоци-
точа, которое длится десятки минут) в НО появляются светятциеся
пятна. указывающие на итттеттсивттый захват красителя во вновь об-
разующиеся за счет энлоцтттоза везикулы. При более длительном
воздействии (I0 и 15 мин) светящиеся пятна не наблюдались. а ттти—
рина тсрминалей увеличивалась. что сви11е'гелье'твует‘ о блоке эндо-
цитоза (рис. 70). После окончания действия типеркалттетзого ра-
„д
Шпръпц ими
tI>.'x_\opcu1cmms1.mn.c,1.
т1Щттт !
Рис. 70. Флуоресценция днигиптельншч) НО лядуъикн при трех-
„ниндчпнол: действии гиперкшиевого раствора или кофеина при ann-
ликации 9/1()0z4un1o3/((220 Kp(I(,‘l!l71€.'l}l FM]-43 6 различные времен/иле
пролтежхтгпки (Зефиров и пр, 2006).
Сверху — схема н временной ход экспериментов. Пунктнрнымтт
стрелками (1, 2, 3, 4, 5) показаны временные промежутки экспозиции
FM 1-43: черным прямоугольником - время Действия гиперкалиевого
раствора (40 мМ) или кофеина (5 мМ). По оси — время, мин. Изображе-
ния участков НО: (а) -- гиперкалттсвьтй раствор; (б) — кофеин. Под a1 —
калибровка › 5 мкм. Средняя шггенсивность свечения участков НО (в)
и средняя ширина нервной терминалы (г). Светлые столбики -на фоне
действия гипсркалисвого раствора. заштрихованные - кофеина. По оси
абсцисс — 1, 2, 3, 4, 5 - варнантьт времени аппликации FM 1 -43; no оси
ординат на в - интенсивность свечения, отн. ед. на г - ширина термина-
лей‚ мкм.
194
створа или кофеина пятна снова ттоятзттялись, слсдоватеттт‚тто, блок
эндоцитозгт был обратимым. При более низких коттцентраттиях ионов
К и кофеина, а также при длительном высокочастотном раздраже-
нии (20 имп/с — 3 мин) блока эндоцтттоза выявлено не было,
бура.
д:
„..„„._„„‚ .
Ca P$��
Рис. 71. Модель блока энооциптозст высокий копием/иронией
ионов Си в области активной зоны анион/посол коры голов/когг; „ноз-
ги крысы (Cousin, Robinson, 2000).
Высокая плотность Са- каналов в АЗ обеспечивает запуск экзо-
цитоза синаптических везикул. С другой стороны, значительное и дос-
таточно длительное повышение локальной концентрации Са (Са-мак-
родомен) может блокировать процессы эндошттоза в окрестности АЗ.
В итоге эндоцтттоз протекает‘ вдали от сайтов экзоцтттоза, 1‘;1c плотность
Са- каналов низка.
Таким образом, длительное действие высоких концентраций
внутриклеточного кальция в ‚твитательттоги НО лягушки приводит к
обратимому блоку эндоцтттоза, при сохранении эктопитоза синап-
тических везикул, то есть разобщают эти процессы. Атталогичттьтй
ингибиторньтм эффект ионов Са на "эндоцитогз был обнаружен в би-
полярных клетках сетчатки золотой рыбки. Одной и’: каштттцтгтгур
мишени иттгттбттторттото ‘эффекта является дннамин 1. 'т.к.‚ микро-
195
лярные уровни свободного кальция блокируют активность 1 "ГФазьт
vans, Cousin, 2007). По всей видимости, разобщение зкзо— и эндо-
тоза может произойти только при массивном и долговременном
ступлении ионов Са в цитоплазму НО, которое в физиологичес-
x условиях случается редко.
IMé'] - 1.8 MM
Ca Sr Ba Cd Mg Мёд!)
„сход 1.5
I-°f 5
35 а:
$9, "E .
55:02 Ё
:5 s
о: О.
РФ s
33$ Э
Sm
u
О .. 1 ‚„
Са Зг Ba Cd Mg Me‘-0 Ca Sr Ba Cd Mg Me‘-0
Рис. 7 2. Роль (meK.'1enz0tuu.1.\' ()6'_}’X(:’(l,‘I(3HIT1Hhl.X‘ катионов в процесч
сах энд()ц11/п()3(1 синапп111ческих визиты (ZCfi rov et £11., 2006).
Вызванная кофеином загрузка FM 1-43 B НО нервио-хиьниечного
синапеа кожно-грудинттой мышцы лягушки нс зависит от типа двухва-
лстттных катионов во внеклеточной среде, но исчезает при их отсут-
ствии, А - Изображения окрашенных FM l -43 нервных терминалеи при
аппликации кофеина (5 мМ, 1 мин) в растворе содержащем эквимо-
лярныс (1,8 MM) концентрации ионов Ca, S1‘, Ba, Cd, Mg И в растворе
6c3;1Byx1s:L1cnT11bxx ионов. Б- Средняя интенсивность свечения (слева) и
тиирина (справа) нервных терминалей.
196
В тоже время физиологический блок эндоцитоза может слу-
читься в области АЗ некоторых синапсов, характеризующихся вь1-
сокой плотностью (‘а- каналов и высокой вероятностью их откры-
тия в ответ на пресинаптический ПД. В этом случае вход ионов Са
через множество близкорасгтоложснпых Са- каналов будет приво-
дить к экзоцитозу везикул и одновременно к блоку эндопитоза. В
рамках этих построений предположено, что эндоцигоз будет проис-
ходить в стороне от АЗ, где плотность Са- каналов мала, куда, по
всей видимости, смещается мембранный фрагмент, встроенной по-
средством экзоцитоза синаптической везикулы (рис. 71).
Исходя из представленных выше данных напрашиваются очень
интересные заключения о взаимосвязи процессов экзо- и эндопито-
за в НО. Действительно, эндоцитоз невозможен без начальной сти-
муляции экзоцитоза. Но экзо- и эндоцитоз сцеплены по той про-
стой причине, что они одинаково стимулируются входом внекле-
точных ионов Са через потенциал-зависимые Са - каналы. Однако,
хотя вход ионов Са первоначально объединяет процессы экзо- и эп-
доцитоза, высокий уровень ионов Са разделяет эти процессы. По-
этому, концепция о том, что зкзоцитоз одной везикулы ведет авто-
матически к эндоцитозу одной везикулы, может быть оправдана толь-
ко при определенных условиях (мягких параметрах стимуляции и
относительно небольших внутриклеточных концентрациях ионов С а).
Недавно нами было выявлено удивительное влияние внекле-
точных ионов Са на процессы зндоцитоза (Zefirov е: 211., 2006). B
экспериментах с использованием кофеина, который способен уве-
личивать внутриклеточную когтцентрациго ионов Са не за счет его
входа из окружающей среды, а за счет освобождения их из внутри-
клеточных депо, было показано, что для захвата красителя НО не-
обходимо присутствие в синаптической щели ионов Са (более
0,lMM) или любого другого двухвалентного катиона (рис. 72). Ис-
ключение двухвалентных катионов из окружающего раствора при-
водит K обратимому блоку эндоцитоза, при сохранении спонтанно-
го экзоцнтоза синаптических везикул.
На основе полученных данных нами была выдвинута гипотеза
о роли ионов Са в зндопитозе. Внеклеточные ионы Ca, взаимодей-
ствуя с липидами наружного монослоя мембраны, экранируют их
отрицательные заряды и переводят монослой из «жидкого» в «твер-
дое» состояние, способствуя зндоцитозу везикулы. Следовательно
(рис. 73), для успешного зпдоцитоза синаптическоёё везикулы необ-
ходимо совместное действие впе- и внутриклеточньтх попов Ca.
. 3+ ‚ _
( ‘-I U ( и `_
внутренний нпружпьци
Фа юные переходы
н цшпидшщ биспое
+ _
с:
жидкий
88888888
88888888 n
жидкий
’“"%ii'i‘x1am;> г
MW
крист ‘.l.‘l. I||'|ecImi'I
Pm: 73. Гип(1п1е.?с1р‹).711 ионов Са н :m()oz¢umo3e синатпической «azu-
Ky.’IbI (Zefimv е1а1.. 3006).
Справа - ионы Ca, действуя с одной стороны мембраны могут акра-
пировать отрицатоельньте заряды липидов н переводит» линилныгт Mom»-
слой из «жидкого» в «твердое» состояние, (рормируя искривление мемб-
раны. В центре и справа: а — Пресинаптическая мембрана после слияния
везикулы. Тонкими линиями показан встроенный фрагмент мембраны ве-
зикулы. Эллиисами со знаком —- показаны отрнцательньте заряды липидов
монослоя мембраны. Белые кружки - внутриклеточные Са-связьтватотцие
сайты эндоцитоза. б- Увеличение внутриклеточной концентрации ионов
(Га, ведет к активации внутриклсшчттых сайтов эндоцитоза. но при отсут-
ствии кальция во внеклеточной среде эндоцитоза не наб1но,тае'гся. в -Прн-
сутствие ионов Са во внеклеточной среде за счет экранирования отрица-
тельных зарядов мембраны. вызывает отвердение наружного монослоя и
ведет к небольшой изгибной деформации плазматической мембраны. Од-
нако, без увеличения внутриклеточной концентрации ионов (За эндоцитоз
не наблюдается. г — При увеличении внутриклеточной концентрации ионов
Ca И присутствии ионов Ca во внеклеточной среде происходит выражен-
ная изгибная деформация мембраны (1) и слияние мембран с образовани-
ем новой везикулы - эндоцитоз (2). д — В случае увеличения внутриклеточ-
ной концентрации ионов Са выше определенного уровня (толстые стрел-
ки) или его длительного действия наблюдается блокирование внугрикло
точных сайтов ‘зндоцитоза (черньле кружки).
198 ё
Эффект внутриклеточного кальция обеспечивается взаимодействи-
ем с мембранными рецепторами, а внеклеточного кальция ~« НССПС-
цифическим взаимодействием с липидами нлагзмггтътктескодт мембрсь
ны. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са выше оп—
ределенътого уровня ведет к блокированию энлоцитоза (рпс. 73). В
рамках этой гипотезы высказывается нредгтоложеттие, что ионы Са,
которые захватываются в везикулу во время зндоцитоза, обеспечива-
ют поддержание сферической формы синаптнчес кой везикулы, за счет
напряжения внутреннего монослоя мембраны везикулы (рис. 73).
Подводя итоги главы о роли ионов Са в зндоцитозе можно счи-
тать, что обратный ход везикулы включает ряд Са - зависимых и Са-
независимых этапов. Первый — Са-зависимый запускающий, вто-
рой — Са- независимый поддерживающий и третий -— Са - зависи-
мый ингибирующий (Зефиров, 2007). Запуск энлоцитоза кальци-
ем, по всей видимости, случается очень рано, и связан с активаци-
ей специальных Са-зависимых белков зидоцгттоза, запускающих цени
белковых и липидных трансформаций. На втором этапе процесс эн-
доцитоза может продолжаться. даже если ионы Са перестают дей—
ствовать. Финальная точка приложения ионов Са в регуляции эндо-
нитоза является ингибирование высокими внутриклеточными кон-
центрациями. Для успешного протекания эидопитоза везикул необ-
ходимо присутствие ионов Са в окружающей среде.
199
ГЛАВА V. Механизмы
транспорта везикул
Везикулярный транспорт. Мы разобрали механизмы участву-
ющие в процессах экзо- и зндоцитоза синаптическттх везикул. Но
для того, чтобы вновь образованная синаптическая везикула могла
повторно использоваться в секреции медиатора она Должна дви-
гаться в НО, включаясь в определенные везикулярные пулы и в ко-
нечном итоге транспортироваться к пресинатттической мембране для
зкзоцитоза (передвижению на короткие расстояния).
Кроме этого существуют специальные транспортные механиз-
мы на большие расстояния, обеспечивающие передвижение пред-
шественников сипаптических везикул (перемещения из около ядер-
ных структур, где они образуются, в НО), и «отработавцтих» си-
паптичееких везикул (из НО в тело нервной клетки). Наряду с си-
паптттческттми везикулами аналогичные механизмы транспорта от-
вечают за перемещение других мембранных всзикулярпых структур
в нейронах.
ТРЗНСПОРТ СИНЗПТИЧЕСКИХ везикул В HCPBHOM
ОКОНЧЗНИИ
АКТИНОВЫЙ ЦИТОСКСЛЕТ
Преситтаптттческитт транспорт синаптижтескттх везикул па ко-
роткие расстояния может осутцествляться с помощью нескольких
механизмов, важнейшим из которых является транспорт с иеполь—
зованттехт белка актина.
Структура актина. Основным белком, (формирующим цитос-
келет клетки, является крайне консервативный протеин - актип,
впервые вьтдезтсттттьтйт Щтраубогхт в 1948 1: В клетках актпп обнару-
живается в двух формах - G (глобулярттьпт) и F ((l)H6p1/If1JI§lp}{bII‘«'X) ак-
тпп. СЗ-акгптт (42 кДа) пмеет‘ грушевпцнуто форму с выступами п
тлубокиьттт щелямп на поверхности. В щели, целящей молекулу ак-
тппа пючтн на равные половины, расположены сайты связывания
пуклсотттлов (АТФ пдпт АДФ), попов Ca плп Mg (рпс. 74).
. ssso
CVGAOMEH” 3 субдомен 1
Рис. 74. T/)ex.wepm1;1 cmpykmypa.-uuuu.-1Ie/muea (ll\‘l}llIIl(1 (Kzxbsch ct
al., I990).
Показаны четыре субдомена актина. В центре впадины показан
нуклеотид (АТФ иди АДФ) н ион двухвалентного метгшла (шарик).
Полимеризация и разборка актина. Мономеры актина за счет
гидрофобных и электростатических сил способны объединяться в
микрофиламентьт (рис. 75), напоминающие две перекрученные нити
из «шариков». При этом гидрофобные выступы одной молекулы
соединяются со строго отгредецтенной частью другой молекулы, в
результате формирующаяся нить акгина имеет полярность. На ол-
ном конце филамента присоединение новых мономеров затруднен-
но (острый, медленньтй или минус-конец), а на другом - вероят-
ность «принятия в свои ряды нового члена» существенно выше (ту-
пой, огтеренный, быстрый, плюс-копен). Поэтому акгиновая нить
преимущественно удлиняется с износ-конца, а укорачивается с ми-
Ёё 201
нус-конца. В процессе полимеризации актина можно выдслт-тть две
стадии: сначала создается «затравка» (нуклеус) из трех мономеров
актина (пуклсацття), затем «наратпиватшс» нити протекает намного
легче. МсЦлттте;тЬт-т0с'тт› первого ‘этапа стаязана с исстабипьиосгыо
димсра актина (Клячко, 2000).
Тупой Н) конец р» Острый l—) конец
_/ * .
ч; - э г
‚ (+) �Yw� (—)
/xcxpmnu HOM Ускорение процесса
дНССОЦИ-Ёд ЦИИ
ФдАтофил и нам
l‘Pa:speaaHMe‘ нитей актина
Ф
G Т Д ‘“""L1M.xuua2a “ж”
*"—_ _‚ @@‹7т %‹.=а +@+oz%<.~o°
Ё ‚ЙПАБ AUX? F ¢oC,baTa3a
%AT¢hav.THH <.t?€§Afl<1>-P,-z:n<‘rnH ®A}J,~’I) акпт КдФДА/кофипин
Фосфс-рыли заданный . _
ФДА/Ко ипин й Прыфилин О р ‘пмоэьчн
Рис. 75. Динамика актина в me/rz1<c(I‘ycc1s. 2001).
Полимеризацття нити актина происходит за счет присоединения
мономеров к плюс концу. и более медленной диссоциации от минус
конца. Кофилтттт и тракторы деполимеризации (ФДА) ускоряют ра3бор—
mg Ракттттта с минус конца. Комплекс нкттттт-котрплтттт (или актин - ФЛА)
диссоциирует при фосфорнзтироватттттт кофидтитта (или ФДА) под дей-
ствием специфичной I.,l.\/I~Kun:131,1. ПРОФШШН облегчает‘ обмен АДФ
на АТФ в мономере актина. АТФ-актин носдте ‚диссоциации от профи-
лпна может встраиваться к пдпосчюнтту филаметтта пгпт вчаттмодсйство-
вать с т нмозттттом. устраняяст, из процесса сборки актиновьтх нитей.
Соединттться с Р-актиттом можсттолько мономср. предваритель-
но связавппттт АТФ. Впосдтедствтттт встроивнтттсся молекулы актина
тидрозптзутот‘ ‚АТФ 110 АДФ и остатка (росфорттотт кислоты и после
от ностттс:тт‚тткт доцнотт паузы актин получает возможность выбросить
202 4
фосфат из своего состава. В итоге на плюс-конце филамента распо-
ложены молекулы актина в АТФ-загруженном состоянии, тогда как
на минус- конце в отдельных молекулах актина обнаруживается
АДФ. Если принять во внимание менее прочное взаимодействие
АДФ-содержащих молекул актина с соседями (по сравнению с АТФ-
актином), то становится очевидным -- разборка Р-актина легче про-
текает с минус конца. В пробирке с достаточной концентрацией
АТФ нить актина постоянно разрушается с одного конца и удлиня-
ется с противоположного, совершается «бесконечная» монотонная
работа. In vivo циклические превращения актина могут значитель-
но видоизменяться, поскольку концы филамента часто «заняты» спе-
циальными белками (Гусев, 2001).
А
М-конеи С-хонец
Wasp
aw
rpm 5 ФЗ _
G белей ПршрилинАтн Arp2r‘3
Сигнал
мембрана
He:-xmenaa конформация Активная конформация 3)
Puc. 76. Структура Wasp и A/‘p2/3-Ko,un/Iexca (КЛЯЧКО, 2000 C
изменениями).
А- Изображены домены, связывающие ФТИ-4,5-Ф2 н другие
сигнальные молекулы ( 1 ), малые ГТФазы (2), профилин (3), мономер-
ный актин (4), Агр2/3 (5). 3- обогащенный пролином домен. Внизу по-
казана активация Wasp. Б --Агр2/3-комплекс из 7 белков: Агр2‚ АгрЗ и
пяти уникальных белков. Внизу - Агр2/3 комплекс запускает полимери-
зашпо новой нити актина, которая отходит от основной строго под
углом 70 градусов.
Ь 203
Ассоциированные с актином белки. На сегодняшний день
известно несколько сотсн актин-связьтватопптх белков, многие из
которых оказывают сильное влияние на полимеризацию актина
(Sankaranarayanan е: а1.‚ 2003; Bader ct а1., 2004). Группа белков, обо-
Значающихся как факторы деполимеризации актина ФДА (ADF, actin
depolymerizing factors), а также белок кофилитт при взаимодействии
с молекулами АДФ-актина на минус-конце филамента ослабляют
контакты между соседними мономерами актина, что ведет к укоро-
чению или разрезанию Р-актина на части (рис. 75).
Отделившийся (З-акгин остается связанным с ФДА или кофи-
лином. Только после фосфорилирования последних протеинкина-
зами (протеинкиназы в свою очередь управляются малыми ГТФаза-
ми) О-актин получает «самостоятельность» и может накапливаться
в клетке в мономерной форме. Однако для участия в полимериза-
ции требуется взаимодействие актина с низкомолекулярным белком
профиличом, облегчающим замену АДФ в тнели О-актина на АТФ.
В результате в клетке накапливается комплекс профилин-актитт-АТФ,
который под воздействием различных сигнальных факторов (изме-
нение степени фосфорилирования фосфоинозитолов, повышение
концентрации некоторых вторичных мессснджеров) разделяется, по-
ставляя актин-АТФ на сооружение микрофиламснтов. Часть моле-
кул «заряженного» АТФ актина передается от нрофилг-ча к другому
маленькому белку -—Б-тимозину, таким образом, актин-АТФ резер-
вируется на некоторое время (рис. 75).
Лимитирующей стадией в формирование нитей актина явля-
ется формирования «зародыша» нити из 3-4 мономеров актина (нук-
леация), поскольку зародыш, не успев соединиться с новым моно-
мером, может диссопиировать на составляющие. Комплекс Агр2/3,
состоянтий из 7 белков, 2 из которых похожи на актин (actin related
proteins), связывает минус-конец зародыша и препятствует его раз-
рушенито, что облегчает полимеризацию актина (рис. 76). Неболь-
шие белки семейства Wasp (Wiscott—/\ldrich syndrom proteins) / Scar
(Suprtcssor 01°cAMP receptor) могут связывать одновременно моно-
мерный актин и /\rp2/3, создавая отттимальньте условия («сбороч-
ную нлотнадку») для нуклеапии актина (рис. 76). Белки Wasp/Scar
взаимодействуют с полифосфорилированными формами фосфоино-
зитидов мембран, малыми ГТФазамтд протеинкиттатзами и профи-
лином. B покое Wasp / Scar протеины не активны. При появлении
на внутренней поверхности плазматической мембраны участков, со-
лержаптих фосфатидттзтиттозитол-4„5-бифосфа'гьт и активные малые
@" ее’
W в)
с? Актив (‘ЁГТФ-связывгающий
белок { сосет
5 Фосфорьэлированньзе
М A:p2"3 W Wasp ‘3’0*3¢“~‘“””"W~b'
Рис. 77. Mo/1eKy.mpm.Ie/uexaHu3MbI полимеризации: актина и deu-
жение синаптической везикулы (Гусев, 2001 с изменениями).
На поверхности мембраны везикулы синтезируются фосфорн-
лированные фосфолипиды и к мембране прикрепляется активирован-
ная малая ГТФаза (состояние 1). При взаимодействии Wasp/Scar с этой
«платформой», белок переходит в активное состояние (состояние 2) и
связывает Агр2/3 комплекс, который запускает [полимеризацию актина
(состояние 3). Быстро растущий конец взаимодействует с вспомога-
тельными белками (обозначены V И Z), прикрепленными к мембране
везикулы. Агр2/3- конец актиновой нити, упираясь в другую актино-
вую нить или мембранную структуру, толкает синаптическую везику-
лу.
ГТФазы (Cdc42, Rho, Rac), Wasp / Зсаг-белки «опускаются» на этот
регион, переходя в активное состояние, в котором оказываются спо-
собными взаимодействовать с актином и Агр2/3 (Клячко, 2000; Dillon,
(Боба, 2005). Таким образом, запускается рост актинового филамен-
та в направлении плюс-конца. В клетке для ограничения роста нити
актина с плюс-концом филамента соединяются специальные белки-
занлутпктт (тотптрук)тттис протситтьт). В некоторых случаях VVusp / Scur-
белки могут‘ активиротааттюя «усилиями» ‘только мальтх ГТфетз. а 321-
тем связьпзатт, Агр2/3 и крепитъ его к боковой поверхности уже име—
тощейея нити актина, где Агр2/3 комплекс запускает полимернзаь
нито новой нити, которая отходит от‘ основной строго под углом 70
градусов. Так появляются боковые ответвления актинового фина-
менга (рис. 77) (Клячко, 2000, Гусев, 2001).
покой активность
\ (;о{` L}
Ё f Ё
£9? 3‘g,v‘?;%‘5o‘~;§‘<’)t
д o<J_ со д _o
5'f§c:)-v:g“<5\>:»')AC-P‘-i§>.fi._.
‚ген ‘ .
...»:
I,
Рис‘. 78. Локализация!’ ак/пнни « пира/пых .11<¢2/1'/a/(mix (Dunacvsky.
C0nno1'.2O()O: Shupliakov 61211.. 2002).
A ч Участок ‚твнт аттельттотт нервной гермитталн лягушки. Cumm-
‘ГНЧССКИС везикулы помечены с помощью (рлуореснентттьтх антител к
белку SV2. а Р-актитт А- фштлоидиттохт е флуоресцирующей группой. Ь.
- Орт анитанття зон эндоптттоза в покое и при активносттт в ретикулостттт-
нальном спнансе миногн. Рециклттротъгттттте еннаттттяттескттх везикул со-
пряжено с разрастанием актинового итттоскелета в зонах зндоттнтозат
(периактттвньтх зонах).
Актттновьтй питоскелет и синаптическтяе везикулы. Актин —
олин из наиболее важных и втноготруъткттионалъньтх белков в экзо-
эттлотиттозттохт цикле синаптическттх везикул и широко распростргъ
нен в НО (рис. 78) (Brodin. 1999: Yurar ct 211.. 2005). Динамику акти-
на способны регулировать многие комноттетт-гьт машины ‘энлоттитоза
(ингерсектттн. еиннапин. линамин. энлофидтитт. синапгоятттттт. ам-
фифттзтттт). Мальте КЬо-ГТФа-зът (Cdc—42. Rae I . Rho/\). cboc(1)aTnm4nn—
H()'5H'I'0.'"lI~.I, тнаперон NSF (Badcr ct '.xl., 2004; Нутаи ct al.. 2006; Nunes
ct 211.. 2006). Обнаружены и обратные связи: влияние элементов пи-
тоскелегц на белки ')n,=1onn'ro's:1 n метаболизм фосфоиттозитилов ( Lee.
Dc (Хиппи. 2002).
перс. пвппженппе
"на хвосте копяеты"
покрытые
везикуль!
"Ограда" "Каркас"
83%: I - д‘
о .,s‘ ч 2 г’
_ I F-aucmu
o perymnopuue
2 4 мцлекдьачьи
Рис. 79. Роль актина в везикулярных процессах и рециюшрова-
нии синоптических ee3ur<y.*1(Sankaranarayanan ct al., 2003; Dillon, боба,
2005).
Варианты организации актиновых филаментов. 1 — образуют гу-
стую сеть, которая препятствует доставке везикул в область АЗ; 2 —
окружают группу везикул, предотвращая их диффузию за пределы дан-
ной территории; 3-- направленная полимеризация актина перемещает
(“толкает”) везикулу; 4 — актиновыс филаментьт служат “площадкой”
для прикрепления везикул (например, с помощью синапситков) в онре-
деленном месте. Подробнее в тексте.
Какую же роль выполняет актин в везикулярном цикле?
Актиновый цитоскелет может ингибировать сборку клатрино-
вого покрытия, образуя непермессивный цитоматрикс, который
разбирается перед формированием покрытой клатрином ямки
(Hutmer et al., 1998; Malacombe ct al., 2006). Кроме этого, ряд иссле-
дований полагают, что актиновая сеть способна образовывать «ба-
рьер» для перемещения некоторых везикул но направлению к АЗ и
207
«ограду», для концентрации везикул в 110 (рис. 79) (S21nk21r21n21rz1y21nan
е: а1., 2003), и в то же время формировать пути транспортировки,
по которым моторные протеины доставляют синаптические везику-
лы в A3 (Richards е: а1., 2004; Тоопеп е: а1., 2006). Актин может
участвовать в образовании глубоких клатриновых почек и уско-
рять их отщепление (рис. 79) (Nonet ct 211., 1999; Mcrrifield ct 211.,
2002). Это согласуется с обнаруженной у динамина способностью
(взаимодействуя с np0q)m1m1o.\i,Abpl, кортактином) организовывать
спиральный актин в шейке везикулы (Ochoa е: а1., 2000; Kessel е: а1.,
2001; Gray et 211., 2005; Mcrrificld е: а1., 2005). Также, актин строго
необходим для полноценного формирования вакуолей, цистерн (эн-
досомоподобньтх структур), эндосом и протекания медленного эн-
доцитоза после массивного экзоцитоза (Brodin, 1999; Richards ct al.,
2004). Присутствие в сайтах эндоцитоза актинового цитоскелета,
который сильно “разрастается” после синаптической активности,
предполагает решающую роль актина в продвижении везикул (и
эндосом) с периферии к центральным: регионам НО (рис. 79) (Richards
е: а1., 2004; Dillon, Goda, 2005; R17:/.011, Bctz, 2005). Причем переме-
щение везикул может осуществляться вдоль актиновьтх дорог с по-
мощью миозиновых и кинезттттевьтх моторов (Doussau, Augustine.
2000), и/или тютеханиззтотмт векторной полимеризации актина, когда
везикулы «толкаются» в заданную область (рие 77) (Mcrrifield ct
£11., 2002, 2005; Nuncs е: а1., 2006).
Синапсиньтгтвезикулярньцд
цикл
Считают, что синапсины служат молекулами, удерживающи-
ми синаптттческие везикулы в резервном пуле неподалеку от АЗ
(рис. 80). Такую функцию они выполняют благодаря связьтваттию
везикул друг с другом и с питоскелетом (1 lilfiker et al., 1998; Bonanomi
01211., 2005). Причем взаимодействие спнансинов между собой явля-
ется главным механизмом удержания везикул в кластере (Supliakov
е: al., 2002). Toma как актнповьтй цитоскелет формирует «ограду»
вокруг скопления везикул (Bloom е: а1., 2003). Идентифицировано
три гена синапситтов (1, ll И Ш), которые с учетом штьтерттатттвттого
сплайсинга дают десять изоформ белков- 1а, lb, На, llb, Ш a/b/c/d/c/
1‘ (lvlilfiker е: 211., 1999). (Зинапсттттьт включают Мжоттцевой «А» до-
мен, содержащий участок из 30 аминокислотных остатков, связыва—
208 Q
ющийся с фосфатидилсерииом, ФТИ и проникающий в гидрофоб-
ную часть мембраны; ктентргьльньтй - «С» домен, образующий комп-
лекс с АТФ и ионами Са, задействованный в формировании тетра-
мера синапсинов. В дополнение к этому «а»-изоформьт содержат
Оконцевой Е-домен, участвующий в объединении синапсинов в
димеры. Взаимодействие АТФ с С-доменом важно для стабилиза-
ции синапсинов в тетрамерной форме.
Mll0'5llll V
WM: Ё и Ф" в
Ca2*(‘.—\.\IJ\' ll
белки
"покрытия"
_ ‚и ч.‘
Рис. 80. Варианты участия актингтого цитоскеле/пи 11.11110311-
ни в nepe()rm.7/ceuuu и рециклировании синапт1Шеск11.\' «езикул
(Doussau, Augustine, 2000; Mcrrificld ct al., 2005 с изменениями и до-
полнеииязттт).
Векторная сборка актина (при участии WASP, Arp2/3) облегчает
иивагиттироваттъте (1) и отделение (2) везикулярной мембраны при зи-
доцитозе, а также транспортировку везикулы (3) вглубь НО. После от-
соединения везикулы от сипапсиъкиъого "якоря" (4), везикула “Humm-
ется" миозииовьлм M0‘r0p0M И доставляется в A3 (5). CAM - кальмоду-
лип, САМК II -A (Ia /Kil.-"lbMO;1)/JIHH зависимая протеипкииаза II, КЛЦМ
кииаза легких цепей миозина, Ф — остаток фосфорной кислот ы.
Ц2
белки. синтеаирующиеся в Kf'.'] 9°3“"Y"|=| И МИТШФНдРИИ |
и липиды упаковываются в ЁЁЁЁЁЁЁЁЁЁДЁО направлению
°m°""°B"'°?4'°':“:°c" ш кг Ix нервному окончанию l
в” к’ _‚ |Cl'10MOUlb|0 кинвзинов
ПОСТ СИНЁПТИЧЭСКИЙ
А M л/ ���� Hem) не вное
ЕЭЗИКУПЫ митохондрии ОКО ЧЗНИВ
он \
эпс кг
V/(/"‘ 1. сё: L3‘ = /
› Q” т „т :‚ п
\_—/ (б
ядро `�� аксон миепин
сома r\%1I:I3OC(§;JlI>l 7 I _—.
микротрубочки `�j� p��
перемещение везикул из нервного окончания
|
.*——. _
—— ф
в сому нейрона по микротрубочкам
посредством белка - диненина I
миепиновая оболочка
.
Б муж
(„а э:
>,\§}3)" т Ё;Ё—:Ё т
`ь^ I
КИНВЗИН
у;__:.:д/\ � ��
В
Amen" пегкие цепи
РЭТООГРЭДНЫЙ акте г н й
транспор, тяжелые цепи Tpg‘?‘c‘:1a.f“JT“
‘Р конец:
Рис. 84 1425. Аксональный транспорт.
А. - Везикулы, митохондрии, а также некоторые крупные белко-
вЬ1е комплексы транспортируются в НО вдоль микротрубочек с помо-
щью моторного белка кинезина. Б. — Эндоцитозные везикулы, эндосо-
мы, некоторые протеины могут доставляться в сому нейрона по мик-
ротрубочкам посредством белка Динеина. В — КинезинЬ1 передвигают-
ся по микротрубочкам в сторону их плюс (+) конца, а динеинЬ1 — по
направлению к минус (-) концу. ЭПС-эндоплазматическая сеть, КГ-
комплекс Гольджи.
А Б
по A110 О
\ Z 31 ` 4
1“ @5�� I "
D -> 1 р -› I `-> P2 I ` \
._ ,
.. .. I ,
а А J 4 ц 4 " ь
-J я! J J J C
J J д i Ф J J м б”
тттп K-
B
{—II lI—j
Фактор роста
jHAp1 г ‘АН-отказа ���
’ п
динеиновый < ‚д, Ч
комплекс у‘ а
незин-1
динактин<
Гантинпин-
протеин
Puc. 85 1426. Механизм перемещения белков-„иоторов по микротрубоч-
каш
А - Движение кинезина (Тихонов, 1999). Т и D — ГОЛОВКИ кинезина, с
которыми связаны АТФ и АДФ, соответственно. В состоянии 1 головка кине-
зина, не связанная с микротрубочкой, содержит молекулу АДФ, вторая го-
ловка, Контактирующая с микротубочкой‚ свободна от нуклеотидов. СвязЬ1-
вание АТФ второй головкой приводит к смешению первой головки (включа-
ющей АДФ) вправо (1-2). После диссоциации АДФ свободная головка свя-
зывается с микротрубочкой (2-3). При гидролизе АТФ и диссоциации фос-
фата головка, содержащая АДФ, отходит от микротрубочки (3-4). Б - Две
молекулы динеина соединены с везикулой и обеспечивают транспорт вдоль
микротрубочек (McGrath, 2005). Одна молекула динеина имеет две головки,
каждая из которых содержит «стебелек», соединяющийся с микротрубоч-
кой, Димер динеина может совершать более длинные «Шаги» по микротру-
бочкам, чем мономер динеина. В - Регуляция направления движения везику-
ПЬ1 белком I“a1-1T1z1Hr'roHa(Go1dstein et а1.‚ 2008). Белок Гантингтона связывает-
ся с динеином и динактином (ретроградным моторным комплексом), а так-
же с кинезином (антероградным мотором), с последним частично через НАР1
(Huntingtin-associated protein 1). Некоторые факторы роста (IGF) активиру-
ют Akt— киназу, которая фос форилирует протеин Гантингтона, в итоге усили-
вается ассоциация везикул с кинезином-1 и анТероградНЫй транспорт вези-
кул.
Ц27
„ ьнч‘ .,..~.-....s|-‘I-'1': _ _.sl-‘|'l'2 5|.-rn. SI-l'l" T
Р - " ‘ I
' i ' "" 5 .
д 3., до i am Ф -. и _ ‚д 1,4‘, W
д _ . Гд" ъ‘ ' I. _|_
. , , р
: 25 им '
Рис. 86 ц2 7. Участок септинового полимера человека (Sirajuddin
е: а1., 2007).
Кристаллическая структура гексамера септина, состоящего из мо-
лекул Sept2, Sept 6 И Sept 7. ССПТИНЫ взаимодействуют друг с другом через
ГТФа3ные домены, гибкие спираль-спиральные (coi1—coi1ed) домены ра-
диально отходят от продольной оси филамента. Полимеризация гексаме-
ров может происходить за счет их соединения «конец в конец».
( ‘питакспнн (‘пптакспп
SNAP25 Nedd5? SNAP25
CDCre|-1 ���� Коми. деке
комплекс ’)l\"¥0llIl’l‘0'HI
Экзоцитш
7
Прикрепление
ТАМР .
к нес-др
V.-\MP Rab?
B("Jlll\'_\'Il&l \
Puc. 87 ц27. Роль септинов в экзоцитозе синаптических везикул
(Kattrnann, Roth, 2001).
Слева: септин CDCre1-l/Nedd5 препятствует слиянию везикулы, свя-
зывая синтаксин пресинаптической мембраны, и таким путем, ингибируя
взаимодействие SNARE белков (синтаксина и УАМР/синаптобревина).
Справа: большой септиновь1й комплекс способствует прикреплению ве-
зикулы к сайту экзоцитоза.
B(".Illl\'} ЛЯ!
зерпныи
Рвцихпииующий
Роцикпирующий
':‹ рвннй
обнища-
РОЦИКПИ РУЮЩИЙ
Рис. 88 Ц28. ВезикулярнЬ1е пулы в нервных окончаниях различ-
ных синапсов (Rizzoli, Betz, 2005 с дополнениями)
А- нервно-мышечный синапс личинки Drosophila,
Б- гиппокампальнь1й синапс крысы,
В - нервно- мышечный синапс лягушки,
Г- мыши,
Д -чашеобразный (Calyx of Held) синапс крысы,
Е- синапс биполярной клетки сетчатки золотой рыбки.
Показаны размеры пулов, их взаимоотношения и смешивание
везикул между пулами (красные стрелки), а также восполнение пулов
при зндоцитозе. Размер кружков вишневого цвета указывают на отно-
сительное количество везикул в НО. Подробнее в тексте.
Речишииующий
Рецикпирующий
Рецикпирующий
209
В зрелых НО присутствуют в основном синапсины Ia, lb, IIb
типов (часть из них связана с синаптическими везикулами), кото-
рые составляют примерно 9% от всех везикулярных бслков (рис. 80)
(Fredc1‘i1<sc ct а1., 2004). У мышей, с нарушениями генов синапсинов
1 и / или П, практически не обнаруживаются кластеры синаптичес-
ких везикул, и количество везикул значительно снижено (Takei et
а1., 1995). В итоге страдает долговременная преситтатттттческая нлас-
тичность, пространственная память и поведение мышей, увеличи-
чается время рефлекторных реакций (Gitler е’: а1., 2004). Мутации
гена синапсина 1 у человека приводят к тяжелым неврологическим
проявлениям, включая эпилепсию и нарушения в когнитивной сфе-
ре (Garcia et а1., 2004). Синапсин III экспрессируется преимуще-
ственно в незрелых нейронах, где концентрируется в конусе роста
аксона‚ а по мере созревания клетки его уровень начинает снижать-
ся (Fcng et а1., 2002). Повреждение синапсина Ш не влияет на клас-
теризацию синаптических везикул и уменьшает синантическую деп-
рессию (Feng ct а1., 2002).
B нефосфорилированном состоянии, синапсины связываются
с синаптическими везикулами как димсры/тетрамеры, частично
через фосфолипил-связывающую активность, определяемую А-до-
меном (Hosaka, Sudhof, 1999). Дефосфорилирование синапсинов за-
висит от фосфатазы - кальциневрина. Фосфорилирование А-до-
мена синансина протеинкиназой А и Са/кальмодулин зависимыми
нротеинкиназами 1 / IV (САМК I/IV) ингибирует связывание фос-
фолипидов и приводит к диссоциации синапсинов, что наблюдает-
ся во время активности (рис. 80). В возбуждающих НО нейронов
гинпокахтна белок АЗ Piccolo может подавлять активность САМКП,
в итоге уменьшается фосфорилирование синапсина Ia и ослабляет-
ся доставка везикул в АЗ, следовательно, ограничивается освобож-
Дсние глутамата (Lca1—O1'tiz е: а1., 2008).
Синансин 1 может также фосфорилироваться в других сайтах
САМКН, митогетт-активируемой (МАР) киназой Ет1‹ и циклин-за-
висимой киназой. Фосфорилирование синапсина МАР-киттазой, ко-
торая активируется нейротрофическими факторами, глтококортико-
идами, снижает его способность взаимодействовать с актином. Та-
кое фосфорилирование наблюдается в покое и определяет количе-
ство не связанных с актином везикул (lovanovic ct а1., 2001). В гин-
нокамне высокочастотная стимуляция вызывает сильную и скоро-
течную активацию МАР-киназы в гигантских нресинантичсских ПО
мшистных волокон, после чего освобождение глутамата облегчает-
210
ея (ттостгетатиптсская гютеипттапия). („Звсрхэкстлреесия мутантных
форм синапситтов 1, которые не могут быть (росфорилированы МАР-
киназой, нарушает феномен увеличения вероятности экзоцитоза cu-
наптттческттх везикул после предшествующего эпизода высокочас-
тотной активности (Giachcllo ct a1., 2010). ОНОСрСДуСМОС глтококор-
т икоидакттт етресс-вьтзванттое улучшение памяти связано с усилени-
ем синтеза синапспнов 1 и их (фосфорилирования МАР-киназой
(Rcvcst ct a1., 2010).
Синапсин На играет плавную роль в организации резервного
пула синаптических везикул в глутаматзргттческих синапсах гиппо-
кампа мыши (Gitlcr ct а1., 2008). В развивающихся нейронах фосфо-
рилироваттие синапситта 1 пАМФ-завттсттатой протеинкиназой облег-
чает диссоциацию еинапситта от мембраны везикул, в результате
везикулы перемещаются на периферию аксональт-того конуса роста
и начинают активно рециклировагь (Bonanomi ct a1., 2005). При
переходе к зрелости в зрительной коре грызунов фосфорилирова-
пис синапсинов протеннкиътатзамтт А и (‘AMK II усиливается, что
коррелирует с увеличением интенсивности синаптической тратте-
мисеии (Scott ct a1., 2010).
Доставку везикул, распределенных в толще НО, в сайты экзо-
цитоза наряду с фосфорилированиеат синаисинов контролирует и
взаимодействие синаисинов с КВИ-З-киназотт 1 типа. CI/IH('lUCHH}>I свя-
зыватотея с ФИ-З-кттттазой и могут активировать ее, в результате
фермент способствует переводу части <ПГР1-4.5-Ф2 везикулярной
мембраны в форму <DTLI—3,4,5~CD3. (D1/1—3,4,5—(D3 связываются со мно-
гими белками нервной терминали (Ода-зависимая киназа 1, проте-
инкиназы В и С, (росфолипаза Су, профилин, динамин 1, синапто-
тагмин, миозин Х, AP—2, иейрограттитт, цитогезтттт’пт5ес7-1 )__ НСКОТО-
рые из которых регулируют работу питоскелега и вовлечены в дос-
тавку везикул в готовьти к освобождению пул. Например, цитоге-
mu. являющийся фактором обмена гуаниловьтх нуклеотидов для
ARF6, может взаимолействовать е белком, локализованным в АЗ,
гпипе13- 1, а затем активировать белок АКЪЪ, учаетвуютций в прай-
минге сипаитическттх везикул (см. роль липидов в зкзоцитозе)
(Cousin ct а|., 2003).
Кроме того, во время еипаптиттескотт активности Сииапситтьт
могут мпгрирова'гт› из области скопления синатггнческих везикул в
зоны чилоттттгоза, где облегчают разрастание актииового цитомат-
puma (Bloum cl а1., 2003). Сииапситтьт являются атенгамтт способ-
CTByI()ll[HI\‘H‘l H)/K.'IC1llUIH LIKTHHLI, B НЧ ПрПСу`Т`СН$ИС СННЖНСТСЯ K011‘
��#� › 211
цептрация С-актина и увеличивается 17-актина, то есть происходит
усиленная полимеризация микрофиламептов. Причем такой эффект
оказывает синапсин, связанный с везикулярной мембраной, но не
свободный (Valtorta et а1.‚ 1992). Более того, синапсины стабилизи-
руют Р-актин и связьтватот актиновые нити в пучки (Jovanovic ct а1.‚
2001). Также синапсины могут взаимодействовать с такими важны-
ми для эндоцитоза белками как эндофилином 1 и 3, амфифизинами
1 и 11, синдапином, ФИЗ-киназой, СгЬ2, профилипом. Связывание
амфифизипа с синапсином уменьшает способность последнего ус-
корять полимеризацию актина, а через взаимодействие с профили-
ном синапсин может включаться в комплекс профилин-динамин-
актип (Bloom et а1.‚ 2003). Предполагается, что взаимодействие си-
напсина с актином в областях эпдоцитоза играет роль в возвраще-
нии образовавшихся везикул в кластер. В Таламокортикальньтх си-
напсах синапсины 1/11 важны для рециклирования синаптических
везикул и поддержания синаптической передачи в течение высоко-
частотной активности (Kielland et а1.‚ 2006).
Таким образом, синапсины определяют количество доступных
для транспортировки в A3 синаптических везикул, способствуют
их мобилизации, участвуют в прикреплении везикул к сайтам экзо-
цитоза‚ а также в возвращении образованных эндоцитозом везикул
в пул.
Белки-моторы в движении
синаптических везикул
Белки моторы. Передвижение синаптических везикул, а так-
же других внутриклеточных органелл и крупных макромолекуляр-
ных комплексов происходит с помощью, так называемых, моторных
белков, принадлежащих к трем семействам: миозины, кинезины и
динеины. Миозины двигаются по актиновьтм трассам, а кинезины
и динеины используют тубулиновые «волокна». Моторные белки
(рис.81 ) присоединяются к мембранам c помощью белков покрытий
(протеины клатринового и СОР5 покрытий, епектрин), каркасных
белков (PDZ—;1oMcH содержащие белки). трансмембрахтиых белков
(Зуд-протеин. родопсигт), молекул малых ГТФаз (КаЬ-семейство),
или других моторных белков (миозин \/) (Klopfenstein ct а1.‚ 2000).
Некоторые авторы понимают под моторными белками и другие про-
теины (РНК полимсраза, л-экзонукзтеаза, субъединицы молекул ша-
перопов С1рХ и 115113). которые способны перемепкгггься по биопо-
Рис. 8/. Способен крап-
‚тет/Я.\шлею:'1›1;1/11›1х.и(п1п›р‹›«
c.w.1z6_1)<1//(1.111: (Klopfcnstcin cl
ul._2()00).
‚ _. Белки моторы соединя-
каркасные
‹ ‘f"°“ ются с везикуламтт через ма-
ЁЁ лые ГТФачьт. каркасные и
алаптерньте белки, а также они
могут присоединяться к дру-
wm тим белкамчиотстратм. accom-
Mm;'>iDr\ao:%M ИрОВЗННЫМ с везикулярной
мембраной.
Ггоаэг"
лимерамтт, в том числе нуклеиновым кислотам и полииептидака
(Hwang and Lang, 2009).
Миозиновьте моторы в нервном окончании. Специальная
труппа белков — немышечттьтх миозинов - используют актииовые
(рилаътетттвт в качестве рельс для передвижения (рис. 80). Мнозины
е помощью своего короткого «хтъоета» цепляют какие-либо грузы (в
том числе синаптическис вехикульт), а головные труппы равномер—
но «шагают» по нитям актина, гидролизуя АТФ (рис. 82). Мнозиио-
вые моторы обеспечивают «местный» транспорт‘ в определенных
регионах нейрона, содержащих хорошо развт-ттуто сеть актиновьтх
филаметттств (нервные ‘терминали, деидритный шиник, околоялср-
пая область). В НО присутствуют множество форм миозииотз, в том
__ числе П, IV,V,VI'rm1o1;(Bridgrnan,2004).
Один из наиболее изученных иредтегствтттедтетт этой группы —
миозин \/‚ который у тнхизотточттьтх ‘граисттортирует синаттттитесктте
Bc3m<y:n,1,u также другие ортаиеильт: гэлеметтты энцотт:та'з!\та'титтееко—
го регикулума в нейронах; хромаффт-тттньте гранулы в клетках иадв
иочечников (Vale, 2()O3;'I'z1kagis}1i ета1., 2005). :\4n0'mHVz1C21—3;usnc1/1-
M0 взаимодействует‘ с белками сииаиттттаескттх везикул еиттатттобре-
вином и еииатттокризитнтт, а также е белком АЗ еитттаксттттожт 1 /\.
Дефекты миозина \/а ведут к заболеваиътто (синдром Griscclli), ео—
ттрово›к;ии0п1емуея неврологичеекими еимтттомами. а в культуре neit-
ронов гиииокахита набдиолаегся угнетение спонтанного освобожпш
пия метпитторгт (Trinchcsc ct 211., 2003). B coo'1nc'1'c'rmm с дтаитиымтт
213
Рис. 82. Модель zzocnzyname/zhuoeo («u1aeame.'zb/1020») ()eu.7Ice-
ния миозина V.w.'1e1<0nunzmou;wc (Vale, 2003),
А- Две, содержащие АДФ «головки» димера миозина связаны с
актиновым филаментом. Из задней головки медленно высвобождает-
ся молекула АДФ (лимитируюнтая скорость стадия). Б - Вместо АДФ
из цитоплазмы привлекается молекула АТФ, что приводит к отсоеди-
нению задней головки от актина. В - Ведущая головка очень быстро
производит мах на 20 нм, в результате которого выбрасывает заднюю
головку вперед, что сопровождается гидролизом АТФ до АДФ и неор-
ганического фосфата. Г- Новая лидирующая головка выполняет «диф-
фузный поиск» мест связывания и взаимодействует, преимуществен-
но, с ЪЗ-ой но счету от головки-«нартера» субъединицей актина. Д-
Вскоре, новая ведуншя головка освобождается от неорганического
фосфата и переходит в АДФ-загруженное состояние. Натяжение, воз-
никающее между двумя головками, вероятно, может ускорять высво—
бождснис АДФ из задней головки. запуская новый шаг.
Semenova И коллег (2008), В то время как миозин V перемещает
везикулы в направлении плюс копна актиновой нити. происходит
рост актннового филамснта, увеличивающий дистанции) для «пу-
214
тешествия» мембранных пузырьков. Таким образом, перемещение
миозина V и полимеризация актина происходят одновременно. Ми-
озин V типа может непосредственно взаимодействовать с кальмо-
дулином, после чего приобретает способность соединяться с синап-
тической всзикулой через синаптобревттът и синаптофизитт. Связан-
ный с миозином V Caz’/1<a:n.M0z1yJmH более ‘эффективно активирует
САМКП, которая может фосфорилировать синапсиньт, в результате
везикула получает «свободу» (рис. 80) (Costa ct al., 1999). Интерес-
но, что при значительном увеличении уровня Ca" (до 0.3-0.4 мкМ)
кальмодулиът может вытесняться из связи с миозином Va, за счет
взаимодействия последнего с синтаксином 1А. В работе Watanabe И
коллег (2005), проводившими исследования на хромаффинных клет-
ках, была изложена следующая гиодель функционирования миозина
Va. Миозин доставляет по актиновьтм нитями везикулу в АЗ. Затем
в ответ на вход ионов Са миозин V соединяется с белком АЗ синтак-
сином, благодаря чему осуществляется прикрепление везикулы и
образуется БМАКЕ-комттлекс. Следующий Са-сигнал запускает сли—
янис мембран, а вииозгттт V отсоединяется от синтаксина. В процессе
зндоцитоза и возвращения везикулы в кластер участвует миозин \/1
- «реверс» мотор. Миозин \/1 транспортирует грузы (эндоцъггозттьте
везикулы) в сторону минус конца Р-актина вглубь НО. Миозип VI
изолируется из клеток в форме мономера, но в ходе соединения с
мембраной покрытых клатрином ямок или везикул (через адаптер-
пые белки ПаЬ2, $ар97) миозин VI, вероятно, димеризуется (Phichith
ct а|.‚ 2009). Во внутренних волосковых клеток мышей при мутации
миозина \/1 существенно нарушается рецикдтирование синаптичео
ких везикул (Roux ct al., 2009).
B НО нейронов шейного ганглия крысы преимущественно ло-
кализуется миозин НВ, который опосредует трафик сипаптическътх
везикул, а миозин \/а располагается главным образом в соме и денд-
ритах нейрона (T:1kag,ishi ct а1., 2005). Миозин П является основным
мотором в двигате:тьньтх НО плодовых мушек, и возможно, Хепорив,
мышей„ крыс и цыплят (Seabrookc е: 211., 2007, 2010). Управляются
миозипы ll THII21 киназой легких цепей миозина, ферментом. актив-
ность которого увеличивается при взаимодействии с комплексом
(Ё21—-кальм‹)ду:тин. (Росфорттлирование миозипов зтим ферментом за-
пускает мнознновьлгт мотор и последний приступает к транспорти-
ровке синатггическотй везикулы (рис. 80)(Douss:1u, Augustine, 2000).
Ё 215
Везикулярные транспортные
механизмы на большие
расстояния
Везикулярный транспорт на большие расстояния (нервное
окончание — тело нервной клетки и тело- нервное окончание)
осуществляется с помощью аксонального транспорта с исполь-
зованием микротрубочек.
микротрубочки — это один из ключевых компонентов ци-
тоскелета в эукариотических клетках, необходимые для поддер-
жания формы клетки, транспорта, митозов, внутриклеточной сиг-
нализации. Они представлены длинными белковыми полимера-
ми (рис.83). микротрубочки составлены из Гетеродимеров ос- и
[З-тубулинов (размеры 4х5х8 нм, 100 кДа). Это очень динамич-
ные полимеры, а их полимеризация точно регулируется в про-
странстве и во времени. Разнообразие функций микротрубочек
достигается несколькими путями: через связывание с различны-
ми регуляторными белками (MAP — ассоциированные с микро-
трубочками белки, например, динактин 1, Racl, MAP4); с помо-
щью экспрессии разных изоформ тубулинов (у человека 6 форм
о‹- и 7 [З-тубулинов), имеющих специфичное предназначение; а
также посредством некоторых посттрансляционньхх модифика-
ций (полиглутаминирование, полигликозилирование, фосфори-
лирование, ацетилирование и т.д.) тубулинов.
Полимеризация микротрубочек начинается с формирования не-
большого зародыша (ядра), это самая медленная стадия, которая обо-
значается нуклеация. Затем происходит быстрая сборка (Элонгация)
тубулинового волокна, при этом тубулиновые димеры соединяются
нековалтентньтми связями. Источником энергии для построения мик-
ротрубочек служит гидролиз ГТФ до ГДФ и неорганического фос-
фата, происходящий во время добавления ГТФ содержащего димера
тубулина к концу микротрубочки (или сразу после этого). Затем
неорганический фосфат диссоциирует от микротрубочки, а ГДФ ос-
тается связанным с тубулином. Конец микротрубочки, содержащий
тубулин, связанный с ГТФ или ГДФ и неорганический фосфат, ста-
бильный и не подвержен деполимеризации. Гидролиз ГТФ и после-
дующий выброс фосфата вызывает конформационттьге изменения
в молекуле тубулина, что дестабилизирует полимер и приводит к
укороченнк). Характерная для микротрубочек черта заключается в
216
их высокой динамичности: на каждом конце постоянно происходит
переключения между фазами роста и укорочения. На одном конце.
обозначаемым как илтос, процессы удлинения и укорочения проте-
кают существенно быстрее и интенсивнее, чем на другом, минус
конце (рис. 83) (Jordan, Wilson, 2004).
ииъэпруьомма ‘уч-Тупиковые
'elep(\,‘1W/I:Db
1‘srpr;"> am: за‘ е
сдърилдуюп up-rfiowy -
РИС‘. 83. Cnzpowmr)A111KpoIn;{)'60twI<.
r€'1‘L‘p0,lHMCpbl из молекул ос- и В-тубулиттов собираются в микро-
трубочку. микротрубочки образована из 13 протофиламенгов, в кото-
рых тубулиновьте гетеродимерьт располагаются по типу головка к хво-
сту. Каждая микротрубочки имеет так называемый плюс конец с лице-
вой стороной из В-тубулинов и минус конец на острие которого parame-
щаются молекулы (х-тубулътнотз. Подробнее в тексте.
Аксоны нейронов часто имеют значительную длину иногда бо-
лее метра, при этом они литиены комплекса Гольджи. Различттые
всзикулярные структуры, транспортируются по аксону быстрым ан-
тероградным и рстроградным аксональньтм транспортом (рис. 84
1125). Антероградтто, со средней скоростью 50-400 мм в день или
0.5-5 мкм/с, передвигаются везикулы, предшественники синацги-
ческих везикул, а также везикулы несущие белковые компоненты
нервных окончаний и АЗ, образованные из КГ; ретроградно ~ «от-
работанные» синаитиътесктте везикулы, эндосомы, лизосомьл. Мед-
ленный аксональньлй транспорт‘ используется для цереметценътя
цитоекслетгтых и цигозольттьпх белков с намного меньшей скорос-
"mm. Hp0T€HHbl. ассоциирутопциеся с нейротрттламентгшти и микро-
‘грубочкамът (тубулин, белок-таи, спектрин), траттснортируются со
скоростьъо 0.3 - 3 MM B день или 0.004-0.04 мкм/с; а цитозольиьте
бСЛКИ (НКГНН, K.‘l2iTpHH. ПИНСИН, ЦИНЦКГИП, ГНИКОЁПГГ11‘|ССКЪ1С ')H'%H-
мы) - 2 8 мм вдень или 0.02—0.09 мкм/с (Brown, ?.()()()).
217
Как переносчик везикул и органелл (митохондрий, лизосом,
зндосом, элементов эндоплазматической сети) может выступать мо-
торный белок - кинезин, который двигается вдоль микротрубочек
(рис. 84 ц25). Кинезин представляет собой димер из одинаковых
цепей, на одном конце которых располагается глобулярная головка,
соединенная со сравнительно длинным хвостом. Хвосты двух це-
пей переплетены между собой, а головки наклонены в разные сто-
роны, образуя «рогатину». Связывание и последующий гидролиз
АТФ головкой кинезина, а также выброс из головки АДФ и неорга-
лического фосфата сопровождаются перемещением кинезина вдоль
микротрубочки. Головки кинезина попеременно связываются с от-
дельными звеньями микротрубочек, что напоминает «шатание»
(рис. 85 1126). За 1 секунду кинезин делает порядка 100 шагов, пере-
мещаясь на 800 HM, при этом КПД подобного мотора достигает 60%.
В естественных условиях после присоединения к тубулиновым пу-
тям кинезин сразу начитает движение, а преодолев несколько мик-
рометров - отделяется.
В аксонах микротрубочки ориентированы преимущественно
плюс конном к периферии, а кинезины, как раз, приспособлены для
движения к плюс концу. То есть перемешают везикулы и другие
грузы из тела нейрона в сторону ПО (рис. 84 Ц25).
Предшественники синаптических везикул транспортируются
белками из семейства кинезинов 3 — Unc—lO4 y C. е1е3ап5,КП‘1А y
Дрозофилы и позвоночных, К1Р1А,К1Р1В0‹/[3, KIFIC y MJlCKOfIl/lTa-
E01111/XIX (Pack—Chung et а1., 2007; Hirokawa, Neda, 2008). Эти моторные
белки содержат РН (гомологичный плекстрину)-домен‚ способность
которого связываться с ФТИ-4,5-Ф2 важна для соединения с повер-
хностью везикул (Klopfenstein and Vale, 2004). «Путешествие» буду-
ших еипаптических везикул может дополнительно обеспечиваться
кинезинами, относящимися к семейству «обычных» кинезннов
(KIFSA, KIFSB, KIFSC) (Goldstcin е: а1., 2008). В гиппокамгталыгьтх
нейронах везикулы со строительным материалом для A3 ,7I0CTL1BfI$!-
1ОТСЯ на периферию мотором KIF5 В, который «хватает» такие вези-
кулы через белок сшггабулъян (Cal ct а1., 2007).
Транспорт везикул в НО регулирует белок Гангигтгтона, кото-
рый связывается как напрямую с кинезинами, так и через протеин
ПАР] (I Iuntingtin—ass0ciated protein 1). Некоторые ростовые факторы
(например, IGF — инсулино-гтодобгтый фактор роста), действуя на
сому нейрона,активируют Акг-киназу, которая фосфорнлирует про-
теин Гангинггогта. Это облегчает присоединение кинезипа к вези-
218
куле и стимулирует его деятельность в роли перевозчика транспор-
тных везикул (рис. 85 1126), B том числе, содержащих нейротрофи-
чеекие факторы, которые затем выделяются из пресинаптическнх
НО.
Другая группа белков —динеины — наоборот, организует транс-
порт в сторону сомы нейрона (по натнравлсттттю к минус - концу
микротрубочки) (рис. 84 1125). Молекула динеина, состоит из двух
головок с АТФ-азной активностью (на кончике головки имеется тон-
кий вырост - «стебелек», который прикрепляется к микротрубочке)
и хвоста. [и vitro их движения часто прерываются паузами. Таким
образом, динеины остаются привязанными к мпкротрубочкам в те-
чение длительного времени, а периоды работы перемежаются пере-
рьтвамн (McGrath, 2005). In viva опосредованное динеином движе-
ние корректируется большим адапторньтм комплексом o6o311al1a1o—
UH/IMCH как динактин. Динактин соединяет диненн е мембранной
везикулы или другой органеллы-груза и способствует однонаправ-
ленности движения к нлтос-коттцу. Одна двухголовая молекула ди-
неина развивает силу недостаточную для перемещения грузов и
может пассивно «гулять» по микротрубочке. с которой она неспе-
пифично и непрочно связана в неактивном состоянии. Поэтому ча-
сто несколько молекул динеина задействованы в транспортировке
(рис. 85 н26). При кооперации двух молекул димер динеина приоб-
ретает «устойчивость», вероятно за счет того, что когда одна моле-
кула не спеплена, другая взаимодействует с микротрубочкой. К тому
же комплекс из 2 (или 3) молекул динеина приобретает размер шага
на 8 HM бодытптй, нежели чем у одной молекулы динеина (Mallik е:
а1., 2005). Упомянутый выше белок Гантинггона связывается одно-
временно с дипеином и динакгином, и в нефосфорилированном со-
стоянии прогсиът Гантинггона способствует функнионированию
динеит-ютзого моторного комплекса (рис. 85 1126) (Goldstcin ct 211..
2008).
Сентины. Новые элементы нитоскелета и
везикулярного транспорта
Сентины представляют собой консервативное, недавно откры-
тое семейство ГТФ-стзязьтваюптих белков. которые были впервые
идснтифипированьт у дрожжей (рис. 861127)(Bycrs and G0Ctsch_ 1976).
В жизнсдеятсльттост и дрожжей эти белки необходимы в координа-
ции полярности мембраны и клеточном делении. Септииьт играют
219
важную роль в развитии мух и червей. Удаление генов септинов у
мышей ведет к многим аномалиям: при делеции гена Sept5 наблю—
дается уменьшение секреторной активности тромбоцитов, гена Sept4
— деформация и неподвижность сперматозоидов, нарушение гена
Sept9 легально на ранних стадиях эмбрионального развития. По-
вреждение экспрессии септинов у человека сопровождается рако—
выми и многими другими заболеваниями (Hall & Russell, 2004).
B геноме человека имеется 13 генов (SEPTl-13) септинов, каж-
лый из которых в результате альтернативного еплайсинга «рожда-
ет» несколько вариантов тканеспецифичньтх септинов (Hall el а1.,
2005). Септины состоят из полиосновного (из остатков основных
аминокислот) и ГТФ-связываюшего доменов. Биологическая функ-
ция септинов связана с их способностью собираться в полимеры (в
виде колец, спиралей пучков и сеток), которые могут формировать
каркасы (для прикрепления определенных белков) и барьеры для
диффузии везикул и крупных молекул (Sirajuddin et а1., 2007), Кир—
пичиком септиновых полимеров служит комплекс из трех разных
гомодимеров септинов (рис. 86 ц27) (Rodal et а1., 2005). Вероятно,
функции полимеров зависят от комбинации септинов в подобных
«строительных блоках». Некоторые септиновые полимеры (напри-
мер, ЗерЩ-содержание филаменты в клетках млекопитающих) чрез-
вычайно динамичные структуры, поскольку постоянно наблюдает-
ся быстрый обмен молекул септинов между цитоплазмой (свобод-
ное состояние) и септиновым (риламентом (включенное в полимер
состояние). Сборка и разборка септиновых агрегатов регулируется
непосредственно белками партнерами (в том числе малыми ГТФа—
зами типа Cdc42, Rho), фосфорилированием протеинкиназами В,
С, Gl, a также присоединением подобной убиквинтину молекулы
(SUMO) K септинам (Хие е: а1., 2004; lto et а1., 2005).
Септины млекопитающих обнаруживаются как на внутрен-
ней поверхности мембраны, так и в цитоплазме, где колокализуют-
ся вместе с актином и микротрубочками, При этом сетттиновьте и
актиновые сети соединяются белком анилином. Более того сборка
септинов может происходит на пучках актина, выступающих в ка-
честве матрицы. Септиновые филаменты могут служить каркасом
для ассоциированных с актином и микротрубочками белков. в том
числе белков-моторов. Так, комплекс Sept2-SepI6-Sept7 взаимодей-
ствует с белком МАР4, что ингибирует связьтвание последнего с
микротрубочками (Кгетег ct а1., 2005). У нокаутных по Sepr4 МЫ-
шах значительно изменяется распределение кинезпнов (Kissel е: а1.,
220
2005). ССПТННЫ ассоциируются с биологическими мембранами. обо-
гащенными фосфоиноаитидамтт, посредством полиосновного реги-
она. '-)11/1 взаимодействия важны для (формирования в плазматичес-
кой мембране и мембране ЧПС микропометтов (области, в пределах
которых латеральная подвижность компонентов мембраны ограни-
чсна), и их «утдержаттия» в определенном регионе. Септины могут
связывать цитоттлазматттческтте хвосты интегральных мембранных
белков, ограничивая их латеральную диффузито ( Lucdekc ct a1., 2005).
В нейронах септины участвуют в направлении везикул к спе-
цифическим сайтам экзоцитоза, в процессах прорастания акеона и
сборки еинаиса, поэтому ими обогащены ирееинатттические НО
(Hazuka ct а1.. 1999).M1101‘1/1c септинвт колокалттзукггея и взаимодей-
ствуют е компонентами машины докирования и слияния (рис. 87
1127) (Vega, Нэп, 2003). Септин 4 присутствует как на мембранах
еинатттттттеекътх везикул. так и на пресинаптттческотт мембране. Сеп-
тины могут котттролироват 1. ДОСТУПНОСТЬ свободных SN ARE—6eJ11<oB
для их участия в экзоцитозе. Так. евявьтватттте в A3 Scpt5 со SNARE
белком еинтаксиноат 1, зависящее от фосфорилирования септина
Cd1<5. угнетает экзоцитоз (Amin е: a1.. 2008). Кроме того, септин 5
(CDCre1-1) котткурирует C NSF и (x—SN/\P за связывание со SNARE-
KOMIIJICKCOM l1OCJ1(:i)K3011Vl'1‘O38, что замедляет разборку «машины сли-
яния» птапероном МЫ‘ (Beites ct 111., 2005). Также Sept 5 образует
комплекс е белком синаптическгтх везикул синаптофттзттном. Sept}
способен соединяться с еинаптттчсскттвттт B631/IKyJ121M11,21B1‘1OI‘1/1I11l0-
кампа колокаттизуется с синаитофттзгтътовт и динамином 1. Следует
отговориться, что в нейронах мутации отдельных генов септинов
не приводят к значительивтхт нарушениями везикулярного цикла.
Вероятно это связано е широкой взаимозаметгяемоствю этих белков
и / или наличием дублирующих механизмов (Tsang cta1., 2008).MHO—
гие септиньт обнаруживаются во фракциях ттостеинатттичеекой плот-
ности. что указывает на вовлечение ееитиптэв в поетсинаитичеекие
функции. Пефиттит Scpt7, обнаруженного в шипиковом аппарате
дендритотз, 1‘1'$MCHS1C'I‘1/IX 1»1op(p(>.11u1‘111o(Xie ct 211.. 2007).
Таким образом в клетках млекопитаюптттх септины участвуют‘
в создании клеточной полярности. компартметггадтизаттиът (созда-
нии обособленных «отсеков» в цитоплазме, в пределах которых ог-
раничено передвижение везикулярных структур и макромолекул),
везикуляриом транспорте. регуляции актинового и тубулиново-
го 11“‚Ж`()СКСД1С‘Г21` процессах ‘жзо- и пшотптгоза (НаН . Russell. 2()O4).
(‘етттипы фортииругот уникальные сети. характеризутотциеся муль-
221
тифутткциотталтьностыо, внутренним непостоянством и динамичной
чувствительностью. Различные виды септинов связываются друг с
другом в гетероолигогиеры, которые в свою очередь формируют по-
лимерные структуры различного размера и состава, с которыми вза-
имодействуют многие цитозольные протеины. Сборка и реоргани-
зация септиновых филаментов происходят очень быстро и зависят
от сигнальных молекул.
222
ГЛАВА VI. Пулы синаптических
везикул, их свойства и пути
рециклирования
Везикулярные пулы. Некоторые синапсы работают «шепо-
том», другие «громко». Для эффективной передачи информации си-
нансами необходимо наличие определенного количества везикул. Это
количество колеблется в различных синапсах от нескольких сотен
до миллиона. Данная популяция везикул функционально не одно-
родна н может быть разделена на несколько пулов (рис. 10). Разме-
ры и взаимоотношения везикулярных пулов имеют решающее зна-
чение в процессах экзоцитоза синаптических везикул и везикуляр-
ного цикла.
Изучение везикулярных пулов началось с работ Birks и Maclmosh
(1961), выполненных на симпатических ганглиях кошки. Ученые по-
стулировали существование двух различных фракций освобожде-
ния медиатора: фракция, немедленно готовая к освобождению,
которая быстро (в течение нескольких раздражений) истощается при
высокочастотной стимуляции и резервная, «неохотно» участвую-
щая в освобождении медиатора. Позже Elmqvist и Quastel (1965), и
их коллеги получили аналогичные результаты при изучении межре-
берных мышц человека, обнаружив быстрое, двухфазное падение
амплитуды постсинантических сигналов при высокочастотном раз-
дражении. Было предположено, что в процессе высокочастотной
активации происходит восполнение везикул готового к освобожде-
нию пула за счет везикул так называемого мобилизационногопула
(рис. 10). B дальнейшем при исследовании различных синапсов
периферической и центральной нервных систем было сделано зак-
люченне, о существование в НО трех везикулярных пулов (гото-
вого к освобождению, мобилизационного и резервного). Характе-
ристики пулов обобщены в табл.3.
Готовый к освобождению медиатора пул составляет 2-5%
обшей популяции везикул, которые могут сливаться с плазматичес-
кой мембраной B ответ на 10-мс входящий Са - ток, короткий высо-
кочастотный залп ПД (5-15 импульсов), гипертоническую стимуля-
цию в течение 1 секунды (Sudhof, 2004; Rizzoli, Веги, 2005; Тоопеп
223
е! a1., 2006). Возможно, что после экзоцитоза везикулы этого пула
наряду с быстрым-клатрин зависимым эндоцитозом, в ряде случаев
способны использовать kiss—and-run механизм (Gandhi, Stevens, 2003;
Harata ct а1., 2006a). Везикулы готового к освобождению пула мор-
фологически обычно представлены докированными везикулами,
прикрепленными к пресинапгической мембране в области АЗ. Од-
нако не все докированные везикулы имеют одинаковую вероятность
вызванного, синхронного экзоцитоза (Веепегег, Rettig, 2006). B не-
рвно-мьтнтечном синансе лягушки некоторые прикрепленные к АЗ
везикулы не входят в готовый к освобождению пул (Rizzoli, Bctz,
2004). В чашеобразных синапсах было показано наличие быстрого
и медленного компонентов освобождения медиатора из везикул го-
тового к освобождению пула (Rizzoli, Betz, 2005).
B031/lKyJ1I>I второго (мобилизационного) пула включают от 5
до 20% всех везикул и находятся на расстоянии от АЗ, но в процессе
активности НО способны быстро перемешаться к сайтам освобож-
дения (мобилизация) и участвовать в экзоцитозе. Данный пул опре-
деляется во всех исследованных объектах за исключением биполяр-
ных НО золотой рыбки, где очень трудно установить такие нара-
метры стимуляции, которые не затрагивают резервный пул. Вероят-
но, данный пул на этом объекте не определен из-за использования в
большинстве исследований сильных стимулирующих воздействий.
В НО дрозофилы и лягушки существует тенденция к расположе-
нию этой популяции синаптических везикул на периферии общего
везикулярного кластера, «приттадлежащего» отдельной АЗ (Кнгопн,
Kidokoru, 1998; Rizzoli, Ве12, 2004). Транспорт везикул мобилизаци-
онного пула к сайтам экзоцитоза остается слабо изученным. Как
механизм мобилизации везикул в двигательном НО лягушки обсуж-
дается простая диффузия. При этом дисперсию («рассеивание»)
везикул от A3 может предотвращать решетка из пока не идентифи-
цированных нейрофиламентов (Gaffield ct 211., 2006). B соответствии
с этой точкой зрения понятно, почему нарушение актинового ци-
тоскелета в двигательном НО лягушки не влияет на рециклир()ва-
ние везикул мобилизационного пула (Rizzoli, Bctz, 2002; Richards ct
a1., 2004). Простая диффузия в качестве основного способа пере-
движения веех везикул обнаружена в лентовидных синапсах сет-
чатки (Holt ct 211., 2004). B I‘nnn()1<a.\1IIanbnbxx синапсах доставка ве-
зикул в A3 происходит преимущественно с участием актиновых
фнламентов и миозиновых моторных белков (.1ог‹1ап е1а1., 2005).
При умеренной стимуляции поддержание сингптгнчсской передачи
224
обеспечивается многократным использованием (рециклированием)
везикул готового для освобождения и мобилизационного пула, ко-
торые в этом случае восстанавливаются быстрым клатрин-опосре-
дованным эндоцитозом (Richards ct 211., 2003; Kavalali ct a1., 2006). На
этом основании эти два пула иногда рассматривают как один — ре-
циклирующий пул (Kuromi, Kidokoro, 2005; Rizzoli, Betz, 2005).
Третью, самую большую (80-90% всех везикул) популяцию со-
ставляют везикулы резервного пула, которые сливаются с мембра-
ной A3 только под действием высокочастотной ‚длительной (интен-
сивной) активности. Освобождение этих везикул идет при частоте
стимуляции более 5 имп/е в нервно-мышечном синапсе лягушки,
30 имп/с в двигательном НО дрозофилы, при продолжительном дей-
ствии гиперкалиевого раствора в чашеобразных и гиппокампаль-
ных синапсах грызунов (Rizzoli, Betz, 2005). Кроме того в НО гип-
покампа на фоне блокирования 621(D}/IJIOMI/IL1}/IHOMA] протонной помпы
при длительной низкочастотной (0.2 ими/с) стимуляции (10 мин)
освобождение медиатора происходит из везикул, входящих в состав
резервного пула. При этом везикулы рециклируют нормально, од-
нако не заполняются медиатором после экзоцигоза (Ikeda, Bekkers,
2009). Пока не совсем ясна природа механизма, запускаюшего ос-
вобождение везикул резервного пула. Для поиска ответа на этот
вопрос Kuromi и Kidokoro (1998) использовали температуро-чув-
ствительные мутанты дрозофилы, у которых процессы экзоцитоза
протекают нормально при комнатной температуре, а при 34 граду-
сах везикулы не могут образовыватъся с помощью эндоцитоза. Сти-
муляция при комнатной температуре приводила к экзоцигозу вези-
кул только из рециклируютцего пула, но при нарушении рецикли-
рования высокими температурами медиатор продолжали освобож-
дать везикулы резервного пула. То есть везикулы резервного пула
вовлекались в зкзоцигоз только после истощения мобилизационно-
го, рециклнруютцего пула. Однако другие работы, проведенные на
нервно-мышечном синапсе лягушки, продемонстрировали участие
везикул резервного пула в зкзоцитозе без предварительного оно-
рожнення рециклируюшего пула (Петров и др. 2008; Pctrov ст 211.,
2008).
Интересно отметить, что в двигательном НО лягушки актино-
вый цитоскелет избирательно используется только везикулами ре-
зервного пула в качестве пути передвижения (Richards е: а1., 2004).
По всей видимости, везикулы резервного пула скреплены друг с
другом и цигоскелетом белками синаггсинагигт (Doussau, Augustine,
225
2000). Поэтому важным сигналом для транслокации везикул резер-
вного пула к АЗ является массивный вход ионов Са, который сти-
мулирует Са-зависимьте протсинкиназы, освобождает еинаптичес-
кую везикулу от актина и запускает миозиновьте «моторы»
(Verstreken е: а1., 2005). В НО дрозофилы перемещение везикул c
ЭЛСКТрОННО-ПЛОТНЫМ содержимым (нейропептидами) к сайтам эк-
зонитоза запускает освобождение ионов Са из ЭПС (Levitan, 2008).
B НО млекопитающих везикулы резервного пула могут иметь
ограниченную возможность к слиянию, вследствие «недостаточ-
ности» молекулярной композиции везикулярной мембраны (мо-
дель биохимической гетерогенности везикул) (Aravanis et al., 2003;
Becherer, Кепи; 2006). Кроме этого было показано, что электрон-
ноплотные гранулы хромаффиттных клеток со временем «изнаши-
ваются» и теряют способность сливаться с плазматической мемб-
раной (Duncan е: а1., 2003).
Табл. 3 Обобщенные свойства трех основных пулов си-
наптических везикул.
Пульт везикул Готовый к Мобилизационный Резервный
осиобпщцияапо (рскккякццццлощй)
% от общего кол-на 1-2°/u I0-20% 80-90%
“ОДНИХ?! в НО
Местоиахожтенпе Цокиооиаиьл Разбросапть! но НО Ризбросаны по НО
Освобожцапотся в
Менее I сек при
Несколько сек
Десятки сек. минут
Арупшп иулами
исрсмстцтпналнъяе с
нсзикушмтт
рсиъяклирутотцсп о
ниш
1 шеи ис нысокочпс rm пой пысокохгцсттттттодг вьтсокочлстотт-той
?l[\'lHHl|UC'l‘H ИКТНПНОСТН ПКГНПНОКЛИ
Реииклир‹›ваиис Бёысджое (сек) Быстрое (сек) Медленное (мин)
Пгремсхпнваиис с Бьтстое -’vIc;1.'1cm:oc Медлсидлос
нерсиеннтнцннс с
резервным пулом
ДРУГИМИ BL"1Hi\'y'.'1-'ll\(H
HCp*.’MClllHBdHHU C
Мобильность в ПО
при покос
Hex. поскольку
цюкироваттьл
Высокая
Низкая (ньтсокая и
биполярных
кис: как)
226
ВВЗИКУЛЯРНЫВ ПУЛЫ В ШЕСТИ ВИДЯХ ХИМИЧССКИХ
синапсов
Большинство данных о везикулярных пулах получены при ис-
следованиях, выполненных с использованием разных методик на 6
объектах, составляющих широкую филогенетическую труппу: не-
рвно-мышечные синапсы личинки дрозофилы, лягушки и мьнни,
синапсьт культивированных гиппокамнальных нейронов крысы, ча-
шеобразньте синапсы новорожденных грызунов, синапсы изолиро-
ванных биполярных клеток сетчатки золотой рыбки. Не смотря на
различия этих препаратов, в каждом из них можно определить вьт-
шеописанныс три везикулярньтх пула (рис. 88 L128).
Нервно-мышечный синапс личинки дрозофилы. Терминаль
содержит около 87000 везикул, распределенных между 400 АЗ, то
есть на каждую A3 приходится примерно 200 везикул. В состав го-
тового к освобождению пула входят примерно 400 везикул (или 1
везикула на АЗ), а мобилизационного - 12000-16000 (30—40 на A3)
(Delgado ct a1., 2000). Причем, судя по данным (флуоресцентной мик-
роскопии, этот пул локализуется преимущественно по периферии
бутонов. Высокочастотная стимуляция (30 Гц) или потиещетттте в гн-
перкалиевые растворы приводит к экзопитозу везикул резервного
пула, который обнаруживается в более глубоких слоях бутонов (рис.
88 ц28). В покое или при низкочастотной активности рециклирую-
щий и резервный пульт смешиваются медленно. Рениклируютций
пул пополняется очень быстро в процессе стимуляции, в то время
как резервный восстанавливается медленно после прекращения вы-
сокочастотной стимуляции (Kuromi, Kidokoro, 2005).
Синапсы гиннокампа. В каждом синаптиттеском бутоне содер-
жится 100-200 везикул, обеснечиваюнтттх функционирование обычно
одной АЗ. В состав готового к освобождению пула, обеспечнватошетх)
секрецию медиатора в течение первых 2 сек стимуляпитт с частотой 20
Гц, входят от 5 до 20 везикул (Schilkorski, Stevens, 1997). .\/1o6n:m3aun—
онный пул включает 10-40 везикул и пополняется достаточно быстро
даже при интенсивной синантический активности. Возможно, это одна
из причин «неохотного» вовлечения в освобождептте медигтгора вези-
кул резервного пула, даже в условиях вьтсокоътастотттой стимулятштт
(Натата cl a1., 2006). Сметниваттис между резервным н ретнтклирутопннхт
пулами протекает очень MCJIJICIIIIO,T011121 как тотовьтй к освобождстнтто
227
и рециклнруюцтий пульт обмениваются всзнкулами быстро (рис. 88
L128).
Нервно-мышечный синапс лягушки. НО лягушки, состоит
из нескольких нервных терминалей, располагающихся в форме кус-
тика на мышечном волокне, содержит около 500000 везикул и око-
ло 300 A3 (примерно 1500 везикул на АЗ) (Heuser and Reese, 1973).
Готовый к освобождению пул составляет 2% от общего количества
везикул (на одну АЗ приходится около 40 везикул), которые осво-
бождаются за 0.5 сек при вьтсокочастотной стимуляции (частота 30
Гц) (Richards ct а1., 2003). Рениклируюнтттй пул, включающий 10-
20% всех везикул. продолжительное время может поддерживать ней-
ропередачу при стимуляции с частотой 2 Гц, но быстро (в течение
10 сек) истощается при раздражении 20-30имн/сек‚ Некоторые ав-
торы рассматривают готовьтй к освобождению пул в качестве
неотъемлемой части рециклирутощего пула. Резервный пул начина-
ет работать через 10-15 сек высокочастотной активности, при этом
восстановление численности «резервных» везикул происходит в те-
чсние нескольких минут (рис. 88 ц28) (Зефиров и др., 2008). Сме-
шивание между рециклирующим и резервным пулами происходит
крайне медленно (часы) (Richards ct 211., 2000).
Нервно-мышечпьтй синапс мыши. НО мьнни, состоит из не-
скольких коротких терминальных веточек, образующих компактные
бутоны на мышечном волокне. В НО содержится около 150-300 ТЬ1-
сяч синантических везикул, нз которых 500-1000 докироватты в 300-
600 A3 (Reid et а1., 1999; Slater ct а1., 2003). Готовый к освобождению
пул составляет приблизительно 1% общего количества везикул (на
одну АЗ приходится 2-4 везикулы), которые освобождаются менее
чем за 2 секунды при стимуляции с частотой 20 имп/сек (Зефиров и
др., 2008). Мобилизационный пул включает порядка 80 тысяч вези-
кул (около 30% от общего содержания везикул), которые вместе с
готовьтм к освобождению пулом составляют рециклнрующий пул.
Примерно через 1 секунду раздражения с частотой 20 ими/сек сни-
жение секреции медиатора сменяется длительным состоянием пла-
то, которое связано как с очень быстрыми процессами восполнен-тля
везикул готового к освобождению пула за счёт мобилизационного
пула, так н за счет быстрого знлонитоза и рецикдттгрования. Ско-
poor}, восполнения составляет около 400 везикул в секунду. Везику-
лы резервного пула (100-200 тысяч) не приннматот‘ участие в секре-
цни медиатора нрн частотах активации до 30 ими/сек. Смешивание
МСНСЛУ pC'iCpBHI»Il\’| H рС1111КЛНрУ1О11111ЁИНУЛЦМИ ПОВССЙ1311)1ИМ0С'1`1’111рО-
228
исходит медленно (рис. 88 1128).
Чашеобразные еинапсы крысы. Общее количество везикул
оценивается в 188000, которые рассредоточены между 600 A3 (при-
мерно 300 везикул на АЗ) (Lenzi, Gcrsdorff, 2001; Wu, Wu, 2007). На
8-11 день постнатального развития готовый к освобождению пул
содержит 1500-4000 везикул (2-6 на АЗ). Причем в ответ на стиму-
ляцию одна половина везикул выделяет медиатор с временной кон-
стантой 3 мс (быстрый компонент), а другая — 30 мс (медленный
компонент). Вероятно, что везикулы обеспечивающие быстрый ком-
понент находятся рядом е Са- каналами, а медленного немного даль-
ше. Необычным представляется тот факт, что первая группа вези-
кул восстанавливается в течение нескольких секунд, тогда как вто-
рая —— 3a 100 MC (Bcchercr, Кепи; , 2006). В любом случае пополнение
везикулами готового к освобождению пула идет очень быстро (вре-
менная константа около 1 с), поэтому вполне вероятно, что восста-
новление идет за счет транспортировки везикул из рециютирующе-
го пула, который составляют по разным оценкам от 10000 до 20000
везикул (около 30 везикул на АЗ). Везикулы рециклттрутотцего пула
способны длительное время (по крайней мере - 5 мин) поддерживать
секрецию медиатора на постоянном уровне даже при частоте стимуля-
ции порядка 20 имп/с. Однако применение гинеркалиевого раствора в
течение 15 минут" может вьтзвать освобождение медиатора из некото-
рых везикул резервного пула. Смешивание между рециклируюнтим и
резервным нулами идет медленно (рис. 88 1128) (Rizzoli, Веги, 2005).
Синапсы биполярных клеток. По оценкам тэлектроттной мик-
роскопии количество везикул в маленькой и большой нервной тер-
минали биполярной клетки составляет 500000 и 900000, соответ-
ственно (Gersdorff, Mattews, 1999). Эти везикулы необходимы для
функционирования 60 синаптических лент активных зон, на каж-
дую и3 которых приходится порядка 1 1000 везикул. Это рекордное
количество на 1-2 порядка превышает количество везикул приходя-
тпееея на одну АЗ в других синапсах. При этом только 1-2% от об-
щей популяции везикул прикреплено к синаптическим лентам, то
есть порядка 6000 везикул (около 100 на A3). B состав готового к
освобождению пула входит около 1000—1800 везикул (т ратитьея за
10 мс деноляризатттти), Оставшиеся 3000-4400 везикул прикрепле-
HM к ленте (не докироватты) и составляют второй пул, для освобож-
дения которого достаточно ‚ттеполяризутотттего стимулы меньше 1 сек.
При проттолжатоптейся более секунды деполяризации, в готовьтй к
освобткдение пул начинают‘ быстро нереметтитгься везикулы резер-
229
вного пула. Везикулам этого пула присуща высокая подвижность
даже в покое, что объясняется экспрессией «не функциональной»
формы синапсина (не способной связываться с синаптическимп вс-
зикулами) в этих ‘типах синапсах (Llobet ct al., 2003). B отличие от
большинства изученных препаратов, в биполярных клетках вновь
образовавшиеся везикулы как с помощью быстрого, так и медлен-
ного эндоцитоза пополняют резервный пул (Holt et al., 2004). Сле-
довательно, в этом виде НО репиклирующим пулом являются гото-
вый к освобождению мобилизационный и резервный пулы (рис. 88
Ц28).
Устройство трех везикулярных пулов
Первоначальные модели функционирования везикулярных пу-
лов предполагали морфологическое их разделение. Они основыва-
лись на положении о последовательном участии везикул трех пулов
в секреции медиатора, определяющееся различным расстоянием ве-
зикул отдельных пулов до сайтов освобождения медиатора. Снача-
ла секрецию обеспечивают везикулы расположенные в АЗ, затем -
поблизости от нее и в последнюю очередь везикулы из более глубо-
ких слоев. Однако многие экспериментальные данные говорят о сме-
шении везикул рециклируюцхего и резервного пулов внутри обще-
го везикулярного кластера. Кроме того, число докированных вези-
кул, выявляемых с помощью электронной микроскопии, иногда не
соответствует размеру готового к освобождению пула, определяе-
мому электрофизиологическими и флуоресиентньтмтт методами. В
гиппокампальттых бутонах, чашеобразных НО грызунов и нервно-
мышечных синапсах лягушки везикулы мобилизационного, рецик-
лируготцего пула разбросаны по всему объему НО и морфологичес-
ки не образуют отдельнух от резервного пула популяций (Юной,
Betz, 2004; Rizzoli, Bctz, 2005). B двигательных НО дрозофилы ре—
циклируюхиитт пул находится в основном по периферии синапти-
ческих бутонов (Kuromi, Kidokoro, 2005). B pc'rm<yJIocnnHanbm.1x
синапсах мипоги резервные везикулы обычно обнаруживаются вда-
леке от A3 (Plerlbonc е: а!., 1995). Отсюда в последнее время доми-
нируют представления о том, что везикулярные пулы представляют
собой больше функциональные группировки везикул, которые
ошичаготся по вероятности экзоиитоза, емкости, путям, скорости и
СПОСОбЦЁИ рСПНКЛНРОВЫННЯ.
230
Возможно пулов синаптических везикул в НО
больше?
В последнее время стали высказываться предположения о на-
личии в НО кроме трех вышеописанных пулов синаптических вези-
кул и других дополнительных пулов. Так, некоторьте факты указьт-
вают на присутствие в НО тинпокамтта, нервно-мышечных синан-
сах дрозофилы, крысы, биполярных клетках сетчатки везикул чет-
вертого «покояшетося» пула, которые никогда не участвуют в экзо-
Цитозе (Sudhof, 2004).
Кроме этого, накапливаются данньтс о существовании в НО
самостоятельного пула везикул, обеспечивающих спонтанное осво-
бождение медиатора (пул спонтанного освобождения). Оказалось,
что в гиппокамтталытьтх синапсах часть везикул, при отсутствии cm-
муляции подвергается спонтанному экзоцитозу, который т1роисхо-
дит с частотой 1 -2 везикулы в минуту, и модулируется активацией
метаботропных рецепторов и ретрограднымтт посредниками (Sara
ct а1., 2005). Одним из основных факторов определяющих уровень
спонтанного экзоцитоза в гиппокамтте является холестерин, вымы-
вание которого из мембран вызывает резкое увеличение (в 10—20
раз) спонтанного выброса глутамата (Wasscr, Kavalali, 2009). Пред-
полагается, что везикулы нула спонтанного освобождения исполь-
зуют для слияния специфичный набор белков экзоцитоза (важная
роль принадлежит‘ VAMP2, синатгтотаттхттттту 12), а сайты спонтан-
ного освобождения медиатора располагаются рядом с A3 (Zcfirov et
al., 2002). Кроме того, везикулы, задействаваттттьте в спонтанном эк-
зонитозе рециклируются собственным, особым путем, а стхтснтетттте
везикул входящих в пул спонтанного и вызванного освобождения
происходит крайне медленно. В ГАМК-эргттческттх НО типпокамтта
блокатор динамина динасор после периода стимуляции блокирует
вьтзваттттос синхронное н атснихроттттое освобождение медиатора, тогда
как спонтанный выброс |7\МК не затрагивается. Было высказано и
очень смелое предположение, что рециклирование везикул пула
спонтанного освобождения медиатора происходит динамнн — не-
зависимо (Chung е! 211., 2010).
В последних работах в центральных синапсах обнаружен пул
синантиттеских везикул, которые пе принадлежат одной активной
зоне, а «охватыватот» несколько ‘терминалсй (суперпуцт). Эти вези-
кулы очень подвижны н бьтсгро обметптвахкттся (в течение минут)
231
между нервными терминалями. В итоге в течение короткого време-
ни количество везикул, обслуживающих одну АЗ значительно изме-
няется. На направление этого процесса могут влиять различные сиг-
нальные каскады, например, механизм. зависимый от активации
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) рецепторов с тирозинки-
назной активностью Trk-B. B НО гиппокампа часть везикул супер-
пула может вести себе наподобие везикул рециклирующего пула:
быстро подвергаясь рециклированию в ответ на стимуляцию (Staras
е1а1., 2010).
ПОВТОРНОЕ ИСПОЛЬЗОВЯНИС синаптических
ВЕЗИКУЛ В секреции медиатора. СКОрОСТЬ
ВЕЗИКУЛЯрНОГО цикла
Одна из главных специализаций нервных окончаний нейронов
Заключается в том, что сипаптическая везикула может быть задей-
ствована несколько сотен раз в секреции медиатора до возвраще-
ния в тело клетки с целью ‚деградации. Время требуемое для эндо-
цитоза, транспортировки и подготовки синаптичсских везикул для
нового раунда освобождения медиатора (время везикулярного цик-
ла) очень сильно варьирует от нескольких секунд до нескольких
десятков минут в зависимости от типа сипапса и условий актива-
ции (Betz, Bewick, 1993; Ryan, 2001; Зефиров и др. 2008 21,6). При-
чем большее время приходиться на этапы зндоцитоза (Dittman, Ryan,
2009).
В последнее время появились методические подходы позволя-
ющие на некоторых видах синапсов ответить на вопрос как скоро
может быть снова использована синантическая везикула в секре-
ции медиатора.
ВРЕМЯ рециклирования СИНЗПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ В
НЕРВНЫХ ОКОНЧЗНИЯХ ГИППОКЗМПЯ
Для оценки времени полного везикулярного цикла использо-
валась постоянно отимулирусмая (10 ИМП/С) нейрональпая культура
(Ryan ct 211., 1993). Сначала при кратковременной аппликации FM 1 -
43 сннаттгические везикулы захваттлватлп краситель посредством
232
0.
(2 щ __ __
ё о т I 1 Ё
2
в 3 ё I
О
Ё Ё Ё Гтт“ FM1—43
Ё N Ё I „М.
��[� а I F"'l_’<~Kt-;'" “L.19_w_Mn/c
в g „А
N. ‚
9
о 3o so 120 150 180
Puc. 89. Определение времени рециклированпя сина/т/пических
вези/ст в жжервпых окончаниях гигшоксыпш (Ryan, Smith, 1995).
Схема эксперимента представлена на вставке. Краситель FM1—43
подавался в омывающую препарат среду на 30 сек. При этом препарат
постоянно стимулируется с частотой 10 имп/с и краситель эндоцито—
зом захватывается в НО и появляется характерное свечение, После изы-
мания красителя из среды стимуляция продолжается съпрелслеттгтое
время дельта г. Не смотря на стимуляцию, в первые 15 ccK(jmy0pcc11c}1—
ция не уменьшалась, то есть краситель не освобождался. Именно за
это время захватившие FM 1-43 везикулы приобретали повторную спо-
собность к экзоцитозу. Если стимуляция продолжалась более 15 сек, то
свечение уменьшалось, что является показателем выгрузки красителя.
Фракцияг освобождения указывает на часть FM 1 -43, которая освобо-
лилась при изменении Дельта t (0.0- FM 1 -43 не освободился из везикул,
1.0 —- FM! -43 покинул все синаптичсские везикулы).
'3II,L1()l1YI”l‘O3E1(FN1I-43 загружался в НО), а затем (после удаления кра-
сителя из омывающей препарат среды) по уменььпениго флуорес-
ценции определяли момент времени, когда краситель начинает ос-
вобождаться из синаптических везикул при экзоцитозе (выгружать-
ся из НО). Оказалось, что минимальное время необходимое для вос-
становления везикулы после эпд‹ити'гоза в гшкпокампадтьлхьтх ней-
ронах составляет 15с (рис. 89). В течение слецукпцих 45сразд1ражс-
ния 75% содержащих F;\/{I-43 везикул теряли краситель. Эти данные
233
свидетельствуют о том, что большинство синаптических везикул
могли быть использованы повторно в течение 1 минуты. Описан-
ные исследования были произведены при комнатной температуре,
поэтому скорость везикулярного цикла в естественных условиях
может быть еще выше. Около четверти РМ1-43-меченных синапти-
ческих везикул не могли быть освобождены немедленно, но эти ве-
зикулы становились компетентными к освобождению через 10 мин.
Было сделано заключение, что большинство синаптических вези-
кул используются повторно быстро и поступают в готовый к осво-
бождению пул, в то время как меньшее количество - отправляется в
резервный пул (Ryan, Smith, 1995). Во время низкочастотного раз-
дражения (0.2 имп/с) все синаптические везикулы поступают в го-
товый к освобождению пул, поскольку потеря краски происходила
в течение 5 мин.
Скорость пресинаптичсского везикулярного цикла
при формировании долговременной
синаптической пластичности в гиппокампе
Во многих областях нервной системы высокочастотная актив-
ность может вызывать долговременные изменения сипаптической
передачи, лежащие в основе механизмов обучения и формирования
памяти (Bliss, Lomo, 1973). Феномен долговременной потенциа-
ции заключается в том, что относительно кратковременная (десятки
мс) высокочастотная (100 ГЦ) стимуляция возбуждающих моноеи-
наптических путей вызывает длительное усиление синаптической
активности в виде возросшего ответа постсинаптического нейрона
на одиночное раздражение тех же волокон. Феномен долговремен-
ной депрессии был впервые показан в синапсах между коллатера-
лями Шаффера и пирамидными клетками поля СА1 гипнокампа.
Так, низкочастотная стимуляция Шафферовских коллатералей в гип-
покампе (~ 1 Гп) вызывает снижение ВПСП в синапсах СА3-СА1,
ч го может продолжаться, по крайней мере, 1 час. Долговременная
депрессия была позже ттро;темонегрироваъта и в других областях мозга,
таких как поле САЗ гиппокампа, зубчатая фаспия, различные облас-
ти новой коры H MO37KC‘lK£1 (Malcnka, Веаг, 2004). B основе возник-
новения долговременной потенпиапии и депрессии лежат различ-
ные пре- и постсинатггические механизмы (Скребипкий, 2010).
В последнее время наткапливатотся данные о том, что преси-
234
наптическии компонент‘ долговременной пластичности определя-
ется главным образом кинетикой кругооборота синаптических
везикул. Причем изменение скорости протекания отдельных этапов
везикулярного цикла может формировать сложные формы преси-
наптичеекой пластичности, проявление которых зависит от часто-
ты активности. Используя флуоресцентные красители, было обна-
ружено, что в процессе формирования долговременной потенциа-
пии в течение часа происходит ускорение захвата и освобождения
FMl—43, отражающее ускорении пресинаптического везикуляр-
ного цикла (Ryan, 2001). ПрСДПОЛОЖСНО, что в гиппокампальных
синапсах крысы связанная с активацией NDMA рецепторов поетеи-
наптическая продукция оксида азота ведет к ускорению эндошттоза
и репиклирования синаптических везикул. В данном случае NO дей-
ствует, как ретроградный мееееттджер, влпяютций на расположен-
ные по близости от поетсинаптичеекого шипика НО, формируя ран-
ний пресинаптический компонент долговременной потенциапии
(Micheva ct а1., 2003). Кроме этого активация пресинагггических
АМРА-рецепторов в НО гиппокампа во время инициации долго-
временной потенпиатгии вызывает стимуляцию МАР-киназьт, кото-
рая фосфорилирует еинапсиньт (ем. раздел о синапситтах), ускоряя
рсциклирование синаптических везикул (Schcnk ct 211., 2005). По дан-
ным Ahmed и Sicgclbaum (2009) долговременная потенциация в С`А1
регионе гиппокампа, вызванная предптесгвутоттгттм эпизодом высо—
кочаетотной активности, почти на 80 % связана с усилением осво-
бождения медиатора и ускорением репиклированпя синагггическттх
везикул, и только на 20% е увеличением чувствительности поетеи-
наптичеекой мембраны к медиатору. Причем важная роль в инициа-
ции лресинаптического компонента долговременной потенциации
принадлежит‘ формируюшемуея при вьтеокочастотътой активности
(Га-домену, который влияет на зкзоцитоз, эндоцитоз и транспорт
синаптических везикул. 1Пресинатттическигт поздний (через часы,
дни) компонент ‚толговреьтенной иогеттпиации в гиппокампе ‘также
связан с интенсификацией везикулярного цикла за счет образова-
ния новых сайтов зкзо- и зндонъггоза, увеличения количества си-
наптических везикул. Обслуживаютцих функттонирование синап-
тичеекого контакта (Ninzm ct 211., 2006). Кроме ‘этого, предполагается
контроль со стороны молекул межнейрохтальттой адгезии знлоттито-
за синаптических везикул и скорости везикулярного цикла. Так_
кинетика рециклироваттия сит-таптическътх везикул в ходе феногие-
нов пластичности изменяется под влиянием перестройки экстрак-
} 235
леточного матрикса (рис. 4 ц2). Сигнализация, связанная с кадгери-
нами, регулирует поставку везикул в АЗ, EphB / эфрин В система
задействована в индукции увеличения освобождения медиатора при
долговременной потенциации, а связка нейрексин / нейролигин мо-
дулирует вероятность экзоцитоза (рис. 5 ц2). Причем в последнем
случае сигнал подается ретроградно через белок PSD-95 и нейроли-
гин из постсинаптической плотности к пресинантичеекой области
(Оошпапп, 2008).
Недавно появились свидетельства участия эндоцитоза и рецик-
лирования синаптических везикул в кратковременных формах пла-
стичности, которые традиционно объясняли исключительно с пози-
ций экзоцитоза. Так, замедление (или блокирование) зндоцитоза в
НО гиппокампа может молниеносно вызывать нарушение доставки
везикул в АЗ и потенцировать кратковременную депрессию. То
есть процесс эндоцитоза не только отвечает за «рождение» новых
везикул и таким путем определяет скорость везикулярного цикла,
но способен напрямую управлять мобилизацией везикул (Новой ct
а1., 2009).
ДВИГЗТЕЛЬНЪКЪ HCPBHBIC 0KOH‘I2UH/HI
Одним из самых точных„ хотя и трудоемких, способов опреде-
ления времени рециклирования синантических везикул является ме-
тод сопоставления данных но выгрузке красителя FM 1-43 и ди-
намике квантовой секреции медиатора в электрофизиологичес-
ких экспериментах (Ветх, Bewick, 1993; Petrov ct а1., 2008). Эти экс-
перименты проводят обычно на нервно-мышечных синапсах холод-
нокровных или теплокровных животных. На рис. 90 представлены
результаты экспериментов по определению скорости везикулярного
цикла в двигательных НО лягушки и мыши (Зефиров и др. 2008 а,
б). При длительном высокочастотном раздражении (в наших экспе-
риментах- 20 ими/сек) кривая выгрузки FM 1 -43 из НО указывает на
то, сколько содержащих краситель везикул слилось с нресинатгти-
ческой мембраной. Послс экзоцитоза окрашенная везикула теряет
медиатор и краситель, а затем захватывается зндоцитозом внутрь
НО. Это приводит‘ к формированию свободной от красителя вези-
кулы, которая может повторно участвовать в секреции медиатора.
Экзоцитоз такой везикулы вызовет секрецию кванта медиатора, но
не приведет к уменьшению флуоресценции в НО. Кумулятивная
кривая секреции медиатора при длительном Высокочасто'гном раз-
236
дражении (сумма выделившихся квантов, можно использовать и су:
марную амплитуду ПКП) показывает. какое количество квантов м
диатора освободилось из синаптических везикул к данному моме
ту времени (рис.12А). В этом случае детектируется общее колич
ство событий экзоцитоза везикул, но не учитывается, что одна в
зикула может участвовать в секреции медиатора несколько раз.
ПЯГУШКЗ
---I--V; ванн
I
3,7x10:'
относительная
флуоресценция, %
о В ‘5 8 8 8
_._—-7:-“‘,.."i
AF, %
o.o‘ . .-- J -... .. ����
so no
время, с
1001 .
Q I
O: °. во: Е
Ё Ё 1 бахча‘: - те
д �/�� '» i
Е, д, 604 I к;
§ g �� '\ E чего‘ 52 °
8 Ё 40‘: Ко И �9�� ' Ш
E а ё \‘\ 2010“ "га (J
О ё 201 L.‘ 'x 1|
01 о" оо| р: ‘о
.‚ __ `��� _ I
О 2 4 6 ` о so то 150
время, мин время. с
Рис. 90. Метод оценки времени 6c31m_y.7;1pHo:() ник-т в двига-
тельном нервном окончании (Зефиров и др. 2008 с изменениями).
Слева - изменения флуоресценции, предварительно загружен-
ных FM 1-43 HO n;nyLu1<n (вверху) п мыши (внизу) при длительном вы-
сокочастотном раздражении (20 ими/с). По оси ординат v— 0'l‘HOCl4'I‘C.ib-
ная флуоресценция (в % от исходной), по оси абсцисс - время раздра-
жения (в мин). На вставке — флуоресценция НО в com BC'I‘CTBy10II_1H€
периоды стимуляции (I, 3, 5 мин). Справа - наложение кугиулвгтивнодт
кривой секреции медпа'г‹›ра, квантовых составов всех ПКП при раздра-
жении 20 имп/с, (Xm) ИЗ рис. 12/\ (сплошная линия) на перевернутую
кривую потери красителя (бГ) из рис. 90 слева (пунктирная ппнпя).
Кривые масштабированы. Показана точка явного расхождения двух
графиков (примерно 50 секунд), соответствующая минимальному вре-
мени рецпклированпя везикул.
237
Сопоставление динамик выгрузки красителя (перевернутая кри-
вая потери красителя) и секреции медиатора (кумулятивная кривая
квантового состава ПКП) при длительном высокочастотном раздра-
жении может помочь оттределить популяцию везикул, которые по-
вторно участвуют в секреции медиатора, и минимальное время их
рециклирования (рис. 90) (Bctz, Bcwick, 1993; Вен, Angelson, 1998;
Reid et а1.‚ 2003; Зефиров и Др. 2008 а, 6). Для этого необходимо
масштабировать кривую потери красителя так, чтобы ее начальная
часть совпала с таковой у кумулятивной кривой квантового состава
(рис. 90). В начале высокочастотной активности секреция медиато-
ра пропорциональна экзоцитозу содержащих краситель везикул. Ког-
да набирают силы процессы рециклирования, значительная часть
медиатора может освобождаться из потерявших FM1-43 везикул
(Betz, Angelson, 1998). Это приведет к явному расхождению кривых,
т.е. скорость выгрузки красителя будет отставать от скорости секре-
ции медиатора. Время, при ко гором выявляется явное расхождение
кривых, будет соответствовать времени рециклирования везикул (д).
Поскольку в НО содержится несколько пулов везикул, то это время
будет характеризовать кругооборот наиболее «скоростных» везикул,
то есть минимальное время везикулярного цикла.
Проведенный нами анализ показал, что минимальное время ре-
циклирования в ‚двигательных НО как мыши, так и лягушки состав-
ляет 50-60 сек (рис.90) (Зефиров и др. 2008 а, б). Поскольку наши
данные получены при комнатной температуре, можно думать. в ес-
тественных условиях в НО мыши скорость кругооборота везикул
может быть еще больше.
Несмотря иа отсутствие существенных различий в минималь-
ной скорости рециклирования синаптических везикул в двигатель-
ных НО теплокровного и холоднокровного животного, динамика эк-
зоцитоза и эндоцитоза в этих объектах сильно отличается (рис. 48).
У лягушки наряду с быстрым зндоцитозом существует мед-
ленный эндоцитоз (рис. 48) и темп экзоцитоза значительно отстает
от темпа эндоцитоза. Причина этого кроется, по всей видимости, в
уровне зкзоцитоза, путях эндоцитоза. емкости машины быстрого
эндоцитоза и функционировании везикулярных пулов. У лягушки
имеется большой объем готового к освобождению пула везикул, по-
этому в ответ на раздражение освобождается большое (несколько
сот) квантов медиатора. При длительной высокочастотной актив-
ности в пресинцптическуто мембрану встраивается большое коли-
чсство везикуляриых фрагментов и механизмы быстрого ‘эндоцътго-
238
за с включением везикул в рециклирующий пул (время везикуляр-
ного цикла около минуты), не могут или не успевают ингернализи-
ровать все эти фрагменты. Поэтому часть мембранного материала
везикул захватывается медленным эпдонитозом с участием эндосо-
мо-Подобных структур и по длинному пути пополняют резервный
пул. Эти везикулы могут повторно использоваться в секреции ме-
диатора только через длительное время (5- 10 мин). Отсюда в НО
лягушки существуют два (быстрый и медленный) везикулярных ник-
ла.
Двигательные НО мыши имеют меньшие размеры и содержат
меньше везикул готового к освобождению пула. Поэтому при таких
же параметрах раздражения уровень экзоцитоза в 5-10 раз меньше
и репиклирование везикул осуществляется главным образом по ко-
роткому быстрому пути (время везикулярного цикла около 1 мин) с
включением их в рецикдгирукпггий пул (Зефиров и др, 2008 а, б). В
этом случае машина быстрого эндопитоза успевает интернализиро-
вать практически все мембранные фрагменты везикул, встроенных
в плазматическую мембрану в процессе экзонитоза.
Подтверждением различных путей рениклирования в двигатель-
ных НО лягушки и мыши послужили данные, проведенного нами,
математического моделирования, описывающего динамику кванто-
вого состава ПКП (экзопитоз) и захват FM1—43 (эпдонитоз) в про-
нессе длительного высокочастотного раздражения (рис. 12, рис. 48,
рис.91 1129).
Для моделирования изменений экзонитоза и зпдопитоза си-
наптпческих везикул при высокочастотной активации были сдела-
ны следующие допущения. Все везикулы в НО содержат медиатор,
переходы везикул между пулами описываются, исходя из закона «дей-
ствующих масс», флуоресценция НО прямо пропорциональна чис-
лу везикул, захвативших краситель при зндонитозе, а везикулы яв-
ляются прозрачными для излучаемого красителем света. Пределы
изменения размеров везпкулярных пулов задавались в соответствии
с ‚литературными данными. Эти допущения позволяют составить
систему дифференциальных уравнений, выражающих скорости из-
менения числа везикул во всех состояниях, возможных для рассмат-
риваемой модельной схемы. Решение уравнений производили чис-
ленным методом. Анализировались модели, включающие от одного
до трех пулов синаптичсских везикул и от одного до двух видов
зпдонгггоза. На рис. 91 н29 представлсньл модели, наиболее адск-
ватно оппсывагощис данные злектрокргтзиологических и оптичес-
239
ких экспериментов на нервно-мышечных синапсах ляпутпки и мьппи.
Видно, что в двигательных НО лягушки в секреции медиатора при-
нимают участие три пула синаптических везикул, существуют два
вида зндоцитоза (быстрый и медленный) и два везикулярных ЦИК-
ла. В НО мыши секрецию медиатора обеспечивают два везикуляр-
ных пула и один везикулярный цикл с использованием одного вида
(быстрый) эндоцитоза.
Заполнены ли рециклирующие везикулы
медиатором?
Репиклирование синаптических везикул не зависит от их за-
полнения медиатором. В норме этап заправки вновь образованных
везикул нейромедиатором происходит очень быстро (в течение не-
скольких секунд) (Atluri, Ryan. 2006; Takamori е: а1., 2006). В сред-
нем на везикуле присутствует около десяти копий молекул транс-
портеров медиаторов, хотя даже одной достаточно для полного за-
полнения медиатором везикулы (Dittman, Ryan, 2009). B итоге все
вновь образовавшиеся синаптические везикулы при очередном ра-
унде экзоцитоза выделяют «стандартную» порцию медиатора в си-
наптическую щель. Блокирование везикулярного транспортера аце-
тилхолина везамиколом в двигательном НО яптерицьт приводит к
зкзоцитозу синаптических везикул, не содержащих медиатор (Parsons
et а1., 1999). Предполагается, что при рециклировании в некоторых
везикулах протонная помпа может приходить в «негодное состоя-
ние» (не способна создавать протонный градиент). Такие везикулы
пе заполнены медиатором («спя1пие» везикулы), но при этом сохра-
нятот способность к экзопитозу (Takamori ct al., 2006). Таким обра-
зом, в нервных терминалях не существует механизма, предотвраща-
ющего ЭКЗОЦИТОЗ пустых (лишенных нейротрансмиттера) синапти-
ческих везикул.
240 Ч
ЦИКЛИЧЕСКИЕ НУКЛСОТИДЬП И СКОРОСТЬ
ВВЗИКУЛЯРНОГО ЦИКЛ?!
Контроль и регуляция кинетики рециклирования синаптичес-
ких везикул является одним из наиболее сложных вопросов синап-
тологии (3ефиров, Петров, 2009; Sudhof, 2004; Kavalali, 2006; Clayton,
Cousin, 2009; Dittman, Ryan, 2009). Действительно, изменяя скорость
везикулярного цикла можно выйти на новые способы регуляции силы
синапсов при высокочастотной активности, что имеет огромное зна-
чение в механизмах кратковременной и долговременной синапти-
ческой пластичности (Rohrbough, Broadic, 2005; DiPao10, DcCai1li,
2006; Zcfirov ct al., 2006).
Нами впервые с использованием электрофизиологического и
оптического методов (рис. 48, рис. 90) в двигательном НО лягушки
были обнаружены внутриклеточные сигнальные системы, участву-
ющие в регуляции скорости везикулярного цикла и оказывающие
выраженные влияния на процессы экзо- и эндоцитоза синаптичес-
ких везикул. Ими оказались циклические Нуклеотиды.
Система цАМФ и процессы везикулярного цикла
Наши исследования показали, что сигнальный каскад цАМФ
сложным образом «вмонтирован» в везикулярный цикл. С одной
стороны, увеличение внутриклеточного уровня цАМФ (8—Br—uAMCD,
дибутирил-ЦАМФ) облегчает экзоцитоз синаптических везикул го-
тового к освобождению медиатора пула и эндоцитоз везикул. С дру-
гой стороны, активация цАМФ пути затрудняет быстрое передви-
жение везикул мобилизационного пула к сайтам освобождения (A3).
Поэтому кругооборот везикул по короткому пути угнетается (рис.92
1129), а минимальное время везикулярного цикла резко увеличива-
ется до нескольких мин. В этих условиях пополнение готового к
освобождению пула, вероятно, обеспечивается везикуламтт резерв-
ного пула, которые восстаттавливаются с помощью медленного an-
доцитоза (рис.92 1129). Таким образом, стимулирование цАМФ-за-
висимых реакций в нресинатгтическом НО направляет репиклиро-
вание синантичсских везикул по медлеНттому пути. B ТО же время,
фоновая активность аденилатциклазьт важна для протекания всех
Ц
Ф
N О
‘ £’i°2”2"3 ‘
" экзоципп
` Ь ц Q — —
Puc. 91 1429. Модели кругооборота синаптических везикул в раз-
личных двигательных НО (Захаров А.В И др. 2010).
А- лягушки, Б- мышь. У лягушки имеется 3 пула везикул, 2 вида
эндоцитоза И 2 везикулярных цикла (быстрый - красные стрелки и медлен-
ный — синие стрелки). У мыши присутствует один вид эндоцитоза, обеспе-
чивающий быстрый везикулярный Цикл. Vd— пул готовый к освобождению
пул, Vm — мобилизационный пул, Vs A резервный пул. Ve — пул мембранно-
го материала везикул, встроившихся в пресинаптическую мембрану в ходе
эндоцитоза. В модели у лягушки этот пул разделен на две части - Ved И Ves,
OT которых берут начало быстрая (еш) и медленная (es) дороги эндоцитоза,
пополняющие мобилизационный и резервный пул.
цАМФ VF
6§o“&:e3epaHbIM
пройде)
О ОШ’ / `\
цАМФ T
é.--u
мобилизационным
—-____
Y Готовым к
освобождению
ЭНДОЦИТОЗ эюоцит оз ЭНд0цитоз эюоцит о:
Рис. 92 1429. Влияние системы цАМФ на процессы кругооборота
синаптических везикул в двигательном НО лягушки (Петров и др.‚ 2008).
Активация цАМФ- зависимых ферментов облегчает экзоцитоз вези-
кул готового к освобождению пула и эндоцитоз везикул, но затрудняет пе-
редвижение везикул мобилизационного пула в АЗ. При снижении уровня
цАМФ «тормозится» протекание всех ключевых эггапов везикулярного цик-
ла. Сплошными стрелками показаны быстрый (короткий), а пунктирными
— медленный (длинный) везикулярные циклы.
29
Ц30
плобипизационньпя
ЭООЦИТОЗ ЗНДОЦ ИТОЗ 3|О ОЦИТ 03
Рис. 93 1430. Влияние цГМФ - протеинкиназа GI сигнального пути
на кругооборот синоптических везикул в двигательном НО лягушки.
Активация ЦГМФ зависимых ферментов облегчает передвижение
везикул мобилизационного пула в АЗ и эндоцитоз везикул. При ингиби-
ровании ЦГМФ системы происходят противоположные изменения.
Сплошными стрелками показаны бысгрый (короткий), а пунктирными —
медленный (длинный) везикулярные циклы.
ksd+
Ml
I ‘я кзоцитоз ' 1
\ЁТ""' .-2'-'
\ъ\==="
Рис. 94 цЗ 0. Модель везикулярного цикла в двигательном нервном
окончании лягушки (Захаров А.В., и др. 2010).
В классическую модель с тремя пулами везикул двумя типами эндо-
цитоза и двумя везикулярными циклами (красные и синие стрелки) добав-
лен еще один везикулярный цикл (зеленые стрелки) в котором везикулы
резервного пула могут непосредственно пополнять готовый к освобож-
ДСНИЮ P���
I'.—\l\ ll\'A- рецептор
щ.
|- ч‘
ll
H‘ Ё "-" '- I ьлзттрлтн
\ ‘F I Гц: '-(I
'* ' AP2
п \
.;‹ ‚я , . д.
} Be'nI|c_\‘.'m ‘
I l\
' Цдггоскелет ‘г
Гольджп-сеть '9'щ°°°“ш
Рис. 95 цЗ 1 . Постсинаптический везикулярный цикл, связан-
ный с контролем Г АМК A — рецепторов на клеточной мембране (Moss,
Smart, 2001).
Слева- ГАМКА- рецепторы образуются в околоядерной области
и транспортируются в посгсинаптическую область, где группируются
вместе с протеинкиназой СЬ2 (РК СЬ2) и белком RAKC1 (receptor for
activated C kinase). GABARAP (GABAA-receptor—associated protein) -
белок, взаимодействующий с ГАМКа-рецепторами, облегчает их встра-
ивание в постсинаптичекую область, а белок гефирин обеспечивает
связь с цитоскелетом. Фосфорилирование Ь-субъединиц ГАМКА- ре-
цептора протеинкиназой СЬ2 подготавливает его к эндоцитозу Спра-
ва — эндоцитозные мотивы ГАМКА-рецепторов узнаются адаптерным
белком АР-2 и подвергаются конститутивному клатрин-динамин зави-
симому эндоцитозу. Поглощенные рецепторы направляются в эндо-
сомальную систему, а затем могут вернуться на клеточную поверх-
ность или деградировать (Doray е’: а1., 2007).
Ц32
IIcxo,:moe состояние
Ю ш к m"*.—\I\lI'.-\ - рецепторы
клдтрппь
1опосредоваииый
NMD—\ — рецепторы
'JIl,'.'|0l|II1'0I
mfi
MJW
долговременная депрессия долговременная потенциация
_\'l‘l.'|QIIlP
эмоции: эпдоппота -""'-"°'“" uuonlrrm
'H\"l0l|ll'l'03
mlw Ют.
por_\'.1IIp_\eM.I-Ill р'г3л'"’3 “щи
„от“. процесс
Рис. 96 143 2. Регуляция количества глутаматных рецепторов в
постсинаптической области с участием экзо- и эндоцитоза.
Долговременная депрессия может вызываться, снижением кон-
центрации АМРА-рецепторов вследствие их эндоцитоза, а долговре-
менная потенциация - с увеличением АМРА — рецепторов, за счет их
встраивания экзоцитозом в постсинаптическую мембрану То есть со-
отношение процессов экзо- и эндоцитоза (указаны красными стрелка-
ми) определяет плотность рецепторов на постсинаптической мембра-
не и силу синапса. Перечисленные процессы регулируются белками,
содержащими PDZ домены. АМРА-рецепторы потлощаются эндоци-
тозом за счет взаимодействия с ц2 субъединицей АР2.
241
ключевых этапов везикулярного цикла (рис. 92 1129). Снижение про-
дукции цАМФ (блокатор аденилатциклазы - MDL) негативно ска-
зывается на процессах зкзоцитоза и эндоцитоза, также нарушается
доставка везикул к местам освобождения медиатора, в итоге реЦик-
лирование ослабляется (рис.92). Получается, что как активирова-
ние, так и ингибирование ЦАМФ системы, действуют специфично
на разные этапы везикулярного цикла, приводят к снижению ин-
тенсивности рециклирования синаптических везикул (Петров и др.
2008) и резкому угнетению секреции медиатора при длительной вы-
сокочастотной синаптической активации.
Усиление экзоцитоза при активации ЦАМФ-сигнального пути
может являться следствием фосфорилирования протеинкиназой А
таких важных белков экзоцитоза как SNAP-25 , CSP И снапина
(Chhcda et а1., 2001; Evans, Morgan, 2003; Scino, Shibasaki, 2005).
Эффект цАМФ системы на процессы доставки везикул в сайты эк-
зоцитоза при высокочастотной активности может определяться вли-
янием протеинкиназы А на Rab ГТФазы, участвующие в прикреп-
лении везикул к специализированным мембранам, и/или на Rho-
семейство малых ГТФаЗ, контролирующих динам ику Р-актина и ней-
рофиламентов, и/или белок синапсин, удерживающий везикулы в
составе резервного пула (Barder е! а1., 2004; Seino, Shibasaki, 2005).
Блокирование зндоцитоза при ингибировании синтеза ЦАМФ воз-
можно связаны с необходимостью фоновой активности протеинки-
назы А для функционирования ключевых белков эндоцитоза: АР-2,
клатрина и динамина (Fingerhut et а1., 2001; Вос2ап et а1., 2004;
Бе11`Асс1ца et а1., 2006).
Система цГМФ и везикулярный цикл
Увеличение активности цГМФ-(З-Вг-ЦГМФ, 8-рСРТ—ЦГМФ)
зависимых ферментов способствует передвижению везикул моби-
лизационного пула в АЗ и усиливает быстрый зндоцитоз. В конеч-
ном счете, рециклирование везикул по короткому пути ускоряется,
а минимальное время везикулярного цикла уменьшается с 60 до 300,
что приводит к замедлению депрессии секреции медиатора при вы-
сокочастотной активности. Ингибирование цитозольной гуанилат-
циклазы (ODQ) ИЛИ протеинкиназы GI (З-Кр-Вг-РЕТ-ЦГМФ), на-
против, подавляет транспортировку везикул мобилизационного пула
в A3 и замедляет быстрый зндоцитоз (рис. 93 ц30). Поэтому время
кругооборота везикул НО резко увеличивается, что сопровождает-
242
ся выраженной депрессией секреции медиатора при высокочастот-
ном раздражении. Значит, в условиях угнетения цГМФ пути секре-
ция медиатора осуществляется за счет доставки в готовый к осво-
бождению пул везикул резервного пула, которые впоследствии мед-
ленным эндоцитозом захватываются в НО (Petrov ет а1., 2008). Поз-
же, аналогичные изменения скорости рециклирования везикул при
активации и инактивации ЦГМФ системы в 2009г. были показаны
Tcgengc и коллегами в молельных нейронах человека (Ntera2 нейро-
ны).
Можно наметить несколько точек приложения данного цГМФ-
протеинкиназа GI сигнального пути в двигательном НО. Компо-
ненты клатринового покрытия (АР-2, AP—180, ЭПСИН, Dab2) И белки
эндофилин, амфифизин, динамин избирательно собираются в ма-
шину эндоцитоза на мембранах, обогащенных ФТИ-4,5-Ф2. Поэто-
му ускорение эндоцитоза на фоне акгпвации цГМФ-пути возможно
связано с направлением метаболизма мембранных фосфоинозитп-
дов в сторону увеличения поли-фосфорилированных форм (Micheva
ет а1., 2003; Di Paolo, Dc Cailli, 2006) Протеинкиназа G1 может уве-
личивать пул мембранных ФТИ-4,5-Ф2 двумя способами: ингиби-
ровать разрушение ФТ`И-4‚5-Ф2 фосфолипазой С, или фосфорили-
ровать малые ГТФазы, контролирующие активность фосфатидили-
нозитол-киназ (Salaun ет а1., 2004; Rohrbough, Broadic, 2005;
Schlosssmann, Hofmann, 2005). Протеинкиназа G1 может действо-
вать на hsp27 и WASP белки (Scholten, Heck, 2006), управляющие
векторной полимеризацией актина. Увеличение скорости передви-
жения везикул при повьпнеътии концентрации цГМФ вряд ли связа-
но с перестройкой только актинового Цитоматрикса, поскольку в
НО лягушки нарушения актинового цитоскелета не влияют на ре-
циклирование везикул мобилизационного пула (Richards ст al., 2004;
Gaffield ст а1., 2006). Гипотетически, выявленный эффект цГМФ си-
стемы достижим за счет влияния протеинкиназы G1 на нейрон-спе-
цифичную ГТФаЗу (Ъсептин, в изобилии содержащуюся в НО как
Drosophila, так и млекопитающих (Хие ет а1., 2000, 2004; Spiliotis,
Nelson, 2006).
243
В нервном окончании лягушки существует
несколько циклов, обеспечивающих повторное
использование синаптических везикул
Мы уже говорили, что в рамках классических представлений,
в НО существует так называемый короткий везикулярный цикл,
включающий экзоцитоз, быстрый клатрин-оносредованный эндо-
цитоз с поступлением новых синаптических везикул в мобилиза-
ционный и готовый к освобождению пул. Кроме этого существует
длинный везикулярный цикл, при котором синаптические вези-
кулы образуются посредством медленного эндоцитоза из эндосомо-
подобных структур и пополняют резервный пул. При этом резерв-
ные везикулы пополняют мобилизационный пул но мере его опус-
тошения. В этой схеме оба везикулярных цикла замыкаются на мо-
билизанионном пуле везикул, которые пополняют готовый к осво-
бождению пул (рис. 91 L129).
Проведенные нами исследования впервые указали на возмож—
ность участия везикул резервного пула, без предварительного исто-
щения мобилизационного пула, в секреции медиатора при высоко-
частотном раздражении под влиянием аналогов цАМФ (Петров и
др. 2008) или ингибирования пути гуанилатциклаза — протеинкина-
32161 (Pctrov et а1. 2008). Это свидетельствует в пользу существова-
ния независимых путей транспорта везикул мобилизационного и
резервного пулов к сайтам освобождения (АЗ). Следовательно, в
двигательных НО существует еще один (длинный) везикулярный
цикл, поставляюлций везикулы в готовый к освобождению пул из
резервного. В этом случае мобилизационный и резервный пул име-
ют возможность одновременно работать в условиях высокочастот-
ной активности. Ранее проведенные исследования не смогли обна-
ружить такую возможность, поскольку отсутствовали фармаколо-
гические инструменты, избирательно подавляющие быстрое рецик-
лирование везикул но короткому пути. Большинство до нас изучен-
ных агентов (вортманин -- блокатор ФИ-З-киназы, латрункулин —
связывает О-актин, предотвращая его полимеризацию) нарушали
медленную дорогу рециклировапия (Rizoli, Веги, 2002; Richards ct
al., 2004;Ga1‘ficldetal, 2006).
Предположение о наличии самостоятельного длинного вези-
кулярного цикла, обеспечивающего секрецию медиатора (зкзоци-
коз - медленный зндоцитоз - резервный пул - готовьнё к освобожде-
244
нию пул - экзоцитоз) было подтверждено при имитационных экспе-
риментах на модели НО лягушки (Захаров и др. 2010). В ходе изуче-
ния поведения модели (рис. 94 ЦЗО) при вариации параметров было
обнаружено, что путь участия везикул резервного пула в экзоцито-
зе (обозначенный на рис. как Ksd+), идущий в обход мобилизацион-
ного пула, может полностью заменить восполнение готового к ос-
вобождению пула везикулами мобилизационного пула (km+>kd+).
Получается, что везикулы резервного пула не должны в обязатель-
ном порядке проходить последовательно через мобилизационный
пул, а могут непосредственно локироваться в A3 (рис. 94 ЦЗО). Од-
нако следует помнить, что эта схема не применима в синапсах или
условиях, в которых резервный пул не участвует в секреции медиа-
тора при высокочастотной активности.
245
ГЛАВА VII. Процессы экзоцитоза и
эндоцитоза, не связанные с
рециклированием синаптических
везикул
В этой главе мы кратко изложим современные представления о
процессах экзо- и эндоцитоза везикулярных структур. События эк-
зоцитоза и эндоцитоза, а также везикулярного транспорта в синап-
се задействованы в многочисленных процессах, напрямую не свя-
занных с пресинаптическим циклом синаптических везикул и осво-
божденнем медиатора. Эти процессы направлены на сортировку и
«проверку» белков (транспортеров, каналов, рецепторов и др.) пре-
и поетсинаптических мембран, изменения количества и плотности
рецепторов на мембранах, образование и элиминацию синаптичес-
ких контактов, формирование долговременных форм синаптичес-
кой пластичности. Различают конститутивные и индуцированные
экзоцитоз и эндоцитоз.
КОНСТИТУТИВНЬПС ЭНДОЦИТОЗ И ЭКЗОЦИТОЗ
В процессе конститутивных (постоянных) энпоцитоза и экзо-
цнтоза с поверхности мембраны удаляются или встраиваются раз-
нообразные белковые и липидные компоненты. Наиболее полно эти
процессы изучены для пресинатттических транспортеров медиато-
ров n IIOCTCI/lllal'ITI/I‘l€CKI’IX рецепторов глутамата и ГАМК.
Транспортеры медиаторов. Важными элементами, вовлечен-
ными в синаптическую передачу, являются транспортеры медиато-
ров, встроенные в пресинаптические мембраны, а также мембраны
г:1иа:1ьнЬ1х клеток. Подобные белки-переносчики в разных нервных
клетках опосредуют захват молекул медиаторов (катехоловых ами-
нов, цофамина, серотонина, глутамата, ГАМК, глицина), в результа-
те снижается концентрация медиатора в синаптической щели и по-
полняется цитоплазматический запас медиатора, необходимый для
заполнения сннаптичсских везикул. Процессы экзо- н энлоцитоза
служат инструментом для регулирования количества и «качества»
транспортеров медиаторов. Так, например, обстоит пело с глици-
246
новым транспортером, который присутствует в пресинаптнческих
нервных термнналях, где часто колокгшизуется с везикулярным транс-
портером r;1yTaMaTz1(Cubelos et а|., 2005). Глициновьтй транспортер
1Ь подвергается быстрому клатрин - динамин-2 зависимому эндо-
цитозу, который усиливается под влиянием протеинкиназы С. При-
чем поглощение происходит только вслед за убиквинтилированием
транспортера (Femandez—SanChez е: а1., 2009). Убиквинтилирование
также требуется для эндоцитоза других транспортеров, например,
дофамина (DAT). глутамата (GLT1) (Miranda, Sorokin, 2007). Кон-
ститутивный эндоцитоз транспортеров сопровождается их консти-
тутивным экзоцитозом.
Постсинаптическне рецепторы. В последнее время накапли-
вается все больше данных о наличие постсинаптического экзо-
эндоцитозного цикла (рис 95 ц31, рис. 96 1132). Хотя в мозге 90%
покрытых клатрином везикул вовлечено в рециклирование синап-
-тичееких везикул (Girard et а1., 2005), клатриновый эндоцитоз и
экзоцитоз с очень медленной кинетикой обнаруживается и в пост-
синаптических регионах нервных клеток. Постеинаптический вези-
кулярный цикл недавно был выявлен в дендритах и соме централь-
ных нейронов при помощи флуоресцентных красителей. Этот Са-
зависимый цикл намного медленнее, дольше пресинаптичеекото:
везикулы метятся FM 1 -43 B течение 16-36 часов, а потеря красителя
происходит в течение более 30 минут (Wang, 2008).
Так. АМРА-рецепторы, участвующие в формировании быст-
рых, возбуждающих постсинаптических сигналов, постоянно погло-
щаются поетсинаптической клеткой. Часто после эндоцитоза осу-
щесгвляется эндосомалытая сортировка, при которой везикулы с зах-
ваченными постситтаптическими рецепторами направляются в эн-
досомы. Последующая судьба рецепторов может сильно отличать-
ся. Некоторые рецепторы направляются в лизосомы на деградацию,
так обстоит дело C убиквинтизтироваттньтми глутаматными рецепто-
рами (например, АМРА-рецеттгоры, которые полиубиквинтнлиру-
ются после их стимуляции агонистамгт. Patrick ct а1.. 2005). Другие
рецепторы - экзоцитозом возвращаются в постеинаптическую мем-
брану. Конститутивттьтй эндоцитоз АМРА-рецегтторов обычно сопро-
вождается эквивалентным KOHc'I‘H'IyTHBHbIM ')K’£0uI/lTO’S()M, B итоге ко-
личеетво рецепторов не изменяется, но происходит их «обновле-
1mc>>(/\1m1:1di;m CI al., 2004). Аналогичные чкзо- чндоттитотттые цик-
лы обнаружены и для других рецепторов, например ‚для ионотроп-
ных ГАМКА- рецепторов, определяющих процессы торможения (рис.
247
95 ц31). ГАМКА- рецепторы встраиваются экзоцитозом в экстраси-
наптические области, откуда с помощью латеральной диффузии про-
никают в синантические регионы, где заякориваются белком гефи-
рином. Избыток экстрасинаптнческих рецепторов быстро захваты-
вается АР-2 зависимым клатриновьтм эндошттозом: 20% общей но-
пуляции поверхностных ГАМКА рецепторов поглощаются в тече-
ние 15 мин. ц2 субъсдиница АР-2 соединяется преимущественно с
В-субъединицамтт ГАМК-рецспторов, однако при фосфорилирова-
нии последних нротеинкиназой А и кальций / кальмодулин зависи-
мой нротеинкиназой связывание с АР-2‚ а следовательно, и эндо-
цитоз, ослабляется. Кроме того в условиях активации протеинкина-
вы А и/или САМК встраивание ГАМКА рецепторов посредством эк-
зоцитова идет интенсивнее (см. регуляцию экзоцитоза), то в ре-
зулвгате происходит увеличение числа числа постсинаптических
ГАМКА рецепторов и размера дендритов (Vithlani. Moss, 2009). Cy-
шествуют данные об эндоцитозе постсинаптических NDMA-peuen—
торов, содержащих NR3/\ субъединицы. Причем в этом случае уз-
навание МПМА-рецептора происходит с участием белка синдапипа
(Perez-Otano et а1., 2006).
Индуцированные ЭПДОЦИТОЗ И ЭКЗОЦИТОЗ В
ПОСТСИНЗПТИЧВСКОЙ КЛСТКС
По носледннжт данным изменения количества ностсинаптичсс-
ких рецепторов, связанное с процессами ‘эндо- экзоцитоза и вези-
кулярного транспорта играют решающую роль во многих интеграль-
ных процессах нервной системы (обучение, намять, двигательный
контроль и др). Это согласуется с обнаружением преимуществен-
ной локалнзацитт экзо- и эндоцитозных белков но краю постсннан-
тической шютности, в регионе расположенном в непосредственной
близости от постсшнпгптческих рецепторов (Racz ct al., 2004).
Индуцированные (вьгзванттьнт какими либо воздействиями) по-
стсинаптический эндоиигоз и экзоцитоз используется для точной
настройки силы синантического котггакга, удаляя с поверхности но-
стситтантическттй клетки или, наоборот, встраивая рспсгггоры к ней-
розтедиагораьт (глутаматньте АМРА-рецстггоры, ГАМКА-рецегт горы,
[З-адретторсцетггорьт, ониатньте рецепторы, н др.) и нейромодуятято-
рам. Это ведет к изменениям чувствитсльтгости ностсинанггнчеекой
мембраны к данным веществам (Wang, 2008), 'I'p;mc(b0p.\1nponzulmo
248
как возбуждающих, так и тормозные влияний, формированию дол-
говременной потенпиации и депрессии (рис. 96 ц32). В отличие
от более медленного конститутивного, индуцированный экзо- и эн-
доцитоз в ностсинаптических областях может происходить в тече-
ние нескольких минут (обычно 10-20 мин), то есть существенно
быстрее.
Как уже было сказано в основе возникновения феномена дол-
говременной потенциации лежат различные механизмы, одним из
которых является встраивание в постсинаптическую мембрану до-
полнительных рецепторов за счет экзоцитоза везикул (Malenka, Bear,
2004). Предполагают, что зкзоцитоз везикул, содержащих АМРА-
рецепторы, запускается кальцием, входящим через канал NDMA—
рецептора при участии кальмодулнтта и СаМКП. При этом происхо-
дит встраивание субъединиц G1uR1 АМРА-рецепторов в постсинап-
тическую мембрану, в итоге ее площадь увеличивается (Malenka,
.‘\’ical1, 1999). Кроме того, показано увеличение количества мРНК,
кодируюшей ЪЁВМА-рецепторы, в течение 5 часов после индукции
долговременной нотенциапии в гиппокамне. Следовательно, экзо-
цитоз может 11OCTi1B.T1S1'I}> и дополнительные ЪЕВМА-рецепторы в по-
стсинаптическую область (Kandel et а1., 2002).
Показано, что долговременная депрессия возникает в резул ь-
тате активации ЫВМА-репепторов, определенных нротеинфофатаз
(кальциневрина и РР1) и малых ГТФаз (RalA). B итоге снижается
вероятность открытия канала АМРА-реценгора и стимулируется ма-
шина клатрин-зависимого эндоцитоза, которая удаляет АМРА-ре-
центорьт с постсинаптической поверхности (рис. 96 1132). B допол-
нение к этому при долговременной депрессии наблюдается убик-
винтилирование белков гтостсинаптнческой плотности, ведущее к
эндоцитозу этих белков и направлению их на ‚гтегралацито в лизосо-
мы (Wang, 2008). Долговременная депрессия в синапсах между Шаф-
феровскимн коллатералями и CA1 регионом, параллельными волок-
нами и клетками Пуркпнье может быть вызвана активацией мета-
ботронньтх рецепторов глутамата (mGluR l „ mGluR5). B этих случа-
ях активируется протеннкиназа С, которая фосфорилирует G1uR—2
субъединицу АМРА-рецепторов, что служит сигналом для их погло-
щения внутрь клетки (Malcnka, Bear, 2004).
Постсигкаптнческий клатритт-зависгтмьхй эндоцитоз /\.VlP/\-pc-
центоров в синапсах CAI региона гипнокамна можно индуцировать
аппликацией инсулина в течение 10-15 минут, что является причи-
ной и11су;кгш-вьгвваттттогт долговременной депрессии. Инсулин ин-
249
дуцирует фосфорилирование рецепторов (например, GluR2-cy61>e—
диницы АМРА-рецепторов, В-адреноцецепторов) по одному или не-
скольким остаткам тирозина‚ в итоге создаются крепежные сайты
для адаптерных белков (например, Grb2) КЛаТрИНОВОГО покрытия
(Hayashi, Huganir, 2004). При этом рецепторы подвергаются эндоци-
тозу в течение примерно 15 минут. Повторное применение кокаи-
на in viva может также усиливать эндоцитоз АМРА-рецепторов в
дендритах и соме нейронов, входящих в состав системы «вознаг-
пажления» (Boudreau, Wolf, 2005).
ПРОЦСССЬП ЭНДО- И ЭКЗОЦИТОЗЯ В регуляции
бСЛКОВОГО синтеза И РЕМОДЕЛИрОВЯНИИ СИНЯПСОВ
Поздняя фаза долговременной потенциации и депрессии свя-
зана с изменением синтеза ключевых белков, участвующих в ней-
ропередаче, и изменением количества еинаптических контактов
(Анохин, 1996; Malenka, Веаг, 2004; Судаков, 2010).
При долговременной потенциации одним из главных путей ре-
гуляции синтеза белков является цАМФ сигнальный каскад. В этом
случае вход кальция стимулирует Са/кальмодуятин зависимую аде-
нилагциклазу, продуцирующую цАМФ, в итоге происходит актива-
ция протеинкиназы А, которая фосфорилирует белок CREB (CAMP
response element binding protein), представляющий собой транскрип-
ционный фактор. Фоефорилированная форма CREB связывается со
специфичной последовательностью ДНК, названной CRE (CAMP
response clement), В результате запускается транскрипция многочис-
ленных генов (Scholten, Heck, 2006). Однако ядро нейрона, распола-
гается часто на значительном расстоянии от постсинаптических об-
ластсй дендритов. По всей видимости, для доведения сведений о
потребностях синапса в ядро необходимо [воспользоваться услугами
везикулярного тршрика. Однако данный вопрос в научной литера-
туре практически не освещен.
Постсинаптический и пресинаптический эндоцитоз специаль-
ных рецепторов, связанных с лигандами может регулировать и син-
тез самых разнообразных белков. Нейротрофические факторы,
относящиеся к семейству нейтрофинов (NGF, BDNF, T\'T—3, NT—4/5)
и способствующие росту, дифференциации, выживанию нейронов
и вовлеченные в долговременную потенцпацию. действуют на ре-
цепторы, обладающие ‘гирозин-киназной активностью (ТгКА, TrkB.
250
TrkC). B пре- и поетсинаптических областях эндоцитозом поглоща-
ются активированные рецепторы факторов роста нервов (точнее
сказать. комплексы факторов роста нерва и Тгк-рецепторов), кото-
рые затем попадают в эндосомы, упаковываются в сигнальные an-
досомы и транспортируются на большие расстояния из отростков в
тело нейрона (содержащее ядро). Поскольку в сигнальных эпдосо-
мах Тгк-рецепторы находятся во «включенном» состоянии и посто-
янно запускают сигнальные каскады, то по маршруту их следова-
ния в аксоне или дендрите возникают «волны активности» в виде
увеличения уровня ионов Са. В околоядерном регионе, рецепторы
за счет своей ферментативной активности действуют на факторы,
управляющие считыванием информации с определенных генов (на-
пример, CREB) и последующим синтезом белков, в том числе ре-
цепторов к нейромедиаторам (Sorokin, Zastrow, 2002). Кроме того, с
транспортной везикулой в сому нейрона могут доставляться неко-
торые адаптерные белки эндоцитоза (например, Numb, HIP 1), кото-
рые задействованы в процессе транскрипции и репликации.
Еще одна функция экзо- и эндоцитоза в нервной системе свя-
зана со структурной реорганизацией синаптического аппарата
(Schmidt, Haulcke, 2007). B ходе эндоцитоза с поверхности клеток
могут удаляться значительные мембранные фрагменты, в итоге раз-
меры пре- и поетсинаптических мембран уменьшаются. Это, есте-
ственно, ослабляет передачу информации между нервными клетка-
ми. Аналогичный процесс может привести к исчезновению (эли-
минации) синапса. С другой стороны образование новых (допол-
нительных) синаптических контактов и увеличение их размеров про-
исходит вследствие процесса экзоцитоза специальных транспорт-
ных везикул, несущих липидные и белковые компоненты пре- и по-
етсинаптических мембран (Зефиров, Петров, 2009). Более подробно
данный вопрос рассмотрен в разделе об образовании A3 (рис. 24).
Образование новых и исчезновение синапсов является одним из важ-
нейших компонентов формирования долговременной пластичнос-
ти. Эта структурная пластичность является фундаментальным свой-
ством нейронов, а изменения количества и морфологии тпипиков
обеспечивает клеточную базу для обработки и хранения информа-
пии в мозге (Kandel ct al., 2002).
251
Пре- и постсинатггические везикулярные циклы и
нейродегенеративные заболевания
Многие психические и неврологические заболевания челове-
ка связаны с нейродегеперацией (массивной гибелью нервных кле-
ток в определенном регионе центральной нервной системы). В на-
стоящее время огромные усилия затрачиваются на исследования эти-
ологии и патогенеза этих заболеваний, при этом широко использу-
ются специальные линии животных, у которых имеются неврологи-
ческие и поведенческие нарушения, похожие не аналогичные у че-
ловека. Однако еще до клинической манифестации симптомов, у
животных с патологиями нервной системы наблюдаются определен-
ные изменения в синаптической передаче, в частности, в процессах
экзо- и эндоцитоза, а также транспортировки синаптических вези-
кул. Некоторые факты, позволяют думать, что причина ряда заболе-
ваний и массивной гибели нейронов может скрываться в неболь-
ших изменения рециклирования сииаптичсских везикул и экспрес-
сии специфических белков, участвующих в процессах экзо- и эндо-
цитоза.
Ниже мы представим современные данные, свидетельствую-
щие о том, что многие широко распространенные психические, не-
врологические и нейродегсперативные заболевания сопровождают-
ся вьтраэкенньтми изменениями белков, принимающих участие в про-
цессах экзо-, эидоцитоза и транспортировки везикул (табл.4).
Болезнь Альцгеймера — нейропатология, характеризующаяся
потерей синапсов и нейронов, аккумулированием вне клетки В-ами-
лоидного пептида (АПВ), агрегирующего в бляшки, накоплением
аномально фосфорилированного белка tau, формирующего внутри-
клеточные пейрофибриллярные переплетения (пучки). При болез-
ни Альцгсйштера еще задолго до образования амилоидных бляшек,
злнминации синапсов и гибели нейронов уменьшается синтез важ-
пых белков экзо- и эндоцитоза (SNAP—25, c1111a11'r0(b1A3u11a, AP—2, АР-
180, дипамина1, сипаптотагмина) в префронтальной коре. Дисфун-
кцнн, связанные с нарушением синаптической передачи представ-
ляет собой наиболее ранние события, приводящие к когнитивным
расстройегважъ (Coleman, Ybo, 2003).
Рано проявляющиеся семейные формы болезни Альпгеймера
строго, генетически связаны с образованием варианта амилоицптого
пептида В, соетоятпего из 42 аминокислотпьтх остатков. Причем тя-
252
жесть заболевания хорошо соглаеутотея с присутствием АПВ внутри
клеток, что особенно ярко выражено в неокортексе (Steinerman ct
а1.‚ 2008). Депрессия нейропередачи показана у мышей с В-амилои-
цозом и совпадает по времени с появлением АПВ внутри термина-
ли, задолго до обнаружения внеклеточных бляшек (LaI’cria cl а1.,
2007). Проникновение АПВ в терминаль связано с эндоцитозом, этим
же путем АПВ попадает в тлиальные клетки. Наличие АПВ42 в
составе эндоцитозттьтх везикул НО активирует казеинкиназу 2, что
приводит к истощению пулов еинаптических везикул после стиму-
ляции. Механизм, вызывающий уменьшение размеров пулов, воз-
можно, связан е влиянием казеинкнназы 2 на такие белки как дина-
мнн и синатггофизнн, которые участвуют в эндоцитозе (Мотепо ct
al., 2009). Хроническое введение АПВ в низких концентрациях, ко-
торые не оказывают токсического действия на нейроны, угнетает
освобождение глутамата нейронами гиппокампа за счет снижения
размера готового к освобождению и рециклирующет о пулов (Parodi
et а1.‚ 2009). Внутриклеточный АПВ в составе эндосом способен
перемещаться аксональньтм транспортом из НО в тело нейрона, где
в ответ на это изменяется экспрессия синаптических белков. Веро-
ятно, поэтому при аппликации АПВ уменьшается синтез в мозге
ключевых белков экзоцитоза и эндоцитоза: SNAP—25, CHH(iII'I‘0TaI‘-
мина, еинаптофттзитта, динамипа 1 и амфифизина 1 (Rcddy ct а1.,
2005). Предполагается, что поглощенные эндоцитозом АПВ при по-
падании мультивезикулярттые тельца нейронов (функционирутот как
лизосомы) начинает образовывать фибрилпы, прободаютцие вези-
кулярную мембрану. Это один из факторов, провоцирующих кле-
точную гибель, после чего амилоилньте скопления освобождаются
во внеклеточное пространство, формируя, по крайней мере, часть
бляшек (Fricd1‘i<:h ct 211., 20 1 О). В целом, больпюс колнчестово иссле-
дований указывают на эндопигоз как ключевой элемент; е которым
связана токсичность АПВ. Причем проникновение в НО АПБ мо-
жет происходить c помощью специфического варианта диттажттттт-за-
впенмого эндоцитоза. который контролируется малой ГТФазой
Rl1oA, при этом участие белка клатрина не требуется (Yu е: а1., 20 1 О).
Другой механизм действия AI [В связан с его способностью фор-
мировать проппцаемуто для ионов (Та пору, что сопровождается уве-
личением внутритермппального уровня кальт111я(Атт5ре ct а1., 2007).
Это увеличение активнруъот‘ расщепление (Га-зависимой протеазотт
кальнаипом дннамина 1 и белка таи, в результате от поеледтнето от-
тпепляется ‘токсичный фрагмент‘ 17кДа (Sinjozmu ct 211., 2008). (Губ-
с
253
стратами кальпаина также могут являться белок предшественник
амилоида, АМРА-и МВМА-рецеттторьт, многие сигнальные белки
(p35, протеинкиназа СТ, GSK3) (Wei ct а1., 2008). Кроме того, АПВ
может вызывать эндоцитоз постсинаптических АМРА и NDMA ре-
Цепторов, не затрагивая транспортировку ГАМКА-рецепторов.
У многих шодей, у которых болезнь началась после 65 лет, об-
наружено изменение в гене динамин-связьтваюпхего белка (DNMBP),
приводящее к уменьшению его экспрессии. DNMBP — каркасный
белок, концентрирующийся в синапсе вместе с амфифизином 1.
DNMBP одновременно связывается с динамином и акгин-регулиру-
юшими белками (N—WASP, Ena), сводя их близко друг к другу и
облегчая их взаимодействие. За счет этого усиливается полимериза-
ция актина в сайтах зндоцитоза, что облегчает отрыв везикулы и
перемещение ее в глубь отростка нейрона (Kuwano ct а1., 2006).
DNMBP может активировать нротеинкиназу Cdc42, контролирую-
щую динамику нитоскелета. Возможно, снижение уровня DNMBP
имеет решающее значение на ранних стадиях «1ате-оп5ет» болезни
Альцгеймера, тогда как накопление АПВ и реализация его токсичес-
кнх ‘эффектов происходит позже.
Шизофрения - это одно из наиболее распространенных нейро-
психнатрическнх заболеваний, которым страдают 0.5- 1 % населения
планеты. Дисбаланс синаптической передачи в 1`АМК-, дофаминд
шутаматзргических системах может быть основной причиной ши-
зофрении (Ross ct а1., 2006). Существует предположения о наруше-
ниях работы ионных каналов, митохондрий, иммунной системы.
Однако сегодня накапливается все большс фактов, свидетельствую-
щих о том, что возникновение шизофрении — это следствие дис-
функции B механизме экзоцитоза синаптических везикул в опреде-
ленных регионах мозга (Johnson et а1., 2008). Во фронтальной коре
людей, страдающих шизофренией и депрессией, обнаружено боль-
шие количества SNAP—25 и синтаксина, которые входят в состав
ЗНАКЕ-комплекса. В тоже время синтез синаптофизина. угнетаю-
щсго формирование ЗНАКЕ-комплекса, и комнлексинов, регулиру-
ющих (‘а-зависимость экзоцитоза, снижается в коре мозга, гипно-
камне и мозжечке. Также в нрефроптальной коре снижаются уров-
ни синансина 2 и 3, NSF, 0c~SNAP. везикулярной помпы (Рогюп,
Wctsel, 2007).
В большинстве случаев (80%) шизофрения обусловлена наслсл-
ствснными генетическими абберацнями. Генетический анализ выя-
вил более 20 генов «кан;1н‚'1а'гов», изменения в которых могут уве-
254
личивать вероятность развития шизофренитт (Ross ct al., 2006). Сре-
ди них многие вовлечены в везикулярный цикл. Это гепьт дистобре-
вин-связывающего белка 1 (дисбиндин), нейрорегулина 1, синтак-
сина 1, SNAP—25, комплексинов, синантотагмитта X1, синаттситта 2 и
3. Причем белок дисбнндин оказывает влияние на освобождение
дофамина в ЦПС, регулируя работу SNARIi~1<oMnncx<ca и экспрес-
сию SNAP—25. Дисбиндип локализуется в синаптическттх везикулах
и связывается с белком снапином, стабилизирующим праймирован-
ные везикулы, усиливая взаимодействия ЗНАКЕ-комплекса с си-
наптотагмиттом (Talbot е: а1., 2006). Дисбипдин считается одним из
главных виновников в возникновении шизофрении (Morris ct 211.,
2008). У большинства больных уровень дисбиндина снижен в гип—
нокампе и нрефротттальттой коре (Weickcrt et al.. 2008). Деления гена
дисбиндина I y мышей приводит к появлению везикул большого
размера, замедлению освобождения квантов медиатора. уменьше-
нито размера готового к освобождению пула в НО гиннокамтта и
хромафцтиттттьтх клетках (Chen ct al., 2008). Мутантньте мьтпти по
SN/\P-25 «b1ind—drunk» имеют сенсомоторньте аномалии, подобные
наблюдаемым у больных шизофренией, и у них нарушается иссле-
довательское поведение и социальные взаимоотношения (Jeans ct
al., 2007).
Эпилепсия, достаточно часто встречающееся заболевание, ха-
рактеризуютцееся гиперактттвттостью нейронов, сопровождается не-
контролпруемыми циклами экзо- эндоцтггоза синаптических вези-
кул. Поэтому одним из самых перспективных лекарственных средств
в лечении указанной патологии является ингибитор белка динами-
на, одного из ключевых игроков команды эндоцигоза. В этиологии
эпилепсии, помимо повреждений в генах, кодируютцих ГАМК-ре-
цспторьт, \'a—, Сад К-ионньтс канаты, определенную роль, вероят-
но, играют изменения в гене SNAP-25 и SV2. Приступы эпилепсии
могут провоцироваться при нарушении способности SNAP—25 ин-
гибировать ттотетнтиатт-завттсттмьтй Са-канал в АЗ, что в норме пре-
дотвращает спонтанное поступление Са, запускающес ‘экзошттоз
(Pozzi ct 211., 2008). Деления гена везикулярного белка S\/2A IIpHBO-
дит к гибели мышей в течение 3 недель после рождения, вслед-
ствие молниеносттотт эпилепсии. Вероятно, функция 5\/2А заклю-
Чается в подготовке нраймттроваттттотт си наптическотт везикулы к Са
—зависттмому слиянию в иттгибтггорттьтх синапсах (Chung, Sudhof,
2009). При дефиците SV2/-\, вызванное ттреситтатттттчеекттыт ПД, ос-
вобождение тормозного медиатора ГАМК может значительно сни-
255
экаться, вследствие умсньцтеттия числа способных освободить меди-
атор везикул, при этом количество докированных везикул не изме-
няется. С другой стороны недостаток $\/2А/В в возбуждающих си-
напсах тиштокампа уменьшает кратковременную синаптическую деп-
рессию при низкочастотном раздражении (2имп/с) (Janz ct al., 1999).
Возможно, $\/2 белки буферизируют Са при низкочастотной актив-
ности, способствуя синаптической депрессии. В отсутствие $\/2
белков накопление внутриклеточного кальция увеличивает вероят-
ность зкзоцитоза везикул по мере продолжения стимуляции (Chang,
Sudhof, 2009). Представитель нового класса антизпилетттических пре-
паратов леветирацетам (lcvetiracctam) связывается с SV2A, причем
терапевтическая эффективность производных леветирацетама по-
ложительно коррелирует с аффинностьто к 5\/2А. Трехчасовая aun-
ликация леветирацетама значительно уменьшает синаптическую пе-
редачу при высокочастотной активности в возбуждающих синап-
сах, что сопряжено с зависимым от 5\/2А снижением интенсивнос-
ти зкзоцитоза и рециклирования синаптических везикул (Yang ct
al., 2007).
Появляются свидетельства о роли дефектов белков, участвую-
ших в везикулярном цикле в патогенезе и других расстройств. Так,
уровень белков, вовлеченных в экзопитоз и везикулярный транс-
порт, значительно изменяется (уменьшается количество - рабфили-
на ЗА, синтаксина, кинезинов 1А,1В,2А; возрастает концентрация -
динеина, динактина 1) в черной субстанции и стиатуме при сверхэк-
спрессии мутантного б-синуклеина (одна из форм болезни Пар-
кипсона). Эти изменения наблюдаются на ранней стадии, перед на-
чалом прогрессирующей потери нейронов (Chung ct al., 2009). В
случае болезни Гантингтотта, характеризующейся повсеместной
смертью нейронов в неокортексе и стриатуме наблюдаются специ-
фические аномалии в экзо- и эндоцитозе, которые проявляются пе-
ред клинической манифестацией симптомов заболевания (Li ct 211.,
2003). Нарушается сборка зндоцитозного мультипротеинового ком-
плекса, изменяется транспортировка и экзоцитоз синаптических
везикул. Болезнь Гантингтотта возникает вследствие экспрессии па-
тологической формы белка Гантинттона, у которого удлиненная по-
литлугамттновая последовательность (более 39 остатков). Этот бе-
лок участвует во внутриклеточном транспорте и локализуется в un-
'I‘OII.‘I:1'5MC, а также может ассоциироваться с покрьттымтт клатрттттоти
везнкуламтт, синаптичсскимн везпкуламн. ‘эндосомамтт, Комплексом
Гольджи. У мышей, имеющих патолотттческитй белок Гатттттттгтотта,
256
Табл .
4. Некоторые заболевания, потенциально связан-
ные с нарушением везикулярного цикла и процессов экзо- и эн-
ЦОЦИТОЗЗ.
‘$21642. теваттттс Пртпттактт Претрастттхтожентт Последствия
пожмите ранние ость
Болсттть Нгткоттлстттте допнтаитдотятттттго (‘ттнженттс зксттресстттт Уиеттьтттеэтиття Нарутттетттте
Аттьтттеттхтерз белю. потери снтт::тт«ттт.тьт&.ть тсттои белков m>xH1.1‘<,wa тксттрссеття mm .\:mm:icmm.
иенроттов m,':n1_ux1nsul_\P2_ AP-I80. ;mu:unm~ ибутетттттт тт
яитттхьттттт.стнтаттттттэтхтттттт еттятываттзтттеткт тнтчэтти
белка
(Нтттстфрсттттк Нчттеттеттттх СННЖСННС сттнтеш Сж-‚титтн Генетические Лстиртнтттттгттт
ттеттринрктттекгеттттътт тт u(n»csc.i (.‘\SI’, етэтмтттгттттЗ .‘~, ([»ilKl0[1bl (В т ч, на мыцтетт тт
ттрефттктттньтьтткттё хоры. ллтттттам \’.-‘\P, xo.\m_x-:r:cnu .u}'w1xn1 я тенак речи.
пнтттотснттттд, uc,nm,'mpca:n.nmr стттннтгефтгзтттт. Нчнцттты. Ыхткотд птхтдтнтттттттатттт
ядра 1~.1.ul.\1yw. H-I]‘}IHCHKlS убньзиттттттдттрьтхттттттс ноттлсчеттттьтх к и. мятннтт
6ШЁЁЁНЁЦ ПАНК. м) L)\hl['.| т: ЁЬЗКХЙРЫФ. твотткечсттттьтх н nc:m~y.1npn1,zi\
.'10(!m.\xu1m8 ШК рситтк тттрттшттттс тттткгтт. нрс-ттгттт
C\il|i\lIl'|1‘!L'\.'l\|lX НС MK}-"I !lUpHH{H<’I.lblH>!&.‘
nC£lk\';HlCHl|‘r|.
cumm.'u.m.:c
yc.2mau>x
'7l1:-l,'lcHL‘H:: B u'x:u'u u.1fi.=x2n,L1c'1cs1 Hcmmpo'm§\yc\n.w Мутитттттт. u том ‘)ттттто,т»т
сзторитттвпттттс и «идеи бьтетрьте ттеиткунэтрттьте числе н генах, ттетароттадьнтт
ттеттрдтттотт. на месте которых тттткдм. Ннкьннеттттня ьширунттттттх белки п
BU muxzuvr L'||l\|S|U:I.' } “ПНИ. «ЁКНШПОСГЬ '>)I,'l()1‘.H1\"|{l Н ЦШЯНППЧССКНХ [ННСТЫЪПНВЛО
криыттттятттнттття тт ияткитт ттеттттьхтттттхтшттттч nu'mk_».1$S\'2;\. стн.
итгттаттзттй обттнптке нон а стнннтгттчтсских нс ттткул $К:\Р-25. ньгттлкатотттттс
сттиаттсттттъц итттттьтлктт
Бттгтечттт. Уметтьтиеттттс ‘mum дсттдртттиьт Нсттяттт›.т;т.тт‚тт:тя Унелттчстттте (‘aii Нгтрутттетттте
I mm1m'10u.|
ттттттатткитт. т ттбсдть ,\1u«.»Ha<
ттеттртттттттт тоепбстттттт гредтттсто
рштхтертт] в нсокктртетшчт! n
ттекттшрьтх pm mum а‘: тилтьттьтл
тхттнтттетт
сттттитттттчсекгзя истинна
тзтдтсдтстттттс тнтттунтетттти
сбпрктт тттцтитттттитттпттт
коиттлгкса. Нтиеттеттття
lpJHk'[lUfHHf’(rHI\h‘ Н
тктотттттттьз кттттаттттттттсектт
ттеиттхутт.
тритьтстпн и теттеП
15. ньътттттуттттътехт
деток ттттттттттт тон
тдттттттнетея
участок m
UL. ГПНЫЦЗ
тлутазтттттл)
мьтттшетттит.
‘тнттт „ттельттот
и тготттрохтя.
игтштттсеьтте
pact троне rm
(‘nu трон
,7lu_\1m
8\xc:\I.u1cImc р:т тмсрз
т титтнткатмттз. прсфтютттзлътттттт
норы. нотке-тю. ттсттытстттттт
.1Стт;ц‘›т11‹_\тт_ ттттглетснрштеттттття
лстсттерлтттзэт хтьттнтерт тт-тсекттх
ттеттроттотт и 6.: ньттыярнозт яте
08,-2:1 souauuu x3c.u\msm\
cnumcnnii
('»cp\'upn'x_\-M1112(nu
-5‹г*-.‚т (те won Bl
v.pu\mco~.u,:. тисненая
‘ПЁЮНН Ш sIn.1cuc:xKu
mmxxttusmun. uurcprcmm
Ru'sp:tc'r тнттертт
(более 35 лет],
уттотребдсттттс
пенок-идти к
аекнрс т теетттттттх
llpcllzlpix mu
1upomuosuuanmnm
е среди т шт.
ртыттштттая
Зттдержкгт
учтет ВсЩКНТт
pa нит т ma.
.'1k‘()\Ch‘! т.т
сеттитат,
скелетных
мыттттт.
нитиуттттпй
системы
Ч Ё 257
наблюдается аномальное фосфорилирование синапсина 1, а с возра-
стом происходит прогрессивное снижение концентрации комплек-
сина 11 в НО. Некоторые белки, задействованные в зндоцитозе, спе-
цифично связываются с белком Гантингготта — это Н1Р1 (huntingtin
interacting protein 1), HIPIR, синдапин 1. При болезни Гантинггона
еиндаттин пропадает из пресинатттических регионов (протеин Ган-
тинттона обычно прочно его связывает), перестает должным обра-
зом функционировать Н1Р1, в итоге эндоцитоз сильно нарушается.
Нокаут белка HIP1 ведет к симптомам характерным для заболева-
ния: у мышей появляется тремор и атаксия. Даже дефекты умствен-
ного развития при синдроме Дауна возможно связаны со сверхэкс-
нрессией таких эндоцитозньтх белков 21 хромосомы как синаптоя-
нин и интерсектин.
Мышиные мутанты coloboma, y которых удален участок, вклю-
чающий 10-12 генов (в том числе ген SNAP—25), на 2 хромосоме
характеризуются гиперактивностью в течение бодрствования. При-
чем если мышам coloboma дополнительно встраивают гены, сверхэк-
спрессирующие SNAP—25, то гинерактивноеть не проявляется. По-
этому считают, что одна из причин синдрома дефицита внимания
с гиперактивностью возможно кроется в уменьшении экспрессии
SNAP—25 (Corradini ct a1., 2009).
B ДЗННОМ разделе были приведены данные, касающиеся пре-
имущественно событий экзо- и эндоцитоза синаптических везикул.
Однако при нейродегенеративттьтх заболеваниях также происходят
значительные нарушения в процессах ноетсинаптичеекого экзо- и
эндоцитоза рецепторов и трофических факторов, которые пока не-
достаточно исследованы.
258
Заключение
Обобщая представленные в книге данные, хочется отметить,
что процессы экзоцитоза и эндоцитоза присущи всем эукариоти-
ческим клеткам. Нейроны заимствовали и трансформировали эти
процессы для передачи информации в специализированных струк—
турах (химических синапсах), используя упикгшьньте пресинапти-
ческие элементы - синантические везикульт. Исследования преси-
наптического везикулярного цикла являются новым этапом в изуче-
нии синаптической передачи, а накопление знаний об экзо- и эндо-
цитозе, рециклировапии, кластеризации синаптических везикул, отт-
рсделение путей регуляции позволит выйти на совершенно новые
механизмы, управляющие квантовой секрецией медиатора и силой
синаптических контактов. Эти исследования могут явиться важным
ключом в понимании многочисленных интегративных функций го-
ловного мозга.
Экзоцитоз, эндоцитоз и везикулярный транспорт широко ис—
пользуются нейронами п в других процессах, напрямую не связан-
ньтми с секрецией медиатора. С участием специальных транспорт-
ных везикул происходят изменения молекулярной композиции мем-
бран (например, постсинаптических рецепторов), также лежащих
в основе точной настройки силы синапса, долговременной плас-
тичности, трансформации возбуждающих и тормозных влияний в
мозге. Процессы экзо A и эпдоцитоза тесно связаны с очень быстрой
структурной реорганизацией синаптического аппарата — увеличе-
нием или уменьшением синаптического контакта, образованием или
элиминацией синапсов. При участии этих процессов происходит
постоянный контроль «правильности» белковой и липидной ком-
позиции синаптических мембран, обеспечивается связь тела нервной
клетки с периферией.
Данные последних лет свидетельствуют о том, что многие пти-
роко распространенные, психические и неврологические заболева-
ния связаны с нарушениями зкзо- зпдоцъттоза и стойкими измене-
ниями в везикулярпом цикле. B связи с этим белки и липиды, уча-
ствующие в этих процессах, выглядят как перспективные мишени
для поиска новых лекарственных средств, упреждающих или оста-
навливающих патологический процесс. Не следует забывать, что в
ходе эпдоттитоза происходит пропикповсттие в первпые клетки ви-
русов (иммуподщриттттттат, герпеса, гриппа, бсптеттства. этщефалита,
ё 259
полиомиелита), бактериальных токсинов (ботулизма, столбняка, кок-
люша) и комплексов белков с тяжелыми металлами, представляю-
щих серьезную опасность для организма. Отсюда необходимость раз-
работки подходов к управлению процессами экзо- и эндоцитоза в
нервной системе становится еще более очевидной.
260
Литература
1. Ачьтман Я.А. и др. Физиология сенсорных систем и высшей нервной
деятельности в 2-х т. / М.: Академия, 2009. - 288с.
2. Анохин КВ. Обучение и намять в молекулярно-генетической перс-
иективе/ 12-е Сеченовские чтения. - М.‚ 1996. - С.23-65.
3. Архииова О.В.,1"риитинС.1-1., Ситдикова Г.Ф„ Зефиров А.Л. Пресинаи-
тические эффекты арахидоновой кислоты и иростагландина E2 B нервно-мы-
шечном синаисе лягушки // Росс. Физиол. журн. им. Сеченова. 2005. -~ T. 40,
Не 3, - С. 268-276.
4. Балабан Г1.М. Клеточные механизмы пластичности поведения в про-
стьтх нервных системах // Росс. Физиол. журн. им. Сеченова. - 2007. - T.93.
N95. - C.521-530.
5. Балезина 0.11., Роль внутриклеточных кальциевых запасов в нервных
терминалях в регуляции секреции медиатора // Усн. Физиол. наук. — 2002. — T.
33, М 3. — С. 1-31.
6. Балезина О.П.‚ Букия А.Н.‚ Лаптева В.И. Вызванная активность не-
рвно-мытттечньтх синапсов мыши на фоне действия дантролена и рианодитта //
Росс. Физиол. журн. им. Сеченова. — 2001. — Т. 87, N9 11,- C. 1511-1518.
7. Бениш Т.В., Зефиров А.Л., Фаткуллитт Н.Ф. Определение места осво-
бождения медиатора в двигательном нервном окончании лягушки при помо-
щи трех внеклеточных Микроэлектроды; // ДАН. —~ 1988. — T. 103. — C. 617-
621.
8. Блохина Г.И., Зефиров А.Л. Электрофизиологическое исследование
и морфологическое исследование синаптической организации тонических мь1-
шечньтх волокон // Физиолжурн. СССР. - 1984. - T.70. N92. - C.l57—l65.
9. Веселкин Н.П., Аданина В.О.‚ Рио Ж.-Р‚ Реиерётт Ж. Морфоттогттчес-
кий субстрат иресинатттической модуляции активности первичных афферен-
тов сиинното мозга // Росс. Физиол. журн. им. Сеченова. - 2004. - Т.90„ N28. -
(_`.416-422.
10. 1`усев 11.13. Движение немышечных щеток и реорганизация актино-
вьтх микрофиламентов // Соросовский образовательный журнал. - 2001. - T. 7.
N: 7. - C.1-7.
ll. Добрецов М.1`.. Зефиров А.Л., Куртасанов Р.С.‚ Халилов И.А., Ви-
нотрадова I/1.f\/1. Формирование нервных окончаний в фазных мышцах лягуш-
ки // 11ейрофи‘апология. - 1983. - 1.15, МЫ. - 089-107.
12. Захаров А.В.. Петров /\.M., Котов Н.В.„ 3е(1›иров А.Л. Исследование
McxaummupeuuK;1np0B:um;1 синаттттптескттх BL-2m<y;1//1$no(1)n’sm<a. - 2010.
13. Зефиров A.J1. Везикулярный цикл в иресинаптнттеском нервном окон-
261
чании // Рос. Физиол. Журнал. — 2007. — Т. 93, N9 5. — C554-563.
14. Зефиров АЛ. Медиаторы, эволюция предтсгаштеттттй // Вестник PAM11.
— 2005. - T. 1. и С. 1-4.
15. Зефиров А.Л. Везикулярпая гипотеза освобождения медиатора в си-
11a11cc// Соросовский образовательный журнал. - 2000. - Т. б, N9 9. - С. 1 -7.
16. Зефиров АЛ. ’):тетстро(1›и3иологичсская оценка секреции и запаса ме-
диатора в отдельной точке освобождения нсрвно-мьппечттого синапса // Бюлл.
экспер. биол. и мед. — 1984. - Т.48, N2 11. — С. 520-523.
17. Зефиров А.Л., Абдрахманов I\/1..\/1., Грнгорьев П.Н., Петров А.М. Внут-
риклеточный кальций и механизмы эндоцитоза сипаптических везикул в дви-
гательном нервном окончании лягушки // Цитология. — 2006. — T. 48, Хе 1. —
C.34-41.
18. Зефиров А. Л., Абдрахматтов М. М., Григорьев П. Н. Эффекты ги-
перкалиевьтх растворов и кофеина на процессы зкзо- эпдоцтгтоза синаптичес-
ких везикул в двигательном нервном окончании лятуптки // Росс. Физнол. журн.
им. Сечснова. — 2005. — Т. 91, N9 7. -~ C. 821-831.
19. Зефиров А. 11., Абдрахманов М. М., Гриюрьсв 11. 11. ”Kiss-and—111n”
механизм квантовой секреции медиатора в нервпо-мьттттеттттотхт сипапсе лягушки
// Бтолл. экспер. биол. и мед. — 2004. — Т. 137, N9 2. — C. 124-128.
20. Зефиров А.Л., Григорьсв П.Н. Чувствительность внутриклеточных
Са-связываютттих сайтов экзо- и эндоцитоза синаптнческих везикул к ионам
5т, Ва и Mg // Pocc. Физиол. журн. им. Сеченов- 2009. - Т. 95, ЮЗ, — С. 262-
272.
21. Зефиров А.Л., Григорьсв 11.Н. Топография и жринность кальциевых
сенсоров экзо- и эндоцитоза в двиггтгцътьпохт нервном окончании // Бюлл. эк-
спер. биол. и мед. — 2008. — Т. 146, N2 12. - C. 608-612.
22. Зефиров А.Л., Грпгорьсв 11.11., Пстров А.М., Миттлебаев МГ, Сит-
дикова Pd). Прижизненное флуоресцентное исследование двигательного пе-
рвного окончания лягушки с использованием эндоцтттозного маркера FM]-
43 // Цнтогтогия. -- 2003. T.45. N: 3. — (I1 163-1 178.
23. Зефиров А. 51., Захаров А. B.,I\/1yxa.\1c'1‘3s111o1; 1’.11., Негров А. .V1. Осо-
бенносги кругооборота c1111a1 ттттческих везикул в двигательных нервных окон-
чаниях лягушки и мыши // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. —
2008. — T. 44, ‚М: 6. — С. 603-612.
24. Зефиров А. 11., Захаров А. P06� Мухамедзянов Р. Д. Негров А. М.,
Ситдикова Г. Ф. Везикулярный цикл в двигательных нервных окончаниях ди-
афрагмы мьппп. Росс. Фпзиол. журн. им. (Ъ-ченов. — 2008. T. 94. N: 2. — (T.
129-141 .
25. Зефиров А.Л., Мухамедьяров M./\. Механизмы кратковременных
форм синаптпческой пластпчттоет н // Росс. Физиол. журн. нм. Сеченов. 2004.
262
- Т. 90. X9 8. - С. 1041-1059.
26. Зефиров А.Л., Петров А.М. Липиды в процессах экзо- и энцюттитоза
синаптических везикул // Росс. Физиол. жури. им. Сеченова. 2010. в неча-
ти.
27. Зефиров A.J1., 11611303 А.М. Эндоцитоз в нервной системе // Приро-
да. - 2009. - N9 9. —C. 12-20.
28. Зефиров А. Л., Сигдикова Г.Ф. Ионные каналы возбудимой клетки
(структура функция патология). ~— Казань: Арт-кафе, 2010. — 270с.
29. Зефиров А.Л., Столов ЕЛ. Статистический атталгтз процесса након-
ления кальция в нервном окончании при ритмическом раздражении // Бюлл.
эксп. биол. и мед. A 1982. - T.44, М 10. - С.3-5.
30. Зефиров АЛ, Черанов C .10. Молекулярные механизмы квантовой
секреции медиатора в сннансе // Успехи физиол. наук. -— 2000. -— Т. 31, N9 3. —
С .3-22.
31. Зефиров А.Л.‚ Шакирьянова Д.М. Действие экзогенного ацетилхо-
лина на каливые токи двигательного нервного окончания лягушки // Нейро-
физиология. ~— 1992. -- Т. 24, N2 6. — C. 678-683.
32. Зефиров А.Л., Халилов И.А. Структурные и функциональные пере-
стройки нервно-мьннечттьтх соединений амфибий // Физиология медиаторов.
Периферический синапс. - Казань.1984. - С.95-97.
33. Клячко Н.Л. Биологическая подвижность и полимеризация актина //
Соросовский образовательный журнал. — 2000. - T. 6, .\'9 10. - С.5-9.
34. J 1a6aC 10.A., Горлеева А.В. Неразгаданная Дарвином биолювшнес-
ценция // Природа. 2003. ~ М 2. С. 34-43.
35. Ma1‘a3auum<J1.1‘. Строение и функции центральных и нервно-мышеч-
ных синапсов / из кн. Современный курс классической физиологии под ред.
Ю.В. Наточина, В.А. Ткачука. - М.: Гэогар-Медиа, 2007. - С.59-99.
36. 1-Izrrotmn Ю.В. Физиология ночки / из кн. Современный курс класси-
ческой физиологии под pen. 10.B. НСГГОЧИНН. В.А. Ткачука. - М.: Гэотар-Ме-
диа, 2007. - C.6-33.
37. Ноздрачев АД. Начала физиологии / СПблЛань, 2001. - 1О88с.
38. Островский .V1./\. Молекулярная физиология зрительной рецепции/
из кн. Избранные лекции по современной физиологии под ред. М.А. Остро-
вского, A.j1. 3c(1)upoBa. — Apr—1<u(1)c, 1(a's:1m,, 2()1(). - C.6-33.
39. Пстров A..‘\/1, Гиниатуллитт А.Р.. Зсфиров А.Л. ul ТИФ-зависимая регу-
ляция рециклирования синаптнчсских везикул. // Неврологический вестник, —
2007. Т. 39, М 1. C. 207-208.
40. Негров А. М., 1`и11иа'1у:1лин А. Р.‚ Зефиров А. J1. Роль сигнального
каскада цАМФ в кругообороте синахггичсских везикул двигатсльнол о нсрвнош
окончания лягушки // Нсйрохимия. 2008. Т. 25, Ха 3. (_`. 202-210.
263
41 . Петров А.М.‚ Касимов МР,Гиниату:1лиг-1А.Р.. Тараканова О.И., Зе-
фиров А.Л. Роль холестерина в процессах зкзо-и энлоцитоза в ‚твигательном
нервном окончании лягушки // Рос. Физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 2009.
— Т. 95, N2 7. — С.762-772.
42. Петров А.М., Кудряшова К.Е., Одношивкитта Ю.Г.„ Зефиров А.Л. Хо-
лестерин и линидные плогики в плазматической мембране нервного оконча-
ния и мембране синаптических везикул // Нейрохимия. - 2011. - в печати.
43. Семченко В.В., Степанов С.С., Боголепов Н.Н. Синаптическая плас-
тичность головного мозга / Омск: Омская областная тинотрафия, 2008. - 408с.
44. С итдикова ГФ.. Халилов I/I.A., Зефиров, А.Л. Влияние фенола на ион-
ные токи двигательного нервного окончания лягушки // Рос. Физиол. журнал
им. И.М. Сеченова. — 1996. — Т. 82, N9 7. — C.78~84.
45. Ситднкова, Г.Ф. Газообразные посредники в нервной системе / Г.Ф.
Ситликова, А.Л. Зефиров // Рос. Физиол. журнал им. И.М. Сеченова. —20О6. —
Т. 92, Кв 7. —- C872-882.
46. Скребицкий В.1Ё Физиология памяти / из кн. Избранные лекции по
современной физиологии под рел. М.А. Островского, А.Л. Зефирова. - Арт-
кафе, Казань, 2010. - С.118-133.
47. Судаков КВ. Физиология мотиваций / из кн. Избранные лекции по
современной физиологии пол рел. М.А. Островского, А.Л. Зефирова. - Арт-
кафе, Казань, 2010. - С.267-302.
48. Тихонов А.Н. Молекулярные моторы. Часть 2. Молекулярные осно-
вы биологической прдвижности // Соросовский образовательный журнал. -
1999. - Не 6. - С.17-24.
49. Угрюмов М.В.Мозг в роли эндокринной железы во взрослом и раз-
вивающемся организме // Рос. Физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т.
90, N9 5. - C. 625-637.
50. Харакоз, Д.П. О возможной физиологической роли фазового нере-
хода «жидкое-твердое» в биологических мембранах // Усп. биол. химии. —
2001. — Т. 41. — C333-364.
51. Яковлев А.Н.. Ситцикова Г.Ф., Зефиров А.Л. Внутриклегочньпе пре-
сипаптические механизмы эффектов оксида азота (2) в нервно-мышечном
соединении лягушки // Нейрохимия. — 2004. — Т. 2!, М 4. — C.325-331.
52. Яковлева О.В.,(Ёи'т;1икова ГФ.,1`ерасимова ��b� Зефиров А.Л. Жир-
ные кислоты модулируют процессы секреции медиатора и функционирования
калиевых каналов в двигательном нервном окончании // Нейрохимия. — 2006.
— T. 23. М: 4. — (Г. 310-316.
53. Ahmari, S.F... Buchanan 1., Smith SJ. Assembly of prcsynaptic active
zones from cytoplasmic transport pz1ckcts// Nut. I\'<:urosci. - 2000 — Vol. 3, М 5.
— Р. 445-51.
264
54. Ahmadian G.. Ju Ш, 1..iu L. et а1. Tyrosine phosphorylation ol‘GluR2 is
required for insulin-stimulated AIVIPA receptor endocytosis and LTD // EMBO J.
- 2004 Vol. 10. —- P. 1040-1050.
55. Ahmed T., Frey J.U. Plasticity~specific phosphorylation ofCaM1(11,IV1AP-
kinases and CREB during late-LTP in rat hippocampal slices in vitro //
Neuropharmacology. - 2005. - Vol. »— 49. — P. 477-92.
56. Ahmed .\/1.S.. Siegelbaum S.A. Recruitment ofl\'-Type Ca(2+) channels
during LTP enhances low release efiicacy of hippocampal CA1 perfor-ant path
synapses // Neuron. -- 2009. — \/о1. 63. — P. 372-385.
57. Akbergenova Y., Bykhovskaia M. Enhancement of the endosomal
cndocytic pathway increases quantal size // Mol Cell Neurosci. — 2009. -— Vol. 40.
— P.199—206.
58. Anggono V, Smillie l(.J., Graham M.E., Valova V.A., Cousin M.A.,
Robinson P.J. Syndapin I is the phosphorylation-regulated dynamin 1 partner in
synaptic vesicle endocytosis. // Nat Neurosci. — 2006. — Vol. 9. — P. 752-60.
59. Alioura /\.. Tanaka Y... Wallncr M е: а1. The large conductance, voltage-
dependcnt, and calcium-sensitive K+~ channel, 1-lslo. is a target o1‘cGI\/1P-dependent
protein kinase phosphorylation in vivo // J. Biol. Chem. A 1998. -~ Vol. 273, М 49.
— P.32950-32956.
60. Р.5. Amieux, 1).E. Cumming, K. 1\/lotamed Compensatory regulation of
R1 alpha protein level in protein kinase А mutant mice / // J. Biol. Chem. A» 1997.
—— Vol. 272. Мг 7, ~ P.3993-3998.
61 . Amin N.D.. ZhengY.L., Kesavapany S.. Kanungo J., Guszczynski '1`.‚ Sihag
R.K., Rudrabhatla P., Albers “К, Grant P.. Pant H.C. Cyelin—dependent kinase 5
phosphorylation of human septin SEPT5 (h(fD(.‘rel-1) modulates exocytosis // J
Neurosci. — 2008 — \/о1. 28. - Р. 3631—3643.
62. Ап 5.. Zenisek D.Regulation ofexocytosis in neurons and neuroendocrine
cells // (.‘urr. Opin. Neurobiol. — 2004. -— Vol. 14. -› Р.522-530.
63. Andersson 17.. Jakobsson J., Luw P.. Shupliakov 0.. Brodin L. Perturbation
of syndapin/PACSIN impairs synaptic vesicle recycling evoked by intense
stimulation // J Neurosci. — 2008 — \/о1. 28. P3925-33.
64. Angleson J.K.. Betz W.J. 1ntraterminalCa(2+) and spontaneous transmitter
release at the frog ncuromuscularjunction // J Neurophysiol. — 2001. — Vol. 85.
1’.287-294.
65. Antonin W.. Reidel 1).. von :\/lollard G.F. The SNARE Vtila-beta is
localized to small synaptic vesicles and participates in a novel SNARE complex /
/ J. 1\'eurosci. — 2000. IK� Vol. 20. P.5724—5732.
66. Aravanis АЛИ. Pyle J.L., Tsien R.W. Single synaptic vesicle fusing
transiently and successively without loss of indentity // Nature. 2003. -- Vol.
423. P643-647.
��� 3 265
67. Attalejo C.R.. Elhamdani A., Palfrey H.C. Sustained stimulation shifts
the mechanism of endocytosis from dynamin—1—dependent rapid endocytosis to
clathrin- and dynamin -2-mediated slow endocytosis in chromaftin cells // PNAS.
-— 2002. — \/о1. 99, N9 9. — R6358-6363.
68. Ashby M.C., Maier S.R., Nishimune A., Henley J.M. Lateral dilfusion
drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated
by spine morphology // J Neurosci. - 2006 - Vol. 26. — Р. 7046-55.
69. Ashton A.C., Rahman M.A., Volynski K.E., Manser C., Orlova E.V.,
Matsushita Н., Davletov B.A., van Heel M., Grishin E.V., Ushkaryov Y.A.
Tetramerisation of alpha—latrotoxin by divalent cations is responsible for toxin-
induced non-vesicular release and contributes to the C a(2+)—dependent vesicular
exocytosis from synaptosomes.// Biochimie. — 2000. — Vol. — 82. — Р. 453-68.
70. Augustin J., Rosenmund C., SudhofT.C., Brose N. Munc13-1 is essential
for fusion competence of glutamatergic synaptic vesicle // Nature. -1999. — Vol.
400. — Р.457-461.
71. Augustine G.J:, Adler E.M.. Charlton lVl.P. The calcium signal for
transmitter secretion from presynaptic nerve tenninals // Ann N Y Acad Sci. —
1991. — \/‚ 635. — Р. 365-81.
72. Augustine G.J. How does calcium trigger neurotransmitter release‘? //
Curr Opin Neurobiol. — 2001. — V. 11. - P. 320-326.
73. Augustine G.J., Morgan J.R., Villalba-Galea C.A., Jin S., Prasad K., Later
ЕМ. Clathrin and synaptic vesicle endocytosis: studies at the squid giant synapse
// Biochem. Soc. Trans. — 2006 — Vol. — 34. — P.68—72.
74. Baba T., SakisakaT., Mochida S., Takai Y. PKA-catalyzed phosphorylation
of tomosyn and its implication in Ca2+-dependent exocytosis ofneurotransmitter
// J. Cell Biol. - 2005 —Vol. 170. - P.l1l3—1125.
75. Bacci A., Coco S., Pravettoni E.et а1. Chronic blockade of glutamate
receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between
synaptophysin-synaptobrcvin // J. Neurosci. — 2001. — Vol. 21. — P.6588—6596.
76. Bader M.-F., Doussau F., Golaz S.C. et al. Coupling actin and membrane
dynamics during ca1cium—regu1ated exocytosis: a role for Rho and Art'GTPases /
/ Biochimica et Biophysica Acta. — 2004. — Vol. 1742. -- P.37-49.
77. Baez L. M., Wcndeland B. Endocytosis adaptors: recruitment,
coordinators and regmlators // TRli1\'DS Cell Biol. —— 2006. — Vol. 16. — P505-
513.
78. Bajjalieh S.M., 1-‘rantz G.[)., Weimann J.M., McConnell S.1(., Schcller
КН. I)ifferential expression of synaptic vesicle protein 2 (SV2) isoforms. // J
Neurosci. - 1994 А Vol. 14. — P.5223—5235.
79. Baldwin M.L.. Rostas J.A., Sim Afl‘. Two modes of exocytosis from
synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and
266 {
2В. // J Neurochem. — 2003. - Vol. 85. - P.1l90-1199.
80. Balaji J., Ryan T. A. Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle
exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode // PNAS. —
2007. — \/о1. 104. — P. 20576-20581.
81. Balaji J., Arrnbruster M., Ryan T.A. Calcium control of the endocytic
capacity at a CNS synapse // J. Neurosci. — 2008. — Vol. 28. — Р. 6742-6749.
82. Ваппег L.R., Herrera A.A. Differences in synaptic efficacy at
neuromuscularjtmctions in frog twitch muscles //J Physiol. — 1986 — \/о1. 379. —
Р. 205-215.
83. Barclay J.W., Craig T.J., Fischer R.J. et al. Phosphorylation ofMunc 18
by protein kinase C regulates the kinetics of exocytosis // J. Biol. Chem. — 2003.
—Vol. 278. — P.10538—l0545.
84. Bar—On D., Gutman M., Mezer A., Ashery Ц, Lang T., Nachliel E.
Evaluation of the heterogeneous reactivity ofthe syntaxin molecules on the inner
leaflet of the plasma membrane // J Neurosci. — 2009. — Vol. 29. — P.12292-
12301. -
85. Barrett E.F., Stevens C.F. The kinetics of transmitter release at the frog
neuromuscularjunction // J. Physiol. -~ 1972. — Vol. 226. — P.69l—708.
86. Basu J ., Betz,A., Brose N., Rosenmtmd C.Munc13—1 Cl domain activation
lowers the energy barrier for synaptic vesicle fusion // J. Neurosci. — 2007. — \/01.
27. — P. 1200-1210.
87. Beard M.B._. Huston Е, Campbell L, Gall I. In additional to the SH3
binding region, multiple regions within the N-terminal noncatalytic portion ofthe
CAMP-specific phosphodiesterase, PDE4A5, contribute to its intracellular
targeting // Cell Signal. — 2002. — Vol. 14. — P.453-465.
88. Beaumont V., Zucker R.S. Enhancement of synaptic transmission by cyclic
AMP modulation of presynaptic 1h channels // Nature neurosci. — 2000. — \/о1. 3,
N2 2. — P.l33-141.
89. Becherer U., Rettig J.Vesicle pools, docking, priming and release // Cell
Tissue Res. — 2006. ~- Vol. 326. — P.393-407.
90. Beites C.L.. Campbell K.A., Trimble W.S. The septin Sept5/CDCrel-l
competes with alpha-SNAP for binding to the SNARE complex // Biochem. J. —
2005. — P. 385. — P.347-53.
91. Bennett ИВ. The origin offiaussian distributions of synaptic potentials
// Prog Neurobiol. » 1995. — Vol. 46. и Р.331-35О.
92. Bennett ТИК, Famell L., Gibson W.G. The probability ofquantal secretion
within an array of ealeium channels ofan active zone // Biophys J. — 2000. -- Vol.
78. P. 2222-40.
93. Benmerah /\._ Верю B., Dautiy-Varsat A.. Cerf-Bensussan N. The ear of
alpha-adaptin interacts with the COOH-terminal domain ofthe lips 15 protein //J
Ь 267
Biol. Chem. ���� 1996. — V. 271. - P.1l1—1l6.
94. Bethoney K./\., King M. С, llinshaw J. E., Ostap E. M., Lemmon M. A.
A possible effector role for the pleckstrin homology (P1-1) domain of dynamin //
PNAS. - 2009. — Vol. 106. ~ P. 13359»--13364.
95. Betz, W.J., Angelson J.K. The synaptic vesicle cycle //Annu.Rev. Physiol.
— 1998. — V. 60. — P.347-363.
96. Betz W.J. , Bewick G.S. Optical monitoring of transmitter release and
synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction // J .Physio1. Lond. —
1993. ~ V. 460. —~ P. 287-309.
97. Bezprozvanny 1., Seheller R.H., Tsien R.W. F Lmctional impact of syntaxin
on gating of N-type and Q-type calcium channels // Nature. — 1995. — Vol. 378. —
P.623-626.
98. Bezzi P.,Vo1terra A. A neuron-glia signalling network in the active brain.
// Curr Opin Neurobiol. — 2001. — Vol. ll. — P. 387-394.
99. Birks R., Huxley 1-1.E., Katz B. The fine structure of the neuromuscular
junction of the frog // J. Physiol. — 1960. -— Vol. 150. — Р. 134-144.
100. Birks К, Maclntosh F.C. Acetylcholine metabolism of a sympatic
ganglion // Canad. J. Biochem. Physiol. — 1961. — Vol. 39. — P. 787-827.
101. Bleck A. The neurologic-psychiatric ward in a general hospital
Krankenpflege (Frankt). 1989. Vol. 43. — P.499-506.
102. Blis T.V., Lomo T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission
in the dentate area oftne anaesthetized rabbit following stimulation ofthe perforant
path // J. Physiol. —- 1973. —— Vol. 232. -— P. 331-356.
103. Blondeau F., Ritter B., Patrick P.D. et а1. Tandem MS analysis of brain
clathrin-coated vesicle reveals thei critical involvement in synaptic vesicle
recycling // PNAS. — 2004. -› \/о1. 101. -- Р.3833-3838.
104. Bloom 0., Evergren E., Tomilin К, Kjaeru1ffO., Luw P., Brodin Д,
Pieribone V.A., Greengard Р.‚ Shupliakov O. Colocalization ofsynapsin and actin
during synaptic vesicle recycling // J Cell Biol. — 2003. 9- Vol. 161. — P.737-47.
105. Boczan J., Leenders A.G.. Sheng Z.11. Phosphorilation of synaptophilin
by cAMP-dependent protein kinase modulates its interaction with syntaxin-1 and
annuls its inhibitory effects on vesicle exocytosis // J. Biol. Chem. — 2004. — \/о1.
279. — P1891 1-18919.
106. Bonanomi A., MegegonA., I\/liccio М, et а! Phosphorylation ofsynapsin
by cA’.\/lP—depend protein kinase controls synaptic vesicle dynamics in developing
neurons // The J. ol’I\'curosci. — 2005. — Vol. 25, Не 32. P7299-7308.
107. Bonifacino .l.S., Schwartz J.L. Coat proteins: shaping membrane
transport // Nature Rev. Mol. Cell Biol. —- 2003. — V. 4. — P.409 —- 414.
108. Bos, J.1.. Epac: a new cAMP target and new avenues in c/\MP research
// Nat. Rev. M01. Cell Biol. 2003. А Vol.4. - P.733—738.
268
109. Boudreau A.C., Wolf M.E. Behavioral sensitization to cocaine is
associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus
accumbens // J. Neurosci. -- Vol. 25. P.9l44—9l5l.
110. Brandon ��O� Zhuo M., Huang Y.Y. ст а1. Hippocampal long-term
depression and depotentiaton are defective in mice carrying a targeted disruption
of the gene encoding the R1 В subunit ol‘c/\MP-dependent protein kinase // Proc.
Natl. Acad. Sci. 1995. — \/о1. 92. - P.8851—8855.
1 1 1. Brandst1_1tterJ.H., Fletcher ЕД, Gamer C.C.,Gunde1finger E.D.,W;1ssle
H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among
ribbon synapses in the mammalian retina. // Eur J Neurosci. 1999. — \/о1. 1. -
Р.3683-3693.
112. Braun А.‚ Pinyol К, I)ahlhaus К, Koch П, Fonarev P., Grant B.D.,
Kessels M.M., Qualmann B. EHD proteins associate with syndapin 1 and П and
such interactions play a crucial role in endosomal recycling // Mol Biol Cell. —
2005. — Vol. 16. — R3642-58.
1 13. Brinckerhot’r‘C.F.., Matrisian l...Vl. Matrix metalloproteinases: a tail of
a frog that became a prince // Nature Rev. Mol. Cell Biol. — 2002. — V. 3. — P.207-
214.
114. Broadie K., Prokop А., Bellen Н]. et al.Syntaxin and synaptobrevin
function downstream of vesicle docking in Drosophila // Neuron. — 1995. -— Vol.
15. —— P.663—673.
115. Brodin L. Actin-dependent steps the synaptic vesicle recycling //
Biochimic. -- 1999. -- V. 81. — P.49.
116. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated
vesicles / Brodsky ЕМ, Chen C.Y., Knuehl C.et a1. //Annu. Rev. Cell Dev. Biol. —
2001. — \/о1. 17. — P.5l7-568.
1 17. Brown A. Slow axonal transport: stop and go traffic in the axon // Nat
Rev Mol Cell Biol. -— 2000. — \/о1. 1. —- P. 153-156.
1 18. Bridgman P.C. .\/lyosin-dependent transport in neurons // J. Neurobiol.
—— 2004. — \/о1. 58. ��<� Р. 164-174.
1 19. Brose М, Rosmmund C., Rettig J. Regulation oftransmitter release by
unc-13 and its homologues // Curr. Opin. :\‘eurobiol. ч 2000. - Vol. 10. — R303-
31 1.
120. Brunelli .\/1., Castellucci V.. Kendal E.R. Synaptic facilitation and
behavioral sensitization in Aplysia: possible role of serotonin and cyclic AMP //
Science. — 1976. Vol. 194. —- 1’.l 178-1 181.
121. Biunger/\.T. Structure and function ofSN/\RE and SNARE-interacting
proteins // Q Rev. Biophys. ч 2005. - Vol. 38. ��� P.1--17.
122. Brunger A.T.. Rummel A. Receptor and substrate interactions of
elostridial neurotoxins // '1"oxicon.- 20()9io .'\/luuno 5410 и Р. 550-560.
269
123. Bruns П, Jahn R. Molecular determinant of exocytosis // J. Physiol. ~
2002. — \/о|. 443. — P333-338.
124. Bukharaeva Ella /\., Samigullin D., Nikolsky Е, Vyskocil Р. Protein
kinase A cascade regulates quantal release dispersion at frog muscle endplate // J.
Phisol. — 20()2. — Vol. 538, Хе 3. - P.837—848.
125. Burgoyne R.D., Morgan A. Secretoty granule exocytosis // Physiol.
Rev. ���� 2003. — Vol. 83. — P.58l-632.
126. Byers B., Goetsch 1... A highly ordered ring of membrane—associated
filaments in budding yeast // J Cell Biol. — 1976. —— Vol. 69. — P.7l7-721.
127. Cai Q., Pan P.Y., Sheng Z.H. Syntabulin-kinesin—1 family member SB-
mediated axonal transport contributes to activity—dependent presynaptic assembly
// J Neurosci. — 2007. — \/о1. 27. — P.7284-7296.
128. Cai Н., Reim K.. Varoqueaux Е, Tapechum S., Hill K., Smrensen J.B.,
Brose М, Chow R.H. Complexin I1 plays a positive role in Ca2+-triggered
exocytosis by facilitating vesicle priming. // Proc Natl Acad Sci. — 2008. — Vol.
105. — P.l9538-19543.
129. Camoletto P.G.. Vara Н., Morando L., Connell E.. Marletto ЕР, Giustetto
M.. Sasson-Pognetto M.. Van Veldhoven P.P., Ledesma M.D. Synaptic vesicle
docking: sphingosine regulates syntaxinl interaction with Munc18 // PLoS One.
— 2009. — Vol. 4. - P.e53l0
130. Castillo P.E., Janz R., Shdhof T.C., Tzounopoulos T., Malenka R.C.,
Nicoll R.A. Rab3A is essential tor mossy fibre long-term potentiation in the
hippocampus // Nature. —— 1997. — Vol. 388. —- Р.590-593.
131. Castillo P.E., Schoch S., Schmitz 1-‘., SsdhofT.C., Malenka R.C.
RJIV1 lalpha is required for presynaptic long-term potentiation // Nature. - 2002 —
Vol. 415. — P.327-330.
132. Del Castillo J, Katz B. Effects ofvagal and sympathetic nerve impulses
on the membrane potential of the frog’s heart // J Physiol. — 1955 —— Vol. 129. —
P.48-9P.
133. Catteroll W.A. Structure and regulation ofvoltage-gated Ca2+ channels
// Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. -- 2000. — \/о1. 16. - P.52l-555.
134. Ceccarelli B., Hurlbut W.P., Mauro A. Turnover of transmitter and
synaptic vesicles at the frog neuromuscularjunction //J Cell Biol. - 1973. — Vol.
57. -- Р.499-524.
135. Ceccarelli B.. llurlbut W.P. Vesicle hypothesis ofthe release ofquanta
of acetylcholine // Physiol Rev. Vol. 60. — P396-441.
136. Chad J.E., Eckert R. Calcium domains associated with individual
channels can account tor anomalous voltage relations ol‘(_?/\-dependent responses
//' Biophys J. 1984. Vol. 45. — P. 993-999.
137. Chamberlain l..H.. Burgoyne КН. (iould (НМ SNARE proteins are
270
highly enriched in lipid rafts in PC12 cells: implications for the spatial control
exocytosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2()01. — Vol. 98. — P.5619-5624.
138. Chamberlain L.H, Gould G.W. The vesic1e- and target- SNARE proteins
that mediated Cilut4 vesicle fusion are localized in detergent-insoluble lipid rafts
present on distinct intracellular membranes // J. Biol. Chem. — 2002. - Vol. 277.
— P.49750-49754.
139. Chang W.P., Sbdhof T.C. SV2 renders primed synaptic vesicles
competent for Ca2+ -induced exocytosis // J. Neurosci. ��~� 2009. - Vol. 29. —
Р.883-897.
140. Chapman E.R. Synaptotagmin: a Ca(2+) sensor that triggers exocytosis?
// Nat Rev Мо1 Cell Biol. — 2002. — Vol. 3. щ P.498—508.
141. Chen У, Deng L, Maeno-Hikichi Y., Lai M., Chang 5., С11еп Ci., Zhang
J.F. Formation of an endophilin-Ca2+ channel complex is critical for Clathrin-
mediated synaptic vesicle endocytosis // Cell. — 2003. ~ Vol. 115. — P.37-48.
142. Chen C.Y., Reese M.L.,1‘1wang P.K., Ota Х.‚ Agard D., Brodsky F.M.
Clathrin light and heavy chain interface: alpha-helix binding superhelix loops via
critical tryptophans // EMB() J. - 2002. — Vol. 21. — P. 6072-6082.
143. Chen X.W..1-‘eng Y.Q., Hao (11., Guo X.L., He Х.‚ Zhou Z.Y.. Guo М,
Huang 11.P., Xiong Щ, Zheng 1-1., Zuo P.L., Zhang C.X., Li W., Zhou Z. DTNBP1, a
schizophrenia susceptibility gene. affects kinetics of transmitter release // J. Cell
Biol. — 2008. — Vol. 181. и P.791—801.
144. Chen X., Tang J., SudhofT.C., Ri7.o J.Are neuronal SNARE proteins
Ca2* sensors‘? // J. Мо1. Biol. — 2005. -- Vol. 347, N9 1. - P.145-158.
145. С11сп Х.‚ Tomchick D.R., Kovrigin Е. Three-dimensional structure of
the complexin/SNARE complex // Neuron. — 2002. — Vol. 33. й P.397-409.
146. Chen Y.A.. Sheller R.11. SNARE-mediated membrane fusion // Nat.
Rev. Мо1. Cell Biol. �j� 2001. — Vol. 2. - P.98—106.
147. The stalk region of dynamin drives the constriction ofdynamin tubes /
Chen Y.J., Zhang Р, Fgelman E.1-1., Hinsha\vJ.F..//1\’at.Struct. Мо1, Biol. -2004.
—- Vol. 11. — Р.574-575.
148. Chen Х.‚ Barg S., Almers W. Release of the styryl dyes from single
synaptic vesicle in hippocampal neuron // J. Neurosci. — 2008. — Vol. 28. — P.
1894-18903.
149. Cheng X.. Arac 1)., Wang ГМ. et а]. SNARE-mediated lipid mixing
depends on the physical state ofthe vesicle // Biophys. J. -~ 2006. — Vol. 90. -- P.
2062-2074.
150. Chcung 11., Atwood H.L.. Zucker R.S. Presynaptic effectors contributing
to cA;\/[P-induced synaptic potentiation in Drosohpila // J. Neurobiol. — 2006. --
Vol. 66. ��A� P.273—280.
151. Chhcda M.(i._Ashrcry U., Thakur 1’. ct al. Pltosphorylation ofsnapin by
271
РКА modulates its interaction with the SNARE complex // Nat. Cell Biol. — 2001.
— Vol. 3. — P331-338.
152. Chieregatti Е, Witkin J.W., Baldini G. SNAP25 and synaptotagmin 1
function in Ca2+-dependent reversible docking ofgranules to the plasma membrane
//TrafT1c.— 2002. — Vol. 3. — R496-511.
153. Chicka M.C.. Chapman E.R. Concurrent binding of complexin and
synaptotagmin to liposome-embedded SNARE complexes // Biochemistry. ~ 2009.
— Vol. 48. — Р.:657-659.
154. Chung C.Y., Koprich J.B.. Hallett P.J.. lsacson О. Functional
enhancement and protection of dopaminergic terminals by RAB3B overexpression
// Proc Natl Acad Sci. — 2009. - Vol. 106. — P.22474-22479.
155. Clayton E.L., Evans G..l., Cousin М.А. Activity—dependent control of
bulk endocytosis by protein dephosphorylation in central nerve terminals // J.
Physiol. — 2007. — Vol. 585. —- P. 687-691.
156. Clayton E.L.. Cousin M.A. The molecular physiology of activity-
dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles // J. Neurochem. — 2009. - Vol.
111. - P. 901-914.
157. Clayton E.L., Evans G.J.. Cousin M.A. Bulk synaptic vesicle endocytosis
is rapidly triggered during strong stimulation // J Neurosci. — 2008. — P. 28. — Vol.
6627-6632.
158. Clayton E.L., Anggono V.,Smi11ie K.J., Chau М, Robinson P.J., Cousin
M.A. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-
dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles // J Neurosci. — 2009. — Vol. 29.
— P. 7706-7717.
159. Cochilla A.J., Angelson .l.K., Betz Ш}. Monitoring secretory membrane
with FMl—43 fluorescence // Annu. Rev. Neurosci. — 1999. —— V. 22. — P.1-10.
160. Cohen J.S., Brown НА. Phospholipases stimulate secretion in RBL
mast cells // Biochem. — 2001. -— Vol. 40. — P6589-6597.
161. Cohen 0., Kimchi A. DAP-kinase: from functional gene cloning to
establishment of its role in apoptosis and cancer // Cell Death Diller. — 2001, --
Vo1.8.—l’.6—15.
162. Cohn Z.A., Fedorko M.E., Hirsch .l.Ci. The in vitro differentiation of
mononuclear phagocytes V. The formation of macrophage lysosomes. // J Exp
Мед. — 1966. — Vol. 123. — P757-766.
163. Colbran R.J., Brown A.M. Calciurn/calmodulin-dependent protein kinase
ll and synaptic plasticity // Curr Opin Neurobiol. —- 2004. — Vol. 14. —~ P318-327.
164. Coleman W.L., Bill C./\.. Bykhovskaia M. Rab3a deletion reduces
vesicle docking and transmitter release at the mouse diaphragm synapse /./
l\'curoscience. ���� 2007. Vol. — 148. - P.1-6.
165. Connell ���� Darios 14., Brocrsen K., (iatsby М. Peak-(Ihew 0M�� Rickman
272
С., Davletov B. Mechanism of arachidonic acid action on syntaxin-Muncl8 //
EMBO Rep. — 2007. -- Vol. 8. -— R414-419.
166. Conner D.S., Schmid S.L. Regulation portals ofentry into cell // Nature.
— 2003. — Vol. 422. — Р. 37-44.
167. Conner D.S., Schmid S.L Difierential requirements forAP-2 in clathrin-
mediated endocytosis // J. Cell Biol. — 2003. - Vol. 162, N9 5. — Р. 773-779.
168. Conti R.. Tan Y.P., Llano l. Action potential-evoked and ryanodine—
sensitive spontaneous Ca2- transients at the presynaptic terminal of a developing
CNS inhibitory synapse. //J Neurosci. - 2004. -- Vol. 24. ›- Р.6946-6957.
169. Cousin М.А., Malladi C.S., Tan T.C. et al. Synapsin 1-associated
phosohatidylinositol 3-kinase mediated synaptic vesicle delivery to the readily
releasable pool // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278. — P.29065-29071.
170. Cousin M.A., Robinson P.J. Mechanisms ofsynaptic vesicle recycling
illuminated by fluorescent Dyes // J. Neurochem. — 1999. — V. 73. — P.2227 —
2239.
171. Cousin, MA. Two mechanism ofsynaptic vesicle recycling in rat brain
nerve tenninal / М.А Cousin, l’.J. Robinson // J. Neurochem. — 2000. — Vol. 75. --
R1645-1653.
172. Cousin M.A., Robinson P.J. The dephosphins: dephosphorylation by
calciuneurin triggers synaptic vesicle endocytosis // Trends Neurosci. ~— 2001. —
Vol. 24. — P. 659-665.
173. Couteaux R. Pficot-Dechavassine М. Synaptic vesicles and pouches at
the level of «active zones» of the neuromuscular junction // C R Acad Sci Hebd
Seances Acad Sci D. 1970. -~ Vol. 271. R2346-2349.
174. Coppola T., Hirling H.. Perret—.\/lenoud М, Gattesco S., Catsicas S.,
Joberty G., Macara l.G., Regazzi R. Rabphilin dissociated from Rab3 promotes
endocytosis through interaction with Rabaptin-5 // J Cell Sci. — 2001. — Vol. 114.
— l’.l757—l764.
175. Corradini 1., Verderio С., $а1а М., Wilson lVl.C., Matteoli M. SNAP-25
in neuropsychiatric disorders // Ann N YAcad Sci. — 2009. ~ Vol. 1152. — R93-99.
176. Gracheva F..()., Burdina A.O., llolgado A.M.. Berthclot-Grosjean M..
Ackley B.D., lladwiger G.. Nonet .Vl.L., Weimer R.M.. Richmond J.E. Tomosyn
inhibits synaptic vesicle priming in Caenorhabditis clegans // Pl-oS Biol. — 2006.
Vol. 4.- 1’. с261.
177. Craft G.l£., Graham Bache М, Larsen f\/1.R.. Robinson Р}. The in
что phosphorylation sites in multiple isoforms ofamphiphysin 1 Нот га1 brain
nerve terminals // .\/lol (‘ell Proteomics. — 2008. — Vol. 7. — Р.1 146-1161.
178. (,'raigT.(i.. Evans G.J.. Morgan A. Physiological regulation ofMuncl8/
nScc1 phospliorylation on scrine—3 13 //J. .\'eur0cliem. - 2003. Vol. 86. — Р. 1450-
1457.
273
179. Greener T., Zhao X., Nojima 1-1., Eisenberg Е. Greene LE. Role of
cyclin G-associated kinase in uncoating clathrin-coated vesicles from non-neuronal
cells //J Biol Chem. — 2000. Vol. 275. Р.1365-137О.
180. Сгстопа 0., DeCamilli P.J. Phosphoinositides in membrane trafiic at
the synapse //` J. Cell Sci. — 2001. — Vol. 114, М 6. -— P.l04l—1052.
181. Groffen A.J., Martens S., Вне: Arazola R., Comelisse ДМ, Lozovaya
М, de Jong A.P., Goriounova ճ� Habets R.L., Takai Y., Borst J.G., Brose �w��
McMahon H.T., Verhagc M. Doc2b is a high-afiinity Ca2+ sensor for spontaneous
neurotransmitter release // Science. — 2010 — Vol. 327/ — P. 1614-1618.
182. Crowder K.M., Gunther J.lVl., Jones T.A., Hale B.D.. Zhang H.Z.,
Peterson M.R., Scheller R.H., Chavkin C., Bajjalieh S.M. Abnormal
neurotransmission in mice lacking synaptic vesicle protein 2A (SV2A) // Proc
Natl Acad Sci. — 1999. —- Vol. 96. P:15268—15273.
183. Cubelos B., Gonz6lez-Gon7.6le7. l.M,, Gimfinez C., Zafra F. The
scaffolding protein PSD—95 interacts with the glycine transporter GLYTI and
impairs its internalization. // J Neurochem. — 2005. — Vol. 95. — P.l()47-1058.
184. Custer S.K., Garden G.A., Gill N., Rueb U., Libby R.T., Schultz C.,
Guyenet S.J., De11crT.. Westrum L.E.. Sopher B.L.. La Spada A.R. Bergmann glia
expression of polyglutamine-expanded ataxin-7 produces neurodegenetation by
impairing glutamate transport // Nat Neurosci. — 2006. - Vol. 9. — P.13()2—1311.
185. Пай, Z., Репа, ll.B. Dynamics of synaptic vesicles in cultured spinal
cord neurons in relationship to synaptogenesis // Mol. Cell Neurosci. — 1996. —
Vol. 7. —— P. 443-452.
186. Daly C., Sugimori IVl.. 0/loreira J.E. ст а1. Synaptophysin regulates
c1athrin—independent endocytosis of synaptic vesicle // PNAS. — 2000. — \/о1. 97.
N9 ll. — P.6l20—6l25.
187. Danglot L., Galli T. What is the function ofneuronal AP-3'? // Biol Cell.
— 2007. — Vol. 99. — P. 349-361.
188. Darios Е, Davletov B. Omega-3 and omega-6 fatty acids stimulate cell
membrane expansion by acting on syntaxin 3 // Nature. 2006. - Vol. 440. A
P.813-817.
189. l)arios 1-‘.,Connel1E..DavletovB.Phospliolipases and fatty acid signalling
in exocytosis // J. Physiol. 2007. Vol. 585. P. 699-704.
190. Darios 17., Wasser C.. Shakirzyanova /\., Giniatullin A., Goodman K..
Munoz-Bravo J.l.., Raingo J., Jorgacevski J., Kreft .'\/1., Zorec К, Rosa J.M.. Gandia
L, Gutii7irrez L.M., Binz T., Giniatullin R., Kavalali E.T.,l)av1etov B. Sphingosine
facilitates SNARE complex assembly and activates synaptic vesicle exocytosis //
Neuron. — 2009. —Vol. 62. — 683-694.
191. Daugaard M., Rohde :Vl.. Jjulttcljl M. The heat shock protein 70 family:
llighly homologous proteins with overlapping and distinct functions // 1-‘IZBS 1.ctt.
274 Q
— 2007. �A�� Vol. 581. — R3702-3710.
192. Daumke 0., Lundmark R., Vallis Y., Martens S., Butler P.J., McMahon
H.T. Architectural and mechanistic insights into an EHD ATPase involved in
membrane remodelling. Nature. — 2007. — Vol. 449. — P923-927.
193. Deak Е, Schoch S., Liu X.et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic
vesicle endocytosis // Nat. Cell. Biol. — 2004. — Vol. 6. — P.ll02-1108.
194. Deak F., Shin O.H., Tang J., Hanson Р, Ubach J., Jahn R., Rizo J., Kavalali
E.T., SbCll’10fT.C. Rabphilin regulates SNARE-dependent re-priming of synaptic
vesicles for fusion // EMBO J. — 2006. — \/о1. 25. — P.2856—2866_
195. Deak Е, Liu X., Khvotchev M., Li G., Kavalali E.T., Sugita S., Sbdhof
Т.С. Alpha-latrotoxin stimulates a novel pathway of Ca2+-dependent synaptic
exocytosis independent of the classical synaptic fusion machinery // J. Neurosci.
ю 2009. ›- Vol. 29. - P.8639—8648.
196. Debanne D. Information processing in the axon // Nat. Rev. Neurosci.
— 2004. —Vol. — 5. — R304-316.
197. De Camilli Р.‚ Takei K. Molecular mechanisms in synaptic vesicle
endocytosis and recycling // Neuron. — 1996. — V. 16. — Р.481-486.
198. Deinhardt K., Beminghausen O._, Willison H.J., Hopkins C.R., Schiavo
G. Tetanus toxin is intemalized by a sequential clathrin-dependent mechanism
initiated within lipid microdomains and independent of epsinl. // J Cell Biol. —
2006. — Vol. 174. — P459-471.
199. Dell’Acqua, M.L. Regulation of neuronal PKA signaling through AKAP
targeting dynamics / M.l.. Dell’/\cqua, КБ. Smith, J.A. Gorski // J. Cell Biol. -4
2006. — Vol. 85. — P.627-633.
200. Delgado К. Maureira С., Oliva С, Kidokoro Y.. Labarca P. Size of
vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses ofa
Drosophila mutant, shibire // Neuron. — 2000. — Vol. — 28. — P. 941-953.
201. De Rooij J., Rehmann H., van Triest M., Cool R.1-I..\/lechanism of
regulation of the Epac family ofcAIV1P—dependent // J. Biol. Chem. -2000. —— Vol.
275. — P.20829—20836.
202. Diao J., Yoon ТЖ, Su 7,., Shin Y.K., На Т. (J2AB: a molecular glue for
lipid vesicles with a negatively charged surface // Langmuir. -— 2009. — Vol. 25. —
P.7177—7l80.
203. Dieck T.S., Altrock W.D., Kessels M.M._ Qualmann B., Regus Н.,
Brauner D. Fejtov6 A.. Bracko 0., Gundelfinger E.D., Brandstr1tterJ.1-I. Molecular
dissection of the photoreceptor ribbon synapse: physical interaction of Bassoon
and RIBEYE is essential for the assembly of the ribbon complex //J Cell Biol.
2005. Vol.l68. ч Р. 825-836
204. Dillon С, (ioda Y. The actin cytoskeleton: integrating form and function
at the synapse // Annu Rev Neurosci. A 2005. - Vol. 28. — P.25-55.
275
205. Di Paolo G.. Sankaranarayanan S.. Wenk M.R., Daniell L., Pemcco Н.
Caldarone B.J., Flavcll R., Picciotto M.R., Ryan Т.А., Сгетопа 0., De Camilli P.
Decreased synaptic vesicle recycling efficiency and cognitive deficits in
amphiphysin 1 knockout mice // Neuron. - 2002 Vol. — 33. -— P. 789-804.
206. Di Paolo G., DcCailli P. Phospholipides in cell regulation and
membrane dynamics // Nature. ~— 2006. — Vol. 443. — P.65l-657.
207. DiPao1o G., Moskowitz H.S., Gipson K.et al. Impaired Ptd1ns(4.5)P2
syntesis in nerve terminals produces defects in synaptic vesicle trafficking //
Nature. — 2004. -- Vol. 431. — P.4l5-422.
208. Diril M.K., Wienisch M., Jung N.eta1. Stonin 2 is an AP-2—dependent
endocytic sorting adaptor for synaptotagmin intemalization and recycling // Dev.
Cell. — 2006. — Vol. 10, Кв 2. — P233-244.
209. Dittman J., Ryan T.A. Molecular circuitry of endocytosis at nerve
terminals // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. —- 2009. Vol. 25. — P. 133-160.
210. DityatevA., Schachner M. Extracellular matrix molecules and synaptic
plasticity // Nature Rev. Neurosci. — 2003. —V.4.N6. — P.456—468.
211. Dodge F.A., Rahamimoff R. Co—operative action a calcium ions in
transmitter release at the neuromuscularjunction // J Physiol. — 1967. — V.193. -
P. 419-432.
212. Domek-Lopacinska K,, Strosznajader J.B. Cyclic GMP metabolism
and its role in brain physiology // J. Physiologe and Pharmacology — 2005. — Vol.
56, Не 2. — Р.15-34.
213. Doray B., Lee 1., Knise1yJ., Bu G.. Komfeld S. The gamma/sigma] and
alpha/sigma2 hemicomplexes of clathrin adaptors АР-1 and AP-2 harbor the
dileucine recognition site // Мо1 Biol Cell. — 2007. — Vol. 18. — P. 1887—1896.
214. Doussau F., Augustine G.J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter
release: an overview // Biochimie. — 2000. — Vol. 82. — P.353-363.
215. Doussau F., Gasman 5., Humeau Y. et al A RhoA-related GTPase is
involved in Ca2+-dependent neurotransmitter exocytosis // J. Biol. Chem. — 2000.
~ Vol. 275. — P.7764—777().
216. Dresbach '11, Qualmann B., Kessels M.M. et al. The presynaptic
cytomatrix of brain synapses // Cell Мо1. Life Sci. — 2001. — Vol. 58. — P.94-116.
217. Dreyer Е, Рерсг К.‚ Akert 1(., Sandri (Д, .V1oor Н. Ultrastmcture ofthe
«active zone» in the frog neuromuscularjunction // Brain Res. — 1973. Vol. 62.
— P.373-380.
218. Dulubova1., Khvotchcv M.. 1.iu S.eta1. Munc18—1 binds directly to the
neuronal SNARE complex // Proc. Natl. Acad. Sci. —— 2()()7. Vol.l04, Мг 8. —
R2697-2702.
219. Dulubova 1., Sugita S.. Hill S. ст al./\ conformational switch in syntaxin
(hiring exocytosis // Ef\/lB() J. 1999. Vol. 18. »— P.4372—4382.
276 Q .
220. Dunaevsky /\., Connor E.A. F-actin is concentrated in nonrelease
domains at frog neuromuscular junctions // J l\'eurosci. ~— 2000. - Vol. 20. — P.
6007-6012.
221. Duncan R.R., Greaves J., Wiegand ЦК. et al. Functional and spatial
segregation of secretory vesicle pools according to vesicle age // Nature. A~ 2003.
— Vol. 422. — P.l76-I80.
222. Duncan M.C., Payne G.S.. Cell biology: protein choreography // Nature.
— 2005. — Vol. 438. — P. 571-573.
223. Eccls J.C. The physiology of synapses // Springer-Verlag Berlin
Gottingen—Heidelberg. — 1963. — 396 р.
224. Ehrlich M., Boll W., Van Oijen A., Hariharan К, Chandran K., Nibert
M.L., Kirchhausen Т. Endocytosis by random initiation and stabilization ofclathrin-
coated pits // Cell. -- 2004. — Vol. 118. — P. 591-605.
225. Etherington S.J., Everett A.W, Postsynaptic production of nitric oxide
implicated in long-term depression at the mature amphibian (Bufo marinus)
neuromuscular junction // J. Physiol. — 2004. �Գ� Vol. 559, N92 — P.507-5l7.
226. Elmqvist D., Quastel D.M. A quantitative study of end-plate potentials
in isolated human muscle //J Physiol. — 1965. — Vol. 178. -— Р. 505-529.
227. Evans G.J., Cousin МА. Activity-dependent control ofslow synaptic
vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5 // J. Neurosci. — 2007. — Vol.
27. — P. 401-4l l.
228. Evans G.J., Morgan A. Regulation of the exocytosis machinery by
cAMP-dependent protein kinase: implications for presynaptic plasticity //
Biochem. Society Transactions. — 2003. - Vol. 31, М 4. — R824-827.
229. Evans (}.J., Morgan А.‚ Burgoyne R.D. Tying everything together: the
multiple roles of cysteine string protein (CSP) in regulated exocytosis // Tratlic.
— 2003. — Vol. 4. — R653-659.
230. Evans R.M., Zamponi G.W. Presynaptic Ca2+ channels — integration
centers for neuronal signaling pathway // Trends Neurosci. — 2006. А- \/о1. 29. —
P.6l7-624.
231. Evergren E., (lad l-1., Walther K., SundborgerA., Tomilin �,�� Shupliakov
О. lntersectin is a negative regulator of dynamin recruitment to the synaptic
endocytic zone in the central synapse // J. Neurosci. — 2007. — Vol. 27. — P. 379-
390.
232. Exton J.l-l. Regulation ofphosphplipase D // FEBS Lett. — 2002. �9�� Vol.
531. — P58-6!.
233. l“a1‘qt1har l\/I.G.. Palade ОБ. Segregation offerritin in glomerular protein
absorption droplets //J Biopliys Biochem Суш]. — 1960. — Vol. 7. — P. 297-304.
234. Farsad K., De Camilli P. Mechanisms of membrane deformation //
Curr Opin Cell Biol. 2003. —- Vol. l5. - P. 372-381.
277
235. Farsad K., Ringstad N, Takei K.et al. Generation of high curvature
membranes mediated by direct endophilin bilayer interaction // J. Cell Biol. —
2001. — Vol. 155. — P.193—200.
236. Farsad K., Slepnev V., Ochoa G.et al. A putative role for intramolecular
regulatory mechanisms in the adaptor function ofamphiphysin in endoeytosis //
Neuropharmaeol. — 2003. —Vol. 45. — P. 787-796.
237. Ран Р.‚ Katz D. Membrane potentials at the motor end-plate //J Physiol.
— 1950. — Vol. 111. — P. 46-47.
238. Feil R., Hartmann J_. I-uo C.et al. Impairment of LTP and cerebellar
leaming by Purkinje ee1l—speeifie ablation of eGMP—dependent protein kinase 1 /
/J. Cell. Biol. — 2003. — \/о1. 163. — Р.295-3О2.
239. Feng J., Chi P., Blanpied T.A., Xu У, Magarinos A.M., Ferreira A.,
Takahashi КН. Као Н.Т.. МсЕшсп B.S., Ryan T.A., Augustine G.J., Greengard P.
Regulation of neurotransmitter release by synapsin III // J Neurosei. — 2002. —
Vol. 22. — Р. 4372-4380.
240. Femandez I., Arac 1)., Ubach J.et al. Three—demensional structure of
the synaptotagmin 1 C2B-domain: synaptotagmin 1 as a phospholipid binding
machine // Neuron. —— 2001. ~ Vol. 32. — P.1057-1069.
241. Femandez-Chaeyn R., Wolfel M., Nishimune Н., Tabares L., Sehmitz
Е, Castellano-Mucoz M., Rosenmund C., Montesinos .Vl.L., Sanes J.R.,
Schneggenburger R., SudhoI'T.C. The synaptic vesicle protein CSP alpha prevents
presynaptic degeneration // Neuron. — 2004. — Vol. 42. — P. 237-251.
242. Femandez—Sanehez E., Martynez-Villarreal J., Gimqnez C.. Zafra F.
Constitutive and regulated endocytosis of the glycine transporter CiLYT1b is
controlled by ubiquitination // J Biol Chem. — 2009. ~ Vol. 284. — Р. 19482-
19492.
243. Ferrero R., Pascual F.R., Portugal M.'I‘.M., Tores M. Nitric oxide-
sensitive guanylyl eyelase activity inhibition through cyclic GMP-dependent
dephosporylation // J. Neurochem. 2000. — Vol. 75. — P.2029-2039.
244. Fesce Е, .’\/leldolesi J. Peeping at the vesicle kiss // Nature Cell Biol. --
1999. —V. 1. — P.I:‘3-E4.
245. FingerhutA., von Figura К, I-Ioning S. Binding ofAP—2 to sorting signals
is modulated by /\P—2 pliosphoiylation //J. Bil. Chem. — 2001. — \/01.276. А- Р.5476—
5482.
246. Finley .’\/l.F., Scheller КН, Madison D.V. SNAP—25 Ser187 does not
mediate phorbol ester enhancement of hippocampal synaptic transmission //
Nctirophannacology. -- 2003. ч Vol. 45. — P. 857-862.
247. Fisher R. .I., Pevsner J., Burgoyne КО. Control offusion pore dynamics
during cxocytosis by .VIunc18 // Science. » 2001. Vol. 291. —~ P.875-878.
248. Fischer шт Mollard С.‚ Stahl В, Solimena (ДАМ et al. l-ocali'/.ation of
278
гаЬ5 to synaptic vesicle identifies endosomal intermediate in synaptic vesicle
recycling pathway // Eur. J, Cell Biol. — 1994. — Vol. 65. — P.319-326.
249. Fischer von Mollard G.. Stahl B., Li С.‚ БЬСПЮГТЁС. Jahn R. Rab proteins
in regulated exocytosis // Trends Biochem Sci. A 1994. — Vol. 19. @�� P. 164-168.
250. Fletcher A.I., Shuang R., Ciiovannucci D.R. et а1. Regulation of
exocytosis by cyclin dependent kinase 5 via phosphorilation ofMunc18 // J. Biol.
Chem. — 1999. —- Vol. 274. �/�� P.4027—4035.
251. Foletti D.L., Prekeris R., Scheller КН. Generation and maintenance of
neuronal polarity: mechanisms of transport and targeting // NeLu'on. — 1999. — V.
23. — Р.641-644.
252. Fo1ettiD.L., Lin К, Finley M.A.,Schcl1er R.H. Phosphorylated syntaxin
1 is localized to discrete domains along a subset of axons // J Neurosci. — 2000. —
Vol. 20. — P. 4535-4544.
253. Ford M.G., Mills I.Ci., Peter B.J. е! а1. Curvature ofclathrin-coated pits
driven by epsin // Nature (London). — 2002. — \/о1. 419. — Р.361-366.
254. Ford M.G., Pearse B.l\/1., Higgins M.K. ст a1. Simultaneous binding pf
Ptdlns(4,5)P2 and clathrin by AP18O in the nucleation of clathrin lattices on
membranes // Science — 2001. — Vol. 291. —— P.1051—1055.
255. Fotin A., Cheng Y.F., Sliz P.eta1. Molecular model for complete clathrin
lattice from electron cryomicroscopy // Nature. -- 2004. — Vol. 432. — Р.537-579.
256. Fouquet W., Owald D., Wichmann C., Mertel S., Depner Н.‚ Dyba M.,
Hallermann S., Kittel R.J., Elmer S., Sigrist S.J. Maturation ofactive zone assembly
by Drosophila Bruchpilot // J Cell Biol. — 2009. - Vol. 186. — P. 129-145.
257. Frederikse P.H., Yun 13., Kao H.T., Zigler J.S. Jr., Sun Q., Qazi A.S.
Synapsin and synaptic vesicle protein expression during embryonic and post-natal
lens fiber cell differentiation // Ио! Vis. — 2004. -— Vol. 10. ���� P. 794-804.
258. Friedrich КР, Тсррсг К., Runicke R., Soom M., Westermann .Vl.,
Reymann К, Kaether С.‚ Fnndrich M. Mechanism of amyloid plaque formation
suggests an intracellular basis of/\beta pathogenicity // PNAS. — 201 О. — \/о1. 107.
~— P. 1942-1947
259. Fredj ВЫ, Burrone J. A resting pool of vesicles is responsible Юг
spontaneous vesicle fusion at the synapse // Nat. Neurosci. — 2()()9. — Vol. 12. — P.
75 1-758.
260. Friedrich К, Yeheskel /\., Ashery U. DOC2B, C2 domains. and calcium:
A tale of intricate interactions // Ио] Neurobiol. —— 2010. — Vol, 41 .- Р.42-51.
261. Fujita Y., Shirataki 11., Sakisata T.et а1. Tomosyn: a syntaxin-1-binding
protein that forms a novel complex in neurotransmitter release process // Neuron.
-- 1998. — Vol. 20. — P905-915.
262. Fykse l{.M., Fonnum F. Amino acid ncurotransmission: dynamics of
vesicular uptake // Neurochem. Res. —- 1996. A Vol. 21. P.1()53-1060.
- › 279
263. Gad I-1., Ringstad М, Low P.et al. Fission and uncoating of synaptic
clathrin-coated vesicles are pcrtrurbed by disruption of interactions with the SH3
domain of endophilin // Neuron. — 2000. — Vol. 27. — P301-312.
264. Gad H., Luw P., Zotova Е.‚ Brodin Д, Shupliakov О. Dissociation
between Ca2+—triggered synaptic vesicle exocytosis and clathrin—mediatcd
endocytosis at a central synapse // Neuron. — 1998. — Vol. 21. — P. 607-616.
265. Gaffield M.A., Rizzoli 5.0., Betz W.J. Mobility of synaptic vesicles in
different pools in resting and stimulated frog motor nerve terminals // Neuron. —
2006. — Vol. 51. — Р.317-325‚
266. Galarreta M., Hestrin S. Spike transmission and synchrony detection
in networks of GABAergic intemeurons // Science. — 2001. — Vol. 292. — P. 2295-
2299.
267. Galli T., Haucke V. Cycling of synaptic vesicles: how far? how fast? //
Sci. STKE. — 2004. — Vol. 19. — P.l—l2
268. Galli T., Haucke V. Teaching resources. Calcium—triggered exocytosis
and clathrin-mediated endocytosis of synaptic vesicles // Sci STKE. — 2005. - Vol.
267. — P. trl.
269. Gallop J.L.,Blut1er P.J., McMahon T. Endophilin and CtBP/BARS are
not acyl transferases in endocytosis or Goldgi fission // Nature. — 2005. — Vol.
438. — P.675—678.
270. Galvan M.D., Luchetti S., Burgos A.M., Nguyen H.X., Hooshmand M.J.,
Hamers F.P., Anderson АД. Deficiency in complement Clq improves histological
and functional locomotor outcome afier spinal cord injury // J Neurosci. — 2008.
— Vol. 28. — P.13876-13888.
27l. Gandhi S.P., Stevens C.F. Three modes of synaptic vesicular recycling
revealed by single-vesicle imaging // Nature. — 2003. — Vol. 423. — P. 607-613.
272. Garcia C.C., Blair H.J., Seager M., Coulthard A., Tennant S., Buddlcs
M., Curtis A., Goodship .l.A. Identification ofa mutation in synapsin l, a synaptic
vesicle protein, in a family with epilepsy. // J Med Genet. — 2004. — Vol. 41. — P.
183-186.
273. Geppert M., Сода Y., Hammer R.E.. е: al. Synaptotagmin I: A major
Ca2+ sensor for transmitter release at a central synapse // Cell — 1994. — V. 79. —
P.7l 7-727.
274. Georgiou J., Robitaille К, Charlton M.P. ’.\/luscarinic control of
cytoskeleton in perisynaptic glia // J Neurosci. — 1999. — Vol. 19. - R3836-46.
275. Gerber S.H., Sudhof T.C. Molecular determinants of regulated
exocytosis // Diabetes. — 2002. — Vol. 51. - P.s3—s11.
276. von Gersdorff H, Matthews G. Electrophysiology of synaptic vesicle
cycling // Annu Rev Physiol. — 1999. — Vol. Ы. 0j�� Р. 725-752.
277. Gibbs S.J.. Barren B.. Beck K.li., Proft 1.. [то Х.‚ l\'oskova T., Braun
280
А.Р., Anemyev N.O., Braun J.E. Hsp40 couples with the CSPalpha chaperone
complex upon induction of the heat shock response // PLoS One. — 2009. »— Vol. 4.
— P. e4595.
278. GiovedM 5., Darchen Р.‚ Valtona F., Greengard Р.‚ Benfenati F. Synapsin
is a novel Rab3 effector protein on small synaptic vesicles. 11. Functional effects
ofthe Rab3A-synapsin I interaction //J Biol Chem. 2004. —~ Vol. 279. -— P. 43769-
43779.
279. Giniatullin A.R., Grishin S.N., Sharifullina E.R., Petrov A.M., Zetirov
A.L., Giniatullin R.A. Reactive oxygen species contribute to the presynaptic action
of extracellular ATP at the frog neuromuscular junction // J . Physiology. — 2005. ~
V. 565, N2 1. -^ Р.229-242.
280. Girard M., Allaire Р.1), McPherson P.S., Blondeau F. Non-
stoichiometric relationship between clathrin heavy and light chains revealed by
quantitative comparative proteomics of clathrin-coated vesicles from brain and
liver // Mol Cell Proteomics. — 2005. - Vol. 4. — P. 1145-1154.
281. Giraudo C.G.. Eng W.S.. MeliaT.J.. Rothman J.E. Aclamping mechanism
involved in SNARE-dependent exocytosis // Science. — 2006. — Vol. 313. — Р.676-
680.
282. Gitler 13., Takagishi Ж, Feng 1., Ren Ж, Rodriguiz R.M., Wetsel W.C..
Green gard P., Augustine GJ. Dilferent presynaptic roles ofsynapsins at excitatory
and inhibitory synapses // J Neurosci. — 2004. — Vol. 24. — P.11368—11380.
283. Goldberg J. Structural and functional analysis of the ARFl-ARFGAP
complex reveals a role for coatomer in GTP hydrolysis // Cell. — 1999. — V. 96. —
P.893 — 902.
284. Goldstein A.Y., Wang X., Schwarz T.L. Axonal transport and the delivery
of pre-synaptic components // Curr ()pin Neurobiol. — 2008. — Vol. 18. — P.495-
503.
285. Goll ПЕ, Thompson ЖЕ, Li H., Wei “д, Cong J. The calpain system /
/ Physiol Rev. ���� 2003. - Vol. 83. — P.731-801.
286. Gottmann K. Transsynaptic modulation of the synaptic vesicle cycle
by cell-adhesion molecules // J Neurosei Res. — 2008. — Vol. 86. — P. 223-232.
287. Govind C .K.. Quigley P.A.. Pearce J . Synaptic differentiation between
two phasic motoneurons to a craylish fast muscle // Invert Neurosci. ~- 2001. —
V01. 4. 0h=� 1’.77-84.
288. Granseth Н., Odermatt B., Royle S.J., Lagnado L. C1athrin—mediated
endoytosis is dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses /
/ Neuron. -2006. — Vol. 51. — P773-786.
289. Granseth B.. Odermatt В.. Royle S.J.. Lagnado 1.. Clathrin-mediated
endocytosis: the physiological mechanism of vesicle retrieval at hippocampal
synapses //J Physiol. 2007. —- Vol. 585. P681-686.
281
290. Grass l., Thiel S., Нити; 5., Haucke V. Recognition ofaibasic AP-2
binding motif within the C213 domain of synaptotagmin is dependent on
multimerization // J Biol Chem. — 2004. —- Vol. 279. - Р. 54872-54880.
291 . Gray N.W., Kruchten A.E., Cheng J., McNiven М.А. А dynamin-3 spliced
variant modulates the acrin/cortactin-dependent morphogenesis ofdendritic spines
// J. Cell Sci. 2005. — Vol. 118. — P.1279-1290.
292. Greene 8., Liu S.1-1., Wilde А.‚ Brodsky F.l\/1. Complete reconstitution
of clathrin basket formation with recombinant protein fragments: adaptor control
of clathrin self-assembly // Traffic. — 2000. — Vol. l. — P.69-75.
293. Grigliatti T.A., Hall Д, Rosenbluth R., Suzuki D.T.Temperature-sensitive
mutations in Drosophila melanogaster. XIV. A selection ofimmobile adults // Ио!
Gen Genet. — 1973. — Vol. 120. - P. 107-114.
294. Grise Е, Taib N, Monterrat C. et al. Distinct roles ofthe C2A and the
C2B domain of the vesicular Ca sensor synaptotagmin 9 in endocrine beta-cell //
J. Biochem. — 2007. —Vol. 403. — R483-492.
295. Grishanin �T�� Kowalchyk J./\., Klenchin V.A. et al. CAPS acts as a
prefilsion step in dense-core vesicle exocytosis as а Р1Р2 binding protein // Neuron.
~ 2004. — Vol. 34. — P.551-562.
296. Groffen A.J.. Brian E.C., Dudok J.J., Kampmeijer J., Toonen КБ,
Verhage M. Ca(2+)-induced recruitment ofthe secretory vesicle protein DOC2B
to the target membrane // J Biol Chem. -~ 2004. — Vol. 279. — Р. 23740-23747.
297. Groemer T.W., Klingauf J. Synaptic vesicles recycling spontaneously
and during activity belong to the same vesicle pool // Nat Neurosci. — 2007. — Vol.
10. - Р.145-147.
298. Guo J., Wenk M.R, Pellegrini Д, Onofri Е, Benfenati Е, De Camilli P.
Phosphatidylinisitol 4-kinase type I16 is responsible for the phosphatidylinositol
4—kinase activity associated with synaptic vesicle // P1\‘/\S. -A 2003. — Vol. 100. —
P. 3995-4000.
299. Guatimosim С, НиН С., Von Gersdor1T Н, Prado M.A. Okadaic acid
disrupts synaptic vesicle trafficking in а ribbon-type synapse // J Neurochem. —-
2002. —P. 82. -V P.1()47—1057.
300. Gundeltingcr E.M.. Kessels l\/1.M., Qualmann B. Temporal and spatial
coordination ofexocytosis and endocytosis // Nature Rev. Мо1. Cell Biol. ч 2003.
V. 4. — P.l27-139.
301 . Hatlner С, Di Paolo (3.. Rosenthal J./\.. Пс Camilli P. Direct interaction
olithe 170 kDa {войти ofsynaptojanin 1 with clathrin and with the clathrin adaptor
/\P-2 // (Тип Biol. - 2000. -— Vol.l0. P. 471-474.
302. Hall P./\., Russell $.15. The pathobiology olithe septin gene family // J
Риты. — 2004. \/о1. 204. —- P. 489-505.
303. Hall P.A., Todd (‘.B.. llyland P.l.., Mcl)z1de ���� Grabsch H., Dattani
282
М., Hillan K.J., Russell [�� The septin-binding protein anillin is overexpressed in
diverse human tumors // Clin Cancer Res. — 2005. — P. 1 1. P. 6780-6786.
304. Hammarlund M., Palfreyman M.'1‘., Watanabe S.. Olsen S.. Jorgensen
E.M. Open syntaxin docks synaptic vesicles // PLOS Biol. 2007. Vol. 5.
Р.е198.
305. Hammarlund M.. Watanabe S.. Schuske K., Jorgensen E.M. CAPS and
syntaxin dock dense core vesicles to the plasma membrane in neurons // J Cell
Biol. ���� 2008. ч \/о1. 180. -- P. 483-491.
306. Hao W., Luo Z., Zheng L., et al. AP180 and AP-2 interact directly in a
complex that cooperatively assembles clathrin // J. Biol. Chem. —— 1999. — V. 274.
—- P.785-794.
307. Harata N.C.,A1avanis A.M., Tsien R.W. Kiss-and-run and ful1—eo11apse
fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion // J. Neurochem. — 2006.
— Vol. 97. — P.1546-1570.
308. Harata N.C., Choi S.. Pyle J.et al. Frequency-dependent kineticks and
prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied novel
quenching methods // Neuron. — 2006. — Vol. 49. — P.243-256.
309. Harel А., Wu Е, Mattson M.P., Morris C.M.. Yao P.J. Evidence for
CALM in directing VAMP2 traflicking // Traflic. — 2008. --Vol. 9. —- P.4l7-429.
310. Harlow L. H., Ress D.. Stoschek A., et al. The architecture of active
zone material at the frog’s neuromuscularjunction // Nature.- 2001. — Vol. 409. —
P.479—484.
311. Hartl F. 1)., Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: from
nascent chain to folded protein // Science. чч 2002. ч- Vol. 295. -— R1852-1858.
312. Hata К, Slaughter C. A., Sudhot‘T.C. Synaptic vesicle fusion complex
contains onc-18 homologue bound to syntaxin // Nature. — 1993. `��� Vol. 366. --
P.347-351.
313. Hatasuzawa K., Lang Т., Fasshauer D. et al. The R—SNARl-1 motifof
tomosyn forms SNARE core complexes with syntaxin l and SNAP-25 and down-
regulates exocytosis // J. Biol. Chem. — 2003. Vol. 278. — P.31l59-31166.
314. Hatheway C.1-. Botulism: the present status of the disease // Curr Top
Microbiol Immunol. — 1995. — Vol. 195. ч Р. 55-75.
315. Haydon P.(3. GLIA: listening and talking to the synapse // Nat Rev
Neurosci. —- 2001. ч Vol. 2. чч P. 185-193.
316. Haydon РЕ. Henderson Е, Stanley Е)’. Localization of individual
calcium channels at the release face ofa presynaptic nerve tenninal // Neuron. -
1994. ч \/‹›1. 13. — P. 1275-1280.
317. Hayashi M., RaimondiA., О’Тоо1с �!�� Paradise S.. (follesi C, (‘remona
0., Ferguson @��� De (‘amilli P. (.‘ell— and stimulus—dependent heterogeneity of
synaptic vesicle endocytic recycling mechanisms revealed by studies olidynamin
283
1-пи11 neurons // Proc Natl Acad Sci U S A. — 2008. — 105. — P. 2175-2180.
318. Hayashi T., Huganir R.l.. Tyrosine phosphorylation and regulation of
the AMPA receptor by SRC family tyrosine kinascs // J Neurosci. — 2004. -— Vol.
24. — Р. 6152-6160.
319. Haucke V. Phosohoinositide regulation of clathrin-mediated
endocytosis // Biochem. Soc. Tranactions. 2005. — Vol. 33, Хе 6. — P.l285—
1289.
320. Haucke V., DeCamilli P. AP—2 recruitment to synaptotagmin stimulated
by tyrosine—based endocytic motifs // Science. — 1999. — V. 285. — P. 1 268 — 1271.
321. Hazuka C.D.,Fo1etti D.L.,Hsu S.C. с: al. The sec6/8 complex is located
at the neurite outgrowth and axonal synapse-assembly domain // J. Neurosci. --
1999. —— Vol. 19. — P.l324—1334.
322. He L., Wu L.G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses //
Trends N-eurosei. @�u� 2007. — Vol. 30. — P.447—455.
323. Не G., Wang H.—R., Huang S.-K., Huang C.—L. lnterseetin links
WNK kinases to endocytosis ofROMK1 // J. Clinical Investigation. — 2007.
— Vol. 117. Не 4. — P.1078—1087.
324. He L., Xue I... Xu J., McNeil B.D., Bai L., Me1icofi'E., Adachi
R., Wu ДО. Compound vesicle fusion increases сшита] size and potentiates
synaptic transmission // Nature. ~- 2009. —— Vol. 459. — Р. 93-97.
325. Heerssen H., Fetter КВ, Davis G.W. Clathrin dependence of
synaptic-vesicle formation at the Drosophila neuromuscular junction // Curr
Biol. — 2008. — Vol. 18. PYj� P.401-409.
326. Heldwein E.E., Macia Е, Wang J., Yin ll.L., Kirchhausen T.,
Harrison S.C. Crystal structure of the clathrin adaptor protein 1 core. Proc
Natl Acad Sci. —2004.- Vol. 101. P. 14108-14113.
327. llenkel A.W., Lubke J ., Betz W.J. FM 143 ultrastructural localization
in and release from frog motor nerve terminals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
— 1996. Vol. 93. ~— P1918-491923.
328. Henkel A.W., Meiri H., Horstmann H., Lindau M., Almers W.
Rh thmic opening and closing of vesicles during constitutive exo— and
en ocytosis in chromaffiri cells // EMBO J. — 2000. Vol. 19. ��a� P.84—93.
329. Herring D., Huang R., Sin Yh M.. Robinson L.C., Dillon G.lI.,
Leidenheimer N.J. Constitutive GAB A receptor endocytosis is dynamin—
mediated and dependent on a dileucine AP2 adaptin—binding motifwithin the
beta 2 subunit or the receptor // J Biol Chem. — 2003. Vol. 278. — P. 24046-
24052.
330. HeLLserJ. Thrcc—dimensional visualization ofeoated vesicle formation
in fibroblast // J. Cell. Biol. 1980. — Vol. 84. — P. 560-583.
33 1. HeuserJ.E., Reese T.S. Evidence for recycling ofsynaptic vesicle
membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction // J
Cell Biol. -- 1973. — Vol. 57. P. 315-344.
332. Heuse1'J.E., Reese T.S., Landis l).:Vl. Functional changes in frog
neuromuscularjunetions studied with 1reeze—lractLirc //J Neurocytol. —- 1974.
Vol. 3. P. 109—131.
284
333. Heuser J.E., Reese T.S., Dennis M.J., Jan 1.. Syna tie vesicle
exocytosis captured by quick freezing and correlated with quanta1)transmitter
release // J. Cell Biology. —- 1979. — V. 81. ~- P.275—300.
334. Heuser ��#� Keen J.H., Amendc L.M., Lippoldt КБ, Prasad K.
Deep—etch visualization of27S clathrinz а tetrahedral tetramer //J Cell Biol. —
1987. — Vol. 105. — Р; 1999-2009.
335. Hicke L.Gettin’ down with ubiquitin: turning off cell-surface
receptors, transporters and channels // Trends Cell Biol. — 1999. — Vol. 9. — P.
107-1 12.
336. Hicks B.W., Parsons S.M. Characterization of the P-type and V—type
ATPases of cholinergic synaptic vesicles and coupling of nucleotide hydrolysis
to acetylcholine transport // J Neuroehem. — 1992. -- Vol. 58. — P.121 1-1220.
337. Hiesinger P.R., Fayyazuddin A., Мета S.Q., Rosenmund T., Schulze
K.L., Zhai КО, Verstreken P.. Cao У, 7.hou Y.. Kunz J.. Bellen H.J. The v—ATPase
V0 subunit al is required for a late step in synaptic vesicle exoeytosis in Drosophila
// Cell. - 2005. — Vol. 121. — R607-620.
338. llill ���� van Der Kaay J., Downes C.1‘._ Smythe E. The role ofdynamin
and its binding partners in coated pit invagination and scission // J. Cell Biol. —
2001, —- Vol. 152. 13.309-323.
339. 1-lilfiker S, Pieribone VA, Czernik А], Као HT, Augustine О], Greengard
P. Synapsins as regulators ofneurotransmitter release // Philos Trans R Soc Lond
B Biol Sci. - 1999. — Vol. 354. — P. 269-279.
340. Hinds H.L.. Goussakov 1.. Nakazawa K., Tonegawa 5., Bolshakov V.Y.
Essential function of alpha-calciurn/calmodulin-dependent protein kinase Н in
neurotransmitter release at a glutamatcrgie central synapse // Proc Natl Acad Sci.
— 2003. — Vol. 100. — Р. 4275-4280.
341. Hinner 1., Тост S.A. Changing directions: clathrin——mediated transport
between the Goldgi and endosomes // J. Cell Sci. — 2003. Vol. 116. —- R763-
771.
342. 1-linriehsen Д, 1-larborth J., Andrees I... Weber K., Ungewickell Е].
Effect ofclathrin heavy ehain— and alpha-adaptin-specific small inhibitory RN/\s
on endocytic accessory proteins and receptor trafficking in Пси cells // J Biol
Chem. — 2003. Vol. 278. — P. 45160-45170.
343. llinrichsen Ь, Meyerhol‘/, A.. Groos S., Ungewickell Н). Bending а
membrane: how clathrin affects budding // Proc Natl Acad Sci. — 2006. -— Vol.
103. 118715-X720.
344. llinshaw, J. Ii. Dynamin spirals / J. ��� llinshaw // Curr. Opin. Struct.
Biol. 1999. Vol. 9. P.260—2(>7.
345. llirr1ingerJ.. llhlsmann 0}�� Kirchhoff Р. Astroglial processes show
spontaneous motility at active synaptic terminals in situ//17,ur.l T\‘eurosci. —- 2004.
Vol. ШИК). - 1’. 2235-2239.
285
346. Hirokawa N, Кода Y. lntracellular transport and kinesin superfamily
proteins, KlFs: structure. function, and dynamics // Physiol Rev. — 2008. —- Vol.
88. — P.1089-118.
347. Hiroyama. M. Localization and regulation ofphospholipase D2 by ARF6
/ M. Hiroyama, J.H. Exton // J. Cell. Biolchem. — 2005. — Vol. 95. N.» 1. — P.149-
164.
348. Hirst, J. Clathrin and adaptors / J. Hirst, M.S. Robinson // Biochim.
Biophys. Acta. — 1998. — V. 1404. — P.173—193.
349. Hirst J., Lui W.W., Bright МА. Totty `�� Seaman МЯЧ. Robinson M.S.
A family ofproteins with gamma-adaptin and VHS domains that facilitate trafficking
between the trans—Go1gi network and the vacuole/lysosome // J Cell Biol. 2000.
—Vol. 149. — Р.67-80.
350. Hlubek M., Tian D., Stuenkel E.L. Mechanism ofalpha—latrotoxin action
at nerve endings ofneurohypophysis // Brain Res. — 2003. -~Vol. 992. — 19.30-42.
351. Hoepfner S.. Severin 15., Cabezas A.. Habermann В.‚ Runge А., Gillooly
D.. Stenmark H., Zerial M. Modulation of receptor recycling and degradation by
the endosomal kinesin K1F16B // Cell. ~ 2005. — Vol. 121. —- Р. 437-50.
352. Hofmann F. The biology of cyclic GMP-dependent protein kinases //
J. Biol. Chem. — 2005. —- Vol. 280, Мг 1. — Р.1-4.
353. Hofmann F., Feil R.,K1eppisch T., Schlossman J. Functional ofcG.\/IP-
dependent protein kinases as revealed by gene deletion // Physiol. Rev. — 2006. —
Vol. 86, М 2. -— P.1-23.
354. Hosaka М.‚ Ssdh0fT.C. Homo- and heterodimerization of synapsins /
/J Biol Chem. — 1999. — Vol. 274. — P.16747—16753.
355. Holt M., Cooke A., Ncef/\., Lagnado L. High mobility of vesicles
supports continuous exocytosis at a ribbon synapse // Curr Biol. — 2004. — Vol.
14. — P.173-183.
356. Honing S.. Ricotta D., Krauss I\/1.. Sp11te K.. Spolaore B., Motley А.‚
Robinson M., Robinson С, Haucke V., Owen D.J. Phosphatidylinositol-(4.5)-
bisphosphatc regulates sorting signal recognition by the clathrin—associated adaptor
complex AP2 // Mol Cell. - 2005 - \/о|. 18. P. 519-531.
357. Hosoi Х. Holt M.. Sakaba Т. Calcium dependence of exo- and
endocytotic coupling at a glutamatergic synapse // Neuron. 2009. —— Vol. 63/ - Р.
216-229.
358. Huang УХ, Kandel ��s� R., Varshavsky 1-.et al. A genetic test ofthe effects
of mutation in PKA on mossy fiber LTP and its relation to spatial and contextual
learning // Cell. - 1995. -— V0l.- 83. Мг 7. - P.121l-1222.
359. Huang F.D.. Woodruff Mohimann К, Broadie K. Rolling blackout
is required for synaptic vesicle exocytosis // J Neurosci. — 2006. -- Vol. 26. —-
R2369-2379.
286 . „ . __ _ .
360. 1-lumeau Y., Vitale N., Golaz S.C. ct а1. А го1е for phospholipase D1 in
neurotransmitter release // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2001. — Vol. 98. -- Р.1530О-
15305.
361. Hunt J.M., Bommen K., Charlton M.P. ct а1. А post—docking role for
synaptobrevin in synaptic vesicle fusion // Neuron. -— 1994. @��� \/о1. 12. ~ P.1269-
1279.
362. Hussain R.J., Carpenter D.O. Development of synaptic responses and
plasticity at the SC-CA1 and MF-CA3 synapses in rat hippocampus // Cell Mol
Neurobiol. 2001. p��� Vol. 21. P. 357-368.
363. Huttner W.B, Zimmerberg J. Implication of lipid microdomain for
membrane curvative, budding and fission // Cur. Opion. Cell Biol. ~ 2001. 08�� Vol.
13. P478-484.
364. Hyman 'l‘., Shmuel M., Altschuler Y. Actin is required for endocytosis
at the apical surface of madin-darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin
regulate the actin cytoskeleton // МОК. Biol. of the Cell. ~- 2006. -— Vol. 17. —
P.427-437.
365. Hwang W., Lang M.J. Mechanical design oftranslocating motor proteins
// Cell Biochem Biophys. — 2009. — Vol. 54. — P. 1 1-22.
366. Itoh '11, Erdmann K.S., Roux A., Habennann B.. Wemer l-1., De Camilli
P. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane
invagination by BAR and F-BAR proteins // Dev Cell. — 2005. — Vol. 9. — P.79l-
804.
367. Itoh T., De Camilli P. BAR. F-BAR (EFC) and ENTH/ANTII domains
in the regulation of membrane-cytosol interfaces and membrane curvature //
Biochim Biophys Acta. -~ 2006. — Vol. 1761. — P897-912.
368. Jackson M.B. Minimum membrane bending energies of fusion pores /
/J Membr Biol. -2009. — Vol. 231. — P. 101-15.
369. Jackson A.P, Parham P. Structure of human clathrin light chains.
Conservation of light chain polymorphism in three mammalian species // J Biol
Chem. — 1988. — Vol. 263. — P. 16688-16695.
370. Jahn К, Grubmuller ll. Membrane fusion // Сип‘. Opin. Cell. Biol. —
2002. — Vol. 14. -- P488-495.
371. Jahn R., Lang '11, Sudhof'I'.C. Membrane fusion // Cell. ~— 2003. -— Vol.
112. — P.519-533.
372. Jahn R., ShellerR.1l. SNAR.13s — engines for membrane fusion /'/ Nat.
Rev. I\/lol. Cell. Biol. — 2006. — Vol. 7. — P. 631-643.
373. Jahn R.. S1.dh0fT.C. Synaptic vesicle tratlic: rush hour in the nerve
terminal // J. Neurochem. ч 1993. ���� V. 61. Pf�� P.12-21.
374. Jahromi ���� Atwood H.1,. Three-dimensional ultrastructure of the
crayfish neuromuscular apparatus // J. (‘ell Biol. 1974. V. 63. 11599-613.
375. Jakobsson J., Gad 11., Andersson Р., Luw Р., Shupliakov 0., Brodin L.
Role of epsin 1 in synaptic vesicle endocytosis // Proc Natl Acad Sci. — 2008. --
Vol. 105. — 19.6445-6450.
376. Jahromi S.S., Atwood H.L. Three-dimensional ultrastructure of the
crayfish neuromuscular apparatus // J Cell Biol. — 1974. — Vol. 63. -— R599-613.
377. Janz R., Hofmann К, SsdhofT.C. SVOP, an evolutionarily conserved
synaptic vesicle protein, suggests novel transport functions of synaptic vesicles /
/ J Neurosci. ~ 1998. — Vol. 18. — P9269-9281.
378. Janz R., Goda Y., Geppert M., Missler .\/1., SsdhofT.C. SVZA and SV2B
function as redundant Ca2+ regulators in neurotransmitter release // Neuron. —
1999. — Vol. 24. — Р.1О03-1016.
379. Jarousse М, Kelly R.B. Endocytosis mechanisms in synapses // Curr.
Opin. Cell Biol. -« 2001. — Vol. 13. — P.461-469.
380. Jarvis S.E., Barr W., Feng Z.P., Hamid J., Zamponi G.W. Molecular
determinants of syntaxin 1 modulation ofN-type calcium channels // J Biol Chem.
— 2002. — Vol. 277. — P. 44399-443407.
381. Jeans A.F., Oliver P.L., Johnson R., Capogna M., Vikman J., Moln6r Z.,
Babbs A., Partridge C.J., Salehi A., Bengtsson I\/1.,Eliasson L., Rorsman P., Davies
K.E. A dominant mutation in Snap25 causes impaired vesicle trafficking,
sensorimotor gating, and ataxia in the b1ind—drunk mouse // Proc Natl Acad Sci U
S A. — 2007. — Vol. 104. — P. 2431-2436.
382. Jia J.Y., Lamer S., Schumann M., Schmidt M.R., Krause E., 1-Iaucke V.
Quantitative proteomics analysis of detergent—resistant membranes from chemical
synapses: evidence for cholesterol as spatial organizer of synaptic vesicle cycling
// Mol Cell Proteomics. — 2006. — Vol. 5. — Р. 2060-2071.
383. Jiang J., Macs E.G., TaylorA.B., Wang L., Hinck A.P., Lafer E.M., Sousa
R. Structural basis ofJ cochaperone binding and regulation ofHsp70 // M01 Cell.
— 2007. ~Vol. 28. — P.422—433.
384. Jockusch W.J., Praefcke G.J., McMahon H.T., Lagnado L. Clathrin-
dependent and clathrin—independent retrieval of synaptic vesicles in retinal bipolar
cells // Neuron. — 2005. А- Vol. 46. -- P.869—878.
385. Johnston 1’.A., Archer B.T. 3rd, Robinson К, Mignery G./\, Jahn R.,
Sudhot‘ T.C. rab3A attachment to the synaptic vesicle membrane mediated by a
conserved polyisoprenylated carboxy-terminal sequence // Neuron. — 1991. -~ Vol.
7. — P. 101-9.
386. Johnson R.D., Oliver P.L.. Davies K.E. SNARE proteins and
schizophrenia: linking synaptic and neurodevelopmental hypotheses // Acta
Biochim Pol. м 2008. Vol. 55. Р.(›19-628.
387. Joo 1%., ’1‘sung C.W., Trimble W.S. Septins: traffic control at the
cytokinesis intersection //' Trallic. 2005. - Vol. 6. — 11626-634.
388. Joohnson D.A., Akamine P., Radzio-Andzelin E. et al. Dynamics of
CAMP-dependent protein kinase // Chem. Rev. ~- 2001. — Vol. 101. — P.2243—
2270.
389. Jordan К, Lemke ���� Klingauf J. Visualization of synaptic vesicle
movement in intact synaptic boutons using fluorescent fluctuation spectroscopy /
/ Biophys. J. — 2005. ~ Vol. 89. P. 2091-2102.
390. Jordens I., Marsman M., Кайл С.‚ Neeljes J. Rab proteins, connecting
transport and vesicle fusion // Tratfic. 2005. --Vol. 6. -- P. 1070-1077.
391. Jorgensen T.D., Gromada J., Tritsaris K., Nauntofte В., Dissing S.
Activation of P22 purinoceptors diminishes the muscarinic cholinergic-induced
release of inositol 1,4,5-trisphosphate and stored calcium in rat parotid acini. ATP
as a co-transmitter in the stimulus-secretion coupling // Biochem J. — 1995. —
Vol. 312. —— P.457—464.
392. Jovanovic J.N., Sihra T.S., Narin A.C. et al.Opposing changes in
phosphorylation of specific sites in synapsin 1 during Ca2+ dependent glutamate
release in isolated nerve terminals // J Neurosci. — 2001. — Vol. 21. — P.7944—
7953.
393. Jung N, Haucke V Clathrin-mediated endocytosis at synapses // Traffic.
— 2007. — Vol. 8. — P.1129-36.
394. Kabsch W., Mannherz H.G., Suck D., Pai E.F., Holmes K.C. Atomic
structure of the actin:DNase I complex // Nature. — 1990. — Vol. 347. — P. 37-44.
395. Kaksonen M., Toret C.P., Drubin I).G. A modular design for the clathrin-
and actin-mediated endocytosis machinery // Cell. — 2005. — Vol. 123. — P. 305-
320.
396. Kaksonen M., Toret C.P., Drubin D.G. Harnessing actin dynamics for
clathrin—mediated endocytosis // Nat Rev Mol Cell Biol. — 2006. — Vol. 7. — P.
404-414.
397. KalthoffC.. Alves J ., Urbanke C. et al. Unusual structural organization
the endocytic proteins APl80 and epsin // J. Biol. Chem. — 2002. — Vol. 277. --
P8209-8219.
398. Kao H. Т., Song H. J., Porton B.et al. A protein kinase A-dependent
molecular switch in synapsins regulated neurite outgrowth // Nat. Neurosci. —
2002. — Vol. 5. '�� P.43l—437.
399. Kandel E.R. The molecular biology of memory storage: a dialogue
between genes and synapses // Science. — 2001. — Vol. 294. — P. 1030-1038.
400. Karege Е, Lambercy (Д, Shwald XVI. et al. Differential changes ot‘cAMP-
dependent protein kinase activity and 3H-CAMP binding sites in rat hippocampus
during maturation and aging // Neurosci. Let. — 2001. »—Vol. 315. — P89-92.
401. Kartmann B., Roth I). Novel roles for mammalian septins: from vesicle
tralticking to oncogenesis // J. (Tell Sci. и 2001. -— Vol. 114. P839-844.
289
402. Kasprowicz J., Kuenen S., Miskiewiez К, Habets R.l.., Smitz I..,
Verstreken P. Inactivation of clathrin heavy chain inhibits synaptic recycling but
allows bulk membrane uptake // J Cell Biol. 2008. — Vol. 182. — P.1007-1016.
403. Kaeser P.S., S1>dl']0fT.C. RIM function in shoi1- and long—term synaptic
plasticity // Biochem Soc Trans. —- 2005. ~ Vol. 33. — P.1345-1349.
404. Kaeser P.S., Deng L., Ch6vez A.E., Liu Х., Castillo P.E., Sbdl'l0fT.C.
ELKS2a1pha/CAST deletion selectively increases neurotransmitter release at
inhibitory synapses // Neuron. — 2009. — Vol. 64. — Р. 227-239.
405. Katz B., Miledi R. The effect of temperature on the synaptic delay at
the neuromuscular junction // J Physiol. — 1965. — Vol. 181. — P. 656-670.
406. Kaufmann N., DeProto J., Ranjan К, Wan Н., Van Vactor D. Drosophila
liprin-alpha and the receptor phosphatase Dlar control synapse morphogenesis //
Neuron. ~ 2002. — Vol. 34. — P.27—38.
407. Kavalali E.T. Synaptic vesicle reuse and its implications //
Neuroscientist. — 2006. — Vol. 12, М» 1. — Р.57-66.
408. Ке B., Oh E., Thurmond D C. Doc2beta is a novel Muncl 8c—interacting
partner and positive effector of syntaxin 4-mediated exocytosis // J Biol Chem. —
2007. — Vol. 282. — P.21786-21797.
409. Kelly ДЕ, Phillips A.M. Molecular and genetic characterization of
the interactions between the Drosophila stoned-B protein and DAP-160
(intersectin) // Biochem J. — 2005. — Vol. 388. — P. 195-204.
410. Kessels M.M.,Qua1mann B. Syndapins integrate N-WASP in receptor-
mediated endocytosis // EMBO J. — 2002. — Vol. 21. — Р.6083-6094.
411. Kessel M.M., F.ngqvist—Goldstein A.E., Drubin D.G., Qualmann
B.Mammalian Abpl, a signa1—responsive F—actin-binding protein, links the actin
cytoskeleton to endocytosis via the GTPase dynamin // J. Cell. Biol. — 2001. —
Vol. 153. — P.351—366.
412. Khanna R., Li Q., Schlichter L.C., Stanley E.F. The transmitter release-
site CaV2.2 channel cluster is linked to an endocytosis coat protein complex //
Eur J Neurosci. — 2007. — Vol. 26. ~— P. 560-574.
413. Khvotchcv ?\/1., Lonart G., Sbdhof T.C. Role of calcium in
neurotransmitter release evoked by alpha—latrotoxin or hypertonic sucrose //
Neuroscience. — 2000. — Vol. 101. — P. 793-802.
414. Kidokoro Y. Roles of SNARE proteins and synaptotagmin 1 in synaptic
transmission: studies at the Drosophila neuromuscular synapses // Neurosignals.
2003. —Vol. 12. 0�w� P.13-30.
415. Kielland A., Erisir A., Walaas S.l., Heggelund P. Synapsin utilization
differs among functional classes ofsynapses on thalamocortical cells //J Neurosci.
~- 2006. — Vol. 26. ~— P. 5786-5793.
416. Kim S.1l., Ryan T.A. A distributed set of interactions controls mu2
290
functionality in the role ofAP-2 as a sorting adaptor in synaptic vesicle endocytosis
// J Biol Chem. — 2009. —- Vol. 284. ~- R32803-32812.
417. Kim W.T., Chang S., Daniell L.. Cremona 0.. Di Paolo G.. De Camilli
P. Delayed reentry of recycling vesicles into the fusion—competent synaptic vesicle
pool in synaptojanin 1 knockout mice // Proc Natl Acad Sci. 2002. Vol. 99. -
P.17143-17148.
418. Kirchhausen T.. Harrison S.C. Protein organization in clathrin trimers
// Cell. —- 1981. Vol. 23. — P. 755-761.
419. Kirchhausen T. Three ways to make a vesicle // Nat. Rev. Мо1. Cell.
Biol. - 2000. — Vol. 1. R650-652.
420. Kissel Н., Georgescu M.M., Larisch S., Manova К, Hunnicutt G.R.,
Steller H. The Sept4 septin locus is required for sperm terminal differentiation in
mice // Dev Cell. — 2005. -- Vol. 8. — Р. 353-364.
421. Klenchin V.A., Martin ТЕ Priming in exocytosis: attaining fusion-
competence after vesicle docking // Biochimie. — 2000. — Vol. 82. — P.399-407.
422. Kleppisch T., Wolfsgruber W., Feil W. е! al. Hippocampal cGMP-
dependent protein kinase 1 supports an age-and protein synthesis—dependent
component of long-term potentiation but is not essential for spatial reference and
contextual memory // J. Neurosci. — 2003. v- Vol. 23. — P.6005-6012.
423. Klopfenstein D.R., Vale R.D., Rogers S.L. Motor protein receptors:
moonlighting on other jobs // Cell. — 2000. — Vol. 103. ~ P. 537-540.
424. Klopfenstein D.R., Vale R.D. The lipid binding pleckstrin homology
domain in UNC-104 kinesin is necessary for synaptic vesicle transport in
Caenorhabditis elegans. M01 Biol Cell. 2004. — Vol. 15. -- P. 3729-3739.
425. Koh T.-W.. Bellen H..1. T.-W. Synaptotagmin 1, Ca2+ sensor for
neurotransmitter release // TRENDS in Neurosci. -— 2003. — Vol. 28. Мг 8. — Р.413-
422.
426. Koh T.-W., Verstreken P., Bellen Н]. Dap160/intersectin acts as a
stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis //
Neuron. и 2004. ~ Vol. 43. — P.193—205.
427. Koh T.W., Korolchuk V.1., Wairkar Y.P., Jiao W.. Evergren Е, Рап 11..
Zhou Y.. Venken K.J.,Shup1iakov 0., Robinson I.M., O’Kane C.J.,Be11en H.J. Eps15
and Dap160 control synaptic vesicle membrane retrieval and synapse development
// .1 Cell Biol. — 2007. А- \/о1. 178. — P. 309-322.
428. Korolchuk V.1.. Banting G. CK2 and GAK/auxi1in2 are major protein
kinases in clathrin-coated vesicles // Trallic. 2002. Vol. 3. — R428-439.
429. Korolchuk V., Banting G. Kinases in clathrin—mediated endocytosis //
Biochem Soc Trans. 2003. — Vol. 31. - P.857—860.
430. Korolchuk V.1., Co’/.ier (}.. Banting G. Regulation of (.‘K2 activity by
phosphatidylinositol phosphates // .1 Biol Chem. 2005. Vol. 280. P.40796-
291
407801.
431. Koushika S.P.. Richmond J.E., Hadwiger G. е: al. A post-docking role
for active zone protein RIM // Nat. Neurosci. —- 2001. — Vol. 4. — 13.997-1005
432. Koushika S.P., Richmond J.E., lladwiger G. ст а1. Formation ofinactive
CAMP-saturated holoenzyme of c/\MP-dependent protein kinase under
physiological conditions // J. Biol. Chem. ~ 2002. — \/о1. 277. — 1’.l3443-13448.
433. Kozlov M.M. Fission of biological membranes: interplay between
dynamin and lipids // Traffic. — 2001. -- Vol. 2. — P.51-65.
434. Kremer B.E.. Haystead T., Macara 1.G. Mammalian septins regulate
microtubule stability through interaction with the microtubule-binding protein
MAP4 // M01 Biol Cell. �5�� 2005. — Vol. 16. — P. 4648-4659.
435. KunerT., Li Ж, Gee K.R., Bonewald l..F., Augustine (М. Photolysis of
a caged peptide reveals rapid action of N-ethylmaleimide sensitive factor before
neurotransmitter release // Proc Natl Acad Sci. -— 2008. — \/о1. 105. — Р. 347-352.
436. Kuromi Н., Kidokori Y. Two distinct pools ofsynaptie vesicles in single
presynaptic boutons in temperature-sensitive Drosophila mutant, shibire // Neuron.
— 1998. — V. 20. — R917-925.
437. Kuromi 11., Kidokoro Y. Exocytosis and endocytosis ofsynaptic vesicle
and functional roles of vesicle pools: lessons from the Drosophila neuromuscular
junction // Neuroscientist. — 2005. — Vol. ll, Мг 2. — 1’.138 — 147.
438. Kushmerick C., von Gersdorff H. Exo-endocytosis at mossy fiber
terminals: toward capacitance measurements in cells with arbitrary geometry //
Proc Natl Acad Sci. — 2003. -- Vol. 100. — Р. 8618-8620.
439. Kuwano К, Miyashita A., Arai H., Asada T., Imagawa M._. Shoji M..
1-liguchi 5., Urakami K., Каюта A.,'1‘al<ahashi Н., Tsukie T., Toyabe S., Akazawa K..
Kanazawa 1.. Ihara Y. Dynamin-binding protein gene on chromosome l0q is
associated with late-onset Alzheimers disease // Hum Mol Genet. A 2006. — Vol.
15. — P. 2170-2182.
440. Labas Y./\., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G.. Fradkov A.F., Lukyanov
K.A., Lukyanov S.A.. Matz ММ Diversity and evolution of the green tluorescent
protein family // Proc Natl Acad Sci. ఱ� 2002. - Vol. 99. — P.4256-4261.
441. LaFerla F.M.. Green K.N., Oddo S. Intracellular amyloid-beta in
Alzheimer’s disease. // Nat Rev Neurosci. — 2007. — Vol. 8. — Р. 499-509.
442. Lagow КВ, Вао 11., Cohen 1i.N., Daniels R.W.. Zuzek A.. Williams
W.H., Macleod G.’I'.. Sutton R.B., [папа В. Moditication ofa hydrophobic layer
by a point mutation in syntaxin [А regulates the rate of synaptic vesicle fusion //
PLoS Biol. 2007. ч Vol. 5. —- P.e72.
443. Lang 'I‘.. Bruns 1)., Wenzel l).et al. SNARES are concentrated in
cholesterol — dependent cluster that dctine docking and fusion sites for exocytosis
// liMB(). J. 2001. Vol. 20. l’.22()2—22l3.
292
444. Lao G., Scheuss V.,Ge1win СМ. et al.Synaptophi1in: a syntaxin-1 clamp
that control SNARE assembly // Neuron. — 2000. — Vol. 25. — P. 191-201.
445. Leal-Ortiz S., Waites C.L., Terry-Lorenzo R., Zamorano P.. Gundellinger
Pii� Garner C.C. Piccolo modulation ofSynapsin 1 a dynamics regulates synaptic
vesicle exocytosis // J Cell Biol. 2008. Vol. 181. ~— P.831-846.
446. Lee ���� De Camilli P. Dynamin at actin tails // Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. ч 2002. — Vol. 99. ~ P.161—166.
447. Lee Н. Synaptic plasticity and phosphorylation // Pharmacol. and
Terapeutics. - 2006. ~— Vol. 112. и Р.810-832.
448. Leenders A.G., Lopes da Silva F.H.. Ghijsen W.E., Verhage M. Rab3a is
involved in transport of synaptic vesicles to the active zone in mouse brain nerve
terminals // Mol Biol Cell. — 2001. п Vol. 12. — P. 3095-3102.
449. Leenders A.G., Scholten G., de Lange R.P., Lopes da Silva F.H.. Ghijsen
W.E. Sequential changes in synaptic vesicle pools and endosome-like organelles
during depolarization near the active zone of central nerve terminals //
Neuroscience. — 2002. -- Vol. 109. — Р.195-206.
450. Leenders A. G. M._. Sheng Z-H. Modulation of neurotransmitter release
by second messenger-activated protein kinases: implication for presynaptic
plasticity // Pharmacol. Ther. — 2005. — Vol. 105 (1) — P. 69-84.
451. Legendre—Gui11emin V., Wasiak S.,11ussain N.K. ENTH/ANT1l proteins
and clathrin mediated membrane budding // J. Cell Sci. — 2004. — Vol. 1 17. — Р.9-
18.
452. Lenzi D.. Gersdorffll. Structure suggests function: the case for synaptic
ribbons as exocytosis nanomachines // Bioessays. -- 2001. — Vol. 23. — P.83l-
840.
453. Letinsky, I\/I.S., DeCino P. Histological staining ofpreand postsynaptic
components of‘ amphibian neuromuscular junction // J .Neuroeyto1. — 1980. — Vol.
9. — P305-320.
454. Levitan E.S. Signaling for vesicle mobilization and synaptic plasticity/
/ Mol Neurobiol. -— 2008. — Vol. 37. — R39-43.
455. Littleton J.T., Bamard R.J., Titus S./\., S1indJ.. Chapman E.R.. Ganetzky
B. SNARE-complex disassembly by NSF follows synaptic—vesicle fusion // Proc
Natl Acad Sci. и 2О01.А Vol. 98. и P. 12233-12238.
456. Lev-Ram V., Jiang T., Wood J.et al. Synergies and coincidence
requirements between NO. CGMP, and Ca2~ in the induction ofcerebellar long-
term depression // Neuron. »— 1997. — Vol. 18. —— P.l025-1038.
457. Li L.. сын 1..-З. The molecular machinery of synaptic vesicle
exocytosis // (fell Mol. Life Sci. —— 2003. — Vol. 60. и P.942-960.
458. Li P�G� Burrone.l.. Tyler W.J.. Hartman K..\'.. /\lbeanuD.F.,Mur1hy УЖ.
Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin
293
// Ргос Natl Acad Sci. -20()5. — Vol. 102. — P.6l3l-6136. ё
459. Lichtman J.W., Sunderland W.J., Wilkinson R.S. lligh-resolution
imaging of synaptic structure with a simple confocal microscope // New Biol. —
1989. ~— Vol. 1. — P.75-82.
460. Lim К, Hoang P., Berger АД. Blockade ofglycine transporter-1 (GLYT—
1) potentiates NMDA receptor-mediated synaptic transmission in hypoglossal
motorneurons // J Neurophysiol. - 2004. — Vol.92. -- P. 2530-2537.
461. Lin C.C., 1-luang C.C., Lin К.Н., Cheng K.H., Yang D.M., Tsai Y.S., Ong
КУ, Huang `ȭ� Kao l..S. Visualization ofRab3A dissociation during exocytosis:
a study by total internal reflection microscopy // J Cell Physiol. — 2007. — Vol.
211. — P. 316-326.
462. Lipowsky R. Domain—induced budding of fluid membranes // Biophys.
-— 1993. — Vol. 64. — Р.1133-1138.
463. Liu Е, Virshup D.M.. Nain1A.C.. Greengard P. Mechanism ofregulation
of casein kinase I activity by group 1 metabotropic glutamate receptors // J Biol
Chem. —- 2002. — Vol. 277. — Р. 45393-45399.
464. Loerke D., Wienisch M.. Kochubey 0., Klingaufl. Ditlerential control
of clathrin subunit dynamics measured with EW-FRAP microscopy // Trallic. --
2005. — Vol. 6. — P918-929.
465. Lonart G., Schoch 5., Kaeser P.S. et al. Phosphorylation ofR1l\/I16 by
PKA triggers presynaptic long-term potentiation at cerebellar parallel fiber
synapses // Cell. — 2003. Vol. 115. -- P.49-60.
466. LongA.A., Kim ���� Leung H.’1‘., Woodruffl-Z 3rd.. An L., Doerge R.W.,
Pak “ЛЬ, Broadie K. Presynaptie calcium channel localization and calcium-
dependent synaptic vesicle exoeytosis regulated by the Fuseless protein // J
Neurosci. —— 2008. — Vol. 28. — P. 3668-3682.
467. Longenecker НЕ. .lr., Hurlbut W.P., Mauro А., Clark A.W. Effects of
black widow spider venom on the frog neuromuscularjunction. Effects on end-
plate potential, miniature end-plate potential and nerve terminal spike // Nature. @r��
1970. — Vol. 225. — P.701-7()3.
468. Lopez 1., Giner 1)., Ruiz-Nuco A., Fuentealba 1., Viniegra S.. Garcia
/\.(}.. Davletov 13., Gutiiirrez L.M. Tight coupling of the t-SNARE and calcium
channel microdomains in adrenomedullary slices and not in cultured chromaflin
cells // Cell Calcium. — 2007. Vol. 41. — P. 547-558.
469. Lou X.. Paradise 5.. Ferguson S.M.. De Camilli P. Selective saturation
ofslow endoeytosis at а giant glutamatergic central synapse lacking dynamin 1 //
Proc Natl Acad Sci. — 2008. —- Vol. l()5. P.l7555—l7560.
470. Lowe M. Structure and function ofthe Lowe syndrome protein O(.‘RLl
// ‘lrtlflic. 2005. — Vol. О. ���� l’.7I 1-719.
471. Llin6s R.. (iruner J./\.. Sugimori M.. Mc(iuinness 'l‘.l.., (ireengard P.
294
Regulation by synapsin I and Ca(2+)-calmodulin-dependent protein kinase ll of
the transmitter release in squid giant synapse //J Physiol. — 1991. — Vol. 436. - Р.
257-282.
472. Llinas К, Sugimori М., Silver КВ. The concept of calcium
concentration microdomains in synaptic transmission // Neuropharmacology. ц
1995. — \/о1. 34. — Р.1443-1451.
473. L1obetA., Cooke /\., Lagnado 1.. Exocytosis at the ribbon synapse of
retinal bipolar cells studied in patches ofpresynaptic membrane // J Neurosci. --
2003. — Vol. 23. - Р. 2706—27l4.
474. Luedeke C., Frei S.B., Sbalzarini 1., Schwarz ll.. Spang /\., Barral Y.
Septin-dependent compartmentalization ofthe endoplasmic reticulum during yeast
polarized growth // J Cell Biol. — 2005. — Vol. 169. -— P.897—908.
475. Macler J.M., Drummond J./\., 1.oewen C.A. et al. The C213 Ca2+-
binding motif of synaptotagmin is required for synaptic transmission in vivo //
Nature. — 2002. — Vol. 418, М 6895. — Р.34О-344.
476. Malacombe М., Bader МЛ, Gasman S. Exocytosis in neuroendocrine
cells: new tasks for actin // Biochim Biophys Acta. ~ 2006- Vol. 1763. — P.1l75-
1 183
477. Ма1еп1‹а R.C., l\'icoll R.A. Long-term potentiation — a decade of
progress‘? // Science. — 1999. — Vol. 285. — P. 1870-1874.
478. Malenka R.C.. Bear M.F. LTP and LTD: An embarrassment of riches //
Neuron. — 2004. — Vol. 44. — 1’. 5-21.
479. Mallik R., Petrov D., Lex S.A.. King S.J.. Gross S.l’.. Building
complexity: an in vitro study ofcytoplasmic dynein with in vivo implications //
Curr Biol. 2005. — Vol. 15. P.2075—2085.
480. Macia 15., Ehrlich M., Massol К, Boucrot Е, Brunner C., Kirchhausen
T. Dynasore, a cell—per1neable inhibitor ofdynamin // Dev Cell. и 2006. — Vol. 10.
— P.839-850.
481. Maldonado-l36ez I... Wendland B. lindocytic adaptors: recruiters.
coordinators and regulators // Trends Cell Biol. — 2006. ~— Vol. 16. - P505-513.
482. Mani М., Lee S.Y.. Lucast L, Cremona 0., Di Paolo (1., De Camilli P.,
Ryan ТА. The dual phosphatase activity of synaptojaninl is required for both
ellicient synaptic vesicle endocytosis and reavailability at nerve terminals //
Neuron. -4 2007. —- Vol. 56. -- P.1004—l018.
483. Marks B..Stowell.’VI.H..Val1is Y. et al. GTPase activity olidynamin and
resulting conformation change are essential for endocytosis // Nature. 2001. ~~
Vol. 410. — P.23l-235.
484. Marks 15., McMahon llfl‘. Calcium triggers calcineurin—dependent
synaptic vesicle recycling in mammalian nerve terminals // Curr Biol. и 1998. ——
Vol. 8. I’. 740~749.
Ё 295
485. Martelli A.f\/1.. Baldini G., Tabellini G. Rab3A and RAb3D control the
total granule number and the fraction of granules docked at the plasma membrane
in PCl2 cells // Traffic. — 2000. -Vol. 1. — P.976-986.
486. Martin T.F. PI(4,5)P(2) regulation of surface membrane traflic // Curr.
Opin. Cell Biol. 4- 2001. — \/о1. 13. - Р.493-499.
487. Marsa ��� Long Т, Saiardi A. Et al. Polyunsatyrated tatty acids influence
synaptojanin localization to regulate synaptic vesicle recycling // Mol. Biol. Cell.
— 2008. — Vol. 19. — Р. 833-842.
488. Massol КН, Boll W., Grillin A.M., Kirchhausen T. A burst ofauxilin
recruitment determines the onset ofclathrin-coated vesicle uncoating // Proc Natl
Acad Sci. — 2006. — Vol. I03. — P.l0265-10270.
489. Matteoli M., Takei K.. Penn МВ. et а1. Exo—endoeytotie recycling of
synaptic vesicles in developing processes of cultured hippocampal neurons // J.
Cell Biol. —- 1992. — V. ll7. - R849 — 861.
490. Matteoli M., Coco S.. Schenk Ц, Vcrderio C. Vesicle tumover in
developing neurons: how to build a presynaptic terminal // TRENDS in Cell Biol.
— 2004. —- \/о1. 14, N9 3. -— P.133—l40.
491. Matveeva E.A., Whiteheaet S.W., Vanaman T.C. et al. Phosphorylation
of the N-ethylmaleimide-sensitive factor is associated with depolarization-
dependent neurotransmitter release from synaptosomes // J. Biol. Chem. — 2001.
— Vol. 276. — P.12174-12181.
492. Matthews G., Sterling P. Evidence that vesicles undergo compound
fusion on the synaptic ribbon // J Neurosei. — 2008. — Vol. 28. — R5403-541 l.
493. Мах1т()\/А., Shin (). 11., Liu X.. SudhofT.C.Synaptotagmin—12, a synatic
vesicle phosphoprotein that modulates spontaneous neurotransmitter release // J.
Cell Biol. — 2007. -- \/о1. 176. ��v� Р.113-124.
494. Мау А.Р., Whiteheart S.W., Weis W.l. Unraveling the mechanism of
the synaptic vesicle transport ATPase NSF, the N-cthylmaleimide-sensitive factor
// J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276. -- P.2l991-21994.
495. Маш M.V., Lukyanov K./\., Lukyanov S./\. Family of the green
fluorescent proteinrjoumey to the end of the rainbow // Bioessays. 2002. —- Vol.
24. —- Р. 953-959.
496. McCrea J.H., l)eCamilli P. 2009 Mutations in Phosphoinositide
metabolizing enzymes and Human dcsease // Physiology. —~ 2009. -— Vol. 24. — P.
8-16.
497. McCirath J.L. Dynein motility: four heads are better than two // Curr
Biol. -2()()5. Vol. 15. -— Р. R97()—972.
498. .\/lcPherson l’.S.. Garcia l-).P., Slepvcv V.l. ct а1. А presynaptie inisit0l-
5-phosphatase // .’\'alure. 1996. Vol. 379. — Р.353-357.
499. McPherson l’.S.. Ritter B. Peptide motifs: building the clathrin
296
machinery // l\/I01 Neurobiol. — 2005. — Vol. 32. - P.73-87.
500. McMahon H.T., Gallop J.L. Membrane curvature and mechanisms of
dynamic cell membrane remodelling // Nature. ч 2005. — Vol. 438. R590-596.
501. McMahon 1l.T., Mills l.G. СОР and clathrin-coated vesicle budding:
different pathways, common approaches // Сшт ()pin Cell Biol. — 2004. — Vol. 16.
— Р. 379-391.
502. Meimaridou 15., Gooljar S.B., Chapple Н’. From hatching to dispatching:
the multiple cellular roles of the Hsp70 molecular chaperone machinery // J M01
Endocrinol. — 2009. ~— Vol. 42. — P.l-9.
503. Meinrenken C.J., Borst J. G., Sakmann B.Meinrenken, C.J. Local routes
revisited: the space and time dependence ofthe Ca2+ signal for phasic transmitter
release at the calyx of Held // J. Physiol. — 2003. — Vol. 547. — Р.665-689.
504. Meinertzhagen l.A., Govind C.K., Stewart B./\._ Caner J.M., Atwood
H.L. Regulated spacing of synapses and presynaptic active zones at larval
neuromuscular junctions in different genotypes of the flies Drosophila and
Sarcophaga // J Comp Конго]. — 1998. —— \/о1. 393. — Р. 482-492.
505. Meir/\.. Ginsburg S., Butkevich А.. Kachalsky S.G.. Kaiserrnan 1., Ahdut
R., Demirgoren 5., Rahamimoff R. lon channels in presynaptic nerve terminals
and control of transmitter release // Physiol Rev. — 1999. — Vol. 79. -~ Р.1019-
1088.
506. Melia Г]. Putting the clamp on membrane fusion: how complexin sets
the stage for calciurn-mediated exocytosis // FEBS lett. — 2007. — Vol. 581. —
P.213l-2139.
507. Mellman 1. Endocytosis and molecular sorting // Annu. Rev. Cell Dev.
Biol. - 1996. — V. 12. -P.575-625.
508. Mennerick �9X� Zenisek 1)., Matthews G. Static and dynamic membrane
properties of large-terrninal bipolar cells from goldfish retina: experimental test
ofa compartment model // J Neurophysiol. -— 1997. — Vol. 78. -- Р.51-62.
509. Merrifield C.J.. Feldman I\/1.13., Wan L., Almers W. Imaging actin and
dynamin recruitment during invagination ofsingle clathrin—coated pits //Nat. Cell
Biol. - 2002. — Vol. 4. -- P.69l—698.
510. Merritield (.‘.J., Perrais D., Zenisek D. Coupling between clathrin-
coated-pits invagination. cortactin recruitment, and membrane scission observed
in living cells // Cell. — 2005. — Vol. 121. 0@T� P. 593-606.
51 1. Micheva K.D.. Buchanana J., Holz R.W., Smith SJ. Retrograde regulation
of synaptic vesicle endocytosis and recycling // Nature neurosci. — 2003. ›— Vol. 6,
Кв 9. —P.925—932.
512. Micheva K.D., Smith S.J. Strong effects of subphysiological
temperature on the function and plasticity of mammalian presynaptic terminals //
J f\leurosci. - 2005. Vol. 25. P. 7481-7488.
���� 297
513. ‘.\/liele 0p�� Watson P.J., Evans P.R. Two distinct interaction motifs in
amphiphysin binds two independent sites on clathrin terminal domain beta-
propeller // Nat. Struct. Мо1. Biol. - 2004. — Vol. l l. — P.242-248.
514. Micsenbnck G., I)e Angelis D.A., Rothman J.E. Visualizing secretion
and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins // Nature.
�f�� 1998. »—- Vol. 394. — P.l92-195.
515. '.\/Iiesenbnck G., Kevrekidis l.G. Optical imaging and control of
genetically designated neurons in functioning circuits // Annu Rev Neurosci. —
2005. — Vol. 28. — P533-563.
516. Mishra S.K., Keyel P.A., Hawryluk MJ. et al. Disable-2 exhibits the
properties of a cargo-selective endocytic xlathrin adaptor // EMBO J. — 2002. —
Vol. 2l. — P.49l5—4926.
517. Misura K.M.S., Scheller КН, Weis W.l. Three-dimensional structure
ofthe neuronal sccl-syntaxin IA complex // Nature. — 2000. — V. 404. — P355 --
362.
5 l 8. Mitsunari T., Nakatsu Е, Shioda N., Love ���� Grinberg A., Bonifacino
J.S., Ohno ll. Clathrin adaptor /\P—2 is essential for early embryonal development
// Мо1 Cell Biol. — 2005. — Vol. 25. —— P. 9318-9323.
519. Montesinos M.L., Castellano-Muco‘/_ M., Garena-Junco-Clemente P.,
Fern6nde7.-Chacyn R. Recycling and EH domain proteins at the synapse /'/ Brain
Res Brain Res Rev. — 2005. — Vol. 49. 4- P.4l6-428
520. Motley A.M., Berg N, Taylor M.J., Sahlender ПА, Hirst J., Owen
D.J., Robinson ИЗ. Functional analysis ot'AP-2 alpha and mu2 subunits // Мо1
Biol Cell. —— 2006. — Vol. 17. — R5298-5308.
521. Morel N. Neurotransmitter release: the dark side of the vacuolar-
H+A'l‘Pase // Biol. Cell. — 2003. »— Vol. 95. — Р.453-457.
522. Моге1 N, Dunant Y._ lSf21."ll М. Neurotransmitter release through the
V0 sector of V—A'l‘Pase // J Neuroehem. — 2001. — Vol. 79. -- P485-488.
523. Morel М, Dedieu J.C., Philippe J.M. Specific sorting ofthe al {войти
of the V-Hr/\TPase a subunit to nerve terminals where it associates with both
synaptic vesicles and the presynaptic plasma membrane // J Cell Sci. — 2003. —
Vol. llo. P.475l—4762.
524. Moreno Н.‚ Yu E, Pigino G., Hemandez A.l., Kim .\'., .\/Ioreira J.l£.,
Sugimori ,Vl.. Llin6s R.R. Synaptic transmission block by presynaptie injection of
oligomeric amyloid beta // Proc Natl /\cad Sci. 2009. -— Vol. l06. — P5901-
5906
525. Morgan/\.. Burgoyne КГ), Barclay J.W.J. е: al. Regulation otexocytosis
by protein kinase C //' Biochem. Soc. Tnans. — 2005. —- Vol. 33. — P. 1341-1344.
526. .Vlorice Е, Andreae l..(.'.. Cooke S.l“., Vanes 1... Fisher l-).f\/l.. 'l‘ybulewic'/..
V.l.., Bliss T.V. Preservation ol' long-term memory and synaptic plasticity despite
298
short-term impairments in the Tel mouse model of1)own syndrome // Leam Mem.
— 2008. — Vol. 15. — P. 492-500.
527. Moss S.J.. Smart ТО. Constructing inhibitory synapses // Nat Rev
Neurosei. —- 2001. Vol. 2. ч Р. 240-250.
528. Mousavi S.A., Malerod L, Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent
endocytosis // Biochem. J. — 2004. Vol. 377. P.l-16.
529. Muhlberg A.B., Warnock �u�� Schmid S.L.Muhlberg, A.B. Domain
structure and intramolecular regulation of dynamin GTPase // EMBO J. 1997. A-
V. 16. P.6676 6683.
530. Muresan V., Lyass A., Schnapp BJ. The kinesin motor KlF3A is a
component of the presynaptic ribbon in vertebrate photoreeeptors // J Neurosci.
ч 1999. Vol. 19. - P. 1027-1037
531. Muithy N.V. DeCamilli P. Cell biology of the presynaptic terminal //
Annu. Rev. Neurosci. — 2003. — Vol. 26. — P.701-728.
532. Musacchio A., Smith C.J., Roseman A.M.,eta1. Functional organization
ofelathrin in coats: combining electron cryomicroseopy and X-ray crystallography
// M01. Cell — 1999. — V. 3. — Р.761—770.
533. Muresan V., Lyass A., Schnapp BJ. The kinesin motor KIF3A is a
component of the presynaptic ribbon in vertebrate photoreceptors // J Neurosci.
— 1999. — \/о!. 19. — P.1027-1037.
534. Nakato-Kobayashi A. Yamazaki M., Unoki Т. et а]. Role ofactivation of
PIP5Kr66l by AP-2 complex in synaptic vesicle endoeytosis // EMBO J. — 2007.
-— Vol. 26. — P. 1105-1116.
535. Nakatsu Е, Okada M., Mori Е, Kumazawa 1\'.,lwasal~l., 7,hu G., Казну
Y., Kamiya 11., Harada A., Nishimura K., Takeuchi A., Miyazaki '11, Watanabe M.,
Yuasa S., Manabe T., Wakabayashi К, Kaneko S., Saito T._ Ohno ll. Defective
function ofGABA-containing synaptic vesicles in mice lacking the AP-3B clathrin
adaptor //J (fell Biol. -- 2004. - Vol. 167. P. 293-302.
536. Nakhost A., Iloueland G.. Castellucci V.F., Sossin W.S. Differential
regulation of transmitter release by alternatively spliced forms of synaptotagmin
1 ��� J ;‘\Ieurosci. — 2003. — Vol. 23. — P6238-6244.
537. Nagwaney S., llarlow M.l_.. JungJ.ll.. SzuleJ.A., Ress D., XuJ.. Marshall
R.M.. MeMahan U.J. Macromolecular connections of active zone material to
docked synaptic vesicles and presynaptic membrane at neuromuscularjunctions
of mouse //J Comp Neurol. —- 2009. — Vol. 513. —— P457-468.
538. Nagy (1.. Kim Н 1.. Pang 7...P.. Matti Ц. RettigJ., Sbdhot"l'.(.‘., Suirensen
J.B. 1)it‘t'erent effects on last exocytosis induced by synaptotagmin 1 and 2 isofonns
and abundance but not by phosphoiylation //J Neurosci. 2006. —~ Vol. 26. — P.
632-643.
539. Nagy (1.. Matti U.. Nehring КН, liinz '1), Rettig 1., Neher 13.. Sorensen
. . 299
J.B. Protein kinase C—depcndent phosphorylation of synaptosome-associated
protein of25 kDa at Serl 87 potentiates vesicle recruitment /'/ J Neurosci. — 2002.
— Vol. 22. — P. 9278-9286.
540. Nagy G., Reim K., Matti U., et al. Regulation of releasable vesicle pool
size by protein kinase A-depend phosphorylation of SNAP-25 // Neuron. »— 2004.
-- Vol. 41. — P351-365.
541. 51аюс111п М., Campbell T.N., Barren B., Miller [..C., 1-lameed S.,
Artemyev l\'.O., Braun J.E. Characterization ofthe G alpha(s) regulator cysteine
string protein // J Biol Chem. — 2005. — Vol. 280. — P. 30236-30241.
542. Neco P, Fernandez-Peruchena C., Navas S. ст al. Myosin ll contributes
to fusion pore expansion during exocytosis // J. of Biol. Chem. — 2008. — Vol.
283. — P. 10949-10957.
543. Neher E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for
understanding their roles in neurotransmitter release // Neuron. — 1998. — V. 20. —
Р. 389-399.
544. Newmyer S.I.., Christensen A., Sever S. Auxilin—dynamin interactions
link the uncoating ATPase chaperone machinery with vesicle formation // Dev.
Cell. — 2003. — Vol. 4, N2 6. p��� P.929-940.
545. Newton J., Kirchhausen T., Murhty V.N. Inhibition of dynamin
completely blocks compensatory synaptic vesicle endocytosis // PNAS. — 2006.
— Vol. 103. — P.17955-17960.
546. Nguyen P.V., Woo N.H. Regulation of hippocampal synaptic plasticity
by cyclic A;\/lP—dependent protein kinases // Progress in Neurobiol. —— 2003. и
Vol. 71. — P.401—437.
547. Nichols B.J.. Ungermann C., Pelham I-{.R., Wickner W.T., Haas A.
l-Iomotypic vacuolar fusion mediated by t- and v-SNAREs // Nature. — 1997. ����
Vol. 387. — P199-202.
548. Nicholson K.L., Munson M., Miller R.B.,eta1. Regulation of SNARE
complex assembly by an T\l—terminal domain of the t SNARE // Ssolp. Nat. Struct.
Biol. - 1998. �7�� V. 5. ш Р.793-8О2.
549. Nishi T., Forgae M. The vacuolar (H+)-ATPases ‘nature's most versatile
proton pumps /'/ Nature Rev. Mol. Cell Biol. — 2002. —- V. 3. — P.94~103.
550. Nonet M.l.., l lolgado A.M., Brewer Е, et al. UNC-l 1. a Caenorhabditis
elegans AP l 80 homologue, regulates the size and protein composition ofsynaptic
vesicles // Mol. Biol. Cell. 1999. -- V. 10. ~- P.2343—23()O.
551. Nossal R. Energetic ofelathrin basket assembly // Trallie. - 2001. —
Vol.2. -11138-147.
552. 51055211 R. Assembly oi" clathrin basket // _\/lacromolecular Symp. -
2005. — \/‹)1. 219. — l’.l—8.
553. .\'unes l‘.. llaincs 51., Kuppuswaniy V. et al. Synaptic vesicle mobility
300 �.�
and presynaptic F-actin are disrupted in a N-ethylma1eimide—sensitive factor allele
ofDrosophi1a // Mol. Biol. Of the Cell. ~ 2006. — Vol. 17. -— P.4709-4719.
554. Ohyama A..l1osaka K., KomiyaY.,A1<agawa K., Yamauchi p��� Taniguchi
11.. Sasagawa М, Kumakura К, Mochida 5., Yamauchi T., Igarashi M. Regulation
ofexocytosis through C a2+/ATP-dependent binding of autophosphorylated Ca2*./
calmodulin-activated protein kinase П to syntaxin 1A //J Neurosci. 2002. — \/о1.
22. -— Р. 3342-3351.
555. Ogawa S., Katsuragi T., Matsuo K... Furukawa T. Inhibitory effect of
okadaic acid on noradrenaline exocytosis from guinea-pig vas deferens // Neurosci
Lett. -— 1994. -\/о1. 178. -— P. 144-146.
556. Oiao J., Mei F.C., Popov V.L., Vergara L.A. Cell cycle-dependent
subcellular localization of exchange factor directly activated by cAMP // J . Biol.
Chem. -2002. — Vol. 277. — Р.26581-26586.
557. Okamoto M.. Sudhof T.C. Mints. Munc18-interacting proteins in
synaptic vesicle exocytosis // J. Biol. Chem. v— 1997. — Vol. 272. @��� P.31459-31464.
558. Ора2о Е, Punge A., Bbckers J.. Hoopmann P., Kastrup L., Hell S.W.,
Rizzoli S.O. Limited Interrnixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle
Recycling // Traffic. - 2010. - Mar 9.
559. Owen D.J., Evans P.R. А structural explanation for the recognition of
tyrosine—based endocytotic signals // Science. — 1998. 9- Vol. 282. -- R1327-1332.
560. Owen D.J. Vallis Ж, Pearse B.M. The structure and function ofthe beta
2-adaptin appendage domain // EMBO J. — 2000. -— Vol. 19. — P4216-4227.
561. Owen D.J., Collins B.M.. Evans P.R. Adaptors for clathrin coats: stiucture
and function // Annu Rev Cell Dev Biol. - 2004. — Vol. 20. ›- Р. 153-191.
562. Owen D.M._. Neil M.A.A., French P.M.W., MageeA.I. Optical techniques
for imaging membrane lipid microdomans in living cells // Seminars in Cell and
Development Biology. — 2007. - Vol. 18. A 17.591 — 598.
563. Pack—Chung Е.‚ Kurshan P.T.. Dickman ЦК, Schwarz TL. A Drosophila
kinesin required for synaptic bouton formation and synaptic vesicle transport //
Nat Neurosci. и 2007. — Vol. 10. — P. 980-989.
564. Pagano %�� Puri V.. Dominguez M.. Marks D.L. Membrane trafiic in
sphingolipid storage diseases // Traffic. - 2000. — Vol. 1. P807-815.
565. Palfreyman M.. J()rgensen ЕМ. PKC defends crown against Munc13 /
/ Neuron. —- 2007. -- Vol. 54. — P. 179-180.
566. Paillart (2.. Li J.. Matthews G., Sterling P. Endocytosis and vesicle
recycling at а ribbon synapse //J Neurosci. 2003. - Vol. 23. P��� P. 4092-4099.
567. Pan P.Y., Tian J.11., Shcng Z.H. Snapin facilitates the synchronization of
synaptic vesicle fusion // Neuron. - 2009. — Vol. 61. P. 412-424.
568. Park J.J., Loh Y.P. Пои’ peptide hormone vesicles are transported to
the secretion site for exocytosis // Mol lindocrinol. 2008. А \/01. 22. Р. 2583-
301
Ь
2595
569. Parodi J., Sephlveda F.J., Кои J., Opazo C.,1nestrosa МС, Aguayo ДО.
Beta-amyloid causes depletion of synaptic vesicles leading to neurotransmission
failure // J Biol Chem. — 2010. — Vol. 285. — P. 2506-2514.
570. Parsons R.l.., Calupca M./\., Merriam l,.A., Prior C. Empty synaptic
vesicles recycle and undergo exocytosis at vesamicol-treated motor nerve
terminals // J Neurophysiol. —— 1999. ~— Vol. 81. ~ P. 2696-2700
571. Patrick ОХ, Bingol B., Weld H.A., Scliuman E.M. Ubiquitin-mediated
protcasome activity is required for agonist-induced endocytosis of GluRs // Curr
Biol. —- 2003. ~— Vol. 13. — P. 2073-2081.
572.Pere7.-Reyes Е, Lee .l.H., Cribbs L.I.. Molecular characterization of
two members ofthe T-type calcium channel family // Ann N Y Acad Sci. — 1999. —
Vol. 868. — P. 131-143.
573. Pearse B. M. Coated vesicles from pig brain: purification and
biochemical characterization // J Mol Biol. — 1975. — Vol. 97. — P. 93-98.
574.Pcarse B..\/1.. Smith C.J., Owen П]. Clathrin coat construction in
endocytosis // Curr. Opin. Struct. Biol. — 2000. — Vol. 10. — P220-228.
575.Peeot-Dechavassine M. Membrane events captured by cooling and
related to transmitter release at frog neuromuscular junction // Neurosci. Lett. —
1982. — Vol. 10. — P.378—379.
576. Peper K., McMahon U.J. Distribution of acetylcholine receptor in the
vicinity of nerve terminals on skeletal muscle ofthe frog // Proc. Roy. Soc. Lond.
— 1972. — Vol. B181. — P.43l-440.
577. Perera R.M., Zoncu R- Lucast 11., De Camilli P., Toomre D. Two
synaptojanin 1 isoforms are recruited to clathrin-coated pits at different stages //
Proc Natl Acad Sci. — 2006. —- Vol. 19. — P.19332-19337.
578. Pi«'rre7.—Otaco 1., Lujan R, Tavalin S.J., Plomann M., Modregger J., Ни
X.B., Jones ВО, lleinemann S.F.. Lo1)_C..Ehlers M.D. Endocytosis and synaptic
removal of NR3/\-containing NMD/\ receptors by PACSINI/syndapinl // Nat
Neurosci. - 2006. — Vol. 9. — P. 611-621.
579. Peskin C.S., Odell G.M., Oster СМ‘. Cellular motions and thermal
lluctuationsz the Brownian ratchet // Biophys J. — 1993. -— Vol. 65. —- P. 316-324.
580. Peters (Д, Bayer M.J.. Bhhlcr 0f�� Andersen J.S.. Mann V1.. Mayer A.
Trans-coinplex formation by proteolipid channels in the terminal phase of
membrane fusion // Nature. —- 2001. — Vol. 409. — P. 581-588.
581. Peters C., Baars T.1.., Bbl'1lC1' S.. .\/layer/\. Mutual control ofmembrane
fission and fusion proteins // Cell. — 2004. ~ Vol. 119. — Р. 667-678.
582. Petrov /\.M., (iiniatullin A.R., Sitdikova (i.li, Zetirov A.1.. The role of
c(}.V1l’-dependent signaling pathway in synaptic vesicle cycle at the frog motor
nerve terminals // J. Neurosei. — Vol. 2008. — Vol. 28, Хе 49. — 1113216-13222.
302
583. Petrov /\.I\/1., Giniatullin A.R.. Zefirov A.l.. Role ofthe CAMP cascade
in the turnover of the synaptie vesicles of the frog motor nerve terminal //
Neurochem. J. — Vol. 2, N9 3. - Р.175-1 82.
584. Phiehith D., Travaglia M., Yang Z., Liu X,, Zong/\.B., Safer Г), Sweeney
H.L. Cargo binding induces dimerization of myosin VI // Proc Natl Acad Sci. —
2009. — Vol. 106. ~ P.l7320—17324.
585, Phillips А.М.. Smith M., Ramaswami M.. Kelly LE. The products of
the Drosophila stoned locus interact with synaptic vesicles via synaptotagmin //J
Neurosci. — 2000. — Vol. 20. — Р‚8254-8261.
586. Phillips G.R. The presynaptic particle web: ultrastmcture, composition,
dissolution. and reconstitutions // Neuron. — 2001. — V. 32. — P63-67.
587. Pike L.J. Rafi defined: a report on the Keystone symposium on lipid
rafts and cellular function // J. Lipid Res. �ܦ� 2006. — Vol. 47. — P.l597-I598.
588. Pieribone V./\., Shupliakov 0., Brodin Ь, Hilliker-Rothenfluh S.,
Czemik A.J., Greengard P. Distinct pools of synaptic vesicles in neurotransmitter
release // Nature. — l995. ~- Vol. 375. — P. 493-497.
589. Pola-Guyon S., Amar M.. Fossier P., Morel N. Alternative splicing
controls neuronal expression ofv—ATPase subunit al and sorting to nerve terminals
// J Biol Chem. — 2006. — Vol. 281. — Р.17164—17172.
590. Porton B., Wetsel W.C, Reduction ofsynapsin Ш in the prefrontal cortex
of individuals with schizophrenia // Schizophr Res. P��� 2007. — Vol. 94. -— P.366~
370.
591. Poskanzer K.E., Marek K.W., Sweeney S.T., Davis (НМ Synaptotagmin
I is necessary for compensatory synaptic vesicle endocytosis in vivo // Nature.
2003. — Vol. 426. w— P. 559-563.
592. Poskanzer ���� Fetter R.D., Davis G.W. Discrete residues in the c(2)b
domain of synaptotagmin l independently specify endoeytic rate and synaptic
vesicle size // Neuron. — 2006. — Vol. 50. — P.49-62.
593. Pozzi D.. Condlifie 5., Bozzi Ж, Chikhladze M., Grumelli C., Proux-
Gillardeaux V,, Takahashi И, Franceschetti S., Vcrderio С, .\/latteoli M. Activity-
dependent phosphorylation of Serl87 is required for SNAP-25-negative
modulation of neuronal voltage-gated calcium channels // Proc Natl Aead Sci. ~~
2008. 9- Vol, 105. — Р. 323-328.
594. Praefcke G..l., McMahon lI.T. Praefcke. О]. The dynamin superfamily:
universal membrane tabulation and fission molecules‘? // Nature Rev. МЫ, Cell
Biol. -- 2004. — Vol. 5. -— P. 133-I47.
595. Pumplin l).W., Reese 'l'.S., I,lin6s R. Are the prcsynaptic membrane
particles the calcium channels‘? // Proc Natl Ac-ad Sci. -- 1981. — Vol. 78. P.
7210-7213.
596. Qucr-alt A./\., (ioldstein I-.S.B. l.inl<ers. packages and pathways: new
303
coneepys in axonal transport Curr. Opin. in .\'eurobiol. — 2001, Vol. 11. —
Р.550-557.
597. Racz. B., Blanpied T.A..,1-jhlers .Vl.D.. Weinberg К}. Lateral organization
of cndocytic machinery in dendritic spines // Nat Neurosci. — 2004. Vol. 7. ��/� P.
917-918.
598. Rao Y., Ma Q., Vahedi~1-‘aridi A.. Sundborger A., Pechstein A..Puch1<ov
D., Luo L.,Shup1iakov 0.. SaengerW.,11auc1<e V. Molecular basis for S113 domain
regulation of F-BAR—mediated membrane deformation // PNAS. —- 2010. — \/о1.
107. -- Р. 8213-8218
599. Rapoport 1,, Boll W.. Yu A.. Bucking Т., Kirchhausen T. A motif in the
clathrin heavy chain required for the Hse70/auxilin uncoating reaction // Mol Biol
Cell. — 2008. — Vol. 19. — P.405~413.
600. Ramaswami M., Krishnan K.S.. Kelly R.B. lntermediates in synaptic
vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular
junctions // Neuron. — 1994. — Vol. 13. ›- Р.363—375.
601. Rash J.E., Yasumura T.. Dudek ЕЕ, 1\'agyJ.1. Cell-specific expression
of connexins and evidence of restricted gap junctional coupling between glial
cells and between neurons // J Neurosci. — 2001. -— Vol. 21. — P.1983—2000.
602. Rea R., Li 1.. Dharia A., Levitan E.S., Sterling P., Kramer КН.
Streamlined synaptic vesicle cycle in cone photoreceptor terminal s// Neuron. —
2004. — Vol. 41. — P.755-766.
603. Reddy P.11.. Mani G.. Park B.S., Jacques J., Murdoch G., Whetsell W.
Л. Kaye 1., Manczak M. Differential loss of synaptic proteins in A1’/,heimer’s
disease: implications for synaptic dysfunction // J Alzheimers Dis. —- 2005. -— Vol.
7. — P. 103-117.
604. Reid B.. Slater C.R..Bewic1< 0�S� Synaptic vesicle dynamics in rat fast
and slow motor nerve terminals // J .\'eurosci. —— 1999. - Vol. 19. — 112511-2521.
605. Reid УМ. Martinov A., Nja S., et al. Activity-depend plasticity of
transmitter release from nerve terminals in rat fast and slow muscles // J. Neurosci.
— 2003. ~—Vol. 23. М: 28. — Р.9340-9348.
606. Reim K.. Mansour M., Varoqueaux F. et al.Complexins regulate a late
step in Ca-dependent neurotransmitter release // Cell. — 2001. ~ Vol. 104. -— Р.71-
81.
607. Ren (3.. Vajjhala P., Lee J.S. et al. The BAR domain proteins: molding
membranes in fission. fusion. and phagy // Microbiol. and molecular boil. rev. —
2006. ~ Vol. 70. N91. P.37-120.
608. Renden К. von (iersdor1'1‘l'l. Synaptic vesicle endocytosis at a CNS
nerve terminal: faster kinetics at physiological temperatures and increased
endocytotie capacity during maturation // J Neurophysiol. -- 2007. Vol. 98. - 1’.
3349-3359,
304
609. Rhee Betz А., Pyoot ��� ct al. B phorbol ester— and diacylglycerol-
induced augmentation of transmitter release is mediated by I\/luncl3s and not by
PKCs // Cell. —— 2002. н Vol. I08. — P,12l—I33.
6 l 0. Richards D.A., Guatimosim С, Betz W.J. Two endocytic recycling routes
selectively till two vesicle pools in frog motor nerve terminal // Neuron. — 2000.
— \/_ 27. —- I’.55l-559.
6l l . Richards D./\., Guatimosim С, Rizzoli S.O., Betz “Н, Synaptic vesicle
pools at the frog neuromuscular junction //Neuron. — 2003. -— Vol.3‘). P'�� R529-
541.
612. Richards D.A,, Rizzoli 5.0., Bet’/. W.J. Effects of wortmannin and
lantrunculin A on slow endocytosis at the frog neuromuscularjunction // J. Physiol
— 2004. ‹ \/01. 557, N2 1, —- Р.77-91.
6 l 3. Richards ПА. Vesicular release mode shapes the postsynaptic response
at hippocampal synapses // J Physiol. — 2009. w— Vol. 587. ~- P. 5073-5080.
614. Richmond E.J., Broadie K.S. The synaptic vesicle cycle: cxocytosis
and endocytosis in Drosophila and C. elegans // Curr. Opin. Neurobiol. › › 2002. и
\/о1. 12, — Р.499-507.
615. Richmond E.J., Davis W.S., Jorgensen � �� Uncl3 is required for
synaptic vesicle fusion in С. clegans // Nat. Neurosci. — 1999. — \/о1. 2. — Р.959-
964.
616. 111с1‹тап С, Medine C.N., Bergmann A.. Duncan 11.11, Functionally and
spatially distinct modes of MUNCIS-syntaxin 1 interaction // J. Biol. Chem. —
2007, — \/‹›1. 282, N9 I6. — P.12097-12103.
617. Rieke F., Schwartz E.A. Asynchronous transmitter release:
control of exocytosis and endocytosis at the salamander rod synapse // J
Physiol. -1996. » Vol. 493. — P21-8.
618. Ringstad М, Gad 11., Low P. et al. Endophilin/Sl-I3P4 is required for
the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle
endocytosis // Neuron. — 1999. ~~ V24 — R143-154.
619. Rixo J., Chen Х.. Arac I). Unraveling the mechanism ofsynaptotagmin
and SNARE function in neurotransmitter release // Trends Cell Biol. - 2006. —
Vol. I6. ~- P.339-350.
620. Rizo J.. Sudhot"l'.C. SN/\Rl;‘s and .'\/lune 18 in synaptic vesicle fusion/
/ Nature Rev. ���� 2002. Vol. 3, — Р.641-653.
62]. Riyo J._. Rosenmund C. Synaptic vesicle tusion // Nat Struct Ио! Biol.
- 2008. ч Vol. — 15, ~ 1’. 665-674.
622. Ri'/Joli S.()., Betz W..l, lifieets of2-(4—morpholinyl)—4H—l ben7.opyran-
4-one on synaptic vesicle cycling at the frog neuromuseularjunction / 5.0. Rizzoli,
W.J. Вы; и/ J. Neurosci. 2002. \/о1. 22. l’.l0680-10689.
623. Ri//.o|i 5.0.. Bety “Н, The structural organi/,ation ol‘ the readily
305
releasable pool of synaptic vesicle // Science. — 2004. — \/о1. 303. —~ P.2037-2039.
624. Ri77.oli S.O., Веги WJ. Synaptic vesicle pools// Nature rev. Neurosci.
м 2005. — Vol. 6. - P.57-69
625. Roberts W.T\/1., Jacobs R./\., lludspcth АД. Colocalization of ion
channels involved in frequency selectivity and synaptic transmission at presynaptic
active zones of hair cells // J Neurosci. — 1990. — Vol. 10. ~ P. 3664-3684.
626. Robertson М). The ultrastrueturc of reptilian myoneural junction //
Ann. Rev. Biocliem. — 1983. — Vol. 52. — R871-926.
627. Robinson МВ. Adaptable adaptors for coated vesicles // Trends Cell
Biol. — 2004. — Vol. 14. — P. 167-174.
628.Robitail1e R., Garcia M.L., Kaczorowski G.J., Charlton M.P. Functional
co-localization of calcium and calcium-gated potassium channels in control of
transmitter release // Neuron. — 1993. ~- V. 11. — P.645-655.
629. Robitaille R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression
by glial cells at the frog neuromuscularjunction // Neuron. — 1998. — Vol. 21. — P.
847-855.
630. Rodal А.А.. Kozubowski Ь, Goode B.L., Drubin D.G., 1-Iartwig J.H.
Actin and septin ultrastructures at the budding yeast cell cortex // Мо1 Biol Cell. —
2005. — Vol. 16. — P. 372-384.
631. Rohde G.,Wenze1 D., Ilauke V. Phosphatidylinositol (4.5)-biphosphate
binding site within mu2— adaptin regulates c1athrin—mediated endocytosis // J. Cell.
Biol. — 2002. -~ Vol. 158. — P. 209-214.
632. Rohrbough J., Broadie K. Lipid regulation ofthc synaptic vesicle cycle
// Nature rev. Neurosci. — 2005. — Vol. 6. ~— P.139-150.
633. Rohrbough 1.. Rhushton Н, Palanker L. et а]. Ceramidase regulates
synaptic vesicle exocytosis and trafficking // .1. Neurosei. —~ 2004. —~ Vol. 24. ��g�
Р.7789-7803.
634. Rogozhin A.A., Pang K.K., Bukharaeva Young C., Slater C.R.
Recovery of mouse neuromuscularjunctions from single and repeated injections
of botulinum neurotoxin A //.1 Physiol. — 2008. — Vol. 586. — P. 3163-3182.
635. Rosenmund С., Sigler/\., Augustin 1.eta1. I)it1'crentia1controlofvesicle
priming and short-term plasticity by Muncl3 isofomi // Neuron. p�z� 2002. -— Vol.
33. v~ P. 411-424.
636. Ross C.A.. Margolis R.L., Reading S,/\., Pletnikov .\/1., Coyle J.T.
Neurobiology М schizophrenia // Neuron. —~ 2006. � �� Vol. 52. —— P. 139-153.
637. Rossetto 0., Rigoni M., Montccucco C. 1)iffcrcnt mechanism of
blockade otncurocxocytosis by prcsynaptic neurotoxins // Toxicol 1.ett. - 2004.
— Vo1.149. ~P.9l-101.
638. Rossetto 0., Morbiato 1... Caccin P.. Rigoni N/1., Montccucco (I.
Presynaptic en7.ymatic neurotoxins // J \'curochcm. — 20()6. и \/о1. 97. - Р.1534—
306
1545.
639. Ross-Canada Cr., Becker КР, Pappas G. Synaptic vesicles and nerve-
muscle preparation is resinless section // J. Neurocyt. — 1983. - V. 12. - P.8l7-
830.
640. Roth ТЕ, Porter K.R. YOLK PROTEIN UPTAKE IN THE OOCYT1-1
OF THE MOSQUITO AED1-LS AEGYPTI. L. //J Cell Biol. 1964. Vol. 20. Р.
313-332.
641. Roth .'\/1. New candidates for vesicle coat proteins // Nat Cell Biol.
2004. -Vol. 6. —- P. 384-385.
642. Roux A., Uyhazi1(., FrostA.. De Camilli P. GTP-dependent twisting of
dynamin implicates constriction and tension in membrane llSSl0I1 // Nature.
2006. \/о1. 441. — P. 528-531.
643. Roy C.R., Wrana J.1.. Clathrin- and non-clathrin-mediated endocytosis
regulation ofcell signaling // Nature rev. Mol. Cell Biol. —— 2005. ~- Vol. 5. Хе 2. —
l’.ll2-126.
644. Royle S.J.. Lagnado L. Endocytosis at the synaptic terminal .// J. Physiol.
— 2003. — Vol. 553. — P.345—355.
645. Royle S.J., Bright N./\., Lagnado L. Clathrin is required for the function
of the mitotic spindle // Nature. -2005. —- Vol. 434. — P. 1152-1157.
646. Royle S.J.The cellular functions of clathrin // Cell Мо1 Life Sci. --
2006. — Vol. 63. -- P. 1823-1832.
647. Rozov A.. Bumashev М, Sakmann B.. Neher E. Transmitter release
modulation by intracellular Ca buffer in facilitating and depressing nerve terminals
of pyramidal cells in layer 2/3 of the rat neocortex indicates a target cell—specitic
dillerence in presynaptic calcium dynamics // J. Physiol. v— 2001. —— Vol. 531. — P.
807-826.
648. Ruiz R.. Casacas J.J., SI>(.ll10l'”l‘.C., Tabares L. Cysteine string protein-
alpha is essential for the high calcium sensitivity of exocytosis in a vertebrate
synapse // Eur] Neurosci. — 2008. - Vol. 27. -1’. 3118-3131.
649. Ryan T.A.. Reuter H.. Wendland B.. Schweizer P�i� Tsien R.W.. Smith
SJ, The kinetics ol' synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic
boutons // Neuron. — 1993. — Vol. ll. — P.7l3-724.
650. Ryan T.A., Smith SJ. Vesicle pool mobilization during action potential
firing at hippocampal synapses //' Neuron, -- 1995. — Vol. 14. - P. 983-989.
651, Ryan T.A. Presynaptic imaging techniques // Curr Opin Neurobiol. —
2001. — Vol. ll. - P. :544—549.
652.SabatiniB.1...Regehr W.(i.'l‘iming ofneurotransmission at fast synapses
in the mammalian brain // Nature. 1996. Vol. 384. —— P.l70-172.
653. Sahin B. Bibb J.A. Protein kinases talk to lipid phosphatases at the
synapse //' Proc Natl Acad Sci. 2004. Vol. 101, - P.lll2-l 113.
307
654. Saito Y., Kawashima A., Ruberu N.N., Fujiwara 11., Koyama S., Sawabe
M., Arai T., Nagura H., Yamanouchi11.,Hasegawa M., lwatsubo T., Murayama S.
Accumulation of phosphorylated alpha-synuclein in aging human brain // J
Neuropathol Exp Neurol. ~ 2003. -- Vol. 62. — Р.644-654.
655. 5а1аип С.‚ James I).J., Chamberlain ДН. Lipid rafts and the regulation
of exocytosis // Traffic. -— 2004. —Vol. 5. — P.255-264.
656. Salazar G., Craige B., Wainer 13.H., Guo J., De Camilli P., Faundcz V.
Phosphatidylinositol-4-kinase type ll alpha is a component of adaptor protein-3-
derived vesicles // Mol Biol Cell. — 2005. ~ Vol. 16. — P. 3692-3704.
657. Salem N. ‚Гл, Pawlosky R., Wegher B., Hibbeln J. In vivo conversion of
linoleic acid to arachidonic acid in human adults // Prostaglandins Leukot Essent
Fatty Acids. -1999. — Vol. 60. — P. 407-410.
658. Salcini A.E., Hilliard M.A., Croce А., Arbucci S., Luzzi Р., Tacchetti C.,
Daniell L., De Camilli P., Pelicci P,(}., Di Fiore P.P., Bazzicalupo P. The Eps15 C.
elegans homologue El-1S-1 is implicated in synaptic vesicle recycling // Nat Cell
Biol. — 2001. — Vol. 3. — P. 755-760.
659. Sankaranarayanan S., Dc Angelis D., Rothman J.E., Ryan T.A. The use
of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity // Biophys J. —
2000. — Vol. 79. — P2199-2208
660. Sankaranarayanan S,, Ryan T.A. Calcium accelerates endocytosis of
vSNAREs at hippocampal synapses // Nat Neurosci. — 2001. — Vol. 4. ~— P.129-
136.
661. Sankaranarayanan S., Atluri P.P., Ryan T.A. Actin has а molecular
scaffolding, not propulsive role in prcsynaptic function // Nature Neurosci. — 2003.
— Vol. 6. — P.127-135.
662. Santini F.A., Keen J.l1. A glimpse of coated vesicle creation // Nat.
Cell. Biol. — 2002. — Vol. 4. — P.E230-I-I232.
663. Sara Y., Virmani Т., l)eak Р., Liu X.et al. An Isolated pool of vesicle
recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission // Neuron. — 2005. »
Vol. 45. — P.563-573.
664. Scales S.J., 1-leuser B./\., Masada E.S. с: al. Amysin, a novel syntaxin-
binding protein that may regulate SNARE complex assembly // J. Biol. Chem. —
2002. — Vol. 277. —— P2827]-28279.
665. Scales S.J., Yoo B.Y.. Scheller R.H. The ionic layer is required for
ettivient dissociation ofthe SNARE complex by 6SN/\P and NSF // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2001. ~ Vol. 98. -- 1214262-14267.
666. Schnee �{� Lawton l)..'\/1.. Furness 1).N., Benke T.A.. Ricci АД.
Auditory hair cell-afferent tiber synapses are specialized to operate at their best
frequencies // Neuron. -~ 2005. Vol. 47. Р, 243-254
667. Schaub ШК, l.u X., Shin B. et al. llemitiusion arrest by complexin is
308
relieved by Ca2+—synaptotagmin 1 // Nat. Stiuct. МЫ. Biol. — 2006. — Vol. 13. A
R748-750.
668. Schiavo G., Matteoli l\/1., Montecucco C. Neurotoxins affecting
neuroexocytosis // Physiol Rev. — 2000. — Vol. 80. — P. 717-766.
669. Schlossmann J., Hofmann F. cGMP—depcndent protein kinases in drug
discovery // Drug Diseov. Today. — 2005. — Vol. 10, N9 9. — P.627-624.
670. Schmidt A./\. Membrane transport: the making ofa vesicle // Nature
(London). — 2002 — Vol. 419. — Р.347-349.
671. Schmid S.L., Braell W.A., Sehlossman D..'\/1., Rothman J.1i. A role for
clathrin light chains in the recognition of clathrin cages by «uncoating ATPase" //
Nature. — 1984.—V. 311. — Р.228-231.
672. Sehmid S.L., I\/lcNiven M.A., De Camilli P. Dynamin and its partners: a
progress 1'Cp0IT // Curr Opin Cell Biol. — 1998. — Vol. 10. —- P. 504-512.
673. Schoch S., Castillo P.E._ Jo T. с: а1. RIMI6 forms a protein scafTold for
regulating neurotransmitter release // Nature. -— 2002. — Vol. 415. — Р.321-326.
674. Schoch S., Deak F., Konigstorfcr A. et al.SNARE function analyzed in
synaptobrevin/VAMP knockout mice // Science. 0;�� 2001. — \/о1. 294. ~- P.lll7-
l 122.
675. Schoch S., Gundelfinger E.D. Molecular organization ofthe presynaptic
active zone // Cell Tissue Res. — 2006. — Vol. 326. — R379-391.
676. Scholten A., Heck A.J.R. An introduction to cAMP/CGMP signaling //
(Chapterl) Thesis Arjen Scholten -- 2006, — Vol. H1V6 — P9-51.
677. Seabrooke S., Qui Х‚, Stewart B. Nonmuscle myosin 11 helps regulate
synaptic vesicle mobility at the Drosophila neuromuscular junction // BMC‘
Neuroscience. -- 2010. — Vol. ll. — I’.l1-37.
678. Semenova 1., Burakov А.‚ Berardone N, Zaliapin 1., Slepchenko B.,
Svitkina T,, Kashina A., Rodionov V. Actin dynamics is essential for myosin—based
transport of membrane organelles // Curr Biol. — 2008. — Vol. l8.- Р. 1581-1586.
679. Seino S., Sliibasaki T. PK/\—dependent and PKA-independent pathways
for cA1VlP—regulated exocytosis // Physiol. rev. — 2005. -— Vol. 85. —v R1303-1342,
680. Sengar/\.S., Wang Щ, Cohen 13., Egan ��� The Ell and SH3 domain lise
proteins regulate eridocytosis by linking to dynamin and Epsl5 // EMBO J. -1999.
V. 18. —P.l159—1171.
681. Sequeira S.M., Carvalho A.P., Carvalho СМ. Both protein kinasc G
dependent and independent mechanisms are involved in the modulating glutamate
release by nitric oxide in rat hippocampal newe tenninal // i‘\'eurosei. Lett. и 1999.
Vol. 261. — R29-32.
682. Serra—l’agus C, Medley Q.C}., Tang M., Hart A.. Streuli M. Liprins. a
family ol‘ L./\R transmembrane protein—tyrosinc phosphatase-interacting proteins
//J Biol (‘hem. А 1998. -— Vol. 273. — l’.l56l l—l562().
683. Seton К, Hekansson I,., Karawajczyk M., Venge P. Scand The stimulus-
dependent release ofeosinophil cationic protein and eosinophil protein х increases
in apoptotic eosinophils // J Immunol. — 2003. — Vol. 58. —— P. 3 l2-320.
684. Sever S.H., Damke Н, Schmid S.I.. Garrotes, springs, ratchets and whips:
putting dynamin models to the test // Traffic. -- 2000. — Vol. 1. — R385-392.
685. Scheuber А.‚ Rudge К, Danglot Д, Raposo G., Binz T., Poncer J.C.,
Galli T. Loss of AP—3 function affects spontaneous and evoked release at
hippocampal mossy fiber synapses // Proc Natl Acad Sci. — 2006. —- Vol. 103. —
P.l6562—l6567.
686. Shen J., Tareste D.C., Paumet F.et al. Selective activation of cognate
SNAREpins by Secl/Muncl8 proteins // Cell. — 2007. — Vol. 3. — P.I83—l95.
687. Schikorski T., Stevens C.F. Quantitative ultrastructural analysis of
hippocampal excitatory synapses // J Neurosci. — 1997. — Vol. 17. — P.5858—5867.
688. Schlhter O.M., Schmitz F., Jahn R., Rosenmund C., ShdhofT.C. A
complete genetic analysis of neuronal Rab3 function // J Neurosci. — 2004. — Vol.
24. — R6629-6637.
689. Schmidt M.R., Ilaueke V. Recycling endosomes in neuronal membrane
traffic // Biol Cell. ~ 2007. — Vol. 99. — P. 333-342.
690. Schneggenburger R.. Neher E. Intracellular calcium dependence of
transmitter release rates at a fast central synapse // Nature. — 2000. -— Vol. 406. —
P889-893.
691. Schneggenburger R, Neher E. Presynaptic calcium and control of
vesicle fusion. Curr Opin Neurobiol. 2005 Jun;l5(3):266-74.
692. Shahin V., Datta П, Hui 15., I Ienderson R.M., Chapman E.R., Edwardson
J.M. Synaptotagmin perturbs the structure ofphospholipid bilayers // Biochemistry.
-— 2008. — Vol. 47. — P.2l43-2152.
693. Shakiryanova D.M., Zetirov A.L.. Nikolsky E.E.. Vyskocil F.The effect
of acetylcholine and related drugs on currents at the frog motor nerve terminal //
Eur J Pharmacol. — 1994. — Vol. 263. — P.l07-114.
694. Sheng Z.H., Кета J., Takahashi M., Catterall W.A. Identification ofa
syntaxin-binding site on .\’-type calcium channels // Neuron. — l994. —- Vol. l3. ~-
P.1303—l3l3.
695. Shibasaki T., Sunaga Y., Seino S. Shibasaki, T. Integration ATP, cAMP
and Ca2~ signals in insulin granule exocytosis // Diabetes. -2004. Vol. 53. —
P.59- (>2.
696. Shih W., Gallusser A., Kirehhausen T. А clathrin-binding site in the
hinge ofthe beta 2 chain of mammalian AP-2 complexes // J. Biol. Chem. — I995.
—- V0l.l2l. —~ P.()l—72.
(>97. Shimazaki Y., Nishiki T., ()mori /\.. Sekiguchi M.. KamataY.. Коши ����
Takahashi M. Phosphorylation of25—kI)-.1synaptosome—associatedprotein. Possible
310
involvement in protein kinase C-mediated regulation of neurotransmitter release
// J Biol Chem. —- 1996. - Vol. 271. — P.145-18-14553.
698. Shimomura 0., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and
properties ofaequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan,
Aequorca // J Cell Comp Physiol. - 1962. Vol. 59. -- P. 223-239.
699. Shin 0.11.. Rhee J.S., Tang J. et a1. Binding to the Ca2+ binding site of
the synaptotagmin 1 С2В domain triggers last exocytosis without stimulating
SNARE interactions // Neuron. — 2003. — Vol. 37. — P.99—108.
700. Shin O.H., Lu J., Rhee J.S., Tomchick D.R., Pang 7..P., Wojcik 0�L�
Camacho—Perez M., Brose М, Мас111115 М., Rizo J ., Rosenmund C.. SbdhofT.C.
Munc13 С2В domain is an activity-dependent Ca2- regulator of synaptic
exocytosis // Nat Struct M01 Biol. —- 2010. — \/о1. 17. — Р. 2280-288.
701. Shupliakov 0., Bloom 0., Gustafsson J.S., KjaerultTO., L()w P..Tomi1in
N., Pieribone V./\., Greengard P., Brodin 1,. Impaired recycling olsynaptic vesicles
after acute perturbation of the presynaptic actin cytoskeleton // Proc Natl Acad
Sci. -- 2002. —— Vol. 99. P.14476-14481.
702. Silva J.P., Suckling J.. Ushkaryov Y. Penelope’s web: using alpha-
latrotoxin to untangle the mysteries ofexocytosis // J Ncurochem. —- 2009. — Vol.
111. — P. 275-290.
703. Sim /\.'1‘., Baldwin M.L., R0stasJ.A., I1olstJ., Ludowyke R.1. The role
of serine/threonine protein phosphatases in exocytosis // Biochem J. —- 2003. —
Vol. 373. ~— P. 641-659.
704. Simkus C.R., Stricker C. Properties of mEPSCs recorded in layer 11
neurones of rat barrel cortex. // J Physiol. ��1� 2002. -— Vol. 545. — Р.5О9-52О.
705. Simon S.M.. Llin6s R.R. Compartnientalization ofthe submembrane
calcium activity during calcium intlux and its significance in transmitter release /
/ Biophys J. — 1985. -— Vol. 48. —- P.485—498.
706. Sinjoanu R.C., Kleinschmidt 5., Bitner R.S.. Brioni J.D., Moeller A.,
Ferreira A. The novel ealpain inhibitor A-705253 potently inhibits oligomeric
beta-amyloid-induced dynamin l and tau cleavage in hippocampal neurons //
Neurochem Int. @=5� 2008. -~ Vol. 53. - P.79-88.
707. Sirajuddin M., Farkasovsky M., Hauer 15., Кь111тапп D.. Macara 1.G.,
Weyand M., Stark 11., Wittinghofer A. Structural insight into filament formation
by mammalian septins // .\'aturc. -— 2007. —- Vol. 449. 1’. 31 1-315.
708. Slater СВ. Structural factors influencing the efficacy ofneuromuscular
transmission // Ann К Y Ac-ad Sci. 2008. ч Vol. 1132. и Р. 1-12.
709. Slepnev \/.l.. De (‘amilli P. Accessory factors in clathrin-dependent
synaptic vcsiclc endocytosis /C’ .\1-at Rev Ncurosei. — 2000. Vol. 1. -- P161-172.
710. Slcpnev V.1.. ()cho'.1(i.(‘., Butler M.H.. 1)c(.‘ami1li 1’. Tandem arrangement
ofthe clathrin and Al’-2 binding domains in amphipltysin 1 . and disruption ofclathrin
311
coat function mediated by amphiphysin fragments comprising these sites // J. Biol.
Chem. — 2000. —-- V. 275. —— 11583-589.
711. Smillie et al., 2005 Smillie KJ. Evans С], Cousin MA. Developmental
change in the calcium sensor for synaptic vesicle endocytosis in central nerve
terminals. J Neuroehem. 2005 Jul:94(2):452—8.
712. Smith C.B., Betz W.J. Simultaneous independent measurement of
endocytosis and exocytosis // Nature. -1996. - Vol. 380. — P. 531-534.
713. Smith R.M.. Baibakov B., Ikebuchi Y., White B.H., Lambert N.A.,
Kaczmarek L.K., Vogel �2�� Exocytotic insertion 01‘ calcium channels constrains
compensatory endocytosis to sites of exocytosis // J Cell Biol. — 2000. — Vol.
148. — P.755—767.
714. Snyder D.A., Kelly M.L.. Woodbury D.J. SNARE complex regulation
by phosphorilation // Cell Biochem. Biophys. — 2006. — Vol. 45. — Р.1 11-123.
715. Sollner T.A., Bennett M.K., Whiteheart S.W. Protein assembly-
disassembly pathway in vitro that may correspond to sequental steps of synaptic
vesicle docking, activation, and fusion // Cell. — 1993. -- Vol. 75. - P.409-418.
716. Sorensen J.B.. Chaeon F.R., Sudhof T.C., Neher E. Examining
Synaptotaginin l function in dense core vesicle exocytosis inder direct control of
Ca2+ // J. Gen. Physiol. — 2003. — Vol. 122. — P.l65-276.
717. Sorokin, A. Cargo recognition during clathrin-mediated endocytosis: a
team effort // Curr. Opin. Cell Biol. —— 2004. - Vol. 16, Мг 4. — R392-399.
718. Sorkin A, von Zastrow M. Endocytosis and signalling: intertwining
molecular networks // l\’at Rev Mol Cell Biol. -- 2009. — \/о1. 10. — Р. 609-622.
719. Spiliotis E.T.. Nelson W.J. Here come the septins: novel polymers that
coordinate intracellular functions & organization // J. Cell Sci. — 2006. — \/о1.
119. — Р.4-10.
720. Springer 5., Spang A., Schekman R. Aprimer on vesicle budding// Cell.
— 1999. — V. 97. —- P.l45—l48.
721. Stadler 1-1., Tsukita S. Synaptic vesicle contain an ATP—dependent proton
pump and show ‘knob—like' protrusions on their surface // EZVIBO. J. — 1984. —
Vol. 3. -— R3333-3337.
722. Stanley E.F. The calcium channel and the organization ofthe presynaptic
transmitter release face // Trends Ncurosci. —- 1997. — Vol. 20. — P.404-409.
723. SteinermanJ.R.,1rizarry .\/1., Scarmeas М, Raju S.. Brandt J.. Albert M.,
Blacker D._ Hyman 13., Stem Y. Distinct pools ofbeta-amyloid in Alzheimer disease-
affected brain: a clinicopathologic study // Arch Neurol. — 2008. -- Vol. 65. -— P.
875-876.
724. Steinman R.M._ Colin ХА. The interaction of soluble horseradish
peroxidase with mouse peritoneal macrophages in vitro // J (fell Biol. 1972. —-
Vol. 55. —- P.l86—204.
312
725. Steinman R.M., Mellman I.S.. Muller W.A., Cohn ХА. I-Indocytosis
and the recycling of plasma membrane // J Cell Biol. — I983. ч \/о1. 96. @��� P.1-27.
726. Staneva G., Angelova M.l., Koumanov K. Phospliolipase A2 promotes
тай budding and fission from giant liposomes / // Chem. Phys. Lipids. — 2004. —
Vol. 129. -- 1’.53—62.
727. Stanton P.K., Winterer J., Barclay C.P. ct al. Long-tenn depression of
presynaptic release from the readily releasable vesicle pool induced by NDI\/IA-
receptor-dependent retrograde nitric oxide //J, Neurosci. — 2003. — Vol. 23. —
P5936-5944.
728. Star E.N., Newton /\.J., Muithy V.N. Rab3 Real-time imaging ofRab3a
and Rab5a reveals differential roles in presynaptic function // J Physiol. — 2005. —
Vol. 569. - P.103—117.
729.Staras K., Branco T.. Burden J.J., Pozo 1<., Darcy К, Marra У, Ratnayaka
A.. Goda Y. A vesicle supeipool spans multiple presynaptic terminals in hippocampal
neurons // Neuron. — 2010. — Vol. 66. — P. 37-44.
730. Stevens C. F. Neurotransmitter release at central synapses // Neuron.
2003. — Vol. 40. — P. 381-388.
731. Stevens C.F., Sullivan ЩИ. The synaptotagmin C2/\ domain is part of
the calcium sensor controlling fast synaptic transmission // Neuron. — 2003. —
Vol. 39, М 2. — Р.299-3О8.
732. Stryker ���� Johnson КО. LAR, liprin alpha and the regulation ofactive
zone morphogenesis // J Cell Sci. — 2007. — Vol. 120. — 113723-3728.
733. Subtil А., Gaidarov 1., Kobylarz K. et al. Acute cholesterol depletion
inhibits clathrin-coated pit budding // Proe. Natl. Acad. Sci. ч 1999. — V. 96. —
P6775 —- 6780.
734. SudhofT.C. The synaptic cleft and synaptic cell adhesion in synapses /
/ed. By Cowan, Sudhof& Stevens. The I-lopkins University Press. ч Baltimore. —
2001 .
735. SudhofT. C. Synaptotagmins: why so many‘? // J. Biol. Chem. — 2002. —
Vol. 277. М 10. — P.7629-7629.
736. SudliofT.C. The synaptic vesicle cycle // Annu. Rev. ‘Neurosci. — 2004.
— Vol. 27. — P.509—547.
737. Sugita S.. Shin О. H., Han W. ct al. Synaptotagmins form a hierarchy of
exocytotic Ca2+ sensors with distinct C212-~ affinities // F.T\/IBO. J. — 2002. — Vol.
21. — P.270-280.
738. Sun J.-Y.. Wu X.—S.. Wu L.—G. Single and multiple vesicle fusion induce
different rates of endocytosis at u central synapses // Nature. ��� 20()2. Vol. 417. —
P.555-559.
739. Sun—Wa(la (3.H,. Toyomura T.. Murata У, Yamamoto /\.. Futai .\/1., Wada
Y. The :13 isoforin ofV-A"l'l’asc regulates insulin secretion from pancreatic beta-
313
cells // J Cell Sci. — 2006. — Vol. ll9. R4531-4540.
740. Sutton M./\., По lI.T., Cressy Р.‚ KempfC., Woo J.C., Schuman F..M.
Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of
local dendritic protein synthesis // Cell. — 2006. -— Vol. 125. — P. 785-799.
741. Sutton M.A., TaylorA.M., ltoll.T. et al. Postsynaptic decoding ofneural
activity: eEF2 as a biochemical sensor coupling miniature synaptic transmission
to local protein synthesis // Neuron. — 2007. — Vol. 55. -- Р. 648-661.
742. Suzuki S., Osanai M., Murase M., Suzuki N., Ito K., Shirasaki T., Narita
K., Ohnuina K., Kuba К, Kijima Н. Са2+ dynamics at the frog motor nerve terminal
// Pflugers Arch. — 2000. — Vol. 440. — P.35l-365.
743. Takagishi Ж, Futaki S., Itoh et al. Localisation of myosin П and IV
isoforms in cultured rat sympathetic neurones and their potential involvement in
presynaptic function // J. Physiol. — 2005. — Vol. 569.1. — Р. 195-208.
744. Takai-Rikitsu @)t� Mochida S., Inoue pB^� et al. Physical and functional
interaction of the active zone proteins, CAST, RIMI, and Basson, in
neurotransmitter release // J. Cell. Biol. — 2004. — Vol. l64. —~ P.301—3l1.
745. Takamori S., Но]: М., Stenius K. ct al. Molecular anatomy of a
trafiicking organelle // Cell. — 2006. — Vol. 127. — P.83l—846.
746. Takamori S., Malherbe P., Broger C., Jahn R. Molecular cloning and
functional characterization of human vesicular glutamate transporter 3 // EMBO.
Rep. -— 2002. — Vol. 3. — P.798-803.
747. Takei K., Mundigl 0., Daniell L., De Camilli P. The synaptic vesicle
cycle: a single vesicle budding step involving clathrin and dynamin //J Cell Biol. -9
1996. — Vol. 133. — R1237-1250.
748. Takei К, Slepnev V.l., Haucke V., DeCamilli P.Functional partner ship
between amphiphysin and dynamin in clathrin—mediated endocytosis // Nature Cell
Biol. — 1999. — V. 1. — P.33-39.
749. Takeshima Н.‚ Shimuta M., Komazaki S., Ohmi K., Nishi M., [то М.,
MiyataA.. Kangawa K. Mitsugumin29, a novel synaptophysin family member from
the triad junction in skeletal muscle // Biochem J. — 1998. — Vol. 331. — P.3l7-
322.
750. Talbot К, Cho I).S., Ong W.Y., Benson lVl.A., Han L.Y.. Kazi H.A., Kamins
J.. Hahn C.(}., Blake D.J., Arnold `�a� Dysbindin-l is a synaptic and microtubular
protein that binds brain snapin // Hum Ио! Genet. —- 2006. - Vol. I5. — P. 3041-
3054.
751. Tall (j.(i., llama l~l.. l)eWald l).B., llorazdovsky B.F. The
phosphatidylinositol-3-phosphate binding protein Vaclp interacts with a Rab
CiTPase and a Seclp homologue to facilitate vesicle-mediated vacuolar protein
sorting // Mol. Biol. Cell. -— 1999. ~— V. 10. А- P.l873-1889.
752. Tan T.(.‘.. Valtona V./\., .\/Ialladi(.‘.S.e1al.Cdk5 is essential for synaptic
314
vesicle endocytosis // Nat. Cell Biol. » 2003. — Vol. 5. I’.70l-710.
753. Tang J., MaximovA., Schin О. et а]. A complexin/synaptotagmin 1 switch
controls fast synaptic vesicle exocytosis // Cell. - 2006. — Vol. 126. -- P.1175-
1 187.
754. Tao Y.X., Hassan A., Johns КА. lntrathecally administered cGMl’-
dependent protein kinase 16inhibitor signilically reduced the threshold for
isoflurane anesthesia: implication for a novel role CGMP-dependent protei kinase
1 6 // Anesthesiology. — 2000. Vol. 92. ~ R493-499.
755. Tasken K., Aandahl Е.М. Localized eflects of CAMP mediated by distinct
routes of protein kinase А // Physiol. rev. — 2004. — Vol. 84. — P.137—167.
756. Tavema E., Saba � Rowe J., Francolini M.. Clementi F., Rosa P. Role
oflipid microdomains in P/Q-type calcium channel (Cav2. 1 ) clustering and function
in presynaptic membranes // J. Biol. Chem. — 2004. p�}� Vol. 279. — P. 5127-5134.
757. Taylor S.S., Kim C., Vigil D.et а]. Dynamics ofsignaling by PKA //
Biochim Biophys Acta. — 2005. b,� Vol. 1754. -~ P.25—37.
758. Tegenge M.A., Stem M., Bicker G. Nitric oxide and cyclic nucleotide
signal transduction modulates synaptic vesicle tumover in human model neurons
// J Neurochem. -- 2009. Vol. 111. »- P. 1434-1446.
759. Teng H.. Lin M.Y., Wilkinson R.S. Macroendocytosis and endosome
processing in snake motor boutons // J. Physiol. — 2007. ~Vo1. 582. P. 243-262.
760. Teng 11., Wilkinson R.S.C1athrin-mediated endocytosis near active zones
in snake motor boutons // J. Neurosci. @�v� 2000. — Vol. 20. — Р.7986-7993.
761. Ter Haar E., Harrison S.C.. Kirchhausen T. Peptide-in-groove
interactions link target proteins to the beta-propeller ofclathrin. Atomic structure
ofclathrinz а beta propeller tenninal domainjoins an alpha zigzag linker // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. -- 2000. — Vol. 97. — P.1096-1100.
762. Terrian I).M. Persistent enhancement of sustained calcium-dependent
glutamate release by phorbol esters: requirement for localized calcium entry // J
Neurochem. — 1995. ч Vol. 64. - P. 172-180.
763. Thakur P., Stevens D.. Sheng Z.-H.. Rettig J.F.lTects 01' PKA-mediated
phosphorylation of snapin on synaptic transmission in cultured hippocampal
neurons // J. Neurosei. — 2004. - Vol. 24. — R6476-6481.
764. Thiele С, Hannah M.J., Fahrcnoholz 15., Huttner W.B.C1io1esterol binds
to synaptophysin and its required for biogenesis ofsynaptie vesicles // Nat. Cell
Biol. —— 2001. - Vol. 2. — P42-49.
765. Thieman J.R., Mishra S.K., Ling K.. Doray B., Anderson R.A., Traub
L.M. (титан regulates the association ot’PlPKlgamma661 with the AP—2 adaptor
beta2 appendage //' J Biol Chem. P46� 2009. Vol. 284. - P. 13924-13939.
766. Thomas � 6� Robitaile R. l)il1‘erential l‘requeney—dcpend regulation ot‘
transmitter release by endogenous nitric oxide at the amphibian ncuromus'cular
315
synapse // The J. of neurosci. — 20()l. -- Vol. 21. М 4. — Р.1О87-1О95.
767. Thomas S., Ritter B., Verbich D.,Sz1nson C., Bourbonnii/Ire Ь, McKinney
R.A., McPherson P.S. lntersectin regulates dendritic spine development and
somatodendritic endocytosis but not synaptic vesicle recycling in hippocampal
neurons // J Biol Chem. —~ 2009. — Vol. 284. — Р. 12410-12419.
768. Thoreson W.B., Rabl K.. Townes-Anderson E., Heidelberger R. A highly
Ca2+-sensitive pool of vesicles contributes to linearity at the rod photoreceptor
ribbon synapse // Neuron. — 2004. -— Vol. 42. — P. 595-605.
769. Thrower E.C. Mobasheri Н, Dargan 5., Marius P., Lea E.J.. Dawson
A.P. Interaction of luminal calcium and cytosolic ATP in the control of type 1
inositol (1,4,5)—trisphosphate receptor channels // J Biol Chem. — 2000. — Vol.
275. — P. 36049-36055.
770. Timsit Y.E., Miller S.l.., Mohney КР, О’Вгуап J.P. The U-box ligase
carboxyl-terminus of Hse 70-interacting protein ubiquitylates Epsin // Bioehem
Biophys Res Commun. — 2005. — Vol. 328. — P. 550-559.
771. Tokuoka, Н Synaptotagmin is Ca2+—dependent exocytosis: dynamic
action in s flash / H. Tokuoka. Y. Goda // Neuron. — 2003. — Vol. 38. — P.521-524.
772. Tokumaru Н.‚ Umayahara K., Pellegrini L.L., Ishizuka T., Saisu Н., Betz
Н.‚ Augustine G.J., Abe T. SNARE complex oligomerization by synaphin/complexin
is essential for synaptic vesicle exocytosis // Cell. — 2001. —Vol. 104. —— P.421-
432.
773. Tomishina N.K., Ryan T.A. Kinetic efficiency of endocytosis at
mammalian CNS synapses requires synaptotagmin 1 // PNAS. — 2004. —Vol. 101.
- P.16648-16652.
774. Tong J., Borbat P. P., Freed J.H., Shin Y—K. A scissors mechanism for
stimulation of SNARE-mediated lipid mixing by cholesterol // PNAS. —— 2009. -
Early Editor. - P. 1-6.
775. Toonen КБ, Kochubey O., de Wit H.et al. Dissecting docking and
tethering of secretory vesicles at the target mcmbrane // Embo J. — 2006. — Vol.
25. — P.3725—3737.
776. Trempe J.F.. Chen C.X.. Grenier K., Camacho F..M.. Kozlov (Ъ
McPherson P.S., Gehring K.. Fon НА. SH3 domains from а subset ofBAR proteins
define a Ubl-binding domain and implicate parkin in synaptic ubiquitination // Mol
Cell. — 2009. —Vol. 36. - P.1034-1047
777. Tsuboi T.. Kanno P^�� Fukuda M. The polybasic sequence in the C2B
domain of rabphilin is required for vesicle docking step in PCI2 cells // J.
l\'eurochcm. 2007. -- Vol. I00. -- P.770-779.
778. Tsuboi T._ Rutter (1./\. .\/lultiple forms of kiss-and-run exocytosis
revealed by evanescent wave microscopy // (Iurr. Cell. 2003. — Vol. 13. — P563-
567.
316
779. Tsui-Pierehala B./\., Eneinas M.. Wilbrandt J., Johnson M. Lipid rafts
in neuronal signaling and function // TRENDS in Neutosei. -— 2002. — Vol. 25, N9
8. — P.4l2—417.
780. Umbach J.A., Saitoe M., Kidokoro Y., Gundersen C.B. Attenuated influx
ofcaleium ions at nerve endings ofcsp and shibire mutant Drosophila // Neurosei.
— 1998. -- Vol. l8. — P. 3233-3240.
781. Umbach .l.A., Zinsmaier K.E., Eberle K.K., Buehner E.. Benzer S.,
Gundersen C.B. Presynaptie dysfunction in Drosophila csp mutants // Neuron. —
1994. — Vol. I3. — P. 899-907.
782. Umeda /\.. Meyerholz/\., Ungewickell E. Identification of the universal
cofactor (auxilin 2) in clathrin coat dissociation // Burl Cell Biol. —- 20()0. — Vol.
79. — P. 336-342.
783. Ungennann С. Langosch D. Function of SNARI-is in intracellular
membrane fusion and lipid bilayer mixing // J. Cell Sci. — 2005. — Vol. l18. —
R3819-3838.
784. Ungewickell E., Branton D. Assembly units of elathrin coats // Nature.
— 1981. — Vol. 289. -- R420-422.
785. Ungewickell E. Clathrin: a goal view ofa shapely leg // Curr. Opin.
Cell. Biol. — 1999. — Vol. 9. — P.R32-R35.
786. Uriu Y., Kiyonaka S., Miki Т., Yagi M.. Akiyama S., Mori E., Nakao/\.,
Beedle A.M.. Campbell K.P., Wakamori M.. Mori Y. RIM {gamma} isofonns
lacking the Rab3—binding domain induce long-lasting currents but block
neurotransmitter vesicle—anchoring in voltage-dependent P/Q—type Ca2-'~ channels/
/J Biol Chem. — 2010. — May 7.
787. Ushkaryov Y.A., Rohou A., Sugita S. alpha-l.atrot0xin and its receptors
// Handb Exp Phannacol. — 2008. - Vol. 184. Р.171-206.
788. Vale R.D. .\/Iyosin V motor proteins: marching stepwise towards a
mechanism // J Cell Biol. — 2003. — Vol. 163. — P.445-450.
789. Valtorta 17., Benfenati Р, Greengard P. Structure and function of the
synapsins // J. Biol Chem. 1992. -- \/о1. 267. — Vol. 7195-7l98.
790. Valtorta Е, Meldolesi J. The presynaptic compartment: signals and
targets // Semin (‘ell Biol. м 1994. - Vol. 5. — P.2l l-219.
791. Valtorta Е, Pennuto .\/1., Bonanomi D., Bentenati F. Synaptophysin:
leading actor or walk—on role in synaptic vesicle exocytosis? // Bioessays. - 2004.
- Vol. 26. P.445—453.
792. van Blitterswijk W.J., van der Luit A.ll., Veldman К]. et al. Ceramide:
second messenger or modulator ofmembrane stmeture and dynamics‘? // Bioehem.
J. - 2003. — Vol. 36‘). ~- P.l99—2ll.
793. Vance J.li., Kanen 13., llayashi ll. Lipid dynamics in neuron // Bioehem.
Soc. Transactions. -› 2000, ~~ Vol. 34, М: 3. ч P.3‘)9—4()3.
317
794. Van der Kloot W._ Molgy J. Quantal acetylcholine release at the vertebrate
neuromuscular junction // Physiol Rev. — 1994. — Vol. 74. —- Р.899—991.
795. van Meer G., Voelker ЦК, Feigenson G.W. Membrane lipids: where
they are and how they behave // Nature. т 2008. —Vol. 9. — P. l 12-124.
796. Vega l.E., Hsu S.C. The septin protein Nedd5 associates with both the
exocyst complex and microtubules and disruption of its GTPase activity promotes
aberrant neurite sprouting in РС12 cells // Neuroreport. — 2003. — Vol. 14. — P.
3l—37.
797. Verderio C., Bianco Е, Blanchard M.P., Bergami M., Canossa M.,
Scarfone E., Matteoli M.. Cross talk between vestibular neurons and Schwann
cells mediates BDNF release and neuronal regeneration // Brain Cell Biol. — 2006.
— Vol. 35. — P.l87-201.
798. Verhage M., Hens .l.J., De Grann P.N., Boomsma F., Wiegant V.M., da
Silva F.H.. Gispen W.H., Ghijsen W.E. Ba2+ replaces Ca2+/calmodulin in the
activation of protein phosphatases and in exocytosis of all major transmitters //
Eur} Pharrnacol. -- 1995. \/о1. 291. P.387-398.
799. Verstreken Р.‚ KjaerulffO.. Lloyd T.E. е: а1. Endophilin mutations block
clathrin—mediated endocytosis but not neurotransmitter release // Cell. — 2002. —
Vol. I09. — P.l0l-112.
800. Verstreken P., Koh T.W., Schulze K.L. et al. Synaptojanin is recruited
by endophilin to promote synaptic vesicle uncoating // Neuron. — 2003. — Vol. 40.
— P.733—748.
801. Verstreken Р., Ly C.V., Venken K.J.T.. et al. Synaptic mitochondria are
critical for mobilization of reserve pool vesicles at Drosophila neuromuscular
junction // Neuron. - 2005. — Vol. 47. —~ P365-378.
802. Vijayaraghavan S. Glial—neuronal interactions—implications for
plasticity and drug addiction // AAPS J. —— 2009. - Vol. l1.— Р. 123-132.
803. Vijayakrishnan N., Woodruff E.A. 3rd. Broadie K. Rolling blackout is
required for bulk endocytosis in non—neuronal cells and neuronal synapses // J
Cell Sci. �0{� 2009. — Vol. 122. Р.114-125.
804. Vijayakrishnan М., Broadie K. Temperature-sensitive paralytic mutants:
insights into the synaptic vesicle cycle // Biochem Soc Trans. — 2006. — Vol. 34. —
P.81-87.
805. Virmani T.. Пап W., Liu X.. SI)dh0fT.C., Kavalali ВТ. Synaptotagmin 7
splice variants differentially regulate synaptic vesicle recycling // EMBO J. — 2003.
Vol. 22. — P.5347-5357.
806. Vithlani M., Moss SJ. The rule of GABAAR phosphorylation in the
construction of inhibitory synapses and the eflicacy of neuronal inhibition //
Biochem Soc Trans. -- 2009. - Vol. 37. Р. 1355—1358.
807. Voglmaier S.M., Kam K.. Yang ll., Fortin D.l... Нин 2.. Nicoll R./\.,
318
Edwards КН. Distinct endocytic pathways control the rate and extent ofsynaptic
vesicle protein recycling // Neuron. — 2006. -— V01. 51. — P.7l—84.
808. Voglmaier S.M., Edwards RH. Do different endocytic pathways make
different synaptic vesicles? // Curr Opin Neurobiol. — 2007. — Vol. 17. — Р. 374-
380.
809. Vogt K.. Mellor J., Tong (3., Nicoll R. The actions ofsynaptically released
zinc at hippocampal mossy fiber synapses // Neuron. — 2000. —— Vol. 26. — P. 1 87-
196.
810. von Gersdorff Н.‚ Matthews G. Dynamics of synaptic vesicle fusion
and membrane retrieval in synaptic terminals // Nature. ��v� 1994. — Vol. 367. —
P.735—739.
811. Wakeham ПЕ, Abi—Rached L.,Tow1er M.C., Wilbur .l.D., Parham P..
Brodsky FM. Clathrin heavy and light chain isoforms originated by independent
mechanisms of gene duplication during chordate evolution // Proc Natl Acad Sci.
— 2005. — Vol. 102. — Р.7209-7214.
812. Walter КА, Berlin КО, Pfeiffer ШК, Oliver J.M. Polarization of
endocytosis and receptor topography on cultured macrophages // J Cell Biol. —
1980. — Vol. 86. — P.199—2l l.
813. Wang НО, Lu F.M., Jin П. et al. Presynaptic and postsynaptic roles of
NO, CGC, and RhoA in long—lasting potentiation and aggregation of synaptic proteins
// Neuron. м 2005. — Vol. 45. Хе 3. — R389-403.
814. Wang X.. Hu B.. Zieba A., Neumann МС}, Kasper-Sonnenberg M..
Honsbein A.,1lultqvistG., Conze T.. Witt W., Limbach C., Geitmann M., Danielson
H.. Kolarow R., Niemann G., Lessmann У, Kilimann M.W. А protein interaction
node at the neurotransmitter release site: domains of/\czonin/Piccolo, Bassoon,
CAST, and rim converge on the N-terminal domain of Munc13-1. //J Neurosci. »—
2009. — Vol.29. য� P. 12584125-96.
815. Wang Y., Liu X.. Biederer T., Sudhot'T.C. A family of RIM-binding
proteins regulated by alternative splicing: implications for the genesis of synaptic
active zones // Proc. Natl. Acad. Sci. p��� 2002. — Vol. 99. — 1’.l4464—l4469.
816. Wang Y.. Okamoto M.. Schmitz F. et al. RIM: a purtative Rab3a-effector
in regulating synaptic vesicle fusion // Nature. — 1997. Vol. 388. — P.593-598.
817. Wang Z.. Edwards J.G., Riley Н.‚ Provance ВАМ Jr., Karcher К, Li
X.D., Davison 1.G.. lkebe M.. Mercer J.A., Kauer J.A., Ehlers УМ). Myosin Vb
mobilizes recycling endosomes and AMP/\ receptors for postsynaptic plasticity /
/(Tell. 2008. Vol. 135. P535-548.
818. Wang Y.T. Probing the role of AMPAR endocytosis and long-term
depression in behavioral sensitization: relevance to treatment of brain disorders,
including drug addiction // British J. ot‘l’hai'macol. — 2008. » Vol. 153. P. 389-
395.
319
819. Washboume P.. Thompson P.T\/1., Carts M.et а1. Genetic ablation on the
I-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanism ofneuroexocytosis // Neurosci.
— 2002. ~ V01. 5. — Р.19-26.
820. WasserC.R, Kavalali E.T. Leaky synapses: regulation of spontaneous
neurotransmission in central synapses // Neuroscience. — 2009. — Vol. 158. — P.
177-188.
821. Watanabe М.‚ Nomura K., Ohyama A. et а1. Myosin-Va regulates
exocytosis through the submicromolar Ca2+ -dependent binding of syntaxin-1 A /
/ M01. Biol. ofthe Cell. -- 2005. — \/о1. 16. — Р. 4519-4530.
822. Watanabe Н., Yamashita T., Saitoh N, Kiyonaka 5.. Iwamatsu A.,
Campbell K.P., Mori Y.. Takahashi T. 1nvolvementofCa2+ channel synprint site in
synaptic vesicle endocytosis // J Neurosci. -2010. — Vol. 30. — P. 655-660.
823. Wei Z., Song M.S., MacTavish D., Jhamandas J.1-1., Kar S. Role ofcalpain
and caspase in beta-amyloid-induced cell death in rat primary septal cultured
neurons // Neuropharmacology. — 2008. — Vol. 54. — P.721-733.
824. Weickert C.S.. Rothmond D.A., Hyde T.M.,K1einman J.F.., Straub R.E.
Reduced DTNBP1 (dysbindin-1) mRNA in the hippocampal formation of
schizophrenia patients // Schizophr Res. — 2008. — Vol. 98. - P.l05-110.
825. Weimer M.R., Jorgensen E.M. Controversies in synaptic vesicle
exocytosis // J. Cell Science. — 2003. — V. 116. — P.3661-3666.
826. Wessels D., Reynolds J., Johnson 0.. Voss E.. Bums R., Daniels K.,
Garrard `�0� O‘1~1alloran T.J., Soll ЦК. Clathrin plays a novel role in the regulation
of cell polarity, pseudopod formation, uropod stability and motility in
Dictyostelium // J Cell Sci. — 2000. — Vol. 113. — P. 21-36.
827. Wienisch M., Klingauf J. Vesicular proteins exocytosed and
subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical // Nat
Neurosci. — 2006. — \/о1. 9. — 17.1019-1027.
828. Wenk M.R., DeCamilli P. Protein-lipid interactions and
phosphoinositide metabolism in membrane traffic: insight from vesicle recycling
in nerve terminals // PNAS. — 2004. — Vol. 10|. — P.8262-8269.
829. Wickner W.. Schekman R. Membrane fusion //Nat. Struct. Mol. Biol. —
2008. -- Vol. 15 (7). —— P. 658-664.
830. Wightman R.M.. Jankowski J .A., Kennedy R.T.. Kawagoe КГБ, Schroeder
T.J., 1.es7.c7.ys7.yn [).J., Near J.A., Diliberto Е]. Jr., Viveros ОН. Temporally
resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual
chromaffin cells // Proc Natl Acad Sci. — 1991. - Vol. 88. —~ P.10754-10758.
831. Wiedenmann J., Икс (`., Spindler K.D., Funke W. Cracks in the beta-
can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Antho7.oa. Actinaria) // Proc
Natl Acad Sci. и 2000. - Vol. 97. P. 14091-14096.
832. Wilde А., Beattie 1i.(I.. Lem 1...Ricthof1).A.. I..iu S.H.. Mobley W.(I..
320
Soriano P., Brodsky F.M. БОР receptor signaling stimulates SRC kinase
phosphorylation ofclathrin, influencing clathrin redistribution and БОР uptake //
Cell. — 1999. — \/о1. 96. — P. 677-687.
833. Willig K.l.. Rizzoli 5.0., Westphal V., Jahn К, Ilell S.W. STED
microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle
exocytosis // Nature. -— 2006. - Vol. 440. — Р. 935-939.
834. Winter Ц, Chen X., Fasshauer D. A conserved membrane attachment
site in alpha-SNAP facilitates N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF)-driven
SNARE complex disassembly // J Biol Chem. — 2009. — \/о1. 284. — Р. 31817-
31826.
835. Wulfcl М., Schneggcnburger R. Presynaptic capacitance measurements
and Ca2+ uncaging reveal submillisecond exocytosis kinetics and characterize
the Ca2+ sensitivity ofvesicle pool depletion at a fast CIVS synapse //J Neurosci.
— 2003. и \/о1. 23. -- P.7()59-7068.
836. Xu J., .VIc.\'eil B., Wu Щ, Necs D., Bai L., Wu I..G. GTP—indcpendent
rapid and slow endocytosis at а central synapse // Nat Neurosci. м 2008. — Vol. 1 1.
p�>� Vol. 45-53.
837. Wu ДО, Betz Щ]. Nerve activity but not intracellular calcium
determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction //
Neuron. — 1996. — V. 17. — Р.769-779.
838. Wu 1..G., Betz W.J. Kinetics of synaptic depression and vesicle recycling
after tetanic stimulation of frog motor nerve terminals // Biophys. J. -- 1998. — V.
74. — P.3003-3009.
839. Wu X., Zhao X., Baylor L.et al. Clathrin exchange during clathrin-
mediated endocytosis // J. Cell Biol. — 2001. — Vol. 155. -— P. 291-300.
840. Wu “д, Xu J., Wu X.S., Wu L.G. Activity-dependent acceleration of
endocytosis at a central synapse // J Neurosci. — 2005. — Vol. 25. ~ P.1 1676-
1 1683.
841. Wu W., Wu LG. Rapid bulk endocytosis and its kinetics of fission pore
closure at a central synapse // Proc Natl Acad Sci. — 2007. --Vol. 104. —— P.l0234-
10239.
842. Wucherpfennig T., Brauninger f\/l.W., Gaitan М. G. Role ofDrosophila
Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked transmitter‘ release
// J. Cell. Biol. ~ 2003. -Vol. 161,- P.609-624.
843. Xie 7... Srivastava D.P.. Photowala H., Kai 1..., Cahill �>M� Woolfrey
K.M.. Shum (ЁЖ, Sunneier l.).J., Pen‘/.es P. Kalirin-7 controls activity-dependent
structural and functional plasticity of dendritic spines // ;\’euron. и 2007. — Vol.
56. —- P. 640-656.
844. Xu J.. Pang Z.P., Shin 0.11., Sb(lliofT.(.‘. Syn-aptotagmin-l fun(:ti()ns as
u (‘.a2* sensor for sp()ntunc0us release // Nat Neurosei. и 2009. Vol. 12. P.
‚ 321
759-766.
845. Xue J., Milburn P.J., Hanna B.T.et al.Phosphorylation ofseptin 3 on
Ser-91 by cGMP-dependent protein kinase l in nerve terminals // J. Biochem. —
2004. — Vol. 381. -— P.753-760.
846. Xue J., Tsang C.W., бай W.P. et al. Septin 3 (G-septin) is a
developmentally regulated phosphoprotein enriched in presynaptic nerve terminals
// J. Neurochem. — 2004. — Vol. 91. — P.579-590.
847. Xue J., Wang X., Malladi C.S. ct al. /Phosphorylation ofa new brain-
specific septin, G-septin, by cGMP—dependent protein kinase // J. Biol. Chem. —
2000. — Vol. 275. — P.l0047-1056.
848. Xia Х., Lessmann V., Martin T.F. Imaging ofevoked dense-core—vesicle
exocytosis in hippocampal neurons reveals long latencies and kiss—and-run fusion
events // J. Cell Sci. — 2009. —Vol. 122. — Р. 75-82.
849. Yao P.J., Zhang P., Mattson M.P., Furukawa K. Heterogeneity of
endocytic proteins: distribution of clathrin adaptor proteins in neurons and glia //
Neuroscience. — 2003. — Vol. 121. — P. 25-37.
850. Yao C.K.. Lin Y.Q., Ly C.V., Ohyama T., Haueter C.M., Moiseenkova-
Bell УЖ, Wensel T.G., Bellen Н}. А synaptic vesicle-associated Ca2+ channel
promotes endocytosis and coL1ples exocytosis to endocytosis // Cell. — 2009. —
Vol. 138. — P. 947-960.
851. Yao J., Nowack A., Kensel-Hammes Р., Gardner R.G., Bajjalieh S.M.
Cotraffieking of SV2 and synaptotagmin at the synapse // J Neurosei. — 2010. —
Vol. 30. -- P. 5569-5578
852. Yamashita T., Hige T., Takahashi T. Vesicle endoeytosis requires dynamin-
dependent GTP hydrolysis at fast CNS synspse // Science. — 2005. — Vol. 303. —
P. 1 24-127.
853. Yang Y., Craig T.J., Chen X.et al.Phosophomimetic mutation of Ser-
187 of SNAP—25 increases both syntaxin binding and highly Ca —sensitive
exocytosis // J. Gen. Physiol. — 2007. — Vol. 129. — P233-244.
854. Yang ХЕ, Rothman S.M. Levetiraeetam has a time- and stimulation-
dependent etlect on synaptic transmission //Seizure. ~ 20()9. -~ Vol. 18. — P.6l5-
619.
855. Yarar D.. Waterman-Storer C.M., Schmid S.L. dynamic actin
cytoskeleton functions at multiple stage ofclathrin-mediated endocytosis // Mol.
Biol. Cell. — 2005. — Vol. l6. —- P.964—975.
856. Ybe J./\., Brodsky F.M., Hofmann K. ст а1. (Ilathrin self-assembly is
mediated by a tandemly repeated superhelix // Nature. - 1999. — V. 399. — P.371 —
375.
857. Yim Y.l., Sun T.. Wu [..G.. Кантона} A.. De (familli Р. liisenberg E..
(ireene l,.l{. Endocytosis and clathrin—uncoating defects at synapses ol‘ auxilin
322
knockout mice // PNAS. — 2010. ~— Vol. 1()7. — P. 4412-4417.
858. Young J.C., Barral J.M.. Hartl U. More than folding: localized functions
of cytosolic chaperones //TRENDS Biochem. Sci. — 2003. и \/о1. 28, Ne 10. —
Р.541-547.
859. Zaccolo M., Magalhaes P., Pozzan T. Compartmentalisation of сАМР
and Ca2+ signals // Curr. Opin. In Cell Biol. — 2002. — Vol. l4. — P.l60-166.
860. Zanazzi G., Matthews G. The molecular architecture of ribbon
presynaptic terminals // Мо1 Neurobiol. — 2009. — Vol. 39. — P. 130-148.
861. Zeck G., Fromherz P. Noninvasive neuroelectronic interfacing with
synaptically connected snail neurons immobilized on a semiconductor chip // Proc
Natl Acad Sci. — 2001. — Vol. 98. — P.10457-10462.
862. Zefirov A.L. Abdrakhmanov M. M., Mukhamedyarov M.A.. Grigoryev
P.N. The role ofintra & extracellular eakcium in recycling ofsynaptic vesicle at
frog motor nerve endings // Neurosci. —- 2006. — \/о1. 143. — P.905—910.
863. Zefirov A.L., Zakharov A.V., Mukhamedzianov R.D., Petrov A.M.
Sitdikova G.F The vesicle cycle in motor nerve endings ofthe mouse diaphragm /
/Neurosci Behav Physiol. - 2009. —~ Vol. 39. —- P. 245-252.
864. Zefirov A.L., Benish T., Fatkullin N. Localization of active zones //
Nature. — 1995. — Vol. 376. — P.393-394.
865. ZefirovA.L., Mukhamed’yarov M.A.. Gafurov B.Sh. Role ofPotassium
Channels in Facilitation of Transmitter Release from Frog Motor Nerve Ending
(Electrophysiology and Mathematical Simulation) // Neurophysiology. — 2002. —
V. 34, Хе 1. �r� P.17-27.
866. Zefirov A.L., Skorinkin A.l., Hafizov P.N., Grigoriev P.N._, Minlebaev
M.G. Differences of spontaneous and evoked monoquantal signals in neuro-
muscular synapse of frog // Neurophysiology. - 2002. - \/о1. 34. - P.276-278.
867. Zengel J.E., Sosa M.A. Changes in MEPP frequency during depression
of evoked release at frog neuromuscularjunction // J. Physiol. (I.ond.) — 1994. —
Vol. 477. — P267-277.
868. Zerial M., McBride H. Rab proteins ��S� membrane organizers // Nat.
Rev. Mol. Cell Biol. — 2001. — Vol. 2. — P.107-117.
869. Zhai R.G.. Bellen1'1.J.The Architecture otithe Active Zone in Preynaptic
Nerve Terminal //J. Physiology. ��@� 2004. —- Vol. 19. —- Р.262-27О.
870. Zhai R.G.. Vardinon-Friedman 11.. Cases-Langhoff С. Becker B.,
(iundelfinger `/L� ХНУ N.13., Gamer (ПС. Assembling the presynaptic active zone:
a characterization of an active one precursor vesicle // Neuron. 2001. \/о1. 29.
Vol. 131-143.
871. Zhang (Д. Xiong W.. Лют; Н. et al. C.‘aleium- and dynamin-independent
endocytosis in dorsal root ganglion neurons // Neuron. ~- 2004. — Vol. 42. ~ P225-
236.
323
872. Zhang “А, Wang 1)., Volk ":� Bellen H.J., Hiesinger P.R., Quiocho F.A.
V-ATP-use V0 sector subunit al in neurons is a target ofcalmodulin //J Biol Chem.
— 20()8. »— Vol. 283. ~— P294-300.
873. Zhang Z., Bhalla А., Dean C., Chapman E.R., Jackson МВ.
Synaptotagmin IV: a multifunctional regulator of peptidergic newe terminals //
Nat Neurosci. — 2009. ~ Vol. 12. — P.163-171.
874. Zhen M.. Jin Y. The liprin protein SYD-2 regulates the differentiation
of presynaptic termini in C. elegans // Nature. — 1999. — Vol. 401. — P.371-375.
875. Zimmerberg J ., Kozlov MM. How proteins produce cellular membrane
curvative // Nature rcv. - 2006. — \/о1. 7. — P.9-19.
876. Zhu G., Okada ?\/1., Yoshida S., Hirose S., Kaneko S. Determination of
exocytosis mechanisms of DOPA in rat striatum using in Vivo microdialysis //
Neurosci Lett. ~ 2004. А- Vol. 367. — P. 241-245.
877. Zhu Y., Li Y., Tsien R.W. Two pathway of synaptie vesicle retrieved
revealed by single-vesicle imaging // Neuron. — 2009. — Vol. 61. — P. 397-411.
878. ZhuL.Q.,LiuD.,11uJ., Cheng J., Wang S.H., Wang Q., Wang Е, Chen
J.G., Wang J.Z. GSK—3 beta inhibits presynaptic vesicle exocytosis by
phosphorylating P/Q-type calcium channel and interrupting SNARE complex
formation // J Neurosci. -— 2010. —Vol. 30. — P. 3624-3633.
879. Zissimopoulos S., West D.J., Williams A.J.. Lai КА. Ryanodine receptor
interaction with the SNARE-associated protein snapin // J Cell Sci. — 2006. -- Vol.
119. — P. 2386-2397.
880. Zitman F. M. P., Todorov B., Furukawa K._. Willison H..l.. Plomp J.J.
Total ganglioside ablation at mouse motor nerve terminals after neurotransmitter
release 1evea1// Synapse. V» 2010. - Vol. 64. — P. 335-338.
881. Zoncu К, Регега R.M., Sebastian К, Nakatsu F., Chen Н., Ва11а Т.,
Ayala G., Toomre D., De Camilli P.V. Loss of endocytic clathrin-coated pits upon
acute depletion of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate // Proc Natl Acad Sci. —
2007. — \/01. 104. — P.3793—3798.
324
А.Л. Зефиров и А.М. Петров
СИНАПТИЧЕСКАЯ ВЕЗИКУЛА
И
МЕХАНИЗМ ОСВОБОЖДЕНИЯ
МЕДИАТОРА
(ЭКЗО-ЭНДОЦИЁОЗНЫЙ
ввзикулягньш ЦИКЛ)
Авторы выражают бпагодарность сотрудникам кафедры медиальной фи-
зиологии КГ М У за помощь при подготовке иллюс/парций книги 3axap06_v Андрею
Викторовичу и Григорьеву Павлу Николаевичу, и тика/се бтагодарносгпь за cadet?-
ствие в оформлении книги дизайнеру Родионовой Ольге Мшгайловне.
Издательство Арт-Кафе, Казань, 2009 г.
Подписано в печать 27.10.2009.
Формат 60х84 Ив. Печать офсетная.
Бумага офсетная - усллещл. 20,25.
Бумага мелованная H5 г/м” - усл.печ.л_ 2.
Зефиров Андрей Аъвович
ЗасАуженный деятеАь науки РФ, чАен-корр. РАМН,
"‘ заведующий кафедрой нормаАьной фИЗИОАОГИИ КГМУ,
к профессор, д.м.н.
Петров Адексей Михайлович
Старший преподаватеАъ кафедры нормаАьной
физиоАогии КГМУ, к.б.н.
В основе функционирования нервной системы Аежит процесс
коммуникации меж/ту нервными кАетками, который осуществАяется в
специаАизированных участках - синапсах. В подавАяющем боАьшинстве
синапсов передача информации происходит посредством выдеАения из
нервных окончаний специаАьных химических веществ - медиаторов при
экзоцитозе синаптических везикуА (пузырьков). В предАагаемой вашему
вниманию книге издоженьт современные представдения о механизме
секреции медиатора в химическом синапсе, процессах экзоцитоза и
эндоцитоза синаптических везикуА (везикуАярного цикАа). Подробно
разбираются разАичные варианты пресинаптического экзо- и эндоцитоза, а
также протекающие в ходе этих процессов беАок-беАковые и беАок-Аипидные
взаимодействия. Рассмотрены механизмы везикуАярного транспорта и
устройство везикуАярных пудов, методы ИССАеДОВаНИЯ экзо- и эндоцитоза в
нервном окончании. Особое внимание удеАено регуАяции пресинаптического
везикуАярного цикАа и освобождения медиатора в синапсе. Освещены
механизмы везикуАярного транспорта, а также процессов экзо— и эндоцитоза
в нервных кАетках не связанные с секрецией медиатора. Эти механизмы
задействованы в формировании и ремодеАирования синаптических
контактов, а также изменениях молекулярной композиции пре- и
постсинаптических мембран, Аежащих в основе синаптической
пАастичности. Книга предназначена ДАЯ всех, кто интересуется вопросами
функционирования нервной системы и мозга.