Текст
                    Сигнальные каскады, запускающие апоптоз клетки
Апоптоз
Митохондрия
Апоптоз
Апоптоз
Фрагментация
FLIP, CIAP2,
BFL1, BCL2
Факторы
роста
ВАК, ВАК, BID,
Ras, Noxa, PUMA,
APAF1, Survivin, /
BCL2 /
/ Деполя-
' ризация
Онкогенный
сигнал
Апоптоз

































Участие кальция во внутриклеточных сигнальных каскадах ж® Антиген Антиген .f Гормоны, нейромедиаторы Ацетилхолин. глутамат, АТ<Ь, Деполяризация/ серотонин потенциал Na+. Гипертрофия Свет, нейромедиаторы, факторы роста, осмолярность Митохондриальный унипортерт кислота, сфингозин одоранты, вкусовые молекулы
JAK-STAT-сигнальные каскады 1Т0ЦИ1 [ито циней IAK1 SHP □АКТ SOC! PI3K IRF9 JAM МЕК STAT1] STAT! STAT1 STAT: ERKs STAT5] STATsl IRF9 ETstati STATv STATj STATs rSTAT3’ STATs1 SOCS rSTAT< Elongin SOCS :pna: RAN STATs STATsl STAT1 STAT1 c-Mycl STAT1 STAT2 1ротеасома IRF9 STATs] IKTO| lOCTi JATIPgl r<JAKf >TATs i Ml A Ubc9 Гр’mohJ [роста КЪфактб| STATsl^ SHP2 SOS Разрушение JAK [генов цируемая экспрессия генов Экспрессия генов , Лиганды GPCR
Сигнальные каскады, запускаемые фактором роста нервов 1-КС Апоптоз Полимеризация актина CRE CRE Экспрессия генов Рост и дифференциация нейритов Выживание нейронов ' Рост и дифференциация нейритов
Авторы: А. А. Болдырев, Н. Д. Ещенко, В. А. Илюха, Е. И. Кяйвяряйнен Рецензенты: кафедра эмбриологии Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова (зав. кафедрой д-р биол. наук, проф. В. А. Голчченков)\ зам. директора Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, д-р биол. наук, проф. Н. В. Гуляева (лаборатория функциональной биохимии нервной системы ИВНДиНФ РАН) Нейрохимия учеб, пособие для вузов / А. А. Болды- Н45 рев, Н. Д. Ещенко, В. А. Илюха, Е. И. Кяйвяряйнен; науч. ред. Ю. А. Владимиров. — М. : Дрофа, 2010. — 398, [2] с. : ил. ISBN 978-5-358-03120-3 В книге рассмотрены вопросы мембранной организации нервной тка- ни, особенности энергетического обмена мозга роль сигна ьных мол< кул в анализе и передаче информации на уровне нейрональны клеток, бщие принципы интеграции метаболизма мозга. Материал представлен в трех разд< пах: <Структура н рвной ткани». Молекулярная нейрохимия» и «Функциональная нейрохилия». Для студентов вузов, специализирую щихся в области биохи- мии, фар "акологии, физиологии и психологии. УДК 577.1(075.8) ББК 28.072я73 ISBN 978-5-358-03120-3 © ООО «Дрофа», 2010
ПРЕДИСЛОВИЕ Данное учебное пособие создавалось на основе «живого», по- стоянно читаемого курса, что было непростой задачей, посколь- ку огромная скорость накопления фактических данных в облас- ти нейронаук стимулирует процессы формирования новых идей и разрушения старых концепций. В книге сделана попытка объединить отечественную традицию преподавания нейрохимии как науки, лежащей на стыке основных биологических дисциплин (биохимии, молекулярной биологии, физиологии), с современным взглядом на нейрохимию как само- стоятельную составляющую естествознания, имеющую свой пред- мет, специфические задачи и оригинальные методы исследования, науку, являющуюся основой наших сегодняшних представлений о молекулярных механизмах клеточной сигнализиции. При написании пособия был использован предшествующий опыт преподавания нейрохимии, в первую очередь академиком Игорем Петровичем Ашмариным. И. П. Ашмарин — автор получив- шего широкую известность и до сих пор единственного отечественного учебника по данной дисциплине (Нейрохимия. М., 1996 и его пере- работанное издание: Биохимия моз- га. СПб., 1999). Построение учебного пособия в целом соответствует структуре лек- ционных курсов по общим вопро- сам нейрохимии, читаемых в МГУ им. М. В. Ломоносова и Санкт-Пе- тербургском государственном уни- верситете. В компоновке матери- ала нашел отражение личный педа- гогический опыт авторов. И. П. Ашмарин Основоположник отечествен- ной нейрохимии
В книге три раздела: «Структура нервной ткани», «Молеку- лярная нейрохимия» и «Функциональная нейрохимия». Пред- лагаемое разделение материала достаточно условно и служит лишь для облегчения его усвоения. Следует иметь в виду, что многие проблемы современной нейрохимии не нашли отражения в данном пособии. Будучи свя- занными рамками учебных часов, авторы вынуждены были предпочесть широту изложения материала глубине анализа ча- стных аспектов функционирования возбудимых структур. Заин- тересованный читатель должен рассматривать эту книгу в каче- стве введения в проблемы современной нейрохимии.
ОТ НАУЧНОГО РЕДАКТОРА Биология во второй Головине XX в. характеризовалась такими же кардинальными открытиями, как физика — в первой его по- ловине. Разгадка строения двойной спирали ДНК стимулиро- вала бурное развитие молекулярной биологии, биохимической генетики, биотехнологии. Создание гибридомных технологий, успехи в исследовании стволовых клеток, проникновение в мембранные механизмы работы нервной системы способство- вали тому, что к началу нового XXI в. нейрохимия оказалась в числе наиболее востребованных дисциплин. Интерес к нейронаукам частично вызван успехами в по- знании механизмов работы нервной клетки (фактически, каж- дая третья Нобелевская премия в последнее десятилетие была присуждена за исследования, так или иначе имеющие отноше- ние к наукам о мозге человека). Но главное — это огромная во- стребованность нейронаук как фундамента для понимания мо- лекулярных нарушений, лежащих в основе нейродегенератив- ных заболеваний, как наследственных, так и вызванных антропогенными факторами. Последнее десятилетие XX в., по предложению Всемирной организации здравоохранения, было названо «десятилетием мозга», однако по его истечении вопреки ожиданиям общества стала очевидной недостаточность наших знаний в этой области. Подобная неоднозначность состояния нейрохимии как науки привлекает внимание биологов разных специализаций. Курс нейрохимии, читаемый на биологических факультетах многих вузов страны, остро нуждается в учебной литературе. Данное издание поможет решить эту проблему. Специфика изложения материала в книге, ее структура обусловлены опытом экспериментальной и педагогической ра- боты авторов: имеет место явное превалирование вопросов мо- лекулярной (мембранной) нейрохимии. Однако не исключено,
что, исходя из вышеназванных особенностей момента, это мо- жет стать одним из достоинств данного учебного пособия. В числе других — ясное и систематическое изложение матери- ала, широта охвата нейрохимических проблем, разнообразие иллюстративного материала. Хочется пожелать, чтобы книга нашла своего заинтересо- ванного читателя, для которого нейрохимия станет полем само- стоятельной научной деятельности. Академик РАМН, профессор Ю. А. Владимиров
ВВЕДЕНИЕ P. Е. Владимиров Выдающийся российский био- химик, известный работами в области окислительного ме- таболизма мозга Конец XX в. ознаменовался дифференцировкой естественно- научных дисциплин, существенным расширением задач и ме- тодов научных исследований в области биологии. В результате классические биологические науки (биохимия, физиология, гис- тология) дали начало целому ряду новых научных направле- ний, в том числе цитологии, молекулярной биологии, энзимо- логии, биоэнергетике. Особое место среди них заняла нейро- химия — наука о молекулярных превращениях, лежащих в основе таких специфических проявлений живого, как возбу- димость, способность анализировать поступающие к клетке извне сигналы и специфическим образом на них реагировать. Динамичное развитие нейрохимии привело к тому, что в на- стоящий момент она рассматрива- ется не только как самостоятель- ная отрасль естествознания, но и как методологическая основа для совершенствования наших знаний в эмбриологии, клеточной биологии, экспериментальной и клинической неврологии и других областях био- логии и медицины. Курсы нейрохи- мии на протяжении многих лет чи- таются во всех крупных универси- тетах нашей страны. На страницах этой книги нель- зя не вспомнить выдающихся оте- чественных ученых, стоявших у исто- ков нейрохимии, благодаря таланту и упорству которых данная наука до- стигла сегодняшних высот: И. П. Аш- марина, Е. С. Лондона, Е. М. Креп-
А. В. Палладии Основоположник украинской школы нейрохимиков. Ос- новные труды — по биохи- мии нервной ткани и голов- ного мозга са, Г. Е. Владимирова, Н.Н. Деми- на, М. И. Прохорову, Г. X. Бунатяна, П. А. Кометиани, А. В. Палладина, А. А. Галояна, Т. М. Турлаева. Сов- ременная нейрохимия обязана им актуальностью своей тематики. В то же время нейрохимия, как, может быть, никакая другая наука, раз- вивается в тесном взаимодействии ученых разных стран: Международ- ное нейрохимическое общество — одно из наиболее многочисленных среди всех естественнонаучных со- обществ в мире. На сегодняшний день знание основ нейрохимии яв- ляется непременным условием по- лучения современного биологичес- кого образования.
СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ткани НЕРВНАЯ ТКАНЬ Нервная ткань — это взаимосвязанная система нервных клеток и нейроглии, выполняющая специфические функции восприятия сигна- лов, выработки ответного импульса и его передачи. Нервная ткань яв- ляется основой строения нервной системы, регулирующей функции всех тканей и органов, их интеграцию в организме и связь с окружающей средой. Нервная система обеспечивает координацию всех жизненных процессов в организме и его взаимодействие с внешней средой. Анатомически нервную систему делят на центральную и перифери- ческую. ^центральной нервной системе (ЦНС) относят головной и спинной мозг, периферическая нервная система (ПНС) объединяет периферические нервные узлы, стволы и нервные окончания. В головном мозге различают серое и белое вещество. Большая часть серого вещества располагается на поверхности мозга и в моз- жечке, формируя их кору. Меньшая часть образует многочисленные ядра ствола мозга. Нервная ткань состоит в основном из нейрональных и глиальных клеток. Нейроны (neuronia, нейроциты) — основные компоненты нервной ткани. Нейроглия обеспечивает существование и функци- онирование нервных клеток, осуществляя опорную, трофическую, разграничительную, секреторную и защитную функции. Нейроны яв- ляются высокоспециализированными клетками нервной системы, от- ветственными за рецепцию, обработку импульсов, их проведение и передачу на другие нейроны, мышечные или секреторные клетки. Нейроны выделяют нейромедиаторы и иные вещества, передающие информацию другим клеткам. 1.1.1. Нейрон Морфологически и функционально самостоятельная единица. С помощью отростков {аксона и дендритов) осуществляет контакты с другими нейронами, образуя рефлекторные дуги — звенья, из ко- торых построена нервная система.
Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ В зависимости от функций в рефлекторной дуге различают аффе- рентные (чувствительные), ассоциативные и эфферентные (эф- фекторные) нейроны. Афферентные нейроны воспринимают импуль- сы, эфферентные передают их на ткани рабочих органов, побуждая их к действию, а ассоциативные нейроны обеспечивают межнейрональ- ные связи. Рефлекторная дуга пред- ставляет собой цепь нейронов, связан- ных друг с другом синапсами и обес- печивающих проведение нервного им- пульса от рецептора чувствительного нейрона до эфферентного окончания в рабочем органе. Нейроны отличаются большим раз- нообразием форм и размеров. Диаметр тел гранулярных клеток коры мозжеч- ка — около 10 мкм, а гигантских пира- мидных нейронов двигательной зоны ко- ры большого мозга — 130— 150 мкм. Рисунок 1.1 иллюстрирует особен- ности строения нервных клеток, прису- щие всем нейронам ЦНС и ПНС. Ос- новным отличием нервных клеток от других клеток организма является на- личие у них длинного аксона и несколь- ких более коротких дендритов. Термины «дендрит» и «аксон» применяют к от- росткам, на которых входящие волокна образуют контакты, принимающие ин- формацию о возбуждении или тормо- жении. Длинный отросток клетки, по которому импульс передается от тела клетки и образующий контакт с клет- кой-мишенью, называется аксоном. Рис. 1.1. Нейрон: / — тело нейрона; 2 — осевой цилиндр; 3 — миелиновая оболочка в разрезе; 4 — ядра глиальных клеток; 5 — миелиновый слой; 6 — насечка миелина; 7 — узловой перехват нервно- го волокна; 8 — нервное волокно, лишенное ми- елина; 9 — нервно-мышечное (двигательное) окончание; 10 — миелиновые нервные волок- на, обработанные осмиевой кислотой
1.1. Нервная ткань По количеству отростков различают униполярные нейро- ны, имеющие только аксон (у высших животных и человека обычно не встречаются), биполярные нейроны, имеющие аксон и один дендрит, и мулътиполярные нейроны, имеющие аксон и много дендритов (рис. 1.2). Иногда среди биполярных нейронов встречается псевдоуниполярный, от тела которого отходит один общий вырост — отросток, разделяющийся затем на дендрит и аксон. Псевдоуниполярные нейроны присутствуют в спинальных ганглиях, биполярные — в органах чувств. Большинство нейронов мультиполярны. Их формы чрезвычайно разнообразны. Аксон и его коллатерали разветвляются на несколько веточек, на- зываемых телодендронами, последние заканчиваются терминальны- ми утолщениями. Аксон содержит митохондрии, нейротубулы и нейро- филаменты, а также агранулярный эндоплазматический ретикулум. Трехмерная область, в которой ветвятся дендриты одного нейрона, называется дендритным полем. Дендриты представляют собой истин- ные выпячивания тела клетки. Они содержат те же органеллы, что и тело клетки: хромафильную субстанцию (гранулярный эндоплазматический ретикулум и полисомы), митохондрии, большое количество микротрубо- чек (нейротубул) и нейрофиламентов. Благодаря дендритам рецепторная поверхность нейрона увеличивается в 1000 и более раз. Так, дендриты грушевидных нейронов (клеток Пуркинье) коры мозжечка увеличивают площадь рецепторной поверхности с 250 до 27 000 мкм2; на поверхности этих клеток обнаруживается до 200 000 синаптических окончаний. Рис. 1.2. Типы нервных клеток: а — униполярный нейрон; б — псевдоуниполярный нейрон; в — биполярный нейрон; г — мультиполярный нейрон
12 г аздел 1. СТРУКТУРА НГЦНОЙ ТКАНИ Не все нейроны соответствуют простому строению клетки, пока- занному на рисунке 1.1. У некоторых нейронов отсутствуют аксоны. Есть клетки, дендриты которых могут проводить импульсы и образо- вывать связи с клетками-мишенями. Ганглиозная клетка сетчатки глаза соответствует схеме стандартного нейрона с дендритами, телом и аксоном, а у фоторецепторных клеток нет очевидных дендритов и ак- сона, поскольку они активируются не другими нейронами, а внешними стимулами (квантами света). Тело нейрона содержит ядро и другие внутриклеточные ор- ганеллы, общие для всех клеток. Подавляющее большинство нейронов человека имеют одно ядро, расположенное чаще в центре, реже — экс- центрично. Двухъядерные и тем более многоядерные нейроны встреча- ются крайне редко. Исключение составляют нейроны некоторых гангли- ев вегетативной нервной системы. Ядра нейронов имеют округлую фор- му. В соответствии с высокой метаболической активностью нейронов хроматин в их ядрах диспергирован. В ядре имеется одно, иногда два-три крупных ядрышка. Усиление функциональной активности нейронов обычно сопровождается увеличением объема (и количества) ядрышек. Плазмалемма (плазматическая мембрана) нейрона обладает спо- собностью генерировать и проводить импульс, ее структурными ком- понентами являются белки, функционирующие как селективные ион- ные каналы, а также рецепторные белки, обеспечивающие реакции нейронов на специфические стимулы. В покоящемся нейроне транс- мембранный потенциал составляет величину 60—80 мВ. При окрашивании нервной ткани анилиновыми красителями в ци- топлазме нейронов выявляется хромофилъная субстанция, обнару- живаемая в виде базофильных зерен различных размеров и форм. Ба- зофильные зерна локализуются в перикарионе и дендритах нейронов, но никогда не обнаруживаются в аксонах и их конусовидных основани- ях — аксональных холмиках. Их окраска объясняется высоким содержа- нием рибонуклеотидов. Электронная микроскопия показала, что хромо- фильная субстанция включает цистерны эндоплазматического ретикулу- ма, свободные рибосомы и полисомы. Гранулярная эндоплазматическая сеть синтезирует нейросекреторные и лизосомальные белки, а также ин- тегральные белки плазматической мембраны. Свободные рибосомы и полисомы синтезируют белки цитозоля (гиалоплазмы) и неинтегральные мембранные белки. Для поддержания целостности и выполнения специфических функций нейронам требуются разнообразные белки. Для аксонов, не имеющих ор- ганелл, синтезирующих белок, характерен постоянный ток цитоплазмы от перикариона к терминалиям со скоростью 1 —3 мм в сутки (см. гл. 3.3).
1.1. Нервнаяткан. Аппарат Гольджи в нейронах хорошо развит. При световой микро- скопии он выявляется в виде различных по форме зернышек, извитых нитей, колечек. Его ультраструктура обычна. Пузырьки, отпочковываю- щиеся от аппарата Гольджи, транспортируют белки, синтезированные в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме, либо к плазматической мембране (интегральные мембранные белки), либо к терминалям (ней- ропептиды, нейросекрет), либо в лизосомы (лизосомальные гидролазы). Митохондрии обеспечивают энергией разнообразные клеточные функции, включая такие процессы, как транспорт ионов и синтез бел- ков. Нейроны нуждаются в постоянном притоке глюкозы и кислорода с кровью, и прекращение кровоснабжения головного мозга губитель- но для нервных клеток (см. гл. 3.2). Лизосомы участвуют в ферментативном расщеплении разнообраз- ных компонентов клетки, в том числе белков-рецепторов. Из элементов цитоскелета в цитоплазме нейронов присутст- вуют нейрофиламенты (диаметром 12 нм) и нейротубулы (диа- метром 24—27 нм). Пучки нейрофиламентов {нейрофибриллы) об- разуют в теле нейрона сеть, в его отростках они располагаются парал- лельно. Нейротубулы и нейрофиламенты участвуют в поддержании формы нейрональных клеток, в росте отростков и осуществлении аксонального транспорта. Способность синтезировать и секретировать биологически актив- ные вещества, в частности медиаторы (ацетилхолин, норадреналин, серотонин и др.), свойственна всем нейронам. Существуют нейроны, специализирующиеся преимущественно на выполнении этой функ- ции, например клетки нейросекреторных ядер гипоталамической об- ласти головного мозга. Секреторные нейроны имеют ряд специфических морфо- логических признаков. Они крупные; хромофильная суб- станция располагается преимущественно на периферии тела таких нейронов. В цитоплазме самих нервных клеток и в аксонах находятся различной величины гранулы нейросекрета, содержащие белки, а в некоторых случаях — липиды и полисахариды. Гранулы нейросекрета выводятся в кровь или в ликвор. Многие секреторные нейроны имеют ядра неправильной формы, что свидетельствует об их высокой функ- циональной активности. Секреторные гранулы содержат нейрорегу- ляторы, обеспечивающие взаимодействие нервной и гуморальной сис- тем организма. Нейроны — высокоспециализированные клетки, су- ществующие и функционирующие в строго определенной среде. Та- кую среду им обеспечивает нейроглия, которая выполняет следующие
14 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ функции: опорную, трофическую, разграничительную, защитную, секреторную, а также поддерживает постоянство среды вокруг нейро- нов. Различают глиальные клетки центральной и периферической нервной системы. 1.1.2. Глия Глия центральной нервной системы. Клетки глии ЦНС делят- ся на макроглию (глиоциты) и микроглию. К макроглии относятся эпецдимоциты, астроциты и олигодендроциты. Эпендимоциты выстилают стенки внутренней полости желудоч- ков головного мозга и центральный канал спинного мозга. Это клетки цилиндрической формы. Они образуют слой эпителиального типа. Между соседними клетками имеются пояски сцепления, пространство между которыми заполнено цереброспинальной жидкостью. Боль- шинство эпендимоцитов имеют подвижные реснички, вызывающие ток цереброспинальной жидкости. Цитоплазма эпендимоцитов содер- жит многочисленные митохондрии, аппарат Гольджи, расположенный над ядром, и слаборазвитый эндоплазматический ретикулум. Астроциты — клетки с большим количеством отростков, бедные органеллами. Они выполняют в основном опорную и разграничитель- ную функции. Различают протоплазматические астроциты, локали- зующиеся в сером веществе центральной нервной'системы, и волок- нистые астроциты, присутствующие в белом веществе. Протоплазматические астроциты характеризуются короткими, силь- но ветвящимися отростками и светлым сферическим ядром. Астроци- ты имеют 20—40 длинных, слабо ветвящихся отростков, в которых много фибрилл, состоящих из филаментов диаметром 10 нм. Отрост- ки астроцитов тянутся к базальным мембранам капилляров, к телам и дендритам нейронов, окружая их синаптические контакты, а также к мягкой мозговой оболочке, образуя пиоглиалъную мембрану, грани- чащую с субарахноидальным пространством. Подходя к капилляру, от- ростки астроцитов полностью окружают его, образуя расширенные «ножки». Подобными отростками астроцитов окружено до 95% по- верхности капилляров. Астроциты накапливают и передают вещества от капилляров к нейронам, захватывают из внеклеточной среды избы- ток ионов калия и других веществ, таких как нейромедиаторы, накап- ливающихся там после интенсивной нейрональной активности. Олигодендроциты имеют по сравнению с астроцитами более мел- кие и более интенсивно окрашивающиеся ядра. Их отростки немного- численны. Олигодендроциты присутствуют как в сером, так и в белом
1.1. Нервна 0 ткань веществе. В сером веществе они локализуются вблизи перикарионов. В миелинизированных нервных волокнах белого вещества их растяну- тые плазматические мембраны образуют миелиновый слой, причем, в противоположность нейроглии периферической нервной системы, один олигодендроцит может участвовать в миелинизации нескольких аксо- нов. Цитоплазма олигодендроцитов содержит много митохондрий, раз- витый аппарат Гольджи, цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, многочисленные микротрубочки. Микроглия представляет собой фагоцитирующие клетки, относя- щиеся к системе мононуклеарных фагоцитов и происходящие из ство- ловой кроветворной клетки. Функция микроглии — защита от ин- фекции и повреждения, а также удаление продуктов разрушения нерв- ной ткани. Клетки микроглии небольшие по размерам, имеют тела продолговатой формы. Их короткие отростки несут на своей поверх- ности вторичные и третичные ответвления, что создает впечатление колючести клетки. В отличие от других типов нейроглии, имеющих сферические ядра, ядра микроглии продолговатые с компактным хро- матином. Описанная морфология характерна для типичной (ветвис- той, покоящейся) микроглии ЦНС. В развивающемся мозге млекопитающих обнаруживается и иная форма микроглии — амебоидная микроглия, активно фагоцитирую- щая в раннем постнатальном периоде, когда гематоэнцефалический барьер еще не вполне развит и вещества из кровяного русла легко по- падают в ЦНС. Созревая, амебоидные микроглиальные клетки пре- вращаются в ветвистую микроглию. Ветвистая микроглия встреча- ется как в сером, так и в белом веществе. После травмы в поврежденной области мозга появляется реак- тивная микроглия. Она не имеет ветвящихся отростков. В цито- плазме клеток реактивной микроглии присутствуют плотные тельца, липидные включения, лизосомы. Есть данные о том, что реактивная микроглия формируется вследствие активации клеток ветвистой мик- роглии при повреждении ЦНС. Глия периферической нервной системы (периферическая ней- роглия). Отличается от макроглии ЦНС — ее клетки происходят из нервного гребня. К периферической нейроглии относятся шванновские клетки (нейролеммоциты) и глиоциты ганглиев. Нейролеммоциты формируют оболочки отростков нервных клеток в нервных волокнах пе- риферической нервной системы. Глиоциты ганглиев окружают тела нейронов в нервных узлах и участвуют в обмене веществ нейронов.
16 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ 1.1.З. Нервные волокна Отростки нервных клеток, покрытые глиальными клетками, на- зывают нервными волокнами. Их делят на два класса: немиели- низированные и миелинизированные. В составе нервных волокон ча- ще всего (за исключением чувствительных нервов) находятся аксо- ны, которые также называют осевым цилиндром нервного волокна. В ЦНС оболочки отростков нейронов образуют отростки олигоденд- роцитов, а в периферической нервной системе — шванновские гли- альные клетки. Немиелинизированные нервные волокна. Находятся преиму- щественно в структурах вегетативной нервной системы. Нейролеммо- циты оболочек немиелинизированных нервных волокон, располагаясь плотно, образуют тяжи, в которых на определенном расстоянии друг от друга видны овальные ядра. В нервных волокнах внутренних орга- нов в таком тяже имеется, как правило, не один, а несколько (10—20) осевых цилиндров, принадлежащих различным нейронам. Такие осе- вые цилиндры могут, покидая одно волокно, переходить в соседнее. Волокна, содержащие несколько осевых цилиндров, называют волок- нами кабельного типа. Оболочки нейролеммоцитов очень тонкие, поэтому под световым микроскопом они выявляются как однородный тяж цитоплазмы, «одевающий» осевые цилиндры. Миелинизированные нервные волокна. Встречаются как в ЦНС, так и в периферической нервной системе. Они значительно тол- ще немиелинизированных нервных волокон: диаметр поперечного се- чения колеблется от 2 до 20 мкм. Состоят, так же как и немиелинизи- рованные нервные волокна, из осевого цилиндра, «одетого» оболоч- кой из нейролеммоцитов, но более сложной по строению. В сформированном миелиновом волокне различают два слоя оболочки: внутренний, более толстый миелиновый слой, и наруж- ный, тонкий, состоящий из цитоплазмы, ядер нейролеммоцитов и ней- ролеммы (плазматической мембраны). В процессе формирования мозга аксон погружается в желобок на поверхности нейролеммоцита. Когда края желобка смыкаются, обра- зуется двойная складка плазмалеммы нейролеммоцита — мезаксон. Мезаксон удлиняется, концентрически наслаивается на осевой ци- линдр и образует вокруг него плотную слоистую зону — миелиновый слой. Миелинизированная оболочка формируется в результате много- кратного закручивания глиальной клетки вокруг аксона. Следователь-
1.1. Нервная ткань 17 но, миелин — это слой относительно богатых фосфолипидами плаз- матических мембран глиальных клеток (олигодендроцитов в ЦНС и шванновских клеток в ПНС). В миелиновом слое через определенные интервалы (1 —2 мм) вид- ны участки волокна, лишенные миелинового слоя, — узловатые пе- рехваты (перехваты Ранвье) (рис. 1.3). Отрезок волокна между Немиелинизированный аксон Ядро шванновской клетки Цитоплазма шванновской клетки Рис. 1.3. Строение миелинизированного нервного волокна в периферической нервной системе: а — фрагмент миелинизированного волокна с перехватом Ранвье; б — строение шванновской клетки 2-1822
18 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ смежными перехватами — межузловой сегмент — формируется оди- ночной шванновской клеткой (или отростком олигодендроцита). От- сутствие миелинового слоя в области узловых перехватов объясняет- ся тем, что в данном участке волокна заканчивается один нейролем- моцит (или отросток олигодендроцита) и начинается другой. Осевой цилиндр в этом месте частично покрыт интердигитирующими, т. е. разобщенными, пальцевидными отростками нейролеммоцитов. В об- ласти перехватов Ранвье аксональная мембрана напрямую контакти- рует с внеклеточной средой. Наличие большого числа митохондрий в области перехватов Ранвье свидетельствует о высокой метаболиче- ской активности аксона в этих участках. Следует отметить, что ветвле- ние аксона также происходит в области перехватов Ранвье. Длина межузлового сегмента, так же как и толщина миелинового слоя, зависит от толщины осевого цилиндра. В миелиновом слое пери- одически встречаются узкие насечки, так называемые насечки Шмид- та—Лантермана. Насечка миелина представляет собой участок миелинового слоя, в котором завитки мезаксона лежат неплотно друг к другу, образуя спиральный туннель (место расслоения миелина), заполненный цитоплазмой нейролеммоцита. Миелиновые волокна ЦНС отличаются тем, что в них миелиновый слой формирует один из отростков олигодендроцита. Остальные его Рис. 1.4. Формирование миелино- вой оболочки аксона в централь- ной нервной системе. Посредством вращательного движе- ния мембрана одного олигодендро- цита окружает несколько аксонов и формирует их миелиновую обо- лочку отростки участвуют в образовании миелинового слоя других миелино- вых волокон (каждый в пределах одного межузлового сегмента), при- чем мембрана одного олигодендроци- та часто окружает несколько аксонов (рис. 1.4). Миелиновые волокна ЦНС не имеют насечек миелина. Суммарный диаметр аксона, по- крытого миелиновой оболочкой, обыч- но составляет около 20 мкм, длина пе- рехвата Ранвье — 2 мкм, а длина ми- елинизированного промежутка между двумя перехватами Ранвье — около 2000 мкм. Миелиновая оболочка мо- жет состоять из 50—100 мембран, иг- рающих роль «электрического изоля- тора» аксона; она предотвращает пе- ренос ионов между цитозолем аксона и внеклеточной жидкостью. В немиели- низированном волокне волна деполя-
1.1. Нервная ткань ризации мембраны распространяется вдоль всей аксолеммы, не пре- рываясь, в миелиновом же волокне она выявляется только в области перехватов Ранвье. Скорость передачи импульса миелинизированными волокнами больше, чем немиелинизированными. Тонкие волокна, бедные миели- ном, и немиелинизированные волокна проводят нервный импульс со скоростью 1—2 м/с, тогда как толстые миелинизированные волок- на — со скоростью 5—120 м/с. Миелин — электрический изолятор, однако его функция облегче- ния проводимости в аксонах не имеет точной аналогии с электриче- скими схемами. Когда мембрана в перехвате Ранвье возбуждена, ток не может течь через оболочку высокого сопротивления и поэтому де- поляризует мембрану в следующем перехвате. Активное возбуждение аксональной мембраны перескакивает от одного перехвата к другому; эту форму распространения импульса называют сальтаторной, или прыгающей, проводимостью (от лат. saltatore — подскакивать). Таким образом, миелин создает прерывистую изоляцию нервного волокна. 1.1.4. Нервные окончания Нервные волокна заканчиваются концевыми аппаратами — нервными окончаниями. Различают три группы нервных оконча- ний: концевые аппараты, образующие межнейрональные синапсы и осуществляющие связь нейронов между собой; эффекторные оконча- ния, передающие нервный импульс на ткани рабочего органа; рецеп- торные (аффекторные) окончания. Эффекторные нервные окончания бывают двух типов — двигательные и секреторные. Двигательные нервные окончания аксонов двигательных клеток вегетативной нервной сис- темы осуществляют передачу нервного импульса на ткани рабочих органов. Двигательные окончания в поперечнополосатых мыш- цах называются нервно-мышечными окончаниями. Плазмалеммы ветвей аксона и мышечного волокна разделены синаптической щелью шириной 50 нм, которая заполнена аморфным веществом, богатым гликопротеидами. Мембрана мышечного волокна образует многочис- ленные складки, формирующие синаптическую щель. Примембран- ный слой, который характеризуется обилием митохондрий, скоплени- ем круглых или слегка овальных ядер, образует постсинаптическую часть синапса.
20 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ П. А. Кометиани Основоположник школы гру- зинских нейрохимиков, автор первого национального учеб- ника по биохимии, выдаю- щийся ученый, известный пионерскими исследованиями в области биоэлектрической активности клеток, биохимии высшей нервной деятельнос- ти и нейрохимических основ памяти Ветви нервного волокна в нервно- мышечном синапсе характеризуются оби- лием митохондрий и многочисленными пресинаптическими пузырьками, содержа- щими характерный для этого вида оконча- ний медиатор — ацетилхолин. При воз- буждении ацетилхолин поступает через пресинаптическую мембрану в синапти- ческую щель на холинорецепторы постси- наптической (мышечной) мембраны, вы- зывая ее возбуждение (см. гл. 2.3). Меж- синаптическая область содержит фермент ацетилхолинэстеразу, разрушающую ме- диатор и ограничивающую этим срок его действия. Нарушения в нервно-мышеч- ных окончаниях вызывают различные мышечные заболевания, например mias- tenia gravis, характеризующееся прогрес- сирующей мышечной слабостью. При этом заболевании в крови циркулиру- ют антитела против ацетилхолиновых ре- цепторов сарколеммы (мембраны мышеч- ного волокна). Эти антитела связывают- ся с холинорецепторами постсинаптиче- ской мембраны и инактивируют их, нарушая нервно-мышечное взаи- модействие. Двигательные нервные окончания в гладкомышечной ткани менее дифференцированны. Они представляют собой утол- щения нервного волокна, контактирующего с гладкомышечными клетками. Сходное строение имеют секреторные нервные окон- чания. Рецепторные нервные окончания — рецепторы, ко- торые воспринимают различные сигналы как из внешней среды, так и от внутренних органов. Соответственно выделяют две большие группы рецепторов: экстерорецепторы (реагирующие на внешние сигналы) и интерорецепторы (реагирующие на внутренние сигналы). К экстерорецепторам относят слуховые, зрительные, обо- нятельные, вкусовые и осязательные рецепторы. К интерорецепторам относят висцерорецепторы (сигнализирующие о состоянии внутрен- них органов) и вестибулопроприорецепторы (рецепторы опорно-дви- гательного аппарата).
1.1. Нервная ткань Специализированные нейросенсорные клетки органов зрения яв- ляются фоторецепторами, преобразующими внешнюю энергию света в нервный импульс. Сетчатка глаза — сенсорная рецепторная часть зрительного анализатора, в которой под воздействием света происходят фотохимические превращения зрительных пигментов, фо- тотрансдукция, изменение биоэлектрической активности нейронов и передача информации о внешнем мире в подкорковые и корковые зри- тельные центры (см. 3.6.1). 1.1.5. Синапсы Синапсы — это структуры, предназначенные для передачи им- пульса с одного нейрона на другой или на мышечные и железистые структуры. Синапсы обеспечивают проведение импульса по цепи ней- ронов, т. е. определяют направление проведения импульса. Только импульс, достигающий нервных окончаний аксона, может с помощью синапсов передать возбуждение на другой нейрон, мышечную или же- лезистую клетку. В зависимости от способа передачи импульса синап- сы бывают химическими или электрическими (см. гл. 2.1). Нервное окончание аксона представляет собой пресинаптиче- скую часть синапса, а область второго нейрона, с которой она контактирует, — его постсинаптическую часть. В пресинаптиче- ской части находятся синаптические пузырьки, многочисленные мито- хондрии и отдельные нейрофиламенты. Форма и содержимое синапти- ческих пузырьков связаны с функцией синапса. Так, в синапсах, в ко- торых передача импульса совершается с помощью ацетилхолина (холинергические синапсы), обнаруживаются округлые прозрачные пузырьки диаметром 30—50 нм; в синапсах, в которых в качестве нейромедиатора используется норадреналин (адренергические си- напсы), синаптические пузырьки имеют диаметр 50—90 нм, в них видна плотная сердцевина диаметром 15—25 нм. Пресинаптическая мембрана — это мембрана клетки, передаю- щей импульс (аксолемма). Межсинаптическая щель между пре- и постсинаптическими мембранами имеет ширину 20—30 нм. Пре- и постсинаптические мембраны находятся в тесном контакте, осуществ- ляющемся с помощью филаментов, пересекающих синаптическую щель. Постсинаптическая мембрана — это участок плазмалеммы клетки, воспринимающий сигнал медиатора. Данная область содер- жит рецепторные белки, способные воспринимать сигнал соответст- вующего нейромедиатора.
22 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ 1.2. ОСОБЕННОСТИ ЛИПИДНОГО И БЕЛКОВОГО СОСТАВА НЕРВНОЙ ТКАНИ Изучение липидов нервной системы составляет существенную часть нейрохимических исследований. Существует несколько очевид- ных свидетельств важной роли липидов головного мозга как структур- ных компонентов, а также их участия в функциональной активности мозга. Среди всего многообразия органов мозг в наибольшей степени обо- гащен липидами (приблизительно 50% сухой массы). Он содержит уникальную структуру — миелиновую оболочку, которая по сравнению с другими тканями и субклеточными компонентами имеет самую высо- кую концентрацию липидов. Липидный состав нервной ткани практи- чески постоянен и мало меняется даже под влиянием внешних факто- ров (диета, гормоны, фармакологические вещества, стрессы), которые существенно изменяют липидный состав висцеральных органов и плаз- мы. Это — следствие защищенности ЦНС от различных внешних воз- действий. Однако следует помнить, что в период развития нервной сис- темы в липидном составе наблюдаются существенные изменения. Существуют генетически детермированные метаболические болез- ни, в механизм развития которых вовлекаются липиды мозга. Возмож- ности идентификации аномальных липидов и поиска лежащих в осно- ве их синтеза ферментативных дефектов дают стимул не только для изучения таких патологических условий, но и для исследования химии и метаболизма липидов мозга в целом. В организме липиды выполняют две основные функции: 1)источника химической энергии, запасенной в триглицеридах; 2) структурного компонента клеточных мембран. Мозг содержит ми- нимальные количества триглицеридов. Вся сложнейшая деятельность нервной ткани опосредуется мембранами, в формировании и функци- онировании которых липиды принимают непосредственное участие. 1.2.1. Липидный состав Фосфолипиды, гликолипиды, стероиды. Липидный состав мозга является уникальным не только из-за высокой общей концент- рации липидов, но также из-за специфики. Почти все липиды голов- ного мозга представлены тремя основными группами: 1)фосфолипидами; 2) гликолипидами; 3) стероидами, причем кон- центрация фосфолипидов особенно высока. Распространение и свой- ства фосфолипидов изучены наиболее детально.
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани Фосфолипиды подразделяют на две группы: глицерофосфолипиды (про- изводные фосфатидной кислоты — фос- фатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит) и сфингофосфолипиды (производные це- рамида, сфингомиелины). Глицерофосфолипиды представляют собой производные фосфатидной кис- лоты, к гидроксилу фосфорной кислоты Ri R2 I I ООН о III II Н—С>-С2-С3-О-Р-О-Х III I Н Н Н О- Рис. 1.5. Схематическое стро- ение молекулы фосфолипида. X — полярная головка; R, и R2 — жирнокислотные радикалы которой сложноэфирной связью присоединен радикал X (рис. 1.5, табл. 1.1); Rj и R2 — ацильные остатки жирных кислот, содержащие от 12 до 18 атомов углерода (как правило, четное количество). Таблица 1.1. Классификация фосфолипидов по структуре полярных радикалов Радикал 1,2-диацилфосфатидной кислоты Фосфолипид -ОН Фосфатидная кислота zch3 -och2-ch2-+n^ch3 хсн3 Фосфатидилхолин (лецитин) -och2-ch2-nh+ Фосфатидилэтаноламин (кефалин) -осн2-сн-соо~ 1 NH3+ Фосфатидилсерин -о-сн-сн-соо- СН3 NH3 Фосфатидилтреонин -ОСН2-СН-СН2 2 1 1 он он Фосфатидилглицерин ОН ОН ОН Фосфатидилинозит
24 Раздел 1. СТРУКТУРА ЬЬРБ.ЧОЙ ТКАНИ Таблица 1.2. Липидный состав некоторых биологических мембран, % от суммарного количества липидов (по: Болдырев и др., 2006) Липид Миелин человека Эритроциты человека Митохондрии сердца быка £. coli Фосфатидная кислота 0,5 1,5 0,0 0 Фосфатидилхолин 10.0 19,0 39,0 0 Фосфатидилэтаноламин 20,0 18,0 27,0 66 Фосфатидилглицерол 0,0 0,0 0,0 18 Фосфатидилинозит 1.0 1,0 7,0 0 Фосфатидилсерин 8,0 8,0 0,5 0 Кардиолипин 0,0 0,0 23,5 14 Сфингомиелин 8,5 17,5 0,0 0 Гликолипиды 26,0 10,0 0,0 0 Холестерин 26,0 25,0 3,0 0 Первая часть сложных слов, используемых для обозначения фос- фолипидов, потерявших одну из двух ацильных цепей, — «лизо». Ли- зофосфолипиды обнаруживаются в мембранах в небольших количест- вах — появление этих веществ приводит к нарушению структуры би- слоя и лизису клеток. Характеристика липидного состава некоторых мембран животных представлена в таблице 1.2. Как видно из таблицы, основными липи- дами мембран животных клеток являются глицерофосфолипиды: фос- фатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. Структура фосфатидилхоли- на представлена на рисунке 1.6. Наиболее часто встречающиеся фосфолипиды построены по еди- ному плану, их молекулы стерически хорошо соответствуют друг другу. В то же время огромное разнообразие фосфолипидов обеспечивается различием жирных кислот, входящих в состав их молекул. Так, су- ществует несколько десятков природных видов фосфатидилхолина, причем диолеилфосфатидилхолин сильно отличается по своим свойст- вам от дипальмитоилфосфатидилхолина. Существует несколько групп фосфолипидов, отличающихся стро- ением от приведенных в таблице 1.2: 1) плазмалогены; 2)диольные
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани 25] фосфолипиды и 3) дифосфатидил глицериды. Плазмалогены отличают- ся от рассмотренных выше фосфоглицеридов тем, что одна из двух имеющихся у них углеводородных цепей представляет собой длинноце- почечную жирную кислоту, а другая — альдегид жирной кислоты. Со- единения этой группы особенно широко распространены в мембранах мышц и нервных клеток. Радикал X в плазмалогенах мышц представ- лен холином, в плазмалогенах мозга — серином или этаноламином. Диольные фосфолипиды характеризуются тем, что вместо глице- рина в составе их молекул содержатся двухатомные спирты: этилен- гликоль или пропандиол; это одноцепочечные липиды. По физико-хи- мическим свойствам, например растворимости, диольные фосфолипи- ды напоминают лизоформы фосфолипидов. В отношении клеточных мембран они обладают более сильной разрушающей способностью, чем лизолецитин. В малых дозах диольные фосфолипиды не повреж- дают мембрану, а лишь изменяют ее свойства, например повышают проницаемость для небольших молекул и ионов. В больших дозах они снижают рецепцию ацетилхолина, модифицируют иммунные реакции клеток. По-видимому, некоторые клетки используют это свойство — а Ci С2 б Рис. 1.6. Молекула фосфатидилхолина: а — структурная формула; б — стереоконфигурация молекулы в пространстве: / — полярная «головка»; 2 — цепи жирных кислот. Жирнокислотный радикал при С2 находится в цис-положении
Таблица 1.3. Липидный состав мозга взрослого человека (по: Benjamins, Hajra, Agranoff, 2006) Компоненты Серое вещество, % Белое вещество, % Влажный вес Сухой вес Липиды Влажный вес Сухой вес Липиды Вода 81,9 — — 71,6 — — Осадок, не растворимый в смеси хлороформ — метанол 9,5 52,6 — 8,7 30,6 — Белок протеолипидов 0,5 2,7 — 2,4 8,4 — Общие липиды 5,9 32,7 100 15,6 54,9 100 Осадок из водно-метанольной фазы 2,2 12,1 — 1,7 6,0 — Холестерин 1,3 7,2 22,0 4,3 15,1 27,5 Фосфолипиды (суммарные) 4,1 22,7 69,5 7,2 25,2 45,9 Фосфатидилэтаноламин 1,7 9,2 27,1 3,7 13,2 23,9 Фосфатидилхолин 1,9 10,7 30,1 2,4 8,4 15,0 Сфингомиелин 0,4 2,3 6,9 1,2 4,2 7,7 Фосфоинозитиды 0,16 0,9 2,7 0,14 0,5 0,9 Фосфатидилсерин 0,5 2,8 8,7 1,2 4,3 7,9 Г алактоцереброзиды 0,3 1,8 5,4 3,1 10,9 19,8 Сульфо цереброз иды 0,1 0,6 1,7 0,9 3,0 5,4 Ганглиозиды (суммарно) 0,3 1,7 1,4 0,05 0,18 1,3 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани 27| Таблица 1.4. Содержание (%) индивидуальных фосфолипидов в коре мозга крысы (по: Туманова, 1999) Фосфолипиды Нейроны Нейроглия Лизофосфатидилхолин 3,9 1,9 Фосфатидилхолин 46,1 46,9 Сфингомиелин 6,7 9,5 Фосфатидилсерин 9,1 7,1 Фосфатидилинозит 77 5,9 Фосфатидилэтаноламин 25,1 24,9 Фосфатидная кислота 1,8 3,6 начинают интенсивно синтезировать диольные липиды в период быст- рого роста и прекращают их образование, когда клеточный рост за- медляется. Возможно, это связано с тем, что в период роста клеток их мембраны должны быть более лабильными. Дифосфатидилглицериды образуются в результате соединения двух молекул фосфатидилглицерида. Наиболее широко распростра- ненным представителем этой группы фосфолипидов является кар- диолипин — непременный компонент митохондриальных мембран, выделенный первоначально из сердечной мышцы. Значительная часть фосфолипидов в мозге представлена фосфати- дилэтаноламинами (на долю которых приходится 25—30% суммарно- го содержания) и фосфатидилхолинами (табл. 1.3). Состав фосфоли- пидов обогащенных фракций нейронов и нейроглии коры мозга крысы представлен в таблице 1.4. Сфинголипиды. Как упоминалось выше, кроме глицерофосфоли- пидов в группу фосфолипидов входят и сфинголипиды, которые можно представить как производные церамида (жирнокислотного эфира нена- сыщенного аминоспирта сфингозина) и монофосфорных эфиров спиртов. В случае наиболее распространенного сфинголипида — сфингомиели- на — таким эфиром является фосфорилхолин; один из его углеводород- ных хвостов — длинная алифатическая цепь сфингозина, а другой — этерифицированная жирная кислота (рис. 1.7). Основным блоком всех сфинголипидов является сфингозин, который представлен длинноцепо- чечным аминодиолом с одной ненасыщенной связью.
28 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Олеиновая кислота Рис. 1.7. Молекула сфингомиелина (церамидфосфорилхолина). Пунктиром обведена сфингозиновая группировка Сфингомиелин может быть оп- ределен как церамидфосфорилхо- лин. Это — единственный фосфо- липид мозга, который является также и сфинголипидом. Сфинго- миелин содержится в больших ко- личествах в белом веществе моз- га, в миелиновых оболочках нерв- ных стволов. Несколько ниже его содержание в сером веществе (см. табл. 1.3). В развивающихся ней- ронах особенно интенсивно синте- зируется сфингомиелин аксональ- ного отростка. Основным сфингозином мозга является С18-сфингозин, а количе- ство С16-, С20- и С22-сфингози- нов — значительно меньшее. Жир- ные кислоты, входящие в его со- став, — длинноцепочечные и со- держат мало двойных связей. Обыч- но это лигноцериновая С24.0 и не- рвоновая С241 кислоты. В сером веществе мозга до 70% жирных кислот сфингомиелина представ- лено стеариновой кислотой С18,0. В мозге присутствует также не- большое количество сфингозинов в насыщенной форме, образуя дигидросфингозины. Церамиды. Повышенный интерес к .этим промежуточным со- единениям в метаболизме сфинголипидов, являющимся предшествен- никами в синтезе сфингомиелина и гликосфинголипидов, связан с тем, что в настоящее время установлено непосредственное участие цера- мида в работе сигнальных систем клетки. Церамид играет регулирую- щую роль в апоптозе, дифференцировке и старении клеток, а также в торможении клеточного цикла. Высвобождение церамидов из мемб- ранного бислоя происходит при стимуляции нейрональных и глиаль- ных клеток различными трофическими факторами. Функции церамида и его метаболитов в нейроне различаются в за- висимости от внутриклеточной локализации церамида и стадии разви-
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани тия нейрона. Рост и развитие нейронов связаны с изменением метабо- лизма церамида. Синтез гликозилцерамида из церамида требуется для роста аксонов в культуре нейронов гиппокампа, а образование цера- мида из сфингомиелина с помощью сфингомиелиназы стимулирует ранние стадии развития этих клеток, а именно — формирование минорных нейрональных отростков и образование аксонов. Гликолипиды клеточных мембран. Это гликозильные произ- водные церамида, к которым относятся цереброзиды, сульфатиды и ганглиозиды (некоторые свойства последних описаны в гл. 1.7). В гли- колипидах гидрофобная часть представлена церамидом; гидрофиль- ная группа — углеводный остаток, присоединенный гликозидной связью к гидроксильной группе у первого углеродного атома церамида (рис. 1.8 и 1.9). Цереброзиды (от лат. cerebrum — мозг) впервые были обнаруже- ны в составе мозга. Молекулы цереброзида образованы остатка- ми аминоспирта сфингозина, жирной кислоты и углевода (галактоза, реже глюкоза с образованием галактоцереброзида или глюкоцереб- розида). В зависимости от длины и строения углеводной части разли- чают цереброзиды, содержащие моно- или олигосахаридный остаток, и ганглиозиды, к ОН-группе которых присоединен сложный, раз- ветвленный олигосахарид — N-ацетилнейраминовая кислота. Рис. 1.8. Структура цереброзида (а) и цереброзидсульфата (б). Пунктиром обведены радикалы сфингозина и церамида
30 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Длинные алифатические цепи Цереброзид (галактоцереброзид) Рис. 1.9. Схематическое изображение гликолипидов. Gal — галактоза; Glc — глюкоза; NANA — N-ацетилнейраминовая кислота Длинные алифатические цепи Ганглиозид Все цереброзиды в мозге взрослого человека в норме являются га- лактоцереброзидами. Глюкоцереброзиды обнаруживаются в мозге толь- ко в определенных патологических условиях и в небольших количествах. Обнаруженные в цереброзидах жирные кислоты содержат в основном 24 атома; чаще всего встречаются нервоновая, цереброновая и лигно- цериновая кислоты. Цереброзиды могут быть отнесены как к гликоли- пидам, так и к сфинголипидам, поскольку эти соединения содержат и гек- созу, и сфингозин. Сульфатиды представляют собой галактоцереброзиды с дополни- тельной сульфатной группой, присоединенной к галактозе; при этом сульфатидом является церамидгалактоза-5О4. Гликолипиды (в первую очередь цереброзиды и сульфатиды) в боль- шом количестве присутствуют в белом веществе мозга. Цереброзиды
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани и сульфоцереброзиды рассматривают как специфические гликолипиды мембран глиальных (прежде всего олигодендроглиальных и шваннов- ских) клеток, поэтому особенно высоко содержание этих липидов в ми- елине. Количество цереброзидов в астроцитах и особенно в мембранах нейронов заметно ниже, чем в олигодендроцитах. Нарушение обмена цереброзидов у человека приводит к психическим заболеваниям. Ганглиозиды определяются как сфингогликолипиды, содержащие сиаловую кислоту. Сиаловой кислотой называют N-ацилнейрамино- вую кислоту, NANA (при этом сиаловая кислота в ганглиозидах мозга всегда ацилирована). Ганглиозиды обнаружены во всех типах клеток нервной системы, но наиболее богаты ими мембраны нейронов, преж- де всего — мембраны синаптических окончаний. Ганглиозиды не только являются структурным компонентом нейро- нальных мембран, но и обладают регулирующим влиянием на процес- сы пролиферации (см. гл. 1.7) и регенерации клеток, а также выражен- ным нейротрофическим и нейритогенным эффектами; они способны предотвращать дегенерацию культивируемых нейронов мозжечка, вы- зываемую глутаматом или каинатом. Кроме того установлено, что ганг- лиозиды ингибируют перекисное окисление липидов в изолированных синаптосомах мозга крысы. Известно, что ключевым моментом в реализации нейротоксического (экзайтотоксического) действия возбуждающих аминокислот при взаимодействии их с глутаматными рецепторами является гиперактива- ция ионных каналов, сопровождающаяся избыточным поступлением Са2+ в клетки и активацией Са2+-зависимых протеиназ и фосфолипаз, что в итоге приводит к необратимому повреждению нейронов. Имеются данные, указывающие на наличие в этих процессах свободнорадикаль- ных реакций. Установлено, что нейрональная дегенерация, вызванная каинатом, опосредуется супероксидными радикалами, генерируемыми ксантиноксидазой. Защитный эффект мембранных ганглиозидов, по-ви- димому, обусловлен образованием доменов, обогащенных этими липи- дами, которые оказываются способными стабилизировать нейрональ- ные мембраны и в конечном итоге защищать нейроны от окисления. Природной функцией ганглиозидов в нейрональных мембранах яв- ляется участие в дифференцировке нейрональной ткани. Ганглиозиды лимфоцитов определяют видоспецифичность и регулируют межкле- точные контакты. Стероиды. Это спирты со стерановым скелетом, к которым от- носятся как немембранные липиды (из них наиболее важны стероид- ные гормоны), так и структурные компоненты мембран. В перечень
32 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ нм 3 Г 2 1 а б О Рис. 1.10. Структурная формула холестерина (а) и его упаковка между двух молекул фосфолипидов (б). Звездочкой отмечен гидроксил, который формирует эфирную связь с жирной кислотой при образовании эфиров холестерина: / — область полярных «головок»; 2 — область, упорядочиваемая холестерином; 3 — область подвижных жирнокислотных цепей мембранных компонентов стероидного ряда входят холестерин, си- тостерин, тетрахименин. В тканях животных распространен хо- лестерин. В растительных клетках холестерин не обнаружен, его за- меняют фитостерины. У бактерий стероиды отсутствуют. Холестерин и его эфиры — непременные составляющие плазматических мембран клеток животных (рис. 1.10). Молекула холестерина не содержит длинных жирнокислотных цепо- чек, она состоит из четырех плоских колец, к одному из которых (шести- членному) присоединена полярная гидроксильная группа (—ОН), а наи- более отдаленное от него пятичленное кольцо соединено с разветвлен- ной углеводородной цепочкой из восьми атомов углерода. Таким образом, молекулы холестерина имеют полярную головку и вытянутую в длину неполярную часть. Поэтому они хорошо встраиваются в бислой- ные липидные структуры, особенно в области мембранных дефектов, образующихся в результате фазового перехода липидов (рис. 1.11). Особенно много холестерина содержится в наружных мембранах. Например, в плазматической мембране клеток печени холестерин составляет около 30% всех мембранных липидов. Холестерин является единственным стеролом, представленным в значительном количестве в мозге взрослого человека. У человека сред- няя концентрация холестерина в ЦНС выше, чем в любой другой ткани (свыше 20 мг/г). Несмотря на то что мозг составляет всего около 2%
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани Рис. 1.11. Встраивание холестерина в жидкокристаллический бислой: а — кристаллическая упаковка липидов в бислое; б — разрыхление бислоя в резуль- тате фазового перехода (сопровождается уменьшением толщины бислоя и возрастани- ем его площади); в — встраивание холестерина в жидкокристаллический бислой, уве- личивающее его толщину веса тела, почти 25% общего количества холестерина, присутствую- щего в организме, локализовано в этом органе, причем большая его часть находится в миелине. Довольно высокое содержание холестерина характерно и для плазматических мембран других клеток нервной тка- ни. Например, в плотных миелиновых мембранах холестерин и фосфо- липиды содержатся в соотношении 1 :0,76; в олигодендроглии — 1 : 2,2; в астроглии — 1 : 2,5; в нейронах — 1 : 3,5 (табл. 1.5). Небольшие концентрации десмостерина и эфиров холестерина об- наружены в ЦНС человека и некоторых животных на ранних стадиях развития, а в ЦНС взрослых организмов все стероиды представлены преимущественно неэстерифицированным холестерином. В ЦНС хо- лестерин находится в основном в олигодендроглии и в плазматической мембране астроцитов и нейронов. Таблица 1.5. Состав и содержание липидов основных типов нервных клеток и миелина мозга крысы, мкмоль/мг сухой массы (по: Туманова, 1999) Липиды Астроглия Нейрон Олиго- дендроглия Миелин Холестерин 14,100 6,610 10,800 54,900 Цереброзиды 0,689 0,513 2,610 22,000 Сульфатиды 0,142 0,090 0,472 2,890 Общие фосфолипиды 35,600 22,400 23,400 41,800 Ганглиозиды 0,582 0,223 0,239 0,0453 Молярное соотношение'. холестерин 1 1 1 1 цереброзиды 0,05 0,075 0,25 0,40 фосфолипиды 2,5 3,5 2,2 0,76
34 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНЕЙ ТКАНИ Метаболизм холестерина в ЦНС существенно отличается от метабо- лизма в других органах и тканях. У всех животных организмов наиболь- ший рост и дифференцировка ЦНС наблюдаются в ранний постнатальный период, и холестерин, расходуемый на формирование плазматических мембран и компактного миелина, образуется исключительно в ходе очень интенсивного синтеза de novo в мозге (главным образом в астроцитах). В отличие от других тканей организма, где интенсивный синтез хо- лестерина продолжается в течение всей жизни, в мозге человека и животных скорость обновления этого липида значительно снижается с возрастом. Так, в мозге взрослого человека скорость обновления хо- лестерина составляет всего 0,03% в день (по сравнению с 0,7% вдень для организма в целом). В настоящее время нет доказательств поступления холестерина в головной или спинной мозг из крови. У взрослых организмов скорость его синтеза превышает потребность в нем, и экскреция холестерина из ЦНС происходит с образованием 24-(C)-гидроксихолестерина. Уро- вень холестерина в крови и интенсивность его обмена имеют большое значение для развития ряда нейродегенеративных болезней, в частнос- ти болезни Альцгеймера. Сравнивая молярное содержание основных классов липидов в спе- циализированных клетках мозга (см. табл. 1.5), можно увидеть, что олигодендроглия и миелин обогащены цереброзидами, а в нейронах и астроглии более высоко содержание фосфолипидов. Это лишний раз подтверждает то, что плазматические мембраны нейронов и глиаль- ных клеток отличны от миелина. Жирные кислоты. В состав молекул как фосфо-, так и гликоли- пидов входят ацильные радикалы различных жирных кислот (табл. 1.6). Как правило, жирнокислотные радикалы имеют четное количество атомов углерода — от 14 до 24; чаще всего встречаются жирные кис- лоты с 16 или 18 атомами углерода. Жирные кислоты с нечетным чис- лом атомов встречаются только в составе цереброзидов и ганглиози- дов. Наиболее распространены кислоты С16, С18 и С20. Жирные кис- лоты различаются как длиной цепи, так и степенью ненасыщенности, которая может быть различной; чаще встречаются ненасыщенные жирные кислоты 18 : 1, 18:2, 18 : 3 и 20 : 4. Первое число в соотно- шении обозначает длину ацильной цепи, а второе указывает на число содержащихся в ней двойных связей. Ненасыщенные кислоты мозга могут содержать от одной (моноеновые) до шести (полиеновые) двой- ных связей. Особенностью липидов мозга является относительно боль- шое содержание длинноцепочечных полиеновых кислот — С20.4, С20.5,
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани Таблица 1.6. Некоторые свойства жирных кислот, входящих в состав мембранных липидов Соединение Тривиальное название Молекулярная масса, Да Температура плавления,°C ^12:0 Лауриловая 200,3 44,2 ^14:0 Миристиновая 228,4 53,9 ^16:0 Пальмитиновая 256,4 63,1 ^17:0 Маргариновая 270,4 61,3 ^18:0 Стеариновая 284,5 69,6 ^20:0 Арахиновая 312,5 76,5 ^22:0 Бегеновая 340,6 81,5 ^24:0 Лигноцериновая 368,5 86,0 С|6: 1(9) Пальмитоолеиновая 254,4 -0,5 С|8: 1(9с) Олеиновая 282,5 13,5 С|8: l(9t) Элаидиновая 282,5 44,5 С|8: 1(7) Вакценовая 282,5 44,0 ^24 : 1(9) Нервоновая 366,6 42,5 С|8:2(9, 12) Линолевая 280,5 -5,0 ^18:3(9, 12, 15) Линоленовая 278,4 -10,0 ^20:4(5,8, 11, 14) Арахидоновая 304,5 -49,5 О>2:5(7, 10, 13, 16, 19) Клупанодоновая 330,5 -45,0 ^22:6(4, 7, 10, 13, 16, 19) Докозогексаеновая 328,5 -44,1 С22.6. Если ненасыщенной является лишь одна жирнокислотная цепь, то она присоединена ко второму углеродному атому глицерина. Почти все природные кислоты характеризуются цис-конфигурацией двойных связей. Цепь в такой конфигурации имеет излом, что нарушает упа- ковку липидных молекул в бислое (см. гл. 1.4). Отдельные классы липидов мозга характеризуются своим набором Жирных кислот. Имеет место также определенная специфичность жир- з*
36 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Таблица 1.7. Состав жирных кислот фосфолипидов синаптосомальных и миелиновых мембран коры мозга обезьяны, % от общего содержания (по: Туманова, 1999) Жирная кислота Фосфатидилхолин Фосфатидил- этаноламин Фосфатидилсерин + + фосфатидилинозит Синапто- сомы Миелин Синапто- сомы Миелин Синапто- сомы Миелин 6*16:0 50 33,1 7,4 4,9 3,5 2,6 6*18:0 12,4 17 25,5 15,9 44,3 43 С18: 1 27,2 42,3 12,1 33,9 11,4 38,5 6*20 1 0,7 0,9 1,6 9,3 — 2,5 6*20:4 3,8 3,2 10,1 11,6 8,3 6,3 6*22:4 0,8 0,6 6,4 11,1 3,5 3,7 6*22:6 3 2,3 24,9 10,6 26,9 2,9 нокислотного состава липидов разных отделов мозга, разных типов клеток и субклеточных структур (табл. 1.7). Например, в синаптиче- ских мембранах велико содержание жирных кислот С22.6, а в миели- не — моноеновых кислот С18. г В липидах мозга набор жирных кислот гораздо шире, чем в липидах других тканей; это существенно увеличивает спектр индивидуальных липидов мозга. Разнообразие жирных кислот в этом органе поражает. Применение различных физических методов исследования, включая газожидкостную хроматографию, ЯМР-спектроскопию, масс-спектро- метрию, позволило обнаружить наличие в головном мозге более 50 жир- ных кислот, длина цепи которых колеблется от 12 до 38 углеродных ато- мов, что было показано, например, для мозга крысы. Длинноцепочеч- ные (более 24 атомов углерода) полиненасыщенные с четырьмя, пятью и шестью двойными связями жирнокислотные цепи локализованы пре- имущественно во фракции фосфатидилхолина. В мозге и сетчатке глаза человека во фракции фосфатидилхолина также были обнаружены отно- сительно высокие концентрации полиеновых жирных кислот с длиной цепи 34, 36 и 38 углеродных атомов, которые присоединены к первому атому углерода молекулы глицерола (см. рис. 1.5), а к атому углерода во второй позиции присоединены насыщенные, моноеновые и полиеновые жирные кислоты с длиной углеродной цепи менее 24 атомов. Такие
1.2. ОСОбёННг. тг ъ гидн I g # 6efHиг«.СТль? И Тч?ии 3 необычные молекулярные формы фосфатидилхолина позволяют пред- положить его физиологическую значимость для функционирования мозга. Мозг млекопитающих содержит высокий уровень докозогексаено- вой кислоты (ДГК); она является главным компонентом жирно- кислотного состава фосфолипидов серого вещества мозга человека. В таблице 1.8 приведено содержание ДГК в фосфолипидах мозга че- ловека и некоторых тканей млекопитающих. Таблица 1.8. Содержание докозогексаеновой кислоты в фосфолипидах различных тканей млекопитающих, % от суммарного содержания остатков жирных кислот в фосфолипидах Объект Вид ткани Фракции Фосфати- дилсерин Фосфатидил- этаноламин Человек Мозг Серое вещество 36,6 24,3 Человек Мозг Белое вещество 5,6 3,4 Бык Мозг Серое вещество 28,7 — Бык Мозг Белое вещество 7,6 — Крыса Мозг Плазматические мембраны синапсов 34,1 32,4 Крыса Мозг Синаптические везикулы 37,0 30,6 Человек Сетчатка — 18,5 22,2 Бык Сетчатка Палочки сетчатки 37,7 38,7 Баран Сперма — — 40,5 Бык Сперма — — 37,8 Крыса Сердце — — 23,4 Крыса Печень Плазматическая мембрана 14,1 6,9 Крыса Мышцы — — 36,1 Человек Тромбоциты — 2,1 4,1 Человек Эритроциты — — 5,9
38 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Из таблицы видно, что значительное количество ДГК содержится в клетках внутренних органов и мышц, а также в палочках сетчатки глаз. Однако в нервной ткани содержание ДГК наиболее высоко. Воз- можно, что высокий уровень докозогексаеновой кислоты в синаптиче- ских мембранах необходим для активного транспорта ионов, так как активность Na/K-АТФазы в них зависит от присутствия в составе фос- фолипидов полиеновых кислот. Изменения концентрации ДГК в мозге сопровождаются нарушения-, ми познавательной и поведенческой активности животных (табл. 1.9). Установлено, что при уменьшении содержания ДГК в мозге крыс на- блюдается ухудшение зрительных и обонятельных функций при выпол- нении ими обучающих тестов. Дополнительно к ухудшению выполнения задач ассоциативного обучения у таких крыс обнаруживаются потеря пространственной памяти и ослабление обоняния. Таким образом, мож- но заключить, что уменьшение содержания ДГК в мозге затрагивает су- щественные функции высшей нервной деятельности. В мозге имеются регуляторные механизмы, поддерживающие степень ненасыщенности и специфический жирнокислотный состав липидов. Таблица 1.9. Влияние жирных кислот на биохимические и физиологические показатели состояния мозга Жирные кислоты (ЖК) Положение первой двойной связи Свойства Линоленовая Эйкозогексаеновая («з)18:3 (п3)20:5 Незаменимые ЖК. Увеличива- ют число дендритов и плотность синапсов в развивающемся моз- ге. Находятся преимущественно в сером веществе. Крысы, дефи- цитные по (л3), плохо обучаются. Докозогексаеновая (л3)22:6 При систематическом приеме алкоголя соотношение (л3)/(л6) в мозге снижается Линолевая Арахидоновая (п6) 18:2 (п6)20:4 Равномерно распределены в тка- нях, количество не зависит от со- става пищи. Избыток вызывает замещение в мембранах докозо- гексаеновой на арахидоновую, диссоциацию от мембран белков RAS и RAF, которые активируют каспазу 3 и вызывают апоптоз
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани 1.2.2. Биологические функции мембранных липидов Клеточная мембрана может содержать более 100 различных ти- пов липидных молекул. Почему их так много и почему каждая мембра- на имеет уникальный липидный состав, пока неясно. Очевидно, что соотношение липидов в различных мембранах мозга не является слу- чайным. Становится все более очевидным то, что липиды активно уча- ствуют в процессах, обеспечиваемых мембранами. Рассмотрим факторы, определяющие специфику липидного состава мембран нервной ткани. 1. Смесь липидов обязательно должна быть способной к образова- нию стабильного бислоя, в котором функционируют белки. 2. Некоторые липиды способствуют стабилизации сильно искрив- ленных участков мембраны, образованию контактов между мембранами или связыванию определенных белков, поскольку форма подобных мо- лекул соответствует нужной упаковке бислоя на тех или иных участках мембраны. По форме липидных молекул можно определить роль от- дельных липидов‘в бислое, например в стабилизации участков мембра- ны с большой кривизной и упаковке молекул вокруг мембранных бел- ков. Так, форма «конус», которая присуща таким липидам, как фосфа- тидилэтаноламин (ненасыщенный), кардиолипин, фосфатидная кислота, фосфатидилсерин (pH < 4,0), моногалактозилдиглицерид, способствует образованию вогнутой формы мембранного бислоя; форма «переверну- тый конус», свойственная лизофосфолипидам, приводит к образованию выпуклых участков липидного бислоя мембран. 3. Ряд липидов — важные биорегуляторы. Некоторые мембранные липиды служат предшественниками вторичных посредников при пере- даче гормонального сигнала. Наиболее изучены в этом отношении про- изводные фосфатидилинозитола в плазматических мембранах эукари- отических клеток. Так, фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (ФИФ2) под действием фермента фосфолипазы С гидролизуется до диацилгли- церола (DAG) — активатора протеинкиназы С и инозитол-1,4,5-трис- фосфата (ИФ3) — регулятора кальциевого обмена в клетке (см. гл. 2.4). DAG, ИФ3, протеинкиназа С и ионы кальция — участники фосфоино- зитольной системы передачи сигнала, причем два первых образуются из мембранных компонентов, третий является амфипатическим мемб- ранным белком, а кальций — это ион, проникающий через специаль- ные каналы на клеточной мембране и запускающий этот процесс. 4. Отдельные липиды необходимы для поддержания оптимальной активности ряда ферментов. Они формируют среду для функциониро- вания мембранных белков, способных принимать нативную конформа-
.о Раздел 1. СТНУН7 EPBt И TH Н цию лишь в гидрофобном окружении. Ферменты, лишенные специфи- ческого липидного окружения, или не проявляют каталитической ак- тивности, как ионные насосы (транспортные АТФазы), или проявляют отличные от нативных ферментов свойства. Такова, например, мито- хондриальная креатинкиназа — фермент, катализирующий образова- ние креатинфосфата и принимающий участие в поддержании энергети- ческого баланса в мозге. Для его нормальной активности требуется взаимодействие с кардиолипином внутренней мембраны митохондрий. 5. Ганглиозиды, как полагают, играют важную роль в регуляции роста и дифференцировки клеток (см. гл. 1.7), участвуя в процессах клеточной адгезии. 6. Некоторые липиды выполняют «якорную» функцию, например к молекуле фосфатидилинозитола через олигосахарид могут присоеди- няться специфические белки наружной поверхности клетки и при этом образуется фосфатидилинозитолгликан. Примером такого «заяко- ренного» белка может служить ацетилхолинэстераза, катализирующая гидролиз ацетилхолина в синаптической щели. Этот фермент фиксиру- ется на постсинаптической мембране, ковалентно присоединяясь к фосфатидилинозитолгликану. При участии фосфолипазы С (гидроли- зующей мембранные липиды) может происходить модификация мемб- раны и отделение белков от внешней поверхности клетки. 7. Липиды могут быть аллостерическими активаторами мембранных ферментов (например, фосфатидилсерин активирует протеинкиназу С). Фермент протеинкиназа С катализирует реакции фосфорилирования белков. Семейство протеинкиназ С (ПК С) включает несколько изофер- ментов — а-, р- и у-изоформы ПК С. Изоформа у-ПК С локализована исключительно в нейронах головного и спинного мозга, в то время как а- и p-ПК С присутствуют и в других тканях. В головном мозге протеин- киназа С встречается преимущественно в мозжечке, гиппокампе и коре. В неактивной форме протеинкиназа С находится в цитозоле. Однако пос- ле стимуляции клетки (приводящей к повышению в ней концентрации ионов кальция) фермент изменяет свою конформацию и приобрета- ет способность ассоциироваться с плазматической мембраной. Функци- онально активная протеинкиназа С представляет собой комплекс, содер- жащий мономер фермента, молекулу диацилглицерола, один или более ионов кальция и четыре молекулы фосфатидилсерина. Обнаружено, что мутация гена ПК С вносит вклад в развитие болезни Паркинсона. Уста- новлено также участие изоформы у-ПК С в развитии ишемического ин- сульта. Одним из центральных событий в развитии ишемического ин- сульта является высвобождение экзайтоксической аминокислоты глута- мата, приводящее к смерти нейрона. Через рецепторы NMDA глутамат
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани 41 вызывает приток ионов Са2+ и Na+ в клетку, а также генерацию свобод- ных радикалов. Изоформа у-ПК С быстро активируется в течение ише- мии, соответственно ингибирование ПК С снижает вызванную NMDA нейротоксичность. Использование мышей с подавленным синтезом ПК С позволяет предположить, что у-ПК С может играть отрицательную роль в процессе мозговой ишемии; как показано с помощью гистологических методов, мыши нокаута ПК С имеют значительно меньше инфарктов по сравнению с животными дикого типа. 1.2.з. Миелин Миелин — уникальное образование, организация которого по- зволяет проводить по нервному волокну электрический импульс с ми- нимальной затратой энергии (см. гл. 1.1). Миелиновая оболочка — высокоорганизованная многослойная структура, состоящая из сильно растянутых и модифицированных плазматических мембран шваннов- ских (в ПНС) и олигодендроглиальных (в ЦНС) клеток (рис. 1.12). Содержание воды в миелине составляет около 40%. Отличитель- ная особенность миелина по сравнению с другими клетками заключа- ется в том, что он содержит в среднем 70% липидов и 30% белка (в расчете на сухой вес). Большинство биологических мембран имеет более высокое значение отношения белков к липидам. Рис. 1.12. Мезаксон и образование миелиновой оболочки на примере миелина в аксонах периферической нервной системы: / — аксон; 2 — шванновская клетка; 3 — единичная мембрана; 4 — мезаксон; 5 — щель; 6 — цитоплазма шванновской клетки; 7 — миелиновая оболочка; 8 — проме- жуточный период; 9 — главный период
42 Раздел 1. тРУК1У-АНЕРЬН0й’КАНИ Липиды миелина ЦНС. Таблица 1.10 иллюстрирует липидный состав миелина некоторых объектов. Как видно из таблицы, все липиды, обнаруженные в мозге крысы, присутствуют и в миелине, т. е. нет липидов, локализованных исклю- чительно в немиелиновых структурах (за исключением специфическо- го митохондриального липида дифосфатидилглицерола, не включен- ного в табл. 1.10). Верно и обратное — нет таких липидов миелина, которые не были бы обнаружены в других субклеточных фракциях мозга. Таблица 1.10. Состав миелина мозга некоторых объектов (по: Quarles, Macklin, Morell, 2006) Компоненты Миелин Белое вещество Серое вещество, человек Мозг крысы Человек Бык Крыса Человек Бык Белок 30,0 24,7 29,5 39,0 39,5 55,3 56,9 Общие липиды 70.0 75.3 70,5 54,9 55,0 32,7 37,0 Холестерин 27,7 28,1 27,3 27,5 23,6 22,0 23,0 Цереброзиды 22,7 24,0 23,7 19,8 22,5 5,4 14,6 Сульфатиды 3,8 3,6 7,1 5,4 5,0 1,7 4,8 Общие галактолипиды 27,5 29,3 31,5 26,4 28,6 7,3 21,3 Общие фосфолипиды 43,1 43,0 44,0 45,9 46,3 69,5 57,6 Фосфатидил этано - ламин 15,6 17,4 16,7 14,9 13,6 22,7 19,8 Фосфатидил хол и н 11,2 10,9 1 1,3 12,8 12,9 26,7 22,0 Сфингомиелин 7,9 7,1 3,2 7,7 6,7 6,9 3,8 Фосфатидил се р и н 4,8 6,5 7,0 7,9 11,4 8,7 7,2 Фосфатидил- инозит 0,6 0,8 1,2 0,9 0,9 2,7 2,4 Плазмалогены 12,3 14,1 14,1 11,2 12,2 8,8 11,6 Белок и липид представлены в % к сухому весу; все другие составляющие — в % к общему весу липида. Плазмалогены являются в основном производными этаноламина.
1.2. Особенности липидного и шелкового состава нервной ткани Цереброзид — наиболее типичный компонент миелина. За исклю- чением самого раннего периода развития организма, концентрация цереброзида в мозге прямо пропорциональна количеству в нем миели- на. Только Vg общего содержания галактолипидов в миелине встреча- ется в сульфатированной форме. Цереброзиды и сульфатиды играют важную роль в обеспечении стабильности миелина. Для миелина также характерен высокий уровень его главных липи- дов — холестерина, общих галактолипидов и содержащего этано- ламин плазмалогена. Установлено, что до 70% холестерина мозга находится в миелине. Поскольку почти половина белого вещества мозга может состоять из миелина, очевидно, что в мозге содержится наибольшее количество холестерина по сравнению с другими органа- ми. Высокая концентрация холестерина в мозге, особенно в миелине, определяется основной функцией нейрональной ткани — генериро- вать и проводить нервные импульсы. Большое содержание холестери- на в миелине и своеобразие его структуры приводят к уменьшению ионной утечки через мембрану нейрона (вследствие ее высокого со- противления). Фосфатидилхолин также является существенной составной частью миелина, хотя сфингомиелин содержится в относительно незначи- тельном количестве. Как видно из таблицы 1.10, липидный состав как серого вещества, так и белого вещества мозга отчетливо отличается от такового у ми- елина. Состав миелина мозга всех изученных видов млекопитающих почти одинаков; имеют место лишь незначительные различия (напри- мер, миелин крысы имеет меньше сфингомиелина, чем миелин быка или человека). Существуют некоторые вариации и в зависимости от локализации миелина, например миелин, изолированный из спинного мозга, имеет более высокое значение отношения липида к белку, чем миелин из головного мозга. В состав миелина входят также полифосфатидилинозиты, из ко- торых трифосфоинозитид составляет от 4 до 6% общего фосфора ми- елина, а дифосфоинозитид— от 1 до 1,5%. Минорные компоненты миелина включают по крайней мере три эфира цереброзида и два ли- пида на основе глицерина; в составе миелина также присутствуют не- которые длинноцепочечные алканы. Миелин млекопитающих содер- жит от 0,1 до 0,3% ганглиозидов. В миелине содержится больше моносиалоганглиозида GMj по сравнению с тем, что обнаруживается в мембранах мозга. Миелин многих организмов, в том числе и чело- века, содержит уникальный ганглиозид сиалозилгалактозилцера- мид GM4.
Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНЙ Липиды миелина ПНС. Липиды миелина периферической и центральной нервной системы качественно подобны, но между ними есть количественные различия. Миелин ПНС содержит меньше це- реброзидов и сульфатидов и значительно больше сфингомиелина, чем миелин ЦНС. Интересно отметить наличие ганглиозида GMH харак- терного для миелина ПНС некоторых организмов. Различия в составе липидов миелина центральной и периферической нервной системы не столь существенны, как их различия по белковому составу. Белки миелина ЦНС. Белковый состав миелина ЦНС более прост, чем других мембран мозга, и представлен главным образом протеолипи- дами и основными белками, которые составляют 60—80% от общего количества. Гликопротеины присутствуют в гораздо меньших количест- вах. Миелин центральной нервной системы содержит уникальные белки. Белковый состав миелина мозга человека и крысы проиллюстриро- ван на рисунке 1.13. Для миелина ЦНС человека характерно количест- 170KG, SAG MAG Т CNPase в г 170KG, SAG MAG 4* — MAG ST CNPase Po MBP MBP, P| MBP p2 MOG PLP MBP DM-20 MBP MBP MBP PMP-22 MBP, P] MBP MBP P2 MOG PLP MBP DM-20 MBP MBP MBP Рис. 1.13. Электрофореграмма белков миелина в полиакриламидном геле: а — миелин ПНС человека; б — миелин ЦНС человека; в — миелин ПНС крысы; г — миелин ЦНС крысы. Указаны некоторые характерные белковые полосы
1.2. Особенности липидного м белковой? состава нервной тк ни венное превалирование двух белков: положительно заряженного ка- тионного белка миелина (myelin basic protein, МВР) и протеолипи- да миелина (myelin proteolipid protein, PLP). Эти белки — главные составные части миелина ЦНС всех млекопитающих. Миелиновый протеолипид PLP (proteolipid protein), также извест- ный как белок Фолча, имеет способность растворяться в органиче- ских растворителях. Молекулярная масса PLP составляет приблизи- тельно 30 кДа (Да — дальтон). Его аминокислотная последователь- ность чрезвычайно консервативна, молекула формирует несколько доменов. Молекула PLP включает три жирные кислоты, как правило, пальмитиновую, олеиновую и стеариновую, соединенные с аминокис- лотными радикалами эфирной связью. Миелин ЦНС содержит несколько меньшие количества другого протеолипида — DM-20, названного так по его молекулярной массе (20 кДа). И анализ ДНК, и выяснение первичной структуры показали, что DM-20 образуется в результате отщепления 35 аминокислотных остатков от белка PLP. В процессе развития DM-20 появляется рань- ше, чем PLP (в некоторых случаях даже до появления миелина); пред- полагают, что в дополнение к структурной роли в образовании миели- на он может участвовать в дифференцировке олигодендроцитов. Вопреки представлениям о том, что PLP необходим для формиро- вания компактного мультиламеллярного миелина, процесс образова- ния миелина у мышей, «нокаутированных» по PLP/DM-20, происхо- дит лишь с незначительными отклонениями. Однако у таких мышей уменьшена продолжительность жизни и нарушена общая подвиж- ность. Напротив, естественно происходящие мутации в PLP, в том числе его повышенная экспрессия (normal PLP over-expression), име- ют серьезные функциональные последствия. Следует отметить, что существенные количества белков PLP и DM-20 представлены в ЦНС, матричная РНК для PLP есть и в ПНС, и небольшое количество белка там синтезируется, но не включается в миелин. Катионный белок миелина (МВР) привлекает внимание исследо- вателей вследствие его антигенной природы — при введении живот- ным он вызывает аутоиммунную реакцию, так называемый экспери- ментальный аллергический энцефаломиелит, который представляет собой модель тяжелого нейродегенеративного заболевания — рассеян- ного склероза. Аминокислотная последовательность МВР у многих организмов высоко консервативна. МВР расположен на цитоплазматической сто- роне миелиновых мембран. Он имеет молекулярную массу 18,5 кДа и лишен признаков третичной структуры. Этот основный белок обна- руживает микрогетерогенность при электрофорезе в щелочных усло- виях.
4G Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Большинство исследованных млекопитающих содержали различ- ные количества изоформ МБР, имеющих существенную общую часть аминокислотной последовательности. Молекулярная масса МБР мы- шей и крыс — 14 кДа. МБР с малой молекулярной массой имеет та- кие же аминокислотные последовательности на N- и С-терминальных частях молекулы, как и остальной МБР, но отличается редукцией око- ло 40 аминокислотных остатков. Соотношение этих основных белков изменяется в процессе развития: зрелые крысы и мыши имеют боль- ше МБР с молекулярной массой 14кДа, чем МБР с молекулярной массой 18 кДа. Две другие изоформы МБР, также обнаруживаемые во многих организмах, имеют молекулярную массу 21,5 и 17 кДа, соот- ветственно. Они образованы присоединением к основной структуре полипептидной последовательности массой около 3 кДа. При электрофоретическом разделении белков миелина выявляют- ся белки с более высокой молекулярной массой. Их количество зави- сит от вида организма. Например, мышь и крыса могут содержать та- ких белков до 30% от общего количества. Содержание этих белков также изменяется в зависимости от возраста животного: чем оно мо- ложе, тем меньше в его мозге миелина, но тем больше в нем белков с более высокой молекулярной массой. Фермент 2\ 3'-циклический нуклеотид 3'-фосфодиэстераза (CNP) составляет несколько процентов от общего содержания миелинового белка в клетках ЦНС. Это гораздо больше, чем в других типах клеток. Белок CNP — не главный компонент компактного миелина, он скон- центрирован лишь в определенных участках миелиновой оболочки, связанной с цитоплазмой олигодендроцита. Белок локализован в ци- топлазме, но часть его связана с цитоскелетом мембраны — F-акти- ном и тубулином. Биологическая функция CNP может заключаться в регулировании структуры цитоскелета для ускорения процессов роста и дифференциации в олигодендроцитах. Миелинассоциированный гликопротеин (MAG) — минорный в количественном отношении компонент очищенного миелина, имеет мо- лекулярную массу 100 кДа (см. рис. 1.13), содержится в ЦНС в неболь- шом количестве (менее 1 % от общего белка). MAG имеет единствен- ный трансмембранный домен, который отделяет сильногликозилиро- ванную внеклеточную часть молекулы, составленную из пяти подобных иммуноглобулину доменов, от внутриклеточного домена. Его полная структура подобна белку адгезии нейрональной клетки (NCAM). MAG не присутствует в компактном, мультиламеллярном миелине, но находится в периаксональных мембранах олигодендроцитов, обра- зующих слои миелина. Напомним, что периаксональная мембрана
1.2. Особенности липидного и белкового состава нервной ткани 4? олигодендроцита — наиболее близко расположена к плазматической мембране аксона, но тем не менее эти две мембраны не сливаются, а разделены экстраклеточной щелью. Подобная особенность локализа- ции MAG, а также то, что этот белок относится к иммуноглобулиново- му суперсемейству, подтверждает участие его в процессах адгезии и передачи информации (сигналинга) между аксолеммой и миелинобра- зующими олигодендроцитами в процессе миелинизации. Кроме того, MAG — один из компонентов белого вещества ЦНС, который инги- бирует рост нейритов в культуре ткани. Из других гликопротеинов белого вещества и миелина следует отме- тить минорный миелинолигодендроцитарный гликопротеин (Myelin- oligodendrocytic glycoprotein, MOG). MOG является трансмембранным белком, содержащим единственный иммуноглобулинподобный домен. В отличие от MAG, который расположен во внутренних слоях миелина, MOG локализован в его поверхностных слоях, в силу чего может уча- ствовать в передаче внеклеточной информации к олигодендроциту. Малые количества характерных белков мембран могут быть иден- тифицированы в результате электрофореза на полиакриламидном ге- ле (ПААГ) (например, тубулин). Электрофорез высокого разрешения демонстрирует наличие других незначительных полос белка; они могут быть связаны с присутствием ряда ферментов миелиновой оболочки. Белки миелина ПНС. Миелин ПНС содержит как некоторые уни- кальные белки, так и несколько общих с белками миелина ЦНС белков. Ро — главный белок миелина ПНС, имеет молекулярную массу 30 кДа, составляет более половины белков миелина ПНС. Интересно отметить, что хотя он отличается от PLP по аминокислотной последо- вательности, путям посттрансляционной модификации и структуре, тем не менее оба эти белка имеют одинаково важное значение для формирования структуры миелина ЦНС и ПНС. Содержание МБР в миелине ПНС составляет 5—18% от общего количества белка, в отличие от ЦНС, где его доля достигает трети все- го белка. Те же четыре формы белка МБР с молекулярными массами 21, 18,5, 17 и 14кДа, соответственно, обнаруженные в миелине ЦНС, присутствуют и в ПНС. У взрослых грызунов МБР с молеку- лярной массой 14 кДа (по классификации периферийных миелиновых белков ему присвоено название «Рг») является самым значительным компонентом всех катионных белков. В миелине ПНС присутствует и МБР с молекулярной массой 18 кДа (в этом случае он носит название «белок Р1»). Следует отметить, что важность семейства белков МВР не так велика для миелиновой структуры ПНС, как для ЦНС.
43 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Гликопротеины миелина ПНС. Компактный миелин ПНС со- держит гликопротеин с молекулярной массой 22 кДа, названный пе- риферийным миелиновым белком 22 (РМР-22), доля которого со- ставляет менее 5% от общего содержания белков. РМР-22 имеет че- тыре трансмембранных домена и один гликозилированный домен. Этот белок не играет значительной структурной роли. Однако анома- лии гена ртр-22 ответственны за некоторые наследственные невро- патологии человека. Несколько десятилетий назад считалось, что миелин создает инерт- ную оболочку, которая не выполняет никаких биохимических функций. Однако позже в миелине было обнаружено большое количество фермен- тов, вовлекаемых в синтез и метаболизм компонентов миелина. Ряд фер- ментов, присутствующих в миелине, включается в метаболизм фосфо- инозитидов: фосфатидилинозитолкиназа, дифосфатидилинозитолкиназа, соответствующие фосфатазы и диглицеридкиназы. Эти ферменты пред- ставляют интерес вследствие высокой концентрации в миелине поли- фосфоинозитидов и их быстрого обмена. Есть свидетельства присутствия в миелине мускариновых холинергических рецепторов, G-белков, фос- фолипаз С и D, протеинкиназы С. В миелине ПНС обнаружена Na/K-АТФаза, осуществляющая транс- порт одновалентных катионов, а также 5'-нуклеотидаза. Наличие этих ферментов позволяет предположить, что миелин может принимать активное участие в аксональном транспорте. 1.2.4. Белки нервной ткани Многие белки нейронов и глиальных клеток близки или полно- стью идентичны белкам из других органов и тканей человека и живот- ных в силу общности базовых процессов жизнедеятельности. Тем не менее к настоящему времени выделена и идентифицирована довольно многочисленная группа нейроспецифических белков, которые экс- прессируются исключительно (или преимущественно) в клетках нерв- ной ткани и участвуют в выполнении функций, присущих только этой ткани. Многие из таких белков представляют собой глико- или липо- протеиды. Они участвуют в формировании рецепторных структур, в процессах адгезии клеток при формировании нейронных ансамблей, в перестройке межклеточных контактов в ходе онтогенеза, в работе синаптического аппарата, в формировании долговременной памяти и в других процессах. Необходимо, однако, подчеркнуть, что поскольку нервная система функционирует как единое целое, то невозможно в ряде случаев рас-
1.2. Особенности липидного и белкового состава Hei вной ткани сматривать нейроспецифические белки отдельно от белков, присутст- вующих в любой другой ткани. Специфичность белков нервной ткани определяется по нескольким критериям: 1) наличие белка исключительно или преимущественно в тканях нервной системы, причем во втором случае количество белка в нерв- ных клетках должно существенно превышать содержание его в других тканях организма; 2) изучаемый белок должен участвовать в реализации специфиче- ских функций нервной ткани (например, в процессах генерации и про- ведения нервных импульсов, в работе синаптического аппарата, в ме- ханизмах обучения и формирования долгосрочной памяти и др.); 3) наличие тесной корреляции между биологической активностью белка и функциональным состоянием нервной системы. Существование нейроспецифических белков обусловлено особен- ностями экспрессии генов в мозге. Известно, что в нервной ткани ак- тивно работают до 8—10% генов, что заметно выше, чем в других тканях организма, где обычно функционирует не более 2—4% генов. Именно разнообразие экспрессируемых уникальных генов определяет синтез множества нейроспецифических белков. Установлено, что в большинстве нервных клеток очень велико со- держание РНК. Средняя величина соотношения РНК/ДНКв мозге мо- жет достигать 50 и лишь в редких популяциях клеток она составляет всего 3. Для сравнения напомним, что в клетках таких активно метабо- лирующих органов, как печень, почки, поджелудочная железа, соотно- шение РНК/ДНК составляет в среднем 2,0—4,5. Высокие значения соотношения РНК/ДНК обеспечиваются главным образом за счет большой концентрации рРНК, что указывает на наличие в мозге мощ- ного, активно работающего рибосомального аппарата синтеза белка. Огромное качественное разнообразие белков клеток нервной ткани определяется многообразием мРНК. Несмотря на то что количество мРНК составляет менее 5% от общей массы РНК клетки, в разных ней- ронах (группах нейронов) или глиальных клетках могут экспрессировать- ся различные гены, поэтому так велико число вариантов мРНК в мозге. Использование методов молекулярного клонирования позволи- ло разделить всю совокупность синтезирующихся в мозге мРНКна четыре группы. Первая группа мРНК (около 18%) экспрессируется во всех тканях с одинаковой интенсив- ностью; вторая группа (около 26%) также экспрессируется во всех тканях, но в разной степени. По-видимому, эти две группы мРНК обеспечивают синтез общих для всех тканей белков, участвую-
50 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ щих в основных процессах жизнедеятельности организма. Третья группа мРНК (около 30%) представляет собой нейроспецифичные мРНК, не обнаруженные в других тканях. К четвертой группе (около 26%) относятся особые нейроспецифичные мРНК, количество которых в целом мозге крайне мало и которые обнаруживаются лишь с помощью высокочувствительных специальных методических прие- мов в отдельных структурных образованиях или даже в отдельных не- больших популяциях нейронов. Таким образом, более половины син- тезируемых в мозге мРНК являются нейроспецифичными, обеспечивающими своеобразие белкового спектра данной ткани. Определенный вклад в создание разнообразия нейроспецифичных белков вносит альтернативный процессинг пре-мРНК, т. е. образова- ние нескольких вариантов зрелых мРНК из одного первичного транс- крипта в ходе альтернативного сплайсинга (соединение разных комби- наций экзонов) или альтернативного З'-процессинга (использование разных сигналов полиаденилирования). Наглядным примером роли альтернативного сплайсинга служит образование целого семейства метаботропных рецепторов глутамата (mGluR). К настоящему време- ни описано восемь подклассов этих рецепторов и для mGluR 1, mGluR4, mGluR5 и mGluR7 установлено наличие вариантов, образо- вавшихся в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Эти варианты рецепторов различаются относительно короткими участка- ми (38 аминокислотных остатков), которые предшествуют четвертому трансмембранному домену и представляют собой петлю белковой це- пи рецептора, находящуюся в цитоплазме. Существование альтерна- тивных вариантов каждого из подклассов метаботропных рецепторов глутамата имеет значение с функциональной точки зрения, поскольку они обладают разными кинетическими свойствами, разной чувстви- тельностью к фармакологическим агонистам и антагонистам и лока- лизованы в разных структурах ЦНС. Другими примерами, подтверждающими значимость процесса аль- тернативного сплайсинга для функционирования различных структур нервной системы, могут быть четыре формы тирозингидроксилазы, обнаруженные в ЦНС человека; три формы ацетилхолинэстеразы в электрическом органе ската и др. К настоящему времени с помощью различных биохимических и мо- лекулярно-биологических методов выявлено более 200 нейроспеци- фичных белков. К сожалению, информация о многих из них сводится пока лишь к сообщениям о выделении и описаниям ряда их физико- химических и антигенных свойств; данные же об участии этих белков
П I 1.3. Современные представления об организации нейрональной мембраны 5: 1.3. в той или иной специфической функции в мозге весьма скудные и про- тиворечивые. Описание всех известных нейроспецифичных белков не входит в на- ши задачи; некоторые белки будут охарактеризованы в соответствую- щих разделах, где рассматриваются те или иные функции нервной ткани (в частности, выше были рассмотрены специфичные белки, входящие в состав миёлина центральной и периферической нервной системы). СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ ОРГАНИЗАЦИИ НЕЙРОНАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ Не вызывает сомнений тот факт, что основные принципы струк- турной организации всех мембран животных клеток по сути одинако- вы. Любая клетка имеет наружную мембрану — ее называют плаз- матической. Она играет роль преграды, отделяющей живое содер- жимое клетки от ее окружения. Но плазматическая мембрана — не просто клеточная оболочка. Она регулирует поступление молекул и ионов в клетку и выход их наружу. Кроме того, в состав плазматиче- ской мембраны входят различные ферменты, природа которых зависит от особенностей данной клетки. Плазматическая мембрана содержит специализированные компоненты, участвующие в межклеточных кон- тактах и взаимодействиях, в гормональном ответе и системах транс- порта через мембрану как малых, так и больших молекул. Вся сложнейшая деятельность нервной ткани опосредуется мемб- ранами. В клетках нервной системы представлено несколько типов высокоспециализированных мембран: сома- тические мембраны мульти- и униполярных нейронов, мембраны денд- ритов, аксонного холмика, миелинизированных и немиелинизированных аксонов, по которым распространяется потенциал действия, мембраны рыхлого и компактного миелина, мембраны синаптических пузырьков, пре- и постсинаптические мембраны, мембраны клеток макро- и мик- роглии. Возбудимость этих мембран колеблется в широких пределах от высоковозбудимых (синаптические, мембраны аксонного холмика) до относительно устойчивых мультимембранных структур миелина. Мембраны нейронов, как и мембраны клеток других тканей, состо- ят из организованных в бислой липидов и встроенных в липиды белко- о вых молекул. Толщина бислоя составляет 50—60 А (ангстрем). В состав биологических мембран входят вещества трех классов, обмен которых составляет основу метаболизма: белки, липиды и угле- воды. Белки составляют 40—60%, остальное приходится на долю ли-
52 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ пидов. Основная масса углеводов является компонентом сложных ли- пидов (гликолипидов) или сложных белков (гликопротеидов). Белко- вый состав мембран чрезвычайно разнообразен, он в значительной мере определяет свойства мембран и их функциональную активность. Для мембран нервной ткани характерно наибольшее структурное разнообразие липидов по сравнению с мембранами других орга- нов. Это существенно отличает нервную ткань от других органов и тканей (см. гл. 1.2). Именно специфические липиды в значительной мере определяют сложность и своеобразие мембран и надмолекуляр- ных образований (таких, как миелин) в нервной системе (см. гл. 1.3). Для нервной ткани характерно наличие таких липидов, как ганглиози- ды, галактоцереброзиды, полифосфоинозитиды, отсутствующих в дру- гих тканях, либо обнаруживающихся в них в незначительных количе- ствах. Эти липиды определяют функциональные особенности и струк- туру гликокаликса нейронов (см. гл. 1.7). Другой компонент мембран нейронов — углеводы — обнару- живается в составе мембран лишь в соединении с белками (гликопро- теинами и протеогликанами) и липидами (гликолипидами). В мембра- нах гликозилировано около 10% всех белков и от 5 до 26% липидов (в зависимости от объекта). В числе углеводных компонентов глюко- за, галактоза, их амины, нейраминовая кислота, фукоза и манноза. Углеводные компоненты мембранных структур в подавляющем большинстве ориентированы во внеклеточную среду. Их функции свя- заны с контролем за межклеточными взаимодействиями, поддержани- ем иммунного статуса клетки, обеспечением стабильности белковых молекул в мембране. Очень важна роль углеводного компонента белковых молекул в формировании специфических функций мембранных белков и липи- дов. Многие белковые молекулы, особенно биологически активные вещества (например, нейропептиды), синтезируются в виде крупных, неактивных предшественников, которые затем расщепляются специ- фическими протеазами с формированием «зрелых» биологически ак- тивных продуктов. Деятельность протеаз контролируется уровнем гликозилирования белков. Так, многие белки, синтезируемые вначале как гликопротеины, в дальнейшем в результате процессинга теряют олигосахаридную часть. Биологические мембраны играют значительную роль в осуществ- лении почти всех биологических функций клетки. Их молекулярная организация обеспечивает инфраструктурную основу для всех специ- альных функций, осуществляемых в клеточной мембране.
1.3. Современные представления об организации нейрональной мембраны 53 Несмотря на многообразие различных типов клеток, их мембраны выполняют общие биологические функции. Прежде все- го, они отграничивают живое содержимое от внешней среды, а внутри клетки организуют компартменты с различными свойствами. С их помощью происходит отделение содержимого ком- партментов от цитоплазмы. В каждом компартменте мембраны обес- печивают сохранение специфических физико-химических условий. Поэтому по разные стороны мембраны такие условия среды, как кис- лотность, концентрация растворенных веществ, электрический потен- циал, как правило, неодинаковы. Для нервной ткани характерна от- четливо выраженная компартментализация метаболизма — как в разных отделах мозга, так и в различных субклеточных структурах нейрона или в элементах системы нейрон—нейроглия. Наиболее от- четливо это продемонстрировано на примере метаболизма аминокис- лот и реакций энергетического обмена — существование цитоплаз- матического и митохондриального метаболических компартментов, отличающихся субстратами окисления, скоростью и направлением протекания отдельных реакций (см. гл. 3.2). Важным примером ком- партментализации метаболических процессов служат специфические биохимические реакции, протекающие в синаптических окончаниях и определяющие функционирование синапсов. Мембраны не только разделяют клетку на отдельные компартмен- ты, но и участвуют в формировании метаболичес- ких сигналов, которые передаются через мембрану в клетки. Это может осуществляться в виде физического переноса ионов или молекул через мембрану или при помощи конформационных измене- ний, индуцируемых в мембранных компонентах. Таким образом мемб- раны «контролируют» проникновение в клетку и выход из нее метабо- литов. Благодаря рецепторам они реагируют на внешние сигналы и подвергают их трансформации (т. е. способны классифицировать и избирательно модулировать сигналы — усиливать важные и снижать до уровня шумов второстепенные), вычленяя и передавая внутрь клет- ки существенную информацию. Мембраны способны обеспечивать образование и поддержание разности потенциалов, а также транс- портировать мембранный потенциал вдоль по мембранным индукто- рам, давая возможность использовать этот специфический вид энер- гии в разных частях клетки. С мембранами связано функционирование многих клеточных ферментов. Мембраны оказывают большое влияние на процессы, протекающие внутри клетки, изменяя их актив-
54 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ ность. Некоторые ферменты активны только тогда, когда они при- креплены к мембране; другие, наоборот, в этом состоянии не проявля- ют активности и начинают действовать лишь после отъединения и пере- хода в цитоплазму. Поэтому важным свойством мембран является способность создавать специальные условия для протекания реакций, осуществляемых гидрофобными белками. Одновременно мембранные липиды регулируют взаимодействие белков, погруженных в толшу мемб- ран. Некоторые ферменты образуют своеобразные мембранные ансамб- ли, осуществляющие цепь последовательных превращений именно бла- годаря тому, что их компоненты объединены общностью локализации, организованы мембраной. Благодаря этому обстоятельству повышается суммарная эффективность каталитического процесса. Существуют фер- менты, которые, действуя на мембраносвязанные субстраты, тем самым участвуют в биогенезе мембран. При том или ином участии мембран осуществляется большинство жизненно важных функций организма, например репликация прока- риотической ДНК, биосинтез белков и их секреция, биоэнергетиче- ские превращения, а также функционирование систем гормонального ответа. Важная функция мембран связана с координацией множества химических реакций, протекающих в клетке: в мембранах различные ферменты объединяются в единый конвейер, в котором каждый фер- мент действует в строгом соответствии с остальными. Мембраны участвуют во взаимодействии клеток со средой. Это свойство лежит в основе обеспечения специфи- ки межклеточных контактов, адгезии нейрональных клеток и т. д. (см. гл. 1.7). Большинство мембран кроме общих выполняют и специаль- ные функции. Для того чтобы организм мог функционировать как единое целое, между его клетками должна осуществляться взаимо- связь — перенос разнообразных химических веществ и информации. В передаче информации участвуют, например, гормоны, доставляе- мые к клеткам кровью. В нервной системе передача информации осу- ществляется прежде всего с помощью нервных импульсов. Мембраны нервных клеток генерируют электрический потенциал. Способность вырабатывать электрические сигналы — важнейшее функциональное свойство нервных клеток, определяемое своеобрази- ем молекулярной организации наружной мембраны нейрона, в кото- рую встроены специфические белковые комплексы — так называе- мые ионные каналы и ионные насосы. Особую роль в связи с этим играет специфика строения нейрональных мембран (в том числе ми- елина), способных к генерации и распространению электрического
1.3. Современные представления об организации нейрональной мембраны 55 импульса. Распространение по нерву импульса — процесс, ограни- ченный плазматической мембраной, определяемый также специфи- ческими изменениями мембранной структуры, скоординированными во времени и в пространстве. Некоторые клетки, например палочки сетчатки глаза, имеют высо- коспециализированные мембраны, позволяющие выполнять уникаль- ные функции преобразования энергии света в нервный импульс. Сен- сорная система обеспечивает восприятие действующих на организм раз- дражителей, преобразование их сигналов в нервный импульс, передача которого по нервным путям в подкорковые и корковые центры ЦНС обеспечивает анализ поступившей информации (см. гл. 3.7). В передаче информации и формировании ответной реакции ЦНС принимают учас- тие контактные зоны между нервными клетками — синапсы. Мембраны синаптических структур обеспечивают осуществление межнейрональных и периферических связей, а также анализ, отбор и модуляцию сигнала с помощью химических и электрических механиз- мов. На одном нейроне может быть от нескольких десятков до несколь- ких тысяч синапсов. Именно благодаря синаптическим образованиям происходит формирование временных и стабильных функциональных ансамблей нейронов, осуществляются межнейронные, нейромышеч- ные и нейросекреторные контакты. Относительно немного известно о механизмах формирования си- напсов в ЦНС. В течение всей жизни организма синапсы непрерывно развиваются как структурно, так и функционально. Постоянное раз- витие синапсов является важным условием обучения и формирования памяти в нормальном мозге. Утрата нейроном такой способности яв- ляется первопричиной различных нейродегенеративных и психологи- ческих расстройств. Для изучения функций мембран было предложено много моделей молекулярной организации этой структуры. Среди них — динамиче- ская жидкостно-мозаичная модель С. Сингера и Дж. Никольсона, существенно усовершенствованная после ее первого описания в 1974 г. и ставшая ныне широко признанной моделью, применимой к большин- ству биологических мембран. В рамках данной модели мембрана представляет собой фосфоли- пидный бислой, в который погружены свободно диффундирующие бел- ки (рис. 1.14). Созданию этой модели способствовало развитие совре- менных подходов к изучению свойств мембранных белков, динамиче- ских свойств мембран и их взаимосвязи с мембранными функциями. Согласно жидкостно-мозаичной модели, клеточная мембрана со- стоит, в основном, из молекул фосфолипидов, организованных в би-
56 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАнИ Рис. 1.14. Жидкостно-мозаичная модель строения биологических мембран слой с включенными в его структуру нелипидными соединениями, представленными интегральными и поверхностными белками. Фосфо- липиды с их ионными и полярными головками находятся в прямом контакте с водной фазой на внешней и внутренней поверхности двой- ного слоя, минимизируя таким образом взаимодействия гидрофобных компартментов мембраны с молекулами воды из внешней среды, в то время как неполярные насыщенные и ненасыщенные жирнокислот- ные цепочки оказываются внутри мембранного двойного слоя, форми- руя гидрофобную среду. Пустоты между ними заполнены липидами, главный компонент которых — холестерин. Жидкостно-мозаичная модель Сингера и Никольсона предполага- ет существование в мембранах липидных кластеров с различными свойствами. Такие кластеры являются необходимой частью клеточно- го механизма перемещения липидов и связанных с липидами белков внутри клетки. Считается, что липидные кластеры важны для осу- ществления различных физиологических функций мембран, в част- ности для обеспечения быстрого перемещения липидных молекул в латеральном направлении. Липидные кластеры представляют собой динамичные (короткоживущие) ансамбли — время их жизни измеря- ется периодами длительностью около 10-7 с. В плазматической мембране образуются и более устойчивые ассо- циаты, время жизни которых сопоставимо с молекулярной активно- стью ферментов. Эти ассоциаты состоят из холестерина, фосфатидил- серина и сфинголипидов, которые в бислойной мембране объединены между собой гидрофобными взаимодействиями более тесно, чем окру- жающие их молекулы. Они получили название липидных рафтов (плавучих островов). Такие рафты могут существовать в окружающем их мембранном бислое достаточно длительное время в виде «движущихся платформ»,
1.3. Современные представления об организации нейрональной мембраны в которых концентрируются специфические белки. Липидный бислой в рафтах более асимметричен, чем в других частях бислоя, при этом его наружный слой обогащен сфинголипидами и гликосфинголипида- ми, а внутренний — фосфатидилсерином и глицерофосфолипидами. Сфинголипиды ассоциированы друг с другом в латеральном направле- нии межзарядными взаимодействиями полярных голов, а с липидным бислоем связаны насыщенными жирнокислотными цепями. Все пус- тоты между ассоциатами сфинголипидных, глицеролипидных и фос- фолипидных групп и их жирнокислотными цепями заполнены молеку- лами холестерина. Внедрение холестерина «уплотняет» жирнокислот- ные цепи липидов. Таким образом, при формировании липидных рафтов холестерин служит своеобразным «наполнителем». Синтез сфинголипидов и модификация их головок завершается, в основном, в аппарате Гольджи. Холестерин синтезируется в эндоплаз- матическом ретикулуме. Ассоциация холестерина с молекулами сфин- голипидов происходит в аппарате Гольджи, откуда эти ассоциаты транспортируются в плазматическую мембрану. Передвижение таких ассоциатов к поверхности плазматической мембраны позволяет увели- чить содержание в ней холестерина; встраивание доставленных компо- нентов в плазматическую мембрану происходит в процессе эндоцитоза. Мембранные рафты — относительно небольшие, весьма подвиж- ные и довольно нестабильные структуры. Их размер и состав непостоян- ны. Подвижность позволяет мембранным рафтам облегчать перенос специфических белков от аппарата Гольджи (/rans-Golgi network — TGN) к поверхности клетки, а также вдоль плазматической мембраны или от плазматической мембраны к внутренним мембранам клетки. Раф- о ты имеют размеры около 5 А. Индивидуальные рафты в ответ на специ- фическое физиологическое воздействие могут сливаться с образованием больших структур. Объединение рафтов индуцируется церамидом. Распределение липидных рафтов в клеточных мембранах зависит от типа клеток. Поскольку почти 25% общего количества холестери- на, присутствующего в организме человека, локализовано в мозге, и его большая часть сосредоточена в миелине, то участие холестерина в формировании липидных рафтов очень велико. В нейронах липидные рафты чаще образуются в сомальных и аксональных мембранах, чем в соматодендритах. Липидные рафты обнаружены также в постсинапти- ческих участках нейронов. В плазматической мембране рафты служат для прикрепления спе- цифических белков, вовлекаемых во многие процессы, такие как пе- редача сигнала (signal transduction), эндоцитоз, рецепция болезне-
58 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ творных микроорганизмов и адгезия клеток. Рафты заякоривают гло- булярные интегральные белки на внешней и на внутренней стороне бислоя. Рафты включаются в процесс передачи сигнала через такие рецепторы, как рецептор эпидермального фактора роста, инсулино- вый рецептор. В их действие вовлекаются тирозинкиназы, G-белки, Ras, аденилатциклаза, изоферменты протеинкиназы С и др. Рафты являются местами связывания многих внеклеточных лигандов. Обнаружение мембранных рафтов, установление их свойств и функций потребовало очередной модификации жидкостно-мозаичной модели мембраны, и этот процесс будет продолжаться по мере совер- шенствования наших знаний. Клеточная мембрана в современном представлении все более отличается по своим свойствам от «класси- ческого» липидного бислоя. Тем не менее жидкостно-мозаичная мо- дель со всеми ее модификациями служит концептуальной основой для объяснения многих мембранных феноменов. Сложность создания еди- ной модели биологических мембран связана с огромным разнообрази- ем их функций. СВОЙСТВА ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ 1.4.1. Фосфолипиды как структурная основа бислоя Мембранные липиды построены по единому плану, их стерео- конфигурация имеет общие черты. По этой причине, оказавшись в вод- ном растворе, фосфолипиды ведут себя сходным образом: проявляют стремление создать ансамбли из множества молекул. Тем не менее ли- пиды плохо растворяются как в полярном растворителе — воде (меша- ют неполярные «хвосты»), так и в неполярной среде — масле (меша- ют полярные «головки»). Самое энергетически выгодное для них расположение — мономолекулярный слой на поверхности раздела между водой и маслом, в этом случае их «хвосты» погружены в масло. Для того чтобы подчеркнуть различное отношение к воде и к маслу, полярные «головки» называют гидрофильными, а «хвосты» — ли- пофильными. Соответственно, липиды, молекулы которых содержат как гидрофильную, так и липофильную группировки, относят к амфи- фильным соединениям. Строение липидных агрегатов в воде может быть чрезвычайно раз- нообразным. Оно зависит не только от природы самого липида, но и от его концентрации, температуры и присутствия других веществ. Боль- шинство липидов плохо растворимы в водной фазе! Лишь при очень
I? I 1.4. Свойства липидного бислоя 51 П. Квин Известный исследователь структурно-функциональных свойств мембранных липи- дов, один из первых ученых, определивших функциональ- ную роль олигомерной орга- низации мембранных белков (Великобритания) большом разбавлении липиды находятся в воде в виде отдельных молекул. Даже при незначительном повышении концент- рации липида его молекулы объединяют- ся в замкнутые агрегаты, так называемые мицеллы. Концентрацию, при которой происходит это объединение, называют критической концентрацией мицелло- образования (ККМ). Для большинства мембранных липидов она составляет ве- личину, меньшую 1 %. При увеличении концентрации липида в воде и/или понижении температуры среды количество мицелл растет. В раз- бавленных водных растворах липиды об- разуют преимущественно шарообразные мицеллы — микроскопические капельки, у которых полярные «головки» обраще- ны наружу, а неполярные «хвосты» — внутрь. В масле происходит аналогичный процесс, но в данном случае мицеллы оказываются «вывернутыми наизнанку». При увеличении концентра- ции липидов в воде происходит дальнейшее изменение структуры липидных ансамблей. При относительно малом содержании воды фосфолипиды способ- ны образовывать несколько типов жидкокристаллических структур: ламеллярную (слоистую) структуру, состоящую из чередующихся липидных бимолекулярных слоев, прослоенных водными промежутка- ми, а также цилиндрические структуры, окруженные водной фазой. Одна структура может переходить в другую при изменении концентра- ции воды и/или ее температуры. Часто липиды одновременно образу- ют агрегаты различных типов, которые могут переходить друг в друга. Такое поведение называют мезоморфизмом. Если переход одних аг- регатов в другие зависит от содержания воды, говорят о лиотропном мезоморфизме. Когда он осуществляется под влиянием изменения тем- пературы — о термотропном мезоморфизме. Такие фазовые перехо- ды возможны и в биологических мембранах, они играют большую роль в жизни клеток. Если концентрация липидов в воде высока, то мицеллы сливаются и образуют плоские бимолекулярные слои, являющиеся аналогами структуры мембранного липидного бислоя.
60 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Наличие у молекул липидов двух частей — полярной «головки» и неполярных «хвостов» — имеет прямое отношение к их способности самопроизвольно образовывать мембраны — из таких молекул проис- ходит спонтанная самосборка мембранного бислоя. В бислойных струк- турах полярные «головки» липидов обращены к воде, а гидрофобные «хвосты» ориентированы внутрь бислоя. Как искусственные, так и ес- тественные мембраны замкнуты сами на себя, образуя полые вакуоли, пузырьки, везикулы, замкнутые мешочки или трубчатые образования. Природные фосфолипиды — выраженные амфифилы. Величина ККМ для них очень мала. Другими словами, уже при низких концентрациях и комнатной температуре они образуют упорядоченные мицеллы, сли- вающиеся при повышении концентрации фосфолипида в однослойные или многослойные агрегаты, которые называют липосомами. Бислойная структура стабилизируется гидрофобными взаимодейст- виями в области ацильных цепей и полярными взаимодействиями на границе раздела водной и липидной фаз. В основе полярных взаимо- действий действуют ионные, диполь-дипольные, водородные и вандер- ваальсовы связи. Все они являются слабыми. Важная роль слабых взаимодействий в стабилизации бислоя объясняется их высокой плот- ностью. Не менее важна роль и гидрофобных взаимодействий. Так как неполярным «хвостам» липидов термодинамически невыгодно взаимо- действовать с упорядоченной структурой воды, стабилизированной во- дородными связями, липиды стремятся избежать взаимодействия с во- дой и объединяются в агрегаты. Такое «притяжение» между молекула- ми, вызываемое присутствием молекул воды, называют гидрофобным взаимодействием. Гидрофобные силы определяют как способность аполярных групп к тесному контакту в водных средах, которая обеспе- чивает вытеснение воды из образуемых агрегатов. В попытках отождествления свойств искусственных липидных агре- гатов со свойствами живых клеток необходимо учитывать влияние со- лей на липидные агрегаты. Липидная мицелла с суммарным отрица- тельным зарядом будет не безразлична к солевому составу окружаю- щей ее среды. На поверхности раздела между водой и липидом создается разность потенциалов. Если к водной среде добавить хлорис- тый натрий, то положительно заряженные ионы натрия (Na+) будут связываться с поверхностью мембраны, а отрицательно заряженные ионы хлора (С1“) — отталкиваться в водную фазу. Обычно примемб- ранную область разделяют на две части — ближайшую к поверхности липида, в которой ионы натрия стабилизированы (в ней концентрация ионов выше — сольватация), и внешнюю, диффузную часть, в которой ионы передвигаются более свободно.
1 I 1.4. свойства липидного оислоя С Как известно, в воде присутствуют (в небольшом количестве) по- ложительно заряженные ионы водорода и отрицательно заряженные гидроксильные группы. Ионы водорода притягиваются отрицательно заряженной поверхностью мицеллы, а гидроксильные группы оттал- киваются в водную фазу Поэтому величина кислотности среды вблизи поверхности мицелл отличается от уровня кислотности водного рас- твора. И по’ своим физическим свойствам вода вблизи поверхности мицеллы заметно отличается от обыкновенной воды (например, она не замерзает при О °C). Таким образом, у поверхности липидов в воде существенно изменяются концентрация солей, физические свойства и уровень кислотности. Форма и размеры образуемых липидных ассо- циатов зависят от многих факторов: от длины ациль- ных цепей фосфолипидов; от жирнокислотного состава фосфолипи- дов; от степени ненасыщенности ацильных цепей фосфолипидов; от структуры полярной части молекулы. Рассмотрим перечисленные факторы подробнее. Упаковка жирно- кислотных цепей в мицеллах зависит от длины углеводородной цепи. При малых значениях п (до 16) количество молекул, необходимое для формирования мицеллы, таково, что в ее объеме жирнокислотные це- пи располагаются достаточно свободно. Структурную стабильность таких мицелл поддерживают полярные связи. При возрастании длины жирнокислотной цепи плотность упаковки в мицеллах увеличивает- ся быстрее, чем их размер, и внутреннее содержимое мицелл стано- вится более компактным благодаря усилению связей между гидрофоб- ными цепями. Гидрофобные взаимодействия зависят от степени кон- такта между ацильными цепями — эффективность этих взаимодей- ствий обратно пропорциональна подвижности цепей. Один из важных факторов, регулирующих подвижность, — наличие в цепи двойных связей. Подавляющее большинство природных жирных кислот содержит четное количество атомов углерода. Ранее это связывали с удобства- ми превращения данных соединений в процессе окисления, поскольку при этом образуются двууглеродные фрагменты ацетил-КоА. Позже было замечено, что жирные кислоты с нечетным числом атомов угле- рода в цепи также подвергаются окислительным превращениям (с об- разованием трехуглеродного малонил-КоА на завершающей стадии окислительного процесса). В то же время обращает на себя внимание разная стабильность мицелл, образуемых жирными кислотами с чет- ным и нечетным числом атомов углерода. Об этом свидетельствует и величина энергии, которую необходимо сообщить структуре для пере-
62 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Таблица 1.11. Зависимость температуры плавления и энтальпии фазового перехода жирных кислот от длины их углеродной цепи Число атомов углерода в жирнокислотной цепи Температура плавления, °C Изменение энтальпии (Я0), ккал/моль Счз -5,4 6,8 Си 5,9 10,8 С15 10,0 8,3 ^16 18,2 12,8 С17 22,0 9,7 ^18 28,2 14,8 ^19 32,0 12,0 ^20 36,7 16,8 вода ее из кристаллического состояния в жидкое. Из таблицы 1.11 видно, что изменение энтальпии для жирных кислот с четным количе- ством атомов углерода заметно выше, следовательно, образуемые ими ассоциаты структурно стабильнее. Углеводородные цепи липидных молекул бывают двух видов: насыщенные и ненасыщенные, причем у ненасыщенных це- пей может быть одна или несколько двойных связей. Если мономолекулярная пленка состоит из смеси насыщенных и нена- сыщенных фосфолипидов, то в месте расположения двойных связей упорядоченность бислоя нарушается, так как цепи не будут распола- гаться строго параллельно друг другу. Гидрофобные взаимодействия при этом ослабевают. Поэтому смеси липидов, содержащих как насы- щенные, так и ненасыщенные цепи, при одной и той же температуре являются более «жидкими», чем смеси, построенные из липидов, со- держащих только насыщенные цепи. Это свойство имеет важное значение для функции биологических мембран в живой клетке. Для того чтобы клетка могла осуществлять процессы жизнедеятельности, липиды, входящие в состав ее мембран, должны обязательно содержать разупорядоченные участки. Только при соблюдении этого условия возможны правильное функциониро- вание мембранных белков и транспорт различных веществ через
1.4. Свойства липидного бислоя мембрану. Например, было показано, что в мембранах бактерий при замене ненасыщенных липидов на насыщенные скорость транспорта веществ снижается в 20 раз. В связи с вышеизложенным становится понятным столь чуткое ре- агирование клеток на изменение температуры окружающей среды в стремлении к обеспечению мембраны разупорядоченными участками. Как только температура снижается, в бактериальных клетках проис- ходит замена насыщенных липидов в мембранах на ненасыщенные. Глубина таких изменений пропорциональна температурному сдвигу. То же самое имеет место в клетках растений. Организм человека и теплокровных животных обеспечивает достаточно «жидкое» состоя- ние клеточных мембран, поддерживая постоянную температуру тела (более высокую, чем в окружающей среде). У некоторых животных эта способность выражена весьма наглядно. Например, в ногах пинг- вина и северного оленя температура тканей падает по мере удаления от корпуса тела, соответственно мембраны клеток в них содержат по- степенно возрастающее количество ненасыщенных жирных кислот. Способность липидов к самоорганизации (самосборке) зависит не только от природы их углеводородных цепей, но и от природы и поляр- ных «головок». Они несут либо отрицательный заряд, либо одновре- менно отрицательный и положительный заряды, нейтрализующие друг друга. Последний тип липидов в большинстве клеточных мембран явля- ется преобладающим. И это не случайно. Липидам с отрицательно заря- женными «головками» трудно объединяться в агрегаты, так как между «головками» действуют электростатические силы отталкивания. В слу- чае липидных молекул, несущих два заряда, их «головки» упакованы та- ким образом, что отрицательный заряд одной молекулы ориентирован на взаимодействие с положительным зарядом соседней молекулы. Это позволяет полностью реализовать выгоду как межзарядных, так и гид- рофобных взаимодействий. 1.4.2. Трансмембранная асимметрия липидов Клеточные мембраны замкнуты, причем их внутренние и внеш- ние поверхности различаются по липидному и белковому составу. Эту особенность мембран называют трансмембранной асимметрией. Данное свойство является характерной особенностью природных кле- точных мембран, определяющей их роль в передаче сигналов в клетку. Известно несколько механизмов, обеспечива- ющих асимметричное распределение фосфолипи- дов в мембране. Один из них связан с термодинамической веро-
64 Раздел 1.: Ta-v н '.> —* ънОй ТКАНИ ятностью распределения липидов в соответствии со стерео- конфигурацией их молекул. Асимметрия в распределении липидов в бислое возникает прежде всего потому, что при замыкании мембранного бислоя липиды с более объемными полярными «голов- ками» за счет градиента кривизны мембраны стремятся остаться в на- ружном монослое, так как в нем больше площадь поверхности, прихо- дящаяся на полярную «головку». По этой причине основная часть фосфатидилхолина, сфингомиелина, полифосфоинозитидов, холесте- рина, цереброзидов и сульфатидов локализована в наружном слое, а аминофосфолипиды (фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин) на- ходятся во внутреннем слое, обращенном в цитоплазму. Это соответ- ственно приводит к различиям в заряде фосфолипидов и гидратации их полярных «головок» по обе стороны бислоя. Неодинакова и степень ненасыщенности жирнокислотных цепей в составе монослоев: во внутреннем обнаруживается 2/3 всех двойных связей в жирных кислотах липидов, а в наружном — только */3. Второй механизм поддержания асимметрии бислоя реали- зуется за счет различий в составе среды по обе его стороны в условиях нативной клетки. С внеклеточной стороны мембрану окружает среда с высоким содержанием натрия и кальция, а со стороны цитоплазмы мембрана контактирует со средой, имеющей повышенную концентрацию магния и калия. Различия ионного соста- ва вне- и внутриклеточной среды также играют роль в формировании и поддержании изгибов мембраны, т. е. «закрепляют» асимметрию бислоя. Именно этот фактор обеспечивает создание градиента кри- визны, складок, сморщиваний, облегчает отшнуровку частей биологи- ческой мембраны в виде везикул, что имеет значение для реализации межклеточных взаимодействий. Асимметрия бислоя обеспечивается также ферментами ли- пидного обмена, к которым прежде всего относятся фосфоли- пазы, ферменты обмена холестерина и метилазы фосфатидилэтанола- мина. Метилирование фосфатидилэтаноламина с превращением его в фосфатидилхолин осуществляется в два этапа и происходит в раз- ных слоях липидного матрикса. Образование монометилфосфатидил- этаноламина под влиянием метилтрансферазы I осуществляется во внутреннем слое*, где и локализован фермент. Монометилфосфатидил- этаноламин переходит из внутреннего слоя во внешний, там под дей- ствием метилтрансферазы II завершается его превращение в фосфа- тидилхолин. Этот транслокационный процесс меняет «жидкостность» мембра- ны и рассматривается как фактор, стимулирующий важные процессы
1.4. Свойства липидного бислоя в мембране: связывание рецепторов с лигандами, Са-индуцируемое освобождение медиаторов из синаптических окончаний, активацию мембранных АТФаз. Асимметричность мембранного бислоя может поддерживаться транспортом липидов: спонтанным, везикулярным или про- исходящим с участием липидпереносящих белков. Низкомолекуляр- ные липидпереносяшие белки обладают различной специфичностью к разным липидным молекулам (от высокоспецифических, обеспечи- вающих обмен одного или двух компонентов, до сравнительно мало- специфических, связывающих и переносящих липиды разных клас- сов), Ъни также вносят свой вклад в поддержание асимметрии мемб- ран. Эти белки транспортируют липиды, образуя с ними устойчивые гидрофильные комплексы. 1.4.3. Подвижность компонентов липидного бислоя Структурная организация липидного бислоя мембраны не лиша- ет его компоненты динамичности, которая возникает из-за передви- жения отдельных липидных молекул в пределах мембранной структуры. В изотропной жидкости молекулам присущи разные виды под- вижности: вибрационные колебания, вра- щение, трансляционные движения. В а н и- зотропном бислое, напротив, молеку- лярная подвижность его компонент упоря- дочена. Различные типы подвижности про- иллюстрированы рисунком 1.15. Молекулы фосфолипидов способны к нескольким видам подвиж- н о с т и в бислое: изменение ориентации полярных «головок»; латеральная под- вижность; колебательная подвижность ацильных цепей; образование кинков и их перемещение вдоль ацильных цепей в по- перечном направлении; ротационная под- вижность (вращение вокруг длинной оси); переход с одной стороны бислоя на дру- гую (по типу «флип-флоп»); выход из бислоя. Рассмотрим некоторые виды подвиж- ности молекул фосфолипидов подроб- нее. 5 Рис. 1.15. Виды подвижнос- ти липидных компонентов в бислое: / — изменение ориентации по- лярных «головок»; 2 — лате- ральная диффузия в двумер- ном пространстве бислоя; 3 — быстрые колебания жирно- кислотных цепей относительно перпендикулярной оси; 4 — образование кинков и их про- движение вдоль ацильных це- пей; 5 — вращательная подвиж- ность; 6 — медленный обмен между компонентами монослоев мембраны («флип-флоп») 5-1822
66 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Латеральная подвижность. Способность липидов перемещать- ся в плоскости мембраны показана многими экспериментами. Напри- мер, измерено, что в мицеллах яичного лецитина при 25 °C молекула преодолевает путь, равный 2,5 мкм, за 1 с. Таким образом, латеральная диффузия в упорядоченной мембране позволяет компонентам бислоя перемещаться с относительно высокой скоростью. Она делает возмож- ным образование липидных кластеров. Латеральная диффузия имеет место даже при температуре, структурирующей мембрану в кристалли- ческом состоянии. Объяснить этот факт можно латеральной неоднород- ностью мембраны, наличием в бислое дефектных зон, в которые могут вытесняться молекулы из соседних упорядоченных областей. Упорядоченность мембран, измеряемая с помощью ЭПР-спектро- скопии, снижается при движении к метильному радикалу ацильной це- пи, что свидетельствует об увеличении подвижности жирнокислотных цепей в этом направлении. Различные конфигурации молекул жирных кислот, возникающие при поворотах (вращении) вокруг единичной С—С-связи, называют ротамерами или конформерами, а изменение конформации молеку- лы за счет таких поворотов носит название транс-гош-изомериза- ции. Вращательная подвижность молекул фосфолипидов, измеренная методом ЯМР-спектроскопии, показала, что подвижность гидрофоб- ных сегментов цепи повышается в направлении от сложноэфирной связи к метильной группе, т. е. к центру бислоя. Трансбислойный переход («флип-флоп»), В искусственных ли- пидных мембранах такие переходы осуществляются достаточно мед- ленно, например полупериод перехода молекул холестерина с одной стороны бислоя на другую в липосомах из фосфатидилхолина занима- ет более 24 ч, однако в принципе такой переход возможен. Даже в присутствии липидпереносящих белков перемещение из наружного слоя во внутренний занимает более 4 ч, а в обратную сторону — бо- лее 10 ч. Повышение температуры до 80 °C не ускоряет «флип-фло- па», но он может быть существенно ускорен в присутствии окислен- ных липидов, лизолецитина. Как правило, холестерин подвергается более быстрому «флип-флопу», чем фосфолипиды. Молекулы липидов не могут преодолеть липидный бислой в попереч- ном направлении путем простого физического перехода с одной стороны бислоя на другую, если в мембране нет особых ферментов — трансло- каз. Поэтому довольно большую частоту миграции липидов в биологи- ческих мембранах с одной стороны на другую связывали с активностью этих ферментов. Однако вероятно, что гетерогенность липидного соста-
1.4. Свойства липидного бислоя 6 ва биологических мембран и образование короткоживущих внутренних гексагональных мицелл увеличивает вероятность неферментативного .<флип-флоп»-перехода в природных мембранах. Результаты, получен- ные с помощью различных физических методов, указывают на возмож- ность образования в природных мембранах гексагональной фазы (вы- вернутых везикул), в которую вовлекаются молекулы липидов с одной стороны бислоя, а возвращаться они могут в другую. Следует отметить, что «флип-флоп» запускает функционально важные события в мембра- не. Латеральная и вращательная диффузия липидов также оказывает регулирующее влияние на активность мембранных белков. Важной для функционального состояния мембранных белков явля- ется и колебательная подвижность жирнокислотных «хвостов» отдель- ных молекул фосфолипидов. Вблизи метильного конца она осуществ- ляется независимо каждой молекулой, но с приближением к полярной «головке» и возрастанием плотности упаковки (особенно начиная с 9-го углеродного атома, ближе которого к поверхности бислоя обычно не встречается цис-двойных связей) подвижность уменьшается. По своей структурной конфигурации насыщенные жирные кислоты сильно отличаются от ненасыщенных. Насыщенные жирные кислоты мо- гут иметь множество различных конформаций вследствие высокой свобо- ды вращения вокруг одиночных С—С-связей. Энергетически наиболее выгодной является транс-конформация. Ненасыщенные жирные кисло- ты имеют жесткую структуру, поскольку вращение вокруг двойных связей невозможно. Они существуют либо в транс-, либо в цис-конфигурации. (Различие между терминами конформация и конфигурация заключает- ся в том, что переход между конформациями осуществляется за счет из- менения взаимного расположения между частями молекул без разрыва и образования новых ковалентных связей; переход же между разными кон- фигурациями требует разрыва ковалентных связей и их замыкания в дру- гом месте. Так, переход между D- и L-стереоконфигурациями аминокис- лот невозможен без разрыва и замыкания ковалентных связей, а цис- транс -переход между разными конформационными состояниями жир- ных кислот легко осуществляется по принципу тепловых движений.) Ненасыщенные жирные кислоты содержат двойные связи почти всегда в цис-конфигурации (рис. 1.16), транс-ненасыщенные жир- ные кислоты в природе почти не встречаются. Исключение составляет лишь вакценовая кислота — конфигурационный аналог олеиновой Кислоты. Ее температура плавления составляет 44 °C, в то время как °леиновая кислота плавится при температуре 13,5 °C. г Цис-конфигурация двойной связи обусловливает изгиб цепи под Углом около 30°. По этой причине цис-ненасыщенные жирные кисло-
68 Раздел 1 СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Полностью транс- конформация Цис- конформация Рис. 1.16. Пространственная конфигурация жирных кислот: а — насыщенная углеводородная цепь; б — ненасыщенная цепь с двойной связы*’ в цис-положении; в — насыщенная цепь в гош-положении
1.4. Свойства липидного бислоя ты с одной двойной связью вызывают локальные возмущения бислоя. При этом длина такой цепи несколько уменьшается, а занимаемый ею объем возрастает. В области локализации двойных цис-связей сосед- ние участки цепи образуют изгибы (так называемая гош-форма). Повышение температуры среды увеличивает тепловую подвиж- ность жирнокислотных цепей и облегчает возникновение изгибов. Ес- ли изгибы, соответствующие гош-конформации^ появляются на близ- лежащих участках жирнокислотной цепи, эта область может прини- мать вид петли или полости (кинк). В результате взаимопереходов транс- и гош-конформаций (так называемого транс-гош-перехода) кинки могут «скользить» вдоль цепи, обеспечивая перемещение их содержимого поперек мембраны. Таким образом может осуществ- ляться диффузия захваченной воды через гидрофобный бислой. При повышении плотности упаковки бислоя конформационная под- вижность С—С-связей снижается. В таком бислое подвижность цепей ограничена согласованными колебаниями около точки прикрепления жирнокислотных радикалов к полярной «головке» фосфолипида. В этой ситуации в бислое наиболее предпочтительны две конформации цепи: когда вся цепь находится в транс-конформации или при наличии струк- туры типа «двойной гош», когда изгибы, возникающие на двух соседних участках цепи вследствие образования гош-конформации, компенсиру- ют друг друга, и вся цепь в целом укорачивается без существенного уве- личения площади, приходящейся на одну молекулу. 1.4.4. Фазовые переходы мембранных липидов Фазовое состояние, в котором в данный момент находятся липи- ды бислоя, — гелеобразное или жидкокристаллическое — оказывает влияние на все типы молекулярной подвижности липидных молекул. Липиды обладают замечательным свойством — они способны к фазовым переходам в физиологических условиях. При определенных температурах, строго характерных для каждого вида липидов, в водной среде липидные мицеллы (рис. 1.17, а, б), образуемые фосфолипида- ми (ламеллярные, мицеллярные, гексагональные), могут находиться в Упорядоченном (гелеобразном) или в разупорядочен- н о м (мезофазном), так называемом жидкокристалличес- ком, состоянии. Жидкие кристаллы — это анизотропные жидкости: оптически они сходны с кристаллами, так как проявляют разные свой- ства в различных направлениях, а механически подобны жидкости (изотропны), текут в зависимости от вязкости.
70 Раздел 1. СТРУIг »А Hl гЪ НОИ I КАНИ шшял щшг~ Вода Шш шот ’ б ши ‘Шт иуяи -. Л. К’Г- ;• - 'Л. а Рис. 1.17. Структуры, образуемые в водных суспензиях липидами, склонными к созданию ламеллярных образований (а, б) и небислойных гексагональных структур (в, г) лВ' тш' Ж Жидкие кристаллы, сочетая в себе упорядоченность твердого тела и подвижность жидкости, отличаются высокой чувствительностью к внешним воздействиям: температуре, примесям, свету, внешним по- лям; они очень пластичны и достаточно долго хранят информацию. Эти свойства приобретают первостепенное значение в мембранах нервной ткани, где изменения электрических свойств лежат в основе проведения возбуждения. Таким структурам присущи лиотропный мезоморфизм (зависи- мость структуры от гидратации) и термотропный мезоморфизм (зависимость структуры от температуры). Температура фазового перехода липидов «гель—жидкий крис- талл» зависит от содержания воды в системе. Температура перехода минимальна, если общее содержание воды превышает то ее количест- во, которое могут связать липидные структуры. В то же время при не- достатке воды липиды могут находиться в упорядоченном состоянии
I 1.4. Свойства липидного бислоя и при температуре, выше критической. Таким образом, температура фазовых переходов липидов, осуществляющихся по типу «гель — жидкий кристалл», зависит от содержания воды в системе. Примером существенного влияния воды на фазовые переходы би- слоя является модификация мембраны под влиянием перекисного окис- ления липидов (ПОЛ), способного снижать температуру фазового пере- хода. Это явление объясняется увеличением содержания воды в бислое. Дело в том, что гидратация бислоя зависит от присутствуя заряженных фосфолипидов. Наиболее сильно она возрастает при индукции ПОЛ. Образующиеся в качестве промежуточных продуктов гидроперекиси яв- ляются высокогидрофильными, они эффективно разрушают бислой, увеличивая доступность гидрофобных доменов мембраны для молекул воды. Именно по этим причинам ПОЛ имеет такое «разрушительное» влияние на клеточные мембраны. Термотропные фазовые переходы липидов в мембране происходят в сравнительно широком температурном интервале (в несколько граду- сов). Это обусловлено тем, что в бислое более «жидкая» фаза возника- ет в окружении другой, более упорядоченной. Сосуществование в ли- пидном бислое двух фаз устанавливает между ними сложное равнове- сие, приводя к снижению кооперативности фазового перехода. Обычно кооперативные фазовые переходы липидов в мембране затрагивают не- сколько сотен молекул. В нативной мембране постоянно находится большое количество кооперативных единиц той или иной фазы. Гетеро- генность мембран выражается, в частности, в наличии липидных рафтов. На температуру фазового перехода большое влияние оказывают природа липидных молекул, длина углеводородного скелета, наличие цис- и транс-двойных связей, структура полярных групп. При переходе липидов из гелеобразного в жидкокристаллическое состояние одновременно происходит несколько событий: возрастает вращательная подвижность липидов, увеличиваются колебательная подвижность жирнокислотных радикалов относительно С—С-связей и скорость латеральной диффузии. Все это связано с изменением геомет- рических размеров бислоя из-за латерального расширения площади, занимаемой каждой молекулой липида. Например, площадь, занимае- мая 2С16-фосфатидилхолином, меняется от 0,49 до 0,58 нм2, среднее расстояние между молекулами увеличивается от 0,49 до 0,52 нм, а тол- щина мембраны уменьшается почти на 0,5 нм, т. е. латеральное расши- рение слоя компенсируется его утончением. Гидрофобный объем мембраны увеличивается примерно на 1,5%. Жидкокристаллическое состояние доменов мембраны, увеличивая вращательную подвижность жирнокислотных радикалов относительно С—С-связей, способствует m/хшс-гош-изомеризации (ротамеризации).
72 раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ В мембранном бислое облегчается образование различных конформе- ров жирных кислот. При повороте на ±120° относительно транс-кон- формации появляются аош( + )- и гош( — )-конформации. Из-за неод- новременное™ проявления этих свойств в ходе фазовых перестроек бислоя более упорядоченные области мембраны сосуществуют с уже расплавленными — наблюдается фазовое разделение. В данных усло- виях для мембраны характерно появление разного рода структурных дефектов, индуцирующих «сплывание» белковых молекул друг с дру- гом, а также встраивание в бислой молекул холестерина, повышение его проницаемости для ионов и т. д. Наличие фазовых переходов, индуцируемых температурой, — объ- ективная характеристика бислоя, состоящего из различных по свойст- вам компонентов. Фазовые переходы липидов при постоянной темпе- ратуре среды могут быть вызваны изменениями заряда их полярных групп, возникающими при изменениях pH, ионной силы, концентрации ионов. Доказано, что температура фазового перехода есть функция ве- личины и плотности заряда липидных молекул. Любое увеличение за- ряда полярных групп благоприятствует сохранению разупорядоченного (жидкокристаллического) состояния ввиду латерального электростати- ческого отталкивания, тогда как уменьшение заряда обусловливает пе- реход в гелеобразное состояние. Важным способом изменения поверхностного заряда липидов в физиологических условиях является адсорбция катионов. Связывание катионов заряженными липидами зависит от поверхностного потенци- ала, значительно различающегося в разных фазовых состояниях, что определяется молекулярной упаковкой липидных молекул. Адсорбция или десорбция катионов на мембранной поверхности мо- жет инициировать фазовые переходы липцдов. При определенных фи- зиологических условиях структурные изменения липидов вызывают вы- свобождение двухвалентных катионов с поверхности мембраны. Так, при переходе «гель—жидкий кристалл» с липидной поверхности высвобож- даются ионы кальция. Са2+ и Mg2+ стабилизируют организованную структуру, повышая температуру фазового перехода, а одновалентные катионы вызывают противоположный эффект. Другими словами, двухва- лентные катионы благоприятствуют гелеобразному, а одновалентные — жидкокристаллическому состоянию мембраны. Таким образом, поверх- ность липидов может рассматриваться как резервуар катионов, объем которого регулируется структурными изменениями мембраны. Таким образом, фазовые переходы в мембране индуцируются не только изменениями температуры. Они могут быть вызваны сдвигом pH среды, электрическим потенциалом, двухвалентными катионами.
1.4.CBv4 iBi ИЛИД м ГОбГ ло< способствующими образованию кластеров определенных фосфолипи- дов и разделению фаз; фазовые переходы также сопровождают дейст- вие гормонов на биологические мембраны. Кроме перехода типа «гель—жидкий кристалл» липиды могут пре- терпевать превращения другого рода, приводящие к образованию гек- сагональной фазы Нп (рис. 1.17, в, г на с. 70). Эти небислойные структуры легко образуются короткоцепочечными кислыми фосфоли- пидами (например, фосфатидил серином, фосфатидной кислотой). Об- разованию гексагональных структур способствуют такие явления, как повышение температуры, увеличение ненасыщенности жирнокислот- ных цепей, высокая ионная сила при щелочном pH, а также пониже- ние гидратации бислоя. Переход отдельных участков бислоя в фазу Нп приводит к нарушению целостности мембраны, формированию кана- лов проницаемости, образованию дефектных зон. 1.4.5. Дефектные зоны. Роль холестерина Как показано выше, различные виды подвижности липидных компонентов в бислое нарушают его гомогенную упаковку и приводят к появлению в мембране динамических дефектов. Высокая скорость вращения жирнокислотных радикалов вокруг С—С-связей, а также наличие в составе фосфолипидов £{ис-изомеров ненасыщенных жир- ных кислот делают бислой достаточно рыхлым. Образование дефектов такого рода демонстрирует рисунок 1.18. Рис. 1.18. Образование дефектов в мембранном бислое: а — обе жирнокислотные цепи молекулы фосфолипида находятся в транс-положе- нии; вращение вокруг С—С-связей, указанное круговыми стрелками, ничем не огра- ничено (1); в результате несогласованного вращения образуется скошенная (гош-) конформация (2) или кинк (3); б — влияние кинков на упаковку бислоя: I — кинки от- сутствуют; II — один кинк на жирнокислотную цепь; III — два кинка на жирнокислот- ную цепь. Жидкокристаллическое состояние бислоя облегчает образование кинков
74 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Рассмотрим насыщенные углеводородные цепи. Наиболее ста- бильна транс-конформация (/), в которой цепь максимально вытя- нута и не меняет своего направления, тогда как в гош-конформации ее направление меняется (2) и образуется дефект упаковки. Последо- вательность гош—транс—гош для трех смежных С—С-связей при- водит к появлению в цепи излома (кинка), в результате чего участки цепи выше и ниже излома оказываются значительно смещенными друг относительно друга (3) — образуется дефект. Возможность фор- мирования таких структур обеспечивает возникновение подвижных дефектов, способных захватывать целые кластеры мембраны. Их кон- центрация и подвижность зависят от температуры. В случае ненасыщенных жирных кислот почти все двойные связи в мембранных липидах находятся в ^uc-форме. Как и в случае гош- формы, это приводит к изменению угла наклона цепи — образует- ся дефект. Такие пространственные дефекты бислоя, индуцируемые включением в него ненасыщенных жирных кислот, являются более стабильными. В результате появления дефектов бислой становится более рыхлым. Рассмотрим вызванное дефектами изменение геометрии бислоя. Растянутая углеводородная цепь жирной кислоты, содержащая 18 уг- о леродных атомов, имеет длину примерно 23—24 А, что возможно в случае геля, т. е. в случае высокоструктурированного (упорядоченно- го) состояния липидов. По этой причине можно было бы предполо- жить, что бислой, составленный из фосфолипидов, жирные кислоты которых содержат 18—20 углеродных радикалов, должен иметь тол- о щину более 47 А. Однако реальная толщина мембраны редко превы- шает это значение (она составляет на 15—20% меньшую величину). Это указывает на то, что жирнокислотные радикалы бислоя не рас- прямлены полностью, а образуют рыхлые структуры. В результате этого площадь мембраны оказывается несколько большей, чем следу- ет из расчета теоретического пространства, приходящегося на одну молекулу фосфолипида. Встраивание холестерина в бислой делает возможным изменение формы мембран в результате значительной де- формации обеих сторон липидного бислоя, так как в отличие от фос- фолипидов холестерин может легко перемещаться из одного монослоя в другой. При этом несколько возрастает и толщина бислоя. Гетерогенность бислоя и образование в нем липидных кластеров способствуют разделению (сегрегации) фаз в мембране. Латеральное разделение липидных молекул в плоскости бислоя — важная особен- ность мембраны. Особая сегрегирующая роль в мембране принадле-
1.4. Свойства липидного бислоя жит холестерину. При низких концентрациях его в мембране происхо- дит латеральное разделение фосфолипид-холестериновых комплексов и свободных молекул фосфолипидов. При этом холестерин взаимодей- ствует в первую очередь с теми молекулами фосфолипидов, которые имеют низкую температуру фазового перехода. Благодаря этому в бислое будут существовать как области только «жидкие» и только «твердые»,’ так и области смешанные, где обе фазы сосуществуют. Наличие разных по плотности областей в пределах одной мембраны изменяет ее сжимаемость, что сказывается на глубине погружения мембранных белков и на эффективности их работы. Необходимо отметить, что кроме сегрегирующего холестерин ока- зывает и другое важное воздействие на структуру и физические свой- ства липидного бислоя. Встраивание холестерина в фосфолипидный бислой вызывает как нарушение упаковки жирнокислотных цепей, так и уменьшение их подвижности. Эти эффекты холестерина называ- ют соответственно разжижающим и конденсирующим. При темпе- ратуре, превышающей точку фазового перехода фосфолипида, холес- терин уменьшает подвижность его углеводородных цепей. Так, при до- бавлении холестерина к фосфатидилхолиновым мембранам площадь молекулы фосфатидилхолина уменьшается с 0,96 до 0,56 нм2. Этот уплотняющий эффект холестерина максимален в районе центрального участка жирнокислотных радикалов и ослабевает в направлении кон- цевых метальных групп. Но при температуре ниже точки фазового пе- рехода фосфолипидов холестерин разжижает углеводородную область бислоя. Наличие в углеводородных цепях кинков, двойных связей и других особенностей приводит к увеличению площади поперечного сечения о углеводородной цепи (минимальное ее значение составляет около 19 А2) при ее полностью транс-конфигурации; это может иметь важные по- следствия для упаковки липидов в бислое. В жидкокристаллической фазе появление в цепи сош-конформеров увеличивает эффективное о поперечное сечение углеводородных цепей по меньшей мере до 50 А2. Толщина бислоя уменьшается за счет наличия в цепях гош-конфор- меров, приводящих к разупорядочиванию цепей, причем сами цепи в целом растянуты и расположены перпендикулярно поверхности бислоя. В фазе геля насыщенные углеводородные цепи фосфолипидов на- ходятся преимущественно в транс-конфигурации. Минимальная пло- щадь поперечного сечения молекулы диацильного фосфолипида со- о ставляет около 38 А2. Примерно такую же площадь занимает полярная
76 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ головка фосфатидилэтаноламина, поэтому насыщенные фосфатидил- этаноламины в фазе геля упаковываются таким образом, что их ацильные цепи располагаются перпендикулярно плоскости бислоя (как в липидных кристаллах). На рисунках и схемах жирнокислотные цепи фосфолипидов в би- слое, как правило, представляют скошенными относительно перпен- дикулярной оси мембран (см. рис. 1.18). Угол наклона цепей опреде- ляется природой полярной «головки» молекулы: наклон возникает в том случае, когда объем гидратированной «головки» молекулы боль- ше площади сечения ее «хвостовой» части. Например, в случае крис- таллов фосфатидилхолина минимальная площадь, приходящаяся на о одну полярную «головку», составляет примерно 50 А2, поэтому ди- о пальмитоилфосфатидилхолин (38 А2) в фазе геля не может упаковы- ваться так, как фосфатидилэтаноламин. В этом случае ацильные цепи дипальмитоилфосфатидилхолина отклоняются от нормали к бислою на 30°, благодаря чему их поперечное сечение увеличивается, чем и до- стигается соответствие размерам полярной «головки». При этом угле- водородные цепи сохраняют полностью транс-конформацию. В слу- чае когда эти величины равны (например, для фосфатидилэтанолами- на), скоса практически не наблюдается. Наличие перечисленных особенностей обеспечивает определен- ную рыхлость упаковки мембранного бислоя при нормальных услови- ях, которая в литературе часто обозначается термином жидкост- носпгь, смысл которого противоположен термину микровязкость. 1.4.6. Микровязкость мембран Для мембран характерна высокая степень текучести бислоя, обеспечивающая способность липидов и белков к латеральной диффу- зии. Повышенная плотность упаковки (структуризация) бислоя увели- чивает сопротивление диффузии молекул, транспортируемых через мембрану, повышает ее микровязкость. Следовательно, скорость пере- мещения молекул зависит от микровязкости мембран, которая, в свою очередь, определяется относительным содержанием насыщенных и не- насыщенных жирных кислот в составе липидов. Микровязкость мемб- ран меньше, если в составе липидов преобладают ненасыщенные жир- ные кислоты, и больше при высоком содержании насыщенных жирных кислот. На этот параметр влияют также размеры углеводородных «хвостов» липидов, с увеличением длины которых микровязкость би- слоя уменьшается.
1.5. Мембранные белки 1.5. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ Липиды — относительно низкомолекулярые соединения с молеку- лярным весом менее 1000 Да (1 кДа), в то время как мембранные белки имеют молекулярную массу, превышающую, как правило, десятки тысяч дальтон. Клеточные мембраны содержат большое число различных бел- ков, молекулярная масса которых колеблется от 10 до 240 кДа. Последовательность аминокислотных радикалов в пептидной цепи, как правило, содержит информацию, диктующую упаковку белковой молекулы в пространстве. Поэтому уже в ходе синтеза белковой моле- кулы происходит спонтанное комплектование вторичной и третичной структур белка. Функции белков определяются особенностями их структуры и упа- ковки. Белковые глобулы являются примером третичной структуры — на ее уровне формируется специфическая ферментативная, рецептор- ная и другие виды активности белковой молекулы. При ассоциации нескольких глобул в олигомерные ансамбли формируется четвертич- ная структура, придающая белку способность тонкого регулирования осуществляемых им функций. Форма образующихся глобул в большой степени зависит от соотно- шения полярных и аполярных аминокислотных радикалов в образую- щемся белке. В водной фазе белковые молекулы стремятся принять такую форму, чтобы гидрофобная сердцевина была «одета» заряжен- ными или нейтральными группами гидрофильных аминокислот. При «невыгодном» соотношении различных по природе аминокислот для защиты от атаки молекулами воды обращенных к внешней среде гидро- фобных радикалов белки вынуждены образовывать ассоциаты — гете- ро- или гомоолигомеры. Другой способ их стабилизации — внедрение в гидрофобные структуры клеточных мембран. Спонтанное образование белковых глобул, происходящее уже в процессе синтеза белковой молекулы, имеет место в случае относи- тельно просто устроенных белков. Более сложные белковые структу- ры принимают окончательную форму с помощью специальных бел- ков-шаперонов в ходе так называемого процессинга, или созревания (maturation). Но и в этом случае для большого количества белковых молекул клеточная мембрана является областью, внедрение в кото- рую обеспечивает белковой молекуле большую стабильность или воз- можность осуществления специфических реакций. В ряде случаев для решения вопроса о цитоплазматической или мембранной локализации белка важным является не общее соотноше- ние гидрофобных и гидрофильных аминокислотных радикалов в первич-
7й Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ ной структуре, а наличие участков первичной структуры, содержащих протяженные гидрофобные цепи. Именно эти участки «нуждаются» в маскировке гидрофобным окружением. 1.5.1. Локализация и подвижность белков в мембранном бислое Мембраны содержат от 20 до 80% белка (по весу). При этом в разных мембранах количество белков существенно различается. Так, в мембранах митохондрий доля белков составляет около 75%, а в плазматической мембране олигодендроцитов — около 25%. Так как о липидные молекулы имеют небольшой размер (около 5 А) и неболь- шую молекулярную массу, их число в несколько десятков раз больше числа белковых молекул. Поэтому белковые молекулы фактически внедрены в липидный бислой мембраны. Белки различаются расположением в мембране (рис. 1.19). Моле- кулы интегральных белков могут глубоко проникать в липидный бислой или даже пронизывать его (в этом случае их называют транс- мембранными белками). Периферические белки прикрепляются к мембране разными способами. Интегральные белки содержат транс- мембранные домены, которые состоят преимущественно из неполяр- ных аминокислотных радикалов и могут пересечь бислой один или несколько раз. Трансмембранные домены обычно имеют структуру Внутренняя поверхность мембраны Рис. 1.19. Встраивание белков в липидный бислой. Трансмембранные белки- 1 — гликофорин; 2 — адренорецептор; поверхностные белки: 3 — белки, связанные с интегральными белками (сукцинатдегидрогеназа); 4 — белки, ассоциированные с полярными «головками» липидного бислоя (протеин- киназа С); 5 — белки, «заякоренные» в мембрану с помощью короткого гидрофобного концевого домена (цитохром 65); 6 — белки, «заякоренные» в мембрану за счет жир- нокислотного радикала, ковалентно присоединенного к белковой молекуле (G-белок)
1.5. Мембранные белки ос-спирали. Интегральные белки могут формировать гидрофильные домены на одной или обеих поверхностях бислоя. Периферические белки отличаются от интегральных меньшей глу- биной проникновения в бислой и более слабыми белок-липидными взаимодействиями (т. е. меньшей зависимостью от бислоя). Перифе- рические белки могут обратимо менять свой статус, прикрепляясь к мембране на определенное время (такие белки называют амфипати- ческими). Прикрепляясь к мембране, они взаимодействуют либо с ин- тегральными белками, либо с поверхностными участками липидного бислоя, приобретая новые свойства. Деление мембранных белков на периферические и интегральные определяется их структурой, количеством гидрофобных аминокислот и их расположением в первичной структуре, т. е. всеми теми свойст- вами, которые обеспечивают взаимодействие белка с бислоем. Для амфипатических белков существуют специальные сигналы, стимули- рующие их ассоциацию с мембраной (часто таким сигналом является фосфорилирование белков специфическими киназами, изменяющее их третичную структуру и гидрофобность, точнее — лиотропность). К таким белкам, например, относят протеинкиназу С. Локализованный в мембране гидрофобный домен или «якорь» яв- ляется еще одним характерным элементом структуры мембранных белков. С помощью такой структуры происходит закрепление перифе- рических белков в мембране. В качестве якоря может выступать жир- нокислотный радикал (чаще всего — пальмитоил или миристоил), ковалентно присоединяющийся к белковой молекуле. Диаметр интегральных мембранных белков в среднем составляет о о 80 А, но встречаются и более крупные белки — размером до 350 А. Обычно эти белки обладают выра- женной асимметрией (см. рис. 1.19). Некоторые из трансмембранных белков пронизывают мембрану один раз (как гликофорин) — они называ- ются битхтическими, другие имеют несколько участков (доменов), последо- вательно пересекающих бислой, — это политопические белки (рис. 1.20). Монотопические белки относятся к периферическим белкам. В качестве примера рассмотрим несколько белков, по-разному свя- занных с мембранами. Рис. 1.20. Монотопическая (а), битопическая (б) и политопи- ческая (в) локализация белков в мембране
80 Раздел ^ СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Белок-предшественник амилоида (АРР) — трансмембранный (ин- тегральный) белок, известный в связи с участием одного из продуктов его протеолиза в развитии тяжелой патологии мозга — болезни Альц- геймера. Этот белок состоит из 695—751 аминокислотного остатка, экспрессируется в различных органах и тканях животных. Из извест- ных трех изоформ этого белка в коре мозга присутствует в основном более короткая форма АРР695, состоящая из 695 аминокислотных ос- татков, которая фиксирована в мембранах нейронов так, что N-конце- вой фрагмент из 625—630 остатков ориентирован во внеклеточное пространство, а короткая (С-концевая) часть локализована в цито- плазме клеток. По-видимому, АРР участвует в организации межней- ронных контактов, особенно в области нервных окончаний. Экстра- клеточные фрагменты белка АРР могут отщепляться протеиназами и, как установлено, стимулируют развитие нейритов, участвуя в форми- ровании следов памяти. Среди многих регуляторных белков нейрональной мембраны осо- бый интерес в связи с участием в развитии тяжелой патологии мозга — болезни Альцгеймера — представляет так называемый бе- лок р-АРР (P-amyloid precursor protein) — предшественник Р-амило- идного пептида (P-А), образующего на поверхности нейронов больно- го мозга структурные бляшки. Участие Р-АРР в возникновении и раз- витии болезни Альцгеймера описано в 3.3.9. АРР и продукты его обмена выполняют важные функции в жизне- деятельности нейрональных клеток-. Эти белки обладают нейротрофи- ческими и нейропротекторными свойствами, модулируют рост нерв- ных окончаний и синаптогенез. Они участвуют в обеспечении возбуди- мости нервных клеток и синаптической пластичности, а также в процессах обучения и памяти. Р-АРР обладает многими характеристи- ками, свойственными мембраносвязанным рецепторным молекулам, так как может функционировать как рецептор, сопряженный с G-бел- ками, опосредованно способствуя запуску каскада внутриклеточных сигнальных реакций. Цитохром 65 имеет единственный гидрофобный сегмент, с по- мощью которого заякоривается на цитоплазматической поверхности микросомальной мембраны. Это монотопический белок. Интересный пример регулируемого взаимодействия с мембраной был обнаружен при изучении аминокислотной последовательности интактной формы микросомального цитохрома Ь5 (см. рис. 1.19). Этот белок участвует в различных окислительно-восстановительных реакциях в качестве пе- реносчика электронов. Его относительно короткий участок пептидной цепи вблизи С-конца сплошь состоит из гидрофобных аминокислот.
| 1.5. Мембранные белки 81 Ес. 1И гидрофобный «якорь» удалить с помощью протеолиза, гемсвя- зывающий домен теряет связь с мембраной и высвобождается в среду. Мембранные белки битопического типа часто вовлекаются в переда- чу сигналов через клеточную мембрану. Например, некоторые из рецеп- торактивируемых цитоплазматических тирозинкиназ являются битопи- ческими белками. Белки ионных каналов, транспортные АТФазы (саркоплазматиче- ская Са2+-АТФаза, см. гл. 2.5) и большинство рецепторных структур (см. гл. 2.2) относятся к политопическим белкам. Белки в бислое достаточно лабильны и могут совершать различные виды движений; их подвижность и возможность ассоциации друг с дру- гом определяются липидным окружением. Некоторые мембранные белки легко перемещаются вдоль бислоя. Например, фосфолипаза А, связываясь с клеточной мембраной (с цитоплазматической стороны), может латерально перемещаться по поверхности бислоя и гидролизо- вывать несколько тысяч фосфолипидов до тех пор, пока не отделится от мембраны. Латеральная диффузия интегральных белков в мембране ограничена их большими размерами, взаимодействием с другими мемб- ранными белками, а также элементами цитоскелета или внеклеточного матрикса. Однако она также имеет вполне измеримую величину. Интегральные белки иммобилизуют окружающие их липидные моле- кулы в так называемый аннулярный слой, в котором эти молекулы об- ладают ограниченной подвижностью — гидрофобные белок-липидные взаимодействия имеют ту же природу, что и гидрофобные взаимодейст- вия между липидами, и зависят в основном от площади контактов. Таким образ* >м, внедрение интегральных белков в мембрану изменяет свойства, упаковку и подвижность мембранных липидов. Количество связанных липидов зависит от насыщенности мембраны белками. Периферические белки оказывают менее значительное воздействие на состояние и под- вижность ацильных цепей фосфолипидов. Важный белковый компонент мембраны — гликопротеины — белковые молекулы, содержащие углеводные цепочки (рис. 1.21). Пе- риферические белки или домены интегральных белков, расположенные на наружной поверхности мембраны, почти всегда гликозилированы. Молекулы клеточной адгезии нейронов (NCAMs) принадлежат к ши- роко распространенному семейству гликопротеинов клеточной поверх- ности, внеклеточные домены которых структурно напоминают домены иммуноглобулинов. Некоторые трансмембранные гликопротеины осу- ществляют взаимодействие между цитоскелетом и внеклеточным мат- риксом. Интегрины являются основными представителями трансмемб- ранных рецепторов с этими свойствами.
82 Раздел 1 СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ Н2С—ОН I НС—ОН СНз N-Ацетил - глкжозамин Рис. 1.21. Углеводные компоненты гликопротеинов. Молекула гликопротеина состоит из белкового остова, к которому присоединены це- почки сахаров. Длина и состав цепочек могут варьировать. Заштрихованными фигу- рами обозначены радикалы аминокислот Неприлизин (НЕП, нейтральная эндопептидаза-24.11) представля- ет собой мембраносвязанный гликозилированный белок с молекуляр- ным весом 93 кДа. НЕП является цинкзависимой металлопептидазой, он деградирует биологически активные пептиды, такие как опиоидные пептиды, тахикинины, хемотактические пептиды, адренокортикотроп- ный гормон (АКТГ), энкефалин и тем самым прерывает передачу сиг- нала в пептидэргических синапсах. НЕП расщепляет многие нейро- пептиды и, следовательно, может регулировать их уровень. НЕП обнаружен не только в центральной нервной системе, но и во многих периферических тканях. Благодаря своим свойствам НЕП при- нимает участие в регуляции разнообразных физиологических процессов, включая сердечно-сосудистую деятельность, воспалительные процессы, миграцию и пролиферацию клеток, развитие опухолей. Важно отметить, что НЕП способен разрушать Р-амилоидные пептиды. Даже частичное снижение активности НЕП может приводить к накоплению токсическо- го [3-амилоида и развитию болезни Альцгеймера (см. гл. 3.9). Углеводные цепочки гликопротеинов имеют разнообразную струк- туру. Роль гликопротеинов в жизни клетки многообразна. Некоторые из них выполняют функцию ферментов, другие обладают гормональ- ной активностью. Предполагают, что одна из функций процесса глико-
к.5. Мембранные белки зилирования — обеспечить возможность транспорта через клеточную мембрану белкам, синтезированным в аппарате Гольджи. Гликопро- теины, расположенные на поверхности клеток, ответственны за такие важные процессы, как взаимное распознавание клеток — с их по- мощью устанавливают межклеточные контакты в многоклеточном ор- ганизме. Подобные контакты необходимы для адгезии клеток. 1.5.2. Функции мембранных белков В отличие от липидов, мембранные белки трудно классифици- ровать по структуре, целесообразнее подразделять основные виды мембранных белков исходя из их функций. Как правило, именно белки ответственны за функциональную активность мембран. К таким бел- кам относятся разнообразные ферменты, транспортные белки, рецеп- торы, канальные белки, белки, образующие водные поры (аквапори- ны), а также различные структурные и регуляторные белки, которые обеспечивают многообразные функции клеточных мембран. По биологической роли мембранные белки можно разделить на четыре группы: 1)белки-ферменты, обладающие каталитиче- ской активностью; 2)рецепторные белки, специфически связываю- щие те или иные вещества; 3) структурные белки; 4) белки, обес- печивающие межклеточные взаимодействия. Белки-ферменты наиболее распространены среди всех мембранных белков. В их число входят как интегральные (мембранные АТФазы, вы- полняющие транспортную функцию), так и периферические (ацетил- холинэстераза, кислая и щелочная фосфатазы, РНКаза) белки. Транспортные белки (см. гл. 2.5) создают устойчивые потоки опреде- ленных веществ и ионов через мембраны. Транспорт ионов приводит к возникновению трансмембранного потенциала во всех клетках, а так- же к его изменениям в нервной и мышечной клетках. Последнее явле- ние лежит в основе таких важнейших свойств этих тканей, как возбу- димость и проводимость. Рецепторными белками называют белки, специфически связываю- щие те или иные лиганды, участвующие в передаче сигналов от одних клеток к другим (см. гл. 2.2). Такая передача осуществляется различны- ми способами. Часто рецепторы входят в состав более сложных мемб- ранных комплексов, содержащих белки-исполнители. Например, в нерв- ных и нервно-мышечных синапсах сигнальной молекулой (медиатором) является определенное низкомолекулярное вещество, а плазматическая мембрана содержит специальные рецепторные белки, соединенные с ионными каналами, изменяющие свои свойства при связывании рецеп-
84 Раздел! СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКдНИ тора с лигандами. Эта реакция обеспечивает проницаемость мембраны для различных ионов (натрия, калия, кальция, хлора) и формирует воз- буждающий потенциал. Некоторые рецепторы (например, никотиновый холинорецептор) сами являются ионными каналами (за счет включения в рецепторный ансамбль дополнительных белковых субъединиц). В ряде случаев рецепторный белок не является ионным каналом, но связан с внутриклеточным сигнальным каскадом, активация кото- рого происходит при связывании с рецептором лиганда, несущего ин- формацию. В результате активации таких рецепторов (их называют метаботропными, в противоположность ионотропным, регули- рующим ионные потоки через мембрану) возникает каскад химических реакций, управляющих клеточными функциями через изменения ме- таболизма (отсюда и название этих рецепторов). Активация метабо- тропных рецепторов лигандами (их можно считать первичными сиг- нальными молекулами, или первичными мессенджерами) приводит к выработке в цитоплазме активируемой клетки вторичных сигнальных молекул (вторичных мессенджеров). Структурные белки (см. гл. 1.7) придают клеткам и органеллам определенную форму; обеспечивают те или иные механические свой- ства (например, эластичность) плазматической мембране; осуществ- ляют связь мембраны с цитоскелетом, а в случае ядерной мембраны — с хромосомами. Структурные мембранные белки, как правило, лишены фермента- тивных свойств (возможно они просто пока мало изучены в химиче- ском отношении). Их исследование затрудняется главным образом двумя обстоятельствами. Во-первых, структурные белки «немы» — не обладают известной ферментативной активностью. Во-вторых, структурные белки имеют в составе своих молекул обширные гидро- фобные участки. При очистке они образуют тесные ассоциаты друг с другом или с липидами, что усложняет их изучение. Нейроспецифический белок В-50 — один из основных фосфори- лируемых структурных белков плазматических мембран синаптиче- ских контактов. Методами иммунохимии установлено, что он локали- зован преимущественно в пресинаптических мембранах. Молекуляр- ная масса белка 48 кДа. Он является эндогенным субстратом (диацилглицерол + Са2+)-зависимой протеинкиназы С. Активаторы протеинкиназы С стимулируют процесс синаптической передачи в срезах гиппокампа. Фосфорилирование белка В-50 приводит к увели- чению времени возбужденного состояния синапса, что способствует удержанию ионных каналов в активированном (открытом) состоянии (в некоторых публикациях этот феномен называют состоянием «про-
1.5. Мембранные белки 85 торенности» синапса). Влияние фосфорилированного белка В-50 на метаболизм фосфоинозитидов может быть одной из причин этого фе- номена. Интересно, что в процессе старения организма интенсивность фосфорилирования белка В-50 в мозге снижается, что, возможно, и обусловливает снижение пластичности синапсов. Еще одно доказательство роли процессов фосфорилирования бел- ка В-50 в функционировании синапсов (на примере пептидергических синапсов) получено в экспериментах in vitro, подтвердивших, что ней- ропептид — фрагмент АКТГ1_24 — в 10 раз более эффективно тор- мозит фосфорилирование В-50 в синаптических мембранах из сеп- тальной области мозга, чем в мембранах целого мозга. В группу мембранных белков также входят множество белков- ферментов, образующих ионные каналы, — Na/K- и Са-АТФазы (см. гл. 2.5), рецепторные белки (см. гл. 2.2), синапсины (см. гл. 3.4) и др. Плазмин — сериновая протеиназа, в плазме крови действует в ос- новном как тромболитический фермент, а также деградирует многие компоненты внеклеточного матрикса. В мозге плазмин вовлекается в осуществление многочисленных функций, таких как нейрональная пластичность, обучение и память. Активация плазминогеновой систе- мы наблюдается в мозге во время и в первые дни после инсульта. При болезни Альцгеймера, напротив, происходит снижение уровня плаз- мина в тканях мозга. Входящий в состав плазматических мембран нейронов плазмин на- ходится в ассоциации с богатыми холестерином рафтами, которые считаются местом преимущественного образования амилоидного (3-А. Это свидетельствует о наличии функциональной связи между плазми- ном, холестерином и метаболизмом мозга. Эндотелинконвертирующий фермент (endothelin-converting enzyme, ЕСЕ-1) является еще одним амилоиддеградирующим ферментом, ко- торый на 37% гомологичен НЕП по аминокислотной последователь- ности. ЕСЕ-1 тоже является мембраносвязанной цинкзависимой ме- таллопротеазой, также как и НЕП он способен расщеплять большое число биологически активных веществ, включая брадикинин, нейро- тензин, ангиотензин-1 и Б-цепь инсулина. В отличие от НЕП, ЕСЕ-1 существует в виде димеров, субъединицы которых соединены дисуль- фидной связью. Эти две металлопротеазы (ЕСЕ-1 и НЕП) различаются и по чувст- вительности к ингибиторам. Для ингибирования НЕП требуются на- Номолярные концентрации тиорфана и фосфорамидона, в то время Как ЕСЕ-1 ингибируется микромолярными концентрациями фосфора- мидона и не чувствителен к тиорфану.
86 Раздели — 'ЕР ОИТКА 1.6. ЕСЕ-1 обнаружен во многих органах и тканях. Наиболее обогаще- ны этим ферментом эндотелиальные клетки, он также экспрессирует- ся в нервной ткани и мышцах. В гладкомышечных клетках ЕСЕ-1 на- ходится в комплексе с а-актиновыми филаментами. В настоящее время известны четыре изоформы ЕСЕ-1 че- ловека (la, 1Ь, 1с и Id), которые не имеют существенных каталитиче- ских отличий, но различаются по внутриклеточной локализации. Изо- формы 1а, 1с и Id находятся на поверхности клетки, а ЕСЕ-16 явля- ется внутриклеточной формой, локализованной в аппарате Гольджи. Обнаружен еще один белок, подобный ЕСЕ-1, который локализо- ван преимущественно в мозге и в незначительных количествах — в эндотелиальных и гладкомышечных клетках. Его первичная структу- ра на 59% идентична аминокислотной последовательности ЕСЕ-1. Он обозначается как ЕСЕ-2 и отличается от ЕСЕ-1 более кислым рН-оп- тимумом. БЕЛОК-ЛИПИДНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Анализ белок-липидных взаимодействий в мембране позволяет выделить четыре основных типа контактов (рис. 1.22). Наиболее распространенный вариант взаимодействия — это когда внедряющийся в бислой белок вызывает локальное возрастание упо- рядоченности части липидной массы и формирование аннулярного слоя (рис. 1.22, а). С помощью метода ЭПР-спектроскопии показа- но ограничение подвижности и характера упаковки углеводородных цепей липидов под влиянием различных интегральных и перифери- ческих белков (цитохром с-оксидаза, цитохром с, полилизин, родоп- син и др.) вплоть до четвертого слоя липидов, окружающих молекулу белка. Второй этап взаимодействия — это прикрепление периферических белков (не проникающих на всю глубину бислоя) к мембране, вызываю- щее эластическую деформацию одной стороны бислоя (рис. 1.22,6). Такое влияние белков на физико-химические параметры бислоя так- же имеет определенные последствия. Именно им определяется облег- чение взаимодействия мембранных рецепторов с инсулином и другими гормонами. Третий тип соответствует ситуации, когда в результате ярко выра- женной гидрофобности белка могут иметь место как локальная дефор- мация, так и резкое изменение градиента кривизны бислоя, что проис- ходит в случае взаимодействия с мембраной цитохрома 65.
1.6. Белок-липидные взаимодействия 8 Полярный липид Рис. 1.22. Различные типы модификации липидного бислоя белковыми моле- кулами: а — схематическое изображение белок-липидного бислоя; б — возможные механиз- мы модификации бислоя белком: 1 — сближение заряженной молекулы белка с мемб- раной; 2 — ассоциация белка с бислоем, индуцирующая градиент кривизны наружного монослоя и способствующая ассоциации белка с внутренней стороной бислоя (3) (по: Твердислов с соавт., 1987)
ьв раздел 1. СТРУКТУРА T-JEPBHOii ТКАНИ Наконец, сочетание гидрофильных и гидрофобных свойств белко- вой молекулы может обеспечить не только проникновение белка че- рез бислой, но и существенное давление на него, приводящее к изме- нению упаковки и толщины бислоя — сжиманию одних частей и рас- ширению других (рис. 1.22, а). В основе белок-липидных взаимодействий лежат межмолекулярные дисперсионные, электростатические и гидрофобные силы. Определен- ную роль играют в этом и водородные связи. Гидрофобные силы являют- ся доминирующими в связывании мембранных компонентов. Некоторые мембранные белки увеличивают свою гидрофобность с помощью кова- лентного присоединения липидных компонентов, чаще всего в этом ка- честве выступают миристиновая С14.0- или пальмитиновая С16.0-жирные кислоты или гликозилфосфатидилинозитол. Белки, связанные с жирными кислотами, локализованы в основном на цитоплазматической поверхно- сти плазматической мембраны, а белки, связанные с гликозилфосфа- тидилинозитолом, — на наружной ее стороне. В структуре многих мембранных белков, как правило, четко выяв- ляются участки, ответственные за их биологическую активность. Очень часто биологически активный участок состоит преимуществен- но из полярных аминокислот, тогда как структурные домены постро- ены главным образом с участием аминокислот с неполярными радика- лами. Поэтому можно предположить, что полярная часть мембранно- го белка контактирует с цитоплазмой и с полярными «головками» липидов и обеспечивает функциональную активность белка, а непо- лярная часть контактирует с углеводородными цепями липидных мо- лекул и обеспечивает структурную устойчивость молекулы. Следова- тельно, мембранные белки обычно взаимодействуют с мембраной с помощью нековалентных взаимодействий двух ти- пов: электростатических (на уровне полярных «головок» фосфо- липидов) и гидрофобных (в толще бислоя). Анализ аминокислотного состава некоторых мембранных белков показал, что они содержат примерно столько же полярных аминокис- лот, сколько и обычные водорастворимые белки. Причина их гидро- фобности кроется не в аминокислотном составе, а в порядке чередова- ния аминокислотных остатков — гидрофобные аминокислотные ради- калы сконцентрированы в гидрофобные домены. Эти белки упакованы в мембранный бислой таким образом, что их неполярные участки кон- тактируют с гидрофобными участками бислоя. Белки, функционирующие в пределах бислоя, обладают способно- стью формировать в мембране межбелковые функциональные струк- туры — олигомерные ассоциаты. Белок-белковые взаимодействия
1.6. Белок-липидные взаимодействия проявляются в виде обратимой внутримембранной агрегации мемб- ранных белков, часто сопровождающейся изменением функциональ- ной активности системы. Циклы агрегация-дезагрегация белков в клеточных мембранах — широко распространенное явление, прояв- ляющееся при пиноцитозе, на ряде стадий клеточного цикла, при взаимодействии и слиянии мембран и т. д. Активность некоторых мембранных ферментов зависит от присутствия определенных липидов. Например, для достижения максимальной актив- ности Na/K-АТФазы требуются фосфатидилсерин, фосфатидилглицерол. Эти ферменты проявляют специфичность по отношению к полярным «го- ловкам» липидов, но их активность мало зависит от жирнокислотного со- става. В противоположность этому функциональная активность, напри- мер, родопсина коррелирует с длиной углеводородных цепей липидов. Холестерин играет роль регулятора микровязкости липидной части мембраны, изменяя подвижность жирнокислотных цепей фосфолипи- дов, необходимых для нормального функционирования мембранных компонентов. Содержание холестерина в клеточной мембране, вызы- вая изменение микровязкости, влияет на конформацию мембранных белков, таких как субъединицы рецепторов и ионных каналов, тем самым регулируя их активность. Примером модификации мембран липидного бислоя белками-фер- ментами является действие фосфолипаз, которые играют значитель- ную роль в функционировании мембранных структур мозга. Активация фосфолипазы А2 постулирована как один из ключевых звеньев транс- мембранной передачи химических сигналов. Фосфолипаза С принима- ет участие в метаболизме фосфолипидов, который сопряжен с регуля- цией транспорта ионов кальция внутрь нервной клетки. Фосфолипа- за D участвует в метаболизме церамидов — важных составных компо- нентов липидов мозга. Активация фосфолипаз в определенных условиях физиологически обусловлена. Функционирование этих ферментов обеспечивает не толь- ко протекание необходимых метаболических процессов, но и одновре- менную модификацию липидного бислоя мембран нейронов и глиальных клеток. Обработка фосфолипазой приводит к изменению параметров процесса возбуждения — длительности возбуждающего потенциала и величины потенциала покоя. Воздействие фосфолипаз на мембраны си- наптических окончаний мозга приводит к их деполяризации. Функционирование биологических мембран реализуется за счет поддержания на определенном уровне ряда их физико-химических ха- рактеристик, что требует наличия биохимических механизмов стаби- лизации биомембран.
90 раздел 1. Г’* ю • - • нг» t jPITKAHi ЦИТОСКЕЛЕТ И ГЛИКОКАЛИКС 1.7.1. Белки цитоскелета Структурные белки мембраны связаны со стороны цитоплазмы с примембранными белками, создающими белковые компоненты ци- тоскелета. Структура цитоскелета довольно лабильна, его перестрой- ки происходят постоянно и с большой скоростью. Изменчива и связь цитоскелета с мембранными белками. Ориентация белков цитоскелета, а также относительное располо- жение индивидуальных белков этой структуры достаточно хорошо ис- следованы на примере эритроцитов. Установлено, что основные прин- ципы организации цитоскелета являются общими для многих типов клеток. В состав цитоскелета входят 12 различных белков с молеку- лярной массой от 25 до 250 кДа (рис. 1.23). Функции ряда белков ус- тановлены. Эти белки придают мембране устойчивость к действию внешних факторов без утраты определенной подвижности ее компо- нентов, необходимой для обеспечения транспортных функций мемб- ран. Одновременно через белок анкирин (белок полосы 3) интеграль- ные белки мембран связываются с молекулами спектрина — основ- ного белка цитоскелета, образующего двумерную сеть, к которой прикрепляется актин. Актин цитоскелета не существует в виде отдель- а Рис. 1.23. Цитоскелет клетки: а — схема расположения белков в цитоскелете эритроцитов: / — спектрин; 2 — ан- кирин; 3 — белок полосы 3,4 — белок полосы 4.1; 5 — белок полосы 4.9; 6 — олигомер актина; 7 — белок полосы 6; 8 - гликофорин; 9 — липидный бислой; б — электрофо- реграмма белков цитоскелета: 1, 2 — спектрины; 2.1 — анкирин; 5 — актин; 6 — не- идентифицированный белок; 7 — тропомиозин; 8, 9, 10 — гликофорины; остальные белки обозначены цифрами, соответствующими их положению на электрофореграмме
1,7. Цитоскелет и гликокаликс 9: 1 I них глобул, а образует микрофиламенты — сократительный аппарат цитоскелета. С промежуточными филаментами цитоскелета связана также на- ружная ядерная мембрана. Они фиксируют положение ядра в объеме цитоплазмы. Митохондрии перемещаются в клетке также при участии элементов цитоскелета. К цитоскелету примыкают микротрубоч- ки (нейротубулы), образуемые при полимеризации глобулярного белка тубулина. Основная роль микротрубочек заключается в обеспечении при- мембранного транспорта веществ, секреции, эндоцитоза. Микротру- бочки и микрофиламенты цитоскелета обеспечивают противодействие клетки изменению ее объема и придают эластичность мембране. Цитоскелет придает мембране дополнительную прочность. Однако роль структурных белков не ограничивается лишь функцией остова, на котором крепятся липиды и ферменты. Известно, например, что струк- турные белки взаимодействуют со многими низкомолекулярными со- единениями, в том числе с АТФ, и могут влиять на работу мембранных ферментов. Достаточно заменить одну аминокислоту в составе струк- турного белка митохондрий, для того чтобы нарушить многоэтапный процесс сборки ферментов митохондриальной дыхательной цепи. Бла- годаря динамическим свойствам цитоскелета изменения в его структу- ре позволяют клетке проявлять гибко-эластичные свойства, изменять свою форму. В той области клетки, где спектриновая сеть цитоскелета разрушается, могут образовываться впячивания или возникать отшну- ровывающиеся части клетки. Специфические структурные белки нервной ткани обеспечивают ее общую динамичность и механическую подвижность синаптических кон- тактов нейрональной клетки, участвуя в самосборке и распаде специ- фических структур — нейротубул, нейрофиламентов и других преси- наптических и постсинаптических образований, в переносе различных соединений между разными областями нейрона, а также в поддержании и модуляции пространственного положения частей нейрона. Механические функции клеток требуют взаимодействий между ин- тегральными мембранными белками и цитоскелетом. Эти функции включают эндо- и экзоцитоз, формирование объединений клеток и ре- гулирование их формы. Спектрин-анкириновая сеть. В большинстве клеток основная структурная связь плазматических белков и цитоскелета опосредова- на взаимодействиями между анкирином и различными интегральными Мембранными белками, ионными насосами и ионными каналами. Ан-
Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ кирин соединяется с гетеродимером спектрина и таким образом обес- печивает прикрепление цитоскелета к плазматической мембране. Длинная фибриллярная молекула спектрина состоит из двух полипеп- тидных цепей (220 и 240 кДа). Димеры спектрина формируют сеть, располагающуюся параллельно плазматической мембране. Нейро- ны содержат две изоформы спектрина — спектрин I (эритрин) и спектрин 11 (фодрин). Спектрин II обнаружен во всех частях нейро- нов, включая аксоны и синаптические окончания, тогда как спектрин I встречается только в теле нейрональной клетки и в дендритах. Обра- зуемая ими спектриновая сеть связывается с актиновыми нейрофила- ментами. Эти ассоциаты, возможно, являются динамическими обра- зованиями, но, может быть, они просто снижают подвижность белков в плоскости мембран. Например, фосфорилирование анкирина может изменить его сродство к спектрину. Фодрин — нейроспецифический белок, который принимает учас- тие в процессах синаптической передачи. Это структурный белок постсинаптических мембран глутаматергических синапсов. Его моле- кулярная масса составляет 230 кДа. Фодрин проявляет способность блокировать активность рецепторов глутамата. Повышение концент- рации ионов Са2+ вблизи постсинаптической мембраны активирует мембранную Са-зависимую протеиназу кальпаин, расщепляющую фодрин. Это возвращает активность глутаматным рецепторам, ранее экранированным фодрином; повышение проводимости синапсов при этом наблюдается в течение 3—6 суток. Внутриклеточный мембранный транспорт — важный процесс для эукариотических, в том числе нервных, клеток. Внутриклеточные мембраны организованы в компартменты, и транспорт веществ между компартментами требует высокой специфичности и регулирования. Межкомпартментный транспорт обычно осуществляется с помощью везикул, образующихся в компартменте, являющемся донором, кото- рые затем транспортируются и присоединяются к акцепторному ком- партменту. Белок клатрин впервые был выделен из мембран так называемых окаймленных пузырьков, принимающих участие в эндо- цитозе и быстром внутриклеточном транспорте веществ. Этот фиб- риллярный белок (180 кДа) образует характерный многоячеистый чехол из пяти- и шестиугольных пептидных цепей на поверхности окаймленных пузырьков. Данная сеть формируется в результате нековалентных свя- зей между «трехлопастными» молекулами клатрина, каждая из кото- рых состоит из трех тяжелых и трех легких полипептидных цепей двух типов. Легкие цепи клатрина активно связывают Са2+ в молярном соотношении 1:1.
11.7. Цитоскелет и гликокаликс Помимо клатрина в состав такого чехла входит так называемый «белок сборки чехла» (50 кДа), который может подвергаться обрати- мому фосфорилированию для регулирования процесса эндоцитоза. При полимеризации клатрина на цитоплазматической стороне плаз- матической мембраны в результате ее впячивания образуются пу- зырьки с заключенными в них мембранными рецепторами. Везикулы, одетые «клатриновым чехлом», также вовлекаются в экспорт белка. Функция клатрина состоит в обеспечении некоторых форм эндоци- тоза, в особенности процесса так называемой интернализации — «втягивания» в цитоплазму клетки больших групп пептидных рецеп- торов, связавшихся со своим лигандом. В последнее время эта форма транспорта веществ в цитоплазму нервной клетки привлекает все большее внимание. В данном процессе Rab-белки (являющиеся по своей природе ГТФазами) играют центральную роль, регулируя обра- зование везикул, их подвижность и слияние. Они принадлежат к се- мейству G-белков. Большое количество этих белков было идентифи- цировано в клетках млекопитающих; каждый из них, как оказалось, регулирует определенный шаг в цепи молекулярных событий, связан- ных с процессами образования, транспорта и слияния везикул. НаЬ5-ГТФаза — регулятор ранних этапов эндоцитоза в клетке. Этот белок играет важную роль в формировании везикул «клатрино- вого чехла» в плазматической мембране, в их слиянии с первичными эндосомами, а также в их слиянии между собой; он также важен для нейрофиламентзависимой подвижности эндоцитозных везикул. К актомиозиноподобным белкам ЦНС относится нейростенин. Он состоит из двух белков — нейрина и стенина. Взаимодействуя меж- ду собой, они образуют комплекс — нейростенин (47—50кДа). По структуре и функциям он имеет много общего с мышечным актоми- озином, хотя и не идентичен ему. Нейростенин обладает АТФазной активностью и активируется ионами Са2+ и Mg2+. Количество нейростенина в мозге составляет около 1 —1,5% от общего белка; в синаптических образованиях его содержание достигает 8—10%. Нейрин локализован преимуществен- но в пресинаптических мембранах, а стенин — на наружной поверх- ности мембран везикул. С образованием нейростенина в присутствии АТФ и ионов Са2+ связывают контакт везикул с пресинаптическими мембранами. Полагают, что сократительные белки мозга, в том числе нейростенин, участвуют в раскрытии везикул и выходе нейромедиато- ра в цитоплазму и синаптическую щель. В локальном изменении микровязкости мембраны в области слияния с ней везикул (синапти- ческих пузырьков или эндосом), называемом иногда «локальным
*4 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ плавлением», важную роль играют также синапсины и другие Са-связывающие белки. Некоторые периферические белки мембраны могут также рас- сматриваться как белки цитоскелета — они ковалентно заякоривают- ся к внешней поверхности мембраны через гликозилированные мемб- ранные фосфоинозитиды. Примером таких белков являются щелочная фосфатаза, 5'-нуклеотидаза, одна из форм ацетилхолинэстеразы и гликопротеин NCAM. Белки цитоскелета спектрин и аннексины (се- мейство белков цитоскелета, которые образуют Са-зависимые ассо- циаты с мембранами клетки в области локализации фосфатидил сери- на) также специфически концентрируются у клеточной мембраны в местах локализации фосфатидил инозита и фосфатидилсерина, соот- ветственно. Некоторые белки цитоскелета становятся мембраносвя- занными в ответ на активацию кальцием. Это протеинкиназа С, фос- фолипаза А2 и синаптотагмин. Часто связывание с мембраной вызывает аллостерическое измене- ние гидрофобности белков и модифицирует их свойства. Один из са- мых известных случаев такого рода — Са-зависимое связывание кальмодулина с другими белками. 1.7.2. Гликокаликс Экстраклеточный матрикс, или так называемый гликокаликс, влияет на многие макромолекулярные процессы, протекающие с учас- тием клеточной мембраны: ионный обмен, проницаемость, эндо- и эк- зоцитоз, межклеточные контакты, морфогенетическую и тканеспеци- фическую агрегацию клеток. Гликокаликс представляет собой внешний по отношению к клеточ- ной мембране слой. Он состоит из гликопротеинов, протеогликанов и глюкозаминогликанов и связывается с мембранными структурами с по- мощью специальных белков, объединяя цитоскелет, мембрану и вне- клеточный матрикс в подвижную структуру (рис. 1.24). Как показали электронно-микроскопические исследования, гликокаликс имеет вид о рыхлого волокнистого слоя толщиной 30—49 А, покрывающего всю поверхность клетки. В состав гликокаликса входят полисахаридные цепочки мембранных интегральных белков — гликопротеидов. Они содержат такие углево- ды, как манноза, глюкоза, сиаловая кислота и др. Углеводные гетеро- полимеры гликокаликса образуют ветвящиеся цепочки, между которы- ми располагаются свободные гликолипиды и протеогликаны. Слой гл и-
L.7. Цитоскелет и гликокаликс 9£ ’ис. 1.24. Взаимодействие цитоскелета с гликокаликсом: — протеогликан; 2 — коллаген; 3 — фибронектин; 4 — молекулы актина; 5 — ин- егральные белки мембраны, подобные белку полосы 3 юкаликса сильно обводнен, имеет желеобразную консистенцию, что начительно снижает диффузию различных веществ из клетки. Здесь ке могут накапливаться выделенные клеткой гидролитические фер- менты, участвующие во внеклеточном расщеплении полимеров до мо- юмерных молекул, которые затем транспортируются в клетку. Гликокаликс содержит внешние компоненты рецепторов гормо- юв, нейромедиаторов, ростовых факторов, нейропептидов, антиге- юв. Он представляет собой комплексную динамичную систему, тесно ссоциированную с мембраной: изменения свойств отдельных компо- нентов мембраны приводит к глубоким изменениям матрикса. Специфичность гликокаликса определяется первичной структурой нлигосахаридной части гликопротеинов, гликолипидов, гликозамино- гликанов; их конформацией и положением относительно плоскости мембраны; площадью, занимаемой гликопротеинами и гликолипидами.
96 Раздел ]. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАН. Состав, структура и динамическая подвижность гликозилирован- ной «шубы» гликокаликса влияют на функции деления, роста, диффе- ренциацию и гибель клетки. Особая роль в этом принадлежит глико- липидам и главным образом кислым гликолипидам — ганглиозидам. Общая характеристика ганглиозидов. Ганглиозиды— спе- цифические липиды гликокаликса нейрональных мембран. Кислые гли- колипиды — ганглиозиды находятся в нервной ткани в высоких кон- центрациях (табл. 1.12) и обнаруживаются преимущественно в возбу- димых мембранах. Ганглиозиды — общее название гликосфинголипидов, в составе которых присутствует сиаловая кислота. Они содержат гидрофобную церамидную часть и гидрофильную, богатую заряженными группами олигосахаридную часть. На рисунке 1.25 приводится структура моно- сиалоганглиозида головного мозга. Гидрофобная часть ганглиозидов включает две длинные углеводородные цепочки — углеводородную цепочку сфингозина и жирную кислоту, которая связана с аминогруп- пой сфингозина пептидной связью. Обращает на себя внимание почти полное отсутствие в ганглиозидах мозга гидроксикислот, кетокислот и разветвленных жирных кислот. Состав сфингозиновых оснований ганглиозидов головного мозга не отличается большим разнообразием. Таблица 1.12. Содержание ганглиозидов в тканях человека, нмоль липидосвязанной сиаловой кислоты на 1 г свежей ткани (по: Ledeen, 1983) Ткань Концентрация Нервная ткань Серое вещество головного мозга 2850—3530 Белое вещество головного мозга 900—1570 Серое вещество спинного мозга 751 Белое вещество спинного мозга 450 Сетчатка 366 Седалищный нерв 259 Надпочечники 407—757 Печень 214 Мышцы 52 Плазма и,з Спинномозговая жидкость 0,841
^,7. Цитоскелет и гликокаликс 97 NH ОН О=< СН2ОН СН2ОН СН2ОН СН2ОН [ ОН NHCOCH3 он он CH3COHN соон неон сон СН2ОН ОН Рис. 1.25. Структура моносиалоганглиозида В ганглиозидах встречаются главным образом четыре основания: сфингозин (4-сфингенин) и дигидросфингозин (сфинганин), содержа- щие 18 атомов углерода, а также С20-сфингозин (4-эйкозасфенгенин) и С20-дигидросфингозин (эйкозасфинганин). Таким образом, углеводородная часть ганглиозидов мозга млеко- питающих достаточно консервативна относительно длины, числа и места двойных связей, а также присутствия метильных групп. Разветвленная олигосахаридная часть присоединена P-связью к ОН-группе первого атома углерода сфингозина. Большинство гангли- озидов мозга имеют общую нейтральную углеводную часть, содержа- щую первой в последовательности молекулу глюкозы, затем молекулу галактозы (интернальная галактоза), ацетилированный галактозамин, вторую молекулу галактозы (терминальная галактоза) и различное число молекул N-ацилнейраминовой кислоты (NANA), прикреплен- ных либо к интернальной, либо к терминальной галактозе. Олигосахаридная часть является доминирующей в проявлении фи- зических, химических и иммунологических свойств молекул ганглиози- дов. Различия в строении олигосахаридной части порождают высокую гетерогенность этих соединений. К настоящему времени в нервной тка- ни м. юкопитающих выявлено свыше 50 различных ганглиозидов, при- чем число их продолжает увеличиваться. Недавно описаны гекса- и Декасиалоганглиозиды, имеющие соответственно шесть или десять сиаловых кислот на церамидный остаток. В силу большей, чем у фосфолипидов, гидрофобности ганглиозиды Повышают жесткость липидного бислоя и тесно взаимодействуют с фос- фолипидами и интегральными белками мембраны. Увеличение числа углеводородных атомов и ненасыщенности сфингозина, изменение природы жирной кислоты ганглиозидов вызы-
98 раздел 1. СТРуКТЧ’рд НЕРВНОЙ ТКАНИ вают конформационные изменения в близлежащих белках. Церамид- ная часть молекулы участвует в выборе определенного состава фос- фолипидов, белков и холестерина в окружении индивидуальных ганг- лиозидов. Организация ганглиозидов в мембранах головного мозга. Ганглиозиды обнаружены фактически в каждом типе клеток и большинстве субклеточных образований ЦНС. Ганглиозиды локализо- ваны главным образом в синаптических мембранах (которые составля- ют примерно 6% сухой массы мозга), причем обнаружена корреляция между накоплением ганглиозидов и интенсивностью синаптогенеза (образования синапсов, ветвления аксонов) во время формирования мозга. Использование специальных методов показало, что ганглиозиды локализованы на наружной стороне пре- и постсинаптических терми- налей, принимающих непосредственное участие в передаче нервного импульса. Молекулы ганглиозидов в мембране высокоподвижны, что, с одной стороны, создает локальную неустойчивость мембраны, а с другой — поддерживает ее целостность. Молекулы ганглиозидов не подвержены «флип-флопу», но способны к латеральной диффузии с изменяющейся в широких пределах скоростью. Несмотря на большую подвижность, ганглиозиды не вносят ха- отичности в распределение компонентов мембраны. Это достигается, во-первых, образованием ковалентных связей между олигосахарид- ными цепочками гликопротеинов и гликолипидов, образующих в мембране устойчивые комплексы. Во-вторых, гликолипиды и глико- протеины могут соединяться с периферическими гликозаминоглика- нами, которые, как правило, свободно диффундируют в бислой и обра- зуют с гликолипидами и гликопротеинами ионные и водородные связи, создавая своеобразный латекс (рис. 1.26). В-третьих, ограничение ла- терального движения гликолипидов достигается сосредоточением их в определенных областях с повышенной вязкостью. В-четвертых, то- пографию поверхности мембраны стабилизирует цитоскелет клетки. Различные поливалентные лиганды гликопротеиновой природы вовлекают цитоскелет в перераспределение мембранных гликолипи- дов в определенные структурные ассоциаты. Степень их агрегации за- висит от взаимодействия олигосахаридных структур с лектинами. Как правило, плотные массы олигосахаридных цепочек гликопро- теинов служат центром, вокруг которого увеличивается упаковка ганглиозидов. Нековалентное кооперативное взаимодействие ганглио- зидов приводит к тому, что в участках их скопления резко возрастает
г 7. Цитоскелет и гликокаликс 99 Гликозилированная часть белка ..зжжжжжжж Белковая молекула Рис. 1.26. Схематическое изображение упаковки молекулы гликолипида в мембране. Гликозильные радикалы белка включаются в состав гликокаликса, белковая молекула погружена в бислой величина отношения ганглиозидов к фосфолипидам. В результате микровязкость данных локусов мембраны увеличивается, ганглиозид- ные кластеры из-за взаимного отталкивания отрицательно заряжен- ных сиаловых кислот становятся нестабильными и мембранный по- тенциал в этом локусе локально возрастает. Участки, занятые заряженными молекулами ганглиозидов, имеют повышенное сродство к экзогенным гидрофильным лигандам, а облас- ти, свободные от ганглиозидов, осуществляют гидрофобное взаимо- действие с лигандами. Взаимодействия такого рода вызывают разно- образные структурные перестройки в мембране, которые оказывают влияния на состояние клетки. Участие ганглиозидов в дифференциации клеток. Ганглиози- ды — важные элементы клеток, которые выполняют разнообразные биологические функции, включая клеточное узнавание, адгезию и пе- редачу сигналов. Ганглиозиды могут оказывать влияние на такие фи- зиологические процессы, как эмбриогенез и дифференциация нейро- нальных клеток и лейкоцитов. Участвуя в дифференциации клеток, ганглиозиды вызывают их морфологические изменения, проявляя нейритогенный эффект. Структура и количество ганглиозидов меня- ются в процессе развития клеток по мере формирования нейрон-ней- рональных взаимодействий. Многочисленные исследования показали,
100 раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ что уровень ганглиозидов во время клеточной дифференциации замет- но повышается, что хорошо коррелирует с изменением активности гли- козилтрансфераз, ответственных за биосинтез этих липидов. Актив- ность гликозилтрансфераз может регулироваться на нескольких уров- нях, включая транскрипционный и посттрансляционный контроль. Таким образом, уровень и пространственное распределение ганглиози- дов в нервной системе регулируются биосинтезом этих специфических липидов в процессе развития организма. Ганлиозиды участвуют в межклеточных взаимодействиях, регули- руют активность рецепторных тирозинкиназ в плазматической мемб- ране, также как и рецепторов эпидермального фактора роста, фактора роста нерва, инсулина, и таким образом могут регулировать процессы клеточной сигнализации. Воздействие ганглиозидов на рецепторы фактора роста осуществляется в три этапа: вначале — модуляция за- крепления лиганда ганглиозидами; далее — регулирование димериза- ции рецептора и в завершение — вовлечение ганглиозидов в актива- цию рецептора. Ганглиозиды распределены по поверхности клетки неравномерно и в комплексе с сфингомиелином и холестерином входят в состав специ- фических рафтов, которые являются физиологической средой для раз- мещения разнообразных рецепторных белков. 1.7.З. Белки гликокаликса Значительная часть (до 90%) всех углеводов и их производных, содержащихся в головном мозге в связанном виде, приходится на до- лю гликопротеинов. Гликопротеины являются непосредственными участниками межклеточных контактов, обеспечивая взаимное узнава- ние определенных нейронов, они участвуют в синаптической передаче, рецепторных реакциях, формировании и хранении памяти, входят в состав сложных надмолекулярных образований синаптических мемб- ран и других цитоструктурных элементов. В этих белках углеводный компонент характеризуется более высо- кой метаболической активностью по сравнению с пептидной частью молекулы. Обращает на себя внимание тот факт, что гликопротеины, содержащие гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, гепаринсуль- фат, сосредоточены в перикарионе нейрона, в аксоне и нейроглии (астроцитах, олигодендроцитах), но отсутствуют в мембранах синап- тических окончаний и митохондрий. Ввиду большого разнообразия гликопротеинов до сих пор не раз- работан единый принцип их классификации. Обычно гликопротеины
j.,7. цитоскелет и гликокаликс 101 делят на д в е основные группы по соотношению белков и углеводов в составе их молекул. Первая группа гликопро- теинов содержит от 5 до 40% углеводов и их производных. Белковая часть этих гликопротеинов сходна с альбуминами и глобулинами. Между пептидными и углеводными компонентами осуществляются не только ковалентные, но и водородные, гидрофобные и вандерваальсо- вы связи. Вторая группа гликопротеинов содержит большее количество углеводов — от 40 до 85%; в их состав иногда входят липидные ком- поненты. В последнем случае образуются более сложные комплек- сы — гликолипопротеины. В состав одного из гликолипопротеинов, выделенных из серого вещества головного мозга человека (180 кДа), входят 208 остатков галактозы, 26 остатков глюкозы, 36 — галакто- замина, 150 — нейраминовой кислоты, 100 — лигноцериновой кис- лоты, 100 — сфингозина. Пептидная часть состоит из 61 аминокис- лотного остатка: 13 — глутамата, 10 — глицина, 10 — пролина, 8 — серина, 6 — аланина; остальные аминокислоты содержатся в незна- чительных количествах. Как видно, пептидная часть молекулы доволь- но монотонна по составу. Углеводный компонент гликопротеинов включает в первую оче- редь N-ацетилнейраминовую кислоту и N-ацетилгалактозамин; эти соединения играют специфическую роль, определяя, по-видимому, своеобразие внешних участков пространственной структуры глико- протеинов. Пептидная часть представляет собой стабильную основу (каркас) молекулы, которая фиксирована непосредственно в мембра- не, в то время как углеводный компонент расположен на ее поверхно- сти. Прослеживается аналогия с молекулярной структурой ганглиози- дов, у которых каркасом служит церамидная часть (жирнокислотный эфир сфингозина), а углеводные компоненты и их производные (га- лактозамин, N-ацетилнейраминовая кислота и др.) составляют наибо- лее вариабельную и специфичную часть молекулы. Первыми нейроспецифическими гликопротеинами, выделенными из ткани мозга, были цитозольные (растворимые) гликопротеины, однако в дальнейшем оказалось, что многие из них существуют и в мембраносвязанной форме. Особый интерес представляют поверхностные гликопротеины, участвующие в клеточной адгезии. Довольно хорошо исследовано шесть таких белков: D2 (139 кДа), NCAM, К4, BSP-2 (семейство бел- ков 120—180 кДа), Ng-CAM и L-1. Первые четыре белка обеспечи- вают гомотипическую адгезию между нейронами. Характерной осо-
102 Раздел 1. СТРукТУг АнEr t HLЯ ТнАНИ бенностью является модификация их структуры в ходе онтогенеза, которая затрагивает, в основном, углеводную часть молекулы. И в эмбриональный период (во время интенсивной миграции нейро- нов), и в течение постнатального развития (в стадии активного синап- тогенеза) нейроспецифические белки клеточной адгезии представлены в значительной мере полисиалогликопротеинами. В мозге взрослых животных они модифицируются в олигосиало- или асиалогликопроте- ины, состоящие из двух-трех полипептидных цепей. Предполагается, что модуляция адгезии происходит именно благодаря изменению числа остатков сиаловых кислот в полисиалогликрпротеинах. Определенные трансмембранные гликопротеины могут способст- вовать взаимодействию между цитоскелетом и внеклеточной матри- цей, таковыми являются белки интегрины. Кадгерины — Са-зависимые белки адгезии, которые в значитель- ной степени ответственны за слипание клеток. Внутри клеток они ас- социированы с актиновыми нейрофиламентами с помощью белков, названных катенанами. Молекулы адгезии нейрональных клеток (NCAM) принадлежат широко распространенному семейству гликопротеинов клеточной по- верхности, внеклеточные домены которых структурно подобны доме- нам иммуноглобулинов (рис. 1.27). Два из них представляют собой трансмембранные гликопротеиназы с идентичными внеклеточными доменами и различными цитоплазматическими доменами. Третий не относится к трансмембранным белкам и не участвует в процессах кле- точной сигнализации, поскольку является внеклеточным гликопро- теином, «заякоренным» в мембрану ковалентной связью с гликозил- фосфатидилинозитолом. По сравнению с белком NCAM, влияющим на межнейронные кон- такты, белок Ng-CAM содержит меньше сиаловых кислот. Он лока- лизован исключительно на поверхности плазматической мембраны нейронов и появляется в онтогенезе позднее, чем гликопротеин NCAM. В постсинаптических уплотнениях и участках синаптических соеди- нений обнаружен целый ряд других гликопротеинов: NSA-3, МВА-2, Thy-I. Они могут служить субстратами для протеиназ и сиалидаз, под действием которых происходят локальные модификации структуры гликопротеинов в ответ на изменение функционального состояния си- напса. Интересно, что аминокислотная последовательность гликопро- теина Thy-1 обнаруживает гомологию с вариабельными доменами им- муноглобулина. Роль этого гликопротеина на поверхности нейронов остается невыясненной.
,Л. Цитоскелет и гликокаликс DCC-R Ll,Ng-CAM COO- COO- COO- COO- NHJ UNC-5, Netrin-R NH3 FGR-R NH3 Домены тромбоспондина I типа coo- coo- 1 2 3 4 5 6 7 8 Eph А, В : DPTP69D NHJ Cys L Cys Домен П П протеин- т киназы соо- соо- Домены тирозин- фосфатазы соо- 10 11 Рис. 1.27. Структура различных представителей суперсемейства иммуно- глобулинов: 1—3 — белки только с иммуноглобулиновыми доменами во внеклеточном сегменте; 4—7 — белки с иммуноглобулиновыми и фибронектиновыми доменами во внеклеточ- ном сегменте; 6 — белок с GPI-якорем; 8 — белок с иммуноглобулиновыми и тром- боспондиновыми доменами во внеклеточном сегменте; 9 — белки-рецепторы с проте- инкиназными доменами; 10 — белок-рецептор, содержащий области, обогащенные цистеином; / / — белок-рецептор с протеинфосфатазными доменами. Члены надсе- мейства иммуноглобулинов характеризуются многочисленными повторами дисульфид- ных мостиков, гомологичными доменам, впервые описанным в постоянной части мо- лекул иммуноглобулина. Многие из этих молекул клеточной адгезии также содержат несколько доменов, сходных с повторами в фибронектине III типа (показано в виде прямоугольников) На плазматических мембранах мозга обнаружены также относи- тельно низкомолекулярные гликопротеины, которые обладают спо- собностью ингибировать клеточное деление и синтез белка в культуре нормальных клеток мозга. По своей структуре это небольшие глико- протеины, как содержащие фукозу (30 и 45 кДа), так и не содержащие этот моносахарид (6—10 кДа). Агрегация ганглиозидов и гликопротеинов на поверхности мембра- ны важна для поддержания контактов между клетками, поскольку конгломераты молекул обеспечивают более устойчивые контакты, чем молекулы, дисперсно разбросанные по клеточной поверхности. Подоб- ные агрегаты могут содержать различные рецепторы или несколько ко- пий одного рецептора, составлять единый рецепторный комплекс из гликолипидов и гликопротеинов. Зона мембраны, в которой происхо- дит восприятие информации, передача ее в клетку, а также иницииру- ется связь с клеточным ядром, представляет собой обширную систему гетерогенных гликозилированных молекул. Эта область является свое-
104 Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ образным «распределительным щитом» регуляторных сигналов, где молекулы гликопротеинов и ганглиозидов могут играть роль триггеров (регуляторов или трансдукторов), выполнять функции сигнальных мо- лекул на стадии дифференцировки и участвовать в определении видо- вой и тканевой специфичности. Таким образом, можно заключить, что гликопротеины и гликоли- пиды участвуют в осуществлении специфических функций нервной ткани, в большей степени — в формировании контактов между раз- личными нейронами. 1.8. МЕМБРАННЫЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ Исследования фазовых переходов в природных мембранах под- водят к одному неожиданному заключению: при всем разнообразии липидного состава клеточных мембран их свойства таковы, что усло- вия проживания разнообразных объектов находятся вблизи темпера- туры их фазовых переходов (или разделения фаз) (Шноль, 1978). Это обстоятельство можно рассматривать в пользу утверждения о том, что живые системы используют изменения упаковки мембранных липидов Е. М. Крепе Основоположник отечествен- ной школы функциональной нейрохимии, длительное вре- мя возглавлявший исследова- ния в этой области в качестве директора Института эволю- ционной физиологии и биохи- мии им. Л. А. Орбели как фактор контроля за функцией мемб- ранных белков. За счет чего происходит изменение микровязкости липидов при изменении условий среды? Ведь живые системы ис- пытывают и смену температур (например, холоднокровные животные при смене се- зонов, гибернирующие в условиях зим- ней спячки), и изменения солености и ос- мотичности среды (проходные рыбы, ухо- дящие для нереста из морей в пресные реки), да и многие другие факторы ло- кально воздействуют на упаковку липид- ного бислоя, изменяя его микровязкость в ходе клеточного цикла или экстремальных воздействий. Интересное наблюдение было сдела- но Е. М. Крепсом (1981) при сопоставле- нии липидного состава нервной ткани жи- вых существ, намеренно далеко находя- щихся друг от друга на эволюционной лестнице (рис. 1.28). Оказалось, что со-
1.8. Мембранные механизмы а даптации Та Рис. 1.28. Фосфолипиды в эволюции животного мира (в % к суммарному фос- фору фосфолипидов): / — фосфатидил инозит; 2 — фосфатидилхолин; 3 — сфингомиелин; 4 — фосфати- дилсерин; 5 — фосфатидилэтаноламин; 6 — кардиолипин (по: Крепе, 1981) отношение основных классов липидов в мозге разных видов, не объ- единенных ни генетической, ни экологической общностью, порази- тельно близко. Способностями к ориентации в пространстве, к обуче- нию, абстрактному мышлению собака, бабочка и улитка разительно отличаются друг от друга, но соотношение основных классов липидов в их нервной ткани очень похоже. Действительно, надо признать, что эволюция функций мозга осуществлялась не в результате совершен- ствования липидного состава, а не затрагивая его. Уникальное соот- ношение основных классов мембранных липидов было найдено приро- дой на самой заре зарождения жизни и с тех пор сохранялось как неос- поримое достижение эволюции. А что же позволяло мозгу (а с ним и всему организму) наилучшим образом приспосабливаться к изменяющимся условиям среды — при смене сезонов, сред обитания, природных катаклизмах? Обширными исследованиями Е. М. Крепса и его коллег (Институт эволюционной физиологии и биохимии им. Л. А. Орбели в Ленинграде, теперь — Санкт-Петербурге) было продемонстрировано, что тонкая адаптация мембран к изменяющимся условиям жизни организмов осуществляет- ся почти исключительно за счет изменений жирнокислотного состава липидов. Следовательно, можно заключить, что клеточные мембраны являются мишенью для адаптации.
106 Раздел 1.: Iгм; , г . г- г г «гнОЙ IКАНИ Стимулом к развертыванию адаптационной программы могут слу- жить сами факторы внешней среды (температура, гидростатическое давление), хотя молекулярные механизмы активации соответствую- щих ферментов пока не выяснены. По скорости осуществления меха- низмы адаптации можно разделить на краткосрочные и долгосроч- ные. Первые реализуются за счет изменения активности имеющихся ферментов, осуществляющих обмен клеточных липидов (десатураз, метилаз, ацилаз, фосфолипаз), вторые представляют собой экспрес- сию адаптационных генов. Определен ряд основных механизмов, используемых клеточными мембранами для приспособления к увеличению уровня солености сре- ды обитания, понижению температуры, возрастанию гидростатиче- ского давления (важно для глубоководных и мигрирующих рыб) и т. д. Во-первых, это активация мембранных десатураз и возрас- тание ненасыщенности жирнокислотных цепей фосфолипидов (главным образом кислых). Во-вторых, это активация фосфо- липазы Л2 и замена в молекулах фосфолипидов коротких жирно- кислотных цепей более длинными. В-третьих, это включение в мембрану дополнительного количества холестерина. Все эти процессы осуществляются достаточно быстро и обратимо, что обеспе- чивает снижение микровязкости мембран. Перечисленные компенса- торные механизмы относятся к так называемой фенотипической адаптации и позволяют мембранным белкам осуществлять свою функцию даже при тех изменениях среды, которые в обычных услови- ях привели бы к резкому возрастанию микровязкости мембран и сде- лали бы невозможным проявления жизнедеятельности. Возрастные изменения липидного состава мембран также выража- ются в изменении набора жирных кислот в молекулах липидов. Объ- ективным показателем возрастных изменений в мозге крыс служит значительное повышение доли ненасыщеных жирных кислот в составе липидов. Так, в период от 10-годо 90-го дня постнатальной жизни ин- декс ненасыщенности жирных кислот, входящих в состав фосфатидил- холина и фосфатидилэтаноламина, возрастает в 1,5—2 раза, в соста- ве сфингомиелина — более чем в 2 раза. Соответственно этому уменьшается содержание короткоцепочечной насыщенной пальмити- новой кислоты С16.0 и растет уровень докозогексаеновой С22.б и тет’ ракозотетраеновой С24.4. Интересно, что количество С18Ч (олеино- вой кислоты) повышается при этом в фосфатидолхолине, но снижает- ся в сфингомиелине (Гуляева с соавт., 2002). Остается неясным, какие изменения носят адаптационный, а какие — нежелательный, связанный со старением характер.
просы и задания ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ 1. Опишите особенности строения нейрональной клетки. 2. Каковы специфические морфологические признаки секреторных ней- ронов? 3. Назовите функции, обеспечивающие взаимодействие нервной и гумо- ральной систем организма. 4. Перечислите и охарактеризуйте типы клеток нейроглии. 5. Как происходит образование миелина в ЦНС и ПНС? 6. Какова структура и функции миелина в ЦНС и ПНС? 7. Назовите типы нервных окончаний аксонов и дайте их краткие харак- теристики. 8. Опишите роль синапсов в проведении нервного импульса. 9. Каковы особенности липидного состава нейрональной мембраны? 10. Охарактеризуйте роль ганглиозидов и цереброзидов в регуляции функ- ционального состояния нейрональных мембран. 11. Какова роль докозогексаеновой кислоты в функциональной активнос- ти головного мозга? 12. Какова роль галактолипидов (цереброзидов и сульфатидов) и холесте- рина в структуре миелина? 13. Охарактеризуйте миелинспецифичные белки. 14. Чем обусловлено качественное разнообразие белков нервной ткани? 15. Перечислите специфические функции нейрональных мембран. 16. Какие контакты образуют мембраны синаптических структур? 17. Опишите модель молекулярной организации биологических мембран Сингера и Никольсона. 18. Охарактеризуйте свойства липидных рафтов в нейрональных мембра- нах. 19. Чем обусловлено разнообразие строения липидных ассоциатов в воде? 20. Какие особенности структуры фосфолипидов приводят к спонтанному образованию бислоя? 21. От каких параметров структуры липидных молекул зависят форма и размеры липидных мицелл? 22. В чем причины трансмембранной асимметрии фосфолипидов в мемб- ране? 23. Какими параметрами регулируется фазовый переход типа «гель— жидкий кристалл»? 24. Назовите основные различия в свойствах мембранных и водораствори- мых белков. 25. Благодаря каким факторам осуществляется стабилизация структуры и функций мембранных белков? 26. Назовите виды подвижности мембранных белков, оцените их времен- ные характеристики. 27. Охарактеризуйте способы взаимодействия белков с клеточной мемб- раной.
Раздел 1. СТРУКТУРА НЕРВНОЙ ТКАНИ 28. Каково значение образования белковых олигомеров в мембране? 29. Какой тип взаимодействий между белками и липидами в мембранах является доминирующим? 30. Опишите циклы агрегации—дезагрегации белков в мембране. Каково их биологическое значение? 31. Охарактеризуйте взаимодействие белков и липидов в мембране на примере процесса активации мембранных фосфолипаз. 32. Охарактеризуйте структурное и функциональное разнообразие белков цитоскелета нейрональной клетки. 33. Какие липиды определяют функциональные особенности и структуру гликокаликса нейронов? 34. Приведите примеры гликопротеинов гликокаликса, указав их локали- зацию и клеточные функции. 35. В чем заключается биологическая роль ганглиозидов? 36. Охарактеризуйте роль агрегатов ганглиозидов и гликопротеинов в ре- ализации специфических функций нервной ткани. 37. Каким образом мембранные липиды контролируют функции мембран- ных белков? 38. Назовите краткосрочные и долгосрочные механизмы приспособления клеточных мембран к изменяющимся условиям среды. 39. Каковы молекулярные механизмы адаптации клеточных мембран, про- текающие с помощью изменений микровязкости липидного бислоя? 40. За счет чего изменяется индекс ненасыщенности мембранных липи- дов?
РАЗДЕЛ 2 МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ 2.1. ТИПЫ СИНАПСОВ И КЛАССИФИКАЦИЯ НЕЙРОМЕДИАТОРОВ 2.1.1. Синапсы в нервной системе Понятие «синапс» было введено в конце XIX в. Ч. Шеррингто- ном, подразумевавшим под этим термином структуру, которая опосре- дует передачу сигнала от окончания аксона к эффектору — нейрону, мышечному волокну, секреторной клетке. В ходе изучения синапсов морфологами, физиологами, биохимиками и фармакологами выяви- лось их значительное разнообразие, при этом обнаружились общие черты в строении и фукционировании; в итоге были выработаны прин- ципы классификации синапсов. Морфологический принцип классификации синапсов учитывает то, какими частями двух клеток они образованы и как они расположены на поверхности воспринимающего нейрона (на теле клетки, на стволе или «шипике» дендрита, на самом аксоне). Соответ- ственно различают синапсы аксо-аксональные, аксо-дендритные, аксо-соматические. Однако эта классификация не объясняет ни функциональной роли, ни механизма работы синапса. Морфологически синапс представляет собой структуру из двух демиелинизированных образований — утолщенного синаптичес- кого окончания (синаптической бляшки) на конце акцона и участка мембраны иннервируемой клетки, через синаптическую щель кон- тактирующего с пресинаптической мембраной. Основной функ- цией синапса является передача сигнала. В зависимости от способа передачи сигнала выделяют химические, электрические и смешан- ные синапсы. Они различаются по принципу работы. Механизм проведения возбуждения в электрическом синапсе ана- логичен механизму проведения возбуждения в нервном волокне — ПД пресинаптических окончаний обеспечивает деполяризацию постсинап- тической мембраны. Такая передача возбуждения возможна благодаря особенностям строения синапсов этого типа — узкая (около 5 нм) си- наптическая щель, большая площадь контакта мембран, наличие попе- речных канальцев, соединяющих пресинаптическую и постсинаптическую
110 к аздел 2. ‘.’ОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Р. Н. Глебов Известный российский ней- рохимии, автор цикла работ по функциональной нейрохи- мии синапсов мембраны и снижающих электрическое сопротивление в области контакта. Наи- более распространены электрические си- напсы у беспозвоночных и низших позво- ночных. У млекопитающих они обнаруже- ны в мезенцефальном ядре тройничного нерва между телами нейронов, в вестибу- лярном ядре Дейтерса между телами клеток и окончаниями аксона и между «шипика- ми» дендритов в нижней оливе. Электриче- ские синапсы образуются между нервны- ми клетками, однотипными по структуре и функциям. Для электрической синаптической передачи характерно отсутствие синап- тической задержки, проведение сигнала в обоих направлениях, независимость пе- редачи сигнала от потенциала пресинап- тической мембраны, устойчивость к изменениям концентрации Са2+ и Mg2+, низкой температуре, некоторым фармакологическим воздейст- виям, а также слабая утомляемость, поскольку передача сигнала не требует значительных метаболических затрат. В большинстве таких синапсов наблюдается «эффект выпрямления», когда сигнал в синап- се передается только в одном направлении. В отличие от электрических синапсов с прямой передачей возбуждения, в значительно большем количестве в нервной сис- теме позвоночных представлены химические синапсы (синапсы сне- прямой передачей сигнала). В химическом синапсе нерв- ный импульс вызывает высвобождение из пресинаптических оконча- ний химического посредника — нейромедиатора, который диффунди- рует через синаптическую щель (шириной в 10—50 нм) и вступает во взаимодействие с белками-рецепторами постсинаптической мембра- ны, в результате чего генерируется постсинаптический потенциал (рис. 2.1). Химическая передача обеспечивает одностороннее прове- дение сигнала и возможность его модуляции (усиление сигнала, а так- же конвергенция многих сигналов на одной постсинаптической клет- ке). Возможность модуляции в процессе передачи сигналов в синапсах химического типа обеспечивает формирование на их основе сложных физиологических функций (обучение, память и т. д.). К особенностям ультраструктуры химического синапса можно отнести широкую синап- тическую щель, наличие в синаптической бляшке везикул, заполнен- ных медиатором, при помощи которого передается сигнал, а в постен -
2.1. Типы синапсов и классификация нейромедиаторов Электрический синапс Рис. 2.1. Различия в устройстве электрических и химических синапсов (объяс- нение в тексте) Химический синапс наптической — многочисленных хемочувствительных каналов (в воз- буждающем синапсе — для Na+, в тормозном — для С1“). Для таких синапсов характерна задержка в проведении сигнала и большая по срав- нению с электрическим синапсом утомляемость поскольку их функци- онирование требует значительных метаболических затрат. Выделяют два основных подтипа химических синапсов. Первый (так называемый асимметричный) харак- теризуется синаптической щелью шириной около 30 нм, сравнительно большой зоной контакта (1 —2 мкм), значительным накоплением плот- ного матрикса под постсинаптической мембраной. В пресинаптической бляшке накапливаются большие везикулы (диаметр 30—60 нм). Хими- ческие синапсы второго подтипа имеют синаптическую щель Шириной около 20 нм, сравнительно небольшую зону контакта (менее 1 мкм), умеренно выраженные и симметричные уплотнения мембран. Для них характерны небольшие везикулы (диаметр 10—30 нм). Пер- вый подтип представлен, в основном, аксодендритными, возбуждаю- щими (глутаматергическими), второй — аксосоматическими, тормоз- ными (ГАМК-ергическими) синапсами. Однако это деление достаточ- но условно, поскольку холинергические синапсы обнаруживают на электронных микрофотографиях светлые везикулы диаметром 20—
112 кгздел 2. МОПЕКуЛяРНАя НЕЙРОХИМИЯ 40 нм, а моноаминергические (особенно с норадреналином) — боль- шие плотные везикулы диаметром 50—90 нм. Еще один принцип классификации синапсов — по веществу, используемому в качестве медиатора (холинергиче- ские, адренергические, пуринергические, пептидергические и т. д.). Несмотря на то что в последние годы было показано, что в одном окончании могут функционировать медиаторы различной природы, эта классификация синапсов до сих пор остается широко употребляемой. 2.1.2. Медиаторы, нейромодуляторы, комедиаторы Нейромедиатор (нейротрансмиттер, нейропередатчик) — это вещество, которое синтезируется в нейроне, содержится в преси- наптических окончаниях, высвобождается в синаптическую щель в от- вет на нервный импульс и действует на специальные участки постси- наптической клетки, вызывая изменения мембранного потенциала и метаболизма клетки. А. Лайта Нейрохимик, широко извест- ный своими работами по изу- чению регуляторных функций нейромедиаторов в мозге, в частности гамма-аминомасля- ной кислоты и глицина, а так- же процессов повреждения и восстановления в мозге; автор и редактор периодического из- дания «Handbook of neuro- chemistry» (США) До середины прошлого века к меди- аторам относили только амины и амино- кислоты, однако открытие нейромеди- аторных свойств у пуриновых нуклеотидов, производных липидов и нейропептидов значительно расширило группу медиато- ров. В конце прошлого века было показа- но, что некоторые АФК также обладают свойствами, сходными с медиаторами. По химическому строению медиаторы являются неоднородной группой (рис. 2.2). В нее входят эфир холина (ацетилхолин); группа моноаминов, включающая катехо- ламины (дофамин, норадреналин и адре- налин); индоЛы (серотонин) и имидазолы (гистамин); кислые (глутамат и аспартат) и основные (ГАМК и глицин) аминокис- лоты; пурины (аденозин, АТФ) и пепти- ды (энкефалины, эндорфины, вещество Р). К этой же группе примыкают вещества, которые не могут быть классифицирова- ны как истинные нейромедиаторы — сте- роиды, эйкозаноиды и ряд АФК, прежде всего NO.
!,1. Типы синапсов и классификация нейромедиаторов 11 I II СНз—N+—СН2—СН2—О—С—СНз I СНз Ацетилхолин Аминокислоты nh2 I ноос—сн2—сн2—сн—соон Глутамат NH2 I НООС—сн2 — сн2—сн2 ГАМК Моноамины Норадреналин НО Пептиды Туг—Gly—Gly—Phe—Met Л4ет-энкефалин Arg-Pro—Lys-Pro-GIn-GIn-Phe-Phe-Gly—Leu-Met-NH2 Вещество P Рис. 2.2. Химическая структура классических нейромедиаторов и нейропептидов Для решения вопроса о нейромедиаторной природе какого-либо соединения используется ряд критериев. Основные из них изложены ниже. 1. Вещество должно накапливаться в пресинаптических окончаниях, высвобождаться в ответ на приходящий импульс. Пресинаптическая об- ласть должна содержать систему синтеза этого вещества, а постсинап- тическая зона — обнаруживать специфический рецептор для данного соединения. 2. При стимуляции пресинаптической области должно происходить Са-зависимое выделение (путем экзоцитоза) этого соединения в межси- наптическую щель, пропорциональное силе стимула. 3. Обязательная идентичность эффектов эндогенного нейромедиато- ра и предполагаемого медиатора при его аппликации на клетку-мишень и возможность фармакологического блокирования эффектов предпола- гаемого медиатора (табл. 2.1). 4. Наличие системы обратного захвата предполагаемого медиатора в пресинаптические терминали и/или в соседние астроглиальные клет- ки. Возможны случаи, когда обратному захвату подвергается не сам медиатор, а продукт его расщепления (например, холин после расщеп- ления ацетилхолина ферментом ацетилхолинэстеразой).
114 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Таблица 2.1. Влияние лекарственных препаратов на различные этапы медиаторной функции в синаптической передаче Этапы Модифицирующее влияние Результат воздействия Добавка предшественника t Синтез медиатора Блокада обратного захвата 1 Блокада ферментов синтеза 1 Накопление Торможение захвата в везикулы и Торможение связывания в везикулах и Стимуляция тормозных ауторецепторов 1 Выделение (экзоцитоз) Блокада ауто рецепторе в t Нарушение механизмов экзоцитоза 1 Действие Эффекты агонистов на рецепторы t на рецепторы Блокада постсинаптических рецепторов I Блокада обратного захвата нейронами и/или глией t Разрушение медиатора Торможение разрушения в нейронах t Торможение разрушения в синаптической щели t Применение различных методов тестирования медиаторной функ- ции, в том числе и самых современных (иммуногистохимических, ре- комбинантных ДНК и др.), затруднено из-за ограниченной доступности большинства индивидуальных синапсов, а также из-за ограниченности набора средств направленного фармакологического воздействия. Попытка дать определение понятия «медиаторы» наталкивается на ряд трудностей, поскольку в последние десятилетия значительно рас- ширился список веществ, которые выполняют в нервной системе ту же сигнальную функцию, что и классические медиаторы, но отличают- ся от них по химической природе, путям синтеза, рецепторам. Прежде всего, сказанное относится к обширной группе нейропептидов, а так- же к АФК, и в первую очередь к оксиду азота (нитроксиду, NO), для которого медиаторные свойства описаны достаточно хорошо. В отли- чие от «классических» медиаторов, нейропептиды, как правило, име- ют больший размер, синтезируются с невысокой скоростью, накапли- ваются в небольших концентрациях и связываются с рецепторами,
2.1. Г ипы синапсов и классификация нейромедиаторов 115 обладающими низким специфическим сродством (рис. 2.3), кроме то- го, они не имеют механизмов обратного захвата пресинаптической терминалью. Продолжительность эффекта нейропептидов и медиато- ров также значительно различается. Что касается нитроксида, то, не- смотря на его участие в межклеточном взаимодействии, по ряду кри- териев он может быть отнесен скорее не к медиаторам, а ко вторич- ным посредникам. Первоначально считалось, что нервное окончание может содер- жать только один медиатор. К настоящему времени показана возмож- ность наличия в терминали нескольких медиаторов, высвобождаю- щихся совместно в ответ на импульс и воздействующих на одну клетку- Пептиды Рис. 2.3. Различия между синтезом, экзоцитозом и дальнейшими превращения- ми классических медиаторов (глутамат, моноамины) и нейропептидов. Синтез и упаковка в везикулы классических нейромедиаторов (а) происходят в нерв- ных терминалях, а необходимые для этого ферменты синтезируются в теле нейрона и затем доставляются в нервное окончание с помощью аксонного транспорта. После вы- броса в синаптическую щель возможно разрушение нейромедиатора с помощью фер- ментов. Обратный захват медиатора (или его метаболитов) с помощью имеющихся специфических транспортеров нервной или глиальной клетками запускает новый цикл его синтеза, упаковки и выделения. Пептидные нейромедиаторы и ферменты (б), моди- фицирующие их предшественников, синтезируются в теле нейрона, упаковываются в аппарате Гольджи и с помощью быстрого аксонального транспорта переносятся в нервное окончание. После выброса в синаптическую щель возможен протеолиз меди- атора; обратный захват такого нейропептида или его метаболитов пресинаптическим нейроном отсутствует
116 Раздел 2 МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ мишень — сопутствующие (сосуществующие) медиаторы (коме- диаторы, котрансмиттеры). При этом происходит накопление разных медиаторов в одной пресинаптической области, но в разных везикулах. Примером комедиаторов могут служить классические ме- диаторы и нейропептиды, которые различаются местом синтеза и, как правило, локализуются в одном окончании. Высвобождение комеди- аторов происходит в ответ на серию возбуждающих потенциалов оп- ределенной частоты. В современной нейрохимии кроме нейромедиаторов выделяют ве- щества, модулирующие их эффекты, — нейромодуляторы. Их дей- ствие носит тонический характер и более продолжительно во времени, чем действие медиаторов. Эти вещества могут иметь не только нейро- нальное (синаптическое), но и глиальное происхождение и не обяза- тельно опосредоваться нервными импульсами. В отличие от нейро- медиатора модулятор действует не только на постсинаптическую мембрану, но и на другие части нейрона, в том числе и внутрикле- точно. Различают пре- и постсинаптическую модуляцию (см. гл. 2.7). Понятие «нейромодулятор» является более широким, чем понятие «ней- ромедиатор». В ряде случаев медиатор может являться и модулято- ром. Например, норадреналин, высвобождающийся из симпатического нервного окончания, действует как нейромедиатор на al-рецепто- ры, но как нейромодулятор — на а2-адренорецепторы; в последнем случае он опосредует торможение последующей секреции норадрена- лина. Вещества, осуществляющие медиаторные функции, различаются не только по химическому строению, но и по тому, в каких компарт- ментах нервной клетки происходит их синтез. Классические низкомо- лекулярные медиаторы синтезируются в аксонной терминали и вклю- чаются в маленькие синаптические пузырьки (50 нм в диаметре) для хранения и высвобождения. NO также синтезируется в терминали, но, поскольку не может быть упакован в пузыръки, то сразу же диффунди- рует из нервного окончания и оказывает воздействие на мишени. Пеп- тидные нейромедиаторы синтезируются в центральной части нейрона (перикарионе), упаковываются в большие везикулы с плотным цент- ром (100—200 нм в диаметре) и транспортируются с помощью аксо- нального тока к нервным окончаниям. Ацетилхолин и катехоламины синтезируются из циркулирующих в крови предшественников, тогда как аминокислотные медиаторы и пептиды в конечном счете образуются из глюкозы. Как известно, ней- роны (как и другие клетки организма высших животных и человека) не
2.2. Общая характеристика мембранных рецепторов 11 2.2. могут синтезировать триптофан. Поэтому первым шагом, ведущим к началу синтеза серотонина, является облегченный транспорт трипто- фана из крови в мозг. Эта аминокислота, как и другие нейтральные аминокислоты (фенилаланин, лейцин и метионин), транспортируется из крови в мозг специальными переносчиками, относящимися к се- мейству переносчиков монокарбоновых кислот. Таким образом, одним из важных факторов, определяющих уровень серотонина в серотони- нергических нейронах, является относительное по сравнению с други- ми нейтральными аминокислотами количество триптофана в пище. Например, добровольцы, которых кормили пищей с низким содержа- нием белка в течение одного дня, а затем давали смесь аминокислот, не содержавшую триптофана, демонстрировали агрессивное поведе- ние и изменение цикла «сон—бодрствование», что связано со сниже- нием уровня серотонина в мозге. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ Важное свойство всех живых существ — способность восприни- мать, перерабатывать и передавать информацию. Несмотря на разнооб- разие систем обработки информации, функционирующих в животных и растительных организмах, все они основаны на едином принципе. Про- цесс получения информации, как правило, начинается с взаимодействия сигнала (химического агента, кванта света, механического воздействия и др.) с рецептором, представленным, как правило, мембранным бел- ком. Следующий этап — передача информации в центр переработки информации, находящийся внутри клетки. Этот процесс происходит с помощью вторичных мессенджеров (посредников). В ответ на полу- чение сигнала вторичного мессенджера в клетке происходит биохими- ческая модификация специализированных молекул-эффекторов, через которые и формируется ответ биологической системы (рис. 2.4). Именно по такому принципу функционируют нервная, гормональ- ная и иммунная системы животных, на такие же стадии могут быть разложены и фотобиологические процессы, протекающие в организ- ме как животных, так и растений. Общий принцип действия всех сис- тем приема и передачи информации связан не только с химической модификацией мембранных белков, но и с изменением концентрации ионов внутри клетки, с изменением мембранного потенциала. В по- следнее время выяснилось, что этот процесс играет важную роль не только в функционировании нервной ткани, но и при переработке ин- формации в тромбоцитах, лимфоцитах, тучных клетках.
118 раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ ______। АТФ с'М[а^(—>-^АМФ]------------»- ПК А —>- Белки —►- Рис. 2.4. Основные сигнальные системы клетки. АЦ — аде нил ил цикл аза; ГЦ— гуанил ил циклаза; КМ — кальмодулин; КМ-ПК — кальмодулинзависимая ПК; Фл С — фосфолипаза С; ФИ — фосфоинозитиды; ФХ — фосфатидилхолин; ИФ3 — инозитолтрисфосфат; ДАГ — ди ацил глицерол е Сигнальные молекулы, как правило, не проникают внутрь клетки, а специфически взаимодействуют с рецепторами, локализованными во внешней клеточной мембране и представляющими собой интеграль- ные мембранные белки, полипептидная цепь которых пронизывает толщу мембраны несколько (7—12) раз. Они могут быть выделены из мембраны только после ее разрушения, например с помощью детер- гента. Стероидные и тиреоидные гормоны, будучи гидрофобными по сво- ей природе, способны проникать через плазматическую мембрану внутрь клетки, где они взаимодействуют с растворимыми рецепторны- ми белками, локализованными в цито- и (или) нуклеоплазме. Они представляют, по-видимому, эволюционно более примитивный (но и более гарантированный) способ передачи информации. Разнообразные молекулы, инициирующие трансмембранную пере- дачу сигналов, активируют рецепторы, воздействуя на них обычно при очень низких концентрациях, порядка 10-8—10-9 М. В соответствии с двумя основными видами передачи информации к клетке рецепторные белки делят на два класса: глобулярные и мембранные.
2.2. исщая характеристика меморанных рецепторов 119 Глобулярные белки представляют собой свободноплавающие в ци- топлазме соединения, обладающие высоким сродством к определен- ным лигандам. Появление в цитоплазме лигандов для этих рецепторов приводит к изменению свойств последних и выполнению ими своих функций. Например, цитоплазматическая протеинкиназа С, связывая ионы кальция, изменяет свою конформацию, формирует гидрофобный участок для «заякоривания» на мембране и начинает атаковать мемб- ранные субстраты. Другим примером такого способа управления явля- ется регуляция синтеза некоторых клеточных белков альдостероном: появляясь в крови, этот гидрофобный гормон легко проникает через клеточную мембрану, находит в цитоплазме свой рецептор и образует с ним комплекс, способный проникать в ядро, где инициирует экспрес- сию соответствующих генов. Иной тип передачи информации осуществляют интегральные белки, которые связывают сигнальные вещества на внешней стороне мембраны и за счет изменения своей конформации генерируют новый сигнал на внутренней стороне мембраны. Мембранный рецептор, вне зависимости от природы связывающе- гося с ним эффектора, имеет общий план строения: участок, расположенный вне клетки, внутримембранный участок и внутрен- ний участок, ориентированный в цитоплазму. Внешний и внутренний участки рецептора являются вариабельными, его внутримембранная часть более консервативна. N-конец рецептора (внешний) специфи- чен к внешнему сигналу, тогда как внутренний С-конец — к ассоци- ированному с рецептором внутриклеточному белку. Свойства последне- го и определяют, с какой из внутриклеточных сигнальных систем будет осуществляться взаимодействие и каким образом будет формироваться физиологический ответ клетки. Сами сигнальные молекулы при этом обычно не проникают внутрь клетки, а сигнал преобразуется в резуль- тате модификации мембранных белков, которая приводит к образова- нию (высвобождению) молекул-посредников — вторичных мессенд- жеров. В общем виде передача сигнала через мембрану может быть сведена к трем основным стадиям: 1) взаимодействие сигнальной молекулы с рецептором; 2) конформационная перестройка рецепторной молекулы и изме- нение функции специализированных мембранных белков-посред- ников; 3) образование «вторичных мессенджеров» — сравнительно не- больших молекул или ионов, диффузия которых в клетке к определен- ным субклеточным структурам обеспечивает распространение сигнала.
12U раздел 2. ‘/ОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Механизмы передачи информации в живых системах универсальны — все громадное разнообразие сигналов, полученных различными рецеп- торами, преобразуется по единому принципу за счет идентичности вто- рой и третьей стадий передачи информации через мембрану (см. рис. 2.4). Различают три типа рецепторов. Рецепторы первого типа являются белками, имеющими одну трансмембранную по- липептидную цепь. Это аллостерические ферменты, активный центр которых расположен на внутренней стороне мембраны. Многие из них являются тирозиновыми протеинкиназами. К этому типу принадлежат рецепторы инсулина, ростовых факторов и цитокинов. Связывание сигнального вещества ведет к димеризации такого рецептора. При этом происходит активация фермента и фосфорилирование остатков тирозина в ряде белков. В первую очередь фосфорилируется молекула рецептора по принципу аутофосфорилирования. Рецепторы второго типа представляют собой олигомерные мембранные белки, образующие лигандактивируемый ионный канал. Связывание лиганда ведет к открыванию канала для ионов Na+, К+, Са2+ или С1“. По данному механизму передают возбуждаю- щий сигнал такие нейромедиаторы, как ацетилхолин (никотиновые рецепторы), глутамат (ионотропные рецепторы, см. далее), у-амино- масляная кислота (ГАМКд-рецептор). Ансамбли рецепторов с ионными каналами — это интегральные мембранные олигомерные белки, состоящие из нескольких субъеди- ниц, полипептидная цепь которых многократно пересекает наружную клеточную мембрану. Кроме канальных структур они одновременно содержат рецепторные участки на внешней стороне мембраны, кото- рые способны специфически связывать лиганды, изменяющие ионную проводимость канала. Ионные каналы этих рецепторов могут нахо- диться в трех основных состояниях: 1) закрытое состояние (в отсутствие внешнего сигнала); 2) активированное (открытое) состояние (первич- ный мессенджер связан с рецептором); 3) инактивированное (закры- тое) состояние — может наступать, когда первичный мессенджер еще связан с рецептором. Эти рецепторы получили название быстрых ионотропных, по- скольку время их действия составляет несколько десятков миллисе- кунд (рис. 2.5). В связи с тем что в состав рецептора может входить несколько субъединиц, различающихся по структуре, существуют его многочис- ленные изоформы, позволяющие варьировать основные свойства ре- цепторов.
2.2. Общая характеристика мембранных рецепторов Рис. 2.5. Взаимодействие быстрых (ионотропных) и медленных (метаботроп- ных) рецепторов с ионными каналами. Связывание медиатора с ионотропным рецептором приводит к быстрому открыванию ионного канала. При связывании медиатора с метаботропным рецептором возможны несколько путей влияния на ионный канал: непосредственно через G-белки, через вто- ричные посредники, а также путем фосфорилирования, связанного с активностью про- теинкиназ Рецепторы третьего типа являются медленнодействую- щими. Они сопряжены с ГТФ-связывающими белками (G-белки, обладающие ГТФазной активностью). Полипептидная цепь этих бел- ков включает семь трансмембранных сегментов (колонн). Такие ре- цепторы передают сигнал с помощью ГТФ-связывающих белков на белки-эффекторы, расположенные на соседних участках мембраны или в цитоплазме. Функция рецепторов данного типа заключается в тонкой модификации клеточного метаболизма, поэтому их называют метаботропными. К этой группе относятся рецепторы катехолами- нов, серотонина, ГАМКв-рецептор, мускариновый ацетилхолиновый рецептор (jwXP), глутаматные метаботропные рецепторы, рецепторы нейропептидов и ряд других. Эффекты, связанные с этими рецептора- ми, развиваются в течение нескольких секунд или минут. Рецепторы, ассоциированные с ферментами, по своей субъеди- ничной структуре весьма разнообразны. Как правило, они представ- лены мономерными белками, но в зависимости от присутствия пер- вичного мессенджера могут объединяться в олигомерные мембран- ные ансамбли. Практически у всех этих рецепторов полипептидная
122 ► аздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ цепь пересекает клеточную мембрану всего один раз. Общим для них является то, что участок для восприятия первичного сигнала лока- лизован на стороне мембраны, обращенной во внеклеточное про- странство. По механизму взаимодействия с цитоплазма- тическими мишенями рецепторы данного типа разделяют на две группы. Первая группа включает рецепторы-ферменты, каталитический центр которых локализован с цитоплазматической стороны мембра- ны; он активируется при действии на рецептор внешнего сигнала (рис. 2.6). К рецепторам этой группы относится обширное семейство тирозиновых протеинкиназ, способных как к аутофосфорилированию (по тирозиновым остаткам), так и к фосфорилированию тирозиновых остатков других белков-мишеней. К этой же группе относятся ре- Рис. 2.6. Основные типы мембранных рецепторов: а — рецепторы, сопряженные с G-белками; б — рецепторы — ионные каналы; в — рецепторы, ассоциированные с ферментами. С — внешний сигнал; Рц — рецептор- ный белок («*» при компоненте сигнальной системы означает, что он находится в со- стоянии «включено»); а — а-субъединица G-белка, которая может находиться в свя- занной с гуанозицдифосфатом (ГДФ) или гуанозинтрифосфатом (ГТФ) форме; ру — функционирующий как единое целое комплекс Р- и у-субъединиц G-белка; Р — фос- фатный остаток (остатки), ковалентно связанный с рецептором; Эф — эффекторы
2.2. Общая характеристика мембранных рецепторов цепторы, обладающие протеинфосфатазной активностью, которые дефосфорилируют фосфотирозиновые остатки белков-мишеней. Как киназы, так и фосфатазы вовлекаются в регуляцию таких важнейших событий, как деление и дифференцировка клеток, развитие иммунного ответа. Вторая группа рассматриваемых рецепторов собственной фер- ментативной активностью не обладает. Однако в присутствии внешне- го сигнала эти рецепторы приобретают способность связывать цито- плазматические протеинтирозинкиназы, которые неактивны в сво- бодном состоянии, но активируются в комплексе с рецептором и осуществляют его фосфорилирование. Включение фосфатных остат- ков в такой рецептор-«якорь» создает условия для связывания с ним других белков-мишеней, которые также фосфорилируются, обеспечи- вая тем самым передачу сигнала. В эту группу входят рецепторы, уча- ствующие в развитии иммунного ответа: рецепторы антигенов и ре- цепторы цитокинов, интерлейкинов. Большинство белков-эффекторов осуществляют свои функ- ции в результате фосфорилирования различными протеинкиназа- ми. Многочисленное семейство протеинкиназ (ПК) подразделяется на группы по м е х а н и з м у активации и по типу субстра- та (см. 2.4.6). ПК А активируется цАМФ, ПКО — цГМФ, ПК С — диацилглицеролом, Са2+-кальмодулинзависимые ПК — ионами каль- ция. Молекула протеинкиназы состоит из двух субъединиц: ре- гуляторной и каталитической. Связывание активатора (напри- мер, цАМФ, цГМФ) с регуляторной субъединицей приводит к отде- лению каталитической субъединицы протеинкиназы (она становится активной) и фосфорилированию соответствующего белка. Классификация по типу субстрата зависит от того, какая амино- кислота белка-мишени фосфорилируется данным ферментом — из- вестны тирозинкиназы и серин-треониновые протеинкиназы. Многие протеинкиназы являются растворимыми белками, другие относятся к мембранным белкам, имеющим трансмембранные домены или «за- якоренным» на мембране с помощью жирных кислот. В каждой клетке обычно функционирует несколько разных рецеп- торов к одному и тому же химическому сигналу (например, а- и Р-ад- ренорецепторы). В дополнение к этому клетки обычно проявляют чув- ствительность одновременно к нескольким регуляторным молеку- лам (нейромедиаторам, гормонам, простагландинам, факторам роста). Каждый из этих регуляторов рождает сигнал характерной продолжи- тельности и амплитуды. На уровне исполнительных систем клетки мо- жет происходить как потенцирование, так и взаимное тушение разных
124 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ 2.3. регуляторных сигналов. Глиальные клетки также имеют рецепторы, однако связывание нейромедиатора с последними не ведет к генера- ции потенциала действия. Вещества, вызывающие тот же эффект, что и природные медиато- ры, принято называть агонистами, а лиганды, которые связываются с рецептором, препятствуя его взаимодействию с агонистом, хотя и не вызывают сами биологического эффекта, — антагонистами. Один и тот же медиатор может взаимодействовать с рецепторами разных типов и подтипов, при этом достигается различный эффект как по времени наступления эффекта, так и по его результату. Оказалось, что многие заболевания нервной системы связаны не только с нару- шением синтеза и выделения нейромедиаторов, но и с функциониро- ванием рецепторного аппарата нервной клетки, и лечение некоторых патологий стало возможным благодаря знанию строения и функци- ональных особенностей рецепторов. ХАРАКТЕРИСТИКА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ МЕДИАТОРНЫХ СИСТЕМ Характеристику отдельных нейромедиаторов целесообразно де- лать с учетом того, в каких структурах мозга обнаруживается их мак- симальная концентрация. Именно такой подходе последующим элек- трофизиологическим и фармакологическим анализом роли этих струк- тур позволил выявить функцию большинства медиаторов в нервной системе. Химические синапсы распределены в нервной ткани не слу- чайным образом, а организованы в определенные группы (рис. 2.7). Для того чтобы уверенно картировать какие-либо медиаторные пути в головном мозге, необходимо иметь надежные специфические марке- ры, с помощью которых можно визуализировать интересующие иссле- дователя межклеточные взаимодействия. В зависимости от изучаемой нейромедиаторной системы применяют определенные методические подходы. В случае если сущест- вует возможность получения окрашенного (флуоресцирующего) произ- водного естественного нейромедиатора, для выявления групп клеток, содержащих этот нейромедиатор, применяют соответствующий спект- ральный подход (в последнее время — с использованием конфокально- го микроскопа). С учетом того что в метаболизме ряда медиаторов при- сутствует механизм обратного захвата, применяют медиатор, меченный радиоактивными изотопами, и последующую авторадиографию. Еще один способ, используемый как для локализации «классических» меди-
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем аторов, так и для выявления нейропептидов и других модуляторов, — применение специфических антител. В случае нейропептидов — к са- мому нейропептиду, в случае нейромедиаторов — к синтезирующим их ферментам или к специфическим рецепторам. Используются так- же различные количественные способы оценки высвобождения ней- ромедиаторов с последующим измерением электрического ответа си- напса. Система ацетилхолина. Система ацетилхолина (АХ) широко представлена в разных отделах нервной системы (см. рис. 2.7). Основ- ная локализация холинергических нейронов — медиальное ядро пере- городки, диагональная связка, базальное гигантоклеточное ядро. Ак- соны этих нейронов проецируются на гиппокамп, таламус, кору боль- ших полушарий и ряд других структур. В спинном мозге АХ играет роль нейромедиатора в синапсах, образуемых а-мотонейронами на клетках Реншоу. В вегетативной нервной системе АХ — медиатор всего парасимпатического отдела, а в преганглионарных нервных окончаниях — симпатического отдела. Выявление этого медиатора в нервных окон- чаниях возможно по наличию в них фермента его синтеза (холин- ацетилтрансферазы) или гидролизующего его фермента (ацетилхолин- эстеразы). Первый способ является более надежным, так как ацетил- холинэстераза широко распространена в различных тканях организма. Для выявления рецепторов АХ применяются также радиоиммунологи- ческие методы. Холинергические системы участвуют в таких функциональных про- явлениях мозга, как память, локомоторная функция, в частности меха- низмы инициации подвижности, создание двигательных стереотипов, регуляция уровня бодрствования (в этих процессах участвуют ретику- лярная формация ствола мозга, базальные ганглии). При паркинсонизме, наряду с нарушением дофаминергической трансмиссии, отмечается гиперактивность некоторых холинергиче- ских систем мозга. При поражении холинергических связей в перифе- рической нервной системе, в частности в нервно-мышечных синапсах, возникают симптомы «усталости» или «слабости» мышц. При неко- торых неврологических заболеваниях, сопровождающихся резкими неконтролируемыми движениями (хорея Гентингтона) и слабоумием (болезнь Альцгеймера), наблюдается дегенерация пирамидных клеток гиппокампа, к которым подходят аксоны холинергических нейронов из других структур.
Ацетилхолин Неокортекс Черепномозговые мотонейроны Спинальные мотонейроны Пре ганглионарные вегетативные нейроны Дофамин Вещество Р НейропептидУ Норадреналин Серотонин Глутамат/Аспартат ГАМК Рис. 2.7. Распределение нейронов, содержащих различные ме- диаторы и нейропептиды, в головном мозге млекопитающих. БШ — бледный шар; ВД — верхнее двухолмие; ИПЯ — интрапедун- кулярные ядра; ВПП — вентральное поле покрышки; ГИ — груше- видная извилина; ГК — гиппокамп; ГП — голубое пятно; ГТ — гипо- таламус; ДЯ — дугообразное ядро; ЗР — задний рог спинного мозга; ЛПП— латеральное поле покрышки; М — миндалина; ОБ — обоня- тельный бугорок; ОЖС — околожелудочковое серое вещество; ОД — обонятельная луковица; П — перегородка; NA —nucleus accumbens; CM — спинной мозг; СМГ — спинномозговой ганглий; СНСМ — се- ротонинергические нейроны спинного мозга; Стр — стриатум; Т — та- ламус; У — уздечка; ЧС — черная субстанция; ЯМ — ядра мозжечка Раздел 1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕИРОХИМИЯ
2.3. Характеристика индивидуальны, медиаторных систем АХ является преимущественно возбуждающим нейромедиатором, реже выполняет тормозные функции (например, в синапсах ответвле- ний блуждающего нерва, иннервирующих миокард). Действие АХ мо- жет быть длительным или кратковременным, возбуждающим или тор- мозным, локальным или дистантным (см. далее). Ацетилхолин синтезируется из холина и ацетил-КоА цитозольным ферментом холинацетилтрансферазой. Основными источни- ками холина для образования нейромедиатора служат: 1) холин, образующийся при гидролизе нейромедиатора, диффун- дировавшего от рецептора, и находящийся в синаптической щели (система «обратного захвата» обеспечивает перенос молекул холина в пресинаптическое окончание; около половины холина, поступающе- го в холинергическую аксонную терминаль, является продуктом гид- ролиза ранее высвобожденного ацетилхолина); 2) холин, поступающий из плазмы крови через гематоэнцефаличе- ский барьер; 3) холин, образующийся при гидролизе фосфатидилхолина. Перенос холина в пресинаптические окончания осуществляется высокоаффинной (Км 1—5 мкМ) Na-зависимой транспортной систе- мой, которая обнаружена только в холинергических нейронах. Во всех других тканях в транспорте холина участвуют низкоаффинные (Км 10—100 мкМ) переносчики. Средняя концентрация холина в плазме крови составляет ЮмкМ. Поступление холина в пресинаптические окончания холинергических нейронов является этапом, лимитирую- щим скорость синтеза нейромедиатора. Поскольку реакция, катализируемая холинацетилтрансферазой, является обратимой, уровень ацетилхолина контролируется соотно- шением концентраций субстратов и продукта реакции. Так, в условиях покоя накопление ацетилхолина ограничено одно- временным гидролизом, который осуществляется внутриклеточной ацетилхолинэстеразой, и ее фармакологическое ингибирование в нерв- ном окончании вызывает повышение содержания медиатора. Таким об- разом, уровень, до которого происходит накопление ацетилхолина, ус- танавливается в результате динамического равновесия между его син- тезом и распадом. Благодаря этому обеспечивается наличие постоянно доступного необходимого количества медиатора. Следует отметить, что в везикулах ацетилхолин защищен от разрушения. Кроме того, заклю- чение ацетилхолина в везикулы приводит к снижению его концентра- ции в цитоплазме, что также влияет на равновесие реакции, сдвигая его в сторону синтеза медиатора.
128 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Холинорецепторы. Холинорецепторы (ХР) подразделяют на никотиновые (нХР) и мускариновые (мХР). Как для первых, так и для вторых агонистом является ацетилхолин, однако первый класс ре- цепторов активируется также и никотином, а второй — мускарином (соединением, содержащимся в мухоморе Amanita muscarina). Успех в исследовании рецепторов во многом обеспечен примене- нием природных токсинов, в первую очередь ядов пчел, пауков, змей и некоторых земноводных. Эти яды содержат фосфолипазы, разрушаю- щие мембранные фосфолипиды, что приводит также к нарушению пе- редачи сигнала в клетке. Но наиболее простой путь для хищников па- рализовать жертву — ингибировать ее «быстрые» рецепторы. В ре- зультате такой «эволюции» животные различных классов (рыбы, земноводные, змеи, насекомые) приобрели способность синтезиро- вать яды — блокаторы «быстрых» рецепторов. а-Бунгаротоксин из яда змей семейства эланидов (кобры, мамбы и др.) способен селективно и цеобратимо связываться с нХР. Это его свойство позволило идентифицировать рецепторный белок и очистить его. Первичная структура ХР вначале была установлена для белка из электрического органа ската (в этой ткани концентрация рецепторно- го белка на два порядка превышает его концентрацию в других тканях, что существенно облегчает процедуру выделения). Позднее на основе исследования соответствующих генов первичная последовательность холинорецептора была определена для тканей человека, теленка, цыпленка и некоторых других животных. Быстродействующие никотиновые холиноре- цепторы делят на рецепторы мышечного и ганглионарного ти- пов. Мышечные нХР, более чувствительные к бунгаротоксину и тубо- курарину, локализованы преимущественно в местах контакта оконча- ний аксонов со скелетными мышцами. Рецепторы ганглионарного типа, более чувствительные к никотину и бензогексонию, сосредото- чены в вегетативных ганглиях и хромаффинной ткани. В головном мозге обнаружены оба типа нХР; максимальная плотность рецепто- ров ганглионарного типа найдена в ядрах таламуса, а также в гипота- ламусе и коре больших полушарий. Данный тип рецепторов может быть локализован не только на пост-, но и на пресинаптических мемб- ранах; в последнем случае они участвуют в модуляции активности до- фамин-, серотонин-, глутамат- и пептидергических синапсов. нХР мы- шечного типа найдены в коре, гипоталамусе, гиппокампе, в некоторых зонах моста и продолговатого мозга. н-Холинорецептор состоит из четырех видов субъеди- ниц — а, р, у и 8; молярное соотношение этих субъединиц в белке —~
2-3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 2 : 1 : 1 : 1» а молекулярные массы составляют 40, 50, 60 и 65 кДа, со- ответственно. Все субъединицы рецептора гликозилированы, на долю углеводного компонента приходится около 20 кДа. Субъединицы, поли- пептидные цепи которых четыре раза пронизывают липидный бислой, взаимодействуют с белками тубулинового и актинового цитоскелета. Первичная последовательность всех субъединиц холинорецептора у различных классов животных.весьма консервативна: гомология пре- вышает 50%, а для некоторых субъединиц (например, ос-субъединица электрического ската и человека) — 80%. Из изолированных а-, р- и 8-субъединиц ХР электрического ската и у-субъединицы ХР теленка удалось реконструировать холинорецептор, полностью обладающий функциональной активностью. Пять субъединиц холинорецептора в последовательности а—р— а—у—8 образуют канал, проницаемый для ионов натрия и калия (в меньшей степени — для кальция и некоторых органических катионов) (рис. 2.8). ХР локализован на постсинаптической мембране клетки и при связывании ацетилхолина изменяет свою конформацию таким об- разом, что через устье, сформированное канальными субъединицами, внутрь клетки устремляются ионы Na+. Происходит деполяризация Рис. 2.8. Схематическое изображение никотинового холинорецептора: а — общий вид; б — структура ионного канала
130 Раздел 2. МОЛЕЮ 1ЯРНАЯ НЕ ЙРОХИМИЯ мембраны, что приводит к выходу К+ из клетки. Ток К+ возвращает потенциал мембраны к исходной величине. В процессе перезарядки мембраны, осуществляемой потенциалом действия, через этот же ка- нал внутрь клетки могут входить ионы Са2+. Следовательно, канал не является высокоизбирательным в отношении катионов. В то же время это быстродействующая регуляторная система — потенциал дейст- вия, вызываемый ацетилхолином, возникает и затухает в тканях мозга за 1 —2 мс, благодаря чему синапс может проводить от аксона на ин- нервируемую клетку до 500имп/с. В нервно-мышечном синапсе по- тенциал действия длится значительно дольше (80— 120 мс). Такое быстрое развитие потенциала действия оказывается воз- можным благодаря высокой скорости обратимого связывания ацетил- холина с рецептором, а также эффективному разрушению ацетилхо- линэстеразой. Разумеется, не менее важен и механизм открывания канала за счет конформационных переходов, происходящих в наносе- кундном интервале. Бесперебойное функционирование холинергиче- ского синапса требует большого запаса ацетилхолина, который синте- зируется впрок, накапливаясь в везикулах пресинаптической зоны. Кроме того, в клетках должны существовать достаточно высокие гра- диенты ионов Na+ и К+ по обе стороны плазматической мембраны, которые создаются и поддерживаются Na/K-насосом. Быстродействие ацетилхолина (как и других нейромедиаторов) опре- деляется также особенностями морфологического образования, находя- щегося между аксоном и иннервируемой клеткой, — синапса. Благода- ря тому что расстояние между пре- и постсинаптической мембранами о составляет всего 300—500 А, а холинорецепторы сконцентрированы в виде кластеров вблизи участков секреции ацетилхолина, сразу же после выброса нейромедиатор оказывается в месте его рецепции. Кроме того, при раздражении аксона происходит выброс нескольких квантов аце- тилхолина, так что молекулы этого нейромедиатора насыщают большое количество ХР и вызывают формирование потенциала концевой плас- тинки (ПКП). Этот сдвиг трансмембранного потенциала (ТМП) до по- рогового уровня и вызывает развитие потенциала действия. Холинергические рецепторы никотинового типа имеют довольно низкое сродство к ацетилхолину. Полумаксимальное насыщение ре- цепторов наблюдается в присутствии 10-4М ацетилхолина, поэтому, как только ацетилхолинэстераза (локализованная в межсинаптиче- ской области) начинает процесс гидролиза, снижение уровня АХ при- водит к диссоциации этого нейромедиатора от рецептора и канал воз- вращается в закрытое состояние.
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем Как известно, сродство рецептора к лиганду (нейромедиатору, гор- мону или др.) определяется соотношением скоростей диссоциации и ассоциации лиганд-рецепторного комплекса. При константе диссоци- ации 10-4—10-3 М скорость диссоциации ацетилхолина от рецептора составляет доли миллисекунды, что очень важно для быстрого восста- новления синаптической передачи. По «канальному» механизму работают многие рецепторы, имею- щие близкую молекулярную массу и, как правило, состоящие из не- скольких субъединиц. В зависимости от селективности ионов, про- пускаемых каналом, эти рецепторы вызывают деполяризацию или гиперполяризацию мембраны. Вероятно, «ворота» каналов всех этих рецепторов открываются по единому механизму, так как у неко- торых субъединиц различных рецепторов найдены гомологичные участки. Совершенно иную, отличающуюся от холинергического рецептора никотинового типа, структуру и другой механизм функционирования име- ют так называемые мускариновые холинергические рецепторы (тиХР) (рис. 2.9), которые локализованы преимущественно пресинаптически. На эти рецепторы не действует никотин, но они легко активируются мускарином, а также, разумеется, и ацетилхолином, константа сродст- ва к которому имеет величину порядка 10-6 М. Существуют по крайней мере пять изоформ мускариновых рецепторов, причем все они близки по структуре (их полипептидная цепь семь раз пронизывает мембрану) и сопряжены с G-белками, но передают сигнал разным системам внутриклеточной сигнализации. Так, например, мускариновые холинорецепторы могут стимулировать фосфолипазу С, которая гидролизует фосфоинозитиды (jmXPj 3 5), или ингибировать аденилатциклазу, а также активировать К-каналы плаз- матической мембраны (?иХР2, ?иХР4). Ответ тиХР растянут во времени, эффекты развиваются спустя одну-две минуты после взаимодействия с лигандом и гасятся за несколь- ко десятков минут. Столь разительное отличие в скоростях проведения ацетилхоли- нового сигнала между никотиновым и мускариновым -рецепторами объясняется, прежде всего, разной кинетикой связывания лиганда с соответствующими рецепторами (диссоциация ацетилхолина от мус- каринового рецептора происходит весьма медленно), многоэтапным каскадом проведения сигнала в случае мускариновой регуляторной системы (необходимо последовательное взаимодействие рецептора с соответствующим G-белком, а затем — G-белка с определенным
132 Раздел 1. МсЛыУлЯРнАч НЕЙРО *ИМИ^ ферментом или каналом), а также сравнительно медленно проте- кающими реакциями образования (высвобождения) вторичных по- средников, фосфорилирования (дефосфорилирования) белков-ми- шеней. Подтипы (изоформы) тиХР различаются как по локализации в структурах мозга и в возбудимых клетках различных органов, так и по вызываемым ими физиологическим эффектам. Работа этих рецепторов связана с процессами психоэмоционального восприятия и распознавания образов в центральной нервной системе, с регуляцией секреторной функции слюнных желез и со многими дру- гими реакциями организма. Рис. 2.9. Процессы, происходящие при активации мускариновых холиноре- цепторов
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем Норадреналин (НА). Наряду с адреналином и дофамином, но- радреналин относится к катехоламинам. Локализация норадренерги- ческой системы — мост (голубое пятно, латеральная ретикулярная формация моста), продолговатый мозг и ядро одиночного тракта (см. рис. 2.7). Многочисленные (несколько сотен) нейроны голубого пятна образуют диффузные проекции большой протяженности, достигая практически всех отделов ЦНС — коры больших полушарий, лимби- ческой системы, таламуса, гипоталамуса, спинного мозга. Норадреналин является медиатором во всех постганглионарных симпатических окончаниях (за исключением потовых желез). В ЦНС, как правило, он выполняет функции тормозного медиатора (кора), ре- же — возбуждающего (гипоталамус) медиатора. Норадреналин ней- ронов голубого пятна способен диффузно выбрасываться в нейро- пиль. Нисходящие норадренергические пути спинного мозга вовлекают- ся в регуляцию мышц сгибателей и сосудистого тонуса. Нарушение обмена норадреналина связывают с возникновением ряда психоэмо- циональных расстройств. Воздействие на метаболизм НА фармакологическими средствами, компенсирующими дефицит или избыток этого нейромедиатора, в ря- де случаев способствует снижению симптоматики шизофрении, мани- акально-депрессивных состояний. Адреналин. Секретируется диффузно (в мозговом слое надпо- чечников) и выполняет в первую очередь роль гормона. Тела нейро- нов, содержащих фермент, осуществляющий метилирование норадре- налина, обнаруживаются в нижних отделах моста и в продолговатом мозге. Нисходящие пути достигают центрального серого вещества и ядер гипоталамуса (в частности, паравентрикулярного и дорзомеди- ального). Нейромедиаторная роль адреналина сомнительна; нейромедиато- ром адренергических нейронов является, очевидно, НА. Адреналин способен играть роль модулятора, высвобождаясь диффузно. Дофамин. Системы использования дофамина в качестве нейро- медиатора сосредоточены в среднем мозге (черная субстанция, вент- ральная покрышка), обонятельной луковице, гипоталамусе и пери- вентрикулярной области продолговатого мозга. Локализация дофами- нергических нейронов в ЦНС показана на рисунке 2.7. Дофамин — первое нейроактивное вещество в цепи синтеза кате- холаминов (рис. 2.10). В нейронах он выявляется при обработке сре-
134 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ зов мозга парами формальдегида или глиоксалевой кислотой; при этом дофамин и близкие к нему моноамины проявляют характерную флуоресценцию. В настоящее время этот способ выявления дофамина дополнен иммуногистохимическими и другими биохимическими мето- диками. Имеются две основные группировки дофамино- вых нейронов — ядра гипоталамуса и среднего мозга (дугооб- разное ядро, черная субстанция и вентральная покрышка). Дофами- новые нейроны черной субстанции дают проекции в хвостатое и чече- вицеобразное ядра (которые вместе называются стриатум, или по- лосатое тело) базальных ганглиев, образующих нигростриарный путь. При болезни Паркинсона данные клетки дегенерируют, вслед- ствие чего и происходит утрата дофаминергических синапсов в стри- атуме. Именно это считают причиной таких типичных для паркин- сонизма двигательных расстройств, как ограниченность движений и тремор рук. Для лечения паркинсонизма применяют большие дозы L-ДОФА — предшественника дофамина, что, к сожалению, чревато существенными побочными эффектами. Фармакологические препара- СООН Тирозин РрСНг- CH-NH2 Тирозингидроксилаза " соон ДОФА H°^yCH2-CH-NH2 НО1^ ДОФА-декарбоксилаза Рис. 2.10. Этапы синтеза норадреналина
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 135 ты, содержащие метаболиты дофамина, проникающие в головной мозг, способны смягчить симптомы болезни. Образования лимбической системы, иннервируемые через мезо- лимбические пути от покрышки среднего мозга, ответственны за такие функции, как эмоции и агрессивное поведение; что касается лобных отделов коры, то они играют важнейшую роль в осуществлении выс- ших когнитивных функций. Есть прямые данные о наличии связи меж- ду развитием шизофрении у человека с нарушениями как метаболизма дофамина, так и функционирования дофаминергической медиаторной системы. В ряде отделов мозга существуют и «короткоаксонные» дофами- нергические клетки. В гипоталамусе такие клетки посылают аксоны к срединному возвышению и оказывают модулирующее влияние на сек- рецию либеринов нейроэндокринными клетками. Дофаминергические нейроны сетчатки, обонятельной луковицы и зрительных структур кры- ши среднего мозга участвуют в организации местных нейронных сетей (см. гл. 3.6). Кроме того, существует система дофаминергических кле- ток вокруг четвертого желудочка, простирающаяся внутри ствола моз- га до гипоталамуса. Синтез катехоламинов (дофамина, норадреналина, адреналина) осу- ществляется из общего для всех катехоламиновых медиаторов пред- шественника — тирозина. На первой стадии аминокислота гидрокси- лируется ферментом тирозингидроксилазой с образованием диоксифе- нилаланина (ДОФА). Далее под действием фермента декарбоксилазы ароматических L-аминокислот из ДОФА образуется дофамин, кото- рый затем превращается в норадреналин под действием дофамин-р- гидроксилазы (см. рис. 2.10). Первые две реакции происходят в цито- плазме, а затем дофамин транспортируется в везикулы, где превраща- ется в норадреналин дофамин-Р-гидроксилазой, связанной с мембра- ной везикул. Основная часть норадреналина хранится внутри везикул; некоторое его количество проникает обратно в цитоплазму, где под- вергается распаду под действием моноаминоксидазы (МАО). Дофаминергические нейроны содержат тирозингидроксилазу и де- карбоксилазу ароматических L-аминокислот, но в них отсутствует до- фамин-р-гидроксилаза. Другие нейроны, так же как и клетки надпо- чечников, высвобождают адреналин, который образуется из норадре- налина поддействием фенилэтаноламин-М-метилтрансферазы. Как правило, такие многоступенчатые процессы регулируются за счет способности конечного продукта к ингибированию первого фер- мента. Тирозингидроксилаза ингибируется как норадреналином, так
136 г ♦ j,4._ n 2. МОпЕК1 ййН.ч-. ЕЙР< -HM.i- и дофамином и адреналином, по мере накопления которых происходит торможение их синтеза и установление состояния равновесия: ско- рость синтеза уравнивается со скоростью распада и высвобождения (см. рис. 2.10). Доказательством того, что лимитирующий скорость процесса этап контролируется по принципу отрицательной обратной связи, явились эксперименты по изменению концентрации норадреналина в термина- ли. Добавление медиатора в инкубационную среду приводило к уве- личению его захвата терминалью и снижению скорости его синтеза, а стимуляция, вызывающая выброс норадреналина, наоборот — уси- ливала синтез медиатора. Описанные выше регуляторные механизмы работают быстро, изме- няя скорость синтеза в нервных окончаниях. Но существуют также ме- ханизмы долговременной регуляции. Прекрасным примером такой ре- гуляции является ответ симпатической нервной системы у животных, подвергнутых продолжительному стрессу. При действии стресса на ор- ганизм активируются симпатические нейроны, что ведет к трех-, четы- рехкратному увеличению уровней тирозингидроксилазы и дофамин-0- гидроксилазы в телах и терминалях симпатических нейронов, происхо- дящему благодаря синтезу новых молекул ферментов. Другие фермен- ты синтеза и деградации норадреналина, такие как декарбоксилаза аро- матических L-аминокислот и МАО, не подвержены такому влиянию. Повышенный уровень глюкокортикоидов при продолжительном стрес- сорном воздействии индуцирует синтез катехол-М-метилтрансферазы, что способствует ускорению образования адреналина. Адренорецепторы. Присутствуют в нервной ткани в относи- тельно небольшом количестве. В зависимости от связывания адрено- тропных лигандов адренорецепторы подразделяют на два клас- са — а и р, которые в свою очередь могут быть подразделены на подклассы (рис. 2.11). Первоначально p-рецепторы были описа- ны в различных периферических тканях: Pj *— в сердце, как усиливаю- щие силу и частоту сокращений, Р2 — в бронхах, как вызывающие ре- лаксацию гладких мышц. Все адренорецепторы относятся к суперсемейству рецепторов, связанных с G-белками, и обладают типичной 7-доменной трансмемб- ранной структурой. 0Cj-Подкласс характеризуется высоким сродством к антагонисту празозину и низким сродством к йохимбину. Их актива- ция приводит к увеличению внутриклеточного содержания Са2+ через включение фосфолипазы С и ИФ3/ОАС-зависимых путей регуляции. Возможны также воздействия на дегидропиридинчувствительные и де-
2.3. V> . -.Pi . . .'НдИеР^уо HU* Мг.Д1о1срНЬ1>СИ -M 13 Адренорецепторы alL a1A a1B alD a2A/D a2B a2C Рис. 2.11. Классификация адренорецепторов гидропиридиннечувствительные Са-каналы, фосфолипазу D, фосфоли- пазу Д2, синтез арахидоновой кислоты и активацию протеинкиназы С, а также активацию MAP-киназы, играющей важную роль в пролифе- ративных процессах. Для ос2-подкласса адренорецепторов характерно высокое сродство к йохимбину. Их активация приводит к тормозным эффектам благода- ря уменьшению синтеза цАМФ, усилению выхода К+ и уменьшению выхода Са2+. Различные изоформы этих рецепторов отличаются срод- ством к празолину: ос2А-изоформа (из тромбоцитов) обладает низ- ким, а а2В-изоформа (из неонатальных легких) — высоким сродством к празолину. В отличие от ос2-адренорецепторов, p-адренорецепторы связаны с Сделками и обладают высоким сродством к пропраналолу; они уси- ливают синтез цАМФ. Исключением из этой группы является толь- ко р3-изоформа, которая не обнаружена в мозге. Степень связывания Р"рецепторов с различными катехоламинами сильно различается, в то время как для ос-адренорецепторов подобные различия менее выра- жены. Для а2- и р2-адренорецепторов характерна пресинаптическая ло- кализация, в то время как для остальных адренорецепторов — пре- имущественно постсинаптическая. Адренорецепторы широко пред- ставлены в периферических тканях. В мозге они обнаружены в коре больших полушарий и в мозжечке (ос2А-подтип), в хвостатом ядре (а2А- и а2В-подтипы) и в ряде других структур. Несмотря на то что чис- ло адренорецепторов в мозге относительно невелико, они играют за- метную роль в регуляции психоэмоционального состояния, и наруше- ние их работы вносит определенный вклад в развитие ряда нейропато- логий (шизофрения, депрессивные состояния и др.).
138 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИ* Дофаминовые рецепторы. Активируются дофамином, являют- ся метаботропными и осуществляют свои функции, изменяя актив- ность аденилатциклазы. Выделяют несколько их подклассов, ко- торые различаются по сродству к дофамину и его агонистам (бром- криптину и апоморфину) и антагонистам (хлоропромазину, гало- перидолу, клозапину), локализации в структурах мозга, направленнос- ти влияний на аденилатциклазу и способности тормозить выброс про- лактина (табл. 2.2). Дофаминовые рецепторы участвуют в контроле двигательных функций (стереотипии, вращение при разрушении нигро-стриарного тракта и др.) и психических реакций. Они вовлечены также в работу системы внутреннего подкрепления. Нарушение функции дофамино- вых рецепторов играет заметную роль в патогенезе таких заболева- ний, как паркинсонизм, шизофрения и др. Таблица 2.2. Характеристика дофаминовых рецепторов Класс D1 D2 Подкласс D1A DIB D2A D2B D2C Классификация D1 D5 D2 D3 D4 Количество аминокислотных остатков (человек) 446 477 414/443 440 387 Сродство к дофамину Низкое Среднее Среднее Высокое Высокое Активация АЦ t t l (!) (!) Оборот ИФ3 (t) — t — — Вход Са2+ (t) — 1 1 Выход К+ — — t — — Распределение в мозге Стриатум -1- -1- Гиппокамп -1- -1- + Гипоталамус -1- -1- -1- Черная субстанция -I- -I-
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 13 Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-НТ). Относится к моно- аминам. Серотонинергические нейроны составляют ядра шва в рост- ральной части моста мозга (см. рис. 2.7). Они дают проекции на лим- бическую систему,.базальные ганглии, кору больших полушарий. Зо- ны иннервации серотонинергических нейронов сходны с проекциями норадренергических нейронов. В продолговатом мозге находятся се- ротонинергические нейроны, аксоны которых образуют нисходящие пути в ствол мозга и в спинной мозг. Кроме того, серотонин обнаружен в нейронах гипоталамуса, черной субстанции, спинном мозге. Серото- нин синтезируется и вне центральной нервной системы, особенно вы- соко его содержание в тромбоцитах и кишечнике. Серотонинергическая система играет важную роль в регуляции двигательной активности, эмоционального, пищевого и полового по- ведения, терморегуляции, участвует в контроле нейроэндокринных систем. Серотонин может выполнять функцию не только нейромеди- атора, но и нейромодулятора. Серотонинергическая система, так же как и норадренергическая, по-видимому, оказывает генерализованное влияние на цикл «сон—бодрствование», восприятие сенсорных и бо- левых сигналов и высшие когнитивные функции. Этот нейромедиатор (наряду с рядом других) обеспечивает функционирование системы внутреннего подкрепления. В опытах на головном мозге позвоночных были выявлены и воз- буждающие, и тормозные эффекты серотонина. Как показали недав- ние исследования, такие препараты, как LSD и трициклические анти- депрессанты, воздействуют на серотонинергическую систему как на пресинаптическом, так и на постсинаптическом уровне. Есть данные о том, что у депрессивных больных содержание серотонина в головном мозге снижено; лекарственные средства, способные понижать в си- напсе уровень моноаминовых нейромедиаторов (дофамин, норадрена- лин и серототин), вызывают депрессию, тогда как препараты, приме- няемые для лечения депрессии, обычно повышают содержание этих нейромедиаторов или усиливают их действие. Серотонин синтезируется из триптофана. Первая (лимитирующая) стадия этого процесса протекает с помощью фермента триптофангид- роксилазы, который превращает триптофан в 5-гидрокситриптофан (рис. 2.12). Последний декарбоксилируется с образованием серотони- на при участии декарбоксилазы ароматических L-аминокислот, т. е. того же самого фермента, который превращает ДОФА в дофамин. Вы- свобождение серотонина из нейронов во время их стимуляции вызы- вает повышение скорости превращения триптофана в 5-гидрокси- триптофан. Предполагается, что это происходит благодаря изменению
140 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ NH СООН I сн2—CH—nh2 Моноаминоксидаза А Альдегиддегидрогеназа 5-Гидрокси индолуксусная кислота Рис. 2.12. Этапы синтеза и метаболизма серотонина свойств триптофангидроксилазы, вызванному Са-зависимым фосфо- рилированием, сходным с эффектами стимуляции тирозингидроксила- зы. Как и в случае тирозингидроксилазы, для функционирования трип- тофангидроксилазы необходим кофактор тетрагидробиоптерин, при- сутствие которого будет определять возможность синтеза серотонина. Если в середине прошлого века было известно лишь два класса ре- цепторов серотонина (5-гидрокситриптамина, 5-НТ), то к настоя- щему времени их уже четырнадцать (табл. 2.3). Подавляющее большинство рецепторов серотонина — метаботропные рецепторы, связанные с G-белками и имеющие характерную 7-доменную транс-
Таблица 2.3. Характеристика серотониновых рецепторов Тип Действие Подтип Вторичный посредник1 Селективный/ преимущественный агонист Селективный антагонист 5-НТ1А Gi/o/z —► | цАМФ 8-OH-DPAT WAY 100635 5-HT1b/d Gi/o —► 1 цАМФ СР 93129 SB 224289 5-HTj Гиперполяризация 5-НТю N/A BRL 15572 5-НТ1Е Gi/o(?) — | цАМФ N/A N/A 5-HT1f LY 334370 N/A 5-НТ2А Gq/11 —► активация фосфолипазы С, 1 калиевой проводимости, | входа Са2+, активация фосфолипазы А2 и СР 94253 MDL 100907 5-НТ2 Деполяризация 5-НТ2В BW 273С86 SB 204741 5-НТ2С пути арахидоновой кислоты МК212 SB 242084 5-НТ3 Деполяризация Лигандуправляемый Na/K- канал 2-Метилсеротонин Ондасетрон 5-НТ4 Деполяризация Gs —> f цАМФ SDZ 216454 GR 113808 5-НТ5 Не известен Не известен N/A2 N/A 5-НТ6 Деполяризация Gs —* Т цАМФ N/A SB 271046 5-НТ7 Деполяризация N/A SB 258719 2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 1 Свойства G-белков см. в гл. 2.4. 2 N/A — селективный агонист или антагонист отсутствует.
142 Раздел 2. ML.nt КУЛЛРНл.я HI ЙРо,ИМИ>. мембранную структуру. Они найдены как в разных структурах мозга (кора больших полушарий, лимбическая система, базальные ганглии, миндалевидный комплекс, черная субстанция, область вентральной покрышки и др.), так и на периферии. Их локализация может быть как пре-, так и постсинаптической. Исключением является подтип серото- нинового рецептора 5-НТ3; он относится к быстродействующим ионотропным рецепторам, канал которых пропускает ионы К+ и Na+. Кроме того, некоторые из этих рецепторов регулируют выделение других медиаторов (дофамина, норадреналина, пролактина и глутама- та) и действуют как гетерорецепторы. В зависимости от типа, они мо- гут использовать в качестве эффекторных ферментативных систем аденилатциклазу или фосфолипазу. Рецепторы серотонина участвуют в регуляции циркадных ритмов и терморегуляции. Некоторые типы серотониновых рецепторов явля- ются компонентами системы внутреннего подкрепления. Из поведен- ческих и физиологических эффектов, связанных с этими рецепторами, следует отметить состояния страха, паники, психозы, навязчивые со- стояния, галлюциногенные эффекты. Существует характерный двигательный синдром, регулируемый 5-НТ2-рецепторами, — синдром «отряхивания мокрой собаки» («wet dog shakes»), его используют в качестве теста в исследованиях серо- тонинергической системы. Периферические эффекты активации рецепторов серотонина всех классов весьма многообразны. Главные из них состоят в сокращении сосудов, в реализации положительных хроно- и инотропных воздейст- вий на сердце. Гистамин. Гистаминергическая система весьма своеобразна по своей локализации и функциям. Важным этапом исследования лока- лизации элементов гистаминергической системы явилось открытие специфического ингибитора синтеза гистамина — а-фторметилгиста- мина. Нейроны, продуцирующие гистамин; сосредоточены в ограни- ченной области мозга — туберомамиллярных ядрах заднего гипотала- муса. Эта группа нейронов распространяет свои эфферентные волок- на практически на все отделы мозга: повсеместно обнаруживаются как постсинаптические, так и пресинаптические рецепторы гистами- на. Столь широкая локализация рецепторов гистамина позволяет по- нять разнообразные функции гистаминергической системы. Гистамин стимулирует двигательную активность, половое поведение, участвует в регуляции цикла «сон—бодрствование», подавляет восприятие бо- ли. Усиливая жажду, он подавляет инстинкт добывания пищи. Гиста-
jp. ларактеристика индивидуальных медиаторных систем мин входит в число факторов, которые участвуют в повышении арте- риального давления, в терморегуляции (снижении температуры тела) и (косвенно) в стимуляции энергетического обмена мозга, усиливая кровообращение. Интересно, что гистамин реализует эти функции не только в рамках классических синапсов, часть гистамина выделяется так называемыми открытыми нервными окончаниями и способна к распространению по межклеточным жидкостям, в том числе через ликвор. Многие гистаминергические нейроны содержат и другие ме- диаторы, такие как ГАМК, вещество Р или энкефалин. Рецепторы гистамина. К настоящему времени выявлено и ис- следовано три класса рецепторов гистамина: Hj и Н2 — постси- наптические и Н3 — пресинаптические. Последние найдены не только в гистаминергических, но и в терминалях аминергических, холинерги- ческих и пептидергических нейронов. Все три класса рецепторов связаны с G-белками и являются мета- ботропными. Активация Hj-рецепторов приводит к образованию ИФ3 и DAG, а Н2 — к активации аденилатциклазы. Ингибиторами Ht-рецепторов служат димедрол, фенкарал, супрас- тин, получившие широкое применение в медицине. Хорошо изученным ингибитором Н2-рецепторов является циметидин — известный проти- воязвенный агент. Пресинаптические рецепторы гистамина класса Н3 являются ауторецепторами, подавляющими выход гистамина из нерв- ных окончаний. Гистаминовые рецепторы обнаруживаются во многих структурах мозга: коре, гиппокампе, лимбических структурах и гипоталамусе. Отмечается участие этих рецепторов в регуляции цикла «сон—бодр- ствование». Аминокислотные нейромедиаторы в соответствии с их функцией делятся на две группы — возбуждающие (глутамат, аспартат) и тормозные (ГАМК, глицин, таурин). Глутаминовая кислота. Является главным возбуждающим ме- диатором, выявляется во всех отделах ЦНС (см. рис. 2.7), очевидно, благодаря тому, что служит не только нейромедиатором, но и пред- шественником других аминокислот (см. гл. 3.1). Проекции глутама- тергических нейронов находятся в коре больших полушарий, обоня- тельной луковице, гиппокампе, черной субстанции, мозжечке, сетчат- ке. Глутаматергические синапсы обнаружены в миндалине, стриатуме, на клетках-зернах мозжечка. В спинном мозге глутамат выполняет
144 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ функцию нейромедиатора в первичных афферентных волокнах дор- сальных корешков. Выявление глутаматергических связей в головном мозге проводит- ся в соответствии с идентифицированными местами высвобождения нейромедиатора, а также с помощью моно- и поликлональных антител к глутаматным рецепторам. Нарушение глутаматергической передачи связано с целым рядом патологических состояний нервной системы: эпилепсией, расстройст- вами вестибулярной системы, ишемическим повреждением мозга. Глутаминовая кислота практически не проникает через гематоэнце- фалический барьер (ГЭБ), поэтому в качестве терапевтического ле- карственного средства при хронической недостаточности аминокис- лотного обмена, вегетососудистой дистонии и эпилепсии рассматри- ваются некоторые ее аналоги, способные преодолевать ГЭБ. Глутамат, являющийся основным возбуждающим медиатором в мозге, может синтезироваться несколькими пу- тями. В нейронах глутамат, использующийся как нейромедиатор, первоначально синтезируется из углерода окисляющейся глюкозы че- рез стадию образования кето глутарата в реакциях ЦТК. После выброса в синаптическую щель и взаимодействия с рецеп- торами пресинаптической мембраны диссоциировавший от рецепто- ров нейромедиатор, а также избыточные количества глутамата удаляются из синаптической щели преимущест- венно двумя способами. Небольшие количества глутамата подвергаются «обратному захвату» и относительно малоактивным транспортером возвращаются в пресинаптическое окончание. Основ- ная часть глутаминовой кислоты поглощается астроцитами, причем в данном случае действует очень активный транспортер глутамата. В астроцитах глутаминовая кислота аминируется глутаминсинтазой до глутамина. Следует отметить, что глутаминсинтаза — очень активный фермент, локализованный преимущественно в этом типе глиальных клеток. О важности глутаминсинтазной реакции для мозга говорит тот факт, что на долю этого фермента приходится до 0,2% суммарного содержания белка в ткани. Из астроцитов глутамин поступает в пресинаптические окончания глутаматергических нейронов, где превращается в глутамат при помо- щи активируемой фосфатом формы фермента глутаминазы. Специ- фичный для мозга транспортер неорганического фосфата локализован избирательно на терминалях глутаматергических нейронов и, таким образом, может регулировать пополнение пула глутамата в пресинап- тических окончаниях.
2.3. характеристика индивидуальных медиаторных систем 145| Частично глутамин, образовавшийся в астроцитах, может выде- ляться в кровь; таким образом из мозга удаляется избыток ионов NH^-. Но вместе с ним из мозга удаляется и глутаминовый «скелет». Для восполнения пула глутаминовой кислоты, выполняющей меди- аторные функции, необходимо постоянное пополнение запасов глута- мата, осуществляющееся за счет а-кетоглутаровой кислоты. Глутаматные рецепторы. Глутаматергическая система, наибо- лее широко распространенная в мозге, представлена как ионотропными, так и метаботропными рецепторными структурами (рис. 2.13). Их иден- тифицируют по лигандам, избирательно активирующим или ингибирую- щим тот или иной класс рецепторов. Ранее эти рецепторы подразделяли на NMDA-рецепторы и He-NMDA-рецепторы, с делением последних на взаимодействующие с а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпро- пионовой кислотой (АМРА), каиновой кислотой и квисквалоновой Рис. 2.13. Схема, отражающая взаимодействие глутамата с различными клас- сами глутаматных рецепторов. mGluR — метаботропный глутаматный рецептор; AMPA-R — АМРА-рецептор; NMDA-R — NMDA- рецептор
146 ► аздел 2. Mt ,’lf КУЛяРН^Я HF ЙРЧ ХИМИЯ Таблица 2.4. Классификация глутаматных рецепторов Глутаматные рецепторы Функциональная характеристика Изоформы Основной агонист Анта- гонисты Метаболическая функция NR1 NR2A NR2B NR2C NR2D NR3A NMDA D-AP5 MK-801 Активация ионных каналов (Са2+, Na+) ИОНО- ТРОПНЫЕ GluRI GluR2 GluR3 GluR4 АМРА CNQX Активация ионных каналов (Na+) GluR5 GluR6 GluR7 КА1 Каиновая кислота DNQX Активация ионных каналов (Na+) КА2 1 группа (mGlui, mGlu5) 3,5-DH- PG MCPG Активация ИФ3-зависимого обмена кальция МЕТАБО- ТРОПНЫЕ 2 группа (mGlu2, mGlu3) L-CCG, NAAG PCCG4 Повышение уровня цАМФ 3 группа (mGlu4, mGlu6, mGlu7, mGlu8) L-AP4 ACPD MSOP LY341495 Повышение уровня цАМФ и понижение уровня цГМФ кислотой. В настоящее время классификация глутаматных рецепто- ров более детализирована (табл. 2.4). Ионотропные рецепторы обеспечивают формирование возбуж- дающих импульсов. Глутаматные рецепторы, активируемые NMDA (N-метил-О-аспартатом), локализованы преимущественно в коре мозга и гиппокампе, где плотность их максимальна; до 70—80% синапсов этих структур мозга обладают именно такими рецепторами. Они обнаружены также в сенсорно-ассоциативной системе и в ба- зальных ганглиях. NMDA-рецепторы ответственны за молекулярные механизмы запоминания, ориентации в новой обстановке, за консоли- дацию памяти (так называемые процессы долговременной памяти),
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 147 принимают участие в формировании нейрональной пластичности, в процессах интегративной деятельности мозга. Большое внимание к NMDA-рецепторам обусловлено тем, что благодаря этим рецепторам осуществляется медленная длительная деполяризация нейронов. Именно с их функцией связаны долговре- менная потенциация в гиппокампе, процессы ноцицепции, эпилепти- формная активность, а также экзайтотоксические эффекты глутамата. NMDA-рецептор имеет гетеромерную структуру. Он состоит из од- ной NR1- и нескольких NR2-субъединиц, которые определяют функ- циональное разнообразие его изоформ. NMDA-рецептор не является специфичным каналом, поскольку может пропускать как ионы каль- ция, так и ионы натрия. Молекула NMDA-рецептора содержит пять различных участ- ков, взаимодействие с которыми приводит к изменению его актив- ности: участок связывания нейромедиатора; участок внутри канала, который связывает фенциклидин и родственные соединения; модуля- торный участок связывания полиаминов; стрихниннечувствительный участок связывания глицина, являющегося коагонистом глутамата, а также потенциалзависимый Mg-связывающий участок, позволяю- щий блокировать канал, который восстанавливает свою работоспо- собность только после деполяризации мембраны. Следует обратить внимание на специфику регуляции NMDA-глута- матных рецепторов, отличающую их от других известных ионотропных рецепторов. Прежде всего, наряду с хемочувствительностью к лиганду они обладают выраженной зависимостью от величины электрического потенциала, что обусловлено потенциалзависимой блокадой канала ионами Mg2+. Далее, NMDA-рецепторы весьма чувствительны к вели- чине pH среды; частота открытия ионного канала снижается по мере возрастания концентрации водородных ионов. Еще одна особенность этих рецепторов — наличие коактиватора (глицина); связывание гли- цина абсолютно необходимо для функционирования рецептора, по- скольку в его отсутствие рецептор не активируется глутаматом. Ионотропные АМРА и каинатные рецепторы (в большинстве натриевые каналы) являются гомо- или гетеромерными пентамерами. В большинстве областей ЦНС с активацией этих рецепторов связан вход Na+ в клетку и быстрое формирование мембранного потенци- ала (в виде деполяризации). Большая часть каналов каинатных и АМРА-рецепторов не проницаемы для Са2+, в то же время вызывае- мая ими деполяризация мембраны активирует потенциалзависимые Са-каналы, что позволяет зарегистрировать Са-токи при активации нейронов каинатом или АМРА.
148 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Интересно, что каинатные рецепторы Glu5R локализуются на пре- синаптической мембране нейронов, выделяющих глутамат, и являют- ся, таким образом, возбуждающими ауторецепторами, усиливающими выброс медиатора в синаптическую щель. Наблюдение процесса фор- мирования синаптических контактов обнаружило явление «переска- кивания» каинатных рецепторов с постсинаптической зоны на преси- наптическую мембрану, сопровождающее совершенствование синап- тического проведения. Метаботропные рецепторы глутамата, с характерной для этой группы рецепторов 7-доменной мембранной структурой, имеют раз- нообразный состав; к настоящему времени описано восемь типов этих рецепторов. Для них характерна как пост-, так и пресинаптическая локализация и экспрессия не только в нейрональных, но также и в глиальных клетках. Эти рецепторы принимают участие в формиро- вании механизмов памяти, восприятия боли, тревожных состояний, а также в процессах нейродегенерации. Следует добавить, что во многих случаях ионотропные (как NMDA, так и не-NMDA) и метаботропные глутаматные рецепторы локализо- ваны на мембранах вблизи друг от друга и действие их является согла- сованным и взаимодополняющим. Аспарагиновая кислота. Наиболее высокое содержание аспар- тата найдено в среднем мозге. В спинном мозге аспартат содержится в дорзальном и вентральном сером веществе. Предполагается нейроме- диаторная роль аспартата в возбуждающих интернейронах, которые регулируют различные спинномозговые рефлексы. у-Аминомасляная кислота (ГАМК). Основным тормозным ме- диатором головного мозга служит у-аминомасляная кислот. Эта спе- цифическая аминокислота, в отличие от обычных аминокислот, не входит в состав первичной структуры белков и синтезируется исклю- чительно в головном и спинном мозге. ‘Не менее трети (у некоторых видов до 50%) синапсов головного мозга используют в качестве тор- мозного медиатора ГАМК. Области распространения ГАМК-ергиче- ских нейронов показаны на рисунке 2.7 (с. 126). Интересно, что боль- шая часть данных нейронов образует лишь внутренние связи в таких отделах, как кора большого мозга, обонятельные луковицы, гиппо- камп, мозжечок и сетчатка (исключение составляют лишь короткие проекционные пути от стриатума к черной субстанции и от коры моз- жечка к его ядрам). К областям, содержащим наиболее высокую кон- центрацию ГАМК, относятся черная субстанция, бледный шар, гипо-
й 2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 14 таламус и мозжечок. Эта аминокислота содержится преимущественно в сером веществе головного и спинного мозга. Высокие концентрации ГАМК найдены также в горизонтальных клетках сетчатки; предпола- гается, что ГАМК обеспечивает обратную связь и латеральное тормо- жение в слое горизонтальных клеток (см. гл. 3.6). Для выявления ГАМК в мозге используется широкий набор мето- дов, в том числе иммуноцитохимическое выявление глутаматдекар- боксилазы — фермента, участвующего в синтезе этого медиатора, а также иммуногистохимическое выявление ГАМК-рецепторов и иссле- дование распределения радиоактивной ГАМК. ГАМК-ергическая система, как основная тормозная система моз- га, участвует в реализации многих функций, в том числе в регуляции моторной активности, формировании эмоционального поведения, в осуществлении условных рефлексов, организации процессов обуче- ния и памяти у млекопитающих. При этом она тесно взаимодействует с другими нейромедиаторными системами мозга: дофаминергической, холинергической, глутаматергической и др., модулируя их функции. Существует большое количество данных о вовлечении системы ГАМК в механизмы многих расстройств нервной системы. Например, для хореи Гентингтона — наследственного неврологического заболе- вания — характерен специфический дефицит ГАМК в мозге. При этом заболевании возникают непроизвольные движения и происходит постепенное разрушение полосатого тела. Нарушение работы ГАМК-ергической системы имеет место при эпилепсии, тревожных состояниях и ряде других нейропатологий. Реакция синтеза ГАМК была впервые описана для мозга Е. де Ро- бертасом в 1959 г. как часть специфического пути метаболизма глю- козы, который позволяет миновать некоторые реакции цикла Кребса (ГАМК-шунт). Благодаря этому а-кетоглутарат превращается в глу- тамат, затем в ходе декарбоксилирования — в ГАМК. После выпол- нения медиаторной функции ГАМК вначале превращается в янтарный полуальдегид, а затем окисляется до сукцината, который может быть далее окислен в ЦТК(рис. 2.14). ГАМК синтезируется из глутамата ферментом глутаматдекарбо- ксилазой (ГАД), обнаруженной только в ГАМК-ергических нейронах. Таким образом, главная функция ГАМК-шунта заключается не в окислении а-кето глутарата с образованием сукцинил - КоА (т. е. мета- болита, способного участвовать в субстратном фосфорилировании для получения макроэргов), а в синтезе основного тормозного медиатора ГАМК (см. гл. 3.2).
150 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕИРОХИМИЯ ГАМК-ергический нейрон Астроцит Глутаматергический нейрон fПостсинаптический нейрон ^Постсинаптический нейрон ) Фермент @ Везикула Митохондрия О Транспортеры глутамина О ГАМК Рис. 2.14. Участие нервных и глиальных клеток в ГАМК-глутамат-глутамино- вом цикле (на фоне схематического изображения митохондрий}’. ДГПЯК — дегидрогеназа полуальдегида янтарной кислоты; ГАД — глутаматдекарбокси- лаза; ГАМК-Т — 4-аминобутираттрансаминаза; ГС — глутаминсинтаза; АТ — амино- трансфераза; ГДГ — глутаматде гидро ген аза; ФАГ — фосфатактивируемая глутаминаза Для синтеза ГАМК также характерен механизм регулирования по принципу отрицательной обратной связи, поскольку в тормозных ней- ронах коры физиологические уровни ГАМК ингибируют ГАД. В мозге млекопитающих имеется несколько дополнительных регуляторов син- теза ГАМК, включая АТФ, неорганический фосфат и кофактор пири- доксальфосфат. В мозге присутствуют две формы глутаматдекарбо- ксилазы: ГАДб7, которая имеет высокое сродство к пиридоксальфос- фату и поэтому постоянно находится в активированном состоянии, и ГАДб5, которая имеет низкое сродство к пиридоксальфосфату, ее ак- тивность может изменяться благодаря доступности этого кофактора. Обратный захват ГАМК характерен как для нейронов (протекает медленно), так и для глиальных клеток — преимущественно астроци- тов, которые активно поглощают ГАМК с помощью высокоаффинной транспортной системы. В астроцитах ГАМК метаболизирует либо че- рез стадию янтарного полуальдегида до сукцината с последующим ис- пользованием его в ЦТК, либо до глутамина. С использованием меха- низмов специфического транспорта глутамин из астроцитов пере- носится в пресинаптические области ГАМК-ергических нейронов, где используется для синтеза новых порций медиатора ГАМК (см. рис. 2.14).
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 151 Рис. 2.15. Структура ГАМКд-рецептора и формируемого им ионного канала: а — субъединица с четырьмя трансмембранными участками, участками внеклеточного гликозилирования и участком фосфорилирования на внутриклеточной петле между М3 и М4; б — ассоциация пяти субъединиц, осуществляющая благодаря М2-домену каждой субъединицы при стехиометрии 2ос : 2р : 1у; в — возможные комбинации субъединиц бензодиазепинчувствительного и бензодиазепиннечувствительного рецепторов (у-субъ- единица заменена на 8-субъединицу), а также рецептор с я-субъединицей ГАМК-рецепторы. Их делят на три класса. Ионотропные ГАМКд- и ГАМКс-рецепторы формируют мембранные каналы, и их активация ведет к увеличению проницаемости для С1“ и НСО3, соот- ветственно. Наиболее хорошо исследованный ГАМКд-рецептор обладает высо- кой чувствительностью к антагонисту — бикукулину. Он состоит из пя- ти субъединиц, каждая из которых имеет четыре трансмембранных до- мена (рис. 2.15). Описано семь разных субъединиц — а, 0, у, 5, е, я, 0, причем для первых трех описаны разные изоформы (а1— б, 0j_3, Yi— 3). На внутриклеточных петлях 0- и у-субъединиц расположены участки, которые могут фосфорилироваться различными протеинкиназами.
152 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Работа рецептора модулируется целым рядом соединений, в том числе фармакологическими препаратами (пикротоксином, анестети- ками, бензодиазепинами, стероидами, барбитуратами), причем эти ве- щества связываются с рецептором в участках, отличных от мест свя- зывания с ним ГАМК, ее агонистов или антагонистов. Особое место среди этих соединений занимают бензодиазепины в связи с их широ- ким применением в качестве лекарственных препаратов снотворного, противосудорожного, нейротропного действия. Детальные исследова- ния механизмов взаимодействия бензодиазепинов с ГАМКд-рецеп- торным комплексом привели к открытию эндогенных лигандов пеп- тидной природы — эндозепинов. Присоединение этих регуляторных пептидов к бензодиазепиновому сайту тормозит открытие С1-канала, вызванное присоединением медиатора (ГАМК) к рецептору. Препара- ты группы бензодиазепинов блокируют сайт связывания эндогенных эндозепинов и удлиняют продолжительность существования открытых ионных каналов, не влияя на их число и скорость транспорта хлора. Барбитураты, в отличие от бензодиазепама, способны активировать хлорные каналы и в отсутствие ГАМК. ГАМКв-рецептор представляет собой связанный с G-белком ме- таботропный рецептор; он влияет на активность аденилатциклазы, подавляет выделение медиатора путем торможения Са-каналов или гиперполяризирует постсинаптическую клетку в результате прямой активации К-каналов (рис. 2.16). Эти рецепторы локализованы глав- ным образом в периферической нервной системе. В ЦНС данный тип рецепторов обнаружен на пресинаптических терминалях, выделяю- Рис. 2.16. Структура и принцип функционирования ГАМКВ-рецептора. Активированная Р/у-субъединица запускает открытие канала, а ос-субъединица оказы- вает тормозящее действие на аденилатциклазу
2.3. Характеристика индивитальных 11- диаторных систем is: Ё1 I щих различные медиаторы, в том числе и ГАМК. Антагонистом данно- го типа рецепторов служит баклофен. ГАМ!^-рецептор имеет сходную с ГАМКд-рецептором пентамерную структуру, но в его состав входит специфическая субъединица р. Его от- личительными чертами являются нечувствительность к бикукулину и способность формировать гомомерный рецепторный комплекс только из р-субъединиц, обладающий более высоким сродством к ГАМК, чем мно- гие ГАМКд-рецепторы, состоящие из комбинации а, [3 и у-субъединиц. Глицин. Выполняет нейромедиаторную роль в стволе головного мозга и в спинном мозге млекопитающих, где опосредует постсинап- тическое торможение мотонейронов, высвобождаясь из окончаний клеток Реншоу. Глицин является нейромедиатором также в тормозных интернейронах промежуточного мозга и ретикулярной формации про- долговатого мозга. Для глутаматных рецепторов определенного клас- са (см. NMDA-рецепторы) он является модулятором. В сетчатке наря- ду с ГАМК глицин выполняет функции тормозного медиатора. Локализация глицинергических нейронов устанавливается авторадио- графически. У больных с некоторыми врожденными метаболическими аномалиями, связанными с повышенным содержанием глицина в ткани мозга и в крови, может развиваться гиперглицинемия, сопровождаю- щаяся симптомами нарушения ряда психоэмоциональных функций. Глициновые рецепторы. Эти рецепторы активируются рядом аминокислот, такими как глицин, 0-аланин, таурин, и избирательно блокируются стрихнином. Наибольшая их плотность обнаружена в области ядер подъязычного и тройничного нервов, локализованных в продолговатом мозге. Участки связывания стрихнина найдены также в ретикулярных ядрах продолговатого мозга, моста, среднего мозга, в передних и задних рогах серого вещества спинного мозга. Строение глицинового рецептора аналогично таковому у ГАМКд-ре- цептора, с той лишь разницей, что в состав пентамера входят четыре а-субъединицы и одна [3-субъединица. На постсинаптической мембране эти рецепторы образуют канал, обеспечивая проницаемость для хлора, за счет чего при возбуждении способны формировать тормозный пост- синаптический потенциал (ТПСП). Находясь на пресинаптической мембране, глициновые рецепторы способны вызывать ее деполяризацию, активируя Са-каналы и увели- чивая выброс медиатора. В отличие от ГАМКд-рецепторов, глицино- вый рецептор нечувствителен к бензодиазепаму, относительно нечув- ствителен к барбитуратам и блокируется некоторыми стероидами.
154 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Пурины. Нейромедиаторами являются и некоторые пурины. Су- ществует два основных типа пуринергической пе- редачи сигнала. При первом типе передачи основным нейроме- диатором служит аденозин, при втором — АТФ и его производное ди- аденозинтетрафосфат. В качестве нейромедиаторов пуринергической системы могут выступать также и другие производные пуринов и (как установлено в последние годы) пиримидинов. В большинстве случаев АТФ является котрансмиттером других медиаторов. Благодаря АТФ осуществляется неадренергическая и нехолинергическая иннервация гладкой мускулатуры кишечника. В периферических органах и тканях, получающих симпатическую и парасимпатическую иннервацию. АТФ используется как медиатор прямого действия. Частично АТФ выбра- сывается из синапсов вместе с другими медиаторами, другая его часть имеет цитоплазматическое происхождение. АТФ служит медиатором во всех синапсах, образуемых метасимпа- тическим отделом вегетативной нервной системы на гладких мышцах. Аденозин играет роль эндогенного антиконвульсанта, а также вещест- ва, регулирующего начальные стадии сна. Он оказывает главным об- разом тормозное влияние на ряд возбуждающих синапсов. Аденозину приписывается роль нейромодулятора метаботропных глутаматных рецепторов. Рецепторы пуринов. Их делят на два класса: Pj (преси- наптические, активируемые аденозином) и Р2 (постсинаптические, ак- тивируемые АТФ и диаденозинтетрафосфатом). Рецепторы аденозина Pj-класса являются медленными метаботропными рецепторами. Сре- ди них есть рецепторы, подавляющие системы синтеза цАМФ (AJ, и рецепторы, активирующие синтез цАМФ (А2). Довольно специфиче- скими ингибиторами Aj-рецепторов являются теофиллин и кофеин. Агонистом Aj-рецепторов служит не только аденозин, но и АМФ, при- чем эти соединения могут иметь как синаптическое, так и экстракле- точное происхождение (т. е. образовываться в других клетках). Это позволяет понять, почему истощение энергетических ресурсов мозга, приводящее к накоплению АМФ и аденозина, активирует Aj-рецепто- ры и оказывает успокаивающее (седативное) и противосудорожное действие. Иными словами, один из физиологических эффектов данных рецепторов — защита энергетических ресурсов мозга в экстремаль- ных ситуациях. Такой же механизм лежит в основе участия аденозино- вых рецепторов в регуляции цикла «сон—бодрствование». Рецепторы Р2-класса в свою очередь подразделяются на две группы— быстрые ионотропные (Р2х) и медленные метаботроп- ные (P2Y) (к настоящему времени известно шесть изоформ первых
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 15! I и семь изоформ вторых). АТФ, воздействуя на быстрые рецепторы, вызывает гипотензию, стимулируя в то же время сократительную деятельность сердца. Следует отметить, что пуринергические рецепторы, локализован- ные пресинаптически, способны модулировать работу других меди- аторных систем, в первую очередь холин- и адренергической. Нитроксид (NO). Образуется из аргинина под действием фер- мента NO-синтазы. Аналогично классическим нейромедиаторам, в пресинаптических терминалях из L-аргинина и молекулярного кисло- рода с помощью фермента NO-синтазы образуется NO: L-аргинин + НАДФН + О2------> цитруллин + NO + НАДФ+. В настоящее время выделяют три изоформы NO-синтазы (NOS). Их классификация основывается на анатомической локализа- ции и механизмах регуляции. По механизму активации NO-синтазы делят на консти- тутивные и индуцибельную (iNOS). Две конститутивные, обнаруживаемые главным образом в эндотелии и нейронах, получили свое название по месту локализации — эндотелиальная (eNOS) и нейрональная (nNOS). Эндотелиальная изоформа постоянно присутст- вует в эндотелиальных клетках и обеспечивает кратковременный выброс из них NO в ответ на активацию мембранных рецепторов и повышение внутриклеточной концентрации Са2+. Нейрональная NO-синтаза отве- чает за кальцийзависимое высвобождение NO из нервных клеток. Индуцибельная NO-синтаза присуща макрофагам, гладко- мышечным клеткам и печени. Она индуцируется действием на клетки цитокинов и бактериальных эндотоксинов и обусловливает долговре- менный синтез больших количеств NO. Конститутивные NO-синтазы постоянно присутствуют в клетках, их активность находится в прямой зависимости от уровня ионов Са2+, а регуляция осуществляется через кальмодулин, являющийся кофактором этого фермента. Индуцибель- ная форма не зависит от содержания кальция и транскрипционно ре- гулируема. Глюкокортикоиды подавляют экспрессию только индуци- бельной NO-синтазы. Основными источниками NO в центральной и периферической нервной системе являются эндотелиоциты сосудов, клетки микроглии и астроциты, а также глутаматергическйе нейроны. В нейронах NO-синтаза связана с ионотропным NMDA-рецептором глутамата. Ионы кальция, входящие через активированный NMDA-рецептор, связываются с кальмодулином, и кальций-кальмодулиновый комплекс активирует NO-синтазу.
156 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ NO является водо- и жирорастворимой радикальной молекулой, способной диффундировать из клетки, в которой образуется, в сосед- ние клетки, где активирует фермент гуанилатциклазу. NO был впер- вые описан как регулятор артериального давления, опосредующий расширение сосудов при воздействии ацетилхолина. В отличие от классических нейромедиаторов, NO не может накап- ливаться в синаптических везикулах, освобождаться нервными оконча- ниями и взаимодействовать с соответствующими рецепторами. Вместо этого NO равномерно диффундирует от места синтеза в близлежащие клетки, и его распространение лимитируется только временем жизни. Это время достигает нескольких (до 10) секунд, вследствие чего его сигнал может распространяться на относительно большие расстояния. Такой тип сигнализации, промежуточный между прямой синаптиче- ской передачей и высвобождением гормонов эндокринными органами в кровеносное русло, называется паракринным. NO, благодаря своей способности проникать через нейрональную мембрану, может коорди- нировать активность ряда близлежащих клеток и, влияя на синаптиче- скую пластичность, объединять нейроны в локальные нейрональные сети. Следова- тельно, в нервной системе NO выступает как своеобразный вторичный мессенджер. Выяснение сигнальных путей, в которые вовлекается NO, привело к пониманию механизма действия нитроглицерина, уже давно используемого для временной ком- пенсации сосудистых спазмов. Нитрогли- церин является донором NO и особенно эффективен для расширения коронарных артерий. Его действие приводит к увеличе- нию кровоснабжения сердца и устранению боли, возникающей при ишемической бо- лезни сердца (приступы стенокардии). Отмечается важная роль NO в разви- тии процесса повреждения нейронов при избытке глутамата и гиперактивации глу- таматных рецепторов (эксайтотоксичность глутамата). Показано участие NO в ноци- цепции. Многими исследователями отво- дится существенная роль этому соединению в долговременной потенциации, наблюдае- мой в гиппокампе. Такая потенциация свя- зана с активацией NMDA-рецепторов, ко- С. Е. Северин Основоположник отечествен- ной биохимии, организатор кафедры биохимии в МГУ им. М. В. Ломоносова, руко- водивший ею более 50 лет, инициатор развития новых направлений биохимической науки — биоэнергетики, ней- рохимии, мембранологии, из- вестен оригинальными иссле- дованиями биологической ро- ли нейропептвда карнозина
2.3. Характер истина индивид сальных медиаторных систе* 15 торые регулируют состояние пресинаптической терминали. Блокада NO-синтазы тормозит эту потенциацию. Развитие ряда нейродегенеративных заболеваний сопряжено с на- рушением баланса между синтезом NO и супероксида. Взаимодейст- вие данных активных радикалов приводит к образованию пероксинит- рита — высокоактивного окислителя. Следовательно, одновременное накопление этих двух соединений является фактором окислительного стресса (см. гл. 3.9). Таким образом, хотя оксид азота не является классическим меди- атором (поскольку не имеет мембранного рецептора), пути его обра- зования в мозге аналогичны таковым для типичных медиаторов нерв- ной системы. Пептидные медиаторы. Нейропептцды составляют достаточно по- лифункциональную группу регуляторов (табл. 2.5). Некоторые из них удовлетворяют критериям нейромедиаторов. С известной долей осторож- ности сюда можно отнести вещество Р, вазоактивный интестинальный по- липептид (ВИП), соматостатин, нейропептидУ, люлиберин. Значительное число нейропептцдов (опиоидные пептиды, кортикотропин и его фрагмен- ты, кортиколиберин, тиролиберин, кокальцигенин, холецистокинин, бом- безин, галанин, нейротензин, ангиотензин, атриопептцды, брадикинин, вазопрессин, окситоцин и др.) обладают свойствами нейромодуляторов. Таблица 2.5. Физиологическая роль некоторых нейропептидов Пептид Участие в регуляции физиологических функций или состояний Опиоиды Боль, тревога, эмоции, функционирование системы внут- реннего подкрепления Тахикинины Воспаление, седативные эффекты Холецистокинин Поиск пищи, модуляция функций дофаминергической сис- темы, восприятие боли НейропептидУ Поиск пищи, эмоции, нейрональная возбудимость Вазопрессин Обучение и память Соматостатин Аналгезия Нейротензин Терморегуляция, терморецепция, аналгезия, восприятие боли, модуляция функции дофаминергической системы Галанин Сенсорная передача
158 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Многие пептиды, известные как гормоны, одновременно проявля- ют свойства нейромедиаторов. Некоторые из них участвуют в форми- ровании эмоций, другие, как вещество Р и опиоиды, вовлечены в про- цесс восприятия боли; меланоцитстимулирующий гормон, адренокор- тикотропин и p-эндорфин регулируют ответ на стрессорные реакции. Среди нейропептидов можно выделить пептиды опиоидные, гипо- физарные, а также гипоталамические «рилизинг-гормоны». Вещество Р оказалось первым веществом пептидной природы, у которого были обнаружены свойства нейромедиатора. Его название связано с тем, что оно было выделено из ацетонового порошка (pow- der) мозга и кишечника. Оно, в отличие от «классических» медиато- ров, синтезируется не в синаптических окончаниях, а в перикарионе первичных сенсорных нейронов спинномозговых ганглиев, депониру- ется в оптически плотных пузырьках, перемещается к пресинаптиче- скому окончанию посредством быстрого аксонального транспорта и высвобождается из сенсорных нейронов под влиянием деполяризации в присутствии Са2+. При аппликации на дорсальные рога спинного мозга вещество Р вызывает мощное возбуждение сенсорных нейронов второго порядка. Этот пептид, состоящий из 11 аминокислотных остатков, обнару- живается в высоких концентрациях в гиппокампе, неокортексе, а так- же в афферентных С-волокнах периферических нервов, участвующих в передаче информации о болевых и температурных сигналах. Веще- ство Р является медиатором, опосредующим передачу сенсорной ин- формации в спинном мозге, его выделение может блокироваться опи- оидами из интернейронов спинного мозга. Вещество Р найдено в нескольких специфических коротких проек- ционных путях (см. рис. 2.7). Наличие его в нигростриальных волок- нах позволило предположить, что оно служит в данном месте типич- ным нейромедиатором, а значит, играет важную роль в функциях ба- зальных ганглиев по организации движения. Вещество Р содержится также в клетках спинномозговых ганглиев. Деполяризующее действие вещества Р на мотонейроны в 200 раз сильнее, чем действие глутама- та. Однако эффект его развивается медленно, тогда как входные сиг- налы, поступающие по многим волокнам задних корешков, передают- ся быстро и раздельно. Вещество Р инициирует медленные возбуждающие постсинаптиче- ские потенциалы, которые связаны с регуляцией тонуса гладких мышц. Наряду с функцией возбуждающего нейромедиатора первичных сен- сорных нейронов вещество Р способно оказывать модулирующее влия- ние, в частности усиливая десенситизацию никотиновых холинорецеп-
2.3. Характер истина индивидуальна. медиаторнь.х систем 591 торов. В одних и тех же синаптических окончаниях вещество Р может обнаруживаться вместе как с «классическими» нейромедиаторами (се- ротонин, АХ, ГАМК, катехоламины), так и с другими пептидами (вазо- активный интестинальный пептид, опиоидные пептиды, соматостатин, нейротензин). НейропептидУ состоит из 36 аминокислотных остатков. Он выяв- ляется иммуноцитохимическими методами в центральной и перифери- ческой нервной системе в значительных концентрациях (см. рис. 2.7). Особенно высокое содержание нейропептида Y свойственно перифе- рическим нервам сердечно-сосудистой системы и регулирующим ее работу нервным центрам. При этом обнаруживается сосуществование и взаимодействие нейропептида Y с норадреналином (характерно для симпатических нервов гладких мышц кровеносных сосудов и других органов). При введении в мозг этот нейропептид вызывает ряд биоло- гических эффектов — увеличение потребления пищи, седативный эффект, изменения в процессах запоминания и циркадных ритмах. Присутствие и высвобождение вазоактивного интестинального (поли)пептида (ВИП) зарегистрированы во многих отделах нервной системы, прежде всего в коре больших полушарий и в вегетативной нервной системе. Нейромедиаторная функция ВИП отмечена для постганглионарных нейронов вегетативной нервной системы, которые участвуют в расслаблении гладких мышц кровеносных сосудов, дыха- тельных путей, кишечника. Кроме того, взаимодействуя с мускарино- выми холинергическими рецепторами, ВИП способен проявлять ней- ромодуляторную функцию. Так, обнаружено реципрокное взаимодей- ствие этого пептида и АХ. Соматостатин представляет собой пептид из 14 аминокислот. Его название обусловлено тем, что, образуясь в гипоталамусе, этот нейро- гормон тормозит секрецию гормона роста (соматотропина) клетками гипофиза. Нейромедиаторные функции соматостатин выполняет в ве- гетативных ганглиях и в клетках внутренних органов, а также в нейро- нах спинномозговых ганглиев, гипоталамусе, миндалинах и коре боль- шого мозга (см. рис. 2.7). Он обнаружен в норадренергических пост- ганглионарных симпатических нейронах. Введение соматостатина в желудочки мозга приводит к снижению двигательной активности. При ионофоретическом подведении к отдельным нейронам это вещество, подобно некоторым другим пептидам, оказывает медленное тормозное действие. Соматостатин увеличивает амплитуду входящих К-токов в нейронах энтеральных ганглиев. Обнаружено снижение уровня этого пептида при болезни Альцгеймера.
160 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРО* ИМИЯ Опиоидные нейропептиды (табл. 2.6) получили свое название из-за способности связываться с теми же постсинаптическими рецеп- торами, которые активируются опием, точнее его активным компо- нентом морфином. Поиск эндогенных лигандов этих рецепторов при- вел к открытию эндорфинов, обладающих, как и морфин, аналитиче- скими свойствами. Обнаружено более 20 опиоидных пептидов, которые делятся на три группы: эндорфины, энкефалины и ди- норфины. Представители каждой из групп образуются в ходе процес- синга из высокомолекулярных белков-предшественников: проопио- меланокортина, продинорфина и проэнкефалина А (рис. 2.17). Таблица 2.6. Некоторые опиоидные пептиды Название Аминокислотная последовательность а-Эндорфин Туг— Gly—Gly—Phe1—Met— Thr—Ser—Clu—Lys—Ser—Gin— Thr—Pro—Leu—Vai—Thr а-Неоэндорфин Tyr— Gly—Gly—Phe—Leu—Arg— Lys—Tyr—Pro—Lys Эндорфины р-Эндорфин Tyr—Gly—Gly—Phe—Met—Thr— Ser—Glu—Lys—Ser—Gin—Thr— Pro—Leu—Vai—Thr—Leu—Phe— Lys—Asn—Ala—He—Vai—Lys— Asn—Ala—His—Lys—Gly—Gin у-Эндорфин Tyr—Gly—Gly—Phe—Met—Thr— Ser—Glu—Lys—Ser—Gin—Thr— Pro—Leu—Vai—Thr—Leu Энкефалины Лей-энкефалин Tyr— Gly—Gly—Phe—Leu Мет-энкефалин Tyr— Gly—Gly—Phe—Met Динорфины Динорфин А Динорфин В Tyr— Gly—Gly—Phe—Leu—Arg— Arg— He—Arg— Pro—Lys—Leu— Lys—Trp—Asp—Asn—Gin Tyr— Gly—Gly—Phe—Leu—Arg— Arg—Gin—Phe—Lys—Vai—Vai— Thr 1 Гомологичные участки отмечены курсивом.
2.3. Характеристика индивидуальных медиаторных систем 161 а Сигнальный пептид Пре-проопиомеланокортин Прорпиомеланокортин Пропептид ГЖЖМ Активные пептиды АКТГ р-Липотропин у-Липотропин р-Эндорфин Активные пептиды ( ) НЬ Сигнальный пептид Пре-проопиомеланокортин Пре-пропептид Проэнкефалин А Пропептид ( |..[J I....I I I И ~~Р Активные пептиды Мет-энкефалин Лей-энкефалин Мет-энкефалин Рис. 2.17. Схема синтеза опиоидных нейропептидов эндорфина (а) и энкефа- линов (б) Опиоидные пептиды широко распространены в мозге и часто обнару- живаются в одних терминалях вместе с «классическими» нейромедиато- рами, такими как ГАМК и серотонин. Их внутримозговое введение при- водит к аналгезии, имеются данные, что именно они участвуют в акупунк- турном обезболивании. Опиоиды вовлекаются в комплекс поведенческих актов, связанных с сексуальным поведением, агрессией и иерархическим подчинением в сообществе. В литературе обсуждается вопрос об их роли в развитии таких психических расстройств, как шизофрения и аутизм. Клетки, содержащие эндорфины, встречаются почти исключитель- но в гипоталамусе (см. рис. 2.7). Их аксоны направляются к различ- ным ядрам самого гипоталамуса и в другие отделы, в том числе к об- асти перегородки и к миндалине; часть волокон доходит до верхних отделов ствола мозга, оканчиваясь на моноаминергических клетках голубого пятна и ядер шва. Большая часть нервных окончаний нахо- дится в глубинных отделах мозга (вокруг желудочков).
162 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ После открытия эндорфинов возникло предположение, что они, действуя подобно препаратам опия, играют роль внутреннего регулято- ра, подавляющего болевые ощущения или их модулирующего. Изуче- ние подобного механизма представляет большой интерес: в частности, весьма заманчиво было бы найти естественный заменитель морфина, не вызывающий болезненного привыкания и побочных эффектов. Кро- ме того, высказывались различные идеи относительно физиологиче- ской роли эндорфинов; им приписывали всевозможные функции — от участия в терморегуляции до поддержания самосознания. Сейчас, од- нако, становится ясно, что для выяснения конкретной роли эндорфинов в различных формах поведения потребуются длительные исследования. Опиатные рецепторы относятся к медленным метаботропным и наиболее изученным среди рецепторов нейропептидов. Первыми ус- тановленными лигандами этих рецепторов были экзогенные вещест- ва — морфин, дигидроморфин, норморфин, леворфанол. Из алкало- идов растительного происхождения наиболее известны налоксон, пен- тазоцин и налтрексон. Два последних обладают свойствами частичных антагонистов. Эндогенные пептиды — эндорфины, энкефалины и ди- норфины — действуют аналогично морфину и относятся к агонистам. Идентифицировано четыре класса опиоидных рецеп- торов: мю-, дельта-, каппа- и ORL-l (Opioid Receptor-Like 1) (табл. 2.7), между которыми, однако, существует меньше различий по взаимодействию с агонистами и антагонистами, чем в других группах рецепторов. Опиоидные рецепторы связаны с Gs- и Gj-белками, их тормозное действие заключается в закрытии Са-каналов (к-рецептор) или в открытии К-каналов (ц-, 3-, ORL-1 -рецепторы). Это приводит к уменьшению выброса медиатора или угнетению нейрональной возбу- димости в зависимости от того, где локализованы рецепторы. Таблица 2.7. Характеристика опиатных рецепторов Эффектор Рецепторы Мю (ц) Дельта (8) Каппа (к) ORL-l Эндогенный лиганд р-Эцдорфин, меторфамид, эндоморфин-1 и-II Мет-энкефалин, лей-энкефалин, Р-эндорфин Динорфин А1 —13, динорфин А1—8, динорфин В Ноцицептин, орфанин FQ Агонист Морфин, DAGO DPDPE, SNC-80, DSTBULET U50488H, бремазоцин, пентазоцин Антагонист Налоксон, P-FNA Налтриндол, налоксон Налоксон, nor-BNI Ноцицептин, (1 — 13)NH2
2.4. G-Белки, вторичные мессенджеры и протеинкиназы 163 Опиоидные рецепторы довольно широко представлены в разных отде- лах ЦНС: в коре, стриатуме, таламусе (преимущественно ц-рецепторы); в ядрах моста мозга, амигдале, обонятельной луковице, глубоких слоях ко- ры (5-рецепторы); в гипоталамусе, срединном возвышении (к-рецепто- ры). Кроме того, опиоидные рецепторы найдены в структурах перифери- ческой нервной системы и в клетках ненейронального происхождения (клетки иммунной системы, сердца, плаценты и др.). Опиоидные рецепторы играют важную роль в системе внутреннего подкрепления, в процессах восприятия боли, могут участвовать в мо- дуляции работы других медиаторных систем. Каннабиоиды. Еще древние цивилизации обнаружили, что раз- личные препараты индийской конопли (Cannabis sativa) могут вызы- вать у человека релаксацию, эйфорию и многие другие психоэмоци- ональные эффекты. Обнаружены рецепторы в головном мозге к ос- новному действующему началу получаемой из этого растения марихуаны — Д9-тетрагидроканнабиолу и позднее выявлены эндоген- ные лиганды этих рецепторов, которые оказались производными ара- хидоновой кислоты, — анандамин и 2-арахидонилглицерол. К настоя- щему времени установлены пути синтеза этих соединений в мозге (рис. 2.18). Наиболее распространенные рецепторы типа СВИ распо- ложенные в различных областях мозга, отвечают за специфические эффекты каннабиоидов: с рецепторами неокортекса связаны измене- ния перцепции, базальных ганглиев и мозжечка — психомоторного контроля, гиппокампа — изменения кратковременной памяти. В пе- риферических отделах нервной системы локализован преимуществен- но другой тип каннабиоидных рецепторов — СВ2. G-БЕЛКИ, ВТОРИЧНЫЕ МЕССЕНДЖЕРЫ И ПРОТЕИНКИНАЗЫ 2.4. 2.4.1. G-Белки и вторичные мессенджеры Как уже отмечалось ранее (см. гл. 2.2), существует обширная группа рецепторов, в которых передача сигнала не осуществляется прямо на эффектор, а опосредуется через цепь химических превра- щений. В настоящее время при классификации клеточных сигналь- ных систем учитывается природа вторичных мессенджеров и регули- руемых ими клеточных реакций. Исходя из этого, к числу основных сигнальных систем относят: циклоаденилатную; Са-инозитолтрис- фосфатзависимую; липоксигеназную; НАДФН-оксидазную (суперок-
164 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХи: 1ИЯ а О СН2 Фосфатидилэтаноламин СН —° сн2 N - Ацетилтрансфераза сн2 -О-Р=О N-Арахидоноил- фосфатидилэтаноламин сн °^NH3 сн2 О О Фосфолипаза D О -О-Р=О НО Анандамин '^NH Рис. 2.18. Пути синтеза и строение некоторых эндоканнабиоидов: а — синтез анандамина из фосфатидилэтаноламина; б — синтез арахидонилглицерола из фосфатидилинозитола
| 2.4. G-Белки, вторичные мессенджеры и протеинкиназы 16! сидсинтазную); NO-синтазную. В последнее время особое внимание привлекает МАР-киназная система (Mitogen Activated Protein Ki- nase), регулирующая клеточный цикл. В большинство осуществляе- мых этими системами реакций в качестве промежуточного звена вов- лекаются так называемые G-белки. Рецепторы, сопряженные с G-белками, GPCR(G-Pro- tein Coupled Receptors), передают сигнал от первичных мессенджеров к внутриклеточным мишеням с помощью цепи «рецептор ----> G-белок ----> эффекторный белок». Первичными сигналами для этих рецепто- ров служат разнообразные молекулы, среди которых низкомолекуляр- ные гормоны и нейромедиаторы (например, адреналин, норадреналин, ацетилхолин, серотонин, гистамин), опиоиды, гормоны пептидной и белковой природы (адренокортикотропин, соматостатин, вазопрес- син, ангиотензин, гонадотропин, эпидермальный фактор роста), неко- торые нейропептиды (см. гл. 2.3). В этот же ряд попадает множество химических сигналов, воспринимаемых обонятельными и вкусовыми сенсорными клетками, а также свет, рецептором для которого служит пигмент фоторецепторных клеток родопсин (см. гл. 3.6). Один и тот же первичный сигнал может передавать информацию через несколько разных GPCR, следовательно, если число внешних сигналов для GPCR составляет несколько десятков, то самих рецепто- ров известно более 200. Следующий за рецептором компонент сигнального каскада пред- ставлен G-б е л к о м. Идентифицировано около 20 различных G-бел- ков, наиболее распространенными являются Gs и G{, которые соответ- ственно стимулируют и ингибируют аденилатциклазу; Gq, активирую- щий фосфолипазу С; G-белки сенсорных клеток: фоторецепторных — Gt (трансдуцин), обонятельных — G0|f и вкусовых — Gg. G-Белки — это гетеротримеры, которые состоят из субъединиц трех вадов: а, р и у. В естественных условиях последние две субъединицы функционируют как единый ру-комплекс. Важнейшая характеристика G-белков — присутствие на а-субъединице центра связывания гуаниловых нуклеотидов. Если с G-белком связан ГТФ, это соответствует его активированному состо- янию (другими словами, G-белок находится в положении «включе- но»). Если в нуклеотидсвязывающем центре присутствует ГДФ, это соответствует «выключенному» состоянию белка. Центральное событие при передаче сигнала от рецептора, на кото- рый подействовал первичный сигнал, к G-белку состоит в том, что ак- тивированный рецептор катализирует процесс обмена ГДФ, связан- ного с G-белком, на присутствующий в среде ГТФ. Это событие, обо-
166 Раздел 2 МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИ значаемое как ГДФ/ГТФ-обмен, сопровождается диссоциацией тримерной молекулы G-белка на две функциональные субъединицы: а-субъединицу, содержащую ГТФ, и ру-комплекс. Далее одна из этих функциональных субъединиц (какая именно — зависит от типа сиг- нальной системы) взаимодействует с эффекторным белком, представ- ленным обычно ферментом или катионным каналом. Как следствие, функциональная активность эффектора меняется, что, в свою оче- редь, приводит к изменению цитоплазматической обстановки и иници- ирует тот или иной клеточный ответ. Диссоциированные компоненты тримера будут активными в тот краткий период, пока ГТФазная актив- ность а-субъединицы не превратит ГТФ в ГДФ. Это резко увеличит сродство а-субъединицы к ру-димеру и восстановит комплекс в исход- ном (неактивном) состоянии. Эффекторными белками в сигнальных систе- мах типа «рецептор---> G-белок--> эффекторный белок» могут быть аденилатциклаза, катализирующая синтез цАМФ из АТФ; фосфо- липаза С, гидролизующая фосфатидилинозитол с образованием DAG и инозитолтрисфосфат (ИФ3); фосфодиэстераза, расщепляющая цГМФ до ГМФ; некоторые типы калиевых и кальциевых каналов (рис. 2.19). Так, например, аденилатциклаза, осуществляющая синтез цАМФ из АТФ, обнаружена во всех тканях, максимальная ее активность от- мечается в мозге. Фермент является мультимолекулярным комплек- Глутамат Дофамин Норадреналин | { ^-Адренергический Рецептор mGluR G-Белок ( © + s Эффекторный\ Аденилатциклаза белок / । -----------/ 1 Фосфолипаза С © + Gi Аденилатциклаза Вторичный мессенджер цАМФ DAG ИФ3 цАМФ Конечный эффектор [киназа А Протеин- киназа С Выброс Са2+ Протеинкиназа А РечАлпьтят \ Усиление / фосфорилирования / белков Усиление фосфорилирования белков и активация кальцийсвязывающих белков Уменьшение фосфорилирования белков Рис. 2.19. Примеры связи G-белков с различными типами рецепторов и запус- каемых ими каскадов внутриклеточных реакций
2.4. G-Белки, вторичные мессенджеры и протеинкиназы 16 сом, состоящим из рецепторной и каталитической субъединиц, первая из которых обращена к наружной поверхности клеточной мембраны, а вторая «смотрит» в цитоплазму. Ответ клетки на действие сигнала за- висит от концентрации рецепторов на поверхности мембраны и степе- ни сопряжения рецепторов с аденилатциклазой. Сопрягающим ком- понентом являются G-белки, обладающие как ГТФ-связывающей, так и ГТФ-гидролизующей активностью. Весьма важно, что при передаче сигнала в каскаде «рецептор-> ----> G-белок -> эффекторный белок» исходный внешний сигнал может многократно усиливаться. Это происходит благодаря тому, что одна молекула рецептора за время пребывания в активированном со- стоянии (R*) успевает перевести в активированную форму (G*) не- сколько молекул G-белка. Например, в зрительном каскаде «родоп- син -----------> Gt-> цГМФ-зависимая фосфодиэстераза» на каждую моле- кулу R* может образовываться несколько сотен или даже тысяч молекул G*, а это означает, что на первой стадии каскада («R*-> G*») коэф- фициент усиления внешнего сигнала составляет 102—103. Хотя на следующей стадии каскада («G* ---> эффекторный белок») каждая молекула G* взаимодействует только с одной молекулой эффекторно- го белка, сигнал в данном случае также усиливается, поскольку на каждую молекулу G* и, соответственно, активированного эффектор- ного белка в цитоплазме появляется (исчезает) большое число моле- кул вторичного мессенджера. Так, на второй стадии зрительного кас- када одна молекула активированной цГМФ-фосфодиэстеразы способ- на расщепить в секунду до 3 тыс. молекул цГМФ, служащего в фоторецепторных клетках вторичным мессенджером. Поскольку уси- ление внешнего сигнала на обеих стадиях суммируется, в конечном счете коэффициент усиления сигнала при его прохождении через кас- кад может достигать достаточно высоких значений: в зрительных клет- ках усиление составляет величину порядка 105—106. Ясно, что прекращение действия внешнего стимула должно сопро- вождаться «выключением» всех компонентов сигнальной системы. На уровне рецепторов это достигается, во-первых, в результате диссоци- ации первичного сигнала из комплекса с GPCR, во-вторых, путем фос- форилирования рецепторов под действием специальных протеинкиназ и последующего связывания с модифицированным рецептором специаль- ного белка (например, Р-арестина). G-Белки обладают способностью гидролизовывать связанный с ними ГТФ до ГДФ, что обеспечивает их инактивацию. И, наконец, чтобы переход клетки к исходному состоянию завершился, специальные механизмы восстанавливают исходный уро- вень вторичного мессенджера в ее цитоплазме. Например, цАМФ, ци-
168 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ топлазматическая концентрация которого повышается при передаче сигнала в каскаде «Р-адренорецептор -> С5-белок ---> аденилат- циклаза», затем гидролизуется цАМФ-фосфодиэстеразой до АМФ, который не обладает свойствами вторичного мессенджера. G-Белки ответственны за трансмембранную передачу сигналов мно- гих гормонов и нейромедиаторов к разнообразным мишеням клетки. Че- тыре G-белка к настоящему времени очищены до гомогенного состояния и биохимически охарактеризованы: Gt (трансдуцин), Gs, G{ и Go. Оказа- лось, что каждый из них имеет уникальные мишени (эффекторные бел- ки). Gt активирует цГМФ-специфичную фосфодиэстеразу в наружных сегментах палочек сетчатки; Gs и Gf, соответственно, стимулируют и ин- гибируют аденилатциклазу и присутствуют во всех клетках; Go представ- лен в большом количестве в клетках мозга и, по-видимому, ингибирует электрочувствительный Са-канал в нейронах. Ряд существенных G-белков пока не очищен. Так, Gp, который ис- пользует в качестве мишени фосфатидилинозитолспецифичную фос- фолипазу С, инициирует быстрый распад фосфатидилинозитола в плазматической мембране и образование нескольких вторичных по- средников. Другой G-белок, Gk, по-видимому, открывает К-каналы в миоцитах сердечной мышцы и других клетках; Ое-белки участвуют в регуляции экзоцитоза. В некоторых случаях один G-белок внутри клетки может реагировать на связывание лиганда с одним из несколь- ких разных рецепторов. Такая ситуация имеет место, например, для белка Gk из ганглионарных клеток Aplysia. G-Белки могут иметь больше одной мишени. В качестве примера можно привести белок Gt, который в наружных сегментах палочек сетчатки глаза быка активи- рует как цГМФ-фосфодиэстеразу, так и фосфолипазу А2. По-видимо- му, в этих процессах участвуют различные субъединицы Gt. Все G-белки прочно связаны с плазматической мембраной, за иск- лючением трансдуцина, который может от нее диссоциировать. Ни од- на из субъединиц G-белка не является трансмембранным белком. Од- нако по меньшей мере у-субъединица ацилирована и может удержи- ваться на мембране с помощью ковалентно связанной жирной кислоты. В качестве такого якоря для закрепления в мембране G-бел- ков часто используется миристат или пальмитат. Наиболее распространенными мишенями G-белков являются адени- латциклаза (для Gs и Go) и фосфолипаза С, ответственная за гидролиз фосфатидилинозитола (для Gp). Модуляция аденилатциклазы приводит к изменению внутриклеточной концентрации цАМФ, который, как из- вестно, влияет на множество внутриклеточных процессов. Одним из по- следствий увеличения содержания цАМФ является, например, стиму-
2.4. G-Белки, вторичные мессенджеры и протеинкиназы 169 ляция цАМФ-зависимой протеинкиназы (протеинкиназа А), которая, в свою очередь, фосфорилирует специфические белковые субстраты. Клетки содержат также два типа Са-зависимых протеинкиназ, акти- вируемых соответственно Са 4- кальмодулином и Са + диацилглицеро- лом и фосфатидилсерином (протеинкиназа С). Активность обеих этих киназ регулируется вторичными посредниками, образующимися в про- цессе обмена фосфатидилинозитола, который во многих клетках ини- циируется путем G-белокзависимой активации специфической фосфо- липазы С. Молекулярные машины, обеспечивающие передачу сигнала от ре- цепторов к внутриклеточным мишеням, состоят, как правило, из не- скольких белковых компонентов, совокупность которых обычно име- нуют каскадом передачи сигнала, или сигнальным каскадом. Помимо белковых посредников в передачу сигнала внутри клетки вовлекаются относительно небольшие молекулы, служащие вторичны- ми посредниками, или мессенджерами (от англ, messenger — посыль- ный). В русскоязычной литературе данные соединения называют как вторичными мессенджерами, так и вторыми посредниками. В лю- бом случае в содержание данного понятия вкладывается мысль о том, что это соединение — следующее в цепочке передачи сигнала, но не в коей мере — что оно менее значимое, т. е. вторичное. Для обозначения сигнальных молекул обычно используется термин «мессенджер», а не «посредник». Дело в том, что в цитоплазме в пе- редачу сигнала вовлечены как разнообразные белки, так и малые мо- лекулы, причем функционально все они являются посредниками меж- ду рецептором, на который подействовал внешний стимул, и клеточ- ным ответом. Однако между ними есть и принципиальное различие: белки образуют своеобразную молекулярную машину, которая, с одной стороны, воспринимает внешний сигнал, а с другой — обладает ферментативной или иной активностью, модулируемой этим сигналом, в то время как малые молекулы действительно служат лишь посыльными (мессенджерами) между различными белками, полифер- ментными комплексами или даже клеточными структурами. Самый из- вестный пример такого посыльного — это уже упоминавшийся выше цАМФ, среди других наиболее важных вторичных мессенджеров следу- ет упомянуть циклический гуанозин-3',5'-монофосфат (цГМФ), ино- зит-1,4,5-трисфосфат (обозначаемый как ИФ3), диацилглицерол (ДАГ), ионы кальция (табл. 2.8). Следует отметить, что изменение уровня вто- ричных посредников, например ионов кальция, может быть обусловлено не только взаимодействием медиаторов с рецепторами, но и являться ре- зультатом изменения мембранного потенциала.
Таблица 2.8. Характеристика некоторых вторичных мессенджеров Вторичный посредник Источник Внутриклеточные мишени Механизм «уборки» Са2+ Плазматическая мембрана-. электроуправляемые Са-каналы; различные лигандза- висимые каналы Эндоплазматический ретикулум-. ИФ3-рецепторы; рианодиновые рецепторы Кальмодулин, протеинкиназы, протеинфосфатазы, ионные каналы, синаптотагмин и др. Са-связывающие белки Плазматическая мембрана: Na/Ca-обменник; Са-насос. Эндоплазматический ретикулум: Са-насос. Митохондрии: Са-транспортер цАМФ Аденилатциклаза действует на АТФ Протеинкиназа А, каналы, ре- гулируемые циклическими нук- леотидами Фосфодиэстераза цАМФ цГМФ Гуанилатциклаза (субстрат ГТФ) Протеинкиназа С, каналы, ре- гулируемые циклическими нук- леотидами Фосфодиэстераза цГМФ ИФ3 Фосфолипаза С (субстрат ФИФ2) ИФ3-рецепторы эндоплазма- тического ретикулума Фосфатазы Диацил глицерол Фосфолипаза С (субстрат ФИФ2) Протеинкиназа С Различные ферменты Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ
2.4. G-Белки, вторичные мессенджеры и протеинкиназы 1711 Наиболее характерные свойства вторичного мессенджера следующие: 1) относительно небольшая по сравнению с биополимерами моле- кулярная масса (посыльный должен с высокой скоростью диффунди- ровать в цитоплазме); 2) способность быстро (по сравнению со временем передачи сигна- ла) расщепляться (или подвергаться связыванию, как в случае Са2+), в противном случае сигнальная система останется во включенном со- стоянии и после того, как действие внешнего сигнала прекратится. Отсутствие одного из этих свойств у вторичных мессенджеров мо- жет оказаться для клетки фатальным в прямом смысле. Так, напри- мер, форболовые эфиры, которые представляют собой структурные аналоги диацилглицерола, но, в отличие от него, в организме не рас- щепляются, способствуют развитию злокачественных опухолей. Это происходит потому, что форболовые эфиры вовлекаются в работу сиг- нальных систем, которые регулируют клеточное деление с помощью диацилглицерола как вторичного мессенджера. Имитируя действие диацилглицерола и обеспечивая передачу пролиферативного сигнала, они не подвергаются расщеплению. В результате сигнальная система остается постоянно включенной, и пролиферация клеток перестает быть контролируемой. В прекращении сигнала цАМФ и цГМФ участвуют фосфодиэсте- разы, гидролизующие данные нуклеотиды. Это преимущественно рас- творимые ферменты. Высокий уровень фосфодиэстеразы цГМФ об- наруживается в постсинаптических окончаниях нейронов. Фосфодиэстеразы представлены большим количеством изоформ, ко- торые различаются по молекулярной массе и сродству к субстратам. Циклонуклеотидактивируемая фосфодиэстераза гидролизует как цАМФ, так и цГМФ, при этом они взаимно ускоряют гидролиз друг друга, что свидетельствует о положительной кооперативности их активных центров. Кроме циклических нуклеотидов, Са2+ и процесса ограниченного проте- олиза фосфодиэстеразу активируют также полианионы, фосфолипиды, жирные кислоты. Ингибиторами или активаторами данного фермента являются многочисленные фармакологические вещества. 2.4.2. Роль мембранных фосфоинозитидов в передаче сигнала Для того чтобы представить механизм действия фосфоинозити- дов в качестве вторичных мессенджеров, необходимо более подробно рассмотреть цикл их метаболических превращений в мембране.
172 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Внешний сигнал после взаимодействия с рецептором через G-белок активирует фосфодиэстеразу (фосфолипазу С), которая гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (ИФ2) с образованием диацил- глицерола (DAG) и инозитолтрисфосфата (ИФ3) (рис. 2.20). Диацил глицерол фосфорилируется диацил глицерол киназой до фосфа- тидной кислоты (реакция требует присутствия АТФ). Фосфатидная кислота взаимодействует с цитидинтрифосфатом с образованием цити- диндиацилглицеролдифосфата. Это соединение после рекомбинации с инозитом восстанавливает фонд гидролизуемых фосфодиэстеразой фосфоинозитидов. Инозит, необходимый для данной реакции, образу- ется из инозитолмонофосфата. Реакция катализируется инозитол-1- монофосфатазой, активность которой блокируется ионами лития. Именно этим объясняется эффективное лечение ионами лития ма- ниакально-депрессивных психозов и некоторых других заболеваний нервной системы. Блокада литием инозитол-1 -монофосфатазы замед- НО-. Арахидоновая кислота — предшественник ►простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов (воспаление) О ФЛС) ЧЭН Активация протеинкиназы С HO-P-OR I о- ч чэ-p-or I \ °” (Са2+ \ ФЛД для цФЛД) о LO-P-OH НО, ОРОз" О" R= -•ОРОз” но—R но он | Мобилизация Са2~*~~| Мобилизация Са2+, торможение аденилатциклазы, активация ФЛС е о е Рис. 2.20. Обмен фосфоинозитидов. ФЛА — фосфолипаза А; ФЛС — фосфолипаза С; ФЛД — фосфолипаза D; ФИ-ФЛС — фосфатидил инозитолспецифичная фосфолипаза С; цФЛД — цитозольная фосфолипаза D
2.4. G-E-fcflKM, ети^имг^ MvCCcH^bpU M npvTvHHHHH23U ляет синтез инозита в организме и ослабляет зависящие от метабо- лизма фосфоинозитидов процессы, протекающие в нейронах. Инозитолтрисфосфат вызывает высвобождение кальция из мемб- ран эндоплазматического ретикулума в результате связывания со спе- циальным рецептором. Несмотря на то что процесс выброса кальция из внутриклеточных депо под действием фосфоинозитидов обнаружен в целом ряде клеток, механизм, с помощью которого этот ион откры- вает внутриклеточные кальциевые каналы, окончательно не выяснен. При передаче сигнала с помощью фосфоинозитидов происходит обра- зование двух вторичных мессенджеров: инозитолтрисфосфата и ди- ацилглицерола. Диацилглицерол выполняет роль вторичного мессенджера, так как инициирует механизмы, в результате которых активируются два типа протеинкиназ: протеинкиназа С и цГМФ-зависимая протеинкиназа. При этом фосфолипаза С играет ключевую роль в процессе переноса сигналов с рецепторов, которые непосредственно не связаны с адени- латциклазой, но регулируют скорость метаболизма фосфоинозитидов. Вклад каждой из ветвей передачи сигнала с помощью фосфоинози- тидов может быть исследован с помощью химических соединений, имитирующих действие одного из двух вторичных мессенджеров, об- разующихся в результате гидролиза фосфоинозитидов и, следователь- но, активирующих эти пути регуляции по отдельности. Действие DAG имитируется форболовыми эфирами, так как эти соединения вызыва- ют активацию протеинкиназы С. Форболовые эфиры — это соедине- ния растительной природы, их выделяют из семян восточноазиатского растения Croton tigtium. Форболовые эфиры резко ускоряют иници- ацию опухолей канцерогенами. Действие инозитолтрисфосфата ими- тируется кальциевыми ионофорами, в том числе А 23187. Существует синергизм между двумя путями передачи сигнала с по- мощью фосфоинозитидов. Так, например, в тромбоцитах форболовый эфир и кальциевый ионофор, действуя совместно, вызывают такую сильную секрецию серотонина, которая не может быть вызвана ни од- ним из этих соединений в отдельности. Форболовый эфир и кальцие- вый ионофор могут инициировать деление некоторых клеток. Это по- зволило предположить, что сигнальные пути, связанные с обменом фосфоинозитидов, могут контролировать не только секрецию гормо- нов и транспорт ионов, но и пролиферацию клеток. Появились экспе- риментальные доказательства того, что форболовые эфиры способст- вуют опухолевому росту через активацию «диацилглицеролзависимой ветви» фосфоинозитидного сигнального пути.
174 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Диацил глицерол может подвергаться дальнейшей деградации под действием диацилглицероллипазы до арахидоновой кислоты, которая превращается в разнообразные биологически активные метаболиты, в том числе эйкозаноиды и простагландины. Суммируя сказанное выше, можно утверждать, что при функци- онировании рассмотренной регуляторной системы образуются по меньшей мере три вторичных посредника: инозитол- трисфосфат, DAG и арахидоновая кислота (последнюю в связи с ее участием в регуляции свертывания крови многие исследователи также относят ко вторичным мессенджерам). Каждый из них выполняет спе- цифические функции, включая увеличение содержания внутриклеточ- ного Са2+ и активацию Са-зависимых протеинкиназ. Эта сигнальная система распространена достаточно широко, хотя в деталях механизм регуляции ею специфических клеточных функций пока неясен. 2.4.3. Метаболизм фосфоинозитидов и регуляция проницаемости мембран для Са2+ Каков же механизм увеличения внутриклеточной концентрации Са2+, вызываемой инозитолтрисфосфатом и диацилглицеролом, обра- зующимися при гидролизе фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата? Сле- дует иметь в виду, что, во-первых, для работы фосфолипазы С необхо- дим ГТФ, т. е. активация рецептора реализуется через G-белок, а во-вторых, метаболизм фосфолипидов обеспечивает по крайней мере два процесса: индукцию входа кальция в клетку из внешней среды по градиенту концентрации и высвобождение ионов кальция в цитозоль из внутриклеточных депо. В модельных системах было показано, что фосфатидная кислота способна транспортировать через искусственные мембраны двухва- лентные катионы с эффективностью, близкой к действию кальциевого ионофора А 23187. При этом ионы магния транспортировались значи- тельно медленнее, чем ионы кальция, что говорит о селективности фосфатидной кислоты в качестве кальциевого ионофора. Относительно механизма ионофорного действия фосфатидной кис- лоты существует ряд гипотез, ни одна из которых в настоящее время не может быть признана полностью доказанной. Возможно, фосфа- тидная кислота каким-то образом модифицирует структуру липидного бислоя, образуя участки с небислойной упаковкой молекул. При этом на границе бислоя и монослоя образуются каналы для ионов кальция. Несмотря на то что имеется много фактов, указывающих на то, что в физиологических условиях под действием ИФ3 происходит высво-
2.4. h-te ьи tniHMiij... мессенджеры и i^c . нниин. зь бождение кальция из цистерн эндоплазматического ретикулума, меха- низм открывания Са-каналов неясен. ИФ3 вызывает высвобождение Са2+ в клетках поджелудочной железы, стимулирует мобилизацию за- пасенного кальция в процессе индуцируемого адреналином поступле- ния глюкозы из печени в кровь. В ооцитах лягушки поток ионов Са2+ увеличивается вдвое в ответ на стимуляцию ИФ3. Секреция корти- кальных гранул, осуществляющаяся яйцеклеткой сразу же после оп- лодотворения (в результате чего образуется так называемая оболочка оплодотворения), также вызывается ионами кальция, концентрация которых в яйцеклетке резко увеличивается в ответ на внутриклеточ- ную инъекцию трифосфоинозитидов. На долю фосфатидилинозитола приходится лишь 2—8% всех фос- фолипидов, содержащихся в клеточных мембранах эукариот. Этот фосфолипид часто называют миоинозитолом, поскольку впервые он был выделен из мышечного гомогената. Небольшая часть фосфатиди- линозитола фосфорилирована в положении 4 или в положениях 4 и 5. От 1 до 10% фосфатидилинозитола, присутствующего в мембране, при- ходится на долю фосфатидилинозитол-(4,5)-бисфосфата, обозначаемо- го как ФИФ2 или ФИ(4,5)Ф2. Этот компонент является, вероятно, пер- вой мишенью для фосфатидилинозитолспецифичной фосфолипазы С, которая активируется во многих клетках G-белками. Последующий гидролиз молекулы приводит к быстрому распаду фосфатидилинозитола и кратковременному нарастанию продуктов распада. Например, во время активации тромбоцитов за 90 с дегради- рует половина общего фонда фосфатидилинозитола. Продукты распа- да участвуют в качестве вторичных мессенджеров во многих клеточ- ных процессах. Исследование этой системы в деталях еще не законче- но, но самая общая ее схема представлена на рисунке 2.20 (с. 172). Начальными продуктами гидролиза ФИФ2 являются диацилглице- рол и инозитол-( 1,4,5)-трисфосфат. Диацилглицерол остается свя- занным с мембраной, а ИФ3 высвобождается в цитоплазму. Обыч- но жирнокислотные компоненты фосфатидилинозитола представлены стеариновой кислотой в положении 1 и арахидоновой кислотой в положении 2. ФИ3 служит вторичным посредником, и его основной функцией, по-видимому, является мобилизация Са2+, аккумулированного в эндо- плазматическом ретикулуме. Возможно, этот компонент путем прямо- го связывания открывает Са-специфичные каналы в эндоплазматиче- ском ретикулуме, что приводит к выходу ионов кальция из ретикулума в цитоплазму, где его уровень возрастает в несколько раз (от 0,1 мкМ до 5—10 мкМ).
176 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕИРОХИМИЯ 2.4.4. Роль ионов кальция в функционировании нейронов Важная роль в нервной ткани отводится еще одному вторичному посреднику — Са2+ (рис. 2.21). Следует отметить, что концентрация свободного (ионизированного) кальция в нервных клетках чрезвычай- но низка и составляет от 10-6 до 10-8М. В нейроне, как и в других клетках, большая часть кальция находится в связанном состоянии. Низкая концентрация ионизированного кальция в цитоплазме обеспе- чивается благодаря его захвату митохондриями в обмен на прото- ны, выкачиванию из клетки за счет работы кальциевого насоса или Рис. 2.21, а. Функция кальция в аксонах Возбуждающие эффекты показаны сплошными тонкими линиями, тормозные эффек- ты — прерывистыми тонкими линиями'. / — активизация потенциалзависимых Са-каналов (Cav) при деполяризации мембра- ны; 2 — активизация цАМФ потенциалнезависимых Са-каналов; 3 — регуляция Са24 уровня цАМФ и цГМФ посредством стимуляции фосфодиэстеразы; 4 — активация ме- диатором аденилатциклазы; 5 — экзоцитоз синаптических и секреторных пузырьков, зависящий от входа Са2+ ; 6 — аксональный транспорт; 7 — захват Са2+ митохондрия- ми в обмен на протоны; 8 — аккумуляция Са2+ в цистерны эндоплазматического рети- кулума; 9 — уменьшение возбудимости нейрона внеклеточным Са2+; 10 — активация сократимых волокон ионами кальция (либо непосредственно, либо через посредство изменений уровня цАМФ); // — метаболический насос для выкачивания Са2+ и Na/Ca-обмена; 12 — Са-зависимая К-проводимость, активируемая повышением уров- ня Са2+ ; 13 — увеличение концентрации Са2+, снижающее проводимость электриче- ских синапсов; 14 — связывание Са2+ с эндоплазматическим ретикулумом и другими органеллами и макромолекулами Знаки вопроса над стрелками — предполагаемые механизмы. — потенциалзависимые К-каналы; G№ и GK — соответственно натриевая и калиевая проводимость (по: Шеперд, 1983).
2.4. G-Белки, вторичные мессенджеры и протеинкиназы 17 Рис. 2.21, б. Функция кальция в дендритах Na/Ca-обменника, аккумуляции в эндоплазматическом ретикулуме и свя- зыванию макромолекулами, включая парвальбумины и кальмодулин. Можно перечислить целый ряд клеточных функций и свойств, за- висящих от кальция: экзоцитоз синаптических и секреторных пузырь- ков, текучесть аксоплазмы и аксональный транспорт, клеточная под- вижность, мышечное сокращение, ферментативные реакции и прони- цаемость мембраны и др. Кроме того, увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ изменяет Са-зависимую К-проводимость мембраны и уменьшает возбудимость электрических синапсов. Са2+ способен воз- действовать на метаболизм нейрона, снижая pH цитоплазмы, влияя на активность ключевых ферментов, понижая содержание цАМФ и цГМФ за счет активации фосфодиэстеразы. Нейрон способен быстро «выкачивать» ионизированный кальций во внеклеточное пространство и «закачивать» его в органеллы, резко уменьшая концентрацию кальция в цитоплазме до необходимого низко- го уровня, а в ответ на внешние сигналы столь же быстро увеличивать ее, благодаря чему клетка может использовать локальные изменения концентрации этого иона для регуляторных целей. Возможно, кальций даже более универсальный внутриклеточный регулятор (вторичный посредник), чем цАМФ, поскольку период действия Са2+ очень коро- ток — измеряется миллисекундами, а не секундами, как в случае
178 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ с цАМФ. Механизмы, контролирующие доступность свободного каль- ция, разнообразными способами связаны с путями синтеза медиаторов и общим метаболизмом клетки. Благодаря этому Са2+ играет важную роль в долговременных процессах, лежащих в основе пластичности си- напсов, распознавания объектов и консолидации памяти (см. далее). Одним из ферментов, регулируемых Са2+, является фосфолипаза С, которая при низкой концентрации Са2+ использует в качестве субстрата преимущественно ФИФ2, но при более высокой концентрации Са2+, по крайней мере in vitro — нефосфорилированный фосфатидилинозитол. Наиболее важным ферментом, активируемым Са2+, является про- теинкиназа С. Этот фермент находится в цитозоле до тех пор, пока в ближайшем его окружении не появляется диацилглицерол и Са2+. В присутствии обоих агентов протеинкиназа С приобретает способ- ность связываться с мембраной, выбирая для этого кластеры, обога- щенные фосфатидилсерином. В данных условиях наблюдается ее вы- раженная активация, причем субстратами фермента становятся мемб- ранные белки ближайшего окружения. Эффекты на протеинкиназу С, сходные с действием диацилглице- рола, оказывают форболовые эфиры, в связи с чем ее часто рассмат- ривают как внутриклеточную мишень для этих соединений. В активи- рованном состоянии протеинкиназа С эффективно фосфорилирует белки-мишени по серину и треонину. 2.4.5. Другие вторичные посредники Наиболее важными вторичными мессенджерами являются цАМФ, цГМФ, Са2+, ИФ3, DAG и активные формы кислорода и азота. цГМФ образуется из ГТФ с помощью фермента гуанилатциклазы. В отличие от аденилатциклазы, этот фермент не связан с мембранны- ми рецепторами. Однако образование цГМФ частично сопровождает- ся активацией трифосфоинозитидного цикла, поскольку некоторые его компоненты, по-видимому, стимулируют гуанилатциклазу. цГМФ активирует специальные G-киназы, вызывающие фосфорилирование многочисленных белков; физиологическая роль некоторых из них пока не установлена. По-видимому, цГМФ может играть роль вторичного мессенджера в клетках нервной ткани. цГМФ образуется с помощью двух разных форм гуанил ил цикла- зы — мембраносвязанной и цитозольной. Мембранный фермент акти- вируется натрийуретическим гормоном (G-белки в этом не принимают участия), а растворимый (цитозольный)— радикалами NO*, СО* и *ОН. Последние представляют собой новый класс неорганических ре- гуляторов, проявляющих свойства то межклеточных (NO, Н2О2), то
14. ,-Б^ 1 . »ч- f । иь । .1 внутриклеточных регуляторов. цГМФ активирует ПК G, но, кроме то- го, изменяет активность и других белков-мишеней, включая ионные каналы (как в случае реализации светового сигнала). Еще одним видом вторичных мессенджеров, чья регуляторная функция установлена лишь недавно, являются активные формы кис- лорода (АФК). Они образуются в ходе окислительного метаболизма в результате постадийного восстановления молекулярного кислорода. Ранее предполагалось, что в нормальных условиях восстановление кислорода до конечного продукта (молекул воды) в митохондриальных мембранах протекает таким образом, что «утечки» промежуточных продуктов не наблюдается, и процесс приводит к образованию АТФ. Однако на самом деле в процессе восстановления могут образовы- ваться различные АФК. Было установлено, что избыток АФК вреден для клетки. В то же время сами эти соединения в нормальных условиях выступают в роли вторичных мессенджеров. В настоящее время к сво- боднорадикальным соединениям кроме АФК относят также NO-ради- кал (активная форма азота) и пероксинитрит, который фактически яв- ляется активной (хотя и нерадикальной) формой азота. В последние годы выявлен широкий спектр физиологических эффек- тов АФК, к которым, прежде всего, относятся регуляция клеточной про- лиферации и тонуса сосудов, индукция транскрипции определенных ге- нов. Показано функционирование АФК в качестве вторичных внутри- клеточных мессенджеров. Так, АФК непосредственно участвуют в активации онкогенов, а также гена, кодирующего главную форму фак- тора транскрипции АР-1 в ответ на ионизирующую радиацию. О2 и Н2О2 активируют фактор транскрипции NFkB, который вызывает экс- прессию генов, кодирующих ряд цитокинов и вирусов, в том числе ВИЧ, а NO* подавляет активацию NFkB, увеличивая индукцию ингибитора фактора транскрипции NFkB и стабилизируя его. В индукции синтеза белков теплового шока, повышающих резистентность клеток к высоким температурам, радиации, токсическому действию ионов тяжелых метал- лов и лекарственных препаратов, основная роль отводится перекиси во- дорода. NO* и СО* связываются с гемовой частью гуанилатциклазы и обратимо изменяют синтез цГМФ, тем самым управляя работой этих важных внутриклеточных регуляторов внутриклеточной коммуникации. Одним из наиболее изученных факторов межклеточных сигнализа- ций является оксид азота (нитроксид, NO’-радикал). Радикал NO* яв- ляется важнейшим нейромедиатором, интермедиатом иммунной систе- мы и регулятором сердечно-сосудистой системы человека. В животном организме NO’ работает как вторичный мессенджер и в перифериче- ской, и в центральной нервной системе. В результате повышения концентрации NO’ активируется цитозоль- ная гуанилатциклаза, катализирующая превращение ГТФ в цГМФ, кото-
180 Раздел 2 МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ рый, в свою очередь, активирует специфическую протеинкиназу (G-кина- зу) (или непосредственно, или с помощью дополнительного сигнального пути, включающего еще один вторичный мессенджер — аденозицдифос- фатрибозу). Последняя открывает Са-каналы внутриклеточных Са-депо, в результате чего повышается концентрация кальция в цитозоле, акти- вируются Са-зависимые протеинкиназы, фосфорилируется белковый фактор регуляции транскрипции и начинается синтез белков теплового шока, обеспечивающих клеточную защиту. Оксид азота обладает широким спектром биологического действия. Он участвует в межклеточной сигнализации в центральной и перифе- рической нервной системе. Его идентифицируют с эндотелиальным фактором релаксации, расслабляющим гладкие мышцы и предотвра- щающим агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к эндоте- лию. Синтез оксида азота фагоцитирующими клетками регулирует пролиферацию лимфоцитов. Он вносит вклад в бактерицидное и про- тивоопухолевое действие фагоцитов. Более того, нитроксид является регулятором внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и, соответ- ственно, активности ряда Са-зависимых ферментов. Источником NO* в центральной и периферической нервной системе являются эндоте- лиоциты сосудов, клетки микроглии и астроциты, неадренергические нервные волокна и глутаматергические нейроны (рис. 2.22). Функции нейронального NO* чрезвычайно разнообразны: он конт- ролирует осцилляторную активность нейронов, является медиатором ноцицепции, участвует в формировании циркадных ритмов, в процес- Рис. 2.22. Возрастание внутриклеточного уровня АФК в результате активации глутаматных рецепторов нейронов
2.4. G-Белки, вторичные мессенджеры и протеинкиназы г сах термогенеза, обоняния, принятия пищи и воды, снижает тревож- ность, регулирует выход нейромедиаторов; играет существенную роль в процессах потенциации и, соответственно, долговременной памяти. Нейрональный NO’ является важнейшим вторичным мессенджером, с помощью которого нервная система управляет тонусом сосудов, снаб- жающих кровью все системы организма, причем действие оксида азота может быть прямым и опосредованным (например, стимулируя высво- бождение вазопрессина). Показано участие оксида азота, выделяюще- гося в синоатриальном узле, в автономном контроле сердцебиения. Снижение содержания цитоплазматического цГМФ при активации клеточных рецепторов L-глутаматом и его производными является NO-обусловленным процессом. В зависимости от уровня NO* он мо- жет или ингибировать, или потенцировать высвобождение глутамата и аспартата, тем самым защищая нейроны от экзайтотоксических эффектов медиатора. Избыточная продукция или недостаточно быст- рая нейтрализация глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, вы- полняющих роль возбуждающих медиаторов в нейронах, приводит к нейротоксическим эффектам. В основе токсического действия лежит стимуляция АФК, способная приводить к окислительному поврежде- нию тканей. Кроме того, NO* защищает головной мозг от ишемиче- ских и нейротоксических инсультов, контролирует осцилляторную ак- тивность нейронов. Нет сомнений в том, что существует гораздо больше сигналтранс- дукторных систем, чем уже описано в настоящее время. В конце про- шлого века были обнаружены сигнальные функции у церамида, фос- фатидной кислоты, циклоаденозиндифосфатрибозы и 5'-АМФ. Сейчас интенсивно изучаются связанные с ними сигналпередающие реакции. 2.4.6. Протеинкиназы и фосфопротеинфосфатазы В настоящее время установлено, что часть вторичных посредни- ков выполняет свою функцию в нейронах, модулируя свойства внутри- клеточных белков за счет фосфорилирования. Фосфорилирование бы- стро, специфично и обратимо меняет свойства и функции белка. Белки фосфорилируются разнообразными протеинкиназами (ПК), а под дей- ствием протеинфосфатаз (ПФ) фосфатная группа легко отщепляется. Обе группы ферментов находятся под регуляторным влиянием раз- личных внутриклеточных вторичных посредников. Как правило, вто- ричные посредники активируют сериновые и треониновые киназы, в то время как внеклеточные сигналы реализуются через тирозиновые про- теинкиназы. Некоторые из них являются узкоспециализированными, р для других субстратом может быть широкий спектр белков (табл. 2.9).
Таблица 2.9. Классификация протеинкиназ (по: Гусев, 2000) Класс Подкласс Семейство Протеинкиназы Циклонуклеотидза - цАМФ-зависимые киназы A, G, С висимые киназы цГМФ-зависимые киназы Фосфолипидзависи- мые киназы Киназы, зависящие от кальция Киназы, не зависящие от кальция Са-кальмоду- Истинные Са-каль- Многофункциональные линзависимые модулинзависимые Са-кальмодулинзависимые протеинкиназы протеинкиназы протеинкиназы Киназа фосфорилазы АМФ-зависимые АМФ-зависимые киназы киназы
00 IQ Возможный субъединичный состав Некоторые регуляторы ферментативной активности R2C2 цАМФ, фосфорилирование С2 цАМФ, фосфорилирование С Диацил глицерол, фосфолипиды, Са2+ CnRn Са2+, кальмодулин, фосфорилирование (CRR'R")4R"4 Са2+, кальмодулин, фосфорилирование Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ CR'R' АМФ, фосфорилирование
Протеинкиназы Циклинзависимые С, М, G киназы Несколько семейств циклинзависимых киназ МАР-киназы Стрессактивируемые киназы, р42, р44 киназы Киназы гликогенсинтазы Киназы гликогенсинтазы Казеинкиназа II Тирозиновые протеинкиназы Растворимые тирози- Более 10 семейств (srk, brk, новые киназы tec, csk, fes, abl, jak и т. д.) Мембраносвязанные Многочисленные семейства тирозиновые киназы киназ—рецепторов гормонов и факторов роста Киназы Киназы МАР-киназ и киназы МАР-киназы киназ МАР-киназ Казеинкиназы I Несколько семейств
Окончание табл. 2.9 CR Фосфорилирование С Фосфорилирование С Фосфорилирование C2R2 Самофосфорилирование, полиамины С Фосфорилирование, регуляторные белки C2R2 Гормоны, фосфорилирование С Фосфорилирование С Mg2+ 2.4. G-Б.гЛги еторим ы._ м, ссендм еиЬ' и пр< тсиньиназы £1
184 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕИРОХИМИЯ Степень фосфорилирования определяется балансом между этими фер- ментами и отражает в интегральном виде состояние сигнальных путей. Субстратом ПК и ПФ являются разнообразные ферменты, рецепторы, ионные каналы и структурные белки. Так, обратимое фосфорилирова- ние характерно для нХР, рецепторов ГАМК, глицина и гутамина, а так- же для 5-НТ3-серотониновых рецепторов. Фосфорилирование нейро- специфических белков играет важную роль в формировании синапти- ческих везикул и высвобождении медиатора (см. гл. 3.4), а также в аксональном транспорте (см. гл. 3.3). ПК переносят фосфатную группу от АТФ на серин, треонин или тирозин субстрата. цАМФ-Зависимые протеинкиназы (ПК А). Являются первич- ным эффектором для цАМФ. ПК А представляет собой тетра- мерный комплекс из двух каталитических и двух регуляторных (ингибиторных) субъединиц. цАМФ активирует ПК А, связываясь с ре- гуляторной субъединицей, что вызывает ее диссоциацию и активацию каталитической субъединицы. Такое снятие тормозного влияния регу- ляторного белка является общим механизмом влияния вторичных по- средников на функционирование ПК. Каталитическая субъединица ПК А фосфорилирует сериновые и треониновые остатки различных бел- ков-мишеней. Этот домен сходен с таковыми у других киназ, особенно- стью является лишь то, что ПК А начинает фосфорилирование в ответ на сигнал, передаваемый цАМФ. ПК А существует в двух изоформах, относительное количество которых варьирует в разных тканях. Протеинкиназы G (ПК G). Другим распространенным классом протеинкиназ являются ферменты, стимулируемые с помощью цГМФ, — протеинкиназы G. В тканях млекопитающих их содержание невелико (1—2% от общей протеинкиназной активности). Наиболее высок уро- вень протеинкиназ G в мозжечке, сердечной мышце и легких, эти же ткани содержат и наибольшее количество цГМФ, не превышающее, впрочем, 10% от содержания в них цАМФ. Фермент состоит из двух субъединиц, обладающих катали- тической активностью и способных связывать циклический нуклеотид. Скорость, с которой ПК G фосфорилирует субстрат, значительно ни- же, чем у ПК А, что может быть основой для субстратной специфич- ности этих двух киназ. (Са + кальмодулин)-зависимые протеинкиназы (ПК В). Ней- роны в изобилии имеют ПК этого типа, являющиеся мультифункци- ональными серин-треониновыми киназами. К настоящему времени
2.4. G-br KP, tk, . J.- Mr • НДЖсч 1 И нс еТеИ»*|-,ИН. jb' Та обнаружено три типа протеинкиназ В, которые в порядке убыва- ния молекулярной массы обозначаются как протеинкиназы В I, II и III. Основные их различия заключаются в субстратной специфичности. Так, протеинкиназа В I фосфорилирует лишь несколько белков в нервной ткани, в то же время для киназы В II только в головном мозге имеется более 10 субстратов. ПК В II образована —14 а- и Р-субъ- единицами, каждая из которых имеет в своем составе каталитический и регуляторный домены, а также другие домены, позволяющие осу- ществлять олигомеризацию фермента в необходимом участке клетки. Са2+ и кальмодулин активируют эту ПК, «отодвигая» регуляторный щмен от каталитического участка. ПК В II фосфорилируют большое количество субстратов, включая белки ионных каналов, а также бел- ки, участвующие во внутриклеточной передаче сигналов. Как установлено, протеинкиназа В II составляет около 0,4% от об- щего белка головного мозга млекопитающих, что свидетельствует о важной регуляторной роли фермента в ЦНС. В отличие от «цитоплаз- матической» ПК В I, она преимущественно связана с мембранной фракцией и сконцентрирована в области постсинаптических уплотне- ний в тех отделах нервной системы, которые связаны с обучением (гиппокамп у позвоночных и сенсорные нейроны у беспозвоночных). ПК В II обладает свойствами двухфазного переключателя со стабиль- ностью, необходимой для кодирования долговременной памяти. Киназа легких цепей миозина является представителем второй группы (Са + кальмодулин)-зависимых протеинкиназ. Регуляция с ее помощью легких цепей миозина осуществляется по принципу «все или ничего». Так, в отсутствие кальмодулина (КМ) фермент практиче- ски не активен, а при действии комплекса Са + КМ его активность возрастает в 200—300 раз. Протеинкиназы группы С (ПК С). Являются еще одной важной группой серин-треониновых киназ. Семейство протеинкиназы С обна- ружено в разных тканях млекопитающих, их локализация лишена строгой тканевой и видовой специфичности. К ПК С относят мономер- ные киназы, активаторами которых являются такие вторичные посред- ники, как DAG и Са2+. Наибольший активирующий эффект на ПК С оказывают диацилглицерол и в меньшей меуе фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и фосфатидная кислота. Диацилглицерол уве- личивает сродство ПК С к фосфолипидам, при этом она становится чувствительной к физиологическим концентрациям Са2+ в клетке. DAG вызывает перемещение ПК С из цитозоля в плазматическую мембрану, где она связывается с мембранным фосфатидилсерином и Са2+. В ре-
186 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ зультате этого происходит разблокирование аутоторможения фермента и активация фосфорилирования различных белков. ПК С способна взаимодействовать не только с плазматической мембраной, но и с эле- ментами цитоскелета, перинуклеарного и ядерного пространства, где также может фосфорилировать белки. Продолжительная активации ПК С может быть вызвана форболовыми эфирами и канцерогенными вещест- вами, обладающими DAG-подобной активностью. В составе изофер- ментов семейства ПК С обнаружена также Са-независимая фосфоли- пидактивируемая форма. Как отмечалось, протеинкиназы, как и сопряженные с ними G-бел- ки, имеют различную преимущественную локализацию в тех или иных клетках нервной ткани. Таким образом, разные типы клеток мозга приспособлены к восприятию сигналов, активирующих синтез различ- ных вторичных посредников: цАМФ, цГМФ, ИФ3, DAG и АФК. Тирозиновые протеинкиназы (ТК). Представлены двумя классами киназ, переносящих фосфатную группу на тирозиновый остаток соответствующего субстрата. Рецептор ТК является транс- мембранным белком с внеклеточным доменом, способным связываться с различными лигандами (фактором роста, нейротрофическим факто- ром или цитокинами), а внутриклеточный каталитический домен отве- чает за фосфорилирование соответствующих субстратов. Нерецептор- ные ТК являются цитоплазматическими или мембраносвязанными ферментами, которые активируются внеклеточными сигналами опос- редованно. Фосфорилирование тирозиновых остатков встречается ре- же, чем фосфорилирование сериновых и треониновых, и чаще всего служит для связывания сигнальной молекулы с фосфорилируемым белком. ТК играют важную роль в процессах роста и дифференциации нервных клеток. Митогенактивируемые протеинкиназы (МАР-киназы, МАРК). В отличие от других протеинкиназ, которые напрямую активируются вторичными посредниками, могут активироваться и другими способа- ми, например при фосфорилировании их другими ПК. Первоначально МАРК были идентифицированы как участники контроля за клеточным ростом, но к настоящему времени известно их участие и во многих других процессах. В нейронах МАРК находятся в неактивном состоянии, но активи- руются при их фосфорилировании другими киназами. Они являются частью киназного каскада, когда одна ПК фосфорилирует и тем самым активирует следующую за ней в каскаде. Внеклеточный
2.4. G Белки, вторичные мессенджеры и протеинкиназы ВАШ сигнал, являющийся пусковым для этого каскада, такой как внекле- точный фактор роста, связываясь с рецептором ТК, на следующем этапе активирует мономерный G-белок Ras. МАРК, будучи активиро- ванной, способна фосфорилировать факторы транскрипции, регули- рующие экспрессию генов. Среди широкого набора субстратов МАРК можно назвать другие ферменты, включая протеинкиназы и белки ци- тоскелета. Протеинфосфатазы (ПФ). Хорошо изучены серин-треонино- вые протеинфосфатазы (ПФ I и II), демонстрирующие меньшую суб- стратную специфичность, чем ПК. Их ограниченная специфичность может объясняться тем, что каталитические субъединицы этих фер- ментов гомологичны, но каждый имеет специфичную регуляторную субъединицу. Среди серин-треониновых фосфатаз в клетках млекопитающих преобладают ПФ 1, дефосфорилирующие широкий круг белков. Их активность регулируется различными ингибиторными белками, экс- прессируемыми в нейроне. ПФ ПА является мультисубъединичным ферментом с широким кругом субстратов. Присутствующая в нейро- нах в больших количествах ПФ ИВ (кальцинейрин) активируется Са-кальмодулином. Несмотря на то что, как и ПК IB, она имеет тот же активатор, субстраты их действия не всегда совпадают. ПФ ИВ состо- ит из регуляторной и каталитической субъединиц. Первоначально для ее активации Са-кальмодулин присоединяется к каталитической субъ- единице и оттесняет тормозной регуляторный домен. Фосфатазы / ингибируются белковыми ингибиторами, относитель- но нечувствительны к ингибированию АТФ и предпочтительно дефос- форилируют Р-субъединицу киназы фосфорилазы. Фосфатазы // не ингибируются термостабильными белковыми ингибиторами, чувстви- тельны к ингибированию АТФ и преимущественно дефосфорилируют ос-субъединицу киназы фосфорилазы. Все ПФ II делятся на подтипы: ИА, ИВ (кальцинейрин) и ИС. Отли- чительной особенностью фосфатаз ИС является регулируемость Mg2+, а фосфатаз ИВ — зависимость от Са2+ и кальмодулина. Активность фосфопротеинфосфатаз регулируется по «внешнему» (субстратному) и «внутреннему» (фосфатазному) механизмам. В пер- вом случае различные метаболиты связываются с субстратом (фосфо- протеином), изменяя скорость дефосфорилирования; во втором слу- чае лиганды связываются с фосфатазой и таким образом изменяют фосфатазную активность.
188 I аздел 2. :лОЛЕКУЛлгН * чЕЙРО.хИМИ» 2.5. ИОННЫЕ КАНАЛЫ И ИОННЫЕ НАСОСЫ Существует два основных вида переноса веществ через клеточную мембрану — пассивный (в направлении от большей концентрации вещества к меньшей; его по устоявшейся привычке называют транспортом по градиенту концентраций (хо- тя на самом деле этот вид транспорта осуществляется против кон- центрационного градиента) и активный (осуществляющийся в на- правлении от меньшей концентрации вещества к большей, т. е. в проти- воположном направлении). Первый обеспечивают мембранные каналы или переносчики, второй — «оплачивается» энергией АТФ и осуществ- ляется с помощью насосов. Классификация основных видов транспорта веществ через клеточную мембрану представлена на рисунке 2.23. Наиболее простым видом транспорта является пассивная диффузия, которая может осуществляться тремя путями: непосредственно через липидный бислой, через канальные структуры и с помощью подвижного переносчика. Движущей силой диффузии являются концентрационные градиенты переносимых веществ, а ее скорость определяется гидрофобностью, конфигурацией и размерами переносимой молекулы, а также размерами канала или сродством пе- реносимой молекулы к переносчику. Первый способ диффузии (непосредственно через бислой) отличается малой специфичностью и хорошо коррелирует с гидро- фильно-липофильным коэффициентом молекулы (коэффициентом рас- пределения в системе «вода—масло»). Липидный бислой Транспортируемая молекула Простая Облегченная диффузия диффузия I_____________________I Пассивный транспорт Активный транспорт Рис. 2.23. Классификация видов транспорта через клеточную мембрану
2.5, Ионные каналы и ионные насосы Второй способ — диффузия через каналы ограничена соот- ветствием размеров переносимого соединения и внутренней поры ка- налов, а также временем их жизни в открытом состоянии и плотно- стью расположения каналов на мембране. Третий способ диффузии (с помощью переносчика), кроме всех вышеуказанных факторов, ограничен временем, необходимым для пересечения переносчиком клеточной мембраны, и, соответствен- но, физико-химическими свойствами мембранного бислоя. Специфический переносчик, осуществляющий процесс пассивной диффузии, может использоваться и для активного транспорта, но для «оплаты» этого вида работы он должен соединяться с преобразовате- лем энергии (см. рис. 2.23). Поскольку чаще всего в клетке для этих целей используется энергия АТФ, системы активного транспорта со- единены с АТФазами или сами представляют собой АТФазы, вклю- чающие участки связывания и переноса требуемых соединений. Наиболее распространенным типом активного транспорта являет- ся транспорт через клеточную мембрану ионов натрия и калия, приводящий к асимметричному распределению этих ионов по обе сто- роны клеточной мембраны (низкий уровень натрия и высокий — ка- лия внутри клетки, табл. 2.10). Имеющиеся в клетке ионные градиенты часто используются в каче- стве движущей силы для транспорта метаболитов. Данный вид транс- порта называют вторичноактивным транспортом (см. рис. 2.23), поскольку при этом АТФ используется не непосредственно, а через создание промежуточного вида энергии, в связи с чем транспорт, осу- ществляемый за счет энергии АТФ, стали называть первичноактив- ным транспортом. Таблица 2.10. Содержание ионов в клетках, во внеклеточной жидкости и в морской воде Объект^^ —~~’ Ионы Na+ к+ Са2+ Mg2+ СГ Крыса мышцы 27 101 1,5 11,0 16 плазма крови 145 6,2 3,1 1,6 116 Лягушка мышцы 24 85 2,5 11,3 10 плазма крови 104 2,5 8,5 1,2 74 Осьминог мышцы 81 101 3,7 12,7 93 жидкость тела 525 12,2 11,6 57,2 480 Морская вода 440 9,5 9,6 56 535
190 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕИРОХИМИ^ / 2 транспортируемых молекул Рис. 2.24. Различия между канальным ( /) и переносчиковым (2) механизмами переноса ионов Для разграничения транспорта веществ (ионов) с помощью каналов или переносчиков пользуются различиями в концентрационной зависи- мости этих процессов: при транспорте вещества через канал, как прави- ло, не наблюдается насыщения, в то время как транспорт с помощью переносчика лимитируется концентрацией его молекул и поэтому дости- гает плато вне зависимости от дальнейшего увеличения концентрации переносимых соединений (рис. 2.24). Кроме того, транспорт через канал в меньшей степени зависит от температуры, чем транспорт с помощью переносчика: для последнего существует критическая температура, со- ответствующая температуре фазового перехода мембранного бислоя. Транспортные процессы по способу переноса классифицируют как унипорт, симпорт и антипорт (рис. 2.25). Классификация транс- портных процессов облегчает понимание их механизмов и особенностей. В настоящем изложении основное внимание будет уделено особен- ностям систем, осуществляющих транспорт ионов (как пассивный, так и активный), поскольку они наиболее хорошо изучены. Ионные каналы. Ионные каналы образованы ассоциатами поли- топических мембранных белков, при этом они являются гомо- или гете- роолигомерами. Наиболее просто устроены ионные каналы микроорга- Унипорт Симпорт Антипорт ।__________________________________I Котранспорт Рис. 2.25. Способы переноса веществ через мембрану
>. Ионные каналы и ионные насосы ic. 2.26. Аламетициновый канал: а — встраивание молекул (/) в бислой (2); — вид канала со стороны бислоя 1змов. Так, продуцентом аламетицина является Trichoderma viride. 'шметициновый канал образуется из переменного количества субъеди- щ, поэтому его размеры могут изменяться (рис. 2.26). Канал, создавае- .1Й антибиотиком амфотерицином, имеет постоянный размер пор. В его ютав обязательно должны включаться молекулы холестерина, поэто- этот канал формируется только в холестеринсодержащей мембране, оответственно, данный антибиотик оказывает воздействие только на микроорганизмы, наружные мембраны которых содержат холестерин. Следует вспомнить, что представление об антибиотиках возник- ) после обнаружения способности некоторых продуцируемых микро- >ганизмами соединений формировать каналы в мембранах тех или тых патогенных микроорганизмов. В природе эти соединения (ихчас- ) называют каналоформерами) синтезируются микроорганизмами в феделенный период их развития для осуществления с помощью кана- IB кратковременной связи и обмена информацией, в том числе и гене- неской, между одноклеточными организмами (каналы, соединяющие ie клетки, называют коннексонами). (Поэтому правильнее называть иродные каналоформеры не антибиотиками, а симбиотиками.) Молекулы-каналоформеры имеют пептидную природу. Ионные ка- мы, образуемые в мембранах животных клеток, формируются также ) принципу олигомеров, но образующие их субъединицы обладают фаздо большей молекулярной массой. В результате эволюционного >вершенствования эти ионные каналы приобрели две важные г о б е н н о с т и: механизм контроля за открыванием — за- быванием канальной поры и большую избирательность. В зависимости от природы пропускаемых ионов, каналы возбудимых 1еток делятся на катионные (Na-, К-, Са-каналы) и анионные (би-
192 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ карбонатньг , хлорные). Механизмы, обеспечивающие их отк р ы вал и е, весьма разнообразны. Одни каналы реагируют на связывание специфического лиганда с рецепторным участком комп- лекса, другие — на деполяризацию мембраны или растяжение клетки. Электрический ток, создаваемый на мембране при открываний кана- ла, зависят от проницаемости канала для данного вида ионов и от их концентрации в устье канала. Ионное каналы различаются своей избирательностью. Натриевые, калиевые и кальциевые каналы достаточно селективны. Анионные каналу гораздо менее избирательны, хотя их часто называют «хлор- ными каналами», поскольку ионы хлора являются наиболее распрост- раненными анионами в животных клетках. Белки, входящие в состав канальной структуры, обладают высокой конформационной лабиль- ностью; отдельные части олигомерных конструкций канала, находясь в состоянии динамической подвижности, меняют свое расположение в пространстве (рис. 2.27). Это способствует спонтанному измене- нию проводимости (открыванию — закрыванию) канала. Следова- Рис. 2.27. Динамические состояния ионных каналов: а, б, в — канал в закрытом состоянии (различные ракурсы); г, д, е — канал в открь' том состоянии
2.5. Ионные каналы и ионные насось тельно, фактор, вызывающий его активацию (мембранный потенци- ал или конформационный сигнал от связывания лиганд. ), только увеличивает вероятность открытого состояния канала. Время, в те- чение которого канал находится в открытом состоянии, является специфической характеристикой каналов каждого вида. Активация канала означает возрастание вероятности перехода в открытое со- стояние, а не увеличение продолжительности открытого состояния канала. \ Устранение активирующего стимула приводит к деактивации ка- нала (при спонтанном открывании канала его деактивация такж^про- исходит спонтанно). Появление активирующего стимула в период, когда канал находится в открытом состоянии, вызывает блокирова- ние работы канала (для потенциалзависимых каналов применяется термин инактивация, для лигандактивируемых — десенситиза- ция). Помимо этого возможно также блокирование открытого ка- нала, вызываемое крупной молекулой (например, токсина) или спе- цифическим агентом (например, ионами магния), связывание которо- го с некоторыми типами каналов препятствует проникновению других ионов. Каналы, активируемые лигандами, содержат'соответствующие цент- ры или с внешней, или с внутренней стороны мембраны. Типичным при- мером первого варианта является никотиновый холинорецептор кон- цевой пластинки мышечного волокна (нХР) (см. гл. 2.2), второго — Са-активируемые калиевые каналы нервной клетки, реагирующие на внутриклеточную концентрацию ионизированного кальция. Важная информация о свойствах ионных каналов была получена в результате разработки в конце XX в. метода регистрации активности одиночных каналов, так называемого «пэтч-клампа», существенные данные об их структуре — с помощью экспрессии в ооцитах Xenopus ионных каналов инъекцией соответствующих мРНК. Ооциты не экспрессируют собственных ХР, однако после микро- инъекции мРНКони не только изготавливают соответствующие рецеп- торные белки, но и обеспечивают их сборку в функционально активные комплексы. Такая модель весьма удобна для выяснения функциональ- ной роли разных частей канала с применением метода направленных мутаций (Site-directed mutagenesis). На рисунке 2.28 представлена структура потенциалзависимого Са-ка- нала, а в таблице 2.11 систематизированы некоторые свойства наибо- лее полно исследованных ионных каналов. Характерной особенностью ионных каналов является большое разнообразие их изоформ. Особенно много изоформ обнаружено у
194 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ а Внешняя I И IV Внешняя Внутренняя Рис. 2.28. Структура потенциалзависимого Са-канала: а — топология -субъединицы: четыре гомологичных домена (I—IV) формируют шесть а-спиральных трансмембранных элементов (представлены в виде цилиндров (1 —6)). Домен IV обычно является сенсором, домены I и II формируют ионную пору; б — субъединичная структура канала, содержащего (Xj -, а2-, р-, у- и 8-субъединицы нХР и К-каналов. Тот факт, что каждая субъединица канала кодирует- ся особым геном, открывает простор для альтернативного сплайсинга. Кроме того, обнаружено, что при синтезе некоторых рецепторов про- исходит редактирование РНК, приводящее к дополнительным вари- ациям изоформ рецепторных белков. Идентифицировано четыре класса опиоидных ре- цепторов: |1-,8-,к- hORL-1 (Opioid Receptor-Like 1)(см. табл. 2.7), между которыми, однако, имеется меньше различий по взаимодейст- вию с агонистами и антагонистами, чем в других группах рецепторов. Опиоидные рецепторы связаны с Gs- и Gj-белками, их тормозное дей- ствие заключается в закрытии Са-каналов (к-рецептор) или в откры- тии К-каналов (ц, 5, ORL-1). В зависимости от того, где локализова- ны рецепторы, это приводит к уменьшению выброса медиатора или уг- нетению нейрональной возбудимости.
Таблица 2.11. Свойства ионных каналов Тип канала Лиганд Функция Олигомерный состав Никотиновый холинорецептор концевой пластинки АХ Создание Na-тока в концевой пластинке Пентамер состава а2Р6с (в эмбриональной ткани — а2р&у) Хлорные тормозные каналы ГАМК-активируемые Глициновые 5-НТ-активируемые ГАМК Глицин Серотонин Обеспечение синаптического торможения, препятствующего деполяризации мембраны Создание Na- и К-тока Гексамер Пентамер Na-канал Са-канал пд пд Na-ток Са-ток Содержат четыре субъедини- цы, состоящие из четырех вну- тримембранных доменов из шести сегментов, соединенных цитоплазматическими петлями Потенциал- зависимые каналы К-канал пд К-ток Состоит из четырех субъеди- ниц, каждая похожа на одиноч- ный домен Са-канала Cl-канал пд Стабилизация ТМП Субъединица содержит один- надцать трансмембранных сег- ментов, димеры образуют в мембране два независимых ка- нала 2,5. Ионные накалы и ио-ннасосы
Окончание табл. 2.11 Тип канала Лиганд Функция Олигомерный состав АТФ-активируемые каналы (активируемые пуринергическими рецепторами) АТФ Регуляция сократимости глад- По-видимому, пентамер, субъ- кой мускулатуры единица содержит два транс- мембранных сегмента и петлю, формирующую пору Ионотропные Глутумат (агонис- Формирование электрического Пентамеры, содержащие субъ- (три вида) ты NMDA, АМРА, потенциала единицы с тремя трансмембран- каинат) ными сегментами и петлей, фор- мирующей пору Глугам атн ы е ------------------------------------------------------------------------------------------------- рецепторы Метаботропные Глутамат Управление метаболизмом че- Гексамер (три группы, (3-HPG, рез сопряженные G-белки всего восемь видов) N-ацетиласпар- тилглутамат, ACPD и др.) Каналы, активируемые циклическими нуклеотидами цАМФ/цГМФ Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ Формирование ионных токов в Вероятно, тетрамер с субъеди- сетчатке и обонятельном эпи- ницей из шести трансмембран- телии ных сегментов £
2.5. Ионные каналы и ионные насосы T91 Для глутаматных рецепторов GluRB, GluR5 и GluR6 показано, на- пример, что они имеют во втором трансмембранном сегменте либо глу, либо арг (присутствие аргинина устраняет Са-проницаемость и уменьшает проводимость канала). Несмотря на то что ДНК всех трех изоформ содержит кодон для глутамата (CAG), в мРНК может по- явиться CGG, кодирующий арг. Это происходит вследствие редакти- рования уже образованной мРНК. В GluR6 также найдено дополни- тельное редактирование (А/G) в первом трансмембранном сегменте. Ионные насосы (транспортные АТФазы). Первичноактивный транспорт. Ионные насосы представляют собой интегральные транс- мембранные олигомерные белки, превращающие энергию АТФ в энер- гию ионных градиентов. Они содержат центры связывания и гидролиза АТФ, ионные центры и обладают высокой конформационной лабильно- стью — способностью принимать несколько устойчивых конформаций, различающихся сродством к переносимым ионам и ориентацией цент- ров связывания этих ионов. Энергия АТФ используется для «оплаты» перехода из конформации с высоким сродством к переносимым ионам (на этой стадии ионы свя- зываются ионными центрами) в конформацию с низким сродством (на этой стадии ионы высвобождаются). Возвращение в исходную кон- формацию происходит спонтанно (релаксационная кинетика) (Блюмен- фельд, 1977; 2002). Термин «транспорт- ные АТФазы» является синонимом тер- мина «ионные насосы». Промежуточным продуктом гидролиза АТФ является фосфофермент, образую- щийся при переносе терминального фос- фата АТФ на белок с образованием мак- роэргической ацилфосфатной связи. По этой причине транспортные АТФазы от- носят к АТФазам Р-типа. История исследования транспортных АТФаз началась в 1957 г., когда В. Хас- сельбах обнаружил в составе микросо- мальной фракции скелетных мышц (со- держащей пузырьки саркоплазматического ретикулума) АТФазную активность, акти- вирующуюся очень низкими концентрация- ми ионов кальция. Кд5 для нее составляла около 5 • 10-7 М. Одновременно два иссле- дователя, Б. Марш и Дж. Бендалл, описали В. Хассельбах Первооткрыватель Са-насо- са, исследовавший его мо- лекулярные свойства и опи- савший его работу как мембранного преобразовате- ля энергии(Германия)
198 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ c. Эбаси Нобелевский лауреат по фи- зиологии и медицине, автор оригинальных работ в облас- ти функциональной биохи- мии, открывший тропонин С и описавший его функцио- нальные свойства (Япония) свойства так называемого «расслабляю- щего фактора», добавление суспензии ко- торого к глицеринированным волокнам, сокращенным вследствие внесения в сре- ду ионов Са, вызывает их релаксацию. Эти феномены было трудно связать друг с другом, поскольку они были обнаружены за несколько лет до сделанного С. Эбаси открытия тропонина С, ответственного за Са-регуляцию сокращения. Тем не менее очень быстро расслаб- ляющий фактор Бендалла—Марша был идентифицирован с саркоплазматическим ретикулумом, и содержащейся в его мемб- ранах Са-АТФазе была приписана роль системы, связывающей кальций и вызы- вающей расслабление глицеринированных волокон (Бендалл, 1970). Одновременно датский ученый Й. К. Скоу приступил к изучению фено- мена утраты ионной асимметрии, проис- ходящей при хранении клеток при пониженной температуре. К тому времени благодаря исследованиям А. Ходжкина было уже известно, что процессы возбуждения обеспечиваются неравновесным распреде- лением ионов натрия и калия на мембране возбудимых клеток (удоб- ным объектом исследования служил гигантский аксон кальмара, но немало опытов было поставлено и на скелетных мышцах лягушки). Кратковременное выдерживание препаратов на холоде не влияло на их жизнеспособность, недлительное хранение в холодильнике (при +4 °C) уменьшало выраженность ионных градиентов и снижало возбудимость аксонов. В 1954 г. А. Шатцман установил, что утрату Na-градиента можно вызвать, выдерживая клетки в присутствии какого-либо сер- дечного гликозида — строфантидина или уабаина. Лечебный эф- фект этих соединений, выделенных из сока строфанта или экстрагиро- ванных из наперстянки, был давно известен: они снижали сердечную недостаточность, но это ничего не объясняло. В 1957 г. Й. Скоу поставил простой опыт, результат которого че- рез 40 лет был отмечен Нобелевской премией. Измельченные до го- могенного состояния нервы краба были подвергнуты воздействию различных концентраций хлористого натрия и хлористого калия в при- сутствии магния и АТФ. Соотношение Na+/K+ изменялось от 0/150 до 150/0 мМ, и пропорционально изменению этого коэффициента из-
2.5. Ионные каналы и ионные насосы 199 менялась способность гидролизовывать АТФ. При этом измерялась АТФазная ак- тивность. Максимум АТФазной активнос- ти приходился на 130мМ Na+ и 20 мМ К+. АТФаза, активируемая совместным присутствием натрия и калия, ингибирова- лась уабаином. В опубликованной статье Скоу сообщил, что им найдена фермента- тивная система, ответственная за асим- метричное распределение ионов натрия и калия на мембране возбудимых клеток; он назвал ее Na/K-зависимой Mg-активи- руемой АТФазой (Скоу, 1957). С этих пуб- ликаций Хассельбаха и Скоу и началась история исследования участия транспорт- ных АТФаз в функционировании возбуди- мых клеток. Са-насос. Ионы кальция выполня- ют во многих тканях функции вторичного мессенджера, что объясняется наличием в клетках большого количества белков, Й. Скоу Нобелевский лауреат в об- ласти биоэнергетики, перво- открыватель Na/K-АТФазы, впервые описавший ее функ- циональные свойства, в том числе молекулярные свойст- ва фосфофермента и спо- собность АТФ регулировать сродство фермента к перено- симым ионам (Дания) обладающих высоким сродством к этому иону: кальмодулин, кальпаин (кальцийнейрин в нервных клетках), тропонин С (в скелетной мускулатуре). Поскольку сродство этих бел- ков к кальцию находится в области 5* 10“6 — 5* 10-7М, для осу- ществления такой регуляции клетка должна иметь систему «уборки» ионизированного кальция, способную снижать его уровень до величи- ны, меньшей 10“7 М. С этой задачей вполне справляется Са-насос саркоплазматического (в других тканях — эндоплазматического) ре- тикулума. Легкость выделения фракции ретикулума из скелетных мышц в виде замкнутых везикул, содержащих Са-АТФазу с активным центром, обращенным наружу, стимулировало массовые исследова- ния кинетических свойств и транспортной функции Са-насоса. В итоге было выяснено, что АТФаза исходно обладает высоким сродством к кальцию и в присутствии Mg-АТФ быстро и обратимо фосфорилиру- ется. Фосфофермент обладает способностью к изменению конформа- ции, вследствие чего участок связывания ионов кальция оказывается доступным по другую сторону мембраны, где ионы диссоциируют от молекулы фермента. При экспериментальном определении эффективности транспорта кальция поначалу получали широко варьирующие значения величины
200 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ ц+ Закисление среды снижает Квых, облегчая выход кальция из СР Рис. 2.29. Экспериментальное определение Са-АТФмакс для Са-насоса сарко- плазматического ретикулума (СР). Стрелками отмечено изменение концентрации оксалата натрия, проникающего через мембрану везикул, и ионов кальция; последняя может быть рассчитана из произведе- ния растворимости оксалата кальция и концентрации оксалат-иона. Зависимость ко- эффициента Са-АТФ от рассчитанной концентрации кальция внутри везикул [Са2+ ]вн позволяет определить максимальную величину Са-АТФ и константу для выхода каль- ция из ретикулума Са-АТФ (от 0,5 до 1,5); причины этого были неизвестны. Использова- ние Са-преципитирующих анионов (оксалата), проникающих через мембрану везикул, позволило измерять скорость транспортного про- цесса против неизменного внутривезикулярного градиента концентра- ции кальция, а варьирование концентраций оксалата позволило из- мерить зависимость Са-АТФ при разных концентрациях [Са2+]вн. Оказалось, что измеряемая величина аккумуляции кальция является результирующей между величинами активного входа и пассивного вы- хода кальция из ретикулума. Получение частично «разобщенных» пре- паратов Са-насоса (в тот период ингибиторы бактериальных протеаз еще не использовались широко) объясняло сильные различия резуль- татов измерения значений Са-АТФ у разных авторов. Расчет макси- мальной стехиометрии процесса на основе зависимости транспорта кальция от величины [Са2+]вн привел к величине, равной 2 (рис. 2.29). Использование этого приема позволило В. Б. Ритову впервые рассчи- тать константу сродства системы кальциевого транспорта для ионов кальция с внутренней стороны мембраны ретикулума. Она оказалась равной 5* 10-4М. Поскольку, согласно эксперименту В. Хассельбаха, эта величина с внешней стороны мембраны составляет (1 —5) • 10“7 М, можно было заключить, что соотношение констант сродства достаточно для того, чтобы создать на мембране ретикулума 1000—5000-кратный градиент ионов кальция (Болдырев, 1978). Следовательно, Са-насос
2 5. VL ннпе нгн л > 20 ЕЬСа2АТФ ЕЬСа2АТФ ЕЬСа2АТФ E2----------Е2ФН-------------Е2Ф ------------Е2ФСа2 Рис. 2.30. Схема гидролиза АТФ Са-насосом (последовательные стадии пронумерованы) способен обеспечить запас кальция в цистернах, достаточный для ре- гуляции мышечного сокращения. Процесс транспорта кальция осуществляется как унипорт, однако создаваемый на мембране ретикулума потенциал немедленно тушится легко проникающими через мембрану ионами магния или протонами. Кинетическая схема, описывающая цикл Са-АТФазы, представлена на рисунке 2.30. Образование комплекса Михаэлиса (АТФ Е2Са2+) может осуществляться любым из двух указанных на рисунке путей (стадии 1—3 или 4—6), но первый путь наиболее вероятен из-за ис- ходно высокого сродства фермента к ионам кальция. Конформации фермента, с которой начинается описание цикла, присвоен индекс Е1, и фосфорилирование переводит фермент в конформацию Е2, в кото- рой ионы кальция оказываются доступными по другую сторону мемб- раны, причем сродство ионных центров к кальцию в этом состоянии резко падает, что делает ионные центры свободными от диссоциирую- щих ионов. После этого наступает процесс дефосфорилирования фер- мента, вследствие чего фермент становится способен релаксировать в исходную конформацию; при этом он восстанавливает высокое срод- ство к кальцию и процесс может повториться. Успехи в исследовании первичной структуры фермента, а в после- дующем и рентгеноструктурный анализ разных конформаций Са- о АТФазы (последнее достижение — с разрешением 2,6 А) позволили установить молекулярные передвижки, сопровождающие Е1 —Е2-пе- реход, и наполнить формальную схему (см. рис. 2.30) конкретным со- держанием (рис. 2.31). Общая характеристика Са-насоса должна была включать и иссле- дование роли липидного окружения. Впечатляющие результаты по ре- конструкции очищенной Са-АТФазы в липосомы, составленные из различных амфифи 1ьных соединений, включая детергенты, были про- ведены В. И. Мельгуновым. Оказалось, что восстановление активное-
202 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Рис. 2.31. Топография Са-насоса в мембране ти прямо пропорционально гидрофильно-липофильному коэффициен- ту, характеризующему свойства соединения, используемого для приго- товления липосом (рис. 2.32) (Болдырев, Мельгунов, 1984). Эти опыты положили конец дискуссиям о специфической потреб- ности каждого мембранного белка в наборе аннулярных липидов, ок- ружающих белковые молекулы в мембране. Действительно, скорость обмена аннулярных липидов, происходящего за счет латеральной диффузии липидных молекул в мембране, составляет величину около 10“4 с (см. раздел 1), в то время как скорость работы транспорт- ных АТФаз достигает величин порядка 60—100 Гц. Это означает, что за время одного цикла аннулярные липиды могут успеть обновиться много раз. Как видно из рисунка 2.32, решающими для сохранения активности Са-АТФазы являются физические характеристики гид- рофобной среды, а не специфические свойства молекул. Некоторые неприродные детергенты (например, Brij 52) обеспечивают более вы- сокую активность реконструированной АТФазы, чем та, которую мож-
2.5. Ионные каналы и ионные . 20; 10 s 8 6 4 2 • Brij 52 • Span 80 «Brij 30 Span 20* ,Tween2I 0 • LubrolPX • Nonidet P-40 BriJ56 ••Triton X-100 • Myij 58 • Tween 20 _Q • Brij 35 Brij 58® eMyrj59 , *Тп1оп X-30 5 10 15 20 Гидрофильно-липофильный коэффициент Рис. 2.32. Реконструкция Са-АТФазы в детергенты. Восстановление активности происходит пропорционально величине гидрофильно-ли- пофильного коэффициента детергента, ГЛК. Названия детергентов приведены в соот- ветствии с Международной классификацией (по: Болдырев, Мельгунов, 1978) но измерить в нативной мембране. Аналогичные опыты с митохонд- риальной АТФазой почти одновременно были проведены Э. Рэке- ром(1979). Однако при реконструкции интегральных белков в искусственные мембраны реконструированная система отличается от нативной. В о - первых, реконструкция молекул в липидный бислой происходит случайным образом, в результате чего часть молекул бывает ориенти- рована нужным образом относительно сторон мембраны, а другая их часть (примерно половина) — инвертирована. Во-вторых, в ходе очистки и реконструкции теряются многочисленные минорные компо- ненты нативной мембраны, обеспечивающие регуляцию процесса тран- спорта. Нарушаются пути, связанные с регуляторным фосфорилиро- ванием протеинкиназами, экстрагируются такие белки-регуляторы, какфосфоламбаН' фосфолемман и др. Таким образом, эксперименты по реконструкции функций мембранных белков решили важную зада- чу — доказали, что свойства мембранных систем определяются из- вестными физическими законами. Однако этот подход быстро исчер- пал себя, и ему на смену пришли методы направленного мутагенеза, искусственной индукции химерных белков и исследования их функций в составе живой клетки.
204 ₽-эздч.л 2. МСПЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ В. И. Мельгунов Талантливый ученый, иссле- довавший молекулярные свой- ства транспортных АТФаз в мышцах; осуществил успеш- ную реконструкцию Са-на- соса в различные детер- генты, показав корреляцию между эффективностью ре- конструкции мембранных бел- ков и гидрофобно-гидрофиль- ным коэффициентом окру- жения Тем не менее одну важную особен- ность транспортных АТФаз оказалось возможным изучать с помощью классиче- ских биохимических подходов. Эта осо- бенность касалась их способности спон- танно образовывать в мембране олиго- мерные ассоциаты, в которых свойства индивидуальных протомеров подверга- лись модификации за счет воздействия соседних молекул. Подробнее роль олиго- мерных комплексов мембранных белков будет рассмотрена на примере гетерооли- гомера Na/K-насоса (см. далее). Следует подчеркнуть, что в качестве ин- тегральных мембранных структур мембран- ные белки являются объектом регуляции со стороны липидного окружения, поскольку белок-белковые гидрофобные связи прин- ципиально не отличаются от липид-липид- ных или белок-липидных. Соответственно, изменения микровязкости (плотности упа- ковки) липидного бислоя, вызванные на- правленным изменением жирнокислотного состава мембранных липидов, отражаются на легкости образования белковых ассо- циатов в мембране и «запрещают» или «разрешают» реализацию взаи- модействий протомеров белка в составе мембранного олигомера. В наружной клеточной мембране обнаружен и другой тип Са-насо- са, имеющий некоторую гомологию с Са-насосом ретикулума, хотя и экспрессирующийся на разных генах. Последнее обстоятельство еще раз демонстрирует наличие в геноме клетки многочисленных повто- ров, которые приобретают смысл при конструировании различных белков, обладающих близкими функциями. Разница между двумя формами Са-насосов заключается и в сродстве к кальцию, и в реали- зации разных регуляторных механизмов. Их сравнение показывает, что живые системы не смогли бы удовлетворительно решить пробле- му кальциевого гомеостаза, обходясь одним видом Са-насоса. Na/K-насос. Термин «Na/K-насос» является синонимом тер- мина «Na/K-АТФаза». Этот белок входит в состав наружных плаз- матических мембран всех клеток животных в качестве интегрально- го компонента, обеспечивающего превращение энергии гидролиза АТФ
2.5. Ионные каналы и ионные насосы 20! Рис. 2.33. Расположение полипептидных цепей каталитической а-субъедини- цы Na/K-АТФазы в мембране. Показано расположение полярной области, содержащей центр связывания АТФ и фос- форилирования (Р) и 10 трансмембранных доменов (Ml—М10). Черным выделены аминокислотные радикалы, участвующие в формировании ионного канала в мембране в энергию градиентов одновалентных ионов натрия и калия в стехио- метрии 1 АТФ : 3 иона натрия : 2 иона калия. Функциональная едини- ца фермента (называемая протомером) представлена глобулой, со- стоящей из двух пептидных цепей — а- и 0-субъединиц (рис. 2.33). Большая субъединица (а) имеет молекулярную массу около 100 кДа и несколько последовательностей, составленных гидрофобными амино- кислотами, что позволяет ей «прошивать» плазматическую мембрану 10 раз, при этом ее и С- и N-концы обращены в цитоплазму. В цито- плазму клетки обращены и протяженные гидрофильные петли между 2-м и 3-м и между 4-м и 5-м сегментами. На последней петле распо- ложен активный центр фермента. Ионные центры также формируют- ся на а-субъединице. В связывании ионов принимают участие карбок- сильные группы дикарбоновых аминокислот, локализованных на 3-м и 6-м трансмембранных сегментах. Р-Субъединица представляет собой гликопротеин, белковая часть которого соответствует молекулярной массе 35 кДа, а полная масса ко-
206 Г аздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Э. Рэкер Автор пионерских работ в об- ласти биоэнергетики, функ- ционирования молекулярных машин — мембранных пре- образователей энергии в ми- тохондриях (США) А. Аскари Исследователь транспортных ферментов, определил функ- циональное значение олиго- мерной организации Na/K- АТФазы(США) леблется в зависимости от типа ткани и других факторов в пределах 45— 55 кДа. Эта субъединица пронизывает мембрану один раз, и ее N-конец обращен в цитоплазму. C-Концевая часть содержит четыре цистеиновых остатка, соединенных двумя дисульфидными связями. Эта часть пептидной цепи имеет участки, подвергае- мые гликозилированию. Как типичная АТФаза P-типа, Na/K- АТФаза обладает способностью находить- ся в двух основных конформациях, обла- дающих высоким сродством к ионам нат- рия (Е1) или калия (Е2). Исходной кон- формацией считается Е1, примерно 70% молекул находится именно в этой конфор- мации в среде, где не присутствуют ионы натрия и калия. Переход между конфор- мациями можно индуцировать добавлени- ем соответствующих катионов, хотя для этого требуются значительно большие кон- центрации ионов, чем имеются в клетке. Е2—Е1-Переход существенно ускоряет- ся при повышении pH среды. Но наилуч- шим активатором такого перехода явля- ется АТФ, взятый в физиологических кон- центрациях (>0,5мМ). АТФ увеличивает сродство фермента к ионам натрия и сни- жает сродство к ионам калия. Таким об- разом, по завершении гидролитического цикла трансформация Е2 в Е1 усиливает- ся при связывании ферментом АТФ, если он присутствует в концентрациях свыше 0,5 мМ. Это свойство фермента опреде- ляет наличие двух констант связывания АТФ: натриевая и калиевая конформации фермента различаются по сродству к суб- страту. Указанные конформации различа- ются также и по чувствительности к. спе- цифическому ингибитору уабаину (рис. 2.34). Центр связывания уаба- ина формируется на конформации Е2, но отсутствует в конформации Е1. По этой причине уабаин, как и другие сердечные гликозиды, более
2.5. Ионные канал.। и и. -ны,- и .г^:; 20 Рис. 2.34. Две конформации Na/K-АТФазы: калиевая — Е2К (слева) и натриевая — ElNa (справа). Латинскими буквами обо- значены некоторые последовательности аминокислотных радикалов в пептидной цепи эффективно связывается с работающими молекулами фермента и практически не влияет на фермент в неактивном состоянии. В самом начале исследований свойств Na/K-АТФазы Й. Скоу за- интересовался фосфорилированным интермедиатом, возникающим при инкубации фермента с АТФ-Р32 в присутствии ионов натрия. Уро- вень интермедиата снижается при последующей инкубации суспензии с ионами калия или с С14-меченным АДФ. В последнем случае образу- ется АТФ, несущий двойную метку, — С14 и Р32. При добавлении ионов магния дефосфорилирующий эффект калия сохраняется, но АДФ теряет способность вызывать дефосфорилирование ЕР. Интерпретация этих данных Скоу была следующей: две конформа- ции фермента способны находиться в фосфорилированном состоянии, но образование Е1Р из АТФ обратимо, и фосфат может возвратиться в адениловую систему. Е1 способен частично превращаться в Е2, этот переход ускоряется ионами магния. Образующийся Е2Р может дефос- форил ироваться (в присутствии ионов калия) только с образованием неорганического фосфата. Таким образом, натрий выступал как акти- ватор стадии фосфорилирования, а калий — стадии дефосфорилиро- вания, причем магний ускорял Е1—Е2-переход. Постулировалось, что энергия АТФ расходуется на перевод молекулы фермента из Na-конформации в К-конформацию. В первом случае фермент связы- вает натрий (со стороны цитоплазмы), во втором — отдает натрий и связывает калий (с внешней стороны клетки) за счет изменившегося сродства к этим ионам. В соответствии с изменяющимся сродством
208 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ а Е-С + АТФ хон Н,8ОН р Н,8ОН Е-С ХО"--------- ХО-Р=О хо- Е-С + Н,8О-Р-Р=О хон хо Е"< /О>8н.8он //О /О'8 О—Р=О--------Е-С + Н,8О-Р-Р=О хо хон хо Рис. 2.35. Доказательство образования фосфофермента в ходе гидролиза АТФ: а — зависимость активности от соотношения Na/K; б — схема, поясняющая включение «тяжелого» кислорода в неорганический фосфат, образующийся при гидролизе АТФ АТФазы к ионам натрия и калия находится и кривая зависимости актив- ности фермента от соотношения Na+/K+ — она напоминает, по выра- жению Скоу, шляпу Наполеона (рис. 2.35). Поначалу эти представления вызывали, разнообразную критику, свя- занную с необычностью свойств данной транспортной системы. Главное возражение выдвинул Р. Пост, обративший внимание на то, что фосфо- фермент можно получить только в среде, не содержащей ионов калия — в его присутствии ЕР быстро гидролизуется. Если при одновременном до- бавлении к препарату фермента натрия и калия ЕР не удается зарегистри- ровать, означает ли это, что ЕР не образуется и в процессе циклической работы фермента? Ответ на этот вопрос был основным для выбора кинетической схемы работы Na/K-АТФазы. Он был получен в опытах с применением тяжелой воды Н2О18. Используя ее как среду реакции, можно было рассчитывать, что в продукте АТФазы неорганическом фосфате будет обнаруживаться по
2.5. Ионные каналы и ионные насосы 209 крайней мере один атом «тяжелого» кис- лорода. Если в ходе АТФазной реакции об- разуется фосфофермент, время жизни ко- торого сравнимо со скоростью О18-обмена (см. рис. 2.35), в неорганическом фосфате должно обнаружиться более одного атома О18, причем величина включения должна быть прямо пропорциональна -времени су- ществования ЕР (Пантелеева, 1975). При достаточно длительной инкубации фермен- та в реакционной смеси, содержащей все компоненты реакции, полный гидролиз до- бавленного АТФ позволял накопить экви- валентное количество Фн и измерить с помощью масс-спектрометра соотношение 018/Р Эти опыты показали, что при рабо- те Na/K-АТФазы в одну фосфатную группу включается достоверно более одного атома «тяжелого» кислорода, что соответствует образованию ЕР в ходе работы фермента (Болдырев, Твердислов, 1978). Более того, оказалось, что увеличение концентрации ионов магния в среде инкуба- ции, активирующее гидролиз АТФ, снижало величину 018/Р, а отклонение соотношения Na+/K+ от оптимального (130/20 мМ) уве- личивало этот коэффициент. Другими сло- вами, магний увеличивал число оборотов фермента (уменьшая время жизни ЕР), а неоптимальное соотношение ионов-акти- Р. Пост Нейрохимик, известный ос- новополагающими исследова- ниями молекулярных свойств Na/K-АТФазы; описал два конформационных состоя- ния фермента, отличающих- ся сродством к переносимым ионам; вместе с Р. Олберсом обосновал схему постадий- ного гидролиза АТФ, пред- сказал наличие окклюдиро- ванного состояния фермента в процессе переноса ионов через мембрану (США) ваторов Na+ и К+ действовало в противоположном направлении (Смирно- ва с соавт., 1977). Интересно, что в присутствии уабаина, являющегося необратимым неконкурентным ингибитором этого фермента, длитель- ность времени, необходимого для полного гидролиза АТФ, возрастала, но значение коэффициента не менялось, поскольку уабаин выключал из ра- боты часть молекул АТФазы, а оставшиеся активными молекулы продол- жали работать по той же схеме. В настоящее время общепринятая схема гидролиза АТФ Na/K-АТФазой включает стадии образования и превраще- ния фосфофермента. Анализ кривых активации фермента при изменении соотношения Na/K в присутствии разных концентраций АТФ или нуклеозидтрифосфатов раз- личной природы привел Скоу к еще одному важному заключению. Как видно из рисунка 2.36, Ко 5 для натрия при низкой концентрации АТФ со- ставляет около 115 мМ и снижается пропорционально увеличению кон- центрации субстрата. Другими словами, АТФ способен увеличивать срод- ство АТФазы к натрию (влияние на сродство к калию противоположно, но его трудно заметить на приведенном рисунке из-за исходно большего
210 Раздел 2 МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ а Na+ К+ Рис. 2.36. Зависимость активности Na/K-АТФазы от соотношения Na/K при использовании АТФ (а) или других нуклеотидов (б). Концентрация субстратов (если она варьировала) указана около каждой кривой сродства фермента к этому иону). Замена АТФ на другие субстраты изме- няет профиль ионной кривой в таком же направлении, что и снижение концентрации АТФ. Данные результаты позволили утверждать, что АТФ является не только субстратом, но и модулятором Na/K-АТФазы, регули- рующим ее сродство к переносимым катионам. Действительно, при тех концентрациях АТФ, которые имеются в возбу- димых клетках, за окончанием АТФазного цикла и образованием Е2-кон- формации фермента должен быстро следовать Е2—Е1 - переход, индуцируе- мый высокими концентрациями АТФ. Действительно, субстратная зависи- мость Na/K-АТФазы свидетельствует о том, что с ростом концентрации субстрата наблюдается отклонение кривой от типичной «михаэлисовской» зависимости и появление промежуточного плато. Строгий кинетический анализ этой сложной субстратной кривой показывает, что она является сум-
2.5. Ионные каналы и ионные насосы 211 мой кривых — похожей на гиперболу при низких концентрациях субстрата и выступающей в качестве сигмоиды при концентрациях АТФ свыше 0,5 мМ. Первая часть зависимости, регистрируемой при низких концентрациях субстрата, характеризуется отрицательной кооперативностью по АТФ (коэф- фициент Хилла < 1). Сигмоида, возникающая при повышении концентрации субстрата, отражает положительную кооперативность фермента по АТФ, эта часть кривой соответствует коэффициенту Хилла, существенно превышаю- щему 2 и зависящему от условий инкубации (температура, присутствие де- тергентов). Как отрицательная, так и положительная кооперативности могут иметь различную природу, основывающуюся и на внутрибелковых, и на меж- белковых взаимодействиях (Корниш-Боуден, 1983; Курганов, 1978). Для прояснения этого вопроса было проведено сравнение свойств на- тивного (связанного с мембраной) фермента и фермента, солюбилизиро- ванного неионным детергентом С12Е8. Оказалось, что первая часть суб- стратной кривой осталась без изменений, сохранив отрицательную коопе- ративность по АТФ; вторая же часть кривой исчезла (рис. 2.37). Поскольку обработка детергентом разрушает белковые ассоциаты, полученные дан- ные свидетельствуют о том, что сигмоидальная кривая отражает взаимо- действие между белковыми протомерами, а отрицательная кооператив- ность присуща протомеру как таковому. Согласно классическим представлениям, ферменты, включающие в свой цикл стадию релаксации, должны соответствовать кинетике Рэбина, проявляя отрицательную кооперативность по субстрату (Болдырев, Мель- гунов, 1984). То, что обработка детергентом не устраняет отрицательной кооперативности по АТФ, подтверждает релаксационный характер работы Na/K-насоса как молекулярной машины. В то же время зависимость ко- оперативности в работе фермента от факторов, влияющих на упаковку мембранного бислоя (температура, обработка детергентами, концентрация АТФ), указывает на способность Na/K-насоса образовывать олигомеры, функциональная активность которых может контролироваться АТФ. Интересно, что субстратная зависимость Na/K-АТФазы после свободно- радикальной атаки приобретает вид, типичный для случая невзаимодейст- вующих протомеров. Другими словами, окислительное повреждение приво- дит к утрате способности мембранных белков взаимодействовать друг с дру- гом. Аналогично этому и Na/K-АТФаза, выделенная из мозга животных, перенесших экспериментальную ишемию, при гидролизе АТФ демонстрирует субстратную зависимость, характерную для солюбилизированного фермента. Насколько важна способность фермента реагировать повышением ак- тивности на возрастание концентрации АТФ, можно видеть на рисунке 2.38. Измерение субстратной зависимости Na/K-АТФазы мозга при разных значениях pH обнаруживает важную закономерность: снижение pH среды приводит к «вырождению» сложной кривой в кривую, подобную гипербо- ле. Это действие pH обратимо, и при восстановлении нормальной кислот- ности среды (до pH 7,4) кривая восстанавливает типичную форму с проме- жуточным плато. Если вспомнить, что защелачивание среды ускоряет Е2—Е1-переход (а закисление среды замедляет его), становится понят- ным, что манипуляции pH являются способом регулировать скорость ли-
212 Раздел 2 МОЛЕКУЛг^нАл НЕЙ/'ОХИМИК а б АТФ, мМ Рис. 2.37. Субстратные кривые: а — мембранного фермента: кривая / — зависимость от концентрации АТФ нативно- го фермента; кривые 2 и 3 получены методом математического разложения из кривой Г, б — солюбилизированного фермента: кривая / — то же, что и на рис. 2.37, а\ кри- вая 2 получена после солюбилизации фермента неионным детергентом С12Е8 (кривые нормализованы приведением максимальной активности к единице) митирующей стадии реакции. В мозге, где нарушения кровоснабжения особенно губительны и могут привести к ацидозу, одним из следствий аци- доза будет торможение Na/K-насоса за счет замедления лимитирующей стадии. Это, конечно, приведет к сбережению клеточных запасов энергии (Na/K-насос затрачивает около 40% всей энергии нейрона), но поставит под угрозу жизнеспособность и функциональную активность клетки. Дело в том, что с помощью специальных механизмов Na/K-АТФаза вовлекает- ся в процессы внутриклеточной сигнализации и, находясь в рабочем со- стоянии, препятствует накоплению активных форм кислорода (АФК) в нейрональной клетке. Подавление работы фермента немедленно приведет к накоплению АФК и созданию условий для окислительного стресса.
2.5. Ионные каналы и ионные насосы 2i: Рис. 2.38. Субстратные кривые для Na/K-АТФазы при различных значениях кислотности среды (указаны у каждой кривой) Действие АТФ на Na/K-насос следует считать высокоспецифичным, поскольку другие нуклеозидтрифосфаты, также являющиеся макроер- гическими соединениями, гидролизуемые ферментом и обеспечиваю- щие активный транспорт натрия и калия, не проявляют положительной кооперативности в координатах Хилла. Данные по кооперативности Na/K-АТФазы сведены в таблицу 2.12. В ней для сравнения приведены результаты расчета коэффициентов Хилла по натрию и калию, величи- на которых не зависит от свойств липидного окружения фермента. Таким образом, было постулировано, что АТФ является не только субстратом и источником энергии для транспорта ионов, но и модуля - Таблица 2.12. Коэффициенты Хилла для Na/K-АТФазы по субстратам и ионам-активаторам, измеренные в разных условиях Анализи- руемый лиганд Условия инкубации В области низких концентраций субстрата В области физиологиче- ских концентраций субстрата Обработка детергентом АТФ 0,8—0,9 3,4 1,1 ГТФ 1,0 1,0 — УТФ 1,0 1,0 — Na+ — 2,3 2,3 к+ — 1,2 1,3
214 газдел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ тором Na/K-насоса, способным выполнять еще какую-то функцию, не присущую другим макроергическим субстратам. В соответствии с этим графики Аррениуса, которые отражают наличие липидного конт- роля за работой мембранного фермента, резко различаются для АТФ и других нуклеотидов. Как иллюстрирует рисунок 2.39, на кривой тем- пературной зависимости гидролиза АТФ Na/K-АТФазой в координатах Аррениуса выявляется анаморфоза в той же температурной области, при которой наблюдается фазовый переход мембранных липидов. Более того, солюбилизация фермента и реконструкция в искусственное ли- пидное окружение меняют характер температурной зависимости та- ким образом, что происходит сдвиг температуры перехода в об- ласть, характерную для липида, применяемого для реконструкции (при реконструкции фермента в «жидкий» диолеилфосфатидилглице- рин (DOPG) перегиба на графике Аррениуса не наблюдается вообще). Согласно общепринятой точке зрения (Блюменфельд, 1977; Болдырев, Твердислов, 1978), анаморфоза на графике Аррениуса отражает чувст- вительность межбелковых взаимодействий к фазовым перестройкам мембранных липидов — до фазового перехода микровязкость липидов в большей степени ограничивает белок-белковые взаимодействия, чем при более высоких температурах, когда липиды оказываются упа- кованными более рыхло. Простое сравнение графиков Аррениуса для Na/K-АТФазы, гидро- лизующей АТФ или другие нуклеотиды (УТФ, ГТФ), обнаруживает су- ществование механизма, по которому АТФ выполняет свою роль регу- лятора фермента. Дело в том, что графики Аррениуса для других суб- Рис. 2.39. Температурная зависимость Na/K-АТФазы (а) и микровязкости мембранного окружения (б), измеренной с помощью мембранного зонда — про- изводного холестерина (спектр приведен сбоку, DH — соответствует измеряе- мому параметру порядка); в — графики Аррениуса для Na/K-АТФазы, реконст- руированной в различные фосфолипиды (DOPG, DMPG, DPPG, DSPG, PS). Видно, что характер температурной зависимости определяется свойствами липидного окружения фермента
>2.5. Ионные каналы и ионные насосы 215 стратов имеют линейную форму. Следовательно, можно предположить, что фермент, который при гидролизе АТФ выступает как олигомер, ис- пользуя другие субстраты, теряет способность к межбелковым контак- там. Другими словами, модифицирующее действие АТФ выражается в его способности организовывать молекулы Na/K-насоса в олигомер- ные ансамбли. Следует иметь в виду, что кинетическое поведение фер- мента может только свидетельствовать о его олигомерной природе. Со временем появились прямые доказательства того, что Na/K-АТФаза функционирует как олигомер. Одним из наиболее прямых физических методов, позволивших рассчитать молекулярные размеры функциональ- ной единицы, является метод «флаш-фотолиза» (в англоязычной лите- ратуре «Time-resolved phosphorescence decay»). Ковалентное мечение препарата Na/K-АТФазы флуоресцентными метками (например, эози- низотиоциатаном) позволяет измерить поляризацию флуоресценции метки после ее кратковременного возбуждения вспышкой лазера. Ха- рактер затухания сигнала показывает, сколькими экспоненциальными компонентами описывается измеряемая кривая, а скорость затухания по- зволяет рассчитать молекулярные размеры глобулы, к которой прикреп- лена метка. Метод имеет ряд ограничений (одним из них является нали- чие значительных различий между молекулярными размерами метящих- ся глобул с тем, чтобы можно было ответить на вопрос о количестве экспоненциальных компонент, которые вносят вклад в формирование кривой затухания сигнала). Соответствует успеху наличие достаточно быстродействующей системы измерения и возможности максимально быстрого начала измерения после окончания лазерной вспышки. Применение данного подхода к исследованию Са-насоса, а затем и Na/K-насоса, позволило установить, что в мембранных препаратах транспортныхАГФаз эозинизотиоцианатом метятся частицы трех сортов: сигнал от самых малоподвижных частиц пропадает после обработки препаратов детергентом. Этот сигнал принадлежит метке, «севшей» на крупные агрегаты: сигнал от наиболее быстрых частиц принадлежит метке, вращающейся вместе с цилиндром, соответствую- щим размеру протомера Na/K-насоса. Вращательная подвижность этой метки не зависит от присутствия лигандов. Средние по враща- тельной подвижности частицы соответствуют по крайней мере диме- рам, состоящим из двух протомеров (аР)2. Измерение вращательной подвижности этих частиц зависит от условий инкубации (табл. 2.13). Последнее обстоятельство позволяет предполагать, что в ходе гид- ролитического цикла интенсивность взаимодействия протомеров мо- жет изменяться таким образом, что на одних стадиях цикла взаимо- действия ослабевают, и протомеры работают как индивидуальные
216 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Таблица 2.13. Вращательная подвижность Na/K-АТФазы (по: Boldyrev, Quinn, 1994) pH Е2-Форма Е1-Форма Быстрая Медленная Быстрая Медленная 6,0 2,4 13,2 2,2 6,9 6,5 2,5 12,2 2,4 7,9 7,0 2,4 и.о 2,4 7,7 7,5 2,4 9,8 2,3 8,4 8,0 2,4 10,3 2,4 9,4 8,5 2,3 5,9 2,4 9,7 белки, на других же стадиях они могут объединяться в более высоко- молекулярные ансамбли. Возможно, именно это обстоятельство объ- ясняет различия в данных, полученных в разных лабораториях. Представляет интерес проследить, как было доказано это предположение и выяснен механизм модифицирующего влияния АТФ на мембранные преоб- разователи энергии. При сравнении структуры нуклеотидов (рис. 2.40) легко обнаружить, что АТФ (в отличие от других рассматриваемых соединений) имеет группу, способную протонироваться при физиологических значени- ях pH. Другими словами, присоединяясь к активному центру, АТФ может акцептировать протон от какой-либо подходящей группы фермента. Обнаружилось, что такой группой является имидазольное кольцо гисти- дина, локализованного недалеко от N-конца а-субъединицы, — отщепле- ние 13-членного фрагмента, содержащего гистидиновый остаток, лишает фермент способности воспринимать регулирующее действие АТФ. Таким образом, АТФ, в отличие от уже протонированных ГТФ, УТФ и ИТФ, по-ви- димому, способен делать то же самое, что делает защелачивание среды. Аденин, А Гуанин, G Цитозин, С Урацил, U Тимин, Т Рис. 2.40. Формулы нуклеотидов (пунктиром обозначена ионогенная группа)
2.5. Ионные каналы и ионные насосы 21 Исключением, казалось бы, является ЦТФ, также имеющий группу, способную к обратимому протонированию в физиологическом интервале pH. На самом деле ЦТФ только подтверждает сделанное заключение, по- скольку он проявляет схожие с АТФ регуляторные способности. Таким образом, можно утверждать, что присоединение АТФ к активно- му центру фермента, находящегося в конформации Е2, оттягивает протон от N 13-остатка гистидина и вызывает целую серию изменений в располо- жении водородных и солевых связей в протомере, приводящих в итоге к конформационному переходу Е2—Е1 (другими словами, к понижению сродства к калию и возрастанию сродства к натрию). В последнее время получены подтверждения этим представлениям. При инкубации фермента в среде с ионами натрия или калия были получе- ны двумерные кристаллы разной конфигурации. Использование их для рентгеноструктурного анализа позволило выявить, что натриевая (Е1) конформация кристаллизуется преимущественно в виде протомера, а ка- лиевая (Е2) — преимущественно в виде димера. Следовательно, индуцированный АТФ Е2—Е1-переход сопровожда- ется изменением размеров олигомерного комплекса (или количеством входящих в его состав протомеров). Вопрос о том, происходит ли это из- менение олигомерного состояния фермента и с какой стадией АТФазного цикла оно связано, был решен с помощью метода молекулярной мише- ни. Этот метод был предложен в 1968 г. Дж. Кепнером и Р. Мейси для оп- ределения молекулярной массы мембранных белков. Суть его заключает- ся в том, что мембранные препараты любой степени очистки подвергают облучению пучком нейтронов (обычно используется кобальтовая пушка) и далее измеряется зависимость остаточной активности от дозы облучения. Авторы метода вывели эмпирическую зависимость степени угнетения функции от дозы радиации: Мг = 6,4 • 105/D37, где Мг — молекулярная масса белка, кДа; D — доза радиации, снижаю- щая измеряемую активность до 37% от исходной величины. При помощи этого уравнения можно получить довольно точное значе- ние молекулярной массы белка, осуществляющего анализируемую функ- цию. Авторы проверили этот метод на недавно очищенной Е0-АТФазе ми- тохондрий. Позже его применяли для оценки размеров рианодинового ре- цептора. Ценность метода убывала по мере разработки методов очистки и выяснения первичной структуры мембранных белков. Применение этого подхода для оценки молекулярных размеров Na/K-АТФазы позволило выяснить, какова эффективная масса фермента, осуществляющего так называемые «частные реакции» общего цикла. Как видно из таблицы 2.14, молекулярный размер белка, выпол- няющего Na-АТФазную реакцию, соответствует массе ос-субъедини- цы. Такими же размерами характеризуется белок, осуществляющий К-зависимую фосфатазную реакцию. Весь Na/K-АТФазный цикл
218 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРГ 'ХИМИЯ Таблица 2.14. Молекулярные размеры Na/K-АТФазы на разных стадиях цикла (по: Болдырев, 1995) Частные реакции Условия измерения Молекулярная масса, кДа В Na-АТФаза Na+,Mg2+,ATO 95 К-фосфатаза К+, Mg2+, р-нитрофенилфосфат 90 Na/K-АТФаза 100 мкМ АТФ 135 Na/K-АТФаза 3 мМ АТФ 360 Na/K-АТФаза ЗмМ ГТФ 125 в присутствии низких концентраций АТФ (соответствующих области отрицательной кооперативности; см. рис. 2.37) осуществляется белком большего размера, сообразного массе ccp-протомера. Если концент- рацию АТФ увеличить до физиологических значений (3 мМ), размер функциональной единицы фермента существенно возрастет. Следова- тельно, в ходе гидролитического цикла размеры АТФазного ансамбля изменяются таким образом, что Na-зависимая АТФаза, Е1Р—Е2Р- переход и К-зависимая фосфатаза осуществляются каждой ос-субъ- единицей независимо. В завершении цикла принимает участие также р-субъединица, а при увеличении концентрации АТФ наступает крат- ковременная ассоциация ccp-протомеров в более крупные Е2-ассо- циаты, которые с большей легкостью способны превратиться в Е1; в этом и заключается причина стимулирующего действия АТФ: п(Е2)----> (Е2)п----> и(Е1). Как видно из примеров, в присутствии высоких концентраций АТФ-фермент работает с гораздо большей молекулярной активно- стью. В чем же заключается выигрыш от образования короткоживу- щих олигомеров в ходе осуществления гидролитического цикла? Этот выигрыш иллюстрирует рисунок 2.41. Суммарная реакция гидролиза АТФ является экзергонической. Но частные реакции цикла могут быть как экзергоническими, так и эндергоническими, т. е. протекать как с выделением, так и с поглощением тепла. «Заслуга» АТФ заклю- чается в организации работы олигомеров со сдвигом по фазе (синфаз- но): экзергоническая стадия одного протомера совпадает с эндергони- ческой стадией другого, происходит «подпитка энергией» соседних белковых структур. Ясно, что субстраты, не вызывающие образования олигомеров, гидролизуются Na/K-АТФазой с меньшей скоростью.
2.5. Ионные каналы и ионные насосы 219 Рис. 2.41. Изменение олигомерного состояния фермента в ходе АТФазного цикла (от мономерного через окта-, тетра- и димерные комплексы при пере- ходе от Е2КкЕ1№) Таким образом, Na/K-насос является системой, работа которой ре- гулируется субстратом и концентрацией переносимых ею ионов. С по- мощью этой регуляции Na/K-насос настраивается на текущие нужды клетки. Однако имеются и дополнительные способы регуляции, осу- ществляющие тонкую настройку его работы. Уже давно замечено, что некоторые препараты фермента содержат низкомолекулярный белок, очистка которого происходит параллельно с очисткой а-субъедин и цы. Он был назван у-субъединицей, но до по- следнего времени его роль в работе Na/K-насоса не была выявлена. Оказалось, что у-субъединица входит в число белков, для которых ха- рактерна последовательность аминокислот (F—X—Y—D), в честь которой их стали называть FXYD-белками. Молекулярная масса FXYD-белков составляет 8—15 кДа, они выполняют разнообразные регуляторные функции. В настоящее время описано около 10 таких мембранных белков, в их числе фосфоламбан, сарколипин, фосфоле- ман и у-субъединица Na/K-АТФазы. В клеточной мембране последняя взаимодействует только с Na/K-АТФазой, в результате чего сродство фермента к ионам натрия и калия снижается. Вне комплекса с фер- ментом у-субъединица нестабильна и быстро разрушается. Еще одна группа природных регуляторов Na/K-АТФазы — сердеч- ные гликозиды. Наиболее употребим уабаин — гликозид растительно- го происхождения, обладающий способностью при связывании «вы- ключать» молекулы Na/K-АТФазы. Исследователи широко исполь- зовали высокое сродство уабаина к ферменту для идентификации при- сутствия этого белка в препаратах и оценки специфической активности
220 (вздел 2. МОЛЕКУЛУ.- —.- НЕЙРОХИМИЯ В. Шонер Автор основополагающих работ в области молекуляр- ной нейрохимии, посвящен- ных исследованию олигомер- ной организации транспорт- ных АТФаз и их регуляции эндогенными уабаинподоб- ными соединениями (Гер- мания) Na/K-АТФазы, не задумываясь о причине такой чувствительности фермента живот- ного происхождения к соединению расти- тельной природы. Однако в дальнейшем были накоплены данные о том, что в тка- нях животных синтезируется эндогенное уабаинподобное соединение, выполняю- щее функции регулятора Na/K-АТФазы. Стационарный уровень этого соединения очень низок, и В. Шонеру (университет г. Гиссен, Германия) понадобилось не- сколько десятков килограммов надпочеч- ников крупного рогатого скота, чтобы вы- делить несколько миллиграммов препа- рата для его идентификации. Оказалось, что инкубация с уабаином вызывает всплеск образования АФК в миоцитах (Xie, Askari, 2002) и нейронах (Болдырев, 2000). АФК, в свою очередь, вызывают активацию факторов трансля- ции и экспрессию определенных белков. Таким образом, Na/K-насос оказывается вовлеченным во внутриклеточные сигнальные процессы (рис. 2.42). Этим, в частности, объясняется заметная гипертрофия сердечной мышцы у пациентов, вынужденных регулярно принимать сердечные гликозиды для компенсации кальциевой недостаточности. Подобная врачебная рекомендация основана на наличии в ряде клеток тесной связи между Na/K-АТФазой и Na/Ca-обменником, в том числе в ми- оцитах. При ингибировании Na/K-АТФазы сердечными гликозидами происходит накопление в миоцитах ионов Na, которые можно обменять на Са2+ внешней среды с помощью Na/Ca-обменника. Дополнитель- ным результатом приема гликозидов является повышение уровня АФК внутри клеток и активация синтеза клеточных белков. Обнаружение эндогенного уабаина и установление участия Na/K- насоса во внутриклеточной передаче сигналов вновь обратили внимание исследователей на тот факт, что разные ткани демонстрируют различ- ную чувствительность к сердечным гликозидам — сердечная мышца и нервные клетки характеризуются высоким к ним сродством, а почки — гораздо более низким. Причиной тому служит экспрессия различных изоформ фермента в разных тканях. Известно несколько изоформ как у а-, так и у р-субъединиц, экспрессируемых в разных тканях, причем из- бирательность их по отношению друг к другу не является абсолютной.
2.5. Ионные каналы и ионные насосы Рис. 2.42. Целесообразность работы Na-насоса в олигомерном состоянии. При работе олигомера со сдвигом по фазе эндергоническая стадия цикла на одном про- томере совпадает с экзергонической стадией цикла на другом протомере В почках и печени экспрессируется только al -изоформа, в клетках глии и скелетных мышцах — al и а2, а в нейронах зрелого мозга обнаружи- вается исключительно аЗ-изоформа (табл. 2.15). Таблица 2.15. Распространение изоформ Na/K-АТФазы в различных тканях Ткани а-Изоформы р-Изоформы al а2 аЗ а4 ₽1 ₽2 ₽3 Почки + + Тимус + + Легкие + + + Печень + + + С рдце + + + Скелетная мышца + + + + + Гипофиз + + + Семенники + + + Мозг + + + 4- +
222 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Биологический смысл экспрессии различных изоформ Na/K-насо- са в разных тканях заключается в различиях их чувствительности к ре- гуляторным факторам. Так, al - изоформа устойчива к окислению и од- новременно обладает низким сродством к уабаину по сравнению с дру- гими изоформами фермента, которые, напротив, легко окисляются активными формами кислорода; они характеризуются высокой чуст- вительностью к сердечным гликозидам. В миоцитах сердечной мышцы экспрессируются две изоформы а-субъединицы — al и а2, причем в ходе развития первая частично замещается второй. Поскольку эти частицы обладают различным сродством к уабаину, по характеру кри- вой ингибирования активности нарастающими концентрациями уаба- ина можно рассчитать долю присутствия разных изоформ АТФазы в исследуемых препаратах. Интересно, что после экспериментального инфаркта в сердце крыс наблюдается замена чувствительной к окис- лению изоформы al на более устойчивую к окислению изоформу а2, т. е. происходит возврат к экспрессии изоформ, присущих онтогенети- чески менее зрелым клеткам (рис. 2.43). Такой же результат был получен на мозге: после ишемического эпи- зода наблюдалось уменьшение доли аЗ-субъединицы и возрастание до- ли al-субъединицы. Поскольку первая субъединица экспрессируется преимущественно в нейронах, а вторая — в глии, наблюдаемые изме- нения, вероятно, отражают перестройку метаболизма поврежденных нейронов мозга, аналогичную той, что наблюдается в условиях окисли- Рис. 2.43. Смена изоформного состава Na-насоса при дифференцировке ми- оцитов сердца (а) и изменение формы кривой ингибирования Na-насоса уабаином после экспериментальной ишемии сердца взрослой крысы (б). В первом случае процесс дифференцировки сопровождается частичной заменой а2-субъ- единицы на al-субъединицу Na-насоса, во втором случае окислительный стресс при- водит к обратному процессу
2.5. Иоанне канали i* ионные насосы 223 тельного стресса в сердце. Смысл этих изменений становится понят- ным, если учесть, что al -субъединица резистентна не только к уабаину, но и к АФК. Одной из особенностей первичной структуры фермента яв- ляется более «замаскированное» расположение SH-групп в структуре белка (кроме того, al-субъединица имеет на одну SH-группу меньше, чем а2-субъединица). Таким образом, можно заключить, что преимуще- ственное замещение менее резистентной к окислительному поврежде- нию изоформы на более к нему резистентную является естественным ответом ткани на окислительный стресс. Однако возникает вопрос о том, что теряет ткань, лишаясь АФК-чувствительной изоформы, ведь одновременно она является и уабаинчувствительной. Индукция окислительного стресса в нейронах за счет инкубации с NMDA приводит к избыточной продукции АФК, которые атакуют кле- точные макромолекулы. Одной из главных мишеней для АФК в нейро- не является Na/K-АТФаза, причем ее уабаинчувствительная форма. Таким образом, в нейроне а2-субъединица представляет собой ми- шень для АФК. Одновременно в активном состоянии Na/K-АТФаза препятствует росту свободных радикалов. Следовательно, Na/K- АТФаза выступает в качестве фактора окислительной устойчивости нейрональной клетки, ее протектора от окислительного стресса. В от- сутствие подобного протектора нейроны не способны использовать АФК в качестве сигнальных молекул (см. рис. 2.42). Не так давно (2005) в лаборатории Дж. Лингрела в США получены изящные доказательства участия уабаинчувствительной АТФазы в осуществлении еще одной функции организма. Известно, что один из существенных участков первичной структуры а-субъединицы, опреде- ляющий сродство к уабаину, представлен двумя аминокислотными ос- татками у N-конца — L111 и N122. С помощью генно-инженерных подходов были получены мыши, содержащие замены в этих аминокис- лотах: LI 11R и N122D. Они не отличались от нормальных животных по длительности жизни и показателям сердечно-сосудистой системы в нормальных условиях, хотя Na/K-АТФаза в их почках обладала высо- ким сродством к уабаину. Введение этим мышам АКТГ, индуцирующе- го выделение из надпочечников эндогенного уабаинподобного соеди- нения, повышало кровяное давление таким же образом, как и у конт- рольных животных. Однако линия мышей, у которых в дополнение к вышеуказанной замене а2-субъединица утрачивала высокое сродство к уабаину, теряла способность отвечать адекватным повышением кро- вяного давления на введение АКТЕ Уабаинподобный фактор выделял- ся в кровь, но не находил своей мишени. Это указывает на то, что тка- невая специфичность чувствительности Na/K-АТФазы к уабаину име- ет прямое отношение к процессу регуляции тонуса сосудов.
224 Раздел 2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОХИМИЯ Изложенные данные иллюстрируют участие Na/K-насоса не толь- ко в создании асимметричного распределения ионов по обе стороны клеточной мембраны, но и в процессе восприятия клеткой различных сигналов и передаче их в ее внутреннее пространство. Трансмембранные транспортеры и обменники. Вторичноак- тивный транспорт. Как уже отмечалось, при вторичноактивном транс- порте в качестве движущей силы используется ранее накопленный гра- диент ионов натрия. Наиболее наглядным примером вторичноактивно- го транспорта является Na-зависимый транспорт в клетку аминокислот и сахаров. Этот весьма важный процесс снабжает метаболические процессы клетки необходимыми субстратами. Для нейрохимических процессов наиболее существенным является вторичноактивный транс- порт ионов и медиаторов. Поэтому далее будет рассмотрен транспорт глутамата, Na/Ca-обмен и вторичноактивный транспорт хлора. Регуляция процессов возбуждения осуществляется при условии до- статочно быстрого устранения после генерации возбуждения из межси- наптической щели молекул медиатора. В холинергической системе это осуществляется благодаря наличию специфической и высокоактивной АХ-гидролазы — ацетилхолинэстеразы (А¥Э), ответственной за уст- ранение данного медиатора. АХЭ локализована в материале межсинап- тической щели, и выделение АХ при возбуждении активирует его взаи- модействие одновременно с двумя белками — ХР и АХЭ. Затратный ме- ханизм обмена АХ, по-видимому, оправдывает себя, так как расход энергии о