- С —*| F  Г Ч
о клеточном
цикле
lifflHJlditfh’iitt
МОСКВА 1997
Российский Фонд Фундаментальных Исследований
О. И. ЕПИФАНОВА
ЛЕКЦИИ
О
КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ
КМК Scientific Press
1997
О.И.Епифанова. «Лекции о клеточном цикле»
Содержание книги, которая написана на основе курса лекций, прочи-
танных автором в течение последних нескольких лет на кафедре цитологии
МГУ, сводится к исследованию закономерностей размножения клеток —
одной из фундаментальных и постоянно волнующих человечество облас-
тей биологии.
Многолетний опыт автора по изучению клеточной пролиферации
позволил подойти к решению поставленной задачи па концептуальной, а
нс па дидактической основе Вместе с тем в книге обобщены многочислен-
ные данные о механизмах регуляции клеточного никла, включая послед-
ние открытия ключевых регуляторных молекул, обеспечивающих репро-
дукцию клеток. Книга содержит информацию об особенностях регуляции
клеточного цикла в эмбриогенезе, при специализации клеток, старении,
апоптозе и неопластической трансформации Она предназначена для
студентов старших курсов — биологов и медиков, а также для широкого
круга специалистов — цитологов, гистологов, эмбриологов, геронтологов,
онкологов и молекулярных биологов.
0.1. Epifanova. «Lectures on the cell cycle»
The object of this book, originally delivered as a series of lectures at the
Moscow State University, is to provide an insight into the fundamental and
intriguing area of cell reproduction. The author spent most of her scientific life
experimenting with animal cells, and her approach to the problem is conceptual
rather than didactic. The book summarizes current data on cell cycle regulation
including recent discoveries of the key rcgulatiory molecules. It gives sufficient
information on this topic encompassing a broad spectrum of adjacent fields such
as embryology, cell specialization, gerontology, the apoptotic state and cancer .
The book can be recommended to advanced students of biological and medical
institutes and also to scientists engaged or interested in the problem of cell
multiplication.
Научный редактор д.б.н. E.C. Надеждина
Издание осуществлено при поддержке Российского фонда фундаментальных
исследований по проекту № 95- 04-62-189
ISBN 5—87317—047—9	© - О И. Епифанова, 1997
60971 ^ © - оформление «КМК, Ltd.», 1997
SUMMARY
There are some biological problems of basic importance. One is
how cells reproduce themselves and the manner in which these
processes are driven. Another point is no less intriguing . Why do cells
sometimes stop multiplying, what forces prevent them from self-
reproduction and how do they regain the ability to proceed through
the cell cycle? The understanding of mechanisms controlling cell
proliferation is crucial for such fundamental problems as cell special-
ization in development, regeneration of tissues and organs, ageing and
cancer. In an exciting recent development, the similarity of cell
growth control mechanisms in all eukaryotes have been discovered.
It is now recognized that the regulatory processes and molecules
involved in cell cycle progression exhibit a high degree of evolutionary
conservation.
It is known that eukaryotic cells are endowed with the ability to
cease proliferation and withdraw from the cell cycle into a resting, or
quiescent state for an indefinite time. The resting cells retain their full
proliferative potential and may re-enter the cell cycle under appropriate
conditions. Our earlier studies formed a basis for an original concept
on proliferative rest as a specific and discrete physiological state of a cell
maintained by active metabolic reactions essential for its survival in the
absence of reproduction. Control over cell growth in higher eukaryotes
is achieved predominantly by regular transition of cells from prolifer-
ation to rest and vice versa as a result of co-ordinated inter-relationships
between extracellular stimulators (mitogens) and intracellular inhibi-
tors. The book has been designed within the framework of this concept
and encompasses an annual course on the cell cycle at the Moscow
State University. It puts the problem of cell cycle regulation in a special
perspective; parts of the book are unique.
Chapters I-III give a brief history of the topic, including the
discovery of mitosis, the cell cycle and the resting states by means of
cell kinetic analysis and biochemistry; examples showing the wide
occurrence of cellular rest in living nature are given. The discussion
is mostly limited to mammalian cells with only occasional references,
in special cases, to lower forms. In Chapter IV data are presented
describing the selective activation of certain metabolic processes in
resting cells and the acquisition of a new protein pattern. The
classification of active processes is given, and their biological signif-
icance outlined.
3
Chapters V and VI contain necessary information on extracellular
growth factors, transduction of the mitogenic signal into the cell and
expression of growth response genes, including proto-oncogenes. In
Chapter VII a substantial place is allotted to the properties of
intracellular growth inhibitors (such as polypeptides secreted by
resting cells, the products of growth arrest-specific genes and short-
hvied repressor proteins) and their interaction with extracellular
growth stimulators reflecting a complex network of negative and
positive feedback loops.
Chapter VIII presents novel data on the molecular mechanisms
that drive the cell cycle during early embryogenesis. The participation
of cyclins and cyclin-dependent kinases in cell cycle regulation is
discussed at length. The appearance of resting states in the develop-
ment of a multicellular organism is considered as a necessary pre-
requisite for cell differentiation.
Chapter IX reveals the peculiarities of cell cycle and proliferative
rest in functionally specialized cell populations and in the course of
senescence and apoptosis. Chapter X contains data on the disruption
of mechanisms controlling the transition of cells between proliferative
rest and cell cycle progression during neoplastic transformation.
These derangements can be overridden by the active involvement of
multiple endogenous cell growth inhibitors including tumour sup-
pressor genes (pRB, p53) and the recently discovered cyclin-
dependent kinase inhibitors.
Ordered cell cycle progression appears to be orchestrated by a
conserved intrinsic protein engine where positive key regulators, such
as cyclins and cyclin-dependent kinases, act in concert with negative
factors. This engine integrates extracellular and intracellular signals
and triggers crucial transitions during the cell cycle.
4
СОДЕРЖАНИЕ
Вместо предисловия.............................................8
Глава 1. Деление клетки и понятие о клеточном цикле...........10
Предмет изучения...........................................10
Биологический смысл деления клеток.........................11
История открытия митоза....................................12
Организация митоза.........................................14
Специфические черты митоза как биологического процесса ....15
Представление о митотическом (клеточном) цикле
и его периодах.............................................16
Глава II. Клеточный цикл и кинетика клеточных популяций ......20
Метод радиоавтографии в изучении клеточного цикла..........20
Основные приемы радиоавтографичсского анализа клеточного
цикла......................................................21
Общие закономерности прохождения клеточного цикла
и его периодов.............................................25
Глава III. Клеточный цикл и состояние пролиферативного покоя .28
Открытие фазы Gc (фазы «вне	цикла») .......................28
Выявление клеток в периоде G, методами клеточной кинетики ....31
Способность клеток выходить из цикла в периоде G,..........33
Представление о состоянии пролиферативного покоя...........34
Экспериментальные системы для изучения покоящихся клеток ....36
Критика представлений о клеточном цикле и состоянии
пролиферативного покоя.....................................38
Особенности вступления покоящихся клеток в митотический
цикл ......................................................39
Значение периодов пролиферативного покоя для
функционирования различных биологических систем............41
Глава IV. Пролиферативный покой — особое физиологическое
состояние клетки .............................................44
Экспериментальные предпосылки изучения метаболизма
покоящихся клеток......................................... 44
Структура клеточной поверхности и транспортная функция
наружной мембраны..........................................44
Структура и функции хроматина..............................46
Синтез макромолекул........................................47
Обновленке макромолекул....................................48
Появление в покоящихся клетках новых белков................49
Активность ферментов анаболизма и катаболизма..............50
Пролиферативный покой — активное метаболическое
состояние клетки ..........................................51
Биологический смысл избирательной активации метаболических
процессов в состоянии пролиферативного покоя...............55
5
Глава V. Регуляция клеточного цикла. Внеклеточные (экзогенные)
регуляторы ..................................................58
Общие принципы регулирования в живых системах.............58
Понятие об экзогенных и эндогенных факторах регуляции.....62
Факторы роста и их участие в регуляции клеточного цикла...63
Фактор роста из тромбоцитов (PDGF)....................... 65
Эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста
фибробластов (FGF) и инсулиноподобные факторы роста (IGF). . 67
Трансформирующие факторы роста (TGF)......................68
Интерлейкины (1L) и факторы, стимулирующие рост клеточных
колоний (CSF).............................................69
Глава VI. Передача внеклеточных митогенных сигналов в ядро...72
Рецепторы факторов роста. Мембранные белки и вторичные
посредники ...............................................72
MAP-киназы и каскад	их фосфорилирования.................. 75
Гены пролиферативного ответа.	Протоонкогены...............76
Глава VII. Внутриклеточные (эндогенные) регуляторы
клеточного цикла............................................ 83
Пересмотр представлений о клеточном цикле и состоянии
пролиферативного покоя....................................83
Универсальная модель размножения клеток...................84
Изучение эндогенной регуляции размножения клеток методом
клеточной гибридизации....................................86
Короткоживущие белки — репрессоры	пролиферации клеток.....91
Ингибиторы пролиферации, вырабатываемые покоящимися
клетками в культуре.......................................94
Гены gas- , специфичные для состояния пролиферативного покоя,
и продукты их активности................................. 95
Взаимодействие эндогенных и экзогенных факторов врегуляции
клеточного цикла..........................................96
Глава VIII. Становление клеточного цикла в процессе
индивидуального развития и молекулярно-генетический контроль
размножения клеток ..........................................99
Клеточные циклы в раннем эмбриогенезе и при специализации
клеток....................................................99
Регуляция клеточного цикла в эмбриогенезе и гипотеза
автономного осциллятора................................. 100
Общность регуляторных механизмов размножения всех
эукариотических клеток — крупнейшее открытие современной
биологии.................................................102
Взаимодействие p34"wn циклинов при вступлении клетки
в митоз................................................. 105
Роль циклинов и зависимых от них протеинкиназ (CDKs)
в регуляции переходов Gp/G, и G/S........................109
6
Глава IX. Регуляция клеточного цикла в специализированных,
стареющих и неопластически трансформированных популяциях
клеток...................................................... ИЗ
Пролиферативный ответ клеток на действие митогенов
в функционально специализированных популяциях........... 113
Углубление специализированных клеток в состояние
пролиферативного покоя.................................. 114
Особенности пролиферации стареющих	клеток......... 117
Апоптоз................................................. 120
Особенности клеточной пролиферации в опухолях
и неопластически трансформированных	культурах клеток ... 121
Глава X. Нарушение регуляции клеточного цикла при
неопластической трансформации клеток и внутриклеточные
факторы, сдерживающие этот процесс ......................   126
Изменения в передаче митогенного сигнала в ядро при
неопластической трансформации клеток.................... 126
Экспрессия протоопкогенов при неопластической
трансформации клеток.................................... 130
Нарушения в системе эндогенной регуляции размножения
клеток при неопластической трансформации и возможность
биологической коррекции.......... ....................   132
Гены-супрессоры опухолей (антионкогены) и продукты
их активности........................................... 133
Ингибиторы циклин-зависимых	киназ	(CKIs)............  136
Общие принципы регуляции клеточного	цикла......... 140
7
Вместо предисловия
Эта книга задумана и написана как курс лекций, которые
содержат и вводную часть, и заключение. Она вряд ли нуждается
в специальном предисловии
Однако было бы несправедливо не сказать слова признатель-
ности тем. кто на протяжении долгих лет вместе со мной думал
над загадками клеточного цикла и искал ответы в бесчисленных
опытах. При подготовке лекций я опиралась на предыдущие
книги и статьи, многие из которых написаны в соавторстве с
коллегами и друзьями. Мои лекции никогда не были бы
прочитаны, если бы затронутые в них вопросы не обсуждались
в семинаре по клеточной пролиферации, регулярно проходив-
шем в Институте молекулярной биоло! ии. Всем моим соавторам
и участникам семинара я приношу глубокую благодарность.
Хотелось бы назвать их поименно, но список получился бы
непомерно длинным.
Мои долг — вспомнить своих учителей. Михаил Михайло-
вич Завадовский — такая крупная и яркая фигура в биологии,
что, казалось бы, о нем все сказано и написано. И все же я хотела
бы добавить несколько слов. Только ему я обязана тем, что стала
биологом. Читая еще в школе его книги о превращении пола и
других не менее фантастических замыслах, я испытывала под-
линный восторг. Поступая в университет, я мысленно поступала
к Завадовскому. На руководимой им кафедре динамики разви-
тия организма было много молодых профессоров, и царила
атмосфера иронической доброжелательности, позволявшая на-
чинающим исследователям чувствовать себя свободно и уверен-
но. Завадовский был настоящим учителем. Он обладал бесцен-
ным даром умения слушать собеседника, не пытаясь его пере-
убедить. Разговаривать с ним было просто и интересно.
Среди учеников Завадовского выделялся Леонид Яковлевич
Бляхер. Именно он развил во мне потребность бережно и строго
относиться к научным терминам и понятиям, чувствовать ответ-
ственность за каждое написанное слово.
С благодарностью вспоминаю также гистолога Всеволода
Николаевича Доброхотова, у которого уже позднее мы проходи-
ли суровую школу того, что в наше время называлось «считать
митозы». Тот, кто обучился этому у Доброхотова, moi распоз-
8
нать в световом микроскопе любую фазу митоза даже по
фрагменту хромосом ы.
Низкий поклон этим ученым.
Возвращаясь к написанной мною книге, хочу выразить
искреннюю признательность сотрудникам кафедры цитологии
МГУ во главе с Ю.С. Ченцовым за организацию и помощь в
проведении лекций, а также всем тем, кто помогал мне при
написании и оформлении книги.
9
ГЛАВА I. ДЕЛЕНИЕ КЛЕТКИ И ПОНЯТИЕ
О КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ
Предмет изучения
Предлагаемая книга содержит материалы курса лекций «Кле-
точный цикл», которые были прочитаны в 1990-1996 гг. на
кафедре цитологии биологического факультета МГУ. Что такое
клеточный цикл? Разумеется это не самостоятельная научная
дисциплина и не конкретная область знания. Правильнее всего
будет сказать, что в контексте данной книги понятие «клеточ-
ный цикл» включает в себя систему представлений о том, что
побуждает клетки к самовоспроизведению и как осуществляет-
ся контроль этого процесса в организме.
По ходу изложения будут раскрыты эти явления и просле-
жена вся история развития учения о клеточном цикле, от его
первоначального описания до наших дней. История эта изоби-
ловала драматическими событиями, и даже само существова-
ние клеточного цикла еще сравнительно недавно ставилось
под сомнение. Тем более замечательно, что сейчас наметился
в буквальном смысле слова прорыв наших знаний в этой
области, когда удалось установить общность молекулярных
механизмов размножения клеток у всех эукариотов — от
дрожжей до человека, и теперь известно, какие это молекулы
и как они взаимодействуют. Нам предстоит оценить современ-
ное состояние вопроса и наметить основные направления его
изучения.
Случилось так, что мне и тем, кто трудился со мной на
протяжении более чем тридцати лет, довелось непосредственно
участвовать в развитии тех или иных положений о клеточном
цикле. Мы изучали клеточный цикл прежде всего как экспери-
ментаторы, и, хотя в процессе исследований нами было разра-
ботано немало методических приемов, их описание не войдет в
настоящий курс. Этим методам посвящены специальные руко-
водства, где каждый может почерпнуть необходимые сведения.
Не будут рассматриваться детально также и многие принци-
пиально важные проблемы клеточной биологии, связанные с
прохождением клетками цикла, но имеющие самостоятельное
значение (такие, как механизмы митоза, участие в этом процес-
се различных клеточных компонентов, механизм инициации
10
синтеза и редупликации ДНК и др.). Каждый из этих вопросов
может служить предметом отдельного курса.
Основная цель книги, как уже было отмечено, — попытаться
проанализировать, что именно заставляет клетки делиться и как
регулируется этот процесс. Но не менее важна и другая сторона
вопроса: почему клетки иногда прекращают на длительное
время свое размножение, какие силы удерживают их в этом
состоянии и что служит причиной их возврата к пролиферации9
Понимание этих процессов совершенно необходимо для про-
никновения в такие фундаментальные направления биологии,
как дифференцировка клеток, их нормальное функционирова-
ние, старение, гибель и злокачественное перерождение. Эти
проблемы также явятся предметом рассмотрения в предстоящих
лекциях. Таким образом, в центре внимания будут, главным
образом, общие принципы регуляции размножения клеток в
живой природе, хотя речь пойдет преимущественно о животных
клетках.
В учение о клеточном цикле внесли свой вклад многие
замечательные исследователи. О тех, кого уже нет в живых,
будет рассказано подробнее. Учение это, как мы увидим,
необычайно динамично, оно все время находится в процессе
формирования, и то, что было открытием вчера, сегодня уже
становится историей. Поскольку это история продолжающихся
открытий, изложение будет носить в основном хронологичес-
кий характер.
Мы начнем с изложения некоторых вопросов биологии
клеточного деления, истории открытия клеточного цикла и
подходов к его изучению.
Биологический смысл деления клеток
Пожалуй, с наибольшим лаконизмом охарактеризовал сущ-
ность процесса клеточного деления современник этого откры-
тия Эдмунд Вильсон, сказавший, что «от клеточного деления
зависят не только явления наследственности, но и сама непре-
рывность жизни». При этом он несомненно развивал известный
принцип Вирхова о непрерывности развития клеток при помо-
щи деления. Несмотря на колоссальный прогресс знаний в
области цитологии и генетики, к этому положению мало что
можно добавить, и биологи последующих поколений обычно
лишь перефразировали формулировку Вильсона.
11
Образно выражаясь, деление обеспечивает «биологическое
бессмертие» клеток путем непрерывного обновления цитоплаз-
мы. Поддержание жизни клетки требует в свою очередь полного
и безошибочного воспроизведения ее организации, то есть всех
структур и прежде всего генетического материала, заключенно-
го в ядре. Равномерное же распределение наследственного
материала между двумя дочерними (сестринскими) клетками
обеспечивается митозом, представляющим собой сложный про-
цесс структурных преобразований и перемещений внутрикле-
точных компонентов, завершающийся делением клетки.
История открытия митоза
Как нередко бывает с великими открытиями, истинный
смысл клеточного деления был постигнут лишь много лет
спустя после того, как это явление впервые описали француз-
ские ученые Прево и Дюма, наблюдавшие дробление яиц у
животных. Их исследование было опубликовано в 1824 году в
трех выпусках трудов по изучению естественных наук. В то
время во Франции научные работы печатались в журналах как
романы, с ремаркой «продолжение следует». Удивительное
ощущение возникает, когда держишь в руках эти маленькие
томики в сафьяновых или атласных переплетах, так непохожие
на современные периодические издания и скорее напоминаю-
щие поэтические сборники.
Прево и Дюма описали процесс деления клеток с большой
точностью, и не их вина в том, что открытие митоза не было по
достоинству оценено современниками. Историки естествозна-
ния обычно упрекают в этом авторов клеточной теории Шлей-
дена и Шванна (1838-1839), допускавших свободное образова-
ние клеток из окружающей их плазмы (бластемы). Как же могло
случиться, что два крупнейших микроскописта и естествоиспы-
тателя своего времени, создавшие теорию, не менее значимую
для биологии, чем эволюционное учение Дарвина, пришли к
столь ошибочному заключению?
Здесь следует немного подробнее остановиться наличности
Шлейдена. В противоположность Шванну, который отличался
уравновешенным характером и был настолько осторожен в
своих высказываниях, что на каждую публикацию испрашивал
разрешения епископа, Шлейден, напротив, снискал репутацию
человека сумасбродного и необузданного, с непредсказуемым
12
поведением. Будучи успешно практикующим адвокатом, он
неожиданно разочаровался в выбранной профессии и в состо-
янии тяжелой депрессии пытался пустить себе пулю в лоб, лишь
по счастливой случайности отделавшись шрамом. Выздоровев,
он обратился сначала к медицине, а затем к ботанике и,
проучившись в обшей сложности еще тринадцать лет, был
наконец аттестован как биолог. Таким образом, к началу работы
над клеткой Шлейдену исполнилось уже тридцать пять лет.
Однако это нисколько не отразилось на его темпераменте.
Именно «неистовыйтевтон», какокрестили Шлейдена коллеги,
был постоянным возмутителем спокойствия для Шванна, по-
буждая его к решению задач, порождаемых своей безудержной
фантазией. К сожалению, будучи тщательным и объективным
наблюдателем, Шлейден допускал порой слишком вольную
интерпретацию описываемых фактов, что и привело, в частно-
сти, к ошибочному взгляду на возникновение клеток из бласте-
мы, окружающей ядро, которое, в свою очередь, формируется,
якобы, вокруг ядрышка Авторитет создателей клеточной тео-
рии был так велик, что немедленно нашлись исследователи,
«подтвердившие» это наблюдение, и результаты опытов Прево
и Дюма подверглись забвению. Впрочем Шлейден всего лишь
десять с небольшим лет был занят всерьез изучением клетки.
Увлекшись в 1848 году революционными событиями во Фран-
ции, он надолго оставил всякую научную деятельность, а
последние годы жизни посвятил преподаванию антропологии и
написанию лирических эссе (подробнее о Шлейдене и Шванне
см. Franke, 1988)
Так или иначе, открытие митоза отделяет от опытов Прево
и Дюма целое пятидесятилетие. Во второй половине семидеся-
тых годов прошлого столетия последовала серия классических
работ Страсбургера и его учеников, описавших отдельные фазы
деления клетки; Флемминга, открывшего различные типы деле-
ния ядра; Вальдейера, охарактеризовавшего хромосомы, и дру-
гих исследователей.
Термин «митоз» (от греческого щтос — нить) принадлежит
Флеммингу. Это слово прочно вошло в научную литературу,
вытеснив введенный ранее Шлейхером термин кариокинез (от
греческих xccpbov — орех и х^рок — движение). В настоящее
время общепризнано, что митоз является самым древним спо-
собом клеточного размножения, а все остальные формы деле-
13
ния возникли в процессе эволюции как его регуляционные или
патологические изменения. В основе этого взгляда лежит пред-
ставление о митозе как наиболее логичном способе равномер-
ного распределения наследственного материала между дочер-
ними клетками.
Организация митоза
Для равномерного распределения наследственного материа-
ла между дочерними клетками необходима его предварительная
упаковка в небольшое число структурных единиц — хромосом
(название подразумевает способность хромосом интенсивно
окрашиваться гистологическими красителями; термин принад-
лежит Вальдейеру). В хромосомах, число которых постоянно
для каждого вида животных, находятся материальные носители
наследственности — гены.
Каждая хромосома состоит из двух нитей — хроматид,
несущих идентичный генетический материал. На протяжении
митоза происходит продольное расщепление хромосом и со-
ставляющих их единиц с последующим расхождением хроматид
к полюсам клетки. Именно эти два события обеспечивают
равномерное распределение наследственного материала между
дочерними клетками, иначе говоря их самовоспроизведение.
Для перемещения хромосом в клетке нужен механизм, осуще-
ствляющий временную и пространственную хореографию кле-
точных компонентов. Поэтому весь процесс митоза логически
разделяется на две части:
(А) Формирование такого механизма. Это ахроматиновый аппа-
рат, состоящий из центриолей и микротрубочек веретена, с которы-
ми хромосомы соединены при помощи кинетохоров. Совокупность
Рис. 1. Метафаза растительной клетки.
ахроматинового аппа-
рата и хромосом на-
зывают митотическим
аппаратом.
(Б) Перемещение
хромосом к полюсам.
Кульминацией
митоза является ме-
тафаза, когда мито-
тический аппарат
полностью сформи-
14
рован, и хромосомы располагают-
ся в экваториальной плоскости
веретена (рис. 1 и рис. 2-3). Как
предлагает Мэзия (1963), отсюда
следует «оглянуться назад и по-
смотреть вперед»
При этом можно выделить глав-
ные группы событий (рис. 2):
Профаза — разделение хромо-
сом на хроматиды и образование
веретена. Прометафаза — расхож-
дение центриолей к полюсам и
начало перемещения хромосом
(мета кинез). Анафаза — движение
хромосом к полюсам и телофаза —
деление клетки.
Поскольку митоз представля-
ет собой единый и непрерывный
процесс, границы между отдель-
ными его этапами не всегда могут
быть четко выявлены. Кроме того,
у разных биологических объектов
детали митоза иногда существен-
но варьируют. Однако эти разли-
чия касаются в основном второ-
степенных признаков, а генерал ь-
Рис. 2. Общая схема митоза у
многоклеточного животного (по
Грелю): 1 — профаза, 2 — промета-
фаза, 3 — метафаза, 4 — анафаза,
5 — телофаза
ный план митоза остается общим для всех видов.
Специфические черты митоза как биологического процесса
Митозу присущи все особенности, которые философы назы-
вают «атрибутами живого».
Это, в первую очередь, как подчеркивает В.А. Энгельгардт
(1960), проявление «единства во множестве, или тождества в
многообразии», когда, как уже было сказано, у эукариотов
сходен нс только конечный эффект (деление клетки), но и
составляющие его ступени (фазы). Второй специфической чер-
той митоза как биологического процесса следует считать нали-
чие явлений авторегуляции, когда возможное отклонение от
нормальной функции само по себе служит стимулом к ее
восстановлению (подробнее об этом см. в главе V). И, наконец,
15
митоз, как и многие важнейшие биологические процессы,
отличает цикличность протекания, что послужило основанием
для возникновения понятия о митотическим цикле.
Представление о митотическом (клеточном) цикле
и его периодах
Понятие о митотическом цикле существовало уже давно,
однако точное определение его отсутствовало. Поскольку основ-
ным объектом изучения митотического деления клеток обычно
служили синхронно дробящиеся яйца животных с быстро проте-
кающими митозами, где вслед за телофазой почти сразу же
начинается профаза, митотический цикл нередко отождествляли
с самим митозом. Лишь позднее появился термин «интерфаза»,
обозначавший подготовительный период к делению в целом.
При этом митоз противопоставлялся интерфазе как активное
состояние клетки пассивному, о чем свидетельствует и первона-
чальное название интерфазы — «интеркинез».
Первая успешная попытка расчленить интерфазу принадле-
жит Говард и Пелку (Howard, Pelc, 1953), показавшим методом
радиоавтографии (см. следующую главу), что включение радио-
активного фосфора (32Р) в ДНК клеток корня конского боба
Vicia faba происходит только в интерфазс, заканчиваясь за
определенное время до начала митоза.
Авторы выдерживали корешки в среде, содержавшей 32Р, в
течение I часа, а затем переносили в среду с нсрадиоактивным
фосфором и фиксировали через каждый час (рис. 3). Для
удаления меченой РНК препараты обрабатывали рибонуклеа-
зой. Первые меченые митозы (профазы) можно было обнару-
жить на радиоавтографах только через 8 час. после начала
контакта клеток с радиоактивным фосфором, из чего был
сделан вывод о прекращении синтеза ДНК за 8 час. до начала
митоза.
Через 6 час. после появления первых меченых митозов снова
начинали преобладать немеченые митозы, что свидетельствова-
ло о локализации синтеза ДНК в течение определенного пери-
ода интерфазы, равного 6 час. Авторам удалось проследить
появление второго максимума меченых митозов — через 30 час.
после первого. Это позволило предположить, что весь митоти-
ческий цикл клеток корня, включая митоз и интерфазу, продол-
жается 30 час. Поскольку было известно, что митоз в клетках
16
Нерадиактивный фосфор + РНКаза
Время после введения радиактивного индикатора
g2 S	S
Рис. 3. Схема опытов Говард и Пелка по выявлению периодов
митотического цикла в клетках корневой меристемы К faba (объясне-
ния в тексте). G2, S — периоды цикла, Т — продолжительность цикла.
корня V. faba длится около 4 час., а суммарная продолжитель-
ность репликации ДНК и отрезка времени, предшествующего
митозу, составляла, по данным Говард и Пелка, 14 час., авторы
пришли к заключению о наличии
одного периода, продолжитель-
ность которого равна 12 час. Они
предложили разбить митотичес-
кий цикл на четыре периода, или
фазы: собственно деление клетки
(митоз), прссинтетичсский пери-
од G( (от англ, gap — интервал)
период синтеза ДНК (S) и преми-
тотический период G, (рис. 4)
Разработанный ими прием опре-
деления временных параметров
в митотическом цикле еще
Рис. 4. Изображение мито-
тического (клеточного) цикла,
принятое после открытия Го-
вард и Пелка. М (митоз), G,, S,
G, — периоды цикла.
митотического цикла, получив-
ший название «отсчет вспять»
(count clown), впоследствии лег в
основу создания метола меченых
митозов.
609715
Чувашский
гос.
Г'* 8	-Г*	-	 "Г Г ’ Г Л
ЫИ - Л'. 1 длдА
17
Несмотря на технические несовершенства, значение работ
Говард и Пелка трудно переоценить. Ими была установлена
дискретность репликации ДНК в митотическом цикле, опроки-
нуто представление об инертности клетки в интерфазе и тем
самым открыт путь к широкому экспериментальному изучению
происходящих в ней событий.
Здесь уместно сказать несколько слов об авторах этого
открытия. Альма Говард родилась в Монреале, окончила с
отличием университет Макгилла по кафедре генетики и была
награждена медалью за диссертационную работу о роли хромо-
сомных изменений в развитии рака молочной железы у мышей.
Выйдя в 1939 году замуж за англичанина ирландского проис-
хождения, она продолжила работу в радиобиологическом отде-
ле Хаммерсмитовского госпиталя в Манчестере, где и познако-
милась со Стивеном Полком (Штефаном Пельцем), эмигриро-
вавшим во время войны из Чехословакии в Англию. Пелк в то
время был занят изучением функции щитовидной железы с
помощью радиоактивного йода. Говард предложилг! Пелку со-
вместно исследовать включение радиоактивного фосфора в
ДНК делящихся клеток мыши, однако проект оказался слиш-
ком дорогостоящим, и пришлось проводить опыты на корневой
меристеме фасоли. Так состоялось открытие клеточного цикла.
Можно лишь добавить, что оба автора этого удивительного
исследования были в высшей степени мужественными людьми.
Овдовев в 1947 году и оставшись одна с двумя детьми, Говард
вынуждена была буквально бороться за жизнь в тяжелые после-
военные годы. А Пелк, ютившийся в крошечной захламленной
лаборатории, по вечерам подрабатывал в качестве скрипача в
местном оркестре. По свидетельству коллег, он был хорошим
п рофесс и онал ьн ы м музы кантом.
Открытие Говард и Пелка в полной мере можно отнести к
категории парадигм, которые автор этого понятия Теодор Кун
определяет как «признаваемое научным сообществом дости-
жение, служащее в течение определенного времени основой
для его деятельности», иначе говоря, позволяющее ставить и
решать научные задачи. Парадигма отвечает двум требовани-
ям. Она должна быть беспрецедентной (чтобы отсутствовали
конкурирующие модели) и открытой (чтобы новые поколения
исследователей могли находить в ее рамках нерешенные про-
блемы).
18
Беспрецедентность открытия Говард и Пелка состоит в том,
что они сместили акцент с изучаемого события как такового
(репликация ДНК) на время его осуществления, создав для нас
не только азбуку клеточного цикла, но, по образному выраже-
нию Мэзии (Mazia, 1978), также его грамматику и календарь.
Подобно тому, как историки придумали задним числом эпоху
Возрождения или эпоху Просвещения, Говард и Пелк сумели
создать историю отдельно взятой клетки с ее периодами, хотя
границы между ними так же условны, как границы между
историческими эпохами.
Литература
Вильсон Э. — «Клетка», Биомедгиз, 1936
Кун Д. — «Структура научных революций», М., Прогресс, 1975.
МэзияД. — «Митоз и физиология клеточного деления» (ред. — JI. Н.Жил-
кин), М., ИЛ, 1963.
Энгельгардт В.А. — Вопр. философии, 1960, 49, 240-259.
Franke W.W. - Енг. J. Cell Biol., 1988, 47, 145-156.
Howard A., Pelc S.R. — Heredity, Suppl., 1953, 6, 261-273.
Mazia D. — In: «Cell Reproduction» (Ed. by Dirksen E.R. et al.), Acad. Press,
N.Y., 1978, p. 1-14.
19
ГЛАВА II. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ И КИНЕТИКА
КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
Метод радиоавтографии в изучении клеточного цикла
Открытие Говард и Пелка положило начало учению о «сне-
точном цикле. Однако в полной мерс значение полученных ими
результатов было оценено лишь позднее, когда они нашли
подтверждение в более точных радиоавтографических исследо-
ваниях с применением специфических предшественников ДНК.
Радиоавтография — один из основных количественных .ме-
тодов изучения метаболических процессов без нарушения цело-
сти клетки и клеточных структур, объединяющий принципы
морфологического и биохимического анализов. Он позволяет
локализовать с помощью радиоактивных изотопов биохимичес-
кие процессы, протекающие а клетках, и изучать таким образом
жизнедеятельность последних. Метод основан на введении в
исследуемый объект радиоактивною метаболита («метки») и
выявлении места его включения путем фотографической ре-
гистрации излучения.
Наиболее крупные успехи в изучении клеточного цикла
были достигнуты благодаря использованию в радиоавтографии
специфического предшественника ДНК — тимидина, меченно-
го тритием. Тритий ( Н) — единственный радиоактивный изо-
топ водорода; период его полураспада равен приблизительно
12,5 г. Возникающие при распаде трития р-частицы обладают
малой энергией и как следствие — небольшой длиной пробега
в фотоэмульсии (1-2 мк). Практически это означает, что если в
исследуемом биологическом объекте два точечных источника
излучения отстоят друг от друга на 1 мк, то на автографе они
будут выявлены как два отдельных зерна фотоэмульсии.
Тимидин — один из четырех нуклеозидов, участвующих в
образовании пол и нуклеотидной структуры ДНК, который харак-
терен только для молекулы ДНК, вследствие чего он является се
специфическим предшественником. Помимо избирательности в
отношении ДНК, к числу достоинств Н -тимидина как меченого
индикатора относятся его доступность для тканей, быстрота
включения в структуры, синтезирующие ДНК, и кратковремен-
ное (не более нескольких минут) пребывание в свободном
состоянии в организме животных. Существенным обстоятель-
ством является также стабильность образующейся метки, кото-
20
рая, как будет ясно из дальнейшего, может быть «разбавлена»
лишь в ходе последовательных клеточных делений.
Основные приемы радиоавтографического анализа
клеточного цикла.
Принципы радиоавтографического анализа клеточного цик-
ла были разработаны сотрудниками Брукхейвенской нацио-
нальной лаборатории во главе с Квастлером (Quastler), а затем
расширены и дополнены многими исследователями.
Это направление в изучении регуляции клеточного цикла
стало самостоятельной научной дисциплиной, получившей на-
звание «кинетика клеточных популяций», или, сокращенно,
«клеточная кинетика». Она оказалась настолько плодотворной,
что позволила в сравнительно короткий срок не только сформу-
лировать новые представления о структуре клеточного цикла,
но и успешно приступить к его анализу с помощью математи-
ческого моделирования.
Основной вехой в развитии этого направления явилась
разработка метода меченых митозов с применением 3Н-тимиди-
на. Метод основан на тех же экспериментальных подходах,
которые были впервые описаны Говард и Пелком, использовав-
шими в качестве индикатора синтеза ДНК в клетках корневой
меристемы фасоли радиоактивный фосфор. При введении в
организм 3Н-тимидина в любой популяции мечеными оказыва-
ются лишь те клетки, которые в данный момент синтезируют
ДНК, то есть находятся в S-периоде клеточного цикла. Клетки,
находящиеся в момент введения меченого предшественника
ДНК в периодах G, и G2 а также в митозе, соответственно не
содержат метки (рис. 5).
Продолжительность периодов клеточного цикла можно
определить графически, регистрируя изменение процента ме-
ченых митозов в различные промежутки времени после одно-
кратной инъекции 3Н-тимидина (рис. 6). В течение некоторого
времени после инъекции в митоз продолжают вступать неме-
ченые клетки, которые в момент введения меченого предше-
ственника находились в периоде G2 Затем в митоз начинают
вступать меченые клетки, причем первыми входят те клетки,
которые были помечены в конце S-периода, а последними —
те, которые были помечены в его начале. Позже в митоз
начинают вступать немеченые клетки из периода Gr
21
Рис 5. Автограф культуры клеток китайского хомячка, меченных 3Н-
тимидином.
Рис. 6. Изменение процента меченых мито-
зов в различные сроки после однократного вве-
дения в организм 3Н-тимидина. Гипотетический
случай, когда продолжительность каждого пе-
риода клеточного цикла постоянна для всех
клеток популяции. По оси абсцисс — время
после введения меченого индикатора, по оси
ординат — процент меченых митозов. Т — про-
должительность клеточного цикла, t,, t, t —
продолжительность периодов Gp S и митоза.
На рис. 6 изоб-
ражен идеальный
случай, когда про-
должительность
каждого периода
митотического
цикла является по-
стоянной величи-
ной для всех кле-
ток популяции.
При этом длитель-
ность S-псриода
равно отрезку пря-
мой, соединяющей
точки, соответству-
ющие 50% меченых
митозов на восхо-
дящей и нисходя-
щей частях первой
22
волны меченых
митозов Однако
в реальных кле-
точных системах
кривые меченых
митозов носят
несколько иной
характер (рис. 7).
Вследствие варь-
ирования дли-
тельности пери-
одов клеточного
цикла, увеличе-
ние процента
меченых митозов
(восходящая
часть кривой)
происходит мед-
Рис. 7. Изменение процента меченых митозов
в эпителии крипт подвздошной кишки мыши в
различные часы после однократного введения 3Н-
тимидина (поданным Квастлера и Шерман). По
оси абсцисс — время (ч) после введения меченого
индикатора, по оси ординат — процент меченых
митозов.
леннее, чем это предполагается в идеальном случае. Поэтому в
реальных клеточных системах минимальная и средняя продол-
жительность периода G2 различаются между собой, а нисходя-
щая часть кривой меченых митозов оказывается более пологой,
и второй пик меченых митозов выглядит несколько «размы-
тым», что иногда затрудняет установление продолжительности
всего клеточного цикла.
Для преодоления этих трудностей были разработаны при-
емы, позволяющие контролировать правильность определения
параметров клеточного цикла по кривой меченых митозов.
Критерием того, что разделились все клетки, находившиеся в
момент введения 3Н-тимидина в S-периоде, может служить
удвоение числа меченых клеток. В противоположность этому,
среднее число зерен серебра на клетку, напротив, должно
уменьшаться в два раза после каждого деления.
Метод меченых митозов остается и в наше время одним из
самых распространенных способов определения продолжитель-
ности периодов клеточною цикла. Со временем в него были
внесены уточнения, которые, однако не поколебали положен-
ные в его основу принципы.
Наряду с методом меченых митозов, Квастлером (Quastler,
1960) были предложены уравнения, позволяющие определять
23
продолжительность периодов митотического цикла в клеточ-
ных системах, находящихся в так называемом стационарном
состоянии (см. главу V), В таких системах число клеток, посту-
пающих за единицу времени в любой период цикла, равно числу
клеток, выходящих из этого периода, а отношение числа клеток
п. в каком-либо периоде цикла к средней продолжительности
этого периода Ц есть величина постоянная и равная отношению
общего числа клеток N в митотическом цикле к его длительно-
сти Т:
iij/tj = const. = N/T, откуда n/N = t,/T
Пользуясь этим уравнением, можно вычислить продолжи-
тельность любого периода цикла, в том числе S-периода (ts),
если известны индекс меченых клеток ns/N и величина Т; точно
так же, зная продолжительность S-периода, можно определить
величину Т.
Вклад Квастлера в учение о клеточном цикле необычайно
велик. «Этому человеку клеточная кинетика обязана более, чем
кому-либо. В научном отношении он был идеально снаряжен,
чтобы стать пионером в данной области», — пишет английский
исследователь Лен Ламертон в некрологе, посвященному Ква-
стлеру.
Создатель метода меченых митозов и клеточной кинетики —
Генри Квастлер начинал свою карьеру как врач-рентгенолог
сначала в Вене, а потом в Албании. В 1937 году он эмигрировал
в США и продолжал практиковать там еще в течение несколь-
ких лет. Участвуя в совместных радиобиологических исследова-
ниях с сотрудниками Иллинойского университета, он понял,
что ему не хватает фундаментальных знании, и самостоятельно
изучил математику и теоретическую физику, причем в такой
степени, что не только смог успешно применять их для решения
биологических проблем, но и опубликовал ряд крупных иссле-
дований в области теории информации, математической биоло-
гии и физики проникающих излучений.
Последние восемь лет жизни Квастлер проработал в Брук-
хейвенской лаборатории, где приступил к исследованиям по
кинетике клеточных популяций. Обладая мощным интеллектом
и большой внутренней силой, Квастлер привлекал к себе
многочисленных учеников. «Хотя его работы в области клеточ-
ной кинетики и легли в основу наших знаний о ней, — пишет
Ламертон, — едва ли не большее значение имело его личное
24
влияние. Он был руководителем, консультантом и другом мно-
гих исследователей из разных стран мира. Его доброжелатель-
ность, научная щедрость и широта кругозора не знали границ».
Квастлер ушел из жизни в 1963 году в возрасте пятидесяти пяти
лет, покончив с собой после смерти жены
Общие закономерности прохождения клеточного цикла
и его периодов
Представление о клеточном цикле стечением лет претерпело
изменение. Вначале под клеточным циклом подразумевали весь
жизненный цикл клетки от момента ее возникновения до
гибели, включая периоды дифференцировки и другие физиоло-
гические состояния. Постепенно понятие клеточный цикл ста-
ли использовать только как синоним митотического, или про-
лиферативного цикла с его четырьмя периодами. Такое смеше-
ние понятий — нередкое явление в научной литературе. Оно
происходит непроизвольно и отражает развитие научной мыс-
ли, которая стремится выйти за рамки жестких определений.
Швейцер полагал, что отвлеченные категории затрудняют есте-
ственный ход мысли, подобно тому, как колеи на дорогах
сковывают движение.
В настоящее время клеточный никл удобнее всего обозна-
чить как интервал между завершением митоза в исходной
клетке и завершением митоза в ее дочерней клетке. Время,
необходимое для прохождения одного клеточного цикла, полу-
чило название времени генерации. В физиологическом отноше-
нии клеточный цикл подразумевает последовательность хроно-
логически связанных событий, происходящих в клетке как во
время подготовки к делению, так и в самом митозе.
Появление метода меченых митозов повлекло за собой в
полном смысле слова лавину исследований по кинетике клеточ-
ных популяций. Расцвет этих работ приходится на начало 60-х
годов, когда были получены многочисленные кривые меченых
митозов и определены параметры клеточных циклов в самых
разнообразных биологических системах, от низших эукариотов
до многоклеточных организмов — высших растений и живот-
ных.
Со временем было установлено, что суммарная длительность
периодов S, G2 и митоза остается сравнительно постоянной, а
вариабельность клеточного цикла зависит, главным образом, от
25
Таблица I. Продолжительность периода G( в тканях мыши
Ткань	Время (ч)
Опухоль Эрлиха	0.0
Эпителий волосяных фолликулов	3,0
Эпителий 12-перстной кишки	4,5
Эпителий подвздошной кишки	9,5
Эпителий роговицы	70,0
Эпидермис уха	528,0
продолжительности нресинтетического периода G, величина
которого может колебаться в разных тканях от нулевых значе-
ний до многих часов, а в некоторых случаях даже месяцев (табл.
1), что явно представлялось абсурдным В данном случае резуль-
тат вступал в противоречие со здравым смыслом, а это, как
показывает научный опыт, нередко таит в себе зерно открытия.
Открытие действительно состоялось, и ему будет посвящена
следующая глава. Пока же достаточно сказать, что положение
стало проясняться, когда было установлено, что в отдельных
тканях может содержаться значительная доля клеток, которые
вообще не участвуют в митотическом цикле. Отношение проли-
ферирующих клеток к общему числу клеток в популяции
получило название фракции роста (Mendelsohn, 1960), или
пролиферативного пула (Kisieleski ct al., 1961).
При работе с культурами клеток пролиферативный пул
обычно определяют по кривым насыщения. Если 3Н-тимидин
находится в непрерывном контакте с клетками в течение дли-
тельного времени, то в результате вступления новых порций
клеток в S-нериод индекс меченых клеток будет возрастать до
тех пор, пока все клетки, способные синтезировать ДНК, не
окажутся мечеными. Однако в целом организме 3Н-тимидин,
как уже было сказано, подвергается быстрому распаду и выве-
дению. В связи с этим был предложен специальный прием
(Kisieleski ct al., 1961) с использованием частых повторных
26
инъекций 3Н-тимидина с интервалами, меньшими чем длитель-
ность S-периода, и на протяжении времени, превышающего
продолжительность всего клеточного цикла.
Применение методов клеточной кинетики позволило выяв-
лять пролиферативный пул в динамике, что способствовало
зарождению новых идей, касающихся регуляции размножения
клеток. Стало очевидным, что события клеточного цикла не
охватывают всех возможных состояний клетки.
Литература
Епифанова О И.,Терских В В , Захаров А.Ф. — «Радиоавтография», М.,
ВШ, 1977.
Kisieleski W.E., Baserga R., Lisco H. — Atompraxis, 1961, 7, 81-85.
Mendelsohn M L. — J. Natl. Cancer Inst., 1960, 25, 485-500.
Quastlcr H., — Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960, 90, 580-591.
Quastler H., Sherman M. — Exp. Cell Res., 1959, 17, 420-438.
27
ГЛАВА III. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ И СОСТОЯНИЕ
ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ПОКОЯ
Открытие периода Go (фазы «вне цикла»)
В 1963 году было впервые высказано предположение, что по
окончании митоза клетка не обязательно сразу же вступает в
пресинтетический период G , а может выйти в состояние «вне
цикла», из которого при необходимости она вновь может
вступить в клеточный цикл под влиянием пролиферативного
стимула. К такому заключению пришли независимо друг от
друга Лайта (Lajtha, 1963) и Квастлер (Quastler, 1963), обозна-
чившие это состояние как период, или фазу G()(pnc. 8).
Открытие того, что клетки могут выходить из митотического
цикла и вновь возвращаться к пролиферации, имело, как будет
видно из дальнейшего, принципиальное значение для изучения
его регуляции. Однако при этом важно обратить внимание на
другое обстоятельство. Казалось бы, этот вывод напрашивался
сам собой. Ведь уже было известно, что во многих популяциях
лишь определенная фракция клеток проходит митотический
цикл. Более того, были разработаны приемы эксперименталь-
ного определения пролиферативного пула. И тем не менее
многочисленные исследователи прошли мимо этого открытия.
Почему же так получилось? Мне представляется, что в
значительной мере здесь повинна магия самих подсчетов и
расчетов — неожиданно открывшаяся возможность при помо-
щи методов клеточной кинетики сравнительно легко измерять
временные параметры клеточного цикла. Но недаром у древних
была поговорка: исчисляемое еще не есть знание. От внимания
исследователей почему-то долгое время ускользало одно суще-
ственное логическое звено: если считать, что с увеличением
пролиферативного пула новые порции пепролиферирующих
клеток вступают в клеточный цикл, следовательно раньше они
должны были выйти из него, а это, в свою очередь, означает, что
они находились вне цикла. Подобное рассуждение и легло в
основу открытия Лайты и Квастлера. которое было сделано
полностью в соответствии с постулатом древневосточной фило-
софии о гармоничности мышления, «когда каждая рождающа-
яся мысль должна завершить свой ход, чтобы не оставлять
отбросов в бессознательном».
28
Рис. 8. Первые модели клеточного цикла, основанные на данных
клеточной кинетики и допускавшие возможность выхода клетки из
цикла. Gp S, G, — периоды клеточного цикла, G(( — фаза «вне цикла»,
D — дифференцирующаяся клетка.
Что касается Квастлера, то он скорее интуитивно подошел к
заключению о возможности выхода клеток из митотического
цикла, опираясь на ранее высказанное предположение (Quastler,
Sherman, 1959), что по окончании митоза клетка должна «при-
нять решение», делиться ли ей снова или же переходить к
дифференцировке Квастлер не успел развить эту идею, посколь-
ку в 1963 году ею уже не стало. Убедительные доводы в пользу
представления о переходе клеток в фазу Go были сформулирова-
ны Лайтой, который по праву считается автором этого открытия.
Сын известного венгерского композитора — Ласло Лайта в
послевоенные годы приехал в Манчестер, где в радиобиологи-
ческом отделе Хаммерсмитовского госпиталя начал изучать
реакцию на облучение таких сложных систем, как костный мозг
и печень млекопитающих Блестящий собеседник, полиглот,
эстет и меломан, Лайта легко натурализовался в Англии, где
прожил до конца своих дней. Он сделался членом престижных
клубов и легко мог предаться соблазнам светской жизни, если
бы не его пытливый ум, научное честолюбие и огромная
работоспособность. Будучи прекрасным организатором, он в
29
скором времени сам возглавил радиобиологический отдел и
направил усилия сотрудников на изучение клеточной кинетики
костного мозга и печени Успех не заставил себя ждать. Именно
печень, отличающаяся низким уровнем пролиферации клеток в
обычных условиях, но быстро регенерирующая после частич-
ной гепатэктомии, оказалась тем объектом, который позволил
экспериментально выявить период G()
Лайта аргументировал свое утверждение следующим обра-
зом. Что происходит в печени при восстановлении пролифера-
тивной активности? Приблизительно через 15 час. после опера-
ции в гепатоцитах начинается синтез ДНК, который продолжа-
ется в течение 7-8 час. (рис. 9, 1). После короткого (2-3 час.)
периода G, клетки вступают в митоз (рис. 9, 2). Если бы в
клетках печени был очень длительный период G (порядка
нескольких месяцев, как это следует из расчетов) и если бы он
просто сокращался до 15 час при регенерации, то должно было
бы наблюдаться немедленное увеличение числа клеток, синте-
зирующих ДНК (рис. 9, 3). На самом же деле перед началом
репликации ДНК всегда отмечается хорошо выраженный лаг-
период (рис. 9, I), указывающий на то, что клетки вообще не
были в цикле в момент стимуляции.
Наличие лаг-периода и кумулятивный характер кривых воз-
растания индекса меченых клеток и митотического индекса
типичны для индукции пролиферативных процессов. Не следу-
Рис. 9. После-
довательность со-
бытий в клетках
печени крысы пос-
ле частичной гепа-
тэктомии (по дан-
ным Лайты, 1964).
По оси абсцисс
— время после ге-
патэктомии (ч), по
оси ординат: —
Д Н К-синтезирую-
щая активность (1, 3) и митотическая активность (2) (в условных
единицах); 1, 2 — результаты, полученные экспериментально, 3 —
результат, ожидаемый в случае непрерывного прохождения клетками
регенерирующей печени «растянутого во времени» клеточного цикла.
30
ет конечно думать, что Лайта открыл само явление индукции
клеточного размножения. Вывод о гормональной регуляции
деления клеток в тканях-мишенях сформированного организма
был сделан ранее Суонном (Swann, 1958), который сравнивал ее
с феноменом эмбриональной индукции, описанной еще Шпема-
ном. Однако именно Лайта сумел угадать по характеру поведе-
ния клеток, стимулированных к пролиферации под влиянием
митогена, их предшествующее состояние. Поэтому его заклю-
чение о способности клеток переходить по окончании митоза в
фазу «вне цикла» получило всеобщее признание, а символ G
стал неотъемлемой частью азбуки клеточного цикла.
Выявление клеток в периоде Go методами клеточной
кинетики
Особенности кинетики вступления стимулированных кле-
ток в S-период (резкое увеличение индекса меченых клеток
после хорошо выраженного лаг-периода) позволяют с достаточ-
ной степенью уверенности судить о наличии в популяции
покоящихся клеток (рис 10)
Другим показателем присутствия клеток в периоде Go может
служить величина пролиферативного пула при насыщении
популяции 3Н-тимидипом. Однако при этом необходимо иметь
в виду возможные источники ошибок. Включение меченого
Рис. 10. Кумулятивный ха-
рактер кривой, отражающей
вступление в период синтеза
ДНК лейкоцитов периферичес-
кой крови человека после ин-
дукции пролиферации с помо-
щью фитогемагглютинипа
(ФГА) (по данным МакКинни
и др., 1962).
По оси абсцисс — время
после введения ФГА (ч), по оси
ординат — индекс меченных 3Н-
тимидином клеток (%). ’Н-ти-
мидин добавляли в среду за 2 ч
до фиксации клеток.
31
тимидина всеми клетками еще не означает, что в популяции
отсутствуют непролиферирующие клетки. По мере увеличения
времени контакта клеток с изотопом пролиферативный пул
будет всегда стремиться к 100%, поскольку непролиферирую-
щие клетки также будут включать метку, если длительность их
пребывания вне цикла окажется меньше продолжительности
контакта с 3Н-тимидином. Кроме того, фракция немеченых
клеток в динамике непрерывно разбавляется делящимися мече-
ными клетками и уменьшается вполовину после каждого удво-
ения размеров клеточной популяции, что также способствует
ассимптотическому стремлению индексе! меченых клеток к
100%. Поэтому величину пролиферативного пула можно рас-
сматривать как надежный показатель присутствия непролифе-
рирующих клеток в популяции только в условиях относительно
длительного пребывания их вне цикла.
Метод меченых митозов позволяет выявлять наличие клеток
в периоде Goтолько лишь в тех случаях, когда происходит их
массовый выход из клеточною цикла. Именно такая картина
наблюдается на заключительном этапе эмбриогенезе! млекопи-
тающих, во время перехода организма от эмбрионального к
постнатальному развитию. Отсутствие второго подъема на кри-
вой меченых митозов свидетельствует о выходе большей части
клеток в фазу С.,(рис. 11).
Рис. 11. Выявление перехода клеток в период Gtl в процессе онтоге-
неза (по данным Жинкина, 1965). По оси абсцисс — время после
однократной инъекции ’Н-ти.мидина (ч), по оси ординат — процент
меченых митозов. 1 — теоретическая кривая меченых митозов по
Кнастлеру; 2 — кривая меченых митозов в клетках подчелюстной
железы 15-дпсвного эмбриона крысы; 3 — кривая меченых митозов в
клетках поджелудочной железы новорожденной крысы.
32
Способность клеток выходить из цикла в периоде G
Изучая пролиферацию клеток эпидермиса уха, Гелфант
(Gelfant, 1963) обнаружил, что клетки могут задерживаться при
прохождении цикла как в периоде Gp так и в периоде Gr Ему
удалось выявить небольшую фракцию эпидермальных клеток,
которые находились в периоде G,более двух суток и вступали в
митоз только после получения пролиферативного стимула (по-
вреждение эпидермиса). Гелфант подразделил всю популяцию
непролиферирующих, но потенциально способных к размноже-
нию клеток эпидермиса уха мыши на две отдельные субпопуля-
ции — G] и G2, соответственно периоду, в котором возникает
блок.
Одним из основных способов выявления клеток С2-популя-
ции может служить подсчет числа меченых и немеченых мито-
зов на радиоавтографах в условиях непрерывной инкубации
клеток с 3Н-тимидином. При этом клетки G,- популяции будут
вступать в митоз немечеными, поскольку они уже раньше
завершили синтез ДНК (рис. 12).
Другим способом является параллельное определение мито-
тического индекса и индекса меченых клеток в условиях стиму-
ляции. Если увеличение числа митозов предшествует увеличе-
нию числа клеток, синтезирующих ДНК, это означает, что в
митоз вступают клетки, бывшие до стимуляции в периоде Gr
Здесь наблюдается картина, прямо противоположная тому, что
Рис. 12. Выявление
С2-популяции клеток в
асцитном раке мыши
при действии антилим-
фоцитар! юй сыворотки
(по данным Де Коссе и
Гелфанта, 1968). До
введения сыворотки
мышам в течение 48 ч
инъецировали 3Н-ти-
мидин с 4-часовы ми
интервалами. Введение
сыворотки отмечено
стрелкой. По оси абс-
цисс — время (ч) после
начала введения меченого индикатора, по оси ординат — процент
немеченых митозов. 1 — контроль (без сыворотки), 2 — опыт.
33
имеет место при стимуляции клеток Gj-популяции, которые
сначала синтезируют ДНК, а уже затем вступают в митоз.
Следует отметить, что при воздействии пролиферативного
стимула на клетки С2-популяции они вступают в митоз не сразу,
а лишь по истечении определенного лаг-периода (Zaitsu, Kimura,
1985), что, как мы видели, характерно для клеток, получивших
стимул к пролиферации в периоде Go Подобная реакция на
пролиферативный стимул служит дополнительным признаком
того, что клетки способны выходить из цикла и в периоде G2.
Представление о состоянии пролиферативного покоя
Следующим шагом в изучении клеток, находящихся вне
цикла, явилась попытка установить связь между данными
клеточной кинетики, выявляющими соотношение пролифе-
рирующих и непролиферирующих клеток в популяции, и их
физиологическим статусом. Было сформулировано представ-
ление (Epifanova, Terskikh, 1969) о пролиферативном покое как
особом физиологическом состоянии клетки, в котором она
может оставаться в течение неограниченного времени, не
пролиферируя, но полностью сохраняя жизнеспособность и
возможность вступления в цикл под влиянием адекватного
стимула. При этом клетки могут переходить в состояние покоя
как после окончания митоза, так и по завершении синтеза
ДНК. Для обозначения периодов покоя были предложены
символы R] (от англ, rest — покой, соответствующий символу
G()) и R2 (соответствующий понятию о С2-популяции), по-
скольку представлялось нецелесообразным использовать сим-
волы, применяемые в клеточной кинетике, для физиологичес-
кой характеристики клеток (рис. 13).
Чередование периодов покоя и активной пролиферации обеспе-
чивает контроль размножения клеток и их специализацию в
процессе индивидуального развития. Клетки, находящиеся в
состоянии пролиферативного покоя, могут (хотя и не обязатель-
но) выполнять специфические функции в составе той или иной
ткани. Тем не менее и специализированные и неспециализиро-
ванные покоящиеся клетки одинаково реагируют на митогенный
стимул, побуждающий их вступать в клеточный цикл. Однако
подобная реакция возможна лишь до определенного возрастного
предела в жизни клетки, после чего она может еще какое-то
время функционировать, но обречена на гибель (рис. 14).
34
Рис. 13. Схема кле-
точного цикла, отража-
ющая чередование пе-
риодов активной про-
лиферации (G,, S, G? и
М) и состояний проли-
феративного покоя (Rt
и R2) (по Епифановой и
Терских, 1969). 2с —
количество ДНК, соот-
ветствующее диплоид-
ному набору хромосом;
4с — удвоенное количе-
ство ДНК.
В физиологическом смысле понятие «вне цикла» предпола-
гает, что при переходе в состояние пролиферативного покоя
клетка прекращает подготовку к митозу и соответственно теряет
некоторые фундаментальные свойства, присущие пролифери-
рующим клеткам.
Рис. 14. Схема жизненного цикла соматических клеток высших
организмов, включающего в себя следующие события: митотический
(клеточный) цикл, периоды покоя, состояние специфического функци-
онирования и гибель клетки Обозначения те же, что и па рис. 13.
35
Экспериментальные системы для изучения
покоящихся клеток
Специализированные клетки во взрослом многоклеточ-
ном организме различаются по своему пролиферативному
потенциалу Их условную классификацию предложил в свое
время выдающийся канадский гистолог Шарль Леблон
(Leblond, 1964), который подразделил их на три основные
группы.
(1)	Статичные, или непролиферирующие клетки, не размно-
жающиеся при нормальных физиологических условиях. Типич-
ными представителями этой категории клеток служат сегменто-
ядерные лейкоциты, тучные клетки и эритроциты позвоноч-
ных. Хроматин в них до такой степени конденсирован, что это
практически исключает транскрипционную активность ядра.
Однако такие клетки сохраняют пролиферативный потенциал и
способны вступать в клеточный цикл в случае адекватного
митогенного стимула. К статичным клеткам относят также
миоциты и нейроны, хотя хроматин в них деконденсирован и
обладаеттранскрипционной активностью, что связано с выпол-
нением клетками специфических функций в отсутствие проли-
ферации. При этом нейроны полностью утрачивают способ-
ность к размножению в постнатальном периоде развития орга-
низма.
(2)	Растущие, или медленно пролиферирующие клетки,
отличающиеся низкой митотической активностью и незначи-
тельным уровнем гибели (лимфоциты, хондроциты, гепато-
циты и др ). Такие клетки сохраняют способность к пролифе-
рации при благоприятных для этого условиях. В частности, в
паренхиматозных клетках печени пролиферативный потен-
циал проявляется, как мы видели, после частичной гепатэк-
томии.
(3)	Обновляющиеся клеточные популяции, в которых
высокий уровень пролиферации уравновешивается гибелью
клеток. В этих клеточных популяциях основная масса вновь
образованных клеток мигрирует, специализируется, претер-
певает терминальную дифференцировку и погибает. Приме-
ром таких популяций могут служить клетки гемопоэтической
системы, эпителиев, выстилающих полости органов, и эпи-
дермиса. Стволовые клетки в обновляющихся популяциях
сохраняют на всем протяжении своей жизни пролифератив-
36
ный потенциал и способность к самоподдержанию и диффе-
ренцировке, восполняя таким образом клеточную потерю во
всей популяции.
Из сказанною следует, что непосредственный анализ поко-
ящихся клеток в тканях целою организма затруднен, поскольку
многие из них рассеяны среди пролиферирующих клеток и
практически не отличаются от них по морфологическим при-
знакам. Стволовые клетки, которые пребывают в состоянии
покоя значительную часть своей жизни, составляют лишь не-
большую долю в клеточных популяциях. Основная же масса
покоящихся клеток во взрослом организме выполняет много-
численные специфические функции.
Для преодоления этих трудностей успешно применяют
экспериментальный прием, заключающийся в митогенной
стимуляции покоящихся клеток с последующим анализом их
поведения в клеточном цикле. Наиболее распространенными
популяциями со стимулированным размножением клеток в
организме животных, помимо уже упоминавшихся гепатоци-
тов регенерирующей печени, служат клетки кроветворной
системы и эпителиальные клетки различных тканей, обрабо-
танных митогенами.
Широко используют в этих целях культуры животных
клеток, которые переводят в состояние пролиферативного
покоя путем увеличения клеточной плотности при многоднев-
ном культивировании, а также с помошыо удаления из пита-
тельной среды сыворотки. В условиях высокой клеточной
плотности или истощения питательной среды число клеток в
популяции стабилизируется, и культуры переходят из экспо-
ненциальной фазы роста в стационарную, отличающуюся
крайне низкими показателями уровня синтеза ДНК и митоти-
ческой активности (рис. 15). При этом клетки остаются жиз-
неспособными в течение длительного времени, сохраняя про-
лиферативный потенциал.
Обычно подавляющая часть клеток стационарных культур
выходит из цикла по окончании митоза (период покоя ИД.
Однако в некоторых клеточных популяциях небольшая часть
клеток может переходить в период покоя R2. Эти клетки
отличаются меньшей стабильностью и жизнеустойчивостыо, по
сравнению с клетками в периоде R , и поэтому не годятся для
длительных наблюдений.
37
300
Рис. 15. Характер пролиферации культуры клеток при длительном
выращивании без смены среды. По оси абсцисс — время культивирова-
ния клеток (ч), по оси ординат: слева — общее число клеток в
популяции (1), справа — индекс клеток, меченных 3Н-тимидином (2) и
митотический индекс (3).
Критика представлений о клеточном цикле и состоянии
пролиферативного покоя
Несмотря на убедительность доводов Лайты, открывшего
фазу Go, отдельные исследователи продолжали настаивать на
том, что клетки не выходят из цикла, а лишь замедленно
проходят период Gt Они утверждали, что при непрерывном
контакте с 3Н-тимидином индекс меченых клеток в популяции
рано или поздно достигает 100%, а это означает, что все клетки
постепенно вступают в S-период. Подобное возражение было
устранено после того, как выяснилось, что величина пролифе-
ративного пула не всегда может служить надежным показателем
присутствия в популяции покоящихся клеток (см. стр. 33).
В 1973 году появилась статья Смита и Мартина (Smith,
Martin) с броским названием «Циклируют ли клетки?» Авторы
подвергли кардинальному пересмотру сложившееся со времени
работ Говард и Пелка представление о клеточном цикле с его
классическими четырьмя периодами и предложили собствен-
ную концепцию так называемого вероятностного перехода.
Согласно их модели, клеточный цикл состоит из двух частей:
38
вероятностного состояния А, в котором клетки не пролифери-
руют, и детерминированной фазы В, включающей в себя пери-
оды S, G2, М и частично период Gr Переход клеток из
состояния А в фазу В происходит случайно, иначе говоря все
клетки популяции имеют одинаковую вероятность вступления
в цикл, а митогенные стимуляторы лишь увеличивают эту
вероятность. В нормальных условиях клетки, вступившие в фазу
В, неизбежно должны разделиться. Модель однозначно посту-
лировала, что контроль клеточного цикла существует исключи-
тельно на этапе А <-> В и не зависит от предшествующей истории
клетки.
Гипотеза вероятностного перехода нашла многочисленных
приверженцев и оживила исследования в области клеточной
кинетики. Однако некоторые данные шли вразрез с ее постула-
тами. Так, стали появляться указания на зависимость продол-
жительности клеточного цикла от событий предыдущего цикла.
Была обнаружена также значительная вариабельность фазы В,
что свидетельствовало против ее жесткой детерминированнос-
ти. Наконец, с помощью цейтраферной киносъемки отдельных
клеток в стационарной культуре фибробластов было установле-
но, что они обладают различной чувствительностью к митоге-
нам и, следовательно, их шансы на вступление в цикл не
равновероятны (Brooks et al., 1984). Классическая модель кле-
точного цикла устояла, и было окончательно признано, что
клетки могут выходить из цикла в особое состояние Go (см
Brooks, Riddle, 1988).
Особенности вступления покоящихся клеток
в митотический цикл.
Изучение клеточного цикла методами клеточной кинетики
доминировало в 60-х годах, но постепенно стало уступать место
ультраструктурным и биохимическим исследованиям свойств
пролиферирующих и покоящихся клеток, подробному рассмот-
рению которых посвящена следующая глава Начало биохими-
ческому подходу было положено работами Базерги (Baserga,
1968), который первым обратил внимание на то, что метаболи-
ческие процессы в непрерывно пролиферирующих клетках,
проходящих период G по окончании митоза, отличаются от
процессов, предшествующих началу репликации ДНК после
митогенной стимуляции покоящихся клеток. Оказалось, что
39
стимулированным клеткам требуется больше времени, чтобы
войти в S-период, чем непрерывно пролиферирующим клеткам.
Для обозначения отрезка времени между применением стимула
и началом синтеза ДНК Базерга предложил термин «пререпли-
кативный период» (рис. 16).
Продолжительность пререпликативного периода в живот-
ных клетках составляет от 10 до 24 час. Пролиферативный
стимул вызывает в клетках серию быстро протекающих множе-
ственных структурных и функциональных изменений — так
называемый плейотипический ответ. Ранний пререпликатив-
ный период характеризуется усилением транспорта низкомоле-
кулярных веществ через наружную мембрану клетки и транзи-
торной активацией синтеза отдельных видов мРНК и белков.
Эти изменения протекают в стимулированной клетке до опре-
деленною момента, получившего название «пункт ограниче-
ния» (restriction point), пройдя который, клетка становится
необратимо комитированной к репликации ДНК (Pardee, 1974).
ПРЕРЕПЛИКАТИВНЫЙ ПЕРИОД
Рис. 16. Схематическое изображение событий, развертывающихся
при переходе клетки из состояния покоя (R) к пролиферации (Р) М —
митоз, G] — пресинтетический период, S — период синтеза ДНК, г-
пункт — пункт ограничения, белые стрелки — плейотипический ответ
клетки па пролиферативный стимул (объяснения в тексте).
40
События позднего прерснликативного периода включают в себя
вторичное усиление общего синтеза РНК и белков, в том числе
образование инициаторов репликации ДНК. Попытки локали-
зации пункта ограничения во времени не привели к однознач-
ным результатам. Если рассматривать сю как этап пререплика-
тииного периода, после которого ингибитор пролиферации уже
не в состоянии воспрепятствовать прохождению клеточного
цикла и вступлению клетки в S-период, то скорее всего он
расположен в непосредственной близости от границы периодов
G/S, что впрочем может варьировать для разных ингибиторов.
В 1974 году Аугенлихт и Базерга (Augenlicht, Baserga, 1974) в
опытах на диплоидных фибробластах человека обнаружили, что
чем дольше клетки находятся в состоянии покоя, тем больше
времени им требуется для прохождения пререпликативного
периода после стимуляции, причем уменьшается также фрак-
ция клеток, вступающих в S-период. Авторы пришли к заклю-
чению, что популяция покоящихся клеток не является гомоген-
ной, и что клетки могут «углубляться» в состояние покоя (см.
рис. 16). Со временем были выявлены и другие признаки
подобного углубления, в том числе изменение ряда метаболи-
ческих характеристик, о чем пойдет речь в следующей главе.
Существенно, что клетки, вышедшие из цикла в период покоя
R,, также углубляются в это состояние по мере пребывания в
нем, о чем свидетельствует увеличение продолжительности лаг-
периода, предшествующего нарастанию митотической актив-
ности после стимуляции (Zaitsu, Kimura, 1985).
Значение периодов пролиферативного покоя для
функционирования различных биологических систем
Способность клеток периодически прекращать пролифера-
тивную активность лежит в основе различных физиологичес-
ких состояний, связанных с наступлением пауз в развитии
организмов. Этим свойством обладают клетки самых разных
биологических объектов, независимо от уровня организации.
Такие явления, как образование бактериальных спор, инцис-
тирование одноклеточных, покой семян у растений, паузы при
метаморфозе насекомых, зимняя спячка у млекопитающих и
многие другие процессы, возможны именно благодаря способ-
ности клеток переходить в состояние пролиферативного по-
коя, что можно считать одной из общих физиологических
41
характеристик живых существ (см. Epifanova, Terskikh, 1969;
Иванов, 1974).
Вместе с тем необходимо отметить, что среди прокариоти-
ческих и низших эукариотических организмов переход в состо-
яние покоя в большей степени связан с необходимостью пере-
живать неблагоприятные для размножения условия среды. У
многоклеточных же организмов этот переход начинает играть,
кроме того, сложную регуляторную роль
Прежде всего, прекращение пролиферации клеток в тканях
многоклеточного организма создает предпосылки для выполне-
ния ими специфических функций в соответствии с дифферен-
цировкой, что может происходить как по окончании митоза
(переход в состояние R(), так и по завершении синтеза ДНК
(переход в состояние RJ. Особое значение состояние покоя
имеет для функционирования стволовых клеток, которые, обла-
дая неограниченной способностью к самоподдержанию, полно-
стью сохраняют в то же время, с одной стороны, пролифератив-
ный потенциал, а с другой — возможность образовывать функ-
ционально специализированные поколения клеток разной сте-
пени зрелости, как это происходит, в частности, при гемопоэзе.
Смена периодов покоя и активной пролиферации клеток
лежит также в основе координированного роста и регуляции
численности и размеров клеточных популяций в пределах ткани
и органов. Филигранные исследования Жинкина и Самошки-
ной (Zhinkin, Samoshkina, 1967) показали, что в процессе
разрастания децидуальной ткани матки во время беременности
клетки эпителия переходят в период G(), а по окончании
беременности в Go переходят клетки соединительной ткани.
Наконец, клетки, находящиеся в состоянии покоя, составля-
ют регенерационный резерв ткани. При этом клетки в периоде
R, можно рассматривать как резерв быстрого регенерационного
ответа.
Литература
Жинкин Л.Н. — В кн »Клеточная дифференцировка и индукционные
механизмы». 1965, М., Наука, с. 233-241.
Иванов В.Б. — «Клеточные основы роста растений». М., Наука, 1974.
Augenlicht L.H., Baserga R. — Exp. Cell Res., 1974, 89, 255-262.
Baserga R. — Cell Tissue Kinel., 1968, 1, 167-191.
Brooks R.F., Richmond F.N., Riddle P.N., Richmond K.M.V. — J Cell
Physiol., 1984, 121, 341-350.
42
Brooks R.F., Riddle P.N. — J. Cell Sci., 1988, 90, 601-612.
DeCosse J.J., Gelfant S. — Science, 1968, 162, 698-699.
Epifanova O.I., Terskikh V.V. — Cell Tissue Kinet., 1969, 2, 75-93.
Lajtha L.G. — J. Cell. Comp. Physiol., 1963, 143-145.
Lajtha L.G. — Medicine, 1964, 43, 625-633.
Leblond C.P. — Natl Cancer Inst. Monograph., 1964, 14, 119-145.
MacKinney A.A., Stohlman F., Brecher G. — Blood, 1962, 19, 349-358.
Pardee A.B. — Proc. Natl Acad. Sci., USA, 1974, 71, 1286-1290.
Quastler H. — In: «Cell Proliferation», 1963 (Ed. by L.F. Lamertonand R.J.M.
Fry ), Oxford, Blackwell, p. 18-36.
Smith J.A., Marlin L. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1973, 70, 1263-1267.
Steel G.G. — Intern. J. Radiat. Biol., 1986, 49, 227-235.
Swann M.M. — Cancer Res., 1958, 18, 1118-1160.
Zaitsu H., Kimura G. - J. Cell. Physiol., 1985, 124, 177-181.
Zhinkin L.N., Samoshkina N.A. — J. Embryol. Exp. Morph., 1967, 17, 593-
605.
43
ГЛАВА IV. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ПОКОЙ -
ОСОБОЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ
КЛЕТКИ
Экспериментальные предпосылки изучения метаболизма
покоящихся клеток
Как мы уже видели, к началу 70-х годов наметилось усиление
интереса к изучению метаболизма клеток в разных периодах
цикла, а также в состоянии пролиферативного покоя. Этому в
немалой степени способствовало то обстоятельство, что пред-
метом изучения стали не только асинхронно делящиеся клеточ-
ные популяции тканей in vivo или же биологические объекты с
естественно синхронным делением клеток (как, например,
дробящиеся яйца животных, многоядерные плазмодии грибов,
корневые меристемы прорастающих растений и т.п.), но также
культуры клеток млекопитающих с искусственно синхронизи-
рованным прохождением клеточного цикла. Суть процесса
синхронизации заключается в воздействии на культивируемые
клетки биохимическим, механическим или температурным
фактором, препятствующим прохождению цикла, в результате
чего значительная часть клеток аккумулируется в каком-либо
определенном его периоде. После снятия ингибирующего воз-
действия клетки с большей или меньшей степенью синхронно-
сти проходят следующие этапы цикла. Применение различных
приемов сихронизации в совокупности с использованием кле-
точных культур, стимулированных митогенами, позволило со-
поставлять метаболические и структурные характеристики про-
лиферирующих и покоящихся клеток в культуре, что в конеч-
ном итоге привело к представлению о пролиферативном покое
как особом физиологическом состоянии клетки.
Структура клеточной поверхности и транспор гная функция
наружной мембраны
Клеточная поверхность выполняет две основные функ-
ции, связанные с переходом покоящихся клеток в митотичес-
кии цикл. Она воспринимает внеклеточные митогенные сиг-
налы и обеспечивает транспорт в клетку необходимых ве-
ществ, принимающих участие в инициации пролиферативно-
го ответа.
С помощью сканирующей электронной микроскопии было
установлено, что на поверхности клеток, находящихся в экспо-
ненциальной фазе роста, присутствуют многочисленные мик-
роворсинки, в то время как при нслостатке сыворотки или
повышении плотности клеточной популяции число ворсинок
снижается. Другим морфофункциональным признаком сглажи-
вания микрорельефа клеточной поверхности в состоянии покоя
можно считать также отсутствие складчатости.
Структурные и конформационные изменения наружной (плаз-
матической) мембраны покоящихся клеток включают в себя
агрегацию внутримембранных частиц, снижение текучести ли-
пидов, экспрессии антигенов, способности аглютинироваться
растительными лектинами и другие изменения, затрагивающие
ее функции таким образом, что мембрана становится в целом
более стабильной. Что это означает?
Известно, что мембраны животных клеток состоят на 60% из
белков и на 40% из липидов. Основным компонентом после-
дних являются фосфолипиды (75-90%), остальную же часть
составляет холестерин. Уменьшение содержания в клетке холе-
стерина снижает текучесть липидов и усиливает связь фосфоли-
пидов с мембранными белками, что способствует стабилизации
мембраны. Именно такая картина наблюдается при переходе
клеток в состояние покоя, причем уменьшается содержание не
только самого холестерина, но также и его предшественников.
Другим фактором, стабилизирующим мембрану, служит уве-
личение на поверхности покоящихся клеток серосодержащих
глюкозаминогликанов — основных углеводных компонентов
внеклеточного ма фикса Пролиферирующие клетки содержат в
своем составе большое количество гиалуроновой кислоты и
лишь незначительное количество гепарина (гепарансульфата),
но при переходе в состояние покоя гепарин становится одним
из основных компонентов поверхности (рис. 17). Гепарин и
другие полисахариды связывают ионы кальция и фиксируют
мембранные белки, способствуя стабилизации мембраны.
Описанные изменения поверхности покоящихся клеток
вызывают снижение проницаемости плазматической мембраны
для низкомолекулярных веществ: ионов, нуклеозидов, сахаров,
некоторых аминокислот и полиаминов Таким образом, суще-
ствует хорошо выраженная корреляция между пролифератив-
ным статусом клетки и скоростью поступления в нее питатсль-
45
Рис.17. Схема, ил-
люстрирующая рас-
пределение ионов
кальция и серосодер-
жащих глюкозами-
ногликапов в проли-
ферирующих (Р) и по-
коящихся (R) клет-
ках.
1 — Са2\ 2 — гепа-
рин, 3 — гиалуроно-
вая кислота.
ных веществ. В то же время низкая скорость проникновения
.молекул в клетку сама по себе не может служить причиной
прекращения пролиферации. Точно так же и раннее усиление
транспорта низкомолекулярных веществ в клетку после мито-
генной стимуляции (характерная составная часть плейотипи-
ческого ответа), является хотя и обязательным, но недостаточ-
ным условием для вступления покоящейся клетки в цикл.
Структура и функции хроматина
Хроматин покоящихся клеток, как правило, отличается
высокой степенью конденсации, что свойственно как живот-
ным, так и растительным клеткам разного происхождения. Чем
дольше клетки пребывают в состоянии покоя, тем более кон-
денсированным становится их хроматин.
С помощью ультрафиолетовой микроспектрофотометрии и
микрофлуориметрии было обнаружено увеличение температур-
ной устойчивости хроматина покоящихся клеток. Данные хрома-
тографии нуклеопротеидов показывают, что комплекс ДНК-
белок может находиться в двух альтернативных состояниях —
релаксированном и стабилизированном — характерных соответ-
ственно для пролиферирующих и покоящихся клеток. При этом
способность хроматина связывать интеркалирующие красители
(акридиновый оранжевый и бромистый этидий), а также актино-
мицин D снижается при переходе клеток в состояние покоя.
Описанные свойства хроматина покоящихся клеток указы-
вают на репрессированное в целом состояние генома, что
проявляется в низкой матричной активности хроматина и его
сниженной способности транскрибировать новые молекулы
46
РНК. Следует, однако, иметь в виду, что инактивация генома
далеко не всегда бывает полной, причем для каждого типа
клеток характерна определенная степень подавления активно-
сти ядра. Это происходит потому, что переход в состояние покоя
сопровождается, с одной стороны, инактивацией генов, про-
дукты которых контролируют прохождение клеточного цикла,
а с другой, стороны, напротив, экспрессией генов, обеспечива-
ющих дифференцированное состояние клеток данного типа,
иначе говоря выполнение ими специализированных функций
(подробнее см. на стр. 36 и в главе IX).
Синтез макромолекул
Покоящиеся клетки, завершившие митоз, содержат вполо-
вину меньше РНК, чем пролиферирующие клетки. Одна из
причин этого — снижение транскрипционной активности хро-
матина. В то же время степень изменения транскрипции отдель-
ных классов РНК варьирует в зависимости от типа клеток.
Необходимо также принимать во внимание, что конечное
количество каждого класса РНК определяется координирован-
ной регуляцией нескольких событий, включающих в себя син-
тез предшественников РНК в ядре, их процессинг, перенос в
цитоплазму и деградацию. Эти события могут быть затронуты в
покоящихся клетках разных объектов лишь частично или же
избирательно, однако в конечном итоге всегда наблюдается
снижение общего уровня образования РНК.
Скорость синтеза белка в покоящихся клетках также в
несколько раз ниже, чем в пролиферирующих, что может
происходить вследствие уменьшения количества цитоплазма-
тической матричной РНК (мРНК) и транспортной РНК (тРНК),
ограниченного числа функционально активных рибосом, со-
бранных в полисомы, а также изменениями трансляционного
аппарата снижением скорости связывания мРНК с рибосома-
ми, замедлением элонгации полипетидной цепи и другими
причинами. В функционирование белок-синтезирующего ап-
парата вовлекается актиновый цитоскелет, который претерпе-
вает реорганизацию в покоящихся клетках (Shestakova et al.,
1993). Несмотря на то, что не каждый из перечисленных
процессов может затрагиваться при переходе клеток в состоя-
ние покоя, происходящие изменения в совокупности приводят
к двукратному снижению в них общего количества белка.
47
Обновление макромолекул
Метаболизм покоящихся клеток характеризуется повыше-
нием скорости обновления, или кругооборота (turnover) макро-
молекул, включающего в себя процессы их деградации и ресин-
теза.
Рибосомная РНК (рРНК) практически полностью стабильна
в активно пролиферирующих клетках и сравнительно быстро
обменивается в покоящихся (табл. 2). Более стабильна в проли-
ферирующих клетках и тРНК. Что касается цитоплазматичес-
кой мРНК, то она не является стабильной ни в пролифериру-
ющих, ни в покоящихся клетках, однако в последних она, как
правило, менее стабильна. Оценить это бывает иногда непросто
по причине наличия в различных типах клеток короткоживущих
и долгоживущих молекул мРНК. Долгоживущие мРНК, сохра-
няющие матричную активность, могут участвовать в образова-
нии белка, обеспечивая быстрый ответ покоящихся клеток на
митогенный стимул в случае длительного пребывания клеток в
состоянии пролиферативного покоя.
Скорость обновления белка в покоящихся клетках также в
целом выше, чем во время пролиферации, хотя встречаются и
отклонения от этого правила, зависящие от типа клеток и
свойств отдельных белков. Причиной ускоренного обновления
белка может служить его быстрая деградация, однако в некото-
рых случаях отмечена одинаковая скорость распада белков в
Таблица 2. Время обновления РНК и белка в пролиферирующих
(Р) и покоящихся (R) клетках
Клетки	Макромолекулы	Период начужизни макромолекул (ч)	
		Р-клетки	R-клстки
Клетки куриного эмбриона	рРНК	Полностью стабильна	35-45
Фибробласты мыши 3T6			*'		60
Фибробласты хомячка BHK			25
Фибробласты мыши 3T6	тРНК	60	36
Фибробласты мыши ЗТЗ	мРНК	18	6-7
L-клетки	Короткоживущие белки	29	Н
48
Таблица 3. Скорость обновления макромолекул в пролиферирую-
щих (Р) и покоящихся клеток (R) клетках (условные ед./мин)
Деградация вещества в R-клстках ускорена
Клетки	П роцесс		
	синтез	деградация	обновление вещества
Р	10	1	10%
R	5	5	100%
Деградация вещества в Р и R-клетках одинакова
Клетки	Процесс		
	синтез	деградация	обновление вещества
Р	10	5	50%
R	5	5	100%
пролиферирующих и покоящихся клетках. Тем нс менее обнов-
ление белков в состоянии покоя ускоряется. Простые примеры,
поясняющие, каким образом при снижении общей скорости
синтеза белка и разной степени его деградации может возрас-
тать скорость его обновления, приведены в табл. 3. В отличие от
пролиферирующих клеток, которые используют новообразо-
ванные белки в основном для своих нужд (удвоение массы,
регуляторные функции и т.д.), покоящиеся клетки легко избав-
ляются от синтезируемых белков, выделяя их, наряду с другими
продуктами метаболизма, в окружающую среду.
Появление в покоящихся клетках новых белков
При переходе клеток в состояние покоя изменяется не
только количественное содержание белков, но также и их
состав. Так, гистон Н1 ° (субфракция хромосомного белка —
гистона Н1) обнаруживается преимущественно в покоящихся
клетках и быстро исчезает при действии митогенов. Нуклеосо-
мы покоящихся клеток содержат также некоторые субфракции
гистонов (в частности, Н2А), которые синтезируются только в
состоянии покоя.
49
В последние годы с помощью моноклональных антител в
покоящихся клетках выявлены белки, считающиеся их специ-
фическими маркерами, поскольку они в обычных условиях не
встречаются в пролиферирующих клетках К их числу относит-
ся статин — белок с мол. массой 57 кД, присутствующий в
нуклеоплазме и ядерной оболочке покоящихся фибробластов и
терминально дифференцированных кератиноцитов (о других
белках, в том числе регуляторных — см. гл. X).
Таким образом, несмотря на снижение общего количества
вырабатываемых макромолекул, при переходе клеток в состоя-
ние покоя в них начинают синтезироваться новые белки,
отсутствующие или встречающиеся в ничтожных количествах
во время прохождения клеточного цикла. Это позволяет заклю-
чить, что покоящимся клеткам присущ особый метаболический
статус, проявляющийся в характерном для этого состояния
наборе синтезируемых молекул.
Активность ферментов анаболизма и катаболизма
Активность анаболических ферментов, катализирующих
образование макромолекул, значительно снижается при пере-
ходе клеток в состояние пролиферативного покоя. Это касается
в первую очередь всех основных ферментов, участвующих в
репликации ДНК. В покоящихся клетках самых разных типов
многократно снижается активность ДНК-полимеразы а, ответ-
ственной за 90% тотального синтеза ДНК, и орнитиндекарбок-
силазы — фермента, катализирующего первый этап биосинтеза
полиаминов, связанный с началом пролиферации клеток. От-
мечается снижение активности ферментов, участвующих в фос-
форилировании пиримидиновых оснований, входящих в состав
ДНК (тимидинкиназы и дезоксицитидинкиназы), и ферментов,
катализирующих разрыв и воссоединение фосфодиэфирных
связей в молекуле ДНК (топоизомераз I и II). Активность
ферментов, катализирующих метаболические пути образования
РНК и белков, в целом также существенно снижается при
переходе клеток в состояние покоя.
В противоположность этому, в покоящихся клетках наблю-
дается повышенная активность многих ферментов катаболизма
(табл. 4). Первые доказательства усиления такой катаболичес-
кой активности были получены при исследовании лизосом —
органелл, участвующих в аутолизе клеток путем образования и
50
Таблица 4. Повышение активности ферментов катаболизма
в покоящихся клетках
Тип клеток	Фермент
Фибробласты человека Фибробласты мыши ЗТЗ Клетки мыши ЕМТ6 L-клетки Клетки гепатомы Ройбсра К четки крысы PC 12 Клетки гепатомы 3924 Kcci ютрапе i члаптаты карий ном ы толстой кишки человека Клетки ки гайского хомячка Клетки печени крысы Клетки Нс La Диплоидные фибробласты человека WI-38 Фибробласты мыши ЗТЗ	Гидролазы, связанные с лизосомами Ацетил холинэстераза. катепсин D Фенилаланин гидроксилаза Т । |розннгидроксилаза П и ри м иди 111 чуклеозидазы Пурин нуклеозидазы Л а ктатде гид роге н аза Дегидрогеназа цикла трикарбоновых кислот Кислая фосфатаза Фосфодиэстераза cG МР Сериновая протеаза
выделения гидролитических ферментов. Оказалось, что культи-
вируемые покоящиеся клетки содержат большое число аутофа-
гических вакуолей, гидролитическая активность которых кор-
ре л и рует снакоплениемлип идо в. У вел и ч е н и е а кти в н ости л и зо -
сомных ферментов в покоящихся клетках может быть предот-
вращено добавлением ингибиторов синтеза белка, что свиде-
тельствует об индукции их образования при переходе клеток в
состояние покоя. Имеются также данные об активации в поко-
ящихся клетках других (нелизосомных) ферментов катаболизма
(см. табл. 4).
Пролиферативный покой — активное метаболическое
состояние клетки
Итак, мы видим, что клетки, перешедшие в состояние
пролиферативного покоя, отличаются весьма своеобразным
метаболическим статусом по сравнению с пролиферирующими
клетками (табл. 5). С одной стороны, их характеризует значи-
тельная метаболическая инертность, проявляющаяся в сниже-
нии притока питательных веществ через наружную мембрану,
конденсации хроматина и уменьшении количества вновь обра-
зуемых макромолекул. С другой стороны, в покоящихся клетках
51
Таблица 5. Метаболические особенности покоящихся клеток
Снижение проницаемости наружной
мембраны
Конденсация хроматина, снижение его
м атр и ч н о й а кти в 11 ости
Уменьшение образования макромолекул
Ускорение обновления РНК и белка
Повышение активности ферментов
катаболизма
избирательно активируются отдельные метаболические процес-
сы: ускоряется обновление макромолекул и повышается актив-
ность ферментов катаболизма.
Возникают следующие вопросы. Являются ли обнаруживае-
мые в покоящихся клетках активные метаболические процессы
характерными признаками состояния пролиферативного покоя
как такового, а не реакциями, предшествующими или сопут-
ствующими возможной гибели клеток в отсутствие пролифера-
ции? И, если справедливо первое предположение, то в чем
заключается биологический смысл подобной активации?
Прежде, чем попытаться ответить на эти вопросы, уместно
сделать небольшое отступление. В этической системе чань-
буддизма существует сложная категория «увей» — недеяние, что
обычно трактуется европейскими синологами как пассивность
и непричастность. Швейцер же усмотрел в этом понятии наи-
высшую, совершенную форму поведения субъекта, когда его
деятельность не нуждается в показной активности, а направлена
на достижение самой важной цели, хотя и скрыта от глаз
постороннего наблюдателя Что же происходит с клеткой,
переходящей в состояние пролиферативного покоя? Налицо,
казалось бы, ее общая метаболическая инертность, однако при
ближайшем рассмотрении в ней можно увидеть признаки изби-
рательной и целенаправленной активации отдельных процес-
сов, назначением которых служит, как будет ясно из дальней-
шего, поддержание жизнеспособности клетки в отсутствие
воспроизведения.
Это заключение иллюстрирует рис. 18, где условно изобра-
жен характер синтеза основных макромолекул в клетке, находя-
щейся в различных состояниях. В пролиферирующих клетках
(А) на протяжении клеточного цикла происходит редупликация
ДН К, а также удвоение количества РНК и белка. По окончании
митоза содержание макромолекул в клетке возвращается к
52
Рис. 18. Схема, иллюстрирующая условное соотношение в содержа-
нии ДНК (1), РНК (2) и белка (3) в клетках, находящихся в состоянии
пролиферации (А), покоя (Б) и несбалансированного роста (В).
исходному (Б). Если искусственно подавить синтез ДНК каким-
либо ингибитором, не влияющим на образование РНК и белка
(В), то наблюдается явление так называемого несбалансирован-
ного роста, когда клетка аномально увеличивается в размерах и
затем погибает. В отличие от этого, покоящиеся клетки (Б)
активно предотвращают избыточное образование РНК и белка,
что поддерживает внутриклеточное содержание макромолекул в
состоянии равновесия, необходимого для жизнедеятельности
клетки. На рис. 19 соотношение тех же событий представлено
в несколько другом аспекте, иллюстрирующим способность
Рис. 19. Схема, иллюстрирующая возможность длительного пребы-
вания клеток в состоянии пролиферативного покоя: А — репродукция
клеток, Б — самоподдержанис клеток без воспроизведения, В — гибель
клеток вследствие несбалансированного роста. Стрелками обозначены
переходы клеток из одного состояния в другое; тонкими стрелками —
недостаток поступления питательных веществ извне, компенсируемый
частичной аутофагией.
53
покоящихся клеток (Б) компенсировать недостаток поступле-
ния питательных веществ извне путем частичной аутофагии,
вызываемой активацией гидролитических ферментов лизосом-
ного аппарата.
Таким образом, если пролиферирующие клетки поддержи-
вают себя посредством воспроизведения, то в покоящихся
клетках существует механизм самоподдсржания без воспроиз-
ведения, препятствующий их гибели в неблагоприятных усло-
виях и позволяющий им пребывать в состоянии покоя неогра-
ниченное время.
Теперь известно, что в покоящихся клетках активируются и
другие метаболические реакции, назначением которых служит,
помимо поддержания жизнеспособности, также и предотвра-
щение возврата клетки к пролиферации. Одним из таких про-
цессов можно считать уже упоминавшуюся аккумуляцию ионов
кальция на поверхности покоящихся клеток, являющуюся час-
тью механизма стабилизации наружной мембраны с последую-
щим снижением поступления питательных веществ в клетку,
утратой подвижности и прекращением пролиферации. Впрочем
необходимо помнить, что роль ионов кальция в метаболизме
клеток многообразна и не является специфической в инициа-
ции событий клеточного цикла. К этому вопросу мы еще
вернемся позднее.
При переходе клеток в состояние пролиферативного покоя
наблюдается повышение активности некоторых ферментов,
принимающих участие в модификации хроматина, в частности,
его деацетилировании, что снижает транскрипционную актив-
ность и в конечном итоге тормозит пролиферацию. Другим
примером может служить активация в покоящихся клетках
фермента поли(АОР-рибозо)-полимеразы, способной сшивать
молекулы гистона Н1, расположенные в межнуклсосомных
участках хроматина, и способствующей таким образом его
конденсации, что, как мы видели, характеризует состояние
покоя.
В поддержании состояния покоя существенную роль играет
также усиление реакций фосфорилирования белков с участием
сАМР-зависимых и сАМР-независи.мых протсинкиназ. На рис.
20 схематически изображено, каким образом сАМР-зависимая
нротеинкиназа может препятствовать синтезу белка в культуре
фибробластов путем фосфорилирования ингибитора, функция
54
Рис.20. Участие сАМР-зависимых протеин киназ в поддержании
состояния покоя.
которого в фосфорилированном состоянии заключается в по-
давлении инициации процесса трансляции (левая часть рисун-
ка), а также воздействием на другие метаболические реакции
(правая часть рисунка).
Биологический смысл избирательной активации
метаболических процессов в состоянии пролиферативного
покоя
Как примирить две, казалось бы, противоположные тенден-
ции в поведении клеток: с одной стороны, стремление к
непрерывному размножению, обеспечивающему «биологичес-
кое бессмертие», а с другой — способность на длительное время
прерывать 11рол иферагтию?
Известно, что каждая отдельная клетка имеет ограниченную
продолжительность жизни и предел роста, но оба эти ограниче-
ния преодолеваются при делении исходной клетки с образова-
нием двух новых. Вместе с тем, реальные клеточные системы
постоянно сталкиваются с воздействиями, неблагоприятными
для воспроизведения. Поэтому еще на раннем этапе эволюции
клеткам необходимо было выработать механизм, позволяющий
использовать благоприятные возможности для репродукции и
прерывать ее при неблагоприятных условиях. Эта задача была
55
решена таким образом, что каждая клетка приобрела способ-
ность находиться в двух состояниях — активной пролиферации
и пролиферативного покоя, когда она выходит из клеточного
цикла, но полностью сохраняет жизнеспособность и пролифе-
ративный потенциал.
Покоящиеся клетки становятся в целом более инертными в
метаболическом отношении, чем пролиферирующие. Переход в
состояние покоя у прокариотов и низших эукариотических
организмов нередко сопровождается формированием спор, цист
и подобных образований, благодаря чему клетки успешно
переносят неблагоприятные условия.
В то же время в покоящихся клетках избирательно акти-
визируются отдельные метаболические реакции. Среди процес-
сов, обеспечивающих жизнедеятельность покоящихся клеток,
особенно существенны повышение скорости обновления мак-
ромолекул и активация ферментов катаболизма (табл. 6). Повы-
шенная активность ферментов катаболизма обусловливает час-
тичную аутофагию покоящейся клетки, компенсирующую не-
достаток поступления в нее питательных веществ. Ускоренное
обновление РНК и белков, наряду с возможностью экскреции
последних, препятствует несбалансированному росту и гибели
покоящихся клеток, а также обеспечивает их устойчивость к
внешним воздействиям за счет более активного разрушения
поврежденных молекул, которые менее стабильны, чем нор-
мальные.
Избирательная активация отдельных метаболических про-
цессов в состоянии пролиферативного покоя присуща как
низшим, гак и высшим организмам и может рассматриваться
как единый принцип существования покоящихся клеток. Спо-
собность же клеток переходить в состояние покоя является, как
мы видели, общим свойством живых систем, приобретенным в
процессе эволюции.
56
Таблица 6. Поддержание жизнеспособности покоящихся клеток
Активация
ферментов
катаболизма
Ускоренное
обновление
макромолекул
Пополнение пула
предшественников
липидов
Разрушение
дефектных
молекул
Компенсация недостатка
питательных веществ
Постоянство количества
РНК и белка
Постоянство объема
и массы
Быстрая реакция па
изменения окружающей
среды
Литература
Епифанова О.И., Терских В.В., Полуповский В.А. — «Покоящиеся
клетки», 1983, М., Наука.
Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. — «Регуляторные
механизмы пролиферации клеток», 1988, Итоги науки и техники,
том 10, М., ВИНИТИ.
Завадская Е.В. — «Культура востока в современном западном мире»,
1977, М., Наука.
Shestakova Е.А., Motuz L.P., Gavrilova L.P. — Cell Biol. Intern., 1993, 17,
417-421.
Wang E. - J.Cell Biol., 1985 a, 100, 545-551.
Wang E. - J.Cell BioL, 1985 b, 101, 1695-1701.
57
ГЛАВА V. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА.
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ (ЭКЗОГЕННЫЕ)
РЕГУЛЯТОРЫ
Общие принципы регулирования в живых системах
Следует подчеркнуть, что назначение регуляторных меха-
низмов клеточного цикла состоит не в регуляции прохождения
цикла как такового, а в том, ч гобы обеспечить в конечном счете
безошибочность распределения наследственного материала в
процессе репродукции клеток. Поэтому целесообразно вначале
рассмо греть общие принципы регулирования в живых системах.
Вопрос этот имеет свою историю, которую важно знать хотя бы
в общих чертах, поскольку современные представления о регу-
ляции юл сточного цикла (а, если говорить шире, то о регуляции
размножения клеток в целом организме) возникли, естествен-
но, не сами по себе, а как логическое развитие идеи, высказан-
ных выдающимися учеными задолго до нашего времени. При-
чем некоторые из ранее введенных понятий так прочно вошли
в научный лексикон, что ими и по сей день широко пользуются
в естествознании.
Все биологические образования характеризуются наличием
более или менее сложной системы регуляторных механизмов,
обеспечивающих возможность их приспособления к изменяю-
щимся условиям. В пределах живого организма можно выделить
различные уровни регуляции, складывающиеся в определенный
иерархический порядок регулирования. В упрощенном виде
такую схему регулирования изобразил известный биолог Пауль
Вейсс (рис. 21). Смысл се заключается в том, что она отражает
постоянное взаимодействие внутренних и внешних частей (ком-
понентов) живой системы, представляющей собой единую сеть
регуляции, охватывающую и молекулярный, и надклеточный
уровни, а также окружающую организм среду. Проще говоря, на
всех уровнях системы действует один и тот же принцип регуля-
ции.
Основным назначением совокупности регулирующих меха-
низмов в живых объектах служит устранение или ограничение
действия факторов (шумов), нарушающих постоянство внут-
ренней среды объекта. Понятие о постоянстве внутренней
среды организма ввел в биологии еще один гигант прошлого
58
Рис.21. Схема возможных взаимодействий в организме, а также
живой системы с окружающей средой по Вейссу.
столетия Клод Бернар в своих знаменитых «Лекциях о телесных
жидкостях» (1855-1856). Роль этого ученого в развитии физио-
логии поистине уникальна. Будучи уже всемирно известным
практикующим врачом — основателем блестящей школы физи-
отерапевтов, Клод Бернар неожиданно обратился к лаборатор-
ным исследованиям на животных, что потребовало от него
большого мужества и немалых усилий. Он плохо знал основы
биохимии и с трудом овладевал навыками препаративной рабо-
ты. В то же время Бернар полагал, что ему повезло, так как он
мог продвигаться шаг за шагом, не будучи ничьим апологетом.
«Я был избавлен от необходимости следовать сумме принятых
знаний, что позволило мне прийти к совершенно свежим
взглядам на физиологические процессы», — признается он в
своих «Заметках».
Результатом почти двадцатилетних исследований Бернара
явились фундаментальные открытия в области физиологии
печени — ее гликогенной функции и роли в глюконеогенезе.
Возглавляя кафедру физиологии животных в Сорбонне, Бернар
одновременно усиленно занимается ботаникой, стремясь про-
никнуть в общие закономерности живого. Так он постепенно
приходит к основополагающему заключению о постоянстве
внутренней среды организма. В своих последних трудах Бернар
59
предстает перед нами как мыслитель, стремящийся предосте-
речь начинающих исследователей от бесплодных усилий и
разочарований. «В начале своей научной карьеры, — пишет он
в трактате «Принципы», — я растрачивал время на теории и
химеры. Я воображал, что истина лежит внутри меня, и настой-
чиво повторял одни и те же опыты, но неизменно получал один
и тот же отрицательный ответ. Впоследствии я осознал, что
борьба была неравной, и что законы природы не могут подчи-
няться моей воле. Я понял, что мы должны пользоваться
теориями только как фонарями для освещения дороги, отбрасы-
вая их по мере исчерпания». Ко всему сказанному можно
добавить, что Клод Бернар оставил нам в наследство также
подлинный шедевр эпистолярного искусства — «Письма из
Божоле», адресованные его пациентке, жене состоятельного
иностранного коммерсанта.
Понадобилось ни много, ни мало семьдесят пять лет, чтобы
идеи Клода Бернара о принципах регуляции получили даль-
нейшее развитие в трудах крупных физиологов. В 1929 году
американский ученый Уолтер Кеннон — исследователь нейро-
гуморальных взаимодействий — предложил термин «гомеос-
таз», отражающий способность организма приспосабливаться
к изменяющимся условиям среды. В 1930 году английским
физиологом Хиллом было введено другое важное понятие — о
стационарном состоянии (steady state) живых систем. С этим
понятием мы уже встречались при рассмотрении уравнений
Квастлера для изучения кинетики клеточных популяций (см.
главу П).
Развивая свои взгляды на регуляцию, и Кеннон и Хилл
исходили из представлений о том, что во внутренней среде
организма (или его части) не может быть и речи о простом
равновесии. Высокая степень постоянства среды, обеспечиваю-
щая ее устойчивое состояние, достигается утонченным балан-
сом непрерывно протекающих динамических процессов. На-
значением механизмов внутренней регуляции, иначе — авторе-
гуляции служит не только поддержание постоянства среды, но
также непрерывное приспособление системы к изменению
внешних условий для обеспечения наиболее эффективной ра-
боты всех его элементов. Другими словами, само отклонение от
нормальной функции является стимулом к восстановлению
нарушенного состояния (функция «-> отклонение).
60
Крупным достижением в развитии идеи авторегуляции яви-
лось учение Селье (1936-1966) об адаптационном синдроме как
стереотипном защитном ответе организма на раздражители
самой разнообразной природы — стрессоры. Огромное значе-
ние имело также создание нашим выдающимся биологом М.М.
Завадовским теории обратных связей между органами, извест-
ной как «принцип плюс-минус взаимодействия». На примере
взаимодействия органов эндокринной системы Завадовский
открыл и экспериментально обосновал существование регуля-
ции по принципу отрицательной обратной связи, распростра-
нив это положение на все звенья организма (1941). К сожале-
нию, эта работа была напечатана малым тиражом в виде
небольшой брошюры в самом начале войны с Германией, и в
силу обстоятельств не могла получить должного резонанса.
Скорее всего, она так и осталась неизвестной научному сообще-
ству на западе. Автором же открытия регуляции по типу отри-
цательной обратной связи стал Норберт Винер, обосновавший
это положение в своей известной книге «Кибернетика» (1948).
Действие принципа отрицательной обратной связи удобно
рассмотреть на примере регуляции работы многоферментных
систем в клетке, как это сделал Кафиани (1962). На рис. 22
буквами А-Д обозначены продукты реакций, буквой Ф с индек-
сами 1 -4 — ферменты, катализирующие реакции. В простейшем
случае ферментная реакция тормозится в силу специфического
Рис.22. Регуляция ферментной системы по механизму отрицательной
обратной связи (по Кафиани, 1962). 1 — угнетение активности фермента
непосредственным продуктом его действия (продуктное угнетение); 2 —
угнетение конечным продуктом первого фермента цепочки (ретроинги-
бирование); 3 — репрессия образования ферментной системы.
61
угнетения активности фермента непосредственным продуктом
его действия (продуктное угнетение). Однако в целом ряде
случаев имеет место так называемое ретроингибирование, когда
конечный продукт подавляет активность первого фермента
цепи реакций. Этот путь является биологически более выгод-
ным, поскольку он исключает возможность ненужного образо-
вания и накопления соединений на каждом этапе реакций.
Наконец, возможен такой способ регуляции, когда действие
конечного продукта направлено на угнетение, или репрессию
образования всей ферментной системы, иначе говоря, на гене-
тический аппарат клетки. Если в первых двух случаях речь идет
об изменении активности фермента, то в последнем случае
происходит регуляция количества его молекул, то есть налицо
иной уровень в иерархии регуляторных процессов. Подробнее
о принципах регуляции в живых системах см. в книге Епифано-
вой «Гормоны и размножение клеток» (1965).
Понятие об экзогенных и эндогенных факторах регуляции
Мы помним, что в основе регуляции размножения клеток
лежит смена состояний активной пролиферации и пролифера-
тивного покоя. Регуляторные факторы, контролирующие раз-
множение клеток, могут быть условно подразделены на две
главные группы: внеклеточные, или экзогенные, и внутрикле-
точные, или эндогенные. Экзогенные факторы находятся в
Рис. 23. Факторы, регулирующие размножение клеток: А — экзоген-
ные (внеклеточные); Б — эндогенные (внутриклеточные).
62
Рис. 24. Взаимодействие экзогенных регуляторов в контроле клеточ-
ного размножения: А, Б, В, В' — аутокринный контроль, В" —
паракринный контроль.
окружающей клетку среде и взаимодействуют с клеточной
поверхностью (рис. 23А). Соответственно, те факторы, которые
синтезируются самой клеткой и действуют внутри нее, относят-
ся к эндогенным (рис. 23Б). Такое подразделение не исключает
возможности того, что некоторые факторы, будучи эндогенны-
ми по отношению к продуцирующим их клеткам, могут выхо-
дить из них и действовать на другие клетки как экзогенные
регуляторы (рис. 24). Если регуляторные факторы взаимодей-
ствуют с теми же клетками, которые их вырабатывают, то такой
тип контроля носит название аутокринного. При паракринном
контроле синтез регуляторов всегда осуществляется другими
клетками.
Факторы роста и их участие в регуляции клеточного цикла
Поскольку в многоклеточном организме каждая клетка на-
ходится под влиянием большого числа самых разнообразных
факторов, регуляцию клеточного цикла удобнее изучать вне
организма, культивируя клетки в искусственных питательных
средах. Было замечено, что в этих условиях для нормального
размножения эукариотических клеток, помимо таких компо-
нентов, как незаменимые аминокислоты, витамины и сахара,
необходимы также соединения полипептидной природы, сти-
мулирующие вступление клеток в цикл и его прохождение. Эти
соединения получили название факторов роста. При отсутствии
или недостатке факторов роста в питательной среде клетки
переходят в состояние пролиферативного покоя.
63
Для возникновения митогенного сигнала факторам роста нет
необходимости проникать в клетку. Каждый фактор роста взаи-
модействует с чувствительными по отношению к нему специфи-
ческими рецепторами, расположенными на поверхности клетки,
вызывая модификацию структуры плазматической мембраны
Вследствие этого, на внутренней поверхности мембраны возни-
кают новые регуляторные сигналы, в передаче которых участву-
ют так называемые вторичные посредники (малые молекулы) и
группа специфических протсинкиназ. В результате происходит
активация факторов транскрипции и экспрессия генов пролифе-
ративного ответа, что в конечном итоге инициирует репликацию
ДНК и вступление клетки в митоз. Более подробно эти процессы
будут рассмотрены в разделе, посвященном механизмам переда-
чи митогенного сигнала.
В главе II уже было сказано, что стимулированные митоге-
нами клетки проходят в пререпликативном периоде несколько
этапов, отличающихся по функциональным и метаболическим
характеристикам. В 1977 году Плейджер и соавторы (Pledger et
al ) обнаружили, что для прохождения пререпликативного пе-
риода и инициации синтеза ДНК, как правило, недостаточно
воздействовать на клетки каким-либо одним фактором роста.
Под влиянием первоначального воздействия клетки лишь при-
обретают компетентность к пролиферации, то есть становятся
чувствительными к новым воздействиям, от которых уже зави-
сит их дальнейшая прогрессия в периоде G, завершающаяся
вступлением в S-период. В соответствии с этим, все факторы
роста (как и другие регуляторы размножения) были подразделе-
ны па факторы компетентности и факторы прогрессии. Совме-
стное действие нескольких факторов роста является одним из
наиболее общих принципов регуляции клеточного цикла у
многоклеточных организмов.
Прежде чем перейти к характеристике конкретных факторов
роста, следует отметить, что некоторые из них, будучи стимуля-
торами для одних типов клеток, ведут себя как ингибиторы по
отношению к другим. Более того, на особенности их воздей-
ствия (стимуляция или подавление пролиферации) могут влиять
условия культивирования клеток, а также присутствие в среде
других регуляторов.
Здесь мы остановимся только на тех факторах роста, роль
которых в регуляции размножения клеток изучена наиболее
64
Таблица 7. Основные полипептидные факторы роста, участвую-
щие в регуляции размножения клеток
PDGF EGF FGF IGF-Г (SmC) I GF-II (Sin A)	Фактор роста из тромбоцитов Эпидермальный фактор роста Фактор роста фибробластов Инсулиноподобный фактор роста 1 (соматомелин С) Инсулиноподобный фактор роста II (соматомелин А)
TGFcx TGFp	Трансформирующие факторы роста
IL-(I,2.3...) CSF-(l,2)	Интерлейкины (1.2,3 и т.д.) Факторы, стимулирующие рост клеточных колоний
подробно и которые чате всего используются в эксперимен-
тальных исследованиях по данной проблеме. На самом же деле
число известных факторов роста давно превысило сотню, и
многие из них объединены в структурно и функционально
сходные семейства. Все они представляют собой полипептиды
с молекулярной массой в пределах 7-70 кД (табл. 7).
Фактор роста из тромбоцитов (PDGF)
Этому соединению (мол. масса 30 кД) посвящена, пожалуй,
самая большая литература, среди которой выделяются работы
шведских исследователей Хслдина и Вестермарка (Hcldin,
Westermark, 1990 и др.). Освобождаясь при разрушении сосуди-
стой стенки, PDGF участвует в процессах тромбообразования и
заживления ран. В структурном отношении PDGF представляет
собой основной белок, молекула которого состоит из двух
полипептидных цепей (субъединиц) А и В, кодируемых отдель-
ными генами. Субъединицы А и В образуются путем ограничен-
ного протеолиза молекул-предшественников. Обнаружены три
изоформы молекулы PDGF: гомодимеры А-А и В-В и гетероди-
мер A-В, цепочки которых соединены дисульфидными мости-
ками (рис. 25). Эти изоформы различаются в функциональном
отношении. Дело в том, что рецепторы PDGF также представ-
ляют собой димерные молекулы, обозначаемые как аа, рр и сф.
Оказалось, что субъединица В молекулы PDGF способна связы-
ваться с обеими субъединицами рецептора — а и р, в то время
как субъединица А связывается только с субъединицей а (рис.
26). Отсюда следует, что максимальное насыщение рецепторов
PDGF, иначе говоря, наибольшая митогенная стимуляция до-
стигается при использовании изоформы В-В.
65
Молекулы-предшественники PDGF
гомодимеры
гетеродимер
Рис.25. Образование трех изоформ димерной молекулы PDGF.
Рис.26. Связывание изоформ PDGF с димерными рецепторами
66
В ранее упомянутой работе Плейджера и соавторов было
показано, что PDGF является мощным фактором компетентно-
сти для покоящихся фибробластов, а функцию факторов про-
грессии выполняют компоненты плазмы, не связанные с тром-
боцитами (такие, как незаменимые аминокислоты, эпидер-
мальный фактор роста, инсулин). В дальнейшем оказалось, что
изоформа PDGF А-А может выполнять только функцию факто-
ра компетентности, в то время как изоформы А-В и В-В
способны в значительной мере обеспечивать как компетент-
ность, так и прогрессию. Естественно, что PDGF не может
служить фактором компетентности для всех типов клеток, о чем
речь пойдет ниже.
Эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста
фибробластов (FGF) и инсулиноподобные факторы
роста (IGF)
EGF был выделен в 1972 году из подчелюстных желез мыши
в лаборатории Стенли Коэна (см. Cohen, 1987), но не сразу
привлек к себе всеобщее внимание, поскольку Коэн предпочел
досконально изучить его свойства, не прибегая к предваритель-
ным публикациям. В результате исследователи получили гото-
вый, всесторонне охарактеризованный регулятор клеточного
цикла, с которым можно было уверенно работать, а Коэн был
удостоен в 1986 голу Нобелевской премии. «Меня настолько
никто не принимал всерьез и не проявлял никакого интереса к
моей работе, что я был полностью свободен и мог отдаться ей
целиком», — сказал он в своей Нобелевской речи.
В настоящее время EGF изучен не менее обстоятельно, чем
PDGF, и широко используется при исследовании регуляции
размножения клеток, особенно на этапе передачи митогенного
сигнала. Ему посвящена обширная литература, в том числе
монография Никольского и соавторов (1987) Мол. масса EGF
составляет около 6 кД и характерной особенностью его молеку-
лы является высокое содержание тирозина. Для фибробластов
мыши, обработанных PDGF, EGF выполняет роль фактора
прогрессии, точно так же, как и для хондроцитов, приобретаю-
щих компетентность под влиянием инсулиноподобных факто-
ров роста. Впрочем известны случаи, когда клетки (например,
эмбриональные клетки крысы линии EL2) могут размножаться
в присутствии только одного EGF.
67
Семейство факторов роста фибробластов включает в себя
близкие по составу кислый (aFGF) и щелочной (bFGF) факто-
ры, которые были выделены из экстрактов клеток головного
мозга и гипофиза в лаборатории Господаровича (Gospodarowicz
et al., 1986). Оба соединения могут выполнять роль факторов
компетентности при воздействии на фибробласты и другие
клетки мезенхимного происхождения или же обеспечивать
прогрессию при стимуляции хондроцитов инсулиноподобными
факторами роста. В экспериментах FGF обычно используют в
сочетании с другими регуляторами размножения клеток. В
организме он принимает участие в процессе ангиогенеза, сти-
мулируя рост и развитие эндотелия.
Семейство инсулиноподобпых факторов роста (IGF), кото-
рые называют также соматомединами (Sm), включает в себя два
полипептида — IGF-I (Sm-C) и IGF-II (Sm-A). Оба они имеют
близкую по значению мол. массу (~7 кД), сходный аминокислот-
ный состав и образуются из более крупных молекул путем
протеолиза. К этой же группе относят и инсулин, который однако
стимулирует размножение культивируемых клеток лишь в кон-
центрациях, значительно превышающих физиологические. При
этом он способен взаимодействовать не только со своими соб-
ственными рецепторами, но и с рецепторами к IGF-I. Что
касается регуляции клеточного цикла, то, как мы уже видели,
представители семейства IGF могут выполнять роль факторов
компетентности или прогрессии, в зависимости от типа клеток.
Трансформирующие факторы роста (TGF).
Трансформирующие факторы роста исходно получили свое
название вследствие способности стимулировать в мягком агаре
рост некоторых клеточных линий, зависимых от прикрепления
к субстрату. В последующем оказалось, что их функция в клетке
значительно многообразнее, а два из них — TGFa и TGF0
принимают непосредственное участие в регуляции клеточного
цикла. Особенно это касается TGFp, считающегося в настоящее
время одним из ключевых регуляторов механизма размножения
клеток.
ТСРабыл впервые получен из кондиционированной среды,
в которой выращивали клетки, трансформированные вирусом
саркомы мыши. Он обнаруживается также в больших количе-
ствах в эмбриональных клетках млекопитающих. Характерно,
68
что молекула TGFa близка по своей аминокислотной последо-
вательности молекуле EGF, и оба фактора взаимодействуют с
одними и теми же рецепторами. При этом аффинность взаимо-
действия TGFa к рецептору выше, по сравнению с EGF.
СемействоТСЕр объединяет три изоформы молекулы: гомо-
димеры TGFpi и TGFJ32, а также гетеродимер TGF0I.2 (мол.
масса ~25 кД). Своеобразие TGF0 заключается в том, что он
обнаруживается в самых различных тканях, выполняя при этом
двоякую роль — стимулятора размножения клеток мезенхимно-
го происхождения, в том числе фибробластов, и ингибитора
размножения эпителиальных клеток. Мультифункциональная
роль TGF0 будет более подробно освещена в разделе о взаимо-
действии стимуляторов и ингибиторов клеточной пролифера-
ции.
Интерлейкины (IL) и факторы, стимулирующие рост
клеточных колоний (CSF)
Эту группу факторов роста объединяет не первичная струк-
тура, а общая функциональная направленность — участие в
реакциях клеточного иммунитета и кроветворения, где они
могут выступать и как стимуляторы, и как ингибиторы размно-
жения и дифференцировки лимфоцитов на разных этапах
иммунного ответа. Поэтому они получили название лимфоки-
нов (см. обзор: Смит, 1990).
На рис. 27 представлена схема взаимодействия разных ин-
терлейкинов в иммунном ответе клеток на проникновение в
организм чужеродной молекулы — антигена. Клетки иммунной
системы — макрофаги выделяют интерлейкин 1 (IL-I), одна из
функций которого заключается в стимуляции образования пред-
шественников В-ли.мфоцитов в костном мозге. Для полного
иммунного ответа необходимо подключение вырабатываемых в
тимусе Т-лимфоцитов. Другая функция IL-1 состоит в стимуля-
ции размножения Т-лимфоцитов, активированных антигенами
(так называемых Т-хелперов), секретирующих ключевой лим-
фокин IL-2, который непосредственно стимулирует пролифе-
рацию цитотоксических Т-клсток, уничтожающих зараженные
клетки.
В настоящее время насчитывается около двадцати различных
ли.мфокинов. Некоторые из них охарактеризованы достаточно
полно, другие изучены менее подробно, но все они выполняют
69
Рис.27. Схема взаимодействия интерлейкинов в иммунном ответе
клеток (объяснение в тексте).
определенные функции в иммунном ответе и в процессе крове-
творения. Так, IL-3 секретируется активированными Т-хелпе-
рами и стимулирует пролиферацию и созревание предшествен-
ников лимфоцитов и других кроветворных клеток, в связи с чем
его называют мульти-CSF. К группе CSF относятся гликопро-
теиды CSF-1, стимулирующий дифференцировку макрофагов,
и CSF-2, действующий на предшественники макрофагов и
гранулоцитов. Т-хелперы вырабатывают также IL-4 — белок с
мол. массой 13 кД, стимулирующий пролиферацию Т-лимфо-
цитов и тучных клеток, а цитотоксичные Т-лимфоциты секре-
тируют IL-5 (мол. масса 12,3 кД), стимулирующий пролифера-
цию и дифференцировку предшественников В-лимфоцитов.
В некоторых случаях лимфокины могут действовать и как
ингибиторы пролиферативных процессов. Показано, что IL-1
подавляет рост эндотелия, выступая как антагонист FGF, a IL-
6, вырабатываемый фибробластами, с одной стороны, стимули-
рует размножение гепатоцитов, а с другой — подавляет проли-
ферацию клеток меланомы.
70
Литература
Епифанова О.И. — «Гормоны и размножение клеток», М,. Наука, 1965.
Завадовский М.М. — «Противоречивое взаимодействие между органами
в теле развивающегося животного», М., 1941.
Кафиани К.А. — Успехи биол. химии, 1963, 5, 100-150.
Никольский Н.Н., Сорокин А.Д.. Соркин А.Б. — «Эпидермальный
фактор роста», Л., Наука, 1987.
Смит К.А. — В мире науки, 1990, N5. 16-24.
Cohen S. - In Vitro, 1987, 23, 239-246.
Gospodarowicz D., Neufeld G., Schweigercr L. — Mol. Cell. Endocrinol.,
1986, 46, 187-204.
Heldin С.-H., Weslermark B. — Cell Regulation, 1990, 1, 555-556.
Holmes F.L. — «Claude Bernard and Animal Chemistry», Harvard University
Press, Mass., 1974.
Pledger W.J., Stiles C.D., Antoniadcs H.N., Scher C.D. — Proc. Natl Acad.
Sci. USA, 1977, 74, 4481-4485.
71
ГЛАВА VI. ПЕРЕДАЧА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ
МИТОГЕННЫХ СИГНАЛОВ В ЯДРО
Рецепторы факторов роста. Мембранные белки
и вторичные посредники
При взаимодействии с чувствительными к ним клетками
экзогенные факторы роста в первую очередь соприкасаются с
клеточной поверхностью. Происходящие при этом события
схематически изображены на рис. 28.
Первая реакция клетки на воздействие факторов роста
состоит в их связывании со специфическими рецепторами (по
образному выражению Берриджа, «антеннами»), находящими-
ся в плазматической мембране. Их назначение, как и других
компонентов мембраны, о которых будет идти речь в дальней-
шем, заключается в преобразовании внешних сигналов во
внутриклеточные. В настоящее время существует обширная
литература, посвященная строению и функциям рецепторов
различных факторов роста, и здесь будут рассмотрены лишь тс
аспекты вопроса, которые необходимы для понимания принци-
па передачи в клетку митогенного сигнала.
Рецепторы полипептидных факторов роста представляют
собой преимущественно интегральные мембранные гликопро-
теиды. Их домены, способные связывать лиганды, расположены
на внешней стороне плазматической мембраны, а эффекторные
домены находятся на ее внутренней, цитоплазматической по-
верхности. После связывания факторов роста с рецепторами
образовавшиеся лиганд-рецепторныс комплексы группируются
в кластеры на внутренней поверхности мембраны и затем
подвергаются интернализации по механизму типа эндоцитоза и
разрушению с участием лизосом. Число рецепторов на поверх-
ности клетки определяется скоростью интернализации комп-
лексов, возвращением части освободившихся'от лигандов ре-
цепторов на поверхность клетки и синтезом рецепторов de novo.
В результате связывания факторов роста с рецепторами их
цитоплазматические домены приобретают способность фосфо-
рилировать определенные белки по тирозиновым остаткам.
Протеинкиназная активность рецепторов увеличивается в ре-
зультате их аутофосфорилирования, как это, например, показа-
но для рецепторов EGF и PDGF.
72
Лиганд
Рис.28. Схематическое изображение передачи митогенного сип кита в
ядро. G — G-белки, РИС — фосфолипаза С, Р1-4,5-Р2— фосфатидил-
инозит-4,5-дифосфат, DAG — диацилглицерин, 1РЭ — трифосфоинозит.
Тем временем в плазматической мембране обеспечивается
дальнейший процесс передачи информации с участием цепочки
мембранных белков, последовательно взаимодействующих друг
с другом. Подобное взаимодействие вызывает конформацион-
ную перестройку каждого следующего в цепочке белка —
изменение его структуры и функции.
Элементы, получающие информацию от первого звена —
рецептора поверхности, представляют собой мембранные бел-
ки, активирующиеся при связывании гуанозинтрифосфата (GTP)
и расщеплении его до гуанозиндифосфата (GDP). Эти белки,
получившие название G-белков, были открыты и подробно
изучены Гилманом (Gilman) и соавторами (США), удостоенны-
ми за эти исследования Нобелевской премии (см. Barnes, 1986).
73
Активированные G-белки взаимодействуют со следующим эле-
ментом цепочки — так называемым усилительным ферментом
фосфолипазой С, которая расщепляет мембранный фосфоли-
пид — фосфатидилинозит-4,5-дифосфат (Р1-4,5-Р[) на диацил-
глицерин (DAG) и три фосфо инозит (IP ), превращая таким
образом молекулы вещества-предшественника в молекулы-по-
средники, или «вторичные мессенджеры». При этом DAG и 1Р3
могут оставаться на внутренней стороне мембраны (см. обзор:
Katan, Williams, 1997).
Дальнейшие события развертываются в цитоплазме. DAG
активирует Са24- и фосфолипидзависимую протеинкиназу С,
которая, осуществляя фосфорилирование белков по остаткам
серина и треонина, посылает сигналы в ядро, a IP, стимулирует
мобилизацию кальция из внутриклеточных депо, что усиливает
реакции фосфорилирования, а также активирует транспорт Са2+
через наружную мембрану клетки.
Эти столь очевидные теперь процессы, которые можно
записать с помощью нескольких символов и стрелок, явились
плодом десятилетних усилий и поисков представителей разных
стран, в первую очередь, лабораторий, возглавляемых Беррид-
жем (Berridge, США), Мичеллом (Michell, Англия) и Нишизу-
кой (Nishizuka, Япония).
Описанный путь передачи митогенного сигнала характерен
для многих факторов роста, в частности, для PDGF. Однако
расщепление Р1-4,5-Р2на DAG и 1Р3не является обязательным
условием передачи сигнала. Известно, например, что EGF не
способствует накоплению 1Р3и слабо мобилизует Са2+из внут-
риклеточных депо. В то же время он активно участвует в
гидролизе фосфатидилхолина с образованием DAG, что косвен-
но приводит к активации протеипкиназы С. В некоторых
случаях при воздействии митогенов содержание 1Р3 возрастает
за счет фосфорилирования его предшественников с помощью
фермента трифосфоинозит(Р1-3)киназы и протекает без учас-
тия фосфолипазы С и последующего гидролизе^ Р1-4,5-Р2. Наря-
ду с фосфолипазой С, в качестве усилительного фермента,
активируемого G-белками, функционирует также аденилатцик-
лаза, которая превращает аденозинтрифосфат (АТР) в цикли-
ческий адснозинмонофосфат (сАМР), участвующий в много-
численных внутри клеточных событиях при размножении и
дифференцировке клеток.
74
На отдельных этапах в процесс передачи митогенного сигна-
ла в ядро включаются метаболические реакции, протекающие
по принципу обратной связи, что может усиливать или ослаб-
лять сигнал. Таким образом, регуляционные возможности клет-
ки в этом плане в высшей степени многообразны.
MAP-киназы и каскад их фосфорилирования
Как уже было сказано в предыдущем разделе, в результате
связывания факторов роста с рецепторами последние приобре-
тают способность фосфорилировать белки по тирозиновым
остаткам. В начале 90-х годов было установлено, что такими
белками являются преимущественно протеинкиназы, которые,
будучи активированы митогенами, вызывают каскад последова-
тельного фосфорилирования протеинкиназ как по тирозино-
вым остаткам, так и по остаткам серина и треонина, причем
процесс может переключаться с одних остатков на другие (см.
рис. 28). Эти протеинкиназы получили название МАР-киназ
(mitogen-activated protein kinases) или ERK (cxtracellular-signal-
regulatcd kinases). Они представляют собой семейство белков с
мол. массой 44 кД (ERK1) и 42 кД (ERK2) Возможность их
двоякого (dual) действия оказалась необычайно важным свой-
ством для передачи митогенного сигнала в ядро, поскольку при
этом активируются не только сами MAP-киназы, но также и
факторы транскрипции, являющиеся их субстратами. Фактора-
ми транскрипции считаются ядерные регуляторы, вызывающие
экспрессию линейно расположенных генов, в том числе генов
пролиферативного ответа. Следует особо отметить большой
вклад, который внесли в эту область исследования работы
Биохимического центра в Ницце, возглавляемого Пюисегюром
(Pouysscgur; см. Brondello et al., 1997, а также обзоры Seger,
Krebs, 1995 и Waskiewicz, Cooper, 1995).
Активация факторов транскрипции происходит, как прави-
ло, в ядре, причем MAP-киназы способны проникать в ядро
только в фосфорилированном виде. Однако в некоторых случа-
ях факторы транскрипции могут пребывать в латентном состо-
янии в цитоплазме, где и происходит их активация, после чего
они уже сами перемещаются в ядро (Karin, Hunter, 1995). Весь
процесс передачи митогенного сигнала от момента взаимодей-
ствия фактора роста с рецептором до начала экспрессии генов
пролиферативного ответа занимает 8-10 минут
75
Гены пролиферативного ответа. Протоонкогены
В литературе нередко встречается такое понятие как «гены
клеточного цикла». Эти гены весьма многочисленны, поскольку
кодируемые ими белки регулируют прохождение разных этапов
цикла. Естественно, что в центре внимания оказались гены,
экспрессия которых происходит при переходе клетки от состо-
яния покоя к пролиферации, то есть в момент ее вступления в
цикл. Такие гены получили название генов раннего пролифера-
тивного ответа, или «самых ранних» генов (immediate early
genes), в отличие от «поздних» генов, которые экспрессируются
в пререпликативном периоде на границе периодов G/S. «Ран-
ние » гены включают в себя довольно обширное семейство, куда
входят некоторые протоонкогены, а также другие гены. Изуче-
ние их экспрессии осуществляется с помощью современных
методов молекулярной биологии и генной инженерии, таких
как блотгибридизация мРНК с ДНК-пробами; прямая транс-
фекция генов или их участков в клетки путем встраивания
конструированных плазмид в ДНК; микроинъекции продуктов
активности генов и антител против этих продуктов с последую-
щей иммунофлуоресценцией и других приемов.
В последние два десятилетия детально изучены многочис-
ленные гены вирусов, функция которых связана с неопласти-
ческой трансформацией клеток. Они получили название вирус-
ных онкогенов (v-o//c). В дальнейшем было установлено, что
нормальные клетки позвоночных животных и других организ-
мов содержат целые семейства эволюционно консервативных
генов, ДНК которых сходна по нуклеотидной последовательно-
сти с ДНК вирусных онкогенов. Эти консервативные гены
потенциально способны трансформировать клетки, однако не
проявляют свою способность в обычных условиях. Они называ-
ются клеточными онкогенами (с-опс), или протоонкогенами,
поскольку было показано клеточное происхождение вирусных
онкогенов.
Исследование протоонкогенов проводится путем анализа
продуктов их активности — онкобелков. В табл. 8 представлены
данные о функциях наиболее хорошо изученных онкобелков,
участвующих в регуляции событий клеточного цикла. Названия
конкретных протоонкогенов обычно соответствуют первым
буквам или сокращенным обозначениям опухоли, вызываемой
гомологичным онкогеном вируса (например, ген sis — произ-
76
Таблица 8. Протоонкогены и онкобелки в клеточном цикле
Протоокоген	On кобел ок	Максимальная экспрессия
sis	Идентичен В-цеии молекулы	Одинакова на протяжении
	PDGF	клеточного цикла
erb В	Тирозинкиназа (усеченный рецептор EGF)	Н«	|Н»	НЧ
ras	G-бслок (р21)	Граница G|/S
raf	Серин/треонинкиназа	ПК	Ц1«
fos	Связан с ядерным матриксом	Ранний п ре ре пл и кати в н ы й
jun	• 1*1	им	период (15-20 мин)
тус	•I«|	mi	мн	„	-(1-2ч)
myb	mi	нм	G|/S и S
водное от Simian sarcoma; ген erbB — от erythroblastoma; ras —
от rhabdomyosarcoma и т.п.).
Продукт гена sis практически идентичен субъединице В
молекулы фактора роста из тромбоцитов — PDGF. Обнаруже-
ние этого породило в начале 80-х годов очередные надежды на
скорое решение проблемы рака, что вылилось в настоящую
гонку за приоритет открытия между лабораториями Уотерфилда
(Waterfield) из Института раковых исследований в Лондоне и
Дулитла (Doolittle) из Национальных институтов здоровья в
Бетесде, США, вплоть до опубликования предварительных
данных в газетах. К сожалению, большие надежды не оправда-
лись, но все же было установлено, что клетки могут секретиро-
вать онкобелок, кодируемый геном sis, в окружающую среду и
таким образом стимулировать размножение клеток, имеющих
рецепторы к PDGF.
Ген erbB, является наиболее изученным представителем
целой группы протоонкогенов (в том числе генов пей, ros,fms и
kit), которые объединяет то, что их продукты представляют
собой тирозинкиназы, гомологичные по аминокислотной пос-
ледовательности рецепторам эпидермального фактора роста,
локализованным в наружной мембране. В частности, продукт
гена erbB можно считать усеченным рецептором эпидермально-
го фактора роста, соответствующим его внутреннему домену.
Продукт протоонкогена s/'c-тирозинкиназа, также расположен-
ная в плазматической мембране, осуществляет фосфорилирова-
ние предшественников фосфатидилинозит-4,5-дифосфата, уча-
ствуя в общем процессе передачи митогенного сигнала.
77
Семейство протоонкогенов ras включает в себя несколько
близких по первичной структуре генов, гомологичных онкоге-
нам вирусов рабдомиосаркомы мыши Кирстена (Ki-ras) и Харви
(Ha-ras), а также онкогены, выделенные из клеток нейроблас-
томы (N-ras) и карциномы мочевого пузыря человека (EJ-ras).
Продукт генов ras — белок р21 локализован на внутренней
поверхности плазматической мембраны и может быть отнесен
к группе G-белков, участвующих в регуляции активности фос-
фолипазы С и аденилатциклазы при взаимодействии факторов
роста с рецепторами. Экспрессия гена ras осуществляется пре-
имущественно в конце периода G( однако функция кодируемо-
го им белка не ограничивается участием в инициации синтеза
ДНК. Как мы видели, он служит одним из звеньев в цепи
передачи митогенного сигнала и должен присутствовать в
клетке при инициации событий следующего цикла.
Другим, нижерасположенпым (downstream) звеном в переда-
че сигнала является продукт одного из группы протоонкогенов
raf~ серин/треонипкиназа Rafi, активируемая непосредствен-
но белком р21который был ранее активирован вышераспо-
ложенным (upstream) звеном цепи передачи — ферментом
тирозинкиназой, представляющей собой внутреннюю часть
рецептора фактора роста, расположенную в плазматической
мембране. Rafi, в свою очередь, фосфорилирует и активирует
иижерасположенную MAP-киназу, способную к двоякому фос-
форилированию по остаткам тирозина и серина/треонина (ее
называют МЕК — mitogen-activated extracellular signal-regulated
kinase). Функция МЕК заключается в фосфорилировании ERK1
и ERK2, которые только в таком виде проникают в ядро, где
сами фосфорилируют факторы транскрипции и вызывают экс-
прессию генов раннего пролиферативного ответа. Указанный
процесс схематически представлен на рис. 29. При этом следует
иметь в виду, что белки, кодируемые протоонкогенами га/и ras,
участвуют в митогенной стимуляции только в случае определен-
ного (умеренного) уровня своей активности, в то время как в
условиях их интенсивной активации наблюдается торможение
пролиферативных процессов.
Ядерная локализация белков, кодируемых протоонкогенами
fosjun, тус и myb, сразу же позволила высказать предположение,
ко торое в дальнейшем подтвердилось, об их участии в регуляции
перехода покоящихся клеток к размножению. Особое внимание
78
Экспрессия
Рис.29. Передача сигнала от тирозинкиназ в ядро с последующей
экспрессией генов раннего пролиферативного ответа (объяснения в тексте).
привлекают к себе гены fos,jun и тус, поскольку их экспрессия
относится к ранним событиям после воздействия на клетки
митогенов. Иногда их объединяют под общим названием «семей-
ство генов компетентности» или «семейство ранних генов».
Белок, кодируемый геном fos, представляет собой фосфопро-
теид с мол. массой 55 кД. Экспрессия гена fos резко увеличива-
ется уже через 15-20 мин после стимуляции клеток митогенами.
Для него характерна транзиторность экспрессии. Образующие-
ся при этом молекулы мРНК и белка деградируют уже через 40
мин после воздействия. Кроме того, ген fos образует путем
прямого стерического взаимодействия гетеродимерный транс-
крипционный комплекс с геном Jun, продукт которого —
онкобелок Jun подавляет транскрипционную активность гена
fos (классический пример ингибирования по принципу обрат-
ной связи). Особенностью гена fos является плейотропность
регуляции его экспрессии. Помимо митогенов, он реагирует на
разнообразные факторы, вызывающие дифференцировку кле-
ток и другие биологические реакции посредством активации
новых генов и кодируемых ими белков, выполняя функцию
«главного переключателя» (master switch).
79
Лиганд
Область
промотора
c-fos
Рис.30. Активация экспрессии протоонкогена c-fos с участием фак-
торов транскрипции по Карину и Хантеру, 1995 (объяснения в тексте).
Активация экспрессии гена fos в ядре происходит следую-
щим образом (рис. 30). ERK усиленно фосфорилирует фактор
транскрипции TCF (ternary complex factor), который, взаимо-
действуя с белком SRF (serum response factor, мол. масса 67 кД),
связывается с участком молекулы ДНК, называемым SRE (serum
response element) и расположенным в области промотора гена
fos, что включает транскрипционный процесс (Treisman, 1995).
Протоонкоген с-тус является самым распространенным
представителем семейства генов тус. Продукт его активности —
ядерный фосфопротеид с мол. массой 65 кД, способный связы-
ваться с ДНК и вызывать трансактивацию других генов, дей-
ствуя как фактор транскрипции. В покоящихся клетках обычно
наблюдается крайне низкий уровень гена тус, что определяется
как снижением интенсивности его транскрипции, так и ускоре-
нием посттранскрипционной деградации мРНК. Подобно он-
когенам fos и jun, тус относится к генам раннего пролифератив-
80
кого ответа, но максимум его экспрессии наблюдается позже —
через 1-2 ч после стимуляции клеток митогеном. Его экспрессия
транзиторна, однако несколько продолжительнее, чем у генаfos.
Несмотря на отчетливую временную последовательность акти-
вации генов fos/jun и тус в ответ на пролиферативный стимул,
причинная связь, а также взаимозависимость этих событий не
установлены, и их регуляция, по-видимому, осуществляется
различными путями. Опыты с прямой инъекцией гена тус в
ядра животных клеток показали, что он может действовать как
фактор компетентности, заменяя собой PDGF. При этом повы-
шение его экспрессии не является достаточным условием для
реализации всех событий периода G] и перехода клеток к
репликации ДНК. В то же время кодируемый геном тус белок
р65 используется клеткой на разных этапах цикла, в том числе
в S-псриодс и на границе периодов S/G2. Продукт протоонко-
гена mybтакже относится к категории трансактиваторов генома.
Максимальная экспрессия гена myb отмечена на границе пери-
одов G/S.
Наряду с этим, в процессе раннего пролиферативного ответа
происходит экспрессия многих генов, не относящихся к прото-
онкогенам. Они носят произвольные обозначения (JE, КС, JB,
pip92 и др.), и их участие в событиях клеточного цикла доско-
нально нс изучено.
Из всего сказанного следует, что протоонкогены являются
частью контроля нормального клеточного размножения. На
разных этапах последовательной передачи митогенного сигнала
в ядро преимущественную роль играет функция того или иного
протоонкогена. В ответ на сигнал в ядре уже через несколько
минут происходит экспрессия «ранних» генов пролиферативно-
го ответа, функция которых состоит в формировании состояния
компетентности клетки кдальнейшим пролиферативным собы-
тиям. Под влиянием факторов прогрессии происходит экспрес-
сия «поздних» генов, контролирующих прохождение клетками
пререпликативного периода и вступление в S-период.
Продукты активности «поздних» генов носят название бел-
ков-инициаторов, или индукторов репликации ДНК, и каждый
из них играет определенную роль в этом сложном процессе.
Среди данной группы белков особое внимание привлекает к
себе PCNA (proliferating cell nuclear antigen), который, как
теперь известно, служит одним из ключевых элементов регуля-
81
ции клеточного цикла. PCNA представляет собой кислый
ядерный белок с мол. массой около 30 кД. Его ген локализован
в 20-й хромосоме человека и экспрессируется через 16-18 ч
после воздействия на клетки митогеном. PCNA является 6-
кофактором ДНК-полимеразы и принимает непосредственное
участие в инициации синтеза ДНК Его роль в регуляции
событий клеточного цикла будет освещена подробно в главе X.
Литература
Barnes D.M. - Science, 1986, 234, 286-288.
Berridge M.J — BioEssays, 1995, 17, 491-499.
Brondello J.-M., Brunet A., Pouyssegur J., McKenzie F.R. — J. Biol. Chem.
1997, 272, 1368-1376.
Karin M., Hunter T. — Current Biol., 1995, 5, 747-757.
Katan M., Williams R.L. — Sem Cell Dev. Biol., 1997, 8, 287-296.
Michell R.H. — Cell Calcium, 1982, 3, 429-440.
Nishizuka Y. — Science, 1992, 258, 607-614.
Seger R , Krebs E G. - FASEB J., 1995, 9, 726-735.
Treisman R. - EMBO J., 1995, 14, 4905-4913.
Waskiewicz A J., Cooper J.A. — Curr. Opin. Cell Biol., 1995, 7, 798-805.
82
ГЛАВА VII. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ
(ЭНДОГЕННЫЕ) РЕГУЛЯТОРЫ КЛЕТОЧНОГО
ЦИКЛА
Пересмотр представлений о клеточном цикле и состоянии
пролиферативного покоя
Анализ путей передачи экзогенных сигналов в ядро так
поглотил внимание ученых, что эндогенные факторы, регулиру-
ющие прохождение клеточного цикла, на длительное время
остались вне поля их зрения. Как ни удивительно, побудили к
изучению этого вопроса работы, казалось бы, далекие, от
основногорусла исследований клеточного цикла, но неожидан-
но поставившие под сомнение всю его концепцию и даже само
это понятие.
Первая группа исследований связана с разработкой методов
соматической гибридизации клеток млекопитающих, иначе
говоря, их слиянием в культуре. На них мы подробнее остано-
вимся несколько позже. Вторая линия работ представляет собой
анализ поведения так называемых температурочувствительных
мутантов клеточного цикла. Основоположником этого направ-
ления считается американский исследователь Хартуэл (Hartwell,
1976). Темпсратурочувствительные мутанты размножаются при
культивировании только в условиях определенной (пермиссив-
ной) температуры, но прекращают прохождение клеточного
цикла после изменения температуры на непермиссивную. В
настоящее время описано большое число мутантов с генетичес-
кими дефектами по разным процессам в клеточном цикле,
многие из них — с дефектами по прохождению прерспликатив-
ного периода после митогенной стимуляции.
Принципиально важными в плане изучения регуляции кле-
точного цикла явились опыты, выполненные в лаборатории
Прескотта (Liskay, Prescott, 1978) на культуре клеток китайского
хомячка V79-8; у клеток этой линии отсутствует в клеточном
цикле период Gp и их обозначают как клетки G" Оказалось,
что, ухудшая условия культивирования путем обеднения пита-
тельной среды, можно получить мутантную линию, клетки
которой проходят период G, (клетки G*); однако при слиянии
между собой клеток G“h G* всегда доминирует фенотип G[(pnc.
31). На основании этого был сделан вывод, что наличие периода
83
,М ,S, Ge , M ,S j Рис.31 Характеристи-
G, * Gt
Gt(I) * Gt® —* Gt
циклогсксилнд
ки клеток G[ — линии
V79-8 поданным Лиске и
Прескотта. М, S, G, —
периоды клеточного цик-
ла; G“ — клетки, у кото-
рых отсутствует период G ,
в цикле; G~— клетки, у
которых существует пери-
од G, в цикле; G] (I) и G',
(II) — клетки, у которых
появляется период G при разных условиях культивирования; X — знак
слияния клеток.
G, в клеточном цикле является следствием генетического де-
фекта. В пользу подобного соображения говорили также резуль-
таты опытов, в которых производили слияние между собой
клеток СТ полученных путем создания различных дефектов
(недостаток сыворотки, изъятие из среды незаменимых амино-
кислот и т.п.). В таких случаях происходила комплементация, то
есть дефекты устранялись, и вновь возникал фенотип G,.
Подавление синтеза белка с помощью циклогексимида, напро-
тив, вызывало появление фенотипа G Исходя из совокупности
проведенных исследований, авторы пришли к заключению
принципиального характера, а именно, что в периоде G( клеточ-
ного цикла эукариотов клетка не несет никаких специфических
функции, и этот период возникает лишь в том случае, если
отсутствуют нормальные условия размножения клеток.
Универсальная модель размножения клеток
К заключению об отсутствии периода G( в клеточном цикле
пришел также Купер (Cooper, 1979), который предложил уни-
версальную модель размножения клеток для всех прокариоти-
ческих и эукариотических организмов, или модель «континуу-
ма» (рис. 32). В основу модели было положено допущение, что
в каждой клетке непрерывно синтезируется некий инициатор
белковой природы. Синтез ДНК начинается как только дости-
гается пороговая концентрация инициатора. Клетка проходит
периоды S и G 2 (у бактерий они обозначаются буквами С и D),
а затем вступает в митоз при любом уровне инициатора. Соглас-
но модели Кунера, митоз лишь завершает начавшийся процесс,
84
Рис.32. Универсальная модель размножения клеток Купера (модель
«континуума»). I — инициатор синтеза ДНК, S(C) — период синтеза
ДНК, G, (D) — премитотический период, М — митоз.
но сам ничего в дальнейшем не обусловливает, и для следующе-
го раунда синтеза ДНК вновь требуется достижение нужного
порога инициатора. Любые воздействия, препятствующие это-
му событию, должны неизбежно вызывать появление в клеточ-
ном цикле периода Gp который является, таким образом,
следствием дефектов, связанных с ухудшением условий роста,
а период Go (иначе говоря, состояние покоя) возникает, по
мнению Купера, в результате еще больших дефектов.
Благодаря своей простоте, универсальная модель снискала
на первых порах немало приверженцев. Однако постепенно
выяснилось, что ни одно из ее основных требований не соответ-
ствует результатам, полученным на клетках высших эукариотов.
Помимо частных противоречий, подробно рассмотренных в
более ранних публикациях (Епифанова и др., 1988), существен-
ным недостатком модели является невозможность объяснить с
ее позиций избирательную активацию отдельных метаболичес-
ких процессов при переходе клеток в состояние покоя, в первую
очередь, синтез новых специфических белков (см. главу IV).
Кроме того, как теперь стало известно, именно в митозе,
которому Кунер отводил роль лишь завершающего этапа в
процессе деления клетки, начинается активация МАР-киназ
для следующего клеточного цикла, а также преобразование и
транспорт при участии веретена деления некоторых ключевых
белков-регуляторов. Наконец, переход клеток к репликации
ДНК, который Купер связывал с повышением до необходимого
уровня внутриклеточной концентрации инициатора, то есть
85
эндогенною стимуляторе! пролиферации, можно в равной мере
объяснить снижением концентрации эндогенного ингибитора
пролиферации. Иными словами, правомерно представить себе
но меньшей мере два типа эндогенного контроля вступления
покоящихся клеток в цикл: позитивный и негативный. Провер-
ка этого допущения была осуществлена в опытах с применением
метода клеточной гибридизации.
Изучение эндогенной регуляции размножения клеток
методом клеточной гибридизации
Автор метода клеточной гибридизации — английский иссле-
дователь Харрис (Harris, 1965). Слияние клеток осуществляется
чаще всего с помощью инактивированного вируса Сендай или
поверхностно-активных соединений, таких как полиэтиленгли-
коль. Используется также электрический разряд. Подробные
сведения об этом можно почерпнуть в монографии Зеленина и
соавторов «Реконструированная клетка» (1982).
Для того, чтобы выяснить, какой тип эндогенного контроля
пролиферации клеток (позитивный или негативный) имеет
место в действительности, анализируют способность к вступле-
нию в период синтеза ДНК ядер гетерокарионов, полученных в
результате слияния пролиферирующих и покоящихся клеток.
При этом, как правило, используют в качестве покоящихся
клетки, культивируемые в условиях низкого содержания сыво-
ротки в среде, г! в качестве пролиферирующих — клетки,
стимулированные сывороткой и проходящие период Gp но еще
не приступившие к синтезу ДНК. Предполагается, что в случае
позитивного типа контроля ядра покоящихся клеток в таких
гетерокарионах должны вступать в клеточный цикл и в дальней-
шем синтезировать ДН К под влиянием предполагаемого стиму-
лятора, вырабатываемого пролиферирующими клетками. В про-
тивоположность этому, при негативном типе контроля ядра
стимулированных клеток в гетерокарионах должны переходить
в состояние покоя под влиянием ингибиторов, присутствующих
в покоящихся клетках (рис. 33).
Важным аспектом при проведении опытов по слиянию
пролиферирующих и покоящихся клеток служит способ иден-
тификации их ядер в гетерокарионах, поскольку морфологичес-
ки они не отличаются друг от друга. С этой целью производится
предварительное маркирование ядер до слияния.
86
позитивный
Л внутриклеточный
стимулятор
НЕГАТИВНЫЙ
• внутриклеточный
ингибитор
Рис.33. Возможные пути эндогенного контроля размножения кле-
ток. R — покоящиеся клетки, Р — пролиферирующие клетки
На рис. 34А воспроизведена в качестве иллюстрации схема
опыта по слиянию пролиферирующих и покоящихся фибробла-
стов мыши с помощью полиэтиленгликоля (Сетков и др., 1984)
Покоящиеся клетки (R) получали путем инкубации клеток в
течение трех суток в среде с низким содержанием сыворотки,
предварительно пометив их в экспоненциальной фазе роста 14С-
тимидином, а пролиферирующие (Р) клетки получали путем
добавления среды с 10% сыворотки, оставляя их немечеными;
при этом использовали клетки на всем протяжении пререпли-
кативного периода. После слияния клетки инкубировали в
течение 16 час в среде с 3Н-тимидином, с целью проследить за
вступлением ядер в S-период. Методом радиоавтографии с
использованием двойного изотопного маркирования (см. Епи-
фанова и др., 1977) на препаратах можно идентифицировать
(рис. 34Б) различные ядра как в исходных клетках — монокари-
онах (R и Р), так и в продуктах слияния: гомокарионах (R х R
и Р х Р) и гетерокарионах (R х Р). Сопоставляя данные по
включению 3Н-тимидина в ядра гетерокарионов с данными по
его включению в ядра моно- и гомокарионов в динамике,
можно судить о взаимном влиянии ядер пролиферирующих и
покоящихся клеток на прохождение ими клеточного цикла и
вступление в S-период.
Для идентификации продуктов слияния клеток и их дальней-
шего изучения применяют и другие способы, например, пред-
87
10% сыворотки
14С- тимидин
ПЭГ
6
Дни
~| 0,5 или 10% сыворотки
3Н-тимидин
Фиксация
клеток I
»	» ‘/Л	'	1 I
9	16 час
10% сыворотки 0,5%
6 2 4 6 в 10 12 14 1б час
I Пререпликативный I §
I период
7
Дни
Рис.34. Схема опытов по слиянию клеток линии NIH ЗТЗ (А). ПЭГ
— полиэтиленгликоль, G() — состояние покоя, S — период синтеза ДНК,
R — покоящиеся клетки, Р — пролиферирующие клетки. Идентифика-
ция исходных клеток и продуктов слияния (Б). R — покоящиеся клетки,
Р — пролиферирующие клетки, X — знак слияния клеток.
Гетерокарион
14С-тимидин
Б
88
Рис. 35. Автограф культуры фибробластов мыши NIH ЗТЗ после
слияния с лейкемическими клетками человека HL60. Для идентифи-
кации продуктов слияния клетки HL60 были предварительно помече-
ны 3Н-тимидином (зерна серебра) с последующим иммуногистохими-
ческим выявлением синтеза ДНК в ядрах по включению бромдезок-
сиуридина. Автограф любезно предоставлен И.А.Прудовским. 1 —
включение 3Н-тимидинГ; 2 — включение бромдезоксиуридина.
варительное маркирование ядер 3Н-тимидином с последующим
выявлением их способности синтезировать ДНК методом им-
муногистохимии при использовании бромдезоксиуридина (рис.
35) (Prudovsky, Tsong, 1991).
В первых же опытах, проведенных независимо в нескольких
лабораториях на культуре диплоидных фибробластов человека
(Rabinovitch, Norwood, 1980; Stein, Yanishevsky, 1981) и культуре
фибробластов мыши NIH ЗТЗ (Polunovsky et al., 1983), были
получены однозначные данные в пользу негативного типа эндо-
генного контроля вступления клетки в митотический цикл.
Когда в одном гетерокарионе в общей цитоплазме оказывалось
ядро пролиферирующей (стимулированной) клетки и ядро поко-
ящейся клетки, ядро пролиферирующей клетки утрачивало спо-
собность синтезировать ДНК (рис. 36А). В то же время присут-
ствие в гетерокарионе пролиферирующей клетки не индуцирова-
ло вступления покоящейся клетки в S-период (рис. 36Б).
89
% сыворотки перед слиянием, час
Рис.36. Результаты опытов по слиянию пролиферирующих (Р) и
покоящихся (R) клеток NIНЗТЗ. Схема опыта и идентификации клеток
представлены на рис 34. А — включение 3Н-тимидина в ядра Р-клеток
после слияния с R-клстками; Б — включение 3Н-тимидина в ядра R-
клеток после слияния с Р-клетками
Дальнейшие исследования (Polunovsky et al., 1983) показа-
ли, что предварительная обработка покоящихся клеток в
течение 4 час ингибитором синтеза белка — циклогсксимидом
устраняет их тормозящее влияние на пролиферирующие клет-
ки в гетерокарионах, что подтверждало предположение о
способности покоящихся клеток вырабатывать ингибитор про-
лиферации. Отсюда вытекало следующее заключение, а имен-
но, что необходимым условием приобретения покоящимися
90
PDGF
Пререпликативный период
Рис.37. Схема, иллюстрирующая предположение о том, что состоя-
ние компетентности клеток для вступления в митотический цикл может
быть индуцировано ие только факторами роста, но также путем подав-
ления синтеза белка. R — состояние покоя, S — период синтеза ДНК.
PDGF, FGF — факторы компетентности; EGF, SmC — факторы
прогрессии; СН — циклогексимид.
клетками компетентности для осуществления пререштикатив-
ных реакций (см. главу V) должно служить снижение внутри-
клеточного уровня эндогенного ингибитора, которое можно
вызвать не только путем воздействия на клетки тем или иным
фактором роста (митогеном), но и с помощью циклогексими-
да, подавляя образование ингибитора пролиферации (рис. 37).
Экспериментальная проверка этого предположения методом
клеточной кинетики (Розенвальд и др., 1989) показала, что
даже кратковременная обработка покоящихся клеток NIH ЗТЗ
циклогексимидом в течение 45 мин без дополнительного
воздействия фактором прогрессии (EGF) стимулирует их вступ-
ление в S-период.
Короткоживущие белки — репрессоры пролиферации клеток
Полученные результаты побудили к проведению сравни-
тельного исследования внутриклеточных процессов, протекаю-
щих при воздействии на клетку, с одной стороны, факторов
роста, а с другой стороны — ингибиторов синтеза белка. С этой
целью была изучена методом блотгибридизации мРНК с ДНК-
пробами экспрессия ранних протоонкогенов (fos, jun и тус) в
покоящихся при низком содержании сыворотки фибробластах
91
c- fos
c-jun
PDGF (50 нг/мл)
12 (ч)
с-тус
• ••••• контроль
Рис. 38. Сопоставление действия
PDGF и циклогексимида па экс-
прессию «ранних» протоонкогенов
в покоящихся клетках NIH ЗТЗ (по
данным Розенвальда и др.). Резуль-
таты блотгибридизации мРНК по-
коящихся клеток (0,5% сыворотки
в течение 3 дней) с ДНК-пробами
с-тус, c-fos и c-jun при воздействии
PDGF в течение 12 ч (А) и кратков-
ременной инкубации с циклогек-
симидом (10 мг/мл) в течение 10
мин, 45 мин и 4 ч (Б); контроль —
экспрессия мРНК гена тубулина.
см
Ц, СН - 10 мин	СН - 45 мин	СН -4ч
।--------------------1 ।-------------------11	I
О О 0,5 2 8 12	0 0,5 2	8 12 0	0,5 2	8
с-тус
c-fos
с- jun
контроль
Б
мыши, подвергнутых действию PDGF, циклогсксимида и пуро-
мицина (Roscnwald et al., 1995). Как показывают данные рис.
38А, экспрессия всех протоонкогенов в состоянии покоя мини-
мальна, вто время как PDGF вызывает быструю и транзиторную
стимуляцию экспрессии. Сходная картина наблюдается при
действии на покоящиеся клетки циклогексимида (рис. 38Б),
причем экспрессия протоонкогенов наиболее отчетливо выра-
жена через 45 мин после начала его применения. Опыты с
другим ингибитором синтеза белка — пуромицином, который
был использован в разных концентрациях, показали, что мак-
симальная экспрессия протоонкогенов наблюдается при крат-
ковременном (45 мин и 2 час) воздействии ингибитором на
покоящиеся клетки в условиях наибольшего подавления синте-
за белка. В параллельных исследованиях по слиянию пролифе-
рирующих клеток с покоящимися, предварительно подвергну-
92
тыми кратковременному воздействию циклогексимида и пуро-
мицина в сочетании с актиномицином D, было установлено, что
для снятия тормозящего действия покоящихся клеток на ядра
пролиферирующих клеток в гетерокарионах нетребуется транс-
крипции новых молекул РНК.
c-jun
"Ранние"
гены
С-/05
с-тус
Ген, кодирующий
предполагаемый
белок-репрессор
Рис. 39. Схема, иллюстрирующая внутриклеточные процессы, при-
водящие к экспрессии «ранних» протоопкогепов и возобновлению
синтеза ДНК в покоящихся клетках NIH ЗТЗ, подвергнутых действию
фактора роста (PDGF) или кратковременному воздействию ингибито-
рами синтеза белка (циклогсксимидом или пуромицином).
Транзиторное прекращение трансляции оказалось достаточ-
ным условием как для экспрессии генов раннего пролифератив-
ного ответа, так и для возобновления синтеза ДНК, из чего
можно было сделать вывод, что вступление клеток в цикл связано
с элиминацией короткоживущего (лабильного) белка-рспрессо-
ра (рис. 39). К сходному заключению пришли Рязанов и Спирин
(Ryazanov, Spirin, 1990) на основании изучения биологической
93
роли фактора элонгации 2 (eEF2), катализирующего движение
рибосом вдоль молекулы мРНК и стимулирующего таким обра-
зом трансляцию. Этот фактор активен только в дефосфорилиро-
ванном состоянии. Его фосфорилирование с помощью Са2+/
кальмодулин-зависимой сЕЕ2-киназы вызывает кратковремен-
ное подавление синтеза белка и исчезновение короткоживущих
белков-репрессоров, побуждая клетки к вступлению в период
синтеза ДНК.
Ингибиторы пролиферации, вырабатываемые покоящимися
клетками в культуре
Естественно возникает вопрос — что же представляют собой
короткоживущие репрессоры пролиферации?
К настоящему времени известно, что покоящиеся клетки
разных культур вырабатывают и выделяют в окружающую среду
ингибиторы белковой природы, обратимо подавляющие проли-
ферацию клеток того же типа. По большей части, это термола-
бильныс белки с мол. массой 20-40 кД и менее, не обладающие
токсическим действием на клетки. Подробный перечень таких
ингибиторов содержится в книге Епифановой и др. (1988).
Лучше всего охарактеризованы полипептиды и гликопептиды,
выделенные из кондиционированной питательной среды после
инкубации в ней покоящихся клеток. Среди них особого вни-
мания заслуживает фактор BSC-1 с мол. массой ~ 24 кД,
Таблица 9. Некоторые ингибиторы клеточного размножения,
вырабатываемые и секретируемые покоящимися клетками млеко-
питающих в культуре
Тип клеток	Источник получения ингибитора	Характеристика ингибитора
Клетки эпителия почки обезьяны (линия BSC-1) Фибробласты мыши ЗТЗ и эмбриональные фибробласты мыши Миелоидные клетки мыши М-1	Кондиционированн ая среда, И которой инкубировали покоящиеся клетки	TGF-0-иодобпый белок (-24 кД) Фактор, состоящий иа двух полипептидов (10 и 13 кД): термолабильные факторы (15 и 40 кД) Интерферон 0
Фибробласты мыши ЗТЗ и человека IMR-90/91 Клетки эпителия аорты человека и быка	Клеточная поверхность покоящихся клеток	Интегральные мембранные гл и ко протеиды (30 кД) Периферический мембранный компонент, чувствительный к обработке трипсином и _ _iu,rP.c.DaHI,K> (30-38 кД)
94
выделенный из среды, где предварительно инкубировали клетки
эпителия почки обезьяны, поскольку он практически идентичен
трансформирующему фактору роста TGF0, который, как мы
помним, является мощным ингибитором размножения клеток
эпителиального происхождения (о нем пойдет речь в главе X).
Эта группа факторов сходна по своим свойствам с так
называемыми кейлонами — термин, введенный в свое время
Буллоу и Лоуренс (Bullough, Laurence, 1968) для обозначения
тканеспецифичного фактора, изолированного из клеток эпи-
дермиса мыши и обратимо подавляющего размножение эпидер-
мальных клеток. Позднее кейлоны были обнаружены и в неко-
торых других тканях, но данные об их свойствах, равно как и
само существование кейлонов, постоянно подвергаются сомне-
нию, ввиду сложности получения чистых препаратов.
Другая группа ингибиторов пролиферации, вырабатываемых
покоящимися клетками, включает в себя пептидные факторы,
связанные с клеточной поверхностью, которые, по-видимому,
близки по своим характеристикам с ингибиторами, выделяемы-
ми в окружающую среду (см. Epifanova, Brooks, 1994). Ни те, ни
другие факторы не могут рассматриваться как основные эле-
менты строго в н утр и кл сточного (intrinsic) механизма негатив-
ного контроля размножения клеток, поскольку они действуют
главным образом через рецепторы наружной мембраны, то есть
по паракринному способу регуляции, и влияют на всю популя-
цию в целом. Однако, как мы увидим в дальнейшем, они играют
важную вспомогательную роль в осуществлении общего нега-
тивного контроля пролиферации.
Гены gas, специфичные для состояния пролиферативного
покоя, и продукты их активности
В конце 80-х годов были открыты и клонированы гены,
экспрессия которых связана преимущественно или исключи-
тельно с пребыванием клеток в состоянии покоя и прекращает-
ся уже через несколько часов после митогенной стимуляции
(Schneider et al., 1988). Эти гены получили название gas (growth
arrest-specific genes). Co временем семейства таких генов (в
частности, квайссцины) были обнаружены в разных культиви-
руемых клетках, главным образом, в фибробластах (табл. 10).
Оказалось, что кодируемые ими белки входят по большей части
в состав плазматической мембраны или внеклеточного матрик-
95
Таблица 10. Гены, избирательно экспрессирующиеся
в покоящихся клетках
Тип клеток	Гены	Кодируемые белки
	Gas (growth arrest- specific)	
Фибробласты мыши	до /	Компонент плазматической мембраны с
NIH ЗТЗ	2	мол. массой -45 кД Компонент микрофиламент с мол. массой -36 кД
Клетки NIH ЗТЗ и	gas 3	Трансмембранный гликопротсид
клетки лейкемии	gas 5	Белок, связанный с витамином К
Френда	gas 6	
Фибробласты человека WI-38	Квайесцины (quiescins) Q 1 Q 2 Q8	Коллагены
	Q4	Белок, входящий в состав клеточного матрикса
са, не выполняя, по-видимому, функций регуляторных моле-
кул, которые были открыты позднее (см. главу X). Кроме того,
продукты отдельных генов gas могут даже способствовать раз-
множению клеток, поскольку они, как выяснилось, входят в
состав рецепторов некоторых факторов роста (в частности, а-
рецепторов PDGF) и, аккумулируясь на поверхности покоя-
щейся клетки, обеспечивают ее быструю реакцию на митоген-
ный стимул.
Взаимодействие эндогенных и экзогенных факторов
в регуляции клеточного цикла
Благодаря успехам в изучении эндогенного контроля раз-
множения клеток, уже к началу 90-х годов стало очевидным, что
регуляция клеточного цикла у высших эукариотов осуществля-
ется путем координированного взаимодействия внеклеточных и
внутриклеточных регуляторных факторов при переходе клеток
из состояния покоя к пролиферации и в обратном направлении.
На рис. 40 последовательность событий представлена в виде
повторяющихся витков спирали, каждый из которых включает
в себя клеточный цикл с периодами G,, S, G2 и митозом (М).
96
Таблица 10. Гены, избирательно экспрессирующиеся
в покоящихся клетках
Тип клеток	Гены	Кодируемые белки
	Gas (growth arrest- spccific)	
Фибробласты мыши	/	Компонент плазматической мембраны с
NIH ЗТЗ	2	мот. массой -45 кД Компонент микрофиламент с мол. массой -36 кД
Клетки NIH ЗТЗ и	gas 3	Трансмембранный гликопротеид
клетки лейкемии	gas 5	Белок, связанный с витамином К
Френда	gas 6	
Фибробласты человека	Ква Веснины
WI-38	(quiescins) Q 1
	Q 2	Коллагены Q8
	Q 4	Белок, входящий в состав клеточного матрикса
са, не выполняя, по-видимому, функций регуляторных моле-
кул, которые были открыты позднее (см. главу X). Кроме того,
продукты отдельных генов gas могут даже способствовать раз-
множению клеток, поскольку они, как выяснилось, входят в
состав рецепторов некоторых факторов роста (в частности, ос-
рецепторов PDGF) и, аккумулируясь на поверхности покоя-
щейся клетки, обеспечивают ее быструю реакцию на митоген-
ный стимул.
Взаимодействие эндогенных и экзогенных факторов
в регуляции клеточного цикла
Благодаря успехам в изучении эндогенного контроля раз-
множения клеток, уже к началу 90-х годов стало очевидным, что
регуляция клеточного цикла у высших эукариотов осуществля-
ется путем координированного взаимодействия внеклеточных и
внутриклеточных регуляторных факторов при переходе клеток
из состояния покоя к пролиферации и в обратном направлении.
На рис. 40 последовательность событий представлена в виде
повторяющихся витков спирали, каждый из которых включает
в себя клеточный цикл с периодами Gp S, G2 и митозом (М).
96
Рис. 40. Модель размножения высших эукариотов, отражающая
взаимодействие внеклеточных и внутриклеточных регуляторов при
смене состоянии активной пролиферации и пролиферативного покоя.
Gp S, G2 М — периоды клеточного цикла. R — состояние покоя, R’ —
более глубокое состояние покоя.
Клетки продолжают проходить один цикл за другим, то есть
непрерывно пролиферировать до тех пор, пока в окружающей
среде присутствуют факторы роста (помеченные стрелками)
Ширина ленты спирали условно отражает внутриклеточный
уровень инду кторов репликации ДН К. В отсутствие экзогенных
факторов роста клетки прекращают пролиферацию и переходят
в состояние пролиферативного покоя, обусловленное достиже-
нием нужной концентрации эндогенного ингибитора. При
длительном отсутствии факторов роста клетки углубляются в
это состояние, и им требуется больше времени для выхода из
него. Под влиянием факторов роста внутриклеточная концен-
трация ингибитора пролиферации снижается, что вызывает
серию прсрспликативных реакции, завершающихся инициаци-
ей синтеза ДНК.
Существенным моментом в регуляции размножения клеток
высших эукариотических организмов следует считать чередова-
ние периодов активной пролиферации и пролиферативного
покоя, что придает гибкость и одновременно устойчивость всей
регуляторной системе.
97
Литература
Епифанова О.И.. Терских В.В., Захаров А.Ф. — «Радиоавтография», М.,
ВШ, 1977.
Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. — »Регуляторные
механизмы пролиферации клеток», М., ВИНИТИ, Итоги науки и
техники, т.1О, 1998.
Зеленин А.В., Кущ А.А.. Прудовский И.А. — «Реконструированная
клетка», М., Наука, 1982.
Розенвальд И.Б., Макарова Г.Ф., Епифанова О.И. — Докл. АН СССР,
1989, 305, 977-980.
Сетков Н.А., Полуновский В.А., Епифанова О.И. — Цитология, 1984,
26, 691-697.
Bullough W.S., Laurence Е.В. — Europ. J. Cancer, 1968, 4, 587-594.
Cooper S. — Nature, 1979, 280, 7-19.
Epifanova 0.1., Brooks R.F. — Cell Prolif., 1994, 27, 373-394.
Harris H. - Nature, 1965, 206, 583-588.
Harwell L.H. - J. Mol. Biol., 1976, 104, 803-817.
Liskav R.M., Prescott D.M. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2873-
2877.
Polunovsky V.A., Setkov N.A., Epifanova O.I. — Exp. Cell Res., 1983, 146,
377-383.
Prudovsky I.A., Tsong T.Y. — Developm. Biol., 1991, 144, 232- 239.
Rabinovitch P.S., Norwood T.N. — Exp. Cell Res., 1980, 130, 101-109.
Rosenwald I.B., Setkov N.A., Kazakov V.N., Chen J.-J., Ryazanov A.G.,
London I.M., Epifanova О. I. — Cell Prolif., 1995, 28, 631-644.
Ryazanov A.G.. Spirin A.S. — New Biol., 1990, 2, 843-850.
Shneider C., King R.M., Philipson L. - Cell, 1988, 454, 787-793.
Stein G.H., Yanishevsky R.M. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1981,78, 3025-
3029.
98
ГЛАВА VIII. СТАНОВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО
ЦИКЛА В ПРОЦЕССЕ ИНДИВИДУАЛЬНОГО
РАЗВИТИЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ
КОНТРОЛЬ РАЗМНОЖЕНИЯ КЛЕТОК
Клеточные циклы в раннем эмбриогенезе и при
специализации клеток
В многоклеточном организме велел за оплодотворением
яйца начинается период дробления. Клеточные циклы в пери-
оде дробления наиболее подробно изучены у амфибий, главным
образом, у шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Нсоплодотворен-
ные зрелые ооциты амфибий, блокированные в метафазе второ-
го мейоза, после стимуляции (например, при оплодотворении
или под воздействием повышенной концентрации ионов каль-
ция вереде) заканчивают мейоз и претерпевают серию синхрон-
ных митотических делении Опыты с трансплантацией ядер
соматических клеток в яйцо показывают, что цитоплазма яйца
содержит все необходимые компоненты по меньшей мере для
12-ти делений дробления, и транскрипции генетического мате-
риала не требуется. Эти деления протекают с интервалом
примерно в 30 мин., причем в клеточном цикле отсутствуют
периоды G[ и G .
Подобная закономерность наблюдается при оплодотворении у
большинства животных, за исключением млекопитающих и неко-
торых других видов, у которых незначительный по продолжитель-
ности период Gt обнаруживается уже в самых первых циклах
дробления. Синтез ДНК происходит на протяжении короткого S-
периода, и один раунд репликации следует за другим, прерываясь
лишь для преми готической реорганизации хроматина и митоза. В
это время бластомеры не нуждаются для деления в экзогенных
стимуляторах пролиферации (факторах роста).
Число делений дробления варьирует у разных видов. В
дальнейшем происходит трансформация эмбрионального кле-
точного цикла в соматический — этим термином условно
обозначается клеточный цикл, устанавливающийся по заверше-
нии периода дробления яйца У амфибий этот переход наблю-
дается на стадии средней бластулы.
Соматические клеточные циклы в многоклеточном организ-
ме характеризуются наличием хорошо выраженных периодов
99
G, и G2, более продолжительного периода S, а также зависимо-
стью прохождения цикла от митогенных стимуляторов. Иными
словами, теми размножения клеток начинает определяться
присутствием факторов роста, что создает предпосылки для
нового этапа регуляции, включающего в себя чередование
периодов активной пролиферации и пролиферативного покоя.
Принципиальное различие в этом плане между взрослым орга-
низмом и эмбрионом состоит в том, что эмбриональные клетки
сами способны вырабатывать и выделять в среду факторы роста,
то есть регуляция осуществляется как по паракринному, так и
по аутокринному типу.
На более поздних стадиях развития — во время нейруляции
и раннего органогенеза — наблюдается общее снижение проли-
феративной активности клеток и их перераспределение по
периодам клеточного цикла таким образом, что в некоторых
участках зародыша увеличивается число клеток в периоде G,.
Значительная часть клеток покидает клеточный цикл и перехо-
дит в состояние покоя. В это же время отмечается появление
ингибиторов пролиферации. Вместе с тем в отдельных очагах
органогенеза сохраняется интенсивный уровень размножения
клеток. Поэтому прохождение клеточного цикла на данных
стадиях развития организма может приводить к разным послед-
ствиям. В одних случаях клетки проходят несколько циклов
подряд, в результате чего возрастает численность клеточной
популяции, главным образом за счет клеток, мало отличающих-
ся от своих предшественников. В других случаях в клетках
появляются признаки специализации, характерные для той или
иной ткани, и они начинают выполнять свои функции, пребы-
вая в состоянии пролиферативного покоя (см. рис. 14 в главе
Ш). Специализированные клетки, необратимо перешедшие в
состояние покоя, относят к категории терминально дифферен-
цированных клеток.
Регуляция клеточного цикла в эмбриогенезе и гипотеза
автономного осциллятора
Для объяснения механизма поддержания синхронного раз-
множения клеток в эмбриогенезе Ньюпортом и Киршнером
(Newport, Kirschner, 1984) была предложена гипотеза автоном-
ного осциллятора, которую удобнее всего рассмотреть на при-
мере процессов, происходящих при созревании и дроблении
100
Рис.41. Первоначальный вариант-,
автономного осциллятора, обеспечи-
вающего синхронное прохождение кле-
точных циклов в эмбриогенезе лягуш-
ки (по Ньюпорту и Киршнеру, 1984). S
— период синтеза ДНК, М — митоз,
MPF — фактор созревания яиц, CSF —
цитостатический фактор.
Анти-MPF
MPF
Блок в
метафазе
яиц Л. laevis. Согласно предлагаемой гипотезе, представленной
в упрощенном виде на рис. 41, клеточный цикл в дробящихся
яйцах лягушки управляется механизмом автономной осцилля-
ции, ключевым элементом которого служит так называемый
фактор созревания — MPF (maturation promoting factor, или
дробления дробления .....
Рис.42. Функционирование автономного осциллятора в эмбриоге-
незе лягушки (по Мюррею и Киршнеру , 1989).
101
mitosis promoting factor), содержащийся в неоплодотворенных
яйцах. В присутствии MPF клетки переходят из периода синтеза
ДНК в митоз. Для завершения митоза и вступления клетки в
следующий S-период MPF должен быть разрушен другим внут-
риклеточным фактором — анти-MPF. Выяснилось, что в не-
оплодотворенных яйцах присутствует еще одно активное веще-
ство, которое получило название цитостатического фактора,
или CSF (см. Masui, 1991). Этот фактор поддерживает в клетках
высокий уровень MPF, защищая его от анти-MPF, и таким
образом блокирует яйцеклетку в метафазе второго мсйоза.
Оплодотворение или стимуляция зрелых яиц приводит к инак-
тивации CSF, снижению уровня MPF и включает осциллятор,
который и регулирует процесс дробления на протяжении пер-
вых 12-ти клеточных циклов, вплоть до стадии средней бласту-
лы. На рис. 42 функционирование автономного осциллятора
представлено в развернутом виде (Murray, Kirschner, 1989), с
указанием начала образования MPF (на V и VI стадиях роста
незрелого ооцита, блокированного в профазе первого мейоза)
под влиянием прогестерона, вырабатываемого фолликулярны-
ми клетками, окружающими ооцит.
Естественно, что подобная схема оставляла больше вопро-
сов, чем предлагала ответов. Что такое анти-MPF? Что пред-
ставляет собой CSF? Откуда они берут свое начало и как
взаимодействуют с MPF? О самом MPF к тому времени было
уже известно, что это белок, способный фосфорилироваться с
участием протеин кин аз.
Общность регуляторных механизмов размножения всех
эукариотических клеток — крупнейшее открытие
современной биологии
В начале 90-х годов произошел подлинный прорыв знаний в
изучении регуляторных механизмов размножения клеток. И,
как ни тривиально эго звучит, произошел он только благодаря
объединению усилий ученых, трудившихся до этого в далеких
друг от друга областях клеточной биологии. Действительно, в
течение многих лет исследования генов и продуктов их актив-
ности, регулирующие размножение клеток у дрожжей, развива-
лись совершенно независимо от выяснения факторов, опреде-
ляющих деления дроблений на ранних стадиях развития амфи-
бий, а те, в свою очередь, были далеки от изучения механизма
102
перехода культивируемых клеток млекопитающих из состояния
покоя в клеточный цикл. Наступил момент, когда эти области
начали самым тесным образом переплетаться между собой, что
вылилось в серию блестящих работ, ознаменовавшихся крупны-
ми открытиями. Стало ясно, что речь идет об изучении одних
и тех же процессов, и была доказана общность молекулярно-
генетического контроля клеточного размножения у всех видов
эукариотических организмов — от дрожжей до человека. Самым
поразительным в этом открытии оказалось то, что весь процесс
регуляции клеточного цикла стал представляться значительно
более ясным и менее сложным, чем прежде. Можно смело
сказать, что это самая крупная объединяющая теория последне-
го времени в биологии.
В суммарном виде она представляется следующим образом.
Исследователи, работавшие с низшими эукариотическими
организмами, такими какдрожжи, первыми обратили внимание
на то, что в нормальных условиях деление клеток зависит от
правильной координации событий клеточного цикла (см. King
et al., 1994). Эта координация обусловлена регуляцией трех
переходов (рис. 43): вступления в митоз, выхода из митоза и
прохождения через пункт ограничения (r-пункт) в периоде G,
(у дрожжей он называется точкой «старт»), после которого
клетки становятся комитированными к инициации синтеза
ДНК (вступлению в S-период). Усилиями нескольких групп
исследователей во главе с Нёрсом (Nurse, Оксфорд, Англия),
Киршнером (Kirschner, Сан-Франциско, США), Ридом (Reed,
Ла Холла, США), Би-
чем (Beach, Колд
Спринг Харбор, США)
и другими учеными
было установлено, что
каждый из этих перехо-
дов протекает с участи-
ем одного и того же
белка — р34 (фосфоли-
пида с мол. массой 34
кД) или его близких
гомологов.
Этот белок был пер-
воначально идентифи-
Рис.43. Участие белка p34fJf2 в коорди-
нации событий клеточного цикла. Gp S,
G2, М — периоды цикла, G() — состояние
покоя, r-пункт — пункт ограничения.
103
Дрожжи
Амфибии
Грибы
Высшие растения
Насекомые
Человек
cdc2
р34
% гомологии
с белком
S.pombe
(D. Beach)
(Р.Nurse)
S.pombe
S.cerevisiae
г	I
Гомологи *
cdc!3 ode 2 *------► cdc28
X laevis
MPF
р34
Gj-циклины
М-циклины
Рис.44. Общность молекулярно-генетического контроля размноже-
ния клеток у эукариотов: cdc2 (cdc28), cdcl3— гены дрожжей, кодиру-
ющие белки, которые входят в состав MPF (объяснения в тексте).
цирован Нёрсом как продукт активности гена cdc2 у делящихся
дрожжей S. pombe (рис. 44). Оказалось, что ему принадлежит
центральная роль в регуляции деления. Возрастание активности
белка р34гЛ-служит непременным условием прохождения дрож-
жевой клетки через точку «старт», а вторичное возрастание
обязательно предшествует митозу. Одновременно в лаборато-
рии Рида было показано, что аналогичная картина наблюдается
при прохождении клеточного цикла у дрожжей S. cerevisiae,
размножающихся почкованием, только в этом случае белок р34
является продуктом активности гена cdc28— гомолога гена cdc2
у S. pombe.
Неожиданным оказалось то, что белок p34'ffc2 одновременно
представляет собой каталитическую субъединицу MPF. Другая
субъединица, получившая исходное название «циклин», пред-
ставляет собой белок-инициатор, точнее, группу регуляторных
белков с мол. массой около 60 кД, аккумулирующихся в клетке
на протяжении интерфазы и деградирующих в митозе. Циклины
были открыты при изучении синтеза белка в процессе развития
яиц у морских ежей, червей, моллюсков, осетровых рыб и
104
лягушек Хантом (Hunt, Кембридж, Англия), который обнару-
жил, что они подвергаются интенсивному фосфорилированию
перед каждым митозом. Эти циклины получили название мито-
тических циклинов (А и В). Они были идентифицированы в
лаборатории Нёрса у дрожжей 5. pombe как продукты активно-
сти гена cdcl3, а у 5. cerevisiae выявлены лишь позднее, что
связано с методическими трудностями при изучении почкую-
щихся дрожжей. Однако именно у этого вида дрожжей Ридом и
его сотрудниками были впервые найдены циклины, участвую-
щие в регуляции прохождения клетками через точку «старт»,
или G, -циклины, обозначенные применительно к S. cerevisiae
символами Clnl, С1п2,С1пЗ.и т.д.
Но самым поразительными и многообещающими можно
считать данные о высокой степени филогенетической консер-
вативности белка р34"/<2 в клетках эукариотических организмов.
В опытах с применением моноклональных антител Мюрреем в
лаборатории Киршнера было показано, что М PF проявляет себя
как гомолог киназы, фосфорилирующей гистон HI у млекопи-
тающих, и что клетки человека содержат продукт гена cdc2 или
очень близкий гомолог. Так, протеинкиназа, выделенная из
клеток линии HeLa, оказалась по меньшей мере на 63% иден-
тична белку p34nfc2 у дрожжей 5. pombe, а последний — полно-
стью идентичен субъединице MPF из яиц лягушки. В этом
фундаментальном исследовании участвовали совместно и неза-
висимо Нёрс, Бич, Ньюпорт (Newport, Сан-Диего, США) и
Маллер (Mailer, Денвер, США). Близкая гомология регулятор-
ных белков с р34о/г2 вскоре была выявлена у грибов, насекомых
и высших растений. Так была постулирована общность молеку-
лярно-генетических механизмов размножения клеток у эукари-
отов (подробнее см. Мюррей, Киршнер, 1991).
Взаимодействие р34сЛ2 и циклинов при вступлении клетки
в митоз
Как уже было сказано, в процессе эмбрионального развития
митотические циклины (А и В) аккумулируются в клетке на
протяжении интерфазы и в дальнейшем разрушаются в митозе,
причем деградация циклина А опережает деградацию циклина
В. В лаборатории Киршнера был разработан метод получения
экстрактов яиц лягушки, способных проходить несколько кле-
точных циклов в пробирке, что позволило установить особен-
105
Актнвация Деструкция
Рис. 45. (А) — осцилляции уровня
циклина в клеточных циклах экстрактов
яиц лягушки по принципу «зубцов пилы»
(по Киршнеру и Ханту, 1989). М — митоз;
(Б) —- соотношение уровня циклина и
MPF на протяжении нескольких эмбрио-
нальных клеточных циклов лягушки.
мости флюктуации со-
держания циклинов от
одного цикла к другому.
Было показано, что в
отличие от всех осталь-
ных белков, содержание
которых нарастает рав-
номерно с увеличением
массы эмбриона, уро-
вень циклина осцилли-
рует по принципу «зуб-
цов пилы» (рис. 45А).
Молекула p34f'/c2
инертна на всем протя-
жении клеточного цик-
ла, то есть не обладает
протеинкиназной ак-
тивностью. В начале
цикла она мономерна и
нефосфорилирована, но
постепенно фосфорили-
руется в периодах S и
G2. Перед началом ми-
тоза происходит физи-
ческое взаимодействие
р34«л-2 с циклином, ко-
торое вызывает конфор-
мационное изменение
молекулы р34“'<2, способствующее ее дальнейшему фосфорили-
рованию, главным образом, по остаткам тирозина и треонина.
Однако такой комплекс представляет собой неактивную (латен-
тную) форму MPF (пре-MPF). Для активации MPF и вступле-
ния клетки в митоз необходимо дефосфорилирование p34tJt- по
15-му остатку тирозина и 14-му остатку треонина. В то же время
он должен оставаться фосфорилированным по 161-му остатку
треонина (у дрожжей) или 167-му остатку треонина (у позвоноч-
ных). При этом активность MPF возрастает перед митозом
очень резко. Соотношения уровней циклина и MPF на протя-
жении нескольких эмбриональных клеточных циклов яиц ля-
гушки иллюстрирует рис. 45Б. Для завершения митоза необхо-
106
дима деградация циклинов А
и В под влиянием протеоли-
тических ферментов, зависи-
мых от убиквитинов — малых
белковых молекул, активиру-
ющих протеолиз (см. King et
al., 1996).
Следует подчеркнуть, что
в действительности процесс
активации-инактивации MPF
регулируется значительно бо-
лее совершенным образом, а
именно, тончайшим балан-
сом между активностью про-
теин киназ и фосфатаз с вклю-
чением механизмов положи-
тельной и отрицательной об-
ратной связи. Так, в лабора-
тории Киршнера было обна-
ружено (Solomon et al., 1991),
Рис.46. Выявление внутриклеточ-
ного ингибитора (INH), удержива-
ющего MPF в неактивном состоя-
нии (по данным лаборатории Киш-
нера, 1990-1991).
что в этом процессе прини-
мает участие негативный регулятор (INH), представляющий
собой фосфатазу типа 2А. В опытах на экстрактах яиц лягушки
было показано, что внезапной активации MPF всегда предше-
ствует лаг-период, продолжительность которого не зависит от
достижения пороговой концентрации цикл ина (рис. 46).
Первоначально было высказано предположение, что INH
дефосфорил и руст цикл ин и удерживает его в неактивном состо-
янии до тех пор, пока потенциальная активность MPF не станет
такой, чтобы обеспечить все события митоза (разрушение
ядерной оболочки, конденсацию хромосом, реорганизацию
веретена деления и др.). В дальнейшем оказалось, что роль INH
далеко не так однозначна, и что в активации MPF принимают
участие многочисленные регуляторные молекулы, причем осо-
бая роль в этом процессе принадлежит циклину А. Благодаря
блестящим исследованиям на развивающихся яйцах лягушки,
выполненным, главным образом, в лаборатории Дорэ (Doree,
Ренн, Франция), удалось воссоздать последовательность и вза-
имосвязь событий, предшествующих инициации митоза. Ее
схематически иллюстрирует рис. 47.
107
INH
__________(2A фосфатаза)
Weel/Mikl |r*	Wecl/Mikl |+p
Неактивный (фосфатаза)	Активный
npc-MPF
MPF
G,-M
Рис.47. Участие циклина А в активации MPF (по данным лабора-
тории Дорэ, 1993). Weel/Mikl — тирозинкиназы (продукты генов
дрожжей S’ pombe)\ Cdc2 — каталитическая субъединица MPF (р34"А2);
G2, М — периоды клеточного цикла (объяснения в тексте).
Главным позитивным регулятором превращения неактивно-
го npc-MPF в активный MPF является продукт одного из
семейства генов cdc25 — тирозинфосфатаза, дсфосфорилирую-
щая p34c'/f2no 15-му остатку тирозина и 14-му остатку треонина,
оставляя при этом 161-й остаток треонина в фосфорилирован-
ном состоянии, чю необходимо для прочной связи р34"'<2 с
циклином. Превращению пре-MPF в MPF препятствует мощ-
ный заслон негативных регуляторов — тирозинкиназ Weel и
Mikl. Они активны только в дефосфорил ированном состоянии,
в котором их поддерживает уже известный нам INH. Их
нейтрализацию путем фосфорилирования осуществляет цик-
лин А, находящийся в комплексе с р34сЛ2 Этот комплекс
активируется раньше, чем комплекс р34"Л2/циклин В; образно
говоря, циклин А прокладывает путь циклину В, «навешивая»
фосфор на регуляторные молекулы, препятствующие актива-
ции MPF. На самом же деле число молекул, тормозящих или
стимулирующих переход G -М, значительно больше, чем изоб-
ражено на схеме. Это усиливает регуляционные возможности
клетки в случае неполной готовности к митозу и в то же время
108
способствует его правильному протеканию в нормальных усло-
виях.
В свете новых данных существенно дополнились представле-
ния о функционировании автономного осциллятора в эмбрио-
генезе X. laevis (см. рис. 42). Помимо детального раскрытия
активации MPF и роли циклинов А и В в этом процессе, стало
известно, что анти-MPF — это группа убиквитин-зависимых
протеолитических ферментов, обеспечивающих разрушение
циклинов и выход клетки из митоза. Изучена также природа
цитостатического фактора CSF, одним из активных компонен-
тов которого оказался продукт протоонкогена mos, способству-
ющий блокированию клеток в метафазе второго мейоза зрелого
ооцита, благодаря связыванию с кинетохорами (Wang et al.,
1994). Другой компонент — МЕК, относящийся к категории
MAP-киназ, препятствует деградации циклинов и, следователь-
но, завершению митоза (Mailer, 1994). Действие обоих компо-
нентов преодолевается при оплодотворении яйца.
Роль циклинов и зависимых от них протеинкиназ (CDKs)
в регуляции переходов G0/Gj и Gj/S
Как уже было сказано, прохождение точки «старт» и переход
в S-период у дрожжей зависит от активации генов cdc2 (у S.
pombe) и cdc28 (у б", cerevisiae), в результате чего образуются
гетеромульти мерные комплексы, содержащие белок р.34сЛ2 и
нестабильные регуляторные белки Gj-циклины (Clns), обна-
руживающие ограниченную гомологию с митотическими пик-
л инам и.
Дальнейшие исследования показали, что у высших эукари-
отов, наряду с митотическим циклинами А и В, существуют
также и С^циклины, получившие в алфавитном порядке назва-
ния С, D, Е и т д. Входящие с ними в комплекс протеинкиназы
— гомологи белка р34гЛ2— стали обозначать символом CDK
(cyclin-dependent kinase), что отражает их тесную взаимозависи-
мость с циклинами. В соответствии с этой терминологией,
символ CDK1 у позвоночных соответствует символу CDC2 у
дрожжей (рис. 48). Киназа CDK1 образует комплексы с мито-
тическими циклинами, киназа CDK2 (гомолог киназы CDC2,
мол. масса 33 кД) — с циклинами А и Е, а близкие по гомологии
киназы CDK4 и CDK6 — с циклином D. Эти комплексы
выполняют роль позитивных регуляторов клС1 очного цикла,
109
Митотические циклины
G, - циклины
Рис.48. Циклины в комплексе
(CDK) (объяснения в тексте).
с циклин-зависимыми киназами
обеспечивая последовательное прохождение его периодов (см.
обзоры: Sherr, 1993, 1995; Draetta, 1994; Lees, 1995; Nigg, 1995).
В настоящее время расположение таких комплексов в кле-
точном цикле сформировавшегося организма выглядит следую-
щим образом (рис. 49). Ключевыми позитивными регуляторами
вступления клеток в цикл служат циклины типа D, входящие в
комплексы с CDK4 или CD Кб. Это единственные циклины,
образующиеся под влиянием внешних стимуляторов (митоге-
нов) и синтезирующихся до тех пор, пока в среде присутствует
фактор роста. Пик их экспрессии приходится на середину
периода Gr Экспрессия циклина Е происходит периодически,
но максимальная активность его комплекса с CDK2 наблюдает-
ся на границе периодов G(/S, предшествуя активации комплек-
са СЭК2/циклин А. Функции циклина А не исчерпываются,
таким образом, его уча-
стием в регуляции ми-
тоза. Основные собы-
тия, осуществляющие-
ся на протяжении кле-
точного цикла при вза-
имодействии комплек-
сов CDK/циклин,
представлены в обоб-
Рис.49. Расположение
комплексов CDK/циклин
в клеточном цикле. М, G(,
S, G2 — периоды цикла,
Go -состояние покоя, г-
пункт — пункт ограниче-
ния.
НО
Таблица 11. Взаимодействие циклинов и циклил-зависимых киназ
в регуляции событий клеточного цикла
Циклил	Киназа	Максимальная экспрессия циклина б клеточном цикле	Регулируемый процесс
A	CDC2-CDK1 CDK.2	S - Сь - М	“Протекция” циклина В на этапе Gi —>М Инициация и прохожде- ние S-псриода, (S—ЯЗ;)
В C	CDC2=CDK 1 He обнаружена	g2-m Gi, далее постоянная	Инициация митоза (G2->M).
D	CDK4, CDK6 Середина G| (преимущественно) CDK2. CDK5		Прохождение G, периода
E G H	CDK2 Не обнаружена CDK7	Граница G|-S	“Протекция” циклина А Инициация S-периода Субстрат транскрипци- онной активности р53 Фосфорилирование ком- плекса СОК4/6-циклнн D
F	I Ic обнаружена	G>	Инициация митоза (G,->M)
шейном виде в табл. 11 Подробнее их роль будет раскрываться
по мерс дальнейшего изложения (см. главу X), однако на
основании ранее рассмотренных материалов уже сейчас можно
сделать заключение, что назначением этих комплексов служит
преодоление действия эндогенных ингибиторов, являющихся
частью внутриклеточного контроля пролиферации клеток и
препятствующих прохождению клеточного цикла.
Литература
Мюррей Э., Киршнер М — В мире науки, 1991, № 5, 24-32.
Doree М. - Curr. Opin. Cell Biol., 1990, 2, 269-273.
Draetta G.F. — Curr. Opin. Cell Biol., 1994, 6, 842-846.
Galaktionov K., Beach D. — Cell, 1991, 67, 1181-1194.
Hunt T. — Nature, 1991, 350, 462-463.
King R.W., Goltzer M., Kirschner MW— Mol. Biol. Cell, 1996, 7, 1343-
1357.
King R.W., Jackson P.K., Kirschner M.W. — Cell, 1994, 79, 563-571.
Lee Т.Н., Solomon M.J., Mumbe M.C., Kirschner M.W. — Cell, 1991, 64.
415-423.
Lees E. — Curr. Opin. Cell BioL, 1995, 7, 773-780.
Mailer J.L. — Sem. Dev. BioL, 1994, 5, 183-190.
Masui Y. — Developm. Growth & Diff., 1991, 33, 543-551.
Murray A.W., Kirschner M.W. — Nature, 1989, 339, 275-280.
Newport J.W., Kirschner M.W. — Cell, 1984, 37, 731-742.
Nigg E.A. — BioEssays, 1995, 17, 471-480.
Nurse P. — Nature, 1990, 344, 503-508.
Reed S. — Trends Genet., 1991, 7, 95-99.
Reed S. — Biochem. Biophys. Acta, 1996, 1287, 151-153.
Sherr C.J. — Cell, 1993, 73, 1059-1065.
Sherr C.J. — TIBS, 1995, 20, 187-190.
Solomon M.J., Glotzer M., Lee Т.Н., Philippe M., Kirschner M.W, — Cell,
1990, 63, 1013-1024.
Xiong Y., Connolly T., Futcher B., Beach D. — Cell, 1991, 65, 691-699.
112
ГЛАВА IX. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
В СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ, СТАРЕЮЩИХ И
НЕОПЛАСТИЧЕСКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ
ПОПУЛЯЦИЯХ КЛЕТОК
Пролиферативный ответ клеток на действие митогенов
в функционально специализированных популяциях
Регуляция размножения клеток в условиях их функциональ-
ной специализации отличается рядом особенностей. Для того,
чтобы понять, как она осуществляется, необходимо иметь
представление о внутриклеточных сигналах, обеспечивающих
репрограммирование генома при переходе дифференцирован-
ных покоящихся клеток к пролиферации. Как известно, диффе-
ренцировка — это биологический процесс, приводящий к
появлению стабильных фенотипических изменений, отражаю-
щих специфическое функционирование.
Пролиферативный ответ клеток, не выполняющих в состо-
янии покоя специфических функций, и функционально специ-
ализированных клеток на действие митогенов во многом схо-
ден, но обладает и чертами различия. Основное сходство заклю-
чается в обратимости состояния покоя, независимо от характера
клеточной специализации, что было установлено в опытах по
слиянию клеток (Harris, 1965; Ringertz, Savage, 1976). Даже при
такой крайней форме инактивации хроматина, какая наблюда-
ется в сегментированных кольцевидных ядрах перитонеальных
гранулоцитов, последние могут быть реактивированы в гетеро-
карионах с пролиферирующими клетками, если те содержат
достаточное количество индукторов синтеза ДНК (табл. 12).
В то же время функционально специализированные клетки
отличаются от неспециализированных тем, что их ядрам требу-
ется больше времени для завершения пререпликативных реак-
ций. Это наблюдается и в тех случаях, когда они находятся в
общей цитоплазме с ядрами неспециализированных клеток. В
отличие от покоящихся клеток, не выполняющих специфичес-
кую функцию, специализированные покоящиеся клетки, как
правило, не подавляют синтез ДНК в ядрах пролиферирующих
клеток в гетерокарионах (рис. 50), что может быть связано с
отсутствием или недостаточным количеством эндогенного ин-
гибитора пролиферации. Поддержание состояния покоя в спе-
113
Таблица 12. Примеры инициации синтеза ДНК в ядрах покоящих-
ся клеток статичных популяций (Rd), реактивированных после
слияния с пролиферирующими (Р) клетками
Тип К^-клсток	Тип Р-клсток
Куриные эритроциты	Клетки Не La Клетки китайского хомячка Диплоидные клетки человека W1-38
Спермин кролика Перитонеальные макрофаги, гранулоциты и тучные клетки мыши	Клетки сирийского хомячка Клетки Не La Клетки меланомы L-клетки Клетки ЗТЗ-4Е
циализированных клетках осуществляется главным образом за
счет репрессивного состояния хроматина и инактивации генов,
экспрессия которых необходима для ответа на митогенный
стимул (см. главу X).
Рис. 50. Пове-
дение специализи-
рованных (Rd) и
неспециализиро-
ванных (R) покоя-
щихся клеток в ге-
терокарионах с
пролиферирующи-
ми (Р) клетка-
ми.(А) оба ядра
синтезируют ДНК
в гетерокарионе;
(Б) оба ядра нс
синтезируют ДНК
в гетерокарионе; • — ингибитор пролиферации; А — стимулятор
пролиферации.
Углубление специализированных клеток в состояние покоя
Сопоставление пролиферативного ответа специализирован-
ных и неспециализированных клеток и поведения их ядер в
гетерокарионах привели к представлению о начальном и уста-
новившемся состояниях пролиферативного покоя.
114
В отсутствие митогенов клетки на первом этапе вступают в
начальное состояние покоя, которое поддерживается за счет
активных метаболических процессов (см. главу IV), включая
образование ингибитора пролиферации. Культивируемые фиб-
робласты способны переходить только в начальное состояние
покоя, и при стимуляции в них быстро возобновляются проли-
феративные процессы. Другие клетки, например, лейкоциты,
постепенно переходят в глубокое состояние покоя. В них
наблюдается сильная конденсация хроматина, они прекращают
или почти перестают вырабатывать ингибитор пролиферации и
в конечном счете теряют способность реагировать на внекле-
точные факторы роста. В то же время такие клетки могут
возобновлять синтез ДНК при слиянии с активно размножаю-
щимися клетками, содержащими достаточное количество ин-
дукторов пролиферации. Такой тип пролиферативного покоя
получил название установившегося, или неактивного состоя-
ния покоя.
Представление о способности клеток углубляться в состоя-
ние покоя первоначально было высказано Базергой и Аугенлих-
том применительно к характеру пролиферативного ответа куль-
тивируемых клеток на стимул в зависимости от времени, про-
веденного ими в состоянии покоя (см. главу III). Специализи-
рованные клетки, как мы видим, также могут углубляться в
состояние покоя. При этом в процессе специализации клетки
обязательно проходят через начальное состояние покоя, общее
для всех клеточных типов и характеризующееся наличием
эндогенных ингибиторов пролиферации. На пути к терминаль-
ной дифференцировке специализированные клетки переходят в
установившееся состояние покоя, когда в них отсутствуют (или
имеются в недостаточном количестве) ингибиторы, а размноже-
ние подавлено в результате инактивации генов пролифератив-
ного ответа (рис. 51).
О способности специализированных юте то к углубляться в
состояние покоя свидетельствуют, в частности, данные опытов
Скотта и соавторов (Wille, Scott, 1982; Wier, Scott, 1986),
детально изучивших соотношение процессов нетерминальной и
терминальной дифференцировки и прохождения клеточного
цикла на модели проадипоцитов, дифференцирующихся в жи-
ровые клетки (адипоциты) при культивировании в среде с
различными компонентами плазмы крови. Для экспрессии
115
Рис. 51. Развитие состояния покоя при клеточной специализации.
• — ингибитор пролиферации, А — стимулятор пролиферации, Р —
пролиферация, R — начальное состояние покоя, Rd — установившееся
состояние покоя.
дифференцированного фенотипа проадипоциты должны нахо-
диться в определенном пункте (Gd) периода G( клеточного
цикла (рис. 52), откуда их можно стимулировать для возобнов-
ления пролиферации или же индуцировать к нетерминальной
дифференцировке (пункт Gd,). При адекватных воздействиях
нетерминально дифференцированные клетки могут либо снова
переходить к пролиферации, либо претерпевать терминальную
дифференцировку с утратой способности к размножению.
Среди специализированных клеток взрослого организма су-
ществует много промежуточных вариантов активного и неак-
тивного состояния покоя. В частности, гепатоциты интактной
печени способны вырабатывать ингибиторы клеточной проли-
ферации и в то же время в них почти не экспрессируются гены
Рис.52. Соотноше-
ние процессов проли-
TD ферации, нетерминаль-
ной и терминальной
дифференцировки на
примере превращения
проадипоцита в адипо-
цит (по данным лабора-
тории Скотта). М, Gp
S, G2 — периоды кле-
точного цикла; Gd —
пункт начала дифферен-
цировки; Gd. — нетерминальная дифференцировка; TD — терминальная
дифференцировка.
116
пролиферативного ответа. Клеточная популяция может быть
гетерогенна и содержать в себе клетки, находящиеся как в
начальном, так и в установившемся состоянии покоя. Промежу-
точные варианты отражают развитие этого состояния в процес-
се специализации клеток.
Особенности пролиферации стареющих клеток
Под старением клеток вне организма понимается существо-
вание предельного срока культивирования, выраженного чис-
лом пассажей, или удвоений клеточной популяции (population
doubling time). Этот феномен был впервые описан Хейфликом
и Мурхедом (Hayflick, Moorhead, 1961), которые определили,
что для диплоидных эмбриональных фибробластов человека
данный показатель составляет около пятидесяти пассажей. При
этом культура проходит три стадии развития: первичная культу-
ра (клетки, изолированные изтканидонора); растущая культура
(пролиферирующие клетки); стареющая культура (постепенная
утрата пролиферативного потенциала). Таким образом, основ-
ной характеристикой стареющей культуры служит снижение
способности клеток к размножению (см. обзор: Campisi, 1996).
В процессе дальнейших исследований было отмечено замет-
ное сходство в метаболизме стареющих и покоящихся клеток.
Уже на 30-40 пассажах культуры фибробластов можно наблю-
дать снижение способности клеток к репликации ДНК и мат-
ричной активности хроматина, падение проницаемости плазма-
тической мембраны к малым молекулам, повышение скорости
обновления РНК и белков, а также активности ферментов
катаболизма.
Подобно покоящимся клеткам ранних пассажей, стареющие
клетки вырабатывают ингибитор пролиферации. В гетерокари-
онах, образующихся при слиянии нормальных, активно проли-
ферирующих и стареющих диплоидных фибробластов человека,
всегда доминирует фенотип стареющих клеток (Stein, Yanishevsky,
1981). Это проявляется в подавлении синтеза ДНК в ядрах
пролиферирующих клеток, находящихся в общей цитоплазме
со стареющими клетками, и свидетельствует о том. что послед-
ние содержат факторы, препятствующие вступлению ядер в S-
период. По мере старения клеток уровень эндогенного ингиби-
тора пролиферации возрастает. Тем нс менее ядра стареющих
клеток могут быть реактивированы в гетерокарионах с клетка-
117
ми, в которых содержание индукторов синтеза ДНК очень
велико, например, с фибробластами, трансформированными
ДНК-содержащими вирусами, или с клетками HeLa, отличаю-
щимися высокой степенью злокачественности (см. заключи-
тельный раздел главы).
Вместе с тем, между свойствами покоящихся клеток на
ранних пассажах культуры и стареющими клетками имеются
существенные различия. Скорость обновления РНК и белков в
стареющих клетках не уравновешивает их образования, что
вызывает избыточное накопление этих макромолекул в клетке
и в условиях низкого уровня синтеза ДН К приводит к несбалан-
сированному росту. Поэтому стареющие клетки увеличены в
размерах, в то время как постмитотические покоящиеся клетки
ранних пассажей обычно мельче пролиферирующих. Эти дан-
ные говорят о том, что при старении существенно повреждается
механизм, поддерживающий жизнеспособность клеток в состо-
янии пролиферативного покоя.
Действительно, в стареющих клетках изменен состав белков,
по сравнению с покоящимися клетками. Если маркером поко-
ящихся клеток служит статин — белок с мол. массой 57 кД (см.
главу IV), то маркер стареющих клеток, названный термини-
ном, хотя и имеет такую же мол. массу, но распознается другим
антителом (Wang, Tomaszewski, 1991). Установлено также сни-
жение экспрессии генов gas по мере старения клеток.
В стареющих клетках нарушается цепочка ранних событий
пролиферативного ответа, и они, в отличие от покоящихся,
постепенно перестают реагировать на факторы роста (Dimri,
Campisi, 1994). Наблюдается снижение активности ферментов,
участвующих в передаче митогенного сигнала, таких как фос-
фолипаза и протеинкиназа С, а также неспособность некоторых
MAP-киназ к «двоякому» фосфорилированию. Стареющие клет-
ки нс могут экспрессировать ген /оу по причине гиперфосфори-
лированного состояния фактора, реагирующего па сыворотку
(SRF), что препятствует его связыванию с промотором fos (см.
главу VI). В то же время другие гены раннего пролиферативного
ответа экспрессируются. Это позволяет считать нарушение
экспрессии гена fos одним из специфических признаков старе-
ния клеток.
В процессе старения затрагивается также и прохождение
клетками периода Gf Несмотря на то, что общее количество
118
циклинов и зависимых от них протсинкиназ не претерпевает
изменений, в образуемых комплексах СОК2/циклин Е и CDK4/
циклин D киназы находятся в нефосфорилированном состоя-
нии, и, следовательно, комплексы остаются неактивными. Это
приводит к тому, что стареющие клетки не могут перейти пункт
ограничения, завершить прохождение периода G, и вступить в
S-период (Dulic et al., 1993).
Утрата способности реагировать на факторы роста присуща
как стареющим, так и терминально дифференцированным клет-
кам, находящимся в состоянии глубокого пролиферативного
покоя (рис. 53). Однако отсутствие способности к размножению
поддерживается в них разными механизмами. Инактивация
Факторы роста
Рис.53. Особенности пролиферирующих, покоящихся и стареющих
клеток в пролиферативном ответе на митоген. Р — пролиферирующая
клетка, R — покоящаяся клетка, Rd — клетка в установившемся
состоянии покоя, Rx — стареющая клетка, X — знак слияния клеток.
• — ингибитор пролиферации, А — стимулятор пролиферации;
толстые стрелки — факторы роста;    — отсутствие реакции на фактор
роста; тонкие стрелки — переход клетки из одного состояния в другое.
119
генов пролиферативного ответа в функционально специализи-
рованных клетках, не вырабатывающих ингибитор пролифера-
ции, происходит, главным образом, вследствие сильной кон-
денсации и утраты матричной активности хроматина, а также
других метаболических изменений, которые, как правило, мо-
гут быть преодолены в условиях, не встречающихся в пределах
целого организма, например, при слиянии с активно пролифе-
рирующими клетками. Ядра стареющих клеток также могут
быть реактивированы в гетерокарионах с пролиферирующими
клетками, содержащими большое количество индукторов син-
теза ДНК, но лишь до определенного возрастного предела. В
отличие от терминально дифференцированных клеток, старею-
щие клетки содержат в большом количестве эндогенный инги-
битор пролиферации, блокирующий передачу митогенного сиг-
нала и не позволяющий регуляторным молекулам осуществлять
инициацию и прохождение клеточного цикла. Поскольку и у
стареющих, и у терминально дифференцированных клеток
нарушен механизм поддержания жизнеспособности в отсут-
ствие самовоспроизведения, присущий покоящимся клеткам, и
те и другие в конечном счете обречены на гибель.
Апоптоз
Представление о гибели клеток как завершающей фазе
терминальной дифференцировки (Cristofalo, 1977) приобрело
повое звучание в связи с интересом к явлению, получившему
название «апоптоз» (от греч. ало — от, лтос, — падение), под
которым подразумевается физиологическая (программирован-
ная) гибель клеток, например, сбрасывание хвоста при мета-
морфозе амфибий, листопад и др. Термин апоптоз был предло-
жен Уайли и соавторами (Wyllie et al., 1980) для того, чтобы
подчеркнуть морфологические различия между процессом фи-
зиологической гибели клеток (сморщивание клетки, межнукле-
осом ная фрагментация ДНК, дезинтеграция мембран) и некро-
зом (набухание клетки и разрыв мембраны с выбрасыванием
клеточного содержимого). Однако детальное изучение апоптоза
началось лишь двадцать лет спустя, когда были охарактеризова-
ны гены и продукты их активности, участвующие в регуляции
этого процесса у млекопитающих.
Выяснилось, что продукт протоонкогена с-тус индуцирует
апоптоз в покоящихся фибробластах. После индукции апоптоза
120
клетки ведут себя вначале сходным образом с клетками, получив-
шими стимул к пролиферации, то есть они проходят этап ранних
пререпликативных реакций, однако в дальнейшем процесс за-
вершается абортивно. При этом отмечается нарушение фосфори-
лирования основных регуляторных молекул, а также падение
содержания статина и других ингибиторов пролиферации клеток.
Апоптоз, индуцированный протоонкогеном с-тус в культуре
фибробластов, может быть подавлен с помощью PDGF и инсу-
линоподобных факторов роста, причем этот эффект не связан с
их митогенным действием, поскольку он проявляется в любом
периоде клеточного цикла. Таким образом, указанные соедине-
ния способны, наряду со стимуляцией размножения клеток,
выполнять своеобразную функцию «факторов выживания». Для
клеток-предшественников гемопоэтической системы факторами
выживания служат отдельные интерлейкины, для клеток эндоте-
лия — компоненты внутриклеточного матрикса.
В подавлении апоптоза лимфоцитов и некоторых других
типов клеток принимает участие продукт протоонкогена Ьс12
(цитоплазматический белок Вс12, вырабатываемый В-лимфо-
цитами), который способствует переходу клеток в состояние
покоя и одновременно повышает их жизнеспособность. Ген Ьс12
является представителем семейства генов, продукты которых
участвуют в регуляции апоптоза. Конститутивная повышенная
экспрессия белка Вс12 защищает клетки от сигналов, вызываю-
щих их физиоло! ическую и патологическую гибель (см обзоры:
Osborne, Schwartz, 1994; Evan et al., 1995).
Механизмам апоптоза присуща эволюционная консерватив-
ность. Близким гомологом гена Ьс12считается ген ced9, предот-
вращающий апоптоз у беспозвоночных.
Особенности клеточной пролиферации в опухолях
и неопластически трансформированных культурах клеток
Превращение нормальной клетки в злокачественную пред-
ставляет собой сложный многоэтапный процесс, который за-
трагивает разные стороны жизнедеятельности клетки, изменяет
ее структуру и метаболизм и отражается на функционировании
и взаимодействии клеток друг с другом как в ближайшем
окружении, так и в пределах всего организма. Поэтому биоло-
гия раковой клетки — такая обширная тема, что ее с трудом
можно вместить в отдельный курс лекций. В рамках же иасто-
121
ящего курса целесообразно сосредоточиться на нескольких
принципиальных вопросах, имеющих непосредственное отно-
шение к клеточному циклу. Среди них можно выделить следу-
ющие: особенности пролиферации неопластических клеток и
нарушение регуляции размножения клеток в процессе канцеро-
генеза (вторая группа вопросов будет рассмотрена в X главе).
Поскольку приобретение злокачественности — это конечный
результат сложного, иногда длительного процесса, его принято
в совокупности называть неопластической трансформацией.
Этот термин охватывает все этапы малигнизации клетки, начи-
ная с самых ранних стадий канцерогенеза.
Изучение параметров клеточного цикла в опухолях мало что
дало для понимания процесса неопластической трансформа-
ции. Продолжительность клеточного цикла зависит от вида
опухоли, ее происхождения и степени прогрессии, причем
существенных сдвигов во времени генерации клеток, как пра-
вило, не наблюдается. В этом нет ничего удивительного, по-
скольку механизмы регуляции размножения клеток в сформи-
рованном организме действуют, главным образом, на этапах
смены состояний активной пролиферации и пролиферативного
покоя Для понимания сущности изменений в системе такой
регуляции необходимо знать, может ли трансформированная
клетка переходить в состояние покоя и вступать в митотический
цикл под влиянием адекватных стимуляторов — факторов роста.
Всесторонний анализ клеточной кинетики опухолей, прове-
денный Стилом (Steel, 1977), позволил сделать заключение, что,
помимо клеток, не способных проходить митотический цикл по
причине нарушенного кровоснабжения и недостатка питатель-
ных веществ, в опухоли присутствуют и покоящиеся клетки,
которые не пролиферируют в силу действия тех же механизмов
регуляции, что и в клетках нормальной ткани, из которой
произошла опухоль. На более поздних стадиях ее развития
решающим фактором, препятствующим прохождению цикла,
становится недостаток питания, приводящий к необратимым
изменениям клеток и некрозам. Поскольку наличие и поведе-
ние покоящихся клеток в растущей опухоли определяется
степенью сохранности дифференцированных участков исход-
ной ткани (что варьирует от случая к случаю), их изучение
сталкивается с определенными трудностями. Последние могут
быть преодолены при использовании клеточных линий, проис-
122
ходящих из первичных опухолей, а также культур клеток,
трансформированных химическими веществами или вирусами.
Известно, что культивируемые клетки, трансформирован-
ные различными агентами, значительно меньше зависят от
экзогенных факторов роста, чем нетрасформированные. Одна-
ко они не полностью утрачивают способность к переходу в
состояние покоя (табл. 13). Радикальную утрату механизма,
обеспечивающего пролиферативный покой, претерпевают только
клетки, трансформированные ДНК-содержащими вирусами, в
то время как при трансформации РНК-содсржагцими вирусами
или канцерогенами этот механизм частично сохраняется
Сходным образом ведут себя неопластически трансформи-
рованные клетки при слиянии с нормальными покоящимися
клетками того же типа. Если в гетерокарионах оказываются ядра
фибробластов, перешедших в состояние покоя в условиях
низкого содержания сыворотки в среде, и ядра клеток, транс-
формированных канцерогенами или РНК-содержащим виру-
сом, то последние не синтезируют ДНК, то есть они переходят
Таблица 13. Утрата способности клеток Swiss ЗТЗ и WI-38
к переходу в состояние покоя (R) при неопластической
трансформации
Клетки	Способность К переходу в R	Поведение ядер нор- мальных фибробластов в гетерокарионах при слиянии с трансформи- рованными клетками
Нормальные	Переходят в R при	Рнорм X R||OpM —* Р
фибробласты	содержании 0,1-0,5% сыворотки в среде	(контроль)
Трансформированные		I ф х Ицпрм R
бснз(«)пиреном Тра нсфор м и ро на н н ы е	Персходяг в R только при	
		Pfp Х Рцо[>М —* Р
вирусом саркомы Рауса	очень низком (0,01-0,02%) содержании сыворотки в среде	
		
Трансформированные вирусом SV-40	Не способны к переходу в R	I Тр X R||i>pM * Р
Примечание: Р — пролиферирующие клетки, R — покоящиеся
кпетки, X — знак слияния клеток, тр — трансформированные, норм —
нормальные; остальные объяснения в тексте.
123
в состояние покоя. Напротив, слияние покоящихся фибробла-
стов с клетками, трансформированными ДНК-содержащими
вирусами, или с клетками линии HeLa, вызывает индукцию
синтеза ДНК в ядрах нстрансформированных клеток, содержа-
щих большие количества эндогенного ингибитора пролифера-
ции (Stein, Yanishcvsky, 1982).
Из всего сказанного следует, что клетки опухолей, а также
неопластически трансформированные клетки в культуре могут
(по крайней мере до определенного предела малигнизации)
переходить в состояние пролиферативного покоя. Это свиде-
тельствует о частичном сохранении в таких клетках механизмов,
регулирующих их размножение. Вместе с тем, состояние покоя
трансформированных клеток несколько отличается по метабо-
лическим характеристикам от состояния покоя нормальных
клеток того же типа. Различия касаются степени конденсации
хроматина, энзиматического профиля, отдельных звеньев обра-
зования макромолекул и структуры внутриклеточных компо-
нентов (подробно см. Епифанова и др., 1988). Однако они не
затрагивают основного свойства покоящихся клеток — способ-
ности возврата к пролиферации при адекватных условиях. Это
обстоятельство необходимо учитывать в терапии опухолей во
избежание их рецидивов, поскольку покоящиеся клетки значи-
тельно более устойчивы к повреждающим воздействиям, по
сравнению с пролиферирующими, в силу особенностей своего
метаболизма (см. главу IV).
Литература
Епифанова О.И., Полуновский В.А., Терских В.В. — «Регуляция раз-
множения клеток в процессе специализации, старения и неопласти-
ческой трансформации», М., ВИНИТИ, Итоги науки и техники, т.
И, 1988.
Campisi J. - Cell, 1996, 84, 497-500.
Cristofalo V.J, — In: «Senescence. Dominant or Recessive in Somatic Cell
Cross?» (Ed. by W.W. Nichols and D.G. Murphy), N.Y., Plenum Press,
1977, 13-21.
Dimri G.P., Campisi J. — Exp. Cell Res., 1994, 212, 132-140.
Dulic V., Drullinger L.F., Lees E., Reed S., Stein G.H. — Proc. Nail Acad.
Sci. USA, 1993, 90, 11034-11038.
Evan G.I.. Brown L.. Whyte M., Harrington E. — Curr. Opin. Cell Biol., 1995,
7, 825-834.
Harris H. - Nature, 1965, 206, 583-588.
124
Hayflick L., Moorhead P.S. — Exp. Cell Res., 1961, 25, 585-621.
Osborne B.A., Schwartz L.M. — Trends Cell Biol., 1994, 4, 394-399.
Ringertz N.R., Savage R.E. — «Cell Hybrids», N.Y., Academic Press, 1976.
Steel G.G. — «Growth Kinetics of Tumours», Oxford, Clarendon Press, 1977.
Stein G.H., Yanishevsky R.M. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1981, 78, 3025-
3029.
Stein G.H., Yanishevskv R.M. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1982, 79, 5287-
5291.
Wang E., Tomaszewski G. — J. Cell. Physiol., 1991, 147, 514-522.
Wier M.L., Scott R.E. - J. Cell Biol., 1986, 102, 1955-1964.
Wille J.J., Scott R.E. — J. Cell. Physiol., 1982, 112, 115-122.
Wyllie A.H., Kerr J.F.R., Currie A.R. — Intern. Rev. Cytol., 1980, 68, 251-
306.
125
ГЛАВА X. НАРУШЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ
КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА ПРИ
НЕОПЛАСТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ
КЛЕТОК И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ФАКТОРЫ,
СДЕРЖИВАЮЩИЕ ЭТОТ ПРОЦЕСС
Изменения в передаче митогенного сигнала в ядро при
неопластической трансформации клеток
Как уже отмечалось, неопластические клетки значительно
меньше зависят от присутствия в среде пол и пептидных факторов
роста, чем нормальные клетки. Это происходит потому, что в
процессе трансформации они сами начинают вырабатывать и
выделять в среду факторы роста, для которых на их поверхности
имеются специфические рецепторы. Эндогенное образование
факторов роста становится постоянным стимулом пролиферации
трансформированных клеток, и у них постепенно начинает преоб-
ладать аутокринный тип регуляции клеточного размножения,
наблюдаемый на ранних стадиях эмбрионального развития орга-
низмов (см. главу VIII). В процессе приобретения клетками
злокачественности может меняться химическая структура отдель-
ных факторов роста, а также их взаимодействие с рецепторами.
Для того, чтобы представить себе возможные нарушения в
системе фактор роста — рецептор, необходимо иметь в виду, что
полипептидныс факторы роста обладают, как правило, значи-
тельно более широким спектром действия, чем это предполага-
лось раньше (когда им были даны названия), фактически
являясь мультифункциональными агентами. Это означает, что
один и тот же фактор роста может выступать в роли стимулятора
или ингибитора клеточной пролиферации, а также проявлять
физиологическую активность, не имеющую отношения к про-
лиферации. Характер действия факторов роста определяется
совокупностью внутриклеточных условий, конкретно — при-
сутствием других факторов роста, состоянием активируемых
ими сигнальных молекул, а также особенностями функциони-
рования рецепторов: их аффинностью к факторам роста и
соотношением концентрации факторов роста и рецепторов в
общем микроокружении (Гуревич, 1997).
На рис. 54 схематически изображены разные ситуации, при
которых может происходить нарушение передачи митогенного
126
Б
Рис. 54. Возможные модуляции в передаче сигнала от факторов роста
через рецепторы в клетку: (А) уменьшение числа рецепторов; (Б)
трансмодуляция рецепторов; (В) наличие мультифункциональных
рецепторов (два лиганда — один рецептор); (Г) индивидуальные рецеп-
торы для разных субъединиц одного и того же фактора роста (один
лиганд — два рецептора). EGF, TGF-oc, инсулин, IGF-I, IGF-II, PDGF
— факторы роста (объяснение в тексте).
сигнала на этапе фактор роста — рецептор. Рис. 54А показывает
случай уменьшения (down-regulation) числа рецепторов к кон-
кретному фактору роста (EGF) под влиянием гомологичного
лиганда (TGF-oc), который постепенно вытесняет EGF. При
этом рецепторы восстанавливаются прежде, чем они деградиру-
ют, и вновь связываются с TGF-oc, благодаря более интенсивно-
му фосфорилированию по остаткам тирозина, чем это происхо-
дит при связывании с EGF. Рис. 54Б отражает феномен перерас-
пределения рецепторов в пользу одного фактора роста (напри-
мер, IGF-II) под влиянием другого фактора роста (инсулина),
который непосредственно не связывается с рецепторами к
первому фактору. Этот феномен получил название трансмоду-
ляции. Рецепторы, как и факторы роста, могут быть мультифун-
кционгтпьными, то есть содержать в своей молекуле участки для
127
связывания разных лигандов (например, IGF-I и IGF-II). Этот
случай изображен на рис 54В. Вместе с тем, к разным субъеди-
ницам (А и В) одного и того же фактора роста — PDGF,
существуют, как это уже было описано в главе V, отдельные
рецепторы (а и Р), причем а -рецепторы способны связывать все
три формы PDGF (А-А, A-В и В-В), а Р-рецепторы — только
форму В-В (рис. 54Г). Такой фактор роста, как TGF-p, облада-
ющий ярко выраженными мультифункциональными свойства-
ми, осуществляет передачу сигнала через систему взаимодей-
ствующих друг с другом рецепторов (на рисунке не показано).
При этом рецепторы типа I отвечают за действие TGF-p на
внеклеточный матрикс (подготовка микроокружения клетки), а
рецепторы типа II (в комплексе с рецепторами типа I) участвуют
в опосредовании сигналов, регулирующих размножение клеток.
Благодаря этим многообразным свойствам комплекса фак-
тор роста — рецептор, в клетке возникает сложный сигнальный
язык (cross-talk), в котором отдельные полипептиды выполняют
роль букв алфавита или кода. Малейшие нарушения в структуре
этого языка могут повлечь за собой изменение всей системы
сигнализации и соответственно внутриклеточного гомеостаза,
что может отразиться в конечном счете на темпах пролифера-
ции клеток.
Рассмотрим это на примере взаимодействия двух факторов
роста — TGF-a и TGF-P в процессах, происходящих при
регенерации печени (Fausto, Mead, 1989), где в полной мере
проявляются и аутокринный, и паракринный типы регуляции
размножения клеток. В упрощенном виде картина выглядит
следующим образом (рис. 55). Нормальный гепатоцит интакт-
ной печени не вырабатывает TGF-p, однако содержит на своей
поверхности рецепторы, специфичные к нему, а также рецеп-
торы, специфичные к EGF. Поскольку TGF-p образуется в
соседних с гепатоцитами клетках эндотелия печени, он, будучи
ингибитором пролиферации, может легко уравновешивать сти-
мулирующее действие других факторов роста, в том числе EGF.
В данном случае имеет место сбалансированная регуляция по
аутокринному и паракринному способам. При регенерации
печени после повреждающего воздействия в гепатоцитах на-
блюдается резкое снижение числа рецепторов к EGF, так как их
занимает TGF-a, образование которого начинается через 12 час
после гепатэктомии. Максимальное содержание TGF-a в реге-
128
Часы после гепатэктомии
TGF-a
Гепатоцит
Аутокринная
петля
Рис.55. Аутокринная и паракринная регуляция размножения клеток
в печени крысы (по данным Фаусто и Мида), объяснения в тексте.
------ синтез ДНК в гепатоцитах;
----- синтез ДНК в клетках эндотелия.
нерируюшсй печени совпадает с пиком синтеза ДНК в гепато-
цитах. Напротив, количество TGF-0 остается в это время
низким и начинает нарастать лишь спустя сутки после гепатэк-
томии, причем максимум TGF-p наблюдается во время пика
синтеза ДНК в клетках эндотелия. При нормальном течении
регенерационного процесса паракринный тип регуляции раз-
множения клеток уравновешивает регуляцию по аутокринному
типу. Смещение процесса в сторону преобладания аутокринно-
го типа регуляции (например, вследствие недостаточного обра-
зования TGF-p) может приводить к необратимому поврежде-
нию всего контура обратных связей (feed-back circuit) и выходу
клеточного размножения из-под контроля регуляционных сис-
тем.
129
Вместе с тем способность клеток к самостоятельной выра-
ботке факторов роста, равно как и отклонения от их нормаль-
ного взаимодействия с рецепторами, сами по себе не являются
достаточным и обязательным условием неопластической транс-
формации, поскольку клетки, как будет ясно из дальнейшего,
располагают мощным арсеналом метаболических реакций, про-
тиводействующих этому процессу.
При неопластической трансформации клеток могут затраги-
ваться отдельные звенья передачи митогенного сигнала в ядро
на уровне вторичных посредников. В частности, наблюдается
конститутивная активация протеинкиназы С в клетках, транс-
формированных вирусами, а также усиление активности фер-
ментов, принимающих участие в каскаде фосфорилирования
MAP-киназ и факторов транскрипции, с последующей экспрес-
сией генов раннего пролиферативного ответа, в том числе
протоонкогенов.
Экспрессия протоонкогенов при неопластической
трансформации клеток
Представления о причинах активации протоонкогенов в
процессе канцерогенеза опираются на две гипотезы, не исклю-
чающие друг друга. Одна из них предполагает, что протоонко-
гены превращаются в трансформирующие гены в результате
мутации. Согласно другой гипотезе, получившей название «дозы
гена», различие между обычными и активированными протоон-
когенами носит количественный характер и заключается в
усилении транскрипции неизмененных протоонкогенов, уча-
ствующих в инициации и прохождении клеточного цикла (см.
главу VI, а также обзор Епифановой и др., 1988).
Как уже было отмечено в главе VI, в 80-х годах появилась
надежда на реальный прорыв в изучении причин злокачествен-
ного перерождения клеток, когда было установлено, что про-
дукт протоонкогена sis гомологичен В-цепи PDGF, а продукт
протоонкогена егЬВ гомологичен части рецептора EGF, На
страницы научных журналов хлынул поток сообщений о повы-
шенной экспрессии протоонкогенов при различного рода ново-
образованиях, а также в неопластически трансформированных
культурах клеток, причем подразумевалось причинная зависи-
мость между указанными процессами. Однако все оказалось не
так просто. Рассмотрим это на нескольких примерах.
130
В некоторых случаях клетки, трансформированные вирусом
саркомы обезьяны (у-sis), начинают секретировать в окружаю-
щую среду PDGF- подобные молекулы, и на их поверхности
появляются рецепторы к PDGF, что указывает на возникнове-
ние аутокринного типа регуляции, характерного для неопласти-
ческих клеток. Однако в других случаях трансформация тем же
вирусом клеток, претерпевающих злокачественное перерожде-
ние, не сопровождается секрецией PDGF, что нс позволяет
рассматривать повышение экспрессии протоонкогена sis как
непременное условие, предваряющее неопластическую транс-
формацию.
В ряде опухолей человека обнаружена амплификация прото-
онкогена erbB и усиление экспрессии его продукта, гомологич-
ного внутреннему домену рецептора EGF. Однако остается
неясным, является ли усиление продукции рецептора EGF при-
чиной или следствием неопластической трансформации клеток.
В равной мере это рассуждение можно применить и к
случаям амплификации в опухолях других протоонкогенов,
например, гена sre, продукт которого фосфорилирует мембран-
ные фосфолипиды, гена ras, сопровождающейся повышенной
экспрессией его продукта — онкобелка р21, а также гена тус,
продукт которого участвует втрансактивации многих генов. Для
проявления трансформирующей активности онкобелка р21 не-
обходима мутация гена ras, в то время как активация гена тус
и его продукта — р65 достигается главным образом посредством
увеличения числа копий гена. Совместная трансфекция фиб-
робластов генами ras и тус приводит к их неопластической
трансформации, в то время как по отдельности эти гены
неактивны. Наблюдаемый эффект, получивший название «транс-
формирующего воздействия», комплементарен, а не аддитивен
Затрагиваемые при этом процессы включают в себя активацию
комплекса СОК2/циклин Е и фактора транскрипции E2F (Leone
eta!., 1997). Практически протоонкоген ras никогда не вызывает
при трансфекции в клетки их полную неопластическую транс-
формацию Для достижения этого результата необходимы до-
полнительные условия, например, подготовка микроокружения
клетки, а также воздействие на систему внутриклеточных инги-
биторов пролиферации, что позволяет устранить факторы пара-
кринного и аутокринного негативного контроля, противодей-
ствующие трансформации клеток (см. следующий раздел).
131
Данные, представленные в настоящем разделе, позволяют
заключить, что неопластическая трансформация клеток не
может быть следствием только повышенной экспрессии прото-
онкогенов, которая отражает лишь одно из многочисленных
нарушений метаболизма в процессе канцерогенеза.
Нарушения в системе эндогенной регуляции размножения
клеток при неопластической трансформации и возможность
биологической коррекции
Как уже неоднократно подчеркивалось, в основе регуляции
размножения клеток лежит сложный процесс взаимодействия
экзогенных и эндогенных регуляторов, обеспечивающих смену
состояний активной пролиферации и пролиферативного покоя.
Неопластические клетки частично или полностью выходят из-
под контроля этой системы: они начинают сами вырабатывать
факторы роста, в них ускоряется передача митогенного сигнала
и усиливается экспрессия протоонкогенов. Однако этих нару-
шений недостаточно для превращения нормальной клетки в
злокачественную. То обстоятельство, что неопластическая транс-
формация — крайне редкое событие в эволюции многоклеточ-
ных, свидетельствует о весьма эффективном функционирова-
нии внутриклеточных факторов, противодействующих неконт-
ролируемому размножению клеток.
Вместе с тем, в процессе канцерогенеза наблюдается посте-
пенное ослабление системы эндогенного контроля пролифера-
ции клеток. Неопластические клетки теряют способность к
образованию в нужном количестве ингибиторов пролиферации,
а также чувствительность к их действию, о чем свидетельствуют,
в частности, результаты опытов по слиянию нормальных и
злокачественных клеток (см. главу IX). В неопластической
клетке создается более высокий пролиферативный потенциал,
который не в состоянии преодолеть ее собственная система
эндогенного контроля.
Можно ли вмешаться в этот процесс? Попытки восстановле-
ния внутриклеточного гомеостаза посредством устранения де-
фектов, возникающих при неопластической трансформации,
предпринимались неоднократно с большим или меньшим успе-
хом. Один из подходов заключается в воздействии па неопласти-
ческие клетки природными ингибиторами пролиферации, таки-
ми как интерферон бета (IF1S-P), TGF-[3 и другими антипро-
132
лиферативными соединениями, вырабатываемыми нормальны-
ми клетками (см. главу VII). Лучше всего изучен в этом отноше-
нии IFN-p, который оказывает тормозящее действие на проли-
ферацию фибробластов и других клеток, препятствуя приобрете-
нию ими компетентности для прохождения пререпликативного
периода. При этом IFN-p ведет себя как антагонист PDGF, а
последний, напротив, стимулирует образование IFN-p. В поддер-
жание гомеостаза могут вовлекаться и другие факторы роста,
например, TGF-p, также стимулирующий образование IFN-P
при воздействии на фибробласты. В результате в клетке возника-
ет каскад регуляторных событий, который может при благопри-
ятном стечении обстоятельств (правильный выбор дозы природ-
ного ингибитора в зависимости от исходного состояния клетки,
ее микроокружения ит.д.) восстановить внутриклеточный гоме-
остаз. благодаря разнообразным реакциям, протекающим по
типу положительной и отрицательной обратной связи.
Использование природных антипролиферативных соедине-
ний в клинической практике, в отличие от хирургического,
радио- и химиотерапевтического воздействий, относится к мето-
дам биологической терапии опухолей. Общий недостаток приме-
нения ингибиторов типа IFN-p и TGF-p — постепенная утрата
чувствительности к ним неопластических клеток в силу наруше-
ния при трансформации более тонких регуляторных механизмов.
Например, клетки перестают реагировать на IFN вследствие
дефектов в системе вторичных сигнальных молекул в частности,
в цепочке MAP-киназ. Для проявления антипролиферативного
действия TGF-P на трансформированные клетки необходимо
подавление активности основных позитивных внутриклеточных
регуляторов — циклинов и зависимых от них киназ, что может
происходить только при полноценно функционирующем комп-
лексе рецепторов TGF-p типа I и типа II (см, стр. 128). Наруше-
ние взаимодействия этих рецепторов в неопластических клетках
снижает их реакцию на TGF-p. Очевидно, что для биологической
коррекции требуются более совершенные способы воздействия
на клетки, претерпевшие неопластическую трансформацию.
Гены-супрессоры опухолей (антионкогены) и продукты
их активности
В середине 80-х годов стали предприниматься попытки
обнаружить внутриклеточные антагонисты онкогенов. Удалось
133
установить, что многие нстрансформированные клетки содер-
жат в определенных хромосомах гены, кодирующие белки,
нормальная функция которых состоит в подавлении неопласти-
ческой трансформации. Они получили название генов-супрес-
соров опухолей, или антионкогенов. К настоящему времени
известно лишь несколько таких генов, в то время как число
онкогенов составляет многие десятки.
Лучше всего изучен ген-супрессор Rb, получивший свое
обозначение от названия опухоли — ретинобластомы, которая
возникает вследствие мутации или отсутствия этого гена Ген Rb
локализован в 13-й хромосоме человека, и его аберрации могут
приводить к появлению разных опухолей. Продукт гена Rb —
белок pRB (мол. масса 105 кД) присутствует во всех нормальных
тканях и вместе со своими близкими гомологами — р 107 и р 130
— является одним из ключевых элементов внутриклеточного
механизма регуляции размножения клеток.
Об этом свидетельствуют следующие данные.
Белок pRB присутствует как в пролиферирующих, так и в
покоящихся клетках, однако в последних он находится в дефос-
форилированном состоянии и только в таком виде проявляет
себя как ингибитор пролиферации. При вступлении покоящих-
ся клеток в цикл pRB подвергается фосфорилированию (осо-
бенно интенсивному в позднем периоде G,), пребывая в этом
состоянии на протяжении периодов S и G2, после чего проис-
ходит его дефосфорилирование в митозе (рис. 56). Таким
образом, фактором, препятствующим прохождению клеточного
цикла, служит не наличие или отсутствие молекулы ингибитора,
а ее биохимическая трансформация. Существенно при этом,
что, будучи в нефосфорилированной форме, pRB тесно связан
с компонентами ядра, а фосфорилирование освобождает его,
позволяя осуществлять другие внутриклеточные функции. От-
сюда следует, что важен не только процесс модификации
ингибитора, но и его перемещение в клетке.
Наконец, еще одним свойством pRB является его способ-
ность образовывать в нефосфорилированном или гипофосфо-
рилированном состоянии комплексы с факторами транскрип-
ции и подавлять таким образом активность генов, продукты
которых участвуют в инициации синтеза ДНК. Это, прежде
всего, комплекс с фактором E2F (активатором промотора аде-
новируса Е2), точнее с одним из представителей этого семейства
134
Рис.56. Активность pRB на протяжении клеточного цикла (по
Хеймелу). Gp S, G2, М — периоды цикла, Gu — состояние покоя.
факторов транскрипции. Комплекс — pRB/E2F обнаруживает-
ся только в состоянии пролиферативного покоя и раннем
периоде Gp исчезая при гипофосфорилировании pRB. Образо-
вание этого комплекса следует рассматривать как принципи-
альное событие в осуществлении негативного контроля проли-
ферации клеток, поскольку сам pRB не способен связываться с
ДНК и может препятствовать репликации только путем взаимо-
действия с другими белками, в частности, выключая E2F (Nevins,
1992; La Thanguc, 1994).
В фосфорилировании pRB последовательно участвуют ком-
плексы циклинЕ)/СЕК4,6 (осуществляющие гипофосфорили-
рование) и циклин E/CDK2 (вызывающий гиперфосфорилиро-
вание), после чего наблюдается инициация синтеза ДНК
(Ezhevsky et aL, 1997). Сходным образом происходит, по-
видимому, и фосфорилирование гомолога pRB — белка р!07. В
отличие от pRB и pl07, третий представитель этого семейства
— белок р 130 не подвергается дефосфорилированию при пере-
ходе клеток в состояние покоя, а, напротив, проходит этапы
ступенчатого фосфорилирования, последовательно образуя ком-
плексы с разными формами фактора транскрипции E2F. При
этом фосфорилирование р 130 осуществляется протеинкиназой,
не относящейся к классу циклип-зависимых киназ и активной
только в покоящихся клетках. Комплекс pl30/E2F уникален для
клеток в состоянии покоя и терминальной дифференцировки и
не обнаруживается в раннем пререпликативном периоде после
135
митогенной стимуляции, как это наблюдается в случае комп-
лекса pRB/E2F, который распадается значительно позже, веро-
ятно — в пункте ограничения. Взаимодействие различных форм
белков семейства pRB создает большие возможности для эндо-
генного негативного контроля клеточного размножения (см.
обзоры: Miiller, 1995; Weinberg, 1995; Beijersbergen, Bernards,
1996; Mayol et al., 1996).
Еще одним представителем продуктов генов-супрессоров,
достаточно детально изученным, является белок р53, известный
также как активатор апоптоза, благодаря способности к транс-
крипционному выключению гена Ьс12, продукт которого защи-
щает клетки от гибели (см. главу IX). Другим важным свойством
р53 служит его антипролиферативная активность, проявляюща-
яся, в частности, в остановке прохождения клетками периода G]
при повреждениях ДНК. В процессе исследования механизма
ингибирующего действия р53 на размножение клеток выясни-
лось, что в его присутствии происходит транскрипционное
включение гена, кодирующего образование другого белка —
р21, который подавляет активность комплексов CDK/циклин и
как следствие — вступление клетки в S-период и митоз. Впро-
чем белок р21 может экспрессироваться и функционировать
независимо от белка р53 (см. обзоры: Сох, Lane, 1995; Gottlieb,
Oren, 1996).
Белок р21 (не имеющий гомологии с белком р21 — продук-
том гена ms) был обнаружен в разных типах клеток, в том числе,
в клетках стареющих культур. Эти работы были выполнены
одновременно и независимо в нескольких лабораториях США
и Израиля в конце 1993 года (см. обзор: Epifanova, Brooks, 1994),
что вывело ученых на открытие нового класса внутриклеточных
антипролиферативных регуляторов — ингибиторов циклин-
зависимых киназ (cyclin-dependent kinase inhibitors, или CKIs).
Ингибиторы циклин-зависимых киназ (CKIs)
Изучение CKIs развивается так стремительно, что позволяет
уже сейчас получить довольно полное представление об их
действии и сгруппировать по основным свойствам. Как следует
из данных табл. 14, все CKIs позвоночных могут быть условно
объединены в два семейства — Cip/Kip и INK. Эти обозначения
представляют собой сокращенные варианты одного и того же
понятия — ингибитор CDK (например, Cip — CDK-interacting
136
protein, Kip — kinase inhibitory protein, INK — kinase inhibitor).
Обилие таких сокращений, равно как и синонимов названий
отдельных ингибиторов, объясняется их быстрым параллель-
ным изучением в разных лабораториях, что не оставляет време-
ни для согласования терминов.
Белок р21 обладает способностью взаимодействовать физи-
чески почти со всеми циклин-зависимыми киназами, входящи-
Таблица 14. Ингибиторы циклин-зависимых киназ (CKls)
в клетках млекопитающих
Название	Преимущественное связывание	Некоторые свойства
Семейство Cip/Kip р21 (Cipl, WafI, Sdil)	СОК2/циклин А СОК2/циклин Е СВК4,6/циклин D	1)	Продолжительность полужизни -2ч 2)	Участвует в образовании тет- рамерных комплексов с CDK/ник- линами и PCNA 3)	Уровень мРНК и белка воз- растает в состоянии покоя и продолжает увеличиваться в течение первых часов после митогенной стимуляции клеток
Р27 (Kipl)	СВК2/циклин А CDK2/hhkjihh Е CDK4,6/hhkjihh D	1)	Продолжительность полужизпи -2ч, возрастает до 6-8 ч в состоянии покоя 2)	Уровень белка значительно воз- растает в состоянии покоя, бла- годаря ускорению трансляции и пост-трансляционпой стабили- зации 3)	После стимуляции клеток митогеном уровень белка не- медленно снижается
р57 (Kip2)	СВК2/циклин А СВК2/циклин Е CDK4,6/hhkjihii D	Характеризуется тканеспсцифич- ностью; присутствует, в основном, в дифференцированных клетках
Семейство INK р 16 р 15 pI8 pl 9	CDK4,6/uhkjihh D	1) Белок р1б препятствует сборке комплекса СОК4,6/циклип D 2) Уровень р 16 низок на протяжении нрерспликативного периода после митоенной стимуляции и возрастает на границе периодов Gi/S
137
ми в комплекс CDK/циклин, отдавая предпочтение CDK2 (см
обзор. Sherr, Roberts, 1995). В свободном виде р21 отличается
неустойчивостью вторичной и третичной структуры, но приоб-
ретает стабильную конформацию при связывании с CDK2 и
другими циклин-зависимыми киназами. В его молекуле присут-
ствуют также отдельные участки связывания с циклинами, что
необходимо для подавления киназной активности комплекса
CDK/циклин.
Принципиально важным свойством р21 оказалось его учас-
тие в образовании тетрамерных комплексов, в состав которых,
помимо CDK и циклинов, входит уже знакомый нам 8-кофактор
ДНК-полимеразы — белок PCNA, являющийся одним из ини-
циаторов репликации ДНК (рис. 57). Для связывания PCNA в
молекуле р21 существуют домены, нс зависимые от его взаимо-
действия с CDK и циклинами, что придает большую устойчи-
вость таким комплексам и прочно блокирует вступление клеток
в S-период. Тетрамерные комплексы могут существовать в
активном (фосфорилированном) и неактивном состояниях и
распадаться до димеров под влиянием митогенных стимулято-
ров, а также при неопластической трансформации клеток (Xiong
et al., 1992; Zhang et al., 1994).
Белок p27 проявляет 40%-ную гомологию с белком р21. Он
взаимодействует в большей или меньшей степени со всеми
основными комплексами CDK/циклин, в зависимости от типа
клеток и условий культивирования В культуре клеток эпителия
легкого, подвергнутых действию TGF-p, р27 связывает и инак-
тивирует комплекс СОК2/циклин Е, а в культуре макрофагов,
пролиферация которых подавлена после обработки с АМР, р27
препятствует фосфорилированию комплекса СОК4/циклин D,
выступая в обоих случаях как медиатор экзогенного ингибиру-
Рис 57. Образование димерных и тетрамерных комплексов между
регуляторными молекулами, определяющими прохождение клеточного
цикла.
138
ющего сигнала. В отличие от р21, он не входит в состав
тетрамерных комплексов с участием PCNA В культуре клеток,
перешедших в состояние покоя, наблюдается быстрое возраста-
ние количества р27 (Hengst, Reed, 1996). Это происходит благо-
даря ускоренной трансляции и многократному увеличению
продолжительности жизни молекул белка, вследствие сниже-
ния активности убиквитин-зависимой протеолитической сис-
темы. Последний факт заслуживает особого внимания в плане
общей оценки свойств покоящихся клеток. Как известно,
скорость обновления молекул в состоянии пролиферативного
покоя в целом выше, чем в пролиферирующих клетках (см
главу IV). Тем не менее, негативные эндогенные регуляторы
обновляются, как мы видим, значительно медленнее, что спо-
собствует поддержанию состояния покоя.
Белок р57 изучен не так подробно, как другие представители
семейства Cip/Kip. Он обладает тканеснецифичностыо, присут-
ствуя в больших количествах в плаценте и в меньшей степени
в других тканях.
Представители семейства INK — белок р 16 (который изучен
лучше других) и его гомологи выполняют функцию специфи-
ческих ингибиторов комплекса CDK4,6/ циклин D, препят-
ствуя его сборке (рис. 58) и не допуская тем самым его
фосфорилирование ферментом САК (CDK-activating kinase).
Помимо этого, белку р 16, который активен только в клетках,
содержащих pRB, принадлежит и другая роль в регуляции
клеточного цикла. Его уровень резко возрастает с началом S-
периода, что обеспечивает снижение активности комплексов
СЕЖ4,6/циклин D и препятствует избыточному фосфорилиро-
ванию pRB, когда клетка уже завершила период Gf (регуляция
по принципу отрицательной обратной связи).
Рис.58. Сборка
комплекса СОК4/цик-
лин D под влиянием
митогена, с последую-
щим фосфорилирова-
нием ферментом САК.
D — циклин D, САК
— киназа, активирую-
щая CDK, PCNA-6 -
кофактор ДНК-полимеразы, р 16 — ингибитор циклин-зависимых киназ.
139
Открытие ингибиторов циклин-зависимых киназ позволило
внести ясность во многие нерешенные вопросы регуляции
размножения клеток. CKIs обнаружены в большом количестве
в стареющих культурах клеток, причем происходит поэтапное
включение разных ингибиторов с увеличением числа пассажей
(Alcorta et al., 1996). Индукция CKIs или близких гомологов
наблюдается при метаморфозе насекомых, она предшествует
установлению соматического клеточного цикла в эмбриональ-
ном развитии лягушки, а также играет определяющую роль в
процессе специализации тканей, предваряя терминальную диф-
ференцировку. Уже сейчас предпринимаются попытки исполь-
зовать СКкдля биотерапии опухолей (втом числе, заместитель-
ной генной терапии), однако это — предмет будущих исследо-
ваний.
Существует ли связь между CKIs и короткоживущими белка-
ми-репрессорами, выявляемыми в опытах по слиянию клеток?
На этот вопрос пока нет определенного ответа, однако наблю-
даемые различия в действии CKIs на основные компоненты
позитивной регуляции клеточного цикла — комплексы CDK/
циклины, а также флюктуации их внутриклеточного уровня
после стимуляции (см. табл. 14), позволяют предполагать совме-
стное участие ингибиторов циклин-зависимых киназ в подавле-
нии синтеза ДНК в ядрах пролиферирующих клеток в гетерока-
рионах с покоящимися клетками.
Общие принципы регуляции клеточного цикла
На основании всего вышеизложенного можно сделать неко-
торые обобщения относительно регуляции клеточного цикла у
эукариотов. Прежде всего, наблюдается участие близких по
структуре молекул — циклин-зависимых киназ и их ингибито-
ров — в прохождении клетками различных контрольных пунк-
тов (checkpoints) клеточного цикла, определяющих последова-
тельность его событий (см обзоры: Nurse, 1994; Elledge, 1996;
Nasmyth, 1996). При этом регуляторные молекулы могут обра-
зовывать димерные и тетрамерные комплексы, распадающиеся
по мерс необходимости. Процесс активации — инактивации
регуляторных молекул обеспечивается многочисленными реак-
циями фосфорилирования — дефосфорилирования, протекаю-
щими по принципу обратной связи, а также убиквитин-зависи-
мым протеолизом молекул, завершивших свою функцию в том
140
или ином пункте клеточного цикла (King et al., 1996). Такая
система регулирования препятствует осуществлению более по-
здних событий клеточного цикла, если предыдущие еще не
закончены, и делает невозможным движение процессов в обрат-
ном направлении. Сходство регуляторных молекул и образуе-
мых ими комплексов на разных этапах клеточного цикла не
означает их тождественности. В противном случае клетка не
могла бы «помнить», в какой точке цикла она находится.
В отсутствие митогенов клетка прекращает прохождение
цикла и переходит в состояние покоя, где, благодаря особенно-
стям своего метаболизма, она сохраняет жизнеспособность и
пролиферативный потенциал. Важную роль в поддержании
состояния покоя играет белок pRB, который в эго время
дефосфорилирован и прочно связан с фактором транскрипции
E2F, что препятствует синтезу ДНК. В покоящихся клетках
комплексы CDK/циклин неактивны, а внутриклеточный уро-
вень ингибиторов циклин-зависимых киназ, напротив, возрас-
тает, по сравнению с пролиферирующими клетками. Получив
стимул к пролиферации, покоящаяся клетка вновь начинает
прохождение цикла. Чередование периодов активной пролифе-
рации и пролиферативного покоя — основополагающий прин-
цип регуляции размножения клеток эукариотических организ-
мов.
На рис. 59 условно изображено прохождение клеткой пре-
репликативного периода при воздействии митогеном в свете
современных представлений о функционировании основных
регуляторных молекул, обеспечивающих этот процесс. Для
удобства показано взаимодействие комплексов CDK/циклин
лишь с одним ингибитором — р21. Основным событием прсрсп-
ликативного периода является фосфорилирование белка pRB (в
котором принимают участие все комплексы) и последующее
освобождение фактора транскрипции E2F для осуществления
индукции синтеза ДНК. Этот момент, очевидно, и следует
считать пунктом ограничения, поскольку, пройдя его, клетка
уже необратимо комитирована к переходу в S-период.
В настоящее время нет ясности в вопросе о том, почему
стимулированной митогеном клетке требуется всего около 10
мин для передачи сигнала в ядро и экспрессии генов пролифе-
ративного ответа, в то время как репликация ДНК начинается,
за редкими исключениями, не раньше, чем через несколько
141
Пререпликативный период
Рис. 59. Панорама событий, развертывающихся на протяжении
пререпликативного периода с участием регуляторных молекул, опреде-
ляющих прохождение клеточного цикла. Gp S — периоды клеточного
цикла; Gu — состояние покоя, г-пункт — пункт ограничения; граница
периодов G /S искусственно растянута. С1Ж — циклин-зависимые
киназы; A, D, Е — циклимы, PCNA — 5-кофактор ДНК -полимеразы;
pRB — продукт гена-супрессора Rb, E2F — фактор транскрипции.
часов. Косвенным указанием на причину задержки могут слу-
жить данные о сложном взаимодействии сигнальных молекул с
комплексами CDK/циклин и белком pRB. Например, МАР-
киназы р42 и р44 усиливают экспрессию циклина D, в то время
как MAP-киназа р38 подавляет ее. Другая сигнальная молекула
— продукт протоонкогена ras также усиливает экспрессию
циклина D, однако активации комплекса СЭК4,6/циклин D
при этом не происходит. Оказалось, что медиатором, связыва-
ющим функцию белка ras с событиями пререпликативного
периода, служит pRB, для фосфорилирования которого требу-
ется ряд условий, в частности, снижение уровня некоторых
циклин-зависимых киназ. Таким образом, задержка во времени
142
при переходе клеток к репликациии ДНК после получения
митогенного сигнала связана, по-видимому, с необходимостью
предварительной подготовки и преобразования основных регу-
ляторных молекул и их комплексов, обеспечивающих прохож-
дение клеточного цикла.
В заключение .можно сказать, что сейчас исследователи
клеточного цикла вплотную подошли к разгадке природы таин-
ственных «биологических часов», отсчитывающих время от
одного деления клетки до другого. Их механизм включает в себя
вполне конкретные позитивные и негативные регуляторные
элементы. Запуск часов осуществляется митогенами, иниции-
рующими последовательную сборку, экспрессию и деградацию
комплексов с киназной активностью, что обеспечивает пра-
вильный ход часов в нужном направлении.
Литература
Гуревич К.Г. — Биохимия, 1997, 62, 1221-1224.
Епифанова О И., Полуновский В А., Терских В.В. — «Регуляция раз-
множения клеток в процессе специализации, старения и неопласти-
ческой трансформации», М.. ВИНИТИ, Итоги науки и техники, т.
11, 1988.
Alcorta D.A., Xiong У.. Phelps D., Hannon G., Beach D., Barrett J.C. — Proc.
Natl Acad Sci? USA, 1996,93, 13742-13747
Beijersbergen R.L., Bernard R. — Biochem. Biophys Acta, 1996, 1287. ЮЗ-
120.
Cox LS . Lane DP- BioEssays, 1995, 17, 501-508.
Elledge S.J. - Science, 1996, 274, 1664-1671.
Epifanova O.I., Brooks R.F. - Cell Prolif., 1994, 27, 373-394.
Ezhevsky S.A , Nagahara H., Vocero-Akbani A M , Gins D.R , Wei M C.,
Dowdy S.F., - Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10699-10704
Fausto N., Mead J.E. — Lab. Investig., 1989, 60, 4-13.
Gottlieb T.M , Oren M. — Biochem. Biophys Acta, 1996, 1287, 77-102.
Hamel P.A., Gallie B.L., Phillips R.A. — Trends Genet., 1992, 8, 180-185.
Hengst L., Reed S.I - Science, 1996, 271, 1861-1864.
King R.W., Deshaies R.J., Peters J.-M., Kirschner M. — Science, 1996, 274,
1652-1658.
Larsen C.-J. — Oncogene, 1996, 12, 2041-2044
La Thangue N.B., — Curr. Opin. Cell Bio!., 1994, 6, 443-450.
Leone G., Gregori I., Sears R., lakoi L.. Nevins J.R. — Nature. 1997, 387,
422-426.
Mayol X., Garriga J., Grana X. — Oncogene, 1996, 13, 237-246.
Muller R. - Trends Genet., 1995, 11, 173-178.
Nasmyth K. — Science, 1996, 276, 1643-1645.
143
Nevins J.R. — Science, 1992, 258, 424-429.
Nurse P. - Cell, 1994, 79, 574-550.
Shcrr C.J., Roberts J.M. — Genes & Developm., 1995, 9, 1149-1163.
Weinberg R.A. - Cell, 1995, 81, 323-330.
Xiong Y., Zhang H., Beach D. — Cell, 1992, 71, 505-514.
Zhang H., Hannon G.J., Beach D. — Genes & Developm., 1994, 8, 1750-
1758.
О.И. Епифанова
ЛЕКЦИИ О КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ
ISBN 5—87317—047—9
Сдано в набор 15.11.97. Подписано в печать 28.12.97.
Формат 60x90/8. Объём 9 уч. изд. листов.
Печать офсетная. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс.
Тираж 500 экземпляров. Отпечатано фирмой «Полтекс".
"Товарищество научных изданий КМК"
111531, Москва, Шоссе Энтузиастов-100-5-56
ЛР № 070831 от 25.01.93
144