/
Автор: Мецлер Д.
Теги: материальные основы жизни биохимия молекулярная биология биофизика химия биология
Год: 1980
Текст
BIOCHEMISTRY
THE CHEMICAL REACTIONS
OF LIVING CELLS
David E. Metzler
IOWA STATE UNIVERSITY
Academic Press
New York San Francisco London
A SUBSIDIARY OF HARCOURT BRACE JOVANOVICH,
PUBLISHERS
Д. Мецлер
БИОХИМИЯ
Химические реакции
в живой клетке
том
1
Перевод с английского
под редакцией
акад. А. Е. Браунштейна,
д-ра хим. наук Л. М. Гинодмана,
д-ра хим. наук Е. С. Северина
Издательство
«Мир»
Москва
1980
УДК 577.1
Новейшее и наиболее современное руководство по биохимии, напи-
санное известным американским ученым, работающим в области биохи-
мии, молекулярной биологии и энзимологии. Отличительной чертой книги
является рассмотрение материала в соответствии с химическими реакция-
ми, происходящими в живой клетке, а не традиционно — по основным
классам соединений.
На русском языке книга выходит в трех томах.
В настоящий, первый, том вошли главы, посвященные общим вопро-
сам, структуре биополимеров, энергетике и функциям клеточных мембран.
Во втором томе изложены основы ферментативного катализа, описаны
пути синтеза и распада молекул в живых организмах. В третьем томе
рассмотрены вопросы биохимической генетики, роста и дифференцировки
тканей, химического взаимодействия клеток, а также влияния внешних
факторов на процессы обмена веществ.
Предназначена для биохимиков, молекулярных биологов, физиологов,
генетиков, микробиологов, цитологов, фармакологов, химиков, медиков,
для студентов, аспирантов и преподавателей биологических, химических
и медицинских специальностей.
Редакция литературы по биологии
200«040000
21005-395 © 1977, Academic Press, Inc.
041(01)-80 П^Щ. ИЗД. 198 © Перевод на русский язык, «Мир», 1980
Предисловие редакторов
перевода
Предлагаемый вниманию читателя учебник написан известным аме-
риканским биохимиком Д. Мецлером. Автор поставил перед собой цель
дать анализ структур, функций и процессов, характерных для живой
клетки, с позиций современной биоорганической химии и молекулярной
физики. Он концентрирует внимание на всестороннем рассмотрении про-
текающих в клетках химических реакций, на ферментах, катализирую-
щих эти реакции, основных принципах обмена веществ и энергии.
Впервые приведена классификация химических механизмов фермента-
тивных реакций (нуклеофильное замещение, реакции присоединения,
реакции элиминирования, реакции изомеризации и др.). В этом наибо-
лее наглядно проявилась особенность рассмотрения биохимических
проблем с позиций биоорганика. Обстоятельно изложены многие вопро-
сы, которым прежде не уделяли должного внимания в курсе биохимии.
Это касается в частности количественной оценки сил межмолекулярно-
го взаимодействия, принципов «упаковки» молекул в надмолекулярных
структурах (самосборка), кооперативных структурных изменений мак-
ромолекул и их комплексов. Приведены основные сведения о структуре
и функциях клеточных мембран, об антигенах и рецепторах клеточных
поверхностей. Весьма подробно рассмотрены также вопросы фотосин-
теза, зрения и ряда других биологических процессов, связанных с по-
глощением света; при этом охарактеризована природа некоторых физи-
ческих явлений, наблюдаемых при взаимодействии света и вещества.
Особое место занимают в монографии главы, посвященные биохими-
ческой генетике и проблемам роста и дифференцировки.
Большим достоинством книги является то, что всюду (где это воз-
можно) автор стремится проследить взаимосвязь между физиологиче-
ским феноменом и лежащими в его основе химическими реакциями, а
также структурными перестройками надмолекулярных комплексов.
Книга хорошо иллюстрирована. Каждая глава сопровождается от-
носительно небольшим, но хорошо подобранным списком литературы.
Следует отметить, что автор использует самые последние данные. В кон-
це глав приведены вопросы и задачи, позволяющие студентам прове-
рить, насколько они усвоили материал.
В книге объективно отражен вклад различных авторов, в том числе
советских ученых, в развитие биохимии. Автор несколько раз посещал
СССР, изучил русский язык и поддерживает постоянные научные кон-
такты с советскими биохимиками.
Учебник Д. Мецлера весьма существенно отличается от переведен-
ных в последние годы на русский язык учебников — А. Ленинджера,
Г. Малера и Л. Кордеса. Он несомненно будет весьма полезен студен-
там и аспирантам, изучающим биологическую и биоорганическую хи-
мию, преподавателям и научным сотрудникам, работающим в этой
области. Ряд разделов учебника представляет несомненный интерес для
биофизиков, физиологов и фармакологов.
А. Е. Браунштейн
Л. М. Гинодман
Е. С. Северин
Предисловие автора
к русскому переводу
я очень рад тому, что мои коллеги — советские биохимики — пере-
вели на русский язык эту книгу и она стала доступной для студентов
Советского Союза. Я имел длительный контакт с одним из ее редакто-
ров, академиком А. Е. Браунштейном, С его работами я познакомился
еще в 1948 г., когда стал аспирантом-биохимиком и начал изучать хи-
мию пиридоксальфосфата. Позднее, в 1965 г., мне посчастливилось
провести пять месяцев в его лаборатории, где я работал с профессора-
ми Р. М. Хомутовым, Е. С. Севериным (также одним из редакторов
настоящей книги) и другими молодыми, увлеченными своим делом био-
химиками. Этот период был очень полезен для моего научного роста.
Некоторые идеи, зародившиеся в то время в дискуссиях с советскими
биохимиками, сыграли важную роль в моем понимании вопросов энзи-
мологии, и сейчас они нашли многообразное отражение в этой книге.
В последние 15 лет сохранялась большая общность научных инте-
ресов моей лаборатории и исследователей из Института молекулярной
биологии. Наша собственная «программа научного обмена» осуществ-
лялась путем личных посещений, переписки и другими способами. Все
это было для меня очень полезно, и достижения московских коллег
представляются мне весьма внушительными; мне особенно хотелось бы
поздравить их в связи с установлением первичной структуры аспартат-
аминотрансферазы сердца, а позже — и трехмерной структуры этого
фермента.
Контакты с советскими учеными важны для меня и в другом плане.
Мне давно уже представляется, что необходимы прочные личные дру-
жеские связи между американцами и гражданами Советского Союза.
Я убежден, что наши два народа очень схожи по своему характеру и
что мы можем и должны жить в мире, уважая друг друга. То, что я
имел возможность пробыть в Советском Союзе несколько месяцев и
«оставить там кусок своей жизни»1, явилось для меня привилегией. Сей-
час в моей стране я пытаюсь способствовать делу мира и бороться с
международной гонкой вооружений, которая представляет угрозу для
нас всех.
Дэвид Э. Мецлер
15 июня 1979 г.
1 Слова, набранные курсивом, были написаны автором по-русски. — Прим. ред.
Предисловие
Современная биохимия, занимающаяся исследованием химических
реакций, которые протекают в живых клетках, представляет настолько
широкую и сложную область, что включает в себя почти все отрасли
химии и биологии. Создание вводного курса по этому предмету — весь-
ма нелегкая задача, и я никогда бы за нее не взялся, если бы стремил-
ся только улучшить существующие учебники. Но я убежден, что курс
биохимии, предназначенный для широкого круга студентов и препода-
вателей, должен быть создан на принципиально новой основе. Вместо
того, чтобы делить книгу на части, посвященные описанию отдельных
классов химических соединений — белков, нуклеиновых кислот, липидов
и углеводов, — я опирался при таком разделении на типы химических
реакций, протекающих в клетках. Неизменно подчеркивая биологиче-
ские аспекты рассматриваемых явлений, я стремился проследить хими-
ческую основу различных физиологических явлений.
Биохимия во всей ее сложности и многообразии нередко представ-
ляется чрезвычайно трудным предметом. Я старался максимально об-
легчить студентам их задачу, ориентируясь при этом на лиц с самым
разным уровнем подготовки. Так, основная часть текста представляет
собой четкое, без излишних деталей изложение принципов биохимии.
Дополнительные сведения, касающиеся витаминов, металлов, ядов, ме-
тодов исследования, болезней, обусловленных нарушением обмена ве-
ществ, могут быть очень интересными для одних студентов и менее ин-
тересными для других. Поэтому такая информация вынесена из текста
в специальные дополнения с тем, чтобы не прерывать изложение фун-
даментальных вопросов (эти дополнения включены в подробно состав-
ленное оглавление; кроме того, их перечень приведен отдельно в конце
книги). В этом учебнике я стремился не только четко и доступно изло-
жить основы биохимии, но и привести ссылки на литературу, которая
пригодится студентам в будущем. В учебнике цитируется следующая
литература: 1) справочники (например, «Enzymes» в 13 томах, под
ред. Р. Boyer, Academic Press, New York); 2) статьи, имеющие принци-
пиальное значение (как старые, так и недавно опубликованные); 3) те-
кущая литература, которая поможет студентам разобраться в работах
по конкретной научной проблеме. В конце каждой главы помещены во-
просы и задачи.
Короче говоря, я надеюсь, что эта книга представит собой удобочи-
таемое введение в проблемы химической структуры живых клеток и
протекающих в них реакций, рассчитанное на студентов. В конечном
счете мне при этом не пришлось резко отступать от принципов, приня-
тых в традиционных учебниках, но оказалось возможным применить
ряд новых подходов.
Первая часть книги (гл. 1—3) содержит вводный материал по струк-
туре клеток, строению молекул и энергетике. В гл. 1 приведены данные
о размерах клеток и клеточных органелл и о генетической сложности
организмов; охарактеризованы основные биологические виды, рассмат-
риваемые в последующих разделах книги. Эта глава рассчитана главным
Предисловие
образом на студентов с минимальной биологической подготовкой, одна-
ко может оказаться полезной и для более подготовленных читателей.
В ней, как и далее во всей книге, описаны микроорганизмы, растения и
животные. В гл. 2 вкратце обсуждаются принципы структурной орга-
низации молекул и затем систематически рассматриваются структура
и химические свойства белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липи-
дов. В соответствии с современными данными акцентируется внимание
на значении конформационных свойств и взаимосвязи между структу-
рой и функцией молекул. В раздел о неорганических элементах вклю-
чен обзор методов, применяемых для определения структуры молекул
(в частности, рассмотрен метод ЯМР).
В гл. 3, начинающейся с рассмотрения уравнений термодинамики,
приведены практические сведения по определению термодинамических
параметров биохимических процессов и ряд табличных данных, в част-
ности все упоминаемые далее значения свободной энергии и энтальпии.
Я всюду выражал их в единицах системы СИ, т. е. в килоджоулях на
моль (кДж-моль-1), поскольку именно эти единицы используются те-
перь в биохимической литературе. Перевести эти единицы в более при-
вычные килокалории на моль не составляет труда. Новой величиной,
которую я ввел в этой книге, является свободная энергия сгорания под
действием NAD+; использование ее упрощает расчет изменения свобод-
ной энергии в процессах метаболизма.
Вторая часть книги (гл, 4 и 5) посвящена проблеме соединения био-
логических молекул друг с другом. В гл. 4 рассмотрены количествен-
ные параметры связывания для различных структур — олигомерных
ферментов, микротрубочек, вирусов, мышц, что составляет одно из са-
мых современных направлений биохимии. Дается также систематизи-
рованный количественный анализ аллостерических эффектов. В гл. 5
описаны структура и химические свойства клеточных мембран и обо-
лочек. Основная цель этой и других глав состоит в том, чтобы дать сту-
дентам возможность приобрести запас знаний, достаточный для чтения
специальной периодической литературы без помощи учебников.
В третьей части книги (гл. 6—8) обсуждаются общие свойства фер-
ментов, вопросы кинетики химических реакций и различные механизмы
ферментативного катализа. В гл. 6 достаточно подробно изложены ос-
новы ферментативной кинетики, а также рассмотрены механизмы регу-
ляции ферментативных реакций в клетках. В гл. 7 дана рациональная
система классификации ферментативных реакций, включающая сведе-
ния о различных ферментах и методике их исследования. Гл. 8 посвя-
щена химическим свойствам и специфической роли коферментов, при-
чем эти свойства рассматриваются в связи с типами реакций, описан-
ными в предыдущих главах. В этих главах много справочного материа-
ла, и их можно не читать целиком. Для студентов и преподавателей
будет совсем нетрудно разобраться в изложенном здесь материале и
применять его. При желании эту часть книги можно легко объединить
с материалом гл. 2, где обсуждаются свойства белков, углеводов, нук-
леиновых кислот и липидов.
Четвертая часть книги (гл. 9—14) посвящена описанию последова-
тельностей метаболических реакций. В гл. 9 обсуждается «логическая
основа» метаболических циклов и других путей обмена веществ. Пока-
зано, что характер процесса обмена определяется теми химическими
превращениями, которые необходимы для образования нужного вещест-
ва из данного метаболита. Мне кажется, что такой подход имеет опре-
деленные преимущества по сравнению с общепринятым. В гл. 10 обсуж-
даются механизмы транспорта электронов и окислительного фосфори-
лирования, а также вопросы энергетического обмена у хемиавтотрофов.
предисловие
В гл. И показано, что многие на первый взгляд сложные процессы ме-
таболизма можно легко понять, если рассматривать их как этапы, необ-
ходимые для сопряжения расщепления АТР с реакциями биосинтеза.
Именно с этой точки зрения анализируются процессы обмена угле-
водов и липидов (гл. 12), что значительно облегчает понимание их ме-
ханизма.
В специальной главе «Свет в биологии» (гл. 13) обсуждаются не
только проблемы фотосинтеза, зрения и других биологических реакций
на свет, но и природа поглощения света, флуоресценции и кругового
дихроизма. В гл. 14 подробно рассматриваются процессы биосинтеза и
распада множества азотистых соединений. Эта глава может быть по-
лезна как студентам-биохимикам — при работе над литературными об-
зорами, так и преподавателям курсов химии природных соединений.
Последняя часть (гл. 15 и 16) посвящена проблемам биохимической
генетики и гормональной регуляции обмена веществ и развития орга-
низмов, а также деятельности мозга. Гл. 15 охватывает не только во-
просы биосинтеза нуклеиновых кислот и белков, но и дает представле-
ние о методах, используемых в биохимической генетике. Указанные
сведения помещены в конце книги, но преподаватели могут их исполь-
зовать (частично или целиком) в начале чтения курса. Последняя глава
представляет собой краткое введение в проблемы межклеточных ком-
муникаций, нейрохимии, дифференцировки клеток, а также экологии.
Я хочу поблагодарить многих своих сотрудников, помогавших мне
при подготовке этой книги, среди них — коллег по Университету штата
Айова, особенно Джона Фосса и Бернарда Уайта, а также ученых из
других институтов. Я особенно обязан фонду Дж. С. Гугенхейма, а так-
же сотрудникам и студентам биохимического факультета Калифорний-
ского университета (Беркли) за неоднократное полезное обсуждение и
критические замечания. Пегги Джонстон, Жанне Петерс и Вильме
Холдрен я благодарен за неоценимую помощь при подготовке рукописи,
Кэрол Харрис — за проведение расчетов, проверку всех цифровых дан-
ных и чтение корректуры. Наконец, я хочу поблагодарить студентов-ди-
пломников, проверивших каждое уравнение и литературные ссылки.
Я весьма признателен работникам издательства Academic Press за их
терпение и поддержку; общение с ними было для меня очень приятным.
Д. Мецлер
Благодарности
Я хочу выразить свою признательность следующим рецензентам,
прочитавшим рукопись (полностью или частично) и высказавшим свои
критические замечания: М. Чемберлину, университет штата Калифорния,
Беркли; Э. Конну, университет штата Калифорния, Дэвис; Ч. Дёрингу,
Стэнфордский университет; X. Эколсу, университет штата Калифорния,
Беркли; Л. Ингрэму, университет штата Калифорния, Дэвис; М. Камену,
Южно-Калифорнийский университет; Э. Хайраллаху, университет штата
Коннектикут; Д. Кошланду мл., университет штата Калифорния, Беркли;
К. Мэтьюзу, университет штата Аризона; Д. Мак-Кормику, Корнелльский
университет; Дж. Нейлендсу, университет штата Калифорния, Беркли;
Л. Пэкеру, университет штата Калифорния, Беркли; Д. Пьюричу, уни-
верситет штата Калифорния, Санта-Барбара; П. Штумпфу, университет
штата Калифорния, Дэвис; Р. Уолфу, университет штата Орегон; А. Ву-
ду, университет штата Мичиган.
Место действия
Эта книга — о непрерывных, сложных последовательностях химиче-
ских реакций, благодаря которым клетки растут и делятся, питаются и
выделяют шлаки, движутся и сообщаются друг с другом. Тысячи реак-
ций, каждую из которых катализирует свой специфический фермент,
связаны между собой в разветвленные и переплетающиеся последова-
тельности, составляя в итоге сложнейшую сеть. Описанию совокупности
этих реакций, называемой метаболизмом или обменом веществ, и по-
священа в основном данная книга.
Не менее важным, однако, является вопрос о структуре своеобразных
молекул, из которых построены клетки. Белки, нуклеиновые кислоты,
углеводы, липиды, коферменты-—все эти вещества необходимы для
жизнедеятельности живых систем. Каждое из них имеет строго опреде-
ленную структуру, соответствующую той специфической роли, которую
они играют в живых клетках. Эти соединения непрерывно образуются и
разрушаются и при этом удивительнейшим образом взаимно регулиру-
ют реакции, протекающие с их участием.
Обмен веществ включает как синтез, так и распад многих химиче-
ских соединений в клетках. У животных расщепление компонентов пи-
щи до более простых веществ обеспечивает организм не только энерги-
ей, но и химическими соединениями, которые используются затем при
синтезе молекул, необходимых для роста. Подобным же образом каж-
дая отдельная клетка любого живого организма синтезирует или погло-
щает из окружающей среды низкомолекулярные вещества и из них, как
из кирпичиков, строит крупные молекулы. В то же время в клетках
имеются ферменты, расщепляющие любые синтезированные организмом
соединения. В итоге устанавливается стационарное состояние, при кото-
ром сложные соединения непрерывно синтезируются в ходе одних про-
цессов и распадаются в ходе других. На этом основана замечательная
система самообновления наших тканей.
Человек живет на Земле не один, а в окружении множества других
живых существ, и их метаболизм для нас жизненно важен. Фотосин-
тезирующие организмы используют энергию солнечного света и выраба-
тывают вещества, которые необходимы для человека, но не синтезиру-
ются в его организме. Микроорганизмы, получая энергию за счет раз-
личных реакций, разлагают сложные органические соединения до форм,
которые могут затем использоваться растениями. В этой книге мы опи-
шем химические реакции, протекающие в самых разнообразных живых
системах. Наряду с метаболическими путями, общими для большинст-
ва организмов, будут рассмотрены и некоторые своеобразные, необыч-
ные процессы.
Биологи описали более миллиона видов живых организмов. Многие
из них ведут сугубо специализированный образ жизни, и тем удивитель-
12 Глава 1
нее, что в химии живого есть много общего. Так, образование молоч-
ной кислоты и в бактериях, и в мышцах человека требует участия одних
и тех же ферментов. Белки растений, животных и микроорганизмов со-
стоят из 20 аминокислот. Генетический код, по-видимому, универсален.
Мы видим, что жизнь едина, и потому можно изучать обмен веществ
в целом как совокупность химических превращений, протекающих во
всех живых организмах.
Но как бы ни впечатляло сходство между живыми существами, раз-
личие между ними не менее поразительно. Отдельные особенности об-
мена веществ живых систем так же разнообразны, как их форма и раз-
меры. Все это разнообразие обусловлено различиями между генами —
участками молекулы ДНК, несущими закодированную информацию.
Генетические различия ведут к разнообразию молекулярной структуры
белков, синтезируемых клетками. Среди этих белков имеются фермен-
ты — сложные миниатюрные аппараты, каждый из которых катализи-
рует специфическую химическую реакцию.
Рассмотрим какую-нибудь химическую реакцию, свойственную прак-
тически любой живой клетке (таких реакций очень много). Выделим
фермент, катализирующий эту реакцию, из тканей разных организмов;
при этом мы, по всей вероятности, обнаружим, что выделенные фермен-
ты имеют сходные свойства и механизм действия, но несколько разли-
чаются по аминокислотному составу. Обычно видовые различия каса-
ются только внешней формы молекулы фермента, а механизм катали-
тического действия остается в принципе тем же. Но в некоторых случа-
ях видовые вариации затрагивают структуру активного центра фермен-
та, а это уже влечет за собой изменения в процессах обмена веществ.
Особенности метаболизма живых существ приводят к различиям в их
форме и поведении. Возможно, причину разницы между лошадью и ко-
ровой нужно искать в совокупности едва заметных особенностей в
структуре их ферментов и других белков.
Различия в структуре белков обусловливают не только видовые осо-
бенности; индивидуумы, относящиеся к одному и тому же виду, также
могут быть неодинаковыми в этом отношении. Тяжелые наследственные
болезни (например, серповидноклеточная анемия) возникают иногда
из-за замены в определенном белке только одной аминокислоты.
Генетически обусловленные отклонения от «нормальной» структуры
белков являются результатом мутаций. Большинство мутаций (незави-
симо от того, возникли ли они в наших собственных клетках или в клет-
ках наших предков) вредны. Но в то же время именно мутации созда-
ют внутривидовую индивидуальную изменчивость, что составляет основ-
ную движущую силу эволюции. Поэтому далее мы уделим особое вни-
мание химической природе мутаций и их последствиям.
Дополнение 1-А
О единицах измерения
В I960 г. Генеральная конференция по мерам и весам при-
няла единую Международную систему единиц (СИ). Едини-
цами измерения массы, длины и времени в этой системе яв-
ляются соответственно килограмм (кг), метр (м) и секунда
(с). Для образования десятичных и дольных единиц исполь-
зуются следующие множители и приставки:
место действия io
Множитель Приставка Обозначение
Ю12 тера т
ю9 гига г
106 мега м
103 кило к
ю-3 милли м
10-6 микро мк
I0-9 нано н
Ю-12 ПИКО п
ю-15 фемто ф
I0-18 ат то а
Укажем на одно отступление от принятого правила: в ме-
рах массы приведенные выше приставки применяются не к
основной единице-—килограмму, а к грамму.
В этой книге мы старались всюду, где это возможно, поль-
зоваться единицами системы СИ. Читатель не найдет здесь
футов, микрон, миль, тонн. Размеры молекул повсеместно
даны в нанометрах, а не в ангстремах (А). (Напомним, что
1 А=0,1 нм). Единицы энергии — калории и килокалории —
заменены принятой в системе СИ единицей — джоулем (Дж).
Большинство журналов уже заменило два наименования в
соответствии с системой СИ, а именно: вместо употреблявше-
гося ранее названия микрон (мк) применяется микрометр
(мкм), а вместо миллимикрона (ммк)—нанометр (нм).
Не следует путать единицы мкм (новая) и ммк (старая).
В книге часто используются следующие символы:
ж означает «примерно равно»;
~ означает «примерно» или «около».
Дополнение 1-Б
Молекулярные веса и массы (дальтоны)
Массы атомов и молекул выражаются в единицах массы
изотопа углерода 12С, атомный вес которого принят равным
12. Масса одного атома 12С равна в точности 12 дальтонам, а
1 дальтон равен 1,661-10-24 г. Массы молекул выражают в
дальтонах, и численно они равны молекулярному весу. Одна-
ко под молекулярным весом понимают молярную массу
(граммы на моль), и потому употреблять дальтон в качестве
единицы молекулярного веса не корректно. В то же время
дальтоны очень удобно использовать в случае таких струк-
тур, как хромосомы, рибосомы, митохондрии, вирусы и целые
клетки, к которым не применим термин «молекулярный вес»а.
а Edsall J. Т., Nature (London), 228, 888, 1970.
А. Простейшие живые организмы
Простейшие организмы на Земле — это бактерии и сине-зеленые
водоросли; они составляют царство прокариот (Procariotae, Мопега)
[1, 2]. Основным отличительным признаком прокариот является отсут-
ствие у них отграниченного мембраной клеточного ядра. Клетки всех
остальных организмов, называемых эукариотами, содержат ядра, отде-
ленные от цитоплазмы мембраной. Некоторые биологи относят к живым
организмам также и вирусы, однако эти поразительные объекты (до-
полнение 4-В) не могут считаться живыми в полном смысле этого сло-
ва, поскольку у них нет, как правило, собственного обмена веществ.
1. Микоплазмы
Микоплазмы относятся к простейшим прокариотам и являются са-
мыми примитивными из всех известных живых организмов. Эти мель-
чайшие бактерии в отличие от большинства других бактерий лишены
жесткой клеточной стенки. Благодаря этому они легко меняют форму и
часто проходят через фильтры, задерживающие другие бактерии.
В отношении питания микоплазмы довольно капризны и обычно
(если не всегда) паразитируют. Некоторые из них обитают в слизистых
оболочках человека, не причиняя ему никакого вреда, тогда как другие
вызывают заболевания, например первичную атипичную пневмонию
(возбудитель — Mycoplasma pneumoniae).
Клетки микоплазм обычно имеют форму сферы диаметром 0,33 мкм
(0,0003 мм) [3] и ограничены тонкой клеточной мембраной толщиной
около 8 нм (80 А). Внутри находится цитоплазма — жидкая субстан-
ция, в которой растворено множество различных веществ, а также со-
держатся субмикроскопические частицы. В центре клетки локализована
одна чрезвычайно плотно свернутая молекула ДНК, составляющая бак-
териальную хромосому. Часть клетки, содержащую хромосому и приле-
гающую к ней область, можно назвать ядром1 или нуклеоидом. Помимо
ДНК, в клетке имеется около 400 примерно сферических частиц диамет-
ром ~20 нм, называемых рибосомами2. Это центры синтеза белков.
В цитоплазму включены также различного рода белки, но их число
не превышает 50 000. Имеется также несколько типов РНК и множест-
во соединений меньшего молекулярного веса.
Каково минимальное количество белков, ДНК и других макромоле-
кулярных структур, достаточное для обеспечения жизнедеятельности
клетки? Это пока неизвестно, но совершенно ясно, что в крошечной
клетке микоплазмы этих соединений достаточно.
2. Escherichia coli
«Лучший друг» биохимиков-—бактерия Escherichia coli — типичный
безобидный обитатель кишечного тракта человека и животных. Эту бак-
терию легко культивировать в лабораторных условиях, благодаря чему
она лучше всех других организмов изучена на молекулярном уровне
[4]. Е. coli можно считать типичным представителем истинных бакте-
рий. Клетки Е. coli имеют форму палочек. Их длина ~2 мкм, ди-
аметр— 0,8 мкм, объем ~1 мкм'1, плотность ~1,1 г-см-3, масса
1 Многие биологи употребляют термин ядро только применительно к клеткам
эукариот.
2 Указанное число частиц есть только грубая оценка, основанная на сравнении
размеров микоплазм и Е. coli и содержания у них РНК.
iviecTO действия
E. coll
-0,8 * 0,8 x 2,0 мкм
0,5mkm
Клеточная мембрана, — 8нм
Клеточная стенка, ~ 10 нм
рибосомы, прикрепленные
к нитям мРНК
ДНК длиной 103мкм.
"Здесь изображен только
1% суммарного количества
ДНК
Пиль (фимбрия). Некоторые бактерии
Е. coll покрыты сотнями пилей
различной длины
13-14 нм
Микоплазма
Bdellovibrio, паразит, живущий
внутри бактерии Е. coll 1
РИС. 1-1. Escherichia coli и некоторые более мелкие бактерии.
См. рисунок в работе Burnham J. С., Hashimoto Т., Conti S. F., J. Bacteriol., 96, 1366 (1968).
Рибосомы
диаметром-' 20 нм
Некоторые штаммы Е. colt
имеют до 8 жгутиков, но обычно
их меньше
Мезосома,
мембранная
структура, свойственная
многим бактериям .
Длина жгутиков варьирует,
но обычно они в 4 раза длиннее
самой клетки
Жгутик
в чехлике,
28 нм
~1-10-12 г (1 пг, или 0,7-1012 дальтон) [5]. Е. coli примерно в 100 раз
больше мельчайшей микоплазмы, но, как показали электронно-микро-
скопические исследования, по структуре она очень проста и чрезвычай-
но сходна в этом отношении с микоплазмой (рис. 1-1 и 1-2,Л).
Каждая клетка Е. coli содержит от 1 до 4 идентичных молекул ДНК
(это число зависит от того, насколько быстро клетка растет), а также
16 Главг 1
РИС. 1-2. А. Электронная микрофотография интактной клетки Е. coli; напыление
платиной. Видны жгутики (изогнутые) и пили (прямые). Обратите внимание, что
F-пили (половые) отсутствуют. (С любезного разрешения Williams F. D., VanderMo-
len Gail E., Amstein C. F.) Б. Электронная микрофотография клетки Spirillum-, негатив-
ное контрастирование фосфовольфрамовой кислотой. Обратите внимание на пучки жгу-
тиков на концах, шероховатую на вид наружную поверхность, темные включения по-
ли-р-оксимасляной кислоты и светлые гранулы неизвестной природы. (С любезного
разрешения Williams F. D., VanderMolen Gail Е., Amstein С. F.)
~ 15 000—30 000 рибосом. Иногда внутри клетки выявляются и другие
образования, например запасы питательных веществ—капельки жира и
гранулы поли-0-оксимасляной кислоты (рис. 1-2,Б), составляющей до
25% веса клетки Bacillus megaterium, и иногда гранулы гликогена. Ча-
сто присутствуют гранулы высокополимеризованной фосфорной кисло-
ты (полиметафосфат), называемые обычно метахроматическими грану-
лами. Обнаруживаются также вакуоли, т. е. капельки изолированной
водной фазы.
РИС. 1-2. В, Электронная микрофотография ультратонкого среза (~60 нм) пресно-
водной грамотрицательной бактерии Aquaspirillum fasciculus. Видны ДНК (светлая
область), темные рибосомы, двойная мембрана, характерная для грамотрицательных
бактерий (гл. 5, разд. Г.1), и клеточная стенка. У полюса клетки видна внутренняя
«полярная мембрана», которая, возможно, имеет какое-то отношение к движению
жгутиков. (С любезного разрешения Williams F. D., VanderMolen Gail Е., Amstein С. F.)
Г. Электронная микрофотография ультратонкого среза делящейся клетки грамполо-
жительного стрептококка Streptococcus. Обратите внимание иа светлоокрашенную
нить ДНК. В центре клетки видна часть мезосомы; видно также начало образования
межклеточной перегородки. (С любезного разрешения Williams F. D., VanderMolen
Gail Е., Amstein С. F)
£-1821
18 Глава 1
3. Геном
Все генетические «приказы», отдаваемые клетке, исходят от ДНК-
Молекулы как ДНК, так и белков построены в виде цепочек, состоящих
в первом случае из нуклеотидов, а во втором —из аминокислот. Моле-
кулы ДНК, как правило, двухцепочечные, т. е. состоят из двух обра-
зующих двойную спираль полинуклеотидных цепочек; комплементарные
основания противоположных цепочек образуют нуклеотидные пары
(рис. 2-21). В настоящее время твердо установлено, что большая часть
генетических сообщений в ДНК представляет собой последовательность,
кодовых «слов», или кодонов. Каждый кодон состоит из трех нуклео-
тидов (или трех нуклеотидных пар, если ДНК двухцепочечная) и соот-
ветствует одной из 20 аминокислот, из которых построены белки. По-
следовательность кодонов в ДНК определяет, в каком порядке должны
соединяться аминокислоты при синтезе каждого из многочисленных
белков.
Допустим, что «средняя» белковая молекула — это свернутая це-
почка, состоящая из ~300 аминокислот. Стало быть, участок молекулы
ДНК (один ген), кодирующий синтез этого белка, должен включать
около 900 пар нуклеотидов. Добавив сюда еще некоторое количество,
нуклеотидов для образования промежутков между генами, мы получим,
что число нуклеотидных пар, составляющих 1 ген, в среднем равно 1000.
Геномом называют полное количество ДНК, несущее всю сумму ге-
нетической информации для данного организма. У бактерий геном
представлен единственной хромосомой, состоящей из одной двухцепо-
чечной молекулы ДНК. У Mycoplasma arthritidis масса ДНК состав-
ляет 0,5-109 дальтон (мол. вес = 0,5-109). Содержание ДНК у Е. coli
примерно в 5 раз больше (мол. вес = 2,5-109).
Средний мол. вес пары нуклеотидов (находящихся в виде натрие-
вой соли) равен 664. Следовательно, ДНК М. arthritidis содержит
0 5-109
—^04— = 8-105 пар нуклеотидов, что достаточно для кодирования 800
различных белков среднего размера. ДНК Е. coli состоит из 3,8-108,
нуклеотидных пар, что позволяет закодировать '-'-'4000 различных
белков. Поскольку некоторые гены ДНК выполняют другую функ-
цию, реальное число генов, кодирующих белки, несколько меньше. Дли-
на бактериальных хромосом поразительна. Расстояние между нуклео-
тидными парами 0,34 нм; следовательно, полная длина молекулы ДНК
в хромосоме Е. coli равна 1,3 мм, что в 600 раз превышает длину клет-
ки, в которой эта ДНК находится. Отсюда ясно, что молекула ДНК в
клетке плотно упакована, в результате под электронным микроскопом
она выглядит как плотное «ядро», занимающее только лишь Vs объема
клетки (рис. 1-2, В, Г). Каждое бактериальное ядро содержит полный
набор генетических «матриц» и функционирует более или менее неза-
висимо. Эти ядра гаплоидные, т. е. имеют один набор генов1.
4. Рибонуклеиновые кислоты (РНК), транскрипция
и трансляция генетической информации
Генетическая информация, заключенная в ДНК, не может непосред-
ственно передаваться белок-синтезирующей системе клетки. Сначала в
соответствии с правилами, закодированными в ДНК, синтезируются
1 Для прокариот характерны гаплоидные ядра, хотя при половой конъюгации
бактерий, а также в некоторых экспериментальных условиях образуются «частично
диплоидные» клетки, содержащие двойной набор отдельных генов.
Место действия
молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК); этот процесс называется
транскрипцией. Установлено, что молекулы РНК несут в точности ту
же информацию, что и соответствующие участки ДНК. Таким образом,
если ДНК — это первичная матрица, то РНК—вторичная. Эта концеп-
ция нашла свое отражение в термине матричная, или информационная,
РНК (мРНК): им обозначают небольшие, быстро обновляющиеся фрак-
ции РНК, которые несут информацию, определяющую последователь-
ность аминокислот в белках. Матричная РНК переносит генетическую
информацию от генов к рибосомам, на которых собственно синтезиру-
ются белки.
Рибосомы представляют собой миниатюрные, но чрезвычайно слож-
ные белок-синтезирующие системы. Каждая рибосома Е. coll обладает
массой 2,7-106 дальтон и состоит на ~65% из особой рибосомной РНК
и на ~35% из белка. В структуру рибосомы входит около 50 различных
белков. Рибосомы способны считывать генетическую информацию с
мРНК и точно собирать именно такую белковую молекулу, которая
детерминируется соответствующим геном (трансляция генетической ин-
формации) .
Дополнение 1-В
Электронный микроскоп, ультратонкие срезы
и реплики
Первые электронные микроскопы появились в продаже в
1939 г. и с тех пор стали одним из важнейших приборов, при-
меняющихся при изучении биологии клетки. Обладая разре-
шением ~0,4 нм, электронный микроскоп позволяет «увидеть»
молекулы белков и нуклеиновых кислот, а также детали
строения клеточных органелл. Еще более широко электрон-
ный микроскоп стал использоваться с 1950 г., когда были
сконструированы микротомы и ножи, позволяющие делать
ультратонкие (20—200 нм) срезы тканей, предварительно за-
литых в пластмассу.
Исследование срезов свежей (замороженной) ткани непо-
средственно, без предварительной обработки, мало что дает,
поскольку большая часть атомов в клетке обладает низким
атомным весом и рассеивает электроны слабо и в одинаковой
степени. Следовательно, ультрасрезы необходимо «окрасить»
атомами с высоким атомным весом, например обработав их
перманганатом калия. Ткани следует также зафиксировать,
чтобы предотвратить разрушение клеточных структур в про-
цессе обезвоживания и заливки в пластмассу. Фиксирующие
вещества (например, формальдегид) реагируют с аминогруп-
пами и другими группами белков и нуклеиновых кислот. Не-
которые белки при этом преципитируют, оставаясь фиксиро-
ванными на своих местах, а протеолитические ферменты,
которые могли бы существенно нарушить тонкую структуру
клетки, инактивируются. Широко используется также глутар-
альдегид (пятиуглеродный диальдегид) — прекрасное фикси-
рующее средство, образующее поперечные связи между моле-
2*
кулами белков в ткани. В качестве фиксирующего средства и
окрашивающего агента часто применяют четырехокись осмия
(гл. 5, разд. А.1). Следует отметить, что при работе с фикси-
рованными тканями всегда стоит вопрос о том, не являются
ли некоторые структуры, видимые на срезах, артефактами,
возникающими при фиксации и окрашивании.
Из одной бактериальной клетки, скажем Е. coli, можно
получить целых 10 ультратонких продольных срезов (рис. 1-2),
а из клетки эукариот диаметром 10 мкм — до 100 срезов. Толь-
ко с такими ультратонкими срезами получаются четко сфо-
кусированные изображения. Для изучения трехмерных струк-
тур используют серийные срезы2.
Частицы небольшого размера, в том числе макромолеку-
лы, выявляют методом напыления. Для этого металл —хром
или платину—испаряют в вакууме и напыляют под опреде-
ленным углом на поверхность исследуемого образца. Так
можно «увидеть» отдельные молекулы ДНК, хотя и при срав-
нительно низкой разрешающей способности. Собственно, вид-
ны не сами молекулы, а только их «тени», которые в 2—3 ра-
за шире. При исследовании белков часто применяют метод
негативного контрастирования. Суть метода состоит в сле-
дующем: тонкий слой раствора, содержащего исследуемые
белки и электроноплотное вещество (например, фосфоволь-
фрамовокислый натрий в концентрации 1%), наносят на угле-
родную пленку-подложку и высушивают. Образуется одно-
родный электроноплотный слой, характеризующийся тем, что
в местах локализации молекул белка отсутствует соль фос-
фовольфрамовой кислоты; отсюда и термин «негативный конт-
раст».
Если поверхность клетки, срез или бактерию покрыть сло-
ем платины или углерода, а затем отделить это покрытие, мы
получим негативный слепок — реплику, которую можно иссле-
довать под электронным микроскопом. Изготовляют также
тонкие реплики из пластмассы, которые дополнительно напы-
ляют (оттеняют).
К числу важнейших методов получения реплик относится
метод замораживания—скалывания и замораживания—трав-
ления. Свежую ткань (которую можно предварительно обра-
ботать глицерином, чтобы предотвратить образование боль-
ших кристаллов льда) быстро замораживают. Поскольку та-
кие замороженные клетки нередко удается потом оживить,
их можно рассматривать как живые. Замороженную ткань
помещают в вакуумную камеру, где делают сколы или срезы
охлажденным ножом. Иногда образец какое-то время выдер-
живают в вакууме при —100 °C, чтобы дать испариться моле-
кулам воды с поверхности. В результате такого травления
под вакуумом выявляется в виде четкого рельефа тонкая
структура клеточных органелл и мембран. После травления
тем или иным методом снимается реплика, которую и иссле-
дуют под микроскопом (рис. 1-11). Последние работы свиде-
тельствуют, что скол проходит большей частью по липидному
слою клеточных мембран.
Каждый биохимик должен обязательно ознакомиться с
прекрасными электронными микрофотографиями, которые
помещены в основных книгах по данном тематике б-ж, а так-
Место действия 21
же в ряде журналов: «Journal of Cell Biology», «Journal of
Ultrastructure Research» и «Journal of Bacteriology».
a Сравнительно недавно опубликованная работа по этому вопросу: Hoff-
mann Н. Р., Avers С. J., Science, 181, 74&—751 (1973).
6 Ledbetter М. С., Porter К. R., Introduction to the Fine Structure of
Plant Cells, Springer-Verlag, Berlin and New York, 1970.
“ Fawcett D. W., An Atlas of Fine Structure, The Cell, its Organelles, and
Inclusions, Saunders, Philadelphia, Pennsylvania, 1966.
r Haggis G. H., The Electron Microscope in Molecular Biology, Wiley (In-
terscience), New York, 1967.
д Porter K. R., Bonneville M. A., The Fine Structure of Cells and Tissues,
3rd ed., Lea & Febiger, Philadelphia, Pennsylvania, 1968.
e Wischnitzer S., Introduction to Electron Microscopy, 2nd ed., Pergamon,
New York, 1970.
ж Hayat M. A., Basic Electron Microscopy Techniques, 2 vols., Van Nost-
rand-Reinhold, Princeton, New Jersey, 1972.
5. Мембраны и клеточные стенки
Подобно микоплазмам, клетки Е. coli окружены тонкой (~8 нм)
мембраной, в состав которой входят белки (~50%) и липиды (~50%)'.
Под электронным микроскопом окрашенная (например, перманганатом)
мембрана имеет вид двух тончайших (~2,0 нм) темных линий, разде-
ленных неокрашиваемым слоем (~3,5 нм) (рис. 1-2, В). Мембраны при?
мерно такой толщины и таким же образом прокрашивающиеся имеют-
ся во всех клетках, как у бактерий, так и у эукариот.
Клеточная мембрана — это не просто мешок. Она регулирует пере-
нос низкомолекулярных веществ в клетку и из клетки. У бактерий с
внутренней поверхностью мембраны связаны ферменты, катализирую-
щие процессы окисления. Нередко бактериальные мембраны образуют
складчатые участки, имеющие в разрезе вид многослойных структур,;
это так называемые мезосомы (рис. 1-1 и 1-2, Г). Предполагается, что
в мезосомах протекают специализированные процессы обмена веществ
и репликация ДНК. В клетках Е. coli мезосомы выявляются не всегда,
и все же, видимо, репликация ДНК у этого организма происходит на
определенных участках поверхности мембраны и регулируется связан-
ными с мембраной ферментами. Образование новой мембраны (перего-
родки) между делящимися клетками происходит синхронно с синтезом
Отличительной особенностью истинных бактерий является наличие
у них жесткой клеточной стенки, окружающей клеточную мембрану.
У Е. coli стенка имеет толщину ~40 нм и сложную многослойную
структуру (химический состав стенки Е. coli рассмотрен в гл. 5). У не-
которых бактерий толщина стенки может достигать 80 нм; кроме того,
она бывает окружена толстой капсулой или слизистым слоем. Основная
функция клеточной стенки заключается, по-видимому, в предотвраще-
нии осмотического набухания и разрыва клеток при попадании бакте-
рии в бессолевую среду. При достаточном осмотическом давлении среды
стенка бактерии может раствориться, и клетку будет окружать только
мембрана. Такие протопласты можно получить, обработав ферментом
лизоцимом грамположительные бактерии, например Bacillus megate-
1 Мембраны истинных бактерий не содержат холестерина, но, как нн парадоксаль-
но, в мембранах большинства микоплазм, как и у человека, холестерин присутствуем.
Представители рода Mycoplasma ведут паразитический образ жизни и получают необ-
ходимый холестерин от организма-хозяина.
22 Глава 1
rium. Протопласты — удобный объект для биохимических исследований,
поскольку в этом случае многие вещества проникают в клетку быстрее
и легче из-за отсутствия клеточной стенки. Термин сферопласт обычно
применяется для клеток грамотрицательных бактерий с частично раз-
рушенной клеточной стенкой. Пенициллин (который нарушает синтез
клеточных стенок у многих бактерий) превращает Е. coli и ряд других
грамотрицательных бактерий в сферопласты. Штаммы бактерий, ли-
шенные жестких стенок, называют L-формами.
6. Жгутики и пили
Большинство бактерий плавает, в чем легко убедиться, рассматри-
вая их в микроскоп. Движение осуществляется с помощью очень тонких
нитевидных жгутиков диаметром 10—20 нм. Иногда такой жгутик толь-
ко один, в других случаях имеется два или несколько жгутиков на од-
ном или противоположных полюсах клетки; все жгутики данной бакте-
рии движутся синхронно. У штопорообразной бактерии Spirillum
(рис. 1-2) пучок жгутиков иа каждом конце клетки вращается со ско-
ростью 50 оборотов в секунду; при этом вся клетка медленно повора-
чивается в противоположном направлении и продвигается вперед со
скоростью до 50 мкМ'С4 [6]. У одних штаммов Е. coli жгутики отсут-
ствуют, в то время как у других их число достигает 8 на клетку, причем
они распределены по ее поверхности более или менее случайно. Когда
клетка плывет, жгутики обычно тянутся пучком сзади.
О другом виде выростов у бактерий даже не подозревали, пока не
стали применять в этой области электронный микроскоп. Это тончай-
шие (толщиной всего от 3 до 25 нм) длинные нити— так называемые
пили (или фимбрии) (рис. 1-2, А). Функция их во многих случаях неиз-
вестна, хотя показано, что клетки с большим количеством этих придат-
ков легко соединяются друг с другом. Некоторые пили (F-пили) у
Е. coli и родственных организмов играют, по-видимому, специфическую
роль при конъюгации.
7. Высокая скорость обмена веществ у бактерий
Наиболее удивительная особенность бактерий заключается в неве-
роятно высокой скорости их обмена веществ и роста. В благоприятных
условиях бактериальная клетка удваивает свои размеры и делится на-
двое всего за 20 мин. Животные клетки проходят этот цикл за 24 ч.
Не меньшее удивление вызывает то, с какой скоростью бактерии пре-
вращают компоненты пищи в другие вещества. Высокую интенсивность
обмена веществ у бактерий объясняют большим значением отношения
поверхности к объему (см. также гл. 3, разд. А.5). Для мелких бакте-
рий сферичесой формы (кокков) диаметром 0,5 мкм отношение поверх-
ности к объему составляет 12-10s м-1, а у амебы диаметром 150 мкм
это отношение равно всего 4-104 м-1, но быстро возрастает, если амеба
образует псевдоподии. У человека весом 90 кг, по оценкам Тимана [7],
отношение поверхности к объему составляет только 30 м-1.
8. Споры
При определенных условиях некоторые бактерии (например, Bacil-
lus subtilis) образуют споры (эндоспоры). Спора представляет собой
компактную маленькую клетку, формирующуюся внутри вегетативной
клетки и составляющую иногда только 7io ее объема. Содержание воды
Место действия 23
в споре очень низко, интенсивность обмена веществ близка к нулю,
устойчивость к нагреванию и высушиванию исключительно высока.
В благоприятных условиях споры прорастают и возобновляют вегета-
тивный рост. Процесс спорообразования интенсивно изучается, посколь-
ку это позволяет получить сведения о способах регуляции жизнедея-
тельности клеток в зависимости от условий окружающей среды.
9. Классификация бактерий
Бактерии крайне разнообразны по химическому составу и характеру
обмена веществ, поэтому разработать их рациональную классификацию
очень трудно. Для высших организмов понятие «виды» можно опреде-
лить как нескрещивающиеся формы. В случае бактерий этот критерий
лишен смысла, поэтому подразделение их на виды и роды нередко про-
извольно. Используемая в настоящее время схема (табл. 1-1) делит
царство прокариот на 19 групп. В основу деления положены различные
признаки, включая форму, отношение к красителям и химические свой-
ства. В таблицу включены названия родов всех бактерий, упоминаемых
в тексте книги.
Бактерии имеют форму сфер или палочек — прямых либо изогнутых.
Некоторые из них (например, актиномицеты) растут в виде разветвляю-
щихся нитевидных образований.
Названия бактерий часто отражают их форму: coccus — это сфера,
bacillus — палочка, vibrio — изогнутая палочка со жгутиком на одном
•конце. Название spirillum относится к винтообразно закрученным бак-
териям с пучком жгутиков на одном или обоих полюсах. В целом вопрос
о классификации бактерий остается нерешенным, так как одни и те
же названия нередко употребляются для наименования как отдельных
видов, так и семейств. Ряд названий отражает особенности химических
свойств описываемых бактерий.
10. Питание бактерий
Автотрофные («самопитающиеся») бактерии синтезируют все орга-
нические компоненты своих клеток из углекислого газа, воды и неорга-
нических соединений азота и серы. Источником энергии для фотоавто-
трофных бактерий служит солнечный свет, а для хемоавтотрофов —
энергия, выделяющаяся в ходе превращений неорганических соедине-
ний. Например, водородные бактерии окисляют Н2 до Н2О, а серные
бактерии (живущие в серных источниках) окисляют H2S до H2SO4.
Большинство видов бактерий, подобно грибам и животным, по типу
питания относится к хемогетеротрофам, т. е. используют энергию, вы-
деляющуюся при распаде органических веществ. Некоторые гетеро-
трофные бактерии — анаэробы. Это означает, что они разлагают слож-
ные органические соединения (например, сахара) при полном отсутст-
вии кислорода. Указанный процесс называется брожением. Некоторые
анаэробы окисляют органические соединения, используя неорганиче-
ские окислители, в частности нитрат (денитрифицирующие бактерии)
или сульфат (сульфатредуцирующие бактерии). Для ряда анаэробных
бактерий, относящихся главным образом к роду Clostridium, кислород
токсичен, их называют облигатными анаэробами. Другие, в том числе
Е. coli, относятся к категории факультативных анаэробов; это означает,
что они способны расти как в присутствии, так и в отсутствие кислоро-
да. Облигатные аэробы используют в качестве источника энергии про-
цессы окисления органических соединений кислородом воздуха.
24 Глава 1
Таблица 1-1
Схема современной классификации бактерий а> * 6
Царство прокариот
Подцарство I: цианобактерии (ботаническое название — цианофиты, сине-зеленые
водоросли)
Подцарство II: бактерии
Бактерии делятся далее иа 19 групп; среди них некоторые роды объединены в се-
мейства и порядки, тогда как «родственные связи» других не определены. В таблице
приводятся названия отдельных родов, причем в основном тех, которые упоминаются
в данной книге. Представители одного семейства перечисляются подряд, через запя-
тую, н отделяются от членов других семейств точкой с запятой.
1. Фотосинтезирующие (фототрофные) бактерии
Rhodospirillum, Rhodopseudomonas (пурпурные несерные бактерии); Chromatium,
Thiospirillum (пурпурные серные бактерии); Chlorobium (зеленые серные бак-
терии)
2. Скользящие бактерии
Beggiatoa (нитевидная бактерия, содержащая гранулы серы)
3. Бактерии, образующие чехлы
4. Почкующиеся и стебельковые бактерии
5. Спирохеты (длинные извитые бактерии, достигающие 500 мкм в длину и способ-
ные продвигаться вперед при помощи аксиальных нитей, которые находятся меж-
ду наружной оболочкой и телом клетки)
Treponema (Т. pallidum — возбудитель сифилиса), Leptospira
6. Спиралевидные и изогнутые бактерии
Spirillum, Bdellovibrio
7. Грамотрицательные палочки и кокки, аэробы
Pseudomonas, Gluconobacter; Azotobacter; Rhizobium; Acetobacter; Brucella
(B. abortus — возбудитель бруцеллеза), Halobacterium
8. Грамотрицательные палочки, факультативные анаэробы
Escherichia, Salmonella (S. typhi— возбудитель брюшного тифа), Shigella (S. dy-
senteriae -—возбудитель бактериальной дизентерии), Klebsiella, Serratia; Proteus,
Yersinia (У. pestis — возбудитель чумы), Enterobacter3, Vibrio (V. choleras—воз-
будитель холеры), Zymomonas; Flavobacterium, Haemophilus
9. Грамотрицательные палочки, анаэробы
Desulfovibrio, Butyrivibrio
10. Грамотрицательные кокки и коккобациллы, аэробы
Neisseria (N. gonorrhea — возбудитель гонореи)
11. Грамотрицательные коккн, анаэробы
Veillonella
12. Грамотрицательные хемилитотрофные бактерии
Nitrobacter, Nitrosomonas; Thiobacillus
13. Метанообразующие бактерии
Methanobacterium
14. Грамположительные кокки
Micrococcus, Staphylococcus (S. aureus — возбудитель фурункулеза, воспалитель-
ных процессов); Streptococcus (S. pyogenes — возбудитель скарлатины, ангины;
S. pneumoniae—возбудитель пневмонии), Leuconostoc; Peptococcus
15. Спорообразующие палочки и кокки
Аэробы: Bacillus (В. anthracis — возбудитель сибирской язвы)
Анаэробы: Clostridium (С. tetani — возбудитель столбняка; С. botulinum — возбу-
дитель ботулизма)
16. Грамположительные палочковидные бактерии, не образующие спор
Lactobacillus
17. Актиномицеты и родственные организмы
Corynebacterium (С. diphtheriae—возбудитель дифтерии); Propionibacterium; Ac-
tinomyces, Bifidobacterium; Mycobacterium (M. tuberculosis — возбудитель тубер-
кулеза) ; Streptomyces
18. Риккетсии (паразитирующие бактерии со строго определенными потребностями в
питательных веществах, а также малым размером генома)
Rickettsia (R. rickettsii — возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор); Chla-
mydia (С. trachomatis — возбудитель трахомы)
19. Микоплазмы
Mycoplasma; Acholeplasma; Thermoplasma
а Данные взяты из Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology, 8th ed. Wil-
liams and Wilkins, Baltimore, Maryland, 1973.
6 Перечислен ряд болезней человека, вызываемых некоторыми видами бактерий.
• Прежнее название — Aerobacter.
Одна из самых больших групп строго аэробных гетеротрофных бак-
терий— псевдомонады (Pseudomonas и близкие роды); они очень инте--
ресны для биохимиков благодаря своей способности окислять органи-
ческие соединения типа алканов, ароматических углеводородов и сте-
роидов, которые не используются большинством других видов бактерий.
Как правило, каждый данный вид бактерий использует лишь неболь-
шое число окислительных реакций. Например, уксуснокислые бактерии;
всю необходимую энергию получают за счет реакции окисления этило-
вого спирта в уксусную кислоту:
СН3СН2ОН + О2 > СН3СООН + Н2О. (1.1 у
Важным критерием при классификации бактерий является их спо-
собность окрашиваться по Граму. В зависимости от способности связы-
вать основный краситель кристаллический фиолетовый, применяемый в.
виде комплекса с иодом, бактерии делятся на грамположительные и
грамотрицательные. Указанная способность определяется структурой
клеточных стенок (гл. 5). Большинство актиномицетов, кокков, а также
спорообразующие палочки относятся к категории грамположительных
бактерий, тогда как Е. coli, другие кишечные бактерии и псевдомона-
ды— грамотрицательные (табл. 1-1).
11. Фотосинтезирующие и азотфиксирующие прокариоты
Считается, что некогда атмосфера Земли была полностью анаэроб-
ной; она содержала метан, формальдегид и более сложные органиче-
ские соединения. В таких условиях первые живые организмы должны,
были напоминать современные бактерии типа Clostridium [8].
На следующей стадии эволюции появились, видимо, организмы,
родственные современным фотосинтезирующим бактериям (пурпурным
и зеленым): они могли использовать энергию солнечного света. Любо-
пытно, что большинство этих (грамотрицательных) фотосинтезирующих
бактерий — строгие анаэробы. В отличие от высших растений ни один
из указанных микроорганизмов не выделяет кислорода. Напротив, для,
восстановления двуокиси углерода в процессе фотосинтеза им необхо-
дим водород, который они получают либо путем расщепления неорга-
нических соединений типа H2S, тиосульфата или Н2, либо из органиче-
ских веществ.
У всех фотосинтезирующих организмов, включая высшие растения,,
фотосинтез протекает в мембранных структурах. У пурпурных бактерий
поглощающие свет пигменты (бактериальные хлорофиллы и каротины)
встроены в мембраны, которые представляют собой складки наружной
клеточной мембраны. Эти участки имеют характерную структуру и на-
зываются хроматофорами. Они состоят из соединяющихся между собой
полых пузырьков, параллельно расположенных трубочек или парал-
лельных пластинок (ламелл); диаметр всей структуры — 50—100 нм.
У зеленых бактерий пигменты выстилают внутриклеточные пузырьки.
В настоящее время фотосинтезирующие бактерии обитают только в
серных источниках и глубоких озерах, но когда-то они были, вероятно,
распространены гораздо более широко и являлись единственными фото-
синтезирующими организмами на Земле.
Для выделения кислорода путем расщепления Н2О до О2 в клетках
должна была возникнуть другая система фотосинтеза (гл. 13). Про-
стейшими выделяющими кислород организмами, существующими в на-
стоящее время, являются сине-зеленые водоросли (цианобактерии) [9].
Некоторые из этих простейших растений — одноклеточные; по структу-
:26 Глава
ре они сходны с бесцветными бактериями. Другие, например Oscillato-
ria, слизистое растение, нередко покрывающее внутренние стенки до-
машних аквариумов, образуют длинные нити диаметром около 6 мкм
(рис. 1-9). Эти нити совершают медленные скользящие движения, по-
средством которых перебираются на чистые участки стенок аквариума.
Все сине-зеленые водоросли содержат 2 пигмента, не встречающиеся
у других прокариот: хлорофилл а и (J-каротин. Эти же пигменты име-
ются у истинных водорослей и у высших растений. Нити некоторых
•сине-зеленых водорослей, в частности Nostoc, помимо пигментирован-
ных клеток, содержат еще слабоокрашенные клетки, называемые гете-
роцистами; последние, по-видимому, выполняют специализированную
функцию — фиксируют молекулярный азот. Развитие способности ис-
.пользовать N2 для образования органических азотистых соединений
представляет собой еще один важный шаг в эволюции. Благодаря своей
•способности фиксировать азот и осуществлять фотосинтез сине-зеленые
водоросли — самые нетребовательные в отношении питания организмы.
.Для роста им необходимы только N2, СО2, вода, свет и минеральные
вещества.
Образование молекулярного кислорода из воды в процессе фотосин-
теза явилось, несомненно, важнейшим событием в эволюции и имело
далеко идущие последствия. По мере накопления кислорода в атмосфе-
ре Земли облигатные анаэробы (для которых кислород токсичен) оста-
лись только в строго анаэробных средах, уступив место новым классам
-бактерий, обладающих механизмами детоксикации кислорода и исполь-
зования его для окисления сложных органических соединений с целью
лолучения необходимой энергии.
Б. Клетки эукариот
Вторая основная категория живых существ — это эукариоты, т. е.
организмы, клетки которых содержат истинное ядро. Клетки эукариот
крупнее и сложнее по строению, чем клетки прокариот. В ядре, окру-
женном мембраной, заключена большая часть ДНК, которая таким об-
разом отделена от цитоплазмы. В цитоплазме содержатся различные
•органеллы, каждая из которых обладает характерной структурой, — ми-
тохондрии, лизосомы, центриоли. Клетки эукариот так разнообразны
по размерам и форме и настолько специализированы, что описать «ти-
пичную» клетку практически невозможно. Все же на рис. 1-3 мы попы-
тались изобразить некую «усредненную» клетку1, отчасти животную, от-
части растительную.
1. Размеры и строение клеток эукариот
Как видно из табл. 1-2, где приводятся диаметр и объем некоторых
клеток, близких по форме к сфере, диапазон изменений клеточных раз-
меров огромен. И тем не менее можно считать, что типичный диаметр
как растительных, так и животных клеток равен 10—20 мкм. Что ка-
сается крупных клеток типа яйцеклетки, то в синтезе питательных ве-
ществ, которые затем переносятся в развивающееся яйцо, принимают
участие большое число окружающих ее клеток.
Многие клетки имеют далеко не сферическую форму. Например,
эритроциты человека представляют собой диски размером 8х8х(1—2)
мкм и объемом 80 мкм3. Клетки растительных волокон достигают не-
1 См. знаменитый рисунок Браше (J. Brachet, Sci. Am., 205, 55, Sep. 1961).
тесто деис1вим
РИС. 1-3, Схематическое изображение «усредненной» эукариотической клетки. На ри-
сунке показаны основные органеллы как животных, так и растительных клеток (при-
мерно в одном масштабе). Сокращения: БМ — базальная мембрана; ЭР — эндоплаз-
матический ретикулум (шероховатый — с прикрепленными рибосомами; гладкий ЭР —
около ядра и в правой стороне клетки); ГС—глубокая складка плазматической мем-
браны; ГГ — гранулы гликогена; щель — пространство шириной ~10—20 нм между
соседними клетками; М—митохондрии; Мт — микротельца; Л — лизосома; Д — дес-
мосома; ПС — плотное соединение; Мв — микроворсинки; Р — ресничка; СГ — секре-
торные гранулы; Г — аппарат Гольджи; В — вакуоль; КС — клеточная стенка (у рас-
тений); Цт — центриоль; П — плазмадесмы; Я — ядро; Яд — ядрышко; Хл — хлоро-
пласт; Кр — гранулы крахмала. (По рисунку Michael Metzler.)
28 Глава 1
Таблица 1-2
Приблизительные размеры некоторых клеток
Клетка Диаметр, мкм Примерный объем, МКМ3
E. coli 1 1,0
Малая клетка тимуса 6 120
Клетка печени 20 4000
Яйцеклетка человека (зрелаи) 120 500 000
Куриное яйцо (без белка) 20 000 4-Ю12-
Клетка дрожжей 10 500
Корешок лука, клетка меристемы 17 2600
Клетка из паренхимы плода растения 1000 1 • 10а
скольких миллиметров в длину. Нервные клетки животных имеют длин-
ные отростки, аксоны; у человека их длина достигает 1 м.
В табл. 1-3 приведены размеры геномов некоторых клеток эукариот;,
здесь же для сравнения указаны размеры генома Е. coli.
Как видно из таблицы, у дрожжей количество генетического мате-
риала примерно в 5 раз больше, чем у Е. coli, а у человека (и мыши) —
в 600 раз. Нужно сказать, однако, что у высших организмов гены неред-
ко дублированы и в клетке присутствуют многократно повторяющиеся!
последовательности ДНК. Функция таких повторов неизвестна (у неко-
торых амфибий содержание ДНК в расчете на одну клетку в 25 раз;
больше, чем у человека). Уотсон [10] высказал предположение, что-
количество собственно генетического материала в клетках позвоночных
по крайней мере в 20—50 раз выше, чем у Е. coli. Следовательно, число
генов в клетке человека составляет величину порядка 105.
2. Ядро
Диаметр ядра обычной клетки животного равен ~5 мкм, а объем
'-'65 мкм3. За исключением того периода, когда клетка делится, ядро
плотно и почти равномерно заполнено ДНК. Даже с помощью элект-
Таблица 1-3
Размеры гаплоидных геномов у ряда организмов
Организм Масса в дальтонах3» Число нуклеотидных пар
Е. coli 2,5- 10е 3,8-10s
Saccharomyces cerevisiae (дрожжи) 13- 10э 20-10®
Морской еж 600-10® 900-10®
Drosophila melanogaster (плодовая мушка) 60-10® 90-10®
Человек н мышь 1500-Ю3 2300-10®
а Thomas С. A., Jr., MacHattie L. A., Annu. Rev. Biochem., 36, 485—518, 19671
6 Mahler H. R., Cordes E. H., Biological Chemistry, 2nd ed., p. 187, Harper, New
York, 1971.
ivieciu дспсюпл
донного микроскопа не удается различить в ядре какой-либо определен-
ной структуры. Вследствие своих кислотных свойств ДНК окрашивает-
ся основными красителями. Задолго до возникновения современной био-
химии ядерное вещество, окрашивающееся этими красителями, получи-
ло название хроматин. Во время деления клетки хроматин организуется
в отдельные хромосомы, содержащие помимо ДНК (15%) еще и РНК
(около 10%), и белок (75%). Почти вся РНК клетки синтезируется
(транскрибируется) в ядре в соответствии с инструкциями, закодиро-
ванными в ДНК- Далее в большинстве случаев РНК выходит из ядра в
цитоплазму, где непосредственно участвует в синтезе белков (трансля-
ция генетической информации), а также, вполне возможно, и в других,
еще не известных нам процессах.
Клеточное ядро содержит одно или несколько плотных ядрышек—
областей, чрезвычайно обогащенных РНК (здесь присутствует 10—20%
суммарного количества РНК клетки). Ядрышки — это места синтеза и
временного накопления рибосомной РНК, которая в больших количест-
вах идет на сборку рибосом.
Ядерная оболочка состоит из двух мембран, разделенных слоем в
несколько десятков нанометров; оболочка окружает ядро и отделяет
перинуклеарное (околоядерное) пространство. В мембранах имеются
поры диаметром 40—100 нм, так что по структуре она напоминает сито.
Поры представляют собой трубчатые канальца диаметром ~4,5 нм, по
которым из ядра в цитоплазму проходят РНК и другие вещества [И].
3. Плазматическая мембрана
Тонкая (~8 нм) наружная клеточная мембрана — плазмалемма
(рис. 1-4)—регулирует поток веществ в клетку и из клетки, проводит
импульсы в нервных и мышечных волокнах, а также участвует в хими-
ческих взаимодействиях с другими клетками. Складки наружной мем-
браны нередко вдаются глубоко внутрь клетки, в цитоплазму; так, на-
.пример, в клетках поперечнополосатых мышц они образуют трубочки
Т-системы, которая участвует в проведении возбуждения, инициирую-
щего процесс сокращения (гл. 4). Складки плазматической мембраны
могут соединяться с ядерной оболочкой, создавая прямые каналы (один
или несколько) между внеклеточной средой и перинуклеарным прост-
ранством [12].
Образованные плазматической мембраной пузырьки в некоторых
случаях отшнуровываются в цитоплазму и сливаются с лизосомами.
Таким путем клетка может заглатывать плотные частицы (фагоцитоз)
или капельки (пиноцитоз) из окружающей среды. На поверхности кле-
ток, функция которых состоит в секреции или поглощении определен-
ных веществ из внеклеточной среды (например, клетки, выстилающие
почечные канальцы, или секреторные клетки поджелудочной железы),
обычно имеются тончайшие выросты — микроворсинки, которые значи-
тельно увеличивают клеточную поверхность. В некоторых случаях от-
ростки соседних клеток соприкасаются друг с другом, обеспечивая тем
самым более тесный контакт между клетками.
4. Цитоплазматические мембраны
Хотя цитоплазма представляет собой жидкость (рассматривая неко-
торые организмы, можно видеть, как она быстро течет), все же с по-
мощью электронного микроскопа выявилось, что жидкая субстанция—
цитозоль — пронизана множеством мембран, образующих так называе-
30 Глава I
РИС. 1-4. А. Электронная микрофотография ультратонкого среза молодой эпидермаль-
ной клетки подсолнечника. Ткань фиксировали и окрашивали уранилацетатом и цитра-
том свинца. Ясно видны ядро, митохондрии, хлоропласты, тельце Гольджи (диктиосо-
ма, слева около ядра), эндоплазматический ретикулум, клеточная стенка, плазмадес-
мы и кутикула (наверху справа в виде тонкого темного слоя). (С любезного разре-
шения Horner Н. Т.)
мый эндоплазматический ретикулум (ЭР), который состоит из сложной
сети трубочек, пузырьков и уплощенных мешочков (цистерн). Внутрен-
няя полость цистерн ЭР соединяется, по-видимому, с перинуклеарным
пространством и с рядом (обычно 3—12) уплощенных, слегка изогну-
тых дискообразных мембран, называемых аппаратом Гольджи [13].
Эта структура (рис. 1-3) была впервые описана Камилло Гольджи
[13а] в 1898 г., но ее существование долгое время ставилось под сомне-
ние. Часть ЭР (шероховатый эндоплазматический ретикулум) выстлана
множеством рибосом диаметром ~21—25 нм. Хотя рибосомы эукариот
сходны с бактериальными рибосомами, они примерно на 50% тяжелее
Место действия 31
РИС. 1-4. Б. Две диктиосомы (тельца Гольджи) из клетки железистого волоска рас-
тения Psychotria Обратите внимание на сетчатость структуры днктносом
___________________(от греч. диктион— сеть).
Глава 1 32
РИС, 1-4. В. Слоистые фотосинтезирующие структуры —
.граны нз хлоропласта листа люцерны. Микрофотография
получена при большем увеличении.
(4-106 дальтон). Глад-
кий эндоплазматиче-
ский ретикулум не не-
сет рибосом, однако он
способен, по-видимо-
му, вносить изменения
в молекулы белка, син-
тезированного на рибо-
сомах шероховатого
ЭР, например присое-
динять к ним углевод-
ные цепи.
Мембраны Гольд-
жи расположены в не-
посредственной близо-
сти к гладкому ЭР со
стороны, обращенной к
центру клетки. Наруж-
ные края мембран
Гольджи образуют
вздутия, из которых за-
тем формируются ва-
куоли, нередко обильно
наполненные фермен-
тами и другими соеди-
нениями. Такие секре-
торные гранулы про-
двигаются к поверхно-
сти клетки и выделя-
ются во внеклеточную
среду. В ходе указан-
ного процесса (экзоци-
тоза) мембраны, окру-
жающие секреторные
гранулы, сливаются с
наружной клеточной
мембраной [14, 15].
Аппарат Гольджи
представляет собой не
просто место «упаков-
ки» белков — в нем
также протекают раз-
личные реакции синте-
за. Как и в гладком
ЭР, в мембранах
Гольджи идет присое-
динение углеводов к
белкам (с образовани-
ем гликопротеидов) и
сульфатных групп к
полисахаридам [16,
17]. В клетках печени
аппарат Гольджи уча-
ствует в процессе вы-
деления в кровь липо-
протеидов, а также, возможно, жирорастворимых витаминов (в част-
ности, витамина А) [18]. Таким образом, ЭР, мембраны Гольджи и
секреторные гранулы представляют собой организованную систему
структур, выполняющую биосинтетические функции.
Эта система участвует не только в синтезе ферментов, которые сек-
ретируются клеткой, но и в образовании новых мембран. По-видимому,
шероховатый ЭР поставляет мембранный материал гладкому ЭР и ап-
парату Гольджи, а компоненты мембран Гольджи включаются в состав
наружной клеточной мембраны. В растительных клетках наружные
мембраны митохондрий и мембраны, окружающие вакуоли, также об-
разуются непосредственно из ЭР [19]. Компоненты наружных клеточ-
ных мембран, вероятно, могут использоваться повторно, включаясь в со-
ответствующую структуру в ходе эндоцитоза [20].
Микросомы (термин, часто встречающийся в биохимической литера-
туре) — это мелкие частицы диаметром 50—150 нм, которые представ-
ляют собой фрагменты в основном ЭР и частично плазматической мем-
браны. Микросомы образуются в процессе растирания или гомогени-
зации клеток. При центрифугировании разрушенных клеток сначала
оседают ядра и другие крупные фрагменты, затем — митохондрии. При
очень высоких скоростях (например, при 100 000 g) оседают микросомы
(их масса составляет ~108—109 дальтон). На электронных микрофото-
графиях видно, что в микросомах фрагменты мембран замыкаются с
образованием небольших мешочков, на наружной поверхности которых
сохраняются рибосомы:
Эндоплазматический • Микросомы
ретикулум
Способность к образованию замкнутых структур присуща, по-види-
мому, фрагментам любых мембран. Так, при гомогенизации нервных
клеток из их синаптических окончаний образуются замкнутые структу-
ры— синаптосомы. Правда, последние формируются из фрагментов
плазматической мембраны, а не ЭР и часто содержат митохондрии.
5. Митохондрии и пластиды
Характерной особенностью клеток эукариот является присутствие
митохондрий — сложных образований с двойной мембраной, близких по
величине к бактериям (рис. 1-3 и 1-4). Внутренняя мембрана митохонд-
рий образует многочисленные глубокие складки, так называемые кри-
сты (гребневидные выросты). Наружная мембрана проницаема для
соединений с небольшим молекулярным весом, но проникновение ве-
ществ во внутреннее пространство митохондрий (в матрикс) и выход из
него находятся под строгим контролем внутренней мембраны. Хотя от-
дельные окислительные реакции протекают в ЭР, все же основные про-
цессы, связанные с образованием и накоплением энергии, у аэробных
организмов локализованы в митохондриях; именно в этих органеллах
происходит утилизация основной части кислорода. В свое время многие
биохимики были крайне удивлены, обнаружив в митохондриях кольце-
вую ДНК с небольшим молекулярным весом. Далее оказалось, что ми-
3—1821
34
Глава 1
тохондрии содержат рибосомы, по размеру сходные с бактериальными^
но меньшие, чем рибосомы, прикрепляющиеся к шероховатому ЭР.
Митохондрии присутствуют во всех клетках эукариот, использующих
для дыхания кислород. Число митохондрий на клетку варьирует от 1
(у мельчайших трипаносом) до 3-105 (в некоторых ооцитах). Типичная
клетка печени содержит более 1000 митохондрий [21]. Новые интерес-
ные данные получены при изучении митохондрий дрожжей [22]. Иссле-
дование серийных срезов через одну клетку (дополнение 1-В) показало,,
что все митохондрии связаны между собой. Таким образом, митохонд-
рии дрожжевых клеток — это не отдельные органеллы, а единая сооб-
щающаяся внутриклеточная структура. Насколько верно это для других,
организмов — пока неясно.
Пластиды — это органеллы клеток растений, выполняющие различ-
ные функции. Наиболее важную роль играют хлоропласты, содержащие-
хлорофилл структуры, в которых протекает фотосинтез. Как и в мито-
хондриях, в хлоропластах имеется складчатая внутренняя мембрана а
некоторое количество ДНК небольшого молекулярного веса.
6. Лизосомы и микротельца
Лизосомы представляют собой пузырьки, окруженные одиночной
мембраной и содержащие полный набор ферментов для расщепления
практически любого компонента клетки. Лизосомы, по-видимому, обра-
зуются из мембран Гольджи. В клетках, способных захватывать частич-
ки пищи (например, у амеб), лизосомы являются источником фермен-
тов для ее расщепления. Лизосомы переваривают также «отработан-
ные» или излишние клеточные компоненты, в том числе митохондрии..
Лизосомы — жизненно необходимые клеточные органеллы [23, 24]; не-
которые серьезные болезни человека обусловлены отсутствием именно'
специфических лизосомных ферментов.
Во многих клетках встречаются микротельца [24, 25], в зеленых,
листьях их число достигает иногда */з числа митохондрий. Микротельца,
по величине близки к митохондриям, но окружены однослойной мем-
браной и иногда имеют кристаллическую по виду «сердцевину» («core»).
Мембрана микротелец проницаема для низкомолекулярных соединений
(например, для сахарозы), что позволяет отделить эти органеллы от
митохондрий путем центрифугирования в градиенте сахарозы, где мик-
ротельца имеют плотность около 1,25 г-см-3, а непроницаемые для са-
харозы митохондрии— 1,19.
В микротельцах находится большое количество ферментов, катали-
зирующих образование и разложение перекиси водорода. Описаны два.
типа микротелец: пероксисомы, присутствующие в клетках печени, по-
чек и зеленых листьев, и глиоксисомы, обнаруженные в прорастающих
семенах масличных культур. Глиоксисомы играют особую роль, а имен-
но катализируют реакции глиоксилатного цикла (гл. 11, разд. Г.4).
7. Центриоли, реснички, жгутики и микротрубочки
Во многих клетках присутствуют центриоли; это маленькие цилинд-
ры диаметром около 0,15 мкм и длиной 0,5 мкм, не связанные с мем-
бранами. Каждая центриоль содержит набор тонких микротрубочек ди-
аметром 20 нм. Практически во всех животных клетках вблизи ядра,
расположена пара центриолей, которые играют важную роль в клеточ-
ном делении. В клетках растений центриоли не обнаружены.
Длина этой реснички около 8мкм.
Длина ресничек варьирует
от 2мкм до 2 мм, чаще всего
составляя 10-20 мкм
0 0,5 мкм
\20
50 40
Поперечный разрез (* 2?)
А
Поперечный
разрез
Мембрана
Микротрубочки ( диаметром 24 нм),
организованные по схеме 9+2
„Ручки" на микротрубочках,
I расположенные с интервалом
' в 17-22 нм
Вторичное
волокно
10
Диаграмма движения
длинного жгутика
Базальное тельце
(кинетосома)
Наружная „ручка"
Субфибрилла В
Субфибрилла А
Б
Центральная
капсула
Мостик между
парными субфибриллами
Основание'
мостика
№1
'иальныи
мостик
Внутренняя
„ ручка ”
РИС. 1-5. А. Структура ресничек и жгутиков эукариот. (Satir Р., Sci. Am. 204, 108— 116, Feb. 1961. Copyright 1961 by Scientific American, Inc.
All rights reserved.) Б. Схематическое изображение участка типичной, построенной по схеме 9+2 аксонемы (части реснички, выступающей над по-
верхностью клетки); вид снизу — от основания к вершине кончика. Наружные двойные трубочки (№ 1, 2 и 9) присоединены к центральной капсу-
ле, образующей парные выступы (а и Р), каждый из которых прикреплен к одной из двух центральных микротрубочек (ЦМ8 и ЦМ3). Микротру-
бочки состоят из 13 нитей, причем каждая нить представляет собой цепочку белковых субъединиц (см. также гл. 4, разд. Г.2). Все детали изо-
бражены примерно в одном масштабе (Sleigh М. A., Cilia and Flagella, р. 14, Acad. Press, New York, 1974). Диаграмма движения жгутика на
рис. А взята из работы Sleigh М.. A., Endeavour, 30, И, 1971.)
РИС. 1-6. Поперечный срез реснички ротовой мембранеллы Tetrahytnena. Такие реснички направляют пищу в ротовое отверстие. Срез прошел
(слева направо) через основания ресничек (9 тройных микротрубочек) и собственно реснички (9 двойных микротрубочек). На срезах ресничек,
расположенных в левой части рисунка, центральные микротрубочки отсутствуют; на срезах, расположенных правее и ближе к центру (что соот-
ветствует более дистальному расположению ресничек), обнаруживаются одна и затем две центральные микротрубочки. Окрашивание уранилаце-
татом и цитратом свинца. (Elliot А. М., Outka D. Е., Zoology, 5th ed., р. 122. Copyri ght 1976. Reproduced by permission of Prentice-Hall, Inc.,
Englewood Cliffs, New Jersey.)
Место действия 37
По структуре центриоли сходны со жгутиками или более короткими
образованиями — ресничками (эти термины, в сущности, синонимы),
обычно находятся на поверхности клеток эукариот и являются органами
движения. Неподвижные клетки тела человека также нередко имеют
реснички. Например, эпителий бронхов несет 10В. 9 ресничек на 1 см2
[26]. Модифицированные жгутики образуют светочувствительные ре-
цепторы нашего глаза и рецепторы вкуса на языке. Жгутики и реснички
несколько больше по диаметру (около 0,2 мкм), чем центриоли, и об-
ладают характерной внутренней структурой: они состоят из И полых
микротрубочек диаметром ~24 нм, организованных по схеме «9 + 2»
(рис. 1-5 и 1-6). Каждая микротрубочка внешне похожа на жгутик бак-
терии, но существенно отличается от него по химическому составу. Ба-
зальное тельце, называемое также кинетосомой (рис. 1-5), по структу-
ре, размерам и способу воспроизведения сходно с центриолью. Микро-
трубочки, подобные тем, которые входят в состав жгутиков, обнаруже-
ны также в цитоплазме клеток [27]. Они выглядят как маленькие ка-
нальцы, но действительно ли играют такую роль — неясно. Скорее все-
го микротрубочки выполняют опорную функцию «цитоокелета». В аксо-
не нерва микротрубочки расположены по всей длине аксона и, вероят-
но, составляют часть механической системы переноса клеточных компо-
нентов.
8. Клеточные оболочки, стенки и раковины
Подобно бактериям, клетки высших растений и животных часто по-
крыты внеклеточным материалом. Так, растительные клетки имеют
жесткую стенку, содержащую в большом количестве целлюлозу и дру-
гие полимерные углеводы. Клетки, расположенные на наружных поверх-
ностях растений, бывают покрыты восковым слоем. Клетки животных
снаружи обычно защищены гликопротеидами — комплексами углеводов
со специфическими белками клеточной поверхности. Пространство меж-
ду клетками заполнено такими «цементирующими веществами», как
пектины у растений и гиалуроновая кислота у животных. Нераствори-
мые белки — коллаген и эластин — секретируются клетками соедини-
тельной ткани. Клетки, лежащие на поверхности (эпителиальные или
эндотелиальные), нередко граничат с другой стороны с тонкой, содер-
жащей коллаген базальной мембраной (рис. 1-3). Часто в результате
совместного действия клеток различного типа происходит отложение
неорганических соединений — фосфата кальция (в костях), карбоната
кальция (скорлупа яиц и спикулы губок), окиси кремния (раковины
Диатомовых водорослей) и т. и. Таким образом, обмен веществ в зна-
чительной мере протекает вне клеток.
В. Эволюция сложных организмов
Огромные различия между клетками про- и эукариот породили мно-
жество предположений относительно характера эволюционных взаимо-
отношений между этими двумя основными категориями живых существ.
Согласно одной из популярных теорий, митохондрии ведут свое проис-
хождение от аэробных бактерий. Предполагается, что после появления
сине-зеленых водорослей и накопления в атмосфере достаточного коли-
чества кислорода возник симбиоз между мелкими аэробными и более
крупными облигатно анаэробными бактериями. При этом аэробные
бактерии, поселившись внутри клеток анаэробов, поглощали весь кис-
лород и защищали тем самым организм хозяина, для которых кислород
38
Глава 1
был токсичным. Со временем эти отношения закрепились, что привело к
возникновению клеток эукариот, содержащих митохондрии [28, 29].
В дальнейшем симбиоз с сине-зелеными водорослями мог аналогичным
образом привести к появлению хлоропластов в клетках растений-эука-
риот.
В пользу рассмотренной выше точки зрения говорит тот факт, что
симбиотические отношения существуют и между современными орга-
низмами. Так, в цитоплазме зеленой парамеции (Paramecium bursa-
ria) присутствует одноклеточная водоросль хлорелла (Clorella) —обыч-
ное зеленое растеньице, которое может жить и самостоятельно.
Вероятно, сожительство хлореллы с парамецией возникло случайно
[28]. Биологи и биохимики сразу приняли симбиотическую теорию воз-
никновения митохондрий. Однако Рафф и Малер выдвинули другую
гипотезу, предположив, что митохондрии возникли скорее из мезосом-
ных мембран, а ДНК в них происходит из внехромосомного генетиче-
ского материала (из плазмид или эписом; гл. 15, разд. Г.7), который
часто встречается в клетках прокариот [30]. Этот вопрос так и остает-
ся открытым и широко обсуждается [30—-32].
Ископаемые остатки бактерий и сине-зеленых водорослей были най-
дены в отложениях, возраст которых, по геохимическим данным, пре-
вышает 3 млрд. лет. Возможно, в это же время появились первые эука-
риоты, давшие в результате эволюции свыше миллиона известных ныне
видов.
1. Дупликация генов
Каким образом увеличивался размер генома клеток при эволюции
организмов от низших форм к высшим? Изменения формы и поведения
организмов обусловлены мутациями, меняющими последовательность
аминокислот в белках. Однако такие мутации не могли увеличить коли-
чества генетического материала в процессе эволюции. Вполне возмож-
но, что в ряде случаев в клеточное ядро случайно включалась копия од-
ного или нескольких генов [32а]. Тогда при наличии дополнительной
копии гена клетка могла выжить, даже если в результате мутации в од-
ном из парных генов нарушались структура и функция кодируемого им
белка; если парный ген оставался неповрежденным, организм был спо-
собен расти и размножаться. Дополнительный, несущий мутацию ген
мог оставаться в нефункционирующем состоянии много поколений. До
тех пор, пока этот ген продуцировал безвредные, нефункционирующие
белки, он не элиминировался под давлением естественного отбора и со
временем мог опять мутировать. Вполне возможно, что в конце концов
белок, кодируемый этим многократно мутировавшим геном, оказывался
в каком-то отношении полезным для клетки.
Примером результата эволюции, идущей через дупликацию генов,
служат белки крови, переносящие кислород. Предполагается, что около
миллиарда лет тому назад ген белка-предшественника (глобина) дуп-
лицировался. Далее в результате эволюции один из парных генов пре-
вратился в ген, кодирующий гемоглобин, а второй — в ген мышечного
миоглобина. Затем ген гемоглобина вновь дуплицировался, что привело
к существованию в настоящее время а- и 0-цепей этого белка (гл. 4,
разд. Г.8). Последние представляют собой родственные, но отчетливо
различающиеся белковые субъединицы; кодирующие их гены располо-
жены даже в разных хромосомах.
Место действия
39
2. Пол, хромосомы и клеточное деление
Бактерии размножаются обычным путем бинарного деления. При
этом единственная молекула ДНК бактериальной хромосомы удваивает-
ся, и в результате дочерние клетки получают по идентичной хромосо-
ме. Однако у некоторых бактерий обнаруживаются зачатки полового
размножения. Процессом, «перемешивающим» бактериальные гены, яв-
ляется при этом генетическая рекомбинация (гл. 15, разд. Ж).
Половое размножение получает окончательное развитие у эукариот,
где рост многоклеточного организма начинается со слияния двух гапло-
шдных гамет—яйцеклетки и сперматозоида. Каждая гамета несет пол-
ный набор генетических инструкций; образовавшееся после слияния
ядер оплодотворенное яйцо (зигота) является диплоидным. Диплоидная
клетка содержит два полных набора генетических матриц, полученных
ют двух совершенно разных родителей. Это дает развивающемуся орга-
низму огромные преимущества. В самом деле, если какой-либо ген,
полученный от одного из родителей, окажется дефектным, то весьма
мало вероятно, что соответствующий ген от второго родителя будет то-
же дефектным. Кроме того, половое размножение — это средство смеши-
вания генов, и каждый из нас получает не просто половину генов от
матери и половину от отца, но также какие-то гены от дедушек и бабу-
шек, от прадедушек и прабабушек и т. д.
Перед началом деления клеток молекулы ДНК в ядре, которые до
этого были распределены по всему объему, начинают концентрировать-
ся, образуя вместе с белками и другими соединениями плотные тель-
ца— хромосомы. У некоторых организмов, например у Ascaris (круг-
лый червь), имеется только 2 хромосомы. Одна хромосома содержит ге-
нетическую информацию, которую «малышка» Ascaris получает от от-
ца, а другая—от матери. Таким образом, в этом случае имеется только
одна гомологичная пара хромосом, каждая из которых несет весь необ-
ходимый комплект генетических инструкций. Обе хромосомы этой пары
распределяются при каждом клеточном делении так, что все клетки
•организма имеют гомологичную пару. Клетки тела человека, подобно
клеткам Ascaris, диплоидные, но в них не одна, а 23 гомологичные пары
хромосом1. Размеры хромосом человека различны, но в среднем их дли-
на составляет 4—6 мкм, диаметр ~ 1 мкм.
•3. Митоз и мейоз
Процесс клеточного деления, называемый митозом, начинает и за-
вершает клеточный цикл, в ходе которого делится отдельная диплоидная
клетка. С биохимической точки зрения митоз представляет собой удвое-
ние числа генетических матриц с последующим формированием из них
компактных образований — хромосом. Последние распределяются по-
ровну между двумя новыми клетками (подробно этот процесс описан в
гл. 15, разд. Г.9).
Что происходит во время митоза с митохондриями? Они, как и хло-
ропласты в растительных клетках, делятся. Следовательно, на опреде-
ленных стадиях клеточного цикла в этих органеллах происходит репли-
кация ДНК- По крайней мере в ряде случаев деление митохондрий так
связано с клеточным делением, что среднее число митохондрий в рас-
чете на дочерние клетки остается строго постоянным. Аналогичное яв-
ление наблюдается и в клетках низших организмов, содержащих водо-
1 Число хромосом у некоторых других организмов следующее: у мыши — 20, у жа-
<бы — 11, у лука — 8, у москита — 3, у плодовой мушки Drosophila — 4.
40 Глава 1
росли-симбионты, несмотря на то что такие водоросли могут жить и са-
мостоятельно вне клеток организма-хозяина. Что заставляет водоросли,
живущие внутри клеток хозяина, делиться синхронно с этими клетками,
остается для биохимиков загадкой.
Путем последовательных митотических делений из одной оплодо-
творенной яйцеклетки формируется взрослый организм. Для формиро-
вания организма человека достаточно всего 40—50 последовательных
митозов. Однако образование гамет (половых клеток), имеющих гапло-
идный набор хромосом, осуществляется путем мейоза — специального
процесса, в ходе которого число хромосом делится надвое. При мейозе
одна хромосома из каждой гомологичной пары, содержащейся в дипло-
идной клетке, переходит в одну из образующихся гамет. В организме,
подобном Ascaris, который содержит единственную пару хромосом, га-
мета получает хромосому либо от отцовского организма, либо от мате-
ринского, но не от обоих сразу. В организмах, имеющих несколько пар
хромосом, хромосомы при мейозе распределяются случайным образом,
так что в каждой гамете имеются как материнские, так и отцовские хро-
мосомы.
Более подробно мейоз рассматривается в гл. 15, где особое внима-
ние уделено кроссинговеру. В ходе этого процесса, составляющего очень
важную особенность мейоза, происходит разрыв связей между генами,
что обеспечивает «перестановку» генов в хромосомах. Кроссинговер
весьма сходен с генетической рекомбинацией у бактерий и на молеку-
лярном уровне, видимо, неотличим от нее.
Дополнение 1-Г
Наследственные нарушения обмена веществ
В 1908 г. Арчибальд Гаррод (A. Garroda) предположил,
что цистииурия (гл. 5, разд. Б.2.6), а также некоторые другие
нарушения обмена аминокислот и сахаров являются наслед-
ственными заболеваниями. С тех пор число обнаруживаемых
наследственных нарушений обмена веществ у человека увели-
чивается с возрастающей скоростью и превышает в настоящее
время 15006. Примерно для 100 из них выявлено, в чем состо-
ит изменение структуры белка, ответственного за нарушение
обменав-е; в качестве примера можно привести серповидно-
клеточную анемию (дополнение 4-Г). Однако в большинстве
случаев нарушения метаболизма обусловлены потерей актив-
ности какого-либо необходимого фермента.
Многие генетические болезни очень редки и встречаются
не чаще чем у одного человека из 10 000, но некоторые, на-
пример кистозный фиброз, поражают одного из 2500. Общее
число страдающих наследственными болезнями превышает,
как полагают, 2% от числа рождающихся. Многие из них
погибают в младенчестве. Еще большее число людей (более
5%) страдает от диабета и психических заболеваний, также
отчасти генетически обусловленных. Поскольку появление но-
вых мутаций — непрекращающийся процесс, генетические за-
болевания представляют все более и более злободневную про-
блему.
Какова частота появления новых мутаций? Исходя из дан-
ных по содержанию гаплоидной ДНК (табл. 1-3), можно рас-
Место действия 4В
считать, что общая кодирующая емкость ДНК клетки чело-
века превышает 2 млн. генов (точнее, два миллиона пар ге-
нов для диплоидной клетки). Однако белки кодируются толь-
ко частью ДНК- По оценкам разных авторов, число пар-
структурных генов у человека колеблется от 20 000 до 100 000.
Обращаясь в поисках какого-то ориентира к бактериям, мож-
но отметить, что частота легко выявляемых мутаций у бакте-
рий составляет около 10~6 на 1 ген, или 10~9 на пару основа-
ний при каждом делении6. Следовательно, можно ожидать,,
что при репликации 2-Ю9 пар оснований (столько их содер-
жится в хромосомах человека) произойдет примерно 2 ошиб-
ки за каждое деление. Поскольку от одного поколения людей
до другого зародышевые клетки претерпевают несколько деле-
ний, число мутаций в каждом поколении должно быть весьма,
значительным. Другой источник новых мутаций — это повреж-
дение двухцепочечной ДНК, которое может возникнуть за
одно поколение (примерно 20 лет). Без сомнения, большая
часть повреждений исправляется с помощью сложной системы
репарации (гл. 15), но некоторые остаются. По счастью, мно-
гие мутации оказываются безвредными или почти безвредны-
ми, а некоторые могут быть даже полезными. Возможно-
также, что система репликации (воспроизведения ДНК) У
эукариот допускает меньше ошибок, чем у бактерий. С другой
стороны, загрязнение окружающей среды мутагенными хими-
ческими веществами не может не вызывать серьезного беспо-
койства, поскольку является новым источником возникнове-
ния мутаций.
Многие мутации легальны. Несущая летальную мутацию-
гомозигота не выживает — происходит спонтанный аборт (что
остается обычно незамеченным). Имеются данные, что у впол-
не здоровых людей можно обнаружить до 10 рецессивных ле-
тальных мутаций, а также по крайней мере 3—5 аутосомных
рецессивных мутаций, влекущих за собой серьезные генетиче-
ские дефекты. Вредные для организма доминантные мутации
тоже часто встречаются в популяции. В частности, они прояв-
ляются в виде повышения уровня липопротеидов в крови и по-
вышения концентрации холестерина, что в свою очередь при-
водит к повышению частоты сердечно-сосудистых заболеваний
в молодом возрасте.
Биохимические нарушения представляют большой теоре-
тический интерес в связи с тем, что они проливают свет на
значение отдельных процессов обмена веществ; в этой книге
мы нередко будем говорить о такого рода заболеваниях. Ра-
зумеется, основная цель изучения этих болезней состоит в
поиске средств их лечения. В некоторых случаях, например
при фенилкетонурии (гл. 14, разд. 3.5) или при галактоземии-
(гл. 12, разд. А.1), своевременно изменив диету больного,
удается предотвратить необратимое повреждение головного-
мозга— органа, который при этих заболеваниях обычно стра-
дает в первую очередь. Во многих других случаях соответст-
вующих методов лечения до сих пор не существует; поиски
путей введения в организм недостающего фермента — своего-
рода «генная хирургия» — относится к одной из наиболее ув-
лекательных областей современной медицинской биохимии
(гл. 15, разд. 3.4).
42
Глава 1
а Garrod А. Е., Inborn Errors of Metabolism, Oxford, London, 1909.
6 Friedmann T., Roblin R., Science, 175, 949—955 (1972).
B Stanbury J. B., Wyngaarden J. B., Fredricksen D. S. eds., The Metabolic
Basis of Inherited Disease, 3rd ed., McGraw-Hill, New York, 1972.
r Brock D. J. H„ Mayo O., eds., The Biochemical Genetics of Man, Acade-
mic Press, New York, 1972.
д Thompson R. H. S., Wootton I. D. P., Biochemical Disorders in Human
Disease, 3rd ed., Academic Press, New York, 1970.
e Watson J. D., Molecular Biology of the Gene, 3rd ed., p. 254, Benjamin,
Menlo Park, California, 1976.
4. Половые хромосомы и аутосомы
Диплоидные клетки большинства высших организмов содержат одну
пару хромосом, которые, помимо всего прочего, определяют пол особи.
У женщин клетки содержат пару «Х-хромосом», а у мужчин — одну
«Х-хромосому» и парную ей короткую, похожую на обрубок «Y-хромо-
сому»1.
О генах, расположенных в половых хромосомах, говорят, что они
сцеплены с полом. Поскольку большая часть таких генов локализована
в длинной Х-хромосоме, а не в Y-хромосоме, генетические дефекты про-
являются у мужчин, имеющих только одну копию этих генов, гораздо
чаще, чем у женщин. Так, гемофилия и цветовая слепота поражают по
преимуществу мужчин. Женщины в большинстве случаев гетерозиготны
по дефектному гену, т. е. у них имеется нормальный ген на второй
Х-хромосоме2.
При этом если поврежден только один ген из пары (как обычно и бы-
вает), то человек практически здоров. В этой ситуации о дефектном
генетическом признаке говорят как о рецессивном. Например, и гемофи-
лия, и цветовая слепота связаны с полом и являются рецессивными
признаками.
Все хромосомы, кроме половых, принято называть аутосомами, а
расположенные на них гены — аутосомными.
5. Гаплоидные и диплоидные клетки
У человека и высших животных в результате мейоза образуются га-
меты— яйцеклетка и сперматозоиды. При их слиянии возникает снова
диплоидное ядро, из которого путем последовательных митозов разви-
вается взрослый организм. Стадия мейоза характерна для жизненного
цикла всех эукариот, однако отнюдь не всегда этот процесс протекает в
период, аналогичный соответствующему моменту жизненного цикла че-
ловека. Так, клетки многих простейших и грибов обычно гаплоидны.
После слияния двух гаплоидных ядер с образованием диплоидной клет-
ки быстро наступает мейотическое деление, в результате которого вновь
возникают гаплоидные особи. Чередование гаплоидных и диплоидных
фаз жизненного цикла часто встречается у низших растений и прими-
тивных животных. Например, гаметы папоротника падают на почву и
1 У млекопитающих наличие или отсутствие Y-хромосомы определяет пол живот-
ного, а у других организмов Y-хромосома может вообще отсутствовать. Например,
у одних насекомых (Orthoptera) самки имеют пару хромосом XX, а самцы — ХО, в то
время как у других (Lepidoptera), а также у ряда позвоночных (например, у птиц)
самцы несут пару хромосом XX, а самки — XY.
2 У женщин синтез матричной РНК идет только на одной из двух Х-хромосом,
присутствующих в клетках. При этом в одних клетках функциональной активностью
обладает Х-хромосома материнского происхождения, в других — отцовского. В ре-
зультате в организме в целом проявляются гены от обоих родителей.
Место действия 43
прорастают в виде маленького зеленого, напоминающего мох, гаплоид-
ного растеньица (заростка), или гаметофита. На нем образуются под-
вижные гаплоидные гаметы, сливающиеся в диплоидную зиготу, из ко-
торой вырастает большая по величине, знакомая всем спорофитная
.форма папоротника.
По всей вероятности, доминирование диплоидной фазы у высших
растений и животных обусловлено способностью гетерозиготы выживать
даже при возникновении одной или нескольких крайне вредных мута-
ций. Для ученых, занимающихся биохимической генетикой, использова-
ние гаплоидных организмов дает огромные методические преимущества,
дозволяя с легкостью выявлять рецессивные мутации.
Г. Царство протистов
К царству протистов (Protista) обычно относят как одноклеточные
-эукариоты, так и многоклеточные организмы, у которых все клетки вы-
полняют сходные функции (т. е. отсутствует или слабо выражена тка-
невая дифференциация). Сюда же можно отнести грибы, но иногда их
..выделяют в отдельное царство.
1. Простейшие
К числу наиболее известных простейших, сходных с животными, от-
носится амеба [подтип саркодовых (Sarcodina), или корненожек (Rhi-
..zopoda)]. Самое удивительное у амебы (рис. 1-7) —это способ ее пере-
движения, который сопряжен с переходом цитоплазмы из жидкого со-
стояния в полутвердый гель. При движении амебы цитоплазма в задней
•части клетки разжижается и перетекает в переднюю часть и в вытяги-
вающиеся псевдоподии, где затем затвердевает по краям. Этот организм
ставит перед биохимиками ряд принципиальных вопросов. Какова хи-
мическая природа обратимого перехода цитоплазмы из жидкого со-
стояния в гель? Какие химические процессы заставляют сократитель-
ные вакуоли [33] периодически выбрасывать избыток жидкости, т. е.
.действовать наподобие зачаточной выделительной системы внутри от-
дельной клетки? Наконец, каким образом происходит быстрый разрыв и
.восстановление клеточных мембран при заглатывании амебой частичек
пищи?
Родственными амебе организмами являются радиолярии (Radiola-
:ria)—морские простейшие, чрезвычайно симметрично организованные
•существа со сложным внутренним скелетом, образованным углеводным
полимером хитином и окисью кремния (SiO2) или сульфатом стронция.
Фораминиферы (Foraminifera) —мелкие амебы, имеющие наружные ра-
ковины из карбоната кальция или двуокиси кремния. В настоящее вре-
мя их известно свыше 20 000 видов и до сих пор, как и в отдаленном
-прошлом, их крошечные скелеты падают на дно океанов и формируют
известняковые отложения.
Мельчайшие простейшие, относящиеся к подтипу споровиков (Sporo-
zoa), паразитируют на животных всех типов. Несколько родов пато-
генных кокцидий (Coccidia) паразитирует на кроликах и домашней
птице, принося огромные убытки.
Человек часто оказывается жертвой простейших, относящихся к роду
Plasmodium (рис. 1-7), которые проникают в кровь и другие ткани и
вызывают малярию, одну из наиболее распространенных болезней чело-
века на земном шаре. От малярии за всю историю человечества погиб-
ло, вероятно, больше людей, чем от любой другой болезни.
44 Глава 1
Trichonympha, обитающая
в кишечнике термитов
Древесные
— которые пе,___,___...
\ с помощью бактерий-
симбионтов
Е. coli—пища
Ъля простейших
частички.
Euglena viridis
Растение это
или животное 2
Хлоропласт
50 мкм-
О
Представитель
панцирных жгутиковых
Второй жгутик
расположен
в специальном,
желобке
Trypanosoma yambiense
(вызывает африканскую
сонную болезнь)
РИС. 1-7. Широкоизвестные представители протистов.
Другой подтип простейших, жгутиковые (Mastigophora), передви-
гающиеся с помощью небольшого числа жгутиков, служит связующим'
звеном между животными и водорослями. Euglena viridis (эвглена),
маленький пресноводный организм с гибким конусовидным телом и
длинным жгутиком на переднем конце, содержит зеленые хлоропласты,
и имеет светочувствительное «глазное пятно», благодаря которому кон-
центрируется в освещенных солнцем местах (рис. 1-7). В отсутствие
света эвглена ведет образ жизни, свойственный животному организму.
При обработке стрептомицином (дополнение 12-А) у эвглены исчезают
хлоропласты, и она необратимо превращается в животное. В морском
планктоне содержатся в большом количестве панцирные жгутиковые
(динофлагелляты, Dinoflagellata) (рис. 1-7), среди которых встречают-
ся как бесцветные, так и зеленые формы.
Гемофлагелляты (Haemoflagellata) являются возбудителями ряда
самых страшных болезней человека. Трипаносомы (род Trypanosoma)
проникают в клетки нервной системы, вызывая сонную болезнь. Неко-
торые жгутиковые находятся в симбиотических отношениях с другими
организмами. Наиболее сложные из известных в настоящее время жгу-
тиковых (рис. 1-7) обитают в пищеварительном тракте термитов и тара-
канов. В клетках этих простейших в свою очередь живут бактерии-сим-
бионты, которые обеспечивают термитов ферментами, необходимыми
для переваривания целлюлозы древесины.
Представители подтипа ресничных инфузорий (Ciliophora) — самые
сложные в структурном отношении простейшие. Они несут большое чис-
ло ресничек, синхронное биение которых служит способом передвиже-
ния этих организмов. Сразу же возникает вопрос: как осуществляется
связь между ресничками, обеспечивающая эту согласованность? Биохи-
мики чаще всего используют в своих исследованиях двух представите-
лей данного подтипа — Tetrahymena [34] (рис. 1-7), наиболее просто
устроенную инфузорию, и Paramecium, более сложноорганизованную.
Миксомицеты (Myxomycetes), или слизевики, вероятно, ближе к про-
стейшим, чем к грибам. Члены семейства Acrisieae, из которых наиболее
изучен вид Dictyostelium discoideum, начинают свою жизнь как мелкие
амебы. Спустя некоторое время, когда запасы пищи истощаются, отдель-
ные амебы начинают выделять небольшими порциями химический
аттрактант — циклический АМР (гл. 6, разд. Е.5). Находящиеся побли-
зости амебы отвечают на этот сигнал спустя примерно 15 с, также вы-
деляя порцию циклического АМР, и затем начинают перемещаться к
исходному источнику аттрактанта [35]. В конце концов все амебы
группируются вокруг нескольких центров, агрегируют и формируют
плодовые тела, напоминающие грибы. В них вегетативным путем обра-
зуются споры, и весь цикл начинается сначала. Другие миксомицеты
растут в виде многоядерного (диплоидного) плазмодия, содержащего
тысячи ядер, не разделенных клеточными мембранами.
2. Грибы
Не обладающие способностью к фотосинтезу, живущие преимущест-
венно в почве, но иногда также в воде, грибы представлены огромным
числом видов: их около 10s, что только вдвое меньше числа видов сосу-
дистых растений. Грибы характеризуются двумя отличительными при-
знаками: у них нет хлорофилла и они растут в виде скопления множе-
ства разветвленных трубочек (обычно 6—8 мкм диаметром); эти тру-
бочки называются гифами, а образованное ими скопление — мицелием.
Грибы в большинстве случаев являются ценоцитными организмами, т. е.
гифы состоят не из отдельных клеток, а из массы протоплазмы с мно-
жеством ядер, и лишь изредка трубочка разделена перегородкой. По
способу питания грибы в основном относятся к сапрофитам, но неко-
торые паразитируют, вызывая у человека серьезные, трудноизлечимые
заболевания. Серьезной медицинской проблемой является отсутствие
антибиотиков, способных справиться с грибковой инфекцией (микоза-
46 Глава I
О
20 мкм.
Макроконидии
Микроконидии
Аск с 8
аскоспорами
Saccharomyces cerevisiae
Аск
Х1О
Протоперитпеции
0о®
оо
РИС. 1-8. Часто используемые в лабораторных исследованиях грибы Neurospora cras-
sa и дрожжи Saccharomyces ' ’ ' - - ... —
Univ.
Прохождение
ядра через
пору в
перегородке
cerevisiae. (Webster I., Introduction to Fungi, Cambridge
Press, London, New York, 1970.)
именно грибы синтезируют многие важнейшие
пенициллин. В грибах же образуются самые
ми). С другой стороны,
антибиотики, например
мощные известные токсины.
Место действия 47
Низшие грибы (Phycomycetae) —это простые пресноводные слизи и
плесени. Высшие грибы в зависимости от способа образования половы^
спор делятся на аскомицетов (Ascomycetae) и базидиомицетов (Basidio-_
mycetae). У аскомицетов споры формируются в маленьких мешочках,
называемых асками (рис. 1-8). В аске содержится четыре или восемь,
спор, расположенных в ряд, причем каждая четверка представляет со-
бой результат одной пары мейотических делений (в случае последующе-
го митоза образуются уже восемь спор). Благодаря такому способу
спорообразования один из аскомицетов, Neurospora crassa (рис. 1-8),
стал излюбленным объектом генетических исследований [36]. Аскоспо-
ры можно в строгом порядке извлекать из аска и выращивать по от-
дельности, чтобы выявить результаты кроссинговера, происшедшего во
время меиоза.
Нейроспора может размножаться и посредством гаплоидных спор —
конидий. Гаплоидные мицелии представлены двумя типами, и конидии
или мицелии одного типа способны оплодотворять клетки другого типа,
(находящиеся в специальном образовании — протоперитециуме) с обра-.
зованием зигот. Последние немедленно проходят мейоз и митоз, форми-.
руя восемь аскоспор.
К числу аскомицетов относятся очень ценные съедобные трюфели ц
сморчки. Однако большинство съедобных грибов представляют собоц
плодовые тела базидиомицетов. К базидиомицетам относятся также,
ржавчинные грибы, наносящие колоссальный ущерб урожаю пшеницы
и других зерновых культур.
Дрожжи — это грибы, приспособившиеся к существованию в среде,
с высоким содержанием сахара; они остаются обычно одноклеточными
и размножаются путем почкования (рис. 1-8). Время от времени их
гаплоидные клетки попарно сливаются и образуют диплоидные клетка
и половые споры. Одни дрожжи относятся к аскомицетам, другие — к
базидиомицетам. Saccharotnyces cerevisiae, активное начало как пекар-
ских, так и пивных дрожжей, является аскомицетом, способным к неог-.
раниченному росту как в диплоидной, так и гаплоидной фазе, причем,
диплоидные клетки несколько крупнее гаплоидных [37].
3. Водоросли
Водоросли представляют' собой весьма разнообразную группу хло-
рофиллсодержащих эукариот, представленных как одноклеточными, таю
и колониальными формами. Колониальные водоросли обычно имеют вид
длинных нитей, прямых или разветвленных; иногда они образуют пла-
стинки, напоминающие листья. Клеточная дифференциация, однако,
практически отсутствует. Золотисто-бурые, бурые и красные водоросли
помимо хлорофилла содержат ряд специфических пигментов.
Эвглениды (Euglenophyta) и панцирные жгутиковые (Pyrrophyta),
упоминавшиеся в разделе о простейших, можно с равным основанием
считать водорослями. Однако ярко-зеленые водоросли (Chlorophyta),
одноклеточные или нитчатые, несомненно, относятся к растениям.
С другой стороны, часто используемая биохимиками хламидомонада
(Chlamydomonas), обладающая двумя жгутиками и содержащим каро-
тиноид глазным пятном, или стигмой, больше напоминает животную,
клетку (рис. 1-9). Хламидомонада содержит единственный хлоропласт.
Внутри хлоропласта наряду с глазным пятном имеется пиреноид —
центр синтеза крахмала. Гаплоидные клетки хламидомонады представ-
лены двумя типами — «плюс» и «минус». Зиготы, рбразующиеся прю
чо 1 лава i
РИС. 1-9. Некоторые виды водорослей.
слиянии подвижных гамет, немедленно претерпевают мейотическое де-
ление с формированием гаплоидных спор. Хромосома хламидомонады
довольно подробно картирована, и этот организм часто используется в
биохимических генетических исследованиях.
Относящийся к нитчатым водорослям Ulothrix образует вегетативные
споры с четырьмя жгутиками и гаметы с двумя жгутиками, напоминая
Место действия
49
этим животные клетки. Диплоидной является только зигота. С другой
стороны, клетки на редкость красивой спирогиры (Spirogyra) (рис. 1-9)
неподвижны, а амебоидная мужская гамета продвигается по трубочке,
соединяющей две спаривающиеся клетки. Такая особенность размноже-
ния указывает на связь спирогиры с высшими зелеными растениями.
Некоторые одноклеточные водоросли достигают значительных раз-
меров. Примером может служить Acetabularia (рис. 1-9), произрастаю-
щая в теплых водах Средиземноморья и других тропических морей.
Клетка этой водоросли содержит одно ядро, расположенное в ее осно-
вании (ризоиде). У взрослой водоросли, жизненный цикл которой
длится от 6 месяцев (в лабораторных условиях) до 1 года (в природе),
формируется характерного вида вырост (шляпка). По завершении раз-
вития этого образования ядро делится примерно на 104 вторичных
ядер, которые мигрируют вверх по стебельку и в радиальные лучи
шляпки, где образуются цисты. Затем шляпка отмирает и цисты высво-
бождаются; в них происходит мейоз, и образовавшиеся жгутиковые га-
меты попарно сливаются, формируя зиготу, из которой вновь вырастает
диплоидная водоросль.
Благодаря своим большим размерам и локализации ядра в основа-
нии клетки ацетабулярия оказалась удобным объектом для исследова-
ния морфогенеза [38, 39]. Растущую водоцосль разрезали на отдельные
части — ризоидную, базальную и апикальную, затем удаляли ядро и
трансплантировали его из одной части в другую; отрезанные части раз-
ных растений сращивали и получали водоросль с несколькими ядрами;
апикальную часть от одного вида соединяли с ризоидной частью друго-
го и т. д. Опыты такого рода показали, что морфология (форма) шляп-
ки определяется информацией, поступающей из ядра. Однако синтез
белка и рост клетки идут даже в отсутствие ядра. Отсюда следует, что,
по-видимому, несущие информацию молекулы (предположительно мат-
ричной РНК) перемещаются из ядра в зону роста на очень ранней ста-
дии развития водоросли. Для синтеза белка в остальной части клетки
постоянного участия ядра не требуется.
Рассматривая любую пробу водорослей из пруда или аквариума под
микроскопом, всегда можно обнаружить крошечные диатомеи, медлен-
но, как лодочки, скользящие в воде. Диатомовые водоросли, относящие-
ся к группе Chrysophyta, широко известны из-за наличия у них на-
ружной «раковины» из двуокиси кремния. Эти кремниевые скелеты,
ажурные, нередко поразительно красивые (рис. 1-9), отличаются чрез-
вычайной прочностью; они образуют обширные древние отложения
«диатомовой земли». Передвигаются диатомеи очень медленно, причем
самым необычным способом—посредством перетекания протоплазмы
по желобку на поверхности клетки. Диатомовые водоросли составляют
существенную часть морского планктона. По оценкам, три четверти ор-
ганических веществ в мире продуцируется диатомовыми водорослями и
панцирными жгутиковыми. Подобно бурым водорослям, хризофиты со-
держат пигмент фукоксантин.
Есть еще две группы водорослей — бурые (Phaeophyta) и красные
(Rhodophyta). К первым относятся гигантская бурая водоросль, из ко-
торой получают полисахарид альгин. Вторые представлены растениями
с многочисленными тонкими веточками, содержащими красный пигмент
фикоэритрин. Полисахариды — агар и каррагенин, — часто добавляемые
в шоколадные напитки и другие пищевые продукты, вырабатывают
именно из красных водорослей.
50 Глава 1
4. Лишайники
На скалах и в других сухих местах (часто с холодным климатом}
произрастает свыше 15 000 разновидностей лишайников. Лишайники
представляют собой сожительство (симбиоз) гриба с истинной водо-
рослью или с сине-зеленой водорослью, относящейся к прокариотам.
Водоросли, по-видимому, не имеют особых выгод от этого симбиоза, но
грибы, проникая внутрь клетки водоросли, получают от нее питательные
вещества [40]. Каждого из партнеров, составляющих лишайник, можно
вырастить по отдельности, однако в комбинации они приобретают новые
свойства. Так, лишайники (но не составляющие его организмы) выра-
батывают специальные пигменты и фенольные вещества, называемые
депсидами.
Д. Многоклеточные организмы
В данном разделе мы не собираемся описать все разнообразие мно-
гоклеточных животных (Metazoa) и растений (Metaphyta), а хотим
только рассмотреть некоторые вопросы, представляющие интерес для
биохимии.
1. Разнообразие форм животных
До недавнего времени внимание биохимиков было направлено глав-
ным образом на изучение высших позвоночных. Однако теперь все
больший интерес вызывают многообразные низкоорганизованные фор-
мы. Простейшими из них являются крошечные симбиотические1 черве-
образные животные, принадлежащие к типу Mesozoa и обитающие в
почках глубоководных головоногих моллюсков [41]. Они состоят всего-
из 25 клеток, которые располагаются в один слой и окружают одну или
несколько аксиальных клеток (рис. 1-10). Было бы очень интересно ис-
следовать природу химической коммуникации между этим небольшим
числом клеток.
Самыми примитивными многоклеточными животными являются
губки (Porifera). У них отсутствует дифференциация на ткани, однако
имеется несколько специализированных видов клеток. Тело губок обра-
зовано неподвижными клетками, которые всасывают воду через поры
и извлекают из нее необходимые питательные вещества. Внутри тела
губок имеются амебоциты, функционирующие согласованно и образую-
щие спикулы (иглы) из углекислого кальция, двуокиси кремния или из
белка спонгина (рис. 1-10). Элементы нервной системы у губок, по-ви-
димому, отсутствуют.
Следующий очень разнообразный и важный тип животных — книда-
рии (Cnidaria, ранее называвшийся Coelenterata-—кишечнополост-
ные)— включает организмы, обладающие радиальной симметрией и
состоящие из двух четко различающихся слоев клеток — эктодермы и
энтодермы. Многие виды существуют одновременно как в форме поли-
пов, или гидр (рис. 1-10), так и в форме медуз. Насколько известно, у
медуз отсутствует мозговой ганглий, но несомненный интерес представ-
ляет способ соединения нейронов, образующих примитивную радиаль-
ную сеть.
1 Представителей типа Mesozoa обычно считают паразитами, но, по-видимому,,
они облегчают выведение NH3 из организма хозяина путем повышения кислотност»
мочи [40а]. Некоторые биологи рассматривают Mesozoa как подцарство, а не как тип.
Место действия 51
Полярные
клетки
Аксобласты
А
1 у
| Головной
I капюшон
Ядро
аксиальной
клетки
Dlcyema, представитель
типа Mesozoa
^Клетки,
(Язразую-'#
Клетки, способствующие
затвердеванию спикул
Пинакоцит
Б
Спермой
Стрекательная
клетка
Пора для всасывания
жидкости
Железистая
клетка
I оскулум
^-(устьв)
Спикула.
Лил (игла)
У\ Хоаноцит
Полость гудки
Пороцит
Железистая
плетка
Мышечная
клетка
наружного
слоя
Интерстициальная
клетка
РИС. 1-10. Некоторые низшие формы многоклеточных животных. А. Тип Mesozoa
(25 клеток). (Hickman С. Р., Biology of Invertebrates, Mosby, St. Louis, Missouri,
1573.) Б. Мелкая мешковидная губка. (Villee C. A., Walker W. E., Barnes R. D„
General Zoology, Saunders, Philadelphia, Pennsylvania, 1973.) В. Амебоидные клетки
губки, образующей спикулы. (Hickman, 1967.) Г. Гидра. (Loomis М. F., Sci. Am., 200,
150. Apr. 1959.)
Мышечная клетка
наружного слоя
Мышечная
клетка
внутреннего
слоя
Мышечная
клетка
внутреннего <=.-
слоя
Мезенхима ишперстициальныГ-
, клетка
Амебоцит
Книдарии устроены исключительно просто и обладают поразительной
способностью к регенерации. Одним из важных объектов биологических
исследований стала пресноводная гидра — организм длиной около сан-
тиметра (рис. 1-10). Целая гидра, состоящая примерно из 105 клеток,
может регенерировать из маленького кусочка ткани, если только в нем
сохранились клетки как наружного, так и внутреннего слоев [42].
Тело плоских червей (тип Platyhelminthes) состоит из двух наруж-
ных слоев (эндодермы и эктодермы) и расположенного между ними
третьего слоя. У плоских червей есть обособленная выделительная си-
стема. В дополнение к нервной сети, напоминающей нервную сеть у
книдарий,'имеются головной ганглий и органы зрения. Большая группа
плоских червей — планарии (обычно около 15 мм в длину) —обитает в
Ручьях. По-видимому, это наиболее просто устроенные существа, на
которых можно изучать поведенческие реакции.
52 Глава 1
Манубриум (рукоятка)
Гонада
Радиальный
^канал
Медуза
РИС 1-10, Д. Стадия медузы у гидроидного кишечнополостного Obelia. Е. Планария
длиной 15 мм. (Hickman, 1973.) а — схема пищеварительной и нервной систем; часть
правой стороны тела удалена так, что виден рот, расположенный на брюшной сторо-
не (вентрально); б — глотка, высовывающаяся изо рта. Ж- Коловратка Philodina
( ~ 103 клеток). (Villee С. A. et al., General Zoology, 1973.) 3. Круглый червь Rhabdl-
tis. Сходный внешний вид имеет аскарида Ascaris (Hickman, 1973).
Среди плоских червей имеется много паразитических форм (тремато-
ды и ленточные черви), поражающих высшие организмы. Так, крошеч-
ные черви рода Schistosoma передаются человеку через улиток и по-
вреждают кровеносные сосуды. Возникающий при этом шистосомоз в
настоящее время представляет собой одно из наиболее распространен-
ных заболеваний, которым страдают более 200 млн. человек.
Круглых червей (Nematoda) и коловраток (Rotifera) выделяют иног-
да в отдельные типы, а иногда объединяют в один тип Aschelminthes.
Эти организмы отличаются тем, что в дополнение к кишечной трубке у
них есть еще полость тела. Среди круглых червей встречаются как сво-
бодно живущие в воде и почве виды, так и паразиты. Последние наносят
огромный вред растениям, а некоторые виды, например трихины, цепни
и ришта, поражают человека.
Коловратки с их подвижным ореолом ресничек на головном конце и
прозрачным телом доставляют истинное удовольствие микроскопистам.
Для специалистов по биологии клетки коловратки особенно интересны
с точки зрения их клеточного постоянства: показано, что у этих орга-
низмов как суммарное число клеток, так и число клеток в каждой части
тела строго постоянно.
Аннелиды (Annelida, кольчатые черви) считаются эволюционными
предками членистоногих. Существующие в настоящее время виды этого
типа включают дождевых червей, пиявок и около 106 видов морских
полихет (многощетинковых червей). У кольчатых червей имеется по-
лость тела, отделенная от пищеварительного тракта и выстланная спе-
циальным слоем эпителиальных клеток. Они обладают также хорошо
развитой кровеносной системой, причем в их крови обычно содержится
гемоглобин или родственное соединение — эритрокруорин.
Членистоногие (Arthropoda) насчитывают ~106 видов, т. е. состав-
ляют около 80% всех известных ныне животных. К этим существам,
имеющим членистый наружный скелет из хитина или других веществ,
относятся мечехвосты, паукообразные (скорпионы, пауки, клещи), рако-
образные, многоножки (губоногие и двупарноногие) и насекомые. Ряд
важных биохимических проблем в этой области возник с изобретением и
использованием инсектицидов. Большой интерес представляет изучение
процесса метаморфоза при развитии многих членистоногих [43].
Среди моллюсков (тип Mollusca) наибольший интерес для биохими-
ков представляют головоногие—кальмары и осьминоги. У кальмара
имеются нервные клетки (нейроны) с гигантским аксоном, изучение ко-
торого внесло большой вклад в развитие наших представлений о меха-
низме проведения нервных импульсов. У осьминогов есть зачатки ра-
зумного -поведения, не свойственные другим беспозвоночным, нервные
реакции которых полностью «запрограммированы». Мозг некоторых
брюхоногих моллюсков состоит всего из 104 нейронов; отдельные из них
необычайно велики. Мозг моллюсков является объектом интенсивного
исследования, направленного на изучение его организации и механизма
функционирования.
Иглокожие (Echinodermata), к которым относятся морские звезды,
морские ежи и голотурии, рассматриваются как тип животных, достиг-
ших высокой ступени эволюционного развития1. Особенно тщательно
исследован процесс их эмбриогенеза.
Тип хордовых (Chordata), к которому относимся и мы с вами, вклю-
чает не только позвоночных, но и более примитивных морских живот-
ных. к этим примитивным формам, которые, по-видимому, родственны
вымершему общему предку хордовых, принадлежат оболочники (Tuni-
cata), в частности асцидии. Данные организмы примечательны тем, что
в крови у них содержится много ванадия.
2. Типы клеток и тканей животных
Клетки тканей, даже высокодифференцированные, при выращивании
в культуре имеют тенденцию быстро утрачивать дифференциацию и
превращаться в клетки одного из трех основных типов — эпителиоциты,
механоциты или амебоциты. Эпителиоциты представляют собой тесно
прилегающие друг к другу клетки, происходящие из эпителиальных
тканей; полагают, что они являются производными двух поверхностных
слоев эмбриональной бластулы. Механоциты, часто называемые также
' Взрослые иглокожие характеризуются пятилучевой радиальной симметрией, и
может показаться, что оии родственны примитивным книдариям. Однако личинки иг-
локожих обладают двусторонней симметрией, и, таким образом, не следует придавать
принципиального значения радиальной организации тела взрослых форм.
фибробластами или фиброцитами, — это клетки, растущие при культи-
вировании мышечной или соединительной тканей. Подобно амебоци-
там, они происходят из клеток эмбриональной мезенхимы, мигрировав-
ших внутрь из нижнего слоя бластулы (гл. 16, разд. В.2). Как отдель-
ные типы клеток рассматривают также нейроны, нейроглию и лимфо-
циты.
а. Ткани
Объединяясь, клетки образуют ткани четырех основных типов. Эпи-
телий выстилает поверхности тела и внутренних органов: кожу, пище-
варительный тракт, мочеполовой тракт и железы. Существуют два ос-
новных типа эпителия: плоский и цилиндрический. Эпителиальные клет-
ки входят в состав желез (потовые, жировые, молочные и железы внут-
ренней секреции), а также некоторых органов чувств. Эти клетки по-
лярны: одна сторона их обращена наружу, в воздушную или водную
среду, другая, как правило, прилегает непосредственно к базальной
мембране.
К соединительной (опорной) ткани относятся жировая, хрящевая
и костная. Последние два вида тканей содержат большое количе-
ство межклеточного вещества, называемого основным и состоящего по
преимуществу из сложных полисахаридов. Эмбриональные фибробла-
сты дифференцируются в два типа клеток: белые продуцируют белок
коллаген, а желтые образуют эластин. Оба эти белка накапливаются
во внеклеточном пространстве и включаются в состав основного веще-
ства. Остеобласты образуют кости путем отложения (слоя-ми в 3—
7 мкм толщиной) фосфорнокислых и углекислых солей кальция, а так-
же органических «цементирующих» веществ.
Третий тип — это мышечная ткань. Различают поперечнополосатые
(произвольные скелетные мышцы) и гладкие (непроизвольные) мыш-
цы; особняком стоит сердечная (непроизвольная поперечнополосатая)
мышца.
Четвертый тип тканей — нервная ткань — состоит по преимуществу
из клеток двух основных видов. Нейроны — главные элементы нервной
системы, с которыми связаны возникновение и проведение импульса, и
глиальные клетки, которые лежат между нейронами и создают для
них опору.
б. Клетки крови
Кровь и клетки, выстилающие кровеносные сосуды, иногда рассмат-
риваются как ткань пятого типа. У человека в 1 мл крови содержится
5-109 эритроцитов (красных кровяных клеток), что в пересчете на об-
щее количество крови в организме (5 л) составляет 2,5-1013 клеток.
Эритроциты быстро синтезируются в костном мозге. Зрелые эритроци-
ты человека и других млекопитающих лишены ядра и почти целиком
заполнены гемоглобином. Средняя продолжительность жизни этих кле-
ток составляет 125 дней; они разрушаются лейкоцитами в селезенке и
печени.
Лейкоцитов (белых кровяных клеток) в 1 мл около 7 • 106, т. е. почти
в тысячу раз меньше, чем эритроцитов. Лейкоциты представлены клет-
ками трех типов: лимфоциты (~26% от общего числа лейкоцитов),
моноциты (~7%) и полиморфноядерные лейкоциты, или гранулоциты
(~70—75%). Лимфоциты имеют примерно такие же размеры, как
эритроциты, но образуются в лимфатической ткани. Продолжительность
жизни отдельных лимфоцитов достигает 10 лет. Их функция состоит в
образовании антител, и именно благодаря этим клеткам поддерживает-
ся длительный иммунитет. Моноциты вдвое крупнее лимфоцитов; они
способны переваривать клетки бактерий. Гранулоциты, имеющие ди-
аметр 9—12 мкм, образуются в красном костном мозге и выполняют
различные функции. При окрашивании разными красителями выявля-
ются три типа гранулоцитов: нейтрофилы, эозинофилы и базофилы.
Нейтрофилы, подобно моноцитам, заглатывают бактериальные клетки;
функция двух других типов гранулоцитов не столь ясна. Известно, что
число эозинофилов возрастает при сенной лихорадке, астме и в при-
сутствии некоторых паразитирующих организмов, а число базофилов
резко повышается при лейкемии, а также при воспалительных процес-
сах. Кровяные пластинки (тромбоциты) представляют собой крошечные
(2—3 мкм в диаметре), напоминающие клетки тельца, которые обра-
зуются из цитоплазмы мегакариоцитов костного мозга; из одного зре-
лого мегакариоцита образуется до 3000 тромбоцитов, а общее содержа-
ние кровяных пластинок составляет 1—3-108 в 1 мл цельной крови.
Тромбоциты играют важную роль в процессе свертывания крови.
б. Культура клеток
Все большее значение в биохимических исследованиях приобретает
выращивание в лабораторных условиях изолированных клеток живот-
ных. В некоторых случаях это необходимо для получения достаточного
количества клеток, обладающих максимально близкой генетической ин-
формацией. В случае бактерий такие клетки получают путем высева-
ния бактерий и отбора небольшой колонии, выросшей из одной клетки
и представляющей собой «чистый штамм». Подобным же образом из
одной клетки эукариот можно вырастить тканевую культуру, получив
клон генетически идентичных клеток, которые будут оставаться таковы-
ми до тех пор, пока не произойдет их изменения под влиянием мута-
ций.
Важным достижением в этой области оказалась разработка метода
культивирования фибробластов эмбриона с целью проведения внутри-
утробной (пренатальной) диагностики наследственных нарушений мета-
болизма (дополнение 1-Г). Легче всего удается культивировать эмбрио-
нальные или раковые клетки, но в определенных условиях можно полу-
чить культуры многих других тканей. Следует иметь в виду, что клетки,
которые лучше всего растут, не вполне нормальны; например, широко-
известная линия клеток HeLa (клеток рака человека, которых выра-
щивают уже много лет в лабораториях всего мира) содержит 70—80
хромосом вместо обычных 46.
3. Межклеточные контакты и взаимодействия
Изучая многоклеточные организмы, мы сталкиваемся с двумя прин-
ципиальными вопросами: во-первых, как клетки соединяются друг с
другом и, во-вторых, как они специфически взаимодействуют?
Чтобы ответить на первый вопрос, обратим внимание, что клетки
растений окружены толстой клеточной стенкой, которая скрепляет их
между собой и удерживает на месте. У животных жестких клеточных
стенок нет, но клетки все же соединены, причем сугубо специфическими
способами. В противном случае все мы просто развалились бы.
РИС. 1-11. Электронные
микрофотографии трех
типов межклеточных со-
единений. А. «Зона сли-
пания» (zona occludens)
между эпителиальными
клетками тонкого кишеч-
ника крысы; препарат
получен методом замора-
живания—скола Плот-
ные соединения выгля-
дят как сеть валиков и
желобков. Она представ-
ляет собой участки слия-
ния мембран В нижней
части рисунка видны
микроворсиики. (Friend
D. S, Gilula N В., J.
Cell Biology, 53, 771,
1972.)
РИС. 1-11. Б. Ультратонкий срез
через плотное соединение между
гепатоцитами мыши. Стрелками
указаны участки слияния мембран
(Gilula N. В., in Cellular Memb-
ranes and Tumor Cells, p. 221.
Copyright 1975 by the Williams
and Wilkins Co., Baltimore.)
РИС. 1-11. В. Перегород-
чатое соединение в реснич-
ном эпителии моллюсков;
препарат получен методом
замораживания—скола. Со-
единения этого типа полно-
стью опоясывают клетки.
«Обнаженная» поверхность
покрыта параллельными ря-
дами мембранных частиц,
соответствующими распре-
делению межклеточных пе-
регородок, видимых на уль-
тратонких срезах. В участ-
ках мембраны, находящих-
ся вне области контакта,
частицы расположены нере-
гулярным образом [44].
РИС. 1-11. Г. Ультратонкий срез перегородчатого контакта того же типа, что и на
рис. В. Плазматические мембраны двух клеток соединяются с помощью электроно-
плотных пластин, или перегородок, регулярно расположенных в межклеточном прост-
ранстве. Обратите внимание на аппарат Гольджи в нижней части снимка [44].
58 Глава 1
РИС. 1-11. Д Десмосомы (macula adhe-
rens) в эпителии кишечника крысы.
Видны широкое межклеточное простран-
ство (25—35 нм), содержащее плотный
материал, две параллельные клеточные
мембраны, плотная пластинка с конвер-
гирующими на ней тонофиламентами,
пронизывающими цитоплазму [44].
а. Контакты и соединения между клетками
Многие эпителиальные клетки, например клетки почечных канальцев
или желез, образуют между собой плотный контакт. В таких контактах
наружные участки мембран местами сливаются (рис. 1-3) [44, 45].
Электронно-микроскопические исследования поверхности сколов замо-
роженных тканей (дополнение 1-В) показывают, что есть области, где
клетки опоясаны лентой плотного контакта, иногда называемого «зоной
слипания» (zonula occludens) или терминальными замыкающими пла-
стинками (рис. 1-11). Плотные контакты между эндотелиальными клет-
ками капилляров головного мозга препятствуют свободной диффузии
веществ из крови в клетки мозга, создавая таким образом гемато-эн-
цефалический барьер [46].
Клетки эпителия беспозвоночных опоясывают контакты другого ти-
па. Это так называемые перегородчатые десмосомы, или диски адгезии.
В этом случае пространство между мембранами соседних клеток, со-
ставляющее ~ 18 нм, перегорожено во многих местах тонкими перемыч-
ками. В области десмосом к мембранам контактирующих клеток приле-
гают скопления электроноплотного материала, к которым прикрепляет-
ся множество тонких нитей (микрофиламентов) диаметром ~6—10 нм
[47]. 1
Помимо плотных контактов часто встречаются обширные межкле-
точные зоны со щелью между соседними клетками шириной 10—20 нм.
В этой области к мембране со стороны цитоплазмы прилегают микро-
филаменты диаметром 6,0 нм.
На препаратах, полученных методом замораживания — скола, в об-
ласти таких щелевых контактов выявляются правильные полигональные
Место действия 59
РИС. 1-11. Е. Поверхность скола, проходящего через области щелевых контактов меж-
ду клетками, находящимися в культуре. Видны как обширные, так и небольшие (по-
казано стрелкой) области [44].
структуры, образующие решетку с периодом 10 нм. Щелевые контакты
представляют, по-видимому, области прочного соединения клеток, и
именно через них осуществляются межклеточные коммуникации.
б. Коммуникативные связи между клетками
Кроме непосредственных контактов, клетки должны обладать и дру-
гими средствами для обмена информацией, в противном случае были бы
невозможны их согласованный рост и дифференцировка. Один из спосо-
60
Глава J
бов коммуникации со-
стоит в обмене химиче-
скими веществами че-
рез специальные участ-
ки, где клетки контак-
тируют друг с другом
[48]. Среди многочис-
ленных примеров, ука-
зывающих на значение
коммуникативных свя-
зей, можно привести
явление «электрическо-
го сопряжения» кле-
ток. Обычно мембраны
клеток обладают очень
высоким электриче-
ским сопротивлением,
однако в мембранах
соприкасающихся кле-
ток имеются участки с
низким сопротивлени-
ем — по-видимому, об-
ласти щелевых контак-
тов [49]. Одна из наи-
более совершенных
форм коммуникативной
связи—это синапс, спе-
циализированный кон-
такт между нейронами.
Нервный импульс, про-
ходящий по мембране
одного нейрона, стиму-
лирует выделение кван-
та химического веще-
ства (медиатора), ко-
торый проходит через
щель синапса и иници-
ирует возникновение
нервного импульса во
втором нейроне.
Высказывалось
предположение, что ра-
ковые клетки образуют
РИС. 1-11. Ж- Щелевые контакты; ультратонкий срез меньше коммуникатив-
ных соединении, чем
здоровые [501, но опы-
ты с культурами тканей не подтверждают эту точку зрения [51].
в Узнавание клеток
Для клеток высших организмов совершенно необходимо уметь «уз-
навать» другие клетки, чтобы выяснить, являются ли они идентичными,
принадлежат ли другим тканям или же «чужеродны».
Рассмотрим один исключительно интересный опыт с губками, клетки
которых разъединяли путем обработки ферментом трипсином (перева-
Место действия 61
ривающим белковый межклеточный «цемент»). При смешивании разъ-
единенных клеток оранжевых и желтых губок происходит их воссоеди-
нение с постепенным формированием новых маленьких губок, причем
оранжевые клетки соединяются с оранжевыми, а желтые — с желтыми
[52, 53]. Аналогичные результаты были получены с культивируемыми
клетками печени, почек и мозга эмбриона. При смешивании указанных
культур клетки печени слипались только с клетками печени, а клетки
почек — с клетками почек. Как же клетки «узнают» друг друга? Ответ
на этот вопрос должны дать биохимические исследования, проводящие-
ся в настоящее время.
При заживлении ран клетки эпителия растут и продвигаются по ра-
невой поверхности до тех пор, пока не соприкоснутся друг с другом.
Подобное так называемое контактное торможение испытывают клетки и
тканевые культуры, растущие на поверхности стекла, в силу чего обра-
зуется слой толщиной только в одну клетку (монослой). Культивируе-
мые опухолевые клетки, напротив, не прекращают роста при соприкос-
новении и громоздятся друг на друга, видимо, из-за отсутствия механиз-
ма узнавания и связи между клетками. Выяснение биохимического ме-
ханизма этого явления имело бы колоссальное значение для медицины.
4. Высшие растения и растительные ткани
Ботаники делят высшие растения на две основные группы. Briop-
hyta, или мохообразные, состоят из мхов (Musci) и печеночников
(Hepaticae). Эти растения, преимущественно наземные, характеризуют-
ся наличием плавающих сперматозоидных клеток и доминированием
гаметофитной (гаплоидной) фазы. Вторая группа — это Tracheophyta,
или сосудистые растения, имеющие проводящие ткани. К ним
относится около 2-105 видов. Папоротники (класс Filicinea, ранее назы-
вавшийся Pteridophyta) характеризуются доминированием диплоидной
фазы, сменяемой в ходе жизненного цикла гаплоидной (разд. В.5).
Семенные растения представлены двумя классами: Gytnnospertnae
(голосеменные, к которым относятся деревья, образующие шишки) и
Angiospermae (покрытосеменные, истинные цветковые растения).
Различают несколько видов растительных тканей. Недифференци-
рованные эмбриональные клетки, расположенные в быстрорастущих
частях стебля и корня, составляют ткань меристемы. В результате диф-
ференцировки клеток из меристемы формируются простые ткани: па-
ренхима, колленхима и склеренхима. Паренхима представляет собой
наиболее распространенный и наименее специализированный вид рас-
тительной ткани. В ходе дальнейшей дифференцировки из нее получает-
ся камбий — растущий слой корней и стеблей. Из паренхимы образу-
ются также клетки, в которых растение запасает питательные вещества
и которые составляют сердцевину, или мякоть стебля и корня.
Колленхима, имеющаяся в травянистых растениях, состоит из удли-
ненных опорных клеток; склеренхима, свойственная деревьям, образо-
вана опорными клетками с прочными лигнифицированными стенками и
низким содержанием воды. К склеренхиме относятся также волокни-
стые клетки, имеющие иногда очень большую длину: например, в стволе
сосны есть волокнистые клетки диаметром 40 мкм и длиной 4 мм.
Два вида сложных тканей — ксилема и флоэма — составляют про-
водящую сеть, или «циркуляторную систему» растения. Клетки, обра-
зующие ксилему, или деревянистую ткань, в основном мертвы, а тол-
стостенные сосуды (трахеиды) служат для переноса воды и растворен-
ных в ней минеральных веществ от корней к стеблю и листьям. Клетки
62 Глава 1
РИС. 1-12. Стебель покрытосеменного растения в разрезе. Внизу в увеличенном мас-
штабе показаны в разрезе сосуды флоэмы (слева) и ксилемы (справа) (Biddulph S.,
Biddulph О., Sci. Am. 200, 44—49, Feb. 1959.)
флоэмы обеспечивают отток питательных веществ от листьев вниз по
стеблю. Они соединены торцами посредством ситовидных пластинок,
пронизанных множеством мельчайших пор, через которые, по-видимому,
сообщается цитоплазма соприкасающихся клеток, образуя здесь нити
диаметром 5—9 мкм [54]. В зрелых ситовидных клетках ядро отсутст-
вует, однако у каждой из них есть «пара» — сопутствующая клетка, со-
держащая ядро.
Эпидермис растений состоит из плоских клеток с толстой наружной
стенкой, как правило, покрытой плотной восковидной кутикулой тол-
щиной около 2 мкм. Хлоропласты в этих клетках обычно отсутствуют.
В эпидермальной ткани встречается только несколько видов специали-
Место действия 63-
зированных клеток. К их числу относятся парные замыкающие клетки,,
которые окружают маленькие отверстия, называемые устьицами, на
нижней поверхности листа; замыкающие клетки регулируют интенсив-
ность испарения воды растением. Специализированные клетки эпидер-
миса корня образуют корневые волоски—-длинные (~1 мм) образо-
вания диаметром 5—17 мкм. Каждый корневой волосок — это одна клет-
ка с ядром, расположенным у кончика волоска.
На рис. 1-12 показан участок стебля цветкового растения. Обратите
внимание на тонкий слой камбия между флоэмой и ксилемой. Клетки
камбия по мере роста дифференцируются и образуют новые слои кси-
лемы, увеличивая таким образом деревянистую часть стебля. Одновре-
менно образуются также клетки флоэмы. По мере утолщения стебля
все ткани, расположенные кнаружи от камбия, обновляются, а старые
клетки превращаются в кору.
Семена растений состоят из трех четко различающихся частей. За-
родыш развивается из зиготы, образованной в результате слияния ядра
спермия, происходящего из пыльцевой клетки, с ядром яйцеклетки.
Оплодотворенная яйцеклетка у голосеменных окружена питательным
слоем, или эндоспермом, происходящим из той же гаметофитной ткани,
что и яйцеклетка, и потому гаплоидным. У покрытосеменных в спермин
формируются два ядра; одно из них оплодотворяет яйцеклетку, тогда
как другое сливается с двумя гаплоидными полярными ядрами, обра-
зующимися в женском гаметофите. (Эти полярные ядра формируются
в ходе того же митотического деления, при котором образуется яйце-
клетка.) В результате развивается триплоидный (Зп) эндосперм.
Е. Регуляция химических процессов в клетке
Биологов уже с давних пор изумляла способность живых организмов
поддерживать постоянным состав внутренней среды вопреки резким
изменениям внешних условий. Например, pH нашей крови всегда равен
7,40±0,05. Концентрация глюкозы в крови может кратковременно воз-
расти после еды, но в целом это строго постоянная величина (5 мМ).
То же можно сказать о содержании большинства других компонентов
жидкостей тела и внутриклеточной среды. Этот феномен, называемый
гомеостазом, обусловлен деятельностью сложной системы регулятор-
ных механизмов.
Представим себе, что в клетку попадает питательное вещество А.
Если это вещество просто поступает в клетку и участвует в ряде реак-
ций, но ни один продукт реакций не выходит из клетки, то вскоре будет
достигнуто состояние равновесия. Такая система не имеет ничего об-
щего с живой клеткой. Живая клетка потребляет питательные вещест-
ва и выбрасывает (экскретирует) продукты распада. Превращения ве-
ществ внутри клетки протекают в ходе сложных, нередко разветвлен-
ных и пересекающихся последовательностей реакций. Ниже изображе-
на простая гипотетическая последовательность реакций с одним раз-
ветвлением.
Уже в такой простой открытой системе видны некоторые особенно-
сти гомеостаза [55]. Если скорости образования и распада промежу-
С ?=^D\
д д .-----» Е -JL Выделение (1-3)
Клеточная ___» D' —^4 иммобилизация
мембрана
64
Глава 1
точных продуктов равны, устанавливается стационарное состояние (не
являющееся, однако, равновесным). Изменение скорости поступления
вещества А в клетку или скорости выведения продукта реакции, изме-
нение активности одного из ферментов, катализирующего необратимый
этап в цепи реакций, — любой из этих факторов может значительно из-
менить стационарные концентрации компонентов системы.
Живые клетки значительно сложнее изображенной выше схемы по
крайней мере в том отношении, что у них есть чувствительные механиз-
мы, которые выявляют и компенсируют сдвиги концентраций, нарушаю-
щие стационарное состояние. В большинстве случаев эти механизмы
действуют по принципу обратной связи, совершенно аналогично тому,
как работает терморегулятор в нагревательной системе.
Активный, или каталитический, центр фермента — это сравнительно
небольшой участок молекулы белка. Аминокислотный состав остальной
части молекулы, особенно тех ее участков, которые находятся на по-
верхности структуры, может довольно сильно меняться в результате
мутаций без изменения каталитической активности фермента. Тем не
менее присоединение к различным участкам поверхности фермента
других молекул может косвенно повлиять на катализ. В концентриро-
ванных растворах, каким является цитоплазма, молекулы могут агреги-
ровать. Присоединение какой-либо молекулы к определенному участку
на поверхности фермента способно изменить его структуру и в свою
очередь вызвать увеличение или уменьшение каталитической активно-
сти. Так, при избыточном накоплении продукта какого-либо метаболи-
ческого пути ингибитор, действующий по принципу обратной связи,
взаимодействует указанным образом с ферментами и «выключает» их.
Взаимодействия такого рода составляют один из распространенных
способов регуляции.
Подобный же механизм лежит в основе связывания гормонов со спе-
цифическими рецепторами, расположенными на мембранах клетки или
в цитоплазме. Гормоны — это соединения с регуляторной функцией,
которые выделяются клетками определенной ткани и регулируют обмен
веществ в клетках-мишенях, принадлежащих другой ткани. Предпола-
гают, что связывание гормонов с рецепторами изменяет структуру (кон-
формацию) последних, и это событие инициирует цепь реакций, приво-
дящих к биологическому ответу на действие гормона.
Вопросы и задачи
1. Опишите принципиальные различия в структуре и организации кле-
ток прокариот и эукариот.
2. Каковы две основные функции белков в клетке, одна функция ДНК,
две функции РНК, одна функция липидов?
3 . Сравните химический состав рибосом, клеточных мембран и жгути-
ков бактерий.
4. Предположим, что мы имеем несколько микроорганизмов и клеток,
характеризующихся следующими размерами: микоплазма — сфера
диаметром 0,33 мкм; Е. coli — цилиндр диаметром 0,8 мкм и длиной
2 мкм; клетка печени — сфера диаметром 20 мкм; корневой воло-
сок— цилиндр диаметром 10 мкм и длиной 1 мм.
а. Рассчитайте для каждой из указанных клеток объем, массу в
граммах и в дальтонах (приняв удельный вес равным 1,0).
б. Приняв, что бактериальные рибосомы имеют форму сферы ди-
аметром 23 нм, рассчитайте их объем. Если масса бактериальных
рибосом 2,7-10е дальтон (гл. 15, разд. В.1), то какова их кажу-
щаяся плотность (разделите массу на объем)? Экспериментально
определяемая в градиенте концентрации хлористого цезия плот-
ность бактериальных рибосом (гл. 2) равна примерно 1,6 г-см-3.
Как объяснить получаемую разницу? Если линейные размеры
рибосом эукариот в 1,17 раза больше, чем у бактериальных рибо-
сом, то каков объем рибосом эукариот?
в. Какую часть объема клетки Е. coli составляют клеточная стенка,
' плазматическая мембрана, рибосомы (примем их число равным
15 000)? Исходя из того, что клетка Е. coli на 80% состоит из
воды, определите, какая часть веса сухой клетки приходится на
долю рибосом? ДНК (в одной клетке имеется 2 хромосомы)?
г. Какую часть объема клетки печени составляют рибосомы, ядро,
плазматическая мембрана, митохондрии (примем, что в клетке
1000 митохондрий)?
5. а. Какова молярная концентрация фермента, имеющегося у Е. coli
в количестве только одной молекулы на клетку?
б. Концентрация К+ в клетке Е. coli составляет 150 мМ. Рассчитай-
те число ионов калия в одной клетке.
в. Если pH внутри клетки равен 7,0, то сколько в ней ионов Н+?
6. Если хромосомы (и хроматин) состоят на 15% из ДНК, то чему
равна масса 23 пар хромосом в диплоидной клетке человека? Если
диаметр ядра равен 5 мкм и плотность 1,1 г-см-3, то какая часть
ядра по весу приходится на долю хроматина?
7. Сравните соотношения поверхности и объема для клеток Е. coli и
печени, для ядра клеток эукариот, для корневого волоска. Если по-
верхность клетки диаметром 20 мкм на 20% покрыта ворсинками
диаметром 0,1 мкм и длиной 1 м.км и при этом каждая ворсинка
расположена в центре квадрата 0,2X0,2 мкм, то насколько это уве-
личит отношение поверхности к объему?
8. Установлено, что каждая аминокислота кодируется последователь-
ностью из трех нуклеотидов в цепочке ДНК (кодон). В ДНК имеет-
ся четыре вида нуклеотидов. Сколько кодонов может быть из них
составлено? Заметим, что рассчитанное число кодонов больше, чем
число аминокислот (20), включающихся в белки, плюс три терми-
нирующих кодона, прекращающих синтез полинептидной цепи.
(Список кодонов приведен в табл. 15-2 и 15-3.)
9. Отметьте по две черты сходства и различия между сине-зелеными и
зелеными водорослями.
10. Сравните размеры и строение жгутиков бактерий и эукариот.
11. Сравните химический состав внеклеточных образований — наружных
оболочек или внеклеточного основного вещества («матрикса»), сек-
ретируемых следующими клетками: бактериями, фибробластами,
остеобластами, растительными клетками, грибами.
12. Определите понятие «стационарное состояние» для живых клеток и
сравните его с понятием химического равновесия.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Stanier R. У., Doudoroff М., Adelberg Е. A., The Microbial World, 3rd ed., Prentice-
Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1970.
2. Mandelstam J., McQuillen K-, Biochem. of Bacterial Growth, Wiley, New York, 1968.
3. Maniloff J., Morawitz H. J., Bacteriol. Rev., 36, 263—290 (1972).
4. 'Watson J. D., Molecular Biology of the Gene, 3rd ed., p. 61, Benjamin, Menlo Park,
California, 1976. [Имеется перевод: Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. —
М.: Мир, 1978.]
5. Luria S. Е. In: The Bacteria (Gunsalus I. C., Stanier R. Y., eds.), Vol. 1, p. 1,
Academic Press, New York, 1960.
5 — 1821
66
Глава 1
6. Berg Н. С., Nature (London), 254, 389—392 (1975).
7. Thimann К- V., The Life of Bacteria, 2nd ed., Macmillan, New York, 1963.
8. Decker K-, Jungermann K-> Thauer R. R., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 9, 138—158
(1970).
9. Stonier R. Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G., Bacteriol. Rev., 35, 171 —
205 (1971).
9a. Wagner G., J., Siegelman H. W., Science, 190, 1298—1299 (1975).
10. Watson J. D., Molecular Biology of the Gene, 3rd ed., p. 499, Benjamin, Menlo Park,
California, 1976.
11. Paine P. L., Moore L. C., Horowitz S. B., Nature (London), 254, 109—114 (1975).
12. Carothers Z. B„ Science, 175, 652—654 (1972).
13. Northcote D. H., Endeavour, 30, 26—33 (1971).
13a. Golgi C„ Arch. Ital. Biol., 30, 60 and 278 (1898).
14. Palade G„ Science, 189, 347—358 (1975).
15. Satir B., Sci. Am., 233, 29—37 (Oct. 1975).
16. Neutra M., Leblond C. P., Sci. Am., 220, 100—107 (Feb. 1969).
17. Whaley W. G., Dauwalder M„ Kephart J. E., Science, 175, 596—599 (1972).
18. Nyquist S. E„ Crane F. L., Morre D. J., Science, 173, 939—941 (1971).
19. Reinert J., Ursprung H., eds., Origin and Continuity of Cell Organelles, Springer-
Verlag, Berlin and New York, 1971.
20. Orel L., Malaisse-Lagae F., Ravazzola M„ Amherdt M., Renold A. E., Science, 181,
561—562 (1973).
21. Loud A. V., J. Cell Biol., 37, 27—46 (1968).
22. Hoffmann H. P., Avers C. J., Science, 181, 749—751 (1973).
23. Dingle J. T., Lysosomes, A Laboratory Handbook, North-Holland Publ., Amsterdam,
1972.
24. de Duve C„ Science, 189, 186—194 (1975).
25. Tolbert N. E., Annu. Rev. Plant Physiol., 22, 45—74 (1971).
26. Sleigh M. A., Endeavour, 30, 11—17 (1971).
27. Olmsted J. B., Borisy G. G., Annu. Rev. Biochem., 42, 507—540 (1973).
28. Margulis L., Sci. Am., 225, 49—57 (Aug. 1971).
29. John P., Whatley F. R., Nature (London), 254, 495—498 (1975).
30. Raff R. A., Mahler H. R., Science, 177, 575—582 (1972).
30a. Cavalier-Smith T., Nature (London), 256, 463—468 (1975).
31. Uzzell T., Spolsky C„ Science, 180, 516—517 (1973).
32. Raff R. A., Mahler H. R„ Science, 180, 517 (1973).
32a. Markert C. L., Shaklee J. B„ Whitt G. S., Science, 189, 102—114 (1975).
33. McKanna J. A., Science, 179, 88—90 (1973).
34. Hill D. L., Biochemistry and Physiology of Tetrahymena, Academic Press, New
York, 1972.
35. Robertson A., Drage D. J., Cohen M. H., Science, 175, 333—335 (1972).
36. Davis R. H., deSerres F. J. In: Methods in Enzymology (Tabor H., Tabor C. W.,
eds.), Vol. 17A, p. 79, Academic Press, New York, 1970; a summary of techniques.
37. Fink G. R. In: Methods in Enzymology (Tabor H., Tabor C. W., eds.), Vol. 17A,
p. 59, Academic Press, New York, 1970.
38. Bracket J. L. A., Endeavour, 24, 155—161 (1965).
39. Rickter G. In: Physiology and Biochemistry of Algae (Lewin R. A., ed.), Vol. 2,
pp. 633—652, Academic Press, New York, 1962.
40. Ahmadjian V. In: Physiology and Biochemistry of Algae (Lewin R. A., ed.), Vol. 2,
p. 817, Academic Press, New York, 1962.
40a. Lapan E. A., Comp. Biochem. Physiol., 52A, 651—657 (1975).
41. Lapan E. A., Morawitz H., Sci. Am., 227, 94—101 (Dec. 1972).
42. Loomis W. F., Sci. Am., 200, 145—146 (Apr. 1959).
43. See Florkin M., Scheer В. T. eds., Chemical Zoology, Vols. 5 and 6, Academic
Press, New York, 1970, 1971.
44. Gilula N. B. In: Cell Communication (Cox R. P., ed.), Wiley, New York, 1974,
pp. 1—29.
45. McNutt N. S„ Weinstein R. S„ Prog. Biophys. Mol. Biol., 26, 47—101 (1973).
46. Reese T. S„ Karnovsky M. J., J. Cell Biol., 34, 207—217 (1970).
47. Hudspeth A. J., Revel J. P., J. Cell Biol., 50, 92—101 (1971).
48. Loewenstein W. R„ Sci. Am., 222, 79—86 (May 1970).
49. Payton B. W., Bennett M. V. L., Pappas G. D„ Science, 166, 1641—1643 (1969).
50. Loewenstein W. R., Kanno Y., J. Cell Biol., 33, 225—234 (1967).
51. Johnson R. G., Sheridan J. D„ Science, 174, 717—719 (1971).
52. Humphreys T„ Dev. Biol., 8, 27—47 (1963).
53. Moscona A. A., Sci. Am., 205, 143—162 (Sep. 1961).
54. Jarvis P., Thaine R., Nature (London), New Biol., 232, 236 (1971).
55. von Bertalanffy L„ Science, 113, 23—29 (1950).
Глава 2
Молекулы,
из которых МЫ СОСТОИМ
С биохимической точки зрения жизнь начинается с небольших хи-
мических «строительных блоков», которые клетки либо делают сами,
либо берут откуда-нибудь в готовом виде. В качестве сырья использу-
ются 20 с лишним аминокислот, несколько сахаров, уксусная кислота и
ряд жирных кислот с чуть более длинными цепочками, глицерин, 2 пу-
риновых и 3 пиримидиновых основания, а также фосфорная кислота:
из этих «блоков» строятся тысячи других, значительно более сложных
соединений. Кроме того, во всех организмах неизменно присутствует
еще около дюжины разнообразных веществ — витамины да плюс к тому
несколько сортов неорганических ионов.
Малые строительные блоки, мономеры, в клетке соединяются в ги-
гантские макромолекулы, или полимеры, в которых мономерные звенья
связаны прочными ковалентными связями. Одни полимеры состоят все-
го лишь из нескольких мономерных звеньев (олигомер), другие из со-
тен, тысяч и даже миллионов. Типичный белок содержит от 100 до не-
скольких сотен аминокислот, молекула ДНК Д. coli состоит из.
~4-10б пар нуклеотидов, а сильно разветвленная молекула крахмала
содержит свыше миллиона сахарных звеньев. Одни молекулы биополи-
меров представляют собой линейные цепочки, другие — разветвленные..
Иногда цепи полимера скручиваются с образованием жесткой цилинд-
рической спирали, стабилизированной большим числом слабых вторич-
ных связей. Но, как правило, такие структуры имеют значительно бо-
лее сложную и нерегулярную конформацию. Довольно часто цепи поли-
мера прилегают одна к другой, образуя сетчатые структуры, волокна,,
мембраны. В отдельных случаях (например, в коллагене соединитель-
ной ткани) молекулы белка «прошиты» в поперечном направлении
сильными ковалентными связями. Однако обычно макромолекулы в
клетках связаны друг с другом более слабыми электростатическими и
вандерваальсовыми силами.
Особую роль в биохимии приобретают форма и размеры молекул.
В следующем разделе мы рассмотрим основные принципы, которыми
здесь следует руководствоваться.
А. Принципы построения малых молекул
Целостность устойчивых органических молекул обусловлена обра-
зованием ковалентных связей. Как правило, это очень сильные связи:
стандартная свободная энергия их образования (AGf)—около
—400 кДж •моль"1. Они имеют определенное направление (задаваемое
значениями валентных углов) и определенную длину.
t>s 1 лава 2
1. Валентные углы
Одинарные связи, образуемые углеродными атомами, а также боль-
шей частью атомов фосфора, обычно характеризуются тетраэдрической
конфигурацией. У таких атомов углерода все 6 валентных углов при-
мерно одинаковы и равны углу тетраэдра, 109,5°. Этот угол полезно за-
помнить. В органических соединениях вдоль цепи атомов углерода ва-
лентные углы очень мало отличаются от этого значения. Близкие зна-
чения обычно характерны даже для атомов, соединенных меньше чем
с четырьмя другими атомами; например, угол Н—О—Н в молекуле
воды равен 105°, в молекуле аммиака углы Н—N—Н равны 107°. Эфи-
ры характеризуются углом С—О—С, равным 111°. Вместе с тем в не-
которых простых соединениях есть валентные углы, близкие к 90°
(например, 92° в молекулах H2S и РН3 и ЮГ в молекуле Н2О2).
Присутствие двойных связей делает конфигурацию плоской, а ва-
лентные углы принимают значения ~ 120° (угол при вершине правиль-
ного шестиугольника). Во многих случаях группы, которые на первый
взгляд не должны быть плоскими, являются таковыми вследствие ре-
Размеры некоторых атомов3 •6
Таблица 2-1
Элемент Ковалентный радиус, нм Вандерваальсов радиус, нм
H 0,030 0,12
F 0,064 0,135
C 0,077 0,16
N 0,070 0,15
О 0,066 0,145
Cl 0,099 0,180
Si 0,117 —.
p 0,110 0,19
s 0,104 0,185
Br 0,114 0,195
I 0,133 0,215
«Радиус» метильной группы 0,20
Полутолщина ароматических молекул 0,170
а Pauling L., The Nature of the Chemical Bond, 3rd ed., pp. 224—227 and 260.
Cornell Univ. Press, Ithaca, New York, 1960.
6 Межатомное расстояние определяется путем сложения двух ковалентных радиу-
сов. Вандерваальсовы радиусы показывают, как плотно могут быть упакованы моле-
кулы. Так, наименьшее расстояние между атомами в макромолекулах примерно на
0,02 нм меньше суммы вандерваальсовых радиусов. [Sasisekharian V., Lakshmina-
rayanan А. V., Ramachandran G. N., in: Conformation of Biopolymers (G. N. Rama-
chandran, ed.), Vol. 2, p. 641, Academic Press, New York, 1967.]
зонанса: например, все атомы, участвующие в образовании пептидной
группы (рис. 2-4), лежат практически в одной плоскости, валентные
углы отличаются от 120° не более чем на 4°.
2.. Длины связей
В химии под длиной связи понимают расстояние между ядрами свя-
занных атомов. Напомним, что одинарная С—С-связь имеет длину
0,154 нм (1,54 А). Связь С—О на ~0,01 нм короче (0,143 нм), а длина
типичной С—Н-связи равна ~0,109 нм. Связь С—N имеет длину, про-
межуточную между длинами С—С и С—О-связей (0,149 нм). Длины
других связей, таких, как О—Н, можно оценить, исходя из значений
ковалентных радиусов, приведенных в табл. 2-1.
Длина двойной связи между двумя данными атомами (например,
С = С) почти на 0,020 нм короче одинарной связи между теми же ато-
мами. При наличии резонанса, вследствие которого связь становится
двойной лишь частично, ее длина также становится промежуточной. На-
пример, длина С—С-связи в бензоле равна 0,140 нм; длины связей
С—О в карбоксилат-анионе равны 0,126 нм.
Карбоксилат-ион
Полный размер молекулы легко рассчитать, исходя из элементар-
ней геометрии. Полезно запомнить два расстояния:
1^0,254-^
I им I
Расстояние между атомами
углерода, стоящими через один
в вытянутой углеводородной цепи
Поперечный размер
молекулы бензола1
1 Химики часто пользуются упрощенными формулами, подобными приведенной
выше формуле бензола, где шесть водородных атомов не указываются. Резонанс меж-
ду двумя возможными вариантами расположения трех двойных связей обозначается
кружком. Далее на протяжении всей книги используются также следующие приемы
сокращенной записи (атомы кислорода и азота указываются всегда):
— СООН —С — CONHR == —С
ОН R
(р) ~ —Р—ОН = Фосфорильная группа
Н
I
,снг
хси3
н
о*
3. Контактные расстояния
Длины ковалентных связей и валентные углы говорят нам о взаим-
ном расположении атомных ядер относительно друг друга, но не дают
никакого представления о внешних очертаниях молекул. Расстояние
от центра атома до точки, в которой он «контактирует» с соседним ато-
мом в случае их плотной упаковки (как в кристалле), называют ван-
дерваальсовым радиусом. Взаимное расположение биологических моле-
кул, находящихся по соседству друг с другом, в основном определяется
значением этих радиусов, которые также приведены в табл. 2-1. В каж-
дом случае они приблизительно равны ковалентному радиусу плюс
0,080 нм. Вандерваальсовы радиусы несколько менее постоянны, чем
ковалентные, поскольку атомы можно чуть-чуть «сжать», но так, чтобы
при этом длина контактного расстояния уменьшилась не более чем на
0,005—0,01 нм.
4. Асимметрия: правые и левые молекулы
Левая и правая руки выглядят почти одинаково, но все же отлича-
ются друг от друга — одна является зеркальным отображением другой.
Практически эта разница выражается в том, что на правую руку нель-
зя надеть левую перчатку. Однако, хотя мы ежедневно сталкиваемся
с различиями между левым и правым, объяснить на словах, чем имен-
но правая рука отличается от левой, очень нелегко. Вместе с тем, по-
скольку биохимические соединения — и мономеры, и полимеры — по
большей части асимметричны, понимать, что такое молекулярная асим-
метрия, чрезвычайно важно. Надо уметь представлять, как пространст-
венно выглядят асимметричные молекулы, и уметь изображать их
структуру на бумаге. Чтобы научиться этому, надо постоянно работать
с молекулярными моделями, а еще лучше делать такие модели своими
руками (см. Приложение).
Когда к центральному атому углерода присоединены четыре разные
группы, молекула обязательно асимметрична. Упомянутые четыре груп-
пы могут располагаться двумя способами, что дает две разные конфи-
гурации. Рассмотрим а-аминокислоту
NH2
R—Lcooh
н
а-Аминокислота
Чтобы отобразить трехмерную структуру молекулы на плоскости, связи,
которые направлены от плоскости рисунка к читателю, часто изобража-
ют в виде треугольников, а связи, уходящие за плоскость рисунка —
тонкими сплошными или пунктирными линиями:
R
I
= H..N—С—СООН =
I
н
ноос
н nh2
L-аминокислота
Аминокислоты, у которых конфигурация относительно атома а-угле-
рода такая же, как на приведенных выше формулах, называют L-ами-
нокислотами. Аминокислоты, являющиеся зеркальным отображением
L-аминокислот, называются D-аминокислотами1. L- и D-формы одного
и того же соединения называют его энантиоморфными формами или
энантиомерами.
Структура L-аминокислоты была изображена выше четырьмя раз-
личными способами. Чтобы показать, что мы имеем дело с одной и
той же структурой, нужно повернуть молекулу в пространстве так, что-
бы карбоксильная группа оказалась сверху, а боковая цепь (радикал
R)—снизу (уходя за плоскость рисунка); при этом аминогруппа и
атом водорода должны оказаться по разные стороны от атома углерода,
выступая вперед из плоскости рисунка. По соглашению, предложенно-
му Э. Фишером, аминокислота находится в L-конфигурации, если в ука-
занной выше ориентации ее аминогруппа оказывается слева, и в D-koh-
фигурации, если она оказывается справа.
СООН
Н—С—NH2
R
D-аминокислота
Одновременно Фишер предложил изображать аминокислоты всегда
именно в этой ориентации, указывая все связи обычными линиями, как
на приведенной ниже проекционной формуле Фишера для L-аланина.
По терминологии Кана — Ингольда — Прелога (разд. 5), такая конфи-
гурация обозначается как S.
СООН
H,N—С-Н
I
сн3
Биохимические реакции, как правило, высокостереоспецифичны; фер-
мент, выступающий в качестве катализатора реакции, оказывает свое
действие лишь в том случае, если молекула находится в одной из двух
конфигураций. Близко связанный факт заключается в том, что белки
обычно целиком состоят из L-аминокислот.
В старой литературе, когда речь шла об оптической изомерии, про-
являющейся в существовании D- и L-соединений, пользовались терми-
нами «асимметрический атом углерода» или асимметрический центр.
В настоящее время чаще используются термины хиральные молекулы,
хиральные центры, хиральность (что в переводе с греческого означает
«принадлежность к правому или левому»). Соединения с одним хираль-
ным центром дают одну энантиоморфную пару, а молекулы с двумя и
более хиральными центрами образуют семейство диастереомеров. Диа-
стереомеры образуют пары изомеров, противоположных по конфигура-
ции при одном или нескольких хиральных центрах, но не являющихся
1 D- и L-коифигурации соответствуют определенному расположению атомов мо-
лекулы в пространстве. Экспериментально измеряемой величиной, которая связана с
асимметрией молекул, является оптическое вращение (гл. 13, разд. Б.5). Иногда од-
новременно с названием соединения указывают знак оптического вращения (+ или —),
например D (+)-глюкоза. Старые обозначения d (dextro — правый) и I (levo — левый)
имеют тот же смысл. Вместе с тем соединение в D-коифигурации может иметь любой
знак оптического вращения: либо «+», либо «—».
72
Глава 2
зеркальным отображением один другого. Примером могут служить
L-треонин* 1, обладающий 2(S) ,3(Я)-конфигурацией, и его диастереомер,
L-алло-треонин, обладающий 2(5),3(5)-конфигурацией.
5. Описание конфигурации с использованием /^-обозначений
В 1956 г. Каи, Ингольд и Прелог предложили однозначный способ
описания конфигурации относительно любого хирального центра [1].
Этот способ особенно полезен для тех классов соединений, для которых
нет твердо установленной системы разделения на D- и L-конфигурации.
Четыре группы, окружающие атом углерода (или другой центральный
атом), располагаются в порядке их приоритета. Приоритет каждой кон-
кретной группы устанавливается в соответствии с набором правил, из
которых наиболее важным является такое: больший атомный номер
ставится перед меньшим. В приведенном ниже примере, взятом для
иллюстрации, приоритет групп молекулы D-аланина указан так: а>Ь>
>c>d. Наивысший приоритет приписывается NH2-rpynne, в которой
с центральным атомом связан атом азота. Чтобы установить конфигу-
рацию, наблюдатель смотрит на молекулу вдоль оеи, соединяющей
центральный атом с группой, имеющей низший приоритет, т. е.
с группой d. В этом случае последовательность групп а, Ь, с может рас-
полагаться либо по часовой стрелке, как в нашем случае, либо против.
d Н
!>
л .___Наблюдатель
О-алани!
Расположению по часовой стрелке соот-
ветствует конфигурация 7? (rectus — пра-
вый), а против часовой — конфигурация S
(sinister — левый).
Чтобы установить приоритет групп, сначала смотрят на атомы, не-
посредственно связанные с центральным атомом, располагая их в по-
рядке уменьшения атомного номера. Затем, если необходимо, переходят
к следующему набору атомов и сравнивают их атомные номера. Именно
так приходится поступать для определения приоритета групп Ь и с
аланина, поскольку обе они связаны с центральным атомом через атом
углерода. Если атомы участвуют в образовании двойных связей, приме-
ром чему служит карбоксильная группа аланина, то они учитываются
1 Иногда к буквам D п L добавляют индексы s или g, указывающие, какое соеди-
нение использовано в качестве эталона конфигурации — серин или глицеральдегид
(разд. В.1). Обычный треонин является Ls- или Ьг-треонином. Конфигурация право-
вращающей ( + )-винной кислоты обозначается 2(/?), 3(/?) или ЕЦ или Lg.
СООН
ИСОН
I
носн
соон
2(R) ,.3(К)-винная кислота
дважды — второй раз как воображаемые атомы, продолжающие цепоч-
ку связей:
/О М) -«-- „ ,
// ’ Воображаемые атомы
-С -------> —С—О—(С) <----
\он ^он
Мы не будем рассматривать здесь полный набор всех правил; укажем
лишь последовательность, в которой приводимые ниже функциональные
группы расположены в порядке уменьшения их приоритета [2]: SH>
> OR > ОН > NHCOCH3 > NH2 > COOR > СООН > ОНО >
>СН2ОН>СбН5>СН3>3Н>2Н>>Н. Хотя RS-система вполне одно-
значна, зачастую два близко родственных соединения, принадлежащих к
одной конфигурации в DL-системе, в RS-системе имеют противополож-
ную конфигурацию. Поэтому при определении конфигурации аминокис-
лот и сахаров применяется обычно DL-система.
6. Конформации: различные формы, которые может принимать
молекула
Помимо определенного расположения ковалентно связанных атомов
(конфигурация), не менее важна в биохимии конформация молекулы,
которая определяется ориентацией групп, обусловленной вращением их
вокруг одинарных связей [3]. Многие группы свободно вращаются да-
же при комнатной температуре; к примеру, —СНз-группу можно пред-
ставлять себе чем-то вроде крыла ветряной мельницы, которое случай-
ным образом поворачивается то в одну, то в другую сторону. Однако
даже простейшие молекулы имеют какую-то преимущественную кон-
формацию, а в более сложных структурах вращение, как правило, в
значительной степени затруднено.
Рассмотрим молекулу, в которой две группы, А и В, соединены
мостиком из двух СН2 (метиленовых)-групп. Если раздвинуть эти груп-
пы на максимально возможное расстояние, то молекула примет пол-
ностью вытянутую, или анти-конформацию:
В
А
Вий вйолб линии связи между атомами углерода
(проекция Ньюмена)
В такой молекуле не только группы А и В, но и все атомы водорода
находятся на максимально возможном расстоянии один от другого.
В этом легко убедиться, если взглянуть на молекулу вдоль оси, соеди-
няющей атомы углерода (проекция Ньюмена). Поворот второго атома
углерода на 180° вокруг одинарной связи переводит молекулу в засло-
ненную конформацию. Если группы А и В достаточно велики, они при
таком повороте будут «наталкиваться» друг на друга, так что заслонен-
ная конформация практически не сможет реализоваться—поворот во-
круг упомянутой связи будет крайне затруднен. Даже если А и В — это
74 Глава 2
просто атомы водорода (этан), переход к заслоненной конформации
связан с преодолением вращательного барьера величиной до
~13 кДж-моль-1; он возникает из-за стерических затруднений при
сближении атомов водорода [3] (это можно без труда продемонстриро-
вать с помощью полных объемных моделей).
А в
Заслоненная конформация
Если А и В — метильные группы (молекула бутана), стерические
препятствия приводят к возникновению вращательного барьера около
25 кДж-моль-1 (~6 ккал• моль-1). Именно по этой причине во многих
биологических молекулах цепочки из СН2-групп стремятся принять
полностью вытянутую конформ,ацию. Такого рода зигзагообразную
структуру углеродной цепи можно обнаружить в полиэтилене, состоя-
щем из длинных цепочек СН2-групп.
Пом.имо полностью вытянутой конформации возможны также две
скошенные (гош-) конформации, которые почти так же устойчивы, как
и анга-конформация, и для которых стерические затруднения возникают
лишь в том случае, если группы А и В очень велики. В одной из этих
двух конформаций группа В лежит справа от А, если смотреть вдоль
Одна из двух скошенных конформаций
оси молекулы, а в другой В оказывается слева от А. Данные конфор-
мации можно рассматривать по аналогии с правым и левым винтом
(в обычных правых винтах нарезка, если смотреть на нее сверху вдоль
оси — неважно с какого конца, — идет от наблюдателя слева направо,
и точно таким же образом на рисунке показан переход от группы А к
группе В). Угол <р — это торсионный угол. Для правых конформаций он
имеет положительное значение (правую конформацию называют также
Р- или « + »-конформацией в отличие от М- или «—»-конформации,
означающей левую конформацию). Скошенные конформации занимают
важное место среди возможных конформаций многих биологических
молекул; например, молекула сахарного спирта рибита в кристаллах
имеет вид серпа [4] —цепь сначала (слева) образует зигзаг, но затем,
начиная с четвертого атома углерода, приобретает скошенную конфор-
мацию, что сводит к минимуму стерические затруднения, обусловлен-
Молекулы, из которых мы состоим
ные взаимодействием между ОН-группами при втором и четвертом ато-
мах углерода.
Pufium в „серповидной" конформации
Многие молекулы содержат кольца из 3, 4, 5, 6 и более атомов угле-
рода. Если кольца, в которых имеется две и более двойные связи, в
большинстве случаев остаются почти плоскими, то с пяти- и шестичлен-
ными кольцами, построенными на одинарных связях, дело обстоит
иначе. Шестичленные кольца из одинарных связей, какие мы встречаем
в циклогексане и в сахарах, как правило, принимают конформацию
скресла», как это видно на примере глюкозы.
Обратите внимание, что все
крупные замещающие гриппы,
—ОН и
он
н |
НО
сн
Н
н
он
но
/3 -D-глюкоз а.
Пиранозное кольцо
имеет форму кресла
—СН2ОН,
находятся в экваториальном
положении с внешней
стороны кольца
и в результате
контактируют
друг с другом
минимально
Все атомы водорода, присоединенные
к кольцевым атомам углерода,
отходят вниз или вверх
в аксиальном направлении
Помимо этого, шестичленные кольца могут принимать менее устой-
чивую конформацию «лодки» [3, 5, 6]. Шесть возможных вариантов
конформации «лодки» свободно переходят одна в другую через проме-
жуточные скошенные конформации.
Скошенная конформация
Поскольку внутренний угол правильного пятиугольника равен 108°
(что очень близко к углу тетраэдра), можно было бы ожидать, что пя-
тичленные кольца образуют плоские структуры. Однако в плоской
го 1 лава 2
структуре атомы водорода при соседних углеродах мешали бы друг
другу; поэтому один из атомов углерода выходит из плоскости осталь-
ных четырех на расстояние около 0,05 нм, в результате чего образует-
ся конформация «конверта» (см. рис. 2-14, на котором изображены
этот и другие типы конформации).
7. Водородные связи и гидрофобные взаимодействия
Хотя целостность молекулы поддерживается ковалентными связями,
многие важнейшие свойства биологических соединений определяются
значительно более слабыми связями. Среди этих нековалентных связей
особенно важны водородные и гидрофобные. Водородные связи обус-
ловлены электростатическим притяжением, возникающим нз-за нерав-
номерного распределения электронов между атомами, участвующими в
образовании ковалентной связи: например, в молекуле воды электроны,
образующие связь Н—О, немного смещены к атому кислорода. В ре-
зультате на атоме водорода создается небольшой нескомпенсированный
положительный заряд, а на атоме кислорода — небольшой отрицатель-
ный. Наличие такой поляризации иногда указывают стрелками, заме-
няющими изображение химических связей; используются также обозна-
чения б+ и б-. Молекулы с сильно поляризованными связями называют
полярными, как и функциональные группы, в которых имеются такие
связи. Им противопоставляют неполярные группы, такие, как
—СНз-группа; здесь образующие связь электроны почти равномерно
распределены между атомами углерода и водорода.
Л-
Водородная связь образуется в тех случаях, когда положительно за-
ряженный конец одного из диполей (одной из поляризованных связей)
притягивается к отрицательно заряженному концу другого диполя. Спо-
собность к образованию водородных связей ярко выражена у молекул
воды; при этом каждый атом кислорода может образовывать водород-
ные связи с двумя другими молекулами воды. Водородные связи имеют
резко выраженный направленный характер: наиболее сильной связь
бывает в том случае, когда все три атома оказываются на одной пря-
мой. Энтальпия образования водородной связи вдоль прямой, Д//°, мо-
жет достигать —20 кДж-моль-1 (—5 ккал • моль-1).
Атом кислорода
в молекуле воды образует
водородные связи с двумя
другими молекулами воды.
Обратите внимание на
тетраэдрическое расположение
связей вокруг атома кислорода
Водородные связи длиннее ковалентных, но заметно короче (на
~0,06—0,08 нм) расстояний, которые соответствуют межатомным кон-
тактам, определяемым значениями вандерваальсовых радиусов. Следует
помнить, что водородные связи всегда образуются между парами групп,
одна из которых обращена к другой отрицательным концом диполя, а
другая служит донором протона. Группа, являющаяся акцептором про-
тона, может также рассматриваться как донор неподеленной пары
электронов. При обсуждении механизмов органических реакций принято
стрелками указывать направление смещения электронов. В этой книге
мы тоже иногда будем указывать направление водородных связей
стрелками, идущими от доноров электронов к атомам водорода (как
это было сделано выше, когда мы рассматривали образование водород-
ных связей между молекулами воды).
Жиры, углеводороды и другие вещества, молекулы которых состоят
в основном из неполярных групп, плохо растворимы в воде и хорошо
растворяются в неполярных растворителях. В водной среде неполярные
группы стремятся ассоциировать — это явление часто называют гидро-
фобным взаимодействием. В то же время сахара и другие соединения,
содержащие много полярных групп, напротив, очень хорошо растворя-
ются в воде и не ассоциируют.
Растворимость сахара в воде объясняется способностью многочис-
ленных гидроксильных групп этого соединения к образованию водород-
ных связей с молекулами воды. Природу гидрофобного связывания, о
котором будет говориться в гл. 4 (разд. Б.4), понять несколько труд-
нее, но обусловлено оно главным образом сильным взаимным притя-
жением молекул воды, вовлеченных в густую сеть водородных связей
[7]-
Многие молекулы, имеющие в своем составе кольцевые структуры
(например, пурины или пиримидины), довольно слабо растворяются как
в воде, так и в органических растворителях. Молекулы этих соедине-
ний, содержащие полярные и неполярные участки, не оказывают пред-
почтения ни одному из растворителей и плотно упаковываются в струк-
туре твердого кристалла.
8. Таутомерия
Многие простые органические соединения существуют в виде смеси
двух и более изомеров, или таутомерных форм, быстро переходящих
одна в другую. Таутомеры, по крайней мере в принципе, можно разде-
лить при низких температурах, когда переход из одной формы в другую
затруднен.
Классическим примером явления такого рода служит кето-енольное
равновесие
О . ОН
Н II н I
R—С—С—R' -<----- R—С=С—R' (2-1)
Н
Кето-форма Енол
Хотя енол обычно менее устойчив, чем кето-форма, он все-таки всегда
присутствует в системе, хотя и в малых количествах. Енол легко обра-
зуется из кето-таутомера благодаря тому, что атомы водорода при уг-
лероде, связанном с карбонильной группой (С = О), имеют отчетливо
выраженные кислотные свойства. Одним из основных факторов, порож-
дающих таутомерию, является наличие легко диссоциирующего прото-
на. Однако обычно атомы водорода, связанные с атомами углерода,
слабо диссоциируют, и поэтому таутомерия возникает лишь в присут-
ствии карбонильной или какой-либо другой «активирующей группы».
Как правило, легко диссоциируют протоны, связанные с атомами
кислорода или азота, предопределяя возможность таутомерии в амидах
78 Глава 2
и кольцевых системах, содержащих атомы О и N [уравнения
(2-2)-(2-5)].
О о—н
11 ->• 1 ,
R—N—С—R' <----- R—N=C—R (2-2)
Н
А В
Пиридоксин
( витамин Bg)
А
(2-4)
(2-5)
Таутомерия, описываемая уравнением (2-2), близка к кето-енольно-
му превращению. Форма В изредка присутствует в пептидах. Пиридок-
син [уравнение (2-3)] в водном растворе находится преимущественно
в форме биполярного ионного таутомера В, но в метаноле принимает
форму незаряженного таутомера А. Пиримидины [уравнение (2-4)] и
пурины [уравнение (2-5)] способны образовывать множества таутоме-
ров. Существование формы D [уравнение (2-4)] послужило основанием
к тому, что урацил называют также диоксипиримидином (правда, здесь
преобладает все же дикето-таутомер А). В паре таутомеров один из
атомов водорода всегда переходит из одного положения в другое, что
сопровождается изменением длин и характера других связей.
Константа равновесия для таутомерного перехода равна отношению
мольных долей двух форм. Например, для енольной и кето-форм ацето-
на в воде это отношение равно ~2-10-6 [8]; для биполярных ионов и
незаряженного пиридоксина [уравнение (2-3)] при 25 °C оно равно
~4 [9]. Относительное содержание таутомеров урацила В, С и D по
сравнению с таутомером А предположительно невелико, но количест-
венные измерения здесь провести трудно [10, 11]. Таутомерные отно-
шения (определяемые для полностью протонированных форм) не зави-
сят от pH, но меняются с изменением температуры, зависят от раство-
рителя и весьма чувствительны к связыванию таутомеров с молекулами
белка или другими молекулами.
9. Резонанс
Необходимо отличать таутомерию от явления резонанса, о котором
говорят в тех случаях, когда свойства молекул оказывается невозможно
описать на основе одной валентной структуры и приходится прибегать
к гибридизации двух или нескольких структур, в которых все ядра оста-
ются на прежних местах. Переход из одной резонансной формы в дру-
гую связан лишь с перераспределением валентных электронов. Приме-
ром может служить енолят-анион, который можно рассматривать как
гибрид структур А и В. Чтобы подчеркнуть, что изображены именно
резонансные структуры, а не таутомеры или какие-либо другие изоме-
ры, стрелки, изображающие переход между соответствующими форма-
ми, делают двунаправленными:
О о-
Н || HI
R—С—С—R' <—> R—С=С—R'
А В
Енолят-анион
Хотя таутомерия и резонанс — явления разные, они все же тесно
связаны. Так, кислотные свойства атомов водорода при атомах углеро-
да в кетонах, приводящие к образованию енольных таутомеров, являют-
ся прямым следствием резонансной стабилизации енолят-аниона, обра-
зующегося при диссоциации одного из этих атомов водорода.
Подобным же образом таутомеризация имидазольной группы, при-
сутствующей в большинстве белков, связана с резонансом имидазолий-
катиона. Представим себе, что протон при взаимодействии со структу-
рой А [уравнение (2-6)] присоединится к атому азота, находящемуся
в 1-м положении; тогда вследствие резонанса положительный заряд не-
медленно распределится между обоими атомами азота. Это придаст
кислотные свойства протону при атоме азота, находящемся в 3-м поло-
жении, протон диссоциирует и образуется таутомер В. Таутомеризации
Н+ — NT NH HN NH HN XN+H
А
Имидазол
Имидазолий-катион
HN N + Н+ (2-6)
В
имидазольной группы приписывают важную роль в функционировании
многих ферментов и других белков; например, если атом азота, нахо-
дящийся в 3-м положении, в структуре А обращен внутрь молекулы
белка, то присоединение протона с внешней стороны может вызвать
таутомерный переход, приводящий к высвобождению протона внутри
молекулы, возможно, в области активного центра фермента (гл. 7,
разд. К-2).
Б. Белки
Мономерными единицами, из которых построены белки, являются
20 а-аминокислот. Эти малые молекулы наделены свойством, общим для
всех молекул, способных к полимеризации: они содержат по меньшей
мере две разные химические группы, способные реагировать друг с дру-
гом с образованием ковалентной связи. У аминокислот такими группами
служат аминогруппа (—NH2) и карбоксильная группа (—СООН), а
связь, которой определяется образование белкового полимера, пред-
ставляет собой пептидную (амидную) связь. Образование пептидной
связи можно представлять себе как отщепление молекулы воды от при-
соединяющихся друг к другу —СООН- и —NH2-rpynn [уравнение
(2-7)]. В водной среде равновесие в реакциях такого типа сдвинуто в
сторону образования свободных аминокислот, а не пептида. Следова-
тельно, синтез пептидов (как в естественных условиях, так и в лабора-
тории) осуществляется непрямым путем и не сводится к простому от-
щеплению воды.
H2N—CH—C-j-QH + Н—N—СН—СООН •
К н
а-Аминокислоты
О R
H2N — СН —с—N — СН— СООН + Н2О (2-7)
R Н
Пептидная связь
в дипетипиде
Поскольку дипептид в уравнении (2-7) также содержит реакционно-
способную карбоксильную и аминогруппу, то к нему с помощью новых
пептидных связей могут присоединиться другие аминокислотные моно-
меры; в результате образуется полипептид (белок).
1. а-Аминокислоты
Для понимания свойств аминокислот как свободных метаболитов
и как компонентов белковых молекул нужно прежде всего запомнить
три простых факта.
1. Аминокислоты существуют преимущественно в форме биполярных
ионов (цвиттерионов).
ни
HjN—С—Сч , а не H2N—С—С—ОН
I хо- |
R R
1 аилица
Структура и химические свойства боковых цепей аминокислот
а. Глицин; «боковая цепь» = —H(GlyG)
Выступает в роли простейшего
связующего звена в цепи белка,
обеспечивая минимальные стериче-
ские препятствия при вращении и
размещении соседних групп
б. Аминокислоты с алкильными боковыми цепями
я ,н
\ 'н
с-н
: чн
н
Валин
(Vol , V)
Аланин
(Ala,А)
,н/н
н —С \
14 \ н н
с—с—н
н н' н н
Лейцин Изолейцин
(Leu,L) (Ие,1)
Эти объемные группы разной
формы очень важны для гидро-
фобной стабилизации белка и для
формирования центров связыва-
ния в ферментах
* Заметьте, что в изолейцине
имеется еще один хиральный
центр
в. Пролин (поскольку его боковая цепь замыкается на аминогруппу, дана полная
структурная формула аминокислоты)
о « Н н но-с L /^н / \ Л Н—N С . Л. ® н н Пролин Заслуживает внимания вторич- ный характер аминогруппы (про- лин иногда называют имииокис- в аксипролине, который лотой) и жесткая конформация аминокислоты. Присутствие ос- на — он-группу татков пролина оказывает сущест- венное влияние на характер ук- ладки полипептидной цепи
(Pro , Р)
г. Ароматические аминокислоты
Фенилаланин
(Phe, F)
Тирозин
(Туг, О)
Триптофан
( Trp . W)
Легко диссоциирующий про-
тон, р/(а ~9,5—10,9. Донор про-
тона в водородных связях и
функциональная группа в фермен-
тативном катализе
Тирозин, фенилаланин и трипто-
фан способны образовывать гид-
рофобные связи и особенно эф-
фективно связываются с другими
плоскими молекулами
6—1821
82
Продолжение
д. Аминокислоты-спирты
/°Н
-с<Н
н
Серин
(Ser, S)
_СЛ-ОН
'сн3’~~
Треонин
(Thr, Т)
—ОН-группа имеет очень сла-
бые кислотные свойства (рАа —
—13,6). Способна к образованию
эфиров фосфорной и органических
кислот и служит местом присо-
единения сахарных колец в глико-
протеидах. Гидроксильные группы
серина обнаружены в активных
центрах ряда ферментов
Обратите внимание на второй
хиральный центр. Здесь показана
конфигурация боковой цепи
L-треонина; D-треонину соответ-
ствует противоположная конфи-
гурация. L-аминокислота с проти-
воположной конфигурацией боко-
вой цепи называется L-алло-трео-
нином
е. Аминокислоты с
боковыми цепями, обладающими кислотными свойствами
— с'-^Н
Хс=о
/
ОН
Аспарагиновая
кислота
(Asp,D)
г-‘>Н
\ Z
X—С
"А он
Глутаминовая
кислота
(Glu, Е)
Карбоксильные группы этих бо-
ковых цепей при нейтральных pH
находятся в диссоциированном
состоянии (рАа = 4,3—4,7). Обус-
ловливают присутствие отрица-
тельного заряда на поверхности
белка
ж. Амиды аспарагиновой
и глутаминовой кислот
Н ,
-С^-Н н
)с—NZ
с/ \
Аспарагин
(Asn , N )
Амидная группа не обладает
кислотными свойствами, но поляр-
на и может участвовать в образо-
вании водородных связей
,Н
~СГ“Н О
Х-с(
н A N~H
н
Глутамин
(Gin, Q)
Если неизвестно, какая амино-
кислота стоит в цепи белка —
аспарагин или аспарагиновая кис-
лота — используют обозначение
Asx или В. В случае глутамина
или глутаминовой кислоты при-
меняется обозначение Glx или Z
з. Серусодержащие аминокислоты
Н
—С —н
S—н
Цистеин
(Cj/s, С)
«---Слабая кислота
рКа -8,3-8,6
Н
— С—Н
Н''Д ,с—Н
Н''А
Метионин
(Met, М)
Наиболее характерная особен-
ность цистеина — его способность
к самопроизвольному окислению
в присутствии О2 с образованием
«двойной» аминокислоты — цисти-
на; этот процесс часто приводит
к образованию поперечных ди-
сульфидных связей между пептид-
ными цепями:
2 —СН2—SH
-Н2С
XS—S.
ХСН,—
Молекулы, из которых мы состоим
83
Продолжение
и. Основные аминокислоты
Гистидин
( His, И)
Н Н Н Н
Лизин
HUS, К')
Н
,:N—Н
ч
/Ч-
N <,N—Н
I I
н н
Аргинин
'Arg ,R)
Эта основная группа несет на
себе положительный заряд и мо-
жет служить акцептором протона;
сопряженная кислота имеет
р7<а~6,4—7,0
Имидазольные группы боковых
цепей гистидина составляют часть
активного центра многих фермен-
тов. Как и другие основные груп-
пы белков, они могут также свя-
зывать ионы металлов
Гибкая боковая цепь с реакци-
онноспособной аминогруппой на
конце. Высокое значение рКа
(~ 10,5) указывает, что боковые
цепи лизина в нейтральных рас-
творах всегда протонированы
Гуанидиниевая группа имеет
рКа выше 12 и в большинстве
случаев остается протонирован-
ной. Стабилизируется резонансом
(как показано кривыми стрелка-
ми). Гуанидиниевые группы при-
обретают иногда важное значение
как центры связывания фосфат-
ных групп
3 В скобках даны трехбуквенные и однобуквенные обозначения аминокислотных,
остатков, входящих в состав пептидов н белков.
2. Аминокислоты асимметричны и образуют два семейства: D и L
(разд. А.4).
3. Аминокислоты отличаются друг от друга структурой боковых
групп (боковых цепей), которые в приведенных выше формулах обозна-
чались через R. Эти группы имеют разную химическую структуру. Они
выступают из основной цепи и формируют в значительной степени по-
верхность полимера, определяя многие химические и физические свой-
ства белков.
В табл. 2-2 приведены структурные формулы боковых цепей амино-
кислот, обычно встречающихся в белках (формула пролина приведе-
на полностью). Даны также сокращенные трехбуквенные обозначения
аминокислот, используемые при выписывании аминокислотных после-
довательностей пептидов и белков, а также однобуквенные сокращения,
принятые в работах по эволюции белков и при составлении программ
для вычислительных машин.
При обсуждении вопросов, связанных со структурой белков, амино-
кислоты, входящие в группы а, б и в, а также фенилаланин и метионин
принято объединять в категорию неполярных аминокислот. Они стре-
84
Глава 2
мятся попасть в гидрофобное окружение «внутри» молекулы белка.
Противоположную по свойствам категорию составляют полярные заря-
женные молекулы (группы е и и), которые обычно выступают наружу,
в водное окружение белка. Остальные образуют категорию полярных
незаряженных аминокислот.
Знакомство со структурой аминокислот лучше всего начать с глици-
на, аланина, серина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.
Отметим, что структуру многих аминокислот можно получить из струк-
туры аланина заменой одного из атомов водорода на другую группу.
Так, замена p-водорода аланина дает:
Замена на фенил
на —ОН
на —SH
на —СООН
Фенилаланин
Серин
Цистеин
Аспарагиновую кислоту
Метаболические взаимоотношения между аминокислотами, о которых
речь пойдет позднее, помогут запомнить структуру остальных амино-
кислот.
В табл. 2-2 включены также значения рКа (см. гл. 4, разд. Б) боко-
вых групп аминокислот. Если концевые амино- и карбоксильные группы
свободны, они тоже могут участвовать в кислотно-основных реакциях;
р/(а этих групп имеет следующие значения:
Концевая —СООН-группа, рКа=3,6—3,7;
Концевая —NHg-группа, рКа = 7,5—7,9.
Поскольку при нейтральных pH —СООН-группы глутаминовой и ас-
парагиновой кислот полностью диссоциированы, в биохимической лите-
ратуре их принято называть глутаматом и аспартатом независимо от
природы присутствующих в среде катионов. Такое же окончание (— ат)
применяется и в случае других кислот — например, малат, оксоалаце-
тат, фосфат, аденилат, что находит отображение и в названии фер-
ментов, например лактатдегидрогеназа.
2. Полипептиды
Последовательность, в которой соединяются мономерные звенья при
полимеризации 100 и более аминокислот, представляет собой первичную
структуру белков. Мономерные звенья цепи называются аминокислот-
ными остатками — в ходе полимеризации каждая аминокислота теряет
молекулу Н2О1. Полипептидная цепь обычно имеет одну свободную ами-
ногруппу на одном конце цепи и свободную карбоксильную группу —
на другом. Однако иногда эти группы связываются одна с другой, что
приводит к образованию циклического пептида. Пептиды называются в
соответствии с составляющими их аминокислотными остатками, начи-
ная от остатка, несущего концевую аминогруппу. Так, Ь-аланил-Ь-ва-
лил-Ь-метионин представляет собой пептид со следующей структурой:
1 Строго говоря, теряется одна молекула воды на пептидную связь, т. е. в сумме
получается на единицу меньше числа аминокислотных остатков.
Молекулы, из которых мы состоим
85
10 20
Ala-Pro-Pro-Ser-Val-Phe-Ala-Glu-Val-Pro-Gin-Ala-Gin-Pro-Vai- Leu-Val-Phe-Lys-Leu- He-Ala-Asp-Phe- Arg'*
30 40 50
GIu-Asp-Pro-Asp-Pro-Arg-Lys-Val-Asn-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Tyr-Arg-Thr-Asp-Asp-Cys-Gln-Pro-Trp-Val-Leu—
60 70
Pro-Vai-Vai-Arg-Lys-Val-Glu-Gln-Arg-Пе-Ala-Asn-Asn-Ser-Ser-Leu-Asn-His-Glu-Ту r-Leu-Pro-lle-Leu-Gly-
80 90 100
Leu-Ala-Glu-Phe-Arg-Thr-Cys-Ala-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Gly-Asp-Asp-Scr-Pro-Ab-Leu-Gln-Glu-Lys-Arg-Val-
110 120
Gly-Gly-Val-Gln-Ser-Leu-Gly-Gly-Thr-Gly-Ala-Leu-Arg-lle-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Ala-Arg-Trp-Tyr-Asn-Gly-
130 140 150
Thr-Asn-Asn-Lys-Asp-Thr-Pro-Val-Tyr-Val-Ser-Ser-Pro-Thr-Trp-Glu-Asn-His-Asp-Gly-Val-Phe-Thr-Thr-Ala-
160 170
Gly-Phe-Lys-Asp-Ile-Arg-Ser-Tyr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Thr-GIu-Lys-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-GIn-Gly-Phe-Leu-Ser-
180 190 200
Asp-Leu-Glu-Asn-Ala-Pro-Glu-Phe-Ser-lle-Phe-Val-Leu-His-Ala-Cys-Ala-H is-Asn-Pro-Thr-GIy-Thr-Asp-Pro-
210 220
Thr-Pro-Glu-Gln-Trp-Lys-Gln-Ile-Ala-Ser-Val-Met-Lys-Arg-Arg-Phe-Leu-Phe-Pro-Phe-Phe-Asp-Ser-Ala-Tyr-
230 240 250
Gln-Gly-Phe-Ala-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Lys-Asp-Ala-Trp-Ala-Ile-Arg-Tyr-Phe-Val-Ser-GIu-Gly-Phe-Glu-Leu-
260 270
Phe-Cys-Ala-GIn-Ser-Phe-Ser-JTyvj-Asn-Phe-Gly-Leu-Tyr-Asn-Glu-Arg-Va!-Glv-Asn-Leu-Thr-Val-Val-Aia-Lys-
280 290 300
Glu-Pro-Asp-Ser-lle-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Gln-Met-Gln-Lys-lle-Val-Arg-Val-Thr-Trp-Ser-Asn-Pro-Pro-Ala-
310 320
Gln-Gly-Ala-Arg-lle-Val-Ala-Arg-Thr-Leu-Ser-Asp-Pro-Glu-Leu •Phe-His-Glu-Trp-Thr-Gly-Asn-Val-Lys-Thr-
330 340 350
Met-Ala-Asp- Arg-Ile-Leu-Ser-Met-Arg-Ser-Glu-Leu- Arg- Ala- Arg-Leu-Glu-Afa-Leu-Lys-Thr-Pro-Gly- Thr-Trp-
360 370
Asn-His-lle-Thr-Asp-Gln-lle-Gly-Met-Phe-Ser-Phe-Thr-Gly-Leu-Asn-Pro-Lys-Gln-Val-GIu-Tyr-Leu-lle-Asn-
380 390 400
Glu-Lys-His-Ue-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ser-Gly-Arg-lJe-Asn-Met-Cys-Gly-Leu-Thr-Thr-Lys-Asn-Leu-Asp-Tyr-Val-
410
Ala-lKr-Ser-Ile-His-Glu-Ala-Val-Thr-Lys-He-Gln
РИС. 2-1. Полная аминокислотная последовательность цитоплазматической аспартат-
аминотрансферазы из сердца свиньи. Состав полипептида: Lys19, His8, Arg26, (Asp+
+Asn)42, Thr26, (Glu+Glnjn, Pro24, Gly28, Ala32, Cys5, Val29, Met6, Uei9, Leu3S, Tyri2,
Phe23, Trp9. Мол. вес одной цепи равен 46 344. Молекула холофермента представляет
собой димер с мол. весом 93 147. Она содержит 2 молекулы связанного с белком ко-
фермента пиридоксальфосфата (гл. 8, разд. Д), присоединенного к лизину, который
заключен на рисунке в рамочку. (Овчинников Ю. и др., FEBS Lett., 29, 31—33, 1973;
Doonan S. et al„ FEBS Lett., 38, 229—233, 1974.)
Заметим, что этот трипептид, как и каждая аминокислота, является
биполярным ионом. Та же структура в сокращенном виде записывает-
ся следующим образом: Ala-Vai-Met. В такой записи N-концевой ами-
нокислотный остаток ставится слева, а С-концевой — справа.
Напомним, что последовательности аминокислот в цепях белков
всегда точно заданы генетически. Знание аминокислотной последова-
тельности очень важно для понимания поведения специфических бел-
ков. По этой причине в последнее время усилия многих биохимиков
направлены на определение последовательностей сотен белков. Одним
из крупных белков, для которых эта задача решена, является у-имму-
ноглобулин человека, содержащий 446 остатков в одной цепи и 214 —
в другой. Полная аминокислотная последовательность другого белка
приведена на рис. 2-1. На рис. 2-2 даны последовательности некоторых
небольших пептидных гормонов и антибиотиков.
86 Глава 2
•S---S-
Cys—Tvr — He—Gin — Asn—Cvs—Pro—Leu—Cly NH2
N-конец С-концевои глицинамид
Окситоцин человека
J' Cvs — Tyr—Phc—Gin — Asn—Cys — Pro—Arg — GIyNH2
Вазопрессин человека
1 Ser — Tvr—Ser — Met — Glu — His—Phc — Arg—Trp—Gly—Lvs — Pro—Vai—Gly — Lys 1?
I
30 Glu—Asp—Glu — Ala —Gly — Asn — Pro—Tyr — Vai — Lys—Vai—Pro—Arg—Arg — Lys
Sei—Ala — Glu — Ala — The — Pro — Leu—Glu — Phe 39
Адренокортикотропин человека (АКТГ)
Тиролиберин (пироглутамил —
гистидилпролинамид ),
вырабатываемый в гипоталамусе
Пироглутамил —His — Trp — Ser — Туг
I
Pro—Arg—Leu—Gly
GlyNH,
Люлиберин
d i Lc—*l-Lcu—>L-Orn—>L-Val—*L-Pro
I 1
L-Pro*—L-Val«— L-Orn-~L-Leu-—D-Phe
Грамицидин S
C—l-G1u—»L-Leu—>D-Leu
L-Val
L-Asp
Сурсрактин
РИС. 2-2. Структура нескольких природных пептидов. Окситоцин и вазопрессин — гор-
моны нейрогипофиза (задней доли гипофиза); адренокортикотропин — гормон адено-
гипофиза (передней доли гипофиза). Гормоны аденогипофиза выделяются под дейст-
вием особых стимулирующих факторов (releasing factors), которые синтезируются в
гипоталамусе в ответ на нервную стимуляцию. Здесь приведена структура двух сти-
мулирующих факторов. Обратите внимание, что у-карбоксильные группы N-концевых
глутаматов в результате взаимодействия с соседней концевой —\тН2-группой образуют
циклические амидные (пироглутамильные) группы. (Guillemin R., Burgus R., Sci. Am..
227, 24—33, Nov. 1972.) Грамицидин S—это антибиотик, синтезируемый бактериями
Bacillus brevis. Сурфактин представляет собой депсипептид (содержащий сложноэфир-
иую связь); это поверхностно-активный антибиотик, синтезируемый бактериями Bacil-
lus subtilus. (Hochster R. M., Kates M., Quastel J. H., eds., Metabolic Inhibitors, Vol. 3,
p. 312, Academic Press, New York, 1973.)
Молекулы, из которых мы состоим
87
3. Конформации пептидных цепей
Рассмотрим цепочку из —СН2 (метиленовых) -групп — такие цепоч-
ки составляют синтетический полимер полиэтилен. Атомы водорода при
углеродах, стоящих в цепи через один, в полностью вытянутой цепи
фактически соприкасаются друг с другом — никаких более крупных
атомов сюда поместить нельзя.
Даже при замещении атомов водорода (вандерваальсов радиус 0,12 нм)
атомами фтора (радиус 0,135 нм) цепь полимера не может остаться
полностью вытянутой. Торсионный угол, равный в полиэтилене 180°, в
полифторэтилене принимает значение 166° — этого изменения достаточ-
но для снятия напряжения в контактах между атомами фтора, и при
этом атомы фтора и соседние атомы углерода еще не мешают друг дру-
гу. Сформировавшаяся в результате спиральная структура напоминает
структурные элементы, встречающиеся в белках и других биополиме-
рах. Итак, образование спиральной конформации — это естественное
следствие взаимного стерического «вытеснения» одних групп атомов
другими [12, 13].
Цепь
Торсионный
Полиэтилен
Торсионный
угол
ровен 166°
Полифторэтилен
Конформационные свойства биополимеров носят сложный характер,
однако все же их значительно упрощает жесткость структуры большин-
ства мономерных звеньев.
а. Пептидное звено
Жесткость полипептидов обусловлена плоским характером пептид-
ных групп, что связано с наличием резонанса
Ожидаемое из-за этого резонанса укорочение связи С—N и удлинение
связи С = О получило экспериментальное подтверждение при рентгено-
структурном анализе данных структур. Каждое пептидное звено можно
изобразить в виде жесткого плоского листка, размеры которого указа-
ны в верхней части рис. 2-3. Правда, расположение связей вокруг ато-
ма азота отчасти сохраняет пирамидальный характер [14, 15] (рис. 2-3,
внизу}.
Глава 2
Этот угол может достигать
значения ±15°.х
Bud вдоль линии С—N-связи
(жирная стрелка в верхней части рисунка)
'ИС. 2-3. Размеры пептидной группы. Указаны межатомные расстояния, а также
лина водородной связи, образуемой с соседней пептидной группой. Все атомы внут-
и пунктирной рамки лежат примерно в одной плоскости. Однако, как показано в
ижней части рисунка, расположение связей вокруг атома азота отчасти сохраняет
пирамидальный характер.
Наиболее распространена трамс-пептидная связь (рис. 2-3), но
стречается и цпс-пептидная связь (она примерно на 8 кДж-моль-1
[енее устойчива, чем первая); цпс-связь чаще всего образуется при
томе азота пролина [16, 17].
цис-Пептидные связи
Полипептид можно рассматривать как цепочку из связанных друг с
ругом плоских пептидных звеньев (рис. 2-4). Каждое пептидное звено
рисоединяется к другому через а-углерод аминокислоты. Этот углерод
бусловливает присутствие в цепи двух одинарных связей, вокруг кото-
ых возможно вращение (исключением служит циклический остаток
ролина). Конформация аминокислотного звена в цепи белка опреде-
яется торсионными углами относительно каждой из упомянутых оди-
арных связей. Эти углы обозначаются через <р и ф и для полностью
ытянутой цепи принимаются равными 180°’, как это показано на
1 Широко используется и другое соглашение, согласно которому в полностью вы-
гнутой цепи ср = ip = 0 [13].
Молекулы, из которых мы состоим 89
рис. 2-4 [18]. Поскольку и ср
и ф могут меняться, аминокис-
лотный остаток в принципе
способен принимать самые
разные конформации. Многие
из них, однако, сразу исключа-
ются, являясь стерически не-
возможными; в этом легко
убедиться с помощью молеку-
лярных моделей.
В наши дни стало привыч-
ным просматривать целиком
всю область возможных зна-
чений <р и ф, используя вычис-
лительные машины. Расчеты
конформации пептидной груп-
пы выполнил Рамачандран.
Результаты такого анализа
часто представляют в виде
графиков зависимости ф от ф
(графиков Рамачандрана, или
конформационных карт), на
которых обводят рамками об-
ласти возможных комбинаций
двух углов. Конформационные
карты пептидов (рис. 2-5) по-
казывают, что число возмож-
ных комбинаций торсионных
углов довольно велико. Су-
щественная часть этих комби-
РИС. 2-4. Две пептидные группы в полностью
вытянутой p-конформации. Торсиовные углы
(ft, ф,- и и, считаются равными 0°, если атомы
главной цепи находятся в заслоненной, или
цис-конформации. В полностью вытянутой це-
пи все эти углы равны 180°.
наций действительно реализуется в белках. Вместе с тем гораздо боль-
ше таких пар углов, которые совершенно исключаются, если не рассмат-
ривать более гибких пептидов, содержащих глицин (рис. 2-5, Б).
В табл. 2-3 приведены приблизительные значения торсионных углов
для ряда пептидов с регулярной структурой.
б. ^-Структура, образуемая вытянутыми участками цепи
Как впервые указал Лайнус Полинг, одним из важных принципов
формирования структуры белков является образование как можно боль-
шего числа водородных связей между группами С = О и N—Н основной
цепи. Простым примером может служить слой уложенных рядом вытя-
нутых цепей (ф=ф=180°), между которыми образованы водородные
связи. Подобную структуру имеет полиглицин — ее до некоторой степе-
ни иллюстрирует рис. 2-6 (вверху слева). Обратите внимание, что на
этом рисунке соседние цепи идут в противоположных направлениях, от-
сюда и название — антипараллельная p-структура. Помимо того что
антипараллельность цепей создает наиболее благоприятные условия
для образования водородных связей между цепями, она еще способст-
вует тому, чтобы цепь повернула и шла назад вдоль самой себя. Это
очень важный фактор при формировании клеточных структур.
Беспрепятственное образование ^-структуры из полностью вытяну-
тых цепей возможно лишь для полиглицина; присутствие боковых (R)
цепей в других аминокислотах неизбежно вызывает искажение струк-
туры. Например, фиброин шелка характеризуется периодичностью
90 Глава 2
РИС. 2-5. А. Рассчитанная Рамачандраном диаграмма (конформационная карта) до-
пустимых значений углов <р и ф. Для двух расположенных слева областей, заключен-
ных в сплошные рамки, стерические ограничения отсутствуют. Обратите внимание,
что в эти области попадают складчатый p-слой, коллагеновая структура и а-спираль.
Области, отмеченные точками, характеризуются наличием небольших стерических
барьеров, однако соответствующие конформации все же могут реализоваться. Б. Гра-
фик Рамачандрана для В-цепей инсулина (гл. 4, разд. Г.7); значения углов ср и ф
получены с помощью построения молекулярных моделей по данным рентгеноструктур-
ного анализа с разрешением 0,19 нм. Большая часть конформаций соответствует ис-
каженной а-спирали или близка к p-структуре. 8, 20 и 23—-.это остатки глицина.
(Blundell Т„ Dodson G., Hodgkin D., Mercola D., Adv. Protein Chem., 26, 279—402,
1972.)
Таблица 2-3
Примерные значения торсионных углов для некоторых
регулярных пептидных структур®
Структура ф Ф
Гипотетическая полностью вытянутая цепь полиглицина —180- + 180°б
р-Поли(L-аланин) в антипараллель- ном складчатом слое —139° + 135°
Параллельный складчатый слой —119° + 113°
Полиглицин II -80° + 150°
Полн(Ь-пролин) II —78° + 149°
Коллаген® —51°, —76°, —45° + 153°, +127°, +1483 4
Правая а-спираль —57° —47°
3 По материалам комиссии IUPAC-IUB по биохимической номенклатуре, Bioche-
mistry, 9, 3471—3479, 1970.
6 Торсионные углы для полностью вытянутой цепи могут быть равным образом
обозначены как +180° или —180°, что полностью эквивалентно одно другому. Для
более удобного сравнения с другими структурами здесь принято, что <р = —180°,
Ф= + 180°.
° Набор из трех углов соответствует трем остаткам, образующим преобладающую
в коллагене повторяющуюся последовательность (Pro-Gly-Pro) n (Yonath A., Traub W.,
JMB, 43, 461—477, 1969.)
Антпипараллельная Параллельная p-стру^ура
РИС. 2-6. Структура складчатого P-слоя, образованного вытянутыми цепями. Слева
показана антнпараллельная структура в фиброине шелка. Периодичность — 0,70 нм —
несколько меньше, чем в полностью вытянутой цепи. Боковые цепи аминокислот (R)
располагаются поочередно то выше, то ниже изображенных на рисунке складок (на-
поминающих меха аккордеона). Пары водородных связей между цепями придают
структуре большую прочность. Цепь может повернуть назад (P-поворот, плп р-изгнб)
н идти вдоль самой себя. В средней точке P-поворота пептидная группа ориентирова-
на почти перпендикулярно плоскости складчатого слоя. Аналогичная структура обра-
зуется из параллельных цепей (справа), хотя в этом случае расположение водород-
ных связей чуть менее выгодно. Внизу приведено стереоизображение пептидного осто-
ва фермента карбоксипептндазы А [26]. Хотя на этом рисунке водородные связи не
показаны п даны лишь положения а-углеродных атомов, все же можно различить во-
семь участков цепи, идущих из левой верхней части молекулы направо вниз. Эти
цепи (среди которых есть и параллельные, и антипараллельные) связаны единой сетью
водородных связей. Рисунок можно рассматривать через специальные стереоскопиче-
ские очки', но после небольшой тренировки стереоизображение удается увидеть и без
очков (этому очень полезно научиться, так как множество молекулярных структур
публикуется теперь в журналах в виде стереоизображений). Поместите хорошо осве-
щенный рисунок на расстоянии 20—30 см от глаз. Расслабьте глаза так, как будто
вы смотрите в бесконечность. Из четырех возникающих изображений два централь-
ных нужно свести в одно, что и дает стереоскопический эффект. Довольно удачная
схема остова цепи в области ^-структуры приведена в книге Днккерсона и Гейса
(стр. 89) [13].
92
Глава 2
0,70 нм, тогда как полностью вытянутая цепь имеет периодичность
0,72 нм (рис. 2-4). Как показали Полинг и Кори, это укорочение цепи
может быть обусловлено изменением угла <р на ~40° (до значения
—140°) и изменением угла ф в противоположном направлении на ~55°
(до значения +135°), в результате чего образуется как бы «гофриро-
ванная» многоцепочечная структура, названная складчатым слоем
(рис. 2-6). В белках нередко встречается и параллельная p-структура.
в. Полиглицин II и коллаген
Известна и другая форма полиглицина, в которой каждый аминокис-
лотный остаток повернут на 120° относительно предыдущего вокруг
винтовой оси 3-го порядка (вид с торца показан на рис. 2-7,Л). Угол
ф для каждого остатка равен примерно 150°, а <р----80°. Смещение
вдоль оси составляет 0,31 нм на остаток, периодичность — 0,93 нм. Мо-
лекулы могут образовывать как правую, так и левую спирали. Группы
N—Н и С=О в такой структуре выступают из спирали перпендикуляр-
но ее оси. При этом, как и в [3-структуре, между соседними цепочками
образуются водородные связи.
Весьма сходную с полиглицином II спиральную структуру имеет
поли (L-пролин). Из-за присутствия больших по размеру боковых групп
более предпочтительной оказывается левая спираль. Надо сказать, что
для полипептидной цепи из L-аминокислот любой способ укладки в спи-
раль будет приводить к разной стабильности правой и левой спиралей.
В организмах животных в очень большом количестве присутствует
коллаген — главный белковый компонент соединительной ткани, базаль-
ных мембран и других структур. Структурной единицей коллагена слу-
жит тропоколлаген, который, как считают, представляет собой отрезок
тройной спирали размером 1,5X280 нм. Он напоминает полиглицин II
(рис. 2-7,Л), но содержит только три цепи. При этом индивидуальные
левоспиральные цепочки оказываются далее скрученными в правую су-
перспираль.
Преобладание в белках какой-то одной аминокислоты — довольно
редкое событие. Коллаген же содержит 33% глицина, 21% приходится
на пролин +оксипролин и 11% составляет аланин. Все дело в том, что
крупные по размеру боковые группы не могут уместиться внутри трой-
ной спирали. То же самое относится и к фиброину шелка, который со-
стоит в основном из периодически повторяющейся последовательности
(—G1 у—Ser—G1 у—А1 а—G1 у—А1 а—) „.
В этом случае при образовании складчатого слоя все боковые группы
серина и аланина оказываются по одну сторону слоя, а в другую обра-
щены лишь атомы водорода глицина. В результате слои прилегают друг
к другу более тесно — боковые цепи аланина и серина одного слоя
встраиваются в промежутки между боковыми цепями аланина и серина
соседнего слоя [19].
г. а-Спираль
Весьма интересный набор конформаций реализуется в том случае,
когда оба угла, <р и ф, близки к —60°. Этой области углов соответству-
ют спиральные структуры, стабилизированные внутрицепочечными во-
дородными связями. Наибольший интерес представляет а-спираль
(рис 2-8), причем правая спираль из L-аминокислот намного стабиль-
нее левой. Пока в природе обнаружены только правые а-спирали. Об-
РИС. 2-7А Структура полиглици
на II и коллагена. Л. Вид на
структуру полиглицина II вдоль
оси спирали. Обратите внимание
иа наличие винтовой оси 3-го по-
рядка. Сходную структуру обра-
зует полипролин, а коллаген, по-
видимому, представляет собой
тройной «канат» из трех пептид-
ных цепей, структура которых то-
же близка к той, что здесь изо-
бражена, однако при этом наблю-
дается правая суперспирализация.
Б. Электронная микрофотография
базальной мембраны (между стрел-
ками) н расположенных ниже кол-
лагеновых фибрилл на срезе ко-
жи земноводного. Нити диамет-
ром 1,5 нм в области базальной
мембраны (указаны стрелками),
по-вндимому, представляют собой
отдельные молекулы тропоколла-
гена, уложенные параллельно, но
с «отставанием на четверть», из-
за чего и возникает периодичность
в 64 нм. Некоторые фибриллы
видны в поперечном сечении (по-
мечены крестиком). (С любезно-
го разрешения Elizabeth D. Нау.)
94
Глава 2
ратите внимание, что в а-спирали все С = О и N—Н-группы, образующие
пептидные связи, примерно параллельны оси спирали; при этом каждая
карбонильная группа образует водородную связь с четвертой по ходу
цепи N—Н-группой. Число аминокислотных остатков на виток спирали
равно 3,61. Шаг спирали (поддающийся экспериментальному определе-
нию с помощью ренпеноструктурного анализа) составляет 0,541 нм.
Роговой слой кожи, волосы, ногти, иглы дикобраза — все эти струк-
туры построены из ряда белков, известных под общим названием кера-
тин. Один из главных компонентов кератина1, так называемый «белок с
низким содержанием серы», состоит из а-спиралей, шаг которых равен
не 0,54 нм, а только 0,51 нм. Такое уменьшение шага объясняется тем,
что две или три правые а-спирали обвиваются одна вокруг другой, фор-
мируя левую суперспираль, которая образует микрофибриллы диамет-
ром около 2,0 нм [19—21]. Считают, что такая же структура лежит в
основе мышечных белков — миозина [22] и тропомиозина [23] (гл. 4,
разд. Е.1). Обычно оба эти белка изображают в виде двунитевых «ка-
натов», в которых гидрофобные боковые группы одной цепи располо-
жены в углублениях на поверхности соседней цепи2.
Встречаются и другие спиральные структуры, диаметр которых мо-
жет быть как больше, так и меньше, чем диаметр а-спирали; они также
играют определенную роль в формировании структуры белков [13].
В спирали Зю на один виток приходится ровно три остатка; каждый
карбонил связан водородной связью с третьей по ходу цепи N—Н-груп-
пой. Таким образом, эта спираль закручена сильнее, чем а-спираль.
л-спираль содержит 4,4 остатка на виток и по диаметру превосходит
а-спираль. Хотя Зю- и л-спирали не относятся к основным структурным
элементам белков, они тем не менее встречаются в них, чаще всего об-
разуя по одному витку на концах спиралей.
4. Глобулярные белки
Большинство белков живой клетки характеризуется значительно
более сложным способом свертывания цепи по сравнению с фибрилляр-
ными белками3. Первым белком, для которого методом рентгенострук-
турного анализа была установлена полная трехмерная структура, стал
миоглобин — небольшой (мол. вес 17 500) кислород-связывающий бе-
лок, присутствующий в мышцах. 153 аминокислотных остатка миоглоби-
на распределено в основном по 8 а-спиральным участкам различной
длины, содержащим от 7 до 26 остатков. Спиральные участки, имеющие
вид прямолинейных стержней, расположены в пространстве весьма не-
регулярным образом, как это показано на рис. 2-8. Рисунок не дает
полного представления о строении белка, поскольку пространство меж-
' Принято считать, что другие белки, входящие в состав кератина, образуют аморф-
ную «матрицу», пронизанную микрофибриллами. Одним из белков «матрицы» является
1«белок с высоким содержанием серы», богатый цистеином и имеющий большое число
поперечных связей. Наиболее богаты цистеином волосы человека.
2 Тенденция к сплетанию и образованию структуры типа «каната» определяется
Тем, что стабилизирующие структуру периодически повторяющиеся связи между це-
почками могут образоваться лишь в том случае, если цепочки обвиваются одна во-
круг другой [23а].
3 Способ укладки пептидной цепи (образование спирали или 0-структуры) часто
Называют вторичной структурой белка. Дальнейшая укладка молекулы, основанная на
взаимодействии групп, далеко отстоящих друг от друга вдоль цепи, приводит к фор-
мированию третичной структуры. Агрегация мономерных белковых субъединиц в оли-
Ьомеры (гл. 4) определяет четвертичную структуру белка.
Молекулы, из которых мы состоим
95
РИС. 2-8. а-Спираль. А. Правая спираль с вер-
тикально расположенными водородными свя-
зями, изображенными в виде пунктирных ли-
ний. Положения боковых цепей аминокислот
указаны цифрами в порядке возрастания от
С-конца к N-концу полипептидной цепи (об-
щепринятым для пептидной цепи является об-
ратное направление — от N-конца к С-кон-
цу. — Перев.) Б. Конформация пептидного ос-
това миоглобина (Kendrew J. С., Sci. Am.,
205, 96—ПО, Dec. 1961). Пять длинных а-спи-
ралей изображены в виде цилиндрических
стержней. Видно еще несколько более корот-
ких спиралей. Полный размер молекулы —
приблизительно 4,4X4,4X2,5 нм.
Шаг спирали равен смещению вдоль оси спирали,
приходящемуся на один витон. Смещение вдоль оси
на один остаток равно шагу спирали, деленному на
число остатков в пределах одного витка; для а-с.лирали
эта величина равна 0,54 /3,6 == 0,15нм
96
Глава 2
ду стержнями и внутри молекулы в действительности целиком заполне-
но боковыми цепями аминокислот, причем почти все они имеют гидро-
фобный характер. Большинство же полярных боковых цепей выступают
из спиралей наружу, в окружающую водную среду.
По мере расшифровки структуры различных белков (особенно в
последние годы) становилось все более очевидным, что глобулярные
белки, как и миоглобин, сохраняют свою структуру преимущественно
благодаря взаимодействию между гидрофобными остатками. Внутри
молекулы белка боковые группы уложены исключительно компактно.
Если где-нибудь в структуре остается свободное пространство, оно
обычно заполняется водой [24, 25]. Например, плотность упаковки (от-
ношение объема, ограниченного вандерваальсовой оболочкой, к полному
объему) молекул лизоцима и рибонуклеазы составляет ~0,75; для
сравнения укажем, что для плотно упакованных сфер теоретическое
значение плотности упаковки равно 0,74. Полярные группы обычно на-
ходятся на поверхности, но иногда бывают «утоплены» внутрь, образуя
водородные связи с другими группами внутри молекулы белка. На от-
дельных участках поверхности встречаются и неполярные боковые цепи,
которые в ряде случаев сгруппированы в гидрофобные кластеры. По-
следние могут обусловливать взаимодействие с другими белками или с
липидными участками мембран.
Миоглобин является в каком-то смысле исключительным белком, по-
скольку у большинства других глобулярных белков содержание «-спи-
ральных участков оказывается сравнительно невысоким. Например, со-
ставленная из 129 остатков цепь лизоцима (рис. 2-9), одного из самых
небольших ферментов (мол. вес 14 600), содержит лишь несколько ко-
ротких спиралей. Цепь лизоцима уложена по большей части сложным и
нерегулярным образом. Обратите внимание на область, содержащую
антипараллельный складчатый [3-слой. Он начинается с участка между
остатками 42 и 45, далее цепь поворачивает назад, формируя петлю
наподобие шпильки, и между остатками 51—54 и 42—45 образуются
водородные связи. Складчатая структура просматривается и в некото-
рых других частях цепи.
Характерной особенностью молекул более крупных белков является
наличие четко выраженной 0-структуры в центральной части молекулы.
Примером может служить фермент карбоксипептидаза А, состоящий из
307 остатков (рис. 2-6, внизу) [26]. 0-Структура, изогнутая в виде лопа-
сти левого пропеллера, образует своеобразную жесткую «основу», к ко-
торой прикрепляются остальные части молекулы. Многие белки содер-
жат как участки, имеющие параллельную 0-структуру, так и участки с
антипараллельной 0-структурой. Для ряда крупных белков, например
для глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (334 остатка), характерно
присутствие четко различимых доменов (двух или более), соединенных
друг с другом «шарнирными» участками . [27]. Преобладающей струк-
турой в каждом из двух доменов является складчатый 0-слой
(рис. 2-10). Обратите внимание, что ЫАП+-связывающий домен имеет
почти всюду параллельную 0-структуру, тогда как «каталитический»
домен содержит как параллельные, так и антипараллельные цепи. Оба
домена имеют а-спиральные участки, расположенные по обе стороны
от центрального слоя.
Если трехмерную структуру лучше всего изображать в виде стерео-
пар, то характер распределения водородных связей внутри молекулы
яснее всего виден на двумерных диаграммах, одна из которых представ-
лена на рис. 2-11.
Молекулы, из которых мы состоим
97
6S
РИС. 2-9. Укладка полипептидиой цепи фермента лизоцима. (Dickerson R. Е., Geis J,
The Structure and Action of Proteins, p. 71. Benjamin, New- York, 1969.) Для большей
части молекулы показаны только места присоединения боковых цепей (атомы а-уг-
лерода). На одном из участков изображены также атомы, участвующие в образова-
нии пептидной связи, что позволяет видеть расположение водородных связей в аити-
параллельиой ф-структуре в центральной части молекулы. Указана одна из а-спира-
лей. Шестиугольники, заштрихованные в средней части, изображают остов полисаха-
ридного субстрата, связанного в «активном центре». Предполагается, что карбоксиль-
ная группа остатка 35 способствует разрыву О—С-связи (жирные стрелки) (гл. 7,
разд. В.4.а). Стрелка слева указывает положение одного из трех дисульфидных мо-
стиков. (В действительности в молекуле лизоцима имеется четыре дисульфидных
мостика. Кроме трех, указанных на рисунке, есть еще мостин между остатками 76 и
94 — на рисунке он должен был бы проходить под молекулой субстрата. — Перев.)
Видны и остальные два мостика — одни находится правее и выше, а другой — левее
и ниже центральной части молекулы.
Исследование синтетических полипептидов, а также анализ извест-
ных белковых структур, полученных с помощью рентгеновской кристал-
лографии, показали, что некоторые аминокислоты, например глутами-
новая кислота, аланин и лейцин, способствуют образованию а-спирали.
Другие аминокислоты, в частности метионин, валин и изолейцин, чаще
|8
Глава 2
РИС. 2-10. Схематическое изображение двух доменов в молекуле глицеральдегидфос-
фатдегидрогеназы (из мышц омара). А. МАО+-связывающий домен. Цифры указыва-
ют номера аминокислотных остатков в последовательности; аВ, аС и т. д., £А, £В
и т. д. обозначают соответственно а-спирали и цепи складчатого fj-слоя. Б. Катали-
тический домен, ориентированный так, чтобы был лучше виден складчатый слой в
области контакта между субъединицами [27].
встречаются в составе ^-структуры, тогда как глицин, пролин и аспа-
рагин обычно расположены в местах изгиба цепи. Напрашивается вы-
вод, что способ укладки полипептида прямо определяется его последо-
вательностью. Так, если в каком-то месте цепи сосредоточено несколько
остатков, способствующих образованию спирали, то образуется спи-
раль. Эта спираль растет в обоих направлениях до тех пор, пока не
«натолкнется» на остатки (например, пролин), препятствующие ее об-
разованию. Подобным же образом, если сгруппированы соответствую-
Молекулы, из которых мы состоим
99
РИС. 2-11. Схематическое изображение системы водородных связей между группами
главной цепи в НАВ+-связывающем домене (остатки 1 —149) глицеральдегидфосфат-
дегидрогеназы [27].
щие остатки, образуется [3-структура. Нерегулярная укладка других
участков цепи приводит к образованию дополнительных водородных
связей и большого числа гидрофобных связей, в особенности характер-
ных для внутримолекулярных областей глобулярных белков.
Теперь, когда известна трехмерная структура многих белков, пыта-
ются предсказывать способ укладки других белковых молекул, исходя
100 Глава 2
из их аминокислотной последовательности [28—30]. Один из таких
методов основан на определении численным методом значений «конфор-
мационных параметров», дающих вероятность нахождения данного ос-
татка в составе спирали, ^-структуры и p-изгиба (табл. 2-4). Согласно
Чоу и Фасману [29], если из шести сгруппированных остатков четыре
способствуют образованию спирали, данную группу можно рассматри-
вать как центр спирализации. От этого центра спираль разрастается в
Таблица 2-4
Классификация аминокислотных остатков по их способности к образованию
1 а-спирали, (3-структуры и |3-изгибаа
Аминокислота P« Тенденция к обра- зованию спирали Тенденция к образо- ванию ft-структуры pt
Glu- 1 ,53 ++ 0,26 анти.-р 0,44
Ala 1 ,45 ++ 0,97 СЛ. 0,57
Leu 1 ,34 1,22 + 0,53
His+ 1,24 + 0,71 анти. 0,69
Met 1,20 + 1 ,67 ++ 0,67
Gin 1 ,17 + 1 ,23 + 0,56
Trp 1,14 + 1 ,19 + 1,11
Vai 1,14 + 1 ,65 ++ 0,30
Phe 1,12 + 1 ,28 + 0,71
Lys+ 1 ,07 сл. 0,74 анти. 1,01
He 1,00 » 1 ,60 ++ 0,58
Asp- 0,98 безр. 0,80 ++ 1,26
Thr 0,82 » 1 ,20 + 1,00
Ser 0,79 » 0,72 анти. 1,56
Arg+ 0,79 » 0,90 безр. 1,00
Cys 0,77 1,30 + 1,17
Asn 0,73 анти. 0,65 анти- 1,68
Tyr 0,61 » 1,29 + 1,25
Pro 0,59 анти. -|- 0,62 анти. 1,54
Gly 0,53 » 0,81 безр. 1,68
• Конформационные параметры Ра, и Pt представляют собой частоты встре-
чаемости данной аминокислоты в составе а-спирали, (3-структуры или (3-изгиба (по
данным для 15 белков с известной структурой), деленные на среднюю частоту встре-
чаемости данной аминокислоты в молекуле. Аминокислотные остатки в таблице рас-
положены в порядке убывания их способности образовывать спираль. Символы «-(—
« + », «сл.», «безр.», «анти.» и «анти.-р» означают, что аминокислота характеризуется
соответственно сильной тенденцией к образованию данной структуры, умеренной тен-
денцией, слабой тенденцией, что ей безразлично, в какой структуре она будет нахо-
диться, что она противодействует нли сильно противодействует образованию структу-
ры данного типа [29].
обоих направлениях, пока ей не встретится тетрапептид из остатков,
препятствующих образованию спирали. Подобным же образом три
остатка из пяти, способствующие образованию (3-структуры, играют
роль затравки для формирования |3-слоя. В этом случае большое зна-
чение имеет возможность образования связей с другими участками це-
пи, отделенными от растущего (3-слоя p-изгибами или участками с нере-
Молекулы, из которых мы состоим 101
гулярной конформацией (статистический клубок). Устраивались даже
своего рода конкурсы, в ходе которых разные группы исследователей
пытались предсказать способ укладки цепи в белках непосредственно
перед определением их структур кристаллографическими методами [31].
Недавно Левитт и Хотиа провели классификацию группы белков, в
которую они включили 31 белок с известной структурой; получились
четыре четко различающиеся структурные группы. (I)- а-Белки, в кото-
рых, как в гемоглобине и миоглобине, преобладают а-спирали.
(II) Белки, построенные из |3-слоев, расположенных один над другим
и образующих многослойную структуру; в эту категорию, в частности,
попадает небольшой белок рубредоксин (рис. 10-4), а также конкана-
валин А (рис. 5-7). (III) (а + р)-Белки, у которых в состав одной и той
же полипептидной цепи входят участки, целиком построенные из
а-спиралей, и участки, целиком состоящие из [3-слоев (как правило, ан-
типараллельных). Примерами таких белков могут служить папаин и
термолизин (гл. 7). (IV) а/р-Белки, в которых а-спирали и p-цепи че-
редуются по ходу полипептидной цепи. Обычно здесь имеется один
центральный p-слой, по обе стороны которого располагаются спираль-
ные участки; такая ситуация имеет место, например, в карбоксипепти-
дазе (рис. 2-6), глицеральдегидфосфатдегидрогеназе (рис. 2-10), а так-
же в гексокиназе и фосфоглицераткиназе (рис. 7-5).
5. Дисульфидные мостики
К характерным особенностям структуры молекулы лизоцима
(рис. 2-9) относится также присутствие четырех поперечных дисульфид-
ных связей (дисульфидных мостиков) между различными участками
цепи. Эти мостики возникают самопроизвольно в тех случаях, когда
—SH-группы двух боковых цепей цистеина подходят близко друг к
другу и окисляются в присутствии О2 или некоторых других реагентов
[уравнение (2-8)]. Дисульфидные связи довольно часто встречаются в
белках, секретируемых клетками, и значительно реже образуются во
внутриклеточных ферментах. Вероятно, внутри клеток ферменты защи-
щены от многих внешних воздействий и не нуждаются в дополнительной
стабилизации.
2—СН2—SH >— Н2С СН2— (2-8)
Xs—S
Один из белков, обладающих наибольшей концентрацией попереч-
ных связей, присутствует в так называемой кератиновой «матрице».
Разрушение дисульфидных связей в этом белке лежит в основе химиче-
ской завивки волос (перманент). Для этого используется какое-либо
тиоловое соединение, под действием которого осуществляется восстано-
вительный разрыв поперечных дисульфидных связей. После укладки
волос окисление на воздухе приводит к образованию новых поперечных
связей.
Немаловажное значение имеет геометрия дисульфидных мостиков.
Торсионный угол при S—S-связи равен, как правило, ^90°, но бывают
и довольно заметные отклонения от этой величины.
^СНг
I
(?)---- СН2
Bud вдоль линии связи S—S
102 Глава 2
6. Размеры и форма молекул белка
Как внутренняя структура белков, так и их размеры и форма могут
сильно различаться. Некоторое представление об имеющихся здесь воз-
можностях дает рис. 2-12, на котором показано несколько способов ук-
ладки полипептидной цепи из 300 аминокислотных остатков. В пол-
ностью вытянутой конформации цепь растягивается до ~ 100 нм. Если
ее сложить 13 раз, то образовавшийся складчатый слой будет иметь
форму квадрата со стороной 7 нм и толщиной около 0,5 нм. Из той же
полипептидной цепи можно получить тонкий а-спиральный стержень
длиной 45 нм и толщиной ~ 1,1 нм. Вместе с двумя другими такими же
цепями (при наличии соответствующего аминокислотного состава) эта
20 НМ
РИС. 2-12. Формы, которые может иметь молекула белка из 300 аминокислотных
остатков (мол. вес —34 500).
Молекулы, из которых мы состоим ЮЗ
цепь может дать тройную спираль коллагенового типа длиной 87 нм и
диаметром ~ 1,5 нм. (Заметим, что это составляет около '/з длины мо-
лекулы тропоколлагена.)
Глобулярные белки заметно различаются по плотности упаковки и
по содержанию гидратационной воды [24, 25]. Однако наиболее типична
для них плотность ~ 1,4 г-см“3. При средней массе остатка в 115 даль-
тон наш полипептид из 300 остатков составит по массе 34 500 дальтон,
или 5,74-10”20 г, и займет объем в 41 нм3. Это может быть куб с ребром
3,45 нм, параллелепипед размерами 1,8X3,6x6,3 нм, сфера диаметром
4,3 нм или же какое-то геометрическое тело весьма неправильной
формы. При расчетах молекулу белка чаще всего представляют в виде
идеализированного эллипсоида или цилиндра.
Полезно сравнить эти размеры с размерами самых мелких клеточ-
ных структур; например, жгутик бактерии имеет диаметр ~ 13 нм, а
толщина клеточной мембраны составляет ~8—10 нм. Из кирпичиков,
эквивалентных по размеру цепи из 300 остатков, могут быть построены
жгутики бактерий или микротрубочки эукариот. а-Спиральный полипеп-
тид может пройти сквозь клеточную мембрану, выступая с обеих сто-
рон, тогда как глобулярный белок с той же длиной цепи целиком
уместится внутри мембраны.
Дополнение 2-А
Белки плазмы крови
Из всех белков лучше всего изучены белки, присутствую-
щие в плазме кровиа’б-в. Простота их выделения и большое
клиническое значение привели к тому, что уже в ранний пери-
од их исследования эти белки были разделены электрофорети-
чески. Электрофорез при pH 8,6 (в барбиталовом буфере)
указывает на присутствие шести главных компонентов. Быст-
рее всех перемещается присутствующий в наибольших количе-
ствах сывороточный альбумин. Далее следуют аг, аг- и р-гло-
булины, фибриноген и у-глобулины. Электрофорез в крах-
мальном геле приводит к расщеплению каждой из этих полос,
так что в конце концов их получается примерно 20. Каждая
из полос содержит, как правило, более одного белка. В общей
сложности выделено и хорошо охарактеризовано свыше 50
белков плазмы крови. В плазме обнаружено примерно 60 фер-
ментов, содержание некоторых из них очень мало — по-види-
мому, их наличие связано с выходом в плазму небольшого ко-
личества внутриклеточных белков.
В норме общее содержание сывороточных белков лежит в
интервале 5,7—8,0 г на 100 мл (~1 мМ). Содержание инди-
видуальных белков варьирует от 3,5—4,5 г на 100 мл для аль-
бумина до нескольких миллиграммов и менее для некоторых
других белков. На втором месте по количеству идут иммуно-
глобулины (дополнение 5-Е); содержание одного из них
(IgG) достигает 1,2—1,8 г на 100 мл. ai-Антитрипсин, аг-мак-
роглобулин, а- и p-липопротеиды, гаптоглобулин, трансфер-
рин и фибриноген присутствуют в количестве более 200 мг на
100 мл.
104 Глава 2
Белки плазмы выполняют множество функций. Одна из
них, присущая в основном сывороточному альбумину, состоит
в поддержании в плазме достаточно высокого осмотического
давления, сравнимого с давлением в цитоплазме клеток. Сы-
вороточный альбумин человека состоит из одной цепи, содер-
жащей 584 аминокислотных остатка; его мол. вес равен
69 000. В молекуле имеются три повторяющиеся гомологичные
области — три домена, каждый из которых содержит шесть
дисульфидных мостиков. Можно предположить, что в ходе
эволюции ген, детерминирующий этот белок, дважды дупли-
цировался1'. Сравнительно низкий молекулярный вес и высокая
плотность отрицательных зарядов на поверхности молекулы
очень помогают сывороточному альбумину в выполнении его
функции, связанной с поддержанием осмотического давления.
Другой важной функцией сывороточных белков является
их транспортная функция. Так, сывороточный альбумин свя-
зывает и переносит многие слаборастворимые продукты мета-
болизма. Трансферрин переносит железо, а церулоплазмин
(аг-белок, см. дополнение 10-3)—медь. Транскортин — это
переносчик стероидных гормонов, в частности кортизола; бе-
лок, связывающий ретинол, является переносчиком витами-
на А, а белки, связывающие кобаламин, переносят витамин
В12. Липопротеиды, подразделяющиеся на три основных клас-
са, переносят фосфолипиды, нейтральные липиды и эфиры
холестеринад. Главным компонентом этих веществ служит ли-
пид. Фракция ai сыворотки содержит липопротеид с высокой
плотностью6. Фракция, идущая непосредственно перед p-бел-
ками, содержит липопротеид с очень низкой плотностью, а в
p-фракции присутствует липопротеид с низкой плотностью.
Все эти белки сейчас интенсивно исследуются. Большой инте-
рес к ним обусловлен их связью с сосудистыми заболевания-
ми, а также с отложением холестерина и других липидов, пе-
реносимых белками плазмы, в атеросклеротических бляшках.
Иммуноглобулины, ингибитор трипсина ai (дополнение
7-В), десяток или больше факторов свертывания крови
(рис. 6-16) и белки системы комплемента (дополнение 5-Ж)
несут защитные функции; этот вопрос будет рассмотрен не-
сколько позже. Гормоны, многие из которых являются белка-
ми (табл. 16-1), присутствуют в крови в процессе их перено-
са к органам-мишеням. Функции целого ряда сывороточных
белков пока не известны. К ним, в частности, относятся мно-
гие гликопротеиды. Концентрация некоторых из них, напри-
мер гаптоглобина (а также аг-макроглобулина), имеет тен-
денцию повышаться при самых разнообразных патологиче-
ских состояниях организма.
а Putnam F. W. ed., The plasma Proteins, 2nd ed., Vols. 1 and 2, Acade-
mic Press, New York, 1975.
6 White A., Handler P., Smith E. L., Principles of Biochemistry, 5th ed.,
Chapter 30, McGraw-Hill, New York, 1973.
B Turner M. W., Hulme B„ The Plasma Proteins: An Introduction, Pitman,
London, 1971.
r Behrens P. Q., Spiekerman A. M., Brown J. R., Fed. Proc., 34, 591
(1975).
д Morrisett J. D., Jackson R. L., Gotto A. M., Jr., Annu. Rev. Biochem.,
44, 183—207 (1975).
e Schonfeld G., Pfleger B„ Roy R., JBC 250, 7943—7950 (1975).
Молекулы, из которых мы состоим 105
7. Конформационные изменения в полипептидах
Полипептидные цепи могут принимать вытянутую конформацию с
образованием водородных связей между участками одной и той же цепи
(p-структура) или находиться в одной из нескольких спиральных форм.
Иногда данный белок принимает то одну, то другую конформацию. До-
вольно характерным примером такого рода служит а-спиральный белок
с низким содержанием серы, входящий в состав волос (разд. Б.З.г). Во-
лос можно очень сильно вытянуть — в этом случае а-спирали раскручи-
ваются и цепь переходит в p-конформацию, причем вместо водородных
связей внутри одной и той же цепи образуются водородные связи меж-
ду цепями.
С растворимыми белками ситуация более сложна, по и в этом слу-
чае цепь может складываться по-разному; здесь также происходит со-
ответствующая перестройка системы водородных связей и гидрофобных
взаимодействий между боковыми группами. Одни конформации, в прин-
ципе возможные для глобулярного белка, более устойчивы, чем дру-
гие, и обычно белок принимает одну из энергетически наиболее выгод-
ных конформаций. Не исключено, однако, и наличие других конформа-
ций с почти той же энергией1. Отсюда следует, что многие белки могут
почти беспрепятственно переходить из одной конформации в другую —
этот факт имеет очень большое биологическое значение.
Конформационные изменения в белках, по всей вероятности, облег-
чаются тем, что некоторые группы, связанные водородными связями,
находятся во внутренней гидрофобной области молекулы белка. Обычно
все «внутренние» атомы водорода, определяющие возможность образо-
вания водородных связей, связаны с соответствующей группой — доно-
ром электронов. Однако, как правило, таких групп больше, чем доступ-
ных атомов водорода, что порождает конкуренцию электроотрицатель-
ных центров за протоны и создает основу для инициации конформаци-
онных изменений [32].
Крайний случай конформационного изменения — денатурация бел-
ков, которая может быть вызвана нагреванием или обработкой различ-
ными реагентами, например сильными кислотами и основаниями, моче-
виной, гуанидингидрохлоридом и додецилсульфатом натрия. Денатура-
ция приводит к развертыванию молекулы белка, и он переходит в бо-
лее или менее разупорядоченное состояние (здесь уже почти нет ни спи-
ралей, ни 0-слоев, ни любых других типов регулярной укладки цепи).
В денатурированном состоянии амидные группы пептидной цепи обра-
зуют водородные связи с окружающими их молекулами воды; таких во-
дородных связей значительно больше, чем внутримолекулярных. Специ-
фическая биологическая активность белка при денатурации теряется,
изменяются и физические свойства, например меняется константа седи-
ментации, вязкость и поглощение света. Легкость, с которой происходит
денатурация белка, и тот факт, что денатурация в принципе обратима,
свидетельствуют о том, что различия в энергии между свернутыми кон-
формациями и открытой конформацией статистического клубка неве-
лики.
Полная денатурация белка долгое время считалась необратимой, но
в 1956 г. Анфинсен показал, что денатурированная рибонуклеаза (гл. 1,
1 Ни одна из вычислительных машин не обладает мощностью, достаточной для
систематического исследования энергий всех конформаций, в которых может находить-
ся простейший белок. Следовательно, высказанное нами утверждение нельзя выразить
количествеиио.
106 Глава 2
разд. Д.2) может самопроизвольно возвращаться к исходному состоя-
нию [33]. Молекула рибонуклеазы, состоящая из 124 остатков, содер-
жит четыре дисульфидных мостика, которые делают ее структуру очень
прочной. Когда эти мостики разрываются в присутствии восстановителя
(разд. 3.3.а), фермент легко денатурирует и инактивируется. Однако
Анфинсен обнаружил, что окисление в соответствующих условиях при-
водит к полному восстановлению активности рибонуклеазы. Очевидно,
молекула способна самопроизвольно свертываться с образованием пра-
вильной конформации — именно той, при которой осуществляется
единственный из 28 возможных способов попарного соединения восьми
—SH -групп, приводящий к образованию нужной четверки дисульфид-
ных мостиков. Этот факт оказал сильное влияние на наши представле-
ния о синтезе белка и свертывании полипептидных цепей с образовани-
ем биологически активных молекул [34, 34а].
Обычно предполагают, что специфическое свертывание полипептид-
ной цепи начинается еще во время ее синтеза на рибосоме. Растущая
цепь свертывается случайным образом и в конце концов принимает наи-
более устойчивую конформацию. По окончании синтеза пептидной це-
пи молекула самопроизвольно складывается в «нативную» конформа-
цию. Однако специфическую биологическую активность белок чаще все-
го приобретает лишь после его модификации другими ферментами, что
иногда приводит к дальнейшему изменению конформации.
В. Сахара и полисахариды
Простейшие сахара (моносахариды) и их олигомеры и полимеры
(полисахариды) составляют один из главных классов клеточных ком-
понентов, объединяемых под общим названием углеводов. Типичным
мономерным звеном служит a-D-глюкоза (а-глюкопираноза)—цик-
лическая форма глюкозы:
Обратите внимание, что этот
атом углерода непосредственно
связан с двумя атомами кис-
лорода; он находится в центре
полуацетальной группы, и его
Ф 11 часто называют аномерным
С атомом углерода
Реакционноспособный
полуацетальный гидроксил
Реакционноспособными группами, участвующими в образовании
связи между мономерами, являются два типа —ОН-групп: полуацеталь-
ная гидроксильная группа плюс еще один гидроксил при любом из
атомов углерода. Разнообразие в типах мономеров и в положениях, по
которым осуществляется связь между ними, приводит к необозримому
множеству полисахаридных структур.
Молекулы, из которых мы состоим Ю7
Сахарные звенья в полисахаридах соединяются посредством
гликозидных (апетальных) связей [уравнение (2-9)]. Уравнение
(2-9) описывает образование дисахарида мальтозы из двух молекул
глюкозы. Дальнейшее присоединение глюкозы в конце концов дает по-
лимер. Символ а-1,4 означает, что в мальтозе гликозидная связь соеди-
няет атом С-1 (аномерный атом углерода) одного сахарного кольца
с атомом С-4 другого кольца, причем конфигурация относительно ано-
мерного атома углерода относится к a-типу (см. следующий раздел).
Функциональными группами полисахаридов являются многочис-
ленные свободные гидроксильные группы, которые иногда вовлекаются
в образование дополнительных гликозидных связей, в результате чего
формируются разветвленные цепи. Кроме того, наличие гидроксильных
групп обеспечивает возможность структурной модификации сахарного
основания еще до полимеризации. В результате полисахарид наряду
с гидроксильными группами может содержать группы •—СООН,
—NH2, сульфат, —NHCOCH3 и другие функциональные группы.
1. Структура и свойства сахаров
Сахара подразделяются на полиоксиальдегиды (альдозы) и полиок-
сикетоны (кетозы). Карбонильная группа обладает высокой реакцион-
ной способностью; типичной реакцией является присоединение групп,
содержащих избыточные электроны, в частности —ОН-группы (гл. 7,
разд. 3). Если сахарная цепочка достаточно длинна (4—6 атомов уг-
108 Глава 2
лерода), к карбонильной группе может присоединяться одна из гидрок-
сильных групп той же молекулы с образованием циклического полуаце-
таля— кольцевой формы, находящейся в равновесии со свобод-
ной альдегидной или кетонной формой [уравнение (2-10)]. Образован-
ные таким образом шестичленные кольца (пиранозные кольца) особен-
но устойчивы, но в некоторых углеводах встречаются и пятичленные
фуранозные кольца. Естественная тенденция пяти- и шестиуглеродных
сахаров (пентоз и гексоз) к циклизации обеспечивает образование ус-
тойчивых полимеров из чрезвычайно реакционноспособных неустойчи-
вых мономеров.
При циклизации сахара возникает новый хиральный центр при ато-
ме углерода (аномерном атоме углерода), ранее входившем в со-
став карбонильной группы. Две конфигурации относительно этого ато-
ма обозначаются как а- и p-конфигурации [уравнение (2-10)]. Равно-
весие для большинства сахаров сдвинуто в сторону образования цикли-
ческих форм. Так, для глюкозы при 25 °C в воде в равновесии содер-
жится ~0,02% свободного альдегида, 38% а-пиранозной формы, 62%
p-пиранозной формы и менее 0,5% каждой из гораздо менее устойчи-
вых фуранозных форм. Хотя полисахариды образованы, как правило,
из циклических остатков, промежуточными метаболическими соедине-
ниями являются иногда формы с открытой цепью.
Сахара содержат несколько хиральных центров, и различным диа-
стереомерам даны разные названия. Так, глюкоза, манноза и галакто-
за— это попросту три из восьми возможных диастереомерных альдо-
гексоз (другими являются аллоза, альтроза, гулоза, идоза и талоза)
[6]. Каждый из этих сахаров представлен парой форм (энантиоме-
ров)— D и L, являющихся зеркальным отображением одна другой.
Для иллюстрации взаимоотношений между сахарами часто пользуются
проекционными формулами Фишера (разд. А.4), как это показано на
рис. 2-13. Проекционные формулы удобны для сопоставления структур
сахаров, но они дают весьма смутное представление о их трехмерной
структуре. Согласно указанию Фишера, вертикальные связи при каж-
дом атоме углерода следует представлять уходящими за данный атом.
В действительности молекула такую конформацию иметь не может.
Сравните, например, трехмерную структуру рибита (разд. А.6), обра-
зующегося при восстановлении глюкозы, с его формулой Фишера.
Молекулы, из которых мы состоим 109
сно
Н — 2С — ОН *----v-манноза (Man) имеет
| противоположную конфигу-
ЫО— 3(р—]-[ рацию относительно
| атома С-2
Н—4С—ОН «--------D -галактоза (Gal) имеет
| противоположную конфигу-
__5Q — ОН рацию относительно
| атома С-4
6СН2ОН
D-глюкоза (Glc);
дана нумерация
атомов
СНО
I
но—с—н
I
н—с—он
I
но—с—н
но—с—н
I
СН2ОН
L-глюкоза
Сахара относят к ъ-
или ъ-семейству
в зависимости от кон-
фигурации относительно
этого атома углерода,
предпоследнего в цепи
СН2ОН
I
С=О
I Ъ-фруктпоза (Рги)-кетоза, близкая по структуре
носн и метаболически родственная п-глюкозе.
| В составе сахарозы (столовый сахар) присутствует
НСОН в виде пятичленного фуранозного кольца
неон
I р
СН2ОН /
СНО СНО 1 сно СНО
1 НСОН НСОН носн НСОН
НСОН носн 1 НСОН носн
1 НСОН 1 НСОН НСОН носн
1 СН2ОН 1 СН2ОН 1 СН2ОН СН2ОН
ъ-рибоза (Rib), компонент РНК п-ксилоза (Xyl), входит в состав древесины п-ара^иноза (Ага) Р-араёиноза, широко распространенная пентоза, имеющая „ неестественную"
и-конфигу рацию
РИС. 2-13. Структурные формулы некоторых сахаров (моносахаридов) согласно пра-
вилу Фишера.
Моносахариды относятся к D- или L-форме в зависимости от кон-
фигурации относительно хирального центра, наиболее удаленного от
карбонильной группы (рис. 2-13). Если в молекуле сахара, ориентиро-
ванной по правилу Фишера, —ОН-группа при этом атоме углерода на-
ходится справа, то сахар относят к D-семейству. Простейшим из всех
хиральных сахаров является глицеральдегид.
7,О
НС'
I
н—с—он
I
сн2он
D-глицеральдегид
110 Глава 2
Циклические формы сахаров часто тоже изображают в соответствии с
правилом Фишера. Например, a-D-глюкопираноза выглядит так:
Н — С—ОН
I
н—с—он
но—с—н °
н—с—он
н— с-------
снрн
ос-ъ-глюкопираноза
При данном способе изображения гидроксил при аномерном атоме уг-
лерода в молекуле a-формы у семейства D-сахаров находится справа,
а у семейства L-сахаров — слева. Таким образом, a-D-глюкопираноза
л a-L-глюкопираноза являются энантиомерами.
Чтобы упростить изображение конфигурации циклических сахаров,
часто применяют структурные формулы Хеуорса:
он
а- п-глюкопираноза
( хеуорсова структурная
формула)
Нижнюю часть кольца (жирные линии) нужно представлять выступаю-
щей к наблюдателю, противоположный же край — лежащим за плос-
костью рисунка. Структуры Хеуорса довольно просто рисовать, они од-
нозначно указывают конфигурацию, но не отображают взаимного про-
странственного расположения групп, присоединенных к кольцу. По
этой причине часто применяются конформационные формулы, представ-
ленные на рис. 2-14.
Большинство сахаров имеет конформацию кресла, при которой
большая часть замещающих групп располагается в экваториальной
плоскости. Для D-альдоз обычно наблюдается «С1»-конформация
(стр. 108), тогда как для L-альдоз характерна иная форма кресла
(форма «1С»), Из этого правила имеются исключения. Так, a-D-идо-
пираноза, по-видимому, принимает 1С-конформацию. Полезно также
отметить, что в кольцах для замещающих групп при аномерном атоме
углерода предпочтительной оказывается аксиальная ориентация [35].
Молекулы, из которых мы состоим
111
НО *— Разветвленные цепи крахмала (в амилопектине и гликогене)
i 6 | имеют точки ветвления в этих положениях
сх-Р-глюкоза (Glc)
Амилоза, линейный крахмал, содержит только
а-1,^-гликозидные связи, в образовании
которых участвуют группы, указанные
стрелками
р-ъ-глюкуроновой кислоты (GlcUA), входящей
многих мукополисахаридов, обведенная
группа замещена на С00*
Зта —ОН-группа в 2-ацетамид - 2-дезокси-
-D-глюкозе ( Ы-ацетилглюкозамине, GlcNAc),
/З-Ъ-глюкоза
(в целлюлозе)
мономерном звене хитина, замещена на
—
\
сна
/3-р-ксилоза
Анион мурамовой кислоты,
О-лактил-GlcNAc (Mur)
растительных ксиланов
З-о-фруктофураноза (Fru)
N-а цетил ней ра миновал
(сиаловая) кислот'1
РИС. 2-14. Структура некоторых циклических сахаров, входящих в состав полисаха-
ридов.
Восстановление карбонильной группы сахара (например, боргидри-
дом натрия) приводит к образованию сахарного спирта, например ри-
бита (разд. А.6) или сорбита [он получается при восстановлении глю-
козы; уравнение (11-8)]. Альдегидные группы альдоз могут окислять-
112 Глава 2
ся множеством реагентов, образуя карбоновые кислоты, известные как
альдоновые кислоты. Этим объясняется редуцирующий характер аль-
доз. Например, в щелочной среде альдозы восстанавливают ионы одно-
валентной меди до закиси меди, ионы серебра — до свободного метал-
ла, феррицианид — до ферроцианида. Последняя реакция может послу-
жить основой для создания чувствительного аналитического метода.
Даже с учетом того, что альдозы в основном существуют в форме по-
луацеталей [уравнение (2-10)], их восстановительные свойства совер-
шенно очевидны. В то время как восстановление реагентами, содержа-
щими металл, обычно проходит через образование свободного альдеги-
да, окисление гипобромитом (Вг2 в щелочной среде) приводит к обра-
зованию лактона, как это наблюдается, например, в ферментативной
реакции, описываемой уравнением (а), табл. 8-4.
Многие производные сахаров встречаются в природе. Среди них
можно назвать альдоновые кислоты [например, 6-фосфоглюконовая
кислота; уравнение (9-12)], а также уроновые кислоты, содержащие
—СООН-группу в концевом положении (в положении 6 глюкуроновой
кислоты; рис. 2-14). Группа —ОН во 2-м положении молекулы глюко-
зы может быть замещена на —NH2-rpynny с образованием 2-амино-2-
дезоксиглюкозы, обычно именуемой глюкозамином (GlcN), или на
—NH—СО—СНз-группу с образованием N-ацетилглюкозамина
(GlcNAc). Аналогичные производные есть и для других сахаров. Во
многих полисахаридах к сахарным звеньям посредством эфирной связи
присоединены сульфатные группы.
Широко распространены два 6-дезоксисахара (лишенные кислорода
при атоме С-6)—рамноза и фукоза1. Оба имеют «неестественную»
L-конфигурацию, хотя метаболически происходят соответственно от
D-глюкозы и D-маннозы.
СНО СНО
I I
Н—С—ОН НО—С—Н
I I
Н—С—ОН Н—С—он
I I
но—С—Н Н—С—он
но—С—Н но—с—н
СН3 (1нз
L-рамноза (Rha) L-фукоза (Fuc)
2. Олигосахариды
Для метаболизма растений и животных большое значение имеют
дисахариды и другие олигосахариды, состоящие из небольшого числа
мономерных звеньев. Примерами служат лактоза (содержащаяся в мо-
локе), сахароза (в зеленых растениях) и трегалоза (в грибах).
Если в свободных сахарах циклические а- и p-формы легко превра-
щаются одна в другую, то при образовании гликозидной связи конфигу-
рация относительно аномерного атома углерода становится «заморо-
женной». Для описания гликозидной связи требуется указать эту кон-
фигурацию и те положения, по которым соединяются кольца [см.
уравнение (2-9)]. Так, лактозу можно представить как дисахарид, со-
держащий одно галактозное звено в ^-пиранозной циклической форме,
1 Этот тип соединений называется также 5-метилпеитозами. — Прим. ред.
Молекулы, из которых мы состоим 113
соединенное через аномерный атом углерода (С-1) с 4-м положением
глюкозы (р-1,4-связь):
но он
D-галактоза D-глюкоза
се-Лактоза
Обратите внимание на а-конфигурацию
указанного стрелкой „редуцирующего
конца" сс-лактозы
Систематическое наименование а-лактозы — O-p-D-галактопиранозил-
(1—М)-a-D-глюкопираноза —полностью описывает стереохимию соеди-
нения, указывает размеры колец и способ их соединения. Сокращенная
запись имеет следующий вид: p-D-Galp-(l—>4)-a-D-Glcp. Мальтоза
записывается как a-D-Glcp-(l—>4)-a-D-Glcp. Поскольку чаще всего
встречаются именно пиранозные кольца и при этом большая часть при-
родных сахаров относится к D-семейству, символы D и р в таких запи-
сях обычно опускаются. Далее в этой книге (если отсутствуют специ-
альные указания) мы будем рассматривать только D-сахара. Иногда
даже после установления последовательности сахарных остатков в по-
лисахариде способ их связывания остается неопределенным: в этом слу-
чае пользуются неполными сокращенными формулами.
Обратите внимание, что на рисунке, изображающем структуру лак-
тозы, кольцо глюкозы «перевернуто» по отношению к галактозному
кольцу — это обусловлено наличием между ними р-1,4-связи. При изо-
бражении мальтозы, у которой связь относится к типу а-1,4, оба коль-
ца даются в одной и той же ориентации [уравнение (2-9)].
В молекуле лактозы кольцо глюкозы может раскрыться с перехо-
дом в альдегидную форму, которая (в растворе) находится в равнове-
сии с другими кольцевыми формами. Поэтому само по себе название
«лактоза» не означает, что глюкозная часть молекулы имеет фиксиро-
ванную циклическую структуру. Таким образом, формула лактозы со-
кращенно может быть записана так: pGall-(1—>4)-Glc. (Отметим, что
в кристаллической форме лактоза находится либо в а-, либо в р-конфи-
Сахароза [а61ср-( !—2)-/3Fruf]
сс.а-Трегалоза [aGlc/>-(T~.1)aGlc/>]
Q__1Я91
114 Глава 2
гурации1.) С другой стороны, в сахарозе и трегалозе два кольца соеди-
нены через редуцирующие группы. Эти молекулы находятся в какой-то
одной форме.
3. Полисахариды
Полимеры сахаров присутствуют во всех клетках и выполняют мно-
жество функций. Так, целлюлоза придает прочность зеленым растени-
ям, хитин обусловливает прочность скелета членистоногих. Гиалуроно-
вые кислоты и другие мукополисахариды образуют защитную прослой-
ку между животными клетками, а пектины и родственные полисаха-
риды играют аналогичную роль в растениях. Клеточные поверхности
обычно покрыты слоем полисахаридов самой разной структуры. Разли-
чия в структуре полисахаридов, составляющих этот наружный слой,
весьма важны, поскольку обусловливают иммунологическую индивиду-
альность организмов. Крахмал, гликоген и другие запасные полисаха-
риды представляют собой легко мобилизуемые пищевые ресурсы кле-
ток [35 а].
Один из компонентов растительного крахмала, амилоза, — это ли-
нейный полимер, состоящий из многих a-D-глюкопиранозных звеньев,
которые соединены друг с другом посредством 1,4-связи. В гранулах
крахмала всегда содержится и второй компонент, амилопектин2. И ами-
лопектин, и гликоген (животный крахмал) состоят из сильно разветв-
ленных молекул. Ветви присоединены к а-1,4-цепям посредством а-1,6-
связей (рис. 2-14 и 2-15). Некоторые бактерии, например Leuconostoc
mesenteroides, синтезируют линейную (1—*6)-поли-П-глюкозу, или дек-
стран; ряд видов присоединяет ветви посредством а-1,4- или а-1,3-свя-
зей. Декстраны, синтезируемые бактериями, обитающими на поверхно-
стях зубов, являются компонентами налета на зубах. Декстраны про-
изводятся в промышленном масштабе; после химической обработки,
«наделяющей» их множеством поперечных связей, образуются гели
(коммерческое название их «сефадекс»), широко используемые в био-
химических лабораториях для разделения смесей разных молекул
(разд. 3.1.г).
Целлюлоза — это, пожалуй, самый распространенный на земле угле-
вод (растения производят ее в количестве ~1014 кг в год); он пред-
ставляет собой полиглюкозу, образованную с помощью р-1,4-связей.
Хитин, другой весьма распространенный полисахарид, содержится в
клеточных стенках грибов и в наружном скелете членистоногих. Это
линейный р-1,4-полимер N-ацетилглюкозамина, структурно сходный с
целлюлозой. Пектины представляют собой р-1,4-полигалактуроновые
кислоты, в которых ряд карбоксильных групп метилирован.
Клеточные стенки дрожжей содержат полимеры маннозы (манна-
ны); в них от главной а-1,6-цепи отходят короткие ветви (из 1—3 ман-
нозных звена), соединенные а-1,2- и а-1,3-связями. Кроме целлюлозы,
все растения содержат ксиланы, которые состоят преимущественно из
Р-1,4-ксилопиранозных цепей. Отметим, что ксилоза, представляющая
собой пятиуглеродный сахар, в этом полимере принимает форму шести-
членного пиранозного кольца. С другой стороны, фруктоза, шестиугле-
родный сахар, в инулине, запасном полисахариде иерусалимского арти-
1 a-Лактоза более растворима и имеет более сладкий вкус, чем р-лактоза. В мо-
роженом при продолжительном хранении р-лактоза может кристаллизоваться, отчего
оно становится «рассыпчатым».
2 Некоторые виды крахмала, в частности крахмал «восковой» кукурузы, содер-
"',”р „ишь амилопектин и не содержат амилозы.
Молекулы, из которых мы состоим 115
шока, присутствует в форме пятичленных фуранозных колец. Эти раз-
личия обусловлены различиями в путях биосинтеза. Пиранозные коль-
ца термодинамически более устойчивы, чем фуранозные. Последние
образуются в инулине и сахарозе, поскольку их биосинтез проходит
через 6-фосфатный эфир фруктозы.
РИС. 2-15. Схематическое изображение молекулы гликогена. А. Структура участка мо-
лекулы гликогена по Мейеру (Meyer К- Н., Adv. Enzymol., 3, 109—136, 1943). Круж-
ки обозначают остатки глюкозы, соединенные а-1,4-связями или (в точках ветвления)
а-1,6-связями. Перечеркнутый кружок обозначает редуцирующую группу. [French D.r
in: Symposium on Foods: Carbohydrates and Their Roles (H. W. Schulz ed.), pp. 26—
54. Avi Pub]., Westport, Connecticut, 1969.] Б. Двумерная схема молекулы гликогена
с мол. весом 760 000, содержащей ~4700 остатков глюкозы (штриховая линия —
внешние контуры молекулы). При обработке Р-амилазой (гл. 7, разд. В.6) получается
«остаточный декстрин» с мол. весом ~410 000, который на рисунке представлен круж-
ками и соединяющими их линиями. Буквами М обозначены сильно ветвящиеся участ-
ки, которые соединены друг с другом участками с малым числом точек ветвления. Под.
действием а-амилазы (гл. 7, разд. В.6) М-участки частично разрушаются с образова-
нием остаточных декстринов, содержащих в среднем по 34 остатка глюкозы. (Bram-
mer G. A., Rougvie М. A., French D., Carbohyd. Res., 24, 343—354, 1972.)
Ряд полисахаридов, включая различные виды крахмала, содержит
один редуцирующий конец, что обусловливает возможность раскрытия-
кольца и образования свободной альдегидной группы, обладающей вос-
становительными свойствами. В других случаях редуцирующий коней,
«заблокирован». Один из видов такой блокировки (реализуемой, как
предполагается, в инулине) состоит в том, что конец цепи имеет струк-
туру сахарозы. В других полисахаридах возможно присутствие конце-
вой трегалозы. Встречаются циклические полисахариды, сахарные цепи
которых замкнуты в кольцо и вообще не имеют свободного редуцирую-
щего конца. Эти полисахариды, как правило, присоединены к молеку-
лам белка или липида.
Во многих полисахаридах повторяющимися единицами являются
мономеры разного типа. В некоторых из таких гетерополисахаридов:
имеет место простое чередование двух сахаров [36, 37]. Примерами
служат гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты и дерматансуль-
фат— важные компоненты основного вещества, присутствующего в
межклеточном пространстве соединительной ткани и выполняющего
роль цементирующего материала. Гиалуроновая кислота — это поли-
мер, в котором чередуются глюкуроновая кислота и N-ацетилглюкоза-
мин; структура этого полимера изображена на рис. 2-16, Хондроитин-
116 Глава 2
В дерматансульфате
имеет место обратная
конфигурация \
В хондроитине и дерматане имеет месте
обратная конфигурация;
в хондроитин-4-сульфате и дерматансульфате здесь
имеется сулыроэфирная связь
В хондроитин-6-сульфате здесь
имеется сульфоэфирная связь
ООС
СН2!ОН1
NH
т>-глн>куроновая кислота
N-оцетил -р-глюкозамин
Гиалуроновая кислота [-/JGlcUA (1—»3)j3GlcNAc-(l~»4)-]„
Хондроитин [jBGlcU А-(1—> 3)-/3GalN Ас-(1~> 4)-]п
Дерматансульфат ^-a-L-идуроновся кислота-(\—3)-GalNAc-4-cyawpcm-(l— 4)-]п
А
Гиалуроновая
кислота
— Связующий
белок
Кератансульфат
Хондроитинсульфат
ши*
Субъединицы
*— Центральный
белок
Б
РИС 2-16 А Повторяющиеся дисахаридные звенья гиалуроновой кислоты и родст-
венных мукополисахаридов. Б. Предполагаемая схема строения протеогликановых
агрегатов в хрящевых тканях, на которой указано расположение молекулы гиалу-
Молекулы, из которых мы состоим 117
сульфаты и дерматансульфат имеют аналогичное строение, но в первом
случае в состав полисахарида входит N-ацетилгалактозамин, а во вто-
ром— a-L-идуроновая кислота; кроме того, в положениях, указанных
на рис. 2-16, находятся сульфоэфирные группы.
Гепарин представляет собой мукополисахарид с антикоагуляцион-
ными свойствами, секретируемый в кровь тучными клетками, присут-
ствующими в легких, печени и других тканях. Этот линейный полиса-
харид, по всей вероятности, содержит дисахаридные звенья следующего
типа: [—уроновая кислота-(1—>4)-С1сМ-2,6-дисульфат-(1—>4)—]„.
Обе аминогруппы и 6-гидроксилы остатков глюкозамина несут сульфат-
ные группы. В некоторых звеньях встречается D-глюкуроновая кисло-
та, присоединенная посредством а-1,4-связи, однако наиболее часто в
роли первого звена дисахарида выступает (L-идуроновая кислота)-2-
сульфат [38].
Кератаны кожи в качестве повторяющегося звена содержат
[—0Gal-(l—>14)-рGlcNAc-6-сульфат-(1—>3)—]п или точно такую же
структуру, но содержащую галактозаминсульфат. Из-за присутствия
карбоксилатных и сульфатных групп все эти полимеры несут большое
число отрицательных зарядов.
4. Пептидогликаны и гликопротеиды
Многие простые гетерополисахариды в действительности являются
протеогликанами, в которых концевое звено полисахарида ковалентно
присоединено через О-гликозидную связь к сериновому остатку в бел-
ке [39—43]. Так, полная структура хондроитинсульфата имеет следую-
щий вид:
Повторяющаяся единица
y3GlcllA-(t—*3)-GalNAc-(1-4)/3GlcUA-(l->3)-y3Gal- (1— 3)-/3Gal- (1 -^4)-/3Xyl/>
Серия
(в белке)
Таким же образом присоединены к белкам дерматансульфат и гепа-
рин [43].
Небольшие олигосахаридные группы часто присоединены к белкам,
находящимся на поверхности клеток, а также к секретируемым бел-
кам. Сахарные цепи прикреплены через О-гликозидную связь к —ОН-
группам остатков серина, треонина и оксилизина (только в коллагене)
или через N-гликозидную связь к амидному азоту аспарагина [43а].
Среди таких гликопротеидов встречаются ферменты, гормоны и струк-
роновой кислоты, а также хондроитинсульфата и кератансульфата. Последние кова-
лентно связаны с белком, образующим центральную часть субъединицы протеогли-
кана; единый протеогликановый агрегат образуется путем присоединения этих субъ-
единиц к молекуле гиалуроновой кислоты. Рисунок выполнен с примерным соблюде-
нием пропорций, за исключением того, что длины цепей хондроитинсульфата изобра-
жены почти наполовину укороченными. [Rosenberg L., in: Dynamics of Connective
Tissue Macromolecules (P. M. C. Burleigh and A. R. Poole, eds.), p. 107, North-Holland,
Amsterdam, 1975.] Такие мукополисахаридные цепи могут электростатически взаимо-
действовать с находящимся в хрящах коллагеном. В. Электронная микрофотография
(негативный контраст) протеогликанового агрегата из бычьего суставного хряща
(расположенного на несущих поверхностях суставов). Волокнистый остов состоит из
гиалуроновой кислоты (см. рис. 5), от остова отходят протеогликановые субъединицы
(индивидуальные полисахаридные цепи не видны). [386]. (С любезного разрешения
L. Rosenberg.)
118 Глава 2
турные белки. В большинстве случаев функция этой углеводной части
остается неизвестной, но в муцинах, выполняющих роль смазки, при-
сутствие большого числа отрицательно заряженных групп сиаловой
кислоты, по-видимому, обусловливает образование жесткой разверну-
той структуры, что сильно повышает вязкость белка [41].
В некоторых муцинах содержание углеводов превышает 50%; напри-
мер, в подчелюстной железе овцы на молекулу белка приходится до
800 цепей вида [a-D-N-ацетилнейраминовая кислота-(2—>-6)-a-D-
GlcNAc-], присоединенных к белку через остатки серина и треонина
[40]. Другие гликопротеиды содержат только одну или несколько угле-
водных цепей. Молекулы яичного альбумина (мол. вес. ~44 500) из ку-
риных яиц имеют каждая по одной углеродной цепи. При этом встреча-
ется по меньшей мере пять различных олигосахаридов следующего ти-
па [39]:
aMan-(l->4)-pGlcNAc-(l->4)-flGlcNAc-N-Asp (белок)
I н
(GlcNAc)---------(Man) 4 или 5
0,1 или 2 |
(GlcNAc) 0 или 1
Подобные углеводные группы присутствуют в таких ферментах, как
бычья рибонуклеаза и рибонуклеаза свиньи, а-амилаза (Aspergillus
oryzae) и бромелаин (ананас) [44]. Гликопротеиды, входящие в состав
сыворотки антарктических рыб, оказываются необыкновенно эффектив-
ными антифризами [45—47].
5. Конформация полисахаридных цепей
Несмотря на все многообразие мономерных звеньев и типов их свя-
зывания, конформационные возможности углеводных цепей довольно
ограниченны. Сахарное кольцо представляет собой жесткую структур-
ную единицу, и соединение двух колец может быть описано двумя тор-
сионными углами, (риф, подобно тому как это делается для пептидов
[48, 49]. Правда, четкие соглашения по поводу того, какой конформа-
ции полисахарида должны соответствовать значения (риф, равные 0°,
отсутствуют. Вообще говоря, имеется примерное общее правило такого
рода для всех полимеров [18], но оно очень неудобно, когда речь идет
о полисахаридах. По-видимому, лучше всего считать, что ф и ф равны
0°, если плоскости, разделяющие сахарные кольца пополам, копла-
нарны:
Эти плоскости проходят через атомы, отмеченные на рисунке звездоч-
ками, и в общем случае не перпендикулярны плоскости колец. Систе-
матическое исследование возможных значений <р и ф для целлюлозы
Молекулы, из которых мы состоим 119
(поли-р-П-глюкозы) показывает, что эти углы ограничены очень узким
интервалом значений, при которых расположение мономерных звеньев
отвечает почти полностью вытянутой конформации.
Целлюлоза
Каждое звено глюкозы оказывается повернутым относительно пре-
дыдущего на 180°. Полимер имеет винтовую ось второго порядка,
причем плоскости колец идут с небольшим зигзагом [50, 51]. Напом-
ним, что у глюкозы в конформации кресла все ОН-группы лежат в эк-
ваториальной плоскости и способны образовывать водородные связи с
соседними цепями. Эта особенность вместе с жесткостью конформации,
обусловленной p-конфигурацией мономерных звеньев, несомненно, объяс-
няет способность целлюлозы к формированию прочных волокон.
В крахмале и гликогене цепь тоже образована остатками глюкозы,
но на этот раз используется а-1,4-связь. Вытянутая конформация уже
невозможна, и цепи скручиваются в спираль. Из спиральных структур,
образуемых биополимерами, одной из первых (в 1943 г.) [52] была от-
крыта левая спираль амилозы, идущая вокруг молекул иода (12) в хо-
рошо известном комплексе иода с крахмалом (рис. 2-17). Число остат-
ков на виток равно 6, шаг спирали — 0,8 нм, диаметр — около 14 нм
[53, 54].
Для амилозы была предложена еще одна структура — более сильно
закрученная двойная спираль [55]. Предполагается, что в такой спи-
рали каждая цепь содержит 6 остатков на виток и обе цепи идут либо
в том же, либо в противоположных направлениях. Молекула амилозы
содержит в среднем 1000 остатков глюкозы и может быть вытянута в
тонкую цепь 500 нм длиной, что превышает размеры кристаллических
областей в гранулах крахмала. Следовательно, цепи в гранулах долж-
ны как-то складываться (например, в виде шпилек):
Укладка перазветвленных молекул крахмала
в виде шпилек с образованием кристаллической
структуры [56]
Агароза (мол. вес. ——120 000) представляет собой углеводный поли-
мер с чередующейся последовательностью звеньев.
Агароза
—/З-D-Gal - (1 —* 4) -3,6 -ангидро -«-i.-Gal-(l — 3)—]—
120 Глава 2
Она является главным компонентом агара и определяет в значительной
мере способность этого замечательного вещества образовывать гель.
Возможно образование твердого агарового геля, содержащего 99,5%
воды. Молекулярная структура агарозы строится на основе левой двой-
ной спирали, имеющей винтовую ось третьего порядка; шаг спирали
РИС. 2-17. А. Структура спирального комплекса амилозы с иодом (12). Молекулы
иода располагаются вдоль оси спирали, образуемой остатками глюкозы, по шесть
остатков на виток. Б. Модель двойной спирали, составленной из двух параллельных
цепей. В каждой цепи содержится по 6 остатков глюкозы на виток. Периодичность,
согласно модели, равна 2,1 нм (через 6 остатков глюкозы вдоль любой цепи). (С лю-
безного разрешения D. French.)
равен 1,90 нм, ее внутренняя полость заполнена водой [57]. Сходную
структуру имеют гельобразуюшие карагенаны из красных морских во-
дорослей. По рентгеновским данным, в этом случае три дисахаридных
звена образуют один виток правой спирали с шагом 2,6 нм. Вторая
цепь идет параллельно, но со сдвигом на полоборота, накручиваясь на
первую спираль [58]. В местах пересечения двуспиральных областей
образуются «узлы», которые представляют собой центры гелеобразо-
вания [59] (рис. 2-18). В боковом направлении попарно отходят суль-
фатные группы, служащие местом связывания ионов кальция, которые
стабилизируют гель.
Молекулы, из которых мы состоим 121
РИС.2-18. Схематическое изображение сетчатой структуры агарозного геля (справа)
и показанной для сравнения сетки из беспорядочно свернутых цепей (такая сетка,
в частности, характерна для сефадекса). Агарозные гели содержат агрегаты из 10—
104 спиралей; меньшее же число спиралей, как это показано здесь, обычно не наблю-
дается [58].
Эпизодическое появление в этих полимерах избыточных сульфатных
групп порождает изломы цепи (так как модифицированные пиранозные
кольца принимают конформацию кресла другого типа). Эти изломы
препятствуют образованию полисахаридом единой регулярной спира-
ли [59а].
L-карагенан: —^-/З-о-вгЛ-Л-сульфат-
(I —4)-3/6-a?7SLtdpo-oc-D-GaI-2-сульфот-(1 — 3) Тг'
Ксилан высших растений, р-1,3-полимер D-ксилозы, по-видимому,
представляет собой трехцепочечную правую тройную спираль [60].
Предполагается, что гиалуроновая кислота имеет двуспиральную
структуру [61]. Хондроитинсульфаты состоят из одиночных спиралей
различного типа [62].
Дополнение 2-Б
Кремний — необходимый микроэлемент
Общеизвестно, что в клетках диатомовых водорослей, ске-
лет которых построен из S1O2, идет активный метаболизм
кремния. Накапливать кремний способны радиолярии, неко-
торые высшие растения и губки; у моллюсков, именуемых
блюдечками, он составляет основу зубцов3. Несмотря на все
122 Глава 2
эти факты, метаболизм кремния не очень интересовал иссле-
дователей, и лишь недавно было показано, что этот элемент
-жизненно важен для роста и развития высших животных6 ^,
в частности у цыплят кремний обнаружен в местах активно-
го обызвествления формирующихся костейг. Во внутренних
органах млекопитающих кремний присутствует лишь в не-
больших количествах, однако в коже, хрящах и связках его
содержание достигает —0,01 %. Шварца установил, что крем-
ний входит в состав мукополисахаридов, таких, как хондрои-
тин-4-сульфат, дерматансульфат и гепаринсульфат. Все они
содержат ——0,04% кремния, т. е. на 130—280 повторяющихся
звеньев полисахаридов приходится один атом этого элемента.
У представителей растительного царства содержание крем-
ния в пектинах примерно в пять раз выше. Кремний в поли-
сахаридах очень прочно связан, по-видимому, посредством
эфирной связи. Шварц предположил, что ортокремневая кис-
лота Si (ОН) 4 реагирует с гидроксильными группами углево-
дов, в результате чего образуются эфирные связи, которые
могут играть роль мостиков между цепями:
ОН ОН ОН
I I I
Rj—О—Si—О—R2 R,—О—Si—О—Si—О—R2
I X * 1
он он он
Отметим, что в каждой из этих структур имеются незамещен-
ные ОН-группы при атоме кремния, вследствие чего сразу
между несколькими полисахаридными цепями могут образо-
вываться поперечные связи. Исходя из этих результатов, но-
сящих, правда, предварительный характер, можно предполо-
жить, что биологическая роль кремния в соединительной тка-
ни состоит в его способности обеспечивать образование попе-
речных связей (см. также гл. 11, разд. Д.З).
а Schwarz К-, PNAS, 70, 1608—1612 (1973).
6 Schwarz К- In: Trace Element Metabolism in Animals (Mills F., ed.),
pp. 25—38, Livingstone, Edinburgh, 1970.
° Schwarz K-, Milne D. B„ Nature (London), 239, 333—334 (1972).
r Carlisle E. M„ Science, 178, 619—621 (1972).
д Hoekstra W. H., Suttle J. W., Ganther H. E., Mertz W. eds., Trace Ele-
ment Metabolism in Animals — 2, Univ. Park Press, Baltimore, Maryland,
1974.
Г. Нуклеиновые кислоты
Нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК-—это полинуклеотиды. Их мо-
номерные звенья (нуклеотиды) в свою очередь состоят из трех частей:
1. Пуринового или пиримидинового основания (их структурные фор-
мулы представлены на рис. 2-19).
2. Сахара — D-рибозы или D-2-дезоксирибозы.
3. Фосфорной кислоты.
Молекулы, из которых мы состоим 123
5Г<^?№
ед
N
1
Пиримидин
В тимине, входящем в ДИК,
в этом положении находится
метильная группа О
/V
Атомы Н, заключенные ' '
в кружочки, при присоеди—^^^
нении оснований к сохарным^~~~* [ { :
остаткам высвойождо-отся
Урацил
Аденин
Заметьте , что все эти
молекулы практически
плоские
Л.
IH j
Цитозин
О
Гуанин
РИС. 2-19. Структурные формулы пиримидиновых и пуриновых оснований. Обычно
в монографиях и справочных изданиях кольца изображают в другой ориентации —
атом С-5 пиримидинового кольца и атом С-8 пурина оказываются справа. Мы же оста-
новились на таком способе изображения для того, чтобы было соответствие между
данным рисунком и рис. 2-20.
Эти части соединяются друг с другом с высвобождением двух моле-
кул воды (рис. 2-20). Нуклеотиды связаны фосфодиэфирными связями,
образующимися между б'-гидроксилом сахара одного нуклеотида и
З'-гидроксилом другого [уравнение (2-11)]. Структура пары коротких
полинуклеотидных цепей изображена на рис. 2-21.
1. Названия и сокращения
Пуриновые и пиримидиновые циклические соединения, входящие в
состав нуклеиновых кислот, называют попросту основаниями, хотя у не-
которых из них основные свойства практически отсутствуют. N-гликози-
ды (или N-гликозильные производные) оснований, содержащие рибозу
или дезоксирибозу, называются нуклеозидами, а фосфатные эфиры нук-
леозидов— нуклеотидами. Подобным образом называются и родствен-
ные биохимические соединения, которые не входят в состав ДНК или
РНК-
Названия нуклеозидов и нуклеотидов связаны с названиями основа-
ний не вполне логичным образом. (Названия главных нуклеотидов,
из которых построены нуклеиновые кислоты, приведены в табл. 2-5.)
124 Глава 2
НО П
Фосфатный
ион /
-О /'он'
'\Н Z
О
О
NH
Урацил, одно из
пиримидиновых
оснований
N О
Уридиновая кислота
(UMP, уридинмонофосфат)}
один из нуклеотидов,
входящих в состав РНК
Жирными стрелками указаны
реакционноспособные группы,
участвующие в полимеризации
1
Н2С
но
Сахар—
D-рибоза
н
Плоскость
основания
Н2С5'
—к Этими пунктирными
! Н\ кружочками подчеркивается
\ОН/ тот факт, что при образо-
вании нуклеотида отщепля-
ется молекула воды
В D-2-дезоксирибозе,
входящей в ДНК,
здесь вместо ОН находится Н
Это
' анти-конформация
Следует помнить, что в 5-членном
Н кольце из одинарных связей один из атомов
углерода (в нуклеотидах это чаще всего С-2 )
примерно на 0,05нм выходит из плоскости
остальных четырех атомов. Это кольцо
находится в С-25эндо-конформации
Н
Н
Н
Н
РИС, 2-20. Образование нуклеотида из пиримидинового основания, D-рибозы и фос-
фатного иона. Показано, что в ходе реакции образуются молекулы воды. Отметим,
что атомы углерода оснований нумеруются от
мы углерода сахаров
1 до 6 или от 1 до 9 (рис, 2-19), а ато-
— от Г до 5'.
НО3Г—о—сахар—основание
---------il 5'
4. p[Q—-р — q—сахар—основание
3'1
ОН
О"
J-JQ р—о— сахар— основание
°х°
О О—сахар—основание
3' I
О—Н
(2-11)
Молекулы, из которых мы состоим 125
РИС. 2-21. Схематическое плоское изображение структуры
ДНК по Уотсону и Крику.
В наибольшей степени это относится к гипоксантину, образующемуся
путем замещения —МН2-группы аденина на —ОН-группу с последую-
щей таутомеризацией группы оксипурина
ОН
ч форму
О
II Н
—С—N—
126 Глава 2
Таблица 2-5
Названия пиримидиновых и пуриновых оснований, нуклеозидов
б'-нуклеотидов и их обозначения
А. Нуклеотидные звенья РНКа
Основания Урацил Ura(U) Цитозин Cyt(C) Аденин Ade(A) Гуанин Gua (G)
Нуклеозиды Уридин Urd Цитидии Cyd Аденозин Ado Гуаиозии Guo
5'-нуклеотиды Уридин-5'-фос фат или 5'-уридиловая кислота Urd-5'-P или UMP Цитидии-5'- фосфат или 5'-цитидиловая кислота Cyd-5'-P или СМР Адеиоз ин-5'-фос- фат или 5'-адениловая кислота Ado-5'-P или АМР Гуанозин-5'- фосфат или 5'-гуаииловая кислота Guo-5'-P или GMP
Б. Нуклеотидные звенья ДНК
ДНК вместо оксирибозы содержат 2-дезоксирибозу, поэтому соответствующие
нуклеозиды и нуклеотиды ДНК называются дезоксиаденозином (dAdo) дезоксиадено-
зин-5'-фосфатом (dAMP) и т. д.
Вместо урацила в ДНК присутствует тимин (Thy). Дезоксирибозными производ-
ными в этом случае являются тимидин (dThd) и тимидин-5'-фосфат. Рибозными про-
изводными тимина являются нуклеозид рибозилтимидин (Thd) и рибозилтимидин-5'-
фосфат (Thd-5'-P).
3 Изомеры 5'-нуклеотидов, в которых фосфат связан с кислородом при С-3', на-
зываются З'-иуклеотидами. Такие изомеры встречаются довольно часто, и нужно из-
бегать путаницы в этом вопросе. Простые сокращения UMP, СМР, АМР и GMP всегда
относятся к 5'-нуклеотидам.
Нуклеозид, состоящий из гипоксантина и рибозы, назван инозином (I),
а соответствующий нуклеотид—инозиновой кислотой.
В обычно используемых сокращенных формулах нуклеиновых кис-
лот сахара изображают вертикальными линиями. Сверху над этими ли-
ниями ставят символы, соответствующие определенным основаниям А,
С, U, Т и G или пуринам (Ри) и пиримидинам (Ру); 3'—б'-фосфоди-
эфирные связи изображаются косыми линиями с буквой Р посередине:
ОН
Концевая
З'—ОЦ-группа
Концевой
5-фосфатц
Структурная формула этого же полинуклеотида может быть записана
еще короче:
pApUpGpPupPy
5'-конец или З'-конец
A-U-G-Pu-Py
5'-конец нуклеотида в таких
формулах принято располагать слева.
2. Функциональные группы нуклеиновых кислот
Ионизированные фосфатные группы полимерного «остова» сообща-
ют молекулам нуклеиновых кислот большой отрицательный заряд. По
этой причине в клетках ДНК обычно присутствует в комплексе с 1) ос-
Молекулы, из которых мы состоим 127
нбвными белками — гистонами или протаминами (в сперматозоидах
рыб); 2) поликатионами аминов типа спермидина (H3N—
СН2СН2СН2СН2—NH2—СН2СН2СН2—NH3 ) или 3) щелочноземельны-
ми катионами, например Mg2+.
В РНК во 2-м положении рибозных остатков имеются свободные
гидроксильные группы, которые сильно влияют на конформацию поли-
мера. Отсутствие 2-ОН-группы в дезоксирибозе делает ДНК более ус-
тойчивой к щелочной деградации.
Пуриновые и пиримидиновые основания — это «боковые цепи» нук-
леиновых кислот. Присутствующие в основаниях полярные группы
ХС=О, XNH ц NH2
способны к образованию водородных связей как с другими цепями нук-
леиновых кислот (в частности, в двуспиральной структуре ДНК), так
и с белками. Между плоскими основаниями осуществляется так назы-
ваемое стэкинг-взаимодействие; кроме того, основания могут взаимодей-
ствовать с ароматическими боковыми цепями аминокислот, с лекарст-
венными и мутагенными химическими соединениями.
3. Химические реакции, в которые вступают полинуклеотиды [63]
Как ДНК, так и РНК легко гидролизуются под действием кислот
(разд. 3.2). Гликозидные связи в ДНК более лабильны, чем в РНК-
Пуриновые нуклеотиды гидролизуются легче, чем пиримидиновые. И все
же, несмотря на легкость, с которой деградируют нуклеиновые кисло-
ты под действием кислот и щелочей, ковалентная структура этих моле-
кул сравнительно устойчива, что предопределяет их способность слу-
жить генетическим материалом. Однако как ДНК, так и РНК вступают
во множество химических реакций.
Азотистая кислота реагирует с аминогруппами оснований, превра-
щая их в —ОН-группы. Образующаяся в результате группировка
I
—N=C—ОН
подвергается таутомеризации и принимает вид
О
II
_ NH—С—
Таким образом, азотистая кислота при взаимодействии с нуклеиновы-
ми кислотами превращает цитозин в урацил и, следовательно, является
эффективным химическим мутагеном (гл. 15, разд. 3.1). Аналогичным
образом аденин превращается в гипоксантин, а гуанин — в ксантин.
Другое мутагенное соединение, гидроксиламин (H2N—ОН), реагирует
с карбонильными группами (особенно в пиримидинах), даже несмотря
на то, что эти карбонильные группы являются частью циклической
амидной структуры и поэтому имеют сравнительно низкую реакцион-
ную способность.
Пиримидины легко восстанавливаются боргидридом натрия NaBH4
[уравнение (2-12)]. Уридин, тимидин и (в меньшей степени) цитозин в
128 Глава 2
составе нуклеиновых кислот димеризуются при УФ-облучении и гидри-
руются [уравнения (13-22) и (13-23)].
(2-12)
Формальдегид вступает в реакцию с аминогруппами пуриновых и
пиримидиновых оснований (гл. 7, разд. 3.3) [64].
4. Конформации нуклеотидов
Фуранозное кольцо рибозы и дезоксирибозы может принимать це-
лый ряд конформаций типа «конверта» и других неплоских «скошен-
ных» конформаций. Обычно либо атом С-2', либо атом С-3' выходят из
плоскости других четырех атомов кольца. Если этот атом углерода рас-
положен выше кольца, т. е. находится от него со стороны основания, то
конформацию кольца называют эндо, если же он лежит ниже кольца,
то получаетсяэкзо-конформация (рис. 2-22,А). Свободные нуклеотиды
находятся преимущественно в С (2')-эндо- и С(3')-эндо-конформациях,
однако в В-форме ДНК, по всей вероятности, реализуется конформация
С (3') -экзо [65]. Скошенные конформации типа С(2')-эндо-С(3')-экэо
(рис. 2-22,А) и конформации конверта легко переходят одна в другую
[66, 67].
Ориентация основания относительно сахара определяется значением
торсионного угла % (рис. 2-22, В и В). Для нуклеотидов единая
система обозначений торсионных углов пока отсутствует, нет и единого
соглашения относительно того, какие углы принимать за 0°. Так, угол %
задается по меньшей мере двумя способами, как это видно из рис. 2-22.
Часто считается, что угол равен 0° при такой конформации, в которой
связь С(2)—N(l) пиримидина или С(4)—N(9) пурина находится в
цис-положении относительно связи С(1')—0(1') в сахаре [66], при-
чем значения угла (обозначенного через %' на рис. 2-22,В) лежат в ин-
тервале от 0 до 360°. В другом варианте нулевой угол соответствует
цис-положению указанной выше связи в основании относительно связи
С(1')—С (2') в сахаре; в этом случае угол % изменяется в пределах от
— 180° до 4-180° (рис. 2-22,В) [65].
Измеренные значения угла % различны для разных нуклеотидов;
наиболее типично значение ~ 127°. В такойаити-конформации группы
СО и NH во 2-м и 3-м положениях пиримидинового кольца (или в по-
ложениях 1, 2 и 6 пуринового кольца) смещены в сторону от сахарного
кольца, тогда как в с«м-конформации (что соответствует повороту на
180°) эти группы располагаются над кольцом. Нуклеотиды как в сво-
бодном состоянии, так и в составе нуклеиновых кислот находятся в ос-
новном в анти-конформации.
Чтобы задать конформацию остова полинуклеотида, требуется еще
пять торсионных углов [65—70] (рис. 2-22,Г). Углы ©, g и 0 определя-
ют расположение групп в молекуле нуклеотида, а ср и ф имеют тот же
смысл, что и в полипептидных и полисахаридных цепях. Набор значе-
ний, которые могут принимать углы и, | и 0, крайне ограничен. Еще
один торсионный угол о располагается внутри сахарного кольца
Молекулы, из которых мы состоим 129
А
Син
300°
0°
108°йля X
В
РИС. 2.22. Конформационные свойства нуклеозидов. А. Несколько возможных конфор-
маций рибозного или дезоксирибозного кольца нуклеозида [66]. Б. Вид на нуклеозид
вдоль линии связи N—С, соединяющей пиримидиновое основание с сахарным кольцом.
Угол %' может пробегать значения от 0 до 360°. К сцн-конформациям относят те
конформации, для которых % принимает значения, расположенные на жирной полу-
окружности [66]. В. Второй вариант соглашения определений торсионного угла отно-
сительно гликозидной связи С—N. Угол % меняется от 0 до ±180°. Показана анти-
конформация нуклеозида. Г. Обозначения конформационных углов остова полинук-
леотида [68]. (Отметим, что имеются еще по меньшей мере четыре другие системы
обозначения этих углов [70].)
(рис. 2-22,Г) и определяет положение атома С-3'. В С(3')-эндо кон-
формации <т = 80±10°, а в С(3')-экзо конформации В-формы ДНК он
составляет ~156°.
5. Двойные спирали
Одно из наиболее впечатляющих открытий в биологии в нашем ве-
ке было сделано в 1953 г., когда Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик уста-
новили, что ДНК представляет собой двойную спираль, составленную
130 Глава 2
0
Вид сверху
Плоскости комплементарных
оснований повернуты одна отно-
сительно другой на 2°
А
-А
Большая
бороздка
„Стэкинг'-взаимодействие между
парами оснований, расположенных
одна над другой на расстоянии
вандерваальсового радиуса
Пару оснований можно распознать
по группам, обращенным в сторону
бороздок. Здесь показана GC-napa
Ось спирали
Т-А
Т-А
А
Большая
бороздка
Поверхность ваниерваальсовыХ
\ контактов
Радиу
—1,0 нм
W0A
Малая оороздка
“О
сн, \
VI
Шаг
3.46 нм
Малая
” бараздка
Молекулы, из которых мы состоим
131
РИС. 2-23. А. Двойная спираль ДНК; В-форма. (Arnott S., Hukins D. W. L., JMB,
81, 93—105, 1975.) Б. Электронная микрофотография молекулы ДНК бактериального
вируса (бактериофаг Т7) в момент ее репликации. Вирусная ДНК представляет со-
бой длинный (~14 мкм) дуплексный стержень, содержащий около 40 000 пар осно-
ваний. Виден небольшой репликативный «глаз» — участок, где происходит удвоение
ДНК. Синтез ДНК начинается в особой точке (точке инициации), расположенной на
расстоянии, равном 17% длины молекулы, от одного из концов дуплекса. Окраска
уранилацетатом; негативное контрастирование. (С любезного разрешения Т. Wolfson
и D. Dressier.)
из двух антипар аллельных полинуклеотидных цепей1. Наиболее важной
особенностью предложенной структуры было спаривание оснований про-
тивоположных цепочек путем образования между ними водородных свя-
зей. Водородные связи (на рис. 2-21 они указаны пунктирными стрелка-
ми) могут образоваться лишь в том случае, если всюду вдоль структу-
ры ДНК аденин образует пару с тимином (две водородные связи), а
цитозин — с гуанином (три связи). Таким образом, последовательность
нуклеотидов в одной цепи оказывается комплементарной, но не иден-
тичной последовательности в другой цепи. Далее почти сразу же стало
очевидно, что последовательность оснований в цепи ДНК содержит в
себе закодированную генетическую информацию. Комплементарность
двух цепей приводит к очень простому механизму репликации генов на
протяжении всех клеточных делений. По этому механизму две цепи ДНК
разделяются и вдоль каждой из них синтезируется новая комплемен-
тарная цепь, что дает в результате две молекулы ДНК, по одной на
каждую из двух дочерних клеток. Принципиальную правильность этой
схемы сейчас уже можно считать доказанной.
Геометрия двойной спирали представлена на рис. 2-23, Л. В волок-
нах молекулы ДНК могут находиться в двух конформациях: А и В.
A-форма1 характеризуется тем, что плоскости пар оснований отклонены
1 Эта структура была найдена в результате построения молекулярных моделей
с привлечением рентгеновских дифракционных данных, полученных Уилкинсом н Франк-
лин при исследовании ориентированных волокон ДНК. За это открытие Уотсон, Крик
н Уилкинс в 1962 г. были удостоены Нобелевской премии.
9*
132 Глава 2
54«шеч -*• pG
с
G
G
А
U
U
и
G А А
hU С U С m2G
hU ....
(Ы1)2-петля С
А
G
А
Ст
, 3-ОИ-акцепторный
/ KOHBif
А
С
С
А
• С
» G
• С
U
• U ТфС-петля
• А \
•А
G А С А С U
т1/.
.............. G
т5С U G U G ф С
С U
m’G
_ -•—Добавочная
„ А “ петля
• G А
• G
• U
• т5С
• Ф
А
А
Петля антикодона
Молекулы, из которых мы состоим 133
РИС. 2-24. Структура фенилаланиновой транспортной РНК из дрожжей. А. Последо-
вательность нуклеотидов, образующая традиционную структуру «клеверного листа».
Б. Схема пространственной укладки полинуклеотидной цепи. Рибозофосфатиый остов
изображен в виде протяженной непрерывной ленты; прямолинейные полосы, соединяю-
щие разные участки ленты, — это пары оснований, связанные водородными связями.
Одиночные основания изображены в виде укороченных полосок. ТфС-петля выделена
точками, лнтикодоиовая петля — вертикальной штриховкой. Взаимодействия на уровне
третичной структуры отмечены черными полосками. (Quigley G. J., Rich A., Science,
194, 796—806, 1976.) В. Стереоизображение структуры дрожжевой фенилаланиновой
тРНК по данным рентгеноструктурного анализа. Акцепторный участок с выступающей
З'-коицевой последовательностью АССА расположен справа, антикодон GAA — в пра-
вой иижней части рисунка. Особенно хорошо видно гуаниновое кольцо в самой нижней
части рисунка. Плоскость среднего аденина антикодона расположена строго перпенди-
кулярно плоскости рисунка, как и для «гипермодифицироваиного» основания Y (см.
рис. 15-10), которое расположено непосредственно над антикодоном. Его боковая
цепь находится в дальней от нас части изображения. Непосредственно перед антико-
доном, в 5'-«половине» молекулы, расположены два неспаренных основания (С и U).
2'-гидроксильные группы цитидина и входящего в состав антикодона гуанозина мети-
лированы. Двигаясь вверх вдоль петли антикодона, мы проходим два триплета осно-
ваний, в которых реализуется схема спаривания как Уотсона — Крика, так и Хугстена.
Рекомендации относительно того, как рассматривать такие рисунки, даны в подписи к
рис. 2-6. (С любезного разрешения A. Rich.)
от нормали к оси спирали примерно на 20°, тогда как в В-форме, реа-
лизуемой при высокой влажности, плоскости почти перпендикулярны
оси спирали (торсионные углы остова составляют ©=155°, g = 36°,
0 = —146°, <р = —96° и ф = 46°) [65] Считается, что ДНК внутри клеток
находится в основном в В-форме.
Если пренебречь асимметрией пары оснований, то можно заметить,
что в составе двойной спирали одна нуклеотидная цепь связана с другой
осью симметрии 2-го порядка. Этот элемент симметрии, порождаемый
антипараллельным расположением цепей, делает молекулу ДНК с обо-
их концов одинаковой — как с точки зрения человека, рассматриваю-
щего модель, так и с точки зрения фермента, вступающего с молеку-
лой во взаимодействие. В действительности две цепи не идентичны, а
генетическая информация может считываться с тех участков, которые
располагаются на поверхности в районе большой бороздки
(рис. 2-23, А).
’ В действительности мы имеем здесь дело с семейством близких форм.
134 Глава 2
Приведем некоторые данные о размерах двойной спирали (рис. 2-23).
Диаметр ее, определяемый расстоянием между атомами фосфора, равен
в точности 2,0 нм. Шаг спирали—3,4 нм, на один виток приходится де-
сять пар оснований. Таким образом, расстояние между плоскостями
оснований равно 0,34 нм, что примерно эквивалентно сумме вандерва-
альсовых радиусов ароматических колец (табл. 2-1). Таким образом,
основания уложены в виде стопки в центре спирали. Типичный ген в
1000 оснований — это участок ДНК около 340 нм длиной (рис. 2-23, Б).
Как и подобает матрице, с которой снимаются копии, двойная спи-
раль ДНК исключительно стабильна. Несмотря на большую длину, в
природных условиях она расщепляется крайне редко. Такая стабиль-
ность структуры обусловлена несколькими факторами: 1) наличием во-
дородных связей между основаниями; 2) вандерваальсовым притяже-
нием плоских оснований, уложенных параллельно одно над другим;
3) присутствием на поверхности молекулы многих атомов кислорода,
отрицательно заряженных и нейтральных, способных к образованию
водородных связей с водой или со специфическими белками, окружаю-
щими молекулу; 4) способностью к образованию различного рода су-
перспиралей (см. ниже).
Как мы отмечали выше, ДНК может переходить в паракристалличе-
скую A-форму (с наклонным расположением оснований и 11 парами
оснований на виток). Напрашивается вывод, что и в природных услови-
ях эта конформация не менее важна, чем В-форма. Хотя молекулы
РНК обычно одноцепочные, они часто образуют шпильки — двухце-
почечные участки, находящиеся в А-форме [71]. В-конформация в этом
случае исключается присутствием 2'-гидроксильных групп в рибозе
РНК. Считается, что в клетках образуется также и переходная «гибрид-
ная» двойная спираль, составленная из молекул ДНК. и РНК, которая,
по всей видимости, тоже ограничена рамками A-формы. Следует отме-
тить, что A-форма отличается от В-формы еще и тем, что имеет доволь-
но большую (~0,8 нм в диаметре) полость вдоль оси спирали, а боль-
шая бороздка у нее более глубокая [71а]. В отличие от структуры,
изображенной на рис. 2-23, в A-форме плоскости пар оснований не пе-
ресекают оси спирали.
Наиболее тщательно изучена структура низкомолекулярной тРНК-
Во всех этих молекулах существуют двухцепочечные участки, стабили-
зированные водородными связями с образованием трех шпилек, к кото-
рым иногда добавляется четвертая .(«клеверный лист»). Структура од-
ной из тРНК установлена методом рентгеноструктурного анали-
за [72—74] (рис. 2-24). Нерегулярность и сложность формы молекулы
ставит ее в один ряд с молекулами глобулярных белков. Обратите вни-
мание на расположенный в нижней части рисунка антикодон (трип-
лет оснований), структура которого обеспечивает спаривание с тремя
основаниями кодона, детерминирующего определенную аминокислоту,
в данном случае фенилаланин.
6. Пары оснований
Структура пар оснований в том виде, как это было предложено Уот-
соном и Криком, изображена на рис. 2-21. Хотя дифракционные данные
показывают, что в ДНК присутствуют именно такие пары оснований,
рассматривались и другие варианты. На рис. 2-25 изображены очерта-
ния пар оснований с указанием групп, способных к образованию водо-
родных связей. Число групп, которые в качестве доноров или акцепто-
ров электронов могли бы участвовать в этом процессе, получается до-
Молекулы, из которых мы состоим
1ОО
РИС. 2-25. Внешние очертания пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеиновых
кислот. Изображены поверхности, определяемые вандерваальсовыми радиусами; от-
мечены также некоторые из возможных направлений, вдоль которых могут быть об-
разованы водородные связи. Толстыми стрелками указаны водородные связи, соот-
ветствующие схеме спаривания оснований по Уотсону и Крику.
вольно большим, а следовательно, может быть несколько вариантов
спаривания оснований. Один из таких вариантов предложил Хугстен
(здесь показана соответствующая этой схеме пара А—Т). Обратите
Н
I
” ‘-------0,88 нм--------
Пара основании по Хугстену
внимание, что расстояние, «покрываемое» данной парой (между атома-
ми сахара С-1'), равно 0,88 нм, что заметно меньше значения 1,08 нм
для пар Уотсона — Крика. В двуспиральных структурах таких пар не
обнаружено, однако не исключается возможность образования тройных
спиралей, в которых присоединяемое к паре третье основание распола-
гается по схеме Хугстена [75]. И действительно, именно такие трипле-
ты оснований недавно обнаружены в некоторых участках молекулы
тРНК [74].
136 Глава 2
В живых системах пуриновые и пиримидиновые основания взаимо-
действуют не только между собой, но и с белками. Они связываются
с ферментами, участвующими в метаболизме нуклеиновых кислот и ну-
клеотидов, и выполняют роль своеобразных «держателей», с помощью
которых к белкам прикрепляются многие промежуточные продукты ме-
таболизма, а также коферменты (гл. 8).
Насколько сильны связи, образуемые между парами оснований в
ДНК? На этот вопрос ответить трудно, поскольку всегда имеет место
сильное взаимодействие молекул с полярными растворителями. Неко-
торое представление об энергии этих связей дают исследования, прово-
димые в неполярных растворителях. Так, было показано, что 1-цикло-
гелсилурацил образует димеры, стабилизированные или водородными
связями, или стэкинг-взаимодействием, но энергия ассоциации при этом
невелика, AG0 равно -~5 кДж-моль-1. В смеси этого соединения с
9-этиладенином получается комплекс — пара оснований — с константой
образования [см. уравнение (4-2)], более чем в 10 раз превышающей
Комплекс (пара оснований)
константу образования димеров [уравнение (2-13)] [68]. Когда атом
водорода, который в уравнении (2-13) заключен в кружок, заменили
на группу —СН3, блокирующую образование пар, константа 7G стала
меньше 1 (AG°>0). Различие в свободной энергии образования в этих
двух случаях составляет всего 7 кДж-моль-1, однако даже такая не-
большая энергия, суммированная по многим парам оснований в моле-
куле ДНК, заметно повышает устойчивость структуры.
Выполненные недавно измерения энергии образования пар между
всеми возможными нуклеотидами позволяют провести количественную
оценку свободной энергии образования спиральных областей в молеку-
лах РНК [76]. В табл. 2-6 приведены приращения свободной энергии
образования таких спиралей из одноцепочечных структур в пересчете
на одну пару оснований, присоединяемую к концу уже существующей
спирали. При добавлении пары AU вклад в AG° составляет всего от —5
до —7 кДж. Точное значение зависит от того, какое из оснований —
А или U-—находится на б'-конце предсуществующей спирали. Добав-
ление пары AU к спирали, оканчивающейся парой CG или GC, дает
вклад —9 кДж-моль-1. Большие приращения энергии имеют место при
Молекулы, из которых мы состоим 137
Таблица 2-6
Изменение свободной энергии AGj! при присоединении одной пары
оснований к предсуществующей спирали РНК (при 25°С)аб
Пара оснований на конце рредсуществующей спирали Присоединяемая пара оснований Д(7^, ккал моль—1 (±Ю%) кДж-моль—1 (±Ю%)
А А —1,2 -5,0
и и
ив А — 1,8 —7,5
А и
С . илн Gr А —2,2 —9
G 3 и
С G —3,2 — 13
G С
G С , G -5,0 — 21
. или .
С G С
G и —0,3 — 1
и G
Шпильки из 4—5 оснований
оканчиваются парой GC +5 +21
оканчиваются парой AU +7 +29
Боковые петли
1 основание + 3 + 12
4—7 оснований +5 +21
а Таблица с некоторыми изменениими заимствована из работы [76 ]
6 Все пары оснований соответствуют следующей ориентации:
5' А > 3'
3' ч— и 5'
U А
8 1е же значения получаются при присоединении пары д к у -концу.
С G А
г Ге же значения получаются при присоединении пар • или • G С к -концу.
добавлении GC-nap, в которых между основаниями имеются три водо-
родные связи, а не две, как в AU-napax.
Пары UG также стабилизируют двойные спирали РНК, хотя и весь-
ма незначительно. Присутствие же неспаренных оснований оказывает
дестабилизирующий эффект. Наиболее прочные шпильки содержат до
4—5 оснований. В зависимости от того, какой парой заканчивается
шпилька — GC или AU, — спираль дестабилизируется на 20—30 кДж-
•моль'4. «Малые петли», отходящие с одной стороны спирали, вносят
меньший дестабилизирующий эффект. Рис. 2-26 дает пример того, как
с помощью табл. 2-6 можно оценить энергию образования петель в ли-
нейной цепи РНК.
138 Глава 2
А
А С 1
1 и 1 и /
и • А
А . и
А . и
G • с
С . с
• А
Л-и • А
А . и 1
А * У
А / и । и \ . и и 1 с /
с 1 • G^ "с
А . и
и . А »
G • с
С . G 1
и 1 • А 1
и • А
G С \ • С \ и Z
G 1 . С
G • с 1
и / 5' • с \ 3'
+ 25 кДж-моль'
— 7,5
-5,0
— 9
-21
—9
-5,0 + 12
-7,5
-5,0
-5,0
+ 8
-9 + 13
-7,5
-9
-13
-9
-5,0
-9
+ 8
-21
О
2 =~91 кДж-моль’1
7. Таутомерия и спаривание оснований
Образование двух и трех водо-
родных связей между основаниями в
ДНК имеет интересную связь с тауто-
мерией. Каждое основание находится
по большей части в какой-то одной
таутомерной форме, однако в любой
момент хотя бы несколько оснований
оказывается в менее устойчивой фор-
ме. Этим, в частности, можно объяс-
нить возникновение некоторых мута-
ций. Так, таутомер В в уравнении
(2-5) уже не может образовать пару с
тимином, своим «законным» партне-
ром, но зато способен образовать во-
дородные связи с цитозином. Если это
случится в ходе репликации гена, то
получится неправильная копия, в ко-
торой заменена одна «буква» генети-
ческого кода.
8. Нуклеотидный состав ДНК и РНК
Диапазон изменений нуклеотид-
ного состава ДНК на удивление ши-
рок. Суммарное процентное содержа-
ние цитозина и гуанина (GC-содержа-
ние) в различных бактериях меняется
от 22 до 74%. (GC-содержание в ДНК
Е. coli равно 51,7%). Для эукариот
этот диапазон более узок (от 28 до
58%). Тот факт, что у бактериальных
ДНК нуклеотидный состав меняется
в гораздо более широких пределах,
чем у высших организмов, удивления
не вызывает. Прокариоты существуют
на Земле почти столько же миллионов
РИС. 2-26. Распределение баланса
свободной энергии при образовании
предполагаемой вторичной структу-
ры по парам оснований и петлям
для фрагмента РНК вируса R17, со-
держащего 55 оснований. Показан-
ная здесь петля является частью бо-
лее крупной петли, приведенной в
работе [76].
лет, сколько и мы. Но из-за их более
простой структуры и высокой скорости
деления природа совершила над их ге-
нетическим материалом значительно
больше экспериментов и внесла в не-
го значительно больше изменений, чем
в наш.
Сравнение организмов по их GC-
содержанию иногда используют как
основу для установления филогенетического родства. Нужно, однако,
учесть, что тимин под действием УФ-света претерпевает ряд фотохими-
ческих превращений, поэтому бактерии с высоким GC-содержанием
могут чаще встречаться там, где мцого солнечного света, тогда как бо-
лее низкое GC-содержание может указывать на то, что местообитани-
ем данного организма являются более защищенные от солнца места
[77].
Представление о ДНК как о цепи, содержащей только четыре вида
нуклеотидов, немного упрощено. В ДНК из разных источников присут-
Молекулы, из которых мы состоим 139
ствует значительное число метилированных оснований. К ним относятся
5-метилцитозин и 6-метиладенин. По всей вероятности, эти метилиро-
ванные основания служат маркерами каких-то специфических участков
генетических копий. Метилирование происходит после синтеза полинук-
леотида. Кроме того, метилирование защищает ДНК от воздействия
ферментов, образующихся при попадании в клетку вирусов (гл. 15,
разд. Е). Некоторые вирусы, в особенности Т-четные бактериофаги, по-
ражающие Е. coli (дополнение 4-Д), выработали собственные защитные
механизмы. Они вместо цитозина содержат оксиметилцитозин. Появля-
ющиеся при этом лишние гидроксильные группы часто несут еще один
или два остатка глюкозы, присоединенные гликозидной связью [78].
Один из бактериофагов, поражающих Bactillus subtilis, содержит вме-
сто урацила оксиметилурацил, а вместо тимина—5-диоксипентилура-
цил [79].
Модификации, встречающиеся в молекулах РНК, значительно бо-
лее распространены и разнообразны, чем в ДНК, и о них будет идти
речь в гл. 15.
9. Кольцевые и суперспиральные структуры; интеркаляция
Молекулы ДНК могут существовать не только в виде открытых, не-
замкнутых молекул; часто их концы ковалентно соединяются друг с
другом. Так, хромосома Е. coli представляет собой единое замкнутое
кольцо. Кольцевые молекулы ДНК часто обнаруживаются в митохонд-
риях, а также в некоторых вирусах [80].
Как и у белков, структуру ДНК можно значительно исказить путем
внесения дополнительных супервитков (суперспиралей). Чтобы полу-
чить такой эффект, к одному из концов цепи необходимо приложить
крутящий момент. Так, если взять слегка скрученное свободно прови-
сающее резиновое кольцо и закрутить его сильнее (как это делают при
подготовке к полету аэромоделей), произойдет положительная супер-
спирализация. Аналогичная ситуация — образование положительных
(или отрицательных) суперспиралей (третичная спирализация)— мо-
жет иметь место и в ДНК. Суперспирали часто встречаются в кольце-
вых молекулах ДНК. При «закручивании» нормального двуспирального
комплекса (дуплекса) общее число оборотов a (the winding number)
одной нити относительно другой равно числу витков во вторичной
структуре р, которое соответствует ненапряженному спиральному дуп-
лексу (т. е. структуре Уотсона — Крика), плюс число супервитков т:
а=т-|-Р. (2-14)
Величина р всегда положительна, но т может быть и отрицательным—
в этом случае образование полностью сформированной вторичной струк-
туры (спираль Уотсона — Крика) сопровождается появлением некото-
рого числа левоспиральных супервитков [81].
Плотность супервитков (степень суперспиральности) молекулы ДНК
обычно выражают величиной а, равной числу супервитков на 10 пар
оснований [80, 82]. Для встречающихся в природе кольцевых молекул
ДНК о чаще всего отрицательна; наиболее типичное ее значение —0,05
(~5 супервитков на 1000 пар оснований). Присутствие супервитков в
кольцевых молекулах ДНК можно легко установить, поскольку при
этом меняется константа седиментации ДНК [81]. Так, суперспираль-
ная природная ДНК вируса полиомы седиментирует довольно быстро.
После внесения разрыва в одну из цепей двойной спирали посредством
кратковременной обработки ее ферментом образуется «релаксирован-
140 Глава 2
РИС. 2-27. А. Электрофорез препарата ДНК вируса SV 40 (дополвеиие 4-В), пред-
ставляющего собой смесь молекул с различным числом супервитков. Молекулы на-
тивной ДНК (электрофореграмма 1) быстро движутся к аноду в виде серии полос,
каждая из которых отличается от соседней по числу супервитков в соответствующей
ДНК на 1. Среднее число супервитков равно 25. Инкубация ДНК в присутствии «ре-
лаксационного» фермента (гл. 15, разд. Д.1) вызывает последовательное уменьше-
ние числа супервнтков; фермент вносит одноцепочечные разрывы и тут же снова сши-
вает цепь. Инкубация ДНК с этим ферментом при 0°С в течение 1, 3, 6, 10 и
30 мин (электрофореграммы 2—6) постепенно переводит ДНК в форму со средним
числом супервитков, равным нулю [82]. Электрофорез проводили в смеси 0,5%-ио-
го агарозного геля и 1,9%-ного полиакриламидного геля; размер пластинки—17Х
X 18X0,3 см. Для выявления полос электрофореграммы окрашивали флуоресциру-
ющим интеркалирующим красителем этидиумбромидом. (С любезного разрешения
W. Keller.)
ная» форма молекулы, которая седиментирует медленнее. Суперспи-
ральность сказывается на вязкости растворов ДНК, а также на элект-
рофоретической подвижности молекул (рис. 2-27, А) [82а]. В некото-
рых случаях наличие супервитков можно наблюдать с помощью элект-
ронного микроскопа.
Чем обусловлено образование супервитков в природных ДНК? Ключ
к решению этого вопроса дают исследования интеркаляции [83—86] —
встраивания плоских ароматических колец между парами оснований
ДНК. Способностью к такой интеркаляции обладают многие лекарст-
венные препараты (в частности, антибиотики), красители и другие ве-
щества. К их числу относятся дауиомицин, профлавин, этидиумбромид
и гикантон (рис. 2-27, £>). Гикантон, одно из наиболее широко приме-
няемых в мире лекарств, употребляется при лечении шистосомоза (гл. 1,
разд. Д.1). Поскольку интеркалирующие соединения обладают мута-
генным действием, применение таких лекарств связано с определенным
риском.
Молекулы, из которых мы состоим
141
Интеркаляция часто исполь-
зуется для оценки степени отри-
цательной суперспиральности мо-
лекул ДНК- Добавляя возраста-
ющие количества интеркалирую-
щего агента, следят за тем, как
изменяется константа седимен-
тации (или другие свойства)
ДНК- По мере возрастания сте-
пени интеркаляции происходит
раскручивание витков вторичной
структуры ДНК [₽ в уравнении
(2-14)]. Каждое интеркалирую-
щее кольцо вызывает раскручи-
вание спирали на ~26°. По-
скольку для замкнутого ковалент-
ного дуплекса значение а [урав-
нение (2-14)] постоянно, пони-
жение [3 при возрастании интер-
каляции ведет к увеличению т.
Когда интеркаляция достигнет
уровня, при котором т повысится
до 0, будет наблюдаться мини-
мальная скорость седиментации.
Дальнейшее добавление интерка-
лирующего агента приведет к по-
ложительной суперспирализации.
«Репликативная форма»
ДНК вируса 0 Х174 (дополне-
ние 4-В)—небольшая кольцевая
молекула из ~5000 пар основа-
ний— обрабатывалась профлави-
ном [82]. Связывание 0,06 молей
профлавина на моль нуклеоти-
дов сводило г к нулю. Отсюда
была получена оценка1 6 = 0,055;
это означает, что при температу-
ре 25°, pH 6,8 и ионной силе
~0,2 в молекуле содержится
—26 супервитков. На плотность
супервитков сильно влияют тем-
пература, pH и ионный состав.
В общем случае о становится
менее отрицательной на ~ 3,ЗХ
X 10-4 при повышении температу-
ры на 1° [86с]. Например, для
ДНК вируса 0 Х174 при ионной
РИС. 2-27. Б. Структурные формулы ряда
интеркалнрующих соединений (см. также
структуру комплекса актиномицин — ДНК
(дополнение 15-Б).
силе 0,2 а получалась равной —0,059 при 15 °C и —0,040 (—19 супер-
витков) при 75°С.
1 Приведенная здесь оценка основана на том, что интеркаляция одной молекулы
профлавина дает угол раскручивания ~16°; для сравнения отметим, что этидиумбро-
мид приводит к раскручиванию на 26°. В более ранней литературе угол раскру-
чивания для этидиумбромида принимался равным 12° и получавшаяся в результа-
те плотность супервитков (12о) оказывалась ниже приводимых теперь (26о) [84, 86а, Ь].
142 Глава 2
Недавно выполненные исследования показали, что при электрофоре-
тическом разделении как природных, так и искусственно полученных
суперспиральных молекул ДНК часто выявляется примерно 10 форм,
каждая из которых отличается от другой на один виток суперспирали
(рис. 2-27,Л). Относительное содержание этих топологически изомер-
ных форм примерно соответствует гауссову распределению. Считается,
что изомеры появляются в результате тепловых флуктуаций степени
суперспиральности в момент ферментативного замыкания цепи ДНК
в кольцо.
Сопряжена ли интеркаляция плоских молекул в цепи нуклеиновых
кислот с какой-либо биохимической функцией? По-видимому, да. На-
пример, в белках, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, аро-
матические кольца боковых цепей аминокислот могут встраиваться
между плоскостями оснований в спиральной структуре ДНК наподо-
бие закладок внутри книги [85, 86]. Изменения в плотности супервит-
ков, вызванные интеркаляцией или изменением ионного окружения, мо-
гут играть роль в соблюдении нужной последовательности во взаимо-
действии ДНК с внутриклеточными ферментными системами.
10. Денатурация и гибридизация
Подобно белкам, нуклеиновые кислоты могут денатурировать. Этот
процесс состоит в расхождении цепей двойной спирали ДНК и двухспи-
ральных участков молекулы РНК (в частности, тРНК; рис. 2-24). Де-
натурацию можно вызвать добавлением кислоты, щелочи, спиртов или
удалением стабилизирующих структуру молекулы противоионов, напри-
мер Mg2+. В результате денатурации каждая из цепей молекулы приоб-
ретает форму беспорядочно свернутого клубка, поэтому данный процесс
называют переходом спираль — клубок. Тепловая денатурация нуклеи-
новых кислот, как и белков, носит кооперативный характер (гл. 4,
разд. В.7) и происходит в довольно узком интервале температур; ха-
рактерным параметром процесса является температура плавления.
Температурная зависимость поглощения УФ-света при 260 нм (дли-
на волны, при которой свет поглощается нуклеиновыми кислотами эф-
фективнее всего) называется кривой плавления (рис. 2-28). В нативном
состоянии нуклеиновые кислоты поглощают свет менее интенсивно, чем
в денатурированном. Этот так называемый гипохромный эффект (гл. 13,
разд. Б.4.д) обусловлен стэкинг-взаимодействием между основаниями,
плотно уложенными стопками в структуре нативной молекулы. Темпе-
ратура плавления, Тпл, — это точка, при которой прирост поглощения
составляет половину максимального (рис. 2-28). Чем выше GC-содер-
жание нуклеиновой кислоты, тем более устойчива она к денатурации,
причем зависимость Тпл от GC-содержания почти линейна. Для раство-
ра, содержащего 0,15 М NaCl + 0,015 М цитрата натрия, pH 7,0, спра-
ведливо уравнение (2-15). Точное соотношение между GC-содержани-
ем ДНК и Тпл очень сильно зависит от ионного состава и pH среды
[87, 88].
GC-содержание (%) =2,44 (Т^- 69,3) °C/ (2-15)
Полная денатурация молекулы ДНК приводит к расхождению комп-
лементарных цепей. При быстром охлаждении раствора денатурирован-
ной ДНК цепи остаются в разделенном состоянии. Однако, если в тече-
ние какого-то времени поддерживать температуру чуть ниже значения
Тпл (этот процесс называют отжигом), может вновь восстановиться на-
тивная структура. Этот факт дает в руки ученым очень важный метод
молекулы, из которых мы сосюим
Температура, °C
РИС. 2-28. Кривые плавления ДНК из двух разных источников — Pneumococcus (кри-
вая /) и Serratia (кривая //). (Davidson J. N„ The Biochemistry of Nucleic Acids,
7th ed., p. 148, Academic Press, New York, 1972).
исследования нуклеиновых кислот, основанный на образовании гибрид-
ных дуплексов [89, 90].
Одним из типов двойных спиралей, которые получают искусствен-
ным путем, является гибрид ДНК—РНК. Оказалось, что молекулы
информационной (матричной) РНК (мРНК) гибридизуются только с
одной из двух разделившихся цепей ДНК, несущей участки, компле-
ментарные мРНК. Метод гибридизации используется также для получе-
ния гетеродуплексов ДНК, в которых две цепи молекулы происходят
от двух разных генетических линий одного и того же вида организмов.
Известно, что некоторые мутации состоят в делении (выпадении) или
вставке одного или нескольких оснований в цепь ДНК. Гетеродуплексы,
в которых одна из цепей нативная, а другая — со вставкой или делеци-
ей, имеют по всей своей длине нормальную структуру по Уотсону—Кри-
ку, за исключением тех участков, где делении или вставки нарушают
комплементарность и образуются одноцепочечные петли (рис. 15-24).
Опыты по гибридизации позволили исследовать гомологичность нук-
леиновых кислот из разных источников. Вначале молекулы расщепляют
(например, с помощью ультразвука) на фрагменты длиной ~ 1000 нук-
леотидов и подвергают денатурации. Фрагменты денатурированной
ДНК смешивают с денатурированной ДНК из другого источника. Уча-
стки ДНК разных видов, имеющие близкие нуклеотидные последова-
тельности, в той или иной степени гибридизуются, тогда как участки
с сильно различающимися последовательностями гибридизации не под-
даются. Рассмотрим один из вариантов постановки таких эксперимен-
тов. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергав-
шуюся деградации, заключают в агаровый гель [90] или наносят на
нитроцеллюлозный фильтр [91]. Фрагменты ДНК из другого источни-
ка пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через
фильтр с абсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соот-
ветствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре,
тогда как фрагменты, не нашедшие себе «партнеров», свободно про-
ходят дальше.
144 Глава 2
А
Число пар нуклеотидов
11 10 1 02 103|Ю4 105 10в|107 108 10Ч 10'°
f---1---1---1——I---+----1——f----1----1-2-
Coi, M-c-'
Б
РИС. 2-29. Кривые реассоциации ДНК (Britten R. J., Kohne D. E., Science, 161, 1968;
Britten R. J., Smith J.). А. Временной ход идеальной реакции второго порядка с ука-
занием основных характеристик графика, построенного в указанных координатах.
Уравнение дает долю одноцепочечных молекул ДНК в данный момент времени после
начала реакции. В начале реакции эта доля принята равной единице, и далее показа-
на ее зависимость от произведения суммарной концентрации ДНК на время (лога-
рифмическая шкала). Б. Кривые реассоциации двухцепочечных молекул нуклеиновых
кислот из разных источников. Размер генома указан стрелками на шкале вверху.
Вплоть до 109 эта величина пропорциональна Cot в момент, когда реакция прошла
наполовину. ДНК фрагментирована (длина фрагмента ~400 нуклеотидов в цепи).
При построении кривых введена поправка, приводящая скорости реакции к тем, ка-
кие имели бы место при концентрации ионов натрия 0,18 М. Реассоциация проводи-
лась при оптимальной температуре, т. е. на ~30° ниже Тлл. Степень реассоциации
определяли по оптическому вращению (ДНК тимуса теленка), устойчивости к рибо-
нуклеазе (MS-2) и гипохромному эффекту.
Очень ценным является изучение кинетики реассоциации фрагменти-
рованной денатурированной ДНК [92—95]. Этот процесс подчиняется
кинетике второго порядка (гл. 6, разд. А.З), описываемой уравнением
(2-16). Его легко получить, проинтегрировав уравнение (6-8) в интер-
вале от 0 до t при [А] = [В] =С.
С/С0=1/(1 + /гС0/). (2-16)
Это соотношение связывает начальную концентрацию денатурирован-
ной ДНК Со с концентрацией С молекул ДНК, оставшихся диссоции-
рованными к моменту времени t. Данные по реассоциации удобно пред-
ставлять в виде графика зависимости относительного числа реассоции-
Молекулы, из которых мы состоим 145
рованных молекул от Cot в логарифмическом масштабе (рис. 2-29,А).
Как видно из рис. 2-29, Б, Cot увеличивается прямо пропорционально
длине генома ДНК, но иногда наблюдается сильное отклонение от
этой зависимости, обусловленное наличием в молекуле большого числа
повторов [поли(Н) или поли (А)]. Наклон кривых в средней точке ха-
рактеризует степень гетерогенности фрагментов ДНК в растворе (гл. 15,
разд. И.1).
11. Конформация ДНК в палиндромах
Вопрос о том, что биологическое значение имеют обе конформации
ДНК — А и В, — уже обсуждался нами ранее. Другой тип конформа-
ционных перестроек связан с присутствием палиндромов1 — последова-
тельностей ДНК, которые одинаково читаются как в прямом, так и в
обратном направлении [95]. Такие последовательности обнаружены в
ДНК многих вирусов и бактерий. Рассмотрим, например, ген, опреде-
ляющий последовательность нуклеотидов в молекуле тРНК, изображен-
ной на рис. 2-24. Он представляет собой участок двуспиральной ДНК,
в котором одна цепь имеет ту же последовательность, что и цепь на
рис. 2-24, за исключением того, что вместо Т стоят U и ф (псевдоури-
5’-TGGTGCGAATTCTGTGGATCGAACACAGGAC.-3'
З'-ACCACGC TTAAGACACCTAGCT TGTGTCCTG-5'
С<ЛТ
-----------ТфС-петля ----- -
Т
А
G
G
Т
G
Т
С
5'-TGGTGCGA АТТ
3' -А С С А С G С Г ТАА
G
А
С
А
> С
С
т
А
• G
G А С- 3*
С Т G- 5'
• С
• Г
• G
• Т
• G ”
Т
т
РИС. 2-30. Две конформации участка гена, детерминирующего дрожжевую фенилала-
ниновую тРНК. Участок кодирует последовательность нуклеотидов на З'-конце моле-
кулы тРНК, изображенной на рис. 2-24, включая область ТфС-петли.
1 Составлением палиндромов — перевертышей на русском языке — с увлечением за-
нимаются многие люди. Приведем два примера таких перевертышей: «Умер — и мир
ему», «Нажал кабан на баклажан». Имеется и много других забавных, хотя и более
специфических перевертышей. — Прим, перев.
146 Глава 2
дин,рис.15-10)стоитТИотсутствуютметилированныеили иным образом мо-
дифицированные основания. Вторая цепь в точности комплементарна
первой. На рис. 2-30 изображена часть этого гена, соответствующая
З'-концу молекулы тРНК вплоть до отметки «добавочная петля» на
рис. 2-24. Этот участок ДНК может иметь и другую конформацию — с
петлями по обе стороны молекулы (рис. 2-30). Обратите внимание, что
«стержни» обеих петель в этой «крестообразной» конформации совер-
шенно идентичны и расположены симметрично относительно центра мо-
лекулы.
Данные, свидетельствующие о существовании крестообразных кон-
формаций ДНК в клетках, отсутствуют, и многие биохимики сомнева-
ются, есть ли они на самом деле. Однако совершенно очевидно, что
палиндромные последовательности в ДНК независимо от того, нахо-
дятся ли они в линейной или петлеобразной конформации, имеют очень
большое значение для взаимодействия нуклеиновых кислот с симмет-
ричными димерными или тетрамерными молекулами белков, примеры
которых будут рассмотрены в гл. 4 [95а].
Читатели, желающие более подробно узнать о биологической роли
нуклеиновых кислот, могут сразу же обратиться к гл. 15.
Д. Липиды [96—99]
Термином липиды называют очень большую и крайне разнородную
группу веществ. В основе отнесения этих веществ к единой категории
лежит их высокая растворимость в неполярных растворителях или
близость к соединениям, которые обладают таким свойством. Большин-
ство липидов не является высокополимерными соединениями и состоит
всего из нескольких связанных одна с другой молекул. Некоторые из
этих «строительных блоков» представляют собой линейные цепи ряда
карбоновых кислот, образующихся в ходе сложных реакций полиме-
ризации. Полученные в результате молекулы, например молекулы жир-
ных кислот, имеют по большей части гидрофобный характер, однако
обычно содержат как минимум одну полярную группу, которая может
служить местом связывания с другими компонентами. Довольно часто
присутствуют ионные группы (фосфат, —NHs) или полярные углевод-
ные компоненты. Липиды, содержащие как полярные, так и неполярные
группы, обычно встречаются в мембранах и на других поверхностях
раздела между водной средой и гидрофобными областями внутри кле-
ток.
1. Строительные блоки липидов
Структурные формулы некоторых липидов приведены на рис. 2-31.
а. Производные уксусной кислоты СН3СООН
Обычные жирные кислоты (с четным числом атомов углерода),
спирты жирного ряда, иногда содержащие двойные связи; они почти
всегда имеют ^пс-конфигурацию (табл. 2-7).
Жирные кислоты с нечетным числом атомов углерода.
Разветвленные, циклопропансодержащие и другие специфические
жирные кислоты.
Полипреновые производные: терпены, каротиноиды, стеролы и сте-
пг.и-ти обпазуюшиеся из ацетата путем восстановительной конденсации
Молекулы, из которых мы состоим 147
и декарбоксилирования, Б структурном отношении их можно рассмат-
ривать как продукт полимеризации изопрена
СН3
I
сн2=с—сн=сн2,
отсюда и их старое наименование — изопреноиды.
б. Полярные компоненты, не являющиеся производными
ацетата
Глицерин.
Серин, этаноламин, холин (эти соединения структурно взаимосвя-
заны, поскольку этаноламин и холин образуются из серина).
Сфингозин (частично является производным жирной кислоты).
Неорганический фосфат и сульфат, а также органические сульфона-
ты и фосфонаты.
Инозит, сахара.
НО СН2ОН
хс
н СН2ОН
Глицерин
Стеаринозая 'кислота,
главный компонент животных
триглицеридов; содержит
18 атомсв углерода
НО СН2ОН
\ / зп-Глицеро-З-фосфат
(ъ-а-глицерофосфот)
Н СН2О
РО32-
Воск (сложный эфир жирной
кислоты и жирного спирта)
Структурные формулы некоторых липидов.
РИС. 2-3]
148 Глава 2
Н
Сфингозин
пигмент моркови центра симметрии в этой 40-дглеродной
и других растений молекуле, построенной из /8 пренильных
звеньев
РИС. 2-31. (продолжение)
Пренилпирофосфат (изопенгпенилпирофосфат),
предшественник стероидных, каротиноидных
и других изопреноидных соединений
2. Соединение компонентов
Компоненты сложных липидов соединяются друг с другом самыми
разными путями; некоторые из них показаны на рис. 2-31 и 2-32. В ро-
ли центрального звена нередко выступает глицерин, который, в частно-
сти, посредством сложноэфирных связей может быть связан с тремя
жирными кислотами, образуя триглицериды (обычные жиры, присутст-
вующие в жировых тканях и входящие в состав растительных масел).
Углеводородные цепи жирных кислот стремятся находиться в вытяну-
той конформации, однако присутствие двойных связей вызывает изло-
мы и изгибы в их структуре. Фосфатиды (табл. 2-8) представляют со-
бой производные sn-глицеро-З-фосфата1 (L-a-глицерофосфата); их ти-
1 Система стереоспецифической нумерации (sn) из двух эквивалентных групп при-
писывает первое положение группе, находящейся в положении npo-S (см. гл. 6,
разд. Г.2).
Молекулы, из которых мы состоим 149'
Таблица 2-7
Некоторые наиболее важные жирные кислоты
Число атомов углерода Систематическое название Обычное название Сокращенное обозначение3 Обычное название ацильной группы
Насыщенные жирные КИСЛОТЫ
1 Метановая Муравьиная Формил
2 Этановая Уксусная Ацетил
3 Пропановая Пропионовая Пропионил
4 Бутановая Масляная 4:0 Бутирил
12 Додекановая Лауриновая 12:0 Лауроил®
14 Тетрадекановая Миристиновая 14:0 Миристоил
16 Гексадекановая Пальмитиновая 16:0 Пальмитоил
18 Октадекановая Стеариновая 18:0 Стеароил
20 Эйкозановая Арахнновая 20:0
22 Докозановая Бегеновая 22:0
24 Тетракозановая Лигноцериновая 24:0
Ненасыщенные жирные кислоты®
4 Кротоновая 4:12(2t) Кротоноил
16 Пальмитолеиновая 16:1(9с)
18 Олеиновая 18:1 (9с) Олеоил
Вакценовая 18:1 (Нс)
18 Линолевая 18:2(9с, 12с)
18 Линоленовая 18:3(9с, 12с, 15с)
20 Арахидоновая 20:4(5с, 8с, Нс, 14с)
а Первым идет число атомов углерода, затем число двойных связей. В скобках
указывается номер первого из углеродов при двойной связи и тип связи — цис (с)
или транс(t).
6 Официальные названия этой н других ацильных групп были предложены Ко-
миссией IUPAC по номенклатуре в органической химии, Pure and Applied Chemistry,
10, ill —125, 1965. В ряде случаев условились добавлять в ранее употреблявшееся на-
звание букву «о», например, пальмитпл стал пальмитоилом, кротонпл — кротоноилом.
Название «ацетил» оставлено без изменения. Логика этого предписания не вполне яс-
на, и многие авторы продолжают употреблять старые названия. Часто бывает удобно
использовать систематические наименования (например, гексадеканоил — радикал гек-
садекановой кислоты). Для алкильных радикалов IUPAC-IUB рекомендует всегда ис-
пользовать систематические наименования (например, говорить «гексадециловый», а не
«пальмитиловый» спирт). Действительно, в старой литературе пальмитил нередко озна-
чал и ацильный, и алкильный радикал, что и побудило IUPAC ввести новые названия
ацильных радикалов.
8 Систематические названия в этом случае очень сложны и почти не употребляют-
ся; например, название линоленовой кислоты — цис,цис,цис-9,12,15-октадекатрпеновая
кислота.
личный представитель — фосфатидилхолин, или лецитин. Электрически
заряженные фосфатная и холиновая группы образуют полярную «го-
ловку» молекулы. В фосфолипидах второй группы, сфингомиелинах, в
качестве центрального звена присутствует особое основание с длинной
цепью — сфингозин. В отличие от триглицеридов, которые при темпера-
туре тела представляют собой жидкость, фосфолипиды находятся в
150 Глава 2
СООН
Арахидоновая кислота,
одна из незаменимых
жирных кислот
сн2
о
н—С
,сн2
•2
Сулыролипид
хлоропластов
ОН в-сульфо-Б-дезокси-а-Р-
глюкопиранозилдиглицерид
Разветвленные жирные кислоты анти-изо-ряда
имеют здесь точку ветвления; началом второй
ветви служит пятиуглеродный „ стартовый
участок" образующийся из изолейцина
Разветвленные жирные кислоты иза-ряда содержат
пятиуглеродный „стартовый участок',' образующийся
из лейцина , или четырехуглеродный участок,
п^пазующийся из валина
о
о
Молекулы, из которых мы состоим 151
Крепининовая кислота 18-2 (9с,12а) составляет 60%
жирных кислот в семенах Crepis foetida, представителя
семейства Compositae
Рицинолевая кислота (12-оксиолевая кислота),
составляет до 90% жирных кислот касторовых
бобов, Ricinus communis
Лактобацилловая кислота, главная жирная
киспота молочнокислых бактерий
РИС. 2-32. Структурные формулы еще нескольких липидов.
твердом состоянии, что, несомненно, предопределяет их участие в по-
строении биологических мембран (гл. 5).
Цереброзиды и ганглиозиды — это сфингозинсодержащие липиды
(сфинголипиды), в которых полярным компонентом является не фос-
фат, а сахар. Другие гликолипиды, обнаруженные в бактериях и зеле-
ных растениях, содержат глицерин и жирные кислоты, а также a-D-ra-
лактозу, глюкозу и маннозу. В хлоропластах в большом количестве со-
держится специфический сульфолипид (рис. 2-32).
3. Жирные кислоты липидов
За исключением нескольких первых членов ряда, растворимых в
воде, жирные кислоты имеют сильно выраженные гидрофобные свойст-
ва. Однако все они являются кислотами, их р/Са~4,8. Встречающиеся
в природе свободные жирные кислоты, как правило, находятся на по-
верхности раздела липидов и воды и содержат диссоциированные кар-
боксильные группы, выступающие в водную среду. Однако обычно при-
родные жирные кислоты этерифицированы или посредством амидной
связи соединены с другими компонентами сложных липидов.
При всем многообразии жирных кислот, встречающихся в том или
ином организме, преобладающими обычно являются лишь некоторые
из них. В высших растениях присутствуют в основном пальмитиновая
кислота (Cie-кислота) и две С^-ненасыщенные кислоты — олеиновая и
линолевая. С!8-насыщенная стеариновая кислота в растениях почти не
встречается, а кислоты от С20 до С24 встречаются редко (за исключени-
ем эпидермиса листьев). В то же время члены некоторых таксономиче-
ских групп содержат необычные жирные кислоты, что и позволяет от-
носить эти организмы именно к данной группе; например, представите-
ли семейства Compositae (сложноцветные, к которым, в частности, от-
носятся маргаритки) содержат ацетиленовые жирные кислоты, а бобы
клещевины — особую жирную оксикислоту (рис. 2-32).
Таблица 2-8
Структура некоторых фосфатидов и сфинголипидов
В плазмалогенах в этом
положении вместо жир-
ной кислоты находится
винил-окси-группа
\ Z../\/R
о
в этерифицированных
фосфатидах здесь нахо-
дится алкокси-группа
Фосфатиды (фосфоглицеролнпиды)
У=—ОН, фосфатидная кислота
—ОН—СН2СН2—N+(CH3)3 фосфатидилхолин (лецитин)
—О—СН2—СН—NH3 фосфатидилсерин
соо-
—О—СН2СН2—NH3 фосфатидилэтаноламии
но
о
фосфатидилинозит
Сокращения
PC
S
РЕ
PI
—О—СН2—СН—СН2ОН
Ан
—о—сн2—сн—сн2—о
I
Он
фосфатидилглицерин
дифосфатидилглицерии (кардиоли-
пин), специфический компонент бак-
терий и митохондрий
В некоторых- цереброзидах мозга в этом положении
находится ОН-группа
О
I
Соединения, в ко-
торых Y=H, на-
зываются церами-
дами. Сфинголи-
пиды часто назы-
вают производны-
ми церамидов
Сфинголипиды
о
V = —(р)— холин (— О—Р—О—CHjCH,-N'tCHj),),
о-
О
II
—Р—CH2CH2NHt,
о-
—p-D-Gal- или P-D-Gal-(1 -► 4)-Glc—;
В цереброзидсульфатидах, например в
на 3-сульфатная группа
GalNAc-(l 3)-Gal-(l — 4)-
-Gal (1 —4)-G]c—;
сфингомиелины
церамидаминоэтилфосфонаты
цереброзиды или церамидмоно- и
олигосахариды
лактозилцерамидсульфате, с галактозой связа-
входит в состав сфинголипида, при-
сутствующего в мембранах эритроци-
тов
I
Молекулы, из которых мы состоим
153
В организме животных тоже содержатся пальмитиновая и олеино-
вая кислоты, но помимо этого в них присутствует в больших количе-
ствах стеариновая кислота. Встречаются также С20-, С2г-, и С24-кисло-
ты, да и вообще набор жирных кислот у животных значительно богаче,
чем у растений. Удивительно, что ненасыщенные жирные кислоты боль-
шинства организмов содержат двойные связи только в цпс-конфигура-
ции. В табл. 2-9 приведен состав жирных кислот в одной из типичных
смесей триглицеридов.
Таблица 2-9
Состав жирных кислот в некоторых жирах и маслах3
Жиры и масла Число атомов углерода и (через двоеточие) число двойных связей
14 16 18 16:1 18:1 18 : 2
Жировая клетчатка у человека 3 23 4 8 45 10
Говяжий жир 4 30 25 5 36 1
Кукурузное масло 13 2 31 54
Топленый свиной жир 1 28 15 3 42 9
3 Gunstone F. D., An Introduction to the Chemistry
Acids and Their Glycerides, 2nd ed., Chapter 6. Chapman
and Biochemistry of Fatty
and Hall, London, 1967.
У бактерий полиненасыщенные жирные кислоты, как правило, от-
сутствуют, но часто встречаются разветвленные жирные кислоты, рав-
но как и циклопропансодержащие кислоты, оксикислоты и свободные
неэтерифицированные жирные кислоты. Содержание жирных кислот в
различных органах одного и того же организма неодинаково. Напри-
мер, липидный компонент биологических мембран может быть на 90%
представлен фосфолипидами. Фосфолипиды в свою очередь характери-
зуются более высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот,
чем триглицериды.
4. Поли-р-оксибутират
Липиды не являются полимерами в буквальном смысле этого слова,
однако как в метаболическом, так и в структурном отношении они
близки к присутствующей в бактериях полиоксимасляной кислоте —
важному запасному веществу. Этот сильно восстановленный полимер
состоит исключительно из звеньев D-p-оксимасляной кислоты, соединен-
ных сложноэфирной связью. Каждая цепь содержит около 1500 остат-
ков. Структура представляет собой компактную правую спираль с вин-
Связующие
группы
в полимере
Ъ~р-оксимасляная кислота
154 Глава 2
товой осью 2-го порядка и шагом 0,60 нм [100]. В бактериальных клет-
ках эти цепи уложены с образованием тонкого слоя толщиной ~ 5,0 нм.
Поскольку длина цепи из 1500 остатков в вытянутом состоянии равна
440 нм, цепь должна быть сложена примерно 88 раз.
Е. Некоторые малые молекулы и ионы
В клетках содержится большое количество малых органических мо-
лекул и ионов металлов. К ним относятся коферменты (гл. 8) — специ-
фические соединения, катализирующие в комплексе с ферментами хи-
мические реакции, которые в их отсутствие практически не идут.
Часто они выступают в роли окислителей, принимая в ходе окисле-
ния электроны от восстановленных органических соединений и переда-
вая их далее кислороду. Коферменты переносят также электроны, необ-
ходимые для процессов восстановления, например в ходе идущего под
действием света фотосинтеза. Исключительно велика во внутриклеточном
энергетическом обмене роль аденозин-5'-трифосфата (АТР) и родст-
венных ему соединений (дополнение 3-А). Важные функции внутри
клеток выполняют гормоны и другие низкомолекулярные регуляторные
соединения, а также целый ряд промежуточных продуктов метаболиз-
ма (промежуточных метаболитов).
1. Неорганические компоненты
Твердые компоненты клеток состоят главным образом из элементов
С, Н, О, N, S и Р. Однако после сжигания отдельной ткани или всего
организма в образующейся золе (обычно она составляет по весу 3—5%
всего твердого вещества, но в минерализованных тканях ее значитель-
но больше) присутствуют и многие другие химические элементы. Сре-
ди катионов относительно высоко содержание Na+, К+, Са2+ и Mg2+.
В организме человека при весе 70 кг содержится 1050 г Са (в основ-
ном в костях), 245 г К, 105 г Na и 35 г Mg. Далее идут железо (3 г),
цинк (2,3 г) и рубидий (1,2 г). Из этих трех элементов жизненно важ-
ными являются железо и цинк, а рубидий, вероятно, необязателен.
Другие элементы, относящиеся к металлам, в организме человека
присутствуют в количестве менее 1 г каждый, но по крайней мере семь
из них играют существенную роль. К ним относятся медь (100 мг),
марганец (20 мг) и кобальт (~5 мг). Роль других элементов — хрома
(<6 мг), олова и ванадия — для высших животных была выявлена
лишь недавно [101 —103]. По всей вероятности, необходимыми являют-
ся также никель, свинец и ряд других элементов [ЮЗ].
Среди металлоидов в золе преобладают фосфор (700 г для челове-
ка), сера (175 г) и хлор (105 г). Помимо этих трех элементов, жизнен-
но важных для всех организмов, высшим животным необходимы се-
лен, фтор, кремний (дополнение 2-Б) и иод, а растениям—бор
(рис. 2-33).
Какова вероятность того, что жизненно важными окажутся и дру-
гие элементы? Рассмотрим эритроцит человека — диск объемом
~80 мк3, содержащий около 3-108 молекул белка (преимущественно
гемоглобина). В одном эритроците находится 7-Ю5 атомов меди и
10s атомов жизненно необходимого элемента олова. Присутствуют
также 2-104 атомов серебра — металла, обладающего токсическим дей-
ствием- Его концентрация — свыше 10~7 М — достаточно высока, чтобы
предположить, что серебро выполняет какую-то важную каталитиче-
rifvin Тяк пи чтп — нризнестно. и скопее всего сепебцо попа-
Молекулы, из которых мы состоим 155
дает в наш организм попросту от того, что мы имеем дело с серебря-
ными предметами — монетами, ювелирными изделиями, посудой и т. д.
В эритроците содержатся также бор и алюминий (по 3-105 атомов
каждый), мышьяк (7-105 атомов), свинец (7-104 атомов) и никель
(2-Ю4 атомов). Из всех элементов периодической таблицы (кончая ура-
РИС. 2-33. Жизненно важные для живых организмов элементы [102] (они располо-
жены в закрашенных клетках). 11 элементов — С, Н, О, N, S, Р, Na, К, Mg, Са
и С1 — составляют 99,9% массы тела человека. Для жизнедеятельности высших орга-
низмов необходимо присутствие в следовых количествах еще 13 элементов. Высшим
растениям необходим бор; для животных, микроорганизмов и водорослей этот эле-
мент, по-видимому, иеобязателеи.
ном) лишь четыре (Ас, Ро, Ра и Ra) присутствуют в среднем в количе-
стве менее 1 атома на клетку [101].
Некоторые из элементов, считающиеся несущественными, в частно-
сти Cs, Rb, Sr и Ni (последний, возможно, существен), относительно
нетоксичны. Другие же высокотоксичны, например Sb, As, Ba, Be, Cd,
Pb, Hg, Ag, T1 и Th.
Ионный состав тканей и жидкостей тела сильно варьирует. Кровь
морских организмов по содержанию Na+, СК, Са2+ и Mg2+ близка к
морской воде. Кровь пресноводных и наземных организмов содержит
почти в 10 раз меньше Na и Cl и в несколько раз меньше Са и Mg, и
тем не менее она сравнительно богата этими ионами.
Вообще клетки богаты К+ и Mg2+ (особенно К+), но содержат мало
Na+ и Са2+. Из неорганических анионов главное место принадлежит
хлориду, но большую часть отрицательных зарядов привносят органиче-
ские карбоксилатные и фосфатные группы (табл. 2-10), многие из кото-
рых входят в состав белков и других макромолекул. По оценкам Лин-
га, концентрация аминокислотных остатков, принадлежащих внут-
риклеточным белкам, обычно составляет 1,66 М. Из этих остатков 10%
имеет отрицательно заряженные боковые группы и 8%—положитель-
но заряженные. Получающийся в итоге суммарный отрицательный за-
ряд достигает концентрации 38 мМ [104].
2. Избирательное накопление ионов
Живые организмы часто способны концентрировать многие присут-
ствующие в воде элементы в 104 и более раз. Даже морские виды кон-
центрируют почти все элементы, за исключением натрия и хлора. Не-
редко какой-то один вид или группа организмов имеют особое сродст-
во к определенному элементу, выступая по отношению к нему в роли
накопителя [101]. Так, плауны накапливают А1, бурые водоросли и
кишечнополостные — As; в бурых водорослях и губках накапливается В;
у позвоночных (в составе скелета) концентрируется F; некоторые бак-
терии, планктон и хвощи накапливают Fe. Кремний накапливается хво-
щами, диатомовыми водорослями, некоторыми простейшими и губками;
156 Глава 2
бурые водоросли вместо Са используют Sr; V накапливается некоторы-
ми видами асцидий, Y—папоротниками, Zn — кишечнополостными. Из-
вестны виды, специфически накапливающие Ba, Со, Li, Ni, Ti, Se, La и
Nd.
Ткани млекопитающих тоже нередко способны концентрировать оп-
ределенные ионы. Так, в составе волос и ногтей накапливаются Al, As,
I и V, в почках — Cd, Hg и Мп, в тканях кишечника — Sn, в предста-
тельной железе—Zn и Sr, в мозге Си, а в слизистой глаз накапливает-
ся В а [101].
Внутри клеток содержание неорганических ионов в разных органел-
лах и отсеках существенно различается. Так, в ткани сердца быка кон-
центрация меди в 10—15 раз меньше, чем в митохондриях [105].
3. Функции неорганических ионов
Очень часто присутствие того или иного нона металла или аниона
(например, С1 ) оказывается необходимым для работы фермента.
В ряде случаев ион металла связывается с ферментом в определенном
центре на его поверхности или внутри молекулы. Влияние иона на ка-
тализируемую реакцию может быть обусловлено присутствием сильно-
го электрического заряда. Некоторые ионы металла способны обратимо
окисляться и восстанавливаться. Благодаря этому свойству железо,
медь и кобальт входят в состав активных центров многих ферментов,
катализирующих окислительно-восстановительные процессы. Важное
значение имеет также способность ионов металлов влиять на взаимную
ориентацию разных участков молекулы белка или других макромоле-
кул. Связывание иона металла может вызывать радикальные измене-
ния в конформации молекулы (гл. 4, разд. В. 8.в).
Ж. Химический состав клеток
Какое количество белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов
и других веществ присутствует в живой клетке? Однозначно ответить
на этот вопрос нельзя, поскольку клетки сильно отличаются одна от
другой. Так, некоторые специализированные клетки накапливают в
большом крличестве триглицериды или углеводы. Железистые клетки
часто характеризуются необычно высоким содержанием белка и РНК.
Состав организма меняется с возрастом. Например, в организме эмб-
риона свиньи содержится 97% воды, а к моменту рождения ее остается
89%; для неоткормленной свиньи весом 45 кг этот показатель состав-
ляет 67%, тогда как для очень жирного животного в 135 кг весом он
не превышает 40%.
Простой приближенный анализ состава ткани проводят следующим
образом. Ткань полностью высушивают в вакууме при низкой темпера-
туре и из полученного твердого материала соответствующими раство-
рителями экстрагируют липиды. После выпаривания растворителя взве-
шивают оставшиеся липиды. Этим методом показано, что в молодых
зеленых овощах содержится 2—5% липидов в пересчете на сухой вес.
Даже в очень постном мясе содержание липидов составляет 10—30%.
Содержание белка часто оценивают по содержанию азота, умножив по-
следнее на 6,25. В молодых зеленых растениях белок может составлять
20—30% сухого веса, но очень постное мясо содержит его до 50—70%.
Мерой содержания в ткани неорганических компонентов служит вес
золы, образовавшейся после сжигания образца ткани при высокой тем-
пературе. Обычно зола составляет 3—10% веса ткани; при сжигании
Молекулы, из которых мы состоим 157
специализированных тканей (в частности, костей) этот процент больше.
В рамках такого приближенного анализа содержание углеводов оце-
нивается вычитанием всего остального из 100%- В молодых зеленых
растениях содержится до 50—60% углеводов, а в типичных животных
тканях — лишь 2—10%. В исключительных случаях содержание угле-
водов в животных тканях оказывается более высоким. Так, в устрицах
гликоген составляет 28%.
Содержание нуклеиновых кислот в клетках колеблется от 0,1% в
дрожжах и 0,5—1% в мышцах и бактериальных клетках до 15—40%
в тимусе (вилочковой железе) и в клетках спермы. Очевидно, в этих
двух последних случаях из-за высокого содержания нуклеиновых кис-
лот умножение содержания азота (в %) на 6,25 не дает правильной
оценки содержания белка.
Таблица 2-10
Примерный состав метаболически активных клеток и тканей
Компонент Е. coli3, % Зеленое расте- ние (шпинат, Spinaci а oleracea)6, о/ /и Печень крысыв, %
H2O Белок Аминокислоты ДНК РНК Нуклеотиды Углеводы Целлюлоза Гликоген Липиды Фосфолипиды Нейтральные липиды Стеролы Другие малые молекулы Неорганические ионы К+ 70 15 0,4 1 6 0,4 3 2 0,2 1 93 2,3 3,2 0,6 0,3 1,5 69 21 0,2 1,0 3,8 6 3,1 1,6 0,3 0,4
Компонент Концентрация крысы, в печени М
Аминокислотные остатки Нуклеотидные звенья Гликоген К+ 2,1 0,03 0,22 ОД
11 Watson J. D., Molecular Biology of the Gene, 3rd ed., p. 69, Benjamin, New York,
1976. В процентное содержание аминокислот, нуклеотидов, углеводов и липидов вклю-
чено содержание их предшественников, присутствующих в клетках.
6 Burton В. Т., Human Nutrition, 3rd ed., р. 505, McGraw-Hill, New York, 1976.
B Long C. ed., Biochemists’ Handbook, pp. 677—679, van Nostrand-Reinhold, Prince-
ton, New Jersey, 1961.
158 Глава 2
В табл. 2-10 приведен сравнительный состав бактерии (£. coli). зе-
леного растения (шпината) и функционально активной животной тка-
ни (печени крысы).
3. Как мы изучаем структуру молекул
Каким образом химики установили те тысячи структурных формул,
которые мы используем для описания встречающихся в природе мо-
лекул? Этот вопрос слишком сложен, чтобы обсуждать его здесь под-
робно. Но поскольку разделение соединений, анализ смесей и установ-
ление структуры молекул по-прежнему занимают важное место в сов-
ременной биохимии, далее мы даем «мини-обзор» и сопровождаем его
рядом ссылок, чтобы помочь читателю ориентироваться в литературе
по этим вопросам.
1. Разделение
Прежде чем начинать работу над выяснением структуры того или
иного вещества, необходимо выделить его в чистом виде из тех слож-
ных смесей, в составе которых оно находится в клетках и тканях, при-
чем зачастую концентрация этого вещества в ткани бывает весьма низ-
кой. Затем молекулы соединения необходимо разрушить и полученные
фрагменты разделить, очистить и идентифицировать. Для определения
относительного содержания компонентов проводят точный количествен-
ный анализ. Далее уже нужна известная изобретательность, чтобы со-
брать из всех фрагментов единое целое и установить структуру исход-
ных молекул.
а. Фракционирование клеток [105—ПО]
Исходным материалом при фракционировании может служить све-
жая ткань или осадок спрессованных клеток микроорганизма, обычно
получаемый с помощью центрифугирования.
Ткань измельчают либо в мясорубке, либо, если нужна более мяг-
кая обработка, в гомогенизаторе'. Клетки микробов чаще всего разру-
шают с помощью ультразвука или продавливанием через пресс под вы-
соким давлением. При фракционировании очень важно подобрать нуж-
ное значение pH и состав буфера, а при выделении субклеточных орга-
нелл— осмотическое давление. Для сохранения целостности органелл
часто в качестве суспендирующей среды используют 0,25 М. сахарозу, к
которой добавляют A4gCl2, а также реагент, образующий комплекс с
металлами, например этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) (табл. 4-2).
Растворимые ферменты обычно экстрагируют без добавления сахарозы,
но при этом используют восстановители — глутатион (дополнение 7-Б),
меркаптоэтанол или дитиотреитол (разд. 3.3.а).
Полученный сырой гомогенат процеживают и обычно центрифугиру-
ют непродолжительное время, чтобы удалить фрагменты клеток и про-
чие «осколки». Клеточные органеллы, как правило, отделяют центрифу-
гированием [106, 107]. Одна из методик подобного рода состоит в сле-
дующем. Гомогенат в 0,25 М сахарозе (изотоничной по отношению к
большей части клеток) центрифугируют в течение 10 мин при 600—
1 Наиболее широко используется гомогенизатор, представляющий собой цилинд-
рический патрон, внутри которого вращается довольно плотно прилегающий к стен-
кам стеклянный или пластиковый поршень.
Молекулы, из которых мы состоим 159
1000 g, что позволяет осадить ядра и целые клетки. Затем надосадоч-
ную жидкость центрифугируют еще 10 мин при -—10 000 g, в результа-
те чего осаждаются митохондрии и лизосомы. Наконец, центрифугиро-
вание в течение часа при —-100 000 g дает микросомный осадок. Каж-
дый из разделенных компонентов можно затем снова суспендировать
и повторно центрифугировать, чтобы получить более чистый препарат
органелл данного типа. Осажденные частицы во многих случаях рас-
творяют с помощью химической обработки, например добавляя детер-
генты. Супернатант (надосадочная жидкость), остающийся после цент-
рифугирования с максимальной скоростью, служит исходным материа-
лом для выделения растворимых ферментов и многих низкомолекуляр-
ных соединений.
б. Разделение, основанное на разной растворимости
компонентов системы
Некоторые фибриллярные белки практически нерастворимы в воде,
так что все остальные компоненты препарата можно удалить растворе-
нием. Растворимые белки чаще всего осаждают из водных растворов
путем высаливания, которое сводится к добавлению большого количе-
ства соли, например сульфата аммония. Разные белки осаждаются при
разных концентрациях соли, поэтому можно отделить фракцию белков,
осаждающихся в заданном интервале концентраций, а затем очищать
эту фракцию дальше. Методы, основанные на таком поэтапном осаж-
дении, широко используются как первый шаг очистки, поскольку они
позволяют получать сразу большие количества материала.
РНК чаще всего получают обработкой препарата фенолом, насы-
щенным водой, в котором осаждаются все белки. При определенных
условиях иногда удается удалить и ДНК. Последовательные стадии
осаждения и экстрагирования позволяют отделить РНК от полисаха-
ридов (в водном слое), ДНК (если она имеется) и других компонентов
[111 —113]. Нуклеиновые кислоты можно отделить от белков, удаляя
последние с помощью протеолитических ферментов.
Некоторые углеводы, например целлюлоза и гликоген, устойчивы к
кипячению в щелочи, и это позволяет удалить все другие компоненты
смеси. Липиды экстрагируют из тканей неполярными растворителями
[114], например смесью СНС13 и СН3ОН в соотношении 2:1.
в. Разделение, основанное на распределении соединений
между разными фазами
Многие наиболее важные методы разделения основаны на много-
кратном распределении соединений между двумя разными фазами, из
которых хотя бы одна обычно является жидкой. Малые молекулы мож-
но разделить с помощью противоточного распределения, когда препа-
рат многократно уравновешивается между двумя жидкими фазами,
причем одна из фаз более полярна, чем другая. После каждого уравно-
вешивания с помощью специального устройства «противоточным» обра-
зом вводятся новые порции обеих жидкостей [115].
В качестве одной из фаз можно использовать порошок или мелкие
частицы; ими заполняют вертикальную колонку или наносят их тонким
слоем на стеклянную пластинку. Все эти методы называются хромато-
графическими— термин, предложенный М. Цветом, который впервые в
1903 г. описал разделение пигментов, присутствующих в листьях рас-
тений (хлорофилла и каротинов). Пропуская пигменты, растворенные
160 Глава 2
в неполярных растворителях (например, гексане), через колонку с
окисью алюминия или другими адсорбентами, М. Цвет обнаружил, что
смесь разделяется на окрашенные полосы, которые перемещаются вдоль
колонки по мере прохождения растворителя. Непрерывно пропуская
растворитель через колонку, можно элюировать отдельные пигменты в
РИС. 2-34. Двумерная тонкослойная хроматография (в силикагеле) смеси флавинов,
образовавшихся при облучении витамина рибофлавина. Появление светлых пятен на
снимке обусловлено флуоресценцией соединений в ультрафиолетовом свете. Какое-то
количество рибофлавина сохраняется в первоначальном виде (пятно, обозначенное
RF). Стрелки указывают место нанесения образца. Для разделения в первом направ-
лении использована смесь уксусная кислота/2-бутанон/метанол/бензол, во втором —
смесь н-бутанол/уксусиая кислота/вода [147].
чистом виде. Описанный метод широко применяется и сейчас и носит
название адсорбционной хроматографии. При этом пигменты не раство-
ряются в твердом материале, а адсорбируются на его поверхности.
Часто в качестве материала, которым наполняют колонки, исполь-
зуют силикагель, содержащий большое количество воды; разделение
компонентов в этом случае происходит за счет их распределения между
водной фазой, иммобилизованной силикагелем, и водой, протекающей
через колонку. Для разделения липидов применяют колонки с обращен-
ной фазой; их наполняют силикагелем, окисью алюминия или другим
инертным материалом, пропитанным неполярной жидкостью. В роли
подвижной фазы в этом случае выступает более полярный раствори-
тель.
Хроматография на бумаге основана на использовании в качестве
иммобилизованной фазы высококачественной фильтровальной бумаги,
адсорбирующей воду. В последнее время широкое распространение по-
лучила тонкослойная хроматография; вместо бумаги здесь использует-
ся тонкий слой силикагеля, нанесенный на стеклянную пластинку. Этот
метод гораздо удобнее хроматографии на бумаге, поскольку дает бо-
лее быстрое и качественное разделение (рис. 2-34). Для разделения
летучих веществ применяется газовая хроматография, основанная на
Молекула, из которых мы состоим 16 1
установлении динамического равновесия между газовой и неподвижной
фазами при сравнительно высоких температурах; область применения
этого метода расширяется в связи с возможностью образования лету-
чих производных разделяемых соединений (например, метиловых эфи-
ров или триметилсилильных производных сахаров).
Весьма важное место принадлежит аффинной хроматографии [116,
117]. Она основана на использовании особых адсорбентов, специфиче-
ски взаимодействующих с макромолекулами и избирательно удержи-
вающих данный вид макромолекул (отсюда и название метода). При-
мером, о котором уже говорилось в разд. Г.10, служит адсорбция комп-
лементарных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты на иммоби-
лизованной ДНК. Аффинная хроматография используется также для
очистки ферментов, антител и других белков, способных прочно связы-
ваться со специфическими малыми молекулами.
Открытый характер структуры в гелях (рис. 2-18), образуемых про-
изводными агарозы, делает крупнозернистые порошки этих гелей удоб-
ной твердой основой для приготовления адсорбентов. Гидроксильные
группы агарозы часто модифицируют присоединением к ним аминов.
Вначале агарозу обрабатывают бромцианом (Вг—C = N) в щелочной
среде, «активируя» тем самым углеводную цепь (химическая сторона
этого вопроса обсуждается в работе [118]), а затем добавляют амины.
Полная реакция описывается следующим уравнением:
Вг-
Агароза—ОН -f- BrCN -f- R—NH2 -->
NH О
! II
Агароза—О—С—NH—R-p Агароза—О—С—NH—R — Другие продукты. (2-17)
Таким образом можно приготовить адсорбенты, содержащие множест-
во разных R-групп. Кроме того, присоединив к активированной агарозе
диамин [R=(CH2)«—NH2], с полученной в результате со-аминоалкил-
агарозой можно далее связать другие соединения. Для этого исполь-
зуется реакция с растворимым в воде карбодиимидом:
О
II Растворимый в воде
Агароза—О—С—NH—СН2—СН2—NH, + R—СООН-----------------
карбодиимид
О о
II н II
--->- Агароза—О—С—NH—СН2—СН2—N—С—R. (2-18)
Карбодиимиды широко применяются в лабораторной практике для об-
разования амидных и фосфодиэфирных связей. Процесс образования
амида, фигурирующего в уравнении (2-18), можно изобразить в виде
схемы (2-19). Для реакций, протекающих в неводной среде, часто ис-
пользуют дициклогексилкарбодиимид (R"= циклогексил; см схему),
однако для последующего присоединения каких-либо групп к сахарозе
лучше брать растворимый в воде реагент, например 1-этил-3-(диметил-
аминопропил)-карбодиимид [119].
Помимо описанных выше, известно также много других способов
приготовления адсорбентов для аффинной хроматографии.
Примером применения аффинной хроматографии для очистки фер-
ментов может служить выделение стафилококковой нуклеазы (фермен-
162 Глава 2
та, гидролизующего ДНК) с помощью хроматографии на колонке с
агарозой, содержащей следующую труппу [120]:
Агароза
Эта ЬифосфонуклеозиЬная группа
комплементарна активному
центру фермента
Тимин
г. Разделение, основанное на размерах молекул
Диализ [121] и ультрафильтрация [122] основаны на применении
в качестве полупроницаемого барьера тонкой мембраны (например, из-
ацетата целлюлозы — целлофана), имеющей поры диаметром 1—10 нм
(чаще всего 5 нм). Малые молекулы такая мембрана пропускает, а
крупные задерживает. Диализ определяется диффузией, и его можно'
ускорить перемешиванием раствора, а скорость фильтрования зависит
от разности давлений по разные стороны мембраны. Более сложный
.характер имеет гель-фильтрация [123]. Колонку наполняют материа-
лом типа декстрана с большим числом поперечных сшивок (сефадекс1);,
обычно он имеет вид спрессованных мягких шариков. Шарик представ-
ляет собой трехмерную сеть из углеводных цепей (рис. 2-18). Прост-
ранство между цепями (оно зависит от числа сшивок, образующихся
в геле при его химической обработке) недостаточно для проникновения
туда крупных молекул, но в нем вполне могут задерживаться малые
молекулы. При пропускании через такую колонку смеси разных моле-
1 Коммерческое название продукта, производимого Фирмой Pharmacia Fine Chemi-
cals, Uppsala, Sweden.
Молекулы, из которых мы" состоим 163
кул малые молекулы диффундируют внутрь частиц геля и задержива-
ются там, а крупные проходят беспрепятственно (рис. 2-35). Сефадекс
G-25 не задерживает ничего, кроме низкомолекулярных солей и соеди-
МЛ
РИС. 2-35. Разделение олигосахаридов с помощью гель-фильтрации. Сахара, раство-
ренные в дистиллированной воде, пропускали через колонку, заполненную сефадексом
G-25. Пики (справа налево) соответствуют глюкозе, целлобиозе, целлотрнозе и т. д.
(Flodin Р., Aspberg К.-, Biol. Struct. Funct. 1st., Proc. IUB/IUBS Int. Symp., 1960, 1,
345, 1961.)
нений типа простых циклических сахаров. Сефадекс G-200 с гораздо
меньшим числом поперечных сшивок применяется для разделения
макромолекул, мол. вес которых лежит в интервале 5000—200 000.
д. Центрифугирование
Самые разнообразные методы разделения связаны с использованием
препаративных центрифуг [124, 125]. Скорость седиментации молекул
в центробежном поле зависит от формы и размеров молекул. Каждая
молекула характеризуется своей константой седиментации s, выражае-
мой в единицах Сведберга, S. Когда же в центрифуге устанавливается
седиментационное равновесие, то главным фактором, определяющим,
где в итоге окажутся частицы, становится их плотность.
Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов
достаточно кратковременного последовательного центрифугирования
при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорени-
ем) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препа-
раты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиен-
те плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций,
различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой
центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора са-
харозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккурат-
но наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень
высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разде-
ляется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируе-
мых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и соби-
рают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций.
Далее определяют положение каждой фракции и содержание в ней
РНК.
При достаточно большом времени центрифугирования частицы до-
стигают в градиенте плотности равновесных положений. Именно та-
щим образом в соответствии с их плотностью в градиенте сахарозы раз-
деляют клеточные органеллы (гл. 1, разд. Б.6). Макромолекулы (на-
164 Глава 2
пример, ДНК) чаще всего разделяют в градиенте CsCl [126]. В плот-
ных солевых растворах градиенты достаточно устойчивы, и для лучше-
го разделения применяются очень сильные центробежные поля. В ре-
зультате можно отделить одноцепочечную ДНК от двухцепочечной или
разделить препараты ДНК с разным GC-содержанием. Последнее ос-
новано на различиях в плавучей плотности р таких ДНК в растворе
CsCl, которая меняется с GC-содержанием в соответствии со следую-
щим приближенным уравнением:
р= 1,660 +0,098-(мольная доля GC-nap).
е. Электрический заряд
В основе ряда методов разделения молекул лежит различие в сум-
марном заряде, который они несут при данном pH среды. Этот суммар-
ный заряд для многих соединений легко оценить по числу содержащих-
ся в них кислых и основных групп. Предположим, что нам известны
значения рЛа каждой группы и степень ее диссоциации при данном pH.
При некотором pH, называемом изоэлектрической точкой, суммарный
заряд молекулы становится равным нулю — в электрическом поле она
не перемещается. При любом другом значении pH молекула будет дви-
гаться к аноду ( + ) или катоду (—).
Электрофорез, процесс разделения молекул, основанный на разной
скорости перемещения их в электрическом поле, проводят самыми раз-
ными способами. Очень небольшое количество раствора, содержащего
смесь белков (например, белков сыворотки крови), наносят в виде
тонкой полоски на лист фильтровальной бумаги или ацетата целлюло-
зы. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический
ток. Напряжения в несколько сот вольт достаточно для разделения
белков сыворотки в течение 1 ч. Для ускорения процесса и снижения
диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоко-
вольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом
случае 2—3 тыс. вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью
термостатируемых пластин; иногда для той же цели всю систему погру-
жают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших
количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крах-
мальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распрост-
раненных и чувствительных методов разделения белков является элект-
рофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод,
в настоящее время сильно усовершенствованный, позволяет проводить
разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому
заряду; его называют методом электрофоретического молекулярного си-
та [127, 128].
При изоэлектрическом фокусировании в вертикальной колонке меж-
ду анодом и катодом электрохимически создается градиент pH. Гра-
диент pH стабилизируется градиентом плотности, чаще всего сахароз-
ным; вся система тщательно термостатируется. Белки в колонке дви-
жутся в направлении, соответствующем их изоэлектрической точке, где
«фокусируются» в виде очень узкой полосы. Две соседние полосы мо-
гут быть разделены интервалом всего лишь в 0,01 единицы pH. Счита-
ется, что изоэлектрические точки белков в обычных экспериментальных
условиях близки к их изоионным точкам, т. е. к тем значениям pH, при
которых белки остаются изоэлектрическими в условиях полного отсут-
ствия добавленного электролита [129].
Чрезвычайно важным методом разделения, связанным с наличием
электрических заряженных групп, является ионообменная хромато-
Молекулы, из которых мы состоим 165
графия. Обычно применяются водные растворы смесей и колонки, на-
полненные ионообменной смолой — пористым веществом, содержащим
связанные ионные группы, например —SO3, —ООО', —NH3, или чет-
вертичные атомы азота. Для разделения малых молекул, как правило,
берут синтетические смолы, основу которых составляет полистирол с
поперечными сшивками. Для крупных молекул больше подходят произ-
।________।________i_
О 10 20
_1_____|_______I______I_______I_____।-------1-------1-----1--------1—
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Время элюирования, мин
РИС. 2-36. Результат ионообменной хроматографии смеси аминокислот в аминокислот-
ном анализаторе. Смесь аминокислот (по 0,5 нмоль каждой) нанесли на колонку диа-
метром 0,9 см и длиной 58 см, заполненную мелкими частицами полнстирол-сульфона-
та (Durrum тип DC-4A), и элюировали ее цитратным буфером при трех значениях pH.
последовательно возраставших от 3,5 до 6,4. Проходящий через колонку раствор об-
рабатывали флуорескамином (стр. 180) и затем непрерывно регистрировали флуорес-
ценцию образовавшегося продукта. (С любезного разрешения Durrum Chemical Corp.)
водные целлюлозы или поперечносшитых декстранов (сефадекс). Со-
единения с положительно заряженными группами, например аминокис-
лоты в кислом растворе, наносят на колонку с катионообменной смо-
лой, скажем дауэкс 50, которая содержит диссоциированные группы
сульфоновой кислоты. Адсорбированные аминокислоты элюируют рас-
твором НС1 или буфером с возрастающим значением pH. Процесс тако-
го типа лежит в основе автоматического количественного анализа сме-
сей аминокислот, образующихся в результате гидролиза белков или
пептидов (рис. 2-36). На сульфонат-замещенном полистироле можно
разделять также пуриновые и пиримидиновые основания. Отрицатель-
но заряженные нуклеотиды обычно разделяют на смолах, содержащих
четвертичные основания [130]. Разработан вариант этого метода для
166 Глава 2
разделения очень малого количества материала; например, можно ко-
личественно определять содержание каждого из нуклеотидов в препара-
те митохондрий из печени крысы, содержащем 5—8 мг белка [131].
2. Гидролиз
Почти все биополимеры по своей природе нестабильны и в реакции
с водой распадаются на мономерные звенья (гидролизуются). Гидро-
лиз катализируют протоны, ионы гидроксила и ферменты. Механизмы
гидролиза рассматриваются в гл. 7. Гидролиз может быть полным или
частичным, неспецифическим или, напротив, направленным на опреде-
ленные связи в молекуле полимера.
Полный гидролиз белков обычно проводят путем нагревания при
температуре около 110° в атмосфере Ns в присутствии 6 н. НС1 в тече-
ние 12—96 ч. Некоторые аминокислоты, в особенности триптофан, при
этом разрушаются. По существу, методика проведения идеального
полного гидролиза отсутствует1. Полный гидролиз белков можно осу-
ществить с помощью основных катализаторов, но при этом наблюдает-
ся значительная рацемизация аминокислот.
Нуклеиновые кислоты тоже гидролизуют сильной кислотой. Напри-
мер, нагревания в течение 1 ч при 100 °C в 12 н. хлорной кислоте доста-
точно для расщепления молекулы до составляющих ее оснований.
В ДНК N-гликозидные связи более лабильны, чем в РНК, связи с пу-
ринами более лабильны, чем с пиримидинами. Последнее обстоятельст-
во позволяет провести весьма полезную операцию: если оставить ДНК
на ночь на холоду при pH 2, произойдет полная ее апуринизация. Об-
разующийся полимер известен как апуриновая кислота (табл. 2-11).
Щелочной гидролиз РНК Дает смесь 2'- и З'-нуклеотидов. Механизм
этого процесса связан с участием свободных 2'-ОН-групп рибозы и
образованием циклических 2',3'-фосфатов и аналогичен механизму
действия панкреатической рибонуклеазы (гл. 7, разд. Д.2). Поскольку
у дезоксирибозы нет свободной 2'-ОН-группы, ДНК в щелочной среде
не разрушается.
Ферментативные методы гидролиза особенно ценны благодаря при-
сущей им во многих случаях специфичности. Трипсин, представляющий
собой так называемую эндопептидазу, быстро расщепляет пептидные
связи лишь в том случае, если карбонильная группа расщепляемой
амидной связи принадлежит одной из основных аминокислот — лизину
или аргинину. Таким образом, трипсин превращает белок в сравнитель-
но малое число триптических пептидов, которые можно разделить и
охарактеризовать. Трипсин расщепляет только денатурированные бел-
ки, причем для получения хороших результатов нужно предварительно
разорвать дисульфидные мостики.
1 Недавно сообщалось, что лучшие результаты дает полный гидролиз в 4-1У-метан-
сульфоновой кислоте в присутствии 3-(2-аминоэтил)-индола [131а].
Молекулы, из которых мы состоим
Таблица 2-11
Некоторые реакции гидролитического расщепления олигонуклеотидов’
Основание
В РНК и других рибонуклеотидах расщепление
b-rnuna мотет идти с участием свободных
2-ОМ-групп за счет нуклеофильной отопи фосфора
Расщепление этой связи под действием
.-слабых кислот (р\12)'дает апуриновую
: кислоту
Ри/ ‘ Pv Основание
5-ионеч
Панкреатическая рибонуклеаза
делает b-разрыв справа от
Пиримидина
А. Расщепление в точках а осуществляется:
1. Эндонуклеазами (по всей длине молекулы)
Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I
2. Экзонуклеазами (только с З'-конца)
Неспецифическая диэстераза змеиного яда, атакует ДНК и РНК.
Реакция идет с обязательным участием свободной З'-ОН-группы
Б. Расщепление в точках b осуществляется:
1. Случайным образом вдоль всей молекулы эндонуклеазами и щелочами (нефер-
ментативный гидролиз)
Панкреатическая рибонуклеаза расщепляет цепь только справа от
пнримидинсодержащих нуклеотидов
Рибонуклеаза TI из Aspergillus oryzae расщепляет цепь справа от
гуаиинсодержащих остатков (З'-гуанилат)
Рибонуклеаза Т2 из Aspergillus oryzae расщепляет цепь справа от
аденинсодержащих остатков (З'-аденилат)
Панкреатическая дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) II
Микрококковая ДНКаза
2. Экзонуклеазами (только с 5'-конца)
Фосфодиэстераза из селезенки быка гидролизует как полирибо-, так
и полидезоксирибонуклеотиды
а В таблицу включены реакции, затрагивающие как РНК, так и ДНК
6 Символ Р в кружочке здесь означает группу—РО»—.
Другие ферменты, например химотрипсин и пепсин (гл. 7, разд Г.2),
менее избирательны, но все же их тоже можно использовать для рас-
щепления пептидной цепи на фрагменты с последующим определением
структуры этих фрагментов. Для установления полной аминокислотной
последовательности белка нужно найти «перекрывающиеся» фрагмен-
ты, содержащие последовательности, в которые входят концы двух
разных триптических фрагментов. Таким путем можно «выстроить»
пептиды в том порядке, в котором они расположены в нативном белке.
Рассмотрим теперь метод пептидных карт. Его первый этап состоит
в разрыве дисульфидных связей, далее белок денатурируют и расщеп-
ляют ферментами, например трипсином или пепсином. В результате по-
лучается набор пептидов, размер и аминокислотный состав которых ха-
рактерен для каждого отдельного белка. Смесь пептидов наносят на
лист хроматографической бумаги и проводят в одном направлении хро-
матографию, а в другом — электрофорез. Пептиды локализуются в ви-
де отдельных пятен, образуя характерную картину («отпечатки паль-
цев»), Метод пептидных карт особенно полезен для выявления малых
168 Глава 2
различий в структуре белка, например различий между генетическими
разновидностями одного и того же белка (рис. 4-20).
Некоторые ферменты катализируют последовательное отщепление
аминокислот с одного или другого конца пептидной цепи. Карбоксипеп-
тидазы отщепляют аминокислоты с карбоксильного конца, а аминопеп-
тидазы атакуют противоположный конец. Используя хроматографиче-
ские методы, можно определить, какие аминокислоты были отщеплены
этими ферментами в заданные моменты времени, и получить представ-
ление о последовательности аминокислот на концах цепи.
Полное ферментативное расщепление белков проводят с помощью
смеси ферментов, которую составляют протеазы, синтезируемые гри-
бами (проназы). Однако ферменты смеси расщепляют еще и друг дру-
га, так что в общем случае для количественного расщепления белка на
составляющие его аминокислоты ферментативный гидролиз не годится.
Один из новых методов основан на применении гидролитических фер-
ментов, иммобилизованных на колонках с агаровым гелем. Гидролизуе-
мый белок пропускают через гель, после чего на дне колонки скапли-
ваются составляющие его аминокислоты [132].
Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с концов полинуклеотидных
цепочек, в то время как эндонуклеазы делают разрывы внутри цепи.
Одни из них гидролизуют лишь одноцепочечные молекулы, другие—
двухцепочечные. Некоторые нуклеазы разрывают обе цепи ДНК, тогда
как другие «надрезают» молекулу, внося разрыв лишь в одну из це-
пей. Специфичность ряда нуклеаз отражена в табл. 2-11. Частичный
ферментативный гидролиз РНК дает расщепление молекулы на корот-
кие нуклеотидные последовательности, позволяющие далее определить
полную последовательность РНК. (Первой РНК, для которой установ-
лена последовательность, была аланиновая тРНК- Расщепление про-
водили с помощью панкреатической рибонуклеазы и рибонуклеазы Т1
[133]. Очень полезным методом получения нуклеотидных карт оказал-
ся двумерный электрофорез в полиакриламидном геле [134].
Дополнение 2-В
Изотопы в биохимических исследованиях
Как стабильные3, так и радиоактивные б~г изотопы широ-
ко используются в химических и биологических исследовани-
ях. Введение изотопных меток произвело целую революцию
в изучении метаболизма. В одном из первых биологических
экспериментов, основанных на использовании стабильного
изотопа 15N (регистрируемого масс-спектрометрически), Шен-
геймер с сотрудниками в 1937 г. обнаружили неожиданно
высокую скорость обновления белков в живых тканях (гл. 14,
разд. Б). Используя 14СО2, Кэлвин и др. впервые проследи-
ли путь углерода в процессе фотосинтеза (дополнение 11-А).
Аналогичным образом применение изотопов 32Р и 35S позво-
лило изучить метаболизм фосфора и серы; тритий (3Н) на-
шел широкое применение для мечения разнообразных органи-
ческих соединений, например тимина. Использование радиоак-
тивных изотопов лежит в основе чувствительных аналитиче-
ских методов, к числу которых относится радиоиммуноанализ
Молекулы, из которых мы состоим 169*
Изотоп Период полураспада Энергия излучения, МэВ
(3 V
2Н (дейтерий) Стабильный
3Н (тритий) 12,26 года 0,018
13С Стабильный
“С 5760 лет 0,159
15N Стабильный
1»О »
22Na 2,6 года 0,54 1,28
32р 14,3 дня 1,17
35S 87,2 дня 0,167
звС1 4-105 лет 0,716
40К 1,4 Ю9 лет 1,4 1,5
45Са 152 дня 0,255
59Fe 45 дней 0,467 7,70
e5Zn 250 дней 0,32 1,14
"Sr 25 лет 0,54
125 J 60 дней 0,035 0,030
131J 8,07 дня 0,606 0,365
гормонов, присутствующих в микроколичествах (дополнение
16-А). В рамках приложений, которые находит радиоавтогра-
фия, изотопы облегчают проведение многочисленных анали-
тических исследований (см. прилагаемый снимок) и составля-
ют основу ценного метода определения концевых групп, выяв-
ляющего последовательность нуклеотидов (рис. 2-37).
Различие в массе изотопов, особенно при переходе от 'Н к
2Н и далее к 3Н, часто сильно влияет на скорости реакций;
проводимое на этой основе изучение кинетических изотопных
эффектов позволило лучше понять механизм многих фермента-
тивных реакций и все детали их стереохимии. Ярким приме-
ром тому служит синтез и дальнейшее использование хираль-
ного ацетата (гл. 7, разд. К. 2.ж). За эти исследования
Дж. В. Корнфорт в 1975 г. был удостоен Нобелевской пре-
мии6. Специфические свойства изотопов лежат в основе ЯМР-
спектроскопии (разд. И).
Некоторые из изотопов, нашедших широкое применение в-
биохимии, указаны в приведенной выше таблице. Для радио-
активных изотопов даны периоды полураспада, а также тип
испускаемых частиц и их энергия. Лучи, испускаемые, напри-
мер, при распаде 1251 и 13Ч, обладают сильной проникающей
способностью; их интенсивность, как и интенсивность сильно-
го p-излучения изотопа 32Р, очень легко определить. Другой
изотоп, 3Н (тритий), регистрировать гораздо труднее*5, однако
испускаемая им слабая р-частица с малой длиной пробега де-
лает тритий уникальным для использования в микрорадиоав-
тографии. Зная период полураспада данного изотопа (уравне-
ние 6-4), можно определить то его количество, которое необ-
170 Глава 2
ходимо для получения данной скорости распада; это имеет
важное практическое значение, поскольку позволяет найти,
какое число распадов в минуту необходимо иметь, чтобы вести
счет импульсов с достаточно малой статистической ошибкой.
Радиоактивность, при которой в 1 с происходит 3,7-1010 распа-
дов (такова радиоактивность 1 г чистого радия, 0,3 мг изотопа
Радиоавтограмма, иллюстрирующая разделение белков Escherichia coli с включен-
ными в них 14С-аминокислотамид. 25 мкл образца (180 000 имп-мин-'), содержащего
~10 мкг белка, нанесли на колонку с полиакриламидным гелем (размер колонки
2,5X130 мм) и провели изоэлектрическое фокусирование (разд. 3.1.е). В результате
белки разделились в соответствии с их изоэлектрическими точками. Затем гель из-
влекли из колонки и поместили на край пластинки из полиакриламидного геля. По-
следующи электрофорез в растворе додецилсульфата натрия в перпендикулярном на-
правлении привел к разделению белковых молекул по размерам. На радиоавтограм-
ме, полученной наложением на пластинку геля фотографической пленки (в течение
875 ч), можно различить свыше 1000 пятен.
3Н или 0,22 г изотопа 14С) составляет один кюри (Ки). Один
милликюри (мКи) —это 2,22-10® расп.-мин-1. Меченое соеди-
нение обычно содержит сравнительно мало радиоактивного
изотопа по сравнению со стабильным изотопом того же эле-
мента. Радиоактивные препараты характеризуют их суммар-
ной радиоактивностью, выражаемой в милли- или микрокюри,
и удельной активностью — мКи-ммоль-1. Например, если со-
единение содержит в каком-то одном положении изотоп 3Н и
обладает удельной активностью 50 мКи-ммоль-1, то 3Н содер-
жится в этом положении в количестве 0,17%.
Молекулы, из которых мы состоим 171
а Matwiyoff N. A.. Ott D. G., Science, 181, 1125—1132 (1973).
6 Wang С. И., Willis D. L., Loveland W. D., Radiotracer Methodology in
the Biological, Environmental and Physical Sciences, Prentice-Hall, En-
glewood Cliffs, New Jersey, 1975.
B Wang Y. ed., Handbook of Radioactive Nuclides, The Chemical Rubber
Co., Cleveland, Ohio, 1969.
r Thornburn С. C., Isotopes and Radiation in Biology, Butterworth, Lon-
don, 1972.
« O’Farrell P. H„ JBC, 250, 4007—4021 (1975).
e Cornforth J. W., Science, 193, 121—125 (1976).
ж Bransome E. D., Jr. ed., Liquid Scintillation Counting, Grune and Strat-
ton, New York, 1970.
Методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК раз-
рабатывались медленнее, и тем не менее к настоящему времени они
уже достаточно хорошо освоены [134а]. Разрыв молекулы ДНК вбли-
зи участка с определенной последовательностью (обычно палиндром-
ной, разд. Г.11) осуществляют с помощью специфических эндонуклеаз
рестрикции (гл. 15, разд. Е.1). Полученные фрагменты далее подвер-
гают депуринизации или обрабатывают экзонуклеазами [135]. Отлич-
ные результаты дает электрофорез на ацетате целлюлозы с последую-
щим применением особой тонкослойной «гомохроматографии»1 на
ДЭАЭ-целлюлозе [136]. Если олигонуклеотиды несут радиоактивную
метку на одном конце, последовательность можно определить, частично
гидролизуя их с помощью экзонуклеазы (см. следующие параграфы) и
проводя затем электрофорез и гомохроматографию (рис. 2-37). Наи-
меньший по длине олигонуклеотид в ходе гомохроматографии продвига-
ется дальше всех; каждое из следующих расположенных ниже пятен
отвечает соединению, содержащему на один нуклеотид больше, чем
предыдущее. По смещению одного пятна относительно другого в ходе
электрофореза можно восстановить примерную нуклеотидную последо-
вательность [137, 137а]. Так, на рис. 2-37 самое верхнее пятно отвечает
олигонуклеотиду неизвестного состава, а нуклеотид, находящийся непо-
средственно ниже его, содержит на один остаток тимина больше, о чем
ясно свидетельствует его более высокая электрофоретическая подвиж-
ность при pH 3,5. Присоединение гуанина увеличивает электрофорети-
ческую подвижность не так сильно, а присоединение аденина почти
совсем на нее не влияет. Присутствие лишнего цитозина, напротив, сни-
жает электрофоретическую подвижность. Последовательность может
быть прямо считана с нуклеотидной карты: (5') -TTATTAGCCAGAAGT-
-(3'). Эти данные были подтверждены дальнейшими исследованиями,
в ходе которых проводилось отщепление пуринов и определение бли-
жайших соседей. Другой недавно разработанный метод быстрого опре-
деления последовательности ДНК описан в работе [137b].
Существует целая группа специфических ферментов, расщепляющих
полисахариды. Обычно эти ферменты специфичны по отношению к ка-
кому-то конкретному сахару, встроенному в цепь с помощью определен-
ного типа гликозидной связи. Примерами такого типа являются фермен-
ты, расщепляющие крахмал. а-Амилазы из слюны и поджелудочной
железы разрывают молекулы крахмала случайным образом, тогда как
1 Разделение меченых олигонуклеотидов проводят в растворителе, содержащем
произвольную смесь немеченых нуклеотидов (продукты гидролиза РНК). В ходе про-
явления пластинки немеченые нуклеотиды становятся на место исследуемых меченых
нуклеотидов и перемещаются вдоль пластинки на расстояния, примерно соответствую-
щие их размерам.
172 Глава 2
растительные р-амилазы последовательно отщепляют мальтозу с кон'
нов неразветвленных цепей (гл. 7, разд. В.6).
Сложные липиды расщепляются липазами. Панкреатическая липаза
удаляет 1- и 3-ацильные группы триглицеридов с образованием 2-моно-
глицеридов. Фосфолипаза А, присутствующая в различных тканях и
бактериях, а также входящая в состав змеиного яда, избирательно от-
т
А
РИС. 2-37. Двумерная нуклеотид-
ная карта, полученная в резуль-
тате частичного гидролиза 32Р-
олигонуклеотнда, отщепленного от
кольцевой копни ДНК, синтезиро-
ванной на цепи глобиновой мРНК
(гл. 15, разд. Ж-4). Олигонуклео-
тид обрабатывали экзонуклеазой
из змеиного яда (фосфодиэстера-
зой, табл. 2-11), отщепляющей
нуклеотиды последовательно с 3'-
конца. Самое верхнее пятно соот-
ветствует нуклеотиду неизвестно-
го состава; каждое следующее
расположенное ниже пятно содер-
жит на одно нуклеотидное звено
больше. По относительной подвиж-
ности промежуточных продуктов
(см. текст) была восстановлена
последовательность: (5')-
T'IATTAGCCAGAAGT-(3') [137].
Электрофорез при pH 35
щепляет от фосфолипидов ацильную группу, стоящую в 1-м или 2-м по-
ложении. В бактериях и растительных тканях присутствуют фосфоди-
эстеразы, известные под названием фосфолипаз С и D соответственно;
они разрывают цепь по разные стороны от фосфодиэфирной связи, как
показано ниже.
Для избирательного расщепления карбоксилатных эфирХр (в поло-
жениях, обозначенных на схеме через Ai и А2) используется мягкий
гидролиз в присутствии основных катализаторов. Получающиеся в ре-
Молекулы, из которых мы состоим 173
зультате фосфодиэфиры, амиды (сфинголипиды) и эфиры можно раз-
делить и идентифицировать.
3. Избирательное расщепление химических связей
В руках химиков, занимающихся определением структуры различ-
ных соединений, имеется множество самых разных химических реаген-
тов, как подобранных эмпирическим путем, так и специально синтезиро-
ванных. Здесь мы рассмотрим лишь немногие из них.
а. Разрыв дисульфидных мостиков в молекулах белков
Прежде чем проводить расщепление полипептидной цепи, обычно
сначала разрывают дисульфидные мостики [138—141]. Для этой цели
можно использовать три реакции [см. уравнения (2-20) — (2-22) ]. При
работе с рибонуклеазой использовалось окисление надмуравьиной кис-
лотой:
о
II
н—с—о—он
Pj—сн2—s—S—сн2—р2--------->- Pj—сн2—so7+p2—сн2—so; (2-20)
Однако этот метод не нашел широкого применения, поскольку надму-
равьиная кислота окисляет также остатки триптофана. Свои недостат-
ки имеет и расщепление мостиков в присутствии сульфита:
Pj—СН2—S—S—СН2—P2-|-SO|-+ Н+---►
---► P1-CH2-S-SO;+HS-CH2-P2 (2-21)
Вероятно, лучшим из трех методов является восстановление дитиотреи-
толом или дитиоэритритолом:
СН2—SH
Н— С—ОН
P1-CH2-S--S-CH2-P2 + | ---► 2Р—СН2—SH + I I (2-22)
н-с-он ho>\/s
CH2—SH
Дитиоэритритол
Эти два дитиола при окислении циклизуются, давая устойчивые ди-
сульфиды. Указанные реагенты оказываются полезными не только для
разрыва дисульфидных мостиков в белках, но и для защиты имеющих-
ся в ферментах SH-групп от случайного окисления кислородом. Для
той же цели используется и меркаптоэтанол HS—СН2—СН2—ОН, но
обычно он несколько менее эффективен.
После того как дисульфидные мостики разорваны, необходимо пред-
отвратить их воссоединение, для чего надо перевести образующиеся
тиоловые группы в устойчивые производные. Обычно для этой цели ис-
пользуют иодацетат или иодацетамид:
Р—СН2—SH + 1СН2СОО" > р—сн2—S—СН2—COO- + Н+ + I- (2-23)
(ICH2CONH2) (Р—СН2—S—СН2—CONH2)
Еще лучшим реагентом является акрилонитрил:
Р—СН2—SH+CH2=CH—CN ------► Р—СН2—S—СН2СН2—CN (2-24)
Акрилонитрил
174 Глава 2
б. Реагенты, избирательно расщепляющие пептидные цепи
Одним из самых ценных реагентов при работе с белками является
фенилизотиоцианат, впервые примененный П. Эдманом. Это соедине-
ние реагирует с N-концевой аминогруппой пептидов [уравнение (2-25)].
Образующийся продукт циклизуется, что в кислой среде влечет за
собой разрыв пептидной цепи (2-25). В итоге образуется соответствую-
щий N-концевой аминокислоте фенилтиогидантоин, который можно
идентифицировать. Проделав ту же операцию с укороченной указан-
ным путем пептидной цепью, можно определить следующий аминокис-
лотный остаток. При тщательной постановке эксперимента с помощью
реакции Эдмана можно «пройти» вдоль пептидной цепи несколько де-
сятков остатков. Есть специальные приборы — так называемые секвена-
торы, в которых все необходимые операции осуществляются автомати-
чески.
=S + H2N—CH—С
R;
фенилизотиоциаяат
Фенилтиогидантоин. соответствуют ии
N-концевой аминокислоте
(2-25>
Существует множество других реагентов, расщепляющих пептидные
связи внутри цепи в специфических местах [138]. Особенно ценен бром-
циан, N=C—Вг, разрывающий цепь вслед за остатками метионина. Как
показывает уравнение (2-26), сера метионина замещает ион брома.
Пространственная конфигурация образующегося сульфониевого соеди-
нения благоприятствует разрыву С—S-связи, протекающему с участием
соседней пептидной группы. Гидролиз связи C = N в полученном про-
дукте обусловливает разрыв пептидной цепи (уравнение 2-26).
Обработка гидроксиламином при высоких значениях pH часто при-
водит к избирательному разрыву связей Asp—Gly. Возможный меха-
низм этого процесса обсуждается в работе [142].
4. Методы, основанные на включении метки в концевые звенья
В 1957 г. Ф. Сэнгеру за определение первичной структуры инсулина
была присуждена Нобелевская премия по химии. Это был первый бе-
лок, для которого удалось установить аминокислотную последователь-
Молекулы, из которых мы состоим
175
ность; этой работе Сэнгер посвятил 10 лет. В основе его подхода ле-
жал частичный гидролиз пептидных цепей, предварительно помеченных
I
HN-----
ПептиЬилгомосеринлактон
в ходе реакции свободной аминогруппы с фтординитробензолом [урав-
нение (2-27)].
Динитрофенилированньш пептиЬ
Связь с динитрофенильной группой устойчива к кислоте, и поэтому
после полного кислотного гидролиза меченого пептида высвобождалась-
динитрофенилированная аминокислота (соединение, имеющее желтую-
окраску), которая находилась ранее на N-конце цепи. Кроме того, Сэн-
гер использовал меченые в-аминогруппы остатков лизина. Частичный,
кислотный гидролиз меченых пептидов приводил в этом случае к обра-
зованию небольших фрагментов, для которых затем определяли ами-
нокислотный состав. В конце концов Сэнгер сложил фрагменты полу-
ченной аминокислотной мозаики и установил последовательность двух
цепей молекулы инсулина, содержащих 21 и 30 остатков и связанных
между собой в цельной молекуле дисульфидными мостиками (рис. 4-13).
В последние годы вместо фтординитробензола чаще применяют дансил-
176 Глава 2
хлорид. Получающиеся в результате пептидные производные сильно
флуоресцируют, что позволяет проводить анализ концевых групп со
значительно меньшим количеством пептидов.
Дансилхлорид
(З-диметиламинонафтпилсульфонилхлориЬ)
Существует ряд способов маркировки SH-группы боковых цепей
белка. Один из наиболее распространенных основан на использовании
реагента Элмана •— 5,5/-дитиобис-(2-нитробензойная кислота), ДТНБ
[уравнение (2-28)].
O2n
Реагент Элмана
(2-28)
Тиоловый анион
Этот реагент количественным образом взаимодействует с —SH-rpyn-
пами, образуя смешанные дисульфиды и высвобождая тиоловый анион,
поглощающий свет при 412 нм, что позволяет определить содержание
—SH-групп в белке. При этом, к сожалению, могут параллельно про-
текать дисульфидные обменные реакции с участием дополнительных
молекул ДТНБ, приводящие к разрыву дисульфидных связей в белке
[143]. Помимо указанных выше, имеется множество других реагентов,
позволяющих модифицировать разные боковые группы в молекуле бел-
ка [138, 143а].
В случае углеводов классическим методом идентификации концевых
групп служит исчерпывающее метилирование. Многократная обработка
метилирующим реагентом, например диметилсульфатом, превращает все
свободные ОН-группы в ОСН3-группы. Полный кислотный гидролиз с
последующим разделением метилированных сахаров и их количествен-
ным определением позволяет оценить число концевых звеньев (содер-
жащих четыре метоксильные группы), число звеньев в неразветвленных
участках цепи (содержащих по три метоксильные группы) и число то-
чек ветвления (содержащих по две метоксильные группы). Кроме того,
Молекулы, из которых мы состоим
177
структура метилированных производных дает информацию о располо-
жении связей в сахарных кольцах.
Сравнительно новым методом маркировки редуцирующих концов
углеводных цепей является восстановление альдегидных групп бортри-
тидом натрия (NaB3H4). Введенная таким способом радиоактивная
метка дает возможность по радиоавтографам хроматограмм определять
положение фрагментов, отщепленных от редуцирующих концов.
Одним из наиболее ценных реагентов, используемых для установ-
ления структуры углеводов, является иодная кислота (или ее натриевая
соль, перйодат натрия). Под действием иодной кислоты расщепляются
С—С-связи, по обе стороны от которых расположены ОН-группы, с об-
разованием диальдегидов.
НЮ,
НОСН2
н^/ V
\/С\ Л-R' (2'29)
° с==о НС
Н II
о
Метод позволяет проводить количественные измерения. Через не-
сколько часов после начала реакции избыток перйодата удаляют эти-
ленгликолем; можно также определить количество перйодата, затра-
ченное в процессе окисления. Если гидроксильные группы связаны с
тремя идущими подряд атомами углерода, то центральный атом отщеп-
ляется в составе муравьиной кислоты, количество которой тоже можно
точно определить. Помимо этого, после удаления избытка перйодата
диальдегид можно восстановить добавлением твердого боргидрида нат-
рия с образованием устойчивых CHzOH-групп и далее с помощью мяг-
кого кислотного гидролиза расщепить ациклические ацетальные связи,
разделить полученные фрагменты и провести их модификацию. Эту по-
следовательность реакций называют деградацией по Смиту [144].
Пример комплексного использования нескольких методов для опре-
деления структуры сложного полисахарида приведен в табл. 2-12.
Концевые группы полирибонуклеотидов тоже отщепляют перйода-
том, предварительно удалив с помощью фосфомоноэстеразы фосфатные
группы на З'-гидроксилах. Образующиеся диальдегиды восстанавлива-
ют далее бортритидом натрия. Другой метод включения в полинуклео-
тиды радиоактивной концевой группы основан на переносе фосфориль-
ной группы с молекул АТР под действием неспецифической полинуклео-
тидкиназы с образованием свободной 5'-гидроксильной группы полири-
бо- или полидезоксирибонуклеотида [145].
Ценным методом изучения структуры ДНК является метод бли-
жайших соседей. Он разработан А. Корнбергом с сотр. и состоит в сле-
дующем [146]. В качестве предшественников для синтеза ДНК берут
какой-нибудь один радиоактивный 32Р-содержащий нуклеозидтрифос-
фат [в уравнении (2-30) это дезоксиаденозинтрифосфат], а три других
178 Глава 2
Таблица 2-12
Определение структуры содержащего 6-О-метилглюкозу липополисахарида
из Mycobacterium рШеИ5
1. Эту связь избирательно расщепляет а-амилаза.
2. В результате частичного гидролиза образуется ряд 6-О-метилглюкозныя
олигомеров.
3. Отщепление D-глицериновой кислоты и восстановление образовавшего-
ся конца с помощью NaB3Hi позволяет в ходе последующего расщеп-
ления цепи (путем частичного кислотного гидролиза) получить набор'
радиоактивных фрагментов.
4. Превращение в сложный эфир и восстановление с помощью ПаВ~Н±
в спирт (глицерин) позволяет после частичного кислотного гидролиза
получить другой набор радиоактивных фрагментов.
5. Метилирование устанавливает наличие разветвления, а пропилирование
невосстанавливающих концевых группировок — положение глюкозы:
и 3-метилглюкозы.
6. По другой методике проводилось замещение О-ацильных групп на
—ОСН3. Последующее окисление перйодатом, восстановление с по-
мощью NaB-'Н/, и гидролиз (деградация по Смиту) приводили к обра-
зованию метилированных фрагментов, идентификация которых позво-
лила определить положение исходных ацильных групп.
а Saier М. Н„ Jr., Ballou С. Е„ J. Biol. Chem., 243, 4332, 1968; Smith W. L„ Bal-
lou C. E„ J. Biol. Chem., 248, 7118—7125, 1973; Gray G. R„ Ballou C. E„ J. Biol'.
Chem., 247, 8129—8135, 1972.
6 В положениях, обозначенных зачерненным треугольником, находятся жирные
кислоты: 3 ацетила, 1 пропионил, 1 изобутирил и 1 октаноил; в положениях, обозна-
ченных светлым треугольником, находятся сукцинильные группы. Метильные группы
обозначены зачерненным кружком.
нуклеозидтрифосфата оставляют немечеными. В присутствии ДНК-по-
лимеразы, катализирующей рост цепи, цепь затравочной ДНК удлиня-
ется с З'-конца (гл. 15, разд. А.З.а). Присутствующая матричная цепь
[в уравнении (2-30) она не представлена] обеспечивает включение в
растущую цепь именно того нуклеотида, какой необходим для образова-
ния двуепиральной структуры Уотсона — Крика. Химическая сторона
этого процесса будет рассматриваться позже (гл. 15, разд. А.З.а) и в
данном случае значения не имеет. Важно лишь то, что 32Р попадает в
фосфатный мостик, который соединяет нуклеотид, первоначально содер-
жавший 32Р, с З'-гидроксилом соседнего нуклеотида.
Продукт, содержащий 32Р, далее гидролизуют с помощью микрокок-
ковой ДНКазы и фосфодиэстеразы селезенки (табл. 2-11) и получают
фрагменты, представленные в уравнении 2:30. Поскольку данные гид-
ролитические ферменты катализируют, только разрывы Ь-типа
Молекулы, из которых мы состоим 179
(табл. 2-11), 32Р оказывается теперь в составе нуклеотида, который
был ближайшим соседом аденозина в структуре ДНК. Измеряя радио-
активность З'-нуклеотидов аденина, тимина, цитозина и гуанина, мож-
но узнать частоты встречаемости в ДНК пар АА, ТА, СА и GA. Исполь-
зуя другие радиоактивные нуклеозидтрифосфаты (по одному типу в
каждом опыте), получают такие частоты для всех возможных пар. Ре-
зультаты описанного выше эксперимента показывают, что цепи двой-
X Y Z л А
Затравочная
цепь
Р—Р—Р
ОН
dATP
X Y Z А
Микрококковая ДНКаза
и фосфодиэстераза селезенки
(2.30)
А
Y
ной спирали действительно антипараллельны, как это предсказывали
Уотсон и Крик (подробнее об этом см. в книге Дэвидсона [146]), в про-
тивном случае частоты ближайших соседей должны были оказаться
другими.
Аналогичным образом, но используя расщепление d-типа под дейст-
вием щелочи, были определены частоты встречаемости различных пар
в цепи РНК, синтезированной на ДНК-матрице [145]. 5 * * * * * * * * * * * * * *
5. Анализ продуктов
Практически в любом биохимическом исследовании очень важно
уметь обнаруживать и точно определять ничтожные количества специ-
фических соединений. Чаще всего для этого используют особые реаген-
ты— индикаторы, которые при взаимодействии со специфическими сое-
динениями определенным образом окрашиваются. Например, для выяв-
ления на хроматограмме аминокислот или пептидов, присутствующих
в очень малых количествах (доли микромоля), хроматограмму опрыс-
кивают нингидрином (дополнение 8-Е). Если выявляемое соединение
находится в растворе, то по интенсивности окрашивания можно опреде-
лить его количество. Фенолы и концентрированная серная кислота ок-
рашивают сахара (в растворе или на хроматографической бумаге) в
красный цвет. Эта реакция лежит в основе колориметрического анализа
углеводов. Восстанавливающие сахара выявляют на хроматограммах,
опрыскивая последние раствором нитрата серебра.
180 Глава 2
Нуклеотиды, как и многие другие поглощающие свет соединения,
определяют количественно по их спектрам поглощения (рис. 13-11 и
13-12) [146]. Еще более чувствительным методом является флуорес-
центный анализ. Например, он позволяет обнаружить на тонкослойной
хроматограмме рибофлавин в количестве 3 пикомоль (1 нг) (рис. 2-34)
'[147]. Один из новых реагентов, флуорескамин, взаимодействует с лю-
бым первичным амином, образуя интенсивно флуоресцирующие про-
дукты. С его помощью можно обнаружить очень малые количества ами-
нокислот— менее 50 пикомолей (рис. 2-36) [148].
Флу оре с кам ин
Флуоресцирующее
соединение
(2-31)
Чрезвычайно чувствительны методы обнаружения летучих соедине-
ний с помощью газовой хроматографии. Применяя пламенные иониза-
ционные детекторы, можно определить содержание практически любого
соединения в количестве, не превышающем несколько пикомолей. Вряд
ли стоит говорить, насколько важна разработка новых, еще более чув-
ствительных методов. Применение наиболее чувствительных из них (в
частности, масс-спектрометрии) позволяет теперь в некоторых случаях
обнаружить вещество, когда его содержание не превышает нескольких
фемтомолей! Анализ выхода нейромедиаторов из одиночных нейронов
мозга может иметь принципиальное значение для понимания работы
нервных клеток, точно так же как анализ содержимого отдельных кле-
ток может оказаться весьма полезным для выяснения многих вопросов
биохимии высших организмов.
Весьма ценной разновидностью обычной тонкослойной или бумаж-
ной хроматографии является диагональная хроматография. Сначала
нанесенный материал хроматографируют в одном направлении, затем
в тонком слое на пластинке или бумаге проводят определенную хими-
ческую реакцию, после чего осуществляют разделение в другом направ-
лении. Немодифицированные соединения располагаются по диагонали
пластинки, тогда как продукты реакции оказываются смещенными по
отношению к ней. Этим методом исследовали фотохимические [149] и
другие {147] реакции флавинов. Аналогичный диагональный электро-
форез применялся для идентификации пар —SH-групп, образующих в
белках дисульфидные мостики [150]. Пептидные фрагменты, содержа-
щие S—S-мостики, разделяли с помощью электрофореза на бумаге, за-
тем обрабатывали бумагу парами надмуравьиной кислоты, разрываю-
щей мостики [уравнение (2-20)], и после электрофореза в перпендику-
лярном направлении опрыскивали бумагу нингидрином. Пятна, распо-
ложенные вне диагонали, соответствовали фрагментам, которые участ-
вовали в образовании S—S-мостиков. По положению пятен подбирали
Молекулы, из которых мы состоим 181
пары, которые далее сопоставляли с пептидами, охарактеризованными
в ходе стандартных операций установления последовательности — опе-
раций, проводившихся на белке, окисленном надмуравьиной кислотой.
6. Определение молекулярного веса
Определение молекулярного веса биополимера зачастую оказывает-
ся чрезвычайно важным. Во многих случаях можно рассчитать мини-
мальный молекулярный вес, исходя из содержания наименьшего из ком-
понентов (например, триптофана в белке или железа в гемоглобине).
Однако в большинстве случаев молекулярные веса определяют физико-
химическими методами [151, 152]. В принципе это довольно просто
сделать, измерив осмотическое давление и светорассеяние, однако и
эти методы имеют свои трудности. Наиболее надежные результаты дает
ультрацентрифугирование. Прямое определение молекулярного веса ос-
РИС. 2-38. Зависимость константы седиментации ряда белков и нуклеиновых кислот
от молекулярного веса (в логарифмическом масштабе). Кружки — глобулярные белки,
треугольники — РНК, квадратики — ДНК. В число белков входят липаза (из моло-
ка), цитохром с, панкреатическая рибонуклеаза, лизоцим (из белка куриных яиц),
фолликулостимулирующий гормон, бактериальные протеазы, гемоглобин человека, бы-
чий протромбин, малатдегидрогеназа, у-глобулин (лошади), триптофаиаза (из Е. co-
li), глутаматдегидрогеназа (из цыплят) н цитохром а. Двухцепочечная ДНК взята
из следующих источников: бактериофага 0X174 (репликативная форма), фагов Т7,
Хъ2, Т2 н Т4 и из вируса папилломы. В число РНК вошли тРНК, рРНК н мРНК
Е. call и РНК вируса желтой мозанки репы («CRC Handbook of Biochemistry», Chem.
Rubber publ. Co., Cleveland, Ohio, 1968; S. P. Colowick and N. O. Kaplan, eds., «Me-
thods in Enzymology», Vol. 12B, pp. 388—389. Academic Press, New York, 1968).
ковано на том, что центрифугирование раствора макромолекул прово-
дят до тех пор, пока не установится седиментационное равновесие [125,
151]. При использовании коротких кювет такое равновесие достигается
за несколько часов. Молекулярный вес рассчитывают, измеряя измене-
ние концентрации раствора от центра кюветы к дну.
Чаще всего молекулярный вес биополимеров определяют по их кон-
станте седиментации s (разд.ЗЛ.д). Значение s зависит не только от
молекулярного веса, но и от плотности и формы молекулы. Однако в
рамках предположения, что молекулы белка являются сферами, s при-
мерно пропорционально мол. весу в степени 2/3. Графически зависи-
мость logs от log (мол. вес) должна представляться прямой. На
рис. 2-38 приведен график такого рода, построенный по данным для
целого рцда белков. Заметим, что точки, полученные для нуклеиновых
кислот (во многих случаях эти молекулы имеют форму палочек, а не
сфер), ложатся на другую прямую. Кроме того, константа седимента-
182 Глава 2
ции с увеличением молекулярного веса изменяется быстрее, чем это
характерно для сферических молекул.
В настоящее время имеется ряд новых методов определения молеку-
лярного веса, которые могут соперничать с ультрацентрифугированием.
Один из них — это простая гель-фильтрация. Колонку тщательно запол-
няют гелем (например, сефадексом) и калибруют, пропуская ряд бел-
ковых растворов. Измеряют Ке — объем элюата, собранного с момента
нанесения вещества на колонку до момента его выхода из колонки, и
делят этот объем на Vo — объем элюата для очень крупных частиц, со-
вершенно не проникающих внутрь частиц геля. Далее строят зависи-
мость Ve/Ко от логарифма мол. веса для ряда белков с известным мо-
лекулярным весом. Как и при оценке молекулярных весов по констан-
там седиментации, здесь предполагается, что молекулы всех белков
имеют примерно сферическую форму; для неизвестного белка значение
молекулярного веса определяют по местоположению отвечающей ему
точки на описанном выше графике [153, 154]. Модификацией этого ме-
тода служит хроматография при высоких концентрациях гуанидинхло-
рида— соли, вызывающей денатурацию белков. Предполагается, что в
таком растворителе белковая молекула представляет собой статистиче-
ский клубок {154]. +
H,N—С1-
\nh2
Гуанидинхлорид
Пожалуй, самым ценным новым методом определения молекулярно-
го веса является гель-электрофорез в присутствии денатурирующего
РИС. 2-39. А. Оценка молекулярного веса азоферредоксина в «нативном» состоянии
с помощью фильтрации через сефадекс G-200. Черные кружки указывают положение
средней точки пика для белков известного молекулярного веса. Стрелкой отмечено
положение азоферредоксина. Материал пика для каждого из белков элюирован в 5—
7 пробирок. Скорость элюции составляла 3,2 мл-час-1. Элюат в коллекторе фракций
распределяли по фракциям объемом в 1,6 мл. Б. Оценка молекулярного веса полппеп-
тидной цепи азоферредоксина с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, со-
держащем додецилсульфат натрия. Каждая точка получена из четырех стандартных
кривых. Маркерными белками служили каталаза (1), фумараза (2), альдолаза (3),
глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (4), а-химотрипсиноген А (5) и миоглобин (6).
Светлый кружок указывает положение азоферредоксина (Nakos G., Mortenson L.,
Rinrhomi^trv 10 457. 1971).
Молекулы, из которых мы состоим 183
детергента додецилсульфата натрия. Под действием этого соединения
белки не только денатурируют, но и покрываются более или менее
ровным слоем детергента [155]. Для получающихся в результате па-
лочковидных молекул обычно характерна примерно одинаковая зави-
симость электрофоретической подвижности от молекулярного веса.
Один из примеров такого рода приведен на рис. 2-39, Б. Здесь тоже
молекулярный вес исследуемого белка определяется из сравнения ско-
рости его перемещения со скоростями для ряда белков с известным
молекулярным весом [153, 156].
7. Конформация макромолекул
Многие физические методы, упоминавшиеся в предыдущем разделе,
сводятся к измерению величин, зависящих как от молекулярного веса,
так и от формы молекул. Следовательно, те же методы могут использо-
ваться и для определения конформации. Однако намного более ценны-
ми в этом отношении являются два других метода: рентгеноструктур-
ный анализ кристаллических соединений и получение спектров ядерно-
го магнитного резонанса (ЯМР) соединений, находящихся в растворе.
•а. Рентгеноструктурный анализ
Вскоре после открытия рентгеновых лучей по дифракционным кар-
тинам, получаемым при прохождении через кристалл рентгеновского
пучка, стали определять межатомные расстояния и устанавливать
структуру кристалла. Этот метод был настолько усовершенствован, что
позволял устанавливать структуру довольно сложных органических
•соединений, затрачивая на эксперимент всего несколько дней. При
этом наиболее серьезной проблемой, затрудняющей применение рентге-
ноструктурного метода, часто оказывалось приготовление достаточно
крупных и совершенных кристаллов.
В последние годы рентгеноструктурный анализ широко применяется
Для определения структуры молекул белков и нуклеиновых кислот.
Длины и углы связей, точно установленные для малых молекул, ис-.
пользуются как стандартные значения в предположении, что они сохра-
няются такими же и в более сложных полимерных структурах. Одним
из этапов определения структуры белков и нуклеиновых кислот являет-
ся построение молекулярных моделей полимеров, согласующихся с
рентгеновскими данными и сохраняющих стандартные значения длин
связей и валентных углов (рис. 4-19, Б) [71].
б. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) {157—162]
В основе ЯААР-спектроскопин лежит поглощение электромагнитных
волн в радиочастотном диапазоне ядрами, обладающими магнитным
моментом. Все ядра с нечетными массовыми числами (например, *Н,
13С, 15N, 17О, 19F и 31Р), равно как и ядра с четным массовым числом,
но нечетным атомным номером, обладают магнитными свойствами,
в то время как 12С и 16О немагнитны. Поглощение кванта энергии
E = hv происходит лишь в том случае, когда ядра находятся в сильном
магнитном поле ЯМР-спектрометра. В спектрометре с рабочей частотой
100 МГц (v=100 МГц) энергия кванта составляет всего £ = 6,625-
• 10-34-108 = 0,04 Дж-моль-1, что на пять порядков ниже среднего зна-
чения энергии теплового движения молекул (3,7 кДж-моль-1). Таким
184 Глава 2
образом, спиновый переход, индуцированный в ЯМР-спектрометре, не
оказывает заметного влияния на химические свойства молекул.
Резонансная частота v, при которой в спектрометре происходит по-
глощение энергии, есть
v=\iH0/h, (2-32}
где Но — напряженность внешнего магнитного поля, ц — магнитный
момент исследуемых ядер, h — постоянная Планка.
В принципе спектр ЯМР можно получить, поддерживая магнитное
поле Но постоянным и определяя, при какой частоте произойдет погло-
щение, как это делается при снятии ультрафиолетовых, видимых и ин-
фракрасных спектров (гл. 13). Однако ЯМР-спектрометры работают
РИС. 2-40. Спектр ПМР для пиридоксаль-5'-фосфата; спектр снят при 60 МГц; pD =
= 7,05. Внутренним эталоном служит соль Тьера. Над каждым пиком указана величи-
на химического сдвига в герцах, внизу изображена шкала 6. Для усреднения неодно-
родностей магнитного поля ампула с образцом в ходе измерений быстро вращается-
вокруг своей оси. Неполное усреднение приводит к появлению так называемых боко-
вых сигналов; на нашем рисунке это два пика, обозначенные SSB. (С любезного раз-
решения J. Likos.)
при фиксированной частоте (чаще всего 60, 100 и 220 МГц), наиболее
мощные из них—на частотах свыше 300 МГц. При снятии спектра
магнитное поле, создаваемое мощным электромагнитом спектрометра,
изменяют с постоянной скоростью. Тем не менее ЯМР-спектры всегда
выражают в виде сдвигов частоты в герцах, как будто изменялась час-
тота генератора.
На рис. 2-40 показан протонный спектр ЯМР (спектр ПМР) кофер-
мента пиридоксальфосфата в растворе 2Н2О (окись дейтерия); спектр^
снят в спектрометре с рабочей частотой 60 МГц (см. также работу
[163]). Из такого спектра можно определить четыре параметра. 1. Ин-
тенсивность (площадь пика). В протонных спектрах ЯМР эти площади,
обычно пропорциональны числу химически эквивалентных протонов,.
Молекулы, из которых мы состоим 185-
дающих данный пик. 2. Химический сдвиг—разницу в частотах пиков,
отвечающих данному протону и какому-то эталонному соединению. На
рис. 2-40 эталонный пик расположен в правой части спектра и отвечает
соли Тьера (З-триметилсилил-1-пропансульфонат натрия). 3. Ширину
пика (в герцах) на половине его высоты. Для быстро движущихся в
растворе молекул ширина протонного пика равна ~0,1 Гц. 4. Констан-
ты спин-спинового взаимодействия, которые являются мерой взаимодей-
ствия между соседними ядрами, обладающими магнитным моментом.
При Яо = 14ООО Гс и частоте 60 МГц протонные сигналы от органи-
ческих соединений растягиваются на интервал примерно в 700 Гц. По-
ложение сигналов всегда определяется по отношению к пику для неко-
торого эталонного соединения, расположенному в высокочастотной об-
ласти. Для протонов эталонным соединением служит чаще всего тетра-
метилсилан (ТМС), инертное вещество, которое можно добавлять пря-
мо в ампулу с образцом. Поскольку биохимики в качестве растворителя
обычно используют D2O, эталоном служит водорастворимая соль Тьера.
Положения пиков для двух соединений различаются лишь незначи-
тельно.
При снятии спектра ЯМР в D2O часто бывает необходимо знать,
значение «pD» среды. Обычно в этом случае к показаниям рН-метра
прибавляют 0,40.
В молекулах, подобных ТМС, ядра экранированы от внешнего маг-
нитного поля окружающими их электронами, поэтому сигналы распо-
ложены в области более высоких частот (более высоких энергий). Про-
тоны, связанные с атомом углерода или каким-либо другим атомом,
имеющим дефицит электронов (из-за того, что они связаны с атомами
или группами, оттягивающими электроны на себя), такой экранировки
не имеют (разэкранированы). Чем сильнее разэкранировка, тем сильнее
слабопольный сдвиг пика ЯМР от положения сигнала ТМС. В спектре,
изображенном на рис. 2-40, пик, соответствующий 2-метильным прото-
нам, расположен на 147 Гц левее пика от соли Тьера, но все же соот-
ветствуют сравнительно высокому полю. В ароматических кольцах про-
тоны очень сильно разэкранированы за счет кольцевого тока, обуслов-
ленного л-электронами. Так, пики, соответствующие 5-метиленовым
протонам, которые расположены вблизи ароматического кольца, сме-
щены на 303 и 310 Гц в слабое поле. Протон, непосредственно связан-
ный с кольцом, разэкранирован еще сильнее, и его пик смещен в слабое
поле на 463 Гц. 4'-водород альдегидной группы разэкранирован вслед-
ствие электронных токов в карбонильной группе; его пик расположен
в еще более слабом поле.
Величину такого химического сдвига, т. е. смещение резонансных
частот химически неэквивалентных ядер относительно, частоты стан-
дартного вещества, можно выражать прямо в герцах, но тогда химиче-
ский сдвиг будет возрастать с увеличением магнитного поля — в спект-
рометре на 100 МГц он будет больше, чем в спектрометре на 60 МГц.
Чтобы этот параметр не зависел от типа прибора, вводится величина б,
измеряемая в миллионных долях (м. д.):
б== Ду (Гц)-10е . (2-33);
v (Гц) генератора
б представляет собой относительный сдвиг частоты и не зависит от
напряженности поля. Однако зависимость от эталонного соединения
остается, поэтому, приводя значение б, указывают, относительно какого
соединения оно определялось. Несколько реже используют шкалу т
т=10—б (относительно ТМС). (2-34)
386 Глава 2
На энергию спинового перехода протона сильное влияние оказывают
локальные поля, создаваемые другими магнитными ядрами, в частности
другими протонами. Такое спин-спиновое взаимодействие (связь) при-
водит к расщеплению сигналов протонного спектра ЯМР на несколько
близко расположенных линий. Так, этильная группа чаще всего пред-
ставлена четырьмя расположенными на одинаковом расстоянии друг
ют друга линиями, соответствующими СН2-группе, и тремя линиями от
СНз-протонов. Протоны, присоединенные к одному и тому же атому уг-
лерода, обычно не дают расщепления собственных линий, но зато при-
водят к расщеплению сигналов от протонов, связанных с соседними
атомами углерода. Эти соседние протоны могут находиться в любом
из двух спиновых состояний, что проявляется в разнице энергии рас-
сматриваемых ЯМР-переходов, которую легко измерить [157—161].
Константа спин-спинового взаимодействия / представляет собой рас-
стояние в герцах между соседними пиками мультиплета. Эта величина
не зависит от напряженности поля, а следовательно, и от частоты спек-
трометра. Представленный на рис. 2-40 сигнал от 5'-метиленовых про-
тонов расщепляется вследствие 1Н-31Р-взаимодействия с J Гц. Чем
ближе расположены ядра друг к другу, тем сильнее спин-спиновое
взаимодействие, однако иногда оно может проявляться и на расстоя-
нии пяти ковалентных связей.
При наличии подозрения на взаимодействие часто применяют техни-
ку двойного облучения, или спиновой развязки. Образец облучают при
резонансной частоте одного из участвующих в спин-спиновюм взаимо-
действии ядер, а спектр снимают в интервале резонансных частот дру-
гого ядра пары. При этих условиях мультиплет вырождается в синг-
лет, что и свидетельствует о взаимной связи двух ядер.
Константа спин-спинового взаимодействия между двумя протонами,
связанными с соседними атомами углерода (или другими атомами),
зависит от торсионного угла <р [уравнение (2-35)]*.
Н Н'
хс^-сх
7н.н' ~ A cos2 (р + В cos tp + С (2-35)
Уравнение Карплуса (2-35) получено теоретическим путем, но констан-
ты А, В и С подбираются эмпирически [164]. В выписанных ниже при-
ближенных уравнениях (2-36)—(2-38) [164] средний член уравнения
(2-35) опущен:
Н—С—С—Н' 7 = 17cos3<p-L 1,1 (2-36)
Н— С— N—Н' 7 = 12 cos2 ф + 0,2 (2-37)
Н— С— О—Н' 7 = 10 cos2 ф — 1,0 (2-38)
Поскольку второй член в этих уравнениях равен 1 Гц или меньше, час-
то используют одночленное уравнение Карплуса.
Спектры ЯМР позволяют определять торсионный угол между ато-
мами водорода при «-углероде аминокислотного остатка и соседнем
атоме азота пептидной связи (<р', но не <р)2; это позволяет установить,
1 Уравнение можно записать и в таком виде: J asA'-J-B'cos ф+C'cos 2ф (М. Кат-
plus, JACS, 85, 2870—2871, 1963). Поскольку cos 2<p=2cos2<p—1, это эквивалентно урав-
нению (2-35), но константы А', В' и. С' получаются иными. Встречается также форма
записи через sin2<p.
2 Если <р (разд. Б.З) = 180°, ф'—-|-120о.
Молекулы, из которых мы состоим
187
в какой конфигурации находится
если
если
или транс.
— 8,5 cos2<p',
=9,5 cos2<p',
малых пеп-
нуклео-
присут-
(Еи) и
Рибонуклеаза
11% в D2O
60 МГц
38°С
pD 7,5
HDO
DSS
8
6
О
Рибонуклеаза
11% в D2O
4 2
3, м. э
А
пептидная группа — цис
<р' лежит между 0 и 90°
Ф' лежит между 90 и 180°
Метод ЯМР использовался для определения конформации
дидов и полиэфиров [165—167] и структуры углеводов [168] и
тидов.
Весьма ценную информацию дают спектры ЯМР, снятые в
ствии парамагнитных ионов лантанидов, таких, как европий
празеодим (Рг) [169, 169а]. Эти
ионы индуцируют существенные
сдвиги многих сигналов ЯМР,
что при наличии определенных
эмпирических соотношений помо-
гает определить структуру того
или иного соединения.
Спектры ПМР белков чрезвы-
чайно сложны, однако в их рас-
шифровке достигнуты весьма зна-
чительные успехи [170—175]. На
рис. 2-41 приведены спектры ПМР
фермента рибонуклеазы, полу-
ченные при 60 и 220 МГц. Как
легко видеть, при более высокой
частоте разрешение выше. Обра-
щает на себя внимание и тот
факт, что после тепловой дена-
турации фермента (до 72,5°С)
многие сигналы спектра, снятого
при 220 МГц, оказываются более
узкими. Это означает, что в ре-
зультате денатурации все одно-
дипные боковые группы белка
попадают в примерно эквивален-
тное окружение. Кроме того, бы-
ло показано, что спектры ПМР
для белков, находящихся в кон-
формации статистического клуб-
ка, хорошо соответствуют спект-
рам, которые можно получить,
исходя из стандартных химиче-
ских сдвигов отдельных амино-
кислот [171], что согласуется с
изложенным выше.
Как правило, спектры ПМР
снимают в D2O, поскольку сиг-
нал Н2О накладывается на боль-
шую часть спектра. Все же при
снятии спектров в Н2О на дале-
ком слабопольном конце спектра
(д>10) видны слабые пики от
NH-протонов имидазольных боковых цепей (рис. 2-42). Спектры, сня-
тые при трех разных значениях pH, показывают, что при повышении
pH от 4,4 до 8,9 сигнал, соответствующий наименьшей энергии, смеща-
ется от 12,9 до 11,1 м. д. При промежуточном значении pH (5,31) пик
б, м. о
В
РИС. 2-41. Спектр ПМР для нативной ри-
бонуклеазы, снятый при 60 МГц (А) и
220 МГц (Б) и для денатурированного
фермента, снятый прн 220 МГц (В). Кон-
центрация фермента в 2НгО составляла
11 %, pD = 7,5 (А) н 6,8 (Б). Эталон —соль
Тьера (MacDonald С, С., Phillips W. D.,
J. Am. Chem. Soc., 89, 6333, 1967).
188 Глава 2
занимает промежуточное положение, довольно близкое к положению,
пика при pH 4,4. Снимая зависимость химического сдвига от pH, полу-
чают S-образную кривую титрования (гл. 4, разд. В), по которой мож-
но оценить значение р'Кл диссоциирующих групп. Для гистидина (кото-
РИС. 2-42. Спектр ПМР для рибонуклеазы А в растворе 0,1 М NaCl при температу-
ре 22°. Три спектра соответствуют трем значениям pH: 4,4; 5,3 и 8,9. Каждый спектр,
есть результат усреднения нескольких измерений; операция усреднения проводилась.
на ЭВМ Varian С1024 (Griffen J. Н. et al., Biochemistry, 12, 2097, 1973).
рый считается функциональной группой активного центра фермента;,
см. гл. 7, разд. Д. 2) полученное таким образом рК& равно 5,8.
В протонных спектрах ЯМР (до 360 мгц) молекул тРНК удалось,
идентифицировать 26 резонансных линий, соответствующих двадцати:
протонам, участвующим в образовании водородных связей между па-
рами оснований (N—Н—N, рис. 2-24) и водородных связей, стабилизи-
рующих третичную структуру (в частности, водородных связей в три-
плетах оснований по схеме Хугстена; разд. Г.6) [176],.
в. Магнитный резонанс на ядрах 13С (13С-ДМР)
Использование ядер 13С в ЯМР-спектроскопии довольно ограничен-
но в связи с малым природным содержанием этого изотопа. Еще одна
трудность связана с наличием спин-спинового взаимодействия между
13С и 1Н, поскольку в органических соединениях в нем участвует боль-
шое число протонов. Поразительные успехи в развитии 13С-ЯМР-спект-
роскопии были достигнуты благодаря использованию «широкополосно-
го подавления связи 13С—‘Н» (шумовой развязки). Поскольку природ-
ное содержание 13С составляет всего 1,1%, этот изотоп редко занимает
в молекуле соседние положения. Таким образом, (13С—13С)-взаимодей-
ствие не вносит никаких осложнений и в 13С-ЯМР-спектре с примене-
нием шумовой развязки каждый атом углерода дает одиночный пик.
Однако даже и в таком виде 13С-ЯМР-спектроскопия не находила ши-
рокого практического применения до тех пор, пока не появились им-
пульсные спектрометры, основанные на использовании Фурье-преобра-
зования [181]. В таких приборах образец облучают сильным радиоча-
стотным импульсом длительностью в несколько микросекунд. Каждый
следующий импульс поступает через 1—2 с, так что за 1—2 с снимается
эквивалент обычного спектра ЯМР- Данные поступают на ЭВМ, где
накапливаются спектры, многократно зарегистрированные в течение не-
Молекулы, из которых мы состоим 189
скольких минут, часов или даже дней. Это позволяет получать спектры
13С-ЯМР с большой точностью.
Химические сдвиги в спектрах 13С-ЯМР часто составляют 100 м. д.
и даже больше относительно ТМС. Присутствие при атоме углерода не-
о
II
—C-NH
—ГОСТ,
Кольцевые Кольцевые
углероды углероды
(с присоединен- 1455
ными ОН-группа-
ми
п-Диоксан
( зтпа'лонное
соединение)
QH2—О—
ш «= 180°
<р *= 60°
Ф = 100°
X *= 162°
Ga3+
он
L - - I___1_____|____|____J_____I t__
120 100 80 60 40 20 0 -20
S, м д. относительно п-диоксана
РИС. 2-43. Спектр ЯМР ядер 13С с шумовой развязкой 13С—44. А. Мономер эитеро-
•бактина [Ы-(2,3-диоксибеизоил)-Ь-серии]. Б. Свободный эитеробактии. В. Са3+-эите-
робактии. Препараты растворяли в (CDs)2SO при ~50°. Химический сдвиг отсчитывал-
ся от внутреннего эталона, n-диоксаиа. Приведенные результаты есть результат усред-
нения от 17 000 до 49 000 спектров (Llinas М. et al., Biochemistry, 12, 3840, 1973).
скольких групп-заместителей чаще всего дает аддитивный эффект
[I77].
На рис. 2-43 приведен спектр 13С-ЯМР соединения, синтезируемого
•бактерией Е. coli, — энтеробактина, который образует комплекс с желе-
1РИС. 2-44. Структура энтеробактина из Е. coli, способного образовывать комплекс
с железом, а также структура его комплекса с ионом галлия Ga3+ [167].
190 Глава 2
зом. Он представляет собой циклический тример 2,3-диокси-Ы-бензоил-
L-серина (рис. 2-44). Статья [167], из которой взят рис. 2-43, помимо
того, что иллюстрирует применение спектров ЯМР для установления
структуры, очень интересна с биохимической точки зрения. Образова-
ние комплекса с трехвалентными ионами вызывает в молекуле энтеро-
бактнна сильные конформационные изменения. Сравнение свободного
энтеробактина с его таллиевым хелатом показывает, что угол ф почт»
не меняется; ср вместо 60° становится равным —150°, а соответствую-
щий боковой цепи угол % принимает значение 60° (вместо прежних
162°). В свободном энтеробактине амидная группа почти плоская, в хе-
лате же торсионный угол w меняется до —133°.
13С-ЯМР применяется и для исследования структуры белков. На
рис. 2-45 показана часть 13С-ЯМР-спектра цитохрома с (гл. 10,.
разд. Б.5). Многие из резонансных линий удалось идентифицировать —
РИС. 2-45. Часть 13С-ЯМР-спектра цитохрома с из сердца лошади, где расположены
полосы резонансного поглощения ароматических углеродов и атомов аргинина.
Спектр снят с применением шумовой протонной развязки при pH 6,7; температура
41 °C, частота 15,18 МГц. Л. Феррицитохром с, 14,4 мМ (результат усреднения!
46 000 спектров, снятых в течение 14 ч). Б. Ферроцитохром с, 11,5 мМ (результат
усреднения 16 384 спектров) [178].
они принадлежат атомам углерода, входящим в состав ароматических,
аминокислот или порфиринового кольца. Обратите внимание на пора-
зительные изменения спектра при восстановлении железа из ферри- а
ферро-состояние.
г. Магнитный резонанс на ядрах 31Р
Чувствительность ЯМР на ядрах фосфора составляет всего 1/15 от
чувствительности протонного ЯМР, однако в биохимии такие спектрьи
ЯМР применяются довольно широко. Особый интерес представляет
возможность измерить pH во внутриклеточной среде по химическому
сдвигу сигнала ЯМР от ортофосфата (неорганического фосфата, Pi)
[182]. ЯМР на ядрах 31Р позволяет следить за ходом химических реак-
ций с участием фосфорилированных субстратов, протекающих внутри
Молекулы, из которых мы состоим 19Е
клеток [183—185]’. Недавно при исследовании белков и других биохи-
мических соединений стали применять ЯМР на ядрах 15N естественного-
содержания [186].
д. Оптические методы исследования конформации
О конформационных изменениях полимеров часто можно судить по-
изменению спектров поглощения ароматических боковых цепей амино-
кислот, а также пуриновых и пиримидиновых оснований (рис. 2-28).
Другими ценными методами являются инфракрасная спектроскопия,
раман-спектроскопия, флуоресцентный анализ и КД-спектроскопия; все
эти методы рассматриваются в гл. 13.
Вопросы и задачи
1. Нарисуйте следующие структуры, стабилизированные водородны-
ми связями:
а. димер уксусной кислоты;
б. тирозин-карбоксилатную группу в молекуле белка;
в. ионную фосфат-гуанидиниевую пару в фермент-субстратном ком-
плексе;
г. пары оснований GC и GU (напомним, что пара GU не уклады-
вается в схему Уотсона — Крика).
2. Нарисуйте структуры возможных таутомерных форм катиона, обра-
зующегося при протонировании 9-метиладенина.
3. Заполните следующую таблицу:
Название Мономер Тип связи Примерный молекулярный вес
Белок
Полисахарид
Нуклеиновая кислота
Тейхоевая кислота
Поли-0-оксибутираг
4. Попробуйте предсказать, в какой конформации скорее всего окажут-
ся приведенные ниже пептидные фрагменты в белке — в а-спирали
или в составе ^-структуры.
а. поли-Ь-лейцин;
б. поли-Ь-валин;
в. Pro-Glu-Met-Val-Phe-Asp-Ile;
г. Pro-Glu-Ala-Leu-Phe-Ala-Ala.
5. Сравните растворимость в воде и в эфире аминокислот и насыщен-
ных жирных кислот и их физическое состояние. Как эти различия
связаны со структурой указанных соединений?
6. Какие функциональные группы встречаются в боковых цепях бел-
ков? Каково структурное и функциональное значение а) гидрофоб-
ных групп; б) кислых и основных групп; в) сульфгидрильных ррупп?
7. Составьте таблицу значений рКя для кислых и основных групп,
входящих в состав белка. Какие из этих групп больше всего влия-
ют на кривые титрования белков?
1192 Глава 2
8. рЛа Для трипептида L-Ala—L-His—L-Gln имеет следующие значе-
ния: 3,0 (а-СООН), 9,1 (a-NHjj), 6,7 (имидазол).
а. Какова изоэлектрическая точка трипептида — значение pH, при
котором его суммарный заряд равен нулю? Указание: для ами-
нокислот р! обычно является среднеарифметическим двух зна-
чений р/Са (см. Е. J. Cohn and J. Т. Edsall, «Proteins, Amino Acids
and Peptides», pp. 90—93. Reinhold, New York, 1943).
б. Нарисуйте структуры ионных форм, которые пептид принимает
при pH 5 и pH 9. При каждом из этих значений pH рассчитайте
процентное содержание каждой ионной формы. Указание-, опреде-
ление понятий pH и р/Са можно найти в гл. 4, где подробно объ-
ясняется их смысл и рассматриваются свойства буферов.
9. Перечислите названия всех изомерных трипептидов, содержащих
по одному остатку тирозина, аланина и валина.
10. а. Напишите структурную формулу глицил-Ь-триптофанил-Е-про-
лил-Ь-серил-Ь-лизина.
б. Какие аминокислоты можно получить из этого пептида в резуль-
тате кислотного гидролиза?
в. В результате щелочного гидролиза?
г. В результате обработки азотистой кислотой с последующим кис-
лотным гидролизом?
д. Куда будет смещаться этот пептид в электролитической ванне
при pH 7,0 — к катоду или к аноду? Чему примерно равна его
изоэлектрическая точка?
е. Если раствор этого пептида привести к pH 7, а затем титровать
гидроокисью натрия в присутствии 10% формальдегида, то сколь-
ко эквивалентов основания на моль пептида потребуется для то-
го, чтобы повысить pH до 10?
.11. Сравните структурные особенности и свойства следующих белков:
фиброина шелка, а-кератина, коллагена, бычьего сывороточного
альбумина.
.12. Как обычно меняется растворимость белков с изменением pH? По-
чему?
43. Известно, что пептид содержит только L-лизин и L-метионин. Из
данных по титрованию следует, что на каждую свободную карбок-
сильную группу пептида приходятся 3 свободные аминогруппы. При
обработке пептида азотистой кислотой (HNOo) в аппарате Ван-
Слайка каждая аминогруппа освобождает 1 моль N2. Если прове-
сти полный кислотный гидролиз дезаминированного пептида и вновь
обработать гидролизат HNO2, то высвобождается то же количество
N2, что и из исходного пептида. Обработка исходного пептида из-
бытком динитрофторбензола дает динитрофенильный (ДНФ-) пеп-
тид, который по спектрофотометрическим данным содержит по три
ДНФ-группы на каждую свободную карбоксильную группу. После
полного гидролиза этого ДНФ-пептида выявляются следующие про-
дукты: бесцветное соединение, содержащее S (Ai); соединение жел-
того цвета, содержащее S (А2), и соединение желтого цвета, не со-
держащее S (А3). При частичном гидролизе ДНФ-пептида обра-
зуются Ai, А2 и А3 и еще четыре соединения, имеющие желтую
окраску — Bi, В2, В3 и В4. При полном гидролизе из Bi образуется
Аь А2 и А3; из В2 — Ai и А2; из В3 —At и А3, а из В4— только А3.
Какова наиболее вероятная структура исходного пептида?
14. Дисахарид, не обладающий редуцирующими свойствами, при обра-
ботке его диметилсульфатом и щелочью дает октамегильное произ-
водное. Кислотный гидролиз этого производного приводит к обра-
Молекулы, из которых мы состоим 193
зованию 1 моля 2,3,4,6-тетраметил-В-глюкозы и 1 моля 2,3,4,6-тет-
раметил-В-галактозы. Дисахарид быстро гидролизуется мальтазой
или лактазой (р-галактозидазой).
Дайте этому дисахариду подходящее описательное наименова-
ние и изобразите его хеуорсову проекционную формулу.
15. Альдопентоза (А) в D-конфигурации при окислении концентриро-
ванной азотной кислотой дает 2,3,4-триоксипентандиоловую кислоту
(триоксиглутаровую кислоту, В), не обладающую оптической актив-
ностью. При добавлении к A HCN с последующим гидролизом, лак-
тонизацией и восстановлением образуются две стереоизомерные
альдогексозы (С и D). Окисление D дает оптически неактивную
2,3,4,5-тетраоксигександиоловую кислоту (сахариновая кислота, Е).
Напишите структурные формулы соединений А—Е.
16. Какие продукты образуются в результате реакции иодной кислоты
с сорбитом?
17. 10,0 г гликогена после метилирования и кислотного гидролиза да-
ют 6,0 миллимолей 2,3-ди-О-метилглюкозы.
а. Какой процент остатков глюкозы в гликогене содержат замещен-
ные группы в а-(1—>6)-положении?
б. Чему равно среднее число остатков глюкозы на каждый нераз-
ветвленный отрезок цепи?
в. Сколько миллимолей 2,3,6-три-О-метилглюкозы могло бы обра-
зоваться из этого полимера?
г. Сколько остатков глюкозы содержит полисахарид, если его мол.
вес равен 2-106?
д. Сколько нередуцирующих концов приходится на молекулу, или,
иными словами, сколько цепей содержит молекула?
18. Что такое температура плавления (7’пл) препарата ДНК? Как Тал
зависит от нуклеотидного состава и как это можно объяснить?
19. Нарисуйте схему полинуклеотидных фрагментов молекул ДНК и
РНК и укажите места разрыва цепи при следующей обработке:
а) НС1, мягкий гидролиз;
б) НС1, более жесткий гидролиз;
в) NaOH, мягкий гидролиз;
г) NaOH, более жесткий гидролиз;
д) панкреатической рибонуклеазой;
е) панкреатической ДНКазой;
ж) ДНКазой селезенки;
з) фосфодиэстеразой селезенки;
и) фосфодиэстеразой змеиного яда;
к) микрококковой ДНКазой.
20. Кислотный гидролиз препарата ДНК дал следующий состав осно-
ваний (в %): аденин — 24,0; тимин —33,0; гуанин — 23,0; цито-
зин— 20,0. Это весьма необычный результат. Укажите две его осо-
бенности и предложите возможные объяснения этого факта, исходя
из особенностей структуры ДНК-
21. Иодное число соединения определяется как количество 12 в грам-
мах, поглощенное одним граммом жира при насыщении С = С-свя-
зей (с образованием дииодпроизводных). Примечание-, обычно при-
меняют галогенизирующие реагенты иодистый монохлорид (IC1) и
иодистый монобромид (1Вг), однако подное число выражают
именно в граммах 12. Число омыления — это количество КОН в
граммах, необходимое для полного омыления (гидролиза и после-
дующей нейтрализации жирных кислот) 1 г жира. Имеется чистый
триглицерид с числом омыления 198 и иодным числом 59,7.
194 Глава 2
а. Каков его молекулярный вес?
б. Чему равна средняя длина цепи жирных кислот?
в. Сколько двойных связей содержится в молекуле триглицерида?"
22. Спермацет (воск, извлекаемый из головы кашалота) как по физи-
ческим свойствам, так и по инертности по отношению к таким ре-
агентам, как Вгг/СНС1з и КМпО4, напоминает высокомолекулярные-
углеводороды; качественный анализ позволяет определенно говорить-
лишь о присутствии в спермацете углерода и водорода. Однако-
ИК-спектры свидетельствуют о наличии в структуре сложноэфир-
ной связи, а количественный анализ дает эмпирическую формулу
С1бНз2О. Титрование пробы раствора, полученного в результате дли-
тельного перемешивания воска в спиртовом растворе КОН, показы-
вает, что на каждые 475 г воска приходится один эквивалент осно-
вания. При добавлении к охлажденной смеси воды и эфира она
разделяется на два слоя — водный и эфирный. Подкисление водно-
го слоя дает твердый продукт А, эквивалент которого по реакции;
нейтрализации составляет 260±5. После испарения эфира образует-
ся твердое, нетитрующееся вещество В. Восстановление как сперма-
цета, так и вещества А литий-алюминий-гидридом дает в качестве-
единственного продукта вещество В.
Какова наиболее вероятная структура спермацета?
23. а. Объясните вкратце два преимущества метода изотопного разве-
дения.
б. Исходя из приводимых ниже данных, рассчитайте количество-
сАМР (циклического АМР), присутствующего в 1 мл клеток се-
далищной мышцы человека. Клетки обрабатывали 32Р-сАМР с
удельной активностью 50 мкКи-мкмоль-1 в течение 0,2 ч (при:
этом весь сАМР был поглощен клетками). Далее клетки подвер-
гали гомогенизации, после чего выделяли и очищали раствори-
мый сАМР. Удельная активность выделенного сАМР оказалась
равной 10 мкКи-мкмоль-1. Суммарное количество добавленного-
сАМР составляло 1,0-10—7 молей на 1 мл клеток.
24. Рисунок в дополнении 2-В иллюстрирует высокоэффективное разде-
ление растворимых белков Е. coli. В белки были включены ^-ами-
нокислоты.
а. Как бы вы поставили эксперимент с введением метки?
б. Какие другие изотопы можно использовать для мечения белков?
Какие химические формы изотопа вы бы предпочли? Какие здесь
возможны ограничения?
в. Какие растворимые компоненты клеток Е. coll, обработанных
ультразвуком, могут помешать проведению подобного двумерного-
разделения и как их можно удалить?
г. Какие еще методы (помимо использования радиоактивных изо-
топов) можно применить для выявления локализации белков?
д. Если бы можно было обнаружить все растворимые белки Е. co-
ll, то сколько отдельных белков вы ожидали бы увидеть?
е. Укажите по крайней мере два наиболее важных качества, кото-
торыми должен обладать метод разделения, для того чтобы его
можно было применить к системам, содержащим очень большое
число белков.
25. 35S испускает только р-частицы; процесс распада характеризуется
следующими параметрами:Zi/2 =86,7 дня, еМакс = 0,168 МэВ.
а. Напишите уравнение радиохимического распада 35S.
б. Рассмотрите преимущества и ограничения, связанные с исполь-
эппяппрм ass R качестве изотопной метки.
Молекулы, из которых мы состоим 195
26. Располагая некоторым количеством агарозы, бромциана, 6-амино-
гексановой кислоты и другими компонентами, необходимыми для
проведения аффинной хроматографии, укажите, какие химические
реакции должны обеспечить связывание триптофана через его ами-
ногруппу.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Chan R. S„ J. Chem. Educ., 41, 116—125 (1964).
2. Bentley R., Molecular Asymmetry in Biology, Vol. 1, pp. 49—56, Academic Press,
New York, 1969.
3. Lambert J. B., Sci. Am., 222, 58—70 (Jan 1970).
4. Strahs G., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 25, 53—107 (1970).
5. Angyal S. J., Angew. Chem., Int. ed. Engl., 8, 157—166 (1969).
6. Pigman IV'. W., Horton D., eds., «The Carbohydrates», 2nd ed., Vol. 1A, pp. 56—
57, Academic Press, New York, 1972.
7. Jencks IV'. P., Catalysis in Chemistry and Enzymology, pp. 4 and 7, McGraw-Hill,
New York, 1969.
8. Cram D. J., Hammond G. S., Organic Chemistry, 2nd ed., p. 221, McGraw-Hill,
New York, 1964.
9. Metzler D. E., Harris С. M., Johnson R. J., Siano D. B., Thomson J. A., Bioche-
mistry, 12, 5377—5392 (1973).
10. Органическая химия нуклеиновых кислот. (Под ред. Н. К- Кочеткова и Э. И. Бу-
довского. — М.: Химия, 1970.)
11. Daniels М„ PNAS, 69, 2488—2491 (1972).
12. Rich A. In: Biophysical Science, A Study Program (Oncley J. L., ed.), p.p. 50—60,
Wiley, New York, 1959. This article also appeared in Rev. Mod. Phys., 31, 50—60
(1959).
13. Dickerson R. E„ Geis J., The Structure and Action of Proteins, Benjamin, New
York, 1969.
14. Ramachandran G. N., Lakshminarayanan A. V., Kolaskar A. S., BBA, 303, 8—13
(1973).
15. Ramachandran G. N., Kolaskar A. S., BBA, 303, 385--388 (1973).
16. Huber R., Steigemann W., FEBS Lett., 48, 235—237 (1974).
17. Rarle I. L., Biochemistry, 13, 2155—2162 (1974).
18. IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 9, 3471—
3479 (1970).
19. Dickerson R. E., Geis I., The Structure and Action of Proteins, pp. 33—43, Benjamin,
New York, 1969.
20. Fraser R. D. B., Gillespie J. M., Nature (London), 261, 650—654 (1976).
21. Suzuki E., Crewther W. G., Fraser R. D. B., MacRae T. P., McKern N. M., JMB,
73, 275—278 (1973).
22. Cohen C„ Holmes К. C.. JMB, 6, 423—432 (1963).
23. Sodek J., Hodges R. S., Smillie L. B„ Jurasek L., PNAS, 69, 3800—3804 (1972).
23a. Crick F. H. C„ Acta Crystallogr., 6, 689—697 (1953).
24. Richards F. M., JMB, 82, 1—14 (1974).
25. Chothia C., Nature (London), 254, 304—308 (1975).
26. Quiocho F. A., Bethge P. H., Lipscomb W. N., Studebaker J. F., Brown R. D.,
Koenig S. H., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 36, 561—567 (1971).
27. Buehner M., Ford G. C., Moras D., Olsen K. W., Rossmann M. G., JMB, 90, 25—
49 (1974).
28. Nagano K-, JMB, 75, 401—420 (1973).
29. Chou P. Y„ Fasman G. D., Biochemistry, 13, 222—245 (1974).
30. Wu T. T„ Rabat E. A., JMB, 75, 13—31 (1973).
31. Schulz G. E. et al., Nature (London), 250, 140—141 (1974).
31a. Levitt M„ Chothia C„ Nature (London), 261, 552—558 (1976).
32. Kretsinger R. H„ Nockolds С. E., JBC, 248, 3313—3326 (1973).
33. Anfinsen С. B., Science, 181, 223—230 (1973).
34. Mahler H. R., Cordes E. H., Biological Chemistry, 2nd ed., pp. 235—245, Harper,
New York, 1971.
34a. Anfinsen С. B., Scheraga H. A., Adv. Protein Chem., 29, 205—300 (1975).
35. Guthrie R. D., Guthrie and Honeyman’s Introduction to Carbohydrate Chemistry,
4th ed., p. 17, Oxford Univ. Press (Clarendon), London and New York, 1974.
35a. French D., Chemistry and Biochemistry of Starch, MTP Int. Ser. Sci. Vol. 5,
pp. 267—335, Butterworths, London, 1975.
36. White A., Handler P„ Smith E. L„ «Principles of Biochemistry», 5th ed., pp. 52—
58, McGraw-Hill, New York, 1973.
196 Глава 2
37. Jeanloz R. W. In: The Carbohydrates (Pigman W., Horton D., eds.), 2nd ed..
Vol. 2B, pp. 589—625, Academic Press, New York, 1970.
38. Silva M. E., Dietrich С. P., JBC, 250, 6841—6846 (1975).
38a. Woodhead-Gallow ay J., Hukins D. W. L., Endeavour, 35, 73—78 (1976).
38b. Rosenberg L., Hellmann W., Kleinschmidt A. K., JBC, 250, 1877—1883 (1975).
39. Montgomery R. In: The Carbohydrates (Pigman W., Horton D., eds.), 2nd ed.,
Vol. 2B, pp. 627—709, Academic Press, New York, 1970.
40. Heath E. C., Annu. Rev. Biochem., 40, 29—56 (1971).
41. Spiro R. G., Annu. Rev. Biochem., 39, 599—638 (1970).
42. Marshall R. D., Annu. Rev. Biochem., 41, 673—702 (1972).
43. Stern E. L„ Lindahl B„ Roden L., JBC, 246, 5707—5715 (1971).
43a. Hallgren P., Lundblad A., Svensson S., JBC, 250, 5312—5314 (1975).
44. Lee У. C., Scocca J. R., JBC, 247, 5753—5758 (1972).
45. DeVries A. L„ Science, 172, 1152—1155 (1971).
46. Vandenheede J. R., Ahmed A. I., Feeney R. E„ JBC, 247, 7885—7889 (1972).
47. Pessac B., Defendi V., Science, 175, 898—900 (1972).
48. Rao V. S. R., Yathindra N„ Sundararajan P. R., Biopolymers, 8, 325—333 (1969).
49. Sathyanarayana В. K-, Rao V. S. R., Biopolymers, 11, 1379—1394 (1972).
50. Rees D. A., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 24, 267—332 (1969).
51 Poppleton В. J., Mathieson A. McL., Nature (London), 219, 1046—1048 (1968).
52. Rundle R. E., French D., JACS, 65, 1707—1710 (1943).
53. French D„ J. Anim. Sci., 37, 1048—1061 (1973).
54. Hybl A., Rundle R. E„ Williams D. E„ JACS, 87, 2779—2788 (1965).
55. Kainuma K-, French D., Biopolymers, 11, 2241—2250 (1972).
56. French D., Dempun Kagaku, 19, 8—25 (1972).
57. Arnott S., Fulmer A., Scott W. E., Dea I. С. M., Moorehouse R., Rees D. A., JMB,
90, 269—284 (1974).
58. Arnott S., Scott W. E„ Rees D. A., McNab C. G. A., JMB, 90, 253—267 (1974).
59. Rees D. A., BJ, 126, 257—273 (1972).
59a. Kirkwood S., Ann. Rev. Biochem., 43, 401—417 (1974).
60. Preston R. D., Sci. Am., 218, 102—108 (June 1968).
61. Atkins E. D. T., Sheehan J. K-, Science, 179, 562—564 (1973).
62. Arnott S., Guss J. M., Hukins D. W. L., Mathews M. B., Science, 180, 743—745
(1973).
63. Brown D. M. In: Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry (P. О. P. Ts’o, ed.).
Vol. 2, pp. 1—90, Academic Press, New York, 1974.
64. Feldman M. Ya., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 13, 1—49 (1973).
65. Arnott S., Hukins D. W. L„ JMB, 81, 93—105 (1973).
66. Saenger W., Angew Chem., Int. Ed. Engl., 12, 591—601 (1973).
67. Altona C., Sundaralingam M., JACS, 94, 8205—8212 (1972).
68. Voet D., Rich A., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 10, 183—265 (1970).
69. Arnott S„ Prog. Biophys. Mol. Biol., 21, 265—319 (1970).
70. Ts’o P. О. P. ed., Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry, Vol. 2, pp. 305—
469, Academic Press, New York, 1974.
71. Arnott S., Hukins D. W. L„ Dover S. D„ Fuller W„ Hodgson A. R., JMB, 81, 107—
122 (1973).
71a. Rosenberg J. M„ Seeman N. C., Day R. 0., BBRS, 69, 979—987 (1976).
72. Kim S. H., Suddath F. L., Quigley G. J., McPherson A., Sussman J. L., Wang A. H. J.,
Seeman N. C., Rich A., Science, 185, 435—440 (1974).
73. Robertas J. D., Ladner J. E., Finch J. T„ Rhodes D., Brown R. S., Clark B. F. C.,
Klug A., Nature (London), 250, 546—551 (1974).
73a. Rich A., Raj Bhandary U. L., Annu. Rev. Biochem., 45, 805—860 (1976).
74. Kim S. H., Sussman J. L., Suddath F. L., Quigley G. L, McPherson A.,
Wang A. H. I., Seeman N. C„ Rich A., PNAS, 71, 4970—4974 (1974).
75. Arnott S., Bond P. J., Nature (London), New Biol., 244, 99—101 (1973).
75а. De Clercq E., Torrence P. F., De Somer P„ Witkop B., JBC, 250, 2521—2531
(1975).
76. Tinoco L, Jr., Borer P. N., Dengler B., Levine M. D., Uhlenbeck О. C., Crot-
hers D. M„ Gralla J., Nature (London), New Biol., 246, 40—41 (1973).
77. Singer С. E„ Ames B. N„ Science, 170, 822—826 (1970); 175, 1393 (1972).
78. Davidson J. N., The Biochemistry of the Nucleic Acids, 7th ed., pp. 204—205, Aca-
demic Press, New York, 1972.
79. Krasuski C., Hayashi H., Nakanishi K-, Fed. Proc., 31, 444 (abstr.) (1972).
80. Helinski D. R., Clewell D. B., Annu. Rev. Biochem., 40, 899—942 (1971).
81. Vinograd J., Lebowitz J., Watson R., JMB, 33, 173—197 (1968).
82. Campbell A. M„ Jolly D. J., BJ, 133, 209—226 (1973).
82a. Keller W., PNAS, 72, 2550—2554 (1975).
83. Pigram W. J., Fuller W., Davies M. E„ JMB, 80, 361—365 (1973).
84. Liu L. F„ Wang J. C„ BBA, 395, 405—412 (1975).
Молекулы, из которых мы состоим 197
85. Gabbay Е. J., Sanford К-, Baxter С. S., Kapicak L., Biochemistry, 12, 4021—4029
(1973).
86. Gabbay Е. J., Scofield R. E., Baxter C. S., JACS, 95, 7850—7857 (1973).
86a. Keller W„ PNAS, 72, 4876—4880 (1975).
86b. Share M., Vinograd J., Cell, 8, 215—226 (1976).
86c. Depew R. E„ Wang C., PNAS, 72, 4275—4279 (1975).
87. Felsenfeld G., Proced. Nucleic Acid Res., 2, 233—244 (1971).
88. Kennell D. E„ Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 11, 259—301 (1971).
89. Borre K., Szybalski N. In: Methods in Enzymology (Grossman L., Moldave K.
eds.), Vol. 21D, pp. 350—383, Academic Press, New York, 1971.
90. Bendich A. I., Bolton E. T. In: Methods in Enzymology (Grossman L., Moldave K.
eds.), Vol. 12B, pp. 635—640, Academic Press, New York, 1968.
91. Gillespie D. In: Methods in Enzymology (Grossman L, Moldave K., eds.), Vol. 12B,
pp. 641—668, Academic Press, New York, 1968.
92. Britten R. J., Kohne D. E., Carnegie Inst. Washington, Yearb., 65, 78—106 (1967).
93. Britten R. I., Kohne D. E„ Science, 161, 529—540 (1968).
94. Britten R. I., Smith J., Carnegie Inst. Washington, Yearb., 68, 378—391 (1970).
94a. Wetmur J. G., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 337—361 (1976).
95. Wilson D. A., Thomas C. A., Jr., JMB, 84, 115—144 (1974).
95a. Sobell H. M., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 307—335 (1976).
96. Christie W. W., Lipid Analysis; Isolation, Preparation, Identification and Struc-
tural Analysis of Lipids, Pergamon, Oxford, 1973.
97. Hitchcock C., Nichols B. W., «Plant Lipid Biochemistry», Academic Press, New
York, 1971.
98. Kates M. In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology
(Work T. S., Work E., eds.), Vol. 3, Part II, North-Holland Publ., Amsterdam,
1972.
99. Garr M. I., James A. T., Lipid Biochemistry, an Introduction, Cornell Univ. Press,
Ithaca, New York, 1971.
100. Okamura K-, Marchessault R. H. In: Conformation of Biopolymers (Ramachand-
ran G. N., ed.), Vol. 2, p. 709—720, Academic Press, New York, 1967.
101. Bowen H. J. M., Trace Elements in Biochemistry, Academic Press, New York,
1966.
102. Frieden E., Sci. Am., 227, 52—60 (Jul 1972).
103. Hoekstra W. G., Suttie J. W., Ganther H. E., Mertz W., eds., Trace Element Meta-
bolism in Animals — 2, Univ. Park Press, Baltimore, Maryland, 1974.
104. Ling G. N., A Physical Theory of the Living State, Ginn (Blaisdell), Boston, Mas-
sachusetts, 1962.
105. Wester P. О., BBA, 109, 268—283 (1965).
106. Birnie G. D., Fox S. M. eds., Subcellular Components, Butterworth, London, 1969.
107. Mahler H. R., Cordes E. H., Biological Chemistry, 2nd ed., pp. 441—457, Harper, New
York, 1971.
108. Некоторые методы получения препаратов митохондрий рассмотрены в издании
Estabrook R. W., Pullman М. Е. eds., Methods in Enzymology, Vol. 10, Academic
Press, New York, 1967.
109. Методы получения препаратов плазматических мембран и аппарата Гольджи рас-
смотрены в книге Jakoby W. В. ed., Methods in Enzymology, Vol. 22, pp. 99—
148, Academic Press, New York, 1971.
НО. Методы выделения лизосом рассмотрены в книге Dingle J. Т., Lysosomes, A La-
boratory Handbook, North-Holland Publ., Amsterdam, 1972.
111. Davidson J. N., The Biochemistry of Nucleic Acids, 7th ed., pp. 73—82, Academic
Press, New York, 1972.
112. Grossman L., Moldave K. eds., Methods in Enzymology, Vol. 12A, pp. 531—708,
Academic Press, New York, 1967.
113. Kirby K. S. In: Methods in Enzymology (Grossman L., Moldave K., eds.), Vol. 12B,
pp. 87—99, Academic Press, New York, 1968.
114. Gurr M. I., James A. T., Lipid Biochemistry, an Introduction, Cornell Univ. Press,
Ithaca, New York, 1971.
115. Morris C. J. O. R., Morris P., Separation Methods in Biochemistry, Wiley (Inter-
science), New York, 1963.
116. Cuatrecasas P., Anfinsen С. B. In: Methods in Enzymology (Jakoby W. B., ed.),
Vol. 22, pp. 345—378, Academic Press, New York, 1971.
117. Jakoby W. B„ Wilchek eds., Methods in Enzymology, Vol. 34, Academic Press, New
York, 1974.
118. Porath J., Nature (London), 218, 834—838 (1968).
119. Inman J. K., In: Methods in Enzymology (Jakoby W. B., Wilchek M., eds.), Vol. 34,
pp. 30—58, Academic Press, New York, 1974.
120. Cuatrecasas P„ Wilchek M., Anfinsen С. B„ PNAS, 61, 636—643 (1968).
198 Глава 2
121. McPhie Р. In: Methods in Enzymology (Jakoby W. B., ed.), Vol. 22, pp. 23—32,
Academic Press, New York, 1971.
122. Blatt W. F. In: Methods in Enzymology (Jakoby W. B„ ed.), Vol. 22, pp. 39—49,
Academic Press, New York, 1971.
123. Reiland J. In: Methods in Enzymology (Jakoby W. B., ed.), Vol. 22, pp. 287—321,
Academic Press, New York, 1971.
124. Cline G. B., Ryel R. B. In: Methods in Enzymology (Jakoby W. B., ed.), Vol. 22,
pp. 168—204, Academic Press, New York, 1971.
125. Bowen T. J., An Introduction to Ultracentrifugation, Wiley (Interscience), New
York, 1970.
126. Davidson I. N„ The Biochemistry of Nucleic Acids, 7th ed., p. 132, Academic Press,
New York, 1972. [Имеется перевод: Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кис-
лот.— М.: Мир, 1976.]
127. Shuster L. In: Methods in Enzymology (Jakoby W. B., ed.), Vol. 22, pp. 412—433,
Academic Press, New York, 1971.
128. Chrambach A., Rodbard D., Science, 172, 440—451 (1971).
129. Vesterberg O. In: Methods in Enzymology (Jakoby W. B., ed.), Vol. 22, pp. 389—
412, Academic Press, New York, 1971.
130. Cohn W. E. In: Methods in Enzymology (Colowick S. P., Kaplan N. O., eds.),
Vol. 3, pp. 724—743, Academic Press, New York, 1957.
131. Heldt H. W., Klingenberg M., In: Methods in Enzymology (Estabrook R. W., Pull-
man M. E., eds.), Vol. 10, pp. 482—487, Academic Press, New York, 1967.
131a. Simpson R. J., Neuberger M. R„ Liu T.-Y., JBC, 251, 1936—1940 (1976).
132. Chin С. C. Q„ Wold F„ Anal. Biochem., 61, 379—391 (1974).
133. Holley R. W. et al., Science, 147, 1462—1465 (1965).
134. Weissman C., Billeter M. A., Goodman H. M., Hindley J., Weber H., Annu. Rev.
Biochem., 42, 303—328 (1973).
134a. Wu R., Bambara R., Jay E., CRC Grit. Rev. Biochem., 2, 455—512 (1975).
134b. Mandeles S., Nucleic Acid Sequence Analysis, Columbia Univ. Press, New York,
1972.
135. Ziff E. B., Sedat J. W., Galibert F., Nature (London), New Biol., 241, 34—37
(1973).
136. Brownlee G. G., Sanger F„ EJB, 11, 395—399 (1969).
137. Proudfoot N. J., Brownlee G. G., Nature (London), 252, 359—362 (1974).
137a. Ling V., JMB, 64, 87—102 (1972).
137b. Sanger F., Coulson A. R., JMB, 94, 441—448 (1975).
138. Barker R., Organic Chemistry of Biological Compounds, Prentice-Hall, Englewood
Cliffs, New Jersey, 1971.
139. Торчинский Ю. M., Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков. — М.: Нау-
ка, 1971; Plenum, New York, 1973 (in English).
140. Friedman M., The Chemistry and Biochemistry of the Sulfhydryl Group in Amino
Acids, Peptides and Proteins, Pergamon, Oxford, 1973.
141. Jocelyn P. C., Biochemistry of the SH Group, Academic Press, New York, 1972.
142. Bornstein P., Biochemistry, 9, 2408—2421 (1970).
143. Ackerman R. J., Robyt J. F., Anal. Biochem., 50, 656—659 (1972).
143a. Means G. E., Feeney R. E., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, San
Francisco, California, 1971.
144. Sloneker J. H., Orentas D. G., Knutson C. A., Watson P. R., Jeanes A., Can. J.
Chem., 46, 3353—3361 (1968).
145. Szekely M., Proced. Nucleic Acid Res., 2, 780—795 (1971).
146. Davidson J. N., The Biochemistry of the Nucleic Acids, 7th ed., pp. 242—245, 294
and 295, Academic Press, New York, 1972.
147. Treadwell G. E., Cairns W. L., Metzler D. E., J. Chromatogr., 35, 376—388
(1968).
148. Udenfriend S., Stein S., Bohlen P„ Dairman W., Leimgruber W., Weigele M.,
Science, 178, 871—872 (1972); см. также Benson J. R., Hare P. E. [PNAS, 72.
619—622 (1975)].
149. Sicbodova S„ Hais I. M., Kostir J. V., Chem. Listy, 47, 205—212 (1953).
150. Brown J. R., Hartley B. S., BJ, 101, 214—228 (1966).
151. Van Holde К. E., Physical Biochemistry, Prentice-Hall, Engelwood Cliffs, New
Jersey, 1971.
152. Mahler H. R., Cordes E. H., Biological Chemistry, 2nd ed., pp. 75—91, Harper, New
York, 1971.
153. Nakos G„ Mortenson L., Biochemistry, 10, 455—458 (1971).
154. Mann K. G„ Fish W. W. In: Methods in Enzymology (Hirs С. H. W., Tima-
sheff S. N., eds.), Vol. 26C, pp. 28—42, Academic Press, New York, 1972.
155. Igou D. K., Lo J.-T., Clark D. S., Mattic.e W. L., Younathan E. S„ BBRC, 60,
140—145 (1974).
Молекулы, из которых мы состоим 199
«356. Weber К., Pringle J. R., Osborn М. In: Methods in Enzymology (Hirs С. H. W.,
Timasheff S. N., eds.), Vol. 26C, pp. 1—27, Academic Press, New York, 1972.
156a. Collins D. M., Cotton F. A., Hazen E. E., Jr., Meyer E. F., Jr., Morimoto C. N.,
Science, 190, 1047—1053 (1975).
J57. Roberts J. D., Nuclear Magnetic Resonance, McGraw-Hill, New York, 1959.
158. Roberts G. С. K., Jardetzky 0., Adv. Protein Chem., 24, 447—545 (1970).
159. Jardetzky O., Wade-Jardetzky W. G., Annu. Rev. Biochem., 40, 605—634 (1971).
160. Bovey F. A., Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Academic Press, New
York, 1969.
161. Emsley J. W., Feeney J., Sutcliffe L. H., High Resolution Nuclear Magnetic Reso-
nance Spectroscopy, Vols. 1 and 2, Pergamon, Oxford, 1965, 1966.
162. James T. L., Nuclear Magnetic Resonance in Biochemistry: Principles and Applica-
tions, Academic Press, New York, 1975.
163. Rorytnyk W., Ahrens H. In: Methods in Enzymology (McCormick D. B.,
Wright L. D., eds.), Vol. 18A, pp. 475—483, Academic Press, New York, 1970.
164. Barfield M., Rarplus M., JACS, 91, 1 — 10 (1969).
165. Tonelli A. E., Biochemistry, 12, 689—692 (1973).
166. Bovey F. A. In: Chemistry and Biology of Peptides (Meienhofer J., ed.), pp. 3—
28, Arbor Sci. Publ., Ann Arbor, Michigan, 1972.
167. Llinas M., Wilson D. M., Weilands J. B., Biochemistry, 12, 3836—3843 (1973).
168. Durette P. L., Horton D., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 26, 49—125 (1971).
169. Horrocks W. DeW. Jr., Sipe J. P., HI, JACS, 93, 6800—6804 (1971).
169a. Willcott M. R„ III, Davis R. E., Science, 190, 850—857 (1975).
170. McDonald С. C„ Phillips W. D„ JACS, 89, 6332—6341 (1967).
171. McDonald С. C„ Phillips W. D., JACS,91, 1513—1521 (1969).
172. Cohen J. S„ Fisher W. R„ Schechter A. W., JBC, 249, 1113—1118 (1974).
173. Griffin J. H., Cohen J. S., Schechter A. N„ Biochemistry, 12, 2096—2099 (1973).
174. Markley J. L., Biochemistry, 14, 3546—3554 and 3554—3561 (1975).
174a. Wiirthrich R., NMR in Biological Research: Peptides and Proteins, North-Holland,
Amsterdam, 1976.
I74b. Shindo H., Hayes M. B„ Cohen J. S., JBC, 251, 2644—2647 (1976).
175. Hayes M. B., Hagenmaier H., Cohen J. S., JBC, 250, 7461—7472 (1975).
176. Reid B. R., Robillard G. T., Nature (London), 257, 287—291 (1975).
177. Anet F. A. L„ Levy G. C., Science, 180, 141—148 (1973).
178. Oldfield E., Allerhand A., PNAS, 70, 3531—3535 (1973).
179. Oldfield E„ Worton R. S„ Allerhand A., JBC, 250, 6381—6402 (1975).
180. Oldfield E„ Allerhand A., JBC, 250, 6403—6407 (1975).
181. Becker E. D., Farrar T. C„ Science, 178, 361—368 (1972).
182. Moon R. B„ Richards J. H„ JBC, 248, 7276—7278 (1973).
183. Hotilt D. I., Busby S. J. W., Gadian D. G., Radda G. R„ Richards R. E., Seeley P. J.,
Nature (London), 252, 285—287 (1974).
1'84. Salhany J. M., Yamane T., Shulman R. G., Ogawa S., PNAS, 72, 4966—4970
(1975).
E85. Burt G. T„ Glonek T„ Barany M„ JBC, 251, 2584—2591 (1976).
Л86. GustD., Moon R. B„ Roberts J. D., PNAS, 72, 4696—4700 (1975).
Глава 3
Энергетика биохимических
реакций
Все мы знаем из собственного опыта, насколько важна для жизни
энергия. Известно, что нельзя жить без еды, что после тяжелой работы
мы испытываем не только усталость, но и чувство голода. Наше тело
вырабатывает тепло—-уже одно это наблюдение привело Лавуазье
примерно в 1780 г. к заключению, что дыхание представляет собой
медленное сгорание питательных веществ в организме. Позднее, после
открытия первого и второго законов термодинамики, было установлено
точное количественное соотношение между теплотой, энергией и рабо-
той. Современная биохимическая литература пестрит ссылками на тер-
модинамические величины — энергию Е, энтальпию Н, энтропию S и
свободную энергию Гиббса G.
Эта глава ставит перед собой три задачи: 1) привести и конспек-
тивно изложить смысл термодинамических уравнений; 2) дать табли-
цы значений термодинамических величин для различных биохимических
соединений и объяснить, как использовать эти данные применительно к
равновесным состояниям биохимических систем; 3) описать аденилат-
ную систему (включающую в себя аденозинтрифосфат, аденозиндифос-
фат, аденозинмонофосфат и неорганический фосфат) и указать на цент-
ральную роль этой системы в процессах энергообмена.
По термодинамике имеется множество книг, которые можно исполь-
зовать для более глубокого изучения этого предмета. Некоторые из них
указаны в библиографии [1—5].
А. Термодинамика
Термодинамика [1—5] занимается количественным описанием изме-
нений энергии и теплоты системы, связанных, в частности, с достижени-
ем химического равновесия. Зная изменение термодинамических вели-
чин, таких, как Н и S, можно предсказать, пойдет ли в данных усло-
виях реакция или нет, и описать состояние равновесия. Более того, ана-
лиз значений термодинамических величин иногда может раскрыть при-
роду сил, связывающих молекулы друг с другом.
Наиболее серьезное ограничение при использовании положений
классической термодинамики определяется тем, что эта наука всегда
имеет дело с равновесным состоянием и ничего не говорит о кинетике
процессов. Отсюда иногда делают вывод, что термодинамика не имеет
отношения к биохимии. Это, безусловно, не так; нам важно знать энер-
гетические соотношения для биохимических реакций. Вместе с тем
очень опасно впасть в другую крайность и считать, что термодинами-
ческие расчеты, выполненные для состояния равновесия, можно прямо
перенести на случай стационарного состояния, которое характерно для
живой клетки (гл. 1).
Энергетика биохимических реакций 201
1. Система и ее окружение
Применяя термодинамические уравнения, необходимо точно опре-
делить, какую систему мы рассматриваем. Такой системой может быть
раствор в колбе, помещенной в термостатированную баню. Колба, баня
и все остальное будут представлять собой внешнее окружение. Систему
плюс ее окружение в термодинамике иногда называют вселенной.
2. Первый закон термодинамики
Первый закон термодинамики—это закон о сохранении энергии и
об эквивалентности работы и теплоты. Работа и теплота представляют
собой разные формы энергии и переходят одна в другую. Система мо-
жет поглощать тепло из внешней среды или выделять его. В процессе
взаимодействия с окружением система может совершать работу. Пер-
вый закон постулирует, что существует функция Е (иногда ее обозна-
чают как [/), называемая внутренней энергией, которая определяется
только состоянием системы в данный момент и не зависит от ее преды-
стории. Согласно первому закону, Е может измениться только в про-
цессе передачи энергии в виде теплоты или при совершении работы.
Другими словами, этот закон утверждает, что энергию нельзя ни соз-
дать, ни уничтожить.
Таблица 3-1
Единицы энергии и работы и значения некоторых физических постоянных
Джоуль, единица энергии в системе СИ
1 Дж=1 кг-м2-с-1 =
= 1 H-м (ньютон-метр) =
= 1 Вт-с (ватт-секунда) =
= 1 К.Л-В (кулон-вольт)
Термохимическая калория
1 кал = 4,184 Дж
Большая калория
1 Кал=1 ккал = 4,184 кДж
Работа, которую необходимо совершить, чтобы поднять груз весом 1 кг на высоту
1 м (над уровнем моря) =9,807 Дж
Свободная энергия гидролиза 1 моля АТР при pH 7 и миллимолярных концеитра-
циях =—12,48 ккал = —52,2 кДж
Работа, которую необходимо совершить для повышения концентрации вещества
в 1000 раз (например, от 10-в до 10-3 М)=4,09 ккал =17,1 кДж
Число Авогадро — число частиц в одном моле вещества
N = 6,0220-1023
Число Фарадея If=96 485 Кл-моль-1
Кулой 1 Кл=1 А-с (ампер-секунда) =6,241 • 1018 (элементарных зарядов)
Постоянная Больцмана
6=1,3807-10-23 Дж-град-1
Газовая постоянная 7? = N-6
^ = 8,3144 Дж-град-1-моль-1 =
= 1,9872 кал-град-1-моль-1 =
= 0,08206 л-атм-град-1-моль-1;
при 25° RT = 2,479 кДж-моль-1
Единица измерения температуры, градус Кельвина, К; 0°С = 273,16 К
1g х = 2,3026 1п х
'202 Глава 3
Математически первый закон записывается так:
ДЕ=Е (продуктов)—Е (реагентов) = Q—W, (3-1)
где Q — теплота, полученная системой из внешней среды, a W — рабо-
та, совершенная системой над ее окружением. Энергия, теплота и ра-
бота измеряются в одних и тех же единицах. Для химиков более при-
вычными все еще остаются калории (кал) или килокалории (ккал);
в системе СИ единицей энергии является джоуль (табл. 3-1). Работа,
выполняемая системой, может быть механической (например, работа
по изменению внешнего объема), электрической (зарядка аккумулято-
ра) или химической (синтез полипептида из аминокислот).
3. Изменение энтальпии и термохимия
При изучении химических реакций мы чаше всего интересуемся из-
менением термодинамических функций; например, тепло, поглощенное
системой внутри калориметрической бомбы при постоянном объеме, Qv,
является прямой мерой изменения энергии Е
QV=EE. (3-2)
Чтобы измерить ДЕ при сгорании биохимического соединения, пуж-
шо поместить его в калориметрическую бомбу вместе с газообразным
кислородом и поджечь смесь с помощью электрической искры. В этом
случае бомба будет выделять в окружающую среду тепло: Qv и ДЕ
будут отрицательными. Калориметр позволяет измерить Qv и, следо-
вательно, ДЕ в ходе реакции.
4. Энтальпия и процессы, протекающие при постоянном давлении
Химические и биохимические реакции значительно чаще протекают
при постоянном давлении (обычно равном 1 атм), чем при постоянном
•объеме. Поэтому химикам удобнее использовать в качестве термодина-
мической функции не внутреннюю энергию Е, а энтальпию Н
H=E+PV. (3-3)
Из уравнения (3-3) следует, что при постоянном давлении АНР=^ЕР +
-r-P&V. В этом случае PW равно работе по изменению объема окру-
жения, а теплота, поглощаемая при постоянном давлении, QP, равна
ЛНР:
Ср=ДЕр-|-РДУ=ДЯр. (3-4)
Термин «энтальпия» введен для того, чтобы отличать Н от Е, но хи-
мики часто не слишком заботятся о терминах, и многое из того, что
в литературе говорится об энергии, фактически относится к энтальпии.
Разница часто оказывается незначительной: если работа по изменению
объема пренебрежимо мала, Е равно Н.
5. Энтальпия сгорания и калорийность «физиологического топлива»
Изменение энтальпии можно определить прямым измерением коли-
чества теплоты, поглощенной системой при постоянном давлении. По-
этому изменения в энтальпии, сопровождающие окисление питательных
веществ, уже с давних времен привлекали внимание как химиков, так
и физиологов. Теплота сгорания (—Д//с) обычно определяется по ДЕС,
Энергетика биохимических реакций 203
измеряемому калориметрически. Поскольку /\EV и ДЕР почти одинако-
вы, то &Нр=ДЕу + Р&V, где AV— изменение объема, которое имело
бы место, если бы реакция шла при постоянном давлении—эту вели-
чину легко рассчитать. Так как интерес представляет ДИ процесса, при
котором продуктами сгорания являются углекислый газ, вода, элемен-
тарный азот (N2) и сера, нужно вводить поправку на образование оки-
сей двух последних элементов. В итоге можно получить с очень хоро-
шей точностью значения ДНС как для биохимических соединений, так
и для многокомпонентных пищевых продуктов. В последние годы опре-
деление с помощью микрокалориметра довольно малых значений ЕН
для различных химических или биохимических реакций стало рутин-
ной процедурой [6, 7].
При обсуждении вопросов, связанных с питанием, величину — ДНС
иногда называют полной энергией. Соответствующие значения обычно
выражают в килокалориях; в биохимической литературе килокалории
обозначают сокращенно ккал, а в литературе по вопросам питания —
Кал.
Калорийностью пищевых продуктов называют скорректированную
величину энтальпии сгорания (ДНС), взятую с обратным знаком. По-
скольку энтальпия сгорания пищи всегда отрицательна, калорийность
выражается положительным числом. Калорийность некоторых веществ
дана в приводимой ниже таблице.
Калорийность 1 г вещества
Углеводы
‘Чистая глюкоза
Липиды
Белки3
4,1 ккал
3,75 ккал
9,3 ккал
4,1 ккал
17 кДж
15,7 кДж
39 кДж
17 кДж
а Азот переходит в состав мочевины.
Для белков расчет ведется исходя из того, что азот переходит не
в КС, а в мочевину (основное азотистое соединение, выделяемое млеко-
питающими) .
Можно ли-—с чисто термохимической точки зрения—-рассматривать
•организм человека или животного как катализатор процессов сгорания
пищевых продуктов? Чтобы ответить на этот вопрос, были построены
большие калориметры, в которые можно поместить человека или жи-
вотное. Если человек, находясь в калориметре, не теряет и не прибав-
ляет в весе, то выделяемое им тепло как раз и должно быть равно
~ДН сгорания пищевых продуктов, превращающихся в ССб, воду и
мочевину. Тот факт, что это положение подтвердилось эксперименталь-
но, у нас удивления не вызывает, однако в начале нынешнего столетия,
когда такие эксперименты ставились впервые, многие ученые сомнева-
лись в применимости первого закона термодинамики к живым орга-
низмам.
На практике калориметрические измерения на животных сопряже-
ны с множеством трудностей, связанных с невозможностью точно изме-
рить количество выделившегося тепла, с неопределенностью в количе-
•стве запасенных питательных веществ, а также с необходимостью вве-
дения поправок в АЯС в связи с образованием продуктов обмена, под-
204 Глава 3
лежащих выделению. Тем не менее такие измерения энергообмена име-
ют важное значение для организации питания и для медицины. Разра-
ботаны косвенные калориметрические методы, позволяющие измерять,
уровень основного обмена у человека. Эти вопросы хорошо изложены
в книге Уайта и др. [8]|.
Основным обменом называют скорость выделения организмом теп-
ла в покоящемся состоянии по прошествии значительного времени?
после приема пищи. В этих условиях организм человека получает
энергию за счет запасенных ранее питательных веществ, причем ско-
рость их потребления оказывается приблизительно постоянной. Основ-
ной обмен, как правило, пропорционален площади поверхности тела',
для девушек эта величина составляет в среднем ~154 кДж-ч-1-м 2,
для юношей ~172 кДж-ч-1-м-2. Для человека весом 70 кг это соот-
ветствует ~320—360 кДж-ч-1. Заметим, что 360 кДж-ч-1 эквивалент-
ны мощности 100-ваттной лампочки. Хотя обмен у разных людей зна-
чительно варьирует, слишком сильные отклонения в ту или иную сто-
рону свидетельствуют о каких-то нарушениях, связанных, например»,
с недостатком или избытком гормона щитовидной железы тироксина.
Скорость метаболизма немного падает во время сна и сильно повыша-
ется при совершении тяжелой физической работы. Иногда у человека
интенсивность обмена возрастает до 2500 кДж-ч-1 (600 ккал-ч-1). При:
интенсивности 320 кДж-ч-1 (76 ккал-ч-1) человек каждые 24 ч дол-
жен получать 7680 кДж (1835 ккал) энергии для поддержания основ-
ного обмена и еще какое-то дополнительное количество энергии для
совершения мышечной работы. Обычная конторская или нетяжелая до-
машняя работа повышает интенсивность обмена примерно вдвое.
6. Энтропия и теплопередача
Почему тепло всегда переходит от теплого тела к холодному и ни-
когда не наблюдается обратного процесса? Мы знаем, что направление-
потока тепла контролируется разностью температур, но тогда возника-
ет другой вопрос: что такое температура? Размышления по этому пово-
ду, а также по поводу взаимных превращений работы и теплоты при-
вели к открытию второго закона термодинамики и к введению новой:
термодинамической функции — энтропии S.
Рассмотрим фазовый переход при постоянных температуре и давле-
нии, например плавление льда. При температуре чуть выше 0 °C лед.
плавится полностью, а при температуре чуть ниже 0°С он вообще не-
плавится. При 0 °C наблюдается равновесие: на языке термодинамики
плавление льда при 0 °C представляет собой обратимый процесс. Исхо-
дя из каких критериев можно было бы предсказать такое поведение
воды? Для многих знакомых нам процессов, например для горения, ха-
рактерно то, что самопроизвольное протекание реакции сопровождает-
ся выделением большого количества тепла, т. е. АД в этом случае от-
рицательно. Однако при плавлении льда тепло поглощается. При 0 °C.
\Н процесса составляет 6,008 кДж-моль-1; почти то же значение полу-
чается и чуть ниже 0 °C, когда лед вообще не плавится, и чуть выше
0 °C, когда лед плавится полностью. В последнем случае плавление
льда представляет собой самопроизвольный процесс, для которого ДЯ
положительно. Принимая во внимание эти факты, можно ясно видеть,,
что знак изменения энтальпии сам по себе не мол(ет служить критери-
ем самопроизвольности реакции.
Понять природу перехода лед — вода удалось лишь после осозна-
ния того факта, что при плавлении льда помимо увеличения Н Hai
Энергетика биохимических реакций 205
<5,008 кДж • моль 1 (в результате чего увеличивается внутренняя энер-
гия молекул — поступательная, колебательная и вращательная) проис-
ходит уменьшение упорядоченности системы. Хотя исторически энтропия
была введена из других соображений, сейчас ее понимают как меру
«микроскопического беспорядка». Когда лед плавится, энтропия S воз-
растает, поскольку структура становится менее упорядоченной.
7. Второй закон термодинамики
Второй закон термодинамики формулируется по-разному, но в обыч-
ной математической формулировке он гласит, что во «вселенной» (илн
в замкнутой системе)
AS (системы ф-ее окружения) = 0 для обратимых процессов,
AS > 0 для реальных (необратимых) процессов.
Иногда второй закон формулируют иначе: энтропия вселенной всегда
возрастает.
Второй закон определяет одновременно S и термодинамическую
шкалу температур:
dS обратим — 7/^, (3*5)
где q — бесконечно малое количество поглощенного тепла. Для обра-
тимого фазового перехода, каким является плавление льда при посто-
янных давлении и температуре, изменение энтропии Н2О равно в точ-
ности &HIT [уравнение (3-6)]. Энтропия измеряется в джоулях на 1 К
или в калориях на 1 К-
^SP^06pa^=Q/T=\H/T. (3 6)
В последнем случае часто пользуются сокращением э. ед. (энтропийные
единицы). Поскольку плавление льда является обратимым процессом,
второй закон утверждает, что энтропия окружения уменьшается на ту
же величину, на которую возрастает энтропия воды. Заметим, что для
воды при 0 °C Г AS численно равно теплоте плавления,
6,008 кДж-моль-1. Таким образом, повышение энтропии льда в ходе
его плавления при 0 °C равно 6,008-103 Дж/273,16 К = 22,0 Дж-град-1.
Определение термодинамической температуры [уравнение (3-7); бо-
лее подробно см. об этом в учебниках по термодинамике]' тоже сле-
дует из уравнения (3-5):
Т (K) = (dE/dS')v=(dH/dS)P. (3-7)
Энтропию можно точно описать математически через степень раз-
упорядоченности системы
5=61пЙ. (3-8)
Здесь k — постоянная Больцмана (табл. 3-1), а й— число микроскопи-
ческих состояний (различных расположений частиц) системы, соответ-
ствующее данному макроскопическому состоянию, т. е. состоянию с
данной температурой, давлением и данным числом молекул. Й возра-
стает с увеличением объема или повышением температуры, а также при
переходе вещества из твердого в жидкое и далее в газообразное со-
стояние. Уравнение (3-8) не является уравнением классической термо-
динамики, которая имеет дело только с макроскопическими системами,
т. е. с большими совокупностями молекул. Однако, используя методы
206 Глава 3
статистической термодинамики [9]', с его помощью можно довольно-
точно определить энтропию газов.
Примером из области биохимии, который можно непосредственно
связать с уравнением (3-8), служит рацемизация аминокислот. Раствор
L-аминокислоты можно легко превратить в рацемическую смесь, когда
50% аминокислоты находится в D-форме и 50%—-в L-форме, с по-
мощью особого фермента рацемазы, причем этот процесс не будет со-
провождаться ни поглощением, ни выделением тепла. Таким образом,.
Д77 = 0 и единственным изменяющимся параметром системы является
энтропия. Обозначим Q чистого изомера через Q'. Принимая во вни-
мание, что каждая из N молекул 1 моля рацемата может находиться
в одной из двух конфигураций, для рацемической смеси можем запи-
сать
Й=2ЛГИ'. (3-9>
Исходя из уравнения (3-8), получаем
AS =k (In 2W + In Q') —k In Q' =Nk In 2 = 7? In 2 =
= 5,76 Дж-моль-1,
(3-10>
8. Определение энтропии через теплоемкость
Из уравнения (3-8) следует, что для идеального кристалла, в кото-
ром молекулярный беспорядок отсутствует, при Т--0 S = 0. Третий за-
кон термодинамики утверждает, что для идеальных кристаллов по ме-
ре приближения термодинамической температуры Т и ОК энтропия
S стремится к нулю. Отсюда следует, что при любой температуре выше
Таблица 3-2
Энтропия ряда веществ3
Вещество Состояние Энтропия
Э. ед. кДж К—1 ’МОЛЬ—1
С (алмаз) Твердое 0,55 2,3
С (графит) » 1,36 5,7
Си 8,0 33
Na » 12,2 К1
Н2О (лед) » 9,8 41
Н2О Жидкое 16,7 70
Н2О Газообразное (1 атм) 45,1 189
Не То же 30,1 126
н2 » 31,2 131
N2 » 45,8 192
со2 » 51,1 214
Бензол » 64,3 269
Циклогексан » 71,3 298
3 Все величины выражены в энтропийных единицах И в кДж-К-1-моль-1 для 25 °C (298,16 К). (э. ед.), т. е. в кал-К-1-моль-1,
Энергетика биохимических реакций 207'
0 К энтропия задается следующим уравнением:
т
S = ^Cpd\nT. (3-11).
6
В этом уравнении Ср — это теплоемкость при постоянном давлении:
СР=(дН/дТ)р. (3-12)
Измерив Ср при низких температурах, приближающихся к 0 К, с по-
мощью уравнения (3-11) можно оценить абсолютное значение энтро-
пии S. Если по мере повышения температуры наблюдается фазовый пе-
реход, то к величине, задаваемой уравнением (3-11), надо прибавить
AS, определяемое из уравнения (3-6), Для некоторых соединений (на-
пример, для воды; гл. 4, разд. Б.4) молекулярный беспорядок сохра-
няется даже в кристаллическом состоянии при 0 К. В этом случае в
уравнение (3-11) надо ввести член, соответствующий энтропии при 0 К.
Энтропия ряда веществ приведена в табл. 3-2. Обратите внимание,
как возрастает эта величина с усложнением структуры, с переходом из
твердого состояния в жидкое и далее в газообразное и с уменьшением
твердости материалов,
9. Критерий самопроизвольности процесса
Как мы видели, одни самопроизвольные процессы, например горение
органических соединений, сопровождаются выделением тепла (АД от-
рицательно), а другие идут с поглощением тепла из окружающей сре-
ды (АД положительно). Примером процессов второго типа служит
плавление льда при температуре чуть выше 0 °C. В этом случае в про-
цессе плавления происходит большое изменение энтропии воды, а в.
равновесии при 0 °C численное значение TAS оказывается в точности,
равным —АД [уравнение (3-6)].
Тот факт, что в равновесии АД—TAS = 0, навел Дж. Гиббса на-
мысль, что можно ввести термодинамическую функцию, позволяющую
получить критерий самопроизвольного процесса, — теперь эта функция
известна как свободная энергия Гиббса
G=H— TS. (3-13)
Для процессов, протекающих при постоянных температуре и давлении,,
изменение G есть
АОГР=ДД—TAS. (3-14)
Более того, для обратимых (равновесных) процессов, в ходе которых со-
вершается только работа по изменению объема,
^GTMliK=AH-TAS=0. (3-15)
Можно легко показать, что для любого самопроизвольного (необра-
тимого) процесса AG отрицательно. Такие процессы называются экзер-
гоническими. Если же AG положительно, то реакция сама не пойдет;
такие реакции называются эндергоническими. Понижение свободной
энергии (—AG) —это мера максимального количества работы, которую
можно совершить с помощью данной реакции, если, конечно, реакция
как-то сопряжена с системой, способной в ходе обратимого процесса
совершать работу. Эта работа может быть электрической, мышечной
или осмотической, совершаемой за счет реакций, протекающих в био-
логических системах. В любой реальной системе совершаемая работа
208 Глава b
неизбежно меньше —AG, поскольку реальные процессы необратимы,
т. е. сопровождаются возрастанием энтропии.
Возвращаясь к высказанному ранее предположению о том, что АН
может служить мерой совершаемой работы, заметим, что TAS для
большинства реакций составляет лишь несколько килокалорий. Следо-
вательно, если А// велико (например, при сгорании питательных ве-
ществ), то оно не слишком сильно отличается от AG для того же про-
цесса. Этим оправдывается использование калорийности пищи как при-
близительной меры работы, совершаемой в результате усвоения пищи
организмом.
10. Стандартные состояния
Чтобы термодинамические данные можно было использовать при
химических расчетах, необходимо какие-то состояния элементов или со-
единений принять за стандартные. Например, если мы говорим об из-
менении свободной энергии при превращении одного или нескольких
чистых соединений в другие, необходимо указать, к какому состоянию
относятся, эти данные (кристаллическому, жидкому, газообразному
или состоянию в растворе) и при каком давлении они получены (осо-
бенно если в реакциях участвуют газообразные вещества). Стандарт-
ное давление — это обычно давление в 1 атм. Стандартным состояниям
элементов отвечают чистые кристаллические, твердые или газообразные
вещества, например С (графит), S (кристаллическая ромбическая),
Р (кристаллический белый), Ыг, Ог и Н2 (газообразные). Необходимо
также указать температуру. Приводимые значения термодинамических
величин чаще всего соответствуют 25°C.
Обычно для химических реакций гораздо важнее знать не сами
величины G или Н, а их изменение-—AG и АН. При составлении таб-
лиц значений свободной энергии принято считать, что для всех элемен-
тов в стандартном состоянии G равно нулю. Тогда можно получить
значения AG образования любого вещества путем соединения элемен-
тов в нужном соотношении (например, измерив АН при сгорании ве-
щества и определив энтропию из измерений теплоемкости). Получае-
мую таким образом стандартную свободную энергию образования обо-
значают через AG°i.
11. Суммирование изменений свободной энергии
Важной особенностью термодинамических расчетов является то,
что AG для совокупности нескольких химических реакций попросту
равно сумме значений AG для отдельных реакций [см. уравнения
(3-16) — (3-19)]. То же относится к АН и AS.
СН3СООН(ж) ------------------------->- 2С + 2Н2 + О2 (3-16)
—AG’ для уксусной кислоты = -f-396,4 кДж-моль-1
2О2+2С ---------------->- 2СО2 (3-17)
2AG^ для СО2 = —788,8 кДж-моль-1
О2+2Н2 --->- 2Н2О (3-18)
2AGj для Н2О =—474,4 кДж-моль-1
СН3СООН (ж) + 2О2 ---> 2СО2 + 2Н2О (ж) (3-19)
AG0 сгорания уксусной кислоты =—866,8 кДж-моль-1
Энергетика биохимических реакций 209
В этом примере уравнение (3-16) разложения уксусной кислоты на
элементы суммируется с уравнениями (3-17) и (3-18), описывающими
образование нужного числа молекул СО2 и Н2О. Суммирование этих
трех уравнений дает уравнение сгорания уксусной кислоты с образова-
нием СО2 и воды, а сумма значений ДО для каждого из трех уравне-
ний дает AG сгорания уксусной кислоты. Заметим, что полученное в ре-
зультате значение AG соответствует сгоранию чистой жидкой уксусной
кислоты в кислороде при давлении в 1 атм, а в качестве продуктов
образуются СО2 при давлении в 1 атм и чистая жидкая вода — и ре-
агенты, и продукты находятся в стандартном состоянии.
Описанную выше процедуру можно представить уравнением
(3-20) — общим уравнением, позволяющим рассчитать AG° любой реак-
ции, зная AG продуктов и реагентов:
AG0 = 2 (продуктов) — AG? (реагентов). (3-20)
Как меняется приращение свободной энергии при переходе соеди-
нения от стандартного к какому-либо другому состоянию? Рассмотрим
случай, когда меняется давление газа. Легко показать (см. любой учеб-
ник термодинамики), что
(dG/dP)r=V. (3-21)
Используя уравнение (3-21) совместно с уравнением состояния идеаль-
ного газа, получим соотношение между свободной энергией G 1 моля
вещества1 при давлении Р и стандартной свободной энергией G0 при
давлении Р°:
G—G°=RT In -ir=RT In P. (3-22)
Поскольку P° по определению равно 1 атм, изменение свободной энер-
гии 1 моля вещества при изменении давления от Р° до Р просто равно
RTkiP. Обычно в термодинамике вывод наиболее важных термодина-
мических уравнений иллюстрируется на примере идеальных газов, од-
нако применительно к биохимическим системам более близким приме-
ром являются растворы.
12. Реакции в растворе
Биохимиков обычно интересуют свойства соединений в достаточно
разбавленных водных растворах (например, в цитоплазме), хотя в от-
дельных случаях приходится иметь дело и с неводными растворами.
В каждом из этих случаев необходимо определить, что такое стандарт-
ное состояние растворенного вещества. За стандартное состояние ве-
щества в водном растворе обычно принимается его состояние в гипо-
тетическом моляльном растворе (1 моль растворенного вещества на
1 кг воды), свойства которого идентичны свойствам растворенного ве-
щества при бесконечном разбавлении. В этом случае можно написать
уравнение, аналогичное уравнению (3-22), которое выражает свобод-
ную энергию 1 моля растворенного вещества, Gj, через свободную энер-
1 Черточка над символами G или AG всегда указывает, что свободная энергия или
ее изменение относятся к 1 молю вещества.
210 Глава 3
гию G°i в гипотетическом стандартном состоянии с единичной активно-
стью и через активность растворенного вещества1:
Gt^Gt+RTlncii. (3-23)
В уравнение (3-23) и в уравнения, которые из него следуют, входят
моляльные активности. Однако для очень разбавленных растворов,
когда свойства растворенных молекул очень близки к свойствам их в
гипотетическом идеальном растворе (стандартное состояние), вместо
активностей можно использовать концентрации. Для любого реального
раствора активность равна произведению коэффициента активности на
концентрацию
а=ус, (2*24)
где а — активность, у — коэффициент активности, а с — моляльная кон-
центрация. Таким образом, чтобы с помощью таблиц термодинамиче-
ских функций для веществ в растворе предсказать поведение этих ве-
ществ в не слишком разбавленных растворах, нужно умножить кон-
центрацию каждого компонента на соответствующий коэффициент ак-
тивности. Для очень грубых расчетов, которые часто вполне устраива-
ют биохимиков, принято приравнивать активности концентрациям. Кро-
ме того, для разбавленных растворов более привычные молярные кон-
центрации (количество вещества в молях на 1 л раствора) почти рав-
ны моляльным2.
Из уравнения (3-23) следует, что изменение свободной энергии при
разбавлении раствора от состояния с активностью щ до состояния с
активностью а2 есть
AG=/?7’ln(a2/a1). (3-25)
13. AG° и константа равновесия
Рассмотрим следующее обобщенное химическое уравнение, описы-
вающее реакцию, в ходе которой а молей вещества А реагируют с b мо-
лями вещества В, давая продукты С, D и т. д.:
аА + ЫВН----=cC-|-dD-1-----. (3-26)
Изменение стандартной свободной энергии для этого процесса равно
AG°=cG° (С) + dG° (D) -|---aG° (А) — bG° (В) • • -. (3-27)
G°(A) обозначает здесь свободную энергию вещества А и т. д. Значе-
ние AG для любых заданных концентраций реагентов и продуктов мож-
но получить из AG°, используя уравнение (3-23) применительно к каж-
дому из компонентов. В результате мы получим
nd
С1{-> Qn, s •
AG=AG° + 7?7’ln-^— (3-28)
Здесь Нс — активность компонента С и т. д. Это полезное соотношение
позволяет рассчитывать AG при низких концентрациях веществ, что
обычно имеет место в биохимических системах (чаще всего эти концент-
рации близки к миллимолярным и существенно ниже концентрации ги-
1 Индекс i относится здесь к одному из компонентов раствора, в котором наряду
с растворителем могут присутствовать я другие вещества. Если быть точным, G; —
это парциальная молярная свободная энергия, т. е. изменение полной свободной энер-
гии очень большого объема раствора при добавлении в раствор 1 моля данного ком-
понента.
2 Те же уравнения можно относить и к мольным долям.
Энергетика биохимических реакций 211
потетического стандартного раствора, равной 1 М). В уравнение (3-28)
обычно прямо подставляют концентрации
AG^AG° + 7?71n [ClC[g]i. • (3-29)
[А]« [B]ft '
Уравнение (3-28) ценно и в другом отношении. Если система нахо-
дится в равновесии, то AG = 0, а отношение acctZp.../«^... есть попросту
константа равновесия Л’. Отсюда следует, что
AG° —— RT\nK^ — 2,303RT lgK=—19,1457 ^КДж-моль’^
=—5,7081g К кДж-моль-1 при 25°C =
=—1,364 IgK ккал-моль-1 при 25 °C. (3-30)
Заметим, Что хотя AG0 измеряется ё кДж-моль-1, изменение свобод-
ной энергии, определяемое уравнением (3-30), относится к реакции, в
которой участвуют а молей вещества А, b молей вещества В и т. д.
14. Коэффициенты активности и кажущаяся
константа равновесия
Строго говоря, уравнение (3-30) применимо только к термодинами-
ческим константам равновесия, т. е. к константам, рассчитываемым с
использованием активностей, а не концентраций. Для эксперименталь-
ного определения таких констант необходимо измерить кажущиеся кон-
станты равновесия К7 для ряда концентраций и далее экстраполировать
полученную зависимость к бесконечно малым концентрациям.
ь-z / х [С]е [D]d /о nix
л (кажущаяся константа равновесия) = ‘д в равновесии. (3-31)
Обычно провести экстраполяцию R' к бесконечно малым концентраци-
ям не составляет труда, поскольку коэффициенты активности для мно-
гих ионных соединений связаны простым соотношением с ионной силой
и в очень разбавленных растворах (при ионной силе <0,01) подчиня-
ются уравнению Дебая—Хюккеля:
1g у=—0,5092^(3-32)
Целые числа Zi и Z2 означают число зарядов (валентностей) катиона
и аниона, образующих молекулу соли. Ионная сила ц равна
(3’33)
i
Здесь С; —молярная концентрация соответствующего иона; суммиро-
вание ведется по всем ионам. Коэффициент активности [уравнение
(3-32)] является средним коэффициентом активности катиона и
аниона.
Как видно из уравнения (3-32), для экстраполяции К.' к бесконечно
малым концентрациям удобно использовать график зависимости 1g К'
от У(1. Такой график [10] представлен на рис. 3-1. Здесь приведено из-
менение рКа для диссоциации Н2РО4, AMP-, ADP2- и АТР3-. Для низ-
ких концентраций зависимость p/G от Ур находится с помощью урав-
нения Дебая—Хюккеля [уравнение (3-32)]:
рК;=рКа-0,509 (Za —Zha) (3-34)
212 Глава 3
Графически эта зависимость изображается прямой с наклоном, рав-
ным —0,509 (Z а—Zha).
Наблюдаемый (отрицательный) наклон кривых (рис. 3-1) равен
— 1,5 для Н2РО; и АМР- — 2,5 для ADP2- и —3,5 для АТР3- Для
всего интервала изменения ионной силы такие кривые описываются эм-
пирическими соотношениями типа
рА’а=Р-^а—af/p-j-bp (для ц<0,2),
(3-35)
где а и b подбираются эмпирически. Например, для Н2РО4 а=1,52,
1,96. Значение рДа получается равным 7,18, что на 0,22 больше, чем
ПрИ ц = о,2, т. е. при ионной силе, чаще всего используемой в лабора-
торной практике, и близко к соответствующему значению в тканях. За-
метим, что для АТР3~ разница
\fil~ 102
РИС. 3-1. График зависимости от Уц ка-
жущихся значений рК вторичной иониза-
ции АМР (/), ADP (II), Н3РО4 (III) и
ATP (/V). Данные получены при темпера-
туре 25 °C. (Phillips et al.. Biochemistry, 2,
503, 1963.)
между значением p/G = 7,68, по-
лученным путем экстраполяции,
и значением —7,04 при ц = 0,2
оказывается еще больше. Исполь-
зование в расчетах экстраполи-
рованных значений К примени-
тельно к растворам с высокой
ионной силой может привести к
серьезным ошибкам. При этом,
чем больше заряд иона (АТР3-,
АТР4-), тем больше ошибка.
Еще одна трудность опреде-
ления константы равновесия ре-
акций, в ходе которых потребля-
ются или высвобождаются ионы
водорода, связана с отсутствием
точного соотношения между pH
и йц+ или [Н+]. Действительно,
с точки зрения термодинамики
понятие активности одного иона
практически лишено смысла.
Тем не менее в интервале зна-
чений pH, представляющих ин-
терес для биохимиков, в предпо-
ложении, что рН-мегр измеряет
активность ионов водорода, по-
лучаются результаты, очень близкие к тем, которые дают более стро-
гие методы. В биохимической практике почти повсеместно считается,
что показания pH-метра, полученные с помощью стеклянного электро-
да, дают значения— и вместо получаемой отсюда величины
«н4 всегда подставляют [Н+], определяя тем самым кажущиеся кон-
станты равновесия.
Часто данные, полученные для состояния равновесия, не могут быть
экстраполированы к ц = 0, и тогда используются значения К', опреде-
ляющие кажущееся изменение свободной энергии AG7.
15. Изменение равновесия с температурой
При постоянном давлении AG изменяется с изменением температу-
ры согласно следующему уравнению:
rf(AG/T) =^Н/Т2 (3-36)
Энергетика биохимических реакций 213
Соответствующие изменения К описываются уравнением Вант-Гоффа
d In К _ ЛЯ»
dT ~ RT2 ’
или
—• (3-37>
Я(1/П R
«ли
ДЯо(кДж) = -О,1914-^-.
Если в интервале температур, соответствующем условиям эксперимен-
та, ДЯ° можно считать постоянным, то график зависимости 1п/( от
l/r позволяет определить А№ (или кН', если график построен для
In К'): наклон прямой равен —AH°/R. Поскольку, зная К, можно рас-
считать AG0, с помощью уравнения (3-14) можно определить далее
AS0. Однако этот метод дает низкую точность, и поэтому лучше прямо
измерять ДЯ калориметрически. Кроме того, предположение о постоян-
стве ДЯ° в значительном интервале температур, в особенности для бел-
ков, может оказаться неверным.
Б. Таблицы значений ДО0 для биохимических соединений
1. Свободная энергия образования
В табл. 3-3 в первой колонке приведены значения ДО? —стандарт-
ной свободной энергии образования из элементов целого ряда чистых
твердых, жидких и газообразных веществ, а также аналогичные зна-i
чения для соединений в растворе при гипотетической моляльной актив-
ности. Остановимся несколько подробнее на последнем случае.
Значение AGf° для чистой уксусной кислоты, находящейся в жид-
ком состоянии, равно —389,1 кДж-моль-1. Уравнение реакции образо-
вания этого соединения из элементов имеет вид
2С (тв)-|-2Н2 (г, 1 атм)-[- О2(г, 1 атм) ->- С2Н4О2(ж),
AG?=—389,1 кДж-моль"1. (3-38)
Чтобы получить свободную энергию образования в водном растворе,
мы должны знать растворимость и коэффициент активности уксусной
кислоты при разных концентрациях. Из этих данных нужно рассчитать
изменение свободной энергии в процессе растворения жидкой уксусной
кислоты в воде, так чтобы получился гипотетический модялялцный вод-,
ный раствор уксусной кислоры в стандартном состоянии:
Уксусная кислота (ж) -► Уксусная кислота (води),
AG= — 7,3 кДж-моль-1. (3-39)
Из уравнений (3-38) и (3-39) получаем
2С-Г 2Н2+О2 --->- Уксусная кислота (водн),
ДС“=—396,4 кДж-моль-1. (3-40)
Во многих расчетах удобно иметь значения AG для ионов одного
сорта, например для ацетата-. Значение AG? ацетата- (водн) можно
Таблица 3-3
Свободные энергии образования я окисления при 25°C ряда соединений3'6
Соединение Формула AG®, кДж-моль-1 AG^, кДж-моль—1 с Окисление с участием NAD+ | Число электронов |
AG° , ox кДж-моль—1 1 AGox(PH7), кДж-моль—1
Ацетальдегид С2Н4О — 139,7 — 1123,5 171 ,5 -28,3 10
Уксусная кислота С2Н4О2 —396,4 —866,8 169,2 9,3 8
Ацетат- —369,2 —894,0 142,0 22,1 8
Ацетил-СоА —374,1* —889,1* 146,9* — 13,0* 8,
Ацетилфосфат — 1218,4 —901 ,7 134,3 —25,6 8
Ацетилен8 с2н2 209,2 — 1235,2 59,8 — 140,0 10
Ацетоацетат- С4Н5О;Г —493,7 — 1795,4 . 276,5 -3,2 16
Ацетон С3н6о —161,2 — 1733,6 338,4 18,7 16
цис-Аконитат3- С6Н3О1- —920,9 —2157,0 173,9 -65,8 18
L-аланин C3H7O2N —371 ,3 —1642,0 300,4 0,8 15
L-аспарагин C4HsO3N2 —526,6 —1999,7 331 ,2 —28,4 18
L-аспартат- c4h6o4n- —700,7 — 1707,0 235,4 —24,3 15
н-Бутанол С4Н10О -171,8 —2591 ,7 516,2 36,7 24
н-Масляная кислота C4HSO2 —380,2 —2146,1 443,8 44,2 20
н-Бутират- с4н7о2 —352,6 —2173,7 416,2 56,6 20
Бутирил-СоА —357,5* —2168,8* 421,1* 21,5* 20
|3-Оксимасляная кислота C4HSO3 —531,4 — 1994,9 336,0 —23,6 18
Р-Оксибутират- С4Н-О7 —506,3 —2020,0 310,9 —8,8 18
L-валин C8HnO2N —360,0 —2916,5 579,9 40,5 27
a-D-галактоза СбН12О$ —923,5 —2865,9 242,0 —237,5 24
a-D-глюкоза C6H12O6 —917,2 —2872,2 235,6 —243,8 24
Гипоксантин С5н6о 89,5 —2773,0 334,8 — 144,6 24
Гликоген СвН10О5 —665,3 —2887,0 220,9 —258,6 24
Гликолат- С^НдОз —522,4 —739,7 37,2 —42,7 6
Глиоксилат- С2НО3” —461,1 —564,9 —46,9 —86,9 4
Глицерии С3Н8О3 —488,5 —1643,4 169,5 —110,2 14
Глицерофосфат —1336,2 — 1652,6 160,3 —119,4 14
3-фосфоглицер ат-г — 1515,7 — 1235,9 59,0 — 100,8 10
2-фосфоглицерат-г —1509,9 —1241,8 53,2 — 106,6 10
Глицеральдегид-3-фосфатг —1285,6 —1466,0 87,9 —151,8 12
Глицин c2h6o2n —373,5 — 1008,3 157,2 —22,6 9
L-глутамат- c5h8o4n- —696,8 —2342,5 376,9 —2,7 21
L-глутамин c5h10o3n2 —524,8 —2633,1 474,8 -4,7 24
Диоксиацетонфосфатг — 1293,2 — 1458,4 95,5 —144,2 12
Капроат- СвНцРг —329,7 —3459,7 684,1 84,7 32
а-Кетоглутарат2- C5H40i- -798,0 — 1885,5 186,4 —53,3 16
Креатин c4h9o2n3 —264,3 —2380,6 338,8 —80,8 21
Креатинин c4h,on3 —28,9 —2378,8 340,6 —79,0 21
Кротонат- c4h5o; —275,7 —2013,4 317,5 —2,1 18
Продолжение
Создинекие Формула X ч о S Й ‘З «3 AG^, кДж-моль—1 Окисление с участием NAD+ Число электронов
1 ’’ ч о - S о о Ж <2 cj <3 X AG' (pH 7), ох кДж-моль—1
Ксантин' -139,3 —2425,6 293,8 —125,7 21
D-ксилулоза С5н10о5 —748,1 —2409,8 180,1 —219,5 20
Лактат- С3НбО3" —516,6 —1378,1 175,9 —23,9 12
а-Лактоза ^12^22^11 —1515,2 —5826,5 389,3 —569,7 48
L-лейцин c6h13o2n —356,3 —3551,7 721 ,6 62,3 33
Малат2- слог —845,1 —1444,0 109,9 —49,9 12
Маннит СвНнО6 —942,6 —3084,0 282,8 —236,6 26
Метан (г) сн4 —50,8 —818,0 218,0 58,2 8
Метанол сн,о — 175,2 -693,5 83,4 —36,4 6
Мочевая кислота csh4o3n4 —356,9 —2089,4 241,5 —118,1 18
Мочевина ch4on2 —203,8 —664,9 112,0 —7,8 6
Оксалат2- C2Of- -674,9 —351,1 —92,1 —52,1 2
Оксалоацетат2- слог -797,2 —1254,7 40,2 —79,7 10
Пируват- C3H3O3 —474,5 —1183,1 111,9 —47,9 10
Оксипируват с3нл —615,9 -1041,6 -5,7 —165,5 8
н-Пропанол с3н8о —175,8 —1956,1 374,8 15,2 18
Изопропаиол С3Н8О —185,9 — 1946,0 384,9 ’ 25,3 18
Пропионат- слог —360,0 —1534,7 278,2 38,5 14
Рибозо5-фосфатг —1599,9 —2414,9 175,0 —224,6 20
Рибулозо-5-фосфатг —1597,6 —2417,1 172,8 —226,8 20
Седогептулозо-7-фосфатг —1913,3 —3364,6 " 261,2 —298,2 28
Седогептулозодифосфатг —2755,8 —3379,0 246,9 —312,5 28
Сахароза ^12^22^11 —1551,8 —5789,9 425,9 —533,1 48
Сорбит С6Н14О6 —942,7 —3083,9 282,9 —236,5 26
Сукцинат2- слог -690,2 —1598,9 214,1 14,3 14
Сукцинил-СоА —686,7* —1602,4* 210,6* —69,2* 14
L-тирозии С8НцО3Ц —387,2 —4466,8 842,5 23,4 41
L-треонин C4H9O3N —514,6 —2130,3 330,1 —49,5 19
Формальдегид сн2о —130,5 — 501,0 16,9 —63,0 4
Муравьиная кислота СН2О2 —356,1 —275,5 —16,5 —56,5 2
Формиат- СНОГ —350,6 —281,0 —22,0 —22,0 2
Фосфоенолпируват- —1269,5 —1245,0 50,0 —109,8 10
Фруктоза СвН12Об —915,4 —2874,1 233,8 —245,7 24
Фруктозо-6-фосфатг —1758,3 —2888,1 219,8 —259,7 24
Фруктозо-1,6-фосфатг —2600,8 —2902,5 205,4 —274,1 24
Фумаровая кислота С,Н,О4 . —647,1 —1404,8 149,2 —90,6 12
Фумарат- С4Н3О4 —604,2 —1447,7 106,2 —93,6 12
Цистеин c3h,o2ns —339,8 —2178,3 541,1 121,5 21
Цистин CeH12O4N2S2 —665,3 —4133,8 1046,0 246,9 40
Цитрат3- — 1166,6 —2148,4 182,5 —57,3 18
П родолжение
Соединение Формула AG®, кДж-моль-1 AG°. кДж-моль-1 с Окисление с участием NAD+ 1 Число электронов |
AG® , OX кДж «моль-1 &g'o*. (pH 7) кДж • мо ль—1
Изоцитрат3- ceH5o?- — 1160,0 —2155,1 175,8 —63,9 18
Эритрозо-4-фосфатг —1439,1 — 1944,1 127,8 — 191,9 16
Этанол C2HeO —181,5 — 1318,8 235,1 —4,6 12
Этилен (г)в c2H4o 68,1 —1331,3 222,7 —17,1 12
СО2 (г) —394,4 0,0 0,0 0,0 0
СО2 (води) —386,2 —8,2 -8,2 —8,2 0
нсо; —587,1 —44,5 —44,5 —4,6 0
со (г) — 137,3 —257,1 1,9 —38,1 2
Н2О (ж) —237,2 0,0 0.0 0,0 0
он- — 157,3 —79,9 —79,9 —39,9 0
н+ 0,0 0,0 0,0 0
н2 (г) o.o —237,2 21,8 — 18,2 2
Н2О2 —136,8 — 100 —359,4 -319,4 —2
H2S — 27,4 —714,6 321,3 161,5 8
HS- 12,6 —754,5 281,4 161,5 8
Н3РО< (водн)Д — 1147,3 0,0 0,0 0,0 0
Н2РО4 (води)д — 1135,1 — 12,1 —12,1 27,8 0
11РО4- (водн)Д — 1094,1 —53,1 —53,1 26,8 0
NH4 —79,5 —276,3 112,0 12,3 3
no; —34,5 —84,1 —472,6 —372,7 —3
NO (г) 86,7 —86,7 -345,7 —305,7 —2
no; —110,5 —8,1 -655,6 -515,7 —5
SO*- —742,0 0,0 0,0 79,9 0
SO'- --497,1 —244,9 14,1 54,0 2
so*- —513,4 —733,4 302,5 222,6 8
а Приведенные в таблице величины представляют собой AG°— стандартные сво-
бодные энергии образования соединений из элементов; AG°— стандартные свободные
энергии сгорания; AG®X— стандартные свободные энергии окисления под действием
NAD+ с образованием NADH+H+, СО2, Н2О, N2, НРО£~ и SO’-; AG'0X (pH 7) —
кажущиеся изменения свободной .энергии при pH 7.’Все величины выражены в кДж-
•моль-1 и, если специально не оговорено, относятсн к водному раствору при 25 °C.
Символ (г) означает, что вещество находится в газообразном состоянии при давле-
нии 1 атм. В последней колонке указано число электронов, участвующих в полном
окислении вещества до СО2, Н20, N2 и H2SO4. Если оно отрицательно, это означает,
что для получения указанных продуктов вещество должно быть восстановлено (на-
пример, 2NO3 + 10e_+ 12Н+—>N2+6H2O). Данные для фосфорных эфиров относятся
к соединениям с полностью диссоциированными фосфатными группами (—О—РО|~).
Значения AG® для многих из этих соединений рассчитывались по формуле: AG®
(нефосфорилнрованного соединения)—AG° гидролиза (до HPOj-, табл. 3-5) —AG®
(на молекулу фосфорного эфира образуется одна молекула воды)+АО®НРО|- (берется
из данной таблицы). Данные Бассхэма и Краузег использованы в таблице без измене-
ний. Для производных ацил-СоА Группа СоА(—SH) рассматривается как «элемент»;
Энергетика биохимических реакций 217
в этом случае значение AGj отмечено звездочкой и относится к образованию соеди-
нения из соответствующих элементов и свободного СоА; при этом значения AG^
и AGox соответствуют окислению с образованием обычных продуктов плюс СоА. Зна-
чения AG ° для каждого из этих соединений рассчитаны из AG® соответствующего
спирта или карбоксилат-аниона с использованием значений AG^ гидролиза (табл. 3-5).
Еще одна весьма полная таблица значений свободной энергии приведена в издании.
Biochemical Microcalorimetry (Brown Н. D., ed.), pp. 305—317, Academic Press, New-
York. 1969.
6 Основной источник данных: Long C., ed., Biochemists Handbook, pp. 90—92.
Van Nostrand, Reinhold, Princeton, New Jersey, 1961. Многие данные взяты из работы:
Burton К., Ergeb. Physiol., Biol. Chem. Exp. Pharmakoi., 49, 275—298, 1957.
8 Stull D. R., Westrum E. F., Jr., Sinke G. C., The Chemical Thermodynamics of
Organic Compounds, Wiley, New York, 1969.
r Bassham J. A., Krause G. H., BBA, 189, 207—221, 1969.
д Van Wazer J. R„ Phosphorus and Its Compounds, Vol. I, p. 889, Wiley (Inter-
science), New York, 1958.
получить из AG“ уксусной кислоты(водн), привлекая AG° диссоци-
ации:
Уксусная кислота ->• Н+ 4- Ацетат",
AG° =—5,708 lgK=5,708pK= -|-27,2 кДж-моль"1 при 25 °C. (3-41}
Свободная энергия образования ионов Н+ принята равной нулю.
Суммируя уравнения (3-40) и (3-41), получаем AG? ацетата_ =
—'—369,2 кДж-моль"1.
2. Свободная энергия диссоциации протонов
В табл. 3-4 приведены термодинамические константы диссоциации н
значения AG° и Д№ для ряда кислот, представляющих биохимический
интерес. Некоторые из этих значений были использованы при опреде-
лении AG? для ионов при составлении табл. 3-3. Данные табл. 3-4 поз-
воляют оценить изменения свободной энергии для реакций, протекаю-
щих с участием ионных форм, не представленных в табл. 3-3.
3. Потенциалы переноса групп
Напомним, что равновесие в реакциях синтеза биополимера из мо-
номеров (будь то амиды, эфиры, фосфодиэфиры или гликозиды) обыч-
но сдвинуто в сторону расщепления, а не образования полимера. Поло-
жение равновесия зависит от конкретных структур. Некоторые связи
при достаточно высоких концентрациях мономеров образуются легко,,
другие практически никогда не образуются в сколько-нибудь заметном
количестве. Соответственно и гидролиз в равновесии может быть лишь
частичным, а может достигать 99,9%.
Рассмотрим гидролиз двух органических фосфатов — аденозинтри-
фосфата (АТР) и глюкозо-6-фосфата (структурные формулы этих со-
единений приведены на рис. 7-1).
НАТР3"+Н2О ----> HADP2- + Н2РО7;
ДС° х—32,9 кДж-моль"1; (3-42}
ДЯ° «—22,6 кДж-моль"1 при 25 °C и р.=0,25.
tz-D-глюкозо-б-фосфат"Н2О -► Глюкоза + 112РО7;
AG° = —16,4 кДж-моль"1 при 25°C. (3-43}
‘ г Таблица 3-4
Значения рЛ'.,, AG° и Д/7° для ионизации кислот при 25°Са 0
Кислота Р*а АО11, кДж-моль—1 •• АН0, кДж -МОЛЬ—1
Муравьиная кислота 3,75 21 ,4 0,04
Уксусная кислота 4,76 27,2 —0,1
Пропионовая кислота 4,87 27,8 —0,6
Молочная кислота 3,97 (35 °C) 23,4 2,2
Пировиноградная кислота 2,49 14,2 12,1
NHj 9,25 52,8 52,2
CH3NHt 10,59 60,4 55,4
Аланин
-соон 2,35 13,4 3,1
—NHJ 9,83 56,1 45,4
(5-Аланин
—СООН 3,55 20,3 4,5
—NH3 (кажущееся) 10,19 58,2
L-алаиил-Е-а ланин 3,34 19,1 —0,5
Аспарагиновая кислота
—СООН 2,05 П,7 7,7
—соон 3,87 22,1 4,0
-NH* 10,60 60,5 38,8
Н2СО3 6,35° 36,2 9,4
Н3РО4 10,33 59,0 15,1
рК1 2,12 12,1 —7,9
рК2 7,18г 41,0 3,8
(кажущееся) 6,78^ 38,7 3,3
рАз 12,40 70,8 17,6
Глицеро-1-фосфат, рА2 6,66 38,0 —З,1
Глюкозо-6-фосфат 6,50 37,1 -1 ,8
Пирофосфорная кислота, Н4Р2О7
рАз 6,7 38,1 — 1 ,3
(кажущееся) 6,121 34,9 0,5
рА4 9,4 53,6 —7,1
(кажущееся) 8,951 51,2 1,7
Аденозин 3,5 20,1 13,0
АМР
pAi (кольцо; кажущееся) 3,74д 21,3 4,2
рА2 (фосфат) 6,67г 38,1 3,6
(кажущееся) 6,451 36,8 3,6
ADP
рА2 (кольцо; кажущееся) 3,93д 22,4 4,2
рАз (дифосфат) 7,20г 41,1 —5,7
(кажущееся) 6,83е 39,0 —5,7
Энергетика биохимических реакций 219
П родолжение
Кислота Р*а дс°, кДж-моль 1 дн°, кДж. «моль—I
АТР рКз (кольцо; кажущееся) 4,06 23,2 0
рК< (трифосфат) 7,68г 43,8 —7,0
(кажущееся) 7,06г 40,2 —7,0
Пиридин 5,17 29,5 20,1
Фенол 9,98 56,9 23,6
а Приведены значения термодинамических величин, соответствующие бесконечно
разбавленным растворам, если специально не оговаривается, что это — кажущиеся
значения. Последние соответствуют ионной силе 0,2—0,25.
6 Большая часть данных взята из издания Handbook of Biochemistry and Molecu-
lar Biology, 3rd ed., Vol. I (G. D. Fasman, ed.), pp. 305—351, © CRC Press, Inc., Cle-
veland, 1976.
в В этом случае pKi соответствует Ki= [Н+]{НСОз]/([СО2] +[Н2СОз]); Fors-
ter R. E., Edsall J. T., Otis A. B,, Roughton F. J. W., eds., NASA, Spec. Publ., 188,
1969.
r Phillips R. C., George P., Rutman R. J., Biochemistry, 2, 501—508, 1963.
д Alberty R. A., JBC, 244, 3290—3302, 1969.
e Данные, которыми пользуется Alberty R. (Alberty R. A., in: Horizons of Bio-
energetics, pp. 135—147, Academic Press, New York, 1972), вычислены для иоиной си-
лы 0,2 с помощью уравнений, приведенных в статье Phillips R. С., George Р., Rut-
man R. J., JACS, 88, 2631—2640, 1966.
Обратите внимание, что уменьшение свободной энергии в ходе гидро-
лиза для АТР вдвое больше, чем для глюкозо-6-фосфата. Глюкозофос-
фат термодинамически более устойчив, чем АТР. По сравнению с АТР
его легче получить с помощью реакции, обратной гидролизу, и биосин-
тез его тоже должен протекать легче. Кроме того, как это следует из
свободной энергии гидролиза, в присутствии соответствующего катали-
затора фосфорильная группа может самопроизвольно перейти с АТР
на глюкозу, но не наоборот.
Поскольку уменьшение свободной энергии в процессе гидролиза
служит количественной термодинамической характеристикой способно-
сти группы к переносу на другой нуклеофил (гл. 7), ее иногда называ-
ют потенциалом переноса. Так фосфорильная группа
—Р—о-
\он
АТР в процессе гидролиза переносится на гидроксил-ион воды с потен-
циалом переноса 32,9 кДж-моль-1. Вода — это произвольно выбранный,
но общепринятый стандартный нуклеофил, относительно которого опре-
деляется потенциал переноса. Перенос групп играет важную роль в про-
цессах энергообмена и биосинтеза биополимеров; поэтому биохимики
довольно часто пользуются потенциалом переноса (отрицательной сво-
бодной энергией гидролиза) биохимических соединений. Значения этой
величины для ряда соединений приведены в табл. 3-5.
Таблица 3-5
Свободная энергия гидролиза некоторых соединений при 25 °C (в кДж-моль-’)
Соединение Продукты АС ° &.G' (рн 7) ДН°
ATP4- ADP3--f-HPO l~ +Н+ 5,416 —34,54 — 19,71
ATP4- АМР2-фНР2О?" +Н+ 2,54в —37,4 —19,0
MgATP2- MgADP-+HPOl- +Н+ 16,0г —24,0 — 14,2
ADP3- АМР2-+НРО|" + Н- 3,67в —36,3 —13,5
AMP2- Аденозин + НРО2- —9,6’ —9,6 0
ATP4- Адеиозин-(-НР301о —36,0’ —36,0 —7,9-
HP2O3- 2НРО l~ ф Н+ 6,54в —33,4 -12,6.
Ацетнлфосфат2- Ацетат-НРО I- +Н+ —7,7е —47,7
1,3-дифосфоглице- рат4- 3-фосфоглицерат3- + HPO^- ф фН+ —14,5Ж —54,5
Фосфоеиолпируват3- Пируват-фНРО|- О -61,9 —61,9 -25,1
Карбамоилфосфат2- II H2N—с—O- + HPOI- +Н+ — 11,5 —51,5
Креатнифосфат- Креатнн+фНРО3- —43,1 -43,1
Фосфоаргинин- АргиниифНРО!- —38, Р (в присутст^ внн Mg24)
Г лнцерофосфат2- Г лнцер ии + HPOl- —9,2 —9,2
a-D-глюкозо-б-фос- a-D-глюкозафНРО^- — 13,8 —13,8 —2,5
фат2-
Глюкозо-1-фосфат2- Глюкоза+ НРО4- —20,9 —20,9
Мальтоза (или глико- ген) 2 Глюкоза — 16,7 — 16,7
Сахароза Г люкоз а ф Ф р у ктоз а --29,3 —29,3
UDP-глюкоза2- ГлюкозафивР3- + Н+ 9,4 —30,5
№°-формилтетрагнд- рофолиевая кисло- Формнат-фН+ + Тетрагндро- фолневая кислота 14,1 —25,93
та
Уксусный ангидрид 2 Ацетат-+ 2Н+ 31,1 —48,9
Ацетил-СоА Ацетат-фН+ + СоА 4,9 —35,1й
Сукцниил-СоА- Сукцинат2- + Н+фСоА —3,5 —43,5К
Этнлацетат Этанол+Ацетат-фН+ 20,2 —19,7
Аспарагин Аспартат-фНН£ — 15,1 — 15,1
Глнцинэтнловый Г лнцннфЭтанол+Н+ 4,9 —35,1
эфир+ (39 °C)
Валил-тРНК+ Валин фтРНК+Н+ 4,9 —35,1
а Все данные (если нет специальных указаний) взяты нз статьи Jencks W. Р., inr
Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3rd ed., Vol. I (G. D. Fasman, ed.),
pp. 296—304, CRC Press, Inc., Cleveland, 1976. В случае высвобождения в ходе реакции-.
одного протона ДО0 составляет —39,96 кДж-моль-1.
6 Guynn R. W„ Veech R. L„ JBC, 248, 6966—6972, 1973.
в При расчете использовано ДО°= +11,80 ккал-моль-1 для гидролиза до Р2О7-
плюс ДО0 диссоциации НР2О3-, взятое нз статьи Alberty R. A., JBC, 244, 3290—3324,
1969. Однако к 11,80 ккал-моль-1 прибавлено еще 1,017 ккал-моль-1, чтобы приве-
сти данные в соответствие с данными по гидролизу АТР до ADP.
г Alberty R. A., Horizons of Bioenergetics, Academic Press, New York, 1972,.
pp. 135—147.
д George P., Witonsky R. J., Frachtman M„ Wu C., Dorwart W., Richman L., Rich-
man W., Shurayh F., Lentz B., BBA, 223, 1—15, 1970.
Энергетика биохимических реакций 221
е Расчет основан на значении AGObs = 3,0 ккал-моль-1 для реакции Ацетилфос-
фат+СоА—“-Ацетил-СоА+Р] [Stadtman Е. R., in: The Enzymes (Р. D. Boyer, ed.),
3rd ed., Vol. 8, pp. 1—49, Academic Press, New York, 1973], а также на значении AG'
(pH 7) для гидролиза ацетил-СоА.
ж Оценка получена из AG° гидролиза АТР и AG' = —19,9 кДж-моль-1 для реак-
ции, катализируемой 3-фосфоглицераткиназой (Burton К-> Krebs Н. A., BJ, 54, 94—
107, 1953; 59, 44—46, 1955).
3 Оценка получена по данным при pH 7,7 и 8,0 (из таблиц Дженкса).
я В работе Guynn R. W., Gelberg- Н. J., Veech R. L., JBC, 248, 6957—6965, 1973
значение AG°=—35,75 кДж-моль-1 дано для 38 °C. Не зная А//, ввести соответствую-
щую поправку, чтобы получить AG° для 25 °C, очень трудно. Согласно работе Burton К.,
BJ, 59, 44—46, 1955,_ AG' (pH 7) для реакции АТР4-4-Ацетат- + СоА—‘ADP3--]-
+ Ацетнл-СоА4-НРО! для 25 °C примерно равно 0. В работе [11] для этой реакции
при 38°C получили значение —0,56 кДж-моль-1. Именно эта величина при 25°C
использована для получения приведенного здесь значения. Это эквивалентно мало
обоснованному предположению, что АН гидролиза АТР и ацетил-СоА примерно оди-
наковы.
к Эта величина, как и в таблицах Дженкса, на 2 ккал-моль-1 более отрицатель-
на, чем для ацетил-СоА.
Дополнение 3-А
Аденилатная система
Центральную роль в энергообмене клеток всех типов иг-
рает аденилатная система, которая включает в себя трифос-
фат, дифосфат и 5'-монофосфат аденозина (АТР, ADP и АМР
соответственно), а также неорганический фосфат (Л) и ионы
магния. Аденозинтрифосфат является термодинамически не-
устойчивой молекулой и гидролизуется с образованием ADP
Аденозинтрифосфат
НАТР4’
дает АМР +
оирофосфат (РРр
Гидролиз этой связи дает АВР
+ неорганический фосфат (РА
или АМР, как это изображено на приведенной выше схеме.
Именно эта неустойчивость (высокий потенциал переноса)
позволяет АТР выполнять функцию переносчика химической
энергии, необходимой для удовлетворения большей части
энергетических потребностей клеток, включая и энергию,
нужную для совершения мышечной работы.
Фосфоангидридная (пирофосфатная) связь в молекуле
АТР образуется путем соединения ADP и неорганического
фосфата, которое осуществляется в ходе ряда специфических
реакций фосфорилирования. Наиболее важными из них яв-
ляются реакции, протекающие в фотосинтезирующих мембра-
нах хлоропластов, а также реакции в мембранах бактерий и
222 Глава 3
митохондрий, сопровождающиеся потреблением кислорода'.
Превращение АМР в ADP осуществляется путем переноса
концевой фосфорильной группы с АТР на АМР (гл. 7) в ходе
реакции, катализируемой присутствующим во всех клетках
необычайно активным ферментом аденилаткиназой. Ниже
схематически изображены специфические реакции фосфори-
лирования, которые в два этапа превращают одну молекулу
АМР в молекулу АТР.
. ч Фосфорилирующая
Аоенилаткиназа Л.
система
Для оценки потенциала фосфорилирования аденилатной
системы внутри клеток предлагалось использовать несколько
разных показателей. В качестве одного из них было взято
соотношение [ATP]/[ADP]![Pj] (названное степенью фосфо-
рилирования Rp). Оно непосредственно связано со свободной
энергией гидролиза АТР [уравнение (3-28)]. Величина А\>
внутри клетока может достигать значения 103 М-1, что дает
вклад в AG гидролиза АТР, равный —22,8 кДж-моль-1. Ат-
кинсон с сотр.б-г предложили другую величину, так называе-
мый «энергетический заряд», представляющий собой моль-
ную долю адениловой кислоты, «заряженной» путем превра-
щения ее в АТР. При этом ADP рассматривается как «полу-
заряженная» форма.
Энергетический заряд =
[АТР] + 1/2 [ADP]
[АТР] + [ADP] + [АМР] '
Энергетический заряд может меняться от нуля, когда при-
сутствует только АМР, до 1,0, что означает превращение в
АТР всех молекул АМР. Измерения, выполненные на целом
ряде клеток и тканейг, показывают, что энергетический заряд
обычно лежит в пределах от 0,75 до 0,90. Найти численное
значение этой величины не составляет труда, однако, к со-
жалению, она оказывается не связанной с химическими урав-
нениями. Предположение о важной роли энергетического за-
ряда клетки в регуляции метаболизма весьма сомнительно»
Замечания по поводу сокращений. Следует помнить, что
через Pi обозначают смесь ионных форм фосфорной кислоты,
присутствующих в растворе при данных условиях. В интер-
вале pH от 4 до 10 это Н2РО4 (pRa=6,8) и HPOf". То же
относится и к обозначениям AMP, ADP и АТР; под PPi под-
разумевают смесь ионов пирофосфорной кислоты. Выше
pH 4,4 в заметном количестве присутствуют только Н2Р2О у"
(рД'=б,1), нр2оз- (Рл;=9,о) и р2ог.
Насколько известно, пирофосфат в клетках обычно быст-
ро гидролизуется под действием пирофосфатазы на две мо-
лекулы Pi. Это тоже одна из важных функций аденилатной
системы (гл. 7, разд. Д.1).
Энергетика 'биохимических реакций 223
Как положения равновесия, так и скорости реакций аде-
нилатной системы зависят от концентраций ионов металлов.
Особенно велика роль ионов магния, причем для многих фер-
ментов, катализирующих реакции с участием АТР, истинны-
ми субстратами считаются комплексы MgATP2-.
а Eilerman L. J., Slater Е. С., ВВА, 216, 226—228 (1970).
6 Swedes J. S., Sedo R. J., Atkinson D. E., JBC, 250, 6930—6938 (1975).
B Shen L. C., Fall L., Walton G. M., Atkinson D. E., Biochemistry, 7,
4041—4045 (1968).
r Chapman A. G., Fall L., Atkinson D. E., J. Bacteriol., 108, 1072—1086-
(1971).
Д Purich D. L., Fromm H. J., JBC, 248, 461—466 (1973).
4. «Константы», изменяющиеся с изменением pH
В уравнении (3-42), описывающем гидролиз НАТР3- с образовани-
ем HADP2- и Н2РО , указанная стехиометрия имеет место лишь при
значениях pH вблизи 6. При pH выше ~7 большая часть АТР нахо-
дится в форме АТР4- и распадается до НРО|_ согласно следующему
уравнению:
АТР4- + Н3О --> ADP3- + НРО£- + Н+; (3-44)
AG° ~ +5,4 кДж-моль"1 при 25 °C и р=0,25;
А//0»—19,7 кДж-моль"1.
Значение AG° = + 5,4 кДж-моль-1 для этой реакции вовсе не является
тем большим отрицательным числом, каким оно должно быть для са-
мопроизвольной реакции. Все дело здесь в том, что в числе продуктов
реакции оказались ионы водорода, а стандартным состоянием для Вы-
является не 10-7 М, а 1 М раствор. Поэтому биохимики часто предпо-
читают пользоваться кажущимися константами диссоциации и кажу-
щимися AG; в этом случае за стандартное состояние для ионов водоро-
да принимается состояние, соответствующее значению pH, при котором
проводится эксперимент, обычно pH 7. Получаемая таким образом
pH-зависимая константа равновесия обозначается К' и определяется
так:
Если в ходе реакции высвобождается один протон, как в уравнении
(3-44), то будет выполняться следующее соотношение:
AG'=AG°— 5,708-pH кДж-моль"1 при 25 °C. (3-46)
Вспомним, что AG' =—RT In К', и еще заметим, что [Н+] не входит в
выражение для К' [уравнение (3-45)]. При AG°=+5,4 кДж-моль-1
получаем, что в ходе гидролиза АТР при 25 °C и ц = 0,25, согласно
уравнению (3-46),
AG'(pH7) =—34,5 кДж-моль-1 = —8,26 ккал-моль"1. (3-47)
В биохимической литературе нередко используется ряд других стан-
дартных состояний. Константа равновесия, часто обозначаемая в ли-
тературе через /Cots [наблюдаемая (observed) константа], связана с
~224 Глава 3
-суммарной концентрацией всех ионных форм каждого из компонентов,
существующих при данном pH. Так,
[ADP, все формы] [фосфат, все формы]_,о до\
A°bs_______________________________________________[АТР, все формы] '
AGobs = -/?Tlntfobs. (3-49)
Изменение свободной энергии AGobs можно связать с AG', исходя из со-
отношений между Коъа и К'- Для гидролиза АТР в интервале значений
pH 2—10 7(obs есть
к Л , [н+] , т2 ) Л , [НЧ \
А 1 + к 1- i К 2--К - / (1 К 2_ I
V \ aHADP VHADP /xHaADP / \ 'ХНРО4 > /о пл\
Aobs —-------[Н+] [Н+]8 \ • 1,3
\ АНАТр3 ^натр3'Ч^н2атр2~ /
В этом уравнении Ahadp2“ и т. д. — константы отдельных стадий дис-
социации (табл. 3-4). Выражения в скобках — это pH-функции Михаэ-
лиса (см. также гл. 6, разд. Д.5). Они связывают полную концентра-
цию данного компонента с концентрацией наиболее диссоциированной
формы. Так, при pH в интервале от 2 до 10
[ЛЪюлн = [НРОГ] (1 + [Н+]/АН2р0;). (3-51)
Используя кажущиеся значения рАа (ц = 0,2) для Н2РО4, HADP2- и
НАТР3-, равные соответственно 6,78; 6,83 и 7,06 (табл. 3-4), мы полу-
чим, что при pH 7 AGObs = —35,0 кДж-моль^1 (приняв при этом, чго
при pH 7 AG' = —34,5 кДж-моль-1). Различие между AG' и AGObs в
этом примере невелико, но оно было бы заметно больше, если бы ион-
ные формы, фигурирующие в уравнении (3-44), при pH 7 не являлись
преобладающими.
Чтобы найти изменение свободной энергии реакции в условиях, от-
личных от стандартных, следует применить уравнение (3-28). Так, при
pH 7 и 0,01 М активностях ADP3-, АТР4- и НРО^~ AG гидролиза АТР,
согласно уравнению (3-44), равно —34,5—2-5,71=—45,9 кДж-моль-1 =
= —11,0 ккал-моль-1. Следовательно, для концентраций, имеющих ме-
сто в клетках (как правило, это миллимоли), потенциал переноса АТР
существенно выше, чем при стандартных условиях.
Чтобы найти AG для температуры, отличающейся от 25 °C, необхо-
димо знать АТ/ реакции. Используя уравнение (3-37), легко показать,
что AG для температуры Т2 связано с AG для температуры 7\ следую-
щим соотношением:
AG2 « (3_52)
ч
Энтальпия гидролиза АТР, согласно уравнению (3-44), равна
—19,7 кДж-моль-1. Используя это значение и применяя уравнение
(3-52), находим1, что AG' (pH 7) гидролиза АТР для 38 °C равно
—35,2 кДж-моль-1. Следует помнить, что все указанные здесь измене-
ния свободной энергии — это кажущиеся величины, относящиеся к рас-
творам с ионной силой ~0,25.
1 Точное значение AG' (pH 7) для 25 °C, использованное для получения приведен-
ного здесь результата, равно •—34,54 кДж-моль-1. Почти такое же значение получил
автор этой книги, исходя из AG' =—35,19 кДж-моль-1 для 38 °C, приведенного в ра-
боте [11].
Энергетика 'биохимических реакций 225
5. Роль ионов металлов
И АТР, и ADP, и неорганический пирофосфат образуют комплексы
с ионами металлов. В физиологических условиях преобладают комп-
лексы ADP и АТР с ионами магния; рассмотрим уравнения соответст-
вующих реакций и изменения свободной энергии.и-энтальпии [12] (при-
ведены кажущиеся значения для 25 °C и ц = 0,2, выраженные в
кДж-молы1).
АТР4- + Mg2+ --► MgATP2*, . (3-53)
AG° = —26,3; ЛД° = 13,8.
ADP3-+Mg2+ ----«-MgADP-, • (3-54)
AG°=—19,8; Л№ = 15,1.
РИС. 3-2. pH-зависимость "кажущейся свободной
энергии AGobs гидролиза АТР при различных кон-
центрациях свободных ионов магния (числа у
кривых — концентрация Mg2+ в мМ). Кривые
построены с помощью ЭВМ и приводятся с лю-
безного разрешения Carol. М. Harris.
Используя кажущиеся значения AG° из уравнений (3-53) и (3-47), по-
лучаем
MgATP2- + Н2О ---> MgADP- + Н2РО2- + Н+, (3.55)
AG' (рН7) = — 28,0 кДж-моль-1.
Стехиометрия уравнения (3-55) никогда в точности не выполняется;
какое-то количество Mg2+ уходит в раствор в результате диссоциации
MgADP-; как протоны, так и ионы Mg2+ связываются с Н2РО7; в среде
присутствуют также НАТР3-
и HADP2-, слабо связываю-
щие Mg2+ [13]. Таким об«.
разом, наблюдаемые значе»
ния AGobs меняются с из-
менением как pH, так и
концентрации магния, а так-
же зависят от ионной силы.
Олберти [13] и Филлипс и
ДР- [И] составили таблицы
и графики кажущихся зна7.
чений AGQbs для различных
условий. На рис. 3-2 пред-
ставлен один из графиков,
построенный исходя из кон-
стант и уравнений Олберти1.
Определяемое из этого гра-
фика AGObs для гидролиза
АТР при pH 7, 25°С, р, = 0,2
и 1 мМ Mg2+ (сравнительно
высокая концентрация [ 15])
равно —30,35 кДж-моль-1
(—7,25 ккал • моль-1).
Мы видим, что образо-
вание комплекса с Mg2+ не-
много снижает потенциал
переноса фосфорильной
группы АТР. СущесФвенноё влияние может оказывать ‘непостоянство
концентрации Mg2+ во времени, а также-неоднородность концентрации
1 Однако значение AG' гидролиза АТР = 35,54 кДж-моль-1 при [Mg2+]=0 полу-
чено по данным работы [.11]. Значения рАя и-.константы образования комплексов с
Mg2+ взяты у Олберти [13]. Интересно отметить, что Джордж и, др. [15] определяли
для этих же комплексов константы образования при- бесконечном разбавлении и по-
лучили гораздо более отрицательные значения AGj, чем приведенные в уравнениях
(3-53) — (3-55).
15—1821
226 Глава 3
внутри клетки [16]. В тканях магний является главным, однако да-
леко не единственным катионом. На равновесие полифосфатов (напри-
мер, АТР) заметное влияние оказывают Са2+, Мп2+ и даже К+.
6. Несоответствие данных, полученных разными авторами
Потенциал переноса АТР измерить непросто, и его значения, полу-
ченные разными авторами, сильно различаются. Согласно Джорджу
и др. [15], AG0 для реакций (3-42) равно —39,9 кДж-моль-1 при 25ОС„
р = 0,2 и —41,25 кДж-моль1 при бесконечном разбавлении. Они оце-
нили точность своих данных как ±4 кДж-моль1. Однако, по оценкам
многих других авторов [17—21], в том числе и по данным, полученным
недавно Гуинном и Вичем [11], эти значения по меньшей мере на
4 кДж-моль"1 менее отрицательны. Внутренне непротиворечивый на-
бор термодинамических данных, используемых всюду в этой книге, ча-
стично основан на значении AG гидролиза АТР, которое получено в ра-
боте [11].
7. Энергии связей и приближенные методы оценки
термодинамических величин
Для приближенных оценок изменения энтальпии той или иной ре-
акции можно использовать эмпирические значения энергии связей
(табл. 3-6), которые представляют собой приблизительные изменения
энтальпии при образовании соединений в газообразном состоянии из-
атомов, находящихся в газовой фазе.
Таблица 3-6
Типичные энергии связейа, кДж-моль-1
Значения энергии одинарных связей
н—н 436 Si—Н 295 С—0 351
с—с 346 N—Н 391 С—S 259
Si—Si 177 Р— Н 320 С—F 441
N—N 161 0-Н 463 С—С1 328
0—0 139 S—н 339 С—Вг 276
s—s 213 С—Si 290 С—I 240
C—H 413 C-N 292 Si—0 369
Значения энергии кратных связей
с=с 615 c=s 477
N=N 418 с==с 812
0=0 402 ('Д-состояние) N=N 946 (N2)
C=N 615 C=N 866 (HCN)
с=о 686 (формальдегид) 891 (нитрилы)
715 (альдегиды)
728 (кетоны)
Энергетика биохимических реакций 227
Продолжение
Эмпирические значения энергии связи в резонансных структурах
Бензол 155 О
Нафталин 314 —С—ОН О 117
Стирол Фенол 155 4- 21 155+29 —С—OR О 100
Бензальдегид 155+ 17 —с—nh2 88
Пиридин 180 Мочевина 155
Пиррол 130 СО 439
Индол 226 со2 151
а Pauling L., The Nature of the Chemical Bond, 3rd ed., pp. 85, 189,
195—198, Cornell Univ. Press, Ithaca, New York, 1960.
8. Свободная энергия сгорания в присутствии О2 и NAD+
Ввиду исключительной важности процессов окисления для метабо-
лизма у аэробных организмов часто бывает весьма полезно знать сво-
бодную энергию сгорания того или иного соединения. Эти данные лег-
ко получить из свободной энергии образования. Например, AGC ацета-
та (водн) можно найти следующим образом:
Ацетат" + Н+ -► 2 С + 2 Н2 + 02
AG°= 4-369,2 кДж-моль-1 =—AG° ацетата (табл. 3-3).
2Н2+ О2 ---->- 2Н2О
AG°=2-(—237,2)=—474,4 кДж-моль"1 =2AG° воды
2 С + 2 О2 -► 2 СО2
AG” = 2 • (—394,4)=—788,8 кДж • моль"1=2AG" СО2
Ацетат" (1 М) + Н+ (1 М) + 2 О2 (1 атм) -► 2СО2(1 атм)-f-Н2О (ж) (3-56)
AG°=—894,0 кДж-моль"1 = AG? ацетата"
В табл. 3-3 наряду со значениями AG” приведены и значения AG?.
Очень многие процесы окисления в клетках идут с участием особо-
го окислителя никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) или родствен-
ного ему соединения NADP+ (гл. 8). Поэтому удобно иметь таблицы
значений AG0 для полного окисления соединений до СО2, происходяще-
го под действием не О2, a NAD+1. Эти значения, обозначенные AG?X и
AGoX (pH 7), тоже приведены в табл. 3-3. Обратите внимание, что зна-
чения эти сравнительно малы и, следовательно, окисление с участием
NAD+ дает клеткам мало энергии. Рассмотрим, например, такую ре-
акцию:
Ацетат" + 2 Н20 + 4 NAD+ > 2 С02 + 4 NADH + 3 Н+ (10"’ М), (3-57)
AGox (pH 7) = 4-22,1 кДж • моль"1.
Когда NADH, образовавшийся в результате восстановления NAD+,
снова окисляется в митохондриях [уравнение (3-58)], клетки получают
1 Близкий подход применили Деккер и др. [22].
15’
228 Глава 3
большое количество энергии:
4 NADH + 4 Н+ 4- 2О2 -> 4 Н2О + 4 NAD+, (.3-58)
AGoX(pH7) = —876,1 кДж-моль-1.
Уравнения (3-57) и (3-58) в сумме дают уравнение сгорания ацетата
в О2, а два значения AG в сумме равны AGC ацетата-.
Ацетат' + Н+ + 2 О2 --> 2 СО2 Д- 2 Н2О, (3-59)
AG? =—894,0 кДж-моль-1,
AGc(pH7) =—854,0 кДж-моль"1.
Значения AG0X (табл. 3-3) не только сразу дают относительное ко-
личество энергии, высвобождаемой при окислении субстратов с уча-
стием NAD+, но и оказываются весьма удобными для оценки AG реак-
ций брожения. Рассмотрим, например, процесс сбраживания глюкозы
в этанол:
a-D-глюкоза -> 2СО24-2 Этанол. (3-60)
Изменение свободной энергии AG' (pH 7) для сбраживания глюко-
зы с образованием этанола и СО2 можно сразу получить из табл. 3-3:
AG'(pH7)=—243,8—2-(—4,6) = —234,6 кДж-моль'1 (3-61)
(значения AG0X для Н2О, СО2 и Н+ всегда равны нулю). Те же вычис-
ления можно проделать, используя значения AG”, (что неудобно, по-
скольку они слишком велики) или AG“. Последние тоже достаточно
велики, к тому же надо вводить в расчеты данные для СО2 и воды.
С помощью табл. 3-3 можно получить значения AG0 для многих мета-
болических реакций, которые мы рассмотрим далее. Для этой цели под-
ходят данные любой из колонок таблицы, но для простоты лучше поль-
зоваться значениями AGqX.
Заметим, однако, что для реакций окисления под действием кисло-
рода или любого другого окислителя, отличного от NAD+ и не включен-
ного в табл. 3-3, нельзя использовать непосредственно значения AGOX.
’В этом случае поступают следующим образом. Сначала из значений
AG0X рассчитывают AG° или AG' для рассматриваемой реакции, считая,
что окислителем является NAD+, а затем к полученному значению при-
бавляют свободную энергию окисления кислородом (или другим окис-
лителем) образовавшегося NADH. Такого типа величины для О2 приве-
дены в табл. 3-7; основываясь на данных этой таблицы, можно оценить
их значение и для ряда других окислителей, таких, как Fe3+ и цито-
хром с.
•В. Электродные потенциалы и изменение свободной энергии
для окислительно-восстановительных
реакций
Мы живем в среде, содержащей мощный окислитель О2. В процес-
сах дыхания, идущих в клетках, кислород восстанавливается до Н2О,
очень слабого восстановителя. На другом конце шкалы окислителей на-
ходится Н1-—-очень слабый окислитель, который отдельные бактерии
’•способны превращать в сильный восстановитель Н2. Пары О2—Н2О и
Н+—Н2 — это две очень важные в биологическом отношении окисли-
тельно-восстановительные систе.мы. Между ними находится множест-
Энергетика биохимических реакций 229
во других пар соединений, которые участвуют в окислительно-восста-
новительных реакциях, протекающих внутри клетки, и имеют большое
значение для метаболизма.
Известно два общепринятых метода количественной оценки окис-
лительных и восстановительных свойств сопряженных окислительно-
восстановительных пар. С одной стороны, можно Выписать значения
Дб для окисления восстановленной формы кислородом Ог и превраще-
ния ее в окислительную форму. Соединение с большим значением —AG
будет хорошим восстановителем. Примером служит Н2, для которого
Л б сгорания при pH 7 (табл. 3-3) равно —237 кДж-моль-1. Слабые вос-
становители, такие, как Fe3+, характеризуются малыми значениями Лб
окисления (—8,5 кДж-моль-1 для реакции 2Fe2+—>-2Fe3jj. Свободные
энергии окисления биологических переносчиков водорода (о которых
речь пойдет в гл. 8), как правило, оказываются между упомянутыми
значениями для Н2 и Fe2+.
Второй способ выражения той же информации связан с использо-
ванием электродных потенциалов (табл. 3-7). Электродные потенциалы
важны еще и потому, что их прямое измерение иногда позволяет подой-
ти к изучению окислительно-восстановительных реакций внутри клеток.
1. Измерение электродных потенциалов
Для измерения электродного потенциала нужно, чтобы окислитель
сопряженной окислительно-восстановительной пары мог восстанавли-
ваться потоком электронов [уравнение (3-62)], «стекающих» с поверх-
ности электрода, во многих случаях покрытого слоем специально об-
работанной платины.
А 4- 2Н++ 2е" АН2. (3-62)
Уравнение (3-62) описывает реакцию, протекающую на одном электро-
де. Электрохимический элемент имеет два электрода, и полная реакция
является суммой двух полуреакций. Электродный потенциал данной
полуреакции определяется путем измерения электродвижущей силы,
создаваемой элементом, в котором одна из полуреакций протекает на
стандартном электроде с известным потенциалом. На рис. 3-3 схемати-
чески изображена экспериментальная система для измерения электрод-
ного потенциала. Стандартный водородный электрод представляет со-
бой платиновый стержень, заключенный в стеклянную трубку, через
которую подается газообразный водород под давлением 1 атм. Элект-
род погружен в раствор, содержащий ионы водорода с единичной ак-
тивностью (пн+ = 1). Потенциал этого электрода условно принят за
нуль. На практике в качестве стандартного электрода чаще всего ис-
пользуют каломельный или какой-либо другой электрод с точно из-
вестным, постоянным потенциалом. Цепь между растворами, куда по-
гружены электроды, замыкается с помощью мостика, заполненного
электролитом. В исследуемом полуэлементе на поверхности другого
электрода (чаще всего платинового) протекает реакция, описываемая
уравнением (3-62). Разность потенциалов между двумя электродами
регулируется потенциометром. Вычитая из этсй разности потенциалов
потенциал стандартного электрода, получают электродный потенциал
исследуемой окислительно-восстановительной пары. Важно, чтобы ин-
тересующая нас электродная реакция была полностью обратима. Пере-
двигая движок потенциометра таким образом, чтобы электродвижущая
сила (э. д. с.) исследуемой системы была точно уравновешена внешним
230 Глава 3
источником напряжения, можно добиться того, чтобы ток через элемент
стал равен нулю. Если реакция обратима, то небольшое изменение на-
пряжения приведет к тому, что через элемент пойдет ток. Повышая или
понижая напряжение, можно изменять направление тока.
Обратимость реакции имеет место не для всех окислительно-восста-
новительных пар. Особенно это относится к органическим соединениям:
например, для пары альдегид — спирт прямо измерить электродный
потенциал невозможно. В ряде случаев, в частности при работе с
Н2^±2Н+- + 2е-
А + 2Н* + 2е-^ГАН2
РИС. 3-3. Устройство для измерения электродных потенциалов. Внизу приведены урав-
нения реакций, протекающих в каждом из полуэлемептов. Максимальная электриче-
ская работа, которую может выполнить такой элемент над окружением, равна —AG =
— nEF, где £=14—К (разность потенциалов, измеренная с помощью потенциометра).
Если вещество А, реагируя с Н2, восстанавливается до АН2, электроны во внешней
цепи будут течь в направлении, указанном на рисунке. При этом в правом полуэле-
менте будет идти восстановление А, а в левом Н2 будет окисляться до Н+. Протоны
будут перетекать слева направо через мостик из геля, насыщенного электролитом, вы-
полняя роль носителей тока во внутренней цепи.
ферментами, помогает добавление в систему легко восстанавливаемого
красителя с потенциалом, близким к потенциалу измеряемой сопря-
женной пары (список соответствующих красителей приводится в ра-
боте [23]). Если краситель может легко обмениваться электронами с
измеряемой парой, то удается прямо измерить электродный потенциал.
Во многих случаях электродные потенциалы, указываемые в таблицах,
рассчитываются по данным для свободных энергий (многие из потен-
циалов, указанных в табл. 3-7, можно рассчитать из данных, приве-
денных в табл. 3-3; советуем читателю проверить это). Когда в иссле-
дуемой системе А, Н+ и АН2 имеют единичные активности, наблюдае-
мый потенциал полуреакции представляет собой стандартный электрод-
ный потенциал Е°. Если э. д. с. гипотетической электродной системы,
в которую входит стандартный водородный электрод, оказывается по-
ложительной, когда ток течет в направлении, указанном стрелкой на
рис. 3-3, то потенциал сопряженной пары А/АН2 также считается по-
ложительным (его часто называют восстановительным потенциалом)
Именно такому предположению соответствуют данные табл. 3-7, однако
следует иметь в виду, что некоторые химики используют такие же по
абсолютной величине, но противоположные по знаку окислительные
потенциалы. Во избежание путаницы рекомендуем запомнить значение
одного-двух потенциалов, например потенциалов пар О>—Н2О и
NAD+—NADH.
Таблица 3-7
Восстановительные потенциалы некоторых биологически важных систем3'6
Полуреакция £°, в Е°' (pH 7), В —AG' (pH 7) для окисления кислородом (в расчете иа два электрона), кДж-моль—1
Ю2+4Н++4е-—>2H2O +1,229 +0,815 0,0
Fe3+ + e-—>Fe2+ 0,771 0,771 8,5
NO^ +2H++2e~—+NO; +H2O 0,421 76,0
Цитохром f (Fe3 * * 6+)+e~—>-Цитохром f (Fe2+) 0,365 86,8
Fe(CN) (феррицианид) + e~—>-Fe(CN)j“ 0,36 87,8
O2+2//+ +2e-—+H2O2 0,709 0,295 100,3
Цитохром a (Fe3+)+e-—>-Цитохром a (F2+) 0,29 101,3
п-Хинон+2Н+ + 2е~—^Гидрохинон 0,699 0,285 102,3
Цитохром c (Fe3+)+е-—э-Цитохром с (Fe2+) 0,254 108,3
Адренодоксин (Fe3+)+e~—>-Адренодоксин (Fe2+) 0,15 128,3
Цитохром b2 (Fe3+)+e~—^Цитохром &2 (Fe2+) 0,12 134,1
Убихинон+2Н+ + 2е-—>-Убихинон • Н2 0,10 138,0
Цитохром & (Fe3+)+е~—> Цитохром b (Fe2+) 0,075 142,8
Дегидроаскорбиновая кислота + 2Н+ + 2е* —>- —^Аскорбиновая кислота 0,058 146,1
Фумарат2-+2Н++2е~—>-Сукцинат2- 0,031 151,3
Метиленовый синий+ 2Н ++2е-—>Лейкометиле- новый синий (бесцветный) 0,011 155,2
Кротонил-СоА+2Н+4-2е-—>Бутирил-СоА —0,015 160,2
Глутатион+2Н + + 2е“—> Дважды восстановлен- ный глутатион 0,10 176,6
Оксалоацетат2- + 2Н++2е-—>Малат2- —0,166 189,3
Пируват-+2Н++2е-—>Лактат2- —0,185 193,0
Ацетальдегид+2Н++2е~—>Этанол —0,197 195,3
Рибофлавин + 2Н + +2е-—> Дигидрорибофлавнн —0,208 197,4
Ацетоацетил-СоА-|-2Н+ + 2е~-—>-(5-Оксибути- рил-СоА —0,238 (38 °C) 203,2
S + 2H++2e~—>H2S 0,14 —0,274 210,2
Липоевая кислота-|-2Н+ +2е_—>Дигндролипоевая кислота -0,29 213,2
NAD++H++2e-—э-NADH —0,113 —0,32 219,0
NADP++H++2e-—>NADPH —0,324 219,8
Ферредоксин (Fe3+)+e-—^Ферредоксин (Fe2+) (Clostridia) —0,413 237,0
2H+ + 2e-—>H2 0 —0,414 237,2
СО2+Н++2е-—>-Формиат- —0,42 (30 °C) 238,3
Ферредоксин (Fe3+)+e-—^-Ферредоксин (Fe2+) (шпинат) —0,432 240,6
3 Соединение с более положительным потенциалом будет окислять восстановлен-
ную форму вещества с более низким потенциалом с изменением стандартной свобод-
ной энергии ДС°=—nFAE°=—raA£°-96,49 кДж-моль-1, где п — число электронов, пе-
редаваемых от восстановителя к окислителю. Если нет специального указания, тем-
пература считается равной 25 °C. Е° относится к стандартному состоянию, при кото-
ром активность водородных ионов равна 1; Е°' относится к стандартному состоянию
яри pH 7, при котором все остальные активности равны единице.
6 Основной источник данных: Loach Р. A., in: Handbook of Biochemistry and Mo-
lecular Biology, 3rd ed., Vol. I (G. D. Fasman, ed.), pp. 122—130, © CRC Press, Inc.,
Cleveland, 1976.
232 Глава 3
Максимальная работа (—AG), которую может совершить поток
электронов во внешней цепи, обусловленный электрохимической реак-
цией (в расчете на моль вещества), есть
—\G=nEF=(nE-96,487) кДж-моль-1 —
= («£•23,061) ккал-моль-1, (3-63)
где £ —заряд моля электронов в кулонах1 (заряд электрона, помно-
женный на число Авогадро, т. е. 96 487 кулонов), а Е — измеренная
разность электродных потенциалов двух полуэлементов (в вольтах).
Если одним из полуэлементов является стандартный водородный элек-
трод, то Е — электродный потенциал сопряженной пары. Число молей
электронов, перенесенных в ходе реакций («), для обычных биохими-
ческих реакций равно 1 или 2 [в уравнении (3-62) оно равно 2].
Поскольку реагенты и продукты не всегда имеют единичную актив-
ность, нам нужно найти зависимость наблюдаемого электродного по-
тенциала от Е° и активностей (концентраций) А, АН2 и Н+. Эта зави-
симость имеет следующий вид:
In 1^ = («=2)
=£° + 0,02961g В при 25 °C. (3-64)
lAri2J
В биохимической литературе обычно вместо Е° Приводят значения
кажущихся стандартных электродных потенциалов при pH 7 (Е°',
табл. 3-7, второй столбец). Заметьте, что Е0' (pH 7) для водородного
электрода равно не 0, а —0,414 В. Связь между Е и Е°' определяется
уравнением (3-64), в котором в числителе отсутствует сомножитель
[Н+]2, поскольку в Е°' уже входит член с 1g [Н+]. По шкале значений
Е°' (pH 7) потенциал пары кислород — вода равен 0,815 В, а потенци-
ал пары NAD+—NADH равен —0,32 В.
Г. Термодинамика и процессы жизнедеятельности
Применимы ли законы термодинамики к живым организмам? Клас-
сическая термодинамика имеет дело с равновесными системами, а жи-
вые существа никогда таковыми не являются. Законы термодинами-
ки— это статистические законы. Могут ли они рассматриваться в при-
менении к живым существам, среди которых есть организмы, чья ге-
нетическая информация заключена в единственной молекуле ДНК?
Скорость идеальных обратимых реакций классической термодинамики
бесконечно мала. Как же может термодинамика прилагаться к быст-
рым химическим реакциям, протекающим в организме? В ответ на это
можно сказать, что термодинамика (даже если она ни на что другое
не пригодна) по крайней мере позволяет решить, может идти реакция
в данных условиях или не может. Таким образом, если нам известны
стационарные концентрации реагентов и продуктов внутри клетки, мы
можем сказать, в каком направлении пойдет реакция.
Вместе с тем многие ученые полагают, что должны существовать
некие положения общего характера типа законов термодинамики, при-
менимые к стационарному состоянию — своего рода «динамическому
равновесию», характерному для живых организмов. Термодинамика
Число Фарадея. — Прим, перев.
Энергетика биохимических реакции
неравновесных, необратимых процессов представляет собой в настоя-
щее время довольно развитую область физической химии.
Характерной особенностью термодинамики необратимых процессов
является то, что в нее в явном виде входит время. При этом рассмат-
риваются открытые системы, т. е. системы, которые обмениваются с
окружающей средой различными веществами. Вполне очевидно, что
живые организмы не могут считаться замкнутыми системами, с кото-
рыми оперирует классическая термодинамика, и являются открытыми
системами. Для любой открытой системы характерно наличие непре-
рывного потока вещества в каком-то направлении. За счет этого в си-
стеме устанавливается градиент концентраций и одно из первостепен-
ных значений приобретают явления переноса. Серьезной проблемой,
ограничивающей применение в биологии термодинамики необратимых
процессов, является то, что большая часть соотношений этой науки
справедлива лишь для состояний, близких к равновесию, в то время
как живые существа чаще всего весьма далеки от него. Поскольку био-
химические реакции могут протекать очень быстро, не вполне ясно,
может ли термодинамика необратимых процессов в том виде, как она
сейчас существует, помочь в решении большинства биохимических за-
дач. Однако в любом случае подход этот достаточно важен и при серь-
езном изучении биохимии без его рассмотрения никак нельзя обой-
тись.
Для ознакомления с неравновесной термодинамикой и соответст-
вующей дитературой можно обратиться к работе [24|; рекомендуем
также книги Пригожина [25]' и Качальского и Куррана [26].
В основе несколько иного подхода, развиваемого Мак-Кларом [27—
29], лежит представление о том, что второй закон термодинамики не
является, как это обычно считают, статистическим. Если его соответ-
ствующим образом сформулировать, он может быть применим и к бак-
териям, обладающим единственной молекулой ДНК- Следовательно,
классическая термодинамика применима и к живым клеткам. Автор
указывает, что характерной особенностью живых организмов, отличаю-
щей их от систем, которыми обычно занимается термодинамика, яв-
ляется то, что все реакции в них протекают очень быстро. Например,
в случае превращения внутримолекулярной энергии в мышцах в меха-
ническую энергию очень важно, чтобы процесс совершался достаточно
быстро и энергия не успевала рассеиваться в виде тепла. Мак-1<лар>
полагает, что для метаболических реакций большее значение имеет из-
менение энтальпии, нежели свободной энергии или энтропии.
Другая интересная идея, высказанная Моровицем [30], сводится
к тому, что поток энергии через любую открытую систему уже сам. по
себе «организует» эту систему. Так, если поставить колбу с водой на
горячую плиту, в ней будет протекать циклический процесс — в резуль-
тате потока энергии через систему в воде возникнут циклические кон-
векционные потоки. Как считает Моровиц, те (6±3)-1018 кДж солнеч-
ной энергии, которые ежегодно попадают на Землю, и составляют ор-
ганизующую основу жизни. Подобно тому как эта энергия вызывает
широкомасштабные циклические перемещения в атмосфере и морях,
она приводит к возникновению различных взаимосвязанных и крайне
разветвленных метаболических циклов. Возможно, этот подход помо-
жет понять происшедшее в ходе эволюции спонтанное развитие из не-
живых предшественников тех организованных систем, которые мы на-
зываем живыми.
234 Глава 3
1. Эффективность роста бактерий
Параллельно с не слишком плодотворными попытками построить
обобщенную термодинамическую теорию, применимую к живым систе-
мам, проводились чисто эмпирические наблюдения над процессами ро-
ста живых систем и потребления ими энергии, выявившие ряд интерес-
ных фактов. Довольно хорошо изучены многие анаэробные процессы
брожения, в ходе которых энергия химических реакций используется
клетками для синтеза АТР (гл. 9). Как правило, стехиометрия этих
реакций известна, и поэтому можно с хорошей точностью оценить ко-
личество АТР, синтезированного при сбраживании данного количества
субстрата. Нетрудно измерить и количество образовавшейся в ходе
брожения биомассы; например, можно собрать культуру клеток быстро
растущих бактерий, промыть, высушить и взвесить ее. Оказалось, что
независимо от того, какой именно субстрат сбраживается (за редким
исключением), величина Удтр — вес высушенных клеток в граммах на
моль синтезированного АТР — остается почти постоянной [22, 31]' и
приблизительно равной 10,5. Другой факт состоит в том, что для бак-
терий, рост и деление которых (в аэробных условиях) сопровождается
выделением только СОг и воды, 40±5 % потребляемого углерода и во-
дорода окисляется до СО2 и воды, а 60±5% ассимилируется клетками.
Отметим, что такой процент ассимилированного материала значитель-
но выше, чем для анаэробного брожения, при котором подавляющая
часть материала сбраживается, а не ассимилируется. Как мы увидим
позднее, это различие обусловлено тем, что окисление дает значитель-
но больший выход АТР, нежели брожение.
Из свободной энергии окисления субстратов ~62% представляет
собой свободную энергию сгорания компонентов, входящих в состав
высушенных бактерий. Таким образом, —AGj^AHc^22 кДж на 1 г
сухого веса бактерии [31].
Д. Линейные соотношения, в которые входит свободная
энергия
Органические функциональные группы определенным образом влия-
ют на распределение электронов в тех группах, к которым они присо-
единены, Выражение этих эффектов в виде линейных соотношений,
в которые входит свободная энергия, позволяет получить весьма по-
лезную связь между определенными химическими свойствами. Наибо-
лее известным из таких линейных соотношений является уравнение
Гаммета, которое связано с передачей влияния на распределение элек-
тронов через бензольные и другие ароматические кольца. Рассмотрим
константы диссоциации соединений трех классов;
Бензойные Фенилуксусные Фенолы
кислоты кислоты
В табл. 3-8 приведены значения рКа как для исходных соединений, так
и для их мета-хлор- и лета-нитрозамещенных производных.
Напомним, что р/<а— это отрицательный логарифм константы дис-
социации. Как следует из уравнения (3-30), рКа прямо пропорциональ-
но AG0 для диссоциации протонов. Гаммет рассматривает различия в
Энергетика биохимических реакций
zoo
Таблица 3-8
Значения р/(а для незамещенных и замещенных бензойных кислот,
фенилуксусных кислот и фенолов
Merna-замещение Бензойные кислотыа Фенилуксусные кислоты Фенолы
—Н (исходное соединение) 4,202 4,31 9,92
—С1 3,837 4,13 9,02
—no2 3,460 3.97 8,39
а Значения рКа для замещенных бензойных кислот недавно приведены в статье
Bolton Р. D., Fleming К. A., Hall F. М., JACS, 94, 1033—1034, 1972. Вычисленные ис-
ходя из них значения о немного отличаются от тех, что приведены в табл. 3-9.
рКа- Замещение атома водорода, стоящего в лета-положении бензойной
кислоты, на С1 или МОг-группу, «оттягивающие» на себя электроны,
снижает рДа, т. е. основность сопряженного основания. Уменьшение
рАа составляет —0,365 и —0,742 для лега-хлорбензойной и лега-нит-
робензойной кислот соответственно. Утверждение Гаммета состоит в
том, что это изменение рАа является мерой способности л/ета-замести-
теля оттягивать на себя электроны [32]. Таким образом, МОг-группа
в этом отношении почти вдвое превосходит С1. Численные значения
изменений константы диссоциации бензойной кислоты определяют кон-
станту замещения а, которая входит в уравнение Гаммета (табл. 3-9).
рА0—рА=о (для замещенной бензойной кислоты). (3-65)
Уменьшение рАа фенилуксусной кислоты, вызванное замещением
мета-водорода на Ci или NO2, составляет соответственно —0,18 и
—0,34, что существенно меньше, чем для бензойной кислоты. Для фе-
нолов же эти различия достигают —0,90 и —1,53, т. е. гораздо больше,
чем для бензойной кислоты. Согласно уравнению Гаммета (3-66) для
таких реакций, как диссоциация протонов в фенилуксусных кислотах
и фенолах, изменение AG, вызванное мета-замещением, пропорциональ-
но о, т. е. изменению AG в ходе стандартной реакции диссоциации про-
тона бензойной кислоты [32—-34]1.
1ё(Л7Ко)=рАо-рА=ро. (3-66)
Фигурирующий в уравнении коэффициент пропорциональности являет-
ся мерой «чувствительности» реакции к присутствию замещающих
групп, способных отдавать или принимать электроны. Для бензойной
кислоты р принято равным 1,00. По данным табл. 3-8, а также соглас-
но многим другим данным, для фенилуксусных кислот среднее значе-
ние р = 0,49; для фенолов р = 2,23, а для отщепления протонов от за-
мещенных пиридиниевых ионов р = 5,7. Чувствительность к замещению
оказывается самой высокой (р максимально) в последнем случае, ког-
да диссоциирует протон, присоединенный непосредственно к атому коль-
ца, и самой низкой, когда протон наиболее удален от кольца (фенил-
уксусная кислота).
1 Это уравнение может быть записано в более общем виде [32]: Igfeij—lgfeoj =
= р;о.-, где k может быть либо константой равновесия, либо константой скорости. Ин-
декс j соответствует рассматриваемой реакции, a i — замещению, оказывающему влия-
ние на ход этой реакции.
236 Глава 3
Таблица 3-9
Константы замещения, входящие в уравнения Гаммета и Тафта®
Замещающая группа ам ап °п а+ О* (из уравнения Таф га)
—о- —0,71 —0,52
-nh2 —0,16 -0,66 — 1,11 0,62
—он 0,121 —0,37 —0,85 1 ,34
—ОСНз 0,115 —0,27 -0,78 1,81
-СНз 0,069 —0,17 —0,31 0,00
--NH—СОСНз 0,2! —0,01 —0,25
—н 0 0 0 0,49
—сн2он 0,08 0,08 0,56
—соо- —0,10 0,00 0,11 — 1,06
- SOs 0.05 0,09 0,12
—SH 0,25 0,15 0,019 1,68
—СН2С1 0,18 1,05
—conh2 0,28 0,36
—F 0,337 0,06 0,02 —0,07
—I 0,352 0,18 0,135
— Cl 0,373 0,227 0.114
—сно 0,36 0,22 0,37
—СОСНз 0,376 0,502 0,85
—соон 0,37 0,45 0,42 2,08
—СООСНз 0,39 0,31 0,49
—SO2NH2 0,55 0,62 0,61
—CN 0,56 0,66 0,89 0,66
—с=сн 2,18
—CF3 0,43 0,54 0,61 2,61
-СС1з 2,65
no2 0,710 0,778 1,25 0,790 4,0
- NH3+ 1,13 1,70 3,76
N(пиридин) 0,73 0,83
NH+ (пиридин) 2,18 2,42 4,0
а Источники данных: Hammett L. Р., Physical Organic Chemistry, 2nd ed., p. 356r
McGraw-Hill, New York, 1970, Swain C G„ Lupton E. C„ Jr., JACS, 90, 4328—4337,
1968; Jaffe H. H„ ibid., 77, 4445—4448, 1955; Barlin G. B., Perrin D. D„ Q. Rev. Chem.
Soc„ 20, 75—101. 1966.
Зная p для данной реакции и имея таблицы значений ст, можно
предсказывать, как изменится рКа под влиянией той или иной заме-
щающей группы. Во многих случаях многократные замещения дают ад-
дитивный эффект;
р7У=рК0—р2ст.
(3-67>
Энергетика биохимических реакций 237
Хотя приведенные здесь примеры касаются лишь диссоциации про-
тонов, уравнение Гаммета справедливо и для многих других процес-
сов. Более того, поскольку скорость реакции связана со свободной
энергией активации, можно установить корреляцию между константа-
ми скорости (гл. 6, разд. Д.5.д).
Так как замещения в орто-, мета- и пара-положениях оказывают
количественно разное влияние, то для каждого положения определя-
ются свои значения о. Заметим, что замещения в орто-положении со-
провождаются дополнительными эффектами, поэтому таблицы значе-
ний о обычно составляются только для мета- и пара-положений1 (а_н и
а„). Еще одно осложнение связано с тем, что некоторые реакции ока-
зываются настолько чувствительными к пара-замещению, что возни-
кает резонанс, охватывающий всю циклическую систему. Примером
служит кислотная диссоциация фенолов. оп для нитрогруппы обычно
составляет 0,778, но, чтобы правильно предсказать влияние пара-нит-
рогруппы на диссоциацию фенола, нужно взять оп, равное 1,25. Это
значение о обозначается через о^. Такое более сильное влияние заме-
щения на нитрогруппу может быть обусловлено резонансом фенолят-
иона:
(Кривые стрелочки указывает направление перехода электронов, при-
водящее к превращению одной резонансной формы в другую.) По
аналогичным причинам для некоторых реакций приходится вводить
о‘п— константы, отвечающие присоединению сильных электронодонор-
ных замещающих групп, таких, как ОН, которые тоже могут вызвать
резонанс в циклической системе. Так, <т,> для ОН-группы равно —0,37,
а Оп = —0,85 [35]. Для метоксильной группы (—ОСНз) ап—-—0,27,
с* =—0,78 и ом = +0,12.
Наличие различных типов констант замещения усложняет примене-
ние уравнения Гаммета. Действительно, сейчас используется свыще
20 различных наборов значений о. Для упрощения ситуации констан-
ты замещения выражают в виде суммы двух слагаемых; одно из них
учитывает «полевые», или «индуктивные», эффекты, а другое — резо-
нансные [35, 36]. Для конкретного заместителя в пара-положении кон-
станты замещения для некоторой серии реакций задаются следующим
уравнением:
(3-68)
В этом уравнении коэффициенты far являются параметрами, харак-
теризующими серию реакций, a F и R соответствуют конкретной заме-
щающей группе. Так, оя обычного уравнения Гаммега оказывается
равной
a„=0,56F+fl. (3-69)
Значения R и F для некоторых замещающих групп даны в приводимой
ниже таблице.
Для орто-замещения в литературе можно найти кажущиеся значения о [34].
238 Глава 3
R F
-nh2 —0,68 0,04
—он —0,64 0,49
-ОСНз —0,50 0,41
-сн3 -0,14 —0,05
—СООН +0,14 0,55
-no2 +0,20 1,11
Группы расположены в порядке убывания количества отдаваемых ими
электронов, создающих резонанс. Замещающие —СООН- и ЫОг-груп-
пы, имеющие положительные значения Р, являются акцепторами элек-
тронов. Как видно из таблицы, все заместители, исключая метильную
группу, дают электронакцепторный индуктивный эффект.
Значения <зм в какой-то мере отражают нерезонансное влияние
группы и поэтому отчасти коррелируют с F-компонентой, тогда как
в основном коррелируют с R.
Существуют и другие линейные соотношения, включающие зависи-
мость от свободной энергии; например, кислотность алифатических со-
единений связана с «константой полярного замещения по Тафту» а*
следующим уравнением:
lg(F//Q=p*o*. (3-70)
Хорошее приближение для оценки значений рКа дают уравнения (3-71)
и (3-72) [34]:
для R—СООН рКа = 4,66— 1,62о*, (3-71)
для R—СН2—СООН рХа = 5,16 —0,73о*. (3.72)
Вопросы и задачи
1. а. Исходя из значения AG0 гидролиза сахарозы (табл. 3-5), рассчи-
тайте константу равновесия
[Глюкоза] [Фруктоза]
~ [Сахароза]
для 25 °C. Назовем эту реакцию гидролиза реакцией 1.
б. Устойчива ли сахароза в 1 М растворе? Объясните почему.
в. Если к 1 М раствору сахарозы добавлена кислота, катализи-
рующая процесс гидролиза, какова будет конечная равновесная
концентрация сахарозы? (Расчет проводите в предположении,
что концентрации равны активностям.)
г. Реакцией 2 является гидролиз а-О-глюкозо-1-фосфат а с образо-
ванием глюкозы и неорганического фосфата (А). Используя зна-
чение AG0 этой реакции (табл. 3-5), рассчитайте константу рав-
новесия.
д. Сахарозофосфорилаза из бактерий Pseudomonas saccharophila
катализирует следующую реакцию (реакция 3):
Сахароза + Р, -а-О-глюкозо-1-фосфат -]- Фруктоза.
Рассчитайте константу равновесия и изменение стандартной сво-
бодной энергии при 25 °C для реакции 3, исходя из полученных
выше значений констант равновесия реакций 1 и 2. Покажите,
что AG0 реакции 3 равно AG0 реакции 1 минус AG0 реакции 2.
е. Могут ли бактерии осуществлять реакцию 3 в две указанные
ниже последовательные стадии? Объясните почему.
Сахароза ---> Глюкоза-j-Фруктоза,
ГлюкозаФосфат -----> Глюкозо-1-фосфат.
2. Для каждой из приведенных ниже реакций укажите, в каком ин-
тервале находится константа равновесия — между 0,1 и 10 (т. е.
около единицы), больше 100 или меньше 0,01. Считайте, что pH
постоянно и равно 7,0.
a. 2ADP3- --> АТР4-4-АМР2-;
б. АТР3-Jr Глюкоза ----> Глюкозо-б-фосфат2- -|- ADP2- -|- Н+;
в. ADP2- + HPOJ- + Н+ --> АТР3-;
г. Глюкозо-б-фосфат2- -> Фруктозо-б-фосфат2~;
д. Фосфоенолпируват3-Глюкоза --->• Глюкозо-1 -фосфат2- -J- Пируват-.
3. В результате сгорания в калориметрической бомбе при 25 °C (при
постоянном объеме) 1 моля твердой мочевины с образованием во-
ды (в жидком состоянии), углекислого газа и газообразного азота
(Na) выделилось 666 кДж тепла. Рассчитайте АД—шзмепение теп-
лосодержания (энтальпии) реакции.
4. По данным табл. 3-3 рассчитайте AG' (pH 7) следующих реакций:
а. Глюкоза ---► 2Лактат--|- 2Н+;
б. 2NHa-]-HCO7 ----> Мочевина-j-2Н2О-|-Н+;
в. а-Кетоглутарат2- 4—О2СоАН+ ---------> Сукцинил-СоА-]- H2O_j- СО2.
5. Какова ионная сила 0,2 М раствора NaCl? 0,2 М NaaSOj?
6. Отношение [АТР]/[ADP] для активно дышащей дрожжевой клетки
равно ~10. При каком отношении [3-фосфоглицерат]/[1,3-дифос-
фоглиперат} в клетке фосфоглицераткиназная реакция (рис. 9-7;
реакция 7) будет смещена в сторону синтеза 1,3-дифосфоглицерата
(при 25 °C, pH 7) ?
7. а. По данным табл. 3-7 определите константу равновесия реакции
между малатом и метиленовым синим, предполагая, что все ре-
агенты вначале присутствовали в равных концентрациях. Четко
укажите, какому направлению реакции соответствует получен-
ное значение изменения свободной энергии.
б. Рассчитайте процентное содержание восстановленной (лейко-)
формы метиленового синего при pH 7 и температуре 25 °C в си-
стеме, электродный потенциал которой равен 0,065 В.
8. NAD+ является коферментом как пируватдегидрогеназы, так и эта-
нолдегидрогеназы. Используя значение Е°' из табл. 3-5, рассчитай-
те изменение свободной энергии и константу равновесия реакции
Лактат- Ацетальдегид --->• Пируват- -|- Этанол.
9. Рассмотрим окисление ацетата при 25 °C:
СН3СОО-(0,1 М) + 2О2 (г, 0,2 атм) + Н+(10-’М) ->- 2Н2О (ж) + 2СО2 (г).
а. Чему равно равновесное давление СО2, если реакция не сопря-
жена ни с какими другими реакциями?
240 Глава 3
б. Чему равно равновесное давление СОо, если реакция сопряжена
с образованием 0,01 М АТР из 0,01 М ADP и НРО*- в цикле
трикарбоновых кислот?
в. Какие выводы вы можете сделать из выполненных выше расче-
тов о возможности 100%-ной эффективности запасания энергии
в виде АТР в ходе цикла трикарбоновых кислот?
г. Если давление СО2 равно 0,01 атм, какова будет эффективность
запасания энергии в условиях, описанных в пункте б?
10. Константа равновесия приводимой ниже реакции, катализируемой
АТР-креатинтрансфосфорилазой, была определена путем непосред-
ственного химического анализа. Данные анализа представлены ни-
же. [Kuby S. A., Noltman Е. A., in: The Enzymes, 2nd ed.
(P. D. Boyer, H. Lardy, K. Myrback, eds.), Vol. VI, pp. 515—602,
Academic Press, New York, 1962].
ATP4- 4- Креатин -> ADP3- 4- Креатинфосфат2- 4- H+
t (°C) к
20 6,30.10-»
30 5,71.10-»
38 5,47.10-»
а. Каковы значения AG°, ЛН° и AS0 реакции при 25°C?
б. Каковы значения AG', АН' и AS' (pH 7) реакции при 25 °C?
в. Каковы значения AG', АН' и AS' (pH 7) реакции гидролиза
креатинфосфата при 25 °C?
11. В калориметре при 25 °C в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) в
присутствии суспензии частичек, содержащих митохондриальную
систему транспорта электронов, была проведена следующая реак-
ция (Рое М., Gutfreund Н., Estabrook R. W., ABB, 122, 204—211,
1967):
NADH 4- Н+4- *2~О2 (насыщ. водн. раств.) — » NAD+-j- Н2О.
Количество потребляемого кислорода непрерывно регистрировалось
с помощью кислородного электрода. Температура контролировалась
погруженной в раствор термопарой. Перед началом реакции в
29,0 мл буфера, содержащего О2, было добавлено 96 мкмолей
NADH. Реакция оказалась очень близка к реакции нулевого по-
рядка, скорость потребления О2 составляла 6,87 мкмоль-мин-1,
а скорость повышения температуры—-0,01171 град-мин4. Теплоем-
кость калориметра вместе с содержимым была равна 254,6 Дж-К-1.
Чему равно АН рассматриваемой реакции? Указание-, источником
Н+ служил фосфатный буфер, имевший АН диссоциации
5,4 кДж-моль-1.
12. Изменения энтальпии и свободной энергии при 25 "С для приводи-
мой ниже реакции даны в табл. 3-5:
АТР4-(1 М) 4-Н2О -> ADP3-(1 М)4-Н+(Ю~’М)4-HPOJ-(1 М).
а. Сколько тепла выделится при постоянных температуре и давле-
нии, если реакция будет идти в пробирке и-не будет совершать-
ся никакой работы, помимо работы по увеличению объема РАК?
б. Сколько тепла выделится или поглотится в ходе этой реакции,
если она с эффективностью 100% будет сопряжена с эндергони-
ческой реакцией?- - .
в. Какой должна быть эффективность сопряжения с эндергони-
ческой реакцией, чтобы приведенная выше реакция Не Сопровож-
далась ни выделением, ни поглощением тепла?
Энергетика биохимических реакций 241
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
I. Mahan В. Н., Elementary Chemical Thermodynamics, Benjamin, New York, 1963.
2. Lewis G. N., Randall M., Thermodynamics and the Free Energy of Chemical Sub-
stances (rev. by Pitzer K. S., Brewer L.), 2nd ed., McGraw-Hill, New York,
1961.
3 Everdell M. H., Introduction to Chemical Thermodynamics, Norton, New York
1965.
4. Denbigh K. G., The Principles of Chemical Equilibrium, Cambridge Univ. Press,
London and New York, 1955.
5. Dickerson R. E., Molecular Thermodynamics, Benjamain, New York, 1969.
6. Sturtevant J. M. In: Techniques of Chemistry (Weissberger A., ed.), Vol. I, Part V,
pp. 347—425, Wiley (Interscience), New York, 1971.
7. Brown H. D., ed., «Biochemical Microcalorimetry», Academic Press, New York,
1969.
в. White A., Handler P., Smith E. L., Principles of Biochemistry, 4th ed., pp. 291—
301, McGraw-Hill, New York, 1968.
9. Gurney R. W., Introduction to Statistical Mechanics, Chapter 1, McGraw-Hill, New
York, 1949.
10. Phillips R. C., George P., Rutman R. J., Biochemistry, 2, 501—568 (1963)
11. Guynn R. W., Veech R. L„ JBC, 248, 6966—6972 (1973).
12. Alberty R. A., Horizons of Bioenergetics (San Pietro A., Gest H., eds.), pp. 135—
147, Academic Press, New York, 1972.
13. Alberty R. A., JBC, 244, 3290—3302 (1969).
14. Phillips R. C., George P., Rutman R. J., JBC, 244, 3330—3342 (1969). (Обратите
внимание, что все термодинамические величины в этой работе приведены для слу-
чая бесконечного разбавления.)
15. George Р., Phillips R. С., Rutman R. J., Biochemistry, 2, 508—512 (1963).
16. Purich D. L., Fromm H. L, Curr. Top. Cell. Regul., 6, 131—167 (1972).
17. Jencks W. P. In: Handbook of Biochemistry (Sober H. A., ed.), p. J-148, Chem.
Rubber Publ. Co., Cleveland, Ohio, 1968.
18. Atkinson M. R., Morton R. K., Comp. Biochem., 2, 1—95 (1960).
19. Bassham J. A., Krause G. H., BBA, 189, 207—221 (1969).
20. Владимиров Г., Власова В., Колотилова А., Лизлова С., Пантелеева Н., Nature
(London), 179, 1350—1351 (1957).
21. Rosing Slater E. C„ BBA, 267, 275—290 (1972).
22. Decker K-, Jungermann K., Thauer R. K., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 9, 138—
158 (1970).
23. Dutton P. L„ BBA, 226, 63—80 (1971).
24. Caplan S. R., Curr. Top. Bioenerg., 4, 1—79 (1971).
25. Prigogine I., Introduction to Thermodynamics of Irreversible Processes, 3rd ed.,
Wiley, New York, 1967.
26. Katchalsky A., Curran P. F., Nonequilibrium Thermodynamics in Biophysics, Har-
vard Univ. Press, Cambridge, Massachusetts, 1965.
27. McClure C. W. F„ J. Theor. Biol., 30, 1—34 (1971).
28. McClure C. W. F, J. Theor. Biol., 35, 233—246 (1972).
29. McClure C. W. F„ J. Theor. Biol., 35, 569—595 (1972).
30. Morowitz H. I., Energy Flow in Biology, Academic Press, New York, 1968.
31. Payne W. J., Annu. Rev. Microbiol., 24, 17—52 (1970).
32. Hammett L. P., Physical Organic Chemistry, 2nd ed., pp. 347—390, McGraw-Hill,
New York, 1970.
33. Wells P. R„ Chem. Rev., 63, 171—219 (1963).
34. Barlin G. B., Perrin D. D., Jr., Rev. Chem. Soc., 20, 75—101 (1966).
35. Swain C. G., Lupton E. C„ Jr., JACS, 90, 4328—4337 (1968).
36. Hansen L. D., Hepler L. G., Can. J. Chem., 50, 1030—1035 (1972).
Глава 4
Как молекулы соединяются друг
с другом
Все клетки построены из молекул, поэтому ясно, насколько велика
роль механизмов, при помощи которых эти молекулы достаточно проч-
но «состыковываются» друг с другом. Известно, что связывание малых
молекул с большими лежит в основе многих биологических процессов,,
например метаболизма питательных веществ и действия гормонов. Вза-
имодействие между макромолекулами является составной частью таких
явлений, как движение жгутиков, мышечное сокращение, действие ан-
тибиотиков, передача нервных импульсов и многих других.
А. Принцип комплементарности
Поскольку межмолекулярные взаимодействия слабы, молекулы спо-
собны достаточно прочно связываться друг с другом, только если есть
соответствие между их поверхностями, а во взаимодействии участвует
большое число атомов. Для образования прочного комплекса соответ-
ствие должно быть достаточно точным, т. е. поверхности молекул долж-
ны быть комплементарными. Так, если на поверхности одной молеку-
лы имеется выступ (например, группа —СН3), то на комплементарной
ей поверхности другой молекулы должно быть углубление; напротив
положительного заряда должен быть расположен отрицательный.
Группа, способная отдавать протон, может образовать водородную
связь только в том случае, если есть комплементарная группа, содер-
жащая неподеленные электроны. Для образования гидрофобных свя-
зей неполярные (гидрофобные) группы должны располагаться одна
против другой. Один из наиболее важных принципов биохимии гласит:
две молекулы, поверхности которых комплементарны, стремятся взаи-
модействовать и соединяться друг с другом, тогда как молекулы, не
содержащие комплементарных поверхностей, не взаимодействуют. Уот-
сон назвал это принципом избирательной «слипаемости» молекул [1].
Он лежит в основе самосборки нитей, трубочек, мембран и полиэдри-
ческих структур из взаимно комплементарных биологических макромо-
лекул. Принцип комплементарности ответствен также за специфическое
спаривание оснований в процессе репликации ДНК.
Комплементарность поверхностей не менее важна и для множества
химических реакций, протекающих в клетке. Эти реакции катализиру-
ются, или «направляются», ферментами, содержащими реакционноспо-
собные химические группы, которые расположены в строго определен-
ном месте и ориентированы таким образом, чтобы иметь возможность
взаимодействовать с другими молекулами — субстратами и химически
модифицировать их. Избирательный катализ — это характерная осо-
бенность биологических систем; основные усилия биохимиков направле-
ны на изучение именно этого вопроса. Изменения структуры клетки то-
Как молекулы соединяются друг с другом
243
же в конечном счете обусловлены химическими реакциями. Прекрасны-
ми примерами таких изменений могут служить сокращение мышечных
волокон и движение цитоплазмы у амебы.
Б. Силы, действующие между молекулами
Характеризуя количественно межмолекулярные взаимодействия,
биохимики говорят обычно о вандерваальсовых силах, электростатиче-
ских взаимодействиях, водородных связях и гидрофобных силах. Коли-
чественными характеристиками суммарного действия всех сил являют-
ся константа равновесия и изменение энтальпии и энтропии рассматри-
ваемой системы.
1. Константы образования и константы диссоциации
Прочность связи между двумя частицами можно охарактеризовать
с помощью константы образования Kt-
Рассмотрим присоединение молекулы X к другой молекуле Р, ко-
торая может представлять собой молекулу белка, нуклеиновой кисло-
ты, ион металла или любую другую частицу. Если на поверхности Р
имеется лишь один центр связывания для X, то взаимодействие мо-
жет быть описано уравнением (4-1), а константа равновесия Kt опре-
деляется уравнением (4-2):
Х + Р^=^РХ, (4-1)
tff=[PX]/|P][Xj. (4-2)
Константа образования выражается обычно в литрах на моль (или
М-1); она является прямой мерой прочности связи — чем больше кон-
станта, тем сильнее взаимодействие. Прочность связи характеризуется
также изменением стандартной свободной энергии AG0 реакции — чем
более отрицательна AG0, тем прочнее связь.
AG? =—RT In Ks=—2,303/?Т 1g Kf =
=—5,708 lg Ks кДж-моль-1 при 25 °C. (4-3)
Чтобы избежать недоразумения, важно помнить, что наряду с констан-
той образования (ассоциации) часто (особенно в энзимологии и при
определении кислотности) используют константу диссоциации К<Г.
tfd=l/Kf. (4-4)
К сожалению, в разных областях химии одинаково часто пользу-
ются и константами образования (или ассоциации), и константами дис-
социации; постарайтесь не путать эти два понятия.
Часто удобнее пользоваться не самими константами образования,
а их логарифмами, поскольку они пропорциональны соответствующим
изменениям свободной энергии. Запомните следующее соотношение:
lgKf=- lgKd=PKd. (4-5)
Логарифм константы образования равен рКа и характеризует уменьше-
ние стандартной свободной энергии в ходе реакции ассоциации. Заме-
тим далее, что изменение стандартной свободной энергии AG0, соответ-
ствующее изменению lg Kt и рАД на единицу, составляет
—5,7 кДж-моль-1. Эту величину тоже следует запомнить.
244 Глава 4
Средняя кинетическая энергия движения молекул в растворе рав-
з
на приблизительно -^Т, где k — константа Больцмана; для 1 моля при
25° эта величина составляет ^-RT, т. е. 3,7 кДж (0,89 ккал). Например,
если /Q=10 (AG°=—5,7 кДж • моль-1, или —1,36 ккал • моль-1), то
энергия связи лишь незначительно превышает энергию теплового дви-
жения молекул и образующийся комплекс непрочен. Если концентра-
ции X и Р в этом примере составляют 10-4 М (типичные значения кон-
центраций для биологических систем), то это означает, что в виде
комплекса будет находиться лишь 0,1% всех молекул ([комплекс] =
= Kt[Х]1[Р]). Если константа образования в 1000 раз больше, т. е.
Kt = 104 (AG° =—22,8 кДж-моль-1), то в составе комплекса находится
38% всех молекул, а при Ю=107 (очень сильное взаимодействие,
AG° = —40 кДж-моль-1, или —9,55 ккал-моль-1), эта величина состав-
ляет 97%.
2. Вандерваальсовы силы
Все атомы в той или иной степени притягиваются друг к другу, вот
почему даже гелий при достаточно низкой температуре переходит в
жидкое состояние. Эти так называемые вандерваальсовы силы очень
короткодействующие. Они обусловл