Текст
                    

А.В. Иванов, Ю. И. Полянский, А.А.Стрелков Большой практикум по зоологии беспозвоночных ПРОСТЕЙШИЕ, ГУБКИ, КИШЕЧНОПОЛОСТНЫЕ, ГРЕБНЕВИКИ, ПЛОСКИЕ ЧЕРВИ, НЕМЕРТИНЫ, КРУГЛЫЕ ЧЕРВИ Издание третье, переработанное и дополненное Допущено Министерством высшего и среднего специального образования СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических специальностей университетов МОСКВА < ВЫСШАЯ ШКОЛА? I98J
ББК 28.691 И21 Рецензенты: Кафедра зоологии беспозвоночных Киевского университета (акад. АН УССР А. П. Маркевич и проф. Б. Н. Мазурмович); проф. В. И. Здун (зав. кафедрой зоологии Львовского университета) Иванов А. В., Полянский Ю. И., Стрелков А. А. И21 Большой практикум по зоологии беспозвоночных. Простейшие, губки, кишечнополостные, гребневики, плоские черви, немертины, круглые черви: Учеб, пособие для биолог, спец, ун-тов. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Высш, школа, 1981.— 504 с., ил. В пер.: 1 р. 80 к. Книга — первый том трехтомного руководства к специализированному студенческому лабораторному практикуму по зоологии беспозвоночных животных. Руководство знакомит с отдельными объектами, изучаемыми на большом практикуме. Все описание составлено по одному плану: название объекта и его положение в системе, методы изучения, наблюдения на живом объекте, внешняя морфология, вскрытие, изучение тотальных препаратов и срезов. Объекты подобраны таким образом, чтобы они были по возможности доступны. 21008—360 И ----—------ 62—81 2005000000 ББК 28.691 001(01)—81 592 © Издательство «Высшая школа», 1981
ПРЕДИСЛОВИЕ К ТРЕТЬЕМУ ИЗДАНИЮ Третье издание «Большого практикума по зоологии беспозвоночных» представлено в трех частях, хотя объем книги остается прежним В первой книге наряду с вводной частью приведено описание простейших, губок, кишечнополостных, гребневиков, плоских червей, немертин, круглых червей; во вторую книгу войдут кольчатые черви и членистоногие; в третью — щупальцевые, моллюски, иглокожие. Книга рассчитана не столько на обычные практические занятия по курсу зоологии беспозвоночных, сколько на расширенный специальный «большой» практикум, который в основном строится на самостоятельной работе студентов в природе и в лаборатории. «Большой практикум» должен способствовать подготовке молодых специалистов-зоологов к исследовательской работе, а также будет служить студентам подготовительной ступенью к дипломной работе. Поэтому особенно важно при проработке практикума наряду с данной книгой пользоваться специальной литературой, списки которой приведены в конце ее. Предполагается, что студент, проходящий большой практикум, владеет не только русским, но и иностранным языком. Важная сторона работы — овладение основными методиками зоологического исследования. Однако несмотря на наличие большого количества специальных руководств по микроскопической технике, мы сочли необходимым в настоящей книге привести основные методики, которыми приходится пользоваться зоологу в практической исследовательской работе. Одни методы излагаются в вводной части, другие, более специальные, при рассмотрении отдельных групп. В число методов включены также методики реконструкций по срезам и инъекций, нередко незаслуженно забываемые, а по существу очень важные для зоолога. Материал данной книги ограничивается светооптическими методами изучения и совсем не затрагивает электронную микроскопию. Практикум по ультраструктуре беспозвоночных требует специального изложения и овладения методиками, что должно найти место в специальном руководстве. Вкрапливать же отдельные данные по ультраструктуре в зоологический практикум представляется нам нецелесообразным. По сравнению со вторым изданием, вышедшим в 1958 г., книга подверглась переработке в соответствии с развитием науки. Несколько изменена микроскопическая техника: устранен ряд устаревших методов, введены более современные, в том числе некоторые простейшие цитохимические методики. Излагаются современные методики импрегна
ции простейших серебром и др. Значительно переработана система жи вотного мира в соответствии с современными представлениями. Осс бенно значительной переработке подверглась глава, посвященная прос тейшим, некоторые разделы которой написаны заново. Авторы учли с благодарностью критические замечания, сделанны многими зоологами по второму изданию практикума. В первой книге работа между авторами распределилась следую щим образом: А. В. Ивановым написаны главы: Техника вскрытиг инъекций и реконструкций, Рисование, Немертины и Приапулиды Ю. И. Полянским: Введение (о постановке практикума по зоологи; беспозвоночных, микроскопическая техника), Жгутиконосцы, Инфузо рии (частично), Споровики, Миксоспоридии, Микроспоридии, Кишечнс полостные, гребневики, коловратки; А. А. Стрелковым: Саркодовые Инфузории (частично), Губки, Плоские черви, Нематоды, Скребни, Во лосатики. В связи с безвременной кончиной А. А. Стрелкова редакти рование и доработка написанных им глав осуществлены А. В. Ивано вым и Ю. И. Полянским. Настоящее руководство создано на кафедре зоологии беспозвоноч ных Ленинградского государственного университета им. А. А. Жданов; по совету профессора Валентина Александровича Догеля (1882—1955) учениками которого являются авторы книги. Проф. А. В. Иванов проф. Ю. И. Полянские
ВВЕДЕНИЕ О постановке практикума по зоологии беспозвоночных Прохождение курса зоологии невозможно без соответствующего практикума. Параллельно с теоретическим изучением той или иной группы животных по учебнику совершенно необходимы практические занятия, на которых происходит конкретное знакомство с объектами изучения. Поэтому в любом вузовском курсе на долю практических занятий отводится примерно столько же времени, сколько и на лекции. На практических занятиях студенты не только знакомятся с отдельными объектами, но также приобретают навыки вскрытия животных, изготовления простейших препаратов, микроскопического исследования и т. п. В нашей учебной литературе наряду с теоретическими курсами (проф. В. А. Догеля, коллектива авторов под ред. проф. Б. С. Матвеева, проф. В. Ф. Натали, проф. С. В. Аверинцева) имеются вполне удовлетворительные руководства для практических занятий по зоологии (проф. С. В. Аверинцева, акад. Е. Н. Павловского, А. Л. Зеликмана и др.), которые дают конкретный фактический материал, методические и технические указания к их организации. В настоящей книге преподаватель вуза и студент также найдут материал для постановки групповых практических занятий по курсу зоологии беспозвоночных. Однако авторы настоящего руководства ставили перед собой еще и другую задачу. В большинстве университетов, где имеются биологические факультеты, и в некоторых педагогических институтах наряду с групповыми практическими занятиями, идущими параллельно с лекционным курсом, существует расширенный «большой практикум» по зоологии беспозвоночных. Он строится на базе уже проработанного общего курса, имеет целью дальнейшее углубление знаний и навыков и служит как бы переходной ступенью к исследовательской работе в области зоологии. Аспиранты-зоологи во многих вузах в течение первого года аспирантуры также проходят большой практикум, являющийся для них подготовкой к кандидатскому экзамену. В деле подготовки научной смены в области зоологии прохождение расширенного практикума чрезвычайно важно и необходимо. Между тем соответствующих руководств в нашей учебной литературе совсем нет, отсутствуют они и за границей.
Настоящая книга и имеет целью служить практическим руководством при прохождении расширенного практикума. Большой практикум по зоологии беспозвоночных в той форме, в которой он проводится в Ленинградском государственном университете и в некоторых других вузах, представляет собой индивидуальные занятия студентов. Помощь преподавателя носит характер периодических консультаций и проверки выполненных работ. Каждый занимающийся имеет индивидуальное рабочее место и индивидуальный план прохождения практикума. Самый разбор и изучение объектов совершается не на основе объяснений преподавателя, а в результате самостоятельного изучения литературы. Прохождение большого практикума прежде всего чрезвычайно расширяет круг знаний занимающегося зоологией. Предлагаемая книга должна помочь разобраться в строении отдельных зоологических объектов и указать методы изучения их. Но она ни в коем случае не должна быть единственным руководством при прохождении практикума. Параллельно с практической работой необходимо изучение литературы. Списки основных работ по каждой группе животных приведены в конце книги. Без знакомства хотя бы с основными работами прохождение большого практикума не достигает цели. Одна из задач руководителя— стимулировать занимающегося к самостоятельному чтению, просматривать его конспекты, разъяснять непонятные места и т. п. Весьма желательно при изучении литературы пользоваться не только русскими, но и иностранными источниками. При прохождении большого практикума, сопровождающегося систематическим чтением литературы, относительно легко приобрести навыки чтения специальных текстов, что явится совершенно необходимым особенно для тех, кто предполагает заниматься исследовательской работой в области зоологии. Практика показывает, что сначала чтение иностранных источников идет медленно, но при настойчивости со стороны занимающегося относительно быстро удается достигнуть хороших результатов. Прохождение большого практикума способствует овладению навыками исследовательской работы. Большинство препаратов при правильной постановке дела изготовляется самим занимающимся. Этим достигается основательное знание микроскопической техники и умение применять ее в различные конкретных случаях. Наряду с навыками морфологического исследования при прохождении практикума приобретаются и некоторые навыкг экспериментальной работы, так как при изучении ряда групп животных необходима постановка экспериментов (например, при изученш жизненных циклов некоторых Sporozoa, червей и др.). По ходу проработки большого практикума приобретается также умение производит! зарисовку анатомических и микроскопических препаратов, что очеш важно и для исследовательской работы. Следует подчеркнуть, что руководителю необходимо добиться того, чтобы занимающиеся зарисовыва ли изучаемые объекты. Ссылки на неумение рисовать, которые чаете приходится слышать от приступающего к практикуму, совершенно не основательны. Речь идет не о художественном, а по существу о техни ческом рисунке, для которого не требуется никаких особых художест
венных способностей. Научиться рисовать так, как это нужно зоологу для работы, может всякий. Ниже даются некоторые практические указания по технике рисования зоологических объектов. Кроме зарисовки каждый работающий над зоологическим практикумом должен научиться фотографировать микроскопические объекты. Однако фотосъемка отнюдь не заменяет собой рисования, а должна сочетаться с ним, ибо в процессе зарисовки изучается объект. На технике фотосъемки в этой книге мы не останавливаемся, так как она излагается в ряде специальных руководств. Прохождение большого практикума по зоологии приводит также к расширению общебиологических горизонтов занимающегося. Дело в том, что детальное изучение 'той или иной группы животных обычно бывает связано с тем или иным кругом общих вопросов. Так, например, изучение Hydrozoa заставляет углубиться в вопросы чередования поколений, в частности метагенеза, факторов, его определяющих. Знакомство с коловратками выдвигает проблему чередования поколений при партеногенезе, проблему постоянства клеточного состава. Изучение плоских червей — ряд проблем общепаразитологического характера и т. п. При прохождении практикума не следует, разумеется, обходить все эти проблемы и ограничиваться только морфологическими и систематическими данными. Это опять-таки приводит к необходимости углубленного изучения специальной литературы. Прохождение полностью большого практикума, охватывающего все группы беспозвоночных, требует значительного промежутка времени. При систематической работе он занимает от двух до двух с половиной лет (учитывая другие формы академических занятий студентов). Очень часто в распоряжении занимающегося имеется меньший срок. Как следует тогда строить прохождение практикума? Нужно ли пропорционально уменьшить глубину проработки всех типов и классов или же идти по линии уменьшения числа изучаемых групп, не снижая уровня? Нам кажется более правильным второй путь. Дело в том, что поскольку практикум преследует цель не только расширения формальных знаний, но в такой же степени и развития ряда навыков (чтение специальной литературы, техника лабораторного исследования и др.),вторая цель не может быть достигнута при ускоренном прохождении практикума. Наконец, отметим еще одну особенность большого практикума. Для изучения ряда групп животных необходим во многих случаях живой материал. Это в свою очередь придает .известный сезонный характер изучению различных групп. Учитывать этот, момент очень важно при составлении индивидуального плана каждого занимающегося. Так как расширенный практикум строится на базе уже проработанного вузовского курса, то в отдельных случаях вполне допустимо отступление от систематического порядка с учетом реальных возможностей добывания материала. Указываемые в практикуме морские объекты рассчитаны в основном на фауну Баренцева и Белого морей, на которых имеются академические и университетские биологические станции.
Прохождение практикума связано с освоением технических приемов изучения зоологических объектов. Поэтому прежде чем перейти к систематическому обзору беспозвоночных, остановимся на основных приемах и технике работы по зоологии. Микроскопическая техника Изучение живых объектов При изучении с помощью микроскопа различных зоологических объектов следует рекомендовать всюду, где это возможно, прибегать к исследованию живого материала. В ряде случаев изучение in vivo является основным методом. Это относится в первую очередь ко многим простейшим, коловраткам, низшим ракообразным и т. п. Мелкие животные рассматриваются целиком. У более крупных возможно изучение отдельных изолированных органов, При исследовании живых объектов особенно важно подобрать не только увеличение, но и соответствующее освещение. Живые ткани многих животных прозрачны и отдельные компоненты их относительно мало отличаются друг от друга по коэффициенту светопреломления. Поэтому в ярком проходящем свете ряд деталей строения не может быть рассмотрен. Обычно приходится несколько затемнять поле зрения. Последнее достигается двумя путями: уменьшением диаметра диафрагмы и опусканием осветителя. При этом резкость изображения возрастает. Иногда приходится прибегать к изучению живого объекта не при проходящем, а при падающем свете. Очень большую помощь при изучении мелких объектов оказывает фазо-контрастная установка, выпущенная в последнее время советской оптической промышленностью. Для микроскопического исследования объекты помещаются по возможности в ту же среду, в которой они живут. Чаще всего это пресная или морская вода. Для паразитов — содержимое того органа (например, кишечника), где они паразитируют. Для изолированных органов, а также для паразитов применяется физиологический раствор NaCl (для беспозвоночных следует брать NaCl 0,6%-ный) и раствор Рингера. Последний имеет следующий состав: дистиллированной воды 100 см3, NaCl 0,85 г, КО 0,025 г, СаСК 0,03 г. Хлористый кальций растворяется последним, так как в противном случае выпадает осадок. Жидкость Рингера представляет собой эквилибрированный раствор, и в нем изолированные органы, а также паразиты выживают гораздо дольше, чем в растворе NaCl. Серьезным препятствием при изучении многих объектов in vivo является их подвижность (инфузории, коловратки и др.). Для преодоления этого можно прибегнуть к различным методам. Наиболее обычным является осторожное придавливание объекта между покровным и предметным стеклом, что достигается путем отсасывания жидкости фильтровальной бумагой. К удовлетворительным результатам приводит также (особенно для инфузорий) следующий прием: на предметном стекле в капле жидкости с изучаемым объектом препаровальными иглами расщипывается на отдельные волоконца маленький кусочек гигроскопи
ческой ваты, после чего препарат покрывается покровным стеклом. Благодаря тигмотаксису мелкие животные как бы «прилипают» к волокнам ваты, оставаясь некоторое время неподвижными или мало подвижными. Для замедления движения инфузорий и других мелких двигающихся при помощи ресничек животных можно также рекомендовать перенести их в каплю раствора вишневого клея или чистого гуммиарабика. Раствор не должен быть очень густым. В вязкой среде движения животного замедляются. Неудобство данного метода заключается. в том, что при этом нередко происходит значительная деформация тела. Наконец, в некоторых случаях, главным образом для водных животных, прибегают к анестезии, которая достигается разными способами. Она служит не только для изучения объекта in vivo, но часто предшествует его фиксированию. Анестезия для простейших применима в относительно редких случаях ввиду их большой чувствительности к различным реактивам. Чаще она используется при изучении таких объектов, как коловратки, мшанки и др. Укажем следующие методы анестезии. Анестезия высокой температурой применяется к некоторым простейшим (Stentor, сувойки и др.). Объект осторожно нагревается до температуры 30—35°С. При этом движение прекращается, но разрушения еще не происходит. Малейший перегрев вызывает гибель организма и распад клетки. Среди различных анестезирующих веществ можно рекомендовать применение хлоралгидрата, сернокислого магния MgSO?,, слабых растворов спирта (10—15%). Если анестезируются относительно крупные объекты (например, мшанки), то поступают следующим образом. Объект помещают в небольшой сосуд, например кристаллизатор или солонку. Понемногу прибавляют анестезирующее вещество в виде капель крепкого раствора или же кристаллов, которые, медленно растворяясь, вызывают постепенное возрастание концентрации наркотика в среде, окружающей объект. Можно с успехом использовать еще следующий прием. Сосуд с раствором наркотика (например, кристаллизатор) помещается рядом с сосудом, где находятся животные, которых предполагают наркотизировать, но несколько выше последнего. Затем оба сосуда соединяются смоченной в воде полоской фильтровальной бумаги. В результате происходит очень медленное и постепенное проникновение наркотика в среду, окружающую животных. Как только прекратится движение животного, вызываемое внешними раздражениями (прикосновение иглой и т. п.), анестезию прекращают и приступают к изучению или фиксированию. Для мелких объектов можно рекомендовать производить анестезию непосредственно на предметном стекле при контроле под микроскопом. Анестезирующие вещества всасывают под покровное стекло при помощи фильтровальной бумаги. Указать точно необходимые концентрации наркотиков не представляется возможным, так как разные объекты требуют различной концентрации. Приходится всякий раз устанавливать необходимую для данного вида концентрацию путем непосредственного опыта. При изучении мелких, нежных объектов для того чтобы их не раздавить покровным стеклом, делают небольшие восковые ножки. Для
этого углами покровного стекла осторожно царапают размягченный предварительно воск, благодаря чему на четырех углах стекла образуются восковые ножки. Лучше брать не чистый воск, а смесь его с венецианским терпентином (2,5 г воска, 1 г терпентина). Смесь приготовляется при нагревании. Толщина ножек определяется размером объекта. Вместо восковых ножек можно подложить под покровное стекло маленькие кусочки стеклянных капилляров или просто человеческий волос. Фиксация Кроме живого материала в большинстве случаев при изучении зоологических объектов используются фиксированные и окрашенные тем или иным способом препараты. Первым этапом при изготовлении микроскопического препарата служит фиксирование материала. Оно преследует цель быстро убить животное, не вызвав значительных нарушений анатомических и гистологических структур. Нужно, однако, иметь в виду, что не существует фиксирующих жидкостей, которые полностью сохраняли бы структуры, имеющиеся у живого объекта. В состав фиксирующих жидкостей (сокращенно их называют «фиксаторами») входят сильнодействующие на живую протоплазму вещества, достаточно быстро проникающие в ткани объекта. Обычными компонентами фиксаторов являются растворы сулемы, пикриновой и хромовой кислоты, осмиевой кислоты, а также формалин, спирт, уксусная кислота и некоторые соли. Продолжительность самого процесса фиксирования варьирует в зависимости от объекта и состава жидкости в широких пределах. Сроки фиксации будут указаны ниже при рассмотрении отдельных фиксаторов. В состав фиксирующих жидкостей входят некоторые ядовитые вещества. Поэтому необходимое условие работы с ними — строгое соблюдение всех установленных правил техники безопасности. При фиксировании материала следует руководствоваться следующими общими правилами. Объем фиксирующей жидкости должен в несколько десятков раз превосходить объем фиксируемого объекта. Размеры объекта не должны быть слишком велики, чтобы фиксатор мог достаточно быстро проникнуть в ткани, а не вызывать медленное отмирание их. Как правило, не следует допускать величину объекта больше 0,5 см в поперечнике. Если животное крупнее, его режут на части или же вырезают и фиксируют отдельные органы. Фиксатор никогда не приливается постепенно. Объект переносится в фиксатор или же последний выливается на объект. Если имеется оболочка или кутикула, не пропускающая или медленно пропускающая фиксирующие жидкости, то объект прокалывается иглой или же надрезается ножницами. Существует множество разнообразнейших фиксирующих жидкостей, большинство которых представляет собой различные смеси. Мы рассмотрим лишь немногие из них, наиболее часто применяемые в зоологической практике и дающие достаточно удовлетворительные результаты. После фиксации в большинстве случаев необходимо произвести
отмывку объекта для того, чтобы удалить из тканей остатки фиксатора. Для разных фиксирующих жидкостей применяются различные методы н сроки отмывки, поэтому соответствующие указания будут даны при описании отдельных фиксаторов. Формалин. Одна из наиболее часто используемых консервирующих жидкостей. Обычно применяется 4%-ный раствор, который получается путем разбавления покупного 40%-ного формальдегида в 10 раз. Иногда для фиксирования применяется 10%-ный формалин. Непосредственно в формалине можно и хранить объект. Формалиновый материал может применяться для вскрытия (крупные объекты), а также для изготовления тотальных препаратов. Предварительно объекты длительно (сутки) отмываются в воде. Нужно иметь в виду, что после формалина ткани плохо прокрашиваются красками. Для гистологических целей фиксация формалином мало пригодна. Изготовление срезов из формалинового материала следует применять лишь в крайних случаях при отсутствии другого материала. Метиловый спирт. Как фиксирующая жидкость применяется редко, почти исключительно для фиксации сухих мазков крови (см. с. 78, 166). Этиловый спирт. В качестве фиксатора используется или абсолютный, или же 96°, чаще 70°. Абсолютный спирт удовлетворительно фиксирует небольшие объекты. Продолжительность действия его от 2 ч до суток. Рекомендуется за это время сменить спирт 2—3 раза. После этого объект либо переводится для хранения в 70° спирт, либо непосредственно заливается в парафин или целлоидин. После фиксации абсолютным спиртом получаются удовлетворительные гистологические картины. Недостатком его служит обычно сильное сморщивание объекта, происходящее в силу быстрого обезвоживания. 96 и 70° спирты фиксируют гораздо хуже, чем абсолютный, и для изучения гистологии мало пригодны. Часто применяются для консервирования небольших объектов (сосальщики, Oligochaeta) и последующего изготовления .тотальных препаратов. Спирт с формалином. Применяется широко при гистологическом изучении позвоночных животных. Может быть использован и при работах с беспозвоночными. Изготовляется следующим образом: 70° спирт — 100 см3, формалин 40%-ный — 2—3 см3. Продолжительность фиксации 12—24 ч, после чего объекты переводятся в 70° спирт, где и хранятся впредь до дальнейшей обработки. Дает удовлетворительные результаты. Этот фиксатор удобен главным образом в силу своей доступности, так как спирт и формалин имеются в каждой лаборатории. Фиксирующие жидкости, содержащие сулему. Наиболее распространенные в лабораторной практике фиксирующие жидкости содержат в качестве основного компонента сулему. Все они характеризуются быстрым действием и относительно короткими сроками фиксации. Сулема чаще всего применяется в форме насыщенного раствора, изготовляемого следующим образом. Берется кристаллическая сулема из расчета 8—• 9 г на 100 см3 дистиллированной воды. Нагревается до кипячения и охлаждается (лучше в темноте); при этом избыток сулемы выпадает в. осадок, а насыщенный раствор (около 7%) декантируется.
После фиксации сулемовыми смесями требуется длительная про- ' мывка в дистиллированной воде (не менее суток при многократной смене) для полного удаления следов фиксатора. Вместо длительной промывки часто применяется иодирование. Оно основано на том, что иод образует с сулемой комплексное, легко растворимое соединение. При иодировании объекты после фиксации сначала переносятся на короткий срок в 70° спирт, после чего переводятся в слабый раствор иода в 70° спирте. Последний должен иметь оттенок чая средней крепости (точно концентрация не существенна). Срок пребывания объекта в растворе иода 1—6 ч в зависимости от величины объекта. Рекомендуется раствор иода сменить хотя бы один раз. После иодирования объекты отмываются в 70° спирте, где и хранятся. При фиксировании морских животных лучше раствор сулемы готовить на морской воде. Раствор иода для иодирования применяется только 1 раз. Повторное применение той же порции раствора не рекомендуется. Сулема с уксусной кислотой представляет собой один из самых распространенных фиксаторов. Готовится следующим образом: сулема (насыщ. раствор) — 100 см3, ледяная уксусная кислота — 3—5 см3. Срок фиксации возрастает в зависимости от величины объекта от 5 до 30 мин. После фиксации длительная отмывка в дистиллированной воде или иодирование. Жидкость Шаудина особенно часто применяется для фиксации различных Protozoa и других мелких животных при изготовлении тотальных препаратов и срезов, а также мазков (см. ниже). Готовится следующим образом: сулема (насыщ. раствор)—2 части, спирт (96° или абсолютный) — 1 часть. Обычно применяется в подогретом (50—60°С) состоянии. Срок фиксации—5—10 мин. Последующая короткая промывка в 70° спирте и иодирование. После фиксации по Шаудину особенно хорошо красятся ядра. Цитоплазматические структуры сохраняются не очень хорошо. Нередко наблюдается довольно грубая вакуолизация, являющаяся артефактом. Жидкость Ценкера относится к числу лучших гистологических фиксаторов. После нее хорошо удаются разнообразные гистологические окраски. Состав ее следующий: сулема (кристаллическая) —50 г, двухромовокислый калий К2СГ2О7 — 25 г, сернокислый натрий Na2SO4—10 г, вода дистиллированная— 1000 см3. Непосредственно перед использованием прибавляется ледяная уксусная кислота из расчета 5 см3 на 100 см3 основного раствора. Смесь, в которую прибавлена уксусная кислота, длительно хранить нельзя. Модификацией Ценкеровской жидкости является Ценкер-формол (Ценкер-Хелли). При изготовлении ее вместо уксусной кислоты к основному раствору перед использованием добавляется в таком же количестве крепкий (40%-ный) формалин. Продолжительность фиксации от 10 мин до 6 ч. Чаще всего фиксируют 20—30 мин. После пребывания в жидкости Ценкера необходима длительная (не менее суток) промывка в многократно сменяемой или проточной воде. При этом происходит отмывка сулемы и двухромовокислого калия. Объекты следует отмывать до тех пор, пока они потеря-12
ют желтоватый оттенок. После промывки водой следует 70° спирт и иодирование. Если промывка совершалась достаточно долго, а размеры объекта невелики, то иодирование не обязательно. Фиксирующие жидкости, содержащие осмиевую кислоту. Наряду с сулемовыми фиксаторами в лабораторной практике широко распространены разнообразные смеси, содержащие осмиевую кислоту. Эти смеси относятся к числу лучших гистологических фиксаторов. Они весьма хорошо сохраняют цитоплазматические структуры. Общим недостатком осмиевых смесей является то, что после них не удается окраска некоторыми гистологическими красками (кармины, смесь Маллори) и сами ткани приобретают сероватый оттенок. Жировые включения окрашиваются осмиевой кислотой в черный цвет, так как OsO4 восстанавливается жиром. Поэтому для последующего изготовления тотальных (за исключением мелких объектов) препаратов осмиевые смеси обычно не применяются. Кроме того, осмиевая кислота относится к числу дорогостоящих реактивов. OsO4 легко разлагается на свету, поэтому хранить фиксирующие жидкости следует в темноте в склянках из темного стекла. Осмиевая кислота продается в запаянных стеклянных трубочках по 1 или 0,5 г. Растворять ее следует весьма осторожно, так как она легко разлагается особенно в присутствии хотя бы следов жира или спирта. Запаянная трубочка с осмиевой кислотой промывается водой, насухо вытирается совершенно чистой тряпкой (не прикасаться пальцами!), надпиливается напильником, разламывается пополам и вместе с осмиевой кислотой бросается в заранее отмеренное количество воды в склянку с притертой пробкой из темного стекла. При надламывании трубочки с осмиевой кислотой нельзя прикасаться к ней пальцами. Следует держать ее кусочками фильтровальной бумаги или чистой тряпкой. Осмиевая кислота растворяется медленно, поэтому раствор ее можно применять лишь через сутки после начала растворения. Обычно приготовляется 2%-ный раствор OsO4, который и используется для изготовления фиксирующих жидкостей. Осмиевая кислота относительно медленно проникает в ткани. Сроки фиксации всегда применяются длительные. После фиксации необходима последующая длительная отмывка (не менее суток) в часто сменяемой или проточной воде. /К ид кость Флемминга. Существуют две модификации, так называемые «крепкая» и «слабая» смеси. Последняя применяется реже для фиксации мелких и особо нежных объектов. Состав обеих модификаций следующий: «Крепкая» смесь Хромовая кислота 1 %-ная1 ... 15 см: Осмиевая кислота 2%-ная ... 4 » Ледяная уксусная кислота ... 1 » «Слабая» смесь Хромовая кислота 1 %-ная ... 25 см! Осмиевая кислота 2%-ная ... 5 » Уксусная кислота 1 %-ная ... 10 » Вода дистиллированная..........60 » 1 Хромовая кислота хранится в форме хромового ангидрида. Последний чрезвычайно гигроскопичен, поэтому необходимо держать его в баночке с притертой пробкой, залив парафином.
Небольшие кусочки тканей или мелкие объекты фиксируют не менее 24 ч. Столь же длительна и промывка в воде, которую необходимо часто менять. Первые порции воды брать дистиллированной, далее можно использовать воду из-под крана. / Жидкость Флемминга — наиболее рапространенный осмиевый фиксатор. После нее хорошо красятся ядра и сохраняются цитоплазматические структуры. Жидкость Бенда отличается от «крепкой» жидкости Флемминга почти полным отсутствием уксусной кислоты. На указанное выше количество хромовой и осмиевой кислот берется 2—3 капли ледяной уксусной. Последующая обработка — та же. Жидкость Бенда лучше жидкости Флемминга сохраняет цитоплазматические структуры, но ядра красятся после нее слабее. Жидкость Шампи состоит из следующих компонентов: Двухромовокислый калий (K2Ci2O7) 3%-ный.....................40 см3 Хромовая кислота 1%-ная.....................................40 » Осмив!ая кислота 2%-ная.....................................20 » Сроки фиксации и последующая обработка те же, что и после жидкости Флемминга. При фиксации по Шампи прекрасно сохраняются цитоплазматические структуры. Ядерные структуры, однако, после него окрашиваются плохо. Пары осмиевой кислоты применяются для фиксации мелких животных, главным образом простейших, с последующим изучением их непосредственно в капле воды без изготовления постоянного препарата. Преимущества этого метода заключаются в том, что очень хорошо сохраняются внешняя форма тела и различные ресничные образования. Живой объект в небольшой капле боды на предметном стекле быстро опрокидывается над открытой баночкой с осмиевой кислотой и выдерживается в таком положении несколько минут. После этого объект прикрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом. Фиксирующие жидкости, содержащие пикриновую кислоту. Третьей группой фиксирующих жидкостей являются смеси, содержащие пикриновую кислоту. Подобно осмиевым смесям, они дают неплохие результаты в отношении анатомии и гистологии. Тонкие цитоплазматические структуры (митохондрии и т. п.) при этом не сохраняются. После фиксации пикриновыми смесями требуется длительная промывка в 70° спирте с неоднократной сменой последнего. Менять спирт следует до тех пор, пока он не перестанет окрашиваться в желтый цвет, а объект потеряет желтоватый оттенок. Жидкость Буэна (Bouin)—одна из наиболее распространенных пикриновых смесей и дает хорошие результаты. Состав ее следующий: насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 150 см3, формалин 40%-ный .50 см3, ледяная уксусная кислота 10 см3. Продолжительность’ фиксации 1—2 чг Крупные объекты можно держать в фиксаторе до одних суток. Промывка в 70° спирте. Годится как для изготовления тотальных препаратов, так и для срезов.
Жидкость Карнуа. Кроме упомянутых выше фиксирующих жидкое- тей следует упомянуть жидкость Карнуа, не относящуюся ни к одной из указанных трех групп. Состав ее следующий: абсолютный спирт 60 см3, хлороформ 30 см3, ледяная уксусная кислота 10 см3. Фиксатор этот проникает в ткани очень быстро. Дает хорошие гистологические картины. Применяется чаще всего при изучении членистоногих. Продолжительность фиксации от 15 мин до 2 ч. После жидкости Карнуа объект переносится непосредственно в абсолютный спирт, после чего следует заливка в парафин или целлоидин. Для изготовления тотальных препаратов не применяется. Изготовление тотальных микроскопических препаратов Изготовление тотального микроскопического препарата цельного животного или отдельного органа его совершается различно, в зависимости от того, в какую среду заключается объект. Такой средой обычно являются канадский бальзам, глицерин или глицерин-желатин. При заключении в канадский бальзам объект в большинстве случаев предварительно окрашивается. Если краска водная (а таковых огромное большинство), то объект из 70° спирта, где он хранится после фиксации, переводится в дистиллированную воду для удаления спирта, а оттуда уже непосредственно в краску. Все эти манипуляции осуществляются в солонках, часовых стеклах или маленьких «бюксах». После окраски избыток ее отмывается дистиллированной водой. Окраска не обязательна. Нередко тотальный препарат делается из неокрашенного объекта. Из 70° спирта объект переводится сначала в 96°, а затем в абсолютный спирт. Абсолютный спирт из 96° спирта можно изготовить различными способами. Наилучшие результаты дает перегонка с негашеной известью. Для этого бутыль объемом 0,5—2 л почти доверху заполняется кусочками негашеной извести и заливается спиртом. Бутыль должна быть плотно закрыта. Через 10—15 дней приступают к перегонке. Бутыль помещают в водяную баню и соединяют обычными, применяемыми в химических лабораториях методами при посредстве дефлегматора с холодильником. Отогнанный абсолютный спирт следует хранить в хорошо закрытой бутыли с притертой пробкой. Более простой метод получения абсолютного спирта — обезвоживание 96° спирта действием безводного медного купороса CuSO4. Для этого обычный кристаллический медный купорос CuSO4-8H2O прокаливается на примусе или электрической плитке. Он превращается при этом в белый порошок. Не следует прокаливать слишком сильно, чтобы не произошло восстановление CuSO4 до закиси меди. Безводный CuSO4 всыпается в бутыль с притертой пробкой приблизительно на */4 ее объема и заливается спиртом. Через 1—2 дня абсолютный спирт готов к употреблению. Его либо сливают с медного купороса, либо оставляют в той же бутыли. В сосуд, где хранится абсолютный спирт, рекомендуется класть несколько кусочков прогретой в термостате желатины, которая поглощает следы воды.
Проведением через спирты возрастающей крепости достигается постепенное обезвоживание и уплотнение. Сроки пребывания в спиртах зависят в значительной мере от величины объекта и плотности тканей. Для небольших животных и органов (например, гидра, медуза, мелкие сосальщики) достаточно пребывание в каждом из спиртов 1,5—2 ч. Более крупные объекты выдерживаются по 6—12 ч. Необходимо менять спирты для того, чтобы достигнуть полного обезвоживания. Это особенно относится к абсолютному спирту, который для крупных объектов сменяется не менее двух раз. Сосуды, в которых происходит обезвоживание, должны быть хорошо изолированы от воздуха, так как спирты, особенно абсолютный, поглощают влагу. Для особо нежных объектов следует применять более последовательную шкалу спиртов возрастающей крепости, чтобы избежать образования складок и сморщивания. Можно рекомендовать следующую последовательность: дистиллированная вода—50° спирт — 60°—70°— 80°—90°— абсолютный. В редких случаях приходится прибегать к еще более последовательной смене спиртов. Прилагаемая табличка облегчает приготовление спирта любой крепости исходя из 95° спирта. Таблица разбавления спиртов (по Гей-Люссаку) Крепость разбавленного спирта в градусах Крепость разбавляемого спирта в градусах 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 Количество воды, см3 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 6,41 13,33 20,95 29,52 39,18 50,22 63,00 77,99 95,89 117,57 144,46 178,71 224,08 6,56 13,79 21,89 31,05 41,53 53,65 67,87 84,71 105,34 130,80 163,28 206,22 6,83 14,48 23,14 33,03 44,48 57,90 73,90 93,30 117,34 148,01 188,57 7,20 15,35 7,64 24,66 16,37 8,15 35,44 26,47 17,58 8,76 48,07 38,32 28,63 19,02 9,47 63,04 52,43 41,73 31,25 20,47 10,35 81,38 69,54 57,78 46,09 34,46 22,90 11,41 104,01 90,76 77,58 64,48 51,43 38,46 25,55 11,7 132,88 117,82 102,84 87,93 73,08 58,31 43,59 27,6 171,1 153,61 136,04 118,94 101,71 84,54 67,45 50,6 14,4 33,4 17,8 Примечание. В данной таблице указано, какое количество воды нужно прибавить к 100 см1 разбавляемого спирта, чтобы получить разбавленный спирт желаемой крепости. Искомая цифра расположена на пересечении соответствующего горизонтального и вертикального рядов. Например; 1) чтобы получить 70° спирт из 95°, следует к 100 см3 последнего прибавить 39,18 см3 воды; 2) чтобы получить 50° спирт из 70°, следует к 100 см3 последнего добавить 41,73 см2 воды и т. п. За обезвоживанием следует просветление объекта. В лабораторной практике применяют различные просветляющие средства. Для тотальных препаратов одним из лучших является гвоздичное масло, куда объекты переносятся из абсолютного спирта. В гвоздичном масле их выдерживают до полного просветления, что занимает для крупных
объектов около часа. Кроме гвоздичного масла хорошие результаты дает кедровое или бергамотное масло. Одну и ту же порцию масла можно использовать несколько раз. Годится также терпинеол, или касторовое масло. Вместо масел для просветления можно воспользоваться ксилолом или толуолом. Объекты при этом лучше перенести сначала в смесь равных частей ксилола (или толуола) с абсолютным спиртом и лишь после этого в чистый ксилол (толуол). В случае если объект очень нежен, при переносе его из абсолютного спирта в масло образуются многочисленные складки (например, у медуз). В таких случаях рекомендуется переход этот осуществлять постепенно. Сначала перенести объект в смесь равных частей масла с абсолютным спиртом, затем в смесь двух частей масла с одной частью спирта и, наконец, в чистое масло. Можно прибегнуть также к следующему приему. В энтомологическую пробирку налить на дно кедрового масла. Сверху прилить абсолютного спирта, куда и перенести объект. При этом объект будет очень медленно опускаться в кедровое масло, которое, в свою очередь, начнет смешиваться со спиртом. После того как объект опустился на дно, его переносят в чистое кедровое масло. Объект перекладывают осторожно шпателем или иглой. Из просветляющей жидкости объект переносят на предметное стекло в каплю канадского бальзама и покрывают покровным стеклом. Размеры капли бальзама следует рассчитать таким образом, чтобы его хватило на препарат, но чтобы он не выступал по краям покровного стекла. Если объект обладает значительной толщиной, то делают восковые ножки или подкладывают капилляры (с. 10). При заключении объекта в глицерин имеет место меньшее количество манипуляций. Из воды или 70° спирта объект переносится в смесь равных частей глицерина со спиртом (или водой), затем следуют смесь двух частей глицерина с одной частью воды или спирта и чистый глицерин. На предметном стекле объект помещается в каплю глицерина. Чтобы последний не испарялся, края покровного стекла обводятся асфальтовым лаком. В таком виде препарат может храниться годами. Для того чтобы лак пристал к стеклу, глицерин не должен выступать из-под покровного стекла и смачивать предметное стекло. Вместо глицерина можно заключить объект в глицерин-желатин. Последний приготовляется следующим образом. Чистый желатин (7 г) размачивают в течение 2—3 ч в 42 см3 дистиллированной воды, добавляют 50 г глицерина и 0,5 г кристаллической карболовой кислоты. Все вместе нагревается при помешивании на водяной бане, фильтруется и охлаждается. При этом глицерин-желатин застывает. Небольшой кусочек глицерин-желатина иглой или скальпелем переносят на предметное стекло. Последнее слегка нагревают на спиртовке, глицерин-желатин расплавляется. В него из глицерина переносится объект и покрывается покровным стеклом. Препараты в глицерин-желатине хранятся очень долго даже без окантовки асфальтовым лаком. При изготовлении тотальных п-р^поуацзв из очень мелких объектов их легко утерять. Существует несколько сриемов, облегчающих изго
товление препаратов из мелких объектов. Можно фиксировать объект непосредственно на предметном стекле, подпустив с краю под покровное стекло немного фиксирующей жидкости. При этом желательно, чтобы покровное стекло имело восковые ножки, а не плавало на поверхности жидкости. Фиксатор, а также и все последующие жидкости вплоть до канадского бальзама протягивают под покровным стеклом при помощи фильтровальной бумаги. С одной стороны покровного стекла жидкости при этом осторожно выпускают из пипетки, с противоположной — вытягивают полоской фильтровальной бумаги. Не следует пускать слишком много жидкости, так как покровное стекло может всплыть. Указанный метод позволяет все время контролировать наличие объекта при помощи лупы или микроскопа. В качестве фиксатора лучше всего применять жидкость Шаудина, так как она приклеивает объекты к предметному или покровному стеклу и при протягивании жидкости они не уплывают. Очень удобен для изготовления тотальных препаратов мелких объектов (инфузорий, личинок червей и т. п., не превышающих размеров 1 мм) метод приклеивания их к покровному или предметному стеклу целлоидином. Жидкость с живыми объектами наносят тонкой пипеткой на чисто вымытое обезжиренное стекло, распределяют равномерно по его поверхности. Избыток воды отсасывают. На стекло наливают несколько капель фиксатора (удобна жидкость Буэна). Через 10—20 мин фиксатор сливают или отсасывают. Стекло ополаскивают 96° спиртом. Объекты, слегка приклеившиеся фиксатором, остаются при этом на стекле. После этого на угол стекла с объектами наносят каплю (из пипетки) жидкого раствора целлоидина на смеси равных частей абсолютного спирта и серного эфира (0,25—0,5%). Покачиванием стекла добиваются равномерного растекания целлоидина. Стекло с объектами, покрытыми целлоидиновой пленкой, переносят на 10—15 мин (можно и больше) в 70° спирт для уплотнения пленки. После этого приклеенные к стеклу объекты можно подвергать всем этапам обработки, необходимым для получения окрашенного тотального препарата. Этот метод можно применять и в несколько иной модификации, особенно удобной при работе с культурами простейших. Объект фиксируется жидкостью Буэна в небольшом сосуде (солонке), где он оседает на дно. Затем тонкой пипеткой берут 1—2 капли фиксатора с объектом и равномерно распределяют по поверхности покровного или предметного стекла. Дальнейшая обработка идет так, как сказано выше. Часто применяется метод центрифугирования. Объекты фиксируются в центрифужной пробирке. В ней же осуществляется и вся дальнейшая смена жидкостей вплоть до просветления. При этом перед каждой сменой жидкости производится центрифугирование. Из просветляющей жидкости со дна центрифужной пробирки объекты при помощи пипетки переносятся на предметное стекло в каплю бальзама. Метод центрифугирования применяется очень часто, например при изготовлении препаратов простейших. Некоторые другие более специальные методы изготовления тотальных' препаратов из мелких объектов будут рассмотрены в специальной части данного руководства.
Декальцинация У многих беспозвоночных животных имеется внутренний или наружный скелет, состоящий из углекислой извести СаСО3. Такие объекты после фиксации перед изготовлением тотальных препаратов или срезов следует декальцинировать, т. е. растворить углекислую известь действием кислоты. Для декальцинации используется соляная или азотная кислота, которая добавляется к 70° спирту (слабый раствор 0,5—1%). Для крупных объектов концентрация HNO3 может быть доведена до 5%. Процесс декальцинации в зависимости от объекта длится от нескольких часов до суток и больше. Более крепких кислот брать не следует, так как они неблагоприятно отражаются на структуре тканей. После декальцинации объект отмывается в нескольких порциях чистого 70° спирта, после чего подвергается дальнейшей обработке (тотальный препарат, заливка в парафин). Иногда бывает полезно на несколько часов поместить декальцинированный объект в 5%-ный водный раствор Na2SO4. Это препятствует его набуханию, которое иногда имеет место после декальцинации, особенно если по ходу обработки объект приходится помещать в воду. Объекты, обладающие известковым скелетом, не следует фиксировать смесями, содержащими значительное количество кислот (сулема с уксусной), так как при этом происходит быстрое растворение СаСО3 и выделение СО2. Пузырьки газа застревают в тканях, а это мешает изготовлению препаратов. Изготовление 'мазков Различают «сухие» и «влажные» мазки. Первые имеют ограниченное применение и используются почти исключительно при изучении крови и кровепаразитов. Способы их изготовления указаны в специальной части при рассмотрении малярийного плазмодия (с. 66). «Влажные» мазки применяются часто главным образом при изучении паразитических простейших, а также и в других случаях. Мазки изготовляются следующим образом. Пинцетом берут тот орган, из которого предполагается сделать мазок, и «намазывают» на покровное стекло. Мазок должен быть совершенно равномерным и одинаковой толщины на всем покровном стекле. Если этого достигнуть сразу не удалось, то при помощи препаровальной иглы можно частично исправить мазок. Не давая подсохнуть мазку, покровное стекло опускают мазком вниз на теплую жидкость Шаудина, предварительно налитую в часовое стекло или солонку. Происходит быстрая коагуляция тканевых элементов, и мазок плотно пристает к стеклу. Дальнейшая обработка мазка та же, что и тотальных препаратов. После фиксатора следуют промывка в 70° спирте, иодирование, вторичная промывка в спирте, перенос в воду, окраска, отмывка в воде; спирты возрастающей крепости, ксилол, бальзам.
Заливка и приготовление срезов При изучении различных зоологических объектов очень часто приходится прибегать к изготовлению разрезов. Для получения тонких срезов толщиной в несколько микрон объект подвергается довольно сложной обработке, в результате которой он заключается в плотную или эластичную среду (заливка), после чего при помощи микротома разлагается на срезы. Существует два основных метода заливки — в парафин и целлоидин— с различными модификациями. При зоологических работах чаще применяется заливка в парафин. Заливка в парафин. Необходимым прибором для заливки в парафин служит термостат, отрегулированный на 56—60°С. В крайнем случае его может заменить водяная баня. Первой манипуляцией при подготовке материала к заливке в парафин является его обезвоживание, которое производится так же, как и при изготовлении тотальных препаратов. Из абсолютного спирта объект не может быть непосредственно переведен в парафин, так как эти вещества друг с другом не смешиваются. Поэтому после абсолютного спирта следует перенести объект в жидкость, которая смешивается как с абсолютным спиртом, так и с парафином. Чаще всего для этой цели служат ксилол или толуол. Из абсолютного спирта объект сначала переводят в смесь равных частей абсолютного спирта с ксилолом (толуолом), а отсюда уже в чистый ксилол. Вместо ксилола (толуола) с успехом можно применять также кедровое масло или хлороформ. Кедровое масло имеет перед ксилолом то преимущество, что в нем объект не столь сильно затвердевает, как это имеет место в ксилоле, что представляет значительное преимущество при последующей резке на микротоме. Недостаток кедрового масла заключается в том, что оно труднее, чем ксилол, замещается парафином и при заливке парафин необходимо менять. Хлороформ, напротив, в силу своей летучести легко замещается парафином, представляя в этом отношении преимущества не только перед кедровым маслом, но и перед ксилолом. Из ксилола объект переводится в смесь ксилола (или толуола, или хлороформа — в зависимости от того, через какую жидкость совершается заливка) с парафином (при заливке через кедровое масло эта манипуляция отпадает, и объект непосредственно переводится в парафин, который сменяется 2—3 раза). Для этого чистый парафин в виде мелких стружек насыпают в сосуд с ксилолом, где помещается заливаемый объект из расчета (приблизительно) равного объема жидкости и парафина, и ставят в термостат с температурой 35—40°С. Происходит медленное растворение парафина. Можно и непосредственно перенести объект из ксилола в заранее приготовленную и подогретую смесь равных частей ксилола и парафина. Сроки пребывания объекта в ксилоле и смеси последнего с парафином варьируют в зависимости от величины объекта. Обычно в ксилоле выдерживают 1—2 ч, в смеси 0,5—1 ч. Во время указанных манипуляций в термостате заранее расплавляют парафин и разливают его в часовые стекла или другие мелкие сосуды (например, маленькие кристаллизаторы) по числу отдельно заливае
мых объектов. Существенно важным является вопрос о точке плавления парафина. Для изготовления не очень тонких срезов (5 мкм и толще) берут парафин с точкой плавления 54—65°С. Парафин должен быть совершенно чистым от всяких механических примесей, поэтому рекомендуется его предварительно профильтровать через бумажный фильтр (разумеется, в термостате). Из смеси ксилола (толуола, хлороформа) с парафином объект переносится шпателем или иглами в термостат в чистый расплавленный парафин. Наиболее удобные сосуды для парафина — часовые стекла. Вовремя пребывания объекта в парафине последний 1—2 раза сменяется. Это осуществляется или путем переноса объекта в другое стекло, или путем декантации и приливания чистого парафина. Первый способ удобнее для крупных, второй — для более мелких объектов. Все эти манипуляции нужно производить быстро, так как при открывании термостата парафин застывает. Продолжительность пребывания объекта в парафине опять-таки варьирует в зависимости от его величины в пределах от 30 мин до 1,5 ч. Более продолжительные сроки приводят к излишнему затвердеванию объекта. Перед окончанием заливки объект переводят еще раз в чистый парафин в часовое стекло. Последнее предварительно слегка смазывается глицерином, что способствует в дальнейшем легкому отставанию парафина от стекла. Если объекты очень мелки и перенос их представляет затруднение, то можно обойтись декантацией парафина и произвести охлаждение в том же стекле без глицерина. Последней манипуляцией при заливке в парафин является быстрое охлаждение последнего. Предварительно наливается вода комнатной температуры в какой-либо открытый сосуд, например простоквашницу. Часовое стекло с объектом вынимают из термостата и своей нижней выпуклой поверхностью приводят в соприкосновение с водой. Начинается быстрое охлаждение и застывание парафина. Как только поверхность парафина подернется довольно толстой пленкой, стекло опускают целиком в воду. Чтобы ускорить процесс образования пленки, рекомендуется осторожно дуть на поверхность расплавленного парафина. Быстрое затвердевание парафина необходимо для того, чтобы избежать кристаллизации, которая портит объект и делает невозможной последующую резку на микротоме. После того как закончилось застывание парафина, при помощи скальпеля обрезают края (не затрагивая объекта) и застывший парафин вместе с объектом снимают с часового стекла. Последнее легко удается в том случае, если часовое стекло было предварительно смазано глицерином. При отсутствии глицерина отделить парафин от стекла сразу не удается. Тогда стекло с застывшим парафином, обрезанным по краям, вновь опускают на несколько часов в воду, после чего парафин с объектом легко отделяется от часового стекла. При отсутствии часовых стекол заливку можно вести в маленьких, сделанных из плотной белой бумаги коробочках, размеры которых определяются размерами заливаемого объекта. Такие коробочки заполняются жидким парафином, ставят в термостат и в них переносят за
ливаемый объект. После охлаждения бумага легко отделяется от парафина, заключающего объект. Иногда при охлаждении парафина в воде происходит растрескивание последнего, что делает невозможным последующую резку. Указанное обстоятельство зависит чаще всего от двух причин: 1) от слишком быстрого охлаждения и 2) от качества самого парафина. Чтобы избежать первой причины, не следует брать слишком холодную воду зимой из водопровода. Лучше всего пригодна вода, имеющая температуру 14—16°С. Со второй причиной бороться труднее. В большинстве случаев помогает прибавление к парафину небольшого количества пчелиного воска (не более 7ю по объему), который делает его более мягким и эластичным. Нужно иметь в виду, что избыток воска делает парафин слишком мягким. Это препятствует последующей резке на микротоме. Заливка в целлоидин. Продажный целлоидин, имеющий вид прозрачных режущихся ножом пластинок, разрезают на мелкие кусочки и высушивают на воздухе (оберегать от пыли!). Приготовляется четыре разной крепости раствора целлоидина в смеси равных объемов абсолютного спирта и серного эфира, а именно: 1, 2, 4 и 8%-ный раствор. Целлоидин растворяется очень медленно, и весь процесс приготовления указанных растворов занимает 2—3 дня. Хранить их следует в небольших склянках с хорошо притертыми пробками, обмазанными вазелином, так как эфир легко испаряется. Объект, подлежащий заливке, основательно обезвоживают абсолютным спиртом, после чего переносят в смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира. Отсюда он поступает последовательно в растворы целлоидина возрастающей крепости. В каждой из них объект выдерживается не менее 2 суток. Крупные объекты приходится держать в каждом растворе по 5—7 дней. Из банки с 8°/0-ным раствором целлоидина объект переносят в маленькую чашку Петри или на часовое стекло и заливают 8—10%-ным раствором целлоидина. Сосуд оставляют открытым и ставят в эксикатор, где происходит благодаря испарению эфира и спирта постепенное застывание целлоидина. Прямо на воздухе сосуд оставлять не следует,. так как атмосферная влага может вызвать помутнение целлоидина и потерю им эластичности. При отсутствии эксикатора можно воспользоваться простым стеклянным колпаком. Для ускорения затвердевания целлоидина под колпак иногда ставят открытую баночку с хлороформом, в парах которого процесс уплотнения целлоидина протекает более быстро и занимает 1—2 суток. К концу его целлоидин приобретает консистенцию густого желе и легко режется ножом. При помощи скальпеля вырезают объект с окружающим его слоем целлоидина в форме прямоугольной призмы. Не следует обрезать целлоидин вплотную к объекту. Вокруг объекта нужно оставить небольшой слой его в 2—3 мм. Вырезанный указанным способом блок промывают в 70° спирте, после чего сразу же приклеивают к пробке или небольшой деревянной призме. Для этого берут густой раствор целлоидина, наносят его на-пробку или деревяшку и прикладывают целлоидиновый блок. Оставля-22
ют на короткий срок затвердеть на воздухе или под колпаком, после чего опускают в банку с 70—80° спиртом. В нем происходит окончательное уплотнение целлоидина, и объект плотно пристает к пробке. В спирте целлоидиновые блоки могут храниться долгое время,прежде чем подвергнутся резке на микротоме. Приклеивание к пробке или деревяшке необходимо потому, что они зажимаются в объектодержателе микротома во время резки. При заливке в целлоидин важно наблюдать, чтобы получилась необходимая консистенция целлоидина, что устанавливается путем практики. Если уплотнение недостаточно, то не удается получить тонких срезов (тоньше 15—20 мкм). Если, напротив, целлоидин слишком тверд, то он плохо режется бритвой. Целлоидин-парафиновая заливка по Петерфи. Наряду с чистой парафиновой и целлоидиновой заливками в микроскопической технике нередко применяется комбинированная целлоидин-парафиновая заливка. Среди различных методов ее наиболее удобным для зоологических объектов является метод Петерфи. При комбинированной заливке объект сначала пропитывается целлоидином, после чего уже происходит заливка в парафин. Преимущество этих методов заключается прежде всего в том, что пропитанные целлоидином объекты при последующей заливке в 'парафин лучше режутся на микротоме. Это имеет особенное значение для объектов, обладающих значительной твердостью, как, например, большинство членистоногих с их хитиновым покровом. Кроме того, во время резки не происходит смещение органов, которое иногда наблюдается при простой парафиновой заливке. Наконец, некоторые специальные видоизменения двойной заливки позволяют точно ориентировать мелкие объекты, что при парафиновой заливке нередко представляет затруднения. При заливке по Петерфи сначала производится обычно обезвоживание объекта, который доводится до абсолютного спирта. После этого объект переносят в 1%-ный раствор целлоидина в гвоздичном масле. Последний приготовляется следующим образом: 2%-ный раствор сухого целлоидина в смеси равных количеств абсолютного спирта и серного эфира разбавляется гвоздичным маслом в отношении I : 1 (по объему) . Хранится в плотно закрывающейся посуде. Можно прямо растворять целлоидин в гвоздичном масле. Нужно иметь в виду, что при этом растворение целлоидина происходит чрезвычайно медленно. Иногда следует использовать более крепкий (3—4%-ный) раствор целлоидина, особенно в тех случаях, когда заливаются объекты, обладающие большой плотностью тканей (например, членистоногие). Гвоздичное масло может быть заменено метилбензоатом, представляющим собой преломляющую свет жидкость с характерным запахом. Некоторые авторы (например, Ромейс) предпочитают метилбензоат гвоздичному маслу. Необходимо иметь в виду, что метилбензоат ядовит и вдыхание паров его строго противопоказано. Поэтому все манипуляции с метилбензоатом надо вести в вытяжном шкафу. В растворе целлоидина объект выдерживается не менее суток. Если производится заливка объекта, обладающего плотными покровами (чле
нистоногие) и при обычной парафиновой методике плохо режущегося на микротоме, то следует в растворе целлоидина выдерживать более длительные сроки — неделю и больше. В растворе целлоидина в гвоздичном масле объекты могут пребывать неограниченно долгий срок. После раствора целлоидина следует хлороформ, в котором выдерживают объект (в зависимости от размеров) 1—2 ч. При этом целлоидин желатинизируется. В том случае, если раствор целлоидина был приготовлен на метилбензоате, вместо хлороформа можно взять бензол. За хлороформом (бензолом) следуют, как при обычной парафиновой заливке, хлороформ с парафином (бензол с парафином) и чистый парафин. Продолжительность пребывания в последнем та же, что и при обычной заливке. Некоторым видоизменением рассмотренного метода является заливка в целлоидиновых каплях, используемая для очень мелких объектов. При этом объекты (например, инфузории), находящиеся в растворе целлоидина в гвоздичном масле, помещаются в центрифужную пробирку и центрифугируются. Со дна пробирки объекты вместе с раствором целлоидина набираются в пипетку с довольно широким отверстием (прибл. 2—3 мм). Из пипетки капают в хлороформ. Капли раствора целлоидина, как только они попадают в хлороформ, сразу же желатинизируются, образуя небольшие прозрачные шарики, внутри которых заключены заливаемые объекты. При дальнейшей обработке эти шарики при посредстве шпателя переносятся в хлороформ-парафин и парафин. В дальнейшем на микротоме режется целый шарик. Удобство этого метода заключается в том, что вместо того чтобы иметь дело с очень мелкими объектами, перенося их из жидкости в жидкость, приходится оперировать с довольно крупной каплей целлоидина. Главный недостаток в том, что ориентировка объектов получается случайной. Кроме заливки мелких объектов в целлоидиновой капле существует метод заливки их на целлоидиновых пластинках, который позволяет производить очень точную ориентировку даже очень мелких объектов (отдельных инфузорий и т. п.). Прежде чем приступить к заливке упомянутым методом, заготовляют целлоидиновые пластинки. Для этого 4—5%-ный раствор целлоидина в смеси абсолютного спирта и эфира выливают в чашку Петри слоем толщиной 5—7 мм. Целлоидину дают застыть под стеклянным колпаком в парах хлороформа (ставится открытая баночка или кладется ватка, смоченная хлороформом). Через 2—3 суток застывший целлоидин нарезают скальпелем небольшими кусочками призматической формы и хранят в банке с терпинеолом. Важно, чтобы целлоидин имел необходимую консистенцию. Он не должен быть слишком мягким, желеобразным. Вместе с тем излишняя плотность его будет препятствовать дальнейшей резке на микротоме. Он должен сохранять эластичность и свободно резаться скальпелем. В терпинеоле целлоидиновые пластинки могут храниться неограниченно долгое время. При заливке по Петерфи на пластинках берут небольшую целлоидиновую пластиночку и стороны ее подравнивают скальпелем. Необходимо, чтобы она имела форму прямоугольной призмы, причем отдельные плоскости должны быть строго перпендикулярны друг другу. Размеры 24
пластинки зависят от величины и количества объектов. Как удобный размер можно указать: длина 3 мм, ширина 2 мм, высота 1,5 мм. Подготовленную указанным способом целлоидиновую пластиночку обсушивают от терпинеола фильтровальной бумагой, переносят на предметное стекло, где кладут широкой поверхностью кверху. Дальнейшие манипуляции лучше производить на предметном столике штативной лупы или бинокуляра (в зависимости от размеров заливаемого объекта). При помощи тонкой пипетки объект из раствора целлоидина в гвоздичном масле переносят на целлоидиновую пластинку. При помощи тонких игл он ориентируется (под лупой и бинокуляром) определенным образом относительно краев (ребер) целлоидиновой пластинки. Например, если заливается инфузория туфелька, то ее можно ориентировать длинной осью тела перпендикулярно к короткому ребру верхнего основания целлоидиновой пластинки. На одну и ту же пластинку можно расположить несколько объектов. На поверхность пластинки не следует вместе с объектом из пипетки вносить большое количество раствора целлоидина в гвоздичном масле. В таком случае объекты будут плавать и ориентировать их не удастся. Нужно, чтобы они лежали на поверхности пластинки, будучи лишь смочены раствором целлоидина. Не рекомендуется также на одной и той же пластинке располагать слишком много объектов, так как это затрудняет ориентировку. Объекты из раствора целлоидина можно брать не пипеткой, а небольшим крючочком, сделанным, например, из зубочистки. При этом захватывается меньшее количество раствора целлоидина. После того как ориентировка объекта закончилась, целлоидиновую пластинку переносят на 15— 20 мин в пары хлороформа, где происходит желатинизация целлоидина, и благодаря этому объект оказывается плотно приклеенным к целлоидиновой пластинке. Для этого удобнее всего поступать следующим образом: предметное стекло с лежащей на нем целлоидиновой пластинкой . переносят в чашку Петри, кладут на дно ее ватку, смоченную хлороформом, и прикрывают крышкой. После паров хлороформа пластинку переносят пинцетом в хлороформ на 1—1,5 ч, вплоть до полного просветления как объекта, так и самой пластинки. Далее заливка идет обычным способом. В самый момент охлаждения часового стекла в конце заливки следует обратить внимание на то, чтобы та сторона целлоидиновой пластинки, на которой помещается объект, оказалась направленной к стеклу, а не в толщу парафина. Это важно для того, чтобы иметь возможность в дальнейшем при резке видеть объект. Указанный способ заливки мелких объектов имеет то большое преимущество, что позволяет достигнуть точной ориентировки. Приклеив объект к целлоидиновой пластинке, в дальнейшем приходится иметь дело уже не с мелким объектом, перенос которого из жидкости в жидкость представляет значительные затруднения, а со всей пластинкой в целом. Зная, например, что длинная ось заливаемой инфузории ориентирована параллельно длинной оси пластинки, можно наверняка сказать, что, порезав на микротоме пластинку поперек, мы вместе с тем получили поперечные срезы инфузории. Если подлежащие заливке объекты очень мелки и их трудно отыскать после просветления в целлоидине с гвоздичным маслом даже под
лупой или бинокуляром, то следует их предварительно подкрасить. Для подкраски лучше всего взять какую-нибудь цитоплазматическую краску (например, эозин) или же гематоксилин Бёмера (с. 30). Резка после парафиновой или парафино-целлоидиновой заливки-Прежде чем приступить к резке на микротоме, вырезают объект при помощи острого скальпеля в форме правильного «блока» из общей массы парафина. Срезать избыточный парафин не следует вплотную к объекту. Необходимо оставить слой его не менее 1 мм. При заливке по Петерфи на пластинках парафин также не следует срезать вплотную к целлоидину. Сам парафиновый блок с объектом должен иметь форму четырехгранной призмы со строго параллельными поверхностями и противоположными ребрами. Если толщина объекта неравномерна на всем протяжении блока, то можно придать ему форму усеченной четырехгранной пирамиды, строго соблюдая при этом параллельность противоположных верхних ребер. Парафиновый блок прикрепляется на пробку или четырехгранную деревянную призму, поверхность которой залита небольшим . количеством парафина. Само прикрепление совершается путем нагревания основания блока разогретой на пламени спиртовки иглой или скальпелем. После этого деревяшка или пробка, на которую прикреплен парафиновый блок, закрепляется в объектодержателе микротома и при помощи винтов ставится на уровень микротомного ножа. Микротомный нож (бритва), который применяется для резки парафиновых блоков, несколько отличается от бритвы, применяемой для целлоидиновых блоков. На первых обычно имеется отметка в виде буквы Ь, на вторых — буквы а. Различие между ними сводится к разной величине утла, под которым совершается точка лезвия. Сам микротом к моменту резки следует начисто вычистить и смазать костяным маслом. Парафиновый блок должен быть обращен к микротомному ножу своей длинной гранью и той стороной, ближе к которой расположен объект. Край его ориентируется строго параллельно краю бритвы. Необходимое положение парафинового блока достигается при помощи нескольких винтов, благодаря наличию которых объектодержатель может двигаться в вертикальном направлении, а также менять свой угол в отношении вертикальной оси. После того как необходимое положение парафинового блока в объектодержателе достигнуто, производится установка желательной толщины среза. Сама резка достигается равномерными не очень быстрыми движениями бритвы, причем каждому движению предшествует поднятие объектодержателя на толщину среза при помощи подающего механизма. Движение бритвы производится правой рукой работающего, которой он прикасается к специальной ручке салазок микротомной бритвы. Не следует нажимать на салазки, так как это повлечет неравномерную толщину срезов. Салазки бритвы должны двигаться по рельсам совершенно свободно. Если резка идет хорошо, то отдельные срезы склеиваются между собой, образуя ленту. Кусочки ленты при помощи влажной кисточки переносят на предметное стекло. Длина кусочка ленты должна быть на 2—3 мм уже ширины покровного стекла, которым в дальнейшем предполагается прикрыть препарат. Предметное стекло, на которое переносят парафиновые срезы, предва
рительно обезжиривается (кипячение в растворе соды и промывка в воде), слегка смазывается смесью глицерина с белком1 и смачивается дистиллированной водой. Парафиновые срезы кладутся на воду, которой не дают испариться, добавляя ее кисточкой или пипеткой. Для дальнейшей обработки весьма желательно возможно аккуратнее располагать срезы на предметном стекле, что особенно необходимо при получении серии срезов. Чтобы площадь, занятая срезами, соответствовала точно размерам покровного стекла, можно рекомендовать пользоваться шаблончиками, которые подкладываются под предметное стекло. На шаблончик наносятся контуры как предметного, так и покровного стекла. Срезы раскладываются только в области последнего. Следующей манипуляцией является расправление срезов. Предметное стекло, смоченное водой, с парафиновыми срезами осторожно нагревают, для чего несколько раз проводят над пламенем спиртовой горелки. Ни в коем случае нагревание не следует доводить до расплавления парафина. Подогретые срезы расправляются, теряют имеющиеся складки и становятся совершенно гладкими. После этого предметное стекло со срезами подсушивают в термостате при температуре 35—40°С. При этом срезы плотно пристают к предметному стеклу. Высушенные срезы, при условии изоляции их от пыли, могут без дальнейшей обработки храниться очень долго. Резка на микротоме требует известных навыков и практики. У начинающего дело далеко не всегда идет гладко. Отметим некоторые наиболее часто встречающиеся трудности. 1. Отдельные срезы на самой бритве закручиваются и не образуют ленты. Это зависит обычно от двух причин: или парафин слишком тверд, или же окружающая температура слишком низка. Указанного недостатка иногда удается избежать, слегка подогрев бритву или поставив около микротома какой-либо нагревательный прибор. 2. Срезы сильно мнутся и их на предметном стекле не удается расправить. Обычно это наблюдается с очень тонкими срезами (тоньше 5 мкм). Возможные причины: парафин слишком мягок, температура слишком высока. Возможные пути исправления: медленнее вести бритву, охладить блок (холодной водой или смочив основание его серным эфиром), перезалить в парафин с более высокой точкой плавления. 3. На срезах образуются полосы и царапины, идущие в направлении движения бритвы. Причина этого явления заключается в том, что на бритве имеются неровности. Следует переменить место, которым режется блок, передвинув бритву в держателе. 4. Объект не режется, а крошится и выпадает из срезов. Это указывает на то, что он не пропитался парафином, что в свою очередь может зависеть от ряда причин. Чаще всего это бывает обусловлено тем, что перед заливкой объект недостаточно обезвожен. Путь исправления: 1 Готовится следующим образом: взбивают яичный белок, после чего ему дают «спасть», и фильтруют через фильтровальную бумагу. Разбавляют пополам глицерином. Чтобы избежать гниения, добавляют кристалл тимола.
растворить парафин в ксилоле, перенести- объект вновь в абсолютный спирт и залить заново. Указанными выше моментами не исчерпываются все те затруднения, с которыми можно встретиться при резке на микротоме. Необходимые практические навыки приобретаются, однако, довольно быстро, и при наличии хороших реактивов и исправного микротома овладеть искусством хорошо резать не представляет особой трудности. После высушивания парафиновые срезы оказываются плотно приклеенными к предметному стеклу, что облегчает все дальнейшие манипуляции с ними, которые удобнее всего производить в цилиндрических стаканчиках с хорошо подогнанной пробкой. Парафин растворяется ксилолом или толуолом. В стаканчик, наполненный одной из указанных жидкостей, предметные стекла со срезами опускаются на 3—5 мин. После этого они переносятся в абсолютный спирт. Последний с успехом может быть заменен карбол-ксилолом или карбол-толуолом, который приготовляется следующим образом. Кристаллическая карболовая кислота (фенол) расплавляется в термостате и приливается в стаканчик с ксилолом или толуолом в количестве — 1/з объема последних. Можно, не расплавляя фенола, всыпать его на дно стаканчика и залить ксилолом. Растворение карболовой кислоты происходит быстро. Из абсолютного спирта или карбол-ксилола срезы поступают в 96, 70° спирт и, наконец, дистиллированную воду. При переносе предметного стекла со срезами из одной жидкости в другую рекомендуется при помощи фильтровальной бумаги или тряпочки обтирать тыльную сторону стекла (где нем срезов), чтобы избежать быстрой порчи жидкостей. После воды приступают к окраске срезов (о методах окраски см. следующую главу). Окрашенные срезы обрабатывают в порядке, обратном рассмотренному выше. Из воды они поступают в 70° спирт, далее следует 96° спирт, карбол-ксилол (или абсолютный спирт) и ксилол. После ксилола на срезы наносят каплю канадского бальзама (или дамар-лака, растворенного в ксилоле, или пихтового бальзама) и препарат покрывают покровным стеклом. Тыльная сторона обтирается тряпочкой. После того как произойдет подсыхание бальзама, препарат готов для изучения. В том случае, если объект был окрашен до заливки (например, борным кармином, с. 30), указанные манипуляции значительно сокращаются. Парафин на срезах растворяется ксилолом, после чего непосредственно наносят бальзам и накладывают покровое стекло. Главная неудача, которая иногда постигает занимающегося при обработке срезов, сводится к тому, что последние отклеиваются от стекла, после чего оказываются безвозвратно потерянными. Чаще всего это происходит при переводе стекла из 70° спирта в воду, а иногда и раньше. Причиной этого явления обычно служит недостаточное предварительное подсушивание срезов или же подсушивание их при низкой температуре, а не при 30—40°С. Вторая причина, обусловливающая отклеивание срезов, — грязное предметное стекло, несущее следы жира. Особенно тщательно следует расправлять и подсушивать срезы при двойной целлоидин-парафиновой заливке, так как целлоидин относительно плохо пристает к предметному стеклу.
Резка после целлоидиновой заливки. Укажем лишь на основные различия резки целлоидиновых блоков от резки парафиновых блоков. Бритва ставится не параллельно краю блока, как это имеет место при парафиновых срезах, а под углом в 45°. Сама резка производится под 70° спиртом. Для этого как на поверхность блока, так и на бритву при помощи кисточки постоянно наносится спирт. Ленты не образуются, и каждый срез отдельно при помощи кисточки переносится в 70° спирт, налитый в кристаллизатор или небольшую чашку Петри. Таким образом, для получения серии срезов целлоидиновая заливка менее пригодна, чём парафиновая. На поверхности бритвы во время резки получающиеся срезы обычно оказываются в большей или меньшей степени смятыми. Они расправляются при переносе в 70° спирт. Существуют методы получения серий срезов и при целлоидиновой заливке, но они довольно сложны и здесь не рассматриваются. Обработка целлоидиновых срезов идет по существу так же, как тотальных препаратов. Если предполагается далее окрашивать срезы, то из 70° спирта кисточкой или шпателем их переносят в 50° спирт и затем в воду. После окраски следуют спирты возрастающей крепости, карбол-ксилол и ксилол (толуол). Из ксилола опять-таки шпателем срез переносится на предметное стекло в каплю бальзама и накрывается покровным стеклом. Если на срезе образовались складки, то они расправляются на предметном стекле осторожными движениями. Полезно также на покровное стекло положить небольшой груз (например, гирьку в 10—15 г) и оставить подсохнуть бальзам на сутки. Таким образом, в отличие от парафиновых срезов при целлоидиновой заливке та среда, в которую производилась заливка, не удаляется, а остается в препарате. Благодаря тому, что целлоидин прозрачен и слабо окрашивается большинством красок, это не препятствует изучению препарата. В тех случаях, когда объект окрашен еще до заливки, соответственно число отдельных манипуляций со срезами сокращается. Из 70° спирта они переносятся в 96°, а затем в карбол-ксилол и ксилол, после чего* помещаются в бальзам на предметном стекле. Целлоидиновые блоки не удается порезать столь же тонко, как парафиновые. Обычная толщина целлоидиновых срезов 15—30 мкм. Срезы тоньше 10 мкм не удаются — целлоидин рвется и сморщивается. Этот метод применяется для относительно крупных объектов с плотными покровами и там, где нет необходимости в получении серии срезов. Окраска препаратов Обычные гистологические красители распадаются на две группы: основные и кислые. Первые преимущественно окрашивают ядерные структуры, вторые — цитоплазму. Не останавливаясь на химической характеристике разных групп красителей, укажем лишь, что самый процесс гистологической окраски представляет собой явление весьма сложное и разнородное. Здесь играет роль плотность структур и дисперсность краски, т. е. явления физического порядка. Существенное значение имеет электроадсорбция, в некоторых случаях несомненно происходит химическое связывание красителя.
Среди огромного количества красителей рассмотрим относительно немногие, которые рекомендуются нами в специальной части Практикума. Сначала изложим способы изготовления и применения основных, затем — кислых красителей и в конце остановимся на более сложных комбинированных и некоторых специальных методах окрашивания препаратов и цитохимии. Квасцовый кармин. Приготовление. Калийные квасцы, 3—5 г, растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Можно вместо калийных взять аммиачные квасцы. Прибавляют 2 г мелкоистертого кармина (среди различных сортов кармина лучше брать кармин-накарат). Кипятят в течение часа. Остужают и фильтруют. Добавляют 1 см3 формалина или кристалл тимола, чтобы избежать развитие плесени. Способ применения. Квасцовый кармин применяется главным образом для окраски тотальных препаратов. Объекты переносятся в него из воды и водой же после окончания окраски обмываются. Продолжительность пребывания объекта в краске невелика (обычно 5—• 15 мин), точно устанавливается всякий раз опытным путем. Квасцовый кармин — один из лучших красителей для тотальных препаратов. Он окрашивает элективно ядра и слабо цитоплазму. Благодаря этому им трудно перекрасить объект. Имеет весьма широкое применение. Борный кармин. Приготовление. Кармин, 2—3 г, смешивают с 4 г буры и вместе возможно мельче растирают в ступке. Растворяют в 100 см3 воды при нагревании. После охлаждения добавляют 100 см3 70%-ного спирта. Оставляют стоять несколько недель, после чего фильтруют. Способ применения. Окраска борным кармином представляет собой один из классических старинных методов. Используется прежде всего для окраски объектов, предназначенных для заливки. Продолжительность окраски 1—3 дня. После этого следует оттянуть избыток краски при помощи очень слабо подкисленного соляной кислотой (0,25—0,5%) 70° спирта (дифференцировка), что длится тоже от 1 до 3 дней. Дифференцировать следует до тех пор, пока из объекта перестает извлекаться краска, образующая вокруг него как бы облачко. После этого объект отмывается в чистом 70° спирте и заливается в парафин или целлоидин. Срезы не требуют дополнительной подкраски. Элективно окрашиваются ядра. Борный кармин часто применяется также для окраски тотальных препаратов. При этом лучше перекрасить объект и избыток краски оттянуть подкисленным спиртом. Борный кармин иногда применяется также в сочетании с некоторыми другими цитоплазматическими красками. Гематоксилин Бёмера. Приготовление. Гематоксилин 1 г, растворяют в 10 см3 96° спирта. Отдельно готовят 200 см3 10%-ных калиевых квасцов. Раствор гематоксилина к раствору квасцов добавляют постепенно в течение нескольких дней. Сначала — по каплям, затем по >/2—1 см3 за раз. Перед окрашиванием краска должна «созреть», что занимает около двух недель. Способ применения. Гематоксилин Бёмера применяется для окраски как тотальных препаратов, так и срезов. Обычно перед исполь-чп
зованием разбавляют в 2 раза водой. Окраска непродолжительна (несколько минут). В случае если объект перекрашен, возможно оттянуть избыток краски подкисленным спиртом. В этих случаях получаются более отчетливые картины, чем при прогрессивной окраске. С?резы после окраски длительно отмывают в сырой воде, где они приобретают сиреневый оттенок. При окраске срезов гематоксилин Бремера часто комбинируется с какой-нибудь протоплазматической окраской, например эозином. Кислый гематоксилин Эрлиха. Приготовление. Гематоксилина 2 г растворяют в 100 см3 96° спирта. Прибавляют 100 см3 дистиллированной воды, 100 см3 чистого глицерина, 3 г калиевых квасцов и 10 см3 ледяной уксусной кислоты. Получающийся светло-красный раствор должен «созревать» не менее 14 дней в открытой бутыли. Цвет его при этом меняется на вишнево-красный. Способ применения. Дает хорошие результаты при окраске срезов; Иногда применяется и для тотальных препаратов. Продолжительность пребывания срезов в краске 2—6 мин. После окраски длительная промывка в водопроводной воде. В результате элективная синяя окраска ядер. Возможно комбинирование с кислыми цитоплазматическими красками. Железный гематоксилин Гейденгайна. Один из наиболее широко распространенных красителей, дающих прекрасные результаты при окраске как срезов, так и небольших объектов in toto. В отличие от предыдущих методов железный гематоксилин относится к числу красок, для которых требуется предварительная протрава и последующая (после окраски) дифференцировка. Приготовление. 0,5 г гематоксилина растворить в 10 см3 96° спирта. Разбавить 90 см3 дистиллированной воды. Раствор должен «созревать» в открытом сосуде 3—4 недели. Перед использованием разбавляется в два раза водой. В качестве протравы служит 3%-ный раствор железно-аммиачных квасцов. Дифференцировка ведется 1,5%-ным раствором железо-аммиачных квасцов или раствором пикриновой кислоты (насыщенный водный раствор, вдвое разбавленный дистиллированной водой). Способ применения. Срезы, или мазки, или мелкие объекты целиком из воды поступают на 6—24 ч в 3%-ные железо-аммиачные квасцы, которые служат протравой к предстоящей окраске. После квасцов быстро споласкивают водой и переносят в раствор гематоксилина на 12—24 ч. В гематоксилине объекты становятся совершенно черными и для получения препарата требуется их дифференцировать. Перед дифференцировкой объекты из гематоксилина переносят на 0,5—1 ч в дистиллированную или водопроводную воду. Дифференцировка (оттягивание избытка красителя) совершается в 1,5% -ных квасцах при постоянном контроле под микроскопом (обычно при малом увеличении). Срезы дифференцируются относительно недолго (2—5 мин в зависимости от толщины среза и характера тканей), дифференцировка мазков и тотальных препаратов занимает гораздо больше времени, иногда до 1 ч. Если малое увеличение микроскопа недостаточно для того, чтобы
понять, достигла ли дифференцировка должной степени, то срезы переносят в дистиллированную воду и рассматривают при большом увеличении. Это необходимо потому, что объектив большого увеличения имеет малое фокусное расстояние. Опускать же его в квасцы нельзя — от этого портятся линзы. Опустить объектив в дистиллированную воду можно без вреда, необходимо только протереть его потом сухой мягкой тряпкой,- Дифференцировку удобнее всего вести в чашках Петри. По окончании дифференцировки объекты основательно отмывают в проточной или часто сменяемой воде (1—2 ч) и после этого обычным способом заключают в бальзам. Железный гематоксилин — в некотором отношении универсальный краситель. Он прекрасно выявляет не только ядра, но и разнообразные цитоплазматические структуры, которые окрашиваются в темно-синий цвет. Железный гематоксилин, особенно при окраске срезов, часто комбинируют с различными цитоплазматическими кислыми красителями, например эозином. Хорошие результаты дает модификация окраски железным гематоксилином, предложенная Кливлендом. Основной раствор готовится по приведенной выше прописи. «Созревания» раствора не требуется. Он используется сразу по изготовлении. Препараты переводятся в раствор гематоксилина на 30—60 мин из 4%-кого раствора железоаммиачных квасцов без промывания. Дифференцировка в 4%-ных железоаммиачных квасцах или в растворе пикриновой кислоты (по приведенной выше прописи). После дифференцировки промывка в проточной воде, спирты, доведение до бальзама по обычной схеме. Эозин. Растворы эозина употребляются главным образом для подкраски окрашенных гематоксилином препаратов. Придает протоплазме розоватый оттенок. Приготовление. Существуют две разновидности эозина, один из них растворим в воде, другой — в спирте. Употребляются в виде слабых (0,1%-ных) растворов. Способ применения. В водный эозин препараты переносятся из воды на непродолжительный срок (обычно не более 5 мин). После отмывки в воде проводятся через спирты обычным способом. Воднорастворимый эозин в спиртах оттягивается слабо, поэтому перекрашивать им препарат не следует. Окраска спиртовым эозином производится при проведении препарата через набор спиртов между 70 и 96° спиртом. Он легко оттягивается спиртом. Поэтому в тех случаях, когда препарат перекрашен, выдерживая его в спирту, легко оттянуть избыток эозина. Оранж G. Подобно эозину, служит для подкраски протоплазмы после различных «ядерных» красок. Приготовление. Применяется обычно в виде 0,5%-ного водного раствора. Способ применения. Тот же, что и для воднорастворимого эозина; спиртом оттягивается слабо. Лихтгрюн. Так же, как эозин и оранж G, представляет собой кислый протоплазматический краситель, употребляемый в комбинации с различными основными красителями.
Приготовление. Употребляется 0,1%-ный раствор на 96й спирте. Способ применения. Тот же, что и растворимого в спирте эозина. Слабо оттягивается спиртами, поэтому перекраска препарата нежелательна. Кроме эозина, оранжа и лихтгрюна — наиболее распространенных кислых протоплазматических красителей — с успехом можно применять для аналогичных целей 0,1%-ный водный раствор кислого фуксина (красная окраска), 0,5%-ный водный бордо (красная), слабый раствор пикриновой кислоты (желтая). Метиловый зеленый. Имеются некоторые красители, которые используются без предварительной фиксации объекта, являясь одновременно и фиксаторами и красителями; они служат обычно для быстрой ориентировочной окраски, для выявления ядер. Из них часто применяются, особенно при изучении простейших, метиловый зеленый и уксуснокислый кармин. Приготовление. Метиловый зеленый растворяется в 1%-ной уксусной кислоте. Приготовляется крепкий (2—3%-ный) раствор. Точная концентрация краски не существенна. Способ применения. Краситель действует непосредственно на живой объект. При окраске мелких животных подпускают каплю метилового зеленого под покровное стекло. При этом наиболее отчетливые картины получаются в зоне соприкосновения красителя с той средой, в которой плавают животные. Уксусная кислота фиксирует объект, ядра же одновременно окрашиваются в зеленый цвет. Уксуснокислый кармин. Приготовление. Сухой, растертый в порошок кармин растворяют при кипячении в 40%-ной уксусной кислоте. Употребляют насыщенный раствор. По охлаждении фильтруют. Способ применения. Тот же, что и метилового зеленого. Изучение ведется непосредственно в самом растворе красителя. Ядра (хроматин) окрашиваются в красный цвет. Окраска кармином по Блажииу. Особый характер носит применяемая для Cestoidea и Trematoda окраска по Блажину, при которой объект окрашивается без предварительной фиксации. Приготовление. Готовятся два раствора: 1) 0,3 г кармина растворяют в 100 см3 30%-ной молочной кислоты; 2) к 100 см3 воды добавляют три капли полуторахлорного железа (liquor ferri sesquichlo-rati) и две капли 1%-ной карболовой кислоты. Способ применения. Цестоды или трематоды мацерируют в воде 3—4 суток (меняют воду). При высокой температуре (например, летом) срок мацерации сокращается до 1 суток. Переносят на 4—6 ч в краситель (контроль под микроскопом или под лупой). После окраски основательно обмывают водой и помещают на 16—24 ч в раствор полуторахлорного железа. Оттенок окраски при этом становится коричнево-черным. После вторичной промывки в воде можно поступать двояким образом: либо обычным путем заключить объект в бальзам, либо предварительно высушить его на предметном стекле (при 35—40°С) и после этого залить бальзамом. Первый способ удобнее применять для относительно мелких объектов, второй — для крупных члеников Cestoi-
dea. При заключении в бальзам Trematoda рекомендуется основательно сплющивать. Метод Блажина дает исключительно четкие картины анатомического строения на тотальных препаратах. Комбинация гематоксилина с кислыми красителями. В микроскопической технике очень часто применяются разнообразные комбинированные способы окраски, включающие как основные, так и кислые красители, а также импрегнацию тканей металлами. Мы упомянем некоторые наиболее распространенные методы, применяемые в зоологической практике. В большинстве случаев, особенно при окраске срезов, различные гематоксилины сочетаются с подкраской кислыми красителями. Это позволяет на препаратах получить большие контрасты в окраске ядерных и цитоплазматических структур. О способах применения цитоплазматических красителей уже говорилось выше. Окраска по Ван Гизону (пикрофуксин). Используется для подкраски окрашенных гематоксилином срезов. Приготовление. К 100 см3 насыщенного водного раствора пикриновой кислоты прилить 10 см3 раствора (водного) кислого фуксина. Способ применения. Препараты предварительно несколькс перекрашивают .гематоксилином. Споласкивают сначала водой, затек подкисленным спиртом (не более 1 мин), после чего переносят на 2— 3 мин в раствор пикрофуксина. Затем следует вновь вода, подкисленныг спирт и, наконец, обезвоживание и ксилол. Предварительная перекраска гематоксилином необходима потому что пикрофуксин несколько оттягивает краску. На удавшихся препара тах мышцы и соединительная ткань окрашиваются в желтые и красные тона, ядра — в коричневатые. Окраска по Маллори. Приготовление. Готовят три раствора последовательно используемых для окраски: 1) 0,5%-ный водный раствор кислого фуксина; 2) 1%-ная фосфорно-молибденовая кислота; 3) смесь: анилиновый синий 0,5 г, оранж G 2 г, щавелевая кислот; 2 г, дистиллированная вода 100 см3. Способ применения. Используется для окраски срезов. Луч ше, чтобы толщина последних не превышала 10 мкм. Из воды препара' переносят на 2—3 мин в раствор фуксина, после чего споласкивают во дой и 2—3 мин выдерживают в фосфорно-молибденовой кислоте За ней следуют вода и смесь анилинового синего, G оранжа и щавеле вой кислоты (1—2 мин). Быстрое споласкивание в воде (не обязатель но), откуда препарат прямо поступает в 96° спирт, а затем в карбол ксилол и ксилол. Спирты сильно оттягивают красители (особенно ани линовый синий), поэтому обезвоживание следует проводить очен быстро. Окраска по Маллори дает очень эффектные гистологические карти ны, отдельные гистологические элементы отчетливо дифференцировань: ядра красные, мышцы фиолетовые, соединительные прослойки голубы; Окраска по Маллори возможна при известных навыках. Указанны выше сроки приблизительны, нередко их приходится менять. Одна и
наиболее часто встречающихся ошибок — перекраска в смеси с анилиновым синим. Последнее приводит к тому, что препарат получается очень темный и красная окраска ядер исчезает. Метод Маллори широко применяется при изучении различных групп животных. Он не годится после фиксаторов, содержащих осмиевую кислоту. Не применяется также после фиксации формалином. Окраска эозин-азуром. Применяется для окраски срезов. Приготовление. Исходным материалом для приготовления красителя служат следующие два основных раствора: 1) 0,1%-ный воднорастворимый эозин; 2) 0,1%-ный водный раствор азур II. Непосредственно перед использованием 10 см3 эозина разбавляют 100 см3 дистиллированной воды и, постоянно взбалтывая, приливают 10 см3 раствора азура II. В таком виде смесь долго храниться не может — выпадает осадок, поэтому всякий раз приготовляют свежую. Способ применения. Срезы из дистиллированной воды поступают на 6—24 ч в смесь эозин-азура. Следует следить, чтобы во время окрашивания не выпал осадок. В случае появления его — сменить краситель. Дифференцировка (несколько минут) в 96° спирте. Быстро обезводить в абсолютном спирте, провести через 2—3 порции чистого ксилола и заключить в бальзам. Не применяется после осмиевых фиксаторов. В хорошо окрашенных препаратах хроматин окрашивается в синий цвет, ядрышки — в розовый, цитоплазматические структуры — в метиленовый от розового до голубого. Окраска по Романовскому—Гимза. Приготовление. Применяется почти исключительно для окраски мазков крови. Содержит метиленовый синий и эозин. Смесь (основной раствор) покупают в готовом виде и лишь разводят дистиллированной водой перед использованием (с. 166). Иногда приходится иметь дело со смесью в порошке. Обычно в сухом виде он продается в капсюлях, рассчитанных на изготовление 100, 50 и 25 см3 основного раствора. Порошок растворяется при нагревании до 60°С в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина. Реактивы должны быть химически чистыми, посуда желательно йенская. От качества реактивов и чистоты посуды в значительной мере зависит успех последующей окраски, так как метод исключительно «чувствительный» к изменениям химического состава растворителей. Способ применения. При окраске кровяных мазков (последние фиксируются в течение 3 мин в метиловом спирте или в смеси абсолютного спирта с эфиром 20 мин) разведенный краситель наливают на высушенный на воздухе препарат. Разведение следующее: 1 капля красителя на 1 см3 дистиллированной воды (0,2 см3 краски на 10 см3 воды). Срок окрашивания — 30 мин, после чего препарат споласкивают водой и высушивают на воздухе (без подогревания!). Кровяные мазки обычно рассматривают без заключения в бальзам. Для окраски срезов используется более сильно разведенный краситель (0,5 см3 красителя на 50 см3 воды), причем срок окраски удлиняется до 12 ч. После промывки в воде обезвоживание производится в смеси ацетона с ксилолом в следующей последовательности. Сначала препарат из воды помещают в смесь из 95 см3 ацетона и 5 см3 ксилола.
Далее в смесь из 70 см3 ацетона и 30 см3 ксилола, потом — ацетона 30 см3 + ксилола 70 см3. Наконец, препарат переносят в чистый ксилол и заключают в кедровое масло, дамарксилол или в нейтральный канадский бальзам. Борный кармин с осмиевой кислотой. Применяется главным образом для паренхиматозных животных. Особенно хорошие результаты дает на пиявках. .Способ применения. Фиксированный любым фиксатором, не содержащим осмиевую кислоту, материал окрашивают in toto борным кармином (с. 30) в течение 0,5—1 ч, дифференцируют подкисленным спиртом и промывают в воде. После этого переносят на сутки в */4— ‘/г^о-ный раствор осмиевой кислоты (обязательно в темноте!). После осмиевой кислоты быстро обмывают водой и переводят на 12—14 ч в древесный уксус (в темноте). За ним следует основательная, в течение суток, промывка в воде и заливка в парафин обычным способом. Срезы ничем дополнительно не подкрашивают. В результате получается очень четкая гистологическая дифференцировка. Ядра красные, соединительнотканные элементы буроватые и коричневые. Некоторые цитохимические методы Ниже излагаются некоторые цитохимические методы, широко применяемые при зоологических работах. От обычных гистологических методик они отличаются тем, что .позволяют судить не только о морфологии, но и о химической природе изучаемых структур. Цитохимические методы применяются как при изучении ядра, так и цитоплазмы и ее включений. Нуклеальная реакция Фёльгена. Реакция Фёльгена существенно отличается от огромного большинства других методов гистологической окраски тем, что она основана на чисто химическом принципе и представляет собой микрохимическую цветную реакцию на нуклеопротеиды дезоксирибонуклеиновой кислоты. Так как нуклеопротеиды в клетке сосредоточены почти исключительно в ядре, то реакция Фёльгена дает отчетливую окраску ядер в красно-фиолетовый цвет, причем в ядре окрашивается только хроматин. Цитоплазматические компоненты клеток г тканей остаются при этом совершенно бесцветными. По элективности г отчетливости окраски ни один гистологический метод не может срав ниться с методом Фёльгена. Самый принцип реакции сводится к еле дующему. При гидролизе в горячей соляной кислоте дезоксирибонуклеи новая кислота отщепляет входящие в состав ее молекулы пуриновые 1 пиридиновые основания. При этом освобождаются альдегидные группы При последующей обработке фуксиносернистой кислотой они образую' с последней соединение, обладающее красно-фиолетовой окраской. Та ким образом окраска ядер обязана не фуксину, а сложному соединении фуксиносернистой кислоты с альдегидом. Это ясно видно и по характе ру окраски — оттенок получается не красный, а фиолетовый. Для реакции Фёльгена материал лучше всего фиксировать сулемо с уксусной кислотой без иодирования, с длительной промывкой в воде 36
Вполне пригодны также жидкости Шаудина и Ценкера (с уксусной кислотой). Поскольку реакция Фёльгена связана с альдегидными группами, недопустимо присутствие формалина, являющегося альдегидом и дающего цветную реакцию с фуксиносернистой кислотой. Для окраски годятся срезы, мазки, а также мелкие объекты in toto, приклеенные к предметному или покровному стеклу. Приготовление реактивов. Для окраски по Фёльгену необходимы: нормальный раствор соляной кислоты, фуксиносернистая кислота, вода, содержащая SO2. 1. Получение нормального раствора НС1: 82,5 см3 концентрированной НС1 плотности 1,19 доливаются дистиллированной водой до объема 1000 см3. 2. Получение фуксиносернистой кислоты: 1 г мелкорастертого основного фуксина заливают 200 см3 кипящей дистиллированной воды (в колбе) и растворяют в течение 5 мин при постоянном помешивании. После охлаждения до 50°С (фильтруется в сосуд с плотно притертой пробкой, удобен цилиндрик с притертой пробкой). Добавляют 20 см3 нормального раствора соляной кислоты, после чего охлаждается далее до 25°С. При этой температуре в раствор всыпают 1 г химически чистого бисульфита натрия NaHSO3. Сосуд плотно закрывают притертой пробкой и оставляют стоять на сутки в темноте. Через 24 ч заканчивают образование фуксиносернистой кислоты, раствор полностью теряет красную окраску и становится либо совершенно бесцветным, либо получает желтоватый оттенок. Если красный цвет фуксина хоть в какой-либо степени сохранился, то реактив не годен для применения. Настоятельно рекомендуем при изготовлении реактива совершенно точно выполнять все указанные выше манипуляции. Фуксиносернистая кислота обладает резким запахом SO2. При доступе воздуха, а также на ярком свету легко распадается, отщепляя фуксин. Поэтому хранение ее, так же как и все манипуляции по окраске препаратов, возможно лишь в герметически закрывающемся сосуде и в темноте. При соблюдении указанных условий сохраняется в течение 1,5—2 месяцев. 3. Вода, содержащая SO2, используется для промывки объектов после пребывания их в фуксиносернистой кислоте и готовится всякий раз заново. К 200 см3 воды прибавляют 10 см3 10%-кого раствора бисульфита натрия и 10 см3 нормальной соляной кислоты. При этом появляется резкий запах SO2, освобождающегося в результате реакции: NaHSO3 + HCl = NaCl + H2SO3. Способ применения. Так же как и при изготовлении реактивов, в самом ходе окрашивания требуется большая аккуратность и точное соблюдение всех условий реакции. Перед окраской срезы1 выдерживают в течение суток в чистом 70° спирте, чтобы извлечь из протоплазмы все альдегиды, которые в небольшом количестве могли бы в ней оказаться. Из спирта объекты переносят в дистиллированную воду. Далее с ними производят следующие манипуляции. 1 Срезы, или мазки, или мелкие объекты, приклеенные к предметному стеклу. Для краткости речь будет идти только о срезах.
1. Гидролиз в нормальном растворе НС1 при температуре 60°С в течение 3—.5 мин (можно в водяной бане, куда помещают стаканчик с НС1). Термометр непосредственно опускают в соляную кислоту. Удобно повесить его в штативе. Вместо металлической водяной бани можно рекомендовать следующую установку из двух химических стаканов: один большой (объем не менее 500 см3), другой — значительно меньше (100—150 см3); меньший стакан укрепляют внутри большого при помощи проволочного держателя таким образом, чтобы стенки обоих стаканов не соприкасались. В большой (наружный) стакан наливают воду, в маленький (внутренний) — соляную кислоту. Оба стакана укрепляют в штативе и во внутренний из них опускают термометр. Нагревание производят при помощи спиртовой горелки. 2. Гидролиз прерывают опусканием объекта в холодный нормальный раствор соляной кислоты. 3. Из соляной кислоты препараты поступают в фуксиносернистую кислоту на 1—3 ч в плотно закрытом сосуде при комнатной температуре. 4. После фуксиносернистой кислоты — промывка в 2—3 порциях воды, содержащей SO2. 5. Промывка в дистиллированной воде. 6. Спирты возрастающей крепости, ксилол, бальзам. Применение воды, содержащей SO2, необходимо, так как при перенесении объекта из фуксиносернистой кислоты в простую воду сейчас же происходит разрушение кислоты и выделение фуксина, который окрашивает дополнительно объект. В воде с SO2 этого не происходит. Лишь после основательной отмывки фуксиносернистой кислоты возможно опустить препарат в чистую воду. При окраске по Фёльгену окрашенными оказываются только ядра Протоплазма совершенно бесцветна. Для ее выявления препарат в дополнение к Фёльгену можно подкрасить каким-нибудь цитоплазматическим красителем, желательно не красным, например лихтгрюном. Ни один другой метод окрашивания не даст таких исключительнс отчетливых картин строения ядер, как метод Фёльгена. Он может быт! использован при окраске различных объектов, но особенно удобен ДЛ5 некоторых Protozoa. В последние годы широкое распространение получила модификацщ нуклеальной реакции Фёльгена, предложенная Лилли. Ее следует при менять на объектах, у которых ядра относительно бедны хроматином ибо. она дает более яркое окрашивание, чем «классический» метод. Со гласно прописи Лилли фуксиносернистую кислоту готовят следующие образом. 1 г основного фуксина и 1,9 г химически чистого бисульфит; натрия растворяют в 100 мл 0,15 нормального раствора НС1. Раство] встряхивают при комнатной температуре в течение 2 ч (с помощью ме ханической мешалки или вручную). Растворение ведется в сосуде с при тертой пробкой. За это время раствор обесцвечивается (становитс: желтоватым и прозрачным). Затем добавляют 500 мг активированноп угля в порошке и раствор встряхивают еще 2—3 мин, после чего еп фильтруют и помещают в сосуде с притертой пробкой в холодильни (0—4°С), где он и хранится.
Обработка препарата ведется сначала, как при «классическом» методе. После гидролиза в нормальном растворе HCI препарат переносят на сутки в холодный раствор фуксиносернистой кислоты, изготовленной по указанной выше методике (в холодильнике). Дальнейшая обработка — как при «классическом» методе. Метиловый зеленый — пиронин для выявления нуклеиновых кислот. Существует несколько прописей этого метода, впервые введенного Пап-пенгеймом. Фиксация объекта осуществляется 10—20%-ным нейтральным формалином или смесями Карнуа или Ценкер формолом. Окрашиваются срезы, мазки или тотальные препараты очень мелких объектов (мелкие инфузории и т. п.). Фиксация осмиевыми смесями непригодна. Приготовление раствора. Первый вариант. Метиловый зеленый кристаллический 0,15 г, пиронин 0,25 г, 96° этиловый спирт 2,5 мл, глицерин 20,0 мл, 0,5%-ный водный раствор карболовой кислоты 100 мл. Второй вариант. Готовится два раствора. Раствор А: 5%-ный водный раствор пиронина 17,5 мл, 2%-ный раствор метилового зеленого 10,0 мл, дистиллированной воды 250 мл. Раствор Б: 51,5 мл 0,2 М, 48,5 мл 0,1 М лимонной кислоты (pH этой смеси должно быть равно 5,0). Перед использованием смеси А и Б смешиваются в равных объемах. В таком виде смесь хранится около недели, после чего ее готовят заново, используя основные растворы А и Б. В раствор красителей препараты переводятся из воды. Продолжительность окраски варьирует в широком диапазоне от 20 мин до суток. Она зависит от фиксации, количества хроматина в ядрах изучаемого объекта и т. п. После красителя быстрое (мгновенное) споласкивание в дистиллированной воде. Удаление воды фильтровальной бумагой с левой стороны предметного стекла. Быстрое обезвоживание в 2—3 порциях (стаканчиках) абсолютного спирта. При этом происходит дифференцировка, оттягивание излишней краски. Длительное пребывание в абсолютном спирте обесцвечивает препарат. Из абсолютного спирта в ксилол с ацетоном (1 : 1), чистый ксилол и бальзам (обязательно нейтральный, иначе препарат быстро обесцветится). На хороших препаратах ядерный хроматин (ДНП) окрашивается в зеленый цвет, ядрышки (содержащие РНК) — в красный цвет, также как и РНК цитоплазмы. Кроме РНК слабо окрашивается пиронином и основное вещество цитоплазмы. Нужно иметь в виду, что метиловый зеленый нередко содержит примесь метилового фиолетового. Для очищения красителя от этой примеси (которая портит весь результат окраски) краситель надо обработать хлороформом, который не растворяет метиловый зеленый и растворяет метиловый фиолетовый. После обработки хлороформом краситель высушивают. Методы выявления полисахаридов (гликогена и амилопектина) Среди довольно многочисленных методов цитохимического выявления полисахаридов остановимся лишь на двух наиболее распространенных в практике зоологических исследований. При любой методике вы
явления полисахаридов в клетке и тканях необходимо иметь контрольные препараты, на которых полисахариды растворяются действием специфических ферментов — птиалина (присутствует в слюне) или диастаза (присутствует в прорастающих семенах растений). Сопоставление препаратов, обработанных и не обработанных ферментами, позволяет сделать вывод о том, в какой мере окраска связана с наличием полисахаридов. Жидкость Люголя. Применяется для окрашивания полисахаридов главным образом у простейших (инфузорий), а также мелких объектов в цикле развития плоских червей (мирацидиев, церкарий, личинок цес-тод и т. п.). Приготовление. Жидкость Люголя представляет собой раствор иода в иодистом калии. Основной раствор приготовляется следующим образом: дистиллированной воды 300 мл, йодистого калия химически чистого 1 г, иода кристаллического 1 г. Способ применения. Разбавляется в большей или меньшей мере дистиллированной водой в зависимости от размера объекта и богатства его гликогеном или амилопектином. Последние окрашиваются жидкостью Люголя в красно-коричневый цвет. Жидкостью Люголя действуют как на живые, так и на фиксированные объекты. При фиксации лучше применять фиксаторы, не содержащие воду (например, абсолютный спирт), так как в воде гликоген постепенно растворяется (в холодной воде медленно, в теплой довольно быстро). Метод ШИК (реактив Шиффа и иодная кислота). Эта методика применяется для окрашивания срезов и дает очень четкие и наглядные результаты. Фиксируется материал жидкостью Карнуа (см. выше). Годится также жидкость Ценкера с формалином. Для окрашивания используют фуксиносернистую кислоту (реактив Шиффа), изготовляемую так же, как и для реакции Фёльгена (в ее «классическом» варианте). Реакция проводится следующим образом. 1. Срезы на предметном стекле, отмытые предварительно в воде, подвергаются окислению. Оно проводится в 0,5% растворе иодной кислоты (Н1О4-2Н2О) в течение 2—5 мин (время подбирается экспериментально для изучаемого объекта). 2. После отмывки в дистиллированной воде проводится обработка срезов реактивом Шиффа (фуксиносернистой кислотой) при комнатной температуре в течение 10—15 мин. 3. Отмывка в нескольких порциях дистиллированной воды и под. краска ядер каким-либо ядерным красителем (например, гематоксилином Бёмера или слабым раствором метиловой зелени). 4. Обезвоживание в спиртах нарастающей крепости, просветление в ксилоле, заключение в канадский бальзам. Полисахариды элективно окрашиваются в красно-фиолетовый цвет (такой же, как хроматин при реакции Фёльгена). Белки, содержащие углеводы (гликопротеиды), окрашиваются так же, но менее интенсивно.
Методы выявления жировых включений Приведем два метода, из которых один применяется преимущественно для тотальных препаратов, второй — для срезов. Окраска жировых включений Суданом III. Эта методика дает результаты при обработке мелких объектов (на тотальных препаратах), как-то: инфузорий, личинок паразитических червей, ресничных червей, мелких ракообразных и т. п. Материал для окрашивания фиксируется формалином или какой-либо фиксирующей смесью, не содержащей спирта. Последний очень быстро растворяет жировые включения. Перед окраской объект рекомендуется на короткий срок поместить в 50 %-ный спирт, ибо при соприкосновении раствора Судана III с водой могут выпасть кристаллы красителя. Готовят насыщенный раствор Судана III на 70° спирте. Для этого 0,3 г красителя заливается 100 мл горячего 70° этилового спирта. В хорошо закрытом сосуде раствор ставят на сутки в термостат при температуре между 50—60°С и после этого фильтруют. Сохраняют в сосуде с хорошо притертой пробкой. Фиксированные формалином объекты промывают в 50° (не крепче!) спирте и переносят в раствор Судана III на 20—30 мин. За этим следу; ет промывка в 50° спирте и заключение в глицерин, в котором и ведется изучение объекта. Жировые включения (капли) оказываются окрашенными в яркий оранжево-красный цвет, все остальные части клеток не окрашиваются. Обработка жировых включений осмиевой кислотой. Эти методы в цитохимическом плане менее специфичны для жировых включений, чем окраска Суданом III, ибо осмиевая кислота (вернее, четырехокись осмия — OsO4) кроме липидов может вычеркивать и ряд других включений иной химической природы. Полученные этими методами результаты следует сопоставлять с результатами других методик (окраска Суданом III, растворение в органических растворителях и др.). Осмиевые методы обнаружения жировых включений используются главным образом при изучении срезов. Материал фиксируют в течение суток или 2%-ным раствором OsO4, или одним из названных выше фиксаторов, содержащих осмиевую кислоту (с. 13). Тщательно отмывают в нескольких порциях дистиллированной воды (в течение суток и более). Затем следует по обычной методике заливка в парафин. Однако при проведении материала через 70° спирт вставляют одно дополнительное звено — 70° спирт, в который добавляют небольшое количество сернистого натрия (NaS) (примерно один кристалл на солонку). В этом растворе объект пребывает около часа. При этом образовавшиеся в результате реагирования OsO4 с жирами низшие окислы осмия (OsO2), которые имеют темную окраску, превращаются в сернистый осмий (OsS). Это необходимо потому, что низшие окислы осмия растворимы в ксилоле и цри заливке растворятся. Сернистый осмий нерастворим ни в спирте, ни в ксилоле. После основательной отмывки в чистом 70° спирте объект заливают обычным способом и режут на микротоме. Возможна дополнительная подкраска ядра и цитоплазмы. В результате жировые включения видны в форме черных, капель.
Прижизненные красители. При изучении живых объектов, особенно обладающих небольшими размерами, нередко применяется окрашивание витальными красителями, т. е. такими, которые в известных концентрациях окрашивают объект, не убивая его. Различают основные и кислые витальные красители, причем при зоологических работах чаще применяются первые. Необходимо отметить, что при обычных условиях витальные красители не окрашивают ядра живой клетки или в очень малой степени окрашивают основное вещество протоплазмы. Краски адсорбируются главным образом различными клеточными включениями. При длительном воздействии на клетки краски откладываются в протоплазме в виде гранул. Мы не можем здесь рассматривать теорию витального окрашивания и ограничимся указанием некоторых наиболее распространенных основных красителей. Нейтральный красный особенно часто применяется для витального окрашивания простейших, при изучении у них процессов внутриклеточного пищеварения и т. д. Применяется в очень слабых концентрациях от 0,1 до 0,001 %-ного. В более крепких концентрациях убивает клетку. Нейтральный красный является индикатором. В кислой среде он имеет ярко-красный оттенок, в щелочной — желтоватый. Конго красный дает коллоидные растворы с малой степенью дисперсности, поэтому лишь с трудом проникает в протоплазму. Является индикатором, в кислой среде синий, в щелочной — красный. Применяется главным образом при изучении внутриклеточного пищеварения. Метиленовый синий — один из обычных витальных красителей. Применяется, как и нейтральный красный, в очень слабых концентрациях. Иногда служит для окрашивания некоторых систем органов — нервной системы, выделительной системы (например, у Dinophilus). Янус зеленый занимает среди прижизненных красителей особое положение. Он окрашивает избирательно митохондрии. Используются очень слабые водные растворы (0,01—0,05%-ные). Окраску объекта лучше вести, не покрывая покровным стеклом. Это связано с тем, что для окраски митохондрий необходимо наличие свободного кислорода. Продолжительность окраски 20—30 мин. Вскрытие Все вскрытия производятся в препаровальной ванночке под водой, если только не оговаривается особо. Дно препаровальной ванночки должно состоять из восковой массы. Для приготовления восковой массы используется обыкновенный пчелиный воск, смешанный с топленым салом в пропорции 4:1. Смесь растапливается на огне, и к ней прибавляется немного голландской сажи. После основательного промешивания горячую массу выливают в нагретую ванночку. Можно массу приготовить также из смеси равных количеств воска и вара. В ванночке по углам припаиваются угольники, чтобы восковая масса не отставала от дна после остывания. При вскрытиях следует соблюдать следующие правила.
1. Орган или животное, подлежащее вскрытию, прочно прикрепляют ко дну ванночки булавками, которые следует втыкать в самые плотные части препарата, наиболее удаленные от препарируемого места. 2. Никогда не следует производить вскрытия под грязной водой. Если вода становится мутной, что может зависеть от разных причин, то объект следует промыть под слабой струей воды и сменить воду в ванночке. 3. Не следует ничего отрезать и удалять без надобности. Удаляются после внимательного рассмотрения только те части и органы, которые мешают дальнейшему вскрытию или исследованию. 4. После употребления инструменты следует тщательно обтереть и обсушить, а сочленение ножниц смазать маслом. В особенности необходим тщательный уход за инструментами, употребляющимися при вскрытии в морской воде, от которой они быстро ржавеют и портятся. Инъекция В некоторых случаях, преимущественно при вскрытиях, приходится прибегать к методу инъекции, т. е. наполнению краской сосудов или других полостей с целью изучения их топографии, отношения к окружающим органам и т. д. Иногда, например при инъекции пищеварительной и выделительной систем у Fasciola или выделительных каналов у Cestoidea, употребляются простые пипетки с резиновой грушей. Конец такой пипетки легко оттянуть до нужной толщины на пламени спиртовой горелки. Все прочие инъекции, рекомендуемые в специальной части руководства, могут быть произведены шприцем «Рекорд» средней емкости (15— 20 см3). Кроме того, необходимо иметь иглы для шприца различных номеров, канюли с небольшим вздутием на конце, за которое могла бы зацепиться нитка при перевязке, и тонкие обыкновенные нитки или лучше хирургический шелк. Необходима также резиновая трубочка длиной в несколько сантиметров такого диаметра, чтобы ею можно было соединить носик шприца с канюлей. Канюлю можно изготовить самому из тонкой иглы для шприца. Конец иглы в том месте, где начинается заострение, смачивают травленой соляной кислотой (дымящейся соляной кислотой, в которой до насыщения растворен металлический цинк). Далее на это место кладут небольшой кусочек припоя (сплава 1 части свинца с 2 частями олова) и нагревают его на пламени спиртовой или газовой горелки. В результате сплав оплавляет кругом конец иглы, образуя головку. Заостренный конец иглы стачивается напильником. Головка канюли должна быть по возможности маленькой и яйцевидной. В качестве инъекционной краски может служить берлинская лазурь или окрашенная желатиновая масса. Берлинская лазурь разводится водой (чайная ложка краски на 100—200 см3 воды). Перед употреблением эту жидкость хорошенько размешивают. Для получения желатиновой массы обыкновенная столовая желатина распускается в небольшом количестве горячей воды и подкрашивается кармином или другим красителем. Эта масса при инъекции должна быть достаточно нагрета.
Инъецируемое животное помещается в- теплую воду, в которой должно пролежать 30 мин до инъекции. После инъекции препарат переносят в холодную воду, и наполняющая сосуды желатина застывает. Самый процесс инъекции производится под водой или вне ее в зависимости от обстоятельств. Нередко достаточно ввести в полость сосуда иглу шприца, проткнув ею стенку сосуда в косом направлении. При впрыскивании получаются вполне удовлетворительные результаты, хотя часть красителя и попадает в воду. Иногда же такой способ недостаточен и приходится, сделав небольшой надрез на сосуде, вводить в него канюлю, которая затем перевязывается вместе со стенками сосуда ниткой. В этом случае для удобства манипуляций необходимо, чтобы канюля была соединена с носиком шприца резиновой трубочкой. Конец инъекции определяется по наполнению сосудов, что часто можно наблюдать непосредственно. В тех же случаях, когда не все сосуды отпрепарированы, окончание инъекции узнается по некоторому растяжению соответствующих органов и частей препарата, что устанавливается путем опыта. Если употреблялась берлинская лазурь, то после того как инъекция закончена, препарат помещают на некоторое время в 70° спирт, от действия которого частицы берлинской лазури оседают на стенках сосудов. Такое же действие оказывает морская вода, поэтому если инъекция производится на морском животном, то необходимо предварительно промыть препарат пресной водой и инъецировать в пресной воде, а затем сменить пресную воду на морскую. Часто для того чтобы наполнить краской всю кровеносную систему, приходится инъецировать несколько раз в различные сосуды. Иногда удобнее инъекции отдельных частей кровеносной системы производить на разных экземплярах животного. При инъекциях необходимо соблюдать следующие условия. 1. Инъекцию всегда следует производить на свежеубитом животном. 2. В наполненном инъекционной жидкостью шприце не должно быть воздуха. Перед инъекцией шприц следует повернуть иглой или канюлей кверху и изгнать из него воздух перемещением поршня. 3. Никогда не следует сначала вводить в сосуд иглу или канюлю, а затем уже надевать иглу или канюлю на носик шприца. Это неудобно и приводит к тому, что в полость сосудов вместе с краской попадают пузырьки воздуха. 4. Если сосуд вскрывают для введения в него канюли, то нужно выпустить как можно больше крови. Прежде чем ввести канюлю, препарат следует тщательно промыть. 5. Перед инъекцией следует пропустить вокруг сосуда нитку, завязав ее неплотным узлом. По удалении иглы или канюли наполненный красителем сосуд немедленно перевязывается, для чего достаточно плотно затянуть узел. 6. Инъекцию следует производить при равномерном давлении. Если встретится сопротивление, то следует, прервав операцию, выяснить причину задержки и по возможности устранить ее. Чаще всего причиной служит сопротивление сети мелких сосудов или лакун. Для устра
I нения его можно проколоть один-два крупных сосуда на удаленном по возможности расстоянии от того места, где производится инъекция. Так, при инъецировании в артерию прокалывают вену, и наоборот. Рисование при прохождении зоологического практикума Особое внимание при прохождении зоологического практикума следует уделять рисованию изучаемых объектов. Необходимо твердо помнить, что только рисуя объект, можно правильно понять и основательно его изучить. В процессе рисования фиксируется внимание на тех деталях, которые ускользают при простом просмотре препарата. Можно сказать, что тот, кто не делает рисунков, теряет половину, если не больше, того, что может дать практикум. Рисование объекта должно быть одним из основных методов его изучения. При неумении рисовать занимающийся нередко склонен обходиться без рисования или рисовать с большой неохотой. Однако надо иметь в виду, что морфологический рисунок представляет собой рисунок технический, которому может научиться всякий. Поэтому неумение рисовать не должно смущать начинающего. Как показывает практика, способность правильно изобразить объект достигается постепенно в процессе работы. В начале прохождения практикума все рисунки следует делать без помощи рисовального аппарата, срисовывая препарат на глаз, ибо только таким образом можно научиться рисованию. Выполнение этого условия обязательно для каждого начинающего. Лишь после того как техника рисунка с натуры усвоена, можно пользоваться рисовальным аппаратом. Рисовать следует на плотной и гладкой бумаге, выдерживающей стирание резинкой. Рисунки, как правило, рекомендуется делать карандашом. Однако желательно, чтобы постепенно, по мере прохождения практикума, занимающийся научился рисовать пером и кистью так называемые чистые рисунки, годные для воспроизведения в печати. При разборе организации отдельного животного, в особенности на живых объектах или при вскрытиях и препаровках и даже на микроскопических препаратах, очень полезно делать предварительные черновые наброски и схемы. В некоторых случаях обойтись без них совершенно невозможно. Часто организация животного разбирается на серии срезов. В этих случаях рисунки делаются двух родов в зависимости от поставленной цели. Если изучается анатомия животного, то зарисовывается несколько отдельных наиболее важных и интересных срезов, причем внимание обращается только на анатомические соотношения органов, а гистологические детали опускаются. На рисунках этого типа изображаются лишь контуры органов, попавших на срез. Отдельные органы или их системы закрашиваются условными цветами акварельными красками или карандашами. Каждый срез рисуется на отдельном листке бумаги, а затем листки склеиваются гармоникой, при разворачивании которой можно обозреть всю се
рию целиком. Помимо этого, желательно изготовление схемы общего плана строения или отдельных систем органов изучаемого животного. Если такая схема не воспроизводится с помощью одного из методов реконструкции по срезам, то ее следует построить на глаз. Анатомические рисунки необходимо дополнять гистологическими, которые должны возможно точнее передавать структуру и взаимоотношения тканевых элементов. В рисунках, изображающих внешнюю морфологию животного или картину вскрытия, главное внимание нужно обращать на точность и четкость контуров. Накладка теней имеет второстепенное значение, и в тех случаях, когда она сопряжена с затратой большого количества времени и труда, можно ограничиться лишь теми тенями, которые необходимы для ясности рисунка. Вообще любой рисунок, даже очень детальный, всегда имеет известную долю схематизации, чем отличается от фотографии. Кроме того, на рисунках нередко подчеркиваются и оттеняются те детали, которые имеют особое значение. Степень схематизации может быть различной в зависимости от назначения рисунка. Поэтому сплошь и рядом законченным рисунком можно считать рисунок контурный, тогда как в других случаях требуется тушовка, накладка теней и т. д. Искусство схематизировать рисунки в нужной мере приобретается опытом. Следует, однако, предостеречь против чрезмерной схематизации рисунка. Нужно помнить, что всякий рисунок должен быть прежде всего рисунком с натуры. При прохождении большого практикума занимающийся должен обладать техникой микрофотографирования. Надо научиться снимать живые объекты, а также гистологические препараты. Нередко целесообразно сочетать фотографию и рисунок. С фотографии снимается через кальку контур снятого объекта, который используется затем для изготовления рисунка. Такое сочетание фотографии и рисунка одного и того же объекта дает хорошие результаты при изучении объекта. Методы реконструкций по срезам Многие морфологические объекты, например органы и их системы у некоторых животных, слишком малы и вместе с тем слишком сложны для того, чтобы можно было получить правильное представление об их форме путем простого вскрытия, препаровки, рассматривания в лупу или при слабом увеличении микроскопа. С другой стороны, они настолько велики, что изучение их на отдельном срезе невозможно. В таких случаях прибегают к методу реконструкции, т. е. к построению целостных картин данного объекта по следующим друг за другом срезам серии. Реконструкции по срезам могут быть плоскостными, т. е. чисто графическими, или же телесными — пластическими. В первом случае изображение реконструируемого объекта получается на бумаге в двух измерениях, и форма отдельных частей может быть показана лишь накладкой теней в соответствующих местах. Плас
тические реконструкции представляют собой телесные модели в трех измерениях. В обоих случаях реконструкция всегда связана с определенным увеличением действительных размеров объекта. Графические реконструкции технически более просты и нередко применяются как вспомогательный метод. Все способы реконструкций кропотливы и отнимают много времени. Поэтому к ним следует прибегать лишь в тех случаях, когда другие методы (вскрытие, препаровка, инъекция и т. д.) оказываются недостаточными или невозможными. Объект, предназначенный для реконструкции, должен быть возможно точно ориентирован во время заливки. Мелкие объекты ориентируют на целлоидиновых пластинках (с. 24). Следует поставить себе за правило при изготовлении срезов поперечную серию начинать резать с переднего конца животного, фронтальную со спинной, а сагиттальную с правой стороны тела. Соблюдение этого условия позволяет избежать ошибки при определении правой и левой сторон на срезах. Для приготовления любой реконструкции необходимо иметь серию срезов без пропусков. Срезы должны быть одинаковой толщины, и толщина должна быть точно известной. В зависимости от величины и характера объекта, а также способности его резаться на микротоме применяются срезы толщиной в 5; 7,5; 10; 15 и 20 мкм. Все срезы должны быть совершенно равными, без складок и смещений отдельных частей. При реконструкциях приходится накладывать изображение (или проекции главных точек) среза на предыдущий и совмещать его с последующим. Поэтому для правильной ориентировки срезов по отношению друг к другу иногда возникает необходимость в специальных ориентировочных линиях, получаемых рядом с каждым срезом. Однако в большинстве случаев (в частности, при реконструкциях, изготовление коих рекомендуется в настоящем руководстве) ориентировочные линии излишни. Они могут быть заменены некоторыми наиболее постоянными, т. е. наименее изменяющимися от среза к срезу элементами самих срезов, как-то: нервами, кровеносными сосудами, наружными контурами тела и т. п. Для построения реконструкции приходится рисовать все срезы, на которых имеются реконструируемые части. Рисование производится обязательно с помощью рисовального аппарата на отдельных листках бумаги. Все рисунки нумеруются в порядке номеров срезов. Увеличение всех изображений срезов должно быть одинаково. При рисовании достаточно изображать лишь внешний контур среза и очертания реконструируемых органов, а также тех элементов, которые могут служить для целей ориентировки при совмещении соседних срезов. Если изображения срезов получаются настолько сложными, что возникает опасение перепутать в дальнейшем отдельные органы и их части, то последние закрашиваются в различные цвета карандашами или акварельными красками. Графическая изоляция по Кащенко. С помощью этого метода можно получить картину объекта в плоскости, параллельной 'плоскостям срезов. Чаще всего приходится по фронтальной серии делать фронтальные же реконструкции или по сагиттальным — сагиттальные.
Принцип метода заключается в том, что все срезы перерисовывают на один лист кальки в порядке их номеров, причем каждый последующий срез по возможности наиболее полно накладывается на предыдущий. Рисование начинают со стороны, обращенной к рисующему. Так, если воспроизводимый объект должен быть изображен со спинной стороны, то сначала рисуют самый дорзальный срез, а последним — самый вентральный. Контуры, которые покрывают уже нарисованными, не изображают. В результате получаются системы контурных линий, лежащих вблизи и вокруг друг друга и дающих форму реконструируемого объекта. Самый внешний контур системы линий отвечает общему наружному контуру данного органа. Расположение и частота внутренних линий указывают на форму органа и позволяют правильно наложить тени на окончательном рисунке. Рассмотрим соответствующий пример. Требуется построить реконструкцию переднего отдела нервной системы немертины Lineus gesserensis по серии фронтальных срезов. Изображение должно быть дано со спинной стороны. 1. Все срезы, на которых имеются разрезы через нервную систему, рисуют с помощью рисовального аппарата на отдельных листках бумаги. Увеличение всех рисунков должно быть одинаковым. Кроме наружных очертаний среза и нервной системы следует изображать также и контуры близлежащих органов, которые понадобятся для ориентировки соседних срезов при накладывании их друг на друга. В нашем примере такими органами могут служить кровеносные сосуды и система хобота (ринходеум, полость влагалища хобота). Рисунки нумеруются соответственно порядковым номерам срезов. 2. Рисунок первый, т. е. изображающий самый дорзальный срез с кальку или тонкое матовое стекло. Далее калька накладывается на рисунок второй и оба рисунка по возможности полнее совмещают. При этом нужно стремиться к наиболее полному наложению отвечающих друг другу сечений всех перерезанных органов. Чем больше элементов изображено на рисунках срезов, тем легче и точнее это можно сделать. После того как все линии второго рисунка перенесены на кальку, последнюю накладывают на рисунок третий, по отношению к которому ориентируют по контурам второго рисунка. Таким же образом наносится изображение четвертого среза и т. д. (рис. 1). Наиболее ответственным моментом, который может вызвать затруднения, нервной системой, переводят на Рис. 1. Реконструкция переднего отдела нервной системы немертины Lineus gesserensis. Графическая изоляция по Кащенко. Цифрами отмечены номера срезов. Объяснения в тексте (ориг.)
служит ориентировка рисунков срезов по отношению друг к другу. Однако при некотором навыке легко избежать грубых ошибок, и реконструкция получается если и не абсолютно точной, то во всяком случае достаточно близкой к действительной форме объекта. 3. При перенесении рисунков на кальку контуры, которые покрываются уже изображенными, не рисуются. 4. Каждый раз после перевода на кальку нового рисунка все контуры предыдущего среза, не относящиеся к реконструируемой нервной системе и ненужные более для накладки следующего среза, стирают резинкой. Если этого не делать, то довольно скоро на кальке отказывается слишком большое количество излишних и мешающих линий, которые к тому же перекрещиваются с нужными контурами в силу налегания отдельных органов друг на друга. Таким образом, в конечном результате на кальке останутся только те системы линий, которые характеризуют форму нервной системы (рис. 1), т. е. реконструируемый объект окажется графически изолированным от остальных органов. Часто, однако, бывает важно получить и внешний контур животного. В таком случае наружную линию, отвечающую этому контуру, следует сохранить. 5. Когда перерисовывание на кальку закончено, обводится общий абрис нервной системы и ее отдельных частей (рис. 1). Уже на этой стадии работы форма реконструируемого объекта, собственно говоря, восстановлена. 6. Общий контур нервной системы и ее частей переносится с кальки на бумагу. На окончательном рисунке накладываются тени в соответствии с конфигурацией и взаимным расположением контурных линий на кальке. Если принять, что источник света находится сверху, то более глубокие тени накладываются в тех местах, где линии расположены гуще. Если допустить, что объект освещен слева и сверху, как обычно изображается на рисунках, то при накладке теней надо внести соответствующие поправки. В тех случаях, когда по одной серии срезов необходимо сделать реконструкцию нескольких систем органов, можно для каждой системы приготовить отдельную реконструкцию, а затем соединить их на одном рисунке или реконструировать все системы одновременно. В последнем случае вместо кальки удобнее употреблять матовое стекло, а контурные линии разных систем рисовать карандашами разного цвета. Так же следует поступать, если объект хотят изобразить прозрачным и внутри него воспроизвести внутренние образования, например полости, сосуды и другие детали. Само собой понятно, что при построении подобных реконструкций многие системы линий должны пересекаться. При перенесении главных контурных линий на бумагу удобно пользоваться ретушерским столиком, употребляемым фотографами. На матовое стекло с реконструкцией кладется бумага, а под стекло помещается электрическая лампа. Просвечивающие сквозь бумагу контуры легко могут быть обведены карандашом. Иногда, впрочем, при обилии и сложности линий разного значения на реконструкции такой способ недостаточен, так как невозможно от
личить линии общего контура органа от других, второстепенных, даже если эти последние сделаны иным цветом, нежели первые. В этом случае можно прибегнуть к приему, введенному в практику А. В. Фурсенко. Предположим, срезы рисовали красным карандашом, а главные контуры были обведены черным. Если на ретушерском столике под матовое стекло подложить тонкую красную бумагу, то сквозь наложенную сверху рисовальную бумагу будут просвечивать только черные контуры, тогда как все красные линии станут незаметными. Так следует поступать всегда, когда необходимо изолировать сложные системы линий, нарисованные двумя различными цветами. Проекционная реконструкция по Гису. Этот способ реконструкции позволяет получать картины объекта, плоскость которых перпендикулярна плоскости срезов. Так, по поперечной серии срезов можно получить изображение органа или системы органов в фронтальной или сагиттальной плоскости. Принцип метода сводится к следующему. На бумагу наносят ряд параллельных линий, расстояние между которыми должно соответствовать толщине срезов при выбранном увеличении. На каждую поперечную линию наносятся проекции на выбранную плоскость главнейших точек с соответствующего среза. Затем отвечающие друг другу точки соединяются. В результате получается контур органа в выбранной плоскости. Рассмотрим следующий пример. Требуется по серии поперечных срезов через дигенетического сосальщика построить фронтальную реконструкцию пищеварительной системы с брюшной стороны, увеличенную против действительных размеров в 200 раз. Вся серия содержит Рис. 2. Проекционная реконструкция. Подготовка рисунков срезов к перенесению с них проекций главных точек (а', б', в' и т. п.) на основу. Изображены рисунки срезов № 17 и 18. Объяснения в тексте (ориг.) 50 срезов. Толщина каждого среза равна 12 мкм. 1. На отдельных листках бумаги с помощью рисовального аппарата приготавливаются рисунки всех срезов. Увеличение рисунков должно быть равно 200. На каждом рисунке изображаются внешний контур среза и очертания присосок и пищеварительных органов. Все рисунки нумеруются в порядке номеров срезов (рис. 2). 2. Увеличение изображений, полученных при помощи рисовального аппарата, определяется следующим способом. На предметный столик микроскопа кладут объект-микро-метр и рисуют всю его шкалу или несколько делений ее с помощью рисовального аппарата. При этом должны быть соблюдены все условия, при которых изготовлялись рисунки срезов (те же объектив,
окуляр и длина тубуса, тот же рисовальный аппарат, та же высота рисовальной бумаги над уровнем стола). Нарисованное изображение шкалы или ее части измеряют. Полученную длину делят на истинную длину шкалы объект-микрометра или ее части. Частное от деления и будет искомое увеличение. Обычно шкала объект-микрометра представляет собой 1 мм, разделенный на 100 частей. Если необходимо подобрать определенное увеличение, при котором нужно приготовить рисунки, то, комбинируя различные объективы и окуляры, подбирают сначала увеличение, по возможности близкое к требуемому. Окончательная подгонка увеличения достигается выдвижением тубуса микроскопа. Иногда приходится изменить высоту над уровнем стола бумаги, предназначенной для рисунка. При этом все увеличения определяют и проверяют при помощи объект-микрометра. 3. На отдельном листе плотной бумаги приготавливают основу, на которую затем будут нанесены проекции срезов. Именно на бумагу наносят 50 (по числу срезов) параллельных линий, расстояние между которыми должно быть равно толщине одного среза, взятой при увеличении в 200 раз, т. е. 12 мкмХ200 = 2,4 мм. Таким образом, вся реконструкция займет пространство длиной в 2,4 ммХ50, т. е. 120 мм. Следовательно, задача сводится к тому, чтобы между двумя параллельными линиями, отстоящими друг от друга на 120 мм, провести 49 параллельных линий с равными промежутками между ними. Однако технически гораздо легче разделить расстояние между двумя параллельными линиями на равные участки в том случае, если число их равняется одному из членов геометрической прогрессии с коэффициентом 2 (2, 4, 8, 16, 32 и т. д.). Ближайшим к 50 и большим, чем число, членов является 64. Итак, чтобы разделить бумагу на 64 равных по ширине полосок, отвечающих 64 срезам, надо сначала провести две параллельные линии с расстоянием между ними в 153,6 мм (2,4 ммХб4) (рис. 3, линии 0—0 и 64—64). Затем промежуток между этими линиями делят пополам; соответствующая линия будет отвечать 32-му срезу (рис. 4, линия 32— 32). Таким же образом проводят линии 16-го и 48-го срезов и т. д., пока не будут нанесены линии всех первых 50 срезов. Все параллельные линии нумеруются, начиная сверху, соответственно порядковым номерам срезов (рис. 3 и 4). 4. На каждый рисунок среза наносят линии пересечения главной фронтальной плоскости объекта с плоскостью рисунка (см. рис. 2, АБ) и затем рядом с рисунком со спинной его стороны прочерчивают вторую линию, параллельную первой (см. рис. 2, ВГ). На эту вторую линию проектируются главные точки среза, как показано на рис. 2 (точка а' есть проекция точки а, б' — бит. д.). Далее край листка, на котором сделан рисунок, отрезают ножницами по линии ВГ. Таким образом подготавливают все рисунки срезов. 5. Следующим этапом работы является перенесение проекции точек с рисунков срезов на разграфленную основу. Рисунок прикладывают обрезанным краем к поперечной линии основы, имеющей одинаковый с ним номер, и на эту линию переносят проекции точек среза (рис. 3). Сперва на основу переносят точки 1-го среза, затем 2-го, 3-го и т. д.
Каждый последующий рисунок среза прикладывают к своей поперечной линии на основе таким образом, чтобы наибольшее количество точек этого среза возможно точнее совпало с точками предыдущего. При этом надо внимательно следить, чтобы правая сторона объекта на ри- сунке совпадала с правой стороной будущей реконструкции, а левая — с левой ее стороной. Так как в данном случае реконструкция должна быть изображением с брюшной стороны, то правая сторона тела на ре- конструируемом изображении должна Я'.--------------------------------------- Рис. 3. Проекционная реконструкция пищеварительной системы дигенетического сосальщика, изображаемая с брюшной стороны. Момент нанесения на основу проекций точек с изображения среза № 17. Объяснения в тексте (ориг.) быть на левой стороне, и наоборот (рис. 3). Следовательно, каждый рисунок прикладывают к соответствующей поперечной линии снизу, это удобно в том отношении, что он не закрывает собой уже ранее нанесенные на основу точки (рис. 3). Если бы эту реконструкцию требовалось построить со спинной стороны, то линии на рисунках срезов, на которые наносят проекции точек, следовало бы провести на брюшной стороне от изображения среза. При ее положении на спинной стороне рисунка накладывать рисунки на основу пришлось бы, переворачивая их вверх ногами. В последнем случае пришлось бы начать перенесение точек на основу с заднего конца животного, т. е. с 50-го среза, затем перейти к 49-му, 48-му и т. д. 6. Соответствующие друг другу точки, нанесенные на основу, соединяют. В результате получают общие контуры тела сосальщика, очертания присосок и всего кишечника (рис. 3, верхняя часть). Для получения окончательного рисунка неровности контуров сглаживаются (рис. 4). Отдельные органы реконструкции могут быть раскрашены условными цветами. Если этим методом необходимо реконструировать несколько различных систем органов, например пищеваритель
ную, нервную, половую и т. п., то для каждой системы делается отдельная реконструкция. Несколько реконструкций затем могут быть объединены в одной схеме. Так же поступают, когда реконструируемая система очень сложна, т. е. производят реконструкцию по частям. Иногда при реконструкции какого-нибудь сложного по форме объ екта, например сильно извитой матки сосальщика с ее многочисленны ми петлями, приходится переносить на основу такое большое количество точек, что в них подчас нелегко разобраться. В этих случаях выбирают такой срез, на котором имеется начало органа, и на- п О носят на основу только точки 2 этой части, несмотря на наличие на этом же срезе еще раз-резов того же органа. На ри- Ё сунке отмечают нанесенную s часть условным знаком, на- /й пример крестиком. На следую-щем срезе находят соответст- /4 венное продолжение органа, переносят на основу его точки и отмечают его на рисунке го условным знаком и т. д. Когда гг орган загибается к переднему го-концу, его продолжение пере- 26 носят с предыдущего среза или с ряда предыдущих срезов и т. д. Часто в подобных случаях приходится возвращаться к уже неоднократно использо-ванным рисункам срезов. Та- 36 ким способом можно пригото- 38 вить реконструкцию весьма 40 сложных по форме объ- 42 ектов. 44 На окончательном рисунке 46 те части, которые скрыты ле- 48 жащими поверх них, не изобра- so жаются или отмечаются пунк-тиром. На готовой реконструкции может быть показана форма отдельных частей путем наложения в соответственных 52 местах теней и полутеней. Пластическая реконструкция. В основе любой пластической реконструкции по срезам лежит метод Борна, принцип которого заключается в следующем. 54--------------------------------------- Рис. 4. Один из моментов окончательного оформления проекционной реконструкции пищеварительной системы дигенетического сосальщика. Объяснение в тексте (ориг.)
С каждого среза при определенном увеличении рисуют части того органа, который нужно реконструировать. Затем эти части вырезают из пластинки, причем толщина последней должна отвечать толщине среза при данном увеличении. Соответственные части наклеивают друг на друга в порядке срезов. В результате получается объемная модель ре-констриуруемого объекта, которая далее может быть обработана для того, чтобы придать ей более аккуратный и изящный вид. В качестве основного материала используют или восковые пластинки, или картон. Первый способ во многих отношениях удобен, но так как для изготовления пластинок из воска требуются специальные приспособления и оборудование, отсутствующие во многих зоологических лабораториях, рекомендуем более доступный способ построения модели из картона. Приведем пример. Требуется реконструировать по серии поперечных срезов передний отдел центральной нервной системы немертины Lineus gesserensis при увеличении от 50 до 80. Толщина срезов 10 мкм. Подготовительные работы. Прежде всего срезы должны быть нарисованы с помощью рисовального аппарата. При этом увеличение рисунков должно быть строго определенным в зависимости от толщины картона, предназначенного для реконструкции. Если имеется картон любой толщины, то увеличение модели может быть точно задано заранее. Если например, при этом условии требуется изготовить модель, увеличенную против- действительных размеров объекта в 50 раз, то толщина картона должна быть 10 мкмХ50 = 500 мкм = 0,5 мм. Однако не всегда под рукой может быть картон нужной толщины. Поэтому на практике приходится, выяснив предварительно толщину имеющегося картона, вычислять соответствующее ей увеличение, в котором должны быть сделаны рисунки срезов. 1. Для выяснения толщины картона 10—20 кусочков его наклеивают друг на друга тем клеем, которым в дальнейшем будут склеивать модели срезов, и измеряют толщину полученного тела. Последняя, разделенная на общее число склеенных кусочков, даст толщину картона с учетом слоя клея. Предположим, что измеренная таким способом толщина картона оказалась 0,655 мм = 655 мкм. 2. Требуемое увеличение вычисляют по уравнению: 10 мкм X х= = 655 мкм; х=65,5, где 10 мкм — толщина срезов, а 655 мкм — толщина картона. 3. В дальнейшем следует подобрать такую комбинацию объектива, окуляра и длины тубуса микроскопа, чтобы увеличение рисунков, сделанных с рисовальным аппаратом, равнялось 65,5. Для этого на листке бумаги прочерчивают две параллельные линии с расстоянием между ними в 65,5 мм. Затем на предметный столик микроскопа кладут объект-микрометр (1 мм, разделенный на 100 частей) и видимое в микроскоп изображение его шкалы сравнивают с помощью рисовального аппарата с промежутком между начерченными на бумаге линиями. Меняя объективы, окуляры и длину тубуса (в некоторых случаях приходится изменять и высоту рисовальной бумаги над уровнем стола), легко добиться точного совмещения шкалы объект-микрометра с отмеренным расстоянием на бумаге. Когда требуемое увеличение достигнуто, все условия
установки записываются (номера объектива и окуляра, длина тубуса и т. д.). Все срезы, на которых имеются те или иные части переднего отдела нервной системы, рисуют с рисовальным аппаратом при увеличении 65,5. На рисунках следует изображать не только контуры реконструируемой системы, но также контуры самого среза полости ринхоце-ля (влагалища хобота) и других образований, которые в дальнейшем служат лишь для ориентировки одного среза по отношению к соседним. Рисунки делают на отдельных листках и нумеруют согласно номерам срезов. 4. Далее все рисунки переводят тушью на листки прозрачной кальки, причем контуры нервной системы рисуют особым цветом (например, красной тушью). Затем следует, накладывая прозрачные рисунки на кальке друг на друга в порядке номеров штук по 10 и ориентируя их по отношению друг к другу, сделать на них особые ориентировочные знаки. Для этого достаточно проколоть все сложенные листки в трех местах препаровальной иглой. Места прокола отмечают тушью. 5. С рисунков на обычной непрозрачной бумаге части нервной системы переводят на картон и вырезают ножницами или острым скальпелем. На каждом вырезанном кусочке сверху пишут номер среза и отмечают, к какому органу или части системы он относится. Можно для этого использовать цветные карандаши или акварельные краски, отмечая условными цветами соответственные части и органы. Чтобы мелкие части модели не растерялись и не перепутались, можно наклеивать их сразу же (непрочно!) при вырезывании на соответствующие предыдущие части. Склеивание модели. 1. В качестве основы берут кусок картона или фанеры. На него наклеивают полоску, вырезанную из того же картона, из которого вырезали срезы. На эту полоску № 1 наклеивают одним краем прозрачный (на кальке),рисунок № 1. Части нервной системы, вырезанные из картона и относящиеся к срезу № 1, наклеиваются на основу в соответственных местах, причем накладыванием на них сверху кальки № 1 (уже приклеенной к полоске картона) устанавливают их правильное и точное положение. Далее на полоску № 1 наклеивают такую же полоску № 2, а на нее наклеивают кальку № 2. При этом ориентировочные точки проколов на обеих кальках должны совпасть. Кальку № 2 отгибают кверху, а кальку № 1 срезают совсем. Затем вырезанные картонки, относящиеся к срезу № 2, наклеивают на соответственные части среза № 1, уже приклеенные к основанию. Ориентировку картонок среза № 2 опять контролируют пригибанием на них сверху приклеенной к полоске кальки № 2. Далее поступают таким же образом с калькой № 3 и частями среза № 3 и т. д. (рис. 5). 2. Если на данном срезе появляется новый орган или часть, соответствующей части для которой на предыдущих срезах не было, то для укрепления в соответственном месте этой картонной модели к основе приклеивается нужной высоты картонный мостик. Последний составляют из прямоугольных (или другой правильной формы) кусочков картона. На этом мостике укрепляют вновь появившуюся часть (рис. 5, 4). 3. Отдельные части модели можно соединить мостиками из карто
на или проволоки. В последнем случае просверливают буравчиком две соответствующие дырочки в обеих соединяемых частях модели и в них вставляют кусочек проволоки подходящей длины. Концы проволоки смазывают клеем. Если нужно, чтобы модель была разборной, то клеем смазывают только один конец проволоки. 4. Если срезов очень много, то для удобства их можно разбить на несколько групп, а потом готовые уже модели этих групп соединить вместе. 5. Срезанные кальки следует сохранять для возможной проверки. 6. Наклейка картонных частей срезов и вообще склеивание картона производится хорошим клеем. Рекомендуется довольно жидкий столярный клей. Лучше всего развести этот клей в выпаривательной чашке и держать его во время работы в водяной бане. Для смазывания картона пользуются щетинной кисточкой. Обработка модели. 1. Когда склеивание модели закончено, острые углы картонных пластинок и неровности подрезают возможно Рис. 5. Пластическая реконструкция. Склеивание модели переднего отдела нервной системы немертины Lineus gesserensis; / — калька с просвечивающим рисунком среза № 72, наклеенная на слой картонных полосок и отогнутая кверху, 2 — картонная полоска № 72, 3 — фанерная основа, 4—опорный мостик, или колонка, склеенная из квадратных кусочков картона, 5 — склеенная часть модели, 6 — остатки обрезанных калек, 7 — просвечивающие сквозь кальку ориентировочные знаки (орнг.)
тщательнее острым ножом или бритвой и всю модель обмазывают особой массой — папье-маше, приготовление которой приводится ниже. Этой массой заполняют все неровности и дефекты, из нее создают даже недостающие детали и части (в нашем примере — тонкие нервы). После обмазки поверхность модели смазывают кисточкой, смоченной в воде. 2. Для изготовления пластической массы требуются: 1) фильтровальная бумага, 2) просеянная ржаная мука, 3) обыкновенный мел в порошке (или зубной порошок). Фильтровальная бумага расщипывается на возможно мелкие кусочки и варится в воде до тех пор, пока не исчезнут отдельные мелкие кусочки и не образуется однородная Рис. 6. Пластическая реконструкция переднего отдела нервной системы немертины Lineus gesserensis. Вид со спинной стороны: /—дорзальная церебральная комиссура, 2 — дорзальный церебральный ганглий, 3 — церебральный орган, 4— боковой нервный ствол, 5—стоматогаст-рический нерв, 6—медиальный нерв, 7—вентральный церебральный ганглий, 8 —- канал церебрального органа, 9—вентральная церебральная комиссура (ориг.) тонкая бумажная масса. Для луч- шего измельчения бумаги необходимо ее почаще помешивать. Готовая бумажная масса вынимается из сосуда и отжимается от воды. Затем ржаную муку обливают в сосуде кипятком, помешивая палочкой; чтобы образовалась густая клейкая кашица. Часть бумажной массы разделяется на мелкие кусочки, которые растираются в руках и на гладкой доске с большим количеством ржаного клейстера. Количество фильтровальной бумаги зависит от цели, ради которой готовится масса. Для выравнивания неровностей модели берут немного бумаги. Для изготовления из массы недостающих деталей модели бумаги берут больше. Когда кусочки бумаги хорошо разотрут с ржаным клейстером, на доску насыпают мел и массу замешивают мелом на доске и в руках. Под влиянием мела масса начинает отставать от рук. Когда полученный ком будет кататься, масса готова, и ее надо лишь еще немного рас-тереть в руках, чтобы не было кусочков бумаги, муки и мела. Хранить эту массу следует в сырой фильтровальной бумаге и сырой тряпочке. 3. После того как обмазка модели окончательно высохла, вся модель тщательно прочищается тонкой наждачной бумагой. Затем небольшое количество столярного клея и гораздо большее количество порошка мела недолго 'кипятят в воде. В результате получается белая жидкость, тонким слоем которой покрывают модель, отчего все подробности ее резче выступают (рис. 6). 4. Изготовленная модель может быть раскрашена акварельными масляными красками. К масляным краскам для придания матовому.: прибавляют немного воска, растворенного в терпентине.
Подцарство Protozoa Тип Plasmodroma КЛАСС SARCODINA - САРКОДОВЫЕ Прохождение практикума по простейшим рекомендуется начинать с Sarcodina из соображений педагогического характера, ибо войти в курс работы с простейшими легче на объектах малоподвижных или на готовых препаратах. Относительная простота организации делает сар-кодовых удобным объектом для начала практикума. Определение пресноводных саркодовых (амеб, раковинных амеб) следует вести по «Определителю пресноводных беспозвоночных...» под ред. Л. А. Кутиковой и Я. И. Старобогатова (1977) или по монографии Пажа (Page, 1976) — см. список литературы в конце книги. Морские Foraminifera. Объекты выбирают из морского песка и так же ведут их определение по Кашмену (1933). Из Heliozoa предлагаем разобрать один объект часто встречающегося в пресных водах солнечника Actinosphaerium eichhorni. Труднее обстоит дело с Radiolaria. Эта весьма богатая формами группа представляет большой интерес, но в практикуме эти группы могут быть затронуты только вскользь, так как получение материала по лучевикам весьма затруднено. Поэтому ограничимся описанием немногих форм, рассчитывая на наличие материала в более крупных лабораториях. ПОДКЛАСС RHIZOPODA — КОРНЕНОЖКИ ОТРЯД AMOEBINA Amoeba proteus Roessel Материалы и методы изучения. Amoeba proteus принадлежит к сем. Amoebidae и живет в иле водоемов со стоячей, часто загрязненной водой (с гниющими на дне растительными остатками, листьями т. д.). Пробы из таких водоемов можно брать планктонным сачком, проводя им вблизи поверхности ила. Ил слегка взмучивают движениями сачка и собирают в последний. Можно также опустить в воду отверстием вниз батарейный стакан или четырехугольную аквариумную банку, быстро поворачивая ее отверстием кверху около водоема. Выходящий воздух взмучивает достаточное количество ила, который и зачерпывают сосудом. После спокойного стояния таким способом наполненных банок наверняка можно рассчитывать на нахождение крупных амеб в каплях воды, взятых пипеткой из придонного слоя. Амебы настолько велики, что их можно разыскивать даже под лупой.
Не представляет труда культивировать крупных амеб в лаборатории. Профильтрованную прудовую воду (лучше из водоема, где водятся амебы) разливают тонким слоем в чашки Петри, которые прикрывают крышечкой, В каждую чашку закладывают 5—6 зерен риса. Через несколько дней вокруг зерен образуется облачко — разводятся бактерии, которые служат пищей амебам. В подготовленные указанным способом чашки вносят живые амебы, которые хорошо живут и размножаются. Если в лаборатории есть культура инфузорий тетрахимен (с. 121), то раз в 3—4 дня в чашки Петри следует добавлять понемногу живых тетрахимен, которые охотно поедаются амебами. Пересев культур следует проводить через каждые 1,5—2 месяца. Изучают главным образом живой материал. Для рассмотрения ядра изготовляют тотальные препараты. Фиксация по Буэну или Шаудину с последующей приклейкой к стеклу целлоидином (с. 18). Окраска квасцовым кармином, железным гематоксилином или же двойная окраска метиловым зеленым (с. 33) для выявления в ядре хроматина и ядрышек. Изучение живого объекта. Amoeba proteus — одна из самых крупных амеб, достигает размера в активном состоянии 200— 500 мкм (даже больше). Данный вид характеризуется наличием многочисленных (до десятка и более) длинных, лопастных псевдоподий, нередко составляющих главную часть тела (рис. 7). Псевдоподии беспрерывно меняют свою форму, исчезают, возникают вновь, благодаря чему постоянство тела у амебы не сохраняется. Цитоплазма A. proteus совершенно ясно подразделяется на экто- и эндоплазму. Эктоплазма представляет собой тонкий гиалиновый гомогенный слой, одевающий тело амебы со всех сторон. Консистенция его вязкая. Приходя в соприкосновение с водой наружной среды, поверхность ее уплотняется (желатинизируется), образуя тончайшую мембрану поверхностной пленки (plasmalemma). Эндоплазма резко выделяется зернистой структурой, массой пищевых включений и мелких вакуолей с экскреторными кристаллами внутри и другими включениями (рис. 8). Окраска тела амебы зависит в значительной степени от включений эндоплазмы, нередко становится темно-серой благодаря наличию большого количества кристаллов, сильно преломляющих свет и выглядящих благодаря этому почти черными включениями в вакуолях. Присматриваясь внимательно к эндоплазме, особенно при больших увеличениях, удается заметить различие в консистенции внутренней и периферической ее областей. В центральной части, несколь Рис. 7. Amoeba proteus. А— в ползущем состоянии, Б— захватывающая пищу (Х200 из кн. Дофлейна): / — эктоплазма, 2 — эндоплазма. 3 — пищевые частички, 4 — ядро, 5 — псевдоподии, 6 — сократительная вакуоль
ко более светлой, замечают интенсивные токи цитоплазмы, что указывает на жидкое состояние этой зоны и что позволяет назвать внутреннюю часть плазмазоль (plasmasol, рис. 8). В периферической же области никаких токов не заметно и она представляет собой желатинизированную цитоплазму, называемую плазмажель (plasmagel). Подобное желатинизированное состояине обратимо — жель легко пере- Рис. 8. Amoeba proteus. Разделение цитоплазмы на слои (Х250) (из кн. Маста): 1— эктоплазма, 2 — плазмажель, 3— плазмазоль, 4— пищевые вакуоли, 5 — вакудли с экскреторными кристаллами, 6 — сократительная вакуоль, 7 — ядро ходит в золь, что можно наблюдать при формировании псевдоподий. Мы видим тогда, что токи протоплазмы устремляются к какому-нибудь пункту поверхности тела амебы. Плазмажель в этом месте разжижается, что хорошо видно, так как токи эндоплазмы как бы прорываются в эктоплазму и вызывают ее выпячивание в виде псевдоподии. В это выпячивание перетекает значительный участок эндоплазмы, и когда псевдоподия сформируется, можно видеть, как снова желатинизируется периферическая область плазмы на конце псевдоподии, бывшая до сих пор жидкой. Псевдоподии выпускаются и .для передвижения тела и для захвата пищи. В первом случае движение обусловливается тем, что в образующуюся псевдоподию начинает перетекать цитоплазма. При этом у A. proteus замечается так называемое шагающее движение. Амеба соприкасается с субстратом не всей нижней поверхностью, а только некоторыми точками. Псевдоподия вытягивается свободно вперед в воду и, загибаясь потом вниз, прилипает к субстрату. Одновременно задние псевдоподии отстают от субстрата, втягиваются в тело и таким образом амеба шагает вперед, снова и снова выпуская вперед псевдоподии (рис. 9).
Наблюдать подобный способ движения можно только рассматривая амебу сбоку. Для этого приходится применять следующее несложное приспособление (рис. 10). На предметном стекле канадским бальзамом наклеивают три полоски стекла (того же предметного) в виде буквы П. Между ними помещают каплю воды с амебами, покрывают покровным стеклом так, что оно ложится своими краями на эти полоски, и предметное стекло ставят вертикально на ребро так, чтобы амебы могли осесть на перекладину буквы П. Вставляя всю эту систему в вертикальном положении в микроскоп, тубус которого нагибают гори- зонтально, можно прекрасно проследить детали этого шагающего дви- жения. Для того чтобы амеба перемещалась в на частью своей поверхности прикрепиться к открепилась от субстрата, то передвижение псевдоподии и могут образовываться. Захватывание пищи производится следующим образом. Псевдоподия прикасается к пищевой частичке, начинает обтекать ее до тех пор, пока она не будет окружена плазмой со всех сторон. Тогда концы псевдоподии сливаются уже за пищевой частичкой, и она таким образом оказывается внутри тела амебы. При дефекации вакуоль с непереваренными остатками подходит к поверхности и прорывается наружу, благодаря чему содержимое ее выбрасывается в окру пространстве, она долж-субстрату. Если амеба ее- прекращается, хотя жающую среду. Единственная сократительная вакуоль лежит у поверхности в толще плаз-мажеля. При обычной комнатной темпе ратуре опорожнение ее совершается через 5—8 мин. Окрашенные препараты. Ядро на живой амебе увидеть почти не удается — оно в редких случаях выглядит светлым пятном, чаще же маскируется темными включениями плазмы. Изучение окрашенного препарата показывает, что ядро имеет дисковидную форму. Центральная часть его занята относительно крупным центральным телом (рис. 11). В периферической зоне разбросаны зернышки, окрашивающиеся гематоксилином, а между ними — вакуоли. Реакция по Фёльгену на тимонуклеиновую кислоту показывает, что хроматин сконцентрирован в центральном теле в виде сеточки. Периферическая же зона совершенно лишена хроматиновых элементов. При Рис. 9. Amoeba proteus «Шагающая» амеба, вид сбоку (Х100) (по Деллингеру из кн. Дофлейна) Рис. 10. Схема устройства приспособления для рассматривания Amoeba proteus сбоку: 1 — предметное стекло. 2 —- покровное стекло, 3 — полосочки стекла, приклеенные канадским бальзамом к предметному стеклу, 4 — комочки воска (ориг.)
Рис. 11. Amoeba proteus. Ядро. A—вид с широкой стороны; Б — вид с узкой стороны— окрашено гематоксилином (Х1000) (из кн. Дофлейна); В — вид с широкой стороны; Г —с узкой стороны — реакция Фельгена (Х750) (из кн. Богдановича): /—периферическая зона, 2 — центральное тело Рис. 12. Difflugia piriformis. Общий вид in vivo (Х150) (из кн. Маста): 1 — песчинки на поверхности раковинки, 2 — граница цитоплазмы внутри раковинки, 3 — выступающая из раковинки цитоплазма. 4 — псевдоподии, 5 — плазмажель, 6 — плазмазоль двойной окраске метиловым зеленым — пиро-нином выявляется, что в периферической части ядра расположены многочисленные нуклео-лы (окрашиваются в розовый цвет). ОТРЯД TESTACEA Difflugia piriformis Perty Материал и методы изучения. Difflugia piriformis (из сем. Difflugiidae) живет приблизительно в тех же условиях, что и Amoeba proteus и может быть поэтому обнаружена в тех же пробах, откуда мы берем эту амебу. Изучение ведется in vivo — живые экземпляры, однако, попадаются далеко не часто, обычно в пробе обнаруживаются пустые раковинки. Для рассмотрения ядра приходится изготовлять из живых корненожек тотальные препараты после фиксации Шаудином, окрашенные квасцовым кармином. Изучение морфологии. Раковинка D. piriformis имеет грушевидную форму, обычно с легким заострением на вершине и округлую в сечении (рис. 12). Суженная часть раковинки— ее основание — открывается наружу устьем, расположенным терминально. Длина раковинки сильно варьирует — от 60 до 500 мкм и более. Раковинка построена из посторонних частичек. Чаще всего это мелкие песчинки неправильной формы, вплотную прилегающие друг к другу. Нередко в состав раковинки входят панцыри диатомей и т. п. Цитоплазма обычно заполняет раковинку целиком. Длинные пальцевидные псевдоподии в небольшом числе выпускаются через
устье. На каждой из них при большом увеличении можно видеть токи цитоплазмы, направленные к концу, если псевдоподия вытягивается, или к основанию, если она втягивается. Поверхностный слой цитоплазмы в них желатинизирован в виде тонкой пленочки на поверхности. Имеется несколько сократительных вакуолей, но их увидеть почти никогда не удается, так как они лежат внутри раковинки и сильно преломляющие свет песчинки мешают рассмотреть содержимое цитоплазмы. Ядро пузырьковидного характера с небольшим кариозомом внутри, оно на окрашенных препаратах также плохо видно. Euglypha alveolata Duj Материал и методы изучения. Euglypha alveolata принадлежит к сем. Euglyphi-dae, в большом количестве может быть обнаружена в выжимках из торфяного мха, которые производятся обычно рукой из верхних частей (стеблей) мха, насыщенных водой. Отжатые вершины полезно прополоскать в отжатой жидкости и снова выжать. Рис. 13. Euglypha alveolata. А — структура раковины; Б — инцистированная корненожка (X 500) (из кн. Дофлейна) Рис, 14. Euglypha alveolata. Общая организация in vivo (Х750) (из кн. Гартмана): I—стенка раковины, 2—гиалиновая цитоплазма, 3 — ядро, 4 — кариосома, 5 — формирующиеся пластинки раковины, 6 — зернистая цитоплазма, 7— сократительная вакуоль, 8—альвеолярная цитоплазма, 9—филлоподии
На дне сосуда отстаивается осадок, из которого берут пипеткой капельки и в них наряду с другими Testacea будут и искомые Euglypha. Изучение ведется, главным образом, in vivo с применением иммерсионной системы. И здесь так же, как и в случае с Difflugia, чаще попадаются пустые раковинки. Тотальные препараты также следует изготовить для рассмотрения ядра и некоторых деталей строения. Рис. 15. Euglypha alveolata на окрашенном гематоксилином препарате (Х750) из книги Дофлейиа: 1 — гиалиновая цитоплазма, 2 — ядро, 3 — зернистая цитоплазма, 4 — альвеолярная цитоплазма Изучение морфологии. Раковинка яйцевидной формы с закругленной вершиной и почти округлым поперечным сечением. Устье—на суженном конце окружено обычно восемью зубцами. Длина раковинки 30—150 мкм. Раковинка бесцветна. В состав раковинки входят тонкие кремневые пластиночки правильной овальной формы (рис. 13), налегающие своими краями друг на друга. Нередко от раковинки в стороны отходят тонкие щетинки или волоски. Цитоплазма выполняет раковинку целиком и подразделяется на три слоя. От устья приблизительно до середины в ней видны крупные вакуоли с водянистым содержимым, это — вакуолистый, альвеолярный слой. Далее следует сравнительно узкая зона с большим количеством гранул и пищевых частичек (рис. 14) — зернистый слой. В этом слое происходит переваривание пищи. Наконец, вершина раковинки занята прозрачной цитоплазмой, в которой помещается ядро. И в зернистом, и в гиалиновом слое можно заметить формирующиеся пластиночки раковины (рис. 14). Псевдоподии отходят во все стороны от выступающего из устья участка плазмы. По типу строения это филлопо-дии — прямые, заостренные на концах, изредка ветвящиеся, прозрачные, исключительно эктоплазматические. Единственная сократительная вакуоль помещается в зернистой плазме. Ядро хорошо видно и на живом объекте в виде прозрачного пузырька с более темным кариозомом внутри. На окрашенных препаратах видны мелкие зернышки хроматина, разбросанные в ядерном соке. На этих же препаратах красится и гиалиновый слой сильней по сравнению с другими участками цитоплазмы (рис. 15). В материале нередко попадаются инци-стированные Euglypha. Циста образуется внутри раковинки, причем вокруг нее за счет запасных пластиночек формируется кремнистая обкладка. Сама же циста (шаровидной формы) лежит свободно в этой обкладке (см. рис. 13, Б). Arcella vulgaris Ehrbg. Материал и методы изучения. Arcella vulgaris (из сем. Arcellidae) попадается часто вместе с Difflugia в тех же пробах. Изучается в живом состоянии и на окрашенных препаратах.
Изучение живого объекта. Раковинка дисковидная (или в виде часового стекла). Устье открывается наружу в центре вогнутой стороны. Другая сторона выпуклая (рис. 16, А). Диаметр колеблется от 50 до 150 мкм. Материал раковинки — псевдохитин, обычно окрашенный (окислами железа) в коричневый цвет, вследствие чего внутреннее содержимое in vivo почти не удается рассмотреть. Поверхность раковинки имеет определенную скульптуру— она разбита на мелкие гексагональные поля (рис. 16, В). Подобная.структура яснее выступает на мертвых пустых раковинках, особенно при рассматривании под иммерсией. Протоплазма не заполняет всего объема раковинки и связана с ее стенками посредством особых выростов (эпиподий). Наружу через устье высовываются немногочисленные лопастные закругленные на концах псевдоподии. Несколько сократительных вакуолей располагается по периферии диска, но увидеть их затруднительно. Окрашенные препараты. На окрашенных препаратах видны два ядра с крупным кариозомом каждое, лежа- Рис. 16. Arcella vulgaris. А — живой экземпляр, вид сбоку (Х500) (из кн. Бючли); Б — окрашенный гематоксилином, вид сверху (Х700) (из кн. Дофлейна); В — структура раковинки {X1500) (из кн. Бючли): 1 — стенка раковинки, 2 — цитоплазма, 3— сократительная вакуоль, 4— псевдоподии, 5 — эпиподии, 6 — ядро, 7 — хромидиальное кольпо щие друг против друга по сторонам от устья (рис. 16, Б). Кроме ядер основными красками сильно окрашивается кольцевидно расположенная зона цитоплазмы (рис. 16, Б, 7), содержащая значительные количества рибосомальной РНК, а также гликопротеидов. В период господства хромидиальной теории строения ядра у простейших эта зона получила название «хромидаль- ного кольца». ОТРЯД FORAMINIFERA Морфология раковинки различных Foraminifera Материал и методы изучения. Ниже предлагается изложение в сравнительно-анатомическом аспекте структуры раковинок различных Foraminifera. В качестве материала служат корненожки из морского песка, собранного с различных глубин наших северных морей (особенно с Мурманского побережья) и Черного моря (в районе Севастопольской и Карадагской биологических станций). Песок собирают в 70° спирт,
часть же с живыми корненожками должна быть зафиксирована сулемовым фиксатором для изготовления окрашенных препаратов. Раковинки выбирают из песка препаровальными иглами под лупой и рассматривают на постоянных тотальных препаратах. Из 70° спивта их переводят в часовом стекле через 96° спирт в карбол-ксилол, из которого их можно заключать прямо в бальзам. Можно делать препараты из высушенных раковинок—бальзам подбавляют к материалу, лежащему на нагретом предметном стекле. Для изучения наружной структуры раковинок их можно рассматривать высушенными, освещая сверху сильным источником света. Нет надобности заключать их в постоянный препарат, их рассматривают в падающем свете на черном фоне. Изучение ядерного аппарата возможно только иа декальцинированных объектах. Для этого корненожек, фиксированных сулемой, следует перенести в 70° спирт, к которому прибавлено 1—2% раствора соляной кислоты. Через несколько часов раковинка растворяется, и объект основательно промывают спиртом и окрашивают квасцовым кармином. Однокамерные раковинки. 1. Мешковидные. Наиболее просто устроены мешковидные раковинки. Более примитивные из них те, которые имеют аггломерированные стенки: на псевдохитиновой основе прикреплены многочисленные посторонние частички — песчинки и т. д. У представителей рода Saccammina (сем. Saccamminidae, рис. 17, /), шарообразная раковинка открывается наружу устьем на вершине слабо выраженной шейки. Эти корненожки подбирают определенный материал для построения раковинки. У более совершенных представителей (например, из рода Lagena сем. Lagenidae, рис. 17, 2) раковинка пропитывается известью. И в этом случае устье открывается на вершине шейки, часто выраженной довольно сильно. 2. Трубчатые. Вытягивание в длину обычно наблюдается у примитивных корненожек с аггломерированной стенкой раковинки, примером чего может служить Hyperammina (сем. Hyperamminidae, рис. 17, 3 и 4) и Rhabdammina (сем. Astrorhizidae, рис. 17, 5 и 6). У первой один конец слепо замкнут, у второй оба конца трубки открыты и служат двумя устьями. 3. 3 в е з д ч а т ы е. От центральной камеры отходят несколько трубчатых отростков — Astrorhiza (сем. Astrorhizidae, рис. 17, 7). На конце каждого из них — устье. 4. Спиральные1. Сильно вытянутые в длину трубчатые раковинки имеют тенденцию закручиваться в спираль, что наблюдается в различных группах Foraminifera. Среди них имеются такие, которые склеивают стенку из песчинок (Ammodiscus, сем. Ammodiscidae, рис. 17, 8 и 9), другие же обладают известковой раковинкой (Cornuspira, сем. Ophtaimididae, рис. 17, 10). Многокамерные раковины. 1. Прямые. Среди них можно видеть формы с аггломерированным скелетом. У Reophax (сем. Reophacidae, рис. 17, 11) раковинка прямая или слегка изогнутая, подразделенная пережимами на сравнительно небольшое количество камер, то объемлющих друг друга, то разъединенных и сообщающихся трубчатыми шейками. 1 Спиральные раковины этого типа на самом деле двухкамерные, так как в них имеется округлая начальная (эмбриональная) камера, к которой пристраивается трубка окончательной, закручивающейся в спираль.
Рис. 17. Раковинки различных Foraminifera (рис. 1—11, 13—22 из кн. Кэш-мена, 12 — из кн. Дофлейна, 23 — из ки. Ланга): 1 — Saccammina sphaerica (ХЮ), 2 — Lagena plumigera (Х50(, 3 — Hyperammina elongata, общий вид, 4— то же, в разрезе (Х50), 5 •— Rhabdammina linearis, общий вид, 6 — то же, в разрезе (Х7), 7 — Astrorhiza llmicola с частично вскрытой стенкой (Х5), 8 —- Ammbdiscus incertus, вид сбоку, 9 — то же, вид со стороны устья (Х135), 10 — Cornuspira involvens (Х20); 11— Rheophax nodulosus (X7), 12—Nodosaria hispida (X10), 13 — Haplophragmoides canariensis, вид сбоку, 14 — то же, вид со стороны устья (Х65), 15 — Nonion umbilicatulus, вид сбоку, 16 — то же, вид со стороны устья (Х50), 17 — Discorb is vesicularis, вид с вершины, 18 — то же, вид с основания (Х20), 19 — Quinqueloculina setninulum, вид сбоку, 20 —* то же, вид со стороны устья (Х40), 21 — Spiroloculina depressa (Х50), 22— Textularia sagittula (X20), 23 — Globigerina sp. (X50).
Известковые стенки мы видим у Nodosaria (сем. Lagenidae, рис. 17, 12) с прямой многокамерной раковинкой. Нередко вдоль нее проходят ребра, служащие средством для укрепления раковинки. 2. Спирально закрученные. Прежде всего должны быть упомянуты довольно редкие в этом типе раковинки с аггломерирован-ной стенкой — Haplophragmoides (сем. Lituolidae, рис. 17, 13 и 14). Здесь небольшое число камер свернуто в плоскую спираль. Последняя камера имеет полулунное устье. Остальные типы раковинок известковые. Раковинка, закрученная в плоскую спираль. Примером служит Nonion, Elphidium ( = Polystomella) из сем. Nonionidae. Внутренние обороты частично прикрывают последующие, но они все же видны снаружи (Nonion, рис. 17, 15 и 16) —эволютная раковинка, или последующие обороты целиком обнимают предыдущие — они оказываются внутренними (снаружи не видными), и такая раковинка приобретает инво-лютный характер (Elphidium, рис. 18, А). Устье в таких случаях щелевидно или их несколько. Следует обратить внимание на пористость стенок. Раковинка, закрученная в коническую спираль (трохоидная). Наиболее обычная форма среди Foraminifera. Более распространены раковинки с низкой спиралью. В качестве примера можно привести Rotalia или Discorbis (из сем. Rotalidae, рис. 17, 17 и 18). На такой раковинке различают вершину (на ней видны все обороты) и основание. Если смотреть со стороны основания, то видны только несколько последних камер и даже иногда только одна последняя, т. е. со стороны вершины Рис. 18. Раковинки Elphidium и Archiacina. А — раковинка Elphidium (Polystomella) strigiata (Х50) (из Шульце); Б — раковинка Archiacina verworni (ХЗО) (изЛаига): У— устье раковинки, 2 — перегородки между камерами, 3—поры, 4 — эмбриональные завитки раковинки
раковинка имеет эволютные обороты, со стороны же основания — инво-лютные. Устье у таких раковинок обычно бывает щелевидно и располагается сбоку. Стенки раковинок у обеих форм прободен-ные. 3. Раковинка Miliolidae. Ее камеры вытянуты в одном направлении параллельно оси раковинки и расположены в нескольких взаимно пересекающихся плоскостях. Наибольшее количество плоскостей— пять — у Quinqueloculina (рис. 17, 19 и 20). Они расположены друг к другу под углом 72°. Снаружи при этом видны всего три оборота, прикрывающие все внутренние. Устье помещается на одном из полюсов раковинки и снабжено зубцом. У Triloculina камеры располагаются в трех плоскостях. У Spiroloculina (рис. 17, 21) камеры распола-ются в одной плоскости, друг против друга. 4. Двухрядные раковинки. Своеобразное видоизменение спирального расположения камер можно продемонстрировать на примере Textularia (сем. Textulariidae, рис. 17, 22). В начале развития камеры располагаются спирально, но позже они образуют два ряда чередующихся друг с другом камер наподобие заплетенной косы. Стенки прободены и аггломерированы песчинками. 5. Ацервальные раковинки. Свойственны представителям рода Globigerina (сем. Globigerinidae, рис. 17, 23) и характеризуются беспорядочным на первый взгляд расположением шарообразных камер. Но, присматриваясь к расположению более старых мелких камер, видно их спиральное расположение. Стенки раковинки прободены порами, и у хорошо сохранившихся экземпляров можно видеть тонкие длинные шипы, играющие существенную роль при парении данной формы, так как она ведет планктонный образ жизни. 6. Циклические раковинки. Данный тип есть производное спирального. При этом внутренние камеры располагаются по спирали, наружные же—концентрическими кольцами (Archtacina, сем. Репегор-lidae, рис. 18, Б, Orbitolit.es и др.). Изучение ядерного аппарата Foraminifera. Для изучения ядерного аппарата декальцинируются фиксированные в живом состоянии Elphi-dium и другие более крупные корненожки. Фораминиферы обладают, как известно, сложным гетерофазным жизненным циклом (диплоидные агамонты и гаплоидные гамонты). На препаратах могут попасться разные стадии цикла. Агамонты многоядерны. В них обнаруживаются покоящиеся ядра, а также стадии мейоза, ведущие к образованию агамет. Вырастающие из агамет гаплоидные гамонты на большей части своей жизни обладают одним крупным пузырьковидным ядром. На препаратах попадаются иногда и стадии гаметогенеза, в результате которого вся цитоплазма гамонта оказывается заполненной огромным числом ядер гамет или уже сформированными гаметами. Чтобы разобраться в стадиях жизненного цикла форамини-фер, см. Догель В. А., Полянский Ю. И. и Хейсин Е. М. «Общая протозоология», 1962; Фурсенко А. В. «Введение в изучение фораминифер», 1978.
ПОДКЛАСС HELIOZOA—СОЛНЕЧНИКИ Actinosphaerium eichhorni Enrbg Материал и методы изучения. Actinosphaerium eichhorni (из сем. Aphrothoraca) живет в мелких стоячих водоемах с водой, богатой органическими веществами. Часто развивается в большом количестве в байках с пробами, взятыми подобно тому, как это было описано в отношении Amoeba proteus. Солнечников легко обнаружить с по- мощью лупы иа стейках сосуда, откуда берут пипеткой для изучения главным образом в живом состоянии. При этом покровное стекло должно быть обязательно снабжено восковыми иожками. Тотальные препараты изготовляют только для изучения ядра. Особенно хорошие результаты получаются при обработке по Фёльгеиу после фиксации сулемой с уксусной кислотой, ио можно ограничиться и окраской гематоксилином или кармином. Изучение морфологии. От шарообразного тела диаметром 200—300 мкм (достигающего и больше 1 мм) отходят многочисленные тонкие прямые псевдоподии, направленные по радиусам (рис. 19). Цитоплазма Actinosphaerium имеет грубо-вакуо-листую (альвеолярную) структуру и разбивается на два слоя. Наружный (кор-диаметра тела, состоит из Рис. 19. Actinosphaerium eichhorni. Живой солнечник (Х500) из кн. Дофлейна: / — сердцевинный слой цитоплазмы, 2 —пища, 3 — ядра, 4— аксоподии, 5 —корковый слой цитоплазмы, 6 — сократительная вакуоль ковый) слой, достигающий ’/ю—Че всего очень крупных вакуолей с прозрачным содержимым, отграниченных друг от друга мелкозернистой цитоплазмой. В «молодом» возрасте (у мелких экземпляров) вакуоли располагаются правильным слоем и сдавливают друг друга в радиальном направлении. У «взрослых» же (крупных) солнечников правильность расположения нарушается, и вакуоли располагаются неправильно, в несколько рядов (рис. 20, А). Вакуоли внутреннего слоя (сердцевинного) значительно мельче, между ними прослойки зернистой цитоплазмы более толстые. Этот слой, кроме того, обычно бывает набит пищевыми включениями (от чего зависит его окраска), и в нем же помещается ядерный аппарат Actinosphaerium. Граница между обоими слоями выражена очень резко (рис. 19). Даружный слой выпускает псевдоподии, постепенно сужающиеся к дистальному концу. Мелкозернистая, текучая плазма псевдоподий образует иногда легкие вздутия (узелки).
4 Рис. 20. Actinosphaerium eichhorni. А—край тела in vivo (XH00) (из кн. Бючли); Б — ядро, обработанное по Фёльгену (Х2500) (из кн. Богдановича) : / — пища, 2— ядро, 3— сердцевинный слой цитоплазмы, 4—корковая цитоплазма, 5— аксоподии, 6 — осевая нить аксоподии, 7— карцозома Внутри каждой псевдоподии при больших увеличениях (под им-мерзией) следует рассмотреть плотную скелетную осевую нить. Каждая нить входит в пределы тела, пронизывает наружный слой и заканчивается в периферической области сердцевинного слоя (рис. 20, Л). Псевдоподии такой структуры носят название аксопо-дий. Они могут медленно изгибаться, могут вытягиваться и, наоборот, могут втягиваться внутрь плазмы. В последнем случае осевая нить разжижается и исчезает. Фибриллярная структура осевой нити может быть уловлена только путем применения специальных методов исследования (затемненное поле зрения, окраска срезов особыми методами и т. д.). Аксоподии служат солнечникам главным образом для захвата пищи, но при медленном их изгибании животные могут передвигаться по субстрату катящимся способом. Кроме того, Actinosphaerium может парить в воде и даже плавать в ней. Пища захватывается аксоподиями. Инфузории, коловратки, мелкие черви и т. п. при прикосновении к псевдоподии перестают двигаться, видимо, их парализует какое-то ядовитое вещество, выделяемое солнечником. Далее вокруг добычи склоняются соседние поверхности коркового слоя плазмы. От последнего нередко выступает широкая лопастная псевдоподия, которая и поглощает пищу, иногда же на поверхности просто образуется ямка, в которую пища и втягивается. Далее она окружается светлым полем и передается в сердцевинный слой в виде пищеварительной вакуоли (см. рис. 19). Непереваренные остатки выталкиваются вон из тела. Сократительные вакуоли у Actinosphaerium располагаются в наружном слое (см. рис. 19). Обычно их две, хотя часто бывает и больше, и количество их может доходить даже до 14. Перед сокращением каждая вакуоль сильно увеличивается в размерах, значительно выдается над поверхностью тела и лопается. Сокращение вакуолей происходит не одновременно, и интервалы между ними при комнатной температуре бывают несколько меньше минуты. аксоподии, и она подводится к
Ядра располагаются в сердцевинном слое в большом количестве (см. рис. 19). У крупных экземпляров их бывает больше 200. Каждое из них небольших размеров, in vivo они видны плохо — обычно мешают многочисленные включения внутреннего слоя, поэтому лучше ядра рассматривать на окрашенном препарате. Тогда выступает их кари-озомная природа. Реакция Фёльгена показывает, что хроматиновые частицы распределены как в кариозоме, так и в окружающей его периферической части ядра (рис. 20, Б). Нередко удается наблюдать стадии деления. Тело солнечника при этом перешнуровывается пополам. ПОДКЛАСС RADIOLARIA — ЛУЧЕВИКИ Данная группа саркодовых живет главным образом в теплых и тропических морях. В пределах Советского Союза радиолярии попадаются изредка в Кольском заливе, известны из морей Дальнего Востока, поэтому получение материала затруднено. Приходится основной объект брать из Средиземноморского материала или Японского моря. Acanthometra sp. Материал и методы изучения. Различные виды Acanthometra (из сем. Acanthomet-ridae) ведут планктонный образ жизни. При обычных методах сбора планктона, с фиксацией формалином, сохраняются плохо. Их следует отбирать из планктонной пробы пипеткой и фиксировать отдельно. В качестве фиксирующих жидкостей годятся пикриновые смеси, Ценкер, осмиевые смеси. Материал хранится в 70° спирте. Окраска квасцовым кармином или гематоксилинами. Рис. 21. Acanthometra elastica in vivo (X1000) (из кн. Бючли): 1 — экваториальные иглы, 2 — тропические иглы, 3 — полярные иглы. 4 — псевдоподии, 5 — экстра-капсулярная цитоплазма, 6— интракапсулярная цитоплазма с разбросанными в ней ядрами, 7— миофриски Изучение морфологии. Шарообразное тело едва достигает в диаметре 40—50 мкм. От него во все стороны расходятся псевдоподии и торчат наружу скелетные иглы. Протоплазма имеет альвеолярную структуру и резко разделяется центральной хитино-идной капсулой на два слоя: внутреннюю интракапсулярную и наружную экстракапсулярную плазму (calymma) (рис. 21). Интракапсулярная плазма более мелкоячеиста, содержит в себе ядерный аппарат, жировые капельки и многочисленные зооксантеллы (симбиотические водоросли), окрашенные в желтый цвет, что и придает окраску всей внутренней плазме. Экстракапсулярная цитоплазма грубо вакуолиста, прозрачна. Промежутки между вакуолями заполнены зернистой
цитоплазмой. От нее отходят во все стороны аксоподии, тонкие, длинные с зернистой цитоплазмой и с осевой нитью внутри. Нередко образуются на них узелки. Псевдоподии служат главным образом для захвата пищи. Переваривание ее идет экстраплазматически, т. е. по псевдоподиям притекает цитоплазма к захваченной пищевой частичке (например, диатомовой водоросли), здесь происходит переваривание, и растворенные вещества перетекают обратно в тело. На препаратах псевдоподии обычно не сохраняются. Псевдохитиновая центральная капсула тонкая, эластичная, пронизана многочисленными порами, с помощью которых оба слоя цитоплазмы сообщаются друг с другом. Сквозь капсулу к центру тела проходят скелетные иглы. Они соединяются вместе своими пирамидально заостренными проксимальными концами и прочно скрепляются. Материал, из которого построены иглы Acanthometra, — сернокислый стронций. Всего имеется 20 скелетных игл одинакового размера. Длина отрезка иглы, выступающего за пределы наружного слоя, равна приблизительно диаметру тела. Иглы располагаются по так называемому Мюллеровскому закону, образуя пять параллельных кругов по четыре иглы каждый. Тело ориентируется таким образом, что четыре иглы располагаются по экватору друг к другу под углом 90°. Два круга (пояса) тропических игл ориентируются в промежутках между экваториальными иглами под углом 30° к экваториальной плоскости по обеим сторонам от нее. Наконец, иглы двух полярных кругов располагаются точно над и под экваториала альной плоскости. При такой ориентировке полюса оказываются совсем без игл. Экстракапсулярная цитоплазма в области каждой иглы выдается конусом, одевая ее на некотором протяжении. Прикреплены эти выросты с помощью пучка (конуса) сократимых элементов, так называемых миофрисков (рис. 22). Сокращением миофрисков растягивается вся внекапсу-лярная цитоплазма, чем изменяется — увеличивается общая поверхность тела. Удлинение миофрисков, наоборот, приводит к сокращению этой цитоплазмы. Подобное изменение поверхности тела позволяет радиолярии передвигаться пассивно в вертикальном иглами, но под углом 4о к эватори- ❖ S Рис. 22. Acanthometra pellucida (Х2000) (из кн. Ланга): / — скелетная игла, 2 — миофриски, <? —псевдоподии. 4— экстракапсулярная цитоплазма, 5 — интракапсулярная цитоплазма
направлении в толще воды, увеличивая и уменьшая свою способность «парения» в водной толще. Миофриски имеют поперечнополосатую структуру, чем эти сократимые элементы резко отличаются от гладких мионем других простейших. Многочисленные ядра разбросаны исключительно во внутренней зоне плазмы, ближе к ее периферии. Различные феодарии Материал и методы изучения. Представители отряда Phaeodaria являются планктонными глубоководными простейшими. Они обильно представлены в дальневосточных морях, и каждая проба, взятая планктонными сетками даже с крупной ячеей с глубины 1000, 500 м, содержит их в массе благодаря значительным размерам этих представителей. Планктонные пробы обычно фиксируются формалином. Из такой пробы под лупой или бинокуляром выбирают радиолярии, и из них готовят тотальные препараты либо в неокрашенном состоянии, либо их слегка подкрашивают квасцовым кармином. Aulacantha scolymantha Haeckel (сем. Aulacanthidae) Эта крупная радиолярия имеет шарообразную форму (рис. 23, А) и достигает в диаметре 3—3,5 мм. В центре цитоплазматического тела Aulacantha сосредоточено особое, свойственное только данному отряду образование — феодиум, представляющее собой скопление пигментных зерен, частиц перевариваемой пищи (чаще это створки диатомовых водорослей) и гранул запасных питательных веществ вместе с каплями жира. Феодиум принимает важное участие в обмене веществ радиолярии. Единственная у неделящихся особей центральная капсула находится в непосредственной близости с феодиумом, она небольших размеров и имеет три отверстия, сообщающих интракапсулярную цитоплазму с экстракапсулярной. Одно из этих отверстий более крупное (астро-пиль), два других — же маленькие (парапили), расположены на противоположном полюсе от первого. Интракапсулярная цитоплазма имеет грубо вакуолистую структуру, и в ней заключено крупное ядро. У делящихся Aulacantha может быть две и даже четыре центральные капсулы. Радиальные скелетные кремнистые иглы прямые, полые внутри, гладкие (или с небольшими бугорками), в числе 30—40, пронизывают толщу внекапсулярной цитоплазмы и своими проксимальными концами сходятся в толще феодиума'. Их дистальные концы слегка выдаются над поверхностью тела радиолярии, приподнимая плазму в этих местах. Кроме радиальных игл Aulacantha у самой поверхности плазмы имеет сплошной слой мелких тоже прямых тангентальных иголочек. 1 У представителей других родов сем. Aulacanthidae иглы могут быть с отростками, как, например, у видов рода Aulospathis (рис. 23, Б).
2 7 Рис. 23. Различные феодарии (ориг.). А— Aulacantha scolymantha, целая радиолярия (Х35); Б — две иглы Aulospathis variabilis (Х150); В — Circospathis sexfurca, общий вид (Х20); Г—Tuscaretta tubulosa, раковинка (ХЗО); Д — Castanidium variabile, раковинка (Х25); Е — центральная капсула Tuscaroridae: 1— феодиум, 2—радиальные иглы, 3 — центральная капсула, 4 — аборальная игла, 5—оральная игла, 6 — устье (пилом), 7 — побочные иглы, 8^ главные иглы, 9 — ядро, 10 — астропиль, 11 — парапили
Circospathis sexfurca Haeckel (сем. Circoporidae) Тело этой своеобразной феодарии заключено в сплошную шарообразную темно-коричневую кремневую раковинку, имеющую на поверхности ячеистую структуру в виде довольно правильных многоугольников (рис. 23, В). С наружной средой полость раковинки сообщается через устье (пилом), окруженное четырьмя крупными зубцами (рис. 23, В, 6). Диаметр шара 0,5—0,75 мм. От раковинки отходят шесть радиальных игл длиной немного меньше ее диаметра. Расширенное основание каждой иглы пронизано десятком пор. На дистальных концах иглы раздвоены или имеют по три концевых веточки. Как поверхность раковинки, так и радиальная игла покрыты редко сидящими, загнутыми щетинками. Tuscaretta tubulosa Murray (сем. Tuscaroridae) Раковинка овальной формы (рис. 23, Г), темно-коричневая, в длину достигает 1,5 мм, пронизана очень тонкими порами. На одном из полюсов раковинки имеется довольно широкое устье (пилом), сжатое с боков, с двумя отходящими от его краев оральными иглами (рис. 23, Г, 5). Они длинные, обычно бывают обломаны и на слегка вздутых основаниях имеют несколько пор. Вблизи устья от стенки раковинки отходят 3—4 аборальные иглы (рис. 23, Г, 4), тоже длинные, загнутые и с порами у основания. Иглы на всем протяжении покрыты загнутыми дистально шипиками. У живых особей экстракапсулярная цитоплазма тонким слоем покрывает как раковинку, так и иглы. Внутри раковинки лежит центральная капсула овальной формы и ярко окрашенный феодиум. Castanidium variabile Borgert (сем. Castanellidae) Обладают правильно шаровидной бесцветной кремнистой раковинкой, пронизанной массой довольно крупных пор одинаковой величины. Диаметр раковинки около 0,75 мм. Наряду с порами имеется и широкое устье (пилом), снабженное 2—3 иглами, прикрепленными к его краям. От поверхности раковинки отходят многочисленные радиальные иглы двух категорий — главные и побочные. Главные иглы длинные, почти равные радиусу раковинки, перемежаются с побочными, которые короче главных в несколько раз. Чаще иглы бывают с обломанными кончиками. КЛАСС MASTIGOPHORA — ЖГУТИКОНОСЦЫ Здесь рассматриваются представители семи отрядов этого класса (Kinetoplastida, Euglenoidina, Phytomonadina, Dinoflagellata, Polymasti-gina, Hypermastigina и Opalinina). В пределах каждого отряда выбраны наиболее характерные формы. Как и среди других Protozoa, при изучении Mastigophora наиболее существенную роль в большинстве 76
случаев играет изучение живого материала. В ряде случаев его приходится дополнять фиксированными и окрашенными различными способами препаратами. ОТРЯД KINETOPLASTIDA Bodo Sp. Материал и методы изучения. Различные виды Bodo довольно часто можно обнаружить в очень сильно загрязненных водах. Обычно удается наблюдать развитие в значительном количестве Bodo в «навозных культурах». Последние получаются следующим образом. Небольшое количество слегка перепревшего конского навоза заливают на 2/3 водой. Через несколько дней наблюдается массовое развитие различных простейших и в том числе Bodo. В пределах этого рода различают несколько видов, чрезвычайно схожих друг с другом по своим морфологическим признакам. Изучение строения Bodo следует вести на живом материале. Если культура богата, то можно сделать препарат, зафиксирован его жидкостью Шаудина по методу мазков и окрасив железным гематоксилином. Изучение живого объекта. Чаще других попадаются Bodo caudatus Duj и В. edax Klebs — два очень близких вида. Первый из них несколько крупнее второго. Форма тела довольно сильно варьирует. Тело несколько суживается к заднему концу (рис. 24, Л). Длина В. caudatus 10—25 мкм. На переднем конце берут начало два длинных жгутика. Рис. 24. Bodo edax (Х1000). А—неделящаяся особь; Б—К — последовательные стадии деления (по Кюну):
Один из них при движении направлен вперед, другой — назад. Первый активно движется, вызывая поступательное движение жгутиконосца, второй более или менее пассивно волочится в воде. На переднем же конце у места отхождения жгутиков происходит заглатывание пищи. Морфологически оформленного ротового отверстия у Bodo нет, но имеется особый участок протоплазмы, лишенный пелликулы («Mundstel-1е»). Одна простая сократительная вакуоль расположена на переднем конце, недалеко от места прикрепления жгутиков. В протоплазме часто имеются мелкие частицы заглоченной пищи (обычно бактерии). Окрашенные препараты. На окрашенных железным гематоксилином препарате следует рассмотреть ядро с кариозомом, расположенное в передней половине тела. Впереди ядра лежит кинетопласт (параба-зальное тело). На удачно окрашенных железным гематоксилином препаратах с иммерсией удается рассмотреть у основания жгутиков кине-тосомы (базальные тельца) в виде темноокрашенных зерен. На препаратах желательно отыскать разные стадии деления Bodo (рис. 24, Б — К). Деление продольное, что ясно видно на первых стадиях. На поздних стадиях оно кажется поперечным, так как происходит изменение оси деления. Ядро делится митотически. Однако по ходу митоза ядерная оболочка не исчезает, а перетягивается, в силу чего фигуры деления напоминают амитоз. Это сходство усиливается еще тем, что в силу очень мелких размеров ядра хромосомы при светооптическом исследовании почти не видны. Кинетопласт делится одновременно с ядром путем простой перетяжки. Trypanosoma lewisi (Kent) Материал и методы изучения. Среди многочисленных видов Trypanosoma, паразитирующих в крови позвоночных животных, наиболее доступны для изучения Т. lewisi, часто встречающаяся в крови крысы пасюка (Rattus norvegicus). Следует взять каплю от живой крысы и исследовать ее, прикрыв покровным стеклом, под микроскопом !. В том случае, если трипанозомы будут обнаружены, сделать мазок и окрасить его сухим способом по Романовскому (методику изготовления мазков крови см. с. 36—38). Второй мазок желательно окрасить по Фёльгеиу (с. 35) с подкраской лихтгрюном. Изучение живого объекта. В плазме крови2 при большом увеличении микроскопа хорошо видно движение трипанозом. При этом наблюдается характерное смещение отдельных эритроцитов. Под иммерсией удается разглядеть ундулирующую мембрану, идущую вдоль края тела с одной стороны почти до заднего конца и продолжающуюся на переднем конце в жгутик. Ундулирующая мембрана производит колебательные движения, которые распространяются волнами от переднего конца к заднему. Сама ундулирующая мембрана образуется в результате того, что жгутик, тянущийся вдоль тела, соединяется с краем последнего тонкой цитоплазматической перепонкой. 1 Получить каплю крови проще всего, надрезав у крысы хвост. 5 Можно также взять кровь, убив крысу. При этом нужно брать кровь от только что убитого животного. Следует иметь в виду, что молодые крысы бывают заражены трипанозомами чаще, чем старые.
Окрашенные препараты. На окрашенных, по Романовскому, сухих мазках под иммерсией удается хорошо рассмотреть морфологию Т. lewi-si. Размеры ее варьируют в довольно широких пределах. Длина ее 7— 35 мкм, ширина 1,5—3 мкм. Чаще встречаются особи длиной 20— 25 мкм. Форма тела ланцетовидная, заостряющаяся к переднему и заднему концу (рис. 25). Обычно тело изогнуто в одну сторону, причем выпуклой является та сторона, которая несет ундулирующую мембрану. Цитоплазма, по Гимза, окрашивается в синий или фиолетовый цвет и часто обнаруживает мелкую зернистость. Ядро, занимающее почти весь поперечник клетки, располагается на границе передней трети тела. Оно имеет овальную форму и несколько вытянуто по продольной оси жгутиконосца, по Романовскому, окрашивается в красный цвет. Жгутик довольно короткий. Его продолжением служит краевая нить унду-лирующей мембраны. На удачно окрашенных препаратах краевая нить отчетливо видна, она окрашена в красный цвет. Кинетопласт располагается около заднего конца трипанозомы. Он значительно меньше ядра, но так же, как последнее, ярко окрашивается в красный цвет. К нему подходит краевая нить ундулирующей мембраны. На обработанных, по Фельгену, препаратах положительную реакцию дает не только ядро, но и кинетопласт. Это доказывает наличие в нем ДНК. По современным представлениям, кинетопласт представляет собой органоид митохондриальной природы, несущий вместе с тем значительное количество ДНК. Если крыса, из которой взята кровь для исследования, недавно заразилась трипанозомами, то на препаратах удается обнаружить раз- Рис. 25. Trypanosoma lewisi (Х2000) (по Веиьону). А — Г — неде-лящиеся особи; Д — деление надвое; Е, Ж — множественное деление: . 1 — жгутик, 2 — уидулирующая мембрана, 3 — кинетопласт, 4 — ядро
ные стадии деления (рис. 25). У Т. lewisi имеет место либо деление надвое, либо множественное деление. При множественном делении образуются характерные формы в виде розеток (рис. 25, Ж)- Кинетопласт при этом смещается и располагается вблизи ядра. Период энергичного размножения у Т. lewisi непродолжителен. Дней через 13—14 после заражения делящихся особей в крови обнаружить почти не удается. Заражение крыс трипанозомами осуществляется через блох (Сега-tophyllus fasciatus, Xenopsylla cheapis) % ОТРЯД EUGLENOIDINA Euglena viridis Ehrbg. Материал и методы изучения. Многочисленные виды рода Euglena встречаются в пресноводных водоемах очень часто. Многие из них преимущественно населяют водоемы, богатые органическими веществами и мезосапробного и полисапробного типа. Некоторые виды Euglena (иапример, Е. gracilis, Е. viridis, Е. deses) удается довольно легко культивировать в искусственных средах1 2. Среди многочисленных сред, которые приводятся в литературе, укажем среду Кнопа (вода дистиллированная 1000 г, MgSO4 — 0,25, Са(МОз)г—1,0, КН2РО4 — 0,25, КС1 — 0,12 г, FeCl3 — следы) и среду Бенеке (вода дистиллированная 1500 г, NH4NO3 — 0,3, СаС12 —0,15, К2НРО4 —0,15, MgSO4 — 0,15, FeCl — следы). На чисто минеральных средах евглены размножаются довольно медленно. Гораздо лучше развиваются культуры, если к минеральным средам прибавить органические вещества. В частности, евглены хорошо развиваются на мясном бульоне (0,25% либи-ховского экстракта). Последний (если нет готового экстракта Либиха) приготовляется путем кипячения мелко нарезанных кусочков мяса (без жира) в воде. Полученная таким путем жидкость фильтруется через вату. Несколько капель бульона следует добавить к минеральной среде. Стерильности среды для культивирования евглен не требуется. Развивающиеся в небольшом количестве бактерии не препятствуют размножению евглен. Но бульон для сохранения (чтобы не готовить всякий раз новый) желательно простерилизовать обычным способом в автоклаве. В качестве посуды для культуры евглен годятся обычные химические пробирки или небольшие эрленмейровские колбы. Вместо искусственно приготовленной минеральной среды можно сделать почвенную вытяжку, на которой (особенно при прибавлении бульона) евглены иногда развиваются очень хорошо. В качестве^ представителя евглен мы рассмотрим организацию Euglena viridis, особенно часто встречающуюся в природе. Изучение живого объекта. Для рассмотрения Е. viridis необходимо использовать большие увеличения микроскопа. Е. viridis (рис. 26) обладает веретеновидным телом, задний конец ее заострен. Длина тела около 50—60 мкм, ширина 14—18 мкм. Форма тела не остается постоянной, евглена обнаруживает ясно выраженную способность к метаболизму. Она сокращается вдоль своей продольной оси, причем в момент сокращения тело ее становится короче и шире. 1 Размножение трипанозом происходит в кишечнике у блох. Затем они концентрируются в прямой кишке и выходят наружу с калом. Крыса, слизывая и проглатывая экскременты блох, заражается трипанозомами. Последние проникают в кровь, по-видимому, через слизистую оболочку ротовой полости. Изучение стадий развития трипанозом в блохах представляет значительные трудности, поэтому здесь и не приводится. 2 О культивировании евглен и других зеленых жгутиконосцев см. в кн.: Определитель пресноводных водорослей СССР. Вып. 1. Общая часть. М., 1951.
Снаружи евглена покрыта тонким эластическим слоем цитоплазмы (пелликулой), играющей роль оболочки. Пелликула обладает очень нежной спиральной исчерченностью, которую, однако, далеко не всегда удается рассмотреть. В цитоплазме Е. viridis имеются многочисленные овальные или удлиненные зеленые хроматофоры, расположенные в виде звезды. Кроме хроматофоров в цитоплазме всегда присутствуют в различном количестве мелкие овальные бесцветные зерна углевода парамила, представляющего продукт ассимиляции. Если парамила очень много, то он маскирует хроматофоры, которые при этом трудно бывает рассмотреть. В таких случаях полезно культуру евглен поместить на 2—3 дня в полную темноту. Число зерен парамила после этого уменьшается и хроматофоры выступают отчетливо. Ядро на живых евгленах без окраски обычно не видно. Оно располагается в задней трети тела и в этом месте имеется светлое пятно, так как хроматофоры оттесняются ядром. При окраске уксуснокислым кармином оно выступает отчетливо. Ядро Е. viridis обладает крупным центрально расположенным ядрышком, хроматин располагается в периферической его части. В цитоплазме кроме хроматофоров и парамила иногда в различном количестве присутствуют зерна красно-коричневого пигмента гематохрома. В передней части тела располагается довольно сложно устроенная сократительная вакуоль. Она состоит из следующих компонентов. Имеется округлая сократительная вакуоль, вокруг которой располагается несколько мелких собирательных вакуолей (рис. 26, 3). При систоле содержимое Рис. 26. Euglena viridis (Х1500) (по До-флейну): 1 — жгутик, 2 — резервуар сократительной вакуоли, 3— сократительная вакуоль, 4— хроматофоры, 5 — ядро, 6 — парамиловые зерна, 7 — стигма (глазок) сократительной вакуоли изливается в довольно обширный резервуар. Последний не обладает сократимостью. Он сообщается с наружной средой при помощи узкого канала (воронки), открывающегося наружу на переднем конце евглены. У евглены имеется один жгут, хорошо видимый на живых экземплярах, особенно при некотором затемнении поля зрения микроскопа. Жгут входит в канал воронки '. В цитоплазме в непосредственном со- седстве с резервуаром располагается ярко окрашенная в красно-коричневый цвет стигма (иначе называемая иногда глазным пятном) (рис. 26, 7). 1 Строение базальной части жгута Euglena довольно сложно. В резервуаре жгут раздваивается. Одна из ветвей его образует на уровне стигмы утолщение. У дна резервуара обе базальные части входят в цитоплазму, где и берут начало от двух базальных телец. Однако для того чтобы обнаружить указанные детали в строении жгута, необходимы специальные методы обработки.
Другие виды евглен 5 Г Рис. 27. Разные виды евглен (из кн. Пашера). А — Euglena gracilis (Х500); Б — Е. acus (Х200); В—Е. deses (Х500); Г — Е. oxyuris (Х250) Наряду с Euglena viridis встречается и ряд других видов этого рода. Здесь дается краткое описание и рисунки наиболее обычных из них 1. Euglena gracilis (рис. 27, А). Небольшие евглены (длина 37—45 мкм, ширина 6—22 мкм), оживленно мета-болирующие. Хроматофоров несколько, обычно 5—10, продолговатой формы, иногда с неправильно изрезанными краями. Каждый хроматофор несет один пиреноид, занимающий его центральную часть. Длина жгута равна длине тела. Eyglena acus (рис. 27, Б). Сильно вытянутые веретенообразные евглены с заостренным задним концом. Почти не метаболируют. Длина около 250—300 мкм, ширина 20—30 мкм. Многочисленные овальные хромато-форы. Парамиловые зерна крупные, палочковидные. Жгутик короткий. Euglena deses (рис. 27, В). Цилиндрическое тело, усиленно метабо-лирует. Длина 85—155 мкм, ширина 15—22 мкм. Многочисленные мелкие хроматофоры, расположенные преимущественно периферически, непосредственно под пелликулой. Жгутик короткий. Euglena oxyuris (рис. 27, Г). Очень крупные формы (длина 350— 500 мкм, ширина 30—45 мкм) с плотной пелликулой, обладающей выраженной спиральной исчерченностью. Многочисленные мелкие хроматофоры. Характерно наличие двух крупных парамиловых зерен в форме колец, из которых одно расположено в передней, а другое — в задней трети тела. Phacus sp., Trachelomonas sp. и Peranema sp. Кроме рода Euglena в пресных водах чрезвычайно обычны представители двух других родов, относящихся к отряду Euglenoidina, а именно Phacus, Trachelomonas и Peranema. Так как они обычно попадаются наряду с евгленами, здесь дается краткое описание наиболее обычных видов, относящихся к обоим указанным родам. Phacus longicauda. Представители рода Phacus отличаются от большинства евглен тем, что имеют весьма прочную пелликулу и форма их 1 Для более точного определения евглен см., например, в кн.: Попова Т. Г. Эвгле-новые водоросли. М., 1955.
тела постоянна. Ph. longicauda обладает сильно сплющенным телом, несущим на заднем конце длинный вырост в виде иглы (рис. 28, А). Длина 85—115 мкм, ширина 45—70 мкм. Пелликула продольно исчерчена. Многочисленные хроматофоры прилегают изнутри к пелликуле. В середине тела располагается одно крупное парамиловое зерно (не путать с ядром). Строение сократительной вакуоли и стигмы такое же, как и у Euglena. Имеется один довольно длинный жгутик на переднем конце тела. Ядро на живых экземплярах рассмотреть не удается. Оно располагается в задней половине тела и имеет у этих жгутиконосцев такую же структуру, как и у Euglena. Выступает отчетливо при окраске ядерными красками. Trachelomonas hispida. Представители рода Trashelomonas обладают весьма прочной оболочкой. При этом цитоплазматическая часть может несколько отделяться от оболочки, которая приобретает характер домика или раковинки. У Tr. hispida (рис. 28, Б), как и у многих других представителей этого рода, домик снаружи имеет характерную скульптуру, он несет многочисленные шипики, довольно густо расположенные. Имеется несколько хроматофоров с пиреноидами. Хорошо выражена стигма. Сократительная вакуоль устроена по тому же типу, каку Euglena. Один жгутик расположен на переднем конце тела. Он выходит наружу через особое отверстие в стенке домика. У Trachelomonas домик часто бывает окрашен в желтоватый и даже в коричневый цвет. Это обусловлено тем, что он инкрустируется солями железа. Ядро, имеющее структуру, сходную с таковой у Euglena и Pha-cus, расположено в задней части клетки. Без окраски его не видно. Рис. 28. Представители отряда евглеиовых. А — Phacus longicauda (Х600); Б — Trachelomonas (Х600); В—Peranema trichophorum (Х1500) (А и Б поДофлей-ну, В—по Грассе): 1 — сократительная вакуоль, 2 —стигма, 3 — пиреноид, 4 — ядро, 5 — передний жгут, 6— па-лочковый аппарат» 7 — задний жгут, 8 т-парамиловые зерна
Род Регапета относится к числу бесцветных представителей Eug-lenoidea. Чаще других в «навозных культурах» и в других богатых органическими веществами настоях развивается в массовом количестве Регапета trichophorum (рис. 28, В). Это довольно крупный жгутиконосец (до 70 мкм длины) почти цилиндрической формы, несколько суживающийся к переднему концу. Обладает прочной эластичной пелликулой, способен к резко выраженным метаболическим изменениям формы тела. Имеет два жгута. Из них передний обладает длиной, равной или превосходящей длину тела, и значительной толщиной, что обусловливает очень хорошую его видимость под микроскопом. При плавании активные движения совершает лишь дистальная часть жгута, остальная же часть направлена прямо вперед и мало подвижна. Второй жгут гораздо тоньше, направлен назад и прирастает к пелликуле. Разглядеть его удается редко. Р. trichophorum может заглатывать оформленные частички пищи. Имеется палочковидный аппарат, окружающий ротовую щель. Он состоит из трех эластических палочек (рис. 28, В, 6). Кроме того, Регапета питается, по-видимому, и сапрофитически. В эндоплазме имеются резервные вещества в виде довольно крупных парамиловых зерен. Ядро с центрально расположенным кариозомом помещается в задней половине тела. Рекомендуется сделать препарат (мазок), окрасив его железным гематоксилином. ОТРЯД PHYTOMONADINA Chlamydomonas sp. Материал и методы изучения. Многочисленные виды Chlamydomonas развиваются иногда в больших количествах в пресноводных водоемах, вызывая «цветение». Чаще всего массовое размножение Chlamydomonas имеют место в небольших лужицах, в канавах, в воде, более или менее богатой органическими веществами. Культивировать Chlamydomonas возможно и в искусственных средах, например в растворах Кнопа и Бенеке. Род Chlamydomonas, к которому относится более 150 видов, отличается исключительным многообразием. Поэтому мы не приурочиваем нашего описания к какому-либо одному виду, а укажем общие признаки рода Chlamydomonas. Изучение живого объекта. Форма тела большинства видов хламидомонад более или менее правильно яйцевидная (рис. 29), иногда округлая. Длина 10—30 мкм. Имеется довольно прочная целлюлозная оболочка. На переднем конце располагается два жгутика одинаковой длины. У многих видов Chlamydomonas на переднем же конце помещается небольшое утолщение оболочки — так называемая папилла. Ярко-зеленая окраска жгутиконосца обязана наличию большого хроматофора чашевидной формы *. В задней части хроматофора обычно имеется один пиреноид. Ближе к переднему концу располагается стигма (она имеется не у всех видов). Две небольшие сократительные вакуоли уда- 1 У некоторых видов Chlamydomonas может быть несколько хроматофоров.
1 Рис. 29. Chlamydomonas angulosa (X1900). A — иеделящаяся особь; Б— Г — последовательные стадии деления (по Дилль): /’—жгут, 2 — сократительная вакуоль, 3 — стигма, 4 — хроматофор, 5 — пиреноид, б— ядро ется иногда рассмотреть у основания жгутиков. В цитоплазме присут- ствуют зерна крахмала. Ядро занимает в клетке более или менее центральное положение. Иногда оно располагается ближе к переднему концу. Без окраски об- наружить ядро не удается. Наряду с изучением строения хламидомонад не представляет особых затруднений познакомиться с их агамным размножением. Нужно, однако, иметь в виду, что размножение у большинства видов происходит в ночное время. Некоторые виды размножаются путем продольного деления в свободноподвижном состоянии. В большинстве случаев, однако, жгутики теряются, хламидомонада опускается на дно, и внутри оболочки происходит деление протопласта сначала на две, а затем на четыре части (рис. 29, Б—Г). Через разрыв оболочки материн- Рис. 30. Chlamydomonas braunii (Х1500). Деление в пальмеллевидной стадии (по Горо-жанкину)
ской клетки образовавшиеся таким путем зооспоры выходят наружу, образуя жгутики, и начинают активно плавать. Вскоре они достигают величины исходной материнской клетки. У многих видов Chlamydomonas, особенно в условиях культуры, наблюдается образование так называемых пальмеллевидных стадий (рис. 30). При этом хламидомонады теряют жгуты, оболочка их ослизняется. В результате многократных делений образуются многоклеточные комплексы. Отдельные клетки могут вновь образовать жгуты и перейти в свободноподвижное состояние. У хламидомонад иногда удается наблюдать и половой процесс, который представляет собой копуляцию гамет. У некоторых видов имеет место изогамия, у других — анизогамия. Polytoma uvella Ehrbg. Материал и методы Рис. 31. Polytoma sp. (схема организаций) (по Энтцу): 1 — жгут, 2 — сократительная вакуоль, 3 — ядро. 4—зерна крахмала, 5 — корневая нить, связывающая ядро с базальными зернами жгутов, 6 — стигма изучения. Polytoma uvella попадается весьма часто в сильно загрязненных водоемах с большим содержанием растворенных органических веществ. Почти всегда она разводится в лаборатории в аквариумах, в которые внесено небольшое количество конского навоза. Часто можно найти ее также в сенных настоях. Изучение Polytoma uvella следует вести на живом материале. \ / Изучение живого объ- ’ / екта. Р. uvella имеет тело / яйцевидной формы, не-\ / сколько расширенное к зад- . \/ нему концу (рис. 31). Дли- /Д\ /лХ на 15—30 мкм, ширина 10— 20 мкм. На переднем кон-рА®,0) че — два-одинаковой длины Жйу) жгутика. В цитоплазме xS&z хД-У обычно имеется довольно значительное количество Zx //ем\ мелких крахмальных зерен, природа которых может ® ) ] быть легко установлена пу- / тем подкраски иодом (синее \. ''Д/ окрашивание). Кроме крахмала иногда имеется небольшое коли- Рис. 32. Polytoma pseuduvela (Х750). Стадии деления (по Пашеру) чество мелких, сильно светопреломляющих гранул, которые представляют собой жировые капли. В переднем конце располагаются две небольшие сократительные вакуоли.
Ядро с крупным кариозомом (ясно видно только после окраски) занимает или центральное положение, или, чаще, смещается ближе к переднему концу. Близ переднего конца располагается стигма. Агамное размножение, которое легко наблюдать, совершается путем деления. Последнее протекает следующим образом. Протопласт внутри оболочки делится сначала надвое, причем продукты деления обычно располагаются друг за другом по продольной оси. После этого каждая из клеток делится еще раз (рис. 32). Получается четыре дочерние клетки, которые выходят наружу через разрыв оболочки. Половой процесс у Polytoma uvella (рис. 33) представляет собой изогамную копуляцию гамет. Наблюдать его можно очень часто, поэтому на данном примере удобно познакомиться с половым процессом у Mastigophora. Вызвать копуляцию у Polytoma обычно удается следующим приемом. Нужно взять небольшое количество жидкости из культуры, где имеется много Polytoma, и разбавить ее в 2—3 раза чистой (например, водопроводной) водой. Вскоре после этого начинается массовая копуляция. Следует под микроскопом наблюдать за образованием парочек и проследить весь процесс копуляции. Гаметы относительно мало отличаются от некопулирующих особей. Размеры их те же. Они несколько больше вытянуты в длину и имеют большее количество зерен крахмала. Копуляция начинается с того, что две гаметы соединяются Рис. 33. Polytoma uvella (Х700) (по Догелю). А— некопулирующая особь; Б—Ж — последовательные стадии копуляции; 3 — зигота в состояния инцистирования одним из жгутиков и плавают некоторое время вместе, причем их продольные оси более или менее совпадают (рис. 33, В). Эта стадия длится 5—10 мин, после чего происходит соединение двумя жгутиками и обе гаметы оказываются расположенными друг против друга. Эта стадия кратковременна (1—7 мин). Далее начинается процесс слияния плазмы обеих гамет (рис. 33, Г—Ж), при этом подвижность гамет не теряется. Жгутики смещаются со своего первоначального терминального положения и оказываются расположенными сбоку. На последних стадиях слияния гаметы обнаруживают повышенную подвижность и очень активно плавают. Процесс слияния протоплазмы гамет довольно длительный и занимает около 2 ч. В конце копуляции жгутики сбрасываются и зигота округляется. В это время совершается слияние ядер. Зигота окружается довольно толстой оболочкой и переходит в состояние покоя (рис. 33, Ж, 3). Eudorina elegans Ehrbg. Материал и методы изучения. Наиболее широко распространенный представитель этого рода — Eudorina elegans Ehrbg., довольно часто
встречается в природе в пресноводных водоемах, чаще всего — в прудах, не очень сильно загрязненных. Возможна также культура Eudorina в искусственных средах. Методику культивирования разработал Гартманн. Однако она здесь не приводится ввиду значительной сложности1. Изучение живого объекта. Eudorina elegans образует колонии, чаще всего состоящие из 32 клеток, реже из 16, 8 и даже 4. Отдельные клетки, входящие в состав колонии, находятся в связи друг с другом благодаря наличию студенистой массы. Общая форма колонии приближается к шаровидной. Обычно колония не образует правильного шара и одна ось ее более длинная (рис. 34). Размеры колонии варьируют в довольно широких пределах. Длинная ось равняется 50—200 мкм. Размеры отдельных клеток 16—24 мкм. В пределах колонии удается подметить определенную полярную диффенцировку. На одном полюсе, который можно назвать передним, стигмы значительно сильнее развиты, чем на противоположном. В средних частях колонии размеры стигм носят промежуточный характер. Кроме того, передний конец колонии всегда правильно закруглен, задний же иногда более или менее тупо срезан. Это различие, однако, не всегда имеет место. Поступательное движение колонии обычно осуществляется передним концом вперед. Расположение отдельных клеток в колонии является закономерным. Они располагаются несколькими рядами (этажами). Первый (передний) ряд состоит из 4 клеток, последующие три ряда — из 8 клеток каждый, последний (задний)—вновь из 4 клеток. Между отдельными клетками колонии имеется довольно значительное расстояние. Необхо Рис. 34. Eudorina elegans (Х450) (по Гартману). А — колония из 32 клеток; Б — агамиое размножение 1 См.; Hartmann М. Die dauernd agame Zucht von Eudorina elegans und ihre Bedeutung fiir das Befruchtungs und Todproblem. Arch. f. Protistenk. Bd. 43, c. 223, 1921.
димо, однако, отметить, что правильность расположения клеток нередко нарушается и от описанного выше порядка их возможны разнообразные уклонения. Наружный слой студенистой прозрачной массы, связывающей клетки колонии воедино, является довольно плотным. Внутренние части ее, напротив, полужидкой консистенции. Вся масса в це-ЛОМ представляет собой, по-видимому, результат ослизнения оболочек отдельных клеток. Отдельные клетки колонии имеют более или менее правильную шаровидную форму. Каждая клетка несет два довольно длинных жгута, проходящих своей базальной частью сквозь студенистую массу и выдающихся наружу. Каждая клетка имеет один чашевидный хрома-тофор. В задней части его располагается пиреноид. Чаще всего имеется только один пиреноид. Но в некоторых случаях число их может возрастать до пяти. На переднем конце каждой клетки имеются две сократительные вакуоли. Близ переднего конца лежит также стигма. Ядро, обладающее довольно крупным кариозомом, располагается не в центре тела клетки, а ближе к переднему концу. Eudorina размножается как агамным, так и половым путем. Стадии ее агамного размножения удается нередко наблюдать. Оно происходит следующим образом. Каждая клетка колонии путем последовательных делений делится на 2, 4, 8, 16 и 32 клетки меньших размеров. Продукты деления каждой клетки дают таким образом начало новой колонии. В пределах одной материнской колонии образуются 32 дочерние (рис. 34, Б). Образовавшиеся дочерние колонии сначала остаются вместе, будучи связаны слизистой массой материнской колонии. Последняя в дальнейшем разрушается, и дочерние колонии становятся свободными. Размеры их клеток увеличиваются, образуется студенистая масса. На этом процесс агамного размножения заканчивается. Половой процесс у Eudorina удается наблюдать гораздо реже, чем агамное размножение. Тем не менее иногда возможно его обнаружить. У Eudorina elegans наблюдается ясно выраженная анизогамия. Колонии раздельнополы. Все клетки женской колонии превращаются, не делясь, в макрогаметы. При этом происходит, по-видимому, обогащение их резервными питательными веществами (крахмал). Мужские колонии образуют гаметы иным путем. Каждая клетка колонии путем последовательных делений дает начало 64 микрогаметам. Последние оказываются более мелкими, чем клетки, образующиеся при агамном размножении. Они не образуют шара, а остаются в связи друг с другом в форме клеточной пластинки. Каждая микрогамета сохраняет хрома-тофор и стигму. В дальнейшем микрогаметы отделяются друг от друга (рис. 35). Они активно плавают, отыскивают макрогаметы и сливаются с ними. Зигота образует довольно толстую оболочку, окрашенную обычно в желтоватый цвет. После некоторого периода покоя зигота может дать начало новой колонии. В пресных водах наряду с Eudorina часто встречаются представители близкого рода Pandorina. Pandorina morum образует колонии из 16 клеток (рис. 36). Отдель-
2 Рис. 35. Eudorina elegans (X400) (из кн. До-флейна): 1 — микрогаметы, 2 — макрогамета, копулирующая с микрогаметой Рис. 36. Pandorina тогит (Х400). Общий вид колонии (по Смит) ные клетки располагаются в непосредственной близости, прилегают друг к другу почти вплотную. Структура отдельных клеток напоминает таковую у Eudorina. Агамное размножение совершается тем же путем. Volvox aureus Ehrbg. Материал и методы изучения. Два широко распространенных вида этого рода Volvox globator и V. aureus часто встречаются в планктоне пресноводных водоемов прудового и озерного типа. Для изучения следует взять живой материал. При отсутствии такового можно использовать материал, фиксированный формалином. На нем, однако, многих деталей организации разглядеть не удается. Препараты, окрашенные н заключенные в канадский бальзам, мало пригодны. Здесь описано строение V. aureus, который встречается чаще, чем V. globator, и изложены кратко те черты, которые характеризуют последний. Изучение живого материала. Общий вид колонии следует рассматривать при малом увеличении микроскопа. Для изучения структуры отдельных клеток раздавить колонию и вести изучение с иммерзионной системой или же с большим увеличением. Volvox aureus Ehrbg. образует большие шаровидные колонии диаметром 500—850 мкм (рис. 37). В состав колонии входит блоьшое количество (500—1000) отдельных клеток. Студенистое вещество, образующее основную массу колонии, представляет собой результат ослизнения оболочек отдельных клеток. Самый наружный слой ее образует довольно плотную мембрану, придающую известную прочность всей колонии. Центральные части студенистого вещества обладают гораздо менее плотной консистенцией, они
Рис. 38. Volvox aureus. Разрез через участок колонии, схематизировано (по Жанэ): 1—вегетативная особь, 2—«вегетативная клетка размножения», 3 — хроматофор с пиреноидами, 4— ядро, 5 — цитоплазматический мостик Рис. 37. Volvox aureus (XlOO). Общий вид колонии. Внутри материнской колонии — шесть дочерних (по Пашеру) являются полужидкими. Несмотря на то, что колония шаровидная, она обладает полярной дифференцировкой. На одном полюсе, подобно тому, как это имело место у Eudorina, стигмы развиты сильнее и занимают в клетках терминальное положение. В этом направлении совершается движение колонии, почему этот полюс и может быть назван передним. На переднем конце колонии никогда не образуется репродуктивных клеток (гамет и «партеногонидий» — см. ниже). Последние формируются на противоположном, заднем, полушарии. Отдельные клетки, входящие в состав колонии, не все одинаковы. Огромное большинство их не способно к дальнейшему размножению и представляет собой вегетативные клетки. На их структуре мы прежде всего и остановимся. Сам протопласт имеет 5—8 мкм в длину и обладает грушевидной формой (рис. 38). Хроматофор один, неправильно чашевидной формы. На нем располагается обычно один (иногда больше) пиреноид. Имеется две сократительные вакуоли. Стигма различно развита на разных участках колонии (см. выше). Два одинаковых жгутика превосходят длину протопласта в 2—3 раза. Ядро маленькое, сдвинуто к переднему концу. Рассмотреть его обычно не удается. При рассмотрении колонии сверху при очень сильном увеличении можно обнаружить вокруг каждого протопласта более или менее правильные шестиугольники, в центре которых располагаются сами протопласты. Эти шестиугольники суть границы ослизненных оболочек отдельных клеток. Протопласты связаны друг с другом очень тонкими протоплазматическими мостиками (рис. 39), обнаружить которые можно, применяя очень сильное увеличение.
Рис. 39. Volvox aureus — участок колонии, вид сверху (по Жанэ): 1 — вегетативная особь, 2— граница между ослизненными оболочками клеток, 3 — цитоплазматический мостик, 4—«вегетативная клетка размножения», 5 хроматофор с пиреноидом, 6 — ядро Среди генеративных клеток следует различать, с одной стороны, клетки, служащие для агамного размножения, так называемые «вегетативные клетки размножения»1, ас другой — гаметы. Вегетативные клетки размножения образуются в числе 4—10 в задней (нижней) половине колонии. Они отличаются большими размерами (20—30 мкм), имеют несколько пиреноидов (см. рис. 38) и соединяются с каждой из ок ружающих их вегетативных клеток несколькими цитоплазматическими мостиками (рис. 39). Каждая такая клетка дает начало дочерней колонии. Если рассматривать молодые колонии, то можно ви деть сами вегетативные клетки размножения. На более старых колониях имеются различные стадии их развития, которое протекает как типичная палинтомия1 2 (рис. 40). Клетка многократно делится. Параллельно с делением происходит процесс впячивания внутрь материнской колонии, что, в свою очередь, ведет к образованию шара, открывающегося наружу лишь небольшим отверстием. При этом передние концы клеток, несущие стигму, обращены первоначально во внутреннюю полость шара. После этого происходит своеобразный процесс выворачивания (экскурвации) шара (рис. 40, Д — Ж), начинающийся с краев отверстия его, расположенного на той стороне, где он граничит с периферическим слоем материнской колонии. Это выворачивание приводит к тому, что внутренняя поверхность шара становится наружной. Благодаря этому передний полюс клеток, несущий стигму и позже развивающий жгутики, вновь занимает нормальное периферическое положение. Развитие дочерней колонии начинается на поверхности материнской. Образующаяся в результате дочерняя колония смещается во внутрь материнской и помещается внутри шара. У V. aureus на дочерних колониях, еще находящихся внутри материнской, нередко начинается развитие следующего поколения и образуются дочерние колонии второго порядка. Выход дочерних колоний из материнской сопровождается разрывом стенок последней и ее гибелью. 1 Многие авторы называют их партеногонидиями, рассматривая их развитие как партеногенез. Против подобного толкования и терминологии решительно возражает Пашер, называя эти клетки «vegetative Vermehrungszellen». 2 Под палинтомией понимают бесполое размножение, происходящее путем ряда равномерных последовательных делений без промежуточных стадий питания и роста.
Рис. 40. Volvox aureus — развитие колонии при агамном размножении (схема по Циммерману). А — стадия двух клеток; Б — переход к четырехклеточной стадии; В, Г — первая пузыревидная стадия; Д, Е, Ж — выворачивание (экскурвация) первой пузыревидной стадии; 3 — молодая колония после окончания выворачивания (по Циммерману) Из клеток, подобных по строению «вегетативным клеткам размножения» (из оогоний), образуются гаметы. V. aureus является раздельнополым, поэтому различают мужские и женские колонии *. У V. globator колонии обоеполые. Женские половые клетки — макрогаметы отличаются значительными размерами (60—75 мкм) (рис. 41), они окрашены в буровато-зеленый цвет. Микрогаметы образуются путем многократного деления клетки. Каждая микрогамета представляет собой небольшую, сильно вытянутую в длину клетку с двумя жгутиками и хроматофором. Все микрогаметы, образовавшиеся из одной материнской клетки (числом около 1 Иногда у V. aureus наблюдается развитие макро- и микрогамет на одной колонии.
Рис. 41. Volvox globator (X250)—участок колонии с половыми клетками (по Клейну): 1 — макрогамета, 2 — микрогаметы Рис. 43. Volvox globator — вид на участок колонии сверху (по Жанэ): видны широкие протоплазматические мосТики (1) и границы между клетками (2) Рис. 42. Volvox globator — схематический разрез через небольшой участок колонии (по Жанэ) ста), некоторое время остаются друг с другом в связи, образуя характерную группу в виде пластинки (рис. 41). После оплодотворения зигота одевается прочной двойной оболочкой. Она освобождается после гибели материнской колонии и может дать начало новой колонии путем многократного деления. Vodvox globator Ehrbg. в отличие от V. aureus может достигать большей величины (диаметр колонии до 2 мм). Число слагающих колонию клеток у него бывает больше, чем у V. aureus (до 20 тыс., чаще около 10 тыс.). Форма вегетативных клеток иная (рис. 42, 43). Они сильно уплощены в передне-заднем направлении. Цитоплазматические мостики, соединяющие отдельные клетки, гораздо шире, чем у V. aureus. Благодаря этому весь протопласт при рассматривании сверху имеет звездчатую форму. Колонии V. globator в большинстве случаев обоеполы. Поэтому в одной колонии удается рассмотреть как микро-, так и макрогаметы 1 Кроме двух рассмотренных видов Volvox иногда встречается третий вид — К tertius. Он походит на V. aureus, но отличается во взрослом состоянии отсутствием цитоплазматических мостиков.
ОТРЯД DINOFLAGELLATA (PERIDINEAE) Peridinium sp. Материал и методы изучения. Различных представителей рода Peridinium очень часто удается обнаружить в пресноводном планктоне. Иногда, развиваясь в больших количествах, они вызывают «цветение» воды в мелких пресноводных водоемах. Некоторые виды этого рода входят в состав морского фитопланктона. Число видов рода Peridinium очень велико. Одни из наиболее обычных для мелких пресноводных водоемов — Р. tabulatum, Р. cinctum и многие другие. Ниже приводится описание Р. tabu-latum. с. п. Рис. 44. Peridinium tabulatum — расположение пластинок панциря. А — с брюшной стороны; Б — со спинной стороны; В—сверху; Г—снизу (Х550) (из кн. Пашера): а. п. — апикальные пластинки, 6. э.—боковые экваториальные пластинки, н. п. — нижние полярные пластинки, п. — передние экваториальные пластинки, п. э. — постэкваториальные пластинки, р. п.—ромбическая пластинка, с. п.— спинные пластинки, з.э. — задняя экваториальная пластинка Изучение живого объекта. Для изучения строения Peridinium следует воспользоваться большим увеличением микроскопа или иммерсионной системой. Форма тела у Peridinium tabulatum (рис. 44) более или менее правильно яйцевидная. Длина около 50. Движение осуществляется при помощи двух жгутов, расположение которых чрезвычайно характерно • для большинства Dinoflagellata, в том числе и для Peridinium. Оба жгута берут начало рядом друг с другом приблизительно по середине тела на стороне, которая называется брюшной. Один жгут идет назад и свободно выдается в окружающую среду. Начало его проходит в небольшом желобке, идущем перпендикулярно к экватору и несколько расширяющемся на заднем конце (рис. 44, Д). Другой жгут (так называемый поперечный) опоясывает все тело в экваториальной плоскости и располагается в довольно глубоком желобке (поясок — cingulum), опоясывающем все тело. Этот желобок образован особой пластинкой клет-чатковой оболочки. Поперечный жгут производит волнообразные движения, что создает иногда ложное впечатление, будто бы в поперечной борозде располагается ряд ресниц. Peridinium обладает прочной оболочкой из клетчатки, которая слагается из отдельных пластинок. Форма, структура и расположение этих пластинок характерны для отдельных видов. Рассмотреть пластинки удается на живом объекте. Более отчетливо они выступают, если подсушить препарат и
рассматривать его без воды в сухом виде, а также на отмерших экземплярах, утерявших цитоплазматическое содержимое. Оболочка Peridinium состоит из двух половинок. Одна из них располагается над пояском (эпитека, или эпивальва), другая — под ним (гипотека, или гиповальва). В свою очередь, обе половинки панциря слагаются из 21 пластинки (щитка). В состав эпитеки входит 14 пластинок, в состав гипотеки — 7 пластинок. Сначала рассмотрим пластинки эпитеки. На брюшной стороне, непосредственно над местом отхождения жгутиков, располагается ромбическая пластинка (рис. 44). Над пояском расположены семь преэкваториальных пластинок, среди которых различаем (на брюшной стороне) две передних экваториальных, четыре боковые экваториальные и одну (на спинной стороне) заднюю экваториальную. Кпереди от ромбической пластинки и ряда преэкваториальных имеется четыре апикальные (верхушечные) пластинки. На спинной стороне над задней экваториальной расположены две спинные пластинки. Спинные, апикальные и ромбическая пластинки окружают небольшое отверстие в оболочке, располагающееся на самом переднем конце Peridinium. Нижняя половинка панциря (гипотека) состоит из меньшего числа пластинок, чем эпитека. В ее состав входят пять постэкваториальных пластинок и две нижние полярные, или антапикальные (рис. 44), расположенные на нижнем полюсе жгутиконосца. Отдельные пластинки, слагающие оболочку Peridinium, соединяются друг с другом довольно - широкими (так называемыми интеркалярными) полосками. Каждая пластинка снаружи несет множество мельчайших шипиков и пронизана очень мелкими порами (последнее обычно разглядеть нс удается). Цитоплазма Peridinium окрашена в буроватый цвет, который обусловлен наличием большого количества мелких дисковидных хроматофоров. В них кроме хлорофилла присутствуют бурые пигменты. Чтобы лучше разглядеть хроматофоры, рекомендуется раздавить Peridinium, выдавив из клетчатковой оболочки цитоплазматическое содержимое. Продуктом ассимиляции является крахмал. Небольшие зерна его удается обнаружить отчетливо при окраске иодом (крахмальные зерна приобретают синий цвет). Peridinium (как и все Dinoflagellata) обладает крупным, массивным, богатым хроматином ядром, занимающим в теле центральное положение. На живых экземплярах разглядеть ядра не удается. Его легко обнаружить, если окрасить препарат каплей уксуснокислого кармина (с. 33). При этом становятся видимыми нуклеола и хроматин, имеющий своеобразную нитчатую структуру. В цитоплазме Peridinium имеется довольно крупная несократимая вакуоль, рассмотреть которую благодаря наличию большого количества хроматофоров возможно далеко не всегда. Иногда удается наблюдать стадии агамного размножения Peridinium, которое совершается в неподвижном состоянии. У Р. tabulatum протопласт делится внутри оболочки. Обе образовавшиеся таким путем клетки выходят наружу через разрыв оболочки в области пояска и 96
каждая из них образует новую оболочку. У других видов Peridinium протопласт может сначала покинуть оболочку и после этого приступить к делению, которое протекает в особой цисте и приводит к образованию многих зооспор. Ceratium hirudinella О. F. Mull Материал. Разные виды рода Ceratium входят в состав как пресноводного, так и морского фитопланктона. В качестве примера рассмотрим одного из обычнейших пресноводных представителей Ceratium hirudinella. Изучение живого объекта. Ceralium обладает чрезвычайно характерной асимметричной формой тела (рис. 45). На переднем конце его имеется длинный апикальный шип. На заднем конце — два или три ан-тапикальных шипа. Длина шипов, особенно антапикальных, варьирует Рис. 45. Ceratium hirudinella (Х400), хорошо видна скульптура панциря (по Энтцу) Рис. 46. Ceratium hirudinella — расположение пластинок скелета. А — с брюшной стороны; Б — со спинной стороны (по Энтцу): Ар1—АрЗ — апикальные пластинки, Prl—Pr6—пре* экваториальные пластинки (из них Ргб называется первой брюшной), Ро1—Ро5 — постэкваториальные пластинки; У, Z — вторая н третья брюшные пластинки, F— жгутиковая пластинка, О — ротовая пластинка, G — поясок, LF— продольная бороздка жгутика, Ап— антапикальные пластинки
в широких пределах. Один из них (левый) довольно часто вовсе отсутствует (на рис. 46, А он слабо выражен). Варьирует также угол, который антапикальные шипы образуют друг относительно друга. Чрезвычайно изменчивы и размеры Ceratium. Длина варьирует приблизительно от 100 до 400 мкм. Столь широкий размах изменчивости различных морфологических признаков послужил основанием для разделения вида С. hirudinella на ряд варьететов и форм. Необходимо, однако, отметить, что природа широкой изменчивости Ceratium1 недостаточно выяснена. Движение Ceratium осуществляется так же, как и у Peridinium, при помощи двух жгутов, расположенных подобно тому, как это описано выше для Peridinium. Поясок (cingulum) опоясывает почти все тело жгутиконосца. Лишь на брюшной стороне в нем образуется перерыв, где располагаются осо- Рис. 47. Ceratium. hirudinella — деление в свободноподвижном состоянии (по Лаутерброну, из кн. Дофлейна): У только что разделившейся особи (справа) недостающие пластинки скелета еще не восстановились 1 Энтц (1927) показал, что широкий размах изменчивости С. hirudinella носит отчасти сезонный характер. Весной он находил преимущественно трехшипные, летом и осенью — четырехшипные формы.
бые брюшные пластинки. Панцирь Ceratium слагается из отдельных целлюлозных пластинок, расположение которых ясно видно на схеме (рис. 46). Пластинки, слагающие панцирь, обычно скульптурированы, они имеют ясно выраженную сетчатую структуру. Интеркалярные полоски развиты у Ceratium слабо, и отдельные пластинки непосредственно прилегают друг к другу. Строение панциря Ceratium лучше изучать на отмерших экземплярах. Буроватая окраска цитоплазмы Ceratium обязана наличию большого количества мелких дисковидных хроматофоров. Имеется одна, по-видимому, несокращающаяся вакуоль. Крупное массивное ядро занимает в теле Ceratium центральное положение. Агамное размножение (деление) происходит у Ceratium в свободноподвижном состоянии (рис. 47). В отличие от других Mastigophora, где плоскость деления совпадает с продольной осью тела, у Ceratium она проходит косо. После деления обе дочерние особи восстанавливают недостающие пластинки. При изучении морского планктона обычно также встречаются различные виды рода Ceratium. В качестве интересной особенности некоторых морских видов следует отметить образование цепочек (рис. 48), которые представляют собой результат незавершенного деления. Gymnodinium sp. Кроме описанных выше Peridinium и Ceratium мы кратко рассмотрим еще один род Dinoflagellata — Gymnodinium. В пресных водах часто встречаются Gymnodinium fuscum (рис. 49). В отличие от Peridi- Рис. 48. Ceratium voltur — «цепочка», образовавшаяся в результате деления (Х80) (по Кофоиду, из кн, Дофлейна) Рис. 49. Gymnodinium fuscum (Х450) (из кн. Штейна): А — с брюшной стороны; Б — со спинной стороны
nium и Ceratium он не имеет клетчаткового панциря из отдельных пластинок. Gumnodinium является представителем «голых» Dinoflagellata. У него имеется два жгута, из которых один лежит в пояске, другой же на заднем конце свободно выдается наружу. В цитоплазме— множество мелких буроватых хроматофоров. Некоторые виды Gymnodinium обладают стигмой. ОТРЯД POLYMASTIGINA Trichomonas muris Grassi Материал и методы изучения. Род Trichomonas включает довольно значительное количество видов, паразитирующих главным образом в кишечнике различных позвоночных. Наиболее удобный и доступный объект—Trichomonas muris Grassi, очень часто встречающийся в толстой и слепой кишке мышей и крыс. Для изучения — Trychomonas следует взять содержимое толстой или слепой кишки у свежеубитой мыши. Нужно рассмотреть при иммерсии живой материал и сделать мазки на покровных стеклах, фиксировав их жидкостью Шаудина. Окрасить мазки железным гематоксилином. г Изучение живого объекта. Т. muris довольно активно двигаются в поле зрения микроскопа. На живом объекте удается рассмотреть общую форму тела, которая почти округлая, и ундулирующую мембрану, располагающуюся с одной стороны тела. Жгутики у Т. muris очень короткие и тонкие и in vivo плохо заметны. Иногда удается увидеть аксостиль в виде эластичного стержня, проходящий по продольной оси в середине тела. Окрашенные препараты. Trichomonas muris достигает в длину около 20 мкм. На переднем конце располагаются три коротких жгута (рис. 50), которые берут начало от группы базальных зерен. С одной стороны вдоль всего тела проходит ундулирующая мембрана, которая у этого вида очень хорошо развита. По наружному краю ее идет краевая нить, резко окрашивающаяся железным гематоксилином. На переднем конце она так же, как и свободные жгутики, берет начало от я конце краевая нить часто свободно выдается в виде короткого жгута. В теле жгутиконосца вдоль основания унд'улирующей мембраны проходит опорная фибрилла, базальная нить. Последняя на препаратах выступает менее отчетливо, чем краевая нить. Аксостиль расположен по средней линии тела, задний конец его иногда свободно выдается наружу. Довольно крупное ядро с кариозомом располагается в передней трети тела. С группой базальных телеп оно связано тонкой нитью — ризопластом В цитоплазме Trichomonas обычно имеются разнообразные включения в форме зерен, палочковидных образований и т. п Эти включения представляют собой пищу заглоченную жгутиконосцем. базальных телец. На Рис. 50. Trichomonas muris (Х1200) (из кн. Гартмана): 1 — жгутики, 2— базальные тельца, 3 — ядро, 4 — аксостиль, 5 — опорная фибрилла ундулирующей мембраны
Рис. 51. Trichomonas muris (X1200)— последовательные стадии деления (по Венриху из Веньона). А — базальные тельца разделились, обе половины их соединены параде-смозой; Б — дальнейшая стадия расхождения базальных телец, в ядре видны хромосомы; В — анафаза деления ядра; Г — деление ядра закончилось; Д — образование дочерних аксостилей и ундулирующих мембран; Е — окончание формирования аксо-стилей Заглатывание пищи совершается через ротовое отверстие (цитостом), расположенное на переднем конце тела вблизи основания жгутиков на стороне, противоположной той, по которой проходит ундулиру-ющая мембрана. На препаратах его далеко не всегда удается обнаружить. Деление Т. muris совершается в свободноподвижном состоянии. На препаратах часто удается обнаружить различные стадии деления (рис. 51, А—Е). Lamblia ( = Giardia) muris Grassi Материал и методы изучения. Один из видов рода Lamblia — L. muris Grassi часто встречается в тонких кишках мышей и крыс, поднимаясь до двенадцатиперстной кишки включительно. Кроме того, L. cunicull часто встречается в кишечнике кроликов, a L. сатае — в морских свииках. Материал от свежеубитых животных следует рассмот-
Рис. 52. Lamblia. А — Lamblla muris, вегетативная особь с брюшной стороны (Х2500); Б — вегетативная особь Lamblia, прикрепившаяся к эпителиальной клетке; В — Lamblia intestinalis, циста (Х2700) (А —по Бензен, из кн. Дофлейна; Б — по Шевякову; В — из кн. Дофлейна) реть in vivo и в случаях нахождения Lamblia сделать мазки на покровных стеклах, фиксировав их жидкостью Шаудина и окрасив железистым гематоксилином. Ввиду незначительных размеров объекта изучение его возможно лишь при использовании иммерсионных систем. Изучение живого объекта. На живых L. muris удается разглядеть общую форму жгутиконосца, имеющего грушевидное тело при рассматривании с брюшной или спинной стороны (рис. 52, А) и довольно сильно сплющенного в дорзовентральном направлении, что видно при рассмотрении его сбоку (рис. 52,Б). Спинная сторона — выпуклая, брюшная— плоская. В передней части брюшной поверхности Lamblia имеется углубление — присоска, при помощи которой происходит прикрепле ние к эпителиальным клеткам стенки кишечника. Следует отметить характер движения Lamblia, при котором все те ло, особенно задний его конец, производит волнообразные сокращения Жгутиковый аппарат in vivo виден плохо, его лучше изучать на окра шенных препаратах. Окрашенные препараты. Длина L. muris равняется 7—12 мкм, ши рина 5—10 мкм. Очень отчетливо выражена двусторонняя симметри: тела. Большинство органоидов присутствует в числе, кратном дву! (рис. 52). По середине тела, начинаясь спереди на уровне ядер, от двух ба зальных телец и до самого заднего конца, проходит двойно аксостил! состоящий из двух эластических нитей. На заднем конце обе нити пре должаются в виде жгутов, которые можно назвать хвостовыми жгутг ками. Общее число жгутов у Lamblia равняется восьми. На брюшно стороне приблизительно от средней части аксостилей берут начало дв пары брюшных жгутов. По сторонам от двух базальных зерен, лежащих у основания аксс стилей, расположена еще одна пара базальных телец. От них кперед отходят две опорные нити (фибриллы). Та фибрилла, которая бере начало от левого базального зерна, идет вперед, затем заворачивает и;
право и продолжается назад, подходя к самому краю тела. Фибрилла, отходящая от правого базального зерна, располагается точно так же, но заворачивает налево. Благодаря этому обе фибриллы перекрещиваются. Подойдя к краю тела, обе нити продолжаются в виде боковых жгутов. От тех же боковых базальных телец отходят еще две фибриллы, лежащие по сторонам от аксостилей. Подходя к краю в задней половине тела, они продолжаются в форме задних боковых жгутиков. Кроме описанных выше опорных фибрилл, являющихся по существу проксимальными частями жгутов, в теле Lamblia имеются еще следующие опорные образования, не связанные непосредственно с локомоторным аппаратом. От края тела, там, где отходят передние боковые жгуты, по заднему краю присоски, расположена опорная нить. Кроме того, опорная фибрилла проходит также по краю присоски, ограничивая ее спереди и с боков. Два ядра овальной формы лежат справа и слева от передней части аксостилей. Обычно ядро имеет один или несколько кариозомов. Ядра связаны с боковыми базальными тельцами при помощи ризопластов. L. muris обладает довольно крупным парабазальным телом, расположенным в задней трети тела жгутиконосца. Питание Lamblia совершается осмотическим путем. Ротовое отверстие отсутствует. Деление в свободноподвижном состоянии у Lamblia наблюдается очень редко. Размножение их имеет место главным образом в инцисти-рованном состоянии. Цисты L. muris можно обнаружить в тонких кишках, а также в заднем отделе кишечника и в кале. Цисты овальной формы с довольно плотной оболочкой (рис. 52, В). В цисте находим два или, чаще, четыре ядра, образовавшихся в результате деления. В цистах сохраняются аксостили, что позволяет очень легко отличить их от цист других кишечных простейших. Кроме того, обычно имеются две пары своеобразных полулунной формы образований, которые, вероятно, представляют собой отделившиеся краевые фибриллы присоски. ОТРЯД HYPERMASTIGINA Lophomonas blattarum Stein Материал и методы изучения. Lophomonas blattarum нередко встречается в заднем отделе кишечника черного таракана (Blatta orientalis). Согласно Д. Н. Засухину (1929), Lophomonas размножается в огромном количестве при кормлении тараканов сырым картофелем. Изучение ведется на живом материале в содержимом кишечника, а также на мазках, фиксированных жидкостью Шаудина и окрашенных железным гематоксилином. Кроме L. blattarum в кишечнике таракана может встречаться и другой вид — L. striata. Изучение живого объекта. Живые Lophomonas blattarum в содержимом кишечника довольно подвижны благодаря движению многочисленных жгутиков, расположенных на переднем конце. На живом материале можно рассмотреть общую форму тела, жгутика, а также констатировать, что L. blattarum способны несколько изменять форму тела благодаря сократимости протоплазмы и эластичности пелликулы. Длина L. blattarum варьирует в пределах 15—30 мкм.
Рис. 53. Lophomonas blatlarum (X1500). A — вегетативная особь; Б, В — стадии деления; Г — циста (А — из Грассе; Б — Г — из Дофлейиа): 1 — венчик жгутиков, 2 — ядро, 3 — радиально исчерченная зона цитоплазмы, 4 — аксостиль, 5 — пищевые включения Окрашенные препараты. Жгутиковый аппарат расположен на переднем конце животного. Он слагается из многочисленных жгутиков числом около 50. Длина их неодинакова. По периферии пучка расположены самые короткие жгутики, в центре — самые длинные. Каждый жгут берет начало от базального зерна. В глубь цитоплазмы от базальных зерен идут фибриллы. По мере углубления в протоплазму они постепенно сближаются и в конце концов соединяются в аксостиль, который тянется до самого заднего конца тела и нередко даже несколько выдается наружу (рис. 53, А—В). Фибриллы между аксостилем и базальными зернами в совокупности отграничивают пространство, напоминающее по форме чашу, внутри которой неделящихся особей располагается ядро. Вокруг чаши с ядром расположена особая радиально исчерченная зона цитоплазмы, слагающаяся из тесно расположенных палочковидных отдельностей (рис. 53, А, 3). Некоторые исследователи считают это образование гомологичным парабазальному телу. В цитоплазме L. blattarum всегда присутствуют многочисленные пищевые включения: зерна крахмала, споры грибков, бактерии и т. п. Специально дифференцированное ротовое отверстие отсутствует, и захват пищевых частиц осуществляется цитоплазмой преимущественно в задней половине тела. Нередко на препаратах удается обнаружить различные стадии деления Lophomonas, которое осуществляется в свободноподвижном состоянии. При этом ядро выходит из чаши (рис. 53, Б,
В), которая у дочерних особей образуется заново. Деление ядра осуществляется путем своеобразного митоза. Наряду с активно подвижными особями в кишечнике таракана часто наблюдаются одноядерные цисты Lophomonas. Массовое инцисти-рование, как показал Засухин, удается вызвать путем изменения характера пищи хозяина. Оно наблюдается при переводе тараканов с кормления сырым картофелем на мясную диету. Последняя, очевидно, неблагоприятна для паразита. ОТРЯД OPALININA Опалин до недавнего времени относили к инфузориям в качестве самостоятельного подкласса Protociliata. Работы последних лет по изучению морфологии, строения ядра и жизненному циклу заставляют пересмотреть вопрос о их положении в системе. Отсутствие у Opalinina ядерного диморфизма, наличие полового процесса по типу копуляции заставляют исключить опалин из инфузорий и рассматривать их как своеобразную глубоко специализированную группу жгутиковых, у которых локомоторный и ядерный аппарат претерпели высокую степень полимеризации. Opalina ranarum Stein Материал и методы изучения. Opalina ranarum (из сем. Opalinidae) — обычный паразит лягушки (Rana temporaria). В задней кишке каждого животного их можно находить в большом количестве. Рассматривать объект in vivo и на окрашенных гематоксилином тотальных препаратах, изготовленных в виде мазка после фиксации жидкостью Шаудина. Ядра при этом часто красятся плохо, поэтому более четкую картину можно получить применением метода Фёльгена. Изучение морфологии. Плоское листовидное асимметричное тело косо срезано спереди и закруглено сзади (рис. 54). Одна сторона тела (длинная) выпуклая, другая имеет небольшую впадину. Длина достигает 500—800 мкм. Поверхность тела покрыта многочисленными, длин- Рис. 54. Opalina ranarum. А — взрослая особь; Б — деление, В — циста, Г — микрогамета; Д — макрогамета; £— копуляция (А, Б—из кн. Целлера; В—Е—из кн. Грассе): 2 == эктоплазма, 2 — эндоплазма, 3 ядра
ными, густо посаженными ресничками. Их ряды проходят вдоль тела, слегка изгибаясь S-образно. Цитоплазма подразделяется на хорошо различимые два слоя: тонкую гомогенную, прозрачную эктоплазму и набитую различными включениями эндоплазму. В эндоплазме разбросаны небольшие дисковидные ядра в количестве нескольких десятков. При больших увеличениях на окрашенных препаратах хорошо видно в центре каждого ядра небольшое ядрышко, окруженное сеточкой хроматина. In vivo ядра также хорошо видны в виде прозрачных пятен на зернистом фоне плазмы. Кроме ядер в эндоплазме есть и другие включения. Из них следует отметить овальные тельца, более мелкие по сравнению с ядрами и окрашивающиеся равномерно. Отношение к краскам заставляет признать их за хондриозомальные производные. Сократительных вакуолей у Opalina до сих пор не обнаружено. Иногда встречаются и делящиеся особи. Борозда деления при этом проходит косо (рис. 54, Б). В лягушках, пойманных ранней весной в момент откладки икры, встречаются мелкие формы опалин с малым количеством ядер —пред-цистные, которые инцистируются и попадают на дно водоема. Цисты далее заглатываются развившимися головастиками, в них из цист вылупляются опять-таки мелкие опалины, дающие при делении удлиненные одноядерные гаметы неодинакового размера, копулирующие анизо-гамно. Зиготы инцистируются, цисты снова заглатываются уже крупными головастиками, и при окончании ими метаморфоза в них развиваются окончательного размера многоядерные формы. Вскрывая головастиков разных возрастов, удается рассмотреть различные стадии полового процесса опалин. Кроме видов рода Opalina в средней и южной полосе СССР в лягушках и жабах нередко встречаются представители другого рода Ора-linina — Cepedea, например С. dimidiata. Род Cepedea отличается от Opalina более сильно вытянутым в длину телом, соотношение длины к ширине у них равняется 3—5:1. В остальном строение Cepedea не отличается от Opalina.
Тип Ciliophora КЛАСС INFUSORIA — ИНФУЗОРИИ Инфузории — группа разнообразных простейших, представляющих интерес с точки зрения сложной морфологии. Это обстоятельство позволяет продемонстрировать на примере данного класса ту высоту организации, которой достигает в процессе эволюции простейший организм. Добывание инфузорий не представляет особых трудностей; изучение ведется главным образом на живом материале, что особенно повышает интерес к этой группе простейших. В пределах каждого отряда следует разобрать более подробно одного из обычных представителей. t Число описанных видов инфузорий превышает 7 тыс., которое слагается в большое число отрядов и семейств. Систематика инфузорий за последние годы подверглась коренной переработке, что обсуловлено расширением наших знаний о структуре инфузорий и в особенности их локомоторных органелл (ресничек и их производных — мембран, мембранелл и т. п.). Выяснилось, что эктоплазма инфузорий, которая получила название кортекса, обладает сложной структурой. Она слагается из мембран, локомоторных органоидов и сложной системы фиб-риллей. Частично на светооптическом уровне структуры кортекса выявляются методами серебрения, которые описываются ниже. Однако полное представление может быть получено лишь путем применения электронно-микроскопических методов исследования. Современная систематика инфузорий базируется главным образом на строении и положении ротового аппарата и связанных с ним ресничных образований, а также распределении локомоторных органелл в кортексе. Важное значение имеет также строение ядра. Методы изучения инфузорий. Прежде чем ознакомиться с отдельными представителями инфузорий, остановимся на некоторых методах изучения, общих для большинства представителей этого класса. Очень важно научиться рассматривать инфузорий на живом материале, применяя при этом кроме обычных светооптических систем фазоконтрастное устройство, что резко улучшает видимость ресничных образований. Сильно препятствует изучению живых инфузорий их подвижность. Чтобы частично устранить это затруднение, можно прибегнуть к следующим приемам. Использовать тигмотаксис инфузорий. Поместить под покровное стекло очень тонкий слой гигроскопической ваты— инфузории застревают между ее волосками. Можно достигнуть за
медления движения повышением вязкости среды, прибавляя раствор агар-агара, вишневый клей, коррагеновый клей и другие нейтральные вещества, вызывающие остуднение капельки жидкости с простейшими. Структура многих инфузорий хорошо сохраняется при фиксации их в парах OsCU. Для этого поступают следующим образом. Небольшую каплю с инфузориями на предметном стекле переворачивают жидкостью вниз над открытым сосудом с 2%-ным раствором осмиевой кислоты. Пары ее быстро убивают инфузорий, хорошо сохраняя их форму и реснички. Препарат покрывают покровным стеклом; изучение ведется без окраски в капле воды. Можно использовать также кратковременную фиксацию в осмиевых смесях (5—15 мин) (с. 13) с последующим рассмотрением объекта без окраски в капле воды. При этом хорошо видны кинетиды. Хорошие результаты при изучении инфузорий дают витальные красители (с. 42). Нейтральный красный хорошо прокрашивает пищеварительные вакуоли. Для изучения ядерного аппарата используются тотальные препараты инфузорий, фиксированные сулемовыми или пикриновыми смесями и приклеенные к стеклу целлоидином (с. 14, 18). Особенно следует рекомендовать окраску по Фёльгену (с. 36—37). Особенно важно при изучении инфузорий хорошо разобраться в строении ротового аппарата и ресничных образований. Для этого применяют различные методики импрегнации солями серебра. Методы эти довольно сложны, но при правильном применении дают очень четкие результаты. Ниже приводится методика Шаттона и Львова в модификации Корлиса, многократно проверенная и дающая прекрасные результаты. 1. Фиксация инфузорий в солонке свежеприготовленной смесью Шампи (с. 14) 1—5 мин. 2. Постепенная замена смеси Шампи раствором Да-Фано (пипеткой оттягивается смесь Шампи и другой пипеткой добавляется раствор Да-Фано) (состав смеси Да-Фано: CoNOs—1 г, NaCl—1 г, формалин 40%-ный—10 см3, дистиллированная вода — 90 см3). Выдерживают объекты в растворе Да-Фано не менее 2 ч. При необходимости в растворе можно хранить объекты неделями. 3. Отмывают инфузорий от раствора Да-Фано в 2—3 сменах дистиллированной воды. 4. Дальнейшую работу продолжают на нагревательном столике 37—45°С (можно заменить чашкой Петри, в которую налита горячая вода). Каплю с инфузориями помещают на подогретое (очень чистое) предметное стекло и добавляют каплю предварительно подогретой соленой желатины (состав ее: желатина — 10 г, хлористый натрий химически чистый 0,05 г, дистиллированная вода—100 см3). Каплю с простейшими и каплю желатины перемешивают теплой стеклянной палочкой. Размазывают по стеклу (по размеру покровного стекла). Избыток оттягивают подогретой пипеткой. Дальнейшие процедуры (5, 6, 7, 8, 9) проводят в холодильнике при 5—10°С. В качестве холодильника можно использовать чашку Петри, на дно которой положены кусочки льда и фильтровальная бумага. 5. Предметное стекло с объектом в желатине переносят на несколь
ко минут в холодильную камеру для застывания желатины (избегать подсушивания! Пользоваться прикрытой чашкой Петри). 6. Предметное стекло с объектом помещают в 3%-ный раствор азотно-кислого серебра (заранее охладить). Раствором можно пользоваться 2—3 раза. Продолжительность выдерживания в растворе варьируют в зависимости от размеров объекта в пределах 10—30 мин. 7. Быстро и тщательно промывают объект в 2—3 сменах холодной дистиллированной воды. 8. Препарат погружают на глубину 3—4 см в чашку с холодной водой, которую ставят в большую чашку со льдом. Выставляют под источник УФ света. Проявлять следует в белой фарфоровой чашке либо под стеклянную прозрачную чашку положить лист белой бумаги. Время восстановления серебра в препаратах зависит от мощности источника УФ излучения. Удобно пользоваться ртутно-кварцевыми лампами ПРК, широко применяемыми в медицинской практике. Время освещения под такой лампой 30—40 мин. Расстояние от препарата до источника света 20—30 см. 9. После прекращения экспозиции быстрая отмывка в 70° холодном спирте. Дальнейшие манипуляции проводятся при комнатной температуре. 10. Обезвоживание в 96° и абсолютном спирте, просветление в ксилоле или толуоле, заключение в бальзам. При удавшейся окраске в черный цвет импрегнируется каждая ки-нетосома, что дает ясную картину распределения ресничного аппарата. Гораздо проще методика, предложенная Клейном и дающая удовлетворительные результаты. Каплю культуры с объектами размазывают по стеклу и высушивают на воздухе (без нагрева). Сухой мазок (лучше через несколько дней после высушивания) на 6—8 мин помещают в 2%-ный раствор азотнокислого серебра. Промывают дистиллированной водой и в белой фарфоровой чашке выставляют на свет (не прямой солнечный, но достаточно яркий). Срок освещения 4—10 ч в зависимости от яркости света. При освещении УФ ртутной лампой срок сокращается до 20—30 мин. Отмывают в воде, высушивают и заключают в бальзам. Импрегнируются кинетосомы, частью реснички, фибриллярные структуры. Для изучения строения крупных инфузорий (парамеции, стентора и др.) рекомендуется прибегнуть к заливке в целоидин-парафин по Пе-терфи с ориентировкой объекта на целлоидиновых пластинках, как это описано на с. 23. ПОДКЛАСС CILIATA — РЕСНИЧНЫЕ ИНФУЗОРИИ Надотряд Kinetojragminophora Этот обширный и наиболее примитивный таксон характеризуется отсутствием специальных ресничных образований (мембран и мембра-нелл), связанных с ротовым аппаратом. Он включает несколько отрядов, из которых здесь рассматриваются представители двух отрядов.
ОТРЯД GYM NOSTOMATA Среди многочисленных родов и видов гимностомид рекомендуется ознакомиться с организацией и биологией представителей трех родов: Prorodon, Dileptus и Didinium, широко распространенных в пресных водах. Материал и методы изучения. Представители всех трех названных выше родов обычны в планктоне мелких водоемов, где они концентрируются преимущественно в придонных слоях. Dileptus и Didinium легко поддерживать в культурах. Виды этих двух родов — активные хищники. Они хорошо разводятся на сенных или навозных культурах при наличии достаточного количества пищи. В качестве последней могут служить живые инфузории туфельки, которых разводят в отдельной культуре (с. 123). Небольшое количество их следует добавлять к среде, в которой живут хищные инфузории. Дилептусы очень хорошо живут в чашках Петри, в которых заложены зерна риса (с. 8). Получается многочленная культура: на рисе разводят бактерии, которые служат пищей инфузориям (парамеции, гипотрихи и др.). Последними в свою очередь питаются хищники. При отсутствии пищи дилептусы и дидиниумы легко инци-стируются. Столь же легко они выходят из цист при пересеве на свежую среду. Изучение ведется преимущественно на живом материале. Кроме того, изготовляют окрашенные различными ядерными красками тотальные препараты после фиксации сулемовыми или пикриновыми смесями (с. 14). Prorodon sp. Одним из наиболее обычных видов этого обширного рода является Р. teres (рис. 55, А) (длина 130—200 мкм). Форма тела у большинства видов этого рода яйцевидная. Ротовое отверстие расположено терминально на переднем конце. Такое положение ротового аппарата рассматривается для ресничных инфузорий как наиболее примитивное. На противоположном (заднем) конце тела помещается сократительная вакуоль. От ротового отверстия в глубь эндоплазмы идет глотка (у разных видов Prorodon разной длины). В стенке ее расположен так называемый палочковый аппарат, слагающийся из нескольких десятков упругих тонких палочек (трихитов). Этот аппарат играет опорную роль, а также направляет заглатываемую пищу в глубину эндоплазмы. Ресничный аппарат (цилиатура) состоит из многочисленных (свыше 100) рядов ресничек, идущих в строго меридиональном направлении (каждый ресничный ряд носит название кинеты). У большинства видов рода Prorodon имеется один бобовидный или яйцевидный макронуклеус и один (иногда несколько) микронуклеус. Пища прородонов разнообразна. Это бактерии или мелкие простейшие или водоросли. Dileptus sp. В пресных водах встречается свыше десяти видов этого рода. Наиболее обычным и легко размножающимся в культуре является Dileptus anser — крупная инфузория, достигающая в длину 500 мкм и более. Размеры дилептусов широко варьируют в пределах вида в зависимости от условий питания. При голодании инфузории резко уменьшаются в размерах. Тело Dileptus распадается на два ясно выраженных отдела. Передняя часть образует относительно узкий очень подвижный хобот (рис. 55, Б), составляющий у разных видов от */з до '/г длины тела. Более широкое туловище на заднем конце вытянуто в виде небольшого заостренного хвостового придатка. На границе между хоботом и туловищем помещается рот. Эта сторона называется брюшной.
1 Рис. 55. Инфузории отряда Gymnostomata: А — Prorodan teres (по Бючли): / — ротовое отверстие, 2 — палочковый аппарат, 3 — пищеварительные вакуоли, 4 — сократительная вакуоль; Б — Dileptus'anser (по Дражеско). / — общий вид инфузории; //— детали строения рта и цилиатуры (с препарата, импрегнированного серебром); 1 — хоботок, 2 — ротовое отверстие, 3 — ядра, 4—сократительные вакуоли, 5 — желобок, лишенный ресничек и несущий трихоцисты; В — Didinium nasutum (по Дражеско). / — начало захвата добычи; II— дидиний, наполовину заглотивший парамецию: /— ротовое отверстие, 2— передний венчик ресниц, 3 — задний венчик ресниц, 4 => сократительная вакуоль, 5 — цитоплазматический вырост, служащий для захвата добычи
Все тело покрыто густо расположенными рядами ресничек. У Dilep-tus anser число кинетид в туловищном отделе равно 40—50, только часть их переходит на хобот, часть же кинетид заканчивается у ротового отверстия (рис. 55, Б). На брюшной стороне хобота имеется желобок, лишенный ресничек и идущий ко рту. Вокруг ротового отверстия располагается валик пелликулы, укрепленный системой фибрилл. От рта в глубь цитоплазмы также идут многочисленные опорные фибриллы, являющиеся опорным аппаратом при прохождении пищи. Эти фибриллы сходны с палочковым аппаратом Prorodon. Их можно хорошо разглядеть, если сделать срезы и окрасить их железным гематоксилином. У не питающихся дилептусов ротовое отверстие закрыто. При поглощении пищи ротовое отверстие может сильно растягиваться, увеличивая свой диаметр во много раз. Вдоль желобка на брюшной стороне хобота в эктоплазме расположены многочисленные палочковидные трихоцисты; их хорошо видно при большом увеличении на живом объекте, и на срезах, окрашенных железным гематоксилином. Сократительные вакуоли в количестве десятка и более расположены по спинной стороне туловища и заходят на хобот. Строение ядерного аппарата в пределах рода Dileptus сильно варьирует. У одних видов (Z). cygnus, D. grandis и др.) макронуклеус четковидный, состоящий из большого количества отдельных узелков, микронуклеусы многочисленные и расположены вблизи четок макронуклеуса. У некоторых других видов, в том числе у D. anser (рис. 55, 5), макронуклеус распадается на отдельные фрагменты, число которых может быть свыше 200. Многочисленные микронуклеусы разбросаны по всей цитоплазме вперемешку с фрагментами макронуклеусов. Такое состояние ядра несомненно является вторичным, ибо после конъюгации из каждого зачатка развивается один макронуклеус, который лишь потом распадается на фрагменты. На живом материале представляет интерес наблюдение за захватом добычи и питанием дилептусов. Спектр пищевых объектов у этих хищников чрезвычайно разнообразен — это инфузории, жгутиконосцы и даже мелкие многоклеточные (коловратки, турбеллярии). Никогда не заглатываются амебы и очень редко зеленые клетки (хламидомонады, эвглены). Хобот дилептуса находится в непрерывном движении. Плавая, дилептусы «размахивают» своим хоботом. Если брюшная сторона хобота прикоснется к пищевому объекту, то происходит выстреливание трихоцист, которые чрезвычайно ядовиты. Происходит немедленное разрушение пелликулы и цитолиз цитоплазмы. Подобные частично разрушенные пищевые объекты, по-видимому, действием ресничного аппарата направляются к ротовому отверстию, которое растягивается в соответствии с размерами добычи, и последняя заглатывается вместе со значительным количеством жидкости. Образуется пищеварительная вакуоль. Если добычи много, то не каждая пораженная трихоцистами пища проглатывается. Дражеско, например, наблюдал, что один дилеп-тус убивает до 70 инфузорий Colpidium, не имея возможности их заглотить. После такого массового поражения добычи дилептусы на некоторое время (2—3 ч) теряют способность убивать, что связано, очевидно, с израсходованием трихоцист.
Didinium nasuium О. F. M., так же как и дилептусы,— хищник, причем излюбленной пищей его являются инфузории рода Paramecium. При отсутствии последних он может питаться и другими инфузориями, но при наличии в среде разных видов активно выбирает парамеций. Инфузория имеет бочонковидную форму, на переднем конце выдается вперед хоботок (рис. 55, В). Длина дидиниев варьирует в пределах 150— 180 мкм. D. nasutum легко разводятся в культурах (настой сена или салата, навозные культуры) при наличии обильной пищи. При отсутствии пищи быстро инцистируются. Чтобы поддерживать культуру, ее надо регулярно пересевать (примерно раз в неделю). Ресничный аппарат на большей части тела редуцирован и сведен к двум пояскам, расположенным один в нижней, другой в верхней части тела. Несмотря на частичную редукцию цилиатуры, инфузории очень подвижны, что необходимо для охоты за добычей. Хоботок, на конце которого помещается ротовое отверстие, обладает двоякого рода структурами. Во-первых, это веретеновидные трихоцисты (токсицисты), используемые при ловле добычи, во-вторых — опорные фибриллы, окружающие глотку (гомолог палочкового аппарата). Эти структуры можно рассмотреть на живом объекте с иммерсионной системой, сильно придавив инфузорию, или на срезах (лучше после фиксации осмиевыми смесями, с. 13) при окраске железным гематоксилином. Одна сократительная вакуоль расположена на заднем конце тела. Ядерный аппарат слагается из почковидного макронуклеуса и располагающегося вблизи него маленького микронуклеуса. Для рассмотрения ядра дидиниев лучше всего прибегнуть к изучению тотальных препаратов, окрашенных по Фельгену. Интересен процесс охоты и поглощения пищи, ибо обычная пища дидиниев — инфузории туфельки, значительно крупнее самого хищника. Весь этот процесс был подробно изучен и описан еще свыше 100 лет тому назад Бальбиани (1873) в специальной статье, посвященной биологии D. nasutum. Если, быстро плавая, дидиний прикоснется хоботком к парамеции, то последняя оказывается прочно закрепленной к хищнику. При этом из тела дидиния через ротовое отверстие выбрасывается наружу особый органоид, имеющий форму языка. Он удерживает добычу и втягивает ее внутрь тела через хоботок (рис. 55, В). Вместе с этим выстреливаются трихоцисты (токсицисты), которые убивают добычу. В результате заглатывания туфельки в теле хищника образуется огромная пищеварительная вакуоль. Туфелька, на которую нападает дидиний, не остается пассивной. Она активно защищается, выстреливая свои трихоцисты, которые неблагоприятно действуют на хищника. Иногда туфельке удается оторваться от хищника, и она уплывает. Такие особи обычно погибают, вероятно, вследствие ядовитого действия токсикоцист. Впрочем, описывались и случаи «выздоровления» поврежденной дидинием парамеции. Все описанные выше процессы вполне возможно наблюдать на живом материале. Детали заглатывания пищи изредка удается наблюдать на срезах, удачно зафиксированных в момент питания дидиниев.
Epidinium ecaudatum Fiorentini Материал и методы изучения. Epidinium ecaudatum относится к подсем. Ophryo-scoleciinae сем. Ophryoscolecidae. Это обычная форма среди инфузорного населения рубца крупного рогатого скота. У данного вида в настоящее время известны так называемые формы, отличающиеся друг от друга только отсутствием или наличием хвостовых отростков при полном тождестве всей остальной наружной и внутренней морфологии. Для наших целей совершенно безразлично, с какой формой придется иметь дело. Материал добывают с бойни. У только что убитого быка из рубца извлекают теплое еще содержимое, из которого отжимают (хотя бы просто рукой) жидкую фракцию в термос, в котором и привозят в теплом состоянии в лабораторию (проба в термосе обычно не остывает в течение 2—3 ч). Желательно в один термос забрать пробы из нескольких рубцов, так как Epidinium хотя и обычная форма, но все же попадается не в каждом животном. Инфузории изучают прежде всего in vivo на нагревательном столике (его может заменить, например, чашка Петри с теплой водой, на которую кладут предметное стекло, пластинку толстого стекла, периодически подогреваемую, и т. д.). Далее материал должен быть зафиксирован для изготовления тотальных препаратов и разрезов. При фиксации желательно иметь инфузорий с расправленным ресничным аппаратом, для чего приходится применять теплый фиксатор и нагретую посуду для фиксации. Лучше всего на спиртовке подогреть чашку Петри с небольшим количеством содержимого рубца. В чашку вливают теплый фиксатор (лучшие результаты дает жидкость Ценкера с формалином для срезов и жидкость Шаудина для тотальных препаратов), все это энергично перемешивают и сливают в центрифуражную пробирку, где и оставляют на 20—30 мин. Дальнейшие манипуляции (промывка, проведение через спирты, иодирование) ведут при помощи центрифуги. Тотальные препараты и срезы лучше всего окрашивать железным гематоксилином. Заливка производится комбинированная в целлои-дин-парафин по Петерфи с применением целлоидиновых пластиночек для ориентировки объекта (см. с. 23). Подобный способ заливки приходится применять из-за наличия у Epidinium довольно плотной кутикулы и твердых скелетных элементов. Последние рвут срезы, если режут материал, залитый обычным способом в парафин. Полезно перед заливкой подкрасить инфузорий тем же железным гематоксилином, что чрезвычайно облегчает выбирание именно Epidinium из массы других инфузорий при раскладке их на целлоидиновую пластиночку. Рекомендуется изготовить серию поперечных и продольных разрезов. Толщина срезов 4—5 мкм. Изучение тотальных препаратов. Внешняя морфология. Вытянутое тело Epidinium имеет в длину от 90 до 180 мкм. Оно округло в поперечном сечении, постепенно суживается кзади. На переднем конце сконцентрирован ресничный аппарат, задний же конец либо гладкий, закругленный (у forma ecaudatum), либо с 1—5 каудальными шипами. Прежде чем разбираться в расположении шипов, следует условиться относительно ориентировки тела Epidinium в пространстве. Мы условно принимаем за брюшную сторону ту, на которую смещено ротовое отверстие и вблизи которой располагается анальная трубка (рис. 56). Тогда ядерный аппарат и сократительные вакуоли будут лежать вблизи 1 Отряд Entodiniomorpha длительное время сближали с отрядом Oligotricha и включали в надотряд (или подкласс) Spirotricha (в современной системе — Polyhyme-nophora). Однако исследования последних лет (Нуаро-Тимотэ, Вольска, Янковского) показали, что у них отсутствует основной признак Polyhymenophora — закрученная спирально адоральная зона мембранелл. Околоротовая цилиатура Entodiniomorpha слагается из расположенных пучками ресничек, а не ряда мембранелл. Таким образом, Entodiniomorpha должны быть выключены из Polyhymenophora и включены в Kinetofragminophora. - - - .
Рис. 56. Epidinium ecaudatum forma ecaudatum (из кн. Шарпа). A — общий вид инфузории с правой стороны и Б — с левой (Х650): / — адоральная зона, 2 — теменной вырост, 3 —скелетная пластинка, просвечивающая сквозь пелликулу — primitiva, 4 — cirri дорзальной ресничной зоны, 5 — передняя сократительная вакуоль, 6— макронуклеус, 7 — мнкро-нуклеус, 8 — задняя сократительная вакуоль, 9—анальное отверстие, 10— анальная трубка, // — скелетная пластинка — sternum, 12— cirri периферического ряда адоральной ресничной зоны, 13 — внутренний ряд адоральных ресничных образований, 14— периферическая двойная губа, 15 — скелетная пластинка parasternum, 16 — губа у основания cirri дорзальной зоны, 17 — околоротовой валик спинной стороны и дополнительная ресничная зона займет дорзальное положение. При этом замечается легкий изгиб тела на вентральную сторону (рис. 56). Наибольшее возможное количество шипов на заднем конце Epidinium. равняется пяти (forma cattaneoi, fasciculus, рис. 57, I—V). Самый крупный из них I занимает вентральное положение. Напротив него значительно меньших размеров IV шип. II и III, еще меньших размеров, обычно располагаются на правой стороне. Пятый же (7), по размерам не уступающий четвертому, лежит слева. У четырехшипного Epidinium (forma quadricaudatum) обычно отсутствует III шип. У трехшипного (forma tricaudatum) сохраняются I, IV и V. У двухшипного (forma bi-caudatum) чаще всего остаются I и IV шипы. У наиболее же обычного
Рис. 57. Epidinium ecauda-turn forma cattaneoi. Задний конец тела с правой стороны (Х650) (из кн. Шарпа): 1— анальная трубка, 2 — эктопласт, 3 — эндоплазматический мешок, 4 — задняя сократительная вакуоль, 5—макронуклеус; I — вентральный шип, II и III— шипы правой стороны, IV — дорзальный шип, V — шип левой стороны брюшную и правую однотипного Epidinium (forma caudatum и forma hamatum) виден только I шип. Каждый шип выходит из тела инфузории широким основанием, заострен на вершине и загнут острием медианно (рис. 57). Анальная трубка открывается наружу у основания I (вентрального) шипа. Ресничный аппарат представлен адоральной (околоротовой) зоной и дорзальной. Его разбор удается лучше всего на живом материале или на фиксированном, но неокрашенном. Ресничные образования в данном случае — это типичные пальцевидные цирры, округлые (или овальные) в сечении и склеенные из многих ресничек. При плохой фиксации концы цирр размочаливаются, распадаются на отдельные составляющие их реснички. Адоральный ресничный аппарат у Epidinium разбивается на две части: периферическую и внутреннюю, отделенные друг от друга высоким цитоплазматическим валиком, который идет по спирали вокруг ротового отверстия (см. рис. 56). Периферический ряд цирр начинается на левой стороне тела, огибает гороны по часовой стрелке и, пройдя по спинной стороне, заканчивается слева на краю ротового отверстия. Образуется полный оборот спирали, причем внутренний конец спирали приподнимается над уровнем наружного (рис. 56, Б). Внутренний ряд составлен из тонких, нежных ресничных образований. Они сидят по краю ротового углубления и образуют оборот спирали, направленный против часовой стрелки. Начало этого оборота совпадает с концом периферического ряда цирр. Основания периферических цирр снаружи прикрываются двойной цитоплазматической губой (см. рис. 56). Дорзальная добавочная ресничная зона имеет в своем составе мощные цирры, концами направленные вперед. Их основания покоятся в глубине борозды, проходящей поперек тела назад от адоральной зоны. Борозда заканчивается асимметрично: на правой стороне тела она несколько не доходит до медианной линии, на левой же несколько переходит за нее. Основания цирр здесь отграничены снаружи двойной складкой (губой, см. рис. 56). Между обеими зонами обособляется выпуклый участок поверхности тела, теменной вырост. Различные внешние раздражения вызывают у Epidinium втягивание ресничного аппарата. При остывании, при медленной фиксации адоральная и дорзальная зоны втягиваются внутрь тела и снаружи прикрываются вытягивающимися губами. На нагревательном столике прекрасно удается наблюдать втягивание обеих зон при остывании и, наоборот, выпячивание их при повышении температуры.
Поверхность тела покрыта прочной пелликулой с многочисленными мелкими продольными бороздками. Протопласт. На окрашенных тотальных препаратах видно подразделение протопласта Epidinium на два слоя: внутренний, объемистый, в который поступает пища через ротовое отверстие и глотку и который следует именовать эндоплазматическим мешком, и наружный, одевающий эндоплазматический мешок — эктопласт Эти подразделения будут лучше видны на разрезах (см. дальше). Эндоплазматический мешок связан с наружной средой через глотку и анальную трубку. Скелет. Для изучения скелета необходимо неокрашенных инфузорий обработать в воде хлор-цинк-иодом или раствором Люголя. Тогда ясно выступят коричневые пластинки скелета. Они расположены главным образом на правой и вентральной стороне тела, непосредственно под пелликулой. Прежде всего бросается в глаза их ячеистая структура. Каждая пластинка разбивается на ряд полигональных призмочек (см. рис. 60, В), поставленных перпендикулярно к кутикуле и имеющих в составе клетчаткоподобное вещество — офриосколецин. Призмочки склеены промежуточной белковой субстанцией. У Epidinium ecaudatum вдоль тела тянутся три скелетные пластинки, разъединенные по середине тела узкими промежутками и тесно прилегающие друг к другу спереди и сзади. На правой стороне тела мы различаем правую дорзальную пластинку (рис. 56), соответствующую таковой у представителей рода Diplodinium, которую Догель (1927) назвал primitiva. Ее передний край упирается в теменной вырост, дорзальным же краем она идет вдоль макронуклеуса. Это самая узкая пластинка из всех трех. На правой же стороне тела, загибаясь и на брюшную, лежит вентральная пластинка, так называемая sternum. Это наиболее широкая пластинка. Наконец, с брюшной стороны наискось налево вперед располагается левая пластинка, несколько более широкая, чем первая, называемая parasternum. Sternum и parasternum заканчиваются спереди около адоральной ресничной зоны. Все три пластинки тянутся приблизительно на расстоянии 5/б всей длины тела, утончаясь кзади и сходя совершенно на нет только позади макронуклеуса. Сократительные вакуоли. У Epidinium видны всегда две сократительные вакуоли, расположенные вблизи концов макронуклеуса дорзально от него, на правой стороне тела. Передняя вакуоль часто несколько крупнее задней. Обе вакуоли имеют линзообразный вид. Каждая из них открывается наружу постоянно существующей порой в кутикуле (см. рис. 56). Сокращение вакуолей in vivo наблюдать трудно, так как интервал между сокращениями достигает 1 ч. Ядерный аппарат. Макронуклеус колбасовидной формы, спереди закруглен, назад постепенно сужается и заканчивается заострением (см. рис. 56). На окрашенных препаратах хорошо видна зер- 1 Подобная терминология имеет целью подчеркнуть принципиальное отличие, например, внутренней зоны Entodiniomorplia от эндоплазмы других инфузорий. Наружный слой при этом резко отграничивается от нее пограничной мембраной (см. дальше), И у данных инфузорий обособляется особый пищеварительный слой.
нистая структура хроматина. Гранулы последнего вплотную лежат друг около друга, образуя ядро массивного типа. Приблизительно посередине на макронуклеусе имеется с правой стороны вдавление, в котором лежит небольшой сферический микронуклеус. Изучение срезов. Прежде всего надо разобраться в серии поперечных срезов. Для этого следует рассмотреть каждый срез под иммерсией, начиная от переднего конца тела до заднего. При этом необходимо обратить внимание на постепенные изменения того или иного органоида в пределах серии. Очень полезно изготовить рисунки 6—8 срезов в разных областях и расположить их в определенном порядке — тогда на них ясно выступают все особенности расположения отдельных органоидов. Из передних срезов остановимся на описании среза в области дорзальной дополнительной ресничной зоны (рис. 58,А). Прежде всего-следует обратить внимание на цирры, отметить их сложную природу: отдельные реснички, входящие в их состав, лучше всего видны именно на срезах. Относительно толстая пелликула сильно красится гематоксилином, и на ней видна ребристость. Под пелликулой виден эктопласт, заполняющий значительную часть среза и утолщенный вентрально. Следует отметить его характерную мелкоячеистую структуру. С вентральной стороны на срезе перерезаются все три пластинки скелета. Они вплотную прилегают к пелликуле, и можно заметить перерезанные фибриллы, проходящие вдоль пластинок с наружной стороны. Primitive здесь из всех пластинок наиболее толстая. На parasternum утолщен дорзальный край, sternum же имеет более или менее равномерную толщину. Хорошо видна на срезах призматическая структура пластинок— сама скелетная субстанция остается бесцветной, а гематоксилином окрашивается только склеивающая призмы прослойка (рис. 58,А). В эктопласте здесь видна также перерезанная поперек глотка. Наконец, около глотки можно рассмотреть пучок сократимых фибрилл — ретрактор околоротовой ресничной системы. Эндоплазматический мешок наполнен мелкозернистой на срезах цитоплазмой с многочисленными гликогеновыми зернами (не окрашивающимися гематоксилином) и пищевыми частичками. Стенка эндоплазматического мешка — очень тонкая пограничная мембрана с проходящими в ней плохо заметными продольными фибриллами. Далее следует обратить внимание на срез в области передней сократительной вакуоли. Эктопласт здесь уже сильно утончается, вдоль дорзальной и правой стороны среза он проходит в виде еле заметного слоя. Утолщение его остается в области скелетных пластинок, сократительной вакуоли и ядра. Primitiva на срезе уже двух остальных пластинок и отстает от пелликулы, погружаясь почти целиком в эктопласт. Sternum сохраняет прежнее положение вплотную к пелликуле. Parasternum также отступает от пелликулы. Глотка в этой области имеет еще замкнутый контур, но она уже с широким просветом и вентральной стенкой прилегает вплотную к скелету. В ее стенках следует отметить продольные лентовидные фибриллы.
1 Рис. 58. Epidinium ecaudatum (ориг.). Серия поперечных разрезов (Х1600). А — разрез в области спинной ресничной зоны; Б — в области передней сократительной вакуоли; В—через микронуклеус; Г — на уровне заднего конца макронуклеуса; Д — в области анальной трубки: J— cirri спинной ресничной зоны, 2—эндопласт, 3— эктопласт, 4 — primitiva, 5 —* sternum, 6—глотка, 7 — ретрактор адоральной зоны, 8 — parasternum, 9— передняя сократительная вакуоль, 10 — пелликула, // — макронуклеус, 12—микронуклеус, /3— анальная трубка
На этом же срезе виден перерезанный поперек макронуклеус, лежащий в специальном углублении эндоплазматического мешка, но окруженный тонким слоем эктопласта. Хорошо видны его оболочка и зернистая структура. Сократительная вакуоль лежит дорзально по отношению к ядру, также в эктопласте. Пелликула в этом месте обычно несколько продавливается внутрь в результате фиксации. На удачных срезах можно видеть и выводную пору. Большая часть среза занята эндопластом. Следующий срез в области микронуклеуса приблизительно посередине тела (рис. 58, В). Эктопласт выглядит так же, как и на предыдущем срезе. Primiti-va становится очень узкой, снова прилегает к пелликуле и ясно прижимается к sternum, сохраняющей тот же вид, что и на предыдущем срезе. Parasternum сильно утолщается по левому краю: вдоль него образуется гребень. Глотка в этой области уже широко сообщается дорзально с эндоплазматическим мешком. В ее стенках, прилегающих к скелету, также видны продольные фибриллы. Макронуклеус имеет вдавление, в котором помещается микронуклеус. Следующие срезы в общем мало отличаются от только что разобранного. На них только видно, как у parasternum сильно загибается левый край (рис. 58, Г). Наконец, брать срез в Ее просвет стороне среза, стенка кольцевых фибрилл. Эктопласт кнаружи от нее утолщен (рис. 58, Д). Из продольных срезов рекомендуем разобрать сагиттальные, легче всего получающиеся. На таких срезах (рис. 59) прежде всего следует обратить внимание на форму эндоплазматического мешка. Он кончается, не доходя до переднего конца тела, и стенка его с вентральной стороны вдается внутрь, соприкасаясь в этом месте с глоткой. На таких срезах хорошо удается рассмотреть глоточный аппарат с продольными фибриллами. В начале глотки можно видеть 15 1Z 11 последним следует чразообласти анальной трубки, приближен к вентральной составлена из Рис. 59. Epidinium ecaudatum. Сагиттальный разрез (Х750) (по Шарпу, с изменен.): 1 — cirri адоральной зоны, 2 — плазматические губы у основания cirri, 3 — теменной вырост, 4 — корневые нити cirri, 5 — эктопласт, б* — cirri дорзальной зоны. 7 — передняя сократительная вакуоль, 8 — макронуклеус, 9 — микронуклеус, 10 — задняя сократительная вакуоль, 11 — анальное отверстие, 12 — анальная трубка, 13 — эндоплазматический мешок, 14 — скелетная пластинка, 15 — глоточные фибриллы, 16 — окологлоточное Фибриллярное кольцо, 17 — ротовое отверстие
фибриллярное кольцо, видимо, играющее роль сфинктера. Так же хорошо удается разобрать способ прикрепления cirri к телу, удается найти их корневые фибриллы, хорошо видно расположение губ у их основания, видны опорные нити шипов (рис. 60) и т. д. Наконец, на таких разрезах следует найти сократительные вакуоли и анальную трубку. Остальные же органоиды легко разобрать, пользуясь прилагаемыми рисунками. Надотряд Oligohymenophora Представители этой обширной и весьма разнообразной группы ресничных инфузорий характеризуются наличием специальной око-лоротовой цилиатуры, слагающейся из мембраны и небольшого числа мембранелл (чаще всего трех). Из многих отрядов этого надотряда здесь будут рассмотрены представители двух отрядов — Hymenostomata и Peri-tricha. ОТРЯД HYMENOSTOMATA ' Tetrahymena pyriformis (Ehrenberg) Материал и методы изучения. Tetrahymena pyriformis, так же как и некоторые другие виды этого рода, широко распространена в природе в разнообразных мелких пресных водоемах. За последнее десятилетие тетрахимены стали объектом для экспериментальных и молекулярно биологических исследований во многих биологических лабораториях мира, так что обычно не Рис. 60. Epidinium ecaudatum. А — продольный разрез через шип заднего конца тела; Б — поперечный разрез через шип (из кн. Гартманна); В—танген-тальный разрез через скелетную пластинку, окрашенную хлор-цннк-иодом (Х1200) (орнг.): I — анальная трубка, 2 — суб-пелликулярная сеть фибрилл, 3— опорные фибриллы шипа цредставляет труда получить для изучения гото- вую чистую культуру. Тетрахимены легко разводятся в культурах на сене или салате. Для получения сенной культуры поступают следующим образом. Хорошее (не кислое) сено мелко нарезают ножницами. Сена 2 г на 100 см3 сырой воды кипятят 10—15 мнн в колбе, заткнутой ватной пробкой. После этого колбы ставят в теплое место на 2— 3 дня. За это время на поверхности жидкости в колбе появляется пленка, состоящая из сенной палочки (споры ее выносят кипячение), которая и служит пищей для инфузорий. В такую культуру вносят инфузории (тетрахимены или туфельки), которые размножаются и сохраняются длительное время. Пересев достаточно делать раз в 1—1,5 месяца. Вместо сена еще лучше использовать порошок салата. Для получения его обычные листья салата высушивают до воздушно-сухого состояния и размельчают. В сенную или салатную культуру кроме сенной палочки желательно внести еще какую-либо бактерию, которая может служить пищей инфузориям. В качестве таковой хорошо использовать Aerobacter. Разработаны методы аксеиичного (безбактериального) культивирования тетрахи-мен, но они довольно сложны и мы не будем их рассматривать. Тетрахимен изучают на живом материале. Изготовляют различным образом окрашенные тотальные препараты (в том числе метод Фёльгена с подкраской лихтгрюном).
На тетрахимене из-за ее небольших размеров и относительно просто устроенного ресничного аппарата, особенно удобно применять методы серебрения (с. 108), которые дают исключительно четкие картины строения цилиатуры. На тетрахимене возможно также изучить все стадии морфогенеза цилиатуры в процессе бесполого размножения (при делении). Изучение морфологии. Тетрахимены (рис. 61) обладают грушевидной формой тела (что отражено и в их видовом названии). Средние размеры тела 50—30 мкм. Инфузории прозрачны. При применении фа- зово-контрастной системы особенно хорошо видна цилиатура, ротовое отверстие с мембраной и мембранеллами, сократительная и пищева- Рис. 61. Tetrahymena pyriformis. Рисунок с препарата, импрегнирован-ного серебром (ориг.): 1 — тетрахимениум, слагающийся из трех мембранелл и одной мембраны, 2 — ряды ресничек (кинеты); кинетосомы >- черные зерна рительные вакуоли. Соматическая цилиатура слагается из продольных рядов ресничек (кинет), идущих в меридиональном направлении (рис. 61). Число последних варьирует от 16 до 26. Чаще других встречается 18— 22 кинет. В передней трети тела помещается ротовое отверстие, в области которого расположена околорото-вая цилиатура, слагающаяся из следующих частей. Справа по краю рта проходит ундулирующая мембрана (рис. 61), слева лежат три мембра-неллы (Mi, М2 и М3). Весь этот околородовой ресничный аппарат получил название «тетрахимениум» (по родовому названию инфузории) и может рассматриваться как исходная и типичная форма околородовой цилиатуры для всего надотряда Oligohyme-nophora. Все другие формы ротовых ресничных образований в пределах этого надотряда удается вывести как от исходного морфологического- типа из тетрахимениума. На заднем конце тела располагается анальная пора, через которую осуществляется дефекация. На заднем же конце тела помещается и единственная сократительная вакуоль. В эндоплазме тетрахимен обычно имеются многочисленные пищеварительные вакуоли, наполненные бакте риями. Ядерный аппарат тетрахимен слагается из одного сферического макронуклеуса и прилежащего к нему микронуклеуса. При окраске по Фёльгену макронуклеус красится элективно,
1 z з if 5 e Рис. 62. Tetrahymena pyriformis (по Вильямсу); I— 6—‘последовательные стадии стоматогенеза в задней особи при делении; импрегнация серебром обнаруживая большое количество ДНК. Желательно отыскать делящиеся формы тетрахимен и рассмотреть стадии митоза микронуклеуса, который обладает у тетрахимен относительно небольшим количеством хромосом (диплоидное число 10). Имея культуру тетрахимен в начальном периоде ее развития, когда в культуре много делящихся особей, на импрегнированных серебром препаратах удается рассмотреть последовательные стадии развития ротового аппарата (стоматогенез) при делении инфузорий. Этот процесс носит строго закономерный характер (рис. 62). Процесс начинается с того, что слева от кинеты I (так называют ресничный ряд, идущий от средней части мембраны к заднему концу инфузории) возникает состоящая из нескольких десятков группа кинетосом '. Сначала в их расположении не наблюдается какой-либо системы. Затем кинетосомы группируются в базальные образования тетрахимениума, т. е. ундулирующей мембраны и трех мембранелл. Каждая из кинетосом дает начало ресничке. Последние, соединяясь друг с другом, формируют названные выше компоненты тетрахимениума. По мере образования нового около-ротового ресничного аппарата непрерывность кинетиды I и двух соседних с ней кинетид нарушается (рис. 62, 6). Таким образом «старый» ротовой аппарат при делении отходит к передней дочерней особи, тогда как задняя особь развивает новый тетрахимениум. В то время как протекает стоматогенез, на хорошо импрегнированных серебром препаратах удается иногда обнаружить процесс возникновения новых ресничек соматической цилиатуры. Перед кинетосомами существующих ресничек возникают новые кинетосомы, сначала лишенные ресничек. Paramecium caudatum Ehrbg. — туфелька Материал и методы изучения. Paramecium caudatum — инфузория туфелька относится к числу обычных обитателей мелких пресноводных водоемов с высоким содержанием органических веществ. Живет в придонных слоях. Легко разводится в культурах. Методы культивирования те же, что и для тетрахимен (с. 121). Для длитель- 1 Способ возникновения кинетосом может быть изучен только на электронномикроскопическом уровне, что не входит здесь в нашу задачу,
ного содержания культуры туфелек можно рекомендовать также метод, предложенный Цингером. Чистые химические пробирки заполняют предварительно прокипяченной водой. Добавляют 2 3 капли снятого молока. Через 3—4 дня в культуру вносят парамеции, которые быстро размножаются, питаясь молочнокислыми бактериями. Каждые 2—3 недели производится пересев культуры в ту же свежую среду. Род Paramecium включает свыше 10 видов. Для изучения морфологии наиболее удобна Р. caudatum в силу своих относительно крупных размеров и широкого распространения в природе (длина 180—280 мкм). Очень сходна с ней Р. multimicronucleatum (длина 180 310 мкм), а также более мелкая Р, aurelia (длина 80—310 мкм). Изучение ведется на живом материале, используя методы частичной остановки движения (с. 8 10). Работа ресничек хорошо видна при использовании фазо-контрастного устройства. Для изучения ядра применяют окраску по Фёльгену со слабой под- 7 1 2 MJ 2 6 Рис. 63. Paramaecium caudatum. Общая организация in vivo (Х750) (из кн. Полянского и Стрелкова): / — реснички, 2 — пищеварительные вакуоли, 3 — микронуклеус, 4 — ротовое отверстие, 5 — глотка, б — содержимое анальной вакуоли, 7 — резервуар сократительной вакуоли, 8 — макронуклеус, 9 — трихоцисты гематоксилином после фиксации осмиевыми или ценкер-формолом. Заливку проводят по на целлоидиновых пластинках краской лнхтгрюном (методы приклеивания инфузо-• рий к стеклу, с 8—10). У туфелек особенно тщательно и подробно изучена цилиатура, как соматическая, так и околоротовая. Для того чтобы разобраться в строении локомоторных органоидов парамеций, необходимо применить методы серебрения, желательно по Шаттону-Корлнсу (с. 108). Для изучения питания и пищеварения применяют витальное окрашивание нейтральным красным и конго красным. Рекомендуется также для изучения цитоплазматических структур изготовить срезы, окрасив их железным смесями методу Петерфи (с. 23). Парамеции представляют собой объект, удобный для изучения полового процесса — конъюгации. Иногда конъюгация возникает в культурах спонтанно. Как известно, конъюгируют между собой особи, принадлежащие к противоположным (комплементарным) типам спаривания. В некоторых лабораториях имеются генетические линии парамеций, относящихся к комплементарным типам спаривания. В таком случае конъюгация получается при смешивании культур, находящихся в хорошем физиологическом состоянии, активно делящиеся. Если таких культур нет, то рекомендуется развести несколько культур, происходящих каждая от одной отсаженной особи (такие культуры представляют собой клоны), взятой нз разных источников. При смешении таких клональных культур между собой имеется значительная доля вероятности, что они окажутся относящимися к разным типам спаривания и вступят в конъюгацию. Для изучения ядерных процессов при конъюгации рекомендуется сделать тотальные препараты на стекле и окрасить их по методу Фёльгена (с докраско^ лихтгрюном). Если удалось получить массовую конъюгацию путем сливания культур, относящихся к разным типам спаривания, то рекомен- дуется проводить фиксацию через разные сроки начала конъюгации на дистанции 2—3 ч в течение суток, чтобы получить разные стадии полового процесса н последующей реконструкции ядерного аппарата. Изучение морфологии. Тело туфельки вытянуто в длину и напоминает по форме своей дамскую туфельку-лодочку, Наиболь-
z Рис. 64. Схема строения кортекса Paramecium (по Греллю): / — гребни пелликулы, образующие шестиугольники, 2 — реснички, 3— кинетосома, 4 — кинетодесмы, 5 — трихоциста шая ширина в задней трети тела (рис. 63). Задний конец у Р. caudatum несколько заострен и несет более длинные реснички, чем остальное тело (отсюда происходит и видовое название — caudatum, т. е. снабженный хвостом). На одной стороне дела, которая: условно называется брюшной, внутрь тела вдается глубокий желоб. Это перистом, в глубине и задней части которого, именуемой вестибулум, открывается отверстие, ведущее в глотку (этот отдел пищеварительного аппарата по Корлису называется предротовой полостью). Вся пелликула инфузории густо покрыта ресничками (соматическая цилиатура). Число ресничек у Р. caudatum равняется примерно 15 тыс., у Р. aurelia — 5 тыс. Поверхность пелликулы парамеций скульптурирована. Схематически это показано на рис. 64. Вся поверхность инфузории покрыта ромбическими полями, отделенными друг от друга валиками. В центре каждого шестиугольника расположена ресничка, берущая начало от кинетосомы, погруженной в толщу эктоплазмы (кортекса). С кинетосомой связаны фибриллярные структуры. Чередуясь с ресничками, на границе между шестиугольниками пелликулы располагаются трихоцисты (рис. 64, 5), число которых таким образом примерно соответствует числу ресниц. Детально эти структуры можно изучить лишь с помощью сканирующего электронного микроскопа, но общую картину структурированности пелликулы можно рассмотреть и со световым микроскопом. Для этого инфузории высушивают на воздухе в крепком растворе конго красного (еще лучше опалового синего), после чего заключают в бальзам и изучают с иммерсионной системой. На удавшихся препаратах структура пелликулы видна очень отчетливо, ибо ромбические поля выполняются краской, а валики между ними остаются светлыми.
Для изучения расположения соматической цилиатуры следует прибегнуть к препаратам, импрегнированным серебром (рис. 65). На удачных препаратах вычеркивается каждая кинетосома, что создает чрезвычайно отчетливую картину распределения цилиатуры по телу инфузории. На спинной стороне (рис. 65,Л) реснички расположены продольными рядами. Всегда отчетливо вычеркиваются отверстия сократительных вакуолей. На брюшной стороне расположение соматической цилиатуры довольно сложно и строго закономерно (рис. 65,5). Различают следующие пять зон. Переднее правое поле состоит из кинетид, проходящих почти параллельно преоральному шву (светлое, лишенное кинетид поле, идущее от перистома к переднему концу). Переднее левое поле слагается кинетидами, идущими перпендикулярно ко шву (на рисунке 65,5 правое поле расположено слева, а левое справа, так как инфузория обращена брюшной стороной к зрителю). Цирку-моральное (вестибулярное) поле окружает ротовое углубление (вести-булум или перистом). Посторальное правое поле слагается из кинет, идущих параллельно щели порошицы и, наконец, левое посторальное поле состоит из кинет, расположенных под острым углом к порошице. Следует подчеркнуть, что вся эта сложная система кинетид, включающая многие тысячи отдельностей — ресничек с кинетозомами — работает согласованно, как единая локомоторная система инфузории, вызывающая ее поступательное и вращательное движение. При определенных воздействиях (например, механическом воздействии на передний ко- Рис. 65. Расположение кинетосом в кортексе Paramecium aurelia (импрегнация серебром). А — со спинной стороны; Б — с брюшной стороны (по Соннеборну): / — поры сократительных вакуолей, 2— правое преоральное иоле, 3 — преораль-ный шов, 4— левое преоральное поле, 5 — перистом и ротовое отверстие, 6— левое посторальное поле, 7 — щель порошицы, 8 — правое посторальное поле, 9 — вестибулярное поле, п — передний конец, з — задний конец Рис. 66. Схема строения ротового аппарата Paramecium (по Корлису): 1 — ротовое отверстие, 2 — vestibulum, 3 —ротовая полость, в которой расположены базальные части мембраны и мембранелл, 4 —цитостом, 5 — цитофаринкс (глотка)
нец) вся работа системы может перестраиваться и происходит реверсия направления движения — инфузория на некоторый отрезок времени двигается задним концом вперед. После устранения действия раздражителя нормальное движение восстанавливается. Пищеварительная система и питание. Номенклатура частей рото Рис. 67. Строение ротового аппарата Paramecium aurelia (схематизировано) (по Дидиэ): 1—3 — пеникулюсы, 4 — околоротовая мембрана (parorale), 5 —ресннчки вестибулярного поля вого и пищеварительного аппарата инфузорий необычайно запутана. Ниже мы примем систему, предложенную Корлисом (1959), и дополним ее данными Дидиэ (1971) (рис. 66). На дне перистомального углубления (вестибулума) распола- гается отверстие, ведущее в предротовую полость (у других авторов это отверстие называется ротовым, а предротовая полость глоткой). В конце этой полости расположено ротовое отверстие, ведущее в эндоплазму. В области этого отверстия формируются пищеварительные вакуоли. В предротовой полости (глотке) расположены в числе трех особые ресничные образования, напоминающие удлиненные мембранеллы, каждое из которых слагается из четырех очень тесно расположенных рядов ресниц, частично склеенных между собой. Они носят название пеникулюсы (peniculus) (рис. 67) Ч Кроме пеникулюсов в предротовой полости на стороне, противоположной пеникулюсам, располагается еще одна оробая кинета, состоящая из тесно расположенных ресничек и получившая название «парорале» (parorale). Пеникулюсы и парора-ле являются мощным аппаратом, направляющим ток воды со взвешенными в ней пищевыми частицами к ротовому отверстию, в области которого формируются пищеварительные вакуоли. Сравнивая организацию околоротовой цилиатуры тетрахимены и парамеции, имеются основания провести ряд гомологий. Пеникулюсы рассматриваются как гомологи мембран тетрахимениума (Ml, М2 и М3), а парорале — как гомолог унду-лирующей мембраны. Это дает основание для включения парамеций и других Hymenostomata в Рис. 68. Paramecium caudatum. Путь пищеварительной вакуоли в цитоплазме (из кн. Кальмуса) 1 Некоторые авторы насчитывают два пеникулюса, а третий с более широко расставленными рядами ресниц называют квад-рулюсом (quadrulus).
надотряд Oligohymenophora. Образующиеся пищеварительные вакуоли (размеры их широко варьируют в зависимости от характера пищи, температуры окружающей среды и других факторов) отрываются от ротового отверстия и как бы соскальзывают по одному из краев пред-ротовой полости в эндоплазму и направляются к заднему концу тела. Описаны специальные опорные фибриллы, идущие от ротового отверстия назад и направляющие начальное движение пищеварительных вакуолей. Далее пищеварительные вакуоли в эндоплазме проделывают сложный и закономерный путь, изображенный на приведенной схеме (рис. 68). От заднего конца тела пищеварительные вакуоли токами эндоплазмы увлекаются вперед и движутся до переднего конца, после чего поворачивают и направляются снова назад. Иногда во время такого циклоза вакуоль проделывает не один, а два круга, из которых первый осуществляется на уровне расположения макронуклеуса. Непереваренные остатки пищи выбрасываются из тела туфельки через особую щель в пелликуле — порошицу (см. рис. 65). Продолжительность пребывания пищеварительной вакуоли в теле инфузории зависит от множества факторов и прежде всего от качества пищи. Как показал еще С. И. Метальников, вакуоли, заполненные питательной пищей (бактерии, куриный желток и т.п.), пребывают в теле инфузории гораздо дольше (при комнатной температуре около 1 ч), чем вакуоли с непитательными веществами (мелко истолченный уголь, стекло и т.п.). Процесс заглатывания пищи у туфельки совершается непрерывно в течение всей жизни, и поэтому ее можно заставить заглатывать любые вещества, лишь бы они по размеру могли пройти через ротовое отверстие, которое постоянно открыто. В этом существенное отличие от механизма питания хищных инфузорий, которые были рассмотрены выше на дидиниях и дилептусах. Для того чтобы наблюдать поглощение пищи и циклоз пищеварительных вакуолей, следует покормить парамеции окрашенной пищей. Лучше использовать мелко растертую тушь или кармин. Для того чтобы ознакомиться с некоторыми физиологическими сторонами процесса, рекомендуется добавить к культуре раствор конго красного (2— 3 крупинки красителя на солонку). Конго красный — индикатор. В щелочной среде он красный, в кислой — синий. Сначала в процессе образования вакуоли и сразу после ее отделения от цитофаринкса и перехода в эндоплазму содержимое остается красным (слабо щелочная реакция). Вскоре цвет меняется — вакуоли становятся синими (кислая фаза пищеварения). Эта фаза сопровождается уменьшением объема вакуолей, что обычно происходит при движении ее к переднему концу тела. Далее содержимое вакуолей опять краснеет (становится щелочным) до конца циклоза. По ходу пищеварения из эндоплазмы в вакуоли поступают лизосомы, несущие ферменты. Однако изучение этой стороны процесса требует применения электронной микроскопии и некоторых специальных методов цитохимии. Перед дефекацией несколько пищеварительных вакуолей обычно сливаются в одну более крупную, которая и опорожняется наружу через порошицу.
Сократительные вакуоли у парамеций расположены в передней и задней трети тела, в цитоплазме, ближе к спинной стороне под кортек-сом. Каждая вакуоль состоит из центрального резервуара и 7-—10 приводящих каналов (систолетт). Вакуоли работают попеременно. Отверстия вакуолей преформированы к пелликуле (см. рис. 65). В пределах каждой сократительной вакуоли сначала наполняются жидкостью систолетты. Содержимое их переливается в центральный резервуар, из которого уже через пору изливается наружу. Интервалы между сокращениями сильно зависят от температуры, физиологического состояния инфузории и осмотического давления окружающей инфузорию жидкой среды. При 16°С частота пульсации составляет примерно 20—25 с. В эндоплазме парамеций кроме органоидов, выявляемых преимущественно методами электронной микроскопии (митохондрии, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи), имеются различные включения, которые можно обнаружить и на светооптическом уровне. Это различные резервные и экскреторные включения. Применяя описанные выше методы (с. 39), в эндоплазме туфелек легко обнаружить наличие гликогена и нейтральных жиров. Количество их варьирует в самых широких пределах в зависимости от условий среды и физиологического состояния инфузорий. Наиболее обильное накопление этих веществ наблюдается при низких температурах, когда расходование их в процессе обмена веществ понижено. Нередко (особенно в старых культурах) в эндоплазме можно наблюдать мелкие кристаллы разной формы. В основном это экскреты разного химического состава. Еще Шевяковым было показано, что среди этих кристаллов преобладает фосфорнокислая известь. Ядерный аппарат Paramecium caudatum слагается из большого почковидного макронуклеуса, исключительно богатого ДНК (изучение ведется на тотальных препаратах, окрашенных по Фельгену), и одного довольно крупного микронуклеуса, один полюс которого остается неокрашенным (в нем сосредоточены элементы, связанные с формированием ахроматинового веретена). У Р. multimicronucleatum тоже один макронуклеус, но несколько микронуклеусов (3—4) гораздо меньших размеров, чем у Р. caudatum. У Р. aurelia один макронуклеус и два очень мелких микронуклеуса. Если изготовлены срезы парамеций (по методу Петерфи, с. 23), то часть их следует покрасить методом двойной окраски по Унна-Пап-пенхейм. При этом выявится, что часть гранул макронуклеуса окрашивается в зелено-фиолетовый цвет. Это тот материал, который дает интенсивную окраску по Фельгену и представляет собой хроматин ядра. Наряду с этим выявятся многочисленные мелкие окрашенные в красный цвет гранулы. Это — нуклеолы, богатые РНК- Размеры и количество нуклеол в высокой степени зависят от физиологического состояния инфузории. В микронуклеусах нуклеолы отсутствуют. В молодых активно размножающихся культурах нередко удается обнаружить стадии деления ядер. Макронуклеус при этом вытягивается и перешнуровывается, а микронуклеус делится митозом, но без разрушения ядерной оболочки. Подробности о делении микронуклеусов см. в Монографии И. Б. Райкова (1978) о ядре простейших.
Выше указано, что, имея разнообразные культуры парамеций, не трудно получить конъюгацию и изучить ход ядерных процессов. Здесь не дается их описания, ибо проходящий практикум сможет разобраться в них, используя руководства по протозоологии В. А. Догеля, Ю. И. Полянского и Е. М. Хейсина (1962) и К. Грелля (К. Grell, 1973), приведенные ниже в списке литературы к этой главе. ОТРЯД PERITRICHA — ' КРУГОРЕСНИЧНЫЕ Vorticella sp. — сувойка Материалы и методы изучения. Vorticella sp. принадлежит к одиночным Peritri-cha (сем. Vorticellidae) и встречается сидящей на водяных растениях, палочках и других предметах иногда в таком количестве, что образует видимый даже на глаз налет. На корешках ряски часто можно найти V. lemnae. Получение материала зимой из природы невозможно, но в любое время можно получить V. microstoma в навозных настоях. Для этого сырой водой заливают в банках навоз (лучше всего конский). Через 1—2 недели почти наверняка разовьется эта форма. Наблюдения ведут исключительно in vivo. Изучение морфологии. Колоколообразное тело сувойки сидит на длинном сократимом стебельке. У наиболее крупных сувоек длина тела достигает 170 мкм (К campanula), обычно же они мельче, в среднем не больше 50 мкм. Длина стебелька очень варьирует в пределах одного и того же вида. Как тело, так и стебелек в обычном состоянии сувойки лишены Рис. 69. Vorticella. Общая организация (из кн. Ноланда): 1 — внутренняя ундулирующая мембрана, 2— средняя мембрана, 3 — наружная мембрана, 4 — микронуклеус, 5 — образующаяся пищеварительная вакуоль, 6 — макронуклеус, 7 —киноплазма мионемы, 8 — текоплазма мионемы, 9 — наружная стенка стебелька, 10—колечко стебелька, 11— ресничная бороздка на заднем конце тела, 12 — сократительная вакуоль, 13— вход в vestlbulum> 14—перистомальный край
ресничек. Пелликула, покрывающая тело, часто бывает скульптуриро-вана. Чаще замечаются кольцевые бороздки, реже — различной формы и расположения бугорки, сосочки, бородавочки (рис. 69). Ресничный аппарат сконцентрирован только в околоротовой области, где формируется перистомальный диск. Тело у большинства сувоек расширяется кпереди, так что этот диск оказывается наиболее широкой частью, хотя у К microstoma можно увидеть резкое сужение тела именно в области перистома, и последний оказывается незначительных размеров (см. рис. 72). Края тела в области перистомаль-ного диска отогнуты наружу в виде леристомальной губы или края (рис. 69). Поверхность диска выпуклая. Ресничный аппарат адоральной зоны расположен по периферии диска в специальной борозде, отделяющей от диска перистомальную губу. Данная борозда образует несколько больше одного полного оборота спирали,. Наружный конец спирали подходит к отверстию преддверия (vestibulum, рис. 69, 70), далее бороздка огибает диск по часовой стрелке, и внутренний ее конец заканчивается на диске и расположен выше наружного. Реснички адоральной зоны склеиваются в три ундулирующие мембраны, проходящие рядом друг с другом. При этом склеивание происходит неполное, концы ресничек остаются свободными, благодаря чему свободный край каждой мембраны оказывается бахромчатым, и мы имеем здесь особую категорию так называемых полумембран (semi-membranae). Реснички обеих внутренних мембран обычно стоят вертикально (перпендикулярно по отношению к поверхности диска, см. рис. 69). Третья же, наружная, мембрана расположена, наоборот, горизонтально. Все три мембраны спускаются в преддверие, и Рис. 70. Vorticella. Вид перисто-мального поля сверху (из кн. Ноланда и Финлей): 1 — базальная линия прикрепления внутренней мембраны, 2 —то же, средней, 3—то же, наружной, 4—макронуклеус, 5— конец обеих внутренних мембран, 6 — сократительная вакуоль, 7 — вестибулярная ундулирующая мембрана, 8—преддверие (vestibulum), 9— перистомальный край, 10— перисто* мальное поле Рис. 71. Vorticella nebulifera. Движение мембран. Вид сбоку (Х600) (из кн. Ноланда и Финлей)
Рис. 72. Vorticella microstoma (из кн. Ноланда и Финлей). А— инфузория в спокойном состоянии (X 600); Б — сократившийся стебелек и втянутый перистом (Х600); В— Е — последовательные стадии образования бродяжки (Х400) здесь за счет наружной формируется широкая, уже настоящая, вестибулярная ундулирующая мембрана. Обе вертикальные мембраны находятся в постоянном волнообразном движении (рис. 71), наружная же в более «спокойном» состоянии. Создается ток воды между наружной мембраной и остальными, направленный против часовой стрелки. При этом захватываются пищевые частички, которые и продвигаются в преддверие. Три описанные выше мембраны (полумембраны) следует рассматривать как гомологов мембранелл тетрахимениума (Мь Мг и М3) (см. с. 122, рис. 61), тогда как четвертая ундулирующая мембрана есть, очевидно, гомолог ундулирующей мембраны тетрахимены. Между обеими внутренними мембранами и внутренней стенкой преддверия создается обратный ток воды, выбрасывающий наружу выделенное в преддверие содержимое сократительной вакуоли и непереваренные остатки из пищеварительных вакуолей (см. ниже). В известный момент жизненного цикла у сувоек появляются дополнительные реснички на заднем конце тела. Они закладываются в специальной ресничной бороздке (см. рис. 69) и функционируют после отрывания тела от стебелька, когда сувойка превращается в бродяжку (рис. 72). У нее задние реснички представляют основной двигательный элемент, так как адоральная зона втягивается внутрь и движение совершается вперед задним концом. Тело бродяжки обычно принимает цилиндрическую форму. Нередко удается наблюдать весь процесс формирования таких свободно подвижных стадий (рис. 72). Весь адоральный аппарат у сувойки может втягиваться внутрь тела под влиянием различных внешних раздражений. Постукивание по стеклу позволяет наблюдать под микроскопом, как весь перистом очень быстро втягивается и как он медленно выпячивается обратно после «успокоения» сувойки. Обнаружить все составные части ресничного аппарата можно только у активных сувоек при рассматривании их с иммерсионным объективом. Наиболее четкая картина получается на оптическом разрезе краев перистома.
Пищеварительная система начинается с преддверия (vestibulum). Широким отверстием он сообщается с наружной средой и представляет собой длинную воронку, загибающуюся внутрь тела инфузории. На конце преддверия формируется пищеварительная вакуоль, которая по узкой глотке, почти незаметной in vivo, передается в плазму, где она и совершает циклоз. Кормление сувоек удается хорошо наблюдать, прибавляя к капельке жидкости с сувойками растертую в воде тушь или кармин. Непереваренные остатки из пищевых вакуолей выбрасываются не прямо наружу, а в определенном месте в преддверие. Единственная шарообразная сократительная вакуоль находится около преддверия и связывается с ним посредством специального, небольшого соединительного резервуара (см. рис. 70). Промежуток между двумя сокращениями у V. microstoma, например, оставляет около 15 с, у ряда других Vorticella отмечаются и меньшие интервалы (5—6 с). Макронуклеус у сувоек сильно вытянут в длину — колбасовидной формы. Часто он изогнут вдоль края перистома и одним концом спускается в плазму к заднему концу тела. In vivo можно заметить его зернистую структуру, если объект посильнее придавить покровным стеклом. Маленький, овальный микронуклеус прижимается к нему в передней части тела. Стебелек у сувоек имеет чрезвычайно характерную структуру. Он состоит из наружной стенки, внутренней жидкости и проходящей внутри по весьма пологой спирали мионемы. Г всего видна сократимая часть — киноплаз) рис. 69), одетая прозрачной, обычно плохо личие у некоторых видов специальных текоплазматических гранул позволяет ее рассмотреть лучше. При сокращении мионемы весь стебелек скручивается в спираль (рис. 72, 5), благодаря чему и получается его укорочение. При расслаблении мионемы, благодаря эластическому действию наружной стенки, стебелек расправляется и вытягивается. Мионема входит в тело сувойки и связывается с пучком фибрилл у его основания. Наружная стенка стебелька отделяется от пелликулы тела кольцеобразной скопулой — зоной железистой цитоплазмы, секретирующей стебелек при делении и при креплении бродяжки к субстрату. В некоторых случаях на стебельке замечается колечко, отделяющее более толстую дистальную часть (см. рис. 69). Оно образуется в том месте, где от старого стебелька отделяется стебелек до- > составе последней лучше ia, или спазмонема (см. заметной текоплазмой. На- Рис. 73. Vorticella microstoma. Циста (X1800) (из кн. Брандта) : 1 — наружная оболочка, 2 — внутренняя оболочка, 3 — сократительная вакуоль, 4 — стебелек, 5 — макронуклеус
черней особи при делении. При сокращении стебелька с колечком в спираль свертывается только проксимальная, более тонкая часть. Стебелек прикрепляется к субстрату базальной пластинкой на дистальном конце стебелька. В культурах V. microstoma часто попадаются цисты с толстой бугорчатой наружной оболочкой, остающиеся прикрепленными к субстрату с помощью стебелька (рис. 73). Zoothamnium arbuscula Ehrbg. Эта чрезвычайно своеобразная колониальная Peritricha заслуживает специального внимания как форма с диморфной колонией и как представитель, позволяющий чрезвычайно легко проследить процесс развития колонии путем деления прикрепившейся бродяжки. Материал и методы изучения. Колонии Zoothamnium arbiscula (из сем. Vorticel-lidae) прикрепляются главным образом к водяным растениям (особенно к Elodea) в водоемах (прудах) со стоячей, но прозрачной водой. Zoothamnium не встречается глубже 1 м. Колонии легче отыскивают, просматривая веточки элодеи в банке с водой, они видны тогда и простым глазом. Изучение ведется только in vivo, причем общую форму колонии легче всего разобрать в чашечке или в часовом стекле, не отрывая от листочка. Для наблюдения за развитием новой колонии из бродяжки следует несколько крупных колоний отсадить в отдельную посуду обязательно с веточками элодеи. Лучше всего подобную отсадку произвести вечером, к утру будет гарантировано прикрепление нескольких бродяжек. Тогда в течение целого дня можно наблюдать за ростом стебелька и делением бродяжки, ведущим к формированию колоний. Изучение морфологии. Колония Zoothamnium имеет вид зонтика. Стебелек ее достигает в длину 2—3 мм. Приблизительно такого же диа- Рис. 74. Zoothamnium arbuscula. Общий характер ветвления колонии (из кн. Фурсенко): /’—место отхождения стебелька колонии, 2 — макро-зоиды метра достигают крупные колонии в расправленном состоянии. При всякого рода внешних, особенно механических, раздражений вся колония сокращается и собирается в комок. Прежде всего следует обратить внимание на ветвление колонии. От стебелька отходят постоянно девять главных ветвей (рис. 74). Постоянство этого количества связано с особенностями развития колонии, о чем речь будет ниже. В обе стороны от стебелька отходят две основные ветви, отдающие от себя одна — пять главных боковых ветвей, другая — четыре. От каждой главной
ветви отходят не больше 20 боковых вето-чек, на которых сидят на коротких ножках 10—40 или даже 50 особей, так называемых микрозондов (рис. 75). Общее количество особей во взрослой колонии достигает 2000—3000. Каждая из главных ветвей может быть обозначена по Фурсенко (1924 и 1929) особыми буквами (см. рис. 74), значение которых становится понятным только после разбора особенностей развития колонии1. На каждой крупной колонии, кроме микрозондов, обязательно имеются так называемые макрозоиды. Если микрозонды имеют колоколообразную форму и достигают в длину 45—60 мкм, то последние обладают шарообразным телом диаметром 200—250 мкм (рис. 75, 76). У микрозондов адоральная зона развита нормально и выглядит типично для Peritricha, в то время как у макрозоидов она редуцирована и не функционирует. Доказательство последнего можно привести весьма убедительно, поместив всю колонию во взвесь туши или кармина. Микрозонды наполняются окрашенными гранулами, в то время как в макрозоидах их не будет. Макрозоиды дифференцируются на главных ветвях за .счет изменения обыкновенных микрозондов. Последние усиленно растут, но своеобразно, неравномерно. Общая масса цитоплазмы увеличивается в несколько сот раз, параллельно растет и ядро, и сократительная вакуоль, но перис- Рис. 75. Zoothamnium arbus-cula. Отдельная веточка колонии in vivo (Х75) (из кн. Фурсенко): 1 — боковые ответвления с микрозондами, 2— макрозоиды, 3— стебелек колонии том, преддверие и глотка в размерах не увеличиваются. Адоральная зона втягивается, и преддверие функционирует только как проток сократительной вакуоли. При этом у основания макрозоида дифференцируется особая область зернистой цитоплазмы— скопула, секретирующая стебелек при развитии новой колонии. Вполне выросшие макрозоиды отрываются от колонии и в обычных условиях становятся родоначальниками новых колоний. На месте их прикрепления к главной ветви остаются круглые следы (рис. 77). Рекомендуется детально рассмотреть структуру ствола колонии. Каждая из главных ветвей представляет собой трубку из плотного хитиноподобного материала, выполняющую поддерживающую роль. Внутри трубка выполнена прозрачной жидкостью, и в ней проходит слегка по спирали мионема. На последней совершенно ясно удается различить Обозначения отдельных ветвей даны по Фурсенко (1929).
зернистую периферическую текоплазму, покрытую пелликулой, и внутреннюю гомогенную киноплазму, разделенные между собой слоем продольных эластичных волокон. Последние in vivo видны плохо. Боковые веточки также содержат мионему, ответвляющуюся от таковой главной ветви. Проксимальный конец ножки колонии также имеет мионему подобной структуры. Приблизительно посередине стебелька мионема превращается в лишенное сократимости сухожилие, которое своим нижним концом переходит в стенки трубки стебелька (рис. 78, А). Дистальный конец стебелька представлен только трубкой. Постукиванием по стеклу при рассматривании стебелька можно вызвать его сокращение. Та часть его, где проходит мионема, свивается в спираль, дистальный же конец, наоборот, не испытывает никаких изменений (рис. 78, Б). Стебелек при этом перегибается в области заднего конца сухожилия — это Рис. 76. Zoothamnium arbuscula. Часть веточки колонии с макрозоидом (Х20) (из кн. Фурсенко): J — микрозонды, 2 — растущий макрозоид, 3 — скопула, 4 — вполне выросший макрозоид, 5 — макронуклеус, 6 — перистом, 7 — сокра* тительная вакуоль
место с полным правом можно назвать шарниром, Нижний конец Стебелька расширен в виде базальной пластинки, которой колония прикрепляется к субстрату. Развитие колонии. У макрозоида перед отрыванием от места прикрепления недалеко от базальной части вырастает аборальное кольцо ресничек. Оторвавшийся макрозоид — бродяжка — получает характерную коническую форму (рис. 79). Вершина конуса при этом занята пе-ристомальным аппаратом, основание же опоясано ресничками и около него в плазме видно . скопление секреторных гранул, образующих ско- jgf пулу. Бродяжка плавает основанием вперед, 1—Ш вращаясь вокруг продольной оси тела и сильно /и раскачиваясь в стороны. Своим базальным кон- Ц цом она натыкается время от времени на встреч- m ные предметы и пытается прикрепиться. На та- 2—ы кие попытки обычно уходит 2—3 ч (иногда этот ]__3 свободный период достигает и суток). 4 Макрозоид легко прикрепляется далеко не к 1 каждому субстрату. Быстрей всего это происхо- | дит на элодее. Если же из чашечки ее вынуть, то к стеклу бродяжки начнут прикрепляться только через сутки. При прикреплении бродяжка прикладывается скопулой к субстрату и приклеива- | Рис. 77. Zoothamnium arbuscula. Следы на местах прикрепления макрозои-дов к ветви колонии (Х175) (из кн. Фурсенко): 1 — мионема стебелька. 2 •— следы от макрозоидов Рис. 78. Zoothamnium. arbuscula (нз кн. Фурсенко) . А — структура нож-ки колонии (Х75); Б — сократившаяся ножка колонии: 1 — наружная трубка, 2 — киноплазма мионемы, 3 — текоплазма мионемы, 4 — су-хожилие, 5 — шарнир, 6 — несократимая часть стебелька, 7 — базальная пластинка
Рис. 79. Zoothamnium arbuscula. Оторвавшийся макрозоид-бродяжка (Х175) (из кн. Фурсенко) : / = скопула, 2 — венчик аборальных ресничек, 3 — макронуклеус, 4— сократительная вакуоль, 5 —перистом Рис. 80. Zoothamnium arbuscula (из кн. Фурсенко). Рост стебелька колонии после прикрепления бродяжки (Х85). А, Б и В—рост несократимой части стебелька; Г — врастание скопулы в стебелек и образование сухожилия Рис. 81. Zoothamnium arbuscula (из кн. Фурсенко). Развитие колонии после достижения стебельком окончательной длины (Х150). А — стадия двух клеток; Б — стадия четырех; В — стадия восьми и Г — стадия шестнадцати; буквами обозначены последовательно образующиеся зооиды (объяснение в тексте)
ется к нему вращательным движением, образуя в этот момент базальную пластинку ножки колонии. Сразу же начинается рост стебелька, аборальный венчик ресничек перестает работать и редуцируется. В первый час успевает выделиться вся несократимая часть стебелька (600—700 мкм длиной, рис. 80). Далее скопула врастает внутрь стебелька — сначала формируется сухожилие, а затем и мионема. Окончательной длины стебелек достигает часов через пять с момента прикрепления бродяжки, когда начинается первое деление, длящееся около 40—50 мин. Этот процесс сопровождается прежде всего увеличением поперечного диаметра макрозоида, потом появляется на переднем конце борозда, разделяющая его тело на две неравные части. Возникают две особи —одна покрупней, другая помельче (рис. 81, Д). Обе отделившиеся особи имеют вытянутую форму тела с еще маленьким перистомом. Далее почти сразу же они приступают к следующему делению, которое длится также 40—50 мин. Плоскость деления на этот раз перпендикулярна предыдущей. Образуются четыре особи, из которых три более или менее одинаковой величины, а четвертая мельче их всех (рис. 81, Б). Затем образуются восемь особей (рис. 81, В) синхронно. На стадии шестнадцати клеток (рис. 81, Г) синхронность нарушается за счет запаздывания в делении мелких особей. На стадии восьми и шестнадцати клеток часть особей принимают типичный для Рис. 82. Zooihamnium arbuscula (из кн. Фурсенко). Схема ветвления эксконьюгаци-онной колонии: 1 — место отхождения стебелька колонии, 2 — за-мещающне веточки 1 3 Рис. 83. Zooihamnium arbuscula. Циста (Х130) (из кн. Фурсенко): 1 — сократительная вакуоль, 2 — макронуклеус, 3 — стебелек
микрозондов облик. Здесь выделяются родоначальники главных ветвей колоний. На колониях, взятых во вторую половину лета, иногда замечаются уклонения от вышеописанной правильности ветвления. Именно вместо девяти веточек развивается десять. Это не что иное, как колонии, на которых происходит конъюгация. Макроконъюганты формируются всегда в количестве двух на концах обеих главных ветвей Л(Е) и В (С). Эти ветви прекращают рост, и тогда начинают расти дополнительные или замещающие веточки — две с одной стороны, одна с другой (рис. 82), что и приводит к образованию 10-веточной колонии. Микро-конъюганты формируются на крупных колониях за счет микрозондов. Они развивают венчик ресниц и уплывают. В редких сравнительно случаях (при неблагоприятных условиях, особенно температурных) макрозоиды после периода выделения несократимой части стебелька инцистируются, не приступая к делению. Структуру такой цисты (с двойной оболочкой) рекомендуется разобрать, пользуясь прилагаемым рис. 83. Надотряд Polyhymenophora Основным признаком, характеризующим этот обширный высший надотряд ресничных инфузорий, служит наличие адоральной зоны мембранелл, слагающийся из большого количества отдельных компонентов. Полагают, что адоральная зона появилась на основе полимеризации компонентов тетрахимениума (с. 122). В пределах Polyhymenophora рассмотрим представителей двух отрядов: Heterotricha и Hypotricha. ОТРЯД HETEROTRICHA - РАЗНОРЕСНИЧНЫЕ Stentor coeruleus Ehrbg. — трубач Материал и методы изучения. Stentor coeruleus из сем. Stenioridae — обычная форма многих стоячих водоемов с прозрачной чистой водой. Инфузории сидят группами на различных мелких предметах на дне. Изучение ведут главным образом in vivo. Ядерный же аппарат рассматривают на тотальных препаратах. Чтобы избежать при фиксации сильного сокращения тела, следует стекло (часовое или предметное) слегка подогреть, чем и вызывается наркотическое состояние. Постукиванием по стеклу устанавливается момент потери чувствительности, и только тогда приливают фиксатор (например, жидкость Шаудина, Буэна или осмиевые смеси). Хорошие результаты получают при окраске тотальных препаратов по Фёльгену. Другие методы дают худшие результаты, что связано с большими размерами инфузории. Изучение морфологии. Тело трубача сильно сократимо, и его истинная форма в расправленном состоянии может быть видна только тогда, когда стеклышко с инфузориями некоторое время спокойно и трубачи имеют достаточное количество воды, чтобы расправиться. В расправленном состоянии длина тела доходит до 1—2 мм. Наиболее узкий конец — задний, которым тело прикрепляется к субстрату и на котором могут для этого образоваться короткие псевдоподии. Кпереди тело постепенно расширяется и на переднем конце образует раструб, занятый перистомальным полем (рис. 84). S. coeruleus имеет свое
образную характерную окраску, зависящую от распределения в поверхностном слое цитоплазмы зерен пигмента стенторина. Общий цвет получается зеленоватосиневатый. Все тело трубача покрыто сплошь нежными ресничками, расположенными продольными рядами. На перистомаль-ном поле эти ряды проходят кольцами. Цитоплазма у трубача имеет мелкопенистую структуру. В поверхностном ее слое дифференцируются сократимые и опорные элементы, сконцентрированные в особых продольных каналах. Придавливая живого трубача покровным стеклом, удается обнаружить эти каналы в виде просветов между пигментированными полосками, идущими параллельно рядам ресничек. Внутри удается обнаружить продольные сократимые ленты — мионемы (рис. 85). Последние обычно пробегают вдоль всего тела. На стороне же, где начинается ряд перистомальных мембранелл, заметна продольная зона, где мионемы сходятся под углом (рис. 86), вследствие чего Рис. 84. Stentor coeruleus. Общий вид живого объекта (Х120) (из кн. Дофлейна): 1 — перистомальное поле, 2 — мембранеллы адоральной зоны, 3 — vestibulum, 4 — макронуклеус, 5 — микронуклеус, 6 — приводящие каналы сократительной вакуоли, 7 — резервуар сократительной получается представление, как будто они ветвятся. На перистомальном поле также должна быть отмечена система мионем, пробегающих параллельно рядам ресничек. вакуоли Перистомальное поле слегка вогнуто и подразделяется на горизонтальный отдел, занимающий большее пространство, и на наклонный, меньший, преораль-ный отдел. Вокруг перистомального поля по самому краю располагаются одним рядом мембранеллы (адоральные). Каждая из них — высокая пластинка (рис. 87), склеенная из двух рядов ресничек. При этом высота краев каждой мембранеллы неодинакова. Наружный край значительно выше внутреннего. Получается общая форма трапеции (рис. 87) или даже треугольника. Ряд мембранелл располагается по спирали. Она начинается на периферии горизонтального отдела перистомального поля, обходит все поле вокруг по часовой стрелке и на
Рис. 85. Stentor coeruleus. Поверхность тела у придавленной живой инфузории (Х1700): / — пигментированные полоски, 2— каналы, 3 — мионемы его преоральном участке уходит с края и спуска-ется к отверстию, ведущему в преддверие vesti-bulum) пищеварительной системы, где образует еще один маленький оборот. Начало спирали лежит значительно выше ее преорального участка, тело здесь выдается резко вперед в виде перистомального выступа. От последнего кзади по телу проходит вдоль легкая борозда (см. рис. 84). Ротовое отверстие на дне преддверия ведет в короткую глотку. Пищевые вакуоли разбросаны в плазме. Пищей трубачу служат различные мелкие организмы, главным образом жгутиконосцы и мелкие инфузории. Выбрасывание непереваренных частичек производится в области сократительной вакуоли. Единственная сократительная вакуоль видна спереди — неподалеку от преддверия. Наполнение ее совершается посредством двух длинных приводящих каналов. Задний тянется почти вдоль всего тела, передний же полукругом идет вдоль края перистомального поля. Ядерный аппарат у Stenor представлен длинным четковидным макронуклеусом и многочисленными мелкими микронуклеусами (см. рис. 84). Отдельные части макронуклеуса имеют Рис. 86. Stentor coeruleus. Расположение мионем (Х85) (из кн. Шуберта) Рис. 87. Stentor. Строение и распо- Рис. 88. Stentor соег-ложение адоральных мембранелл uleus. Структура мак-(схематично) (из кн. Гелей): ронуклеуса (Х600)' I — мембранеллы, 2 — край перистома, 3— (из KH. Дофлейна) система опорных фибрилл, связанных с основанием мембраиелл
грубозернистую структуру. Зерна сильно прокрашиваются и являются хроматиновыми. Между собой четки связаны тонкими перемычками гомогенного строения (рис. 88). Микронуклеусы в количестве свыше десяти обычно бывают приложены вплотную к фрагментам макронуклеуса. Каждый из них на препарате имеет темноокрашенный центр и широкий светлый ободок. ОТРЯД HYPOTRICHA —БРЮХОРЕСНИЧНЫЕ Stylonychia mytilus О. F. Miill. Материал и методы изучения. Stylonychia mytilus из сем. Oxitrichidae, одна из наиболее крупных Hypotricha, живет в любом небольшом стоячем водоеме. В пробе, взятой из придонных слоев воды планктонным сачком, после недельного стояния без труда можно найти эту инфузорию. Изучение ведут на живом материале, а также на тотальных препаратах, фиксированных сулемовыми или пикриновыми смесями. Окраска по Фёльгену, а также квасцовым кармином или гематоксилином. Для изучения цилиатуры хорошие результаты дает импрегнация серебром (с. 108). Изучение морфологии. На сплющенном теле Stylonychia различают: расширенный, срезанный углом передний конец и закругленный задний (рис. 89), плоскую брюшную сторону, на которой открывается ротовое отверстие и на которой слева расположен перистом и главная масса ресничных образований, и наконец, спинную, слегка выпуклую. Длина тела колеблется между 100—350 мкм. Прежде всего следует разобрать наиболее характерную для Hypotricha систему органоидов— ресничный аппарат. На спинной стороне неподвижно торчат редко расставленные, тонкие, короткие щетинки (рис. 90). Им условно придают осязательную функцию. На брюшной же стороне видны сложные ресничные образования — цирры (cir- Рис. 89. Stylonychia mytilus. Общая организация, вид с брюшной стороны (Х450) (из кн. Ланга): 1 — вентральная передняя губа перистома, 2 — группа фронтальных (лобных) cirri, 3 — маргинальные cirri, 4 — спинные щетинки, 5 — пища, 6 — группа брюшных cirri, 7 — группа анальных cirri, 8 — каудальные cirri, 9 — макронуклеус, 10— микронуклеус, //—резервуар сократительной вакуоли, 12— правый край перистома, 13—прео-ральные реснички, 14 — перистомальное поле, /5— преоральная ундулирующая мембрана, 16 — приводящий канал сократительной вакуоли, 17 — мембраиеллы адоральной зоны
Рис. 90. Передвижение по субстрату Stylonychia mytilis (хЗОО) (из кн. Бючли): 1 — спинные щетинки, 2— резервуар сократительной вакуоли, 3 — лобные cirri, 4 — брюшные cirri, 5 — маргинальные cirri, 6 — анальные cirri, 7 — каудальные cirri, 8— приводящий канал сократительной вакуоли ri), расположенные характерным образом в группы. Поверхность тела в промежутках между этими группами остается голой. Каждый цир-рус — это пальцевидный органоид с широким основанием, постепенно суживающийся и заканчивающийся заострением. При больших увеличениях может быть замечена его продольная штриховатость — указание на то, что он составлен из пучка ресничек, склеенных между собой. В некоторых случаях концы цирр размочаливаются, и тогда их ресничная природа становится совершенно очевидной. У Stylonychia myiilus различают следующие категории брюшных цирр. 1. Лобные (фронтальные) в количестве восьми лежат справа от перистома и разбиваются на три категории по своим размерам. Наиболее крупные из них, грифелеобразные — три передних (см. рис. 89). Два других уступают передним по размерам и лежат ближе к перистому. Самые же тонкие последние три располагаются косым рядом ближе к правому краю тела. 2. Брюшные в количестве пяти занимают пространство позади перистома. Три из них группой сидят около самого перистома, две же отодвинуты назад (см. рис. 89). По размерам они более или менее одинаковы. 3. Анальные (трансверзальные) в числе пяти расположены на заднем конце брюшной стороны, три из них образуют косой ряд, две же более крупные отступают от этого ряда немного назад. 4. Каудальные — три, симметрично отходят от заднего конца тела и нередко бывают расщеплены на концах. 5. Краевые (маргинальные) располагаются двумя рядами на брюшной стороне вдоль правого и левого краев тела. Правый ряд тянется от заднего конца тела и заканчивается в области передних цирр фронтальной группы. Количество цирр здесь превышает пять десятков. На левой же стороне ряд короче и заканчивается, не доходя до уровня ротового отверстия, включает приблизительно половинное количество цирр по сравнению с правым рядом. В области каудальных цирр краевых нет. _
Функциональное назначение этих категорий цирр выявляется довольно хорошо, если наблюдать за Stylonychia в капле воды под микроскопом без покровного стекла. Тогда видно, что она главным образом ползает по различным частичкам в воде, подпираясь определенными группами цирр. Нормальное, спокойное передвижение осуществляется с помощью лобных и брюшных цирр и части анальных (рис. 90). Задние же два крупных анальных цирруса вступают в действие, когда Stylonychia совершает характерные для нее прыжки. Хвостовые и маргинальные цирры при этом субстрата не касаются. Зато они энергично работают, когда инфузория плавает. Особой сложности достигает околоротовая система ресничных органоидов, составные части которой удается разобрать только на живом объекте. Ротовое отверстие помещается на расстоянии несколько большем >/з длины тела от его переднего конца вблизи медианной линии. От ротового отверстия треугольником по левому краю тела располагается перистом. Его поверхность слегка вогнута. Наиболее мощно развитые ресничные элементы перистома образуют адоральную зону, проходящую по левому краю перистома (см. рис. 89) и огибающую передний конец тела, выходя на спинную сторону. С вентральной стороны пери стом альное поле выдается вперед в виде особой губы (см. рис. 89, /). В состав адоральной зоны входят мощные треугольные мембраны. С правой стороны перистом резко отграничивается от поверхности тела загибающимся внутрь перистомальным краем. С внутренней стороны к этому краю прикрепляются, во-первых, реснички прео-рального ряда (рис. 91) и, во-вторых, очень широкая преоральная же ундулирующая мембрана. Последняя прикрывает собой значительную часть перистома (см. рис. 89). В самой глубине перистома вдоль проходит внутренняя ундулирующая мембрана. Влево от нее видна еще одна более широкая— эндоральная мембрана. Наконец, косо по середине перистома проходит ряд эндоральных ресничек. Все эти образования своими задними концами сходятся к ротовому отверстию и входят внутрь глотки (рис. 91). Вышеописанные составные части совместной работой загоняют пищу через ротовое отверстие в Рис. 91. Stylonychia mytilus (из кн. Ланга). А—ресничный аппарат перистома с брюшной стороны (Х1000); Б — то же, на поперечном разрезе: 1 — правый край перистома. 2 — преоральная ундулирующая мембрана, 3— преоральные реснички, 4 — внутренняя ундулирующая мембрана, 5 — эндоральная ундулирующая мембрана, 6 — глотка, 7 — эндоральные реснички, 8 — адоральные мембранеллы, Р«-спиниые щетинки
глотку. Stylonychia — всеядное животное. Бактерии, водоросли жгутиконосцы, мелкие инфузории — все употребляется ею в качестве пищи. В плазме формируются пищевые вакуоли. Непереваренные остатки выбрасываются наружу через анальную пору, расположенную на спинной стороне тела, в задней его трети. Сократительная вакуоль одна, лежит слева на уровне ротового отверстия. Спереди к ней подходит приводящий канал. Опорожняется вакуоль на спинную сторону приблизительно через каждые 15—20—30 с. Макронуклеус двойной, обе его части связаны перемычкой (см. рис. 89). В ядре заметны довольно крупные хроматиновые гранулы и проходящая поперек каждой половинки неокрашивающаяся полоса — реорганизационная полоса, принимающая, как предполагают, какое-то участие в делении макронуклеуса, так как перед делением она смещается к концу каждой половины ядра. Два маленьких микронуклеуса прилегают к обеим половинкам макронуклеуса. ПОДКЛАСС SUCTORIA —СОСУЩИЕ ИНФУЗОРИИ Tocophrya quadripartita Clap, et Lachm. Материал и методы изучения. Tocophrya quadripartita относится к сем. Acinetidae. Ведет сидячий образ жизни, прикрепляясь к различному субстрату с помощью ножки. Очень часто эта суктория садится на стебельки колониальных Peretricha, в част- Рис. 92. Tocophrya quadripartita. А—общий вид инфузории сбоку (Х1000) (из кн. Бючли); Б — конец сосательных щупалец (X2000) (из кн. Ланга); В — инфузория сверху (Х1000) (ориг.): 1 — отверстие для выхода эмбриона, 2— сосательные щупальца, 3 — цитоплазматическое вздутие со Щупальцами, 4закладывающийся ресничный покров эмбриона, 5 — макрюнуклеус, 6*—стебелек, 7 — каналец внутри щупальца, 8 — пелликула щупальца, 9 — сократительная вакуоль
ности, Epistylis. Этим следует воспользоваться для получения материала. Колонии Epistylis plicatilis без труда удается находить на раковинках моллюсков Gastropoda, на подводных мелких предметах, веточках и т. д. в различных стоячих водоемах (лужах, заводях, прудах). Колонии Epistylis соскабливаются скальпелем или иглами в каплю воды на предметном стекле. Изучение ведут главным образом in vivo, но ядер-ный аппарат может быть разобран на тотальном препарате, окрашенном гематоксилином, — квасцовым кармином, или по методу Фёльгена. Изучение морфологии. Тело Tocophrya постепенно суживается назад, в длину достигает 80—100 мкм и заканчивается стебельком (ножкой) более длинным, чем тело. Последнее четырехгранно в сечении и на переднем конце образует четыре вздутия с сидящими на них сосательными щупальцами (рис. 92). Цитоплазма обычно прозрачная с мелкими гранулами, в центре просвечивают ядро и сократительные вакуоли. Последних — две, чаще три, расположенных в передней части тела. Стебелек прикрепляется к субстрату расширенным основанием — базальным диском. В месте соединения ножки с телом видна ясная граница. Стебелек несократим и не способен к самостоятельным движениям, благодаря присутствию под пелликулой продольных эластичных поддерживающих фибрилл. Они хорошо видны в виде продольной штриховатости стебелька. Сосательные щупальца сидят на каждом из четырех вздутий переднего конца в количестве больше десятка на каждом. Дистальный конец щупальца слегка расширен и представляет собой сосательное окончание. При больших увеличениях (с иммерсионным объективом) удается рассмотреть структуру щупалец: снаружи видна тонкая пелликула, утолщающаяся на дистальном конце щупальца и образующая вышеупомянутое сосательное окончание (рис. 92, Б). Под пелликулой виден слой цитоплазмы с канальцем внутри, наполненным водянистой жидкостью. Цитоплазма щупальца может выступать на конце в виде капли, вероятно клейкой, приклеивающейся к натыкающимся на щупальца инфузориям, жгутиконосцам и т. д. После приклеивания содержимое Рис. 93. Tocophrya quadripartita. Последовательные стадии внутреннего почкования (Х800) (из кн. Бючли): 1 — отверстие для выхода эмбриона, 2—эмбрион, 3—сократительные вакуоли инфузории, 4 — макронуклеус, 5 — сократительные вакуоли почкн Рис. 94. Tocophrya quadripartita. Свободные эмбрионы (Х100) (из кн. Филипьева)
добычи перекачивается по канальцу в плазму, где образуются пищевые вакуоли. Щупальца обладают способностью медленно удлиняться и укорачиваться. В спокойном состоянии они совершенно прямые. Когда же захватывается пища, то щупальца могут изгибаться в сторону добычи и приклеиваться к ней своими концами. Т. quadripartita обладает вытянутым в длину ядром (рис. 92, А), которое расширяется спереди параллельно стенкам тела. На препаратах хорошо видна его зернистая структура. Небольшой микронуклеус прижимается вплотную к макронуклеусу и заметен только на окрашенных препаратах. Развитие ресничного эмбриона. При наличии большого количества инфузорий обычно удается рассмотреть отдельные стадии внутреннего почкования. Почка — эмбрион формируется впереди от ядра. Ранее всего в плазме обособляется небольшая щелевидная полость, сообщающаяся с наружной средой посредством отверстия. Через него впоследствии эмбрион выплывет наружу. Щелевидный просвет в плазме отделяет в конце концов некоторый ее участок (рис. 93), на котором довольно рано формируется ресничный аппарат. В конце почкования эмбрион полностью отделяется от окружающей его плазмы и лежит поперек тела инфузории. В нем появляются сократительные вакуоли, и он может вращаться в своей плоскости. Вполне сформированный эмбрион имеет овальную форму. Плавает он благодаря работе ресничек, опоясывающих тело в 4—5 рядов ближе к переднему концу. На заднем конце эмбриона виден небольшой пучок ресничек (рис. 94). Если попадутся стадии почкования на тотальных препаратах, то следует обратить внимание на отшнуровывание части от макронуклеуса материнского организма и перемещение ее в почку.' Dendrocometes paradoxus Stein Материал и методы изучения. Dendrocometes paradoxus (из сем. Dendrocometi-dae) паразитирует на жаберных листочках обыкновенного бокоплава (Gammarus pulex). Жаберные листочки легко отпрепаровываются у основания грудных ножек с помощью препаровальных игл. Инфузории, сидящие обычно вблизи краев листочка, хорошо заметны уже и при просмотре под лупой. Изучение материала ведут главным образом in vivo, хотя никакого затруднения не представляет изготовление тотального препарата из целого жаберного листочка с инфузориями, окрашенного гематоксилином или кармином после любой сулемовой фиксации. Изучение морфологии. Тело паразита имеет форму полушара. Плоской стороной Dendrocometes прикрепляются к жаберному листочку. От тела под углом к поверхности отходят толстые отростки (руки), отдающие боковые ответвления с сосательными заостренными щупальцами. Количество рук варьирует, но чаще встречается четыре (рис. 95). Сосательные щупальца внутри имеют канальцы, по которым содержимое добычи перетекает в плазму инфузории (рис. 96, А). Можно специально в каплю воды с жаберными листочками прибавить густой взвеси (отцентрифугированной) с какими-нибудь мелкими инфузориями, хотя бы из навозной культуры. Тогда удается видеть захват инфузорий щупальцами (см. рис. 95) и наблюдать, как содержимое добычи перека-
Рис. 95. Dendrocometes paradoxus. Общий вид инфузории сверху (Х500) (из кн. Ланга): 1 — инфузория, захваченная боковыми ответвлениями рук, 2 — рука, 3 — сократительная вакуоль, 4 — макронуклеус. Рис. 96. Dendrocometes paradoxus. А — структура сосательных окончаний боковых ответвлений рук (Х2000) (из кн. Ланга); Б—ядерный аппарат (х800) (из кн. Пестеля): 1 — пелликула, 2 — каналец, 3 — цитоплазма, 4 — макронуклеус, 5 — микро^уклеусы чивается в плазму Dendrocometes. Цитоплазма данной формы непрозрачна, переполнена темными гранулами. Единственная сократительная вакуоль лежит около пелликулы выпуклой стороны тела. Макронуклеус овальной формы с зернистой структурой можно хорошо рассмотреть только на окрашенном препарате. Микронуклеусы рассмотреть довольно трудно. Обычно их три (рис. 96, 5), располагаются они около макронуклеуса и по форме очень похожи на пищевые включения.
Тип Sporozoa —споровики Изучение Sporozoa представляет большой интерес, так как позволяет познакомиться со сложными жизненными циклами простейших, включающими различные формы размножения. Предлагаемый ниже материал подобран так, чтобы в пределах каждого отряда познакомиться с одним представителем, цикл которого изучается по возможности полно. Среди грегарин изучается цикл Monocystis, среди кокци-дий — Eimeria. Кроме основного объекта более кратко рассмотрены и некоторые другие представители данного отряда. Наиболее подробно изучают Coccidiida и Haemosporidia, многие из них представляют большой практический интерес как возбудители заболеваний животных. Изучение жизненных циклов Sporozoa в ряде случаев требует постановки специальных экспериментов для заражения хозяев. Ниже, по возможности полно, указывается методика и техника опытов. Постановка их представляет интерес не только потому, что это источник материала для изучения, но и потому, что прививает навыки эксперимен- . тальной работы. Изучение жизненного цикла кокцидий проведено на одном виде — Eimeria magna. В отношении Haemosporidia мы ограничимся рассмотрением кровяной части цикла возбудителей малярии. Хотя заболевание это в Советском Союзе в основном ликвидировано, но во многих медицинских и биологических учреждениях имеются препараты (кровяные мазки), которые могут быть использованы для изучения. КЛАСС GREGARINIDA — ГРЕГАРИНЫ ОТРЯД EUGREGARINARIA Monocystis sp. Материал и методы изучения. Род Monocystis принадлежит к подотр. Acephalina сем. Monocystidae. Acephalina характеризуются отсутствием расчленения тела на эпи-, прото- и дейтомерит. Monocystis паразитируют в семенных мешках разных видов дождевых червей. К роду Monocystis относится большое количество близких и трудно различимых видов. Например, Берлин (1924), исследовавший фауну Monocystidae Швеции, нашел 27 различных видов. Очень часто в одном и том же экземпляре хозяина паразитируют несколько разных видов грегарин. В СССР фауна Monocystidae специально не исследо
валась, но естественно предполагать, что разнообразие видов у нас не меньше, а вероятно больше, чем в Швеции. Цикл развития протекает, однако, у всех более или менее одинаково, что позволяет говорить о всем роде вместе, лишь попутно указав на некоторые видовые отличия. Для получения материала можно взять как обычного дождевого червя Lumbricus terrestis, так и дождевых червей других видов. В семенных мешках разные стадии жизненного цикла грегарин встречаются очень часто. Процент заражения нередко достигает 100. У живого или усыпленного слабым спиртом дождевого червя вскрывают передний конец (см. вскрытие дождевого червя), причем обнажаются семенные мешки. Острыми маленькими ножницами отрезают небольшой кусочек семенного мешка, переносят в каплю воды или лучше физиологического раствора на предметное стекло, придавливают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. В случае сильного заражения грегарины видны и простым глазом, так как в толще семенного мешка просвечивают многочисленные белые очень мелкие точки. Исследование in vivo позволяет познакомиться с основными стадиями развития Monocystis. Для более детального изучения внутренних процессов и, в частности, ядерных изменений следует изготовить препараты — мазки и разрезы. При изготовлении мазков пинцетом берут небольшой кусочек семенного мешка, сильно зараженного грегаринами, и равномерно размазывают по покровному стеклу, после чего фиксируют жидкостью Шаудина. Для изготовления срезов небольшие кусочки фиксируют также по Шаудину. Толщина срезов не больше 5 мкм. Как мазки, так и срезы окрашивают гематоксилином Бёмера или же железистым гематоксилином с подкраской эозином. Для обнаружения гликогена следует использовать раствор Люголя (J+KJ). Рис. 97. Часть среза через семенной мешок дождевого червя, зараженного разными видами Monocystis (Х65) (из кн. Веньона): 7— группа семенных клеток червя, 2 — циста с сизигием, в обоих грегаринах началось деление ядер, 3— циста с ооцистами, 4 — цисты с гаметами, 5 — ооцисты мелкого вида Monocystis Рис. 98. Разные виды Monocystis (гамонты). А—М. magna (Х80) (из кн. Веньона); Б—М. agilis (Х140); В — М. caudata (Х480) (из кн. Берлина): 1 — ядро
Рис. 99. Monocystis sp. Гамонт, окруженный семенными клетками дождевого червя (из кн. Дофлейна) Изучение препарата. При изучении живого материала, мазков и срезов через семенные мешки прежде всего бросается в глаза большое количество семенных клеток червя. Частью это зрелые сперматозоиды, частью половые клетки, находящиеся на разных стадиях созревания (рис. 97) (сперматогонии, сперматоциты). Последние собраны группами вокруг бластофоров, представляющих собой скопление клеток, имеющих опорное и питательное значение. Между половыми элементами червя разбросаны различные стадии развития грегарин (часто одновременно присутствует несколько видов). Грегарины попадают в семенные мешки в стадии спорозоитов, которые выходят из случайно заглатываемых червем ооцист. Спорозоиты проникают в семенные мешки и внедряются в бластофоры, где и начинается их рост, в результате которого они превращаются в гамонтов. Различные стадии роста так же, как взрослых гамонтов, следует отыскать на препаратах. Форма тела и размеры выросших гамонтов у разных видов Monocystis различны. На рис. 98 изображены некоторые наиболее обычные в дождевом черве виды (М. agilis, М. caudata, М. magna)1. Размеры Monocystis разных видов также сильно варьируют. Длина выросшего гамонта М. caudata около 70 мкм, М. agilis 300—500 мкм, М. magna до 1 мм. На переднем конце у некоторых видов имеется небольшой хоботообразный вырост (М. agilis). Нередко гамонты Monocystis оказываются окруженными как бы длинными немерцающими ресничками (рис. 98, В; 99). На самом деле это не ресницы, а сперматозоиды хозяина. Указанные соотношения получаются потому, что грегарины внедряются в бластофор, вокруг которого развиваются семенные клетки. По мере роста грегарины и вытеснения ткани бластофора сперматозоиды оказываются прилежащими непосредственно к телу грегарины1 2. В теле грегарины следует рассмотреть тонкий слой прозрачной эктоплазмы и гораздо более темную гранулированную эндоплазму. В последней при изучении материала in vivo просвечивает пузыревидное ядро с нуклеолой. При окраске живых грегарин раствором Люголя эндоплазма принимает интенсивный красно-коричневый цвет. Это зависит от присутствия в ней большого количества гликогена в форме зерен, для которого окраска по Люголю представляет одну из типичнейших реакций. Гамонты Monocystidae обладают некоторой подвижностью. Они медленно как бы скользят между тканями. Некоторые (М. magna) могут изгибаться и менять форму тела. По-видимо 1 Некоторые авторы рассматривают М. magna как отдельный род Nematocystis, основанием для чего служит главным образом нематодообразная форма тела гамонта. 2 Нужно, однако, иметь в виду, что существуют некоторые виды Monocystidae (род Rhynchocystis), у которых образуются настоящие цитоплазматические волосковидные выросты, не имеющие ничего общего со сперматозоидами червя.
му, у Monocystidae указанные формы движения зависят от наличия в эктоплазме сократительных волоконец (мионем). Кроме самих гамонтов как на окрашенных препаратах, так и in vivo следует отыскать различные стадии их полового размножения и спорогонии. Половой процесс начинается с того, что две грегарины тесно сближаются друг с другом (конъюгируют) и одеваются общей оболочкой (рис. 100, Б), образуя таким путем сизигий. Цитоплазма обеих входящих в состав сизигия грегарин не сливается и граница между ними сохраняется. В обеих грегаринах, заключенных в цисту, пузыревидное ядро разрушается и за счет хроматина его образуется первое веретено ка-риокинетического деления (рис. 100, В). Все эти ядерные изменения Рис. 100. Monocystis magna (по Кэно из кн. Дофлейна). А — соединение двух грегарин и сизигий; Б — сизигий в цисте, ядра еще не приступили к делению; В — первое деление ядра грегарин в сизигии; Г — дальнейшие деления ядер, ведущие к формированию гамет: 2— ядро, 2— клетки эпителия семенного мешка, 3 — веретена деления возможно рассмотреть лишь на срезах. Вслед за первым делением быстро следуют другие, в результате чего в цитоплазме обеих конъюгирующих грегарин образуется много мелких ядер. Вокруг каждого из них обособляется небольшой участок цитоплазмы. Получается множество округлых мелких клеток, которые представляют собой гаметы. С образованием гамет гра- Рис. 101. Monocystis magna (по Кэно из кн. Дофлейна). Копуляция гамет и образование ооцист. <4 — гаметы; Б — их копуляция; В — зигота; Г— вытягивание зиготы; Д — образование оболочки, в образующейся ооцисте 8 ядер; Е — ооциста со спорозоитами
ница между обеими грегаринами нарушается. Гаметы занимают по отношению ко всей протоплазматической массе преимущественно периферическое положение. Далеко не вся цитоплазма идет на образование половых клеток. Большая часть ее остается в виде большого остаточного тела. Гаметы сближаются попарно и сливаются (рис. 101). Копуляция всегда осуществляется между гаметами, принадлежащими разным особям. Некоторые виды Monocystis характеризуются изогамией, т. е. размеры всех гамет одинаковы. У других описана анизогамия: обе копулирующие гаметы несколько разнятся по величине. Зиготы тотчас же после своего образования имеют сферическую форму (рис. 101, В); они отличаются от гамет большей величиной. Дальнейшие процессы приводят к превращению каждой зиготы в ооцисту1. Происходит вытягивание зиготы в длину и образование вокруг нее оболочки (рис. 101, Д, Е). Получается характерная для Monocystidae веретеновидная форма ооцисты, заостренная на обоих вытянутых концах. Ядро зиготы трижды делится. Внутри оболочки ооцисты образуется 8 ядер. Вокруг каждого из них обособляется цитоплазма и формируются 8 червеобразных спорозоитов. На этом развитие ооцист заканчивается. Первоначально все они лежат под общей оболочкой цисты. Со временем последняя разрушается и ооцисты попадают в полость семенного мешка. Размеры ооцист у разных видов Monocystis различны. Наиболее крупными ооцистами обладают М. magna. Все указанные выше стадии жизненного цикла Monocystis могут быть обнаружены на препаратах. Однако для того чтобы рассмотреть их, нужен очень большой материал. Чаще других попадаются взрослые гамонты, сизигии в начале гаметогонии, цисты с гаметами и цисты со сформированными ооцистами. Неодинаковая частота нахождений отдельных стадий зависит от их различной продолжительности. Грегарины из подотряда Cephalina Материал и методы изучения. Грегарины, относящиеся к Cephalina и характеризующиеся расчленением тела на эпи-, прото- и дейтомерит, паразитируют в кишечнике различных беспозвоночных животных. Особенно многочисленны они в членистоногих, в частности в насекомых. Материал добывают путем вскрытия животных-хозяев и изучают in vivo в капле воды или физиологического раствора NaCl. Кроме того, изготовляют тотальные препараты (мазки), фиксируемые жидкостью Шаудина н окрашенные гематоксилином Бёмера. Определение грегарин представляет затруднение, так как соответствующих определителей на русском языке пока не существует. Для этого можно использовать монографию Ватсон-Камм, 1922 (см. список литературы). Здесь приведено описание трех родов грегарин, довольно часто встречающихся, изучение которых дает достаточно полное представление об организации Cephalina. Цикл развития не рассматривается, так как он в основном совпадает с Monocystidae, отмечаются только некоторые особенности в строении цист. 1 Ооцисты грегарин часто называют спорами. Эта терминология, однако, не точна. «Споры» грегарин полностью соответствуют ооцистам кокцидий, так как и те и другие представляют собой снабженную оболочкой зиготу. Споры у кокцидий формируются внутри ооцисты, у грегарин же образований, гомологичных спорам кокцидий, не выражено и формирование спорозоитов происходит непосредственно в ооцисте.
Достигают длины Рис. 102. Gregarina blattarum (Х300). Два гамонта, соединенные в сизигий (из кн. Дофлейна): 1 — протомерит, 8 — дейтоме-рит, 3 — ядро Изучение морфологии Gregarina Dufour (Clepsidrina Hammersch-midt). Представители этого рода, относящиеся к сем. Gregarinidae Labbe, обычны в кишечнике черного таракана, пруссака и в личинках жука Tenebrio molitor (мучных червях). В тараканах паразитирует Gr. blattarum Siebold (рис. 102), в Tenebrio — три вида того же рода (Gr. cuneata Stein, Gr. polymorpha Stein и Gr. steini Berndt.) (рис. 103, A—Б). Кроме того, в «мучных червях» встречаются грегарины из сем. Actinocephalidae — Steinina1 ovalis Leger et Dubosque (рис. 103, Г). Грегарины, живущие в полости кишечника, почти всегда соединены попарно (см. рис. 102), образуя сизигий. Это соединение, совершающееся здесь очень рано, связано с половым процессом. Сизигии наиболее обычны для Tenebrio molitor Gregarina cuneata. ~ 350 мкм. В дальнейшем каждый сизигий инцис-тируется. Передняя и задняя грегарины, входящие в состав сизигия, несколько отличаются друг от друга морфологически и соответственно получают название примята и сателлита. Каждая из соединенных попарно грегарин обладает протомеритом и дейтомеритом. Протомерит сателлита прикрепляется к дейтомериту примита. В дейтомерите расположено крупное пузыревидное ядро с кариозомом. Эпимерит у грегарин, находящихся в просвете кишечника, не выражен. При большом увеличении ясно видно разделение цитоплазмы на светлую эктоплазму и гораздо более темную эндоплазму. Снаружи тело грегарины покрыто довольно толстой пелликулой с продольными бороздками. За ней идет тонкий слизистый слой и светлая зона эктоплазмы (рис. 104). На живом материале и тотальных препаратах слизистый слой виден плохо. Граница между прото- и дейтомеритом образована эктоплазмой. Эндоплазма зернистая. В ней присутствует в большом количестве гликоген, который легко обнаружить при окраске иодом по Люго-лю. При изучении живого материала нередко пелликула отстает от протоплазматической массы на значительное расстояние. Цикл развития Gregarina протекает сходно с Monocystis. Интересно строение цист. Они (рис. 105) обладают длинными спородуктами, служащими для выведения ооцист из полости цисты. Цисты бочонковидной формы, выходя из спородуктов, образуют характерные цепочки. ! Род Steinina в отличие от рода Gregarina характеризуется наличием подвижного пальцевидного эпимерита.
Рис. 104. Gregarina munieri. А — при малом увеличении в капле туши, видна выделенная на заднем конце слизь; Б — детали строения цитоплазмы (из кн. Шевякова): 1 — пелликула, 2 — слизистый слой, 3 — эктоплаз-ма, 4 — граница между прото- и дейтомеритом, 5 — мионемы, 6 — эндоплазма, забитая зернами парагликогена Б В Рис. 103. Грегарины из кишечника «мучных червей» (из кн. Ватсон). А — Gregarina steini; Б — Gregarina polymorpha; В — Gregarina steini; Г — Steinina avails, гамонт и его передний конец Рис. 105. Gregarina cuneata — циста с ооцистами и со споропродуктами, из которых выводятся зрелые ооцисты, лежащие цепочкой (из кн. Кушакевича) Gregarina представляют удобный объект для изучения движения. При наблюдении живых грегарин под микроскопом видно, что они медленно передвигаются в поле зрения, движение их носит характер равномерного скольжения, не сопровождающегося изменением формы тела. Если поместить грегарин в каплю мелко растертой в воде туши, то по мере движения животного за ним остается светлый след (см. рис. 104,А). Шевяков показал, что
этот след — не что иное, как выделяющаяся на заднем конце тела грегарины слизь. Последняя выделяется отдельными струйками через тонкие поры пелликулы. Частички туши прилипают к слизи. Самый механизм движения объясняется по-разному. Шевяков предполагал, что выделяющаяся слизь — это как бы стебелек, при нарастании которого происходят пассивные движения самого тела грегарины. Однако за последние годы взгляды на механизм скользящего движения грегарин совершенно изменились. Исследования, проведенные с электронным сканирующим микроскопом, показали, что пелликула грегарин обладает системой продольно идущих по телу гребней. Эти гребни совершают колебательные (ундулирующие) движения, что и служит причиной скользящего поступательного движения грегарины. Вопрос требует еще дальнейших исследований, ибо механизм движений складок пелликулы остается нераскрытым. Hoplorhynchus Carus относится к сем. Acti-nocephalidae. Один из видов этого рода (И. oli-gacanthus Schneider) нередко встречается в кишечнике как личинок, так и имаго различных стрекоз. Организация взрослых грегарин (гамонтов) типична для Cephalina. Размеры Н. oli-gacanthus довольно велики: они достигают длины 600 мкм, ширины 70 мкм. Отчетливо выражены ее три отдела тела: эпи-, прото- и дейто-мерит (рис. 106, Б). Эпимерит несет крону коротких, загнутых назад крючков. Протомерит конической формы, отделен перетяжкой от дей-томерита. В передней части последнего расположено пузыревидное ядро. Эндоплазма, как и у других грегарин, богата гликогеном. Sciadophora phalangii Leger (сем. Actino-cephalidae) часто встречается в кишечнике сенокосцев (из родов Phalangium, Opilio). Это одна из самых крупных грегарин, длина ее достигает 2,5 мм (рис. 106, А). Небольшойэпимеритимеет Рис. 106. Грегарины. А — Sciadophora phalangii (Х40) (из кн. Шнейдера); Б — Hoplorhynchus oligacanthus (Х200) (ориг.); 1—эпимерит, 2 —• протомерит, 3 ~ дейтомерит, 4 — ядро, 5 — грану* лы парагликогена А
форму конического бугорка. Протомерит расширен, кутикула его несет многочисленные ребрышки. На заднем краю протомерита они продолжаются назад в виде коротких крючьев. Дейтомерит расширен в передней своей части, назад равномерно утончается. Задний конец заострен. Ядро помещается в передней части дейтомерита. Если вскрытие сенокосцев производится осенью, то нередко удается обнаружить крупные цисты Sciadophora, находящиеся на разных стадиях развития, вплоть до образования ооцист. Спородукты у цист отсутствуют. КЛАСС COCCIDIOMORPHA — КОКЦИДИЕОБРАЗНЫЕ ОТРЯД COCCIDIIDA—КОКЦИДИИ Eimeria magna Perard 1 Эндогенная часть жизненного цикла Материал и методы изучения. В кишечпике кролика встречается несколько видов рода Eimeria. Наиболее обычны Е. magna, Е. intestinalis, Е. perforans, Е. media-, кроме того, Е. stiedae поражает печень. Наличие паразита в кишечнике устанавливается путем исследования под микроскопом кала на присутствие ооцист. По ооцистам же ведется и определение видов Eimeria. Для этого поступают одним из следующих двух способов. Берут небольшой (4—5 мм), кусочек кала, растирают его с каплей воды на предметном стекле и исследуют под микроскопом. Зрелые ооцисты обладают толстой оболочкой и четырьмя спорами, но в свежем кале в ооцистах виден лишь протоплазматический шар, так как процесс спорогонии еще не закончен. Второй способ сводится к предварительному обогащению пробы ооцистами. Для этого кал растирают сначала с небольшим количеством насыщенного раствора поваренной соли, доливают затем большим количеством раствора, взбалтывают и дают отстояться в течение нескольких часов в небольшой пробирке. Объем осадка кала на дне ее должен составлять приблизительно Vs—V4 всего объема жидкости. После этого с поверхности жидкости при помощи петли из железной проволоки диаметром около 0,5 см берут каплю жидкости и исследуют под микроскопом. Ооцнсты, если они имеются в кале, всплывают наверх, и таким путем их легко обнаружить даже при относительно малом заражении кролика. Необходимо заметить, что совершенно свободных от кокцидий кроликов почти не встречается. У взрослых животных число ооцист обычно бывает очень невелико, и для исследования эндогенной части цикла они не годятся. Сильнее зараженными оказываются молодые кролики в возрасте 1—2 месяцев. Если найдено массовое заражение кролика, то его можно использовать для исследования (см. ниже). Более богатый и, главное, однородный материал удается получить при экспериментальном заражении молодых животных. Для этого можно предположить следующую методику. Молодых кроликов в возрасте 10—12 дней отнимают от матери и содержат отдельно в особом помешении в продезинфицированной предварительно клетке. Особенно удобны для этого железные клетки, которые можно прокалить при помощи паяльной лампы. Кролика кормят молоком трижды в день из маленькой соски. Выкармливание их не представляет большого труда. Следует соблюдать особую осторожность (мытье рук, халат, стерилизация посуды), чтобы не заразить крольчат кок-цидиями раньше времени. Чтобы кролики не страдали от холода, следует сделать им подстилку из стерилизованной ваты. 1 Все последующее изложение жизненного цикла кокцидий дается на основании монографии Е. М. Хейсина «Кокцидни кишечника кролика». Уч. зап. Ленингр. пед. ин-та им. Герцена, т. 51, 1947.
Для заражения ооцистами Е. magna (или другим видом кокцидий) берут молодых кроликов в возрасте 18—22 дней. Предварительно, путем исследования кала, находят кролика, выделяющего ооцисты. Желательно найти такого кролика, который выделял бы ооцисты только Е. magna, что встречается довольно часто. Производят обогащение указанным выше методом с насыщенным раствором NaCl. Переносят каплю с ооцистами на предметное стекло и приблизительно подсчитывают их количество. Чтобы получить хороший результат, следует взять 1—2 тыс. ооцист (разумеется, никакой особой точности при подсчете не требуется). Каплю раствора NaCl с ооцистами с предметного стекла втягивают в пипетку и вносят в ротовую полость заражаемого кролика. Ему открывают рот руками и капают из пипетки на язык. Выделение ооцист у зараженного кролика начнется через 8 суток (196—210 ч), в течение которых совершается эндогенный цикл (шизогония, образование гамет, оплодотворение). Желательно заразить не одного, а 3—4 кроликов. Чтобы правильно выбрать момент для вскрытия зараженных животных и фиксации материала, необходимо учесть следующие сроки отдельных моментов жизненного цикла Е. magna (по Хейсину). После заражения ооцистами (при отсутствии повторных инвазий) в кишечнике кролика паразит проделывает пять агамных поколений (т. е. 5 раз происходит шизогония). Начиная с третьего агамного поколения параллельно с бесполым размножением происходит и половой процесс, приводящий к образованию ооцист. Мерозоиты пятого агамного поколения дают начало исключительно гаметам. После этого кролик освобождается от паразита, если не последует повторного заражения ооцистами per os. Более точно (в часах) продолжительность отдельных стадий выражается следующими цифрами. Первая шизогония заканчивается через 80— 96 ч после заражения, вторая—110—132, третья— 135—158, четвертая— 150—165, пятая— 175—208 ч. Появление первых гамет имеет место через 148—151 ч. Первые сформировавшиеся ооцисты появляются в кале через 180—186 ч. Необходимо отметить, что первые две агамные генерации протекают синхронно и все особи паразита находятся на одной и той же стадии, начиная же с третьей генерации, строгая синхроничность нарушается, что позволяет одновременно находить разные стадии жизненного цикла. Для изучения эндогенной части жизненного цикла Eimeria зараженного кокци-диями кролика убивают (хлороформом, эфиром) и вскрывают. Е. magna локализуется в нижней части тонкой кишки на протяжении около 60 см от места ее впадения в толстые кишки. В части кишки, прилежащей к желудку, Е. magna никогда не встречается. Маленькие участки кишки взрезают вдоль. При сильном заражении простым глазом ясно видно поражение кишечника, которое выражается в набухании слизистой и в красноватом оттенке его внутренней стенки. Для изучения паразита in vivo скальпелем производят соскоб, который рассматривают при разбавлении физиологическим раствором с иммерсией. При наличии достаточно сильного заражения с внутренней поверхности кишечника делают мазок на покровном стекле, фиксируют жидкостью Шаудина и окрашивают железным гематоксилином. Небольшие кусочки зараженного участка (около 1—2 см) фиксируют жидкостью Ценкера с уксусной кислотой. Срок фиксации кишки около 2 ч. Далее следует по обычному методу заливка в парафин, изготовление срезов (толщина 5—10 мкм) и окраска их железным гематоксилином с подкраской эозином или лихтгрюном. Если имеется несколько кроликов, то можно рекомендовать следующие сроки вскрытия. Первое вскрытие производят через 120 ч после заражения. На препаратах— только взрослые шизонты и мерозоиты. Второе—через 144—145 ч. На препаратах— разные стадии шизогонии (нарушение синхроничности). Третье вскрытие — через 175—180 ч. На препаратах — гаметы и разные стадии формирования ооцист. В случае если можно вскрыть лишь одного кролика, то рациональнее это сделать через 150—160 ч после заражения, так как здесь — наибольшее богатство стадий. В тех случаях, когда заражение кроликов произведено ооцистами не Е. magna, а других видов, техника работы остается той же. Однако при вскрытии нужно иметь в виду, что локализация паразитов в кишечнике будет иная. Е. perforans локализована в верхней части тонких кишок. Е. media главным образом в двенадцатиперстной кишке и ниже. Наконец, Е. stiedae поражает печень, где она образует характерные мелкие узелки. При фиксировании материала их и следует брать, так как они представляют собой места скопления кокцидий.
Изучение срезов, мазков и живого материала. Шизонтам первого агамного поколения дают начало спорозоиты, выходящие в кишечнике из заглоченных ооцист. Все последующие поколения шизонтов так же, как и гаметоциты, развиваются из мерозоитов предыдущего агамного поколения. Первые стадии развития шизонта протекают внутриклеточно в эпителиальных клетках ворсинок кишечника. По мере Рис. 107. Eimeria magna (Х350) — ворсинка кишечника кролика с шизонтами в момент их распадения на мерозоиты (по Хейсину): /—клетки эпителия, 2 — шизогония разрушения клетки хозяина шизонт переходит в подлежащую соединительную ткань, где и заканчивается агамное размножение (рис. 107). На рис. 108 изображены последовательные стадии роста и развития шизонта. На самых ранних стадиях'он является одноядерным и имеет правильную сферическую форму. Деление ядра начинается на ранних стадиях роста (рис. 108, Б). Можно последовательно отыскать на срезах 2, 4, 8-ядерных шизонтов и т. д. Сами ядра обладают довольно крупным кариозомом. Картину митозов почти никогда наблюдать не удается. По мере роста шизонт постепенно переходит в соединительную ткань стенки кишки. Процесс шизогонии завершается формированием мерозоитов (рис. 108, Д). Число последних варьирует в довольно широких пределах. Каждый шизонт дает начало от 8 до 60 мерозои-там по числу образовавшихся в нем во время роста ядер. Почти вся цитоплазма шизонта используется на образование мерозоитов, иногда часть ее остается в виде небольшого остаточного тела. Мерозоиты (рис. 109), особенно в тех случаях, когда их не очень много, располагаются друг около друга наподобие долек апельсина (рис. 108, Д). Они имеют веретеновидную форму (длина 8 мкм, ширина 2—3 мкм) и одно ядро. Изредка встречаются мерозоиты с двумя, тремя и даже большим числом ядер. Строение отдельных мерозоитов также хорошо удается рассмотреть на мазках. Кроме ядра при очень большом увеличении в цитоплазме видна мелкая зернистость, располагающаяся с одной стороны ядра. Один конец мерозоита (передний) заострен и несет образование, резко красящееся гематоксилином и на-
Рис. 108. Eimeria magna (хЮОО)—рост шизонта и шизогония (по Хейсииу). А— молодой шизонт, ядро еще не приступило к делению; Б—Г—увеличение числа ядер путем деления и рост шизонта; Д — распад шизонта на мерозоиты, в центре видно остаточное тело поминающее перфораторий сперматозоида многоклеточных (рис. 109). Начиная со 148 ч, наряду с шизогонией можно наблюдать и различные стадии образования гамет. Самые ранние стадии развития макрогамет (макрогаметоциты) трудно отличимы от молодых шизонтов. На более поздних стадиях макрогаметы легко отличаются от шизонтов прежде всего тем, что ядро их не делится (рис. НО). Объем цитоплазмы значительно увеличивается, и в ней накапливается большое количество гранул. Из эпительных клеток макрогаметы по мере роста переходят в подлежащую соединительную ткань. Форма их сферическая, диаметр около 20 мкм. Выросшие макрогаметы обладают пузыревидным ядром с крупным кариозомом. Очень часто периферическая часть к следующему, (рис. 111). Пласти- Рис. 109. Eimeria magna (Х1500) — мерозоиты (по Хейсину) не окрашивается, и в таких случаях отчетливо виден один лишь кариозом. Среди многочисленных цитоплазматических гранул макрогаметы, достигающих размера 1 мкм и больше, различают более темноокраши-вающиеся хроматоидные и более светлые пластиноидные гранулы или стеклообразующие тельца. Дальнейшие изменения макрогаметы сводятся Форма клетки из сферической становится овальной ноидные гранулы приближаются к периферии и располагаются непосредственно в один слой под поверхностью. За их счет образуется оболочка, поэтому сами гранулы при этом исчезают. На одном из полюсов макрогаметы в оболочке остается отверстие (микропиле), служащее, вероятно, для оплодотворения. Самый процесс оплодотворения наблюдать не удается. После оплодотворения формируется вторая (внутренняя) оболочка, микропиле закрывается особой слизистой пробкой и зигота попадает в просвет кишечника. Обладающая двумя оболочками зигота кокцидий получает название ооцисты. Ее дальнейшее развитие осуществляется лишь во внешней среде. В кишечнике при отсутствии кислорода ооцисты Eimeria спорулировать не могут. • При развитии микрогаметоцита, дающего начало микрогаметам, деление ядер начинается на
Рис. ПО. Eimeria magna (Х35О)~ различные стадии эндогенной части цикла в ворсинке кишечника кролика (по Хейсину): 1— эпителий, 2—макрогаметы, 3 — микрогаметоцит с микрогаметами, 4 — шизонт в начале роста, 5—мерозоиты, 6 — шизонт в конце роста с многочисленными ядрами самых ранних стадиях роста. Оно совершается гораздо быстрее и чаще, чем при шизогонии. Параллельно с делением ядер осуществляется рост микрогаметоцита (рис. 112). Он достигает размеров, превышающих диаметр макрогаметы (см. рис. ПО). В цитоплазме располагаются многочисленные мелкие (в количестве нескольких сот), занимающие к концу роста преимущественно периферическое положение. Микрогаметы образуются путем вытягивания отдельных ядер. Тело их состоит из ядерного вещества. На переднем конце имеется два жгута (рис. 113). Строение микрогамет лучше всего изучать на мазках. Большая часть цитоплазмы микрогаметоцита не идет на образование гамет и остается в виде большого остаточного тела. Размеры микрогамет не велики. Длина их равняется 3—4 мкм. Длина жгутов гамет 5— 8 мкм. Экзогенная часть жизненного цикла (развитие ооцисты) Материал и. методы изучения. Ооцисты поступают из кишечника наружу вместе с калом. Процесс споруляции изучают в живом виде. Изготовление препаратов невозможно вследствие полной непроницаемости оболочек ооцист для красителей. Обычно кал с ооцистами помещают в 2%-ный К2СГ2О7. Последний не препятствует споруляции, так как не проникает через оболочки. Подавляя развитие бактерий, двухромовокислый калий делает более благоприятным снабжение ооцист кислородом. Свободный доступ кислорода— необходимое условие их развития. При 18°С продолжительность споруляции 70—75 ч. Необходимо иметь в виду, что развитие отдельных ооцист протекает ие вполне синхронно. Изучение живого материала. Только что вышедшие из кишечника ооцисты имеют овальную форму (рис. 114). Цитоплазматическое содержимое их отделено от оболочки и в форме шара занимает центральную часть ооцисты Процесс споруляции начинается с того, что многочисленные сильно светопреломляющие гранулы концентрируются в средней части цитоплазматического шара. Эти гранулы входят в состав остаточного тела. На самом плазматическом шаре образуются четыре 1 Изредка попадаются ооцисты, в которых цитоплазма не отделена от оболочек. Такие ооцисты, по-видимому, не способны к дальнейшему развитию.
Рис. 111. Eimeria magna (X1000)—развитие макрогамет (по Хейсину). Д — молодой макрогаметоцит; Б — Д— последовательные стадии роста и формирования макрогаметы Рис. 112. Eimeria magna (Х1000)—развитие микрогамет (по Хейсину). А — молодой микрогаметоцит с неразделившимся ядром; Б — Г — стадии роста микрогаметоцита, сопровождающиеся делением ядер; Д — формирование микрогамет, большая часть протоплазмы остается в виде остаточного тела
Рис. 113. Eimeria magna (X1700) — микрогаметы, каждая с двумя жгутиками (по Хейсину) вздутия, отделяющиеся от остаточного тела и представляющие собой споробласты. Далее следует «стадия пирамид» (48 ч после начала споруляции при 18—20° С). Дистальная часть споробластов вытягивается, заостряется и доходит до оболочки; основание же, прилежащее к остаточному телу, остается широким. На остром конце каждой йирамиды располагается сильно преломляющее свет зернышко (Шнейдеровское тельце). Споробласты после стадии пирамид вновь округляются и одеваются тонкой оболочкой с утолщением на одном полюсе (55—65 ч). Таким путем споробласты превращаются в споры. Внут ри них происходит разделение протоплазмы на два спорозоита. При этом внутри каждой споры, кроме спорозоитов, остается небольшое остаточное тело. В каждом спорозоите обособляется светопреломляющее полярное тельце. Этим заканчивается процесс споруляции. Размеры ооцист Е. magna варьируют в величине. Длина их 25— 40 мкм, ширина 18—30 мкм. Средняя величина длины 35,0 мкм, ширины 23,0 мкм. Диаметр остаточного тела 6,5—9,0 мкм. Рис. 114. Eimeria magna (Х1000) —последовательные стадии споруляции ооцисты (по Хейсину). А— только что вышедшая из кишечника ооциста, цитоплазма в виде шара; Б — концентрация гранул в центре; В — Д — формирование «пирамид»; Е — округление споробластов; Ж — К — преврашение споробластов в споры с двумя спорозоитами в каждой. Ясно видно сферическое остаточное тело
Так как изучение споруляции имеет место на живом материале, деления ядер наблюдать не удается. Ооцисты других видов кокцидий кролика. Наряду с Eimeria magna в кале кролика часто попадаются и другие виды кокцидий. Из них наиболее обычны Е. perforans, Е. media и Е. stiedae. Рис. 115. Зрелые ооцисты трех видов кокцидий кролика (X1000). А — Eimeria stiedae; Б — Е. media; В — Е. perforans На рис. 115 при одинако- вом увеличении изображены ооцисты указанных видов. Основные различия их сводятся к следующему. Ооцисты Е. perforans имеют овальную форму, микропиле плохо видно, оболочка в большинстве случаев бесцветная. От других видов Е. perforans отли- чается наименьшей величиной ооцист (длина в среднем 25 мкм, ширина 14 мкм). При споруляции кроме четырех спор остается небольшое остаточное тело (2,5—4 мкм). Ооцисты Е. media светло-бурого цвета с ясно выраженным микропиле. Размеры несколько крупнее Е. perforans (длина 29 мкм, ширина 17 мкм). При споруляции остается остаточное тело. Ооцисты Е. stiedae окрашены в бурый цвет. Микропиле слабо заметно. Размеры ооцист наиболее крупные (длина 36,5 мкм, ширина 20,4 мкм). Морфологически оформленного остаточного тела при споруляции обычно не образуется, между спорами остаются мелкие зер нышки. Вместо кокцидий из кролика в качестве объекта для изучения как эндогенной, так и экзогенной части цикла можно взять представителей рода Eimeria, встречающихся в птицах. Цыплята довольно часто страдают кровавым поносом, возбудителем которого является Е. tenella и ряд других близких видов. Паразит этот локализуется в слепых кишках и при сильном заражении может дать обильный материал для изучения. Ход жизненного цикла Е. tenella близок к таковому Е. magna. ОТРЯД HAEMOSPORIDIA Plasmodium vivax Grassi et Felleti, P. malariae Laveran, P. falciparum Welch.1 Агамные поколения и гаметоциты в крови человека Материал и методы изучения. Малярия как массовое заболевание на территории Советского Союза ликвидирована. Это одно из выдающихся достижений здравоохранения в нашей стране. Однако в медицинских учреждениях и на биологических факультетах некоторых университетов имеются препараты возбудителя малярии. Пре 1 Четвертый паразитирующий в человеке вид рода Plasmodium — Р. ovale Stephens встречается только в Африке и поэтому препараты его практически недоступны для изучения.
параты эти представляют собой мазки, окрашенные по Романовскому-Гимза. Ввиду большого интереса, который представляет изучение возбудителя малярии как в теоретическом, так и в практическом плане, приводим описание тех стадий жизненного цикла паразитов, которые протекают в крови человека. Описание жизненного цикла возбудителя малярии и соответствующие схемы имеются в любом учебнике зоологии, паразитологии' или протозоологии, поэтому нет необходимости повторять их в данной книге. Напомним лишь, что агамное (бесполое) размножение малярийного плазмодия осуществляется в два этапа. Первые поколения шизонтов, развивающихся непосредственно из спорозоитов, проникающих в кровь при укусе комара, протекают в клетках печени. Мерозоиты, возникающие в результате этой виеэритроцитариой шизогонии, внедряются в эритроциты, и дальнейшие агамные поколения, так же как и образование гаметоцитов, происходит в кровяном русле. Эти стадии жизненного цикла и описаны ниже. При отсутствии препаратов человеческой малярии можно попытаться получить материал по другим видам плазмодиев, паразитирующих в грызунах и птицах. Об этом будет сказано ниже. Шизонты и шизогония в крови человека. Ниже подробно описываются те стадии жизненного цикла Plasmodium vivax, которые можно обнаружить в крови человека. В отношении двух других видов (Р. malarias и Р. falciparum) укажем главным образом на отличие их от Р. vivax. У Plasmodium vivax, возбудителя трехдневной малярии (febris tertiana), в эритроциты проникают мерозоиты, образовавшиеся в результате последней экзоэритроцитарной шизогонии. Мерозоиты, образующиеся в результате агамного размножения (шизогонии), вновь внедряются в красные кровяные тельца, но наблюдать момент внедрения мерозоита почти никогда не удается. Он Рис. 116. Plasmodium vivax из крови человека (по Дофлейну). А — типичное «кольцо», Б — амебоидная форма (видна Шюффнерова пятнистость) ; В — многоядерный растущий шизонт, Г — шизогония, Д — макрогамета, Е — микрогаметоцит
протекает, по-видимому, чрезвычайно быстро. Начальные стадии роста внедрившегося мерозоита, который получает название шизонта, чрезвычайно характерны. Они имеют вид колец диаметром около */з (от 'А до V2) эритроцита (рис. 116). Центр такого кольца занят вакуолью, стенки его состоят из протоплазмы паразита (на хороших препаратах голубая). Ядро имеет вид зерна (обычно красного), расположенного где-либо по краю кольца. На дальнейших стадиях роста правильная кольцевидная форма шизонта утрачивается, но вакуоль обычно сохраняется (рис. 116). Очертания его становятся весьма неправильными и непостоянными, образуются многочисленные псевдоподиеобразные выросты и т. и. Ядро по-прежнему одно, оно располагается чаще всего близ вакуоли. Размеры ядра несколько возрастают, но не превышают 2 мкм. Указанное непостоянство формы плазмодия зависит от его подвижности. Растущий шизонт Р. vivax внутри эритроцита производит активные амебоидные движения. К концу периода роста шизонт заполняет своим телом большую часть эритроцита. Параллельно с ростом как в. самом плазмодии, так и в эритроците происходят следующие чрезвычайно характерные для Р. vivax изменения. В шизонте отлагается коричневый пигмент в форме мелких зерен. Отложение пигментных гранул начинается приблизительно через 6 ч после внедрения мерозоита в эритроцит. В мелких кольцах он отсутствует. Объем эритроцита довольно значительно увеличивается, диаметр его возрастает почти в 1,5 раза. В цитоплазме эритроцита появляются многочисленные мелкие гранулы, окрашивающиеся, по Романовскому, в красный цвет — так называемая Шюффнерова крапчатость, или зернистость. Через 36 ч после внедрения паразита в эритроцит начинается процесс шизогонии, который заканчивается к 48 ч. Вакуоль при этом исчезает, шизонт принимает правильную округлую форму. Ядро делится несколько раз. Деления эти протекают не вполне синхронно. В результате образуется от 12 до 24 ядер. Пигмент, распределенный вначале равномерно по цитоплазме, собирается в центре шизонта в виде немногочисленных более крупных темноокрашенных включений. Вокруг каждого из образовавшихся путем деления ядер обособляется участок цитоплазмы. Таким путем формируются мерозоиты. Пигмент, сконцентрированный в центре, образует остаточное тело. Число мерозоитов равно числу ядер. Чаще всего их образуется 16. Они лежат сначала неправильной кучкой. Каждый мерозоит — овальной формы. Размеры его очень малы (около 2 мкм). При разрушении эритроцита мерозоиты попадают в плазму крови и вновь внедряются в красные кровяные тельца. Весь период развития шизонта от момента внедрения мерозоита до конца шизогонии занимает 48 ч. Все указанные стадии можно обнаружить в периферической крови. При сильном заражении удается нередко -наблюдать наличие в эритроците не одного, а двух и даже большего числа шизонтов. Plasmodium malariae (рис. 117), возбудитель четырехдневной малярии (febris quartana), отличается от Р. vivax целым рядом особенностей строения шизонта и шизогонии. Начальные стадии роста шизон-
та («кольца») почти не отличимы от Р. vivax. В дальнейшем вакуоль исчезает, неправильной формы протоплазматические выросты, характерные для Р. vivax, не образуются. Шизонт принимает характерную форму ленты, пересекающей эритроцит. На этой стадии в цитоплазме происходит отложение зерен пигмента. Увеличение объема эритроцита и образование зернистости Шюффнера не имеет места. В процессе дальнейшего роста шизонт заполняет почти все тело эритроцита, причем характерная лентовидная форма его превращается в округлую. Пигмент, отложившийся в цитоплазме, в значительном количестве начинает концентрироваться в центральной части шизонта. Ядро при этом делится. В результате образуется от 8 до 12 ядер, располагающихся близко к периферии тела плазмодия. После этого происходит распад тела паразита на мерозоиты, число которых соответствует числу ядер. Пигмент переходит в остаточное тело, мерозоиты же в отличие от Р. vivax располагаются более или менее правильной «розеткой» вокруг остаточного тела. После этого эритроцит разрушается и мерозоиты попадают в плазму крови. Подобно Р. vivax, все указанные выше стадии могут быть обнаружены в периферической крови. Продолжительность цикла развития Р. malariae в крови человека (от шизогонии до новой шизогонии) равняется 72 ч. Возбудитель четырехдневной лихорадки встречается гораздо реже, чем Р. vivax. У Plasmodium falciparum в отличие от обоих предыдущих видов далеко не все стадии роста шизонтов и шизогонии протекают в периферической крови. Он вызывает тропическую форму малярии (febris tropica). На мазках удается обнаружить в большинстве случаев лишь «кольца» — начальные стадии роста шизонтов. Кольца Р. falciparum отличаются очень маленькими размерами. Они равняются лишь V5— ’/б диаметра эритроцита. Впрочем, по мере роста они могут достигнуть ’/3 эритроцита. В последнем случае они оказываются почти неотличимыми от. соответствующих стадий Р. vivax и Р. malariae. В кольцах Р. falciparum иногда наблюдается по два и даже три ядра, и сами они нередко принимают линзообразную форму. Кроме того, в крупных кольцах Р. falciparum на стороне, противоположной ядру, наблюдается некоторое утолщение цитоплазмы, имеющее линзообразную форму (см. рис. 118). В цитоплазме эритроцита, объем которого не увеличивается, нередко появляются немногочисленные довольно крупные, неправильной формы пятна, окрашивающиеся, по Романовскому — Гимза, в пурпурнокрасный цвет. Они обычно обозначаются в литературе как «Мауреров-ская пятнистость» и легко отличимы от Шюффнеровской крапчатости, вызываемой Р. vivax. Дальнейшие стадии роста шизонта и сам процесс шизогонии протекает в капиллярах внутренних органов. Лишь в редких случаях эти стадии появляются в периферической крови. Выросший шизонт tropica — меньших размеров, чем у обоих предыдущих видов; он занимает лишь V2—2/з эритроцита. В нем также накапливаются зерна пигмента. Мерозоиты очень мелки. Их образуется от 8 до 24 (чаще 10— 12) из одного шизонта. - Продолжительность цикла в крови человека у Р. falciparum не отличается такой правильностью, как у Р. vivax и Р. malariae. Она рав-168
няется 40—48 ч, но самый процесс шизогонии может растягиваться на несколько часов, благодаря чему синхронность нарушается. Имеются указания на существование штаммов Р. falciparum с 24-часовым циклом. Большинство исследователей считает, однако, что в подобных случаях так называемого febris quotidiana имеет место двукратное заражение больного комаром. Гаметоциты в крови человека. Шизогония не совершается в крови человека неограниченное число раз. После нескольких циклов агамного размножения часть внедрившихся в эритроциты мерозоитов превращается в гаметоциты. Последние представляют собой подготовительные стадии к половому процессу, который осуществляется в теле комара, насосавшегося крови малярика. Гаметоциты трех видов малярийного плазмодия отличаются друг от друга морфологически и требуют отдельного описания. Они встречаются в периферической крови. Кроме различий между разными видами в пределах одного и того же вида можно отличить макрогаметоцитов (будущие женские гаметы) от микрогаметоцитов (дающих в дальнейшем микрогаметы). У Plasmodium vivax гаметоциты появляются в крови на 10—14-й день после первого появления шизонтов. Молодые гаметоциты отличаются от шизонтов отсутствием вакуоли и более правильными очертаниями тела — амёбовидные выросты отсутствуют (рис. 116). Зрелые гаметоциты почти целиком заполняют тело выросшего эритроцита, оставляя лишь тоненький ободок с Шюффнеровой зернистостью. В отличие от шизонтов у них имеется лишь одно ядро. Форма тела их приближается к сферической. В протоплазме имеются зерна пигмента. Отличие макрогаметоцитов от микрогаметоцитов сводится к следующему. Микрогамегоциты характеризуются более крупным ядром и более светлой протоплазмой, у макрогаметоцитов ядро меньше, а протоплазма более темная, с большим количеством включений. У Plasmodium malariae гаметоциты (рис. 117) весьма напоминают таковые Р. vivax. Они отличаются от последних меньшими размерами, при этом величина эритроцитов не является гипертрофированной. Отсутствует также Шюффнерова зернистость. Различия между микро- и макрогаметоцитами те же, что и у Р. vivax. Образование гаметоцитов у Р. falciparum так же, как и шизогония, протекает во внутренних органах. Сформировавшиеся гаметоциты попадают в периферическую кровь и легко обнаруживаются на препаратах. Их строение чрезвычайно ха- Рис. 117. Plasmodium malariae из крови человека (по Дофлейну), А —растущий шизонт в форме «пояска», Б — шизогония; В — макрогамета, Г — микрогаметоцит
л в Рис. 118. Plasmodium falciparum из крови человека (по Дофлейну). А —начало роста шизонта, мелкое «кольцо»; Б — «кольцо» с двумя ядрами; В — более крупное «кольцо»; Г — макрогамета; Д — микрогаметоцит Рис. 119. Plasmodium relictum в эритроцитах воробьиных птиц (по Тиованола из кн. Гарнэма). А— В — последовательные стадии шизогонии; Г, Д— гаметоциты Рис. 120. Haemoproteus columbae стадии развития гаметоцита; в эритроцитах голубя. А—Г — последовательные Д — микрогаметоцит; Е, Ж — макрогаметоциты рактерно и служит безошибочным признаком при диагнозе тропической малярии. Они имеют бобовидную форму (рис. 118), слегка изогнуты на одну сторону. Длина их 9—14 мкм. Обычно гаметоцит окружен остатком эритроцита. Макрогаметоциты при окраске по Гимза окрашиваются в темно-синий цвет. Микрогаметоциты красятся в голубой или розовый цвет. Зерна пигмента у макрогаметоцитов сконцентрированы около ядра, тогда как у микрогаметоцитов распределены почти по всей плазме. Наконец, ядро у макрогаметоцитов значительно мельче, чем у микро
гаметоцитов. В крови гораздо чаще встречаются макрогаметоциты. Например, по подсчетам Ноуэльс, они наблюдаются в 10 раз чаще, чем микрогаметоциты. Это, возможно, объясняется тем, что мужские клет-кие быстрее дегенерируют. Виды рода Plasmodium (сем. Plasmodiidae) широко распространены в природе во всех широтах. Они паразитируют в крови млекопитающих, птиц, рептилий. Общее число видов этого рода, которое приводится в монографии Гарнэма (Garnham, 1966, см. список литературы), превышает 80. В крови многих воробьиных, утиных и других семейств птиц в эритроцитах на мазках, окрашенных по Романовскому—Гимза1, удается обнаружить шизонты, гаметоциты Plasmodium relictum, Р. cathemerium (рис. 119) и другие виды. В последнее время в некоторых лабораториях в качестве модельного объекта для изучения кровепаразитизма используется Р. berghei. Этот паразит в естественной обстановке был обнаружен в Африке в грызунах Thamnomys surdaster и в других видах. Штаммы этого паразита поддерживаются на лабораторных грызунах (мыши, крысы, хомячки) путем пересева. Стадии развития Р. berghei очень напоминают Р. vivax. Часто в крови многих птиц обнаруживаются виды рода Haemoproteus, относящегося к сем. Haemoproteidae. Они отличаются от Plasmodiidae тем, что шизогония у них протекает не в эритроцитах, а в эндотелии сосудов. В эритроцитах обнаруживаются лишь гаметоциты и стадии их развития (рис. 120). ' Технику изготовления и окраски мазков крови см. в кн.: Лабораторные методы исследования патогенных простейших/Под ред. Д. Н. Засухина. М., 1957.
Тип Cnidosporidia — книдоспоридии КЛАСС MYXOSPORIDIA — СЛИЗИСТЫЕ СПОРОВИКИ Myxidium lieberkiihni Biitschli Материал и методы изучения. Myxidium lieberkiihni (отр. Bivalvulea, подотр. Platysporea, сем. Myxidiidae) весьма часто встречается в мочевом пузыре щук. Для получения миксоспоридий вскрывают свежую, только что убитую щуку и извлекают мочевой пузырь. Тонкими препаровальными ножницами его взрезают вдоль. Препаровальной иглой делают соскоб с внутренней стенки пузыря и изучают сначала в живом виде в небольшой капле воды. Кроме того, изготовляют мазки (на покровном стекле), фиксируют жидкостью Шаудина и окрашивают железным гематоксилином. Специально для спор можно рекомендовать окраску 1%-ным водным раствором метиленовым синим (окраска 30 мин — 1ч проведение, как обычно, через спирты и ксилол, препарат в канадском бальзаме). При этом окрашиваются полярные капсулы и ядра аме-боида. Споры миксоспоридий хорошо сохраняются, не изменяя своей формы, если их без предварительной фиксации смешать с теплым глицерин-желатином и покрыть покровным стеклом. Чтобы такие препараты не подсыхали, по краю покровного стекла следует обвести асфальтовым лаком. Такие препараты могут храниться годами. Изучение живого материала и мазков. На препаратах следует отыскать различные стадии роста плазмодиев, а также изолированно лежащие споры Myxidium. Размеры плазмодиев в зависимости от стадии их роста различны. Наряду с очень мелкими (30—40 мкм), не приступившими еще к спорообразованию, встречаются крупные (300 мкм и больше), набитые спорами (рис. 121). Между теми и другими существуют всевозможные переходы. Форма плазмодиев варьирует, но в общем они более или менее выгнуты в одном направлении. На мелких плазмодиях ясно видно разделение на прозрачную гомогенную эктоплазму и зернистую эндоплазму. На крупных экземплярах это разделение менее отчетливо. Эктоплазма образует псевдоподии (рис. 121, А), в которые иногда частично вовлекается и эндоплазма. Плазмодии обладают способностью менять свою форму и медленно передвигаться. В эндоплазме имеются многочисленные ядра (видны на окрашенных гематоксилином препаратах). Кроме того, присутствуют сильно преломляющие свет капли жира и красно-коричневые кристаллы гематоидина. Последние в молодых плазмодиях имеются в небольшом количестве или даже отсутствуют вовсе, в крупных же их образу-
Рис. 121. Myxidium lleberkuhni (Л — по Шредеру; Б — по Либеркюну; В — по Лангу; Г — Е— по Василевскому). А — молодой плазмодий; 5 — плазмодий с двумя спорами; В — бесполое размножение путем почкования; Г — плазмодий, набитый спорами; Д — отдельная спора; Е — то же, с выброшенными стрекательными нитями; / — псевдоподии, 2 — жировые капли, 3 — ядра, 4 — эктоплазма, 5 — эндоплазма ется очень много. В мелких плазмодиях процесса спорообразования еще нет. Споры образуются в эндоплазме группами по две вместе. Это объясняется тем, что образованию спор предшествует обособление так называемых панспоробластов, которые представляют собой участок протоплазмы с 14 ядрами. В пределах каждого панспоробласта образуется две споры. В построении каждой из них участвуют по шесть ядер, два остающихся ядра панспоробласта в этом процессе участия не принимают. Детали развития спор на тотальных препаратах рассмотреть не удается, вследствие чего мы и не даем здесь описания этого процесса. Споры Myxidium lieberkilhni имеют веретеновидную форму (рис. 121, Г, Д), длина их 18—20 мкм, ширина 5—6 мкм. Оболочка споры, состоящая из двух створок, исчерчена в продольном направлении. На заостренных концах споры располагаются две полярные стрекательные капсулы. Внутри оболочек имеется цитоплазматическое содержимое (амебоид) с двумя ядрами. При заражении спорами нового хозяина амебоид, выходящий из оболочки спор, дает начало плазмодию. Кроме образования спор, Myxidium способен, по-видимому, и к бесполому размножению. Иногда наблюдается на крупных плазмодиях процесс почкования (рис. 121, В), приводящий к увеличению числа плазмодиев.
Myxobolus sp. Материал и методы изучения. К роду Myxobolus (подотр. Platysporea, сем. Myxobolidae) относится несколько десятков видов миксоспоридий, паразитирующих в различных тканях пресноводных рыб. Чаще всего они локализуются в коже, на жабрах (рис. 122) и в мышечной ткани. Обычно Myxobolus образуют в пораженном органе цисты различных размеров (от долей миллиметра в поперечнике до сантиметра и даже более). Иногда же плазмодий паразита более или менее диффузно инфильтрирован между тканями хозяина. Для определения видов, довольно трудно отличимых друг от друга, следует обратиться к монографии С. С. Шульмана (см. список литературы). Удобны для изучения цисты с жабр. В Ленинграде высокий процент зараженности Myxobolus обнаруживает судак из Невской губы. Для рассмотрения спор in vivo циста раздавливается и исследуется с иммерсионной системой. Изготовляют неокрашенные препараты в глицерин-желатине. Кроме того, изготовляют обычным способом мазки, фиксируемые жидкостью Шаудина и окрашиваемые железным гематоксилином и метиленовым синим. Небольшие цисты фиксируют целиком (при фиксации тонкой иглой надо проколоть оболочку цисты), заливают в парафин, после чего изготовляют срезы (не толще 5 мкм), окрашиваемые каким-либо гематоксилином с подкраской эозином. Рис. 122. Цисты Myxobolus на судаке (из кн. Догеля) Рис. 123. Споры Myxobolus sp. (X1200) .А — со стороны створки; Б — со стороны шва; В — отдельная створка: 1 — стрекательная капсула, 2 — аме-боид, 3 —ядра амебоида, 4— иодо-фильная вакуоль, 5 — эндоплазма Изучение живого материала и мазков. Споры Myxobolus овальной или эллиптической формы. Размеры их у разных видов различны. Длина варьирует приблизительно от 10 до 20 мкм, ширина 5—10 мкм. Толщина спор меньше ширины (рис. 123). Оболочка состоит из двух створок, плотно прилегающих друг к другу. Линия соприкосновения обеих створок называется швом или сутуральной (шовной) линией. Она обычно несколько приподнята и образует краевой валик, или гребень. На переднем конце споры располагаются две полярные капсулы, внутри которых видны стрекательные нити. У большинства видов Myxobolus обе капсулы одинаковой величины. Некоторые виды характеризуются неодинаковыми размерами стрекательных капсул (Af. dispar) (рис. 124). Наконец, споры немногих видов имеют лишь одну капсулу (А4. misgurni). Среди спор попадаются
с выброшенными стрекательными нитями, длина которых значительно превышает длину споры (рис. 125). Изучение срезов. На срезах через цисты Myxobolus в большом количестве присутствуют споры. В тех случаях, когда плазмодий еще относительно «молодой», наряду со сформированными спорами удается рассмотреть некоторые стадии их развития. При этом зрелые споры обычно занимают центральную часть цисты. В протоплазме плазмодия, в тех участках его, где еще не закончился про- цесс спорогонии, присутствуют многочисленные ядра и происходит формирование панспоробластов, споробластов и спор. Проследить детально все последовательные стадии этого процесса вряд ли удастся, так как благодаря наличию очень большого числа ядер и включений в протоплазме получается чрезвычайно запутанная и сложная картина. Легче всего отыскать панспоробласты, в которых уже закончился процесс деления ядер и начинается формирование спор (рис. 126). Панспоробласт представляет собой обособившийся из общей протоплазматической массы участок протоплазмы вытянутой овальной формы, в котором присутствуют 14 ядер, из которых 12 принимают участие в образовании двух спор. Два ядра остаются в качестве остаточных ядер. В образовании каждой споры участвуют шесть ядер. Из них два переходят в амёбоидный зародыш; два других тесно прикладываются к образующейся оболочке, сморщиваются и претерпевают пикноз. По-видимому, они играют активную роль в формировании двустворчатой оболочки споры. Наконец, Рис. 124. Споры Myxobolus dispar со стрекательными капсулами различной величины (с жабер плотвы) (по Шульману) Рис. 125. Споры Myxobolus schulmani с выстреленными и невыстреленными стрекательными нитями (с плавников белоглазки) (по Шульману) еще два ядра располагаются в передней части формирующейся споры и участвуют в образовании стрекательных капсул. Таким образом, спора Myxobolus — довольно сложное образование, в развитии которого участвуют шесть ядер. Оболоч- ка цисты Myxobolus так же, как и других миксоспоридий, образуется не самим паразитом, а представляет собой разрастание соединительной ткани хозяина, которая располагается концентрическими слоями.
Рис. 126. Myxobolus pfeifferl—развитие спор (Х1500) (из кн. Кеисселитца). А — панспоробласт; Б — незрелая спора; В — зрелая спора Рис. 127. Henneguya acerinae (из кн. Грассе). А— участок жабры ерша с цистами; Б — спора: 1 — стрекательные капсулы, 2 — ядра, 3 — амебоид с двумя ядрами, 4 — ядра створок споры Henneguya sp. Материал и методы изучения. Род Henneguya (сем. Myxobolidae), подобно Myxobolus, включает много видов, паразитирующих в разных органах почти исключительно пресноводных рыб. Некоторые виды образуют цисты иа жабрах и в мускулатуре. Главный интерес представляет изучение спор. Последние рассматриваются как в живом виде, так и на фиксированных и окрашенных мазках, подобно Myxobolus. Изучение строения спор. Характерной особенностью строения спор Henneguya служит наличие длинных отростков (рис. 127). На заднем конце споры обе створки несут длинные стилетообразные выросты.
Nosema apis Zander и N. bombycis Naegeli Материал и методы изучения. Микроспоридия Nosema apis паразитирует в эпителии средней кишки медоносной пчелы, вызывая заболевание, известное под именем белого поноса пчел. Наличие заражения устанавливается путем микроскопического анализа кала, в котором обнаруживаются споры. Ввиду того, что они очень мелки, необходимо применение иммерсионной системы. Усыпив хлороформом или эфиром зараженную пчелу, ее вскрывают. Часть средней кишки фиксируют (жидкостью Шаудина или Ценкера) для изготовления срезов. Из другой части делают мазки и изучают in vivo, раздавив в капле физиологического раствора или воды под покровным стеклом. Срезы окрашиваются железным гематоксилином или по Маллори; мазки — железным гематоксилином. Другой вид рода Nosema — N. bombycis является возбудителем тяжелого, почти всегда смертельного, заболевания гусениц тутового шелкопряда, называемого пебриной. Морфологически стадии развития и споры N. bombycis почти не отличимы от N. apis, за исключением меныпнх размеров. Но в отличие от N. apis N. bombycis локализуются не только в кишечнике, но и почти во всех других органах гусеницы, в том числе и в яйцевых клетках, что делает возможным осуществление трансовариальной передачи в тех случаях, когда больная гусеница все же окукливается и дает бабочку. Изучение N. bombycis осуществляется также на мазках и срезах. Изучение материала. На мазках, а также in vivo рассматривают споры. Они имеют овальную форму и очень мелки (рис. 128). У N. apis длина спор 4,5—6,5 мкм, ширина 2,5—3,5 мкм, у N. bombycis соответственно 2—4 и 1—2 мкм. Имеется прочная оболочка, не являющаяся у Nosema в отличие от Myxosporidia двустворчатой. Внутри споры имеется один полярипласт, вакуоль, длинная спирально закрученная нить и амебоидный зародыш. Ввиду очень мелких размеров спор нить обычно не видна. На препаратах полярипласт и вакуоль имеют вид светлых пятен, расположенных на концах споры. Если живые споры поместить в довольно крепкую соляную кислоту (около 1О°/о), то споры разбухают и нередко происходит выбрасывание длинной (до 70 мкм) нити. На срезах через кишечник видно, что эпителиальные клетки набиты спорами, которые обычно бывают расположены продольными рядами (рис. 129). Подобное расположение зависит от того, что проникающий в клетку из споры амебоид делится в одном направлении, обычно по продольной оси эпителиальной клетки. Образующаяся цепочка распадается на отдельные участки — споробласты, за счет которых формируются споры. При сильном заражении многочисленные споры обнаруживают также в просвете кишечника.
Рис. 128. Споры — Nosema apis (из кн. Грассе): / — стенка споры, 2 — стрекательная нить, 3 — амебоид с ядрами Рис. 129. Nosema bombycis (Х2000). Срез через эпителий кишечника гусеницы, набитый шизонтами и спорами (по Штемпелю из кн. Грассе) Кроме Nosema apis и N. bombycis не представляет особых затруднений добыть материал по микроспоридиям, паразитирующих в рыбах. Чаще других встречается паразитирующая в колюшках Glugea anomala. Этот вид образует на теле рыб опухоли в форме горошин. Массовое заражение вызывает гибель рыб. Споры этого вида по своему строению сходны с таковыми Nosema.
Тип Spongia— губки При изучении губок используют материал, легко добываемый в наших северных морях и в пресных водах. Это представители групп Сака-геа и Cornacuspongia. Наиболее ясное представление об общем плане организации губок можно получить при изучении одиночных известковых губок; поэтому в качестве основного объекта предлагаем разбор организации Sycon. Пример более сложно организованной губки дан в виде пресноводной бадяги. Необходимо иметь в виду, что многообразие губок разобранными здесь примерами далеко не исчерпывается. Особенно разнообразно строение скелетных элементов губок. КЛАСС CALCISPONGIA (CALCAREA) — ИЗВЕСТКОВЫЕ ГУБКИ ОТРЯД HETEROCOELA Sycon raphanus О. Schmidt ( = Sycandra raphanus Auct.) Материал и методика изучения. Sycon raphanus (из сем. Sycettidae) — обычная форма, находящаяся на каменистом грунте, на глубине 15—20 м и больше вместе с красными водорослями в наших северных морях. Каждая драга с этих глубин обычно приносит несколько экземпляров данной губки. Для изучения лучше воспользоваться молодыми, более мелкими экземплярами не длиннее 4—5 мм. Разбор строения ведут на срезах (продольных и поперечных) из материала декальцинированного и из необработанного кислотой. В последнем случае изготовляют очень толстые срезы бритвой от руки, слегка подкрашенные квасцовым кармином. Такие срезы (особенно продольные) позволяют составить хорошее представление о расположении системы полостей в теле губки и особенно о расположении скелетных элементов. Из декальцинированных губок (после обработки 1%-ным раствором соляной или азотной кислоты в 70° спирте в течение 1—2 суток) изготовляют обычным способом срезы, но также сравнительно толстые (10—12 мкм). На этих срезах изучают гистологические особенности объекта. Для фиксации применяют либо сулему с уксусной кислотой, либо какой-нибудь осмиевый фиксатор (например, крепкая жидкость Флемминга). Мелкие экземпляры фиксируются целиком, крупные же должны быть разрезаны на куски. Срезы окрашивают гематоксилином. При изучении спикул материал вываривают в течение нескольких минут в 20%-ном
Рис. 130. Sycon raphanus. Общий вид губки (Х10) с вскрытой пара-гастральной полостью (со стенной таблицы Пфучеллера) растворе едкой щелочи в жавелевой воде Осадок из спикул промывают многократно дистиллированной водой (лучше при помощи центрифуги), вылавливают пипеткой на предметное стекло, на котором и высушивают над пламенем спиртовки. Сухие спикулы заделывают в бальзам, причем препарат следует покрыть покровным стеклом с восковыми ножками. Общая морфология. S. raphanus имеет вид вытянутого в длину конического, овального или веретеновидного мешка, прикрепляющегося суженным основанием к субстрату (рис. 130). Длина взрослых экземпляров достигает 1 см и больше. Поперечное сечение — правильно округлое. На свободном конце помещается, иногда сдвинутый несколько набок, osculum, обычно окруженный воронкообразным перистомом с оскулярной кроной спикул. Цвет губки обычно желтовато-серый. Внутренняя парагастральная полость цилиндрической формы суживается в области osculum, ее стенка достигает наибольшей толщины в базальной части губки. С наружной по верхности выдаются многочисленные собранные пучками ворсинки, шипи-ки — это выступают над поверхностью спикулы дермального скелета. Поверх ность тела пронизана отверстиями (дермальными порами), ведущими в приводящие (интеркалярные) полости. Наличие последних устанавливается лучше всего на толстых срезах (рис. 131). В толще стенКи тела, кроме того, залегают радиальные цилиндрические жгутиковые каналы (камеры), широкими отверстиями (апопилями) сообщающиеся с пара-гастральной полостью. Каждая камера сохраняет правильную цилиндрическую форму только у молодых экземпляров, в то время как у старых их концы разветвляются и анастомозируют друг с другом. Приводящие каналы сообщаются с жгутиковыми камерами порами (прозопилями) диаметром (на фиксированном материале)- 10—20 мкм. Скелет. Скелетные элементы у S. raphanus представлены спикулами трех категорий. Их приходится рассматривать на препаратах из губок, вываренных в едкой щелочи. Первая категория — так называемые одноосные, монаксонные иглы, прямые, постепенно утончающиеся и за- 1 Жавелевая вода — крепкий раствор едкого натра, насыщенный хлором. Обращаться с осторожностью, так как легко проедает ткани и портит металлические предметы.
остряющиеся на концах (рис. 132). Размеры их различны. Наиболее крупные достигают 1 мм и более в длину, в то время как мелкие бывают всего в несколько десятков микрон. Вторая категория спикул — четырехосные, тетраксонные, составлены из четырех ответвлений каждая. Три образуют базальный треугольник с широко расставленными концами, над которым поднимается апикальная четвертая ветвь (рис. 132, В). Наконец, третья категория спикул — трехосные, триаксонные, составлены из трех ответвлений — двух базальных ветвей, иногда с таким большим углом между ними, что они являются как бы продолжением друг друга, и одной апикальной, часто более длинной, чем базальные (рис. 132). Базальные отростки спикул двух последних типов часто бывают слегка изогнуты по направлению к апикальному отростку. Каждая спикула известковая, в центре имеет тонкий каналец, заполненный органическим веществом. Его обнаружить удается при больших увеличениях. Располагаются спикулы в теле губки весьма закономерно и группируются следующим образом (разобрать на толстых, продольных и поперечных срезах, сделанных из недекальцинированного материала). К поверхности па-рагастральной полости прилегают тонким слоем трех- и четырехосные иглы. Их базальные отростки ложатся параллельно эпителию, а каждый Рис. 131. Sycon raphanus. Часть продольного разреза через стенку тела (схематизировано) (из ки. Коршель- та и Гейдера): J — прозопили, 2 — пора, 3 — интеркалярная полость, 4 — жгутиковая камера, 5 — апопили Рис. 132. Sycon raphanus. Спикулы. А— общее расположение в области жгутиковой камеры (Х75) (из кн. Геккеля); — Б — четырехосная спикула — гелотроп; В — четырехосная игла — тризна; Г — склеробласт; Д — редко встречающийся тип одноосной иглы с зубчиками (Х240) (из кн. Шульце): 1 — трехосные иглы, один из отростков которых выдается в парагастральную полость, 2 — трех- и четырехосные иглы, расположенные вдоль жгутиковой камеры, 3 — одноосные иглы'
Рис. 133. Sycon raphanus. Фрагмент продольного разреза через стенку тела (Х400) (из кн. Шульце): 1 — звездчатые клетки мезенхимы, 2 — яйцевые клетки на разных стадиях созревания, 3— приводящие каналы (интеркалярные полости), 4— хоаноциты, выстилающие стенкн жгутиковых камер, 5—клетки плоского эпителия, выстилающего приводящие каналы, в разрезе, 6 — спикулы, 7 — клетки стенок приводящих канальцев, вид с плоскости апикальный отросток либо выдается в парагастральную полость и торчит, слегка загибаясь к osculum (рис. 132), либо направляется вдоль радиальных жгутиковых камер, образуя их пристеночный скелет. Кроме того, многочисленные трех- и четырехосные спикулы располагаются около радиальных камер, вытягиваясь вдоль их стенок своими апикальными отростками, а базальными — параллельно продольной оси тела. Дистальный конец каждой камеры одевается целой шапочкой (конусом) из спикул, преимущественно одноосных, выдающихся пучком над поверхностью тела. Эти пучки составлены из крупных спикул вперемежку с мелкими, очень тонкими элементами. Наконец, последняя группа спикул залегает в области около озси-lum, поддерживая перистомальную воронку. Здесь видны главным образом трех- и четырехосные иглы, между которыми вклиниваются гигантские одноосные, изредка зазубренные, достигающие 1—3 мкм в длину и выдающиеся наружу. За их-то° счет и формируется оску-лярная крона спикул. Гистология. На срезах через декальцинированную губку следует познакомиться с основными особенностями гистологического строения S. raphanus. Поверхность тела, парагастральная полость и приводящие каналы выстланы плоскими клетками эпителия со сплющенными ядрами (рис. 133). Стенки жгутиковых каналов (камер) составлены из воротничковых жгутиковых клеток — хоаноцитов. На срезах и воротнички сохраняются очень плохо, и удается рассмотреть только тело этих клеток с ядром в центре каждой. Ядра богаты хроматином и поэтому хорошо видны на препарате в виде резко окрашенного слоя вблизи поверхности камер. Структуру хоаноцитов можно рассмотреть только in vivo, расщипывая губку иглами или изготовляя из нее от руки срезы и рассматривая их в воде. Тело
Рис. 134. Sycon raphanus. Хоаноциты различной формы (Х1350) (из кн. Шнейдера): 1 — жгутик, 2 — воротничок, 3 — базальное зерно жгутика, 4 — корне-* вая нить жгутика, 5 — ядро, 6 — сократительная вакуоль Рис. 135. Sycon raphanus. Мезоглея на срезе (Х750) (из кн. Шнейдера): I — спикулы, 2— звездчатые клетки, 3 — перерезанные приводящие ка-налы, 4 — археоцит
клетки суживается дистально, и от этого конца отходит цилиндрический воротничок, достигающий половины высоты клетки (рис. 134). Жгутик, выходящий изнутри воротничка, имеет длину, вдвое превышающую высоту клетки. В цитоплазме хоаноцитов заметны многочисленные зернистые включения, главным образом пищевые и сократительные вакуоли (одна или несколько). При этом удается заметить плазматические отростки, которыми эти клетки закрепляются в мезоглее. В студенистой массе мезоглеи следует рассмотреть некоторые клеточные элементы. Во-первых, можно видеть разбросанные изредка звездчатые клетки с длинными отростками, зернистой цитоплазмой и ядром, занимающим значительную часть центрального отдела клетки. Это соединительнотканные элементы — колленциты (рис. 135). Отростки их ветвятся и могут анастомозировать с таковыми соседних клеток. Кроме того, удается рассмотреть и амебоидные элементы — археоциты и все переходы между ними и половыми клетками. Они также отличают- Рис. 136. Sycon raphanus. Часть поперечного разреза стеики тела (Х550); (из кн. Шульце): /•«-спикулы, 2 хоаноциты, 3 — крупные клетки амфибластулы* 4 — мелкие жгутиковые клетки амфибластулы, 5—археоцит, 6 — приводящие каналы, 7 — звездчатые клетки мезоглеи
ся крупным пузыревидным ядром. Цитоплазма археоцита окрашивается довольно интенсивно, чем они и выделяются среди других клеточных элементов. У крупных губок в мезоглее можно найти половые клетки и развивающиеся зародыши. На Ьрезах попадаются сформированные амфибластулы (рис. 136), в составе которых следует отметить крупные клетки нижнего полюса, лишенные ресничек, и мелкие верхнего полюса с ресничками. Наконец, в мезоглее можно разыскать и склеробласты — веретеновидные клетки с маленьким ядром и заложенным в цитоплазме зачатком спикулы. КЛАСС DEMOSPONGIA — ОБЫКНОВЕННЫЕ ГУБКИ ОТРЯД CORNACUSPONGIA — КРЕМНЕРОГОВЫЕ ГУБКИ Бадяга Материал и методы изучения. Бадяги — обычные пресноводные губки. Наиболее часто встречаются представители двух родов: Spongilla lacustris L., Ephydatia mullert (Lieberkiihn) и E. fluviatilis (L.) из сем. Spongillidae. Общий план строения этих видов чрезвычайно схож, различие заключается главным образом в деталях строения скелетных элементов, так что не имеет никакого значения, какой вид будет взят для изучения. Встречаются губки в различных как стоячих водоемах типа прудов, озер, так и в текучих — реках и ручьях. Прирастают губки к любому субстрату, избегая, однако, заиления. Даже живые объекты (например, раковины моллюсков) могут служить субстратом для бадяг. Наиболее многочисленны они вблизи берега и не заходят далеко вглубь. Добывают губок непосредственно на дне водоема или с берега, а также с лодки и вытаскивают руками или сачком, скребком. Изучение ведут и in vivo, и на препаратах. Живые клеточные элементы рассматривают после расщипывания иглами кусочка губки в воде или используют особый род культивирования тонкого слоя губки на покровном стекле (см. ниже). Препараты изготовляют прежде всего в виде толстых срезов бритвой от руки из фиксированного объекта, окрашивают кармином и заключают в бальзам так же, как и любой тотальный препарат. При этом в разрез должны обязательно попасть геммулы. Далее для изучения спонгинового скелета следует кусочки или лучше толстые срезы мацерировать продолжительное время (неделями) в изредка сменяемой воде. После мацерации изготовляют тотальные препараты, окрашенные фуксином с пикриновой кислотой (объект выдерживают около 10 мин в насыщенном спиртовом растворе пикриновой кислоты, к одному кубику которой прибавляют 5—10 капель 1%-ного раствора кислого фуксина в воде). После окраски объект следует промыть в спирте, далее его обезвоживают, просветляют и заделывают в бальзам. Наконец, для изучения спикул следует выварить кусок губки с геммулами в серной кислоте или хромовой смеси. В химическую пробирку опускают кусочек губки, прибавляют 2—3 кубика разбавленной вдвое крепкой серной кислоты или хромовой смеси и кипятят в течение 1—2 мин, после чего ткань губки и геммулы разрушается. Осевшие на дно пробирки спикулы промывают многократно дистиллированной водой (лучше при помощи центрифуги), осадок переносят пипеткой на предметное стекло, высушивают над спиртовкой и заделывают в бальзам. Определение бадяг следует вести по книге П. Д. Резвого «Губки», Фауна СССР (1936). Морфология. Пресноводные губки определенной формы не имеют. Форма губок зависит от особенностей субстрата, на котором они сидят. Ephydatia остается всю жизнь в виде неправильных наростов и корок (рис. 137, Л), во взрослом состоянии достигающих толщины в не-
Рис. 137. Общий вид губок (из кн. Шредера). А — Ephidatia тйР leri (натуральная величина); Б — Spongilla lacustris (уменьшено) сколько сантиметров. У Spongilla от таких плоских наростов поднимаются ветвистые выросты (рис. 137, Б). Размер колоний увеличивается с возрастом: осенью старая губка отмирает, за зиму обычно не успевает распасться и на ней развиваются новые молодые губки из старых геммул. Таким образом могут образоваться скопления массой в несколько килограммов. Цвет губок желтовато-серый, бурый, красноватый, в зависимости от цвета иловых частиц, заносимых во внутренние полости. На свету губки часто приобретают ярко-зеленую окраску, зависящую от присутствия внутри них зоохлорелл. Бадяги обладают своеобразным запахом, уловить который можно, растирая губку между пальцами. Время от времени с поверхности тела губки поднимаются прозрачные оскулярные трубки (рис. 138), которые могут вытягиваться до 10 мм в длину при ширине 2—3 мм. Оскулярные трубки при прикосновении к ним или при сотрясении медленно втягиваются внутрь в течение нескольких минут. Вытягивание совершается гораздо медленнее. Через них вода выбрасывается из тела губки наружу, что можно хорошо наблюдать, впрыснув шприцем взвесь кармина в толщу губки. Струи воды с красителем начинают бить из трубок на расстояние нескольких сантиметров. Поверхность губки покрыта дермальной мембраной, местами легко отстающей от подлежащих тканей. Содрав пинцетом участок мембраны, следует рассмотреть его под микроскопом, тогда хорошо видны по-
ры. Каждая из них является внутриклеточным просветом специальной клетки — пороцита (рис. 139). Диаметр пор в раскрытом состоянии — около 50 мкм. Засасывание воды через поры удается наблюдать в аквариуме, выпуская пипеткой около живой губки облачко карминовой взвеси. Частички кармина как бы прилипают к поверхности тела и исчезают внутри. Система каналов у взрослой губки не поддается рассмотрению. Можно только более или менее разобрать субдермальные полости, сообщающиеся с наружной средой посредством пор дермальной мембраны. На дне субдермальных полостей начинаются приводящие каналы — неправильные полости и протоки, пронизывающие тело губки. В стенках этих каналов имеются отверстия, ведущие в очень небольшие жгутиковые камеры (рис. 140). Рассмотреть последние можно только in vivo, использовав специальный метод выращивания тонких пластинок регенерирующей губки на покровных стеклах. Для этого лучше использовать быстрей растущую Spongllla lacustris. Цилиндрический отросток этой губки разрезают вдоль, небольшой кусочек плоскостью прикладывают к большому покровному стеклу и помещают в аквариум либо с проточной водой, либо с водой, сменяемой по крайней мере один раз в сутки. Ткань губки прирастает к стеклу, и от кусочка распространяется во все стороны тонкая пленочка, увеличивающаяся постепенно в толщину. Приблизительно через неделю в ней формируется система каналов и появляются жгутиковые камеры. Такое стекло, положенное на специальных стеклянных подставках в маленький сосуд с водой вниз губкой так, чтобы вода не покрывала стекла сверху, позволяет рассматривать в проходящем свете при любом увеличении (вплоть до иммерсии) детали устройства жгутиковых камер. Каждая из них шарообразной формы, имеет в диаметре 25—50 мкм (рис. 140). С приводящей системой эти камеры сообщаются несколькими узкими отверстиями (прозопилями) . В отводящую же систему они открываются очень широким апопилем. Жгутиковые воротничковые клетки (хоаноциты) выстилают внутренность камеры одним слоем и концентрируются главным образом около прозопилей (рис. 141), оставляя свободной стенку вблизи апопиля. Тела хоаноцитов располага- Рис. 138. Ephidatia miilleri. Оскулярные трубки (слабо увеличено (из Резвого) Рис. 139. Ephidatia miilleri. Дермальная мембрана с порами, вид с поверхности (Х250) (из кн. Резвого): i — пузыревидные клетки, 2— цитоплазма пороцита, 3 — пора, 4 — ядра клеток покровного эпителия
Рис. 143. Ephidatia miilleri (из кн. Резвого). А — археоциты в движении (X 1 000); Б — пузыревидные клетки (Х/50) Среди обрывков ткани губки можно разыскать амебоидные элементы (рис. 143, Л) и наблюдать за их движением. Диаметр археоцитов около 20 мкм. Звездчатые клетки, которым приписывается выделение студня мезоглеи, при таком способе изучения обычно не видны. У некоторых видов Ephydatia (Е. miilleri, например) мы замечаем в мезоглее особые пузыревидные клетки диаметром до 35 мкм. Каждая такая клетка имеет овальную форму и характеризуется наличием громад- ной вакуоли, наполненной прозрачным содержимым (см. рис. 143, Б). Далее можно обнаружить в мезоглее и половые клетки —• именно яйцевые, которые выделяются среди других клеточных элементов, своими крупными размерами (до 100 мкм). Они сохраняют амебоидный облик и обычно окружаются слоем археоцитов, образующих вокруг них род фолликула. В мезоглее же лежат и тельца бесполого размножения —• геммулы (см. ниже). Скелет. В мезоглее располагается довольно хорошо развитый скелет. Прежде всего следует изучить препараты, изготовленные из мацерированного материала. На них удается без труда обнаружить скелетные элементы двух категорий: во-первых, кремневые спикулы, и, во-вторых, спонгиновые волокна. Спикулы собраны кучками и склеиваются друг с другом спонгином — образуется скелетная сеть из ячей неправильной формы. Количество спонгина у бадяги невелико, и роговые элементы лучше всего видны по углам ячеек (рис. 144). Среди пучков спикул выделяются главные, которые идут перпендикулярно к поверхности тела и упираются в дермальную мембрану, образуя на ней заметные снаружи мелкие конические возвышения — конули. Спикулы рассматриваются на препаратах, изготовленных вывариванием в кислоте. Они у бадяги всегда бывают двух сортов: мегасклеры и микросклеры (рис. 145). Первая категория спикул составляет главным образом пучки скелета. У Spongilla lacustris мегасклеры слегка изогнуты, заострены на концах, имеют гладкую поверхность и достигают в длину 200 мкм. У нее же в состав пучков входят так называемые паренхимные микросклеры, более мелкие, изогнутые и заостренные, но покрытые массой мелких шипиков (рис. 145, Б). Наконец, микросклеры особого вида покрывают поверхность геммул. Эти гем-мульные микросклеры мелкие, шиповатые, но шипики посажены реже по сравнению с паренхимными микросклерами (рис. 145, В). У Ephydatia мегасклеры большей частью шиповатые, но заостренные концы спикул обычно остаются голыми (рис. 145, Г). Микросклеры же у нее располагаются только на поверхности геммул и представлены своеобразными амфидисками (рис. 146)—короткими спикулами, составленными из двух параллельных, сильно вырезанных пластинок (звездчатых), соединяющихся сравнительно коротким (Е. miilleri) или,
/ Рис. 144. S pong ilia lacustris. Скелет после мацерации (X50) (из кн. Резвого): / — спикулы, 2— спонгин (изображен черным) V А Рис. 145. Спикулы бадя-ги (из кн. Резвого). А — мегасклера Spongilla lacustris; Б — паренхимные микросклеры Spongilla lacustris; В — геммуль-ные микросклеры Spongilla lacustris; Г — мегасклера Ephidatia mulleri (Х350) Рис. 146. Амфидиски. А—Ephidatia mulleri; Б — Ephidatia fluviatilis (Х50) (из кн. Резвого) Рис. 147. Spongilla lacustris. Гем-мула (Х60) (из кн. Резвого): / — поровое отверстие, 2 — мегасклеры, 3 — геммульные микросклеры
наоборот, длинным (Е. fluviatilis) стержнем. Амфидиски своими пластинками прилегают изнутри к поверхностной оболочке геммул, образуя правильный слой. Промежутки между ними заполнены воздухом. В центре каждой спикулы (особенно это относится к мегасклерам) проходит осевая нить из органического вещества, хорошо заметная на готовых препаратах в виде канальца вдоль спикулы. Геммулы. В мезоглее бадяги к концу лета (или в начале осени) начинают формироваться геммулы, призванные при отмирании губкизи-мой пережить и развиться следующей весной в новых губках, которые поселяются на отмершем материнском организме. Геммулы у бадяги имеют правильную шарообразную форму (рис. 147). На одном из полюсов ее видно поровое отверстие с небольшой оторочкой у Spongilla lacustris или оно приподнимается воронкой у Ephydatia miilleri. Внутри геммулы собран комок археоцитов с запасом питательного материала, покрытый двойной оболочкой. Между наружным и внутренним слоем ее располагаются микросклеры. Их меньше у Spongilla, и они имеют типичный игольчатый характер. У Ephydatia амфидиски в большом количестве заполняют все пространство между обеими оболочками. Геммулы выносят замораживание благодаря развитию теплоизоляционного воздушного слоя и могут высыхать, сохраняя жизнеспособность в течение нескольких лет.
Тип Coelenterata — кишечнополостные I КЛАСС HYDROZOA - ГИДРОИДНЫЕ Класс Hydrozoa представляет собой довольно обширную группу животных, большинство которых живет в морях. Изучение их лучше начать с пресноводных гидр, которых легко найти в природе и которые позволяют детально ознакомиться с организацией одиночного гидроидного полипа. Гидры имеют еще и то преимущество перед другими объектами, что их почти всюду можно иметь в живом виде, и, следовательно, можно поставить ряд наблюдений над живыми объектами. Среди морских колониальных форм (отр. Leptolida) с организацией подотряда Athecata следует ознакомиться на примере Tubularia, позволяющей вместе с тем изучить строение гонофоров. Дополнительными объектами для Athecata взяты часто встречающиеся в наших северных морях представители родов Clava и Согупе. В качестве основного объекта изучения Thecaphora лучше всего взять широко распространенную в морях СССР Obelia, которая дает вместе с тем типичный пример метагенеза. Разнообразие форм Thecaphora не позволяет ограничиться одним представителем этого подотряда, и в качестве дополнительных объектов приводится описание Sertularia и Aglaophenia. Кроме медузы Obelia, являющейся представителем лептомедуз, необходимо изучить организацию антомедуз. В качестве представителя последних рассматриваются Sorsia. Отряд Trachilyda специально не рассматривается. ОТРЯД HYDRIDA Hydra oligactis Pallas — стебельчатая гидра Материал и методы изучения. Пресноводных гидр легко найти в прудах, озерах и медленно текущих реках, на водяных растениях, камнях, сучьях и т. п. Чтобы обнаружить гидр, следует брать небольшие веточки растений (например, элодеи), переносить их в банку с чистой водой и просматривать на свет. При этом легко удается обнаружить гидр невооруженным глазом. Размеры их варьируют в пределах при- 1 Стебельчатая гидра в 1917 г. П. Шульце (Р. Schulze) была выделена из рода Hydra в самостоятельный род Pelmatohydra. Однако в 1948 г. Юер (Ewer) в результате обстоятельной ревизии систематики гидр вновь объединяет роды Hydra н Pelmatohydra, считая, что наличие стебля не является достаточным и надежным признаком для обоснования самостоятельного рода.
близительно от 2—3 мм до I —1,5 см (не считая длины щупалец) в зависимости от вида и физиологического состояния животного. Гидры хорошо живут в аквариумах с водяными растениями. Чтобы они длительно жили и размножались, их следует регулярно кормить. Лучшей пищей являются дафнии. При отсутствии их, особенно зимой, гидр можно питать личинками Chirono-mus, нарезанными предварительно на куски, или даже маленькими кусочками дождевого червя. Если пища неподвижна, то приходится остроконечным пинцетом подносить ее непосредственно к щупальцам гидры. В естественных условиях гидру удается находить в водоемах в северной и средней полосе СССР приблизительно с июня до конца сентября. В летние месяцы она размножается лишь вегетативным путем. Образование половых продуктов наблюдается обычно лишь осенью. После полового процесса гидры отмирают и весной вновь развиваются из оплодотворенных перезимовавших яиц. В искусственных условиях в аквариумах можно содержать гидр в течение всей зимы, причем они размножаются путем почкования. Основными условиями для этого служат более или менее равномерная комнатная температура и регулярное кормление. Встречающиеся в пресных водах гидры относятся к двум родам Chlorohydra и Hydra. Hydra oligactis (см. рис. 149), обычно называемая стебельчатой гидрой, характеризуется относительно длинным стебельком. Chlorohydra обладает симбиотическими зелеными водорослями в клетках тела и поэтому окрашена в ярко-зеленый цвет. Окраска других видов гидр (серая, коричневатая, красноватая) зависит от цвета энтодермы, клетки которой имеют многочисленные, главным образом пищевые включения. Изменяя характер питания гидр, можно менять их окраску. При изучении гидры следует применить разнообразную методику. Многие черты строения ее можно разглядеть на живом объекте под лупой, бинокулярной лупой и микроскопом. Для изоляции отдельных элементов тканей применяется мацерация, которую производят одним из следующих способов. Живую гидру помещают на 20— 30 мнн в 30° спирт. После этого ее переносят осторожно пипеткой на предметное стекло в воду и слегка придавливают покровным. При этом гндра распадается и удается разглядеть отдельные клетки. Более совершенен метод, предложенный Роскиным. Живую гидру помещают на 1 мин в смесь, состоящую из 9 частей 5%-ного раствора уксусной кислоты и 1 части 2%-ного раствора осмиевой кислоты. После этого ее переносят в каплю воды на предметное стекло и расщепляют иглами или кисточкой. Получается большое число совершенно изолированных и хорошо сохранившихся клеток. Дополнительно препарат можно подкрасить каким-нибудь водным основным красителем, чтобы отчетливее выявить ядра. Рекомендуется использовать фазо-контрастное устройство. Кроме мацерации для изучения строения гидры необходимо изготовить срезы как поперечные, так и продольные толщиной 5—7 мкм. Фиксировать гидру для срезов можно различными способами. Удовлетворительные результаты дает сулема с уксусной кислотой и смесь Буэна. Хорошо фиксирует гидр смесь Шампи. Окрасить срезы лучше всего железным гематоксилином с подкраской эозином. Хорошие результаты дает также окраска эозиназуром. Ее нельзя, однако, применять после фиксации по Шампи. Для окраски срезов можно также рекомендовать смесь Маллори, особенно отчетливо выявляющую основную пластинку. Тотальные препараты гидр дают гораздо меньше для изучения, чем живой объект, поэтому изготовление их не имеет особенного смысла. Для изучения пищеварения гидры можно применить некоторые специальные методы кормления окрашенной пищей, о которых будет сказано ниже. Изучение живого объекта. Тело Hydra oligactis имеет более или менее правильную цилиндрическую форму. Одним концом гидра обычно прикрепляется к субстрату. На противоположном помещается ротовое отверстие, окруженное щупальцами. В самом теле гидры различают следующие части, терминологию которых мы применяем по Гелею (см. его работу в Zool. Anzeiger, Bd. LXIV, H, 5/6, 1925, с. 117—125). Верхний конец, окруженный щупальцами и несущий ротовое отверстие,
носит название гипостома. За ним следует желудочный отдел, переходящий в стебелек. Последний по сравнению с желудочным отделом имеет несколько меньший диаметр. Стебелек заканчивается подошвой, которая непосредственно и прикрепляется к субстрату. Желудочный отдел обычно отличается от стебелька и по окраске. Он окрашен в более темный коричневатый цвет. Это зависит от того, что в этом отделе совершается пищеварение и эктодермальные клетки его богаты включениями. Указанные отделы тела гидры отличаются и по гистологическому строению, о чем подробно будет сказано ниже. Число щупалец у Н. oligactis варьирует от 5 до 8—9. Изредка можно встретить и большее число щупалец. Чаще всего наблюдается 6— 7 щупалец. Длина щупалец различна, так как они обладают способностью сильно вытягиваться и сокращаться. Особенно длинными бывают щупальца у голодающих гидр, где они во много раз могут превосходить длину тела. Поверхность щупалец не гладкая. При рассматривании животного под бинокуляром или при малом увеличении микроскопа отчетливо видны многочисленные небольшие утолщения. Они представляют собой батареи стрекательных клеток, расположенные в очень большом числе на щупальцах. Если слегка придавить гидру покровным стеклом, то можно рассмотреть строение разных типов стрекательных клеток. Их удобнее, однако, изучать на мацерированном материале. Если содержать гидр в аквариуме, то иногда удается наблюдать их своеобразный способ движения (рис. 148). Он заключается в том, что гидра оральным концом прикрепляется к субстрату при помощи щупалец. После этого подошва отрывается от субстрата и гидра прикрепляется ею в новом месте. При этом нередко гидра в течение некоторого времени как бы «стоит на голове», прежде чем прикрепится вновь подошвой. Рис. 148. Последовательные стадии передвижения гидры (по Трамблэ)
На живой гидре следует познакомиться со способностью ее тела и щупалец к сокращению. При механическом или ином раздражении гидра быстро сокращается. Тело ее укорачивается и становится толще, так что вся гидра превращается как бы в комочек. Щупальца также сильно укорачиваются и утолщаются. При прекращении действия раздражителя гидра довольно скоро вновь вытягивается и принимает обычную форму. Сокращение тела гидры происходит временами и без всякого раздражения извне. Такие «спонтанные сокращения», вероятно, играют роль при дыхании и, возможно, захвате пищи. Кроме указанных форм движения и сокращения гидры способны еще перемещаться по субстрату путем медленного скольжения на подошве. Механизм этой формы движения в достаточной степени еще не выяснен. На живом материале следует также провести наблюдения над почкованием. Чтобы вегетативное размножение имело место, необходимо регулярно питать гидр и содержать их при комнатной (не низкой) температуре. Для удобства просмотра и зарисовки материала рекомендуется рассадить гидр в небольшие кристаллизаторы. У Н. oligactis почки никогда не образуются в области стебелька. Зона почкования располагается над стебельком. Почки образуются в известной последовательности. Первая почка формируется у самой границы желудочного отдела и стебелька. Следующая образуется несколько ближе к оральному концу и т. д. При этом самая зона форми- Рис. 149. Hydra oligactis. Различные стадии почкования (рисунок с живого объекта при небольшом увеличении)
рования почек располагается по спирали вокруг продольной оси животного (рис. 149). Почка сначала имеет вид небольшого вздутия на теле материнского организма. Ее рост совершается довольно быстро. Вскоре на дистальном конце почки начинается образование щупалец. У Н. oligactis щупальца закладываются не все сразу. Сначала образуются лишь два щупальца, затем формируется третье, четвертое и т. д. до тех пор, пока не образуется нормальное их число.. Во время формирования щупалец образуется и ротовое отверстие. После того как образовались щупальца, дочерняя гидра отделяется от материнского организма. При благоприятных условиях температуры и питания весь процесс развития почки завершается в 2—3 дня. Образование половых продуктов на живых гидрах удается наблюдать обычно лишь осенью. Гидры, приступившие к формированию гонад, почти никогда не почкуются. Н. oligactis в отличие от некоторых других видов гидр является раздельнополой. Гонады образуются в эктодерме в виде характерных набуханий. Порядок появления и характер расположения гонад в общем соответствует таковому почек. Семенники образуются в большем количестве, чем яичники (рис. 150). О гистологическом строении гонад будет сказано ниже, так как с ними придется познакомиться при изучении срезов. Наконец, на живой гидре следует отметить еще одну деталь ее строения, которая часто ускользает от наблюдения. Дело в том, что ротовое отверстие не единственное, ведущее в гастральную полость, как это обычно указывается. На аборальном полюсе в центре подошвы существует еще небольшое отверстие — аборальная пора. У прикрепленной к субстрату гидры аборальная пора обычно закрыта. Если отделить гидру от субстрата и рассматривать ее подошву под бинокуляром, то обычно удается обна- д ружить аборальную пору в виде очень не- большого отверстия. Особенно отчетливо Рис. 150. Hydra oligactis (Х15). аборальная пора выступает, если предвари-с женс7имиКИго/а°дНаамДиМтельно накормить гидру окрашенной в ка-
Рис. 151. Эктодермальная эпителиально-мускульная клетка гидры (по Рос-кину) красными водяными клещами сем. Hydracarina). Функция этого образования у гидры не вполне ясна. Оно, безусловно, не является анальным отверстием, так как непереваренные остатки пищи всегда выбрасываются через рот. Возможно, что аборальная пора играет известную роль при откреплении гидры от субстрата. По-видимому, подошва, при помощи которой прикрепляется гидра, функционирует отчасти как присоска. При откреплении гидры аборальная пора открывается и через нее из гастральной полости в полость присоски поступает жидкость, что облегчает отделение подошвы от субстрата На живой гидре следует также провести ряд наблюдений над питанием и пищеварением. Это удобнее сделать после изучения ее гистологического строения, поэтому эта работа и излагается ниже (с. 207). Мацерация гидры. Прежде чем приступить к изучению срезов, можно рекомендовать произвести мацерацию гидры. Изучение отдельных изолированных клеточных элементов эктодермы и энтодермы облегчит понимание тех соотношений между клетками, которые наблюдаются при изучении срезов. При этом следует иметь в виду, что на мацерированном материале удается отчетливо разглядеть лишь некоторые клеточные элементы тела гидры и для того, чтобы получить полное представление об ее гистологии, необходимо изучение срезов. Следует применять параллельно оба, указанных выше (с. 193) метода мацерации. При мацерации спиртом получают очень отчетливые картины строения стрекательных клеток, но плохо видны другие клеточные элементы. При мацерации по методу Роскина хорошо сохраняются эпителиально-мышечные и некоторые другие клетки. Из элементов эктодермы обращают прежде всего внимание на эпителиально-мускульные клетки (рис. 151). Каждая клетка состоит из цитоплазматической части и мускульного отростка. Последний в теле гидры обращен в сторону мезоглеи, причем все мускульные выросты эктодермальных клеток направлены параллельно длинной оси животного. Цитоплазматическая часть эктодермальных эпителиально-мускульных клеток имеет более или менее цилиндрическую форму, часто несколько расширяется к дистальному концу. Высота клетки бывает раз- 1 Об аборальной поре и ее значении см. статью И. Канаева в Zool. Anzeiger, Bd. LXXVI, H, 1/2, 1928, с. 37—44.
лична в зависимости от того, на каком участке тела она расположена. На щупальцах эпителиально-мускульные клетки не высоки. На теле, напротив, их длинная ось во много раз превосходит ширину. Цитоплазма имеет обычно многочисленные включения в форме гранул и мелких вакуолей. Ядро пузыревидное с ясно видимым ядрышком. Цри мацерации по методу Роскина ядра очень хорошо видны без всякой специальной окраски. В мускульной части клетки залегает мускульное волоконце (фибрилла), оно отчетливо видно благодаря сильной лучепреломля-емости. Согласно исследованию Роскина сама фибрилла состоит из плотного футляра и более жидкого содержимого. Мускульный отросток имеет иногда довольно значительную длину, превосходящую высоту эпителиальной части клетки. Нужно, однако, иметь в виду, что концы муск-. льных выростов обычно обрываются. Иногда наблюдается ветвление мускульных отростков, особенно часто это имеет место у эпителиально-мускульных клеток эктодермы подошвы. На мацерированных спиртом гидрах очень хорошо видны стрекательные клетки. Они располагаются в эктодерме и особенно многочисленны в щупальцах. Каждая стрекательная клетка состоит из протоплазмы с ядром (без ядрышка) и стрекательной .капсулы, называемой иначе книдой или нематоцистой, причем в мацерированных препаратах значительная часть книд лежит вне клеток. Рис. 152. Hydra oligactis. Различные типы стрекательных клеток (по Шульце). А — пенетранта с невыброшенной стрекательной нитью; Б — пенетранта с выброшенной стрекательной нитью; В—пенетранта, стрекательная нить которой внедрилась в покровы добычи; Г — воль-вента; Д — глютинанта стрептолина; Е — глю-тинанта стреолина. 1 — стрекательная нить. 2 — шипики, 3 — стилеты, 4— шейка, 5— крышечка От стрекательной клетки наружу выдается особый чувствительный волосок — книдоциль. Стрекательная капсула обладает плотной хитиноидной стенкой, наполнена жидкостью и в ней располагается скрученная спирально полая внутри нить, которая может выбрасываться наружу. Стрекательная нить представляет собой впяченное внутрь продолжение стенки капсулы. На препаратах обычно имеется некоторое количество стрекательных клеток с выброшенной нитью. Существует несколько типов стрекательных клеток, отличающихся друг от друга по строению стрекательных капсул. У гидр имеется четыре типа стрекательных капсул (книд). Наиболее крупные пенетранты (рис. 152, А—В). Стрекательная капсула имеет здесь грушевидную форму. На своем дистальном конце она прикрыта крышечкой, раскрывающейся в
Рис. 153. Последовательные стадии выстреливания пенетранты (по Шульце из кн. Канаева) момент выбрасывания нити. Непосредственным продолжением стенки капсулы является шейка, вокруг которой частично закручена нить. На месте перехода шейки в нить имеется три стилета и несколько рядов мелких шипиков. Пенетранты служат главными орудиями нападения. Их нить пробивает покровы добычи. До выстрела пенетранты три стилета (шипа) сложены вместе и направлены вперед (рис. 153). В момент выстрела они вылетают вперед первыми, внедряются в ткани добычи, а затем разворачиваются в разные стороны и назад, увеличивая ранку и закрепляясь в ней наподобие гарпуна. Тотчас же после этого (весь процесс измеряется долями секунды) в образовавшуюся ранку происходит выстреливание нити, которая выворачивается, как палец перчатки, внося вместе с тем ядовитые для жертвы вещества. Шипы, однако, не всегда проникают в ранку, иногда они остаются вне ее, и в ткань жертвы про- никает лишь нить, снабженная очень шипиками. Длина выстреленной нити пенетранты превосходит общую длину книды примерно в 30 раз. Вторую категорию стрекательных капсул представляют собой вольвенты. Они меньших размеров, чем пенетранты, но также приблизительно грушевидной формы. Стрекательная нить образует внутри них петлю (см. рис. 152, Г). При выбрасывании нити она не пробивает покрова добычи, а обвивается вокруг различного рода выступов и придатков (вокруг хитиновых волосков, щетинок и т. п.) (рис. 154). мелкими направленными назад Рис. 154. Вольвенты Hydra oligactis, стрекательные нити которых обвились вокруг хитиновых волосков конечности низшего рачка (по Шульце)
На нити вольвентов также имеются маленькие шипики, направленные назад в сторону книды. Третью категорию стрекательных капсул представляют собой стрептолины (иначе большие глютинанты) (см. рис. 152, Д). Они несколько крупнее вольвент и вытянуты в длину. Обладают длинной нитью, закрученной в покоящейся книде, как в продольном, так и в поперечном направлении. Шейка, как и у вольвент, отсутствует, на нити имеются мелкие, расположенные по спирали шипики. Этот тип книд является, по-видимому, орудием зашиты. Четвертая категория стрекательных капсул — стереолины (малые глютинанты) несколько мельче стрептолин. Нить их образует петли по продольной оси книды (см. рис. 152, Е) и лишена шипиков. При выстреле она оказывается липкой. Стереолины служат, вероятно, для прилипания к субстрату в процессе движения гидры. Стрептолины и стереолины нередко объединяют в общую группу, называемую глюти-нантами. Процесс выбрасывания нити необратим. Стрекательная клетка, выбросившая нить, вскоре погибает. В течение всей жизни гидры происходит новообразование стрекательных клеток за счет особых недифференцированных элементов, так называемых интерстициальных или i-клеток. Последних, однако, на мацерированных гидрах рассмотреть не удается, они видны на срезах. При хорошо удавшейся мацерации из эктодермальных элементов можно еще рассмотреть нервные клетки (рис. 155). Они звездчатые, мультиполярные и обладают длинными отростками. Ядро в нервных клетках крупное, пузыревидное. Из элементов энтодермы при мацерации хорошо видны эктодермальные эпителиально-мускульные клетки. Они в общем напоминают по строению соответствующие клетки эктодермы. Отличается тем, что мускульный вырост здесь развит слабее, длина его меньше. В цитоплазме имеются более многочисленные включения, чем в клетках эктодермы. Среди этих включений различной формы и величины главная масса представляет собой пищевые включения, находящиеся на разных стадиях внутриклеточного пищеварения. Изучение мацерированной гидры необходимо дополнить рассмотрением срезов. Срезы через гидру. (ПО Следует приготовить серию поперечных и про- Рис. 155. Нервные клетки из эктодермы гидры Шнейдеру)
дольных срезов толщиной в 5 мкм. При рассматривании срезов даже при малом увеличении микроскопа ясно видно, что гидра — двухслойное животное — состоит .из двух слоев клеток: наружного — эктодермы и внутреннего — энтодермы, ограничивающих внутреннюю гастральную-полость. Между ними располагается тонкая бесструктурная прослойка мезоглеи — опорная пластинка (рис. 156). Гастральная полость продолжается также и в щупальца, которые являются полыми. Стенки щупалец состоят из тех же слоев, что и стенка тела. Общие гистологические различия между частями тела Н. oligactis сводятся к следующему. Эктодерма щупалец состоит из невысоких эктодермальных клеток. Энтодерма щупалец не имеет мускульных отростков. Опорная пластинка в щупальцах очень тонка. В туловище, а в особенности в стебельке и подошве, опорная пластинка значительно толще, чем в щупальцах. В области гипостома энтодерма образует несколько складок (рис. 157), прилегающих друг к другу наподобие долек апельсина. Соотношение этих складок хорошо поясняет прилагаемая схема. Число складок энтодермы в области гипостома обычно равно шести. Наличие их делает возможным растягивание ротового отверстия, что имеет место при заглатывании пищи, часто превосходящей своими размерами поперечное сечение тела гидры. При заглатывании пищи указанные складки в большей или меньшей степени расправляются. Наиболее богат различными клеточными элементами желудочный отдел тела гидры. Стебелек на срезах окрашивается слабее, чем остальные части тела гидры. Это зависит от того, что клетки энтодермы- Рис. 156. Hydra oligactis (Х80). Поперечный разрез (ориг.): 1 — эктодерма, 2 — энтодерма, 3 — опорная пластинка, 4 — стрекательная капсула, 5 — группа интерстициальных клеток, 6 — железистая клетка энтодермы Рис. 157. Hydra oligactis. Поперечный разрез в области гипостома (по Канаеву): Г —эктодерма, 2 —складки энтодермы
Рис. 158. Гистологическое строение разных отделов тела стебельчатой гидры (поперечные срезы, несколько схематизировано) (по Хайман из Канаева). А— гипостом; Б — туловище; В — подошва; Г — стебель: 1 — эктодерма, 2 — ацидофильные железистые клетки энтодермы, 3—базофильные железистые клетки энтодермы, 4 — интерстициальные клетки, 5 — гранулы секрета в эктодермальных клетках подошвы Рис. 159. Книды и их строение. А— батареи книд на щупальце гидры (по Корда); Б — схема строения батареи книд (по Бялашевичу из кн. Канаева): 1 — батарея книд, 2 — пенетранта, 3 — вольвенты, 4— ядро эпителиально-мышечной клетки стебелька сильно вакуолизированы и относительно бедны включениями. Подошва окрашивается довольно сильно, благодаря наличию в эктодерме ее особых железистых клеток, выделяющих липкий секрет, служащий для прикрепления животного к субстрату. После общего знакомства со строением эктодермы и энтодермы в различных отделах тела гидры следует перейти к более детальному изучению их гистологии (рис. 158). Отдельные клетки как экто-, так и энтодермы не резко отграничены друг от друга и богаты разнообразными включениями, что создает довольно сложную гистологическую картину, при изучении которой хорошо пользоваться иммерсионной системой. Главная масса эктодермы состоит из эпителиально-мускульных клеток, строение которых уже рассматривалось выше. На срезах связи между цилиндрической эпителиальной частью клетки и мускульным выростом не видно. Но миофибриллы мускульного выроста, непосредственно прилежащие к опорной пластинке, особенно при окраске железным гематоксилином, выступают очень отчетливо. На продольных срезах они видны в форме волокон, на поперечных — в виде точек, так как мускульные выросты эпителиально-мышечных клеток проходят параллельно продольной оси гидры. По наружному краю эпителиально-мускульных клеток, граничащему с внешней средой, располагается ряд гранул, образующих в совокупности некоторое подобие кутикулы. Стрекательные клет
ки, подробное описание которых дано выше, хорошо видны и на срезах. Следует отметить их распространение в эктодерме. Вполне сформированные стрекательные клетки обычно внедряются внутрь эпителиально-мускульных клеток. Они особенно многочисленны в эктодерме щупалец, где образуют характерные батареи, хорошо видимые на живой гидре (с. 198). На срезах следует более подробно рассмотреть состав батареи. Каждая батарея помещается внутри одной эпителиально-мускульной клетки (рис. 159) и состоит из 3—15 книд. В центре располагаются одна-две пенетранты, по сторонам от них — стрептолины и стереолины, еще дальше к периферии — вольвенты. Стрекательные клетки, несущие глютинанты и вольвенты в своей базальной части, образуют выросты, направленные к мускульным волоконцам, к которым они, по-видимому, прикрепляются, как к якорю. В области гипостома стрекательные клетки имеются лишь в небольшом количестве. В области желудочного отдела они многочисленны, тогда как в эктодерме стебелька стрекательных клеток очень мало. Книды разных типов распределяются по телу гидры далеко неравномерно. Об их расположении у Hydra oligactis дает представление следующая таблица, составленная Бялашевичем (1914) (в таблице стрептолины и стереолины объединены в общую группу — глютинанты). Таблица соотношения разных типов книд в различных отделах тела гидр, % Область тела П еиет-оанты Глюти - нан ты Вольвенты 1. Щупальца 2. Гипостом и передняя гаст- 28 7 65 ральная часть тела .... 30 65 5 3. Гастральная 44 56 0 4. Ножная 100 0 0 Из таблицы видно, что вольвенты сосредоточены исключительно в передней части тела, в заднем отделе встречаются только пенетранты. В энтодерме функционирующих стрекательных клеток нет, но в ней иногда встречаются перевариваемые отработанные книды, а также молодые, еще не созревшие, которые в дальнейшем попадут в эктодерму.. Среди эпителиально-мускульных и стрекательных клеток располагаются интерстициальные клетки (иначе кратко обозначаемые i-клетка-ми) (см. рис. 158, А, 4). Они небольших размеров, в несколько раз мельче эпителиальных клеток, цитоплазма их сильно воспринимает краску, форма их округлая или овальная. Ядро, по сравнению с массой цитоплазмы, велико. Интерстициальные клетки располагаются в главной своей массе у основания эпителиально-мускульных клеток, около опорной пластинки. Базальные части эпителиальных клеток не тесно прилежат друг к другу, между ними имеются просветы. В них, главным образом, и локализуются интерстициальные клетки, которые часто располагаются группами (см. рис. 158, 4). Больше всего их имеется в
эктодерме желудочного отдела. В стебельке они совершенно отсутствуют. Изредка на препаратах удается наблюдать митотическое деление этих клеток. Значение интерстициальных клеток в жизни гидры очень велико. Они представляют собой недифференцированные, эмбриональ- яые элементы, за счет которых развиваются все другие клеточные эле- Рис. 160. Группа клеток энтодермы гидры (по Шнейдеру из кн. Канаева): 1 — пищеварительная (эпителиально-мускульная), 2 — железистая, 3—чувствительная Рис. 161. Железистые ацидофильные (тектиэпителиальные) эктодермальные клетки гидры (из кн. Канаева) менты как эктодермы, так и энтодермы На срезах, особенно через щупальца, нередко удается разглядеть различные стадии формирования стрекательных клеток из интерстициальных. В период половогс размножения за их же счет образуются и половые клетки. Однако интерстициальные клетки — не единственный источник формирования клеточных элементов тела гидры. Эпителиально-мускульные и железистые клетки как эктодермы, так и энтодермы могут самостоятельно делиться. Лишь стрекательные клетки, по-видимому, совершенно не способны к делению и всегда образуются из интерстициальных клеток. Кроме рассмотренных типов клеток в состав эктодермы входят нервные клетки. Рассмотреть их обычно на срезах не удается. Некоторые авторы описывают в эктодерме особые чувствительные клетки, которые также без специальных методов обработки не видны. Энтодерма также слагается из нескольких типов клеток. Главную массу ее составляют пищеварительные клетки более или менее ясно выраженной цилиндрической формы, снабженные мускульным выростом, прилежащим к опорной пластинке. На стороне, обращенной в пищеварительную _ полость, каждая клетка несет два жгутика. Число жгутов может изредка увеличиваться до трех, четырех и даже пяти у одной клетки. В цитоплазме у основания каждого жгутика располагается базальное тельце. Его удается разглядеть только при условии хорошо удавшейся фиксации. В этом отношении лучшие результаты дает смесь Шампи. Мускульные выросты эктодермальных клеток располагаются в кольцевом направлении, перпендикулярно к продольной оси гидры. Поэтому на продольных срезах они оказы :2О4
ваются перерезанными поперек и видны в знде точек. Напротив, на поперечных срезах хорошо видны мускульные волоконца (фибриллы), лежащие в мускульном выросте эктодермальных клеток. Мускульные элементы энтодермы являются антагонистами мускульных выростов эктодермы. При сокращении их и расслаблении эктодермальной мускулатуры происходит вытягивание тела гидры. На срезах так же, как и на мацерированном материале, в пищеварительных клетках энтодермы видны многочисленные включения. Их особенно много у хорошо накормленных особей. Эти включения частью представляют собой пищевые частицы, частью — экскреторные гранулы. Последние окрашены в темный цвет. Ядро довольно крупное, с ядрышком, располагается в средней части клетки. Пищеварительные эпителиально-мускульные клетки способны к фагоцитозу и внутриклеточному пищеварению. Кроме эпителиально-мускульных пищеварительных клеток в состав энтодермы входят железистые клетки (рис. 160). У гидры описаны два типа эктодермальных железистых клеток. Первый — это тектиэпители-альные, или ацидофильные, клетки (рис. 161). Секрет этих желёз элективно окрашивается кислыми красками (например, эозином), он вы Рис. 162. Hydra oligactis. Продольный разрез в области мужской гоиады (ориг.): 1 = эктодерма, 2 — энтодерма, 3 мужская половая железа Рис. 163. Сперматогенез гидры. А— В — разные стадии развития семенника; Г — образование и развитие сперматид; Д — созревающие и зрелые сперматозоиды в семеннике (па Танрейтеру из кн. Канаева); 1 — сперматогонии, 2 — сперматоциты, 3 — сперматиды и спермин
деляется в пищеварительную полость и обладает протеолитическим действием. Эти клетки не имеют ни мускульных выростов, ни жгутиков. Второй тип железистых клеток — это базофильные клетки. Они иногда имеют жгутики и небольшой мускульный вырост. Они обладают гранулами базофильного секрета. Ацидофильные клетки встречаются в энтодерме гипостома и туловища и отсутствуют в стебельке. Базофильные клетки расположены в основной массе в области гипостома (см. рис. 158, А). Совершенно особый характер имеют эктодермальные клетки Н. oligactis в области стебелька. Они обладают многочисленными вакуолями, напоминая растительные клетки. На препаратах цитоплазма имеет вид Рис. 164. Овогенез гидры (по Брияну из кн. Канаева): 1 — овогония, 2 — питательные клетки Рис. 165. Яйцо гидры (овогоиия) в амебообразной стадии (по Клейненбергу из кн. Канаева) тонких тяжей, располагающихся между объемистыми вакуолями. Пищевые включения отсутствуют. В состав энтодермы входят еще интерстициальные клетки. Количество их, однако, здесь очень невелико. Кроме того, некоторые авторы описывали в составе энтодермы немногочисленные нервные клетки. Видеть их на срезах не удается. Гидры, собранные осенью, позволяют рассмотреть на срезах строение гонад. Последние развиваются за счет интерстициальных клеток в эктодерме (об их расположении на теле гидры см. с. 203). В мужской половой железе (рис. 162) находим различные стадии созревания мужских половых клеток, причем клеточные элементы здесь очень мелки. Сперматогонии располагаются в непосредственном соседстве с мезоглеей. Ближе к периферии лежат сперматоциты и зрелые сперматозоиды. Последние обладают небольшой цилиндрической головкой, короткой широкой шейкой и длинной хвостовой частью (рис. 163). Эпителиально-мускульные клетки в области семенников сохраняются. Они прикрывают гонаду снаружи, их проксимальные части продолжаются вплоть До основной пластинки. В женской половой железе нахо дятся яйцевые клетки на разных стадиях роста. Интересной особенностью яичника гидры является то.
что дефинитивных размеров в яичнике достигает обычно лишь одна яйцевая клетка. В процессе роста более крупные озоциты образуют псевдоподии и поглощают более мелкие. За счет этого фагоцитоза и происходит рост овоцитов. В результате в каждом яичнике лишь одна яйцевая клетка заканчивает рост и становится способной к оплодотворению. В зависимости от того, на какой стадии развития находится женская половая железа, на срезах удается обнаружить различные стадии указанного процесса (рис. 164). В период роста яйцевая клетка образует многочисленные псевдоподии (рис. 165). В конце роста она становится шаровидной, прорывает эктодерму и выходит на поверхность гидры. Зрелое яйцо остается связанным с поверхностью гидры лишь при помощи тонкой цитоплазматической ножки. Самый процесс оплодотворения и первые стадии развития яйца происходят на теле гидры. Вокруг оплодотворенного и развивающегося яйца образуется оболочка, называемая эмбриотекой. Форма эмбриотеки и характер ее скульптуры представляют собой важный систематический признак при определении гидр. Питание гидры. На живом объекте следует проследить процесс захвата гидрой пищи. В качестве последней лучше всего использовать живых дафний. При соприкосновении со щупальцами гидры дафния как бы «прилипает» к ним. Это объясняется действием стрекательных клеток, которые частью пробивают покровы (пенетранты), частью же при помощи нитей обвиваются вокруг волосков добычи (вольвенты). В течение нескольких минут дафния производит резкие движения, пытаясь освободиться, что обычно не удается. Через короткий срок движения добычи прекращаются, что зависит от ядовитого, парализующего действия стрекательных нитей. После этого начинается процесс заглатывания пищи. Движением щупалец добыча приближается к ротовому отверстию. Последнее сильно растягивается, и добыча постепенно заглатывается в гастральную полость. Ротовое отверстие гидры обладает исключительной растяжимостью. Если добыча велика, то в момент заглатывания ее диаметр ротового отверстия превосходит диаметр гидры в несколько раз (3—4 раза). Через 4—5 ч пребывания пищи в гастральной полости непереваренные остатки вновь выбрасываются наружу через ротовое отверстие. В частности, если пищей служила дафния, то выбрасываются все хитиновые части, которые гидрой не могут быть переварены. Изучению процесса пищеварения у гидры посвящено несколько исследований. Согласно работам Беутлер (1924, 1927) у гидры* имеет место как внеклеточное пищеварение в гастральной полости, так и внутриклеточное. Попадающая в гастральную полость пища подвергается действию ферментов, разжижающих белки. Отдельные клетки энтодермы параллельно с этим процессом при помощи псевдоподий заглатывают как твердые частички, так и капельки жидкости. В эктодермальных клетках протекает внутриклеточное пищеварение. Наличие его легко показать следующими простыми приемами, тоже указанными Беутлер. Живых дафний помещают в эмульсию кармина на 2—3 ч. После этого кишечник их оказывается в значительной степени запол
ненным кармином, который также в виде мельчайших частиц оседает на конечностях и других частях тела рачка. Дафнию убивают тонкими иглами, снимают панцирь и скармливают гидре. Через 5—6 ч накормленную гидру подвергают мацерации. В клетках энтодермы удается обнаружить в значительном количестве зерна кармина, которые лежат в пищеварительных вакуолях. Таким образом, кармин оказывается заглоченным эктодермальными клетками, чем и доказывается способность их к активному заглатыванию твердых частиц, попавших в гастральную полость. Скармливать гидрам нужно убитых, а не живых дафний потому, что при захвате живых дафний гидрой последние производят судорожные движения, во время которых часть кармина с них сбрасывается, а кишечник частично освобождается от содержимого. Вместо кармина можно воспользоваться тушью. При этом результаты получаются, однако, менее убедительными, так как в клетках энтодермы всегда имеются темноокрашенные экскреторные гранулы, которые легко спутать с заглоченными частичками туши. Вместо мацерации можно прибегнуть к изготовлению срезов. При этом их не следует окрашивать, чтобы зерна кармина или туши в клетках энтодермы были видны достаточно отчетливо. В процессе пищеварения гидра производит периодически сокращения тела, сопровождающиеся вытягиванием. Эти своеобразные перистальтические движения способствуют перемешиванию пищи и ее равномерному распределению в пищеварительной полости. Кроме того, пищеварительная кашица двигается в пищеварительной полости благодаря постоянной работе жгутиков эктодермальных клеток. ОТРЯД LEPTOLIDA Tubularia sp. Материал и методы изучения. В наших морях встречается несколько видов рода Tubularia. Их можно найти в Баренцевом, Белом и Черном морях, а также вх Японском море. В Каспийском и Азовском морях и в опресненной части Балтийского моря Tubularia не встречается. На Мурманском побережье Т. larynx живут на небольших глубинах, так что добывание материала не представляет особых затруднений. Общую форму колонии и строение отдельных гидрантов следует рассмотреть на живом или фиксированном формалином или спиртом материале при помощи лупы и бинокуляра. Изготовить тотальные препараты отдельных гидрантов и гонофоров, окрасив их квасцовым кармином. Кроме того, приготовить серию срезов, порезав гидранта с гонофорами в продольном направлении. Дополнительно желательно сделать и поперечные разрезы. Для срезов материал фиксируют сулемой с уксусной кислотой или жидкостью Ценкера. Срезы окрашивают железным гематоксилином или гематоксилином Бёмера с подкраской эозином. Описание организации Tubularia мы даем применительно к Т. larynx, от которой другие виды, встречающиеся в наших морях, отличаются лишь некоторыми деталями строения. Изучение живого объекта или тотальных препаратов. Колонии Tubularia (рис. 166) обладают слабо развитой гидроризой1, от которой 1 Гидроризой называются стелющиеся по субстрату корневидные выросты стволов колонии.
Рис. 166. Tubularia larynx. Общий вид колонии. берет начало слабо ветвящийся гидрокаулусветви его заканчиваются отдельными, довольно крупными гидрантами. Здесь имеет место моноподиальный тип ветвления колонии. Это значит, что отдельные ветви колонии представляют собой разрастание в длину тела полипа, который остается на вершине оси. При этом зона роста и почкования помещается непосредственно у основания ветвей. Путем вытягивания базальной части тела отпочковавшихся полипов образуются побочные ветви колонии. Моноподиальный тип ветвления характерен для большинства представителей подотряда Athe-cata, к которму принадлежит и Tubularia. Гидрориза и гидрокаулус покрыты снаружи хитиноидной кутикулой, выделяемой эктодермой и носящей название перидерма, а также перисарка или тэки. Перидерм играет роль наружного скелета колонии. Его толщина у Tubularia невелика. На гидрантов перидерм не распространяется, они являются «голыми». Отсутствие тэки, прикрывающей гидрантов, представляет собой отличительную характерную черту подотряда Athecata. Тело отдельных гидран* тов имеет форму бутыли Рис. 167. Tubularia larynx (х25). Отдельный гидрант (по Альману): /—оральные щупальца, 2 — аборальные щупальца, 3 — гонофоры 1 Отходящие от гидроризы стволы колонии, несущие гидрантов, называются гидрокаулусом.
(рис. 167). Аборальная часть расширена, оральный отдел вытянут и образует гипостом, на конце которого помещается ротовое отверстие Каждый гидрант несет два венчика щупалец. Щупальца орального венчика коротки и непосредственно окружают ротовое отверстие. Абораль ные щупальца гораздо длиннее оральных и прикрепляются к телу поли па у его основания. Каждый венчик слагается из 15—20 щупалец. От тела полипа, несколько ближе к оральному полюсу, чем осно вание нижнего венчика щупалец, но в непосредственном соседстве с ни ми отходят особые щупальцевидные придатки, несущие гонофорь (рис. 167,5). Последние представляют собой редуцированное медузо идное поколение. В них развиваются половые продукты. Tubularia — раздельнополы. Поэтому на одной колонии присутствуют либо муж ские, либо женские гонофоры. Развитие и созревание их совершается I определенной последовательности. Дистально располагаются наиболее зрелые гонофоры. По своей структуре они приближаются к организа ции медузы, отличаясь от последней главным образом слабым разви тием мезоглеи в зонтике и отсутствием паруса (velum). Тип строени? гонофора, который имеет место у Tubularia и обладает основными чер тами организации медузы, называют эумедузоидом. Детали строени? гонофоров следует рассмотреть на срезах, но основные части их виднь и на тотальных препаратах Зрелый гонофор имеет яйцевидную форму. По длинной оси его располагается spadix — часть, соответствующая ротовому стебельку свободноплавающих медуз В эктодерме этой части гонофора и развиваются половые продукты. Наружная стенка гонофора представляет собой несколько редуцированный зонтик со слабс развитой мезоглеей. В зрелых гонофорах spadix выдается наружу на дистальном конце. У женских особей Tubularia оплодотворение яйцевой клетки-происходит в гонофоре, куда из морской воды проникают сперматозоиды. Здесь же протекает и развитие оплодотворенного яйца, которое в это время располагается между spadix и наружной стенкой гонофора. Из яйца развивается сначала личинка — планула, Рис. 168. Tubularia larynx (ХЗО). Продольный разрез (по Кюкенталю): 1 — ротовое отверстие, 2 — эктодерма, 3 — энтодерма, 4— гонофор, 5 — валик у основания аборальных щупалец, 6 — гастральная полость
превращающаяся в свою очередь в так называемую актинулу. Последняя имеет уже два венчика щупалец и приближается по своей организации к полипу. Лишь достигнув стадии актинулы, личинка выходит из гонофора наружу. При изучении тотальных препаратов женских гонофоров в них нередко удается обнаружить указанные выше стадии развития. Актинулы по своим размерам приближаются к spadix гонофора. Срезы через Tubularia. На продольном разрезе через гидранта Tubularia (рис. 168) рассматривают два слоя клеток — эктодерму и энтодерму, которые имеются и у гидры. В состав эктодермы входят те же основные типы клеток. Стрекательные клетки у Tubularia, особенно многочисленные в эктодерме щупалец, более однотипны, чем у гидры. Они обладают яйцевидными стрекательными капсулами. Эктодерма отделена от энтодермы тонкой бесструктурной опорной пластинкой. Энтодерма, выстилающая гастральную полость, в области гипостома образует некоторое количество складок, не обнаруживающих в своем расположении особой закономерности. Опорная пластинка в состав этих складок не вовлекается. Полость с выстилающей ее энтодермой продолжается в ствол колонии — гидрокаулус. Щупальца в отличие от гидры не имеют внутренней полости. Их осевая часть сплошь заполнена клетками эктодермального происхождения. В околородовых щупальцах в дистальной их части клетки располагаются в один ряд. Ближе к основанию и у самого его основания они расположены в несколько рядов. От энтодермы, выстилающей внутреннюю полость, они отделены опорной пластинкой. Осевые клетки щупалец имеют своеобразную гистологическую структуру. Они сильно вакуолизированы, ядра оттеснены к периферии клеток. Имеется некото- Рис. 169. Tubularia larynx. Разрез через основание аборального щупальца (из кн. Гофмана): 1—эктодерма, 2— хордоидная ткань валика у основания щупальца, 3 — энтодерм ма щупальца, 4 — основная пластинка Рис. 170. Схема строения гонофора эумедузоидного типа (по Кюну): 1 — наружная эктодерма, 2 — внутренняя эктодерма, 3 — энтодерма, 4 — половые клетки, 5— spadix
Рис. 171. Tubularia sp. (X250). Продольный разрез через мужской гонофор (по Шнейдеру): 7 — эктодерма spadix, 2—кольцевой канал, 3 — полость, соответствующая субумбрелле, 4 — семенник, 5—энтодерма, 6—полость spadix, 7 — стебелек гонофора ной пластинки она отграничена и от рое сходство в их строении с клет-ками хорды позвоночных. Аборальные щупальца имеют ту же структуру, что и околоротовые за исключением своей базальног части. У их основания располагается особый валик соединительной ткани хордоидного типа, глубоко вдающийся в гастроваску-лярную полость (рис. 169). Это! валик, имеющий опорное значение, является непосредственные продолжением осевой, эктодермальной части щупалец и также развивается за счет энтодермы Он слагается из тесно располо женных друг около друга клетог неправильной формы, сильно ва куолизированных. Клетки эти более крупны, чем соответствующие элементы осевой части щупалец причем их большие размеры обу словлены особо сильным разви тием вакуолей !. Ядра распола гаются у самой периферии тел; клеток. От энтодермы, выстилаю щей гастральную полость, ткан! валика отделена опорной плас тинкой. Особым выростом опор аборальных щупалец (рис. 169) У некоторых видов Tubularia (например, Т. coronata') такой же валик но меньших размеров располагается и у основания ротовых щупалец Выше уже указывалось, что гонофоры могут быть мужские ил! женские. Обычно на срезе попадается несколько гонофоров, перерезан ных в различных направлениях. Для изучения лучше всего выбрат гонофор, перерезанный в продольном направлении. На рис. 170 изо бражена схема строения гонофора эумедузоидного типа, рис. 171 изо бражает действительную картину продольного среза через мужской го нофор Tubularia. Наружный слой эктодермы соответствует эксумбрел ле типичной медузы. На дистальном краю гонофора эктодерма заги бается внутрь и ее внутренний слой отвечает субумбрелле. Межд? 1 В ряде руководств указанная ткань называется мезоглеей и самый валик мезо глеальным валиком. Эта терминологии нам кажется неправильной и может повести недоразумениям. Под мезоглеей понимают бесструктурную, неклеточную массу, рас полагающуюся между экто- и энтодермой и являющуюся продуктом выделения клето двух основных слоев тела Coelenterata. «Мезоглея» же аборальных щупалец Tubulari н некоторых других Athecata имеет клеточное строение и представляет собой не чт иное, как видоизмененную энтодерму щупалец. Происхождение ее из энтодермы под тверждается и историей развития Tubularia.
обоими слоями эктодермы мезоглея почти не развита (в отличие от свободноплавающих медуз), но имеется тоненькая прослойка энтодермы. По краю редуцированного зонтика гонофора, на месте перехода эксумбрел-лы в субумбреллу, энтодерма образует так же, как и у свободноплавающих медуз, кольцевой канал. Полость зонтика не выражена, и между субумбреллой и ротовым стебельком имеется лишь узкая щель, которая не всегда бывает выражена,. Ротовой стебелек, или spadix, снаружи одет эктодермой. Внутренняя полость его, сообщающаяся с полостью ствола, выстлана энтодермой, слагающейся из сильно вакуолизированных клеток. Она не сообщается с наружной средой. В эктодермальном слое spadix мужского гонофора развивается семенник (рис. 171,4). В нем можно рассмотреть разные стадии созревания половых клеток Рис. 172. Tubularia sp. (Х200). Поперечный разрез через женский гонофор (по Шнейдеру): 1 — эктодерма эксумбреллы, 2 — эктодерма субумбреллы, 3 —- актинула, 4 — щупальце ак-тинулы, 5 — яйцевая клетка, 6 — spadix вплоть до зрелых сперматозоидов. Анатомическая и гистологическая картина строения зрелого женского гонофора (рис. 172) несколько сложнее, чем мужского, что зависит от того, что в нем протекает развитие оплодотворенных яиц вплоть Рнс. 173. Tubularia sp. А, Б, В — последовательные стадии развития гонофора (по Шнейдеру): /—«почечное ядро», 2 —эктодерма, 3 — энтодерма, 4 — гастральная полость, 5 — первичные поло* вые клетки, 6— энтодерма spadix. 7 — энтодерма зонтика. Я — кольцевой канал
ДО стадии актинулы, как это отмечалось выше (с. 210). В эктодермальном слое spadix располагается яичник. Между spadix и субумбреллой помещаются развивающиеся зародыши, находящиеся на разных стадиях онтогенеза (рис. 172), в том числе и личинки актинулы. В последних можно рассмотреть эктодерму и энтодерму, выстилающую гастровас-кулярную полость, а также щупальца. Наконец, в полости женского гонофора нередко удается обнаружить сперматозоиды, проникшие сюда из окружающей морской воды. Наряду со зрелыми гонофорами на препаратах нередко попадаются и разные стадии их развития. Гонофоры развиваются из небольших почек, состоящих первоначально из одного слоя эктодермы и слепо замкнутых на дистальном конце. Формирование гонофора начинается с того, что на дистальном конце почки образуется утолщение эктодермы в форме трапеции, состоящее из двух слоев клеток' (рис. 173, А, Б) (так называемое «почечное ядро»). Постепенно разрастаясь, эктодерма ограничивает в средней части spadix (рис. 173, В). Наружный слой «почечного ядра» дает эктодерму субумбреллы. Между эксумбреллой и субумбреллой врастает энтодерма, дающая радиальные и кольцевой каналы зонтика. Clava multicornis (Forskal) Материал и методы изучения. Clava multicornis — весьма обычный вид на литорали Мурманского побережья, часто встречается и в Белом море. Колонии Clava по- 1 — ротовое отверстие, 2—щупальца, J — гонофиры
селяются на разных субстратах, но чаще всего на фукусах. Не встречается на заиленном грунте. Изучают живой материал или тотальные препараты, окрашенные квасцовым кармином. Изучение живого объекта или тотальных препаратов. Clava multicornis обладает нитевидно стелющейся по субстрату гидроризой, на которой довольно часто на коротких ножках сидят отдельные гидранты. Сами полипы имеют веретеновидную форму. Щупальца более или менее беспорядочно располагаются в средней части полипа. Гипостом и нижняя часть тела лишены щупалец (рис. 174). Число их варьирует в довольно широких пределах (от 20 до 40). На оральном конце гипостома помещается ротовое отверстие. Размеры отдельных гидрантов тоже сильно варьируют (от 1,7 до 5,5 мм в длину). Сразу же под нижними щупальцами располагаются многочисленные почти шаровидные гонофоры. Последние устроены очень просто и утеряли почти все признаки организации медузы. Они представляют собой эктодермальные мешки, набитые развивающимися или зрелыми половыми продуктами. Поэтому более правильно было бы называть их споросаками. Число последних на одном полипе может достигать нескольких десятков (рис. 174,5). Перидерм выражен очень слабо. Он одевает стволы колонии и не заходит на гидрантов. При жизни колония обычно бывает окрашена в розовый цвет. Согупе sarsi (Loven) Материал и методы изучения. Согупе sarsi часто встречается на литорали Баренцева и Белого морей, поселяясь на фукусах, камнях, раковинках моллюсков и т. п. Этот вид образует типичное поколение свободноплавающих медуз, развивающихся на колониях полипов. Медузы, относящиеся к Согупе sarsi, носят название Sarsia tubulosa Lesson '. Изучение полипоидного поколения осуществляется на живом материале или на тотальных препаратах, окрашенных кармином. Фиксировать полипов лучше всего сулемой с уксусной кислотой или Буэном. Медуз изучают в живом виде или же после фиксации их 4%-ным формалином, который хорошо сохраняет внешнюю форму этих нежных организмов. Желательно дополнительно изготовить тотальные препараты в канадском бальзаме, окрасив их квасцовым или борным кармином. При этом, однако, нежный зонтик медузы сильно мнется. Кроме Согупе sarsi на литорали часто встречается и другой вид того же рода — С. loveni М. Sars. Этот вид отличается от С. sarsi главным образом тем, что образующиеся на теле полипа медузоиды, хотя и имеют почти типичную организацию медуз, тем не менее не отрываются от материнской колонии и созревание половых продуктов у них происходит в прикрепленном к полипу положении. Изучение полипоидного поколения. Согупе sarsi образует небольшие колонии высотой 10—15 мм. Гидрориза ветвится слабо. От нее вертикально отходят стволы гидрокаулуса. Последние либо непосредственно заканчиваются терминально сидящими гидрантами, либо образуют небольшое количество боковых веточек (рис. 175). Внутри ветвей колонии можно рассмотреть выстланный энтодермой канал. Тело от- 1 Различие видового названия полипа и медузы, являющихся разными поколениями одного и того же организма, обусловлено тем, что разработка систематики полипов и медуз осуществлялась независимо и лишь позже были установлены связи между теми и другими,
дельных гидрантов имеет веретеновидную форму, длина гидранта 0,5—0,6 мм, ширина 0,15—0,2 мм. Гидрориза и стволы колонии одеты хорошо выраженным перидермой, образующим слабо выраженные кольцевые перетяжки (рис. 176). Как и у других Athecata, тело гидрантов не одето перидермой. Однако на базальную часть полипов все же заходит нежная пленка, представляющая собой продолжение перидерма стволов колонии. Ротовое отверстие помещается на конце конусовидного гипостома. Щупальца располагаются довольно беспорядочно в средней части полипа, число их варьирует в пределах 10—16. На дистальном конце каждое щупальце несет мощную батарею крупных стрекательных клеток (рис. 176), образующую характерное булавовидное вздутие. У основания гидрантов отпочковываются медузы, разные стадии развития которых следует рассмотреть на препаратах (рис. 176). Число одновременно отпочковывающихся медуз у одного гидранта может достигать шести. Изучение медузоидного поколения. Медузоидное поколение Согупе sarsi носит название Sarsia mirabilis. Рассматривают общую форму тела медузы, ротовой стебелек, щупальца. Sarsia mirabilis обладает высоким куполообразным прозрачным зонтиком (рис. 177). Высота колокола 0,5—1 см. Снизу к краю зонтика прикрепляются четыре довольно длинных щупальца. У основания щупалец помещаются особые вздутия эктодермы, богатые стрекательными клетками. Сами щупальца не гладкие, а несут многочисленные бугорки, также состоящие главным образом из групп стрекательных клеток. По краю зонтика, на месте перехода эксумбреллы в субум-бреллу располагается хорошо развитый парус (velum), представляющий собой складку эктодермы, в которую вдается тонкая пластинка мезоглеи. Сокращения паруса способствуют движению медузы. В центре субумбреллы берет начало длинный ротовой стебелек (manubrium), окрашенный у живых медуз обычно в красный цвет. Желудочный отдел гастроваскулярной системы помещается в полости ротового стебелька. В его верхней половине в эктодерме развиваются половые продукты, образующие иногда вздутия. В толще мезоглеи зонтика хорошо видны
Рис. 176. Coryne sarsi (из кн. Шульце). А — гидрант с медузой; Б — стрекательная клетка с выброшенной нитью: 1 — ротовое отверстие, 2 — щупальца, 3 — эктодерма, 4—энтодерма, 5 — перидерм, 6 — отпочковывающаяся медуза, 7 — пищеварительная полость четыре радиальных канала гастроваскулярной системы, впадающих в кольцевой канал. У основания щупалец кольцевой канал образует расширения, от которых берут начало каналы, идущие в щупальца, являющиеся у Sarsia полыми внутри. Из органов чувств имеются четыре просто устроенных глазка в форме бокалов, расположенных у основания щупалец со стороны эксумбреллы. Они отчетливо видны ввиду наличия пигментных клеток. Obelia sp. (= Laomedea) Материал и методы изучения. Разные виды рода Obelia встречаются в Баренцевом и Белом, а также в Черном и дальневосточных морях. На Мурманском побережье чаще других встречаются Obelia geniculata L., О. longissima Pall., О. flexuosa Alder,
6 Рис. 177. Медуза Sarsia mirabilis (ориг.), рисунок Д. В. Наумова. А— общий вид живой медузы; Б — вид на медузу сверху, В — глазок: / — радиальные каналы, 2 —щупальца, 3 — ротовой стебелек, 4 — коль-цевой канал, 5глазок, 6 — подушечка эктодермальных клеток у основания щупальца
О. loveni (Allman). Все эти виды живут на литорали или на небольших глубинах в сублиторали. Медуз Obelia довольно часто можно найти в планктоне. Для изучения полипоидного поколения надо изготовить тотальные препараты небольших веточек колонии, окрасив их квасцовым или борным кармином. Фиксировать лучше всего сулемой с уксусной кислотой. В крайнем случае можно использовать материал, консервированный спиртом или формалином. Из медуз изготовить тотальные препараты, применив те же методы фиксации и окраски, что и для полипов. Кроме тотальных препаратов следует изготовить серию срезов, порезав медузу в направлении, перпендикулярном к плоскости зонтика. Для срезов медуз лучше фиксировать какой-либо осмиевой смесью, например жидкостью Флемминга. Окрасить срезы железным гематоксилином. Если медузы фиксированы не осмиевым фиксатором, то можно также рекомендовать окраску по Маллори, которая хорошо оттеняет мезоглею. В дальнейшем описании мы ориентируемся преимущественно на О. geniculata, от которой полипоидные поколения других видов отличаются лишь некоторыми деталями строения гидротеки. Более существенны различия в строении гонангиев. Свободных медуз дает лишь О. geniculata, у остальных видов имеет место большая или меньшая степень редукции медузоидного поколения. Изучение полипоидного поколения. Obelia образует довольно большие древовидные колонии, состоящие иногда из нескольких сот и даже тысяч особей. Характер ветвления иной, чем у Tubularia, так как здесь имеет место симподиальный тип ветвления. Это значит, что ветви колонии слагаются из осей последовательно отпочковывающихся полипов, причем ось каждого последующего полипа является надставкой к предшествовавшей части оси (рис. 178). Этот тип ветвления характерен для большинства представителей подотряда Thecaphora, к которым принадлежит Obelia. Ветви гидрокаулуса колонии снаружи одеты хорошо развитым перидермой, образующим местами кольцевые перетяжки, которые не затрагивают, однако, ценосарка. Ценосарком называется совокупность эктодермы, мезоглеи и энтодермы гидрокаулюса; в понятие ценосарка не входит перидерм. Внутри ветвей проходит выстланный энтодермой канал, соединяющий, как и у большинства Hydrozoa, гастральные полости отдельных гидрантов. Перидерм продолжается на гидрантов, образуя гидротеку, имеющую форму колокольчика (рис. 179). Внутри гидротеки помещается гидрант. Наличие гидротеки представляет собой главную отличительную черту подотряда Thecaphora. В расплавленном состоянии тело гидранта и его щупальца выдаются из гидротеки. При раз-' дражении гидрант целиком втягивается в полость гидротеки. Тело гидранта несет кольцевую перетяжку, которая делит его на два отдела. Дистальную часть его иногда называют хоботком. На конце его помещается ротовое отверстие, ведущее в гастроваскулярную полость. Довольно длинные щупальца расположены одним венчиком. Они прикрепляются к телу гидранта несколько ниже кольцевой перетяжки. Внутри щупалец следует рассмотреть тяж эктодермальных клеток- Кюну) Рис. 178. Схема симпо-диального ветвления (по
Рис. 179. Obelia geniculata (X25) (ориг.): I — ротовой хоботок, 2— щупальца. 3 — гидротека, 4— перидерм, 5 —канал в стебельке, 6 — гастральная полость полипа Наряду с гидрантами на препаратах попадаются разные стадии почкования. Зона, где образуется почка, располагается на гидрокаулусе, на некотором расстоянии от базальной части полипа (рис. 180). Почка в процессе роста образует стебелек более длинный, чем стебелек полипа, у основания которого она образовалась. Нередко еще до окончательного сформирования полипа, у основания его формируется почка второго порядка. В результате описанный способ почкования приводит к симподиальному типу ветвления всей колонии. На препаратах желательно отыскать последовательные стадии формирования гидранта в процессе развития почки (рис. 180). Кроме гидрантов следует отыскать на препаратах гонангии, дающие начало ме-дузоидному поколению Obelia (рис. 181). Гонангии крупнее, чем гидранты, и не несут щупалец. Каждый гонангий снаружи прикрыт тэкой, которая здесь получает название гонотэки. Внутри гонотэки располагается видоизменный полип, на котором происходит отпочковывание медузок, носящий название бластостиля. Последний лишен ротового отверстия и щупалец. Дистальный конец его не несет почек и образует крышечку (Operculum). На бластостиле формируется довольно большое количество медузоидных почек, которые находятся на разных стадиях развития. У основания бластостиля располагаются самые молодые почки, у дистального конца его — готовые к отделению молодые медузы. Общее количество медузоидных почек, образующихся на одном бластостиле, около пятидесяти. Изучение медузоидного поколения. В живом состоянии мелкие медузки Obelia (2—3 мм в поперечнике) очень активны. Они плавают благодаря частым сокращениям зонтика. Velum у них рудиментарен. Obelia относятся к лептомеду-зам, которые характеризуются широким плоским зонтиком и относительно слабым развитием, а иногда даже рудиментарным состоянием velum.
Рис. 180. Почкование полипа Obelia (по Кюну, Деляжу и Геруару). А—В — разные стадии почкования: Г—3 — последовательные стадии развития гидранта из почки: 1 — перидерм, 2— эктодерма, 3 — энтодерма, 4 — щупальца, 5 — гидротека На тотальном препарате надо ознакомиться с расположением ор- Рис. 181. Obelia geniculata (ХЗО). Гонангий (по Аль-ман): 1 — operculum. 2 — гонотэка, 3— формирующиеся медузы ганов медузы. Зонтик имеет форму диска (рис. 182). По периферии его прикрепляются многочисленные короткие щупальца. У основания щупалец эктодерма образует утолщения, состоящие главным образом из стрекательных клеток. По краю зонтика располагаются также органы равновесия — статоцисты в количестве восьми. Они имеют Рис. 182. Obelia geniculata (Х15). Медуза, вид со стороны ротового стебелька (ориг.): / — щупальца, 2 — кольцевой канал. 3 — гонада, 4— радиальный канал, 5 — ротовой стебелек, 6— стрекательные клетки у основания щупальца
Рис. 183. Obelina gelatinosa — медуза с вывороченным зонтиком, вид сбоку (по Геккелю): / — ротовой стебелек, 2 — гонада (яичннк), 3 — радиальный канал, 4—щупальца вид небольших пузырьков со статолитом внутри. На тотальных препаратах статоцисты не всегда бывают видны. В центре субумбреллы расположен ротовой стебелек (manubrium), свисающий вниз и заканчивающийся ротовым отверстием. Хорошо видны четыре радиальных канала гастроваскулярной системы. Они берут начало от центральной полости гастроваскулярной системы (желудка) и впадают в кольцевой канал, проходящий по краю зонтика. Гонады в числе четырех располагаются с нижней стороны зонтика по ходу радиальных каналов. Гонады довольно велики (рис. 183), имеют более или менее правильную сферическую форму. Obelia раздельнополы. Яйцевые клетки у самок бывают ясно видны на препарате. На срезах следует изучить- гистологию Obelia и уточнить некоторые анатомические отношения, трудно констатируемые на тотальных препаратах (рис. 184). Эктодерма эксумбреллы, субумбреллы и щупалец представляет собой однослойный плоский эпителий. Клетки эктодермы образуют мускульные выросты, расположенные главным образом на субумбрелле, по краю зонтика, вдоль щупалец, в эктодерме хоботка. Парус у взрослых медуз отсутствует. Эктодерма у основания щупалец имеет иной характер, будучи очень богата стрекательными клетками. Мезоглея представляет собой бесструктурную гомогенную массу, в которой изредка встречаются амебоциты. По краю зонтика проходит двойное нервное кольцо. Однако на препаратах оно обычно не бывает отчетливо заметно. Статоцисты, располагающиеся по краю зонтика, имеют форму пузырька, заключающего сферический статолит (рис. 185). Эктодермальные, клетки, образующие стенку статоциста, Рис. 184. Obelia—медуза, схематический разрез (по Кюиу): / — эксумбрелла, 2 — кольцевой канал гастроваскулярной системы, 3— щупальце, 4 — гонада, 5 — субумбрелла, 6 — ротовой стебелек, 7 —ротовое отверстие, 8 — радиальный канал
частью чувствительные клетки и несут чувствительные волоски. При условии хорошей фиксации их удается разглядеть на препарате. Гистологический характер энтодермы в разных частях гастроваску-лярной системы различен. Ротовой стебелек и желудочный отдел выстланы высокими цилиндрическими, сильно вытянутыми в длину клетками, среди которых много железистых клеток. Радиальные и кольцевой каналы ограничены плоским эпителием, также несущим железистые клетки. Между радиальными каналами в мезоглее зонтика зале- о 1 — эктодерма щупальца, 2 — энтодерма. 3 — гает ОДНОСЛОЙНаЯ пластинка ЭНТО* статоцист, 4— статолит, 5 — полость статоци-дермы (так называемая катаммаль- ста- «-чувствительные клетки ная пластинка). В щупальцах имеется один ряд эктодермальных клеток и внутренняя полость отсутствует (рис. 185). В тех местах, где радиальные каналы проходят над гонадами, они образуют слепые выросты, вдающиеся в виде мешочка в ткань половой железы (рис. 186). Наличие дивертикула гастроваску-лярной системы, вероятно, играет существенную роль в питании гонады. В яичнике обычно удается рассмотреть разные стадии роста ооцитов. В семенниках — различные стадии созревания сперматозоидов. Снаружи гонада выстлана слоем плоских эктодермальных клеток, представляющих непосредственное продолжение эктодермы субумбреллы. Рис. 186. Obelia geniculata — медуза, часть радиального среза в области половой железы (ориг.): 1 — эктодерма эксумбреллы, 2 — мезоглея, 3 — катаммальная пластинка, 4 — эктодерма субумбреллы, 5 —яйцевая клетка, 6— дивертикул гастроваскулярной системы в область гонады, 7 —» часть радиального канала
Другие представители гидроидных полипов Кроме рассмотренных выше представителей Hydrozoa, желательно ознакомиться еще с несколькими видами, обратив внимание главным образом на различные типы образования колоний и разнообразные формы гонофоров. Для этого следует изготовить тотальные препараты разных имеющихся налицо представителей гидроидных полипов, слегка окрасив их квасцовым или борным кармином. Для общей ориентировки и определения можно использовать указанные в списке литературы монографию Д. В. Наумова и определитель под ред. Н. С. Гаевской. Ниже приводится краткое описание еще двух гидроидных полипов из подотряда Thecaphora, встречающихся в морях Советского Союза и представляющих сравнительно морфологический интерес. Sertularia sp. Различные виды этого рода широко распространены почти во всех морях, омывающих СССР. В Баренцевом море, в частности, Sertularia pumila L. в больших количествах встречается на водорослях в литоральной зоне. Sertularia образует колонии различных размеров, характеризующиеся большей частью перистым ветвлением (рис. 187) и до Рис. 187. Sertularia abietina. Участок колонии (по Деляжу и Геруару) Рис. 188. Sertularia ри. Участок колонии при не! шом увеличении (ориг. J — гидрант, 2 — гидротек;
вольно слабо развитой гидроризой. По ходу ветвей колонии гидранты располагаются супротивно с обеих сторон гидротеки1 (рис. 188). Наружный край гидротек несет большей частью 3—4 зубчика. Кроме того, имеется особая тонкая кожистая пластинка — operculum, которая прикрывает отверстие гидротеки, когда гидрант втягивается внутрь. У основания гидротек располагается перегородка, септа, прободенная отверстием, сквозь которое проходит ценосарк. Сами гидранты небольших размеров имеют более или менее правильную цилиндрическую форму и несут щупальца, располагающиеся в один круг. Гонангии отличаются от гидрантов большей величиной. Они располагаются с одной стороны ветвей колонии. Гонотека грушевидной формы. Внутри нее располагается бластостиль (рис. 189), на котором отпочковываются гонофоры, представляющие собой простые споросаки. Последние Рис. 189. Sertularia tamarlsca. Мужской гонангий (по Альма-ну): / — operculum, 2 — споросаки, 3 — гонотека представляют собой такую форму гонофоров, кото- рые утеряли (в отличие от эумедузоидов) все черты организации медузы и представляют собой мешки, заполненные половыми продуктами. Sertularia раздельнополы. Aglaophenia pluma (L.) Один вид этого рода (A. pluma L.) (рис. 190) встречается в Черном море, где он селится преимущественно на небольших глубинах. Изучение его представляет интерес в том-отношении, что здесь имеет место диморфизм гидрантов и имеются особые защитные образования гонофоров, так называемые корзиночки или корбулы (corbulae). Ветвление главных стволов колонии носит неправильный характер. От ветвей гидрокаулуса отходят мелкие боковые веточки (гидрокладии), причем их расположение перистое. Гидротеки располагаются на гидрокладиях в один ряд, имеют более или менее правильную треугольную форму, причем одна сторона треугольника прирастает к ветви колонии (рис. 190, А). Край гидротеки несет зубчики. У гидрантов, как у всех Thecaphora, — один венчик щупалец. В связи с каждым гидрантом стоят два нематофора. Каждый не-матофор представляет собой пальцевидный придаток, лишенный щупалец и ротового отверстия и богато снабженный стрекательными клетками. В него заходит энтодерма и имеется очень узкая внутренняя полость, сообщающаяся с каналом ценосарка. Нематофоры способны сильно вытягиваться и сокращаться. Они представляют собой видоизмененных гидрантов. Каждый нематофор окружен тэкой, которая здесь получает название нематотэки. 1 Близкий к Sertularia род Sertularella характеризуется чередующимися, а не супротивно расположенными гидротеками.
Рис. 190. Aglaophenia sp. A — полип и часть гидрокладия; Б— корзиночка (по Кюну и Аль-ману): / — щупальца, 2 — нематофор, 3 гидрокладий Гонангии располагаются группами и защищены корзиночкой (corbula). Кор-була (рис. 190, 5) представляет собой укороченную веточку колонии (гидрокладия), имеющую яйцевидную форму. С нижней стороны корбулы проходит стержень. На нем более или менее вертикально в виде ребрышек располагается несколько рядов видоизмененных нема-тотэк. Наружные края их спаиваются тонкой хитиноидной пленкой, благодаря чему образуется так называемая «закрытая корбула», внутри которой и располагаются обычно многочисленные гонофоры. У некоторых видов Aglaophenia хитиноидной пленки, соединяющей нематотэ-ки, не образуется и тогда получается «открытая корбула». КЛАСС SCYPHOZOA— СЦИФОИДНЫЕ МЕДУЗЫ Организация разных групп Scyphozot отличается значительным многообразием что не позволяет при прохождении прак тикума ограничиться рассмотрение, только одного представителя этого кла( са. В силу этого предлагаются для из? чения две формы {Aurelia и Haiclystus относящиеся к разным отрядам (Disct medusa и Lucernarida), довольно сущее венно отличающимися друг от друга i своему строению. ОТРЯД SEMAEOSTOMAE Aurelia aurita Lam. Материал и методы изучения. Aurelia aurita представляет собой чрезвычайно i роко распространенную форму, встречающуюся почти всюду, начиная от Арктичес) морей и кончая тропиками. У нас она водится в Баренцевом, Белом и Черном моря? также на Дальнем Востоке. A. aurita достигает значительных размеров, диаметр s тика наиболее крупных экземпляров равняется 30—40 см. Для изучения лучше вз не очень крупные экземпляры, консервированные формалином. Внешнюю морфоло и расположение основных частей гастроваскулярной системы можно рассмотреть всякой окраски. Дополнительно полезно окрасить небольшой экземпляр (2—3 с диаметре) медузы квасцовым кармином и сделать тотальный препарат в канадс бальзаме. Органы чувств, так называемые ропалии, следует фиксировать, вырезав ножницами у живой медузы, жидкостью Флемминга или Ценкера. Готовят тоталг препараты, окрасив квасцовым кармином или не окрашивая (после фиксации по Ф. мингу). Изготовляют среды, залив в парафин, по продольной оси ропалии (т. е.
диально по отношению тела медузы). Срезы делают не толще 7,5 мкм, раскрасив их гематоксилином Бёмера или Деляфильда. Кроме взрослых Aurelia делают тотальные препараты из эфир (отобрать из планктона), окрасив квасцовым кармином. Если работы проводятся на живом материале на морской станции, то следует изучить процесс выхождения планул из карманчиков ротовых лопастей и развитие из них полипоидного поколения — сцифистом. Подробнее об этом см. ниже с. 231—233. Изучение строения медузы. Плоский зонтик медузы A. aurita имеет консистенцию студня, благодаря сильно развитой мезоглее. По краю его расположены многочисленные короткие щупальца, полые внутри (рис. 191). Край зонтика образует восемь неглубоких вырезов, в которых располагаются краевые тельца — ропалии. Парус, характерный для гидромедуз, у Aurelia, как представителя Scyphozoa, отсутствует1. В центре нижней стороны зонтика — субумбреллы расположен короткий ротовой стебелек (manubrium), на конце которого помещается четырехугольное ротовое отверстие. Края его вытянуты в четыре длинные, мощно развитые ротовые лопасти, образующие по своему нижнему краю желобок. Края желобка, особенно в своей дистальной части, образуют короткие щупальцеобразные выросты — так называемые диги-телли. У живой медузы эти лопасти подвижны и играют активную роль при поимке добычи. Их эктодерма богато снабжена стрекательными клетками. Ротовые лопасти у половозрелых самок аурелий несколько длиннее и массивнее, чем у самцов, что обусловлено наличием в них особых выводковых камер — карманчиков, в которых происходит развитие оплодотворенных яиц до стадии планулы (см. с. 231). Таким образом, у аурелий наблюдается довольно редкий среди кишечнополостных случай полового диморфизма. Ротовые лопасти вытянуты в радиальном направлении. На субумбрелле располагаются, чередуясь с ротовыми лопастями, четыре глубоких кармана — субгенитальные мешки, соответствующие по своему положению гонадам, лежащим в полости желудка. Центральную часть гастроваскулярной системы образует объемистый желудок с четырьмя неглубокими карманообразными выступами. Последние располо- Рис. 191. Aurelia aurita со стороны субумбреллы (по Кюкеиталю): / — щупальца, 2 — краевое тельце (ропалия), 3— перрадиальный (ветвящийся) канал, 4—интер-радиальиый (ветвящийся) канал, 5 — адрадиаль-ный (неветвящийся) канал, 6 — ротовая лопасть, 7 — гастральные нити в карманах желудка, 5 — кольцевой канал 1 Небольшая, имеющаяся у Aurelia по краю зонтика velarioid, отнюдь не играет роли velum. складка, называемая
жены между ротовыми лопастями в интеррадиальном направлении. На дне их помещаются многочисленные гастральные нити. От желудочка берут начало многочисленные радиальные каналы, впадающие по краю зонтика в кольцевой канал. Часть радиальных каналов образует разветвления, часть не ветвится. Среди них различают каналы 1-го (перрадиальные), 2-го (интеррадиальные) и 3-го (адра-диальные) порядков. Каналы 1-го порядка (ветвящиеся) в числе четырех совпадают по своему направлению с ротовыми лопастями. Каналы 2-го порядка (ветвящиеся) тоже в числе четырех располагаются в промежутках между каналами 1-го порядка и представляют собой как бы продолжения' карманообразных выпячиваний желудка. Против центральных ветвей этих каналов располагаются по краю зонтика восемь краевых телец, или ропалий. Наконец, между каналами первых двух порядков проходят восемь каналов 3-го порядка, которые не ветвятся и не связаны с ропалиями. Радиальные каналы выстланы изнутри жгутиковым эпителием, наличие которого обеспечивает движение пищи по каналам. Имея в своем распоряжении живых медуз, желательно воспроизвести опыты, осуществленные впервые И. А. Ветохиным, а затем Судвар-дом ', иллюстрирующие характер движения пищи в радиальных каналах разных порядков. Для этого живую медузу кладут в большое часовое стекло (по размеру зонтика) субумбреллой кверху. При помощи изогнутой стеклянной пипетки с оплавленным краем через ротовое отверстие вводят последовательно в четыре кармана желудка разбавленную морской водой в отношении 1 : 1 или 1 :2 кровь рыбы или млекопитающего. Наблюдают порядок заполнения кровью радиальных каналов. В первую очередь заполняются неветвящиеся адрадиальные каналы 3-го порядка. По ним кровь двигается в центробежном направлении. Затем заполняется кольцевой канал, после чего начинается с периферии к центру заполнение ветвящихся каналов 1-го и 2-го порядков, по которым кровь движется в центростремительном направлении. Заполнение всей системы кровью занимает около часа. Чтобы иммобилизовать медузу на время опыта, прекратив перио дические сокращения колокола, рекомендуется следующий прием. Мор ская вода насыщается углекислым газом и выливается в часовое сте кло, где лежит медуза. Следующий за этим наркоз не отражается н. движении жидкости в радиальных каналах, но препятствует сокращу нию зонтика. Движение инъецированной крови в каналах возможн рассмотреть, ввиду прозрачности медузы, под микроскопом (очень ш большое увеличение). При этом, особенно в крупных каналах, видн «завихрение» движущейся крови, происходящее из-за мерцания жг тиков эктодермальных клеток. Приблизительно через 24 ч происходг обесцвечивание инъецированной крови, вызванное процессами внутр! клеточного пищеварения. 1 Ветохин И. А. О работе мерцательного эпителия гастроваскулярной систек медузы Aurelia aurita. Работы Мурманской биологической станции, т. И, 195 с. 107—120. Southward A. J. Onservation on the ciliary currents of the Jelly-Fish Aure aurita. Journ. Mar. Biol. Ass. U. K., 1955, vol. 34, № 2.
Гонады у Aurelia развиваются в энтодерме желудка в карманообразных выпячиваниях. У живой медузы они окрашены в фиолетовый цвет и имеют вид подковообразно изогнутых валиков. Aurelia раздельнополы. Мускулатуру зонтика можно частично рассмотреть на удачных тотальных препаратах небольших экземпляров медуз. Она слагается из кольцевой мускульной ленты, проходящей по краю зонтика, и из восьми радиальных лент, проходящих в перрадиальном и интеррадиальном направлениях. Мускулатура сцифомедуз состоит преимущественно из эпителиально-мускульных клеток. Нервная система Aurelia на тотальных препаратах не видна. С некоторыми элементами ее можно познакомиться при изучении срезов через ропалии. Строение ропалий. Ропалии, расположенные в числе восьми по краю зонтика, помещаются в особых выемках. Сверху каждое краевое тельце прикрыто покровной лопастью (рис. 192, 193), у основания которой с верхней стороны имеется «обонятельная ямка». По сторонам ропалии свешиваются две лопасти, прикрывающие ее с боков. Сама ропалия состоит из проксимального и дистального отделов, расположенных под тупым углом друг к другу. В дистальной части помещается орган равновесия — статоцист. На границе между обоими отделами ропалии с верхней и нижней стороны расположены глазки. На продольном разрезе через краевое тельце и покровную лопасть видно, что ропалия снаружи покрыта эктодермой и в нее заходит выстланный энтодермой канал гастроваскулярной системы (рис. 194). Покровная лопасть состоит только из эктодермы и довольно толстого слоя мезоглеи. Строение эктодермальных клеток разных частей ропалии неодинаково. В дистальной части, где располагается статоцист, эктодерма состоит из плоского эпителия. В проксимальной части ропалии клетки эктодермы цилиндрические, среди покровных здесь разбросаны чувствительные клетки и между эктодермой и опорной пластинкой мезоглеи Рис. 192. Aurelia aurita — краевое тельце с окружающими его лопастями (по Шевякову): .' — боковая лопасть , 2 — чувства-тельная лопасть, 3— краевое тельце (ропалия), 4 — кроющая лопасть Рис. 193. краевые тельца Aurelia aurita (по Шевякову). А — сбоку; Б — со стороны субумбреллы: 1— глазное пятно, 2 —скопление отолитов, 3 — бо* каловидный глазок
Рнс. 194. Продольный разрез через ропалию Aurelia aurita (по Шевякову): I — эктодерма, 2— нервное сплетение, 3— мезоглея, 4— глазок (ocellus), 5—отолиты, 6 — бокаловидный глазок, 7 — гастроваскулярная полость, <8 — «обонятельная ямка» располагаются нервные элементы. Между экто- и энтодермой имеет тонкая прослойка мезоглеи. В дистальной части эктодермальный кан выполнен синтициальной протоплазматической массой с многочисле ными ядрами и кристаллическими конкрециями углекислой извес-представляющей собой отолиты'. Оба глазка в гистологическом oti 1 Необходимо отметить, что ряд авторов (Нагель, 1894; Мюрбах, 1904; Ветох 1926) на основании экспериментальных данных отрицают значение краевых те. медуз как органов равновесия. Другие исследователи (Харгит, 1930), напротив, с тают их органами статического чувства. Вопрос, по-видимому, требует дополните ных физиологических исследований.
шении устроены различно. Глазное пятно, расположенное на верхней умбеллярной стороне ропалии, состоит из многочисленных пигментных клеток, между которыми располагаются светочувствительные клетки (рис. 194). Глазок, расположенный на нижней субумбреллярной стороне, помещается под слоем эктодермы. Он имеет вид бокала и состоит из двух слоев. Внутренний пигментный слой образован энтодермальны-ми элементами. Внутри пигментного бокала располагаются чувствительные клетки. Их нервные отростки направлены кнаружи, в сторону покрывающей глазок эктодермы. Подобное положение чувствительных элементов в нижнем глазке Aurelia заставляет причислить его к глазам инвертированного типа, встречающемуся у Coelenterata весьма редко Наблюдения над размножением и развитием Aurelia.Оплодотворение зрелых яиц у Aurelia происходит в гонадах самок, куда вместе с морской водой проникают сперматозоиды. Оплодотворенные яйца не выбрасываются в морскую воду, как это имеет место у большинства медуз, а, выходя из ротового отверстия, проходят по нижнему краю ротовых лопастей, попадают в особые эктодермальные впячивания, играющие роль выводковых камер (рис. 195). Последние представляют собой мешковидные выпячивания стенок ротовой лопасти, которые обращены своими отверстиями в сторону желоба лопасти (рис. 196).. Следует на живом объекте исследовать содержимое карманчиков, расщипывая их иглой. В них в течение почти всего лета удается найти разные стадии эмбрионального развития аурелий — от начальных стадий дробления до сформированных и покрытых ресничками планул. Рис. 195. Aurelia aurita, ротовая лопасть с выводковыми камерами (из кн. Наумова): / — выводковые камеры Рис. 196. Поперечный разрез через ротовую лопасть Aurelia aulita (схема) (из кн. Наумова): 1 — выводковая камера с эмбрионами, 2 — дигителли 1 Подробнее о краевых тельцах медуз см. W. Schewiakoff. Beitrage zur Kennthis. des Acalephenauges. Morphol. Jahrb.-, Bd. 15, 1889, c. 21—60.'
шении устроены различно. Глазное пятно, расположенное на верхней умбеллярной стороне ропалии, состоит из многочисленных пигментных клеток, между которыми располагаются светочувствительные клетки (рис. 194). Глазок, расположенный на нижней субумбреллярной стороне, помещается под слоем эктодермы. Он имеет вид бокала и состоит из двух слоев. Внутренний пигментный слой образован энтодермальны-ми элементами. Внутри пигментного бокала располагаются чувствительные клетки. Их нервные отростки направлены кнаружи, в сторону покрывающей глазок эктодермы. Подобное положение чувствительных элементов в нижнем глазке Aurelia заставляет причислить его к глазам инвертированного типа, встречающемуся у Coelenterata весьма редко'. Наблюдения над размножением и развитием Aurelia.Оплодотворение зрелых яиц у Aurelia происходит в гонадах самок, куда вместе с морской водой проникают сперматозоиды. Оплодотворенные яйца не выбрасываются в морскую воду, как это имеет место у большинства медуз, а, выходя из ротового отверстия, проходят по нижнему краю ротовых лопастей, попадают в особые эктодермальные впячивания, играющие роль выводковых камер (рис. 195). Последние представляют собой мешковидные выпячивания стенок ротовой лопасти, которые обращены своими отверстиями в сторону желоба лопасти (рис. 196). Следует на живом объекте исследовать содержимое карманчиков, расщипывая их иглой. В них в течение почти всего лета удается найти разные стадии эмбрионального развития аурелий — от начальных стадий дробления до сформированных и покрытых ресничками планул. Рис. 195. Aurelia aurita, ротовая лопасть с Рис. 196. Поперечный разрез через выводковыми камерами (из кн. Наумова): ротовую лопасть Aurelia aulita 1 — выводковые камеры (схема) (из кн. Наумова): 1 — выводковая камера с эмбрионами, 2 — дигителли 1 Подробнее о краевых тельцах медуз см. W. Schewiakoff. Beitrage zur Kennthis-:es Acalephenauges. Morphol. Jahrb.-, Bd. 15, 1889, c. 21—60.’ L
Рис. 197. Сцифистома Aurelia aurita на стадии 8 щупалец (ориг.): 1 — щупальца, 2 — стебелек В условиях аквариума легко получить дальнейшее развитие пла пул вплоть до образования сцифистом. Для этого половозрелую самк с заполненными эмбрионами карманчиками следует поместить на не продолжительное время (15—20 мин) в небольшой аквариум с мо{ ской водой. При этом из карманчиков при резких сокращениях зонтик выйдут многочисленные планулы, которые извлекают из аквариума пр помощи пипетки и рассаживают в кристаллизаторы с чистой морско водой. В течение некоторого промежутка времени (от 2 до 7 суток планулы плавают в воде, затем оседают на дно и стенки сосуда превращаются в полипоидное поколение медузы — сцифистому. От м< мента оседания планулы до сформирования сцифистомы при комнатнс температуре проходит 2—3 дня. Сцифистомы представляют собой н больших одиночных полипчиков, при помощи ножки прикрепляющихс к субстрату. Сначала у развивающейся сцифистомы прорывается рот вое отверстие и вокруг него образуются четыре щупальца. Затем во никают еще четыре щупальца (рис. 197). После этого развивается еп восемь щупалец. Стебелек сцифистомы аурелий состоит из двух чаете дистальная, прилегающая к полипу, слагается из мягких тканей (э тодермы, энтодермы и основной пластинки), проксимальная, прилета, щая непосредственно к субстрату (рис. 197, 2), имеет, кроме того, ei наружный скелет, весьма напоминающий перидерм гидроидных полипе
Внутри гастральной полости сци-фистомы имеется четыре продольные складки, образованные энтодермой и мезоглеей. Они называются тэниолями и напоминают септы коралловых полипов. В условиях аквариума удается иногда наблюдать и почкование сци-фистом, сводящееся к отпочкованию на теле полипчика таких же дочерних полипов, в дальнейшем отделяющихся от материнского. Кроме наблюдений за живыми сцифистомами следует изготовить из них тотальные препараты, окрасив их квасцовым кармином1. Стробиляцию сцифистом и образование на них эфир (молодых медузок) Рис. 198. Aurelia aurita — эфира (из кн. Аверинцева): 1 — краевая лопасть, 2 — краевое тельце, 3 — край диска, 4 — гастральные нити, 5 — ротовое отверстие в условиях аквариума наблюдать обычно не удается. Эфиры аурелий следует отыскать в пробах морского планктона, где они встре- чаются нередко в значительных количествах. Такой же тип развития планул в карманчиках ротовых лопастей имеет место и у крупной арктической медузы Cyanea arctica, часто встречающейся в Белом и Ба ренцевом морях. Изучение строения эфиры Aurelia. Qt взрослой формы эфиры Aurelia (рис. 198) отличаются меньшими размерами и целым рядом морфологических особенностей. Края зонтика не несут щупалец и образуют восемь глубоких вырезов. Адрадиальные каналы гастроваскулярной системы не развиты, а перрадиальные и интеррадиальные не ветвятся. Ротовой стебелек не образует еще ротовых лопастей. Ротовое отверстие имеет форму креста. Гастральные нити в желудке имеются в небольшом количестве. Ропалии развиты. Имея достаточный материал по эфирам, можно подобрать разные стадии превращения ее в медузу. Отметить изменение формы зонтика, образование щупалец и ротовых лопастей, ветвление радиальных каналов и развитие каналов 3-го порядка. ОТРЯД STAUROMEDUSAE Haliclystus sp. Материал и методы изучения. В Баренцевом и Белом морях нередко встречаются представители двух родов Lucernaria О. F. М. и Haliclystus J. Clark (оба эти рода относятся к сем. Eleutherocarpidae). В Черном море живет только одна Lucernaria. Для изучения одинаково пригодны представители и того и другого рода. Haliclystus представляет некоторые преимущества для изготовления срезов своими относительно небольшими размерами (2—3 см), тогда как Lucernaria quadricornis Mull из Баренцева 1 Более подробно о размножении аурелий см. статью Д. В. Наимова. К биологии размножения сцифомедуз аурелии и цианеи. — Природа, 1955, № 2.
моря достигает 10—12 см. Анатомия обоих родов весьма близка, на некоторые различия будет указано ниже. Haliclystus и Lucernaria живут на небольших глубинах, прикрепляясь своим стебельком к камням, водорослям и другим предметам. Для изучения их организации следует рассмотреть, пользуясь бинокулярной и штативной лупами, экземпляры медуз, консервированные формалином, а также изготовить тотальные препараты из небольших экземпляров, окрасив их квасцовым или борным кармином. Эти препараты