/
Теги: материальные основы жизни биохимия молекулярная биология биофизика общая биофизика, общая биохимия и общая физиология
ISBN: 978-5-9558-0415-6
Текст
©СЕВАСТОПОЛЬСКИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ
Г.П. ГОРБЕНКО
В.М. ТРУСОВА
М.П.ЕВСТИГНЕЕВ
ФИЗИЧЕСКИЕ
ОСНОВЫ
БИОСЕНСОРИКИ
УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ
znanium
электронно-бибчиотечная система
Москва
ВУЗОВСКИЙ УЧЕБНИК
ИНФРА-М
2025
УДК 577(075.8)
ББК 28.07я73
Г67
Горбенко Г.П.
Г67 Физические основы биосенсорики : учебное пособие / Г.П. Горбен-
ко, В.М. Трусова, М.П. Евстигнеев. — Москва : Вузовский: учебник :
ИНФРА-М, 2025.-140 с.
ISBN 978-5-9558-0415-6 (Вузовский учебник)
ISBN 978-5-16-010613-7 (ИНФРА-М, print)
ISBN 978-5-16-102429-4 (ИНФРА-М, online)
В учебном пособии описаны физико-химические основы функциониро-
вания биосенсоров, различные конфигурации биосенсорных анализаторов,
принципы их действия и современные тенденции развития биосенсорики.
Значительное внимание уделено молекулярному узнаванию и систе-
мам усиления сигнала на молекулярном уровне. Подробно рассмотрены
методы иммобилизации биологических компонентов биосенсоров. От-
дельные разделы посвящены детальному описанию процессов, лежащих
в основе формирования аналитического сигнала в электрохимических
и оптических биосенсорах. Приведены примеры применения биосенсоров
в различных областях жизнедеятельности.
Предназначено для студентов и аспирантов физических и биологиче-
ских специальностей.
УДК 577(075.8)
ББК 28.07я73
ISBN 978-5-9558-ОН5-6 (Вузовский учебник)
ISBN 978-5-16-010613-7 (ИНФРА-М, print)
ISBN 978-5-16-102429-4 (ИНФРА-М, online)
© Горбенко Г.П., Трусова В.М.,
Евстигнеев М.П., 2015
© Вузовский учебник,
2015
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.......................................6
РАЗДЕЛ L БИОСЕНСОРЫ КАК НОВЫЙ КЛАСС
АНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ........................8
1.1. Предмет и задачи сенсорики................8
1.1.1. Основные понятия сенсорики..............8
1.1.2. Предмет и задачи сенсорики............1 I
1.2. Классификация биосенсоров................11
1.3. История создания биосенсоров.............14
1.4. Вопросы для самоконтроля.................17
РАЗДЕЛ 2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БИОСЕНСОРОВ..................18
2.1. Молекулярное узнавание...................18
2.2. Комплекс фермент-субстрат................23
2.2.1. Гидролазы..............................25
2.2.2. Оксидазы (Н202-генерирующие ферменты)..26
2.2.3. Дегидрогеназы..........................27
2.3. Комплекс антиген-антитело................28
2.4. Комплекс гормон-рецептор.................29
2.5. Молекулярные системы усиления............31
2.5.1. Ферментативное усиление................32
2.5.2. Модуляция неспецифической реакции......33
2.5.3. Смещение равновесия....................35
2.5.4. Каскадное усиление.....................36
2.6. Вопросы для самоконтроля.................37
РАЗДЕЛ 3. МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ
БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ СЕНСОРОВ..............39
3.1. Адсорбция на носителях...................40
3.2. Ковалентное присоединение к носителям....41
3.2.1. Металлохелатный метод..................44
3.3. Сшивание с бифункциональными реагентами..47
3.4. Включение в пространственную сетку гелей.48
3.5. Микрокапсулирование......................51
3.6. Сравнительная характеристика методов иммобилизации
белков..........................................55
3.7. Методы иммобилизации липидов...............57
3.7.1. Химическая модификация поверхности подложки... 58
3.7.2. Формирование липидных мембран на твердой
подложке........................................59
3.8. Вопросы для самоконтроля...................64
РАЗДЕЛ 4. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ.............65
4.1. Физико-химические основы функционирования
электрохимических сенсоров. Электрохимическая цепь.... 65
4.2. Основные характеристики электрохимических
процессов.......................................69
4.3. Классификация электродов...................73
4.4. Ионселективные электроды...................75
4.5. Стеклянный электрод........................78
4.6. Другие типы ионселективных электродов......83
4.7. Ферментные электроды.......................84
4.8. Современные тенденции развития электрохимических
биосенсоров.....................................87
4.9. Вопросы для самоконтроля...................88
РАЗДЕЛ 5. ОПТИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ.................90
5.1. Распространение света в оптическом волокне.90
5.1.1. Полное внутреннее отражение..............90
5.1.2. Затухающее поле..........................94
5.1.3. Поверхностный плазмонный резонанс........96
5.2. Классификация оптических датчиков..........98
5.3. Датчики с модулируемой амплитудой.........100
5.3.1. Прямые внешние сенсоры..................101
5.3.2. Прямые внутренние сенсоры.............. 102
5.3.3. Непрямые внешние сенсоры................103
5.3.4. Непрямые внутренние сенсоры.............105
5.4. Датчики с модулируемой длиной волны.......107
5.4.1. Прямые внешние флуоресцентные сенсоры....108
5.4.2. Прямые внутренние флуоресцентные сенсоры. 108
5.4.3. Непрямые внешние флуоресцентные сенсоры.109
5.4.4. Непрямые внутренние флуоресцентные сенсоры... 113
5.5. Сенсоры, основанные на комбинационном рассеянии
(КР-сенсоры).................................114
5.6. Датчики с фазовой модуляцией........... 117
5.7. Датчики с поляризационной модуляцией....122
5.8. Датчики с временной модуляцией..........123
5.9. Вопросы для самоконтроля................124
РАЗДЕЛ 6. ДРУГИЕ ТИПЫ БИОСЕНСОРОВ............127
6.1. Биосенсоры на объемных пьезоэлектрических
резонаторах..................................127
6.2. Биосенсоры на поверхностных акустических волнах
(ПАВ>........................................129
6.3. Калориметрические биосенсоры............130
6.4. Вопросы для самоконтроля................130
РАЗДЕЛ 7. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ
БИОСЕНСОРОВ..................................132
7.1. Применение биосенсоров в медицине.......132
7.2. Применение биосенсоров для анализа объектов
окружающей среды.............................135
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.....................137
ВВЕДЕНИЕ
Одной из важнейших черт современной науки
является формирование контактов между различными
отраслями знаний, взаимопроникновение и
взаимообогащение этих отраслей, возникновение на этой
основе новых научных направлений. Среди таких
направлений в последние десятилетия особенно интенсивно
развивается биосенсорика, наука о новом классе датчиков -
биосенсорах.
Биосенсор - это аналитический прибор, в котором
высокоспецифичные реакции между чувствительным
биологическим элементом и веществом, уровень которого
необходимо определить (анализом), приводят к генерации
сигнала, зависящего от концентрации анализа.
Консз'руктивно биосенсор состоит из биоселективной
мембраны или биоматрицы и физического элемента,
который превращает биохимический сигнал в электронный.
Возникновение биосенсорики является результатом
интеграции многих отраслей науки и технологии -
аналитической химии, электрохимии, физики твердого тела,
биохимии, биофизики, микроэлекзроники,
материаловедения. Важность биосенсорных анализаторов
трудно переоценить. Биосенсоры находят все более
широкое применение в различных сферах
жизнедеятельности - медицине, сельском хозяйстве, охране
окружающей среды, пищевом, фармацевтическом.
химическом производствах и т.д. Наиболее важными
преимуществами биосенсоров являются высокая
чувствительность и селективность, безреагентность и
скорость анализа, широкий диапазон анализируемых
веществ. Несмотря на бурное развитие биосенсорной
концепции, и сегодня существует немало проблем,
связанных, в частности, с необходимостью создания
безопасных для организма датчиков, способных к
продолжительному эффективному функционированию in
vivo, обеспечения возможности многоразового
использования биосенсоров, избежания нежелательного
влияния интерферирующих веществ и т.д. Преодоление
этих и множества других нерешенных проблем невозможно
без глубокого понимания процессов, которые протекают в
биосенсорах, а также без знания свойств биологических и
физических элементов датчиков.
Цель данного пособия - ознакомить читателя с
физико-химическими основами функционирования
биосенсоров, принципами их действия и основными
конфигурациями. Наряду с детальным рассмотрением
фундаментальных концепций работы биосенсоров и
современных тенденций развития биосенсорных
анализаторов, достаточно внимания уделяется и
прикладным аспектам проблемы.
РАЗДЕЛ J.
БИОСЕНСОРЫ КАК НОВЫЙ КЛАСС АНАЛИТИЧЕСКИХ
УСТРОЙСТВ
1.1. Предмет и задачи сенсорики
1.1.1. Основные понятия сенсорики
Сенсор - аналитическое устройство, в котором
высокоспецифичные химические реакции между
чувствительным химическим элементом и определяемым
веществом (аналитом) формируют сигнал, зависящий от
концентрации аналита.
Биосенсор - аналитический прибор, содержащий
биологический чувствительный элемент (ферменты,
рецепторы, гормоны, антитела, нуклеиновые кислоты,
надмолекулярные комплексы, внутриклеточные органеллы,
клетки, микроорганизмы и т.д.). В биосенсоре
аналитический сигнал формируется за счет биохимических
процессов.
Первичный отклик - изменение определенных
характеристик химического или биологического
чувствительного элемента сенсора в результате его
взаимодействия с аналитом.
Преобразователь (трансдуктор) - элемент сенсора,
с помощью которого первичный отклик системы
преобразуется в электрический, оптический, механический,
термический или частотный аналитический сигнал. В
качестве трансдуктора могут использоваться термисторы.
оптические волокна, электроды, полевые транзисторы,
пьезоэлектрические кристаллы и т.д.
Головной каскад - система первичной обработки и
усиления измеряемого сигнала.
Селективность - способность сенсора к ответу
только на узко специфический химический сигнал и
относительная нечувствительность к неспецифическим
воздействиям. Высокая селективность является одним из
основных преимуществ биосенсоров по сравнению с
другими видами датчиков.
Быстродействие (время ответа) - время,
необходимое для достижения стационарного состояния
сенсора (постоянного сигнала) при изменении
концентрации аналита. При больших временах ответа
возможно проведение анализа в кинетическом режиме, т. е.
без достижения стационарного состояния.
Динамический диапазон (пределы измерения)
сенсора - область значений анализируемого параметра, в
которой детектируемый сигнал с высокой
воспроизводимостью коррелирует со специфическим
первичным откликом.
Калибровочная кривая - зависимость аналитического
сигнала (X) от концентрации аналита (С).
Предел детектирования - самая низкая
концентрация аналита (С/67)), которая приводит к
генерации сигнала (XLOD), статистически отличимою от
фонового сигнала.
Чувствительность - соотношение детектируемого
сигнала и концентрации аналита. Эта величина равна
наклону калибровочной кривой 5 - dX /dC = ДХ / АС. Чем
выше чувствительность, тем ниже предел детектирования.
Взаимосвязь между этими параметрами определяется
соотношением С/ОР=35л/5, где SB - стандартное
отклонение фонового сигнала, измеряемого в отсутствие
аналита, В таблице 1.1 приведена шкала концентраций
аналита, измеряемых с помощью биосенсоров.
Таблица 1.1
Шкала концентраций аналита, используемых в
биосенсорах.
Обозначение Концентрация, моль/л Число молекул в
Моль (М) 1 ~6*10’7
Миллимоль (гпМ) ю3 ~6х1014
Микромоль (рМ) 10" ~6х10И
Наномоль (пМ) Iff* ~6х108
Пикомоль (рМ) 10‘12 ~6х105
Фемтомоль (fM) Iff-*’ -6Х102
Аттомоль (аМ) ю18 0,6
Зептомоль (zM) 10‘21 0,0006
ю
1.1.2. Предмет и задачи сенсорики
Предмет сенсорики - физико-химические основы
функционирования сенсоров, принципы их действия,
основные конфигурации сенсоров.
Основная задача сенсорики - разработка и создание
аналитических устройств, отвечающих требованиям
высокой чувствительности, селективности, стабильности,
воспроизводимости результатов измерения.
1.2. Классификация биосенсоров
Принципиальная схема биосенсора может быть
представлена следующим образом (рис. 1.1):
.11а гекулярное у питан не
Биорецептор
Первичный отклик
Трансдуктор
Аналитический сигнал
Регистрация
сигнала
Рисунок 1.1 - Принципиальная схема биосенсора
Биосенсоры могут быть классифицированы по
нескольким критериям (рис. 1.2).
Биосенсоры
Капки ити чески е
Аффинные
Электро-
химические
Оптические
J 'равим ст-
оические
Калоримет
рические
Ферменты
Антитела
НК, РНК
Клетки
Клеточные
системы
С Бечки у —----
Биомиметики'
Рисунок 1.2 - Классификация биосенсоров
/. По химической природе определяемого вещества
(или по специфичности). Биосенсоры используются для
измерения количества или активности широкого диапазона
веществ - от простейших молекул, таких как газы (СЬ, SO2,
H2S, NO2), ионы тяжелых металлов (Hg. Tl, Pb, Cd), до
органических молекул (глюкоза, фенол и его производные,
пестициды и т.д.), макромолекул и даже микроорганизмов.
Таким образом, существуют отдельные группы биосенсоров
на кислород, перекись водорода, глюкозу и т.д.
2. По пишу биологического чувствительного
элемента. В качестве биологического элемента могут
использоваться:
а) ферменты (например, глюкозооксидаза,
супсроксиддисмутаза);
б) антитела (например, иммуноглобулин IgG);
в) другие функциональные белки (в частности,
бактериородопсин);
г) ДНК, РНК;
д) надмолекулярные комплексы (например, фотосистема
И);
е) клеточные органеллы (например, хлоропласты);
ж) клетки;
з) микроорганизмы (чаще всего бактерии);
и) срезы тканей растений и животных.
3. По принципу действия. По принципу действия, т.е.
в зависимости от механизма чувствительности, биодатчики
можно условно разделить на каталитические, аффинные,
основанные на ингибировании и др. В каталитических
датчиках биологически активными элементами являются
ферменты, катализирующие определенную биохимическую
реакцию (цепочку реакций) превращения субстрата,
продукт которой может быть проанализирован
трансдуктором. В аффинных сенсорах чувствительными
элементами чаще всего являются антитела, специфически
связывающие анализируемые молекулы. Биосенсоры,
основанные на ингибировании определенных процессов,
содержат ферменты, снижение активности которых
коррелирует с концентрацией ингибирующего анализа.
4. По типу трансдуктора. В зависимости от типа
трансдуктора можно выделить следующие основные
группы и подгруппы биосенсоров:
1) электрохимические, которые подразделяются на:
а) амперометрические;
б) потенциометрические;
в) кондуктометрические;
2) оптические:
а) флуоресцентные;
б) хемилюминесцентные;
в) абсорбционные;
г) плазмонно-резонансные;
3) гравиметрические:
а) пьезоэлектрические;
б) основанные на поверхностных акустических
волнах;
4) калориметрические.
1.3. История создания биосенсоров
Основоположником современной биосеисорики
является Леланд Кларк, который в 1956 году опубликовал
работу, посвященную созданию кислородного электрода. В
1962 году, в докладе на симпозиуме Нью-Йоркской
академии наук, Кларк описал эксперименты, в которых
была продемонстрирована принципиальная возможность
введения глюкозооксидазы в состав кислородного
электрода. Уменьшение концентрации кислорода в
процессе ферментативно]! реакции было пропорционально
концентрации глюкозы. Так был создан первый биосенсор.
Таблица 1.2
Основные вехи развития биосенсоров.
Год Этап развития
1916 Первое упоминание об иммобилизации белков на активированном угле
1922 Создание первого стеклянного электрода
1956 Создание Леландом Кларком кислородного электрода
1962 Первое упоминание о биосенсоре: Кларк и Лайонс описали амперометрический ферментативный электрод для детектирования глюкозы
1969 Создание первого потенциометрического биосенсора: уреаза была иммобилизована на аммиачном электроде для регистрации мочевины
1970 Создание биосенсора на полевом транзисторе
1973-1975 Первый коммерческий биосенсор на глюкозу для контроля уровня сахара в крови
1974 Создание ферментного термистора
1975 Первый биосенсор на основе оптическою волокна
Продолжение.
Таблица 1.2
1976-1982 Создание биосенсоров на основе бактерий и первый иммуносенсор
1985-2000 Бурное развитие биосенсоров, производство коммерческих биосенсоров
2000 Первый наносенсор
В 1974 году Гилболт и Монтальво впервые легально
описали строение и принцип действия
потенциометрического электрода. Это послужило основой
сенсора для определения мочевины на основе уреазы,
иммобилизованной на аммоний-чувствительном электроде.
В том же году было предложено использовать термические
трансдукторы в качестве элементов биосенсора. Такого
рода трансдукторы были названы термическими или
калориметрическими ферментными зондами, а датчики на
их основе - ферментными термисторами.
В 1975 году Любберс и Опитц создали первый
оптрод, волоконно-оптический сенсор, предназначенный
для измерения концентрации углекислого газа и кислорода.
Сейчас коммерческие оптроды широко используются для
определения pH, рСО? и рОз in vivo.
Дальнейшее развитие биосенсоров связано с
работами Диви, который предположил, что бактерии могут
быть использованы в качестве биологического элемента
сенсоров. Эти работы положили начало интенсивной
разработке биосенсоров на основе бактерий и
иммуносенсоров. Особенно бурно это направление
развивалось в период с 1976 по 1982 год в Японии, где было
создано большое количество сенсоров для
биотехнологических целей.
В 1984 году была опубликована серия работ об
использовании ферроцена и его производных в качестве
медиаторов. Это был значительный прорыв в создании
недорогих ферментных электродов. На основе этих
приборов американская компания МедиСенс в 1987 году
выпустила первый компактный датчик для определения
уровня сахара в крови в домашних условиях. В
последующее десятилетие получили развитие
теоретические основы биосенсорной концепции,
создавались новые приборы, совершенствовались старые.
Так продолжалось до 2000 года, когда был создан первый
наносенсор. Это положило начало новому перспективному
направлению биосенсорики.
1.4. Вопросы для самоконтроля
1. В чем основное отличие биосенсоров от остальных типов
датчиков?
2. Что такое аналит?
3. Могут ли в состав биосенсоров входить клетки?
4. Что такое трансдуктор?
5. К какой группе относятся биосенсоры, чувствительные к
изменению массы?
РАЗДЕЛ 2.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БИОСЕНСОРОВ
2.1. Молекулярное узнавание
Ключевым этапом функционирования биосенсоров
является молекулярное узнавание, т.е. специфическое
взаимодействие молекулы аналита с биорецептором.
Рассмотрим взаимодействие макромолекулы (белка) с
низкомолекулярным анализом (лигандом). Прочность связи
макромолекула-лиганд характеризуется константой
ассоциации:
’ L(nP-В)
(2-1)
где В - концентрация связанного лиганда;
L - концентрация свободного лиганда;
Р - общая концен грация белка;
п - число центров связывания лиганда на одной
молекуле белка;
пР - общее число центров связывания.
KaLnP _ LnP
l + K,L^ К,,+L
Ln
Kj + L
(2.2)
Kd = 1/ Ka - константа диссоциации.
Изотерма связывания имеет вид (рис. 2.1). Величина К.
соответствует молярной концентрации свободного лиганда
£, при которой половина центров связывания заняты.
Рисунок 2.1 - Изотермы связывания (ось Y - f = В/пР \ ось
X - общая концентрация лиганда (B+L\ константа
ассоциации: 1 - 2х 10' М 2 - 2* 10х М1; 3 -2х 109 М
1О1оМ.
Уравнение (2.2) может быть представлено в виде:
v п v
График зависимости г/|л] от v называют графиком
Скетчарда (рис. 2.2). Точка пересечения этого графика с
осью X равна и, а точка пересечения с осью Y равна п/ Kd.
Используя график Скетчарда. можно определить параметры
п и Л',. для простейшего случая, когда на одном центре
связывания сорбируется одна молекула лиганда.
Рассмотренная выше модель равновесного
связывания (уравнения (2.1) - (2.3)) называется также
моделью Ленгмюра. Эта модель справедлива при
следующих допущениях:
1) все центры сорбции идентичны;
2) на каждом центре сорбируется не более одной
молекулы лиганда;
3) адсорбированные молекулы не взаимодействую!
друг с другом.
Рисунок 2.2 - График Скетчарда (к - Kd)
Зная константу ассоциации, можно определить
изменение свободной энергии при образовании комплекса:
ЛС = -ЛПп^я = ЛЯ-TAS’. (2.4)
Константа ассоциации выражается в литрах на моль
(М '), AG - в кДж/моль. Чем выше , т.е. чем более
отрицательна величина AG, тем прочнее связь, т.е. тем
выше сродство лиганда к рецептору. Изменение энтальпии
(АН) определяется характером химических связей и
тепловыми эффектами, а изменение энтропии (AS) зависит
от степени упорядоченности системы.
Различают неспецифическое и специфическое
связывание. При неспецифическом связывании изотерма
адсорбции не выходит па насыщение (имеет вид прямой) в
исследуемом диапазоне концентраций лиганда. Существует
сильная корреляция между специфичностью и сродством:
чем выше константа ассоциации лиганда с рецептором, тем
выше будет степень дифференцирования между
специфическим и неспецифическим связыванием.
Ни один сенсор не может работать во всем диапазоне
концентраций - от молей до зептомолей. Нижний предел
зависит от чувствительности сенсора, а верхний предел
возникает вследствие эффекта насыщения, т.е. полного
заполнения рецепторных участков связывания аналитом.
Например, сенсор, разработанный для детектирования
пикомолей определенного вещества, будет реагировать на
изменение содержания анализа только до того момента,
пока все центры не будут заняты. Применение такого
сенсора для анализа образцов с миллимолярными или
микромолярными концентрациями аналита приведет к
быстрому выходу на насыщение и отсутствию какого-либо
дальнейшего изменения сигнала. Это означает, что сродство
сенсоров должно быть строго адаптировано к требуемому
концентрационному диапазону аналита. Для
моновалентного обратимого связывания лиганда пригодный
для анализа концен грационный диапазон обычно
ограничивается концентрациями на один порядок ниже и
выше константы диссоциации комплекса аналит-рецептор,
что соответствует степени занятости рецепторов от 20 до
80%. Селективность сенсора будет определяться
соотношением сродства к рецептору аналита и мешающих
примесей. Например, внутри клетки уровень ионов кальция
должен быть определен в присутствии ионов магния,
концентрация которого намного выше, а физико-
химические характеристики сходны. В таблице 2.1
приведены примеры комплексов лиганд-рецептор с разным
сродством Ка.
Таблица 2.1
Примеры комплексов лиганд-рецептор с разным сродством.
Взаимодействие к,, м-1 Пример
Слабое < 105 Взаимодействие молекул детергента в мицелле
Среднее 105- ю7 Комплекс фермент-субстрат или фермент-ингибитор
Продолжение.
Сильное 107- ю10 Взаимодействие липидов в мембране, комплексы гормонов и лекарств с клеточными рецепторами
Очень сильное > 1О10 Комплексы антиген-антитело
2.2. Комплекс фермент-субстрат
Ферменты - это белки, которые увеличивают
скорость биохимических реакций синтеза, распада и
взаимопревращения огромного множества разнообразных
химических соединений (скорость реакции может
возрастать до 1010 раз).
Субстрат - это вещество, которое после
взаимодействия с ферментом превращается в продукт.
Ферменты отличаются высокой специфичностью действия в
отношении как химической природы субстрата, так и типа
реакции, т.е. каждый фермент катализирует только
определенную химическую реакцию. Для каждого фермента
характерны специфическая последовательность
расположения аминокислотных остатков и
пространственная езруктура.
Активный центр - уникальная комбинация
аминокислотных остатков в молекуле фермента,
обеспечивающая ее связывание с молекулой субстрата и
прямое участие в акте катализа. В активном центре
различают так называемый каталитический центр,
непосредственно вступающий в химическое
взаимодействие с субстратом с образованием продукта
реакции, и связывающий центр, обеспечивающий
специфическое сродство к субстрату и формирование его
комплекса с ферментом.
Специфичность фермент-субстратных
взаимодействий - способность фермента отличать свой
субстрат от других родственных молекул. В рамках модели
индуцированного соответствия, предложенной Кошландом
в 1959 году, такая избирательность объясняется
взаимозависимыми конформационными изменениями
фермента и субстрата про принципу «рука в перчатку».
Аллостерический центр (от греч. alios - другой, и
steros - пространственный) - участок молекулы фермента, с
которым связываются определенные низкомолекулярные
вещества (эффекторы), отличающиеся по структуре от
субстратов. Присоединение эффектора к аллостерическому
центру изменяет третичную и четвертичную структуру
молекулы фермента, а также конфигурацию активного
центра, вызывая снижение или повышение ферментативной
активности.
Ферменты - наиболее распространенные
рецепторные компоненты биосенсоров. Рассмотрим
примеры биосенсоров на основе различных классов
ферментов.
Молекула химотрипсина
Рисунок 2.5 - Активный центр фермента
2.2.1. Гидролазы
Гидролазы - ферменты, катализирующие реакции
расщепления органических соединений при участии воды.
Эти реакции сопровождаются изменением pH, генерацией
или поглощением ионов (например, NH4 , НСОГ) или газов
(например, NH% СО2), которые определяют с помощью ион-
селективных электродов, ион-селективных полевых
транзисторов (ИСПТ), кондуктометрических
преобразователей или оптродов.
Таблица 2.2
Примеры биосенсоров на основе гидролаз.
Аналит Фермент Датчик
Глюкоза Глюконолактоназа pH-электрод, ИСПТ
Пенициллин Пенициллиназа pH-электрод, ИСПТ, кондуктометрия
Мочевина Уреаза газовый электрод, ИСПТ, кондуктометрия
Продолжение.
Ацетилхолин Холинэстераза pH-электрод, ИСПТ, кондуктометрия
Креатинин Креатинин деиминаза газовый электрод
2.2.2. Оксидазы (Н2О2~генерирующие ферменты)
Оксидазы - это ферменты, катализирующие реакции
переноса водорода или электронов на атомы кислорода в
реакциях окисления органических веществ. Эти реакции
сопровождаю гея образованием перекиси водорода Н2О2,
концентрацию которой можно определить множеством
методов: фотометрическими измерениями с
использованием медиаторов, анодным окислением на
амперометрическом электроде, хемилюминесцентными
методами, кондуктометрией и т.д.
Таблица 2.3
Примеры биосенсоров на основе оксидаз
Аналит Фермент Датчик
Глюкоза Г люкозооксидаза рН-электрод, ИСПТ, кондуктометрия, амперометрия
Продолжение.
Галактоза Г алактозооксидаза рН-электрод, амперометрия
D-и L- аминокислоты Оксидаза D-, L- аминокислот газовый электрод, ИСПТ, кондуктометрия
Метанол Алкогольоксидаза рН-электрод, ИСПТ, кондуктометрия
Этанол Алкогольоксидаза рН-электрод, ИСПТ, оптрод
Холестерин Холестеролоксидаза амперометрия
2.2.3. Дегидрогеназы
Дегидрогеназы - ферменты, в состав которых входят
производные никотинамиддинуклеотида NAD. В этих
системах происходит окисление или восстановление NAD
или NADPH, которые определяются амперометрическими
методами или с помощью оптродов.
Таблица 2.4
Примеры биосенсоров на основе дегидрогеназ.
Аналит Фермент Датчик
Глюкоза Глюкозодегидрогеназа рН-элекгрод, амперометрия
Лактат Лактат дегидрогеназа амперометрия, оптрод
Этанол Алкогольдегидрогеназа амперометрия, оптрод
Продолжение
Глутамат Глутаматдегидрогеназа амперометрия, рН-элек грод
Малат Малатдегидрогеназа амперометрия, оптрод
Пируват Л актатдегидрогеназа оптрод
2.3. Комплекс антиген-антитело
Антигены - это чужеродные молекулы (вирусы,
бактерии, низкомолекулярные вещества), проникающие в
организм.
Антитела (иммуноглобулины) - это гликопротеины,
распознающие и обезвреживающие антигены любой
химической природы. Различают 5 классов
иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.
Наиболее подробно изучена структура IgG (рис. 2.6). Он
имеет Y-образную форму и тетрамерное строение, состоит
из двух идентичных легких L-цепей (от англ, light) и двух
идентичных тяжелых Н-цепей (от англ, heavy) с
молекулярной массой 23-24 кД и 50-70 кД соответственно.
Каждая из этих цепей имеет 2 типа доменов - вариабельные
(V) участки, состоящие из 108 аминокислотных остатков, и
константные (С) участки, состоящие из 110 и 350
аминокислотных остатков соответственно в L- и Н-цепях.
Четыре цепи IgG ковалентно связаны между собой
дисульфидными мостиками. Антигенсвязывающий центр
образуется гипервариабельными участками L- и Н-цепей,
находящимися в верхней части Y-образной молекулы IgG.
Эпитоп - участок молекулы антигена, с которым
специфически связывается антитело. Комплекс антиген-
антитело стабилизируется водородными связями, солевыми
мостиками, ван-дер-ваальсовыми и гидрофобными
взаимодействиями. Прочность комплекса очень высока -
константа ассоциации превышает 10‘" М1.
-S
Рисунок 2.6 - Структура IgG человека. Показаны легкие (L)
и тяжелые (Н) цепи, дисульфидные связи, вариабельные V
(темные) и константные С (светлые) участки.
2.4. Комплекс гормон-рецептор
Гормоны - вещества органической природы, которые
продуцируются специализированными клетками желез
внугренней секреции, поступают в кровь и оказывают
регулирующее влияние на обмен веществ и
физиологические функции. Структура гормонов крайне
разнообразна - например, гормон инсулин, секретируемый
поджелудочной железой, является белком с молекулярной
массой 6 кД, а вазоактивный амин адреналин, влияющий на
артериальное давление, представляет собой небольшую
ароматическую молекулу с молекулярной массой 172 кД.
Один и тот же гормон может вызвать изменения
метаболизма в клетках разного типа. Например, повышение
уровня глюкозы в крови после приема пищи служит
сигналом для поджелудочной железы к секреции инсулина.
Инсулин стимулирует самые разные ткани-мишени (печень,
жировую ткань, мышцы), которые утилизируют глюкозу и
снижают ее содержание в крови. Когда уровень глюкозы
снижается до нормы, секреция инсулина прекращается.
Все гормоны можно разделить на 2 большие группы,
в зависимости от того, в какой части клетки возникает
первичный ответ на них - на клеточной поверхности или
внутри клетки.
Рецепторы гормонов - это белки (или
гликопротеины), способные специфически связывать
гормон в результате точного стерического соответствия.
Для каждого гормона существуют свои рецепторы, которые
могут быть расположены в плазматической мембране
(мембранные рецепторы) или находиться в растворенном
состоянии в цитоплазме или ядре.
Типичный механизм действия гормонов (например,
адреналина) включает следующие стадии’.
1. Образование комплекса гормон-мембранный
рецептор.
2. Присоединение рецептора к G-белку.
3. Изменение конформации G-белка, образование
комплекса G-белок-ОТР.
4. Связывание комплекса G-6cjiok-GTP с ферментом
аденилатциклазой.
5. Образование вторичного посредника сАМР,
способного активировать множество клеточных
ферментов и запуска ть каскад метаболических
реакций.
2.5. Молекулярные системы усиления
Обеспечение высокой чувствительности и
селективности биосенсора требует устранения
нежелательных эффектов, связанных с несиецифическими
реакциями между компонентами анализируемого раствора и
чувствительным слоем биоматериала (биоселективной
мембраной). Конструирование биосенсоров включает, как
правило, соединение мембраны или подложки, содержащей
биологический элемент, специфически связывающий
аналит, с гране дукз ором (электродом. полевым
транзистором, оптическим волокном и т.д.) и системой
первичной обработки и усиления измеряемого сигнала
(головным каскадом). Наибольшее распространение
получили конструкции, в которых чувствительный
биологический элемент размещен в непосредственной
близости от трансдуктора или иммобилизован на его
поверхности. Усиление специфического сигнала может
быть реализовано как на молекулярном уровне (уровень
чувствительного элемента), так и на уровне электронных
систем трансдуктора и головного каскада. Важной
особенностью биосенсоров является значительное усиление
сигнала на молекулярном уровне. Можно выделить четыре
принципиально различные кинетические модели
реализации усиления сигнала в биосенсорах.
2.5.1. Ферментативное усиление
Это тип усиления, при котором рснептирующая
(узнающая) молекула осуществляет преобразование
сигнала, например, путем каталитического превращения
определяемого вещества L в продукт Р. Процессу
соответствует следующая кинетическая схема:
L + R<—^-»LR ——>P + R , (2.5)
u
I
где R - рецсптирующая молекула (фермент);
LR - комплекс определяемого вещества L с рецептором
R;
Р - продукт каталитической реакции;
I - интенсивность сигнала трансдуктора;
К - константа равновесия образования комплекса LR;
к - константа скорости каталитического распада
комплекса LR.
Коэффициентом усиления а биосенсора называется
отношение копцен грации продукта реакции Р.
непосредственно связанного с сигналом 1, к концентрации
комплекса LR на поверхности датчика. Таким образом,
коэффициент а показывает, во сколько раз возрастает
сигнал по сравнению с прямым сенсором, когда
интенсивность сигнала транслятора I непосредственно
связана с концентрацией комплекса LR.
Тогда для рассматриваемого случая:
„ . Н = A[LR>
[LR]' [LR]
= kt.
(2.6)
Следовательно, при ферментативном типе усиления
величина а прямо пропорциональна величине кинетической
константы к и времени наблюдения за реакцией t. Другими
словами, чем больше число оборотов фермента и время
реакции, тем больше усиление. Среди биосенсоров этого
типа наиболее распространены ферментные электроды и
датчики на основе полевых транзисторов, используемые для
определения субстратов таких ферментов, как оксидазы,
гидролазы и лиазы (ферменты, катализирующие
отщепление от субстрата негидролитическим путем какой-
либо группы с образованием двойной связи или
присоединение определенной группы по месту разрыва
двойной связи).
2.5.2. Модуляция неспецифической реакции
В этом случае усиление происходит вследствие
влияния комплекса LR по определенному закону /([LR]) на
скорость И некоторой неспецифической реакции А —> В:
[в]-[в! _
[LR] =
<2.7)
где [в]„ - концентрация вешества В в момент времени t в
отсутствие комплекса LR определяется как скоростью и
временем проведения модулируемой реакции, так и видом
функции влияния [LR] на скорость V. В любом случае, чем
выше скорость модулируемой реакции и чем больше
степень ее изменения под действием комплекса LR, тем
больше коэффициент усиления биосенсора а.
Характерными примерами датчиков этого типа
являются сенсоры для определения кофакторов,
активаторов, ингибиторов ферментов, иммуноферментные
электроды. В последнее время развиваются подходы к
созданию гравиметрических биосенсоров на основе
модуляции скорости неспецифической сорбции из раствора
специфическими взаимодействиями типа антиген
антитело на поверхности трансдуктора. Применение таких
биосенсоров существенно расширяет класс анализируемых
веществ по сравнению с ферментными датчиками типа 1.
2.5.3. Смещение равновесия
Основа усиления специфического сигнала в этом
случае - смещение равновесия системы АоВ при
образовании комплекса LR:
В I
L + R<—»LR f(tLRj) >$
А
я 1И-Н.1
[LR]
где К2 = И/[4 В этом случае а тем выше, чем выше
исходная концентрация вещества А, не влияющего на
сигнал I, чем больше величина константы равновесия К2,
определяющая количество активного вещества В. и чем
выше степень изменения константы К2 под действием
комплекса LR -Д| LR]).
Высокие коэффициенты усиления (до 50 000)
характерны для датчиков, основанных на модуляции
ионной проницаемости специфических мембран за счет
взаимодействий типа антиген - антитело и лиганд -
рецептор. Высокие значения а можно получить и при
использовании датчиков на основе ориентированных
мономолекулярных слоев антител, в которых при адсорбции
антигена происходит переориентация монослоев или
фазовый переход.
2.5.4. Каскадное усиление
При каскадном усилении образование комплекса LR
приводит к инициации процесса перехода фермента из
неактивной формы Ei, в активную Eia. При этом
образование фермент-субстратного комплекса фермента Eia
приводит к активации второго фермента каскада Ег—>Ега и
т. д. Кинетическая модель этого процесса имеет вид:
Получить выражение для а в общем виде
затруднительно, но при линейном представлении получаем:
а = |[H„J-[Enj]„| = [e,Ie2][e„.,]/([lr])-i| (2 9)
[LR] [LR]
Таким образом, усиление тем больше, чем больше
ферментов в каскаде, чем выше их концентрации и чем
выше степени активации к и /([LR]) перехода ферментов из
неактивного в активное состояние. Типичными
представителями биосенсоров каскадного типа являются
рецепторные датчики, в которых осуществляется каскадное
сопряжение непосредственно рецептора, G-белка,
обладающего GTP-азной активностью, и эффекторного
фермента типа аденилатциклазы, фосфодиэстсразы или
ионного канала. Коэффициенты усиления в подобных
системах достигают 105. Наиболее перспективными среди
датчиков этого тина являются сенсоры на основе целых
клеток.
2.6. Вопросы для самоконтроля
1. Какие параметры характеризуют прочность связи
макромолекула-лиганд?
2. Какие параметры можно определить из графика
Скэтчарда?
3. Какой концентрационный диапазон оптимален для
биосенсоров, основанных на моновалентном обратимом
связывании лиганда?
4. Какие из известных комплексов являются самыми
прочными?
5. В чем состоит суть модели индуцированного
соответствия?
6. Какие реакции катализируют гидролазы?
7. Какие реакции катализируют оксидазы?
8. Что такое антиген и антитело?
9. Что такое эпитоп?
10. Какой гормон секретируется при повышении уровня
глюкозы в крови?
11. Сколько существует кинетических моделей усиления
сигнала на молекулярном уровне?
12. Что такое коэффициент усиления биосенсора?
13. Как реализуется усиление при модуляции
неспецифической реакции?
14. Что такое каскадное усиление?
15. Каких значений могут достигать коэффициенты
усиления в датчиках каскадного типа?
РАЗДЕЛ 3.
МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ЭЛЕМЕНТОВ СЕНСОРОВ
Разработка аналитических приборов, содержащих
биологический элемент, требует развития методов,
позволяющих стабилизировать этот элемент и сохранять
или целенаправленно модифицировать его свойства. К
числу таких методов принадлежат, в частности, методы
иммобилизации ферментов. Иммобилизованные ферменты,
т.е. ферменты, подвижность которых существенно
ограничена за счет связывания с нерастворимыми в воде
или с высокомолекулярными водорастворимыми
полимерами, являются основной составной частью
большинства биосенсоров.
Преимущества иммобилизации заключаются в:
а) стабилизации структуры фермента;
б) строгом контроле за специфичностью и
кинетическими свойствами фермента;
в) возможности повторного использования фермента;
г) простоте отделения продукта от фермента;
д) возможности прекращения реакции простым
удалением фермента из раствора.
Методы получения иммобилизованных ферментов
можно разделить на 5 основных групп’.
1) адсорбция на носителях;
2) ковалентное присоединение к носителям;
3) сшивание с бифункциональными реагентами;
4) включение в пространственную сетку гелей;
5) микрокапсулирование.
3.1. Адсорбция на носи гелях
Самый простой метод иммобилизации ферментов -
адсорбция на нерастворимом носителе. Суть этого метода
состоит в смешивании фермента и носителя, инкубации и
разделении растворимого и нерастворимого компонентов
смеси центрифугированием или фильтрованием. Основной
недостаток этого метода заключается в недостаточно
прочной фиксации фермента. Комплекс фермент-носитель
стабилизируется слабыми силами - электростатическими,
ван-дер-ваальсовыми и гидрофобными взаимодействиями и
водородными связями, поэтому изменение pH, ионной
силы, температуры и природы растворителя может
приводить к десорбции фермента. Десорбцию фермента
может вызвать также присоединение субстрата. В качестве
носителей используются: окись алюминия, карбонат
кальция, уголь, целлюлоза, глина, коллаген, пористое
стекло, гидроксиапатит, ионообменные смолы, фенольные
полимеры, силикагель, каолин. Для увеличения
сорбционной способности носители обрабатывают
гидрофобными соединениями или растворами солей
переходных металлов (титана, хрома, олова, алюминия).
Адсорбция на носителях - мягкий метод иммобилизации,
который, как правило, несущественно влияет на активность
фермента.
3.2. Ковалентное присоединение к носи гелям
Метод иммобилизации ферментов с помощью
ковалентного связывания основан на образовании
химической связи между молекулой фермента и носителем.
При этом важно, чтобы аминокислоты, образующие
активный центр фермента, не принимали участия в
ковалентном связывании с носителем. Поскольку этого
трудно избежать, ковалентная иммобилизация часто
приводит к снижению ферментативной активности.
Инактивацию фермента можно предотвратить, если
проводить иммобилизацию в присутствии субстрата,
который защищает активный центр. Фермент ковалентно
присоединяется к носителям, содержащим
реакционноспособные группы, или к предварительно
активированным носителям. Носитель может реагировать с
определенными группами белка: аминогруппами остатков
лизина, карбоксильными группами аспарагиновой и
глутаминовой кислот, а также с функциональными
группами остатков тирозина, гистидина, цистеина и
аргинина.
К числу носителей, содержащих
реакционноспособные группы, принадлежат, в частности:
Г) органические полимеры, которые получают пугем
сополимеризации малеинового ангидрида с этиленом или
акриловой кислотой. Эти полимеры содержат ангидридные
группировки, которые реагируют с аминогруппами белков
(Е - фермент):
2) сополимеры акриламида и производных акриловой
кислоты, сшитые бисакриламидом (так называемые
энзакрилы), состоящие из следующих элементарных
звеньев (3.2):
сн—сн—сн2-сн—сн2-сн—
CONH2 R СОХ
(3.2)
где X - активная группа, например. X = -NHCIbCHfOCHs^
- (энзакрил полиацеталь). В этом случае иммобилизация
белка происходит с образованием шиффового основания
(3.3):
- NHCH2CH(OCH3)2 + H2N-E “►
—NH СН,—СН — NE + 2СН3ОН (3 3)
Отдельную группу составляют органические и
неорганические носители, которые необходимо
активировать, т.е. присоединить к ним группировки,
способные реагировать с белком. В качестве примера такого
рода носителей можно привести целлюлозу, которая
активируется аминодихлортриазином (3.4):
хн-
NH-
Неорганические носители (пористые стекла,
металлы, алюмосиликаты) содержат на поверхности
гидратированные окисли металлов, которые активируются
с помощью обработки у-амипопропилтриэтоксисилапом
(3.5):
он
ОС2И5
О—Si----ОН-----+ С2Н5О—Si—(СН2)з----ЫН2
ОН ОС2Н5
ОН ОС2Н5
—► -----Si-о—Si (СН2)3 NH2
ОН ОС2Н5
Введенные таким пулом аминогруппы в присутствии
бифункциональных агентов присоединяются к
аминогруппам белка. Наиболее широко применяемый
бифункциональный агент - глутаровый альдегид (рис.3.1),
который образует сшивки между двумя аминогруппами
(рис 3.2):
Рисунок 3.1 - Структура глутарового альдегида, CsHgCh
NH2 + H С------(СН2)з---С—Н + NH2--------Е
-----► ----N=CH (СН2)3 CH=N—Е
Рисунок 3.2 - Образование сшивок между аминогруппами
белковых молекул
Носитель может быть активирован также с помощью
переходных металлов. Этот принцип лежит в основе
металлохелатного метода иммобилизации ферментов.
3.2.1. Металлохелатный метод
Этот метод основан на способности переходных
металлов, в частности титана и циркония, образовывать
хелатные комплексы. Рассмотрим систему хлорид титана
(IV) + целлюлоза. В растворе хлорида титана образуются
координационные (хелатные) комплексы различных типов
(3.6):
|Ti(H2O)6]4\ [Ti(H2O)5Cl]3+, [Ti(H2O)Cl5]-, [TiCk]2'. (3.6)
Рисунок 3.3 - Комплексный ион титана
L-нейтральный лиганд
Целлюлоза представляет собой полимер, состоящий
из молекул D-глюкопиранозы, соединенных [3-1,4 -
гликозидной связью (рис. 3.4).
Рисунок 3.4 — Структура целлюлозы
Две гидроксильные группы целлюлозы (2 и 3),
которые не участвуют в образовании гликозидных связей,
являются эффективными лигандами для ионов титана. Эти
группы замещают два лиганда иона титана, связывая таким
образом вдоль своих цепей различные аква-, хлораква- и
хлор-комплексы попов титана, имеющиеся в растворе (рис.
3.5). По стерическим причинам все лиганды иона титана
невозможно заместить гидроксильными группами
целлюлозы. Поэтому любая другая молекула, содержащая
группы, способные замещать лиганды, в частности белок,
может образовывать комплексы с титаном, связанным с
целлюлозой. В молекулах ферментов, антител и антигенов
комплексы с титаном могут образовывать свободные
карбоксильные группы, гидроксильные группы тирозина,
серина и треонина, свободные сульфгидрильные группы
цистеина и аминогруппы остатков лизина.
Целлюлоза
X = Н2О
Целлюлоза
Рисунок 3.5 - Связывание комплексов ионов титана с
целлюлозой
При иммобилизации белков металлохелатным
методом в качестве носителей используют также пористое
стекло, силикагель, желатину, поперечно сшитую
глутаровым альдегидом. Стабильность препаратов,
получаемых металлохелатным методом, варьирует в
широких пределах. Различают два вида стабильности
ферментов: а) стабильность при хранении (т.е. доля
активности, сохранившейся в течение определенного
времени) и б) операционная стабильность (т.е. стабильность
в процессе функционирования, которая характеризуется
временем полуинактивации фермента в рабочих условиях).
Стабильность иммобилизованных ферментов можно
повысить путем поперечного сшивания аминогрупп
белковых молекул глутаровым альдегидом, однако это
приводит к снижению ферментативной активности.
3.3. С шивание с бифункциональными реагентами
Этот способ используется для получения
ферментных мембран, необходимых для изготовления
ферментных электродов. При добавлении в раствор
фермента реагента, обладающего двумя или большим
числом реакционноспособных групп, молекулы белка
сшиваются, образуя пространственную сетку (3.7).
Наиболее распространенным бифункциональным
агентом является глутаровый альдегид (рис 3.1).
Существует четыре основных способа
иммобилизации ферментов с помощью бифункциональных
агентов:
1. Непосредственное сшивание ферментов.
2. Сшивание ферментов с инертными белками.
3. Адсорбция ферментов на водонерастворимом
носителе с последующей обработкой
бифункциональным агентом.
4. Активация носителей бифункциональными агентами
с последующей иммобилизацией фермента.
Наибольшее распространение получили второй и третий
способы иммобилизации.
В частности, второй метод включает следующие
стадии:
1) растворение фермента и инертного белка (как
правило, альбумина) в буфере (суммарная
концентрация белка - 4 %);
2) добавление 25% раствора глутарового альдегида
до конечной концентрации 2%;
3) тщательное перемешивание смеси;
4) замораживание раствора сухим льдом;
5) размораживание при температуре 4 °C на плоской
стеклянной поверхности (до образования тонкого слоя
фермента);
6) отделение губкообразного иммобилизованного
фермента от стекла;
7) промывание ферментной пленки буфером и водой.
3.4. Включение в пространственную сетку гелей
Преимуществом этого метода является проведение
иммобилизации в мягких условиях, исключающих
химическую модификацию и денатурацию фермента. Для
иммобилизации белков используются полиакриламидные,
полиэтиленгликольметакрилатные, полисахаридные,
полиионитные гели, а также различные неорганические
гели.
Полиакриламидный гель (ПААГ) образуется при
реакции акриламида (CH2=CH-CONH2) с N-N’-
метиленбисакриламидом (CH2=CH-CONH)2-CH2, который
сшивает линейные полимерные цепи акриламида (рис. 3.6).
Полимеризация акриламида протекает по
свободнорадикальному механизму, поэтому для инициации
реакции необходимо генерировать свободные радикалы,
например, УФ-облучением. Свободные радикалы вызывают
ра?рыв двойной связи в молекуле акриламида и
присоединяются к ней таким образом, что снова образуется
радикал с неспаренным электроном. Этот радикал, в свою
очередь, вызывает разрыв двойной связи и присоединение
следующей молекулы акриламида и т.д. Цепная реакция
полимеризации идет до тех пор, пока столкновение двух
радикалов не приводит к образованию ковалентной связи. В
растущие цепи линейных полимеров по этому же
механизму встраивается N-N’-метиленбисакриламид,
образуя поперечные сшивки между цепями.
Акриламид Н2с—СМ + Н2С=СН * С—о о=о 1 1 Nllj NH сн2 1 NH 1 С=О ЩС— гн
Полиакриламид
с— Oil ОН2 ОН ОН2 -он
С“-О С=О С=О 1 1 1
NH? NH2 NH
1 (ТН2 1 NH2 NH? NH 0=0 0=0 0=0
—с—с—с—с—п/:—с —
Н2 Н Н2 н я
Рисунок 3.6 - Полимеризация акриламида с образованием
геля
При образовании поперечных связей между
растущими полиакриламидными цепями гель приобретает
структуру грехмсрной сетки, ячейки которой захватывают
молекулы фермента. Физико-химические свойства геля
(прочность, эластичность, вязкость) определяются степенью
полимеризации акриламида и числом поперечных сшивок,
которое можно изменять, варьируя соотношение
акриламида и бис-акр ил амида. Наилучшими свойствами
обладают гели, полученные при полимеризации 5%
раствора акриламида и бис-акриламида (процентное
отношение суммарной массы обоих мономеров к объему их
раствора), количество бис-акриламида в котором составляет
5% от общей концентрации мономеров. При правильно
проведенной иммобилизации нс должно наблюдаться
утечки фермента из геля в раствор.
Полисахаридные и полиионитные гели отличаются
тем, что их пространственная структура образуется нс за
счет ковалентных, а за счет водородных и ионных связен.
Наиболее часто используемые полисахариды - агар,
крахмал, альгинат. Для образования полиионитных гелей
поликатионит (например, полиэтиленимин) и полианионит
(полиакриловая кислота) растворяют в
высококонцентрированном растворе КС1 (образование
ионных связей блокируется), а затем этот раствор ставят на
диализ против воды или разбавляют водой, что приводит к
усилению электростатических взаимодействий между
полиэлектролитами и формированию геля. Для
иммобилизации ферментов применяются также
неорганические гели, образующиеся из окислов алюминия,
титана или олова.
3.5. Микрокапсулирование
Отличительной особенностью этого метода является
иммобилизация не отдельных молекул фермента, а
раствора, содержащего фермент. Водные растворы
ферментов включают в полимерные микрокапсулы.
Полимер должен обладать когезионными свойствами,
обеспечивающими образование непрерывной пленки, быть
проницаемым для субстрата и инертным по отношению к
реакционной среде. С этой целью используют, например,
карбоксиметилцеллюлозу, нитрат целлюлозы, желатину,
силиконированный каучук. эпоксидные смолы,
полиуретаны, стирол и полиамиды.
Системы, в которых одно вещество распределено в
другом в виде частиц различных размеров, называются
дисперсными. Среда, содержащая вещество в
раздробленном состоянии, называется дисперсионной, а
раздробленное в ней вещество - дисперсной фазой.
Дисперсные системы, в которых дисперсионная среда и
дисперсная фаза находятся в жидком состоянии,
называются эмульсиями. Эмульсии образуются из двух
несмешивающихся жидкостей, например воды и
неполярного или малополярного растворителя (бензола,
хлороформа, масла), при дроблении одной жидкости в
другой (диспергировании). При дроблении жидкости на
капельки площадь границы раздела между двумя жидкими
фазами значительно увеличивается, что приводит к
возрастанию избыточной поверхностной энергии. Такие
системы термодинамически неустойчивы. Уменьшение
избыточной энергии происходит за счет сокращения
площади поверхности раздела при слиянии (коалесценции)
отдельных капелек друг с другом. Это приводит к
расслаиванию эмульсии на два несмешивающихся слоя.
Эмульсия может быть устойчива только в присутствии
веществ, которые, адсорбируясь на поверхности капелек,
препятствуют их слипанию. Вещества (стабилизаторы),
способные обеспечивать устойчивость эмульсий,
называются эмульгаторами.
Наиболее распространенными методами
микрокапсулирования являются межфазные коацервация и
поликонденсация. Коацервация состоит в фазовом
разделении коллоидных частиц полимера, которые
конденсируются вокруг водных капель и затем образуют
непрерывную мембрану при коалесценции этих капель. При
этом наиболее часто используются такие полимеры, как
нитрат целлюлозы, ацетат целлюлозы и бутадиеновый
каучук.
Метод межфазной коацервации включает
следующие стадии:
1) смешивание раствора фермента с раствором
инертного белка или полимера, предохраняющего
фермент от инактивации (с этой целью часто
используют белки - бычий сывороточный альбумин,
гемоглобин или полимеры полиэтиленимин,
поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль);
2) введение эмульгирующего агента в не
смешивающуюся с водой органическую фазу (эфир,
циклогексан, толуол);
3) добавление раствора фермента (1) к органической
фазе (2) и перемешивание в течение определенного
времени с заданной скоростью, от которой зависит
размер микрокапсул;
4) добавление к двухфазной смеси, полученной на
стадии 3. раствора полимера (например, нитрата
целлюлозы) в органическом растворителе, в
результате чего происходит образование коллоидной
системы (т.е. системы, в которой одно вещество
распределено в другом в виде частиц различных
размеров, от 1 нм до 0.1 микрона);
5) упаривание органического растворителя, в ходе
которого формируются микрокапсулы с оболочкой,
состоящей из молекул полимера (толщина оболочки
зависит от концентрации полимера и времени
упаривания);
6) выделение микрокапсул центрифугированием и их
промывка буферным раствором, содержащим
детергент.
При микрокапсулировании методом межфазной
поликонденсации один из реагентов, необходимых для
полимеризации, находится в водной, а другой - в
органической фазе. На границе раздела фаз происходит
реакция полимеризации и вокру] водных капель,
диспергированных в органической фазе, образуется слой
полимера. Недостатком этого метода является возможность
реакции между полимеризующим агентом и ферментом в
водной фазе. Еще одним методом микрокапсулирования
является включение ферментов в полые волокна. При
добавлении водного раствора фермента к раствору
полимера в не смешивающемся с водой растворителе
образуется эмульсия, из которой формируются полые
волокна, захватывающие фермент. Таким способом были
иммобилизованы, например, глюкоамилаза, галактозидаза,
глюкозоокс и даза.
Существенно, что рассмотренные выше принципы
иммобилизации ферментов используются также при
иммобилизации других биологических макромолекул,
макромолекулярных комплексов, клеток, бактерий,
микроорганизмов.
3.6. Сравнительная характеристика методов
иммобилизации белков
Выбор метода иммобилизации определяется типом
аналитического устройства, в котором используется данный
биологический элемент. Например, в устройствах, действие
которых зависит от скорости диффузии веществ через слой
иммобилизованного фермента (ферментных электродах,
подложках для флуоресцентных измерений), применяются
ферменты, включенные в гели или сшитые
бифункциональными реагентами. В системах на основе
миниреакторов применяются ферменты, ковалентно
связанные с носителем.
Наиболее сложными и дорогими методами являются
ковалентное пришивание и микрокапсулирование.
Универсальным методом иммобилизации, который был
применен для подавляющего большинства ферментов и
клеток, является включение в гидрофильные гели.
Преимущества и недостатки методов иммобилизации
ферментов приведены в таблице 3.1.
Таблица 3.1
Сравнительный анализ методов иммобилизации
ферментов.
Метод иммобилизации Преимущества Недостатки
1 Адсорбция на носителях Сохранение конформации фермента, простота, доступность, дешевизна Десорбция белка в результате изменения температуры, pH, ионной силы или концентрации субстрата, низкая специфичность
2 Ковалентное присоединение к носителям Стабилизация структуры белка, широкий выбор носителей и способов связывания Сложность, дороговизна, потеря активности фермента
3 Сшивание с бифункциональными реагентами Слабая десорбция фермента, совместимость с другими методами иммобилизации Потеря активности фермента при сшивании
4 Захват гелем или капсулой Широкая применимость, сохранение нативной структуры белка Повреждение активного центра свободными радикалами, неприменимость в случае большого размера субстратов
3.7. Методы иммобилизации липидов
Эффективность функционирования ферментов в
составе биосенсоров (т.е. степень сохранения нативной
конформации белка и его ферментативной активности) в
значительной степени определяется микроокружением
иммобилизованного фермента. Одним из способов
предотвращения инактивации фермента является адсорбция
белка на поверхности липидного слоя. В этом аспекте
большой интерес представляют методы получения
липидных и белок-липидных мембран, иммобилизованных
на носителе (или подложке).
Выбор подложки определяется типом
регистрируемого аналитического сигнала. Например, в
сенсорах, основанных на явлении поверхностного
плазмонного резонанса или ньезоакустических эффектах,
используются металлические подложки, а в оптических
волноводных сенсорах - подложки из оксида кремния.
Создание оптимальных условий для
самоорганизации иммобилизованных компонентов мембран
и их ковалентного связывания с носителем требует
химической модификации (активации) поверхности
подложки.
3.7.1. Химическая модификация поверхности
подложки
Поверхности благородных металлов
модифицируются серосодержащими соединениями, в
частности, длинноцепочечными тиолами SH(CH2)WX, п>10.
Эти вещества адсорбируются из раствора на поверхность
металла, образуя плотно упакованные ориентированные
монослои. Наибольшее распространение получили
монослойные пленки, образующиеся при адсорбции тиолов
на поверхности золота. Такие пленки не имеют дефектов и
устойчивы к воздействию кислот и щелочей. Природа
концевой группы (X) может варьироваться в широких
пределах, поскольку очень мало лигандов конкурируют с
тиолом (SH) за участки связывания на поверхности золота.
Выбор концевой группы определяет свойства
формирующейся поверхности. Так, монослои алкилтиолов
(Х=СНз) служат гидрофобной подложкой для липидных
монослоев. Гидрокситиолы (Х=ОН) придают поверхности
гидрофильные свойства, что предотвращает денатурацию
контактирующих с поверхностью белков и способствует
образованию липидного бислоя. При введении титруемых
концевых групп (Х=СОО‘ или X-NH.T) степень
гидрофильности поверхности становится зависимой от pH.
Более сложные тиолы служат для выполнения специальных
функций. Например, тиолы, в которых концевой группой
является полиэтиленгликоль, образуют монослой,
препятствующий адсорбции белка. Ковалентное
присоединение тиольной группы к полярной головке
фосфолипидов позволило получить тиолипиды, которые
используются для иммобилизации («заякоривания»)
липидного бислоя на подложке. Более сложные
поверхности могут быть получены при адсорбции двух и
более типов тиолов с различными концевыми группами и
разной длиной цепей.
Поверхности оксидов (в частности, оксида кремния,
применяемого для изготовления волноводов) по своей
природе гидрофильны и могуг быть использованы без
предварительной химической модификации. Если же
введение дополнительных химических групп необходимо,
для активации поверхности применяют соединения кремния
(силаны), в частности аминопропил-триэтоксисилан и
меркаптопропил-триметоксисилан (рис. 3.7). Силаны могут
содержать разнообразные функциональные группы, что
позволяет создавать поверхности с заданными свойствами.
Монослои силанов устойчивы к повышению температуры,
воздействию кислот и органических растворителей, но
нестабильны в щелочной среде.
3.7.2. Формирование липидных мембран на твердой
подложке
Существует три различных конфигурации липидных
слоев на подложке:
1) фосфолипидный монослой на гидрофобном слое
подложки;
2) «плавающий» липидный бислой на гидрофильной
поверхности;
3) липидный бислой, ковалентно связанный с
поверхностью (рис. 3.8).
Рисунок 3.7 - Химическая модификация поверхности:
ДОФ-SH - 1,2-олеоил-$72-глицеро-3-фосфотиоэтанол, МДК
-1,1 -меркаптоундекановая кислота, АПТЭС -
амипопропил-триэтоксисилан, МТС - меркаптопропил-
триметоксисилан, НТК - нитрило-триуксусная кислота
О'
Рисунок 3.7 - Продолжение
( 17Н3.’
1. A - гидрофобный слой подложки, образуется
путем: а) самосборки алкилтиолов на поверхности золота;
б) самосборки алкилсиланов на поверхности оксида
кремния; в) переноса ленгмюровской пленки жирных
кислот с границы раздела вода - воздух на гидрофильную
поверхность, г) связывания жесткого гидрофобного
полимера с поверхностью.
2. Б - «плавающий» липидный бислой образуется на
гидрофильной поверхности свободного от примесей стекла,
кварца или оксида кремния, на которых липидные бислои
могут быть могут быть сформированы путем «растекания,
распластывания» липидных везикул или путем
двухступенчатого переноса ленгмюровских монослосв.
Поверхности золота можно придать свойство
гидрофильности путем введения тиолов с гидрокси-,
карбокси- или аминоконцевыми группами.
«Распластывание» бислоя происходит более эффективно,
если концевые группы тиолов и полярные головки
фосфолипидов противоположно заряжены. Возможно также
образование «плавающих» бислоев на поверхности
гидрофильного полимера, сорбированного па твердой
подложке.
3. В - для ковалентного связывания липидов с
поверхностью золота используются тиольные липиды, а с
поверхностью оксида кремния - липиды с определенной
функциональной группой, образующей ковалентную связь
химическими группами активированной поверхности. В
этом случае иммобилизованный бислой образуется путем
самосборки из суспензии липидных везикул или раствора
детергента.
Рисунок 3.8 - Архитектура липидных слоев на
подкладке: (Л) фосфолипидный монослой на гидрофобной
подкладке; (Б) «плавающий» липидный бислой на
гидрофильной поверхности; (В) липидный бислой,
ковалентно связанный с поверхностью
Наиболее стабильные липидные бислои получаются
при использовании ковалентной иммобилизации. Другим
преимуществом этого метода является возможность
создания эластичной прокладки (спейсера) между бислоем
и поверхностью. Например, синтезированы тиольные
липиды, в которых между SH-группой и полярной головкой
липида располагаются гидрофильные спейсерные группы.
Третьим преимуществом ковалентного метода
иммобилизации является возможность образования водной
прослойки между липидным бислосм и твердой подложкой.
Это позволяет создать условия, обеспечивающие
сохранение активности везроенных в бислой ферментов.
3.8. Вопросы для самоконтроля
1. Стабилизируется ли структура фермента при
иммобилизации?
2. Какими взаимодействиями стабилизируется комплекс
фермент-носитель при иммобилизации методом адсорбции
на носителях?
3. Может ли ковалентная иммобилизация приводить к
снижению ферментативной активности?
4. Какой бифункциональный реагент наиболее широко
применяется при иммобилизации ферментов?
5. Денатурирует ли фермент при включении в
пространственную сетку геля?
6. Из каких жидкостей (смешивающихся или не
смешивающихся) образуются эмульсии?
7. Чему препятствуют эмульгаторы (стабилизаторы)?
8. Какие методы иммобилизации являются наиболее
дорогими?
9. Какие соединения используются для модификации
поверхности благородных металлов?
10. Какие соединения используются для модификации
оксида кремния?
РАЗДЕЛ 4.
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ
4.1. Физико-химические основы
функционирования электрохимических сенсоров.
Электрохимическая цепь
В настоящее время наибольшее распространение
получили сенсоры с электрохимическими детектирующими
элементами - электродами или полевыми транзисторами.
Существует три основных группы электрохимических
сенсоров, различающихся по типу измеряемого сигнала,
потенциометрические, амперометрические и
кондуктометрические сенсоры. Потенциометрические
сенсоры характеризуются линейной зависимостью
потенциала от логарифма концентрации определяемого
вещества. В амперометрических датчиках ток,
регистрируемый при постоянном или переменном (заданной
формы) потенциале линейно зависит от концентрации
аналита. В кондуктометрических сенсорах измеряемой
величиной является проводимость. В большинстве
электрохимических сенсоров аналит находится в растворе,
контактирующем с трансдуктором. В основе
функционирования этих сенсоров лежат электрохимические
процессы, протекающие на границе раздела
электролит/поверхность трансдуктора.
Основной стадией электрохимического процесса
является реакция переноса заряда, состоящая в обмене
электронами, ионами или электронными вакансиями
(дырками) между электродом и раствором. Существует два
механизма переноса электрона r окислительно-
восстановительных реакциях - химический и
элекзрохимический. Первый механизм реализуется при
непосредственном контакте между окислителем (Ох) и
восстановителем (Red), тогда как во втором случае реакции
восстановления соединения Ох и окисления Red
пространственно разобщены в электрохимической ячейке и
протекают на границе раздела электрод - раствор. Ход
электрохимического процесса зависит от строения границы
раздела, концентраций реагентов и продуктов
окислительно-восстановительной реакции.
Простейшую окислительно-восстановительную
реакцию можно представить в виде:
Ох + пе <-+ Red
(4.1а)
где п - общее число электронов, которые переносятся от
восстановителя к окислителю.
Например, в реакции образования воды 21Ь + О: —*•
2НгО атомы кислорода восстанавливаются (принимают
электроны), а атомы водорода окисляются (отдают
электроны). Рассмотрим другую реакцию - окисления
железа четырехвалентным церием:
Fe2+ + Ce(lV) -> Fe3+ + Се(1П)
(4.16)
где роль окислителя играет ион Ce(IV), а роль
восстановителя - ион Fe .
Эту реакцию можно осуществить двумя путями - 1)
химическим и 2) электрохимическим. Химический путь
реализуется при непосредственном контакте реагирующих
частиц (при добавлении раствора церия к раствору железа).
Если реакция осуществляется электрохимическим путем,
окислитель и восстановитель пространственно разделены, а
передача электронов осуществляется с помощью
металлических проводников. Например, пластинка из
платины, опущенная в раствор с ионами Fe2+, будет
электродом, который принимает электроны:
Fe2+ + Pl -> Fe3+ + ePt. (4.1«)
Этот электрод называется анодом. Если другой
платиновый электрод (катод) поместить в раствор с ионами
Ce(IV) и соединить растворы Ье' и Ce(lV) солевым
мостиком, электроны по внешней цепи буду!' переходить с
анода на катод, т.е. в системе будет протекать
электрический ток. Поскольку в растворах Fe2 и Ce(IV)
свободных электронов нет, электрический ток является
результатом переноса ионов через раствор солевого
мостика. Солевой мостик представляет собой устройство,
обеспечивающее электрический контакт между двумя
растворами, но не позволяющее растворам смешиваться
друг с другом. Обычно солевой мостик заполняют
раствором КС1, поскольку ионы К и СГ движутся под
действием электрического поля почти с одинаковой
скоростью. Таким образом, в рассматриваемой системе
электрический ток будет протекать благодаря переносу
ионов К и СГ. Изображенная на рисунке 4.1 система
представляет собой электрохимическую цепь.
Электрохимическая цепь работает как химический источник
тока - в ней электрический ток возникает в результате
самопроизвольно протекающей окислительно-
восстановительной реакции. Основными элементами
электрохимической цепи являются: 1) металлические (или
полупроводниковые) электроды; 2) проводник второго рода
(раствор электролита, его расплав или твердый электролит)
и 3) границы раздела фаз - между металлом и
электролитом, между двумя различными металлами и
между двумя различными электролитами. Все эти элементы
определяют закономерности протекания тока в
электрохимической цепи. Физические явления, лежащие в
основе электрохимических реакций, существенно
отличаются от явлений, характерных для химических
процессов. Особенно важным для электрохимических
реакций является строение границ раздела и
направленность потоков окислителя и восстановителя к
поверхности электродов, а продуктов реакции - от
электродов в объем раствора. При этом большая часть
химической энергии превращается в электрическую
энергию.
Рисунок 4.1 - Электрохимическая цепь
4.2.
Основные
характеристики
электрохимических процессов
Химическое равновесие в объеме раствора (Ь), в
котором протекает реакция (4.1с/), описывается следующим
соотношением:
/-1Ох + п^е “ ZzRec/ , (4.2с/)
Где - химический потенциал, связанный со стандартным
химическим потенциалом (//'') и активностью /-го
компонента реакции (а,) соотношением:
//z- = д" + RT In c/z. (4.26)
При погружении в раствор металлического электрода в
системе должно установиться электрохимическое
равновесие, для которого характерно равенство
электрохимических потенциалов электрона в растворе и
в электроде /7J:
(4.2«)
Электрохимический потенциал / - го компонента в фазе а
определяется соотношением:
(4.2г)
где Zi - заряд частицы;
F - постоянная Фарадея (96485 Кл моль1);
(ра - внутренний электрический потенциал фазы а,
численно равный работе, совершаемой при переносе
элементарного положительного заряда из бесконечности в
фазу а.
Потенциал (ра может быть представлен в виде
суммы внешнего потенциала у/7, обусловленного
свободными зарядами фазы «, и поверхностною потенциала
(ра = Va + •
(4.2с))
Для растворов величина определяется
ориентацией находящихся на поверхности диполей
растворителя, а на границе металл-вакуум поверхностный!
потенциал возникает в результате частичного смещения
элеклронного газа относительно ионов кристаллической
решетки металла, чго приводит к образованию дипольного
слоя.
Комбинируя соотношения (4.2), легко показать, что
разность потенциалов между электродом и раствором
(элекзролитом) равна:
Z'ReJ
п
оЪ Z? 7^
+ ^- + RT\nae„ + — ln-^-
« J «Ree/
(4.3)
Величина A/,^> называется гальвани-потенциалом.
Возникновение гальвани -потенциала обусловлено
образованием у поверхности электрода двойного
электрического слоя (ДЭС). Ввиду зависимости
химического и электрического потенциалов /л? ы(ра
(уравнение (4.2г)) абсолютные значения <ра и Д^
определить невозможно (химический потенциал не
определяется экспериментально). Экспериментально можно
измерить только изменение электродного потенциала или
напряжение Е (э.д.с.) гальванического элемента, состоящего
из погруженных в исследуемый раствор индикаторного
(рабочего) электрода и электрода сравнения. Потенциал
электрода сравнения принимают равным 0. Электродным
потенциалом называют э.д.с. электрохимической цепи,
состоящей из стандартного водородного электрода и
электрода окислительно-восстановительной реакции.
Напряжение Е можно представить как сумму скачков
потенциала:
Е = Е',пЧ> + ^se<p + А'/> + △"> •
(4.4а)
где индексами w, se, ie обозначены металл клеммовых
соединений гальванического элемента, раствор электрода
сравнения и индикаторный электрод соответственно.
Состав исследуемого раствора влияет только на
значения Л’дд и Д^. Величина Л\.<^ представляет собой
диффузионный скачок потенциала на границе двух
жидкостей (Ed) (исследуемый раствор - раствор электрода
сравнения), а величина Д^ определяется выражением
(4.3).
Полагая, что = 1, получаем:
E = E°+-ln-^ + Ed, (4.46)
aRed
где Е° - стандартный потенциал окисли тельно-
восстановительной реакции, определенный относительно
электрода сравнения.
Электродом сравнения обычно служит стандартный
водородный электрод. Если при измерениях Е величина Ej
пренебрежимо мала или известна, уравнение (4.46)
преобразуется в уравнение Нернста:
Е = Е° + — In . (4.5а)
nF "Re</
Взаимосвязь между активностью (о) и
концентрацией (с) описывается соотношением a = fc, где/
- коэффициент активности, который для иона с зарядом г,-
(при молярных концентрациях меньше 0.01 М) в рамках
теории Дебая-Хюккеля определяется выражением:
2 3
In fi =---'' ‘ (2000-V^)1 2
/1/2,
(4.56)
гДе /=тХ
с^~ - ионная сила раствора.
Для разбавленных водных растворов электролитов
активности в уравнении (4.5а) можно заменить
концентрациями окисленной и восстановленной форм
реагента:
Е = Е° + — In .
(4.6)
4.3. Классификация электродов
Основным критерием классификации электродов
является химическая природа веществ Ох и Red,
участвующих в электродном процессе. Различают
электроды 1-го, 2-го и 3-го рода и окислительно-
восстановительные электроды, или редокс-системы.
Электродом 1-го рода называют систему, в которой
восстановленной формой является металл электрода, а
окисленной формой - простые ионы этого же металла.
Потенциал электрода 1-го рода определяется выражением:
£• = £"+ — In
wF ам
(4.7)
где Ui - активность ионов металла в растворе.
а.м - активность металла.
RT
Для чистых металлов ам = const и член----In a w
nF
вводится в стандартный потенциал. Например, для системы
24 , RT
Си‘ + 2е <-> Си потенциал равен Е = Е" +-In а , 2+ •
2F (и
Электродом 2-го рода называют систему, в которой
металл покрыт слоем его груднорастворимой соли (или
оксида), а раствор содержит анионы этой соли (для оксида
- ионы ОН ). Примерами электродов 2-го рода являются
электроды сравнения (4.8а, в):
а) хлорсерсбряпый электрод: AgCl + е <-> Ag + СГ
(Е = Е° —— In 47 );
(4.847)
б) каломельный электрод: HgiCb + 2е <-> 2Hg Н-2С1
(£ = £°-—1пасг );
(4.86)
в) ртутно-окисный электрод: Hg2O + 2е + НгО «-> 2Hg +
2ОН' (Е = Е°
RT.
г ^паон
(4.ВД
В редко используемых электродах 3-го рода металл
находится в контакте с двумя труднорастворимыми солями.
Электроды, в которых металл является лишь
переносчиком электронов между веществами Ох и Red.
называют окислительно-восстановительными электродами
(или редокс-системами). К числу таких систем относятся, в
частности, газовые электроды. Газовые электроды состоят
из инертного металла (часто платины), к которому
подводится электрохимически активный газ. Молекулы газа
адсорбируются на поверхности металла, распадаясь при
этом на атомы, которые затем участвуют в электродных
реакциях. Примером газового электрода является
водородный электрод, на поверхности которого
устанавливается равновесие: Н + е <-> I/2H2. В этом
электроде пластина из платины помещается в раствор
кислоты с единичной активностью и омывается током
водорода, давление которого равно 1 атм (1.01* 10 Па).
Стандартный потенциал водородного электрода равен 0.
4.4. Ионселективные электроды
Широкое практическое применение нашли
электрохимические цепи, в которых растворы электролитов
разделены мембраной, проницаемой для определенного
вида ионов. В таких системах возникает мембранная или
доннанова разность потенциалов. Рассмотрим границу двух
растворов (1 и 2), разделенных мембраной, проницаемой
только для ионов Д’, В и молекул растворителя и
непроницаемой для ионов R (рис. 4.2).
Рисунок 4.2 - Граница между растворами, М -
полупроницаемая мембрана
Ионы А , В и молекулы растворителя будут
диффундировать через мембрану до тех пор, пока не
установится электрохимическое равновесие и растворы (1)
и (2) не станут электронейтральными. Условие
электронейтральности имеет вид:
где С - равновесные концентрации ионов.
Условие электрохимического равновесия для
границы растворов (1) и (2) имеет вид:
(1) = //(2)- /7(П = //(2)
А~ •> ^В+ ’
где и - элекфохимическис потенциалы ионов в фазах (1) и
(2).
Учитывая заряд ионов, условие (4.96) можно
переписать в виде:
/z^ + F^^^+F^, (4.9e)
/1 /1 D L$
где (ра\<р( J - внутренние потенциалы фаз (1) и (2).
Складывая уравнения (4.9), получаем:
,(1) + „(О _ „(2) Л2)
Л +/ZS’ + '‘в*
(4.10)
Принимая во внимание, что jLit=/./'/+ RT In , и
учитывая, что стандартный химический потенциал ионов в
обеих фазах одинаков, уравнение (4.10) можно представить
в виде:
а“> а™ а"' а®
)п - = In ' - - = -
а'2} с/'0’ б/’2) ’
Г А В~
Учитывая соотношения (4.9), разность потенциалов
между фазами (1) и (2) можно записать как:
RT am RT a(2>
£o=<p(1)-^2, = ^ln-Ay = -^-ln-^r. (4.12)
Величина Ed называется мембранной или
доннановой разностью потенциалов. Используя
концентрации вместо активностей, из уравнений (4.9) и
(4.11) получаем:
Подставляя это выражение в уравнение (4.12) и
учитывая, что С\? = С, получаем:
На принципе полупроницаемости мембран основан
большой класс электродов - ионселективные электроды. К
их числу относится, в частности, стеклянный электрод,
используемый для определения pH.
4.5. Стеклянный электрод
Стеклянный электрод состоит из тонкостенного
стеклянного шарика, внутри которого находится
стандартный раствор с определенным значением pH (как
правило, 0.1 н. раствор ИС1), в который погружен
металлический электрод (серебряный электрод, покрытый
слоем хлорида серебра). Стеклянный электрод опускают в
раствор, pH которого необходимо определить, и измеряют
потенциал этого электрода относительно каломельного
электрода сравнения. Разность потенциалов цепи со
стеклянным электродом равна:
RT, а2
; 1П — ,
F
ст
ас
(4.15д)
где «/ - активность ионов Н во внутреннем раствор;
а? - активность ионов Н в исследуемом растворе;
Еас - потенциал асимметрии, обусловленный
различиями в свойствах внутренней и внешней
поверхностей стеклянного шарика (эта величина обычно не
превышает нескольких мВ и зависит от состава стекла и
технологии изготовления шарика).
Поскольку активность ионов Н во внутреннем
растворе постоянна, уравнение (4.15tz) можно записать в
виде:
RT
Е.т=Е:т+ -\па2, (4.156)
RT
где = Еас-—^\па{ - стандартный потенциал данного
электрода, определяемый калибровкой с использованием
растворов с известными pH. Уравнение (4.15о) строго
справедливо для кислых, нейтральных и слабощелочных
растворов. При больших pH наблюдаются отклонения от
этого уравнения, называемые щелочной ошибкой
стеклянного электрода. Эта ошибка зависит от сорта стекла,
природы катионов и pH исследуемого раствора. Потенциал
стеклянного электрода не искажается в растворах солей
тяжелых и благородных металлов, в окрашенных и мутных
растворах, в системах, обладающих окислительно-
восстановительными свойствами.
Потенциал стеклянного электрода является
мембранным потенциалом, возникающим как следствие
ионообменных свойств стекла. Щелочные катионы стекла
(ионы Na ) обмениваются с катионами раствора (ионами
водорода):
Na (стекло) + Н (раствор) «-► Na (раствор) + Н (стекло) (4.15«)
Таким образом, граница стекло - раствор оказывается
проницаемой только для катионов. В установлении
равновесия (4.15в) участ вуют поверхностные слои стекла на
внешней стороне электрода, проводимость между которыми
обеспечивается ионами Na . Число мест поверхности
стекла, на которых происходит обмен (4.15«), ограниченно
и постоянно.
Рисунок 4.3 - Стеклянный электрод: 1 - стеклянный шарик
со стандартным раствором, 2 - серебряный электрод, 3 -
мостик, соединенный со стандартным электродом
сравнения, 4 - исследуемый раствор.
Поэтому предполагается, что сумма активностей
ионов Na (а1) и Н ( а‘) также постоянна:
v Na ' Н 7
а + а „+ = а = const.
Na Н
(4.16а)
Равновесие (4.15«) можно описать с помощью константы
равновесия:
cm „
aH+aNa
cm
aH*aNa
(4.166)
Из уравнений (4.16) получаем:
а * а * а * а * + Ка *
/Г _ Na+ . Н+ _ Na Н+
„ст is f „ „ст ст „
ан /С yd J dн* l\.d
Подставляя
получаем:
соотношение (4.17) в уравнение (4.156),
RT /
^ст ~ ст *
(4.176)
Если Кагт+ »а„ + , что
Н Na
справедливо для кислых и
нейтральных растворов, то
+^’nkv)-
(4.18)
В этом случае стеклянный электрод селективен
только по отношению к ионам Н . При а^, + » KaIl+ , что
г Na Н '
справедли во для щелочных сред:
(4.19)
Щелочную ошибку стеклянного электрода можно
оценить, вычитая уравнение (4.18) из уравнения (4.176):
(4.20)
Из уравнения (4.20) следует, что щелочная ошибка
возрастает с увеличением концентрации ионов Na и pH
среды. Таким образом, в кислых и нейтральных средах
стеклянный электрод селективен по отношению к ионам
водорода, а в щелочных средах электрод становится
селективным к катионам щелочного металла. Путем
подбора состава стекла катионобменные свойства стекла
можно модифицировать, что позволило создать электроды
для определения не только Na’, но и К , Ag+, NI-Щ, Tl+, Li’,
Cs’ и органических катионов.
4.6. Другие типы ионселею ивных электродов
К настоящему времени разработано большое число
ионселективных электродов, с помощью которых можно
определять ионы Са ’, Са + Mg ', Zn Pb ’, La , СГ, Вг, Г,
S', F', CIO4, NCh и др. В качестве полупроницаемых
мембран в этих электродах используются различные
твердые и жидкие иониты (ионообменные вещества),
монокристаллы солей, полиэфиры и т.п.
Например, в одной из конструкций электрода для
определения Са' используется жидкая мембрана,
содержащая 0.1М раствор кальциевой соли
дидецилфосфорной кислоты в диоктилфенилфосфонате.
Фосфатные и полифосфатные ионы образуют с ионами Са2
прочные комплексы, т.е. такая мембрана проницаема
преимущественно для ионов Са' . Во фторидном электроде
использована мембрана из монокристалла фторида лантана
(LaFj). Этот монокристалл обладает повышенной
проводимостью ионов F по сравнению с другими видами
ионов. Большую группу составляют электроды, действие
которых основано на связывании катионов нейтральными
макроциклическими молекулами, например антибиотиками
(валиномицин) или полиэфирами.
4.7. Ферментные электроды
Особую группу электродов составляют ферментные
электроды - устройства, в которых электрохимический
датчик (ионселективный электрод) находится в
непосредственном контакте с иммобилизованным
(нерастворимым) ферментом. Схематически ферментный
электрод можно представить в виде рисунка 4.4. Наличие
фермента, специфически связывающего определенное
вещество, обеспечивает исключительно высокую
селективность таких электродов. Сопряжение
ферментативной и электрохимической реакций
осуществляют, главным образом, с помощью
низкомолекулярных медиаторов (электроактивных агентов,
которые переносят электрон с фермента на электрод). При
контакте ферментных электродов с анализируемым
раствором в приэлектродном слое протекает
ферментативная реакция. Скорость реакции определяют
либо по убыли концентрации субстрата в единицу времени,
либо по скорости образования продукта реакции. 13
зависимости от природы регистрируемого электроактивного
вещества (NH4 , Са , К , Н , СО2, О2, Jj, Н2О2, фенол и др.)
применяют амперометрические или потенциометрические
датчики различных типов и конструкций. Для изготовления
потенциометрических ферментных электродов, как
правило, используются ионселективные электроды.
Наиболее часто используемые ферменты - оксидазы,
гидролазы, лиазы. Регистрируя скорость реакции,
катализируемой иммобилизованным ферментом, можно
определять субстраты, активаторы, ингибиторы и сами
ферменты в анализируемом образце. Некоторые вещества
определяются в очень низких концентрациях - вплоть до
10 ' м.
Разработаны ферментные электроды различных
конфигураций:
1) простые ферментные мембраны;
2) системы с сопряженными ферментативными
реакциями, в которых реализуется субстратное
усиление сигнала;
3) системы неинтерферирующих ферментных мембран,
повышающие специфичность датчиков;
4) сенсоры для определения кофакторов, основанные на
конкуренции кофакторзависимого фермента и самого
фермента за общий субстрат;
5) сенсоры на основе медиатормодифицированных
электродов.
Большинство ферментных электродов предназначено для
определения органических соединений (сахаров - глюкозы,
галактозы, мальтозы, лактозы, аминокислот, мочевины,
гормонов, биогенных аминов, пестицидов, фенольных
соединений и т.п.).
Рисунок 4.4 - Ферментный электрод: 1 - корпус, 2 -
внутренний электролит, 3 - электрод сравнения, 4 - анод
(катод), 5 - ферментная мембрана, 6 - внешняя мембрана
4.8. Современные тенденции развития
электрохимических биосенсоров
Развитие амперометрических биосенсоров связано с
осуществлением переноса электрона непосредственно в
органические проводящие электроды. Эго необходимо для
достижения прочного контакта между слоем
биологического чувствительного элемента и
преобразователем, что позволяет улучшить параметры
биосенсора. Предпринимаются также попытки создания
молекулярного электрода путем объединения
органического проводника и белковых молекул в единую
молекулярную систему.
Потенциометрические биосенсоры состоят из
внутреннего ион-селективного электрода с
иммобилизованной на его поверхности активной
мембраной, электрода сравнения и раствора, в который
помещены оба этих электрода. В мембране один из
компонентов анализируемого раствора (как правило,
определяемое вещест во) превращается в форму, пригодную
для потенциометрического измерения при помощи
внутреннего ион-селективного электрода. В качестве
специфических химических реакций, лежащих в основе
работы биосенсоров, обычно используют ферментативные
реакции, которые проходят в гидрофильной мембране,
содержащей иммобилизованный фермент.
Развитием потенциометрических биосенсоров
являются ион-селективные полевые транзисторы (ИСПТ), в
которых изменяется заряд поверхности затвора транзистора
при действии определенного типа иоиов. Промежуточным
вариантом между иов-селективным электродом и ИСПТ
является сенсор, в котором мембрана нанесена на
металлоксидный полупроводниковый полевой транзистор и
затвор заменен ион-селективной мембраной,
контактирующей с анализируемым раствором. Основным
преимуществом ИСПТ является то, что преобразование
импеданса и усиление сигнала происходит на самом
датчике, поэтому можно устранить помехи и использовать
более простые электронные схемы.
На основе полевых транзисторов разрабатываются
мультисенсорные системы, позволяющие одновременно
проводить анализы на различные биологические вещества.
Чувствительность ферментных биосенсоров составляет
единицы микрограмм в миллилитре.
4.9. Вопросы для самоконтроля
1. Какие существуют механизмы переноса электрона в
окислительно-восстановительных (ОН) реакциях?
2. Восстанови гель принимает или отдает электроны в ОВ
реакции?
3. Каким раствором обычно заполняют солевой мостик?
4. В чем состоит условие электрохимического равновесия?
5. Чему равен потенциал электрода сравнения?
6. Сколько существует типов электродов?
7. К какому типу относится водородный электрод?
8. На каком принципе основаны ионселективные
электроды?
9. Обладает ли стекло ионообменными свойствами?
10. Можно ли с помощью стеклянного электрода измерить
концентрацию ионов натрия?
11. Из чего состоит ферментный электрод?
12. Для сопряжения каких реакций применяются
медиаторы?
13. Какой нижний предел детектирования
потенциометрических ферментных электродов?
14. Какое основное направление развития
амперометрических биосенсоров?
15. В чем состоит основное преимущество ИСПТ?
РАЗДЕЛ 5.
ОПТИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ
Основными преимуществами оптических сенсоров
являются:
а) бесконтактность (отсутствие подводимой
электрической энергии);
б) возможность комбинации химической
селективности со спектральной селективностью;
в) широкий диапазон измеряемых величин;
г) компактность;
д) невосприимчивость к электромагнитным помехам;
е) химическая пассивность;
ж) совместимость с телеметрическими устройствами;
з) безопасность при применении в диагностических
целях.
Простейшая схема оптического датчика может быть
представлена следующим образом: источник света -
оптическое волокно - образец - оптическое волокно -
фотодетектор.
5.1. Распространение свела в оптическом волокне
5.1.1. Полное внутреннее отражение
Рассмотрим две непроводящие диэлектрические
среды с коэффициентами преломления п\ и /?2, разделенные
плоской границей (плоскость ху). Предположим, что
плоская волна, расположенная в плоскости xz,
распространяется в среде 1 и падает на границу раздела под
углом . Отраженная и прошедшая волны образуют с
границей раздела углы вг и в{ в плоскости xz (рис. 5.1).
Рисунок 5.1 - Отражение и преломление света
В геометрической оптике явления отражения и
преломления света описываются двумя основными
законами:
1. При отражении от границы раздела двух сред
отраженный луч лежит в одной плоскости с падающим
лучом и нормалью к границе раздела в точке падения
(плоскости падения), угол отражения равен углу
падения.
%=0Г (5.1а)
2. При преломлении на границе раздела двух сред
преломленный луч тоже лежит в плоскости падения, а
отношение синуса угла преломления к синусу угла
падения равно отношению показателей преломления
различных сред (закон Снеллиуса):
/?] sin sin 0t; sin О, = — sin 0-. (5.16)
«2
Очевидно, что sin 6, и sin6z меньше 1. Однако, если
«2 < «1, (т.е. вторая среда оптически менее плотная, чем
первая), то может оказаться, что:
sin0j> —, (5.1е)
т.е. sin 6^ >1 (5.1 в). Это условие не может быть выполнено
для вещественных значений угла 6. , т.е. реального
преломленного луча нет. Критическое значение синуса угла
падения равно:
sin 9 = — . (5.1г)
Для любых значений 0, > 0{ свет полностью отражается от
границы, это явление называется полным внутренним
отражением (ПВО).
На явлении полного внутреннего отражения
основано распространение света в оптическом волокне
(световоде).
Световод состоит из сердцевины (с коэффициентом
преломления п\) и оболочки (с коэффициентом преломления
п2). Наибольшее распространение получили волокна с
кварцевой или стеклянной сердцевиной и полимерной
оболочкой (например, из полиуретана) (рис. 5.2).
Рисунок 5.2 - Оптическое волокно
Рассмотрим введение света в волокно. Для луча,
падающего на торец волокна под углом и имеющего угол
преломления 6^ закон Снеллиуса может быть записан в
виде:
770 sin^0 =/7] sin^j ,
(5.2(7)
где /7о - коэффициент преломления воздуха.
Обозначим угол, под которым луч попадает на
границу сердцевина - оболочка, - . Для ПВО должно
выполняться условие:
sin6r > —.
«1
(5.26)
Поскольку
неравенство (5.26) можно
—
77 э
записать как cos6] > — (5.2#).
п\
Учитывая соотношение (5.1#), получаем:
COS fl] =
2 2 11/2
«0 SHI 77o
-----s— > —;
«i щ
Величина
hq sin fl0
2 2p2
h -"2 J
(5.3)
называется числовой апертурой
волокна. Для большего угла ввода необходима большая
разность показателей преломления сердцевины и оболочки,
для большинства волокон ~ 10°.
5.1.2. Затухающее поле
Взаимодействие падающего и отраженного света
приводит к возникновению стоячей волны вблизи границы
раздела сердцевина - оболочка. Если на определенном
участке световода удалить оболочку, стоячая волна будет
затухать по экспоненциальному закону, т.е. образуется
затухающее поле, интенсивность которого уменьшается в е
раз на расстоянии:
= 7 2 2 W ’
2^j(sin“вТ-sin*' fl )
где к - длина световой волны в вакууме (рис. 5.2).
С затухающим полем может взаимодействовать лишь
материал, расположенный на расстоянии порядка длины
волны от сердцевины. Это явление используется в ряде
оптических сенсоров. Более глубокое проникновение
затухающей волны возможно лишь при использовании
высококоллимированных пучков света, падающих под
углами, близкими к критическому.
Стоячая волна
электромагнитного поля
Рисунок 5.2 - Затухающее поле
5.1.3. Поверхностный плазмонный резонанс
Интенсивность затухающего ноля, возникающего на
границе раздела двух оптически прозрачных сред, мала,
поскольку энергия стоячей волны составляет лишь
небольшую долю мгновенного максимального значения
потока энергии элекзрического ноля падающей световой
волны, возбуждающей стоячую волну. Поэтому для
повышения чувствительности датчика необходимо
увеличить интенсивность поля за счет изменения свойств
поверхности раздела. Для этой цели используется явление
поверхностного плазмонного резонанса. Поверхностный
плазмон - это поверхностная электромагнитная волна,
которая возбуждается в тонком слое металла. Устройство,
используемое для возбуждения поверхностного плазмона,
состоит из тонкой металлической пленки (толщиной около
50 нм), нанесенной на подложку с относительно высоким
показателем преломления п\ (рис. 5.3).
Анализируемая
Рисунок 5.3 - Поверхностный плазмон
Благодаря небольшой толщине металлического слоя
некоторая часть световой энергии может проникать через
него и при углах падения меньше критического имеет место
неполное отражение от металлической поверхности (от
верхней храницы слоя металла). При углах падения больше
критического весь свет отражается, за исключением
диапазона углов, при которых условия согласования для
импульса света таковы, что между металлическим слоем и
средой с более низким показателем преломления
возбуждается поверхностный плазмон. При определенном
угле падения (0,.J компонента волнового вектора
падающего света, параллельная поверхности раздела,
оказывается равной постоянной распространения
поверхностного плазмона, что приводит к возникновению
эффекта поверхностного плазмонного резонанса. Угол
падения света при резонансе определяется из следующего
условия:
2тг
Т
sin 0sp
(5.5а)
где кч, - волновой вектор поверхностного плазмона;
ст - вещественная часть диэлектрической
проницаемости металла;
~ диэлектрическая проницаемость среды с более
низким показателем преломления.
При падении света под углом 0S// коэффициент
отражения уменьшается почти до 0, в то время как при
углах падения, больших критического угла этот
коэффициент близок к 1. (т.е. при возникновении
поверхностного плазмонного резонанса волна проходит
через металл и попадает в среду с более низким показателем
преломления пг). В среде с более низким показателем
преломления электрическое поле поверхностного плазмона
уменьшается по экспоненциальному закону, подобно
затухающему полю. Однако интенсивность поверхностного
плазмона более чем на порядок выше, чем интенсивность
затухающего поля. Поэтому взаимодействие света с
примыкающей к поверхности металла средой будет более
сильным, что позволило создать сенсоры более
чувствительные к поверхностным изменениям, чем
сенсоры на затухающем поле.
5.2. Классификация оптических датчиков
Оптические сенсоры могут быть классифицированы
по нескольким критериям.
Во-первых, различают внешние и внутренние
оптические сенсоры. Во внешнем датчике свет, свет от
оптического источника вводится в волновод (обычно
оптическое волокно), направляется в точку, в которой
должны быть выполнены измерения, выводится из волокна,
модулируется на определенном участке и опять вводится в
это же или другое оптическое волокно (рис. 5.4).
Рисунок 5.4 - Внутренний и внешний оптические датчики
Во внутреннем датчике свет не выводится из
волокна, а модулируется в процессе распространения через
образец. К числу внутренних датчиков относятся также
датчики на затухающем поле. Разработаны также датчики
промежуточного типа, в которых свет, распространяющийся
в волокне, взаимодействует с образцом через иоле,
туннелирующее из волокна.
Во-вторых, различают прямые и непрямые
оптические сенсоры. Действие прямых сенсоров основано
на непосредственном измерении определенных
спектральных характеристик аналита.
В непрямых сенсорах используются реагенты,
оптические свойства которых изменяются при их
взаимодействии с аналитом. К числу таких свойств
относятся, в частности, упругое и неупругое рассеяние,
длина оптического пути, поглощение, интенсивность, время
жизни и поляризация флуоресценции. При непрямом
детектировании химическая селективность сочетается со
спектральной селективностью, что позволяет устранить
нежелательные побочные вклады в измеряемый сигнал.
В-третьих, оптические сенсоры классифицируются
по измеряемому параметру - амплитуде, длине волны,
фазе, поляризации и временным характеристикам световой
волны.
Таким образом, сенсоры различаются по способу
использования оптического волновода (внешние и
внутренние датчики), ио принципу действия
чувствительного элемента (прямые и непрямые сенсоры) и
по измеряемому параметру. К каждой категории сенсоров
предъявляются свои специфические требования.
5.3. Датчики с модулируемой амплитудой
Датчики, основанные на измерении амплитуды
световой волны (оптической плотности образца)
отличаются простотой, надежностью и низкой стоимостью.
Оптические явления, которые лежат в основе изменения
интенсивности света, проходящего через образец и
регистрируемого фотодетектором, включают поглощение,
упругое рассеяние, отражение, преломление и
флуоресценцию. Однако амплитудные сенсоры имеют
существенный недостаток, связанный с необходимостью
сравнения измеряемого сигнала с эталоном (с целью
достижения хорошей точности измерения и стабильности
калибровки). Возможны различные конфш урации
амплитудных сенсоров.
5.3.1. Прямые внешние сенсоры
Для этих сенсоров характерны две основные
конфигурации, в которых образец помещается между двумя
оптическими волокнами или на конце одного волокна
(одногорцсвая конфш урация) (рисунки 5.5. Л и Б). В
конфи! урации второго тина используются эффекты
зеркального и диффузного отражения или обратного
рассеяния света для того, чтобы возвратить свет от
чувствительного элемента системы к фотодетектору. При
анализе слабо рассеивающих образцов используются
оптические отражатели. Сенсоры, основанные на обратном
рассеянии, применяются, в частности, для измерения
скорости дыхания и определения параметров крови.
Рисунок 5.5 - Конфигурации оптических сенсоров
5.3.2. Прямые внутренние сенсоры
Большинство прямых внутренних сенсоров основано
на взаимодействии затухающего поля с внешней средой,
которой чаще всего является сам образец (рис. 5.5, В).
Интенсивность света, прошедшего через образец, является
функцией комплексного показателя преломления
I
п =п + ik
(5.50,
где п - действительная часть показателя преломления; к -
коэффициент экстинкции. Изменения п и к измеряются
сенсорами, которые называются рефрактометрическими и
спектроскопическими соответственно. В конструктивном
плане датчики на затухающем поле представляют собой
световод, на определенном участке которого удалена
оболочка, так что сердцевина, с иммобилизованными па ее
поверхности биологическими компонентами может
непосредственно контактировать с жидким образцом.
Особенно эффективными датчики на затухающем поле
оказались при наблюдении связывания лигандов со слоем
антител, иммобилизованных па поверхности волновода. В
спектроскопических сенсорах используются также полые
волноводы, которые служат оптической ячейкой для
газообразных или жидких образцов (рис. 5.5, I ).
Использование 1-4 м полого волновода для
спектроскопического анализа жидкостей позволяет
повысить чувствительность в 1000 раз по сравнению со
стандартной кюветой, в которой оптический путь равен 1
см, при условии, что анализируемый раствор имеет
больший показатель преломления, чем оболочка волокна.
5.3.3. Непрямые внешние сенсоры
В непрямых внешних сенсорах детектируется
изменение оптических свойств (коэффициента экстинкции
или показателя преломления) не самого аналита, а другого
агента, (как правило, красителя (хромофора) или
флуоресцентного зонда (флуорофора)), изменения
оптических параметров которых зависят от концентрации
аналита. Непрямые внешние сенсоры могут быть основаны
на пропускании (рис. 5.6, А) (трансмиссионные сенсоры) и
на обратном рассеянии или отражении света (рис. 5.6, Б)
(одноторцевые сенсоры). В одноконцевых сенсорах
микрокамера с образцом находится на кончике волокна.
Если реагент, среда или подложка не рассеивают свет,
используются металлические отражатели для того, чтобы
возвратить световой пучок в волокно. Трансмиссионные
сенсоры удобны для контроля окружающей среды, когда
размеры образца не являются критичными.
Рисунок 5.6 - Конфигурации оптических сенсоров: Р -
падающий свет, D - детектируемый свет, Р , D*-
возбуждение и детектирование под прямым углом, Т -
трансдуктор, S - образец
5.3.4. Непрямые внутренние сенсоры
Наиболее распространенная конфигурация сенсоров
этого типа основана на детектировании затухающей волны,
проходящей через слой аналит-чувствительного слоя,
иммобилизованного на боковой поверхности волновода
(рис. 5.6, В). Принцип детектирования основан на
регистрации изменений пропускания волновода,
обусловленных изменением комплексного показателя
преломления чувствительного слоя в присутствии аналита.
На основе кварцевых волокон с силиконовой оболочкой
сконс груированы сенсоры, в которых используются
различные методологии:
а) силиконы химически модифицируются так, что их
коэффициент поглощения становится функцией
концентрации аналита;
б) некоторые органические аналиты могут проникать
в силиконовый слой, изменяя его оптические свойства;
в) оболочка световода на определенном участке
замещается силиконом, легированным индикатором (хромо-
или флуорофором).
Другая конфи! урация сенсоров основана на
использовании капилляров, внугренняя поверхность
которых покрыта химически чувствительным слоем (рис.
5.6, Г). Преимуществом такого вида сенсоров является
минимальный объем образца и малое время отклика.
Созданы также сенсоры, в которых чувствительный слой
сам служит волноводом (рис. 5.6, Д). В таких сенсорах
измеряется показатель преломления и поглощение
волновода как функция концентрации аналита в
окружающем волновод образце.
В ряде непрямых внутренних сенсоров используется
явление поверхностного плазмонного резонанса. В этом
случае угол минимального отражения света от поверхности
металлического слоя является функцией концентрации
аналита. Эффект резонансного взаимодействия световой
волны с поверхностными плазмонами на поверхности
тонкая металлическая пленка/диэлектрик наблюдается
тогда, когда волновые векторы светового излучения и
поверхностных плазмонов, возбужденных р-
поляризованным светом, оказываются согласованными.
Наиболее простой путь получения такого согласования -
использование техники полного внутреннего отражения.
Применительно к биосенсорам используются две основные
конфигурации преобразователя (Рис. 5.7) Это призмы,
покрытые тонким (около 50 нм) слоем металла
(Kretschmann-конфигурация), а в последнее время -
металлические дифракционные решетки.
Изменение показателя преломления раствора будет
приводить к изменению угла минимального отражения (6^).
Основная проблема в создании биосенсоров этого типа
заключается в точной регистрации угла 0sp, которая в
конечном счете определяет чувствительность сенсора.
Сенсоры этого типа могут успешно применяться в
сочетании с технологией Ленгмюра - Блоджетт.
Рисунок 5.7 - Схема биосенсора на поверхностном
плазмонном резонансе: 1 - подложка, 2 - металлическая
пленка. 3 - биологически активная пленка. 4 - призма. 5 -
камера, 6 - поток реагента. 7 - луч лазера
Сенсоры на поверхностном плазмонном резонансе и
дифракционных решетках используются для определения
лекарств, пестицидов, ионов металлов, для исследования
специфического связывания лигандов, адгезии клеток и т.д.
5.4. Датчики с модулируемой длиной волны
Сенсоры, основанные на измерении флуоресценции
или комбинационного рассеяния относятся к числу
датчиков с модулируемой длиной волны. В таких
устройствах образец или молекулы аналита возбуждаются
на одной длине волны, а аналитический сигнал
детектируется па другой длине волны. I [ри этом
регистрируются изменения амплитуды, фазы, поляризации
или временного параметра.
5.4.1. Прямые внешние флуоресцентные сенсоры
Флуоресцентные методы используются для
определения большого числа аналитов в жидких, твердых и
газообразных образцах. Прямые внешние флуоресцентные
сенсоры имеют, как правило, одноторцевую конфигурацию
(рис. 5.4). Основным фактором, лимитирующим
чувствительность таких сенсоров, является потеря сигнала,
которая пропорциональна квадрату расстояния от торца
волокна. Амплитуда сигнала может быть увеличена (в 2 -4
раза) путем зеркального отражения света от удаленного
конца образца в волокно. Другой способ увеличения
сигнала (почти на порядок) состоит в отклонении концов
волокна так, чтобы конусы возбуждающего и испускаемого
света максимально перекрывались.
5.4.2. Прямые внутренние флуоресцентные сенсоры
На рисунке 5.4, В изображены сенсоры, основанные
на флуоресценции полного внутреннего отражения. В таких
сенсорах флуоресценция возбуждается в образце
затухающей волной на границе раздела волновод - образец,
энергия флуоресцентного излучения «захватывается»
волноводом и передается на фотодетектор. Выход по
энергии возрастает с увеличением разности показателей
преломления сердцевины и оболочки.
Разработаны также сенсоры, в которых высокая
чувствительность обеспечивается большой длиной
оптического нуги (рис. 5.4, 1 ). При этом используются
волокна с жидкой сердцевиной (показатель преломления
жидкости должен быть больше, че.м оболочки). Такие
сенсоры позволяют детектировать следовые количества
флуоресцирующих аналитов (например, перилен
детектировался в концентрации 0,4 пг/мл при длине
оптического пути 12 м).
5.4.3. Непрямые внешние флуоресцентные сенсоры
При конструировании биосенсоров этого типа
предпочтение отдается соединениям, флуоресцирующим в
дальней красной (700-900 нм) и ближней ИК (1000 нм)
областях. Эти флуорофоры имеют ряд преимуществ,
обусловленных:
а) наличием в указанной области спектра
полупроводниковых источников света и фотодетекторов,
позволяющих упростить конструкцию сенсора и
существенно уменьшить его размеры;
б) существенным уменьшением величины эффектов,
связанных с релеевским и рамановским рассеянием;
в) снижением вклада фонового испускания примесей;
присутствующих в образце.
Флуорофор. используемый в сенсорах, должен
удовлетворять следующим требованиям'.
а) высокий квантовый выход (отношение числа
испущенных фотонов к числу поглощенных фотонов);
б) большой Стоксов сдвиг (разность между
максимумами спектров поглощения и флуоресценции);
в) возможность возбуждения флуоресценции
промышленными лазерными диодами;
I) химическая и фотохимическая стабильность;
д) наличие реакционноспособных групп,
позволяющих иммобилизовать флуорофор.
Этим требованиям удовлетворяют, в частности,
карбоцианиновые и фталоцианиновые красители.
Наиболее распространенной конфигурацией
непрямых внешних флуоресцентных сенсоров являются
одноконцевые сенсоры (рис. 5.5, Б). Небольшой диаметр
сердцевины волокна ограничивает освещаемую площадь и
может приводить к фотообесцвечиванию. Для коррекции на
эффект фотообесцвечивапия используются
радиометрические методы.
Эти методы основаны на измерении:
а) отношения максимумов испускания двух
индикаторов;
б) отношения интенсивностей на двух длинах волн в
спектре флуоресценции;
в) отношения интенсивностей флуоресценции,
измеренных па одной длине волны при двух разных длинах
волн возбуждения.
Радиометрические методы позволяют также
компенсировать изменения сигнала, обусловленные
различными условиями измерения (различиями в
температуре, ионной силе и вязкости/
Развитие оптической микроскопии привело к
созданию субмикрометровых оптоволоконных сенсоров.
Теоретически доказано, что чувствительность этих сенсоров
существенно зависит от радиуса (R) конического кончика
волокна, на котором иммобилизуется чувствительный
реагент. Уменьшение размеров позволило снизить предел
детектирования (пропорциональный R), пространственное
разрешение и чувствительность сенсора, а также уменьшить
время отклика (пропорциональное R ), объем образца,
эффект нагрева, токсичность, инвазивность и стоимость. В
то же время уменьшение размеров ухудшает отношение
сигнал/шум (пропорциональное R) и усиливает утечку и
фотообесчвечивание.
Первый субмикрометрический химический сенсор
был сконструирован в 1992 году путем фотополимеризации
pH-чувствительного флуорофора на вытянутом
(конусообразном) кончике оптического волокна.
Флуоресценция возбуждалась светом, распространяющимся
по волокну, и детектировалась с помощью линз
фокусирующего объектива. По сравнению с обычным
флуоресцентным pH-сенсором, размеры чувствительной
зоны уменьшились в К) ' раз, объем образца - в 1()” раз,
время отклика сократилось в 10 раз и предел
детектирования уменьшился в Ю” раз. Аналогичная
технология была использована для конструирования
сенсоров на различные вещества, в том числе и на глюкозу.
Кроме фотополимеризации, в субмикрометрических
сенсорах были применены другие методы иммобилизации,
включая иммобилизованные пленки и антитела.
Фотополимеризация была использована также для
создания полимерной микроматрицы, состоящей из тысяч
отдельных полусферических элементов, иммобилизованных
на оболочке пучка волокон. Транспорт аналита к каждому
полусферическому чувствительному элементу
контролируется главным образом радиальной диффузией (в
отличие от латеральной диффузии, происходящей в
пленочных чувствительных слоях). При радиальной
диффузии аналита к чувствительной поверхности время
отклика сенсора сокращается до 0,2 - 0.3 с. Разработаны
сенсоры, в которых химически чувствительные микросферы
располагаются в ячейках (диаметром 100 нм - 1 мкм),
вытравленных на кончиках волокон, собранных в пучок.
В ряде сенсоров используется пучок когерентных
одномодовых оптических волокон. Пространственное
разрешение в таких сенсорах достигается путем точного
размещения нескольких чувствительных элементов на
удаленном конце пучка. Интенсивность флуоресценции
(пропорциональная концентрации анализа) и
пространственное распределение аналита детектируются
одновременно с помощью видеокамеры. Первый сенсор
такого типа содержал три pH-чувствительных конуса
диаметром 125 мкм, изготовленных путем
фотополимеризации полимера, легированного красителем.
Дальнейшее развитие такой технологии привело к созданию
сенсоров, способных одновременно детектировать
несколько веществ (кончики различных волокон
чувствительны к различным реагентам).
5.4.4. Непрямые внутренние флуоресцентные
сенсоры
Одна из конфигураций сенсоров этого типа
изображена на рисунке 5.5, В. На определенном участке
световода оболочка замещена аналит-чувствительным
слоем, в котором распространяется затухающая волна.
Такая геомезрия позволяет регулировать чувствительность
путем изменения параметров чувствительного слоя.
Вследствие низкой интенсивности затухающего поля
уменьшается нежелательный вклад эффекта
фотообесцвечивания. Малая глубина проникновения
затухающей волны позволяет разделить флуоресцирующие
комплексы, связанные с волокном и находящиеся в
растворе. Этот фактор является одним из наиболее
существенных при конструировании флуоресцентных
сенсоров. Когда чувствительный кончик волокна
погружается в образец, флуоресценция самого раствора
может искажать аналитический сигнал. Этот эффект можно
ослабить, помещая слой поглощающего свет материала
между раствором и кончиком волокна. Иммобилизация
реагента на лишенном оболочки участке оптического
волокна изменяет диэлектрические характеристики
волновода. Часто используются короткие волокна,
лишенные оболочки на всей длине. Такие сенсоры
позволяют определять очень малые количества
флуоресцирующего аналита. Например, в сенсоре,
основанном на реакции гибридизации ДНК с
комплементарным флуоресцентно-меченым
олигонуклеотидом, предел детектирования составляет
около 200 фемтомолей.
Для детектирования малых нейтральных молекул
созданы сенсоры с химически модифицированной
оболочкой, проницаемой для аналита. Преимущество таких
сенсоров состоит в сохранении структуры волновода и
механической гибкости чувствительного участка.
Силиконовая оболочка обычных оптических волокон может
быль использована как среда для иммобилизации многих
флуоресцирующих реагентов. Однородность
микроокружения флуорофора в оболочке позволяет достичь
более высокой точности регистрации флуоресценции, чем
при использовании силиконовых пленок, для которых
характерна более высокая степень агрегации
иммобилизованного флуорофора. Свойства силиконовой
оболочки в ряде случаев оказываются важными для
обеспечения селективности сенсора.
5.5. Сенсоры, основанные на комбинационном
рассеянии (КР-сенсоры)
КР-сенсоры не столь ограничены в применении, как
флуоресцентные сенсоры, поскольку рамановское рассеяние
характерно для большинства молекул. Эффект
комбинационного рассеяния света был открыт в 1928 году
индийским ученым Раманом, который обнаружил, что часть
рассеянного в жидкости света имеет длину волны, которая
отличается от длины волны падающего света. Свет с
измененной длиной волны называют комбинационно-
рассеянным светом. Комбинационное рассеяние
обусловлено неупругими столкновениями фотонов с
молекулами. Под неупругими понимают столкновения, при
которых происходит обмен энергией между фотоном и
молекулой, т.е. энергия фотона и молекулы меняется.
Изменения энергии молекулы соответствуют переходам
между се энергетическими уровнями, главным образом
колебательными. Спектр КР - это колебательный спектр,
который содержит информацию о расположении атомных
ядер и химических связей в молекуле, а также о
взаимодействии молекулы с ее ближайшим окружением.
В УФ и видимой областях спектра комбинационное
рассеяние на 4-6 порядков слабее, чем фоновая
флуоресценция образца. Поэтому спектры КР
регистрируются в ближней ИК области, где флуоресценция
большинства соединений пренебрежимо мала.
Прямые внешние КР-сенсоры конструируются с
использованием конфи! ураций прямого (рис. 5.5, Л) или
обратного рассеяния (рис. 5.5. Б). В большинстве
волоконно-оптических приборов используется
конфигурация обратного рассеяния. Конфигурация прямого
рассеяния предпочтительна для мутных сред, таких как
природная вода и коллоидные растворы. В этом случае
высока эффективность сбора рассеянного света, поскольку
конусы возбуждающего и собираемого света почти
полностью перекрываются. В прямых КР-сенсорах
используется также явление усиления комбинационного
рассеяния на поверхности (surface-enhanced Raman
scattering, SERS). При сорбции молекул аналита на
металлической поверхности или на металлических
коллоидных частицах рамановское рассеяние аналита
значительно усиливается (вплоть до 106 раз), тогда как
рассеяние растворителя и других компонентов раствора
остается относительно слабым. Это позволяет достичь
пределов детектирования порядка пико- и фемтомолей.
Селективность обеспечивается путем разложения КР
спектра на составляющие, соответствующие различным
компонентам образца.
Рамановский сигнал может быть получен также при
использовании конфигурации (рис. 5.5.В), в которой пленка,
содержащая аналит, сорбируется на поверхности волновода.
При распространении электромаг нитной волны в волноводе
в пленку аналита попадает затухающее поле. Недавно было
обнаружено явление резонансного усиления
комбинационного рассеяния на поверхности полимерной
матрицы, содержащей аналит (surface-enhanced resonance
Raman scattering, SER RS). В сенсорах, основанных на этом
явлении, усиление сигнала может достигать К)1 . Волновод
также может использоваться как матрица для
концентрирования аналита или как ячейка для образца (Рис.
5.5,Г). Преимуществами такой конфигурации являются
возможность достижения более сильного рамановского
сигнала и малый объем анализируемого раствора.
В непрямых КР-сенсорах аналит детектируется по
характерному изменению SERS-спектров определенного
индикатора. С использованием конфигураций,
представленных на рисунках 5.5, Б и 5.5, В были созданы
КР-сенсоры на ионы металлов и pH.
5.6. Датчики с фазовий модуляцией
Менее распространенными (ввиду более сложной
конструкции и большей стоимости) являются датчики с
фазовой поляризационной или временной модуляцией. В
сенсорах с фазовой модуляцией (интерферометрических
сенсорах) разность фаз между пучком света, проходящим
через образец, и опорным пучком является функцией
концентрации аналита. В этих сенсорах чаще всего
используются интерферометры Маха-Цендера. и Фабри-
Перо. В интерферометре Маха-Цендера пучок света
разделяется на два идентичных пучка с помощью зеркала
Mi (рис. 5.8).
Рисунок 5.8 - Схема интерферометра Маха-Цендера
Эти пучки проходят через среды А и Б и
объединяются с помощью зеркала Мд. Возникающая
интерференционная картина зависит от разности
показателей преломления сред А и Б. Волоконно-
оптический аналог интерферометра Маха-Цендера имеет
вид, представленный на рисунке 5.9. В данном случае роль
зеркал Mi и М4 играют оптические соединения между
сердцевинами двух волокон. Интенсивность света на конце
волокна определяется разностью фаз световых пучков,
распространяющихся в плечах I (плечо, содержащее
образец) и 2 (опорное плечо).
Рисунок 5.9 - Схема волоконно-оптического
интерферометра Маха - Цендера
Распространение элеклромагнитной волны во
времени и в пространстве в направлении к описывается
выражением:
E(r/) = Е, ехр(2^[/<г/л+ d'J, (5.6)
где Е(г,Г) - электрическое поле в точке г в момент
времени Z;
к - единичный вектор в направлении к: Л - длина
волны; со - частота (с ’); д'- начальная фаза волны,
которая определяет величину электрического поля в точке
г - 0 в момент времени t = 0, (12^7 кг/Л-cot 4-д' )-
мгновенная фаза в данный момент времени, в данной точке
пространства);
Ео - амплитуда волны (максимальное значение
интенсивности элекгрического поля). Аналогичным
образом описывается магнитное ноле. Скорость волны
равна:
Эта величина связана с диэлектрической (гг) и
магнитной (//) проницаемостью среды, в которой
распространяется волна:
где 6’,. и диэлектрическая и магнитная проницаемости
среды, отнесенные к значениям этих величин в вакууме
(б\и //,), с,-скорость света в вакууме (3 10ь м/с).
Большинство оптических сред принадлежат к классу
диэлектриков, для которых ~ 1, > 1. Отношение
со/с = п по определению является показателем
преломления среды (и). Из соотношений (5.7) следует, что
. и п зависят от частоты приложенного поля. С учетом
уравнений (5.7) уравнение (5.6) можно записать как:
E{r,t) = Ео ехркГсоИлс-cot+ 8 )=
= Ео ехр( 2тгс[/(У гл/2ли0£ 1 2 - cot + д'])
Отсюда следует, что распространение двух
изначально идентичных волн в средах с различной
диэлектрической проницаемостью приведет к сдвигу фаз.
Разность фаз зависит от показателя преломления образца,
который связан с диэлектрической проницаемостью (5.7).
Диэлектрическая проницаемость вещества связана с числом
частиц в единице объема (ЛО соотношением:
, , z- г, ч
8 = 1+ — , (5.9и)
где а- поляризуемость (величина, характеризующая
способность электронов к смещению относительно ядер
атомов, способность атомов к смещению в молекуле,
способность полярных молекул к ориентации в
направлении электрического поля). Для плоской волны,
распространяющейся вдоль оси z:
а = ez(t)/Ez(t). (5.96)
Таким образом, сдвиг фаз будет зависеть от
концентрации аналита в образце и его поляризуемости, т.е.,
измеряя сдвиг фаз, можно определить концентрацию
аналита.
В отличие от интерферометра Маха-Цендера, в
интерферометре Фабри-Перо интерферируют не два, а
множество пучков, которые образуются при отражении
света от диэлектрической пластинки (рис. 5.10). В этом
случае возможны измерения очень малых изменений длины
оптического пути (или изменения скорости
распространения света). Точность определения сдвига фаз в
таких сенсорах достигает 0.002тг, что соответствует
определению показателя преломления с точностью 10’6.
Преимуществами интерферометрических сенсоров
являются их нечувствительность к факторам, вызывающим
изменение интенсивности света, и более широкий
динамический диапазон.
Рисунок 5.10 - Многократная интерференция световых
пучков в интерферометре Фабри - Перо
5.7. Датчики с поляризационной модуляцией
Различают два основных типа датчиков с
поляризационной модуляцией. Датчики первого типа
основаны па прямом измерении концентрации оптически
активных веществ. Пример такого сенсора приведен на
рисунке 5.11, А. С помощью поляризатора
неполяризованный падающий свет превращается в плоско -
поляризованный. При прохождении через образец
плоскость поляризации поворачивается на определенный
угол, зависящий от концентрации оптически активного
вещества и длины оптического пути. Прошедший через
образец луч с помощью дополнительного поляризатора
разделяется на два луча, поляризованные в двух взаимно
перпендикулярных направлениях, интенсивность которых
измеряется.
Рисунок 5.11 - Основные конфигурации датчиков с
поляризационной модуляцией: Р - падающий свет, D -
детектируемый свет, Т - трансдуктор, S - образец
К сенсорам второго типа относятся внутренние
датчики, основанные, в частности, на измерении сдвига
фазы при прохождении затухающей волны через образец
(рис. 5.11, Б, В). Например, при адсорбции белков с
молекулярным весом 65-150 кД на лишенном оболочки 5
см участке оптического волокна наблюдался сдвиг фаз (0.1-
0,25)2л. Измерение сдвига фаз в сенсорах с
поляризационной модуляцией позволило повысить
точность определения показателя преломления до 2-10’8, что
соответствует разрешению фаз 0.0002л. В таких датчиках
возможно детектирование изменений в массе
адсорбированного па волокне вещества порядка 10
фемтограмм/мм'.
5.8. Датчики с временной модуляцией
Разработаны два основных типа датчиков с
временной модуляцией. Датчики первого типа
предназначены для анализа пространственного
распределения концентрации аналита и конструируются,
как правило, с использованием множества волокон
различной длины, которые собирают информацию с
различных точек образца. Сенсоры второго типа основаны
на измерении времени затухания флуоресценции аналит-
чувствительного зонда. Динамическое тушение
флуоресценции зонда аналитом приводит к изменению
времени затухания флуоресценции.
Преимуществами таких сенсоров по сравнению с
сенсорами, основанными на измерении интенсивности
флуоресценции, являются:
1) нечувствительность к колебаниям интенсивности
источника света и чувствительности фотодетектора;
2) независимость от рассеяния и поглощения света в
образце;
3) отсутствие необходимости в постоянной
калибровке (при условии, что фотообесцвечивание
флуорофора не приводит к образованию флуоресцирующих
продуктов).
Основной недостаток сенсоров с временной
модуляцией состоит в сложности конструкции.
Дальнейшее совершенствование оптических
биосенсоров связано с:
1) развитием новых принципов детекции,
позволяющих повысить отношение сигнал/шум;
2) созданием генетически модифицированных
ферментов и новых типов антител обладающих высоким
сродством и селективностью к различным лигандам;
3) синтезом новых поглощающих и
флуоресцирующих реагентов, применимых в области 700-
1000 нм, для которой разработаны наиболее доступные и
дешевые источники и приемники излучения.
5.9. Вопросы для самоконтроля
1. В чем состоят основные преимущества оптических
сенсоров?
2. На каком явлении основано распространение света в
оптическом волокне?
3. Что такое поверхностный плазмон?
4. Сколько существует критериев классификации
оптических сенсоров?
5. В каких сенсорах измеряются спектральные
характеристики аналита (прямых или непрямых)?
6. В чем состоит основной недостаток амплитудных
сенсоров?
7. В чем состоит конструктивная особенность датчиков на
затухающем поле?
8. Какой параметр является функцией концентрации
аналита в сенсорах на поверхностном плазмонном
резонансе?
9. Детектируется ли изменение оптических свойств аналита
в непрямых внешних сенсорах?
10. Какие сенсоры относятся к числу датчиков с
модулируемой длиной волны?
11. Какой фактор лимитирует чувствительность прямых
внешних флуоресцентных сенсоров?
12. Каким флуорофорам отдается предпочтение при
конструировании непрямых внешних флуоресцентных
сенсоров?
13. Каким пробованиям должен удовлетворять флуорофор.
используемый в биосенсорах?
14. Какие методы используются для коррекции на эффект
фотообесцвечивания ?
15. В чем состоят преимущества датчиков с временной
модуляцией?
16. Чем обусловлено комбинационное рассеяние?
17. В какой области регистрируются спектры
комбинационного рассеяния?
18. Как можно усилить рамановское рассеяние аналита?
19. В чем состоят преимущества интерферометрических
сенсоров?
20. Какие основные направления развития оптических
сенсоров?
РАЗДЕЛ 6.
ДРУГИЕ ТИПЫ БИОСЕНСОРОВ
6.1. Биосенсоры на объемных пьезоэлектрических
резонаторах
Принцип работы биосенсоров на объемных
пьезоэлектрических резонаторах заключается в изменении
резонансной частоты кварцевого резонатора, электроды
которого покрыты пленкой, специфически адсорбирующей
биологически активное вещество. Например. если
электроды (поверхность резонатора) покрыты слоем
иммобилизованных антител, то при погружении в раствор,
содержащий антигены, происходит специфическая сорбция
антигенов на поверхности резонатора. В результате
изменяется резонансная частота, на основании чего
делается вывод о наличии специфической сорбции.
Зависимость резонансной частоты от массы F (т)
является следствием ее зависимости от резонансного
размера
р 2h'
(6.1а)
где V-скорость упругой волны;
h - резонансный размер, при А/?« h (случай тонких
мономолекулярных пленок)
(6.16)
При этом приращение массы составляет:
Д/и = ДЛ/тД, (6.1#)
где рк - плотность пьезоэлемента;
5] - площадь, на которой сорбируется аналит, образуя
слой толщиной Д7?.
Для типичных размеров h « 0.1 мм, F « 15 МГц:
—^ = ЛЛ =1(Г7-1О10;
h
д"'п«о =ДЛт.пА =10 -10 1 г;
=ДЛ,ипЛ =10 9 -IO’12 г/см2.
(6.2)
На практике чаще всего используется
дифференциальная схема измерения с опорным
резонатором, позволяющим сводить к минимуму дрейф
температуры и влияние неспецифической сорбции.
6.2. Биосенсоры на поверхностных акустических
волнах (ПАВ)
В отличие от гравиметрических резонансных
биосенсоров, основанных на объемном пьезоэлектрическом
эффекте, в сенсорах на поверхностных акустических волнах
используется зависимость параметров распространяющейся
поверхностной волны в пьезоэлектрике от состояния
поверхности. Из сенсоров на ПАВ наибольшее
распространение получила дифференциальная
конфигурация датчиков. На пьезоэлектрической подложке
(кварц, LiNbOa, ZnOfSiCb/Si)) расположены две идентичные
линии задержки на ПАВ, каждая из которых состоит из
напыленных возбуждающих и детектирующих электродов,
представляющих собой встречно-штыревые системы, шаг
которых определяет частоту возбуждаемой волны. В
области распространения ПАВ на одной из линий задержки
нанесен биочувствительный слой, селективно
адсорбирующий молекулы из анализируемого раствора.
Адсорбция молекул сопровождается уменьшением скорости
распространения ПАВ и, как следствие, частоты резонанса
генератора. Смеситель выделяет резонансную частоту,
пропорциональную количеству адсорбированных молекул.
Рабочая частота генератора на ПАВ составляет согни
мегагерц, поэтому чувствительность такой системы выше,
чем системы на объемном резонаторе. Однако стоимость
систем на ПАВ значительно больше, а технология их
изготовления сложна. По этой причине в настоящее время
структуры на ПАВ не нашли широкого распространения. В
отличие от объемных резонаторов, в датчиках па ПАВ
можно регистрировать изменение амплитуды, фазы и
частоты, что позволяет получать более подробную
информацию об адсорбируемом слое.
6.3. Калориметрические биосенсоры
Калориметрический биосенсор фактически является
микрокалориметром с биоспецифическими компонентами,
обычно ферментами или клетками, иммобилизованными на
микроколонке и находящимися в непосредственном
контакте с теплочувствительным элементом (термистором).
При реализации специфической реакции регистрируется
количество выделившейся теплоты. Ферментативные
реакции сопровождаются значительным выделением тепла,
обычно в диапазоне 25—100 кДж/моль. Использование
микрокалориметрической техники также возможно и при
регистрации взаимодействий антиген - антитело (метод
TELISA, thermometric enzyme linked immunosorbent assay
systems).
6.4. Вопросы для самоконтроля
1. Какой параметр изменяется при связывании аналита с
биосенсором на объемных пьезоэлектрических
резонаторах?
2. Какие минимальные изменения массы позволяют
детектировать биосенсоры на объемных
пьезоэлектрических резонаторах?
3. Какой параметр изменяется при связывании аналита с
биосенсором на поверхностных акустических волнах?
4. Какие биосенсоры получили большее распространение,
на объемных пьезоэлектрических резонаторах или на ПАВ?
5. Какое количество тепла может выделяться в процессе
ферментативной реакции?
РАЗДЕЛ 7.
ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОСЕНСОРОВ
7.1. Применение биосенсоров в медицине
Биосенсоры, содержащие ферменты, все более
широко применяются в клинических и биохимических
лабораториях. Ферменты обеспечивают высокую
селективность сенсоров к таким метаболитам и
физиологически активным веществам как сахара (в
частности, глюкоза), мочевина. мочевая кислота,
аминокислоты, спирты, липиды, холестерин, нуклеозиды,
антибиотики. Биосенсоры используются также для
диагностики различных заболеваний (инфаркта миокарда,
рака, инфекционных заболеваний) и анализа распределения
лекарственных препаратов в организме.
Наибольшее число биосенсоров различных типов
создано для определения глюкозы в крови и дру! их
биологических жидкостях. При определении глюкозы
используются различные ферментативные реакции,
главным образом, катализируемое глюкозооксидазой
окисление глюкозы кислородом воздуха, которое
сопровождается образованием перекиси водорода и
глюконовой кислоты.
GOx-FAD + D-Glucose « > GOx-FADH2 + D-Gluconolactone
GOx-FADH2 + O2 < > GOx-FAD + H2O2
(7.1)
D-Gluconolactone + H2O —> D-Gluconic acid
Концентрацию глюкозы можно определить, измеряя
с помощью электрохимических, флуориметрических,
фотометрических или других методов: а) количество
потребленного кислорода; б) сдвиг pH среды или в)
количество образовавшейся перекиси водорода.
Среди методов определения концентрации ИзО?
наибольшее распространение получил фотометрический
метод, основанный на расщеплении перекиси водорода под
действием фермента пероксидазы. При этом образуется
активная форма кислорода - супероксид анион-радикал О',
который, в свою очередь, окисляет хромоген, что приводит
к значительным изменениям спектров поглощения
хромофора. Основанный па этом принципе глюкометр «One
Touch» является одним из наиболее простых и точных
детекторов уровня сахара в крови. Тест-полоска этого
прибора (рис. 7.1) содержит глюкозооксидазу, пероксидазу
и хромоген, сорбированные на пористой гидрофильной
мембране. В результате реакции окисления глюкозы
образуется окрашенный комплекс, интенсивность цвета
которого регистрируется отражательным минифотометром.
В состав прибора «One Touch» входят два светодиода.
Обработка тест-полоски начинается с нулевого считывания.
После нанесения капли крови плазма впитывается
мембраной, и последующее протекание реакций с участием
глюкозооксидазы, пероксидазы и хромогена приводит к
окрашиванию тест-полоски. Прибор регистрирует
изменение в величине отражения света. Окрашенный
продукт реакции поглощает свет, излучаемый первым
светодиодом. Форменные элементы крови также поглощают
свет, поэтому для коррекции на эффект фонового
отражения производится еще одно считывание с помощью
второго светодиода, на другой длине волны. Разность
сигналов от светодиодов несет информацию о поглощении
света хромогеном. Далее по специальной калибровочной
шкале оценивается концентрация глюкозы.
Рисунок 7.1 - Строение тест-полоски глюкометра «One
Touch»
Первый биосенсор на глюкозу был создан в 1962
году Кларком и Лайнсом, которые нанесли на кислородный
элекзрод глюкозооксидазу. Поскольку в ходе
ферментативного окисления глюкозы потребляется
кислород, введение глюкозооксидазы в приэлектродный
слой позволило измерить концентрацию глюкозы
амперометрически. К настоящему времени разработано
множество ферментных электродов на основе
глюкозооксидазы, в которых для иммобилизации фермента
используются различные методы, например включение в
полиакриламидным гель, ковалентное связывание с
производными полиакриловой кислоты, инкапсулирование
в липидных везикулах и т.д.
7.2. Применение биосенсоров для анализа
объектов окружающей среды
При определении токсичных соединений в воздухе,
воде, почве, продуктах, кормах используются различные
типы биосенсоров, содержащие в качестве биологического
компонента ферменты, антитела, клетки, микроорганизмы.
Действие большинства фермент-содержаших сенсоров
основано на ингибирующем влиянии токсичных веществ на
ферментативную реакцию. Например, фосфорсодержащие
пестициды определяют по ингибированию холинэстеразы
или карбоксилэстеразы; серосодержащие соединения и
различные фенолы определяют с помощью пероксидазы;
инсектициды - с помощью бактериальной люциферазы,
папаина, ацетилхолинэстеразы, тяжелые металлы (ртуть,
свинец, кадмий) - по ингибированию уреазы и
холинэстеразы.
В иммуносенсорах используют антитела к вредным
веществам, например к бензапиренам, динитрофенолу,
паратиону. В зависимости от способа преобразования
сигнала, антитела могут быть иммобилизованы на
поверхности пьезоэлектрического кварцевого резонатора,
оптическом волокне, поверхности электрода.
Для определения содержания углекислого газа и
аммиака в сточных водах используются биосенсоры на
основе иммобилизованных бактерий, которые потребляют
эти газы. Кроме бактерий, при контроле загрязнения
окружающей среды применяются другие микроорганизмы -
дрожжи, водоросли, дафнии, инфузории, рыбы и т.д.
Токсические вещества вызывают морфологические и
функциональные изменения в состоянии этих организмов.
Таблица 7.1
Приложения биосенсоров.
Область применения Примеры
Медицина: диагностика in vitro диагностика in vivo Домашний контроль содержания глюкозы в крови Диагностика почечной недостаточности
Контроль окружающей среды Уровень потребления кислорода при очистке сточных вод
Пищевая промышленность Содержание сахарозы, свежесть продуктов
Контроль биопроцессов Контроль ферментации
Сельское хозяйство и смежные области Контроль уровня пестицидов
библиографический список
1. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы
(Ред. Дж. Вудворд), М.: Мир, 1988. - 215 с.
2. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе
иммобилизованных ферментов - Вильнюс: Мокслас,
1981.200 с.
3. Кулис Ю.Ю., Разумас В.И. Биоамперометрия.-
Вильнюс: Мокслас, 1986. 215 с.
4. Курочкин И.И., Попов Б.Н., Чернов С.Ф. Физико-
химические принципы функционирования
биосенсоров // Биол. мембраны. -1990. - Т. 7, № 10. -
С. 1068 - 1080.
5. Львов Ю.М., Ерохин В.В., Зайцев С.К). Белковые
пленки Ленгмюра - Блоджетт // Биол. мембраны-
1990.-Т. 7, №9.-С. 917-937.
6. Ивницкий Д.М., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.Д.
Электрохимические биосенсоры // Журн. анал.
химии. - 1991. - Т. 46, № 8. - С. 1462 - 1478.
7. Будников Г.К., Евтюгин Г.А. Сверхмалые дозы
биохимически активных веществ и отклик
биосенсоров в анали тических системах И Журн. анал.
химии. - 2001. - Т. 56, № 6. - С.655 - 658.
8. Туманов А. А., Китаева И. А., Баринова О. В.
Биологические методы определения физиологически
активных веществ в обьекгах окружающей среды //
Журн. анал. химии. - 1993. - Т. 48, № 1. - С. 6 - 17.
9. Коростылева Е.А., Мельниченко О.А., Туманов А.А.
Иммупохимичсские методы определения пестицидов
при экологическом контроле // Журн. анал. химии. -
1991.- Т. 46, № 12.- С.2314- 2324.
10. Будников Г.К., Евтюгин Г.А., Ризаева Е.П., Иванов
А.И., Латыпова В.З. Сравнительная оценка
электрохимических биосенсоров для определения
ингибиторов - загрязнителей окружающей среды И
Жури. анал. химии. - 1999. - Т. 54, № 9. - С. 973 -
9X1.
11. Туманов А.А., Коростылева Е.А. Биосенсоры в
анализе объектов окружающей среды // Журн. анал.
химии, - 1990.- Т. 45, № 7. - С. 1304- 1311.
12. Туманов А.А., Постнов И.Е. Биологический метод
анализа: проблемы избирательности и
чувствительности определения биологически
активных веществ И Журн. анал. химии. - 2000. - Т.
55, №2.- С. 208-211.
13. Vo-Dinh Т, Cullum В. Biosensors and biochips:
advances in biological and medical diagnostics // J. Anal.
Chem. - 2000, V. 366. - P. 540 - 551.
14. Potyrailo R., Hobbs S., Hieftje G. Optical waveguide
sensors in analytical chemistry: today's instrumentation,
applications and trends for future development H J. Anal.
Chem. - 1998, V. 362. - P. 349 - 373.
l5. D'Auria S., Lakowicz J. Enzyme fluorescence as a
sensing tool: new perspectives in biotechnology //
Current Opin. Struct. Biol. - 2001. - V. 12, P. 99- 104.
16. Bianco P. Protein modified- and membrane electrodes:
strategies for the development of biomolecular sensors //
Rev. Mol. Biotechnol. - 2002, V. 82, P. 393 - 409.
17. Demchenko A.P. Optimization of fluorescence response
in the design of molecular biosensors И Anal. Biochem.
- 2005.-V. 343, P. 1-22.
18. Zhang X., Guo Q., Cui D. Recent advances in
nanotechnology applied to Biosensors // Sensors. - 2009,
V. 9, P. 1033-1053.
19. Monosik R., Stredansky M., Sturdik E. Biosensors -
classification, characterization and new trends // Acta
Chimica Slovaca. - 2012. V. 5, P. 109 - 120.
20. Neha A. Recent advances in biosensors technology: a
review // Octa. J. Biosci. - 2013, V.l, P. 147 - 150.
Но вопросам приобретения книг обращайтесь:
Отдел продаж «ИНФРА-М» (оптовая продажа):
127214. Москва, ул. Полярная, д. 31 В. стр. 1
Тел. (495) 280-33-86 (лоб. 218, 222)
E-mail: bookware@intra-m.ni
•
Отдел «Книга—почтой»:
тел. (495) 280-33-86 (доб. 222)
ФЗ Издание не подлежит маркировке
Ne 436-ФЗ в соответствии с п. 1 ч 2 ст 1
Учебное издание
Горбенко Галина Петровна,
Трусова Валерия Михайловна,
Евстигнеев Максим Павлович
ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ
БИОСЕНСОРИКИ
УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ
Издательский Дом «Вузовский учебник»
127247, Москва, ул. С. Ковалевской, д. 1, стр. 52
www.vuzbook.ru
ООО «Научно-издательский центр ИНФРА-М»
127214, Москва, ул. Полярная, д. 31В, стр. 1
Тел.: (495) 280-15-96, 280-33-86. Факс: (495) 280-36-29
E-mail: books@infra-m.ru http://www.infra-m.ru
Подписано в печать 26.03.2025.
Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Petersburg.
Печать цифровая. Усл. печ. л. 8,75.
ППТ12. Заказ № 00000
ТК 330900-2203051-251214
Отпечатано в типографии ООО «Научно-издательский центр ИНФРА-М»
127211, Москва, ул. Полярная, д. 31 В. стр. 1
Тел.: (195) 2«0-15-96. 280-33-86. Факс: (495) 280-36-29